(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターであって、以下：
（ａ）第１の酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下にある、ＡＤＲ  ＩのＤＮＡコード配列；および
（ｂ）非酵母タンパク質のＤＮＡコード配列が挿入されるべきクローニング部位であって、第２の酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下にあり、
該第２の転写開始配列が酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む、
クローニング部位、
を含む、ベクター。
【請求項２】
キットであって、以下：
（ｉ）第１の酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下にあるＡＤＲ  ＩのＤＮＡコード配列を含む、第１のベクター；ならびに
（ｉｉ）第２のベクターであって、非酵母タンパク質のＤＮＡコード配列が挿入されるべきクローニング部位を、第２の酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下に含み、
該第２の転写開始配列が酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む、第２のベクター、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，組換えＤＮＡ技術により酵母内で異種タンパクを生産するのに有用な方法，および材料に関する。より詳しくは，本発明は，酵母が酵母アルコールデヒドロゲナーゼイソ酵素ＩＩ（ＡＤＨＩＩ）遺伝子プロモーターまたはその上流の活性化配列（ＵＡＳ）の制御下で発現される場合に，該酵母内で作られる異種タンパクの収率を改善する方法および材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＤＨＩＩの発現を引き起こす系によって調節される酵母の異種遺伝子の発現は，非常に有益であることが証明されている。このような発現は，通常，異種タンパクをコードする配列を，ＡＤＨ２遺伝子由来のプロモーター，あるいはハイブリッドプロモーターの制御下に配置することを包含する。このハイブリッドプロモーターは，強カな酵母プロモーター（例えば，グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）プロモーター）と組み合わせて，ＡＤＨ２プロモーターの上流の調節領域を使用する。例えば，ＥＰＯ公開公報第１６４，５５６号；ＥＰＯ公開公報第１９６，０５６号；および共有する米国特許出願第８６８，６３９号（１９８６年５月２９日付で出願）を参照されたい。ＡＤＨ２調節領域を用いる異種タンパク用の発現カセットは，通常，高いコピー数で酵母発現宿主中に存在する。このような発現系を用いて良好な結果が得られてはいるが，依然として，異種タンパクの収率を増す必要がある。
【０００３】
酵母ＡＤＲ１遺伝子によるＡＤＨ２遺伝子の調節に関して，若干の研究が報告されている。例えば，Ｓｈｕｓｔｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１８９４−１９０２；Ｄｅｎｉｓら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：３６０−３７０を参照されたいＡＤＲ１の発現レベルと，天然のＡＤＨ２遺伝子の発現レベルとの間の関係を調べたいくつかの研究が報告されている。Ｉｒａｎｉら（１９８７）Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１２３３−１２４１；Ｄｅｎｉｓ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２０８：１０１−１０６を参照されたい。しかしながら，これらの研究は，ＡＤＲ１の発現の増加が，ＡＤＨ２調節配列の制御下で発現される異種タンパクの収率を，最終的に改善するかどうかは示していない。例えば，１００を越えるＡＤＲ１のコピーが，多重ＡＤＨ２プロモーターにより引き起こされるＡＤＨ２転写における３〜４倍の阻害を克服しなかったことが，Ｉｒａｎｉら（１９８７）によって観察された。この結果により，ＡＤＲ１とは別の，ＡＤＨ２の発現を積極的に制限する因子が存在するＡＤＨＩＩ調節モデルが支持されることが示唆された。Ｄｅｎｉｓ（１９８７）も，ＡＤＲ１遺伝子の用量増加が，明らかに酵母宿主に有毒であり，その結果，細胞倍加時間に有意の増加を生じるということを報告している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
異種タンパクの収率を増すこと。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに，ＡＤＨ２調節系を用いる異種タンパク用発現カセットで形質転換された酵母宿主による異種タンパクの収率が，酵母宿主中のＡＤＲ１遺伝子でコードされたタンパクの発現を増加させることにより，有意に増加させ得ることが発見された。この結果は，報告されているＡＤＲ１遺伝子の用量増加による毒性と，多重ＡＤＨ２プロモーターで形質転換された酵母宿主におけるＡＤＨＩＩ活性に対する，ＡＤＲ１遺伝子の１００を越えるコピーの効果が小さいことから考えて，驚くべきことである。
【０００６】
