(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１’−（２，３−ビス（ヘキサデカノイルオキシ）プロピル〕−α−Ｄ−グルコピラノス−６’−イル−２”−（トリメチルアンモニウム）エチルフォスフェート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＧＧＰＬ株の脂質画分から見出された新規な『ホスホリルコリン含有α−グルコース（糖）脂質化合物』に関するものである。
【０００２】
【従来技術の説明】
ヒトレトロウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉ、およびＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）はいずれもリンパ球のなかでもとくにヘルパーＴ細胞に感染しやすく、ＨＴＬＶ−Ｉではこれをモノクローナルに腫瘍化し、ＨＩＶではこれを破壊することにより発症する。また、マイコプラズマ・フェルメンタンスは、ＨＩＶによるＡＩＤＳの発症やリウマチの病態に深く係わっているという報告があるが、そのメカニズムについては全くわかっていない。
【０００３】
【本発明が解決しようとする問題点】
本発明の発明者らは、このメカニズムを解明するために、マイコプラズマ・フェルメンタンスの脂質における主要な抗原性を持つ種特異的抗原であるところの糖リン脂質を分離、精製して構造解析を試み、生理活性を有する可能性のある新規な構造の物質を見出すべく、鋭意研究した。
【０００４】
【問題点を解決する手段】
発明者らは、前述の目的で研究を行った結果、新規な糖リン脂質を分離、精製することに成功し、さらに、その物質を構造解析すること〔例えば、赤外吸収分析（ＦＴＩＲ）、質量分析、１３Ｃおよび１Ｈ−ＮＭＲなどにより構造解析すること〕により、その絶対構造を確定した。
【０００５】
即ち、本発明のホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物は、１’−〔２，３−ビス（ヘキサデカノイルオキシ）プロピル〕−α−Ｄ−グルコピラノス−６’−イル−２”−（トリメチルアンモニウム）エチルフォスフェートに関する。
【０００６】
本発明のホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物は、次に示す構造式Ｉを有している。
【０００７】
【化１】
0003551525.tif 000002
【０００８】
マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）は、最近、ヒトレトロウイルス感染患者及び細胞から高率に分離されウイルス感染による病態の重要な増悪因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）となっている可能性が示唆されてきている。
今回、構造決定した物質は、このマイコプラズマ・フェルメンタンスを分離、クローニングしてその脂質成分を解析したところその生物の成分であることがわかった。この物質はマイコプラズマ・フェルメンタンスに特徴的に見出された新規化合物である。
【０００９】
この物質はＡＩＤＳの病態、ＲＡの病態解明の可能性をもつ有望な新規化合物である。また、この化合物とその中間体は、ヒトレトロウイルス疾患などに対する医薬またはそのような医薬の中間体としても有望な化合物である。
【００１０】
以下、本発明の構造式Ｉで示されるホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質を精製、分離・取得し、その構造解析を行った実施例を示す。
実施例１
ｉ）培養；マイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ株をＰＰＬＯ培地で増殖培養し、これをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄したものを−８０℃に保存した。
【００１１】
ｉｉ）脂質の抽出；脂質は、６０ｍｌ（湿潤状態の容量）の細胞に対しそれぞれ４００ｍｌのクロロホルムとメタノールとの混合溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１、１：１および１：２である３種の混合溶媒）を用いて抽出し９９３ｍｇの総脂質を得た。
【００１２】
ｉｉｉ）分画Ａ（非結合部分の取得）；総脂質はカラム（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラム）により非結合部分と結合部分とに分け、非結合部分７７５ｍｇが得られた。
【００１３】
ｉｖ）分画Ｂ（ホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質の単離）；クロロホルムとメタノールと水との混合溶媒の３回濃度勾配を変え（例えば、１回目の容量比、クロロホルム：メタノール：水＝８３：１６：０．５〜２０：８０：８）イアトロビーズにかけて分画Ａ（非結合部分）をさらに分画し、最後に１−プロパノールとアンモニアと水との溶液（容量比、１−プロパノール：アンモニア：水＝８０：５：１５〜７５：５：２０）による濃度勾配を用いて各成分を単離した。
