(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を含む構成物であって、該基板が、
ａ）ｉ）それぞれが共有結合により付着した捕獲リガンドを含む各検出電極のアレイ；
ｉｉ）少なくとも第１の電気泳動電極；
を含む第１の表面；
ｂ）少なくとも第２の電気泳動電極を含む第２の表面；および
ｃ）該第１および第２の表面を連結する、少なくとも１つのチャンネル；
を含むものである、構成物。
【請求項２】
該チャンネルが浸透層物質を含む、請求項１に記載の構成物。
【請求項３】
該チャンネルが膜を含む、請求項１に記載の構成物。
【請求項４】
さらに検出チャンバーを含み、該検出チャンバーが該表面を含む、請求項１に記載の構成物。
【請求項５】
検出チャンバーを含む構成物であって、該検出チャンバーが、
ａ）ｉ）１）それぞれが共有結合により付着した捕獲リガンドを含む各検出電極のアレイ；
を含む第１の表面
ｉｉ）第２の表面；
ｉｉｉ）該第１および第２の表面を連結する、少なくとも１つのチャンネル；
を含む基板；および
ｂ）該第２の表面に接触している吸収物質
を含むものである、構成物。
【請求項６】
該チャンネルが浸透層物質を含む、請求項５に記載の構成物。
【請求項７】
該チャンネルが膜を含む、請求項５に記載の構成物。
【請求項８】
サンプル中の標的被検体を検出する方法であって、
ａ）該標的被検体を検出チャンバー内で濃縮すること、但し、該検出チャンバーは
ｉ）１）それぞれが共有結合により付着した捕獲リガンドを含む各検出電極のアレイ；
２）少なくとも第１の電気泳動電極；
を含む第１の表面；
ｉｉ）少なくとも第２の電気泳動電極を含む第２の表面；および
ｉｉｉ）該第１および第２の表面を連結する、少なくとも１つのチャンネル；を含むものである；
ｂ）該標的被検体を該捕獲リガンドに結合させてアッセイ複合体を形成すること、但し、該アッセイ複合体はさらに少なくとも１個の電子伝達部分（ＥＴＭ    ）を含む；および
ｃ）該検出電極を用いて該ＥＴＭの存在を検出すること；
を含む方法。
【請求項９】
サンプル中の標的被検体を検出する方法であって、
ａ）該標的被検体を検出チャンバー内で濃縮すること、但し、該検出チャンバーは
ｉ）１）Ａ）それぞれが共有結合により付着した捕獲リガンドを含む各検出電極のアレイ；
を含む第１の表面；
２）第２の表面；
３）該第１および第２の表面を連結する、少なくとも１つのチャンネルを含む基板；および
ｉｉ）該第２の表面に接触している吸収物質
を含むものである；
ｂ）該標的被検体を該捕獲リガンドに結合させてアッセイ複合体を形成すること、但し、該アッセイ複合体はさらに少なくとも１個の電子伝達部分（ＥＴＭ    ）を含む；および
ｃ）該検出電極を用いて該ＥＴＭの存在を検出すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９９年１２月２３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１７１，９８１、１９９９年１１月１２日に出願された同０９／４４０，３７１、１９９９年６月２３日に出願された同０９／３３８，７２６、１９９８年８月１４日に出願された同０９／１３４，０５８、および１９９８年７月２３日に出願された同６０／０９０，３８９の継続出願である。これらのすべてを、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、表面の捕獲リガンドへの標的被検体の結合促進に有用な組成物および方法に関する。電子伝達部分（ＥＴＭ）の電子的検出を可能とする、標的被検体と直接または間接的に関係しているＥＴＭを使用して、検出を推進する。
【０００３】
発明の背景
液体または気体中の特異的な物質の存在および／または濃度を検出することについては、多くのアッセイまたはセンサーがある。これらの多くは、検出のためのメカニズムとして特異的なリガンド／抗リガンドの反応によっている。すなわち、対の物質（即ち、結合対やリガンド／抗リガンド）は、互いには結合するが、他の物質とはほとんどまたはまったく結合しないことが分かっている。多くの技術において複合体の検出にこれらの結合対が使用されてきた。一般的にこれらの方法は、複合体の１つの成分をなんらかの方法、例えば、放射性同位体、蛍光物質および他の光学活性分子、酵素などを用いて標識し、複合体全体を検出可能にして実施される。
【０００４】
他のアッセイは検出に電子的シグナルを用いる。とくに興味深いのはバイオセンサーである。少なくとも２種のバイオセンサーが知られている。それらは酵素をベースとするかまたは代謝性のバイオセンサー、および結合性またはバイオ親和性センサーである。例えば、米国特許第４，７１３，３４７号、第５，１９２，５０７号、第４，９２０，０４７号、第３，８７３，２６７号およびこれらの特許に開示の文献参照。これらの既知センサーのいくつかは交流電流（ＡＣ）技法を利用しているが、この技法は、バルク（または誘導）インピーダンスの相違を検出することに限定される。
【０００５】
続く検出用に、生体分子のその結合パートナーとの結合を助長するための、ミクロ流体工学の方法における電気泳動の使用は、既知である；例えば、米国特許番号第５，６０５，６６２、および第５，６３２，９５７、ならびにそれらの中で開示されている参照文献を参照のこと。
【０００６】
同様に、電極を使用する核酸の電子検出も既知である；例えば、米国特許第５，５９１，５７８号、第５，８２４，４７３号、第５，７０５，３４８号、第５，７８０，２３４号および第５，７７０，３６９号；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９１１，５８９；およびＷＯ９８／２０１６２；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０１０４；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５；およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３参照。
【０００７】
バイオセンサー応用の重大な障害の一つは、標的被検体が検出表面に結合する速度と表面の親和性である。核酸への応用では結合速度を加速すること、あるいは検出表面でのサンプル濃度を上げることのために開発された多くの技法がある。それらの技法としては、核酸の沈殿（デタージェント添加を包含するＥＰ０２９９４４２Ａ１参照（Ｐｏｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８２３７ （１９９１） 参照）；液状２相系への核酸の分配（Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０３：１−１２ （１９６５）； Ｋｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｅｍ． １６（２４）：５３２９ （１９７７）； および Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈ． ７ ｉｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８５ 参照）、並びにマクロリガンド存在下の分配（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８：２６９ （１９８１））； および核酸結合タンパク質の添加（Ｐｏｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：８４０３ （１９９０）） および米国特許第５，０１５，５６９号参照）などを包含する。これらの文献を出典明示により本明細書の一部とする。さらに、ある種タンパク質についての分配系も開発されているが、Ｇｉｎｅｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３９：４００ （１９８４）（出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。
【０００８】
しかし、核酸を含む標的被検体が引続く電子検出用の検出電極に結合するのを促進する組合わせシステムが必要である。
【０００９】
（発明の要約）
上記に概説した目的に従い、本発明は、検出電極のアレイを含む第１の表面を含む基板を有する構成物を提供する。各検出電極はそれぞれ、共有結合により付着した捕獲リガンドおよび少なくとも第１の電気泳動電極を含む。該基板はまた、少なくとも第２の電気泳動の電極と、第１および第２の表面を連結する少なくとも１つのチャンネルを含む、第２の表面も有する。該チャンネルは、本明細書で概説する浸透層物質または膜を含んでもよい。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、第１の表面を含む基板を有する検出チャンバーを含む構成物を提供する。第１の表面は、共有結合により付着した捕獲リガンドをそれぞれ含む検出電極のアレイを含む。該表面はまた、第２の表面および、第１および第２の表面を連結する少なくとも１つのチャンネルも含む。該検出チャンバーはまた、第２の表面に接触している吸収物質も含む。再度、該チャンネルは本明細書で概説する浸透層物質または膜を含んでもよい。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、標的被検体を上記の検出チャンバー内で濃縮し、該標的被検体を捕獲リガンドに結合させてアッセイ複合体を形成させることを含む、サンプル中の標的被検体の検出法を提供する。該アッセイ複合体はさらに、少なくとも１つの電子伝達部分（ＥＴＭ）を含む。該方法は、検出電極を用いてＥＴＭの存在を検出することを含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明はサンプル中の標的被検体の検出法を提供する。本方法は、共有結合した捕獲リガンドを含む検出電極を含む検出チャンバー内で、標的被検体を濃縮することを含む。標的被検体は該捕獲リガンドに結合して、少なくとも１つの電子伝達部分（ＥＴＭ）を含むアッセイ複合体を形成する。次いで、ＥＴＭの存在を検出電極により検出する。
【００１３】
さらなる態様において、該濃縮工程は、少なくとも１つの第１電極と少なくとも１つの第２電極間の電界であって、サンプルが検出電極に電気泳動輸送されるために十分な電界にサンプルを載置することを含む。
【００１４】
他の態様において、該濃縮工程は検出チャンバー内に少なくとも１種の容積排除剤を含ませることを含む。
【００１５】
さらなる態様において、該濃縮工程は標的被検体を沈殿させることを含む。
【００１６】
他の態様において、該濃縮工程は、標的被検体が一方の相に濃縮されるように、２つの分離可能な溶液相を形成する少なくとも２種の試薬を含ませることを含む。
【００１７】
さらなる態様において、該濃縮工程はシャトル粒子に標的被検体を結合させることを含む。
【００１８】
他の態様において、本発明は、アッセイ複合体の形成に至らしめる条件下で、共有結合した捕獲リガンドを含む検出電極を通過するようにサンプルを流動させることを特徴とする標的被検体の検出法を提供する。上記のように、アッセイ複合体はさらに少なくとも１つの電子伝達部分（ＥＴＭ）を含み、ＥＴＭの存在は当該検出電極により検出する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は標的核酸検出のためのものであり、ハイブリダイゼーション促進剤の使用を含む。アッセイ複合体はハイブリダイゼーション促進剤の存在下に形成されるが、該促進剤は核酸結合タンパク質または多価イオンである。
【００２０】
他の態様において、本発明は、アッセイ複合体の形成に至らしめる条件下で、共有結合した捕獲リガンドを含む検出電極にサンプルを加えることを特徴とする標的被検体の検出法を提供する。該条件は混合粒子の存在を包含する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は複数の金電極を含む基板を提供する。各金電極は、自己集合した単層、捕獲リガンド、および各電極が独立してアドレス参照可能となるような相互接続体を含む。好適な基板はファイバーグラスなどのプリント回路基板物質などである。
【００２２】
他の態様において、本発明は、複数の金電極を含む基板の作製法を提供する。該方法はファイバーグラス基板上に接着金属を被覆し、接着金属上に金を被覆することを含む。次いで、リトグラフィーにより型を形成するが、該型は複数の電極および連結した相互接続体を含む。該方法は選択肢として各電極に自己集合単層（ＳＡＭ）を付加することも包含する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、複数の金電極を含む基板の作製方法を提供する。該方法は基板上に接着金属を被覆し、接着金属上に金を被覆することを含む。次いで、リトグラフィーにより型を形成するが、該型は複数の電極および連結した相互接続体を含む。該方法はさらに各電極に自己集合単層（ＳＡＭ）を付加することも包含する。
【００２４】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆは２組の電極セット、電気泳動セットおよび検出セットの数種の代表的な形状を描出する。図１Ａおよび１Ｂにおいて、基板３０は第１電気泳動電極１０を有し、該電気泳動電極１０は電極から電気的に離れたその上に、またはそこに埋め込んだ検出電極２０を有する。そこにはサンプル受容領域４０がさらに存在する。電気泳動と検出電極に対する対電極は示していない。図１Ｃは図１Ａの側面図を表し、対極となる電気泳動電極５０および任意なものとして対極となる検出電極６０を加えてある。浸透層２５も示す。当業者が認めるように、これらの対電極は、連続して用いるなら同じ電極であってもよい。図１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆは個々の電気泳動電極の使用を描出する。図１Ｅは１Ｄの側面図である。図１Ｆは以下により詳細に説明するように、サンプルが１つの検出電極から他の電極に順次移動する構図を示す。
【００２５】
図２はサンプルの空間的標的化ならびに結合速度を上げる「混合」用に多次元配列した電気泳動電極の使用を描出する。図２Ａは電気泳動電極１０と検出電極２０を示す。電気泳動電極１０と１５の間に、また、同時に電気泳動電極１２と１７の間に加える電気泳動電圧が検出器電極２０に標的被検体を推進させる。
【００２６】
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、標的核酸配列を電極に結合させる３つの好ましい実施態様を示す。図３Ａは、結合リンカー１０６を介して連結する捕獲プローブ１００にハイブリダイズする標的配列１２０を示す。それは本明細書で概略する通り、伝導性オリゴマーか絶縁体のいずれかとなり得る。電極１０５は、不動態化剤１０７の単層を含み、それは伝導性オリゴマー（本明細書中では１０８として示す）および／または絶縁体（本明細書中では１０９として示す）を含み得る。図に示した全実施態様に関するかぎり、ｎは少なくとも１である整数である。システムは捕獲プローブを全く利用しなくてもよいが（すなわち、ｎは０である）、当業者には明らかなように、このことは通常好ましくはない。ｎの上限は、標的配列の長さおよび必要な感度に依存する。図１Ｂは、標的配列１２０の第１部分にハイブリダイズする第１部分１１１および捕獲プローブ１００にハイブリダイズする第２部分を有する単一捕獲伸長プローブ１１０の使用を示す。図１Ｃは、２つの捕獲伸長プローブ１１０および１３０の使用を示す。第１捕獲伸長プローブ１１０は、標的配列１２０の第１部分にハイブリダイズする第１部分１１１および補足プローブ１００の第１部分１０２にハイブリダイズする第２部分１１２を有する。第２捕獲伸長プローブ１３０は、標的配列１２０の第２部分にハイブリダイズする第１部分１３２および捕獲プローブ１００の第２部分１０１にハイブリダイズする第２部分１３１を有する。当業者に明らかなように、これらの結合配置はいずれも図４、５および６の実施態様に使用し得る。
【００２７】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄはいくつかの可能なメカニズム−１のシステムを描出する。図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃはいくつかの可能な核酸システムを描出する。図４Ａでは、検出プローブ１４０（捕獲プローブとしても作用する）が伝導性オリゴマー１０８を介して電極１０５に付着している。電極１０５はさらに不動態化剤１０７の単層を含む。標的配列１２０は検出プローブ１４０にハイブリダイズし、ＥＴＭ１３５が付着する（標的配列または検出プローブの一方または他方に共有結合により、あるいは非共有結合により、すなわち、ハイブリダイゼーション指示体として）。図４Ｂでは、電極に対する図３Ａの付着は、付着リンカー１０６により電極１０５に付着した捕獲プローブ１００によって使用され、リンカー１０６は絶縁体または伝導性オリゴマーである。標的配列１２０は捕獲プローブおよび標識プローブ１４５にハイブリダイズし、標識プローブ１４５は第１部分１４１とリクルートリンカー１４２を含み、第１部分１４１は標的配列１２０の一部にハイブリダイズし、リクルートリンカー１４２は伝導性オリゴマー１０８を介して電極に付着している検出プローブ１４０にハイブリダイズする。図４Ｃは、第１捕獲伸長プローブ１１０を示してある以外、同様であるが、増幅プローブ１５０は第１部分１５１と第２部分１５２（増幅配列）を含み、第１部分１５１は標的配列１２０の第２部分にハイブリダイズし、第２部分１５２は標識プローブ１４５の第１部分１４１ハイブリダイズする。標識プローブ１４５の第２部分１４２は少なくとも１つのＥＴＭ１３５を有する検出プローブ１４０にハイブリダイズする。図３Ｃは電極に対する図３Ｂの付着を利用する。図４Ｄは付着リンカー１０６を介して電極１０５に付着している捕獲結合リガンド１６０に結合した非核酸標的被検体１６５を描出する。溶液結合リガンド１７０も標的被検体に結合するが、これは少なくとも１つのＥＴＭ１３５を有する検出プローブ１４０にハイブリダイズする核酸を含むリクルートリンカー１７１を含む。
【００２８】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇおよび５Ｈは、本発明の、核酸メカニズム−２のいくつかの態様を示す。核酸を表わす場合、同様に非核酸態様で使用することができる。本明細書中で考察するように両者を種々異なる割合で用い得るし、また絶縁体は完全に欠失していてもよいのであるが、本明細書中に示したすべての単層では、伝導性オリゴマー１０８と絶縁体１０７の両方が、おおよそ１：１の割合で存在するように示している。加えて、当業者には明らかなように、これらのどの構造も、特定の標的配列を繰り返し得、すなわち、長い標的配列の場合、形成された多アッセイ複合体が存在し得る。加えて、図３の任意の電極結合態様は、任意のこれらシステムに使用され得る。
【００２９】
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｄは、ＥＴＭ１３５を含む標的配列１２０を有し、本明細書において考察するように、これらは、例えば、ＥＴＭで修飾したヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応の間に酵素学的に添加され得、標的配列を通して実質的にランダムに組込まれるか、または標的配列の末端に加えられる。図５Ｃは、標的配列１２０の種々の部分にハイブリダイズする２種の捕獲プローブ１００および１００’の使用を示す。当業者には明らかなように、この実施態様で２つの捕獲プローブの５’−３’方向は異なる。
【００３０】
図５Ｃは、標的配列１２０に直接ハイブリダイズする標識プローブ１４５の使用を示す。図５Ｃは、標的配列１２０の部分にハイブリダイズする第１部分１４１、ＥＴＭ１３５を含む第２部分１４２を含む標識プローブ１４５の使用を示す。
【００３１】
図５Ｅ、５Ｆおよび５Ｇは、標的には直接ハイブリダイズしないが、むしろ、直接的（図５Ｅ）または間接的（図５Ｆおよび５Ｇ）に標的配列にハイブリダイズする増幅プローブにハイブリダイズする標識プローブ１４５を用いるシステムを示す。増幅プローブ１５０を用いる図５Ｅは、標的配列１２０にハイブリダイズする第１部分１５１および標識プローブの第１部分１４１にハイブリダイズする少なくとも１つの第２部分１５２、すなわち、増幅配列を有する。図５Ｆは同様である。但し、標的配列１２０にハイブリダイズする第１部分１６１および増幅プローブ１５０の第１部分１５１にハイブリダイズする第２部分１６２を含む第１標識伸長プローブ１６０を用いる。増幅プローブ１５０の第２部分１５２は、標識プローブ１４０の第１部分１４１にハイブリダイズし、それはＥＴＭ１３５を含むリクルートリンカー１４２をも含む。図５Ｇは、第２標識伸長プローブ１７０を加え、標的配列１２０の部分にハイブリダイズする第１部分１７１および増幅プローブの部分にハイブリダイズする第２部分を有する。
【００３２】
図５Ｈは、多標識プローブを利用するシステムを示す。標識プローブ１４０の第１部分１４１は、リクルートリンカー１４２のすべてまたは一部にハイブリダイズし得る。
【００３３】
図６Ａ〜６Ｈは可能な非核酸メカニズム−２の態様のいくつかを描出する。図６Ａでは付着リンカー１０６によって電極１０５に結合した捕獲結合リガンド２００を利用する。標的被検体２０５は捕獲結合リガンド２００に結合し、そしてＥＴＭ１３５を含むリクルートリンカー２２０を有する溶液結合リガンド２１０に結合する。図６Ｂは、捕獲結合リガンド２００が第２結合パートナー相互作用、例えば、核酸を用いる表面に付着する以外、同様の事例を描出する；捕獲結合リガンドの部分２０１が表面上の捕獲プローブ１００に結合するか、またはハイブリダイズする。図６Ｃでも第２結合相互作用、例えば、核酸相互作用を利用し、シグナルを増幅する。この場合、溶液結合リガンド２１０は、標識プローブ２３０の第１部分２３１に結合またはハイブリダイズする第１部分２２０を含む。標識プローブ２３０もリクルートリンカーである第２部分２３２を含む。図６Ｄは６Ａと同様の態様を描出するが、ここでは第２溶液結合リガンド２４０を使用する。図６Ｅは１を越える捕獲結合リガンド（２００および２００’）が使用される事例を描出する。図６Ｆは標的の添加が結合リガンドのコンホメーションを変化させ、リクルートリンカーが単層表面の近位に位置するようになったコンホメーションを示す。図６Ｇは候補バイオ活性物質のスクリーニングに本発明を使用する例を示し、薬物候補を標的に加えて、溶液結合リガンドを解離させ、シグナルを消失させる例を示す。さらに、溶液結合リガンドは他の表面に付加して結合するが、それを酵素について図６Ｈに一般的に示す。図６Ｈは酵素がリクルートリンカーを含む基板を切断してシグナルの消失を招く用例を描出する。切断された断片はさらなる電極に付加し、シグナルを増大するが、これはメカニズム−１またはメカニズム−２のいずれかを用いている。
【００３４】
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅは標識プローブとＥＴＭ付着の異なる可能な構成を描出する。図７Ａ〜Ｃでは、リクルートリンカーは核酸である；図７Ｄおよび７Ｅでは、核酸ではない。Ａ＝ヌクレオシド置換；Ｂ＝塩基への付着；Ｃ＝リボースへの付着；Ｄ＝リン酸エステルへの付着；Ｅ＝塩基、リボースまたはリン酸エステル（または他の主鎖類似体）に付着したメタロセン・ポリマー（図に示すとおりであるが、同様に他のＥＴＭのポリマーであってもよい）；Ｆ＝塩基、リボースまたはリン酸エステル（または他の主鎖類似体）を介して付着した樹枝状構造；Ｇ＝塩基、リボースまたはリン酸エステル（または他の主鎖類似体）を経た、「分枝」構造を介しての付着；Ｈ＝メタロセン（または他のＥＴＭ）ポリマーの付着；Ｉ＝樹枝状構造を介した付着；Ｊ＝標準的リンカーを用いる付着。
【００３５】
図８Ａおよび８Ａは技術上既知の「分枝」点ホスホラミダイトを用い、核酸に同時に多数のＥＴＭを付加する代替法を図示するものである。当業者が認めるように、各終末点は相当数のＥＴＭを含むことができる。
【００３６】
図９は「分枝」点ヌクレオシドを用いて複数のＥＴＭを核酸に同時に取り込ませる合成について図示したものである。
【００３７】
図１０はＥＴＭポリマーの付加を可能とする「分枝」点（この場合はアデノシン）の合成を描出する。
【００３８】
図１１は予め形成されたＳＡＭに、一級アミンで機能化した核酸を付加させるために活性化カルボン酸エステルを使用した図を描出する。
【００３９】
図１２は代表的なヘアピン構造を描出する。５００は標的結合配列、５１０はループ配列、５２０は自己相補性領域であり、５３０は検出プローブに実質的に相補的であり、５３０は「粘着末端」、すなわち、プローブの他の部分にハイブリダイズせず、ＥＴＭを含む部分である。
【００４０】
図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは本発明のある実施態様を描出する。
【００４１】
図１４は実験例の結果を描出する。
【００４２】
図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｆおよび１５Ｇは、２電極システムのいくつかの可能な配置を描写している。側面図１５Ａでは、電気泳動電極１０の上に置かれた基板３０が、検出電極２０を含んでいる。該基板３０には、中に孔またはチャンネルがある。本明細書で描写するすべてのチャンネルに関して、該チャンネルは浸透層物質２５で満たされている場合がある；あるいは、透析膜のような膜を、チャンネルのどちらの末端ででも使用し得る。アガロース、アクリルアミドなどの浸透層物質は、電気泳動のためのイオンは通過させるが、標的被検体のようなサンプルの成分が浸透層に入るのを防ぐものであることが好ましい。しかし、当業者に了知されるであろうように、これらのチャンネルは開放することができ、従って緩衝液で満たすことができる。逆電極５０は、どこにでも配置できる。電気泳動電極１０と逆電極５０との間に電界を起こすことによって、該サンプルは検出電極の近傍に移る。図１５Ｂは同様の設定を示すが、電気泳動電極１０は、浸透層と直接は接していない；むしろ、イオン性伝導性物質２７を用いる；好ましい実施態様では、緩衝液を利用する。図１５Ｃは、「非対称的」配置を描写し、逆電極５０が検出電極のアレイの片側にあり、チャンネルが他方にある。図１５Ｄは同様であるが、「対称的」である。図１５Ｅは、２組の電気泳動電極を使用する；このことにより、電極５１と１１を用いる、ある期間にわたって泳動可能な第１の電気泳動工程に続いて、電極５２と１２を用いる第２の電気泳動工程を行えるようになる。図１５Ｆと１５Ｇは基板３０の平面図を描写する；他の電気泳動電極が基板のもう一方の側にあり、示されていない。この実施態様では、検出電極（群）２０がチャンネルを取り囲み、場合によっては浸透層２５で満たされている。従って、図１５Ｆには１個のチャンネルがあり、検出電極はチャンネルの周りに配置されている。図１５Ｇには、中にチャンネルを有する各パッドがある。
【００４３】
図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃは、図１５のシステムに似たシステムを描写する。これらのシステムでは電気泳動を用いるよりも、むしろ容積排除剤に似た吸収物質か、または電気泳動と吸収物質の組合せを使用して、ハイブリダイゼーションの促進を成し遂げる。図１６Ａでは、サンプルをチャンバー４０内に導入し、液体をチャンネル（場合によっては浸透層で満たされている）を通して吸収物質５００を含むチャンバー中に流すようにする。図１６Ｂは別の配置を示し、ここではサイズ排除隔壁（例えば、半透膜）が基板（例えば、ＰＣ基板）の表面上にある。図１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆは、吸収物質と電気泳動の使用を組合せる様々な配置を描写する。当業者に了知されるであろうように、このシステムを他のハイブリダイゼーション促進技法と共に用いてもよい。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、電極上での電気化学的検出に基づき、生物学的標的被検体の種、例えば、核酸およびタンパク質などの検出に有用な方法と構成物を目的とする。技術上知られるように、バイオセンサー、特に核酸検出用バイオセンサーの重大な障害の一つは、溶液ベースの標的が表面結合捕獲リガンドに結合する速度（すなわち、核酸の場合はハイブリダイゼーション）である。例えば、Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １３：５３７３ （１９８７）（全文を出典明示により本明細書の一部とする）参照。このことに多くの方法で影響を与え得る；例えば、（１）標的被検体を表面付近で濃縮させ、大量の標的被検体が捕獲リガンドに効果的に結合するようにする方法；（２）良好な流動または「混合」を可能とするシステムを設定し、再度、大量の標的被検体が捕獲リガンドに結合するようにする方法；または（３）核酸の場合に、ハイブリダイゼーション促進剤を用い、標的配列と捕獲プローブを含むアッセイ複合体のハイブリダイゼーション速度を事実上上げる方法などである。これら３つの方法は、すべて本明細書において時には結合またはハイブリダイゼーションの促進というが、これらの技法のいくつかは事実上結合の速度定数を増大させるものではなく、濃度を増大させることによるか、または輸送量を向上させることにより、単位時間当たりの標的被検体の結合量を増加するものである。このように、本発明は所定の単位時間内に表面に結合する標的分子の数を増大させる構成物と方法の使用を目的とする。本明細書にて概説した多くの技法を核酸により一般的に例示したが、当業者はこれらの技法すべてがタンパク質などの他の標的被検体にも適用し得ることを認めるものである。
【００４５】
このように、本発明はアッセイ複合体形成の速度を増大するため、または所定時間内にアッセイ複合体の数を増加させるために使用し得る多くの技法について記載するが、この場合の標的被検体は電極表面上の捕獲リガンドと会合することになる。これらの技法は以下の技法を含むが、これらに限定されるものではない：電気泳動輸送；容積排除剤の使用；核酸結合タンパク質の使用（核酸標的被検体の場合）；多価イオンの使用；沈殿剤；分配法；相適合性の調整；流動パラメーターの構築；「シャトル」または「ミキサー」としての微粒子の使用（磁性および非磁性粒子両方を含む）；温度勾配の使用；フィルターの使用；およびその組合わせ。
【００４６】
従って、本発明はサンプル溶液中の標的被検体を検出する方法を提供する。当業者が認めるように、サンプル溶液は以下の相当数の対象物を含むがこれらに限定されるものではない：体液（例えば、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌液、汗および精液などであるが、これらに限定されるものではなく、実質的に生体からのもの、好ましくは哺乳動物のサンプル、特にヒトのサンプルであることが好ましい）；環境サンプル（例えば、空気、農業、水および土壌の各サンプルなどであるが、これらに限定されるものではない）；生物学的戦闘剤サンプル；研究サンプル（すなわち、核酸の場合、サンプルは増幅反応の産物であってもよく、例えば、ＰＣＲまたはＳＤＡ増幅反応など、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５に一般的に記載されているような標的およびシグナル増幅のサンプルを含む）；精製したサンプル、例えば、精製したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質など；粗製サンプル（バクテリア、ウイルス、ゲノムＤＮＡなど）。当業者が認めるように、サンプルについては実質的にどのような実験的取扱いもなし得る。
【００４７】
本方法は標的被検体の検出を目的とする。本明細書での「標的被検体」またはその文法的等価物とは、検出すべき分子または化合物を意味する。以下に概説するように、標的被検体は、好ましくは、結合リガンドに結合するが、それについては以下により詳細に説明する。当業者が認めるように、大多数の被検体は本方法により検出することが可能である；基本的に、それに対応する下記の結合リガンドを作製し得るあらゆる標的被検体を、本発明の方法によって検出することができる。
【００４８】
電気泳動を使用する場合、以下により詳細に説明するように、標的被検体は、好ましくは、帯電しており、すなわち、実験条件下で正味の電荷をもち、その結果、電界において電気泳動的に輸送され得る。しかし、非帯電標的被検体は、帯電した結合パートナーまたは結合リガンドが該標的被検体と会合すれば利用可能となる。例えば、以下により詳細に説明するように、ある種の標的被検体、例えば、タンパク質が殆どまたは全く正味の電荷をもたない場合、可溶性の結合リガンドを用い、標的被検体に結合させＥＴＭおよび／または帯電種を追加的に含ませることができる；ある態様において、ＥＴＭは帯電していてもよく、その結果、電気泳動と検出を容易にし得る。
【００４９】
適切な被検体は有機および無機分子であり、生体分子を包含する。好適な態様において、被検体は以下のとおりである：環境汚染物（害虫駆除剤、殺虫剤、毒素などを含む）；化学物質（溶媒、有機物質などを含む）；治療剤分子（治療および誤用薬物、抗生物質などを含む）；生物分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭化水素、細胞膜抗原およびレセプター（中性、ホルモン性、栄養性、および細胞表面レセプター）またはそれらのリガンドなどを含む）；全細胞（原核細胞（病原性バクテリアなど）および哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞などを含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）；および胞子など。特に好適な被検体は環境汚染物、核酸、タンパク質（酵素、抗生物質、抗原、成長因子、サイトカインなどを含む）、治療および誤用薬物、細胞、およびウイルスなどである。
【００５０】
特に好適な標的被検体はタンパク質および核酸である。本明細書にて使用する際の「タンパク質」とはタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドである。該タンパク質は天然産アミノ酸とペプチド結合から造られているか、または合成ペプチド模倣構造であってもよい。その側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）いずれの立体配置であってもよい。好適な態様において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。非天然の側鎖を用いる場合、非アミノ酸置換基を用い、例えば、生体内での分解を防止または遅延させることができる。
【００５１】
本明細書で「核酸」または「オリゴヌクレオチド」またはそれらの文法的均等物は、一緒に共有結合されている少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、下記で概説されている通り、交互の主鎖を有し得る核酸類似体が含まれ、例えばホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ ４９ （１０） ：１９２５ （１９９３）およびそれに記載された参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３５：３８００ （１９７０）、 Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８１：５７９ （１９７７）、 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：３４８７ （１９８６）、 Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８０５ （１９８４）、 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０ （１９８８）、 および Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、 ホスホロチオエート （Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１４３７（１９９１）、および米国特許第５６４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ２３２１ （１９８９）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連鎖（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ 参照）、およびペプチド核酸主鎖および連鎖（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１８９５（１９９２）、Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３１： １００８ （１９９２）、Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５： ５６６ （１９９３）、Ｃａｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ２０７ （１９９６）参照、これら全てを引用して説明の一部とする）が含まれる。他の類似核酸には、鍵付き（ｌｏｃｋｅｄ）核酸を含む二環式構造（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０：１３２５２−３ （１９９８））、正の主鎖（Ｄｅｎｐｃｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２： ６０９７ （１９９５））、非イオン性主鎖（米国特許第５３８６０２３号、第５６３７６８４号、第５６０２２４０号、第５２１６１４１号および第４４６９８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ， ３０： ４２３ （１９９１）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１０： ４４７０ （１９８８）， Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， １３： １５９７ （１９９４）、２および３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ４：３９５（１９９４）、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ， ３４：１７（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７： ７４３ （１９９６）） および非リボース主鎖を伴うもの、例えば米国特許第５２３５０３３号および第５０３４５０６号、および６および７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編記載のものがある。また、１個またはそれ以上の炭素環状糖類を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． （１９９５） ｐｐ １６９−１７６参照）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２， １９９７ ｐａｇｅ ２５ に報告されている。これらの参考文献は全て特に引用して説明の一部とする。リボース−リン酸主鎖にこれらの修飾を加えることにより、ＥＴＭの付加が簡易化され、または生理学的環境における上記分子の安定性および半減期が増加され得る。
【００５２】
当業界の技術者が認めるように、これらの核酸類似体は全て本発明で使用され得る。さらに、天然に存する核酸および類似体の混合物が製造され得る。例えば、伝達性オリゴマーまたはＥＴＭ結合部位では、類似構造が使用され得る。別法として、異なる核酸類似体の混合物、および天然核酸および類似体の混合物も製造され得る。
【００５３】
