(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主に形質転換されたとき、該宿主の細胞表面でトロンビンレセプターを生産し得る発現系を含む核酸分子であって、該発現系が、該宿主中で作動可能な異種の調節配列に作動可能に連結された以下のヌクレオチド配列：
（ａ）以下のアミノ酸配列に示される哺乳類トロンビンレセプターをコードする以下のヌクレオチド配列
【化１】
0003556215.tif 000012
【化２】
0003556215.tif 000013
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｃ）以下のアミノ酸配列：
【化３】
0003556215.tif 000014
【化４】
0003556215.tif 000015
に示される該トロンビンレセプターをコードする縮重ヌクレオチドアナログ；または
（ｄ）以下に示されるアミノ酸配列
【化５】
0003556215.tif 000016
【化６】
0003556215.tif 000017
において１または数個のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
を含み、該トロンビンレセプターは、ペプチドSFLLRNにより活性化される、核酸分子。
【請求項２】
（ａ）以下のアミノ酸配列：
【化７】
0003556215.tif 000018
【化８】
0003556215.tif 000019
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）トロンビンレセプターのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、
を有するトロンビンレセプターであって、
該トロンビンレセプターは、ペプチドSFLLRNにより活性化される、トロンビンレセプター。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子で形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項４】
細胞表面で哺乳類トロンビンレセプターを発現する細胞を生産する方法であって、該トロンビンレセプターをコードするヌクレオチド配列が発現する条件下で請求項３に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項５】
候補物質のトロンビンレセプターアゴニスト活性を測定する方法であって、以下の工程：
トロンビンレセプターをコードするヌクレオチド配列を発現する条件下で培養された請求項３に記載の細胞を該物質の存在下および非存在下でインキュベートする工程、および
該物質の存在下で該細胞上で生産されたトロンビンレセプターの活性化の存在、非存在または量を、該物質の非存在下と比較して検出する工程であって、これにより該物質の非存在下と比較した場合、該物質の存在下での活性化は、該物質がトロンビンレセプターアゴニストであることを示す工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
トロンビンレセプターアンタゴニストとして作用する候補物質の能力を評価する方法であって、以下の工程：
トロンビンまたはトロンビンレセプターアゴニストの存在下、および該候補物質の存在下および非存在下で、トロンビンレセプターをコードするヌクレオチド配列を発現する条件下で培養された請求項３に記載の細胞をインキュベートする工程、および
該候補物質の存在下および非存在下で該細胞の表面上でトロンビンレセプターの活性化を測定する工程であって、これによって該候補物質の存在下の該活性の減少が該候補物質のアンタゴニスト活性を示す工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
哺乳類トロンビンレセプタータンパク質またはその部分と特異的に免疫反応性の抗体またはそのフラグメントであって、該トロンビンレセプタータンパク質が、以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下のアミノ酸配列
【化９】
0003556215.tif 000020
【化１０】
0003556215.tif 000021
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）トロンビンレセプターのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、
を有し、該トロンビンレセプターは、ペプチドSFLLRNにより活性化される、抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体であって、前記部分がトロンビン−結合部分であるか、または前記部分がトロンビンプロテアーゼ標的部分であるか、または前記抗体が、活性化されたトロンビンレセプターと特異的に免疫反応性であるかまたはトロンビンレセプターの少なくとも一種の細胞外ループと特異的に免疫反応性であるか、またはトロンビンレセプターの開裂された活性化ペプチドと特異的に反応性である、抗体。
【請求項９】
活性化されたトロンビンレセプターをインシトゥに局在化するためのキットであって：
活性化されたトロンビンレセプターに特異的な、一定量の抗体またはそのフラグメント；
該活性化されたトロンビンレセプターを持つと疑われる被験体に、一定量の該抗体またはそのフラグメントを投与すること、および該抗体またはそのフラグメントの位置を検出することを指示する指示書、
を備え、
該トロンビンレセプターが、以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下のアミノ酸配列
【化１１】
0003556215.tif 000022
【化１２】
0003556215.tif 000023
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）トロンビンレセプターのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、
を有し、該トロンビンレセプターは、ペプチドSFLLRNにより活性化される、キット。
【請求項１０】
サンプルを分析するための方法であって、以下の工程：
哺乳類被験体の生物学的流体の試料をトロンビンレセプターの開裂された活性化ペプチドの存在、非存在または量を測定する検出系と接触させる工程；および
該開裂されたペプチドの存在、非存在または量を検出する工程であって、これにより、該開裂されたペプチドの存在、非存在または量が、血栓症の存在または非存在と相関され、
該トロンビンレセプターが、以下のアミノ酸配列：
（ａ）以下のアミノ酸配列
【化１３】
0003556215.tif 000024
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）トロンビンレセプターのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、
を有し、該トロンビンレセプターは、ペプチドSFLLRNにより活性化される、
工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、循環系の制御に関連した物質に関し、特に、トロンビンおよびその細胞レセプターによって仲介される活性に関する。より詳細には、本発明は、トロンビンレセプターの生産に有用な組換え物質、診断手段としてのレセプターの使用、およびトロンビンレセプター活性化およびレセプターに関連した診断組成物を刺激またはブロックする治療剤に関する。
技術背景
トロンビンは、循環系の状態を制御する強力な因子である。トロンビンが、ファブリノーゲンから、たいていの凝血の必要欠くべからざるフィブリンへの変換を触媒することによって、血液凝固の形成を補助することは明白である。さらに、トロンビンは、血液中および血管内壁中の細胞に直接作用し、特に血小板を活性化して凝血を形成することが公知である。トロンビンで誘導された血小板活性化は、心筋梗塞、ならびにある形態の不安定な狭心症および脳卒中を引き起こすプロセスである、動脈血栓形成に特に重要である。さらに、トロンビンは炎症および他の細胞活性を促進する。トロンビンは、単球に対して走化性であり、リンパ球に対して細胞分裂促進性であり、内皮細胞に、好中球粘着性タンパク質GMP−140をその表面に発現させ、これらの細胞の増殖を阻害する。トロンビンは、血小板由来の増殖因子を内皮から誘導し、そして間葉細胞の分裂促進因子である。
トロンビンは、細胞を直接活性化することができるので、少なくとも１つのトロンビンレセプターが存在すると想定される。しかし、従来の結合研究では、トロンビンレセプターの存在を検出することが可能ではなかった。なぜなら、トロンビンは、トロンビンに対する細胞応答を直接仲介しない、細胞上に存在する多数の物質を結合し得、バックグラウンドレベルの結合がかなり高いからである。
同定されているトロンビン結合性タンパク質は、トランスダクション分子として機能しないようである（Gronke,R.S.ら、J Biol Chem（1987）262:3030−3036;Okamura,T.ら、J Biol Chem（1987）253:3435）。生理学的に不活性な改変されたトロンビンは、トロンビン自身と同様に血小板に結合するようである。従って、従来の結合研究で同定される結合部位は、機能的トロンビンレセプターと関連し得ない。また、トロンビンはプロテアーゼであるため、そのレセプターがトロンビンとの相互作用によってタンパク質分解で開裂されるなら、レセプターのトロンビンへの強力な結合能力は低下し得る。上記の要素はすべて、トロンビンレセプターを発見しようとする従来の結合研究が、最終的には非生産的であり得ることを示唆している。
トロンビンレセプターが存在し得ることが想定されている一方、トロンビンによるタンパク質分解いよる開裂がそのレセプター活性化に関与しているか否かは、これまでに行われた研究からでも明白でない。トロンビンが、トロンビンを共有結合によって改変し、トロンビンをタンパク質分解によって不活性にする試薬で処理されると、血小板を刺激するトロンビンの能力は破壊される（Berndt,M.C.ら、"Platelets in Biology and Pathology"（1981）Elsevier/North Holland Biomedical Press,pp.43−74;Martin,B.M.ら、Biochemistry（1975）14:1308−1314;Tollefsen,D.M.ら、J Biol Chem（1974）249:2646−2651;Phillips,D.R.,Thrombin Diath Haemorrh（1974）32:207−215;Workman,E.F.ら、J Biol Chem（1977）252:7118−7123;Greco,N.J.ら、Blood（1990）75:1983−1990）。上記の報告に記載の改変された形態のトロンビンは、活性部位を占めるかさばった（bulky）または荷電した部分および基質に結合するトロンビン表面の辺縁の付加領域をまた含む（Bode,W.ら、Embo J（1989）８:3467−3475）。事実、化学的に改変されたトロンビンの中には、トロンビンで誘導された血小板活性化をブロックするものがあり、血小板活性化をブロックする１つの改変されたタンパク質分解性でないトロンビンである、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニルクロロメチルケトン（PPACK）トロンビンは、基質に結合しない。従って、プロテアーゼ活性の欠乏が、血小板を活性化しないことの原因であるとは結論できない。
本願に記載の研究中に、２つのグループは、トロンビン応答性細胞系から調製されるメッセンジャーRNAが、アフリカツメガエル卵母細胞に微量注入されると、卵母細胞にトロンビン応答性を供与すると報告している。mRNAは、ハムスターの肺の線維芽細胞系CCL39（Van Obberghen−Schilling,E.ら、FEBS Letters（1990）262:330−334）またはヒト臍静脈内皮細胞（Pipili−Synetons,E.ら、Biochem Biophys Res Commun（1990）171:913−919）から調製された。
本明細書に記載のように、トロンビンレセプターを同定し特徴づけると、循環系における血栓症を制御し得るシステムおよび物質の設計が可能になる。さらに、この研究によって、循環状態を評価するための新しい診断試薬が提供される。
発明の開示
本発明は、哺乳類における循環系の制御に有用な方法および物質を提供する。トロンビンによって活性化される細胞の表面に関連するトロンビンレセプターの単離、組換え生産および特徴づけにより、これらの機能が有効に制御される。
