(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルホルダに含まれる流体サンプルにおける目標成分を示すピーク事象を検出する方法であって、前記方法は
サンプルに沿った第１の方向における複数の場所において対物レンズを位置決めするステップと、
複数の場所の各々において第１の方向に対して実質的に垂直な第２の方向において対物レンズを焦点合わせすることによって、複数の場所の各々に対応する第２の方向における最適な蛍光の位置を見出すステップと、
最適な蛍光の少なくとも１つの位置から定められる焦点距離に対して第２の方向において対物レンズを調整しながら少なくとも第１の方向においてサンプルを走査してピーク事象を検出するステップとを含み、
前記サンプルは、第２の方向に対して実質的に垂直な２次元面において走査される、方法。
【請求項２】
サンプルホルダに含まれる流体サンプルにおける目標成分を示すピーク事象を検出する方法であって、前記方法は
サンプルに沿った第１の方向における複数の場所において対物レンズを位置決めするステップと、
複数の場所の各々において第１の方向に対して実質的に垂直な第２の方向において対物レンズを焦点合わせすることによって、複数の場所の各々に対応する第２の方向における最適な蛍光の位置を見出すステップと、
最適な蛍光の少なくとも１つの位置から定められる焦点距離に対して第２の方向において対物レンズを調整しながら少なくとも第１の方向においてサンプルを走査してピーク事象を検出するステップとを含み、
走査するステップは、対物レンズを複数の場所からの最大蛍光の少なくとも２つの位置の一次補間から定められる焦点距離に調整するステップを含む、方法。
【請求項３】
サンプルホルダに含まれる流体サンプルにおける目標成分を示すピーク事象を検出する方法であって、前記方法は
サンプルに沿った第１の方向における複数の場所において対物レンズを位置決めするステップと、
複数の場所の各々において第１の方向に対して実質的に垂直な第２の方向において対物
レンズを焦点合わせすることによって、複数の場所の各々に対応する第２の方向における最適な蛍光の位置を見出すステップと、
最適な蛍光の少なくとも１つの位置から定められる焦点距離に対して第２の方向において対物レンズを調整しながら少なくとも第１の方向においてサンプルを走査してピーク事象を検出するステップとを含み、
前記サンプルは第１および第２の方向に対して垂直な第３の方向においてさらに走査される、方法。
【請求項４】
前記サンプルホルダは走査毛細管である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１の方向は走査毛細管の軸長に対して実質的に平行である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
最適蛍光の位置は蛍光が最大である第２の方向における位置である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の目標成分を識別しかつ数えるステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルは血液サンプルであり、目標成分は蛍光ラベル付けされた白血球である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、一般的にある容積の資料内の細胞もしくは細胞組成を計数し、特徴付ける容積（  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ）毛細管血球計数データの処理に関する。
【０００２】
【著作権の部分的な放棄】
本特許出願書の開示の一部は著作権保護の請求がなされている資料を含んでいる。著作権所有者は、米国特許及び商標庁ファイルもしくは記録に本特許文書もしくは特許が開示された時には誰がそれを複写再生しようと異議を申し立てるものではないが、他の全ての権利は完全に留保するものである。
【０００３】
【継続出願データ】
本出願は、本出願と同一譲渡人に譲渡された  １９９３  年２月１７日付出願の一連番号第  ０８／１８，７６２号「容積毛細管血球計数方法及び装置」の部分継続である。
【０００４】
【関連出願との相互参照】
本出願は、本出願と同日に出願され、同一譲渡人が所有する  Ｂａｅｒ  らが発明した米国特許出願「容積毛細管血球計数方法及び装置」に関連する。
【０００５】
【従来の技術】
血液のような生物試料の光学分析は広い応用を有している。このような分析を行うために流れ血球計数装置、自動化血液細胞分析装置及び血液細胞分類装置を含む多くのコンピュータ制御装置が市販されている。
上記相互参照出願に記載されているように、容積血球計数装置は多くの長所を有している。具体的に言えば、分析中の血液の量が制御可能であり、血液の処理が減少し、そしてさらなる処理のために分析した血液のサンプルを貯蔵できることである。
しかしながら、容積システムにおける血液サンプルの処理は多くの問題をもたらす。即ち、もし血液細胞の計数を必要とするのであれば、分析すべき資料を保持する毛細管もしくは他の容器内の全体積を分析する必要がある。もし分析装置が容器の精密な寸法に対して較正されていなければ、容器の側上の血液細胞を検出することは困難になる。例えば、Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ  の米国特許第  ５，０７２，３８２号においては、血液のサンプルはスライドに付着させられる。分析すべき領域は走査装置内で同期パルスによって限定される（  Ｋａｍｅｎｔｓｋｙの  １４  頁  ４９  −  ６３  行参照）  。毛細管もしくはキュベットのような血液サンプルの容器の形状には変動があり、またこれらの容器を走査機構内に取付けるマウントの整列にも変動があるために走査機構内の同期パルスをこれらの容器と精密に整列させることはできない。容器を精密に取付け、製造する能力は極めて高度な技術であることは明白である。しかしながら、細胞を処理するために容器を走査するには、ミクロン単位の分解能を必要とする。
【０００６】
目標細胞をマークするために使用される色素（もしくは染料）の特性の故に付加的な問題が発生する。例えば、指定された抗体の有無を調べるために細胞を分析する場合、励起ビームに応答して特定のスペクトルの蛍光を発する色素で細胞にタグ付けすることが一般的である。もし２以上の抗体を検出するのであれば、２以上の色素が使用される。しかしながら、種々の色素の蛍光スペクトルが重なり合う可能性がある。従って、複数の色素によって生成された重なり合ったスペクトルを有する検出された蛍光内の情報を完全に処理することは困難である。