特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。天然に存する核酸の高荷電ホスホジエステル主鎖とは対照的に、これらの主鎖は中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって、２つの利点が得られる。まず、ＰＮＡ主鎖は、改善されたハイブリダイゼーション反応速度論を示す。ＰＮＡでは、誤対合対完全適合塩基対において融解温度（Ｔｍ）がより大きく変化する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部誤対合の場合典型的にはＴｍの２−４℃降下を呈する。非イオン性ＰＮＡ主鎖の場合、降下は７−９℃に近い。これは不一致をよりよく検出することを可能とする。同様に、それらの非イオン的性質故に、これらの主鎖に結合された塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して比較的非感受性である。
【００５４】
核酸は、明記されている通り１本または２本鎖であるか、または２本鎖または１本鎖の両配列の部分を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム性およびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、その場合核酸はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい態様は、米国特許第５６８１７０２号で総括的に記載されている通り、非特異的ハイブリダイゼーションを低減化するために、標的配列ではなく、他のプローブと相補的になるように設計された核酸においてイソシトシンおよびイソグアニンを用いる。ここで使用されている、「ヌクレオシド」の語は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを包含する。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然的類似構造を包含する。すなわち、例えば各々塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、ここではヌクレオシドと称される。
【００５５】
好適な態様において、本方法は検出電極の近傍に標的被検体を濃縮することを含む。検出電極構成物の説明を以下に記載する。当業者が認めるように、サンプル中の標的被検体の開始濃度は、使用するサンプルのタイプにより大きく変わり得る。一般に、サンプル中の標的被検体の開始濃度は比較的低く、好適な技法としては、検出電極の近傍に標的被検体を濃縮することを可能とする方法を利用する。
【００５６】
一般に、「濃縮」とは、標的被検体が表面に結合するために移動しなければならない有効な拡散距離が減少することを意味する。好適な態様において、検出電極での、またはその近傍での濃度は開始サンプルでの濃度よりも高い。これは様々な方法で、直接に、または結合促進の関数として間接的に測定し得る。すなわち、好適な態様において、濃度が少なくとも２倍に増加することが好ましく、少なくとも５倍であることが特に好ましく、さらに少なくとも１０倍に増加することがとりわけ好ましい。当業者が認めるように、濃度の増加は同様に開始サンプルサイズに依存し、従って、非常に大きな濃度の増加、例えば、１００倍、１，０００倍および１０，０００倍（またはそれ以上）の増加が望ましい。ハイブリダイゼーションの速度が濃度の指標として用いられる場合、単位時間当たりの検出電極に結合する標的被検体濃度は少なくとも２倍以上増加することが好ましく、少なくとも５倍であることが特に好ましく、さらに少なくとも１０倍に増加することがとりわけ好ましい。さらに、より高い増加が一部の態様において好ましい。
【００５７】
本明細書に概説するように、様々な適切な濃縮法が存在する。好適な態様において、濃縮化は電気泳動により実施する。一般に、そのシステムは以下のように説明される。第１電極と第２電極を用い、輸送を果たす電界を生成させる；一般に、標的被検体種の電気泳動輸送が検出電極でその濃度を増加させるが、該電極は標的被検体を（直接または間接的に）結合する共有結合した捕獲結合リガンドを有する。この方法において、標的被検体がその捕獲リガンドに結合する反応速度は、捕獲リガンドを取囲む媒体中の標的被検体の濃度を増加させ、かつ、所定の標的被検体分子が結合リガンドを見つけるために拡散しなければならない距離を減少させることで、顕著に増大する。
【００５８】
検出電極は第１電極と同じであっても同じでなくてもよい。すなわち、一態様において、表面に被検体を輸送することとなる電界の生成に使用される電極は、検出に使用される電極とは異なる；すなわち、２組の電極があり、当業者の認めることであるが、この２組は電極、例えば、対極を共有する。他の態様において、電気泳動輸送および検出に使用される電極は同一であってもよい；すなわち、電極は１組のみ存在する。ある種態様において、標的被検体を引き付ける電気泳動電極は浸透層を含むが、浸透層は電極表面に標的被検体が接近するのを制限するように働き、被検体が電気化学的に分解するのを防止する。
【００５９】
検出プローブ近傍へのこの電気泳動輸送は、標的被検体が検出プローブ表面またはその近傍で濃縮されることを可能にする；検出プローブ表面は捕獲結合リガンドを含み、それが標的被検体に結合してアッセイ複合体を形成する。一部の態様においては、複数の電気泳動電極を連続的にまたは同時に使用することで多次元電気泳動を可能とする。すなわち、溶液を標的とし、さらに結合の反応速度を上げるために検出電極の近傍で「混合」または「撹拌」する。以下に説明するように、アッセイ複合体はＥＴＭを含み、そのＥＴＭを検出電極により検出する。
【００６０】
多くの電気泳動工程が使用し得ることも留意すべきことである；例えば、このシステムの成分を連続的に添加することが可能であり、各添加に続いて電気泳動工程により試薬を検出電極に輸送する。同様に、電気泳動を用いて「洗浄」工程を実施することが可能であり、その場合、過剰の試薬（非結合標的分子または非結合の余分の結合リガンド成分など）またはサンプルの他の成分（例えば、非相補性核酸）は検出電極から排除される。このように、電気泳動工程はいずれかを組合わせて使用することができる。さらに、電気泳動工程の時間が変更可能である。
【００６１】
本発明の方法と構成物は２組の電極に依存することもあり、その場合、１組は電気泳動用として使用し、第２の組は検出に使用するか、あるいは以下に一般的に説明するように、１組を電気泳動と検出の両方に作用するように機能する電極とすることができる。
【００６２】
標的被検体を含むサンプルを、少なくとも第１および少なくとも第２の電気泳動電極の間の電界内に置く。本明細書での「電極」は、電子装置に接続したとき、電流または電位を感知し、それをシグナルに変換し得る構成物を意味する。あるいは、電極を、電位を電子に適用し得る、および／または、溶液中の種へまたは種から電子を移し得る構成物として定義することができる。このように、電極とは下記のＥＴＭである。好適な電極は技術上既知であり、これらに限定されるものではないが、ある種の金属およびその酸化物、例えば、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウム；金属酸化物電極、例えば、酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化スズインジウム、酸化パラジウム、酸化けい素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）および酸化ルテニウム；および炭素（ガラス状電極、黒鉛およびカーボンペースト）などを包含する。好適な電極は金、白金、けい素、炭素および金属酸化物電極などであり、金が特に好ましい。
【００６３】
本明細書に記載の電極は平らな表面として図示しているが、これは電極の可能な一形状であって、図式化を目的とするのみのものである。電極の形状は使用される検出法により変わる。例えば、平面状の電極は光検出法に好適であり、あるいは、核酸のアレイが作成され、従って合成および検出のためにアドレス可能な位置が必要な場合に好適である。あるいは、伝導性オリゴマーと内部表面に結合した核酸を含むＳＡＭの場合には、単一プローブ分析のために、電極をチューブの形状とすることができる。電極コイルまたはメッシュも、いくつかの実施態様では同様に好ましい。これは、核酸に接触する表面領域を、少用量のサンプルに最大限露出させるのを可能にする。
【００６４】
当業者に了知されるであろうように、電極は様々な方法で配置される。好ましい実施態様では、電気泳動は当分野で周知のように互いに入り込み得る。さらに、異なる電極（例えば検出電極と電気泳動電極）は、同じかまたは異なる金属であり得る；例えば、該電気泳動電極は白金であり得、検出電極は金であり得る。
【００６５】
さらに、以下により詳細に説明するように、検出電極はサンプル全体と電極との接触が最大となるように、または混合を可能とするように構成することができる。
【００６６】
好適な態様において、電気泳動電極の一方（もしくは双方）または基板中のチャネルは、米国特許第５，６３２，９５７号および第５，６０５，６６２号（両特許全文を出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に記載されているように、浸透層を含む。この層はシステムを高電圧で行う場合、すなわち、水での加水分解が起こる場合に特に有用である。この浸透層は中間的分散層として働き、一般に細孔制限性を有していて、それが標的被検体、反応物などが電極表面と物理的に接触するのを阻害または妨害し、電気化学的悪影響に対し防御する。この浸透層は以下の種々の物質で形成されるが、これらに限定されるものではない：炭素鎖ポリマー、炭素−ケイ素鎖ポリマー、炭素−リン鎖ポリマー、炭素−窒素鎖ポリマー、ケイ素鎖ポリマー、ポリマー合金、重層化ポリマー複合体、浸透性ポリマー物質、セラミック、制御多孔性ガラス、ゾル−ゲルとして形成される物質、エーロゲルとして形成される物質、アガロース、アクリルアミド、ヒドロゲルとして形成される物質、多孔性黒鉛、クレーまたはゼオライト。特に好適なのは、アクリルアミドと架橋剤とから形成されるメッシュ型ポリマーであり、トリエチレン・グリコール・ジアクリレート、テトラエチレン・グリコール・ジアクリレートおよびＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドなどであるが、これらに限定されものではない。
【００６７】
好ましい実施態様では、電気泳動電極および／またはチャンネルは、伝統的な浸透層物質ではなく、むしろ伝導性の物質、特に電気的重合が可能なポリマーである物質を含む。この実施態様では、電気泳動電極の表面上にポリマーを重合させることによって電気泳動電極を作製する。これらの電気的重合が可能な物質の利点は、重合した物質の厚さを制御かつ変更できることである；例えば、物質の１つの単層を作成でき、あるいは数ミクロンの厚さに及ぶ層を作成できる。さらに、電気泳動電極の表面上に、ポリマーを非常に特異的に局在させることが可能である。
【００６８】
適する電気的重合が可能なモノマーには、ピロール（ポリピロール層になる；出典明示により本明細書の一部とする Ｂｒａｊｔｅｒ−Ｔｏｔｈ， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ６６：２４５８−２４６４ （１９９４） 参照）、アニリン（ポリアニリン層になる）、フェノール（ポリフェノール層になる）、アズレン、ピレンおよびカルバゾール（出典明示により全体を本明細書の一部とするＨｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔａｌｓ ６４：２５９ （１９９４） 参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい物質はポリピロールである。なぜなら、これは伝導性に関して興味深い特性を有するためである。ピロールの過酸化によって、伝導性のポリマーを、分子認識特質を有する絶縁体に変換できる。
【００６９】
好ましい実施態様では、イオン隔膜またはゾル−ゲル成分を、電気泳動電極を保護するために使用できる。Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７２：１８３５ （２０００）参照、出典明示により本明細書の一部とする。この実施態様では、核酸（または他の標的被検体）が膜またはゲルに実際に入り得る（例えば、それらは捕らえられる、あるいは集められる）。さらに、これに続いて緩衝液交換の工程を行い得る。
【００７０】
電界は第１および第２電気泳動電極の間に生成される。「第１」および「第２」という用語は実質的に相互入れ替えが可能であり、何ら空間的または配座的区別を与えることを意味するものではないが、一般的に本明細書で使用する場合、第１電極は一般に空間的に検出電極に最も接近した電極である（２組の電極を使用する場合）か、あるいは第１電極は一般に検出電極として描出される（１組のみの電極を使用する場合）。当業者が認めるように、相当数の可能な電気泳動電極の構成が、図１、２および１５に一般的に描出したように使用可能である。一般に、２つの型の構成、すなわち、バルク電気泳動と標的化電気泳動とがある。
【００７１】
好適な態様においては、バルク電気泳動の構成が使用される。すなわち、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに一般的に示すように、１組の電気泳動電極を使用する。第１電気泳動電極（図１において１０）は一般に検出電極よりも大きく、空間的には検出プローブが電気泳動電極により生成される電界内にくるように配置される。電極間に直流電圧を印加することにより、電界が生じ、その結果、帯電した標的被検体が検出プローブの近傍に電気泳動輸送されることになる。これは必ずしも標的被検体を直接検出プローブ上に置くものではなく、検出表面での有効な拡散距離の縮小と有効な濃度上昇が、検出プローブ表面上の捕獲結合リガンドに結合する標的被検体の反応速度を上昇させるが、その場合、拡散は３次元よりもむしろ本質的に２次元で起こる必要がある。
【００７２】
好適な態様において、標的化電気泳動の構成は、図１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆに一般的に示すように使用する。この態様においては、最も一般的なこととして、被検体を特異検出電極に対し特異的に標的化するために使用する複数の電気泳動電極が存在するが、常にそういう組み合わせというわけではない。これは基本的な２つの方法の一方で実施する。好適な態様においては、図１Ｆに一般的に描出するように、また、米国特許第５，６０５，６６２号（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている構成部分のように、各検出電極は随伴した電気泳動電極をもつ。このように、電気泳動電極セット間に連続的にまたは同時に電圧を印加することにより、標的被検体が一方の検出電極から他方へ移動することになる。核酸などの負に帯電した標的被検体をさしあたり仮定すると、このシステムは図１Ｆのシステムを用いて以下のように実施することができる。一態様において、電界は陽極５０と陰極として作動する電気泳動電極１０との間に生じ、アニオン標的被検体混合物を電気泳動電極１０と検出電極２０の両方に運ぶが、そこでは標的被検体混合物中の一種の結合が起こり得る。次いでその電界が遮断され、新たな電界が今度は陽極として作動する電気泳動電極１０と、陰極として作動する電気泳動電極１１との間に形成される。これは非結合アニオン種を１０から１１に運び、そこで標的被検体の２つ目の種が結合し得る。この電界が切断され、新たな電界が１１（陽極として作動）と１２（陰極として作動）との間に生じ、非結合標的被検体を新たな検出電極に移動させる（以下同様）。このタイプの方法の利点は、標的被検体集団全体を実質的に各捕獲リガンドに輸送し、その結果、捕獲リガンドに結合する機会のある標的被検体数を最大化することである。
【００７３】
別法として、各パッドでの電気泳動は（負に帯電した標的被検体集団と仮定して）陽極５０と陰極１０、１１、１２および１３との間に生じた電界により同時に実施することができる。これは迅速ではあるが、各検出電極に標的被検体の４分の１のみが「提示される」結果となる（４つのパッドと仮定すれば）。これは態様よっては望ましいことでもあり、望ましくないことでもある；例えば、感度よりもむしろスピードが重要な場合である。
【００７４】
好適な態様においては、関連するが異なるタイプの標的化電気泳動が実施される。この態様において、複数組の電気泳動電極が三次元様式で配置され、標的被検体が異なる位置に移動するのを可能とする。例えば、図２に示すように、電気泳動電極を三次元に配列して使用すると、サンプル溶液を特定の位置、すなわち、個々の検出電極または検出電極のセットに局在化させることが可能となる。このように、例えば、図２を参照すると、電気泳動電極１０および１５、また同時に電気泳動電極１２および１７の間に印加された電気泳動電圧が標的被検体を検出電極２０に移動させることができる。
【００７５】
あるいは、好適な態様においては、複数の電気泳動電極を使用し、特定の位置に特異的に標的化するのではなく、むしろ連結された捕獲リガンドをもつ検出電極の近傍でサンプルを「混合」または「撹拌」することにより、結合反応速度を上げる。例えば、図２に示すように、最初の電気泳動工程は電気泳動電極１８と描出していない第２の電気泳動電極との間で実施し、標的被検体を検出プローブ表面に移動させる、すなわち、上記の「バルク電気泳動」である。次いで、それぞれのパルスを含む電圧、直流または交流電圧をさらなる電気泳動電極のセット間に印加し、標的被検体を輸送し、検出電極上に固相化した捕獲結合リガンドに対する標的被検体の利用能と結合反応速度を増加させることができる。同様に、図１５Ｅに示すように、２セットの電気泳動電極を違う時間に使用して、標的被検体を検出プローブの表面にもたらすことができる。
【００７６】
印加される電界の強度は多くの因子、例えば、これらに限定されるものではないが、電気泳動の所望の時間、サンプルのサイズ（すなわち、標的被検体が移動しなければならない距離）、溶液の組成（すなわち、電気活性帯電担体の存在または不存在とその酸化還元電位）、成分組成（すなわち、電気化学ポテンシャルに対する本発明の特定成分の安定性）、溶液中の電気活性帯電担体の存在または不存在、チャンバーのサイズ、標的被検体の電荷、電極のサイズと位置、電極物質、などにより決定される。
【００７７】
一般に、直流電圧は最初の電気泳動に対し印加され、可能であれば、混合のために直流または交流パルスまたは電界が加わえられる。
【００７８】
印加される電界強度はシステムの他の構成要素に一部左右される。例えば、電極１組のみが使用され、チオール結合がシステムの構成要素を検出電極に結合させるために使用（すなわち、不動態化剤と伝導性オリゴマーを検出電極に付着させること；詳細は下記のとおり）されている場合には、印加される電気泳動電圧はチオール化合物の酸化電位以下、すなわち、一般には１Ｖ未満である。あるいは、より高い電圧を用い得るが、その場合チオール結合は用いない。同様に、２組の電極を使用する場合、すなわち、感受性の化学物質を含む検出電極が高電圧に曝されない場合には、チオール結合をより高い電界強度で使用することが可能である。
【００７９】
このように、一般に、電気泳動電圧は１ｍＶないし約２Ｖの範囲であり、当業者も認めるであろうが、必要な電圧は所望の稼動時間、被検体の正味の電荷、バッファーの存在または不存在、電極の位置、などに左右される。技術上知られているように、電気泳動速度はμ（ｄΦ／ｄｘ）であり、式中のμはイオン移動度である。１組の電極の実施態様にでは、電気泳動電圧は約５０ｍＶないし約９００ｍＶの範囲であり、好ましくは約１００ｍＶないし約８００ｍＶであり、特に好ましいのは約２５０ｍＶないし約７００ｍＶである。２組の実施態様にとって、電気泳動電圧は約１００ｍＶないし約２Ｖまたはそれ以上の範囲であり、好ましくは約５００ｍＶないし約１．５Ｖであり、特に好ましいのは約１Ｖないし約１．５Ｖである。勿論、当業者が認めるように、これらの電圧は被検体の電荷に応じて陽性であっても陰性であってもよい。
【００８０】
低電圧、すなわち、１．２３Ｖ（標準の水素電極を基準として）未満の電圧、水による加水分解が起こる電圧未満、を用いる場合には、溶液中に電気活性物質を含ませることが必要であり、その結果、電流が電極から溶液に流れ、溶液中に電界が形成され得る。電気活性種のタイプと濃度は、電圧、電気泳動に必要とされる時間の長さ（必要とされる距離に関係する、すなわち、サンプル容量）などと共に変化する。好適な態様において、電気活性種の酸化還元電位は検出に使用するＥＴＭの電位よりも高い。例えば、酸化還元電位が３００ｍＶの電気活性電荷担体を使用し、該ＥＴＭの酸化還元電位が１００ｍＶであるならば、電気泳動は３００ｍＶで実施し、それに続く検出は１００ｍＶで実施することが可能であり、電気活性種を除く必要はない。
【００８１】
当業者が認めるように、広範囲の適切な電気活性電荷担体を使用することが可能であり、その例は以下のとおりであるが、これらに限定されるものではない：水性ＦｅＣｌ、Ｆｅ（ＣＮ）６４−／３−およびフェロセンとその誘導体を包含する鉄化合物；Ｒｕ（ＮＨ３）５ｐｙｒおよびＲｕ（ＮＨ３）５Ｈ２Ｏを包含するルテニウムの複合体；Ｃｏ（ＮＨ３）６３＋、Ｃｏ（ｂｐｙ）３３＋およびＣｏ（ｔｒｉｓ）ｂｐｙ３＋などを包含するコバルトの複合体；Ｏｓ（ｂｐｙ）３２＋およびＯｓ（ｔｒｉｓ）ｂｐｙと誘導体を包含するオスミウムの複合体；Ｒｈ（ＮＨ３）４Ｃｌ２を包含するレニウムの複合体；およびヨウ素Ｉ３−。技術上知られるように、一部の酸化還元反応は固形物を生成する（すなわち、可逆的な対はない）。一般に、これらの種は好ましくはないが、一部の事例では検出電極が可溶性反応の場合に使用し得る。このように、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ反応は、ＡｇＣｌ反応が陽極で起こるので、核酸と共に使用してもよい。酸化還元分子の濃度は変化するが、当業者も認めるように、飽和点またはそれ以下の濃度が有用である。この態様において、電気活性電荷担体を使用する場合、電気泳動に際し、システムを混合または撹拌することが必要であることもまた留意すべきである。
【００８２】
電気泳動を利用するいかなるシステムでも、特にアレイ・ベースのシステムでも電気活性電荷担体を使用し得ることが留意されるべきである。例えば、電気活性電荷担体は、米国特許第５，５３２，１２９号、第５，６０５，６６２号、第５，５６５，３２２号および第５，６３２，９５７号、およびその関連出願（これらすべてを出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているような電気泳動アレイシステムで使用し得る。
【００８３】
サンプルを電界に設置し、１つ以上の検出電極に対して電気泳動輸送を実施する。検出電極の構成物は電気泳動電極について上記したとおりであるが、金、シリコン、炭素、白金および金属酸化物の電極が特に好ましい。
【００８４】
好適な態様において、検出電極は基板上に形成する。さらに、本明細書における検討は一般的に金電極の形成に向けられているが、当業者も認めるように、他の電極も同様に使用し得る。基板は、当業者も認めるように、多様な物質を含むが、プリント回路基板（ＰＣＢ）物質がとりわけ好ましい。このように、一般的に、適切な基板はこれらに限定されるものではないが、ファイバーグラス、テフロン、セラミック、ガラス、シリコン、雲母、プラスティック（アクリル、スチレンと他の物質とのポリスチレンおよびコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、およびその誘導体など）、ＧＥＴＥＫ（プロピレンオキシドとファイバーグラスの混合物）などである。
【００８５】
一般に、好適な物質はプリント回路基板物質である。プリント回路基板物質は伝導層で被覆されている絶縁基板を含む物質であり、リトグラフィー技法、特に露光リトグラフィーにより処理加工して、電極と相互接続体の型を形成する（場合により技術上、相互接続またはリード線という）。絶縁基板はすべてというわけではないが、一般にポリマーである。技術上知られているように、１層または複数層を使用し、「二次元」基板（例えば、すべての電極および相互接続体が同一平面にある）または「三次元」基板（この場合、電極は１方の表面にあり、相互接続体が基板を貫通して他側へ出てもよい）を作製する。三次元システムは多くの場合、穿孔またはエッチングを使用し、次いで、銅などの金属で電気メッキし、「貫通基板」相互接続を作製するようにする。回路基板物質はしばしば基板にすでに付着した銅箔などの箔を備えており、必要により（例えば、相互接続のために）、例えば、電気メッキによりさらに銅が加えられる。銅の表面は、次いで、粘着層の付着を可能にするために、例えば、エッチングによりざらつかせる必要がある。
【００８６】
一部の態様において、ガラスは基板として好ましくない場合がある。
【００８７】
従って、好適な態様において、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を含む基板を含むバイオチップ（場合により本明細書では「チップ」という）を提供する。電極数はアレイについて概説したとおりとする。各電極は、好ましくは、本明細書に概説したように自己集合した単層を含む。好適な態様において、単層形成種の１つは本明細書に概説したように捕獲リガンドを含む。さらに、各電極は相互接続をもち、それが一端で電極に付着し、最終的に電極を制御し得る装置に付着している。すなわち、各電極は独立してアドレス参照可能である。
【００８８】
該基板はより大きな装置の部分であってもよく、該装置は検出電極に一定容量のサンプルを暴露する検出チャンバーを含む。一般に、検出チャンバーは約１ｎＬないし１ｍｌの範囲であり、好ましくは約１０μＬないし５００μＬである。当業者が認めるように、実験条件およびアッセイによっては、より少量またはより大量を用いてもよい。
【００８９】
一部の態様において、検出チャンバーと電極は電極構成要素（交流／直流電圧源、電流計、プロセッサ、読み出しディスプレー、温度制御器、光源など）を含む装置内に配設し得るカートリッジの部分である。この態様において、各電極からの相互接続は、装置内にカートリッジを挿入することにより、電極と電子組成間の接続が確立するような位置に配置する。
【００９０】
回路基板物質（または他の基板）上の検出電極は一般に多様な方法で調製される。一般に、高純度の金を用い、真空蒸着法（スパッタリングおよび蒸発）または溶液析出（電気メッキまたは無電解方法）により被覆してもよい。電気メッキを実施する場合には、基板はまず伝導性物質を含まねばならない；ファイバーグラスの回路基板は多くの場合銅箔を備えている。多くの場合、基板によっては、良好な機械的安定性を保証するために、基板と金の間に粘着層が用いられる。このように、好適な態様では、粘着金属、例えば、クロム、チタン、チタン／タングステン、タンタル、ニッケルまたはパラジウムなどの析出層を利用するが、これらの金属は上記金同様に析出させ得る。電気メッキ金属（粘着金属または電極金属）を使用する場合、粒状精製添加物（多くの場合、業界では光沢剤という）を任意に加えて、表面析出性を変化させる。好適な光沢剤は有機物および無機物の混合物であり、コバルトとニッケルが好ましい。
【００９１】
一般に、粘着層は約１００Åから約２５ミクロン（１，０００マイクロインチ）の厚さである。もし粘着金属が電気化学的に活性であるならば、電極金属は「染み出し」を防止する厚さで被覆しなければならない；もし粘着金属が電気化学的に不活性であるならば、電極金属は薄くてもよい。一般に、電極金属（好ましくは金）は約５００Åから約５ミクロン（２００マイクロインチ）の範囲の厚さで、好ましくは約３０マイクロインチないし約５０マイクロインチの厚さで析出させる。一般には、金を析出させて、直径約５ミクロンないし約５ｍｍの範囲、好ましくは約１００ないし２５０ミクロンのサイズの電極とする。このようにして形成される検出電極は、好ましくは、清浄にし、以下に検討するようにＳＡＭを付加する。
【００９２】
このように、本発明は複数の金電極を含む基板の作製法を提供する。この方法はまず基板上に、ニッケルまたはパラジウムなどの粘着金属を（選択肢として光沢剤と共に）被覆することを含む。電気メッキが好ましい。次いで、電極金属、好ましくは金を粘着金属上に（好ましくは再度電気メッキにより）被覆する。次いで、電極とそれに繋がる相互接続を含む装置の型をリトグラフ技法、特に技術上既知の露光リトグラフィー技法、および湿式化学エッチングにより作製する。多くの場合、非伝導性化学抵抗性絶縁物質、例えば、蝋マスクまたはプラスティックを露光リトグラフィー技法により敷き、露光した電極とリード線への接続点のみを残す；リード線はそれ自体一般に被覆されている。
【００９３】
本方法ではＳＡＭの付加が続く。好適な態様においては、点滴析出技法を用い、必要な化学物質、すなわち、単層形成種であって、その一つは、好ましくは捕獲リガンド構成種、などを付加する。点滴析出技法は「スポット」アレイ作製について周知である。これは各電極に異なる構成物を付加するために実施する。すなわち、異なる捕獲リガンドを含む配列を作製する。あるいは、ＳＡＭ種は各電極について同一であってもよく、この場合は点滴析出技法またはその溶液に基板全体もしくは基板表面を浸漬する方法により実施してもよい。
【００９４】
好ましい実施態様では、検出電極を通過するサンプルの流動が最大になるようにシステムを配置する。図１５に一般的に描写するように、このことを可能にする様々な方法がある。好ましい実施態様では、中にチャンネルまたは穴（これらは本明細書で孔またはバイア（ｖｉａ）とも呼ばれる）がある基板上に検出電極を配置する。電気泳動電極を、この基板の反対側に置く。電界の導入により、サンプルは検出電極を通って、または通過して移動し、かくしてより高いハイブリダイゼーション反応速度がもたらされる。
【００９５】
当業者に了知されるであろうように、電気泳動電極の配置は変化し得る。好ましい実施態様では、検出電極と少なくとも１つの電気泳動電極を基板の第１の表面に置き、そして少なくとも第２の電気泳動電極は基板の第２の表面にある（一般的な平面の基板を想定している；当業者に了知されるであろうように、他の配置もまた可能である）。あるいは、検出チャンバーの表面が電気泳動電極を含み得る；つまり、これらの電極を基板から離して、基盤の他の側に置くことが可能である。さらに、本明細書で一般的に概説するように、複数の電気泳動電極を使用できる。
【００９６】
好ましい実施態様では、これらのチャンネルは、電気泳動を遂げるためにイオンは通過させるが、標的被検体は通過させない物質で満たされる。例えば、チャンネルは、本明細書で定義する浸透層物質で満たされる。
【００９７】
好ましい実施態様では、ゲル様物質の利用よりも、むしろチャンネルの一端または両端に膜を置く。好ましくは、この膜は、電気泳動を遂げるためにイオンの動きは可能にするが、標的被検体は通過させず、従って標的被検体を検出電極の近傍に濃縮する。
【００９８】
好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションの促進は、システムの配置と吸収物質の組合せを用いて達成される。この実施態様では、図１６に一般的に描写するが、検出チャンバーは２つのサブチャンバーを有し、これらは一般的にゲル基質または膜などのサイズ排除隔壁によって隔てられている。１つのチャンバーは、サンプル導入の流入口を含み、検出電極を含む。もう１つのチャンバーは、サンプルの水性溶液を吸着できる吸収物質を、通常は乾燥状態で含む（しかし、サンプルが有機相にあり、吸収物質は有機相の溶液を吸着するであろう場合がる）。
【００９９】
このように、好ましい実施態様では、サイズ排除隔壁が用いられる。本明細書で「サイズ排除隔壁」は、成分をその分子量に基づいて排除する物質を意味する。従って、例えば、ゲル基質（本明細書において浸透層で概説するようなもの。アクリルアミド、アガロースなど）または当分野で周知のようなサイズ排除遮断膜を使用する。いくつかの実施態様では、特に標的被検体がシステムの他の混入成分に比べて大きい分子量を有する場合、膜またはゲルによる分子量の遮断は、複雑さを減少させる工程を行うためにも選択される。つまり、例えばリボソームＲＮＡが標的被検体である場合に、平均的なｍＲＮＡを通過させるサイズ排除隔壁を使用する。同様に、標的被検体が大きいゲノムＤＮＡを含む場合、ｍＲＮＡと断片化したＤＮＡを通過させる、分子量の遮断物を用いることができる。
【０１００】
この実施態様では、サンプル導入に際して、検出チャンバーで標的被検体を濃縮しながら、標的被検体を含有する水性溶液を、検出電極を含む検出チャンバーから吸着チャンバーへ移動させる。従って、例えば、１ｍｌのサンプルを、０．９５ｍｌの吸着チャンバーを有するカートリッジに注入すると、標的被検体は検出チャンバー中で２０：１に濃縮される。
【０１０１】
好ましい実施態様では、検出チャンバーおよび吸着チャンバーは電極を含む基板中の孔またはバイアによって隔てられているが、いくつかの実施態様ではサイズ排除隔壁の「上に」検出電極があることも可能である。
【０１０２】
この実施態様では、吸着を助長するために、カートリッジ中の各チャンバーの容積を調整することが望ましい。つまり、検出チャンバーの容積がサンプルの容積と同じかまたはより少ない場合、チャンバーへサンプルを注入しても、吸収物質が乾燥保存状態にあれば、吸着に至らないかもしれない。しかし、サンプルの容積が検出チャンバーの容積よりもわずかに大きければ、仕切られたチャンバーにサンプルを注入することにより、吸収物質を「湿らせる」ことを押し進めることができ、かくして毛管現象を通じて反応を引き起こす。従って、好ましい実施態様では、液体が吸着チャンバーに「押し込まれる」ように、検出チャンバーの容積はサンプルの容積よりわずかに小さい。
【０１０３】
さらに、サイズ排除隔壁の使用によって、サンプル容積に基づくハイブリダイゼーションの促進が可能になる。つまり、膜やゲル基質のようなサイズ排除隔壁の使用によって、水性溶液をサイズ排除隔壁を通じて吸着チャンバーへ押しやりながら、大容積のサンプルを検出チャンバーに導入し得る。従って、例えば、サンプルの容積が５ｍｌ、検出チャンバーの容積が１ｍｌ、吸着チャンバーが４ｍｌならば、サンプルの容積中の標的被検体の５倍の濃縮が達成される。当業者に了知されるであろうように、このことは吸着チャンバー内に吸収物質があっても無くても行われ得る。この実施態様で重要なことは、サイズ排除隔壁が、標的披検体が検出電極の近傍から離れるのを防ぐということである。さらに、いくつかの実施態様では、サンプルチャンバーの容積は調整可能である；つまり、サンプルの導入に際しては、サンプルチャンバーは全サンプルを保持するために十分大きい。しかし、サンプル溶液が吸着チャンバーに「引きこまれる」につれて、サンプルチャンバーの容積は、例えば膜や曲げやすい封の使用を介して、減少する。このようにして、濃縮された標的被検体を、検出電極の近傍に保持する。
【０１０４】
当業者に了知されるであろうように、図１６に一般的に描写するように、該システムは数々の配置をとることができる。
【０１０５】
好ましい実施態様では、吸収物質を電気泳動と合同で使用し得る。つまり、図１６に一般的に描写するように、本明細書で概説する配置を「混合する」ことを含む、使用され得る数々の配置がある。
【０１０６】
さらに、図１３Ｂに描写するように、サンプルが、電気泳動チャンネルに沿って置かれた数々の検出電極を通過して流動するのを可能にするように、システムを配置する。つまり、本明細書で概説するように、できるだけ多くのサンプルを検出電極に接触させるために、サンプル受取チャンバーを配置し得る。
【０１０７】
同様に、２つの電極システムを用いる場合、好適な態様では第１および第２電気泳動電極間に設置した多孔性検出電極を利用するが、それによって標的が検出電極を「通過」するようにし、標的被検体と検出電極の接触を最大化するようにする。例えば、ポリカーボネートの微細孔膜を電子顕微鏡分析用に金スパッター被覆する。あるいは、金被覆ポリアニリンを使用することができる。このように、０．０１ないし２０μｍの範囲の極めて均一な細孔サイズを有する金電極を作製し得る。同様に、１０μｍ細孔のシリコン・ウエハーが標的配列の捕獲を７００倍上昇させる遺伝子センサーとして使用するように開発されている。流速、パッド領域、孔径、深さ、および電気泳動パラメーターを調整することにより、サンプル中の標的被検体の実質的に１００％を検出電極に結合させ得る。
【０１０８】
多数の電気泳動工程を用い得ることも留意すべきである；例えば、システムの構成成分は連続的に添加し得るが、検出電極に試薬を送達するために各添加後に電気泳動工程を実施する。同様に、電気泳動は「洗浄」工程を実施するために使用してもよいが、その場合、過剰の試薬（非結合標的分子または非結合の余分の結合リガンド成分など）は検出電極から排除される。このように、電気泳動工程はいずれかを組合わせて使用することができる。さらに、電気泳動工程の時間が変更可能である。
【０１０９】
さらに、本明細書に概説するように、電気泳動工程は検出電極表面に被検体を濃縮するための他の技法と組合わせることもできる。例えば、図１３に示すように、このシステムはサンプルが検出電極の一方向に流れるように、反対方向の電気泳動の流れと連結して構成することができるが、それによって標的被検体を効率的に濃縮し得る一方、他のサンプル成分（特に未変化の成分または被検体と逆の電荷をもつ成分）を「洗い流す」ことができる。この態様において、電界強度は標的のサイズと電荷に基づいて調節し、標的が検出電極に相対的に固定された状態とする。
【０１１０】
さらに、当業者に了知されるであろうように、ハイブリダイゼーションを最大限促進するために、サンプル受取チャンバーを形成することも可能である。例えば、全サンプルが電気泳動の領域に収まるように、チャンバーを配置し得る；このことは、幅広く多様な方法で行われ得る；例えば、異なる幾何的形態（三角形など）を用いる、電極にチャンバーの１つまたはそれ以上の表面を覆わせる、などによる。
【０１１１】
好適な態様において、標的被検体の濃縮はアッセイ試薬混合物中で少なくとも１つの容積排除剤を用いることにより達成される。この態様において、容積排除剤は溶媒とイオンなどの小分子を吸収するが、標的被検体などの大型分子は排除するものであり、これを包含させることで標的被検体を見掛け上より小さな容積に濃縮し、それによって標的被検体が遭遇する有効な拡散容量を縮小し、それによって標的が捕獲リガンドを見つけ出す可能性を増大させる。当業者が認めるように、容積排除剤は検出電極に接近するサンプルを必ずしも濃縮するものではない；むしろ、標的被検体が遭遇するまたは存在する有効な拡散容量を縮小するものである。
【０１１２】
このように、本発明方法は少なくとも１種の容積排除剤をアレイ混合物に添加することを含む。当業者が認めるように、この操作は実質的にアッセイのどの段階で実施してもよく、例えば、他の試薬類（例えば、標識プローブなど）を添加する前に排除剤とサンプルを事前に混合すること、１種以上の他のアッセイ試薬と共に、またはアッセイ試薬の添加後に排除剤を添加することなどである。あるいは、サンプルの存在下で膨潤するような容積排除剤（例えば、アガロース、セファデックス、セファロース、ポリアクリルアミドなど）で検出チャンバーを予め被覆してもよい。一部の態様において、標的被検体に対し非貫通性の膜を使用し、検出電極から容積排除剤を分離することもできる。同様に、システムの他の構成部分は、膨潤性の容積排除剤、例えば、本明細書に記載した磁性粒子などで被覆してもよい。一般に、該試薬を他のアッセイ試薬と共に加えることが好ましい。添加後は、当業者が認めるように、一般的にはインキュベーション工程がある。
【０１１３】
適切な容積排除剤は技術上既知であり、これらに限定されるものではないが、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ポリ硫酸、ヘパリン硫酸、ヘスパン、高分子量核酸などである。例えば、以下の文献を参照：Ａｍａｓｉｎｏ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １５２：３０４ （１９８６）； Ｗｅｔｍｕｒ， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １４：２５１７ （１９７５）； Ｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３４３５ （１９８４）； Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：３６８３ （１９７９）； ａｎｄ Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １５：５３７３ （１９８７）； これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする。さらに、これら試薬の混合を実施してもよい。容積排除は濃縮工程であるが、排除剤は以下に述べるようにハイブリダイゼーション促進剤とも考え得ることを留意すべきである。
