(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単独では検体中の糖化ヘモグロビン及びヘモグロビンと凝集しない特性をもつ抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子の混合粒子と、糖化ヘモグロビンを含む検体とを接触させ、得られる凝集反応によって糖化ヘモグロビンを測定する方法。
【請求項２】
単独では、検体中の糖化ヘモグロビン及びヘモグロビンと凝集しない特性をもつ抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘモグロビンを含む検体と接触させても凝集しない、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子との混合粒子を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
粒子の直径が０．０２〜４μｍのラテックスを用いる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１Ｃ）は、糖尿病患者において、疾病の進行度に応じ血中濃度が増加することが知られており、糖化ヘモグロビンの測定は血糖値の測定と併用して糖尿病の診断及び治療に広く利用されている。従来、糖化ヘモグロビンの測定は、検体中の糖化ヘモグロビンを直接固相に結合させ、酵素標識抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させるエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により行われていた〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９９，９５（１９８７）〕。しかしながら、この方法では、それぞれの検体中の糖化ヘモグロビンを固相に直接結合させるという前処理が必要であり、大量の検体を迅速かつ正確に測定するには不適当な方法であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、簡便、迅速、かつ正確にヒト糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる方法を開発するべく鋭意研究した結果、２種の特定のモノクローナル抗体と不溶性担体粒子との結合体の組み合わせを用いると、検体中のヘモグロビンの妨害を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行うことができることを見出した。
本発明はこうした知見に基づくものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、単独では検体中の糖化ヘモグロビン及びヘモグロビンと凝集しない特性をもつ抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子の混合粒子と、糖化ヘモグロビンを含む検体とを接触させ、得られる凝集反応によって糖化ヘモグロビンを測定する方法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明方法において使用する抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子は、それ単独で、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体と接触させても、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンのいずれに対しても凝集反応を示さない抗体結合粒子である。また、本発明方法で使用する抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子も、それ単独で、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体と接触させても、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンのいずれに対しても、同様に凝集反応を示さない抗体結合粒子である。しかしながら、前記の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子との組合せを、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体と接触させると、ヘモグロビンに対しては凝集反応を示さないが、糖化ヘモグロビンに対しては特異的に凝集反応を示す。
【０００６】
すなわち、本発明方法において使用する前記の組合せ、すなわち、前記の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子との組合せは、糖化ヘモグロビン１分子に対して２個のエピトープをもつので凝集するのに対し、ヘモグロビン１分子に対して１個のエピトープしかもたないので凝集しない。従って、本発明による前記の組合せを用いると、凝集反応により、検体中の糖化ヘモグロビンを特異的に非常に迅速に測定することができる。
本発明において、検体とは、糖化ヘモグロビンを含有するおそれのある生物学的試料であれば特に限定されないが、特には、血液、血清、血漿又は尿である。なお、本明細書において、生物学的試料は特にヒトの試料であり、従って、ヘモグロビンは、特にヒトヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビンは、特にヒト糖化ヘモグロビンである。また、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体は、特に抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体であり、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体は、特に抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体である。
【０００７】
本発明方法で用いることのできる粒子は、凝集反応のモノクローナル抗体用担体として、通常使用されている水不溶性担体粒子であれば特に限定はされないが、ポリスチレン粒子が最も好ましい。ポリスチレン粒子の平均粒径（直径）も特に限定されないが、好ましくは０．１〜１μｍである。ポリスチレン粒子の平均粒径が０．１μｍ未満になると、遠心分離が困難であり、１μｍを越えると均一に分散させにくい。
【０００８】
抗ヘモグロビンモノクローナル抗体それ自体、及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体それ自体は、従来より周知であり、それぞれ周知の方法で調製することができる。しかし、本発明方法で使用することのできる抗ヘモグロビンモノクローナル抗体は、それを粒子と結合させ、その結合粒子を単独でヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンと反応させた場合に、いずれとも凝集反応をしないという性質をもつことが必要である。更に、この抗体のエピトープが本発明方法で使用するもう一方の抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体のエピトープと相互に立体障害を起こさない位置にあることが必要である。
【０００９】
従って、本発明方法で使用することのできるモノクローナル抗体は、前記の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体の中から、目的に沿って選択する。すなわち、各抗体を粒子と結合させ、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子を調製し、それぞれ単独でヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンと反応させ、いずれとも凝集反応をしないモノクローナル抗体を選択する。次に、選ばれたモノクローナル抗体結合粒子の中から、ヘモグロビンを含む検体と接触させても凝集しないが、糖化ヘモグロビンを含む検体と接触させると凝集を起こす、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子との組合せを選択する。こうして本発明方法で用いる結合粒子の組み合わせを得ることができる。
【００１０】
本発明で用いるモノクローナル抗体と不溶性担体との結合は、周知の方法で実施することができる。例えば、ラテックスと抗体含有緩衝液とを、撹拌下に混合し、遠心分離して得られる沈渣を適当な緩衝液に懸濁する。得られた感作ラテックスはこの懸濁液で保存することができる。
【００１１】
本発明方法で用いる抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子との組合せにおいて、両者の使用比率は、特に限定はされないが、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子：抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子の比が、好ましくは１：１である。
また、検体に対して使用する抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子の添加量は、特に限定されないが、好ましくは１：１（ｖ：ｖ）である。