従って、１つの局面では、本発明は、トロンビンレセプターの生産に関連する組換え物質に関する。これらには、例えば、培養されることにより、その表面上にトロンビンレセプターを示すことが可能なトランスフェクトされた細胞が含まれ、そしてそれ故物質と天然のトロンビンレセプターとの相互作用をアッセイするシステムを提供する。これらの細胞またはレセプターの関連部分を有するペプチドは、試料中のトロンビンのレベルを決定する診断薬、およびインビボにおいてトロンビン活性に影響を与える候補物質をスクリーニングする手段として使用され得る。
他の局面において、本発明は、活性化形態のレセプタータンパク質の細胞外部分を模倣するトロンビンレセプターアゴニストに関する。これらのアゴニストは、例えば、血有病者の内出血部位に局部付与することによって、血小板凝血形成を促進するのに有用である。アゴニストはまた、線維芽細胞増殖を刺激するトロンビンの能力を模倣するため、創傷治癒の促進に有用であり得る。
さらに他の局面において、本発明は、トロンビンレセプターのアンタゴニストに関する。これらのアンタゴニストは、レセプターの活性化に必要な重要な特徴を欠く、改変された形態のトロンビンレセプターアゴニストペプチドを含む。これらのアンタゴニストは、レセプターに結合するが、レセプターを活性化せず、トロンビンによるレセプター活性化を防止する。
トロンビンの作用を拮抗する本発明の第２グループの化合物は、事実、トロンビン阻害剤である。このグループは、通常にはレセプターの開裂およびトロンビン結合領域を示すであろうレセプターの模倣を含み、非開裂性ペプチドおよびトロンビンに対する結合が向上したペプチドを含む。これらのペプチドは、トロンビンに直接結合し、レセプターに結合し得るトロンビンのレベルを低下させ得る。従って、これらのペプチドは、トロンビンで誘導された血小板凝固、フィブリノーゲン凝血および細胞増殖などのトロンビン仲介事象を減少または防止する。
アンタゴニストとして作用する第３グループの化合物は、トロンビンレセプターのアニオン領域に、それと入れ替わる代替アニオン領域を提供することによって、レセプターへのトロンビンの結合をブロックする。これらのアンタゴニストは、レセプターのトロンビン結合部分に含まれるアニオン領域の模倣である。これらのアンタゴニストはまた、トロンビンに結合し、トロンビンと無傷のレセプターとの相互作用を防止する。
逆に、トロンビンリガンドに存在するカチオン領域を模倣する代替カチオン領域は、レセプターの結合領域を占有するアンタゴニストに含まれ、トロンビンの結合を防止し得る。
第５グループのアンタゴニストは、レセプタータンパク質の特異的領域を結合するように設計される抗体を含み得る。一般に、これらのアンタゴニストは、トロンビンレセプターの任意の所望の領域に対して高い特異性を有するモノクローナル抗体調製物である。本発明の抗体はまた、レセプタータンパク質の免疫アッセイ、例えば、組換えシステムにおいて遺伝子が首尾よく発現していることを評価するのに有用である。
第６グループのアンタゴニストは、改変された形態の、タンパク質分解活性を欠くトロンビンを含む。
他の局面では、本発明は、組換えトロンビンレセプターを用いてアゴニストとアンタゴニストとをスクリーニングするアッセイシステムに関する。あるシステムは、アゴニストペプチドを用いて、アゴニストの効力を阻害するアンタゴニストをスクリーニングする。
本発明の他の局面は、血栓症の尺度として活性化されたときにトロンビンレセプターから開裂されたペプチドを、血液または尿などの液体中で検出することによる、循環系疾患の診断に関する。本発明に含まれる他の診断方法は、活性化レセプターに特異的な抗体を用いて、インシトゥ（in situ）のこれらの標的を位置付け、イメージ化することによる、活性化形態のレセプターの明視化および体内の凝血の検出である。
本発明の他の局面は、本発明の化合物を含む薬物組成物に関する。トロンビンレセプターの活性化に対してアンタゴニストとして作用する本発明の化合物は、抗血栓症剤として有用であり、様々な臨床兆候において役立つ。臨床兆候には、血管形成における突然の閉鎖の治療、血管形成における再狭窄の治療、不安定な狭心症の治療、心筋梗塞の治療、および特定の形態の血栓または血小板塞栓溶解性（thromboembolytic）発作の治療が含まれる。本発明の化合物は、単独で用いられるか、またはウロキナーゼおよびtPAなどの他の治療薬と組み合わせて用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトのトロンビンレセプターのDNAおよび推定アミノ酸配列を示す。
図２は、推定アミノ酸配列に基づいて提案された、トロンビンレセプター活性化のモデルを示す。
図３は、ヒトのトロンビンレセプターをコードするcDNAおよびネズミのトロンビンレセプターをコードするcDNAから推定される開裂部入および外部部位結合ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。図３はまた、ヒルジン配列の関連部分も示す。
図４は、アゴニストペプチドに対する血小板応答を示す。
図５は、線維芽細胞に対する、本発明のアゴニストペプチドの細胞分裂促進効果を示す。
図6A、6Bおよび6Cは、トロンビンで誘導された血小板活性化に対する、３つのトロンビン阻害剤ペプチドの効果を示す。
図７は、トロンビンによって刺激された血小板ATP分泌に対する、変異トロンビンの効果を示す。
図８は、変異トロンビンによる血小板ATP分泌の阻害を克服するのに必要なトロンビンの増加を示す。
図９は、トロンビン変異体の濃度を変化させることによる、血小板ATP分泌に対するトロンビンの効果を示す。
発明を実施するための様式
本発明によって解明されるトロンビンレセプターの特徴は、図１および２に要約される。図１は、レセプターをコードするクローンの完全なDNA配列を、その推定アミノ酸配列と共に示す。全アミノ酸配列は、425個のアミノ酸を含み、これらのアミノ酸は、約400個のアミノ酸からなる成熟レセプタータンパク質を提供する24個または26個のアミノ酸シグナル配列を含む。
図１に示される配列の疎水性／親水性プロットは、成熟レセプターが７トランスメンブレンドメインレセプターファミリーのメンバーであり、アスパラギンに連結したグリコシル化のためのいくつかのコンセンサス部位を含む比較的長い（約75個のアミノ酸）細胞外のアミノ酸伸長部位を有することを示す。第１の細胞外ループにおけるシステイン175と、第２の細胞外ループにおけるシステイン254とを連結するジスルフィド結合は、ロドプシンおよびβ−２アドレナリンレセプターと類似し得る。インシトゥレセプターの提案されたモデルは、図２に示される。
再び図１を参照すると、トロンビンで触媒された開裂部位は、41位および42位においてArg−Ser連結によって示される。この部位における開裂によって、成熟ペプチドの１位から開裂部位へ伸長する「活性化ペプチド」として示されるレセプターのペプチド断片が遊離する。レセプターの正確なプロセッシング部位は知られていない。従って、成熟タンパク質のＮ末端は、あまり明白でない。しかし、成熟タンパク質Ｎ末端は、恐らく28位のアルギニン残基である。従って、「活性化ペプチド」は、配列RPESKATNATLDPRを有し得る。Ｎ末端の正確な位置は、本発明の化合物の設計にはあまり重要ではない。この「活性化ペプチド」は、腎臓で大まかに濾過され、尿中に濃縮され得、トロンビンによる血小板活性化の指標として使用され得る。
トロンビンによって開裂されるアミノ酸配列、すなわち、開裂部位は、伸長した結合ポケットに含まれるトロンビンの活性部位／「オキシアニオン孔」領域の結合する。このオキシアニオン孔は、疎水性結合、水素結合および電荷相互作用によって大きな基質と結合する。代表的には、開裂される配列は、活性詠部位のアミノ酸と相互作用し、一方、この開裂部位に対してカルボキシル側にある配列は、さらに伸長した「アニオン結合外部部位」と相互作用する。トロンビンレセプターは、図１に示されるように、52−60位のアニオン配列YEPFWEDEEを含む。この領域は、41位と42位との間の開裂部位に対してすぐカルボキシル側にある。この配列YEPFWEDEE（芳香族／疎水性残基およびアニオン残基）の位置および組成は、この配列がトロンビンのアニオン結合外部部位を介してトロンビンがレセプターに結合するのを仲介する領域を含むことを強力に示唆している。この仮定は、レセプターのこの領域の少なくとも一部を示すペプチドがトロンビンを結合し、その作用を阻害することを示すことによって、以下のように確認される。この見解はまた、レセプターのこの部分に結合するポリカチオン性物質が、トロンビン結合およびレセプター活性化をブロックし得ることを予想している。
活性化ペプチドの放出により、レセプタータンパク質が再度折りたたまれて、レセプターを活性化する。このことは、図２に図式的に示される。図２はまた、活性化ペプチドの遊離および再折りたたみによって生じるコンホメーション変化が、レセプターの細胞内コンホメーションを変化させることも示している。この仮定は、トロンビンレセプターが、活性化によって形成される新しいアミノ末端を模倣するペプチドによって活性化され得ることを見いだすことによって確認される。従って、活性化レセプター上の新しいアミノ末端であるＮ末端の模倣は、そのアゴニストとして振舞う。レセプター活性化に対する、レセプター中に新たに形成されたアミノ末端の最初の２つのアミノ酸の重要性もまた、以下のように確認された。アミノ末端セリンの位置とフェニルアラニンの位置とを交換すると、上記のアゴニストペプチドのアゴニスト活性が完全に失われる。この情報に基づいて、そしてトリプシノーゲンのトリプシンへの活性化に存在するメカニズムとの類似性によって、トロンビンがレセプターを開裂するときに新たに露出されるセリン上の正に帯電したアミノ基が、レセプター活性化において重要な役割を果たすようである。トロンビンレセプターを結合するが、α−アミノ基を欠失するように改変されたアゴニストペプチド配列に基づくペプチドは、トロンビンレセプターのアンタゴニストとして機能し得る。従って、特異的な活性化相互作用能力を欠失するアゴニストペプチドの改変体は、トロンビンレセプターアンタゴニストとしての役割を果たす。
本発明の化合物
本発明のペプチド化合物の記載に用いる命名法は一般的な習慣に従い、ペプチドのＮ−末端のアミノ基を各アミノ酸残基の左側に置き、カルボキシル基を右側に置いた。本発明の選択された特別な実施態様を表す式において、アミノ−およびカルボキシ−末端基が多くの場合、特に示されないにもかかわらず、特に条件を指定しない限り生理的なpH値を示す形態であることが理解される。従って、必ずしも条件指定および表示されないが、生理的pHのＮ−末端H+2およびＣ−末端O-が特定の実施例または一般式のいずれにも存在することが理解される。アミノ酸残基の側鎖上の遊離の官能基もまた、アミド化、アシル化または他の置換によって改変され得、例えばこの化合物の活性に影響することなくこれらの溶解性を変更し得る。
示されたペプチドにおいて、それぞれの遺伝子にコードされた残基は、適切に、次の慣用表に従って、アミノ酸の種の名称に対応する単一の文字で表記される：
0003556215.tif 000002
遺伝子的にコードされないアミノ酸は、下記の議論に示すように省略される。
本願に示す特定のペプチドにおいて、Ｄ−型が特に上付短剣符
0003556215.tif 000003
で表される他は、光学異性体を有するアミノ酸残基のＬ−型を意味する。
本発明の化合物は、指定するクラスのアミノ酸残基によって部分的に定義されるペプチドである。アミノ酸残基は、一般に、次のような４つの主要なサブクラスに下位分類され得る：
酸性：残基は生理的pHでＨイオンを失うことによる負の荷電を有し、そしてペプチドが生理的pHで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドのコンフォメーション中の表面の位置を求める。
塩基性：残基は生理的pHでＨイオンに会合することによる正の荷電を有し、そしてペプチドが生理的pHで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドのコンフォメーション中の表面の位置を求める。
中性／非極性：残基は生理的pHで荷電せず、そしてペプチドが生理的pHで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性溶液によって反発され、残基が含まれるペプチドのコンフォメーション中の内部の位置を求める。これらの残基はまた、本明細書では「疎水性（hydrophobic）」と表記される。
中性／極性：残基は生理的pHで荷電せず、しかしペプチドが生理的pHで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドのコンフォメーション中の外部の位置を求める。
それぞれの残基分子の統計的な収集において、ある分子は荷電し、またある分子は荷電せず、そして水性媒体による吸引または反発がより大きいかまたはより小さい範囲で存在することが、当然理解される。「荷電した（charged）」の定義に適合するためには、生理的なpHでそれぞれの分子の有意な百分率（少なくとも約25％）が荷電される。極性または非極性として分類するために必要な、誘引または反発の程度は任意であり、従って、本発明によって特に想定されるアミノ酸は、１つまたはその他の分類に分類され得る。特に指名しないほとんどのアミノ酸は、公知の性質に基づいて分類され得る。
