(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡のための試験片低温移送ホルダであって、
試験片チップ（14）を有するホルダ本体（12）及び試験片チップ（14）のための冷却源（52）を含み、
前記試験片チップ（14）は熱伝導性材料の試験片グリッド（16）を含み、試験片グリッドはグリッド開口（30）を形成するように交差する複数のグリッドバー（26、28）を有し、グリッド開口の各々は長さ及び幅を有し、各グリッド開口の長さはホルダ本体の長手軸線に実質上垂直で当該グリッド開口の幅より大であり、試験片チップ（14）は水平から両方向に少なくとも約90゜の角度にわたって回転できるようにされる試験片低温移送ホルダ。
【請求項２】
前記試験片グリッド（16）がクランプ（32）により試験片チップ（14）に固定される請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項３】
前記試験片グリッド（16）がその第１の端部にタブ（24）を備え、試験片チップ（14）が前記タブに係合するクランプ（32）を有する請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項４】
前記クランプ（32）がクランプ本体（34）とクランプ本体をタブに対して押し付けるバネ（36）とクランプ本体にネジ固定されるナット（38）とを有する請求項３の試験片低温移送ホルダ。
【請求項５】
前記クランプ本体（34）が低温シールドと試験片チップの端部を越えて伸長する視界位置と低温シールド内の引き戻し位置との間で試験片グリッド（16）を移動させる機構（60）とを有する請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項６】
前記試験片チップ（16）の冷却源（52）が低温液体を収容するための第１及び第２の端部を備えた容器（52）を有し、該容器（52）はその第１の端部でホルダ本体内のロッドに固定され、該容器（52）及びロッドはそれぞれの水平軸線のまわりで回転できる請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項７】
前記容器（52）はその第２の端部に位置する実質上水平に指向したフィラーネック（60）を有する請求項６の試験片低温移送ホルダ。
【請求項８】
前記容器（52）は更に該容器のまわりに延びる外側の絶縁本体を有する請求項６の試験片低温移送ホルダ。
【請求項９】
前記試験片チップ（14）の冷却源（52）が低温液体を収容するための第１及び第２の端部を備えた容器を有し、該容器がその第１端部でホルダ本体内のロッドに固定され、該ロッドが試験片チップと連通し、該容器及びそれぞれの水平軸線のまわりで回転できる請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項１０】
前記試験片グリッドが複数のグリッド開口（30）を有し、グリッド開口の各々がホルダ本体の長手軸線に実質上垂直で該開口の幅より大きな長さを有し、試験片チップ（14）が水平から両方向に少なくとも約90゜の角度にわたって回転できる請求項１の試験片低温移送ホルダ。
【請求項１１】
前記ホルダ本体が低温シールドと試験片チップの端部を越えて伸長する視界位置と低温シールド内の引き戻し位置との間で試験片グリッド（16）を移動させる機構（60）とを有する請求項９の試験片低温移送ホルダ。
【発明の詳細な説明】
本発明は透過電子顕微鏡のための試験片ホルダに関し、特に側進入式の試験片冷却ホルダに関する。
電子顕微鏡試験片ホルダはカートリッジ又はロッドの形をとることができる。カートリッジ型のホルダは対物レンズの上方ポールピースを通して顕微鏡内へ垂直に挿入され、一方、ロッド型のホルダは上方及び下方のポールピース間で顕微鏡の側部を通して水平に挿入される。近年、ロッド型のホルダは、試験片を傾斜させる機構が一層簡単で一層の信頼性を有するため、一層幅広く使用されてきている。試験片を傾斜させる能力は立体作像、三次元再生、及び最適な回折状態の調整にとって重要である。
