(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動核酸分析用統合機器システムであり、以下からなる：
ａ）試験試料由来の１種以上の標的核酸配列を提供する試料調製ステーション。
ｂ）１種以上の前記標的核酸配列またはその相補配列上で第１ハイブリダイゼーション反応を行う場であり、前記第１反応は少なくとも１個から５０個の別個の核酸配列を有する低次検出フォーマット機器からなる第１試験反応ステーション。
ｃ）１種以上の前記標的核酸配列またはその相補配列上での第２ハイブリダイゼーション反応を行う場であり、前記第２反応は１００個以上の別個の核酸配列を有する高次検出フォーマット機器からなる第２試験反応ステーション。
ｄ）前記第１および第２ハイブリダイゼーション反応における標的核酸配列またはその相補配列用の陽性ハイブリダイゼーション信号を検出するための、少なくとも１個の検出器。
ｅ）前記検出器からの結果に基づいて、第２ハイブリダイゼーション反応の処理の必要性と、前記第１・第２ハイブリダイゼーション反応由来の検出シグナル解析の必要性を決定する、前記機器の統合操作のための制御モジュール。
【請求項２】
内部の前述の機器に加えて、さらに高次検出フォーマットで前述標的核酸配列またはその相補的配列の陽性ハイブリダイゼーション反応シグナルを検出するための第二検出器も含み、また内部の前述高次検出フォーマットでは前述標的核酸配列についてのさらなるデータを供給する、請求項１に記載の機器。
【請求項３】
内部の前述試料調製ステーションに加えて、選抜された標的核酸配列の調製手段を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項４】
内部の前記試料調製ステーションに加えて、さらに工程ａから提供される前記標的核酸配列上の核酸増幅処理を行う手段を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項５】
内部の前記試料調製ステーションに加えて、さらに内部標準核酸配列を供給する手段を含む、請求項４に記載の機器。
【請求項６】
内部の前記機器に加えて、さらに試料調製ステーションから前述の第１試験反応ステーションへの液体移送手段を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項７】
内部の前記機器に加えて、前述制御モジュールで決定される、前述の第１試験反応ステーションから前述第２試験反応ステーションへの液体移送の手段を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項８】
内部の前記機器に加えて、自動的かつ人手を介さず、移送される液体と外部環境の間で接触の起こることなく、前述の第１試験反応ステーションから前述第２試験反応ステーションへの液体移送の手段を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項９】
内部に、均一溶液ハイブリダイゼーション反応実行手段を提供する前記低次検出フォーマット機器を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項１０】
内部に、マトリックスハイブリダイゼーション反応実行手段を提供する前記高次検出フォーマット機器を含む、請求項１に記載の機器。
【請求項１１】
内部で、前記標的核酸配列上と内部標準核酸配列上での増幅工程を実行する、請求項５に記載の機器。
【請求項１２】
内部で、前述第１ハイブリダイゼーション反応からの検出信号データの結果に基づき、前記制御モジュールによって一つまたは複数の高次検出フォーマットの使用が選択される、請求項１に記載の機器。
【請求項１３】
内部で、前記標的核酸配列上と前記内部標準核酸配列上の前記増幅が同時に実行される、請求項１１に記載の機器。
【請求項１４】
内部で、ＴＭＡ、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡおよびＬＣＲからなる群から前記増幅工程が選択される、請求項４に記載の機器。
【請求項１５】
内部で、前記低次検出フォーマット機器がマトリックスハイブリダイゼーション反応実行の手段を提供する、請求項１に記載の機器。
【請求項１６】
内部に、複数の核酸配列を含み４００ヌクレオチド／ｃｍ2以上の空間密度を有する前記高次検出フォーマットのある、請求項１に記載の機器。
【請求項１７】
内部に、少なくとも１０００個の別個の核酸配列を含む前記高次検出フォーマット機器がある、請求項１に記載の機器。
【請求項１８】
内部の、前記低次・高次検出フォーマット機器が使い捨て可能である、請求項１に記載の機器。
【請求項１９】
核酸配列分析実施のための方法であり、自動核酸試験機器内で実施される該方法は第１検出フォーマットを提供し、および前記第１検知フォーマットの結果が示すところで、前述の機器と提携した制御モジュールによる制御下で第２検知フォーマットを提供する、以下の工程からなる核酸分析法：
（ａ）試験試料由来の少なくとも１つの標的核酸配列またはその相補配列と第１ハイブリダイゼーション反応を行い、前記第１ハイブリダイゼーション反応は前記第１の低次検出フォーマットで行われる工程であり、前記第１検出フォーマットは１個から５０個の既知の核酸配列を包含する、
（ｂ）前記第１ハイブリダイゼーション工程から信号を発生する工程、
（ｃ）前記信号を前記制御モジュールに供給する工程、
（ｄ）前記信号を前記制御モジュールで処理し、前記信号が閾値レベルより大きいかどうかを決定する工程、
（ｅ）前記信号が前記閾値レベルより大きい場合、自動的にさらなるデータ解析が必須であるところで、前記標的核酸配列またはその相補配列を前記機器内の前記第２の高次検出フォーマット機器に移送する工程であり、前記第２検出フォーマットは１００個以上の既知の核酸配列を包含する、
（ｆ）第２ハイブリダイゼーション反応を行う工程、
（ｇ）前記第２反応から信号を発生する工程、
（ｈ）前記信号を制御モジュールで処理して前記標的核酸を解析する工程。
【請求項２０】
１０００個以上の核酸配列からなる高次検出フォーマットからなる前記第２反応を含む、請求項１９に記載の分析法。
【請求項２１】
前述に加え、選択された標的核酸配列と内部標準核酸配列を同時に増幅する工程、前記内部標準からの信号を測定する工程、前記内部標準からの信号とそれに対する閾値を比較し、内部標準信号が閾値より小さかった場合には試験を排除する工程を網羅した、請求項１９に記載の分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試験試料中の微生物またはウイルスの同定および微生物またはウイルスの薬剤感受性または抵抗性試験を目的とする、分析的または生物学的試料試験の方法および機器に関する。本発明は特に、生物試験試料中に存在する核酸の検出および分析のための方法および機器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸試験は、遺伝子配列および発現の研究を含む試験試料分析において常に生じる分野である。まず最初にヒトの患者または他の起源の試験試料が分離され、試料中の標的核酸を増幅してコピーの数を増やし、試験試料を分析可能にする。次に標的配列のコピーは、１種またはそれ以上の相補オリゴヌクレオチドプローブに対し、溶液中または相補プローブを担持する固体担体との間でハイブリダイゼーションされ、ハイブリダイゼーション複合体を生成する。検出用プローブもある条件で標的配列にハイブリダイゼーションされる。生成したハイブリダイゼーション複合体が信号を発生すると、ハイブリダイゼーション生成物の検出と同定が行われる。核酸配列を増幅することにより、微生物培養に頼らずに微生物の有無に関する情報が得られる。
【０００３】
増幅法は米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ）および４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）に記載され、この中ではポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により標的核酸分子を指数的に複製するため、ＤＮＡポリメラーゼ、相補プライマー分子および熱反応反復サイクルが利用される。米国特許第５，７９２，６０７号（Ｂａｃｋｍａｎ）にはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と呼ばれる増幅法が記載され、米国特許第５，７４４，３１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）、５，６４８，２１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）および５，６３１，１４７号（Ｌｏｈｍａｎ）には分子鎖置換増幅（ＳＤＡ）に基づく等温増幅系が記載される。等温増幅の記載についてはＷａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０、１６９１−１６９６（１９９２）、米国特許第５，４３７，９００号（Ｂｕｒｇ）および欧州特許第３７３９６０号（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）も参照のこと。さらに別の核酸増幅法が米国特許第５，３９９，４９１号（Ｋａｃｉａｎ）および５，４０９，８１８号（Ｄａｖｅｙ）に記載されている。前記それぞれ、および全ての参考資料は、本明細書に引用するその他全ての特許および文献と共に本明細書に参考資料として含まれる。
【０００４】
