(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジクチオステリウム・ジスコイデウムから単離された至適ｐＨ約３．５を有する約２２５キロダルトンのジペプチジルアミノペプチダーゼ。
【請求項２】
ジクチオステリウム・ジスコイデウムの培養から請求項１に記載のジペプチジルアミノペプチダーゼを単離する方法であって、
ａ）培養液から細胞を含まない培地を得、
ｂ）該培地をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、
ｃ）工程ｂ）からの溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、そして
ｄ）工程ｃ）からの溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにかける
ことを含む方法。
【請求項３】
前駆体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを除去する方法であって、前駆体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを順次除去するジペプチジルアミノペプチダーゼの作用を可能にするに十分な条件下に前駆体ポリペプチドを請求項１に記載のジペプチジルアミノペプチダーゼと接触させることを含む方法。
【請求項４】
前駆体ポリペプチドが、ヒトプロインスリンの前駆体、ヒト成長ホルモンの前駆体、およびヒトプロインスリンのアナログの前駆体から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前駆体ポリペプチドが、ヒトプロインスリンのアナログ前駆体である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ヒトプロインスリンのアナログ前駆体が[ＬｙｓＢ２８，ＰｒｏＢ２９]−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−プロインスリンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒトプロインスリンのアナログ前駆体が[ＬｙｓＢ２８，ＰｒｏＢ２９]−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−プロインスリンである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳しくは、本発明は組換え法により製造される生物学的化合物のプロセシングにおいて有用な、粘菌ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Ｄictyostelium discoideum)から単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄictyostelium discoideumは一般に粘菌、より詳しくは細胞性粘菌と称される原始的な真核微生物である。この名称は、肉眼で見たときの微生物の２つの極限状態を由来としている。活発に成長しているときには、Ｄ.discoideumは単細胞アメーバとして成長する。この時期には、それらは細胞壁を持たず、ゆえにそれらの外観は薄いフィルム(または粘液)のようである。固体培地上での飢餓により、個々の細胞が集合してコロニーを形成する。このコロニーは多細胞生物の特徴を示し、スラグと称される形態で移動し、次いで分化してスラグの後方細胞が足を形成し、前方細胞が柄を形成し、そして中央部細胞が子実体を形成する。この生物は土および糞の表面に天然に見られる。野生型のアメーバはもっぱら細菌全体の摂食(食作用)により栄養分を得るが、この意味においてそれらは肉食性であると称されることもある。Ｄ.discoideumの純培養の突然変異体が単離されているが、この変異体は「食物」細菌の共培養なしで成長することができ、ゆえに可溶性培地で成長することができる。本発明はＤ.discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【０００３】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ(ＤＡＰ)は、末端から２番目のアミノ末端ペプチド結合を加水分解して、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からジペプチドを遊離させる酵素である。現在４クラスのジペプチジルアミノペプチダーゼ(ＤＡＰ−Ｉ、ＤＡＰ−II、ＤＡＰ−III、ＤＡＰ−IVと称される)が存在し、それらの物理的性質および様々なアミノ末端ペプチド配列の切断を触媒する速度に基づいて分類されている。ＤＡＰ Ｉは、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からの多種組合せのジペプチドの遊離を触媒する比較的非特異的なＤＡＰである。ＤＡＰ Ｉは、現れたジペプチドがＸ−Ｐro、Ａrg−ＸまたはＬys−Ｘ(Ｘは任意のアミノ酸)であるならば、ほとんどまたは全く活性を示さない。