ある実施態様では，本発明は，酵母内で異種タンパクを発現させる方法に関する。該発現方法は，次の工程（ａ），（ｂ）および（ｃ）を包含する：（ａ）次の（ｉ）および（ｉｉ）により形質転換された酵母宿主を提供すること：（ｉ）酵母が認識し，該酵母宿主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下に，該非酵母タンパクのＤＮＡコード配列を有する，該非酵母タンパクの発現カセットであって，該転写開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，発現カセット；および（ｉｉ）酵母が認識し，該酵母宿主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下にＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの発現カセット；（ｂ）該非酵母タンパクおよび該ＡＤＲＩが発現される条件下で，形質転換された該酵母宿主のクローン集団を培養すること；（ｃ）該クローン集団から該非酵母タンパクを回収すること。
【０００７】
他の実施態様では，本発明は，次の（ａ）および（ｂ）により形質転換された酵母細胞に関する：（ａ）酵母が認識し，該酵母宿主で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下に，非酵母タンパクのＤＮＡコード配列を有する発現カセットであって，該転写開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，発現カセット；および（ｂ）酵母が認識し，該酵母宿主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下に，ＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの発現カセット。
【０００８】
さらに他の実施態様では，本発明は，酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下にＡＤＲＩのコード配列を含むゲノムに組込まれた発現カセットを有する形質転換された酵母を包含する。該転写開始配列は，ＡＤＲ１プロモーター以外のプロモーターである。
【０００９】
本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は，以下の記述から当業者には容易に明らかとなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明を実施するためには，特に指示しない限り，当該技術分野の範囲内の通常の分子生物学，微生物学，および組換えＤＮＡ技術を用いるものとする。このような技術は，文献に詳細に説明されてる。例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬプレス，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。
【００１１】
本発明を記述するにあたって，以下の用語は下記の定義に従って使用される。
【００１２】
「ＡＤＨ  ＩＩ」は，酵母（特にサッカロミセス属，特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するグルコース抑制性アルコールデヒドロゲナーゼＩＩを意味する。「ＡＤＨ２」は，ＡＤＨＩＩをコードする酵母遺伝子およびその関連調節配列を意味する。例えば．Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：２６７４−２６８２を参照されたい。
【００１３】
「ＵＡＳ」は，上流活性化配列またはエンハンサー領域に対して当該技術分野で認められた用語である。これらは，通常，プロモーターのＴＡＴＡボックスの上流に位置する短い反復ＤＮＡ配列である。本発明で特に興味深いのは，ＡＤＨ２  ＵＡＳである。これは，ＡＤＨ２  ＴＡＴＡボックスから上流に位置する，２２ｂｐの完全逆転反復配列である。Ｓｈｕｓｔｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１８９４−１９０２を参照されたい。
【００１４】
「ＡＤＲ１」は，ＡＤＨＩＩの発現に必要な酵母由来の正の調節遺伝子を意味する。例えば、Ｄｅｎｉｓら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：３６０−３７０を参照されたい。ＡＤＲ１遺伝子によりコードされるタンパクは，ここでは「ＡＤＲＩ」と呼ばれる。
【００１５】
「レプリコン」は，インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する（すなわち，それ自体の制御下で複製が可能である）遺伝子学的要素（例えば，プラスミド，コスミド，染色体，ウイルス）である。
【００１６】
「ベクター」は，他のＤＮＡセグメントが付着することにより，該付着セグメントの複製が引き起こされるレプリコン（例えば，プラスミド，ファージ，またはコスミド）である。
【００１７】
「二本鎖ＤＮＡ分子」とは，その正常な二本らせん構造のデオキシリボヌクレオチド（アデニン，グアニン，チミジン，またはシトシン）の重合形態を意味する。この用語は，分子の一次構造および二次構造についてのみ用いられており，この分子を特定の三次元形態に限定するものではない。従って，この用語は，特に鎖状ＤＮＡ分子（例えば，制限断片），ウイルス，プラスミド，および染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する際には，ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向の配列のみを記述するという通常の慣行に従って配列を記載する。つまり，鎖は，特定のコード配列から産生されたｍＲＮＡと相同の配列を有する。
