(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株又は抗アレルギー活性を有するＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株の変異株を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品。
【請求項２】
抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、１日に摂取する飲食品の量当たり、５×１０9個以上となるように含有させたことを特徴とする請求項１記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
【請求項３】
飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有していないことを特徴とする請求項１又は２記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
【請求項４】
飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有しない錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、又はドリンク剤であることを特徴とする請求項３記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
【請求項５】
乳酸菌を、殺菌して用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
【請求項６】
請求項１記載の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲料。
【請求項７】
飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項６記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
【請求項８】
飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする請求項７記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
【請求項９】
密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料１００ｇあたり１０9〜１０11個の範囲であることを特徴とする請求項７又は８記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
【請求項１０】
食品又は飲料が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、又は病者用食品として調製されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する食品又は飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーの予防・治療に有用な抗アレルギー用組成物、特に、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を添加した抗アレルギー機能を有する食品及び飲料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。アレルギーの発症機構は通常Ｉ型からIV型の4つに分類される。Ｉ型アレルギーは、ＩｇＥ抗体が関与し、花粉症、喘息、じん麻疹、アナフィラキシーショックなどに代表される。II型アレルギーはＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体が関与し、補体系を活性化する細胞傷害性反応であり、胎児赤芽球症や自己免疫性溶血性貧血がこれにあたる。III型アレルギーは、抗原抗体複合体によって起こる組織傷害であり、アルックス反応や血清病、糸球体腎炎に代表される反応である。ＩＶ型アレルギーは、Ｔ細胞が関与する遅延型アレルギー（遅延型過敏症）であり、ツベルクリン反応や接触性皮膚炎に代表される反応である。アレルギーのうち、食物アレルギーの発症には、Ｉ型、II型及びＩＶ型が関与するとされている。一方、環境アレルギー、すなわち花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギーは、主としてＩ型の発症機構を持つことが知られている。
【０００３】
前記のＩ型アレルギーはアレルゲン特異的ＩｇＥの誘導とヒスタミンやロイコトリエン等のケミカルメディエーターの放出をその特徴とする。免疫応答は、種々の細胞による相互作用により生ずるが、これに関わる細胞の一種としてヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）がある。ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞亜群に分類され、抗原を認識して各種サイトカイン（ヘルパー因子）を産生し、免疫応答誘導を調節する働きを持つ。ヘルパーＴ細胞は、そのサイトカイン産生能からＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される。Ｂ細胞において抗体のクラススイッチが起こり、ＩｇＥ抗体が産生されるようになるには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球にはＴｈ２細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞・マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部をＭＨＣ class II分子に結合した状態でＴ細胞に対して提示され、Ｔｈ２細胞が活性化・分化する。Ｔｈ２細胞が放出したＴｈ２サイトカインはＢ細胞のクラススイッチを誘導し、ＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃ・Ｒに結合する。アレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がのケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって、アレルギーの諸症状が現れる。
【０００４】
ＩｇＥやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防・治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーターの産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗アレルギー剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがある。しかし、そのいずれもが副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがない。
【０００５】
近年ＩｇＥを抑制するために、Ｔｈ２サイトカインの産生を調節する方法に注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌はＴｈ１免疫を増強することにより、Ｔｈ２免疫を抑制し、その結果ＩｇＥを低下させることが報告されている（臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁；特開平９−２９５９号公報）。
【０００６】
中でも乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌にＴｈ１免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗アレルギー乳酸菌としては、Ｌ．rhamnosus  ＬＧＧ株が公知であり妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特開平９−２９５９号公報には、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、及びＬ．カゼイ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際のＩｇＥ産生量が３０ｎｇ／ｍｌ以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特開平１０−３０９１７８号公報には、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・ビフィダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗アレルギー剤として用いることについて、及び、特開２０００−９５６９７号公報には、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトバシルス・ロイテリーなどの乳酸菌をアレルギ性気管支喘息、アレルギ性鼻炎及びアトピ−性皮膚炎等のＩ型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。
【０００７】
一方で、乳酸菌等が、Ｔｈ１免疫を増強することはＩＬ１２やＩＦＮ・ガンマーなどの産生を介してマクロファージやキラーＴ細胞、ＮＫ細胞の細胞性免疫の活性化を意味し、ウイルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的にはマクロファージが産生するＩＬ−１２は未分化のヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、単球・マクロファージ・ＮＫ細胞の活性化を通して、外敵・ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株は免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁；特開平７−２２８５３６号公報；特開２００２−８０３６４号公報）。
【０００８】
また、乳酸菌が腸管へ生きて到達し、様々な効果を発揮するためには、胃酸、胆汁酸という消化液に対して耐性であることが必要であるといわれている（学会出版センター、腸内フローラシンポジウム３、腸内フローラとプロバイオティクス、ｐ４１−５５、光岡知足 編、１９９８年）。また、腸管への付着性の高い乳酸菌は腸管にとどまってその効果を十分に発揮することが知られている。従って、経口で乳酸菌を摂取する場合、当該乳酸菌の機能性の高さもさることながら、生きて腸管に届いてとどまることが望ましいとされている。
【０００９】
近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情である。
【００１０】
そのような状況に鑑みて、最近になって食餌によってアレルギーを抑えようとする研究が活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフェノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見い出して、それらを用いた対処が行われている。
【００１１】
抗アレルギー効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたヨーグルトや乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。この種の抗アレルギー用飲食品による予防或いは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。しかしながら、従来のものでは、その高抗アレルギー活性の菌株を選択取得する方法が明確にされていなかったため、有力な菌株が取得されておらず、実用上満足できるものではなかった。更に、従来の乳酸菌の使用においては、ヨーグルトや乳酸菌飲料におけるように乳酸菌による発酵に主な目的が置かれ、抗アレルギー作用は副次的な位置付けとされ、更に、ヨーグルトや乳酸菌飲料の場合は、チルド流通が必須で日持ちしないものが多く、取扱いの自由度が少ないという問題もあったりして、手軽に、毎日継続摂取することが可能な、効能のある本格的なアレルギーの予防或いは治療用の飲食品としては満足のいくものではなかった。したがって、昨今、これらの要件を満足する効能のある抗アレルギー用組成物やそれを用いた飲食品等の開発が要望されている。
【特許文献１】特開平７−２２８５３６号公報。
【特許文献２】特開平９−２９５９号公報。
【特許文献３】特開平１０−３０９１７８号公報。
【特許文献４】特開２０００−９５６９７号公報。
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報。
【非特許文献１】臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁。
【非特許文献２】インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁。
【非特許文献３】ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁。
【非特許文献４】キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁。
【非特許文献５】学会出版センター、腸内フローラシンポジウム３、腸内フローラとプロバイオティクス、ｐ４１−５５、光岡知足 編、１９９８年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、アレルギーの予防・治療に有用な抗アレルギー用組成物、特に、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー用組成物、及び該乳酸菌の取得方法、更には、該抗アレルギー機能を有する食品及び飲料等を提供することにある。ここで「抗アレルギー機能を有する」とは、「アレルギーの予防・治療に効果を発揮する、及び／又は、アレルギー症状を改善・緩和する」との意味である