ＤＡＰ IIはＡrg−ＸまたはＬys−Ｘで始まるアミノ末端ジペプチド配列に対する選択性を示し、Ｘ−Ｐroには比較的低い選択性を示す。ＤＡＰ−IIは他のほとんどのジペプチド組合せに対して有意に一層低い切断速度を示す。ＤＡＰ IIIはＡrg−ＡrgおよびＬys−Ｌys型のアミノ末端ジペプチド配列への性向を有しているようである。ＤＡＰ IVはＸ−Ｐro型のジペプチド配列に対して最高の加水分解活性速度を示す。ＤＡＰ酵素、特にＤＡＰ−ＩおよびＤＡＰ−IVは、タンパク質のプロセシングにおいて有用であることが示されている。本発明は、偶数のアミノ酸Ｎ末端伸張を有する組換えタンパク質のプロセシングにおいて有用な、Ｄictyostelium discoideumから得た新規なＤＡＰに関する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞性粘菌Ｄictyostelium discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。この新規なＤＡＰ酵素であるdＤＡＰは、ＤＡＰ−ＩおよびＤＡＰ−IIIの両方にいくらか類似しているが、これらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質において大きく区別される活性を示す。さらに本発明は、このdＤＡＰ酵素を用いて、組換え法により製造された前駆体タンパク質またはペプチドのＮ末端からジペプチドを除去するための方法に関する。本発明のdＤＡＰ酵素は１個のジペプチドをポリペプチドのＮ末端から除去するために用いることができ、さらに１を越えるジペプチドを前駆体ポリペプチドのＮ末端から連続的に除去するために用いることができる。さらに、本発明はdＤＡＰ酵素をＤ.discoideumの培養物から単離および精製するための方法に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本明細書中に開示し特許請求の範囲に記載した本発明のために、次の用語および短縮形を以下の様に定義する。
dＤＡＰ：ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Ｄictyostelium discoideum)から単離されたジペプチジルアミノペプチダーゼであり、ＧＦpＮＡを基質として用いたときにpＨ約３.５の至適pＨを示し、分析用超遠心により測定したときに約２２５,０００ダルトンの天然分子量を有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したときに約６６,０００ダルトンのサブユニット分子量を有する。
ＧＦpＮＡ：Ｇly−Ｐhe ｐ−ニトロアニリド。
前駆体ポリペプチド：目的の所望のポリペプチドのアミノ末端から伸張された偶数のアミノ酸を含む、組換え法により製造されたポリペプチド。
プロセシングされたポリペプチド：目的の所望のポリペプチドを得るためにＮ末端のジペプチドまたは複数ジペプチドが除去されたポリペプチド。
ＲＲＢＮＡ：Ａrg−Ａrg−β−ナフチルアミド。
本明細書中で用いるすべてのアミノ酸の短縮形は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.８２２(ｂ)(２)(１９９０)に記載されている米国特許商標局により承認された短縮形である。
【０００６】
本発明は、細胞性粘菌Ｄictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼ dＤＡＰに関する。dＤＡＰ酵素はＤＡＰ−ＩおよびＤＡＰ−IIIの両方に通常関係している未ブロックのアミノ末端配列を切断する性向を示すが、dＤＡＰはこれらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質の両方において大きく区別される。dＤＡＰは、ＧＦpＮＡを基質として用いたときにpＨ約３.５の至適pＨを示し、約２２５,０００ダルトンの天然分子量、約６６,０００ダルトンのサブユニット分子量を有する。レクチン・アフィニティークロマトグラフィーにより、dＤＡＰ酵素は糖タンパク質らしいことが示されている。dＤＡＰ酵素は、ジペプチドを、合成基質であるＧly−Ｐheパラニトロアニリド(ＧＦpＮＡ)およびＡrg−Ａrg−β−ナフチルアミド(ＲＲＢＮＡ)から、さらに他の数多くの合成および組換えにより製造されたポリペプチドから除去する能力を有する。
【０００７】
