(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与する単離されたDNA分子であって、
（ａ）本願明細書に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と、
（ｂ）60℃にて、0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSという洗浄ストリンジェンシー（厳密性）で表される条件で、上述の（ａ）のうちの一配列を有する単離されたDNAにハイブリダイゼーションし、かつ、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するDNA配列と
から成る群から選択される配列を有する前記単離されたDNA分子。
【請求項２】
発現カセットを含むDNA構成物であって、前記構成物は5'から3'方向に、根皮層に特異的なプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記プロモーターと機能的に関連した異種DNAセグメントとを含み、前記根皮層に特異的なプロモーターが、
（ａ）本願明細書に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と、
（ｂ）60℃にて、0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSという洗浄ストリンジェンシーで表される条件で、上述の（ａ）のうちの一配列を有する単離されたDNAにハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するDNA配列と
から成る群から選択される配列を有することを特徴とする構成物。
【請求項３】
前記構成物はプラスミドをさらに含む請求項２に記載のDNA構成物。
【請求項４】
前記異種DNAセグメントが、殺虫性タンパク質をコードする遺伝子である請求項２に記載のDNA構成物。
【請求項５】
前記異種DNAセグメントが、昆虫に有毒なバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）結晶タンパク質をコードする遺伝子である請求項３に記載のDNA構成物。
【請求項６】
請求項２に記載のDNA構成物を含有する植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の植物細胞から植物を再生するステップを含む形質転換植物を作成する方法。
【請求項８】
請求項２に記載のDNA構成物を含有するアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の細胞であって、前記DNA構成物はTiプラスミドをさらに含むことを特徴とする
Agrobacterium tumefaciensの細胞。
【請求項９】
請求項８に記載のAgrobacterium tumefaciensに植物細胞を感染させて、形質転換した植物細胞を作成するステップと、その後、前記形質転換した植物細胞から植物を再生させるステップとを含んでなる形質転換植物を作成する方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のDNA構成物を担持する微粒子であって、植物細胞の発射注入による形質転換に適する前記微粒子。
【請求項１１】
請求項10に記載の微粒子を植物細胞内に撃ち込んで、形質転換した植物細胞を生成するステップと、その後、前記形質転換した植物細胞から植物を再生させるステップとを含んでなる形質転換植物を作成する方法。
【請求項１２】
請求項２に記載のDNA構成物を含有する植物細胞プロトプラスト。
【請求項１３】
請求項12に記載の植物細胞プロトプラストから植物を再生させるステップを含む形質転換植物を作成する方法。
【請求項１４】
形質転換した植物細胞を含む形質転換植物であって、前記形質転換した植物細胞は異種DNA構成物を含み、前記DNA構成物は5'から3'方向に根皮層に特異的なプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記プロモーターと機能的に関連した異種DNAセグメントとを含み、前記プロモーターは前記異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与し、前記プロモーターは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と、
（ｂ）60℃にて、0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSという洗浄ストリンジェンシーで表される条件で、上述の（ａ）のうちの一配列を有する単離されたDNAにハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するDNA配列と
から成る群から選択される配列を有することを特徴とする形質転換植物。
【請求項１５】
前記植物は双子葉植物である請求項14に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
前記植物は単子葉植物である請求項14に記載の形質転換植物。
【請求項１７】
前記植物はタバコ（Nicotiana tabacum）である請求項14に記載の形質転換植物。
【請求項１８】
植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するプロモーターから実質的に成り、かつ本願明細書に記載の配列番号１〜９から成る群から選択される配列を有する単離されたDNA分子。
【請求項１９】
発現カセットを含むDNA構成物であって、5'から3'の方向に、請求項18に記載のプロモーターと、前記プロモーターから下流に位置し、かつ前記プロモーターと機能的に関連した異種DNAセグメントとを含むDNA構成物。
【請求項２０】
形質転換した植物細胞を含む形質転換植物であって、前記形質転換した植物細胞は請求項19に記載のDNA構成物を含有する形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、National Science Foudationから助成金第MCB−9206506を受け、政府援助を得て行われた。政府は本発明に対してある一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、組織特異的な遺伝子プロモーターに関し、特に植物の根皮層で活性のあるプロモーターに関する。
発明の背景
プロモーターは転写される遺伝子に隣接するDNA配列であり、その隣接した遺伝子をメッセンジャーRNAに転写する場合、このプロモーターにRNAポリメラーゼが結合しなければならない。プロモーターは、異なる方式でプロモーターと機能的に関連した構造遺伝子に影響を及ぼす多数の異なる調節要素から成ると考えられる。たとえば、調節遺伝子は、関連した構造遺伝子の発現を増強または抑制したり、その遺伝子を発生的な調節下に置いたり、あるいはその遺伝子の組織特異的な調節に寄与したりすることが可能である。組換えDNA手順を使用して、プロモーターに修飾を加えると、任意の遺伝子発現パターンが可能になる。たとえば、Old and Primrose,Principles of Gene Manipulation（第４版、1989年）を参照されたい。