アミノ酸残基はさらに、環状または非環状、および芳香族または非芳香族などの、残基の側鎖置換基に関する自明な分類、ならびに小または大などとして下位分類され得る。残基がカルボキシル炭素を含めて合計４個以下の炭素原子を含有するとき、小さいと考えられる。小残基は、当然、常に非芳香族である。
天然に存在するタンパク質アミノ酸に関して、前記体系に従う下位分類は次の通りである：
酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；
塩基性／非環状：アルギニン、リジン；
塩基性／環境：ヒスチジン；
中性／極性／小：グリシン、セリン、システイン；
中性／非極性／小：アラニン；
中性／極性／大／非芳香族：スレオニン、アスパラギン、グルタミン；
中性／極性／大  芳香族：チロシン；
中性／非極性／大／非芳香族：バリン、イソロイシン、ロインシン、メチオニン；
中性／非極性／大／芳香族：フェニルアラニン、およびトリプトファン。
遺伝子にコードされた二級アミノ酸であるプロリンは、技術的には中性／非極性／大／環状および非芳香族の群に入るが、ペプチド鎖の二次構造における公知の作用による特別な例であり、従って、この定義の群には含まれない。
遺伝子コードによってコードされないある種の共通に見い出されるアミノ酸としては、例えば、ベータ−アラニン（beta−Ala）、または３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸などの他のオメガ−アミノ酸、アルファ−アミンイソ酪酸（aminisobutyric acid）（Aib）、サルコシン（Sar）、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−BuA）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−BuG）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−MeIle）、フェニルグリシン（Phg）、およびシクロヘキシルアラニン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、システイン酸（Cya）２−ナフチルアラニン（２−Nal）;1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Tic）；β−２−チエニルアラニン（Thi）；ならびにメチオニンスルフオキシド（MSO）を含む。これらはまた、便宜上特別なカテゴリーに分類される。
上記の定義に基づき、
Sarおよびbeta−AlaおよびAibは中性／非極性／小；
ｔ−BuA、ｔ−BuG、Ｎ−MeIle、Nle、MvlおよびChaは中性／非極性／大／非芳香族；
Ornは塩基性／非環状；
Cyaは酸性；
Cit、アセチルLys、およびMSOは中性／極性／大／非芳香族；そして
Phg、Nal、ThiおよびTicは中性／非極性／大／芳香族である。
種々のオメガ−アミノ酸が、大きさに従って、中性／非極性／小（beta−Ala、すなわち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大（その他すべて）として分類される。
遺伝子中にコードされた他のアミノ酸置換基はまた、本発明の範囲のペプチド化合物に含まれ得、そしてそれらの構造に従ってこの一般的な体系の範囲に分類され得る。
本発明のすべての化合物が、アミノ酸がＣ−末端を形成するとき、薬学的に許容可能な塩またはエステルの形態であり得る。塩は、例えば、Na+、K+、Ca+2、Mg+2などであり得；エステルは一般に１−6Cのアルコールのエステルである。
A.  アゴニスト
本発明のアゴニストは、次式の一連のペプチドを含む：
AAx−AAy−（AAi）ｎ−Ｚ                   （１）
ここでAAxは小アミノ酸またはスレオニン、好ましくはser、ala、glyおよび、およびthrから選択され、そしてAAyは中性／非極性／芳香族アミノ酸残基であるかまたは中性／非極性／大／非芳香族アミノ酸であり、環状部分（好ましくは中性／非極性／芳香族アミノ酸残基）を含む；
ここでAAはアミノ酸残基を意味し、そして下付文字ｉは整数であり、式（１）のAAy残基の下流（Ｎ→Ｃ）側の該当するアミノ酸残基の位置を示し、そしてｎは２−12の整数である。ただしｎ＝２であるとき、Ｚは必ず式NR'R'のアミド化されたＣ末端を含み、少なくとも１つのR'が少なくとも１つの極性置換基を含むアルキルであるという条件で；そして
一般に、Ｚは干渉しない置換基である。
AA1およびAA2は、従って、式１の化合物の中に存在しなければならず;AA3−AA12は任意である。AA1およびAA2は比較的正確に定義されるが;AA3−AA12は、一般に、LPアミノ酸残基である。AA1の位置はまた、比較的許容性がある；従って、
AA1は、Ｌ−配置中に遊離のα−アミノ基を有する中性または塩基性アミノ酸であり；
AA2は中性または塩基性Ｌ−アミノ酸残基であり；
AA3−AA12は、好ましくはAA3が塩基性または中性アミノ酸残基である、Ｌ−アミノ酸残基であり；
AA4およびAA6は、それぞれ独立に中性／極性／大／非芳香族アミノ酸であるか、またはAA4は塩基性アミノ酸であり得；
AA5およびAA11は、それぞれ独立に、プロリンまたは小アミノ酸残基であり；
AA7およびAA10は、それぞれ独立に酸性アミノ酸残基であり；
AA8は塩基性アミノ酸残基であり；そして
AA9およびAA12は、それぞれ独立に中性／芳香族アミノ酸残基である。
式１のペプチドは、後続のアミノ酸配列によってＣ−末端（しかしＮ−末端ではない）で伸長されて（Ｚに含まれるものとして示す）、非干渉置換基を含有し得る。
式１の化合物のＣ−末端において、カルボキシル基は未誘導体化型またはアミド化型であり得；未誘導体化型ではカルボキシルは遊離酸または塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩であり得る。
Ｃ−末端がアミド化される場合は、Ｃ−末端でカルボニル炭素と共有結合しているアミド基のチッ素原子は、NR'R'であり、それぞれのR'が独立に水素であるか、または１−6Cの直鎖または分枝鎖アルキルである。そのようなアルキルは、メチル、エチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシルなどのような１−6cの直鎖または分枝鎖の飽和ハイドロカルビル（hydrocarbyl）残基である。そのようなアミド基の典型は：特に−NH2、−NHCH3、−Ｎ（CH3）２、−NHCH2CH3、−NHCH2CH（CH3）２、および−NHCH2CH（CH3）CH2CH3である。さらに、いずれか１方または両方のR'は次に、例えば、それぞれのR'は、−OR'、−NR'R'、ハロ、−NR'CNR'NR'R'などの、１つまたはそれ以上の置換基で任意に置換され得る。ここでR'はそれぞれ独立に上記定義の通りである。従って、Ｚは−OH（もしくはエステルもしくは塩の形態）、または−NR'R'であり得、R'は上記定義の通りである。
AAx−AAyの好ましい実施態様としては、GF、AF、SF、TF、Ｇ（pClPhe）、Ａ（pClPhe）、Ｓ（pClPhe）、Ｔ（pClPhe）、GThi、AThi、SThi、およびTThiを含む。AA1およびAA2の好ましい実施態様は大きい非極性アミノ酸である。この他の式（１）の化合物の残基としての好ましい実施態様は、AA1およびAA2がそれぞれ独立にLeu、Val、Ile、Cha、Phe、２−NalもしくはTic;またはAA3がArg、Lys、Orn、HarもしくはAlaである、実施態様である。他のアミノ酸としては、AA4およびAA6がそれぞれ独立にGln、AsnもしくはLysであり；またはAA7およびAA10がそれぞれ独立にAspもしくはGluであり;AA8がArgもしくはLysであり；またはAA12はPheでありそしてAA9がTryであり；またはＺがOH、もしくはNR'R'でありR'は上記定義の通りである；またはＺがさらに下記に定義するAA13−AA17のいくつかもしくはすべてを含む、実施態様が好ましい。特に好ましくは、SFLLRNPNDKYE;SFLLRNPNDK;SFLLRNPN;SFLLRNP;SFLLRN;SFLLR;GFLLR;TFLLRNPNDK;S（pClPhe）LLR;S（Thi）LLR;SFFLR;SFFLRN;SF（Phg）LR;SFL（Nal）RN;SFL（Cha）R;SF（Cha）（Cha）RN;SF（Cha）（Cha）RK;SF（Cha）（Cha）LRPNDK;SFLLKN;SFLL（Har）N;SFLLKN;SFF（Cha）AN;およびそれらのアミド化型からなる群より選択される、式（１）の化合物である。
B.  アンタゴニスト
トロンビンレセプターによって仲介される血小板活性化および他の細胞活性を干渉する本発明の化合物は以下のものを含む：
１）Ｎ−末端セリン残基を欠如する改変されたアゴニストペプチドを表すトロンビンレセプターに対するアンタゴニスト；
２）循環しているトロンビンに対する誘引物として挙動する、トロンビンレセプターの細胞外部分の、開裂不能および／または強化結合型を表すトロンビンインヒビター。
３）YEPFWEDEEのアニオン性−結合外部部位領域の少なくとも１部分を模倣し、そしてやはり循環しているトロンビンに対する誘引物として挙動する、アニオン性および疎水性／アニオン性ペプチド。
４）トロンビンそれ自身のアニオン性−結合外部部位領域を模倣し、そしてトロンビンと競合してレセプターに結合する、カチオン性または伸長したカチオン性ペプチド。
５）トロンビンレセプターの種々の重要な位置と免疫反応性の抗体であり；そして
６）レセプターに対して天然のトロンビンと競合する、タンパク質分解活性を欠如するトロンビン変異体。
トロンビンレセプターアンタゴニスト
前記第１グループ−−改変されたアンタゴニスト−−は以下の式で表され得る。
Ｘ−AAy−（AAi）ｎ−Ｚ                    （２）
ここで、ＸはSer、Ala、Thr、CysあるいはGly以外のアミノ酸残基または脱アミノもしくはＮ−アシル化アミノ酸であり；
AAyは環状部分、好ましくは芳香族を含んでいる、中性で非極性の大きなアミノ酸残基であり；
AAはアミノ酸残基を表し、下付文字ｉは整数で、（２）式のAAy残基の下流（Ｎ→Ｃ）側の該当するアミノ酸の位置を表し、ｎは４−12の整数であり、そして；
AA1およびAA2は、それぞれ独立に、中性または塩基性であるＬ−アミノ酸残基であり、AA1は遊離α−アミノ基を有し；
AA3およびAA8は、それぞれ独立に、塩基性または中性アミノ酸残基であり；
AA4およびAA6は、それぞれ独立に、塩基性または非芳香族アミノ酸類であり；
AA5およびAA11は、それぞれ独立に、プロリン残基または小さいアミノ酸類であり；
AA7およびAA10は、それぞれ独立に、酸性アミノ酸残基であり；
AA9およびAA12は、それぞれ独立に、中性／芳香族アミノ酸残基であり、そして；
Ｚは非干渉性の置換基である。
好ましいＸの実施態様は、３−メルカプトプロピオン酸（Mpr）、３−メルカプト吉草酸（Mvl）、２−メルカプト安息香酸（Mba）およびＳ−メチル−３−メルカプトプロピオン酸（SMeMpr）の残基を包含する。
この抗トロンビン活性化合物のグループの好ましい実施態様は、AA1およびAA2が、それぞれ独立に、Leu、Val、Ile、Phe、Cha、２−NalまたはTlcであり;AA3およびAA8が、それぞれ独立に、Arg、lys、OrnまたはHarであり；あるいはAA4およびAA6が、それぞれ独立に、Lys、Arg、Orn、Har、Gly、GlnまたはAsnであり；あるいはAA5およびAA11が、それぞれ独立に、ProまたはAlaであり；あるいはAA7およびAA10が、それぞれ独立に、Asp、Glu、β−Aspまたはβ−Gluであり；あるいはAA12がPheおよびAA9がTryであり；あるいはＺがOH（またはエステルもしくは塩の形態）、NH2またはNR'R'でそれぞれのR'は独立にＨまたは上記のように任意に置換された１−6Cの直鎖または分枝鎖のアルキルを包含する。
特に好ましい実施態様はＸがMpr、Ｓ−Me MprまたはMbaであり、AAyがPheであり、AA1がChaであり、AA2がChaであるようなペプタイド類である。
特に好ましい実施態様は、遺伝子によってコード化されているAA1−AA12であるか、あるいはAA1−AA2がそれぞれ独立にChaであり得る。このクラスのアンタゴニストペプチドの中で特に好ましいのは、