ハイブリダイゼーション技術については多くの他の文献に、例えば米国特許第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ）および４，８５１，３３０号（Ｋｏｈｎｅ）、およびＤｕｎｎら、Ｃｅｌｌ  １２、ｐｐ２３−６６（１９７８）に記載がある。溶液中ハイブリダイゼーション、一段階または多段階反応における固体支持体上へのプローブ補足を含め、ハイブリダイゼーション反応に対する様々な変法が公知である。
【０００５】
米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）、４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）、４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）および４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｏ）に記載される検出法は、特定の核酸並列を検出するための標識検出プローブの製法を示している。検出可能な標識は、塩基、糖または１以上の特定のリン酸基上のリンカーアームにより、直接または間接的に結合している。公知の標識には蛍光発色体、放射性同位元素、染料、アルカリホスファターゼ等の酵素、発光または化学発光分子が含まれる。検出プローブは増幅核酸反応生成物またはアンプリコンに結合し得る。アンプリコンへのハイブリダイゼーション後に標識検出プローブから検出される信号量は、アンプリコン、従って元の試験試料中の一個以上の選択された標的核酸の有無を反映する。
【０００６】
一般的に、試料中の内部標準は既知の初期量を増幅し、次いで逆の配列またはセンスを有する検出プローブとハイブリダイゼーションして、内部標準アンプリコンとの複合体を生成し、最後に発生する信号を検出することにより、試験試料中の標的核酸の定性および定量が可能な一つの方法が得られる。
【０００７】
試験試料中に存在する標的の定量法は、米国特許第５，２１３，９６１号（Ｂｕｎｎ）、５，４７６，７７４号（Ｗａｎｇ）、５，４７６，７７４号（Ｒｙｄｅｒ）および５，４５７，０２７号（Ｎａｄｅａｕ）に記載されている。
【０００８】
核酸検出キットが市販され、上に参照した増幅、ハイブリダイゼーション、標識検出および定量の技術が用いられている。例えば、増幅された核酸を検出するＨＩＶ分析が米国特許第５，５５９，６６２号（Ｒｅｓｐｅｓｓ）およびＧｒａｔｚｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ  ６６、ｐｐ２６９−２９２（１９９７）に記載されている。この様なＨＩＶ核酸の増幅を行うキットには、Ｃｈｉｒｏｎ  ＱＵＡＮＴＩＰＬＥＸ  Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡおよびＯｒｇａｎｏｎ
Ｔｅｋｎｉｋａ  ＮＡＳＢＡ−ＱＴが含まれる。
【０００９】
Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ用試験キットが米国特許第５，６４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇ）に記載され、マイコバクテリア試験用核酸が５，５８９，５９５号（Ｍａｂｉｌａｔ）、５，７０２，３１２号（Ｍａｂｉｌａｔ）および５，８３９，９０１号（Ｍａｂｉｌａｔ）に記載されている。
【００１０】
核酸配列解析は制限検出または低次検出フォーマットと、多重または高次検出フォーマットの二つの異なった分類に分けられる。その区別は、フォーマットから得られる特定のデータ信号数、または応答数である。
【００１１】
欧州特許第０８７５５８４号には低次検出フォーマットを用いる機器が記載されている。検出プローブに結合した単一タイプの蛍光標識を測定し、試験試料中の相補核酸の存在を検出する。この技術を順番に用いることにより、その機器が試験試料中の少なくとも２種の特異的標的を測定し得ることが示された。また、スクリーニング検定で多重標識（例えば、異なった放射特性を有する蛍光または発光標識）も同時に測定することができる。しかしながら実用上の理由で、スクリーニング検定で測定し得る標的被分析物の数は１０以下である。これらの技術は低次検出フォーマットのカテゴリーに入ると考えられる。
【００１２】
高次検出フォーマットにおいて、試験パネルの設計または選択は、一部には顧客の要請、特定部位での疾病発生率、微生物およびウイルス同時感染の頻度、および（数は少ないが例を挙げれば）環境条件によって決められると思われる。
【００１３】
この二番目のカテゴリーである多重検出または高次検出フォーマットは、試験アンプリコンに関するより詳細な情報を提供する。この例の一つは、逆ドット−ブロット技術であり、マトリックス上に固定化された多重相補標識に核酸がハイブリダイゼーションされる。染色処理後、染色された多重セクションが相補標的の存在を示す。他の技術では多量のオリゴヌクレオチドが沈降した、光学的手法で空間的に位置決めできるマトリックスまたは配列を提供する。
【００１４】
大規模遺伝子解析における最近の進歩では、微細作成技術による多重検出アレイとして組み込まれたオリゴヌクレオチドが利用される。これらのアレイの合成と方法は米国特許第５，７００，６３７（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、米国特許第５，４４５，９３４（Ｆｏｄｏｒ）、米国特許第５、８０７、５２２（Ｂｒｏｗｎ）、米国特許第５，２０２，２３１（Ｄｒｍａｎａｃ）および米国特許第５、８３７、８３２（Ｃｈｅｅ）に記載されている。これらのアレイによりハイブリダイゼーションが行われ、単一または多重塩基置換等の変異体または突然変異の同定のための固定化オリゴヌクレオチドが標識プローブまたは標識アンプリコンにより探査される。応用例として、ヒト免疫不全ウイルス検出用の多重検出アレイがＦｏｄｏｒ、Ｓｔｅｐｈｅｎら、「光学的手法で空間的に位置決めし得る平行化学合成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２５１、ｐｐ７６７−７７３（１９９１）に記載されている。
【００１５】
低次および高次フォーマットが分析および診断試験の双方に用いられているが、それぞれ別な能力を持っている。低次検出フォーマットは簡便であり、比較的コストが低く、例えばこの試料が典型的なＨＩＶウイルス領域由来の核酸を含んでいるかという、試料に関する特定の質問に答えることができるという利点がある。高次検出フォーマットはより高価であるが、例えばこのＨＩＶ核酸試料が野性型配列由来の突然変異を有するか、もしそうならそれは何かという、分析のためのより多くのデータまたは情報を提供できるが、高価であるため、日常のスクリーニング試験では多重検出または高次検出フォーマットは費用効率の良い手段とは見なされていない。従って、典型的な有償の試験では制限された、または低次検出フォーマットが図１に示す様な医学的仮説を確認するために行われる。
【００１６】
図１において、試験手順は患者が結核に罹っているという仮定から始まる。工程１０で呼吸試料を患者の唾液から得る。工程１２で試料を処理し、培養用組織を得る。次いで試料を分割し、一部を組織培養に用いる。工程１４で試料の第２の部分を抗酸性スメア試験に提供する。抗酸性スメア試験の結果が陰性である場合、工程１６で示されるように医師は培養の結果を待たなければならない。可能であれば臨床技師は試料を再度処理し、工程１８で行われる増幅種特異性ＴＢ試験に提供する。工程２２では、増幅Ａｖｉｕｍ細胞内試験が試料を同定するために行われる第３の試験となり得る。工程２２での試験結果が陰性である場合、試験試料または新しい第２の試料で次の試験反応または培養を行い、試料中に病原体が存在するかどうか決定する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の技術においては、前記の核酸検出キット等の低分解能または低感度検出フォーマットは簡便で、比較的コストが低く、保存された、または限定された数の標的配列の存在を検出するのに有用であるが、これらの試験は特定の突然変異体、その薬剤感受性または突然変異の有無の解析に必要な、高いレベルのデータまたは標的核酸に関する詳細を得るためにはあまり有効でなかった。高次検出フォーマットは分析のためのより多くのデータまたは情報を提供できるが、それが高価であるため、日常のスクリーニング試験では多重検出または高次検出フォーマットは費用効率の良い手段とは見なされていない。
【００１８】
図１は公知の低コスト試験の典型例であり、抗酸性スメア（工程１４）がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａを含むと疑われる試験試料のうち、陰性である９０％の試料をを排除するために用いられる。以後の試験を陽性である１０％の試料に用いることは正当であるが、試験試料の全てに適用しなければならない場合、仮に試験費用が低くても人件費と試料処理費は正当とは言えない。
【００１９】
核酸分析のための限定検出スクリーニングを含むだけでなく、更に先へ進む機器および自動化法の必要がある。このような機器の能力は、例えば他の遺伝的欠陥と類似、または重複する生理学的影響を生じ得る遺伝的欠陥の同定等、価値のある情報およびデータを提供すると思われる。また、集中試験ステーションおよび使用し得る薬剤に対する微生物の耐性を決定し、適当な治療法を決めるためのデータを提供できる機器システムも必要である。さらに、この様なシステムは研究者または医療関係者の操作、特に試料調製、増幅および検出を含む工程を最小にすることを目的としなければならない。その機器はモニタリング、データ収集、配列および核酸の遺伝子型決定と共に、各試験または工程間の汚染の危険性を制限するための道具として応用し得ることが好ましい。その機器はまた、正確、高感度であり、妥当な価格で利用者が購入できることが可能でなければならない。
