(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性化合物であって、それぞれリボースまたはデオキシリボース糖部分および塩基部分を含む、共有結合により結合した複数のヌクレオシドを含み；
前記ヌクレオシドは、前記ヌクレオシドの塩基部分がＲＮＡ塩基配列またはＤＮＡ塩基配列に相補的な混合塩基配列を形成するように、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびホスホアミデート結合からなる群から選択されるヌクレオシド間結合により互いに連結しており；
少なくとも１つの前記ヌクレオシドは、Ｃ3 〜Ｃ12アルコキシルからなる群より選択される２’−置換基を有する修飾デオキシフラノシル成分を含み；
ただし：
前記ヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるとき、前記修飾デオキシフラノシル成分は２’−プロポキシデオキシフラノシル成分ではない；
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
約５ないし約５０個のヌクレオチド塩基を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
少なくともいくつかのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはホスホトリエステルを含むようにさらに修飾されている、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
薬学的に受容できるキャリヤー中の、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記ＲＮＡ塩基配列またはＤＮＡ塩基配列が、ＨＩＶゲノム、ヘルペスウイルスゲノムおよび乳頭腫ウイルスゲノムからなる群より選択される部分を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
生物によるタンパク質の生産を変調させるための組成物であって、前記タンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの選択された配列と特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基の配列を有し、かつ少なくとも１つの修飾２’−デオキシフラノシル部分を有する請求項１記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
前記化合物が約５ないし約５０個のヌクレオチド塩基を有する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記修飾が前記化合物の３’末端にある、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
前記化合物が、前記化合物の少なくともいくつかのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはホスホトリエステルを含むようにさらに修飾されている、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物が薬学的に受容できるキャリヤー中にある、請求項６記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＲＮＡまたはＤＮＡの選択された配列が、ＨＩＶゲノム、ヘルペスウイルスゲノムおよび乳頭腫ウイルスゲノムからなる群より選択される部分を含む、請求項６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法、診断及び研究試薬に有用なヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドの設計、合成及び応用に関するものである。ヌクレアーゼによる分解に耐性で、かつＤＮＡ及びＲＮＡの活性を変調することのできる、糖修飾されたオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の修飾オリゴヌクレオチドを用いた、タンパク質の生産を変調する方法も提供される。
【０００２】
【従来の技術】
感染状態を含む、哺乳類の身体状態の大部分が、タンパク質によって影響されることは良く知られている。そうしたタンパク質は、直接あるいはその酵素的機能を通して作用することにより、動物及びヒトの多数の病気に大きく関与している。
【０００３】
古典的な治療法は一般に、その病気を起こす、あるいは病気を起こし得る要素を緩和するために、これらのタンパク質との相互作用に注目していた。しかし、最近では、その合成を支配する分子、即ち細胞内ＲＮＡとの相互作用により、そうしたタンパク質の実際の合成を変調する試みがなされている。タンパク質の生産を干渉することにより、治療結果に最大の効果と最少の副作用を生じることが望まれている。特定の遺伝子発現を阻害するための一つの方法は、アンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体の使用である。
【０００４】
アンチセンスの方法論は、比較的短いオリゴヌクレオチドを、１本鎖ｍＲＮＡあるいは１本鎖ＤＮＡと相補的にハイブリダイゼーションさせ、その結果、これらの細胞内にある核酸の正常かつ必須な機能が破壊されるというものである。ハイブリダイゼーションとは、オリゴヌクレオチドのＲＮＡあるいは１本鎖ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対への、配列特異的な水素結合のことである。このような塩基対は、互いに相補的であると言われる。
【０００５】
オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害剤（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｌｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＣＲＣプレス社、ボカ・ラートン、ＦＬ（１９８９）で、コーエンによって述べられたように、核酸の機能破壊を与えるような、自然に起こる出来事には２つのタイプがあると考えられている。その第一、即ちハイブリダイゼーション阻止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的核酸に結合し、その結果、単純な立体障害により必須のタンパク質、大部分はリボソームが核酸に結合することを阻害する、終結反応を意味する。ホスホン酸メチルオリゴヌクレオチド；Ｐ．Ｓ．ミラー＆Ｐ．Ｏ．Ｐ．  Ｔｓ’Ｏ、アンチーキャンサー・ドラッグ・デザイン（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）、２：１１７−１２８（１９８７）及びα−アノマー・オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション阻止によって核酸の機能を破壊すると考えられる、最も良く研究された２種のアンチセンス剤である。
【０００６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる第２のタイプの終結反応は、細胞内ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの酵素的分解を含む。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、デオキシリボ型でなければならないが、標的ＲＮＡにハイブリダイゼーションし、この複合体はＲＮａｓｅＨ酵素を活性化してＲＮＡ鎖を切断させるため、そのＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、このタイプのアンチセンス終結反応によって作用するアンチセンス剤の最も顕著な例である。
【０００７】
重要な研究が、治療を目的にして、アンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体の応用に向けられている。診断薬、研究薬及び有力な治療薬としてのオリゴヌクレオチドの全ての応用は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が大量に合成され、細胞膜を透過するか、あるいは細胞に取り込まれ、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに適切にハイブリダイゼーションし、続いて核酸の機能を終結または破壊することを必要とする。これらの決定的な機能は、ヌクレアーゼによる分解に対する、オリゴヌクレオチドの初期の安定性に依存している。
【０００８】
これらの目的、とりわけアンチセンス療法に関するオリゴヌクレオチドの重大な欠陥は、細胞内及び細胞外に局在し、以後「ヌクレアーゼ」と呼ばれる、種々の遍在する核酸分解酵素による、投与されたオリゴヌクレオチドの酵素的分解である。非修飾の、即ち「野生型」のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによって直ちに分解されるため、有用な治療薬とはならないだろう。従って、ヌクレアーゼに対し耐性となるようなオリゴヌクレオチドの修飾は、現在アンチセンス研究の第一の中心である。
【０００９】
ヌクレアーゼ耐性を促進するためのオリゴヌクレオチドの修飾は、これまで、もっぱら糖−リン酸骨格、特にリン酸原子に対してなされてきた。ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホイミジル酸及びホスホトリエステル（リン酸メチル化ＤＮＡ）は、さまざまなレベルのヌクレアーゼに対する耐性を持つことが報告されている。しかし、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが特異的なＤＮＡあるいはＲＮＡに正確に結合する能力は、アンチセンス方法論にとって根本であるが、一方、修飾リン酸を含むオリゴヌクレオチドは、さまざまな度合いのヌクレアーゼ耐性を提供するとはいえ、ハイブリダイゼーション特性の低下をもたらす。
【００１０】
リン酸原子のプロキラルな性質により、修飾リン酸オリゴヌクレオチドに内在するリン酸原子の修飾は、Ｒｐ及びＳｐ立体異性体を生ずる。立体配座の一定したオリゴヌクレオチド（全てＲｐあるいはＳｐのリン酸結合）の実用的合成法が不明であるため、修飾リン酸原子を持つオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さあるいは塩基数をｎとしたとき、ｎ２個の異性体を持つ。更に、リン酸原子への修飾は、糖−リン酸骨格の立体配座を妨げ、その結果、２重鎖の安定性を妨害するような、ホスホジエステル結合に関して不自然な嵩高さを持つ。リン酸原子の修飾の影響により、標的核酸に対して、同じ標的にハイブリダイゼーションする非修飾のオリゴヌクレオチドよりも劣ったハイブリダイゼーションが起こる。
【００１１】
相補的核酸へ結合するオリゴヌクレオチドの相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を決定することによって比較される。融解温度（Ｔｍ）は２重らせんの特徴的な物理的特性であり、コイル（非ハイブリダイゼーション）型に対して、５０％のらせん型が存在する摂氏温度を表わす。ＵＶスペクトルを用いてＴｍを測定し、ハイブリダイゼーションの成立と開裂（融解）を決定する。ハイブリダイゼーションの間に起こる塩基の重なりに伴い、ＵＶ吸収の減少（淡色効果）が起こる。従って、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを意味する。Ｔｍが高ければ高いほど、鎖の結合力も強い。非ワトソンークリック塩基対合はＴｍに強い不安定効果を及ぼす。従って、塩基対合の完全な正確さが、標的ＲＮＡへのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの最適な結合に必須である。
【００１２】
ホスホン酸メチル及びホスホロチオエートのハイブリダイゼーション特性の有意な低下は、コーエンによって報告されている。ホスホン酸メチルは、終結反応として、ＲＮＡと形成された２重鎖がＲＮａｓｅＨによる分解を活性化しない代わりに、リボソームに局在するらせん融解活性によって打ち消され得るハイブリダイゼーション阻止によって作用する点にもう一つの欠点がある。ホスホロチオエートは大部分のヌクレアーゼに対して高い耐性を有する。しかし、ホスホロチオエートは、典型的な非アンチセンス的な作用様式、特に非特異的な結合によるさまざまな酵素機能の阻害を示す。配列特異的オリゴヌクレオチドによる酵素の阻害は、アンチセンス化学療法の、まさしく基礎を危うくするものである。
【００１３】
従って、ヌクレアーゼに対する耐性を示す修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ終結反応を活性化し、その標的ＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）に対して、適切な強度と正確さを持ってハイブリダイゼーションするために、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法に強く所望されるものである。
【００１４】
Ｍ．イケハラら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３９：４４７−４５０（１９８４）は、１残基の２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンもしくは１残基の２’−デオキシ−２’−フルオロアデニンを含む、混合８量体の合成を報告している。Ｗ．ガッシュルバウアー及びＫ．ヤンコフスキー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：１４２１（１９８０）は、Ｎ型（３’−エンド、２’−エクソ）の寄与により、２’−置換体の電気陰性度が増加することを示した。従って、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンは、８５％のＣ３’−エンド型を含んでいる。Ｍ．イケハラらは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２：４０７３（１９７９）で２’−置換体の電機陰性度と一連の２’−デオキシ−アデノシンの％Ｎコンフォメーションとの間に直線関係を表した。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５：１８７７（１９７８）は、化学的に２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシンを５’−２リン酸に転換した。これは、続いて酵素的に重合され、ポリ（２’−デオキシ−２’−フルオロアデニリル酸）が得られた。
【００１５】
更に、２’−置換型２’−デオキシアデノシン・ポリヌクレオチドは、ＤＮＡよりもむしろ２本鎖ＲＮＡに似ていることを示す証拠が示された。Ｍ．イケハラら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５：３３１５（１９７８）は、それぞれＵ、ＣあるいはＩ相補鎖と複合体を形成したポリＡ、ポリＩ及びポリＣにおける２’−フルオリン置換体が、標準的な融解アッセイによって決定されたところによると、リボあるいはデオキシ・ポリ２本鎖よりも明らかに安定であることを示している。Ｍ．イケハラら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４：４２４９（１９７８）は、ポリ（２’−デオキシ−アデニリル酸）内の２’−塩化または臭化置換体がヌクレアーゼ耐性を与えることを示している。Ｆ．エックシュタインら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：４３３６（１９７２）は、ポリ（２’−塩化−２’−デオキシウリジル酸）及びポリ（２’−塩化−２’−デオキシシチジル酸）が、種々のヌクレアーゼに耐性であることを示している。Ｈ．イノウエら、Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１（１９８７）は、ヌクレオチド単位ごとに２’−ＯＭｅを含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成について述べている。混合２’−ＯＭｅ置換型配列は、リボ−リボ複合鎖（ＲＮＡ−ＲＮＡ）と同じ強さで、そのリボオリゴヌクレオチド相補鎖にハイブリダイゼーションし、これは、同じ配列のリボ−デオキシリボ・ヘテロ２本鎖よりも明らかに強いものである（９量体について、Ｔｍ、３３．０℃に対し４９．０及び５０．１）。Ｓ．シバハラら、Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２３９（１９８７）は、ヌクレオチド単位ごとに２’−ＯＭｅを含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成について述べている。混合２’−ＯＭｅ置換型配列は、ＨＩＶの複製を阻害するために設計された。
【００１６】
水素原子の性質に比べ、水酸基の立体効果と、その水素結合能、及びその電気陰性度の複合効果が、ＲＮＡとＤＮＡの大きな構造的相違の原因である。温度融解研究により、２’−メトキシ・オリゴヌクレオチド複合鎖の安定性（ハイブリダイゼーション）の順位は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡの順である。
【００１７】
数種の天然に存在するヌクレオチドの２’−デオキシ−２’−ハロ、アシド、アミノ、メトキシ・ホモポリマーは、ポリメラーゼ処理によって調製された。必要とされる２’−修飾ヌクレオシド・モノマーは、核酸合成機によってオリゴヌクレオチドに取り込まれた。従って、それぞれの糖に２’−修飾を含む混合配列（配列特異的な）オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−メトキシ類似体を除いて知られていない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、ヌクレアーゼ分解に耐性であるが、ＤＮＡ及びＲＮＡの活性を変調する組成物が提供される。これらの組成物は、糖修飾されたオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体からなり、その標的部分は１本鎖あるいは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの、あらかじめ選ばれたヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。糖修飾されたオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを認識して２本鎖を形成するか、もしくは２本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡと３本鎖を形成する。すなわち、本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性化合物を提供し、この化合物は、それぞれリボースまたはデオキシリボース糖部分および塩基部分を含む、共有結合により結合した複数のヌクレオシドを含み；
前記ヌクレオシドは前記ヌクレオシドの塩基部分がＲＮＡ塩基配列またはＤＮＡ塩基配列に相補的な混合塩基配列を形成するようにヌクレオシド間結合により互いに連結しており；
少なくとも１つの前記ヌクレオシドは、ハロ、アジド、アミノ、置換アミノ、シアノ、ハロメチル、シアナート、アルコキシル、チオアルコキシル、ハロアルコキシル、アルキルスルフィド、アルキルスルホネート、ニトレート、ニトリット、アンモニウム、アリルオキシおよびアルケンオキシからなる群より選択される２’−置換基を有する修飾デオキシフラノシル成分を含み；