XFLLRNPNDKYEPF;XFLLRNPNDKYEP;XFLLRNPNDKYE;XFLLRNPNDKY;XFLLRNPNDK;XFLLRNPND;XFLLRNPN;XFLLRNP;XFLLRN;XFLLR;XFLL;XFL;X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDK,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDKY,XF（Cha）（Cha）RNPNDKYE−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDKY−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPND−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RN−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RAPNDK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RGPNDK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNANDK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPADK−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDA−NH2,X−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNEK−NH2,およびＸ−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDA−NH2;
の中から選ばれ、特にＸがMprであるようなものである。
特に好ましいのは、
Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDK,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDKY,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDKYE−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDKY−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPND−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RN−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RAPNDK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RGPNDK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNANDK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPADK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RNPNDA−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNEK−NH2,Mpr−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDA−NH2,Mba−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDK−NH2,およびSMeMpr−Ｆ（Cha）（Cha）RKPNDK−NH2
である。
トロンビン阻害剤
グループ２）のトロンビン阻害剤は、レセプターと競合してトロンビンと結合する化合物で、非開裂性および／または高い結合特性を示すものである。これらの化合物は以下の式で表される：
0003556215.tif 000004
ここで、Ｊは２−５個のアミノ酸残基のペプチド伸張またはそのアシル化されたもしくは脱アミノ化されたものである。
上記式（３）の化合物中、AAyは中性で非極性の大きなアミノ酸残基であり、環状部分好ましくは芳香族を含んでおり、かつｎは８である。
上記中、AAはアミノ酸残基を表し、下付文字ｉはAAyから下流方向に数えた位置を表す。
上記中、AA1およびAA2は、それぞれ独立に、中性または塩基性アミノ酸残基であり；
AA3およびAA8は、それぞれ独立に、中性または塩基性アミノ酸残基であり；
AA4およびAA6は、それぞれ独立に、塩基性または中性の、非芳香族アミノ酸類であり；
AA5およびAA11は、それぞれ独立に、プロリン残基または小さいアミノ酸類であり；
AA7およびAA10は、それぞれ独立に、酸性アミノ酸残基であり；
AA9およびAA12は、それぞれ独立に、中性／芳香族アミノ酸残基であり；
AA13は芳香族または小さく非極性のアミノ酸残基であり、そして；
Ｚは非干渉性の置換基である。
上記グループ（２）のトロンビン阻害剤ペプチドはトロンビンレセプターの細胞外鎖を模倣しているがタンパク質分解部位を欠き、および／またはトロンビンに対する結合性が高いが、その特に好ましい実施態様は、下流にアニオン性アミノ酸残基を含有し、Ｊが４−５個のアミノ酸残基のペプチド伸張であるものである。特に好ましいのは、AAyのすぐ上流の残基がpro−arg−pro（PRP）という配列を有し、その配列が、大きく／非芳香族／非極性／中性アミノ酸残基がペプチド結合を介して下流の酸性アミノ酸残基と結合しジペプチド配列類から選ばれる残基のあとにつづくものである。このジペプチド配列の特に好ましい実施態様は、ile−asp、val−asp、ile−gluおよびleu−aspであり、特に、Ｊによって表される前記ペプチド伸張がLDPRP、LEPRP、IDPRP、IEPRP、VDPRPおよびVEPRPから選ばれるようなものである。
さらに、ペプチド伸張がすぐ上流の配列pro−arg−proを含有するとき、上流に更に追加される好ましい伸張はＤアミノ酸である。特に好ましいのは、大きく／非極性／中性／芳香族であるＤアミノ酸、特にトリプトファンまたはフェニルアラニンであり、そして特にフェニルアラニンである。
Ｚは好ましくはOH（またはエステルもしくは塩の形態）またはNR'R'で、R'は上記のように定義され、AA13から下流のレセプター配列を模倣しているペプチド伸張に任意に続き得るものである。
式（３）の化合物で特に好ましいものは、
LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNES;LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNE;LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKN;LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEK;LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEE;LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDE;およびLDPRPFLLRNPNDKYEPFWED,
ならびにそのアミド化またはアシル化したものから選ばれる。また好ましいものは、
Ｆ†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNE,F†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKN,F†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEK,F†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEE,F†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDE,およびＦ†PRPFLLRNPNDKYEPFWED;およびＦ†PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFLRNPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFRNPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFNPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFPNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFNDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFDKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFKYEPFWEDEEKNES,F†PRPFYEPFWEDEEKNES,
およびそのアミデート化およびアシル化したものから選ばれる。
アニオン外部部位結合アンタゴニスト
レセプターの結合領域YEPFWを模倣したペプチドを表すアンタゴニストは、そのグループ３のアニオン伸長（EDEE）を任意に含有しうるが、以下の式で表される。
Ｂ−AA9−AA10−AA11−AA12−AA13−Ｚ       （４）
ここで、AA9、AA12およびAA13は、それぞれ独立に、中性の芳香族アミノ酸残基または小さいアミノ酸残基であり、AA10は酸性アミノ酸残基であり、AA11はプロリンまたは小さいアミノ酸残基である。ＢおよびＺは非干渉置換基、典型的にはペプチド伸長であるが、一般的には非干渉有機ラジカルも含有し得る。ＢはＨまたはアシルでも有り得る（該ペプチド伸長が存在すればそれを含む）;ZはOH（もしくはそのエステルもしくは塩の形態）またはNR'R'（該ペプチド伸長が存在すればそれも含む）でも有り得、上記したものである。
式（４）で示される化合物の好ましい形態は、AA9、AA12およびAA13のそれぞれがphe、trp、alaまたはtyrであり；およびAA10がglu、asp、β−gluまたはβ−aspである化合物である。
特に好ましい実施態様は、AA9・AA13がYEPFW、FEPFW、YDPFW、YEPYW、YEPFY、YEPWYまたはWEPFWである。Ｚがペプチド配列EDEE、QDQQ、EDEQ、QDEQ、QDEE、EDQE、EDQQまたはQDQEを含むことも有り得る。
Ｂの好ましい実施態様は、ＢがＨまたは１−４個のアミノ酸のペプチド伸長もしくはそのアクリル化された形態を含む。
これらのアンタゴニストはトロンビンに対して誘引物として作用し、それゆえトロンビンの有効濃度を低下させる。
アニオン結合外部部位模倣
トロンビンのアニオン結合外部部位（グループ４）を模倣したカチオンペプチドは、以下の式で表される。
Ｂ−AAa−AAb−AAc−AAd−AAe−Ｚ           （５）
ここで、ＢおよびＺは上記で定義された通りであり、AAaおよびAAeは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸または塩基性アミノ酸であり、かつAAb、AAcおよびAAdは、それぞれ独立に、塩基性アミノ酸である。
式（５）で表される化合物の好ましい化合物は、ＢがアクリルまたはＨを含み；またはＺがOH（もしくはエステルまたは塩）またはNR'R'を含み、それぞれのR'は上記で定義されたものであり；またはAAaおよびAAeが、それぞれ独立に、phe、trpおよびalaから選択され；またはAAb−AAdが、それぞれ独立に、arg、lysおよびglnからなる群から選択される化合物、特に、AAa−AAeがWKKKK、KKKKW、QKQQW、またはWQKQQ配列を有する化合物である。
ＢおよびＺで表される非干渉置換基は更にペプチド伸長であり得、該ペプチド伸長は、トロンビンアニオン結合外部部位の結合パターンと矛盾しない。該ペプチド伸長がトロンビンが基質と結合するこの能力を模倣する場合、これらのアンタゴニストは、トロンビンレセプタープロテインの関連領域、特に図１で示される位置52−60のYEPFWEDEE領域、に結合する能力によって作用する。
抗体
トロンビンレセプターの重要部分に対して免疫反応性の抗体であるアンタゴニスト（グループ５）は、適切な哺乳類被験体に免疫処置を施すことによって得られる。この免疫処置は、抗体によって標的されるように意図されたトロンビンレセプターの部分を抗原領域として含有するペプチドを用いて行われる。重要な領域としては、タンパク質分解性の開裂の領域、YEPFWEDEEボックスでの結合部位、活性化に重要な細胞外セグメントのセグメント（これは開裂部位を含む）、および細胞外グループを形成する配列の部分、特に、活性化されたレセプターの細胞外領域のＮ末端と相互作用を起こす領域が挙げられる。本発明のアゴニストペプチドは、この場合の免疫原として用いられ得る。
従って、所望の抗体を調製する免疫原として用いるための適切なペプチドとしては、YEPFWEDEE領域のＣ末端における28位から68位までの細胞外領域の成熟配列の部分を表すペプチドが包含される。この領域は以下の配列：
PESKATNATLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTEY
を有し、そして配列LDPRSFLL（この配列は開裂部位を含む）およびYEPFWEDEE（この配列は結合部位を含む）を含むペプチドは特に有用である。免疫原として有用である他の領域としては、アミノ酸の161−176位;240−265位；および336−346位を表すセグメントが挙げられる。配列YYFSGSDWQFGSELCR、KEQTIQVPGLNITTCHDVLNETLLEG、およびHYSFLSHTSTTのこれらのペプチドは、それぞれ、提案された細胞外ループを表す。
これらの抗体は、ペプチド性ハプテンを用いた適切な免疫処置のプロトコルに従って、適切な哺乳類宿主に免疫処置を施すことによって調製される。ペプチド性ハプテンは、十分な長さである場合は単独で、または免疫原性を増強することが所望されもしくは必要とされる場合は適切な担体に結合されて用いられる。BSA、KLH、または他の担体タンパク質のような担体を有する免疫原性結合体を調製するための方法は、当該技術分野において公知である。場合によっては、例えばカルボジイミド試薬を用いた、直接的な結合が有効であり得る。他の場合では、結合試薬、例えば、イリノイ州、ロックフォードのPierce Chemical Co.によって供給される結合試薬が、ハプテンへの接近を可能とするために望まれ得る。ハプテンのペプチドは、Cys残基を用いてアミノ末端またはカルボキシ末端を伸長するか、またはシステイン残基を散在させることによって、例えば、担体への結合を容易にし得る。免疫原の投与は、一般的には、当該技術分野において一般的に知られているように、適切な時間にわたって注射し、そして適切なアジュバントを用いて行われる。免疫処理の期間中、抗体の力価は、抗体形成が十分かどうかを決定するために利用される。
この方法で生産されるポリクローナル抗血清は、ある種の適用には、十分満足できるものであり得るが、薬学的な組成物としては、モノクローナルの調製物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不朽化された細胞系は、一般的に知られているように、KohlerおよびMilsteinの標準法、あるいはリンパ球または脾臓細胞の不朽化をもたらす改変法を用いて調製され得る。所望の抗体を分泌する不朽化された細胞系は、イムノアッセイによってスクリーニングされる。この方法では、抗原はペプチド性ハプテンであるか、または組換え宿主細胞上に現れたトロンビンレセプターそれ自身である。所望の抗体を分泌する適切な不朽化された細胞の培養物が同定されると、これらの細胞は、インビトロで、または腹水内での生産によって培養され得る。
次いで、所望のモノクローナル抗体は、培養上清液から、または腹水上清液から回収される。モノクローナルのフラグメントまたはポリクローナル抗血清のフラグメントは、免疫学的に重要な部分を含有するならば完全な抗体と同様にアンタゴニストとして用いられ得る。免疫学的に反応性であるフラグメント、例えば、Fab、Fab'の使用、Ｆ（ab'）２の使用は、特に治療上の情況において、しばしば好ましい。なぜなら、これらのフラグメントは、一般的に、全免疫グロブリンより免疫原性が少ないからである。
これらの抗体またはフラグメントはまた、最新の技術を用いて、組換え法によって生産され得る。レセプターの所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数種の起源のキメラの情況において、生産され得る。
非開裂性トロンビン
前記に加えて、アンタゴニストは、レセプターに対して天然のトロンビンと競合する、タンパク質分解活性が欠如しているトロンビン変異体（グループ６）を含む。上記のように、トロンビンのタンパク質分解性の開裂部位における関連部位としては、Ｂ鎖の205位のセリン残基、57位のヒスチジン残基、および99位のアスパラギン酸残基が包含されることが知られている。トロンビン分子のタンパク質分解性の不活性にするこれらの残基の置換体を含有するトロンビンの変異体は、標準的な部位特異的変異誘発法を用いて調製される。この変異遺伝子を用い、組換え法を用いて改変トロンビンが製造される。関連する置換体は、天然の残基を前に有する位置番号、次いで置換された残基によって示される。従って、アラニンで置換された205位のセリンを有するトロンビンは、S205Aと示される。
好適な実施態様
本発明のアゴニストおよびグループ（１）−（４）のアンタゴニストの両方では、アミノ酸配列のある種の好適な実施態様は、ペプチドにおけるアミノ酸が遺伝子によってコードされたものである。１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸残基が遺伝学的にコードされていないアミノ酸で置換されているものも含まれる。
さらに詳しくは、これらの好適な実施態様では、AA1およびAA2の好適な実施態様は、leu、val、またはileであり；特にleuが好ましい。AA3およびAA8の好適な実施態様は、argまたはlysであり；特に、AA3がargであり、そしてAA8がlysである実施態様が好ましい。AA4およびAA6の好適な実施態様は、glnまたはasnであり、特にasnが好ましい。AA7およびAA10の好適な実施態様は、aspまたはgluであり；特に、AA7がaspであり、そしてAA10がgluである実施態様が好ましい。AA12の好適な実施態様はフェニルアラニンであり、そしてAA9の好適な実施態様はチロシンである。
好ましいアシル基は、式RCO−であり、ここでＲは１〜６個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のアルキルを表す。アセチルが、特に好ましい。
本発明の全てのペプチドでは、１個またはそれ以上のアミド結合（−CO−NH−）は、同配体（例えば、−CH2NH−、−CH2S−、−CH2CH2、−CH＝CH−（シス型およびトランス型）、−COCH2−、−CH（OH）CH2−、および−CH2SO−）である他の結合と任意に置換され得る。この置換は、当該技術分野において公知の方法によって行われ得る。以下の参考文献では、これらの他の結合部分を含むペプチドアナログの調製について述べられている:Spatola,A.F.、Vega data（1983年３月）、第１巻、第３号、「ペプチド骨格の改変」（総説）;Spatola,A.F.、「アミノ酸ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学」、B.Weinstein編、Marcel Dekker、ニューヨーク、267頁、（1983）（総説）;Morley,J.S.、Trends Pharm Sci（1980）、463−468頁（総説）;Hudson,D.,ら、Int J Pept Prot Res（1979）14:177−185（−CH2NH−、−CH2CH2−）;Spatola,A.F.,ら、life Sci（1986）38:1243−1249（−CH2−Ｓ）;Hann,M.M.、J Chem Soc Perkin Trans I（1982）307−314（−CH−CH−、シス型およびトランス型）;Almquist,R.G.,ら、J Med Chem（1980）23:1392−1398（−COCH2−）;Jennings−White,C.,ら、Tetrahedron Lett（1982）23:2533（−COCH2−）;Szelke,M.,ら、ヨーロッパ出願EP 45665（1982）CA:97:39405（1982）（−CH（OH）CH2−）;Holladay,M.W.,ら、Tetrahedron Lett（1983）24:4401−4404（−Ｃ（OH）CH2−）；およびHruby,V.J.,Life Sci（1982）31:189−199（−CH2−Ｓ−）。
ペプチド性アゴニストおよびアンタゴニストの調製
本発明のペプチド性アゴニストおよびアンタゴニストは、当該技術分野で公知のように、標準的な固相（または液相）ペプチド合成方法を用いて調製され得る。さらに、これらのペプチドをコードするDNAは、市販のオリゴヌクレオチド合成器械を用いて合成され得、かつ標準的な組換え生産システムを用いて組換え的に生産され得る。遺伝子でコードされていないアミノ酸が含まれるべき場合は、固相ペプチド合成を用いた生産が必要とされる。
トロンビンレセプターの組換え生産
本発明は、組換え細胞の表面に現れるトロンビンレセプターを生産させるための組換え物質を提供する。これらの組換え法を用いたレセプターの生産は、有用な診断用試薬を提供する。この試薬は、生物学的サンプル中のトロンビンのレベルを測定するために、またはさらに重要なこととしては、トロンビン活性に影響する候補物質をスクリーニングする試薬として用いられる。
この組換え生産では、トロンビンレセプターをコードするDNA配列（図１に示されている）、またはその縮重アナログは、以下に示されるような天然配列の読み出しによって調製されるか、または公知の天然配列の実質的な部分をプローブとして用いることによって調製される。あるいはそれらは標準的な方法を用いて新たに合成され得る。このDNAは、所望の形質転換された宿主に適切な発現ベクターに結合され、そして適合性の細胞に形質転換される。これらの細胞は、トロンビンレセプターをコードする遺伝子の発現に好ましい条件下で培養され、そして表面にレセプターが現れた細胞が採収される。
診断用およびスクリーニング用の手段としての組換えトロンビンレセプターの使用
トロンビンレセプターをコードする組換えDNAの利用により、宿主細胞表面でのレセプターの発現が可能となる。従って、レセプターに結合するアゴニストまたはアンタゴニストの候補の能力を評価するための手段として有用な細胞が提供される。
容易に行われるアッセイの１つのタイプでは、標識されたトロンビン、トロンビンのアゴニストまたは公知の結合アンタゴニストのいずれかとの、アンタゴニストの候補の競合が、レセプターへの結合に関して試験され得る。レセプターに結合する公知の標識された物質は、もちろん、合成ペプチドであり得る。種々の濃度の候補体は、一定の濃度の標識されたトロンビン、トロンビンのアゴニストまたはアンタゴニストと共に供給され、そしてレセプターへの標識物質の結合の阻害が、公知の方法を用いて評価され得る。
さらに幾分か複雑なアプローチでは、トロンビンにより誘導される応答への候補体化合物の効果が、下記のように、トロンビンレセプターを組換え的に発現させる細胞中で、測定され得る。これらの細胞へのトロンビンの効果に関するアッセイ系としては、カルシウムの可動化および電圧固定（これらは、以下でさらに詳細に述べられている）が挙げられる。他の適切なエンドポイントとしては、トロンビンにより誘導されるホスホイノシトールのターンオーバーおよびアデニルシクラーゼの阻害が挙げられる。これらのアッセイは、アンタゴニストの候補の、単にトロンビンに結合する能力ではなく、レセプターの活性への効果の評価を可能にする。
心臓血管の疾患の診断
１つの実施態様においては、組換えトロンビンレセプタータンパク質の利用により、レセプターの活性化された形態に免疫特異的である抗体を生産することができる。次いでこの抗体は、インビボで活性化されたレセプターの診断用の造影に用いられ得る。これらの抗体は、組換え的に生産されたレセプターの活性化された形態に対して、または以下の実施例２に記載されている「新しいアミノ末端」ペプチドを表すペプチドに対して生産される。生じた抗体、または免疫特異的なそのフラグメント、例えば、Fab、Fab'、Fab'2フラグメントは、次いで、公知の方法によって検出される標識物質に結合される。これらの標識物質としては、テクネチウム99およびインジウム111または当該技術分野において公知の他の放射活性標識物質を包含する放射性標識物質が挙げられる。インビボで注射されると、これらの抗体は、活性化されたレセプターの部位へと向かう。従って、血栓症にかかった問題の領域の位置づけを可能にする。
診断の他の実施態様においては、体液中における活性化ペプチドの存在を検出および測定することが可能となる。抗体は上記のような活性化ペプチドに対して製造され、そして標準的なELISAまたはRIAアッセイに用いられて、過剰量の活性化ペプチドを、例えば、尿中で検出し得る。
アンタゴニストの利用および投与
本発明のアンタゴニストは、血管形成の情況における急激な閉塞または再狭窄の治療；不安定なアンギナの治療；および心筋梗塞の治療において、治療学的に有用である。アンタゴニストとして作用する本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の全身投与のための通常の処方によって投与される。典型的なこのような処方は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,イーストン、ペンシルバニア州、最新版中に見い出され得る。
