(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、非ヒト起源の相補性決定部（ＣＤＲｓ）、ヒト起源のフレームワーク部（ＦＲｓ）を有する可変部、および重鎖と軽鎖の定常部を含むヒト化抗体からなり、該定常部はヒト起源のものであり、該相補性決定部（ＣＤＲｓ）の重鎖および軽鎖は、以下に示すアミノ酸配列を有し、該フレームワーク部（ＦＲｓ）の重鎖および軽鎖は、以下に示すアミノ酸配列を有する、上記モノクローナル抗体。
相補性決定部（ＣＤＲ２）の軽鎖：
0003585303.tif 000017
相補性決定部（ＣＤＲｓ）の重鎖：
0003585303.tif 000018
フレームワーク部（ＦＲｓ）の軽鎖：
0003585303.tif 000019
フレームワーク部（ＦＲｓ）の重鎖：
0003585303.tif 000020
（A,B,C,D及びEはそれぞれ、arg,val,ser,thr及びala; arg,val,thr,asn及びthr; lys,ala,thr,asn及びthr; arg,val,ser,thr及びthr; あるいはlys,ala,ser,thr及びthrを表す）
0003585303.tif 000021
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫学の分野に関し，とくに天然のマウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が低く，改良されたエフェクター機能を有する，ＥＧＦ−Ｒに対するキメラおよびヒト化モノクローナル抗体である新規な２種の生成物に関する．
本発明はまたこれらの抗体を含有する治療用および診断用組成物に関する．
【０００２】
【従来の技術】
５３個のアミノ酸を有するポリペプチドであり，分子量６０４５Ｄ  の上皮成長因子（ＥＧＦ）は，最初にマウス顎下腺から単離され精製された［Ｃｏｈｅｎ  Ｓ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  （１９６２），  ２３７，  １．５５５］．その後，類似分子がヒト尿から得られた［Ｃｏｈｅｎ  Ｓ  ＆  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｇ，  （１９７５），  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７２，  １３１７］．このポリペプチドの作用は，主としてその膜受容体，分子量１７０ＫＤの糖タンパク質を介して行われる．その細胞内ドメインはチロシンキナーゼ活性に関連し，悪性転換過程との関係が示されている腫瘍遺伝子ｖ−ｅｒｂ−Ｂ  と構造的相同性を有する［Ｈｅｌｄｉｎ  ＣＨ  ら，  （１９８４），  Ｃｅｌｌ  ３７，  ９−２０  ］．
【０００３】
高レベルのＥＧＦ−Ｒが上皮起源の悪性腫瘍たとえば乳癌，膀胱癌，卵巣癌，外陰癌，結腸癌，肺癌，脳腫瘍および食道癌から検出されている．腫瘍増殖の調節においてＥＧＦおよびその受容体が果たす役割は未知であるが，腫瘍細胞内でのＥＧＦ−Ｒの発現は制御不能な増殖を招く自己分泌増殖刺激のある機構を与えることが示唆されている［Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＡＢ，  Ｌｅｖｉ  Ａ，  Ｌｉｂｅｒｍａｎ  Ｔ＆  Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ，  （１９８３）  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４（２），  ９３−１１１］．
【０００４】
ＥＧＦが乳癌細胞系の過剰増殖を引起こし［Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＣＫら，  （１９８０），  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，  ２．３６１  ］，さらにある種の細胞性システム下に分化を調節することが報告されている［Ｔｏｎｅｌｌｉ  ＣＪ，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８０），  ２８５，  ２５０−２５２  ］．細胞の分化および増殖に対するこれらの作用はＥＧＦ−Ｒの高発現と相関する（Ｂｕｓｓ  ＥＪ  ら，  １９８２，  ＰＮＡＳ  ７９，  ２．５７４）．
【０００５】
腫瘍細胞中のＥＧＦ−Ｒの存在はヒト乳癌における予後不良の指標となることが明らかにされている．乳房腫瘍の約４０％がＥＧＦ対して高親和性の特異的結合部位を示す［Ｐｅｒｅｚ  Ｒ，  Ｐａｓｃｕａｌ  ＭＲ，  Ｍａｃｉａｓ  Ａ，  Ｌａｇｅ  Ａ，  （１９８４）  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔ．  ４，  １８９−１９３］．またエストロゲン受容体の存在とは逆相関があり，これはＥＧＦ−Ｒを悪性細胞の増殖の潜在能力の未分化マーカーまたは指標として指摘するものである．
【０００６】
他のグループは，ＥＧＦ−Ｒの発現が原発性乳癌におけるより局所性転移結節腫において高いこと［Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ＪＲ    ら，  （１９８５）  Ｌａｎｃｅｔ  １，  ８．４２５，  ３６４−３６６  ］，受容体の発現はヒト乳癌細胞の組織学的サブタイプの差により異なり，その存在は予後不良の兆候となること［Ｍａｃｉａｓ  Ａ    ら，  （１９），  Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６：  ８４９−８５２］を報告している．
様々な研究で得られた所見がＥＧＦ−ＥＧＦ−Ｒ系を治療活動の可能な標的として考慮することを促進してきた．
【０００７】
本発明者らは，欧州特許出願第９３  ２０２  ４２８．４号に記載のようにヒト胎盤に対して作成されたマウスモノクローナル抗体（Ｒ３）を得て，それがヒトＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインと結合することを見出した．これは低および高親和性ＥＧＦ−Ｒ部位の両者においてＥＧＲの結合を阻害することが見出された．
【０００８】
ＥＧＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体を用いる受動免疫療法が多くの研究の対象とされ，これらから，その抗体に対する受容体の特異的認識がＥＧＦの結合を阻害し，悪性細胞の分裂促進刺激に対して阻害作用を示すことが明らかにされた［Ｓａｔｏ  ＪＤ  ら，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ，  １４８  ６３−８１  ］．しかしながらマウス起源のこれらの抗体はヒト抗マウス抗体応答を生じるとの証拠もある．
【０００９】
Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  によるハイブリドーマ抗体技術の発展は免疫化学の秩序に革命をもたらし，臨床診断および免疫療法への適用の可能性を有する試薬の新規なファミリーを提供することになった［Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７］．基礎研究および臨床診断における使用のためマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造が定常化した一方で，これらは，ヒトにおける半減期が短いこと，ヒト免疫系によるマウス抗体エフェクタードメインの認識が貧弱であること，および異種免疫グロブリンが抗グロブリン応答（ＨＡＭＡ応答）を誘発し，これが治療の妨害となることから，インビボ免疫療法でのこれらの使用は困難であった．
【００１０】
抗体遺伝子を遺伝子操作し，ついでこれらの改変された遺伝子をトランスフェクション法により発現できるは，既存のハイブリドーマ抗体よりさらに望ましい性質をもつｍＡｂの製造を可能にする．すなわち，遺伝子工学技術を用いて，抗体分子における所望のエフェクター機能を増強し，望ましくないエフェクター機能を減弱または消失させること可能である．
【００１１】
抗体遺伝子をクローン化するための組換えＤＮＡ技術の使用は，マウスｍＡｂを同一の抗原結合性を有する支配的にはヒト型の抗体に変換した代替物を提供してきた．Ｓ．Ｌ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎは１９８４年に，マウス抗体産生骨髄腫細胞系の可変部遺伝子を取り出し，それらをヒト免疫グロブリン定常部に連結することによって，特定の抗原−結合特異性を有するマウス−ヒト抗体分子を創成した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ  ら，  １９８４，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１，  ６８５１−６８５５）．
【００１２】
他の研究者は，マウス抗体から全可変ドメインではなく抗原結合部位のみを移植することによりヒト抗体中に直接，齧歯類抗原結合部位を構築することを試みている［Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ    ら，  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ５２２−５２４；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  Ｍ  ら，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６］．この方法のいくつかの応用が開発され［Ｒｉｅｔｃｈｍａｎｎ  Ｌ    ら，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７；  Ｑｕｅｅ  Ｃ  ら，  （１９８９）  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３］，他の研究者らは，元の抗原に対する親和性を回復させるために，ヒトＦＲ中に一部マウス残基を包含させた再構成抗体の研究を行っている［Ｔｅｍｐｅｓｔ  ＰＲ  （１９９１），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  ２６６−２７２  ］．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって，本発明は，非ヒト起源の抗原結合部位ならびにヒト起源の定常部（キメラ）および，必要に応じて結合の特異性が保存または回復されるように修飾されたヒト起源の可変部および定常部のＦｒから構成された，とくにＥＧＦ−Ｒに対するキメラおよびヒト化ｍＡｂの提供を目的とする．
【００１４】
とくに，本発明はＥＧＦ−Ｒに対する抗体の抗原結合部位の超可変領域の特性を明らかにし，上に定義したヒト化およびキメラｍＡｂ内のこれらのＣＤＲを提供することを目的とするものである．
【００１５】
これらの抗体は，ＥＧＦ−Ｒを高度に発現する腫瘍と交戦するための治療薬または診断薬としての役割を果たすものと考えられる．
【００１６】
【課題を解決するための手段】
Ｒ３の可変部のｃＤＮＡ合成および遺伝子増幅：
本発明者らによって得られた［Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ  ら，（１９８９）  ＩＦＮ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ６（３），  ２８９−２９８  ］抗体Ｒ３（ＩｇＧ２Ａ）の細胞質ＲＮＡを，ハイブリドーマ細胞約１０６  個から抽出した．ＲＮＡの抽出には  Ｆａｌｏｒｏ  らにより記載された方法を用いた［Ｆａｌｏｒｏ  Ｊ，  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ  ＆  Ｋｅｍｅｎ  Ｒ，  （１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ  ６５：７１８−７４９  ］．
【００１７】
ｃＤＮＡ合成反応混合物は  Ｔｅｍｐｅｓｔらの記載のように処理した［Ｔｅｍｐｅｓｔ  ＰＲ，Ｂｒｅｍｎｅｒ  Ｐ，  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｍ，  Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ，  Ｆｕｒｚｅ  ＪＭ，  Ｃａｒｒ  ＦＤ  Ｊ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ  ＷＪ，  （１９９１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ２６６−２７１  ］．略述すれば，５μｇ  のｍＲＮＡ，２５ｐｍｏｌのＶｈまたはＶＫプライマーＦＯＲ，２５０μＭの各ｄＮＴＰ，１０ｍＭのＤＴＴ，５０ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ８．３），８ｍＭのＭｇＣｌ２  ，７５ｍＭのＫＣｌおよび１５単位のＲＮＡｓｅインヒビターを含有する反応混合物５０μｌ  を７０℃に１０分間加熱し，３０分間を要して３７℃まで徐々に冷却した．ついで１００単位のＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を添加し，インキュベーションを３７℃で１時間継続した．