ただし：
前記修飾デオキシフラノシル成分は、２’−フルオロフラノシル成分ではなく；前記ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるとき、前記修飾デオキシフラノシル成分は２’−メトキシデオキシフラノシル成分ではなく；そして前記ヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるとき、前記修飾デオキシフラノシル成分は２’−メトキシデオキシフラノシル成分、２’−エトキシデオキシフラノシル成分または２’−プロポキシデオキシフラノシル成分ではない；ことを特徴とする。
【００１９】
本発明の別の目的は、ＤＮＡあるいはＲＮＡの活性の変調に有効な、そうしたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。
【００２０】
本研究の別の目的は、所望されないあるいは毒性の副反応を招く可能性がより低い、そうしたオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。
【００２１】
本研究の更に別の目的は、動物の身体状態、特に病気の状態をアッセイするための研究及び診断法、並びに材料を提供することである。
【００２２】
本研究の更に別の目的は、ＤＮＡ及びＲＮＡの活性変調により、病気の治療を行うための研究及び診断法、並びに材料を提供することである。
【００２３】
これら及び他の目的は、本明細書及び添付の請求の範囲を概観することによって、通常の技術を持った当業者に明らかとなるだろう。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、ヌクレアーゼ分解に耐性であるが、ＤＮＡ及びＲＮＡの活性を変調する組成物が提供される。これらの組成物は、糖修飾されたオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体からなり、その標的部分は１本鎖あるいは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの、あらかじめ選ばれたヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。糖修飾されたオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを認識して２本鎖を形成するか、もしくは２本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡと３本鎖を形成する。
【００２５】
本発明のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、結合基を介して互いに結合した核酸塩基の１本鎖からなる。このヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの標的部位は、約５から約５０核酸塩基長の範囲をとることができる。しかし、本発明の好ましい態様に従い、約１５塩基長の標的配列が最適である。
【００２６】
核酸塩基はチミン、ウラシルあるいはシトシンなどのピリミジンまたは、グアニンもしくはアデニンなどのプリン、またはその両者が特異的な配列に整列することができる。こうした塩基の糖部分は、デオキシリボースあるいはリボース型であることが可能である。塩基どうしを連結する基は、通常の糖リン酸の核酸骨格であることも可能だが、また、糖修飾されたオリゴヌクレオチドの特性を更に促進するために、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチルあるいはリン酸アルキル化団として、５’−メチレン基及び／または環型糖の除去とともに修飾されることができる。
【００２７】
本発明に従い、標的部分は少なくともヌクレオシド単位の２’−デオキシ・リボフラノシル部分のひとつが修飾されている、オリゴヌクレオチドの類似体である。水素あるいは水酸基、ハロ、アジド、アミノ、メトキシあるいはアルキル基が添加され得る。たとえば、アルキルはＣ１からＣ１２の直鎖あるいは分枝鎖が使われることができ、炭素鎖には、特に勧められるアリロキシなどの不飽和結合を含むところの、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリロキシ）、ＯＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＣＨを用いることができる。
【００２８】
その結果得られる、新規なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はヌクレアーゼによる分解に耐性であり、野生型（ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＲＮＡ−ＤＮＡ）複合鎖及びホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデート及びホスホトリエステルを含む、リン酸修飾オリゴヌクレオチド・アンチセンス複合鎖に比べて高いハイブリダイゼーション特性を示す。
【００２９】
本発明はまた、次の考察に従って構成された組成物を生物と接触させることからなる、生物によるタンパク質の生産を変調する方法も対象とする。変調されるべきＲＮＡあるいはＤＮＡ部分は、その構成が変調されるべきタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのその部分を含むように、あらかじめ選択されることが好ましい。従って、用いられるべき組成物の標的部位は、あらかじめ選択されたＤＮＡあるいはＲＮＡ部分に相補的であるように選択され、これは即ちその部分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
本発明は、所望されないタンパク質の生産によって特徴付けられる病気にかかった生物の処置法も対象とする。この方法は、次の考察に従った組成物を生物と接触させることからなる。この組成物は、その生産が阻害されるべきタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに特異的に結合するように設計されたものが好ましい。
【００３１】
本発明は更に、生物あるいは細胞内の異常なＲＮＡ分子の存在の有無、あるいは正常型ＲＮＡ分子の異常な発現または不適切な発現を検出するための診断法を対象とする。
【００３２】
本研究はまた、研究及び診断のためのＲＮＡの選択的結合に関する方法にも向けられている。このような選択的で強力な結合は、他の既知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のいずれよりも分解性ヌクレアーゼに耐性であり、より強くハイブリダイゼーションし、より高い正確さを有する本研究の組成物とこのようなＲＮＡまたはＤＮＡと相互作用することによって行われる。
【００３３】
以上に加え、本研究は２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシド、とりわけグアノシン化合物の合成法を対象とする。本法に従い、グアノシンの２’−水酸基が最初に酸化され、次に２’位の添加により還元され、その結果９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンが得られる。２’アラビノ水酸基は、脱離基によって誘導化される。求核試薬を用いた脱離基の求核置換は、更に添加することによって行われ、その結果２’−デオキシ−２’−置換型グアノシン化合物が得られる。
【００３４】
本発明によるＲＮＡあるいはＤＮＡ分子の活性変調に有用な組成物は、一般にあらかじめ選択された１本鎖あるいは２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼーションする標的配列を含み、ヌクレアーゼ耐性の糖修飾されたオリゴヌクレオチドからなる。
【００３５】
一般に、その合成が最終的に変調されるか、または全く阻害されるタンパク質の生産に関わるＤＮＡもしくはＲＮＡの配列を選択することが所望される。組成物の標的化部位は、一般にオリゴヌクレオチド類似体である。これは既知の方法論である固相合成法によって簡便に合成され、あらかじめ選択されたＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるか、あるいは少なくとも特異的に結合する。核酸合成機は市販されており、所望されるであろう適当な長さを持つほぼどの様なオリゴヌクレオチドを生産するにも有効であることから、それらの利用は一般に当業者において通常の技術を有した者によって理解されている。
【００３６】
本発明の文脈中、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然のホスホジエステル結合により糖基を介して連結された、天然に存在する塩基及びペントフラノシル基由来の特異的配列に形成された、連結された多数のヌクレオチド単位を意味する。これらのヌクレオチド単位としては、グアニン、アデニン、シトシン、チミンあるいはウラシルなどの核酸塩基が可能である。糖基としては、デオキシリボースまたはリボースが可能である。この用語は、天然物または天然に存在するサブユニットから作られた合成物のいずれにも適用する。
【００３７】
本発明に関連して用いられる用語としての「オリゴヌクレオチド類似体」とは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが非天然由来の部分を有する部分を示す。オリゴヌクレオチド類似体は、改変された糖部分あるいは糖間結合、たとえば当業における使用法が知られるホスホロチオエート及び他の含硫黄種を持つことができる。オリゴヌクレオチド類似体は、また本発明の精神に合致した改変を行った塩基あるいは他の修飾、特にアンチセンス療法、診断または研究試薬としての、特定のオリゴヌクレオチドの利用を促進するために、オリゴヌクレオチド組成物のヌクレアーゼ耐性を強化することができるような修飾を含むことができる。
【００３８】
ヌクレオチド塩基のいくつかの位置が、オリゴヌクレオチドの結合能力の完全さを保ったまま、組成物のヌクレアーゼ耐性を増加させるために置換されることは、本発明のいくつかの態様に用いるために一般に好ましい。
【００３９】
更に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることは、本発明のいくつかの態様において好ましい。この場合、修飾オリゴヌクレオチド類似体は一般に天然のオリゴヌクレオチドと似ているが、しかし一つあるいはそれ以上の重要な方法で修飾されている構造を言う。
【００４０】
そうした修飾は、本発明の糖骨格で起きるだろう。糖修飾されたオリゴヌクレオチドの標的配列が、全組成物の標的であるメッセンジャーＲＮＡあるいはＤＮＡが存在する細胞の細胞内空間へ透過してゆく能力を増強することが一般に好ましい。従って、オリゴヌクレオチドの細胞内への透過を促進するために、天然型よりも実質的にイオン強度が弱くなるようなオリゴヌクレオチドの修飾が提供されることが一般に好ましい。この目標を達成するための既存の方法あるいは発見されるべき方法のいずれも、本発明の実施にともなって用いることができる。現在、置換が天然に存在する結合よりも相対的にイオン強度が弱いだけでなく、また実質的に非キラル型であるところの、ホスホジエステル結合の置換を用いることが好ましいことが見いだされている。
【００４１】
理解されるであろう様に、ホスホジエステル結合のリン酸原子は「プロ−キラル」である。ホスホン酸メチル及びホスホロチオエートタイプのオリゴヌクレオチドでなされたのと同様な、リン酸における修飾は、基本的にはキラル構造を生ずる。キラリティーは、細胞の分子と異なった相互作用をする事のできる、それぞれのキラル中心に関して２つの異性体の存在をもたらす。こうした、分離されていない異性体の混合物は、生じた化合物を細胞内空間への輸送を阻害するか、あるいは特異的な標的ＲＮＡまたはＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの親和性及び特異性を減少させるかも知れない。従って、本発明のいくつかの態様において、実質的に非イオン性で、実質的に非キラルな物をホスホジエステル結合のいくつかあるいは全ての代わりに用いることが好ましい。このために、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキル構造、特にＣ２−Ｃ４構造が好ましい。同日付けで本出願とともに出願され、かつ本出願の共通の受託者に受託された、「細胞による取り込みを促進するためのポリアミン・オリゴヌクレオチド」、出願番号第５５８，６６３号、１９９０年７月２７日出願（代理人要録ＩＳＩＳ−２４）と題された該出願に述べられるように、酸素の機能の一つを除くことを含む糖構造の修飾がそのような実質的に非キラルで非イオン性の置換体をこの部位に導入することを可能とする。出願番号第５５８，６６３号で開示される全ては、このような修飾を更に完全に開示するために、ここに参考文献として取り入れられている。
【００４２】
ＰをＳ、Ｍｅ−ｐ、ＭｅＯ−Ｐ、Ｈ２Ｎ−Ｐなどに置換するような、標準的な骨格の修飾は、本発明の目標と一致している。これらの置換は、いくつかの場合、糖修飾オリゴヌクレオチドの特性を促進すると考えられる。
【００４３】
本発明の組成物の標的部位は５から約５０塩基単位を有するオリゴヌクレオチド類似体が好ましい。こうした機能単位が８から約４０塩基単位を持つことがより好ましく、また約１２から２０塩基単位が用いられれば更に好ましい。約１５塩基単位を持つオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の特定の態様を実施するために好ましい。
【００４４】
標的部位は、変調するために選択されたＲＮＡあるいはＤＮＡの、あらかじめ選ばれたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼーションすることができるように適合されることが所望される。本発明の一つまたはそれ以上の態様の実施に特に適したオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレオシド単位の２’−デオキシ・リボフラノシル団の一つあるいはそれ以上が、水素または水酸基、ハロ、アジド、アミノ、アルキロキシ、チオアルコキシ、アルキルアミノまたはアルキル基で修飾された２’−糖修飾オリゴヌクレオチドを含む。たとえば、実施可能な置換は、アルキルがＣ１からＣ１２の直鎖あるいは分枝鎖であり、その炭素鎖にアリロキシなどの不飽和結合を含むところの、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＣＨを含む。
【００４５】
これらの修飾塩基は、糖連結基を介して互いに連結され、またオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の残りに結合される。連結基は、オリゴヌクレオチドの糖団を互いに連結して本発明の組成物の標的部位を形成できる、本明細書記載のこれらの構造の任意のものである。これらの連結基がホスホジエステル構造もしくはその誘導体からなることが好ましい。ホスホジエステル構造の誘導体とは、酸素を硫黄やメチル、メチルオキシドなどのアルコキシ基あるいはアミン基と置換したものを含んでも良い。糖リン酸核酸骨格は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートあるいはリン酸アルキル化団（ホスホトリエステル）などのアルキルホスホネートとして修飾されても良い。ホスホジエステル結合はまた、炭素もしくはエーテル結合によって置換されることができる。
【００４６】
本発明の別の態様において、連結団は修飾オリゴヌクレオチドの３’−端の末端部位に、修飾単位が直接連結できるように工夫されている。従って、エステルまたは、より好ましくはブロモメチルケト基が、ジメトキシトリフェニルメチル基で保護され、もし複素環がシトシン系であれば、ベンゾイル保護基で保護された複素環を有する、５’−ヒドロキシルを持つ２’−修飾ヌクレオシドの３’−ヒドロキシルに連結される。もし所望された標的配列が末端に３’−チミンあるいはシトシン塩基を有する場合、ブロモメチルケト・リンカーを含んだ、所望される修飾チミンまたはシトシン塩基は、その３’−水酸基を介して結合した正常なヌクレオシドを含む、コントロール・ポア・ガラス（ＣＰＧ）固相担体に連結するための、最初の単量体として用いられるだろう。ＣＰＧに連結したヌクレオシドに２’−修飾ヌクレオシドを結合する、塩基感受性エステル結合は、ＣＰＧ担体からオリゴヌクレオチドをはずすために用いられる通常の濃アンモニア水存在下で切断される。これにより、修飾オリゴヌクレオチドがその末端である３’一端に２’−修飾単位を持つことができるだろう。
【００４７】
核酸分解酵素によるオリゴヌクレオチドの切断は、酵素−基質複合体の形成、あるいは特にヌクレアーゼーオリゴヌクレオチド複合体の形成を必要とする。ヌクレアーゼ酵素は、一般に適切な結合のためにオリゴヌクレオチド上に存在する特異的な結合部位を必要とするだろう。もし、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合しないようにオリゴヌクレオチド結合部位が除去されるか、妨害されれば、ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドができる。配列特異的な回文２本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素の場合、３−及び７−位にある環内窒素などの特定の結合部位が、必要とされる結合部位として同定された。これらの部位の一つあるいはそれ以上の除去あるいは、認識配列内のこれら特定部位へのヌクレアーゼの接近を妨害することは、特異的なヌクレアーゼに対する、さまざまな程度の耐性を提供する。
【００４８】
本発明は、優れたハイブリダイゼーション特性によって特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。我々は、構造と活性の相互作用研究から、そのＲＮＡ標的（相補物）に対する特定の２’−糖修飾オリゴヌクレオチドの結合（Ｔｍ）ｓの顕著な増加が、ヘテロ２本鎖の「Ａ」型の立体配座の増加と相関があることを発見した。さらに修飾オリゴヌクレオチドの絶対的な正確さが維持される。我々の２’−糖修飾された配列特異的なオリゴヌクレオチドは、文献で知られるようなメチルホスホネート、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル及びホスホアミダイトよりも優れた能力及び特異性を提供する。
【００４９】
ＤＮＡ及びＲＮＡ２本鎖の唯一の構造的相違は、（ウラシル環系のメチル基の有無は影響がないと仮定して）ＤＮＡリボフラノシル団の２’−位には水素原子があるのに対し、ＲＮＡリボフラノシル団の２’−位に水酸基があることである。しかし、ＤＮＡ及びＲＮＡ２本鎖の間には大きな立体配座的相違が存在する。核酸線維のＸ−線回折分析、アーノットとフーキンス、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  ４７：１５０４−１５１０（１９７９）及び２本鎖核酸の結晶解析から、ＤＮＡが「Ｂ」型構造をとり、ＲＮＡのみがずっと堅い「Ａ」型構造をとることが知られている。ＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオシド単量体単位の糖の襞部分（「Ｂ」型ＤＮＡのＣ２’エンド及びＡ−型ＲＮＡのＣ３’エンド）の相違は、２本鎖核酸の間の主要な立体配座の違いである。
【００５０】