【００１２】
本発明方法は、スライドグラス上での肉眼による凝集検査だけでなく、自動分析機による分光学的自動分析にも適用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗体の作製
ヒトヘモグロビン（２ｍｇ／ｍｌ）をフロイント完全アジュバンド（体積比１：１）に充分に分散させた。この分散液１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに一回免疫し、４週間後から２週間毎に、生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌの濃度にしたヒトヘモグロビン液１００μｌにより４回免疫した。
この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、この脾臓より脾細胞をマウス一匹あたり０．５×１０８  個得た。この脾細胞１．５×１０８  個とマウスミエローマ細胞（ＳＰ  ２／ｏ）３．０×１０７  個とを、ＰＥＧ４０００（４５％）存在下で、融合させ培養した。
増殖した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒトヘモグロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を限界希釈法によりクローニングし、抗ヒトヘモグロビン抗体を産生している細胞８種を確立した。
これにより得られた細胞８種を抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として、それぞれ大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹水を採取し、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体８種（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、Ｈ−８）を得た。得られたモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブクラスは、以下の表１に示すとおりであった。
【００１４】
【表１】
0003550614.tif 000002
【００１５】
実施例２：抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックス反応性
ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌを、実施例１で作製した抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体それぞれを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．８ｍｌ（それぞれの抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）に混合し、マグネチックスターラーで攪拌した。
混合液を遠心分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％ＮａＮ３  を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存した。各感作ラテックスと種々の濃度のヒトヘモグロビンを混合し、凝集の有無を確認した。結果を表２に示す。以下の各表において「Ｌ−」は、モノクローナル抗体Ｈ−１〜Ｈ−８とラテックスとの結合体であることを意味し、「＋」は凝集有り、「−」は凝集無しを示す。
【００１６】
【表２】
0003550614.tif 000003
抗体ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体Ｈ−２、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、又はＨ−８を感作したラテックス試薬であるＬ−Ｈ−２、Ｌ−Ｈ−４、Ｌ−Ｈ−５、Ｌ−Ｈ−６、Ｌ−Ｈ−７、又はＬ−Ｈ−８、単独ではヒトヘモグロビンと凝集しなかった。
【００１７】
実施例３：糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体の作製
糖化ヘモグロビンをフロイント完全アジュバンドに充分に分散させ、この分散液１００μｌ（糖化ヘモグロビン濃度１ｍｇ／ｍｌ）でマウスに３週間毎に３回免疫した。
この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、この脾臓から一匹あたり１．５×１０８  個の脾細胞を得た。この脾細胞１．５×１０８  個とマウスミエローマ細胞（ＳＰ  ２／ｏ）３．０×１０７  個とを、ＰＥＧ４０００（４５％）存在下で、融合させ培養した。
増殖した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を限界希釈法によりクローニングし、抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体を産生している細胞１種を確立した。
これにより得られた細胞１種を抗ヒト糖化ヘモグロビンマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹水を採取し、抗糖化ヒトヘモグロビン抗体１種（ｇＨ−１）を得た。得られたモノクローナル抗体ｇＨ−１の免疫グロブリンサブクラスは、ＩｇＧ１  κであった。
【００１８】
実施例４：抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックスの反応性
ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌと、実施例３で作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体（ｇＨ−１）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．８ｍｌ（抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）とを混合し、マグネチックスターラーで撹拌した。
混合液を遠心分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％ＮａＮ３  を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存した。この感作ラテックスと種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビン、又はヒトヘモグロビンとを混合し、凝集の有無を確認した。結果を表３及び表４に示す。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
【表４】
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抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体ｇＨ−１を感作したラテックス試薬Ｌ−ｇＨ−１単独では、ヒト糖化ヘモグロビン及びヒトヘモグロビンの両方とも凝集しなかった。
【００２１】
実施例５：抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスと抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスの混合ラテックスの反応性
単独ではヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体ラテックスと、単独ではヒト糖化ヘモグロビン及びヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスを混合して、前記の抗原との反応性を調べた。結果を表５及び表６に示す。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
【表６】
0003550614.tif 000007
【００２４】
表５及び表６に示すとおり、抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスＬ−ｇＨ−１と抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスＬ−Ｈ−２との混合ラテックスだけがヒト糖化ヘモグロビンと凝集反応を示した。この混合ラテックスを用いて、光学的測定機器ＬＰＩＡ−２００〔登録商標；三菱化学（株）〕により、検体中の糖化ヘモグロビンを分光学的反応速度法で測定した結果を図１に示す。なお、図１のＶ値とは、凝集反応速度である。図１から明らかなとおり、本発明方法によれば、自動分析装置を利用する定量も可能である。
【００２５】
【発明の効果】
本発明方法によれば、従来法に比べて遥かに短時間（１０分以内）で、検体中のヘモグロビンの妨害を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による混合ラテックスを用いて、光学的測定機器により糖化ヘモグロビン濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
0003550614.tif 000008