(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
ＡＣＣＡＣＣＣＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧ        （１）
又は式（２）
ＧＡＴＡＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＴ        （２）
で表される塩基配列を有するビフィドバクテリウム属細菌に特異的なＤＮＡプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡプローブを用いることを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の検出方法。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム（Ｂ．）ブレーベ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ロンガム、Ｂ．インファンティス、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アステロイデス、Ｂ．カテヌラータム、Ｂ．コリネフォーム、Ｂ．キュニキュリ、Ｂ．ミニマム、Ｂ．ズイス、Ｂ．サーモフィラム、Ｂ．アングラータム、Ｂ．アニマリス、Ｂ．バウム、Ｂ．チョエリナム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．ガリカム、Ｂ．ガリナラム、Ｂ．インディカム、Ｂ．マグナム、Ｂ．メリシカム、Ｂ．シュードカテヌラータム、Ｂ．シュードロンガムｓｓグロボサム、Ｂ．シュードロンガムｓｓシュードロンガム、Ｂ．プローラム、Ｂ．ルミナンティウムから選ばれる１ないし２以上のビフィドバクテリウム属細菌である、請求項２記載のビフィドバクテリウム属細菌の検出方法。
【請求項４】
請求項１記載のプローブと被検体とをハイブリダイゼーションさせ、ハイブリッド形成の有無を検出することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の検出方法。
【請求項５】
被検体に、蛍光色素で標識した請求項１記載のプローブを加えて、被検体中のビフィドバクテリウム属細菌を染色し、蛍光顕微鏡により観察することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）に特異的なＤＮＡプローブを使用する正確、簡便なビフィズス菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビフィズス菌は、ヒト又は動物種の大腸などの消化器官内に生息する嫌気性の細菌であり、近年は、健康と関連した観点で非常に注目されており、ビフィズス菌を利用した食品、医薬品なども多数提供されている。
【０００３】
ビフィズス菌はＢ．ロンガム、Ｂ．ビフィダムなどいくつかの種が存在することが知られており、ヒトの消化器官から由来するものとし、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ロンガム、Ｂ．インファンティスなどが報告され、また食品に応用されている。
【０００４】
また、他の動物例えばブタ由来のＢ．チョエリナム、Ｂ．ズイス、マウス、ラット由来のＢ．アニマリス、Ｂ．シュードロンガムｓｓ（サブスピーシズ）シュードロンガム（以下、Ｂ．シュードロンガム）、Ｂ．シュードロンガムｓｓグロボサム（以下、Ｂ．グロボサム）、昆虫由来のＢ．インディカム、Ｂ．アステロイデス、Ｂ．コリネフォームなど、数多く知られている。
【０００５】
従来、ビフィドバクテリウム属の同定は、主に表現形質、すなわち菌の培養液中の代謝産物をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、そのパターンを解析することによって行われていた。
【０００６】
近年では、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の情報がデータベースに蓄積されたことから、この情報を基にして属特異的なＤＮＡプローブを作製し、対象とする菌体とのハイブリダイゼーションによる判定も行われている（Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１：３０６９−３０７５，  １９９５）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、表現形質を基にした同定方法は、嫌気操作など試験者の熟練を必要とし、しかも結果が得られるまでかなりの時間がかかるという問題があった。
【０００８】
一方、属特異的なＤＮＡプローブを用いた同定方法は、系統分類の指標として用いられている１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に基づいているため正確であり、２０塩基程度の短いオリゴヌクレオチドプローブを用いれば、核酸抽出の必要が無いｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行うことが出来、判定時間がかなり短縮されるなどの利点がある。しかし、既に報告されているビフィドバクテリウム属は特異的とされるＤＮＡプローブは、既存のデータベースに登録されている１６ＳｒＲＮＡの塩基配列のみの解析から得られたものであり、データベースに未登録のビフィドバクテリウム属に属する一部の菌種に対して配列が異なるためハイブリダイズせず、その特異性には問題があった。
例えば、フロンシンガムらは、ビフィドバクテリウム属細菌に共通に特異的なプローブとして５’−ＣＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣ−３’のシークエンスを提案している（Ｒ．  Ｆｒｏｎｔｈｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｉｃｒｏＢｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ｖｏｌ．６，  ｐ２３−２７）が、この配列は、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．コリネフォーム、Ｂ．キュニキュリ、Ｂ．インディカム、Ｂ．アニマリス、Ｂ．チョエリナムに対して、１塩基のミスマッチを有している。
また、ランゲンジックらは、ビフィドバクテリウム属細菌に共通に特異的なプローブとして５’−ＣＡＴＣＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＣ−３’のシークエンスを提案している（Ｐ．  Ｓ．  Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．６１，  Ｎｏ．８，  ｐ３０６９−３０７５）が、この配列は、Ｂ．アニマリス、Ｂ．コリネフォーム、Ｂ．キュニキュリ、Ｂ．ガリカム、Ｂ．マグナムに対して、１塩基のミスマッチを有している。