ペプチドの全身投与の好ましい形態としては、注射、典型的には静脈注射が挙げられる。他の注射の経路、例えば、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔内注射もまた用いられ得る。さらに最近では、ペプチドの全身投与の他の手段が工夫されている。このような手段としては、胆汁の塩またはフシジン酸のような浸透剤、または他の界面活性剤を用いた経粘膜投与および経皮投与が挙げられる。さらに、腸剤またはカプセル化剤として適切に処方されれば、経口投与もまた可能であり得る。
必要とされる投与量の範囲は、アンタゴニストの選択、投与経路、処方物の性質、患者の疾患の性質、および診察する医師の判断に依存する。しかし、適切な投与量の範囲は、被験体1kgあたり0.1−100μｇの範囲である。しかし、入手可能なアンタゴニストの多様性および種々の投与経路の効果の違いによって、必要とされる投与量の広範囲の変更が予期され得る。例えば、経口投与は静脈注射による投与より多くの投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量のレベルにおける変化は、当該技術分野においてよく知られている最適化のための標準的な経験的慣用法を用いて調整され得る。
本発明のアゴニストは、創傷の治療において、および線維芽細胞の増殖が有用である他の情況において有用である。これらの化合物は、一般的に、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態で局所的および／または限局的に投与される。
アッセイ系
種々のアッセイ系が、トロンビンとそのレセプターとの相互作用、およびその相互作用への種々の候補アゴニストおよびアンタゴニストの影響を測定するために用いられ得る。血小板凝集におけるトロンビンレセプターおよびトロンビンの役割は、血小板凝集法によって直接的に測定され得、またはフィブリンを含む血液凝固への効果が指標として用いられ得る。さらに、血小板によるATPの取り込みが、測定され得る。トロンビンレセプターの活性化の測定法として有用なものには他に、トロンビンレセプターを発現することが公知の細胞におけるカルシウムの可動化または電圧固定アッセイを利用するアッセイがある。これらの後者のアッセイは、トロンビンレセプターを発現する組換え細胞において、特に有用である。
血小板凝集：このアッセイでは、Baenzinger,M.G.,Meth Enzymol（1974）31:149−155の方法、またはCharo,I.F.,ら、J Clin Invest（1977）63:866−873に記載の方法によって、洗浄されたヒト血小板を調製する。凝集を誘導するために、約１−20nMのトロンビンまたはEC50の代わりのアゴニストを用いて、コントロール反応における凝集を刺激する。その結果は、発光血小板凝集法（lumiaggregometry）で観察する。凝集を刺激するために、トロンビンの代わりに、種々の濃度の候補アゴニストを用いることもできる。凝集を妨げる能力を評価するためには、候補のインヒビターをトロンビンと共に反応混合物に加える。
2mMのマグネシウムおよび1mMのカルシウムを有するTyrodeの修飾された緩衝液（pH7.4）中に、108血小板/mlの濃度で、洗浄された血小板を懸濁させる。トロンビンまたは試験化合物を、600mMのNaCl、10mMのMES（pH6.0）、0.5％のPEG 6000緩衝液中に少容量（約20μＬ）で加え、そして血小板懸濁液と共に37℃で15分間インキュベートする。
血小板の活性化/ATPの分泌:480μｌの懸濁液中の上記のような調製された血小板を、最終濃度約10nMを得るのに十分な量のトロンビンを含有する、20μｌのリン酸緩衝生理食塩水に加える。あるいは、代わりのアゴニストがそのEC50の量で加えられる。約20μｌのChromolume▲R▼試薬（Chronolog Corporation,Havertown,ペンシルバニア州）を加える。凝集を測定すると共に、ATPの分泌を評価する。これらの結果は、chronolog dual channel lumiaggregometer（Chronolog Corporation）での発光および光透過率の変化を独立して測定することによって定量化される。血小板のATPの分泌を、発光信号として、発光凝集計中で測定する。トロンビンと相互作用を起こすことが推定される候補アンタゴニストは、血小板に加える前に、室温で５分間、20μｌのPBS中でトロンビンと共に予めインキュベートする。予め行われるインキュベーションは、レセプターと直接相互作用を引き起こすアゴニストまたはアンタゴニストを試験するためには必要ではない。
マイクロタイタープレートを用いた血小板凝集アッセイ:96ウェルのマイクロタイタープレート中での、洗浄された血小板を用いて測定されるトロンビン仲介またはアゴニスト仲介血小板凝集を、Fratantoni,J.C.ら、Am J Clin Pathol（1990）94:613−617に記載の方法で行った。ハイブリドーマの上清液、精製されたモノクローナル抗体（MoAb）、またはペプチド性アンタゴニストの、トロンビンレセプターをブロックする能力を、種々の濃度の抗体またはアンタゴニストを用いて、このアッセイによって評価した。
フィブリノーゲン凝固アッセイ:150mMのNaCl、20mMのTris（pH7.4）、10mMのCaCl2、0.5％のPEG 6000を含む合計容量300μｌの溶液中で、37℃で、フィブリノーゲンの最終濃度3.3mg/mlで、フィブリノーゲン凝固反応を行う。標準的なFibrosystem▲R▼coagulation timer（Fisher Scientific,スプリングフィールド，ニュージャージー州）によって測定すると、5nMのトロンビンによって、約10秒間の凝固時間が得られる。
上記のように、フィブラント（fibrant）の形成を刺激するためには、トロンビンの代わりに候補アゴニストを用い；血餅形成を妨げる能力を試験するためには、アンタゴニストまたはインヒビターをトロンビンと共に加える。
カルシウムの可動化：トロンビンレセプターをコードするcRNAを発現する卵母細胞による、アゴニストにより誘導される45Ca放出の増加を、刊行物に記載された方法（Williams,J.A.,ら、Proc Natl Acad Sci USA（1988）85:4939−4043）によって評価した。簡単にいうと、50μCiの45CaCl2を含有するカルシウムを含有しないMBSH（10−40mCi/mg Ca;Amersham）300μｌ中で30個の卵母細胞のグループをRTで４時間インキュベートすることによって、細胞内のカルシウムプールを標識する。標識された卵母細胞を洗浄し、次いで、抗生物質を含まないMBSH II中で90分間インキュベートする。５個の卵母細胞のグプールを選択し、それを、抗生物質を含まない0.5ml/ウェルのMBSH IIを含有する24ウェルの組織培養プレート（Falcon 3047）中で各ウェルにおく。この培地は、10分ごとに除去して新鮮な培地と取り替える。採収した培地をシンチレーションカウンティングによって分析して、それぞれ10分間のインキュベーションの間に卵母細胞によって放出された45Caを測定する。単位時間あたりの45Ca放出が安定したベースラインを示すまで、10分間のインキュベーションを継続する。さらに２回分の10分間の採収物を得、次いでアゴニストを含む試験培地を加え、そしてアゴニストにより誘導される45Caの放出を測定する。
電圧固定:1個の電極による電圧固定法を用いたこと以外は、本質的に、以前Julius,D.,ら、Science（1988）241:558−563に記載された方法で、トロンビンレセプターをコードするcRNAを発現する電圧固定された卵母細胞において、アゴニストにより誘導される内部方向への塩化物電流を測定する。
以下の実施例は例示を意図するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
トロンビンレセプターをコードするcDNAの調製
要約すれば、ヒト細胞系HEL（Papayannopoulou,T.ら,J Clin Invest（1987）79:859−866）およびDami細胞（Greenberg,S.M.ら,Blood（1988）72:1968−1977）をホルボール12−ミリステート13−アセテート（PMA）で刺激し、その後アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞内へのマイクロインジェクションのためにmRNAを単離した。次に、これらのmRNA試料で注入された卵母細胞を、それらの卵を検出するために細胞性カルシウムの可動性に対してアッセイした。それらの卵は、それらの表面のRNAによりコードされるトロンビンレセプターを発現していた。mRNAのサイズによる選択をした後、40kbのmRNA画分をcDNAライブラリーの調製に使用した。E.coli内でクローン化されたプラスミドDNAをインビトロ系においてキャップ化cRNA内に変換し、キャップ化cRNAを卵母細胞内に注入することにより、ライブラリーをアッセイした。陽性クローン内の挿入部分を図１に示されるcDNAおよび推定アミノ酸配列を得るためにシークエンスした。
更に詳細には、アフリカツメガエル卵母細胞を雌のアフリカツメガエル（Xenopus laevis）から集め、公知の方法を用いて処理する（Coleman,A.,hames,B.D.およびhiggins,S.J.,編,Transcription and Translation:A Practical Approach,IRL Press,pp.271−302;Williams,J.A.ら,Proc Natl Acad Sci USA（1988）85:4939−4943）。卵胞細胞を除去するために、卵母細胞を、カルシウムを含まない改変型Barth溶液（MBSH）中1mg/mlのシグマ社製II型コラゲナーゼを用いて室温で４時間インキュベートし、次いで、洗浄し、MBSH II（1mg/mlウシ血清アルブミン、1mg/mlフィコール、100U/mlペニシリン、100μl/mlストレプトマイシン、および50μg/mlゲンタマイシンを含有するMBSH）中で18℃で一晩中インキュベートした。
Dumont段階Ｖの卵母細胞を選択し、50mlのmRNAでマイクロインジェクトして試験した（10mM Hepes,pH7.0中１μg/μｌ）；分泌型アルカリ性ホスファターゼをコードするcDNAから転写されたcRNA（S.Udenfriend博士により寛大に供与された）5ngを、健全な卵母細胞の選択に対する内部標準として，すべてのmRNAあるいはcRNA試料と共に同時注入した（Tate,S.S.ら,FASEB J（1990）４:227−231）。マイクロインジェクトされた卵母細胞を96−ウェル培養プレートの個々のウェルにおいてMBSH II中で18℃で48時間培養した；次いで、卵母細胞−調整培地を上記（Tateら，（上述））のアルカリ性ホスファターゼ活性に対してアッセイし、“最高に発現する”卵母細胞を機能性アッセイに対して選択した。
細胞質性RNAおよびポリＡ＋RNAを標準的方法（Sambrook,J.ら,Molecular Cloning,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）によりHEL細胞およびDami細胞から調製した。Sumikawa,K.ら,Nucl Acids Res（1982）10:5809−5822に記載のように、10−30％ショ糖密度勾配を厳密にかけて遠心分離によりサイズごとにポリＡ＋RNAを分画した。各勾配画分の一定分量をグリオキサールゲルで電気泳動によりサイズに対して分析した。各画分の残渣を２回エタノール沈澱させ、RNAは10mM Hepes,pH7.0中に１μg/μｌで溶解した。各画分の一定分量を上記の卵母細胞系においてトロンビンレセプター活性に対してアッセイした。
サイズで選択されたcDNAライブラリーをトロンビンレセプター活性の強い4kb mRNA画分からGublerおよびhoffmanの方法（Gene（1983）25:263−269）を用いて合成した。BstX Iアダプター（AruffoおよびSeed,Proc Natl Acad Sci USA（1987）84:8573−8577）に連結後、約3.5kbあるいはより大きなcDNAを、クローニングベクターpFROG内に連結する前に、アクリルアミドゲル電気泳動により選択した。pFROGベクターを、Not I部位の隣りにまれなカッターのMlu Iの制限部位を挿入するリンカーを加えることにより、pCDM6XL（C.Spencer Yost,UCSFにより寛大に供与されたpH4M誘導ベクター（AruffoおよびSeed（上述））から誘導した。pFROGは、SP6 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下でcDNAを配置し、アフリカツメガエルのグロビンの5'−非翻訳領域を含有し、続いてcDNA挿入部によりコードされた情報を有するハイブリッドmRNAの合成を指示した。