ペントフラノシル団の立体配座に対しておもに寄与する要因は、２’−位における置換の性質である。従って、２’−置換体の電気陰性度が増加するにつれて、Ｃ３’−エンド型の数はＣ２’−エンド型に関して増加する。たとえば、２’−デオキシ−２’−ハロ−アデニンヌクレオシドの内、２’−フルオロ誘導体はＣ３’−エンド型の最大の割合（６５％）を示し、２’−ヨード型は最少の割合（７％）を示す。アデノシン（２’−ＯＨ）及びデオキシアデノシン（２’−Ｈ）の割合は、それぞれ３６％と１９％である。更に、アデニン・ジヌクレオチド（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンまたはウリジン）の２’−フルオロ基の影響は、リボまたはデオキシリボ修飾２量体よりも更に強く、重なり立体配座の安定性に相関する。研究により、ジヌクレオシドリン酸は、幾何学的にはＡ−Ａの重なり立体配座に似ているが、しかしＡ−Ａよりもより強く塩基−塩基間の重なりを持つことが示されている。Ｃ２’−Ｆ結合の、高い極性のある性質及びＣ３’−エンドのパッカリングに対する、極端な選択性が「Ａ」構造の重なり立体配座を安定化できるのだろうと推測されている。
【００５１】
ＵＶ淡色効果、円偏光２色性及び１Ｈ  ＮＭＲのデータもまたハロゲンの電気陰性度が低下するにともなって、重なりの度合いも低下することを示している。更に、２’−位における立体的な大きさは、「Ｂ」型の２本鎖よりも「Ａ」型の２本鎖においてより良く変調されている。
【００５２】
従って、ジヌクレオシド１リン酸の３’−ヌクレオチジル単位上の２’−置換体は、重なり立体配座：即ち立体相反、フラノース・パッカリング選択性、静電気的相反、疎水的吸引及び水素結合能などに多くの影響を与えると考えられる。これらの置換体の影響は、置換体の分子サイズ、電気陰性度及び疎水性によって決定されると考えられている。
【００５３】
２’−ヨード置換されたヌクレオシドは、ハロゲン類の中では最も低い割合（７％）の３’−エンド型を持つ。従って、立体効果だけでは、２’−ヨードあるいは同様の基が重なりによる不安定性と、それによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関する結合（Ｔｍ）ｓの低下に寄与すると考えるだろう。しかし、ヨウ素原子とそれと同様の基の低い電気陰性度及びに高い疎水性による吸引力は、重なり安定化及び結合強度の予想を複雑にする。
【００５４】
２’−デオキシグアノシン、シチジン及びウリジンジヌクレオチドリン酸の２’−ＯＭｅ修飾に関する研究は、それらに相当する非メチル化種（２’−ＯＨ）に関して重なり効果の促進を示す。この場合、メチル基の疎水性吸収力はその立体的大きさ（障害）の不安定効果を打ち消す傾向がある。
【００５５】
２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシンは、ヌクレオシドの間に異常に高い割合の３’−エンド・パッカリングを持つことが決められている。アデノシン、２’−デオキシアデノシン及びその他の誘導体は、一般に３’−エンド型配座異性体の４０％以下を占める。しっかりと重なったオリゴヌクレオチドのヌクレオシド残基は、３’−エンド・リボフラノース・パッカリングを好むことが知られている。
【００５６】
融解温度（相補的結合）は、２’−置換型アデノシン２リン酸によって上昇する。立体配座の３’−エンド選択性あるいは置換体の存在が、結合の増加によるものなのかは明らかでない。しかし、述べられているように、隣接した塩基とのより多くの重なり（スタッキング）は、３’−エンド型立体配座でなされ得る。
【００５７】
より強い結合を得るための現在の新規な試みは、標的ＲＮＡへ結合するアンチセンスＲＮＡ模造物を調製することである。従って、任意の構造−活性相関関係に関する研究法は、適切なハイブリダイゼーション特性を維持した、ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドを見いだすために行われた。
【００５８】
アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びこれらの塩基の特定の類似体の一連の２’−デオキシ−２’−修飾ヌクレオシドが調製され、固相核酸合成法によって配列特異性なオリゴヌクレオチドに、修飾ヌクレオシドとして挿入された。新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性及び、非修飾の親型オリゴヌクレオチドに匹敵するハイブリダイゼーション特性を有するかについてアッセイされた。初めは、小さい電気陰性原子あるいは基が、必要とされるワトソン−クリック塩基対合の水素結合（ハイブリダイゼーション）を立体的に妨害しないであろう故に選ばれた。しかし、２’−位の原子あるいは基の電気陰性度による電気的変化は、糖の立体配座にもっぱら影響を与えることができる。構造と活性の相関関係に関する研究を行う間に、我々は糖修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾のもの（２’−デオキシリボシル型）よりも強く標的ＲＮＡにハイブリダイゼーションする事を見いだした。
【００５９】
２’−置換型オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ社３８０Ｂあるいは内蔵型ミリジェン／バイオサーチ７５００または８８００などの標準的な固相、自動核酸合成機によって合成される。トリエステル、ホスホアミダイトあるいはホスホン酸水素カップリング化学（オリゴヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤．  Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、ｐｐ７−２４、Ｊ．Ｓ．コーエン編、ＣＲＣ出版社．  ボカ・ラートン、フロリダ、１９８９）が、所望のオリゴヌクレオチドを提供するために、これらの合成機とともに用いられた。ビュウケイジ試薬（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１２、１２５３−１２５５、１９９０）あるいは硫黄要素（Ｓ．ビュウケイジら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２、１８５９−１８６２、１９８１）が、ホスホアミダイトまたはホスホン酸水素化学とともに、２’−置換型ホスホチオエートオリゴヌクレオチドを提供するために用いられた。
【００６０】
必要とされる２’−置換型ヌクレオシド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）及び核酸塩基類似体）は、一般に下記のいくつかの文献的方法の修飾によって調製される。
【００６１】
方法１．  アラビノ・プリン・ヌクレオシドの２’−脱離基の求核置換。アデニン、グアニンまたはそれらの類似体ヌクレオシドの、２’−上位の脱離基（２’−デオキシ−２’−（脱離基）アラビノ糖）の求核置換。このタイプの一般的な合成法は、Ｍ．イケハラら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３４、１１３３−１１３８（１９７８）；同雑誌、３１：１３６９−１３７２（１９７５）；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、２６：２４４９−２４５３（１９７８）；同雑誌、２６：２４０−２４４（１９７８）；Ｍ．イケハラ、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２：４７−５３（１９６９）；及びＲ．ランガナーサン、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５：１２９１−１２９４（１９７７）によって述べられている。
【００６２】
方法２．  ２，２’−アンヒドロ・ピリミジンの求核置換。ヌクレオシドのチミン、ウラシル、シトシンあるいはそれらの類似体は、Ｊ．Ｊ．フォックスら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：５５８−５６４（１９６４）の記載に従い、２，２’−シクロアンヒドロ・ヌクレオシドを仲介して２’−置換型ヌクレオシドに転換される。
【００６３】
方法３．  ２’−カップリング反応。保護されない２’−水酸基を持つ、適切に３’，５’−糖及び塩基で保護されたプリン及びピリミジン・ヌクレオシドは、ヨウ化メチルやジアゾメタンなどの求電子試薬とカップルされ、２’−ＯＭｅ基を含む混合配列を提供する。Ｈ．イノウエら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１３１−６１４８。
【００６４】
方法４．  ２−デオキシ−２−置換型リボシル化。適切に保護された核酸塩基及び核酸塩基類似体の２−置換型−２−デオキシリボシル化は、Ｅ．Ｔ．ヤーヴィら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ８：１１１１−１１１４（１９８９）及びＬ．Ｗ．ハーテルら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３：２４０６−２４０９（１９８８）によって報告されている。
【００６５】
方法５．  ２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシドの酵素による合成。ピリミジン及びプリンリボもしくはデオキシリボリン酸化の助けを受けた、一つのヌクレオシドから別のヌクレオシドへの２−デオキシ−２−置換型グリコシル転移は、Ｊ．Ｒ．リドウトとＴ．Ａ．クレニツキー、米国特許第４，３８１，３４４号（１９８３）によって述べられている。
【００６６】
方法６．  ２’−置換体の、新たな置換体への転換。２’−置換型−２’−デオキシヌクレオシドは、標準的な化学的操作により新たな置換体へ転換される。たとえば、Ｓ．クラデックら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ７：６３−７５（１９８０）は、アラビノフラノシルアデニンから調製された２’−デオキシ−２’−アジドアデノシンの、２’−デオキシ−２’−アミノアデノシンへの転換について述べている。
【００６７】
方法７．  遊離ラジカル反応。遊離ラジカル反応による。ハロゲン置換型ヌクレオシドの２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシドへの転換は、Ｋ．Ｅ．Ｂ．パークスとＫ．テイラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２９：２９９５−２９９６（１９８８）によって述べられている。
【００６８】
方法８．  リボヌクレオシドの２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシドへの転換。保護されない２’−水酸基を持つ、適切に３’，５’−糖及び塩基保護されたプリン及びピリミジンヌクレオシドは、２’−ケト基への酸化、求核試薬との反応及び最終的な２’−デオキシ生成という処理によって、２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシドに転換される。このタイプの方法は、Ｆ．ドゥ・ラ・ハラら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２９：９４１−９４４（１９８８）によって述べられている。
【００６９】
方法９．  本発明の好ましい処理法において、２’−デオキシ−置換型グアノシン化合物は、酸化−還元反応を介して得られたｎ（アラビノフラノシル）グアニン中間体を経て調製される。中間体であるアラビノ化合物のアラビノフラノシル糖団の２’位にある脱離基は、適当な求核試薬を用いたＳＮ２  反応により置換される。従って、この方法は上述の方法１と方法８の原理を取り入れている。２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンは、この方法を経て調製されるのが好ましい。中間型のアラビノ化合物は、ハンスケ、Ｆ．、マデ、Ｄ．及びロビンス、Ｒ．Ｊ．（１９８４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４０：１２５の酸化還元反応の変法を用いて得られた。本発明に従い、還元反応は−７８℃から実行され、この還元反応は約−２℃まで外部温度による温度上昇が許される。これにより、中間型アラビノ化合物が高収量で得られる。
【００７０】
低温還元反応の使用と併せて、開始材料のグアノシン化合物の３’及び５’位に対するテトライソプロピルジシロキサンブロッキング基（「ＴＰＤＳ」基）の利用は、酸化及び還元に続くリボ化合物に対する中間型アラビノ化合物の割合を改善することに寄与する。酸化／還元に続き、中間型アラビノ化合物のＮ２  グアニンアミノ窒素及び２’−水酸基は、イソブチリル保護基（「Ｉｂｕ」基）でブロッキングされる。テトライソプロピルジシロキサンブロッキング基は除去され、３’及び５’水酸基は、更に第２のブロッキング基であるテトラヒドロピラニルブロッキング基（「ＴＨＰ」基）で保護される。イソブチリル基は２’−水酸基から選択的に除去され、続いてトリフレート（トリフルオロメチルスルフォニル）脱離基を用いた２’位の誘導化がなされる。次にトリフレート団は、２’位に関する反転により置換され、所望の２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン化合物が得られる。
【００７１】
トリフレート脱離基に加え、他の脱離基はアルキルスルフォニル、置換型アルキルスルフォニル、アリールスルフォニル、置換型アリールスルフォニル、ヘテロシクロスルフォニルあるいはトリクロロアセチミジル酸を含むが、しかし必ずしもこれに限定されない。代表的な例には、ｐ−（２，４−ジニトロアニリノ）ベンゼンスルフォニル、ベンゼンスルフォニル、メチルスルフォニル、ｐ−メチルベンゼンスルホニル、ｐ−ブロモ−ベンゼンスルホニル、トリクロロアセチミジル酸、アクリロキシ、２，２，２−トリフルオロ−エタンスルフォニル、イミダゾールスルフォニル及び２，４，６−トリクロロフェニルが含まれる。
【００７２】
グアニン環のＮ２ヘテロシクリック・アミノ団に残るイソブチリル基は、完全に脱ブロツキングされたヌクレオシドを得るために除かれ得るが；しかし、オリゴヌクレオチドへの２’−デオキシ−２’−置換型化合物の取り込みには、Ｎ２イソブチリル保護基の脱ブロッキングは、オリゴヌクレオチド合成が完了するまで延期されることが好ましい。通常、自動核酸合成機で使用するには、イソブチリル基によるＮ２グアニン・アミノ団のブロッキングが好ましい。従って、簡便のために、本発明の方法から得られるＮ２−イソブチリルブロッキングされた２’−デオキシ−２’−置換型アデノシン化合物は、自動核酸合成機におけるオリゴヌクレオチドで直接使用することができる。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は診断、治療において利用可能であり、また研究試薬やキットとして用いることができる。治療で用いる場合、オリゴヌクレオチドはいくつかのタンパク質によって影響を受ける病気にかかった動物に投与される。その病気の症状を緩和するために有効な量のオリゴヌクレオチドを、病気にかかっていると疑われる患者に投与することが好ましい。こうした処置法のための最適な投薬量及び処置計画の決定は、当業者の技術範囲内にある。
【００７４】
本発明に従い、治療薬を経口、静脈内あるいは筋肉内などの内用として適用することが好ましい。経皮的、局所的あるいは患部内などへの、別の投薬様式も有用であろう。座薬への包含もまた有用であろう。また、医薬的に許容される担体の使用もいくつかの態様においては有用である。
【００７５】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の実施を述べている。
【００７６】
実施例１  −２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【００７７】
Ａ．Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル・ホスホアミダイト。
【００７８】
Ｎ６−ベンゾイル−９−（２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニンは、Ｍ、イケハラら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２：３７３−３８５（１９８３）によって報告された方法の修飾法を用いた、５段階の合成によって９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンから調製された。従って、Ｎ６−ベンゾイル誘導体は、クロロトリメチルシランによる一過的な保護法を用い、高収率で得られた。Ｒ．Ａ．ジョーンズ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，  １０４；１３１６（１９８２）。テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）によるＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンの３’−及び５’−水酸基の選択的な保護は、文献の方法、即ちＧ、バトケら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  第３部；１４９−１５２、タウンセンド、Ｌ．Ｂ．及びティプソン、Ｒ．Ｓ．編（Ｊ．ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク１９８６）の修飾法によって行われ、高収量でＮ６−ベンゾイル−９−［３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノ・フラノシル］アデニンが得られた。ジクロロメタン中での、無水トリフルオロメタンスルホン酸を用いたＮ６−ベンゾイル−９−［３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノ・フラノシル］アデニンの処理により、その不安定性から単離されていない。２’−トリフレート誘導体であるＮ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンが得られた。２’−トリフレート基の置換は、テトラヒドロフラン中でのフッ化テトラブチルアンモニウムとの反応によってなされ、適当量の２’−フッ化誘導体であるＮ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンが得られた。Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンのＴＨＰ基の脱保護は、メタノール中においてＤｏｗｅｘ−５０Ｗで処理することによって行われ、適当な収量のＮ６−ベンゾイル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニンが得られた。６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは文献値と一致した。Ｍ．イケハラとＨ．ミキ、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６：２４４９−２４５３（１９７８）。標準的な方法論が、５’−ジメトキシトリチル−３’−ホスホアミダイト中間体であるＮ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン及び、Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイトを得るために用いられた。Ｋ．Ｋ．オギルヴィ、Ｃａｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．６７：８３１−８３９（１９８９）。
【００７９】
Ｂ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン。
【００８０】