【００２０】
本発明は、核酸分析のために多重または高次検出フォーマットを何時選択するかを自動的に制御する方法および機器を提供し、定性および定量分析のための１回以上の第１試験反応から１個以上の信号データを提供し、また低コスト技術、即ち自動化システムにおいて限定検出フォーマットを使用してさらなる解析の必要性を決定するに当たり、試料中の標的核酸配列のスクリーニングを行うことを目的としている。本発明は他の方法の試みに固有の様々な制約を克服し、生物または試験試料中の核酸を正確かつより完全に同定する、費用効率のよい手段を提供する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明の提供する、多重または高次検出フォーマットの選択を自動的に制御する方法および機器には、制限検出また低次検出フォーマット中の少なくとも１回の増幅反応で生成した標的アンプリコンを検出し、次いで低次検出フォーマット由来のデータまたは信号を取り込む統合システム中の制御アルゴリズムを使用し、標的アンプリコンを高次検出フォーマットを使用しその費用で分析するかどうかを決定する工程が含まれる。本システムは第１試験反応からの出力データを、制御アルゴリズムおよび高次検出フォーマット選択のための入力データとして利用する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、定性および定量分析のための１回以上の第１試験反応から１個以上の信号データを提供することである。第１反応では、試験試料由来の増幅標的核酸と共に、好ましくは既知の濃度を有する増幅された内部標準配列がハイブリダイゼーションおよび検出反応に提供され、信号データを発生する。得られた信号は制御モジュールに供給され、処理され、標的／試験試料または内部標準アンプリコンいづれかに特有の閾値レベル信号と比較される。信号の組み合せは、標的アンプリコンをさらなる試験のため、自動的に機器内部の別のステーションへ移送するかどうかを決定するアルゴリズムに使用される。必要ありと判断された場合、１個以上の選ばれた高次検出フォーマットを用いる第２試験反応により、変異体の同定、核酸配列の突然変異、微生物またはウイルスの薬剤感受性または耐性等の標的アンプリコンに対するさらなるデータが得られる。第２試験反応の解析には、少なくとも１個の高次検出フォーマット中でのアンプリコンのハイブリダイゼーションが含まれる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、可能ならば核酸増幅能を有する試料調製ステーション、第１および第２ステーションまたはモジュールおよび適当な検出ステーションを包含し、各ステーションは制御モジュールによって指令される核酸分析用機器を提供する。流体流路または流体転送手段も備えられ、随意に第１試験反応ステーションからのアンプリコンを第２反応ステーションまたはモジュールに接続する。各ステーションは他のステーションとモジュールの制御下に連通する。制御モジュールは第１反応ステーションおよびフィードバックループ中の対応する検出ステーションから得られたデータを統合し、プロセスを終了するか、または第２試験反応ステーション中の第２反応を開始し、その後検出と信号解析を行う。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、試料処理、増幅、ハイブリダイゼーションおよび検出法を統合したモジュール状の自動化機器システムであり、システムはさらに試験試料に関して追加データ収集を行うべきかどうかを解析し、その後この様な追加データ収集分析を行うことができる。
【００２５】
本発明一つの目的は、低コスト技術、即ち自動化システムにおいて限定検出フォーマットを使用し、さらなる解析の必要性を決定するに当たり試料中の標的核酸配列をスクリーニングすることである。少なくともシステムの高次検出フォーマットによりさらに解析し得る全ての試料を「陽性」とするために、スクリーニング工程は高感度であるが広範な特異性を有する必要がある。
【００２６】
別の態様では、異なった反応技術、即ちハイブリダイゼーションおよび検出を利用して標的核酸配列を完全に決定するために、総合的な機器システムが提供される。好ましい実施形態では、均一溶液ハイブリダイゼーション反応を利用するスクリーニング試験が行われ、多重検出解析のために、単一アレイ／マトリックスハイブリダイゼーションが利用される。別な目的では、１回以上のマトリックス系ハイブリダイゼーション分析を行う必要性を決める目的で信号データを制御モジュールへ提供するため、増幅プロトコールを行わずにスクリーニング解析を提供することが可能である。
【００２７】
本発明のシステムは例えば微生物学、ウイルス学、食品研究、水試験、ヒトおよび動物の疾病の診断、および分析研究用に使用できる。適当な生物または試験試料材料には動物、ヒトまたは植物細胞または組織、血液、尿、糞および尿道粘膜が含まれる。さらに、本発明は食品加工、汚染制御または医薬品研究等の産業用途にも使用可能である。
【００２８】
特に、本発明の一つの態様では疾病の検出、薬剤耐性の同定および治療の目的で重要なデータと情報が提供される。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明の代表的な、好ましい選択的な実施形態が、添付図面と共に以下に示される。参照番号はそれぞれの図面での対応する要素を表す。
【００３０】
制限または低次検出フォーマットは前記のハイブリダイゼーションおよび検出法を含む。これらは溶液中、またはマトリックスに結合した捕捉プローブを用いて行われる。プローブが固定化されたマトリックスにはポリスチレン系ポリマー、ニトロセルロース、様々な組成のシート、ビーズ、ミクロタイターウエル、チューブ、ガラス粒子、磁気粒子、天然および合成繊維が含まれる。本明細書で言う低次検出フォーマットには、別個の配列を有する５０以下、好ましくは少なくとも１個から１０個のオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。各プローブは試験試料由来のアンプリコンに対し、また随意に内部標準に対し、完全なまたは部分的な相補配列を含んでいる。本明細書で言う高次検出フォーマットとは、１００個以上、好ましくは４００個以上、最も好ましくは１０００個以上のオリゴヌクレオチドプローブを含み、そのそれぞれが適当なマトリックスに結合または固定化された別個の配列を有する。プローブはマトリックスに対し高い空間密度、例えば４００プローブ／ｃｍ２から１０００プローブ／ｃｍ２で結合している。各プローブはその一部に潜在的標的アンプリコン配列に対し完全に、または部分的に相補性のある配列を含んでいる。
【００３１】
好ましい実施形態では、低次検出フォーマットは高次検出フォーマットと異なっている。例えば、低次検出フォーマットには均一溶液ハイブリダイゼーション反応を行う機器が含まれるが、高次検出フォーマットにはマトリックスハイブリダイゼーション反応を行う機器が含まれる。また、少数の標的アンプリコンおよび内部標準アンプリコンをスクリーニングするために、マトリックスハイブリダイゼーション反応は低次検出フォーマットに用いられる。
【００３２】
図２を参照すると、分析の継続を自動的に指令し、高次検出フォーマットの選択を制御する方法と機器を提供するある好ましい実施形態がフローチャートに示されている。その方法には、低次検出フォーマット（一般的に工程３０で示される）と制御アルゴリズム４０を用いて、試験試料中の標的核酸の増幅反応により生成したアンプリコンを検出し、１個以上の高次検出フォーマットを使用を決定する工程が含まれる。その好ましい実施形態には試験試料中の核酸の完全な分析のための単一増幅工程が含まれていてもよい。従って、試料は広範な特異性を有するスクリーニング検定を行う目的の初期数の第１ハイブリダイゼーション反応に提供され、検定に用いられる技術の費用効率の良い選択は、適当なデータ入力を伴う自動制御アルゴリズム４０を用いて決定される。低次検出フォーマットからの出力データは、選ばれた高次検出フォーマット（工程５０）のための入力データとなる。
【００３３】
図２の方法により、試料をスクリーニングするために低コスト技術、即ち工程３０の低次検出フォーマットを使用することが可能になる。この様なアプローチを用いることにより、標的アンプリコンを試料分析中に用いることができる。制御アルゴリズム４０が高次検出フォーマット５０の必要性が正当であることを決定する場合、第２分析５０を開始する。本発明の機器に試料を導入する以前、または導入時に、システムユーザーによりそれ以前の試験または分析からのデータも入力される。
【００３４】
前記手法の第１工程３０（即ち、低次検出フォーマットで標的アンプリコンを測定する工程）では、核酸が処理または放出され、好ましくは１００％に可能な限り近い「スクリーニング」感度が得られるように選ばれた分析で増幅される。言い換えれば、選ばれたスクリーニングフォーマット中の任意のパラメータで試料が実際に陽性である場合、第１分析試験反応は陽性の結果を与える。
【００３５】
代表的な実施形態において、第１工程３０は２個の独立した工程からなる。第１サブ工程３２は内部標準配列、および代表的試験パネル中の全ての疑わしい標的核酸、即ち呼吸、血液中の核酸等を増幅し、内部標準アンプリコンおよび標的アンプリコン（Ｔ１、Ｔ２、…Ｔｎ）を生成する工程からなる。内部標準アンプリコンは、技術的欠陥による陰性の結果が生じていないことを補償する手段として測定される。本明細書で用いる内部標準配列とは、標的核酸配列により影響されないように加工され、試料中のいかなる核酸配列と実質的に類似でなく、かつ陽性増幅プロセスを決定するオリゴヌクレオチド配列である。一般的に、内部標準は標的と共に増幅され、増幅の陽性対照となる。内部標準信号はまた、定量的試験試料分析にも利用可能である。