植物プロモーターの１例は、ペチュニアのリブロース−1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットの遺伝子に隣接することが確認されたプロモーターである。米国特許第4,962,028号を参照されたい。もう１つの例は、小麦Em遺伝子の5'側の隣接した領域を含むプロモーターである。EPO出願第335528号を参照されたい。また別の例は、EPO出願第0 330 479号に開示されているストレス誘導性調節要素である。
植物の発育に重要な役割を果たしているにも拘わらず、根における遺伝子発現の調節に関する研究は比較的少ない。この研究の不足は、ある程度は、遺伝子を容易にクローニングして研究することが可能な、直ちに同定できる根特異的な生化学的機能が少ないことに起因する。Evans et al.,Mol.Gen.Genet.214,153−157（1988）は、エンドウ由来の根に特異的なcDNAクローンの単離を試みたが不成功に終わり、根に特異的なmRNA類（存在する場合）は、非常に低レベルの存在量で根mRNA群に存在するにすぎないと結論づけた。Fuller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2594〜2598（1983）は、多数の根粒に特異的な遺伝子をクローニングして特性付けを行った。転写開始のDNA配列5'を比較すると、試験した３種の遺伝子に存在する反復オクタヌクレオチドが明白である。不運なことに、ほとんどのマメ科植物（Leguminaceae）では、効率のよい形質転換／再生システムがなかったため、このようなシス作用性配列の機能的分析が妨げられた。Bogusz et al.,Nature 331,178−180（1988）は、非根粒形成植物の根に特異的に発現されるヘモグロビン遺伝子を、密接に関連した根粒形成種のヘモグロビン遺伝子との相同性によって単離した。Keller and Lamb,Genes ＆ Dev.3,1939−1646（1989）は、側根開始中に発現される細胞壁ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質をコードしている遺伝子を単離した。最近、Lerner and Raikhel,Plant Physiol.91,124−129（1989）は、オオムギ根に特異的なレクチンのクローニングおよび特徴について報告した。
多くの植物病原体および害虫は植物根を損傷し、作物の重大な損害および損失を引き起こす。損傷を受けることが最も多い根組織は、表皮の下にあって根の中心柱を囲む貯蔵柔組織で主に構成される層である、根皮層である。根皮層はさらに厚膜組織、分泌細胞、樹脂道および他の構造や細胞タイプを含む。根皮層の細胞は空気中で生長する苗条の皮層細胞と形態学的類似および発生的類似を示す。
遺伝子工学技術を使用した外来遺伝子の発現によって有用な特性を植物に与えるためには、新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される様々な組織に特異的なプロモーターが必要である。本発明は、この問題と関連した我々の連続的研究に基づくものである。
発明の概要
本発明は、関連した遺伝子の根皮層に特異的に発現に関与するタバコRD2（TobRD2）プロモーターの同定に基づくものである。本発明の第１の態様は、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与する単離されたDNA分子であって、（ａ）本願明細書に記載の配列番号１〜９と、（ｂ）厳密な条件下で配列番号１〜９のいずれかにハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与するDNA配列とから成る群から選択された配列を有する単離されたDNA分子である。
本発明のさらなる態様は、Tobacco RD2プロモーターと、このプロモーターから下流に位置し、かつこのプロモーターと機能的に関連した異種DNAセグメントとを含む発現カセットである。
本発明のさらなる態様は、根皮層に特異的なプロモーターおよび異種DNAセグメント、本願明細書に記載の配列番号１〜９から選択された根皮層に特異的なプロモーターの配列、厳密な条件下で配列番号１〜９のいずれかにハイブリダイゼーションし、植物細胞において根皮層に特異的な転写に関与するDNA配列を含む発現カセットである。
本発明のさらなる態様は、上述の発現カセットを含有する植物細胞、このような植物細胞から形質転換植物を作成する方法、およびこのような形質転換植物細胞を含む形質転換植物である。
【図面の簡単な説明】
図1Aは、７日齢苗のタバコ根の横断面図におけるTobacco RD2転写産物のin situにおける局在性を示す図である。
図1Bは、７日齢苗のタバコ根の縦断面図におけるTobacco RD2転写産物のin situにおける局在性を示す図である。
図２は、TobRD2の5'領域の2010塩基対配列（配列番号１）を示す図である。
図３は、RD2プロモーターが根皮層に特異的な遺伝子発現に関与する能力の試験に使用されたTobRD2プロモーター／グルクロニダーゼ（GUS）構造物を示す略図である。
図４は、表１に示したキメラレポーター遺伝子構造物で形質転換された植物の根（無地の棒）、葉（斑点をつけた棒）および茎（点線入り棒）のβ−グルクロニダーゼ（GUS）活性を要約した棒グラフである。グラフは、異なるプロモーター（CaMV35S、Δ2.00、Δ1.50、Δ1.40、Δ1.25、Δ0.80、Δ0.70、Δ0.60、Δ0.30）を使用し、ベクターpBI101.3のみを対照実験として使用した遺伝子構造物で形質転換された植物の活性を示す。
GUS活性は、pmolMU/μｇタンパク質／分で測定した。
図5Aは、表１に示したように、異なるプロモーター（CaMV35S、Δ2.00、Δ1.50、Δ1.40、Δ1.25、Δ0.80、Δ0.70、Δ0.60、Δ0.30）を使用し、ベクターpBI101.3のみを対照実験として使用して、キメラレポーター遺伝子構造物で形質転換されたタバコ植物の根と葉の相対β−グルクロジナーゼ（GUS）活性を要約した棒グラフである。GUS活性は、pmolMU/μｇタンパク質／分で測定し、表示した活性は根活性／葉活性である。
図5Bは、表１に示したように、異なるプロモーター（CaMV35S、Δ2.00、Δ1.50、Δ1.40、Δ1.25、Δ0.80、Δ0.70、Δ0.60、Δ0.30）を使用し、ベクターpBI101.3のみを対照実験として使用して、キメラレポーター遺伝子構造物で形質転換された植物の根と茎の相対β−グルクロジナーゼ（GUS）活性を要約した棒グラフである。GUS活性は、pmolMU/μｇタンパク質／分で測定し、表示した活性は根活性／茎活性である。
図6Aは、Δプロモーターで推進されたレポーター遺伝子（GUS）で形質転換されたタバコ植物の根の横断面図におけるGUS活性の組織化学的局在性を示す顕微鏡写真である。
図6Bは、Δ2.0プロモーターにより促進されたレポーター遺伝子（GUS）で形質転換されたタバコ植物の根端におけるGUS活性の組織化学的局在性を示す顕微鏡写真である。
