(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜厚１００〜５００Åの酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材。
【請求項２】
チタン被膜を基材にコーティングし焼成することにより得られる請求項１に記載の細胞接着性基材。
【請求項３】
コーティング方法がスパッタリングであることを特徴とする請求項２に記載の細胞接着性基材。
【請求項４】
基材がカバーガラスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性基材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞培養基質の表面処理によって細胞の接着を制御する技術としては、細胞培養基質のガラス表面をポリリシンやポリオルニチン等のアミノ酸やポリエチレンイミンなどでコートする方法が多く使用されている。しかし、これらのコート膜は比較的耐久性が低く、特に、長期間神経細胞を生存させる場合には必ずしも有効ではない。また、コートされた細胞質基質を一度細胞培養に使用した後は、コート膜がガラス表面から容易にはがれてしまい、再利用することができない。さらに、培養液中に遊離した分子には細胞毒性があり、コートの時間、洗浄方法等によってこれら分子の遊離状況が変化するため、安定したコート膜を形成しにくいという欠点がある。
【０００３】
また、従来のポリリシン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミンなどによる細胞接着被膜は、ＵＶ滅菌やオートクレーブ滅菌ができないという欠点もあった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材の提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材が細胞接着性に優れることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の細胞接着性基材を提供するものである。
項１．酸化チタン被膜を有する細胞接着性基材。
項２．チタン被膜を基材にコーティングし焼成することにより得られる項１に記載の細胞接着性基材。
項３．コーティング方法がスパッタリングであることを特徴とする項２に記載の細胞接着性基材。
項４．基材がカバーガラスであることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性基材。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、基材は、チタンによるコーティングが可能であり、焼成によって不必要な変形等を生ずることがないものであれば特に制限されず、用途に応じて適宜選択される。例えば、ガラス、金属などが基材として使用可能である。細胞培養用カバーガラスを作成する場合、好ましい基材はガラスであり、さらに好ましくは顕微鏡用カバーガラスである。細胞外電位記録電極基板又は生体埋込型神経電極基板又は神経再接続材料を作成する場合、好ましい基材は、それぞれガラス、又はガラス、樹脂もしくは金属、又はガラス、樹脂もしくは金属である。基材の形状は用途に応じて適宜選択される。
【０００８】
チタン被膜を基材にコーティングする方法としては、めっき、無電解めっき、アノード酸化、ゾル−ゲル法などの液相コーティング、ＣＶＤ、ＰＶＤなどの気相コーティング等が使用でき、好ましくはＰＶＤである。ＰＶＤとしては、例えば真空蒸着、イオンプレーティング、スパッタリング、分子線エピタキシー法等が使用でき、好ましくはスパッタリングである。
【０００９】
上記のようなコーティング法により形成された被膜の膜厚は特に制限されないが、好ましくは１０〜１０００Å、さらに好ましくは５０〜５００Å、より一層好ましくは１００〜３００Åである。
【００１０】
チタン被膜がコーティングされた基材を焼成する方法としては、クリーンオーブン、電気炉中で加熱する方法が採用される。加熱温度は基材、膜厚等に応じて適宜選択されるが、好ましくは２００〜８００℃、さらに好ましくは２５０〜５００℃、より一層好ましくは３００〜４００℃である。加熱時間は、加熱温度、膜厚等に応じて適宜選択されるが、好ましくは１０〜１００分、さらに好ましくは２０〜６０分、より一層好ましくは２５〜４０分である。
【００１１】
本発明の細胞接着性基材は、細胞培養用カバーガラス、細胞外電位記録電極基板、生体埋込型神経電極基板、神経再接続材料として有用であり、接着性に劣る神経細胞の接着性においても優れたものである。
【００１２】
【発明の効果】
本発明の細胞接着性基材は、以下の長所を有している。（１）耐久性が高く、長期間にわたり安定した接着層を形成する。（２）再利用が可能である。（３）細胞毒性がきわめて少ない。（４）成膜が比較的容易にできる。（５）ＵＶ滅菌、オートクレーブ滅菌が可能である。（６）焼成条件を調節することによって被膜の可視光透過性を調整することができ、基材に光透過性の高い材料（特にガラス）を用いることによって培養した細胞等をそのまま顕微鏡等で観察することが可能である。（７）被膜をパターン形成することが可能である。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１４】
実施例１
細胞接着性カバーガラスの作成
通常使用されている培養用カバーガラス（直径２２ｍｍ、厚さ０．１７ｍｍ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ製）に、以下の条件で、焼成方法のことなる３種類のチタン被膜を真空成膜する（図１）。
【００１５】