適当な顕微鏡内で右まわり及び左まわりの両方向に水平から90゜の角度まで傾斜させる能力を有する１つのロッド型の試験片ホルダはチャルクロフト（Chalcroft）及びデイビー（Davey）著による文献「J.Microscopy  134」（1984年）の41−48頁に記載されている。この文献では、単一の傾斜ホルダの端部を越えて突出する試験片グリッドが摺動カラーにより係止されたピンセットによって一側でクランプされる。しかし、設計上の欠点としては、低温温度ではなく大気温度での作動、グリッドのためのシールド又は保護体の欠如、試験片の装填、挿入及びホルダからの取り外し中の未保護グリッドの損傷及び汚染が生じ易いこと、及び最大サンプル視界のためにグリッドバーにより支持されていない大きな領域を有するグリッドを選択する必要があることである。
ロッド型の試験片ホルダはまた低温での試験片の観察にとって好ましい型式のものとなっている。その理由は、銅の如き熱伝導性材料で試験片チップを形成し、チップを銅ロッドの形としてロッドの他端に装着した液体窒素又はヘリウムのジュワー（dewar）へ延長させることにより、試験片からの熱の抽出を容易に達成できるからである。低温移送ホルダはつい最近開発されたロッド型の冷却ホルダであって、試験片の冷凍無しに外部の低温ステーションから顕微鏡内へ試験片を低温で移送できるものである。
生体サンプルのための従来の樹脂埋設技術は生きた細胞内のミクロ構造の詳細を参照して解釈できる容易に特定可能な人工物を製造することを示している。しかし、樹脂埋設中細胞に含まれる水をサンプルから取り除かねばならず、人工物の拡散及び微妙な細胞構造の収縮を生じさせてしまう。電子顕微鏡の真空環境内で試験中に生きた器官の三次元構造を維持するために、顕微鏡観察者は試験のための生体試験片を準備するために超高速冷凍技術を使用する。
このような冷凍技術は多くの利点を提供するが、いくつかの技術的な問題が存在し、これらを解決しなければならない。特に、無定形の氷の形成を促進するために試験片を迅速に冷凍しなければならない。また、冷凍後、生体試験片の構造を損傷させる虞れのある結晶氷の形成を阻止するために試験片を約−130℃以下の温度に始終維持しなければならない。典型的には、冷凍した試験片は電子顕微鏡の近傍に位置する特殊な低温ステーション内で低温移送ホルダに装着され、次いで、顕微鏡のエアロックへ迅速に移送される。
米国特許第4,703,181号明細書に記載された型式の低温移送ホルダは、試験片を冷えた状態に保持し、試験片装填ステーションから顕微鏡内へのホルダの移送中試験片上に霜が形成されるのを阻止するものとして開発されてきた。このようなホルダは、移送中に試験片を覆うような位置へ移動できる液体窒素ジュワーに関連する嵌合低温シールドを含む。顕微鏡の内部に達したら、シールドを引き戻すことができる。
三次元作像即ち電子断層写真は試験片の大きな傾斜範囲にわたって収集された投影データからの個々の物体の再生を含む。電子断層写真の実践上の制限は、電子ビームの繰り返しの放射による試験片の損傷、及び投影データを得るために試験片ホルダが利用できる傾斜の範囲により決まる。増分的な傾斜角度の幅広い範囲にわたって撮影された冷凍の生体試験片の電子顕微鏡画像を統合することにより、ほぼ0.5nmの解像度での生体分子の三次元構造及び細菌粒子の表面形状を決定することができる。
解像度を更に改善するためには、利用できる傾斜角度の範囲を約±70゜の現在の限界を越えて増大させることが望ましい。この限界は（ａ）試験片ロッドチップでの試験片支持フレームの厚さ及び（ｂ）標準の3mm直径の試験片支持グリッドのグリッドバーにより与えられる機械的な制約による。これら両方の特徴は大きな傾斜角度において電子ビームから試験片を陰にしてしまう。小さなポールピースギャップを有する電子顕微鏡においては、傾斜範囲は試験片ロッドと対物レンズのポール面又は対物口径との間の機械的な干渉により更に制限されることがある。最後に、傾斜範囲はまた、試験片ホルダの端部に装着された回転したジュワーから溢れた液体窒素又はヘリウムにより制限されることもある。電子顕微鏡において生体分子、細菌粒子等を研究する大半の学術調査では、これらすべての機械的な制約を回避できた場合に、顕著な利点が得られることが判明している。
従って、この技術分野において、試験片の適正な冷却を維持した状態で、ジュワーから低温の液体を溢れさせることなく、幅広い角度範囲にわたって回転できる試験片移送ホルダの要求が依然として存在する。
