(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
七面鳥ヘルペスウイルスまたはマレック病ウイルスの（１）ＵＬ４４とＵＬ４５の間および（２）ＵＬ４５とＵＬ４６の間からなる群から選ばれる非翻訳領域の少なくとも１箇所の挿入部位に、少なくとも１つの外来遺伝子が挿入された、鳥類感染型組み換えヘルペス属ウイルス。
【請求項２】
前記外来遺伝子が、鳥類の感染症の病原体に由来する遺伝子である請求項１に記載の組み換えウイルス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された組み換えウイルスを有効成分とする鶏用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）のゲノムまたはマレック病ウイルス（以下、ＭＤＶということがある）のゲノムの非必須領域に外来遺伝子を組み込んだ組み換えＨＶＴおよびＭＤＶ、及びそれを利用したワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子組み換え手法を使ったウイルスベクターワクチンは、ポックスウイルス属をベクターとしたワクチン（Ｏｇａｗａ  Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，  ８：４８６−４９０（１９９０））、アデノウイルスをベクターとしたワクチン（Ｈｓｕ，  Ｋ．  Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，  １２：６０７−６１２  （１９９４））、バキュロウイルスをベクターとしたワクチンのほか、ヘルペスウイルス属をベクターとしたワクチン（Ｓｈｉｎ，  Ｍ．−Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：５８６７−５８７０（１９８４））  が知られている。中でもヘルペスウイルス属の遺伝子組み換えベクターワクチンは近年盛んに研究されている。
【０００３】
外来抗原遺伝子を発現させるウイルスベクターとして用いるウイルスは、ヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ）やオーエスキー病ウイルス（ＰＲＶ）（Ｖａｎ  Ｚｉｊｌ  Ｍ．，ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６５：２７６１−２７６５（１９９１））、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）（Ｍｏｒｇａｎ  Ｒ．  Ｗ．ら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．  ３６：８５８−８７０（１９９２））、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）などが知られている。これらの中でもＨＶＴウイルスおよびワクチン株ＭＤＶは接種対象動物となる家禽での安全性が高く、ワクチン特性も良好であることから、鳥類に対するベクターウイルスとして注目されている。
【０００４】
また、ＨＶＴおよびＭＤＶの感染様式として、感染細胞から他の細胞にウイルスが感染する際、ウイルスが感染細胞から一旦血中に放出されてから他の細胞に感染するというポックスウイルスのような感染様式をとらず、隣り合う細胞へ、細胞間−細胞間で感染が成立する。このため、血流中に存在するＨＶＴまたはＭＤＶ特異的抗体の影響を受けにくい。
【０００５】
従来、親鳥からの移行抗体（Ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の存在によって、ウイルス生ワクチンの効果が減弱され、十分な効果を発揮できないという問題があった。
近年、鶏へのワクチン接種法の一つとして、発生途中の鶏卵内にワクチンを接種する方法も開発され、ＨＶＴまたはＭＤＶのワクチンとしての有用性も認められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、組み換えＨＶＴもしくはＭＤＶでこれまで知られている遺伝子組み換え領域は、ＴＫ領域（Ｒｏｓｓ  Ｌ．ら、１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  （１９９１））、ＵＳ１０領域（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，  １２：９５３−９５７（１９９４）  ）、ＵＳ２領域（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，  １１：３４９−３５８（１９９３）  ）などのＨＶＴの生存に非必須と考えられる遺伝子の中に外来抗原遺伝子を組み込むという報告ばかりであった。このような非必須領域への組み込みは、外来遺伝子を、非必須とはいえ本来ＨＶＴで発現するべき遺伝子、すなわち抗原決定基となる遺伝子の代わりに発現させるため、ＨＶＴもしくはＭＤＶの抗原性を減弱させる可能性がある。そればかりでなく、挿入部分のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の転写及び翻訳に関係した遺伝子機構（エンハンサー、プロモーター、ターミネーターなど）が、挿入遺伝子の発現に対して悪影響を及ぼす可能性を否定できない。
【０００７】
事実、多くのウイルスで、非必須と考えられるタンパク質をコードする遺伝子領域を欠失させたり、その部分に外来遺伝子を組み込んだりした場合に、ウイルスの形状が変化したり抗原性が低下したりすることが報告されている。さらに、弱毒ワクチンの調整方法としても、外来遺伝子を組込む方法が用いられているケースがある。
【０００８】
また、ＴＫ領域に外来遺伝子を挿入して発現させたときに、発現遺伝子の抗原性が低下するという報告もある（Ｒｏｓｓ  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４：３７１−３７７（１９９３））。さらに、特定のＯＲＦ内に挿入できる抗原遺伝子の長さが限られてしまうため、多くの抗原遺伝子を挿入できないなど、ワクチンとして多くの問題点がある。
【０００９】
本発明者らは、かかる問題点を解決すべく鋭意研究を進めた結果、何種類もの外来抗原遺伝子を挿入でき、かつ安定的に抗原タンパク質を発現できるＨＶＴまたはＭＤＶの遺伝子挿入領域、つまりここでいうＨＶＴまたはＭＤＶの非翻訳領域を見いだし、その部分に種々の外来抗原遺伝子を挿入できること、そしてこれらの外来抗原遺伝子が挿入された組み換えＨＶＴまたはＭＤＶを作製し、これらの組み換えウイルスを宿主に感染させることにより、宿主側に十分なワクチン効果を付与する事を見いだし、本発明を完成するに至ったのである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、鳥類感染型ヘルペス属ウイルスに属するウイルスの非翻訳領域中の特定の部位に外来遺伝子を挿入した組み換えウイルスを作製し、この組み換えウイルスをワクチンとして使用できることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、ゲノム中の非翻訳領域である遺伝子領域に外来遺伝子が挿入された、鳥類感染型組み換えヘルペス属ウイルスである。ここで、上記ウイルスは、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、ヒト単純ヘルペスウイルスの各オープン・リーディング・フレームに相当する七面鳥ヘルペスウイルスまたはマレック病ウイルスのオープン・リーディング・フレームの間に存在する非翻訳領域中にあり、かつ、（１）  ＵＬ４４とＵＬ４５の間、（２）  ＵＬ４５とＵＬ４６の間、（３）  ＵＬ４１とＵＬ４２の間、（４）  ＵＬ４０とＵＬ４１の間、（５）  ｇＢ遺伝子の下流領域、（６）  ＵＬ５３とＵＬ５４の間、および（７）  ＵＬ３６とＵＬ３７の間からなる群から選ばれる少なくとも１箇所の挿入部位に、少なくとも１つの外来遺伝子が挿入されている組み換えウイルスであることを特徴とする。
【００１３】
さらに、上記外来遺伝子は、鳥類の感染症の病原体に由来する遺伝子であり、ウイルス、細菌、真菌、および原虫からなる群から選ばれる病原体由来の抗原遺伝子であることを特徴とする。さらにまた、上記外来遺伝子は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ガンボロ病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マイコプラズマ（ＭＧ）、およびコクシジウムからなる群から選ばれる病原体由来の遺伝子であることを特徴とする。
