(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン分解能を有する担子菌  ＭＴ００３株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１８１７１）。
【請求項２】
請求項１記載の微生物もしくは当該微生物の産生するダイオキシン分解酵素を、ダイオキシン汚染物に作用させることを特徴とするダイオキシンの分解方法。
【請求項３】
ダイオキシン汚染物が、焼却灰又は土壌であることを特徴とする請求項２記載のダイオキシンの分解方法。
【請求項４】
焼却灰が、ｐＨ１０以上の高アルカリ性の焼却灰である請求項３記載のダイオキシンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はダイオキシン分解能を有する新規微生物及びダイオキシン分解方法に関し、詳しくはダイオキシン分解能を有する新規な担子菌株及び該微生物をダイオキシン汚染物に作用させてダイオキシンを分解する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機塩素化合物であるダイオキシン類は、廃棄物の不適切な焼却処理あるいは農薬等の製造や紙等の塩素漂白工程などにおいて、副生成物として発生する非常に毒性の強い化合物である。
一般に、ダイオキシンという名称は、ジベンゾ−ｐ−ジオキシンを骨格とする塩素置換体であるポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下、ＰＣＤＤと略記することがある。）及びジベンゾフランを骨格とする塩素置換体であるポリクロロジベンゾフラン（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ、以下、ＰＣＤＦと略記することがある。）の総称である。
骨格中の８個の水素原子は１〜８個の塩素原子に置換し得るため、ダイオキシンには、理論的には合計で２１０種類の化合物が存在する。その毒性は、塩素の置換位置と置換した塩素数により異なり、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ  、以下、２，３，７，８−ＴｅＣＤＤと略記することがある。）は、最も毒性が高く、急性毒性はシアン化カリウムの１万倍と試算されている。
【０００３】
また、ダイオキシン類は毒性ばかりでなく、極微量であっても発がん性やホルモン様作用を有することが指摘されている。しかも、ダイオキシン類は微生物等による分解を受け難いために、環境中に残留し、生物によって呼吸時の吸入や食物と共に生体内に取り込まれる。
さらに、ダイオキシン類は生体組織に蓄積しやすい性質を持つため、食物連鎖の上位にあるヒトにおいてはダイオキシン類の蓄積は他の動植物よりも深刻である。このため、近年はダイオキシン類による環境汚染は重大な社会問題となっている。
【０００４】
ところで、ダイオキシン類を分解し、除去する技術としては、これまでに過酸化水素添加後、紫外線を照射して分解する方法（特開昭５２−０３５４４５号公報）、熱分解法（特開平６−２９６７１０号公報）、燃焼条件の改善法（特公平３−１７８３８９号公報）、各種化学的分解法及び超臨界水処理法等が報告されている。
しかし、かなりの微量で広範囲にわたって汚染しているダイオキシンの処理には、これら既知の方法を適用することは難しく、また一般的に分解処理に要するコストが高いという問題を抱えている。さらに、副次的な廃棄物の発生も懸念されている。
【０００５】
一方、ダイオキシン類に対して高い分解能を有する微生物を活用して、環境修復を行う試みがなされている。この手法は、低コストであること、２次廃棄物の発生が少ないことを利点とし、新しい環境浄化技術として注目されている。
難分解性有機物の微生物分解については、Ｂｕｍｐｕｓらによって、木材の難分解性成分であるリグニンの分解能を有する白色腐朽菌であるファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）による数種の有機物の分解事例が報告されている。この報告以来、白色腐朽菌を中心に、ダイオキシン類など多数の難分解性有機物に対する分解能を検討した報告が見られる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２８，  ｐ．１４３４，  １９８５年）。
【０００６】
リグニン分解に関与する酵素としては、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びラッカーゼがある。これらの酵素は、その基質特異性の広さから、協同的にダイオキシン類を分解し得ることが見出されている。例えば、Ｖａｌｌｉらは、ファネロカエテ・クリソスポリウムによる２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，７−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下、２，７−ＤＣＤＤと略記することがある。）の分解と、該分解における前記菌の産生するリグニンペルオキシダーゼ及びマンガンペルオキシダーゼの関与について明らかにしている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７４（７），  ｐ．２１３１，  １９９２年）。
