(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変更された花の色を示すカーネーション植物の製造方法であって、DHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができないカーネーション植物を選択し、そしてF3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対して実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体を、前記選択されたカーネーション植物に導入することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記選択されたカーネーション植物がまた、F3'Hを合成することができない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された植物中に導入されるDFRをコードするヌクレオチド配列がペチュニア起原のものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
F3'5'Hをコードする前記ヌクレオチド配列がペチュニアからである請求項１〜３のいずれか１項に項記載の方法。
【請求項５】
前記変更された花の色が紅藤色／青紫又はそれらの色調である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
下記性質：
（ｉ）DHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない能力；
（ii）DHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対して実質的に作用することができない非固有のDFRを合成する能力；
（iii）導入されたF3'5'HによるDHMを合成する能力；及び
（iv）DHKに対して作用するDFRを発現するカーネーション植物に対しての変更された花色、
を示すトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項７】
F3'Hを実質的に合成することができない能力を更に有する請求項６に記載のトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のトランスジェニックカーネーション植物からの切り花、又は花を含む切断部分。
【請求項９】
変更された花の色を示すトランスジェニックカーネーション植物であって、F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列及びDHMに対して作用することができるがしかしDHKに対して実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子を担持し、そしてDHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができないトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項１０】
前記植物がまた、F3'Hを実質的に合成することができない請求項９に記載のトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項１１】
前記DFRをコードする核酸分子がペチュニア起原のものである請求項９又は10に記載のトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項１２】
前記F3'5'Hをコードする前記核酸分子がペチュニア起原のものである請求項９〜11のいずれか１項に記載のトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項１３】
前記変更された花の色が紅藤色／青紫又はそれらの色調である請求項９〜12のいずれか１項に記載のトランスジェニックカーネーション植物。
【請求項１４】
請求項９〜13のいずれか１項に記載のトランスジェニックカーネーション植物から切られた花、又は前記カーネーション植物の一部。
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的に、変更された花の色を示すトランスジェニック植物を製造することへの新規アプローチに関する。より具体的には、本発明は、カーネーション植物に天然に関連しない花の色を示すトランスジェニックカーネーション植物及びそれらの切り花を提供する。本発明はさらに、変えられた花の色を有するトランスジェニックカーネーション植物を製造するための方法にも関する。
本明細書に関連する引用文献の出版の詳細は、この記載の最後に集められている。本明細書に言及されるヌクレオチド配列についての配列番号は、引用文献に続いて定義されている。
本明細書を通して、特にことわらない限り、用語“含んで成る（comprise）”又はその変型、例えば“含んで成る（comprises又はcomprising）”は、言及された成分もしくは全体、又はその成分もしくは全体のグループを包含することを意味するが、しかしいづれか他の成分もしくは全体、又はその成分もしくは全体のグループを排除することを意味しないことが理解されるであろう。
組換えDNA技法の急速に高まった高度の知識は、園芸から医学及び類似の健康産業に至る広範囲の産業工程をひじょうに促進している。園芸及び関連する農芸産業は、組換えDNA技法における進歩から特に利益を得ている。
花卉園芸産業は特に、耐病性及び耐病原性から花色の変更にわたる改良された特徴を有する新規及び異なった種類の花卉植物を開発することに努力している。従来の繁殖技法はある成功をもって使用されて来たが、このアプローチは特定の種の遺伝子プールの拘束により制限されて来た。たとえば、単一の種が十分な範囲の色の種類を有することはまれである。従って、実質的な努力が、所望する特徴を示すトランスジェニック植物を生成するために組換えDNA技法の使用に向けられて来た。
主な切り花種、たとえば広範囲の色の紅藤色、すみれ色、紫色及び青色にわたる色の範囲を示す花を有するカーネーション植物の品種の開発が、切り花及び装飾市場において有意な機会を付与するであろう。
花の色は、主として２種のタイプの色素、すなわちフラボノイド及びカロテノイドに依存する。フラボノイドは、黄色〜赤又は青色までの広範囲の色に寄与する。カロテノイドはオレンジ色又は黄色の色合いを付与し、そして通常、黄色又はオレンジ色の花における唯一の色素である。花の色への主要な寄与をするフラボノイド分子は、シアニジン、デルフィニジン、ペツニジン、ペオニジン、マルビジン及びペラルゴニジンのグリコシル化された誘導体であるアントシアニンであり、そして液胞に位置する。異なったアントシアニンが色の著しい差異を生成することができる。花の色はまた、無色のフラボノイドとの同時色素形成、金属複合体化、グリコシル化、アシル化、メチル化及び液胞のpHにより影響される（Forkmann,1991）。
フラボノイド色素のための生合成路（この後、“フラボノイド経路”として言及される）は、十分に確立されている（Ebel and Hahlbrock,1988;Hahlbrock and Grisebach,1979;Wiering and de Vlaming,1984;Schramなど.,1984;Stafford,1990）。前記経路における最初の明確にされた段階は、ｐ−クマロイル−CoAの１つの分子とマロニル−CoAの３種の分子の縮合を包含する。この反応は、酵素カルコンシンターゼ（CHS）により触媒される。この反応の生成物、すなわち2',4,4',6'−テトラヒドロキシカルコンは通常、急速に異性化し、酵素コルコン−フラバノンイソメラーゼ（CHI）によりナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは続いて、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（F3H）により中央の環の3'−位置でヒドロキシル化され、ジヒドロケンフェロール（DHK）が生成される。
ジヒドロケンフェロール（DHK）のＢ環は、3'、又は3'及び5'の両位置のいづれかでヒドロキシル化され、それぞれジヒドロクエンセチン（DHQ）及びジヒドロミリセチン（DHM）が生成される（図１を参照のこと）。DHQは、シアニジン基礎のアントシアニンの生成のために必要とされる中間体であり、そしてDHMはフラボノイド経路においてデルフィニジン基礎のアントシアニンの生成のために必要とされる中間体である。この経路に包含される２種のキー酵素は、フラボノイド3'−ヒドロキシラーゼ（F3'H）及びフラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）である。F3'Hは、DHQを生成するためにDHKに対して作用する。F3'5'Hは、3'及び5'位置においてDHKの及び5'位置においてDHQのヒドロキシル化を触媒する広範囲の酵素であり（Stotz and Forkmann,1982）、ここで両者の場合、DHMが生成される。アントシアニンのＢ−環のヒドロキシル化のパターンは、花弁の色を決定することにおいてキーの役割を演じる。
