(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物であって、
（ａ）（１）前記抗原の少なくとも一つのエピトープをコードする配列を含有するＮ−末端ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）前記DNA配列から発現したタンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン、をコードするキメラDNA配列によりコードされるタンパク質；および
（ｂ）主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子；
を発現する抗原提示細胞を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記標的化シグナルが、テトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbb（式中、Xaaはいずれのアミノ酸であり、そしてXbbは疎水性アミノ酸である）を含む、請求項１のワクチン組成物。
【請求項３】
前記主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子が前記動物のMHCタンパク質と適合性である、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記標的化シグナルが、テトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbb（式中、Xaaはいずれかのアミノ酸であり、そしてXbbは疎水性アミノ酸である）を含む、請求項３のワクチン組成物。
【請求項５】
動物において抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物であって、
（１）前記抗原の少なくとも一つのエピトープをコードする配列を含有するＮ−末端ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）タンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン、を含有する前記タンパク質をコードするキメラDNA分子を含有するベクターを含む、前記組成物。
【請求項６】
前記ベクターがウイルスである、請求項５のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ベクターが組換えワクシニアウイルスである、請求項６のワクチン組成物。
【請求項８】
前記動物がヒトである、請求項５のワクチン組成物。
【請求項９】
前記少なくとも一つのエピトープが、主要組織適合性複合体クラスII分子と複合体を形成するペプチドである、請求項５のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記標的化シグナルが、テトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbb（式中、Xaaはいずれかのアミノ酸であり、そしてXbbは疎水性アミノ酸である）からなる、請求項５のワクチン組成物。
【請求項１１】
動物において抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物であって、
（１）前記抗原の少なくとも一つのエピトープをコードする配列を含有するＮ−末端ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）そのタンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン、を含むタンパク質を含有する、前記組成物。
【請求項１２】
抗原提示細胞を含有する細胞集団であって、前記抗原提示細胞が
（ａ）タンパク質の少なくとも一つのエピトープをコードする配列を含有するＮ−末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および前記DNA配列から発現したタンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン、をコードするキメラDNA配列によりコードされるタンパク質；および
（ｂ）主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子
を発現する、前記細胞集団。
【請求項１３】
前記エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルが、テトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbb（式中、Xaaはいずれかのアミノ酸であり、そしてXbbは疎水性アミノ酸である）を含む、請求項12の細胞集団。
【請求項１４】
修飾された幹細胞をex vivoまたはin vitroにて産生するための方法であって、この方法は、
（１）新生物腫瘍の切除後の癌患者から得られた、抗原提示細胞（APC）に分化する能力を有する幹細胞の細胞の表面上に特徴的に見つかる抗原の少なくとも一つのエピトープを含有するＮ−末端ドメイン；（２）膜貫通ドメイン；および（３）タンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン；を含有するキメラタンパク質をコードするDNA分子を導入することにより幹細胞を修飾することを含む方法であり；
ここで前記標的化シグナルは、テトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbb（式中、Xaaはいずれかのアミノ酸であり、そしてXbbは疎水性アミノ酸である）を含み；
ここで前記幹細胞はAPCに分化し、このAPCが前記キメラDNA分子によりコードされるタンパク質およびMHCクラスII分子を発現する、前記方法。
【請求項１５】
抗原提示細胞（APC）中に、タンパク質の少なくとも一つのエピトープをコードする配列を含有するＮ−末端ドメイン；膜貫通ドメイン；および前記DNA配列から発現されたタンパク質をライソゾーム／エンドソーム小室に導く、エンドソーム／ライソゾーム標的化シグナルを含有する細胞質ドメイン；をコードするキメラDNA分子をex vivoまたはin vitroにて導入することを含む、抗原提示細胞を含む細胞集団をex vivoまたはin vitroにて産生する方法であって：
ここで前記APCはキメラDNA分子によりコードされるタンパク質を発現し、そして主要組織適合性複合体（MHC）クラスII分子もまた発現する、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明に導く研究は一部、交付No.NOIHD62951によってNIHから援助された。連邦国政府は本発明についていくらかの権利を保有するであろう。
発明の背景
発明の分野
本発明は概略、主要組織適合抗原系クラスIIタンパクによって認識されるペプチド残基へとタンパクを処理する細胞の小胞にタンパクを誘導する生物学的標的作用を有するアミノ酸セグメントのタンパクへの導入、及び抗原としてこれらの標的タンパクに対して哺乳動物が免疫応答する能力を高めるための手順の用途に関する。
関連技術の概要
A.抗原処理及びＴ細胞への提示
哺乳動物の免疫系における抗原認識及び応答の機構に関する通説は、細胞の外部から導入された外来の抗原（外来の化学物質、バクテリア及び毒物のような）と細胞の内部で産生された内因性の抗原（ウイルスやオンコジーン産物のような）との抗原の２タイプを識別する、２つの並行するＴ細胞の細胞系及び抗原提示分子があるというものである。細胞の免疫応答において抗原のタイプを識別する細胞がＴ細胞であることは今や明らかである。その異型二量型（heterodimeric）Ｔ細胞レセプターを介して、Ｔ細胞は主要組織適合抗原（MHC）分子との複合体として提示されたこれらの抗原のペプチドフラグメントを認識する（ユーデル及びベネンク，Cell,62:203,1990;デイビス及びビョルクマン、Nature,334:395,1988）。
MHC分子には、MHCクラスＩ及びMHCクラスIIタンパクの２つの一般的クラスがある。これらのMHC分子は抗原と結合し、それらを白血球のＴ細胞類の２タイプである細胞障害性Ｔ細胞（Tc）又はヘルパーＴ細胞（Th）の１つに提示する。MHCクラスＩ分子は一般に内因的に産生されたタンパク由来のペプチド抗原を、抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞の主要なものであるCD8+Tc細胞に提示する。MHCクラスII分子は一般に、エンドソーム／リソソーム小器官におけるペプチドフラグメントの産生を含む抗原提示のための別の経路を使用して、細胞外から導入された抗原を提示する。MHCクラスII分子は又、これらの酸性の小器官中で、小胞体中のMHCクラスIIタンパクと結合し抗原性ペプチドと置換されるインバリアント鎖（invariant  chain）の膜の糖蛋白と共に局在して観察される。抗原のクラスII分子との結合後、抗原/MHC II複合体はCD4+Th細胞に対する抗原提示のために細胞表面に運ばれる。
２つのタイプのＴ細胞の作用は、それらの名称によって暗示されているとおり、有意に異なっている。細胞障害性Ｔ細胞は、直接細胞を破壊し、又はγ−インターフェロンのようなサイトカインを分泌することによって、細胞内の病原体や腫瘍を撲滅するために作用する。ヘルパーＴ細胞も細胞を溶解させることができるが、その基本的作用はＢ細胞及び他のＴ細胞の活性を促進するためのサイトカインを分泌することであり、このようにしてそれらは抗体介在及びTc介在応答機構を含む外来抗原に対する免疫応答を広く高揚させる。
CD4+T細胞は免疫応答における主要なヘルパーＴ細胞の表現型である。それらの主な作用は免疫応答の他の全ての作用を本質的に調節するサイトカインを産生することである。CD4+の涸渇した（depleted）動物又はCD4+細胞の涸渇したヒト（AIDS患者のような）は抗体応答、細胞障害性Ｔ細胞応答又は遅延型過敏症性応答をおこすことができない。これらの結果はヘルパーＴ細胞が免疫応答の調節において決定的であることを示唆している。
CD4+MHCクラスII制限（restricted）細胞はいくつかの系において細胞障害能をもつことも示されている。CD4+細胞障害性Ｔ細胞の関与が証明されている最重要の疾患関連症例の１つは、HIVgp120タンパクのフラグメントに対する応答におけるものである（ポリデフキス等，J.Exp.Med.,171:875,1990）。CD4+MHCクラスII制限細胞は、又、腫瘍に対する全身性の免疫応答の発生においても重要であることが示されている。養子移入モデルにおいて、CD4+細胞はマウスのFBL腫瘍の消去に不可欠である。ゴルンベック等の能動的な免疫療法モデル（1991,Science,254:713）において、CD4+細胞は又、いくつかの異なる固形の悪性腫瘍に対する全身性免疫応答において不可欠であることが示されている。
これらの理由のために、与えられた特異的抗原に対してMHCクラスII細胞制限CD4+細胞を最も効率的に活性化させる戦略を展開する興味が増大している。さらに、CD4+MHCクラスII制限細胞はＴ細胞群において免疫応答の重要な記憶細胞であるようにみえる。従って、適切なワクチン接種戦略はCD4+抗原特異的MHCクラスII制限記憶Ｔ細胞集団を産生することである。
細胞溶解性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞は機能の相違に呼応して、これらの細胞に抗原を提示するMHC分子の組織分布も顕著に異なっている。自己又はウイルス性抗原を認識するMHC Iタンパク複合体は実質的に全細胞型に発見され、一方外来抗原と反応するMHC IIタンパクは、Th細胞のＢ細胞刺激に必要なサイトカインを分泌するか、又はそれら自身の刺激のためにTh細胞サイトカインを要求するマクロファージやマクロファージ様細胞のような免疫細胞に多量に発見される。MHC IIタンパクを提示する細胞は一般に抗原提示細胞と呼ばれる。
自己又は外来抗原の処理及びMHC I又はMHC II複合体への提示は、それぞれ、一般的に異なる経路で起きる（ベバン、Nature,325:192,1987;ブレイシアル等，Immunol.Rev.,98:95,1987;ジャーメイン、Nature,332:687,1986）：
▲１▼MHC I関連タンパク分解系は、高度に異常なタンパク及び短命分子又はウイルス性タンパクを分解するために、本質的に全ての細胞中に存在する。このタンパク分解は非リソソーム性であり、ポリペプチドユビキチンに対するATP依存性共有結合を含むと考えられる（ゴールドバーグ等，Nature,357:375,1992）。ペプチドフラグメントは、おそらくはより大きいプロテアソーム（proteasome）複合体とともに、小胞体又は他のタイプのエキソサイトーシス小室（エンドサイトーシス／リソソーム性小室以外の）に入ると仮定される。ここで、それらはMHCクラスＩ分子と結合し、小胞体からゴルジを通って細胞表面に至る本質的な分泌経路をたどり、細胞表面でMHC IタンパクによってCD3−CD8細胞障害性Ｔ細胞抗原レセプターに提示される。