また、カウフマンらは、ビフィドバクテリウム属細菌に共通に特異的なプローブとして５’−ＣＧＧＧＴＧＣＴＩＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（Ｉはイノシン塩基）のシークエンスを提案している（Ｐｅｔｅｒ．  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．６３，  Ｎｏ．４，  ｐ１２６８−１２７３）が、この配列は、ビフィドバクテリウム属細菌以外にも、ガルドネレラ・バギナリスやプロピオンバクテリウム等の菌種にも反応を示している。また、このシークエンスのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの利用可能性については確認されていない。
【０００９】
従って、本発明の目的は、真にビフィドバクテリウム属に特異的であり、ビフィドバクテリウム属細菌を正確に検出できるＤＮＡプローブ及びこれを用いた検出方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、データベースに１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が登録されているビフィズス菌は１１菌種にすぎず、この既知の塩基配列の検討だけでは真にビフィズス菌に特異的なプローブは得難いことから、他の１６菌種の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を決定した。そして、更にそれら２７菌種の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を詳細に比較検討することにより、従来用いられているプローブとは異なるオリゴヌクレオチドが、全ビフィズス菌とハイブリダイズし、かつ非ビフィズス菌には反応しないこと、またこのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することにより、簡便につか正確にビフィズス菌の検出が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、式（１）
ＡＣＣＡＣＣＣＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧ        （１）
又は式（２）
ＧＡＴＡＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＴ        （２）
で表される塩基配列を有するビフィドバクテリウム属細菌に特異的なＤＮＡプローブ、及びこのＤＮＡプローブを用いることを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の検出方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡプローブは、前記式（１）又は式（２）で表される塩基配列を有するものであるが、これらの配列を有する限り、その前後に数塩基含む配列もプローブとして有効であり、本発明に包含される。
【００１３】
式（１）と式（２）の塩基配列は、前記の如く、既知の１１菌種の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列と今回本発明者が決定した１６菌種の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列とを比較することにより見出されたものである。ここで、１６菌種の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の決定は、通常の知られた、１６ＳｒＲＮＡの配列を決定する際に用いられる方法により行う。例えば塩化ベンジル法（Ｈ．  Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｖｏｌ．  ２１，  ｐ５２７９−５２８０（１９９３）参照）により簡便抽出したＤＮＡからＰＣＲ法によって１６ＳｒＲＮＡを増幅した。その生成物をテンペレートとして、ダイプライマー法又はダイデオキシターミネーター法によるシークエンス反応を行い、オートシークエンサーを用いて、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を決定する。また、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が既知の菌種は、ビフィドバクテリウム（Ｂ．）アドレセンティス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ロンガム、Ｂ．アステロイデス、Ｂ．カテヌラータム、Ｂ．コリネフォーム、Ｂ．キュニキュリ、Ｂ．ミニマム、Ｂ．ズイス及びＢ．サーモフィラムの１１種である。一方、今回新たに塩基配列の決定された菌種は、Ｂ．インファンティス、Ｂ．アングラータム、Ｂ．アニマリス、Ｂ．バウム、Ｂ．チョエリナム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．ガリカム、Ｂ．ガリナラム、Ｂ．インディカム、Ｂ．マグナム、Ｂ．メリシカム、Ｂ．シュードカテヌラータム、Ｂ．シュードロンガムｓｓグロボサム、Ｂ．シュードロンガムｓｓシュードロンガム、Ｂ．プローラム及びＢ．ルミナンティウムの１６種である。
【００１４】
本発明のＤＮＡプローブは、例えば自動ＤＮＡ合成機によって容易に合成することができ。
【００１５】
本発明のプローブは、後記実施例に示すように、全てのビフィズス菌とハイブリダイズし、かつ近縁の他の属に属する菌とはハイブリダイズしない。従って、このプローブを用いれば、被検体中のビフィズス菌の検出が正確にできる。
【００１６】
本発明プローブを用いてビフィズス菌を検出するには、本発明プローブと被検体とのハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無を検出すればよい。ここでハイブリッド形成の有無の検出には、プローブとして標識体を用いれば、該標識物の検出をすればよいので好適である。
【００１７】
標識体は、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧシステム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ）や蛍光物質などの検出可能な標識物を、通常の方法によりプローブに結合させたものを使用することが出来る。標識体とサンプルとのハイブリダイゼーションは、通常の方法により、例えばドットブロットハイブリダイゼーションやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等の方法により行うことが出来、また形成したハイブリッドの確認は、Ｘ線フィルムや蛍光顕微鏡などにより標識物を検出することにより行えばよい。