【０１１４】
好適な態様において、標的被検体の濃縮は標的被検体を沈殿させることによって実施される。これは特に核酸について有効である。すでに示されているように、核酸の沈殿はハイブリダイゼーション速度を５０倍ないし１００倍増大する；ＥＰ０２２９４４２Ａ１（出典明示により本明細書の一部とする）参照。上記のように、沈殿は濃縮工程であるが、沈殿剤は以下に説明するようにハイブリダイゼーション促進剤とも考え得る。好適な態様においては、２本鎖核酸を沈殿させるが、１本鎖核酸は沈殿させない条件を選択し、これが強力な推進力となり、非特異的損失を削減する。
【０１１５】
適切な核酸沈殿剤は、これらに限定されるものではないが、以下のとおりである：少なくとも１種の強力な塩析カチオンまたはアニオン基を含む塩（ＳＯ４、ＰＯ４、ＬｉおよびＣＯＯＨのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩）；本反応溶液と混和し得る、沈殿性もしくは塩析性を有する有機化合物、例えば、これらに限定されるものではないが、デタージェント（Ｐｏｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８： ８２３７ （１９９１）参照；出典明示により本明細書の一部とする）、ジヒドロキシベンゼン、サルコシル（Ｎ−ラウロサルコシン・ナトリウム塩）、ドデシル硫酸ナトリウム、ジイソブチルスルホコハク酸ナトリウム、およびテトラデシル硫酸ナトリウム。各試薬の適切な濃度は出典明示した文献に記載されている。以下に概説するいくつかの応用例では、デタージェントは、実際には核酸を沈殿させるものではなく、むしろハイブリダイゼーション促進剤として添加される。
【０１１６】
さらに、ＥＰ０２２９４４２Ａ１に記載されているように、さらなる試薬、例えば、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ＳＫ、ＰＫ、ＥｔＯＨ、尿素、グアニジンＨＣｌ塩、グリコーゲン、希アンフィルなどを添加してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、既知濃度の少なくとも１種の核酸変性剤、例えば、アルコールを添加してもよい。
【０１１７】
上記のように、核酸沈殿剤の添加は実質的にアッセイのどの段階で実施してもよく、例えば、他の試薬類（例えば、標識プローブなど）を添加する前に該沈殿剤とサンプルを事前に混合すること、１種以上の他のアッセイ試薬と共に、またはアッセイ試薬の添加後に該沈殿剤を添加することなどである。一般に、該試薬を他のアッセイ試薬と共に加えることが好ましい。添加後は、当業者が認めるように、一般的には再度インキュベーション工程がある。
【０１１８】
好適な態様において、濃縮は、２つの分離可能な溶液相を形成する少なくとも２種の試薬を包含させることにより実施し、標的被検体が当該相の一方にまたは界面に濃縮されるようにする。技術上知られているように、もしサンプルが２相に分離し得る溶液相に向けられるならば、被検体は一方の相から他方に移動し、結果として一方の相に濃縮されることとなり、あるいは一部の状況下では、２相間の界面で濃縮が起こる。例えば、以下の文献を参照：Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０３： １−１２ （１９６５）； Ｋｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６ （２４）： ５３２９ （１９７７）； Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈ． ７ ｉｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８５； Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８： ２６９ （１９８１）； これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする。このように、サンプル容量、各相の容量、検出電極チャンバーおよび検出電極の位置を設定することにより、電極での好適な濃縮を達成し得る。Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈ． ７ ｉｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８５ およびＡｌｂｅｒｔｓｓｏｎ（前出）に示されているように、分配は、イオン強度とイオン種双方を含む電解質組成、ポリマー濃度、核酸のサイズ、核酸の構造および／または複雑さ、およびある種リガンドの存在または不存在などにより影響される。
【０１１９】
好適な態様において、リガンドは分配混合物に含ませ、分配を実施することができる。Ｍｕｅｌｌｅｒ らの両文献に示されているように、核酸に結合するリガンドを包含させることで分配を果たすことができる。このように、例えば、ＰＥＧなどのヘテロアルキル鎖に共有結合した核酸結合色素を用いることにより、分配係数を著しく上昇させることができる。Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１８：２６７ （１９８１）； および Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２８： ２３１ （１９８２）参照（両文献を出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１２０】
好適な態様において、フェノール・エマルジョン再会合技法（ＰＥＲＴ）を上記 Ｋｏｈｎｅ ら記載どおりに実施する。この態様においては、フェノールと水（または他の水性溶液）を適切な比率で添加し、振盪または混合し、エマルジョンを形成する。振盪を止め、エマルジョンを壊し、２相を形成する。１本鎖核酸と塩を水相に添加することで、極めて急速にハイブリッドが形成される。上記 Ｋｏｈｎｅ ら記載どおりに、核酸ハイブリダイゼーション速度は以下に左右される：（ａ）エマルジョンの存在；（ｂ）イオンの型と濃度；（ｃ）インキュベーションの適切な温度；（ｄ）適当なｐＨ；（ｅ）エマルジョンの撹拌速度と方式；（ｆ）存在するフェノール量；（ｇ）核酸の断片のサイズ；（ｈ）核酸の複雑さ；および（ｉ）核酸濃度。
【０１２１】
さらに、分配化はタンパク質についても既知である；Ｇｉｎｅｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３４：４００ （１９８４）（出典明示により本明細書の一部とする）参照。
【０１２２】
好適な態様において、容積排除および分配化は同時に実施してもよい。例えば、デキストラン（３〜８％）およびＰＥＧ（３．５〜６％）を混合し、分離した相を形成する。カチオンまたはアニオンの比をシフトさせ、高分子量核酸を一方の相から他方へ移動させ、二重らせんの形成を誘発する。
【０１２３】
好適な態様において、濃縮工程はシャトル粒子を用いて実施する。一般に、この技法は以下のように説明し得る。重力により検出電極上に静置するか（例えば、検出電極がチャンバーの「底部」にある場合）、浮遊するか（例えば、検出電極がチャンバーの「上部」にある場合）、または検出電極と会合するように誘発され得る（例えば、磁性粒子の使用による）シャトル粒子が使用される。これらのシャトル粒子はアッセイ溶液中で標的被検体と会合する結合リガンド（一般に必ずしも非特異的とは限らない）を含み、標的被検体を検出電極に往復輸送するが、そこで被検体は遊離され捕獲結合リガンドに結合する（以下に概説するように直接または間接に）。当業者が認めるように、シャトル結合リガンドは、好ましくは、アッセイ複合体の構成分、すなわち、捕獲結合リガンドよりも余り強固ではなく標的被検体と相互に作用する。すなわち、シャトル粒子との相互作用は、検出電極に結合しようとする標的被検体の遊離を可能とするために十分に弱くなければならない。
【０１２４】
好適な態様において、標的被検体は核酸であり、シャトル粒子は多くの様式で構成され得る。あるシステムにおいて、シャトル粒子は一般に標的被検体に結合し得る短鎖（すなわち、４ないし１０であり、使用する温度に左右されるが、より長くてもよい）の核酸プローブを含む。これらは特異的（すなわち、標的被検体に特異的な短鎖配列を含む）であっても、または非特異的（すなわち、サンプル中の核酸すべてを表面に往復輸送するランダム・プローブ）であってもよい。核酸が粒子に付着するのは既知である；例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１０５，８７５および Ｃｈａｄ Ｍｉｒｋｉｎ の資料を参照。同様に、非核酸標的については、多様な結合親和性をもつリガンドが使用し得る；例えば、タンパク質に弱く結合する抗体をビーズに付着させ、より親和性の強い抗体を表面上の捕獲リガンドとして作用してもよい。あるいは、溶液変化を用いてビーズから表面への伝達を推進してもよい。
【０１２５】
あるいは、核酸およびタンパク質を含む他のタイプの被検体については、粒子を修飾し（例えば、アミン部分（リジン部分など）またはカルボキシ基での誘導化により）、標的と粒子が静電相互作用するための電荷を保持させてもよい。
【０１２６】
好適な態様において、再度、標的被検体が核酸である場合、シャトル粒子は核酸結合成分を含んでいてもよく、それが１本鎖または２本鎖核酸に結合する。例えば、層間物質を含む粒子は既知である；米国特許第５，５８２，９８４（その全文を出典明示により本明細書の一部とする）参照。同様に、１本鎖または２本鎖結合タンパク質を含む粒子を作製し得る。検出表面での標的被検体は既知の技法、例えば、加熱、ｐＨ変更、塩変更などにより遊離し得る。これらの粒子はすべての標的被検体に結合して、残余のサンプルを洗い流すかまたは除去することを可能にするか、または標的被検体を含む粒子をサンプルから取出すことを可能にするので、サンプル調製に使用し得るということを留意すべきである。
【０１２７】
好適な態様において、電極表面または本明細書に記載の基板表面は、標的被検体に対する結合を増大させるか、および／または有効拡散空間を縮小するように変更することが可能である。すなわち、三次元（検出チャンバー）から二次元（検出表面）に縮小すると、結合反応速度を有意に上昇させる。この縮小はいくつかの方法で達成し得る。例えば、好適な態様において、ＳＡＭの末端基は標的被検体と逆の電荷の静電基をもつように修飾することができる。このように、特定の標的分子が表面と会合する時間が増大し、拡散は三次元よりも二次元において好適に起こる。これが標的被検体を拡散層から検出表面上に有効に移動させ、新たな標的被検体を拡散層に運ぶ勾配を形成する。このように、例えば、カチオン末端不動態化剤、例えばＨＳ−ＣＨ２−ＮＲ３＋などを用いてもよい。あるいは、検出チャンバーの基板全体（すなわち、個々の電極周辺領域）を、本明細書に記載のシャトル粒子同様、弱く結合するリガンドで被覆し、結合リガンドの「芝生」を形成してもよい。例えば、特異的に標的配列に結合するか、または相対的に短い非特異配列であるオリゴヌクレオチド・プローブを表面上で用いることができる。標的配列とこれらの表面プローブとの会合に基づき、結合と遊離の平衡を介しての拡散は、三次元の拡散よりもむしろ二次元の拡散を可能にする。この態様において重要なことは、表面リガンドと標的被検体間の相互作用は捕獲リガンドよりも弱く、その結果、捕獲リガンドへの結合が優先することである。これは核酸の場合にはプローブの長さにより制御し得る；捕獲プローブは一般に表面プローブよりも長い。当業者が認めるように、これらの技法は単独で、または本明細書に概説した他の促進技法のいずれかに加えて実施し得る。
【０１２８】
さらに、以下により詳しく記載するように、粒子を「混合粒子」としても使用することができ、検出電極近傍の溶液を撹拌する働きをし、かくしてハイブリダイゼーションを増加させる。
【０１２９】
好適な態様において、結合の促進は、所定の時間内に検出電極に結合し得る標的被検体量を最大化するようにシステムを構成することで実施される。この操作は、例えば、標的被検体を含む大容量のサンプルを、標的被検体が検出電極と会合する可能性が高くなるように検出電極に流すか、露呈することにより実施する。
【０１３０】
従って、好適な態様において、本方法は標的被検体を含むサンプルを検出電極に流し、アッセイ複合体を形成させることを含む。この態様において、標的被検体の濃縮は単位時間当たりに大量のサンプルが検出電極と接触する結果として起こり、停滞するサンプルに比較し結合時間をも短縮させる。このように、好適な態様において、電気泳動について上述したように、検出電極を含む装置は、サンプルが検出電極を通過流出するように構成することができる。このように、好適な態様では、金電極などの多孔性電極を、上記概説のように、サンプル・フロー・チャンネルに位置するように利用する。例えば、ＷＯ９５／１１７５５（出典明示により本明細書の一部とする）参照。サンプルは必要であればさらに再循環してもよい。回転式ディスク電極も好ましい。
【０１３１】
このように、好適な態様においては、検出電極と周囲領域をサンプルが混合されるように構成するが、それがこの拡散層を撹乱するように働き、表面に大きく接近するのを可能にする。例えば、一態様において、検出電極は狭いサンプル・チャンネルに設置する。このように、実質的に、検出電極はチャンネルの周長を囲むバンドまたはゾーンである。再度、上記概説のように、再循環が生じ得る。
【０１３２】
別の態様において、チャンバーに関して、電極を通過するサンプルの流動が混合またはサンプル乱流を起こすように、検出電極を構成する。例えば、一態様において、検出電極はチャンバーに関して「くぼみ」または「へこみ」であり、電極を通過するサンプルの流動（フロー）を混合するようにする；図１３参照。この効果は盛り上がった表面、ある場合には本明細書において「ワイヤ」と呼ぶものを、混合を引起す電極（くぼみ電極を含む）の縁に設けることにより高めることができる。
【０１３３】
本明細書に開示した方法のいずれかに加えて、またはその代りに、好適な態様では粒子を「混合ボール」として利用する。本明細書にて「粒子」または「ミクロ粒子」または「ナノ粒子」または「ビーズ」または「ミクロ球」とはミクロの粒状物を意味する。当業者が認めるように、該粒子はその用途により様々な物質を含むことができる；例えば、これらに限定されるものではないが、架橋デンプン、デキストラン、セルロース、タンパク質、ポリスチレンとメチルスチレン並びに他のスチレン共重合体を含むスチレンポリマーを含む有機ポリマー、プラスティック、ガラス、セラミック、アクリル・ポリマー、磁気応答物質、コロイド、トリア・ゾル、炭素黒鉛、二酸化チタン、ナイロン、ラテックス、およびテフロンなどがすべて使用し得る。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ からの”Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ” は有益な案内書である。好適な態様では、下記概説のように、磁性粒子を利用する。さらに、ある事例では、混合粒子はミクロ粒状物を含む必要がない；例えば、重力混合では（すなわち、装置の撹拌に基づく混合のため）サンプルとは異なる密度の成分を使用することができる；気泡も例えば混合粒子として使用し得る。
【０１３４】
他の態様において、混合粒子は高い誘電率をもつものを選択し、該粒子が、集光または拡散無線周波（ｒｆ）場により生成させ得る電磁場勾配を当てることで取出せるようにする。ある場合にはまた、粒子は反磁性物質を含んでいてもよい。かかる粒子は線形磁場を当てても本質的に影響を受けないが、非線形磁場を当てることで取出し得る；非線形磁場は非線形磁石を用いるか、または大型の線形磁石を小型の強磁性または常磁性混在物と組合わせて用いることで加え得る。
【０１３５】
粒子サイズはその構成物に依存する。粒子は球状である必要がない；不揃いの粒子を使用してもよい。さらに、粒子は多孔性であってもよく、それによって部分の付着のために利用し得る粒子の表面積を拡大し得る。一般に、粒子サイズはその組成分と共に変わる；例えば、磁性粒子は一般にコロイド粒子よりも大きい。このように、粒子は１〜５ｎｍ（コロイド）ないし２００μｍ（磁性粒子）の範囲の直径を有する。
【０１３６】
当業者が認めるように、粒子はアッセイのどの時点でも、すなわち、サンプルの添加前、添加に際し、または添加後に加えることができる。
【０１３７】
粒子はより多くの標的が結合するようにサンプルを撹拌する助けとなる。これは多くの方法で達成し得る。例えば、粒子を検出チャンバーに加え、チャンバーまたは装置全体を掻き混ぜる。好適な態様においては、技術上既知の磁性ミクロ粒子などを使用し得る。好適な態様においては、第１粒子は磁性粒子または磁性の発揮を誘発し得る粒子である。本明細書での「磁性」とは、該粒子が強磁性、常磁性、および反磁性を含む磁場に吸引されることを意味する。この態様において、粒子は、好ましくは、直径が約０．００１ないし約２００μｍ、さらに好ましくは約０．０５ないし約２００μｍ、特に好ましくは約０．１ないし約１００μｍ、とりわけ好ましいのは約０．５ないし１０μｍである。
【０１３８】
この態様において、磁場の方向および／または強度は、例えば、検出チャンバー周囲に多様な方向にビーズを動かす電磁石を設置することで変化させることが好ましい。このように、例えば、往復輸送と混合用粒子としての磁性シャトル粒子の使用が多様な磁場により遂行し得る；該磁場により、粒子を検出電極に移動し、また、検出電極表面でビーズをかき混ぜる。あるいは、非磁性粒子を加え、上述の流動型混合を強化し得る。
【０１３９】
ミクロ粒子のサイズは本明細書記載のように変化する。４．５μｍのミクロ粒子は溶液中拡散の影響を比較的受けずに固相支持体上に留まることが観察されているが、同じサンプルにおいて、１．０μｍの粒子は固相表面から離れて懸濁状態のままにあり、拡散を強めるように思われる。このように、大きな粒子は、流動と組合わせた場合に拡散層内で遊離した状態で移動し得る。
【０１４０】
さらに、粒子は促進作用と組合せるために、例えば、本明細書記載の容積排除剤またはハイブリダイゼーション促進剤により化学的に変化を加えてもよい。
【０１４１】
当業者が認めるように、上記のシャトル粒子は混合粒子としての二重機能をもつことも可能である。
【０１４２】
このように、本発明は検出電極と混合粒子を含む構成物、および当該構成物を用いる標的被検体の検出方法を提供する。
【０１４３】
さらに、技術上知られているように、表面における標的捕獲の律速段階の一つは、分子が固相近辺の境界層を横切る拡散であると考えられる。この境界層はサンプル流動の間にもよく混合しているようには見えない。この境界層およびその統計的深度は溶媒、固相および液相の性質の関数である。従って、これらのパラメーターの変化は、標的被検体が表面に達するために通過しなければならない境界層を「縮小」するように作用し得る。例えば、液相の有機含量を調節し、被検体がより表面に接近し易いようにする。このことに影響し得る他のパラメーターは粘性、表面電荷、標的の二次および三次構造、および温度である。
【０１４４】
好適な態様において、標的被検体が核酸である場合、結合促進はハイブリダイゼーション促進剤を使用することにより実施する。この態様において、検出電極に対する標的被検体の結合はハイブリダイゼーション促進剤の存在下に実施する。本明細書に説明するように、核酸ハイブリダイゼーションの速度を事実上上げる様々なハイブリダイゼーション促進剤が存在し、例えば、核酸結合タンパク質、塩、多価イオン、およびデタージェントなどであるが、これらに限定されるものではない。
【０１４５】
好適な態様において、ハイブリダイゼーション促進剤は核酸結合タンパク質である。技術上示されているように、ある種の結合タンパク質は１本鎖核酸のハイブリダイゼーション速度を増進する；Ｐｏｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：８４０３ （１９９０） および米国特許第５，０１５，５６９号（両文献を出典明示により本明細書の一部とする）参照。このように、例えば、ｈｎＲＮＰ（Ａ１ｈｎＲＮＰ）およびｒｅｃＡはすべて２本鎖核酸のアニーリング速度を上げることが知られている。他の１本鎖核酸結合タンパク質および主要および少数派定型結合タンパク質も使用し得る。適切な条件は既知であるか、またはその技術から説明される。
【０１４６】
好適な態様において、ハイブリダイゼーション促進剤は塩である。技術上知られているように、高濃度の塩を含有させ、ハイブリダイゼーション速度を上昇させ得る；ＥＰ０２２９４４２Ａ１（出典明示により本明細書の一部とする）参照。一般に、大まかに２Ｍまでの塩濃度がハイブリダイゼーション速度を上昇させ得る。適切な塩は以下のとおりであるが、これらに限定されるものではない：塩化ナトリウム、塩化セシウム、リン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および塩化アンモニウム。
【０１４７】
好適な態様において、ハイブリダイゼーション促進剤は多価イオンである。Ｍｇ＋＋など原子価の高いイオンは静電的相互作用を介して核酸鎖の親和性を増進し、かくして、ハイブリダイゼーションを促進する。さらに、これらの多価イオンは潜在的に表面上でのパッキングに影響し得る；すなわち、表面上の核酸密度が増大するにつれ、陰性電荷が蓄積し、それが引続くさらなる核酸の結合を阻害する。従って、「塩橋」として働き得る多価イオンを含有させると、ハイブリダイゼーションを増進させるように働き得る。Ｍｇ＋＋は同様の効果をもつ。
【０１４８】
さらに、Ｍｇ＋＋などのある種のイオンは、ＲＮＡでの結合を他の方法によって改善することが示されている。ＲＮＡはＭｇ＋＋イオンの周囲にループを形成し、Ｍｇ＋＋と配位する安定な二次構造になる。Ｍｇ＋＋を取除くと、ＲＮＡが他の構造に変化し、その構造もまた安定であり得る。しかし、遷移段階は到来するプローブの接近性を高める期間である。従って、Ｍｇ＋＋を、次いでＥＤＴＡまたは同様のキレート化剤を連続して繰返し加え、この遷移段階を経て循環させ、結合を高める。
【０１４９】
好適な態様において、ハイブリダイゼーション促進剤はデタージェントである；Ｐｏｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８２３７ （１９９１）（出典明示により本明細書の一部とする）参照。この事例において、ある種のデタージェントは１０４倍もハイブリダイゼーション速度を上昇させ得る。適切なデタージェントは、これらに限定されるものではないが、カチオン・デタージェントであり、これらに限定されるものではないが、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）および臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ），並びに他の種類の臭化四級アミン・テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＢ）である。
【０１５０】
上記方法はすべて所定時間内に結合と検出のために検出電極上に接近し得る標的被検体量を増加させることを目的とする。本発明の検出システムは標的被検体結合の結果として電子伝達部分（ＥＴＭ）をアッセイ複合体内に取込ませることに基づく。
【０１５１】
一般に、２つの基本的検出メカニズムがある。好適な態様において、ＥＴＭの検出は、２本鎖核酸の積層したπ−軌道を通しての電子伝達に基づく。この基本的メカニズムは米国特許第５，５９１，５７８号、第５，７７０，３６９号、第５，７０５，３４８号およびＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４に記載されており、本明細書では「メカニズム−１」と名付ける。簡単に説明すると、これまでの研究では、電子伝達が、２本鎖核酸の積層したπ−軌道を通しては急速に、また、１本鎖核酸では有意によりゆっくりと進行することが示されている。従って、このメカニズムはアッセイの基本となり得る。このように、伝導性オリゴマーを介して検出電極に付着している核酸にＥＴＭ（下記のように、鎖の一方に共有結合により、またはハイブリダイゼーション指示薬の使用を経てハイブリダイゼーション複合体に非共有結合により）を加えることにより、ＥＴＭと電極間の電子伝達が、核酸と伝導性オリゴマーを通して検出し得る。この一般的な概念を図３に描出する。
【０１５２】
これは標的被検体が核酸である場合に実施し得る；あるいは、非核酸標的被検体は任意の捕獲結合リガンド（標的被検体を検出電極に付着させるための）および核酸「テール」をもつ可溶性結合リガンドと共に用いられ、これが次いで直接または間接的に検出を実施するための表面上の検出プローブに結合することができる。この一般的な概念を図３Ｃに描出する。
【０１５３】
あるいは、必ずしも核酸を経由する電子伝達を介在せずにＥＴＭを検出することができ、むしろ伝導性オリゴマーを用いて検出することができる；すなわち、ＥＴＭからの電子は積層したπ−軌道を通して移動してシグナルを生成する必要がない。代りに、伝導性オリゴマーを含むＳＡＭの表面にＥＴＭの存在することが直接検出し得る。この基本的概念は本明細書において「メカニズム−２」と呼ぶ。従って、標的被検体の結合により、ＥＴＭを含む可溶性結合リガンドは表面上に搬送され、ＥＴＭの検出が進行する。伝導性オリゴマーを含むＳＡＭの役割は、溶液成分から電極を保護し、電極に対する非特異結合量を低減させることである。別の見方をすれば、結合リガンドの役割は、ＥＴＭを表面に採り入れるための特異性を与えることであり、そこでＥＴＭは電子的に露出した末端をもつ伝導性オリゴマーにより検出可能となる。この一般的な概念を図４、５および６に示す。
【０１５４】
このように、両態様において、以下により詳細に説明するように、アッセイ複合体はＥＴＭを含んで形成され、それを次いで検出電極により検出する。
【０１５５】
このシステムはアレイ方式での特定用途が明らかになっている；すなわち、アドレス参照可能な検出電極のマトリックスがある場合である（本明細書では「パッド」、「アドレス」または「ミクロ領域」と一般的にいう）。本明細書において、「アレイ」とは複数の捕獲リガンドがアレイ方式にあることを意味する；アレイのサイズはアレイの構成物および最終用途に左右される。約２つの異なる捕獲リガンドから数千ものリガンドまでを含むアレイを作製し得る。一般に、該アレイは電極のサイズ並びにアレイの最終用途によって、２個から１００，０００以上にも及んで構成される。好適な範囲は約２個から約１０，０００個であり、好ましくは約５個から約１０００個であり、特に好ましいのは約１０個ないし約１００個である。一部の態様において、本発明の構成物はアレイ方式でない場合もある；すなわち、一部の態様では単一の捕獲リガンドを含む構成物を同様に作製し得る。さらに、一部のアレイにおいて、異なる構成物または同一の構成物を含む複数の基板を用い得る。このように、例えば、大型のアレイは複数の小型基板から構成されてもよい。
【０１５６】
検出電極は自己集合単層（ＳＡＭ）を含む。本明細書での「単層」または「自己集合単層」または「ＳＡＭ」とは、表面上に自動的に化学吸着した分子の比較的秩序だった集合体を意味し、そこでは分子が互いに好ましい方向関係を有しており（例えば、互いに略平行に方向づけられており）、かつ、表面に対し好ましい方向関係を有している（例えば、表面に対し大まかに垂直に方向づけられている）。分子それぞれは官能基を含み、それが表面に接着し、また、一部が単層中の隣接する分子と相互作用し、比較的秩序だった配列を形成する。「まじりあった」単層は不均質の単層からなる。すなわち、そこでは少なくとも２つの異なる分子が単層を作り上げている。ＳＡＭは伝導性オリゴマーのみであっても、あるいは伝導性オリゴマーと絶縁体の混合物であってもよい。本明細書に概説するように、被検体が電極から少し離れているとき、標的被検体結合の有効性（例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）は増加し得る。同様に、単層が存在すると、生体分子（標的被検体を含む）の電極への非特定結合は、一般に減少する。このように、単層は電極表面から離れている被検体の維持を容易にする。さらに、単層は他種電気活性種を電極表面から離れているようにするのに役立つ。このように、この層は、溶媒内で、各電極と各ＥＴＭ間または電極と他種電気活性種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。かかる接触は、直接の「短絡」またはサンプル内に存在する可能性のある荷電種を介した間接の短絡となり得る。したがって、ある態様においては、この単層は、好ましくは電極表面上の均一層にきっちりと詰込まれ、「孔」が存在するのを最少にする。この態様では、単層は電極への溶媒接近をブロックする物理的障壁として作用する。
【０１５７】
好適な態様において、単層は伝導性オリゴマーを含む。本明細書において「伝導性オリゴマー」は実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、好ましくは線状であり、そのある態様では文献上「分子ワイヤ」という。本明細書において「実質的に伝導性」とは該オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動し得ることを意味する。一般に、伝導性オリゴマーは、伝導性オリゴマーの単量体単位間のように、実質的に重なり合うπ−軌道、すなわち、共役π−軌道を有するが、伝導性オリゴマーは１つ以上のシグマ（σ）結合をも含んでいる。さらに、伝導性オリゴマーは会合したＥＴＭへの電子の注入またはＥＴＭからの受け入れ能力によって機能的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは本明細書に定義した絶縁体よりもより伝導性である。さらに、本発明の伝導性オリゴマーは電気活性ポリマーとは区別すべきもので、これはそれ自体で電子を供与または受容できるものである。
【０１５８】
好適な態様において、伝導性オリゴマーは約１０−６ないし１０４Ω−１ｃｍ−１の伝導性Ｓを有し、好ましくは約１０−５ないし１０３Ω−１ｃｍ−１であって、これらのＳ値は約２０Åないし約２００Åの範囲の分子から計算される。以下に記載するように、絶縁体は約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導性Ｓ、好ましくは１０−８Ω−１ｃｍ−１より低い値を有する。一般的には、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ５１ （１９９５） ５７−６６ （参照により本明細書に取込む） を参照されたい。
【０１５９】
伝導性オリゴマーの所望の性質は、高い伝導性、本発明の構成物の合成と使用のために有機溶媒および／または水への十分な溶解性、および反応に対する好適な化学的抵抗などであるが、該反応が起こるのは、１）結合リガンド合成の際（すなわち核酸合成であり、本発明の構成物合成に際し、伝導性オリゴマーを含むヌクレオシドを核酸シンセサイザーに加えることができる）、２）伝導性オリゴマーが電極に付着する際、または３）結合アッセイの際、である。さらに、自己集合単層の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。
【０１６０】
本発明のオリゴマーは、本明細書に記載のように、少なくとも２つの単量体サブユニットを含む。下記に詳しく説明するが、オリゴマーには、ホモおよびヘテロオリゴマーがあり、ポリマーも含む。
【０１６１】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造１に示した構造を持つ：
構造１
【化１】
0003548159.tif 000002
当業者には理解されるとおり、ここに示した構造は全て、更なる原子または構造を有し得る。即ち、構造１の伝導性オリゴマーは、電極、遷移金属錯体、有機ＥＴＭ、およびメタロセンなどのＥＴＭに、および核酸などの結合リガンドに、またはこれら数種に結合させることができる。特記しない限り、ここに示した伝導性オリゴマーは、その左側で電極に結合させる。つまり、構造１の場合は、左側の「Ｙ」を本明細書に記載の電極につなげる。伝導性オリゴマーを結合リガンドに結合させるとき、右側の「Ｙ」は、存在するならば、直接的にまたは本発明に記載のリンカーを用いて、核酸などの結合リガンドに結合させる。
【０１６２】
本実施態様では、Ｙは芳香族基であり、ｎは１から５０の整数であり、ｇは１または０のいずれかであり、ｅは０から１０の整数であり、ｍは０または１である。ｇが１のとき、Ｂ−Ｄは隣接した結合と共有し得る結合であり（本明細書中でＡ共役結合＠とよぶ）、好ましくは、アセチレン、アルケン、置換アルケン、アミド、アゾ、−Ｃ＝Ｎ−（−Ｎ＝Ｃ−、−ＣＲ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＲ−を含む）、−Ｓｉ＝Ｓｉ−および−Ｓｉ＝Ｃ−（−Ｃ＝Ｓｉ−、−Ｓｉ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝Ｓｉ−を含む）から選択される。ｇが０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄは好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部であり、このヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素、ケイ素またはリンから選択される。そのため、適切なヘテロ原子部には、−ＮＨおよび−ＮＲ、式中、Ｒは本明細書に定義のとおりである；置換硫黄；スルホニル（−ＳＯ２−）スルホキシド（−ＳＯ−）；酸化ホスフィン（−ＰＯ−および−ＲＰＯ−）；およびチオホスフィン（−ＰＳ−および−ＲＰＳ−）があるが、これらに限定されない。しかしながら、下記に概略説明するとおり、伝導性オリゴマーを金電極に結合させるような場合、硫黄誘導体は好ましくない。
【０１６３】
「芳香族基」またはその文法的均等物とは、本書では、一般に５から１４の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式炭化水素部（より大きい多環式環構造を作ることもできるが）およびそれらの炭素環式ケトンまたはチオケトン誘導体で、その遊離の原子価を持つ炭素原子が芳香族環の一員であるものを意味する。芳香族環には、アリーレン基および２つ以上の原子を除いた芳香族基がある。本願の目的には、芳香族は複素環を含む。「複素環」または「ヘテロアリール」とは、１から５個の指定炭素原子を、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されるヘテロ原子で置換した、そしてその遊離の原子価を持つ原子が芳香族環の一員である芳香族基、およびそれらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体を意味する。従って、複素環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル等がある。
【０１６４】
重要なのは、伝導性オリゴマーのＹ芳香族基が異なっていてもよいこと、即ち、伝導性オリゴマーがヘテロオリゴマーであり得ることである。つまり、伝導性オリゴマーは、単一型のＹ基または複数型のＹ基のオリゴマーを含むことができる。
【０１６５】
芳香族基は、本書中で一般にＲで表す置換基で置換できる。Ｒ基は、必要に応じて加え、伝導性オリゴマーのパッキングに影響を及ぼすことができる、即ち、Ｒ基を用いて単層におけるオリゴマーの会合を変化させることができる。Ｒ基を加えて、１）オリゴマーまたはオリゴマーを含む組成物の溶解度を変える；２）システムの共役または電子化学電位を変える；および３）単層表面の電荷または特性を変えることもできる。
【０１６６】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーが３つのサブユニットより大きいとき、Ｒ基は、溶液合成を行う場合の溶解度を高めるのに好ましい。しかしながら、Ｒ基およびその位置は、下記のように、表面上、特に単層内での伝導性オリゴマーのパッキングへの影響を最小限にするよう選択される。一般に、単層内では小さいＲ基のみが使用され、大きいＲ基は一般に単層表面上にある。そのため、例えば、単層内の伝導性オリゴマー部分にメチル基を付けて溶解度を高めるのが好ましく、例えば、Ｃ３からＣ１０のより長いアルコキシ基を単層表面上に付けるのが好ましい。一般に、本明細書に記載のシステムでは、このことは、一般に、立体的に重大なＲ基は、単層を形成する分子の平均長さによるが、最初の２つまたは３つのオリゴマーサブユニットのいずれにも結合させないことを意味する。
【０１６７】
適切なＲ基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、ケイ素部、ハロゲン、硫黄含有部、リン含有部、およびエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。本明細書に示した構造では、Ｒは、その位置が置換されていない場合は水素である。ある位置では、２つの置換基、ＲおよびＲ’が可能であり、その場合、ＲおよびＲ’基は同一であるかまたは異なっているかのいずれかでよい。
【０１６８】
「アルキル基」またはその均等物とは、直鎖状または分枝状アルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１箇所以上の、特記しなければ任意の位置で枝分かれしている。このアルキル基は、約１から約３０の炭素原子（Ｃ１−Ｃ３０）の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素原子（Ｃ１−Ｃ２０）を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２ないしＣ１５が好ましく、Ｃ１ないしＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、もっと大きくてもよい。アルキル基の定義の中に含まれるものには、Ｃ５およびＣ６環などのシクロアルキル基や、窒素、酸素、硫黄、またはリンを持つ複素環式環もある。アルキルはまた、好ましくは硫黄、酸素、窒素およびケイ素のヘテロ原子を持つヘテロアルキルも含む。アルキルは、置換アルキル基も含む。「置換アルキル基」とは、更に上記定義の１以上の置換基部「Ｒ」を含むアルキル基を意味する。
【０１６９】
「アミノ基」またはその均等物とは、−ＮＨ２、−ＮＨＲおよび−ＮＲ２基を意味し、Ｒは本明細書に定義のとおりである。
【０１７０】
「ニトロ基」とは、−ＮＯ２基を意味する。
【０１７１】
「硫黄含有部」とは、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−およびスルホ−化合物、チオール（−ＳＨおよび−ＳＲ）、スルフィド（−ＲＳＲ−）、スルホキシド（−Ｒ−ＳＯ−Ｒ−）、スルフォン（−Ｒ−ＳＯ２−Ｒ−）、ジスルフィド（−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−）およびスルフォニルエステル（−Ｒ−ＳＯ２−Ｏ−Ｒ−）、があるが、これらに限定されない。「リン含有部」は、リンを含有する化合物を意味し、ホスフィンおよびリン酸があるが、これらに限定されない。「シリコン含有部」とは、シリコン含有化合物を意味する。
【０１７２】
「エーテル」とは、−Ｏ−Ｒ−基を意味する。好ましいエーテルはアルコキシ基であり、−Ｏ−（ＣＨ２） ２ＣＨ３および−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３が好ましい。
【０１７３】
「エステル」とは、−ＣＯＯＲ基を意味する。
【０１７４】
「ハロゲン」とは、臭素、ヨウ素、塩素またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、部分的にまたは全体的にハロゲン化したアルキル、例えばＣＦ３等である。
【０１７５】
「アルデヒド」とは、−ＲＣＯＨ基を意味する。
【０１７６】
