(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＨ鎖可変領域が配列番号１記載のアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列を含み、抗体のＬ鎖可変領域が配列番号２記載のアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列を含むガングリオシドＧＭ２に反応するヒト型キメラ抗体。
【請求項２】
形質転換体FERM BP-3931が生産するヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株。
【請求項４】
請求項１または２に記載のヒト型キメラ抗体を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項５】
配列番号１記載の１〜１２０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２記載の１〜１０７番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５および／または６記載のＤＮＡを含む、ＤＮＡ発現用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト化抗体に関する。ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体に比べて患者体内で抗マウスイムノグロブリン抗体ができないため、副作用が減少し、血中半減期も伸び、さらには抗腫瘍エフェクター効果も増大する。従って、ヒト化抗体はヒト癌の治療等においてマウスモノクローナル抗体より優れた治療効果が得られると期待される。
【０００２】
【従来の技術】
一般にマウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることによりヒト体内に抗マウスイムノグロブリン抗体ができてしまい、投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり〔ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），２，８８１（１９８４）  、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）  、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．），８０，９３２（１９８８）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８２，１２４２（１９８５）  〕、抗体がはやくクリアランスされ〔ジャーナル・オブ・ニュクレアー・メディシン（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．），２６，１０１１（１９８５）  、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），６５，１３４９（１９８５）  、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．），８０，９３７（１９８８）〕、その効果を減じてしまうことが知られている〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），  １３５，  １５３０（１９８５）  、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），４６，  ６４８９（１９８６）〕。これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してマウス型モノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体あるいはＣＤＲ（相補性決定部位；Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）移植抗体（再形成ヒト抗体）のようなヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域はマウス由来で定常領域はヒト由来である抗体であり〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８１，  ６８５１（１９８４）〕、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウスイムノグロブリン抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が６倍のびることが報告されている〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，  ４２２０（１９８９）〕。ＣＤＲ移植抗体はヒト抗体のＣＤＲのみをヒト以外の動物由来のＣＤＲに置換した抗体であり〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），  ３２１，  ５２２（１９８６）〕、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びることが報告されている〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），  １４７，  １３５２（１９９１）  〕。
【０００３】
また、抗体の殺細胞活性に関してもマウス抗体Ｆｃ領域に比べヒト抗体Ｆｃ領域の方がヒト補体やヒトエフェクター細胞を活性化することが報告されている。例えば、ガングリオシドＧＤ２  に対するマウスモノクローナル抗体は、ヒト抗体Ｆｃ領域を持つキメラ抗体に変換するとヒトエフェクター細胞を介した抗腫瘍効果が上昇することが報告されているし〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），  １４４，  １３８２（１９９０）  〕、ＣＤＲ移植抗体についても同様の結果が報告されている〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，  ３２３（１９８８）  〕。このような結果は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体はヒト化抗体の方がマウスモノクローナル抗体より好ましいことを示している。
【０００４】
抗体のクラスには、ＩｇＡ  、ＩｇＭ  、ＩｇＧ  、ＩｇＤ  、ＩｇＥ  があり、さらにＩｇＧ  はマウスの場合ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ  、ＩｇＧ２ｂ  、ＩｇＧ３（ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）  の４つのサブクラスに分かれる。動物に抗原を投与した場合、作られる抗体はほとんどの場合ＩｇＭ  かＩｇＧ  である。ＩｇＧ  は分子量およそ１６万で２量体構造を持ち、比較的扱いやすい分子である。ＩｇＭ  は分子量がおよそ９０万という大きな分子であり、Ｊ鎖でつながれた複雑な５量体構造で存在しているため、精製が困難であること、凝集を起こしやすく保存が難しいこと、蛋白分解酵素による部分分解で失活しやすくＦａｂ  を作製することが難しいこと、抗癌剤や毒素などを化学結合させるなどの化学修飾すると結合活性を失う場合が多いことなどの欠点がある〔モノクローナル抗体：原理と実技  （Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ  著，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６〕。また、癌に対する治療効果においてＩｇＧ  クラスのモノクローナル抗体とＩｇＭ  クラスのモノクローナル抗体のどちらが優れているかについては、バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）  らがリンパ球のＴｈｙ−１  抗原に対するＩｇＧ  クラスとＩｇＭ  クラスのモノクローナル抗体を用いて詳細に検討している〔モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔ，  Ｔ．Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎａｎｄ  Ｋ．Ｂ．Ｂｅｃｈｔｏｌ編集，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８０，  ｐ．２７５）〕。それによると、Ｔｈｙ−１  抗原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩｇＧ  クラスとＩｇＭ  クラスのモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を比べた結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの補体依存性抗腫瘍効果はＩｇＭ  モノクローナル抗体が優れていたにもかかわらず、担癌マウスを用いて調べたｉｎ  ｖｉｖｏ  の抗腫瘍効果では、ＩｇＧ  クラスのモノクローナル抗体に有意な抗腫瘍効果が認められたのに対し、ＩｇＭ  クラスのモノクローナル抗体には抗腫瘍効果が認められなかった。さらに、マウスにアイソトープで標識したモノクローナル抗体を投与して血中半減期を調べたところ、ＩｇＧ  クラスのモノクローナル抗体に比べＩｇＭ  クラスのモノクローナル抗体の血中半減期が非常に短いことが明らかになった。このような結果は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体はＩｇＧ  クラスが好ましいことを示している。
【０００５】
ガングリオシドは動物の細胞膜を構成している糖脂質の１種で、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖であるスフィンゴシンおよび脂肪酸とから構成される分子である。ガングリオシドの種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種等によって異なることが知られている。さらに細胞が癌化する過程においては、発現しているガングリオシドが量的および質的に変化を起こすことが明らかになった〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），  ４５，  ２４０５（１９８５）〕。例えば、悪性度が高いといわれている神経外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど認められないガングリオシドＧＤ２，ＧＤ３，ＧＭ２  等が発現していることが報告されている〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），  １５５，  １１３３（１９８２）  、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），  ２５７，１２７５２（１９８２）  、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），４７，  ２２５（１９８７）  、同，  ４７，１０９８（１９８７）  、同，  ４５，２６４２（１９８５）  、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８０，５３９２（１９８３）  〕。
【０００６】
シアル酸をもつ糖脂質であるガングリオシドの一種であるＧＭ２  は、正常細胞にはごく微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノーマ、神経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在し、ＧＭ２  に対するモノクローナル抗体は、これらの癌の治療に有用であると考えられている〔ランセット（Ｌａｎｃｅｔ），  ４８，  ６１５４（１９８８）  〕。しかし、現在までに報告されているＧＭ２  に対するモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＭ  クラスであるか、ラットＩｇＭ  クラス、マウスＩｇＭ  クラスおよびマウスＩｇＧ  クラスである〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ），４６，  ４１１６（１９８６）  、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），    ７９，  ７６２９  （１９８２）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），４８，  ６１５４  （１９８８）  、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ），２６４，  １２１２２  （１９８９）  〕。
【０００７】
抗ガングリオシドＧＭ２  モノクローナル抗体についても、ヒト型キメラ抗体あるいはＣＤＲ移植抗体等のヒト化抗体ができれば、これを使用するに際しては、患者体内で抗マウスイムノグロブリン抗体ができず、副作用が減少し、血中半減期も伸び、さらには抗腫瘍エフェクター効果も増大し、マウスモノクローナル抗体より優れた治療効果が得られると期待される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経外胚葉系由来の癌等の治療等に有用なガングリオシドＧＭ２  に対するヒト化抗体（以下、抗ＧＭ２  ヒト化抗体と略記する）を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、特願平０３−０７７５１８  に出願されているＩｇＧ３クラスに属するガングリオシドＧＭ２  に対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ７５０，ＫＭ７９６  ならびにＩｇＭ  クラスに属するガングリオシドＧＭ２  に対するラットモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ６０３  より抗体重鎖（以下、Ｈ鎖と略記する）可変領域（以下、ＶＨ  と略記する）ｃＤＮＡおよび軽鎖（以下、Ｌ鎖と略記する）可変領域（以下、ＶＬ  と略記する）ｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体Ｈ鎖定常領域（以下、ＣＨ  と略記する）またはヒト抗体Ｌ鎖定常領域（以下、ＣＬ  と略記する）をコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより抗ガングリオシドＧＭ２  ヒト型キメラ抗体を発現させた。そのうち配列番号１に示したアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列をＨ鎖可変領域に含み、配列番号２に示したアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列をＬ鎖可変領域に含む抗ガングリオシドＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  がガングリオシドＧＭ２  に反応し殺細胞活性を示すことを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明はガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト化抗体に関する。本発明のヒト化抗体はいずれのイムノグロブリン（Ｉｇ）クラスに属するものでもよいがＩｇＧ  型のものが好適である。本発明においてヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体を意味する。このうちヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ  およびＶＬ  とヒトの抗体のＣＨ  およびＣＬ  とからなるヒト型キメラ抗体を意味し、ＣＤＲ移植抗体とは、ヒトの抗体のＶＨ  およびＶＬ  のＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＶＨ  およびＶＬ  にそれぞれ置換した抗体を意味する。
【００１１】
ヒト型キメラ抗体の具体例としては、抗体のＶＨ  が配列番号１記載のアミノ酸配列のうちの１〜１２０番目のアミノ酸配列を含み、ＶＬ  が配列番号２記載のアミノ酸配列のうちの１〜１０７番目のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
ＣＤＲ移植抗体の具体例としては、抗体のＶＨ  のＣＤＲが配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬ  のＣＤＲが配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を含む抗体があげられる。
【００１２】
ヒト化抗体のうちヒト型キメラ抗体は以下のようにして製造することができる。
（１）  ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを以下のようにして取得する。
【００１３】
マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、例えば、マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ７９６  産生ハイブリドーマ細胞等よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを、ベクターとしてファージあるいはプラスミドを用いてライブラリーを作成する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の定常領域部分あるいは可変領域部分をプローブとして用い、ＶＨ  をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびＶＬ  をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドを得、組換えファージあるいは組換えプラスミド上のＶＨ  をコードするｃＤＮＡおよびＶＬ  をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１４】
（２）  ヒト型キメラ抗体発現用ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現用ベクターとは、それぞれヒトＣＨ  およびＣＬ  をコードするｃＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒトＣＨ  およびＣＬ  をコードするｃＤＮＡをそれぞれ挿入することにより構築する。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体定常領域をコードするｃＤＮＡを組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７  〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），  ３，１３３（１９９０）  〕、ｐＡＧＥ１０３  〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７  （１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４  〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２７  ，２２３（１９８４）〕、ｐＫＣＲ〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）  〕、ｐＳＧ１βｄ２−４〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）〕等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１０１，１３０７（１９８７）〕、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ  プロモーターとエンハンサー〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，  １４９，  ９６０（１９８７）  〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター〔セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９  （１９８５）〕とエンハンサー〔セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７  （１９８３）〕等があげられる。
【００１５】
（３）  ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
次に、（２）  で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現用ベクターのヒト定常領域の上流に、ヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設ける。このクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域の５’末端側の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて挿入することにより、該合成ＤＮＡを介してヒト抗体定常領域をコードするｃＤＮＡとヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡとが結合挿入されたヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。ここで用いる合成ＤＮＡは、ヒト抗体の定常領域の５’末端側の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の３’末端側の塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて製造する。
【００１６】
（４）  ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターは、例えば、ヒト抗体ＣＨ  をコードするｃＤＮＡを、５’末端付近のＡｐａ  Ｉ部位より３’末端まで切り出し、動物細胞用発現ベクターに挿入することにより構築する。このヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターに、ヒト以外の動物のＶＨ  をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け、このクローニングサイトに、ヒト抗体ＣＨ  の５’末端からＡｐａ  Ｉ部位までの塩基配列とヒト以外の動物の抗体のＶＨ  の３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて、適当な制限酵素により切り出したヒト以外の動物の抗体のＶＨ  をコードするｃＤＮＡを挿入することで、発現したときにＶＨ  のアミノ酸配列に変化を生じないようなヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを取得する。
【００１７】
（５）  ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターは、例えば、ヒト抗体ＣＬ  をコードするｃＤＮＡを、５’末端付近に突然変異誘発によりＥｃｏＲＶ  部位を導入し、ＥｃｏＲＶ  部位より３’末端まで切り出し、プラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４  等のプラスミドに挿入することにより構築する。このヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターに、ヒト以外の動物の抗体のＶＬ  をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け、このクローニングサイトに、ヒト抗体ＣＬ  の５’末端からＥｃｏＲＶ部位までの塩基配列とヒト以外の動物の抗体のＶＬ  の３’末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて、適当な制限酵素により切り出したヒト以外の動物の抗体のＶＬ  をコードするｃＤＮＡを挿入することで、発現したときにＶＬ  のアミノ酸配列に変化を生じないようなヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを取得する。
【００１８】
（６）  ヒト型キメラ抗体発現ベクターの宿主細胞への導入
ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターとヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターとを宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への導入に際しては、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターにスプライシングシグナル（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）  等を導入することにより、ｍＲＮＡを安定化させることができる〔セル（Ｃｅｌｌ），１７  ，７３７（１９７９）〕。
【００１９】
宿主細胞への導入法としては、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターをエレクトロポレーション法〔特開平２−２５７８９１、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕等により同時に宿主細胞に導入する方法とヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクター（タンデム発現ベクター）を構築し、これを宿主細胞に導入する方法〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，６４（１９９１）  〕等があげられる。とくに、タンデム発現ベクターを用いる方法の方が、ヒト型キメラ抗体の発現量が高く、また、Ｈ鎖とＬ鎖の発現量がほぼ一致する等の理由から好ましい。