【００１８】
ＶＨおよびＶＫ    ｃＤＮＡを，Ｏｒｌａｎｄｉ  らの記載に従い，ＰＣＲを用いて増幅した［Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｒ，  Ｇｕｓｓｏｗ  ＤＨ，  Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ，  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ，  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：  ３８３３−３８３７  ］．ＶＨのＰＣＲ増幅には，５μｌ  のｃＤＮＡ，２５ｐｍｏｌのＣＧ２ＡＦＯＲおよびＶＨ１ＢＡＣＫプライマーからなるＤＮＡ／プライマー混合物を使用した．ＶＫのＰＣＲ増幅には，ＤＮＡ／プライマー混合物は５μｌ  のｃＤＮＡ，２５ｐｍｏｌのＣＫ２ＦＯＲおよびＶＫ１０ＢＡＣＫプライマーの構成とした．これらの混合物に最終容量５０μｌ  中２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ，１０×サーモレース緩衝組成液５μｌ  および  Ｔｈｅｒｍｏｌａｓｅ  （ＩＢＩ  ）１  単位を添加した．サンプルを９４℃で３０秒間，５０℃で３０秒間，７２℃で１分間の加熱サイクルに付し，これを２５回反復し，最終のインキュベーションは７２℃で５分間行った．増幅されたＶＨおよびＶＫ    ＤＮＡを  Ｐｒｅｐ．  Ａ  Ｇｅｎｅ  精製キット（ＢｉｏＲａｄ）で精製した．
【００１９】
増幅ｃＤＮＡのクローンニングおよび配列決定：
精製されたＶＨおよびＶＫ    ｃＤＮＡをＭ１３−ｍｐ１９    ベクター中にクローン化した．クローンはＴ７ＤＮＡ    Ｐｏｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ）を用いジデオキシ法により配列を決定した．本発明者らはＶＨについてはＶＨ１ＢＡＣＫおよびＶＨ１ＦＯＲプライマーを，ＶＫについてはＶＫ３ＢＡＣＫおよびＶＫ３ＦＯＲプライマーを用いＰＣＲによりｃＤＮＡを再増幅した．増幅されたｃＤＮＡを，ＶＨ遺伝子については  ＰｓｔＩ  および  ＢｓｔＥＩＩ  ，ＶＫ遺伝子については  ＰｖｕＩＩおよび  ＢｇｌＩＩで消化した．フラグメントをＭ１３−ＶＨＰＣＲ１（ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化）またはＭ１３−ＶＫＰＣＲ１（ＰｖｕＩＩ  および  ＢｇｌＩＩで消化）にクローン化した．Ｖ遺伝子挿入体を含有するＭ１３ＶＨＰＣＲ−Ｒ３およびＭ１３ＶＫＰＣＲ−Ｒ３は配列決定によって直接同定した．
【００２０】
キメラ遺伝子の構築：
ＶＨ遺伝子を，Ｉｇ重鎖プロモーター，適当なスプライシング部位およびシグナルペプチド配列とともに，Ｍ１３ベクターから  ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ  での消化によって切り出し，発現ベクター（ｐＳＶｇｐｔ）中にクローン化した．ヒトＩｇＧ１定常領域［Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，  Ｖｅｄａ  Ｓ，  Ｏｂａｔｕ  Ｍ，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｔ，  Ｎａｋａｉ  Ｓ  ＆  Ｈｏｎｊｏ  Ｔ；  （１９８２），  Ｃｅｌｌ  ２９：  ７１８−７４９］をついで  ＢａｍＨＩフラグメントとして添加した．得られた構築体はＲ３ＶＨ−ｐＳＶｇｐｔであった．Ｒ３ＶＫ−ｐＳＶｈｙｇの構築もｇｐｔ遺伝子がハイグリマイシン抵抗性遺伝子に置換され，ヒトκ鎖定常部が付加された以外は本質的に同様に行われた［Ｈｉｅｔｅｒ  ＰＡ，  Ｍａｘ  ＥＥ，  Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＧ，Ｍａｉｚｅｌ  ＪＶ  Ｊｒ  ＆  Ｌｅｄｅｒ  Ｐ  （１９８０），  Ｃｅｌｌ  ２２：１９７−２０７］．
【００２１】
キメラ抗体の発現：
ＮＳＯ細胞に４μｇ  のＲ３ＶＨ−ｐＳＶｇｐｔγ１領域をエレクトロポレートし，８μｇ  のＲ３ＶＫ−ｐＳＶｈｙｇκ定常部をＰｖｕＩで消化して線状化した．これらのＤＮＡを一緒に混合し，エタノール沈降させ，２５μｌ  の水に溶解した．約１０７  個のＮＳＯ細胞を半集密状態まで増殖させ，遠心分離により収穫し，エレクトロポレーションキューベット内で消化ＤＮＡとともにＤＭＥＮ０．５ｍｌ中に再懸濁した．５分間氷上に置いたのち，細胞を１７０ボルト，９６０ｕＦのパルスで処理し（Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ），さらに３０分間氷上に放置した．ついで細胞を２０ｍｌのＤＭＥＮ＋１０％ウシ胎児血清中に取り，４８時間放置して修復させた．この時点で細胞を９６−ウエルプレートに分配し，選択培地（ＤＭＥＮ，１０％ウシ胎児血清，０．８μｇ／ｍｌ    ミコフェノール酸，２５０μｇ／ｍｌキサンチン）を適用した．トランスフェクトされたクローンは１４日後には肉眼で見ることができた．
【００２２】
トランスフェクトされたクローンを含有するウエルの培地中におけるヒト抗体の存在をＥＬＩＳＡによって測定した．マイクロタイタープレートウエルをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体（Ｓｅｒａ  Ｌａｂ）でコートした．ＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝食塩溶液，ｐＨ７．５）で洗浄後，トランスフェクタントを含むウエルからの培養培地２０μｌ  を各マイクロタイターウエルに添加して３７℃に１時間放置した．ついでウエルの内容物を空け，ＰＢＳＴで洗浄し，ペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−ヒトκ軽鎖特異的抗体（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ）を添加し３７℃で１時間インキュベートした．ついでウエルの内容物を空け，ＰＢＳＴで洗浄して，ｏ−フェニレジアミンを含む基質緩衝液を添加した．数分後に硫酸を加えて反応を停止させ，４９２ｎｍにおける吸光度を測定した．