更に、統計的な有効計数を求めるために、ある容積内の特定数の目標細胞を計数する必要がある場合、比較的大量のサンプルを使用しなければならない。ミクロン単位で走査する場合、大量の血液サンプルは莫大な量のデータを生成する可能性がある。実際の分析装置にとって、データを合理的な時間内に処理することが重要である。例えば上記相互参照出願に記載されているように、サンプルは２色素の重なり合ったスペクトルと、２チャネルのデータとで走査することができる。各データチャネルは、両色素に関連する情報を含む。更に走査は、それぞれが  ２００  画素の約  １０，０００  走査線を含むので、２，０００，０００  サンプル／チャネルのデータが得られる。２バイト／サンプルの２チャネルでは、これは合計８メガバイトの生データになる。
【０００７】
更に、蛍光監視技術の信号対雑音比は低くなりがちである。従って、特に、結合していない抗体が存在する場合には、容積内の目標細胞を正確に特徴付け、識別するためには、高い背景雑音を有するこれらの大量のデータを処理できることが重要である。
従って、容積血球計数システムからのデータを処理する頑健且つ正確な方法及び装置を提供することが望ましい。更に、このシステムは比較的高速で、且つメモリに対する要求が比較的低いシステムとして動作すべきである。
【０００８】
【発明の概要】
本発明は、（限定するものではないが、容積血球計数システム内の毛細管内の血液を含む）細胞もしくは細胞組成のサンプルを分析する方法及び装置を提供する。本発明によれば、サンプル細胞もしくは細胞組成は１もしくはそれ以上の検出可能な特徴を有する。システムは容器の縁を検出し、容器内の細胞もしくは細胞組成を計数し、容器内の細胞もしくは細胞組成を特徴付け、そして細胞もしくは細胞組成の２以上の検出可能な特徴に関する情報を含むデータのチャネルを評価する。
従って、本発明は、目標細胞もしくは細胞組成を含むサンプルの容器を走査するスキャナを備えている装置であることを特徴とすることができる。データサンプリング回路がスキャナに結合されていて、容器内のサンプルの走査された画像を生成する。一面によれば、スキャナ及びデータサンプリング回路は複数のデータチャネルと、同数の走査された画像を発生する。走査された画像に応答して目標細胞もしくは細胞組成を計数及び／または特徴付けるための資源を含む処理システムがサンプリング回路に結合されている。
【０００９】
これらの処理資源は、一面によれば、細胞もしくは細胞組成の２以上の検出可能な特徴を区別するために、これらの検出可能な特徴に関連する情報を含む走査された画像を処理することが可能である。これらの資源は、２以上の特徴に関連する情報を有する走査された画像と、複数の走査された画像内の別の１つの走査された画像との間の相関分析を遂行するためのソフトウェアを含むことができる。一つの好ましいシステムでは、重なり合ったスペクトルを有する色素からの蛍光データに基づいて２つの走査された画像が生成される。これら２つの走査された画像は、目標細胞に近い走査された画像内の対応画素の間で線形回帰分析を使用して処理され、目標細胞もしくは細胞組成内の２つの蛍光色素の相対含有率が特徴付けられる。
本発明の別の面によれば、近隣内のピーク画素を識別し、このピークの振幅と近傍の周辺画素の振幅とを比較する処理資源を使用して、目標細胞もしくは細胞組成を走査された画像から識別する。もしピーク画素値が周辺画素値を所定のしきい値より大きく超えれば、資源はその近傍が目標細胞を含むものとして特徴付ける。このようにして目標細胞が識別されると、識別された細胞に対応する複数の走査された画像からのデータのセグメントは、上述した線形回帰分析のようなさらなる分析のために保管することができる。
【００１０】
更に、本発明の別の面によれば、走査された画像に対する２以上の色素の相対的な貢献度を決定する他に、複数の走査された画像からのデータの識別されたセグメントを目標細胞もしくは細胞組成の予測される特性に基づいて濾過することによって、目標細胞もしくは細胞組成の蛍光強度を表すパラメタが決定される。例えば本発明の１つの新規な面では、セグメントは走査された画像内の識別された各セグメント毎に画素の近傍を限定する（この近傍は目標細胞の予測される大きさよりも大きい）ことによって濾過される。この近傍内の画素は背景雑音を補償するために処理され、この近傍内の画素値のみに基づいてこの近傍内の目標細胞の強度値が生成される。例えばこの処理は、ある細胞の近傍の強度値に、典型的な細胞の予測される強度プロファイルを表す一組の値を乗ずる整合フィルタを含んでいる。得られた積は合計され、その細胞の信号対雑音比を最適化する振幅推定が求められる。近傍の周辺は、その近傍内の目標細胞もしくは細胞組成の予測される形状に基づいて決定される。
本発明の更に別の面によれば、処理資源は縁検出を遂行し、容器の検出された縁の外側の走査された画像の貢献度は無視される。
【００１１】
好ましいシステムでは、細胞もしくは細胞組成は、２つの色素の重なり合った蛍光スペクトルから生成された細胞の２つの走査された画像間の目標細胞のために限定された近傍を線形回帰解析して決定される勾配値を使用して特徴付けられる。線形回帰分析を使用して“勾配値”が各目標細胞毎に決定される。この勾配値には、走査された画像の１つの近傍の強度値が乗ぜられて分析座標が求められる。細胞もしくは細胞組成は、特徴付けグラフ上の分析座標の位置に基づいて特徴付けられる。特徴付けグラフは、１つの色素を有する目標細胞もしくは細胞組成が入るべき第１の領域と、第２の色素を有する目標細胞もしくは細胞組成が入るべき第２の領域と、両色素で染色された目標細胞もしくは細胞組成が入るべき第３の領域とによって限定される。これらの領域は、信号の雑音に対する免除性と、より正確な特徴付けの目的のために、走査された画像の背景信号特性に基づいて限定される。
本発明は、上述したような容器内のサンプルを分析する方法としても特徴付けることができる。本方法は、
検出器を用いて資料を走査して複数のデータのチャネルを生成させ、少なくとも１つのチャネルが目標細胞もしくは細胞組成の２以上の複数の検出可能な特徴に関連する情報を含むようにする段階と、
複数のデータのチャネルをサンプリングしてサンプルの複数の走査された画像を発生する段階と、
複数の走査された画像を分析し、複数のデータのチャネルに応答して目標細胞もしくは細胞組成を特徴付ける段階と
を備え、上記分析段階は、
２以上の特徴に関連する情報を含む１つのチャネルに対応する走査された画像を処理してこれらの検出可能な特徴を区別する段階と、複数の走査された画像の少なくとも１つを処理して目標細胞もしくは細胞組成を含む複数の走査された画像内のセグメントを識別する段階と、目標細胞もしくは細胞組成の予測される特徴に基づいてデータの識別されたセグメントを濾過して識別されたセグメントのためのそれぞれの強度値を生成する段階と、複数の走査された画像の少なくとも１つ内の強度値とデータのセグメントの２つの走査された画像の間の相関分析（線形回帰解析における勾配のような）に基づく値とに基づいて目標細胞もしくは細胞組成を特徴付ける段階とを含む。
【００１２】
本システムは、走査された画像の少なくとも１つを分析して容器の縁を検出する段階と、検出された縁の外側に見出されたデータを無視する段階をも含むことができる。更に、データの特定セグメントのための強度値を特徴付けるプロセスは、各識別されたセグメント毎に画素の近傍（この近傍は目標細胞の予測される大きさよりも大きい）を限定する段階と、この近傍内の画素を処理して背景信号を補償し、この近傍内の目標細胞もしくは細胞組成のための強度値を生成する段階を含むことができる。
