(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、２価金属イオンを共存させ、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化する方法。
【請求項２】
肺サーファクタント蛋白質が肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２価金属イオンがカルシウムイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、抗原含有水溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる安定化された抗原含有水溶液を使用する方法。
【請求項５】
肺サーファクタント蛋白質が肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
２価金属イオンがカルシウムイオンである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットであって、標準抗原溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる抗原含有水溶液を構成試薬として含有することを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キット。
【請求項８】
さらに、洗浄液として２価金属イオンを含む洗浄液が添付されている、請求項７記載のキット。
【請求項９】
肺サーファクタント蛋白質が肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項７または８記載のキット。
【請求項１０】
２価金属イオンがカルシウムイオンである、請求項７または８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、肺サーファクタント蛋白質における抗原活性の安定化法、安定化された抗原含有水溶液を使用した肺サーファクタント蛋白質の測定法、および安定化された抗原含有水溶液を構成試薬として含有する肺サーファクタント蛋白質測定用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
肺サーファクタント蛋白質は肺サーファクタントに特異的なアポタンパク質（ＳＰ）であり、現在までに親水性のＳＰ−ＡとＳＰ−Ｄ、および疎水性のＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃの４種類が報告されている。その中でも、ＳＰ−Ｄは気道−肺胞系における生体防御機構において重要な役割を果たしていると考えられており、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル（血清など）中のＳＰ−Ｄを測定し、特発性間質性肺炎などの肺疾患を診断できることが報告されている（医学と薬学  ３６（４）：８０３−８０８（１９９６）参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記報告書で報告されている方法は、組換えＤＮＡ手法により取得されるリコンビナントＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）を標準物質として使用しており、このｒＳＰ−Ｄが２５℃以上になると抗原性を徐々に失ってしまうため、標準抗原溶液を低温で保存するとともに測定時の反応温度も４℃などの低温で行わなければならず、更なる操作性、安定性の向上が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、まったく意外なことにＳＰ−Ｄとカルシウムなどの２価金属イオンを共存させるだけで、３７℃の条件下でも抗原活性が失活せずに安定化されること見いだし、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、２価金属イオンを共存させ、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化する方法に関するものである。
また、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、抗原含有水溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる安定化された抗原含有水溶液を使用する方法に関するものである。
さらに、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットであって、標準抗原溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる抗原含有水溶液を構成試薬として含有することを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キットに関するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における肺サーファクタント蛋白質とは、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｄのいずれであってもかまわないが、特に断らない限り診断項目として有用性が確認されているＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｄを意味する。
【０００７】
最初に、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、２価金属イオンを共存させ、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化する方法に関するものである。
共存させる２価金属イオンとしては、周期表２族ａ亜族元素の２価金属イオンであればよく、具体的にはカルシウム、バリウム、マグネシウムなど各イオン例示することができ、特にカルシウムイオンが好適である。
このような２価金属イオンは、肺サーファクタント蛋白質と共存していればよく、必ずしも水溶液の状態である必要はない。後述の実施例に示すように、溶液状はもとより、肺サーファクタント蛋白質をプレートに結合させ、大方の水分を取り除いた状態であっても２価金属イオンを共存させることにより肺サーファクタント蛋白質を安定化させることが可能である。
共存させる２価金属イオンの濃度は特に制限されるものではないが、通常０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭの範囲から適宜選定すればよい。
【０００８】
次に、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定する際、抗原含有水溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる安定化された抗原含有水溶液を使用する方法に関するものである。
肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンは上述したものを使用することができる。ＳＰ−Ｄとカルシウムイオンを例に挙げ、具体的に説明すれば、塩化カルシウムなどの金属無機塩を水または適当な緩衝液に溶解させ、これに組換えＤＮＡ手法により調製したリコンビナントＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）を添加することで調製した安定化された抗原含有水溶液を使用することができる。