９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１．０７ｇ、４．００ｍ．ｍｏｌ）を、アルゴンガス中で無水ピリジン（２０ｍｌ）及び無水ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液は氷温まで冷やされ、クロロトリメチルシラン（３．８８ｍｌ、３０．６ｍ．ｍｏｌ）が注射器によってゆっくりと反応混液に加えられた。氷温で３０分間反応混液を撹拌した後、塩化ベンゾイル（２．３２ｍｌ、２０ｍ．ｍｏｌ）がゆっくりと加えられた。この反応混液は２０℃に暖められ、２時間撹拌された。この反応混液を氷温まで冷やした後、冷水（８ｍｌ）が添加され、この混合液は１５分間撹拌された。アンモニアが終濃度２Ｍになるように、この反応混液に濃水酸化アンモニア水（８ｍｌ）がゆっくりと加えられた。この冷反応混液を３０分間撹拌した後、溶媒は２０℃で真空（６０ｔｏｒｒ）蒸発乾燥され、続いて４０℃で真空（ｌｔｏｒｒ）蒸発乾燥され、油性物が得られた。この油性物をジメチル・エーテル（５０ｍｌ）で粉末化し、濾過され、ジメチル・エーテルで３回洗われた固形物が得られる。この粗固形物は還流温度においてメタノール（１００ｍｌ）中で３回粉末化され、溶媒が蒸発乾燥されて、固形物としてＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンが生じた（１．５ｇ，１００％）。
【００８１】
Ｃ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［３”，５”−ジ−）テトラヒドロピラン−２−イル）−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００８２】
Ｎ６−ベンゾイル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン（２，６２ｇ、７．０６ｍ．ｍｏｌ）は、アルゴンガス中で無水ジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）に溶解され、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（１．３２ｇ、６．９２ｍ．ｍｏｌ）が添加された。この溶液は氷温まで冷やされ、ジヒドロピラン（１．２６ｍｌ、１３．８ｍ、ｍｏｌ）が注射器によって加えられた。この反応混液は２０℃まで暖められた。５時間にわたって、合計１０倍相当量のジヒドロピランが記載された様にして２倍相当量ごとに加えられた。この反応混液は氷温まで冷却され、飽和炭酸ナトリウム溶液がｐＨ８になるまでゆっくりと添加され、次に水が７５０ｍｌとなるように添加された。この水性混合液は、塩化メチレンで４回（４×２００ｍｌ）抽出され、有機層をまとめて硫酸マグネシウム上で乾燥させた。固形物は濾過され、溶媒は３０℃で真空（６０ｔｏｒｒ）蒸発乾燥されて少量の液体になり、これは４０℃で真空（ｌｔｏｒｒ）蒸発乾燥されて油性物を生じた。この油性物は４０℃でｐ−キシレンと供に真空乾燥されて油性物を生じ、これは塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解された。ヘキサン（２００ｍｌ）が溶液に加えられ、低沸点溶媒は３０℃で真空蒸発乾燥され、ヘキサンに懸濁された白色の固形物が残った。この固形物は濾過され、ヘキサンで３回（３×１０ｍｌ）洗われた後、シリカを用いたカラムクロマトグラフィーにより、塩化メチレン−メタノール（９３：７、ｖ／ｖ）を溶出剤として精製された。最初の画分からは、白色の泡（３．１９ｇ、８３％）として化合物３と名付けられた化合物が得られ、２番目の画分からは白色の泡（０．８１ｇ）が得られ、これはＮ６−ベンゾイル−９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンの５’−モノ−テトラヒドロピラニル誘導体と同定された。
【００８３】
Ｄ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００８４】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（２．６５ｇ、４．９１ｍ．ｍｏｌ）は無水ピリジン（２０ｍｌ）に溶解され、溶媒は４０℃で真空（１ｍｍＨｇ）蒸発乾燥された。これによって生じた油性物は、アルゴンガス中で無水塩化メチレン（１３０ｍｌ）に溶解され、無水ピリジン（３．３４ｍｌ、４１．３ｍ．ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１．９５ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）が添加された。この反応混合液は氷温まで冷却され、無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．３６ｍｌ、８．０５ｍｍｏｌ）が注射器によってゆっくりと加えられた。氷温で１時間この反応混合液を撹拌した後、冷飽和重炭酸ナトリウム溶液（１４０ｍｌ）に注がれた。この混合液を振盪し、有機層を分離して氷温に保った。水層はさらに２回（２×１４０ｍｌ）塩化メチレンで抽出された。注意深く低温に保たれた有機抽出物をまとめ、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒は、２０℃で真空（６０ｔｏｒｒ）蒸発乾燥され、次に２０℃で真空（ｌｔｏｒｒ）蒸発乾燥されて、粗油性物としてＮ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンが得られ、これはそれ以上精製されなかった。
【００８５】
Ｅ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００８６】
粗油性物状のＮ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（＜４．９ｍｍｏｌ）は、無水テトラヒドロフラン（１２０ｍｌ）に溶解され、この溶液はアルゴンガス中で氷温まで冷やされた。水和物としてテトラブチルアンモニウム（１２．８ｇ、４９．１ｍｍｏｌ）が無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）に溶解され、その半分が注射器を用いて冷やした反応混液にゆっくりと添加された。氷温で１時間撹拌した後、試薬の残りがゆっくりと添加された。この反応混液は、氷温でさらに１時間撹拌され、その後溶媒は２０℃で真空（６０ｔｏｒｒ）蒸発乾燥されて油性物を生じた。この油性物は塩化メチレン（２５０ｍｌ）に溶解され、塩類溶液で３回洗われた。有機層が分離され、硫酸マグネシウム上で乾燥された。この固形物を濾過し、溶媒を蒸発乾燥させて油性物が得られた。この粗産物は焼結ガラスじょうご（６００ｍｌ）に入れたシリカを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製され、溶出剤として酢酸エチルが用いられた。Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンが油性物として得られた（２．０３ｇ、７６％）。
【００８７】
Ｆ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン。
【００８８】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（１．３１ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）はメタノール（６０ｍｌ）に溶解され、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ２−１００（４ｃｍ３、２．４ｍ．ｅｑ）が反応混液に添加された。この反応混液は２０℃で１時間撹拌され、次に氷温まで冷やされた。次に、この冷反応混液にｐＨ１２になるまでトリメチルアミン（５ｍｌ）をゆっくりと添加した。樹脂は濾過され、洗液がＵＶ吸収物質を含まなくなるまで３０％トリエチルアミン・エタノール溶液で洗われた。トルエン（５０ｍｌ）が洗液に添加され、溶媒は２４℃で真空（６０ｔｏｒｒ、次にｌｔｏｒｒ）蒸発乾燥され、残査が得られた。この残査を部分的に塩化メチレン（３０ｍｌ）に溶解し、この溶媒は分離用じょうごに移された。残査の残りは温水（６０℃）に溶解され、溶媒を冷却した後、これも分離用じょうごに加えられた。この２層系は抽出され、有機層が分離されて水で３回（３×１００ｍｌ）抽出された。まとめた水性抽出物は４０℃で真空（６０ｔｏｒｒ、次にｌｔｏｒｒ  Ｈｇ）蒸発乾燥されて油性物を生じ、これは無水ピリジン（５０ｍｌ）と供に蒸発乾燥された。この油性物は更に、５酸化リン存在下で一夜、２０℃で真空（ｌｔｏｒｒ  Ｈｇ）乾燥され、少量の不純物を含む黄色泡状のＮ６−ベンゾイル−９−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（１．０８ｇ、１００％）が得られた。
【００８９】
Ｇ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン。
【００９０】
少量の不純物を含むＮ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（１．０８ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）は、アルゴンガス中で無水ピリジン（２０ｍｌ）に溶解され、乾燥したトリエチルアミン（０．５２ｍｌ、３．７６ｍｍｏｌ）が添加され、続いて４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（１．１３ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）が添加された。２０℃で４時間撹拌した後、反応混液は分離用じょうごに移され、ジメチル・エーテル（４０ｍｌ）が添加されて白色懸濁液が生じた。この混合物を水で３回（３×１０ｍｌ）洗い、有機層が分離されて硫酸マグネシウム上で乾燥された。この溶液にトリメチルアミン（１ｍｌ）が添加され、２０℃で真空（６０ｔｏｒｒ  Ｈｇ）蒸発乾燥されて油性物を生じ、これはトリメチルアミン（１ｍｌ）を含むトルエン（２０ｍｌ）と供に蒸発乾燥された。この粗産物は、シリカ及び酢酸エチル−トリエチルアミン（９９：１、ｖ／ｖ）に続いて酢酸エチル−メタノール−トリエチルアミン（８０：１９：１）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製され、２つの画分の産物を生じた。この画分は２０℃で真空（６０ｔｏｒｒ、次にｌｔｏｒｒ  Ｈｇ）蒸発乾燥されて泡を生じ、これは更に水酸化ナトリウム共存の下、２０℃で真空（ｌｔｏｒｒ  Ｈｇ）乾燥され、泡状のＮ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（１．０２ｇ、５２％）が得られた。
【００９１】
Ｈ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト。
【００９２】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（１．２６ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）はアルゴンガス中で無水ジクロロメタン（１３ｍｌ）に溶解され、ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍｌ、４．６６ｍｍｏｌ）が添加され、この反応混液は氷温まで冷却された。クロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（０．８８ｍｌ、４．０３ｍｍｏｌ）がこの反応混液に添加され、これは２０℃まで暖められ、３時間撹拌された。酢酸エチル（８０ｍｌ）及びトリエチルアミン（１ｍｌ）が添加され、この溶液は塩類溶液で３回（３×２５ｍｌ）洗われた。有機層が分離され、硫酸マグネシウム上で乾燥された。固形物の濾過をした後、溶媒は２０℃で真空蒸発乾燥されて油性物を生じ、これはシリカ及び溶出剤としてヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン（５０：４９：１）で精製された。この画分を２０℃で真空蒸発乾燥することにより泡が得られ、これは無水ピリジン（２０ｍｌ）と供に２６℃で真空（ｌｔｏｒｒ）蒸発乾燥され、更に水酸化ナトリウム共存の下、２０℃で２４時間真空（ｌｔｏｒｒ  Ｈｇ）乾燥する事により、泡状のＮ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト（１．０５ｇ、６３％）が得られた。
【００９３】
Ｉ．  ２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【００９４】
２，２’−シクロウリジンを、ジオキサン中で７０％フッ化水素／ピリジン溶液と、１２０℃で１０時間処理し、溶媒を除去すると７５％の収率で２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンが得られる。５’−ＤＭＴ及び３’−シアノエトキシジイソプロピルホスホアミダイト誘導化ヌクレオシドは標準的な文献による方法、即ちＭ．Ｊ．ガイトら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、（ＩＲＬ出版、ワシントン、ＤＣ、１９８４）あるいは実施例１Ａの方法により得られる。
【００９５】
Ｊ．  ２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【００９６】
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンは、トリアゾロ中間体を経て対応するシチジン類似体に転換され、これは次にアミノ化される。次に、ヘテロシクルはＮ４−ベンゾイル化によって保護される。５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシ−トリチル）−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）は、実施例１Ａに従って調製することができる。
【００９７】
Ｋ．  ９−（３’，５’−［１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９８】
グアノシンの３’及び５’位は、Ｍ．Ｊ．ウィルソン、Ｊ．Ｓ．，ソウヤー、Ｌ．及びジェイムス、Ｍ．Ｎ．Ｇ．（１９８３）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、６１：１９１１の方法により、ＴＰＤＳ（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル）保護基の添加によって保護された。撹拌されたＤＭＳＯ（１６０ｍｌ）及び無水酢酸（２０．０ｍｌ、２１２ｍｍｏｌ）溶液に，ＴＰＤＳグアノシン（２１．０ｇ、０．０４０ｍｏｌ）が添加された。反応液は室温で３６時間撹拌され、次に０℃に冷却された。冷エタノール（４００ｍｌ、９５％）が添加され、反応混液は更にドライアイス／アセトン浴中で−７８℃に冷却された。ＮａＢＨ４（２．０ｇ、１．３２ｍｏｌ．ｅｑ）が添加された。この反応液は−２℃まで冷やされ、−２℃で３０分間撹拌されて再び−７８℃に冷却された。この操作を更に２回繰り返した。ＮａＢＨ４添加完了後、反応液は氷温で３０分間、次に室温で１時間撹拌された。この反応液にＥｔＯＡｃ（１１）加え、飽和食塩水で２回洗った。有機層は硫酸マグネシウム上で乾燥され、室温で蒸発乾燥された。この残りをトルエンと供に２回蒸発乾燥し、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（９０：１０）を溶出剤として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。これらの画分を蒸発乾燥する間に、適当なカラム画分から沈澱された６．０２ｇの純粋な産物及び、それに加えて１１．４９ｇの産物が、この画分を蒸発乾燥した残査として得られた。
【００９９】
Ｌ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−［１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１００】
９−（３’，５’−［１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（６．５ｇ、０．０１２４８ｍｏｌ）はアルゴンガス中で無水ピリジン（１５６ｍｌ）に溶解された。ＤＭＡＰ（９．１５ｇ）が添加された。無水イソ酪酸（６．１２ｍｌ）をゆっくりと添加し、反応混液は室温で一夜撹拌された。この反応混液は飽和冷ＮａＨＣＯ３（１５６ｍｌ）に注がれ、１０分間撹拌された。この水溶液はＥｔＯＡｃ（１５６ｍｌ）で３回抽出された。有機層は飽和ＮａＨＣＯ３で洗い、室温で蒸発乾燥された。この残査を室温でトルエンと供に蒸発乾燥した。残査は、ＣＨ２Ｃｌ２−アセトン（８５：１５）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製され、５．６７ｇ（６８％）の産物が得られた。
【０１０１】
Ｍ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１０２】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−［１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（９．８３ｇ、０．０１４７６ｍｏｌ）はアルゴンガス中、室温で無水ＴＨＦ（８７．４ｍｌ）に溶解された。ＴＨＦ中、ＩＭのＮ（ｎＢｕ）４Ｆ（２９．５２ｍｌ、２ｅｑ．）が添加され、この混合液は３０分間撹拌された。この反応混液は室温で蒸発乾燥され、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（８５：１５）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製され、４．９８ｇ（８０％）の産物が得られた。
【０１０３】
Ｎ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１０４】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（４．９ｇ）はアルゴンガス中、室温で無水１，４−ジオキサン（９８ｍｌ）に溶解された。ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（０．９７ｇ、．４４ｅｑ．）が添加され、続いて３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン、即ちＤＨＰ（９．３４ｍｌ、８．８ｅｑ．）が添加された。この混合液は２時間撹拌され、次に氷温まで冷却されて、反応を停止するために飽和ＮａＨＣＯ３（１２５ｍｌ）が添加された。反応混液は１２５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２の一部で３回抽出され、有機層はＭｇＳＯ４上で乾燥された。有機層は蒸発乾燥され、残査は最少量であるがシロップ状ではなく、透明な液体となるに充分な量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、ＣＨ２Ｃｌ２の１００倍量のヘキサンに滴下された。沈澱物が濾過されて５．５９ｇ（８１．５％）の産物が得られた。
【０１０５】