発明の詳細な説明
本願明細書では、ヌクレオチド配列を、１本鎖のみによって、5'から3'の方向を、左から右に示す。本願明細書では、ヌクレオチド配列を、IUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commisionが推奨する方式で示す。
特定の害虫や病原体を抑制または殺傷するペプチドを発現する形質転換植物は、作物の損害や損失を減らす方法を提供する。たとえば、形質転換トウモロコシにおけるバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質の発現は、アワノメイガ（European corn bore）に対する抵抗性を提供する。しかし、植物の全組織における導入遺伝子発現（構成的発現）は、非標的生物を形質転換タンパク質に曝す可能性があり、さらに、形質転換タンパク質に対して抵抗性の病原体や害虫が発生する選択的困難が増加する可能性があるため、不都合である。植物全体に高レベルの導入遺伝子が発現することは、植物の成長および収量に負の影響を及ぼす可能性もがある。代替戦法は、特定の害虫または病原体に冒される器官または組織のみに有毒ペプチドを発現させることである。植物の根を攻撃する害虫および病原体に対するこの戦法は、特徴的な根に特異的なプロモーターがないため、実行することができなかった。
遺伝子の転写は、RNAポリメラーゼ酵素と遺伝子プロモーターの間に安定な複合体が形成されたときに開始する。すべての転写ユニットの開始時に発生するプロモーターは一般に長さ約100塩基対であり、転写開始部位からすぐ上流に位置する。たとえば、Maniatis et al.,Science 236:1238（1987）を参照されたい。プロモーターは、その「強さ」、すなわち、転写を正確かつ効率よく開始する能力が異なる。RNAポリメラーゼホロ酵素は、転写領域のすぐ上流の約50塩基に及ぶと考えられる。場合によっては、転写されるDNAからすぐ上流にあるプロモーターの領域の直前に結合する補助タンパク質によって転写開始の強度が増強されることがある。たとえば、Singer ＆ Berg,Genes and Genomes,140−145,University Science Book,Mill Valley,CA（1991）を参照されたい。
本発明の根皮層に特異的なプロモーターの具体的な例は、配列番号１〜９に表示されているいずれか１つに相当する配列を有するDNA分子であり、そのすべてを以下でさらに詳細に検討する。外来配列より長くても短くても、些少の付加、欠失または置換が行われても、TobRD2根皮層に特異的なプロモーターを担持するTobacco RD2の5'に隣接した領域の他の配列フラグメントを作製することができ、そのすべてが本発明に含まれることが明白になるであろう。本発明のさらなる態様は、他のタバコ遺伝子、あるいは下記のタバコ以外の植物から単離されたプロモーターを含み、これは、タバコRD2プロモーターと相同であり、かつ植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与することができる。
本願明細書で使用されるTobRD2プロモーターは、タバコRD2遺伝子の5'から転写領域にあるDNAの連続セグメントと同じか、実質的に相同の配列を有するDNA分子を指す。本願明細書に示す配列番号１は、TobRD2遺伝子の5'の隣から転写の開始までに存在する2kb領域の配列を提供する。TobRD2プロモーターは、5'からTobRD2領域まで、少なくとも100塩基対の領域、150塩基対の領域、あるいは好ましくは200塩基対の領域を含み、根皮層に特異的な発現に関与する。本願明細書で使用される、「実質的に相同な」領域は、少なくとも75％、さらに好ましくは80％、85％、90％または95％までも相同である。
本願明細書で使用されるように、根皮層に特異的なプロモーターは、葉組織または茎組織での発現に比して、根皮層組織において機能的に関連した遺伝子の発現に優先的に関与するプロモーターである。
他の植物の根皮層に特異的なプロモーター配列は、転写されるDNA領域のすぐ上流のTobaco RD2プロモーターの約100塩基対のセグメントと少なくとも約75％相同（さらに好ましくは80％、85％、90％または95％までも相同である）であり、かつ植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与することができる配列を含む。他の植物の根皮層に特異的なプロモーターは、配列番号１〜９によって、本願明細書に記載のTobRD2プロモーターの連続部分に少なくとも75％相同（さらに好ましくは80％、85％、90％または95％までも相同である）であり、植物細胞において下流に位置する異種DNAセグメントの根皮層に特異的な転写に関与することができる配列を含む。
相同なDNA配列が本願明細書に記載されているようなDNA配列のいずれかにハイブリダイゼーションすることが可能な非常に厳密なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。たとえば、本願明細書に開示されているDNAへのこのような配列のハイブリダイゼーションは、25％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハルド溶液中で、100μｇの１本鎖DNAおよび42℃の５％硫酸デキストランを用いて、25％ホルムアミド、５×SSC、42℃の0.1％SDS、42℃、15分間の洗浄条件で実施することができ、約60％相同の配列のハイブリダイゼーションが可能である。さらに厳密な条件は、標準in situハイブリダイゼーションアッセイを使用する60℃または70℃、0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSの厳密な洗浄条件で表される。（Sambrook et al,,Molecular Cloning,A Laboratory Manual（第２版、1989）（Cold Spring Harbor Laboratory）を参照されたい）。一般に、根皮層に特異的なプロモーターをコードし、本願明細書に開示されているタバコRD2根皮層に特異的なプロモーターをコードしているDNA配列のいずれかにハイブリダイゼーションする植物DNA配列は、本願明細書に開示されているタバコRD2根皮層に特異的なプロモーターをコードしているDNA配列と少なくとも75％、80％、85％、90％あるいは95％以上相同である。
本発明の根皮層に特異的なプロモーターは、形質転換植物での導入遺伝子の組織特異的な発現に関与するのに有用である。このような組織特異的な発現は、植物の根を攻撃する害虫や病原体によって生じる損害に対する抵抗性を提供するのに有用である。さらに、根皮層は光合成産物貯蔵用シンク器官であるため、貯蔵された炭水化物を変化させるように設計された導入遺伝子の発現は、このようなプロモーターによって調節され得る。根皮層に特異的な発現に関して特に関心のある外来遺伝子としては、重金属を結合するタンパク質（メタロチオネインなど）、土壌害虫や病原体に対する抵抗性を与えるタンパク質、熱、塩（塩分）および渇水に対する抵抗性を与えるタンパク質、脱塩用タンパク質、および植物貯蔵化合物を別の好ましい生成物または形に代謝するタンパク質をコードするものなどがある。