もう１つのキー酵素は、その植物源に特別に依存する種々の基質を有し、そしてDHK,DHQ及びDHMのいづれか１又は複数に対して作用する可能性を有するジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（DFR）である。
主な切り花種の多くはF3'5'Hを欠いており、そして結果的に、デルフィニジン及びその誘導体の合成に起因する色の範囲を示すことができない。これは特に、世界中の切り花市場の主要割合を構成するカーネーションについての事例である。従って、F3'5'Hを生成することができ、それによりDHK及びDHQをDHMに転換できる手段を提供し、それにより、アントシアニンのヒドロキシル化パターンに影響を及ぼし、そしてデルフィニジンに起因するアントシアニンの生成を可能にするトランスジェニック植物を製造するためにカーネーション植物を変更する必要性がある。花の色が結果として変更され、そして単一の種がより広い範囲の花の色を発現することができる。
本発明に導びく研究において、本発明者は、DHK代謝をペラルゴニジン又はシアニジンに対してよりもかむしろデルフィニジンに対して向ける能力を有する広範囲の植物を製造するために、カーネーション植物においてフラボノイド経路を遺伝的に操作しようと努めた。その得られる植物は、現在利用できるカーネーション植物に対して変更された花の配色を示す。この新規のトランスジェニックカーネーション植物及びより具体的にはそれから切られる花は、園芸において、及びより具体的には、カーネーションに関する花卉産業において長く切望して来た必要性を満たす。本発明の技法はまた、広範囲の他の開花植物、例えばバラ及びキクに対しても適用できる。
従って、本発明の１つの観点は、変更された花の色を示す植物を製造するための方法に関し、前記方法は、DHKに対して作用するDFRを実質的に合成できない植物を選択し、そしてF3'5'H、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体を前記選択された植物中に導入することを含んで成る。
従って、本発明の１つの観点は、変更された花の色を示す植物を製造するための方法に関し、前記方法は、DHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない、前記第１植物が誘導されるべき植物を選択し、そしてF3'5'H、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体を前記選択された植物中に導入することを含んで成る方法。
より具体的には、本発明は、変更された花の色を示すカーネーション植物を製造するための方法を提供し、前記方法は、花におけるDHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない、前記第１カーネーション植物が誘導されるべきカーネーション植物を選択し、そしてF3'5'H、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対して実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造物を前記選択された植物中に導入することを含んで成る。
本発明の方法は、本明細書においては、カーネーション植物を用いて例示されている。しかしながら、これは、本発明が広範囲の開花植物、例えばバラ及びキク（但し、これらだけに限定されない）に拡張できることの理解を伴って実施される。この後、カーネーションに対する言及は、他の適切な開花植物への言及として取られるべきである。
本発明のもう１つの観点は、変更された花の色を示すカーネーション植物を生成するための方法に向けられ、前記方法は：
（ｉ）花においてDHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない、前記カーネーションが誘導されるべき植物を選択し；
（ii）F3'5'H、及びDFR（但し、該DFRはDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができない）を別々にコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体により前記選択された植物の細胞を形質転換し；
（iii）再生される植物が段階（ii）の前記F3'5'H及び前記DFRを発現することができるように、前記形質転換された細胞からトランスジェニック植物を再生し；そして
（iv）花において段階（ii）の前記F3'5'H及び前記DFRの発現を可能にする条件下で前記植物を育成する段階を含んで成る。
本明細書における変更された花の色に関する言及は、花弁、萼片及び雄ずいを包含する花のいづれかの又はすべての成分の色の変化を包含する。便利には、変更された花の色は、本発明に従って製造されたトランスジェニック植物の花の色と、DHKに対して作用することができるDFRを有する同じ種の植物とを比較することによって示される。実際的には、比較は、トランスジェニック植物と“選択された”植物、すなわちトランスジェニック植物が誘導される植物との間で行なわれ得る。
本発明は、ロイコペラルゴニジン及びペラルコニジン誘導体又はDHQ、及びロイコシアニジン及びシアニジン誘導体を通してよりもむしろDHM及びデルフィニジン及びそれらの誘導体に対して選択的にDHKの代謝を向けるためにカーネーション植物におけるアントシアニン経路の遺伝子操作に一部、基づかれている。カーネーション植物の花はF3'5'Hを欠いており、そして従って、DHKは、紅藤色、青紫、紫及び青色又はそれらの種々の色調を包含する範囲での花の色を生成するために必要とされるデルフィニジン経路下で代謝を受けることができない。デルフィニジン経路下でのDHK代謝生成物の選択的な再方向づけを達成するためには、本発明者は機能的DFRを欠いているカーネーションの白色系統についてスクリーンし、そして位置決定した。導入された核酸分子の発現はDHK代謝をDHMに向けることができるF3'5'Hをもたらす。DHKに対してではなくDHMに対して作用することができる非固有のDFRをコードする核酸分子の導入及び発現は、ロイコデルフィニジンに向けられ、それによりデルフィニジンの他の誘導体への続く転換を可能にするDHM代謝をもたらす。ペラルゴニジン又はシアニジン経路を通しての代謝は、ほとんど又はまったく生じない。
特に好ましい態様においては、出発植物の花はまた、F3'Hを欠いている。
この好ましい態様によれば、本発明は変更された花の色の性質を示すカーネーション植物を製造するための方法に関し、この方法は、F3'H、又は花においてDHKに対して作用することができるDFRのいづれも実質的に合成することができない、第１の言及されたカーネーション植物が誘導されるべきカーネーション植物を選択し、そしてF3'5'H、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体を前記選択された植物中に導入することを含んで成る。
より特定には、本発明のこの観点は、変更された花の色を示すカーネーション植物を製造するための方法に関し、この方法は：
（ｉ）F3'H'、又は花においてDHKに対して作用することができるDFRのいづれかを実質的に合成することができない、前記第１の言及されたカーネーション植物が誘導されるべきカーネーション植物を選択し；
（ii）F3'5'H、及びDFR（但し、前記DFRはDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができない）を別々にコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体により前記選択された植物の細胞を形質転換し；
（iii）再生される植物が段階（ii）の前記F3'5'H及び前記DFRを発現することができるように、前記形質転換された細胞からトランスジェニック植物を再生し；そして
（iv）花において段階（ii）の前記F3'5'H及び前記DFRの発現を可能にする条件下で前記植物を育成する段階を含んで成る。
本発明は、DHKに対してではなく、DHMに対して作用することができる酵素としてペチュニアDFRを用いて、本明細書に例示される。しかしながら、これは、本発明がDHKに対してではなく、DHMに対して作用することができるいづれかの植物からのDFR酵素に拡張できることの理解を伴って、実施される。同様に、特に有用なF3'5'Hはペチュニアからであるが、しかしF3'5'Hの他の源、例えばナス、リシアンタス（lisianthus）、リンドウ、パンジー、エゾギク、アネモネ、ブドウ、アヤメ、ヒヤシンス、デルフィニューム及びカンパニゥムも包含される。
