(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス（Bacillus）種ZI315から得られうるプロテアーゼであって、以下の：
（ａ）SDS−PAGEにより測定するとき、38kDの見掛け分子量、
（ｂ）9.3以上の等電点、
（ｃ）25℃で、かつ、基質としてカゼインを用いて計測するとき、pH9〜pH11の範囲内の最適pH、及び
（ｄ）pH9.5で、かつ、基質としてカゼインを用いて計測するとき、40℃における最適温度、
を有し、並びに
（ｅ）バシラス種ZI315,DSM9702から得られた前記プロテアーゼと同一の免疫化学的性質、
を有することを特徴とする前記プロテアーゼ。
【請求項２】
バシラス種ZI315，DSM9702株から得られた、請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
以下のステップ：
（ａ）炭素及び窒素源並びに無機塩を含有する、好適な栄養培地中で、バシラス種ZI315のプロテアーゼ産生株を培養し、及び
（ｂ）上記プロテアーゼを回収する
を含む、請求項１に記載のプロテアーゼの製造方法。
【請求項４】
前記株が、バシラス種ZI315,DSM9702である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載のプロテアーゼ、及び界面活性剤を含む洗剤組成物。
【請求項６】
アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼから成る群から選ばれる１種または２種以上の他の酵素をさらに含む、請求項５に記載の洗剤組成物。
【請求項７】
布帛に請求項５に記載の洗剤組成物を添加することを含む、布帛の洗浄方法。
【請求項８】
非発塵性粒状物、液体、スラリー又は保護された酵素の形態にある、請求項１に記載のプロテアーゼを含む洗剤添加剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、バシラス（Bacillus）種の株から得ることができる洗剤プロテアーゼに関する。さらに詳しくは、バシラス（Bacillus）種の株から誘導された新規なアルカリ性プロテアーゼに関する。さらに、本発明は、プロテアーゼの製造方法、洗剤酵素としてプロテアーゼの使用、および本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物に関する。
発明の背景
洗剤酵素は20年以上の間市販されてきており、現在全世界にわたって粉末および液体の双方の洗剤の通常の洗剤成分としてよく確立されている。
洗浄配合物において使用される酵素は、多数の異なる酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ならびに他の酵素、またはそれらの混合物を含んでなる。商業的には、最も重要な酵素はプロテアーゼである。
洗剤プロテアーゼは、天然に見出されるプロテアーゼを単離し、次いで洗剤配合物を試験することによって、開発されてきている。大部分の洗剤プロテアーゼはバシラス（Bacillus）属の構成員から得られる。
商用プロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ALCALASETM）、エスペラーゼ（ESPERASETM）およびサビナーゼ（SAVINAZETM）であり、
それらのすべてはノボ・ノルディスク社（Novo  Nordisk  Ａ−Ｓ、デンマーク国）により供給される。アルカラーゼ（ALCALASETM）プロテアーゼは、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus  licheniformis）種の株により産生される。エスペラーゼ（ESPERASETM）およびサビナーゼ（SAVINAZETM）プロテアーゼは、好アルカリ性バシラス（Bacillus）の株の培養により得られる。
洗浄の伝統、特に使用する洗浄温度、使用する水の硬度、および洗剤の成分は国毎に非常に変化する。典型的な条件を下記において概説する。
−  低いpHおよび低い水硬度：米国およびアジアにおける液状洗剤；
−  低いpHおよび高い水硬度：ヨーロッパにおける液状洗剤；
−  高いpHおよび低い水硬度：米国およびアジアにおける粉末状洗剤；および
−  高いpHおよび高い水高度：ヨーロッパにおける粉末状洗剤。
（洗剤における低いpHは典型的には8.0〜9.5の範囲、特に約９のpHである；洗剤における高いpHは典型的には10〜11.5の範囲、特に約10.5のpHである；低い水硬度は典型的には３〜６゜dHの範囲である；高い水硬度は典型的には15〜20゜dHの範囲、特に約18゜dHである）。
さらに、洗剤の組成は洗浄プロセスを環境に優しいものとするために数年来変化している。洗剤産業内のすべてのこれらの差および変化は、この分野を極めて複雑とする。したがって、ある特定された条件の組において最適に性能を発揮する、新規なプロテアーゼを見出すことが常に要求されている。
発明の要約
本発明の目的は、中程度ないし低い洗浄温度において改良された洗浄性能を有する、新規な洗剤プロテアーゼを提供することである。
したがって、本発明は、その第１の面において、
−  バシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702株から誘導されたプロテアーゼの免疫化学的性質と同一であるか、または部分的に同一である免疫化学的性質を有する、
ことによって特徴づけられるプロテアーゼを提供する。
第２の面において、本発明は、バシラス（Bacillus）種ZI315株により代表される、バシラス（Bacillus）種の株の単離された生物学的に純粋な培養物に関する。より特定の面において、本発明は、バシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702株、またはその突然変異株または変異型に関する。
第３の面において、本発明は、炭素および窒素源および無機塩を含有する、適当な栄養培地中で、バシラス（Bacillus）種ZI315のプロテアーゼ産生株を培養し、次いで所望の酵素を回収することを含む、プロテアーゼを製造する方法を提供する。より特定の面において、バシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702株、またはその突然変異株または変異型、またはバシラス（Bacillus）種ZI315株から誘導されたプロテアーゼの免疫化学的性質と同一であるか、または部分的に同一である免疫化学的性質を有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物を培養する。
それ以上の面において、洗剤酵素としての酵素の使用が特許請求される。より特定の面において、本発明は、プロテアーゼを含んでなる洗剤組成物および洗剤添加剤を提供する。
