(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレート及びカテキンガレートを含有する溶液をリグノセルロースに接触させた後、吸着した成分を溶出することを特徴とする工程を含むポリフェノール化合物の精製法。
【請求項２】
リグノセルロースが木粉を酸、アルカリおよび有機溶媒を用いて洗浄し、それぞれの可溶性成分を除去したものである請求項１記載の精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ポリフェノール化合物の精製法に関するもので、とくにポリフェノール化合物を含有する溶液を木製品の製造工程で出る端材，ノコ，カンナ屑などの製材廃棄物である木粉より調製したリグノセルロースに接触させた後，吸着した成分を溶出する工程を含むことにより、高純度のエピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレートおよびカテキンガレートを低コストで精製する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物起源のポリフェノール化合物、特にツバキ科植物である茶に含まれるポリフェノール化合物は種々の生理作用、例えば抗菌・静菌作用，抗う蝕作用，抗酸化作用，コレステロール上昇抑制作用，抗ガン作用などを有することが明らかにされ、食品，化粧品，医薬品に利用され、その利用用途は益々広がっている。
これらの目的に利用するために、ポリフェノール化合物であるエピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートを高含量に含む画分が要求されている。これら化合物を効率的に高純度で製造するには、ツバキ科植物好ましくは茶を抽出した液に含まれるカフェイン，色素類，アミノ酸類，糖類，ステロイド類やポリフェノール化合物の酸化重合物等の夾雑物を除去することが必要である。
これまで茶葉からポリフェノール化合物を抽出、精製する方法として熱水、含水アセトンおよび含水エタノール等で茶葉から抽出した後、ヘキサン，クロロホルム，酢酸エチル等の有機溶媒で分配する方法や、特開平３−１４５７２に記載のように親水性ビニルポリマー樹脂、デキストランのヒドロキシプロピル化樹脂を用いて吸着、精製する方法が既に知られている。しかしながら、これらの方法は、単位時間当たりの処理量が限られており、茶葉中に乾重量として１０〜２０％含まれるポリフェノール化合物の精製法としては、設備面やコスト面から不適当な方法である。
【０００３】
茶ポリフェノール化合物と他成分との分離方法として、上記方法以外にも抽出物中に含まれる、カフェインを除去する方法が種々検討されている。例えば特開平１−２８９４４８の実施例１に記載のように、超臨界状態の液化炭酸ガスにより緑茶中のカフェインを除去する方法や活性炭，シリカゲル，活性アルミナ等の吸着剤を用いて脱カフェインする方法（特公昭５９−３９０９７，特公昭５９−４６５７６）も知られているが、超臨界状態の液化炭酸ガスを使用する方法は、高圧における操作を必要とし、大がかりな抽出装置を用いるため抽出コストも高くなるという欠点がある。また活性炭，シリカゲル，活性アルミナ等の吸着剤を用いる方法は、カフェインのみならずポリフェノール類も同時に吸着するという欠点があり、選択的分離の面から満足のいくものではない。
木粉を吸着剤として用いる技術は、これまでにもノコ屑を用いたヒト尿中のウロキナーゼの製造（特公昭６０−５０４３６）やトリプシンの精製（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２９４，１９８４）に検討されているが、これらはいずれも高分子であるタンパク質、酵素の精製に関するものであり、ポリフェノール化合物のような低分子化合物の精製には全く検討されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に示した諸問題を解決するためになされたもので、リグノセルロースを用いることによりポリフェノール化合物を含有する溶液からポリフェノール化合物、特にエピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートを簡便にかつ効率的に精製することを目的とする。本発明により得られる精製されたポリフェノール化合物は、抗菌・静菌作用，抗う蝕作用，消臭作用，酸化防止作用，コレステロール上昇抑制作用，抗ガン作用を有し、食品，化粧品，医薬品に使用が可能である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ツバキ科植物特に茶に含まれるポリフェノール化合物は、抗菌・静菌作用，抗う蝕作用，消臭作用，酸化防止作用，コレステロール上昇抑制作用，抗ガン作用などを有することが知られている。特に、天然物から抽出される上記効果を持つ物質の利用が期待されると共にこれら化合物の精製法が種々検討されている。しかし、茶を原料とし熱水や有機溶媒で、ポリフェノール化合物を抽出すると、必ず色素類やカフェインも同時に抽出される。その混合物に含まれる茶ポリフェノール化合物と、カフェイン等との安全な選択的除去方法は、未だ商業化されていないのが現状である。
