(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に含まれる塩基１〜１５４２の配列断片を含む、トラメテスまたはポリポラスにおいて活性なプロモーター活性を有する調節エレメント。
【請求項２】
トラメテスおよびポリポラスの属から選択される宿主生物における形質転換後にポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡベクターにおいて、選択マーカー遺伝子が、宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損（栄養要求性）を相補する遺伝子の群から選択され、かつ選択マーカー遺伝子が、宿主生物において活性な少なくとも１種の請求項１記載の遺伝子調節エレメントによってコントロールされることを特徴とする、ＤＮＡベクター。
【請求項３】
糸状菌においてタンパク質を製造するための、
ａ）トラメテスおよびポリポラスの属から選択される宿主生物ならびに、
ｂ）宿主生物の形質転換の後にポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードし、かつ宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損（栄養要求性）を相補する遺伝子の群から選択される選択マーカー遺伝子を有し、その際、選択マーカー遺伝子の発現が宿主生物において活性な少なくとも１つの遺伝子調節エレメントによってコントロールされる請求項２記載のＤＮＡベクター、および
ｃ）製造されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有し、その際、該遺伝子の発現および、場合によりこうして製造されたタンパク質の分泌が宿主生物において活性な請求項１記載の１つの遺伝子調節エレメントによってコントロールされるＤＮＡベクター
からなり、その際、選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡベクターと製造されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有するＤＮＡベクターとが１つのＤＮＡベクターとして存在してもよい発現系。
【請求項４】
宿主生物がトラメテスまたはポリポラスの属からの一核性の株である、請求項３記載の発現系。
【請求項５】
宿主生物がトラメテス ベルシカラーである、請求項３又は４記載の発現系。
【請求項６】
宿主生物がオロチジン−５’−ホスフェート デカルボキシラーゼ（ｐｙｒＧ遺伝子）に欠損を有し、かつウリジンに対して栄養要求性であり、かつ選択マーカー遺伝子がｐｙｒＧ遺伝子である、請求項３から５までのいずれか１項記載の発現系。
【請求項７】
宿主生物において活性な遺伝子調節エレメントがグリセリンアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子）のためのプロモーターエレメントおよび、場合によりターミネーターエレメントならびにラッカーゼ遺伝子のためのプロモーターエレメントおよびターミネーターエレメントから選択される、請求項３から６までのいずれか１項記載の発現系。
【請求項８】
発現されるべきタンパク質がラッカーゼである、請求項３から７までのいずれか１項記載の発現系。
【請求項９】
タンパク質の効率よい発現および分泌を可能にする菌類株を製造するための方法において、宿主株としてトラメテスおよびポリポラスの属から選択されるウリジン栄養要求性遺伝子欠損の菌類を使用し、その際、該菌類は自体公知の方法によって、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子を有するＤＮＡベクターで形質転換し、かつ形質転換混合物から前記ＤＮＡベクターで形質転換したクローンを栄養要求性の遺伝子欠損の相補による選択によって選択し、その際、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子発現を宿主生物において活性な請求項１記載の１つの遺伝子調節エレメントによってコントロールすることを特徴とする、菌類株の製造方法。
【請求項１０】
タンパク質を製造するための方法において、請求項３から７までのいずれか１項記載の発現系を、自体公知の方法でタンパク質製造のために使用するか、または請求項９記載の方法によって製造した菌類株を自体公知の方法で培養することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）およびポリポラス（ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）の属の菌類におけるタンパク質の製造のための発現系、その製造およびその使用に関する。
【０００２】
タンパク質製造のために、原核性および真核性の種々の発現系が知られている。原核性の発現系の例は、エシェリキア コリおよびバシラス サチリスである。該生物の遺伝子操作のための方法は十分に確立されている。これらの発現系特有の欠点は、就中真核性タンパク質の生産率が屡々期待はずれに少ないことである。その際生産されるタンパク質が活性形で存在することは殆どなく、かつ就中発現されたタンパク質の翻訳後修飾が不足するほど生産されたタンパク質は折り畳まれている。不足した翻訳後修飾として、例えば発現されるべきタンパク質の置換基の付加の不足またはグルコシル化の不足が挙げられる。
【０００３】
原核性の発現系の欠点は真核性の発現系の使用によって回避することができる。
【０００４】
広く使用される周知の真核性の発現系には、ホニュウ類細胞と同様に昆虫細胞ならびに真核性の微生物、例えば酵母もしくは糸状菌の細胞培養系が属する。一方、前記の発現系において発現されるべきタンパク質は一般に活性形で形成されるが、就中生産率は異種タンパク質の発現においては多くの場合において低すぎる。このために例として酵母サッカロマイセス セレビシエまたはアスコマイセテン（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｎ）綱からの糸状菌における発現が役に立っている。
【０００５】
アスペルギルスのような糸状菌での高い生産率は、就中同種タンパク質またはアスコマイセテン綱の糸状菌のタンパク質の発現のために記載されている。異種タンパク質の発現は僅かまたは高くない収率でのみ成功している。ＷＯ９６／００２９０号は、例えばバシドマイセテン（Ｂａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅｎ）綱の糸状菌、ポリポラス ピンシツス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｐｉｎｓｉｔｕｓ）の綱からのラッカーゼＬＣＣ１の異種発現を記載している。アスペルギルスでの発現において、アスコマイセテン綱の糸状菌に発酵において０．３５ｇ／ｌまでの収率が達成された。これは、比較可能な野生株の０．１〜０．２ｇ／ｌの発酵での生産能力に比して比較的僅かな収率増加である。
【０００６】
バシドマイセテンおよび就中白色腐敗菌の綱からの酵素に関して特に、工業的使用に対する関心がますます増加している。例として、加水分解酵素、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリパーゼが挙げられるが、またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼも挙げられる。前記の酵素は、例えば木材もしくはパルプの加工において使用可能である。
【０００７】
殊にバシドマイセテン中に存在する、工業的使用に大きな関心が抱かれている酵素クラスはラッカーゼ（ｐ−ヒドロキシフェノールオキシダーゼ、ＥＣ１．１０．３．２）の酵素クラスである。ラッカーゼは、いわゆる“青色銅タンパク質”のタンパク質ファミリーであり、かつ一般に４個の銅イオンを有し、１型〜３型を示す３つの銅中心に配置されている。ラッカーゼは更に、一般に分泌タンパク質であり、かつ分子量の１０〜４５％のグリコシル化部分を有することがあることで際立っている。高分子化合物、例えばリグニンの分解の他に、ラッカーゼは就中芳香族化合物の重合を触媒する。これに関する例として、リグニン生合成は植物において利用されており、その際に植物中に存在するラッカーゼが関与している。ラッカーゼの工業的な使用の可能性は、製紙においてあらゆる種類の重合反応、例えば下水処理においてパルプの脱リグニンをもたらす。ラッカーゼの使用は有機化学合成において、例えば芳香族炭化水素のカップリング反応または側鎖酸化において公知である。しかしながら前記の全ての方法における工業的使用のためには、ラッカーゼ酵素がコスト的に有利であり、かつより大量に提供できることが前提条件である。
【０００８】
バシジオマイセス綱からの種々の糸状菌に関して、形質転換および形質転換体の選択に適当であるべきＤＮＡベクターが記載されている。バシドマイセテン綱ファネロカエテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）に関して、同種形質転換（ｈｏｍｏｌｏｇｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のための方法が記載されている（Ｍ．Ａｌｉｃ他  （１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９，４９１−４９４）。バシドマイセテン綱のプロイロタス オステレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓｏｔｒｅａｔｕｓ）に関しては、形質転換のためのＤＮＡ構築物が記載されている（Ｋ．Ｙａｎａｉ他  （１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，４７２−４７５）。ＵＳ５３６２６４０号はバシドマイセテン綱コリオラス ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）の形質転換のためのＤＮＡベクターを記載している。同様に、バシドマイセテン綱コリオラス ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の形質転換のためにＤＮＡベクターが記載されている（Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ他（１９９２）５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，４２７−４３１）。バシドマイセテン綱からの発現系によって、同種もしくは異種のタンパク質に関する発現率のかなりの増加が達成されることは知られていない。