第４において、本発明は、プロテアーゼの添加を含む洗浄法を提供する。
【図面の簡単な説明】
添付図面を参照することによって、本発明をさらに説明する。
第１図は、温度と本発明による酵素のタンパク質分解活性との間の関係を示す（実施例１に従い得られた酵素調製物、pH9.5において、基質として１％のカゼインを使用する）。
第２図は、pHと本発明による酵素のタンパク質分解活性との間の関係を示す（実施例１に従い得られた酵素調製物、25℃において、基質として１％のカゼインを使用する）。
発明の詳細な開示
微生物
本発明の新規な微生物は、本発明の新規な酵素を産生することができ、土の試料から単離された菌株により代表される。バシラス（Bacillus）種ZI315は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認ついてのブダベスト条約の規定に従い、1995年１月30日にドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ゼルクルツレン（Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen）GmbHに受け入れ番号DSM9702で受託された。
本発明の微生物は、バシラス（Bacillus）属に属する、好気性、好アルカリ性、胞子形成細菌である。形態学的には、それは直径0.6〜0.9ミクロン、長さ1.5〜３ミクロンの、グラム陽性、運動性桿菌として記載することができる。胞子（稀に発生する）は、中央から終わりにかけて、楕円形であり、胞子嚢を膨潤させる。
増殖に最適な温度は30〜40℃の範囲内であり、50℃において増殖せず、そして増殖に最適なpHは９〜10の範囲内であり、pH10.0においてすぐれた増殖を示し、pH7.0において増殖せず、これによりこの菌株は厳密に好アルカリ性である。
この微生物は、アルカリ性栄養寒天斜面上で、黄色ないしオレンジ色のコロニーを形成し、丸く、平滑であり、そして寒天の中への顔料の拡散は観察されない。
バシラス（Bacillus）種ZI315は、バシラス（Bacillus）属のグループ１の範囲内の新しい種として同定された。完全な16S  rDNA配列の分析は、バシラス（Bacillus）種ZI315がバシラス・フィルムス（Bacillus  firums）、バシラス・セレウス（Bacillus  cereus）、およびバシラス・ベンゾエボランス（Bacillus  benzoevorans）に密接に関係することを示した；それはグループ１の他の好アルカリ性種、例えば、バシラス・コーニイ（Bacillus  cohnii）およびバシラス・ハルマパルス（Bacillus  halmpalus）から分岐する。ZI315はその最も近い系統発生的関係株から分岐しかつそれに対して有意差を示しそして、これらの理由で、バシラス（Bacillus）属のグループ１内の新しい種であると考えられる。
微生物の培養
本発明の微生物は、好気性条件下に、同化可能な炭素および窒素ならびに他の必須栄養を含有する栄養培地中で培養することができ、この培地は既知の技術の原理に従い構成される。
適当な炭素源は、炭水化物、例えば、スクロース、グルコースおよび澱粉、または穀類、麦芽、イネおよびモロコシのような物質を含有する炭水化物である。培地の中に混入されル炭水化物の濃度は、広く変化することができ、例えば、25％まで高くそして１〜５％まで低くすることができるが、通常８〜10％は適当であろう。百分率はグルコースの当量として計算される。
栄養培地中の窒素源は、無機および／または有機の性質であることができる。適当な無機窒素源は硝酸塩およびアンモニウム塩である。有機窒素源の間で、細菌の培養を包含する発酵プロセスにおいて多数のものが適当に使用される。例示的な例は、大豆粉末、綿種粉末、落花生粉末、カゼイン、トウモロコシ、トウモロコシ浸漬液、酵母エキス、尿素、およびアルブミンである。さらに、栄養培地は、また、通常の微量物質を含有すべきである。
本発明の新規なバシラス（Bacillus）種はわずかに好アルカリ性である。したがって、増殖培地の滅菌後、培養は好ましくはアルカリ性pH値（これは適当な緩衝剤、例えば、炭酸ナトリウムの添加により得ることができる）、pH9.0〜pH10.5において実施される。培養槽中の培養のために、人工的エアレーションを使用することが必要である。エアレーション速度は慣用のタンク培養において使用されるものに類似する。
培養後、ブロスから粗大物質を除去するか、または必要に応じて、ブロスを、例えば、低温における蒸発または逆浸透により、濃縮することによって、液状酵素濃縮物を生産することができる。最後に、保存剤を濃縮物に添加することができる。
精製されたおよび／または濃縮されたブロスから、塩、例えば、Na2SO4または水混和性溶媒、例えば、エタノールまたはアセトンを使用する沈降により、固体の酵素調製物を調製することができる。適当な乾燥法、例えば、噴霧乾燥により、ブロス中の水を除去することもできる。
タンパク質分解活性についてのアッセイ
タンパク質分解活性は、抗体としてカゼインを使用して決定される。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準的条件、すなわち、25℃およびpH9.5における30分間インキュベーション下に、1mMの第一アミノ基（セリン標準との比較により決定される）／分を遊離させる酵素の量として定義される。分析法を記載するフォルダーAF228は、ノボ・ノルディスク社（Novo  Nordisk  A/S、デンマーク国）に要求されると、入手可能であり、このフォルダーは引用することによって本明細書の一部とされる。
酵  素
本発明の酵素は、新規な洗剤プロテアーゼである。それは、炭素および窒素源および無機塩を含有する適当な栄養培地中で、本発明の微生物、好ましくはバシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702、またはその突然変異株または変異型を培養することによって得ることができる。酵素は、また、組換えDNA技術により得ることができる。
本発明のプロテアーゼは、下に記載する物理化学的性質により特徴づけられる。
物理化学的性質
SDS−PAGEにより決定された、38kDの分子量。9.3以上におけるpIは、LKBアンホリン（Ampholine▲Ｒ▼）PAGプレート上の等電点電気泳動により測定することができる。プロテアーゼ活性は、PMSF、α−抗トリプシン、およびシチメンチョウ卵白プロテイナーゼインヒビターにより阻害される。EDTAおよび大豆タンパク質インヒビターは、プロテアーゼ活性に影響を与えない。
温度活性関係は、基質として１％のカゼインを使用してpH9.5において決定された。インキュベーション温度を10℃から70℃に間隔で変化させる変更を加えて、以前に記載されたタンパク質分解活性についてのアッセイを使用した。
