(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体からなることを特徴とする反応性小胞体形成剤。
【化１】
0003575037.tif 000005
〔式中、Ｒ１Ｃ（＝０）およびＲ２Ｃ（＝０）は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。
Ｒ３は水素原子またはメチル基、
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
Ｍは水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
【請求項２】
請求項１記載の反応性小胞体形成剤の一種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小胞体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、反応性小胞体形成剤、およびこれを小胞体形成成分として含む反応性小胞体に関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームまたは脂肪乳剤等の小胞体の製造に用いられる反応性小胞体形成剤、およびこれを小胞体形成成分として含む反応性小胞体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームはリン脂質の二分子膜からなる小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題となっている。
【０００３】
従来、リポソーム表面上または膜中への機能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆したリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチルカルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサクシニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ８９８，  ３２３（１９８７））、あるいはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加えておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じたアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５，  １０５０９（１９８０））などがある。
【０００４】
しかし、これらの従来法では、リポソーム調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点がある。
【０００５】
一方、リポソームを生体内へ投与したとき、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉されるため、十分な効果が得られないことが指摘されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４３，  ５３２８（１９８３））。そこで、この網内系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソーム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチレングリコール鎖を導入することが試みられている（例えば、特開平１−２４９７１７号公報、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２６８，  ２３５（１９９０））。また、ポリエチレングリコールで修飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維持できることが明らかになっている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０６６，  ２９−３６（１９９１））。
しかし、このような方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入されたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。
【０００６】
さらに、特開平４−３４６９１８号公報には、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与したポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレングリコール）部分を含む化合物を反応させることにより、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合リポソームが得られることが記載されている。
しかし、このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げられるため、期待される効果が十分には得られないという問題点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題点を解決するため、リポソームその他の小胞体にポリアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、このポリアルキレンオキシド鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くすることが可能な反応性小胞体形成剤、およびこの反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含む反応性小胞体を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の反応性小胞体形成剤および反応性小胞体である。
（１）下記一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体からなることを特徴とする反応性小胞体形成剤。
【化２】
0003575037.tif 000002
〔式中、Ｒ１Ｃ（＝０）およびＲ２Ｃ（＝０）は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。
Ｒ３は水素原子またはメチル基、
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
Ｍは水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
（２）上記（１）記載の反応性小胞体形成剤の一種以上を小胞体形成成分として含むことを特徴とする反応性小胞体。
【０００９】
一般式〔１〕においてＲ１Ｃ（＝０）、Ｒ２Ｃ（＝０）で表わされる脂肪酸のアシル残基は、炭素数（カルボニル基の炭素も含む）３〜３０、好ましくは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステアリン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。
【００１０】
これらの中では、安定なリポソームまたは脂肪乳剤が形成できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン酸のアシル残基が好ましく、特にパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のアシル残基が好ましい。Ｒ１Ｃ（＝０）とＲ２Ｃ（＝０）とは同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００１１】
一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
一般式〔１〕のｎは１〜１０００、好ましくは１０〜３００、さらに好ましくは２０〜１２０の正数である。
【００１２】
ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。ポリアルキレンオキシド鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。