【０００９】
アスコマイセテン綱の糸状菌における発現のための遺伝子調節エレメントを有する公知の発現ベクターは、バシドマイセテン綱の糸状菌において効率よく発現することができない。従って該ベクターはバシドマイセテン綱の糸状菌の形質転換の際に、例えば後天的な抗生物質耐性または発色性のインジケータータンパク質の発現に基づくか、または栄養要求性の遺伝子欠損の相補に基づいてポジティブな形質転換体の選択を可能にしない。
【００１０】
本発明は、糸状菌中でのタンパク質の生産のために発現系に関し、その際発現系は、
ａ）トラメテスおよびポリポルスの属から選択される宿主生物ならびに
ｂ）ＤＮＡベクター、該ベクターは宿主生物の形質転換によってポジティブな形質転換体の選択を可能にするタンパク質をコードし、かつ宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損（栄養要求性）を相補する遺伝子の群から選択される選択マーカー遺伝子を有し、その際選択マーカー遺伝子の発現は宿主生物中で活性な少なくとも１種の遺伝子調節エレメントによってコントロールされ、
ｃ）ＤＮＡベクター、該ベクターは生産されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有し、その際、遺伝子の発現および、場合により生産されたタンパク質の分泌も宿主生物において活性な遺伝子調節エレメントによってコントロールされ、その際、選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡベクターおよび生産されるべきタンパク質をコードする遺伝子を有するＤＮＡベクターが１つのＤＮＡベクターとして存在してもよい
からなる。
【００１１】
抗生物質耐性遺伝子として、有利にはハイグロマイシン、ビアラフォス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）、カナマイシン、ジェネティシン、ブレオマイシン、オリゴマイシン、Ｇ４１８、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）、ベノミルおよびフレオマイシンの群からの抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子が適当である。
【００１２】
有利には、発色反応の能力があるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子、例えばグルコニダーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のための遺伝子を他に使用してよい。
【００１３】
宿主生物の遺伝子欠損（栄養要求性）を相補できる選択マーカー遺伝子が特に適当である。
【００１４】
本発明による発現系のために有利な宿主生物は、トラメテスおよびポリポラスの属からの一核性の株である。
【００１５】
トラメテス ベルシカラー（ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）種の宿主生物が特に有利である。
【００１６】
本発明による発現系における宿主生物は、代謝における遺伝子欠損（栄養要求性）を有し、それに基づき１種以上の増殖のために必須の代謝物がもはや合成されず、かつ前記の１種以上の代謝物の添加無しに最少培地上でもはや増殖できないという点で優れている。
【００１７】
本発明は発現系に関し、その際、トラメテスおよびポリポラスの属から選択された宿主生物は代謝における遺伝子欠損（栄養要求性）を有し、それに基づき１種以上の増殖のために必須の代謝物がもはや合成されず、かつ前記の１種以上の代謝物の添加無しに最少培地上でもはや増殖できず、かつ選択マーカー遺伝子が、宿主生物の栄養要求性遺伝子欠損を相補するように選択されている。
【００１８】
宿主生物における栄養要求性遺伝子欠損を相補できる選択マーカー遺伝子のための例は、ＯＣＴ−遺伝子（オルニチン−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする、ＵＳ５３６２６４０号）、ｐｙｒ Ｇ−遺伝子（オロチジン−５’−ホスフェート デカルボキシラーゼをコードする、Ｇｏｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． （１９８７） １１， ４９９−５０３）、ｔｒｐＣ遺伝子（ホスホリボシル−アントラニル酸イソメラーゼ、グルタミン−アミドトランスフェラーゼおよびインドール−グリセリンホスフェートシンターゼの酵素活性を有する三機能の遺伝子産物をコードする、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８４）８１， １４７０−１４７４）、またはｎｉａ Ｄ遺伝子（ニトレートレダクターゼをコードする）である。
【００１９】
選択マーカーとして、オロチジン−５’−ホスフェート デカルボキシラーゼ（ウリジン代謝の酵素）をコードし、かつｐｙｒＧ遺伝子に欠損を有する宿主株のウリジン栄養要求性を相補できるｐｙｒ Ｇ遺伝子が特に有利である。その際特に有利には宿主生物は、ｐｙｒＧ遺伝子における欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属からの、ウリジンに対して栄養要求性の株である。
【００２０】
ｐｙｒＧ遺伝子は、有利にはバシドマイセテン綱、例えばアガリクス属、コリオラス、ポリポラス、プロイロタス、ファネロカエテ、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）またはトラメテスからの菌類に由来する。
【００２１】
有利には、例えばバシドマイセテン綱からの糸状菌、シゾフィルム コミュネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アガリクス ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（ＧＡＰＤＨ Ａｇ２遺伝子）、ファネロカエテ クリソスポリウム、トラメテス ベルシカラーからのグリセリンアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）またはラッカーゼ遺伝子、有利にはトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼＩ遺伝子もしくはラッカーゼＩＩＩ遺伝子のためのプロモーターエレメントおよびターミネーターエレメントがｐｙｒＧ遺伝子のために適当である。
【００２２】
特に、有利にはバシドマイセテンのシゾフィルム コミュネまたはバシドマイセテンのトラメテス ベルシカラーからのオロチジン−５’−ホスフェート デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ遺伝子）が本発明による発現系のための選択マーカー遺伝子として適当である。
【００２３】
有利には、バシドマイセテンのシゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の発現はシゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子のためのプロモーターおよび場合によりターミネーターによって調節される。
【００２４】
有利にはバシドマイセテンのトラメテス ベルシカラーからのｐｙｒＧ遺伝子の発現は、トラメテス ベルシカラーからのｐｙｒＧのためのプロモーターによって調節される。
【００２５】
本発明による発現系は、特に、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリパーゼの群またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼの群からの加水分解酵素をコードする遺伝子の発現のために適当である。
【００２６】
特に有利には、ラッカーゼのための遺伝子の発現に適当である。
【００２７】
本発明は、更にトラメテスおよびポリポラスの属から選択された菌類の形質転換後にポジティブな形質転換体の選択を可能にする少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡベクターにおいて、選択マーカー遺伝子を、宿主生物が耐性でない抗生物質の増殖阻害作用をうち消すタンパク質をコードする抗生物質耐性遺伝子、発色反応の能力があるタンパク質をコードする遺伝子ならびに宿主生物の遺伝子欠損（栄養要求性）を相補する遺伝子の群から選択し、かつ該選択マーカー遺伝子が宿主生物中で活性な少なくとも１種の遺伝的調節因子によってコントロールされることを特徴とするＤＮＡベクターに関する。
【００２８】
本発明によるＤＮＡベクターは、ポジティブな形質転換体の選択を宿主生物における栄養要求性の遺伝子欠損の相補に基づいてトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類の形質転換の際に可能にする。
【００２９】
特に、糸状菌トラメテス ベルシカラーの形質転換体の選択および特に有利な実施態様においてはｐｙｒＧを欠損した栄養要求性のトラメテス ベルシカラー株の形質転換体は、有利には好適な遺伝子として挙げられる遺伝子によって宿主生物における栄養要求性の遺伝子欠損の相補を可能にする。
【００３０】
本発明によるＤＮＡベクターは、トラメテスおよびポリポラスの属の宿主生物において、タンパク質をコードする遺伝子の発現のためにも適当である。またタンパク質をコードする遺伝子とは、本発明の意図としては構造遺伝子から誘導されるタンパク質のｃＤＮＡ遺伝子を意味すべきである。タンパク質とは、宿主生物に対して異種のタンパク質または宿主生物に対して同種のタンパク質である。
【００３１】
従って本発明のＤＮＡベクターは、有利には発現されるべきタンパク質をコードする少なくとも１種の遺伝子を有する。
【００３２】