【０００７】
さらに、リグニン分解に関与する酵素を産生することができる菌が、総じて２，７−ＤＣＤＤを分解できる能力があることも示唆されている（紙パルプ技協誌，５０（１２），  ｐ．１２２，  １９９６  年）。また、細胞融合技術を用いて、新たにダイオキシン分解能を有する微生物も作出されている（特開平１１−１９７８号公報）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ダイオキシン分解微生物あるいは該微生物が産出するダイオキシン分解酵素等を用いてダイオキシン類の分解除去を行うにあたっては、それらが化学構造の異なる２１０種類にも及ぶダイオキシン類に対して網羅的に分解能を示すことが求められる。
しかし、ダイオキシン類の分解酵素は、該酵素を産生する微生物の種類によって異なる。従って、基質特異性、活性あるいは安定性等の酵素の基本的な性質においても異なっている。
また、個々のダイオキシン分解酵素についても、２１０種類も存在するダイオキシン類のそれぞれに対する分解能は一様ではなく、その分解作用には程度の差があり、ダイオキシン類に対して幅広い分解能を有する酵素は、未だ見出されていないのが現状である。
特に、公知のダイオキシン分解菌のダイオキシン分解能は、毒性の比較的低い二塩素置換体である２，７−ＤＣＤＤのみに対するものが中心であり、毒性の高い四塩素置換体あるいは分解が極めて困難とされる４個以上の塩素原子による置換体等に対する分解能に関しては、十分に示されたものではなかった。
【０００９】
本発明の第１の目的は、廃棄物等に含まれる多種類のダイオキシン類に対して幅広く分解能を示す微生物を新たに提供することである。
さらに、第２の目的は、該微生物あるいは該微生物によって産生される酵素を用いて、低コストで、かつ２次廃棄物の発生が少ないダイオキシン分解方法を提供することである。
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の末、腐朽木材やその周辺土壌からリグニン分解能を有する新規な担子菌を見出し、本発明に到達した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、ダイオキシン分解能を有する担子菌  ＭＴ００３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１７１）に関する。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載の微生物もしくは当該微生物の産生するダイオキシン分解酵素を、ダイオキシン汚染物に作用させることを特徴とするダイオキシンの分解方法に関する。
請求項３記載の本発明は、ダイオキシン汚染物が、焼却灰又は土壌であることを特徴とする請求項２記載のダイオキシンの分解方法に関する。
請求項４記載の本発明は、焼却灰が、ｐＨ１０以上の高アルカリ性の焼却灰である請求項３記載のダイオキシンの分解方法に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
第１の本発明は、ダイオキシン分解能を有する担子菌  ＭＴ００３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１７１）である。本菌は、腐朽木材やその周辺土壌から、真菌類を分離する既知の方法を用いて分離することができる。
特に、本菌はリグニン分解に関与する酵素群を生産するため、例えばリグニン分解微生物分離用培地（紙パルプ技協誌，５０（１２），  ｐ．１２２，  １９９６  年）を用いることによって、リグニン分解微生物として比較的容易にスクリーニングすることができる。すなわち、野外より採取した腐朽木材片などを蒸留水に懸濁し、この懸濁液を適宜希釈したものをスクリーニング用試料として用いる。この試料を、上記文献に記載されている分離用培地、すなわち上層にレマゾールブリリアントブルーＲ（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）  を含む２層からなる寒天培地上に塗沫し、適温で培養する。そして、当該色素を脱色し得る菌株をリグニン分解に関与する酵素を生産する菌株であると見なし、該菌株の集落を前記の２層寒天培地に再び塗抹し、上記と同様の条件で培養する。この操作を繰り返すことによって菌株を純粋に分離し、良好な脱色成績を示す菌株を選抜する。
【００１２】