本発明はまた、上記の組み換えウイルスを有効成分とする鶏用ワクチンである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳述する。
（本発明で使用するウイルス）
本発明で使用するウイルスは、鳥類に感染するウイルスのうち、ヘルペスウイルス属に属するもの（鳥類感染型ヘルペス属ウイルス）であることが好ましい。これは、ヘルペスウイルス属に属するウイルスが、潜伏感染（ｌａｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）や持続感染（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の状態で感染動物の体内に永続的に生存し続けるという性質を有するためである。
【００１５】
鳥類感染型ヘルペス属ウイルスのなかでも、特に、七面鶏ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であることが好ましい。上記のウイルスは感染期間が長いために長期にわたってワクチン効果を感染した鳥類に付与できる可能性があり、ワクチンとしての有効性が期待されることによる。
【００１６】
（ＨＶＴまたはＭＤＶ）
本発明において使用するＨＶＴまたはＭＤＶは、天然に得られたり、ＡＴＣＣなどから有償または無償で入手できるものなどであればよく、特に限定されるものではない。
【００１７】
ＨＶＴの好ましい例としては、ガンマヘルペスウイルス亜科に属し、生来非病原性であり、かつ非腫瘍性のウイルスで家禽用のワクチンとして用いられているものが挙げられる。具体的には、ＦＣ１２６（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８４Ｂ）  、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。また、ＭＤＶとしては、具体的には、ＣＶＩ９８８やＳＢ１などを挙げることができる。
【００１８】
本発明の組み換えウイルスを作製するためには、まず、上記のウイルスを適当な宿主細胞中で増殖させ、ゲノムＤＮＡを得る。そして、このゲノムＤＮＡ中の非翻訳領域を確認し、その領域に、後述する外来遺伝子を挿入する。
ウイルスを増殖させるための宿主および増殖条件は、増殖させようとするウイルスに応じて適宜選択する。例えば、ＨＶＴを増殖させる場合には、宿主細胞としてＣＥＦ、発育鶏卵、鶏腎細胞などを用いる。Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ、ライボビッツＬ−１５／マッコイ５Ａ（１：１混合）培地などの中で、３７℃前後にて、３〜４日間培養する。
【００１９】
以上のように培養した細胞から定法に従ってＤＮＡを抽出する。すなわち、単層培養した細胞をはがし、遠心上清をとり、リシスバッファーでタンパク質を変性除去した後に、フェノールとエタノールでＤＮＡを抽出する。
このようにして得たウイルスＤＮＡの非翻訳領域を後述のように確認する。
【００２０】
非翻訳領域とは、ＯＲＦを有さず、翻訳によって発現されるタンパク質のアミノ酸配列を規定していない塩基およびＯＲＦが転写、翻訳、タンパク質発現のいずれにも関与していない塩基領域をいう。この領域に含まれている塩基配列は、その領域がＯＲＦを含むこととならない限り、塩基の置換、欠失、付加されたものであってもよい。
【００２１】
（外来遺伝子挿入領域）
外来遺伝子を挿入する領域を、外来遺伝子挿入領域といい、外来遺伝子を挿入する部位を外来遺伝子挿入部位という。
外来遺伝子挿入領域は、以下のようにして得ることができる。ＨＶＴまたはＭＤＶの場合を例にとって説明する。
【００２２】
これらのウイルスの非翻訳領域を、以下のようにして得る。まず、全塩基配列が解明されているヒト単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）や、ＨＶＴと相同性の高い塩基配列を持つＭＤＶ−１など相互で配列が確定されている領域などから、非翻訳領域と推定される配列の前後の配列を選択する。
【００２３】
ついで、これらの配列をもとにＤＮＡプライマーを合成し、ＨＶＴまたはＭＤＶのＤＮＡを鋳型として所定の条件でポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行い、特定の遺伝子を増幅することによって得られる。
【００２４】
この増幅された遺伝子にＯＲＦがないことをＤＮＡ配列分析で確認し、ＯＲＦの転写および翻訳に関係した遺伝子機構（エンハンサー、プロモーター、ターミネーターなどを含む機構）なども存在しない位置を確認して、外来遺伝子挿入領域を決定する。
【００２５】
この領域がウイルスの増殖に非必須であり、外来遺伝子を導入できることを明らかにするために、この領域に、特異的な配列を付加し、もしくは欠失させ、または置換を行い、ＣＥＦ（鶏胚繊維芽細胞）に感染させ、このような変化を生じさせた前後における感染性および増殖性の変化を調べる。
【００２６】
上記のような特定の配列の付加、欠失、置換などは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ＰＣＲ、部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、および特公平６−１６７０９号公報に記載された部位特定変異法など、一般的な手法を用いて行うことができる。
【００２７】
また、ＣＥＦに対しては、ｍ．ｏ．ｉ．≒１で感染させ、３７℃で３〜４時間インキュベートして増殖させ、ウイルスの増殖性、細胞の形態、プラークの形態、細胞の不死化を観察する。
【００２８】
この結果、塩基の変更前の株と細胞やプラークの形態に差がなく、また、ウイルスの増殖性も５回の繰り返し実験の平均で塩基の変異前の株との差が±２０％以内であることを確認し、同部位を外来遺伝子の挿入が可能な領域（外来遺伝子挿入可能領域）と判断する。この際、外来遺伝子挿入領域は、非翻訳領域を含めて外来遺伝子挿入部位の前後１０ｂｐ以上あればよく、好ましくは１００ｂｐ以上、より好ましくは５００ｂｐ以上あればよい。
【００２９】
外来遺伝子挿入部位は非翻訳領域内にあれば特に限定されるものではないが、具体例としては、（１）  ＵＬ４４とＵＬ４５との間およびＵＬ４５とＵＬ４６との間、（２）  ＵＬ４１とＵＬ４２、（３）  ＵＬ４０とＵＬ４１との間、（４）  ｇＢ遺伝子の下流領域、（５）  ＵＬ５３とＵＬ５４との間、（６）  ＵＬ３６とＵＬ３７との間、などが挙げられる。これらは、第１６回国際ヘルペスウイルスワークショップ（１９９１年０７月７〜１２日に米国カリフォルニア州パシフィックグローブで開催された）の予稿集中に、ＨＳＶ−１について掲載されている。
【００３０】
これらの中でも、好ましいものとして、ＨＳＶ−１だけでなく、ＭＤＶでも相同性がＯＲＦにおいて確認されている（１）および（４）を挙げることができ、より好ましくはＯＲＦ間の非翻訳領域が推定できる（１）を挙げることができる。
【００３１】
（外来遺伝子含有プラスミドの構築）
外来遺伝子をＨＶＴもしくはＭＤＶの非翻訳領域に挿入するには、非翻訳領域を含んだ配列をプラスミドにクローニングしておく必要があるが、このプラスミドも特に限定されるものではない。
例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、およびｐＵＣ９などのプラスミド、ラムダファージ、Ｍ１３ファージなどのようなファージ、ｐＨＣ７９などのコスミドを例示することができる。
【００３２】
これらのプラスミドに、上記のようにして得た非翻訳領域を常法によって組み込む。
このように組み込まれた非翻訳領域へ外来遺伝子を挿入するためには、上記のようなプラスミドなどにクローニングした非翻訳領域の特定の部分に変異を加えて新たな制限酵素切断部分を作り出し、そこに外来遺伝子を挿入する。
【００３３】
変異を加える方法は定法に従えばよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓやＰＣＲなど当業者において通常用いられる方法を使用することができる。すなわち、ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマーに１〜２塩基の欠失、置換、付加などの変異を生じさせ、このプライマーを使用することにより変異を生じさせることができる。
【００３４】
ここで挿入する外来遺伝子とは、本来その領域には含まれていない自己由来の遺伝子、非自己由来の遺伝子の双方を含み、鳥類感染型ヘルペス属ウイルスの抗原遺伝子であることが望ましい。
【００３５】
このような遺伝子としては、例えば、鳥類の感染症の病原体に由来する遺伝子を挙げることができる。鳥類の感染症を引き起こす病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などを挙げることができ、これらの病原体が有する抗原遺伝子、すなわち、抗原決定基をコードする遺伝子を好適に使用することができる。
