(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CECT−10817の番号で寄託された種カンジダ・サケ（Candida sake）株の生物学的培養物。
【請求項２】
収穫後の果実の腐敗に関与する病原性真菌の生物学的制御のための拮抗剤としての、請求の範囲第１項に記載の培養物の使用。
【請求項３】
病原性真菌は、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）、およびリゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）の何れかに属する、請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項４】
果実は、種子果実として知られているものである、請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項５】
果実は、柑橘類である、請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項６】
果実は、イチゴまたは核果として知られているものである、請求の範囲第２項に記載の使用。
【請求項７】
果実の収穫の前の果実の病原性真菌の生物学的制御における拮抗剤としての、請求の範囲第１項に記載の培養物の使用。
【請求項８】
果実は収穫の前または後に、請求の範囲第１項に記載のCECT−10817培養物で処理される、果実の腐敗の防止方法。
【請求項９】
拮抗剤CECT−10817の水性分散液を果実に噴霧するか、または果実を該分散液で湿らせるかまたは浸漬することにより処理を行う、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
水性分散液中における拮抗剤CECT−10817の濃度は、105〜107c.f.u./mlの範囲である、請求の範囲第８項または９項に記載の方法。
【請求項１１】
果実の保存条件は、周囲温度および周囲酸素の条件である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１２】
果実の保存条件は、５℃未満の低温、および酸素含量が５％未満の空気の条件である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
本発明は、カンジダ・サケ（Candida sake）の新しい株と、保存条件下で果実が腐敗するのを防止することを目的とした、収穫後の果実の真菌疾病の生物学的制御における拮抗剤としてのその使用に関する。
〔技術の現状〕
果実の収穫後の疾病は、毎年全世界の総収穫量の15％〜20％の量で、農業に損害を与えている。
収穫後の果実の腐敗を引き起こす真菌を防除するために現在最も広く使用されているシステムは、殺真菌剤を用いた収穫物の処理による化学的制御である。殺真菌剤の使用は世界中に普及しており、ヨーロッパおよびアジアにおける殺菌剤市場の26％、北米市場の６％を占めると推定されている。
この殺真菌剤の大規模な使用により多くの問題が発生し、例えば耐性病原株の出現（このため処理コストが上昇し、腐敗による損失が増加する）、および果実への殺真菌剤残存量の増加（これは衛生問題を引き起こし、衛生上の制限が厳しい国への果実の輸出を困難にする）の問題が発生している。
この問題に直面して、収穫後の果実の疾病を制限するための新しい代替法を求めて数年前頃から研究が始まり、その最も顕著な進展の１つは、腐敗を引き起こす真菌の生物学的制御である。この生物学的制御は、病原性真菌の増殖と作用に及ぼすい幾つかの微生物の阻害作用に基づいている。すなわち、Janisiewicz,W.J.,Phytopathology 77:481−485（1987）は、リンゴの青カビの生物学的制御処理を報告し、Janisiewicz,W.J.and Roitman,J.,Phytopathology 77:1776（1987）は、リンゴの腐敗を防除するための収穫後の生物学的制御物質としてのシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）の使用を報告しており、Janisiewicz,W.J.,and Roitman,J.,Phytopathology 78:1697−1700（1988）は、リンゴとナシの灰色のカビと青カビを防除するための収穫後の生物学的制御物質としてのシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）の使用を報告している。
果実の腐敗を引き起こす真菌の拮抗剤（アンタゴニスト）の中で、酵母は、長時間果実の表面にコロニーを形成し、細胞外多糖を産生してその生存を増強し利用できる栄養物質をより早く利用して、真菌のコロニー形成と胎芽の発芽を押さえる点において、特に興味深い。すなわち、McLaughlin,R.J.et al.,Phytopathology 80:456−461（1990）は、リンゴの収穫後の疾病の生物学的制御における、カンジダ（Candida）種酵母の濃度の影響を報告した；特許出願PCT WO−91/1641は、植物生産物の収穫後の疾病の生物学的制御のための物質として、数種類の酵母（中でも、カンジダ・ギリエルモンジ（Candida guilliermondii）に属する株または単離物）の使用を記載している。この単離物は、特に以下の病原性真菌に対して活性を示す：ペニシリウム・イタリカム（Penicillium italicum）、ペニシリウム・ジギタツム（Penicillium digitatum）、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、ゲオトリチュム・カンジヅム（Geotrichum candidum）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）およびアルテルナリス・アルテルナータ（Alternaris alternata）。米国特許US−5041384（これは前述のPCT特許出願と優先権が同じである）は、カンジダ・ギリエルモンジ（Candida guilliermondii）の３つの具体的な株の活性に注目している。