▲２▼外来抗原が抗原提示細胞（APC）によって処理されるMHCクラスII関連プロセスは一般にエンドサイトーシスの経路で起きると信じられている。流動相の飲作用（pinocytosis）、吸収性エンドサイトーシス（absorptive  endocytosis）又は貪食作用（phagocytosis）によって細胞内に取り込まれた抗原は、大きい分子がプロテアーゼ及び他のハイドロラーゼの消化によりペプチドに変換される後期のエンドソーム性／リソソーム性小室に入る。このプロセスの間に、免疫的に優勢な小ペプチドはMHCクラスII分子と接触して結合し、ペプチドは細胞表面に運ばれる。APCの細胞表面上では、MHCクラスII分子と結合しているこれらの短いペプチドは、ヘルパーＴ細胞の表面上のCD3−CD4複合体と結合し、これらの細胞の複製及び免疫機能を活性化する。この相互作用に続いて、ヘルパーＴ細胞は、リンホカインを放出し、白血球の増殖と分化を刺激し、感染部位からのそれらの移出を抑制する。一般に、ペプチド負荷（peptide−loaded）APCによるヘルパーＴ細胞の活性化は、Ｂ細胞及びＴ細胞の最適な活動のために要求され、このように適切な免疫系の機能のために必要である。
ある種の内因性タンパクも又抗原提示のためにMHCクラスII系に入ることができる（マルナチ等，Nature,357:702,1992;ポリデフキス等,1990）。疎水性のアンカー配列によって、管腔（luminal）／細胞外の膜に結びつけられて保持されている内因的に生産された膜抗原は、大量の流れ（bulk flow）を経て初めに細胞表面に到達し、さらにエンドサイトーシスによる取込みと続いておこる外因性抗原の処理のための通常のクラスII経路による処理によってエンドソーム性／リソソーム性小室にリサイクルされることができると推定されている。MHCクラスII分子は又、小胞体又は他の小室中に隔離され、その後リソソームへの救済経路（salvage pathway）で処理される内因性タンパクから誘導されたいくつかの抗原決定基を提示することもできる（ブルック等，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,88:3290,1991）。
MHCクラスII制限Ｔ細胞に対する提示のための、内因的に誘導された、又は細胞質ゾルに含まれるタンパクの他の可能な処理の経路も、いくつかの、しかし全てが実験に基づかない系中に開示されている。これらは、クラスＩ結合プロセスより低効率にみえ、又十分に理解されていない（モレノ等、J.Immunol.,147:3306,1991;ジャラケマダ等，J.Exp.Med.,172:947,1990）。タンパク処理の別の経路による別のタイプの抗原提示細胞が、異なるプロテアーゼの可能性も含めて示唆されている。MHCクラスIIを有する細胞の抗原提示能は細胞型による変化を示し、その変化はタンパク分解機構、及び抗原とMHCクラスII分子のたどる細胞内ルートに関連しているようである（ペーター等，Nature,349:669,1991）。
エンドソーム性／リソソーム性経路における抗原処理及び処理タンパクとMHCクラスIIとの結合の正確な部位はまだ明瞭でない。MHCクラスII分子が細胞内に摂取されたタンパクと初期の（early）エンドソーム性小室中で出会うことを示唆するデータが示されている（グアリアルデイ等，Nature,343:133,1990）。部分的に処理された抗原及び容易に分解できる抗原は初期のエンドソーム性小室中でMHCクラスIIと結合することのできるペプチドを産生することができるであろう。しかし、多くの証拠は抗原処理及びMHCクラスIIとの結合の主な部位は後期のエンドソーム、リソソーム中か、又はリソソームと関連する別の小室で起こることを裏づけている（ネフューズ等，Cell,61:171,1990）。最近の研究では、リソソーム性特性を有し、高濃度のリソソーム関連膜タンパク（LAMP−１）及びMHCクラスII分子を特徴とする別の小胞小室（vasicular compartment）を開示している（ペーター等,1991）。
今日迄のデータはMHCクラスII分子の細胞内移動における次のような事象の連鎖を示唆している：インバリアント鎖を有するMHCクラスII分子が小胞体中で集められ、MHCクラスＩを含む他の膜タンパクと同様にゴルジ体を通って輸送される。分子は特定のエンドソーム性／リソソーム性の小器官に未知のメカニズムによって標的され、MHCクラスＩ分子から分離される（MHCクラスＩ分子は構造的ルートを経て細胞表面へ移動する）。エンドサイトーシス／リソソームのルートにおいて、インバリアント鎖は酸性環境下で作用するプロテアーゼによってMHCクラスIIから除去される。同時に、エンドサイトーシス／リソソームの経路に入ったタンパクの抗原性フラグメントがこれらのプロテアーゼによって産生され、産生されたペプチドはクラスII分子と結合し細胞表面に運ばれる。
B.リソソーム性／エンドソーム性小室
本明細書記載のリソソーム性／エンドソーム性小室は膜と結合した酸性液胞からなり、この液胞中には膜中のLAMP分子、抗原処理のために作用する加水分解酵素、及び抗原認識及び提示のためのMHCクラスII分子が含まれている。この小室は、エンドサイトーシス、貪食作用、飲作用を含む各種のメカニズムのいずれかによって細胞表面から取り込まれた外来物質、及び特殊な消化現象（ドデユーブ，Eur.J.Biochem.,137:391,1983）によりこの小室に届けられた細胞内物質の分解のための部位として作用する。
リソソーム性／エンドソーム性小室に存在する加水分解酵素の生合成及び液胞標的メカニズムは広範に研究されてきた（コンフェルトとメルマン，Ann.Rev.Cell Biol.,5:483,1989）。ゴルジ装置で新たに合成されたヒドロラーゼは、マンノース６−ホスフェートレセプターとこれらの酵素の結合のための特異的な認識マーカーとして作用するマンノース６−ホスフェート基を取得し、該レセプターと結合した後、未知の機構でプレリソソーム性液胞に標的される。この液胞中で、レセプター−酵素複合体は低pHで解離し、レセプターはゴルジ装置へリサイクルされ、一方酵素を含む液胞は成熟してリソソームになる。
リソソーム膜の構造及び機能の研究は、リソソーム膜における主要な局在性によりリソソーム関連膜タンパク（lysosomal−associated memmbrane proteins）１及び２（LAMP−１及びLAMP−２）と、後に名付けられた主要な細胞の糖タンパクの発見で、オーガストと同僚によって1981年に始められた（ヒューズ等，J.Biol.Chem.,256:664,1981;チェン等，J.Cell Biol.,101:85,1985）。類似するタンパクが続いて、ラット、鶏及びヒトの細胞中で同定された（バリオカナル等，J.Biol.Chem.,261:16755,1986;ルイス等，J.Cell Biol.,100:1839,1985;ファムボー等，J.Cell Biol.,106:61,1988;メイン等，Arch.Biochem.Biophys.,268:360,1989）。典型的には、LAMP−１は、cDNAクローン（チェン等，J.Biol.Chem.,263:8754,1988）から推定したところ、大きな（346残基）管腔内（intraluminal）のアミノ−末端ドメインとそれに続く24残基の疎水性の膜貫通領域及び短い（12残基）カルボキシ−末端の細胞質側尾部をもつ、約382のアミノ酸からなるペプチドコア（Mr≒42,000）からなる。管腔内のドメインは高度にグルコシル化され、アスパラギンに結合した約20の複合体型のオリゴ糖で置換され、プロリン／セリンに富む領域によって分割されている約２〜160残基の相同単位からなる。これらの相同ドメインの各々は、４ケの等間隔のシステイン残基を含有し、ジスルフィド結合により形成され、２つの管腔内ドメインの半分の内部に対称に配置された４ケの36−38残基のループを有する（エールバーン等，J.Biol.Chem.,265:7419,1990、特に図６参照）。LAMP−２分子は全体的なアミノ酸配列においてLAMP−１と高度に類似している（チャ等，J.Biol.Chem.,265:5008,1990）。
CD63、ME491又はLIMP1として開示されている他の糖タンパクも、液胞構造における他のものと同様にリソソーム膜中で発見された（アゾーザ等，Blood,78:280,1991）。この分子は、約25,000kDaのコアポリペプチド及び４ケの膜貫通ドメインを有するので、LAMP類とは明らかに異なるが、LAMP分子類似の細胞質側構造及び配列を有する。さらに、このタンパクは、シストゾーママンソニ（Schistosoma mansoni）膜タンパクSM23、CD37、腫瘍関連抗原CO−029及び抗増殖性抗体−１の標的を含む、４ケの膜間（membrane spanning）ドメインをも含有する他の分子の仲間との間にも広範なアミノ酸配列の類似性がある。
リソソームのアシッドホスファターゼ（LAP）も最初にリソソームの膜に存在し、そこで溶解性の成熟した酵素を産生するために制限的蛋白分解を受ける（ペーター等，EMBO J.,9:3497,1990）。タンパクは他の開示されたリソソーム膜成分とほとんど配列類似性を有しないが、分子の細胞質側尾部の19残基に標的配列を含んでいる（ポールマン等，EMBO J.,7:2343,1988）。
LIMP IIはリソソーム及びリソソームの性質を有する分泌顆粒の膜中に存在するさらに別の糖蛋白である（ベガ等，J.Biol.Chem.,266:16818,1991）。アミノ末端付近の開裂できないシグナルペプチドの特性を有する配列及びカルボキシ末端付近の疎水性のアミノ酸セグメントは、タンパクがアミノ及びカルボキシ末端で２ケの短い細胞質側尾部によって、２つの部位で細胞膜に固定（anchored）されていることを示唆している。分子は開示されたリソソームの膜タンパクの他のいずれにも配列類似性を有しないが、細胞接着に関与する細胞表面タンパクCD36に高度に類似している。
C.エンドソーム性／リソソーム性小室で発見される他のタンパク
多くの他のタンパクが、機能上、リソソーム性／エンドソーム性小室を含むことのできる液胞に対する又は液胞を通る運搬又は標的に関与する生物学的作用を有する。現在、これらのタンパクの最も広範な特徴的な例は次のとおりである：
1.細胞表面受容体：
多くの細胞表面受容体は、その機能がリガンドを結合して細胞内に運ぶものとして知られている。例として、低密度リポプロテイン（LDL、Chenら、J.Biol.Chem.265:3116,1990）、インシュリン（Rajagopalamら、J.Biol.Chem.266:23068,1991）、上皮成長因子（HelinおよびBeguinot、J.Biol.Chem.266:8363,1991）、多量化免疫グロブリン（Poly−Ig、Breitfieldら、J.Biol.Chem.265:13750,1990）、トランスフェリン（Collawnら、Cell,63:1061,1990）、カチオン依存性および非依存性マンノース６−リン酸受容体（MPR,Johnsonら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,87:10010,1990;Canfieldら、J.Cell Biol.266:5682,1990;Jadotら、J.Biol.Chem.267:11069,1992）およびCD3（LetourneurおよびKlausner、Cell,69:1143,1992）などに対する受容体がある。これらの受容体は一般にエンドソーム構造、および時にはリソソーマル構造に輸送される。エンドソーム／リソソーム胞の酸性環境における受容体−リガンド複合体の機能的分離によって、リガンドが細胞内に放出され、細胞質膜への受容体の再利用へと続くメカニズムが良く知られている。
2.マンノース６−リン酸受容体およびリソソームの加水分解酵素：
加水分解酵素のリソソームへの輸送に特有のメカニズムは、これらの酵素に生合成経路で選択的に付加されたマンノース６−リン酸を特異的に認識するマンノース６−リン酸受容体である（概観にはKornfeldおよびMellman、1989年を参照）。この受容体は加水分解酵素をそれを含んだ液胞が成熟するか、またはLAMP分子によって標識されるリソソーム小胞と融合する間に、膜に結合した受容体が可溶化した加水分解酵素から分離し、受容体をゴルジ体または細胞質膜に再利用しようとする前リソソーム小室に送り込む。
3.MHCクラスII分子：
MHCクラスII分子もまたLAMPタンパクと共にエンドソーム／リソソーム構造に局在化し、この構造内でタンパク分解酵素によって処理された分子から生じたペプチド断片に結合する。この局在化へのターゲッティングのシグナルはMHCクラスII分子と結合した不変鎖の細胞質側の尾部にあるという証拠がある。
4.その他のリソソーム／エンドソーム膜タンパク：
エンドソーム／リソソーム膜の構成要素として上記したタンパクに加えて、輸送分子、受容体、または特異的な接着、結合、またはシグナル分子のような、小胞の構造または機能に関連した様々な機能を付与するための多くの他のリソソーム／エンドソーム膜タンパクの存在の証拠がある。
5.リソソーム／エンドソームのターゲッティングのシグナル
リソソーム膜の糖タンパクの局在化は加水分解リソソーム酵素の明確にされたマンノース６−リン酸受容体（MPR）経路とは独立したターゲッティングのメカニズムによって調節されている（KornfeldおよびMellman、1989）。細胞内輸送および新たに合成されたLAMP−１および他の類似したタンパクのターゲッティングに対する動力学的解析により、その分子は小胞体で合成され、ゴルジ槽で処理されて、生合成から１時間以内に、細胞質膜への蓄積が検知されないままリソソームに輸送されることが示された（Barriocanalら、1986;D'Sousaら、Arch.biochem.Biophys.249:522,1986;Greenら、J.Cell Biol.105:1227,1987）。LAMP−１および他の類似したリソソーム膜糖タンパクの細胞質側尾部の11個のアミノ酸配列は次のような配列である:Arg372−Lys373−Arg374−Ser375−His376−Ala377−Gly378−Tyr379