Ｏ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１０６】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（５．５８ｇ）は、室温でピリジン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（６５：３０：１５、５２ｍｌ）に溶解された。この溶液は氷温まで冷却され、ＥｔＯＨ−ＭｅＯＨ（９５：１５）に溶かした２ＮのＮａＯＨ  ５２ｍｌがゆっくりと添加され、続いて氷温で２時間撹拌された。氷酢酸がｐＨ６となるように添加された。次に飽和ＮａＨＣＯ３がｐＨ７となるように添加された。この混合液は室温で蒸発乾燥され、その残査はトルエンと供に蒸発乾燥された。この残査はＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）に溶解され、飽和ＮａＨＣＯ３で３回洗われた。有機層は蒸発乾燥され、残査はＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製され、３．８５ｇ（７８．３％）の産物が得られた。
【０１０７】
Ｐ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１０８】
Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（３．８４ｇ）は、アルゴンガス中、室温で無水ＣＨ２Ｃｌ２（７９ｍｌ）、無水ピリジン（５．０ｍｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（２．９３ｇ）に溶解された。この溶液は氷温まで冷却され、撹拌しながら無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．９９ｍｌ）がゆっくりと加えられた。この混合液は１時間撹拌され、次に１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３が注ぎ込まれた。水層は冷ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出された。有機層はＭｇＳＯ４上で乾燥され、室温で無水ＣＨ３ＣＮと供に蒸発乾燥されて粗産物が得られた。
【０１０９】
Ｑ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１１０】
実施例１−Ｐ由来の粗産物、即ちＮ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンは、アルゴンガス中、氷温で無水ＴＨＦ（１１３ｍｌ）に溶解された。ＴＨＦに溶かした（ピリジンと供に蒸発乾燥することにより乾燥された）１Ｍ無水Ｎ（ｎＢｕ）４Ｆ（３６．９５ｍｌ）を、撹拌しながら添加した。１時間後、更にＴＨＦに溶かした１Ｍ無水Ｎ（ｎＢｕ）４Ｆ（３６．９５ｍｌ）溶液（合計１０ｍｏｌ．ｅｑ．）が添加された。この混合液は氷温で５時間撹拌され、一夜−３０℃で凍結保存された。この反応混液は室温で蒸発乾燥され、残査はＣＨ２Ｃｌ２（１６０ｍｌ）に溶解され、脱イオン水で５回抽出された。有機層はＭｇＳＯ４上で乾燥され、蒸発乾燥された。残査はＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製され、５．２５ｇの産物が得られた。
【０１１１】
Ｒ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【０１１２】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（３．８５ｇ）は、室温でＭｅＯＨ（８０ｍｌ）に溶解された。あらかじめ洗ったＤｏｗｅｘ５０Ｗ樹脂１２．３２ｃｍ３を添加し、この混合物を室温で１時間撹拌した。樹脂は濾過され、濾過液は蒸発乾燥された。樹脂は透明になるまでピリジン−トリエチルアミン−Ｈ２Ｏ（１：３：３）で洗われた。この濾過液は蒸発乾燥され油性物を生じた。この２つの濾過液由来の残査をＨ２Ｏ（２００ｍｌ）中で合わせ、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で３回洗った。水層は蒸発乾燥され、この残査は熱ＭｅＯＨから再結晶されて白色結晶の最初の０．２９９ｇの産物が得られた。残りのＭｅＯＨ溶液はシリカゲルクロマトグラフィーで精製され、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（８０：２０）による溶出で、更に０．７８３ｇの産物が得られた。
【０１１３】
Ｓ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリチル］−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（１．０９ｇ）は、アルゴンガス中、室温でピリジン（２０ｍｌ）及びトリエチルアミン（０．５６ｍｌ）に溶解された。４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（１．２０ｇ、１．１５ｍｏｌａｒ  ｅｑ．）が添加され、この混合液は室温で５時間撹拌された。この混合液を分離用じょうごに移し、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍｌ）で抽出した。有機層は飽和ＮａＨＣＯ３で３回（７０ｍｌを分割）洗い、水層はＥｔ２Ｏで３回戻し抽出した。まとめられた有機層はＭｇＳＯ４上で乾燥され、溶液を塩基性に保つためにトリエチルアミン（４ｍｌ）が添加された。溶媒は蒸発乾燥され、残査はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製された。カラムはＥｔＯＡｃ−Ｅｔ３Ｎ（１００：１）で溶出され、次にＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ３Ｎ（９５：５：１）で溶出されて、１．０３ｇの産物が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ６．０９（ｄｄ、１、Ｈ１’、Ｊ１−２  ＝２．６１、Ｊ１’，Ｆ＝１６．２Ｈｚ）；δ５．２８（ｄｄｄ、１、Ｈ２’、Ｊ２’−Ｆ＝５２．８Ｈｚ）；δ４．３８（ｍ、１、Ｈ３’、Ｊ３’，Ｆ＝１９．８Ｈｚ）。
【０１１４】
Ｔ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリチル］グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト。
【０１１５】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリチル］−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（０．５８７ｇ）はアルゴンガス中、室温で無水ＣＨ２Ｃｌ２（３１ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍｌ）に溶解された。この溶液は氷温まで冷却され、クロロ（ジイソプロピルアミン）−β−シアノエトキシホスフィン（０．４２ｍｌ）がゆっくりと添加された。反応液は室温まで暖められ、３．５時間撹拌された。ＣＨ２Ｃｌ２−Ｅｔ３Ｎ（１００：１、３５ｍｌ）が添加され、この混合液は飽和ＮａＨＣＯ３（６ｍｌ）で１回洗われた。有機層はＭｇＳＯ４上で乾燥され、室温で蒸発乾燥された。残査は、２カラム容量のＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ−Ｅｔ３Ｎ（７５：２５：１）、続いてＨｅｘ−ＥｔＯＡｃ−Ｅｔ３Ｎ（２５：７５：１）、最後にＣＨ２Ｃｌ２−Ｅｔ３Ｎを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製された。産物を含む画分は保存され、室温で蒸発乾燥された。その結果生じた油性物はＣＨ３ＣＮと供に２回蒸発乾燥され、乾燥するために真空ポンプ内に一夜置かれた。この結果生じた白色の固体はＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解され、撹拌しているヘキサン（３００ｍｌ）に滴下された。生じた沈澱は濾過され、真空ポンプで乾燥されて０．６７３ｇ（８８％）の産物が得られた。３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５０．５、１５１．５。
【０１１６】
実施例２  ２’−デオキシ−２’−シアノ修飾オリゴヌクレオチドの調製。
【０１１７】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−シアノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１１８】
２’−デオキシ−２’−シアノアデノシンは、２’−デオキシ−２’−ヨード−３’，５’−Ｏ−（ジシロキシテトライソプロピル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシンの２’−ヨード基を、Ｋ．Ｅ．ＢパークスとＫ．テイラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９：２９９５−２９９６（１９８８）によって述べられたものと同様な方法に従って、遊離ラジカル置換することにより調製される。２’−デオキシ−２’−ヨードアデノシンは、Ｒ．ランガナーサンによってＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１２９１−１２９４（１９７７）に述べられた様にして調製され、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３部、ｐｐ．２２２−２３１、タウンセンド、Ｌ．Ｂ．；ティプソン、Ｒ．Ｓ．編（Ｊ．ワイリー・アンド・サン社、ニューヨーク、１９８６）においてＷ．Ｔ．マーキヴィッツとＭ．ヴイウィロフスキーが述べる様にしてジシリル化された。この物質は、トリエン中でヘキサメチルジチン、ＡＩＢＮ及びｔ−ブチルイソシアン酸によって処理され、保護された２’−デオキシ−２’−シアノアデノシンが得られた。この物質は選択的脱保護を行った後、実施例１Ａに記載の様に、その５’−ＤＭＴ−３’−ホスホアミダイトに転換される。
【０１１９】
Ｂ．  ２’−デオキシ−２’−シアノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１２０】
上述のように３’，５’−ジシリル化された２’−デオキシウリジン（または５−メチルウリジン）は、Ｋ．Ｅ．ＢパークスとＫ．テイラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９：２９９５−２９９６（１９８８）に記載のトリフェニルホスホニウム・メチルヨウ化物によって、２’−ヨード誘導体に転換された。Ｋ．Ｅ．ＢパークスとＫ．テイラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９：２９９５−２９９６（１９８８）に記載の遊離ラジカル反応条件の適用により、保護されたヌクレオシドの２’−シアノ基が得られる。上述のような、この物質の脱保護とそれに続いての保護された単量体への転換により、所望の核酸合成機用の材料が提供される。
【０１２１】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−シアノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１２２】
２’−デオキシ−２’−ヨードシチジンは、従来のケトからアミノ転換により、対応する上述のウリジン化合物から得られる。
【０１２３】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−シアノ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１２４】
２’−デオキシ−２’−シアノグアノシンは、３’，５’−ジシリル化されたＮ２−イソブチリルグアノシンの２’−上位（アラビノ糖）におけるトリフレート基置換によって得られる。標準的な脱保護及びそれに続く再保護により、表題の単量体が得られる。
【０１２５】
実施例３  −  ２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメチル）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【０１２６】
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチルリボシドは、Ｑ．−Ｙ．チェンとＳ．Ｗ．ウーにより、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３８５−２３８７（１９８９）において述べられた文献の方法の修飾法によって調製される。実施例１Ａ記載の標準的方法は、以下に挙げた５’−ＤＭＴ及び３’−ホスホアミダイトを調製するために用いられた。
【０１２７】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１２８】
Ｂ．  ２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１２９】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３０】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３１】
実施例４  −  ２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【０１３２】
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチルリボシドは、Ｂ．Ｓ．スプロートら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：４１−４９（１９９０）及びＨ．イノウエら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１３１−６１４８（１９８７）において述べられた文献の方法の修飾法によって調製される。実施例１Ａ記載の標準的方法は、以下に挙げた５’−ＤＭＴ及び３’−ホスホアミダイトを調製するために用いられた。
【０１３３】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３４】
Ｂ．  ２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３５】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３６】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１３７】
実施例５  −  ２’−デオキシ−２’−（１−プロプロキシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【０１３８】
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２’−デオキシ−２’−Ｏ−プロピル  リボシドは、Ｂ．Ｓ．スプロートら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：４１−４９（１９９０）及びＨ．イノウエら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１３１−６１４８（１９８７）において述べられた文献の方法の修飾法によって調製される。実施例１Ａ記載の標準的方法は、以下に挙げた５’−ＤＭＴ及び３’−ホスホアミダイトを調製するために用いられた。
【０１３９】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−（１−プロプロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４０】
Ｂ．  ２’−デオキシ−２’−（１−プロプロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４１】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−（１−プロプロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４２】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−（１−プロプロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４３】
実施例６  −  ２’−デオキシ−２’−（ビニロキシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製  。
【０１４４】
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２’−デオキシ−２’−Ｏ−ビニルリボシドは、Ｂ．Ｓ．スプロートら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：４１−４９（１９９０）及びＨ．イノウエら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１３１−６１４８（１９８７）において述べられた文献の方法の修飾法によって調製される。この場合、１，２−ジブロモエタンは、２’−水酸基とカップルされ、続くデヒドロブロム化により所望のブロックされた２’−ビニルヌクレオシドが得られる。実施例１Ａ記載の標準的方法は、以下に挙げた５’−ＤＭＴ及び３’−ホスホアミダイトを調製するために用いられた。
【０１４５】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−（ビニロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４６】
Ｂ．２’−デオキシ−［２’−（ビニロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４７】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−（ビニロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４８】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−（ビニロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１４９】
実施例７  −  ２’−デオキシ−２’−（アリロキシ）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【０１５０】
核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）及びＣの所望の２’−デオキシ−２’−Ｏ−アリルリボシドは、Ｂ．Ｓ．スプロートら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：４１−４９（１９９０）及びＨ．イノウエら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１３１−６１４８（１９８７）において述べられた文献の方法の修飾法によって調製される。実施例１Ａ記載の標準的方法は、以下に挙げた５’−ＤＭＴ及び３’−ホスホアミダイトを調製するために用いられた。
【０１５１】
Ａ．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−（アリロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１５２】