【００２０】
次に、ヒト化抗体のうち、ＣＤＲ移植抗体の製造法を説明する。
まず、ＣＤＲ移植抗体発現ベクターをＷｉｎｔｅｒらの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，  ３２３（１９８８）  〕に従って以下のようにして構築する。
ヒト以外の動物の抗体のＶＨ  の３つのＣＤＲのペプチド、例えば、配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするｃＤＮＡの両端にそれぞれヒト抗体のＶＨ  の対応するＣＤＲの両端の数個のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するように設計された３つの合成ＤＮＡをプライマーとし、ヒト抗体のＶＨ  を有するプラスミドを鋳型としてＤＮＡの合成を行う。ヒト抗体ＶＨ  を有するプラスミドとしては、ヒト抗体ＮＥＷ由来の配列を有するＭ１３  プラスミド〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ），２５３  ，５８５（１９７８）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕等があげられる。
【００２１】
得られたＤＮＡを前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターに挿入することにより、ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築する。
同様に、ヒト以外の動物の抗体のＶＬ  の３つのＣＤＲのペプチド、例えば、配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするｃＤＮＡの両端にそれぞれヒト抗体のＶＬ  の対応するＣＤＲの両端の数個のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するように設計された３つの合成ＤＮＡをプライマーとし、ヒト抗体のＶＬ  を有するプラスミドを鋳型としてＤＮＡの合成を行う。ヒト抗体ＶＬ  を有するプラスミドとしては、ヒトミエローマタンパク質（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓｐｒｏｔｅｉｎ）ＲＥＩ由来の配列を有するＭ１３  プラスミド〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ），４５  ，５１３（１９７４）  、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８８）〕等があげられる。
【００２２】
得られたＤＮＡを前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターに挿入することにより、ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築する。
また、ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターはヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲをヒト以外の動物の抗体のＨ鎖およびＬ鎖の対応するＣＤＲにそれぞれ置換したアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡを合成し、前記したヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築法と同様にしてヒト型キメラ抗体Ｈ鎖またはＬ鎖発現用ベクターに挿入することにより構築することもできる。
【００２３】
ＣＤＲ移植抗体発現ベクターは、ヒト型キメラ抗体発現べクターと同様にして宿主細胞に導入することにより、ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換株を得ることができる。
ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１、以下ＳＰ２／０  細胞と略記する）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３  細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下ｄｈｆｒと略記する）が欠損したＣＨＯ細胞〔ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６，（１９８０）〕、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下ＹＢ２／０  細胞と略記する）等があげられる。
【００２４】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８および牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地により選択する。ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株の具体例としては、ガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株であるＫＭ９６６  があげられる。ＫＭ９６６  は平成４年７月１５日付で、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−３９３１として寄託されている。
【００２５】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト型キメラまたはＣＤＲ移植抗体を生成蓄積させることができる。培養液中のヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ  法：  抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  刊、１９８８年）により測定する。形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系を利用して抗体の生産量を上昇させることができる。
【００２６】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体は、上記培養液の上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  刊、１９８８年）。このようにして得られるヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の具体例としては、ガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  等があげられる。
【００２７】
ヒト型キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体の反応性はＥＬＩＳＡ  法等で測定する。精製した抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウエスタンブロッティング法（抗体実験マニュアル、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  刊、１９８８年）等で測定する。ガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の培養癌細胞株に対する結合活性は、蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ  法等により測定する。ヒト型キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の培養癌細胞株に対する補体依存性殺細胞活性（ＣＤＣ  活性）、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）は、免疫学実験入門（松橋ら、学会出版センター刊、１９８１年）記載の方法により測定する。
【００２８】
本発明のヒト化抗体はヒト癌細胞と特異的に結合し、ヒト癌細胞に対してＣＤＣ  活性およびＡＤＣＣ活性を示すため、ヒト癌の治療等において有用である。
本発明のヒト化抗体は、単独でまたは少なくとも１種以上の製剤上許容される補助剤と共に抗腫瘍組成物として用いることができる。例えば、ヒト化抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成物とする。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を作成する。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩等を含有することができる。
【００２９】
本組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒト化抗体を０．２  〜２０ｍｇ／ｋｇ／日投与する。投与は、一日一回（単回投与または連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、３週間に１回静脈注射により行う。
本組成物は、ヒトを含む哺乳動物のメラノーマ、神経芽細胞腫等の腫瘍の治療に効果が期待される。
【００３０】
以下に、本発明の実施例および参考例を示す。
【００３１】
【実施例】
実施例１  抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体の製造
１．マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０産生ハイブリドーマ細胞およびラット抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ−６０３産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ−７９６産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３４０）、マウス抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ−７５０産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３３９）、およびラット抗ＧＭ２  モノクローナル抗体ＫＭ−６０３産生ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６３６）の１×１０８  細胞より、それぞれｍＲＮＡを取得した。
【００３２】
２．モノクローナル抗体ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記１項で取得したＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０のｍＲＮＡの各５μｇ  から、ファルマシア社製のｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（  商品番号  ２７−９２６０−０１）を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したそれぞれのｃＤＮＡの約６μｇ  を１０μｌ  の滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧ  型抗体のＨ鎖に対応する約１．８ｋｂ  のｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１  μｇ  回収した。次に、各々の約１．８ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  および約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  と、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクター〔Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩで切断後、ウシ腸アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで）  処理したもの：ストラタジーン社製〕１  μｇ  をＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌ  に溶解し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１７５  単位を加えて、１２℃にて２４時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。各々の反応液のうち４μｌ  を常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．９５、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用してラムダファージにパッケージングし、これらを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．９５−１０７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ〔バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），５  ，３７６（１９８７）〕に感染させて、ＫＭ−７９６，ＫＭ−７５０  のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約４千個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．１１２  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕。
【００３３】
３．ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記１項で取得したＫＭ−６０３のｍＲＮＡの５μｇ  から、ファルマシア社製のｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号  ２７−９２６０−０１）を用いて、両端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。作製したｃＤＮＡの約６μｇ  を１０μｌ  の滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＭ  型抗体のＨ鎖に対応する約２．２ｋｂ  のｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１  μｇ  回収した。次に、約２．２ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  および約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  と、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクター〔Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩで切断後、  ウシ腸アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）  で処理したもの：ストラタジーン社製〕１μｇ  をＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌ  に溶解し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１７５  単位を加えて、１２℃にて２４時間インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。これら反応液のうち４μｌ  を常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．９５、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダファージにパッケージングし、これを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．９５−１０７、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕に従って、ギガパックゴールドに付属の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させて、ＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約１万個のファージクローンを取得した。次にファージを常法に従い、ニトロセルロースフィルター上に固定した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．１１２  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９刊行〕。
【００３４】
４．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
２項で作製したＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．１０８  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９年刊行〕に従い、マウス免疫グロブリンの定常領域のｃＤＮＡ〔Ｈ鎖はマウスＣｒ３  ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｗｅｌｓ  ら：ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３，２０４１−２０４６，１９８４）  、Ｌ鎖はマウスＣｋ  ｃＤＮＡ  のＨｐａＩ−ＸｈｏＩ  断片（Ｈｉｅｔｅｒ  ら：Ｃｅｌｌ  ，  ２２，１９７−２０７，１９８０）〕を３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く結合したファージクローンを取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）  を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  に変換し、ＫＭ−７９６のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１およびＫＭ−７９６のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７９６Ｌ１（図１）、ＫＭ−７５０のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７５０Ｈ１およびＫＭ−７５０のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ７５０Ｌ１（図２）を取得した。ｐＫＭ７９６Ｈ１，ｐＫＭ７５０Ｈ１  およびｐＫＭ７９６Ｌ１，ｐＫＭ７５０Ｌ１  をＥｃｏＲＩを用いて切断したところ、ｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｈ１には約１．８ｋｂ  のｃＤＮＡ断片が、ｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１には約０．９ｋｂ  のｃＤＮＡ断片がそれぞれ挿入されていた。
【００３５】
５．ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
上記３項で作製したＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、２．１０８  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９年刊行〕に従い、マウス免疫グロブリンの定常領域の染色体遺伝子〔マウスＣμ遺伝子を含む約１１．５ｋｂのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ  断片（Ｋａｔａｏｋａら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，９１９−９２３，１９８０）およびマウスＣｋ遺伝子を含む約３ｋｂ  のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ  断片（Ｓａｋａｎｏ  ら：Ｎａｔｕｒｅ，２８０，２８８，１９７９）  〕を３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く結合したファージクローンを取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）  を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  に変換し、ＫＭ−６０３のＨ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１およびＫＭ−６０３のＬ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６０３Ｌ１を取得した（図３）。ｐＫＭ６０３Ｈ１およびｐＫＭ６０３Ｌ１をＥｃｏＲＩを用いて切断したところ、ｐＫＭ６０３Ｈ１には約２．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片が、ｐＫＭ６０３Ｌ１には約０．９ｋｂ  のｃＤＮＡ断片がそれぞれ挿入されていた。
【００３６】
６．Ｈ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列
上記４項および５項で得られたＨ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡの可変領域の塩基配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いてダイデオキシ法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１３．４２  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８９年刊行〕により決定した。すべて５’端に開始コドンＡＴＧ  と推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のｃＤＮＡであった。決定された各々のｃＤＮＡの塩基配列より、ＫＭ−７９６、ＫＭ−７５０、ＫＭ−６０３のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を決定した。配列番号１にＫＭ−７９６のＨ鎖、配列番号２にＫＭ−７９６とＫＭ−７５０のＬ鎖、配列番号３にＫＭ−７５０のＨ鎖、配列番号４にＫＭ−６０３のＨ鎖、配列番号５にＫＭ−６０３のＬ鎖のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００３７】
７．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターの構築
（１）モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを運ぶベクターｐＡＧＥ１４７  の構築
特開平１−６３３９４  に記載のプラスミドｐＰＭＯＬ１の２μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），  ６ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、２０単位のＳｍａＩを加え、３０℃で３時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムの濃度が５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを含む約０．６Ｋｂ  のＤＮＡ  断片を回収した。
【００３８】
次に、下記２種の合成ＤＮＡ  を自動ＤＮＡ  合成機〔３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）  製〕を用いて合成した。
【００３９】
【化１】
0003565572.tif 000002
【００４０】
得られた合成ＤＮＡ  の２５ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）ずつを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６），  １０ｍＭ  塩化マグネシウム，  ５ｍＭ    ＤＴＴ，  ０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  アデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰ  と略記する）からなる緩衝液１０μｌ  に溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡ  キナーゼを加え、３７℃で３０分間反応させることにより５’末端をリン酸化した。