【００１８】
ＤＮＡ「コード配列」は，適切な調節配列の制御下に配置された場合，インビボで転写され，ポリペプチドヘ翻訳され得るＤＮＡ配列である。コード配列の境界は，５’（アミノ）末端の翻訳開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンにより決定され，かつこれらを包含する。コード配列は，原核ＤＮＡ配列，ウイルスＤＮＡ配列，真核細胞源（例えば，哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列，および合成ＤＮＡ配列さえ包含し得るが，これらに限定はされない。
【００１９】
「酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列」は，コード化配列に隣接し，該コード配列と相同なｍＲＮＡの酵母内における転写に関与するＤＮＡ調節領域を意味する。該ｍＲＮＡは，次いで該コード配列によりコードされたポリペプチドに翻訳され得る。転写開始配列は，酵母プロモーター配列を有する。これらは，細胞中の酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し，下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節配列である。
本発明を定義するために，プロモーター配列は，その３’末端においてコード配列の翻訳開始コドンに接しており（ただし，該翻訳開始コドンは含まれない），上流（５’方向）はバックグラウンドを越えて検知し得るレベルで転写を開始させるのに必要な最少数のヌクレオチドまたは要素を包含する範囲まで及んでいる。プロモーター配列内には，転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼを用いてマッピングすることにより都合よく定義される）および酵母ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列，例えばＴＡＴＡボックス）が見られる。転写開始配列はまた，例えばプロモーターの調節または増強に関与する他の調節領域（例えば，ＵＡＳ）を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において有用なプロモーターには，野生型ＡＤＲ１プロモーターおよび他の酵母プロモーターが含まれる。特に好ましいものとしては，解糖経路の酵素（例えば，ホスホグルコイソメラーゼ，ホスホフルクトキナーゼ，ホスホトリオースイソメラーゼ，ホスホグルコムターゼ，エノラーゼ，ピルビン酸キナーゼ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ），ＡＤＨＩ，ＡＤＨＩＩ）と関連するプロモーター、およびこれらのプロモーターのハイブリッドがある。特に好ましいハイブリッドプロモーターは，ＡＤＨ２遺伝子の５’調節配列（ＵＡＳを含む）と，ＧＡＰＤプロモーターの転写開始部位およびコンセンサス配列とから形成されたハイブリッドである。これらは，「ＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーター」と呼ばれる。例えば，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号および第１６４，５５６号，そして第１９６，０５６号を参照されたい。同様に，翻訳終結コドンの３’側に位置する転写終結配列は，野生型ＡＤＲ１，ＡＤＨ２，またはＧＡＰＤ転写終結配列か，あるいは酵母が認識する他の終結配列（例えば，他の解糖酵素の遺伝子由来の終結配列）のいずれかであり得る。
【００２１】
コード配列は，ＲＮＡポリメラーゼが転写開始配列に結合し，かつコード配列をｍＲＮＡに転写し，この転写が転写終結配列において終結する場合，転写開始配列および転写終結配列の「制御下にある」。次いで，ｍＲＮＡは，コード配列によりコードされたポリペプチドヘ翻訳される（すなわち，「発現」）。
【００２２】
「発現カセット」は，転写開始配列および転写終結配列の制御下にコード配列を有するＤＮＡ構築物である。本発明の実施において，このような構築物は，酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列を包含する。該発現カセットは，例えばＡＤＲ１タンパクまたは非酵母タンパク，あるいはこれらの両方のコード配列を含む。適切なベクターに発現カセットを都合よくクローニングするために与えられる制限部位を，該発現カセットに隣接するように配置することが特に好ましい。
【００２３】
外来ＤＮＡがある細胞内に導入されている場合，この細胞は該外来ＤＮＡにより「形質転換される」という。外来ＤＮＡを維持するような細胞の後代を，ここでは同様に「形質転換された」細胞と呼ぶ。外来ＤＮＡは，必ずしも細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込む（共有結合させる）必要はない。外来ＤＮＡは，形質転換された細胞中で，染色体外のプリコン（例えば，プラスミド）上に維持されてもよい。外来ＤＮＡが染色体に組込まれた場合，該外来ＤＮＡは染色体の複製により娘細胞に受け継がれる。染色体中に組込まれた外来ＤＮＡにより形質転換された細胞は，「安定に」形質転換された細胞と呼ばれる。
【００２４】
「クローン」または「クローン集団」は，単一の細胞または共通の祖先細胞から有糸分裂により誘導された細胞集団である。