結果は第１図に示されている。この図面から、酵素は10℃以下の温度から、約50℃までにおいてタンパク質分解活性を有し、そして約40℃における最適温度を有することが明らかである。
pHに対する活性の依存性は、６〜11のpH範囲において前以て決定されたpH値に調節されたブリッテン−ロビンソン（Brittten−Robinson）緩衝液を使用して、同一方法により決定された。
結果は第２図に示されている。この図面から、酵素は６以下から11以上のpH値においてタンパク質分解活性を有し、最適pHはpH9〜pH11の範囲であることが明らかである。
本発明のプロテアーゼは、低い水硬度および中程度ないし低い洗浄温度を使用する洗剤において、特別の可能性を有する。
免疫化学的性質
本発明のプロテアーゼは、バシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702株から誘導されたプロテアーゼの免疫化学的性質と同一であるか、または部分的に同一である免疫化学的性質を有する。
種々のバシラス（Bacillus）のプロテアーゼについての免疫化学的性質は、事実非常にきわ立った特徴である。これに対して最適pH、最適温度、pIなどは、前述したように、多少同一であり、異なる免疫化学的性質は種々の洗剤において非常に異なる安定性を生ずる。
免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学的に決定することができる。同一性試験は、よく知られたオクタローニー二重免疫拡散法によるか、または下記の文献に従う縦列交差免疫電気泳動法により実施することができる:N.H.Axelsen;Handbook  of  Immunoprecipitation−in−Gel  Techniques;Blackwell  Scientific  Publications（1983）、chapter5および14。用語「抗原同一性」および「部分的抗原同一性」は、同一の本、chapter5、19および20に記載されている。
前述の方法に従い、ウサギを本発明の精製されたプロテアーゼで免疫化することによって、単一特異的抗血清を発生させた。免疫原をフロインドアジュバントと混合し、第２週毎にウサギに皮下注射した。８週の合計免疫化期間後に抗血清を収穫し、それから免疫グロブリンをN.H.Axelsen、前掲、に記載されているように調製した。
前述のオクタローニー二重免疫拡散試験を使用して、本発明のプロテアーゼは既知のセリンプロテアーゼに対して交差反応を示さなかった：
−  アルカラーゼ（ALCALASETM）（ノボ・ノリディスク社から入手可能）、
−  サビナーゼ（SAVINASETM）（ノボ・ノリディスク社から入手可能）、
−  エスペラーゼ（ESPERASETM）（ノボ・ノリディスク社から入手可能）、
−  スブチリシンNovo（ノボ・ノリディスク社から入手可能）、
−  カズサーゼ（KAZUSASETM）（昭和電工から入手可能）、
−  WO92/07067号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO92/17576号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO92/17577号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO92/17578号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO93/18140号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO93/24623号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、
−  WO93/01532号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ、及び
−  WO93/07350号に記載されているバシラス（Bacillus）プロテアーゼ。
種々のバシラス（Bacillus）プロテアーゼは、大きい多様性を有する種々の洗剤に対して許容性であり、そしてバシラス（Bacillus）プロテアーゼを弁別する今日最良のツールは免疫化学的同一性ツールである。
洗剤組成物
本発明によれば、プロテアーゼは典型的には洗剤組成物、例えば、皿洗浄または洗濯洗剤組成物の１成分であることができる。それ自体、プロテアーゼは非ダスチング粒子、安定化された液体、または保護された酵素の形態で洗剤組成物の中に含めることができる。非ダスチング粒子は、例えば、米国特許第4,106,991号および米国特許第4,661,452号（双方共、ノボ・インダストリ社）に開示されているように製造することができ、必要に応じてこの分野において知られている方法によりコーティングすることができる。ワックス状コーティング材料は、下記の通りである:1000〜20000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）;16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；エトキシル化肪族アルコール（このアルコールは12〜20個の炭素原子を含有し、そして15〜80エチレンオキシド単位が存在する）；肪族アルコール；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリド。流動床技術による適用に適するフィルム形成コーティング材料の例は、親の英国特許第1,483,591号に記載されている。液状酵素調製物は、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を確立された方法に従い添加することによって安定化できる。他の酵素安定化剤はこの分野においてよく知られている。保護された酵素は、欧州特許（EP）第238,216号に開示されている方法に従い製造することができる。
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、粉末、粒子、ペーストまたは液体の形態であることができる。液状洗剤は水性であり、典型的には70％までの水および０〜30％の有機溶媒を含有するか、または非水性であることができる。