既知のＤＡＰ−Ｉ酵素は多種多様の動物および動物組織から単離されている。新規な酵素dＤＡＰはＤictyostelium discoideumの培養ブロスから単離される。ＤＡＰ−Ｉ酵素は活性のためにハロゲン化物および還元剤を必要とする。システインのスルフヒドリルを修飾するヨード酢酸などの試薬はＤＡＰ−Ｉ酵素を不活性化する。ＤＡＰ−ＩはpＨ５〜６で最高活性を有する。対照的に、dＤＡＰ酵素は、基質としてＧly−Ｐhe−pＮＡまたはＧly−Ａrg−pＮＡを用いたときに約３.５の至適pＨを有し、pＨ３.５でペプチドおよびタンパク質に対して有意な活性を示す。dＤＡＰ酵素は６を越えるpＨで有意な活性を持たない。dＤＡＰ酵素は還元剤の添加を全く必要とせず、ヨード酢酸またはテトラチオネートなどのシステイン修飾剤の存在下で完全に活性である。ブロックされたＮ末端でペプチドを切断することができない点においてdＤＡＰはウシＤＡＰ−Ｉに似ているが、Ｎ末端に酸化型メチオニンを有する基質に対して活性である点においてウシＤＡＰ−Ｉに似ていない。ウシＤＡＰ−ＩはＮ末端に酸化型メチオニンを有する基質を切断することができない。さらに、ウシＤＡＰ−Ｉとは異なり、dＤＡＰ酵素はＡrg−Ａrg−β−ナフチルアミド基質を容易に切断することができる。このアミノ末端Ａrg−Ａrgジペプチジル含有基質を切断する能力は哺乳動物および微生物を供給源とするＤＡＰ−III酵素の活性により類似しているが、ＤＡＰ−III酵素はアルカリ性の範囲に至適pＨを有すると報告されており、一方、dＤＡＰは酸性の範囲において最も有効に機能する。ＳＤＳ ＰＡＧＥで評価したときのdＤＡＰのサブユニット分子量は約６６,０００ダルトンであり、一方、哺乳動物のＤＡＰ−Ｉのサブユニット分子量は約２２,０００ダルトンである。
【０００８】
本発明のdＤＡＰ酵素は、前駆体ポリペプチドをプロセシングされたポリペプチドに変換するのに最も有用である。例えば、ヒト成長ホルモンが所望のポリペプチドであるなら、単にヒト成長ホルモンの前駆体(１つの場合において、Ｍet−Ａsp−ヒト成長ホルモン)を発現させ、次いでこの前駆体をdＤＡＰ活性に供してジペプチドＭet−Ａspおよび所望のプロセシングされたポリペプチドであるヒト成長ホルモンを遊離させる。プロセシングされるペプチドは「天然の」野生型ポリペプチドである必要はなく、類似体または中間体を製造するのが好ましいことが多い。さらに、前駆体ポリペプチドのプロセシングの方法は本発明の一部である。dＤＡＰによりプロセシングし得る他の前駆体ポリペプチドには、Ｍet−Ａrg−hＧＨ、Ｍet−Ｔyr−プロインスリン、Ｍet−Ａrg−プロインスリン、Ｍet−Ａrg−プロインスリン類似体(Ｂ２８ Ｌys、Ｂ２９ Ｐro)、Ｍet−Ｔyr−プロインスリン類似体(Ｂ２８ Ｌys、Ｂ２９ Ｐro)、Ｍet−Ａrg−プロインスリン類似体(Ｂ１０ Ａsp、Ｂ２８〜３０を欠失)、Ｍet−Ｔyr−プロインスリン類似体(Ｂ１０ Ａsp、Ｂ２８〜３０を欠失)が含まれる。インスリン類似体(Ｂ２８ Ｌys、Ｂ２９ Ｐro)は欧州特許出願番号９０３０１２２４.３に開示されており、インスリン類似体(Ｂ１０ Ａsp、Ｂ２８〜３０を欠失)は欧州特許出願番号９２３０５６７８.２に開示されている。さらに、dＤＡＰは前駆体ポリペプチドのＮ末端から１組以上のジペプチドを連続的に除去するのに用いてよい。ウシＤＡＰ−ＩによるＭet−Ａrg−プロインスリンおよびＭet−Ａrg−プロインスリン類似体のプロセシングは、Ｂeckerら,米国特許出願番号５,１２６,２４９(１９９２年６月３０日発行)に開示されており、そのすべての教示は本明細書の一部を構成するものとする。
【０００９】
前駆体タンパク質からジペプチドを除去するためのdＤＡＰ酵素の使用は、dＤＡＰが約３.５の至適pＨを有する点で有利である(このpＨは、多くの前駆体ポリペプチドが溶解する酸性pＨ範囲で反応を行うことを可能にする)。さらに、中性またはそれ以上のpＨでのある種の前駆体ポリペプチドの変換により、基質の鎖間ジスルフィド二量体または多量体量の一層の増大が、生成物収量の損失と共に導かれることがある。ジスルフィド・スクランブリングとして知られるこの現象は、特にウシＤＡＰ−Ｉを用いるときに問題となるが、これはＤＡＰ−Ｉがβ−メルカプトエタノールまたはシステインなどの還元剤を反応混合物に添加することを必要とするからである。また、メチオニン残基の酸化は酸性pＨ範囲においては比較的低い割合で起こる。さらに、発酵法はより高い製品の一様性および酵素の再現性を可能にするので、動物供給源から得た酵素の市販品に依存するよりもＤ.discoideumの発酵培養物から得た酵素を用いる方が経済的に適切である。動物由来の酵素の回避により、高度に精製された大量の物質の一定した供給が可能になる。Ｄ.discoideum Ａx３(ＡＴＣＣ ２８３６８)の発酵に続いて遠心分離、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行い、前駆体ポリペプチドのプロセシング用に保存もしくは即時に用いることのできるdＤＡＰ酵素の高度に精製された溶液を得る。発酵ブロスからのdＤＡＰの単離および精製も本発明の一部である。
【００１０】
前駆体ポリペプチドのプロセシングされたポリペプチドへの変換は広範な温度、pＨ領域および時間で行うことができる。反応は通常、約２.５〜約５.５のpＨを達成してそれを維持するために適切に緩衝化された水性媒体中で行う。この媒体のpＨは約３.０〜約４.５の範囲が好ましく、約３.０〜約３.５が最も好ましい。至適pＨは基質により若干変化することがある。例えば、Ｇly−Ｐhe−pＮＡおよびＧly−Ａrg−pＮＡのプロセシング速度はpＨ約３.５で最も速く、一方、Ｍet−Ａsp−hＧＨのプロセシング速度はpＨ約３.０〜約３.５で速い。Ａrg−Ａrg−βＮＡのプロセシング速度はpＨ約４.５で最も速い。任意の特異的な反応の至適pＨが、与えられた前駆体ポリペプチドおよび酵素の安定性および溶解性などの因子により決定されるであろうことは当業者の理解するところであろう。いくつかの場合においては可溶化剤、例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニジンなどを用いてよい。