特に有利には本発明によるＤＮＡベクターは、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリパーゼの群またはオキシドレダクターゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、セルビオース−キノン−オキシドレダクターゼまたはセルビオース−オキシダーゼの群からの加水分解酵素をコードする少なくとも１種の遺伝子を有する。
【００３３】
特に有利には、本発明によるＤＮＡベクターはラッカーゼのための遺伝子を有する。
【００３４】
タンパク質をコードする遺伝子の発現のために必須のプロモーターは発現されるべき遺伝子に由来するか、または外来遺伝子のプロモーターを、発現されるべき遺伝子のコードされる領域と機能的に連結させて使用してもよい。
【００３５】
従って本発明によるＤＮＡベクターは、有利にはタンパク質をコードする遺伝子の発現のためのプロモーターを有する。
【００３６】
特に有利には本発明によるＤＮＡベクターは、タンパク質をコードする遺伝子の発現のためのプロモーターとして高い発現能力が保証されるプロモーターを有する。
【００３７】
例えば前記の目的のために有利に使用されるプロモーターは、例えばトラメテス ベルシカラー種からのグリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のタンパク質のための遺伝子のプロモーターである。
【００３８】
本発明によるＤＮＡベクターは、有利にはタンパク質をコードする遺伝子のための転写ターミネーターも有する。
【００３９】
転写ターミネーターとして、発現されるべきタンパク質をコードする遺伝子のターミネーターを使用してよいが、または外来遺伝子のターミネーターを使用してもよい。ラッカーゼの遺伝子からの転写ターミネーターが有利である。
【００４０】
タンパク質の発現は細胞内でか、または機能的シグナル配列の存在下で、分泌の目的のために細胞外でも実施できる。
【００４１】
細胞からの発現されたタンパク質の分泌が望ましい場合に、本発明によるＤＮＡベクターは有利にはタンパク質をコードする遺伝子の前に機能的シグナル配列５’を有する。更にまた、タンパク質をコードする遺伝子の５’−末端と機能的に連結するいわゆる分泌キャリヤー（Ｓｅｋｒｅｔｉｏｎｓｃａｒｒｉｅｒ）は本発明によるＤＮＡベクターに含まれている。
【００４２】
分泌キャリヤーは、分泌されるタンパク質のための遺伝子または分泌されるタンパク質のための遺伝子の断片であってよい。分泌キャリヤーは分泌されるべきタンパク質と、融合タンパク質が分泌キャリヤーおよび分泌されるべきタンパク質から生じるように機能的に連結してよい。別の実施態様において、分泌キャリヤーおよび分泌されるべきタンパク質の連結は、分泌キャリヤーが分泌されるべきタンパク質から分離できるように構成する。これは、例えばタンパク質分解酵素のための認識配列を分泌キャリヤーと分泌されるべきタンパク質の間の連結部位に挿入することによって実施できる。このために例としては、いわゆるＫＥＸ２プロテアーゼのためのリジン−アルギニン認識部位が知られており、かつ分泌キャリヤーのための例としてアスペルギルス ニガーからのグルコアミラーゼが知られている（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１） ９， ３７８−３８１， Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９３） ３１， １３５−１４５）。
【００４３】
他にタンパク質をコードする遺伝子の３’−末端の転写ターミネーターとして発現されるタンパク質の発現および分泌に関与しているＤＮＡ配列は同様に本発明によるＤＮＡベクター中に含まれている。それに関する例として、ノイロスポラ クラッサからのラッカーゼのための遺伝子が提供され、該遺伝子の３’−末端は１３個のアミノ酸のための配列を有し、該配列はタンパク質の分泌の間に除去され、かつ未成熟のタンパク質をもはや含まない（Ｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８８） ２６３， ８８５−８９６）。
【００４４】
本発明によるＤＮＡベクターの製造は、先行技術において公知の方法によって実施する。種々の可能性を実施例に説明する。そこに記載される方法は当業者によって別の任意のベクター、耐性遺伝子、調節エレメントおよび構造遺伝子を用いて使用される。
【００４５】
本発明によるＤＮＡベクターは、タンパク質の効率のよい発現および分泌を可能にする菌類株の製造のために適当である。
【００４６】
従って本発明は、タンパク質の効率のよい発現および分泌を可能にする菌類株の製造方法に関する。
【００４７】
前記の方法は、宿主生物として栄養要求性の遺伝子欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類を使用し、その際、該菌類は宿主株における栄養要求性遺伝子欠損の相補のための遺伝子を有するＤＮＡベクターを使用して自体公知の方法によって形質転換され、かつ形質転換混合物から、ＤＮＡベクターで形質転換したクローンを栄養要求性の遺伝子欠損の相補による選択によって選択し、その際、宿主株における栄養要求性の遺伝子欠損の相補のための遺伝子発現は、宿主株中で活性な遺伝子調節エレメントによってコントロールされていることを特徴とする。
【００４８】
遺伝子発現のための宿主として使用してよい糸状菌はトラメテスおよびポリポラスの属に属する。
【００４９】
遺伝子発現のための宿主として、トラメテスおよびポリポラスの属からの一核性のバシドマイセが有利である。
【００５０】
更に、挙げられるバシドマイセテン綱からの宿主株が栄養要求性の遺伝子欠損を有する場合に有利であり、該遺伝子欠損はポジティブな形質転換体を同定するための選択マーカーとして使用できる。例えばＯＣＴ−遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子またはｎｉａＤ遺伝子に遺伝子欠損を有するバシドマイセテン綱からの宿主株を使用してもよい。
【００５１】
遺伝子発現のための宿主としては、ｐｙｒＧ遺伝子に欠損を有するトラメテスおよびポリポラスの属から選択された菌類が有利である。
【００５２】
遺伝子発現のためには、ｐｙｒＧ遺伝子に欠損を有し、かつウリジンに対して栄養要求性であるトラメテス ベルシカラー種の宿主が特に有利である。
【００５３】
宿主株の形質転換は、先行技術に相当する方法によって実施する。前記の方法には、ＣａＣｌ２／ＰＥＧ法によるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換またはＤＮＡを有する微小弾丸を打ち込むことによる形質転換が属する。前記の方法は標準的な教科書に記載されている。
【００５４】
例えば公知の方法で形質転換させるべき遺伝子を本発明によるＤＮＡベクター中にクローニングし、挙げられた方法によってトラメテスおよびポリポラスの属から選択される糸状菌中に導入する。
【００５５】
しかしながら形質転換されるべき遺伝子を、選択マーカー遺伝子を有さない発現ベクター中にクローニングし、かつ宿主株の栄養要求性の遺伝子欠損を相補するベクターと一緒に使用（同時形質転換）して形質転換体を得てもよい。
【００５６】
形質転換のために有利な株は、トラメテスおよびポリポラスの属から選択される糸状菌である。バシドマイセテン綱からの当該株は一核性であってよいが、または二核性の株であってもよい。有利な実施態様においては、ｐｙｒＧ遺伝子中に欠損を有するウリジン栄養要求性株が対象である。
【００５７】
形質転換のためには、トラメテス ベルシカラー種からの一核性のウリジン栄養要求性のｐｙｒＧ欠損株が特に有利である。
【００５８】
ポジティブな形質転換体の選択は、例えばプロトプラストをベクターＤＮＡによる形質転換の後に、プロトプラストの浸透安定化のために、例えばソルビトール、マンニトールもしくはサッカロースのような添加物が添加され、かつ相補されるｐｙｒＧ遺伝子を使用して形質転換体の選択を可能にする培地上に播種して実施する。
【００５９】
本発明の有利な実施態様においては、糸状菌トラメテス ベルシカラーを同種系中でトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼの遺伝子で形質転換する。それによって、前記のラッカーゼのための発現率の向上が達成され、それによって先行技術によって得られる生産率は０．１ｇのラッカーゼ／培養培地のリットルの発酵において大いに改善される。
【００６０】
有利には付加的にラッカーゼ遺伝子自体のプロモーターまたはトラメテス ベルシカラーからの強力に発現される遺伝子のためのプロモーターを使用する。有利には４で単離されるラッカーゼ遺伝子ＩおよびＩＩＩのプロモーターを使用する。
【００６１】
例を記載する。その際、ラッカーゼＩ遺伝子のなかでも、有利には配列番号１に含まれる塩基１〜１１９２の配列断片を使用する。ラッカーゼＩＩＩ遺伝子の中でも、有利には配列番号２に含まれる塩基１〜５４７の配列断片を使用する。他の強力に発現される遺伝子のプロモーターは、トラメテス ベルシカラーからのグリセリンアルデヒド−３−ホスフェートヒドロゲナーゼのためのＧＡＰＤＨプロモーターである。ＧＡＰＤＨは５において単離している。例を記載する。ＧＡＰＤＨプロモーター配列は配列番号３の塩基１〜１５４２に挙げられる配列断片に相当する。特に配列番号３の塩基１３６５〜１５４２ならびに該配列断片と相同の７３％より高いホモロジーを有する配列が発現のために適当なことが明らかである。有利には、更に以下の配列断片の少なくとも１つは本発明による調節エレメント上になお同様に存在する：
配列番号３：塩基１００５〜１１２３ならびに該配列断片と相同の５２％より高いホモロジーを有する配列、または
配列番号３：塩基８１７〜９４７ならびに該配列断片と相同の４４％より高いホモロジーを有する配列、または
配列番号３：塩基６４０〜７２８ならびに該配列断片と相同の５０％より高いホモロジーを有する配列。
【００６２】