酵素、たとえばDFR,F3'H及びF3'5'Hを生成するか又は生成しない能力に関する本明細書における言及は、花におけるその能力であり、そして必ずしも植物における他の場所におけるその能力ではない。
本発明の特に好ましい態様は、変更された花の色を示すカーネーション植物を製造するための方法に関し、この方法は、F3'H、又は花においてDHKに対して作用することができるDFRのいづれも実質的に合成することができない、前記第１カーネーション植物が誘導されるべきカーネーション植物を選択し、F3'5'H及びペチュニアDFRを別々にコードするヌクレオチド配列を含んで成る１又は複数の遺伝子構造体を前記選択された植物の細胞中に導入し、そして次に、前記植物が前記選択された植物に対して異なった色の花を生成するように、前記F3'5'H及び前記ペチュニアDFRの発現を可能にするのに十分な条件下で前記植物を育成することを含んで成る。好ましくは、F3'5'Hはペチュニア起原のものである。
変更された花の色を示す対象のトランスジェニック植物が誘導される選択された植物は、それがDFRを実質的に生成しないか、又は低下したレベルのこの酵素を生成するか、又は変更された基質特異性、たとえばDHKを代謝しない実質的な能力を有する酵素を生成するようにDFRのための天然の突然変異体であり得る。しかしながら、好ましくは、選択された植物はDFR及びF3'Hのための二重突然変異体である。それらのタイプの突然変異体は一般的に白色の花を有する。突然変異は、酵素を定義するヌクレオチド配列の単一又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加であり得る。他方、突然変異は、たとえばトランスポゾンタッギング、オリゴヌクレオチド指令突然変異、アグロバクテリウム指令突然変異又はウィルス指令突然変異により誘発され、又は指令され得る。
他方、遺伝子構造体が、たとえばアンチセンス又はコーサプレッション法によりDFR及び／又はF3'Hの発現を減じるために導入され得る。本発明のこの観点においては、DFR又はF3'Hの１つを合成することができない実質的な能力及び前記DFR又はF3'Hの他方の発現を減じるために導入される遺伝子配列を有する植物が選択され得る。他方、DFR又はF3'Hの１つを合成することができない実質的な能力及び前記DFR又はF3'Hの他方において誘発された突然変異を有する植物が上記手段のいづれかにより選択され得る。いづれの場合でも、その得られる植物は、“選択された”植物、並びにF3'5'H、及びDHKに対してではなくDHMに対して作用することができるDFRのための受容体である。“選択された”植物また、それが、変更された花の色を示すトランスジェニック植物が本発明の方法に従って誘導されるこの植物からであるので、“親”植物と思われる。
本発明により企画される変更された花の色は、紅藤色、青紫、紫及び青色の花又はそれらの種々の色調、たとえば深藤色〜濃青色〜紫色又はそれらの種々の色調又はそれらの組合せを包含する広範囲の色を生成するカーネーションの能力を包含する。
本発明のもう１つの観点は、DHKに対して作用し、そしてF3'5'H、及びDHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができないDFRをコードするヌクレオチドの配列を含んで成る核酸分子を担持するDFRを実質的に合成することができない、変更された花の色を示すトランスジェニック植物に関する。
好ましくは、前記植物は、カーネーション、バラ、ガーベラ又はキクである。本発明のこの観点によれば、核酸分子は、DFR及びF3'5'Hを別々にコードする複数の遺伝子構造体、又は両酵素をコードするが、しかしその発現は一般的に２つの別々のプロモーターにより指令されている単一の組合わされた遺伝子構造体を含んで成る。用語“核酸配列”とは、単一又は複数の核酸分子を包含する。
本発明の好ましい観点においては、次の性質を示すカーネーション植物が供給される：
（ｉ）DHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない能力；
（ii）DHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができない生来的でないDFRを合成する能力；及び
（iii）DHKに対して作用するDFRを発現するカーネーション植物に対しての変更された花の色。
好ましくは、カーネーション植物はまた、F3'Hを実質的に合成することができない。この好ましい態様によれば、次の性質を示すカーネーション植物が供給される：
（ｉ）F3'Hを実質的に合成することができない能力；
（ii）DHKに対して作用するDFRを実質的に合成することができない能力；
（iii）DHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対しては実質的に作用することができない生来的でないDFRを合成する能力；及び
（iv）F3'H、及び／又はDHKに対して作用するDFRを発現するカーネーション植物に対しての変更された花の色。
本発明は、本明細書に開示される方法により製造されたそのようなトランスジェニックカーネーション又は植物からの花及び特に切り花に及ぶ。
“生来的でない"DFRは、カーネーション植物において通常生成されない酵素であり、そして１つの好ましい態様においては、ペチュニアからである。“生来的でない"DFRは他方では、カーネーション植物からの起原であるが、しかしDHMに対するその基質特異性を制限するために突然変異を受け得る。F3'5'Hはまた、生来的でなく、そして１つの観点において、好ましくは、ペチュニアからである。
本発明のもう１つの観点は、変更された花の色を示すカーネーション植物を生成するための方法に関し、前記方法は、花が形成する一定の時間、及びその条件下でトランスジェニック開花カーネーション植物を育成し、そして次に、場合によっては、前記花を収穫することを含んで成り、ここで前記トランスジェニックカーネーション植物は、
（ｉ）DHKに対して作用することができるDFRを実質的に発現することができず；
（ii）生来的でないF3'5'Hを発現することができ；そして
（iii）DHMに対して作用することができるが、しかしDHKに対して実質的に作用することができないように遺伝的に操作されている。
本発明のこの観点によれば、変更された花色を示す花は、フラボノイド経路におけるDHKをDHM及びデルフィニジン並びにその誘導体に代謝する能力を有するであろう。
好ましくは、トランスジェニック植物はまた、F3'Hを実質的に発現することはできない。
本発明の他の観点は、DHKに対して作用することができるDFRを合成することができるカーネーション植物に比較して、変更された花の色を示すカーネーション植物の製造を可能にするために、DHK又はDHMに対して作用することができる活性DFRを実質的に発現又は合成することができないカーネーション植物の遺伝子操作における、F3'5'H DHMに対して作用することができるがしかしDHKに対して実質的に作用することができないDFR、及び場合によってはさらにまたF3'Hを別々にコードする遺伝子配列の使用を包含する。関連する観点においては、本発明は前記カーネーション植物からの花及び特にそれからの切花に及び。
本発明はさらに、次の図及び例により記載される。
図１はジヒドロフラボノールのフラボノール及び／又はアントシアニンへの転換のための経路の図である。略号:DHK＝ジヒドロケンフェロール、DHQ＝ジヒドロクエルセチン、DHM＝ジヒドロミリセチン、Ｋ＝ケンフェロール、Ｑ＝クエルセチン、Ｍ＝ミリセチン、F3'H＝フラボノイド3'−ヒドロキシラーゼ、F3'5'H＝フラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼ、FLS＝フラボノールシンターゼ、DFR＝ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ、ANS＝アントシアニジンシンターゼ、3GT＝フラボノイド３−グルコシルトランスフェラーゼ。
図２は、13の市販の白色カーネーション品種におけるDFR及びANS mRNAの発現レベルを比較するノザン分析を示すオートラジオグラムである。矢印は適切な転写体を示す。