２価金属イオンの濃度は特に制限されるものではないが、通常０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭの範囲から適宜選定すればよい。
【０００９】
さらに、本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットであって、標準抗原溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる抗原含有水溶液を構成試薬として含有することを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キットに関するものである。
このようなキットを、ＥＬＩＳＡ法によるＳＰ−Ｄ測定キットを例に挙げ、具体的に説明すれば、たとえば以下のキットを例示することができる。
（キットＡ）
▲１▼固相化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬
▲２▼酵素標識化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬
▲３▼ＳＰ−Ｄ標準抗原溶液（カルシウムイオン含有）
さらに、上記キットに診断用キットに通常添付されている酵素反応基質液、酵素反応停止液、洗浄液などを添付してもよい。特に、２価金属イオンを含有する洗浄液、具体的には０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭのカルシウムイオンを含有する洗浄液を添付することにより、測定中のＳＰ−Ｄの抗原活性をより強固に安定化することで測定精度を高めるとともに、操作性も向上させることができる。
このようなキットの使用法は、例えば、医学と薬学  ３６（４），１９９６  ８０４−８０８（１９９６）などに記載の公知の測定方法に準じて行えばよい。
【００１０】
【発明の効果】
肺サーファクタント蛋白質（たとえば、ＳＰ−Ｄ）と２価金属イオン（たとえば、カルシウムイオン）を共存させることで、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化することは本発明者らによって初めて見いだされたことである。このことにより、従来低温保存を要求されていた肺サーファクタント蛋白質の標準抗原液は常温でも保存流通が可能になるとともに、測定時の反応温度も常温で行うことができ、肺サーファクタント蛋白質の免疫学的測定の操作性、汎用性を飛躍的に向上せしめることが可能となった。また、液状の安定性のみならず、プレート上に結合した肺サーファクタント蛋白質の安定性も２価金属イオンを共存させることで向上させることができ、精度および操作性が向上した肺サーファクタント蛋白質の測定が初めて可能となった。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１２】
実施例１  溶液状での安定化の検討（１）
緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ウシ血清アルブミン、０．５％トライトンＸ−１００、ｐＨ７．２）に、最終濃度で１０ｍＭなるように塩化カルシウム、塩化マグネシウムまたは塩化カリウムを添加、あるいは５ｍＭ  になるようにＥＤＴＡを添加した。この緩衝液を希釈用緩衝液とする。また、当該希釈用緩衝液にｒＳＰ−Ｄを一定量添加し、４℃または３７℃で３時間インキュベートし、これをサンプル液とした。このような希釈用緩衝液、サンプル液を用い、ヤマサ醤油株式会社製のＳＰ−Ｄ測定キットを使用して、医学と薬学  ３６（４），８０４−８０８（１９９６）記載の測定法（以下、標準操作法という）に従ってサンプル液中のＳＰ−Ｄを測定した。
その結果を表１に記す。表１から明らかなように、２価金属イオン、特にカルシウムイオンがＳＰ−Ｄの抗原活性の安定に有効であることが明らかとなった。
【表１】
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【００１３】
実施例２  溶液状での安定化の検討（２）
カルシウム添加希釈用緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、１．０％ウシ血清アルブミン）を用いてｒＳＰ−Ｄを希釈して標準抗原液を調製した。この標準抗原液ならびにカルシウム無添加標準抗原液を４℃または３７℃で３時間インキュベート後、標準操作法に従って、標準抗原液中のＳＰ−Ｄを測定した。その結果を図１に示す。
その結果、図１に示すように、カルシウム添加標準液は３７℃、３時間処理後も４℃の場合と同等の抗原性を保持することが認められた。一方、カルシウム無添加の場合は３７℃、３時間処理で５０％以上抗原性の失活が確認された。
【００１４】
実施例３  カルシウム添加標準液での温度安定性
実施例２で調製した、１０ｍＭ塩化カルシウムを添加した標準抗原液およびカルシウム無添加の標準抗原液を用いて２５℃、３０℃または３７℃で１、３、６時間または一晩インキュベート後、標準操作法に従って標準抗原液中のＳＰ−Ｄを測定した。カルシウムの添加により大幅に熱安定性が向上し、３０℃、３７℃でも６時間、２５℃ならば一晩処理しても９０％以上抗原活性が保持できることが明らかとなった。
【００１５】
実施例４  プレート上での安定性
抗ＳＰ−Ｄモノクローナル抗体を９６穴マイクロプレートに結合させ、この固相化抗体と実施例２で調製したカルシウム含有標準抗原液を４℃で一晩反応させた。次に、洗浄液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）と、この洗浄液に１０ｍＭ塩化カルシウムを添加したカルシウム添加洗浄液にて各ウエルを３回洗浄後、紙タオル等の上で水分を完全に取り除き乾燥状態にした。その状態のまま５分間または１０分間放置した後、以後標準操作法に従ってＳＰ−Ｄを測定した。その結果を図２および図３に示す。
カルシウム無添加洗浄液を用いた場合は５分放置で１０％、１０分では１５％吸光度が低下した。しかしカルシウム添加洗浄液を用いた場合では１０分放置しても５％の低下にとどまり、プレート上でもカルシウムイオンの共存でＳＰ−Ｄが安定化することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、カルシウムイオンの有無による溶液状でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示すものである。縦軸は４℃での抗原活性を１００％としたときの相対活性（％）を、横軸は抗原液の濃度を示す。
【図２】図２は、カルシウムイオン無添加洗浄液を用いた場合のプレート上でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示すものである。縦軸は洗浄直後の放置時間が０分の時の抗原活性を１００％としたときの相対活性（％）を、横軸は抗原液の濃度を示す。
【図３】図３は、カルシウムイオン添加洗浄液を用いた場合のプレート上でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示すものである。縦軸は洗浄直後の放置時間が０分の時の抗原活性を１００％としたときの相対活性（％）を、横軸は抗原液の濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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