「アルコール」とは、−ＯＨ基およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する。
【０１７７】
「アミド」とは、−ＲＣＯＮＨ−またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【０１７８】
「エチレングリコール」または「（ポリ）エチレングリコール」とは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は、一重にまたは二重に置換されていてもよく、即ち、−（Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２）ｎ−、但しＲは上記定義のとおりである、であってよい。酸素の位置に他のヘテロ原子を持つエチレングリコール誘導体（即ち、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または置換基を持つ）も好ましい。
【０１７９】
好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、−Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３および−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３などのアルコキシ基およびエチレングリコールおよびそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０１８０】
好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリンおよび縮合環誘導体を含むこれらそれぞれの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０１８１】
本明細書に示した伝導性オリゴマーでは、ｇが１のとき、Ｂ−Ｄは２つの原子または化学部分をつなげる結合である。好ましい実施態様では、Ｂ−Ｄは、重複または共役π軌道を含有する共役結合である。
【０１８２】
好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−、アルキンまたはエチンとも呼ばれる）、アルケン（−ＣＨ＝ＣＨ−、エチレンとも呼ばれる）、置換アルケン（−ＣＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝ＣＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−および−ＮＲ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＲ−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、エステルおよびチオエステル（−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、ＣＳ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＳ−）および他の共役結合（−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＲ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−および−Ｎ＝ＣＲ−）、（−ＳｉＨ＝ＳｉＨ−、−ＳｉＲ＝ＳｉＨ−、−ＳｉＨ＝ＳｉＲ−、およびＳｉＲ＝ＳｉＲ−）、（−ＳｉＨ＝ＣＨ−、−ＳｉＲ＝ＣＨ−、−ＳｉＨ＝ＣＲ−、−ＳｉＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＳｉＨ−、−ＣＲ＝ＳｉＨ−、−ＣＨ＝ＳｉＲ−および−ＣＲ＝ＳｉＲ−）などから選択される。特に好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケン、アミドおよびこれら３種の置換誘導体およびアゾである。とりわけ好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケンおよびアミドである。二重結合に結合させたオリゴマー成分は、トランスまたはシス配置、または混合型であってよい。そのため、ＢまたはＤのいずれかは、炭素、窒素またはケイ素を含むことができる。置換基は、上記Ｒのところで定義したとおりである。
【０１８３】
構造１伝導性オリゴマーのｇ＝０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ部分は上記定義のカルボニルまたはヘテロ原子部分であり得る。
【０１８４】
上記Ｙ環のように、どの単一伝導性オリゴマー内でも、Ｂ−Ｄ結合（またはｇ＝０のときＤ部分）は、全て同じでもよく、または少なくとも１つが異なっていてもよい。例えば、ｍが０のとき、末端Ｂ−Ｄ結合は、アミド結合であることができ、残りのＢ−Ｄ結合はアセチレン結合であることができる。一般に、アミド結合が存在するとき、アミド結合はできるだけ少ない方が好ましいが、ある実施態様では、全てのＢ−Ｄ結合がアミド結合である。よって、上記Ｙ環のところで概略説明したとおり、単層内ではある一つの型のＢ−Ｄ結合が伝導性オリゴマー中に下記のように存在でき、そして、単層レベル上に別の型のＢ−Ｄ結合、例えば核酸が伝導性オリゴマーを介して結合している場合核酸ハイブリダイゼーションにより大きな柔軟性を与えるために存在できる。
【０１８５】
本明細書に示した構造中、ｎは１から５０の整数であるが、より長いオリゴマーもまた使用できる（例えば、Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４ ３３（１３）： １３６０参照）。理論によって限定されないが、表面上での効率のよい核酸ハイブリダイゼーションのためには、ハイブリダイゼーションが表面から少し離れて起こるべきであり、ハイブリダイゼーション速度は、特に２００から３００塩基対の長いオリゴヌクレオチドの場合、表面からの距離の関数として上昇すると思われる。従って、核酸が伝導性オリゴマーを介して結合しているとき、以下でより詳しく記すように、伝導性オリゴマーの長さは、その核酸の最も近いヌクレオチドが電極表面から約６Åから約１００Å（但し、５００Åまでの距離が使用できる）に位置するような長さであり、約１５Åから約６０Åが好ましく、約２５Åから約６０Åも好ましい。従って、ｎは芳香族基のサイズに応じて変わるが、一般に、約１から約２０であって、約２から約１５が好ましく、約３から約１０が特に好ましい。
【０１８６】
本明細書に示した構造中、ｍは０または１のいずれかである。つまり、ｍが０のとき、伝導性オリゴマーの末端には、Ｂ−Ｄ結合またはＤ部分があり、即ち、Ｄ原子が直接的かまたはリンカーを介するかのいずれかで核酸に結合している。ある実施態様では、例えば、伝導性オリゴマーを核酸のリボース−リン酸主鎖のリン酸に結合させるとき、伝導性オリゴマーと核酸の間に結合させたリンカーなどの別の原子があってもよい。更に、下記に概略説明するとおり、Ｄ原子は、アミノ修飾リボースの窒素原子であり得る。あるいは、ｍが１のとき、伝導性オリゴマーの末端にはＹ、芳香族基があり、即ち、その芳香族基は、核酸またはリンカーに結合している。
【０１８７】
当業者には明らかなように、多数の伝導性オリゴマーが利用できる。これらは、例えば、縮合芳香族環または、−（ＣＦ２）ｎ−、−（ＣＨＦ）ｎ−および−（ＣＦＲ）ｎ−などのテフロン（登録商標）様オリゴマーを含む化合物などの当分野で知られている他の伝導性オリゴマーと同じく、構造１や構造８式の範囲内にある伝導性オリゴマーを含む。例えば、Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３： １３６１ （１９９４）； Ｇｒｏｓｓｈｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｍｅｔａｌｓ Ｒｅｖ． ４０ （１）： ２６−３５ （１９９６）； Ｔｏｕｒ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９６： ５３７−５５３ （１９９６）； Ｈｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ １４： ４８０８−４８１５ （１９９５）；およびここに引用されている文献参照、これらは全て出典明示により本明細書に組込まれている。
【０１８８】
本実施態様の特に好ましい伝導性オリゴマーは、下記である：
構造２
【化２】
0003548159.tif 000003
構造２は、ｇが１のときの構造１である。構造２の好ましい実施態様には、ｅが０であり、Ｙがピロールまたは置換ピロールであるもの；ｅが０であり、Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであるもの；ｅが０であり、Ｙがフランまたは置換フランであるもの；ｅが０であり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの；ｅが０であり、Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであるもの；ｅが１であり、Ｂ−Ｄがアセチレンであり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの（例えば、下記構造４参照）がある。構造２の好ましい実施態様はまた、下記構造３に示した、ｅが１である場合のものである：
【０１８９】
構造３
【化３】
0003548159.tif 000004
構造３の好ましい実施態様は、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアゾであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアルケンであるもの；Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフランまたは置換フランであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたはフラン（または置換チオフェンまたはフラン）であり、Ｂ−Ｄがアルケンおよびアセチレン交互の結合であるものである。
【０１９０】
本明細書に示した構造の殆どが構造３の伝導性オリゴマーを利用している。しかしながら、どの構造３オリゴマーも、本明細書中の他の構造、即ち構造１または８オリゴマー、または他の伝導性オリゴマーで置換でき、かかる構造３の使用は、本発明の範囲を限定する意味を持たない。
【０１９１】
構造３の特に好ましい実施態様は、下記の構造４、５、６および７を含む：
構造４
【化４】
0003548159.tif 000005
構造４の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１９２】
構造５
【化５】
0003548159.tif 000006
構造５のようにＢ−Ｄ結合がアミド結合であるとき、伝導性オリゴマーは、擬似ペプチドオリゴマーである。構造５中のアミド結合は、カルボニルを左側にして、即ち、ＣＯＮＨ−で示すが、逆、即ち−ＮＨＣＯ−も使用できる。構造１７の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの（この実施態様では、末端窒素（Ｄ原子）はアミノ修飾リボースの窒素であり得る）、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１９３】
構造６
【化６】
0003548159.tif 000007
構造６の好ましい実施態様には、第１のｎが２であり、第２のｎが１であり、ｍが０であり、全てのＲ基が水素であるもの、または溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１９４】
構造７
【化７】
0003548159.tif 000008
構造７の好ましい実施態様には、第１のｎが３であり、第２のｎが１−３であり、ｍが０または１のいずれかであるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１９５】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造８で示した構造を持つ：
構造８
【化８】
0003548159.tif 000009
この実施態様では、Ｃは炭素原子であり、ｎは１から５０の整数であり、ｍは０または１であり、Ｊは酸素、窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはスルホキシドからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｇはアルカン、アルケンまたはアセチレンから選択される結合であって、２つの炭素原子と一緒になってＣ−Ｇ−Ｃ基がアルケン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、置換アルケン（−ＣＲ＝ＣＲ−）またはそれらの混合物（−ＣＨ＝ＣＲまたは−ＣＲ＝ＣＨ−）、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）またはアルカン（−ＣＲ２−ＣＲ２−、Ｒは水素または本明細書に記載の置換基のいずれかである）であるようにする。各サブユニットのＧ結合は、他のサブユニットのＧ結合と同一かまたは異なっていてもよく、つまり、アルケンとアセチレン結合が交互にあるオリゴマーが使用できる。しかしながら、Ｇがアルカン結合であるとき、オリゴマー中のアルカン結合数は最小に維持すべきであり、伝導性オリゴマー当りシグマ結合約６以下が好ましい。アルケン結合が好ましく、本明細書に総括的に示しているが、アルカンおよびアセチレン結合は、当業者には明らかなように、本明細書に記載したどの構造または実施態様でも置換できる。
【０１９６】
ある実施態様では、例えば、ＥＴＭが存在しないとき、ｍ＝０ならば少なくとも１つのＧ結合はアルカン結合である。
【０１９７】
好ましい実施態様では、構造８のｍは０である。特に好ましい実施態様では、構造９に示したように、ｍは０であり、Ｇはアルケン結合である：
構造９
【化９】
0003548159.tif 000010
構造９のアルケンオリゴマーおよび本明細書に示した別のものは、一般に、好ましいトランス配置で示しているが、シスまたはトランスとシスの混合したオリゴマーも使用できる。上記のように、Ｒ基を加えて、電極上での組成物のパッキング、オリゴマーの親水性または疎水性、およびオリゴマーの柔軟性、即ち、回転、ねじれ、または縦の柔軟性を変えることができる。ｎは上記定義のとおりである。
【０１９８】
好ましい実施態様では、Ｒは水素であるが、Ｒはアルキル基およびポリエチレングリコールまたは誘導体であってもよい。
【０１９９】
別の実施態様では、伝導性オリゴマーは、異なる型のオリゴマー、例えば、構造１や８の混合物であってもよい。
【０２００】
伝導性オリゴマーは末端基を有していても有していなくてもよい。従って、好ましい実施態様では、余分な末端基がなく、伝導性オリゴマーはその末端が、例えばアセチレン結合などのＢ−Ｄ結合のような基の１つで終る構造１から９を示す。あるいは、好ましい実施態様では、本明細書中でしばしば「Ｑ」として示す末端基を加える。末端基はいくつかの理由、例えば、ＥＴＭの検出用の伝導性オリゴマーの電子的利用可能性を改善するために、またはＳＡＭの表面を例えば非特異的結合を防ぐなどの他の事由によって変えるために、使用することができる。例えば、標的被検体が核酸である場合、ハイブリダイゼーションを促進するために、末端で陰性に荷電した基として陰性荷電表面を形成させ、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、核酸が表面上に着地するのに反発するか、妨げるようにし得る。好ましい末端基は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ３等のアルキル基、および、（ポリ）エチレングリコールのような（ポリ）アルキルオキサイドを含み、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好ましい。
【０２０１】
一実施態様において、異なるタイプの末端基を有する伝導性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。従って、例えば、いくつかの末端基は検出を容易にし、いくつかは非特異的結合を防止し得る。
【０２０２】
単層は異なる伝導性オリゴマー種を含み得るが、適度に同一なＳＡＭが形成され得るように、異なる種を選択するのが好ましいことが、理解されるであろう。従って、例えば、核酸などの捕獲結合リガンドを伝導性オリゴマーを用いて電極に共有結合させるとき、１つのタイプの伝導性オリゴマーを使用して核酸を結合させ、別のタイプをＳＡＭ中で用いることは可能である。同様に、異なる長さの伝導性オリゴマーの混合物を単層中に有して、非特異的シグナルの減少を促進するのが望ましい。従って、例えば、好ましい実施態様は、単層の残部の表面下、つまり使用されているなら、絶縁層の下で、または他の伝導性オリゴマーの特定のフラクション下で終わる伝導性オリゴマーを利用する。同様に、異なる伝導性オリゴマーを使用して、単層の形成を容易にしたり、別の特性を持つ単層をつくることもできる。
【０２０３】
好ましい実施態様において、単層はさらに絶縁部を含み得る。本明細書における「絶縁体」とは、実質的に非伝導性オリゴマーを意味し、好ましくは線状である。本明細書において、「実質的に非伝導性」とは、絶縁体が１００Ｈｚで電子を伝達しないことを意味する。絶縁体を介した電子伝達の比率は、好ましくは本明細書に記載の伝導性オリゴマーを介した比率よりも遅い。
【０２０４】
好ましい実施態様において、絶縁体は、約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導率Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１より低いのが好ましい。一般にＧａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照。
【０２０５】
通常、絶縁体はシグマ結合を有する、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、いずれの具体的な絶縁体分子も芳香族基または１以上の共役結合を含み得る。本明細書において「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、つまり鎖に含まれた窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたはホウ素を有するアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、好ましくは電子伝達を実質的に阻害するかまたは遅らせる１以上のヘテロ原子または結合を添加した伝導性オリゴマーと非常に類似であり得る。
【０２０６】
適切な絶縁体は当業者に既知であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲＨ）ｎ−および−（ＣＲ２）ｎ−、エチレングリコールまたは酸素の代わりの他のヘテロ原子、つまり窒素または硫黄（電極が金のとき、硫黄誘導体は好ましくない）を用いる誘導体を含むが、これらに限定しない。
【０２０７】
伝導性オリゴマーについて、絶縁体は本明細書に定義のＲ基で置換され得、電極でのその部分または伝導性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、および絶縁体の柔軟性、すなわち回転の、捩れのまたは縦の柔軟性を変える。例えば、分枝アルキル基を使用し得る。同様に、上記概説のように絶縁体は特に単層の表面に作用する末端基を含み得る。
【０２０８】
単層をつくる種の長さは必要に応じて変化する。上記に概説のように、標的被検体の結合（例えば核酸のハイブリダイゼーション）は、表面から離れてより有効であるように見える。核酸が結合する種（下記に概説のように、これらは絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかであり得る）は、基本的に単層を形成する種と同じ長さかそれらより長く、捕獲結合リガンドがハイブリダイゼーションのための溶媒により接近可能となる。いくつかの実施態様において、捕獲結合リガンドが結合する伝導性オリゴマーは単層より短い。
【０２０９】
当業者には明らかなように、単層をつくる異なる種の、実際の組合せと比率は、非常に広範に変化し得、そしてメカニズム−１またはメカニズム−２のいずれが使用されているか、また、電気泳動の場合、１電極システムまたは２電極システムのいずれかが使用されているかに左右される。これらを以下で詳記する。一般に、メカニズム−２システムでは３成分システムが好ましく、第１の種は、種を含有する捕獲結合リガンド（標的被検体が核酸である場合、捕獲プローブという）を含み、絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかを介して電極に結合している。第２の種は伝導性オリゴマーであり、第３の種は絶縁体である。この実施態様において、第１の種は約９０％から約１％を含み得、約２０％から約４０％が好ましい。標的被検体が核酸である場合、約３０％から約４０％が短いオリゴヌクレオチド標的に特に好ましく、約１０％から約２０％が長い標的に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約９０％が好ましく、約４０％から約６０％が特に好ましい。第３の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約４０％が好ましく、約１５％から約３０％が特に好ましい。これらの近似比率を達成するための、ＳＡＭ構成溶媒中の第１：第２：第３の種の好ましい比率は、短い標的については２：２：１、長い標的については１：３：１であり、全チオール濃度（これらの種との結合に使用する場合、以下で詳記）は、５００μＭから１ｍＭの範囲および８３３μＭが好ましい。
【０２１０】
あるいは、２成分システムを使用することができる。ある実施態様では、メカニズム−１またはメカニズム−２のシステムのいずれかで使用する２成分は、第１および第２の種である。この実施態様において、第１の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。あるいは、メカニズム−１システムでは、２成分は第１および第３の種である。この実施態様において、第１の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。
【０２１１】
好ましい実施態様として、水性溶液中でＳＡＭの析出を行なう。Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０： ４６７０ （１９９８）， Ｈｅｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９：８９１６ （１９９７）およびＡ． Ｊ． Ｂａｒｄ， Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｓ， Ｖｏｌ． ２０． Ｄｅｋｋｅｒ Ｎ．Ｙ． １９９６−のＦｉｎｋｌｅａ， Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓに概略説明されているように、ＳＡＭ形成種の析出を水性溶液（しばしば塩を含む）から行なうことができる（これらすべては出典明示により本明細書に組込む）。
【０２１２】
さらに、電気泳動システムを使用する場合、単層の組成および保全性は、１電極または２電極システムのいずれを使用するかによって決まるであろう。従って、例えば、１電極システムを電気泳動と検出の両方に使用する場合、システムの構成は、電気活性電荷担体を（もしそれを使用する場合）電極に近づけて配置することを可能とする。当業者に明らかであろうように、伝導性オリゴマーの化学結合が、水の加水分解で使用される程度の高電圧で安定あれば、電気活性電荷担体を使用する必要はない。これを数種の方法のうちの１つで行ない得る。好ましい実施態様として、単層は、電子的に露出した伝導性オリゴマーの有効な成分を含む；このような有意な単層は電極の表面を引き上げて、電気活性電荷担体を間接的に電極に接近させる。あるいは、溶媒が直接電極へ接近するように、不充分な単層（すなわち「ピンホール」または「欠陥」を含む単層））を使用することもできる。あるいは、電極の配置を電極がその全表面より少なくＳＡＭで覆われているようにして、電極に直接近接し得るようにしてもよいが、非特異的結合についてはそのような表面は最小にする。
【０２１３】
伝導性オリゴマーと絶縁体の電極への共有結合は、様々な方法で達成され、使用する電極、および絶縁体と伝導性オリゴマーの組成に依存する。好ましい実施態様として、本明細書に記載のヌクレオシドまたは核酸と共有結合した結合リンカーは、電極に共有結合している。従って、結合リンカーの一方の端または末端がヌクレオシドまたは核酸に結合しており、もう一方が電極に結合している。ある実施態様において、結合リンカーが末端以外の位置で結合するか、またはさらに、分枝結合リンカーが一方の末端で電極に結合し、他の末端で２またはそれ以上のヌクレオシドに結合するのが望ましいことであるが、これは好ましくない。同様に、一般に構造１１−１３に記載されるように、結合リンカーは２つの部位で電極に結合し得る。一般に構造１０で「Ａ」として下記に示すように、あるタイプのリンカーが使用される。構造１０において、「Ｘ」は伝導性オリゴマー、「Ｉ」は絶縁体であり、斜線の表面は電極である：
【０２１４】
【化１０】
0003548159.tif 000011
本実施態様において、Ａはリンカーまたは原子である。「Ａ」の選択は、電極の特徴に一部依存する。従って、例えば、Ａは、金電極を使用する場合、硫黄部である。あるいは、酸化金属電極を使用するとき、Ａはオキサイドの酸素に結合したシリコン（シラン）部である（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０： ３３３２−３３３７ （１９９４）； Ｌｅｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７８： １９５−２０１ （１９７７）参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする）。炭素ベースの電極を使用するとき、Ａはアミノ部である（好ましくは、１級アミン；例えば、Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０： １３０６−１３１３ （１９９４）参照）。従って、好ましいＡ部は、シラン部、硫黄部（アルキル硫黄部を含む）およびアミノ部を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、当分野で既知のようなレドックスポリマーとのエポキシドタイプ結合は使用しない。
【０２１５】
本明細書には一つの部分としてしか記載していないが、絶縁体および伝導性オリゴマーは、１個以上の「Ａ」部で電極と結合し得る；「Ａ」部は同一かまたは異なっていてもよい。従って、例えば、電極が金電極であり、「Ａ」が硫黄原子または部分であるとき、一般に下記構造１１、１２および１３に記載のように、複数の硫黄原子を、電極に伝導性オリゴマーを結合させるのに使用し得る。当業者に認められるように、このような他の構造が製造できる。構造１１、１２および１３において、Ａ部は硫黄原子だけであるが、置換硫黄部も使用し得る。
【０２１６】
【化１１】
0003548159.tif 000012
【０２１７】
【化１２】
0003548159.tif 000013
【０２１８】
【化１３】
0003548159.tif 000014
【０２１９】
構造１３と同様に、３つの硫黄部で電極に結合している一つの炭素原子で終了する伝導性オリゴマーを有することが可能であることも留意すべきである。さらに本明細書に必ずしも記載されていないが、伝導性オリゴマーと絶縁体はまた「Ｑ」末端基を含み得る。
【０２２０】
好ましい実施態様において、電極は金電極であり、結合は当分野で既知のように硫黄結合を介しており、すなわち、Ａ部は硫黄原子または部分である。金−硫黄結合の正確な特徴は知られていないが、この結合は本発明の目的で、共有結合と考える。代表的な構造は構造３の伝導性オリゴマーを用いて構造１４に記載するが、本明細書に記載のすべての構造について、いずれの伝導性オリゴマーまたは伝導性オリゴマーの組合せも使用し得る。同様にいずれの伝導性オリゴマーまたは絶縁体も本明細書に記載の末端基を含み得る。構造１４は、「Ａ」リンカーが硫黄原子のみを含むように記載しているが、他の原子も存在し得る（すなわち、硫黄から伝導性オリゴマーへのまたは置換基へのリンカー）。さらに、構造１４は、Ｙ芳香族基に結合した硫黄原子を表わしているが、当業者に明らかであろうように、Ｂ−Ｄ基（すなわち、アセチレン）と同様に結合したものであってもよい。
【０２２１】
【化１４】
0003548159.tif 000015
【０２２２】
一般的には、チオール結合が好ましい。電気泳動を使用するシステムにおいて、チオール結合は２組の電極を両方共使用する場合に好ましく（すなわち、ＳＡＭを含む検出電極は高い電気泳動電圧（すなわち８００または９００ｍＶより高い）では、チオール結合が酸化されてＳＡＭが失われるため、使用されない）、１組の電極を使用する場合は、下に概略説明するように低い電気泳動電圧を使用する。
【０２２３】
好ましい実施態様において、電極は炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素原子を介している。代表的な構造を構造１５に示す。また別の原子が存在し得、すなわち、ＺタイプリンカーおよびＸまたは末端基であり得る。
【０２２４】
【化１５】
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【０２２５】
【化１６】
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【０２２６】
構造１６において、酸素原子は金属酸化物電極の酸化物からのものである。Ｓｉ原子は他の原子を含んでもよく、すなわち、置換基含有のケイ素部分であってもよい。他の電極に対するＳＡＭの他の付着は技術上既知である；例えば、インジウム酸化スズ電極に対する付着については Ｎａｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ， １９９７ 参照、およびインジウム酸化スズ電極に対するリン酸エステルの化学吸着（ＣＨＩ会議（１９９８年５月４〜５日）での Ｈ． Ｈｏｌｄｅｎ Ｔｈｏｒｐｅ の講演）。
【０２２７】
本発明のＳＡＭは種々の方法、例えば、有機溶液からの析出および水性溶液からの析出などにより作製し得る。本明細書にて概説した方法では、例として金電極を使用するが、当業者が認めるように、他の金属および方法も同様に使用し得る。好適な一態様においては、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）が電極として用いられる。
【０２２８】
好適な態様において、金表面をまず洗浄する。様々な洗浄手法が採用可能であり、例えば、これらに限定されるものではないが、化学的洗浄またはエッチング用試薬（ピランハ（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液（過酸化水素／硫酸）または王水（塩酸／硝酸））、電気化学的方法、火炎処理、プラズマ処理またはそれらの併用などである。
【０２２９】
洗浄に続いて、金基板はＳＡＭ種に露呈する。電極がＩＴＯである場合、ＳＡＭ種はリン酸エステル含有種である。この処理も様々な方法で実施し得るものであり、例えば、溶液析出、気相析出、微小接触プリンティング、スプレー析出、ニート成分を用いる析出などであるが、これらに限定されるものではない。好適な態様では、溶液中で種々のＳＡＭ種、一般にはチオール含有種の混合物を含む析出溶液を利用する。標的被検体、特にＤＮＡを含む混合単層は通常２工程手法を用い調製する。チオール化ＤＮＡは（一般に少なくとも１種の他の単層形成種の存在下）最初の析出工程に際し析出し、混合単層形成はＤＮＡを含まない第２チオール溶液を加える第２工程の間に完結する。第２工程は、単層再構成を促進するための緩和な加熱を含み得るが、そのことはすべての実施態様で好ましいわけではない。
【０２３０】
好適な態様において、析出溶液は有機析出溶液である。この態様において、清浄金表面は清浄バイアル中に入れる。有機溶媒中の結合リガンド析出溶液は、総チオール濃度がマイクロモルと飽和の間にあるように調製する；好適な範囲は約１μＭないし１０ｍＭであり、特に好ましくは約４００μＭないし１．０ｍＭである。好適な態様において、析出溶液はチオール修飾ＤＮＡ（すなわち、付着リンカーに付着した核酸）およびチオール希釈分子（伝導性オリゴマーまたは絶縁体であるが、後者が好ましい）を含有する。ＤＮＡと希釈剤（もしあるとすれば）との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。好適な溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、またはその混合物である；一般に、捕獲リガンドを溶解するのに十分な極性の溶媒であれば、その溶媒が表面と反応するような官能基をもたない限り、使用可能である。十分なＤＮＡ析出溶液をバイアルに加えて電極の表面を完全に覆うようにする。この金基板は外界温度または外界温度より少し高い温度で、数秒ないし数時間、好ましくは５分ないし３０分間インキュベートする。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみの有機溶媒溶液（約１μＭないし１０ｍＭ，好ましくは約１００μＭないし約１．０ｍＭ）を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で所定時間（数秒ないし数日、好ましくは約１０分ないし約２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒中ですすいで使用する。
【０２３１】
好適な態様においては、水性析出溶液を用いる。上記のように、清浄金表面を清浄バイアル内に入れる。ＤＮＡの析出水性溶液は総チオール濃度が約１μＭと１０ｍＭの間、好ましくは約１μＭないし２００μＭであるように調製する。水性溶液は多くの場合、塩を存在させている（飽和まで、好ましくは約１Ｍである）が、精製水を使用し得る。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡおよびしばしばチオール希釈分子を含有する。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。ＤＮＡ析出溶液は電極の表面を完全に覆うような容量でバイアルに加える。この金基板を外界温度または外界温度より少し高い温度で１〜３０分間インキュベートするが、通常５分で十分である。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみ（１０μＭないし１．０ｍＭ）の水性溶液または有機溶媒溶液を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で、完全な単層が形成されるまで（１０分〜２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒にすすいで使用する。
【０２３２】
好適な態様においては、本明細書に説明するように、回路基板が金電極用の基板として使用される。金表面上ＳＡＭの形成は、まず基板を、本明細書に記載のように、例えば、１０％硫酸溶液中３０秒間、デタージェント溶液、王水、プラズマなどで清浄にすることにより一般に実施する。硫酸処理に続いて、基板は、例えば、２個のミリ−Ｑ水浴にそれぞれ１分間浸漬することにより洗浄する。この基板を次いで、例えば、窒素気流下で乾燥する。基板上に析出溶液をスポットするには、相当数の既知スポット・システムを用い、一般には基板をＸ−Ｙテーブル上に置き、調湿チャンバー中で実施する。スポット滴のサイズは基板上の電極サイズと溶液送達に使用する器具により変わる；例えば、２５０μＭサイズの電極では、３０ナノリットルの液滴が用いられる。この容量は電極表面を完全に覆うのに十分でなければならない。液滴は室温で所定時間（秒ないし一夜であるが、５分間が好適）インキュベートし、次いでミリ−Ｑ水浴中ですすぐことにより液滴を除去する。基板は次いで、好ましくは、第２析出溶液、一般に有機溶媒、好ましくはアセトニトリル中に絶縁体を含む溶液により、４５℃の浴に浸漬することによって処理する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒間浸漬し、次いでミリ−Ｑ水浴中３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下で乾燥する。
【０２３３】
好適な態様においては、検出電極はさらに捕獲結合リガンド、好ましくは共有結合により付着したリガンドを含む。本明細書において「結合リガンド」または「結合種」とは、標的被検体の存在を探査するために用いる化合物であって、標的被検体に結合する化合物を意味する。一般に、本明細書に記載された態様の殆どについて、標的被検体１分子当たり少なくとも２つの結合リガンドが存在する；すなわち、本明細書に記載の検出電極に付着する「捕獲」または「アンカー」結合リガンド（本明細書では、特に核酸結合リガンドに関して「捕獲プローブ」という）および可溶性結合リガンドであって、標的被検体に独立に結合し、直接または間接に少なくとも１個のＥＴＭを含むリガンドである。
【０２３４】
一般に、捕獲結合リガンドは検出を目的として、検出電極に標的被検体が付着するのを可能にする。以下により詳細に説明するように、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着するのは直接的（すなわち、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着する）または間接的（１種以上の捕獲伸長リガンドを使用し得る）であってもよい。
【０２３５】
好適な態様において、結合は特異的であり、結合リガンドは結合対の部分である。本明細書において「特異的に結合する」とは、該リガンドが、試験サンプルの被検体と他の成分または混入物とを識別するのに十分な特異性をもって被検体に結合することを意味する。しかし、当業者には明らかなように、それ程特異的ではない結合を用いても被検体を検出することが可能である；例えば、このシステムには異なる結合リガンド、例えば、異なるリガンドのアレイを使用でき、特定のどの被検体の検出も、結合リガンドのパネルへの結合の「サイン」を介するが、これは「電子の鼻」が作用する様式に類似している。この結合は、被検体が非特異結合を除去するための洗浄工程を含むアッセイの条件下でも結合したままであるために十分なものでなければならない。ある態様においては、例えば、ある生体分子の検出では、結合リガンドに対する被検体の結合定数は少なくとも約１０４〜１０６Ｍ−１であり、好ましくは約１０５ないし１０９Ｍ−１であり、そして特に好ましいのは約１０７〜１０９Ｍ−１である。
【０２３６】