【００２３】
ヒトフレームワーク中へのＣＤＲの移植
Ｒ３−ｈｕＶＨ（ａ）およびＲ３−ｈｕＶＫのヒト化第一バージョンの構築はＫｕｎｋｅｌらにより記載された方法［Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ  （１９８５），  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８２，  ４８８；  Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ  （１９８７），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５５，  １６６］と同様にしてＣＤＲグラフト法を用いて行った．略述すれば，Ｍ１３ＶＨまたはＶＫ    ＰＣＲベクター（ヒトＥｕＶＨ領域配列およびヒトＲＥＩＶＫ領域配列をコードする）中のＶＨまたはＶＫ一本鎖ウラシルＤＮＡ０．５μｇ  に，マウスＣＤＲ配列をコードするＶＨまたはＶＫリン酸化オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌを添加した．プライマーを７０℃に加熱して鋳型上にアニーリングさせ，徐々に３７℃に冷却した．部位特異的突然変異誘発ののち，ＤＮＡをコンピテントな大腸菌ＴＧ１細胞にトランスフォームした．各プラークから一本鎖ＤＮＡを調製して，配列を決定した．単一突然変異体または二重突然変異体のみが得られた場合には，これらを，適当なオリゴヌクレオチドを用い，三重ＣＤＲ突然変異体が得られるまでさらに突然変異誘発工程に付した．
【００２４】
再構成ヒトＲ３ＶＨのさらに他のバージョンはＰＣＲ突然変異誘発［Ｋａｍｍａｎｎ  Ｍ，  Ｌａｕｆｓ  Ｊ，  Ｓｃｈｅｌｌ  Ｊ  ＆  Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ  Ｂ  （１９８９），  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ８６，  ４２２０−４２２４  ］により，例５に記載のオリゴヌクレオチドを用いて構築した．
【００２５】
ＮＳＯ細胞中へのヒト化Ｒ３抗体のクローンニングおよびその発現：
ＣＤＲ−グラフトののち，Ｒ３ヒト化ＶＨおよびＲ３ヒト化ＶＫ遺伝子をもつＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ  フラグメントを発現ベクター中に再クローン化して，プラスミドＲ３ＨｕＶＨ  （１−７）−  ｐＳＶｇｐｔγ１およびＨｕＲ３ＶＫ−ｐＳＶｈｙｇκ定常部を得た．ベクターを  ＰｖｕＩ  で線状化し，ヒト化発現をＮＳＯ細胞へのキメラ発現と同様に行った．
【００２６】
ｍＡｂ    Ｒ３ＶＫおよびＶＨの分子モデリング：
マウスｍＡｂ    Ｒ３の可変領域のモデルは，１５０ＭＨｚ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩｎｄｉｇｏＥｘｔｒｅｍｅワークステーション上で走る分子モデリングプログラムＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲｍ  ４．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，  １９９４  ）を用いて作成した．ＶＫおよびＶＨフレームワークは別個に，それぞれ，Ｆａｂ２６−１０［Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｐ．Ｄ．，  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｒ．Ｋ．，  Ｓｉｅｋｅｒ  Ｌ．Ｃ．，  Ｃｈａｎｇ  Ｃ．Ｙ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｒ．Ｌ．，  Ｐｅｔｓｋｏ  Ｇ．Ａ．，  Ｈａｂｅｒ  Ｅ．，  Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ  Ｍ．Ｎ．  ＆  Ｓｈｅｒｉｆｆ  Ｓ．  （１９９３），  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，  ＵＳＡ，  ９０，  １０３１０］およびＦａｂ  ３６−７１［Ｓｔｒｏｎｇ  Ｒ．Ｋ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｒ．Ｌ．，  Ｒｏｓｅ  Ｄ．Ｒ．，  Ｐｅｔｓｋｏ  Ｇ．Ａ．，  ＳｈａｒｏｎＪ．  ＆  Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ  Ｍ．Ｎ．  （１９９３），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，  ３７３９  ］から作成した．Ｆａｂ２６−１０とｍＡｂ    Ｒ３はＶＫフレームワークで９２％の相同性，ＶＫ全領域では８８％の相同性を示した．Ｆａｂ３６−７１とＲ３    ｍＡｂのＶＨフレームワークには８５％の相同性が認められた．
【００２７】
座標は  Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （登録１ＩＧＩおよび６ＦＡＢ）より入手した．Ｆａｂ３６−７１のフレームワークをＦａｂ２６−１０のフレームワークとフィッティングさせたところ，マッチングは軽鎖および重鎖可変部の間のインターフェースに頻繁に含まれることが見出されている残基［Ｃｈｏｔｉａ  Ｃ，  Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｙ  Ｒ  ＆  Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ  （１９８５），  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １８６，  ６５１  ］のみに見られた．Ｆａｂ２６−１０のＶＨドメインおよびＦａｂ３６−７１のＶＫドメインはついで，必要なハイブリッドを残して削除した．側鎖の置換は最大重複操作に従って実施し［Ｓｎｏｗ，  ＭＥ  ＆  Ａｍｚｅｌ  ＬＭ  （１９８６），  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １，  ２６７  ］，可能な場合には他の結晶構造と比較した．