特許出願PCT WO−92/18009は、果実の収穫後の疾病の生物学的制御剤として酵母の使用を記載しており、特にロードトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロードトルラ・ムシラギノーサ（Rhodotorula mucilaginosa）、カンジダ・パラプシロピス（Candida parapsilopis）およびカンジダ・ギリエルモンジ（Candida guilliermondii）の単離物を引用している。最後に、NTIS（米国技術情報サービス）文書番号PB92−102334として公表された、米国特許出願US−７−745796において、Wilson,C.L.は、リンゴ、モモおよびオレンジのような果実の収穫後の疾病に対する生物学的制御剤として、トマトの皮から単離されたカンジダ・サケ（Candida sake）の３つの株の使用を記載している。これらの株は、ブタペスト条約に従って、61604イリノイ州ペオリア（Peoria）の米国農務省北部研究センター（The Northern Reginonal Research Center）に、寄託番号NRRL Y−18844、NRRL Y−18845、およびNRRL Y−18846として寄託された。
しかし、同じ種であっても、異なる単離物または異なる株の間で抗原活性の大きな差が証明されており、収穫された果実の種々の保存条件下でのその有効性に関する情報が欠如しているため、研究を続けて、厳しい保存条件下で防除作用を示すことができ、さらに有効で作用が長く持続する生物学的制御剤を見いだすことが必要である。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、収穫後の果実の腐敗に関与する病原性真菌の生物学的制御において、非常に有効な拮抗剤（アンタゴニスト）として作用することができ、低温と低酸素空気下でもその有効性を保持する、カンジダ・サケ（Candida sake）の新しい株を提供することである。
本発明のさらなる目的は、収穫した果実の保存中の腐敗を防止するための、前記拮抗剤（アンタゴニスト）の使用に関する。
本発明のさらに別の目的は、種々の保存条件下での収穫された果実のより良い保存法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
本発明のより良い理解のために、本明細書には７枚の図面が添付されている。以下にその概要を説明するが、これは本発明を限定するものではない。
図１は、低温条件下での、NYDB培地中のCECT−10817株の増殖曲線のグラフである。
図２は、15℃、26℃および30℃での、NYDB培地中のCECT−10187株のグラフである。
図３は、34℃および37℃の温度での、NYDB培地中のCECT−10817株のグラフである。
図４は、25℃での、「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴでの、CECT−10817株の細胞数増加のグラフである。
図５は、以下の低温保存条件下での、「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴでの、CECT−10817株の細胞数増加のグラフである：通常の低温（１℃の温度、および酸素含量21％の空気中）；制御された空気中（１℃の温度、および酸素含量３％の空気中）；および制御された極低酸素空気中（１℃の温度、および酸素含量１％の空気中）。
図６は、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817の接種により引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、20℃で６日間インキュベートして得られた。
図７は、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817の接種により引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、20℃で７日間インキュベートして得られた。
図８は、リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817の接種により引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、20℃で６日間インキュベートして得られた。