上記で得られたプラスミドｐＰＭＯＬ１由来のＣｌａＩ−ＳｍａＩＩ断片（０．６Ｋｂ）０．０５  μｇ  と５’末端がリン酸化された２種の合成ＤＮＡ  （１ピコモルずつ）およびＨｉｎｄＩＩＩ  リンカー（５’−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’；  宝酒造社製）  （１ピコモル）を６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），  ６．６ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭ  ＤＴＴ  および０．１ｍＭ  ＡＴＰ  からなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ（宝酒造社製、以下同じ）２００  単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。エタノール沈澱により該ＤＮＡ  断片を回収した後、２０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），  ６ｍＭ塩化マグネシウム，  １００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  および１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により該ＤＮＡ  断片を回収した。
【００４１】
一方、プラスミドｐＡＧＥ１０７  〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３，  １３３（１９９０）〕１μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），  ６ｍＭ塩化マグネシウム，  １００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、Ｇ４１８耐性遺伝子およびアンピシリン（以下、Ａｐという）耐性遺伝子を含む約６．０Ｋｂ  のＤＮＡ  断片を回収した。
【００４２】
上記で得られたプラスミドｐＡＧＥ１０７  由来ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（６．０Ｋｂ）０．３μｇ  とプラスミドｐＰＭＯＬ１由来ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（０．６３Ｋｂ）０．０１μｇ  を６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），  ６．６ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭ  ＤＴＴ  および０．１ｍＭ  ＡＴＰ  からなる緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ２００  単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４に示したプラスミドｐＡＧＥ１４７  を得た。
【００４３】
（２）β−グロブリン３’スプライシングシグナル（ＳＰ）を運ぶベクターｐＡＧＥ１４８  の構築
構築したヒト型キメラ抗体発現ベクターの抗体定常領域遺伝子の下流にβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを導入するため、β−グロブリン３’スプライシングシグナルを有し、かつヒト型キメラ抗体発現ベクターと同一の遺伝子（ヒト抗体定常領域遺伝子は除く）を有するベクターであるｐＡＧＥ１４８  を以下のようにして構築した。
【００４４】
特開平２−２５７８９１に記載のｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ  消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約６．６７ｋｂと約１．９８ｋｂのＤＮＡ  断片を各々約０．２  μｇ  回収した。
【００４５】
次に、（１）で得られたｐＡＧＥ１４７  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６６ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．２  μｇ  回収した。
【００４６】
次に、上記で得られたｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３  のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約６．６７ｋｂ）０．１  μｇ  、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１．９８ｋｂ）０．１  μｇ  とｐＡＧＥ１４７  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片（約０．６６ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え、４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５に示したプラスミドｐＡＧＥ１４８  を得た。
【００４７】
（３）ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１またはｐＫＭ７５０Ｈ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ  部位および３’末端付近のＭａｅＩＩＩ部位で切断し、配列番号１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  と共にヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクター  ｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１に連結させた（図６）。
【００４８】
４項で得られたｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｈ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＭａｅＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４３ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１．０  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ７９６Ｈ１またはｐＫＭ７５０Ｈ１のＥｃｏＲＩ−ＭａｅＩＩＩ断片（約０．４３ｋｂ）０．１μｇ  およびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約９．０ｋｂ）０．１  μｇ  および配列番号１２に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え、４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図６に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１を得た。
【００４９】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、  ＫＭ−７９６，ＫＭ−７５０  由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図７）。
ｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡ  と略記する）からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．４ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭ１，ｐＫＭ７５０ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  およびｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図７に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１  およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１  を得た。
【００５０】
（４）ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ  部位および３’末端付近のＡｆｌＩＩＩ部位で切断し、配列番号１３に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  と共にヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクター  ｐＣｈｉＩｇＬＡ１に連結させた（図８）。
【００５１】
ｐＫＭ７９６Ｌ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＡｆｌＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．３９ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１  の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＥｃｏＲＶ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１μｇ  回収した。
【００５２】
次に、上記で得られたｐＫＭ７９６Ｌ１，ｐＫＭ７５０Ｌ１  のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片０．１  μｇ  およびｐＣｈｉＩｇＬＡ１  のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ  断片０．１  μｇ  および配列番号１３に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図８に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１を得た。
【００５３】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１へモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを以下の方法により導入した（図９）。
ｐＣｈｉ７９６ＬＩ１またはｐＣｈｉ７５０１ＬＩ１  の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．２ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例２で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクター  ｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。
【００５４】
次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＬＩ１またはｐＫＭ７５０ＬＩ１  のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１  μｇ  およびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図９に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１を得た。
【００５５】
次に、プラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、  ＫＭ−７９６  およびＫＭ−７５０  由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図１０）。
ｐＣｈｉ７９６ＬＭ１またはｐＣｈｉ７５０ＬＭ１の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６ＬＭ１またはｐＫＭ７５０ＬＭ１  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  およびｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１０に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１  およびｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１  を得た。
【００５６】
８．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖タンデム発現ベクターの構築
１つのベクター上にヒト型キメラ抗体のＨ鎖をコードするｃＤＮＡとＬ鎖をコードするｃＤＮＡが存在するタンデム発現ベクターを以下のようにして構築した（図１１および図１２）。
７項で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１  およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１  の各３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約５．９ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、特開平３−２２９７９  に記載のｐＡＧＥ１０７  の２  μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．２  μｇ  回収した。次に、ｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１  またはｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１  のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ  断片０．１  μｇ  とｐＡＧＥ１０７  のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ  断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１１に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７  およびｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７  を得た。
【００５７】
次に、ｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７  またはｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５  単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約７．５ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、ｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１  またはｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１  の３μｇ  を３０μｌ  の２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化カリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、２０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５  単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＸｈｏＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約９．３ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７  またはｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７  のＭｌｕＩ−ＣｌａＩ  断片０．１  μｇ  とｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１  またはｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１  のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩ  断片０．１  μｇ  とを全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１２に示したプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＬ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＬ１を得た。
９．ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１の抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを５’末端のＥｃｏＲＩ  部位および３’末端付近のＳｔｙＩ部位で切断し、配列番号１４で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  と共にヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクター  ｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１に連結させた（図１３）。
【００５８】
５項で得られたｐＫＭ６０３Ｈ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＳｔｙＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＡｐａＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１．０  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６０３Ｈ１のＥｃｏＲＩ−ＳｔｙＩ断片（約０．４ｋｂ）０．１  μｇ  およびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約９．０ｋｂ）０．１  μｇ  および配列番号１４で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１３に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１を得た。
【００５９】
次にプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、  ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図１４）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＨＭ１の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．３ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。
【００６０】
次に、７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得たｐＣｈｉ６０３ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  およびｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１４に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１  を得た。
【００６１】
１０．ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、プラスミドｐＫＭ６０３Ｌ１の抗体可変領域ｃＤＮＡの５’末端のＥｃｏＲＩ  部位および３’末端付近のＡｆｌＩＩＩ部位で切断し、配列番号１５で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  とともにヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクター  ｐＣｈｉＩｇＬＡ１に連結させた（図１５）。
【００６２】
５項で得られたｐＫＭ６０３Ｌ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｆｌＩＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１  の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＥｃｏＲＶを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６０３Ｌ１のＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片０．１  μｇ  およびｐＣｈｉＩｇＬＡ１  のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１  μｇ  および配列番号１５で示した塩基配列を有する合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１５に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１を得た。
【００６３】
次に、プラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１へモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター／エンハンサーを以下の方法により導入した（図１６）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＩ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．３ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、参考例２で得られたｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＩ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１  μｇ  およびｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１６に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１を得た。
【００６４】
次にプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１へβ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、  ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図１７）。
上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＭ１の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％  ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３μｇ  回収した。次に、７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３μｇ  を３０μｌ  の３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）  ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．５ｍＭ  ＤＴＴ  および０．０１％  ＢＳＡ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏＩと１０単位のＫｐｎＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＣｈｉ６０３ＬＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  およびｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４  ℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図１７に示したプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１  を得た。
【００６５】
１１．ＫＭ−７９６およびＫＭ−７５０由来抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体のＹＢ２／０  細胞における発現
ＹＢ２／０  細胞へのプラスミドの導入は、Ｍｉｙａｊｉらの方法に従い、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３−１４０，１９９０〕にて行った。
【００６６】
８項で得られたｐＣｈｉ７５０ＨＬ１またはｐＣｈｉ７９６ＨＬ１の４μｇを４×１０６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へ導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０）［ＦＣＳを１０％、７．５％ＮａＨＣＯ３を１／４０量、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を０．５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）］に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μｌずつ分注した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体活性を以下に示したＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００６７】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ  法）