当業者には明らかなように、結合リガンドの組成は標的被検体の組成に依存する。広範な被検体に対する結合リガンドが既知であるか、または既知技法を用いて容易に見出すことができる。例えば、被検体が１本鎖核酸である場合、結合リガンドは、一般に、実質的に相補的な核酸であろう。あるいは、米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，５６７，５８８号、第５，５９５，８７７号、第５，６３７，４５９号、第５，６８３，８６７号、第５，７０５，３３７号、および出典明示により明細書に組込まれている関連特許に概略説明されている通り、核酸「アプトマー（ａｐｔｏｍｅｒ）」を、任意の標的被検体と実質的に結合させるために発生させることができる。同様に、被検体は核酸結合タンパク質であってもよく、捕獲結合リガンドは１本鎖または２本鎖核酸である；あるいは、結合リガンドは、被検体が１本鎖または２本鎖核酸である場合、核酸結合タンパク質であろう。被検体がタンパク質である場合、結合リガンドは、タンパク質（とりわけ、それらの抗体またはフラグメント（ＦＡｂｓなど）を含む）、小分子、または上記したアプトマーを含む。好適な結合リガンドタンパク質はペプチドを包含する。例えば、被検体が酵素である場合、適切な結合リガンドは基質、阻害剤、および酵素と結合する他のタンパク質（すなわち、多酵素（またはタンパク質）複合体の成分）を包含する。当業者には明らかなように、会合する任意の２つの分子を、被検体または結合リガンドとして、好ましくは特異的に、使用し得る。適切な被検体／結合リガンド対は、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸；核酸／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物および他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質；およびタンパク質／小分子などを含むが、これらに限定されるものではない。これらは野生型または誘導配列であってもよい。好適な態様において、結合リガンドは多量化することの知られる細胞表面受容体、例えば、成長ホルモン受容体、グルコース輸送体（特にＧＬＵＴ４受容体）、トランスフェリン受容体、表皮成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１７受容体を含む）、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、毛様神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体、およびＴ細胞受容体などの部分である。同様に、結合化学方法に基づく、結合パートナーの発展に関係する多くの文献がある。
【０２３７】
本実施態様において、結合リガンドが核酸である場合、好ましい組成と技術はＷＯ９８／２０１６２；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３；およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／１３５，１８３；６０／１０５，８７５および０９／２９５，６９１に概略説明されており、これらすべては出典明示により本明細書の一部とする。
【０２３８】
捕獲結合リガンドを付着リンカー（絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれか）に付着させる方法は、一般に当該技術分野で知られているように実施されるが、付着リンカーの組成と捕獲結合リガンドの両方に左右される。一般に、捕獲結合リガンドは官能基の使用を介して付着リンカーに付着させるが、各官能基は次いで付着に用い得るものである。付着に好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基である。これらの官能基は次いで直接または間接的に本明細書では「Ｚ」で表すリンカーの使用を介して付着させ得る。リンカーは当技術分野でよく知られている；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーがよく知られたものである（参照：１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ， ｐａｇｅｓ １５５−２００；出典明示により本明細書の一部とする）。好適なＺリンカーは、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基）、短鎖アルキル基を有するエステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコール、および好ましい誘導体などであり、プロピル、アセチレン、およびＣ２アルケンがとりわけ好ましいが、これらに限定されるものではない。Ｚはスルホンアミドを形成するスルホン基であってもよい。
【０２３９】
この様式で、タンパク質、レクチン、核酸、小型有機分子、炭水化物などを含む捕獲結合リガンドを付加し得る。
【０２４０】
好適な態様ではタンパク質性の捕獲結合リガンドを利用する。当技術分野で知られているように、相当数の技法がタンパク質性の捕獲結合リガンドを付着リンカーに付着させるのに使用し得る。ある部分をタンパク質に付加させるための広範な技術が知られている。
【０２４１】
好適な態様では核酸を捕獲結合リガンドとして利用する。当業者には明らかなように、下記概説のいくつかの方法を、同様の方法で非核酸システムに同じように適用することができる。
【０２４２】
核酸捕獲結合リガンドは、伝導性オリゴマー（メカニズム−１システム）であるか、または絶縁体であり得る「付着リンカー」を介して電極に共有結合により付着している。本明細書において「共有結合により付着した」とは、２つの部分が少なくとも１つの結合により付着していることを意味し、該結合はシグマ結合、パイ結合および配位結合を包含する。
【０２４３】
このようにして、付着リンカーの一端を核酸（あるいは他の結合リガンド）に付着させ、他端（当業者が認めるところであるが、いずれの場合にも正確な末端である必要はない）を電極に付着させる。このように、本明細書中に描出した構造のいずれもさらに末端基として有効な核酸を含み得る。このように、本発明は、下記構造１７に一般的に描出したように、電極に共有結合により付着した核酸を含む組成物を提供する。
【０２４４】
【化１７】
0003548159.tif 000018
構造１７において、左側の斜線記号は、電極を表す。本明細書に定義するように、Ｘは伝導性オリゴマーであり、Ｉは絶縁体である。Ｆ１は、電極および伝導性オリゴマーまたは絶縁体の共有結合をもたらす結合であり、本明細書に記載され、例えば下記に「Ａ」と定義されるように、結合、原子またはリンカーを含む。Ｆ２は、核酸に伝導性オリゴマーまたは絶縁体を共有結合させる結合であり、本明細書に記載のように結合、原子または結合であり得る。Ｆ２は伝導性オリゴマーの一部、絶縁体の一部、核酸の一部であり得、または例えば本明細書で「Ｚ」について定義するように両方に外在性であり得る。
【０２４５】
好適な態様において、捕獲プローブ核酸は伝導性オリゴマーを介して電極に共有結合により付着している。核酸と伝導性オリゴマーの共有結合付着は、いくつかの方法で達成することができる。好適な態様において、その付着は下記説明のように、ヌクレオシド塩基への付着によるか、核酸の主鎖（リボース、リン酸エステル、または核酸類似体主鎖の類似基）への付着によるか、または遷移金属配位子への付着による。下に概説する技法は一般に天然に存在する核酸について説明しているが、当業者も認めるように、同様の技法は核酸類似体にも使用し得、そしていくつかの場合では他の結合リガンドを使用することができる。
【０２４６】
好適な態様において、伝導性オリゴマーは核酸のヌクレオシド塩基に付着させる。これは下記説明のように、オリゴマーの種類に応じていくつかの方法で実施し得る。一態様において、オリゴマーは末端のヌクレオシド、すなわち、核酸の３’または５’ヌクレオシドに付着させる。あるいは、伝導性オリゴマーを内部ヌクレオシドに付着させる。
【０２４７】
塩基への付着点は塩基により異なる。一般に、いずれの位置での付着も可能である。一部の態様では、例えば、ＥＴＭを含むプローブがハイブリダイゼーション（すなわち、メカニズム−１システム）に使用される場合、相補的な塩基の水素結合に関与しない位置に付着させるのが好ましい。このように、例えば、一般に付着はウリジン、シトシンおよびチミンなどのピリミジン類の５または６位置に対するものである。アデニンおよびグアニンなどのプリン類については、結合は、好ましくは８位置を介する。非標準の塩基に対する付着は、相当する位置で好適になされる。
【０２４８】
一態様において、付着は直接的である；すなわち、伝導性オリゴマーと塩基の間に介在する原子はない。この態様において、例えば、末端アセチレン結合を有する伝導性オリゴマーを塩基に直接付着させる。構造１８はこの結合の一例であり、ここでは構造３の伝導性オリゴマーと塩基としてウリジンを使用しているが、当業者も認めるように、他の塩基と伝導性オリゴマーを使用することもできる。
【０２４９】
【化１８】
0003548159.tif 000019
【０２５０】
本明細書に示したペントース構造には、水素、ヒドロキシ、リン酸またはアミノ基などの他の基が結合していることに留意すべきである。更に、本明細書に示したこのペントースおよびヌクレオシド構造は、通常表現の鏡像として非慣用的に示す。更に、ペントースおよびヌクレオシド構造はまた、任意の位置に、例えば、合成中に必要に応じて、保護基などの新たな基を含有できる。
【０２５１】
加えて、塩基は、必要に応じて更なる修飾を含むこともあり、即ち、カルボニルまたはアミン基を変更したり、保護することもできる。
【０２５２】
別の実施態様では、結合は、一般に、塩基としてウリジン、および構造３のオリゴマーを用いる構造１９に示したように、アミドおよびアミン結合を含む、多くの異なるＺ−リンカーを介する：
【０２５３】
【化１９】
0003548159.tif 000020
この実施態様では、Ｚはリンカーである。好ましくは、Ｚは約１から約１０原子の短いリンカーであり、１から５原子が好ましく、アルケン、アルキニル、アミン、アミド、アゾ、イミンなどの結合を含有してもよく、含有しなくてもよい。リンカーは当分野では知られており、例えば、よく知られているとおり、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーである（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ， ｐａｇｅｓ １５５−２００ 参照、出典明示により本明細書の一部とする）。好ましいＺリンカーには、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含有するアルキル基を含む）があるが、これらに限定されず、好ましいのは、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体であり、特に好ましいのは、プロピル、アセチレンおよびＣ２アルケンである。Ｚはまた、スルホン基であってもよく、下記のようにスルホンアミド結合を形成する。
【０２５４】
好ましい実施態様では、核酸と伝導性オリゴマーの結合は、核酸主鎖への結合を介して行う。これは、リボース−リン酸主鎖のリボースへの結合または主鎖のリン酸への結合、または類似主鎖の他の基への結合を含む多くの方法で実施できる。
【０２５５】
予備事項として、下記に十分説明するように、本実施態様における結合部位は、３’または５’末端ヌクレオチド、または内部ヌクレオチドであると理解されるべきである。
【０２５６】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーをリボース−リン酸主鎖のリボースへ結合させる。これは、いくつかの方法で実施できる。当分野では知られているように、リボースの２’または３’位のいずれかにアミノ基、硫黄基、ケイ素基、リン基またはオキソ基で修飾したヌクレオシドを作成できる（Ｉｍａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ４４： ２０３９ （１９７９）； Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４２ （４）： ７１４ （１９７７）； Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３６ （２）： ２５０ （１９７１）； ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６１： ７８１−７８５ （１９９）； Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｅｂｉｇｓ． Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． ５１３−５１９ （１９９３）； ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４ （６）： １３２９ （１９９５）、全て出典明示により本明細書の一部とする）。次いで、伝導性オリゴマーを加えるためにこれらの修飾ヌクレオシドを用いる。
【０２５７】
好ましい実施態様は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。このとき、これらのアミノ修飾リボースを用いて、伝導性オリゴマーに対してアミドまたはアミン結合を形成できる。好ましい実施態様では、アミノ基を直接リボースに結合させるが、当業者には明らかであるように、「Ｚ」について記載したような短いリンカーをアミノ基とリボースとの間に与えることができる。
【０２５８】
好ましい実施態様では、リボースに結合させるためにアミド結合を使用する。好ましくは、構造１〜３の伝導性オリゴマーを用いるならば、ｍは０であり、従って伝導性オリゴマーの末端はアミド結合である。この実施態様では、アミノ修飾リボースのアミノ基の窒素は、伝導性オリゴマーの「Ｄ」原子である。よって、本実施態様の好ましい結合を、構造２０に示す（構造３の伝導性オリゴマーを用いる）。
【０２５９】
【化２０】
0003548159.tif 000021
当業者には明らかなように、構造２０は、アミド結合として固定された末端結合を有する。
【０２６０】
好ましい実施態様では、ヘテロ原子結合、即ち、オキソ、アミン、硫黄等を用いる。好ましい実施態様はアミン結合を利用する。また、アミド結合について上記で概説したとおり、アミン結合の場合も構造３の伝導性オリゴマーを用いると、アミノ修飾リボースの窒素が伝導性オリゴマーの「Ｄ」原子であり得る。よって、例えば、構造２１および２２は、それぞれ構造３および９の伝導性オリゴマーを持つヌクレオシドを示し、ヘテロ原子として窒素を用いているが、他のヘテロ原子を使用することもできる：
【０２６１】
【化２１】
0003548159.tif 000022
構造２１では、好ましくは、ｍもｔも０ではない。ここで好ましいＺはメチレン基またはその他の脂肪族アルキルリンカーである。この位置にある１、２または３つの炭素は特に合成の際に有用である。
【０２６２】
【化２２】
0003548159.tif 000023
構造２２では、Ｚは上記定義のとおりである。適切なリンカーには、メチレンおよびエチレンがある。
【０２６３】
別の実施態様では、伝導性オリゴマーを、核酸のリボース−リン酸主鎖（または類似体）のリン酸を介して核酸に共有結合させる。この実施態様では、結合は直接的か、またはリンカーまたはアミド結合を利用する。構造２３は、直接結合を示しており、構造２４は、アミド結合を介した結合を示している（両方とも、構造３の伝導性オリゴマーを利用しているが、構造８の伝導性オリゴマーも可能である）。構造２３および２４は、３’位の伝導性オリゴマーを示しているが、５’位も可能である。更に、構造２３および２４とも、天然のホスホジエステル結合を示しているが、当業者には明らかなように、ホスホジエステル結合の非標準類似体も使用できる。
【０２６４】
【化２３】
0003548159.tif 000024
構造２３中、末端にＹが存在する（即ちｍ＝１）場合、Ｚは存在しない（即ち、ｔ＝０）のが好ましい。末端にＹが存在しない場合、Ｚは存在するのが好ましい。
【０２６５】
構造２４は、末端Ｂ−Ｄ結合がアミド結合であり、末端にＹが存在せず、Ｚが上記定義のリンカーである好ましい実施態様を示す。
【化２４】
0003548159.tif 000025
【０２６６】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、遷移金属の配位子を介して核酸に共有結合する。本実施態様では、伝導性オリゴマーを遷移金属に１以上の配位原子を提供する配位子に共有結合させる。一実施態様では、下記構造２５に総括的に示したように、伝導性オリゴマーが結合する配位子には、核酸も結合している。あるいは、下記構造２６に総括的に示したように、伝導性オリゴマーは１つの配位子に結合しており、核酸は別の配位子に結合している。よって、遷移金属の存在下で伝導性オリゴマーは核酸に共有結合する。これらの構造はいずれも構造３の伝導性オリゴマーを示しているが、その他のオリゴマーを利用することもできる。構造２５および２６は、核酸用の２つの代表的な構造を示す：
【０２６７】
【化２５】
0003548159.tif 000026
【０２６８】
【化２６】
0003548159.tif 000027
【０２６９】
本明細書記載の構造中、Ｍは金属原子であり、遷移金属が好ましい。本発明に使用するのに適した遷移金属はカドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタニウム（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）などであるが、これらに限定されるものではない。すなわち、遷移金属の第１系列、白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ）並びにＦｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃが好ましい。特に好ましいのはルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
【０２７０】
Ｌは補助配位子であり、金属イオン結合のための配位原子を提供する。当業者が認識するように、補助配位子の数と性質は金属イオンの配位数に依存する。単座、二座または多座補助配位子はどの位置で使用してもよい。従って、例えば、金属が６の配位数を有する場合、伝導性オリゴマーの末端からのＬ、核酸から与えられるＬ、およびｒを６まで加える。従って、金属が六配位数の場合、ｒは０（全配位原子が他の２つの配位子によって与えられる場合）から４（全ての補助配位子が一座配位の場合）の範囲であろう。従って、一般に、金属イオンの配位数および他の配位子の選択に依存してｒは０ないし８であるであろう。
【０２７１】
ある実施態様において、金属イオンは６の配位数を有し、そして伝導性オリゴマーに付着した配位子および核酸に付着した配位子は、両方共、少なくとも２量体である；すなわち、ｒは、好ましくは、０、１（すなわち残った補助配位子は２量体である）または２（２つの一座配位補助配位子が使用される）である。
【０２７２】
技術的に認識されるように、補助配位子は同一であっても異なってもよい。適切な配位子は２つの範疇に入る：配位原子（一般的には文献上、シグマ（σ）供与体という）として（金属イオンに依存して）、窒素、酸素、イオウ、炭素またはリン原子を用いる配位子、およびメタロセン配位子などの有機金属配位子（一般的には文献上、パイ（π）供与体といい、本明細書ではＬｍで図示する）である。適切な窒素供与配位子は技術上周知であり、以下のものを包含するがこれらに限定されるものではない：ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと略記）およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと略記）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと略記）；９，１０−フェナントレンキノン・ジイミン（ｐｈｉと略記）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと略記）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと略記）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニド。融合した誘導体を包含する置換誘導体も使用することができる。ある態様においては、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用してもよい。例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｅｄ． Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １３．２ （ｐｐ ７３−９８）， ２１．１ （ｐｐ ８１３−８９８） ａｎｄ ２１．３ （ｐｐ ９１５−９５７）参照。この文献の全部を特に参照により本明細書に取込む。
【０２７３】
炭素、酸素、イオウおよびリンを用いる適切なシグマ供与配位子は技術上既知である。例えば、適切なシグマ炭素供与体はＣｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９８８に見出されるが、この文献を参照により本明細書に取込む；例えば、３８ページ参照。同様に、適切な酸素配位子は、クラウンエーテル、水、および技術上既知の他のものを包含する。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適切である；Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎの３８ページ参照。
【０２７４】
酸素、イオウ、リンおよび窒素−供与配位子は、ヘテロ原子が配位原子として作動するような様式で付着する。
【０２７５】
好適な態様においては、有機金属配位子を用いる。レドックス部分として使用する純有機化合物、およびヘテロ環状またはエキソ環状置換基として供与原子をもつδ−結合有機配位子との種々の遷移金属配位複合体に加えて、π−結合有機配位子をもつ多様な遷移金属有機金属化合物が入手可能である（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｃｏｔｔｏｎ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９８８， Ｃｈａｐｔｅｒ ２６； Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ， Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２ｎｄ Ｅｄ．， １９９２， ＶＣＨ； およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ， Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ １９８２−１９９４， Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｄ．， Ｖｏｌ． ７， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ７， ８， １０ ＆ １１， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， 特に参照により本明細書に取込む）。かかる有機金属配位子は、シクロペンタジエニド・イオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環状芳香族化合物および種々の環置換および環融合誘導体、例えば、インデニリド（−１）イオンなどであって、一群のビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわち、メタロセン）を産生する；例えば、Ｒｏｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０４： １８８２−１８９３ （１９８２）； および Ｇａｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０８： ４２２８−４２２９ （１９８６）参照；これらを出典明示により本明細書に組込まれている。これらの内、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］およびその誘導体が多様な化学的（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ｅ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９６： ８７７−９１０ （１９９６）， 出典明示により本明細書に組込まれている）および電子化学的（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： １−９３； およびＧｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４： ８７， 出典明示により本明細書に組込まれている）電子伝達または「レドックス」反応に使用されている原型的な例である。様々な第１、第２および第３列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基のいずれかに共有結合により付着しているレドックス部分としての有力な候補である。他の潜在的に適切な有機金属配位子は、ベンゼンなどの環状アレンなどを包含し、ビス（アレン）金属化合物とその環置換および環融合誘導体を産生するが、そのビス（ベンゼン）クロミウムは原型的な例である。アリル（−１）イオンなどの他の非環状π−結合配位子またはブタジエンは潜在的に適切な有機金属化合物を産生し、かかる配位子はすべて他のπ−結合およびδ−結合配位子と連携して、金属−炭素結合をもつ一般クラスの有機金属化合物を構成する。架橋有機配位子およびさらなる非架橋配位子を有し、同様に金属−金属結合を有し、また有さない、かかる化合物の種々のダイマーおよびオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析に��ける有力な候補レドックス部分である。
【０２７６】
１種以上の補助配位子が有機金属配位子である場合、該配位子は一般に有機金属配位子の炭素原子の一つを介して付着するが、ただし付着は複素環式の配位子に対し他の原子を介してであってもよい。好適な有機金属配位子は、置換誘導体およびメタロセンオファンを含むメタロセン配位子を包含する（上記 Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ の１１７４ページ参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセン配位子の誘導体、好ましくは複数のメチル基を有する例えば、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどを用い、メタロセンの安定性を増大させることができる。好適な態様において、メタロセンの２つのメタロセン配位子の１つのみが誘導化される。
【０２７７】
本明細書に記載のように、配位子の任意の組み合わせを使用し得る。好ましい組み合わせは：ａ）全配位子が窒素供与配位子である；ｂ）全配位子が有機金属配位子である；そしてｃ）伝導性オリゴマーの末端の配位子がメタロセン配位子であり、核酸により提供される配位子は窒素投与配位子であることを含み、必要により、他の配位子と一緒であり、それは窒素供与配位子またはメタロセン配位子またはその混合物である。これらの組み合わせは、構造３の伝導性オリゴマーを使用した代表例に記載され、構造２７（フェナンスロリンおよびアミノを代表的配位子として使用して）、２８（フェロセンを金属−配位子組合わせとして使用して）および２９（シクロペンタジエニルおよびアミノを代表的配位子として使用して）に記載する。
【０２７８】
構造２７
【化２７】
0003548159.tif 000028
【０２７９】
構造２８
【化２８】
0003548159.tif 000029
【０２８０】
構造２９
【化２９】
0003548159.tif 000030
【０２８１】
好ましい態様において、本発明で使用する配位子は、キレート化金属イオンのレドックス状態に依存して、別の蛍光特性を示す。下記のように、これは、従って、ＥＴＭと電極間の電子伝達の検出の別のモードとして作用する。
【０２８２】
さらに、同様の方法を使用して、タンパク質を検出電極に付着させることができる；例えば米国特許第５，６２０，８５０号参照、出典明示により本明細書に組込まれている。
【０２８３】
下記により詳細に示すような、好ましい態様において、核酸に結合した配位子は、リボース−リン酸主鎖のリボースの２’または３’位置に結合したアミノ基である。本配位子は、金属イオンに結合する多座配位子を形成するように、多くのアミノ基を含み得る。他の好ましい配位子は、シクロペンタジエンおよびフェナンスロリンを含む。
【０２８４】
核酸を結びつけるために金属イオンを用いると、システムの内部対照または目盛として機能し、表面上の利用可能な核酸の数を測定できる。しかしながら、当業者には明らかなように、金属イオンを用いて核酸を伝導性オリゴマーに結びつける場合、下記のように、システムの残部で使用されるＥＴＭのレドックス電位とは異なるレドックス電位を、この金属イオン錯体が有しているのが、通常望ましい。これは、標的配列の存在から捕獲プローブの存在を区別し得るために一般的に正しい。これは同定、測定および／または定量化に有用である。従って、電極での捕獲プローブの量をハイブリダイズした２本鎖核酸の量と比較して、サンプル中の標的配列の量を定量化することができる。これはセンサーまたはシステムの内部対照として機能するのに非常に重要である。これにより、標的を添加する前または後のいずれにおいても、似ているが異なる対照システムに依存するよりも、むしろ検出に用いられる同一の分子上での測定が可能となる。従って、検出に使用されるであろう実際の分子を、いかなる実験にも先立ち定量化できる。これは以前の方法より重要な利点である。
【０２８５】
好適な態様において、捕獲プローブ核酸（または他の結合リガンド）を、絶縁体を介して電極に共有結合により付着させる。核酸（および他の結合リガンド）がアルキル基などの絶縁体に付着することは周知であり、それらの付着は、塩基、またはリボースまたはリン酸エステル部分を含む主鎖に対して、または核酸類似体の代替主鎖に対して実施し得る。
【０２８６】
好適な態様においては、表面上に１種またはそれ以上の異なる捕獲プローブ種があってもよい。一部の態様においては、以下により詳細に説明するように、そこには捕獲プローブの１タイプまたは捕獲伸長プローブの１タイプがあってもよい。あるいは、異なる捕獲プローブ、または多様な異なる捕獲伸長プローブをもつ１種の捕獲プローブを用いることもできる。同様に、（特にメカニズム−２システムでの核酸被検体および結合リガンドの場合）比較的短いプローブ配列を含む補助捕獲プローブを使用することが望ましく、これはシステムの成分、例えば、リクルートリンカーを「取押さえる」のに使用し、表面でのＥＴＭ濃度を上げることができる。
【０２８７】
このように、本発明は標的被検体検出システムに有用な、単層と捕獲結合リガンドを含む、少なくとも１つの検出電極を含む基質を提供する。
【０２８８】
好適な態様においては、該組成物はさらに溶液あるいは溶解性結合リガンドを含むが、メカニズム−１システムについて下に詳記したように、ＥＴＭを、非共有的に付着したハイブリダイゼーション指示体の形態で添加してもよい。溶液結合リガンドは、好ましくは特異的に、標的被検体に結合する点で捕獲結合リガンドに似ている。溶液結合リガンドは捕獲結合リガンドと同一でもまたは異なっていてもよい。一般に、溶液結合リガンドは、図５Ａに描出したような場合もあるが、直接表面に結合するものではない。溶液結合リガンドは少なくとも１つのＥＴＭ（図４Ａ）を含むリクルートリンカーを直接含むか、またはリクルートリンカーが溶液結合リガンドと直接的（図４Ａ）にまたは間接的（図４Ｆ）に結合する。
【０２８９】
このように、共有結合的に付着したＥＴＭを含むリクルートリンカーを有する、「溶液結合リガンド」または「溶解性結合リガンド」または「シグナル担体」または「標識プローブ」または「標識結合リガンド」が提供される。すなわち、標識プローブまたは溶液結合リガンドのある部分が、直接的または間接的に、標的被検体と結合しており、そしてある部分が共有結合的に付着したＥＴＭを含むリクルートリンカーを含む。いくつかのシステム、例えばメカニズム−１核酸システム中では、これらは同一であってもよい。同様に、メカニズム−１において、リクルートリンカーは、検出プローブとハイブリダイズし得る核酸を含む。「電子供与体部分」、「電子受容体部分」、および「ＥＴＭ」（ＥＴＭ）という用語または文法的均等物は、一定の条件下で電子伝達し得る分子をいう。電子供与体および電子受容体の許容力は相対的であるということは理解されるべきである；すなわち、一定の実験条件下で電子を失う分子が、異なる実験条件下で電子を受容し得る。可能な電子供与体部分と電子受容体部分の数は非常に多く、また、電子転移化合物の当業者であれば本発明において多くの化合物を利用し得るであろう、ということも理解されるべきてある。好適なＥＴＭとは、遷移金属錯体、有機ＥＴＭ、および電極であるが、これらに限定されるものではない。
【０２９０】
好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属錯体である。遷移金属とはその原子が部分的または完全な電子のｄ殻を有するものである。本発明に使用する適切な遷移金属は上に列記してある。
【０２９１】
遷移金属は上記定義の様々な配位子Ｌと錯体を形成し、当該技術上周知のように、適切な遷移金属錯体となる。
【０２９２】
遷移金属錯体に加えて、他の有機電子供与体および受容体は、本発明に使用する核酸に共有結合により付着していてもよい。これらの有機分子は、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザピレニウム・ジクロリド（ＤＡＰ２＋）、メチルビオロジェン、臭化エチジウム、キノン類、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアントラ（２，１，９−ｄｅｆ．６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’）ジイソキノリン・ジクロリド（ＡＤＩＱ２＋）；ポルフィリン（［メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム）ポルフィリン・テトラクロリド］）、ベルラミン・ブルーＢ塩酸塩、ビンドシェドラー（Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ）グリーン；２，６−ジクロロインドフェノール、２，６−ジブロモフェノールインドフェノール；ブリリアント・クレストブルー（塩化３−アミノ−９−ジメチルアミノ−１０−メチルフェノキシアジン）、メチレンブルー； ナイルブルーＡ（アミノアフトジエチルアミノフェノキサジン硫酸塩）、インジゴ−５，５’，７，７’−テトラスルホン酸、インジゴ−５，５’，７−トリスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−モノスルホン酸；サフラニンＴ；塩化ビス（ジメチルグリオキシマト）鉄（ＩＩ）；インデュリンスカーレット、ニュートラルレッド、アントラセン、コロネン、ピレン、９−フェニルアントラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアジン、フルオランテン、フェナントレン、クリセン、１，８−ジフェニル−１，３，５，７−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよびこれら化合物の類似体と置換誘導体であるが、これらに限定されるものではない。
【０２９３】
一態様において、電子供与体および受容体は技術上既知のレドックスタンパク質である。しかし、多くの態様においてレドックスタンパク質は好ましくない。
【０２９４】
一態様において、特に電気泳動工程を用いる場合、ＥＴＭは、好ましくは標的被検体が帯電していない場合、帯電した分子であるものが選択される。このように、例えば、多数の帯電したＥＴＭを直接または間接に含む溶液結合リガンドを電気泳動に先立ち標的被検体に結合させ、標的被検体が電界内で移動するのに十分な電荷をもつようにし、結果として電荷と検出部分を与える二重の目的を実現させ得る。このように、例えば、帯電したＥＴＭを含む標識プローブが使用可能であり、標的被検体に直接結合する、または増幅プローブなどの中間体種に結合するプローブが使用できる。あるいは、他の帯電種をＥＴＭに加えて付加し得る。あるいは、これらの電荷種はこのシステムの不可欠な部分でもあり得る；例えば、標識プローブの部分がポリリジンのような帯電ポリマーであってもよい。しかし、この態様において、非特異的に結合した標識プローブの検出表面移動は非特異シグナルの増大に至ることにもなる。従って、この態様において、電気泳動後に逆電界（一般には逆極性のパルス）を使用すると、非特異的に結合した標識プローブを検出プローブ表面から追い出しまたは放出するに至り、バックグランドの非特異的シグナルを減少させる。
【０２９５】
特異ＥＴＭの選択は、以下に一般的に概説するように、使用する電子伝達検出のタイプにより影響を受ける。好適なＥＴＭはメタロセンであり、特に好ましいのはフェロセンとその誘導体である。
【０２９６】
好適な態様においては、複数のＥＴＭが使用される。実施例に示すように、多様なＥＴＭの使用はシグナルの増幅につながり、より感度の高い検出限界を可能とする。以下に検討するように、相補鎖にハイブリダイズする核酸上で複数のＥＴＭを使用すると、その数、付着の部位および複数ＥＴＭ間の空間関係に依存してハイブリダイゼーション複合体のＴｍの減少を引起す。一方、それはＥＴＭがリクルートリンカー上にある（すなわち、「メカニズム−２」）場合、要因ではなくなる。なぜなら、それが相補配列にハイブリダイズしないからである。従って、複数のＥＴＭが好ましく、リクルートリンカー当たり少なくとも約２個のＥＴＭが好ましく、また少なくとも１０個が特に好ましく、また少なくとも約２０〜５０個がとりわけ好ましい。ある事例では、非常に多くのＥＴＭ（５０ないし１０００個）が使用可能である。
【０２９７】
このように、共有結合付着したＥＴＭをもつ溶液結合リガンドまたは標識プローブが提供される。ＥＴＭを溶液結合リガンドに付着させる方法は、検出様式（すなわち、メカニズム−１または２のシステム）および溶液結合リガンドの構成物に依存して変化する。以下により詳細に説明するように、メカニズム−２システムにおいて、ＥＴＭを含む溶液結合リガンド（または標識プローブ）の部分は「リクルートリンカー」といい、核酸または非核酸から構成されていてもよい。メカニズム−１システムの場合、リクルートリンカーは核酸でなければならない。
【０２９８】
このように、当業者が認めるように、使用し得る多様な構成が存在し得る。好適な態様において、リクルートリンカーは核酸（類似体も含む）であり、ＥＴＭの付着は、下記に示すように、（１）塩基；（２）主鎖、例えば、リボース、リン酸エステル、または核酸類似体の相当する構造；（３）下記のヌクレオシド置換；または（４）下記のごときメタロセンポリマー；を介する。好適な態様において、リクルートリンカーは非核酸であり、メタロセンポリマーまたはＥＴＭ置換基を含むアルキル型ポリマー（以下により詳細に説明するように、ヘテロアルキルを含む）であってもよい。これらの選択肢は図７に一般的に描出する。
【０２９９】
好適な態様において、リクルートリンカーは核酸であり、共有結合により付着したＥＴＭを含んでいる。ＥＴＭは様々な位置で核酸内のヌクレオシドに付着していてもよい。好適な態様は、（１）ヌクレオシド塩基への付着、（２）塩基置換体としてのＥＴＭの付着、（３）リボース−リン酸主鎖のリボースまたはリン酸部分への、または核酸類似体の類似構造へなどの核酸主鎖への付着、および（４）メタロセンポリマーを介しての付着、などであるが、これらに限定されるものではない。
【０３００】
さらに、下記のように、リクルートリンカーが核酸である場合、第２の標識プローブを用いることが望ましく、該プローブは本明細書に定義のように第１標識プローブの一部にハイブリダイズする第１部分とリクルートリンカーを含む第２部分を有する。これは一般的に図６Ｑおよび６Ｒに図示される；これは増幅プローブの使用に似ているが、第１および第２標識プローブ両者がＥＴＭを含む場合は例外である。
【０３０１】
好適な態様において、伝導性オリゴマーの付着のために、既に一般的に概説されているようにヌクレオシドの塩基に付着する。付着は内部ヌクレオシドまたは末端ヌクレオシドに対してなされる。
【０３０２】