本発明において、全ての挙げられるホモロジー値は、コンピュータプログラム“ウィスコンシン パッケージ バージョン９．１（Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１）、ジェネティクス コンピュータ グループ（ＧＣＧ）、マジソン、ウィスコンシン”によって得られた結果に関連している。ホモロジー決定は、サブプログラム“ファスタ（ｆａｓｔａ）”および前調節値（ワードサイズ６）を使用するデータベースにおけるサーチによって実施する。次いで最も類似した配列のホモロジーをサブプログラム“ギャップ（ｇａｐ）”を使用して調べる。その際、前調節されたパラメーター“ギャップ クリエーション ペナルティー５０（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ５０）”および“ギャップ エクステンション ペナルティー３（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ３）”を使用した。更に、サブプログラム“ギャップ”および前記に挙げた前調節されたパラメーターを使用してＪＰ０９０４７２８９号に開示されているが、依然としてデータベースで使用可能でないコリオラス ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）からのＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター配列のホモロジーを調べる。
【００６３】
従って本発明はトラメテスまたはポリポラスにおいて活性な調節エレメントにおいて、配列番号１に含まれる塩基１〜１１９２の配列断片または配列番号２に含まれる塩基１〜５４７の配列断片または配列番号３に含まれる塩基１３６５〜１５４２の配列断片ならびに該配列と相同の７３％より高いホモロジーを有する配列を含むことを特徴とする調節エレメントに関する。
【００６４】
有利には、ｐｙｒＧ遺伝子のための機能的に発現される選択マーカー遺伝子で形質転換されたトラメテス ベルシカラーのかかる形質転換体のみが増殖できる選択培地が使用される。２におけるものが対象である。例えばウリジン不在の前記の最少培地上では、トラメテス ベルシカラーのｐｙｒＧ栄養要求性株はもはや増殖できないか、もしくはウリジンの添加によって初めて再び増殖できる。
【００６５】
選択系としてｐｙｒＧ遺伝子を有する本発明によるＤＮＡベクターの効果的な使用は、トラメテス形質転換体における選択マーカー遺伝子の効果的な発現に依存している。効果的な発現のためには、相当する発現シグナルが必須である。
【００６６】
トラメテス ベルシカラーにおいて、バシドマイセテンからの発現シグナルは、別の方法で使用できるアスコマイセテンからの発現シグナルよりも意想外に著しく高い効率で機能的発現をもたらす。従って、本発明によるＤＮＡベクターにおいて、有利にはバシドマイセテンからの遺伝子調節エレメントのコントロール下、特に有利にはトラメテスおよびポリポラスの属から選択された係る調節エレメントのコントロール下にｐｙｒＧ選択マーカー遺伝子を配置する。
【００６７】
有利にはｐｙｒＧ遺伝子を、その上流の５’−プロモーター領域ならびにその下流の３’−ターミネーター領域のコントロール下に配置する。シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子がシゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の発現シグナルのコントロール下に配置されているＤＮＡ断片はＦｒｏｅｌｉｇｅｒ他、Ｇｅｎｅ（１９８９）８３，３８７−３９３によって記載されている。更にｐｙｒＧ遺伝子は、ｐｙｒＧ遺伝子とは異なるバシドマイセテンからの発現シグナルのコントロール下に配置されていてよい。機能を満たす発現シグナルには、バシドマイセテン綱からの糸状菌、例えばコリオラス ヒルスツス、ファネロカエテ クリソスポリウム、アガリクス ビスポラスまたはトラメテス ベルシカラーのＧＡＰＤＨ−プロモーター、コリオラス ヒルスツスからのＯＣＴプロモーター、トラメテス ベルシカラーからのラッカーゼＩもしくはラッカーゼＩＩＩのプロモーターならびにアガリクス ビスポラスからのＧＡＰＤＨ遺伝子のターミネーターまたはトラメテス ベルシカラーからのラッカーゼＩもしくはラッカーゼＩＩＩ遺伝子のターミネーターが属する。
【００６８】
３におけるベクターが特に有利である。シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子がシゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の発現シグナルのコントロール下に配置されている例を記載する。
【００６９】
ｐｙｒＧ遺伝子は、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子であってよい。有利にはｐｙｒＧ遺伝子はバシドマイセテン綱からの糸状菌、例えばアガリクス ビスポラス、ファネロカエテ クリソスポリウム、コリオラス ヒルスツス、ポリポラス ピンシツス、シゾフィルム コミュネまたはトラメテス ベルシカラーに由来する。
【００７０】
シゾフィルム コミュネおよびトラメテス ベルシカラーからのｐｙｒＧ遺伝子が特に有利である。
【００７１】
更に、本発明はトラメテスおよびポリポラスの属から選択される菌類株において、これらが本発明によるＤＮＡベクターを有することを特徴とする菌類株に関する。
【００７２】
これらの菌類株は、タンパク質の効果的発現および分泌を可能にする。
【００７３】
従って、本発明は特にトラメテスおよびポリポラスの属の糸状菌において、これらが本発明によるＤＮＡベクターを有することを特徴とする糸状菌に関する。
【００７４】
発現されかつ分泌されるタンパク質とは異種タンパク質であるが、同種タンパク質であってもよい。
【００７５】
有利にはラッカーゼが対象である。かかるラッカーゼは、例えばトラメテス ベルシカラー株から知られている（ラッカーゼ遺伝子のための例はラッカーゼＩ：配列番号１の塩基１１９３〜３３１２またはラッカーゼＩＩＩ：配列番号２の塩基５４８〜２５４２のための遺伝子である）。
【００７６】
従って本発明はタンパク質を製造するための方法において、本発明による発現系をタンパク質製造のために自体公知の方法で使用するか、または本発明による方法によって製造した菌類株を自体公知の方法で培養することを特徴とする、タンパク質の製造方法に関する。
【００７７】
かかる製造方法は、例えばＣＡ：ＡＮ ９６−２０３１４２、Ｅｇｇｅｒｔ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）６２，１１５１，Ｍａｒｔｉｎｅｚ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４１，５００−５０４またはＷＯ９３／０８２７２号から知られている。
【００７８】
以下の実施例は本発明の更なる説明に役立つ。実施例に使用されるＤＮＡまたはＲＮＡの取り扱い、例えば制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等のための標準的方法ならびに細菌の形質転換、サザンおよびノーザン分析、ＤＮＡ配列決定、放射性標識、スクリーニングおよびＰＣＲ技術のような標準的方法は、特に記載がない限り、製造者が推奨するように実施するか、または製造者の説明書が存在しない場合、標準的な教科書から公知の先行技術に従って実施する。
【００７９】
１．実施例：
トラメテスのプロトプラストの製造および菌類コロニーの再生
プロトプラストの製造のために、二核菌株トラメテス ベルシカラーＴＶ−１（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ＴＶ−１ ： ＤＳＭＺ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託番号ＤＳＭ１１５２３で寄託）、トラメテス ベルシカラー３８０７０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ２０８５２ ＵＳＡから入手可能）および単核菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００（ＤＳＭＺ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託番号ＤＳＭ１１９７２で寄託）を使用した。最初に、トラメテス ベルシカラーの菌糸体を麦芽寒天プレート（麦芽エキス３％、大豆粉からのペプトン０．３％、寒天１．５％、ｐＨ５．０）上で２８℃で７日間培養することにより獲得した。この麦芽寒天プレートから３個打ち抜き、これで５００ｍｌ三角フラスコ中の滅菌した１．５％麦芽エキス培地（麦芽エキス３％、大豆粉からのペプトン０．３％、ｐＨ５．０）１００ｍｌもしくは１６２ｃｍ２の細胞培養容器中の該滅菌培地１２５ｍｌを接種した。この培地を、培養液が菌糸体のマットで密に覆われるまで、振盪することなく２８℃で７日間インキュベーションした。培養液を傾瀉除去し新鮮な培地を添加した（１００ｍｌの培養物の菌糸体に関して３０ｍｌ）。この菌糸体をウルトラ・チュラックス（Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ， ９５００ｒｐｍ， ４分）を用いて均質化し、１００ｒｐｍで振盪下に２８℃で更に１８時間インキュベーションした。
【００８０】
このようにして製造された菌糸体懸濁液を１５００ｒｐｍ（２０００×ｇ）で５分間遠心分離することにより収穫し、この際得られた菌糸体を３回ＭｇＳＯ４０．１Ｍ、サッカロース０．６Ｍ、ホスフェート０．１Ｍ、ｐＨ５．８（ＯＭＴ−培地）と共に懸濁させ、引き続き遠心分離することにより洗浄した。単離した菌糸体が得られ、溶解酵素で処理するまで４℃で保存した。
【００８１】
プロトプラストを次のように製造した：滅菌三角フラスコ中で配合量の菌糸体を新たに製造し、かつＯＭＴ−培地中の溶解酵素混合物Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４（３ｍｇ／ｍｌ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄａｅｎｅｍａｒｋ）の滅菌濾過した溶液１５ｍｌ中に懸濁させた。酵素溶液中に再懸濁させた菌糸体を振盪インキュベーター（Ｉｎｆｏｓ）上で、低い回転数（８０ｒｐｍ）で、３０℃で１〜３時間インキュベーションした。インキュベーションの間、プロトプラストの形成を顕微鏡中で観察した。自由に可動性のプロトプラストは通常１時間後に観察することができる。プロトプラスト形成の最終時点は顕微鏡の視覚による観察で決定し、このプロトプラストをガラスフィルター中のガラスウールを介する濾過により残りの菌糸体から分離した。ガラスウールを氷冷ＯＭＴ−培地で十分に洗浄した。プロトプラストを懸濁液の遠心分離により滅菌試料容器中で単離した（２０００ｒｐｍ；２５００×ｇ、４℃、１０分間）。細胞の更なる操作は４℃で実施した。プロトプラストペレットをＯＭＴ−培地中に懸濁させることにより洗浄し、かつ遠心分離により再単離した。必要であれば、洗浄工程を繰り返した。プロトプラストの濃度を顕微鏡下に計算室中で決定した。プロトプラスト懸濁液をプロトプラスト再生のための試験のために、または形質転換のためにプロトプラスト１×１０８／ｍｌの濃度に調節した。