本発明に係る担子菌  ＭＴ００３株は、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌａｃｅａｅ）科に属する白色腐朽菌に分類されるものと認められる新種である。すなわち、以下に示した方法により、本菌の同定を実施した。
【００１３】
Ｗｈｉｔｅらによって報告された方法（ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ３１５−３２２，  １９９０  年）に従って、ＭＴ００３株と既知の菌株のリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列との相同性を検索することに拠って行った。
まず、ＭＴ００３株について、上記文献に記載されている方法に従い、分類上有用な遺伝子領域となっている５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその近傍の６２２塩基対の塩基配列、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のほぼ全長に相当する１７３７塩基対の塩基配列並びに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’  末端領域６０３塩基対の塩基配列を決定した。それぞれの塩基配列を配列表の配列番号１、２、３に示す。
【００１４】
ＭＴ００３株の塩基配列は、以下の方法により決定した。まず、ＭＴ００３株の凍結乾燥菌体を液体窒素中で破砕後、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  社）  を用いてＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって目的とするリボソームＲＮＡ遺伝子領域を増幅した。このとき、５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅にあたっては、前記文献に記載されているプライマーＩＴＳ４及びＩＴＳ５を、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅には、同じくプライマー  ＮＳ１及びＮＳ８  を、さらに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅には、同じくプライマー  ＬＲＯＲ  及びＬＲ７  を用いてＰＣＲを行った。何れのリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅反応も、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  社）  を用い、プライマー４０ｐｍｏｌ、ＤＮＡ１０〜５０ｎｇ及び蒸留水で総量２５μｌの反応液を４本調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社）  上で反応を行った。温度条件は、９６℃で３分間保持後、９４℃（３０秒間）−５５℃（３０秒間）−７２℃（１分間）を３０サイクル行い、最後に７２℃で４分間保持して反応を終了した。
【００１５】
増幅したそれぞれの目的ＤＮＡ断片について、ダイターミネーター（Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  法によるサイクルシーケンシング（Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）  反応を行い、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）  により塩基配列を分析した。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社）  を用い、同社のプロトコルに従って行った。それぞれのリボソームＲＮＡ遺伝子領域のサイクルシーケンシング反応にあたっては、前記文献に記載されているプライマー等を用いた。それぞれの増幅断片について得られた塩基配列を連結し、目的塩基配列を得た。
【００１６】
これらの塩基配列について、米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供しているＢＬＡＳＴ検索を利用して、ＧｅｎＢａｎｋ登録データから塩基配列の相同性検索を行った。
その結果、登録データには、どの遺伝子領域についても、塩基配列の一致する登録菌株は存在しないことが分かった。
しかしながら、５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、スポンギペリス・ディレクタンス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ  ｄｅｌｅｃｔａｎｓ）の遺伝子との相同性が９１％と登録データ中で最も高かった。