成膜方法：スパッタリング
焼    成：３００℃で３０分（クリーンオーブン中）、又は３５０℃で３０分（電気炉−大気雰囲気中）
水    洗：純粋シャワー洗浄（２０秒）の後クリーンエアブロー
滅菌処理：９０％エタノール処理（１５分）後、滅菌ｍｉｒｉＱ水で３回洗浄し、ＵＶ滅菌（３０分）
得られた被膜は膜厚が１５８〜２６０Åで、酸化処理（焼成）により、被膜の顕微鏡観察が可能な程度に可視光透過性が増し、導通もかなり減少していた。
【００１６】
実施例２
細胞接着性カバーガラスの評価
実施例１で作成した各カバーガラスの細胞接着性評価を、胚齢１８日齢のラット海馬解離培養系を用いて行った。
【００１７】
Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）とＦ１２（Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ１２）とを１：１の比率で含有する混合培養液に、インシュリン、ペニシリン−ストレプトマイシン混合液（１００ｕｎｉｔ−１００μｇ／ｍｌ）、牛胎児血清及び馬血清を、混合培地に対して、インシュリンが５μｇ／ｍｌ、ペニシリンが１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、ストレプトマイシンが１００μｇ／ｍｌ、牛胎児血清が５％（ｖ／ｖ）、馬血清が５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように添加した。この培養液に、ラット海馬から解離した神経細胞を、細胞密度が１５万個／ｍｌとなるよう加えた。
【００１８】
実施例１で作成したカバーガラスをＵＶ滅菌及びオートクレーブ滅菌した後、培養皿に置き、ラット海馬解離神経細胞を含有する２ｍｌの培養液を加え、細胞を培養した。培養後、１０日目にカバーガラスの細胞接着の状態を顕微鏡で観察した（図２、図３）。
【００１９】
比較例１
培養皿に培養用カバーガラスを置き、１ｍｌのポリ−Ｌ−リシン水溶液（２５μｇ／ｍｌ）を加えて、２時間３０分静置した後、ポリ−Ｌ−リシン水溶液を棄てた。ポリ−Ｌ−リシンコートされたカバーガラスを滅菌水にて４回洗浄し、よく乾燥させて、ポリ−Ｌ−リシン成膜カバーガラスを得た。次に、細胞接着性カバーガラスとしてここで得られたポリ−Ｌ−リシン成膜カバーガラスを用い、ＵＶ滅菌及びオートクレーブ滅菌を行わないこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着の状態を観察した（図４）。図２及び３と図４とを比較して明らかなように、本発明のカバーガラスで培養した神経細胞（図２及び３）は従来のカバーガラスで培養した神経細胞（図４）より、神経細胞突起の伸長及びグリア細胞の増殖に優れている。
【００２０】
実施例３
・ニワトリ胚終脳解離培養系による評価
ラット海馬から解離した神経細胞を、ニワトリ胚終脳から解離した神経細胞に代え、血清として牛胎児血清のみを１０％（Ｖ／Ｖ）使用した以外は実施例２と同様にして、細胞接着の状態を観察した。顕微鏡観察の結果、比較例１の細胞接着の状態より細胞接着性は良好であった。
【００２１】
・細胞接着性（Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ記録外液存在下）
Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ記録外液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））はＣａ２＋濃度が低くＭｇ２＋を含まないため、細胞と皮膜の接着性を劣化させる作用がある。実施例１で得られた細胞接着性カバーガラスおよび比較例で得られたポリ−Ｌ−リシンコートカバーガラスの各１０枚をＭｇ２＋−ｆｒｅｅ記録外液に室温で３０時間浸漬し、細胞の接着性を観察した。その結果、ポリ−Ｌ−リシンコートカバーガラスでは４０％のカバーガラスに細胞の剥離が観察されたが、実施例１で得られたカバーガラスでは細胞の剥離が観察されたのは１０％であった。
【００２２】
・神経細胞の電気的活動
ホールセル記録法
実施例１で得られた細胞接着性カバーガラスおよび比較例で得られたポリリシンコートカバーガラスで１２日間培養されたラット（胚齢１８日齢）神経細胞の電気的活動を電位固定法又は電流固定法によりホールセル記録法で測定した。測定条件は以下の通りである。
ガラス電極：内径約１μｍ
電極内液：１３０ｍＭのグルコン酸カリウム、１０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭのＫ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）
記録外液：１３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）
その結果、神経細胞の電気的活動である興奮性シナプス後電流及び活動電位を確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞接着性カバーガラスを上から見た模式図及び横から見た模式図である。
【図２】チタン皮膜を３００℃で焼成した本発明カバーガラスにて培養した神経細胞を撮影した顕微鏡写真である。
【図３】チタン皮膜を３５０℃で焼成した本発明カバーガラスにて培養した神経細胞を撮影した顕微鏡写真である。
【図４】従来のポリ−Ｌ−リシン皮膜カバーガラスにて培養した神経細胞を撮影した顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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