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、花粉症・アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎などの環境アレルギーの予防・治療を目的として、その有効成分について探索する中で、まず、その安全性の面から乳酸菌に着目し、鋭意探索した結果、Ｔｈ２の活性化阻害とＴｈ１活性化をバランスよく行うことができる乳酸菌を選択することにより、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を得ることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の取得方法は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに着目した方法である点で特徴を有する。従来の方法は、ＩｇＥを測定して抗アレルギー活性の評価を行なっているが、ＩｇＥがアレルギーに関係していることは疑いのない事実であるが、一方で例えばアトピー患者には高ＩｇＥのヒトと低ＩｇＥのヒトがいることが分かっているように、ＩｇＥの程度で全てを説明できないのも事実である。アレルギーの発症にはＩｇＥ以外にも好酸球の増加やリンパ球の局所への浸潤を起こさせるケモカインの放出など様々な事象が総合的に関与することが分かっている。したがって、本発明では、ＩｇＥの増加、好酸球の増加やケモカインまで総合的に説明できるＴｈ１／Ｔｈ２バランスに着目し、該バランスを指標として、抗アレルギー性の菌株を評価、分離する方法を開発することにより、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を得ることに成功した。
【００１５】
本発明の抗アレルギー機能を有する飲食品の有効成分である乳酸菌は、Ｔｈ２の活性化の指標としてのインターロイキン４（ＩＬ−４）及びＴｈ１の免疫の活性化の指標となるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の生成量の特定のバランスを持つ乳酸菌を探索することにより取得されたもので、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、産生するＩＬ−４及びＩＬ−１２の量を測定することにより取得されたものである。すなわち、本発明の乳酸菌は、Ｌactobacillus  Paracasei（Ｌ．Paracasei）  ＫＷ３１１０株からなるものであり、更に、該菌株の抗アレルギー活性を維持した変異株を包含するものである。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食品は、該乳酸菌を有効成分として添加した抗アレルギー機能を有する飲料又は食品からなるものである。本発明の乳酸菌は、該乳酸菌を指標にして、他の乳酸菌のＩＬ−４及びＩＬ−１２の産生量を測定することにより、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を取得することができる。すなわち、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として本発明のＬ．paracaseiＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を選別することにより、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を取得することができる。
【００１６】
本発明の有効成分である高抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、該乳酸菌を配合して、該乳酸菌を有効成分として含有する抗アレルギー用組成物として、また、該乳酸菌に、担体、賦形剤及び／又はその他の補助剤を添加して製剤化し、アレルギー疾患の予防及び／又は治療のための抗アレルギー剤としての利用することが可能なものである。すなわち、本発明は、本発明の抗アレルギー用組成物の飲食品への利用、及び製剤化により、経口的に投与する抗アレルギー用剤としての利用を可能とするものである。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食品の有効成分であるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株は、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であり、経口的に摂取された場合に特に優れた効果を奏する。本発明で抗アレルギー機能を有する飲食品の有効成分として使用されるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０は、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４として寄託されている。また、該菌株の変異株は、該菌株を公知の変異処理により変異し、該変異処理を施した菌株の中から、本発明の抗アレルギー活性の測定方法を用いて抗アレルギー活性を有する菌株を選抜することにより、容易に取得することができる。
【００１７】
本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌の飲食品への利用については、特に、本発明の有効成分である高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を茶飲料のような飲料に適用し、抗アレルギー機能を有する飲料を提供することを包含する。本発明の抗アレルギー機能を有する飲料は、嗜好性、保存性が高い飲料とすることができ、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮される抗アレルギー機能を有する飲料として調製できる。本発明において、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、これを加熱殺菌のような処理により殺菌した形で用いることができ、例えば、本発明における乳酸菌を加熱殺菌した後に添加して、殺菌済みの密封容器入り飲料として製造することにより、飲料自体の香味を保持し、飲料製品として安定し、しかも抗アレルギー機能が保てる密封容器入り飲料として製品化することが可能である。更に、密封容器入り飲料として製造する場合には、用いる乳酸菌の濃度を調整することにより、抗アレルギー機能を保持しつつ、しかも、飲料自体の香味の保持機能を増加して嗜好性、保存性の高い飲料を製造することが可能である。本発明においては、抗アレルギー作用及び製品の保存、安定化の観点から、乳成分を含まない、すなわち、例えば、果汁入り清涼飲料或いは茶飲料のような乳成分非配合の形の、各種タイプの飲料とすることが特に好ましい。
【００１８】
本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌の飲食品への利用においては、本発明により採取された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、２種以上併存させて用いることができる。その際に、それぞれの飲食品や乳酸菌に合わせて、その組み合わせや、配合量を調製することができる。更に、他の抗アレルギー用組成物との配合若しくは併用も行うことができる。
【００１９】
すなわち具体的には本発明は、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株又は抗アレルギー活性を有するＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株の変異株を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項１）や、抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、１日に摂取する飲食品の量当たり、５×１０9個以上となるように含有させたことを特徴とする請求項１記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項２）や、飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有していないことを特徴とする請求項１又は２記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項３）や、飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有しない錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、又はドリンク剤であることを特徴とする請求項３記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項４）や、乳酸菌を、殺菌して用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項５）や、請求項１記載の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲料（請求項６）や、飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項６記載の抗アレルギー機能を有する飲料（請求項７）や、      飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする請求項７記載の抗アレルギー機能を有する飲料（請求項８）や、密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料１００ｇあたり１０9〜１０11個の範囲であることを特徴とする請求項７又は８記載の抗アレルギー機能を有する飲料（請求項９）や、食品又は飲料が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、又は病者用食品として調製されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する食品又は飲料（請求項１０）、からなる。
【００２０】
また、本発明は、（１）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする抗アレルギー用組成物や、（２）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、７５％以上のインターロイキン１２産生量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする（１）記載の抗アレルギー用組成物や、（３）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの４０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の抗アレルギー用組成物や、（４）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、７５％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの４０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の抗アレルギー用組成物や、（５）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、８０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの３０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の抗アレルギー用組成物や、（６）上記（１）〜（５）のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のインターロイキン１２及びインターロイキン４生成量を示す乳酸菌が、Ｌactobacillus．paracasei  ＫＷ３１１０株、Ｌactobacillus  plantarum  ＫＷ４１１０株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２５株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus  salivarius  ＫＷ３２１０であることを特徴とする抗アレルギー用組成物や、（７）請求項１〜５のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のインターロイキン１２及びインターロイキン４生成量を示し、且つ、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であるＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を有効成分とする抗アレルギー用組成物に関する。
【００２１】
また、本発明は、（８）アレルギーが、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の抗アレルギー用組成物や、（９）抗アレルギー用組成物が、医薬であることを特徴とする上記（８）記載の抗アレルギー用組成物や、（１０）抗アレルギー用組成物が、飲食品であることを特徴とする上記（８）記載の抗アレルギー用組成物や、（１１）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、被検乳酸菌としてＬactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を分離することを特徴とする高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の取得方法や、（１２）上記（１１）の方法により分離した乳酸菌を、培地を用いて培養し、増殖することを特徴とする高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法や、（１３）培地を用いて培養し、増殖した乳酸菌の抗アレルギー活性を確認することを特徴とする上記（１２）記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法や、（１４）増殖した乳酸菌の抗アレルギー活性の確認が、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁した培地に、該乳酸菌を添加して培養し、インターロイキン１２及びインターロイキン４の産生量を測定することにより行われることを特徴とする上記（１３）記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法や、（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法により製造された乳酸菌を、医薬又は飲食品に配合し、容器に充填し、密封することを特徴とする密封容器入り医薬品又は飲食品の製造方法や、（１６）上記（１）〜（１０）のいずれか記載の抗アレルギー用組成物をアレルギー疾患の予防及び／又は治療のための処置に用いることを特徴とするアレルギー疾患の予防及び／又は治療方法や、（１７）アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする上記（１６）記載のアレルギー疾患の予防及び／又は治療方法や、（１８）アレルギー疾患の予防及び／又は治療のための上記（１）〜（１０）のいずれか記載の抗アレルギー用組成物の使用や、（１９）アレルギー疾患の予防及び／又は治療が、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎の予防及び／又は治療であることを特徴とする上記（１８）記載の抗アレルギー用組成物の使用に関するものである。