【００８２】
再生実験のためには、このプロトプラスト懸濁液から希釈列を製造し、麦芽エキス１．５％、トリプチカーゼペプトン（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｐｅｐｔｏｎ）０．１％、グルコース２％、寒天１．５％および浸透圧安定化のためにマンニトール０．４Ｍを含有する寒天プレート上に塗布した。このようにして、生存可能な細胞の割合を測定し、得られたプロトプラストが菌糸体状の増殖に再生可能かどうか試験した。同様にして、浸透圧的に安定化していないプレート（マンニトールなし）上で、浸透圧的に安定な細胞（例えば、菌糸体フラグメント）の割合を測定した。２８℃で７日間インキュベーションした後、得られたクローンを数えた。一連のプロトプラスト調製物からの生存可能な細胞の割合は約０．５％であった。この結果はトラメテス ベルシカラーから形質転換実験のために生存可能であり、かつ再生可能なプロトプラストが製造される得ることを示す。
【００８３】
実施例２
トラメテス ベルシカラーのｐｙｒＧ−欠損突然変異体の単離
ピリミジン物質代謝に遺伝子欠損を有するトラメテス ベルシカラーの栄養要求性突然変異体（ｐｙｒ−突然変異体）をベーケ等（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８７） １５４， １６４−１７５）による方法に従って、単離した。選択性の薬剤としては、遺伝毒性の物質５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）を使用した。トラメテス ベルシカラープロトプラストの突然変異誘発はＵＶ−処理により行った。
【００８４】
Ａ：ＵＶ−突然変異誘発：
突然変異誘発のために、実施例１に記載された単核菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００を使用した。この菌株のプロトプラストを実施例１に記載の方法と同様にして、製造した。
【００８５】
突然変異誘発のためにはＢｉｏＲａｄ ＵＶ−リンカー（５．８Ｗ／ｃｍ２、ＵＶ−源からの距離１６ｃｍ）を使用した。突然変異誘発のために使用したプロトプラストの数は８×１０９個であった。トラメテス ベルシカラーのプロトプラストをペトリシャーレ中に入れ、ＵＶ−光で異なる長さの時間の間照射した。この際、前記条件下に６０秒間の照射が、これに続く栄養要求突然変異体の選択に最適であることが明らかになった。
【００８６】
Ｂ：ウリジン栄養要求性突然変異体の選択：
ウリジン栄養要求性突然変異体の選択のためには次の最少培地（ＭＭ）を使用した：
グルコース                              ２０ｇ／ｌ
寒天                                    １５ｇ／ｌ
リン酸二水素カリウム                      １ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム                        ０．５ｇ／ｌ
リン酸一水素二ナトリウム                ０．１ｇ／ｌ
アデニン                              ２７．５ｍｇ／ｌ
ＤＬ−フェニルアラニン                ０．１５ｇ／ｌ
Ｌ−アスパラギン                        ２．５ｇ／ｌ
チアミン                              ０．４８ｍｇ／ｌ
塩化カルシウム                            １０ｍｇ／ｌ
硫酸鉄                                    １０ｍｇ／ｌ
硫酸銅                                      ２ｍｇ／ｌ
硫酸亜鉛                                    １ｍｇ／ｌ
硫酸マグネシウム                            １ｍｇ／ｌ
硫酸でｐＨ５．０に調節。
【００８７】
プロトプラストの浸透圧安定化のために、ＭＭにサッカロース０．６Ｍを補充した（ＭＭＳ）。液体培養のためには寒天なしにＭＭを製造した。
【００８８】
開始のために、ＭＭＳに異なる濃度のＦＯＳならびにウリジン１０ｍＭを添加し、種々のトラメテス菌株に関して選択培地上での成長特性を特徴付けた。ＦＯＡ１．５ｍｇ／ｍｌおよびウリジン１０ｍＭを含有するＭＭＳ（選択性ＭＭＳ）は試験したトラメテス菌株を完全に抑制した。
【００８９】
選択性ＭＭＳを有するプレートをＵＶ−突然変異プロトプラスト（工程Ａ中に記載）で接種し、２８℃で２１日間インキュベーションした。突然変異していないプロトプラストとは異なり、３５コロニーの成長が観察された。ウリジン栄養要求性表現型をより詳細に特徴付けるために、この潜在的なｐｙｒ−欠損突然変異体を、ＭＭ−プレート、ウリジン１０ｍＭを含有するＭＭ−プレートおよび選択性ＭＭ−プレート上に担持し、その成長を出発菌株Ｆ２  １００に対して比較した。その際、採取した３５個のコロニーの内、３個のトラメテス突然変異体が明らかに、ｐｙｒ−欠損表現型を示した。このことは第１表に示されている。
【００９０】
【表１】
0003585840.tif 000002
【００９１】
Ｃ：ｐｙｒＧ−突然変異体の同定
ＦＯＡでの突然変異誘発はｐｙｒＦ遺伝子（オロト酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ）中で、または所望のｐｙｒＧ遺伝子（オロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ）中で突然変異体に導く。ｐｙｒＧ突然変異体およびｐｙｒＦ突然変異体はシゾフィルム コミュネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）からのｐｙｒＧ遺伝子で形質転換することにより区別された（プラスミドｐＳＣｐｙｒＧは実施例３参照）。
【００９２】
プラスミドｐＳＣｐｙｒＧで形質転換した後、第１表に記載された３つのｐｙｒ−欠損突然変異体からコロニーが観察された。このことは３つ全ての突然変異体がｐｙｒＧ遺伝子中に欠損を有していることを示した。しかしながら、ｐｙｒＧ−欠損トラメテス ベルシカラー菌株Ｆ２  １００Ｂ１１は約１０倍高い頻度で形質転換するので、この菌株をこの後の実験に使用した。
【００９３】
菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００Ｂ１１、Ｆ２  １００Ｂ１４およびＦ２  １００Ｂ１６はトラメテス ベルシカラーの最初にこれまで記載したｐｙｒＧ−欠損菌株である。これらのｐｙｒＧ−欠損菌株はトラメテス ベルシカラーの従来記載されていない形質転換体のための宿主生物として使用することができ、こうして担子菌類の綱からの糸状菌の中でのタンパク質発現およびタンパク質分泌のために重要な新規宿主生物である。この目的のための菌株Ｆ２  １００Ｂ１１の使用を以下の実施例に記載する。
【００９４】
実施例３
シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ−遺伝子でのｐｙｒＧ栄養要求性トラメテス ベルシカラー菌株の形質転換
Ａ：シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の単離
シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の単離およびＤＮＡ−配列（文献中ではＵＲＡ１遺伝子として命名）はフロエリガー等（Ｆｒｏｅｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９８９） ８３， ３８７−３９３）により記載されている。シゾフィルム コミュネの菌糸体（菌株ＡＴＣＣ４４２０１、ＡＴＣＣ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２−１７７６， ＵＳＡによる）を麦芽エキス培地中でトラメテス ベルシカラーに関して実施例１に記載したように製造した。染色体ＤＮＡの単離をトラメテス ベルシカラーに関する方法と同様に行い、実施例４に記載する。ｐｙｒＧ遺伝子をシゾフィルム コミュネの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このためには、プライマーＡおよびＢを使用し（Ｆｒｏｅｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９８９） ８３， ３８７−３９３中で公開された配列から誘導された）、これでもってコード領域の他に、プロモーターおよびターミネーター配列も増幅することができた。
【００９５】
【外１】
0003585840.tif 000003
【００９６】
ＰＣＲ−増幅を製造者（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰＣＲキット）の指示書に従って、公知技術により実施した：シゾフィルム コミュネの染色体ＤＮＡ２００ｎｇを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に１．２５Ｕ Ｐｆｕポリメラーゼ、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を各０．２ｍＭおよびプライマーＡおよびＢ各１００ｐｍｏｌを含有するＰＣＲ１００μｌ中に添加した。所望のＰＣＲ−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は：９４℃で５分間、引き続き２５サイクルの９４℃で１分間、５０℃で１．５分間および７２℃で２．５分間を実施し、ならびに７２℃で５分間、である。約１．６ｋｂの大きさの所望のＰＣＲ−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ＰＣＲ−スクリプトＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でクローニングし、Ｅ．コリ中に形質転換した。培養した形質転換Ｅ．コリからプラスミドを単離した。プラスのクローンに関して、挿入物のＤＮＡ−配列分析により、シゾフィルム コミュネｐｙｒＧ遺伝子が増幅されたことが確認された。シゾフィルム コミュネｐｙｒＧ遺伝子を有するこのプラスミドをｐＳＣｐｙｒＧ（図１）と命名した。