本発明は、低温の液体を溢れさせることなく、試験片の適正な保護及び冷却を維持した状態で、360゜の全傾斜角度（水平から右まわり及び左まわりに180゜）にわたって試験片を回転させることのできる超高傾斜低温移送ホルダを提供することにより、上記要求を満たす。本発明の１つの態様に従えば、試験片チップを有するホルダ本体と、試験片チップのための冷却源とを備えた超高傾斜試験片低温移送ホルダが提供される。試験片チップは交差するグリッドバー間に複数のグリッド開口を有する熱伝導性材料の試験片グリッドを含む。
極めて大きな傾斜角度でさえ、グリッド上の試験片の遮りの無い視界を可能にするため、グリッドバー間のグリッド開口は各々その幅より大きな（ホルダ本体の長手軸線に対して実質上垂直な）長さを有する。グリッド開口の幅に対する長さの好ましい比率はほぼ5:1である。試験片チップは水平から両方向に少なくとも約90゜回転するようになっており、好ましい実施の形態においては、±180゜回転できる。
好ましくは、試験片グリッドは低温の温度においてさえ作動できるクランプにより試験片チップに固定される。試験片グリッドはその第１の端部においてタブを有し、試験片チップはタブに係合するクランプを有する。クランプはクランプ本体と、クランプ本体をタブに対して押圧するバネと、クランプ本体にネジ固定されるナットとを有する。ナットの回転は、バネを圧縮してタブの取り外しを可能にするか、または、バネを解放してクランプ本体を試験片グリッド上のタブに対して押圧する。
好ましくは、ホルダ本体はまた、試験片ホルダチップ内の開口により形成された低温シールドと、試験片チップの端部を越えた伸長視野位置と低温シールド内の引き戻し位置との間で試験片グリッドを移動させる機構とを有する。試験片チップのための好ましい冷却源は低温液体を収容するための第１及び第２の端部を有する容器を備え、容器はその第１の端部でホルダ本体内のロッドに固定され、容器及びロッドはそのそれぞれの水平軸線のまわりで回転できる。容器はほぼ水平に指向し、好ましくはその第２の端部に位置するフィラーネック（首部）を有し、更に、容器のまわりを延びる外側の絶縁本体を有する。
従って、本発明の特徴は、サンプル試験片の遮りの無い視界を可能にするために360゜の全傾斜角度（水平から右まわり及び左まわりに180゜）にわたって試験片を回転させることのできる超高傾斜低温移送ホルダを提供することである。本発明の別の特徴は、試験片の適正な保護及び冷却を維持した状態で、低温の液体を溢れさせることなく、サンプルの回転中に作動できる試験片冷却源を提供することである。本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付図面を参照しての以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
ここで、例示として図面を参照する。
第１図は、試験片グリッドが伸長視界位置にある状態での、移送ホルダの上面図、
第２図は、第１図と同様の図で、試験片グリッドが引き戻し位置にある状態での、試験片グリッドを備えた移送ホルダの上面図、
第３図は、試験片グリッドが伸長視界位置にある状態での、試験片移送ホルダの側断面図、
第４図は試験片ホルダチップ内の開口により形成された低温シールド内に引き戻された試験片チップ及びグリッドを示す端面図、
第５図は試験片グリッドの詳細上面図、
第６図は回転可能な低温液体収容容器の側断面図、
第７図及び第８図は本発明のクランプの作動を示す側断面図である。
ここで、第１図を参照すると、本発明の低温移送ホルダの上面図が示されている。試験片低温移送ホルダ10は試験片チップ14を備えたホルダ本体12を有する。チップ14は、試験片20を支持するための第１の端部18と、クランプ構造体を介して試験片チップに固定されるようになったタブ部分24を含む第２の端部22とを備えた試験片支持グリッド16を有する。
ここでまた第５図を参照すると、第１の端部18での試験片支持グリッド16は複数のグリッドバー26、28を有する。図示のように、グリッドバー26はホルダ本体の長手軸線に対して実質上平行に延び、一方、グリッドバー28は長手軸線に対して実質上垂直に延びる。また、図示のように、グリッドバーは交差して、複数のグリッド開口30を形成する。グリッド16はグリッド開口の境界の外側に（大きな傾斜角度での試験片の観察能力に抵触するような）外部の支持構造体を有しない。