図３は二元発現ベクターpCGP1470の図であり、この構成は例９に記載されている。Tc耐性＝テトラサイクリン耐性遺伝子;LB＝左側ボーダー、RB＝右側ボーダー;surB＝タバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子のためのコード領域及びターミネーター配列;35S＝カリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子からのプロモーター領域;CHS＝キンギョソウのカルコンシンターゼ遺伝子からのプロモーター領域;Hf1＝ペチュニアフラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼをコードするDNA配列;D8＝ペチュニアリン脂質トランスフェラーゼからのターミネーター配列;MAC＝カリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子配列により増強されたマンノピンシンターゼプロモーター;DFR＝ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードするDNA配列;mas＝アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）マンノピンシンターゼ遺伝子からのターミネーター配列。選択された制限酵素部位が示されている。
図４は、二元発現ベクターpCGP1473の図であり、この構成は例10に記載される。Tc耐性＝テトラサイクリン耐性遺伝子;LB＝左側ボーダー、RB＝右側ボーダー;surB＝タバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子のためのコード領域及びターミネーター配列;35S＝カリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子からのプロモーター領域;CHS＝キンギョソウのカルコンシンターゼ遺伝子からのプロモーター領域;Hf1＝ペチュニアフラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼをコードするDNA配列;D8＝ペチュニアリン脂質トランスフェラーゼからのターミネーター配列；ゲノムDFR＝ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードするゲノムDNA配列。選択された酵素部位が示されている。
図５は、選択マーカーとしてのタバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子、およびF3'5'H及びDFRをコードする核酸分子を含む遺伝子構造体（pCGP1470）により形質転換された、White Unescoからの葉の組織から単離されたDNAのサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラムである。カーネーションゲノムDNAが制限エンドヌクレアーゼXba Iにより消化され、そしてサザンブロットがペチュニアF3'5'Hコード領域の32P−ラベルされた730塩基対のフラグメントによりプローブされた。フィルターは、0.2×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で洗浄された。レーン１〜12は独立したトランスジェニック植物から単離されたDNAサンプルを示し、そしてレーン13は形質転換されていないWhite Unesco（負の対照）である。バンドは形質転換されていない負の対照においては検出されなかった。レーン14は、Xba Iにより消化された33pgのpCGP1470プラスミドDNAを表わす。
図６は、花弁におけるF3'5'H及びDFR RNAのノザンブロットのオートラジオグラフである。pCGP1470により形質転換されたWhite Unesco植物の花弁（レーン１〜７）、及び非トランスジェニック植物White Unesco花の花弁（レーン８）からの全RNA（10μg/レーン）が分析された。バンドは、レーン８における形質転換されていない負の対照には検出されなかった。レーン９は、ペチュニアハイブリダcv.Old Glory Blueから単離されたRNA10μｇを表わす。A:ノザンブロットがペチュニアF3'5'H cDNAクローンの730bp  EcoR Vフラグメントからの32P−ラベルされたDNAによりハイブリダイズされ、そして２×SSC/1％（w/v）SDSにおいて65℃で0.5時間、洗浄された。B:ノザンブロットがプラスミドpCGP1403からのペチュニアDFR cDNAクローンの32P−ラベルされた1.2kbのSac I/Xba I DNAフラグメントによりハイブリダイズされた（例8aを参照のこと）。
図７は、非トランスジェニックWhite Unesco対照花（左側の白色の花）及びpCGP1470により形質転換されたWhite Unesco植物からの花を表わすカラー写真プレートの黒及び白表示である。形質転換された植物は、紅藤色／青紫色である花を生成する。
元のカラープレートは、出願者から、検査のために入手できる。
例１ DFR変異体品種を用いて花の色を変えるための手段
いくつかの植物、たとえばバラ、カーネーション及びガーベラの花は、それらの遺伝子型に依存して２種のタイプのアントシアニジン、すなわちペラルゴニジン及びシアニジンを生成する。F3'H活性の不存在下で、ペラルゴニジンが生成され；その存在下で、シアニジンが生成される。ペラルゴニジンは通常、ケンフェロール、すなわち無色のフラボノールにより付随される。シアニジン色素は通常、クエルセチン、又はケンフェロール及びクエルセチンの両者のいづれかにより付随される。ペラルゴニジン及びケンフェロールの両者はDHKから誘導され；シアニジン及びクエルセチンの両者はDHQから誘導される（図１）。多くの酵素、たとえばDFR,ANS及び3GTが、着色されたアントシアニンへのジヒドロフラボノール（DHK,DHQ及びDHM）の転換のために必要とされる。第３タイプのアントシアニジン、すなわちデルフィニジンは、F3'5'H活性の天然での不存在のために、それらの植物の花に生成され得ない。
カーネーションにおいて、DFR酵素は、究極的には、花色を担当するアントシアニジン色素に転換されるロイコアントシアニジンに２種のジヒドロフラボノール、すなわちDHK及びDHQを代謝することができる。DHKはロイコペラルゴニジンに転換され、赤色のカーネーションを生ぜしめ、そしてDHQはロイコシアニジンに転換され、深紅色のカーネーションを生成する（Geiissman and Mehiquist,1947;Stichなど.,1992b）（図１を参照のこと）。カーネーションDFRはまた、DHMをロイコデルフィニジンに転換することができる（Forkmannなど.,1987）。しかしながら、天然に存在するカーネーション系は、フラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼ酵素を含まず、そして従って、DHMを合成しない。
ペチュニアDFR酵素は、カーネーションDFRの特異性とは異なった特異性を有する。DHQをロイコシアニジンに転換することができるが、しかしDHKをロイコペラルゴニジンに転換することができない（Forkmannなど.,1987）。F3'5'H酵素を含むペチュニア系において、ペチュニアDFR酵素は、F3'5'Hの作用により生成されるDHMをロイコデルフィニジンに転換することができ、これはさらに変性され、デルフィニジン、すなわち青色の花を担当する色素を生ぜしめる。ペチュニアDFRがDHQ及びDHMの両者を転換することができたとしても、それはデルフィニジンの生成を好むDHMをより効果的に転換することができる（Forkmannなど.,1987）。
カーネーションは他の種からのペチュニアF3'5'Hをコードする核酸分子により形質転換することができ、それにより、DHMの生成及び究極的には、デルフィニジンの蓄積を可能にする（国際特許出願番号PCT/AU94/00265;WO94/28140）。しかしながら、多くのそれらの植物におけるデルフィニジン生成の効率は、カーネーションDFRと基質としてのDHK又はDHQのためのF3'5'H酵素との競争のために低い。従って、有意な量のデルフィニジンの蓄積は、カーネーションDFRの作用により制限される。
本発明者は、デルフィニジン生成の効率が適切な遺伝子構造体を有するDFR変異体品種の形質転換により著しく高められることを示した。そのような系統においては、DFR酵素活性の不在により、アントシアニンの蓄積は存在しない。しかしながら、ペチュニアDFR酵素をコードする核酸分子がこの系統を形質転換するために使用され、そしてフラボノイド3',5'−ヒドロキシラーゼ及び両酵素をコードする核酸が発現される場合、DHKは導入された酵素によりロイコデルフィニジンに及び究極的には、植物の内因性酵素によりデルフィニジン色素に転換される。DFR突然変異体系がまたF3'H突然変異体でもある場合、DHQの生存がほとんど又はまったく存在せず、そして従って、トランスジェニック植物により生成されるアントシアニンのみがデルフィニジン誘導体である。F3'Hの存在下で、シアニジン色素がまた生成され得るが、しかしデルフィニジンは、ペチュニアDFRが基質としてのDHQよりもDHMを用いてより効果的であるので、生成される主要なアントシアニンである。この態様で遺伝的に操作されたカーネーション植物からの花は、紅藤色、青紫、紫及び青又はそれらの種々の色調を包含する広範囲の花の色を生成する。変更された花の色を有するカーネーションの生成における本発明のこの手段の適用の例は、次の例に提供されている。