【００１１】
プロセシング反応は、ほんの数秒から数日までの範囲の任意の必要時間で行うことができる。約１分から約２４時間の間で反応を行うのが好ましく、約１時間から約８時間で行うのが最も好ましい。反応時間を調節して、任意の所望の前駆体ポリペプチドまたはプロセシングされるポリペプチドに必要とされるあらゆるパラメーターを容易に満足させ得ることは当業者の理解するところであろう。
【００１２】
またプロセシング反応の温度は、与えられた任意の基質に応じて調節することができる。反応は約１５℃から約４５℃の間の温度で続けられるのが好ましい。反応温度は約２０℃から約３７℃の間がより好ましく、約２５℃から約３７℃の間で反応を行うのが最も好ましい。時間、温度およびpＨの反応パラメーターは任意の所望の前駆体またはプロセシングされるポリペプチドの要求に従い変化させ得ることも当業者の容易に理解するところであろう。
【００１３】
任意の広範囲の緩衝剤を用いることができ、その唯一の必要条件は所望の範囲内にpＨを維持する能力である。通常の緩衝剤の例として、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシンなどが挙げられる。好ましい緩衝剤は酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびグリシンである。
【００１４】
本発明で使用するための前駆体ポリペプチドは通常、組換えＤＮＡ技術により製造する。その製造において、所望の前駆体ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はその合成のための通常の技術を使用して製造する。これらの方法は通常、所望の暗号配列のフラグメントおよびその相補性配列の両方をコードしているオリゴヌクレオチドの製造を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、暗号配列の１つのフラグメントと相補性配列の２つのフラグメントおよびその逆の重複をもたらすように設計する。これらオリゴヌクレオチドを対にして結合させ、最終的には所望の遺伝子配列を製造する。
【００１５】
配列はクローニングベクター中、この配列がコードする生成物の発現を可能にする位置に挿入する。適当なクローニングベクターは少なくとも発現制御配列の部分を含む。
【００１６】
【実施例】
以下に示す実施例は、本発明をさらに説明する手段として挙げるものである。これらは本発明に限定を課すものと解釈すべきではない。
【００１７】
実施例１  Ｄictyostelium discoideumの発酵
Ｄictyostelium discoideum Ａx３の凍結乾燥培養物をＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection(Rockville, Maryland)から受託番号ＡＴＣＣ ２８３６８のもとで入手し、Ｄifco酵母抽出物(７.１５g/l)、Ｄifco Ｂactoペプトン(１４.３g/l)、Ｎa2ＨＰＯ4(０.５１g/l)およびＫＨ2ＰＯ4(０.４９g/l)からなる緩衝化酵母抽出物−ペプトン培地を含む寒天プレート(１.２％Ｄifco Ｂacto Ａgar)上にいくつかの密度で平板培養し、これにグルコース(最終１０g/l)を個別の滅菌の後に無菌的に加え、これをＮaＯＨまたはＨ2ＳＯ4を用いて最終pＨ６.５(＋/−０.１)に調整した。この同じ培地(寒天を含まない)を約１リットル以下の容量で液体培養物の成長のために用いた。寒天プレートを３〜５日間２１℃〜２４℃でインキュベートした。Ａx３培養物と共に凍結乾燥された「食物細菌」を拾い上げるのを防止するよう注意してプレートから胞子嚢を採収し、次いで緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロス(３ml)中に接種し、穏やかに震盪しながら２１〜２４℃でインキュベートした。次いで、Ｄ.discoideum細胞を次第に大きな容量の緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロスへの連続的な移し替えにより増幅させた。各々の一連の移し替え工程は、約１０倍から２５倍の間の希釈により、細胞密度が約２×１０6／mlを越えたときに行った。ブロスは常に２１〜２４℃で緩やかに撹拌しながらインキュベートした。
【００１８】