２ｎｇ  のＧＭ２  （Ｎ−アセチルＧＭ２  、ベーリンガー・マンハイム社製）またはその他のガングリオシドを５ｎｇ  のフォスファチジルコリン（シグマ社製）と２．５ｎｇ  のコレステロール（シグマ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。この溶液２０μｌ  またはこの溶液の希釈液２０μｌ  を９６ウェルマイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％ＢＳＡ  を含むＰＢＳ  でブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、精製したマウスモノクローナル抗体または精製したヒト型キメラ抗体を５０〜１００  μｌ  加え、１〜２時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ  で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を５０〜１００  μｌ  加え、１〜２時間室温で反応させた。ＰＢＳ  で洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２，２’アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−  スルホン酸）二アンモニウムの５５０ｍｇ  を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）  に溶解し、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶液〕を５０〜１００  μｌ  加えて発色させ、ＯＤ４１５  を測定した。
【００６８】
得られたクローンの中で、ＥＬＩＳＡ  法で最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約１．０  μｇ／ｍｌであった。
上記抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、メソトレキセート（以下、ＭＴＸ  と略記する）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ  分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ  法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約５．０  μｇ／ｍｌであった。
【００６９】
上記５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を２００ｎＭ  含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ  分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃で１〜２週間培養して、２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ  法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約１０μｇ／ｍｌであった。ｐＣｈｉ７５０ＨＬ１およびｐＣｈｉ７９６ＨＬ１から得られた２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンをそれぞれ形質転換株ＫＭ９６６  （ＫＭ−７９６由来ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  生産株）およびＫＭ９６７  （ＫＭ−７５０由来ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６７  生産株）と命名した。
【００７０】
上記形質転換株ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  が抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体を発現することをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により以下のようにして確認した。
形質転換株ＫＭ９６６  、ＫＭ９６７  の各々をＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を２００ｎＭ  含むＧＩＴ  培地（日本製薬社製）に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に１００ｍｌ  ずつ分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。該培養液約１．０  リットルよりアフィゲルプロテインＡ  ＭＡＰＳ−ＩＩ  キット（バイオラッド社製）を用いて、精製抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体を各約５ｍｇ  ずつ取得した。この精製抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  の約２μｇ  を、公知の方法〔レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）  、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）  ２２７，６８０，（１９７０）〕に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図１８に示した。図１８に示したように、ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  ともに還元条件下では抗体Ｈ鎖の分子量は約５０キロダルトン、抗体Ｌ鎖の分子量は約２５キロダルトンであり、正しい分子量のＨ鎖およびＬ鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではヒト型キメラ抗体の分子量はＫＭ９６６，ＫＭ９６７  ともに約１５０  キロダルトンであり、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖よりなる正しい大きさの抗体の発現が確認された。
【００７１】
１２．ＫＭ−６０３由来抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体のＹＢ２／０細胞における発現
１１項と同様にエレクトロポレーション法で９項で得られたｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１およびｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１の２μｇを４×１０６個のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へ導入後、４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（１０）に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μｌずつ分注した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体活性を前記に示したＥＬＩＳＡ法で測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ２ヒト型キメラ抗体量は約０．１μｇ／ｍｌであった。
【００７２】
上記抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ  ずつ分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、２〜３週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ  法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約０．３  μｇ／ｍｌであった。
【００７３】
上記５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を２００ｎＭ  含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ  ずつ分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、２〜３週間培養して、２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ  法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約０．５  μｇ／ｍｌであった。
【００７４】
上記２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を５００ｎＭ  含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウェルプレートに２ｍｌ  分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養して、５００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンを誘導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体活性をＥＬＩＳＡ  法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体量は約１．０  μｇ／ｍｌであった。この５００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンを形質転換株ＫＭ９６８  と命名した。
【００７５】
上記形質転換株ＫＭ９６８  が抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体を発現することをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより以下のようにして確認した。
形質転換株ＫＭ９６８  を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を５００ｎＭ  含むＧＩＴ  培地（日本製薬社製）に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に１００ｍｌ  分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、５  〜７  日間培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収した。該培養液約３．０  リットルよりアフィゲルプロテインＡ  ＭＡＰＳ−ＩＩ  キット（バイオラッド社製）を用いて、精製抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体を約１ｍｇ  取得した。この精製抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６８  の約２  μｇ  を、公知の方法〔レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）  、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）  ２２７，６８０，１９７０〕に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図１９に示した。図１９に示したように、還元条件下では抗体Ｈ鎖の分子量は約５０キロダルトン、抗体Ｌ鎖の分子量は約２５キロダルトンであり、正しい分子量のＨ鎖およびＬ鎖の発現が確認された。また、非還元条件下ではヒト型キメラ抗体の分子量は約１５０  キロダルトンであり、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖よりなる正しい大きさの抗体の発現が確認された。
【００７６】
１３．抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体の反応特異性
ガングリオシドＧＭ１  ，Ｎ−アセチルＧＭ２  （ベーリンガー・マンハイム社製），Ｎ−グリコリルＧＭ２  ，Ｎ−アセチルＧＭ３  ，Ｎ−グリコリルＧＭ３  ，ＧＤ１ａ，ＧＤ１ｂ（ヤトロン社製），ＧＤ２  ，ＧＤ３  （ヤトロン社製），ＧＱ１ｂ（ヤトロン社製）に対する抗ＧＭ２  キメラ抗体の反応性をＥＬＩＳＡ  法で測定した。その結果を第１表に示す。なお、ＧＭ１  と  ＧＤ１ａ  はウシ脳より、Ｎ−グリコリルＧＭ２  と  Ｎ−  グリコリルＧＭ３  はマウス肝臓より、Ｎ−アセチルＧＭ３  はイヌ赤血球より、ＧＤ２  は培養細胞株ＩＭＲ３２  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２７  ）よりそれぞれ公知の方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６３，１０９１５，  １９８８〕に準じて精製した。
【００７７】
第１表に示したように、抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  はＧＭ２  に特異的に反応することが確認されたが、反応の強さは、ＫＭ９６６  の方がＫＭ９６７  より大きかった。一方、ＫＭ９６８（ＫＭ−６０３由来ヒト型キメラ抗体）にはＧＭ２  に対する反応性は認められなかった。
【００７８】
【表１】
0003565572.tif 000003
【００７９】
１４．抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  の癌細胞との反応性（蛍光抗体法）
ヒト肺小細胞癌培養細胞株ＱＧ９０〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），４９，２６８３（１９８９）  〕、ＮＣＩ−Ｈ６９  （ＡＴＣＣ    ＨＴＢ１１９）、ＮＣＩ−Ｈ１２８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ１２０）、ＳＢＣ−１  （ＪＣＲＢ  ０８１６）、ＳＢＣ−２  （ＪＣＲＢ  ０８１７）、ＳＢＣ−３  （ＪＣＲＢ  ０８１８）、ＳＢＣ−５  （ＪＣＲＢ  ０８１９）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ（ＪＣＲＢ  ０８１２）、Ｌｕ−１３４−Ａ−Ｈ（ＪＣＲＢ  ０２３５）、Ｌｕ−１３９（ＲＣＢ  ４６９）、Ｌｕ−１３０（ＲＣＢ    ４６５）、Ｌｕ−１３５（ＲＣＢ    ４６８）、Ｌｕ−１３４−Ｂ（ＲＣＢ    ４６７）、Ｌｕ−１４０（ＲＣＢ    ４７０）、ＰＣ−６〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８  〕、ヒト肺扁平上皮癌培養細胞株  ＰＣ−１〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８  〕、ＰＣ−１０  〔内藤ら、癌と化学療法，５，（ｓｕｐｐｌ．）８９，１９７８  〕、Ｃｏｌｏ１６〔Ｍｏｏｒら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）３５，２６８４，１９７５〕、Ｃａｌｕ−１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ５４）、ＳＫ−ＬＣ−４  （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，４４４１，１９８８）  、ヒト肺腺癌培養細胞株ＰＣ−７（早田ら、人癌細胞の培養，１３１，１９７５）、ＰＣ−９〔Ｋｉｎｊｏ  ら、ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ），３９，  １５，１９７９〕、ＰＣ−１２  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７２１  ）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ（ＪＣＲＢ００８１）、ＨＬＣ−１  （ＲＣＢ    ０８３）、ヒト肺大細胞癌培養細胞株  ＰＣ−１３  （大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３  ，６９７，１９７８  ）、Ｌｕ６５（ＪＣＲＢ００７９）、ＣＡＬＵ−６（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ５６  ）、ＳＫ−ＬＣ−６  （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，４４４１，１９８８）、ヒト神経芽細胞腫培養細胞株ＹＴ−ｎｕ  〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｊａｐ．），２７，  ６９７，１９７７  〕、ＮＡＧＡＩ  〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｊａｐ．），２９，  ２８９，１９７９  〕、ＮＢ−１〔石川ら、アクタ・パソロジー・ジャパン（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｊａｐ．），２７，  ６９７，１９７７  〕、ＩＭＲ３２  （ＡＴＣＣＣＣＬ１２７  ）、ＧＯＴＯ（ＪＣＲＢ  ０６１２）、ＮＢ−９（ＲＣＢ    ４７７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ  （ＡＴＣＣ  ＨＴＢ１０  ）、ヒト脳腫瘍（グリオーマ）培養細胞株  Ｐ１２２（ＥＭＢＯ  Ｊ．，６  ，２９３９，１９８７）、Ａ１７２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６２０  ）、Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６９０  ）、Ｕ−１１８ＭＧ  （ＡＴＣＣ  ＨＴＢ１５  ）、ヒト白血病培養細胞株  ＨＳＢ−２  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２０．１  ）、ＡＴＮ−１  、Ｕ−９３７  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９３  ）、ＨＰＢ−ＡＬＬ  （大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３  ，６９７，１９７８  ）、ＣＣＲＦ−ＳＢ  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２０）、ＫＯＰＮ−Ｋ（羽井、肺癌，２５  ，５２４，１９８５）、ＴＹＨ  〔原中ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）���３６，  ３１３，１９８５  〕、ＭＯＬＴ−３  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５２  ）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１１９  ）、ＴＡＬＬ−１（ＪＣＲＢ  ００８６）、ＮＡＬＬ−１（大屋ら、蛋白質核酸酵素，２３  ，６９７，１９７８  ）、ＣＣＲＦ−ＳＢ  （ＪＣＲＢ  ００３２）、ＴＨＰ−１  （ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２０２）、ＨＥＬ９２−１−７  （ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１８０）、ヒト悪性黒色腫培養細胞株  Ｃ２４・２２（特願平３−３１４９８１）、ＫＨｍ−３／Ｐ  （Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，５９，７７５，１９７７）、Ｇ３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４２４  ）のそれぞれ１ｘ１０６  個をＰＢＳ  に懸濁させ、マイクロチューブ（トレフ社製）にとり遠心分離（３０００ｒｐｍ  、２  分）して細胞を洗浄後、ＫＭ９６６  またはＫＭ９６７  を５０μｌ  （５０μｇ／ｍｌ）加えて攪拌し、４℃で１  時間反応させた。反応後、ＰＢＳ  で３回遠心分離して洗浄した後、フルオレッセインイソシアネートで蛍光標識したプロテインＡ（３０倍希釈、ベーリンガーマンハイム山之内社製）２０μｌ  を加えて攪拌後、４℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ  で３回遠心分離して洗浄した後、さらにＰＢＳ  に懸濁し、フローサイトメーター  ＥＰＩＣＳ    Ｅｌｉｔｅ（コールター社製）で解析を行った。対照としてヒト型キメラ抗体無添加で上記と同様の操作を行い解析した。その結果を第２表に示した。ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  は肺小細胞癌株の１４例中９例（ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＳＢＣ−１  、ＳＢＣ−３  、ＳＢＣ−５  、Ｌｕ−１３９、Ｌｕ−１３０、Ｌｕ−１３５、Ｌｕ−１３４−Ｂ、Ｌｕ−１４０）、肺扁平上皮癌株の５例中２例（ＰＣ−１０  、Ｃａｌｕ−１）、肺腺癌株の５例中２例（ＰＣ−９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）、肺大細胞癌株の４例中２例（ＰＣ−１３  、ＳＫ−ＬＣ−６  ）、神経芽細胞腫株の７例中７例（ＹＴ−ｎｕ  、ＮＡＧＡＩ  、ＮＢ−１、ＩＭＲ３２  、ＧＯＴＯ、ＮＢ−９、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ  ）、脳腫瘍（グリオーマ）株の４例中４例（Ｐ１２２、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ−１１８ＭＧ  ）と反応を示した。一方、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６７  はいずれの培養細胞株とも反応しなかった。以上の結果は、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  が脳腫瘍、末梢神経系腫瘍および肺癌の診断、治療等に有用であることを示している。
【００８０】
【表２】
0003565572.tif 000004
【００８１】
１５．抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果：補体依存性細胞障害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ  ）
（１）  標的細胞の調製
１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した標的細胞ＳＢＣ−３  、Ｌｕ−１３５、ＰＣ−１０  、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、ＰＣ−１３  、ＮＡＧＡＩ  、ＧＯＴＯおよびＡ１７２をそれぞれ５  ×１０６  個／ｍｌ  になるように調製し、Ｎａ２５１ＣｒＯ４  を１００  μＣｉ／５ｘ１０６  個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で３回洗浄した。次いで４℃で３０分間培地中に放置し、自然解離させ、遠心分離後、培地を加え１  ×１０６  個／ｍｌ  に調製した。
【００８２】
（２）  補体の調製
３人の健常人の血清を混合し、ヒト補体源として用いた。
【００８３】
（３）ＣＤＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレートに抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  および抗ＧＭ２  マウス抗体ＫＭ−６９６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３３７  ）を各最終濃度０．５  〜５０μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ加え、各々に（１）  で調製した標的細胞を５  ×１０４  個  ／ウェルを添加した。室温で３０分反応させ、遠心分離後、上清を除去し、（２）  で得られたヒト血清（最終濃度１５％Ｖ／Ｖ）を１５０  μｌ  添加し、３７℃で１時間反応させた。遠心分離後、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、補体溶液の代わりに培地のみを添加し、上記と同様に上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、補体溶液の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様に上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＣＤＣ  活性は、下式により求めた。
【００８４】
【数１】
0003565572.tif 000005
【００８５】
その結果を図２０〜２３に示した。いずれの細胞に対してもヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  はＣＤＣ  活性を示すことが示された。