【００３６】
第２工程３４は、内部標準および標的それぞれからの信号を測定する工程からなる。信号を測定するために用いられる機器は、システム中に組み込まれている。
【００３７】
プロセス４０の第２工程、即ち制御アルゴリズムを実行する工程において、点線ボックス４０で示すように信号が制御アルゴリズムに与えられる。内部標準信号は、増幅プロセスが満足できるものかどうかを示すために用いられる。制御アルゴリズム４０は、試料の分析を次工程５０に進めるべきかどうかを制御する２個の信号を実行する。
【００３８】
図２に示される１つの実施形態では、内部標準信号が設定された閾値（４２）以下であった場合、増幅反応が生じなかった、または他の理由で適切な閾値に達しなかったということで、その試験は排除される。内部標準信号が閾値以上である場合、アルゴリズムにより１個以上の標的に対するスクリーニングパラメータが閾値以上であるかどうかが決定される（４４）。そうでない場合、試験結果は陰性とみなされ、仮説が排除される。したがって分析の第２工程５０の費用または必要性の負担はない。逆に、スクリーニングパラメーターが閾値以上である場合（４４）、第２工程５０の分析へ進むことができる。
【００３９】
好ましい実施形態において、工程３０の出力または結果が選択された高次検出フォーマット上で第２工程５０を実施すべきかどうかを判断するための入力として使用されるような方法で、図２の方法が行われる。対照的に、先行技術に記載されるさらに進んだ、または継続した試験では、試料を独立に、または繰り返し扱うことが必要であり、多くの場合、さらにサンプリングを行う必要がある。先行技術の試験は試料の保管、追加操作、および処理工程一回の反復が必要であるが、それらは本発明では避けることができる。さらに、先行技術においては第１試験の結果を調べ、次の行動を決めるために人手を介する必要がある。好ましくは、図２のプロセスの最初に試料にただ１回だけ接触する方がよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、工程３０、４０および５０は自動化分析機器内に組み込まれ、低次検出フォーマット（工程３０）を含むプロセス中に人手を介さず最終結果に達することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、この機器は高次検出フォーマット５０で分析される全ての標的に対し、第１工程３０内であらゆる増幅を行う。次いで、この機器は十分な量のアンプリコンを有する試料を、より包括的な分析同定のための高次検出へ向かわせることができる。
【００４１】
高次検出フォーマットの好ましい実施形態は、米国特許第５、８３７、８３２号（Ｃｈｅｅ）に記載されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥ  ＣＨＩＰ技術である。患者試料からの核酸由来の標識されたアンプリコンが標準生化学技術で単離され、高密度カートリッジ（ＧＥＮＥ  ＣＨＩＰ）の表面で洗浄される。高密度カートリッジ中の一本鎖ＤＮＡ配列またはプローブのコピーは相補標識アンプリコンとハイブリダイズする。レーザースキャナーにより、標識配列がハイブリダイゼーションした既知の位置からの信号が検出される。
【００４２】
図２中の工程３０の代表的な好ましい実施形態をさらに説明する。疑わしい核酸標的を分析の最初の部分で処理しなければならない。試験プロトコールの開発中にプローブ配列、プライマー、保存配列等の増幅反応に含まれる条件をパネル中で試験されるパラメーターを参照に同定しなければならない。さらに、例えば、唾液試料由来のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの試験である図３を参照して、米国特許第５，５８９，５８５号（Ｍａｂｉｌａｔ）、５、７０２、３１７号（Ｍａｂｉｌａｔ）および５，８４９，９０１号（Ｍａｂｉｌａｔ）に記載される制御アルゴリズムの一部となる性質を有する少なくとも１個の部位を選ばなければならない。２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の保存またはコンセンサス領域が、低次検出フォーマットに対するスクリーニングパラメーターとして選ばれる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの検出に用いられる２３Ｓ  ｒＲＮＡの高度保存領域の増幅は、低次検出フォーマット中で行われる。スクリーニング検定結果が適当な閾値に合致する場合、高次検出フォーマット用の工程３２Ａで示されるように、増幅はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中のリファムピン耐性に関係するｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ上でも行われる。微生物１個あたりＤＮＡよりｒＲＮＡのコピー数が多いので、２３Ｓ  ＲＮＡ領域はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの存在をより示し易い。最後の要請として、２３Ｓ  ｒＲＮＡに用いられるプライマーが内部標準配列と組み合せて用いられ、増幅効率と定量分析が達成されるように内部標準アンプリコンが生成する。
【００４３】
ある実施形態では、試験の第１工程３０由来のアンプリコンが第２工程５０へ転送されるが、スクリーニングおよび検出技術は高次検出フォーマットと互換性がなければならない。このことは、米国特許第５、５１２、４９３号（Ｍａｔｈｉｓ）またはＧ．Ｈ．ＫｅｌｌｅｒおよびＭ．Ｍ．Ｍａｎａｋ「ＤＮＡプローブ」第２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、第６節に記載される様に、工程３２の均一系検出技術を用いて行われることが好ましい。また、エネルギー転移に基づくハイブリダイゼーションまたはビーコン／検出基技術がＧｉｏｎａｔａ  Ｌｅｏｎｅら、「ＲＮＡの均一、リアルタイム検出を可能にするＮＡＳＢＡによる増幅と組み合せた分子ビーコンプローブ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２６、ｐｐ２１５０−２１５５（１９８８）に記載されている。標的配列を均一系で検出可能なビーコン／検出基は、幹ループ構造からなり、ループ部分はアンプリコンに対し相補性である。標的が存在する場合、ビーコン／検出基構造は「開」の状態であり、ループは標的にハイブリダイズする。「開」ビーコン／検出基は通常「閉」状態では消光される蛍光を発する。本発明の１つの実施形態によれば、ビーコン／検出基部分は当業者に公知の技術を用いて固体支持体上に固定化される。固体支持体は好ましくは微粒子または磁気粒子を含む使い捨て器具である。ビーコン／検出基は、反応条件により幹構造配列が開くような方法で構築する必要がある。アンプリコンはビーコン／検出基と接触することによりビーコン／検出基の幹構造を開き、ループ構造へハイブリダイズすることができる。図３の工程３２Ｂ参照。標的アンプリコンが存在する場合、開構造が消光剤を検出分子から取り去り、標識を検出可能にする。得られた信号は蓄積され、制御アルゴリズム４０で使用される。
【００４４】
選ばれた閾値と組み合せて使用した場合、制御アルゴリズム４０は３種の異なったプロセスを行う：（１）予想される標的の存在の定性的検出、（２）高次検出フォーマットの結果と組み合せて用いられる１個以上の標的の定性的検出、および（３）数個の標的のうちの１個の定性的検出、および高次検出フォーマット分析５０用の試験の特定のアレイの予備選択。
【００４５】
好ましい実施形態における第１のタイプのプロセスである標的の保存領域の存在の定性的検出は、唾液試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの試験のために先に記載されている（図３参照）。例えば、図３で第１ハイブリダイゼーション反応、または内部標準アンプリコンの検出子またはビーコン／検出基へのハイブリダイゼーションからの信号が閾値レベル以下である場合（工程４２）、その試験は排除される。信号が上記閾値以上である場合、保存２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の標識またはビーコン／検出基の第２グループへのハイブリダイゼーションに対する信号は工程４４で解析される。この信号が閾値レベル以下である場合、工程４６に示される様に制御アルゴリズムは結果が陰性であることを示す。逆に信号が閾値レベル以上である場合、他の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅領域およびｒｐｏＢを含むアンプリコンは工程５０に示すように高次検出フォーマットへ転送される。
【００４６】
第２タイプの制御プロセス、すなわち多重検出解析結果と組み合せて用いられる１個以上の標的の定量的検出も、制御アルゴリズムで可能である。ある場合は、標的核酸の量が分析または診断で重要である。例としてＡＩＤＳの治療を受けているＨＩＶ患者を考える。全ウイルス核酸またはウイルス負荷の測定は重要な診断／治療上の指針である。例えば、ウイルス負荷レベルが閾値より大きい場合、医者はＨＩＶアンプリコンの遺伝子型分析をさらに行う価値がある。このような解析は高価な高次検出フォーマットが必要であるが、適当な治療によって全ウイルス核酸レベルが低い場合は必要がなくなる。この用途と図３の単純な定量例との主な違いは、定量的信号が制御アルゴリズムで使用されるばかりでなく、例えば多点補正において、または内部標準のレベルが増幅前に既知である場合、既知レベルのウイルスからのデータを伴い、それにより解析される報告された場合の結果であることである。