また、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、スポンギペリス・ユニカラー（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ）との相同性が９８％と最も高く、登録菌株の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列をもとに作成した近隣結合系統樹において、ＭＴ００３株はスポンギペリス・ユニカラーと系統枝を形成することが分かった。２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）属のデータが登録されていないが、前記の近隣結合系統樹において、スポンギペリス・ユニカラーと登録菌株の中では最も近縁となるパナス・ラディス（Ｐａｎｕｓ  ｒｕｄｉｓ）との相同性が９５％と最も高いことが分かった。
【００１７】
以上の結果から、ＭＴ００３株はカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌａｃｅａ）科スポンギペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）属に属するか、またはその近縁の新種の菌株であることが分かった。これまでに、スポンギペリス属に属する菌株がダイオキシン分解能を有することに関しては全く報告がなく、本発明者らによって初めて見出されたことである。
ＭＴ００３株は、経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８１７１である。
ＭＴ００３株は、本菌の増殖に適した市販の合成培地、例えば市販のポテトデキストロース寒天培地などを用いて調製したスラント等に植菌して保存し、ダイオキシン類の分解に供することができる。
【００１８】
本発明においてダイオキシン類とは、前記したＰＣＤＤ及びＰＣＤＦである２１０種類の化合物を指す。ＰＣＤＤとＰＣＤＦの中で、特に問題とされるものは四塩素置換体以上の化合物である。一般に、四塩素置換体以上の化合物は毒性が高く、難分解性を示すと言われている。
具体的な化合物を例示すると、四塩素置換体としては、テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ  、以下、ＴｅＣＤＤと略記することがある。）やテトラクロロジベンゾフラン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ  、以下、ＴｅＣＤＦと略記することがある。）等、五塩素置換体としては、ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ  、以下、ＰｅＣＤＤと略記することがある。）やペンタクロロジベンゾフラン（ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ  、以下、ＰｅＣＤＦと略記することがある。）等が挙げられる。
【００１９】
また、六塩素置換体としては、ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下、ＨｘＣＤＤと略記することがある。）やヘキサクロロジベンゾフラン（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ、以下、ＨｘＣＤＦと略記することがある。）等、七塩素置換体としては、ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ  、以下、ＨｐＣＤＤと略記することがある。）やヘプタクロロジベンゾフラン（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ、以下、ＨｐＣＤＦと略記することがある。）等、八塩素置換体としては、オクタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下、ＯｃＣＤＤと略記することがある。）やオクタクロロジベンゾフラン（ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ、以下、ＯｃＣＤＦと略記することがある。）等が挙げられる。
【００２０】
次に、ダイオキシン汚染物とは、上記したダイオキシン類によって汚染されている灰、土壌等を指し、具体的にはごみ焼却炉等から排出される焼却灰や飛灰、農薬等の製造工程、金属精錬の燃焼工程や紙の塩素漂白工程等からの排出物、さらにはこれらにより汚染された土壌等がある。ダイオキシン類を含む焼却灰の中には、ｐＨが１０以上、特に１２〜１３という高アルカリ性のものが存在し、このような焼却灰そのものに微生物を作用させてダイオキシン類を処理する方法は、これまでに報告がないが、本発明によれば、係る焼却灰を処理してダイオキシン類を分解、除去することができる。
【００２１】