【００２８】
Ｒ３−可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（Ｌ１，Ｌ２およびＬ３）の超可変領域は，Ｆａｂ２６−１０の場合と同じ主鎖コンフォーメーションを保持させて構築した．両抗体の相当するＣＤＲが高い相同性を有し同一標準構造グループに属するからである［Ｃｈｏｔｉａ  Ｃ，  Ｌｅｓｋ  ＡＭ，  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，  Ｌｅｖｉｔｔ  Ｍ，  Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ，  Ａｉｒ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｉ  Ｓ，  Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，  Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ，  Ｔｕｌｉｐ  ＷＲ，  Ｃｏｌｍａｎ  ＰＭ，  Ｓｐｉｎｅｌｌｉ  Ｓ，  Ａｌｚａｒｉ  ＰＭ  ＆  Ｐｏｌｊａｋ  ＲＪ  （１９８９），  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  ８７７  ］．ｍＡｂ    Ｒ３のＶＨドメインにおいては，ＣＤＲ    Ｈ１はＦａｂ３６−７１の場合と同様に，標準構造グループ１に属し，したがって母体分子の主鎖ねじれ角を保持させた．ＣＤＲ    Ｈ２は標準構造グループ２に相当し，このループの主鎖コンフォメーションは，そのＨ２ループ塩基がＦａｂ３６−７１のフレームワークと良好なマッチングを示すことにより，とくに他の高度に解析された構造の中から選ばれたＦｖフラグメント４Ｄ５（登録１ＦＶＣ）より取り入れた．側鎖の配向のためには，上述のすべてのループについてデータバンクからの他のＣＤＲとの比較を行った．
【００２９】
ｍＡｂ    Ｒ３中１４アミノ酸長のＣＤＲ    Ｈ３のモデリングにはコンフォメーションのサンプリングのために高温分子ダイナミクスを使用した（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ＲＥ  ＆  Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ，  １９９０，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２９，  １８４７）．最初に，ＣＤＲ    Ｈ３を除いた全構造を，残基Ｈ−９４およびＨ−１０３を固定し，また主鎖原子には１０Ｋｃａｌ／（モル原子Ａ２）の調和拘束を用いてエネルギーの最小化を行った．ついでループを２個の先に固定したアミノ酸から開始して任意のコンフォメーションで構築した．フレームワークに近接するこれらの残基は他の結晶構造を考慮して配置し，ループの頂部は分子の残部との強い立体相互作用を回避するため拡張コンフォメーションで構築した．次のモデリング工程ではＣＤＲ    Ｈ３と５Å以内の距離の隣接側鎖のみを運動させた．最初にエネルギーの最小化を行い，ついで８００Ｋにおいて１５０ピコ秒間分子ダイナミックスを走らせた．走行のタイムステップは０．００１ピコ秒にセットし，座標を１００ステップ毎にセーブした．ダイナミックス計算から１２０個の最低エネルギーコンフォメーションを抽出し，構造内の全原子を運動させてエネルギーの最小化を行った．数個の低エネルギーコンフォメーションを得て，最低エネルギーをもつコンフォメーションを以後分析に使用した．Ｒ３抗体のマウスおよびヒト化変異体の差を，ＣＤＲコンフォメーション対する可能な影響を検討するために，個々にモデル化した．
【００３０】
ＥＧＦ受容体放射性リガンド競合アッセイ：
１２５  Ｉ−ＥＧＦのその受容体への結合の抗ＥＧＦ−Ｒ    ｍＡｂによる見掛けの阻害定数（Ｋｉ  ）の測定はヒト胎盤ミクロソーム分画を用いる均一放射受容体分析（ＲＲＡ）によって行った［Ｍａｃｉａｓ  Ａ，  Ｐｅｒｅｚ  Ｒ，  Ｌａｇｅ  Ａ（１９８５），  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ２：  １１５−１２７］．抗原抗体反応の親和性定数も競合ＲＲＡにより，ただし放射標識プローブとしてｍＡｂ  １２５Ｉ−Ｒ３を用いて評価した．
【００３１】
材料：
組換えヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）は  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｈａｖａｎａ，  Ｃｕｂａ  より入手した．１２５  Ｉ−ｈＥＧＦはクロラミンＴ法により放射性ヨウ素化した（比活性  １５０〜２００  μＣｉ／  μｇ  ）．マウスハイブリドーマ細胞系Ｒ３は本発明者らにより得られた（ＥＰＡ  ９３  ２０２  ４２８．４  ）．ラット骨髄腫ＮＳＯは非Ｉｇ分泌細胞系であり，１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＮ）中で増殖させた．ベクター，Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１，Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１，ｐＳＶｇｐｔおよびｐＳＶｈｙｇについては詳細な記載があり［Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｒ，  Ｇｕｓｓｏｗ  ＤＨ，  Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ（１９８９），  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８６：  ３８３３−３８３７］，Ｇｒｅｇ  Ｗｉｎｔｅｒ，  ＭＲＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ  より入手した．  オリゴヌクレオチドは  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８１  ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した．