【００８６】
１６．抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果：抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）
（１）  標的細胞の調製
１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した標的細胞ＳＢＣ−３  、Ｌｕ−１３５、ＰＣ−１０  、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、ＰＣ−１３  、ＮＡＧＡＩ  、ＧＯＴＯおよびＡ１７２をそれぞれ１  ×１０６  個／ｍｌ  になるように調製し、Ｎａ２５１ＣｒＯ４  を５０μＣｉ／１ｘ１０６  個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で３回洗浄した。次いで４℃で３０分間培地中に放置して自然解離させ、遠心分離後、培地を加え２  ×１０５  個／ｍｌ  に調製した。
【００８７】
（２）  エフェクター細胞の調製
ヒト静脈血２５ｍｌを採血し、ヘパリンナトリウム（武田薬品、１０００単位／ｍｌ  ）０．５ｍｌ  を加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ  （Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ  社製）を用いて遠心分離（１５００〜１８００ｇ  ，３０分）してリンパ球層を分離し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回遠心分離（１５００〜１８００ｇ  ，１５分）して洗浄後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁（５  ×１０６  個／ｍｌ  ）し、エフェクター細胞とした。
【００８８】
（３）ＡＤＣＣ  活性の測定
９６ウェルＵ字底プレートに抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  および抗ＧＭ２  マウス抗体ＫＭ６９６  を各最終濃度０．０５〜５  μｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ加え、各々に（１）  で調製した標的細胞を５０μｌ  （１  ×１０４  ／  ウェル）および（２）  で調製したエフェクター細胞を１００  μｌ  （５  ×１０５  個／  ウェル）添加した（エフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１）。３７℃で４時間反応させ、遠心分離後、上清の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに培地のみを添加し、上記と同様に上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加し、上記と同様に上清の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
【００８９】
【数２】
0003565572.tif 000006
【００９０】
結果を図２４〜２７に示した。いずれの細胞に対してもキメラ抗体ＫＭ９６６  はＡＤＣＣ活性を示したが、抗ＧＭ２  マウス抗体ＫＭ−６９６は、ＡＤＣＣ活性を示さないか、または低かった。以上の結果は、ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  の方がマウス抗体ＫＭ−６９６よりもヒトの癌治療上有用なことを示している。
【００９１】
実施例２    抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体の製造
１．抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  の構築
（１）抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  の構築
配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列を各々ＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列とするヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  であるｈＫＭ７９６Ｈ  を以下のようにして構築した。
【００９２】
各ＣＤＲを移植するヒト抗体Ｈ鎖可変領域ＤＮＡ  としてはＮＥＷＭ〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），  ９，  ２６６（１９９１）〕を選択し、各ＣＤＲ配列に対応する部分を配列番号６、７および８記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  で置換したＤＮＡ  を構築するため、配列番号２３−２９  の塩基配列を有するＤＮＡ  を自動ＤＮＡ  合成機（３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成したＤＮＡ  の５０ｐｍｏｌｅｓ  を５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＤＴＴ  、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  ＡＴＰ  よりなる緩衝液２０ｍｌに溶解し、５  単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３０分間反応させることにより５  ’末端をリン酸化した。各合成ＤＮＡ  は両端に制限酵素部位が存在するため、リン酸化した各合成ＤＮＡ  （配列番号２３−２９  ）の１０  ｐｍｏｌｅｓ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、キットに添付の使用説明書に従って配列番号順に順次結合することにより、最終的に図５５に示したＤＮＡ  、ｈＫＭ７９６Ｈ  を得た。ｈＫＭ７９６Ｈ  がコードするアミノ酸配列を配列番号３６に示した。
【００９３】
（２）抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  の構築
配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列を各々ＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列とするヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  であるｈＫＭ７９６Ｌ  を以下のようにして構築した。
各ＣＤＲを移植するヒト抗体Ｌ鎖可変領域ＤＮＡ  としてはＲＥＩ  〔バイオテクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），  ９，  ２６６（１９９１）〕を選択し、各ＣＤＲ配列に対応する部分を配列番号９、１０および１１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  で置換したＤＮＡ  を構築するため、配列番号３０−３５  の塩基配列を有するＤＮＡ  を自動ＤＮＡ  合成機（３８０Ａ、アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成したＤＮＡ  の５０ｐｍｏｌｅｓを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＤＴＴ  、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  ＡＴＰ  よりなる緩衝液２０ｍｌに溶解し、５  単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で３０分間反応させることにより５  ’末端をリン酸化した。各合成ＤＮＡ  は両端に制限酵素部位が存在するため、リン酸化した各合成ＤＮＡ  （配列番号３０−３５  ）の１０ｐｍｏｌｅｓをＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、配列番号順に順次結合することにより、最終的に図５６に示したＤＮＡ  、ｈＫＭ７９６Ｌ  を得た。ｈＫＭ７９６Ｌ  がコードするアミノ酸配列を配列番号３７に示した。
【００９４】
２．ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターの構築
（１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、実施例２の１項（１）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ  断片を実施例１の７項（３）で得られたプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１に連結した（図５７）。
【００９５】
実施例１の７項（３）で得られたｐＣｈｉ７９６ＨＭ１の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＡｐａＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＮｏｔＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約９．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約２ｍｇ  回収した。次に、実施例２の１項（１）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ  断片０．５  ｐｍｏｌｅｓと上記のｐＣｈｉ７９６ＨＭ１のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ  断片約０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５７に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１を得た。
【００９６】
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１へｂ−グロブリン３’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図５８）。
ｐｈＫＭ７９６ＨＭ１の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１  単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１  単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約２．１ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．２ｍｇ  回収した。次に、実施例１の７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１ｍｇ  回収した。
【００９７】
次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１ｍｇ  とｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５８に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１  を得た。
【００９８】
（２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
まず、以下の方法に従って、実施例２の１項（２）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  のＥｃｏＲＩ−平滑末端断片をヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１  に連結させた（図５９）。
参考例１で得られたｐＣｈｉＩｇＬＡ１  の３ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＥｃｏＲＶ  を加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１ｍｇ  回収した。次に、実施例２の１項（２）で得られたヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ  のＥｃｏＲＩ−平滑末端断片０．５  ｐｍｏｌｅｓと上記のｐＣｈｉＩｇＬＡ１  のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ  断片約０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５９に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１を得た。
【００９９】
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１へＰＭＯ  を以下の方法により導入した（図６０）。
ｐｈＫＭ７９６ＬＩ１の３ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．２ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１ｍｇ  回収した。次に、参考例２で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  の３ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＥｃｏＲＩ  と１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約０．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３ｍｇ  回収した。
【０１００】
次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＬＩ１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ｍｇ  とｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図６０に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１を得た。
次に、プラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１へｂ−グロブリン３  ’スプライシングシグナルを以下の方法により導入し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した（図６１）。
【０１０１】
ｐｈＫＭ７９６ＬＭ１の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約１．６ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３ｍｇ  回収した。次に、実施例１の７項（２）で得られたｐＡＧＥ１４８  の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約８．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約１ｍｇ  回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＬＭ１のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１ｍｇ  とｐＡＧＥ１４８  のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ  断片０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図６１に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１  を得た。
【０１０２】
３．ヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖タンデム発現ベクターの構築
一つのベクター上にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖をコードするｃＤＮＡとＬ鎖をコードするｃＤＮＡが存在するタンデム発現ベクターを以下のようにして構築した（図６２および図６３）。
実施例２の２項（１）で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１  の３ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１  単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で１０分間反応させ、部分消化した。該反応液をエタノール沈殿した後、３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液にて溶解し、さらに１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約５．９ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．２ｍｇ  回収した。
【０１０３】
次に、特開平３−２２９７９  に記載のｐＡＧＥ１０７  の２ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＭｌｕＩと１０単位のＳａｌＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．２ｍｇ  回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１  のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ  断片０．１ｍｇ  とｐＡＧＥ１０７  のＭｌｕＩ−ＳａｌＩ  断片０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図６２に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７  を得た。
【０１０４】
次に、ｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７  の３ｍｇ  を３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＣｌａＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、２０ｍｌのＤＮＡ  ポリメラーゼＩ  緩衝液に溶解し、５  単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩ  クレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＣｌａＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらにアガロース電気泳動にて分画し、約３．３５ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．２ｍｇ  回収した。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約７．５ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３ｍｇ  回収した。次に、ｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１  の３ｍｇ  を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、さらに１０単位のＸｈｏＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、２０ｍｌのＤＮＡ  ポリメラーゼＩ  緩衝液に溶解し、５  単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩ  クレノー断片を加え、２２℃で３０分反応させ、ＸｈｏＩ消化によって生じた突出末端を平滑末端に変えた。さらに該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、３０ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５  ）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液と１０単位のＭｌｕＩを加えて、３７℃で１  時間反応させた。該反応液をアガロース電気泳動にて分画し、約９．３ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３ｍｇ  回収した。次に、上記で得られたｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７  のＭｌｕＩ−ＣｌａＩ  断片０．１ｍｇ  とｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１  のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩ  断片０．１ｍｇ  をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図６３に示したプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＬ１を得た。
【０１０５】
４．抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０  細胞における発現
ＹＢ２／０  細胞へのプラスミドの導入は、宮地（Ｍｉｙａｊｉ）らの方法に従い、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），  ３，  １３３  （１９９０）  〕にて行った。
実施例２の３項で得られたｐｈＫＭ７９６ＨＬ１の４ｍｇ  を４  ×１０６  個のＹＢ２／０  細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）へ導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）〔ＦＣＳ  を１０％  、７．５％  ＮａＨＣＯ３  を１／４  量、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液（ギブコ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび５０００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン含有）を０．５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）〕に懸濁し、９６ウエルマイクロタイタープレートに２００ｍｌ  ずつ分注した。ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体を実施例１の１１項に記載の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ  法）により測定した。得られたクローンの中で、ＥＬＩＳＡ  法で最も高い活性を示したクローンの培養液中の抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約０．１ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
上記抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性を示したクローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウエルプレートに２ｍｌ  分注し、ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養し、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンを誘導した。コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性をＥＬＩＳＡ  法により測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約１．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
上記５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性クローンについて、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸ  を２００ｎＭ  含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地に１〜２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、２４ウエルプレートに２ｍｌ  分注し、ＣＯ２  インキュベーターで３７℃、１〜２週間培養し、２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンを誘導した。コンフルエントになったウエルより培養液を回収し、抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体活性をＥＬＩＳＡ  法により測定した。得られたクローンの中で、最も高い活性を示した２００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性クローンの抗ＧＭ２  ヒト型ＣＤＲ移植抗体量は約５．０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