E.coli MC1061株をエレクトロポレーションによりcDNAライブラリーを用いて形質転換し、１プール当り20,000クローンを有する50個のプールをプレートした。モデルクローン、すなわちpFROG内のセロトニン1cレセプターcDNAを運搬するMC1061は、内部標準として2000個当り１クローンに包含された。プラスミドDNAを各プールから調製し、Not Iでの消化により直鎖状にした；キャップ化cRNAをインビトロで生成し（KriegおよびMelton,Meth Enzymol（1987）155:397−415）、上記の卵母細胞系においてトロンビンレセプター活性に対してアッセイした。
電圧固定法および45Ca遊離アッセイの両方を用いて、すべてのプールをスクリーニングした。最初の５つのスクリーニングされたプールのうち全部がいくらかのトロンビンレセプター活性を示した;45Ca遊離アッセイにおいて、トロンビン誘導による45Ca遊離の増加は、２倍から６倍までの範囲である。最も活性なプールを１プレート当り約2000クローンで再びプレートし、卵母細胞系において再スクリーニングした。スクリーニングされた10個のプールのうち２個は、トロンビンレセプター活性に対して陽性であった。これらのうち最も活性なものを１プレート当り300クローンで再びプレートし、そのプールを再スクリーニングした。活性プールの漸進的選択および下位区分化により、単一クローンを同定した。
3480−ヌクレオチドcDNA挿入部をpBluescriptのXho I部位内にサブクローン化した。挿入部の制限断片をM13内にサブクローン化した。cDNA配列をジデオキシシークエンシング法により各方向に２回（コード領域に対しては３回）決定した。その結果を図１に示す。
図１は、トロンビンレセプタータンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を共に示す。推定シグナル配列および７つのトランスメンブランスパンを含有する疎水性領域に上線を引いている。シグナルペプチダーゼによるシグナル配列のプロセシングの後、おそらくプロリン特異性アルギニル開裂による追加プロセシングは、図上で印を付けた27および28の位置のアルギニン間で起こる。それゆえ、成熟タンパク質のアミノ末端はRPESK...で始まる。アスパラギン連結が可能である糖結合部位は下線を引き、コンセンサスポリアデニル化領域は太文字にしてある。R41/S42での推定のトロンビンレセプター開裂部位もまた印をつけてある。
上記のように、図２は、細胞膜におけるトロンビンレセプターの配置図を提供する。図２に示されるように、無傷の、および不活性化のトロンビンレセプターのアミノ末端の細胞外の伸長は、トロンビンにより開裂され、新しいアミノ末端をさらし、本明細書中で“活性化ペプチド”と称される短いレセプター断片を遊離する。次いで、新たにさらされたアミノ末端は、アゴニストとして機能し、トロンビンレセプターの未だ不確定な領域に結合し、そしてそれを活性化する。それゆえ、トロンビンレセプターは、チモーゲン−酵素の変換に類似のメカニズムにより活性化される。それゆえ、７つのトランスメンブラン領域を含有する他のレセプターのようなトロンビンレセプターは、S42/F43の天然体Ｎ−末端を有するそれ自身のリガンドを含有する。
トロンビンレセプターをコードするヒトcDNAを利用することにより、対応するマウス型を検索することが可能になる。高い相同性の度合いは、開裂部位および陰イオン性外部部位の結合ドメインに示される。これらの配列のお互いとの、およびヒルジンの陰イオン性外部部位の結合ドメインとの相同性が図３に示される。
実施例２
Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2（SFLLRN−NH2）の合成
パラメチルベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩（0.5mmol合成、0.77meq/g、Applied Biosystems、Foster City,CA）は、Ｎ−メチルピロリジノン（NMP）中のジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を中和させ、続いて洗浄し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルと結合した要求されるアミノ酸を加え、Applied Biosystems社製の431A peptide synthesizerを用いて順序正しく導入した。Boc−アミノ酸は次の側鎖の保護を有していた:Ser（OBzl）およびArg（Tos）。完全ペプチド樹脂の開裂をHF/アニソール／メチルエチルスルフィド（56/6/1（v/v））で行い、粗ペプチドを与えた。その粗ペプチドを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）含有の勾配をかけたアセトニトリル−水を用いてC18逆相液相クロマトグラフィーにより精製した。
実施例３
野生型および変異型トロンビンレセプターcRNAを発現する卵母細胞上の“新しいアミノ末端”ペプチドのアゴニスト活性
野生型トロンビンレセプターcRNA（WT）5ngあるいはアミノ酸置換R41A（R41A）を有する変異型トロンビンレセプターをコードするcRNA 5ngで卵母細胞にマイクロインジェクトした。表示は、上記のようにトロンビンに対するそれと同様である−−41位でアラニンがアルギニンと置換する。次に、未注入の卵母細胞あるいはトロンビンレセプターcRNAを発現する卵母細胞を48時間培養し、トロンビンあるいはペプチド誘導45Ca遊離を上記のように測定した。候補アゴニストを飽和濃度で加えた:250pMのトロンビンおよび25μＭの“新しいアミノ末端”ペプチドSFLLRNPNDKYEPF（SFLLペプチド）。対照ペプチドFSLLRNPNDKYEPF（FSLLペプチド）を100μＭで加え、応答を誘起しなかった。表１に示されたデータは、３回反復測定の平均値＋／−SEMを示す；これらの結果は、３つ、あるいは４つの別々の実験で得られたデータを表す。
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アゴニストSFLLペプチドは、未注入の卵母細胞に対して活性を有しない（未掲載）。アゴニスト誘導45Ca遊離よりむしろ電圧固定された卵母細胞内のアゴニスト誘導内部電流をエンドポイントとして使用したとき、定性的に同一の結果が得られた。
実施例４
血小板の分泌および凝集およびマイトゲン効果に対する“新しいアミノ末端”ペプチドのアゴニスト機能
洗浄された血小板を調製した。これは、Baenzinger,N.G.,Meth Enz（1974）31:149−155;およびCharo,I.F.ら,J Clin Invest（1977）63:866−873に記載されている。アゴニスト誘導応答を上記のように評価した。
１、10、20、100あるいは200μＭペプチドSFLLRNPNDKYEPF“SFLL"ペプチド、あるいは20nMトロンビンに応答した血小板凝集を発光血小板凝集計（lumiaggregometer）で測定した。その結果を図4Aに示す。
表示の最終濃度の“新しいアミノ末端”ペプチドに応答した血小板ATP分泌も、発光血小板凝集測定法により続いて測定した。その結果を図4Bに示す。
図４に示されたデータは、各アゴニスト濃度に対して３回得られた凝集あるいは分泌の応答を表す実測の軌跡であり、５つ以上の別々の実験において得られた結果を表す。100％凝集は、１分で飽和濃度のトロンビンに応答して起こる凝集として任意に定義される。100％分泌は、飽和濃度のトロンビンに応答して起こる最大応答として任意に定義される。“新しいアミノ末端”ペプチドは、図に示されるような両アッセイにおいて、100μＭ濃度で20μＭトロンビンと同等に活性である。対照ペプチドFSLLRNPNDKYEPFおよびLLRNPNDKYEPFは、200μＭという高い濃度では両方とも活性がなかった（未掲載）。
追加の測定において、アゴニストペプチドのマイトゲン効果をCCL−39細胞を用いて実証した。線維芽細胞系CCL−39を無血清培地中で静止させ、次いで、トリチウム標識チミジンの存在下、候補アゴニストで48時間処理する。次に、標準方法を用いてDNAへの標識の取り込みを、図５中のcpmとして示されるTCA−不溶性活性として測定した。図に示されるデータは、６回反復測定の平均値のプラスあるいはマイナスの95％信頼限界を表す。
図に示されるアゴニストは以下の通り：
なし（無血清）；
10％胎児ウシ血清（10％FCS）；
100nMα−トロンビン（ａ−Ｔ）；
配列SFLLRNPNDKYEPFの１、10あるいは100μＭアゴニストペプチド（NTP）；
100μＭ“スクランブルされた（scrambled）”アゴニストペプチド、これは、FSにスクランブルされたＮ−末端を有する前記のもの（アゴニストペプチド）である（FSLL）。
図５に示されるように、100μＭのNTPは、生育に有意な刺激を与える。アゴニストの最初の２残基の位置を単に交換することは、活性の喪失を引き起こす。それゆえ、アゴニストペプチドは、血小板凝集を刺激し、そして線維芽細胞の増殖を刺激することに有用であり、傷の治療の応用に有用である。
血小板凝集アゴニスト
上記の血小板凝集アッセイを用いて、50％最大凝集を誘起するために必要な種々のペプチドの濃度を測定した。EC50として示される得られた値をマイクロモル単位で表２に示す。
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実施例５
トロンビン阻害剤ペプチドによるトロンビン誘導血小板活性化の阻害
本発明の３つのアンタゴニストペプチドである、LDPRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNES（LDPRPペプチド）、F+PRPFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNES（F+PRPペプチド）、およびLDPRPFLL（短小化LDPRPペプチド）を、トロンビン誘導血小板活性化を阻害する能力について試験した。トロンビンを候補となる阻害ペプチドと共に、５分間インキュベートし、次いでその混合物を洗浄した血小板に加え、血小板活性化を発光血小板凝集法によって血小板ATP分泌として測定した。上記混合物は全容量20μｌのリン酸緩衝生理食塩水中で、上述の標題「アッセイ」の記載に記載されるように調製されおよび懸濁された血小板480μｌに加えた。候補ペプチドは、種々の濃度で用いた。この結果を図6A、6B、および6Cに示す。ATP分泌は、候補ペプチドの非存在下10nMトロンビンによって発生した平均蛍光シグナルに対する百分率で表示した。示される図は、３回の反復実験を行って得られた結果の代表例である。
図6Aは、LDPRPペプチドに対する結果を示す。これは、約500nMのIC50を示す。LDPRPペプチドは、開裂部位および推定のトロンビン結合部位の両方を表す配列を含む。図6Bは、短小化LDPRPペプチドに対して得られた結果を示す。LC50は、約200μＭである。
しかし、図6Cに示されるように、別の形の推定の開裂部位および推定の結合部位を含むF+PRPペプチドは、約200nMのIC50を示す。従って、このペプチドは、LDPRPペプチドまたはその短小化形のいずれよりもより有効なアンタゴニストである。
実施例６
トロンビンレセプターアンタゴニストペプチドの調製：
Mpr−Phe−Cha−Cha−arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−OHの合成
Ｎ−α−Boc−ε−（Cl−CBZ）−Lys−Ｏ−Pam−樹脂（0.5mmol、0.70meq/g、Applied Biosystems、Foster City、CA）を出発物質とし、Boc基をTFAで除去し、中和して、洗浄した。そして必要なアミノ酸を、Apllied Biosystems社製の431A peptide synthesizerを用いて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとして結合することにより、配列に加えた。ペプチドを樹脂から切断し、実施例３に記載のように逆相クロマトグラフィーによって精製した。
類似的に合成した候補ペプチドを、上述の血小板活性化／凝集アッセイにおいて試験し、トロンビンの存在下に種々の濃度で加えた。活性化または凝集の50％阻害を生じた濃度をIC50と称し、試験した種々のペプチドに対して、表３にマイクロモル単位で示す。
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表３に示されるように、ロイシンにChaおよびAsn残基にLysのようなアミノ酸の置換が、アンタゴニスト活性を改良する。
実施例７
活性部位トロンビン変異体の生成