【００２５】
２つのＤＮＡ配列は，ヌクレオチドの少なくとも約６０％（好ましくは少なくとも約７５％，最も好ましくは少なくとも９０％）が，これらの分子の一定の長さ（例えば，１００ｂｐ，２００ｂｐ，５００ｂｐ，１ｋｂ，２ｋｂまたはそれ以上）にわたって一致する場合に，「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は，特定の系について定義される選択された厳密性の条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は，当該技術分野の範囲内のものである。例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照されたい。
【００２６】
ＤＮＡ分子の「異種」領域は、天然の大きなＤＮＡ分子には見られない該ＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントである。同定可能なセグメントは、大きな該ＤＮＡ分子またはその起源である生物に対して外来となる起源を有するものとして同定するのに充分な長さの配列である。従って，異種領域が哺乳動物タンパクをコードする場合、該異種領域には，起源である生物のゲノム中では哺乳動物ＤＮＡ配列に隣接していないＤＮＡが通常隣接している。異種コード配列の他の例として，コード配列自体が天然には存在しない構築物がある（例えば，ゲノムのコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ，あるいは同じタンパクまたは類似のタンパクをコードする，生物とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異，点突然変異，あるいは自然に発生する突然変異現象は，ここで用いられているようなＤＮＡの「異種」領域を生じない。ある生物に対する「異種」タンパクは，該生物のゲノムにより天然ではコードされないタンパクである。「非酵母」タンパクは，問題の酵母に対して異種である。
【００２７】
ここで使用されているように，「酵母」には，有子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ），有担子胞子酵母，および不完全菌類に属する酵母（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）が含まれる。有子嚢胞子酵母は，２つの科（すなわち，Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ科およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）に分けられる。後者は，４つの亜科〔すなわち，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科（例えば，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科，Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科，およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科，（例えば，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）〕からなる。有担子胞子酵母には，Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，およびＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属が含まれる。不完全菌類に属する酵母は，２つの科〔すなわち，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科（例えば，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属，Ｂｕｌｌｅｒａ属）およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科（例えば，Ｃａｎｄｉｄａ属）〕に分けられる。本発明で特に興味があるのは，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，およびＣａｎｄｉｄａ属に属する種である。特に興味があるのは，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ，Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ，Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ，およびＳ．ｏｖｉｆｏｒｍｉｓである。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属で特に興味のある種には，Ｋ．ｌａｃｔｉｓが含まれる。酵母の分類は将来変わるかもしれないので，本発明では，酵母は，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｆ．Ａ．Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｐａｓｓｍｏｒｅ＆Ｒ．Ｒ．Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ編，１９８０年）（Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９）に記載されているように定義されるものとする。