グリッドバーは、隣接するグリッドバー26間に比較的大きな空間を生じさせるように位置決めされる。好ましくは、グリッド開口の幅に対する長さの比率はほぼ5:1である。これより小さな比率では、大きな傾斜角度での試験片が不鮮明になることがあり、一方、大き過ぎる比率では、グリッドの機械的な強度が弱過ぎて試験片を支持できなくなることがある。図示のようなグリッド16の機械的な強度は、例えば低温ミクロトーム及び低温プランジングの技術を含む低温温度での試験片の準備及び装着において生じる力に対して十分なものである。
このような方法（即ち、試験片ホルダ本体の長手軸線に垂直なグリッドバーの比較的大きな間隔）でグリッドバーを位置決めすることにより、グリッドバーは大きな傾斜角度において試験片を陰にすることがない。「蔭」とは、バーの厚さが電子顕微鏡からの電子ビームと試験片との間の直接のライン内に位置することを意味する。従来の試験片支持フレーム及びグリッドメッシュ構造体は水平からほぼ±70゜以上の試験片傾斜角度で試験片に蔭を生じさせる。
支持グリッド16は好ましくは電気蒸着銅の如き熱伝導性材料で作られる。グリッド16のための典型的な寸法としては、幅が約3mmより小さく、長さがほぼ6.5mmであり、厚さがほぼ20−50μｍである。3mmより小さな幅は電子顕微鏡内で上方及び下方のポールピース間でのグリッドの自由回転を許容するように設計される。グリッドバー26、28の幅はほぼ0.05−0.06mmであり、バー26間の間隔はほぼ0.70mmであり、バー28間の間隔はほぼ0.15mmである。
グリッド16は第１、２、７、８図に明示するクランプ構造体を使用して試験片ホルダ本体12に固定される。クランプ機構32はクランプ本体34と、バネ36と、ネジナット38とを有する。試験片グリッド16をホルダ本体12のチップ14内に装填するため、試験片のための低温シールドを形成する試験片チップホルダ14（第４図に明示）の溝穴40を通して第２の端部22を挿入する。そこで、タブ24がクランプ機構32内に着座する。クランプ機構32は最初は第７図に示す位置にあり、ナット38がバネ36を圧縮状態に保持している。ネジナット38が回転すると、第８図に示すように、バネ36が解放され、クランプ本体34をタブ24上へ押し下げ、グリッドを固定する。ナット38は１回転以下しか回転しないように端ストッパ44により拘束される。
ホルダ本体12へのグリッド16の固定は好ましくは低温ステーションにおいて低温で行われる。ナット38は、試験片チップ14が液体窒素の如き低温環境内に浸されている場合でさえ、試験片20及びグリッド16をクランプできるようにする長い薄壁のソケットレンチ（図示せず）を使用して調整することができる。
第２図は試験片グリッド16が引き戻された（保護）位置にある状態での、低温移送ホルダ10の上面図である。グリッド16はホルダ本体12の長手軸線に沿って延びる引き棒46により伸長位置から引き戻し位置へ移動される。電子顕微鏡の外部に位置する電気式、液圧式又は空気式のドライバ（図示せず）を使用して引き棒46を作動させることができる。グリッド16が引き戻されたとき、グリッド16を低温温度に維持するための低温シールドとして作用する試験片チップホルダ14の溝穴40内へグリッドが進入する。これにより、ホルダが低温ステーションから実験室環境を通して電子顕微鏡へ移送されている間、試験片20を霜から保護する。
第３図はクランプ機構32によりクランプされた試験片グリッド16を示す、試験片チップホルダ14及びホルダ本体12の側断面図である。クランプナット38はその完全な左回り位置へねじ込まれていて、バネ36がクランプ本体34を試験片グリッドの端部のタブに押し付けている。この図では、引き棒46は伸長されていて、試験片キャリア48を伸長位置へ移動させ試験片チップホルダ14の肩部50に押し付けている。試験片グリッド16は伸長した前方の視界位置にある。また、図示のように、試験片チップホルダ14はホルダ本体12内でジュワー（第３図には示さないが、第６図に示す）の方へ長手方向に延びる。好ましくは、試験片チップホルダは銅の如き熱伝導性材料で作られ、試験片の低温冷却を提供するようにジュワーと連通する。