Ｂ．  ２’−デオキシ−２’−（アリロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１５３】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−（アリロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１５４】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−（アリロキシ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）。
【０１５５】
実施例  ８  −２’−デオキシ−２’−（メチルチオ）、（メチルスルフィニル）及び（メチルスルホニル）修飾されたオリゴヌクレオチドの調製。
【０１５６】
Ａ．  ２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン
２，２’−無水ウリジン（１５．５ｇ、６８．２ｍｍｏｌ）［ラオ、Ｔ．Ｓ．とリーズ、Ｃ．Ｂ．（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、９９７］、メタンチオール（１５．７ｇ、３２７ｍｍｏｌ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（３９．２ｇ、３４１ｍｍｏｌ）及びジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）が一緒に６０℃で加熱された。１２時間後、反応混液は冷却され、減圧下で濃縮された。残った油性物はシリカゲル（３００ｇ）を用いたフラッシュカラムクロマトで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を濃縮し、残査を高真空下で乾燥させると、薄い黄色固体状の２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン（１４．１１ｇ、７５．４％）が得られた。（イマザワ、Ｍ．、ウエダ、Ｔ．、及びウキタ、Ｔ．（１９７５）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２３：６０４によって報告されたように）エタノールーヘキサンからのこの固体の結晶化の試みは失敗し、この材料は吸湿性の泡となった。
【０１５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−ｄ６）δ２．０（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．３４（１Ｈ、ｄｄ，Ｊ３’，２’＝５４．Ｈｚ、２’Ｈ）、３．５９（２Ｈ、ｂｒ  ｍ、５’ＣＨ２）、３．８４（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、４．２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ３’，４’＝２．２Ｈｚ、３’Ｈ）、５．１５（１Ｈ、ｔ、５’ＯＨ）、５．６２（１Ｈ、ｔ、３’ＯＨ）、５．６４（１Ｈ、ｄ、ＪＣ６，Ｃ５＝８．２Ｈｚ）、６．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ１’，２’＝６Ｈｚ、１’Ｈ）、７．８２（１Ｈ、ｄ、ＪＣ５，Ｃ６＝８．２Ｈｚ、Ｃ６Ｈ）、１１．３８（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１５８】
Ｂ．  ２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
ヘキサメチルホスホアミド（１７５ｍｌ）に溶かした５−メチルウリジン（１６．７７ｇ、６９．２ｍｍｏｌ）、ジフェニル炭酸塩（１７．８ｇ、８３．１ｍｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（１００ｍｇ）の混合物は、ＣＯ２の発生が終わるまで（約１時間）撹拌しながら１５０℃に加熱された。反応混液は冷却され、撹拌しながらジメチルエーテル（１１）に注がれ、茶色のガム状物質ができた。ジメチルエーテルを用いて洗浄を繰り返す（４×２５０ｍｌ）ことにより、麦わら色の吸湿性粉末が得られた。この固形物は、シリカゲル（４００ｇ）のショートカラムクロマトグラフィーによって精製された。ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（８５：１５、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を保存して濃縮すると、２２６−２２７℃の融点を持つ長い針状の結晶がＥｔＯＨから結晶化されるところの、麦わら色の固形状の表題にある化合物が得られた（１２ｇ、７７．３％）。
【０１５９】
Ｃ．  ２’−デオキシ−２’−メチルチオ−５−メチルウリジン
２．２’−無水−５−メチルウリジン（１７．０２ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）、メタンチオール（１６．３ｇ、３３９ｍｍｏｌ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（４０．６ｇ、３５３ｍｍｏｌ）及びジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）は、一緒に６０℃で加熱された。１２時間後、産物は減圧下で冷却及び濃縮された。そこで残った油性物はショートシリカゲル（３００ｇ）カラムクロマトグラフィーで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（９３：７、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を濃縮すると、表題にある白色の泡状化合物（１５．０８ｇ、７４．１％）が得られた。Ｅｔ−ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２からの結晶化により白色の針状結晶が得られた。
【０１６０】
Ｄ．  ２’−デオキシ−２’−メチルスルフィニルウリジン
撹拌した２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン（１ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍｌ）に対して、０℃で４５分にわたり、ｍ−塩化過安息香酸（５０％、１．２６ｇ、３．６５ｍｍｏｌの５０ｍｌ  ＥｔＯＨ溶液）が添加された。この溶液は真空下で除かれ、残査がショートシリカゲル（３０ｇ）カラムクロマトグラフィーで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（７５：２５、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を濃縮すると、表題にある白色の固形化合物（０．６５ｇ、６１．４％）が得られた。ＥｔＯＨからの結晶化により、２１９−２２１℃の融点を持つ白色の顆粒が得られた。
【０１６１】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−ｄ６）δ２．５（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．５６（２Ｈ、ｂｒ  ｓ、５’ＣＨ２）、３．８（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、３．９１（１Ｈ、ｍ、２’Ｈ）、４．５７（１Ｈ、ｍ、３’Ｈ）、５．２（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、５’ＯＨ）、５．７５（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、６．１９（１Ｈ、ｄ、３’ＯＨ）、６．３５（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．８８（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）、１１．４３（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１６２】
Ｅ．  ２’−デオキシ−２’−メチルスルホニルウリジン
撹拌した２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン（１ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍｌ）に対して、ｍ−塩化過安息香酸（５０％、３．２７ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）が室温において１回で添加された。２時間後、溶液は白色の沈澱を集めるために濾過され、これを洗い（ＥｔＯＨで２×２０ｍｌ、Ｅｔ２０で２×２０ｍｌ）、乾燥することにより２２７−２２８℃の融点を持つ細かい粉末状の、表題にある化合物（０．７６ｇ、６８％）が得られた。
【０１６３】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−ｄ６）δ３．１（３Ｈ、ｓ、ＳＯ２ＣＨ３）、３．５８（２Ｈ、ｍ、５’ＣＨ２）、３．９５（１Ｈ、ｍ、２’Ｈ）、３．９８（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、４．５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、３’Ｈ）、５．２（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、５’ＯＨ）、５．７５（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、６．２５（１Ｈ、ｄ、３’ＯＨ）、６．５（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．８（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）、１１．４５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１６４】
Ｆ．  ２’−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオウリジン
乾燥させたピリジン（１０ｍｌ）に溶解した２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン（１．０９ｇ、４ｍｍｏｌ）溶液に対し、撹拌しながら室温で４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（１．６９ｇ、５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（５０ｍｇ）が添加された。この溶液は１２時間撹拌され、ＭｅＯＨ（１ｍｌ）を添加することにより反応が止められた。反応混液を真空下で濃縮させ、残査はＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）に溶解して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍｌ）、飽和食塩水（２×５０ｍｌ）で洗い、（ＭｇＳＯ４上で）乾燥した。この溶液は真空下で濃縮され、残査はシリカゲル（３０ｇ）カラムクロマトグラフィーで精製された。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：トリエチルアミン（８９：１：１、ｖ／ｖ）による溶出で、均質な材料として表題にある化合物が得られた。適当な画分を保存し、濃縮することにより、泡状の５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシド（１．５ｇ、６６．５％）が得られた。
【０１６５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＳＯ−ｄ６）δ２．０２（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．１５−３．５５（１Ｈ、ｍ、２’ＣＨ）、３．７５（６Ｈ、ｓ、２  ＯＣＨ３）、３．９７（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、４．２４（１Ｈ、ｍ、３’Ｈ）、５．４８（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、５．７３（ＩＨ、ｄ、３’−ＯＨ）、６．０３（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、６．８２−７．４（１３Ｈ、ｍ、ＡｒＨ）、６．６５（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）１１．４（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１６６】
Ｇ．  ２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオウリジン
乾燥させたＴＨＦ（２５ｍｌ）に溶解した２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオウリジン（１．５ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）溶液に対し、撹拌しながらジイソプロピルエチルアミン（１．４ｍｌ、８ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を０℃で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミジル酸塩化物（１．２６ｍｌ、５．３４ｍｍｏｌ）が、１５分にわたって滴下された。次にこの反応液を室温で２時間撹拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ、１％トリエチルアミンを含む）を添加し、この溶液を飽和食塩水（２×５０ｍｌ）で洗い、有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥した。溶媒を真空下で除き、残査はショートシリカゲル（３０ｇ）カラムクロマトグラフィーで精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：トリエチルアミン（９８：１：１、ｖ／ｖ）による溶出で、ジアステレオ異性体の混合物として産物が得られた。適当な画分を蒸発乾燥することにより、泡状の表題にある化合物が得られた（１．３２ｇ、６４．７％）。
【０１６７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．０及び２．０２（３Ｈ、２ｓ、ＳＣＨ３）、５．３及び５．３５（１Ｈ、２ｄ、Ｃ５Ｈ）、６．２３（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．８及び７．７８（１Ｈ、２ｄ、Ｃ６Ｈ）及び他のプロトン。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５１．６８及び１５２．２ｐｐｍ。
【０１６８】
Ｈ．  ２’−デオキシ−３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−メチルチオウリジン
２’−デオキシ−２’−メチルチオウリジン（５．０ｇ、１８．２４ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（５．６ｍｌ、５４．７４ｍｍｏｌ）は、室温で１２時間、乾燥ピリジン（３０ｍｌ）中で撹拌された。次に、この産物を減圧下で濃縮し、得られた残査をショートシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を合わせて減圧下で蒸発乾燥し、残査をＥｔＯＨから結晶化することにより、表題にある１３２℃の融点を持つ白色の針状の産物（６．０ｇ、９１．８％）が得られた。
【０１６９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．１７（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、２．２０（６Ｈ、ｓ、２  ＣＯＣＨ３）、３．４０（１Ｈ、ｔ、２’Ｈ）、４．３１−４．４０（３Ｈ、ｍ、４’，５’Ｈ）、５．３１（１Ｈ、ｍ、３’Ｈ）、５．８０（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、６．１１（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．４５（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）、８．７（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１７０】
Ｉ．  ２’−デオキシ−３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２’−メチルチオウリジン
トリエチルアミン（８．４ｍｌ、６０．３ｍｍｏｌ）及びリン酸塩化物（１．２ｍｌ、１２．９ｍｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ（５０ｍｌ）に溶解した２’−デオキシ−３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−メチルチオウリジシ（４．６ｇ、１３ｍｍｏｌ）溶液に撹拌しながら添加した。次に、１，２，４−トリアゾール（４．１４ｇ、５９．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を室温で撹拌した。１６時間後、この産物にトリエチルアミン−水（６：１、ｖ／ｖ；２０ｍｌ）に続き、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ）を加え、生じた混合液をＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で蒸発乾燥した。この残査をショートシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で溶出された適当な画分を減圧下で蒸発乾燥し、残査をＥｔＯＨから結晶化することにより、表題にある１２７−１３０℃の融点を持つ青白色針状の産物（３．０１ｇ、５６．４％）が得られた。
【０１７１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．１８（６Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ３）、２．３０（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．６７（１Ｈ、ｍ、２’Ｈ）、４．３８−４．５０（３Ｈ、ｍ、４’，５’Ｈ）、５．１７（１Ｈ、ｔ、３’Ｈ）、６．２１（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．０８（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、８．１６（１Ｈ、ｓ、ＣＨ）、８．３３（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）、９．２５（１Ｈ、ｓ、ＣＨ）。
【０１７２】
Ｊ．  ２’−デオキシ−２’−メチルチオシチジン
２’−デオキシ−３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２’−メチルチオウリジン（３．０ｇ、７．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨのアンモニア飽和溶液（７０ｍｌ）に溶解し、この溶液を圧力容器に入れ、室温で３日間撹拌した。次にこの産物を減圧下で濃縮し、残査をＥｔＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２から結晶化して２０１℃の融点を持つ結晶として、表題にある化合物（１．０６ｇ、５１．７％）が得られた。
