(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＭ型抗体を含有する抗体製剤であって、ＩｇＭ型抗体を総抗体量の  少なくとも約２０重量％を含んでなり、かつ、放射免疫拡散法により測定した場合にＩ ｇＭの抗原決定因子の損失が４０％未満である特異的補体活性化活性を有するが、試験  管内でのアナフィラトキシンＣ４ａの発生について評価するとＣ４ａが約１．０μｇ／  ｍｌ未満である非特異的補体活性化を示すにすぎないことを特徴とする抗体製剤。
【請求項２】
ＩｇＭを総抗体の少なくとも約３０重量％含有する請求項１記載の抗体  製剤。
【請求項３】
ＩｇＭ型およびＩｇＧ型の生物学的に活性な抗体を有する抗体製剤にお  いて、
（Ａ）総抗体量の少なくとも約２０重量％の量でＩｇＭ型抗体を含み、
（Ｂ）試験管内でのアナフィラトキシンＣ４ａの発生について評価するとＣ４ａが約１  ．０μｇ／ｍｌ未満である非特異的補体活性化を示し、ならびに
（Ｃ）放射免疫拡散法により測定した場合に少なくとも５０％のＩｇＭの抗原決定因子 が残存するような抗原結合性および特異的補体活性化活性が残存している、
ことを特徴とする改良された抗体製剤。
【請求項４】
非特異的補体活性化活性がシノモルグス猿における心臓血管作用の評価  試験において、対象より動脈血圧の低下が１０％未満である最小の低血圧を示す請求項
３記載の抗体製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
分野：  この開示は一般的には治療用抗体すなわち免疫グロブリンに関するものであり、そして特に、少なくとも数種のＩｇＭ型抗体を含んでいる治療用免疫グロブリン製剤に関するものである。
【０００２】
先行技術：  抗体は公知の類別システム（すなわちＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）に従い分類されており、そしてＩｇＧの場合には副類別（すなわちＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に従い分類されている。
【０００３】
市販の免疫グロブリン製剤（免疫血清グロブリンすなわちＩＳＧとして知られている）は一般的には主としてＩｇＧ型抗体からなっており、ＩｇＧ副類別の分布は人間の血漿中で観察されるものと似ている。典型的には、そのような製剤中のＩｇＭ量は、たとえ存在しているとしても、比較的少量である。
【０００４】
ＩｇＭは、人間で観察される免疫グロブリンの約７％を構成している公知の１９Ｓ免疫グロブリンである。ＩｇＭ抗体は少なくとも５の抗体価を有していると言われており、そしてそれらは免疫応答において生成する最も初期の抗体である。ＩｇＭ抗体は特にバクテリア性感染において非常に有効であるという傾向があるが、それらは約５日という比較的短い生体内半減期を有している。さらに、ＩｇＭ抗体は凝集する傾向があり、そして特に精製形で安定化させるのは比較的困難である。
【０００５】
現在まで、相当量のＩｇＭ抗体を有する唯一の公知の商業的静脈用（ＩＶ）製品は西ドイツのバイオテストＧｍｂＨから販売されているペンタグロビンＴＭとして知られている製品である。その製品の用途は、Ｋ．Ｄ．チンプナー（Ｔｙｍｐｎｅｒ）他、「静脈内ＩｇＭ−適用（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ＩｇＭ−Ａｐｐｌｉｋａｔｉｏｎ）」、Ｍｓｃｈｒ．  Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋ．、１２３、４００−４０１（１９７５）およびＫ．Ｎ．ハーク（Ｈａｑｕｅ）他、「新生敗血症におけるＩｇＭに富んでいる静脈内免疫グロブリン治療（ＩｇＭ−Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｓｅｐｓｉｓ）」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｄｉｓ．  Ｃｈｉｌｄ．、１４２、１２９３−１２９６（１９８８）による論文中に記載されているようである。その製品は、全蛋白質基準の重量％で、約７６％のＩｇＧ、約１２％のＩｇＡおよび約１２％のＩｇＭからなっている。
【０００６】
ＩＳＧ製品中での比較的大量のＩｇＭの使用は逆反応をもたらすと思われてきている。例えば、免疫反応における補体カスケードの活性化ではＩｇＭはＩｇＧより数倍有能である。この理由は、抗原と結合している１個だけのＩｇＭ分子が補体を活性化させるのに対して、ＩｇＧは２個以上のＩｇＧ分子が互いに緊密に関連して抗原と結合して補体を活性化させなければならないからである。
【０００７】
ＩｇＭに富んでいる製品を製造する際に使用される製造方法が減成反応により得られるＩｇＭの量を限定するかもしれないようである。例えば、ＩｇＭに富んでいる製品を静脈内に投与可能にさせるためのβ−プロピオラクトンの使用を記載しているＷ．ステフェン（Ｓｔｅｐｈｅｎ）の米国特許４，３１８，９０２を参照のこと。従って、どの理由にせよ、ＩｇＭが非常に有効であると認識されていながら、約１２重量％より多い合計蛋白質量の市販の静脈内用ＩＳＧ製品はまだ出現していないようである。２０重量％ＩｇＭ製品は過去に得られているが（ガンマ−Ｍ−コンツェントラート、ベリングヴェルケＡＧ、マルブルグ、ドイツ）、それは筋肉内（静脈内ではない）用途用に製造されており且つそれに限定されていた。
【０００８】