次に、第２の本発明である、ダイオキシン類分解能を有する微生物もしくは当該微生物の産生するダイオキシン分解酵素を、ダイオキシン汚染物に作用させてダイオキシンを分解する方法について説明する。
ダイオキシン類の分解には、ＭＴ００３株自体もしくは本菌の生産するダイオキシン類分解酵素を用いる。
本発明によるダイオキシン類の分解は、微生物あるいはその産生酵素を利用した公知の方法を適用して行うことができる。例えば、焼却灰、土壌などのダイオキシン汚染物を含む対象物にＭＴ００３株もしくは本菌が産生するダイオキシン類分解酵素を作用させる。より具体的には、浄化の対象であるダイオキシン汚染物に、ＭＴ００３株の生育に好適な栄養源を加え、これにＭＴ００３株を添加するか、あるいは対象物を酵素作用の発現に都合の良い条件（温度、ｐＨなど）下に調整して、これに酵素を添加することによって行う。なお、栄養源の種類や添加量を変えたり、微生物や酵素による処理時の温度、湿度、処理対象物のｐＨなどの条件を適宜変えることによって、ダイオキシン類の分解率をさらに高めることが可能である。
【００２２】
本発明によれば、ダイオキシン分解能を有する微生物を直接に、又は該微生物の産生するダイオキシン分解酵素をダイオキシン汚染物に作用させることによって、該汚染物中のダイオキシン類を分解し、浄化することができる。しかも、本発明に係るＭＴ００３株は、多種類のダイオキシンに対して分解能を示し、特に四塩素置換体以上の高い毒性や難分解性を示すダイオキシン類も分解することができる。また、本発明の方法は、従来法よりも低コストであり、かつ２次廃棄物の発生が少ない。
【００２３】
【実施例】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ＭＴ００３株の単離）
ダイオキシン分解能を有する微生物を単離するため、リグニン分解微生物分離用培地（紙パルプ技協誌，５０（１２），  ｐ１２２，  １９９６年）を用いて分離した。まず、野外より採取した腐朽木材片を滅菌蒸留水に懸濁し、この懸濁液を試料とした。
この試料をリグニン分解微生物分離用培地、すなわち上層にレマゾールブリリアントブルーＲを含む２層からなる寒天培地上に塗沫して、２５℃で培養した。上記色素を脱色した菌株のコロニーを釣菌し、新しく調製した前記２層からなる寒天培地上に同様に塗抹し、２５℃で培養する操作を繰り返すことによって、リグニン分解能を示す菌株を純粋に単離した。
【００２４】
分離した菌株は、ポテトデキストロース寒天培地（１リットルあたり、ポテト浸出液末４．  ０ｇ、ブドウ糖２０．  ０ｇ、寒天１５．  ０ｇ、ｐＨ６．  ０）（日水製薬社製）を用いて調製したスラント（寒天斜面）に植菌し、これを２５℃で培養した。菌体の増殖を確認した後、該スラントを４℃にて保存した。
このようにして良好な脱色成績を示す菌株を単離した。この菌株は、ポテトデキストロース寒天平板培地で２５℃で５〜１０日培養することにより、白色の綿状の集落を形成する。本菌は、前記した特色を有する担子菌に属する新種であると認め、ＭＴ００３株と名づけた。
【００２５】
実施例２（ＭＴ００３株の同定）
実施例１で単離したＭＴ００３株の同定を行った。本菌の同定は、Ｗｈｉｔｅらによって報告された方法（ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ  ３１５−３２２，  １９９０年）に従って、ＭＴ００３株のリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と既知の菌株の当該遺伝子との相同性を検索することによって行った。
まず、分類上有用な遺伝子領域となっているＭＴ００３株の５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその近傍の６２２塩基対の塩基配列、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のほぼ全長に相当する１７３７塩基対の塩基配列、及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’  末端領域６０３塩基対の塩基配列を決定した。
【００２６】
これらの塩基配列の決定は、前記の方法により行った。すなわち、ＭＴ００３株の凍結乾燥菌体を液体窒素中で破砕後、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  社）  を用いてＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって目的とするリボソームＲＮＡ遺伝子領域を増幅した。このとき、５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅にあたっては、前記文献に記載されているプライマーＩＴＳ４及びＩＴＳ５を、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅には、同じくプライマー  ＮＳ１及びＮＳ８  を、さらに２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅には、同じくプライマー  ＬＲＯＲ  及びＬＲ７  を用いてＰＣＲを行った。