(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィーを行う糖化ヘモグロビンの測定方法であり、
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せが、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＳＯ3Ｈ基をもつ充填剤との組合せであることを特徴とする糖化ヘモグロビンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体クロマトグラフィー法による糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化ヘモグロビンは、赤血球中のヘモグロビンが非酵素的に血液中のグルコースと反応して形成される。糖化ヘモグロビンを測定することにより血液中のグルコースの平均濃度がわかるため、糖化ヘモグロビンの測定は糖尿病の診断に広く用いられている。この糖化ヘモグロビンの測定は、主としてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって行われている。このＨＰＬＣでは、弱カチオン性イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が使用されており、例えば、特開昭５８−２２１１６４号公報には、アクリル酸又はメタクリル酸のエステルとアクリル酸又はメタクリル酸との共重合体でなる充填剤、特開平２−３０９２５３号公報には、疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、アクリル酸及び／又はメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重合体粒子からなる充填剤などが開示されている。
【０００３】
血液を溶血した試料を、上記のクロマトグラフィーに導入すると、糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）及びヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）並びに非糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡ０  （ＨｂＡ０  ）などのピークが出現する。これらのピークのうち、ＨｂＡ１ｃの値が糖尿病の診断に有効であり、ＨｂＡ１ｃの測定値は上記の全ピークの面積の和に対する、ＨｂＡ１ｃのピークの面積の割合として表され、健常人では約４〜６％とされている。
【０００４】
そこで、上記に開示されたような充填剤を使用すると、糖化ヘモグロビンを良好に測定し得、その結果は糖尿病の診断に広く使用され得るが、より一層精度を高めるために、各ピーク、特にＨｂＡ１ｃピークの分離性などのクロマトグラムの更なる改良が望まれていた。
【０００５】
ＨＰＬＣにおいて、各ピークの分離性、各ピークの保持時間の短縮等のクロマトグラムを改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことではない。
【０００６】
また、液体クロマトグラフィーの分析手法を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示されている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報には、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてアルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィーによる陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されているが、これは、カラムを交換することなく両方のイオン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていないし、また、糖化ヘモグロビンのクロマトグラフィー測定に適用されてもいない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化ヘモグロビンを一層分離性良く短時間で測定し得る液体クロマトグラフィー法による測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の糖化ヘモグロビンの測定方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、糖化ヘモグロビンを含有する試料を、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィーを行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明１でいうクロマトグラムの改良とは、例えば、各ピークの分離性、各ピークの保持時間の短縮、ピークのシャープさなどを言う。
【００１０】
本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、糖化ヘモグロビンの分離に主に作用する充填剤であり、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。
【００１１】
上記充填剤（Ａ）としては、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はなく、公知のいずれもが使用可能である。カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とは、前述のカチオン交換液体クロマトグラフィーに使用される充填剤のことであり、例えば、官能基として、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３  Ｈなどをもつ充填剤が挙げられる。充填剤（Ａ）の骨格の素材としても、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１２】
本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の糖化ヘモグロビンに対するクロマトグラムを改良し得るカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記のように限定された範囲内のものであれば、公知のカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤のいずれの充填剤も使用可能であり、具体的には、上述の充填剤（Ａ）に例示されたものが挙げられる。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合されて使用されてもよい。
【００１３】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとしては、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基が相違する組合せがあり、具体的には、ＣＯＯＨ基をもつ充填剤とＳＯ3Ｈ基をもつ充填剤の組合せからなるものが挙げられる。
【００１５】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１６】
本発明１で用いられるカラムは、従来から液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられているものであれば、特に制限されないが、直径１〜１０ｍｍ、長さ２０〜１００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１７】