上記のことに加えて，当業者は，酵母の生物学および酵母の遺伝子操作について，おそらく熟知している。例えば，Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｍ．Ｂａｃｉｌａ，Ｂ．Ｌ．Ｈｏｒｅｃｋｅｒ＆Ａ．Ｏ．Ｍ．Ｓｔｏｐｐａｎｉ編，１９７８年）：Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ（Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ＆Ｊ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ編，第２版，１９８７年）：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編，１９８１年）を参照されたい。
【００２８】
本発明は，一例として，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（特に，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母に関して記載される。しかしながら，本発明はこれらの酵母に限定されない。
【００２９】
本発明（すなわち，酵母における異種タンパクの増強発現）は，異種タンパクのコード配列を酵母宿主内のＡＤＨ２調節配列の制御下に配置し．該酵母宿主におけるＡＤＲＩ発現を増強することにより達成される。ＡＤＨ２プロモーター（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターのようなハイブリッドＡＤＨ２プロモーターを包含する）を用いる非酵母タンパク用の発現カセットの構築は，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号および第１６４，５５６号に詳細に記載されている。
【００３０】
本発明は，野生型酵母株と比べてＡＤＲＩ発現が増強された酵母宿主を用いるこのような酵母宿主を，ＡＤＨ２プロモーターに基づく上記の発現カセットと共に用いた場合，ＡＤＨ２カセットから産生される異種タンパクの生産量が実質的に増加する。ＡＤＲＩ発現が増強された酵母宿主は，数多くの方法で提供することができる。
【００３１】
ある好ましい実施態様では，増強されたＡＤＲＩ発現は，（通常，ＡＤＲ１遺伝子に由来する）ＡＤＲＩのコード配列を含む発現カセットで酵母宿主を形質転換することにより与えられる。該発現カセットは，宿主におけるＡＤＲＩのより高い発現レベルを与える。該発現カセットは，ＡＤＲ１転写開始配列および転写終結配列の制御下にあるコード配列を含み得る。あるいは，異種の転写開始配列および転写終結配列を用いてもよい。ある好ましい実施態様では，ＡＤＲＩカセットは，ＡＤＲ１プロモーターの代わりに，強力な酵母プロモーター（すなわち，ＡＤＲ１プロモーターに比べて，コード配列の転写を少なくとも５倍増加させるプロモーターである）を用いて構築される。このようなプロモーターの例として，ＧＡＰＤプロモーターがある。
【００３２】
ＡＤＲＩカセットは，カセットを染色体外ベクター（例えば，コピー数の多いベクター）上に維持するか，あるいは組込みベクターを用いて酵母宿主ゲノム内に組込むことにより，酵母宿主を形質転換するのに用いることができる。ＡＤＲＩカセットおよび非酵母タンパクカセットは，酵母宿主の内部における同じベクターまたは異なるベクター上に維持するか，あるいは同じ組込みベクターまたは異なる組込みベクターを用いて宿主ゲノム内に組込むことができる。
【００３３】
特に好ましい実施態様では，酵母宿主は，強力な酵母プロモーターを用いたＡＤＲＩカセットを有する組込みベクターにより形質転換され，異種タンパクカセットは，染色体外の高コピーベクター上に維持される。例えば，組込まれたＡＤＲＩカセットは，ＧＡＰＤプロモーターを用いることができ，染色体外非酵母タンパクカセットは，ＡＤＨ２プロモーターまたはＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターを用いることができる。
【００３４】
本発明において使用されるレプリコン（通常，プラスミド）は，１つまたはそれ以上の複製系，望ましくは発現用の酵母宿主とクローニング用の細菌宿主（例えば，Ｅ．ｃｏｌｉとの両方において，レプリコンの維持を可能にする２つの複製系を包含する。このような酵母−細菌シャトルベクターの例には，ＹＥｐ２４〔Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ，８：１７−２４〕，ｐＣ１／１〔Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：４６４２−４６４６〕，およびＹＲｐ１７〔Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．１５８：１５７〕が挙げられる。さらに，染色体外ベクターは，コピー数が多いかまたは少ないベクターであってもよい。コピー数は，一般に約１〜約５００である。高コピー数酵母ベクターを用いると，単一宿主内におけるコピー数は，一般に少なくとも１０，好ましくは少なくとも２０であり，通常は約１５０〜５００を越えない。選択された非酵母タンパクによって，宿主に対するベクターおよび異質タンパクの影響により，コピー数の多いベクターまたはコピー数の少ないベクターが望ましい。例えば，Ｂｒａｋｅら（前出）を参照されたい。本発明のＤＮＡ構築物はまた，組込みベクターによって酵母ゲノム内に組込むことができる。このようなベクターの例は，当該技術分野で知られている。例えば，Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（前出）を参照されたい。ゲノムに組込まれるカセットのコピー数は，好ましくは５０より少なく，より好ましくは約１０より少なく，通常は約５より少ない（野生型遺伝子に加えて）。典型的には，組込まれるカセットのコピー数は，１または２である。