【００２２】
更に、本発明は、（２０）滅菌した食品又は飲料に、実質的に無菌状態において、上記（１）〜（７）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌、又は該乳酸菌を殺菌したものを配合し、容器に充填して密封することを特徴とする抗アレルギー機能を有する密封容器入り飲食品の製造方法や、（２１）卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるインターロイキン１２及び／又はインターロイキン４の量を測定することを特徴とする乳酸菌の抗アレルギー活性の測定方法や、（２２）被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるインターロイキン１２及び／又はインターロイキン４の量を、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と比較して評価することを特徴とする上記上記（２１）記載の乳酸菌の抗アレルギー活性の測定方法や、（２３）上記（１）〜（７）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌に、担体、賦形剤及び／又はその他の補助剤を添加して製剤化したことを特徴とする抗アレルギー剤や、（２４）上記（１）〜（７）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌からなる医薬品や、（２５）乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の一部、又は全部を上記（１）〜（７）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品や、（２６）乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の乳酸菌の一部、又は全部を上記（１）〜（７）のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲料又は食品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を取得することができ、該乳酸菌を有効成分とする高抗アレルギー効果を示す組成物を得ることができる。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。特に、花粉症データや花粉を抗原として用いた喘息治療実験データに示されるように、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎のような粘膜過敏症疾患の予防・治療に著効を有する。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物の有効成分の一つであるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０は、強い抗アレルギー・免疫賦活活性に加えて、腸管細胞への接着性、胃酸・胆汁酸に対する耐性についても優れており、該乳酸菌乃至は該乳酸菌を用いた製品を経口的に摂取することにより、抗アレルギー機能とともに、整腸作用・コレステロール低下作用・血圧低下作用など従来知られているプロバイオティックスの機能をも併せて発揮することができる飲食品としての利用が期待できる。本発明の高抗アレルギー機能を有する飲食品は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する、抗アレルギー機能を保持し、しかも嗜好性、保存性が高い飲料を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、Ｔｈ２の活性化の指標としてのインターロイキン４（ＩＬ−４）及びＴｈ１の免疫の活性化の指標となるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の生成量の特定のバランスを持つ高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を有効成分として含有する抗アレルギー機能を有する飲食品からなる。
【００２５】
（本発明の有効成分である乳酸菌）
本発明の有効成分である高抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）で感作させたマウス脾臓由来リンパ球をＯＶＡ含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等或いは６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌である。より好ましい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌が、ＯＶＡで感作させたマウス脾臓由来リンパ球をＯＶＡ含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等或いは７５％以上のインターロイキン１２産生量を示す乳酸菌である。更に好ましい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌において、ＯＶＡで感作させたマウス脾臓由来リンパ球をＯＶＡ含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの４０％未満のインターロイキン４生成量を示すことを特徴とする乳酸菌である。
本発明において、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌として最も好ましい態様は、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）で感作させたマウス脾臓由来リンパ球をＯＶＡ含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等或いは８０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの３０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌である。
【００２６】
本発明において有効成分として用いる高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を取得するには、アレルゲンで感作させた動物脾臓由来リンパ球を当該アレルゲン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、被検乳酸菌としてLactobacillus paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いは paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のＴｈ１誘導サイトカイン産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を分離する高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の取得方法による。すなわち、公知の乳酸菌の菌株或いは新しく分離した乳酸菌の菌株を用いて、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁したものに該乳酸菌を添加して培養し、基本的には、被検乳酸菌としてＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を分離することにより取得することができる。前記のとおり、本発明において有効成分として用いる乳酸菌は、種々の公知の或いは新たに分離した乳酸菌の中から、in vitroにおける抗アレルギー活性を評価する実験方法を行うことにより、本発明の指標を基準に当業者が容易に選択し取得することができるものであるが、その詳細は実施例１に具体的に開示する。
【００２７】
本発明において有効成分として用いる、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、例えばＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株は、L.casei  Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、Ｌ１４株はＬ．caseiとの記載があるが、本発明者らがQUALICON社製リボプリンターを用いたＲＦＬＰ（Restriction Flagment Length Polymorphism）及びＡＦＬＰ（Amplified Flagment Length Polymorphism）を用いて解析したところ、当該株はＬ．paracaseiと判断されたため、本発明においてはＬ．ｐaracaseiと記載した。本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用されるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、更に、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４として寄託されている。
また、本発明で抗アレルギー機能を有する飲食品の有効成分として使用されＬ．plantarum  ＫＷ４１１０株はＬ．plantarum  ＪＣＭ１１４９株として、Ｌ．paracasei  ＫＷ３９２６株はＬ．paracasei  ＪＣＭ８１３２株として、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、及び、Ｌ．paracasei  ＫＷ３９２５株はＬ．paracasei  ＮＲＩＣ１９１７株として、ＮＲＩＣ（東京農業大学）から入手することができる。
【００２８】
本発明において有効成分として用いる乳酸菌の選択に際しては、抗アレルギー作用の他に、多くの乳酸菌で言われている整腸作用・コレステロール低下作用・血圧低下作用など従来知られているプロバイオティックスの機能をも併せて発揮する乳酸菌を選択することもできる。また、本発明の有効成分である乳酸菌を、経口的に投与する場合に、乳酸菌が腸管にとどまりその効果を十分発揮することがより効果的となるため、上記の基準で選択取得した乳酸菌を、更にin  vitroにおけるヒト腸管由来株化細胞Ｃａｃｏ−２への接着性試験に供し、より高い細胞接着能を有する株を選択することで、更に有効性の高い乳酸菌を取得することができる。本発明の有効成分の一つであるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株は、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であり、抗アレルギー剤として経口的に投与した場合に特に優れた前記効果を兼ね備えている。
【００２９】
本発明による有効成分たる乳酸菌は、Ｍ．Ｒ．Ｓ．（de Man, Rogosa, Sharpe）培地等の当業者に知られた乳酸菌培養用培地にて適宜培養増殖させた後、生菌で或いは殺菌処理し、必要によっては凍結乾燥或いはスプレードライして粉末化し、本発明の飲食品の有効成分として使用することができる。また、工程管理のため、必要に応じて得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を測定することができる。すなわち、該抗アレルギー活性の測定方法としては、アレルゲンで感作させた動物脾臓由来リンパ球を当該アレルゲン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるＴｈ１誘導サイトカイン及び／又はＴｈ２誘導サイトカインの量を測定する乳酸菌の抗アレルギー活性の測定方法を用いることができる。
【００３０】
本発明においては、本発明の方法で取得した高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を変異させて、抗アレルギー活性等の高い変異株を作製し、用いることができる。菌株の変異手段としては、ＵＶ等の公知の変異手段を用いて行うことができる、例えば、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌であるＫＷ３１１０株を変異手段で変異させて、本明細書に記載された乳酸菌の抗アレルギー活性の評価方法を用い、抗アレルギー活性の増加した或いは他の特性を変異させた好ましい特性の変異株を取得して、用いることができる。また、ＫＷ４１１０株、ＫＷ３２１０株、ＫＷ３９２５株、及びＫＷ３９２６株等を変異させて用いることもできる。
【００３１】
（派生株の選抜）