血漿から誘導されたＩｇＭ、より最近ではモノクローンから誘導されたＩｇＭ、に関しては種々の精製方式が示唆されている。血漿から誘導されたＩｇＭの場合には、コーン留分ＩＩＩとして知られているものからアルコール分別技術を使用して比較的濃縮されたＩｇＭを得られることが１９４０年代から知られている。例えば、静脈内（ＩＶ）投与に適している濃縮された（１２％）ＩｇＭを製造するためのベータ−プロピオラクトンの使用に関するＷ．ステフェンの上記で引用されている米国特許４，３１８，９０２（およびそこでの引用文献）も参照のこと。さらに、ミウラ（Ｍｉｕｒａ）他のＥＰＯ出願０  ０３８  ６６７（ＩｇＭアシル化）も参照のこと。他のＩｇＭ精製または製造技術は、Ｕ．スッグ（Ｓｕｇｇ）他、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、３６：２５−２８（１９７９）；Ｍ．ステインバッフ（Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ）他、プリパラティブ・バイオケミストリー（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３（４）、３６３−３７３（１９７３）およびＡ．ウッヒマン（Ｗｉｃｈｍａｎ）他、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ）、４９０：３６３−６９（１９７７）により開示されている。種々の技術的理由により、血漿から誘導されたＩｇＭは精製が比較的難しくそして現在までの最高既知純度（分析目的用に使用されている）は約９０重量％のＩｇＭである。
【０００９】
ＩｇＭに富んでいる製剤に関連する上記の問題点の他に、製剤は使用時に非−特異的補体活性化として知られている事象を生成する傾向があることが観察されている。非−特異的補体活性化とは、抗体−抗原複合体の不存在下での補体カスケードの開始をさしている。この現象はしばしば免疫グロブリン凝集物の注入に伴われる。非−特異的補体活性化は例えば低血圧症の如き望ましくない副作用を起こすかもしれないため、それは避けるべきである。一方、特異的補体活性化は望ましく、しかもそれは免疫グロブリンが例えば血液流中の微生物の抗原性表面に結合した後にのみ起きる。
【００１０】
ｐＨ３．８−４．０において２４時間にわたりそしてその後にｐＨを７．０に調節して３７℃に加熱された静脈投与用の人間ガンマ−グロブリンが補体固定試験により測定された抗補体活性（ＡＣ）の減少をもたらすことは、Ｓ．バランダン（Ｂａｒａｎｄｕｎ）他、「人間ガンマ−グロブリンの静脈内投与（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇａｍｍａ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、７、１５７−１７４（１９６２）により報告されている。しかしながら、比較的長い培養期間にわたるこの処理は凝集したガンマ−グロブリンの生成により高い抗補体活性を生じる。これらの著者は抗原と結合された時の加熱された免疫グロブリンによる特異的補体活性の保有は示していない。さらに、これらの著者は生体内安全性は示していなかった。さらに、Ｍ．ヴッケルハウセル（Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ）他、「巨大グロブリンの大規模製造（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、２３、１１９−１２５（１９７２）は、ＰＥＧ沈澱により製造されたＩｇＭ濃縮物は標準的補体固定試験により高い抗補体活性（ＡＣ）を有しており且つこのＡＣ活性はＩｇＭ濃縮物をｐＨ４．０において３７℃で８時間培養しそしてその後に中性ｐＨに再調節することにより１０倍も減じられたことを示している。前の論文（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、７、１５７−１７４（１９６２））と同様に、これらの著者も加熱されたＩｇＭ濃縮物の特異的補体活性化能力を評価しておらず、また、彼らは動物モデルにおける安全性も評価していない。
【００１１】
我々は、ＩｇＭまたはＩｇＭに富んでいる免疫グロブリン製剤に関する非−特異的補体活性化問題を比較的簡単でしかも驚異的な方法で（特異的補体活性化を損なうことなく）最小にできることを、今見いだした。
【００１２】
【発明の要旨】
特異的補体活性化効果剤機能を保有しながらＩｇＭ−含有免疫グロブリン製剤において非−特異的補体活性化を実質的に排除するという我々の方法は、該製剤をＩｇＭ抗体の通常の生物学的活性または抗原結合活性に悪影響を与えずに非−特異的補体活性化を排除するのに充分な条件下で穏やかな加熱段階にかける工程を含んでいる。これを行うには、加熱段階は少なくとも約１０分間にわたる約４０℃−６２℃の、好適には約４５℃−５５℃の、範囲内の温度であるべきでありそして製剤は好適には約４．０−５．０の酸性ｐＨ範囲を有する水溶液状であるべきであるということを、我々は見いだした。現在までは、好適温度は少なくとも約３０分間にわたる５０℃付近であるようである。
【００１３】
我々の改良製品は、少なくとも数種の測定可能なＩｇＭ型抗体を含有している免疫グロブリン製剤からなっている。好適製品は乾燥重量基準で少なくとも２０％のＩｇＭ型抗体を含んでおり、抗体の残りは主としてＩｇＧ型のものである。痕跡量（２０重量％以下）の他の型が存在しているかもしれない。我々の好適製品および方法の詳細は以下に記されている。
【００１４】
【特定態様】