例２ ジアンタスカリオフィラス（Dianthus caryopayllas）（カーネーション）品種のスクリーニング
a.カーネーションの花のフラボノール分析
例１の手段の適用のために適切な遺伝子型を有するカーネーション品種を同定するために、白色の栽培変種植物を得た。フラボノールを個々から抽出し、そして薄層クロマトグラフィー（TLC）により、例16aに記載されるようにして分析した。それらの品種のすべてに検出される唯一のフラボノールはケンフェロールであり、これはF3'H活性がすべての品種の花において不存在であり又は実質的に低下していることを示唆する。
b.白色カーネーション品種のノザン分析
ノザン分析を例14に記載されるようにして実施した。RNAをゲルからHybond−Ｎフィルター（Amersham）に移した後、フィルターを、32PによりラベルされたANSの290bp  BamH I/Hind III cDNAフラグメント（例６に記載される）によりプローブした。1.2kbpのAsp718/BamH I部分的DFRクローン（例７に記載される）も32Pによりラベルし、そして二重フィルターをプローブするために使用した。プレハイブリダイゼーション（42℃で１時間）及びハイブリダイゼーション（42℃で16時間）を例14に記載されるようにして実施した。フィルターを２×SSC,1％（w/v）SDSにより65℃で１〜２時間洗浄し、そして次に、0.2×SSC,1％（w/v）SDSにより65℃で0.5〜１時間洗浄した。ノザンを−70℃で一晩、オートラジオグラフ処理した。
この分析は、２種の試験されたカーネーション品種がDFRメッセージを有さず、ところが有意なレベルのANS mRNAをまだ生成することを示唆した（図２を参照のこと）。従って、それらの２種のカーネーション品種、すなわちWhite Unesco及びWhite Dianaは、この手段の適用のために正しい遺伝子型のものであると思われた。
c.ロイコアントシアニジンフィード実験
White Diana及びWhite Unescoがロイコアントシアニジンのアントシアニンへの転換のために必要な遺伝子のいづれかにおいて突然変異誘発されなかったことを確かめるために、前駆体フィード実験を実施した。White Diana及びWhite Unescoの花弁セグメントを、ロイコペラルゴニジン及びロイコシアニジンの1mg/ml溶液に配置し、そして室温で16時間、インキュベートした。アントシアニン合成は、個々の場合、花弁の切断された端近くで生じた。
ロイコペラルゴニジンフィードはペラルゴニジンの合成を導びき、そしてロイコシアニジンはシアニジン合成を導びいた。アントシアニジンの同定を、TLC分析により決定した（例16bを参照のこと）。それにより、それらの２種の品種のいづれかが、DFR変異手段を用いての遺伝子操作のための適切な候補であることが示された。さらなる例示は、cv.White Unescoにより提供される。
例３ 生物学的試薬
すべての制限酵素及び他の試薬は市販のものであり、そして一般的に製造業者の説明書に従って使用された。
クロニングベクターpBluescript II（KS+）は、Stratageneから得られた。Sma I−切断されたpUC18クローニングベクターは、Pharmaciaから得られた。
例４ 菌株
次の例に使用される菌株は下記の通りである：
E.コリ（E.coli）：
XL1−Blue
supE44,hadR17（rk-,mk+），recA1,endA1,gyrA96（NalR），thi−1,relA1,lac−，［F'proAB，lac Iq，lacZΔM15,Tn10（tetr）］（Bullock et al.,1987）。
DH5α
SupE44,Δ（lacZYA−ArgF），Ｕ169,φ80lacZΔM15,hadR17（rk-,mk+），recA1,endA1,gyrA96（Nalr），thi−1,relA1,denR（Hanahan,1983:BRL,1986）。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス：
A GLO Lazo et al.（1991）
例５ 植物の成長条件
特にことわらない限り、植物は、最小10,1000ルクスの光の強さ及び22℃〜26℃の温度で14日間、特定の育成部屋において成長せしめられた。
例６ カーネーションアントシアニジンシンターゼcDNAクローンの単離
a.ポリメラーゼ連鎖反応プライマー
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて、カーネーションアントシアニジンシンターゼ（ANS）を表わすDNAフラグメントを単離した。縮重オリゴヌクレオチドを、植物からの２−オキソグルタレート−依存性ジオキシゲナーゼ配列の保存された領域に企画した。オリゴヌクレオチドを、ホスホラミジット化学を用いてApplied biosystems PCR−Mate DNA合成機に基づいて合成した。合成されたオリゴヌクレオチドは次の通りであった：
0003585932.tif 000002
b.カーネーションの花弁からのANSフラグメントの単離
全RNAを、Turpen and Griffith（1986）の方法を用いて、スタージ１でのカーネーションcv.Lagunaの花（Stichなど.,1992a）の花弁から抽出した。オリゴdT（12−18）によりプライムされたcDNAを、製造業者の説明書に従って、SaperscriptTM（BRL）により全RNAの50μｇから合成した。cDNAを、S200回転カラムクロマトグラフィー（Pharmacia）、続いてエタノール沈殿により精製した。PCR増幅を、10mMのトリス−HCl（pH8.3）,50mMのKCl,2mMのMgCl2,0.01％のゼラチン、0.2mMのdATP,0.2mMのdCTP,0.2mMのdGTP,0.2mMのdTTP,0.4μＭの個々のプライマー及び1.25単位のTaqポリメラーゼ（Cetus）の存在下で、50ngのcDNAに対して行なった。その反応混合物（50μｌ）を、95℃で３分;48℃で１分;72℃で１分、それぞれ１回、循環し；そして次に、95℃で１分;48℃で１分;72℃で１分、それぞれ39回、循環した。290塩基対（bp）のDNAフラグメントを生成した。
c.カーネーションANSフラグメントの配列分析
290bpのフラグメントを、TAE緩衝液（40mMのトリス、50mMの酢酸、50mMのEDTA）において、Sea PlaqueTM低ゲル化温度アガロース（FMC）電気泳動により単離した。DNAを、65℃に加熱し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈殿せしめることによりアガロースから抽出した。次に、フラグメントを、Holton and Graham（1991）により記載されるようにして調製されたddT−末端ベクター中に連結した。プラスミドクローンの配列決定を、PrismTM Ready Reaction Dye Primer化学及びDNA Sequencing System 373A（Applied Biosystems）を用いて行なった。EASTA（Pearson and Lipman,1988）を用いてペチュニアANS cDNA（Weissなど.,1993）と比較される場合、カーネーションの配列は、アミノ酸レベルで83％の相同性を示した。この290bpのcDNAフラグメントを、白色カーネーション品種の範囲のノザン分析に使用した（例2bに記載されるようにして）。
例７ カーネーションのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（DFR）cDNAクローンの単離
a.cDNAライブラリーの構成
全RNAを、段階９でのカーネーションcv.Laguna花弁から抽出した（Stichなど.,1992a）。ポリアデニル化されたRNAを、製造業者の説明書に従って、Oligotex（Oiagen）精製システムを用いて選択した。直接的なcDNAライブラリーを、cDNA合成のための鋳型としてポリ（Ａ）+RNA2μｇ、及びSaperscriptTM（BRL）を用いて構成した。DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて、ブラント末端化された第２鎖cDNAを合成し、そしてEcoR Iアダプターに連結した。Xho Iによる消化の後、cDNAを、S200カラム（Pharmacia）上でサイズ分別した。cDNAの1/3を、１μｇのUni−ZapTM XRベクター（Stratagene）により連結した。連結を４℃で４日間行ない、そして次に、PackageneTM（Promega）を用いてパックした。得られるライブラリーは、1.5×105のプラーク形成単位（p.f.u.）を含み、そして寒天プレートからファージ貯蔵緩衝液（100mMのNaCl,10mMのMgCl2,10mMのトリス−HCl（pH7.4）,0.05％（w/v）のゼラチン）中にバクテリオファージを溶出することによって増幅した。