共有結合による塩基への付着は選定されたＥＴＭ上の部分に依存するが、一般には上記されているように、伝導性オリゴマーが塩基に付着するのに似ている。付着は、一般には、塩基のどの部位になされてもよい。好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属錯体であり、かくして、適切な金属配位子の塩基への付着がＥＴＭの共有結合による付着に導く。あるいは、当業者が認識するように、同様のタイプの結合を有機ＥＴＭの付着に使用してもよい。
【０３０３】
一態様において、シトシンのＣ４付着アミノ基、アデニンのＣ６付着アミノ基、またはグアニンのＣ２付着アミノ基が遷移金属配位子として使用し得る。
【０３０４】
芳香族基を含む配位子は技術上既知のようにアセチレン結合を介して付着することができる（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２．４； Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐ２ ａｎｄ ｓｐ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｅｎｔｅｒｓ， Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ， ｐｐ ５２１−５４９， ａｎｄ ｐｐ ９５０−９５３参照； 出典明示により本明細書に組込まれている）。構造３０は金属イオンと他の必要な配位子存在下での代表的な構造を図示する；構造３０ではウリジンを図示しているが、本明細書全体について、他の塩基を使用することも可能である。
【０３０５】
【化３０】
0003548159.tif 000031
Ｌａは配位子であり、窒素、酸素、イオウまたはリン供与配位子またはメタロセンリガンドなどの有機金属配位子を包含する。適切な配位子Ｌａはフェナントロリン、イミダゾール、ｂｐｙおよびｔｅｒｐｙなどであるが、これらに限定されるものではない。ＬｒおよびＭは上記定義のとおりである。再度、当業者が認識するように、リンカー（「Ｚ」）はヌクレオシドとＥＴＭの間に含まれる。
【０３０６】
同様に、伝導性オリゴマーに関しては、その結合がリンカーを用いてなされるが、リンカーはアミド結合を利用することができる（一般的に、Ｔｅｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ７２２１−７２２６ （１９８９）； Ｔｅｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ７２２６−７２３２ （１９８９）参照；両文献を特に出典明示により本明細書に組込まれている）。これらの構造は下記構造３１に一般的に図示する。再度ここではウリジンを塩基として使用しているが、上記同様、他の塩基も使用し得る。
【０３０７】
【化３１】
0003548159.tif 000032
この態様において、Ｌは上記定義の配位子であり、ＬｒおよびＭも上記定義のとおりである。好ましくは、Ｌはアミノ、ｐｈｅｎ、ｂｙｐおよびｔｅｒｐｙである。
【０３０８】
好適な態様において、ヌクレオシドに付着したＥＴＭはメタロセンである；すなわち、構造３１のＬおよびＬｒは両者ともメタロセン配位子であり、上記のＬｍ’である。構造３２は好適な態様を図示するものであり、この場合メタロセンはフェロセン、塩基はウリジンであるが、他の塩基も使用可能である。
【０３０９】
【化３２】
0003548159.tif 000033
予備データが示唆するところでは、構造３２は環化可能であって、第２アセチレン炭素原子がカルボニル酸素を攻撃し、フラン様構造を形成する。好適なメタロセンはフェロセン、コバルトセンおよびオスミウムオセンなどである。
【０３１０】
好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸主鎖のいずれかの位置、すなわち、５’または３’末端またはいずれかの内部ヌクレオシドでリボースに付着している。この場合のリボースはリボース類似体を包含する。技術的に知られているように、リボースの２’または３’位置のいずれかで修飾されているヌクレオシドは、窒素、酸素、イオウおよびリン−含有修飾により可能となり得る。アミノ−修飾および酸素−修飾リボースが好ましい。一般的には、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１（出典明示により本明細書に組込まれている）を参照されたい。これらの修飾基は遷移金属配位子として、または他の遷移金属配位子および有機金属配位子付着のための化学的に官能性の部分、または当業者認知の有機電子供与体部分として使用することができる。この態様において、本明細書において「Ｚ」として図示したようなリンカーも同様に、あるいはリボースとＥＴＭ間の伝導性オリゴマーも使用可能である。好適な態様では、リボースの２’または３’位での付着を利用するが、２’位置が好ましい。このように例えば、構造１３、１４および１５に図示された伝導性オリゴマーはＥＴＭに置換えることができる；あるいは、ＥＴＭは伝導性オリゴマーの遊離末端に加えてもよい。
【０３１１】
好適な態様において、メタロセンはＥＴＭとして作動し、下記構造３３に図示するようにアミド結合を介して付着する。例示ではメタロセンがフェロセンである場合の好適な化合物につきその合成を概説する。
【化３３】
0003548159.tif 000034
【０３１２】
好適な態様においては、アミンの結合が構造３４に一般的に図示するように使用される。
【化３４】
0003548159.tif 000035
Ｚは本明細書に定義のごときリンカーであり、１〜１６原子のものが好ましく、２〜４原子がとりわけ好ましい。ｔは１または０である。
【０３１３】
好適な態様においては、オキソ結合が構造３５に一般的に図示するように使用される。
【化３５】
0003548159.tif 000036
構造３５において、Ｚは本明細書に定義のとおりのリンカーであり、ｔは１または０である。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎおよび（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０３１４】
他のヘテロ原子を利用する結合も可能である。
【０３１５】
好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸主鎖のいずれかの位置でリン酸エステルに付着する。これは様々な様式でなされる。一態様において、ホスホジエステル結合類似体、例えば、ホスホラミドまたはホスホラミダイト結合は核酸中に取込まれていてもよく、その場合、ヘテロ原子（すなわち、窒素）が遷移金属配位子として作動する（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１参照；出典明示により本明細書に組込まれている）。あるいは、構造２３および２４に図示されている伝導性オリゴマーをＥＴＭに置換えてもよい。好適な態様において、組成物は構造３６に示した構造を有する。
【化３６】
0003548159.tif 000037
【０３１６】
構造３６において、ＥＴＭはリン酸エステル結合を介して、一般にはリンカーＺを使用することにより付着する。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０３１７】
メカニズム−２システムにおいて、ＥＴＭがヌクレオシドの塩基または主鎖に付着している場合、より詳しく下に概説するように、「樹枝状」構造を介してＥＴＭを付着させることが可能である。図３７に一般的に示すように、アルキルベースのリンカーを用い、各枝の末端に１個以上のＥＴＭを含む多数の分枝構造を創り出すことができる。一般に、これは多数のヒドロキシ基を含む分枝点を創り出すことにより実施されるが、このヒドロキシ基を用いてさらなる分枝点を加えることができる。一般的にはヌクレオシド置換およびメタロセンポリマー反応のために以下に実施するように、末端のヒドロキシ基を次いでホスホラミダイト反応に用い、ＥＴＭに加えることができる。
【０３１８】
好適な態様において、メタロセンなどのＥＴＭは、ＥＴＭとして作動するように「ヌクレオシド置換体」として使用する。例えば、フェロセンの２つのシクロペンタジエン環の間の距離は、２本鎖核酸中の２つの塩基間の直交距離に類似している。フェロセンに加え、他のメタロセン、例えば、コバルトまたはルテニウムなどを含むメタロセンなどの空気安定性メタロセンを使用することができる。このように、メタロセン部分は、構造３７（リボース−リン酸主鎖を有する核酸）および構造３８（ペプチド核酸主鎖）に一般的に図示するように、核酸の主鎖に取込んでもよい。構造３７および３８ではフェロセンを図示しているが、当業者が認識するように、他のメタロセンも同様に使用し得る。一般に、空気に安定なメタロセンが好ましく、金属としてルテニウムおよびコバルトを利用するメタロセンが包含される。
【０３１９】
【化３７】
0003548159.tif 000038
構造３７において、Ｚは上記定義のリンカーであり、一般的には短いアルキル基をもち、酸素などのヘテロ原子を含むものが好ましい。一般に、重要なことはリンカーの長さであり、より詳しく以下に説明するように、２本鎖核酸の混乱が最小になるようにする。このように、メチレン、エチレン、エチレングリコール、プロピレンおよびブチレンがすべて好適であり、エチレンおよびエチレングリコールが特に好ましい。さらに、各Ｚリンカーは同一であっても、異なってもよい。構造３７はリボース−リン酸主鎖を表示しているが、当業者が認識するように、リボース類似体およびリン酸エステル結合類似体などの核酸類似体を使用してもよい。
【０３２０】
【化３８】
0003548159.tif 000039
構造３８において、好適なＺ基は上記掲載のとおりであるが、再度、各Ｚリンカーは同一または異なってもよい。上述のように、他の核酸類似体も同様に使用し得る。
【０３２１】
さらに、上記の構造と検討ではメタロセン、特にフェロセンを描出しているが、同じ一般的な着想を用い、下記のように、ヌクレオシドの置換体として、またはポリマーの態様において、メタロセンに加えてＥＴＭを付加することができる。このように、例えば、１、２または３個（またはそれ以上）の配位子を含む、メタロセン以外の遷移金属錯体である場合、該配位子をフェロセンについて表現したように機能化し、ホスホラミダイト基の付加を可能とすることができる。特に、この態様において好ましいのは、少なくとも２つの環（例えば、アリールおよび置換アリール）配位子を含む複合体であり、その場合、各配位子はホスホラミダイト化学による付着のための官能基を含む。当業者が認識するように、このタイプの反応は、核酸主鎖の一部としてまたは核酸の「側鎖基」としてＥＴＭのポリマーを創出し、ここで生じるシグナルの増幅を可能とするが、このタイプの反応を、正しい化学基を含むように官能化し得る実質的にいずれのＥＴＭによっても実施することができる。
【０３２２】
このように、フェロセンなどのメタロセン（または他のＥＴＭ）を核酸の主鎖に挿入することにより、核酸類似体が調製される；すなわち、本発明は少なくとも１個のメタロセンを含む主鎖をもつ核酸を提供する。これは、主鎖に付着した、すなわち、リボース、リン酸エステルなどを介して、メタロセンを有する核酸から識別される。すなわち、伝統的な核酸または類似体から造られた２つの核酸（この場合の核酸は単一のヌクレオシドを包含する）それぞれは、メタロセンを介して互いに共有結合により付着することができる。異なる観点で、メタロセン誘導体または置換メタロセンが提供されるが、その場合は、メタロセンの２つの芳香環それぞれが核酸置換基を有する。
【０３２３】
さらに、より詳しく以下に説明するように、間にヌクレオチドをもつか、および／または隣接するメタロセンをもつ１個より多いメタロセンを主鎖に取込ませることが可能である。隣接するメタロセンを主鎖に付加する場合、これは「メタロセンポリマー」としての下記の工程と同じである；すなわち、主鎖内にメタロセンポリマーの領域が存在する。
【０３２４】
核酸置換基に加え、ある場合には、メタロセン（またはＥＴＭ）の芳香環の一方または双方にさらなる置換基を付加することが望ましい。例えば、これらのヌクレオシド置換体は一般に実質的に相補的な核酸、例えば、標的配列またはもう一つのプローブ配列とハイブリダイズすべきプローブ配列の部分なので、置換基をメタロセン環に付加して、反対鎖上の１個または複数個の塩基に水素結合形成するのを容易にすることが可能である。これらはメタロセン環上のどの位置に付加してもよい。適切な置換基は、アミド基、アミン基、カルボン酸、および置換アルコールを含むアルコール類であるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの置換基は同様にリンカーを介して付着させることができるが、一般的には好ましくない。
【０３２５】
さらに、ＥＴＭ、特にフェロセンなどのメタロセン上に置換基を付加してＥＴＭのレドックス性を変化させてもよい。このように、例えばある態様では、より詳しく以下に記載するように、異なる様式で（すなわち、塩基またはリボース付着）、異なるプローブ上、または異なる目的で（例えば、目盛または内部基準として）付着した異なるＥＴＭを有することが望ましい。このように、メタロセン上に置換基を付加することは、２つの異なるＥＴＭの識別を可能とする。
【０３２６】
これらのメタロセン主鎖核酸類似体を生成させるために、中間成分も提供される。このように、好適な態様において、本発明は構造３９に一般的に表示するように、ホスホラミダイト・メタロセンを提供する。
【化３９】
0003548159.tif 000040
【０３２７】
構造３９において、ＰＧは保護基であり、一般に核酸の合成に適した基であって、ＤＭＴ、ＭＭＴおよびＴＭＴなどがすべて好適である。芳香環はメタロセンの環であるか、または遷移金属錯体もしくは他の有機ＥＴＭ用配位子の芳香環であることができる。芳香環は同一または異なってもよく、また、本明細書に検討するように置換されていてもよい。
【０３２８】
構造４０はフェロセン誘導体を図示する：
【化４０】
0003548159.tif 000041
【０３２９】
これらのホスホラミダイト類似体は技術上既知の標準的オリゴヌクレオチド合成に追加することができる。
【０３３０】
構造４１はフェロセンペプチド核酸（ＰＮＡ）モノマーを図示し、技術上既知のＰＮＡの合成に追加することができる。
【化４１】
0003548159.tif 000042
構造４１において、ＰＧ保護基はペプチド核酸合成に使用するのに適しており、ＭＭＴ、ｂｏｃ、およびＦｍｏｃなどが好ましい。
【０３３１】
これら同一の中間化合物を用いてＥＴＭまたはメタロセンポリマーを形成することが可能であり、これらは、より詳しく以下に説明するように、主鎖置換体としてよりもむしろ核酸に付加される。
【０３３２】
好適な態様において、とりわけメカニズム−２システムの使用については、ＥＴＭはポリマーとして、例えば、メタロセンポリマーとして、本明細書および米国特許番号第５，１２４，２４６号に概説されているように、「分枝したＤＮＡ」態様と同様の「分枝した」構成で、修飾した機能化ヌクレオチドを用い付着させる。一般的な着想は以下のとおりである。修飾されたホスホラミダイトヌクレオチドが生成されるが、それはメタロセンなどのホスホラミダイトＥＴＭの付着に使用し得る遊離のヒドロキシ基を最終的に含むことができる。この遊離のヒドロキシ基は塩基またはリボースもしくはリン酸エステルなどの主鎖上に存在し得る（当業者も認識するであろうが、他の構造を含む核酸類似体も使用し得る）。修飾されたヌクレオチドを核酸に取込み、ヒドロキシ保護基を除去し、遊離のヒドロキシを生じる。構造３９および４０において上述したように、メタロセンなどのホスホラミダイトＥＴＭの付加に基づき、メタロセンＥＴＭなどのＥＴＭを付加する。メタロセンなどのさらなるホスホラミダイトＥＴＭを付加し、図９でフェロセンについて描写したように「メタロセンポリマー」を含む「ＥＴＭポリマー」を形成することができる。さらに、ある態様においては、図９に一般的に描出したように、「キャッピング」基をポリマー中の末端ＥＴＭに、例えば、最終リン酸エステル基をメタロセンに付加することによりポリマーの溶解性を上昇させることが望ましい。他の適切な溶解度上昇性「キャッピング」基は当業者が認識するであろう。留意すべきことは、これらの溶解度上昇性基は、配位子の環（例えば、本明細書で検討したメタロセン）を含む他の位置でポリマーに付加させることができることである。
【０３３３】
この一般的な着想の好適な態様を図面に概説する。この態様において、ホスホラミダイトヌクレオチドのリボースの２’位置を、この場合はオキソ結合を介して保護されたヒドロキシ基を含むようにまず官能化するが、リンカーの数については、Ｚリンカーについて本明細書で一般的に記載するようにいずれの数も使用し得る。保護修飾されたヌクレオチドは、次いで標準的なホスホラミダイトの化学によって、伸長している核酸中に取込む。保護基を除去し、遊離のヒドロキシ基を用い、再び標準的なホスホラミダイトの化学を用い、フェロセンなどのホスホラミダイトメタロセンを付加させる。同様の反応は核酸の類似体についても可能である。例えば、構造４１に示したペプチド核酸とメタロセンモノマーを用い、メタロセンポリマーを含むペプチド核酸構造を生成させることができる。
【０３３４】
このように、本発明は図８および９に一般的に図示したように、メタロセンポリマーの「分枝」を含む核酸のリクルートリンカーを提供する。好適な態様ではメタロセンの長さが１ないし約５０個、好ましくは約５ないし約２０個、とりわけ好ましくは約５ないし約１０個のメタロセンポリマーを利用する。
【０３３５】
さらに、リクルートリンカーが核酸である場合、任意の組合わせでＥＴＭの付着がなされる。一般的には、本明細書で概略するように、メカニズム−１システムを使用する場合、ＥＴＭを含むヌクレオシドのクラスターによって、標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションのＴｍを減少させることができる；従って、一般的に、メカニズム−１システムでは、ＥＴＭは、配列の全長にわたって介在するか、またはそれらの少数が使用される。
【０３３６】
メカニズム−１では、非共有的に付着したＥＴＭを使用することができる。ある実施態様では、ＥＴＭはハイブリダイゼーション指示体である。ハイブリダイゼーション指示体は、ＥＴＭ （加えると２本鎖核酸と選択的に通常は可逆的に会合する） として働き、これはＭｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６５：２３１７−２３２３ （１９９３）； Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６２９４３−２９４８ （１９９４） と同様の方法であり、両方とも引用して明示的に本明細書の一部とする。この実施態様では、ＥＴＭの局部濃度の増加 （ＥＴＭハイブリダイゼーション指示体と２本鎖核酸との表面での会合による） を、伝導性オリゴマーを含む単層を使用してモニターすることができる。ハイブリダイゼーション指示体は、インターカレーターとマイナーグルーブおよび／またはメジャーグルーブ結合部分を含む。好ましい実施態様では、インターカレーターを使用してもよい；挿入（インターカレーション）は、一般的に、２本鎖核酸の存在下でのみ起こるので、２本鎖核酸の存在下でのみＥＴＭは濃縮される。遷移金属錯体ＥＴＭの挿入は、当業者に知られている。同様に、メチレンブルーなどのメジャーグルーブまたはマイナーグルーブ結合部分を本実施に使用してもよい。
【０３３７】
さらに、本発明の結合促進システムを、標的被検体の電気化学的検出に依存するいずれの方法で、実質的に使用してもよく、核酸検出に特に有用である。例えば、本発明の方法および組成物を、標的被検体に固有のＥＴＭの検出に依存する核酸検出方法で使用することができる。例えば、Ｎａｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ８：９０６ （１９９７）（引用して明示的に本明細書の一部とする）で概略説明されているように、核酸のグアニン塩基を、酸化還元状態の変化（すなわち、ルテニウム錯体によるグアニン酸化）によって検出することができる。同様に、本発明の方法は、銅表面を触媒電極として利用して核酸のリボースを酸化する検出システムでの使い道も有用である。
【０３３８】
好適な態様において、リクルートリンカーは核酸ではなく、代りにいかなる種類のリンカーまたはポリマーであってもよい。当業者が認識するように、ＥＴＭを含むように修飾し得る一般的なリンカーまたはポリマーを用いることができる。一般に、ポリマーまたはリンカーは適度に溶解すべきであり、ＥＴＭ付加のための適切な官能基を含むべきである。
【０３３９】
本明細書にて用いる場合、「リクルートポリマー」とは共有結合により付着している少なくとも２または３個のサブユニットを含む。モノマーサブユニットの少なくともある部分はＥＴＭの共有結合による付着のための官能基を含む。ある態様において、カップリング部分を、サブユニットとＥＴＭとを共有結合させるために用いる。付着のための好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基などであって、アミノ基が特に好ましい。当業者が認識するように、多様なリクルートポリマーが可能である。
【０３４０】
適切なリンカーとしては、アルキルリンカー（ヘテロアルキル（（ポリ）エチレングリコール型構造を含む）、置換アルキル、アリールアルキルリンカーを含む）を包含するが、これらに限定されるものではない。ポリマーについては上記のごとく、リンカーはＥＴＭ付着のための１個以上の官能基を含み、付着は当業者認識のとおりに、例えば、周知のホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーを使用することによって実施される（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ， ｐａｇｅｓ １５５−２００ 参照。出典明示により本明細書の一部とする）。
【０３４１】
適切なリクルートポリマーは、機能化したスチレン、例えば、アミノスチレン、機能化したデキストラン、およびポリアミノ酸などを包含するが、これらに限定されるものではない。好適なポリマーは、ポリリジンなどのポリアミノ酸（ポリ−Ｄ−アミノ酸およびポリ−Ｌ−アミノ酸両方）、およびリジンと特に好適な他のアミノ酸を含むポリマーなどである。上記概略のように、ある実施態様では、荷電したリクルートリンカーが好ましい（例えば非荷電標的被検体を検出する場合など）。他の適切なポリアミノ酸は、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リジンとグルタミン酸またはアスパラギン酸との共重合体、リジンとアラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、および／またはプロリンとの共重合体などである。
【０３４２】
好適な態様において、リクルートリンカーには上記のようにメタロセンポリマーが含まれる。
【０３４３】
標識プローブ第１部分（すなわち、標的被検体に直接的または間接的のいずれかで結合する部分）へのリクルートリンカーの付着は、当業者が認識するように、リクルートリンカーの組成に依存する。リクルートリンカーが核酸である場合、付着は、一般に、要求されるＥＴＭ含有ヌクレオシドの取込みとともに、標識プローブの第１部分の合成の際に形成される。あるいは、標識プローブの第１部分とリクルートリンカーが別個に造られ、次いで付着してもよい。例えば、相補性の重なり合う区分があって、例えば、技術的に既知のソラレンを使用することにより、化学的に架橋し得る２本鎖核酸の区分を形成させてもよい。
【０３４４】
非核酸リクルートリンカーを使用する場合、リクルートリンカーのリンカー／ポリマー付着は一般に、当業者が認識するような標準的化学技法を用いて実施される。例えば、アルキル−ベースのリンカーを使用する場合、付着は核酸への絶縁体付着と同様である。
【０３４５】
さらに、核酸と非核酸の混合物であるリクルートリンカーを、線状形態（すなわち、核酸セグメントがアルキルリンカーとともに結合している）または分枝形態（ＥＴＭを含み、かつ、さらに分枝していてもよいアルキル「分枝」をもつ核酸）で入手することが可能である。
【０３４６】
好適な態様において、例えば標的被検体が核酸である場合、ＥＴＭを担持するのは、標識プローブのリクルートリンカーよりもむしろ標的配列それ自体である。例えば、以下により詳しく説明するように、本発明の各ＥＴＭを含むヌクレオチド三リン酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に際し、増殖する核酸に酵素的に加えることが可能である。当業者が認めるであろうように、いくつかの酵素は修飾したヌクレオチドに対し一般に寛容 （ｔｏｌｅｒａｔｅ） であることが示されているが、本発明の修飾ヌクレオチドの一部、例えば、「ヌクレオシド置換」の態様および恐らく一部リン酸エステルの付着は、増殖する核酸への取込みを可能とする酵素により認識されることもあり、されないこともある。したがって、この態様での好適な付着はヌクレオチドの塩基またはリボースに対するものである。
【０３４７】
このように、例えば、当業者周知のように、標的配列のＰＣＲ増幅は、その配列に一般にランダムに取込まれたＥＴＭを含む標的配列を与えることとなる。本発明のシステムは、図６Ａおよび６Ｂに一般的に描出したように、これらのＥＴＭを用いて検出可能となるように構成することができる。
【０３４８】
別法として、より詳細に以下に説明するように、ＥＴＭを含むヌクレオチドを核酸の末端、例えば、標的核酸に酵素的に付加することが可能である。この態様においては、図６Ｑに一般的に描出したように、有効な「リクルートリンカー」を標的配列の末端に付加させ、それを検出に使用することができる。このように、本発明は、伝導性オリゴマーの単層と捕獲プローブを含む電極を利用する構成物、並びにアッセイ複合体の成分にハイブリダイズすることの可能な第１部分、およびアッセイ複合体の成分にハイブリダイズせず、少なくとも１つの共有結合により付着した電子伝達部分を含む第２部分とを含む標的配列を提供する。同様に、これらの組成物を利用する方法も提供する。
【０３４９】
プローブ配列、すなわち、相補性配列にハイブリダイズするように設計された配列（すなわち、メカニズム−１配列だが、これをメカニズム−２システムでも使用することができる）にＥＴＭを連接させることも可能である。このように、ＥＴＭは非リクルートリンカーにも同様に付加させることができる。例えば、アッセイ複合体の成分にハイブリダイズする標識プローブ断片、例えば、第１部分に、または上記および図６Ｒに記載の標的配列に付加したＥＴＭが存在してもよい。これらのＥＴＭは一部の態様において電子伝達検出に使用してもよく、あるいはその位置とシステムによっては使用することができない。例えば、ある態様において、例えば、図６Ａおよび６Ｂに図示したように、無作為に取込ませたＥＴＭを含有する標的配列が捕獲プローブに直接ハイブリダイズする場合には、捕獲プローブにハイブリダイズする部分にＥＴＭが存在する。もし捕獲プローブが伝導性オリゴマーを用いる電極に付着するならば、これらのＥＴＭはすでに説明したように電子伝達を検出するのに使用することができる。あるいは、これらのＥＴＭは特異的に検出し得ない可能性もある。
【０３５０】
同様に、ある態様においては、リクルートリンカーが核酸である場合、リクルートリンカーの一部またはすべてが２本鎖であることが、ある例（例えばメカニズム−２システムなど）では望ましい。一態様においては、第２リクルートリンカーが存在し、それが実質的に第１リクルートリンカーに相補的であり、第１リクルートリンカーにハイブリダイズし得ることがある。好適な態様において、第１リクルートリンカーは共有結合により付着したＥＴＭを含む。別の態様において、第２リクルートリンカーはＥＴＭを含み、第１リクルートリンカーは含まず、ＥＴＭは第２リクルートリンカーが第１に対してハイブリダイズすることにより表面に集められる。さらにもう一つの態様においては、第１および第２リクルートリンカー双方がＥＴＭを含む。留意すべきことは、上記のように、大量数のＥＴＭを含む核酸は、同様にはハイブリダイズしない、すなわち、ＥＴＭの付着部位と特性に依存してＴｍが低下することがある。かくして、一般に、多数のＥＴＭが鎖のハイブリダイズに用いられるとき、すなわちメカニズム−１システムでは、一般には約５より小さく、好ましくは約３より小さくする。あるいはＥＴＭは、介在するヌクレオチドが充分にハイブリダイズして良好な反応速度が可能となるように十分な空間距離をとるべきである。
【０３５１】
好適な態様において、本発明の構成物は、サンプル中の標的被検体を検出するために使用される。好ましい実施態様において、標的被検体は核酸であり、標的配列が検出される。本明細書において「標的配列」という用語または文法的等価物は１本鎖核酸上の核酸配列を意味する。標的配列は、遺伝子の部分、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡとｒＲＮＡを含むＲＮＡ、その他であってよい。長さは任意であるが、配列が長い程より特異性が増すことは理解される。当業者が認めるであろうように、相補標的配列は多くの形状を取り得る。例えば、それはより大きな核酸配列内に、すなわち、とりわけ、遺伝子またはｍＲＮＡのすべてまたは部分、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメント内に含まれていてもよい。以下により詳細に概説するように、プローブは標的配列にハイブリダイズするように調製し、サンプル中標的配列の存在または不存在を測定する。一般に、この用語は当業者が理解するところである。標的配列は異なる標的ドメインから構成されていてもよい；例えば、サンプル標的配列の第１標的ドメインは捕獲プローブまたは捕獲伸長プローブの一部にハイブリダイズしてもよく、第２標的ドメインは増幅プローブの一部、標識プローブ、または異なる捕獲もしくは捕獲伸長プローブなどにハイブリダイズしてもよい。標的ドメインは隣接していても、離れていてもよい。「第１」および「第２」という用語は標的配列の５’−３’方向に関して、配列の方向を付与することを意味するものではない。例えば、相補標的配列の５’−３’方向を仮定すると、第１標的ドメインは第２ドメインに対して５’に位置してもよく、あるいは第２ドメインに対して３’に位置してもよい。
【０３５２】
必要であれば、標的被検体は既知技法により調製する。例えば、既知の溶解バッファー、エレクトロポレーションなどによりサンプルを処理して細胞を溶解し、当業者には明らかなように、必要に応じ精製および／またはＰＣＲなどで増幅させる。
【０３５３】
核酸システム用に、本発明のプローブは標的配列に相補性（下に説明するように、サンプルの標的配列または他のプローブ配列に対し）となるように設計し、標的配列と本発明プローブのハイブリダイゼーションが起こるようにする。下に概説するように、この相補性は完全である必要はない；標的配列と本発明の１本鎖核酸間のハイブリダイゼーションを阻害するような、相当数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、もし突然変異の数が多すぎて、ストリンジェンシーが最少のハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こらないならば、その配列は相補的標的配列ではない。このように、本明細書において「実質的に相補的」とは、プローブが通常の反応条件下でハイブリダイズするために標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【０３５４】
一般に、本発明の核酸組成物はオリゴヌクレオチドプローブとして有用である。当業者には明らかなように、プローブの長さは、標的配列の長さおよびハイブリダイゼーションと洗浄条件により変わる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは約８ないし約５０ヌクレオチドの範囲であり、好ましくは約１０ないし約３０であり、特に好ましいのは約１２ないし約２５である。ある場合には、非常に長いプローブ、例えば、５０ないし２００〜３００ヌクレオチドの長さのものを用いてもよい。このように、本明細書に描出した構造において、ヌクレオシドは核酸と置換え得る。
【０３５５】
多様なハイブリダイゼーション条件が本発明において使用し得るが、高度、中程度および低度のストリンジェンシー条件などである；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．（出典明示により本明細書の一部とする）参照。ストリンジェンシー条件は配列依存性であり、異なる環境では異なってくる。配列が長くなると、温度を上げて特異的にハイブリダイズさせる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細にわたる説明がＴｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，  ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）にある。一般に、ストリンジェンシー条件は、定めたイオン強度ｐＨにおける特異的配列の熱融点（Ｔｍ）より約５−１０℃低い温度になるように選択する。Ｔｍは（定めたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（Ｔｍで標的配列が過剰量存在するとき、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０ないし８．３で、塩濃度が約１．０ナトリウムイオン以下であり、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短プローブ用（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長プローブ用（例えば５０ヌクレオチド以上）では少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェンシー条件は、ホルムアミドなどの非安定化剤の添加によっても実現できる。
【０３５６】
他の実施態様では、よりストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件を使用する；例えば、当業者に知られている、穏やかなまたは低度のストリンジェンシー条件を使用してもよい；Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出、および Ｔｉｊｓｓｅｎ， 前出、参照。
【０３５７】
ハイブリダイゼーション条件は技術上知られるように、非イオン性主鎖、すなわちＰＮＡを用いても変わり得る。さらに、標的結合の後にのハイブリダイゼーション複合体の２本鎖を架橋する、すなわち、共有結合により付着させるために、架橋剤を加えてもよい。
【０３５８】
当業者には明らかなように、本発明のシステムは、図３、４、５および６に一般的に描出したように、多数の異なる配置を取り得る。一般に、使用し得るシステムには３つのタイプがある：（１）標的配列それ自体がＥＴＭで標識されるシステム（図４Ａ、５Ａ、５Ｂおよび５Ｄ参照；一般的に核酸システムについて有用）；（２）標識プローブが直接標的配列に結合するシステム（核酸の実施例については図４Ｃおよび４Ｈ、そして非核酸被検体の実施例については図６Ａ、６Ｂ、６Ｄおよび６Ｅ参照）；および（３）標識プローブが間接的に標的配列に、例えば、増幅プローブの使用を介して結合するシステム（核酸の実施例については図４Ｃ、５Ｅ、５Ｆおよび５Ｇ、そして非核酸標的被検体の代表例ついては図６Ｃ参照）。
【０３５９】
これら３つのシステムすべてにおいて、要求されるというわけではないが、電極表面に標的配列を固定するのが好ましい。これは捕獲結合リガンドと所望により１つまたはそれ以上の捕獲伸長プローブを用いて好適に実施される；核酸の代表的実施例については図３参照。捕獲プローブのみを利用する場合には、各標的配列に対しユニークな捕獲プローブをもつことが必要である；すなわち、表面はユニークな捕獲プローブを含むように設計しなければならない。あるいは、捕獲伸長プローブを使用することが可能であり、それが「普遍的」表面、すなわち、全ての標的配列を検出するのに使用し得る単一タイプの捕獲プローブを含む表面を可能とする。「捕獲伸長」プローブは一般的に図４Ｃ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｇおよび５Ｈ、同様に図６Ｂなどに描出され、捕獲プローブの全部または一部にハイブリダイズする第１部分と、標的配列の一部分にハイブリダイズする第２部分とをもつ。これが次いで設計された可溶性プローブの生成を可能にするが、当業者も認めるように、一般により簡単でコストも掛らない。本明細書に示すように、２つの捕獲伸長プローブを使用し得る。これは一般にアッセイ複合体を安定化するためになされる（例えば、標的配列が大きい場合、または大きな増幅プローブ（特に、分枝または樹枝状増幅プローブ）が使用される場合）。
【０３６０】
本明細書中の検討および図は、一般的に、核酸の実施態様を描出しているが、同じ思想を非核酸標的被検体についても使用することができる。例えば、当業者が必要とするときには、捕獲伸長リガンドを調製してもよい。例えば、図６Ｂに一般的に図示したように、核酸「テール」を結合リガンドに加えてもよい。
【０３６１】
好適な態様において、結合リガンドは以下に検討するＳＡＭの形成後に加えられる（上記（４））。これは、当業者が認識するように種々の方法で実施し得る。一態様において、末端官能基を有する伝導性オリゴマーは、活性化されたカルボン酸エステルとイソチオシアン酸エステルを利用する好適な態様により調製されるが、それは、活性化されたカルボン酸エステルを用いて、核酸などの結合リガンドに存在するかまたは取付けたかの一級アミンと反応する。これら二種類の試薬は水溶液中で安定であるという利点をもち、さらに一級アルキルアミンと反応する。しかし、塩基のうち、一級芳香族アミンおよび二級および三級アミンは反応してはならず、そのようにして、核酸が表面に部位特異的に付加するようにしなければならない。同様の技法を非核酸成分に使用することができる；例えば、上に概略のとおり、タンパク質の、金属キレートを含むＳＡＭへの付着は、公知である；米国特許第５，６２０，８５０号参照。これがその表面上に既知方法（インクジェット、スポッティングなど）によるプローブ（捕獲プローブまたは検出プローブのいずれか、または両方）のスポッティングを可能とする。
【０３６２】
さらに、核酸を表面上に固定化するために用い得る多くの非核酸方法がある。例えば、結合パートナー対が利用し得る；すなわち、一方の結合パートナーは伝導性オリゴマーの末端に付着させ、他方は核酸の末端に付着させる。これはまた核酸捕獲プローブを使用せずに実施し得る；すなわち、一方の結合パートナーは捕獲プローブとして作用し、他方は標的配列または捕獲伸長プローブのいずれかに付着する。すなわち、標的配列が結合パートナーを含むか、または標的配列にハイブリダイズする捕獲伸長プローブが結合パートナーを含むかのいずれかである。適切な結合パートナー対は、ビオチン／ストレプトアビジンなどのハプテン対、抗原／抗体、ＮＴＡ／ヒスチジンタグなどであるが、これらに限定されるものではない。一般に、より小型の結合パートナーが好ましく、そのようにして電子は核酸から伝導性オリゴマー中へ移動し、検出を可能とする。
【０３６３】
好適な態様において、標的配列それ自体が修飾され結合パートナーを含む場合、結合パートナーは標的配列に酵素的に付着し得る修飾ヌクレオチドを介して、例えば、ＰＣＲ標的増幅工程に際して付着する。あるいは、結合パートナーは標的配列に容易に付着する。
【０３６４】
あるいは、標的にハイブリダイズするための核酸部分および結合パートナーを有する捕獲伸長プローブを利用してもよい（例えば、捕獲伸長プローブは結合パートナーに付着するのに使用されるアルキルリンカーなどの非核酸部分を含んでもよい）。この態様においては、安定性のために標的の２本鎖核酸と捕獲伸長プローブとを、例えば、技術上既知のプソラレンを用い架橋することが望ましい。
【０３６５】
一態様において、該標的は捕獲プローブを用いて電極表面に結合しない。この態様において重要なことは、本明細書のすべてのアッセイについて、過剰の標識プローブは検出前に除去すべきであり、アッセイ複合体 （リクルートリンカー） は表面に接近させるべきことである。当業者が認識するように、これは他の方法で実施するのがよい。例えば、アッセイ複合体は、単層を含む電極に付加されるビーズ上に存在してもよい。ＥＴＭを含むリクルートリンカーは、表面上へのビーズの重力沈降、ビーズ成分と表面間の静電気的または磁気的相互作用などの当技術分野で周知の技法を用い、上述の結合パートナー付着を用いて伝導性オリゴマー表面に近接して設置することができる。あるいは、過剰の標識プローブなどの過剰の試薬を除去した後、アッセイ複合体を、例えば、本明細書で概略する通り、電気泳動を介して、表面に送り込むことが可能である。