撹拌発酵は通常、最初の酵母抽出物−ペプトン培地中Ｂactoペプトンの代わりに大豆ペプトン(ＰhytoneペプトンまたはＭarcor大豆ペプトンなど)を２〜１４.３g/lの濃度で含む同様の培地中で行った。採収物は通常、４０〜１５０rpmで回転している１〜３のＲushtonタービン羽根を装着した１０〜５０００リットルの作業容量を有する発酵槽から得た。温度は２２＋/−１℃に制御し、空気流は液体ブロスの容量当たり０.１から０.５の間の空気容量に制御し、背圧は３〜５p.s.i.に維持した。一部の発酵は硫酸によりpＨを６.４に制御して行い、また一部は撹拌および空気流を変化させることにより溶存酸素を４０〜６０％に制御して行った。この細胞は成長中は壁の少ないアメーバであるので、細胞の取扱いおよび発酵中の剪断を最少限にするために注意を払った。
【００１９】
通常、Ｄ.discoideum Ａx３の撹拌培養物は１２〜３６時間の倍増時間で成長した。溶存酸素は次第に減少し(制御しない場合)、次いで細胞密度の増加が停止してしばらく後に増加し始めた。最終の細胞密度は３×１０6/ml〜５×１０7/mlの範囲にあり、酸素の移動はより低い最大細胞密度を有する発酵においては明らかに制限されていた。
【００２０】
サンプルを時々採取し、細胞密度およびＧＦ−pＮＡse活性について分析した(下記の実施例３を参照)。Ｐetroff−Ｈauser計算板を使用して約５×１０5／mlを越える細胞密度を概算した。通常、ＧＦpＮＡ加水分解活性は発酵中に上昇した。最大dＤＡＰ活性は最大細胞密度に達してから２〜４日後に見られた。全ブロスを４℃で保存するかまたは−２０℃で凍結させ、後に解凍して活性を分析した。１０℃以下に冷却し、細胞を連続−流出遠心機で除去することにより発酵の収穫を行った。
【００２１】
実施例２  dＤＡＰの製造
Ａ．細胞の除去および濃縮
Ｄictyostelium discoideum発酵ブロスからのdＤＡＰの最初の精製には、細胞の除去および濃縮の工程が含まれる。細胞の除去はＷestern Ｓtates遠心機での連続−流出遠心により行った。細胞を含まない培地を５０,０００分子量カットオフ膜を使用した接線流出超遠心により約２０倍濃縮した。保留液を超遠心ユニットから排出させ、このユニットを５０mＭトリス緩衝液(pＨ７)で洗浄してdＤＡＰをさらに回収した。保留液および洗浄液のサンプルを合わせて最終濃縮液を得、これをさらに処理を行うまで数カ月間、−２０℃で凍結保存した。
【００２２】
Ｂ．清浄化
凍結最終濃縮液を約１２時間室温で解凍した。解凍したら、最初のカラムクロマトグラフィー工程の前に最終濃縮液の清浄化を行った。清浄化は、遠心分離、次いで５ミクロン膜による濾過の組み合わせにより行った。清浄化された最終濃縮液をpＨ７.０に調整し、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を待つ間、１２時間以内４〜１０℃で保持した。
【００２３】
Ｃ．陰イオン交換クロマトグラフィー
dＤＡＰ精製工程の最初のクロマトグラフィー工程は、Ｐharmacia Ｑ−Ｓepharose Ｆast Ｆlow樹脂(ＦＦＱ)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーであった。カラムは５０mＭトリス緩衝液(pＨ７)で平衡化した。清浄化細胞を含まない濃縮液を、５０cm/時の直線流出速度で樹脂１リットル当たり非濃縮発酵培地６０リットルの比でカラムにかけた。この結果、樹脂１リットル当たりのタンパク質量は約６０gであった(タンパク質の定量はＰierce ＢＣＡタンパク質アッセイに基づきウシ血清アルブミン標準に対して行った)。ＦＦＱ樹脂１リットル当たりにdＤＡＰ活性約２５０単位を適用した。細胞を含まない濃縮液の伝導率は約５mＭＨＯＳ/cmであった。サンプルの賦課を完了した後に、ＦＦＱ樹脂を平衡化緩衝液の３カラム容量で洗浄した。０〜１Ｍ ＮaＣl、５０mＭトリス(pＨ７)の直線勾配を１０カラム容量以上、流速５０cm/時で用いてdＤＡＰ活性を樹脂から溶離した。分画サイズは０.１カラム容量であった。このＦＦＱカラムをさらに３カラム容量の５０mＭトリス(pＨ７)中の１.０Ｍ ＮaＣlで溶離した。流出物を伝導率および２８０nmでの吸光度でモニターし、pＨ３.５で比色基質Ｇly−Ｐheパラ−ニトロアニリド(ＧＦpＮＡ)を切断する能力により各分画をdＤＡＰ活性について分析した。全溶出dＤＡＰ活性の約９０％を含む画分を合わせることにより主プールを調製した。dＤＡＰ活性はサイズが約２カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを１０％v/v ＨＣlを用いてpＨ３.５の酸性にした。ＦＦＱ酸性化した主プールは２日以内４℃で保持した。
【００２４】
Ｄ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