b.cDNAライブラリーのスクリーニング
約100,000のp.f.u.をNZYプレート上にプレートし（10,000pfu/プレート）,37℃で８時間、及び４℃で１時間インキュベートした。その後、二重のコロニーをColong/Plaque  ScreenTMフィルター（DuPont）上に取り、そして製造業者により説明されるようにして処理した。ハイブリダイゼーションの前、二重フィルターを、50mMのトリス−HCl,pH8.0,1MのNaCl,1mMのEDTA,0.1％（w/v）サルコシンの溶液（予備洗浄溶液）により42℃で30分間、予備洗浄し、続いて0.4MのNaOHにより及び中和溶液（0.5Mのトリス−HCl,pH8.0,1.5MのNaCl）により同様にして洗浄した。２×SSCによりすすいだ後、コロニーを、６×SSC（0.6MのNaCl,0.06Mのクエン酸ナトリウム）,0.5％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）,0.1％のポリビニル−ピロリドン（PVP）,0.1％（w/v）のウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％のficoll,0.01Mのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び100mg/mlの変性されたニシン精子DNAの溶液において、予備ハイブリダイズし（42℃,1時間）、そしてハイブリダイズした（42℃、一晩）。pCGP1403（例８）からの十分な長さの32P−ラベルされたペチュニアジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（DFR）cDNAクローンを、ハイブリダイゼーションのために使用した。フィルターを２×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で洗浄し、そして増強スクリーンを有するKodak XARフィルムに−70℃で16時間、暴露した。
c.カーネーションDFR cDNAクローンの配列分析
単離されたクローンを、PrismTM Ready Reaction Dye Primer化学及びDNA Sequencing System 373A（Applied Biosystems）を用いて配列決定した。１のつクローンは、ペチュニアのDFRと相同性を有することが見出された。このクローンは、1.2キロ塩基対（kbp）のcDNA挿入体を含み、そして部分的なDFRクローンのみであるように見えた。
完全なcDNA挿入体の二本鎖DNA配列を、ショットガンクローン配列決定手段を用いて得た。DFR cDNAフラグメントを精製し、自己連結し、そして超音波により剪断した（結合されるマイクロプロープを有するBranson音波処理機から20wで４×７秒の破壊）。フラグメント端をT4 DNAポリメラーゼを用いて修復し、そしてTAEランニング緩衝液におけるアガロースゲル電気泳動を用いて、350〜600bpの範囲でサイズ分別した。フラグメントをGeneclean（Biolol）を用いて精製し、Sma I−切断されたpUC18中に連結し、そして個々のクローンを配列決定した。FASTAプログラム（Pearson and Lipman,1988）を用いてのSwissprotタンパク質データベースとのカーネーション配列の比較は、ペチュニアDFR cDNAとアミノ酸レベルで66.9％の同一性及びキンギョソンDFRと65.7％の同一性が存在することを示した。この1.2kbpの部分的DFRクローンを、白色カーネーション品種の範囲のノザン分析のために使用した（例2bに記載されるようにして）。
例８ ペチュニアDFR遺伝子配列の単離
a.機能的DFR cDNAクローンの単離
十分な長さのペチュニアDFR cDNAを単離するために、200,000クローンのペチュニアハイフリダ（Petunia hybrida）cv.Old Glory Blue λZAP cDNAライブラリー（Holtonなど.,1993）を、前記のペチュニアcDNAクローンの12P−ラベルされた1kbのフラグメントを用いてスクリーンした（Bruglieraなど.,1994）。20のクローンがこのプローブと強くハイブリダイズした。それらのクローンを取り、そしてプラスミドをインビトロで切り出した。DNA配列分析は、それらのクローンの８つが、公開された配列（Beldなど.,1989;Huitsなど.,1994）と比較される場合、DFRの全タンパク質コード領域を含んだことを示した。
プラスミドpCGP1403に含まれる８個の完全な長さのペチュニアDFR cDNAクローンの１つを用いて、例７に記載されるようにして、カーネーションcDNAライブラリーをスクリーンした。この完全な長さのクローンを植物発現ベクター中にサブクローン化し、次の通りに機能について試験した。DFR cDNAを含む、pCGP1403の1.5kbのAsp718/BamH Iフラグメントを、ベクターpCGP40（国際特許出願番号PCT/AU92/00334〔WO93/01290〕）のAsp718/BamH I消化物により連結した。得られるプラスミド（pCGP1406）は、MACプロモーター（Comaiなど.,1990）とマンノピンシンターゼ（mas）ターミネーター（Comaiなど.,1990）との間にペチュニアDFR cDNAを含んだ。このプラスミドのBgl II消化物を、例９に記載されるようにして、pCGP1407の構成に用いた。
プラスミドpCGP1406におけるcDNAクローンは、ペチュニアハイブリダcv.Br140の花弁の衝撃により機能的であることが示された。Br140は、an6遺伝子座での突然変異のためにDFR活性を欠いており、その結果、その花は白色であり、そしてアントシアニンを生成しない。しかしながら、pCGP1406との花弁の衝撃の後、着色された細胞がアントシアニン合成のために生成され、これは、このプラスミドに存在するDFR遺伝子フラグメントが機能したことを示唆する。
b.機能的DFRゲノムクローンの単離
ゲノムライブラリーを、ベクターλ2001（Holton,1992）におけるペチュニアハイブリダcv.Old Glory Blue DNAから製造した。約200,000p.f.u.をNZYプレート上にプレートし、リフトをNENフィルター上に取り、そしてそのフィルターを、400,000cpm/mlの32P−ラベルされた1kbのペチュニアDFR cDNAフラグメントによりハイブリダイズした（上記8aを参照のこと）。ハイブリダイズするクローンを精製した。DNAを個々から単離し、そして制限酵素消化により位置決定した。それらのクローンの１つの13kbのSac Iフラグメントを単離し、そしてSac I−切断されたpBluescript IIにより連結し、pCGP1472を創造した。プラスミドpCGP1472におけるゲノムクローンはまた、ペチュニアハイブリダcv.Br140花弁の衝撃により機能することが示された。pCGP1472による花弁の衝撃の後、着色された細胞が、アントシアニン合成のために生成された。精密な地図は、5kbのBgl IIフラグメントが完全なDFR遺伝子を含むことを示唆した。この5kbのフラグメントが、例10に記載されるように、pCGP1473の構成に使用された。
例９ pCGP1470の構成
プラスミドpCGP485（国際特許出願PCT/AU94/00265〔WO94/28140〕）をPst Iにより消化し、キンギョソンCHSプロモーター配列、ペチュニアHf1 cDNAフラグメント及びペチュニアリン脂質トランスファータンパク質ターミネーター配列から成る3.5kbの遺伝子構造体を放した（国際特許出願PCT/AU92/00334〔WO93/01290〕）。そのフラグメントのオーバーハング3'端を、標準の技法（Sambrookなど.,1989）に従ってT4 DNAポリメラーゼにより除去し、その後、二元ベクターpWTT2132（DNAP）のSma I部位中に連結した。その得られるクローンをpCGP1452と命名した。
MACプロモーター（Comaiなど.,1990）、ペチュニアDFR cDNA（例15）及びマンノピンシンターゼ（mas）ターミネーター（Comaiなど.,1990）を含む3.4kbの遺伝子構造体を、Bgl IIフラグメントとしてpCGP1406から単離した（例8aを参照のこと）。得られる5'−オーバーハングを、標準の技法（Sambrookなど.,1989）に従って、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて“フィルイン”した。次に、そのフラグメントを、Pst I制限された、T4 DNAポリメラーゼ処理されたpCGP1452中に連結し、pCGP1470を創造した。pCGP1470の地図は図３に与えられている。
例10 pCGP1473の構成