【００３５】
本発明を実施するのに適切な酵母および他の微生物宿主（例えば，二倍体，一倍体，栄養要求株など）の選択は，当該技術の範囲内のことである。発現用の酵母宿主を選択する場合，適切な宿主には，特に，良好な分泌能力，低いタンパク分解活性，および全体的な強さを有することが知られているものが含まれる。酵母および他の微生物は，一般に様々な供給源から入手できる。これらの中には，カリフォルニア州バークレーのカリフォルニア大学生物物理および医学物理学部の酵母遺伝子ストックセンター，およびメリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションが含まれる。
【００３６】
外来ＤＮＡを酵母宿主内に導入する方法は，当該技術分野でよく知られている。酵母を形質転換するには，種々様々な方法がある。例えば，スフェロプラスト形質転換が教示されている（例えば，Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９１９−１９３３；およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，ＥＰＯ公開公報第４５，５７３号）。形質転換体は，適切な栄養培地で増殖し，適切な場所で，内存ＤＮＡの保持を確実にする選択圧下で維持される。発現を誘発させ得る場合，酵母宿主を増殖させて細胞密度を高くすることができ，次いで発現を誘発させる。非酵母タンパクは，従来の手段により採集され，クロマトグラフィー，電気泳動，透析，溶媒抽出などにより精製される。
【００３７】
【実施例】
以下の実施例は，単に例示を目的とするものであり本発明の範囲を限定するものではない。この発明を実施するのに必要な生物学的出発材料は，同一もしくは同等物を公に入手できるので，寄託する必要はないと思われる。本願明細書に引用されているすべての文献に記載されている内容は，当業者が熟知していると思われ，特に本願に引用文献として用いる。
【００３８】
実施例Ｉ
この実施例では，ＡＤＲＩの発現が強化された発現カセットの構築，自律的に複製する酵母ベクターへの該カセットの挿入，および該ベクターによる酵母株の形質転換について述べる。第１図は，ベクター構築の流れ図を示し，第２図は，得られたベクターの部分制限地図を示す。
【００３９】
プラスミドＹＰｐ７−ＡＤＲ１−４１１〔デニス（Ｄｅｎｉｓ）ら．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３巻，３６０〜３７０頁，１９８３年〕は酵母ＡＤＲ１遺伝子を有する。このプラスミドを，制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し，５’末端の最初の１６個のアミノ酸のコドンを欠いたＡＤＲ１遺伝子を含む断片を単離した。標準方法で，Ｎ末端コドンを置換してＢｇｌＩＩ制限部位を含む５’延長部分を付与し，ひとつのオリゴヌクレオチドを合成した。ＡＤＲ１遺伝子に通常存在するコドンの代わりに酵母に好ましいコドンを用いて調製したオリゴヌクレオチドアダプターの配列は下記のとおりである。
【００４０】
【化１】
0003561513.tif 000002
【００４１】
このアダプターを，ＹＰｐ７−ＡＤＲ１−４１１由来の上記ＨｉｎｃＩＩ断片に，標準条件下で連結した。リガーゼを不活性化した後，得られた混合物をＢｇｌＩＩで切断し，ＡＤＲＩの最初の６４１個のアミノ酸のコード配列を有する１．９ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を創製した。次にこのＢｇｌＩＩ断片を精製し，再クローン化し，プラスミドｐＡＢ２７のＧＡＰＤプロモーターとＧＡＰＤターミネーターとの間のＢｇｌＩＩ部位に連結した。上記連結は，このプロモーターが，ＡＤＲＩをコードする配列の正確な転写を指示するように行なわれた。得られたプラスミドをｐＪＳ１１８と命名した。
【００４２】
プラスミドｐＡＢ２７は，酵母の２ミクロンプラスミド，Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＢＲ３２２プラスミド，酵母の標識遺伝子ＵＲＡ３およびＬＥＵ−２ｄ由来の配列，そして，ＧＡＰＤプロモーターおよびＧＡＰＤターミネーターの配列の間に配置されたＢｇｌＩＩ挿入部位を有する”空の”（ｅｍｐｔｙ）ＧＡＰＤ発現カセットを含む酵母シャトル発現ベクターである。
【００４３】
プラスミドｐＪＳ１１８は，ＡＤＲＩの最初の６４１個のアミノ酸のみをコードするので，中間体である。次に，ＡＤＲ１遺伝子由来のコード配列の残りの部分をこのベクターに付加してｐＪＳ１１９を得た。まず，ＹＲｐ７−ＡＤＲ１−４１１をＳａｃＩで切断し，ＡＤＲ１由来の残りのコード配列と，ＡＤＲ１の３’隣接配列とを有する４ｋｂの断片を単離した。次いでこの４ｋｂの断片を，ＳａｃＩで切断してアルカリホスファターゼで処理したｐＪＳ１１８に連結して，プラスミドｐＪＳ１１９を創製した。ＡＤＲ１コード配列の完全性を制限酵素分析法で試験して，断片が正しい方向に挿入されていることを確認した。プラスミドｐＪＳ１１９を，標準法を用いて，２種の異なる酵母宿主株ＡＢ１１０およびＪＣ４８２に形質転換した。〔例えばヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９頁，１９７８年，を参照〕。