本発明の他の面及び長所は、添付図面に基づく以下の説明から明白になるであろう。
【００１３】
【実施例】
本発明の好ましい実施例を、添付図面に基づいて以下に詳細に説明する。図１及び２は、本発明のハードウェア環境を示す。図３−１４は、本発明により目標細胞もしくは細胞組成を計数し、特徴付けるために使用される処理資源を説明する図である。
図１に示すように、容積毛細管血球計数装置が提供される。装置は、既知の容積を有する毛細管１０内の資料を処理するように設計されている。好ましいシステムでは、毛細管は断面が矩形であり、幅は約  ０．４  ｍｍ  乃至  １．５  ｍｍ  であり、長さは約  ４０  ｍｍであり、深さは約  ２５  乃至  ２２５    ミクロン（一実施例では  １００    ミクロン）  である。この毛細管は、種々の細胞もしくは細胞組成を検出もしくは特徴付けるのに適している。一実施例では、この毛細管が、ＣＤ３及びＣＤ４抗体の濃度を決定するＣＤ３／ＣＤ４アッセイ（  ａｓｓａｙ）の特徴付けのために使用される。この型のアッセイでは、典型的に３つの集団（  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ）、即ちＣｙ５でラベル付けされた抗体だけで染色されたＣＤ３陽細胞、Ｃｙ５でラベル付けされたＣＤ３抗体及びＣｙＦｒでラベル付けされたＣＤ４抗体の両方で染色されたＣＤ４細胞が存在する。単核細胞はＣｙＦｒでラベル付けされたＣＤ４抗体だけで染色される。このアッセイにおける関心細胞は直径が約  １０  ミクロンであり、前述した寸法の毛細管を使用して良好に分類されることが分かった。本発明がＣＤ３／ＣＤ４アッセイの特徴付けに限定されるものではないことを理解されたい。
【００１４】
本発明を使用する有用な一方法によれば、全体が凝固していない血液のような生物流体を、所与の波長で励起可能な蛍光担体（  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含む過大量の結合剤と反応させることができる。蛍光でラベル付けされた結合剤は、サンプル内に存在する結合サイト（  ｓｉｔｅ  ）と反応するように選択される。例えば、若干の白血球血液下位分類上に存在するＣＤ４細胞表面マーカに導かれた蛍光でラベル付けされた抗体は、全血液のサンプルと反応する。ラベル付けされた結合剤及び結合サイト、即ちこの例ではラベル付けされた抗ＣＤ４抗体及びＣＤ４担持白血球の表面は、本発明の装置と共に使用した場合に信号を放出する蛍光複合体を形成する。
流体サンプルとラベル付けされた結合剤とを反応させた後に、それは希釈されて毛細管１０内へ導かれる。本発明の方法を実行する際の何れの点においても、生物流体の成分の処理、もしくは結合された及び結合されていない結合剤の分離は最小で済む。光学走査は容積手法でサンプルに対して遂行され、また蛍光放出は照射された各柱状領域から順次に記録される。
蛍光放出は、結合剤・結合サイト複合体の両方から、及び自由結合剤から発生するが、背景レベルに対してより強い信号は、結合剤が群れている領域（即ち、結合剤が導かれる結合サイトを細胞もしくは細胞組成が呈する領域）から到来する。従って強められた蛍光の信号は細胞もしくは細胞組成に対応し、そのように記録される。上例においては、抗ＣＤ４抗体をラベル付けする蛍光担体が励起されると蛍光が放出され、ＣＤ４抗体を表す白血球の存在を意味する事象として記録される。
【００１５】
毛細管の長さ方向走査の開始点及び終了点に注目し、それらの間の増分ステップを測定することによって、所望の応用に依存する目録（  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を絶対容積で発生させることができる。固定された精密な容積内の全ての蛍光目標のこの数量表示は、詳細な集団データを迅速に得る有力な方法である。
異なる波長で活動する蛍光担体を異なる結合サイトに導かれる結合剤と混合することができるので、サンプル内に多くの反応部分（  ｍｏｉｅｔｙ  ）が存在することを検出することができる。走査された毛細管の容積が精密に知られていることから、迅速な読みによって、サンプル内に存在する単位容積当たりの特定下位分類の細胞もしくは細胞組成の数が識別される。この方法は、全サンプルを細胞表面抗原に導かれる異なって励起可能な蛍光でラベル付けされた抗体と反応させることによって、所与の体積の血液サンプルの単核細胞顆粒性白血球もしくはリンパ球部分集合を迅速に区別し、一覧表にすることができる。Ｔ細胞白血球はＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８へ導くことができる。光学システムは単に各蛍光担体をその重要波長で励起するようにセットされるだけであり、各蛍光担体の放出波長に対応して検出チャネルが作られる。代替として、精密な容積を計数することなく比を求めることができる（例えばこれは、エイズの進行を決定する上で重要なＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞比を求めるための迅速技術である）。
【００１６】
本発明の技術を使用して全体が凝固していない血液内の白血球下位分類を決定するためにアッセイを遂行する場合、反応してないサンプルを毛細管内へ配置してから、赤血球が毛細管の底に沈殿し、それに伴って白血球が変位してサンプル内に存在する多数の赤血球の自然密度を光学走査できるようになるまでに２乃至３分間待機する。この自然浮揚効果によって白血球は毛細管の上側部分付近に位置し、蛍光検出を援助するようになる。それは本発明が上下の走査ジオメトリを有しているからである。この効果の故に、目標の偶然の一致（  ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）も無視できるようになる。
スキャナは、経路１２に沿ってレーザビームを生成するヘリウム・ネオンレーザ（図示のもの）、イオンレーザ、半導体レーザ等々のようなレーザ１１の使用に基づいている。レーザ１１は  ６００    乃至  １０００  ｎｍ  の範囲のビームを放出することが好ましい。経路１２に沿うレーザビームはビームスプリッタ１３を通過し、ビームの一部はレーザ出力パワーを監視するパワーメータ１４へ偏向される。主ビームはビームスプリッタ１３を通過し、レーザ１１が生成する関心波長を選択する狭い線フィルタ１５に達する。次に、フィルタ１５を通過したビームはダイクロイックビームスプリッタ１６に達する。ダイクロイックビームスプリッタ１６はレーザからの選択された出力をステアリングミラー１７へ偏向させる。ステアリングミラー１７はこのビームを屈折鏡もしくはプリズム１８へ偏向させる。屈折鏡もしくはプリズム１８からのビームはスキャナ１９へ導かれる。
【００１７】