本発明では、本発明で取得した乳酸菌株から生じた形質の異なる菌株を派生株として選抜し、用いることができる。該菌株の選抜方法は、ＫＷ３１１０を例として説明すると次のようになる：ＫＷ３１１０株をＭＲＳ培地のような培地を用いて、所定温度で、所定菌数に達するまで静置培養し、培養液を新鮮なＭＲＳ培地で、希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸でｐＨを３．０にしたＰＢＳ（大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解）に１０％分懸濁し、３７℃３時間インキュベートする。酸処理した菌体懸濁液をＰＢＳで希釈し、ＭＲＳプレート培地にまき、コロニーを形成させた。形成させたコロニーを色調等を指標に選抜し、この色調に基いて選抜したコロニーから更に1株を選抜し、ＭＲＳ培地で４８時間培養する。該培養物の抗アレルギー活性を本発明の抗アレルギー活性の測定法（実施例２の方法）で測定し、各コロニーの抗アレルギー活性を判定する。該方法により、試験菌株の中から高抗アレルギー活性の菌株を選抜取得する。本発明の実施例で、ＫＷ３１１０株の派生株として分離された株はＮｏ．９０株と命名され、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５として寄託されている。
【００３２】
（抗体の作製）
本発明においては、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を含有する製品の品質管理や製造工程における管理を行うために、該本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の分離、検出を行って、その乳酸菌の同定や含有量の検査を行う必要がある。該乳酸菌の分離、検出を目的として抗体を作製し、用いることができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記乳酸菌を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生方法は、それ自体既に公知の方法により産生することができる。例えば、該産生方法は、Koehler,G.及びC. Milstein,Nature:256,495-497(1975)、及び、Davis, B. ,R. Dulbecco, H. Eisen,H. Ginsberg及びW. Wood, Principles of Microbiology and Immunology 第２巻、Harper & Row, New York,1973を参照することができる。すなわち、該モノクローナル抗体の産生には、例えば、本発明の乳酸菌を用いてマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞によって産生することができる。本発明の乳酸菌に特異的に結合する抗体を用いて、本発明の乳酸菌を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的検出法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。
【００３３】
（本発明の有効成分である乳酸菌の抗アレルギー作用）
アレルギーは、抗原刺激によりＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体の組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃレセプターに結合し、次の抗原刺激（アレルゲンの再侵入）でマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成され、この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって諸症状が現れる。従って、アレルギーの治療・予防の為にＩｇＥを抑制すること、そしてその為にはＴｈ１免疫を増強しＴｈ２免疫を抑制することが必要となる。
【００３４】
本発明による乳酸菌は、マウスリンパ球を用いたin vitroの系において、Ｔｈ１免疫の指標であるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生を強く誘導するとともに、Ｔｈ２免疫の指標であるインターロイキン４（ＩＬ−４）産生を強く抑制する。従って、本発明による乳酸菌は、Ｔｈ１免疫を増強しＴｈ２免疫を抑制することにより、ＩｇＥ抗体産生を抑制するという作用機序に基づくアレルギーの治療・予防効果がある。
【００３５】
そこで、本発明の抗アレルギー機能を有する飲食品は、花粉症・アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎・気管支喘息などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。また、本発明における乳酸菌は、上記抗アレルギー作用の他に、多くの乳酸菌で言われている整腸作用・コレステロール低下作用・血圧低下作用など従来知られているプロバイオティックスの機能をも併せて具備することができ、本発明における有効成分の乳酸菌の一つであるＫＷ３１１０株は、強い抗アレルギー・免疫賦活活性に加えて、腸管細胞への接着性、胃酸・胆汁酸に対する耐性についても優れていることが確認され、更に前述のプロバイオティックスの機能の面からもその効果が期待できる。本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、抗アレルギー用組成物として、及び、抗アレルギー剤として、投与することができる。
【００３６】
（抗アレルギー用組成物の投与）
抗アレルギー用組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、抗アレルギー剤として用いることができる。抗アレルギー剤は、経口的或いは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。なお、製剤化にあたっては、抗アレルギー組成物がその機能を生体内において適時的且つ効果的に発揮できるよう、即ち溶出開始時間を制御したり、苦味マスキング剤としての機能を付加したり、酸素や湿度に対する安定性を高めたりする形、例えば特許３３４９６７７記載の酵母細胞壁を主成分としたコーティング剤でコーティングされたコーティング処理物や定法に従って軟カプセルや硬カプセルによりカプセル化することで得られるかプセル剤として共に医薬製剤や健康食品等の分野で好ましく使用することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００３７】
製剤は例えば次のようにして製造できる。すなわち、経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【００３８】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００３９】
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【００４０】
（飲食品配合による利用）
本発明の抗アレルギー用組成物は、飲食品に配合し、抗アレルギー機能を有する飲食品として用いることができる。本発明の抗アレルギー用組成物を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、下記のような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。
【００４１】
すなわち、本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人１人当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重）、非経口的に投与する場合は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲で一日１〜３回に分けて投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲食品の量に合わせて、各々の食品あたりの含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、食品（ヨーグルト）として摂取する場合に、成人１人１日当たり５０〜５００ｇの範囲、好ましくは６０〜２００ｇの範囲の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【００４２】
本発明においては、本発明の抗アレルギー用組成物の有効成分をそのまま、或いは前記のような製剤の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明の飲食品は、本発明の有効成分を適宜基材と配合して、そのまま飲食品として調製したもの、或いは、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、更には、一般の飲食品へ添加、配合したもの等、種々の利用形態を採ることができる。
【００４３】
従来より、乳酸菌を利用した飲食品の分野としては、その活用の態様分類としては、乳製品類、肉類、パン類、飲料、及び野菜類に大別される。これらの乳酸菌を利用した飲食品の製造における乳酸菌又はその一部として、或いは、製造した該飲食品の添加物として、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いて、該飲食品に抗アレルギー機能を付与することができる。
【００４４】
本発明の他の実施の態様として、有効成分である乳酸菌を飲食品に添加する場合に、乳酸菌自体の発酵を必要とせず、かつ、飲食品自体の香味の保持を図る場合には、乳酸菌を例えば加熱殺菌のような処理により殺菌して用いるのが特に好ましい。また、本発明の高抗アレルギー機能を有する飲食品は、他の微生物や異物の混入を防ぎ、内容物の品質を保持するために、密封容器詰飲食品の形態で製造されることが好ましい。
【００４５】
本発明における食品としては、抗アレルギー機能を持たせた、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、或いは病者用食品として調製することができる。また、特に、食品の形態に限定されるものではなく、抗アレルギー機能を持たせた飲料の形態であってもよい。本発明による有効成分は、抗アレルギー作用を有するため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品等に本発明の有効成分を配合することにより、継続的に摂取可能な、アレルギーの発症の予防および治療といった機能を併せ持つ食品として提供することができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、例えば、茶類やドリンク剤或いはタブレットのような、その飲食品中にアレルギーを引き起こす成分を含まない飲食品中に配合して用いることにより、アレルギー問題から完全に遮断された抗アレルギー機能を有する飲食品を提供することができる。また、本発明においては、乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の乳酸菌の一部、又は全部を本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌で代替することにより、高抗アレルギー機能を有する飲料又は食品とすることができる。
【００４６】
（飲食品製剤形態での利用）
本発明において、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品としては、各種のものをあげることができるが、それらの健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。
【００４７】
本発明において、特に、健康食品および機能性食品に適した形状として、タブレット状、カプセル状、顆粒状、粉末状、懸濁液状、乳化液状のものが例示でき、特に本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品は、本発明が解決しようとする課題から見て、アレルギー特定原材料を含まない原材料を組み合わせたものが好ましい。タブレット状健康食品及び機能性食品の製造法を具体的に例示すれば、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合した処方物を一定の形状に圧縮して製造するか、または水またはアルコールのような溶媒で湿潤させた練合物を、一定の形状にするか若しくは一定の型に流し込んで成型して製造したものがあげられる。カプセル状健康食品および機能性食品の製造法を具体的に例示すれば、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合した処方物を液状、懸濁状、のり状、粉末状または顆粒上などの形でカプセルに充填するか、またはカプセル基剤で被包成型して製造したもので、硬カプセル剤および軟カプセル剤等があげられる。
【００４８】
（食品への配合）
また、本発明においては、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品に配合して、抗アレルギー機能を持たせた食品として調製することができる。かかる飲食品として具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品（インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
【００４９】
特に本発明による有効成分を乳製品に含有させる場合には、本発明による有効成分を生菌として乳原料に加えて菌増殖／発酵を行い、ヨーグルト等の発酵乳酸菌飲食品とすることもできる。
【００５０】
（飲料への配合）
本発明の高抗アレルギー活性の組成物は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する抗アレルギー機能を有する飲料として提供することができる。本発明における高抗アレルギー活性活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、飲料自体の香味を保持し、しかも安定した物性の飲料を調製するためには、乳酸菌を加熱殺菌した形で用いるのが好ましい。
【００５１】
本発明における高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、乳酸菌の配合量は適宜決定することができるが、通常、飲料として継続的に摂取することができる量で、乳酸菌のもつ抗アレルギー活性を充分に発揮するための配合量が採用される。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲料の量に合わせて、上記指標により、各々の飲料あたりに含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、１日あたり１００ｇの飲料が摂取されるとすれば、飲料１００ｇあたり１０9個以上の菌数を添加することが好ましい。一方、乳酸菌の添加で、飲料の香味や外観を損なわない範囲を考えると、１０11個以下が好ましい。更に、５×１０10個以下がより好ましい。したがって、抗アレルギー機能を有し、かつ、安定性があり、嗜好性、保存性が高い飲料の乳酸菌の濃度としては、飲料１００ｇ当たり、１０9〜１０11個の範囲のものが特に好ましい。なお、乳酸菌の菌体数と乾燥菌体重量の関係については、例えば、Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０株では、菌体数１０12個が乾燥菌体重量１ｇに相当する。