収量は、ホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質（以下、ＧＧＰＬ−１と言う）が３ｍｇであった。
【００１４】
ｖ）質量分析；質量分析装置〔フィネガン・ＭＡＴ社製、機種名：ＴＳＱ７０ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｇｅ  ｇｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ〕を用いて、前記のＧＧＰＬ−１について、ＬＳＩＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｏｒｏｍｅｔｒｙ）及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【００１５】
ｖｉ）ＮＭＲ分析；前記のＧＧＰＬ−１について、（ＣＨ３）２ＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ（９８：２）０．５ｍｌに溶解し、ＮＭＲ測定装置（日本電子（株）製；ＦＸ−４００）を用いて、６０℃で１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲを行った。
【００１６】
〔詳細な分析試験の結果〕
（ａ）マイコプラズマ・フェルメンタンスのホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質；マイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ株から抽出した脂質の中性脂質画分にｏｒｉｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４（糖の検出）、及びＤｉｔｔｍｅｒ（リンの検出）試薬に反応する数種の脂質（リン糖脂質）を検出し、このうち１種（以下、ＧＧＰＬ−１と言う）についてシリカビーズカラムへの吸着を行ってその溶出分離を行った。
【００１７】
前記のＧＧＰＬ−１は、クロロホルム／メタノール／水による濃度勾配法において、ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（以下、ｌｙｓｏＰＣとも言う）と分離不可能であったが、１−プロパノール／アンモニア／水による濃度勾配法（この場合、カラムから溶出した各フラクションを酢酸で速やかに中和してアルカリによるエステルの分解を抑えた）によって分離することができた。
【００１８】
前記ＧＧＰＬ−１は、ｏｒｉｃｉｎｏｌ−Ｈ２ＳＯ４、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬及びＤｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬（コリンの検出）に陽性を示し、しかも、緩和なアルカリ処理で分解するものであった。
【００１９】
（ｂ）ＦＴＩＲ分析；ＧＧＰＬ−１をＩＲ分析した結果、９６０ｃｍ−１にコリンに由来する強い吸収が認められ、又、エステル結合に由来する１７４０ｃｍ−１及び１１７０ｃｍ−１の吸収が認められた。
【００２０】
（ｃ）ＬＳＩＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｏｒｏｍｅｔｒｙ）及びＭＳ／ＭＳ分析；ＧＧＰＬ−１の陽イオン−ＬＳＩＭＳの結果を図１に示す。その図１によれば、分子イオンに相当するシグナルｍ／／ｚ８９６および９２４が確認された。
そこで、ＧＧＰＬ−１における主な分子イオンｍ／ｚ８９６について、ＭＳ／ＭＳ分析を行った。そのＧＧＰＬ−１の分析において、主要シグナルの帰属を概略示す結果を、図２に示す。
その図２の結果によれば、Ｍ−Ｃ１６：０（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｇｒｏ−Ｈｅｘ−Ｐ−ｃｈｏｌｉｎｅ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｈｅｘｏｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｈｅｘ−Ｐ−ｃｈｏｌｉｎｅ（ｈｅｘｏｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−ｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｐ−ｃｈｏｌｉｎｅ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ｃｈｏｌｉｎｅに相当する各シグナルが明確に認められた。
【００２１】
このことから、ＧＧＰＬ−１における（［Ｍ＋Ｈ］＋８９６）は、グリセロール−ヘキソース−ホスホコリンに脂肪酸Ｃ１６：０が２分子結合したグリセロ糖リン脂質であることが示唆された。
【００２２】
