(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象試料の分離に主に作用するイオン性官能基を有する充填剤（Ａ）と、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得るイオン性官能基を有する充填剤（Ｂ）とが、一本のカラムに充填されてなり、かつ、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せが、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＳＯ3Ｈ基をもつ充填剤の組合せであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィー分析、特にＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、最も汎用されている分析手法の一つである。液体クロマトグラフィー分析において、測定対象試料のクロマトグラムを改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことではない。
【０００３】
また、液体クロマトグラフィーの分析手法を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示されている。
【０００４】
特開平６−２７３４０１号公報には、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてアルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出させて分析を行う、イオン交換クロマトグラフィーによる陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されているが、これは、カラムを交換することなく両方のイオン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。
【０００５】
また、特開平１−１５８３４９号公報には、リン酸カルシウム系化合物の粒子を充填してなる液体クロマトグラフィーカラムにおいて、溶媒流入側にカラムの残りの部分に充填された粒子よりも耐久性の高い粒子が充填されたカラムが開示されているが、これは溶媒による充填剤への溶解作用及び力学的衝撃が、溶媒の流入側に強く働くことに着目して、溶媒流入側の部分に耐久性の高い粒子を充填し、残りの部分に吸着能に優れた粒子を充填することにより、カラムの耐久性の向上と吸着能の保持を目的とするものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得る液体クロマトグラフィー用カラム及びそれを用いた分析方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤（Ａ）と、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが、一本のカラムに充填されてなることを特徴とする。
【０００８】
本発明１でいうクロマトグラムの改良とは、例えば、各ピークの分離性、ピークのシャープさ、各ピークの保持時間の短縮などを言う。
【０００９】
本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤である。
【００１０】
上記充填剤（Ａ）としては、測定対象試料が主にイオン交換の分離モードで分離できる試料であれば、カチオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ばれ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ3Ｈなどをもつ充填剤が挙げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＮＲ2、−ＮＲ3（Ｒは水素原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
【００１１】
上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としては、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１２】
充填剤（Ａ）は、通常、１種の充填剤が使用されるが、同じ分離モードの充填剤であれば、２種以上の充填剤を混合して用いてもよい。
【００１３】
本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限定される。充填剤（Ｂ）は、充填剤（Ａ）の種類により変わるが、その選択範囲は、具体的には、上記充填剤（Ａ）の選択範囲と同様のものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合して使用してもよい。
【００１７】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１８】
本発明１で用いられるカラムは、従来から液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられているものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１９】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序としては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層状態でカラム内に存在することになる）してもよい。また、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的には、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合った量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００２０】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムの測定対象試料は、本発明１で用いられる複数の充填剤のうち、主となる充填剤（Ａ）の分離モードで一般に分析される試料であり、分離モードを変えることにより従来液体クロマトグラフィーにより分析されてきた殆ど全ての試料が分析可能である。従って、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、従来から行われてきた広範囲にわたる領域の液体クロマトグラフィー分析に応用できる。
【００２１】
本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムの使用方法は、公知の液体クロマトグラフィー用カラムの使用方法と同様である。以下その使用方法を説明する。図１は、本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して分析する際の装置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー４から測定対象試料を注入する。分離された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記録計６に記録される。なお、測定対象試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
【００２２】
上記移動相としては、各分析モードにおける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。また、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが用いられる。また、水と有機溶媒の混合系も用いられる。移動相の通液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれる。
【００２３】
上記の分離については、公知の方法が採用され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマトグラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもできる。
【００２４】
