(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた動物の皮膚中の表皮細胞を形質転換して、該表皮細胞が通常の生物学的様式で脱落するまでの時間にわたり該動物中でタンパク質をインビボで生成するための組成物であって、該組成物は不活性な高密度の金粒子を含み、該金粒子は、外来遺伝子構造物のコピーを被覆されており、該細胞の寸法に対して小さな寸法であり、そして該外来遺伝子構造物は、蛋白をコードするDNA配列及び該細胞内で該蛋白を発現するのに有効な近接調節配列を含み、ここで該外来遺伝子構造物は該細胞における蛋白をコードする該DNA配列の発現に適合され、該組成物は該生きた動物の皮膚に直接向けて加速される、組成物。
【請求項２】
前記金粒子が１〜３μの寸法である、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】
前記動物がヒトである、請求の範囲第１または２項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般的に言えば遺伝的形質転換技術に関し、より詳細には動物の非生殖細胞系列の細胞の遺伝的形質転換計画に関するものである。
発明の背景
動物のゲノムDNAに外来または異種遺伝子を導入することを可能とする、動物の遺伝子工学に係わる様々な技術が開発されている。従来技術においては、典型的にはこのような動物の遺伝的形質転換はマイクロインジェクションにより、あるいはレトロウイルスを基本とする形質転換ベクタの使用により行われ、その効果は発生における比較的初期の段階の動物胚を遺伝的に形質転換することにある。この異種DNAは該動物胚のゲノムに導入され、次いで該胚から生ずる各娘細胞のゲノムに導入されることになる。このような遺伝的形質転換により、該挿入DNAは、全ての細胞中におよび生殖細胞系列の即ち該生物の生殖細胞を包含する、得られる全ての生物中に挿入される。このことは、この形質転換された動物の正常なメンデル様式による子孫へのこの遺伝形質の移行を保証する。
動物細胞をその場で形質転換して、該動物の生殖細胞系の遺伝子的構造に影響を与えずに、遺伝子構造を持つ遺伝子生成物を与え得ることが望ましい場合が往々にしてみられる。特に、ヒトへの応用の際に、このような体細胞形質転換の利用は、人類の生殖細胞系へのヒトの介入から起こる倫理上のかつ理性上の問題の大部分を回避する。これらの遺伝子操作された体細胞は、正常な生物学的機能発現に必要な酵素の不活化または欠如からなる受け継がれた遺伝的疾患を遺伝子的に修正する能力を与える。このような体細胞、即ち非生殖細胞系細胞の遺伝的形質転換はいくつかの治療上の応用において望ましいものであり得る。例えば、患者に対して治療上の有用性をもたらすいくつかの蛋白は厳密なタイムスケジュールにもとづいて定期的に注射しなければならない。しかしながら、この大量の蛋白の周期的注射をたとえ頻繁に行っても、注射の直後には該蛋白の供給過多となり、かつ次回の注射の直前には過少供給となり、これは該注射に伴う有害なショックおよび次回の注射の直前の治療効率にとっては不十分な供給を結果する。もうひとつの方法は、該動物およびヒトの体細胞中に所定の蛋白に対する遺伝子を組み込み、かくして得られる形質転換細胞が生きながらにして一貫した濃度で該治療用の蛋白を生成するようにすることである。所定のかつ確認し得る平均余命を有する体細胞、例えば皮膚細胞などに該形質転換細胞を導入することにより、治療すべき動物およびヒトへの蛋白の投与においては時間的に限りのあるこの種のインビボ治療生産系を生成することが可能である。獣医学的応用において、動物の改良、治療または疾病予防の目的で、該動物の体細胞部分に一時的ではなく該動物と共にその平均余命にわたり留まるホルモンまたは他の成長因子または蛋白を導入することが望ましい場合がある。