【００１３】
一般式〔１〕のＲ３は水素原子またはメチル基である。
一般式〔１〕のＭは水素原子またはナトリウムもしくはカリウム等のアルカリ金属原子である。
【００１４】
一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体は、例えば次のような２段階の反応により、容易に製造することができる。
第１段階目の反応では、ホスホリパーゼＤ酵素（ＰＬａｓｅ−Ｄ）の存在下に、リン脂質とポリアルキレングリコールとを反応させ、ホスファチジル＝ポリアルキレングリコールを合成する。このとき使用するホスホリパーゼＤとしては、市販品または「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，４７７−４８４（１９６７）」に記載されている方法などにより抽出・精製したものであってもよい。またリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸などが使用できる。ホスホリパーゼＤの使用量は、特に限定されないが、リン脂質１ｇに対して１００〜５００単位とするのが好ましい。また、リン脂質とポリアルキレングリコールとの仕込モル比は、リン脂質１モルに対してポリアルキレングリコール５〜１００モルとするのが好ましい。
【００１５】
反応は酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等の水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とクロロホルム、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の有機溶媒との混合溶媒中で行うのが好ましい。反応温度は０〜８０℃、好ましくは３０〜４０℃、反応時間は１０分間〜１７０時間、好ましくは３０分間〜２４時間とするのが望ましい。
このようにして得られたホスファチジル＝ポリアルキレングリコールは、そのまま、または再沈殿、カラム処理、吸着剤処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法により単離・精製して、次の第２段階目の反応に供する。
【００１６】
第２段階目の反応では、第１段階目の反応で得られたホスファチジル＝ポリアルキレングリコールにＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはその誘導体を反応させ、目的とするリン脂質誘導体を合成する。両者の仕込モル比は特に限定されないが、ホスファチジル＝ポリアルキレングリコール１モルに対してＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールまたはその誘導体０．１〜１００モル、好ましくは１〜１０モルとするのが望ましい。
【００１７】
反応はクロロホルム、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等の有機溶媒中で行うのが好ましい。反応温度は−１００〜１００℃、好ましくは０〜４０℃、反応時間は１分間〜４８時間、好ましくは１０分間〜６時間とするのが望ましい。
反応終了後は、得られた反応混合物はそのまま、あるいは蒸留、再結晶、再沈澱、吸着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法により単離・精製した後、反応性小胞体形成剤として使用することができる。
【００１８】
ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いた場合の反応式を次に示す。なお、式中Ｒ１（Ｃ＝Ｏ）、Ｒ２（Ｃ＝Ｏ）、Ｍおよびｎは前記と同じもの、ＰＬ−ＰＥＧはホスファチジル＝ポリエチレングリコールを示す。
【化３】
0003575037.tif 000003
【００１９】
本発明の反応性小胞体形成剤は、アミノ基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級アミノ基に対して高い反応性のあるオキシカルボニルイミダゾール基を有しているので、このような官能基を有する機能性物質と容易に反応し、共有結合が形成される。このため、本発明の反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として用いることにより、小胞体にポリアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、前記官能基を有する機能性物質に対する反応性を付与することができる。
【００２０】
本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含有し、前記官能基を有する機能性物質に対する反応性を有するものである。反応性小胞体形成剤は一種単独で含有されていても、二種以上が組合されて含有されていてもよい。また小胞体形成成分としては本発明の反応性小胞体形成剤の他に小胞体を形成し得る他の小胞体形成成分が含まれていてもよい。
【００２１】
本発明において小胞体とは、反応性小胞体形成剤または反応性小胞体形成剤と他の小胞体形成成分の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。具体的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳化された脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。
【００２２】
本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式〔１〕で表わされる反応性リン脂質誘導体を一種単独で、または二種以上組合せて、あるいは小胞体を形成しうる他の小胞体形成成分、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、その他のリン脂質類、コレステロールやイントラリピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー油などと混合して使用することにより、反応性リポソームをはじめ反応性脂肪乳剤、反応性ミセルなどの反応性小胞体を形成することができる。この場合、小胞体は公知の方法により製造することができる。
本発明の反応性小胞体形成剤を用いて得られた反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる化合物中のオキシカルボニルイミダゾール基を官能基として利用して、種々の機能性物質を共有結合により導入することができる。
【００２３】
次にそれぞれの反応性小胞体について詳しく説明する。
代表的な反応性小胞体である反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤を膜形成成分（小胞体形成成分）として含有するものである。反応性小胞体形成剤の含有量は、反応性小胞体形成剤および他の膜形成成分の合計量に対して０．００１〜１００モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。０．００１モル％未満では期待される効果が小さくなるため、一般的には使用されない。反応性小胞体形成剤は、一種単独で使用することもできるし、二種以上のものを組合せて使用することもできる。
【００２４】
反応性小胞体形成剤と混合して用いられる他の膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分として用いられているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０６６，  ２９−３６（１９９１）」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００２５】