図９は、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817の接種により引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、以下の保存条件下で60日間インキュベートして得られた：低温条件下（１℃の温度、および酸素含量21％の空気中）；制御された空気中（１℃の温度、および酸素含量３％の空気中）；および制御された極低酸素空気中（１℃の温度、および酸素含量１％の空気中）。
図10は、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817の接種により引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、通常の低温条件下（１℃の温度、および酸素含量21％の空気中）で60日間インキュベートして得られた。
図11は、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴにおける、拮抗剤CECT−10817にリンゴを浸して引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。データは、通常の低温条件下（１℃の温度、および酸素含量21％の空気中）で60日間大規模試験して得られた。
図12は、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）を接種した「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴでの、７×106c.f.u./mlの拮抗剤CECT−10817を噴霧し、科学的殺真菌剤イマザリル（Imazalil）を7.5％の濃度で適用して引き起こされた、腐敗の低下パーセントの３次元の棒グラフの模式図である。比較データは、20℃の低温条件下で８日間インキュベートして得られた。
図13は、収穫、取り扱いおよび通常の低温条件下（１℃の温度、および酸素含量21％の空気中）で保存の間、畑で噴霧して適用した拮抗剤CECT−10817の、「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴでの細胞数変化のグラフである。
〔発明の説明〕
本発明の出願人は、広範囲の温度と酸素空気中において収穫後の果実の疾病を引き起こす真菌種に対する拮抗剤（アンタゴニスト）としての有効性を示し、真菌種の生物学的制御の工業的利用を可能にし、および保存条件下での腐敗を防止する禁株として、カンジダ・サケ（サイトウ・アンド・オータ）ファン・ユーデン・アンド・バックレイ（Candidia sake（Saito and Ota）van Uden and Buckley）の新しい株の単離に成功した。
本発明の目的の株は、無菌水で繰り返し洗浄することによりリンゴの表面から単離され、この培養物を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、バレンシア（Valencia）大学生物科学部（Faculty of Biological Scineces）（46100、ブルジャソット（Burjasot）（バレンシア）、スペイン）の国際的寄託機関であるColceccion Espanola de Cultivos Tipo（スペイン標準培養物保存機関（Spanish Collection of Standard Cultures））に寄託し、寄託番号CECT−10817を付与された。
CECT−10817単離物は、オランダの″Centraalbureau voor Schimmelcultures″が、NYDA培地（酵母エキス、ブドウ糖および寒天よりなる）、およびNYDB培地（酵母エキスのブロース、およびブドウ糖よりなる）中で培養して、カンジダ・サケ（Candida sake）と同定した。単離物CECT−10817は、縁が平滑で中央部が少し盛り上がり、培養物中で偽菌糸を有する、クリーム様の白色の丸い明確なコロニーを形成する。
CECT−10817株は、表１と２に詳述する生化学的特徴を示す。
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さらにCECT−10817株は、0.5g/lの濃度の抗生物質ストレプトマイシンに対して耐性である。
NYDB培地（pH7）中でCECT−10817株微生物の「インビトロ」増殖は、好気性条件下で広範囲のインキュベート温度で起き、１℃〜34℃の間の温度で充分な増殖を示す。図１、図２、および図３で観察されるように、１℃で細胞数が最大になり、これは試験した他のどの温度で起きるよりも大きい。
図４と図５のグラフに示されるように、果実に微生物を接種すると、好気的条件下で、周囲温度（25℃）でも１℃の温度でも、周囲空気（21％酸素）または３％酸素および１％酸素の制御された空気（極低酸素）（これらは、果実園芸センターの保存条件である）でも大きな増殖を示す。
CECT−10817株の単離物は、研究室でも工業的使用においても、適切な培地中で、専門家によく知られたの従来法を用いて得られる。例えば、NYDB培地（pH7）中で、容器を振盪し通気して、１℃〜34℃の温度で、20〜50時間、元の株を培養することにより得られる。NYDB培地の最大細胞数は、25℃で37時間で達成される。インキュベート時間終了後、沈降法、遠心分離またはろ過の通常法により、培養培地から微生物を分離して、培養物を例えばシリカゲルで凍結して保存することができる。