洗剤組成物は１種または２種以上の界面活性剤を含んでなり、それらの各々はアニオン、非イオン、カチオン、または双性イオンの界面活性剤であることができる。洗剤は、通常、０〜50％のアニオン界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼルスルホネート（LAS）、アルファ−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルサルフェート（肪族アルコールサルフェート）（AS）、アルコールエトキシサルフェート（AEOSまたはAES）、第二アルカンスルホネート（SAS）、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−またはアルケニルコハク酸、またはセッケンを含有するであろう。洗剤は、また、０〜40％の非イオン界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（AEOまたはAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグルコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、WO92/06154号に記載されているもの）を含有するであろう。
洗剤組成物は、さらに、１種または２種以上の他の酵素、例えば、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼ、例えば、ラッカーゼを含んでなることができる。
洗剤は、１〜65％の洗浄ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロトリ酢酸（NTA）、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTMPA）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩（例えば、ヘキスト社からのSKS−６）を含有することができる。洗剤は、また、アルビルトである、すなわち、洗浄ビルダーを本質的に含有しないことができる。
洗剤は１種または２種以上のポリマーを含んでなることができる。ポリマーの例は下記の通りである：カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマー。
洗剤は漂白系を含有することができ、この漂白系はH2O2源、例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩を含んでなることができ、これらは過酸形成漂白活性化剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）またはノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）と組み合わせることができる。また、漂白系は、例えば、アミド、イミド、またはスルホン型の過酸を含むことができる。
本発明の洗剤組成物の酵素は、慣用の安定剤、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ボレートエステルを使用して安定化することができ、そして組成物は、例えば、WO92/19709号およびWO92/19708号明細書に記載されているように配合することができる。
洗剤は、また、他の慣用の成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば、粘土、泡増強剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含有することができる。
pH（使用条件下に水溶液中で測定する）は、通常中性またはアルカリ性、例えば、７〜11の範囲内であろう。
本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は、下記のものを包含する：
１）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ７〜12％
アルコールエトキシサルフェート（例えば、C12-18アルコール、１〜2EO）またはアルキルサルフェート（例えば、C16-18）                              １〜４％
アルコールエトキシレート（例えば、C14-15アルコール、7EO）                                 ５〜９％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            14〜20％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       ２〜６％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              12〜22％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ０〜６％
クエン酸ナトリウム／クエン酸（C6H5Na3O7/C6H8O7として）                                      ０〜15％
過ホウ酸ナトリウム（NaBO3・H2Oとして）    11〜18％
TAED                                      ２〜６％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP、PEG）                            ０〜３％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光漂白剤）                                    ０〜５％
２）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ６〜11％
アルコールエトキシサルフェート（例えば、C12-18アルコール、１〜2EOまたはアルキルサルフェート（例えば、C16-18）                              １〜３％
アルコールエトキシレート（例えば、C14-15アルコール、7EO）                                 ５〜９％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            15〜21％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       １〜４％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              24〜34％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ４〜10％
クエン酸ナトリウム／クエン酸（C6H5Na3O7/C6H8O7として）                                      ０〜15％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP、PEG）                            １〜６％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）        ０〜５％