【００３６】
このような病原体としては、具体的には、鶏の一生を通じて問題となるニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ガンボロ病ウイルス（ＩＢＤＶ）、中雛以降で問題となる伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マイコプラズマ（ＭＧ）、およびコクシジウムなどを挙げることができる。
【００３７】
特に、中和抗原遺伝子または感染防御抗原と考えられる抗原の遺伝子が同定されている疾病では、これらの遺伝子をＨＶＴやＭＤＶなどの鳥類感染型ヘルペス属ウイルスに組み込むことによって、組み換えウイルスが感染した鶏の体内で抗原として発現させることが可能となることによる。また、これによって、効果的なワクチンとして使用することが可能になる。
【００３８】
具体的に、ＨＶＴまたはＭＤＶなどの鳥類感染型ヘルペス属ウイルスに遺伝子を組み込んで組み換えウイルスを作製し、これらのウイルスに感染した鳥類の体内で発現されるタンパク質は、構造タンパク質、非構造タンパク質のいずれであってもよく、ＤＮＡ配列のわかっているタンパク質であれば特に限定されない。
【００３９】
例えば、ＮＤＶでは、ＨＮタンパク質、Ｆタンパク質、ＮＰタンパク質が、また、ＩＢＶでは、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質、スパイクタンパク質が挙げられる。ＩＢＤＶでは、ＶＰ１〜ＶＰ５の全タンパク質、ＩＬＴＶはヘルペスウイルスであることから、ＨＳＶ−１やＭＤＶ、ＨＶＴと相同性のあるタンパク質（特にｇＢタンパク質やＵＬ３２相当タンパク質など）、マイコプラズマではアドヘシンタンパク質、ＨＭＷ関連タンパク質、４０Ｋタンパク質、６６Ｋタンパク質、６７Ｋタンパク質など（国際公開公報ＷＯ９４／２３０１９号に配列が記載）などが挙げられる。
【００４０】
したがって、これらのタンパク質をコードしている遺伝子を組み込むことが好ましい。このような外来遺伝子を、異種抗原遺伝子という。
【００４１】
また、異種抗原遺伝子をＨＶＴまたはＭＤＶで発現させるためには、異種抗原遺伝子の上流域にプロモーター配列を組込む必要がある。使用するプロモーターは、合成プロモーター、天然プロモーターのいずれであってもよく、ＨＶＴまたはＭＤＶが感染した細胞内で保有する転写の系でプロモーターとして有効に機能し得るものであれば特に限定されない。
【００４２】
このようなプロモーターとしては、ＨＶＴまたはＭＤＶが保有している固有のプロモーターは無論のこと、ＨＶＴもしくはＭＤＶ以外のウイルス由来のプロモーターやＤＮＡ、または真核生物もしくは原核生物由来のものや合成プロモーターであっても上記要件を満たす限り、本発明において使用することができる。
【００４３】
具体的には、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター（Ｒｏｓｓ  Ｌ．  Ｊ．，  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：３７１−３７７（１９９３））、ＨＶＴおよびＭＤＶのｇＢタンパク質プロモーター（前出）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモーター（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  Ｍ．  Ａ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １７：９４９４（１９８９））  、ＳＶ４０プロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ  Ｐ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４：４８３１−４８３５（１９８７））、ヒトおよび鶏のβアクチンプロモーター（前出、およびＫｏｓｔ  Ａ．  Ｔ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １１：８２８７−８３０１（１９８３）  ）、β−グロビンプロモーター（Ｓｐｉｔｚｎｅｒ  Ｊ．  Ｒ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １８：１−１１（１９９０））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモーター（Ｆｉｅｋ  Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２０：１７８５（１９９２））などが挙げられる。その他、ＨＶＴまたはＭＤＶの構造タンパク質や必須遺伝子のプロモーターを利用することができる。
【００４４】
上述した非翻訳領域に、特定のプロモーターの支配下において外来抗原遺伝子が発現するような形でこれらを組込み、プラスミドを構築する。このようにして構築されたプラスミドは、ＨＶＴおよびＭＤＶゲノムの特定領域と組み換えを起こして組み換えウイルスを作ることができる。
【００４５】
（組み換えウイルスの作製）
鳥類感染型ヘルペス属ウイルスのゲノムの非翻訳領域内への上記のような外来遺伝子の挿入は、定法に従って行えばよい。ＨＶＴの場合を例にとって説明する。
【００４６】
まず、上記のようにして得たＨＶＴ非翻訳領域内に外来抗原遺伝子が挿入されたプラスミドを、ＨＶＴ感染細胞に、エレクトポレーションや、リン酸カルシウム法、リポフェクチンを用いた方法や遺伝子銃などで導入する。導入効率の高さから、エレクトロポレーションやリポフェクチンを用いた方法を採用することが好ましい。導入するプラスミドの量を、０．１〜１０００μｇの範囲とすると、このようなプラスミドを導入した細胞内における、ＨＶＴ−ＤＮＡとプラスミドの相同領域との間での組み換えウイルスの発生率が高くなる。
【００４７】
このようにして誕生した組み換えＨＶＴのみを選択するためには、プラスミドの非翻訳領域に１または複数の外来遺伝子を組み込み、そのうちの少なくとも１つを特定の基質を発色させる酵素遺伝子としておくとよい。このような酵素遺伝子の例としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられる。
【００４８】
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組み換えＨＶＴは、ブルオガルなどの基質の添加により特定の色を呈するため、非組み換えウイルスと明確に区別できる。したがって、このような遺伝子を組み込んだウイルスに感染させた細胞を、特定の基質を添加した培地中で培養することにより、発色したウイルス感染細胞を選択することができる。この操作を繰り返すことによって、組み換えウイルスを純化することができる。
【００４９】
（生ワクチン）
本発明の生ワクチンの調製方法は特に限定されないが、たとえば次の方法によって調製することができる。
【００５０】
本発明の組み換えウイルスの感染細胞を当該ウイルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、増殖させた後、細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清とに分離する。
【００５１】
宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好ましく、ＣＥＦ（ニワトリ胚繊維芽細胞）、鶏腎細胞などを好適に使用することができる。
得られた感染細胞は、１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワクチンとして使用するときは１００倍量のリン酸緩衝液にこの凍結保存品を溶かして使用する。
【００５２】
液体窒素下で上記感染細胞を保存するための安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定的に生存でき、かつレシピエントにとって薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。
本発明の生ワクチンの家禽への投与方法は特に限定されないが、皮下に注射により接種する方法が一般的に用いられており、現行のＨＶＴワクチンと同じである。接種量も従来ワクチンと同様でよい。
【００５３】
本ワクチンはヘルペス属ウイルス感染症用ワクチンとしてだけでなく、非翻訳領域に挿入した抗原遺伝子によって、それらの遺伝子が由来する病原体によって惹起される疾病のワクチンとして使用することができる。本発明のワクチンは、有用な組み換えＨＶＴ多価ワクチンとして使用することができる。
【００５４】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５５】