【００９７】
Ｂ：トラメテス ベルシカラーｐｙｒＧ欠損菌株の形質転換
トラメテス ベルシカラーＦ２  １００Ｂ１１のプロトプラスト（実施例２参照）を実施例１中に記載された方法で製造した。この際培地に栄養要求性菌株のためにウリジン１０ｍＭを補充した。ベクターｐＳＣｐｙｒＧ（工程Ａに記載）で形質転換した。
【００９８】
実施例１に記載したように、トラメテス ベルシカラーＦ２  １００Ｂ１１のプロトプラストを製造し、かつ最終濃度１０８／ｍｌに懸濁した。容積１２ｍｌのインキュベーション容器中で、プロトプラストの分割量０．１ｍｌをプラスミドのＤＮＡ各１０μｇと混合し、かつ３０分間氷上でインキュベーションした。その後、ゆっくりと混合を繰り返してＰＥＧ４０００溶液１．２５ｍｌを形質転換配合物に加えた。室温で更に２０分間インキュベーションした後、反応容器を実施例１に記載したＯＭＴ−培地で充填し、混合し、かつ４℃で２０００×ｇで１０分間遠心分離した。このペレットを再懸濁し、浸透圧に関して安定化したウリジンを有しないＭＭＳ−プレート上に塗布した（実施例２中に記載）。このプレートを２８℃で１４日間インキュベーションし、コロニーの成長に関して試験した。種々異なる実験においてプラスミドＤＮＡ１μｇあたり形質転換体０．１〜３の形質転換率が達せられた。
【００９９】
Ｃ：形質転換体の精製
得られた形質転換体の菌糸体を採取し、ＭＭを有する新鮮なプレート上に塗布することにより精製した。この際、接種物をプレートの中心に点状に担持した。２８℃で７〜１４日間インキュベーションした後、放射状の菌糸体成長を観察することができた。この精製工程を繰り返したが、この際接種物のための菌糸体は最初の精製プレートの縁から採取した。次いで、ＭＭプレートを第二の精製プレートの接種物で新たに接種し、プレートが完全に菌糸体で覆われるまで２８℃でインキュベーションした。
【０１００】
Ｄ：形質転換体の分析
トラメテス ベルシカラーの形質転換体をサザンブロット分析法によりプラスミドｐＳＣｐｙｒＧの組み込みに関して試験した。このためには種々の形質転換体からおよび参照としてｐｙｒＧ欠損菌株Ｆ２  １００Ｂ１１から、菌糸体を液体培地中で製造した（実施例１参照、ウリジン１０ｍＭを添加した麦芽エキス培地）。単離した菌糸体から染色体ＤＮＡを後記の実施例４中に記載されているように単離した。
【０１０１】
実験菌株から、それぞれ染色体ＤＮＡ１μｇおよびプラスミドｐＳＣｐｙｒＧ１００ｎｇをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ダブル消化により切断し、引き続きアガロースゲル電気泳動により分離し、ナイロンフィルター（Ｑｕｉａｇｅｎ）上にブロッティングし、シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子に関して特異的である放射性標識したＤＮＡ−プローブとハイブリダイズした。
【０１０２】
プラスミドｐＳＣｐｙｒＧをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ダブル消化により切断し、かつその際得られたｐｙｒＧ遺伝子の１．４ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントを調製ゲル電気泳動で単離することにより、ＤＮＡ−プローブを準備した。１．６ｋｂの長さのｐｙｒＧ−特異的ＤＮＡ−フラグメントをα−［３２Ｐ］−ｄＡＴＰで放射性に標識した（“Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ”キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。遊離の放射活性をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を介してクロマトグラフィーを行うことにより分離した。放射性に標識したＤＮＡ−プローブの特異的活性は１×１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。ナイロンフィルター上にブロッティングしたＤＮＡと放射性標識ＤＮＡ−プローブとのハイブリダイゼーション温度は６０℃であった。その他にはサザンブロット法に関して専門書中に記載されている条件を保持した。サザンブロットをオートラジオグラフィーで評価した。その際、１．６ｋｂの長さのｐｙｒＧ−特異的ＤＮＡ−フラグメントは形質転換体中にのみ検出され、ウリジン−栄養要求性菌株Ｆ２  １００Ｂ１１中には検出されなかった。この結果は、ウリジン−栄養要求性菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００Ｂ１１の形質転換の際には、プラスミドｐＳＣｐｙｒＧはゲノム中に組み込まれており、選択マーカー遺伝子ｐｙｒＧの生産的発現に導き、これによりこの菌株のウリジン栄養要求性は補足された、ということを証明した。意外にも、この際担子菌類シゾフィルム コミュネからのｐｙｒＧ遺伝子の発現シグナルはトラメテス ベルシカラー中でも機能性であることが初めて確認された。
【０１０３】
実施例４
トラメテス ベルシカラー・ラッカーゼ遺伝子のクローニング
Ａ：トラメテス ベルシカラーからの染色体ジーンライブラリーの製造
トラメテス ベルシカラーのゲノムＤＮＡを振盪フラスコ培地の菌糸体から単離した。トラメテス ベルシカラーの菌糸体１ｇを液体窒素の存在下に乳鉢および乳棒で粉砕し微細な粉末にした。この粉末を滅菌試料容器中に取り入れ、即座に抽出溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ０．１Ｍ、ＮａＣｌ０．２５Ｍ、プロテイナーゼＫ０．６ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌおよび１０％（Ｗ／Ｖ）ナトリウムラウリルサルコシン溶液０．５ｍｌと混合した。５０℃で少なくとも２時間インキュベーションした後、この混合物を５Ｍ ＮａＣｌ ０．８５ｍｌおよび０．７Ｍ ＮａＣｌ中の１０％（Ｗ／Ｖ）ＣＴＡＢ−溶液０．７ｍｌと混合し、６５℃で３０分間インキュベーションする。クロロホルム−イソアミルアルコール混合物（２４：１）７ｍｌの添加後、この配合物を振盪し、両方の相を遠心分離により分離する。水相を除き、染色体ＤＮＡをイソプロパノール０．６容積部を添加することにより沈殿させる。引き続き、この沈殿したＤＮＡをカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ）を介して精製する。このようにして、菌糸体１６ｇから遺伝子ＤＮＡ０．５ｍｇを単離することができた。
【０１０４】
染色体ジーンライブラリーの製造のためにはトラメテス ベルシカラーＴＶ−１の染色体ＤＮＡ９０μｇをＳａｕ３Ａでの部分消化において切断し、アガロースゲル電気泳動により分離した。染色体ＤＮＡ−フラグメントを５〜２０ｋｂの範囲の大きさおよび２０ｋｂより大きい範囲に単離し、それぞれＢａｍＨＩで前切断したλ−ファージ中でクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｋｌｏｎｉｅｒｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍ）。５〜２０ｋｂＤＮＡ−フラクションからはファージ４×１０４／μｇベクターＤＮＡがおよび２０ｋｂより大きいＤＮＡ−フラクションからはファージ５×１０４／μｇベクター−ＤＮＡが得られた。このファージをＥ．コリ菌株ＸＬ−１ブルーＭＲＦ′の感染により増幅した。
【０１０５】
Ｂ：ラッカーゼ特異的ＤＮＡプローブの単離
ラッカーゼ遺伝子の単離のためのＤＮＡ−プローブを変性プライマーを用いてトラメテス ベルシカラーゲノムＤＮＡからＰＣＲ−増幅により製造した。変性プライマーは公知のラッカーゼ遺伝子の配列比較により作成された。ＥＭＢＬ遺伝子データバンクに保有されている、アカバンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）コリオラス ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フレビア ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、アガリクス ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）のラッカーゼ遺伝子および詳細に特徴付けされていない担子菌類の亜網からの菌糸状菌のラッカーゼ遺伝子のアミノ酸配列を比較した。この配列比較により、全てのラッカーゼ中に完全に保存されている、長さ５〜７のアミノ酸を有する４つのペプチドを同定することができた。縮重コドンを考慮して、これらのペプチドをＤＮＡに翻訳し、変性プライマーを製造した。このプライマーは次の配列を有した：
【０１０６】
【外２】
0003585840.tif 000004
【０１０７】
プライマーＥおよびＦは５′−領域にＢａｍＨＩ切断部位（下線）を有し、これにそれぞれ相応する変性ラッカーゼ配列が結合している。ＰＣＲ−増幅を製造者の（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＰＣＲキット）指示書に従って公知技術に相応して実施した：最初のＰＣＲにおいてトラメテス ベルシカラーの染色体ＤＮＡ２００ｎｇを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２１．２５ｍＭ、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を各０．２ｍＭおよびプライマーＣおよびＤ各１００ｐｍｏｌを含有するＰＣＲ１００μｌ中に添加した。所望のＰＣＲ−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は：９４℃で５分間、引き続き７サイクルの９４℃で０．５分間、４０℃で１分間および６０℃で２．５分間、ならびに３０サイクルの９４℃で０．５分間、５０℃で１分間および７２℃で２．５分間である。最初のＰＣＲの１μｌを第二のＰＣＲに使用し、このＰＣＲは更に１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２１．２５ｍＭ、４つのｄＮＴＰを各０．２ｍＭおよびプライマーＥおよびＦ各１００ｐｍｏｌを含有する。所望のＰＣＲ−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は：９４℃で５分間、引き続き７サイクルの９４℃で０．５分間、４０℃で１分間および６０℃で２．５分間、ならびに３０サイクルの９４℃で０．５分間、５０℃で１分間および７２℃で２．５分間、である。約１．１ｋｂの大きさのＰＣＲ−生成物が得られた。このＰＣＲ−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて切断し、ＢａｍＨＩを用いて切断したｐＵＣ１８ベクター中でクローニングし、Ｅ．コリ中に形質転換した。形質転換Ｅ．コリの培養物からプラスミドを単離した。５′−および３′−末端のＤＮＡ−配列分析はクローニングしたＤＮＡ−フラグメントがラッカーゼ遺伝子のフラグメントであることを証明した。