何れのリボソームＲＮＡ遺伝子領域の増幅反応も、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  社）  を用い、プライマー４０ｐｍｏｌ、ＤＮＡ１０〜５０ｎｇ及び蒸留水で総量２５μｌの反応液を４本調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社）  上で反応を行った。温度条件は、９６℃で３分間保持後、９４℃（３０秒間）−５５℃（３０秒間）−７２℃（１分間）を３０サイクル行い、最後に７２℃で４分間保持して反応を終了した。
【００２７】
増幅したそれぞれの目的ＤＮＡ断片について、ダイターミネーター（Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  法によるサイクルシーケンシング（Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）  反応を行い、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）  により塩基配列を分析した。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社）  を用い、同社のプロトコルに従って行った。それぞれのリボソームＲＮＡ遺伝子領域のサイクルシーケンシング反応にあたっては、前記文献に記載されているプライマー等を用いた。それぞれの増幅断片について得られた塩基配列を連結し、目的塩基配列を得た。
ＭＴ００３株の５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の３’  側１７３７塩基の塩基配列を配列番号２に、２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の５’  側近傍６０３塩基の塩基配列を配列番号３にそれぞれ記載した。なお、配列表の配列番号１記載の塩基配列において、３３〜２２１番目の塩基配列はＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ−１  （ＩＴＳ−１）、３８３〜５８６番目の塩基配列はＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ−２  （ＩＴＳ−２）である。
【００２８】
これらの塩基配列について、米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供しているＢＬＡＳＴ検索を利用して、ＧｅｎＢａｎｋ登録データから塩基配列の相同性検索を行った。
その結果、登録データには、どの遺伝子領域についても、塩基配列の一致する登録菌株はなかった。
しかしながら、５．  ８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、スポンギペリス・ディレクタンスの遺伝子との相同性が９１％と登録データ中で最も高かった。また、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子についてはスポンギペリス・ユニカラーとの相同性が９８％と最も高く、登録菌株の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列をもとに作成した近隣結合系統樹において、ＭＴ００３株はスポンギペリス・ユニカラーと系統枝を形成することが明らかとなった。
２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、スポンギペリス属のデータが登録されていないため、相同性について検索することはできなかったが、近隣結合系統樹においてスポンギペリス・ユニカラーと登録菌株の中では最も近縁となるパナス・ラディスとの相同性が９５％と最も高いことが分かった。
【００２９】
以上の結果から、ＭＴ００３株はカワラタケ科スポンギペリス属に含まれる菌であるか、またはこれに近縁の菌であり、新種の菌株であることが判明した。なお、スポンギペリス属に属する菌株がダイオキシン分解能を有することについては、これまでに報告がなく、本発明者らによって初めて見出されたことである。ＭＴ００３株は、経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８１７１である。
【００３０】
実施例３（ＭＴ００３株のリグニン分解酵素の生産性試験）