３）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ５〜９％
アルコールエトキシサルフェート（例えば、C12-15アルコール、7EO）                             ７〜14％
脂肪酸として、セッケン（例えば、C16-22脂肪酸）１〜３％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            10〜17％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       ３〜９％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              23〜33％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ０〜４％
過ホウ酸ナトリウム（NaBO3・H2Oとして）    ８〜16％
TAED                                      ２〜８％
ホスホン酸塩（例えば、EDTMPA）            ０〜１％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP、PEG）                            ０〜３％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０〜５％
４）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ８〜12％
アルコールエトキシレート（例えば、C12-15アルコール、7EO）                                 10〜25％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            14〜22％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       １〜５％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              25〜35％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ０〜10％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP、PEG）                            １〜３％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）        ０〜５％
５）下記の成分を含んでなる水性液状洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      15〜21％
アルコールエトキシレート（例えば、C12-15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO）      12〜18％
脂肪酸としてセッケン（例えば、オレイン酸）３〜13％
アルケニルコハク酸（C12-14）              ０〜13％
アミノエタノール                          ８〜18％
クエン酸                                  ２〜８％
ホスホン酸塩                              ０〜３％
ポリマー（例えば、、PVP、PEG）            ０〜３％
ホウ酸塩（例えば、B4O7として）            ０〜２％
エタノール                                ０〜３％
プロピレングリコール                      ８〜14％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）                                      ０〜５％
６）下記の成分を含んでなる水性構造化液状洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      15〜21％
アルコールエトキシレート（例えば、C12-15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO）      ３〜９％
脂肪酸としてセッケン（例えば、オレイン酸）３〜10％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              14〜22％
クエン酸カリウム                          ９〜18％
ホウ酸塩（例えば、B4O7として）            ０〜２％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、、PVP、PEG）            ０〜３％
定着ポリマー、例えば、ラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比25:1;分子量3800 ０〜３％
グリセロール                              ０〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）                                      ０〜５％
７）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
肪族アルコールサルフェート                ５〜10％
エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド    ３〜９％
脂肪酸としてセッケン                      ０〜３％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            ５〜10％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       １〜４％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              20〜40％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ２〜８％
過ホウ酸ナトリウム（NaBO3・H2Oとして）    12〜18％