拮抗剤CECT−10817は、任意の従来法で果実の表面に適用される。例えば、培養物を水に分散したものを調製し、収穫前に畑で果実に噴霧または散布するか、または収穫した果実の処理工程の間、保存の前に、処理を適用（この場合、処理も浸漬により行われる）される。
図13から明らかなように、果実が木の上にある時噴霧により処理すると、CECT−10817株の単離物は、果実の収穫および保存工程の間、果実の表面でその生存活性を維持するかまたは細胞数を増加させる。
果実の処理のための適用分散液中の拮抗剤CECT−10817の有効濃度は、果実のタイプ、その成熟度、果実上の病原性真菌の濃度、果実に影響する傷害のタイプ、保存温度および湿度などの因子の関数として変動する。有効濃度の範囲は、通常105〜107c.f.u./ml（コロニー形成単位/ml）であるが、この範囲は本発明の目的を限定するものではない。
CECT−10817株の単離物は、果実の非常に多数の病原性真菌種の生物学的制御において非常に有効であり、病原性真菌としては、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）、およびリゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）を含むが、これらに限定されない。果実の腐敗の防止における有効性は、温度や酸素の周囲条件下での保存に限定されず、微生物の前述の特徴のため、工業的果実園芸センターで通常使用される低温保存と制御された空気条件下でも優れた結果を示す。
病原性真菌の制御におけるCECT−10817株の単離物の有効性は、イミダゾール（１−［２−（2,4−ジクロロフェニル）−２−（２−プロペニルオキシ）エチル］−1H−イミダゾール）由来の化学物質である殺真菌剤、即ちイマザリル（Imazalil）の作用に匹敵する。イマザリル（Imazalil）は、果実の収穫後に適用するための、世界中で最も広く使用されている殺真菌剤の１つである。CECT−10817株単離物は、イマザリル（Imazalil）の有効な代替物となり、これはイマザリル（Imazalil）に特徴的な毒性がないという利点を有する。
CECT−10817株の単離物は、すべてのタイプの果実の任意の変種（特に、リンゴ、ナシおよびマルメロのような種子果実；オレンジ、レモンおよびマンダリンのような柑橘果実；モモ、アプリコットおよびプラムのような核果（stone fluit）；およびイチゴのような他の果実）の腐敗を防ぐのに有効に使用できる。
本発明の発明者は、病原性真菌であるリゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）種に対する具体的な拮抗剤生物学的制御物質に関する報告は、本発明に至るまで不知である。この種は、ペクチン溶解性酵素を有し、発症のために傷害を必要とする感染がなくても果実の組織を破壊するため、病原性が非常に強い。このために、感染した果実に健康な果実が接触すると、その腐敗を引き起こす（巣効果（nest effect））。さらにこの種が引き起こす腐敗は、非常に急速に進展し、果実の組織は非常に水っぽく柔らかくなり、その結果多量の汚染した液体を出すため、他の保存箱に感染が容易に広がる。このため、工業的低温保存チャンバー中のリゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）の存在は、非常に高率に腐敗を引き起こす。さらに本願の発明者の知る限り、リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）に対する特異的な化学的殺真菌剤は存在しない。
このことは、例えば果実園芸生産の多い国であるスペインで、真菌種リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）は最も危険な病原体の１つになりつつあり、種子果実の収穫後に重大な損失を引き起こしていることを意味する。
従って本発明の目的である拮抗剤CECT−10817は、前述の種リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）の真菌により産生される悪影響を防ぐために報告された最初の有効処理法である。
〔実施例〕
以下に概説する実施例は、本発明を理解するための補助となるものであり、決して本発明を限定するものと解釈してはならない。
実施例1.  CECT−10817の水性分散液物の作成
拮抗剤CECT−10817を、NYDA培地を含む試験管中に接種し、25℃で24〜48時間インキュベートした。次にこの試験管の内容物を用いて、50mlのNYDB培地の入った三角フラスコに接種し、150rpmのオービタル攪拌器中において25℃で24時間インキュベートした。次に、フラスコの内容物を6,000rpmで10分間遠心分離し、浮遊部分を除去した。沈殿物を50mlの無菌蒸留水に分散し、この分散液を用いて、拮抗剤の濃度の間接的な測定値として、分光光度計中での微生物懸濁液の透過率を計算して、所望の濃度の拮抗剤を調製した。透過率と微生物濃度の等価解析は、トーマ（Thoma）の微生物カウントチャンバーを用いて行なった。濃度は、c.f.u./ml（コロニー形成単位/ml）として表した。
実施例2.  周囲温度で保存した果実に及ぼすCECT−10817の有効性
この試験は、各リンゴについて約３×３×3mmの大きさの２つの穴を開けてから、水で洗浄し乾燥させた健康な「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴについて行なった。２つの切り込みはリンゴの同じ側に行い、１つは上方に１つは下方に入れた。試料単位は３つのリンゴであり、各処理について３回の繰り返しを行なった。