参考例１    ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＬＡ１  の構築
１．ＫＭ５０細胞由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー遺伝子の取得
（１）ＫＭ５０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞およびラット腎臓からの染色体ＤＮＡ  の調製
公知の方法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ９．１６  〕に従い、以下のようにして染色体ＤＮＡ  を調製した。
【０１０９】
ＫＭ５０細胞１．２  ×１０８  個、Ｐ３Ｕ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９７）２  ×１０８  個、ラット腎臓（−８０  ℃で凍結後、木槌で充分たたいて砕いたもの）１．６ｇのそれぞれを２ｍｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸，１５０  ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略記する）からなる緩衝液（ｐＨ７．５）  に懸濁し、この溶液にプロテイネースＫ（シグマ社製）０．８ｍｇ  とラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳ  と略記する）１０ｍｇを加えて３７℃で一晩インキュベートした。次に等量のフェノールで１回、クロロホルムで２回、エーテルで１回抽出し、１０ｍＭトリス−塩酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．５）  に一晩透析を行った。透析チューブよりＤＮＡ  溶液を回収し、これにリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加えた。この溶液を６時間、３７℃にてインキュベートし、ＲＮＡ  を充分分解させた後に、１５ｍｇのＳＤＳ  と１ｍｇ  のプロテイネースＫを加え、３７℃で一晩インキュベートした。次に等量のフェノールで２回、クロロホルムで２回、エーテルで２回抽出し、１０ｍＭトリス−塩酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．５）  に一晩透析を行った。透析チューブよりＤＮＡ  溶液を回収して、染色体ＤＮＡ  サンプルとした。ＤＮＡ  の濃度を２６０ｎｍ  における吸光度で測定した結果、ＫＭ５０細胞１．２  ×１０８  個より１．６ｍｇ  、Ｐ３Ｕ１細胞２×１０８  個より１．５ｍｇ  、ラット腎臓１．６ｇより１．９ｍｇ  の染色体ＤＮＡ  がそれぞれ得られた。
【０１１０】
（２）サザンブロッティングによる、ＫＭ５０細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の同定
（１）で得られたＫＭ５０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ラット腎臓の染色体ＤＮＡ  の各３μｇ  ずつを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液２５μｌ  に溶解し、１５単位のＸｂａ  Ｉ（宝酒造社製、以下、制限酵素は宝酒造社製を使用した）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｘｂａ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた後、サザンらの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），９８，５０３（１９７５）〕に従い、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡ  をトランスファーし、常法〔亀山ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ）  ，  ２４４，３０１−３０６（１９８９）  〕に従って、同文献記載のマウスＪＨプローブでハイブリダイゼーションを行った。ＫＭ５０細胞のＤＮＡ  においてのみ約９．３ｋｂ  の位置にバンドが認められた。従って、この位置に存在する免疫グロブリンＸｂａ  Ｉ断片ＤＮＡ  が、ＫＭ５０細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺伝子をコードしていると考えられる。
【０１１１】
（３）ＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡ  ライブラリーの作製
（１）で得られたＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡ  ６０μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液２５０  μｌ  に溶解し、１５０  単位のＸｂａ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｘｂａ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画後、９．３ｋｂ  の部分をＤＥＡＥペーパー法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ６．２４  〕等を用いて、ＫＭ５０細胞の９．３ｋｂ  ＤＮＡ  サンプルとして約２μｇ  を回収した。一方ベクターとして用いるラムダ−ＺＡＰ  （ストラタジーン社製）は３μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液２００  μｌ  に溶解し、５０単位のＸｂａ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｘｂａ  Ｉ部位で切断した。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ  を約３μｇ  回収した。このＤＮＡ  を１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  溶液１００  μｌ  に溶解し、アリカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位を加えて、ベクターＤＮＡ  の制限酵素切断末端の脱リン酸化反応を行った。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ  を２μｇ  回収した。このＤＮＡ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液１０μｌ  に溶解しベクターＤＮＡ  サンプルとした。次にベクターＤＮＡ  サンプルを０．２μｇ  と、ＫＭ５０細胞の９．３ｋｂ  ＤＮＡ  サンプル０．２  μｇ  とを、Ｔ４リガーゼ緩衝液５μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ（宝酒造社製）１７５  単位を加えて、３日間、４℃にてインキュベートした。この混合液のうち２μｌ  を常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．９５  〕に従い、ストラタジーン社製ギガパックゴールドを使用してラムダファージにパッケージングし、これを大腸菌ＢＢ４  に感染させて、２０万個のファージクローンを取得した。次にこのうち１０万個のファージを常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．１１２〕に従って、ニトロセルロースフィルター上に固定した。
【０１１２】
（４）ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子を含む組換えＤＮＡ  の選択
（３）で作製した１０万個のファージライブラリーより、亀山らの方法〔フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ），４４，３０１−３０６（１９８９）  〕に従って３２Ｐで標識したマウスＪＨプローブに、６５℃において強く会合するクローンを２個取得した。常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、  モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．１１８−２．１６９〕に従って、ファージＤＮＡ  を回収したところ、９．３ｋｂ  のＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡ  のＸｂａ  Ｉ断片が組み込まれていた。
【０１１３】
（５）ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子の塩基配列
（４）で得られた２個のクローンについて、種々の制限酵素で消化し、制限酵素切断地図を作ったところ、全く同一のＤＮＡ  断片（９．３ｋｂ）  が挿入されていることが明らかとなった（図２８）。そこで次にこのＤＮＡ  断片９．３ｋｂ  のうち、ラット免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター領域および可変領域をコードしていると考えられる部分について、サンガー法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）  、Ａｍｅｒｓｈａｍ社  Ｍ１３  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｈａｎｄｂｏｏｋ〕に従って塩基配列を決定した。配列番号１６の中で、ＡＴＧＣＡＡＡＴ等のオクタマー配列およびＴＴＧＡＡＡＡ  等のＴＡＴＡ  ｂｏｘ配列を含む部分は、免疫グロブリンのプロモーター領域と考えられる部分である。
【０１１４】
２．ＫＭ５０細胞中において活性型となっている（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子のプロモーターとエンハンサーを用いた異種タンパク発現ベクターの構築
（１）ｐＫＭＢ１１の構築
１項（５）で得られた９．３ｋｂ  の免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子断片１μｇ  を、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＢｇｌ  ＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ  を加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｂｇｌ  ＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ  部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、０．８ｋｂ  の免疫グロブリンプロモーターを含むＤＮＡ  断片を０．０１μｇ  回収した。次にプラスミドｐＢＲ３２２−ＢｇｌＩＩ〔桑名（Ｋｕｗａｎａ）ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ），２１９，３６０（１９８７）〕の１μｇ  を、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウム，１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＢｇｌ  ＩＩと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｂｇｌ  ＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ  部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約４．２ｋｂ  のＤＮＡ  断片を回収した。このようにして得たｐＢＲ３２２  Ｂｇｌ  ＩＩ  由来の約４．２ｋｂ  のＤＮＡ  断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンプロモーターを含むＤＮＡ  断片０．０１μｇ  を、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ（宝酒造社製）１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）  ４１，４５９（１９６９）〕をスコット（Ｓｃｏｔｔ）  らの方法〔重定勝：細胞工学    ２，６１６（１９８３）  〕に従って形質転換し、Ａｐ耐性のコロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡ  を回収し、図２９に示したｐＫＭＢ１１を得た。
【０１１５】
（２）ｐＫＭＤ６  の構築
免疫グロブリンプロモーター下流に適当な制限酵素部位を設けるため、（１）において構築したｐＫＭＢ１１のＮｃｏ  Ｉ部位からヌクレアーゼＢＡＬ３１  を用いて消化を行った。プラスミドｐＫＭＢ１１の１０μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化カリウムからなる緩衝液１００  μｌ  に溶解し、３０単位のＮｃｏ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｎｃｏ  Ｉ部位で切断した。該反応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱後、ＤＮＡ  断片を全量１００  μｌ  のＢＡＬ３１  緩衝液〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）  ，６００ｍＭ  塩化ナトリウム，１２ｍＭ塩化カルシウム，１２ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液〕に溶解し、０．２５単位のＢＡＬ３１  〔ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ）  社製〕を加え、３７℃で５秒間反応を行った。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ  を１μｇ  回収した。このＤＮＡ０．１μｇ  と合成ＤＮＡ  リンカーＳａｌ  Ｉ  ０．０１  μｇ  とをＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株をスコットらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡ  を回収し、図３０に示したｐＫＭＤ６  を得た。このプラスミドのうち、ＢＡＬ３１  にて消化を行った部分について、サンガー法に従って塩基配列を決定したところ免疫グロブリンの開始コドンＡＴＧ  の上流に向かって３番目の塩基（配列番号１６で３０３  番目の塩基）まで除かれていた。
【０１１６】
（３）ｐＥＰＫＭＡ１，ｐＥＰＫＭＢ１，ｐＡＧＥ５０１  の構築
免疫グロブリンの本来のプロモーターとエンハンサーは、その位置が離れている。従って異種タンパクを発現させるためのベクターとして、そのプロモーターとエンハンサーを接続したベクターを作っておくことが必要となる。そのために以下の操作を行った。
【０１１７】
１項の（５）で得られた９．３ｋｂ  の免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子断片１μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＸｂａ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＥｃｏＲＶ部位とＸｂａ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約１ｋｂ  の免疫グロブリンエンハンサー領域を含むＤＮＡ  断片を０．１  μｇ  回収した。一方（２）で得たプラスミドｐＫＭＤ６  の１μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液１００  μｌ  に溶解し、１０単位のＢｇｌ  ＩＩを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｂｇｌ  ＩＩ部位で切断した。フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ  断片を全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を加え、１６℃で９０分間反応させ、Ｂｇｌ  ＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ  断片を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩＩＩ  部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約０．８ｋｂ  の免疫グロブリンプロモーター領域を含むＤＮＡ  断片を０．１  μｇ  回収した。次にプラスミドｐＵＣ１８  〔メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）  、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）  １０１，２０（１９８３）〕の０．２  μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  と１０単位のＸｂａ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩＩＩ  部位とＸｂａ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約２．７ｋｂ  のＤＮＡ  断片を０．１  μｇ  回収した。このようにして得たｐＰＫＭＤ６由来の０．８ｋｂ  のＤＮＡ  断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンエンハンサー領域を含むＤＮＡ  断片０．０２μｇ  と、ｐＵＣ１８  の０．１  μｇ  とを、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡ  を回収し、図３１に示したｐＥＰＫＭＡ１  を得た。
【０１１８】
次に、プラスミドｐＥＰＫＭＡ１  の１μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液１００  μｌ  に溶解し、１０単位のＸｂａ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｘｂａ  Ｉ部位で切断した。フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ  断片を全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で９０分間反応させ、Ｘｂａ  Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮＡ  断片を回収した。このＤＮＡ  断片と合成ＤＮＡ  リンカーＸｈｏ  Ｉ（宝酒造社製）の０．０１μｇ  を、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡ  を回収し、図３２に示したｐＥＰＫＭＢ１  を得た。
【０１１９】
次に、動物細胞用異種遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ１０７  〔宮地（Ｍｉｙａｊｉ）ら、サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）    ３，１３３−１４０（１９９０）  〕のＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域（ＰＳＥと略記する）を、ｐＥＰＫＭＢ１  の持つＫＭ５０由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー（ＰＩＨと略記する）に以下に示す方法により変換した。
【０１２０】
プラスミドｐＡＧＥ１０７  の１μｇ  を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１５０ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＳａｌ  Ｉと１０単位のＸｈｏ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｓａｌ  Ｉ部位とＸｈｏ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約５．９５ｋｂのＧ４１８耐性遺伝子等を含むＤＮＡ  断片を０．５  μｇ  回収した。次に、プラスミドｐＥＰＫＭＢ１  の１μｇ  を、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１５０ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液３０μｌ  に溶解し、１０単位のＳａｌ  Ｉと１０単位のＸｈｏ  Ｉを加え、３７℃で２時間インキュベートし、Ｓａｌ  Ｉ部位とＸｈｏ  Ｉ部位で切断した。該反応液をアガローズゲル電気泳動後、約１．７ｋｂ  の免疫グロブリンプロモーターおよびエンハンサー領域を含むＤＮＡ  断片を０．１  μｇ  回収した。このようにして得たｐＡＧＥ１０７  由来の５．９５ｋｂのＤＮＡ  断片（０．１μｇ）と、免疫グロブリンプロモーターおよびエンハンサー領域を含むＤＮＡ  断片０．０２μｇ  を、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、Ａｐ耐性コロニーを得、このコロニーより組換えプラスミドＤＮＡ  を回収し、図３３に示したｐＡＧＥ５０１  を得た。
【０１２１】
（４）ｐＡＧＥ１０９  の構築
ｐＡＧＥ１０６  に２つあるＥｃｏＲＩ切断部位の１つが除去されたプラスミドｐＡＧＥ１０９  を以下のように構築した。
【０１２２】
特開平３−２２９７９  に記載の動物細胞用異種遺伝子発現ベクターｐＡＧＥ１０６  の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩとＳａｃ  Ｉをそれぞれ加え、３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＳａｃ  Ｉで切断したＳＶ４０初期遺伝子プロモーターおよびＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０６  のＤＮＡ  断片（４．３ｋｂ）  を約１．５  μｇ  回収した。次にこのＤＮＡ  断片を全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩラージ断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｓａｃ  Ｉ消化によって生じた３’突出末端と、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出後、エタノールで沈澱させ、２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この混合溶液に更に３５０  単位のＴ４ＤＮＡ  リガーゼを加え、４℃で４時間反応を行った。このようにして得た組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３４に示したプラスミドｐＡＧＥ１０９  を得た。
【０１２３】
（５）ｐＡＧＥ５０２  の構築
ｐＡＧＥ１０７  のＳＶ４０のプロモーターとエンハンサーを免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターとエンハンサーに変換するために、プラスミドｐＡＧＥ５０２  を以下のように構築した。
【０１２４】
特開平３−２２９７９  記載のｐＡＧＥ１０７  の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ  消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、３０μｌ  の１０ｍＭ    トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｘｈｏ  ＩとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したＧ４１８耐性遺伝子とＡｐ耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０７  のＤＮＡ  断片（約５．９５ｋｂ）  を約１．５  μｇ  回収した。
【０１２５】
次に（３）で得られたｐＡＧＥ５０１  の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１７５ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＳａｌ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｓａｌ  Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｘｈｏ  ＩとＳａｌ  Ｉで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー遺伝子を含むｐＡＧＥ５０１  のＤＮＡ  断片（１．８ｋｂ）  を約０．２  μｇ  回収した。
【０１２６】