我々の研究所における研究は、ペントバルビタールで麻酔をかけたシノモルグス猿中のＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の注入により誘発される再現性のある逆応答を示した。その製品は乾燥重量基準で約５０重量％のＩｇＭを含んでおり、残りはＩｇＧであった。混合物は５％水溶液状で静脈内に投与された。投与速度は１ｍｇ／ｋｇ／分（ＩｇＭ）であり、５０ｍｇ／ｋｇの総投与量であった。逆応答の主な要素は動脈血圧の大減少であった。逆作用機構を理解するための試みでは、我々は中性ｐＨ（酸性ｐＨではない）において製造された熱−凝集ＩｇＧは猿に注入された時にはＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の注入後に観察されるものと同様な作用を顕著に誘発したことを示した。中性ｐＨで製造されたＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物およびＩｇＧの凝集物の両者とも補体の正統的経路を活性化させることができるため、我々は補体活性化はシノモルグス猿中での逆作用の誘発と関連があると仮定した。正統的補体経路はインフラメーション（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、基本的原則および臨床的関連補体：化学および経路（Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ）、２１−５３頁中に記載されておりそれの技術はここでは参考用に記しておく（ラヴェン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８８）。
【００１５】
補体系統は主として微生物感染に対する免疫防衛における効果剤機構として機能する。補体系統の活性化製品は食細胞を引き付けそしてオプソニン作用による異質粒子の吸収および破壊を大きく促進させる。補体の活性化用には２種類の経路すなわち正統的経路および別の通路が存在している。正統的通路の活性化は抗原−抗体複合体によりまたは細胞状もしくは粒状抗原と結合された抗体により開始される。別の経路は抗体とは独立して例えばバクテリア性壁成分、バクテリア性脂肪多糖類（ＬＰＳ）、酵母（チモサン）の細胞壁成分および真菌の如き物質により活性化される。別の経路は免疫応答前の感染に対する保護を与えるが、正統的経路は抗体が生成した後に重要であると思われている。
【００１６】
血液補体系統の活性化により、アナフィラトキシンと称されている生活性ペプチド断片が発生する。補体４ａ（Ｃ４ａ）アナフィラトキシンはＣ４の分裂生成物（分子量８７４０）である。Ｃｌｑは抗原−抗体複合体または凝集物により活性化されて、Ｃｌ複合体はＣ４をＣ４ａおよびＣ４ｂに分裂させて、Ｃ４ｂが活性化表面と結合することができて、Ｃ４ａアナフィラトキシンが血漿中に放出される。分析学的生化学における最近の研究により、放射免疫検定による血漿Ｃ４ａの測定が可能になるという技術が提唱されている。例えば、両方ともＰ．Ｓ．サトウ（Ｓａｔｏｈ）のものである米国特許４，７３１，３３６およびヨーロッパ特許９７，４４０を参照のこと。
【００１７】
血漿中でのＣ４ａ水準の測定により、生体内の正統的補体カスケードの活性化に関する直接的情報が得られる。さらに、例えば補体源の如き人間血清を用いる種々の免疫グロブリン製剤による試験管内でのＣ４ａ発生の誘発は免疫グロブリン注入後の猿における生体内補体活性化と相互関連している。
【００１８】
ここに記載されている研究では、我々は中性ｐＨにおいて製造されたＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物および／または熱−凝集されたＩｇＧにより誘発された逆作用（低血圧症）が高水準の血漿Ｃ４ａと関連しているかどうかを測定した。さらに、免疫グロブリン製剤により誘発された補体（正統的経路）の非−特異的活性化も試験管内でのＣ４ａ発生により評価した。
【００１９】
これらの評価方式を用いて、我々はさらにＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の穏やかな熱処理が試験管内でのＣ４ａ発生を減少させそしてこれに関連して穏やかな熱処理が非−人間霊長動物中への非経口的（静脈内）投与に伴う逆の副作用（低血圧症）を減少させることも示した。最後に、我々は穏やかな熱処理工程段階はＩｇＭもしくはＩｇＧまたは特異的抗原結合位置の抗原的測定には意義あるほどの影響を与えず、従って免疫グロブリンの効果剤機能は変わらないことも示した。免疫グロブリンの望ましい特別な補体活性化性質の保有は、その後のオプソニン作用研究で確認された。
【００２０】
【方法】
種々の免疫グロブリン製剤により誘発される逆作用（低血圧症）をシノモルグス猿中で評価した。猿にケタミン塩酸塩の筋肉内注射（５ｍｇ／ｋｇ）により麻酔をかけた。挿管法の後に、ペントバルビタールナトリウムの静脈注射（必要に応じて５−１０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔状態を保った。それぞれ、平均的動脈血圧および免疫グロブリン製剤の非経口的投与の測定のために、カテーテルを大腿動脈および静脈の中に挿入した。
【００２１】
ＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物用には、我々は１ｍｇ／ｋｇ／分の注入速度（ＩｇＭ）を５０ｍｇ／ｋｇの総投与量となるまで用いた。この速度および投与量は３０分以内に重症の低血圧症をもたらした（表示されたデータ）。