【００４７】
この第２タイプの制御アルゴリズムの一例が図４に示される。この例では、試料はＨＩＶ患者から得られる。工程３０（低次検出フォーマット）は工程３２Ａで示されるような内部標準配列、保存ＨＩＶ配列および多形ＨＩＶ配列を増幅する工程からなる。プロセスは工程３２Ｂで示されるように、内部標準アンプリコンのハイブリダイゼーションで始まり、ビーコン／検出基および保存配列アンプリコンまで続く。また、アンプリコンは最初に固体支持体に捕捉されて複合体を生成し、次いで検出子がアンプリコンを検出するために複合体にハイブリダイズする。次に工程３４に示すようにビーコン／検出基複合体のハイブリダイゼーションから信号が測定される。発生した得られた信号はデジタル化され、制御アルゴリズム４０を実行する制御モジュールまたは演算ユニットへ送られる。
【００４８】
制御アルゴリズム４０では、工程４２は図３と同じである。ビーコン／検出基＃１からの信号が第２閾値（工程４４）より小さい場合、工程４６で示す高次検出フォーマットを実行するために、アルゴリズム４０はそのレベルが閾値以下である核酸の報告を提供する。ビーコン／検出基＃２からの信号が第２閾値より大きい場合、アンプリコンは第２反応ステーションへ転送される（工程５０）。
【００４９】
また、定量的検出において、補正データを独立で得るための増幅前に既知料の核酸を有する内部標準（図示せず）の増幅は、制御アルゴリズムで行われる。工程４４で検出される信号からの結果は、内部標準アンプリコン由来のデータを参照して計算され、工程４６で示すように報告される。
【００５０】
実行し得る第３タイプのプロセスは数個の標的のうち１個の定量的検出、および第２ハイブリダイゼーション反応用の特定試験パネルの予備選択である。図２の一実施形態のより一般的な場合として、数個の可能な標的の内の１個以上を検出するために多重ビーコン／検出基を使用し、制御アルゴリズムで使用する多重入力信号を提供することができる。例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、インフルエンザまたはＲＳＶを呼吸パネルで試験することができる。結核における薬剤耐性を検出する必要があるため、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはこの標的のみに用いられる多重検出分析が必要である複合標的である。同様に、インフルエンザとＲＳＶはウイルスであり、それぞれ異なった多重検出機器を必要とする。従って、３種の異なった高次検出フォーマットが試験試料のさらなる、または第２の解析のために適当である。３種の低次検出フォーマットそれぞれに対する異なった保存配列を選ぶことにより、制御アルゴリズムが３種の高次検出フォーマットの内のいづれかを選ぶことができるビーコン／検出基を設計することが可能である。この第３プロセスの一例が図５に示される。
【００５１】
図５を参照して、図２および図４に共通の基本的な特徴、すなわち、制御アルゴリズム４０中のスクリーンの信号出力を用いる、および制御アルゴリズムの結果に基づく工程５０におけるより広範囲の高次検出フォーマットを制御、開始する、工程３０中の低次検出フォーマットが図５でも共通である。
【００５２】
図５の実施形態では、工程７２、７４および７６で示されるように３種の低次検出フォーマットが平行に走る。この例では、ある与えられた診断仮説に対する工程７０で呼吸試料が得られる。試験試料が機器に提供され、次いで核酸を放出するために処理される。工程７８におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ＲＮＡと同時に、最初のフォーマット７２で内部標準も増幅される。内部標準アンプリコンのビーコン／検出基の第１セットへのハイブリダイゼーション、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＲＮＡアンプリコンの第２セットへのハイブリダイゼーションを伴って、前記方法は工程８０へ続く。最後に、工程８２でビーコン／検出基の第１および第２セットからの信号が、既知の蛍光または他のタイプの検出機器を用いて測定される。信号はデジタル形に変換され、制御モジュール、独立コンピュータ、または制御アルゴリズム４０を実行するその他の演算ステーションへ供給される。
【００５３】
第２フォーマット７４の工程８４で、試料中のＲＳＶとインフルエンザ標的が増幅される。工程８６でＲＳＶとインフルエンザアンプリコンがビーコン／検出基番号３および４とそれぞれハイブリダイゼーションされる。次いで工程８８でビーコン／検出基の第３および第４セットからの信号が既知の蛍光または他の型の検出機器を用いて測定される。信号はデジタル型に変換され、制御アルゴリズム４０を実行する制御モジュールに供給される。
【００５４】
第３フォーマット７６の工程９０で、試料中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａとＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ標的が増幅される。米国特許第５，６１４，３８８号にはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ解析法が記載され、本明細書中に参考文献として用いられる。工程９２でアンプリコンは番号５および６にそれぞれ指定されたビーコン／検出基にハイブリダイゼーションされる。次いでビーコン／検出基の第５および第６セットからの信号が既知の蛍光または他の型の検出機器を用いて測定される。信号はデジタル型に変換され、制御アルゴリズム４０を実行する制御モジュールに供給される。増幅反応を評価し、必要あれば定量分析のため、内部標準アンプリコンを用いることができる。
【００５５】
図５の制御アルゴリズムはまず内部標準アンプリコン信号と第一フォーマット７２の比較（工程１００で示される）を行い、信号が所定の閾値より大きいかどうかを決定する。大きくない場合、工程１０２に示されるように試験全体が排除される。内部標準信号が閾値より大きい場合、制御アルゴリズムは第２ビーコン／検出基信号の比較へ進み（フォーマット７２から）、それが第２閾値より大きいかどうかを決定する。第２閾値より大きい場合、陽性の結果が示される。工程１１２で示されるように、その後の多重検出分析に対する閾値が設定される。例えば、工程１１２では呼吸試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対する陽性の結果は、タイプ「Ａ」の高次フォーマット分析をＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをさらに分析するために開始しなければならないことを示す。
【００５６】
工程１０４における比較が陰性値となる場合、制御アルゴリズムは更に進んでその試験に対する陰性の結果が正当であるかどうかを決定する。特に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの結果が陰性であっても、制御アルゴリズムは工程１０６で第３ビーコン／検出基の測定が第３閾値（ＲＳＶウイルスに対し）より大きいかどうか、または第４ビーコン／検出基の測定が第４閾値（インフルエンザウイルスに対し）より大きいかどうかを決定する。これらのビーコン／検出基信号のいづれかが閾値より大きい場合、アルゴリズム４０は分析パラメーター（ｘ）を２の、または異なった値、または、例えばＲＳＶまたはインフルエンザのさらなる解析を行なうためにタイプ「Ｂ」における高次検出フォーマットを開始しなければならないことを示す特性「Ｂ」に設定する。
【００５７】
工程１０６における比較が陰性の場合、アルゴリズムは第３フォーマット７６の同様な解析のために先へ進む。特に、制御アルゴリズム４０は工程１０８で、ビーコン／検出基信号の第５セットの測定が第５閾値（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａに対する）より大きいかどうか、またはビーコン／検出基信号の第６セットの測定が第６閾値（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａに対する）より大きいかどうかを決定する。これらのビーコン／検出基信号のいづれか一つが閾値より大きい場合、アルゴリズム４０は分析パラメーター（ｘ）を第３または異なった値に設定する、例えば「Ｃ」は分析タイプ「Ｃ」をＭｙｃｏｐｌａｓｍａまたはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのさらなる解析のために開始しなければならないことを示す。
【００５８】
工程１０８における比較が陰性である場合、３個のフォーマット７２、７４、７６検出／ビーコンの全て（制御ビーコン以外）は陰性である。従って、制御アルゴリズムが示す陰性の結果は第１試験パネルに対して得られ、機器が高次検出フォーマットに進まないことを示している。
【００５９】
工程１０４、１０６および１０８における比較の少なくとも一つが陽性の結果になると仮定すると、陽性の結果を有するフォーマットからの適当なアンプリコンが、好ましくは自動的に適当な高次検出フォーマットへ転送される。好ましい実施形態では、第１反応ステーション（３０）から第２反応ステーション（５０）への転送工程が、アンプリコンを環境に暴露せずに生じる。
【００６０】
図５で３個の低次フォーマット分析が平行に走っている間に、第１工程３０中のパネルの任意の数の組み合せをプロセスに適用することができ、制御アルゴリズム４０が適当なデフォルト設定で異なったフォーマットまたはフォーマットの組み合せを説明するために変更されることを、当業者は理解し得ると思われる。