組織に特異的なプロモーターを使用して、選択された組織部位で殺虫剤前駆体を活性型に変換することも可能である。Hsu et al.Pestic.Sci.,44,9（1995）は、根で優先的に殺虫剤前駆体を活性型に変換するための、根に特異的なプロモーターTobRB7およびβグルクロニダーゼ酵素遺伝子を含むキメラ遺伝子の使用について報告している。不活性な殺虫剤前駆体（ヒドロキシメチロキサミルのグルクロニド）を葉群に塗付すると植物篩部を通って根に輸送され、そこでグルクロニダーゼによって活性な殺線虫型に変換された。
さらに、根に特異的なプロモーターは、組織学的目的のため、βグルクロニダーゼなどのレポーター遺伝子を使用した根−皮層組織の同定または染色に有用である。
本願明細書で使用される用語「機能的に関連した」は、そのの機能が他によって影響を受けるように関連したDNA分子１個内に含まれるDNA配列を指す。それ故、プロモーターがその遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、遺伝子がプロモーターの転写調節下にある）とき、プロモーターはその遺伝子と機能的に関連している。このプロモーターは、遺伝子から「上流に位置する」といわれ、同様に、遺伝子はプロモーターから「下流に位置する」といわれる。
本発明のDNA構成物、あるいは「発現カセット」は、転写の方向に5'〜3'、本発明のプロモーター、プロモーターと機能的に関連した異種DNAセグメント、および、選択により、終止シグナルやポリアデニル化領域など転写終止領域および翻訳終止領域を含む。これらの調節領域はすべて、形質転換細胞で機能することが可能でなければならない。3'終止領域は、転写開始領域と同じ遺伝子または異なる遺伝子から誘導することが可能である。
植物は、葉緑素がないもの（真菌類など）と葉緑素を含有するもの（緑藻、蘚類など）に分けることができ、さらに葉緑素を含有し、かつ維管束組織を有するもの（羊歯、裸子植物、針葉樹、単子葉植物および双子葉植物など）に分けることができる。後者の植物群には、根、茎および葉が存在する植物が含まれる。本願明細書で使用される用語「植物」は、上述の生物体すべてを含む。本願明細書で使用される用語「天然植物DNA」は、非遺伝学的に変化させた植物、あるいは形質転換させていない植物（たとえば、選択的育種によって産生される植物変種）から単離されたDNAを意味する。
本願明細書で使用される用語である異種遺伝子または異種DNAセグメントは、遺伝子工学技術で細胞を形質転換するのに使用され、細胞に自然発生しないと考えられる遺伝子（またはDNAセグメント）を意味する。構造遺伝子はタンパク質、ポリペプチド、またはその一部をコードするDNAセグメントを含む遺伝子の一部であり、リボソーム結合部位および／または翻訳開始コドンを含むが、プロモーターは欠如していると考えられる。この用語は、本来細胞内に認められるが、人工的に導入される構造遺伝子のコピーも指す。構造遺伝子は、遺伝子が導入される植物細胞か、あるいは機能的に関連したプロモーターと組み合せられている植物細胞で通常認められないタンパク質をコードしていてもよい。植物種での発現のために本発明のプロモーターと機能的に関連しうる遺伝子は、染色体遺伝子、cDNA、合成遺伝子、あるいはそれらの組合せから誘導することが可能である。本願明細書で使用される用語である異種DNAセグメントは、リボザイムやアンチセンスRNAなど、非タンパク質産物をコードするDNAセグメントも含む。アンチセンスRNAは周知である（たとえば、米国特許第4,801,540号（Calgene,Inc.）を参照されたい）。
本発明と共に植物で使用される目的の遺伝子には、広く様々な表現型特性および非表現型特性に影響を及ぼすものが含まれる。有数の表現型特性は、脱水（熱、塩分または渇水に起因する）、除草剤、有毒金属、微量元素、害虫および病原体によって生じるストレスを含め、様々な環境ストレスに対する抵抗性を提供する酵素などのタンパク質であるが、環境ストレスはこの限りではない。抵抗性は標的部位の変化、宿主細胞の標的タンパク質の量の増大、宿主をストレスから保護する生成物の生合成経路と関係のある１種以上の酵素量の増加等々に起因すると考えられる。構造遺伝子は、原核生物、真核生物、細菌、真菌から、（たとえば、酵母、ウイルス、植物、および哺乳類から）獲得することが可能であり、あるいは全体または一部を合成することが可能である。例示的遺伝子としては、グリホスフェート抵抗性３−エノールピルビルホスホシキネートシンターゼ遺伝子、ニトリラーゼ、プロリンおよびグルタミン生合成経路の遺伝子およびメタロチオネイン類などがある。
本発明のプロモーターと機能的に関連した構造遺伝子は、昆虫に有毒なBacillus thuringiensis結晶タンパク質など、昆虫に対して有毒なタンパク質をコードするものであってもよい。米国特許第4,853,331号には、鞘翅類に対して有毒なB.thuringiensis毒素をコードしているDNA配列、およびコードした毒性を保持しているこの配列の変形物が開示されている（米国特許第4,918,006号および第4,910,136号も参照されたい）（本願明細書に引用されるすべての米国特許参考文献の開示内容は、参照することにより本願明細書に完全に組込まれる）。PCT出願第WO90/02804号には、鱗翅目（Lepidoptera）に対して有毒な植物種を与えるB.thuringiensis由来の遺伝子配列が開示されている。PCT出願第WO89/04868号には、B.thuringiensis結晶タンパク質の発現を促進するベクターでトランスジェニック植物が開示されており、その配列は本発明と関連させて使用することが可能である。PCT出願第WO90/06999号には、鱗翅目（Lepidoptera）に対して活性なB.thuringiensis結晶タンパク質性毒素をコードしているDNAが開示されている。米国特許第4,918,006号には、殺虫性結晶タンパク質をコードしている別の遺伝子配列が開示されている。他の昆虫に対する毒素をコードしている遺伝子配列の具体例は、米国特許第4,940,840号やPCT出願第WO90/07001号に開示されている、キチナーゼ（たとえば、EC−3.2.1.14）をコードする遺伝子配列である。米国特許出願第08/007,998号には、根線虫類に対して抵抗性のトランスジェニック植物を作成するのに有用な線虫類誘導性孔形成性タンパク質をコードする遺伝子が開示されている。米国特許第4,948,734号および第5,093,120号（Edwards et al.）には、線虫類に対して活性なポリペプチド毒素を産生するB.thuringiensisの菌株が開示されている。
遺伝子発現産物が細胞質以外の細胞区画に存在する場合、特定のアミノ酸配列をコードする領域を含むように構造遺伝子を構成することが可能であり、その結果、その産物を細胞原形質膜などの特定の部位に移動させたり、細胞周辺腔または細胞の外部環境に分泌したりすることになる。文献には、ペプチド発現産物を特定の部位に振り向けるための様々な分泌リーダー、膜貫通配列、および移動配列が記載されている。たとえば、Cashmore et al.,Biotechnology（1985）3:803−808、Wickner and Lodish,Science（1985）230:400−407を参照されたい。