【００２２】
逆作用が生じる場合にはこの時間枠内で起きることを我々は認識していたため、血圧測定は９０分間の期間にわたり大腿動脈から行われた。Ｃ４ａアナフィラトキシンの測定は、０、３０、６０および９０分において採取した全血（クエン酸塩を用いて抗凝固処理された）からの血漿に対して行われた。試料を−７０℃で貯蔵した。Ｃ４ａ測定は、アメルシャム・インターナショナル（アーリントン・ハイツ、イリノイ州）製の器具を用いる放射免疫検定により行われた。
【００２３】
【定義】ここで使用されている抗体（または免疫グロブリン）製剤という表現は、少なくとも約２０重量％のＩｇＭ型抗体を含んでおりそして存在している場合には残りの抗体は主としてＩｇＧ型抗体および痕跡量の例えばＩｇＡなどの如き他の型であるような治療用抗体の堆積物を意味している。個々の抗体は例えば血漿（例えば上記のもの）の如き種々の源からまたは細胞媒体系統（例えば雑種もしくは変換された細胞線からのモノクローン性抗体）から得られる。下記の実施例では、我々のＩｇＭに富んでいる抗体製剤は平均して３０−５０重量％のＩｇＭ型抗体を含有しており、残りの抗体は主としてＩｇＧ型のものである。
【００２４】
非−特異的補体活性化は、抗原の不存在下における免疫グロブリンによる補体カスケードの活性化を意味している。
【００２５】
最小の非−特異的補体活性化は、抗原の不存在下での試験管内評価における約１．０μｇ／ｍｌ以下のＣ４ａの発生を意味している。一方、最小の非−特異的補体活性化は、対照用としてｐＨ４．２５の液体ＩＶＩＧを用いて発生するＣ４ａ量の約１００％以内のＣ４ａ発生量を意味している。
【００２６】
特異的補体活性化は、抗原の存在下での免疫グロブリン（ＩｇＭまたはＩｇＧ型のもの）による補体カスケードの活性化を意味している。
【００２７】
ＩｇＭに富んでいる抗体製剤に適用される際に特異的補体活性化が実質的に損失されないということは、抗体製剤が抗原と結合可能でありそして試験管内もしくは生体内での補体の正統的経路を活性化可能であることを意味している。
【００２８】
【物質】
Ｐｄ ＩｇＭ 免疫グロブリン濃縮物製剤
１２．５容量部のｐＨが３．５−４．０の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液中に懸濁されておりそして室温で２−３時間にわたり混合されたコーン留分ＩＩＩペースト（４５ｋｇ）から、Ｐｄ  ＩｇＭ  免疫グロブリン濃縮物を単離した。該混合物に２．０容量／重量％のｐＨが４．８のカプリル酸を加えて、遠心により脂肪蛋白質およびプレカリクレイン活性化剤（ＰＫＡ）を除去した。抽出されたカプリレート上澄み液は、ダイアフィルタレーションまたはＰＭ−３０を通す限外濾過後に、ｐＨ４．８における０．０３−０．０６ｍｍｈｏ／ｃｍという低い伝導率を与える。ウィルスの不活性化は、０．３％ＴＮＢＰ／１％ツィーン−８０を用いて２４℃において６時間以上にわたり得られた。カプリルレート上澄み液を例えばトリス（０．０１０１容量の１Ｍトリス、ｐＨ７．８）またはイミダゾール緩衝液（０．００５容量の１Ｍイミダゾール、ｐＨ７．８）殺菌水の如き緩衝液を用いて沈澱させ、ｐＨを酢酸を用いて４．０−４．８に調節し、そしてさらに水に対してダイアフィルタレーション／限外濾過し、次に固体グリセリンを加えてｐＨが４．０−４．８の０．２５Ｍグリシンの最終的濃度とする。Ｐｄ  ＩｇＭ  免疫グロブリン濃縮物は低いＰＫＡ（対照用の１０％以下）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定された５％以下の凝集物を与えた。最終的なＩｇＭに富んでいる生成物は、合計５％の蛋白質水溶液中の、乾燥重量基準で５０−６０％のＩｇＭ、３０−４０％のＩｇＧ、３−５％のＩｇＡからなっていた。
【００２９】
熱−凝集されたＩｇＧ製剤
ＩＧＩＶ（ロット＃２８５５−１１Ｂ）の５％溶液を適当な抗体対照用として使用した。５％ＩＧＩＶ溶液から、１時間にわたる６２℃における加熱（ｐＨ７．０）により、熱−凝集されたＩｇＧ溶液を製造した。２時間にわたる６２℃における加熱（ｐＨ４．２５）により、他の熱−凝集されたＩｇＧ溶液を製造した。
【００３０】
熱処理されたＩｇＭ、ＩｇＧ製剤
最適処理方式を決めるための水またはグリシン（ｐＨ４．０−４．８）中でのＩｇＭ、ＩｇＧ調合物の熱処理は１０分間−８時間の期間にわたる３７℃−６２℃の範囲であった。
【００３１】
【検定方法】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による凝集物測定
天然のＩｇＭおよびＩｇＧ製剤または加熱により誘発されたもの中での凝集物生成を、ＴＳＫＧ４０００ＳＷＸＬゲル（７．８×３００ｍｍ、８μｍの粒子寸法、東洋ソーダ株式会社、日本）を用いそして０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、０．２０Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ５．０で溶離される高圧液体クロマトグラフィーにより測定した。
【００３２】
ＩｇＭ免疫グロブリン濃縮物の生物学的および機能的活性測定
１．放射免疫拡散（ＲＩＤ）によるＩｇＭに富んでいるＩｇＧの抗原性測定
ＩｇＭおよびＩｇＧの濃度および抗原性測定は、ヘレン・ラボラトリイス（ビューモント、テキサス州）製のキプレートシステムを用いる放射免疫拡散（ＲＩＤ）により測定された。この方法は、抗体保有の間接的評価を与えるものである。
【００３３】