【００６１】
図５（同時に他の図面）の制御アルゴリズム４０が例えば論理ゲートを用いるハードウエアで実行し得ることも、当業者は理解し得えると思われる。しかしながら、スクリーニング分析３０または多重検出分析５０のいづれかを行っている機器の反応ステーションが、プログラム可能中央演算ユニットにリンクすると期待されているので、別個にハードウエア制御モジュールを構築するよりも、演算ユニットで実行される制御モジュールを設置する方が好ましい。しかしながら、図２〜５の制御アルゴリズムの操作工程が与えられた場合、完全にハードウエアで実行される制御モジュールが他の実施形態となり得ることも確かである。
【００６２】
図６を参照して、ブロック図に示される図２〜５の方法を実行する機器１２０は、モジュールの組み合せ、即ち本明細書に記載される様なモジュールの操作および連絡方法を提供する。
【００６３】
図６を参照すると、試料は試料調製ステーション１２２と第１（１２８）および第２（１３４）反応ステーション（必要であれば）の間で、流体転送手段、例えば流路１２４、１２６、１３２を通って転送される。また、アンプリコンは第１反応ステーション１２８から第２反応ステーション１３４へ、制御モジュール１３８で制御される流体流路１４２を通って転送される。転送は人手を介さず、液体と外部環境の間の接触がなく自動的に行われ、試料汚染と空中に飛散したアンプリコンの放出の危険性が増幅反応で最小になる。
【００６４】
試料調製ステーション１２２から第１（１２８）、第２（１３４）反応ステーションを経て検出ステーション１３６への試料の転送が、流体流路１２４、１２６、１３２中の試料を実際に動かさずに行われる。また、第１反応ステーション１２８から、高次検出フォーマットが実行される第２反応ステーション１３４へ転送される。これは、米国特許第５，７８６，１８２（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ）に記載されるようなチャンバー内の試料モジュールを通じて行われる。この様なチャンバーは試料調製工程の場所ともなり得る。この様な転送を行う手段の他の例は、ＦＲ９８１１３８３（出願１９９８年９月８日）に記載されている。
【００６５】
前記の如く、図６のステーション１２８は第１セットのハイブリダイゼーション反応を行う。第１反応ステーション１２８は、試料中に存在すると考えられる少なくとも１個から１０個の別個の核酸配列を分析する手段を有する媒体または機器を含んでいる。内部標準アンプリコンも検出され、従って、内部標準アンプリコンに相補性のある標識も提供されなければならない。
【００６６】
機器１２０は、第１ハイブリダイゼーション反応中の標的またはアンプリコンの陽性ハイブリダイゼーション信号測定に使用される、少なくとも１個の適当な検出システム１３６と制御モジュール１３８を含む。特に、検出システム１３６は制御モジュール１３８に信号を供給し、次いで制御モジュール１３８中の中央演算ユニットで使用するために信号がデジタル化され、図２〜５の制御アルゴリズム４０を実行する。
【００６７】
好ましい実施形態における第２反応ステーション１３４は、目録１２９から検索した高次検出フォーマット機器上で第２セットのハイブリダイゼーション反応を行うステーションからなる。高次検出フォーマットは、１００個以上の別個の核酸配列、好ましくは１０００個以上の別個の核酸配列を解析する手段を有する媒体または機器からなる。高次検出フォーマットは前述の多重検出分析の一例である。
【００６８】
制御モジュール１３８は機器１２０の操作全体にわたる統御と制御を提供する。制御モジュール１３８は、図２〜５に記載される様に、第１低次検出フォーマットにおける標的またはアンプリコンの陽性ハイブリダイゼーションが検出ステーション１３６により検出されたかどうかに基づき、１個以上の選ばれた高次検出フォーマット上での第２セットのハイブリダイゼーション反応の完結または実行の必要性を決定する。最後に、検出ステーション１３６と制御モジュール１３８が、ステーション１３４中の高次検出フォーマット上の複数の標的またはアンプリコンの陽性ハイブリダイゼーション信号を検出するが、高次検出フォーマットは試験試料中の標的核酸配列に対するさらなる分析データを提供する。
【００６９】
機器１２０には試料調製ステーション１２２が含まれる。研究者は例えば、患者または他の起源からの生物または分析試料をステーション１２２に置き、試料を公知の技術または本明細書に記載の技術で処理する。好ましくはステーション１２２には、試料の起源または他の状況から増幅した方が良いと考えられる場合は核酸を増幅するための、積算増幅ステーション構成が含まれる。増幅ステーションは離れたステーションでもありうる。さらに別な実施形態では、検出ステーション１３６が増幅しない試料の結果が陰性であることを示す場合は、試料の増幅が開始される。特定の試料処理工程は、一部は既に行った資料分析により決定される。
【００７０】
機器１２０には、標的またはアンプリコンを含む流体を３方バルブ１３０に供給する試料調製ステーション１２２に繋がれた流体移送手段、例えば流体流路または導管１２４が含まれる。バルブ１３０は制御モジュール１３８により制御され、流体を第１反応ステーションまたはモジュール１３８に導く第２導管１２６に供給し、低次検出フォーマット（図２〜５の工程３０）が実行される。流体導管１２４が試料を第１反応ステーション１２８に供給する手段として選ばれる場合は、試料の汚染を防止するため、適当な既存の脱汚染／洗浄プロセスを導管１２４のために用いなければならない。その例には酸、漂白、オゾンまたはその他の化学的手法、熱または電気処理技術が含まれる。
【００７１】
第１反応ステーション１２８は標的またはアンプリコンによるハイブリダイゼーション反応を行い、検出子プローブからの信号は検出ステーション１３６により作られる。検出ステーション１３６は標的アンプリコンに相補的である検出子プローブからの信号（例えば蛍光または発光信号）を測定し、信号をデジタル化し、デジタルデータバス１４６に沿って制御モジュール１３８に供給する。本明細書に記載した制御アルゴリズム４０は、制御モジュール１３８中のハードウエアまたはソフトウエアで実行される。
【００７２】
好ましい実施形態では、第１反応ステーション１２８で用いられたスクリーニング分析が使い捨て器具内で行われ、ユーザーインターフェース１４０でのユーザーからの入力に基づき機器１２０で選択することができる。例えば、ユーザーが患者由来の血液試料または喉の試料を処理している場合、各タイプの試料に対し機器１２０はステーション１２８で異なったタイプの低次検出フォーマットを使用する。ユーザーはユーザーインターフェース１４０で患者試料のタイプを入力し、制御モジュールが低次検出フォーマット陽のパネルをパネルの目録１２９から選ぶか、またはユーザーにこの様な使い捨て器具を機器システム中に搭載するように指示する。理想的には、低次検出フォーマットを用いた第１反応ステーションでの試験の試験費用を低減するため、機器は制限された数のウエルまたはチャンバーを有するパネルを包含し、試薬の少量のスペクトルを検出する（例えば試料の起源にもよるが１０個以下のウエル、またはそれ以上）。さらに、目録１２９に記憶された異なったタイプの全てのフォーマットが、パネルの同定が
機器１２０中の安全処理ルーチンにより確認でき、正しいフォーマットを目録１２９から検索できる様に、バーコードまたは類似の指標で標識されていなければならない。
【００７３】
第１反応ステーション１２８は検出ステーション１３６のごく近くに位置している。検出ステーション１３６は、第１反応ステーション１２８で検出される信号のタイプに応じて、例えば光電増幅管、蛍光検出器または他のタイプの検出システムを含んでいる。第１反応ステーション１２８中における分析を含む機器はまた、適当な転送機構により検出ステーション１３６へ移動する。好ましい検出標識は化学発光または蛍光標識である。
【００７４】
制御モジュール１３８で実行される制御アルゴリズムの結果により、試験は排除されるか、陰性と見なされるか、または多重検出分析へ進む。試験の進行状況はの一例は、第１反応ステーション１２８を高次検出フォーマットが実行される第２反応ステーション１３４へ繋ぐ導管内に置かれた導体１４４に沿って、バルブ１４２へ制御モジュール１３８にアナログ信号を出させることである。バルブ１４２が開いている場合、試験中の標的に対するアンプリコンを含む液１流体が第２反応ステーション１３４へ転送される。
【００７５】
代表的な実施形態では、第２反応ステーション１３４中のハイブリダイゼーション反応が、前記と同様な高密度アレイ生成物等の使い捨て高次検出機器上に備えられる。第２多重検出分析用高次検出フォーマットが同様に装置目録１２９から検索される。高次検出フォーマットでハイブリダイゼーションを検出するため、多重検出手段がさらに第２反応ステーション１３４中、またはその隣りに取り込まれる。
【００７６】
検出ステーション１３６が第２反応ステーションからのハイブリダイゼーション信号の検出を終了すると、その結果は制御モジュール１３８で処理され、ユーザーインターフェース１４０に表示される。また、機器１２０は用意し適当な報告を印刷するか、次の検索のためにデータを電子的に記憶するか、または結果を付属機器またはコンピューターの位置へ送る。
【００７７】