−Gln380−Thr381−Ile382−COOH（Chenら、1988）。これらのタンパクをリソソームに送り込むシグナルの研究はこの配列に焦点があてられ、Tyr379がリソソームへのターゲッティングに非常に重要で、His376、Ala377、およびGly378はタンパクのターゲッティングには重要でないことが示された（WilliamsおよびFukudaら、J.Cell Biol.111:955,1990）。
細胞質側のTyrはまた、低密度リポプロテイン（LDL）（Chenら、1990）、インシュリン（Rajagopalamら、1991）、多量化免疫グロブリン（Poly−Ig）（Breitfieldら、1990）、トランスフェリン（Collawnら、1990）、カチオン依存性および非依存性のマンノース６−リン酸受容体（MPR）（Johnsonら、1990;Canfieldら、1990;Jadotら、1992）、およびCD3（LetourneurおよびKlausnerら、1992）を含むいくつかの受容体の、細胞膜からの内在化にも非常に重要である。CD3の場合は、その分子またターゲッティングのメカニズムにおいて二ロイシンモチーフを利用する。
E.ワクチンの発達
伝来のワクチンは、効果を失わせた病原株かまたは病原性を弱められた株のどちらでも全組織に依存している。一方、これらのワクチンはその減衰化が不十分であったり、ワクチンの調製の間の滅菌のステップにもかかわらずじゅうぶんな組織が生き延びたりすれば、阻害するように構築されたはずの病気を導入する危険をおかすことになる。一方、そのようなワクチンは伝染性が減衰させてあり、しばしば抗原として不適当なので、予防接種をしてもじゅうぶん予防ができない。
最近、分子生物学的手法が病原組織からの個々の抗原タンパクに由来した新しいワクチンの開発の目的に用いられるようになった。概念的には、全組織よりも抗原ペプチドを用いた方が、大部分の免疫原エピトープを含むワクチンの調製の間の病原性を避けられると思われる。しかしながら、純粋なペプチドまたは炭水化物は抗原性が弱くなる傾向にあり、その結果、適切に処理されたり、免疫機構に効率良く提示されるように化学調節剤を必要とするように思える。Ｔ細胞の反応に依存したワクチンは多様なMHCのタイプの標的数で免疫系を刺激するのに十分と思われるＴ細胞の抗原提示基を含んでいるはずである。さらに、Ｔ細胞の認識には細胞内タンパクの処理が必要であるため、抗原の内在化および処理を促進するようなワクチンの調製がより効果的な免疫応答を引き起こすはずである。抗原をMHC分子にもっていく以前の試みは（U.S.特許4,400,276）、抗原の処理の過程が行われなかったため効果的ではなかった。成功したＢ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウィルスのクローン化した表面抗原を利用して調製されたが、これは肝炎表面抗原分子の凝集する性質によっていると思われ、この結果、高度に抗原活性のある規則的な粒子を形成する。
F.癌ワクチン
今日では、腫瘍が免疫機構のＴ細胞の腕によって宿主の抗原とは異質であると認識されうる抗原を発現することが知られており、腫瘍に特異的な抗原の多くの可能な型が存在する：
＊バーキッツおよび他のリンパ腫同様、ホジキンリンパ腫のEBV Epstein−Barrウィルス遺伝子産物、成熟したＴ細胞白血病のHTLV−１ゲノム産物、および頚部癌腫のヒトパピローマウィルス（HPV）E6およびE7遺伝子産物。
＊K rasの12番目の変異のような様々な癌遺伝子の変異が、他の悪性腫瘍同様、結腸癌の主要な遺伝子的変化として関連付けられてきた。
＊P53のような癌抑制遺伝子の変異が多くの悪性腫瘍できわめて共通に存在する。
＊慢性骨髄性白血病のBCRおよびabl遺伝子の間の転位のような、結果的に癌遺伝子が活性化する転位により新たなタンパク配列が生じる。
＊個体の正常細胞では発現されない発育および胚性の遺伝子を再発現する腫瘍。このような例としてヒト悪性腫瘍のＴ細胞に認識される抗原の原因として同定されたMAGE遺伝子がある。
多くの場合、上記の種類の変異した遺伝的連鎖由来のペプチドがMHCクラスＩまたはMHCクラスII分子のいずれかと結合し、適当なヘルパーおよび傷害性Ｔ細胞によって認識されうるということが実証されてきた。
癌の免疫療法の主要な矛先はこれらの腫瘍特異的な抗原を明らかにし、これらの抗原に対するＴ細胞依存性の免疫を最も効果的に生じさせると思われる免疫法を開発することにある。例えば、SV40のＴ抗原遺伝子か、HPVまたはインフルエンザの核タンパク由来のE6およびE7遺伝子かどちらかを含む種痘ウィルス組換え体ワクチンにより、これらのタンパクを腫瘍抗原として発現する腫瘍細胞によって、続いて起こる問題から動物を保護することが、研究により示されている。この防御は宿主内のＴ細胞での抗原特異的な反応の発生と関係している。
実際には、宿主抗原提示細胞のMHC分子に対する特異的な抗原の提示を助長するような方法は、いずれもヒトの癌のためのウィルスに基づいた方法のような免疫力も助長すると思われる。HIVのようなウィルスの感染に対するワクチンの高い効果の産出にも同様の議論がなりたつ。
発明の概要
本発明の目的はワクチンに高い抗原活性を付与することである。
本発明のさらなる目的は、ヘルパーＴ細胞が選択的に刺激されるように処理され、主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）クラスII分子に提示されるようなリソソーム／エンドソーム小室に送り込まれる新規の免疫原を利用して、ワクチン接種のより効果的な方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヘルパーＴ細胞の刺激を通じて抗腫瘍免疫応答を引き起こすことにより、癌治療の改良された方法を提供することである。
これら、および他の目的は次のような具体例により達成された。
一具体例として、本発明は哺乳類で抗原に対して免疫反応を引き起こすワクチンの構成を提供することであり、このワクチンは（１）前記の抗原のエピトープを少なくとも一つはコードする配列を含むＮ末ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）タンパクをリソソーム膜に向かわせるエンドソーム／リソソーム標的シグナルを含む細胞質ドメイン、を含むタンパクをコードするキメラDNAが含まれるワクチンベクターから成る。詳細な具体例として、キメラDNA部分にコードされるタンパクは主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）クラスII分子と複合体をつくるペプチドである少なくとも一つのエピトープからなる管腔内Ｎ末ドメインを含み、そのタンパクは、タンパクのＣ末端近くにエンドソーム／リソソーム標的シグナルを含む短い細胞質ドメインを持つ。その標的シグナルはテトラペプチド配列Tyr−Xaa−Xaa−Xbbからなり、ここでXbbは疎水性アミノ酸である。
他の具体例として、本発明は、ベクターが（１）前記の抗原のエピトープを少なくとも一つは含むＮ末ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、（３）DNAから発現されたタンパクをリソソーム膜に持っていくエンドソーム／リソソーム標的シグナル、を含むタンパクをコードする異型のDNA部分を含み、哺乳動物に感染するようなベクターを含んだワクチン成分の哺乳動物への投与からなる、抗原への免疫応答を引き起こすワクチン接種法を提供する。
さらなる具体例として、本発明は、上述の哺乳動物で複製可能な抗原提示細胞（APC）を含む細胞数の上述の哺乳動物への投与からなる、哺乳動物での抗原に対する免疫応答を引き出すワクチン接種法を提供し、ここでは投与後、APCが（１）抗原のエピトープを少なくとも１つは含むＮ末ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、（３）DNA配列から発現されたタンパクをリソソーム膜に持っていくエンドソーム／リソソーム標的シグナル、をコードするDNA配列を発現し、また、哺乳動物のMHCタンパクと適合する、MHCクラスIIグループ由来の細胞表面タンパクを発現すると思われる。
さらに別の具体例として、本発明は、患者の中で複製可能な抗原提示細胞（APC）を含む細胞数を投与され、投与後にAPCが患者の腫瘍由来の細胞の細胞表面に特徴的につくられた抗原のエピトープを少なくとも一つはコードしている配列を含むＮ末ドメイン、膜貫通ドメイン、およびDNA配列から発現されたタンパクをリソソーム膜に持っていくエンドソーム／リソソーム標的シグナルを含む細胞質ドメインをコードするDNA配列を発現し、また、患者のMHCタンパクと適合するMHCクラスIIグループ由来の細胞表面タンパクを発現すると思われるような癌患者の治療法を提供する。
本発明は、発明者たちの、タンパクをエンドソーム／リソソーム小室に送り込むと思われる標的シグナルの発見、および、管腔の抗原ドメインおよび細胞質のエンドソーム／リソソーム標的シグナルを含んだキメラの膜貫通タンパクが、抗原の処理およびMHCクラスIIとの結合がおこるエンドソーム／リソソーム小室に抗原を効果的に持っていくという発見に基づいている。これらの発見は興味深いことに、様々な免疫性ベクターでLAMP−１の配列のようなエンドソーム／リソソーム標的シグナルに連結した抗原に関与したキメラ遺伝子を含むという概念を直接支持している。これらのベクターによって細胞にキメラ遺伝子が導入されると、組換え抗原が発現され、MHCクラスII分子とより効果的に結合するエンドソーム／リソソーム小室に送り込まれて、その結果、生体内での組換え抗原に特異的なCD4+T細胞の刺激が高められる。これは、提示のためにタンパク抗原をMHCクラスII経路にもっていく新規のメカニズム−以前の免疫法よりも効果的と思われるメカニズムを示している。そのようなリソソーム標的シグナルを含むキメラ構造物によって抗原をエンドソーム／リソソーム小室に送り込む方法は、CD4+MHCクラスIIに限定した免疫応答を刺激しようとする、ワクチン接種または免疫の方法のどちらにおいても価値があると思われる。
【図面の簡単な説明】
図１は非修飾および変異のLAMP−１のcDNAでトランスフェクションした、ヒトの腎臓の繊維芽細胞の蛍光顕微写真を示している。72時間の感染後、細胞を固定し、透過性にして、マウスおよびヒトのLAMP−１に特異的なモノクローナル抗体、続いて蛍光をつけた二次抗体とともにインキュベートした。図1Aは抗マウスLAMP−１抗体とインキュベートしたコントロールの（疑似感染した）細胞を示している。図1Bは抗ヒトLAMP−１とインキュベートしたコントロールの（疑似感染した）細胞を示している。図1Cは非修飾のマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1Dは非修飾のマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗ヒトLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1EはIle382の欠失によって修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1FはIle382およびThr 381の欠失によって修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1GはIle382をLeuで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1HはIle382をPheで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1IはIle382をThrで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1JはGln380をAlaで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1KはThr381をAlaで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。図1LはGln380−Thr381をAla−Alaで置換して修飾したマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している。
図２は非修飾または変異いずれかのCD44 cDNAをトランスフェクションしたヒトの腎臓の繊維芽細胞の蛍光顕微写真を示している。72時間の感染後、細胞を固定し、透過性にして、マウスのCD44に特異的なモノクローナル抗体、続いて蛍光をつけた二次抗体とともにインキュベートした。図2Aは非修飾のマウスCD44 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスCD44抗体で視覚化した細胞を示している。図2BはTyr−Gln−Thr−Ile−COOHという配列で終結する欠失した細胞質尾部をもつマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスCD44抗体で視覚化した細胞を示している。図2CはTyr−Gln−Thr−Ile−COOHという配列で終結する欠失した細胞質尾部をもつマウスLAMP−1 cDNAをトランスフェクションし、抗ヒトLAMP−１抗体で視覚化した細胞を示している（右側の焦点から外れているものはトランスフェクションされていない細胞）。図2Dは細胞質尾部の内部にTyr−Gln−Thr−Ile−COOHという配列をもつ修飾されたマウスCD44 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスCD44抗体で視覚化した細胞を示してる。図2Eは正常な（欠失していない）CD44の細胞質尾部のカルボキシル末端の後にTyr−Gln−Thr−Ile−COOHという配列をもつ修飾されたマウスCD44 cDNAをトランスフェクションし、抗マウスCD44抗体で視覚化した細胞を示している。
