【手続補正書】
【提出日】平成27年8月26日(2015.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
参考例１
菌懸濁液の調製：
第１６改正日本薬局方  一般試験法４．０５  微生物限度試験法に準じて、微生物試験に使用する接種用菌液を調製した。
（試験菌株）
大腸菌（Escherichia coli，以下、ＥＣＯと略す）：IFO No.3972
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus，以下、ＳＡＵと略す）:IFO No.13276
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa，以下、ＰＡＥと略す）：IFO No.13275
バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis，以下、ＢＳＵと略す）：IFO No.3134
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans，以下、ＣＡＬと略す）：IFO No.1594
アスペルギルス・ブラジリエンシス（Aspergillus brasiliensis，以下、ＡＢＲと略す）：NBRC No.9455
クロストリジア（Clostridium sporogenes, 以下、ＣＳＰと略す）：NCTC No.12935
（菌懸濁液の調製）
100mL容の三角フラスコに入れたＳＣＤ培地５０ｍＬに斜面培地保存菌株を１エーゼ（白金耳）接種し、ＥＣＯ、ＳＡＵ、ＰＡＥは３０〜３５℃で、ＣＡＬは２０〜２５℃で培養して、菌懸濁液とした。
ＢＳＵは培養菌液を加熱処理し、栄養細胞を殺滅して胞子懸濁液を調製した。
ＡＢＲはＰＤＡ培地で２０〜２５℃で培養し、良好な胞子形成が認められたら、得られた胞子をかき取り、胞子液を調製した。
（接種用菌液の調製）
これらの菌懸濁液をペプトン食塩緩衝液等で段階希釈し、接種用菌液を調製した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ＨＰ２ＭＧはいずれの含有量でも、良好な回収率を示した。これに対し、ＨＰ２０では、１０質量％では良好な回収率を示したものの、５質量％以下では不十分であった。また、ＨＰ２ＭＧは１０質量％でもハンドリング性は良好であったが、ＨＰ２０は３質量％でもピペット操作が困難であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例４
吸着剤の検討（３）：
ＢＳＵに対して抗菌活性を示すことが確認されている潤腸湯のエキス粉末、二朮湯および大承気湯の漢方エキス顆粒（いずれも株式会社ツムラ製）およびＳＡＵに対して抗菌活性を示すことが確認されている潤腸湯のエキス粉末および大承気湯の漢方エキス顆粒（いずれも株式会社ツムラ製）を生菌数試験の被験試料とした。また、ＥＣＯに対して抗菌活性を示すことが確認されている大柴胡湯、大黄甘草湯、通導散の漢方エキス粉末（いずれも株式会社ツムラ製）を大腸菌試験の被験試料とした。各漢方エキス製剤について、第１６改正日本薬局方  一般試験法４．０５の微生物限度試験法に準じ、生菌数試験及び大腸菌試験を行った。漢方エキス顆粒については、各試料１０ｇを秤取し、表４に示す吸着剤を１０質量％添加したＳＣＤ培地９０ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、３０分間攪拌し、試料液を調製した。これら試料液を分取し、篩を通過させて１０倍希釈の試料液とした。エキス粉末については、各試料５ｇを秤取し、表４に示す吸着剤を１０質量%添加したＳＣＤ培地９５ｍＬに加えた以外は同様にして２０倍希釈の試料液とした。
（生菌数試験）
調製した試料液に、参考例１で調製したＢＳＵもしくはＳＡＵの接種用菌液を接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、攪拌した。攪拌後の試料液をろ過し、ろ液をシャーレに分注して、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内で培養し、ＢＳＵもしくはＳＡＵの集落測定を実施した。実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。
（大腸菌試験）
調製した試料液に、ＥＣＯの接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。これらの結果を表４に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【表６】
2015047106.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
実施例６
添加回収試験（２）：
希釈倍率の添加回収率に対する影響を確認した。ＢＳＵに対して抗菌性があることが確認されている漢方エキス粉末（大黄甘草湯、大承気湯；いずれも、株式会社ツムラ製）を５ｇ秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬまたは１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌して希釈倍率２０倍試料液を得た。同様に、当該漢方エキス粉末をＳＣＤ培地または１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地に３０、５０、および１００倍希釈になるように加え、攪拌して希釈倍率３０、５０、および１００倍試料液を得た。希釈倍率２０、３０、５０、１００倍の各試験区に、参考例１で調製したＢＳＵの接種用菌液を接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、１時間静置した。その後、ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤＢにて調製した試料液は篩を通過させて、各試料液をシャーレに分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内にて培養後、集落測定を行い、実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。結果を表９と図１及び図２に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実施例８ 
特定微生物試験（大腸菌）：
（直接培養法）
大腸菌に対して抗菌活性があることが確認されている漢方エキス粉末（乙字湯、大柴胡湯、 小柴胡湯、加味逍遙散、潤腸湯、桃核承気湯、シャク薬甘草湯、大黄甘草湯、通導散、柴苓湯、茵チン蒿湯；いずれも、株式会社ツムラ製）５ｇを秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、２０倍希釈の試料液を調製した。試料液に参考例１で調製したＥＣＯの接種用菌液を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１１に示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（希釈法）
直接培養法（２０倍希釈）でＥＣＯの発育が認められなかった大黄甘草湯エキス粉末を１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地にて２０倍希釈の試料液を調製した。当該試料液にＥＣＯの接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加した後、２０倍希釈液２０ｍＬを４０ｍＬのＳＣＤ培地に分注して６０倍希釈液とし、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１１に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
実施例９
特定微生物試験（クロストリジア）：
クロストリジアに対して抗菌活性があることが確認されている漢方エキス顆粒（麻黄湯、茵チン蒿湯；いずれも、株式会社ツムラ製）１０ｇを、ＳＣＤ培地９０ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９０ｍＬに加えて攪拌し、１０倍希釈の試料液を調製した。各試料液１０ｍLを９０ｍLの強化クロストリジア培地に接種したのちに、ＣＳＰ菌液（シスメックスビオメリュー社製ＢｉｏＢａｌｌ（登録商標）ＭｕｌｔｉＳｈｏｔ５５０  Clostridium sporogenes NCTC12935）を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で４８時間嫌気的条件下培養した。培養後、培養液をコロンビアカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で４８時間嫌気的条件下培養し、ＣＳＰの発育を確認した。ＣＳＰが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１２に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例１０ 
特定微生物試験（大腸菌）：
大腸菌に対して抗菌活性があることが確認されている生薬（大黄）を５ｇ秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌して希釈倍率２０倍試料液を得た。同様に、生薬（大黄）をＳＣＤ培地または１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地に１００および２００倍希釈になるように加え、攪拌して希釈倍率１００、２００倍試料液を得た。各試料液に参考例１で調製したＥＣＯの接種用菌液を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１３に示す。