スキャナ１９は、サンプル毛細管１０を横切って横方向及び長手方向にレーザビームを走査させることができる。スキャナ組立体は、約 20 乃至 200 Hz のような高速で前後に数度（ピーク・トゥ・ピークで６− 12 °）回転するガルバノメータに取付けられた鏡３を含む。ビームはガルバノメータに取付けられた鏡３によって偏向され、第１のレンズ２２、第２のレンズ２３及びレンズ２４を通って毛細管１０に到達する。２つのレンズ２２及び２３は共焦点であるように（即ちそれらが光路に沿ってそれらの焦点距離だけ分離し、それらが等しい焦点距離を有しているように）設計されている。レンズを共焦点にする必要はないが、それらは重なり合った焦平面を有していなければならない。同様にレンズ２３と顕微鏡の対物レンズ２５との間の距離は、ビームがガルバノメータに取付けられた鏡３によって回転された時、ビームが顕微鏡対物レンズの直前の仮想点を中心として回転して見えるように、精密に制御されなければならない。破線３９で示してあるように、走査組立体即ちスキャナ１９は約 40 mm の距離にわたって毛細管１０に沿って長手方向に運動するように設計されている。本発明の特定応用に適当な他の種々のスキャナ機構を使用しても差し支えない。
【００１８】
スキャナ組立体１９全体は、線３６によって示してあるようにコンピュータ４０によって制御される。毛細管１０の外壁に衝突するビームは壁を横切ってサンプルの柱状領域を照射し、サンプルから蛍光を放出させる。光の収集は、照射後に行われる。放出された蛍光は顕微鏡対物レンズ２４によって収集され、戻りビームとして導かれる。顕微鏡対物レンズ２５は、入射ビームを通過させて毛細管１０を通る入射ビームの焦点深度を均一にする中央部分を有している。蛍光放出は極めて広い角度にわたっているから、蛍光収集は顕微鏡対物レンズ２５のより広い部分を通して行われる。
レーザ１１が生成した励起ビームに応答して色素が放出する蛍光は、スキャナ１９、プリズム１８、ステアリングミラー１７を通る光路を逆戻りしてダイクロイックビームスプリッタ１６に到達する。蛍光は顕微鏡対物レンズ２５の焦点から到来し、顕微鏡対物レンズ２５から出てくる時には約８ mm の直径を有するように平行化されている。ダイクロイックビームスプリッタ１６は蛍光波長を経路２６に沿って進行させることができる。
【００１９】
経路２６上のビームは、帯域通過フィルタ２７（もしくは一連の帯域通過フィルタ）に入る。帯域通過フィルタ２７は、光学要素及び毛細管の表面からの弱い反射を原因とするレーザビーム自体の後方散乱を濾過するように設計されている。これらの反射は、サンプルから検出される実際の蛍光よりも遙かに強くなり得る。
帯域通過フィルタ２７からのビームは屈折鏡２８によって合焦レンズ２９へ導かれる。合焦レンズはサンプルからの平行化された光を合焦させ、ピンホールフィルタ３０を通過させる。顕微鏡対物レンズ２４の焦点の外側で発生した毛細管からの光は、それがレンズ２９に入っても柱状化されない。従ってピンホールフィルタ３０は関心がない領域からの蛍光を排除する。ピンホールの大きさは、サンプルから蛍光強度を収集する容積を限定するように選択される。典型的には、この容積は、目標細胞の予測される容積の約５乃至  １０  倍になるように選択される。
ピンホールフィルタ３０を通ったビームは光電子増倍管箱３１に入る。光電子増倍管箱は、検出された蛍光を２つの基本成分に分離するダイクロイックビームスプリッタ３２を含む。この実施例では、第１の成分であるチャネル０は約  ６８０  ｎｍ  より下の波長を有する光である。第２の成分であるチャネル１は約  ６８０  ｎｍ  より上の波長を有する光である。チャネル０は第１の光電子増倍管３３に導かれる。チャネル１は第２の光電子増倍管３４に導かれる。これらの光電子増倍管は線３５を通してコンピュータ４０に接続されている。
【００２０】
図示していないが、この機構内には自動焦点機構も含まれている。自動焦点機構は、予備走査において蛍光を測定することを含むアルゴリズムを使用する。毛細管の第１の位置において、顕微鏡対物レンズ焦点は最大蛍光の位置を見出すように走査される。この値が記憶され、対物レンズは毛細管の第２の位置に移動される。再度この位置における焦点が最大蛍光の位置を見出すように走査される。この値が記憶される。これら２つの値を走査の開始点及び終了点として使用し、顕微鏡焦点がこれら２つの間で線形に補外され、長さに沿う蛍光の読みが最適化される。更に、各走査線の長さが、毛細管の内部の幅よりも僅かに大きくセットされる。これは毛細管寸法を過走査することによって全細胞を検出し、後刻毛細管の縁を検出して無関係な情報を濾過できるようにするために行われるのである。
図２に、コンピュータ４０内の処理資源の概要を示す。コンピュータ４０はシステムバス４２を通して結合されているＣＰＵ  ４１を含む。システムバス４２上には、公知のようにキーボード４３、ディスクドライブ４４もしくは他の非揮発性メモリシステム、表示装置４５、その他の周辺装置４６が接続されている。バス４２には、プログラムメモリ４７及びデータメモリ４８も接続されている。光電子増倍管の出力、チャネル０及びチャネル１はそれぞれ線３５−０及び３５−１を通してアナログ・デジタル変換器４９−０及び４９−１に供給される。アナログ・デジタル変換器の出力は、チャネル０及び１からのアナログ信号の  １６  ビット画素値である。これらの値は画素値を転送する直接メモリアクセス（ＤＭＡ）回路５０を通してデータメモリ４８内へ供給される。
【００２１】
コンピュータ４０は、チャネル０及び１のデータの走査された画像を記憶する資源、データの処理中に使用されるバッファ、細胞もしくは細胞組成が探知、特徴付け及び／もしくは分類されると細胞データを記憶するメモリを含む。同様にプログラムメモリ４７は、毛細管の縁を検出し、走査された画像内の目標細胞もしくは細胞組成を計数して探知し、目標細胞もしくは細胞組成を特徴付け、そして結果を報告する資源を含んでいる。コンピュータ４０内の処理資源の詳細に関しては、図３−１４の流れ図及びグラフを参照して後述する。これらの処理資源は、本発明の特定用途に適するようにハードウェア、ソフトウェア、もしくは両者の組合せによって実現できることは明白である。
図３は、毛細管からデータを収集するために使用される走査技術を示す。図３に示すように、毛細管１０の幅は約  ０．６６７  ｍｍ  であり長さは約  ４０  ｍｍ  である。ガルバノメータ走査システムは、毛細管１０の幅よりも長い線上のトラック１に沿ってレーザビームを走査させる。走査線１の終わりに、ビームは走査線２の始まりまで跳ね返って走査線２を走査する。走査線１と２の中心間の距離は、本実施例では約４ミクロンである。
【００２２】
幅が約  ０．６６７  ｍｍ  の毛細管の場合には、走査線の長さは約  ０．８  ｍｍ  である。これは各走査線に沿って  ２００    の４ミクロンのサンプルを供給する。毛細管の長さが  ４０  ｍｍ    であり、走査線が４ミクロンだけ離間している場合には、各血液サンプル毎に約  １０，０００  の走査線が収集される。