（実施例１）ＨＶＴ−ＤＮＡの調製
ＨＶＴ−ＤＮＡの調製は、基本的にＬｅｅらの方法（Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．，  ７：２８９−２９４  （１９７１））に準じて行った。
【００５６】
先ず１６ｃｍ培養皿で、ライボビッツ／マッコイ５Ａ（１：１）混合培地中３７℃で４日間培養したＨＶＴ（ＦＣ−１２６株）感染細胞（５×１０７個）をスクレーパーで剥がし、低速（２，０００ｒｐｍ、５分）で遠心分離した。遠心上清をすて、沈殿した感染細胞の１０倍量にあたるリシスバッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）を加えた。
【００５７】
３７℃で一昼夜保温した後、等量のフェノールを加えてタンパク質を変成させ、この操作を２回繰り返してＨＶＴ−ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはエタノール沈殿によって回収した。
【００５８】
（実施例２）ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉの構築
ＭＤＶ−１型のｇＣｈ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：２３７３−２３７９（１９８１））遺伝子とそれに隣接するＢａｍＨＩ−ＢフラグメントのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（特開平６−２９２５８３号公報）の情報をもとにして、ＯＲＦの間にＳｆｉＩ部位を導入できるように合成ＤＮＡ（プライマー１〜４）を設計した。
ここで、上記のＣｏｕｓｓｅｎｓらの文献ではＵＬ４４および４５が記載されており、特開平６−２９２５８３号公報にはＵＬ４６が記載されている。
【００５９】
このプライマーを用いて以下のようにＰＣＲを行い、ｐＵＣ１８にクローニングした。  ＨＶＴ−ＦＣ１２６株感染ＣＥＦより、実施例１の方法でＤＮＡを取得し、このＤＮＡ１００ｎｇをテンプレートとして用いた。また、プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）からなるプライマーセットＡ（それぞれ５０ｐｍｏｌ）およびプライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）とからなるプライマーセットＢ（それぞれ５０ｐｍｏｌ）とを用いて、通常の方法でＰＣＲを行った。３０サイクルで反応を停止させ、それぞれ約１０μｇの増幅産物を得た。
【００６０】
これら２つのＰＣＲ産物を混合したもの（混合比１：１、それぞれ１００ｎｇを混合したもの）をテンプレートとして、プライマー１とプライマー４とを用いて、４５℃１分、６０℃２分、７３℃３分を１サイクルとして３０サイクルＰＣＲを行うことにより、ＵＬ４５ｈおよびＵＬ４６ｈのＯＲＦの間にＳｆｉＩ部位を導入した。
【００６１】
得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＴ４リガーゼ（宝酒造社製）４ユニットを用いて１６℃で、３０分間インキュベートして挿入し、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉを構築した。
【００６２】
（実施例３）ｐＮＺ４４／４５ｆｉの構築
実施例２と同様に、ＨＶＴ−ＦＣ１２６株感染ＣＥＦより取得したＤＮＡ（１００ｎｇ）をテンプレートとして、プライマー１およびプライマー５（配列番号５）からなるプライマーセットＣ（それぞれ５０ｐｍｏｌ）およびプライマー６（配列番号６）とプライマー４からなるプライマーセットＤ（それぞれ５０ｐｍｏｌ）とを用いて、実施例２と同様にしてＰＣＲを行った。それぞれ約１０μｇの増幅産物が得られた。
【００６３】
これら２つのＰＣＲ産物を混合したもの（混合比１：１、それぞれ１００ｎｇを混合したもの）をテンプレートとして、プライマー１（５０ｐｍｏｌ）とプライマー４（５０ｐｍｏｌ）とを用いて実施例２と同様にしてＰＣＲを行うことにより、ＵＬ４４ｈ（ＭＤＶ１のＨＳＶ−１に対応するｇＣｈまたはｇＡ）およびＵＬ４５ｈのＯＲＦの間にＳｆｉＩ部位を導入した。
この産物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断し、得られた断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に実施例２と同様にして挿入し、ｐＮＺ４４／４５Ｓｆｉを構築した。
【００６４】
（実施例４）ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉの構築
（１）ドナープラスミドｐＧＴＰｓの構築
ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に、合成ＤＮＡ（５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号７））を挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼでこの部分を二本鎖とした。次いで、得られたプラスミドのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部位に合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号８））を挿入し、同様にＤＮＡポリメラーゼで二本鎖とした。さらに、ここで得られたプラスミドのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、２本の合成ＤＮＡ（５’−ＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号９））および（  ５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号１０））をアニールさせたものを挿入し、最後にこのプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位にプラスミドｐＮＺ１７２９Ｒ（Ｙａｎａｇｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６６：１４０２−１４０８（１９９２）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで消化して得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＧＴＰｓを構築した。
【００６５】
（２）  ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉの構築
ｐＵＣ１８をＤｒａＩで切断し、ＸｈｏＩリンカー（宝酒造社製）を実施例２と同様にして挿入し、ＸｈｏＩサイトを導入したｐＵＣ１８Ｘを構築した。
このｐＵＣ１８ＸをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断し、合成ＤＮＡ１（配列番号１１）と合成ＤＮＡ２（配列番号１２）とをアニールした断片を作製した。これをＴ４ライゲース（宝酒造社製）を用いて上記のＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＵ１８ＸＧを構築した。
【００６６】
このｐＵ１８ＸＧのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、ポリＡ付加シグナルおよびＳｆｉＩサイトを導入するために、合成ＤＮＡ３（配列番号１３）と合成ＤＮＡ４（配列番号１４）とをアニールした断片をＴ４ライゲースによって挿入し、ｐＵＣｐｏｌｙＡＳｆｉを構築した。
【００６７】
このｐＵＣｐｏｌｙＡＳｆｉのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに、実施例４（１）に記載のｐＧＴＰｓのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片３６ｂｐを挿入し、ｐＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを構築した。
このｐＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩサイトに合成ＤＮＡ５（配列番号１５）を実施例２と同様にして挿入し、ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを構築した。
【００６８】
（実施例５）ｐＲＳＶおよびｐＣＭＶの構築