【００１８】
このうち、標識体として蛍光物質を用い、ハイブリッド形成の確認を蛍光顕微鏡で行うｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションが好ましい。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  プローブの設計方法
ビフィドバクテリウム属に特異的な塩基配列の決定には、表１に示したＤＮＡＤａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録されているビフィドバクテリウム属の１１菌種と、データベースに未登録の１６菌種（ダイプライマー法又はダイデオキシターミネーター法により配列を決定した。）の計２７菌種の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を用いた。また、ビフィドバクテリウム属と近縁な菌種として、オルセンら（Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７６：１−６  ）の系統樹でビフィドバクテリウム属と同じクラスターに含まれる１１菌属１３菌種を用いた（表１）。そして、塩基配列の比較には系統樹作製用ソフト  Ｃｌｕｓｔａｌ．  Ｗ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．  ５）を用い、生物種によって配列の異なっている領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ：Ｖ１〜Ｖ９）に注目して、図１及び図２の下線で示したビフィドバクテリウム属に特異的な塩基配列を選択した。
【００２１】
【表１】
0003605496.tif 000002
【００２２】
実施例２  ドットブロットハイブリダイゼーションによるプローブの特異性の確認
（１）プローブの合成及び標識
図１の下線で示された配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチド（以下Ｂｐ１５３と呼ぶ）、及び図２の下線で示された配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチド（以下Ｂｐ２２８と呼ぶ）とユニバーサルプライマー（Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８２，  ６９５５−６９５９，  １９８５）をプローブとしたプローブＰＰＲを合成した。これらのプローブは、ＤＩＧオリゴヌクレオチド３’−エンドラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３’末端をＤＩＧ−ｄｄＵＴＰで標識した。
【００２３】
（２）ＤＮＡ抽出法
表２に示した菌株をＧＡＭブロス（日水製薬社製）にグルコースを１％加えた培地１０ｍｌで２４時間培養後、菌体をＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、ＯＤ５９５＝０．８〜０．９になるように再懸濁した。更に菌液の５ｍｌを遠心し集菌後、２００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。菌液に１．７ｇの滅菌済みガラスビーズと０．８ｍｌのフェノールを加え４℃３０分振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）を行った。１５，０００ｒｐｍ５分間遠心後、水層のみを別のチューブに移し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を等量加え５分間攪拌した。１５，０００ｒｐｍ５分間遠心後、上清に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２倍量の冷エタノールを加えエタノール沈殿を行い、得られた核酸は真空乾燥後適当量のＴＥバッファーに溶解した。
【００２４】
【表２】
0003605496.tif 000003
【００２５】
（３）ＰＣＲ
ＰＣＲはＴａｋａｒａ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて以下に示す組成で行った。
【００２６】
【表３】
0003605496.tif 000004
【００２７】
テンペレートは前述の方法で抽出したＤＮＡ溶液を用い、バクテリアの１６ＳｒＲＮＡのほぼ全長を増幅させるためプライマーには次に示す配列を有するプライマー（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５９：１４３−１６９）を用いた。
【００２８】
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ                                        プライマー  １
ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ                                    プライマー  ２
【００２９】
反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用い、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行った。ＰＣＲ産物は、Ｍｕｐｉｄ（ＡＤＶＡＮＣＥ．  Ｃｏ．  Ｌｔｄ）を用いて１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い約１，５００ｂｐ付近にバンドを確認した。
【００３０】
（４）ＰＣＲ産物のナイロンメンブレンへのブロッティング
ＰＣＲ産物は、沸騰水中で１０分間加熱後急冷して２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸Ｎａ溶液）を等量加えた。この溶液２μｌを１０×ＳＳＣ  ２００μｌで希釈し、マイクロフィルトレーション装置（バイオ−ドット、バイオラッド）にセットしたナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）にアプライした。
メンブレンは、変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）を染み込ませたろ紙上に５分間静置し、次に中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を染み込ませたろ紙上に移して１分間静置した。そして、室温で乾燥させてからＵＶトランスイルミネーターにて固定し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００３１】
（５）ハイブリダイゼーション