試験した３種類の真菌種は、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）、およびリゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）であり、これらの胞子の懸濁液の力価測定は、ツイーン80を含有する無菌蒸留水中にコロニーを掻き取って、コロニーを、PDA培地（ジャガイモ、ブドウ糖および寒天）中に接種した５〜７日令の若い培養物を用いて、28℃でインキュベートして行なった。目的の濃度（c.f.u./mlで表す）を設定して、トーマ（Thoma）チャンバー中で、胞子数を数えた。
前述のように調製した３つのリンゴのバッチに、25μｌのCECT−10817拮抗剤懸濁液を、2.62×106c.f.u./ml、7.0×106c.f.u./mlおよび1.15×107c.f.u./mlの濃度で接種した。果実が乾燥したら、そこに選択した３つの種の病原体の力価を測定した懸濁液20μｌを、103c.f.u./ml、104c.f.u./mlおよび105c.f.u./mlの濃度で接種した。これと平行して、対照試験を準備し、病原体の力価を測定した懸濁液と無菌蒸留水のみをリンゴに接種した。
処理したすべてのリンゴを小室に入れ、乾燥させ、次に箱に入れて20℃で周囲温度でインキュベートした。ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）を接種した果実では、インキュベート時間は７日間であり、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）の場合はこれは６日間であり、リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）の場合は、５日間であった。インキュベート期間は、対照のリンゴが大きな腐敗直径を示すまでに要する時間に基づいて設定した。このインキュベート期間後、作成したすべての穴の腐敗の直径を測定して、結果を読んだ。
種々の繰り返し試験の腐敗した直径の読み値を、分散分析に基づく統計解析を行い、分散分析値が有意であった（α＜0.01〜α＜0.05）場合は、ダンカンマルチプルレンジ試験（Duncan Multiple Range Test）を用いて平均値の分離を行い、その結果をアルファベットの小文字（ａ、ｂ、ｃ、ｄなど）で表し、同じ文字の処理の場合は統計的に同じであるとし、異なる文字の場合は統計的に異なるものとした。
表３は、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）の生物学的制御について得られた結果を示し、表４はペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）の結果であり、表５は、リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）の結果である。
この表の結果をグラフで示したものが、それぞれ図６、７、および８である。
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図６、図７および図８のグラフとともに、表３、表４および表５の前述のデータは、試験した病原性真菌の３つの種の制御、従って果実の腐敗の制御における拮抗剤CECT−10817の高度の有効性を示している。
得られた結果を米国特許出願US−７−745796（ウィルソン（wilson）の記載と比較すると、特に重要なことは、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）およびペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）の制御において、カンジダ・サケ（Candida sake）CECT−10817株の作用は、前記特許出願に記載のNRRL Y−18844、NRRL Y−18845、およびNRRL Y−18846株より、明らかに大きいことである。
実施例3.  低温および異なる酸素空気中で保存した果実に及ぼすCECT−10817の有効性
実施例２に記載の方法の後、１回の繰り返しあたり20個の「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴと処理あたり３回の処理で、試験を行なった。
拮抗剤CECT−10817の水性分散液の25μｌを、実施例２で使用した３つの濃度で、そして104c.f.u./mlの濃度の20μｌのペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）接種物を接種した。次に接種したリンゴの３つのバッチを、分離し、60日間保存した。１つのバッチは、通常の低温保存条件（１℃および周囲酸素）、他のバッチは制御された空気条件（１℃および３％酸素）、そして最後のバッチは極低酸素条件（１℃と１％酸素）で保存した。
実施例２の方法と同様に読み、統計処理した結果を、表６、表７および表８に示す。これらをまとめたグラフを図９に示す。