引き棒46を（第３図に示す位置から）右へ移動させると、試験片グリッド16は試験片チップホルダ14の溝穴40を通して引き戻される。従って、試験片チップホルダは試験片及びグリッドのための低温シールドとして作用する。第４図はグリッド16を収容した状態の溝穴40を示す。試験片チップホルダ14が熱伝導性材料で作られ、ジュワー内の低温液体と連通しているので、試験片20は低温温度の材料で完全に囲まれることとなる。試験片チップホルダ14の壁と試験片16の壁との間の溝穴40内の間隙は、大気圧にあるときに試験片上のガスの大きな対流を阻止するのに十分小さく、また、試験片が顕微鏡のエアロック真空内にあるときにガス分子間の平均自由経路より小さくなるように、選定される。これにより、試験片装填ステーションと顕微鏡真空との間での移送中低温ホルダが湿気に晒されている間中、試験片を霜から保護することができる。
試験片のための低温冷却剤を収容するジュワー即ち容器の断面を第６図に示す。図示のように、容器52は水平軸線のまわりで回転するようになっており、内壁54及び外壁56を有する。その第１の端部で、ジュワーの内壁54は引き棒46の反対側の端部に連結される。熱伝導性材料58は引き棒46を取り囲み、試験片チップホルダ14と連通する。容器52の第２の端部には、水平に指向したネック60が位置し、このネックを通して、例えば液体窒素の如き低温液体でジュワーを満たすことができる。
ネック60の位置決め及び方位のため、低温移送ホルダが全±180゜の傾斜にわたって回転する場合さえ、低温液体の溢れは生じない。むしろ、低温液体は自由に流れ、容器の下半部分内に維持される。更に、低温液体はジュワーの内壁54を冷却し、この冷却は熱導電性材料58に沿って試験片へ導かれる。内壁54は真空空間70により外壁56から隔離される。
試験片グリッド16を伸縮させるように引き棒46を手動で作動させることができ、または、第６図に略示するように、電磁式に引き棒を作動させることができる。ソレノイド64が電流源（図示せず）により付勢されたとき、引き棒46の一端に取り付けられた円筒状電磁石66が、磁石の極性及びソレノイドコイルを通って流れる電流の方向に応じて、低温シールドに対して試験片グリッド16を出し入れ移動させる。
本発明の低温移送ホルダは低温超ミクロトーム内に準備され又は液体懸濁液の迅速冷凍によって準備された試験片を研究するために使用できる。これら両方の準備技術においては、試験片は試験片ホルダ上に置かれ、低温温度で試験片を取り巻くように形成された無定形の氷によりそこに保持される。次いで、装着された試験片は、カリフォルニア州プリーザントン（Pleasanton）のガータン社（Gatan Inc.）から商業的に入手できる型式の液体窒素を満たしたカプセル内の試験片グリッド装填ステーションへ低温温度で移送することができる。
次いで、試験片20を上に装着したグリッド16はカプセルから取り外され、低温移送ホルダのチップ14と整合した水平の支持プラットフォーム上に置かれる。この位置で、グリッド16を試験片チップホルダ14の溝穴40内へ滑入でき、クランプ機構32によりタブ24を溝穴内に固定できる。この装填及びクランプ動作は低温温度で実行することもできる。
試験片グリッドの装填及び固定の後、引き棒46を一時的に作動させ、グリッドを溝穴40内及び試験片チップにより形成された低温シールド内へ引き戻す。試験片がこの引き戻し位置にあるとき、次いで、試験片グリッド装填ステーションから本発明の低温移送ホルダを引き出し、電子顕微鏡内へ迅速に移送することができる。ホルダが顕微鏡内で真空下にある場合、ソレノイド64が再度一時的に作動され、グリッド16をその前方の視界位置へ伸長させる。
ある代表的な実施の形態及び詳細を本発明の例示の目的で示したが、当業者にとっては、請求の範囲に規定された本発明の要旨を逸脱することなく、ここに開示した方法及び装置における種々の変更が可能であることは明らかである。例えば、ソレノイド作動移送機構を手動の機構に代えることができる。更に、移送ホルダは大気状態の下で使用するようにすることができ、試験片は電気的にチャージされたプラスチップグリッドを使用してグリッドに固定することができる。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図６】
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【図８】
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