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Kunkel,T.A.,ら、Meth Enzymol（1987）154:367−383）を用いて、Bluescript SK−プラスミドベクター系（Stratagene、La Jolla、CA）にクローン化された天然プロトロンビンcDNA中で、活性部位の残基の置換S205AおよびD99N/S205Aを生成した。DNAシークエンスにより確認した後に、トロンビン活性部位および天然プロトロンビンcDNAにおいて所望の変異（類）を有するプロトロンビンのDNAコーディングを、pBJ1発現ベクター（pcDL−SRα296由来）（Takabe,Y.,ら、Mol Cell Biol（1988）８:466−472）にサブクローン化し、pSV2DにおけるDHFR選択マーカーを用いて（Sabramani,S.,ら、Mol Cell Biol（19819２:854−864）、リポフェクション（lipofection）により（Felgner,P.,ら、Proc Natl Acad Sci USA（1987）84:7413−7417）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）−マイナスCHO細胞に同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクト体を単離し、遺伝子増幅を80nMメトトレキセート中で行った。
組換えプロトロンビンの生産をELISAおよびウェスタンブロットにより測定し、最も高収量のクローンを生育させて、MEMのα−ヌクレオシド欠乏培地で24,000cm2の表面を有する細胞「factory」（Nunc,Inter Med社,Neperville,IL）中で培養した。上記の培地は、80nMのメトトレキセート、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、25mMのHepes緩衝液、５μg/mlのビタミンＫ、0.2mg/mlのプロリン、および10％透析ウシ血清を含有する。充分に増殖したとき、培地をすべて除去し、全増殖表面をリン酸緩衝生理食塩水で６回洗浄して、夾雑するウシのプロトロンビンおよびトロンビンを除去し、そして細胞をMEMのα−ヌクレオシド欠乏培地で36−48時間培養した。この培地は、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、25mMのHepes緩衝液、５μg/mlのビタミンＫ、0.2mg/mlのプロリン、１μg/mlのインシュリン、および５μg/mlのトランスフェリンを含有する。
調製培地から遠心分離および濾過によって細胞残渣を取り除き、水で1:1に希釈し、10mMのTris−HCl、pH7.4、および20mMのクエン酸（最終濃度）にして、１％（v/v）Ｓ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。Ｓ−セファロースビーズを遠心分離によって除去し、調製培地を再濾過し、１％（v/v）Ｑ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。次いで、Ｑ−セファロースを10mlカラムに採集し、600mMのNaCl、10mMのTris−HCl、pH7.4、0.5％のPEG 6000で1mlの画分で溶出し、抗ヒトトロンビン抗血清を用いてウェスタンブロットにより同定される組換えトロンビンを含む陽性の画分を得た。
陽性の画分をプールし、150mMのNaCl、10mMのTris−HCl、pH7.4、0.5％のPEG 6000中にS205A変異プロトロンビンが100μg/mlの濃度になるように希釈し、そして既に記載されるように（Krishaswamy,S.,ら、J Biol Chem（1987）262:3291−3299）、プロトロンビナーゼ複合体で１時間処理した。次いで、pHを1MのHCLで7.0に変え、S205AまたはD99N/S205A変異トロンビン含有溶液を約1,000倍モル過剰の（ｐ−アミジノフェニル）−メタンスルフォニルフルオライド（APMSF）で処理し、調製物に夾雑し得るXa因子および任意のウシトロンビンを阻害した。APMSFはセリン依存性の不可逆的のトロンビンアンタゴニストであり、これはpH7.0では天然のトロンビンを急速に不活性化するが、pH8.0ではその半減期が10-3秒でしかない。この理由のために、APMSF処理された変異トロンビン調製物のpHを、次いで8.0に15分間変えて、全APMSFを除去した。
変異トロンビン含有溶液を、次いで1HNClの添加によりpH6.0に変え、１％（v/v）Ｓ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。このＳ−セファロースを10mlカラムに採集し、150mMのNaCl、10mMのMES、pH6.0で洗浄し、続いて1ml画分に600mMのNaCl、10mMのMES、pH6.0、0.5％のPEG 6000で溶出した。陽性の画分を抗ヒトトロンビン抗血清を用いてウェストンブロットによって同定し、組換えS205AまたはD99N/S205Aトロンビン調製物の濃度および純度をクーマシーおよび銀で染色したSDS−PAGEゲルによって測定した。本研究で用いた変異トロンビンの調製物は、銀染色SDS−PAGEゲル上で均一であった。
実施例８
フィブリノーゲン凝固アッセイ
フィブリノーゲン凝固活性を、標準のFibro System▲R▼凝固タイマー（Fisher Scientific社,Springfield,NJ）により、種々のフィブリン濃度でフィブリン凝固を生成するのに必要な時間として測定した。全てのフィブリノーゲン凝固反応は、150mMのNaCl、20mMのTris、pH7.4、10mMのCaCl2、0.5％のPEG 6000中の全容量300μｌ中で、37℃で行い、フィブリノーゲンの最終濃度を3.3mg/mlとした。標準WTおよび組換えWTは共に同一の曲線を示した。例えば、5nMでは、凝固時間は10秒である。S205AおよびD99N/S205Aのいずれも凝固を誘導し得なかった。
実施例９
血小板ATP分泌および凝集の研究
洗浄した血小板を上述のように調製し、2mMのマグネシウムおよび1mMのカルシウムを有する改変したTyrodeの緩衝液、pH7.4中で、108血小板/mlの濃度で懸濁した。血小板の全ての研究は、20μｌのChromolume▲R▼試薬（Chronolog Corporation社,Havertown,PA）を有する全容量500μｌ中で行った。血小板のATP分泌および凝集を、Chronolog dual−channel lumiaggregometer（Chronolog Corporation社,Havertown,PA）で、それぞれ蛍光と光透過とにおける変化を測定することにより、個別に定量した。血小板を300rpmで攪拌し、アゴニストを速くかつ均一に分散させた。
500μｌの血小板を15分間37℃で、所望の最終濃度を与えるような、600mMのNaCl、10mMのMES、pH6.0、0.5％のPEG 6000緩衝液中の希釈されたS205A貯蔵液18μｌと、または18μｌの緩衝液のみとインキュベートし、次いで天然トロンビン（最終濃度1mM）を投与した。血小板ATP分泌および凝集を、トロンビン添加後30秒間測定した。血小板ATP分泌データは、緩衝液で前処理した血小板に1mMの天然トロンビンの添加後30秒で得られた蛍光シグナルとして定義される、最大に対する百分率として表示した。この結果を図７に示す。各点は３回の反復測定の平均値を示し、３回の反復実験の典型例である。図示されるように、S205Aトロンビン濃度が上昇すると、トロンビン誘導血小板分泌の阻害が増加する。同様の結果が、D99N/S205A変異トロンビンを用いて得られた。
さらに測定を行ったところ、400nMのS205Aトロンビンにおいて、天然トロンビンに比べて、血小板の投与反応の結果が約1log右にシフトすることが示された（図８）。この測定では、600mMのNaCl、10mMのMES、pH6.0、0.5％のPEG 6000緩衝液中でS205Aを最終濃度400nMにしたS205A 18μｌ、または同量の緩衝液のみ（固体系）を、血小板500μｌと、15分間37℃でインキュベートした。次いで、指示した最終濃度のαトロンビンで血小板を刺激し、血小板ATP分泌および凝集をトロンビン添加後30秒間行った。示されたデータは、血小板ATP分泌の初速度、特にアゴニスト添加後30秒以内および凝集が検出される前に生ずる血小板ATP分泌の最大速度を示す。従って、報告された血小板ATP分泌速度によりアゴニスト誘導反応が示されるが、凝集誘導反応は示されない。３回反復実験から得られた曲線を図５に示す。ここでの任意の１単位は、ATP標準を用いた検量に基づくと、１秒当り放出されるATP量の33pmoleに相当する。
さらに実験を重ねたところ、S205Aトロンビンは天然トロンビンに誘導される血小板分泌の割合を阻害することが示された。血小板を種々の濃度のS205Aとともに予めインキュベートし、次いで天然トロンビン（最終濃度1nM）で刺激した。凝集により誘導される分泌を妨害するために、本実現での血小板を最終濃度が２×107血小板/mlになるように懸濁し、天然トロンビンを加えた後に攪拌しなかった。この条件下では、血小板は凝集しないが、トロンビンと反応してATPを分泌した。血小板分泌速度は上述の任意の単位で表した。図９は血小板分泌曲線を示し、３回反復実験で得られた結果を表す。コントロール曲線（0nM S205Aトロンビン）で見られる蛍光の減少は本アッセイに特徴的であり、ルシフェラーゼの最終生産物阻害を表す。
しかし、S205Aトロンビンは、アゴニストペプチドまたはカルシウムイオノフォアでの刺激により血小板に誘導されたATP分泌を阻害しない。
実施例10
抗体の調製
トロンビンレセプターアミノ末端伸長の部分を表すペプチドを免疫原として用い、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を調製した。
PESKATNATLDPRSFLLCペプチド（開裂部位ペプチド）およびYEPFWEDEEKNESGLTEYCペプチド（アニオン外部部位ドメインペプチド）を用いて、抗体を生産した。これらの抗血清を、上述の血小板活性化アッセイにおいて、アンタゴニストとして作用を試験した。いずれもが活性化を阻害するのに有効であった。アニオン外部部位ドメインペプチドであるAb1047と免疫反応性のポリクローナル抗体調製物を、トロンビンを加える前に1nMの濃度で血小板とインキュベートし、血小板を加えた。Ab1047を結合するペプチドすなわち「ペプチド360」の添加により、阻害が生じなくなった。1:100希釈でのAb1047は、血小板の凝集および活性化をほとんど完全に阻害する。
レセプターの開裂部位および推定アニオン結合外部部位を含むPESKATNATLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTECペプチドもまた用いて、モノクローナル抗体を阻害する有効なレセプターを調製した。この40残基のペプチドは、天然配列のカルボキシル末端にCys残基を付加されており、チオール特異的試薬であるｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル（Sulfo−MBS,Pierce Chemical Co.）を用いて、Cys残基によりキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に共有結合した。ペプチド−KLH結合体の透析の後、この物質を用いて、３匹のBALB/cマウスを免疫処理した。各マウスから得られた脾臓細胞をP3X細胞と融合し、ハイブドーマのパネルを形成した。
これらのハイブリドーマから得られる上清液を、免疫処理に用いた天然の40残基ペプチドおよびELISAアッセイで配列の長さを40残基に拡げた15残基ペプチドと交叉反応する能力についてアッセイした。IgG特異的クローンのみをさらに研究した。ポジティブなハイブリドーマを、マイクロタイタープレートシェーカーアッセイで、トロンビン誘導血小板凝集の阻害の能力について試験した。最終的に、ポジティブなハイブリドーマを、塩濃度を増加して洗浄した条件下で、40残基ペプチドを用いて、ELISAアッセイで再びアッセイし、見かけ上親和性が高い６つのハイブリドーマを選択した。この６つのハイブリドーマを限界希釈によりサブクローン化し、４−２、10−６、31−２、33−１、61−１、および62−５クローンを得た。
各クローンを、腹腔内にマウス当たり１×107細胞を注射することにより腹水を生産した。IgGを豊富に含む腹水をプロテインＡ−セファロースを用いて精製した。これはIgGの治療可能性がIgMよりも大きいからである。これらの精製モノクローナル抗体のトロンビン誘導血小板凝集の（アゴニストとしてトロンビンを用いる）阻害に対する能力を洗浄した血小板で評価して、その結果を表５に示す。これらのMoABについてのIC50は、2.5−20μg/mlの範囲の精製IgGを示した。
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【図３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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