アナログ・デジタル変換器は走査されたデータを約４ミクロン×４ミクロンの寸法を有するスポットで蛍光を表す画素値を作成するレートでサンプルする。図４は画素の７×７近傍を示す。右上隅の画素は行１、列７である。画素の近傍の中心には行４、列４の画素が見出される。同様に右下隅の画素は行７、列７である。図４には、サンプル寸法に対するレーザスポットの大きさも示してある。好ましい実施例では、レーザスポット（例えば５１）の直径は約  １０  ミクロンである。従って過サンプリングが発生する。即ち、レーザスポット５１は行７、列１の画素のために直径  １０  ミクロンの領域を励起する。行６、列１においては第２のスポット５２が直径  １０  ミクロンの領域を照射するが、これは行７、列１のためのスポット５１と実質的に重なり合う。同様に、行７、列２のためのスポット５３は列１のためのスポット５１及びスポット５２と実質的に重なり合う。
【００２３】
図５は、本発明のチャネルの１つを用いて生成された走査された画像の一部を示している。図５のグラフはベースライン減算表示であり、ベースラインは６０で示されている。ベースラインは本質的に、走査領域内の全ての走査線の平均高さである。この値を減算すると多くのピーク、例えばピーク６１を走査された画像内に見出すことができる。これらのピークは典型的に目標細胞に対応し、後述するように処理される。また、各走査は全体を６２で示す領域と、全体を６３で示す領域とを含み、これらは毛細管の外側を表している。ベースライン６０は毛細管の縁を限定するのに使用することができる。それは６４及び６５で示されている急激な落ち込みが毛細管の縁に対応するからである。細胞を特徴付ける処理資源は、検出された縁の外側の画素値を無視する。
前述したように、本発明によれば２チャネルが検出される。図５は単一のチャネルを示している。同じようなプロファイルを有する第２のチャネルからの対応する走査された画像が存在するのであるが、第２のチャネル内で検出された蛍光の大きさに依存してピークの振幅は異なっている。また若干のピークは一方の画像には見出すことができるが、他方の画像には見出されないことがある。
【００２４】
処理資源が実行する基本処理段階を図６及び７に示す。図６の第１の段階は、チャネル０及びチャネル１からデータを受けることである（ブロック１００）。データを受けると、ＤＭＡ回路はそれをデータメモリ内のバッファ内へロードする（ブロック１０１）。バッファは、循環バッファもしくは他のデータ構造とし、受けつつあるデータの量を追跡するために使用することができる。次いでアルゴリズムは、予め指定されたサイズを有するデータのブロックを受けたか否かを決定する（ブロック１０２）。例えば、約  １００  乃至  １５０  の走査線によって適当なブロックサイズを構成することができる。もしブロックが未だに完全に受けられていなければ、アルゴリズムは血液サンプルからの最後のブロックを受けたか否かを決定する（ブロック１０３）。もし受けていれば、アルゴリズムは完了する（ブロック１０４）。もし受けていなければ、アルゴリズムはブロック１０１へループバックしてバッファ内へのデータのロードを継続する。
ブロック１０２において完全ブロックを受けたことを検出すると、アルゴリズムはそのデータを、第１のチャネルのラスタ画像ファイルＩｍ０と、また第２のチャネルのラスタ画像ファイルＩｍ１とに分割することによってそのデータを複数の走査された画像にパーズする（ブロック１０５）。
【００２５】
データの事前処理は、ブロック内のデータを読み込んで処理することを含む。信号処理には符号付き数が必要であるから、符号が付いていない  １６  ビットのデータは  １５  ビットの符号付きデータに変換される。
次に、２つの走査された画像Ｉｍ０及びＩｍ１を合計、もしくは平均して複合画像Ｉｍ２を生成させ、この複合画像Ｉｍ２を記憶する（ブロック１０６）。
次に、図１２を参照して後述するような縁検出アルゴリズムを実行する（ブロック１０７）。縁検出アルゴリズムは、毛細管内の泡によって検出され得るような偽の縁を検出しないように、結果を評価するアルゴリズムで補足することができる。
縁検出は、あるしきい値よりも高いピークを有する走査を無視するために、ベースラインプロファイル（ベースラインは、ブロック内の全ての走査の平均である）を使用して行われる。
ブロック１０７の後に、アルゴリズムは図７のブロック１０８へ進んで複合画像Ｉｍ２内の粒子検出に使用されるしきい値を決定する。これらのしきい値は、予め指定された、経験に基づいて決定された値であっても、または各バッファもしくは各サンプル毎に適応するように計算された値であってもよい。しきい値を決定するための一つのアルゴリズムは、処理中のブロック内の各７×７画素近傍毎に最大値及び最小値を決定することを含むことができる。最高頻度で発生する最大値マイナス（−）最小値を使用して粒子検出のためのしきい値を推定する。バッファ内の近傍のピークの最大及び最小の分布を決定し、もし近傍内の最大値及び最小値が、平均ピーク高さより３標準偏差低いしきい値よりも小さい量だけ異なっていれば、これらのピークが検出されるようにしきい値をセットする。
【００２６】
ブロック１０８において粒子検出のためのしきい値を決定した後に、アルゴリズムは図１１を参照して説明するようなアルゴリズムを使用して、走査された画像Ｉｍ０及びＩｍ１の背景指標を計算する（ブロック１０９）。背景指標を計算した後に、アルゴリズムは走査された画像Ｉｍ０及びＩｍ１に対するベースライン減算を遂行する（ブロック１１０）。この段階は、後述する粒子検出及び細胞特徴付けに使用される技術に依存して任意選択的である。
ベースラインを除去する一つの技術は、所与の走査に沿う最小Ｎ（Ｎは約  １０  ）個の最低点の最小もしくは平均を見出すことを含む。この最小もしくは平均をブロック内の全ての画素から減算し、負の値を０にクリップする。ベースライン除去は任意選択である。即ち、もし細胞検出のために後述するようにピーク勾配基準を使用するのであれば、ベースラインを除去する必要はない。しかしながら過走査状況において縁効果を排除するためにはベースライン減算を行った方が望ましいであろう。
画像Ｉｍ０及びＩｍ１に対してベースライン減算を行った後に、アルゴリズムは画像Ｉｍ２を使用して粒子検出ルーチンを実行する（ブロック１１１）。粒子検出プロセスに関しては図１３を参照して後述する。
【００２７】
次のブロック１１２は、粒子が検出されたか否かを決定する。もし粒子が検出されれば、画像Ｉｍ０、Ｉｍ１、及び任意選択的にＩｍ２から画素の近傍を保管し、例えば保管した近傍に応答して、画素写像の近傍内のデータを使用して細胞パラメタを計算する（ブロック１１３）。もし粒子が検出されなければ、アルゴリズムは粒子検出のためにＩｍ２バッファが完全に処理されたか否かを決定する（ブロック１１４）。もし完了していなければ、アルゴリズムはブロック１１１へループバックして粒子検出ルーチンを継続する。もしバッファの処理が完了していれば、アルゴリズムは図６のブロック１０２へ戻って次のデータのブロックを処理し始める。