【０１０８】
ラッカーゼ遺伝子のスクリーニングのためのＤＮＡ−プローブを製造するために、ＢａｍＨＩで処理することによりラッカーゼ特異的なＰＣＲ−フラグメントを切断し、アガロース電気泳動を介して単離し、α−［３２Ｐ］−ｄＡＴＰで放射性に標識した（“Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ”キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。遊離の放射性をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を介してクロマトグラフィーを実施することにより分離した。放射性標識したＤＮＡ−プローブの特異的活性は１×１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。
【０１０９】
Ｃ：染色体ラッカーゼ遺伝子の単離
工程Ａ中に記載されているトラメテス ベルシカラーＴＶ−１の染色体ジーンライブラリーを使用した。ゲノムラッカーゼ遺伝子によるスクリーニングは公知技術により行った。最初のスクリーニングの回においては、Ｅ．コリＸＬ−１ブルーＭＲＦ′を１０個のペトリシャーレ上で最初に培養し、次いでペトリシャーレあたり染色体ジーンライブラリー（５〜２０ｋｂフラクション、実施例４のＡ参照）ファージ５００００個で感染した。３７℃で一夜インキュベーションした後、新たに形成されたファージをナイロンフィルター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移した。次いで、このフィルターを製造者の指示書に相応して放射性に標識されたラッカーゼ−特異的プローブ（工程Ｂ参照）とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション温度は５０％ホルムアミド含量のハイブリダイゼーション緩衝液中で４５℃であった。プラスのクローンを採取し、スクリーニング法を繰り返すことにより精製した。個別化を３回行った後、スクリーニングにおいて強力にハイブリダイズするファージクローン２０個が単離され、これを製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示書に従って、“ｉｎ ｖｉｖｏ 切り出し”によりｐＢＫＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で再クローニングした。制限エンドヌクレアーゼでの消化およびＤＮＡ−配列決定によるクローンの分析は、１５〜２０個のクローンがラッカーゼクローンであるということを示した。２種の異なるラッカーゼクローンが得られた。
【０１１０】
両方のラッカーゼ遺伝子はラッカーゼＩおよびラッカーゼＩＩＩという名称を有した。両方のラッカーゼ遺伝子を有するプラスミドをｐＬａｃ１００（配列番号１）およびｐＬａｃ３００（配列番号２）と命名した。両方のラッカーゼ遺伝子は構造遺伝子（コードする領域）に関する配列情報の他に、ＡＴＧ−開始コドン前の５′領域（プロモータ領域）中の配列情報ならびに終止コドンの後の３′領域（ターミネーター領域）中の情報を含有している。この際、担子菌類の綱からの糸状菌中の遺伝子発現のためのＤＮＡ−ベクターを製造するために使用することができる、トラメテス ベルシカラーのための新規遺伝学的制御エレメントに関する。第２表は配列番号１（ラッカーゼＩ遺伝子）および配列番号２（ラッカーゼＩＩＩ遺伝子）中の相応する配列領域に関して概要を示す。
【０１１１】
0003585840.tif 000005
実施例５
トラメテス ベルシカラーＧＡＰＤＨ−遺伝子のクローニング
Ａ：トラメテス ベルシカラーからのＧＡＰＤＨＤＮＡ−プローブの単離
菌株トラメテス ベルシカラーＴＶ−１（実施例１を参照）を使用した。ＴＶ−１の培養および染色体ＤＮＡの単離は実施例１もしくは実施例４中に記載されているように行った。
【０１１２】
ファネロカエテ クリソスポリウム（Ｆａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ； Ｍ．Ｃ．Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２２， ４４７−４５４）からのＧＡＰＤＨ−遺伝子およびコリオラス  ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ， ＪＰ ９−４７２８９）からのＧＡＰＤＨ−遺伝子の公開されたＤＮＡ配列を基にして、ＧＡＰＤＨ−特異的遺伝子フラグメントのＰＣＲ−増幅のためのプライマーを作成した。このプライマーは次のＤＮＡ−配列を有した：
【０１１３】
【外３】
0003585840.tif 000006
【０１１４】
ＰＣＲ−増幅を公知技術に従って実施した：ＰＣＲにおいてトラメテス ベルシカラーの染色体ＤＮＡ２００ｎｇを、製造者により調製された緩衝剤を含有し、更に１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２１．２５ｍＭ、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を各０．２ｍＭおよびプライマーＧおよびＨ各１００ｐｍｏｌを含有するＰＣＲ１００μｌ中に添加した。所望のＰＣＲ−生成物の特異的増幅のための、その他の条件は：９４℃で５分間、引き続き７サイクルの９４℃で０．５分間、４７℃で１分間および７２℃で１分間、ならびに３０サイクルの９４℃で０．５分間、５０℃で１分間および７２℃で１分間、である。約０．４３ｋｂのＰＣＲ−生成物が得られた。
【０１１５】
このＰＣＲ−生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ベクターＰＣＲ−スクリプトＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でクローニングし、Ｅ．コリ中で形質転換した。形質転換Ｅ．コリの培養物からプラスミドを単離した。５′−および３′−末端のＤＮＡ−配列分析はクローニングしたＤＮＡ−フラグメントがファネロカエテ クリソスポリウムＧＡＰＤＨ−遺伝子のフラグメントであるということを証明した。
【０１１６】
ラッカーゼ遺伝子のスクリーニングのためのＤＮＡ−プローブを製造するために、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理することによりラッカーゼ特異的なＰＣＲ−フラグメントを切り出し、アガロース電気泳動を介して単離し、α−［３２Ｐ］−ｄＡＴＰで放射性に標識した（“Ｒａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ”キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。遊離の放射性をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を介してクロマトグラフィーを実施することにより分離した。放射性標識したＤＮＡ−プローブの特異的活性は１×１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。
【０１１７】
Ｂ：トラメテス ベルシカラーからの染色体ＧＡＰＤＨ−遺伝子の単離：
実施例４の工程Ａに記載したトラメテス ベルシカラーＴＶ−１の染色体ジーンライブラリーを使用した。染色体ＧＡＰＤＨ−遺伝子によるスクリーニングは公知技術により行った。最初のスクリーニングの回において、Ｅ．コリＸＬ−１ブルーＭＲＦ′を１０個のペトリシャーレ上で最初に培養し、次いでペトリシャーレあたりジーンライブラリー（５〜２０ｋｂフラクション、実施例４参照）のファージ５００００個で感染した。３７℃で一夜インキュベーションした後、新たに形成されたファージをナイロンフィルター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上に移した。次いで、このフィルターを製造者の提案に相応して放射性に標識されたＧＡＰＤＨ−特異的プローブ（工程Ａ参照）とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション温度は５８℃であった。成長温度は５８℃であった。２８個のプラスのクローンを採取した。これらの内の１０個のクローンをスクリーニング法を繰り返すことにより精製した。個別化を３回行った後、スクリーニングにおいて強力にハイブリダイズするファージクローン９個が単離され、これを製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示書に従って、“ｉｎ ｖｉｖｏ 切り出し”によりｐＢＫＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で再クローニングした。制限エンドヌクレアーゼでの消化およびＤＮＡ−配列決定によるクローンの分析は、９個のクローン全てがＧＡＰＤＨ−クローンであるということを示した。制限分析により、９個のクローンを６個のクラスに分類することができた。最も大きなＧＡＰＤＨ−遺伝子フラグメントを有するクローンをｐＧＡＰＴＶ（配列番号３）として命名し、これから提供可能なコード領域（配列番号３、ｂｐ１５４３−２３８７）およびＡＴＧ開始コドンの前の５′プロモータ領域の約１．５ｋｂ（配列番号３、ｂｐ１−１５４２）が決定された。