少なくとも１種の複製システムも有するDNA構成物で、発現カセットを提供することが可能である。便宜上、ColE1、pSC101、pACYC184等々、大腸菌（Escherichia coli）で機能しうる複製システムを有することが一般的である。この方式では、各操作後の各段階で、結果として得られる構成物をクローニングし、配列決定し、操作の正さを決定することが可能である。さらに、あるいは大腸菌複製システムの代わりに、Ｐ−１不和合性プラスミドの複製システム、たとえば、pRK290などの複製システムのような、広宿主範囲複製システムを使用することが可能である。複製システムのほかにも、１種以上の宿主に有用な少なくとも１種のマーカーが存在する、すなわち、個々の宿主に異なるマーカーが存在する。すなわち、原核生物宿主では選択に１つのマーカーを使用し、真核細胞宿主、特に植物宿主では選択に別のマーカーを使用する。マーカーは、抗生物質などの殺生物剤、毒素、重金属等々に対する保護を提供し、栄養要求性宿主に原栄養性を与えることによって相補性を提供したり、植物において新規化合物を産生することにより、目でみることができる表現型を提供したりすることが可能である。使用することが可能な遺伝子の具体例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPT II）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ニトリラーゼ、およびゲンタマイシン耐性遺伝子などがある。植物宿主選択に関しては、適当なマーカーの非限定的例はβグルクロニダーゼ（GUS）（インジゴ生成物を提供する）、ルシフェラーゼ（目に見える光生成物を提供する）、NPT II（カナマイシン抵抗性またはG418抵抗性を提供する）、HPT（ハイグロマイシン抵抗性を提供する）、および突然変異aroA遺伝子（グルホセート抵抗性を提供する）である。
適当な複製システムを制限酵素で切断すること、および特定の構成物またはフラグメントを適当な部位に挿入することによって、様々な構成物、発現カセット、マーカー等々を含む様々なフラグメントを連続的に利用部位に導入することが可能である。連結反応およびクローニングの後、さらに操作するために、DNA構成物を単離することが可能である。これらの技術はすべて、文献に十分に例示されている。たとえば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）を参照されたい。
ベクターは複製可能なDNA構成物である。本発明のDNA構成物で植物組織を形質転換するのに使用することが可能なベクターとしては、アグロバクテリウムベクターと発射注入用（ballistic）ベクターの両者、ならびにDNAを介在した形質転換に適するベクターがある。DNA構成物がTiプラスミドを含むことを特徴とする本発明のDNA構成物を含有するアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞は、形質転換植物を作成する方法に有用である。植物細胞をAgrobacterium tumefaciensに感染させると、形質転換した植物細胞が作成されるので、この形質転換植物細胞から植物を再生させる。
本発明の実行に有用な多数のアグロバクテリウムベクターが知られている。たとえば、米国特許第4,459,355号には、双子葉植物を含め、影響を受け易い植物を形質転換する方法が開示されており、アグロバクテリウム株はTiプラスミドを含有する。米国特許第4,795,855号には、アグロバクテリウムベクターによる大本植物の形質転換が開示されている。さらに、Schilperoort et al.に付与された米国特許第4,940,838号には、本発明の実行に有用なバイナリーアグロバクテリウムベクター（すなわち、そのアグロバクテリウムは、１つはTiプラスミドのvir領域を有するがＴ−DNA領域を有さない第一のプラスミドと、Ｔ−DNA領域を有するが、vir領域を含まない第二のプラスミドを含むベクター）が開示されている。
植物細胞の発射注入による形質転換（ballistic transformation）に適する、本発明のDNA構成物を担持する微粒子は、本発明の形質転換植物の作成にも有用である。微粒子を植物細胞内に発射して形質転換細胞を作成し、この形質転換植物細胞から植物を再生させた。適当な発射注入による細胞形質転換方法論およびその装置を本発明の実行に使用することができる。Sanford and Wolf、米国特許第4,945,050号および「花粉が介在する植物形質転換（Pollen−mediated Plant Transformation）」と題するAgracetus欧州特許出願広告第0 270 356号には、例示的装置および手順が開示されている。発射注入による形質転換手順を使用するとき、形質転換の対象である細胞で複製することができるプラスミドに発現カセットを組込むことが可能である。このようなシステムで使用するのに適した微粒子の例としては、１〜５μｍの金球体などがある。沈殿など、任意の適当な技術によってDNA構成物を微粒子に沈積させることが可能である。
形質転換宿主細胞は、組換えDNA技術を使用して、本願明細書に開示されているDNA配列を含有する構成物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。当該技術で周知の手順による植物細胞プロトプラストのDNA介在形質転換および後続のプロトプラストからの植物再生によって、本発明のDNA構成物で植物等を形質転換することが可能である。
本願明細書に開示されているプロモーター配列を使用して、同プロモーターを利用することができる任意の植物種（すなわち、そのRNAポリメラーゼが本願明細書に開示されているプロモーター配列に結合する任意の植物種）に異種DNA配列を発現することが可能である。単子葉植物も双子葉植物も本発明のDNA構成物を用いた形質転換に適した植物種の例に含まれ、タバコ、大豆、ジャガイモ、綿、砂糖大根、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、アマ、キャベツおよび他のアブラナ科植物、コショウ、トマト、カンキツ類の木、インゲンマメ、イチゴ、レタス、トウモロコシ、アルファルファ、カラスムギ、コムギ、コメ、オオムギ、モロコシ属およびカノーラなどがあるが、この限りではない。それ故、本発明のDNA構成物で形質転換することが可能な植物の例証的カテゴリーは双子葉植物であり、本発明のDNA構成物を使用して形質転換することが可能な植物のさらに具体的なカテゴリーは、ナス科植物である。
器官形成であれ胚発生であれ、その後のクローン増殖が可能な任意の植物組織を本発明のベクターで形質転換することが可能である。本願明細書で使用される用語「器官形成」は、分裂組織中心から苗条および根が発生する過程を意味し、本願明細書で使用される「胚発生」は、体細胞または生殖体から、（逐次ではなく）一斉様式で苗条と根が一緒に発生する過程を意味する。選択された特定の組織は、形質転換される特定の種に利用できるクローン増殖システム、あるいは形質転換される特定の種に最も適したクローン増殖システムによって異なる。例示的組織標的としては、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、存在する分裂組織（たとえば、先端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、および誘導された分裂組織（たとえば、子葉分裂組織や胚軸分裂組織）などがある。