ＭＴ００３株のリグニン分解酵素の生産性を、以下の方法によって評価した。まず、４℃で保存したスラントからＭＴ００３株を採取し、これを新しく調製したポテトデキストロース寒天培地に植菌して２５℃で７日間培養した。次に、１白金耳の培養菌体を、オートクレーブ滅菌した３００ｍｌ容三角フラスコに入れた濾過滅菌した液体培地６０ｍｌに植菌し、２５℃で所定期間静置培養した。なお、液体培地の組成は１リットルあたり、ブドウ糖１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、リン酸二水素カリウム１．  ５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．  ５ｇ、硫酸銅五水和物１６ｍｇ及びチアミン塩酸塩２ｍｇであり、塩酸によりｐＨを５．  ６に調整して用いた。
この培養液中のリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びラッカーゼ活性を、以下の公知の測定方法によって経日的に調べた。
【００３１】
リグニンペルオキシダーゼ活性は、酵素の基質としてベラトリルアルコール及び過酸化水素を用いる方法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ｐ  ２２８０−２２８４，１９８３年）により測定した。すなわち、ベラトリルアルコール（０．４ｍＭ）、酒石酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ３）、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．１％）を加えた溶液を、吸光度測定用のセルに入れ、さらに過酸化水素水（０．１ｍＭ）を加えた後、酵素５０μＬを加えて反応を行った。反応は、３７℃で行い、３１０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。
マンガンペルオキシダーゼ活性は、酵素の基質として２価のマンガンイオン及び過酸化水素を用いる方法（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５７，  ｐ  ２２４０−２２４５，  １９９１年）により測定した。すなわち、マロン酸ナトリウム（５０ｍＭ）、硫酸マンガン（０．２ｍＭ）、過酸化水素水（０．１ｍＭ）及び蒸留水を順に吸光度測定用のセルに入れ、酵素を１００μＬを加えて反応させた。反応は、３０℃で行い、２７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。
ラッカーゼ活性は、酵素の基質としてシリンガルダジンを用いる方法（Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３，  ｐ  ５５−５８，  １９８１年）により測定した。すなわち、２−モルホリノエタンスルホン酸−水酸化ナトリウム緩衝溶液（０．０３７Ｍ、ｐＨ５．３）、蒸留水、シリンガルダジン・エタノール溶液（０．００８ｍＭ）を吸光度測定用のセルに入れ、最後に酵素２０μＬを加えて反応させた。反応は、３０℃で行い、５２７ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。
その結果、ＭＴ００３株は、上記３種類のリグニン分解に関与する酵素の全てを菌体外に生産していることが分かった。
【００３２】
実施例４
（１）ＭＴ００３株のダイオキシン分解性試験方法
ＭＴ００３株のダイオキシン分解能を、焼却飛灰に本菌を作用させて該灰中のダイオキシン類の分解率を測定することによって評価した。
ダイオキシン分解性試験用培地としては、おが屑４２０ｇ、米糠６０ｇ、蒸留水２４０ｍｌを混合したものを用い、これを容量６リットルのステンレス製容器に入れてオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）した後、飛灰処理試験に使用した。
【００３３】
はじめに、上記のダイオキシン分解性試験用培地と同じ組成の培地（総量２０ｇ）に、保存スラントから採取したＭＴ００３株の１白金耳を植菌し、２５℃で７日間前培養して前培養菌体を得た。この前培養菌体を、前記ステンレス製容器中のダイオキシン分解性試験用培地に植菌した。これを２５℃で１４日間培養した後、篩により粒度を揃えた焼却飛灰１２０ｇを加えて良く混合した。
焼却飛灰を混合した後、さらに２５℃で１５日間静置培養した。ダイオキシン分析用の試料として、飛灰を混合した直後（０日目）及び１５日間培養後に、それぞれ１００ｇを計り取った。
【００３４】
（２）ダイオキシンの分析方法
上記（１）の試料中のダイオキシンの分析は、厚生省生活衛生局水道環境部環境整備課による「廃棄物処理におけるダイオキシン類標準測定分析マニュアル」（平成９年２月）に記載の方法に準拠して行った。すなわち、試料を２ｍｏｌ／Ｌ塩酸に懸濁、攪拌し、濾過した。固形分はヘキサンによって十分に洗浄した水（ヘキサン洗浄水）で洗浄後、メタノールで置換し、風乾した。この固形分を、トルエンを用いて２０時間ソックスレー抽出を行い、抽出液は、無水硫酸ナトリウムで脱水した。
【００３５】