反応性リポソームは、反応性小胞体形成剤およびレシチン、その他のリン脂質、コレステロール等の他の膜形成成分を、有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知の方法によりリポソーム化することにより製造することができる。また、これらの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有する反応性リポソームを製造することができる。
【００２６】
このようにして得られた反応性リポソームは、リポソーム膜の内外表面にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介してオキシカルボニルイミダゾール基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よくかつ簡単にリポソームの二分子膜上にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、ウレタン結合、カーボネート結合またはチオカーボネート結合により化学的に固定化することができる。
【００２７】
反応性リポソームに固定化できる機能性物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬などがあげられる。
【００２８】
反応性リポソーム上への機能性物質の固定化反応は、種々の緩衝液等の水系溶媒、またはこれらの水系溶媒とアセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと機能性物質とを−１０〜１２０℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好ましくは４０〜１２０℃で、５分間〜１０００時間、好ましくは３０分間〜７２時間攪拌下に反応させる方法などにより、一段階で容易に行うことができる。これらの条件外では、リポソームの安定性が悪くなるため好ましくない。
【００２９】
リポソーム表面上でのアミノ基を有する機能性物質の固定化反応を模式的に示すと次のようになる。式中、Ｒ３、ＡＯ、ｎは前記と同じものを示す。
【化４】
0003575037.tif 000004
【００３０】
また、反応性リポソームの内部には、一般のリポソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入することが可能である。被封入物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類などがあげられる。
固定化反応または封入操作の終了後は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。
【００３１】
機能性物質を固定化したリポソームは、ポリアルキレンオキシド鎖の先端に機能性物質が固定化されているので、ポリアルキレンオキシド鎖に邪魔されることなく機能性物質の作用が十分に発揮される。また、ポリアルキレンオキシド鎖が導入されているので、従来からのポリアルキレンオキシド鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原性、リポソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待できる。
このため反応性リポソームは、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利用できる。
【００３２】
なお、反応性リポソームを製造する際、他の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することにより、重合性の反応性リポソームとすることができる。重合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好ましい。
【００３３】
重合性リポソームは、リポソーム調製後に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容易に重合を行うことができる。
このようにして得られた重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているので、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等により粉末状に調製し、安定して使用することができる。
【００３４】
他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤は、本発明の反応性小胞体形成剤と、大豆油、サフラワー油等の植物油と、大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質と、必要により添加される他の添加剤、例えばイントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質などを含む油脂混合物が乳化されたものである。
油脂混合物中に占める反応性小胞体形成剤の含有量は、０．００１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モル％であるのが望ましい。
【００３５】
反応性脂肪乳剤は、公知の方法により製造することができる。例えば、本発明の反応性小胞体形成剤、植物油、他のリン脂質および必要により配合する添加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイザー等で均質化する方法などにより製造することができる。
【００３６】
このようにして得られた反応性脂肪乳剤には、反応性リポソームの場合と同様にして、同様の機能性物質を容易に固定化することができる。
このため反応性脂肪乳剤は、医薬の運般体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒などとして利用できる。
【００３７】
上記以外の反応性小胞体である反応性ミセルは、本発明の反応性小胞体形成剤だけからなるものであっても、レシチン、その他のリン脂質類、コレステロール等の他の成分が含有されているものであってもよい。反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化することができ、同様の用途に利用できる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の反応性小胞体形成剤は、一般式〔１〕で表わされる構造を有しているので、小胞体にポリアルキレンオキシド鎖を導入できるとともに、このポリアルキレンオキシド鎖の先端に、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くすることができる。
【００３９】
本発明の反応性小胞体は、上記反応性小胞体形成剤を小胞体形成成分として含有しているので、ポリアルキレンオキシド鎖が導入されるとともに、小胞体にポリアルキレンオキシドからなるスペーサーを介して、簡単にかつ効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、しかも機能性物質の導入量を多くすることができる。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により、さらに詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
合成例１
ジパルミトイルホスファチジルコリン０．５ｇ（０．６５ｍｍｏｌ）およびポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００、ｎ≒４５）５ｇ（１．７ｍｍｏｌ）を溶解させたクロロホルム溶液４０ｍｌに、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）製）４０単位を溶解させた１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌを加え、４０℃で１２時間攪拌して反応させた。次に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、有機層を減圧下で濃縮した。得られた反応混合物をシリカゲルカラム（２０％メタノール／クロロホルム）を用いて分画し、濃縮した後、少量のクロロホルムに溶解させ、これをジエチルエーテルに再沈殿することにより、ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレングリコールを得た（収率３０％）。