TAED                                      ２〜７％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）                                 １〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、蛍光増白剤、泡抑制剤、香料）０〜５％
８）下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ８〜14％
エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド    ５〜11％
脂肪酸としてセッケン                      ０〜３％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            ４〜10％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       １〜４％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              30〜50％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ３〜11％
クエン酸ナトリウム（C6H5Na3O7として）     ５〜12％
ポリマー（例えば、PVP、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）                             １〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、泡抑制剤、香料）        ０〜５％
９）下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      ６〜12％
非イオン界面活性剤                        １〜４％
脂肪酸としてセッケン                      ２〜６％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            14〜22％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              18〜32％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ５〜20％
クエン酸ナトリウム（C6H5Na3O7として）     ３〜８％
過ホウ酸ナトリウム（NaBO3・H2Oとして）    ４〜９％
漂白活性化剤（例えば、NOBSまたはTAED）    １〜５％
カルボキシメチルセルロース                ０〜２％
ポリマー（例えば、ポリカルボキレートまたはPEG） １〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、蛍光増白剤、香料）      ０〜５％
10）下記の成分を含んでなる水性液状洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      15〜23％
アルコールエトキシサルフェート（例えば、C12-15アルコール、２〜3EO）                         ８〜15％
アルコールエトキシレート（例えば、C12-15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO）      ３〜９％
脂肪酸としてセッケン（例えば、オレイン酸）０〜３％
アミノエタノール                          １〜５％
クエン酸ナトリウム                        ５〜10％
ハイドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）                                    ２〜６％
ホウ酸塩（例えば、B4O7として）            ０〜２％
カルボキシメチルセルロース                ０〜１％
エタノール                                １〜３％
プロピレングリコール                      ２〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、ポリマー、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）                          ０〜５％
11）下記の成分を含んでなる水性液状洗剤組成物：
線状アルキルベンゼンスルホネート（酸として計算する）                                      20〜32％
アルコールエトキシレート（例えば、C12-15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO）      ６〜12％
アミノエタノール                          ２〜６％
クエン酸                                  ８〜14％
ホウ酸塩（例えば、B4O7として）            １〜３％
ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、定着ポリマー、例えば、ラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマー）                  ０〜３％
グリセロール                              ３〜８％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、ハイドロトロープ、分散剤、泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）                    ０〜５％
12）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
アニオン界面活性剤（線状アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート、α−オレフィンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホネート、セッケン）                        25〜40％