２．Ｐｓ．ＩＴ４ＬＰＳに対するＥＬＩＳＡによる特異的抗原結合位置研究
ＩｇＭ免疫グロブリン濃縮物および穏やかに熱処理されたＩｇＭ濃縮物の生物学的活性を酵素−結合された免疫吸収剤検定（ＥＬＩＳＡ）により測定して、Ｐｓ．ＩＴ４ＬＰＳ（脂肪多糖類）へのＩｇＭ結合を定量化しそして特異的抗原結合位置の保有を評価した。ｐＨが９．５の０．０６Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の１０μｇの緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）免疫型４ＬＰＳをイミュロン１板（ダイナテク・ラボ）に３７℃において３時間にわたり被覆させた。板の各ウエルをＰＢＳ−０．０５％ツィーン緩衝液で２回洗浄した。標準的シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）モノクローン性抗体および未加熱／加熱処理されたＩｇＭ濃縮物をＢＳＡを含有しているｐＨが７．８の０．０１Ｍトリス緩衝液中で希釈し、そして室温で一夜培養された板に加えた。各ウエルをＰＢＳ−ツィーン緩衝液で３回洗浄した。山羊の抗−人間ＩｇＭアルカリ性ホスファターゼ共役物（ハイクローン、ロガン、ユタ州）を室温で４時間培養されたウエルに加え、そしてウエルをＰＢＳ−ツィーン緩衝液で５回洗浄した。ｐＨが９．８のジエタノールアミン基質溶液中のｐ−燐酸ニトロフェニルを各ウエルに室温において３０分間にわたり加え、そしてＡ４０５ｎｍ／４５０ｎｍを読み取った。
【００３４】
３．食細胞検定による特異的補体活性測定
食細胞検定を使用して、穏やかに熱処理されたＩｇＭ免疫グロブリン濃縮物のオプソニン活性（特異的補体活性）を測定した。食細胞検定は、組織培養流体中に懸濁されているバクテリア（大腸菌０５０：ｋ１）および人間食細胞（ＰＭＮ）を使用した。バクテリア対ＰＭＮ比は２０対１であり、そして５（容量／容量）％のモルモット血清（ＧＰＳ）が補体源として作用した。２．５μｌのＩｇＭ濃縮物を総検定混合物（５００μｌ）に加え、そして３７℃において１００分間にわたり培養した。検定混合物の試験試料を９容量の蒸留水に加えてＰＭＮを溶解させ、そして生存バクテリアを二重寒天板計数により数えた。
【００３５】
４．アナフィラトキシン（Ｃ４ａ）発生により評価される試験管内および生体内での非−特異的補体活性化
種々の免疫グロブリン製剤の試験管内での補体の正統的経路を活性化させる能力を、各製剤（１．４７ｍｇのＩｇＭまたはＩｇＧ／ｍｌの血清）を人間血清と共に３７℃において２０分間にわたり培養しそして生じたＣ４ａ水準生成を放射免疫検定（ＲＩＡ）により評価した。ＲＩＡ器具はアメルシャム（アーリントン・ハイツ、イリノイ州）製のものであった。
【００３６】
生体内での系統的補体活性化は、猿における種々の免疫グロブリン製剤の非経口的投与後の血漿Ｃ４ａ水準を測定することにより、評価された。人間のＣ４ａ（ＲＩＡ器具）に対して上昇した抗体は部分的にすなわち約６０％ほど猿のＣ４ａと相互反応した。
【００３７】
【結果】
表１は、非−特異的補体活性化が静脈内注入後の逆の心臓血管事象と関連があるという仮説を試験するために設定された初期実験において使用された免疫グロブリン製剤を記している。この仮説を試験するために、補体源として人間血清を使用する際のＣ４ａ発生を測定することにより、種々の免疫グロブリン製剤をそれらが試験管内での補体の正統的経路を活性化させる能力に関して評価した。心臓血管安全性を評価するために、免疫グロブリン注入後に９０分間の期間にわたり猿の食細胞中での平均動脈血圧（ＭＡＰ）を測定した。注入後の補体活性化を確認するために、血漿Ｃ４ａ水準も測定した。
【００３８】
試験管内データ
ｐＨが４．２５の０．２Ｍグリシン中の５％ＩＧＩＶ免疫グロブリン（対照用）溶液は、人間血清（＜１％、０．２３μｇ／ｍｌ）と共に培養された時には、試験管内では認識できるほどのＣ４ａ発生を起こさなかった。ｐＨが４．２５の同様なグリシン緩衝液中での真性グロブリン沈澱により製造された前記の富んでいるｐｄ  ＩｇＭは試験管内でかなりのＣ４ａ発生（４．５μｇ／ｍｌ）を生じた。補体の公知の活性化剤である凝集されたＩｇＧを製造するために、我々はｐＨが７．０の５％ＩＧＩＶ蛋白質溶液を６２℃に１時間加熱した。この加熱処理で、１９％の五量体凝集物を有する溶液が生じ、それはＲＩＤにより評価されたそれの抗原性決定因子の７２％以上を依然として保有していた。この免疫グロブリン溶液は、人間血清と共に培養された時には、かなりの量のＣ４ａ（１４．０μｇ／ｍｌ）も生成した。しかしながら、同じＩＧＩＶ溶液は試験管内でｐＨ４．２５において加熱された時には５８％の凝集物（五量体より小さい寸法）を生成したがかなりの量のＣ４ａは生成しなかった（０．５６μｇ／ｍｌ）。このＩＧＧ溶液はＲＩＤにより測定されたそれの抗原性決定因子の８０％以上を損失していた。
【００３９】
【表１】
0003591782.tif 000002
これらの結果は、ｐＨが７．０ではｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物並びに熱−凝集されたＩＧＩＶの両者は試験管内でかなりＣ４ａを発生したが、ｐＨが４．２５の天然ＩＧＩＶおよび加熱されたＩＧＩＶはあまりＣ４ａアナフィラトキシンを発生しなかったことを示している。
【００４０】
免疫グロブリン溶液を静脈内に注入した時のこれらの非特異的補体活性化の試験管内測定値がシノモルグス猿中での逆の心臓血管作用と関連しているかどうかを測定することが重要である。