ｐＢＫ−ＲＳＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）からＮｓｉＩとＮｈｅＩとを用いて二重消化して切り出したＲＳＶプロモーターを含む約６００ｂｐのＮｓｉＩ−ＮｈｅＩ断片を、実施例３で得られたｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ部位に実施例２と同様にして導入し、ｐＲＳＶを構築した。
【００６９】
同様に、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＣＭＶプロモーターを含むＮｓｉＩ−ＮｈｅＩ断片を切出し、実施例３で得られたｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ部位に実施例２と同様にして導入して、ｐＣＭＶを構築した。
【００７０】
（実施例６）ｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）  の構築
（１）ｐＣＭＶのＣＭＶプロモーターからのＢｇｌＩ部位の欠失
ｐＣＭＶのＣＭＶプロモーター内には、ＢｇｌＩ部位が３箇所存在するため、ＢｇｌＩ部位を欠失させるために、以下のようにＰＣＲを行って変異を導入した。変異は次の方法によって行った。
【００７１】
実施例５で構築したｐＣＭＶ（１００ｎｇ）をテンプレートにして、プライマー７（配列番号１２）とプライマー８（配列番号１５）からなるプライマーセットＥ、Ｍ１３Ｐ７プライマー（東洋紡績株式会社製）とプライマー９（配列番号１３）からなるプライマーセットＦとを用いて、実施例２と同様の条件でＰＣＲを行った。それぞれ約１０μｇの増幅産物を得た。
【００７２】
上記２つのプライマーセットを用いて得た増幅産物１００ｎｇを混合比１：１で混合し、その混合物をテンプレートとして、今度は、Ｍ１３Ｐ７プライマーとプライマー８とを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物（１）を約１０μｇ得た。
【００７３】
同様にｐＣＭＶ（１００ｎｇ）をテンプレートにして、プライマー１０（配列番号１４）とプライマー１１（配列番号１７）とのセットＦ、およびプライマー１２（配列番号１６）とＭ１３Ｐ８プライマー（東洋紡績株式会社）とで、実施例２と同様にしてＰＣＲを行った。
【００７４】
同様に、これら２つのプライマーセットの産物それぞれ１００ｎｇを１：１で混合した混合物をテンプレートとして、今度は、プライマー１０とＭ１３Ｐ８プライマーのプライマーでＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物（２）を約１０μｇ得た。
さらに、ＰＣＲ産物（１）と、ＰＣＲ産物（２）とを混合し、Ｍ１３Ｐ７プライマーとＭ１３Ｐ８プライマーとを用いて実施例２と同じようにＰＣＲを行うことにより、ＢｇｌＩ部位を欠失したＣＭＶプロモーターを得ることができた。
【００７５】
（２）ｐＵＣＣＭＶの構築
また、ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ部位に、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＣＭＶプロモーターを含む約６００ｂｐのＮｓｉＩ−ＮｈｅＩ断片を実施例２のようにして挿入して、ｐＵＣＣＭＶを構築した。
【００７６】
（３）ｐＮＺ８７の構築
（３−１）７．５Ｋプロモーターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が連結されたプラスミド（ｐＮＺ７６）の作製
１０μｇのｐＭＡ００１（Ｓｈｉｒａｋａｗａら、Ｇｅｎｅ，  ２８：１２７−（１９８４））をＢａｍＨＩで消化後、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿により、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（約３．３ｋｂｐ  ）を回収した。
【００７７】
一方、０．３μｇのｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで消化後、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収し、上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とライゲーションし、ハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６を作製した。
【００７８】
４０μｇのｐＵＷＰ−１（ワクチニアウイルスＷＲ株の７．５ＫダルトンのペプチドをコードするＤＮＡのプロモーターを含むプラスミド）をＨｐａＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、１．５％低融点アガロース電気泳動（７０Ｖ、６時間）により、７．５Ｋプロモーターを含む約０．２６ｋｂｐの断片を分離し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片の接着末端をＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした。
【００７９】
０．３μｇのｐＮＺ６６をＨｉｎｃＩＩで消化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により断片を回収し、上記の約０．２６ｋｂｐの７．５Ｋプロモーター遺伝子をライゲーションし、得られたハイブリッドプラスミドをｐＮＺ７６と命名した。
【００８０】
（３−２）ハイブリッドファージｍｐ１０−ＨＮ１８０からプロモーターおよびその支配下にＮＤＶのＨＮ遺伝子ＤＮＡを連結したハイブリッドプラスミドｐＮＺ８７の作製
ｐＮＺ７６をＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲルより、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含まない約２．９ｋｂｐ  の断片を回収した。
【００８１】
一方、ハイブリッドファージｍｐ１０−ＨＮ１８０をＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩとで消化後、０．８％アガロースゲルより約１．８ｋｂｐ  のＨＮ遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。
両者をリガーゼにより連結し、得られたプラスミドでコンピテントな大腸菌ＴＧ−１株を形質転換し、常法に従ってプラスミドを抽出し、ＨＮ遺伝子を含むハイブリッドプラスミドを検出し、これをｐＮＺ−８７と命名した。
【００８２】
（４）ｐＮＺ８７ＣＭＶの構築
次に、（３）で構築したｐＮＺ８７から、ＮＤＶのＨＮ遺伝子を含む約１．８ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を切り出した。この断片をｐＵＣＣＭＶのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ部位に実施例２と同様にして挿入して、ｐＮＺ８７ＣＭＶを構築した。
このｐＮＺ８７ＣＭＶのＣＭＶプロモーター領域にはＢｇｌＩ部位が含まれるので、ＣＭＶプロモーター領域を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を（２）でＰＣＲにより構築したＢｇｌＩ部位を欠失したＣＭＶプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と実施例２に記載したようにして入れ替えて、ｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）を構築した。
【００８３】
（実施例７）ｐＲＳＶ−Ｆの構築
（１）ｐＵＣＲＳＶ−ｐＡの構築
ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ部位に、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＲＳＶプロモーターを含む約６００ｂｐのＮｓｉＩ−ＮｈｅＩ断片を実施例２に記載したようにして挿入し、ｐＵＣＲＳＶを構築した。
【００８４】
これとは別に、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、１００ｎｇ）をテンプレートとして、プライマー１３（配列番号１８）とプライマー１４（配列番号１９）のプライマー（それぞれ５０ｐｍｏｌ）とを用いて、実施例２と同様にしてＰＣＲを行うことによって、ｐＢＫ−ＲＳＶに含まれるＳＶ４０プロモーターのｐＡ付加シグナルを持つ断片を作製した。