図３および図４は、修飾または非修飾のHAでトランスフェクションした細胞を提示するA20抗原とともにインキュベートした、抗HA/I−EdのトランスジェニックＴ細胞の増殖応答を決める二つの実験結果をグラフで示している。
発明の詳細な説明
A.定義
本発明の実践には、別記されていない場合は、当該分野において慣例的な分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術が使われる。そのような技術に関しては出版物において十分な説明がなされている。例えば、マニアチス、フリッチュおよびサムブルック（Maniatis,Fritsch ＆ Sambrook）,"MolecularCloning:A Laboratory Manual"（1982）;"DNA Cloning:A Practical Approach,"第Ｉ巻及び第II巻（D.N.グローバー（Glover）編、1985）;"Oligonucleotide Synthesis"（M.J.ゲイト（Gait）編、1984）;"Nucleic AchidHybridization"（B.D.ヘイムズ（Hames）とS.J.ヒギンズ（Higgins）編、1985）;"Transcription and Translation"（B.D.ヘイムズとS.J.ヒギンズ編、1984）;"Animal Cell Culture"（R.I.フレシュニー（Freshney）編、1986）;"Immobilized Cells and Enzymes"（IRLプレス、1986）;B.パーバル（Perbal）、"A Practical Guide to Molecular Cloning"（1984）を参照していただきたい。
本発明の記載において、下記の技術用語は以下に示される定義にしたがって用いられる。
「二本鎖DNA分子」は、正常な二本鎖螺旋の形をとったデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、もしくはシトシン）の重合形態に関する。特定の二本鎖DNA分子の構造について述べる場合、配列は、通常の慣例にしたがって、転写されない鎖のDNA（即ち、mRNAと相同な配列を持つ鎖）に沿って５′から３′の方向に配列が一義的に表されるように、本明細書中では記載される。
「キメラDNA」は、ある比較的大きな分子中に存在する、天然の該比較的大きな分子に関して見出だされない同定可能なDNAセグメントである。従って、キメラDNAが蛋白質セグメントをコードする場合、そのセグメントをコードする配列は、天然に存在するゲノムのいずれにおいても該コード配列と隣接しないDNAに隣接することになるであろう。アリル変異体もしくは自然に生じた変異事象では、本明細書中に定義されるキメラDNAが生じることはない。
コード配列は、（遺伝子暗号の観点から）蛋白質もしくはペプチド配列に対応する若しくはその配列をコードする、読み枠の合った（イン−フレーム（in−frame）の）コドン配列である。２つのコード配列は、それらの配列もしくはそれに相補的な配列が同じアミノ酸配列をコードしているなら、互いに一致している。適当な調節配列に関する「コード配列」はin vivoで転写されポリペプチドに翻訳されうる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常コード配列に対して３′側に位置するであろう。「プロモーター」配列は、細胞内においてRNAポリメラーゼと結合し、下流（３′の方向）のコード配列の転写を開始させる能力を持つDNA上の調節領域である。プロモーター配列に結合するRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次いで今度はそのmRAがコード配列にコードされる蛋白質に翻訳される場合には、コード配列は細胞においてプロモーター配列の「制御下」にある。
外来DNAが細胞壁の内側に導入されている場合、細胞はその外来DNAにより「形質転換」されている。外来DNAは、その細胞のゲノムを構築している染色体DNAに統合（integrate;共有結合により繋がっていること）されていてもいなくてもよい。原核生物および酵母においては、例えば、外来DNAをプラスミドのようなエピソームエレメント上で維持することもできる。真核生物に関しては、安定に形質転換された細胞とは、外来DNAが染色体中に統合され、染色体複製を通じて娘細胞に遺伝されるようになったものである。この安定性は、その真核細胞の、外来DNAを含む娘細胞の集団から成る細胞系列もしくはクローンを確率できる能力により示される。「クローン」は、細胞分裂により一つの細胞もしくは共通の祖先から派生した細胞集団である。「細胞系列」は、in vitroで何世代もの間、安定に増殖できる初代細胞のクローンである。
「レプリコン」とは、in vivoにおけるDNA複製の自律的な単位として機能するいずれかの遺伝子エレメント（例、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、DNA、RNAもしくは蛋白質などの外来性の物質をある生物に導入するために使われる道具である。典型的なベクターには、組み換えウイルス（DNA用）およびリポソーム（蛋白質用）が含まれる。
「エピトープ」は、通常短いペプチド配列もしくはオリゴ糖からなる構造で、免疫系の構成要素により特異的に認識されるか若しくは特異的に結合される構造である。２つのエピトープは、それらが同じ抗体により特異的に結合され得るならば、互いに一致している。２つの抗体は、共に同じエピトープに結合し、且つ、エピトープへの一方の抗体の結合が他方の抗体による結合を妨げるならば、互いに一致している。
B.リソソーム膜糖蛋白質の輸送標的配列
本発明者らは、リソソーム膜蛋白質、LAMP−１（チェンら、1988）、LAMP−２（チャら、1990）およびCD63（ホッタら、Cancer Res.,48:2955,1988）の既知の細胞質尾部配列を、LAP（ポールマンら、1988）の細胞質尾部のチロシンを含むインターナリゼーションシグナル（internalization signal）と、表１において突き合わせた。このチロシンはエンドソーム／リソソームへのターゲッティングに必要であることが知られており、他の分子をリソソームへと送り込むのに必要な完全な配列にはTyr−Ｘ−Ｘ−hyd配列（チロシンの後に２つのアミノ酸、その後ろに疎水性残基が続く）が要求されることを、本明細書中で証明する。
0003581366.tif 000002
カルボキシル末端部もしくはその付近における疎水性残基の重要性は、LAMP−１のTyr−Gln−Thr−Ile配列の修飾から得られた結果により示される。Ileを他の２つの疎水性残基LeuもしくはPhe、および極性残基Thrに置換した、変異cDNA分子を構築した。Leu（Tyr−Gln−Thr−Leu）およびPhe（Tyr−Gln−Thr−Phe）への置換はリソソームへのターゲッティングに影響を及ぼさなかったが、Thrを含む変異蛋白質（Tyr−Gln−Thr−Thr）は細胞表面に蓄積した。GlnおよびThrの役割を、Gln（Tyr−Ala−Thr−Ile）、Thr（Tyr−Gln−Ala−Ile）、およびその両方（Tyr−Ala−Ala−Ile）をAlaに置換した、さらに３種の変異体を用いて解析した。これらの置換は該蛋白質のリソソーム膜へのターゲッティングに何の影響も持たず、これらの位置には電荷を持った残基、極性残基もしくは非極性残基のいずれが占めてもよいことが示された。
さらに別の構築物により、Tyr−Gln−Thr−Ile配列が、一方でリソソーム膜へのターゲッティングを賦与するのに十分でありながら、リソソームへのシグナル伝達を媒介する特異な流れにおいて存在していなければならないことが示される。配列Tyr−Gln−Thr−Ileが長い（〜70アミノ酸）細胞質配列の中央に挿入された、または長い細胞質配列の末端に該モチーフが置かれた、非短縮型の変異蛋白質は、リソソームへ標的輸送されず、むしろ原形質膜に現れた。
C.他の蛋白質をエンドソーム／リソソーム小室へ標的輸送させるための、これらの蛋白質の改変
本発明は、（１）蛋白質分解酵素により放出された場合にMHCクラスII分子と複合体を形成するであろう１つもしくは複数のペプチドセグメントを含む、抗原性ポリペプチドドメイン；（２）膜貫通ドメイン、および（３）抗原性ドメインを、抗原プロセシングおよびMHCクラスII分子への提示が可能な区画に輸送させる、エンドソーム／リソソームターゲッティングシグナルを含む細胞質尾部から成る免疫刺激性構築物を提供する。さらに、シグナル配列と読み枠の合った翻訳開始部位（分泌区画への発現を指示する）、抗原性ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、エンドソーム／リソソームターゲッティングシグナルおよび翻訳終結シグナルの順に、適当な制御配列も含んだ構築物をコードする、ヘテロもしくはキメラDNAが提供される。このヘテロDNAを含むレプリコンも本発明により提供される。
レプリコンは哺乳動物細胞中でin vivoでの免疫刺激性構築物を発現させることができるのが普通である。本発明の抗原提示細胞によるヘテロDNAの発現は、免疫刺激性構築物のリソソーム／エンドソーム小室へのターゲッティングをもたらし、該小室でペプチドセグメントは放出されてMHCクラスII分子と複合体を形成し、その結果、該構築物の該抗原性ドメインに特異的なCD4＋  Ｔ細胞集団の刺激がもたらされるであろう。
1.抗原性ドメイン
抗原性物質の点では、本発明はワクチンもしくは他の関連事項に有用な抗原性物質に広く適用可能である。本明細書中で使われる用語「抗原性物質（antigenic materials）」は、処理されMHCクラスII分子と組み合わせて提示されると特定の免疫応答を誘起する基質のいずれも含む。この抗原性物質は、一般的には、リソソーム酵素により放出され得るもので、放出されればMHCクラスIIエピトープに対応するペプチドセグメントを含む。抗原性物質はまた、免疫系の他の構成要素を刺激する領域も含み得る。
本発明の構築物はリソソーム画分へ輸送される前の翻訳後修飾画分を通過するので、抗原性ドメインはまた、細胞性修飾により生じるエピトープも含み得る。本質的に、哺乳動物細胞により合成されることができ、MHCクラスII分子により複合体を形成することのできるエピトープを含むいずれのポリペプチドも、直接１次アミノ酸配列にいれることで若しくは翻訳後のプロセッシング中に作られるようにシグナルをいれることで、抗原性ドメインに取り込むことができる。抗原性ドメインとして利用するのに求められる抗原蛋白質の最も適当な部分の選択は、機能性スクリーニングによりできる。広義では、本スクリーニング法は、本明細書中で教示するように、免疫刺激性構築物をコードするDNAの抗原性ドメインとして、１つもしくは複数の蛋白質抗原のセグメントをコードするDNAのクローン化を伴う。ここで、そのような構築物にはLAMP−１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が取り入れられていることが望ましい。クローン化したDNAを、好適には抗原提示細胞で、発現させる。
特定のスクリーニング操作は、抗原の型およびその抗原活性のアッセイに依存する。抗原性は、抗原特異的なMHCクラスII特異的なＴ細胞系列もしくはクローンの刺激により測定することができる。また、抗原性は、in vivoで抗原に特異的な抗体もしくはＴ細胞を生産させる能力を測ることによって決定してもよい。抗原活性に関するこれらのおよび他の試験法は、当該分野に熟達した者にはよく知られている。
好適な抗原性物質の供給源として利用可能な抗原には、腫瘍抗原、自己抗原、哺乳動物細胞に見つかる細胞表面蛋白質、細菌蛋白質、原生動物もしくは菌類（特にこれらの生物の細胞壁もしくは細胞膜に見つかる蛋白質を含む）、およびHIVおよびヘパドナウイルス（hepadnavirus）などのレトロウイルスを含むウイルスのゲノムによりコードされる蛋白質が含まれる。特に好適な抗原は、肝炎、狂犬病、マラリア、住吸血虫病、癌、AIDS、黄熱、デング熱、ウマ脳炎、リフトバレー熱（Rift valley fever）、猫ひっかき病、ウイルス性髄膜炎の原因生物もしくは関連生物のゲノムにコードされる抗原である。特に好適なウイルス性抗原は、ヒト、ウマ、ウシ、ブラ、ラマ、キリン、イヌ、ネコもしくはトリに対して病原性のウイルスのゲノムにコードされる、ウイルス性コード蛋白質である。
2.膜貫通ドメイン
ポリペプチドの膜貫通ドメインの構造は当該分野においてよく知られている（例えば、バンガム（Bangham）,Anal.Biochem.,174:142,1988;クライン（Klein）ら、Biochem.Biophys.Acta,815:468,1985;カイル（Kyle）とドゥーリトル（Doolittle）、J.Mol.Biol.,157:105,1982を参照していただきたい）。膜貫通領域は、１次配列において、親水性領域に挟まれた20−25の疎水性アミノ酸残基として現れる。そのような配列は、例えば、他の多くの膜蛋白質と動揺にGenebankに挙げられている大抵の細胞表面抗原配列に見出だされる。特定の膜貫通配列は、それが抗原ドメインを細胞質尾部に結合させ、膜画分中の構築物に係留させる働きをしている間は、決定的なものではない。