一方、前記の濾液、ヘキサン洗浄水による洗浄液及びメタノール洗浄液は、ジクロロメタンによる液・液振盪抽出を２回行い、ジクロロメタン相を無水硫酸ナトリウムで脱水した。ソックスレー抽出液とジクロロメタン抽出液を併せて濾過した後、濃縮し、１０ｍＬとした。このうち５ｍＬをとり、内標準物質を添加した。その後、濃縮して以下のクリーンアップ処理を行った。すなわち、硝酸銀シリカゲル３ｇ／シリカゲル０．５ｇ／硫酸シリカゲル４．５ｇ／シリカゲル０．５ｇの４層から成る多層シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ｎ−ヘキサンを用いて溶出した。溶出液は、さらにアルミナ（６ｇ）のカラムに供し、ｎ−ヘキサンの溶出液は前捨てし、５０％ジクロロメタン含有ｎ−ヘキサンでダイオキシン類を溶出した。さらに、この溶出液を活性炭埋蔵シリカゲル（０．９５ｇ）のカラムに供し、２５％ジクロロメタン含有ｎ−ヘキサンの溶出液は前捨てし、トルエンでダイオキシン類を溶出した。この溶出液を濃縮し、シリンジスパイクを添加し、ガスクロマトグラフ質量分析の試料とした。なお、ガスクロマトグラフ質量分析は下記の分析条件で行い、選択イオンモニタリング検出法（ＳＩＭ検出法）により、ダイオキシンの検出を行った。
【００３６】
0003550099.tif 000002
【００３７】
0003550099.tif 000003
【００３８】
ガスクロマトグラフフィーにおいては、四塩素置換体（ＴｅＣＤＤ及びＴｅＣＤＦ）、五塩素置換体（ＰｅＣＤＤ及びＰｅＣＤＦ）及び六塩素置換体（ＨｘＣＤＤ及びＨｘＣＤＦ）の分析には分離条件Ａ、七塩素置換体（ＨｐＣＤＤ及びＨｐＣＤＦ）及び八塩素置換体（ＯｃＣＤＤ及びＯｃＣＤＦ）の分析には分離条件Ｂを適用して分析を行った。
得られた分析値より、試料中に含まれるダイオキシンのうちの全ての四塩素置換体、五塩素置換体、六塩素置換体、七塩素置換体及び八塩素置換体濃度を、前記のマニュアルに従って算出した。
【００３９】
第１表に飛灰処理試験の試料中のダイオキシン同族体の濃度及びそれらの分解率を、第２表に飛灰処理試験の試料中の毒性等価係数（ＷＨＯ、１９９８年）の示されたダイオキシン異性体の毒性当量及びそれらの分解率の結果をそれぞれ示す。なお、表中のＴＥＱ（Ｔｏｘｉｃ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）  は毒性当量を指し、ダイオキシン類のそれぞれの異性体の毒性を２，  ３，  ７，  ８−ＴｅＣＤＤに換算して合計したものである。
【００４０】
【表１】
第  １  表
0003550099.tif 000004
【００４１】
第１表から明らかなように、本発明の担子菌  ＭＴ００３株をダイオキシン汚染物である焼却飛灰に作用させることによって、該飛灰中に含まれるダイオキシン類を分解、浄化することができる。特に、毒性が最も高いＴｅＣＤＤを４８％、ＴｅＣＤＦを４７％という高率で分解することが明らかとなった。
一般に、ダイオキシンは置換塩素原子数の増加に伴い、分解作用を受け難くなることが知られているが、本発明の方法によれば、四塩素置換体、五塩素置換体、六塩素置換体、七塩素置換体及び八塩素置換体に対して、十分な分解率が得られ、また毒性が高いとされる四塩素置換体、五塩素置換体及び六塩素置換体に対してもＭＴ００３株は高い分解能を有していることが示された。
【００４２】
【表２】
第  ２  表
0003550099.tif 000005
【００４３】
第２表は、ダイオキシンの中で毒性等価係数の示されたダイオキシン異性体の飛灰処理試験試料中の濃度を比較したものである。この表から明らかなように、ＭＴ００３株は毒性等価係数の高い四塩素置換体、五塩素置換体及び六塩素置換体に対して、分解率３５〜５２％という値を示し、これらに対する高い分解能を有している。一方、七塩素置換体及び八塩素置換体に対しても、本菌は同様に分解能を有していることが判明した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の担子菌  ＭＴ００３株は、カワラタケ科スポンギペリス属に属する新規な微生物であり、毒性が強く、しかも分解が困難とされているダイオキシン類を分解することができる。特に、毒性の高い四塩素置換体のみならず、４〜８個の塩素原子による置換体の多くに対しても、幅広い分解能を有している。
したがって、この微生物自体、もしくは当該微生物の産生するリグニン分解酵素をダイオキシンにより汚染された焼却灰や土壌等に作用させることによって、これら汚染物を無害化して環境浄化に貢献することができる。
また、本発明の方法は、ダイオキシンの分解を低コストで実施でき、しかも２次廃棄物の発生が少ないという特色を有している。
【００４５】
【配列表】
0003550099.tif 000006
0003550099.tif 000007
0003550099.tif 000008
0003550099.tif 000009