このＰＣＲで増幅した断片をＳａｃＩとＥｃｏＲＩとで二重消化して、ｐＵＣＲＳＶのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位に実施例２に記載のようにして挿入することにより、ｐＵＣＲＳＶ−ｐＡを構築した。
【００８５】
（２）ｐＮＺ９８の構築
ＮＤＶのＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子を含むプラスミドＸＬＩＩＩ−１０Ｈ（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７：２４１−２５５（１９８７））を使用した。
４μｇのプラスミドＸＬＩＩＩ−１０ＨをＸｂａＩで消化し、生じた付着末端をＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿により回収した。回収したＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動して、約２．１ｋｂｐ  のＦ遺伝子を完全に含む断片を回収した。
【００８６】
一方、上記のようにして作製したｐＮＺ７６をＢａｍＨＩとＳｍａＩで二重消化し、ｌａｃＺ遺伝子部分を除いた約３．０ｋｂｐのとＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片を回収した。回収したこの断片と、約２．１ｋｂｐ  のＦ遺伝子を完全に含む断片とをリガーゼによって連結し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換した。
【００８７】
５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育してきたコロニーから、上記と同様の操作によってプラスミドを調製した。制限酵素（ＢａｍＨＩとＳｍａＩ）でこのプラスミドを切断し、目的のクローンを確認し、ｐＮＺ９８’と命名した。このｐＮＺ９８’には、Ｆ遺伝子全長の他、ＨＮ遺伝子の５’−末端約３００ｂｐが含まれる。この部分を除去するために、ｐＮＺ９８’をＳｍａＩとＫｐｎＩとで二重消化し、約４，１５０ｂｐのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により回収した。また、ｐＮＺ９８’をＳｍａＩとＡｖａＩＩとで同様に二重消化し、約６５０ｂｐのＳｍａＩ−ＡｖａＩＩを１．５％アガロースゲル電気泳動により回収した。
【００８８】
これら２つの断片を混合し、ＤＮＡポリメラーゼによって付着末端を平滑末端とした後にコンピテントな大腸菌ＴＧ１を形質転換し、形質転換体を得た。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上でこの形質転換体を生育させ、形成されたコロニーより上述のようにしてプラスミドを得た。このプラスミドをＳｍａＩで再び消化し、切断されたものを選択してプラスミドｐＮＺ９８を得た。
【００８９】
（３）上記（２）で構築したｐＮＺ９８から、ＮＤＶのＦ遺伝子を含む約１．８ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を切り出し、ｐＵＣＲＳＶ−ｐＡのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ部位に実施例２に記載したようにして挿入し、ｐＮＺ９８ＲＳＶ３’を構築した。
また、ｐＮＺ９８をＰｓｔＩで切断したのち、ＢａｍＨＩにて部分消化を行い、１２５ｂｐの断片を回収した。
【００９０】
この回収した断片とｐＮＺ９８ＲＳＶ３’に含まれるＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片７５ｂｐと交換して、ｐＮＺ９８ＲＳＶｐＡを構築した。
実施例５で構築したｐＲＳＶのＭｌｕＩ−ＳａｃＩ切断２，８９２ｂｐ断片と、ｐＮＺ９８ＲＳＶｐＡのＮＤＶのＦ遺伝子を含むＭｌｕＩ−ＳａｃＩ切断２，２６２ｂｐ断片をライゲーションすることによって、ｐＲＳＶ−Ｆを構築した。
【００９１】
（実施例８）ｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓ（Ｏｋａｙａｍａ）の構築
（１）ｐＣＭＶ／ＭＣＳの構築
実施例６で構築したｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）  のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ部位に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片６２ｂｐを実施例２に記載したように挿入し、ｐＣＭＶ／ＭＣＳを構築した。
【００９２】
（２）ｐＣＭＶ／ＭＣＳｐＡの構築
これとは別に、実施例７と同様に、ｐＢＫ−ＲＳＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）をテンプレートとして、プライマー１５（配列番号２０）とプライマー１６（配列番号２１）とを用いて、実施例２と同様にＰＣＲを行い、ＳＶ４０のｐＡ付加シグナルを持つ断片を作製した。
このＰＣＲで増幅した断片をＡｐａＩとＫｐｎＩとで二重消化して、ｐＣＭＶ／ＭＣＳのＡｐａＩ−ＫｐｎＩ部位に実施例２に記載したように挿入することにより、ｐＣＭＶ／ＭＣＳｐＡを構築した。
【００９３】
（３）ｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓの構築
さらに、ＩＢＤＶ野外分離株岡山株より、常法によりＲＮＡを抽出し、リバーストランスクリプターゼとｃＤＮＡ合成キット（宝酒造製）とを用いてｃＤＮＡを作製した。
このｃＤＮＡをテンプレートとして、ＶＰ２に相当する領域を特開昭６２−５０３００６号公報に記載された遺伝子配列を元にして、プライマー１７（配列番号２２）とプライマー１８（配列番号２３）とを設計した。
【００９４】
これら２つのプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行うことによってＩＢＤＶのＶＰ２に相当する領域を取得した。
これとは別に、ｐＣＭＶ／ＭＣＳｐＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、ついでＳａｌＩで部分消化して３，６８７塩基対の断片を得た。上記のＰＣＲによって取得したＩＢＤＶの断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩとで二重消化し、これを３，６８７塩基対の断片に実施例２で記載したようにして挿入し、ｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓ（Ｏｋａｙａｍａ）を構築した。
【００９５】
（実施例９）ｐＵＣ１８Ｘｌａｃの構築
ｌａｃＺのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片（Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６６：１４０２−１４０８（１９９２）  ）を、実施例４で構築したｐＵ１８ＸＧのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に実施例２に記載したようにして挿入し、ｐＵＣ１８Ｘｌａｃを構築した。
【００９６】
（実施例１０）ｐＮＺ４５／４６ＲＳＶｌａｃおよびｐＮＺ４４／４５ＲＳＶｌａｃの構築
（１）ｐＮＺ４５／４６ＲＳＶｌａｃの構築
実施例２で構築したｐＮＺ４５／４６ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に、実施例５で構築したＲＳＶプロモーターを含むｐＲＳＶのＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したように挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＲＳＶを構築した。
このｐＮＺ４５／４６ＲＳＶのＳｆｉＩ部位に、実施例９で構築したｌａｃＺを含むｐＵＣ１８ＸｌａｃのＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したように挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＲＳＶｌａｃを構築した。
【００９７】
（２）ｐＮＺ４４／４５ＲＳＶｌａｃの構築
同様に、実施例３で構築したｐＮＺ４４／４５ＳｆｉのＳｆｉＩ部位に、実施例５で構築したＲＳＶプロモーターを含むｐＲＳＶのＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＲＳＶを構築した。このｐＮＺ４４／４５ＲＳＶのＳｆｉＩ部位に、実施例９で構築したｌａｃＺを含むｐＵＣ１８ＸｌａｃのＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したように挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＲＳＶｌａｃを構築した。