【０１１８】
実施例６
ＧＡＰＤＨ−プロモータとラッカーゼＩＩＩの遺伝子との機能的結合
Ａ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中でのラッカーゼＩＩＩ遺伝子のクローニング
更なる操作のために、ｐＬａｃ３００からのラッカーゼＩＩＩ遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に再クローニングした。このためには実施例４で得られたｐＢＫＣＭＶベクターからラッカーゼＩＩＩを３．５ｋｂのＳｐｅＩ−ＳｍａＩフラグメントとして単離し、ＳｐｅＩおよびＳｍａＩで予め切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中でサブクローニングした。この際生じた６．５ｋｂのプラスミドをｐＬａｃ３０１と命名した。ｐＬａｃ３０１はＧＡＰＤＨ−プロモータと結合するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから由来するＮｏｔＩ切断部位を有し、これを介してＧＡＰＤＨ−プロモータの３′−末端と機能的結合をすることができる（この実施例の工程Ｂを参照）。
【０１１９】
Ｂ：ラッカーゼＩＩＩ遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンとＧＡＰＤＨ−プロモータとの機能的結合
実施例４において単離されたＧＡＰＤＨ−遺伝子の１．５ｋｂの長さのプロモータ領域をｐＧＡＰＴＶ（配列番号３、実施例５参照）からＮｏｔＩ−ＢｓｐＬｕ１１Ｉフラグメントとして単離した。この際、ＮｏｔＩ切断部位はｐＢＫＣＭＶベクター部分から、およびＢｓｐＬｕ１１Ｉ切断部位はＧＡＰＤＨ遺伝子の開始ＡＴＧ−コドンから由来する。
【０１２０】
ベクターｐＬａｃ３０１をＮｏｔＩでおよび部分的にＢｓｐＬｕ１１Ｉで切断し、ラッカーゼＩＩＩ遺伝子の０．５５ｋｂの大きさのプロモータ部分だけ短くなった６ｋｂの大きさのベクターフラグメントが単離された。
【０１２１】
１．５ｋｂの長さのＮｏｔＩ−ＢｓｐＬｕ１１ＩＧＡＰＤＨプロモータフラグメントをｐＬａｃ３０１の６ｋｂの大きさのＮｏｔＩ−ＢｓｐＬｕ１１Ｉベクターフラグメントと連結し、Ｅ．コリ中に形質転換した。形質転換したＥ．コリの培養物からプラスミドを単離した。プラスのクローンを制限分析およびＤＮＡ−配列決定により試験した。その中でラッカーゼＩＩＩ構造遺伝子がＧＡＰＤＨ−遺伝子のプロモータと機能的に結合している７．５ｋｂの長さのベクターをｐＬａｃ３ｇａｐ（図２）と命名した。ｐＬａｃ３ｇａｐ中ではＧＡＰＤＨ−プロモータ領域がＢｓｐＬｕ１１Ｉ切断部位を介してラッカーゼＩＩＩ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧ−コドンと機能的に結合している。
【０１２２】
Ｃ：ベクターｐＬａｃ３ｇａｐ中への選択マーカー遺伝子ｐｙｒＧの組み込み
準備のために、ベクターｐＳＣｐｙｒＧにおいて、ｐＣＲ−スクリプトＳＫ（＋）ベクターのポリリンカーから由来するＥｃｏＲＩ切断部位に付加的なＮｏｔＩ切断部位を組み込んだ。このためには次の配列を有するアダプターＡを使用した：
【０１２３】
【外４】
0003585840.tif 000007
【０１２４】
ベクターｐＳＣｐｙｒＧをＥｃｏＲＩで線状にし、アルカリ性ホスファターゼで５′−脱リン酸化した。引き続き、線状にされたｐＳＣｐｙｒＧベクターを種々異なる濃度のアダプターＡと連結し、Ｅ．コリ中に形質転換した。プラスのクローンを単離したプラスミドＤＮＡのＮｏｔＩでの消化により同定し、この際第二のＮｏｔＩ切断部位の導入によりシゾフィルム コミュネ遺伝子フラグメントの１．６ｋｂの大きさのフラグメントが遊離された。このベクターをｐＳＣｐｙｒＧ−Ｎｏｔと命名した。
【０１２５】
ベクターｐＳＣｐｙｒＧ−ＮｏｔをＮｏｔＩで処理し、この際遊離した１．６ｋｂの大きさのｐｙｒＧフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した。
【０１２６】
ベクターｐＬａｃ３ｇａｐをＮｏｔＩで線状にし、引き続き７．５ｋｂの大きさのフラグメントをアルカリ性ホスファターゼで処理し、５′−リン酸基を切断した。
【０１２７】
１．６ｋｂの大きさのｐｙｒＧフラグメントをＮｏｔＩで線状にし、脱リン酸化したｐＬａｃ３ｇａｐ中にクローニングし、Ｅ．コリ中で形質転換し、プラスのＥ．コリ形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。プラスの形質転換体は１．６ｋｂの大きさのｐｙｒＧ遺伝子フラグメントを有した。制限分析により、ｐｙｒＧ選択マーカー遺伝子の方向がラッカーゼＩＩＩ遺伝子の方向と同じであるクローンが同定された。ラッカーゼＩＩＩ遺伝子の他にｐｙｒＧ選択マーカー遺伝子をも含有する、９．１ｋｂの長さのベクターをｐＬ３ＧｐｙｒＧ（図３）と命名した。
【０１２８】
実施例７
トラメテス ベルシカラー中でのラッカーゼＩＩＩの過剰生産
Ａ：トラメテス ベルシカラーの形質転換
トラメテス ベルシカラーのプロトプラストを実施例１に記載した方法で製造し、実施例６中に記載されたベクターｐＬ３ＧｐｙｒＧで形質転換した。
【０１２９】
実施例２中に記載したように、ｐｙｒＧ−欠損菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００Ｂ１１のプロトプラストを製造し、かつ最終濃度１０８／ｍｌに懸濁した。容積１２ｍｌのインキュベーション容器中で、プロトプラストの分割量０．１ｍｌをプラスミドｐＬ３ＧｐｙｒＧのＤＮＡ１０μｇと共に、かつ３０分間氷上でインキュベーションした。その後、ゆっくりと混合を繰り返してＰＥＧ４０００溶液１．２５ｍｌを形質転換配合物中に加えた。室温で更に２０分間インキュベーションした後、反応容器を実施例２に記載したＯＭＴ−培地で充填し、混合し、かつ４℃で２０００×ｇで１０分間遠心分離した。このペレットを再懸濁し、浸透圧に関して安定化したウリジンを有しないＭＭ上に塗布した（実施例２中に記載）。このプレートを２８℃で１４日間インキュベーションし、コロニーの成長に関して試験した。異なる実験においてプラスミドＤＮＡ１μｇあたり形質転換体０．５〜３個の形質転換率が達せられた。
【０１３０】
Ｂ：形質転換体の精製
得られた形質転換体の菌糸体を採取し、ウリジンを有しないＭＭ−選択培地を有する新鮮なプレート上に塗布することにより精製した。この際接種物をプレートの中心に点状に担持した。２８℃で７〜１４日間インキュベーションすることにより、放射状の菌糸体成長を観察することができた。この精製工程を繰り返したが、この際接種物のための菌糸体は最初の精製プレートの縁から採取した。次いで、選択プレートを第二の精製プレートの接種物で新たに接種し、このプレートを完全に菌糸体が覆った後に、ラッカーゼ生産を振盪フラスコ培養物中で試験した。
【０１３１】
Ｃ：振盪フラスコ中での培養
振盪フラスコ中での培養のためには完全に成長したプレートから菌糸体２ｃｍ２を取出し、滅菌遠心分離し、かつこれで麦芽エキスの培地（実施例１参照）５０ｍｌの予培地（２５０ｍｌフラスコ中）を接種した。予培地を振盪下に２８℃で６日間、１２０ｒｐｍでインキュベートした。６日目に予培地を９５００ｒｐｍで３０秒間ウルトラ・チュラックスを用いて均質化し、これでもって１ｌ三角フラスコ中の主培地（組成は実施例１参照）２５０ｍｌを接種した。次いで主培地を再び２８℃で１２０ｒｐｍで振盪下にインキュベーションした。ラッカーゼの生産を培養２日目から毎日測光により測定した。ラッカーゼの活性を基質ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸））を用いて、４２０ｎｍで測定した。４２０ｎｍでのＡＢＴＳの吸光係数ε４２０：３．６×１０４［１×ｍｏｌ−１×ｃｍ−１］。その際、１Ｕラッカーゼ活性は、３７℃、ｐＨ４．５におけるＡＢＴＳ１μｍｏｌ／分の変換率に相当する。振盪フラスコ培養物中でのラッカーゼ生産の最大には主培養の開始後８〜１０日で達する。第３表は種々異なる形質転換体と形質転換していない出発菌株トラメテス ベルシカラーＦ２  １００との比較を示す。形質転換していない菌株Ｆ２  １００に関しては更に文献中に記載されている誘発物質２，５−キシリジン（Ｙａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９６６） ６２， ８３４−８４１）での誘発後に、ラッカーゼ生産を測定した。第３表から明らかなように、形質転換していない出発菌株に比較して、菌株Ｆ２  １００の最良の形質転換体において、振盪フラスコ中でのラッカーゼ生産は、約ファクター１２（誘発なし）もしくは約ファクター５（誘発あり）だけ上昇した。
【０１３２】
【表２】
0003585840.tif 000008
【０１３３】
【外５】
0003585840.tif 000009
【０１３４】
【外６】
0003585840.tif 000010
配列表
【０１３５】
【外７】
0003585840.tif 000011
【０１３６】
【外８】
0003585840.tif 000012
【０１３７】
【外９】
0003585840.tif 000013
【０１３８】
【外１０】
0003585840.tif 000014
【０１３９】
【外１１】
0003585840.tif 000015
【０１４０】
【外１２】
0003585840.tif 000016
【０１４１】
【外１３】
0003585840.tif 000017
【０１４２】
【外１４】
0003585840.tif 000018
【０１４３】
【外１５】
0003585840.tif 000019
【０１４４】
【外１６】
0003585840.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シゾフィルム コミュネｐｙｒＧ遺伝子を有するプラスミドｐＳＣｐｙｒＧを示している。
【図２】図２は、ラッカーゼＩＩＩ構造遺伝子がＧＡＰＤＨ−遺伝子のプロモータと機能的に結合している７．５ｋｂの長さのベクターｐＬａｃ３ｇａｐを示している。
【図３】図３は、ラッカーゼＩＩＩ遺伝子の他にｐｙｒＧ選択マーカー遺伝子をも含有する、９．１ｋｂの長さのベクターｐＬ３ＧｐｙｒＧを示している。
【図１】
0003585840.tif 000021
【図２】
0003585840.tif 000022
【図３】
0003585840.tif 000023