培養による動物生体または動物細胞の形質転換を意図する大多数の努力はマイクロインジェクション法またはレトロウイルス形質転換ベクターの使用に向けられているが、本発明による形質転換法で使用する装置は、全く異なる異種DNAを形質転換すべき体細胞のゲノムに形質転換する方法論にもとづいている。従来技術の装置においては、本発明の装置の現在の使用を特に適したものとする特徴の幾つかを含む一つの示唆がある。クライン（Klein）等（Nature,1987,327,pp.70−73）が述べているように、DNAを担持する極めて小さな金属粒子の加速装置が、培養中の植物細胞の形質転換に有効であることが立証された。この形質転換DNAは物理的に加速された極めて小さな粒子上に被覆されて、実際に弾道状発射体として形質転換すべき組織内に打ち込まれる。この装置が、培養中の植物細胞の形質転換において有用であることが立証されてはいるが、該粒子の衝撃力の調節可能性に欠け、このことは、形質転換すべき組織に該粒子を挿入するための広範囲のエネルギーに渡る該装置の生物の形質転換への使用を困難にするという欠点を構成する。
発明の概要
本発明は、インビボで動物の体細胞を形質転換する方法を提供することを目的とし、該方法では、該動物の体細胞中で表現しようとする蛋白をコードする外来DNAを、該動物細胞中にその生物学的機能を破壊せずに導入するのに十分小さな寸法を有する小さな微粒子上に被覆し、動物をターゲット位置に置き、該粒子を調節可能な放電により加速して、該粒子を該ターゲットに向けて加速し、かつ該ターゲット動物の細胞に該粒子を打ち込み、かくしてこのように処理した該細胞の一部を遺伝的に形質転換し、インビボで該動物中の多数の細胞を形質転換して、該外来遺伝子でコードされた蛋白を生成する。
本発明のもうひとつの目的は、動物を外来遺伝子で処理して、表現外来遺伝子構造と該遺伝子構造を該動物細胞中に持ち込むための極めて小さな金属物質の粒子とを該動物の体細胞中に含ましめた該動物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、動物体の表皮細胞を形質転換して、該表皮細胞が通常の生物学的様式で脱落するまでの限られた時間に渡り該動物中で蛋白を生成する方法を提供することにある。
本発明の他の目的、利点および特徴は、添付図面を参照して記載される以下の明細書の記述から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の方法を実施するために使用する装置の分解斜視図であり、
第２図は第１図の装置の放電室の平面図である。
好ましい態様の説明
本発明は動物または人類の体細胞の形質転換を目的とする。ここで使用する「体細胞」なる用語は、形質転換された場合に、該生物の全ての生殖細胞が遺伝的特性または構成に変化を受けず、従って該動物またはヒトの正常な生物学的生殖の様式に従って生殖を行った場合に、該導入された外来遺伝子物質が該生物の生物学的子孫には移行されないような、動物または人類のこの種の細胞を意味する。
形質転換された動物の体細胞は該ターゲット動物の任意の型の適当な組織であり得る。好ましいターゲット組織は皮膚、筋肉組織および内部器官の組織を包含し、その全てがインビボで形質転換し得る。該動物中で通常露出していない組織の体細胞、即ち内部器官は簡単な形質転換手続きのために一時的に外科手術により露出させることが可能である。体細胞形質転換に適したターゲット器官は肝臓、脾臓、膵臓、心臓、腎臓、脳、骨髄、乳腺、生殖器官、胸腺および胃腸管などをも包含する。他の組の適当な動物体細胞は以下のものを包含する。
（１）ヒトまたは動物から新たに単離した細胞、
（２）（１）に記載の細胞であって、後に短時間にわたり（数分から４週間）培地中で培養または処理したもの（これらは、特に初代培養物と呼ばれる）、および
（３）長期間（一箇月乃至数年）培養により育成した細胞。
このような細胞は形質転換後該動物中に再導入できる。このようなインビボでの動物細胞培養の有利な形式は類器官培養と言われる。類器官とは、インビトロ培養で生成でき、かつ生きた動物中に再度外科的に導入できる、細胞クラスタの器官状の構造または組織である。このような類器官培養は哺乳類において有効に利用され、ヒトでは遺伝療法および他の治療上の用途において、形質転換された体細胞を患者に戻すのに有効である。