次に上記で得られたｐＡＧＥ１０７  のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏ  Ｉ断片（約５．９５ｋｂ）０．１μｇ  と、ｐＡＧＥ５０１  のＳａｌ  Ｉ−ＸｈｏＩ断片（約１．８ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３５に示したプラスミドｐＡＧＥ５０２  を得た。
【０１２７】
（６）ｐＡＧＥ５０３  の構築
ｐＡＧＥ５０２  に２つあるＥｃｏＲＩ切断部位の１つが除去されたプラスミドｐＡＧＥ５０３  を以下のように構築した。
【０１２８】
（４）で得られたｐＡＧＥ１０９  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  と１０単位のＣｌａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｃｌａ  ＩとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したベーターグロビンとＳＶ４０初期遺伝子のポリＡシグナル遺伝子を含むｐＡＧＥ１０９  のＤＮＡ  断片（約１ｋｂ）を約０．２  μｇ  回収した。
【０１２９】
次に（５）で得られたｐＡＧＥ５０２  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  と１０単位のＣｌａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＨｉｎｄＩＩＩ  とＣｌａ  Ｉで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーター、エンハンサー遺伝子、Ａｐ耐性遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ５０２  のＤＮＡ  断片（約６．１ｋｂ）をＤＥＡＥペーパー法にて約１μｇ  回収した。次に上記で得られたｐＡＧＥ１０９  のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ  Ｉ断片（約１ｋｂ）０．１  μｇ  と、ｐＡＧＥ５０２  のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａ  Ｉ断片（  約６．１ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３６に示したプラスミドｐＡＧＥ５０３  を得た。
【０１３０】
（７）ｐＳＥ１ｄ１の構築
ｐＡＧＥ１０７  にｄｈｆｒ遺伝子が導入されたプラスミドｐＳＥ１ｄ１を以下のように構築した。
【０１３１】
特開平３−２２９７９  記載のｐＡＧＥ１０７  の２μｇ  を１００  μｌ  の１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノ−ル−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌ  の１０ｍＭ    トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したＧ４１８耐性遺伝子とＡｐ耐性遺伝子を含むｐＡＧＥ１０７  のＤＮＡ  断片（約５．６ｋｂ）を約１．５  μｇ  回収した。
【０１３２】
次にｐＳＶ２−ｄｈｆｒ  〔スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）  ら，モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ）１，８５４（１９８１）  〕の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＢｇｌ  ＩＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱を行い、次に全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｂｇｌ  ＩＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｂｇｌ  ＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したデハイドロフォレートレダクターゼ（以下ｄｈｆｒと略記する）遺伝子を含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒＤＮＡ断片（０．７６ｋｂ）を約０．２  μｇ  回収した。
【０１３３】
次に上記で得られたｐＡＧＥ１０７  のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約５．６ｋｂ）０．１  μｇ  と、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ  のＢｇｌ  ＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  断片（約０．７６ｋｂ）０．１μｇ  とを全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３７に示したプラスミドｐＳＥ１ｄ１を得た。
【０１３４】
（８）ｐＳＥ１ｄ２の構築
ｐＳＥ１ｄ１のＨｉｎｄＩＩＩ  切断部位が除去されたプラスミドｐＳＥ１ｄ２を以下のように構築した。
【０１３５】
（７）で得られたｐＳＥ１ｄ１の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、ＨｉｎｄＩＩＩ  消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３８に示したプラスミドｐＳＥ１ｄ２を得た。
【０１３６】
（９）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２  の構築
ｐＡＧＥ５０３  にｄｈｆｒ遺伝子が導入されたプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２  を以下のように構築した。
【０１３７】
（６）で得られたｐＡＧＥ５０３  の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａ  Ｉを加えて３７℃４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｃｌａ  Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｃｌａ  ＩとＭｌｕ  Ｉで切断したＫＭ５０免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサーを含むｐＡＧＥ５０３  のＤＮＡ  断片（約５．４ｋｂ）を約１μｇ  回収した。
【０１３８】
次に（８）で得られたｐＳＥ１ｄ２の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＸｈｏ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｘｈｏ  Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＭｌｕ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｘｈｏ  ＩとＭｌｕ  Ｉで切断したｄｈｆｒ遺伝子を含むｐＳＥ１ｄ２のＤＮＡ  断片（約３．８ｋｂ）を約１μｇ  回収した。
【０１３９】
次に上記で得られたｐＡＧＥ５０３  のＣｌａ  Ｉ−ＭｌｕＩ断片（約５．４ｋｂ）１  μｇ  と、ｐＳＥ１ｄ２のＸｈｏ  Ｉ−ＭｌｕＩ断片（約３．８ｋｂ）１μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図３９に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２  を得た。
【０１４０】
（１０）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  の構築
ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２  のＡｐａ  Ｉ切断部位が除去されたプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  を以下のように構築した。
【０１４１】
（９）で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ２  の２μｇ  を１００  μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  および６ｍＭ  塩化マグネシウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ａｐａ  Ｉ消化によって生じた３’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４０に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  を得た。
【０１４２】
（１１）ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４  の構築
ｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  のＨｉｎｄＩＩＩ  切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位の間にクローニングサイトを設けるために、配列番号１７で示した合成ＤＮＡを挿入したプラスミドであるｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４  を以下のように構築した。
【０１４３】
（１０）で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  とＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＨｉｎｄＩＩＩ  とＥｃｏＲＩで切断したＫＭ５０細胞の免疫グロブリンＨ鎖プロモーター、エンハンサー、Ａｐ耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を含むｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  のＤＮＡ  断片（約９．２ｋｂ）を約１μｇ  回収した。
【０１４４】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥ１ｄ３  のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約９．２ｋｂ）０．１  μｇ  と、合成ＤＮＡ  （配列番号１７）の１０ｎｇを全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にＴ４ＤＮＡ  リガーゼ３５０  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４１に示したプラスミドｐＩｇ１ＳＥ１ｄ４  を得た。
【０１４５】
３．モロニーマウス白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ）  （以下、ＭｏＬＴＲ  と略記する）の調製
ＭｏＬＴＲ  はプロモーターおよびエンハンサー活性を有することが知られている〔桑名ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．），１４９，９６０  （１９８７）  〕。そこで、ＭｏＬＴＲ  をヒト型キメラ抗体発現用ベクターのプロモーターおよびエンハンサーとして用いるために、ＭｏＬＴＲ  を有するプラスミドｐＰＭＯＬ３を以下に示す方法により調製した。
【０１４６】
特開平１−６３３９４  記載のｐＰＭＯＬ１の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＣｌａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、１６℃で２時間反応させ、Ｃｌａ  Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ  断片を２μｇ  回収した。このＤＮＡ  断片と合成ＤＮＡ  リンカーＸｈｏ  Ｉ（宝酒造社製）の０．０１μｇ  を、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４２に示したプラスミドｐＰＭＯＬ２を得た。次に、ｐＰＭＯＬ２の３  μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウム，１０ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ  ２  −メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＳｍａ  Ｉを加えて３７℃４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＤＮＡ  断片を２μｇ  回収した。このＤＮＡ  断片と合成ＤＮＡ  リンカーＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）  の０．０１μｇ  を、Ｔ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４３に示したプラスミドｐＰＭＯＬ３を得た。
【０１４７】
４．ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＨ鎖定常領域（Ｃγ１）ｃＤＮＡおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）ｃＤＮＡのクローニング
（１）キメラ抗体産生細胞ＳＰ２−ＰＣ  Ｃｈｉｍｅｒａ−１からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用いて、抗フォスフォリルコリン活性を有するキメラ抗体産生細胞でフェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ），  ２４４，３０１−３０６（１９８９）  に記載されているキメラ抗体産生細胞ＳＰ２−ＰＣ  Ｃｈｉｍｅｒａ−１の１×１０８  細胞より、ｍＲＮＡを６．２  μｇ  取得した。
（２）ＳＰ２−ＰＣ  Ｃｈｉｍｅｒａ−１  ｃＤＮＡ  ライブラリーの作製とヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域（Ｃγ１）ｃＤＮＡおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）ｃＤＮＡのクローニング
（１）で得られたｍＲＮＡの２μｇ  から、ファルマシア社製のｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号２７−９２６０−０１）  を用いて、ＥｃｏＲＩアダプターを付与した後、カイネーションを行った。得られたｃＤＮＡ溶液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、４μｇ  のｃＤＮＡを回収した。このｃＤＮＡを２０μｌ  の滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、約１．８ｋｂ  と約１．０ｋｂ  のＤＮＡ  断片をそれぞれ約０．３  μｇ  回収した。
【０１４８】
次に、ベクターｐＵＣ１８  の５  μｇ  を１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液１００  μｌ  に加え、更に５０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で４時間反応させ、ｐＵＣ１８  のＤＮＡ  中のＥｃｏＲＩ部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８  のＤＮＡ  断片を約３μｇ  回収した。
【０１４９】
次に上記で得られたｐＵＣ１８  のＥｃｏＲＩ断片（約２．７ｋｂ）０．１  μｇ  と、ＳＰ２−ＰＣ  Ｃｈｉｍｅｒａ−１細胞より調製した１．８ｋｂ  および１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片各０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４ＤＮＡ  リガーゼを加え、４℃で２４時間反応させた。
このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＬＥ３９２  株を形質転換した。得られた約３０００個のコロニーをニトロセルロースフィルター上に固定した。亀山らによって単離されたヒト免疫グロブリン定常領域の染色体遺伝子（ＩｇＧ１のＨ鎖の定常領域であるＣγ１  と、  Ｌ鎖の定常領域であるＣκ）〔亀山ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２４４，３０１（１９８９）  〕を３２Ｐで標識したプローブに６５℃で強く会合した菌株のうちＣγ１  と会合するもの１個（ｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１）、Ｃκと会合するもの１  個（ｐＰＣＶＬｈＣＫ１）  をそれぞれ得た。
【０１５０】
（３）ヒトＩｇκ鎖定常領域へのＥｃｏＲＶ部位の導入
プロメガ社製のキット（カタログ番号Ｑ６２１０  ）を用いた部位特異的変異導入法によりヒトＩｇκ鎖定常領域５’末端近傍領域にＥｃｏＲＶ部位を導入した。プラスミドｐＰＣＶＬｈＣＫ１  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＫｐｎ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｋｐｎ  ＩとＥｃｏＲＩで切断したヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＬｈＣＫ１  のＤＮＡ  断片（約０．８ｋｂ）を約０．２  μｇ  回収した。
【０１５１】
次にｐＳＥＬＥＣＴ１（プロメガ社製のキット：カタログ番号Ｑ６２１０  ）の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩとＫｐｎ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＩとＫｐｎ  Ｉとで切断したｐＳＥＬＥＣＴ１のＤＮＡ  断片（約５．７ｋｂ）を約１μｇ  回収した。
【０１５２】
次に上記で得られたｐＰＣＶＬｈＣＫ１  のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（約０．８ｋｂ）０．１  μｇ  と、ｐＳＥＬＥＣＴ１のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（約５．７ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４ＤＮＡ  リガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＪＭ１０９  株を形質転換し、図４４に示したプラスミドｐｃｈＣＫＡ７  を得た。
【０１５３】
次にｐｃｈＣＫＡ７  を用いて、配列番号１８の合成ＤＮＡ  を変異導入プライマーとして使用して、ヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域のＮ末端から１２ベース目より１４ベース目までのＡＣＣ  配列をＧＡＴ  に変換することにより、その部位にＥｃｏＲＶ部位を導入したプラスミドｐｃｈＣＫＢ１  を構築した（図４５）。
次に、ｐｃｈＣＫＢ１  のＥｃｏＲＶ部位をＨｉｎｄＩＩＩ  切断部位に変換するために、以下の操作を行った。
【０１５４】
プラスミドｐｃｈＣＫＢ１  の２μｇ  を１０μｌ  の１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、全量４０μｌ  のＤＮＡ  ポリメラ−ゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、３７℃で３０分間反応させ、ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物を該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、更に０．１  μｇ  のＨｉｎｄＩＩＩ  リンカー（宝酒造社製）を加えて２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４６に示したプラスミドｐｃｈＣＫＣ１  を得た。
【０１５５】
５．ヒト型キメラ抗体発現用ベクターの構築
（１）ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築するために用いるベクター（ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクター）の構築
２項（１１）で得たｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶとＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＡｐａ  Ｉで切断した９．２ｋｂ  のｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  のＤＮＡ  断片（約９．２ｋｂ）を約１．５  μｇ  回収した。
【０１５６】
次に４項（２）で得たｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  および６ｍＭ  塩化マグネシウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｐａ  Ｉと１０単位のＳｍａ  Ｉを加えて３７℃で１時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ａｐａ  ＩとＳｍａ  Ｉで切断したヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１  のＤＮＡ  断片（約１ｋｂ）を約０．２  μｇ  回収した。
【０１５７】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  のＥｃｏＲＶ−ＡｐａＩ断片（約９．２ｋｂ）０．１  μｇ  と、ｐＰＣＶＨｈＣＧＩ１  のＡｐａ  Ｉ−  Ｓｍａ  Ｉ断片（約１ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４ＤＮＡ  リガーゼを加えて４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４７に示すヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＨＢ２  を得た。
【０１５８】
（２）ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築するために用いるベクター（ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクター）の構築
２項（１１）で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  のＤＮＡ  断片（約９．２ｋｂ）を約１．５  μｇ  回収した。
【０１５９】
次に４項（３）で得られたｐｃｋＣＫＣ１  の２μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１００ｍＭ  塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＶと１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ  を加えて３７℃で１時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むｐＰＣＶＬｈＣＫ１  のＤＮＡ  断片（約０．６ｋｂ）を約０．２  μｇ  回収した。
【０１６０】
次に上記で得られたｐＩｇ１ＳＥＩｄ４  のＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  断片（約９．２ｋｂ）０．１  μｇ  と、ｐｃｈＣＫＣ１  のＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  断片（約０．６ｋｂ）０．１  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４ＤＮＡ  リガーゼを加えて４℃で２４時間反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図４８に示したヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現用ベクタｐＣｈｉＩｇＬＡ１  を得た。
【０１６１】
参考例２      ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の構築
１．マウス抗ＧＤ３  モノクローナル抗体ＫＭ−６４１産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの取得
インビトロジェン社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（商品番号Ｋ１５９３−０２）を用いて、参考例１で得られるマウス抗ＧＤ３  モノクローナル抗体ＫＭ−６４１産生ハイブリドーマ細胞の１×１０８  細胞より、ｍＲＮＡを３４μｇ  取得した。
２．ＫＭ−６４１のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