以下の実施例は本発明の様々な具体的な実施態様を例示するために示すものであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。
例  １
ゲノム根皮層に特異的なRD2遺伝子の単離
タバコ苗から単離されるDNAのタバコ（Nicotiana tabacum）ゲノムライブラリーを、EMBL 3 SP6/T7ラムダベクター（ClonTech,Palo Alto,CA）で構築した。TobRD2 cDNA（Conkling et al.,Plant Phys.93,1203（1990））をプローブとして使用して、Tobacco RD2遺伝子を含有するゲノムクローンを一次ライブラリーから単離した。合計で1.2×107の組換えファージをK802細菌細胞でスクリーニングした。プラークをナイロン膜（Magnagraph）に載せ、DNAをオートクレーブ処理（10分、重力サイクル）により固定した。ハイブリダイゼーションは全て、水溶液中（５×SSC［750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム］、５×デンハルト（Denhardt's）［フィコール、BSA、ポリビニルピロリドンを各0.1％］、0.5％SDS、100mg/mlの変性サケ精子DNA）、65℃で16時間実施した。0.2×SSCおよび0.1％のSDS中60℃で、フィルターを洗浄した。
TobRD2 cDNAプローブにハイブリダイゼーションした13のゲノムクローンを、1.2×107の組換えファージをスクリーニングすることによって同定した。これらのクローンを単離し、制限地図作成によって更に特徴付けを行った。制限地図は、Rachwitz et al.,Gene,30:195（1984）の迅速地図作成手順によって作図した。TobRD2 cDNAに相同な１つのクローン全体の配列を決定し、そのプロモーターを同定した。TobRD2 cDNAおよびゲノムクローンのアラインメントを作成することにより、ゲノムクローン5'から転写される領域までの領域を同定した。この未転写領域の配列を調査し、推定されるプロモーターのTATAAボックスを同定した。植物プロモーターでは、TATAAボックスは一般に転写開始点から−35〜−29のヌクレオチドである。プライマー伸長実験を使用して、転写の5'末端を同定した。
TobRD2 cDNAの転写される領域から上流の2010塩基対領域を図２（配列番号１）に示す。この配列は、予測される転写領域の開始点（ヌクレオチド2000）、およびプロモーターのTATAAボックス（ヌクレオチド1971〜1975）を含む。
例  ２
核酸配列決定
単離されたゲノムクローン（例１）をブルースクリプト（pBS KS II＋またはpBS SK II＋、Stratgene,La Joll,CA）ベクターにサブクローニングした。Exonuclease IIIおよびS1ヌクレアーゼ消化（Henikoff,Gene 28,351（1984））により、各クローンおよび両DNA鎖の一方向性欠失シリーズを入手した。酵素Sequenase（U.S.Biochamicals,Cleveland,OH）を使用し、ジデオキシ鎖末端法（Sanger et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA,74,5463（1977））によってDNA配列を決定した。あらゆる場合に、両DNA鎖の配列が決定された。
例  ３
in situハイブリダイゼーション
根の様々な組織におけるTobRD2 mRNA転写産物の空間分布を決定するために、形質転換していない植物でin situハイブリダイゼーションを実施した。Meyerowitz,Plant Mol.Biol.Rep.5,242（1987）およびSmith et al.,Plant Mol.Biol.Rep.5,237（1987）に記載された技術を用いて、根組織のTobRD2のアンチセンス鎖によるTobRD2 mRNAへのin situハイブリダイゼーションを実施した。７日齢のタバコ（Nicotiana tabacum）苗の根をリン酸緩衝グルタルアルデヒド中で固定し、Paraplast Plus（Monoject Inc.,St.Louis,MO）に包埋し、厚さ8mmに薄切して、横断面ならびに縦断面を入手した。35S−ATPの存在下、in vitroで合成されたアンチセンスTobRD2転写産物をプローブとして使用した。使用前に、標識RNAをアルカリ処理で加水分解して平均長100〜200塩基とした。
約５×106カウント／分（cpm）の標識RNA/mlハイブリダイゼーション溶液を用いて、50％ホルムアルデヒド中、42℃で16時間、ハイブリダイゼーションを実施した。曝露後、スライドグラスを発色させ、明暗視野顕微鏡下で可視化した。
図1Aおよび1Bからわかるように、ハイブリダイゼーションシグナルは根の皮層に局在している。同じ断面の明視野画像と暗視野画像を比較すると、TobRD2転写産物は根皮層の柔組織細胞に局在していることがわかる。ハイブリダイゼーションシグナルは、表皮または中心柱に全く見られなかった。
例  ４
キメラ遺伝子作成
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、プロモーター欠失シリーズを作成した。鋳型は、Exonuclease III/S1ヌクレアーゼ消化によって生成しておいたTobRD2ゲノムクローン（例２）の5'隣接領域の様々な欠失であった。
鋳型はすべて、同一セットのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅させた。１つのプライマーは、修飾バクテリオファージM13前進プライマー（たとえば、Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）を参照）であり、オリゴヌクレオチドの5'末端は、Hind III認識配列とともに、制限酵素によってさらに効率よく切断することが可能な別の5'配列を含んでいた。もう１つのプライマーは、その5'末端に（効率よく切断するための別のヌクレオチドとともに）BamH I部位を有するように設計されており、5'からATG開始コドンまでの22塩基にあるTobRD2の16のヌクレオチド配列と相同であった。（すなわち、このプライマーは配列番号１の相同塩基1973〜1988であった）。
PCR増幅反応は、鋳型プラスミドDNA（５〜10ng）、反応緩衝液（50mMのKCl、10mMのTris−HCl、pH9.0［25℃］、0.1％のTriton X−100、1.5mMのMgCl）、各々0.25mMのdATP、dGTP、dTTP、およびdCTP、各プライマー40ng、Tag DNAポリメラーゼ（Promega,Madison,WS）1.25単位を含んでいた。