（ｄ）ＮＭＲ分析（１Ｈ−ＮＭＲ）；ＧＧＰＬ−１のＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）分析の結果を、図３に示す。図３の結果によれば、ＧＧＰＬ−１の構造としては、ＤＨＱ−ＣＯＳＹ  ｓｐｅｃｔｒａｍにより、セラミドを含まず、ジアシルグリセロール構造（以下、Ｇｒｏとも言う）を含むことが確認された。
また、核には、α−グルコースでその６位にホスホリルコリン基が結合し、１位がグリセロール基と結合していることがわかった。
１Ｈ−ＮＭＲ分析の各ピークの帰属をさらに詳細に明らかにした結果を、図８および表１に示す。
【００２３】
（ｅ）ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ）；すべてのピークが前述の各構造であることが説明された。また、ホスホリルコリン基がα−グルコースの６位に結合していることも再確認された。
【００２４】
さらに、ＧＧＰＬ−１は、グリセロール構造のＣ−３（３位の炭素）において酸素を介してグリセロール基がグルコース構造と結合していることを示している約６ｐｐｍの低磁場シフトが見られた。
また、ＧＧＰＬ−１において、コリン構造のリン酸エステル側、Ｎ側およびメチル基炭素は、それぞれの標準品のＰＣとほぼ等しい化学シフトと結合定数を示した。
【００２５】
従って、前述のようにして得られたＧＧＰＬ−１は、グリセロール構造：１モル、脂肪酸構造：２モル、α−グルコース構造（糖構造）：１モル、ホスホリルコリン：１モルを有しており、しかもα−グルコースの６’位の炭素にホスホリルコリンが結合している新規なタイプの糖リン脂質化合物であることが明らかになった。
【００２６】
本発明の化合物は、マイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ株の培養によって得られその構造が正確に確認されたものであり、その化学的な構造が前述の構造式Ｉで示される化学構造を有している新規なホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物である。  即ち、前記の化合物（ＧＧＰＬ−１）は、１’−〔２，３−ビス（ヘキサデカノイルオキシ）プロピル〕−α−Ｄ−グルコピラノス−６’−イル−２”−（トリメチルアンモニウム）エチルフォスフェートである。
【００２７】
グリセロ糖脂質化合物類は、植物バクテリアで数多く見つかっているが、ホスホリルコリンを含有したこのタイプのものは今まで報告がない。また、α−グルコースにホスホリルコリン基が結合した構造も今まで報告がない。哺乳動物では脳と精巣からグリセロ糖脂質が分離され構造が決定されているが、これは、α−グルコース核、ホスホリルコリン構造を有していない。以上のことにより、このＧＧＰＬ−１は極めてユニークでグリセロ糖脂質である。
【００２８】
参考例１
ｉ）培養；マイコプラズマ（マイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ株を含む）の培養はＰＰＬＯ液体基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に１０％（容量／容量）牛血清、ペニシリン、０．０００２％（重量／容量）フェノールレッドおよび１％グルコースを加えた液体培地１００ｍｌにて３７℃で培養する。培地のｐＨの変化により、マイコプラズマの増殖を確認した後、１６，０００ｘｇで１時間遠心分離する。この洗浄操作をもう一度繰り返す。このようにして得られた菌体を脂質抽出用の試料とする。
【００２９】
ｉｉ）脂質の抽出；菌体試料をメタノール１０ｍｌに浮遊させて４時間なじませる。クロロホルム２０ｍｌを加え、メタノールとの割合が２：１（クロロホルム：メタノール）と成るようにする。超音波で菌体を破砕し、さらに４時間放置する。３０００ｒｐｍで遠心し、その上清を回収しエバポレーションし、目的の脂質を得る。
【００３０】
ｉｉｉ）分画（ＴＬＣ）；展開溶媒は、クロロホルム：メタノール：０．２％塩化カルシウム水溶液（５５：４５：１）の混合溶媒を用いた。
ｉｖ）検出；分画後のリン脂質の検出はデットマー（Ｄｉｔｔｍｅｒ’ｓ）の試薬により、糖脂質の検出はオルシノール（ｏｒｃｉｎｏｌ）の試薬を用い、それぞれ染色により行った。
【００３１】
図４は、各種のマイコプラズマ株の脂質画分をＴＬＣで展開したものをリン脂質染色する方法で染色した。図４の各番号は次に示すマイコプラズマ株である。
番号１：ＭＴ−４（ＧＧＰＬ＋）細胞
番号２：マイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＧＧＰＬ）株
番号３：マイコプラズマ・アルギニニＧ２３０      （Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ  Ｇ２３０）株
番号４：マイコプラズマ・フェルメンタンスＰＧ１８（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＰＧ１８）株