【００３２】
【実施例】
例１：
分子クローニングと配列決定
ＶＨおよびＶＫをＰＣＲを用いて増幅した．
使用した特異的オリゴヌクレオチドは次の通りとした．
重鎖可変部については，
0003585303.tif 000002
軽鎖可変部については，
0003585303.tif 000003
精製したＶＨおよびＶＫ    ｃＤＮＡをＭ１３ベクター内にクローン化した．１２個の独立したクローンをＴ７ＤＮＡ    Ｐｏｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ）を用いてジデオキシ法により配列決定した．図１にマウスＲ３    ｍＡｂの可変部の配列を示す．ＶＨ配列はｋａｂａｔ  サブグループＶＨＩＩＢに，またＶＫ配列はｋａｂａｔ  サブグループＩＩに最も類似している．
【００３３】
例２：
キメラ遺伝子の構築：
以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを再増幅した．
ＶＨ：
0003585303.tif 000004
Ｖｋ：
0003585303.tif 000005
増幅されたｃＤＮＡをＶＨ遺伝子については  ＰｓｔＩ  および  ＢｓｔＥＩＩ  により，またＶＫ遺伝子についてはＰｖｕＩＩ  およびＢｇｌＩＩ  により消化した．フラグメントをＭ１３−ＶＨＰＣＲ１（ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化）またはＭ１３−ＶＫＰＣＲ１（ＰｖｕＩＩ  およびＢｃｌＩＩ  で消化）にクローン化した．ベクターに関しての詳細は，Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｒ  ら；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：  ３８３３−３８３７，  １９８９    参照．Ｖ遺伝子挿入体を含むＭ１３ＶＨＰＣＲ−Ｒ３およびＭ１３ＶＫＰＣＲ−Ｒ３は配列決定により直接同定した．
【００３４】
ＶＨ遺伝子はＩｇ重鎖プロモーター，適当なスプライシング部位およびシグナルペプチド配列とともに，Ｍ１３ベクターからＨｉｎｄＩＩＩ  およびＢａｍＨＩ  消化により切出し，発現ベクター（ｐＳＶｇｐｔ）にクローン化した．ついでヒトＩｇＧ１定常部（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ  ら，  Ｃｅｌｌ  ２９：  ７１８−７４９，  １９８２）をＢａｍＨＩ  フラグメントとして添加した．得られた構築体はＲ３ＶＨ−ｐＳＶｇｐｔであった．Ｒ３ＶＫ−ｐＳＶｈｙｇの構築はｇｐｔ遺伝子をハイグロマイシン抵抗性遺伝子に置換し，ヒトκ鎖定常部を付加した以外は本質的に同様に行った（Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．Ａ    ら；  Ｃｅｌｌ  ２２：  １９７−２０７  １９８０  ）．
【００３５】
例３：
Ｒ３のマウスＣＤＲのヒトＦＲへの移植：
本発明者らはＲ３のマウスの軽鎖および重鎖可変部をヒト免疫グロブリンの可変部配列と比較した．
マウスＲ３重鎖可変部は，ヒトサブグループＶＨＩと６３．４％の相同性を有し，Ｒ３軽鎖可変部はヒトサブグループＶＫＩと６３．７％の相同性を有する．選択されたヒトＦＲは，軽鎖についてはヒト免疫グロブリンＲＥＩ，重鎖についてはヒト免疫グロブリンＥＵに由来するものとした．
【００３６】
ヒト化Ｒ３重鎖およびヒト化Ｒ３軽鎖の第一バージョンの構築は「課題を解決するための手段」の項に記載のＣＤＲグラフト法を用いて行った．
オリゴヌクレオチドは，ＶｈについてはヒトＥｕ，ＶＫについてはヒトＲＥＩの隣接ＦＲをコードするＤＮＡ配列に相補性のＤＮＡの各末端から１２塩基までをコードするＤＮＡ配列から構成されるよう設計した．
設計されたオリゴヌクレオチドは次の通りであった．
軽鎖のＣＤＲ１について，
0003585303.tif 000006
本発明者らは，ＲＥＩヒトＣＤＲ２がＲ３のＣＤＲ２と同一であることから，ＣＤＲ２についてはオリゴヌクレオチドを用いなかった．
軽鎖のＣＤＲ３について，
0003585303.tif 000007
重鎖のＣＤＲ１について，
0003585303.tif 000008
重鎖のＣＤＲ２について，
0003585303.tif 000009
重鎖のＣＤＲ３について，
0003585303.tif 000010
【００３７】
例４：
ＮＳＯ細胞内におけるキメラおよびヒト化抗体の発現：
ＮＳＯ細胞を  ４μｇ  のマウスまたはヒト化Ｒ３ＶＨ−ＣＭＭＡＲγ１領域でエレクトロポレートし，８  μｇ  のマウスまたはヒト化Ｒ３ＶＫ−ＣＭＭＡＲｈｙｇκ定常部をＰｖｕＩで消化して線状化した．これらのＤＮＡを一緒に混合し，エタノール沈殿させ，２５μｌ  の水に溶解した．約１０７  個のＮＳＯ細胞を半集密状態まで増殖させ，遠心分離により収穫し，エレクトロポレーションキューベット内で消化ＤＮＡとともに０．５ｍｌのＤＭＥＮ中に再懸濁した．氷上に５分間置いたのち細胞を１７０ボルト，９６０ｕＦのパルスで処理し（Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ），さらに３０分間氷上に放置した．細胞を２０ｍｌのＤＭＥＮ＋１０％ウシ胎児血清中に入れ，４８時間放置して修復させた．この時点で細胞を９６−ウエルプレートに分配して，選択培地を適用した（ＤＭＥＮ，１０％ウシ胎児血清，０．８μｇ／ｍｌミコフェノール酸，２５０μｇ／ｍｌキサンチン）．トランスフェクトされたクローンは１４日後には肉眼で見ることができた．
【００３８】
トランスフェクトされたクローンを含有するウエルの培地中におけるヒト抗体の存在をＥＬＩＳＡによって測定した．マイクロタイタープレートウエルをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体（Ｓｅｒａ  Ｌａｂ）でコートした．ＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝食塩溶液，ｐＨ７．５）で洗浄後，トランスフェクタントを含むウエルからの培養培地２０μｌ  を各マイクロタイターウェルに添加して３７℃に１時間放置した．ついでウエルの内容物を空け，ＰＢＳＴで洗浄し，ペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−ヒトκ，軽鎖特異的抗体（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ）を添加して３７℃で１時間インキュベートした．ついで，ウエルの内容物を空け，ＰＢＳＴで洗浄し，ｏ−フェニレジアミンを含む基質緩衝液を添加した．数分後に硫酸を加えて反応を停止させ，４９２ｎｍにおける吸光度を測定した．