PCRサイクルは、鋳型を94℃で１分間変成し、プライマーを46℃で１分間アニーリングし、鎖伸長を72℃で５分間続行した。このサイクルを40回繰返し、最後の伸長サイクルを10分延長した。PCR増幅は、プログラム可能なサーマルサイクラー（PTC−100、M.J.Research）にて行った。
増幅産物をHind IIIおよびBamH Iで消化し、アグロバクテリウムバイナリーベクターpBI101.3のHind III部位およびBamH I部位にクローニングした（R.Jefferson et al.,EMBO J.6,3901−3907（1987））。このベクターは、β−グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子およびＴ−DNA境界配列と隣接するntp II選択可能マーカーを含んでいた。
例  ５
植物の形質転換：方法
本質的にAn et al.,in S.Belvin and R.Schilperoot.eds.,Plant Molecular Biology Manual,Martinus Nijhoff,Dordrecht,The Netherlands,pp A3−１−19（1988）に記載されている通りに、Ｔ−DNAトランスファーおよび植物ゲノムへの組込みに必要なvir機能を（トランスで）提供することができる非武装Ti−プラスミド（LBA4404）担持しているアグロバクテリウム宿主に、キメラレポーター遺伝子構成物を導入した。当業者には周知の、三親交配または電気有能でででで電気的にコンピテントな（electrocompetant）アグロバクテリウム細胞のエレクトロポレーションにより、構成物を宿主に導入した。An et al.,Plant Physiol.81,301−305（1986）に記載の通りに、タバコ（SR1）の葉ディスク形質転換および植物再生を実施した。さらに分析するため、カナマイシン耐性植物を選択した。
例  ６
形質転換植物のGUS分析：方法
形質転換植物の切り取った根、茎および葉に組織化学的染色を実施した。基質を暫く真空浸潤した後、1mMの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Gluc）、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、0.5％DMSO中、37℃で一晩、外植体組織をインキュベートした。GUS活性を発現する組織はこの基質を切断し、その結果、青色に着色する。
Jefferson et al.,EMBO J.6,3901−3907に記載の通りにGUS蛍光測定法を実施し、GUS発現レベルを定量した。1mMの４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−グルクロニドの存在下、37℃で、根、葉および茎の細胞抽出物をインキュベートした。０、５、10、15および20分間隔で試料を採取した。0.2Mの炭酸ナトリウムを加えて酵素反応を停止させた。10nMのMUGおよび100nMのMUGで蛍光計を較正した。Bradford,Anal.Biochem.72,248（1976）の方法に従って、試料中のタンパク質濃度を測定した。
例  ７
キメラ遺伝子構成物は組織に特異的な遺伝子発現に関与することができる
TobRD2遺伝子の2010塩基対配列（配列番号１）が、本質的に根皮層の柔組織細胞における特異的な発現に関与するプロモーター要素を含むかどうかを決定するため、キメラ遺伝子を構成した。1988塩基対領域（配列番号２）をポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、（上述の通り）5'をGUSレポーター遺伝子にクローニングした。（上述の通り）キメラ遺伝子をタバコに導入し、（上述の通り）トランスジェニック植物のGUS発現能を分析した。
９種の形質転換体（すなわち、各形質転換体は独立した形質転換による）の分析結果を表１、25〜33行（形質転換体325II1〜325IV5）に示す。Δ2.0プロモーター（配列番号２）は、高レベルの遺伝子発現（一般に「強力な」プロモーターと呼ばれるCaMV35Sプロモーターの約４倍）に関与することが確認された（図４）。葉または茎で、対照よりも高いレベルでのレポーターの発現を検出することはできなかった（表１から採用した平均活性を示す図４、5Aおよび5Bを参照されたい）。図６からわかるように、GUS活性は本質的に根に限定され、特に根皮層に限定されていた。pBI101.3のΔ2.0プロモーター促進GUSを使用して図６に示す植物を形質転換した。
（複数の形質転換された個々の葉ディスクをペトリプレートに入れた。表１の形質転換体の名称はプロモーター／番号をふってあるペトリプレート／独立した形質転換体の数を示す。したがって、325II1は、Δ2.0プロモーターを使用し、ペトリプレートIIで、葉ディスク１由来の形質転換体を指すが、101.I1はpBI101.3（対照実験として使用したプロモーターのないGUS）を使用した形質転換と、ペトリプレートＩでの形質転換体数とを指す。表１で、接頭辞121はpBI121（GUSを含むCaMV35Sプロモーター）の使用を指し、325はGUSを含むΔ2.0プロモーター（配列番号２）を指し、484はGUSを含むΔ1.4プロモーター（配列番号３）を指し、421はGUSを含むΔ1.3プロモーター（配列番号４）を指し、428はGUSを含むΔ1.0プロモーター（配列番号５）を指し、490はGUSを含むΔ0.7プロモーター（配列番号６）を指し、491はGUSを含むΔ0.6プロモーター（配列番号７）を指し、492はGUSを含むΔ0.5プロモーター（配列番号８）を指し、495はGUSを含むΔ0.2プロモーター（配列番号９）を指す。「Ｒ−GUS」は根組織のGUS活性を指し、「Ｌ−GUS」は葉組織のGUS活性を指し、「Ｓ−GUS」は茎組織のGUS活性を指す。R/Lは根／葉の相対GUS活性であり、R/Sは根／茎の相対GUS活性である。GUS活性はpmolMU/μｇタンパク質／分である。
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例  ８
5'プロモーター欠失がレポーター遺伝子活性の発現に及ぼす影響
隣接した領域のいかに様々な部分がGUSの発現に影響を及ぼすかを調査するために、プロモーターとして使用するTobRD2の隣接した領域の長さを変えたこと以外は、上述の例７に記載のものと本質的に同じ方法で以下の実験を実施した。
プロモーター配列として使用するために、2010塩基対TobRD2配列（配列番号１）上流領域で一連の７つのネストした（nested）5'欠失突然変異を発生させた。これらの欠失突然変異体を図３にグラフで示し、Δ2.0（配列番号２）、Δ1.4（配列番号３）、Δ1.3（配列番号４）、Δ1.0（配列番号５）、Δ0.7（配列番号６）、Δ0.6（配列番号７）、Δ0.5（配列番号８）、およびΔ0.2（配列番号９）として表示する。
例３に記載されており、かつΔ2.00プロモーター（配列番号２）または先端の欠けたプロモーター（配列番号３〜９）を含有するキメラ遺伝子構成物を、（例４に記載の通り）葉ディスクをアグロバクテリウムによる形質転換によりタバコに導入した。対照実験としてアグロバクテリウムベクターpBI101.3を単独で使用し、CaMV35Sプロモーターを参照標準を提供するために使用した。再生した植物の根、葉および茎のGUS活性を分析した（表１、図４）。