本発明は外来遺伝子構造、しばしばキメラ遺伝子構造を動物の体細胞に導入することを目的とする。このような外来遺伝子構造は種が同一もしくは異なっている、他の生物のDNAからなり、これは人為的処置を介して形質転換すべき生物中に、該形質転換すべき生物の細胞中に人工的に導入するなどにより導入される。この外来遺伝子構造は、通常転写生成物または対象とする蛋白のコード配列を、近接調節配列と共に含む。後者は生物の該形質転換細胞の該コード配列によりコードされた該蛋白または転写生成物の表現を生ずるのに有効である。近接調節配列は、例えば転写を開始するのに十分なプロモータ配列および転写または翻訳の終止のいずれであれ、該遺伝子によりコードされた該遺伝子生成物を終止するのに十分なターミネータ配列である。翻訳欠損の適当な転写エンハンサを該外来遺伝子構造に誘発して、全体としての転写過程の効率を更に助長することができ、かつ該蛋白の表現は形質転換された細胞を与える。蛋白以外の遺伝子生成物も該挿入された遺伝子構成により表現することもできる。例えば、この挿入された構造は、元の遺伝子の表現を抑え、もしくは病理的疾患を阻害するのに有効な負のRNAストランドを表現できる。この挿入された構造は、該遺伝生成物の一過性の表現のみが所望である場合には、それ自体DNAに代わるものとしてのRNAである。
本発明では、特別に小さな粒子に被覆したDNAを物理的に加速して、動物体細胞中に挿入するための調節可能な放電を利用する装置を使用する。本発明で使用するのに適した装置は第１図に示されている。この装置は火花放電室12からなり、該火花放電室には２つの電極14が挿入されており、該電極は約１−2mmの間隔で隔置されている。この火花放電室は上方端部における２つの開口16と18とを有する水平に伸びた矩形のものである。開口18はアクセス板20により閉じられている。電極14の反対側に位置する他の開口はキャリヤシート22により閉じられるようになっている。電極14は適当な放電電位の調節可能な電源に接続されている。このような放電電位の電源は、好ましくは１〜２μＦのキャパシタに接続された適当な電気スイッチを含んでおり、該キャパシタに導入される電荷の電位の量は、例えば単巻変圧器の使用により、例えば１〜50,000Vの範囲内で調節可能である。適当なスイッチは、該キャパシタが使用者により安全かつ有利に電極14を介して放電し得るように与えられる。
該キャリヤシート22は火花放電室12の開口18上に配置されるようになっており、好ましくはアルミ鍍金したサラン被覆マイラーのシートである。該火花放電室の開口の上方には、保持スクリーン24がその上方約５〜10mmの位置に配置されている。該保持スクリーンの上方約５〜25mmにはターゲット表面26が配置されている。その使用に際して、動物の体細胞内に形質転換しようとする外来異質遺伝子構造を、当業者には周知の適当なDNA調製法により調製し、金などの耐性材料の小さな粒子上で乾燥する。この粒子は典型的には１〜３μの寸法を有している。上部に乾燥されたDNAを有するこの担体粒子は次いで該キャリヤシート22上に置かれ、該シートは該火花放電室12の頂部に挿入される。ターゲット組織、例えば生きたまたは麻酔された動物を次に該ターゲット表面26に近接して配置する。次いで、水の小滴（寸法約２〜４μｌ）を該電極14の両端を橋絡するように配置する。アクセス板カバー20を、次いで該火花放電室12の頂部上に置く。この時点で、該キャリヤシート22と該ターゲットとの間の雰囲気は、該装置および該ターゲットを包囲し、かつ該雰囲気ガスの大部分を置き換えるのに十分な量のヘリウムを該囲い内に導入することにより、その大部分をヘリウムで置換する。
この時点で、該電極間での火花放電を、適当な電気スイッチの使用により開始し得る。この電気放電の力は該電極間の該火花放電を橋絡し、これらの間に置かれた水の小滴は瞬間的に蒸発する。この水の蒸発力は該火花放電室12内に衝撃波を生じ、外側のあらゆる方向に放射される。この衝撃波の該キャリヤシート22に与える衝撃は、該キャリヤシート22を大きな速度で上方に推進する。この上方に移動するキャリヤシート22は保持スクリーン24と接触するまで上方に加速される。ヘリウムの存在は該キャリヤシートから逃散する薬剤を少なくし、同様にターゲットまで伝播する衝撃波の力を小さくする。保持スクリーン24の位置において、キャリヤシート22は保持され、かつ予めDNAで被覆された粒子は該キャリヤシートから飛び出して該ターゲット表面を自由に移動する。かくして、該粒子は該ターゲット表面を突き抜けて該ターゲット細胞内に侵入する。該粒子が該ターゲット生物または組織の表面に衝撃を与えた際の、該粒子の運動量は電極14に印加された初期放電電位にもとづいて調節することができる。かくして、該電極14を通しての電気エネルギーの放出量の変動により、該粒子が該ターゲットに衝撃を与える速度は調節でき、即ちターゲットの組織内への該粒子の侵入深度は、該電極14全体にわたる放電の調節範囲に渡り連続的に調節できる。