１項で取得したｍＲＮＡの３μｇ  から、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）  を用い、５’末端にＥｃｏＲＩアダプター、３’末端にＸｈｏ  Ｉアダプターを有するｃＤＮＡをそれぞれ合成した。このｃＤＮＡ約６μｇ  を１０μｌ  の滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｈ鎖に対応する約１．８ｋｂ  のｃＤＮＡ断片とＬ鎖に対応する約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１  μｇ  回収した。次に、約１．８ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  および約１．０ｋｂ  のｃＤＮＡ断片０．１  μｇ  と、ベクターとして用いるＵｎｉ−ＺＡＰ    ＸＲ  （ストラタジーン社製、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰＩＩベクターをＥｃｏＲＩとＸｈｏ  Ｉで切断後、  Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  で処理したもの）１  μｇ  をＴ４リガーゼ緩衝液１１．５μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１２℃にて１晩インキュベートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。この反応液のうち４μｌ  を常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．９５  〕に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダファージにパッケージングし、これを常法〔Ｍａｎｉａｔｉｓら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．９５−１０７  〕に従って、大腸菌株ＰＬＫ−Ｆ  に感染させて、Ｈ鎖のｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖のｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約１万個のファージクローンを取得した。次に常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．１１２〕に従い、ファージをニトロセルロースフィルター上に固定した。
【０１６２】
３．モノクローナル抗体ＫＭ−６４１のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
２項で作製したＨ鎖のｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖のｃＤＮＡライブリーより、常法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ２．１０８〕に従い、マウス免疫グロブリン定常領域の染色体遺伝子であるマウスＣγ１  遺伝子を含む約６．８ｋｂ  のＥｃｏＲＩ断片〔Ｒｏｅｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８，４７４（１９８１）〕およびマウスＣκ遺伝子を含む約３ｋｂ  のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ    ２８０，２８８（１９７９）  を３２Ｐで標識したプローブを用いて、プローブに６５℃で強く会合したファージクローンをそれぞれ１個ずつ取得した。次に、ストラタジーン社製のｃＤＮＡ合成キットであるＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品番号ｓｃ２００４００）  を用いて、ファージクローンをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  に変換し、ＫＭ−６４１のＨ鎖のｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３  およびＫＭ−６４１Ｌ鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＫＭ６４１ＬＡ２  をそれぞれ取得した。ｐＫＭ６４１ＨＡ３  およびｐＫＭ６４１ＬＡ２  をＥｃｏＲＩとＸｈｏ  Ｉを用いて切断したところ、それぞれ約１．６ｋｂ  および約０．９ｋｂ  のｃＤＮＡ断片が挿入されていた（図４９）。
【０１６３】
４．ＫＭ−６４１のＨ鎖ｃＤＮＡ（ｐＫＭ６４１ＨＡ３）  およびＫＭ−６４１のＬ鎖ｃＤＮＡ（ｐＫＭ６４１ＬＡ２）  の免疫グロブリン可変領域の塩基配列
３項で得られたｐＫＭ６４１ＨＡ３  およびｐＫＭ６４１ＬＡ２  の免疫グロブリン可変領域の塩基配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いてダイデオキシ法〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  、１９８９年、ｐ１３．４２〕により決定した。その結果を配列番号１９および配列番号２０に示した。ｐＫＭ６４１ＬＡ２  は、５’端付近に開始コドンＡＴＧ  と推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のｃＤＮＡであった。ｐＫＭ６４１ＨＡ３  は、５’端付近に開始コドンと推定されるメチオニンが存在せず、リーダー配列が一部欠損していた。
５．ＫＭ−６４１由来ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築
プラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３  の可変領域遺伝子の５’末端付近のＡｌｕ  Ｉ部位および可変領域遺伝子の３’末端付近のＳｔｙ  Ｉ部位で切断して得られるＨ鎖可変領域遺伝子を配列番号２１および２２に示す合成ＤＮＡ  を用いて参考例１で得られたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターと連結させることにより、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図５０）。
【０１６４】
まず、ｐＫＭ６４１ＨＡ３  の免疫グロブリンＨ鎖可変領域の３’末端から３’末端付近にあるＳｔｙ  Ｉ切断部位までの塩基配列と、ｐＡＧＥ２８の免疫グロブリンＨ鎖定常領域の５’末端から５’末端付近にあるＡｐａ  Ｉ切断部位までの塩基配列とからなり、Ｓｔｙ  Ｉ切断部位とＡｐａ  Ｉ切断部位を両端に有する配列番号２２に示したＤＮＡ（図５０参照）をＤＮＡ合成機で合成した。次に、この合成ＤＮＡを以下に示す方法で、プラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３  に導入した。
【０１６５】
ｐＫＭ６４１ＨＡ３  の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＳｔｙ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、０．４１ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、ｐＡＧＥ２８〔水上ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７−１３１０  （１９８７）  〕の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、２．４５ｋｂのＤＮＡ  断片を約２μｇ  回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＡ３  のＥｃｏＲＩ−ＳｔｙＩ断片（約０．４１ｋｂ）０．１μｇ  およびｐＡＧＥ２８のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約２．４５ｋｂ）０．１μｇ  および配列番号２２に示す合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換え体プラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５１に示したプラスミドｐＫＭ６４１ＨＥ１  を得た。
【０１６６】
ｐＫＭ６４１ＨＥ１  はリーダー配列が欠損しているため、それを補填するために配列番号２１に示した合成ＤＮＡを用いて以下の操作を行った。
ｐＫＭ６４１ＨＥ１  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４２ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．４  μｇ  回収した。ｐＫＭ６４１ＨＥ１  のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約０．４２ｋｂ）０．４μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＡｌｕ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、約０．４ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。
【０１６７】
次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＥ１  のＡｌｕ  Ｉ−ＡｐａＩ断片（約０．４ｋｂ）０．１  μｇ  およびｐＡＧＥ２８のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約２．４５ｋｂ）０．１μｇ  および配列番号２１に示す合成ＤＮＡ  の０．３  μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５２に示したプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１  を得た。
【０１６８】
次に、ｐＫＭ６４１ＨＦ１  の免疫グロブリンＨ鎖可変領域をヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターｐＣｈｉＩｇＨＢ２  に導入するために以下の操作を行った。
ｐＫＭ６４１ＨＦ１  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロ−スゲル電気泳動にて分画し、０．４４ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．５  μｇ  回収した。次に、ｐＣｈｉＩｇＨＢ２  の３μｇ  を３０μｌ  の１０ｍＭ    トリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，７ｍＭ  塩化マグネシウムおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＡｐａ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、約３  μｇ  のＤＮＡ  を回収した。次に、上記で得られたｐＫＭ６４１ＨＦ１  のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約０．４４ｋｂ）０．１μｇ  およびｐＣｈｉＩｇＨＢ２  のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（約１０．１ｋｂ）０．１μｇ  を全量２０μｌ  のＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に３５０  単位のＴ４リガーゼを加え４℃で２４時間反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ  を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５３に示したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１を得た。
【０１６９】
次に、以下に示す方法で、ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１のＫＭ５０由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー領域をＭｏＬＴＲ  に変換した。
ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の３μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約８．８ｋｂ  のＤＮＡ  断片を約０．２  μｇ  回収した。実施例１の２で得られたｐＰＭＯＬ３の３  μｇ  を３０μｌ  の５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）  ，１０ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＤＴＴ  からなる緩衝液に加え、更に１０単位のＥｃｏＲＩと１０単位のＸｈｏ  Ｉを加えて３７℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ＭｏＬＴＲ  を含む０．６３ｋｂのＤＮＡ  断片を約０．３  μｇ  回収した。次に、ｐＣｈｉ６４１ＨＡ１のＥｃｏＲＩ−  Ｘｈｏ  Ｉ断片０．１  μｇ  およびｐＰＭＯＬ３のＥｃｏＲＩ−  Ｘｈｏ  Ｉ断片０．１  μｇ  をＴ４リガーゼ緩衝液２０μｌ  に溶解し、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼ１７５  単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大腸菌ＨＢ１０１  株を形質転換し、図５４に示したＫＭ−６４１由来ヒト型キメラＨ鎖発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  を得た。
【０１７０】
【発明の効果】
本発明により、ガングリオシドＧＭ２  に反応するヒト化抗体が提供される。
【０１７１】
【配列表】
0003565572.tif 000007
0003565572.tif 000008
【０１７２】
0003565572.tif 000009
0003565572.tif 000010
【０１７３】
0003565572.tif 000011
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【０１７４】
0003565572.tif 000013
0003565572.tif 000014
【０１７５】
0003565572.tif 000015
0003565572.tif 000016
【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
0003565572.tif 000019
【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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0003565572.tif 000034
【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０５】
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【０２０６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】はプラスミドｐＫＭ７９６Ｈ１およびｐＫＭ７９６Ｌ１を示した図である。
【図２】はプラスミドｐＫＭ７５０Ｈ１およびｐＫＭ７５０Ｌ１を示した図である。
【図３】はプラスミドｐＫＭ６０３Ｈ１およびｐＫＭ６０３Ｌ１を示した図である。
【図４】はプラスミドｐＡＧＥ１４７  の造成工程を示した図である。
【図５】はプラスミドｐＡＧＥ１４８  の造成工程を示した図である。
【図６】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図７】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＭＳ１  およびｐＣｈｉ７５０ＨＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図８】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＩ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図９】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭ１およびｐＣｈｉ７５０ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図１０】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＬＭＳ１  およびｐＣｈｉ７５０ＬＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図１１】はプラスミドｐＣｈｉ７９６Ｈ１０７  およびｐＣｈｉ７５０Ｈ１０７  の造成工程を示した図である。
【図１２】はプラスミドｐＣｈｉ７９６ＨＬ１およびｐＣｈｉ７５０ＨＬ１の造成工程を示した図である。
【図１３】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図１４】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＨＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図１５】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図１６】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図１７】はプラスミドｐＣｈｉ６０３ＬＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図１８】は精製した抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６６  およびＫＭ９６７  のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１５％グラジエントゲルを使用）  の電気泳動パターンを示した図である。左側が還元条件、右側が非還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンの左側より、低分子マーカー、ＫＭ９６７  、ＫＭ９６６  （還元条件）、ＫＭ９６７  、ＫＭ９６６  （非還元条件）の泳動パターンをぞれぞれ示した。
【図１９】は精製した抗ＧＭ２  ヒト型キメラ抗体ＫＭ９６８  のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１５％グラジエントゲルを使用）  の電気泳動パターンを示した図である。左側が還元条件、右側が非還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンの左側より、高分子量マーカー、低分子マーカー、ヒトＩｇＧ  スタンダード、ＫＭ９６８  （還元条件）、低分子マーカー、ヒトＩｇＧ  スタンダード、ＫＭ９６８  （非還元条件）の泳動パターンをぞれぞれ示した。
【図２０】はヒト肺小細胞癌株ＳＢＣ−３  およびＬＵ−１３５に対するＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ  活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性をそれぞれ示す。
【図２１】はヒト肺扁平上皮癌株ＰＣ−１０  およびヒト肺腺癌株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳに対するＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ  活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性をそれぞれ示す。
【図２２】はヒト肺大細胞癌株ＰＣ−１３  およびヒト神経芽細胞腫株ＮＡＧＡＩ  に対するＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ  活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性をそれぞれ示す。
【図２３】はヒト神経芽細胞腫ＧＯＴＯおよびヒト脳腫瘍株Ａ１７２に対するＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＣＤＣ  活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＣＤＣ  活性をそれぞれ示す。
【図２４】はヒト肺小細胞癌株ＳＢＣ−３  およびＬＵ−１３５に対するＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２５】はヒト肺扁平上皮癌株ＰＣ−１０  およびヒト肺腺癌株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳに対するＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２６】はヒト肺大細胞癌株ＰＣ−１３  およびヒト神経芽細胞腫株ＮＡＧＡＩ  に対するＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２７】はヒト神経芽細胞腫ＧＯＴＯおよびヒト脳腫瘍株Ａ１７２に対するＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸は細胞障害活性、横軸は添加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のグラフがＫＭ−６９６のＡＤＣＣ活性を、斜線のグラフがＫＭ９６６  のＡＤＣＣ活性をそれぞれ示す。
【図２８】は９．３ｋｂ  のＫＭ５０細胞の染色体ＤＮＡ  のＸｂａＩ断片の制限酵素切断地図を示した図である。
【図２９】はプラスミドｐＫＭＢ１１の造成工程を示した図である。
【図３０】はプラスミドｐＫＭＤ６  の造成工程を示した図である。
【図３１】はプラスミドｐＥＰＫＭＡ１  の造成工程を示した図である。
【図３２】はプラスミドｐＥＰＫＭＢ１  の造成工程を示した図である。
【図３３】はプラスミドｐＡＧＥ５０１  の造成工程を示した図である。
【図３４】はプラスミドｐＡＧＥ１０９  の造成工程を示した図である。
【図３５】はプラスミドｐＡＧＥ５０２  の造成工程を示した図である。
【図３６】はプラスミドｐＡＧＥ５０３  の造成工程を示した図である。
【図３７】はプラスミドｐＳＥｄ１  の造成工程を示した図である。
【図３８】はプラスミドｐＳＥ１Ｄ２の造成工程を示した図である。
【図３９】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ２  の造成工程を示した図である。
【図４０】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ３  の造成工程を示した図である。
【図４１】はプラスミドｐＩＧ１ＳＥ１ｄ４  の造成工程を示した図である。
【図４２】はプラスミドｐＰＭＯＬ２の造成工程を示した図である。
【図４３】はプラスミドｐＰＭＯＬ３の造成工程を示した図である。
【図４４】はプラスミドｐｃｈＣＫＡ７  の造成工程を示した図である。
【図４５】はプラスミドｐｃｈＣＫＢ１  の造成工程を示した図である。
【図４６】はプラスミドｐｃｋＣＫＣ１  の造成工程を示した図である。
【図４７】はプラスミドｐＣｈｉＩｇＨＢ２  の造成工程を示した図である。
【図４８】はプラスミドｐＣｈｉＩｇＬＡ１  の造成工程を示した図である。
【図４９】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＡ３およびｐＫＭ６４１ＬＡ２  を示した図である。
【図５０】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の造成工程を示した図である。
【図５１】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＥ１  の造成工程を示した図である。
【図５２】はプラスミドｐＫＭ６４１ＨＦ１  の造成工程を示した図である。
【図５３】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡ１の造成工程を示した図である。
【図５４】はプラスミドｐＣｈｉ６４１ＨＡＭ１  の造成工程を示した図である。
【図５５】はＤＮＡ  、ｈＫＭ７９６Ｈ  の造成工程を示した図である。
【図５６】はＤＮＡ  、ｈＫＭ７９６Ｌ  の造成工程を示した図である。
【図５７】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭ１の造成工程を示した図である。
【図５８】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図５９】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＩ１の造成工程を示した図である。
【図６０】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭ１の造成工程を示した図である。
【図６１】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＬＭＳ１  の造成工程を示した図である。
【図６２】はプラスミドｐｈＫＭ７９６Ｈ１０７  の造成工程を示した図である。
【図６３】はプラスミドｐｈＫＭ７９６ＨＬ１の造成工程を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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