ＰＣＲ産物を固定したメンブレンは、０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ溶液に浸して、室温で１時間静かに振とうした。次にメンブレンをプラスチックバッグに移し、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、５×デンハート氏液）を加え３７℃１時間反応させ、続いて、プレハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、５×デンハート氏液、５ｐｍｏｌ／ｍｌのＤＩＧ標識プローブ）に置き換えて５２℃一晩振とうさせた。そして、メンブレンをプラスチックバッグから取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で室温５分間の洗浄を２回繰り返した。更に、より厳重に６２℃で３０分間洗浄した。
【００３２】
ハイブリダイゼーションの結果は、ＤＩＧ蛍光検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって検出し、Ｘ線フィルムにて記録した。表３にＰＣＲ増幅した１６ＳｒＤＮＡを用いて行ったドットブロットハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド形成が認められたものを＋、認められなかったものを−で示した。
【００３３】
（６）結果
表４から明らかなように、プローブＰＰＲは、すべての菌とハイブリダイズした。このことは、このプローブの配列がバクテリア１６ＳｒＤＮＡの共通な部分に相補的であることを、よく反映しており、プローブＰＰＲはターゲットとするＲＮＡの存在を確認するポジティブコントロールとして用いている。一方、Ｂｐ１５３やＢｐ２２８を用いた場合は、ビフィドバクテリウムの１６ＳｒＤＮＡにはハイブリダイズしているが、他の菌属にはハイブリダイズしていない、すなわちＢｐ１５３やＢｐ２２８はビフィドバクテリウム属に対し特異的であることが示された。
【００３４】
【表４】
0003605496.tif 000005
【００３５】
実施例３  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによるプローブの特異性の確認
（１）プローブの合成及び標識
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションに用いるプローブＢｐ１５３、Ｂｐ２２８とプローブＰＰＲの合成は実施例１（１）と同様に行った。ただし、これらのプローブは、合成の際５’末端側を蛍光色素テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）で標識した。
【００３６】
（２）サンプル処理
表２に示した菌株は、適当な液体培地で一晩培養しその菌液１００μｌを遠心集菌、及びＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社）で洗浄した後、１００μｌのＰＢＳ（−）に再懸濁した。これにホルマリン原液を１０μｌ加えよく攪拌し氷中に３０分間静置した。遠心集菌及びＰＢＳ（−）による菌体の洗浄を２回繰り返し、適当な量のＰＢＳ（−）に懸濁した。
【００３７】
（３）Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション
ＰＬＬコートした無蛍光のスライドグラス上に上記サンプルを０．５μｌずつ塗抹した。風乾後５０％、８０％、９９．５％のエタノールに順次３分間浸し、風乾後キシレンに３分間浸した。風乾後、１００μｌのハイブリダイゼーション溶液（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＢＳＡ、０．２％  Ｐｏｌｙ  Ａ、１０％デキストラン硫酸、１５０ｎｇ標識プローブ）をサンプル塗抹上に塗布し、カバーグラスをかけ、ＳＥＴ溶液（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で湿潤化したチューブ内にスライドグラスを入れ４５℃２時間ハイブリダイゼーションを行った。予め５５℃にプレインキュベーションした洗浄溶液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２ｍＭ  ＥＤＴＡ）にカバーグラスを外したスライドグラスを浸し、５５℃３０分間軽く振とうしながら洗浄した。このスライドグラスを滅菌蒸留水で２〜３回洗浄し暗箱内で乾燥した後、封入剤（Ｓｌｏｗ  Ｆａｄｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＩＮＣ．）を滴下しカバーグラスをかけた後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００３８】
表５にＩｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの結果をハイブリッド形成が認められたものを＋、認められなかったものを−で示した。
【００３９】
（４）結果
表５から明らかなように、プローブＰＰＲを用いた場合、表３と同様、属や種に関わらずどの菌体にハイブリダゼーションが認められ、どの菌体もよく固定されていることがわかる。一方、Ｂｐ１５３やＢｐ２２８を用いた場合は、ビフィドバクテリウム属の菌体にはハイブリダイズしているが、他の菌属の菌体にはハイブリダイズしていない、すなわちＢｐ１５３は、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの手法を用いてもビフィドバクテリウム属に対し特異的であることが示された。
【００４０】
【表５】
0003605496.tif 000006
【００４１】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡプローブはビフィズス菌に特異的であり、これを用いれば全てのビフィズス菌を正確かつ簡便に検出できる。
【００４２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｒＲＮＡ
配列
ＡＣＣＡＣＣＣＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧ
【００４３】
配列番号：２
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｒＲＮＡ
配列
ＧＡＴＡＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＴ
【図面の簡単な説明】
【図１】ビフィドバクテリウム属菌における１６ＳｒＲＮＡの塩基配列のアラインメント結果を示す図である。
【図２】ビフィドバクテリウム属菌における１６ＳｒＲＮＡの塩基配列のアラインメント結果を示す図である。
【図１】
0003605496.tif 000007
【図２】
0003605496.tif 000008