次に、ＦＦＱ酸性化主プールをＰharmacia Ｐhenyl Ｓepharose Ｆast Ｆlow樹脂による疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)により精製した。カラムは陰イオン交換カラムの容量の１／３であった。樹脂１リットル当たり約６５０単位の活性を適用し、タンパク質賦課量は樹脂１リットル当たり４gとした(２８０nmでの１吸光度単位を１mg/mlタンパク質に等しいとした)。１４０g/Ｌの硫酸アンモニウムの添加により、ＨＩＣカラムへの賦課用にＦＦＱ主プールを調製した。この賦課物をpＨ３.５に調整し、最終伝導率を約９０mＭＨＯＳ/cmとした。ＨＩＣカラムを、少なくとも１４０g/Ｌの硫酸アンモニウムを含む５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)中に平衡化した。この賦課物を直線流速４０cm/時で適用し、樹脂を少なくとも３カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した。１４０g/Ｌから０g/Ｌまでの硫酸アンモニウム[５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)中]の直線勾配を４０cm/時で１０カラム容量以上用いて樹脂からdＤＡＰ活性を溶離した。さらにカラムを、少なくとも３カラム容量の５０mＭクエン酸塩(pＨ３.５)で溶離した。分画サイズは０.１カラム容量であった。流出物を伝導率および２８０nmでの吸光度でモニターし、pＨ３.５でＧＦpＮＡを切断する能力により各分画をdＤＡＰ活性について分析した。全溶出dＤＡＰ活性の約９０％を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dＤＡＰ活性はサイズが約２カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを１０％v/v ＨＣlまたは１０％w/w ＮaＯＨを用いてpＨ３.５に調節した。ＨＩＣ主プールは工程を続行する前に１日以内４℃で保持した。
【００２５】
Ｅ．サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＩＣ主プールをさらにＳ−２００ Ｓepharose ＨＲのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)により処理した。このカラムはＨＩＣカラムの２倍の容量であり、７８cmのベッド高さを有していた。ＨＩＣ主プールを、１０,０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて限外濾過ユニット中で濃縮することにより、ＨＩＣ主プールをＳＥＣカラム用に調製した。ＨＩＣ主プールをＳＥＣカラム容量の２.５％に濃縮し、保留液をユニットから排出した。限外濾過ユニットを、ＳＥＣカラム容量の２.５％に等しい容量の５０mＭクエン酸塩緩衝液(pＨ３.５)で洗浄した。保留液および洗浄液を合わせて最終濃縮物を得、１０％v/v ＨＣlまたは１０％w/v ＮaＯＨを用いてpＨ３.５に調節した。最終濃縮物の伝導率は約３０mＭＨＯ/cmであった。ＳＥＣカラムを５０mＭ酢酸、２０mＭ塩化ナトリウム、pＨ３.５で平衡化し、これは約２mＭＨＯ/cmの伝導率を有していた。最終濃縮液を１５cm/時の直線流出でＳＥＣカラムにかけ、１カラム容量の平衡化緩衝液を注ぐことによりdＤＡＰ活性を溶離した。分画サイズは０.０２カラム容量であった。流出物を伝導率および２８０nmでの吸光度でモニターし、pＨ３.５でＧＦpＮＡを切断する能力により各分画をdＤＡＰ活性について分析した。全溶出dＤＡＰ活性の約９０％を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dＤＡＰ活性はサイズが約０.０８カラム容量の単一ピークとして溶出した。ＳＥＣ主プールは４℃で数カ月間保持することができる。
【００２６】
陰イオン交換、疎水性相互作用、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを用いたdＤＡＰの精製の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で主バンドとして移動する物質を得た。このバンドは分子量標準のウシ血清アルブミン(６６キロダルトン)と等しいゲル上の位置に移動した。このタンパク質はＩＳＳ Ｐro−ブルー染色により染色した。移動パターンはサンプル調製中の０.１Ｍ ＤＴＴ(＋１００℃で５分間)の存在または不在による影響を受けなかった。ＤＡＰ−Ｉ(ウシ供給源)のサブユニット分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約２２,０００ダルトンであると概算される。
【００２７】
実施例３  dＤＡＰの活性
Ａ．変換反応
１．ＧＦ−pＮＡの切断
dＤＡＰ活性は通常、色素基質Ｇly−Ｐheパラ−ニトロアニリド(ＧＦ−pＮＡ)の切断を追跡することによりモニターする。通常このアッセイは、酵素をpＨ３.５に調整された４mＭ ＧＦpＮＡ(１.０ml)中に１１倍希釈することにより行う。ＧＦジペプチドの切断速度は４０５nmでの吸光度の上昇を測定することにより３７℃でモニターした。１単位の活性はこれらの条件下で１分間あたり０.９０のＯＤ変化を導く。単位/mlの概算は、遊離pＮＡに対する吸光度係数を４０５nmで９.９mＭ-1cm-1であると仮定して行うことができる。
【００２８】