ペチュニアDFRゲノムクローンpCGP1472（例8bに記載される）からの5kbのBgl IIフラグメントを単離し、そしてその得られる5'−オーバーハングをDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて“フィルイン”した。そのフラグメントを、Pst I−制限酵素処理された、T4 DNAポリメラーゼ処理されたpCGP1452中に連結し、pCGP1473を作製した。pCGP1473の地図は図４に示される。
例11 E.コリ及びA.ツメファシエンスの形質転換
通常の操作のために使用されるE.コリ株DH5α及びXL1−Blueを、Inoueなど.,（1990）の方法を用いて形質転換した。
プラスミドpCGP1470及びpCGP1473を、50mlのMG/L（Garfinkel and Nester,1980）培養物を接種し、そして28℃で16時間、振盪しながら増殖することによって調製されたコンピテントアグロバクテリウムツメファシエンス100μｌにプラスミドDNA5μｇを添加することによって、アグロバクテリウムツメファシエンス株AGLO中に導入した。次に細胞をペレット化し、そして1mlの20mMのCaCl2中に再懸濁した。DNA−アグロバクテリウム混合物を、液体窒素において２分間インキュベートすることによって連結し、そして次に、37℃で５分間のインキュベーションにより融解した。次に、その細胞を1mlのMG/L培地と共に混合し、そして28℃で４時間、振盪しながらインキュベートした。pCGP1470又はpCGP1473を担持するA.ツメファシエンスの細胞を、50μg/mlのテトラサイクリンを含むMG/L寒天プレート上で選択した。プラスミドの存在が、テトラサイクリン耐性の形質転換体から単離されたDNAのサザン分析により確認された。
例12 DFR及びF3'5'Hをコードする核酸分子によるジアンタスカリオフィラス（Dianthus caryophyllus）（カーネーション）cv.White Unescoの形質転換
a.植物材料
カーネーションcv.White Unescoの切り枝を、Van Wyk and Son Flower Supply,Victoria,Australiaから入手した。外側の葉を除去し、そしてその切り枝を、70％（v/v）のエタノール、続いて1.25％（v/v）の次亜塩素酸ナトリウム（Tween 20と共に）により６分間、すばやく殺菌し、そして滅菌した水により３度すすいだ。すべての見える葉及び腋芽を、同時培養の前、切開用顕微鏡下で除去した。
b.アグロバクテリウム及びカーネーション組織の同時培養
二元ベクターpCGP1470又はpCGP1473を含むアグロバクテリウムツメファシエンス株AGLO（Lazoなど.,1991）を、50mg/lのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で４℃で維持した。単一のコロニーを、50mg/lのテトラサイクリンを含む液体LBブイヨンにおいて一晩、増殖し、そして次の日、５×108個/mlに希釈し、次に接種した。カーネーションの茎組織をアグロバクテリウムと共に５日間、３％（w/v）のスクロース、0.5mg/lのベンジルアミノプリン、0.5mg/lの2,4−ジクロロフェノキシ−酢酸（2,4−Ｄ）、100μＭのアヤトシリンゴン及び0.25％（w/v）のGelrite（pH5.7）により補充されたMS培地上で同時培養した。
c.トランスジェニックカーネーション植物の回収
形質転換された茎組織の選択のために、個々の同時培養された茎の上部６〜8mmを、３〜4mmのセグメントに切断し、次にこれを、0.3％（w/v）のスクロース、0.5mg/lのBAP,0.5mg/lの2,4−D,1μg/lのクロルスルフロン、500mg/lのチカルシリン及び0.25％（w/v）のGelriteにより補充されたMS培地（Murashige and Skoog,1962）に移した。２〜３週間後、外植体を、0.3％のスクロース、0.16mg/lのチジアズロン（TDZ）、0.5mg/lのインドール−３−酪酸（IBA）、２μg/lのクロルスロフロン、500mg/lのチカルシリン及び0.25％（w/v）のGelriteを含む新鮮なMS培地に移し、そしてこの段階で注意して、茎外植体から腋芽を除去した。３週間後、健康な偶発性の苗条を、３％（w/v）のスクロース、３μg/lのクロルスルフロン、500mg/lのチカルシリン、0.25％（w/v）のGelriteを含む、ホルモンフリーのMS培地に移した。３μg/lのクロルスルフロンで生存する苗条を、３％（w/v）のスクロース、500mg/lのクロルスルフロン及び0.25％（w/v）のGelriteにより補充された苗条成長のためのMS培地に移した。
２〜３週間後、葉を、選択から生存した苗条から取り、そして0.22mg/lのTDZ,0.5mg/lのIBA,3μg/lのクロルスルフロン、500mg/lのチカルシリン及び0.25％（w/v）のGelriteにより補充されたMS培地から成る再生培地上に置き、選択の存在下で苗条の再生を得た。再生された苗条を、５μg/lのクロルスルフロン、500mg/lのチカルシリン及び0.25％（w/v）のGelriteを含むホルモンフリーのMS培地に２〜４週間移し、次に、200mg/lのチカルシリン及び0.4％（w/v）のGelriteを含むホルモンフリーのMS培地を含むガラスジャーに標準化のために移した。Suncaps（Sigma）をガラスジャーの上部に配置し、苗条の標準化を促進した。すべての培養物は、23℃±２℃で、16時間の光周期（120μE/m2/秒の冷白色螢光）下で維持された。標準化された苗条（約1.5〜2.0cmの高さ）を、3g/kgのIBA根付き粉末上で根付かせ、そして噴霧下で順応せしめた。75％のパーライト/25％のピートを含む土壌混合物を順応のために使用し、これは14時間の光周期（200μE/m2/秒のハロゲン化水銀光）下で23℃で行なわれ、そして典型的には３〜４週間、続いた。植物を、1g/lのCaNCO3、及び微量元素及び4.7:3.5:29.2の比でのN:P:Kの混合物（0.75g/l）を含むカーネーション用混合物により生長を促した。
例13 サザン分析
a.カーネーションからゲノムDNAの単離
DNAを、Lassnerなど.,（1989）の方法を用いて、葉の組織0.3〜0.5gから単離した。
b.サザンブロット
約１μｇのゲノムDNAをXba Iにより消化し、そしてTAEのランニング緩衝液において１％（w/v）アガロースゲルを通して電気泳動した。次に、DNAを、変性溶液（1.5MのNaCl/0.5MのNaOH）において0.5〜1.0時間、変性し、0.5Nのトリス−HCl（pH7.5）/1.5MのNaClにおいて0.5〜1.0時間、中和し、そして次に、DNAを、20×SSCにおけるHybond−Ｎ（Amersham）フィルターに移した。
フィルターを、ペチュニアHf1 cDNAクローンの730bp  EcoR Vフラグメントからの32P−ラベルされたDNA（108cpm/μg,2×106cpm/ml）によりハイブリダイズした。フィルターを２×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で１時間洗浄し、そして次に、0.2×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で１時間洗浄した。
クロルスルフロンに基づく選択の後に得られた推定上のトランスジェニックカーネーション植物のサザン分析は、図５に示されるように、F3'5'Hをコードする核酸分子を含んで成る遺伝子構造体のゲノム中への組込みを確認した。下記例14に記載されるようにして行なわれた、pCGP1470により形質転換されたカーネーション植物からの花のノザン分析は、F3'5'H及びDFRを定義するその導入された核酸分子が両者とも発現されたことを確認した（図６を参照のこと）。
例14 ノザン分析
全RNAを、液体窒素において凍結され、そして乳鉢及び乳棒を用いて細かな粉末に粉砕された組織から単離した。4Mのグアニジンイソチオシアネート、50mMのトリス−HCl（pH8.0）,20mMのEDTA,0.1％（w/v）のSarkosylの抽出緩衝液を組織に添加し、そしてその混合物をポリトロンを用いて最大速度で１分間、均質化した。その懸濁液をMiraclothを通して濾過した後、それをJA20ローターを用いて10,000rpmで10分間、遠心分離した。その懸濁液をきれいな管に移し、そして0.2gのCsClをそれぞれのmlの上清液に対して添加した。CsClを混合することによって溶解し、そして次に、サンプルを38.5mlの即密封性遠心分離管（Beckman）において5.7MのCsCl,50mMのEDTA（pH7.0）の緩衝液10ml上に積層し、そしてTi−70ローターを用いて23℃で12〜16時間、42,000rpmで遠心分離した。ペレットをTE/SDS（10mMのトリス−HCl（pH7.5）,1mMのEDTA,0.1％のSDS）に再懸濁し、そして10mMのEDTA（pH7.5）により飽和されたフェノール：クロロホルム（1:1）溶液により抽出した。エタノール沈殿に続いて、RNAペレットをTE/SDSに再懸濁した。