【００９８】
（実施例１１）ｐＮＺ４５／４６ＶＰ２ＳおよびｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓの構築
（１）ｐＮＺ４５／４６ＶＰ２Ｓ
実施例１０で構築したｐＮＺ４５／４６ＲＳＶｌａｃのＳｆｉＩ部位に、実施例８で構築したＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓ（Ｏｋａｙａｍａ）のＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したように挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＶＰ２Ｓを構築した。
【００９９】
（２）ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ
同様に、実施例１０で構築したｐＮＺ４４／４５ＲＳＶｌａｃのＳｆｉＩ部位に、実施例８で構築したＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓ（Ｏｋａｙａｍａ）のＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したように挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓを構築した。
【０１００】
（実施例１２）ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦおよびｐＮＺ４４／４５ＨＮＦの構築
（１）ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦの構築
実施例１０で構築したｐＮＺ４５／４６ＲＳＶｌａｃのＳｆｉＩ部位に、実施例６で構築したＮＤＶのＨＮ遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）のＢｇｌＩ断片を実施例２に記載したようにして挿入し、ｐＮＺ４５／４６ＨＮを構築した。さらにｐＮＺ４５／４６  ＨＮのＳｆｉＩ部位に、実施例７で構築したＮＤＶのＦ遺伝子を含むｐＲＳＶ−ＦのＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦを構築した。
【０１０１】
（２）ｐＮＺ４４／４５ＨＮＦの構築
同様に、実施例１０で構築したｐＮＺ４４／４５ＲＳＶｌａｃのＳｆｉＩ部位に、実施例６で構築したＮＤＶのＨＮ遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）のＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＨＮを構築した。さらにｐＮＺ４４／４５ＨＮのＳｆｉＩ部位に、実施例７で構築したＮＤＶのＦ遺伝子を含むｐＲＳＶ−ＦのＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＨＮＦを構築した。
【０１０２】
（実施例１３）ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦ−ＶＰ２ＳおよびｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮＦの構築
（１）ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦ−ＶＰ２の構築
実施例１２で構築したｐＮＺ４５／４６ＨＮＦのＳｆｉＩ部位に、実施例８で構築したＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＶＰ２Ｓ（Ｏｋａｙａｍａ）のＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦ−ＶＰ２Ｓを構築した。
【０１０３】
（２）ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮＦの構築
実施例１１で構築したｐＮＺ４４／４５ＶＰ２ＳのＳｆｉＩ部位に、実施例６で構築したＮＤＶのＨＮ遺伝子を含むｐＣＭＶ−ＨＮ（ＢｇｌＩ−）のＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮを構築した。さらにｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮのＳｆｉＩ部位に、実施例７で構築したＮＤＶのＦ遺伝子を含むｐＲＳＶ−ＦのＢｇｌＩ断片を挿入して、ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮＦを構築した。
【０１０４】
（実施例１４）組み換えＨＶＴの純化
トリプシンではがした単層のＣＥＦを、ＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。このた細胞懸濁液（２×１０７個）に、実施例１１、１２および１３で作製した組み換え用プラスミドｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ４４／４５ＨＮＦ、ｐＮＺ４５／４６  ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ４５／  ４６ＨＮＦ、ｐＮＺ４４／４５ＶＰ２Ｓ−ＨＮＦ  ｐＮＺ４５／４６ＨＮＦ−ＶＰ２Ｓをそれぞれ４０μｇと、実施例１で調製したＨＶＴのＤＮＡを１００μｇずつ混合した。
【０１０５】
この溶液を室温にて１０分間放置した後、室温にてジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）を用いて、３．０ＫＶｃｍ−１、０．４  ｍｓｅｃ、２５℃の条件下でエレクトロポレーションした。
プラスミド及びＨＶＴのＤＮＡを導入した細胞を、その後９ｃｍ径の培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）にまき、３７℃にてＨＶＴ特有のプラークが形成されるまで約４日〜５日間培養した。
【０１０６】
プラークが形成された細胞を１％トリプシンではがし、同様にトリプシンではがしたＣＥＦ（２×１０７個）の細胞と混合し、培養用９６ウェル平底マルチプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）１０枚に限界希釈した。これらのプレートを、３７℃で各ウェルにＨＶＴ特有のプラークが形成されるまで、さらに、約４日〜５日間培養した。ついで、各プレートの半数のウェルにβガラクトシダーゼの発色基質であるブルオガル（Ｂｌｕｏｇａｌ：  Ｇｉｂｃｏ社製）１００μｇ／ｍｌ及び０．８％寒天を含むＣＥＦ培養用培地を１００  μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃において約４時間インキュベートした。
【０１０７】
その後、各ウェルの青プラーク数を数え、最も青プラーク数の多かったプレートを選択し、任意の２０ウェルに１％トリプシンを加えて組み換えＨＶＴ感染細胞を含むＣＥＦをそれぞれ回収し、１×１０６個の細胞と混合し、それぞれに培養用９６ウェル平底マルチプレートに播いた。
培養用９６ウェル平底マルチプレートから培養用９６ウェル平底マルチプレートに一回継代する行程を一回のスクリーニングとしては、全ウェルが青プラークになるまで繰り返し、ブルオガルを加えたときに全プラークが青変するまで繰り返し、ウイルスを純化した。通常は、ほぼ５〜１０回のスクリーニングで純化できる。
【０１０８】
９ｃｍ径の培養用ディッシュ上で感染細胞を増殖させたのち、１６ｃｍ径の培養用ディッシュで感染細胞をさらに増殖させ、組み換えＨＶＴの力価を測定したところ、組み換えＨＶＴの力価は１〜６×１０５ＴＣＩＤ５０であった。
各組み換え用プラスミドから作製された組み換えＨＶＴを以下の表１ように呼ぶこととした。
【０１０９】
【表１】
0003587065.tif 000002
【０１１０】
（実施例１５）  サザンハイブリダイゼーション
実施例１４で調製した組み換えウイルスＤＮＡ  （ＨＦ００３，  ＨＦ００４）を実施例１のＨＶＴ−ＤＮＡ抽出方法と同じ方法で抽出した。
得られた組み換えウイルスＤＮＡ  （ＨＦ００３，  ＨＦ００４）、その組み換え用プラスミド（ｐＮＺ４５／４６ＶＰ２Ｓ、ｐＮＺ４４／４５ＨＮＦ）、及び親株ウイルスＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化し、これらを０．８％アガロース電気泳動に供し、サザンブロットハイブリダイゼーションとオートラジオグラフィーで分析した。
【０１１１】