基質ＧＦpＮＡ指向性のdＤＡＰの阻害特性を、ウシＤＡＰ−Ｉの活性を阻害することが知られているスルフヒドリル修飾剤であるヨードアセトアミドおよびカリウム・テトラチオネートを用いてウシＤＡＰ−Ｉのものと比較した。dＤＡＰまたはウシ脾臓ＤＡＰ−Ｉのサンプルを、１００mＭトリス緩衝液中、pＨ７でどちらかの阻害剤の最終濃度０、０.５、５.０、または５０mＭ中にて室温で１５分間インキュベートした。次いで、このインキュベートした溶液を４mＭ ＧＦpＮＡ(pＨ３.５)で２１倍に希釈した。切断速度は、３７℃で４０５nmでの吸光度の上昇を測定することによりモニターした。ウシＤＡＰ−ＩのＧＦpＮＡ切断速度は５mＭヨードアセトアミドに暴露することにより９０％以上減少し、５mＭカリウム・テトラチオネートにより９５％阻害された。試験したヨードアセトアミドまたはカリウム・テトラチオネートのいずれの濃度によってもdＤＡＰの有意な阻害の形跡はなかった。
【００２９】
dＤＡＰのＧＦpＮＡ切断能力に対する至適pＨを、０.５トリス、リン酸塩およびクエン酸塩からなる緩衝液を１０％ＨＣlまたは１０％ＮaＯＨで３〜８の範囲内の種々のpＨに調節することにより測定した。dＤＡＰ酵素を、１００mＭシステアミンおよび１０mＭ ＮaＣlを含む緩衝液中に２０倍希釈した。ウシＤＡＰ−Ｉは同じ緩衝液中に２００倍希釈した。ＧＦpＮＡ基質溶液(４mＭ)を２％ＤＭＦ中に調製した。微量滴定プレート中で、種々のpＨのトリス／リン酸塩／クエン酸塩緩衝液(０.０２５ml)を、希釈酵素(０.１ml)および基質溶液(０.１ml)と合わせた。４１０nmでの吸光度の上昇速度をプレートリーダーで３０分間にわたって測定した。この結果により、ＧＦpＮＡ切断に対するdＤＡＰの至適pＨは３.５〜４.０の間であることが示された。
【００３０】
２．Ｇly−Ａrg−pＮＡの切断
４mＭ Ｇly−Ａrg−pＮＡ(ＧＲ−pＮＡ)を５０mＭ酢酸、５０mＭグリシン緩衝液、pＨ５中に調製した。ＨＣlまたはＮaＯＨを用いて５.１から２.３の種々のpＨにした。上記のpＨ緩衝化基質(１８０μl)にdＤＡＰ(５μl)(最終４９ミリ単位/ml)を加えた。４１０nmでの吸光度の上昇速度をモニターし(プレートリーダーを使用)、上昇速度を反応溶液のpＨと比較した。ＧＦ−pＮＡの場合と同様に、ＧＲ−pＮＡ基質は約３.５の至適pＨを有していた。この基質を用いた場合に、酵素はpＨ２.５以下またはpＨ５以上では活性はほとんどなかった。
【００３１】
３．Ａrg−Ａrg−Ｂ−ナフチルアミド(ＲＲ−ＢＮＡ)の切断
約０.２５mＭのＲＲ−ＢＮＡまたは０.２５mＭのベンジルオキシカルボニル−ＲＲ−ＢＮＡ(Ｚ−ＲＲ−ＢＮＡ)を１００mＭ酢酸(pＨ３.５)または１００mＭクエン酸緩衝液(pＨ５.０)のどちらかにおいて調製した。基質(２ml)にdＤＡＰまたはウシＤＡＰ−Ｉ(約１５ミリ単位/ml溶液)を加えた。切断速度(３４０nmでの励起と共に４１０nmでの蛍光の上昇をモニターする)をモニターした。ウシＤＡＰ−Ｉはどちらの基質も切断することができなかった。驚くべきことに、dＤＡＰはＲＲ−ＢＮＡ基質を効率的に切断することができた。dＤＡＰはブロックされたアミノ基Ｚ−ＲＲ−ＢＮＡ基質を切断することができなかったが、これはdＤＡＰがＤＡＰ酵素であるという観察を支持している。ＲＲ−ＢＮＡの切断のための至適pＨを、５０mＭ酢酸および５０mＭクエン酸塩からなる緩衝系を用いてＲＲ−ＢＮＡ切断の速度をモニターすることにより調べた。ＨＣlまたはＮaＯＨを用いて種々のpＨとし、１.５mlの容量をＲＲ−ＢＮＡの１mＭ保存溶液(最終濃度約０.２５mＭ)０.５mlにより２.０にした。dＤＡＰを加え(約１５mＵ/mlに)、切断速度を測定した。ＲＲ−ＢＮＡ切断のための至適pＨは約４.５であることが観察され、調べた全範囲(pＨ３.５〜pＨ５.７)にわたって有意な活性が見られた。この驚くべき結果は、dＤＡＰがＤＡＰIIIの特性の一部を共有していることを示唆している。
【００３２】
基質切断のための至適pＨは、酵素だけでなく基質それ自体、すなわち除去されるジペプチドの構成ならびに指示基自体にも依存することを当業者は理解しているであろう。例えば、dＤＡＰを使用した場合、Ｇly−Ａrg−pＮＡは約３.５の至適pＨを有するが、Ｇly−Ａrg−７−アミド−４−メチルクマリン(ＧＲ−ＡＭＣ)の切断のための至適pＨは約pＨ５であり、このことはこのリポーティング基が切断特性に影響を与え得ることを示唆している。
【００３３】
Ｂ．合成オクタペプチドおよびデカペプチドの変換
オクタペプチドＭet−Ａsp−Ｐhe−Ｐro−Ａla−Ｍet−Ｓer−Ｌeuを５０mＭ ＨＯＡc(pＨ３.５)で４mＭの濃度に溶解した。この溶液をdＤＡＰ(１０mＵ/ml)で１：１に希釈し、室温で６時間インキュベートした。この反応を、１％リン酸を含む７Ｍ尿素に２０倍希釈することにより停止させた。反応停止サンプルを高速逆層(ＨＰＬＣ)クロマトグラフィーにより分析した。切断生成物をオクタペプチド標準、Ｍet−Ａspジペプチド、およびＰhe−Ｐro−Ａla−Ｍet−Ｓer−Ｌeuヘキサペプチドと比較した。dＤＡＰは、オクタペプチドの未ブロックのアミノ末端からＭet−Ａspジペプチドを容易に除去したが、現れたＰhe−Ｐroジペプチドを容易に切断することはできなかった。
【００３４】