【００４４】
エス．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２１５０−２−３（ワシントン大学のリー  ハートウェルより入手）と，ｐＣｌ／ｌ誘導体を有するエス．セレビシエＡＢｌ０３．１形質転換体とを交雑させることによって酵母株ＡＢ１１０を得た。二倍体の胞子が形成され，四分染色体は全裂であった。酵母株は，プラスミドの保持を確実にするためにロイシン選択プレート上に維持した。なぜなら親株が栄養素要求体だからである。一連のコロニーを，いくつかの標識（Ｍａｔα，ｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｐｅｐ４−３）について，その遺伝子型を選別した。得られた雑種株を，ロイシンの存在下（すなわち選択圧なし）で増殖することによってその常在性プラスミドを除去（ｃｕｒｅ）し，次にレプリカ平板法でｌｅｕコロニーを選別することによって，ＡＢ１１０株を得た。ＡＢ１１０は，遺伝子型Ｍａｔα，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−０４，またはｌｅｕ２−３とｌｅｕ２−１１２，ｐｅｐ４−３，ｈｉｓ４−５８０，ｃｉｒ°を有する。種々の非相同プラスミドを有する上記の株の試料は，１９８４年５月９日付でＡＴＣＣに寄託番号第２０７０９号で寄託された。ＥＰＯ公開公報第１６４，５５６号を参照されたい。
【００４５】
ＪＣ４８２株は，米国，ペンシルヴェニア州，フィラデルフィアのペンシルヴェニア大学のジョン  キャノン博士（Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｃａｎｎｏｎ）から入手した。この株は常在性２ミクロンプラスミドが除去されている。
【００４６】
上記の株は，ＡＤＨＩＩ活性が増強されているので，ＡＤＨ２調節配列，特に組込みベクター上の発現カセットの制御下にある，非相同タンパクの発現カセットで形質転換するのに適している。あるいは，このような発現カセットは，ｐＪＳ１１９の通常の制限部位に挿入され，得られたベクターを適当な酵母株を形質転換するのに使用することができる。
【００４７】
実施例ＩＩ
この実施例では，ＡＤＲＩの発現カセットを有する組込みベクターの構築と，そのベクターによる，酵母株の形質転換について述べる。組込みプラスミドｐＤＭ１５を第３図に示し，その構築を第１図の流れ図に示す。
【００４８】
プラスミドｐＪＳ１３２は，ｐＢＲ３２２配列と；クライベロミセス  ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＤＨ１のプロモーターおよびターミネーター配列の制御下で酵母のＧ４１８耐性をコードする遺伝子と；を有するプラスミドである。このプラスミドをＳｍａＩとＳａｌＩとで切断し，得られた大きい方の線状断片を精製した。
【００４９】
プラスミドｐＪＳ１１９をＰｓｔＩで切断した。このＰｓｔＩは，ＡＤＲＩをコードする配列の３’末端から下流の部位で切断する。次に，切断されたプラスミドを一重鎖に特異的に作用するＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑断端をつくり出し，次にＳａｌＩで切断してＡＤＲＩ発現カセットを有する６．２ｋｂの断片を得た。フェノールによる抽出とエタノールによる沈澱とを，各逐次工程の間に行った。ＳａｌＩによる平滑断端を有する断片を，前記の大きい方のｐＪＳ１３２断片に連結してプラスミドｐＤＭ１５を作製した。
【００５０】
次にプラスミドｐＤＭ１５を用い，標準方法を使用して酵母を形質転換することによって，ＡＤＲＩを過剰生産するサッカロミセスを作製した。例えば，ＡＢ１１０株を，Ｇ４１８耐性株に形質転換し，ＡＤＲＩ過剰生産性を示す株を分離した。この株をＪＳＣ３００と命名した。もうひとつのＡＤＲＩ過剰生産株ＪＳＣ３０２を、常在性プラスミドを除去したＢＪ２１６８（前出のＹｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ）から同様の方法で作製した。さらに他のＡＤＲＩ過剰生産株はＪＳＣ３０８である。
【００５１】
実施例ＩＩＩ
以下の実施例では，非相同性タンパクの発現宿主として，ＡＤＲＩ生産性を強化された酵母株が有用であることを証明する。
【００５２】
酵母株ＪＳＣ３００を，スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＤＤ）／インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）融合タンパクの発現カセットと，塩基性ヒト繊維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ）の発現カセットとで形質転換した。
【００５３】
ＳＯＤ／ＩＧＦＩＩ発現ベクターであるｐＹＬＵＩＧＦ２−１４はＥＰＯ公開公報第１９６，０５６号に記載されている。またこのベクターは，ＡＴＣＣ寄託番号第２０７４５号で寄託されている（１９８５年２月２７日）。
【００５４】
塩基性ｈＦＧＦ発現ベクターのｐＡ／Ｇ−ｈＦＧＦは次のようにして作製した。最初に，標準的な方法で下記の配列を有する合成ｈＦＧＦ遺伝子を作製した。
【００５５】
【化２】
0003561513.tif 000003
【００５６】