特定の免疫刺激性構築物に関する抗原性ドメインの供給源として働く多くの蛋白質は、その１次配列中の膜貫通ドメインを含めた表面抗原であろう。そのような膜貫通ドメインは保持されうるもので、細胞質ドメインは、本明細書中に教示されるように、リソソーム／エンドソームターゲッティング配列に置き換えられることができるものである。また、LAMPの膜貫通ドメイン（LAMP細胞質尾部とくっついていることが望ましい）（チェンら、J.Biol.Chem.,263:8754,1988、本明細書で参考事項に含まれている）を、構築物をリソソームプロセッシングを受けさせ、MHC  II/ヘルパーＴ細胞系により提示させるために、求める抗原ドメインの１次配列に繋げることもできる。
3.リソソーム／エンドソーム標的シグナル
エンドソーム／リソソームへの標的を行うシグナルを含むいずれの配列でも使用できる。このような配列の例は、様々なリソソーム／エンドソーム膜糖タンパク質の細胞質ドメインおよびエンドソームと細胞質膜の間を回る受容体に見られる。標的シグナルを含む配列はHAの抗原ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定されるリソソーム／エンドソーム標的シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含むキメラDNAの構築によって同定される。標的の効率は、キメラタンパク質を発現する抗原提示細胞がHAエピトープ特異的にＴ細胞に限られたMHCクラスIIを刺激する能力によって測定される（例えば、下記実施例５を参照）。
リソソーム／エンドソーム小室への好ましい標的シグナルは、膜貫通ドメインの近くでＣ末端付近でもある細胞質ドメイン中に位置するテトラペプチド配列を含む。細胞質ドメインは、好ましくは遊離のカルボキシル基で終了する短いアミノ酸配列（70アミノ酸未満、好ましくは30アミノ酸未満、最も好ましくは20アミノ酸未満）である。より好ましい態様に置いては、テトラペプチドは、標的シグナルを含む短い細胞質尾が終了するＣ末端に存在する、またはLAMP−１と同様である。テトラペプチドに適した４つのアミノ酸配列は、モチーフがTyr−Ｘ−Ｘ−Hydを含み（Ｘはどのアミノ酸でもよく、Hydは疎水性アミノ酸を示す）、リソソーム／エンドソームへの標的能力が保存されているならば、アミノ酸置換によって得られる。特に好ましいテトラペプチドはTyr−Gln−Thr−Ile配列である。最も好ましい態様に置いて、膜貫通ドメインと結合した完全なLAMP細胞質尾を、非常に効率的なMHCクラスIIのプロセッシングおよび提示用に抗原ドメインの１次配列に結合させる。
4.免疫源をコードする配列の結合
キメラタンパク質の構築の手順は当該技術分野に置いてよく知られている（例えばウイリアムス、ら.,J.Cell.Biol.111:955、1990、参考文献にふくむ）。広範には、望ましい部分をコードするDNA配列はアメリカン・タイプカルチャー・コレクション、12301パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド20852、米国.,または望ましいDNAを含むDNAライブラリーより入手できるような容易に入手可能な組換えDNA源から得られる。それから、抗原ドメイン、膜貫通ドメインおよびリソソーム標的配列（細胞質尾）に相当するDNA部分は組換えDNA手法の通常の手順を使用して適切なコントロールおよびシグナル配列と結合させる。手順は、本発明における構築物へのリソソーム標的配列の付加を除けば、米国特許4,593,002,およびラングフォード，ら.,Molec.Cell.Biol.6:3191,1986（全て本明細書中に参照として含む）に記されたのと一般に同様である。
タンパク質またはポリペプチドをコードしたDNA配列は、いくつかの手段のうちの１つによって化学的に合成されるかまたは単離されることが可能である。合成されるDNA配列は、望ましいアミノ酸に適したコドンで作成できる。一般的に、配列を発現用に使用する予定の宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列は標準的な方法によって調製したオリゴヌクレオチドのオーバーラップから結合させ、完全なコード配列とする。例えば、エッジ（1981）Nature292:756;ナンバー、ら．（1984）Science223:1299;ジェイ、ら（1984）J.Biol.Chem.,259;6311参照。
好ましくは、抗原ドメイン、膜貫通ドメイン、およびリソソーム／エンドソーム標的シグナルを含む細胞質ドメインはポリメラーゼ鎖反応を使用して個々に単離する（M.A.イニス，ら.,"PCRプロトコール；方法と応用の手引き、”アカデミックプレス1990）。ドメインは、好ましくはこれらを含むことが知られている公的に入手可能なクローンから単離されるが、ゲノムまたはcDNAライブラリーから単離してもよい。反応の条件は、単離した断片が、免疫源蛋白配列をコードするキメラDNAを構築するための適した制限エンドヌクレアーゼ部位によって揃えられるようなものである。この技術は当該技術分野でよく知られている。
核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニングと同様にオリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびDNAライブラリーの調製の基本的な方法は、当該技術分野に置いて通常の知識を有するものにはよく知られたものである。例えば、ザムブロック、ら.,"分子クローニング、実験室用マニュアル”（1989）;B.パーバル,"分子クローニングへの実質的なガイド”（1984）参照。適切なゲノムDNAまたはcDNAライブラリーの構築は当該技術分野内である。例えば、B.パーバル，上述参照。あるいは、適切なDNAライブラリーまたは公的に入手可能なクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのような公的な寄託と同様に、クロンテックおよびストラタジーンのような生物研究用品の供給先から入手可能である。
選択はDNAの発現ライブラリーから配列を発現させて発現したペプチドを免疫学的に検出することによって成し遂げられる。MHC II分子および望ましい抗体/T細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。これらの選択方法は、当該技術分野に置いて通常の知識を有する者にはよく知られている（例えば、ザムブルック、ら参照）。
望ましいポリペプチド配列のコード配列を含むクローンを１度調製または単離すれば、配列をいずれかの適切なレプリコン中にクローニングし、それによって実質的にコード配列を含まないレプリコンのない組成物中に保持できる。クローニング用の多くのレプリコンが当業者に知られており、適切なレプリコンの選択は自由である（例えば、ザムブロック、ら．参考文献として本明細書に含む、参照）。本発明のDNA配列およびDNA分子は、非常に様々な宿主／レプリコンの組み合わせを使用して発現させられる。本発明の好ましい態様に置いて、ポリペプチドのコード配列を、この発現構築物を含むレプリコンによって形質転換した宿主細胞中でDNA配列がRNAに転写されるようにプロモーター、リボソーム結合部位（発現用）および場合に応じてオペレーター（本明細書中では”コントロール”要素としてまとめて言及した）のコントロール下に置いた。好ましくはコード配列はシグナルペプチドまたはリーダーペプチドを含む。
好ましくは、本発明のレプリコンはヒト、ウマ、ウシ、ブラ、ラマ、キリン、イヌ、ネコまたはニワトリを含む動物の細胞に感染し、さらに好ましくはレプリコンはこれらの生物に感染する。特に好ましいレプリコンは以下に記載するワクチンベクターを含む。
D.組換えワクチン
本発明はベクターまたは抗原に係わらず、すべての組換えワクチンへの全般的な応用であり、MHCクラスII分子を含みおよびＴ細胞に抗原を提示する細胞へのベクターの導入を提供する。このような細胞タイプの例は樹状突起、マクロファージ、肥満細胞腫およびＢ細胞系列の細胞であり、該細胞は他の抗原提示細胞前駆体の幹細胞、抗原提示細胞になるように誘導され得る細胞または成熟した抗原提示細胞のいずれかである。
本発明の方法はMHCクラスIIに限ったＴ細胞の反応を意図したすべての免疫またはワクチン手法を意図している。この治療が特に適応できる病気には、すべての感染病、癌、および自己免疫疾患を含む。
最近のワクチン研究における主要な努力は、病原菌ベクターによる抗原タンパク質の発現に向いている。組換え発現ベクターはヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコまたはニワトリを含む動物に容易に感染する微生物由来である。好ましいベクターはワクシニアのような生ワクチンとして既に使用したものを含む。これらの組換え体は、直接宿主に接種することが可能で、微生物のベクターのみならず発現した外来抗原に対しても免疫を与える。生の組換えワクチンとして本明細書中で意図した好ましいベクターは、フレクスナーAdv.Pharmacpl.,21:51,1990、本明細書中に参考文献として含む、中にあるように、RNAウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、およびワクシニアおよび他のポックスウイルスを含む。
1.組換えウイルス
ほとんどのウイルスは外来タンパク質またはエピトープを発現するように処理されることが可能である。すでに1978年に、外来DNA配列を相同組換え及びマーカー選択によって大きなDNAウイルスに導入した（総説はロイズマンおよびジェンキンス、Science,229:1208,1985）。その後すぐに、このような組換え体を生ワクチンとして提案された。技術はヘルペス単純ウイルスについて発達したが、相同組換えはポックスウイルスのような他の大きなDNAウイルス中に外来DNAを挿入するのに有用である（モスおよびフレクスナー、Ann.Rev.Immunol.,5:305,1987）。
ポリオウイルスのようなRNAウイルスはヘテロはエピトープを発現するのに使用されたが、小さなRNAウイルスは固くパッケージされていて、可欠なDNA領域をほとんど含まないので、外来ポリペプチドの発現の能力が限られている。小さなDNAウイルスおよびRNAウイルスであればあるほど、１つの抗原タンパク質または小さなポリペプチドの発現に限られる。他のウイルスベクターはたんぱく発現に広く使用されているが、哺乳動物宿主中での複製不能（例えばバキュロウイルス）または構性的なタンパク質の発現および癌化能（例えばレトロウイルス）の問題によりワクチンとしての使用に制限がある。
スモールポックスを根絶させるための世界的な運動の中で、生のウイルスワクチンとしてワクシニアを使用することにより、生の組換えワクチンベクターとしての開発用にワクシニアを選択することが自明になった。100近い異なる外来タンパク質を発現する生の組換えワクシニアウイルスを報告され、これらのうち多くが効果的な実験ワクチンである（モスおよびフレキシナー、1987による総説）。ワクシニアは、大きなゲノムサイズなので少なくても25,000塩基対の外来DNAを受け入れる能力があり、昆虫細胞（ibid）を含むほとんどの真核細胞型に感染する能力があるために発現ベクターとして特に用途が広い。他のDNAウイルスとは違い、ポックスウイルスは感染細胞の細胞質中でもっぱら複製するため、宿主染色体と組換えウイルスDNAの遺伝的交換の可能性が減少する。組換えワクシニアベクターは適切にプロセスし、ヒト、他の哺乳類、寄生虫、RNAおよびDNAウイルス、バクテリア及びバクテリオファージを含む様々な源からタンパク質を発現する。ウイルスはほとんどの哺乳類に感染でき、ヒトおよび哺乳類の病気を広範に研究するための有用なベクターである。
生の組換え微生物の構築は当業者によく知られている標準的な技術に基づいている。（以下の記述はワクシニアウイルスで使用された手法をカバーするが、他のベクターで使用された同様の手法は当該技術分野で通常の知識を有する者には既知である。）外来タンパク質をコードするDNAの発現は、上流プロモーター配列および必要であればRNAプロセッシングシグナルを含む宿主のウイルス制御要素によって制御される。ワクシニアウイルスゲノムの不必要な領域中への外来DNAの挿入は、相同組換えによって行われる（パニカリ，ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:4927,1872;マケット，ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:7415、1982）。DNA中での外来遺伝子の発現は、挿入部位またはその近くの転写制御要素またはより正確な遺伝子工学によって起こりうる。外来遺伝子の挿入及び発現を非常に促進するプラスミドベクターが作成された（マッケット，ら.,J.Viol.49:857,1982）。これらのベクターは、ワクシニア転写プロモーターおよびワクシニアゲノムの可欠な領域のDNAのわきへの外来コード領域の挿入のための１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む発現部位を含む。プロモーターの選択により発現の時期（例えば早期、遅期）およびレベルの両方が決定し、わきのDNA配列は相同組換えの部位を決定する。この手法によって生産された1000ものウイルス粒子の約１つだけが組換え体である。組換えウイルス粒子はDNAハイブリダイゼーションによって同定されるが、効率的な選択方法が開発されてきた。わきの配列としてワクシニアウイルスの可欠なチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の断片を使用して、外来遺伝子をTK座位中に組み込み、挿入によってTK遺伝子を不活化する。TKウイルスの選択は、５−ブロモデオキシウリジン存在下でTK細胞におけるウイルスプラークアッセイを行うことによって遂行される。核酸類似体のリン酸化およびその結果としてのウイルスDNAへの致死産物の取り込みはTK＋の親株ウイルスで感染させた細胞においてのみ起こる。形質転換および組換え効率によると、80ほどのプラークが望ましい組換え体であり、残りはTK遺伝子の突然変異である。