図３にＥＧＦ−Ｒに同じ親和性で結合する（ＲＲＡにて試験）キメラおよびマウスＲ３抗体を示す．ヒト化Ｒ３抗体の第一バージョンはＥＧＦ−Ｒに結合しなかったことが明らかである．
【００３９】
例５：
ＦＲ部に一部マウス残基を有するヒト化Ｒ３抗体の各種バージョンの構築：
本発明者らが構築した第一バージョンのヒト化抗体が抗原に結合しなかったことから，ヒトＦＲへ一部マウス残基の導入が必要であった．
本発明者らは，マウスＲ３ＶＨ／ヒト化Ｒ３ＶＫおよびヒト化Ｒ３ＶＨ／マウスＲ３ＶＫの間のハイブリッドを構築した．図４はハイブリッドマウスＲ３ＶＨ／ヒト化Ｒ３ＶＫが，元のマウスＲ３と同じ親和性でＥＧＦ−Ｒに結合することを示している．
【００４０】
ヒト化Ｒ３ＨｕＶｋはマウスＲ３ＶＫの  Ｖｅｒｎｉｅｒの残基を保持していた．この事実は，ヒト化操作がκ鎖の結合能に影響しなかった理由を説明するものと考えられる．
これに対して，ヒト化Ｒ３ＶＨ／マウスＲ３ＶＫは作動しなかった．この結果は，この抗体の抗原への結合の回復には，ヒト重鎖のＦＲ中にマウス残基を包含させる必要があることを示唆するものであった．
【００４１】
したがって，再構成ヒト化重鎖をもつ他のバージョンがＰＣＲ突然変異誘発により構築された．これらの新しいバージョンにおいては，本発明者らは Vernier領域を無傷のまま維持することを試み，ＦＲ領域中の位置６７，６８，７６，７７および９７における改変を進めた．
再構成Ｒ３ＶＨ−Ｋ６６Ａ６７を得るために設計されたオリゴヌクレオチドは以下の通であった．
トップ鎖：
0003585303.tif 000011
下方鎖：
0003585303.tif 000012
再構成Ｒ３ＶＨ−Ｓ７６Ｔ７７を得るために設計されたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった．
トップ鎖：
0003585303.tif 000013
下方鎖：
0003585303.tif 000014
再構成Ｒ３ＶＨ−Ｔ９７を得るために設計されたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった．
トップ鎖：
0003585303.tif 000015
下方鎖：
0003585303.tif 000016
【００４２】
例６：
ｍＡｂ    Ｒ３    ＶＫおよびＶＨの分子モデリング：
マウスｍＡｂ    Ｒ３の可変領域のモデルは，１５０ＭＨｚ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｄｉｇｏ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  ワークステーション上で走る分子モデリングプログラムＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲｍ４．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，  １９９４  ）を用いて作成した．
Ｒ３抗体のマウスおよびヒト化変異体の相違点を，ＣＤＲコンフォメーションに対する可能な影響を検討するために，個々にモデル化した．
【００４３】
ヒト化Ｒ３ｈｕＶＨ（図６）において改変された位置６７，６８，７６，７７および９３の重鎖可変部残基は超可変ループに近接していることから，ＣＤＲコンフォメーションに影響する可能性が考えられる．本発明者らの実験結果およびモデリング研究はいずれも，Thr ７７および Thr９７のみが結合親和性に重要であることを示唆している．
【００４４】
マウスＲ３重鎖可変部の分子モデルは，これらの突然変異が起こしうる影響を分析するため構築した．残基９３はＣＤＲ    Ｈ３の直下に  Ｐｈｅ１００ｆ  に近接して位置し（図６），Ｔｈｒ  を  Ａｌａのようなより小さいアミノ酸で置換すると隣接する側鎖の再配置を誘発し，Ｈ３ループの全体的コンフォメーションが修飾されるものと考えられる．
【００４５】
Thr ７７はＣＤＲ  Ｈ２に近接し（図２），この位置に大きな Asn残基を導入すると，ＣＤＲ  Ｈ１骨格との水素結合によって相互作用を生じることが考えられる．さらに，残基７６は可変部頂部からの接近が可能で，直接ＥＧＦ−Ｒへの結合に関与する可能性もある．置換 Ser７６--Thr の単独では何ら影響しないようであったが，位置７６の突然変異を伴った場合には，重要であるものと思われる．変化 Lys６７--Arg および Ala６８--Val は構造に影響しないよう見えたが，それらが再構成ｍＡｂ４２５の機能性結合にある程度影響することが見出されているので［Kettleborough C, Saldanha J, Heath VJ, Morrison CJ & Bending MM (1991)Protein Engineering 4, 773-783］，本発明者らはこれらの位置にも置換を行うことに決定した．
【００４６】
ヒト化Ｒ３ＨｕＶＫには，マウスＲ３ＶＫのすべての Vernierの残基を保持させた．この事実は，ヒト化操作がκ鎖の結合能に影響しなかった理由を説明するものと考えられる．
Ｓ７６／Ｔ７７またはＴ９７のいずれかを含有する再構成Ｒ３ｈｕＶＨ抗体は部分的に結合能を回復し，一方，それらの両者を含有する構築体では完全な結合活性の維持が認められた（図７）．
【００４７】
例７：
ＥＧＦ受容体放射性リガンド競合アッセイ
１２５  Ｉ−ＥＧＦのその受容体への結合のマウスＲ３，キメラおよびヒト化抗体による親和性定数の測定は，ヒト胎盤ミクロソーム分画を用いる均一放射受容体分析（ＲＲＡ）により行った［Ｍａｃｉａｓ  Ａ，  Ｐｅｒｅｚ  Ｒ，  Ｌａｇｅ  Ａ（１９８５），  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｙ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  ２：  １１５−１２７］．
【００４８】
これらのキメラおよびヒト化の異なるバージョンの抗体を，この方法を用いてＥＧＦ−Ｒへの結合能についてアッセイした（図７）．再構成ヒトＶＨ領域の各種バージョンは広範囲の抗原結合レベルを示した（図７）．バージョン６と７は元のマウス抗体と同じ親和性を有し，これらの最高レベルの結合を示すバージョンにバージョン３，４および５が続き，ついでバージョン２の順であった．