【００５２】
本発明において、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する飲料としては、各種のものを挙げることができるが、それらの飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、香料、果汁、食品添加物などいずれも使用することが出来る。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。
【００５３】
本発明において、特に、配合に適した飲料としては、抗アレルギー作用及び製品の保存、安定化の観点から、乳成分を含まない、すなわち、例えば、果汁入り清涼飲料或いは茶飲料のような乳成分非配合の形の飲料が特に好ましい。
【００５４】
配合する飲料を具体的に例示すれば、アルコール飲料（ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、酎ハイ等）や非アルコール飲料（ドリンクタイプのヨーグルト、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、ウメ、スイカ等の果汁、トマト、ニンジン、セロリ、キュウリ等の野菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー茶、ローズ茶、キク茶、ミント茶、ジャスミン茶等の各種ハーブ茶、スポーツ飲料、ミネラルウオーター、栄養ドリンク等）の各種飲料が挙げられる。
【００５５】
飲料のカテゴリーによって例示すれば、緑茶、ウーロン茶、紅茶、麦茶、ブレンド茶などの茶系飲料と、コーヒー、果汁入り飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、栄養ドリンクとが例示できる。
【００５６】
本発明において、抗アレルギー機能を有する飲料を製品化するに際しては、食品衛生法に定められた方法に従って、適宜、飲料の殺菌を行うことができる。該殺菌方法としては、飲料のpHによって、パストル殺菌、ホットパック殺菌、ＵＨＴ殺菌、レトルト殺菌等を使い分けることができる。
【００５７】
更に、製品形態としては、通常飲料の製品形態に使用されている密封容器入り飲料の形態が特に好ましく、該密封容器としては、缶、ビン、ＰＥＴ、紙容器のいずれの形態でもよい。また、容量についても特に制限はないが、一般的に、消費者が日常的に飲料として摂取している量と、配合する乳酸菌の菌数と1日の必要菌数を考慮して、適宜、決定することができる。
【００５８】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
（本発明の実施例で用いた乳酸菌）
本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を、図１（Ｎｏ．１）及び図２（Ｎｏ．２）に示す。本発明においては、全ての菌株をＫＷで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれのＫＷ株と入手由来との関係は図１（Ｎｏ．１）及び図２（Ｎｏ．２）の通りである。なお、該図１の「入手先」において、「ＪＣＭ」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「ＩＦＯ」は前財団法人発酵研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物資源センター（ＮＢＲＣ））を表す。
【実施例２】
【００６０】
（乳酸菌群のin  vitroにおける抗アレルギー活性の評価）
１．試料
乳酸菌の各菌株をＭ．Ｒ．Ｓ．（de Man, Rogosa, Sharpe）培地（ＯＸＯＩＤ）で４８時間培養したものを、滅菌水で３回洗浄し、滅菌水に懸濁後１００℃、３０分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、ＰＢＳに懸濁した。使用した乳酸菌は図１（Ｎｏ．１）及び図２（Ｎｏ．２）を参照のこと。
【００６１】
２．実験動物、飼育
７−１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）にｄａｙ０とｄａｙ６に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１ｍｇをアジュバントであるAlum２ｍｇと共に腹腔内注射した。Ｄａｙ１３に解剖し、脾臓を単離・リンパ球を調製した。実験は、ｎ＝６で行った。
【００６２】
３．脾細胞ＩＬ−４、ＩＬ−１２の測定
ＩＬ−４、ＩＬ−１２の測定は、OptEIA ELISA Set（ベクトン・ディッキンソン）を用いて測定した。
【００６３】
４．実験条件
「２．実験動物、飼育」の方法で調製した脾臓リンパ球をＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）＋１０％ＦＣＳ（ロシュ）＋１ｍｇ  ＯＶＡ培地で２．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁した。さらに試験する乳酸菌を０．１あるいは１μｇ／ｍｌで添加した。１週間後に培養上清を回収し、Ｔｈ１サイトカインとしてＩＬ−１２をＴｈ２サイトカインとしてＩＬ−４をそれぞれ測定した。
【００６４】
５．実験結果
Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−１２の各乳酸菌による生成量を図３及び表２に示す。乳酸菌の添加量は１μｇ／ｍｌである。菌株の違いにより、様々な産生量の違いが見られた。約１００株の中で最も強いＴｈ１誘導能を示したのはＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株であった。データは全てＫＷ３１１０株によるＩＬ−１２産生量を１００％としたときの比率で示されている。便宜的にＫＷ３１１０株に対して７５％以上の産生量を示した株をＡ評価、５０％以上〜７５％未満の産生量を示した株をＢ評価、２５％以上〜５０％未満の産生量を示した株をＣ評価、１０％以上〜２５％未満の産生量を示した株をＤ評価、１０％未満の産生量を示した株をＥ評価とした。
【００６５】
アレルギーの原因であるＴｈ２サイトカイン、ＩＬ−４の各乳酸菌による生成量を図４及び表２に示す。乳酸菌の添加量は０．１μｇ／ｍｌである。菌株の違いにより、その抑制効果は様々な値を示した。約１００株の中で最も強いＴｈ２抑制能を示したのはＬ．paracasei ＫＷ３１１０株であった。データは全てコントロール（乳酸菌無添加）のＩＬ−４産生量を１００％としたときの比率で示されている。便宜的にコントロールに対して３０％未満の産生量を示した株をＡ評価、３０％以上〜５０％産生量を示した株をＢ評価、５０％以上〜７０％未満の産生量を示した株をＣ評価、７０％以上〜１００％未満の産生量を示した株Ｄ評価、１００％以上の産生量を示した株をＥ評価とした。Ｔｈ１、Ｔｈ２それぞれのパラメーターについてＡ〜Ｅ評価をまとめた「抗アレルギー乳酸菌評価結果」を表１及び表２に示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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Ｔｈ１パラメータがＫＷ３１１０株の６０％以上、Ｔｈ２パラメーターがコントロールの５０％以下の株を抗アレルギー乳酸菌であるとすると該当する株は、ＫＷ３１１０株、Ｔ株、ＮＲＩＣ１９１７株、ＪＣＭ８１３２、ＪＣＭ１１４９株の５株である。また、強いＫＷ３１１０株の７５％以上のＴｈ１誘導能を示した株を免疫賦活乳酸菌であるとすると該当する株はＫＷ３１１０株、ＫＷ４５１０株、ＪＣＭ１１４９株、Ｔ株、ＮＲＩＣ１９１７株、ＪＣＭ１０５９株の６株である。そして、当該乳酸菌を配合した免疫賦活用組成物（医薬品、飲食品）を、本明細書記載の方法で製造することができる。また、抗アレルギー乳酸菌として知られるＬ．acidophilusＬ−９２株はＩＬ−１２の産生量でＫＷ３１１０株の１１．７％程度、ＩＬ−４の抑制活性についてはＫＷ３１１０株がコントロール（無添加）の２６．４％であるのに対し、Ｌ−９２株は７４．６％と、どちらのパラメーターに関してもＫＷ３１１０株のような強い抗アレルギー乳酸菌に比べて圧倒的に劣ることが示唆された（図５）。本発明の乳酸菌株及び対照となる乳酸菌株の抗アレルギー活性について測定した結果を表３に示す。
【００６８】
【表３】
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【実施例３】
【００６９】
（派生株の選抜）
本実施例では、本発明で取得した乳酸菌株ＫＷ３１１０株から派生した抗アレルギー活性を有する菌株を選抜した例である。ＫＷ３１１０株をＭＲＳ培地にて３７℃でＯＤ６００が０．８から１．０に達するまで静置培養した。
培養液を新鮮なＭＲＳ培地で、ＯＤ６００＝０．５になるように希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸でｐＨを３．０にしたＰＢＳ（大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解）に１０％分懸濁し、３７℃３時間インキュベートした。酸処理した菌体懸濁液をＰＢＳで希釈し、ＭＲＳプレート培地にまき、３７℃でコロニーを形成させた。形成させたコロニーの中に色調の薄いコロニーが認められた。これを選抜し、ＭＲＳ培地で４８時間培養した。この株をＮｏ．９０と命名した。Ｎｏ．９０株を実施例２の方法で抗アレルギー活性を測定した。Ｎｏ．９０株は野生株と比較して同程度のＩＬ−１２産生能を示した（図６）。なお、図中、「比活性（％）」は、ＫＷ３１１０株のＩＬ−１２産生能を１００とした時の派生株（Ｎｏ．９０）のＩＬ−１２産生能で示した。このＮｏ．９０株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５として寄託された。
【実施例４】
【００７０】
（in vitro高抗アレルギー活性株ＫＷ３１１０株のin vivoでの評価）
１．投与試料
Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０株をＭＲＳ培地で４８時間培養したものを、滅菌水で３回洗浄し、滅菌水に懸濁後１００℃、３０分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料ＡＩＮ９３（アメリカ国立栄養研究所による標準組成）にマウス一匹が１日１ｍｇ摂取するように練りこんだ混餌を作製した。
【００７１】
２．実験動物、飼育
８週齢ＢＡＬＢ／ｃを用いた。１群６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＣＥ−２（日本クレア）及び水を自由摂取させて１週間馴化飼育を行った。ｄａｙ０の抗原感作後は、コントロール群は精製原料を使用して作製したＡＩＮ９３粉末飼料での飼育に、ＫＷ３１１０群はＡＩＮ９３にＫＷ３１１０菌が練りこまれた混餌に切り替えた。
【００７２】
３．血中ＩｇＥ、脾細胞ＩＬ−４、ＩＬ−１２の測定
ＩｇＥ、ＩＬ−４、ＩＬ−１２の測定は、OptEIA ELISA Set（ベクトン・ディッキンソン）を用いて測定した。
【００７３】
４．実験条件
実験群としてはコントロール群（ＡＩＮ９３）、ＫＷ３１１０株をＡＩＮ９３に１ｍｇ／mouse／ｄａｙになるように添加した群（ＫＷ３１１０群）を設定した。コントロール群、ＫＷ３１１０群共に粉末飼料４ｇを水で練ったものを実験終了時（ｄａｙ９８）まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン（ＯＶＡ）でのアレルギー感作は１００μｇＯＶＡをアジュバントであるAlum２ｍｇと共に、ｄａｙ０、１４、４２、７０、９４の合計５回腹腔に注射することで行った。この間、１週間ごとに眼底静脈より採血を行った。実験終了時には全血採取及び脾臓の摘出を行い、リンパ球を調製した（図７）。脾臓リンパ球はＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）＋１０％ＦＣＳ（ロシュ）＋１００μｇＯＶＡ培地で３７℃、５％ＣＯ2の条件で１週間培養し、培養上清を回収した。血液サンプルに対してはＩｇＥ量を脾臓リンパ球培養上清サンプルに対してはＩＬ−４、ＩＬ−１２を測定した。
【００７４】
５．実験結果
９８日間の実験期間中における血中ＩｇＥの変動を図８に示す。ｄａｙ４８時での血中ＩｇＥでＫＷ３１１０群はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意に低い血中ＩｇＥ値を示した。ｄａｙ４８及び解剖時ｄａｙ９８での血中ＩｇＥ量をドットブロットで図９に示す。ｄａｙ９８においてもＫＷ３１１０群はコントロール群に対して有意に低い血中ＩｇＥを示した。コントロール群、ＫＷ３１１０群の９８日解剖時の脾細胞培養におけるＩＬ−１２産生量を図１０に、ＩＬ−４産生量を図１１に示す。ＫＷ３１１０群はコントロール群に対して有意に高いＩＬ−１２産生を示した。ＩＬ−４について有意差はつかなかったが、コントロール群に対して低い傾向を示した。以上の結果は、ＫＷ３１１０株摂取により体内の免疫バランスがＴｈ１にシフトし、アレルギー状態が改善されたことを示唆する。また、図１２に示すようｄａｙ３０時でコントロール群では例外なく鼻周辺の脱毛が見られたが、ＫＷ３１１０群では例外なく脱毛が起こらなかった。このときコントロール群では頻繁に鼻の引っかき行動が観察された。ＫＷ３１１０群でコントロール群と同様な鼻周辺の脱毛及び鼻の引っかき行動が観察されたのはｄａｙ６０前後であった。鼻の引っかき行動の観察結果は、ＫＷ３１１０群がアレルギー症状を実際に抑制していることを示唆している。
【実施例５】
【００７５】
（公知の抗アレルギー乳酸菌、ＫＷ４６１０株（L.rhamnosus  ＬＧＧ株）との比較）
１．投与試料