第２の遺伝子用の発現部位と同様に大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターにより、親株ウイルスと組換えウイルスを区別する別の方法が可能になった（チャクラバルチ，ら.,Mol.Cell.Biol.5:3403,1985）。このような組換え体によって形成されたプラークは、適切な指示薬の添加によって生じた青色により正に同定されることが可能である。TK選択およびβ−ガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることによって、組換えウイルスは容易に早く単離される。それから、組換え体は適した細胞系列中で子孫を増やすことによって増幅し、挿入遺伝子の発現は適当な酵素学的、免疫学的または物理的手法によって確認される。
ワクシニアウイルスゲノムに付加できる遺伝的情報の上限の量についてはまだ知られていない。しかし、25,000塩基対近くの外来DNAを付加しても、ウイルス生産には何の欠損効果も示さなかった（スミス，ら.,Gene,25:21、1983）。必要である場合には、ワクシニアウイルスゲノムから大きな断片を欠失させて、容量を大きくすることが可能である（モス，ら.,J.Viol.40:387,1981）。
2.ペプチドワクチン
上述したDNA配列によってコードされる免疫刺激構築物に対応した、膜貫通領域およびリソソーム標的領域をつけた細胞質尾を含む、無細胞系ペプチド免疫源を含むワクチンもまた、本発明の意図内である。免疫刺激構築物はワクチンとして投与されると膜構造中に結合するのであろう。このような免疫源は、例えば本明細書中に参考文献として含む、米国特許第4,448,765号に記載されたように、好ましくはリポソーム中に取り込ませる。
タンパク質またはポリペプチドを免疫源として使用する場合、組換え細胞中でDNAを発現して生産するか、または化学合成によって調製される。例えば、メリフィールド技術（Journal of Amerikan Chemical Society,vol.85,pp2149−2154,1968）が使用可能である。
3.投与
本発明に従ったワクチン物質は、上述した免疫刺激構築物を含むもの、または免疫刺激構築物を発現する組換え微生物でありうる。本発明に従ったワクチン物質を含む組成物の調製およびこのような個々の免疫組成物の投与は、当業者によく知られている免疫の原理に従って遂行される。大量のこれらの物質は上述したキメラDNAを発現するレプリコンを含む組換え体または形質転換した細胞の培養によって得られる。培養方法は当業者によく知られており、上記に挙げた文献の１つまたはそれ以上に記されている。ワクチン物質は、一般に組換え体または形質転換細胞の培養によって生産し、例えば本明細書中に参考文献として含む米国特許第4,446,128号のように、当該技術分野で記載されたように、生理学的に受け入れられる水溶性液体といった薬理学的に受け入れられる溶液または懸濁液の形、または被服錠剤、錠剤、カプセル、座薬またはアンプルの形で処方される。投与は経口、直腸、鼻内または例えば経皮、皮下、筋肉内または静脈内への注射を含むいずれの適切な方法でもよい。
ワクチン化合物は哺乳類中で免疫反応を誘導するのに十分な量を哺乳類に投与する。好ましい最少の投与量は、投与前よりも少なくても４倍濃度の抗体形成を起こすのに必要な量である。典型的な最初の投与量は、免疫刺激構築物、またはプラーク形成単位が105から1010の組換えベクターを静脈、筋肉または皮下に投与するときは10−100マイクログラムで、経口なら100から1000マイクログラムであるが、この量は免疫反応を誘導するワクチン及び他の薬の投与に置いて通常行われているように投与を行う医者によって調節できる。１度の投与で免疫を誘導するには十分であるが、何度も投与すれば反応を確定し高めることになる。
本発明に従った処方及び投与の適当な方法についてのさらなる記述は、本明細書中に参考文献として含む下記米国特許中に見られる：米国特許第4,454,116号（構築物）、米国特許第4,681,762号（組換えバクテリア）、および米国特許第4,592,002号および第4,920,209号（組換えウイルス）。
E.形質転換した抗原提示細胞
昂進した抗原提示を免疫に用いる方法は、体内から抗原提示細胞を取り出し、細胞をin vitroで培養し、目的とする抗原を上に記載したようにLAMP標的シグナルで修飾したものをコードする適当なベクターで、そうした細胞を形質転換することである。これらの形質転換された抗原提示細胞は目的とする抗原を発現するようになるので、これを個体に注射して戻すことで免疫応答を起こすことができる。この方法の例は、GM−CSFの影響下で樹状細胞に分化途上のCD34+前駆細胞を感染または形質転換した後、これらの形質転換した樹状細胞を注射して戻すことである。エンドソーム／リソソーム標的シグナルにつながった抗原配列を含んだ構築物を用いることにより、形質転換した抗原提示細胞上では、特定の抗原に由来するペプチドのMHCクラスII分子への結合が昂進し、効能の高い全身的なＴ細胞依存性の免疫応答が起こることが期待される。この方法で形質転換する抗原提示細胞は同種の細胞であることが望ましいが、宿主中で効率よく抗原を提示できるMHCクラスII+の細胞であれば、いかなるものも用いることができる。
F.免疫寛容と自己免疫
多くの自己免疫疾患は、特定のMHCクラスIIハプロタイプとの相関を見せ、自己抗体の異常な産生を伴うことから、MHCクラスIIで限定された自己反応性のCD4+T細胞の発生が、病理発生の重要な段階であると推測されている。二次シグナル（CD28がそのリガンドであるB7を受けて共に働くようになるなど）の非存在下でＴ細胞受容体が働くことにより、特定の条件下でCD4+細胞が不活化または活性化されるとするならば、適当な二次シグナルを発現していないMHCクラスII＋細胞上に、MHCクラスIIで限定して抗原を効率よく提示させて、これを有効な寛容原とすることができる。こうした免疫寛容の発生または特定のCD4+T細胞の不活化は、自己免疫疾患における異常な免疫応答を抑制するのに用いることができる。
この原理の態様においては、抗原提示能の低い（いかなる共刺激シグナルも発現しなかった）細胞において、MHCクラスIIの発現を誘導させるか、適当なMHCクラスII遺伝子で形質転換する。この細胞をさらに目的の自己免疫原、たとえば重症性筋無力症の場合にはアセチルコリン受容体をエンドソーム／リソソーム標的シグナルにつないだもので形質転換する。こうした細胞を宿主に注射してやれば、適当な共刺激シグナル（抗原を有効に提示する細胞により供給されるシグナル）の非存在下、でMHCクラスII分子のペプチド配列をCD4+T上のＴ細胞受容体に効率よく提示することにより、抗原に対するＴ細胞応答を抑制することができる。
G.癌免疫療法
1.治療法の対象
癌免疫療法の対象は、定義されかつ同定されている腫瘍特異的な抗原をもち、そうした抗原をクローン化し、本明細書に記載されたようにLAMPエンドソーム／リソソーム標的配列で修飾できるような癌をもつ患者である。実施的には、記載されたエプスタイン−バールウイルスに付随する白血病の患者、HPVに付随する頸管癌腫の患者、または腫瘍遺伝子や腫瘍抑制遺伝子に、定義された転位や変異をもつ患者が含まれる。リソソーム／エンドソーム標的配列につないだ腫瘍抗原をウイルスワクチンにまとめたワクチンを用いる治療が、個々の患者の癌が同定されれば、その後のいかなる進行時期においても利用できることは明らかである。また危険度の高い患者においても、定義された腫瘍特異的な抗原をもつ癌がさらに出現するのを防ぐために、ワクチンを投与することができる。
2.治療の手順
一つの態様においては、リソソーム／エンドソーム標的配列につないだ抗原を含む組換えウイルスワクチンを、ワクシニアなどのウイルスワクチンに合わせたものを、上に記載したように大量に産生し、悪性腫瘍の進行の適当な時期に患者に注射する。ワクチンは腫瘍の軽度の段階で注射するのが望ましい。もう一つの態様では、個々の患者の抗原提示細胞にこの構築物を導入するが、この場合まず抗原提示細胞の前駆細胞または成熟した抗原提示細胞を、個々の患者の骨髄または末梢血管から静脈穿刺により採取する。これらの細胞は培養細胞として確立した後、キメラ構築物で形質転換する。形質転換が起こったところで、これらの抗原提示細胞を患者に注射して戻してやる。
特に望ましい態様では、本発明は病気の早期であったり、悪性腫瘍の切除後や、腫瘍細胞の程度が他の方法で低減されているなどといった、軽度の腫瘍をもつ癌患者に対する治療法を供給する。この方法では、まず患者の腫瘍に特徴のある腫瘍特異的な細胞表面抗原を同定して、MHCクラスII分子を発現する抗原提示細胞に分化しうる同種の幹細胞を含んだ細胞集団を患者から取得する。これらの細胞を培養し、以下を含んだタンパク質をコードする異種またはキメラのDNA分子を導入して形質転換する。（１）患者の腫瘍の細胞上に見出された腫瘍特異抗原の少なくとも一つのエピトープを含んだＮ末端領域、（２）膜貫通領域、（３）タンパク質をリソソームの細胞膜に指向するエンドソーム／リソソーム標的シグナルを含んだ細胞内領域。すなわち、このDNAは上に記載した免疫刺激構築物をコードする。形質転換された幹細胞集団は患者に戻され、ここで幹細胞は、腫瘍特異的な抗原に由来するThエピトープと複合体となったMHCクラスII分子を発現する抗原提示細胞に分化する。腫瘍特異的な抗原に対する免疫応答は、ヘルパーＴ細胞集団による刺激の昂進により昂進される。
以下の実施例は説明だけを目的として供給される。これは上に記載した本発明を制限することを意図するものではなく、本発明は添付の請求によってのみ制限される。
実施例
実施例１
細胞質領域尾部に連続的な欠損をもつ変異型LAMP−１タンパク質の解析
我々は細胞質領域に段階的な欠損をもつ一連の変異型LAMP−1 cDNA分子を作製した。欠損Ile382;欠損Ile382およびThr381;欠損Ile382,Thr381およびGln380;欠損Ile382,Thr381,Gln380およびTyr379
変異型LAMP−1c DNAの部位特異的変異導入およびサブクローニング
欠損変異型をポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製した。基質はリニアーLAMP−1 cDNAクローン9E5（チャ（Cha）ら、1990）であった。センス鎖プライマーはEcoRV制限酵素部位の54塩基5'のアミノ酸残基Ser102からAsp108に相当する配列にアニールした。以下のアンチセンス鎖プライマーは欠損を生じるのに用いた（本来より前にできた停止コドンは太字で、Xho I制限酵素部位は括弧で表している）。
0003581366.tif 000003
約850塩基対のPCR産物が２％アガロースゲルで単離され、GENE CLEAN（Bio−101）を用いて精製された。ベクターPcDNA1（Invitrogen）のEcoR I制限酵素部位にLAMP−１クローン9E5を挿入したプラスミドをEcoRVおよびXho Iで切断した。この切断で生じる野性型断片を除き欠損型をコードする断片で置換した。
ネズミcDNA分子をヒト胎性腎臓線維芽細胞に感染させ、72時間だけ発現させた。細胞を固定し、透過性をもたせ、適当な蛍光標識した２次抗体とともにモノクローン抗体を用いて、感染させたネズミのLAMP−１とヒト細胞がもつLAMP−１の局在を、リソソームの局在のコントロールとして決定した。
感染および免疫蛍光法
90％DMEM/F12（Gibco）,10％牛胎児血清（Gibco）で増殖させた1.5ml（mlあたり103細胞）の293Sヒト胎性腎臓細胞を、滅菌カバースリップをもつ35mmの滅菌組織培養皿にのせた。細胞を37度で一晩CO2で保温した。培地を感染の３時間前に取り換えた。感染の直前に10μｌのCaCl2を5ugのLAMP−１（野生型または変異型）プラスミドDNAを含む90μｌの1mM tris HCl（pH7.5）,0.1mMEDTAに加えた。この溶液に100μｌの2XHepes緩衝液を加えた。このDNA緩衝液を皿に加えた。37度で４時間後、培地を皿から除き、リン酸緩衝液（PBS）に溶かした15％グリセロールを1ml加えた。30秒後細胞をPBSで洗い、1.5mlの培地を加えた。72時間目に細胞をPBSに溶かした４％パラフォルムアルデヒドで固定した。そして細胞を、PBSに溶かした0.1％サポニンおよび４％正常ヤギ血清と共に15分保温した。そしてLAMP−１を感染させた細胞を、ID4B（ラット抗−マウスLAMP−１モノクローン抗体、チェン（Chen）ら、1985）およびH5G11（マウス抗ヒトLAMP−１モノクローン抗体、メイン（Mane）ら,Arch.Biochem.Biophys.,268:360,1989）の等量の混合物および0.1％サポニン0.7mlと30分間保温した。0.1％サポニンを含むPBSで洗った後、細胞を10ug/mlTexas Red結合ヤギ抗ラットIgG、20ug/mlFITC結合ヤギ抗マウスIgG（Jackson Immunochemicals）、0.1％サポニンを含むPBSで30分間保温した。細胞をPBSで３回洗い、カバースリップを25％グリセロールPBSを一滴おいたスライドに逆さにおいた。スライドを63X油侵レンズ下でZeiss Axiophorを用いて観察した。露出は手動で400TMAXフィルム（Kodak）を用いて４分の１自動セッティングに調整した。