番号５：マイコプラズマ・ヒオルヒニスＤＢＳ１０５０  （Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ  ＤＢＳ１０５０）株
番号６：マイコプラズマ・オラレＣＨ１９２９９      （Ｍ．ｏｒａｌｅ  ＣＨ１９２９９）株
番号７：マイコプラズマ・ペネトランスＧＴＵ−５４−６Ａｌ（Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ  ＧＴＵ−５４−６Ａｌ）株
番号８：マイコプラズマ・サリバリウムＰＧ２０    （Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍＰＧ２０）株
【００３２】
この図から、ＧＧＰＬ−１に相当するバンドが示されているが、これはマイコプラズマ・フェルメンタンスが感染したＴ細胞（レーン１）とマイコプラズマ・フェルメンタンスＧＧＰＬ株（レーン２）及びマイコプラズマ・フェルメンタンスＰＧ１８株（レーン４）にのみ認められ、その他のマイコプラズマ種では認められなかった。
【００３３】
図５は、図４と同じ試料についてＴＬＣで展開後、糖脂質を発色させる試薬を用いて染色したものである。ＧＧＰＬ−１に相当するバンドが図４と同様に染色された。
図５における番号１〜８は、図４における各試料の番号と同じ内容である。
【００３４】
図６は、図４と同じ試料についてＴＬＣで展開後、マイコプラズマ・フェルメンタンスをウサギに免疫し作製したポリクロナール抗体で図４と同じ試料を免疫染色したものである。図６よりＧＧＰＬ−１のバンドがマイコプラズマ・フェルメンタンスの成分とのみ特異的に強く反応していることがわかる。
図６における番号１〜８は、図４における各試料の番号と同じ内容である。
【００３５】
図７は、マイコプラズマ・フェルメンタンスの脂質をＴＬＣで展開後、他の各種マイコプラズマをウサギに免疫し作製した抗血清との反応性を調べたものである。他のマイコプラズマ種に対して作製した抗血清はマイコプラズマ・フェルメンタンスの脂質成分とは反応せず、マイコプラズマ・フェルメンタンスに対し作製した血清のみ（番号１，２）が反応していた。
【００３６】
図７の各番号は次に示す内容である。
番号１：抗Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  １  血清
番号２：抗Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ２  血清  （番号１と異なるウサギに免疫したものである）
番号３：抗Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清
番号４：抗Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ血清
番号５：抗Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ血清
番号６：抗Ｍ．ｏｒａｌｅ血清
番号７：抗Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ血清
【００３７】
各種マイコプラズマの同定は、血清反応が今のところ最も重視されている。今回、構造決定した物質は、マイコプラズマ・フェルメンタンス種に特異的に存在し、しかも脂質画分において最も重要な抗原決定基であることが示された。
【００３８】
【表１】
0003551525.tif 000003
【００３９】
【本発明の作用効果】
本発明の化合物は、マイコプラズマ・フェルメンタンスから精製分離された新規なホスホリルコリン含有グリセロ糖脂質化合物である。また、マイコプラズマ・フェルメンタンスは、ヒトレトロウイルス、あるいはリウマチなどで病原性が強く疑われている微生物である。従って、このユニークなグリセロ糖脂質やその中間体が診断薬及び医薬に有用である可能性は大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＧＰＬ−１の陽イオン−ＬＳＩＭＳの結果を示すチャート図である。
【図２】ＧＧＰＬ−１のＭＳ／ＭＳ分析の結果を示すチャート図である。
【図３】ＧＧＰＬ−１のＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）分析の結果を示すチャート図である。
【図４】リン脂質染色
【図５】糖脂質の染色
【図６】脂質の免疫染色
【図７】各種抗血清との反応性
【図８】ＧＧＰＬ−１のＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）分析の結果を示すチャート図である。
【図１】
0003551525.tif 000004
【図２】
0003551525.tif 000005
【図３】
0003551525.tif 000006
【図４】
0003551525.tif 000007
【図５】
0003551525.tif 000008
【図６】
0003551525.tif 000009
【図７】
0003551525.tif 000010
【図８】
0003551525.tif 000011