RNAサンプルを、40mMのモルホリノ−プロパンスルホン酸（pH7.5）、5mMの酢酸ナトリウム、0.1mMのEDTA（pH8.0）を含むランニング緩衝液を用いて2.2Mのホルムアルデヒド/1.2％（w/v）のアガロースゲルを通して電気泳動した。RNAを製造業者により説明されるようにしてHybond−Ｎフィルター（Amersham）に移し、そして適切な32P−ラベルされたcDNAフラグメント（108cpm/μg,2×106cpm/ml）によりプローブした。ハイブリダイゼーション（42℃で１時間）及びハイブリダイゼーション（42℃で16時間）を、50％（v/v）のホルムアミド、1MのNaCl,1％（w/v）のSDS,10％（w/v）のデキストランスルフェートにおいて実施した。変性されたニシン精子DNA（100μg/ml）を、ハイブリダイゼーション段階のために32P−ラベルされたプローブと共に添加した。
フィルターを、２×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で１時間、及び次に、0.2×SSC/1％（w/v）SDSにより65℃で１時間、洗浄した。すべてのフィルターを、−70℃で48時間、強化スクリーンを有するKodak XARフィルムに暴露した。
例15 変更された花の表現型
DFR/F3'H変異体カーネーション品種White UnescoにおいてF3'5'H及びDFRを表わす導入された核酸分子の発現は、花色に対して著しい効果を有した。非トランスジェニック植物の花は白色であり、そしてトランスジェニック植物は、紅藤色／青紫色である花を生成する。観察される色の変化はまた、Royal Horiticultural Society's Colour Chartからの数字により記載され得る。一般的に、その変化は、80〜98の色の基準により表わされる白から紫／青紫／青の色相に色を移動するものとして記載され得る。
達成され得る可能な色の変化を制限することを望むものではないが、形質転換されたWhite Unesco植物の花に観察される色のいくつかは、白色（形質転換されていない）から84B/C（形質転換された）に変化されたものとして記載され得る。さらに、導入された核酸分子の発現を指図するためへのより強いプロモーターの使用は、さらに一層の量のデルフィニジン色素の生成を可能にし、それにより、より青色の色相の色の開発を可能にする。他の生化学及び生理学的条件、たとえば花弁のpH、同時色素形成の程度及びアントシアニンのアシル化の程度がまた、個々の結果に影響を及ぼすであろうことを思い出すべきである。それらは、他の適切な品種の形質転換により、又はpH、同時色素形成又はアシル化に影響を及ぼす核酸分子による同時形質転換により操作され得る。これがより青色の色相の色の開発を可能にする。達成される特定の色の例証は、可能な範囲を定義し、又は制限するものとして解釈されるべきでない。
例16 フラボノイド分析
a.フラボノールのTLC分析
約0.5gの新鮮なカーネーション花弁組織を、1.5mlの微小遠心分離管（Eppendorf）における2MのHCl 1mlに添加し、そして煮沸水槽において30分間、加熱した。細胞残骸を、14,000rpmでの５分間の遠心分離によりペレット化し、そして上清液500μｌをきれいな微小遠心分離管に移した。フラボノイドを200μｌの酢酸エチルにより抽出し、そして短時間、遠心分離し、相を分離した。上部（酢酸エチル）相を新しい微小遠心分離管に移し、Speed Vac Concentrator（Savant）において真空下で乾燥せしめ、そして酢酸エチル15μｌに再懸濁し、そして２μｌのアリコートをセルロースTLCシート（20cm×20cm,Merck）上にスポットし、そしてForestal溶媒（30部の酢酸:3部のHCl:10部の水）において約３〜４時間、運転した。次に、TLCプレートを空気乾燥せしめ、そしてフラボノールを紫外線下で観察した。
b.アントシアニジンのTLC分析
２つのカーネーション花弁を、1.5mlの微小遠心分離管（Eppendorf）における2MのHCl 1mlに添加し、そして煮沸水槽において30分間、加熱した。細胞残骸を、14,000rpmでの５分間の遠心分離によりペレット化し、そして上清液500μｌをきれいな微小遠心分離管に移した。アントシアニジンを200μｌのイソ−アミルアルコール（IAA）により抽出し、そして短時間、遠心分離し、相を分離した。上方の相（IAA）を新しい管に移し、真空下で乾燥せしめ、そして20μｌのIAAに再懸濁し、そして１μｌのアリコートをセルロースTLCシート（20×20cm,Merck）上にスポットし、そしてForestal溶媒において約３〜４時間、運転した。TLCプレートを空気乾燥せしめ、そしてアントシアニジンを通常の光下で観察した。
c.アントシアニジンのHPLC分析
アントシアニンを抽出し、そして2MのHCl 1mlにより約0.5gのカーネーション花弁を100℃で30分間インキュベートすることによって加水分解した。アントシアニジンをIAA 200μｌにより抽出した。この混合物の1/4を真空下で乾燥せしめ、そして50％アセトニトリル200μｌおよび0.5％TFA（トリフルオロ酢酸）に再懸濁した。５μｌのアリコートを、10分間にわたっての50％Ｂ〜60％Ｂ、次に10分間にわたっての60％Ｂ及び最後に、５分間にわたっての60％Ｂ〜100％Ｂのグラジエント条件を用いてのグラジエント溶離によるHPLCにより分析し、ここで溶媒ＡはTFA:水（5:995）から成り、そして溶媒Ｂはアセトニトリル:TFA:水（500:5:495）から構成された。Asahi Pac ODP−50遠心分離カラム（250mm×4.6mm、内径）を、逆相クロマトグラフィー分離のために使用した。流速は1ml/分であり、そして温度は40℃であった。アントシアニジンの検出を、400〜650nmで、Shimadzu SPD−M6A立体検出器を用いて行なった。
例17 DNA−被覆されたマイクロプロジクチルによるペレットの衝撃
１μｍの金粒子を用いての粒子衝撃を、Sanfordなど.,（1993）により実質的に記載されるようにして行なった。1100psiの破壊ディスクを有するBio−Rad  PDS−100ヘリウム−駆動ガンを、すべての衝撃のために使用した。花弁を開花しているカーネーションの花の芽から切り出し、そしてMS培地（＋0.25％のGelrite）のプレートの上部に配置し、その後、衝撃を与えた。個々のプレートを、独立して調製されたDNA−被覆された金粒子群により２度、衝撃を与えた。衝撃のために使用されるプラスミドDNAを、CsClグラジエント法（Sambrookなど.,1989）又はQiagenカラム（Qiagen）のいづれかを用いて精製した。１μｇのDNAを、１回のショット当たりに使用した。
例18 DNAプローブの32P−ラベリング
DNAフラグメント（50〜100ng）を、オリゴラベリングキット（Bresatec）を用いて、50μCiの〔α−32P〕−dCTPにより放射性ラベル化した。組込まれなかった〔α−32P〕−dCTPを、Sambrookなど.,（1989）により記載されているようにして、Sephadex G−50（Fine）カラム上でのクロマトグラフィー処理により除去した。
当業者は、本明細書に記載される発明が、特別に記載されているもの以外の変更及び修飾を実施できることを認識するであろう。本発明はすべてのそのような変更及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に言及され又は示唆されるすべての段階、特徴、組成物及び化合物を、個々に又は集合的に、並びにいづれか複数の前記段階又は特徴のいづれか及びすべての組合せを包含する。
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配列の列挙
（１）一般情報：
（ｉ）出願者:INTERNATIONAL FLOWER DEVELOPMENTS PTY LTD
（ii）発明の名称：変更された花の色を示すトランスジェニック植物及びその生成方法
（iii）配列の数:2
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:23個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号1:
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（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:20個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号2:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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