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上記の表および図９に示すように、得られた結果は、通常の低温保存条件下でペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）の制御において高い効率が得られ、この効率は、試験を低温保存条件と低酸素環境条件下で行う時、顕著に上昇することを示している。
実施例4.通常の低温保存条件下でのボツリチス・シネレア（B.cinerea）の制御
ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）接種物20μｌを、104c.f.u./mlの濃度で用いて、実施例３と同じ条件下で試験を行なった。試験は、通常の低温保存条件（１℃および周囲酸素）で行なった。
前述の統計処理法で得られた結果を表９に、そしてグラフを図10に示す。
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腐敗直径の低下の結果は、優れたものであり、特に７×106c.f.u./mlの濃度のCECT−10817インヒビターで優れていた。
実施例5.  ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）の大規模試験での制御
この試験のために、以下の方法で拮抗剤の大規模な分散液を調製した。
拮抗剤CECT−10817を、NYDA培地を含有する試験管に接種し、25℃で24〜48時間インキュベートした。この試験管の内容物を、攪拌器と通気装置を取り付けた、2,000mlのNYDB培地の入った発酵槽に入れて、25℃で37時間インキュベートした。次に発酵槽の内容物を6,000rpmで10分間遠心分離し、浮遊物質を除去した。沈殿物を無菌蒸留水に分散し、分散液を使用して、実施例１と同じ方法で目的の濃度の拮抗剤を調製した。
１回の繰り返し当たり１箱の「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴ（70個）を使用し、１回の処理当たり４回の繰り返しを行なった。畑で集めたリンゴを、その赤道線に沿ってメスで（１個当たり４カ所に）切り込みを入れ、７×105と７×106c.f.u./mlの濃度の拮抗剤分散液を含有する浴に果実の箱を入れて、CECT−10817拮抗剤で処理した。未処理の対照バッチも使用した。次にリンゴが乾燥した後、104c.f.u./mlの濃度のペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）の胞子の力価を測定した分散液を含むバッチに箱を入れた。
リンゴの箱を低温保存条件（１℃と周囲酸素）下で60日間保存し、保存期間終了後、前記の実施例と同じ条件で結果を読み、同じ統計処理を行なった。
結果を表10に、そしてグラフを図11に示す。
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前述の表や図が示すように、前述の試験で得られたペニシリウム・エクスパンスム（P.expansum）の優れた制御結果が、大規模試験で確認された。７×106c.f.u./mlの濃度のCECT−10817拮抗剤を用いる時、腐敗直径の低下は実質的に90％であることは、注目すべきである。
実施例6.  殺真菌剤イマザリル（Imazalil）との比較
１回の繰り返し当たり20個の「ゴールデンデリシャス」（″Golden Delicious″）リンゴを使用し、１回の処理当たり４回の繰り返しを行ない、各リンゴに５つの切り込みを入れて試験を行なった。
CECT−10817拮抗剤とイマザリル（Imazalil）殺真菌剤は、これらの溶液または分散液にリンゴを浸すことにより適用した。拮抗剤は７×106c.f.u./mlの濃度で、イマザリル（Imazalil）は7.5重量％の濃度で適用した。
次にリンゴに、104c.f.u./mlの濃度のペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）病原体を接種した。拮抗剤で処理したリンゴの１つのバッチは、処理後24時間目に病原体を接種した。
果実を20℃で８日間インキュベートし、次に結果を読み統計的に処理した。
得られた結果を表11に、そしてグラフを図12に示す。
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処理後24時間目に拮抗剤を接種すると、CECT−10817拮抗剤とイマザリル（Imazalil）の有効性は実質的に同じであることがわかる。
CECT−10817株の寄託に関する情報
この微生物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、バレンシア（Valencia）大学生物科学部（Faculty of Biological Scineces）微生物学科（46100、ブルジャソット（Burjasot）（バレンシア））にある、Colceccion Espanola de Cultivos Tipo（CECT）に寄託した。1994年７月６日に寄託し、寄託番号CECT−10817を付与された。
前記のブダペスト条約の規定に従い、寄託物は一般に自由に入手できるが、入手可能であることは、本発明の目的を実施する権利が与えられるものと解釈することはできず、本願特許の出願人の権利を侵害するものであると理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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