生データは、例えば各チャネル０及びチャネル１のための２つの  ２００×Ｎ（Ｎは  １０，０００  に等しいか、もしくは小さい）ラスタ画像ファイルからなり、各画素はアナログ・デジタル変換器の出力によって生成された  １６  ビットの符号付きではない整数である。画像データはブロックで処理することができる。画像ブロックの境界における走査線に関連するデータは、画像ブロック境界を横切る細胞を処理するために緩衝することができる。
【００２８】
データブロックサイズは  ２００    画素高さ×Ｎ走査幅である（Ｎは約  １２８  である）。緩衝されるブロックサイズは、ブロック境界上で  ２００×  １６  画素であってよい。ブロックで画像を処理することによって、画像処理のために使用するメモリ資源は少なくて済む。
粒子が検出されるにつれて各ブロック毎に走査された画像から近傍値を保管し、次いで付加的なブロックの処理を継続する技術は、細胞パラメタを計算して後刻細胞を特徴付ける能力を使用するか、もしくは時分割処理技術を使用して実時間でのデータの収集と、細胞もしくは細胞組成検出とを可能にする。これは計算資源の使用効率を大いに高め、実質的に実時間で極めて大量の走査されたデータのサンプリングを可能にする。
本発明の好ましい実施例によれば、細胞もしくは細胞組成の特徴付けは２つのチャネルからの情報を使用することを含む。本システムの２つのチャネルは、検出すべき両色素に関連のあるデータを含む。従って、２つのチャネル内の２つの色素からの情報を弁別するために、効率的で雑音を伴わない技術を使用しなければならない。従って、本発明の一つの面では、検出された粒子に関して保管された画素の近傍に対して線形回帰技術を適用する。
【００２９】
解消すべき問題は、チャネル０及びチャネル１によってそれぞれ検出された２つの色素の蛍光のスペクトルを示す図８から明白であろう。即ち、第１の色素によって染色された抗原を含む細胞は、スペクトル１２０のようなスペクトルの蛍光を発する。同様に、第２の型の抗原に付着した色素を有する細胞は、スペクトル１２１の蛍光を発する。図示のように２つのスペクトルは実質的に重なり合っている。図１に示した光電子増倍管箱３１内のダイクロイックビームスプリッタ３２は、  ６８０  ｎｍ  線１２２に沿って蛍光ビームをスプリットして２つの信号を生成する。この線は、説明中のシステムにおいて良好な分離が得られるように経験に基づいて決定されたものである。従って、２つの信号は共に、両色素に応答して生成された情報を含んでいる。
２つのチャネル内の情報を弁別するために使用される線形回帰技術を、図８を参照して説明する。即ち、７×７の画素の近傍は、図６及び７のアルゴリズムを使用して検出される各目標細胞を中心として各画像Ｉｍ０及びＩｍ１から保管される。  ４９  座標を図９に示すようにプロットすることができる。ここに、各ドットは、第１のチャネルの振幅をＸ軸に沿って、及び第２のチャネルの振幅をＹ軸に沿って位置決めしたものである。例えば、行１、列１のサンプル、及び行７、列７のサンプルは点（１，１）及び（７，７）に示されている。同様に、行４、列４のサンプルを点（４，４）に示すことができる。図から明白なように、行４、列４のサンプルの平均振幅は、細胞分類技術によって両チャネルで最高の値を有している。これらのドットに公知の線形回帰アルゴリズムを適用し、ドットプロットに対する最良適合線を見出す（  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｉｎ  Ｃ，  １９８８，  ｐ．  ５２３  参照）。これは各目標細胞毎の勾配“ｍ”及びオフセット“ａ”を発生する。従って、チャネル０の貢献度の大きさは、勾配“ｍ”にチャネル１の貢献度の大きさを乗じ、オフセット値“ａ”を加算して表すことができる。
【００３０】
図１０は、検出された細胞を特徴付けるために使用される技術を説明するグラフである。即ち検出された細胞のための強度値を、それぞれの７×７近傍内で、走査された画像Ｉｍ１では〔Ｃｈ１〕と定義し、走査された画像Ｉｍ０では〔Ｃｈ０〕と定義する。この強度値は７×７近傍の目標細胞の予測される特徴に基づく整合濾過技術によって決定される。
整合フィルタは、細胞の近傍内の予測される、もしくは典型的な画素値から構成することができる。整合フィルタは、係数の行列（もしくはマトリクス）であり、これらは検出された細胞の近傍の対応画素に乗ぜられる。得られた  ４９  の積を合計すると、検出された細胞のための単一の強度値（〔Ｃｈ０〕もしくは〔Ｃｈ１〕）を求めることができる。これらの係数は合計すると０になるように選択することができ、このようにすると一定の背景信号が打ち消される。
次いで、上述した線形回帰分析を使用して決定された勾配に、一方のチャネルの強度値を乗ずることによって、細胞のための強度値を図１０のグラフ上にプロットする。
図１０に示すように、このグラフは５つの領域に分かれる。第１の領域１３０は、実質的にチャネル１内に中心を有する第１の色素だけによって着色された目標細胞のためのものである。第２の領域１３１は、実質的に第２の色素だけによって着色された目標細胞に関する。第３の領域１３２は、両色素で染色されたと考えられる細胞に関する。第４の領域１３３及び第５の領域１３５は、不良データを無視するための“ノーコール”（  ｎｏ  ｃａｌｌ）領域である。
【００３１】
第１の領域１３０は、第１の色素だけを用いて着色されたサンプルを走査することによって装置を較正する時に限定される。チャネル１から１つの色素を検出することによって線１３６を求めるために、線形回帰分析が適用される。同じ技術を使用して、チャネル０によってそのスペクトルの殆どが検出される第２の色素のための線１３７が限定される。当該バッファに関する背景指標が計算され、破線１３８及び１３９によって示されている領域が限定される。チャネル１に関しては破線１３８より下、またチャネル０に関しては破線１３９より上においてはサンプルは１つの色素だけを有しているものと特徴付けられる。領域１３２内に入るサンプルは両方を有しているものと特徴付けられる。領域１３３及び１３５内に入るか、もしくは振幅値が低過ぎるサンプルは、ノーコールとして特徴付けられる。
以下の表は、このような分類を達成するために使用することができる処理資源の例を提供する手段としての、本発明の一実施例による細胞特徴付けルーチンのための原始コードである。
0003591911.tif 000002
細胞もしくは細胞組成分類の目的は、集団とは無関係なパラメタに基づいて決定（  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ）境界を決定することである。もし必要ならば、これらの決定された境界を集団統計を用いて検査することができる。
【００３２】
ＣＤ３／ＣＤ４アッセイには３つの細胞集団が存在する。ＣＤ３陽細胞は、Ｃｙ５ラベル付けされた抗体だけで染色されている。ＣＤ４細胞は、Ｃｙ５ラベル付けされたＣＤ３抗体と、ＣｙＦｒラベル付けされたＣＤ４抗体の両方で染色されている。単核細胞は、ＣｙＦｒラベル付けされたＣＤ４抗体だけで染色されている。