重要なTyrをもつものを含めて、すべての欠損変異体はリソソーム膜ではなく細胞表面に蓄積していた（欠損Ile382,図1E;欠損Ile382およびThr381,図1F;より広い範囲の欠損をもつ２つの変異体は示していない）。対照的に、修飾していないネズミLAMP−１は、ヒトLAMP−１とともに存在しており（図1D）、リソソーム膜に局在してイタ（図1C）。感染していないヒト細胞では非特異的染色は見られなかった（図1AおよびＢ）。これらのデータはカルボキシル末端のIle382および、おそらくThr381とGln380も、LAMP−１の局存在において重要な役割を果たしていることを示している。
実施例２
細胞質領域の尾部の末端の３つ（380−382）のアミノ酸を置換したLAMP−１タンパク質の解析  ２つのリソソーム膜たんぱく質、LAMP−２（チャら、1990）とCD63（メッツェラー（Metzelaar）ら、J.Biol.Chem.,266:3239,1991）の既知の細胞質尾部の配列と、LAMP（ピーターズ（Peters）ら、1990）の細胞室尾部にTyrを含む膜貫通シグナルが存在することともに上述のデータはこれらの分子のリソソーム標的シグナルはTyrとそれに続く２つのアミノ酸、少なくともそのうち１つは局性または荷電アミノ酸であり、続いて疎水性残基がくるコンセンサス配列であることを示している（表１）。カルボキシル末端の疎水性残基の重要性は、Ile382が他の２つの疎水性残基;LeuまたはPheで、そして局性残基Thrで置換された３つの変異型cDNA分子から得られる結果によって支持された。
置換および挿入変異体はアマシャム部位特異的変異導入キット（Amersham Site directed Mutagenesis Kit）を用いて調製した。LAMP−１クローンのアンチセンス鎖をM13mp18のEcoR I部位へサブクローニングした。以下のプライマーをLAMP−１変異体用に使った（プライマーはセンス鎖で、ミスマッチは太字で示している）。
0003581366.tif 000004
置換Leu（Tyr−Gln−Thr−Leu）およびPhe（Tyr−Gln−Thr−Phe）はリソソームへの局在に影響を与えなかったが、Thr（Tyr−Gln−Thr−Thr）を含む変異型タンパク質は細胞表面に蓄積した（図1G−Ｉ）。部位380および381の役割はGln380（Tyr−Ala−Thr−Ile）、Thr381（Tyr−Gln−Ala−Ile）および両残基（Tyr−Ala−Ala−Ile）としたAla置換を含む３つのさらなる変異体を用いて解析した。これらの置換はタンパク質のリソソーム膜への局在に影響を与えず、これらの部位が荷電、局性、または非局性残基で占められていることが示された（図1J−Ｌ）。
実施例３
原形質膜内在タンパク質の細胞質尾部へのアミノ酸Tyr−Gln−Thr−Ileの挿入置換
配列Tyr−Gln−Thr−Ileがタンパク質のリソソーム膜への局在に十分なものであるか決定するためさらなる実験を行った。この目的で、これらのアミノ酸をネズミCD44（ヒューズ（Hughes）ら、J.Biol.Chem.,265:664,1981）の細胞質尾部、リソソーム膜へ結合しないタイプＩ細胞膜糖タンパク質およびヒアルロン酸受容体に挿入した。この糖タンパク質は252アミノ酸の細胞外領域、21残基の１つの膜貫通領域、72アミノ酸の細胞質領域の計345アミノ酸からなる。65個のカルボキシル末端残基が欠損しており、配列Tyr−Gln−Thr−Ile−Endで置き換えられた（Gly280の後）タンパク質をコードする修飾ネズミCD44 cDNAを作製した。この作製物ではLAMPの場合と同様に、４アミノ酸シグナルが11の細胞質尾部アミノ酸の終わりにおかれている。
置換および挿入変異体はアマシャム部位特異的変異導入キットを用いて調製した。ネズミCD44（ウォルフェ（Wolffe）ら,J.Biol.Chem.,265:341,1990）のセンス鎖をM13mp19のHind III−Xba I部位へサブクローニングした。以下のプライマーをCD44の挿入変異用に使った（プライマーはアンチセンス；挿入によってさえぎられたCD44アミノ酸の位置は上つきの数字で示している；挿入された配列はカッコをつけて示している）。
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変異体をM13ベクターから本来の制限酵素部位を用いてPcDNA Iへ再びサブクローニングした。すべての変異体は、変異領域のダイデオキシ塩基配列決定法（サンガー（Sanger）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463,1977）で確認した（Sequenase Kit Version 2.0,United States Biochemical）。
感染と免疫蛍光の方法は、ネズミLAMP−1 cDNAと抗ネズミLAMP−１モノクローン抗体がネズミCD44 cDNAと抗ネズミCD44モノクローン抗体に置き換えられていることを除いて、上述の実験の方法と同一とした。CD44を感染した細胞を0.7mlの50％ラット抗CD44モノクローン抗体（このパーセンテイジは３つの独立の抗体LM33,H63,および5D2−27（ヒューズら、J.Biol.Chem.,258:1014,1983）の等量の混合物からなる）、50％H5G11および0.1％サポニン中で30分間保温した。ヒト線維芽細胞の感染の後、結論のタンパク質をリソソームマーカー、ヒトLAMP−１との共存によって示されるように（図2C左のパネルの細胞）、リソソームへ局在させた（図2B）。
他の作製物によって、Tyr−Gln−Thr−Ile配列はリソソーム膜局在に関しては十分であるが、リソソームシグナル伝達に関して特別な流れで現れなければならないということが示された。Gly280とGly281の間に配列Tyr−Gln−Thr−Ileを挿入した（停止コドンがかけている、図2D）非短縮型変異ネズミCD44タンパク質またはネズミCD44のカルボキシル末端アミノ酸のVal345の後にモチーフをもつ（図2E）タンパク質はリソソームに局在せず、むしろ原形質膜上に見られた。今度も、細胞の非特異的染色はなかった（図2BおよびＣ、パネルＣの右側に見え、パネルＢでは見えない非感染細胞）。予想どうりに、非修飾感染ネズミCD44は原形質膜へ結合した（図2A）。
実施例４
LAMP−１の細胞質尾部の修飾の同定
タンパク質のリソソームへの導く時のLAMP−１の細胞質尾部の役割をさらに説き明かすために、細胞質尾部に相当するたんぱく質分解断片を単離して配列を決定した。LAMP−１をスイスウエブスターマウス（ロックランド）の肝臓の洗浄剤抽出物からID4Bモノクローン抗体親和性クロマトグラフィーによって精製した。凍結組織をPBS、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）、1mg/lアポロチニン中で解凍し、ポリトロンで破壊した。300Xgで10分間の遠心によって得られる核フラクション沈殿を捨てた。膜を50,000Xgで30分間遠心し集めた。沈殿を10mMTris−HCl（pH7.5）、1MグアニヂンHCl、1mM PMSF、1mg/lアポロチニンに再懸濁した。ホモジェネートを50,000Xgで30分間遠心し、沈殿を1M KCl、10mM Tris−HCl（pH7.5）、1mM PMSF、1mg/lアポロチニンに再懸濁した。ホモジェネートを50,000Xgで30分間遠心し、沈殿を１％Triton X−100、10mM Tris−HCl（pH7.6）、0.4M KCl、1mM PMSF、1mg/lアポロチニンに再懸濁した。抽出物を３回凍結解凍し、50mM Tris−HCl（pH7.6）、0.2％Triton X−100、1mMヂソヂウムエチレンヂニトリロテトラアセヂック酸（EDTA）で透析した。100,000Xgで１時間遠心した後、上清を同じ緩衝液で中和した抗体カラムの上においた。タンパク質の溶出の前に、カラムを0.5％オクチルグルコシドを含む50mM Tris−HCl（pH7.5）中に置き換え、カラムの10倍量の高塩濃度緩衝液（1M NaCl,100mMほう酸、25mM塩化ほう酸,pH8.8）で洗浄した。タンパク質は100mMヂエチルアミン（pH10.5）および0.5％オクチルグルコシドを含む0.12倍量の2M Tris−HCl（pH7.5）で溶出した。精製したタンパク質を含むフラクションを集め、1mM EDTAおよび0.25％オクチルグルコシドを含む5mMNaPO4（pH7.4）に対する陰圧透析によって２から3mg/mlへ濃縮した。
トリフルオロメタンスルフォン酸による糖分解、トリプシン分解、逆相クロマトグラフィーおよびアミノ酸配列解析は記載されているように行った（アーターバーン（Arterburn）ら、J.Biol.Chem.,265:7419,1990）。トリプシン分解断片は糖分解LAMP−１タンパク質およびモノクローン抗体クロマトグラフィーによってマウス肝臓の膜フラクションから精製したネイティブLAMP−１タンパク質から作製せいた。カルボキシル末端の細胞質尾部に対応するペプチドを逆相クロマトグラフィーによって単離し、アミノ酸配列解析を行った。ネズミLAMP−1 cDNAのヌクレオチド配列から予想されるArg374の後のトリプシン切断により、タンパク質のカルボキシル末端に相当する８量ペプチドSer375−His376−Ala377−Gly378−Tyr379−Gln380−Thr381−Ile382が得られる。しかし、糖分解LAMP−１から得られたトリプシン分解ペプチドの配列は、末端のThrおよびIle残基を欠いた６量体Ser375−His376−Ala377−Gly378−Tyr379−Gln380であった。この６量体は保持時間30分に溶出した。同じ短縮ペプチドが、ネイティブ（非糖分解）タンパク質で繰り返した実験からも得られた。
ThrおよびIle残基がトリプシン分解の間に切断されたという可能性を、細胞質尾部に相当する合成ペプチドを作製し調べた。
ペプチド,NH2−Leu−Ile−Gly−Arg−Lys−Arg−Ser−His−Ala−Gly−Tyr−Gln−Thr−Ile−COOHをアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）430A自動ペプチド合成機で合成し、マルチプルペプチドシステムズ（Multiple Peptide Systems）、サンディエゴによってヒドロフルオロ酸でレジンから切断した。ペプチド配列はNH2末端配列解析によって確認し、精度は逆相HPLCで調べた。この合成ペプチドでネイディブタンパク質と同様に糖分解とトリプシン分解を行ったが、８量体トリプシン分解ペプチドSer−His−Ala−Gly−Tyr−Gln−Thr−Ileが得られた。８量体のHPLCの保持時間は６量体より10分長く、疎水性のIle残基の存在と一致する。８量体に一致するそのようなピークは、糖分解またはネイティブネズミLAMP−１タンパク質の本来のトリプシン分解では見られなかった。
実施例５
抗原としてこれらのタンパク質にたいするMHCクラスII/ヘルパーＴ細胞反応を増強する手段としての、リソソームに標的した修飾したインフルエンザヘムアグルチニン（HA）/LAMPキメラの使用
LAMPリソソーム標的シグナルを持つキメラタンパク質のMHCクラスIIに制限した抗原提示の方法を評価するのに有用なシステムはモデル抗原、インフルエンザヘムアグルチニン（HA）を使用する。HAは様々なマウス株で多くのヘルパーＴ細胞エピトープに含まれるとして知られる。特に、111−120アミノ酸断片はBALB/cおよびDBA−２のようなマウス株中でMHCクラスII要素Ｉ−Edに限られた主要ヘルパーエピトープを示す。
111−120残基を含むインフルエンザウイルスのHA遺伝子の口径内H1サブユニットをPCRで増幅し、膜貫通ドメインおよびLAMP−１の細胞質尾部をこの欠失型HAのカルボキシル末端（3'）にライゲーションした。次に、同様に、キメラをLAMP−１細胞質尾が欠損した末端の４アミノ酸（すなわち、リソソーム膜標的シグナル）で合成する。これらの２つのHA/LAMP−１キメラ及び修飾していないHAを選択マーカー（ネオマイシン）を含む哺乳類用の発現ベクター中にサブクローンした。繊維芽細胞腫中で行った形質転換および免疫蛍光実験に置いて、リソソーム標的シグナルを持つHA/LAMP−１キメラは期待どうりリソソームに局在した一方、コントロールの標的シグナルを欠くHA/LAMP−１キメラおよび修飾していないHAは予測どうり細胞膜に局在した。それ故、先の研究で示したように、このモデル抗原にLAMP細胞質部位をつけると、膜へのバルクフロー経路から外れてエンドソーム／リソソーム小室に進む。