第１図の装置は、培養中の細胞塊および全成長生物を含む様々な形態の分化または未分化の組織の形質転換に有用であることが既に立証されている。ここで議論する研究を通して、該装置は同様に培養中の動物細胞の形質転換または動物の体組織の形質転換のいずれに対しても適していることがわかった。細胞を形質転換しようとする場合、逆転させることができ、かつ第１図の装置における該ターゲット表面26として利用し得るペトリ皿または他の手段に、該細胞を配置することができる。また、動物の種および型に応じて該動物を麻酔し、次いでターゲット表面として機能することになる平坦な表面に設けた穴に該麻酔した動物を配置することにより、該動物の一部分のみを形質転換することも可能である。ターゲット表面26中の穴を介して露出した該動物の部分がこの形質転換法により形質転換されるターゲット組織となる。
実  施  例
ａ）使用するベクター
以下の例では動物内に酵素、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、を表現するように構築された一対のキメラ表現ベクターを使用し、該酵素は該抗生物質クロラムフェニコール耐性を付与する。これらいずれのキメラ遺伝子表現プラスミドも動物の形質転換において有効であることが既に記載され、かつ立証されている。プラスミドpSV2catはゴーマン（Gorman）等の論文（Mol.Cell Boil.,1982,２,pp.1044−1051）に記載されており、表現ベクターpRSVcatはウォーカー（Walker）等の論文（Nature,1983,306,pp.557−561）に記載されている。このプラスミドpSV2catはシミアンウイルス40（SV 40）初期プロモータ、プラスミドpBR322−Tn9からの該クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード領域、SV 40 t−抗原イントロンおよびpBR322ベクターの担持するSV 40初期ポリアデニル化領域を含むキメラcat遺伝子構造にある。このプラスミドは完全なSV 40ウイルスゲノムを含んでおらず、かつ感染性ではない。該プラスミドpRSVcatはpBR322の基本プラスミドでもあり、該プラスミドはキメララウス肉腫ウイルス（RSV）の長い末端繰り返しおよびプロモータフラグメント、Tn9からのcatコード領域、マウスβ−グロブリン遺伝子およびSV40初期転写単位のポリアデニル化領域を含む。このプラスミドもウイルスゲノムを含んでおらず、かつ感染性ではない。同様に使用される関連プラスミドはpRSVNPT IIと記述され、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ−II遺伝子のコード領域、抗生物質カナマイシンおよびG418をコードする領域、およびSV40からのポリアデニル化領域を含む。このプラスミドもウイルスゲノムを含んでおらず、かつ感染性ではない。
ｂ）培養中の哺乳類（ヒト）の細胞
ヒト乳腺の上皮細胞由来のMCF−７と呼ばれるセルラインを得た。このセルラインを、10％の子牛血清を補充したRPMI成長培地によりインビトロで増殖させた。次いで、このセルラインの細胞を35mmの培養物となるようにカバーグラス（２×2cm2）上に塗布し、80％の密集率となるまで育成して、カバーグラス当たり約５×104個の細胞を得た。
次いで、カバープレート上の細胞の単層をプラスミドpRSVNPT IIおよび第１図および第２図に示した形質転換装置を使用した放電粒子−媒介形質転換により形質転換した。このDNAは、金結晶ビーズ上に、金結晶ビーズ1mg当たりDNA0.5μｇなる密度で被覆した。この装置は０（コントロール：加速粒子なし）、６および8KVなる火花放電レベルで操作した。
この形質転換操作後、該細胞を培地に戻し、標準的条件下、即ち選択することなしに、２日間育成した。この期間中、細胞の成長を顕微鏡で観察したところ、正常であることが分かった。