ＣＤ３陽細胞及び単核細胞は１つの色素だけで染色されているから、それらの勾配分布はそれぞれＣｙ５及びＣｙＦｒ勾配の周囲に群れる筈である。Ｃｙ５及びＣｙＦｒ勾配は補償行列較正で決定される。群れ（もしくはクラスタ）の広がりもしくは分布は、背景雑音推定から決定することができる。
同様に、ＣＤ３／ＣＤ８アッセイには３つの細胞集団が存在する。ＣＤ３陽細胞は、Ｃｙ５ラベル付けされたた抗体だけで染色されている。ＣＤ８細胞は、Ｃｙ５のラベル付けされたＣＤ３抗体と、ＣｙＦｒラベル付けされたＣＤ８抗体の両方で染色されている。ＮＫ細胞は、ＣｙＦｒラベル付けされたＣＤ８抗体だけで染色されている。
ＣＤ３陽細胞及びＮＫ細胞は１つの色素だけで染色されているから、それらの勾配分布はそれぞれＣｙ５及びＣｙＦｒ勾配の周囲に群れる筈である。Ｃｙ５及びＣｙＦｒ勾配は補償行列較正で決定される。群れの広がりもしくは分布は、背景雑音推定から決定することができる。
【００３３】
以下の分類規則を適用することができる。
非細胞
もし以下の基準の何れかに合致すれば、粒子は非細胞として分類される。
１．しきい値（  ０．８）より小さい相関関数（面０及び１に対する回帰適合に関し）を有する粒子、
２．背景雑音しきい値より小さいチャネル０値、
３．背景雑音しきい値より小さいチャネル１値。
単核細胞及びＮＫ細胞
１．ＣｙＦｒ勾配線マイナスチャネル１の一定の背景雑音オフセットより大きいチャネル１値を有する細胞。
ＣＤ３細胞
１．Ｃｙ５勾配線プラスチャネル１の一定の背景雑音オフセットより小さいチャネル１値を有する細胞。
ＣＤ４／８細胞
上記基準を満足しない細胞は何れも潜在的にＣＤ４／８細胞である。Ｃｙ５もしくはＣｙＦｒ勾配に近過ぎる細胞は“ノーコール”としてラベル付けされる。ＣｙＦｒ勾配とＣｙ５勾配との勾配差は勾配領域に分割される。領域境界の  １０  ％より下で  ９０  ％より上の細胞はノーコールとして分類される。
【００３４】
線形回帰分析からの勾配値を使用すると雑音の影響を受けなくなり、システムの頑健さが改善される。この分析は、それぞれがチャネル０及びチャネル１の強度値に基づく２つの未知数を有する２つの方程式を解くことによって置換することができる。
画像０及び画像１からの対応する画素間の相互相関係数が決定される。もし信号が優勢なランダム雑音であれば、相関係数は貧弱であることが予測される。良好な信号を有する細胞は  ０．９    乃至  １．０    の範囲の相関を与える。
相互相関技術は、平均細胞プロファイルを有する個々の細胞を相関させるように拡張することができる。複合平均細胞プロファイルは、検出された全ての細胞の細胞プロファイルを平均することによって生成することができる。良好な相関係数は、細胞形状が平均細胞形状に類似していることを表す。アーチファクトピークは一般に異なる細胞形状を有しており、従ってより貧弱な相互相関係数を与える。
図１１は、図１０を参照して説明したように使用した背景雑音指標を計算して２つの色素の線の周囲の領域（これらの領域内で細胞がその色素だけを含むものと特徴付けられる）を限定するためのアルゴリズムを示す。
【００３５】
この背景指標は、各バッファ毎に計算することも、もしくは画像全体にまたがって計算することもできる。
この技術は、Ｎ背景ベースライン雑音レベルに対して複数のビン（  ｂｉｎ）を限定することを含む（ブロック２００）。但し、一実施例ではＮは約  ２，０００    であり、各ビンは  １６  ビット幅である。各バッファ毎に、各画素を取り囲むＷ×Ｗ画素写像が限定される。Ｗ×Ｗは、細胞の予測されるサイズからの殆ど全ての信号を含むように十分に大きくする。これは、本例では約５×５であってよい（ブロック２０１）。
各Ｗ×Ｗ画素写像毎に、画像Ｉｍ１及びＩｍ０内の各画素毎の最大画素値及び最小画素値が決定される（ブロック２０２）。
次いで各画素に整数ビン番号が割当てられる。この割当ては、画素写像内の最大値と最小値との差を割当てられたビンのサイズで除すことに基づく（ブロック２０３）。前述したように、それぞれが  １６  ビットずつの  ２，０００    ビンが存在するから、合計では約  ３２，０００  の値になる。
整数のビン番号を使用し、対応するビンの計数をその画素に関してインクリメントさせる（ブロック２０４）。ビン番号をインクリメントさせた後、アルゴリズムはバッファ内に処理する画素が未だに存在するか否かを決定する（ブロック２０５）。もし存在すれば、アルゴリズムはブロック２０１へループバックし、存在しなければ、アルゴリズムは最高の計数を有するビン番号を決定する（ブロック２０６）。このバッファのための背景雑音指標が、最高出現を有するビン番号×ビンサイズにセットされる（ブロック２０７）。両チャネルのこれらの指標が記憶される（ブロック２０８）。前述したようにこのプロセスは両チャネルについて遂行され、２つの分離した背景雑音指標が求められる。
【００３６】
図１２に、前述した縁検出を遂行するアルゴリズムを示す。この例の血液サンプルは色素でラベル付けされていない抗体を含むので、独特な背景信号がもたらされる。この信号は毛細管の管腔の境界を探知するために使用される。チャネル０及びチャネル１から平均画像１ｍ２が生成される（ブロック３００）。指定された数Ｎの走査を画素毎に平均し、平均走査を発生させる（ブロック３０１）。平均走査から最大値及び最小値を決定する（ブロック３０２）。次に、最大値と最小値とのサンプルに  ０．１    乃至  ０．８  の範囲の係数を乗じてしきい値をセットする。これにより、所与の走査線からの蛍光の平均振幅の百分率であるしきい値が確立される。次いで、ベースライン値が左縁検出のためのしきい値より小さくなるまで、走査の中心から左まで走査線を探索する。しきい値が横切られた位置を左縁としてセットする（ブロック３０４）。同様に、アルゴリズムは右縁検出のためのしきい値を通過するまで走査の中心から右へ探索する。右縁の位置は、しきい値が横切られた位置として限定される（ブロック３０５）。縁検出を使用して検出された縁の外側の走査された画素は、上述した付加的な処理において無視される。
【００３７】
図１３は、細胞もしくは細胞組成を検出するためのアルゴリズムである。細胞検出アルゴリズムは、画像Ｉｍ０及びＩｍ１の平均（もしくは合計、この目的のためには両者は実質的に同一である）に基づく画像Ｉｍ２を使用する（ブロック４００）。次いで、各画素を取り囲む５×５画素写像を順次限定する（ブロック４０１）。この画素写像を試験する。この試験は５段階の試験であり、中心画素が画素写像内の全ての画素の最高の値を有する画素であるか否かを決定する段階を含む。もし諾であれば、試験は中心画素と左上隅画素との差を取り、この差が、細胞もしくは細胞組成検出のために割当てられているしきい値より大きいか否かを決定する。次に、中心画素と右上隅画素とを使用してしきい値決定を行う。次に中心画素と左下隅画素とを使用してしきい値決定を行う。次に中心画素と右下隅画素とを使用してしきい値決定を行う。もし中心画素が最高値を有しており、また写像内の別の画素が等しい値を有していれば、アルゴリズムは試験に合格する。この場合、１つの細胞を２度計数するのを回避するために中心画素値を１だけインクリメントさせるので、高い値を有する他の画素値に遭遇した時に、それが最高値画素ではないことが決定される（ブロック４０２）。