これらのHA−LAMP構築物に対するＴ特異的なMHCクラスIIに限られたＴ細胞の反応を、HA111−120とＩ−Edに特異的なＴ細胞クローン由来のリアレンジしたαおよびβ鎖をマウス生殖系列に挿入したＴ細胞受容体トランスジェニックマウスを使用して測定した。これらのマウス中では、およそ20％のCD4+T細胞がHA特異的Ｔ細胞受容体を発現する；それ故リンパ節または脾臓リンパ球の総数はリンフォカインの分泌によって反応し、Ｉ−Edを発現するAPCsでHA111−120を提示すると増殖する。Ｉ−Ed＋Ｂ細胞リンパ腫であるA20は、抗原提示細胞として使用される。これまでの成果は、HAを発現する腫瘍細胞由来のライセートをA20細胞に与えると、HAタンパク質が取り込まれ、A20細胞によってプロセスされてHA特異的トランスジェニックマウス由来のＴ細胞に提示することが示された。A20細胞は２つの構築物のうち１つで定常的に形質転換されている：（１）野生型HAおよび（２）LAMP−１遺伝子の細胞質部分をHAの細胞外および膜貫通部分につないだ（HA/LAMP）ものを含むキメラ構築物。
図３に示したように、服量反応曲線は様々な数の形質転換したA20細胞で行ったが、野生型HAを形質転換したA20または細胞抽出物を含むHAを細胞外で加えたA20に比較して、HA/LAMPキメラを形質転換したA20によるトランスジェニックマウス由来のHA特異的Ｔ細胞の刺激は増強していた。１つの実験では、刺激する細胞が最も少ないとき（穴あたり300細胞）、HA/LAMPを形質転換したA20細胞は最大レベルに増殖を刺激し続けた。反対に、野生型HAを形質転換したA20細胞は穴中り1000細胞を越す希釈で有意にプラトーレベルを下回った。これらのデータは、細胞質LAMP標的配列を結合することによる特異的標的抗原のエンドソーム／リソソーム小室への移行は、MHCクラスII提示を非常に増強させることを示す。
より少ない数の抗原提示細胞（APC）を使用して異なる実験観点で実験を繰り返したのを図４に示す。HA/LAMP構築物は再び高い刺激効果を示した。
インフルエンザウイルスのHA抗原は、通常はプロセスされて細胞障害性Ｔ細胞経路に置いてMHC I分子と結合して感染細胞に提示される。我々はウイルスタンパク質のリソソームおよびMHCクラスII/ヘルパーＴ細胞経路への直接標的を示すための１つのモデルとしてインフルエンザウイルスHA抗原を使用した。
配列表
（２）配列情報SEQ ID NO:1
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:11アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:1:
0003581366.tif 000006
（２）配列情報SEQ ID NO:2
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:2:
0003581366.tif 000007
（２）配列情報SEQ ID NO:3
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:3:
0003581366.tif 000008
（２）配列情報SEQ ID NO:4
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:4:
0003581366.tif 000009
（２）配列情報SEQ ID NO:5
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:5:
0003581366.tif 000010
（２）配列情報SEQ ID NO:6
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:6:
0003581366.tif 000011
（２）配列情報SEQ ID NO:7
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:7:
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（２）配列情報SEQ ID NO:8
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:4..15
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:8:
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（２）配列情報SEQ ID NO:9
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:9:
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（２）配列情報SEQ ID NO:10
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:4..15
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:10:
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（２）配列情報SEQ ID NO:11
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:11:
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（２）配列情報SEQ ID NO:12
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:3..14
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:12:
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（２）配列情報SEQ ID NO:13
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:13:
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（２）配列情報SEQ ID NO:14
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:8..19
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:14:
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（２）配列情報SEQ ID NO:15
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:15:
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（２）配列情報SEQ ID NO:16
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:5..16
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:16:
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（２）配列情報SEQ ID NO:17
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:17:
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（２）配列情報SEQ ID NO:18
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:10..21
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:18:
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（２）配列情報SEQ ID NO:19
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:19:
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（２）配列情報SEQ ID NO:20
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:43塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:20:
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（２）配列情報SEQ ID NO:21
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:6アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）フラグメント型：中間部
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:21:
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（２）配列情報SEQ ID NO:22
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:46塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:22:
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（２）配列情報SEQ ID NO:23
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:5アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:23:
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（２）配列情報SEQ ID NO:24
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:46塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｃ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）アンチセンス:YES
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:24:
0003581366.tif 000029
（２）配列情報SEQ ID NO:25
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:6アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:25:
0003581366.tif 000030
（２）配列情報SEQ ID NO:26
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:8アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:26:
0003581366.tif 000031
（２）配列情報SEQ ID NO:27
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:6アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:Yes
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:27:
0003581366.tif 000032
（２）配列情報SEQ ID NO:28
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:14アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:Yes
（ｖ）フラグメント型:C−末端
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト
（xi）配列DESCRITPION:SEQ ID NO:28:
0003581366.tif 000033
【図１Ａ】
0003581366.tif 000034
【図１Ｂ】
0003581366.tif 000035
【図１Ｃ】
0003581366.tif 000036
【図１Ｄ】
0003581366.tif 000037
【図１Ｅ】
0003581366.tif 000038
【図１Ｆ】
0003581366.tif 000039
【図１Ｇ】
0003581366.tif 000040
【図１Ｈ】
0003581366.tif 000041
【図１Ｉ】
0003581366.tif 000042
【図１Ｊ】
0003581366.tif 000043
【図１Ｋ】
0003581366.tif 000044
【図１Ｌ】
0003581366.tif 000045
【図２Ａ】
0003581366.tif 000046
【図２Ｂ】
0003581366.tif 000047
【図２Ｃ】
0003581366.tif 000048
【図２Ｄ】
0003581366.tif 000049
【図２Ｅ】
0003581366.tif 000050
【図３】
0003581366.tif 000051
【図４】
0003581366.tif 000052