本発明は、エピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレートおよびカテキンガレートなどのポリフェノール化合物を含有する溶液をリグノセルロースに接触させた後、吸着した成分を溶出する工程を含むポリフェノール化合物の精製法である。
【０００６】
本発明に用いるリグノセルロースは、木製品の製造工程で出る端材やノコ，カンナ屑などの製材廃棄物に由来する木粉より調製される。リグノセルロースの原料となる木粉は、落葉樹，常緑樹，針葉樹など通常木材として利用されうる樹木に由来するものが使用可能であるが、精油成分の少ない針葉樹のマツ目，スギ目に属する樹木が特に望ましい。ここでマツ目の植物としては、モミ，ツガ，エゾマツ，カラマツ，ヒマラヤスギ等があげられ、スギ目の植物としては、セコイヤ，アケボノスギ，ヒノキ，アスナロイブキ等があげられるが、これらは特に限定するものではなく、入手可能なマツ目，スギ目の製材廃棄物が使用できる。ノコ屑等として製材所より得た木粉は、カラム操作が可能なように粒径を、１０〜６０メッシュに揃えた後、乾燥しアルカリ、酸で順次洗浄する。アルカリとしては、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム，水酸化アルミニウム，炭酸ナトリウム等の一種または二種以上などが使用でき、酸としては、塩酸，硫酸，硝酸，リン酸等の無機酸や酢酸，クエン酸，コハク酸，リンゴ酸，乳酸，フマル酸等の有機酸の一種または二種以上が使用されうる。これらのアルカリ、酸の濃度は、０．０１規定から１０規定の範囲が使用できるが、望ましくは０．０５規定から３規定である。アルカリ，酸で洗浄後、有機溶媒により洗浄することにより、テルペン等の精油類を除去する。有機溶媒としてエタノール，メタノール，ｎ−プロパノール，イソプロパノール，ブタノールなどのアルコールやアセトン，メチルイソブチルケトンなどのケトン類、酢酸エチル，ヘキサン，ジエチルエーテル等の一種または二種以上が使用できる。
酸，アルカリ，有機溶媒は、各々、木粉の２〜１０倍量を用い、室温で洗浄することができる。洗浄温度は、特に限定するものではないが、５〜６０℃の範囲で実施できる。洗浄時間は、１時間以上好ましくは１〜３日間浸漬し時々攪拌することにより、洗浄するのが望ましい。
アルカリ，酸，有機溶媒で洗浄し、それぞれの可溶成分を除去した木粉は乾燥した後、リグノセルロースとして、カラム法あるいは浸漬法のいずれでもポリフェノール化合物の精製に使用できる。
【０００７】
本発明に用いるポリフェノール化合物を含有する溶液は、ツバキ科植物の葉を既知の方法により抽出したものが使用できる。ツバキ科植物としては例えばヤブツバキ，リンゴツバキ，ユキツバキ，サザンカ，ヒメサザンカ，トウツバキ，ワビスケ，ハルサザンカ，カンツバキ，キンカチャ，ホンコンツバキ，ユチャ（油茶），ベトナメンツス，ギガントカルパ，ポリオドンタ，セミセラータ，チェキアンオレオーサがあげられるが、含有されるポリフェノール化合物の種類から茶が望ましい。原料としての茶の形態は特に限定するものではないが、例えば茶の生葉，不発酵茶，半発酵茶，発酵茶，後発酵茶が好ましく、いずれの製造段階のものでも良い。すなわち形態は粉茶から完全葉まで、制限無く用いることができる。抽出に用いうる溶媒は特に限定するものではないが、熱水またはアルコールやアセトン含有水溶液などが望ましい。抽出液は熱水抽出の場合はそのまま、また有機溶媒抽出の場合は有機溶媒を除去後使用することができる。更には、用いる溶液はポリフェノール化合物を含有していればよく、精製途中のものでも良い。
例えば、茶葉を１０倍量の５０％アセトン水溶液で抽出後、アセトンを除去した水溶液を酢酸エチルで分配し、その酢酸エチル可溶画分を酢酸エチルを除去後、その残留物を水に溶解し、使用することができる。