上記の検出についても公知の技術が用いられる。例えば、測定対象試料が蛋白質等の生体試料の場合には、紫外可視分光光度計が、糖類や高分子物質の場合には示差屈折計が、イオン類の場合には電気電導度検出器などが好適に使用される。
【００２５】
請求項４記載の分析方法（以下、請求項４記載の発明を本発明４という）は、前記充填剤（Ａ）がイオン性官能基を有する充填剤である請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いた分析方法である。
【００２６】
本発明４で使用される充填剤（Ａ）は、測定対象試料の分離に主に作用する充填剤であり、イオン性官能基を有する充填剤であれば、従来からイオンクロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたいずれの充填剤も使用可能である。
【００２７】
上記充填剤（Ａ）としては、カチオン交換基又はアニオン交換基をもつ充填剤が選ばれ、カチオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３  Ｈなどをもつ充填剤が挙げられ、アニオン交換基をもつものとしては、例えば、官能基として−ＮＲ２  、−ＮＲ３  （Ｒは水素原子又はアルキル基）などをもつ充填剤が挙げられる。
【００２８】
上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としては、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材のとしては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００２９】
充填剤（Ａ）は、通常、１種の充填剤が使用されるが、同一種のイオン交換系（例えば、カチオン交換同士又はアニオン交換同士）の充填剤であれば、２種以上の充填剤を混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明４で使用される充填剤（Ｂ）は、測定対象試料との相互作用が上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の測定対象試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）に限定される。充填剤（Ｂ）は、充填剤（Ａ）の種類により変わるが、その選択範囲は、従来から液体クロマトグラフィー用充填剤として使用されてきたいずれの充填剤も使用可能であり、具体的には、上述の本発明１の充填剤（Ｂ）の選択範囲と同様のものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合して使用してもよい。
【００３１】
本発明４の充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとしては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）が共にイオン性官能基を有する充填剤である組合せが挙げられる。具体的には、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）のイオン性官能基が異なる例として、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＳＯ3Ｈ基をもつ充填剤の組合せ、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＮＲ2基をもつ充填剤の組合せ、ＮＲ2基をもつ充填剤とＮＲ3基をもつ充填剤の組合せが挙げられる。
【００３４】
本発明４における充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率、液体クロマトグラフィー用カラムの製造方法などは本発明１と同様である。
【００３５】
本発明４の分析方法の測定対象試料は、一般にイオンクロマトグラフィーで測定され得る物質を含む試料である。例えば、有機や無機の陽陰イオンなどである。
【００３６】
本発明４の分析方法は、分析装置の構成例としては、液体クロマトグラフィー用カラムとして、上記のイオン交換モードの液体クロマトグラフィー用カラムのみが使用されることの他は、本発明１の説明で述べたものと同様であり、使用される移動相、分離方法、検出方法なども本発明１の説明で述べたことと同様である。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例における分析装置は、前記図１のように構成して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。
送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。
サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０。
検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰＤ−６ＡＶ。
【００３８】
実施例において使用した充填剤は、以下の通りである。
充填剤  カチオン−１
以下のように、特開平３−７３８４８号公報の方法によりカチオン交換充填剤を製造した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯＨを有する。
【００３９】
充填剤  カチオン−２
市販のカチオン交換充填剤（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、メルク社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基として−ＳＯ３  Ｈを有している。
【００４０】
充填剤  アニオン−１
市販のアニオン交換系充填剤（ＥＳ−５０２Ｎ、旭化成社製）。骨格の素材として、ビニルアルコール系ポリマーが使用され、官能基として−Ｎ（Ｃ２  Ｈ５  ）２  を有している。
【００４１】
充填剤  アニオン−２
市販のアニオン交換系充填剤（ＩＣＰａｋ  Ａｎｉｏｎ、Ｗａｔｅｒｓ社製）。骨格の素材として、アクリル系ポリマーが使用され、官能基として−Ｎ（ＣＨ３  ）３  を有している。
【００４２】
充填剤  逆相−１
市販の逆相系充填剤（Ｍｉｃｒｏｎｅｘ  ＲＰ−３０、積水化学工業社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基としてフェニル基を有している。
【００４３】
充填剤  順相−１
市販の順相系充填剤（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ−ＮＨ２  、Ｗａｔｅｒｓ社製）。骨格の素材として、シリカが使用され、官能基として−ＮＨ２  を有している。
【００４４】
充填剤  アパタイト−１
市販のアパタイト系充填剤（ＨＣＡ−Ａ、三井東圧社製）。
【００４５】
（実施例１〜３、比較例１）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００４６】
【表１】
0003561349.tif 000002
【００４７】
▲２▼蛋白質の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、蛋白質標品（ミオグロビン、キモトリプシノーゲン、チトクロムＣ及びリソゾームを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２８０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）に、０．５Ｍの濃度でＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を混合するリニアグラジエント法にて溶出し、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを図３に示した。なお、実施例２、３のクロマトグラムも実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図２及び３における各ピークは、１１ミオグロビン、１２キモトリプシノーゲン、１３チトクロムＣ、１４リソゾームである。
【００４８】