【０３６６】
しかし、好適な態様では、核酸捕獲プローブを介して付着したアッセイ複合体を利用する。
【０３６７】
好ましい実施態様として、標的配列自体がＥＴＭを含む。上記に検討したように、このことは相当数の位置に取込まれたＥＴＭをもつ標的配列により実施し得ることであり、上記概説のとおりである。この態様においては、このシステムのその他について、プローブと標的の３’−５’方向が、ＥＴＭ含有構造（すなわち、リクルートリンカーまたは標的配列）が可能な限り単層の表面に接近するように、また、正しい方向となるように選択される。これは図面に一般的に示したように、絶縁体または伝導性オリゴマーを介する付着により実施することができる。さらに、当業者が認めるであろうように、複数の捕獲プローブは、捕獲プローブの５’−３’方向が異なる場合である図５Ｄに描出したような形状で、または複数の捕獲プローブを用いた場合に標的の「ループ」が生成する場所で利用することができる。
【０３６８】
好ましい実施態様として、図に一般的に描出したように、標識プローブが標的配列に直接ハイブリダイズする。これらの態様において、標的配列は、好ましくは、捕獲伸長プローブを含む捕獲プローブにより表面に固定するが、必ずしも必要ではない。次いで、標識プローブを用い、伝導性オリゴマーからなる単層の表面近傍にＥＴＭをもってくる。好適な態様においては、複数の標識プローブを用いる；すなわち、標識プローブを、標的配列にハイブリダイズする部分が多数の異なる標識プローブに応じて異なり得るように設計する。その結果、シグナルの増幅が起こるが、その理由は複数の標識プローブがそれぞれの標識配列に結合し得るからである。このように、図に描出したように、ｎは少なくとも１の整数である。所望の感度、標的配列の長さ、標識プローブ当たりのＥＴＭ数により、ｎの好適な範囲は１〜５０、特に好ましくは約１ないし約２０、そしてとりわけ好ましいのは約２ないし約５である。さらに、もし「一般の」標識プローブが望ましいのであれば、増幅プローブの使用について一般的に下に説明したように、標識伸長プローブを用いることができる。
【０３６９】
上記のように、この態様においては一般に、システムの形状と標識プローブの配置は単層表面に可能な限り近接してＥＴＭが集まるように設計する。
【０３７０】
好適な態様において、標識プローブは間接的に標的配列にハイブリダイズさせる。すなわち、本発明はシグナル増幅技術と電極上での電子伝達検出との新規な組合わせに用途を見出だすが、これは核酸の実施態様について図（以下参照）に一般的に描出したように、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにとりわけ有用である；同様のシステムを非核酸標的被検体について発展させることができる。これらの態様において、本発明の増幅プローブはサンプル中の標的配列に直接または間接的に結合する。増幅プローブは、好ましくは標識プローブの結合に利用し得る比較的多数の増幅配列を含むので、検出可能なシグナルが有意に増加し、標的の検出限界が有意に改善され得る。これらの標識と増幅プローブ、および本明細書に記載の検出方法は、本質的に既知の核酸ハイブリダイゼーションによるいずれかの方式、例えば、標的を直接固相に結合する方式で、または標的が１つ以上の核酸に結合し、それが次いで固相に結合するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにて、使用可能である。
【０３７１】
一般に、これらの態様は、核酸を特に参照して以下のように説明し得る。増幅プローブは標的配列に直接（例えば、図４Ｃおよび５Ｅ）または標識伸長プローブの使用を介して（例えば、図５Ｆおよび５Ｇ）ハイブリダイズするが、これは「一般的な」増幅プローブの調製を可能とする。標的配列は、好ましくは捕獲プローブを使用して電極上に固定するが、必ずしも必要ではない。好ましくは、増幅プローブは多様な増幅配列を含むが、ある態様においては、下記説明のように、増幅プローブは唯１つの増幅配列を含む。増幅プローブは多くの異なる形状をとることができる；例えば、分枝立体配座、樹枝状立体配座、または増幅配列の線状「ひも」などである。これらの増幅配列を使用して標識プローブとのハイブリダイゼーション複合体を形成し、電極を用いてＥＴＭを検出することができる。
【０３７２】
したがって、本発明は少なくとも１つの増幅プローブからなるアッセイ複合体を提供する。本明細書において「増幅プローブ」または「核酸多量体」または「増幅多量体」または文法的均等物とはシグナル増幅を容易にするために用いる核酸プローブを意味する。増幅プローブは以下に定義するように、少なくとも１つの１本鎖核酸プローブ配列、および少なくとも１つの１本鎖核酸増幅配列、好ましくは多様な増幅配列を含んでいる。
【０３７３】
増幅プローブは標識配列にハイブリダイズするために、直接または間接に使用する第１プローブ配列を含む。すなわち、増幅プローブ自体が標的配列に実質的に相補的である第１プローブ配列をもち得るか（例えば、図５Ｅ）、またはそれが追加のプローブの一部に実質的に相補的である第１プローブ配列をもち、その追加のプローブはこの場合標識伸長プローブと呼ばれるものであって、標的配列に実質的に相補的である第１部分を有する（例えば、図５Ｆおよび５Ｇ）。好適な態様において、増幅プローブの第１プローブ配列は標的配列に実質的に相補的であり、それを図５Ｅに一般的に描出してある。
【０３７４】
一般に、本明細書のプローブすべてについて、第１プローブ配列は特異性と安定性を与えるに十分な長さのものである。このように一般に、もう一つの核酸にハイブリダイズするように設計された本発明のプローブ配列（すなわち、プローブ配列、増幅配列、より大きなプローブの部分またはドメイン）は少なくとも約５個のヌクレオシドの長さであり、好ましくは少なくとも約１０個であり、そして特に好ましくは少なくとも約１５個である。
【０３７５】
好適な態様において、増幅プローブまたは本発明の他のプローブのいずれかは、それらの標的の非存在下でヘアピンステムループ構造を形成することがある。ステムの２本鎖配列の長さは、ヘアピン構造が標的の存在下で有利にならないように選択する。本発明のシステムにおいて、またはいずれかの核酸検出システムにおいて、これらの型のプローブを使用すると非特異結合が有意に減少し、結果としてシグナル−ノイズ比が増大するに至る。
【０３７６】
一般に、これらのヘアピン構造は４つの成分を含む。その第１成分は標的結合配列、すなわち、標的に相補的な領域（サンプル標的配列であるか、または結合が要望どおりである他のプローブ配列であってもよい）であって、約１０個のヌクレオチドの長さがあり、好ましくは約１５個である。第２成分はループ配列であり、核酸ループの形成を容易にし得るものである。この観点で特に好ましいのはＧＴＣの反復であり、脆弱Ｘ症候群において屈曲部を形成するものとして同定されている。（ＰＮＡ類似体を使用する場合、屈曲部はプロリン残基を含むものが好ましい）。一般に、３ないし５つの反復が用いられるが、４ないし５が好ましい。第３の成分は自己相補性領域であり、これは標的配列領域の一部に相補的な第１部分と標識プローブ結合配列の第１部分を含む第２部分を有する。第４の成分は標識プローブ（または場合によっては他のプローブ）に実質的に相補的である。第４の成分はさらに「粘着末端」、すなわち、プローブの他の部分にハイブリダイズしない部分を含み、好ましくは、すべてではないが、ＥＴＭの殆どを含む。当業者が認めるであろうように、増幅、捕獲、捕獲伸長、標識、および標識伸長プローブを含めて、本明細書に記載したプローブのいずれかまたはすべてが、それらの標的非存在下でヘアピンを形成するように配列することができる。
【０３７７】
好適な態様においては、数種の異なる増殖プローブを用いるが、そのそれぞれが標的配列の異なる部分にハイブリダイズする第１プローブ配列をもつ。すなわち、１以上の増幅レベルがある；増幅プローブは多数の標識事象によりシグナルを増幅し、また、それぞれ多様な標識をもつ数種の異なる増幅プローブが各標的配列に対して使用される。このように、好適な態様では少なくとも２種類の異なる増幅プローブのプールを利用するが、それぞれのプールは標的配列の異なる部分に対しハイブリダイズするための異なるプローブ配列をもつ；異なる増幅プローブの数に関して唯一実際の制限は、当初標的配列の長さであろう。さらに、一般に好ましいことではないが、異なる増幅プローブが異なる増幅配列を含むことも可能である。
【０３７８】
好適な態様において、増幅プローブはサンプルの標的配列と直接ハイブリダイズしないが、代りに、図５Ｆに一般的に描出したように、標識伸長プローブの第１部分にハイブリダイズする。これは「一般的な」増幅プローブ、すなわち、様々な異なる標的と共に使用し得る増幅プローブの使用を可能とするためにとりわけ有用である。これは増幅プローブのいくつかが特別の合成技術を必要とするという理由で望ましいことである。このように、標識伸長プローブとして比較的短いプローブを加えることが好ましい。このように、増幅プローブの第１プローブ配列は、第１標識伸長１本鎖核酸プローブの第１部分またはドメインに実質的に相補性である。標識伸長プローブはまた、標識配列の一部に実質的に相補性である第２部分またはドメインをも含む。これらの部分双方が、好ましくは少なくとも約１０ないし約５０ヌクレオシドの長さであり、好ましくは約１５ないし約３０の範囲である。「第１」および「第２」という用語は標的またはプローブ配列の５’−３’方向に関して、配列の方向を付与することを意味するものではない。例えば、相補標的配列の５’−３’方向を仮定すると、第１部分は第２部分に対して５’に位置してもよく、あるいは第２部分に対して３’に位置してもよい。本明細書では便宜上、プローブ配列の順序を一般に左から右に示すこととする。
【０３７９】
好適な態様において、１つ以上の標識伸長プローブ増幅プローブ対が使用される、すなわち、ｎは１以上である。すなわち、複数の標識伸長プローブを用い、その各々が標的配列の異なる部分に実質的に相補性である部分をもつ；これはもう一つの増幅レベルとして役立ち得る。このように、好適な態様では少なくとも２つの標識伸長プローブのプールを利用するが、その上限は標的配列の長さにより決まる。
【０３８０】
好適な態様においては、図５Ｇに描出し、また米国特許第５，６８１，６９７号（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に概説されているように、１つ以上の標識伸長プローブを単一の増幅プローブと共に用い、非特異結合を減少させる。この態様において、第１標識伸長プローブの第１部分は標的配列の第１部分にハイブリダイズし、第１標識伸長プローブの第２部分は増幅プローブの第１プローブ配列にハイブリダイズする。第２標識伸長プローブの第１部分は標的配列の第２部分にハイブリダイズし、第２標識伸長プローブの第２部分は増幅プローブの第２プローブ配列にハイブリダイズする。これらの形状構造は、ある場合に「十字型」構造または形状といい、一般に、大型の分枝または樹枝状増幅プローブを用いる場合には、安定性を付与するために実施される。
【０３８１】
さらに、当業者が認めるであろうように、標識伸長プローブは下記のように、直接増幅プローブとよりもむしろプレ増幅プローブと相互作用する可能性がある。
【０３８２】
同様に、上記に概説したように、好適な態様では数種の異なる増幅プローブを利用するが、それぞれが標識伸長プローブの異なる部分にハイブリダイズする第１プローブ配列をもつ。さらに、上に概説したように、これは一般に好ましいことではないが、異なる増幅プローブが異なる増幅配列を含むことも可能である。
【０３８３】
第１プローブ配列に加えて、増幅プローブはまた、少なくとも１つの増幅配列を含んでいる。本明細書において「増幅配列」または「増幅セグメント」または文法的均等物とは、下記により詳しく説明するように、標識プローブの第１部分に結合させるために、直接または間接に使用する配列を意味する。好ましくは、増幅プローブは多様な増幅配列を含んでおり、好ましくは約３ないし約１０００からなり、特に好ましくは約１０ないし約１００からなり、そしてとりわけ好ましいのは約５０である。ある場合には、例えば、線状の増幅プローブを使用する場合、１ないし約２０が好ましく、特に、約５ないし約１０が好ましい。
【０３８４】
増幅配列は当業者が認めるであろうように、様々な様式で互いに結合することができる。これらは互いに共有結合により直接結合するか、またはリン酸ジエステル結合、ＰＮＡ結合などの核酸結合を介して、またはアミノ酸、炭水化物またはポリオールブリッジなどの挿入結合剤を介して、または他の架橋剤または結合パートナーを介して、介在配列もしくは化学的部分に結合してもよい。結合部位はセグメントの末端であっても、および／または１つ以上の鎖内の内部ヌクレオチドであってもよい。好適な態様において、増幅配列は核酸結合を介して付着する。
【０３８５】
好適な態様においては、米国特許第５，１２４，２４６号（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に説明されているように、分枝状の増幅配列を使用する。分枝状の増幅配列は「フォーク様」または「櫛様」の立体配座を採ることが可能である。「フォーク様」分枝状増幅配列は一般に分枝状構造を形成する起点から発生する３つ以上のオリゴヌクレオチドセグメントをもつ。起点とは、少なくとも３つのセグメントが共有結合によりまたは堅固に結合し得るもう一つのヌクレオチドセグメントまたは多機能分子である。「櫛様」分枝状増幅配列とは、線状の背骨をもち、その背骨から多数の側鎖オリゴヌクレオチドが伸び出しているものである。いずれの立体配座においても、張り出したセグメントは、通常、修飾したヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド付着用の適切な官能基をもつ他の有機部分に左右される。さらに、いずれの立体配座においても、多数の増幅配列が、検出プローブに直接もしくは間接に結合させるために利用し得る。一般に、これらの構造は修飾した多機能ヌクレオチドを用い、とりわけ米国特許第５，６３５，３５２号および第５，１２４，２４６号に記載されているように、技術上既知として調製される。
【０３８６】
好適な態様において、樹枝状増幅プローブは、米国特許第５，１７５，２７０（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているように使用する。樹枝状増幅プローブはハイブリダイゼーションを介して付着する増幅配列をもち、その結果、それらの構造の成分として２本鎖核酸の部分をもつ。樹枝状増幅プローブの外表面は多様な増幅配列をもつ。
【０３８７】
好適な態様においては、線状の増幅プローブを用いるが、これは個々の増幅配列が末端−末端で直接結合するか、または短い介在配列と結合してポリマーを形成する配列をもつ。他の増幅形状でのように、増幅配列間に追加の配列または部分があってもよい。さらに、本明細書に概説するように、線状の増幅プローブは図１２に描出したように、ヘアピンステムループ構造を形成してもよい。
【０３８８】
一態様において、線状の増幅プローブは単一の増幅配列をもつ。これは、ハイブリダイゼーション／解離のサイクルが起こり、標的にハイブリダイズしていた増幅プローブが次いで除去されて、さらにプローブが結合できるようにする増幅プローブのプールを形成している場合、または大量のＥＴＭを各プローブに対し使用する場合に有用である。しかし、好適な態様においては、線状の増幅プローブは多様な増幅配列を含む。
【０３８９】
さらに、増幅プローブは全体が線状であるか、全体が分枝であるか、全体が樹枝状であるか、またはその組合わせであってもよい。
【０３９０】
増幅プローブの増幅配列を直接または間接に用い、検出を可能とする標識プローブに結合させる。好適な態様において、増幅プローブの増幅配列は標識プローブの第１部分に実質的に相補的である。あるいは、増幅伸長プローブを用いるが、これは増幅配列に結合する第１部分と、標識プローブの第１部分に結合する第２部分をもつ。
【０３９１】
さらに、本発明の組成物は「プレ増幅」分子を含んでもよいが、これは標識伸長分子と増幅プローブ間の架橋部分としての役割をもつ。この方法で、さらに多くの増幅因子と、したがて、さらに多くのＥＴＭが最終的に検出プローブに結合される。プレ増幅分子は線状であっても分枝状であってもよく、典型的には約３０〜３０００個の範囲でヌクレオチドを含む。
【０３９２】
以下に概括する反応は、当業者が認めるであろうように様々な方法で実施することができる。反応成分は同時に加えてもよいし、何らかの順序で順番に加えてもよいが、好適な態様は以下に概括するとおりである。さらに、この反応はアッセイに含まれ得る種々の他の試薬を含んでもよい。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などの試薬類を含み、最適なハイブリダイゼーションと検出を容易にし、および／または非特異もしくはバックグランド相互作用を減少させるために使用することができる。他の条件でアッセイ効率を改善する試薬として、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などを、サンプル調製方法および標的の純度に応じて使用してもよい。
【０３９３】
一般的に、本方法は以下のとおりである。好適な態様において、標的を最初に、上記方法の一つを用いて検出プローブの近傍に移動させる。一般に、２つの方法が採用し得る；ハイブリダイゼーション促進剤を含む下記のごときアッセイ複合体がまず形成され（すなわち、すべての可溶性成分、例えば、捕獲伸長プローブ、標識プローブ、増幅プローブ、標識伸長プローブなどが共に、同時にまたは連続的に添加される）、次いで、該複合体は検出電極に結合するための表面に加えられる。あるいは、標的を添加し、ハイブリダイゼーションを促進させ、捕獲結合リガンドに標的が結合することを可能とし、次いで追加の成分を加えてアッセイ複合体を形成する。後者については下記に詳細に記載するが、双方の手法は以下のとおりである。同様に、一部の成分を加え、電気泳動し、次に他の成分を加える；例えば、標的被検体はいずれかの捕獲伸長プローブと組合わせ、次いで輸送するなどである。さらに、本明細書に概説するように、電気泳動工程は「洗浄」工程実施のために使用してもよく、その場合に過剰の試薬（未結合被検体、過剰のプローブなど）を表面から排除し得る。
【０３９４】
好適な態様において、非特異的相互作用はいくつかの電気泳動法を用いて減少させることができる。好適な態様において、標的配列に直接または間接的に特異結合しない標識プローブは逆の電界パルスにより表面から除去することができる、すなわち、電界をある時間の間逆転させる。逆電界強度は特異的に結合した標識プローブを（または付着とアッセイ複合体の他の必要な成分のいずれをも）排除しないように選択する。
【０３９５】
好適な態様において、例えば、電気泳動を使用する場合、ＥＴＭを含む標識プローブまたは標識結合リガンドは標的被検体と逆の電荷をもつ。これは核酸標識プローブまたは帯電溶液結合リガンドにより実施し得るが、議論は核酸の態様に焦点をしぼる。これは２つの異なるシステムにおいて有用である。好適な態様において、標的被検体は大過剰の電荷を担持している、すなわち、核酸の場合における負電荷である。１つ以上の陽性帯電標識プローブの結合が標的複合体上の正味の負電荷を有意に変えることはない；すなわち、標的はなお陰極に引き付けられている。しかし、非結合標識プローブ、または標的に特異的に結合していない標識プローブは反発され、その結果、非特異結合の減少に至る。例えば、ＰＮＡ主鎖は正味の正電荷をもつように修飾し得るし、正に帯電する技術上既知の他の核酸類似体が存在する。
【０３９６】
好適な態様において、標識プローブは大量の逆電荷をもち、その結果、標的被検体へ結合すると、標的被検体の正味の電荷が変化する。このように、例えば、核酸では、標識プローブが標識プローブ−標的被検体複合体を陽性に帯電させるに十分な正電荷を担持する。これは結果として特異標的被検体を陽極に引き付けることになるが、他の陰性に帯電した要素、すなわち、他の核酸は撃退される。これは特に過剰の他の標的が存在する場合に有用である；例えば、標的被検体が大過剰の他の核酸中の少数種である場合がその例である。
【０３９７】
好適な態様において、標的被検体は最初に電気泳動により検出電極に輸送され、次いで、検出電極に固定または付着する。一態様において、これは捕獲プローブと標的被検体の一部との間に付着複合体（核酸成分を使用する場合、本明細書では多くの場合ハイブリダイゼーション複合体という）を形成することにより実施される。好適な態様では捕獲伸長結合リガンド（本明細書では捕獲伸長プローブとも呼ぶ）を利用する；この態様において、付着複合体は標的配列の一部と捕獲伸長プローブの第１部分との間に形成され、さらなる付着複合体が捕獲伸長プローブの第２部分と捕獲プローブの一部との間に形成される。さらに好適な態様ではさらなる捕獲プローブを利用し、標的配列の一部と第２捕獲伸長プローブの第１部分との間に付着複合体を形成し、第２捕獲伸長プローブの第２部分と捕獲プローブの第２部分との間に付着複合体を形成する。
【０３９８】
別法として、電極に対する標的配列の付着は他の反応と同時に実施する。
【０３９９】
この方法は、もし利用するのであれば、増幅プローブの導入で始める。好適な態様においては、増幅プローブは標的配列の一部分に実質的に相補的な第１プローブ配列と、少なくとも１つの増幅配列を含む。
【０４００】
一態様において、増幅プローブの第１プローブ配列は標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズしていない増幅プローブは除かれる。これは技術上既知のとおりに実施されるが、アッセイのタイプに依存する。標的配列が電極などの表面に固定化されると、過剰の試薬の除去は一般に、当業者が認めるであろうように、１回以上の洗浄工程により実施される。この態様において、標的は固形支持体上に固定される可能性がある。標的配列が表面に固定されない場合、本発明プローブなど、過剰の試薬の除去は、該プローブに相補的な配列を含むビーズ（すなわち、固形の支持体粒子）を添加することにより実施することができるが、その場合、過剰のプローブはビーズに結合する。次いで、ビーズは、例えば、遠心分離、濾過、磁場または静電場の適用などにより除去し得る。
【０４０１】
次いで、反応混合物は、増幅プローブが標的配列から解離する条件（温度、高濃度塩、ｐＨ変化など）に付し、増幅プローブを取得する。次いで、増幅プローブは増幅プローブ用の捕獲プローブからなる電極に加え、標識プローブを添加し、次いで検出を実施する。
【０４０２】
好適な態様においては、標的配列にさらに増幅プローブを添加することにより、より大きなプローブ・プールが生成し、ハイブリダイゼーション／解離反応が繰返され、増幅プローブのより大きなプールを生成する。この増幅プローブのプールは、次いで、増幅捕獲プローブからなる電極に添加し、標識プローブを添加し、次いで検出を始める。
【０４０３】
この態様においては、本明細書に記載の方法を用い、電極を含む固形支持体上に標的配列を固定化するのが好ましい；当業者が認めるところであるが、代りの固形支持体付着技術、例えば、ガラス、ポリマーなどへの付着技術を用いてもよい。１つの固形支持体上で反応を行い、次いでプールした増幅プローブを検出用の電極に加えることも可能である。
【０４０４】
好適な態様において、増幅プローブは多様な増幅配列を含む。
【０４０５】
一態様において、増幅プローブの第１プローブ配列は標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズしていない増幅プローブを除去する。再度、好適な態様では固定化した標的配列を利用するが、ここでは電極に付着した捕獲プローブとのハイブリダイゼーションにより固定化するか、または捕獲伸長プローブにハイブリダイズし、それを次いで本明細書に記載のように固定化した捕獲プローブとハイブリダイズさせることにより固定化する。一般に、これらの態様においては、捕獲プローブと検出プローブを電極上、一般には同一の「アドレス」に固定する。
【０４０６】
好適な態様において、増幅プローブの第１プローブ配列は少なくとも一つの標識伸長プローブの第１部分にハイブリダイズし、標識伸長プローブの第２部分は標的配列の一部分にハイブリダイズする。他の好適な態様では、図５Ｇに一般的に図示したとおり、１を超える標識伸長プローブを利用する。
【０４０７】
好適な態様において、増幅プローブの増幅配列は、少なくとも１つの標識プローブ配列にハイブリダイズさせることにより、直接検出に使用する。
【０４０８】
本発明はこのように標的配列と標識プローブを最小限に含んでいるアッセイ複合体を提供する。本明細書で「アッセイ複合体」とは、被検体を含む付着またはハイブリダイゼーション複合体の集合体を意味し、検出を可能とする結合リガンドおよび標的を含む。アッセイ複合体の組成物は本明細書に概説した異なるプローブ成分の用途に依存するものである。このように、図６Ａにおいて、アッセイ複合体は捕獲プローブと標的配列を含む。アッセイ複合体はまた、捕獲伸長プローブ、標識伸長プローブ、および増幅プローブを包含するが、本明細書に概説するように、使用する形状に依る。
【０４０９】
このアッセイは、標的の存在下にのみ標識プローブ付着複合体の形成を可能とするストリンジェンシー条件下に一般に実施する。ストリンジェンシーは熱力学的変数である工程パラメーターを変えることにより制御し得る。パラメーターは温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などであるが、これらに限定されるものではない。ストリンジェンシーに電気泳動工程の使用を含めて、非特異的（すなわちストリンジェンシーが低い）物質を検出電極から離れさせてもよい。
【０４１０】
これらのパラメーターは、米国特許第５，６８１，６９７号に一般的に概説されているように、核酸における非特異結合を制御するためにも使用することができる。このように、一定の工程はストリンジェンシーが高い条件で実施するのが望ましい；例えば、最初のハイブリダイゼーション工程が標的配列と標識伸長と捕獲伸長プローブの間で実施される場合である。特定の結合を優先させる条件でこの工程を実施すると、非特異結合を減少させることができる。
【０４１１】
好適な核酸態様において、本明細書に概括した成分のすべてを使用する場合、好適な方法は以下のとおりである。１本鎖標的配列をハイブリダイゼーション条件下で捕獲伸長プローブおよび標識伸長プローブとインキュベートする。好適な態様ではこの反応を固定化した捕獲プローブを有する電極の存在下で行うが、この反応は最初のインキュベーションと引続く電極への付加による２工程で実施してもよい。過剰の試薬は洗浄除去し、次いで増幅プローブを添加する。もしプレ増幅プローブを用いるならば、それらは増幅プローブの前に、または増幅プローブと同時に加えてもよい。過剰の試薬は洗浄除去し、次いで標識プローブを添加する。過剰の試薬は洗浄除去し、下に概説するように検出を始める。
【０４１２】
一態様においては、標的配列の異なる部分にそれぞれ実質的に相補性である多くの捕獲プローブ（または捕獲プローブと捕獲伸長プローブ）が使用される。
【０４１３】
再度、本明細書に概説するように、増幅プローブを用いる場合、このシステムは、一般に、標識プローブ結合に際し、ＥＴＭを含むリクルートリンカーが、伝導性オリゴマー（メカニズム−２）を含む単層表面の近接位にまたは検出プローブの近接位に位置するように配置される。このように、例えば、メカニズム−２システムについては、本明細書に概説するように、ＥＴＭが「樹枝状」型構造を介して付着する場合、核酸の付着点からＥＴＭまでのリンカーの長さは、特に、捕獲伸長プローブを用いる場合に捕獲プローブの長さと共に変わり得る。すなわち、より長い捕獲プローブは、捕獲伸長をもち、より短い捕獲プローブにおいてよりも、表面からさらに離れて「保持」された標的配列となる。プローブ核酸とＥＴＭの間に余分の連結配列を加えると、ＥＴＭが表面に空間的に近接することとなり、より良好な結果を与える。同様に、メカニズム−１システムについて、リクルートリンカーの長さ、検出プローブの長さ、およびそれらの距離を最適化することができる。
【０４１４】
さらに、所望により、本発明に利用される核酸は検出に先立ち、もし適用可能であれば、リガーゼの使用などの標準的分子生物学技法を用いることにより結合させることもできる。同様に、安定性を望むのであれば、架橋剤を加え、構造を安定させることが可能である。
【０４１５】
当業者に認められるように、核酸について記載しているが、本明細書で概説したシステムは、他の標的非検体について同様に使用することができる。
【０４１６】
本発明の構成物は、一般に、下記およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／７４３，７９８、０８／８７３，９７８、０８／９１１，０８５、０８／９１１，０８５、およびＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４（これらすべては出典明示により本明細書の一部とする）に概説のように、一般に当分野で既知の方法を使用して合成する。当業者に認められるように、下記に概説の多くの方法は、リボース−リン酸主鎖を含む核酸に関する。しかしながら、上記に概説のように、多くの別の核酸類似体を使用し得、そのいくつかは主鎖にリボースまたはリン酸を含まない。これらの実施態様において、塩基以外の位置での結合に関して、結合は、主鎖に依存して、当業者に認められるように行う。従って、例えば、結合はＰＮＡ主鎖の炭素原子で、下記に記載のように、またはＰＮＡのいずれかの末端で行うことができる。
【０４１７】
本構成物はいくつかの方法で製造し得る。好ましい方法は最初にヌクレオシドに結合した伝導性オリゴマーを、更にヌクレオシドを添加して捕獲プローブを形成し、続いて電極へ結合させて、合成する。あるいは、全捕獲プローブを製造し、次いで、完全な伝導性オリゴマーを添加し、続いて電極に結合する。あるいは、伝導性オリゴマーの単層（そのいくつかは、捕獲プローブの結合のための官能基を有する）を最初に電極に結合し、続いて捕獲プローブを結合する。後者の二つの方法は、使用する伝導性オリゴマーが、溶媒中でおよび慣用的核酸合成の条件下で安定でないとき、好ましいことがある。
【０４１８】
好ましい実施態様において、本発明の構成物は、最初に、ヌクレオシドに共有結合した伝導性オリゴマーを形成し、続いて、さらにヌクレオシドを添加して捕獲プローブ核酸を形成し、伝導性オリゴマーを電極へ添加することを含む最後の工程により製造される。
【０４１９】
伝導性オリゴマーのヌクレオシドへの結合はいくつかの方法で行い得る。好ましい実施態様において、全てまたは一部の伝導性オリゴマーを、最初に合成し（一般に、電極への結合のために官能基を末端に有する）、これを次いでヌクレオシドに結合させる。次いで、さらにヌクレオシドを必要に応じて添加し、最後の工程で一般に電極へ結合させる。あるいは、オリゴマー単位を一度にヌクレオシドに添加し、さらにヌクレオシドを添加し電極へ結合させる。多くの代表的な合成をＷＯ９８／２０１６２、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ０９／１３５，１８３、６０／１０５，８７５、および０９／２９５，６９１の図面に示し、これら全ては出典明示により本明細書の一部とする。
【０４２０】
次いで、伝導性オリゴマーを、本明細書に記載のように結合した、１個（またはそれ以上の）オリゴマー単位を含み得るヌクレオシドに結合させる。
【０４２１】
好ましい実施態様において、結合は、アミドおよびアミン結合を含む、リボース−リン酸主鎖のリボースに対してである。好ましい実施態様において、リボースに結合した窒素と伝導性オリゴマーの芳香族環の間に、少なくとも一つのメチレン基または他の短い脂肪族アルキル基（Ｚ基として）が存在する。
【０４２２】
あるいは、ＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４で一般的に概説のとおり、結合はリボース−リン酸主鎖のリン酸を介する。
【０４２３】
好ましい実施態様において、結合は塩基を介する。好ましい実施態様において、保護基を、当業者に一般的に知られているように、伝導性オリゴマーの付加の前に塩基に添加してもよい。加えて、パラジウム交差結合反応を変えて、二量体化問題を防止することもできる；すなわち、二つの伝導性オリゴマーが、塩基に結合せず、むしろ二量体化する。
【０４２４】
あるいは、塩基への結合を、一単位のオリゴマーを有するヌクレオシドを製造し、続いて他を添加することによりなし得る。
【０４２５】
修飾ヌクレオシドを製造し、保護して活性化したら、電極への結合の前に、標準的な合成技法（Ｇａｉｔ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ １９８４； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）により、伸長しているオリゴヌクレオチドに、幾通りかの方法でそれらを包含させ得る。
【０４２６】
一実施態様において、１またはそれ以上の修飾ヌクレオシドを三リン酸形態に変形させ、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に、酵素ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるなど、標準的な分子生物学技法を用いて包含させる。３’修飾ヌクレオシドの核酸への包含には、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用し得る。（Ｒａｔｌｉｆｆ， Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｖｏｌ． １４Ａ． Ｐ． Ｄ． Ｂｏｙｅｒ ｅｄ． ｐｐ １０５−１１８． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ １９８１）。従って、本発明は、共有結合したＥＴＭを含むデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供する。好ましい実施態様は、一般に下記構造４２および４３に示すように、塩基またはリボース（好ましくは２’位で）などの主鎖へのＥＴＭ結合を利用する。
【０４２７】
【化４２】
0003548159.tif 000043
【０４２８】
【化４３】
0003548159.tif 000044
【０４２９】
従って、いくつかの実施態様において、ＥＴＭを含む核酸をその場で産生させることができる。例えば、標的配列の末端が露出する、すなわちハイブリダイズしないように、標的配列は捕獲プローブ（例えば、表面上の）にハイブリダイズし得る。酵素とＥＴＭで標識した三リン酸ヌクレオチドの添加により、その場での標識の製造が可能となる。同様にポリメラーゼにより認識される標識ヌクレオチドを用いると、ＰＣＲと検出とを同時に行い得る；つまりその場で標的配列が生成する。
【０４３０】
好ましい実施態様において、修飾ヌクレオシドをホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート形に変換し、これを次いでオリゴヌクレオチド合成の固相または溶液合成に使用する。この方法で、リボースでの（すなわち、アミノ−またはチオール−修飾ヌクレオシド）または塩基での結合用の、修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに内部位置または５’末端で包含させる。これは、一般に、二つの方法の一つで行う。第１に、リボースの５’位を４’，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護し、続いて２−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルアミノホスフィンとジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド存在下で反応させるか、または２’−シアノエトキシホスフィンクロロジイソプロピルアミノと反応させ、当分野で既知のようにホスホルアミダイトを得る；しかしながら、他の方法を当業者に認められるように使用し得る。Ｇａｉｔ 前出； Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： ２８１ （１９８５）参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【０４３１】
基の３’末端への結合のために、好ましい方法は制御孔ガラス（ＣＰＧ）または他のオリゴマー支持体への修飾ヌクレオシド（またはヌクレオシド代替物）の結合を使用する。この実施態様において、修飾ヌクレオシドを５’末端でＤＭＴで保護し、次いで、無水コハク酸と活性化しながら反応させる。得られるスクシニル化合物をＣＰＧまたは当分野で既知の他のオリゴマー支持体に結合させる。更に、修飾しているか、またはしていないホスホルアミダイトヌクレオシドを、脱保護後に５’末端に結合させる。従って、本発明はＣＰＧのような固体オリゴマー支持体に結合したヌクレオシドに共有結合した伝導性オリゴマーまたは絶縁体、および本発明のヌクレオシドのホスホルアミダイト誘導体を提供する。
【０４３２】
本発明はさらにＥＴＭを含むリクルートリンカーを有する標識プローブの製造方法を提供する。当業者には明らかなように、これらの合成反応はリクルートリンカーの特徴とＥＴＭの結合方法に依存する。核酸リクルートリンカーについて、標識プローブは、本明細書で概説したように、１以上の位置でＥＴＭを包含させて一般につくられる。遷移金属錯体をＥＴＭとして使用する場合、合成はいくつかの方法で行われる。好ましい実施態様において、配位子、続いて遷移金属イオンをヌクレオシドに添加し、次いで、遷移金属錯体が結合しているヌクレオシドをオリゴヌクレオチドに添加する、つまり、核酸合成機に添加する。あるいは、配位子を結合させ、続いて成長しているオリゴヌクレオチド鎖に包含させ、金属イオンを添加する。
【０４３３】
好ましい実施態様において、ＥＴＭをリボース−リン酸主鎖のリボースに結合させる。これは、伝導性オリゴマーについて本明細書に概説したように通常行われ、本明細書およびＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１に記載のように、アミノ−修飾またはオキソ−修飾ヌクレオシドを使用して、リボースの２’または３’位に行う。次いで、配位子として、例えば金属イオンの結合のための遷移金属配位子として、または、例えばアミド結合を介した、他の配位子または有機ＥＴＭの結合に使用できる化学的官能基として、当分野で認められるように、アミノ基を使用し得る。例えば、例として、リボースを介して結合した種々のＥＴＭを有するヌクレオシドの合成を記載する。
【０４３４】
好ましい実施態様において、ＥＴＭはリボース−リン酸主鎖のリン酸に結合する。本明細書に概説のように、これは、ホスホルアミダイト結合のようなホスホジエステル類似体を使用して行われてもよく（一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１参照）、またはＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４に記載のものと同様の方法を使用し、但し、伝導性オリゴマーを遷移金属配位子または錯体または有機ＥＴＭと置きかえて行なうこともできる。
【０４３５】
別の主鎖、例えば、ペプチド核酸または別のリン酸結合への結合は、当業者に認められるように行う。
【０４３６】
好ましい実施態様において、ＥＴＭはヌクレオシドの塩基に結合する。これは、種々の方法でなし得る。一実施態様において、天然に存在するか、または本明細書に記載ように添加した（例えば、図参照）塩基のアミノ基を、遷移金属錯体の配位子として、または例えば、アミド結合を介して他の配位子をまたは有機ＥＴＭを添加するのに使用できる化学的官能基として使用する。これは、当業者に認められるように行う。あるいは、複素環式環に結合したハロゲン原子を含むヌクレオシドは商品として入手可能である。アセチレン結合配位子は、一般的に既知のように、ハロゲン化塩基を使用して添加し得る；例えば、Ｔｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６（３４）： ６０１７−６０２０ （１９９５）； Ｔｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６（２）： ３４８９−３４９０ （１９９５）； およびＴｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （投稿中） １９９６参照、全て出典明示により本明細書の一部とする。また、塩基へのアセチレン結合を介して結合したメタロセン（この場合では、フェロセン）の合成を記載した図面および実施例も参照。