【００４１】
【表２】
0003591782.tif 000003
【００４２】
表２および図１−４は、各免疫グロブリン製剤を用いた生体内結果を表示している。これらの結果は、試験管内ではかなりのＣ４ａ水準を生成する免疫グロブリン製剤すなわちｐＨが７.０におけるｐｄＩｇＭおよび熱−凝集されたＩＧＩＶはシノモルグス猿中で重症の低血圧症および高められた血漿Ｃ４ａ水準を引き起こす一方で、試験管内でかなりのＣ４ａを生成しない免疫グロブリン製剤すなわちｐＨが４.２５における天然ＩＧＩＶおよび熱凝集されたＩＧＩＶはシノモルグス猿中で低血圧症を引き起こさずしかも血漿Ｃ４ａ水準を大きく増加させないことを示している。従って、種々の免疫グロブリン製剤によるＣ４ａ発生の試験管内評価は静脈注入後の生体内での逆の心臓血管作用と関連があるようである。
【００４３】
ｐＨ４.２５において加熱されたＩＧＩＶ蛋白質溶液は試験管内でかなりのＣ４ａ発生を引き起こさず且つ静脈内に投与された時には低血圧症を引き起こさないため、我々は多分ｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物のｐＨ４.２５における加熱が溶液中に存在しているＩｇＧに悪影響を与えずにＩｇＭの非−特異的補体活性化能力を減少させると理由づけた。すなわち、酸性ｐＨにおけるＩｇＧの加熱は試験管内で補体を活性化させそしてシノモルグス猿中に注入された時の悪影響を有していない溶液を与えない。この仮説を試験するために、我々は最初にｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン溶液を６２℃に２時間加熱しそしてそれのＣ４ａ発生能力を試験管内で評価した。この溶液は試験管内でかなりのＣ４ａを発生せず（０.２７μｇ／ｍｌ）、そしてシノモルグス猿中に注入された時に低血圧症または血漿中でＣ４ａの実質的な増加を引き起こさなかった。表３ａ、３ｂおよび図１、２。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
表３ｂ
猿におけるＭＡＰおよび血漿Ｃ４ａアナフィラトキシン水準に対する熱処理されたｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の急性作用（Ｎ＝３）
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これらの結果は、酸性ｐＨ（４.２５）におけるＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の加熱（２時間にわたる６２℃）により、試験管内での非−特異的補体活性化能力を劇的に減少させそしてシノモルグス猿に注入された時に低血圧症を引き起こさない蛋白質溶液が生成したことを示している。しかしながら、この特定熱処理（２時間にわたる６２℃）はＩｇＭ抗原性決定因子の８０％以上の損失および４７％以上の五量体凝集物生成をもたらした、表３。
【００４６】
従って、この熱処理は静脈内投与に関連している逆の心臓血管作用を減少させるが、免疫グロブリンの効果剤機能も減少させるようである。従って、我々は関連する生物学的効果剤機能すなわち抗原結合、オプソニン作用などを保有しながら最小の非−特異的補体活性化能力を有するＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物を生じるであろう最適加熱温度および培養時間をさらに詳細に規定しようと試みた。
【００４７】
この評価中に、多くの条件を試験した。表４には、試験管内でのＣ４ａアナフィラトキシン発生に対する温度および培養時間の影響に関するデータがまとめられている。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
６２℃に１０分間加熱されたｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物（５０％ＩｇＭ、ｐＨ４．２４）は試験管内で実質的でない量のＣ４ａ発生を引き起こしたが（０．４９μｇ／ｍｌ）、ＩｇＭ抗原性決定因子の約５０％が損失された。ＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物を５５℃に３０分間加熱すると、試験管内でのＣ４ａ発生が０．３５μｇ／ｍｌに減少し、そしてＩｇＭ免疫グロブリンはそれの抗原性決定因子の７５％以上を保有していた。５２℃に１２０分間にわたり加熱すると、Ｃ４ａ発生が０．６０μｇ／ｍｌに減少しそして免疫グロブリンはそれの抗原性決定因子の９８％以上を保有していた。５０℃に１８０分間にわたり加熱すると、Ｃ４ａ発生が０．７７μｇ／ｍｌに減少しそして免疫グロブリンはそれの抗原性決定因子の９２％以上を保有していた。４５℃−３７℃に加熱された免疫グロブリンはかなりのＣ４ａ発生能力（＞４μｇ／ｍｌ）を保有しておりそしてＩｇＭ抗原性決定因子の減少は示さなかった。
【００５０】
次に我々は試験管内でのＣ４ａ発生に対するｐＨ、ＩｇＭ濃度および培養時間の影響を試験した、表５。温度は５０℃に一定に保たれていた。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