非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）                                      １〜10％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            ８〜25％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       ５〜15％
硫酸ナトリウム（Na2SO4として）            ０〜５％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              15〜28％
過ホウ酸ナトリウム（NaBO3・4H2Oとして）   ０〜20％
漂白活性化剤（TAEDまたはNOBS）            ０〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、蛍光増白剤、泡抑制剤、香料）０〜５％
13）線状アルキルベンゼンスルホネートのすべてまたは一部分が（C12−C18）アルキルサルフェートで置換された、１）〜12）に記載するような洗剤配合物。
14）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
（C12−C18）アルコールサルフェート        ９〜15％
アルコールエトキシレート                  ３〜６％
ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド        １〜５％
ゼオライト（NaAlSiO4として）              10〜20％
層状ジケイ酸塩（例えば、ヘキスト社からのSK56）10〜20％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            ３〜12％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       ０〜６％
クエン酸ナトリウム                        ４〜８％
過ホウ酸ナトリウム                        13〜22％
TAED                                      ３〜８％
ポリマー（例えば、ポリカルボキレートおよびPVP） ０〜５％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、蛍光増白剤、光漂白剤、香料、泡抑制剤）                                    ０〜５％
15）少なくとも600g/lの嵩密度を有し、下記の成分を含んでなる粒子として配合された洗剤組成物：
（C12−C18）アルコールサルフェート        ４〜８％
アルコールエトキシレート                  11〜15％
セッケン                                  １〜４％
ゼオライトMAPまたはゼオライトＡ           35〜45％
炭酸ナトリウム（Na2CO3として）            ２〜８％
可溶性ケイ酸塩（Na2O・2SiO2として）       ０〜４％
過ホウ酸ナトリウム                        13〜22％
TAED                                      １〜８％
カルボキシメチルセルロース                ０〜３％
ポリマー（例えば、ポリカルボキレートおよびPVP） ０〜３％
酵素（純粋な酵素タンパク質として計算する）0.0001〜0.1％
少量成分（例えば、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料）０〜３％
16）追加の成分として、または既に特定した漂白系の代替物として、安定化された、またはカプセル封入された過酸を含有する、１）〜15）に記載する洗剤配合物。
17）過ホウ酸塩が過炭酸塩で置換された、１）、３）、７）、９）および12）に記載する洗剤組成物。
18）マンガン触媒をさらに含有する、１）、３）、７）、９）、12）、14）および15）に記載する洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば、″Efficient  manganses  catalysts  low−temperature  bleaching″、Nature  369、1994、pp.637−639、に記載されている化合物の１つであることができる。
19）液状非イオン界面活性剤、例えば、線状アルコキシル化第一アルコール、ビルダー系（例えば、リン酸塩）、酵素およびアルカリを含んでなる非水性洗剤液として配合された洗剤組成物。洗剤は、また、アニオン界面活性剤および／または漂白系を含むことができる。
本発明のプロテアーゼは、普通に使用されている濃度で洗剤中に混入することができる。現在、本発明の組成物において、プロテアーゼは洗浄液の１リットル当たり0.00001〜1mg（純粋な酵素タンパク質として計算する）のプロテアーゼに相当する量で添加することができることが考えられる。
下記の実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、いかなる方法においても特許請求する本発明を限定しない。
実施例１
30℃において回転震盪テーブル（300rpm）上で、下記の組成（１リットル当たり）の培地の100mlを含有する、500mlのそらせ板付きエルレンマイヤーフラスコ中で、バシラス（Bacillus）種ZI315、DSM9702を培養した：
ジャガイモ澱粉                              100g
オオムギ粉砕物                               50g
大豆粉末                                     20g
Na2HPO4×H2O                                  9g
プルロニック（Pluronic▲Ｒ▼）              0.1g
炭酸ナトリウム                               10g
培地中の澱粉はα−アミラーゼであり、そして培地を120℃において45分間加熱することによって安定化する。
安定化後、10mlのセスキ炭酸ナトリウムの1M溶液の添加により、培地のpHを9.7に調節する。
培養（３日）および固体物質の分離後、プロテアーゼを慣用法により精製した。
1.5リットルの培養ブロスからの収量は、70CPU/lを有する50mlであった。
この実施例に従い調製された調製物の特性は、この明細書中で最初に言及されので、それを参照のこと。
実施例２