２日後、トリプシンを該細胞培養物に適用して、該カバープレートから該細胞を分離し、かつ該細胞をT 25培養フラスコに塗布した。この培地に、選択剤としてG418を250μg/mlの濃度で添加した。該トリプシン処理した細胞の50％〜70％が該フラスコのプラスチック培養基板に付着し、１時間以内に該表面に広がり、これらの細胞が依然として生きていることを示した。この細胞を選択条件下で３週間生育させた。大多数の細胞が始めの一週間以内に死滅することが観測された。
３週間経過時点で、クラスタ状の50〜5,000細胞からなる各細胞コロニーがこの形質転換された細胞培養物中に観測された。形質転換処理には掛けられていないが、G418選択操作には掛けられたコントロール細胞培養物中には何等生きたコロニーは観察されなかった。次いで、この形質転換された培養物を更に３週間選択条件下に維持した後、コロニー数を計数した。
選択培地中で６週間培養した後に、該形質転換コロニーをトリプシン処理し、プールし、かつT 25培地に塗布した。細胞はこの選択培地中で生育し続けた。形質転換後10週間目に約２千万の細胞が各形質転換培養物から生成し、かくして安定に該形質転換されたMCF−７細胞が原培養物として連続的に生育できた。
６週間目のコロニー計数の結果を、テストした該形質転換条件下での形質転換頻度の評価のために利用した。結果は以下の通りであった。
形質転換条件 耐性コロニー/0.5×105細胞
０（形質転換せず）               0
6KV                             32
8KV                             26
この結果は、該形質転換工程に掛けた細胞に対して、約5.2〜6.4×10-4細胞の範囲内の形質転換頻度が達成されたことを示している。
ｃ）インビボでの哺乳類体細胞
マウスをクロロホルムで麻酔した。各マウスの毛を剃って、その側部に約1cm2の領域を形成した。次に、このマウスを、窓を設けたペトリ皿上に、その毛を剃った部分が該窓にくるようにして配置した。
次いで、pRSVcatのDNAを１〜３μの金粒子に、該金粒子1mg当たりDNA0.1μｇなる割合で被覆した。該DNAは６％ポリエチレングリコール（m.w.＝3,000）を含み、かつ最終濃度が0.6MとなるようにCaCl2を添加した25mMのスペルミジンで沈澱させることにより該金粒子上に被覆した。このDNA被覆金ビーズを次に100％エタノール中で洗浄し、エタノール懸濁液としてキャリヤシート1cm2当たり乾燥金ビーズ0.05mgなる濃度で該キャリヤシートに適用した。
該マウスを配置した該ペトリ皿を、ターゲット表面として、第１図および第２図に示した装置に設置した。電気火花放電に先立って、該キャリヤシートと該ターゲットとの間の領域を15秒間ベリウムでフラッシングして該キャリヤシート上の大気起原の薬物および起こり得るあらゆる該動物に対する衝撃波損傷を減じた。
この形質転換処理後、該動物は全て害を受けておらず、かつ完全に回復したように見えた。いかなる種類の傷も出血も見られなかった。24時間後、該マウスを屠殺し、該皮膚部分を取り出し、cat活性につき検定した。この検定は、アセチル化活性をテストすることにより実施し、その際C14による放射性標識を利用した。かくして、このアセチル化生成物の放射性崩壊を形質転換された酵素の尺度として利用することができる。
種々の放電レベルで行ったテストおよび使用したコントロールのテスト結果は以下に記載の通りである。
0003573454.tif 000002
これらの結果はcat活性がバックグラウンドレベルの少なくとも100倍であることを示している。かくして、該動物に何等害および損傷を与えることなしにその体細胞内に異種遺伝子が導入され、表現された。
ｄ）インビボでの両棲類の体細胞
蛙（ツメガエル）を４℃まで冷却することにより麻酔し、この冷却蛙を、ペトリ皿に形成した窓の部分に配置し、これを第１図および第２図に示した形質転換装置内に、マウスの場合と同じ様式で入れた。
マウスに対して使用した条件および手順を、以下の点を除いて、繰り返した。使用したDNAはpSV2catであった。このDNAで被覆した金ビーズを0.1mg/cm2なる密度でキャリヤシートに載せた。
この場合にも、形質転換工程の後、該動物は全く害されることはなかった。また、該動物には傷も出血も見られなかった。24時間後、この蛙を殺し、形質転換した1cm2の部分を取り出し、cat活性につき検定した。この結果を以下の表に纏めた。
0003573454.tif 000003