【０１７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−ｄ６）δ１．９５（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．３６（１Ｈ、ｍ、２’Ｈ）、３．５５（２Ｈ、ｍ、５’ＣＨ２）、３．８２（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、４．１８（１Ｈ、ｄｄ、３’Ｈ）、５．７５（１Ｈ、ｄ、Ｃ５Ｈ）、６．１（１Ｈ、ｄ、１’Ｈ）、７．７７（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）。Ｃ１０Ｈ１５Ｎ３Ｏ４Ｓに関する分析計算値：Ｃ、４３．９４；Ｈ、５．５３；Ｎ、１５．３７；Ｓ、１１．７３。実測値、Ｃ、４４．０７；Ｈ、５．４５；Ｎ、１５．４７；Ｓ、１１．８０。
【０１７４】
Ｋ．  ２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−２’−メチルチオシチジン
乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に溶かした２’−デオキシ−２’−メチルチオシチジン（０．８６ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）溶液に対し、トリメチルクロロシラン（２．０ｍｌ、１５．７５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。この溶液にベンゾイル塩化物（２．１８ｍｌ、１８．９ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。次にこの混合液を氷浴中で冷却し、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を添加した。５分後、ＮＨ４ＯＨ（２０ｍｌ、３０％水溶液）を添加し、この混合液を３０分間撹拌した。次にこの反応混液を真空下で濃縮し、残査をショートシリカゲル（７０ｇ）クロマトグラフィーで精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で浴出し、適当な画分を分取して蒸発乾燥することにより、表題の化合物が得られ、これはＥｔＯＨから１９３−１９４℃の融点を持つ針状結晶として結晶化された。
【０１７５】
Ｌ．  Ｎ４−ベンゾイルアミノ−１−［２−デオキシ−５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−メチルチオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ピリミジン−３（２Ｈ）−オン（または２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオシチジン）
乾燥ピリジン（１０ｍｌ）に溶かした２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−２’−メチルチオシチジン（０．８０ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）溶液に、４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（１．１６ｇ、３．４１ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）を室温で撹拌しながら添加した。この溶液を２時間撹拌し、産物を真空下で濃縮した。この残査ＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍｌ）、飽和食塩水（２×５０ｍｌ）で洗い、（ＭｇＳＯ４上で）乾燥し、減圧下で蒸発乾燥した。この残査はショートシリカゲル（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーで精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：トリエチルアミン（９９：１、ｖ／ｖ）で浴出し、適当な画分を分取して濃縮することにより、白色泡状の表題の化合物（１．２９ｇ、９０％）が得られた。
【０１７６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．１（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．５（１Ｈ、ｍ、２’Ｈ）、３．７５（６Ｈ、ｓ、ＯＣＨ３）、４．１５（１Ｈ、ｍ、４’，Ｈ）、４．４（１Ｈ、ｔ、３’Ｈ）、５．７４（１Ｈ、ｂｒ、３’ＯＨ）、６．１５（１Ｈ、ｄ、Ｃｌ’Ｈ）、６．８−８．０（２５Ｈ、ｍ、ＡｒＨ及びＣ５Ｈ）、８．２４（１Ｈ、ｄ、Ｃ６Ｈ）、１１．３（１Ｈ、ｂｒ  ｓ、ＮＨ）。
【０１７７】
Ｍ．  ２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−３−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ’（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオシチジン
２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオシチジン（１．４１ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）は、上の実施例８−Ｇ記載のようにして、乾燥ＴＨＦ（２５ｍｌ）中でジイソプロピルエチルアミン（１．４ｍｌ、８ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミド塩化物（１．２６ｍｌ、５．３４ｍｍｏｌ）で処理された。この粗産物をショートシリカゲル（５０ｇ）クロマトグラフィーで精製し、ＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン：トリエチルアミン（８９：１０：１、ｖ／ｖ）で溶出することにより、表題の産物が得られた。適当な画分を混合し、減圧下で蒸発乾燥することにより、白色泡状の表題の化合物（１．３０ｇ、７１％）（ジアステレオ異性体の混合物）が得られた。
【０１７８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．３１（３Ｈ、ｓ、ＳＣＨ３）、３．４５−３．７（３Ｈ、ｍ、２’Ｈ及び５’ＣＨ２）、３．８３（６Ｈ、ｓ、ＯＣＨ３）、４．２７−４．３５（１Ｈ、ｍ、４’Ｈ）、４．６−４．８（１Ｈ、ｍ、３’Ｈ）、６．３５（１Ｈ、２ｄ、１’Ｈ）、６．８２−７．８（２５Ｈ、ｍ、ＡｒＨ及びＣ５Ｈ）、８．３８及び８．４５（１Ｈ、２ｄ、Ｃ６Ｈ）、及び他のプロトン。３１Ｐ  ＮＭＲ  δ１５１．０３及び１５１．０８ｐｐｍ。
【０１７９】
Ｎ．  ２’−デオキシ−２’−メチルスルフィニルシチジン
実施例８−Ｊの２’−デオキシ−２’−メチルチオシチジンを実施例８−Ｄの方法で処理することにより、複雑な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを有するジアステレオ異性体混合物として表題の化合物が得られた。
【０１８０】
Ｏ．  ２’−デオキシ−２’−メチルスルホニルシチジン
実施例８−Ｊの２’−デオキシ−２’−メチルチオシチジンを実施例８−Ｅの方法によって処理することにより、表題の化合物が得られた。
【０１８１】
Ｐ．  Ｎ６−ベンゾイル−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシン
実施例１−Ｄ由来のＮ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンは、表題の化合物を得るために、テトラメチルグアニジン存在下でメタンチオールにより処理することにより調製された。
【０１８２】
Ｑ．  Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシン
実施例８−Ｐ由来のＮ６−ベンゾイル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシンは実施例１−Ｆによって処理され、表題の化合物が得られた。
【０１８３】
Ｒ．  Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルスルフィニルアデノシン
実施例８−Ｑ由来のＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシンは、実施例８−Ｄの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１８４】
Ｓ．  Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルスルホニルアデノシン
実施例８−Ｑ由来のＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシンは実施例８−Ｅの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１８５】
Ｔ．  Ｎ２−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−２’−デオキシ−２’−メチルチオグアノシン
実施例１−Ｐ由来のＮ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンは、１，１，３，３，−テトラメチルグアニジン存在下でメタンチオールと処理することにより、表題の化合物が得られた。
【０１８６】
Ｕ．  Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−メチルチオグアノシン
Ｎ２−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−２’−デオキシ−２’−メチルチオグアノシンは、実施例１−Ｒにより処理されて表題の化合物が得られた。
【０１８７】
Ｖ．  Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−メチルスルフィニルグアノシン
実施例８−Ｕ由来のＮ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−メチルチオグアノシンは実施例８−Ｄの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１８８】
Ｗ．  Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−メチルスルホニルグアノシン
実施例８−Ｕ由来のＮ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−メチルチオグアノシンは実施例８−Ｅの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１８９】
Ｘ．  ２’−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルスルフィニルウリジン
実施例８−Ｄ由来の２’−デオキシ−２’−メチルスルフィニルウリジンは実施例８−Ｆの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９０】
Ｙ．  ２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルスルフィニルウリジン
２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルスルフィニルウリジンは、実施例８−Ｇの方法により処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９１】
Ｚ．  Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオアデノシン
上述の実施例８−Ｑ由来のＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−メチルチオアデノシンは実施例８−Ｆにより処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９２】
ＡＡ．  Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオアデノシン
Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオアデノシンは、実施例８−Ｇにより処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９３】
ＢＢ．  ２’−デオキシ−Ｎ２−イソブチリル−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオグアノシン
上述の実施例８−Ｕ由来の２’−デオキシ−Ｎ２−イソブチリル−２’−メチルチオグアノシンは、実施例８−Ｆにより処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９４】
ＣＣ．  ２’−デオキシ−Ｎ２−イソブチリル−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルチオグアノシン
２’−デオキシ−Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメチルトリチル）−２’−メチルチオグアノシンは、実施例８−Ｇにより処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９５】
ＤＤ．  ２’−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルスルホニルウリジン
上述の実施例８−Ｅ由来の２’−デオキシ−２’−メチルスルホニルウリジンは、実施例８−Ｆにより処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９６】
ＥＥ．  ２’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−Ｏ−β−シアノエチルホスホアミド］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−メチルスルフィニルウリジン
２’−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメチルトリチル）−２’−メチルスルホニルウリジンは、実施例８−Ｇによって処理され、表題の化合物が得られた。
【０１９７】
実施例９−  チミンまたはシトシン（ピリミジン型塩基）のそのβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−置換エリトロ−ペントフラノシル  ヌクレオシドへの化学的変換；２’−置換リボシル化）
チミンまたはシトシン型の類似体を、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）および酸触媒（すなわち、塩化アンモニウム）のような標準的な条件下でトリメチルシリル化し、次に、ルイス酸触媒（すなわち塩化第二スズ、ヨウ素、テトラフルオロホウ酸ホウ素、など）の存在において塩化３，５−Ｏ−ジトルオイル−２−デオキシ−２−置換−α−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシルで処理する。特異的な手順が、最近、ジェイ・エヌ・フレスコス（Ｊ．Ｎ．Ｆｒｅｓｋｏｓ），
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ８：１０７５−１０７６（１９８９）によって開示されたが、この方法では沃化銅（Ｉ）が使用される触媒である。
【０１９８】
実施例１０−  アデニンまたはグアニン（プリン型塩基）の、そのβ−Ｄ−２’−デオキシ２’−置換−エリトロ−ペントフラノシル  ヌクレオシドへの化学的変換；２’−置換リボシル化）
保護されたプリン型類似体を、アセトニトリル中の水素化ナトリウムによってそのナトリウム塩に変え、次に周囲温度で塩化３，５−Ｏ−ジトルオイル−２−デオキシ−２−置換−α−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシルで処理する。特異的な手順が最近、アール・ケイ・ロビンス（Ｒ．Ｋ．Ｒｏｂｉｎｓ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １０６：６３７９（１９８４）によって開示された。
【０１９９】
実施例１１−２’−デオキシ−２−置換チミジンの、相当する２’−デオキシ−２’−置換シチジンへの変換（ピリミジン型４−ケト基の４−アミノ基への化学的変換）
２’修飾ヌクレオシド型の３’，５’−糖ヒドロキシル基を、酸の塩化物または無水物およびピリジン／ジメチルアミノピリジン溶媒および触媒の標準条件を用いてトルオイル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチル、イソブトリル、トリフルオロアセチルなどのようなアシル基によって保護する。保護されたヌクレオシドを今度は、ピリジンまたはその他の適当な塩基性溶媒中の塩化チオニルまたは塩化ホスホリルで塩素化する。ピリミジン型４−クロロ基を、ここでメタノール中のアンモニウムで置換する。糖ヒドロキシル基の脱保護も起こる。このアミノ基を標準２段階完全ベンジル化法によってベンゾイル化し（糖ヒドロキシルおよびアミノ基）、水酸化ナトリウム水溶液によってアシルを選択的に除去する。
【０２００】
別法として、最初の、糖ヒドロキシルを後続のアシル化から保護するためのヌクレオシドのクロロトリメチルシランおよび塩基によるｉｎ ｓｉｔｕ処理法を使用することができる。ケイ・ケイ・オギルビー（Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ），Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６７：８３１−８３９（１９８９）。もう一つの変換方法は、ピリミジン型４−クロロ基を、１，２，４−トリアゾロ基によって置換することであり、この基はＤＮＡ合成装置でのオリゴヌクレオチド合成中、無傷のままであり、ＣＰＧ支持体からオリゴヌクレオチドを除去する水酸化アンモニウム段階および複素環の脱保護中にアンモニウムによって置換される。さらに、多くの場合に、ピリミジン型４−クロロ基は、ここに記載するように利用され、オリゴヌクレオチド合成の終わりに置換されることができる。
【０２０１】
実施例１２−  ＣＰＧ支持体に結合したヌクレオシドの５’−ヒドロキシルへの２’−デオキシ−２’−置換５’−ジメトキシトリフェニルメチルリボヌクレオシドの結合法