ＫＷ３１１０株、ＫＷ４６１０株をＭＲＳ培地で４８時間培養したものを、滅菌水で３回洗浄し、滅菌水に懸濁後１００℃、３０分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料ＡＩＮ９３（アメリカ国立栄養研究所による標準組成）にマウス一匹が１日１乃至１０ｍｇ摂取するように練りこんだ混餌を作製した。
【００７６】
２．実験動物、飼育
８週齢ＢＡＬＢ／ｃを用いた。１群６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＣＥ−２（日本クレア）及び水を自由摂取させて１週間馴化飼育を行った。抗原感作２１日前からＫＷ３１１０株、ＫＷ４６１０株の混餌あるいはＡＩＮ９３粉末飼料を摂取させた。
【００７７】
３．血中ＩｇＥの測定
ＩｇＥの測定は、OptEIA ELISA Set（ベクトン・ディッキンソン）を用いて測定した。
【００７８】
４．実験条件
実験群としてはコントロール群（ＡＩＮ９３）、ＫＷ３１１０株又はＫＷ４６１０株をＡＩＮ９３に１あるいは１０ｍｇ／mouse／ｄａｙになるように添加した群（ＫＷ３１１０群、ＫＷ４６１０群）を設定した。コントロール群、ＫＷ３１１０群、ＫＷ４６１０群共に粉末飼料４ｇを水で練ったものを実験終了時（ｄａｙ１３３）まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン（ＯＶＡ）でのアレルギー感作は１００μｇＯＶＡをアジュバントであるAlum２ｍｇと共に、ｄａｙ０、１４、４２、７０、９８、１２６の合計６回腹腔に注射することで行った。この間、１週間ごとに眼底静脈より採血を行った（図１３）。血液サンプルに対してはＩｇＥ量を測定した。
【００７９】
５．実験結果
試験期間中の血中ＩｇＥ量の変動を図１４に、ＯＶＡ５次、６次投与後の個体ごとの血中ＩｇＥ量をドットで図１５に示す。ＯＶＡの抗原感作と共に血中ＩｇＥレベルは全ての群で上昇することが確認されたが、ＫＷ３１１０群においてＯＶＡ５次投与後からコントロールに対して有意な血中ＩｇＥ量の低下が観察された。一方、ＫＷ４６１０群ではコントロールに対して有意な血中ＩｇＥ量の低下は観察されず、ＫＷ３１１０株の抗アレルギー活性がより強いことを示唆した。また１ｍｇ摂取群より１０ｍｇ摂取群でより強いＩｇＥ低減効果があることが示唆された。
【実施例６】
【００８０】
（乳酸菌の酸耐性及び胆汁酸耐性）
乳酸菌が腸管へ生きて到達し、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、胃酸、胆汁酸という消化液に対して耐性であることが必要であるといわれている。ＫＷ３１１０株がこの条件を満たす株であるかを検証するために、in vitroにおける酸耐性及び胆汁酸耐性を測定した。
【００８１】
１．方法
酸耐性は、乳酸菌を対数増殖後期まで培養したのち、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）でＯＤ６００＝０．５になるように調整した菌体を、塩酸でｐＨ３．０になるように調整したＭＲＳ培地に１／１０量添加し、これを３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後１時間、２時間、３時間にサンプリングを行い、ＭＲＳ寒天培地で生菌率を測定した。
【００８２】
２．実験結果
胆汁酸耐性はＭＲＳ液体培地に胆汁酸（OXOID社 Bile Salts）を最終濃度２％になるように添加したものに、ＫＷ３１１０株前培養液を１％植菌し、オリエンタルインスツルメンツ社のＢＩＯＰＬＯＴＴＥＲを用いてＯＤ６３０を測定することにより、生育速度を測定した。
【００８３】
いずれの実験にも対象としてＬ．delbrueckiiの基準株であるＫＷ３３１７株（ＪＣＭ１０１２株）を用いた。その結果、酸耐性試験（図１６）では３時間も約５０％のＫＷ３１１０株が生存していることが示唆された。また胆汁酸耐性試験（図１７）では２％の胆汁酸を含む培地においても、ＫＷ３１１０株は十分な生育を示し、胆汁酸に耐性であることが示された。一方、ＫＷ３３１７株は酸、胆汁酸のいずれに対する耐性も低いことが示唆された。
【実施例７】
【００８４】
（乳酸菌の腸管接着性）
腸管へ生きて到達した乳酸菌が、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、菌が腸管にとどまることが必要である。乳酸菌が腸管にとどまり、その効果を十分発揮するための指標として、in vitroにおけるヒト腸管由来株化細胞Ｃａｃｏ−２への接着性試験が頻繁に用いられる。そこで、ＫＷ３１１０株のＣａｃｏ−２細胞接着能を測定した。
【００８５】
１．方法
Ｃａｃｏ−２細胞の培養は、Coconnierらの方法（アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー、１９９２年、第５８巻、２０３４頁）に準じて行った。１．２×１０4個／ｃｍ2のＣａｃｏ−２細胞をスライドグラス上で約１〜２週間、ポストコンフルエントとなるまで培養した。ＫＷ３１１０株はＭＲＳ培地で３７℃、２晩培養したものを集菌し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＰＢＳでＯＤ６００＝１．０に調製したものを用いた。調製したＫＷ３１１０液２ｍｌに、Ｃａｃｏ−２細胞を培養したスライドグラスを浸し、３７℃、１０％炭酸ガス存在下で１時間接触させ、その後スライドグラスをＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地で３回洗浄した。次にスライドグラスをメタノールで固定した後、グラム染色法（メディカルテクノロジー、１９９５、第２３巻、２０５頁）でＫＷ３１１０株を染色した。これを検鏡して、Ｃａｃｏ−２細胞に付着した乳酸菌数を数え、４視野あたりの平均値を接着数として求めた。また基準株であるＫＷ３９１３株（ＪＣＭ８１３０株）およびＫＷ３１１５株（ＪＣＭ１１３４株）をはじめとする、Ｌ．paracasei、Ｌ．casei１５株についても同様の検討を行った。
【００８６】
２．実験結果
各乳酸菌のＣａｃｏ−２細胞への接着能の試験の結果を表３に示す。OuwehandらはＬ．paracasei、Ｌ．casei菌がＣａｃｏ−２細胞への接着能力が低いことを報告しているが（フードマイクロバイオロジー・アンド・セイフティー、２００１年、第６６巻、８５６頁）、今回の実験でも、ＫＷ３１１０株以外の株は、接着能力が低かった。しかし、ＫＷ３１１０株はＬ．paracasei、Ｌ．casei菌の中では、著しく高いＣａｃｏ−２細胞接着能力を示しており、優れたプロバイオティクス効果が期待できる株であることが示唆された。
【００８７】
【表４】
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【実施例８】
【００８８】
（花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果）
１．実験方法
（動物種）
ＢＤＦ１♀マウス4週令（チャールズリバー）を購入
（実験群）
実験Ａ：点鼻による抗原感作（花粉症モデル）
Control群：標準飼料（ＡＩＮ−７６ベース）を投与した群
ＫＷ群：ＫＷ1ｍｇ／mouse（１ｍｇ ＫＷ３１１０／３ｇＡＩＮ−７６ベース）投与した群
実験Ｂ：ネブライザによる抗原感作（気道炎症モデル）
Control群：標準飼料（ＡＩＮ−７６ベース）を投与した群
ＫＷ群：ＫＷ１ｍｇ／mouse（１ｍｇ ＫＷ３１１０／３ｇＡＩＮ−７６ベース）投与した群
（試薬・機器）
スギ花粉抽出物ＣＰ（LSL社）
ＡＬＵＭ（Sigma社）
超音波式ネブライザＸＥ−Ｕ１２（オムロン社）
集細胞遠心機：サイトスピン４（ThermoBioAnalysis社）
【００８９】
（評価方法）
実験Ａ
ＢＤＦ−１マウスを購入後１週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総ＩｇＥ濃度で群分けを行った（ｎ＝７）。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後３週目からＣＰ＋ＡＬＵＭ溶液（ＣＰ １０μｇ＋ＡＬＵＭ ２ｍｇ／mouse）を週1回／３週間腹腔内投与した。３回目のＣＰ＋ＡＬＵＭ溶液投与後２週目からマウス両鼻にＣＰ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌずつ点鼻した。また未刺激モデル（Basal）として点鼻に生理食塩水を投与するマウスも設定した。点鼻は５日間実施し、点鼻後５分間のくしゃみの回数（１、３、５日目）と、鼻部引っ掻き回数（３、５日目）をカウントした。
【００９０】
実験Ｂ
ＢＤＦ−１マウスを購入後１週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総ＩｇＥ濃度で群分けを行った（ｎ＝７）。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後３週目から週１回／３週間ＣＰ＋ＡＬＵＭ溶液（ＣＰ １０μｇ＋ＡＬＵＭ ２ｍｇ／mouse）を腹腔内投与した。３回目のＣＰ＋ＡＬＵＭ溶液投与後２週目から、密閉容器内でマウスにＣＰ溶液（４０μｇ／ｍｌ）を１５分間ネブライザで噴霧した。また未刺激モデル（Basal）として生理食塩水を噴霧するマウスを設定した。この噴霧は５日間実施した。またＣＰ腹腔内投与時（０日目）、ネブライザ開始時（３５日目）、解剖時（４０日目）に眼窩採血を行い、血中総ＩｇＥ濃度を測定した。５日目に麻酔下で気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、ＢＡＬＦ中の細胞数カウント、ＢＡＬＦ中細胞同定、ＢＡＬＦ中のサイトカインの測定を行った。ＢＡＬＦは麻酔下のマウス頚部を切開及び気道のカニュレーションし、０．１％ＢＳＡ入りSaline０．７ｍｌ×３回（計２．１ｍｌ）によって洗浄した。遠心後上清及び細胞を回収し、細胞は細胞数を計測した。さらに塗抹標本を作製し、ライト・ギムザ染色により細胞を同定した。
【００９１】
２．実験結果
（実験Ａ）
点鼻後５分間のくしゃみの回数に関して、物理的刺激の影響を考慮するため、点鼻後０〜１分、１〜５分、総回数に分けて評価した。結果、生理食塩水点鼻ではほとんどくしゃみ症状を示さないのに対し、Control群は抗原点鼻を繰り返すにつれてくしゃみ頻度を増していった。一方、ＫＷ群ではくしゃみ症状を抑制する傾向が見られた（図１８a、b、c）。また鼻部引っ掻き行動に関しては点鼻後５分間の連続した引っ掻き行動を１pointとした（総point数）。また軽度の引っ掻き（連続１〜４回の引っ掻き行動）と重度の引っ掻き（連続５回以上の引っ掻き行動）に分けた場合もpoint評価した。Control群に比べＫＷ群は引っ掻き行動は抑えられ、５日目の軽度のpoint数に関して有意な抑制がみられた（図１９ａ、ｂ）      
【００９２】
（実験Ｂ）
ネブライザ前ならびに解剖時にControl群に対してＫＷ群は有意に血中総ＩｇＥ濃度上昇を抑制した（図２０）。ＢＡＬＦ中の細胞の種類は通常状態であれば、マクロファージを中心とした単球が殆んどを占めている。しかし抗原刺激によりControl群のＢＡＬＦ中には好酸球が６５％程度を占め、単球比率が減少する。一方、ＫＷ群はControl群に比べ、好酸球％の上昇を抑えている傾向がみられた（図２１ａ）。また好酸球数においても同様にＫＷ群がControl群に比べ好酸球の局所への浸潤を抑制している傾向がみられた（図２１ｂ）。
【００９３】
またＢＡＬＦ上清中のサイトカインを測定したところ、好酸球の増殖・分化を担うＴｈ２サイトカインであるＩＬ−５がControl群に比べ、ＫＷ群は低値を示した（図２２）。
【００９４】
以上の結果から、ＫＷ３１１０を摂取することにより、即時型アレルギーのなかでも花粉症の臨床症状に近いスギ花粉抗原によるくしゃみ行動、引っ掻き行動を抑制する可能性が示唆された。またＫＷ３１１０はＩｇＥ上昇を抑制することにより、抗原暴露による気道炎症に対しても肺局所でのＩＬ−５産生を抑制し、さらには好酸球の浸潤を抑制することが分かった。IL-5と気道炎症・好酸球の関係はJ. Allergy Clin. Immunol  88(6)935-942,1991に述べられており、このことはＫＷ３１１０投与が気道炎症を主な症状とするアレルギー性喘息に有効であることを示している。
【実施例９】
【００９５】
（アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果）
アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果の検証に、ピクリルクロライド塗布によるアトピー性皮膚炎モデルを用いた。（引用文献・応用薬理  59（6） 123-134,2000 ）
【００９６】
１．実験方法
（動物種）
ＮＣ／ＮｇａＴｎｄＣｙｊマウス♂５週令（チャールズリバー）を購入
（実験群）
対照群：標準飼料（ＡＩＮ−７６ベース）を１１週間投与した群
ＫＷ１ｍｇ−１１ｗｋ群：１ｍｇ ＫＷ３１１０／３ｇ ＡＩＮ−７６ベースを１１週間投与した群
ＫＷ １０ｍｇ−１１ｗｋ群：１０ｍｇ ＫＷ３１１０／３ｇ ＡＩＮ−７６ベースを１１週間投与した群
ＫＷ１ｍｇ−８ｗｋ群：標準飼料を３週間投与した後、１ｍｇ ＫＷ３１１０／３ｇ ＡＩＮ−７６ベースを８週間投与した群
（試薬）
ピクリルクロライド：ＰＣＩ（東京化成工業）
感作用溶液：５％溶液（エタノール：アセトン＝４：１）
腹部・・・１００μｌ、後肢部・・・２５μｌ両足
チャレンジ用溶液：０．８％溶液（オリーブオイル）
耳介部・・・両面・両耳に１０μｌずつ（計４０μｌ）、背皮部・・・５０μｌ
【００９７】
（評価方法）
ＮＣ／Ｎｇａマウスを購入後１週間馴化し、眼窩採血で得られた血清をもとに血中総IgE濃度で群分けを行った（ｎ＝１０）。群分けし実験食を投与開始した３週間後、ＰＣ１感作用溶液を毛剃した腹部と後肢部両側に塗布し、次にチャレンジとして１週間後に両耳介部・両面及び毛剃した背皮部にチャレンジ用溶液を塗布した。このチャレンジを１週間おきに計７7回実施した。またチャレンジ用溶液溶媒による耳介肥厚がないことを確認するため、オリーブオイル塗布後、０、１、４、２４、７２、９６、１２０、１４４、１６８ｈにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定した。さらにチャレンジ１，３回目の後、同様に０、１、４、２４、７２、９６、１２０、１４４、１６８ｈにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定し浮腫を評価した。また感作後毎週眼窩採血を実施し、感作後週２回臨床スコアを評価した。最終チャレンジ７回目から１週間後に屠殺し、血清及び耳介部組織を回収した。血清に関しては総ＩｇＥ濃度を、耳介部組織はヘマトキシリン・エオジン染色、トロイジンブルー染色を実施した。