合成されたデカペプチドＭet−Ａrg−Ｍet−Ｔyr−Ｐhe−Ｖal−Ａsn−Ｇln−Ｈis−Ｌeuを、１００mＭグリシン(pＨ３.５)中の１.７mＭ保存溶液として調製した。この溶液(０.５ml)にの６.４mＵ/ml dＤＡＰ[１００mＭグリシン(pＨ３.５)中に調製](８μl)を加えた。毎時間、この溶液(５μl)を逆層ＨＰＬＣクロマトグラフィー系に直接注入して切断生成物をモニターした。Ｍet−ＡrgおよびＭet−ＴyrジペプチドならびにＭet−Ｔyr−Ｐhe−Ｖal−Ａsn−Ｇln−Ｈis−ＬeuおよびＰhe−Ｖal−Ａsn−Ｇln−Ｈis−Ｌeuペプチドを比較のために独立して注入した。dＤＡＰは容易にＭet−Ａrgジペプチドをデカペプチドから除去し、さらに現れたＭet−Ｔyrジペプチドを除去した。これにより、ジペプチドはdＤＡＰによりアミノ末端から連続的に除去され得ることが示された。
【００３５】
Ｃ．Ｍet−Ａspヒト成長ホルモンの変換
Ｍet−Ａspヒト成長ホルモン(Ｍet−Ａsp−hＧＨ)を、Ｅ.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を可溶化し、折り畳んで適切なジスルフィド対が形成されたＭet−Ａsp−hＧＨを製造し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。この調製物の溶媒を交換し、pＨ３.５に調整した。Ｍet−Ａsp−hＧＨを３７℃に暖め、２８０nmでの吸光度を測定した。Ｍet−Ａsp−hＧＨの１mg当たり６ミリ単位のdＤＡＰを加えた。この変換反応を、３７℃で撹拌しながら約４〜約６時間進行させた。反応の進行は、より少ない酵素、より低い温度、またはより低いＭet−Ａsp−hＧＨ濃度を用いることにより損失を受けることなく遅くすることができる。反応速度は、より多くの酵素の添加、Ｍet−Ａsp−hＧＨの濃度の上昇または反応温度の上昇により高めることができる。変換反応の進行は逆層クロマトグラフィーによりモニターした。撹拌しながらＮaＯＨを急速に添加してpＨ８にし、さらに３０％v/vアセトニトリルを加えることにより変換反応を停止させた。dＤＡＰ処理の後に生成したヒト成長ホルモンの反応産物を、ペプチドマッピング、Ｎ末端配列決定、質量分光分析、アミノ酸分析、および逆層クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を含む多数の一連の分析操作に供した。すべてのデータが、真正なヒト成長ホルモンがdＤＡＰにより製造されたことを示した。
【００３６】
Ｄ．Ｍet−Ａrg−ヒトプロインスリンの変換
Ｍet−Ａrg−ヒトプロインスリン(Ｍet−Ａrg−hＰＩ)を、Ｅ.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を７Ｍ尿素中で可溶化した。タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ｍet−Ａrg−hＰＩを亜硫酸分解し、溶媒を交換し、天然のジスルフィド結合対および天然の３次構造を形成させるために折り畳んだ。さらにこの物質を逆層クロマトグラフィーを用いて精製した。酸化型メチオニル[Ｍet(Ｏ)]−Ａrg−hＰＩをＭet−Ａrg−hＰＩから過酸化水素を用いて調製し、次いで逆層クロマトグラフィーで精製して凍結乾燥した。
【００３７】
Ｍet−Ａrg−hＰＩは約２４mg/ml[約２０mＭグリシン緩衝液(pＨ３.５)中]であった。この物質(約２.４mg)をdＤＡＰ(０.１９ミリ単位)とpＨ３.５でインキュベートした。この反応は室温で進行させた。定期的に、反応液の一部を取り１０％リン酸で希釈した。この物質を中性の逆層ＨＰＬＣ系に注入し、Ｍet−Ａrg−hＰＩまたはＭet(Ｏ)−Ａrg−hＰＩの消失およびその後のhＰＩの生成についてモニターした。さらに、反応液の一部を適当な希釈液で希釈してＭet−ＡrgまたはＭet(Ｏ)−Ａrgジペプチドのどちらかの出現をＨＰＬＣでモニターした。約６０％のＭet−Ａrg−hＰＩが８時間でhＰＩに変換された。予期せぬことにＭet(Ｏ)−Ａrg−hＰＩ変換実験について同様の結果が見られた；即ち、hＰＩが生成した。両基質の切断速度は類似していた。ウシＤＡＰ−ＩがhＰＩのＭet(Ｏ)−Ｘ−誘導体(ＸはＡrg、ＰheおよびＴyr)を切断することができないようであるので、この結果は意外であった。さらに逆層分析により、Ｍet−Ａrgジペプチドは基準のＭet−Ａrgジペプチドとの比較によりＭet−Ａrg−hＰＩから放出され、またＭet(Ｏ)−Ａrgジペプチドとなり得るＭet(Ｏ)−Ａrg−hＰＩ基質を用いた実験についてピークはＭet−Ａrgジペプチドの領域に現れることが判明した。酸化型Ｍet(Ｏ)−Ｘ基質を切断するdＤＡＰの能力は、この切断を行うことができない酵素を凌ぐ明確なプロセシングの利点を有している。
【００３８】
Ｅ．Ｍet−Ａrgヒトプロインスリン類似体の変換
さらにdＤＡＰ酵素を用いて、折り畳まれたＭet−Ａrgプロインスリン類似体(Ｂ２８ Ｌys、Ｂ２９ Ｐro)ならびに折り畳まれたＭet−Ａrgプロインスリン類似体(Ｂ１０ Ａsp、Ｂ２８〜Ｂ３０を欠失)を効率よく変換した。これらの反応は、実質的にＭet−Ａrg−hＰＩの変換の説明において示した方法に従って行った。