(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも作用極および対極の２電極が設けられた絶縁性基板上の作用極上に、酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの混合物水溶液を滴下し、膜厚0.05〜10μmの混合物層を形成せしめることを特徴とするバイオセンサの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサの製造法に関する。更に詳しくは、作用極上に酸化還元酵素および電子受容体の混合物層を形成せしめるバイオセンサの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
絶縁性基板上に少なくとも作用極および対極の２電極を設け、この作用極上に酸化還元酵素、電子受容体およびＣＭＣ等の親水性高分子からなる酵素反応層を設けたバイオセンサが知られている（特開平３−２０２７６４号公報）。しかるに、このような構成のバイオセンサにあっては、測定液のｐＨ変化に対するバラツキが大きいという問題がみられた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、作用極上に酸化還元酵素および電子受容体を含む酵素反応層を設けたバイオセンサであって、測定液のpH変化に対するバラツキの小さいものの製造法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
かかる本発明の目的は、少なくとも作用極および対極の２電極が設けられた絶縁性基板上の作用極上に、酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの混合物水溶液を滴下し、膜厚0.05〜10μmの混合物層を形成せしめてバイオセンサを製造する方法によって達成される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）などの絶縁性基板上には、作用極および対極あるいは作用極、対極および参照極が設けられる。作用極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成され、参照極は参照極リード上にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによって形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁膜などによって被覆される。なお、参照極を設けない２電極構造のものとすることもできる。
【０００６】
そして、作用極上には酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの混合物層の形成が行われる。酸化還元酵素としてはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、乳酸オキシダーゼ等が、また電子受容体としてはフェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が一般に用いられる。
【０００７】
グルコースがＧＯＤの作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生するＨ２Ｏ２を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速されるため、グルコース濃度が約１００ｍｇ／ｄｌ程度迄しか直線検量範囲を示さない。
【０００８】
そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、電子受容体（メディエータ）がＧＯＤ等と共に用いられる。メディエータがフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６の場合、この反応は次のように進行する。
0003591104.tif 000002
この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。
0003591104.tif 000003
【０００９】
また、メディエータとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、ＧＯＤ存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。
0003591104.tif 000004
【００１０】
作用極上への混合物層の形成は、水１ｍｌ当り牛血清アルブミン約１〜１００ｍｇ、好ましくは約５〜２０ｍｇ、ＧＯＤ約１〜５０ｍｇ、好ましくは約１〜２０ｍｇ（１６５８００単位の場合）およびパラベンゾキノン約１〜２００ｍｇ、好ましくは約５０〜１８０ｍｇまたはフェリシアン化カリウム約１〜１００ｍｇ、好ましくは約１０〜６０ｍｇを溶解させた水溶液約０．５〜１０μｌ、好ましくは約０．５〜３μｌを滴下法、スピンコート法などによって作用極上に滴下することによって行われ、そこに約０．０５〜１０μｍ、好ましくは約０．１〜２μｍの膜厚の混合物層を室温条件下で形成させる。
【００１１】
グルコース濃度の測定は、このようにして作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコース水溶液を滴下して約１〜６０秒間程度反応させた後、そこに約０．０５〜０．８Ｖ、好ましくは約０．５〜０．７Ｖの電圧を印加し、例えば印加２０秒後の電流値を測定することによって行われる。測定には、ポテンショガルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用いられる。
【００１２】
【発明の効果】
作用極上にグルコースオキシダーゼによって代表される酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの混合物層を0.05〜10μmの膜厚で形成させることにより、溶存酸素に律速されることなく、広い検量範囲(0〜1000mg/dlまたはそれ以上)でグルコース水溶液などの濃度をそれのpHに左右されることなく測定することができるので、このようなバイオセンサは原液サンプルが測定液とされる使い捨てバイオセンサとして、家庭内健康診断(セルフケァ)、特に血糖、尿糖の測定による糖尿病の自己管理、糖尿病の予防および早期発見などに効果的に用いることができ、また食品製造工程中のグルコース管理に用いられるなど、幅広い用途を期待することができる。
【００１３】
【実施例】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００１４】
実施例
ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ０．２５ｍｍ）上に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の対極、作用極および参照極リードを作用極を中心として、膜厚５μｍで形成させた。次いで、参照極リード上に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって５μｍの厚さで印刷し、焼成して銀電極とした。これらの各電極の中央部分を厚さ１５μｍのポリエステル樹脂製絶縁膜で覆った後、銀電極部分を０．１Ｍ塩酸中に浸漬し、０．６ｍＡ／ｃｍ２の電流密度で２０分間の定電流電解を行い、その表面を塩化銀化して、銀／塩化銀参照極を形成させた。この定電流電解には、ポテンショガルバノスタット（北斗電工製ＨＡ５０１）が用いられた。
【００１５】
このような構成の各電極の内の作用極上に、下記混合液（Ａ）または（Ｂ）を１．５μｌ滴下して室温条件下で乾燥させ、２種類のグルコースバイオセンサＡおよびＢを作製した。
（Ａ）混合液：水１ｍｌに牛血清アルブミン１０ｍｇ、グルコースオキシダーゼ（１６５８００単位）１０ｍｇおよびパラベンゾキノン１６０ｍｇを添加
（Ｂ）混合液：水１ｍｌに牛血清アルブミン１０ｍｇ、グルコースオキシダーゼ（１６５８００単位）１０ｍｇおよびフェリシアン化カリウム４８ｍｇを添加
【００１６】
作製されたグルコースバイオセンサに、所定濃度のグルコース水溶液４０μｌ（ｐＨ６．０）を滴下して５秒間反応を進行させた後、０．６Ｖの電圧を印加し、印加２０秒後の電流値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット（ＨＡ５０１）およびファンクションジェネレータ（北斗電工製ＨＢ−１０４）が用いられた。
【００１７】
測定結果（出力）は、次の表１および図１のグラフに示される。
0003591104.tif 000005
これらの結果から、グルコース濃度０〜１０００ｍｇ／ｄｌの範囲での直線検量性が得られることが分かる。なお、各センサは、１サンプル測定毎に使い捨てとした。また、グルコース濃度１００ｍｇ／ｄｌでの各センサ間の再現性（ｎ＝１０）を示す変動係数は、センサＡでは３．８％、センサＢでは３．６％であった。
【００１８】
更に、参照極を用いない場合について評価すると、直線検量範囲は各センサ共グルコース濃度が０〜１０００ｍｇ／ｄｌで、変動係数はセンサＡでは４．３％、センサＢでは３．９％であった。
【００１９】
なお、（Ｂ）混合液において牛血清アルブミンを用いた場合と用いない場合にそれぞれ得られたセンサＢについて、緩衝液を違えたｐＨ６．０、７．０または８．０のグルコース水溶液について測定したときの変動係数を求めると、次の表２に示される如くであった。
0003591104.tif 000006
【００２０】
これらの結果から、牛血清アルブミンを用いた場合の方が、測定液（グルコース水溶液）のｐＨ変化に対してバラツキが少ないことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるグルコース濃度と出力との関係を示す検量線グラフである。
【図１】
0003591104.tif 000007