プラスミドｐＢＳｌ００（ＥＰＯ公開公報第１８１，１５０号）はＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターカセットを有する。合成ｈＦＧＦ配列をゲルで精製し，Ｎｃｏｌ／Ｓａｌｌで消化したｐＢＳｌ００にクローン化して，ｈＦＧＦ配列をカセット中に配置した。このカセットを，ＢａｍＨＩで，ｐＢＳｌ００／ＦＧＦプラスミドから切取り，次いで酵母シャトルベクターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ＥＰＯ特許出願第８８３１２３０６．９および特願昭６３−３３５６８５号、ならびにＢｒｏｓｃｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、第１巻、４４５頁（１９８１）を参照されたい。得られたベクターをｐＡ／Ｇ−ｈＦＧＦと命名した。
【００５７】
上記発現カセットは，ＡＤＨ２遺伝子由来のＵＡＳをもっていた。酵母株を形質転換後増殖させ，標準法で非相同性タンパクを回収した。分離したタンパクをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。酵母株ＡＢ１１０（対照）およびＪＳＣ３００内に，ＳＯＤ／ＩＧＦＩＩ融合タンパクとｈＦＧＦとが発現したということが，ＪＳＣ３００を宿主として用いた時に非酵母のタンパクの収量が３００倍も増加したことによって証明された。
【００５８】
高収量発現の他の例としては，ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１由来のポリペプチドがある。例えば，ＨＩＶ  ｇｐ１２０ｅｎｖの１／２のカルボキシ末端に相当するポリペプチドを，高レベルで発現することができる。適切な発現ベクターの例は，ＥＰＯ公開公報第１８１，１５０号および特願昭６０−２４６１０２号に開示されている。これらの文献に開示される特に好ましいベクターは，ｐＢＳ２４／ＳＯＤ−ＳＦ２ｅｎｖ４である。
生物材料の寄託
下記の株およびプラスミドの試料は，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国，メリーランド州，ロックビル，パークローン  ドライブ１２３０１）に寄託され，ブダペスト条約の規定に基づいて保管されている。これらの寄託番号と寄託日を以下に別記する。
寄託物                                ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．  寄託日
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＪＳＣ３００    ２０８７８    １９８８年５月５日
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＪＳＣ３０８    ２０８７９    １９８８年５月５日
ｐＤＭ１５    ＤＮＡ                      ４０４５３  １９８８年５月５日
ｐＪＳ１１９  ＤＮＡ                      ４０４５４  １９８８年５月５日
これらの寄託は，当業者の便宜のために行われるものである。これらの寄託は，このような寄託物がこの発明を実施するのに必要であることを認めるものではなく，また，同等の実施態様が，本願の開示からみて，当該技術分野に含まれていないということを認めるものではない。これらの寄託物が公に入手できるとはいえ，この特許もしくは他の特許に基づいて寄託された材料を使用して，製造，使用もしくは販売する認可を承認しているわけではない。寄託された材料の核酸配列は参照のため本願に組み込まれ，本願に記載の配列と矛盾するか否かをコントロールされている。
【００５９】
本発明は，明確さと理解を目的として，図示と実施例とでいくぶん詳細に説明したが，添付の特許請求の範囲から逸脱することなく改変および修飾が行なわれ得ることは明らかである。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、異種タンパクの収率を増すことが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，プラスミドｐＪＳ１１９およびｐＤＭ１５の構築を示すフローチャートである。
【図２】図２は，プラスミドｐＪＳ１１９の制限地図である。すべての制限部位が示されているわけではない。この図では以下の略号が用いられている：ＵＲＡ３，酵母ＵＲＡ３遺伝子；ＬＥＵ２−ｄ，酵母ＬＥＵ２−ｄ遺伝子；ＧＡＰ−ｔ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ終結配列；ＡＤＲ１，酵母ＡＤＲ１遺伝子；ｐ−ＧＡＰ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡプロモーター開始配列；ｐＢＲ３２２，Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド配列；２μｍ，酵母２ミクロンプラスミド配列。
【図３】図３は，プラスミドｐＤＭ１５の制限地図である。すべての制限部位が示されているわけではない。略号は第２図と同じであるが，以下のものが付け加えられている。：Ｇ４１８，Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）に対する耐性を与える遺伝子；（Ｓｍａ／Ｐｓｔ），ＳｍａＩとＰｓｔＩとの制限部位間の融合部位。
【図１】
0003561513.tif 000004
【図２】
0003561513.tif 000005
【図３】
0003561513.tif 000006