【００９８】
（臨床スコア）
耳介部の掻痒症、発赤・出血・糜爛、浮腫、擦傷・組織欠損、痂皮形成・乾燥の５項目、頭皮部の脱毛、発赤・出血・糜爛、痂皮形成・乾燥の３項目の８項目について症状無（０点）、軽度（１点）、中度（２点）、重度（３点）と点数化し、加算したものをスコアとして評価した。
（統計）
統計は分散分析並びに対照群に対するDunnettの多重比較検定を行い、各々の項目で危険率が５％以下のものを有意差ありとした。
【００９９】
２．実験結果
血中総ＩｇＥ濃度は、対照群はPClチャレンジ４週目あたりから大幅に上昇していくのに対し、ＫＷ３１１０摂取全群でその上昇は抑えられ、ＫＷ １０ｍｇ−１１ｗｋ群とＫＷ１ｍｇ−８ｗｋ群ではチャレンジ４回目から、ＫＷ１ｍｇ−１１ｗｋ群はチャレンジ６回目から有意に上昇を抑制した（図２３）。
臨床スコアは、対照群では早期から耳介及び頭皮の病態悪化、すなわちスコアの上昇が確認された。一方ＫＷ３１１０摂取全群でその上昇が抑制され、ＫＷ１ｍｇ−１１ｗｋ群、ＫＷ １０ｍｇ−１１ｗｋ群はチャレンジ２回目から、ＫＷ１ｍｇ−８ｗｋ群はチャレンジ３回目直後から有意に上昇を抑制した。耳介部のみの臨床スコア、頭皮のみの臨床スコアに関しても同様にＫＷ３１１０摂取全群で有意差が見られた（図２４、２５、２６）。また頭部の写真からも耳介部の糜爛・組織欠損が、ＫＷ摂取群で抑えられているのが確認できる（図２７）。
【０１００】
ＰＣＩチャレンジによる耳介肥厚に関して、感作段階で実施した溶媒塗布では耳介の肥厚はみられなかったが、ＰＣＩをチャレンジすることにより耳介の肥厚・発赤・浮腫が確認できた。チャレンジ１回目では対照群は１、４時間目に即時型反応が関与する１相目の肥厚、４８時間目に遅延型反応による２相目の肥厚、さらに１２０〜１４４時間目に即時型反応が関与すると言われいている３相目の耳介部の肥厚が確認できた。一方、ＫＷ３１１０摂取群は３群とも即時型反応が関与する１、４時間目に有意な肥厚抑制が見られ、ＫＷ １０ｍｇ−１１ｗｋ群はさらに１４４時間目に、Ｋｗ１ｍｇ−８ｗｋ群に関しては２４、１４４時間目に有意な肥厚の抑制がみられた。チャレンジ３回目には対照群は塗布後継続して肥厚していたが、ＫＷ３１１０摂取群は全体的に肥厚抑制傾向がみられ、ＫＷ１ｍｇ−１１ｗｋ群、ＫＷ １０ｍｇ−１１ｗｋ群では有意な抑制が確認できた（図２８、２９）。
【０１０１】
耳介部の病理学的評価の結果、対照群は真皮並びに表皮が肥厚し浮腫などの炎症も見られるのに対し、ＫＷ摂取全群では対照群よりも肥厚が全体的に抑えられているのが確認できた（図３０）。またトロイジンブルー染色による病理組織評価において肥満細胞数がKW摂取群は対照群に比べ少ないことが確認できた（図３１）。
以上の結果から、KW摂取により血中総ＩｇＥ濃度の上昇抑制、ハプテン刺激による耳介肥厚の抑制、臨床レベルでの症状悪化の抑制が確認された。よってＫＷ３１１０摂取によりＮＣ／Ｎｇａマウスにおけるハプテン誘発アトピー性皮膚炎に対して症状改善効果をもつことが示された。
【実施例１０】
【０１０２】
（花粉症についてのＫＷ３１１０株のヒトでの効果）
ＫＷ３１１０株のヒトでの効果を検証するために、花粉症ボランティアに対して下記の試験を行った。
【０１０３】
１．試験方法
（試験試料）
実施例２でＴｈ１、Ｔｈ２両パラメーターの評価が共にＥ評価であったLactobacillus delbrueckii Ｂ株あるいはL. paracasei ＫＷ３１１０株で作製したヨーグルト試作品。菌数として２×１０8 ｃｆｕ／ｍｌを含む。
（試験対象）
企業に勤務するボランティア花粉症患者２８名。本試験は、ヘルシンキ宣言にのっとり，全ての被験者に対して事前に試験内容、方法に関する十分な説明を行い、文書によるインフォームドコンセントを得て行った。
（試験群）
被験者２８名を無作為に２群に分けた。１群は対照ヨーグルトであるL.delbrueckii Ｂ株ヨーグルト、もう1群はL.paracaseiＫＷ３１１０株ヨーグルトを一日２００ｍｌ（ＫＷ３１１０株乾燥菌体４０ｍｇに相当する）摂取した。群分けの結果については試験終了まで第３者が情報を管理する２重盲検試験で行われた。
（試験期間）
２００３年１月２０日から４月１４日。
【０１０４】
（測定項目）
被験者に対して、０週（試験開始時）、４、８、１２週目（試験終了時）に採血を行った。血液はファルコバイオシステムズ（株）において次の項目について測定を行った：ＮＫ細胞活性、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞数の比（Ｔｈ１／Ｔｈ２比）、好酸球数、ＥＣＰ値、血中総ＩｇＥ量、血中スギ花粉特異的ＩｇＥ量。
これらのデータは試験終了後、統計処理を行ってデータ化した。
また、被験者は表に示すアンケートフォームに５段階（３＋：高度、２＋：中等度、＋：軽度、±：軽微、−：なし）で採血時に答えた。３＋を４点、２＋を３点、＋を２点、±を１点、−を０点として、スコア化して統計処理を行った。
【０１０５】
【表５】
0003585487.tif 000006
【０１０６】
【表６】
0003585487.tif 000007
２．実験結果
図３２に示すように、試験開始時と終了時を比較した時、対照であるL. delbrueckii Ｂ株ヨーグルト群（対照群）ではＴｈ１／Ｔｈ２比が有意な低下を示し、図３３に示すように、ＥＣＰ値では有意な上昇を示した。一方、L. paracasei ＫＷ３１１０株ヨーグルト群（ＫＷ群）ではどちらの値についても試験前後での有意な変化は認められなかった。また、図３４に示すように、自覚症状をスコア化したものについてものどのかゆみ、目の痛み、まぶたの重みの項目でＫＷ群の方が対照群より低い傾向が認められた。以上の結果、ヒト花粉症においてもＫＷ３１１０株の有効性が示された。
以下に、本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料の製造に適用した場合の実施例について記載する。
【実施例１１】
【０１０７】
（飲料添加原料となる乳酸菌菌体の調製方法）
調製例１．乳酸菌ＫＷ３１１０株菌体の調製
乳酸菌の培養には、培養用培地（グルコース  １％、酵母エキスＳ(武田キリン社)１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ５０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ５０ｐｐｍ）を使用した。前培養は乳酸菌ＫＷ３１１０株を培養用培地１０ｍｌに接種し、３７℃で２０〜２４ｈｒ静置し、行った。本培養は、前培養液０．６ｍｌを１２０ｍｌの培養用培地に接種し、２００ｍｌ容ファーメンター（モデルＢＭＪ−２５、エイブル社）を用いて、２８℃にて培養した。通気量は０．１２Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度は５００ｒｐｍとした。ｐＨは２５％  ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ  ４．５以下にならないように制御した。培養は４８時間行った。
【０１０８】
培養終了後、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌した。３０ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁し、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌した。この洗浄操作を３回繰り返し、培地由来成分を除去した。洗浄菌体を、１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、オートクレーブにて１００℃、３０分間処理した後、凍結乾燥した。最終的に乳酸菌乾燥菌体５０〜７０ｍｇが得られた。得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を確認した。
【実施例１２】
【０１０９】
（茶系飲料の製造）
８５℃の熱水で抽出した烏龍茶、紅茶、緑茶、ほうじ茶、ジャスミン茶の抽出液に対して、茶葉使用率が０．８重量％になるように脱イオン水を追加した。その際、アスコルビン酸を０．０２５重量％になるように添加し、ついで重曹を用いて飲みやすいｐＨに調整した。さらに当該調合液１００ｇに対して、乳酸菌ＫＷ３１１０株を菌数が１．５×１０10個、３×１０10個になるように添加した後、常法通りＵＨＴ殺菌をおこない、３５０ｍｌ容ＰＥＴボトルに充填した。
【０１１０】
これらの１０個の実施例（５種の茶×２段階乳酸菌濃度）をパネラーによる官能評価に供した。その結果いずれの飲料の香味も満足できるものであり、充分毎日継続して飲みつづけられるとの高い評価が得られた。ただし、３×１０10個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、１．５×１０10個の方がより好ましいと評価された。
【実施例１３】
【０１１１】
（麦茶の製造）
はと麦茶２５０ｇを熱湯１０ｋｇで３０分間煮出して、ろ過した後、遠心分離をおこなった。得られた抽出液に、乳酸菌ＫＷ３１１０株を最終製品１００ｇあたり８×１０10、１．５×１０10、３×１０10個になるように加えた後、さらにアスコルビン酸と重曹を加えて味を調整してから、１０ｋｇに脱イオン水で再度メスアップした。ついで常法通りＵＨＴ殺菌して、５００ｍｌ容ＰＥＴボトルにアセプティック充填した。官能評価に供したところ、いずれも満足できる香味であり、充分毎日継続して飲みつづけられるとの高い評価が得られた。ただし、３×１０10個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、それ以下の方がより好ましいと評価された。
【実施例１４】
【０１１２】
（果汁入り飲料の製造）
混濁リンゴ果汁９００ｇと香料１ｇに対して所定量の乳酸菌菌体を添加し、さらに脱イオン水を加えて合計１ｋｇになるようにした後、常法通り１８０ｍｌ容ガラス瓶でホットパック充填をおこない、リンゴ果汁入り飲料を調製した。なお、乳酸菌ＫＷ３１１０株は、当該調合液１００ｇに対して、菌数が２×１０10個、若しくは４×１０10個になるように添加した。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による香味の違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。
【実施例１５】
【０１１３】
（スポーツドリンクの製造）
グラニュー糖４．５重量％、クエン酸０．２重量％、クエン酸ナトリウム０．０５重量％、香料０．１重量％を含む調合液に対し、乳酸菌ＫＷ３１１０株を０．０１４３重量％（製品１００ｇあたり１．５×１０10個）を添加した。さらにこの液を９０℃まで加熱して殺菌し、ペットボトルにホットパックしてスポーツドリンクタイプの飲料を調製した。官能評価の結果、外観、香味ともに満足できるものであった。本飲料中の乳酸菌菌体を遠心分離してから、純水で２回洗浄した後、凍結乾燥を行い、乾燥菌体を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図３５）。
【実施例１６】
【０１１４】
（トマトジュースの製造）
トマトジュースに対して所定量の乳酸菌菌体を添加た後、１９０ｇ缶に充填して常法に従ってレトルト殺菌をおこなったた。なお、乳酸菌ＫＷ３１１０株は、当該調合液１００ｇに対して、菌数が２．５×１０10個もしくは５×１０10個になるように添加した。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。
【実施例１７】
【０１１５】
（コーヒーの製造）
粉砕したコーヒー焙煎豆（コロンビア）を９５℃の熱水で抽出してコーヒー抽出液を得た。これに脱イオン水を添加して可溶性固形分１．４％になるように希釈した。当該調合液１００ｇに対して、乳酸菌ＫＷ３１１０株を菌数が２×１０10個、４×１０10個になるように添加した後、１９０ｇ缶に充填し、常法通りレトルト殺菌をおこなった。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなかった。ただし、コップ等に移した場合４×１０10個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、１．５×１０10個の方がより好ましいと評価された。しかし、缶から直接飲用する場合には問題なかった。
【０１１６】
以下に、本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品の製造に適用した場合の実施例について記載する。
【実施例１８】
【０１１７】
（ヨーグルトの製造）
乳を含む原材料（牛乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖液糖、安定剤、香料、水）を均一に混合し、１２８℃、１５秒の加熱殺菌を行い、４０℃以下まで冷却後、乳酸菌スターターＫＷ３１１０を添加し、３７℃に維持した発酵タンクで発酵を開始した。乳酸菌ＫＷ３１１０が混合液中の乳糖を分解し乳酸が生成して、約１８時間でｐＨ４．６となり、乳タンパク質の等電点凝集により、ゲル化が安定した時点で撹拌冷却した。撹拌によりペースト状になったヨーグルトを紙容器に充填、密封し、１０℃以下の冷蔵庫で冷却保管した。冷却後、官能検査により、ヨーグルトとして適正な食味と物性を有することを確認した。このときのヨーグルト原材料の配合割合を表７に示す。また原材料中の脂肪分、ＳＮＦ（無脂乳固形分）の割合及び甘味度を表８に示す。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図３６）。
【０１１８】
【表７】
0003585487.tif 000008
【０１１９】
【表８】
0003585487.tif 000009
以下に、本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を健康食品製剤の製造に適用した場合の実施例について記載する。
【実施例１９】
【０１２０】
（タブレット状健康食品の製造）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末６７ｇに、糖類である還元パラチノース、ソルビトール、キシリトールおよびアラビアガムを、適宜、水をバインダーとして加熱・造粒しながら添加し、クエン酸、ステビア、香料等で味を調整し、打錠機によりタブレット状に成型しやすいよう、粉末油脂とショ糖エステルを加え１０００ｇの混合物を得た。その後、１粒あたり１．５ｇになるよう打錠し、香味的に好ましいタブレット状の健康食品を製造した。この際、乳酸菌ＫＷ３１１０株は１粒当たり５×１０10であった。