図４は、完全長のTobRD2プロモーター、プロモーター欠失シリーズ、カリフラワーモザイクイルス35S（CaMV35S）プロモーター、およびベクターpBI101.3を対照として使用した、根、葉および茎のGUS活性をグラフで表示した図である。図４からわかるように、試験したプロモーターのうち６個は、すなわち、Δ2.00（配列番号２）、Δ1.4（配列番号３）、Δ1.3（配列番号４）、Δ1.0（配列番号５）、Δ0.7（配列番号６）、Δ0.6（配列番号７）は、高レベルの根皮質に特異的な発現を与えることが確認された。図４は、平均した表１のデータを示す。
さらに図４からわかるように、長さ約50塩基対の領域を失うと（Δ0.6（配列番号７）およびΔ0.5（配列番号８）と比較されたい）、GUS発現レベルが徹底的に低下する。しかし、結果から、Δ0.5プロモーター（配列番号８）によって提供される根組織のGUS発現のレベルは、CaMV35Sプロモーターによって誘導されるものと同等であったことがわかる。Δ0.2プロモーター（配列番号９）によって提供される根皮層のGUS発現は、CaMV35Sプロモーターによって提供されるものの約半分であった。
図5Aおよび図5Bはさらに、TobRD2プロモーターを使用したレポーター遺伝子発現の器官特異的な性質を示す。試験した全ての場合に、GUS活性は厳密に根に発現され、同一形質転換タバコ植物の茎または葉には、存在しても、無視できる活性が検出されただけであった。Δ0.60プロモーターおよびΔ0.30プロモーターで形質転換した根で測定されたGUS活性のレベルはCaMV35Sプロモーターによって提供されたものと同等またはそれ以下であった（図４）が、Δ0.60プロモーターおよびΔ0.30プロモーターが関与する発現は根に特異的であり、CaMV35Sプロモーターが関与する発現とちがって、茎および葉の活性は無視できることが、図5Aおよび図5Bからわかる。
前述の実施例は本発明を例証するものであって、本発明を限定するものとして構成されるものではない。本発明は下記の請求の範囲によって明確に定められ、請求の範囲と同等のものはその中に含まれる。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：コンクリング，マーク・エイ
メンドゥ，ナンディニ
ソン，ウェン
（ii）発明の名称：根皮層に特異的な遺伝子プロモーター
（iii）配列の数:9
（iv）連絡先：
（Ａ）あて先:Kenneth D.Sibley;Bell,Seltzer,Park ＆ Gibson
（Ｂ）街:Post Office Drawer 34009
（Ｃ）市:Charlotte
（Ｄ）州：ノース・キャロライナ州
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:28234
（ｖ）コンピュータ読取可能な形式
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM PC  互換器
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.30
（vi）本出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viia）代理人の情報：
（Ａ）氏名:Sibley,Kenneth D.
（Ｂ）登録番号:31,665
（Ｃ）参照番号:5051−294
（ix）電子通信の情報：
（Ａ）電話番号:919−420−2200
（Ｂ）ファックス番号:919−881−3175
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:2010塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号１
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0003565562.tif 000009
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1988塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号２
0003565562.tif 000010
0003565562.tif 000011
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1372塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号３
0003565562.tif 000012
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1294塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号４
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（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1030塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号５
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（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:722塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号６
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（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:574塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号７
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（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:523塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号８
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（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:220塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号９
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【図６Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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