【００３８】
もし上記５つの条件が全て満足されれば（ブロック４０３）、中心画素のｘ及びｙ座標が保管され、中心画素を取り囲む７×７画素写像、即ち近傍が各画像Ｉｍ０及びＩｍ１から細胞パラメタリスト内に保管される（ブロック４０４）。これらの値は、後刻上述したようなデータ処理のために使用することができる。
細胞検出のために平均された（もしくは合計された）画像を使用することにより、所与の細胞上での２つの色素の何れか一方からの信号の振幅が極めて低くなり得るので、より良好な細胞分解能が得られる。この細胞もしくは細胞組成検出は、絶対ピーク値に基づいているのではなく、検出される細胞の周囲の近傍内の最大値及び最小値に基づいているのである。これにより、背景レベルに対する免責を走査領域にわたって変化させることができる。
図１４は、７×７画素写像の線形回帰分析のための基本アルゴリズムである。線形回帰分析は、検出された細胞の７×７画素写像を両画像Ｉｍ０及びＩｍ１から取り込むことから開始される（ブロック５００）。Ｉｍ１（ｉ，ｊ）が勾配×Ｉｍ０（ｉ，ｊ）＋オフセットを近似するように、行ｉ及び列ｊの全ての指標について線形回帰線を画像Ｉｍ０及びＩｍ１からの対応する画素点に適合させる（ブロック５０１）。回帰線を適合させた後、勾配、オフセット及び相関係数ｒ２（適合の良さ）が細胞パラメタリスト内に記憶される（ブロック５０２）。
【００３９】
以上のようにして、線形回帰線適合が画像０及び画像１からの対応する画素間で計算され、勾配及び適合の良さの値が求められる。決定された勾配は、その細胞が２つの抗体の一方で染色されているか否かを表している。勾配を決定するために７×７画素写像を使用すると、細胞の勾配のより良好な推定が得られる。適合の良さはデータの良さを表している。線形回帰分析の長所には、雑音低減、信号の質の良好な推定、ベースライン減算に対するシステムの不感性、及び直交座標の良好な限定が含まれる。
要するに、決定すべき２以上の特性に関連する情報を含み、容器から取り込まれた１もしくはそれ以上のデータのチャネルが生成したデータを処理するための方法及び装置が提供される。この技術により、含まれる領域内の細胞もしくは細胞組成を計数し、特徴付けることが可能になり、操作員のサンプル処理が最小になり、再現性が良好になり、そして処理資源の効率的な利用が可能になる。
データ処理資源は、データ収集、毛細管の縁及び細胞検出操作のための画像平均化、背景雑音決定、ベースライン除去、及び細胞特徴付けを遂行する。
検出された細胞もしくは細胞組成からのデータは、それをメモリ内の細胞パラメタリスト内に保管することによって抽出される。これにより、大量のデータを連続的に走査することができ、より多くの処理資源が使用可能になった時に、保管しておいたデータを取り出してその後の諸段階を処理することができる。またもしその後の分析のために  ２００×１０，０００    画素ファイルの全部を保管しなければならないような場合と比較して遙かに小さいファイルサイズであるために、検出された細胞のデータを将来再分析することも可能になる。
【００４０】
本発明は、走査されたデータを処理するための極めて頑健で、正確なシステムを提供する。このシステムは、データの同時収集及び分析を可能にし、また収集後のデータの分析を可能にする。更にこのシステムは、データ収集完了の直後に極めて迅速にデータ分析を完了させることができる。
以上の本発明の好ましい実施例の説明は、単なる例示に過ぎない。この実施例は本発明を開示した精密な形状に限定するものではない。明らかに、当業者ならば種々の変更及び変化を考案することが可能であろう。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって限定されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるデータ処理システムを有するスキャナ装置の概要図である。
【図２】図１のシステムと組合せて使用されるデータ処理システムのブロック線図である。
【図３】図１のスキャナにおいて使用される走査プロセスを示す概要図である。
【図４】図１のスキャナの出力をサンプリングすることによって生成される走査された画像内のデータの編成を示す図である。
【図５】図１のシステムからの走査された画像を表すプロットである。
【図６】本発明によるシステムの基本データ処理ループの流れ図の一部である。
【図７】図６の流れ図の続きである。
【図８】本発明により分析される２つの色素のスペクトルが重なり合っている様を示す図である。
【図９】本発明による細胞の特徴付けに使用される線形回帰分析を示すグラフである。
【図１０】重なり合った情報を含むデータのチャネルに基づき本発明によって細胞を分類するのに使用される細胞分類グラフである。
【図１１】本発明による背景雑音指標生成の流れ図である。
【図１２】本発明による縁検出プロセスの流れ図である。
【図１３】本発明による細胞検出プロセスの流れ図である。
【図１４】本発明による線形回帰分析プロセスの流れ図である。
【符号の説明】
１０  毛細管
１１  レーザ
１２  レーザビーム経路
１３  ビームスプリッタ
１４  パワーメータ
１５  線フィルタ
１６  ダイクロイックミラー
１７  ステアリングミラー
１８  プリズム
１９  スキャナ
２２  第１のレンズ
２３  第２のレンズ
２４  対物レンズ
２５  鏡
２６  戻りビーム経路
２７  帯域通過フィルタ
２８  屈折鏡
２９  合焦レンズ
３０  ピンホールフィルタ
３１  光電子倍増管箱
３２  ダイクロイックミラー
３３  第１の光電子倍増管
３４  第２の光電子倍増管
３９  スキャナの移動位置
４０  コンピュータ
４１  ＣＰＵ
４２  システムバス
４３  キーボード
４４  ディスクドライブ
４５  表示装置
４６  その他の周辺装置
４７  プログラムメモリ
４８  データメモリ
４９  アナログ・デジタル変換器
５０  ＤＭＡ回路
５１、５２、５３  レーザスポット
６０  ベースライン
６１  ピーク
１２０、１２１  スペクトル
１２２  ６８０ｎｍ線
１２３  最良適合線
【図１】
0003591911.tif 000003
【図２】
0003591911.tif 000004
【図３】
0003591911.tif 000005
【図４】
0003591911.tif 000006
【図５】
0003591911.tif 000007
【図６】
0003591911.tif 000008
【図７】
0003591911.tif 000009
【図８】
0003591911.tif 000010
【図９】
0003591911.tif 000011
【図１０】
0003591911.tif 000012
【図１１】
0003591911.tif 000013
【図１２】
0003591911.tif 000014
【図１３】
0003591911.tif 000015
【図１４】
0003591911.tif 000016