【実施例２０】
【０１２１】
（硬カプセル状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｇに、デキストリンを５０ｇ添加し、均等に混和したのち、プルラン、植物油脂、カラギーナン、塩化カリウムからなる硬カプセル基材に充填し、硬カプセルで被包された、１カプセル２１３ｍｇの健康食品を得た。この際、乳酸菌ＫＷ３１１０株は１カプセル当たり５×１０10であった。
【実施例２１】
【０１２２】
（硬カプセル状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｇに、デキストリンを５０ｇ添加し、均等に混和したのち、ゼラチンとグリセリンからなる硬カプセル基材に充填し、硬カプセルで被包された１カプセル２１３ｍｇの健康食品を得た。この際、乳酸菌ＫＷ３１１０株は１カプセル当たり５×１０10であった。
【実施例２２】
【０１２３】
（軟カプセル状健康食品）          
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｋｇを、サフラワー油１８０ｋｇ、ミツロウ２０ｋｇ、大豆レシチン５ｋｇの混合物で均等に懸濁したのち、カラギーナン、デンプン、グリセリンを主成分とするカプセル基材で被包し、１カプセル４５０ｍｇの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌ＫＷ３１１０株は１カプセル当たり５×１０10であった。
【実施例２３】
【０１２４】
（軟カプセル状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｋｇを、サフラワー油１８０ｋｇ、ミツロウ２０ｋｇ、大豆レシチン５ｋｇの混合物で均等に懸濁したのち、ゼラチンとグリセリンからなるカプセル基材で被包し、１カプセル４５０ｍｇの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌ＫＷ３１１０株は１カプセル当たり５×１０10であった。
【実施例２４】
【０１２５】
（顆粒状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｋｇを、スティック充填機にて、１スティック１ｇとなるように充填し、乳酸菌ＫＷ３１１０株が１スティック当たり５×１０11個となる健康食品を得た。
【実施例２５】
【０１２６】
（顆粒状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｋｇに、デキストリン９００ｋｇを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和・加熱・造粒を行い、造粒物１０００ｋｇを得た。その後この造粒物を、スティック充填機にて、１スティック１ｇとなるように充填し、乳酸菌ＫＷ３１１０株が１スティック当たり５×１０10個となる健康食品を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたin vitroの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図３７）。
【実施例２６】
【０１２７】
（粉末状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｋｇに、デキストリン９００ｋｇを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和・加熱・造粒を行い、造粒物１０００ｋｇを得た。その後この造粒物を、１８号篩を全量通過するまで粉砕し、スティック充填機にて、１スティック１ｇとなるように充填し、乳酸菌ＫＷ３１１０株が１スティック当たり５×１０10個となる粉末状健康食品を得た。
【実施例２７】
【０１２８】
（懸濁液状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｇを、ケール葉の搾汁液１０ｋｇに添加し、乳酸菌が液中で分散しやすいよう、アルギン酸ナトリウム１０ｇで粘度を調整し、懸濁液状健康食品を得た。
【実施例２８】
【０１２９】
（懸濁液状健康食品）
乳酸菌ＫＷ３１１０株の調整乾燥末１００ｇをぶどう糖０．７ｋｇ、蒸留水５ｋｇとぶどう香料５ｇ混和し、加熱殺菌後、１本５０ｍｌの密封容器に無菌的に充填することでシロップ状の懸濁液状健康食品を得た。このものは小児に違和感を与えず好評であった。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を示す一覧（Ｎｏ．１）である。
【図２】本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を示す一覧（Ｎｏ．２）である。
【図３】本発明の実施例において、Ｔｈ１サイトカインであるＩＬ−１２の各種乳酸菌による生成量を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４の各種乳酸菌による生成量を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、本発明の乳酸菌株（ＫＷ３１１０）と対照株（Ｌ−９２株）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにより、ＩＬ−１２とＩＬ−４の産生量を比較した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例において選抜した、ＫＷ３１１０株から派生した菌株Ｎｏ．９０株の抗アレルギー活性について測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験スケジュールを示す図である。
【図８】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、９８日間の実験における血中ＩｇＥの変動を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、ｄａｙ４８及び解剖時ｄａｙ９８での血中ＩｇＥ量をドットブロットで示した図である。
【図１０】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及びＫＷ３１１０群の９８日解剖時の脾細胞培養におけるＩＬ−１２産生量を示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及びＫＷ３１１０群の９８日解剖時の脾細胞培養におけるＩＬ−４産生量を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株のin vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及びＫＷ３１１０群の鼻周辺の脱毛を観察した結果を示す写真である。
【図１３】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株と、抗アレルギー乳酸菌として公知のＫＷ４６１０株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験の実験スケジュールを示す図である。
【図１４】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株と、抗アレルギー乳酸菌として公知のＫＷ４６１０株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験の試験期間中における血中ＩｇＥ量の変動を示す図である。
【図１５】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株と、抗アレルギー乳酸菌として公知のＫＷ４６１０株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験のＯＶＡ５次、６次投与後の個体ごとの血中ＩｇＥ量をドットで示す図である。
【図１６】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株の、酸耐性試験の結果を示す図である。
【図１７】本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株であるＫＷ３１１０株の、胆汁酸耐性試験の結果を示す図である。
【図１８】図１６ａ、ｂ、ｃは、本発明の実施例において花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果について、モデルマウスのくしゃみ行動について試験した結果を示す図である。
【図１９】図１７ａ、ｂは、本発明の実施例において花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果について、モデルマウスの引っ掻き行動について試験した結果を示す図である。
【図２０】本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果について、モデルマウスの血中総ＩｇＥ濃度の上昇の抑制について試験した結果を示す図である。
【図２１】本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果について、モデルマウスの好酸球上昇の抑制（図１９ａ）及び好酸球の局所への浸潤の抑制（図１９ｂ）について試験した結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症・気道炎症のＫＷ３１１０株による改善効果について、モデルマウスにおけるＩＬ−５の値について試験した結果を示す図である。
【図２３】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、血中総ＩｇＥ濃度の上昇について試験した結果を示す図である。
【図２４】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスにおける総臨床スコアの測定結果について示す図である。
【図２５】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの臨床スコア（耳介部）の測定結果について示す図である。
【図２６】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの臨床スコア（頭皮部）の測定結果について示す図である。
【図２７】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの頭部の耳介部の糜爛・組織欠損の抑制の状況を示す写真である。
【図２８】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの耳介肥厚（図２６ａ）及び、モデルマウスのチャレンジ１回目の耳介の肥厚の抑制傾向（図２６ｂ）について試験した結果を示す図である。
【図２９】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスのチャレンジ３回目の耳介の肥厚の抑制傾向について試験した結果を示す図である。
【図３０】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの耳介の肥厚の抑制について、ヘマトキシリン・エオジン染色を用いた耳介部の病理学的評価の結果を示す写真である。
【図３１】本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するＫＷ３１１０株の改善効果について、モデルマウスの耳介の肥厚の抑制について、トロイジンブルー染色を用いた耳介部の病理学的評価の結果を示す写真である。
【図３２】本発明の実施例において、花粉症についてのＫＷ３１１０株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験における、Ｔｈ１／Ｔｈ２比の変化について測定した結果を示す図である。
【図３３】本発明の実施例において、花粉症についてのＫＷ３１１０株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験において、試験開始前と開始後におけるＥＣＰの変化について測定した結果を示す図である。
【図３４】本発明の実施例において、花粉症についてのＫＷ３１１０株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験において、試験開始前と開始後における花粉症自覚症状の変化について観察した結果を示す図である。
【図３５】本発明の実施例において、ＫＷ３１１０株を用いて、各種処理加工を施して製品化した場合の抗アレルギー活性の維持について、清涼飲料水として製品化した場合のＩＬ−１２の産生量について試験した結果を示す図である。
【図３６】本発明の実施例において、ＫＷ３１１０株を用いて、各種処理加工を施して製品化した場合の抗アレルギー活性の維持について、ヨーグルトに配合して製品化した場合のＩＬ−１２の産生量について試験した結果を示す図である。
【図３７】本発明の実施例において、ＫＷ３１１０株を用いて、各種処理加工を施して製品化した場合の抗アレルギー活性の維持について、錠剤化した場合のＩＬ−１２及びＩＬ−４の産生量について試験した結果を示す図である。
【要約】
【課題】  アレルギーの予防・治療に有用な抗アレギー機能を有する食品及び飲料を提供すること。
【解決手段】  高抗アレルギー活性を有するＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株、及びその変異株を有効成分とする抗アレルギー機能を有する飲料又は食品からなる。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物は、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料或いは食品に配合した形態で、或いは、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤又はドリンク剤のような製剤形態で用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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