ｐＨ４．４２において３時間にわたり５０℃に加熱された５０％のＩｇＭを含有しているｐｄＩｇＭ免疫グロブリン濃縮物はＣ４ａ発生において７．０６μｇ／ｍｌから０．８８μｇ／ｍｌへの減少を生じそして完全にＩｇＭ抗原性決定因子を保有していた。ｐＨ４．２４において６０分間にわたり５０℃に加熱された５０％のＩｇＭを含有しているｐｄＩｇＭ免疫グロブリン濃縮物は試験管内でのＣ４ａ発生を引き起こして０．５４μｇ／ｍｌに減少させそして依然としてかなりのＩｇＭ抗原性決定因子（８８％）を保有していた。ｐＨ４．２５において３０分間にわたり５０℃に加熱された２０％のＩｇＭを含有しているＩｇＭ濃縮物は少量のＩｇＭ抗原性決定因子を損失させながらＣ４ａ発生を引き起こして０．８８μｇ／ｍｌに減少させ、そしてさらに１８０分間培養しても、試験管内ではＣ４ａ発生におけるそれ以上の減少は引き起こされなかったがＩｇＭ抗原性決定因子の損失（４０％）をもたらした。
【００５３】
免疫グロブリン効果剤機能に対する加熱の影響をさらに評価するために、我々は種々の加熱条件下でのＰｓ．ＩＴ４脂肪多糖類に対するＩｇＭの抗原結合活性を評価した。これらの結果は表６にまとまられている。
【００５４】
【表７】
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１２０分間にわたり６２℃に加熱されたｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ濃縮物はＩｇＭ抗原性決定因子に悪影響を与えて、特異的抗原結合活性の９０％以上の損失および特異的活性（αＬＰＳ／ＩｇＭ）における３倍の減少を生じた。比較的低温で処理された試料は全てかなりの特異的抗原結合活性および特異的活性におけるかなりでない減少を全て保有していた。
【００５５】
次に我々は、生物学的効果剤機能の別の重要な指示であるオプソニン活性に対して加熱がどのような影響を有しているかを試験した。これらの結果は表７にまとまられている。
【００５６】
【表８】
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血清だけ未加熱のＩｇＭはバクテリア死滅を相当促進させた。１０分間にわたり６２℃に加熱されたＩｇＭ、ＩｇＧ濃縮物はオプソニン活性を相当損失した。５５℃に加熱された濃縮物は活性を２０分間で減少させ、そして４０分間でオプソニン活性をかなり損失した。５０℃における加熱はオプソニン活性を時間につれてわずかに減少させたが、実質的なオプソニン活性は５時間においても依然として保有されていた。４５℃−３７℃の間の温度における加熱は８時間にわたりオプソニン活性を減少させなかった。
【００５７】
３時間にわたり５０℃に加熱されたＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物のオプソニン活性は、大腸菌０５０：Ｋ１に対する食細胞化学蛍光検定でも評価された、図５。３時間にわたる５０℃におけるＩｇＭの加熱はＩｇＭが化学蛍光およびバクテリアの食細胞死滅を促進させる能力を無傷のまま残した。
【００５８】
３時間にわたり５０℃に加熱されたＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物は効果剤機能、すなわちオプソニン食細胞活性、抗原性結合位置など、を保有しており、そして試験管内で減少された非−特異的補体活性化（Ｃ４ａ発生）を示したため、我々はシノモルグス猿中での静脈内注入後のこの製剤の心臓血管作用を評価した。このデータは表８にまとめられている。
【００５９】
【表９】
表８
猿におけるＭＡＰおよび血漿Ｃ４ａアナフィラトキシン水準に対する熱処理されたＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の急性影響（Ｎ＝３）
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これらの猿では免疫グロブリン濃縮物の注入後には重症の低血圧症は観察されず、そして血漿Ｃ４ａ水準は未加熱のＩｇＭ調合物が注入された動物（表２）と比べてはるかに減じられた。
【００６０】
【議論】
ＩｇＭに富んでいるＩｇＧ（ＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物）の非経口的投与がシノモルグス猿中での重症の系統的低血圧症を含むひどい副作用に関連している。ＩｇＭ、ＩｇＧ濃縮物注入がこれらの逆作用を誘発させる際の機構は現在では知られていない。
【００６１】
しかしながら、これらの実験では我々は種々の免疫グロブリン調合物が系統的低血圧症を誘発する能力が正統的補体経路を活性化させるそれらの能力と関連していることを示した。すなわち、試験管内で補体の正統的経路を活性化させる免疫グロブリン調合物（すなわち、中性ｐＨにおけるｐｄＩｇＭおよび熱処理されたＩｇＧ）は猿に静脈内投与された時には系統的低血圧症を誘発する。試験管内で補体の正統的経路を活性化させない免疫グロブリン調合物（例えば、酸性ｐＨにおける未処理のｐｄＩｇＭ、天然のＩｇＧおよび熱処理されたＩｇＧ）は猿に静脈内投与された時には逆の血液動態作用を誘発しない。
【００６２】
従って、種々の免疫グロブリン調合物の補体活性化（正統的経路）の試験管内評価がこれらの調合物が猿に逆作用を誘発する能力を推定するための予測価を有するようである。これが直接原因でありそして関係に影響するかどうかまたはこれらの現象が一時的に関連しているかどうかは測定されていない。さらに、比較的重要のことであるが、我々はｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物の穏やかな熱処理がそれの試験管内で補体を非−特異的に活性化させるそれの能力を減少させそしてこの最終的な工程処理が我々の哺乳動物モデルであるシノモルグス猿中での逆の心臓血管作用（低血圧症）を誘発させるそれの能力を大きく減少させることも示した。