ポリフェノール化合物を含有する溶液と、リグノセルロースとの接触方法は、リグノセルロースをカラムに充填し、ポリフェノール化合物を含有する溶液を通過し接触させる方法、ポリフェノール化合物を含有する溶液を入れた容器内にリグノセルロースを添加し、一定時間攪拌することにより接触させる方法などが用いられる。リグノセルロースに接触させることにより、エピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートなどのポリフェノール化合物は吸着し、カフェインや色素類などの夾雑物は吸着せずに除去される。
リグノセルロースに吸着したポリフェノール化合物は、エタノール，メタノール，イソプロパノール，ｎ−プロパノール，アセトン，酢酸エチルの１種、あるいはこれらの２種以上の混合物により溶出することができる。混合物としては、エタノール，アセトン混液、エタノール，イソプロパノール混液が使用でき、その混合比は、特に限定する必要はない。溶媒再生を考慮すると、単品での使用、特にエタノール，アセトン，メタノールが望ましい。また、これらの有機溶媒を含む水溶液も使用できるが、有機溶媒の濃度は４０％以上であるのが溶出効率から望ましく、抽出温度は特に限定されるものではないが、５℃〜６０℃以下の低温が望ましい。溶出されたポリフェノール化合物は、溶媒を留去することにより乾燥物とし、各種製品形態に加工が可能である。また、更に精製し、各種クロマトグラフィーを用いることにより純度を上げることも可能である。
溶出方法は、常法に従いカラム法の場合は、ポリフェノール化合物を含有する溶液を下降法あるいは上昇法により、カラムを通過させることにより溶出ができ、バッチ法の場合は、リグノセルロースを２〜１０倍量の溶出液に浸漬することにより容易に目的とするポリフェノール化合物の溶出ができる。
【０００８】
このように本発明は、ポリフェノール化合物の精製方法において、木粉より調製したリグノセルロースを用いることにより、従来分離不可能であったポリフェノール化合物とカフェイン等の夾雑物とを、分離可能とするとともに、多量の有機溶媒を必要とせず、高純度のポリフェノール化合物を低コストで効率よく精製することを可能にした。
以下、試験例，実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【０００９】
試験例１    （リグノセルロースの調製１）
製材所より入手した北米産杉材のノコ屑１ｋｇを５０℃で１日間乾燥した後、１８〜３２メッシュの粒径品を１０リットルの０．１規定の水酸化ナトリウム溶液に３日間浸漬した後、水で充分に洗浄し、次いで１０リットルの０．１規定の塩酸溶液に１日間浸漬した後、水で充分に洗浄した。更に６０％エタノール溶液で１日間洗浄することにより残存する油脂，精油類を除去し、水で洗浄した後熱乾燥により乾燥しリグノセルロースを調製した。得られたリグノセルロース乾燥品は２００ｇであった。
【００１０】
試験例２  （リグノセルロースの調製２）
製材所より入手した北米産松材５００ｇを破砕機により１０〜６０メッシュに揃え、５リットルの１規定の水酸化カリウム溶液に１日間浸漬した後、水で洗浄し、次いで０．５規定の硫酸溶液にて１日間浸漬した。水で充分に洗浄後、９５％メタノール溶液で洗浄し、通風乾燥した。得られたリグノセルロース乾燥品は５０ｇであった。
【００１１】
【実施例】
実施例１
市販の煎茶１００ｇを水道水１０００ｍｌで８０℃、３０分間抽出した抽出液３００ｍｌを試験例１で調製したリグノセルロース１５ｇを充填したカラムにチャージし、水道水で通過液の色がなくなるまで洗浄した。次いで、濃度を変えたエタノール水溶液（２０％，４０％，６０％，８０％）各１００ｍｌで順次溶出した。チャージした茶抽出液およびカラム溶出液のカフェイン量，エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）量，エピカテキンガレート（ＥＣｇ）量を表１に示した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
表１に示すように４０％以上のエタノール濃度の溶液で溶出することによりエピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートをカフェインと分離溶出することができた。例えば、カラムチャージ液の茶抽出液では、（ＥＧＣｇ量／カフェイン量）が１．４４であるが、４０％エタノール溶出液では４１１．７となった。
【００１４】
実施例２