バシラス（Bacillus）種ZI315プロテアーゼの洗濯性能（20℃における）
洗濯性能の試験は、草の汁で汚れた綿について、モデル洗濯系において20℃で、一定温度で20分間達成された。
試験は1.6、3.2、８、16、32、64および160nMのプロテアーゼ濃度において実施された。
2.0g/lのアメリカ型粉末状洗剤組成物を試験において使用した。本発明のプロテアーゼの添加前に、洗剤は酵素を含有しない。洗剤をほぼ６゜dH（ドイツ硬度）の水中に溶解した。洗濯液体のpHは10であった。繊維材料／洗濯液の比は、ほぼ5gの繊維材料／リットルの洗濯液であった。各酵素濃度について、２つの独立の試験を実施した。
布帛洗濯に引き続いて、布を流れる水道水中で20分間フラッシュし、次いで空気乾燥した。データカラー・エルレフォメーター（Datacolor  Elrephometer）2000で測定した460nmにおける規約反射率（remission）（％Ｒ）の変化（△Ｒ）により、本発明のプロテアーゼおよびサビナーゼ（SavinaseTM）の性能を評価した。△Ｒはプロテアーゼを添加した洗濯後の規約反射率−プロテアーゼを添加しないで洗濯後の規約反射率である。
これらの試験の結果を、下記表１に示す（２回の試験の平均）。
0003585928.tif 000002
表１から理解できるように、△Ｒ（バシラス（Bacillus）種ZI315）は、すべての測定したプロテアーゼ濃度において、△Ｒ（サビナーゼTM）より高い、すなわち、本発明のプロテアーゼは20℃ですべての測定したプロテアーゼ濃度においてよりすぐれた洗濯性能を有する。
実施例３
バシラス（Bacillus）種ZI315プロテアーゼの洗濯性能（25℃における）
洗濯性能の試験は、草の汁で汚れた綿について、モデル洗濯系において25℃で、一定温度で20分間達成された。
試験は１、２、7.5、および20nMのプロテアーゼ濃度において実施された。
試験において、下記の組成を有する洗剤の2.0g/lを使用した：
線状アルキルベンゼンスルホネート          0.3  g/l
アルコールエトキシレート                  0.04 g/l
セッケン                                  0.1  g/l
Na2SO4                                    0.3  g/l
Na2CO3                                    0.4  g/l
ゼオリス（Zeolith）                       0.6  g/l
Na3−クエン酸塩                           0.08 g/l
カルボキシメチルセルロース                0.006g/l
ポリカルボキレート                        0.083g/l
洗剤をほぼ６゜dH（ドイツ硬度）の水中に溶解した。洗濯液体のpHを10に調節した。繊維材料／洗濯液の比は、ほぼ5gの繊維材料／リットルの洗濯液であった。各酵素濃度について、２つの独立の試験を実施した。
布帛洗濯に引き続いて、布を流れる水道水中で20分間フラッシュし、次いで空気乾燥した。データカラー・エルレフォメーター2000で測定した460nmにおける規約反射率（％Ｒ）の変化（△Ｒ）により、本発明のプロテアーゼおよびサビナーゼ（SavinaseTM）の性能を評価した。△Ｒはプロテアーゼを添加した洗濯後の規約反射率−プロテアーゼを添加しないで洗濯後の規約反射率である。
これらの試験の結果を、下記表２に示す（２回の試験の平均）。
0003585928.tif 000003
表２から理解できるように、△Ｒ（バシラス（Bacillus）種ZI315）は、すべての測定したプロテアーゼ濃度において、△Ｒ（サビナーゼ）より高い、すなわち、本発明のプロテアーゼは25℃ですべての測定したプロテアーゼ濃度においてよりすぐれた洗濯性能を有する。
実施例４
改良因子／モデルの洗剤
サビナーゼを参照としてpH9においてモデルの洗剤を使用して、低いおよび高い水硬度において、本発明のプロテアーゼについての改良因子（下記において定義する）を確立した。
改良因子は、下記の方法において決定した：
エルレフォ（Elrepho）2000フォトメーター（UVを含まない）を使用して460nmにおいて、被験材料（綿上の草）についての規約反射（Ｒ）の測定を行った。測定値を下記式に適合させた：
Ｒ＝（ａ・△Rmax・ｃ）／（△Rmax＋ａ・ｃ）＋ｂ
次いで、この曲線を初期勾配を利用して、改良因子（IF）を計算する：
IF＝a/aref
式中、
Ｒは規約反射単位の酵素の洗濯作用であり、
ａは適合させた曲線の初期勾配であり、
arefは参照酵素の初期勾配であり、
ｂは適合させた曲線とｙ軸との交点であり、
ｃは規約反射単位の酵素の理論的最大洗濯作用であり、そして△Rmaxは規約反射単位の酵素の理論的最大洗濯作用である。
下記の実験条件を使用した：
洗剤:35％のSTP（Na5P3O10）
25％のNa2SO4
10％のNa2CO3
20％のLAS（Nansa  80S）
5％のNI（Dobanol  25−７）
5％のNa2Si2O5
0.5％のCMC（カルボキシメチルセルロース）
9.5％の水
洗剤の投与量:3g/l
pH:9.0
洗濯時間:15分
洗濯温度:15℃
水硬度:6゜dHおよび18゜dH
酵素濃度:0、３、６、９、15、30および60nM
スワッチ／体積:5スワッチ（直径:2.5cm）/50mlの洗濯液
被験材料：綿上の草
下記の結果が得られた：
水硬度が６゜dHであったとき、IF＝4.8、そして
水硬度が18゜dHであったとき、IF＝1.4。
この実施例が示すように、本発明のプロテアーゼは米国およびアジア（ここで水硬度は低く、約６゜dHまたはそれより低い）において使用される液状洗剤（低いpH）において非常に有用であろう。
実施例５
改良因子／商用洗剤
実施例４において説明したようにして得られた改良因子を、また、再びサビナーゼを参照酵素として、コソ・トップ（Koso  Top）およびオモ・パウダー・チャイナ（Omo  Powder  China）について確立した。
下記の実験条件を使用した：
洗剤の投与量:1g/l
pH:10.5（コソ・トップ）および
10.2（オモ・パウダー・チャイナ）
洗濯時間:15分
洗濯温度:15℃
水硬度:3゜dH
酵素濃度:3、６、９、15、30および60nM
スワッチ／体積:5スワッチ（直径:2.5cm）/50mlの洗濯液
被験材料：綿上の草
下記の結果が得られた：
IF＝2.1（コソ・トップ）、そして
IF＝3.1（オモ・パウダー・チャイナ）
この実施例が示すように、本発明のプロテアーゼはアジア（ここで水硬度は低く、約３゜dHである）において使用される高いpHの液状洗剤において非常に有用であろう。
【図１】
0003585928.tif 000004
【図２】
0003585928.tif 000005