使用したプローブは、ｐＮＺ４５／４６ＶＰ２ＳまたはｐＮＺ４４／４５ＨＮＦをＥｃｏＲＩで消化した断片をマルチプライムラベリングシステム（アマシャム社製）で、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡである。
その結果、プローブＤＮＡと相同な配列が組み換えＨＶＴにも存在することが判明した。
【０１１２】
（実施例１６）  組み換えＨＶＴ感染細胞での外来抗原の発現確認（蛍光抗体法）
組織培養用チャンバースライド上で、上記組み換えＨＶＴ感染細胞をＣＥＦとともに３７℃でプラークが出現するまで培養し、冷アセトンで固定した。
【０１１３】
発現した抗原を検出するために、一次抗体抗体として以下のものを用いた。β−ガラクトシダーゼの検出には、抗βガラクトシダーゼウサギ抗血清（ポリクローナル抗体：Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｃａ  Ｎ．  Ｖ．社製）、ＮＤＶ−ＨＮタンパク質及びＦタンパク質の検出には、ＮＤＶワクチン免疫鶏血清を、それぞれ５００倍にＰＢＳで希釈して用いた。ＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質の検出には、抗ＶＰ−２モノクローナル抗体ＧＫ−５（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，  ４０：５０１−５０９（１９９６））をＰＢＳで１００倍に希釈して用いた。
【０１１４】
標識抗体としては、ＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧ抗体、  ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（いずれもハーランセララボ社製）を、それぞれ使用時にＰＢＳで１００倍に希釈した。
上記の抗体を含む各溶液を冷アセトンで固定したチャンバースライド上の細胞と接触させ、室温１００％湿度で約一時間放置し、ＰＢＳで三回洗浄した。この後、ＦＩＴＣ結合抗鶏イムノグロブリンまたは抗マウスＩｇＧの希釈液とともに、約一時間、室温にて反応させた。その後、ＰＢＳで三回洗浄し、蛍光励起波長光（４９３．５ｎｍ）下で顕微鏡観察して反応性を調べた。
【０１１５】
対照ウイルスとしてＨＶＴ親株ＦＣ−１２６を感染させ、この親株ウイルスを感染させた細胞を対照細胞として使用した。結果を表２に示した。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
ＮＤＶ抗原遺伝子を組み込んだ組み換えＨＶＴは抗ＮＤＶモノクローナル抗体と反応し、ＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子を組み込んだ組み換えＨＶＴは抗ＶＰ２モノクローナル抗体と反応した。
この結果から、各組み換えＨＶＴは、挿入した遺伝子がコードするタンパク質を発現していることが確認された。
【０１１８】
（実施例１７）  鶏ワクチンのＮＤＶに対する効果実験（ＳＰＦ鶏）
実施例１４で得られた組み換えＨＶＴのワクチンの効果を判定するためにワクチン効果実験を実施した。
各群１０羽の試験用ＳＰＦ鶏（Ｌｉｎｅ  Ｍ、日本生物科学研究所）に、表２に示す組み換えＨＶＴを接種した。陽性対照群にはＮＤＶの市販の生ワクチンを接種し、陰性対照群は未接種とした。
【０１１９】
試験用ＳＰＦ鶏が孵化したときに、各組み換えＨＶＴを、鶏の背部皮下に１０４ＴＣＩＤ５０となるように２６Ｇの注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販のＮＤＶ生ワクチン（日本生物科学研究所）は、４日齢の雛に用法通り点眼接種した。
接種４週後に、各群の鶏に強毒ＮＤＶウイルス（Ｓａｔｏ株）を１０４ＰＦＵとなるように右大腿部にチャレンジした。チャレンジ後約２週間までの鶏の生死及びＮＤＶの発症の有無を観察し、生存率を指標として効果を判定した。
【０１２０】
ＮＤＶウイルスをチャレンジする前に各鶏から採血を行い、各鶏の血清中のＮＤＶに対する赤血球凝集抑制抗体の検出を行った。測定は市販されているＮＤＶ赤血球凝集素（日本生物科学研究所）の使用説明書に従った。結果は表３に示した。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
組み換えＨＶＴを接種した鶏では、ＮＤＶのチャレンジに対して１００％感染防御がなされた。ＨＩ抗体価はＦＣ１２６接種鶏群と非接種鶏群で２倍以下という低い値であったのに対して、他の群では全鶏１２８倍から１０２４倍であった。
以上の結果から、各組み換えＨＶＴによってＮＤＶに対する感染防御能が接種鶏に付与されていることが明らかとなった。
【０１２３】
（実施例１８）  鶏ワクチンのＩＢＤＶに対する効果実験（ＳＰＦ鶏）
実施例１４で得られた組み換えＨＶＴのワクチン効果を判定するために、ワクチン効果実験を実施した。
各群１０羽の試験用ＳＰＦ鶏（Ｌｉｎｅ  Ｍ、日本生物科学研究所）に、ＨＦ００３、および親株ウイルスであるＦＰＶをそれぞれ接種した。陽性対照群にはＩＢＤＶの市販のワクチンを接種し、陰性対照群は非接種とした。
【０１２４】
試験用ＳＰＦ鶏が孵化したときに、各組み換えＨＶＴを、鶏の背部皮下に１０４ＴＣＩＤ５０となるように２６Ｇの注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販のＮＤＶ生ワクチン（北里研究所）は、１６日齢の雛に用法通り点眼接種した。
【０１２５】
生ワクチン接種１７日後に、各群の鶏に強毒ＩＢＤＶウイルス（Ｏｋａｙａｍａ株）を１．５ｘ１０３．８ＥＩＤ５０となるように経口でチャレンジした。チャレンジ後約３日での鶏の生死を観察した。その後生存した鶏を屠殺し、ＩＢＤＶの発症の有無をファブリキウス嚢の病変形成状態を指標として効果を判定した。ファブリキウス嚢の病変形成状態は、出血（Ａ）、嚢内チーズ様浸出物形成（Ｂ）、黄色病変（Ｃ）、ゼリー様浸出物形成（Ｄ）の４点で判定した。各病変スコアは、病変を形成した鶏羽数で表わし、スコア合計で接種ワクチンの効果を判定した。
結果を表４に示した。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
組み換えＨＶＴを接種した鶏では、ＩＢＤＶのチャレンジに対して市販のワクチンとほぼ同等の感染防御能を示した。
この結果から、組み換えＨＶＴの接種によってＩＢＤＶに対する感染防御能が付与されていることが示された。
【０１２８】
（実施例１９）  鶏ワクチン効果実験（移行抗体保有鶏）
実施例１４で得られた組み換えＨＶＴが移行抗体を保有している鶏に対してもワクチン効果を発揮するかどうかについて、市販鶏に接種して調べた。
使用した鶏は、市販されている白色レグホン（Ｄｅｋａｌｂ鶏、神奈川養鶏連合会）から生まれた初生雛である。ＨＦ００４とＨＦ００６を実施例１７と同様に背部皮下接種した。このとき同じロットの雛２０羽から、心臓採血によって血液を採取し、血清を得た。移行抗体が完全になくなる８週後に実施例１７と同様にＮＤＶによるチャレンジを行い、生存率の有無で感染防御能を評価した。結果を表５に示した。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
なお、初生齢のＨＩ抗体価は９７であった（２０羽の平均値）。
この結果から明らかなように、組み換えＨＶＴを接種した群ではＮＤＶのチャレンジに対してほぼ完璧なワクチン効果が示された。また、チャレンジ時のＨＩ抗体価もＦＣ１２６接種群（＜２）や非接種群（＜２）と比較して明らかに高い値を示した（１６および１５．５）。
【０１３１】
また、ＨＦ００４とＨＦ００６の間ではＨＩ抗体価に有意な差もなく、挿入抗原の多少に関わらず、鶏に対して有意な免疫効果を与えることが示された。
これらの結果から明らかなように、本明細書で示した組み換えＨＶＴは、すべて挿入抗原遺伝子が由来する疾病の効果的なワクチンになった。そればかりでなく、移行抗体の影響を受けない。
【０１３２】
また、挿入抗原の多少に関わらず効果を発揮したことから、多価組み換えＨＶＴワクチンとしての有用性が示された。
【０１３３】
【発明の効果】
本発明によれば、七面鳥ヘルペスウイルスゲノム中の非翻訳領域である遺伝子領域に外来遺伝子が挿入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルスおよび当該組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを含有するワクチンが提供される。
【０１３４】
【配列表】
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【０１３５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜２３：合成ＤＮＡ