特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端３’−位にあるであろう２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシドをその５’−ＤＭＴとして保護し（シトシンおよびアデニン環外アミン基をベンゾイル化し、グアニン  アミノをイソブチリル化する）、ピリジンおよびジメチルアミノピリジン中のトリフルオロ−酢酸／ブロモ酢酸混合無水物で、５０℃で５時間処理する。この溶液を減圧、蒸発させて薄いシロップにし、これを酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルのカラムを通過させる。均一な分画を集めて、蒸発乾燥させた。アセトニトリル１０ｍｌ、３’−Ｏ−ブロモメチルエステル修飾したピリミジン  ヌクレオシド１０マイクロモル、およびピリジン／ジメチルアミノピリジン（１：１）１ｍｌの溶液をシリンジでゆっくり（６０ないし９０秒）ＣＰＧチミジンの１マイクロモルのカラム［アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）］に注入する（カラムは遊離の５’−ヒドロキシル基を得るための標準条件に従って前もって酸で処理した）。その他のヌクレオシドが結合したカラムを使用することができた。溶出液を集めて再びシリンジで注入してこのカラムを通す。この工程を３回くり返す。ＣＰＧカラムをアセトニトリル１０ｍｌでゆっくり洗浄した後、ＡＢＩ  ３８０Ｂ核酸合成装置にとりつける。オリゴヌクレオチド合成が今開始される。ＣＰＧ支持体からチミジンエステル結合を開裂させる濃水酸化アンモニウム脱保護の標準的な条件はまた、ピリミジン修飾したヌクレオシドを、最初にＣＰＧヌクレオシドに結合されたチミジンに連結させている３’，５’エステル結合をも開裂させる。このようにして、すべての２’−置換ヌクレオシドまたは一般的に複素環および／または糖中に修飾をもつすべてのヌクレオシドを、オリゴヌクレオチド配列のまさに３’−末端に結合させることができる。
【０２０２】
実施例１３−  ２’−デオキシ−２’−置換リボヌクレオシド−５’−ＤＭＴ−３’−ホスホアミダイトのオリゴヌクレオチドへの変換方法
２’−修飾オリゴヌクレオチドを製造するために、ビー・エス・スプロート（Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏａｔ）外、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１７：３３７３−３３８６（１９８９）のポリリボヌクレオチド固相合成法を用いる。
【０２０３】
２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基ヌクレオチドを有する配列ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＡＣのオリゴヌクレオチドは、この配列内の種々の位置に組み入れられた。第一のオリゴヌクレオチドにおいては、位置３，６，１０，１１および１４（５’から３’方向に数えた）のアデノシンヌクレオチドの各各を、２’−デオキシ−２’−フルオロ部分を包含するように修飾した。別のオリゴヌクレオチドでは、位置３，５，６，７，１０，１１，１３および１４のアデノシンおよびウリジンヌクレオチドをこのように修飾した。さらに別のオリゴヌクレオチドでは、位置１，３，４，５，６，７，９．１０，１１，１３および１４のアデノシン、ウリジンおよびシチジンヌクレオチドをこのように修飾し、さらに別のオリゴヌクレオチドでは、すべての位置のヌクレオチド（アデノシン、ウリジン、シチジンおよびグアノシン）をこのように修飾した。さらに、位置１，２，３，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１５および１６に、２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基成分を含むように修飾もされたアデノシン、ウリジンおよびシチジンヌクレオチドを有する、配列ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣを有するオリゴヌクレオチドが製造された。
【０２０４】
２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するヌクレオチドを組み入れた種々のオリゴヌクレオチドを製造した。２’−デオキシ−２’−メチルチオを有するヌクレオチドのオリゴヌクレオチド内への結合効率を確かめるために三量体ＴＣＣおよび四量体ＴＵＵ  Ｕを合成した。三量体ＴＣＣでは、中央のシチジンヌクレオチド（２番目のヌクレオチド）が２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を包含していた。四量体では、ウリジンヌクレオチドの各々が、２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を包含していた。別のオリゴヌクレオチドでは、２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するヌクレオチドが選択された配列の位置でオリゴヌクレオチド配列内に組み入れられた。残る配列位置にある各ヌクレオチドは、そのヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル置換基を組み入れた。この結果、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドがその上に置換基、２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基または２’−Ｏ−メチル置換基のいずれか、を含んでいた。これらのオリゴヌクレオチドは次のものである：位置４，５，６，７および８に２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するＧＡＧ  ＣＵＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ；位置１，４，５，７，９および１３に２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するＣＧＡ  ＣＵＡ  ＵＧＣ  ＡＡＧ  ＵＡＣ；位置１，２，３，７，９，１０，１１および１４に２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するＵＣＣ  ＡＧＧ  ＵＧＵ  ＣＣＧ  ＡＵＣ；位置１０，１１および１２に２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＧ  ＵＵＵ  Ｃ；および位置１０，１１および１２に２’−デオキシ−２’−メチルチオ置換基を有するＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  Ｃ。
【０２０５】
実施例１４−  ２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造
実施例１−７に記載したようにして製造した２’−デオキシ−２’−置換５’−ＤＭＴヌクレオシド３’−ホスホアミダイトを、エス・ビューケイジ（Ｓ．Ｂｅａｕｃａｇｅ）他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１２：１２５３−１２５５（１９９０）およびビー・エス・スプロート（Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏａｔ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：３３７３−３３８６（１９８９）によって開示されたようにして配列−特異性オリゴヌクレオチドホスホロチオエート内に挿入した。
【０２０６】
ホスホロチオエート主鎖結合および２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基ヌクレオチドを有する配列ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＡＣのオリゴヌクレオチドを、この配列内の種々の位置に組み入れた。第一のオリゴヌクレオチドでは、各主鎖結合は、ホスホロチオエート結合であり、位置１，３，４，５，６，７，９，１０，１１，１３および１４（５’から３’方向に数えた）のアデノシン、ウリジンおよびシチジンヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−２’−フルオロ部分を含むように修飾された。別のオリゴヌクレオチドでは、各主鎖結合はホスホロチオエート結合であり、すべての位置のオリゴヌクレオチド（アデノシン、ウリジン、シチジンおよびグアノシン）は２’−デオキシ−２’−フルオロ部分を含むように修飾された。
【０２０７】
実施例１５−  ２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾された酸メチル化オリゴヌクレオチドの製造
ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４：１６５７−１６６４（１９８９）にエル・エイチ・クーレ（Ｌ．Ｈ．Ｋｏｏｌｅ）他によって記載された保護、塩化トシルに仲介されるメタノリシス、および穏やかな脱保護を、２’−置換オリゴヌクレオチドに適用して、リン酸メチル化２’−置換オリゴヌクレオチドを得る。
【０２０８】
実施例１６−  ハイブリッド形成分析
Ａ．２’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の熱力学の評価
２’−修飾オリゴヌクレオチドがそれらの相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリッド形成する能力を、熱溶融分析によって決定した。ＲＮＡ相補体は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びアプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）３８０Ｂを用いて合成したＤＮＡのテンプレート−プロモーターから合成した。ＲＮＡ種はＦＰＬＣ［エル・ケイ・ビー・ファーマシア社（ＬＫＢ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）］を用いるイオン交換によって精製した。天然のアンチセンス  オリゴヌクレオチドまたは特定位置に２’−修飾を含むアンチセンス  オリゴヌクレオチドをＲＮＡまたはＤＮＡ相補体に化学量論的濃度で加えて、ランダムコイル転移に対する二重らせんに関する吸光度（２６０ｎｍ）深色性を、ギルフォード・レスポンス（ＧｉｌｆｏｒｄＲｅｓｐｏｎｓｅ）ＩＩ分光光度計を用いて監視した。これらの測定は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０種類の０．１Ｍまたは１．０Ｍのイオン強度を得るためのＮａＣｌの緩衝液中で実施した。データは、１／Ｔｍ対Ｉｎ［ｃｔ］の図示によって分析したがここで［ｃｔ］は総オリゴヌクレオチド濃度であった。この分析から、熱力学パラメーターを決定した。形成されたヘテロ二重らせんの二重らせんの安定性に関連して得た情報に基づいて、２’−デオキシ−２’−置換基を含むヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への配置をそのらせん安定性に関する効果について評価した。ハイブリッドの安定性を激烈に変える修飾は自由エネルギー（デルタＧ）の減少を示し、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての有用性に関する決定が行なわれた。
【０２０９】
下の表１に示すように、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への組み入れは、結果として修飾されたオリゴヌクレオチド鎖（アンチセンス鎖）およびその相補的ＲＮＡ鎖（センス鎖）の二重らせん安定性の有意の増大をもたらした。ホスホジエステル主鎖およびホスホロチオエート主鎖オリゴヌクレオチドの両方において、二重らせんの安定性は、アンチセンス鎖中の２’−デオキシ−２’−フルオロ含有ヌクレオチドの数が増加するとともに増大した。表１から明らかな通り、例外なく、２’−デオキシ−２’−フルオロを有するヌクレオチドの付加は、個々の置換基を有するヌクレオチドに関係なくまたはオリゴヌクレオチド配列中にそのヌクレオチドの位置に関係なく、二重らせん安定性の増大という結果をもたらした。
【０２１０】
表１では、下線をひいたヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基を含むヌクレオチドを表わす。下線のないヌクレオチドは、正常なヌクレオチドである。表示“ｐｓ”を前置きするオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有している。標識していないオリゴヌクレオチドは、正常なホスホジエステル主鎖オリゴヌクレオチドである。
【０２１１】
【表１】
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表１から明らかなように、ＲＮＡと２’−デオキシ−２’−フルオロ置換されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとの間で形成された二重らせんは、ハイブリッド形成熱力学的安定性によって測定したとき、増大した結合安定性を示した。２０℃より大きなデルタＴｍが測定された。主鎖をホスホチオエート主鎖に修飾することによってさらに大きなデルタＴｍが観察された。この場合には、３１℃より大きなデルタＴｍが測定された。これらのフルオロ置換されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを用いて形成された二重らせんの熱力学的安定性のばらつきのない付加的な増大を示した。我々は理論によって束縛されたくないけれども、現在のところ２’−フルオロ置換基の存在の結果、２’−フルオロ置換されたヌクレオチドの糖成分が事実上３’−エンド配座をとり、そしてこの結果オリゴヌクレオチド−ＲＮＡ二重らせんがＡ−型らせん状配座をとることになると考えられる。
【０２１２】
Ｂ．２’−修飾されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の忠実度
２’−修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに対する絶対特異性をもってハイブリッド形成する能力は、全細胞ＲＮＡの存在における精製された標的ＲＮＡのノーザンブロット分析によって示された。標的ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから下流に位置する標的ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを含むベクターから合成された。合成されたｍＲＮＡを、アガロースゲル中で電気泳動させ、適当な支持体膜（すなわちニトロセルロース）に移動させた。この支持体膜をブロックして、［３２Ｐ］−標識したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプローブとした。緊縮性を、レプリカブロットおよび高温または低下したイオン強度の洗浄緩衝液中での洗浄によって決定した。ヘテロ二重らせん形成の存在を評価するためにオートラジオグラフィーを行ない、オートラジオグラムをレーザーデンシトメトリー［エル・ケイ・ビー・ファーマシア社（ＬＫＢＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）］によって定量した。ハイブリッド形成の特異性を、標準技術による全細胞ＲＮＡの単離およびアガロース電気泳動、膜移動および標識した２’−修飾オリゴヌクレオチドを用いてプローブとすることによるその分析によって決定した。緊縮性を、未修飾のアンチセンス  オリゴヌクレオチドについて前もって決定して、特に標的としたｍＲＮＡだけが２’−修飾オリゴヌクレオチドとヘテロ二重らせんを形成することができるような条件を使用した。
【０２１３】
Ｃ．オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡの塩基対特異性
２−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたオリゴヌクレオチドとＲＮＡ相補体（“Ｙ鎖”）との塩基対特異性を、単一塩基対誤対合およびバルジを起こさせることによって決定した。これらの決定の結果は表２に示されている。２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基を有する１４アデノシン、ウリジンおよびシチジンヌクレオチドを含む１８量体“Ｘ鎖”オリゴヌクレオチドを、１０位が変化しているＲＮＡ相補体“Ｙ鎖”とハイブリッド形成させた。表２中、下線をひいたヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ置換基を含むヌクレオチドを表わす。
【０２１４】
【表２】
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表２から明らかなように、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたオリゴヌクレオチドは類似の配列をもつ未修飾オリゴヌクレオチドより大きな特異性をもった、ＲＮＡ相補体との二重らせんを形成した。
【０２１５】
実施例１７−  ヌクレアーゼ耐性
Ａ．２’−修飾オリゴヌクレオチドの血清および細胞質ヌクレアーゼに対する耐性の評価
天然のホスホロチオエート、および２−修飾オリゴヌクレオチドを、これらの血清ヌクレアーゼに対する耐性について、種々の濃度の胎児の子ウシ血清または成人のヒト血清を含有する培地におけるオリゴヌクレオチドのインキュベーションによって評価した。標識したオリゴヌクレオチドを種々の時間インキュベーションし、プロテアーゼＫで処理してから、２０％ポリアクリルアミド−尿素変性ゲルに関するゲル電気泳動およびそれに続くオートラジオグラフィーによって分析した。オートラジオグラムはレーザーデンシトメトリーによって定量した。修飾の位置および公知のオリゴヌクレオチドの長さに基づいて、その特定の２’−修飾によるヌクレアーゼ分解への効果を決定することが可能であった。細胞質ヌクレアーゼ用には、ＨＬ６０細胞系を使用した。ポストーミトコンドリアル上澄を分画遠心法によって調製し、標識したオリゴヌクレオチドを種々の時間、この上澄中でインキュベーションした。インキュベーションのあと、オリゴヌクレオチドを、血清核酸溶解分解について上に概略を示したように、分解について評価した。オートラジオグラフィーの結果を、未修飾、ホスホロチオエート、および２’−修飾のオリゴヌクレオチドの比較のために定量した。
【０２１６】
これらの試験系を利用して、位置１２および１４の２−デオキシ−２’−フルオロ置換されたヌクレオチド、およびホスホロチオエート主鎖、を有する１５量体オリゴヌクレオチドの安定性を研究した。対照として、未置換ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、１時間以内に５０％分解し、２０時間以内に１００％分解した。ホスホロチオエート主鎖を有する２’−デオキシ−２’−フルオロ置換オリゴヌクレオチドについて比較すると、分解は２０時間後に１０％未満に限定された。
【０２１７】
Ｂ．２’−修飾オリゴヌクレオチドの特定エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼに対する耐性の評価
天然ならびに２’−修飾オリゴヌクレオチドの、特定のヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼ、３’，５’−エキソ、および５’，３’−エキソヌクレアーゼ）に対する耐性の評価を行なって、分解に関する修飾の正確な効果を決定した。修飾オリゴヌクレオチドを、種々の選択されたヌクレアーゼに特異的な限定された反応緩衝液中でインキュベーションした。生成物をプロティナーゼＫで処理した後、尿素を加え、尿素を含む２０％ポリ−アクリルアミドゲルについての分析を行なった。ゲル生成物を、ステインズ・オール（Ｓｔａｉｎｓ  Ａｌｌ）［シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）］を用いる染色によって目に見えるようにした。レーザーデンシトメトリーを使用して分解の程度を定量した。２’−修飾の効果を特定のヌクレアーゼに対して決定して、血清および細胞質系から得た結果と比較した。