【００６３】
抗原性決定因子および特異的抗原結合一は比較的過酷でない熱処理（３時間にわたる約５０℃の現在の好適温度におけるもの）で保有されているため、抗体保有性はこれらの温度においては損傷されないまま非−特異的補体活性化能力が劇的に減少されるようであり、従ってこの処理によってはるかに良好な製品が生じるであろう。
【００６４】
ＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物を抗原性決定因子または特異的抗原結合位置のかなりの損失を伴わずに長時間にわたり高温で熱処理できることが今示された。該製剤は劇的に減じられた非−特異的補体活性を示しながら依然としてオプソニン食細胞活性は保有している。従って、ＩｇＭに富んでいるＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物生成物中では、適当なｐＨ、適当な蛋白質濃度および適当な安定剤における適当な期間にわたる適当な加熱温度により、非−特異的補体活性は減じられるが、抗原と結合された時の（オプソニン食細胞活性）抗原性決定因子、特異的抗原結合位置、特異的補体活性並びにｐｄＩｇＭ、ＩｇＧ免疫グロブリン濃縮物製品の治療保有性は保っている。
【００６５】
上記の開示があるが、当技術の専門家により改変がなされると思われる。従って、上記の開示は説明用のものであるべきでありそして本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されべきであると考えられている。
【００６６】
本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。
【００６７】
１．特異的補体活性化活性を生成可能でありながら最小の非−特異的補体活性化を生じるという特徴を有する、ＩｇＭ型抗体を含有している抗体製剤。
【００６８】
２．製剤がＩｇＧ型抗体を含んでいる、上記１の製剤。
【００６９】
３．ＩｇＭ型抗体が抗体全量の少なくとも約２０重量％を構成している、上記１の製剤。
【００７０】
４．最小の非−特異的補体活性化の発生が試験管内検定における約１．０μｇ／ｍｌ以下のＣ４ａの発生により示されている、上記１の製剤。
【００７１】
５．ＩｇＭおよびＩｇＧ型の生物学的に活性な抗体を含有している抗体製剤において、
（Ａ）試験管内または生体内で試験した時に最小の非−特異的補体活性化を生じ、且つ
（Ｂ）抗原結合および特異的補体活性化活性を保有している
という特徴からなる改良。
【００７２】
６．製剤が抗体の乾燥重量基準で少なくとも約２０重量％のＩｇＭ型を含有している、上記５の製剤。
【００７３】
７．ＩｇＭが混合物の少なくとも約３０重量％を構成している、上記６の製剤。
【００７４】
８．最小の非−特異的補体活性化が試験管内検定における約１．０μｇ／ｍｌ以下のＣ４ａの発生により示されている、上記５の製剤。
【００７５】
９.非−特異的補体活性化の実質的な不存在が非−人間霊長動物試験における最小の低血圧症（対照用の動脈圧において１０％以下の減少）により示されている、上記５の製剤。
【００７６】
１０．ＩｇＭの少なくとも５０重量％が生物学的に活性でありそして試験管内検定において製剤が約１．０μｇ／ｍｌ以下のＣ４ａを発生させる、上記５の製剤。
【００７７】
１１．ＩｇＭ型抗体を含有している抗体製剤の処理方法において、該製剤をＩｇＭの特異的補体活性化活性を実質的に減少させずに非−特異的補体活性化を最小にするために充分な条件下で穏やかな加熱段階にかける工程を含んでいる方法。
【００７８】
１２．加熱段階が４０℃−６２℃の範囲の温度である、上記１１の方法。
【００７９】
１３．加熱段階が４５℃−５５℃の範囲の温度である、上記１２の方法。
【００８０】
１４．製剤が約４．０−５．０の範囲のｐＨを有する水溶液状である、上記１３の方法。
【００８１】
１５．製剤を約５０℃の温度に約１−３時間にわたり加熱する、上記１４の方法。
【００８２】
１６．ｐＨが約４．２４−４．４２である、上記１５の方法。
【００８３】
１７．上記１の製剤を哺乳動物に注入する段階からなる、哺乳動物に抗体を投与する方法。
【００８４】
１８．注入が約１ｍｇ／ｋｇ／分の速度の静脈注入である、上記１７の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、血漿から誘導されたＩｇＭ（ｐｄＩｇＭ）または熱処理された血漿から誘導されたＩｇＭ（ＨＴｐｄＩｇＭ）が注入されている猿における血漿Ｃ４ａアナフィラトキシン水準を表示している。
【図２】図２は、血漿から誘発されたＩｇＭ（ｐｄＩｇＭ）が注入されている猿における平均動脈血圧（ＭＡＰ）測定値を表示している。
【図３】図３は、天然の静脈内ガンマグロブリン（ＩｇＧ）または中性ｐＨで熱処理された静脈内ガンマグロブリン（ＨＴＩｇＧ）が注入されている猿における血漿Ｃ４ａアナフィラトキシン水準を表示している。
【図４】図４は、天然の静脈内ガンマグロブリン（ＩｇＧ）または中性ｐＨで熱処理された静脈内ガンマグロブリン（ＨＴＩｇＧ）が注入されている猿における平均動脈血圧（ＭＡＰ）測定値を表示している。
【図５】図５は、未加熱のまたは加熱されたＩｇＭが大腸菌０．５０：ｋ１バクテリアに対する食細胞化学蛍光を促進させる能力を表示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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