本発明１で用いられる液体クロマトグラフィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序としては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層状態でカラム内に存在することになる）してもよい。また、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的には、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合った量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明１で測定される糖化ヘモグロビンを含有する試料としては、血液を溶血した試料が挙げられる。試料の採取方法としては、例えば、血液を抗凝固剤を用いて採血後、界面活性剤を含む溶血試薬にて溶血させる方法が挙げられる。また、通常、血液を溶血した試料には、ヘモグロビンＡ１ｃとして、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの他に不安定型ヘモグロビンＡ１ｃが含まれるが、ヘモグロビンＡ１ｃを糖尿病の指標として利用するためには、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの混入は精度上好ましくないので、これを除去することができる。不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの除去は、ポリリン酸水溶液のような不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ除去試薬を試料に添加し、加温することにより短時間で効率よく行うことができる。
【００１９】
本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法は、測定に使用するカラムとして、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用することの他は、従来の液体クロマトグラフィー法による糖化ヘモグロビンの測定方法と同様である。以下、本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法について詳述する。
【００２０】
図１は、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して糖化ヘモグロビンの分析をする際の装置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー４から糖化ヘモグロビンを含有する試料を導入する。液体クロマトグラフィー用カラム１によって分離された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記録計６に記録される。
【００２１】
上記移動相としては、ｐＨ５〜８の緩衝液が好ましく、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）及び／又はこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられ、緩衝液のｐＨ及びイオン強度を適当に調節することにより最良のクロマトグラムが得られる。移動相の通液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれる。
【００２２】
上記の分離については、適当濃度の移動相により、糖化ヘモグロビンがＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃの順で、さらに非糖化ヘモグロビンであるＨｂＡ０  が溶出されるが、ＨｂＡ１ｃより後の溶出物は、糖尿病診断においては、不要なので、高濃度又は高ｐＨの移動相に切り替えて一度に溶出させてもよい。
【００２３】
上記の検出については、通常、４１５ｎｍの吸光度測定により行われる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例における測定装置は、前記図１のように構成して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。
送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。
サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０。
検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰＤ−６ＡＶ。
【００３８】
実施例において使用した充填剤は、以下の通りである。
充填剤  カチオン−１
以下のように、特開平２−３０９２５３号公報の方法によりカチオン交換充填剤を製造した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯＨを有する。
【００３９】
充填剤  カチオン−２
市販のカチオン交換充填剤（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、メルク社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基として−ＳＯ３  Ｈを有している。
【００４３】
（実施例１、比較例１）
(1)液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）とを、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６）に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００４４】
【表１】
0003561350.tif 000002
【００４５】
(2)糖化ヘモグロビンの分離
健常人からフッ化ナトリウム採血後、界面活性剤及びポリリン酸を含む水溶液を添加して溶血及び不安定型ヘモグロビンの除去を行った。得られた試料を上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置に導入して糖化ヘモグロビンの測定をした。溶出は、ｐＨ５〜６のリン酸緩衝液を使用し、ｐＨ及びイオン強度を調節して各実施例及び比較例で最良のクロマトグラムが得られるようにした。また、ＨｂＡ1Cより後の溶出物は、移動相をｐＨ７、５００ｍＭのリン酸緩衝液に切り替えて一度に溶出させた。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを図３に示した。なお、図２及び３における各ピークは、１１ＨｂＡ1a及びＨｂＡ1b、１２ＨｂＦ、１３ＨｂＡ1C、１４ＨｂＡ0である。
【００４６】
【発明の効果】
本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法の構成は上記の通りであり、糖化ヘモグロビンのクロマトグラムの改良がなされ得、糖化ヘモグロビンを一層分離性良く短時間で測定し得る。また、本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法に使用される液体クロマトグラフィー用カラムは、その製造が容易である。従って、本発明１の糖化ヘモグロビンの測定方法は、簡便な方法でより精度よく糖化ヘモグロビンを分析できる方法である。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖化ヘモグロビンの測定を行う際の装置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１  液体クロマトグラフィー用カラム
２  移動相
３  送液ポンプ
４  サンプラー
５  検出器
６  記録計
【図１】
0003561350.tif 000003
【図２】
0003561350.tif 000004
【図３】
0003561350.tif 000005