図７を参照して、図２〜５の方法を実行するための分析機器２００の他のデザインがブロック図で示される。機器２００は図６の機器と同じ基本構造と操作法を有する。その機器は本明細書で説明した様な核酸配列を処理し、次いで増幅する、試料準備ステーション２０２と増幅ステーション２０３を有する。そのステーションはアンプリコンを第１反応ステーション２０４に提供し、そこで標的および内部標準アンプリコンのハイブリダイゼーションを行って機器をビーコン／検出基に加工する。ステーション２０４で処理されるパネルまたは装置は検出子２０９の近傍に位置し、ハイブリダイゼーション生成物の測定を行い、信号を制御モジュール２１０へ提供する。制御モジュール２１０は図２〜５からのアルゴリズム４０を実行する。検出モジュール２０８は第２反応ステーション２０６のごく近傍に位置している。高次検出フォーマット、または他の機器が第２反応ステーション２０６で使用され、検出モジュール２０８で読み取られ、本明細書で説明した様な方法で信号が制御モジュール２１０に提供される。制御アルゴリズムの結果が高次検出フォーマット分析が保証されることを示した場合、制御モジュール２１０はアンプリコンの第１反応ステーション２０４から第２反応ステーション２０６への転送を指令するのみである。最終結果はユーザーインターフェース２１２上に表示されるか、報告に印刷されるか、または必要あれば電子的に転送される。
【００７８】
前述の様に、第１反応ステーション２０４から選択した高次検出フォーマット分析へのアンプリコンの転送を指示すべきかどうかを決定する手段を、制御アルゴリズムは提供する。第２反応ステーションはその使用が完全に任意である様に、第１反応ステーションから物理的に分離されていなければならない。試験の最初の部分（すなわち図２〜５の抗体３０）で、増幅処理工程３０は含まれるべき大量のアンプリコンを生成することができるか、またはそのアンプリコンが将来の試験の潜在的汚染物になる。これらのアンプリコンの転送中に試験モジュールに対する潜在的汚染を物理的に制限する必要があるため、通常は試験処理ステーションのこの部分を密封しようとするか、何らかの方法で閉じ込めようとする。
【００７９】
他の態様では、好ましくは前記制御モジュールで決定される様に人手を介さず標的、好ましくはアンプリコンを供給源またはその他の起源から第１反応ステーションへ、指示されればアンプリコンを第２反応ステーションへ転送するために、システムが流体流路を含む。
【００８０】
また、転送機器はアンプリコンを受け取り、第１反応ステーションおよび、アンプリコンを１個以上の第２反応ステーション２０６へ転送するため、必要あれば第２反応ステーションへ転送し得る。
【００８１】
以下の実施例は本発明の多様な実施形態を説明するためのものである。実施例は本発明をこれらの実施形態に制限するために構成されるものではなく、本明細書とその等価な内容を総括する請求の範囲によってのみ定義されるものである。
【００８２】
実施例１
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの保存領域の増幅を、第１試験反応ステーション中の試料から行った。核酸配列は米国特許第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎ）、５，６４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇ）、５，５８９，５８５号（Ｍａｂｉｌａｔ）、５，７０２，３１７号（Ｍａｂｉｌａｔ）および５，８４９，９０１号（Ｍａｂｉｌａｔ）に記載される。
【００８３】
単離するため、バクテリアの新しく生育した１または２個のコロニー（直径３〜５ｍｍ、バクテリア約１０８個）をへらの端で掻き取り、１．５ｍｌのエッペンドルフ管中の２５０μｌの滅菌水中に再懸濁した。ガラスビーズの存在下にバクテリア懸濁液をボルテックス処理し、全核酸を培養材料から放出した。５μｌ分の溶菌液をＰＣＲ反応に直接加えた。また、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応に加えた。１６Ｓ超可変領域を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ族プライマー（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ参照配列上の２１３−２３６位、Ｍ２０９４０、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＴＢアンプリコンサイズは２０２ｂｐ）を用いてＰＣＲ増幅した。その部位は５’末端にバクテリオファージＴ３またはＴ７プロモーター配列（Ｔ３−ＭＩ  ５’ａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇ  ＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡ、およびＴ７Ｍ２  ５’−ｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔＴＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡ（下部文字中のプロモーター配列、上部文字中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ配列）のいづれかも含んでいた。Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｐｏＢ  Ｒｉｆ部位を、前記のＴ３およびＴ７プロモーター配列末端を有するＭＴＸ  ２２８１  ＴＢおよびＭＴＸ  ２９８５  ＴＢプライマーを用いて増幅した。アレイ上で解析したＭ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｋａｔＧの増幅はＴ３またはＴ７末端プライマー３３ｆ  ５’−ＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣおよび２２８８ｒ  ５’−ＧＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＡＧＣ（Ｘ６８０８１上の１９４２−１９６２位および４１９７−４２１７位、ＴＢアンプリコンサイズは２２７５ｂｐ）を用いて行った。
【００８４】
５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、５％のＤＳＭＯ、０．５μｌの各プライマー、２００μＭの４種それぞれのデオキシヌクレオチド３リン酸および１．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含む１００μｌの反応容積中でＰＣＲを行った。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００熱サイクラー中、初期変性工程が９４℃で５分間、サイクリング条件９４℃で４５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒（ｋａｔＧ標的では２分間）でＰＣＲを行い、最後のサイクルは７２℃で１０分間行った。
【００８５】
試料中にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが存在するかどうかをスクリーニングするためＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの保存領域（この様な領域は２個のプライマーにより増幅される）中に設計されたプローブを調製しなければならない。この例では、配列５’ＧＡＴＧＡＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴ３’からなる検出プローブによりスクリーニングが可能である。熱またはアルカリ処理でＰＣＲフラグメントを変性、および増幅フラグメントの標識プローブへのハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２６、ｐｐ２１５０−２１５５（１９８８））後、蛍光信号の分析はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種が存在することを示している。
【００８６】
スクリーニング手順が陽性である場合、プロモーターでラベルされたＰＣＲアンプリコンを標識一本鎖ＲＮＡ標的を生体外転写で生成するために用いた。各２０μｌの反応生成物は約５０ｎｇのＰＣＲ生成物、２０ＵのＴ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．１）、１００ｍＭの酢酸Ｍｇ（アセテート）２、１０ｍＭのＤＴＴ、各１．２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、０．５ｍＭのＵＴＰおよび０．２５ｍＭのフルオレスカイン−ＵＴＰを含んでいた。反応は３７℃で１時間おこなわれた。生体外で転写されたＲＮＡをＭｇＣｌ２濃度を３０ｍＭに調節し９４℃で３０分間加熱するか、３０ｍＭのＭｎＣｌ２および３０ｍＭのイミダゾールと共に６５℃で３０分間インキュベートすることにより断片化した。断片化の効率を変性ＰＡＧＥで分析した。
【００８７】