【００４１】
次に、乾燥させたクロロホルム１０ｍｌ中に、上記ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール１００ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ′−ジカルボニルイミダゾール８７ｍｇ（０．５４ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間攪拌した。得られた反応混合物をジエチルエール中で再沈殿させ、目的の反応性リン脂質誘導体（一般式〔１〕において、Ｒ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がパルミトイル基、Ｒ３の水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約４５の反応性リン脂質誘導体）を得た（収率９２％）。
反応の進行は、１Ｒスペクトル（ＫＢｒ法）において、ポリエチレングリコール末端の水酸基（ＯＨ伸縮、３４２８ｃｍ−１）の消失およびオキシカルボニルイミダゾール基（カルボニル結合）の生成（Ｃ＝Ｏ伸縮、１７６０ｃｍ−１）により確認した。
【００４２】
実施例１−１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）に、合成例１で得られた反応性リン脂質誘導体を前記二者に対して１０ｗｔ％（２．４ｍｇ、０．８μｍｏｌ）ナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーにより多重層リポソームを得た。また、さらにエクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネート製メンブランを順次通過させ、大きな単層の反応性リポソームを得た。得られた反応性リポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用いて測定したところ、平均粒径は２２１ｎｍ（ＣＶ値１９％）であった。
【００４３】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ３が水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約１０である反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（１μｍｏｌ）と、ジミリストイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００）５ｗｔ％（０．４μｍｏｌ）とを用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２６８ｎｍ、ＣＶ値２２％）。
【００４４】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ３が水素原子、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約３０である反応性リン脂質誘導体３０ｗｔ％（３．５μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２３８ｎｍ、ＣＶ値２２％）。
【００４５】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシプロピレン基（平均付加モル数約１０）とオキシエチレン基（平均付加モル数約２５）とがランダムに付加したものである反応性リン脂質誘導体１ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）と、ジミリストイルホスファチジル＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２０００）５ｗｔ％（０．４μｍｏｌ）とを用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２３９ｎｍ、ＣＶ値２５％）。
【００４６】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシプロピレン基（平均付加モル数約１０）とオキシエチレン基（平均付加モル数約１５）とがブロック状に付加したものである反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（０．６μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２４７ｎｍ、ＣＶ値１９％）。
【００４７】
実施例１−６
実施例１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕においてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がステアロイル基、Ｒ３が水素原子、Ｍが水素原子、オキシアルキレン鎖がオキシテトラメチレン基（平均付加モル数５）とオキシエチレン基（平均付加モル数約２７８）とがブロック状に付加したものである反応性リン脂質誘導体５ｗｔ％（０．１μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２９０ｎｍ、ＣＶ値２３％）。
【００４８】
実施例１−７
実施例１−１と同様にして、ただし合成例１の反応性リン脂質誘導体の代わりに、一般式〔１〕におけるてＲ１（Ｃ＝Ｏ）およびＲ２（Ｃ＝Ｏ）がミリストイル基、Ｒ３がメチル基、Ｍが水素原子、ＡＯがオキシエチレン基、ｎが約１０である反応性リン脂質誘導体２０ｗｔ％（４．２μｍｏｌ）を用いて、反応性リポソームを得た（平均粒径２１１ｎｍ、ＣＶ値１９％）。
【００４９】
実施例２
実施例１−１と同様にして、ただし卵黄ホスファチジルコリンの代わりに１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＤＰ）を用いて、平均粒径２５４ｎｍ（ＣＶ値２３％）の重合性を有する大きな単層の反応性リポソームを得た。このリポソームに０．７５Ｍｒａｄのγ線照射を行い、ＤＯＤＰを重合させた。得られた重合リポソームは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いてゲル濾過後、凍結乾燥により粉末状サンプルとした。このリポソーム粉末は、生理的食塩水で膨潤させることにより再生することができた。
【００５０】
実施例３
実施例１−１で得られた反応性リポソーム溶液（固形分量２．５ｗｔ％）０．５ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌの西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を、４℃で２４時間攪拌してＨＲＰを反応性リポソームに固定化した。これをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取した。これにＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。
この結果から、実施例１−１の反応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを固定化できることが確認できた。
【００５１】
比較例１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、およびコレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）のみにより、実施例１−１と同様の操作により、固形分量２．５ｗｔ％の大きな単層のリポソームを得た。このリポソーム溶液に実施例３と同様にしてＨＲＰを作用させ、ゲル濾過により精製後、１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は見られなかった。
この結果から、反応性リン脂質誘導体を膜形成成分として含まない比較例１のリポソームでは、ＨＲＰを固定化することができなかったことがわかる。