かくして、本例ではcat活性のレベルがバックグラウンドレベルの少なくとも50倍を越えることが観測された。かくして、異種遺伝子の導入および表現が、該動物に認識し得る程の損傷または傷害を与えることなく、体細胞内で起こった。
ｅ）インビボでの両棲類の体細胞−全身処理した生成物
ツメガエルの関する第２の実験では、上記と同様な条件下で、但し同一の蛙に２回（背部に電圧16KVでおよび腹部に12KVで）形質転換を行った。この場合、0.1mg/cm2なる密度の代わりに僅かに0.05mg/cm2の密度のDNA被覆金ビーズを使用した。この蛙を20時間後に殺し、形質転換された皮膚の部分を採取した。更に、形質転換されていない皮膚の部分（噴射の際に遮蔽した）をもcat活性検定のために採取した。得られた結果を以下の表に纏めた。
0003573454.tif 000004
該形質転換した皮膚部分の全活性は低いビーズの担持密度の故に減少したが、非形質転換皮膚サンプルは明らかに前の実験と同様に非形質転換動物の皮膚の少なくとも２倍の評価を与えた。このことは、該形質転換された皮膚部分における生産された酵素の全身的蓄積を示している。
ｆ）インビボ形質転換
ホルツマン（Holtzman）ラットを麻酔にかけた。この麻酔にかけたラットの腹腔を外科的に開いて、該動物の肝臓を露出させた。かくして露出した肝臓をもつこの生きた動物を次に粒子−媒介形質転換工程にかけた。ここで、該動物はその露出した肝臓がターゲット表面26となるように、第１図および第２図に示した装置に設置した。
このラット肝臓の形質転換工程において使用したDNAは、金粒子に１μg/mgの割合で被覆したpRSVcatであった。この被覆は20μｇのDNAを100μｌの緩衝液（150mMのNaCl;10mMのTris;pH8.0）、50μｌのCaCl2（2.5M）および20mgの寸法１μの金粒子を併合することにより行った。次に、この混合物を遠心分離し、乾燥し、キャリヤシートに担持する前にエタノール中に再度懸濁させた。該キャリヤシート上での担持率は乾燥金粒子基準で0.05mg/cm2であった。
該キャリヤシートを所定の場所に配置した後、かつ該ラットをその器官を露出した状態で所定の位置に配置した後、該粒子の移動する領域に大気圧下で2l/minのヘリウムを流した。真空封止は何等行わなかった。該ラットの肝臓を10および14KVの火花放電電位にて形質転換操作にかけた。
付着している肝臓は摘出せず、露出させただけである。次に、このラットの腹腔を縫合により閉じた。該動物を該外科手術および形質転換手続きから回収した。術後の動物の肝臓からの出血は全く見られなかった。
２日後、この動物を殺し、かつ該肝臓を摘出した。この摘出した肝臓組織をcat活性につき分析した。該金粒子は該肝臓組織の深さ300μまで侵入していることがわかった。
触媒作用を受けた基質の割合およびcat活性の規定された標準単位の割合として示したcat活性のレベルにより、上記の手続きの結果を以下に纏めた。
0003573454.tif 000005
肝臓以外に、マウスの腹筋組織をも肝臓につき上記したのと同様に遺伝子転移のために処理した。結果は以下に示す通りである。
0003573454.tif 000006
かくして、これらの実施例は、本発明の形質転換技術により、インビボおよびその場での内部器官の一部として存在する体細胞の形質転換を実施し得ることを立証している。この形質転換遺伝子の一時的活性は少なくとも１〜４週間に及ぶことが期待され、かつ数箇月に及ぶより低いレベルでの安定な表現も達成し得る。
ｇ）類器官の形質転換
類器官はインビトロで培養された器官−状の細胞のクラスタまたは組織であり、これは動物器官から単離し、次いで組織培養処理することにより、あるいは予めインビトロで培養した哺乳類細胞の初代培養により得られる。類器官は体細胞形質転換用の興味ある対象である。と言うのは、これらが生きた哺乳動物に再度移植した際に、生存性および血管形成能を維持していることが以前に立証されているからである。