（実施例４、５、比較例２）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表２に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表２に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２０％メタノール水溶液に分散した（比較例２は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００４９】
【表２】
0003561349.tif 000003
【００５０】
▲２▼医薬品の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、医薬品標品（アスピリン、サリチル酸、コデイン、サリチルアミド及びカフェインを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２５４ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２０％メタノール水溶液にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例４で得られたクロマトグラムを図４に、比較例２で得られたクロマトグラムを図５に示した。なお、実施例５のクロマトグラムも実施例４のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図４及び５における各ピークは、１５アスピリン、１６サリチル酸、１７コデイン、１８サリチルアミド、１９カフェインである。
【００５１】
（実施例６、比較例３）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表３に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表３に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの２０％アセトニトリル水溶液に分散した（比較例３は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５２】
【表３】
0003561349.tif 000004
【００５３】
▲２▼水溶性ビタミンの分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、水溶性ビタミン標品（リボフラビン、ピリドキシン、チアミン及びアスコルビン酸を含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２５４ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、２０％アセトニトリル水溶液にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例６で得られたクロマトグラムを図６に、比較例３で得られたクロマトグラムを図７に示した。なお、図６及び７における各ピークは、２０リボフラビン、２１ピリドキシン、２２チアミン、２３アスコルビン酸である。
【００５４】
（実施例７、比較例４）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表４に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表４に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に分散した（比較例４は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５５】
【表４】
0003561349.tif 000005
【００５６】
▲２▼蛋白質の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、蛋白質標品（オブアルブミン、ラクトアルブミン、ミオグロビン及びリソゾームを含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２８０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を混合するリニアグラジエント法にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例７で得られたクロマトグラムを図８に、比較例４で得られたクロマトグラムを図９に示した。なお、図８及び９における各ピークは、２４オブアルブミン、２５ラクトアルブミン、２６ミオグロビン、２７リソゾームである。
【００５７】
（実施例８〜１０、比較例５）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表５に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表５に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの１ｍＭ過塩素酸水溶液に分散した（比較例５は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００５８】
【表５】
0003561349.tif 000006
【００５９】
▲２▼有機酸の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、有機酸標品（クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸及び酢酸を含有）を水に溶解したものを分析した。検出は２１０ｎｍの吸光度測定にて行った。溶出は、１ｍＭ過塩素酸水溶液にて溶出し、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例８で得られたクロマトグラムを図１０に、比較例５で得られたクロマトグラムを図１１に示した。なお、実施例９、１０のクロマトグラムも実施例８のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図１０及び１１における各ピークは、２８クエン酸、２９リンゴ酸、３０コハク酸、３１乳酸、３２酢酸の各イオンである。
【００６０】
【発明の効果】
本発明１〜３の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は上記の通りであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得る液体クロマトグラフィー用カラムが得られる。従って、本発明１の液体クロマトグラフィー用カラムを使用すれば、分離モードを選択することにより、従来液体クロマトグラフィーにより分析されてきた殆ど全ての試料を、簡便な方法でより正確に分析できる。
【００６１】
本発明４〜６の分析方法の構成は上記の通りであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良がなされ得、かつ容易に製造され得るイオン交換系液体クロマトグラフィー用カラムを使用しているので、イオン交換の分離モードによって測定可能な測定対象試料を、簡便な方法でより正確に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して分析する際の装置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
【図４】実施例４のクロマトグラムである。
【図５】比較例２のクロマトグラムである。
【図６】実施例６のクロマトグラムである。
【図７】比較例３のクロマトグラムである。
【図８】実施例７のクロマトグラムである。
【図９】比較例４のクロマトグラムである。
【図１０】実施例８のクロマトグラムである。
【図１１】比較例５のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１  液体クロマトグラフィー用カラム
２  移動相
３  送液ポンプ
４  サンプラー
５  検出器
６  記録計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003561349.tif 000013
【図８】
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【図９】
0003561349.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
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