【００４９】
これらの結果に基づいて，抗原結合に有利に働くＦＲ中の各残基の相対的寄与についての言及が可能である．７５および７６の改変は９３とともに結合に極めて重要であり，一方６６および６７の改変の導入は有意な抗原結合の生成の障害となる．
【００５０】
例８：
マウス，キメラおよびＶＨ変異抗体によるオナガザルの免疫処置：
各群２匹のオナガザル（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ）の３処置群を以下のように免疫処置した：１．マウスＲ３モノクローナル抗体（２ｍｇ）とアジュバントとして５ｍｇの水酸化アルミニウム，２．キメラＲ３抗体（２ｍｇ）とアジュバントとして５ｍｇの水酸化アルミニウム，および３．ヒト化（バージョン６）Ｒ３抗体（２ｍｇ）とアジュバントとして５ｍｇの水酸化アルミニウムである．すべての群を週１，３，５および７に皮内に免疫処理した．週１に開始して全群から毎週，血液を採取した．
【００５１】
得られた血清およびＥＧＦ−Ｒに対する抗体力価をＥＬＩＳＡ法により定量した．
Ｃｏｓｔａｒプレート（Ｉｎｃ，高結合）を重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍｌ濃度のマウスＲ３モノクローナル抗体でコートし，一夜インキュベートした．ついで，プレートをＰＢＳＴで洗浄し，１％ＢＳＡを含む同じ緩衝液で室温にて１時間ブロックした．
【００５２】
洗浄工程を反復し，５０μｌ  ／ウエルの各種血清稀釈液を添加した．３７℃で２時間インキュベーションしたのち，プレートを再度洗浄し，アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−ヒト総または抗−ヒトＩｇＧＦｃ部特異的抗血清（Ｓｉｇｍａ  ｉｎｃ．）と３７℃で１時間インキュベーションした．ＰＢＳＴで洗浄後，ウェルを５０μｌ  の基質緩衝液［ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に稀釈した  ｐ−  ニトロフェニルホスフェート  １  ｍｇ／ｍｌ］とともにインキュベートし，ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，  ｉｎｃ）によって４０５  ｎｍ  の吸光度を読み取った．
【００５３】
マウスＲ３抗体に対してはこの抗体を免疫原として用いた場合，高度なＩｇＧ応答が得られた．サルをキメラ抗体で免疫処置した場合には，ヒト化抗体（バージョン６）で得られた結果（図８）とは異なり，低いがなお測定可能なＲ３抗体に対するＩｇＧ応答（１／１００００）が認められた．ヒト化抗体では３回の免疫処置後にも応答は測定できなかった．
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＲ３抗体の（ａ）ＶＫおよび（ｂ）ＶＨの推定アミノ酸配列．
【符号の説明】
下線はＣＤＲを示す．
【図２】ｍＡｂＲ３    ＣＤＲを含むマウスおよびヒト化ＶＫ（ａ）およびＶＨ（ｂ）のアミノ酸配列．
【符号の説明】
下線はＣＤＲを示す．
【図３】キメラおよびヒト化Ｒ３のＥＧＦ−Ｒへの結合のＲＲＡによる検出．
精製マウスＲ３（＋），キメラＲ３（＊）およびヒト化（１）Ｒ３（−■−）の様々な濃度において抗原結合活性をアッセイし，結合１２５  Ｉ−ＥＧＦのＣＰＭ（×１０００）を各抗体濃度の対数に対してプロットした（ＩｇＧ濃度はＥＬＩＳＡによって定量した．本文参照）．
【符号の説明】
−■−  ヒト化
−＋−  マウス
−＊−  キメラ
【図４】ハイブリッドマウスＲ３ＶＨ／ヒト化Ｒ３ＶＫおよびヒト化Ｒ３ＶＨ／マウスＲ３ＶＫの結合の検出．
トランスフェクトされたＮＳＯ細胞からの濃厚上清希釈液中の抗原結合活性をアッセイし，ＥＬＩＳＡによって評価されたＩｇＧ濃度の対数に対して，ｃｐｍ（×１０００，膜結合放射能）としてプロットした．実験プロトコール参照．
【符号の説明】
−■−  マウス
−＋−  キメラ
−＊−  ｈｕＲ３ＶＨ／ｍｕＲ３ＶＫ
−□−  ｍｕＲ３ＶＨ／ｈｕＲ３ＶＫ
【図５】再構成ヒト化Ｒ３重鎖可変部のアミノ酸配列の比較．
【符号の説明】
ＣＤＲには下線を付す．Ｈｕｍ＝ヒト，Ｒｅｓ＝再構成．
【図６】マウスｍＡｂＲ３の可変部の分子モデル．
【符号の説明】
結合部位は頂部にある．分子はＶＨドメインが観察者に近づくように垂直軸の回りでわずかに時計廻りに回転した．ＶＬフラグメントは淡青色にＶＨフラグメントはピンク色に着色してある．相当するＣＤＲは暗青色および赤色で着色してある．残基  Ｓｅｒ７５および  Ｔｈｒ９３の側鎖（極性水素原子を含む）は緑色で示す．Ｐｈｅ  １００ｆ  の側鎖は赤色で示す．
【図７】各種再構成ｍＡｂＲ３のＥＧＦ−Ｒに対する結合のＲＲＡによる検出．
【符号の説明】
トランスフェクトされたＮＳＯ細胞からの濃厚上清希釈液中の抗原結合活性をアッセイし，ＥＬＩＳＡによって評価されたＩｇＧ濃度の対数に対して，ｃｐｍ（×１０００，膜結合放射能）としてプロットした．実験プロトコール参照．再構成されたヒトＶＨ領域のすべてのバージョンがｈｕＶＫＲ３とコトランスフェクトされ，図中に示されている．
−■−  キメラＲ３Ｍａｂ
−＋−  ＶＨｈｕ（７）Ｒ３
−＊−  ＶＨｈｕ（６）Ｒ３
−□−  ＶＨｈｕ（５）Ｒ３
−×−  ＶＨｈｕ（４）Ｒ３
−◇−  ＶＨｈｕ（３）Ｒ３
−△−  ＶＨｈｕ（２）Ｒ３
−  −  ＶＨｈｕ（１）Ｒ３
【図８】Ｒ３マウスｍＡｂおよび各種組換えバージョンのサルにおける免疫原性．
【符号の説明】
オナガザルを１５日間隔で，各種ｍＡｂバージョン２ｍｇにより，アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫処置した：Ｒ３ｍＡｂの各種バージョンに対するサルＩｇＧの検出は間接ＥＬＩＳＡを用いて動物の血清中で調べた．
−■−  ｍｕＲ３（サル１）
−＋−  ｍｕＲ３（サル２）
−＊−  キメラＲ３（サル１）
−□−  キメラＲ３（サル２）
−×−  ｈｕｍＲ３（サル１）
−◇−  ｈｕｍＲ３（サル２）
【図１】
0003585303.tif 000022
【図２】
0003585303.tif 000023
【図３】
0003585303.tif 000024
【図４】
0003585303.tif 000025
【図５】
0003585303.tif 000026
【図６】
0003585303.tif 000027
【図７】
0003585303.tif 000028
【図８】
0003585303.tif 000029