市販の番茶１００ｇを５０％エタノール溶液１リットルで２時間攪拌（３００回転／分）しながら抽出した。得られた抽出液からエバポレーターによりエタノールを留去し、水可溶性画分３００ｍｌに試験例２で調製したリグノセルロース標品２０グラムを加え、２００回転／分で２時間攪拌しながら吸着させた。吸着後、濾紙で吸引濾過し、脱イオン水で濾過水の目視により色がなくなるまで洗浄した。次に、５０％アセトン溶液２００ｍｌで１時間攪拌することによりリグノセルロースに吸着した成分を溶出した。得られた溶出液をエバポレーターで濃縮乾固した。リグノセルロース処理前の抽出液と溶出液の各々乾燥物中のエピガロカテキンガレートとエピカテキンガレートの割合を表２に示した。
【００１５】
【表２】
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【００１６】
表２より明らかなようにエピガロカテキンガレート，エピカテキンガレート含量はリグノセルロースカラムで処理することにより約５倍上昇した。また、溶出液の乾燥物は処理前と比べ色素類が除去され淡褐色に脱色されていた。
【００１７】
実施例３
中国産の釜入り緑茶１００ｇを８５℃の熱水１リットルで１時間攪拌（３００回転／分）し、抽出した。この茶抽出液３００ｍｌをリグノセルロース１０ｇを充填したカラムを通過させ、水で充分に洗浄した。洗浄後、６０％エタノール１００ｍｌをカラムに通過させ吸着物質を溶離させた。茶抽出液と６０％エタノール溶離液のＨＰＬＣチャートを図１に示した。図から明かなようにカラム処理前の茶抽出液に含まれていた夾雑物がカラム溶離液ではほとんど見られず、エピガロカテキンガレート，エピカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートの茶ポリフェノール類を効率的に精製することができた。
【００１８】
実施例４
台湾産ウーロン茶葉５００ｇを粉砕し、１５メッシュ以下の粒径とした後、１０リットルの９５％メタノール溶液を加え、時々攪拌し３日間抽出した。抽出液をエバポレーターにより乾固し、乾燥物を水２リットルに加熱溶解した。溶解液を別途準備したリグノセルロースカラム（内径２．５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）を通過させた後、目視により水道水で通過液の色が無くなるまで洗浄した。リグノセルロースに吸着したポリフェノール類は６０％メタノール溶液により溶出した。得られた溶出液をエバポレーターにより乾固し、エピガロカテキンガレート，エピカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートの含量を測定した結果，リグノセルロースカラムを通過させることにより、各々の化合物は６．２倍、５．３倍、５．８倍、４．９倍それぞれ含量が増加した。
本発明の実施態様ならびに目的生成物をあげれば以下のようなことが考えられる。
（１）ポリフェノール化合物を含有する溶液を木粉を用いて精製することを特徴とするポリフェノール化合物の精製法。
（２）ポリフェノール化合物を含有する溶液を木粉に接触させた後、吸着した成分を溶出することを特徴とする工程を含むポリフェノール化合物の精製法。
（３）ポリフェノール化合物が植物起源である前記（２）の方法。
（４）植物がツバキ科植物である前記（３）の方法。
（５）ポリフェノール化合物がエピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレートおよびカテキンガレートである前記（１）〜（３）記載の方法。
（６）木粉が、アルカリを用いて洗浄し、その可溶性成分を除去したものである前記（１）の精製法。
（７）木粉が、酸を用いて洗浄し、その可溶性成分を除去したものである前記（１）の精製法。
（８）木粉が、有機溶媒を用いて、洗浄しその可溶性成分を除去したものである前記（１）の精製法。
（９）木粉がリグノセルロースである前記（２）の方法。
（１０）リグノセルロースが製材廃棄物などの木粉を酸、アルカリおよび有機溶媒を用いて洗浄し、それぞれの可溶性成分を除去したものである前記（９）の方法。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリフェノール化合物を含有する溶液、例えば茶葉の抽出液からカフェイン等の夾雑物を除去し、効率的に商業規模で目的とするエピカテキンガレート，エピガロカテキンガレート，ガロカテキンガレート，カテキンガレートなどのポリフェノール化合物を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】カラム処理前の茶抽出液（Ｉ）と６０％エタノール溶離液（ＩＩ）のＨＰＬＣチャートを示した図である。
【図１】
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