米国特許第５，８３７，８３２（Ｃｈｅｅ）に記載されるものと同様なアレイタイル戦略を用い、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株とｒｐｏＢ突然変異株を区別する配列を同定した。一定の参照配列内の全ての塩基に対し、同じ長さの４個のプローブをアレイ上に合成した。問題の塩基はプローブの中心に位置し、共通の３’および５’末端を有している。１個のプローブは参照配列に対し正確に相補的であるが、他の３個のプローブは問題の塩基に対し１個の塩基のミスマッチを有する可能性がある。基本となる細胞を標識標的のハイブリダイゼーション強度を４個のプローブと比較して決定した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列では、アレイ上で１回だけ参照される２個以上を共有するプローブを合成することにより、過剰のプローブを除去した。ｒｐｏＢに対する野性型プローブに加えて、リファンピン耐性突然変異体はそれ自体のプローブのセットで表される。アレイはまた、カタラーゼ、ペルオキシダーゼをコードする２．２ｋｂのＭ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｋａｔＧ遺伝子並列を含む。プローブアレイは１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｒｐｏＢアンチセンス、およびｋａｔＧセンス配列に対応する、４個の別個のゾーンに分けられる。アレイは１．２８ｃｍ×１．２８ｃｍの面積にわたり、特定の５０μｍ×５０μｍユニットまたは細胞に分割され、総数で６５，０００の異なった合成部位となる。８２の固有の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のデータベースを用いてアレイを設計したが、それにより５４の異なったフェノタイプの株を区別することができた。アレイ上に張り合わせた１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域で観察される配列の異質性のために、ある株、または分類学上の複合体が、１個以上の参照配列で表される（例えばＭ．  ａｖｉｕｍ細胞間複合体）。また、６１リファンピン耐性単離株由来のｒｐｏＢ配列のデータベースがアレイ上に表されている。これらの配列は５１個の固有のｒｐｏＢ突然変異体を含んでいる。
【００８８】
プローブアレイのハイブリダイゼーションをＧＥＮＥ  ＣＨＩＰ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。断片化した標識ＲＮＡ標的の１から５μｌを５００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した。ハイブリダイゼーション緩衝液１の組成は４．５Ｘ  ＳＳＰＥ（０．６７５Ｍ  ＮａＣｌ、４５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、４．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、３０℃であった。アレイに結合した標的により放射される蛍光信号をＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）により光学濃度６で検出した。プローブアレイ細胞濃度、ヌクレオチド塩基呼び出し、配列決定および報告は、ＧＥＮＥ  ＣＨＩＰソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に用意された機能で作成した。候補選択インデックスを、実験的に導き出した配列と、アレイ上に貼り合せた参照配列のすべてとの間の相同性の比率で決定した。核酸配列は米国特許第５，５８９，５８５（Ｍａｂｉｌａｔ）、米国特許第５，７０２，３１７（Ｍａｂｉｌａｔ）および米国特許第５，８４９，９０１（Ｍａｂｉｌａｔ）に記載されるか、ＧｅｎＢａｎｋまたはその他のデータベースから入手できる。
【００８９】
実施例２
ＨＩＶ分析
本発明の第１アレイで、特にウイルス負荷測定のために用いられたＨＩＶ核酸配列は、Ｌｉｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６（３）、ｐｐ８３５−８３９（１９９８）およびＫｏｒｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０、ｐｐ１８６８−１８７１（１９９８）に記載され、Ｇｅｎｂａｎｋまたは他のデータベースで一般に公開されている。ＨＩＶ核酸配列を記載する公開文献には欧州特許第０３４５３７５号（Ｄｅ  Ｌｅｙｓ）、０１７３５２９号（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａｌ）、０１７８９７８号（Ａｌｉｚｏｎ）、０１８１１５０号（Ｌｕｃｉｗ）、および０１８５４４４号（Ｃｈａｎｇ）が含まれる。核酸配列を記載する米国特許には米国特許第５，０７９，３４２号（Ａｌｉｚｏｎ）および５，３１０，５４１号（Ａｌｉｚｏｎ）が含まれる。また、Ｋｏｚａｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．ら「高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて観測したＨＯＶ−１クレードＢプロテアーゼ遺伝子中の広範囲多形」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．２、ｎｏ．７、ｐｐ７５３−７５９（１９９６年７月）も参照のこと。
【００９０】
【発明の効果】
本発明は以上説明したように構成されることにより、以下のような効果を奏する。
【００９１】
第１・第２ハイブリダイゼーション反応由来の信号の検出器と、分析機器の統合操作を行う制御モジュールを備えることにより、検出器からの結果に基づいて第２ハイブリダイゼーション反応の処理と、解析の必要性を決定することができる。
【００９２】
高次検出フォーマットで前述標的核酸配列またはその相補的配列の陽性ハイブリダイゼーション反応シグナルを検出するための第二検出器を備えることにより、内部の高次検出フォーマットでは標的核酸配列についての追加データを供給することができる。
【００９３】
試料調製ステーションで選抜された標的核酸配列の調製する手段を備えることにより、ここから提供される標的核酸配列上の核酸増幅行程を行うことができる。
【００９４】
試料調製ステーションに内部標準核酸配列を供給する手段を備えることにより、ここから提供される内部標準核酸配列上の核酸増幅行程を行うことができる。
【００９５】
試料調製ステーションから第１試験反応ステーションへ、また制御モジュールでの決定により第１試験反応ステーションから第２試験反応ステーションへの液体移送の手段を備えることにより、自動的かつ人手を介さずに、移送される液体と外部環境の間で接触の起こることのない液体の移送を実現する。
【００９６】
低次検出フォーマットで均一溶液ハイブリダイゼーション反応実行の手段を備え、第１ハイブリダイゼーション反応からの検出信号データの結果に基づき、制御モジュールによる一つまたは複数の高次検出フォーマット使用の選択を可能にする。
【００９７】
高次検出フォーマットにマトリックスハイブリダイゼーション反応実行の手段を備えることにより、多重検出解析を可能にする。
【００９８】
低次検出フォーマット機器がマトリックスハイブリダイゼーション反応実行の手段を備えることにより、少数の標的アンプリコンおよび内部標準アンプリコンをスクリーニングすることを可能にする。
【００９９】
内部標準配列と標的配列を増幅し、増幅された核酸配列の制限検出解析から測定された内部標準信号と第１閾値、標的信号と第２閾値の比較を行い、比較の結果より以降の多重検出分析を行うか否かを決定する工程を備えることで、より多くの分析データの収集を費用効率の良く行う核酸分析法を実現する。
【０１００】
上記分析法の工程を自動的に、人手を介さず行うことにより、人件費や試料処理費を削減し低コスト化をはかる。
【０１０１】
１個以上のアンプリコンに対する相補核酸配列からなる低次検出フォーマットにアンプリコンを提供し、ハイブリダイゼーションされたアンプリコンの存在を検出して、制御アルゴリズムにより陽性の決定が得られた場合にのみ、アンプリコンを高じ検出フォーマットでさらに解析するという工程により、１個以上の核酸を含む試験試料から低コストでのデータ収集するための診断法および自動化機器上での手順を実現する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト試料に関して複数の試験を行うための先行技術の方法の概略図であり、フローチャートでは感染源が試料中にあるという仮定から出発している。
【図２】本発明による方法の概略図であり、低次検出フォーマットからの制御アルゴリズム処理信号が高次検出フォーマットが正当であることを示した場合のみ、高次検出フォーマットが行われる。
【図３】図２の方法の変法の概略図である。
【図４】図２の方法の２番目の実施形態の概略図であり、第２レベルの試験を行うかどうか、同様に試料中の核酸レベルの定量評価を行うべきかどうかが、制御アルゴリズムにより決定される。
【図５】本法の３番目の実施形態の概略図であり、３個の低次検出フォーマットが平行して走り、結果を表す信号が制御アルゴリズムを実行する制御モジュールに供給される。３個の異なった分析パラメータが供給され、１個の高次検出フォーマット選択用の１個の入力となる。
【図６】図２から５の方法を行うために用いられる好ましい分析機器のブロック図である。
【図７】図２から５の方法を行うための分析機器の別な設計のブロック図である。
【符号の説明】
１２０  核酸分析機器
１２２  試料調製ステーション
１２４  流路
１２６  流路
１２８  第１反応ステーション
１２９  パネル目録
１３０  ３方バルブ
１３２  流路
１３４  第２反応ステーション
１３６  検出ステーション
１３８  制御モジュール
１４０  ユーザーインターフェース
１４４  導体
２０２  試料調製ステーション
２０３  増幅
２０４  第１反応ステーション
２０６  多重検出反応ステーション
２０８  多重検出器
２０９  第１検出器
２１０  制御モジュール
２１２  ユーザーインターフェース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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