類器官を生成するために、組織サンプルを雌ラットの乳腺組織から、0.2〜0.4cm3のクランプ（clump）として外科的に摘出した。この組織をビーカー内の哺乳動物組織用培地（RPMI;10％子牛血清；および成長因子（例えば、インシュリン）を含む）に添加した。この培地に、更に「支質」組織を消化して、管状構造としての乳腺を除去するために、コラーゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ酵素を添加した。得られた培養物を遠心分離し、次いでナイロンメッシュを通して篩分けして、0.1〜1.0mmの乳腺類器官を、より小さな（５〜30μ）繊維芽細胞および他の型の細胞から分離した。
新たに単離したラットの乳腺からの約100の類器官をピペットで35mmの皿に分取した。過剰の培地を除去した。該皿内の該類器官を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（クローンテック（Clontech））に接合したマウス組織特異的プロモータであるpRSVcatまたはMMTVLTR−Ｂ−Galのいずれかを使用して、15KVにて形質転換処理に付した。
次いで、培地を該類器官と共に該皿に戻した。更に、該類器官を２日間培養したが、その間いくらかの類器官は利用し得る基質に付着したが、残りの類器官は自由に浮遊していた。次に、この類器官を収穫し、適当にCATまたはＢ−Gal活性を検定した。
これらの付着したおよび浮遊していた両方の型の類器官は明らかにCAT活性を示した。同様な結果はＢ−Gal活性の検定からも観察された。
この手続きをラット乳腺（類器官）の上皮細胞の５日−齢の初代培養物についても実施した。該細胞は電圧3KV、6KV、12KVおよび15KVにて、pRSVCATを使用して形質転換した。形質転換後の培養の３日目に該類器官を検定した。全ての電位レベルにおいて、形質転換活性が見られたが、3KVでは明らかに量的に劣っていた。
ヒト乳腺上皮細胞初代培養物を使用した同様な複製を8KVおよび10KVにて、pRSVCATを使用して実施した。同様に培養の２日後に検定を実施したところ、CAT活性がみられた。
同様な類器官のMMTV−Ｂ−Galを使用した同様な形質転換から、一時的に形質転換された細胞の割合の近似を求めることができた。該ラットの乳腺上皮細胞は約５％がＢ−Galを表現した。初代培養物中のヒト乳腺上皮細胞は約３％が正のＢ−Gal活性を示すことが検定により分かった。ヒト乳腺癌のセルライン（MCF−７）を使用した場合には、約５％の該細胞が形質転換されていた。Ｂ−Galを表現するのにより強力なプロモータ（サイトメガロウイルス:CMV）を使用した場合には、20〜35％の細胞がＢ−Gal活性を示すことが分かった。
このことは、類器官がこの粒子−媒介形質転換法に極めて敏感であることを立証している。この証拠を基にして、他の型の組織または器官（例えば、肝臓）からのオルガノイドが同様に形質転換可能であるものと予想することは論理的に妥当である。該形質転換された類器官は生存性を維持しており、かつ動物内に再度移植して、形質転換遺伝子の利点を得ることが可能である。同様な手順は他の再移植可能な組織に対しても利用できる。
ｈ）初代細胞培養
ラットの乳腺類器官を、子牛血清、インシュリンおよび上皮成長因子を含むRPMI培地に塗布した。３〜10日後、該類器官の上皮および筋上皮細胞を、単層培地で生育中の該基質上に展開した。これらの初代培養物を、トリプシンで処理し、かつ新たな皿に再付着させることにより、３〜４回継代培養した。
初代培養で増殖させたラットの乳腺上皮細胞をpRSVCATを用いて３、６、８、12および15KVにて、およびMMTV−Ｂ−GalDNAを使用して８および10KVにて形質転換処理した。該形質転換の前に該培地を取り出し、その後置換した。この処理した細胞を２〜３日間不変の条件下で培養し、次いで検定した。８〜15KVの放電電位の下で形質転換した細胞は高レベルのCAT活性を示し、またＢ−Gal検定は、集団中の３〜５％の単一細胞がＢ−Galを表現することを示した。
このことは、哺乳動物細胞の初代細胞培養がこれらの手続きにより容易に形質転換し得ることを示している。このような初代細胞培養が様々な臨床的応用として提案されているので、このような応用においては、所定の異種蛋白のトランスジェニックな表現をも含めることが今や可能である。
本発明は上記の特定の態様または実施例により何等制限されず、以下の請求の範囲に含まれるこれらの態様または実施例のあらゆる改良をも包含する。
【図１】
0003573454.tif 000007
【図２】
0003573454.tif 000008