【０４３７】
ある実施態様において、ヌクレオシドを遷移金属配位子で製造し、核酸に包含させ、次いで、遷移金属イオンおよび残りの必要な配位子を当分野で既知のように添加する。別の実施態様において、遷移金属イオンおよび付加的配位子を、核酸への包含前に添加する。
【０４３８】
一旦、本発明の核酸を、共有結合により付着した付着リンカー（つまり、絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれか）を含めて製造したら、付着リンカーを電極に付着させる。本方法は、使用する電極のタイプによって変化する。本明細書に記載のように、結合リンカーは一般に末端「Ａ」リンカーと共に製造され、電極への付着を促進する。本適用の目的のために、硫黄−金結合は共有結合とみなす。
【０４３９】
好ましい実施態様において、伝導性オリゴマー、絶縁体および付着リンカーは硫黄結合を介して電極に共有結合する。しかしながら、驚くべきことに、分子の金電極への結合に使用する慣用的保護基は、一般に、本明細書に記載の組成物の合成およびオリゴヌクレオチド合成反応への包含の両方への使用に理想的でない。従って、本発明は、図に記載のようなエチルピリジンおよびトリメチルシリルエチルを含む、普通でない保護基を利用する、伝導性オリゴマーの金電極への結合の新規方法を提供する。しかしながら、当業者が理解するように、伝導性オリゴマーが核酸を含まないとき、アセチル基などの慣用的保護基を使用し得る。参照、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， 前出。
【０４４０】
これは、いくつかの方法でなし得る。好ましい実施態様において、電極への付着のために硫黄原子を含む伝導性オリゴマーのサブユニットをエチル−ピリジンまたはトリメチルシリルエチル基で保護する。前者に関して、これは一般に硫黄原子（好ましくはスルフヒドリルの形で）を含むサブユニットをビニルピリジン基またはビニルトリメチルシリルエチル基と、エチルピリジン基またはトリメチルシリルエチル基が硫黄原子に添加されるような条件下で接触させることにより行う。
【０４４１】
このサブユニットはまた、一般に、付加的サブユニットの付着のために官能部を含み、かくして、付加的サブユニットが付着して伝導性オリゴマーを形成する。次いで、伝導性オリゴマーをヌクレオシドに付着させ、付加的ヌクレオシドが結合する。保護基を次いで除去し、硫黄−金共有結合を行う。あるいは、伝導性オリゴマーの全てまたは一部を製造し、次いで、保護硫黄原子を含むサブユニットを添加するか、硫黄原子を添加して、保護する。伝導性オリゴマーを次いでヌクレオシドに付着させ、付加的ヌクレオチドを付着させる。あるいは、核酸に付着した伝導性オリゴマーを製造し、次いで保護硫黄原子を含むサブユニットを添加するか、硫黄原子を添加して、保護する。あるいは、エチルピリジン保護基を上記のように使用してもよいが、１以上の工程の後に除去し、ジスルフィドのような標準的な保護基に置き換える。このように、エチルピリジンまたはトリメチルシリルエチル基は、合成反応のいくつかで保護基として作用し得、次いで、除去して慣用的保護基に置き換えられる。
【０４４２】
本明細書の伝導性ポリマーの「サブユニット」は、硫黄原子が結合する伝導性オリゴマーの少なくとも一部を意味するが、伝導性オリゴマーの付加的成分の添加を可能にする官能基、または伝導性オリゴマーの付加的成分を含む付加的原子も存在し得る。従って、例えば、構造１のオリゴマーを使用するとき、サブユニットは少なくとも第１のＹ基を含む。
【０４４３】
好ましい方法は、１）一般に、ビニルピリジンまたはトリメチルシリルエチル基をスルフヒドリルに添加して行う、伝導性オリゴマーの第１サブユニットに結合した硫黄原子への、エチルピリジンまたはトリメチルシリルエチル保護基の添加；２）伝導性オリゴマーの形成のための付加的サブユニットの添加；３）少なくとも第１ヌクレオシドの伝導性オリゴマーへの添加；４）核酸を形成するための付加的ヌクレオシドの第１ヌクレオシドへの添加；５）伝導性オリゴマーの金電極への付着を含む。これはまた実施例に記載のように、ヌクレオシドの非存在下でも行い得る。
【０４４４】
上記の方法は、金電極への絶縁分子の結合にも使用し得る。
【０４４５】
好ましい実施態様において、伝導性オリゴマー（および所望により絶縁体）を含む単層を電極に添加する。一般に、添加の化学は、伝導性オリゴマーの電極への添加と類似か同じであり、即ち、金電極への結合に硫黄原子を使用するなどである。核酸に共有結合した伝導性オリゴマーに加えて、単層を含む構成物を、少なくとも５つの方法の一つでなし得る：（１）単層の添加、続く結合リンカー−核酸複合体の連続的添加；（２）結合リンカー−核酸複合体の添加、続く単層の添加；（３）単層と結合リンカー−核酸複合体の同時添加；（４）完全な核酸の付着に適した官能部で終了している付着リンカーを含む単層の形成（１，２または３のいずれかを使用した）；または（５）核酸合成に適した官能部で終了している付着リンカーを含む単層の形成、即ち、核酸を当分野で既知のように単層表面で合成する。このような適当な官能部は、ホスホルアミダイト添加のためのヌクレオシド、アミノ基、カルボキシル基、保護硫黄部、またはヒドロキシル基を含むが、これらに限定されない。例としては、好ましい方法（１）を用いた金電極上の単層の形成を記載する。
【０４４６】
好ましい実施態様において、核酸はペプチド核酸または類似体である。この実施態様において、本発明は、少なくとも一つの共有結合したＥＴＭまたは結合リンカーを有するペプチド核酸を提供する。好ましい実施態様において、これらの部分はＰＮＡの単量体サブユニットに共有結合する。本明細書の「ＰＮＡの単量体サブユニット」は、−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（ＣＯＣＨ２−塩基）−ＣＨ２−ＣＯ−単量体またはＰＮＡの誘導体（ここでは「ヌクレオシド」の定義内に含まれる）を意味する。例えば、ＰＮＡ主鎖の炭素原子の数を変え得る；一般に、ＰＮＡ誘導体の数を記載したＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． １９９７， ｐａｇｅ ７３ 参照、出典明示により本明細書の一部とする。同様に、塩基を主鎖に結合させるアミド結合を変え得る；ホスホロアミドおよびスルファーアミド結合を使用し得る。あるいは部分を内部単量体サブユニットに結合する。本明細書で「内部」は、単量体サブユニットがＮ−末端単量体サブユニットまたはＣ−末端単量体サブユニットでないことを意味する。本実施態様において、部分を単量体サブユニットの塩基または主鎖に付着できる。塩基への付着は、本明細書に概説のように、または文献から既知のように行う。一般に、部分を塩基に添加し、これを次いで本明細書に概説のようにＰＮＡに包含させる。塩基は、化学置換基の添加前またはその後に、ＰＮＡ合成反応への包含に必要なように保護されているか、包含されるように誘導体化されている。塩基の保護および誘導体化をＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４に示す。塩基を次いで単量体サブユニットに包含できる。
【０４４７】
好ましい実施態様において、部分はＰＮＡ単量体の主鎖に共有結合する。結合は、一般に、単量体サブユニットの非置換炭素原子の一つ、好ましくは主鎖のα−炭素に行われるが、１または２位の炭素、または塩基を主鎖に結合させるアミド結合のα−炭素での結合もなし得る。ＰＮＡ類似体の場合、他の炭素または原子も同様に置換し得る。好ましい実施態様において、部分を、α−炭素原子に末端単量体サブユニットまたは内部の末端単量体サブユニットへ添加する。
【０４４８】
この実施態様において、修飾単量体サブユニットを、ＥＴＭ、結合リンカーまたはその結合のための官能基で合成し、次いで塩基を添加し、修飾単量体を成長しているＰＮＡ鎖に包含させ得る。
【０４４９】
製造した共有結合部分を有する単量体サブユニットを、Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１（４４）： １２０６９−１２０８２ （１９９５）およびＶａｎｄｅｒｌａａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｔ． Ｌｅｔ． ３８： ２２４９−２２５２ （１９８７）（両方ともその全体を出典明示により本明細書の一部とする）に概説のような方法を使用して、ＰＮＡに包含させる。これらの方法は、ペプチド核酸への化学置換基の添加を、化学置換基を破壊させることなく可能にする。
【０４５０】
当業者に認められるように、電極は、核酸、伝導性オリゴマーおよび絶縁体の任意の組み合わせを有するように製造し得る。
【０４５１】
本発明の組成物は、更に、一個以上の標識を任意の位置で含み得る。本明細書での「標識」は、化合物の検出を可能にするために結合した元素（例えば、アイソトープ）または化学化合物を意味する。好ましい標識は放射活性同位体標識、着色または蛍光色素である。標識は、任意の位置で化合物に包含し得る。加えて、本発明の組成物は、架橋剤のような他の部分も含み得、標的−プローブ複合体の架橋を促進する。例えば、Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２４（４）： ６８３ （１９９６）およびＴａｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ３７５ （１９９４）参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【０４５２】
一旦製造されると、構成物は本明細書に記載のように、多くに適用されて使用される。特に、本発明の構成物は、標的被検体検出（特に核酸標的配列）用の結合アッセイで使用される。当業者には明らかなように、電極は、結合リガンドの単一種、または多数の結合リガンドの種（すなわち、アレイ方式）を有するようにつくられ得る。
【０４５３】
加えて、本明細書に概説のように、電極のような固体支持体の使用は、これらの遺伝子アッセイのアレイ形での使用を可能にする。オリゴヌクレオチド配列の使用は、当分野で既知である。加えて、電極内に位置を「アドレス参照」するため、および電極の表面修飾のための方法は既知である。従って、好ましい実施態様において、核酸を含む異なる結合リガンドのアレイは、電極の下に置かれ、その各々は付着リンカーを介して電極に共有結合する。この実施態様において、多くの異なる結合リガンドは、１から数千に広く変化し得、好ましくは約４から約１００，０００、および特に好ましくは約１０から約１０，０００である。
【０４５４】
少なくとも１つの標的被検体と１つの標識プローブを含む本発明のアッセイ複合体が形成されると、検出が電子的イニシエーションにより進行する。メカニズムまたは理論に制限されないが、検出は、ＥＴＭから電極への電子伝達に基づいており、「π軌道」の介在を含んでいる。
【０４５５】
電子伝達、すなわち、ＥＴＭの存在の検出は一般に好適な電圧により電子的に開始される。電位はアッセイ複合体に加える。加えられる電位の正確な制御と変化はポテンシオスタットおよび３つの電極システム（１つは参照用、１つはサンプル用（または実施用）、１つは対向電極用）または２つの電極システム（１つはサンプル用、１つは逆電極用）による。このことにより、一部ＥＴＭの選択に左右されるシステム、そして一部使用した伝導性オリゴマー、単層の組成と整合性、およびどのタイプの参照電極を使用したかに左右されるシステムのピーク電位に、印加した電位がマッチするようになる。本明細書に記載のように、フェロセンが好ましいＥＴＭである。
【０４５６】
好適な態様においては、共還元体または共酸化体（統合して、共酸化還元体）を追加の電子源または吸込みとして用いる。一般的には、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ ６６： １０３２ （１９９３）； Ｕｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３６： １７９９ （１９９１）；ａｎｄ Ａｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １００： １７０５０ （１９９６）（これらすべてを出典明示により本明細書の一部とする）参照。
【０４５７】
好ましい実施態様において、溶液中の入力電子源が電子伝達の開始に用いられる。好ましくは、直流電流を用いるか、または拡散が制限されない交流周波数で開始および検出がなされるときである。一般に、当業者に了知されるであろうように、好ましい実施態様で「孔」含有の単層を用いると、システムの短絡が回避できる。これはいくつかの一般的な方法で行うことができる。好ましい実施態様において、入力電子源は、標識プローブのＥＴＭよりも低いか同じレドックス電位を有する。このように、入力電子源のレドックス電位以上の電圧において、ＥＴＭおよび入力電子源が酸化されて電子を与え得る。ＥＴＭは電極に電子を与え、入力源がＥＴＭに与える。例えば、実施例中に記載した本発明の構成物に結合したＥＴＭとして、フェロセンは、水溶液中で大略２００ｍＶのレドックス電位を有する（フェロセンが結合したもの、結合の方法およびなんらかの置換基の存在によって非常に変化する）。電子源のフェロシアニドは、同様に約２００ｍＶのレドックス電位を有する。従って、約２００ｍＶまたはそれ以上の電圧において、フェロセンはフェリセニウムに変わり、電子を電極に伝達する。フェリシアニドを酸化して電子をＥＴＭに伝達することができる。この方法において、電子源（または同時還元剤）はシステムに生じたシグナルを増幅するために働き、電子源分子が核酸に結合したＥＴＭに電子を迅速に、かつ繰り返して伝達する。電子の供与・受容の速度は、同時還元剤の拡散の速度すなわち同時還元剤とＥＴＭとの間の電子伝達に制限される。電子伝達は濃度および大きさなどの影響を受ける。
【０４５８】
他方、ＥＴＭよりも低いレドックス電位を有する入力電子源が用いられる。ＥＴＭのレドックス電位よりも低いが、電子源のレドックスよりも高い電圧において、フェロシアニドなどの入力源は酸化され得ず、ＥＴＭに電子を与え得ない。すなわち電子伝達が起きない。フェロセンが酸化されると、電子の伝達経路ができる。
【０４５９】
他の好ましい実施態様において、入力電子源は、標識プローブＥＴＭよりも高いレドックス電位を有する。例えば、電子源のルミノールは大略７２０ｍＶのレドックス電位を有する。ＥＴＭのレドックス電位よりも低い電圧、すなわち２００−７２０ｍＶにおいては、電圧がルミノールのレドックス電位よりも低いので、ＥＴＭはルミノール電子源から電子を受けることができない。しかし、ルミノールのレドックス電位またはそれ以上で、ルミノールはＥＴＭに電子を伝達し、迅速かつ反復の電子伝達を可能とする。この方法において、電子源（または同時還元剤）はシステムで生じたシグナルを増幅するのに働き、電子源分子は標識プローブのＥＴＭに迅速にかつ反復して電子を供与する。
【０４６０】
ルミノールは酸化に際して化学的発光種になるという別の利点もあり（Ｊｉｒｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ ２８４：３４５（１９９３） 参照）、ＥＴＭから電極への電子伝達の光学的検出が可能となる。ルミノールが電極に直接接触しない限り、すなわち電極への効率的な電子伝達経路がないようなＥＴＭの存在において、アッセイ複合体上のＥＴＭに電子を伝達することのみによりルミノールは酸化される。ＥＴＭが存在していない（即ち、標的配列が本発明の組成物をハイブリダイズしない場合）と、ルミノールは顕著に酸化されないで、ルミノールからの光子放出が少なくなり、その結果（もしあれば）シグナル放出が少なくなる。標的の存在で非常に大きいシグナルが生じる。このように光子放出によるルミノール酸化の測定は、電極に電子を与えるＥＴＭの能力についての間接的な測定となる。さらに、光子検出は一般的に電子検出よりも感度がよいので、システムの感度が増大する。最初の結果から、発光が過酸化水素濃度、ｐＨおよびルミノール濃度（これは直線的ではない）に依存していることが示唆される。
【０４６１】
適切な電子源分子は周知であり、フェリシアニドやルミノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６２】
他方、出力電子受容体を用いることができる。すなわち上記反応を逆に行う。電極から電子を受けるメタロセンなどのＥＴＭを用いる。電子を迅速に繰り返し受ける出力電子受容体でメタロセンをメタリセニウムに変える。この実施態様では、コバルトイセニウムが好ましいＥＴＭである。
【０４６３】
単層の表面のＥＴＭの存在は、種々の方法によって検出することができる。光学的検出には、これらに限定されるものではないが、例えば蛍光、燐光、発光、化学発光、電気発光および屈折率がある。電子的検出には、これらに限定されるものではないが、アンペロメトリー、ボルタメトリー、キャパシタンス、インピーダンスがある。これらの方法には、交流または直流の電流に基づく時間・周波数依存法、パルス法、ロックイン法、フィルター法（高パス、低パス、バンドパス）および時間分解蛍光などの時間分解法がある。
【０４６４】
１つの実施態様において、ＥＴＭから電極への電子の効率的な伝達は、ＥＴＭのレドックス状態に定型的変化をもたらす。ビピリジン、ピリジン、イミダゾール環含有のルテニウム錯体を含む多くのＥＴＭでは、これらのレドックス状態の変化はスペクトルの変化に関連している。吸収の顕著な相違がこれらの分子について還元状態と酸化状態の間にみられる。例えば、Ｆａｂｂｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１９９５ ｐｐ１９２−２０２ を参照のこと。これらの相違は、分子光度計あるいは光電子増倍管を用いて監視することができる。
【０４６５】
この実施態様において、電子供与体および受容体には、光学活性化すなわち開始について上記したすべての誘導体が含まれる。好ましい電子供与体および受容体は電子伝達を高感度で監視し得るレドックスについて大きいスペクタル変化を特徴としている。好ましい例に、Ｒｕ（ＮＨ３）４ｐｙおよびＲｕ（ｂｐｙ）ｚｉｍがある。吸収によって監視される供給体または受容体のみが理想のスペクトル特性を有していることが理解されるべきである。
【０４６６】
好ましい実施態様において、電子伝達は蛍光定量で検出される。ルテニウムなどの遷移金属錯体の多くが明白な蛍光性を有する。従って、核酸に結合した電子供与体と受容体とのレドックス状態の電荷は、Ｒｕ（４，７−ビフェニル２−フェナントロリン）３２＋などによる蛍光を用いて、感度よく監視することができる。この化合物の生成は、標準的蛍光検出法によって容易に測定することができる。例えば、レーザー誘発蛍光は、標準的単細胞蛍光定量、「オンライン」蛍光定量（例えばクロマトグラフィーシステムに取りつけられたもの）でのフローあるいは９６ウエル・イムノアッセイ用に市販されているものに類似の多サンプル「プレートリーダー」で記録することができる。
【０４６７】
他方、溶液中かまたは光ファイバーに付着した核酸プローブを有する光ファイバーセンサーを用いて、蛍光を測定することができる。蛍光は光ファイバーに結合した光学増倍管または他の光検出器を用いて監視することができる。これについての有利な点は、検出に用いられるサンプル量が極めて少量でよいことである。
【０４６８】
さらに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃから販売されているＦｌｕｏｒｌｍａｇｅｒなどの走査蛍光検出器が固体表面に並んだ修飾核酸分子の蛍光を監視するのに非常に適している。このシステムの利点は、何千もの別異の核酸プローブでカバーされたチップを一度に用いて多数の電子伝達プローブを走査できることである。
【０４６９】
多くの遷移金属錯体が大きいＳｔｏｋｅｓシフトでもって蛍光を現す。適当な例として、ルテニウムなどの遷移金属のビスおよびトリスフェナントロリン錯体、およびビスおよびトリビピリジン錯体がある（Ｊｕｒｉｓ， Ａ．， Ｂａｌｚａｎｉ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｏｒｄ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， Ｖ．８４， ｐ．８５−２７７， １９８８ 参照）。好ましい例では、効率的な蛍光（合理的に高い量子収量）および低い再構築エネルギーを示す。これらには、Ｒｕ（４，７−ビフェニル２−フェナントロリン）３２＋、Ｒｕ（４，４’−ジフェニル２，２’−ビピリジン）３２＋および白金錯体がある（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８：１９４９−１９６０（１９９６） 参照）、出典明示により本明細書の一部とする）。他方、ハイブリダイゼーションに関連する蛍光の低下は、これらのシステムを用いて測定できる。
【０４７０】
別の実施態様において、電子化学発光が電子伝達検出の基礎として用いられる。Ｒｕ２＋（ｂｐｙ）３などのＥＴＭのいくつかで直接発光に励起状態の低下がおきる。この性質の変化は、核酸ハイブリダイゼーションに関連しており、簡単な光学増倍管で監視することができる。（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｇ．Ｆ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３７：１５３４−１５３９（１９９１）；および Ｊｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， 前出、参照）。
【０４７１】
好ましい実施態様において、電子検出に、アンペロメトリー、ボルタメトリー、電気容量およびインピーダンスなどが用いられる。好ましい技法として、これらに限定されるものでないが、電解重量分析、クーロメトリー（電位制御クーロメトリーおよび定電流クーロメトリーを含む）、ボルタメトリー（サイクリックボルタメトリー、パルスボルタメトリー（通常パルスボルタメトリー、矩形波ボルタメトリー、示差パルスボルタメトリー、Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇ 矩形波ボルタメトリー、静電量パルス法）、ストリッピング分析（アノードストリッピング、カソードストリッピング、矩形波ストリッピングボルタメトリー）、伝導率測定（電子的伝導、直接分析）、時間依存電子化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンショメトリー、サイクリッククロノアンペロメトリー、交流ポログラフィー、クロノガルバメトリー、クロノクロメトリー）、交流インピーダンス法、電気容量法、交流ボランタメトリー、光学電子化学法がある。
【０４７２】
好ましい実施態様において、電子伝達の監視はアンペロメトリー検出で行われる。この検出法において、望む標的遺伝子を含有するサンプル中の核酸結合電極と対照（逆）電極との間の電位（単離された対照電極と比較して）が利用される。相違する効率の電子伝達が標的核酸の存在または不存在によって生じる。すなわち標的核酸の存在また不存在、および従って標識プローブ、が異なる電流をおこす。
【０４７３】
アンペロメトリーで電子伝達を測定する器具は、感度のよい電流検出を含み、電圧電位を制御する手段、通常はポテンシオスタットを含む。この電圧は標識プローブ上の電子供与複合体の電位を参照することにより最適化される。電子供与複合体には、鉄、オスミウム、白金、コバルト、レニウム、レテニウムの錯体について上記したものが含まれ、鉄錯体が最も好ましい。
【０４７４】
好ましい実施態様において、他の電子検出法が用いられる。例えばポテンシオメトリー（すなわちボルタメトリー）には、非ファラデー法（ネット電流なし）が含まれ、ｐＨや他のイオン検出器において通常用いられる。同様のセンサーがＥＴＭと電極との間の電子伝達を監視するために用いられる。さらに、絶縁体（抵抗など）および伝導体（伝導、インピーダンス、電気容量）などの他の性質がＥＴＭと電極との間の電子伝達を監視するために用いられる。また、電流を生じるいかなるシステム（電子伝達など）も小さい磁場を生じ、ある実施態様で監視され得る。
【０４７５】
本発明の組成物で見られる電子伝達の速い速度がもたらす一つの利点は、時間分解能が吸収、蛍光あるいは電子流などによるモニターにおけるシグナル対ノイズ結果を非常に高め得ることである。本発明の電子伝達の速い速度は、高度のシグナルと電子伝達開始・完了間の定型的遅延とをもたらす。特定の遅延のシグナルを増幅することにより、電子伝達のパルス開始および「ロックイン」増幅検出およびフーリエ変換がなされる。
【０４７６】
好ましい実施態様において、電子伝達は交流電流（ＤＣ）法を用いて始められる。理論によって限定されないが、電極に連結したＥＴＭは、抵抗とコンデンサーを含む回路を流れる交流電圧と同様に反応する。基本的に、これらの抵抗とコンデンサーとして働く複合体の性質を測定し得る方法は、検出の基本とすることができる。驚くべきことに、従来からの電気化学理論、例えば、Ｌａｖｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ９７：１３５（１９７９） および Ｌａｖｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １０５：３５（１９７９）（出典明示により本明細書の一部とする）は、非常に小さいＥＡＣ（１０ｍＶ以下）および比較的多数の分子を除き、本明細書に記載のシステムのモデルとはならない。すなわち、交流電流（Ｉ）は、Ｌａｖｉｒｏｎの式に正確には記載されていない。このことは、この理論が電子の限界のない供給源と吸込みを想定していることに部分的には由来するものであり、これは本発明のシステムには当てはまらない。
【０４７７】
これらのシステムのよいモデルとなる交流電圧理論は、Ｏ’ Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ４６６（２）：１９７−２０２ （１９９９）（出典明示により本明細書の一部とする）に概略説明されている。これらのシステムを予測する式を、式１として下に示す：
式１
【数１】
0003548159.tif 000045
式１中で、ｎはレドックス分子毎の酸化または還元電子数、ｆは適用振動数、Ｆはファラデー定数、Ｎ全はレドックス分子の総数、Ｅ０はレドックス分子の形式的電位、Ｒはガス定数、ＴはＫｅｌｖｉｎ度数での温度、そしてＥＤｃは電極電位である。このモデルは実験データと非常によく適合している。ある場合に、電流が予測より小さくなるが、これは、フェロセンの減少によるものであり、多くの方法で回復させ得る。
【０４７８】
加えて、ファラデー電流も、式２に示すとおり、時間の関数として表わすことができる：
式２
【数２】
0003548159.tif 000046
ＩＦはファラデー電流であり、ｑｅは電気素量である。
【０４７９】
しかし、電子伝達速度の影響も機器による因子も、式１に組み入れられてない。電子伝達速度は、応用周波数に近いか、それより低いと、重要である。このように真のｉＡＣは下記の式１２に示すような３因子の関数である。
式３
ｉＡＣ＝ｆ（Ｎｅｒｎｓｔ因子）ｆ（ｋＥＴ）ｆ（機器因子）
【０４８０】
これらの式は、交流素子および直流素子を含む入力シグナルを利用するシステムにおける期待交流電流をモデル化し、予測できる。上記したように、驚くべきことに従来の理論は、非常に低電圧の場合以外は、これらのシステムをまったくモデル化しない。
【０４８１】
一般に、非特異的に結合した標識プローブ／ＥＴＭは、ＥＴＭを含む標識プローブが正確な方向に特異的に結合したときよりも、インピーダンスに相違を示す（すなわち、高いインピーダンス）。好ましい実施態様において、非特異的結合物質を洗い落とすと、無限大の効果的なインピーダンスをもたらす。このように、一般的に下記するように交流検出はいくつかの利点があり、それには、感受性の増加およびバックグラウンドのノイズを「濾去する」能力が含まれる。特に、インピーダンスの変化（例えばバルクインピーダンスを含む）を、ＥＴＭ含有プローブの非特異的結合と標的特異的アッセイ複合体形成の差として監視できる。
【０４８２】
従って、交流開始および検出方法を用いると、システムの周波数応答がＥＴＭ存在の結果として変化する。「周波数応答」は、電極とＥＴＭとの間の電子伝達の結果としてのシグナルの変化を意味する。この変化はシグナル周波数に従って相違する。周波数応答には、１以上の周波数での交流電流、位相シフト、直流オフセット電圧、ファラデーインピーダンス等が含まれる。
【０４８３】
標的配列および標識プローブを含むアッセイ複合体がつくられると、第１入力電子シグナルはシステムに用いられ、好ましくは少なくともサンプル電極（本発明の複合体を含む）および逆電極を介してシステムに用いられ、電極とＥＴＭとの電子伝達が開始される。電極システムも対照および実施電極に適用される電圧で用いられる。第１入力シグナルは少なくとも１つの交流素子を含む。交流素子は変化し得る振幅と周波数である。一般的に、本発明方法での使用において、交流振幅は約１ｍＶ−１．１Ｖであり、約１０ｍＶ−８００ｍＶが好ましく、特に約１０−５００ｍＶが好ましい。交流周波数は約０．０１Ｈｚ−１００ＫＨｚであり、約１０Ｈｚ−１０ＭＨｚが好ましく、約１００Ｈｚ−２０ＭＨｚが特に好ましい。
【０４８４】
交流と直流シグナルとの組み合わせ使用は、驚くべき感受性とシグナル最大化を含む種々の利点がある。
【０４８５】
好ましい実施態様において第１入力シグナルは交流素子および直流素子を含む。すなわち、サンプルと逆電極直流オフセット電圧は、ＥＴＭ（例えば、フェロセンを用いると、掃引は一般に０から５００ｍＶ）（あるいは、作動電極をグラウンドすると、対照電極は０から−５００ｍＶで掃引される）の電子化学的電位を介して掃引される。この掃引はシステムの最大応答が見られる直流電圧を同定するのに用いられる。これは一般にＥＴＭの電子化学的電位かその周辺である。この電圧が測定されると、掃引または１以上のユニホーム直流オンセット電圧が用いられる。直流オンセット電圧は約−１Ｖから＋１．１Ｖであり、約−５００ｍＶから＋８００ｍＶが望ましく、約−３００から５００ｍＶが特に望ましい。好ましい実施態様において直流オンセット電圧はゼロではない。直流オンセット電圧のトップで、変化し得る振幅および周波数のシグナル交流素子が適用される。もしＥＴＭが存在して交流摂動に応答し得ると、電極とＥＴＭとの間の電子伝達によって、交流電流が生じる。
【０４８６】
確立したシステムにおいて、ＥＴＭ（即ち標的配列の存在する）核酸の有無を識別するのに、単一の入力シグナルを用いて十分である。他方、複数の入力シグナルも適応される。これには、多くの種類があり、多重周波数、多重直流オフセット電圧、多重交流振幅あるいはこれらの組合せが用いられる。
【０４８７】
このように好ましい実施態様において、多重直流オンセット電圧を用いると、直流電圧掃引が好ましい。これは単一の周波数または２以上の周波数で行われる。
【０４８８】
好ましい実施態様において、交流振幅は変更することができる。理論にとらわれることなく、振幅を上げると推進力が増すようである。高い振幅は高い過電位をもたらし、電子伝達に速い速度を与える。一般的に同じシステムがその周波数での高い過電位の使用を介して単一の周波数での応答を改善する（すなわち、より高い出力シグナル）。振幅が高周波数で増すと、システムを通しての電子伝達の速度を増し、感受性が大きくなる。さらに、例えば、これは、適当な空間のある配置を有さないような遅いシステムでの応答を惹起するのに用いられる。
【０４８９】
好ましい実施態様において、システムの測定は、少なくとも２つの単離した振幅または過電位でなされる。複数の振幅が好ましい。上記したように、振幅変化の結果としての応答の変化は、システムの同定、校正および定量の基礎を形成する。さらに１以上の交流周波数を同様に用いることができる。
【０４９０】
好ましい実施態様において、交流周波数は様々である。相違する周波数において、異なる分子が異なる方法で応答する。当業者に了知されるであろうように、周波数が増すと出力電流は一般に増加する。しかし、電極とＥＴＭに電子が行き来する速度よりも周波数が大きいときは、高い周波数は出力シグナルの喪失または低下をもたらす。ある時点で周波数がＥＴＭと電極との間の電子伝達の速度よりも大きくなり、出力シグナルも低下する。
【０４９１】
ある実施態様において、検出に単一周波数における出力シグナルの単一測定を用いる。すなわち、標的配列の不存在と従ってＥＴＭを含む標識プローブの不存在でのシステムの周波数応答はあらかじめ測定でき、特定の高周波数で非常に低い。この情報を用いると、特定の周波数応答がアッセイ複合体の存在を示す。すなわち、特定の周波数でのすべての応答はアッセイ複合体を特徴付ける。単一入力高周波数を用いることのみが必要であり、すべての周波数応答のなんらかの変化は、分析物が存在すること、標的配列が存在することを示す。
【０４９２】
さらに交流技法を用いると、ＥＴＭ以外の物質によるすべての単一周波数でのバックグラウンドシグナルの顕著な低下をもたらす。すなわち、望まないシグナルの「閉め出し」または「濾去」である。溶液中の電荷キャリヤーすなわちレドックス活性分子の周波数応答が、その拡散係数および電荷伝達係数によって制限される。従って、高周波数では、電荷キャリヤーはその電荷を電極に伝達するのに十分速く拡散し得ず、および／または電荷伝達速度が十分に速くない。このことは、適切な単層を用いない場合あるいは部分的または不完全な単層を用いる場合、すなわち溶媒が電極に到達し得ない場合に著しい。すでに概記したように、直流技法において、電極に溶媒が到達し得る「孔」の存在は、溶媒電荷キャリヤーがシステムを「短絡」する結果をもたらすことがある。すなわち、電極への到達およびバックグラウンドシグナルの生成である。しかし、現在の交流技法を利用すると、１以上の周波数が選ばれて、単層の存在・不存在にかかわらず溶液中の１以上の電荷キャリアーの周波数応答を防ぐ。このことは血液などの多くの生物体液が、アンペロメトリー検出を妨害し得るレドックス活性分子を顕著な量で含有しているので、特に意味がある。
【０４９３】
好ましい実施態様において、システムの測定は少なくとも２つの単離された周波数で行われ、複数の周波数の測定が好ましい。複数の周波数には走査がある。例えば交流電流は、１−２０Ｈｚなどの低い入力周波数で、１０−１００ｋＨｚなどの高い周波数での出力シグナルに対する応答と比較すると、ＥＴＭの存在の有無による周波数応答の相違を示す。好ましい実施態様において、周波数は少なくとも２、好ましくは約５、さらに好ましくは少なくとも約１０周波数で測定される。
【０４９４】
電子伝達を開始するために入力シグナルを伝導した後に、出力シグナルが受けられ、すなわち検出される。出力シグナルの存在および増大は多くの因子に依存する。すなわち、入力シグナルの過電位／振幅；入力交流シグナルの周波数；介在媒体の組成；直流オンセット；システムの環境；ＥＴＭの性質；溶媒；塩の種類と濃度である。１つの与えられた入力シグナルにおいて、出力シグナルの存在および増大は、一般的にＥＴＭの存在の有無、単層表面からのＥＴＭの位置と距離および入力シグナルの性質に依存する。いくつかの実施態様において、標識プローブの非特異的結合と標識プローブを含む標的特異的アッセイ複合体の形成との相違をインピーダンスに基づき識別することは、可能である。
【０４９５】
好ましい実施態様において、出力シグナルは交流電流を含む。上記したように、出力電流の大きさはパラメーターの数に依存する。これらのパラメーターを変えると、数においてシステムが最適化される。
【０４９６】
本発明で生じる交流電流は一般的に、約１フェムトアンペア−約１ミリアンペアにあり、約５０フェムトアンペア−約１００マイクロアンペアが好ましく、約１ピコアンペア−約１マイクロアンペアが特に好ましい。
【０４９７】
好ましい実施態様において、出力シグナルは入力シグナルに比較すると交流素子でシフトする位相である。理論にとらわれることなしに、本発明のシステムを充分に均一にすると、位相シフトの検出が可能となるようである。すなわち、本発明の電子伝達が起きるバイオ複合体は、均質に交流入力と反応し、これは標準の電子素子と同じであり、位相シフトが測定できる。このことは、ＥＴＭの存在の有無の検出の基礎として、および／または標識プローブを含む標的特異的アッセイ複合体の存在とシステム成分に対する物質の非特異的結合との差異として働く。
【０４９８】
出力シグナルは、ＥＴＭの存在に特有のものである。すなわち出力シグナルは、標識プローブとＥＴＭを含む標的特異的アッセイ複合体の存在に特有のものである。好ましい実施態様において、検出の基礎は、アッセイ複合体の形成の結果としてのシステムのファラデーインピーダンスの相違にある。ファラデーインピーダンスは、電極とＥＴＭのシステムのインピーダンスである。ファラデーインピーダンスはバルクすなわち２電子インピーダンスとまったく異なり、バルクインピーダンスは電極間のバルク溶液のインピーダンスである。多くの因子がバルクインピーダンスに作用しないファラデーインピーダンスを変えることができ、その逆も可能である。このように核酸を含む本システムのアッセイ複合体は一定のファラデーインピーダンスを有し、これはＥＴＭと電極の距離、その電子的性質、介在媒体の組成などに依存している。本発明方法で重要なことは、ＥＴＭと電極との間のファラデーインピーダンスが、ＥＴＭを含む標識プローブが電極に特異的または非特異的に結合するかどうかにより非常に異なることである。
【０４９９】
従って、本発明はさらに、本発明の構成物を用いて被検体を検出するための電子器具または装置を提供する。この装置は、少なくとも第１測定すなわちサンプル電極および第２測定または逆電極を有する、サンプル溶液受取用の試験チャンバーを含む。３電極システムも用いられる。第１および第２測定電極は試験サンプル受け領域に接触し、液体試験サンプルの存在下で、２つの電気泳動電極は電子的に接触していてもよい。
【０５００】
好ましい実施態様において、本明細書に記載のように、装置はまた、付着リンカーを介して共有結合した１本鎖核酸捕獲プローブを含む検出電極、および伝導性オリゴマーを含む単層も含む。
【０５０１】
装置は、試験チャンバーに、すなわち測定電極に、電気的に連結した交流電圧源を含む。好ましくは、交流電圧源はオフセット電圧も同様に放出し得る。
【０５０２】
好ましい実施態様において、装置はさらに、入力シグナルと出力シグナルとを比較し得るプロセッサーを含む。プロセッサーは電極に結合しており、出力シグナルを受けるように配置され、表面ヌクレオシドの存在を検出する。
【０５０３】
従って本発明の組成物は、種々の研究、臨床、品質管理、野外試験などに用いられる。
【０５０４】
好ましい実施態様において、これらのプローブは遺伝子診断に使用される。例えば、本明細書中に開示した技術を使用して、プローブを、例えば、非腺腫性大腸癌遺伝子、ＢＲＣＡ１胸部癌遺伝子、各種の癌関連遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病の最大リスク指標であるアポＥ４遺伝子、などの標的配列を検出するために調製し、患者の前駆症状スクリーニング、嚢胞性腺維症遺伝子変異、あるいはその他の当技術分野で周知のすべてを容易にすることができる。
【０５０５】
別の実施態様では、ウイルスおよびバクテリアの検出を、本発明の複合体を使用して実施できる。この実施態様では、プローブは、各種ウイルスおよびバクテリアから標的配列を検出するためにデザインされる。例えば、現今の血液スクリーニングは坑ＨＩＶ抗体の検出に依存している。本明細書中に開示した方法は、臨床サンプルのＨＩＶ核酸配列、殊に高度に保存性のＨＩＶ配列を検出する直接スクリーニングを可能とする。さらにこれは、坑ウイルス治療の効果を評価する改良方法として、患者の体内を循環しているウイルスを直接モニターすることを可能とする。同様に、白血病関連ウイルス、ＨＬＴＶ−ＩやＨＬＴＶ−ＩＩをこの方法で検出することができる。バクテリア感染症、例えば、結核、クリミディア（ｃｌｙｍｉｄｉａ）および他の性的伝染症も検出できる。
【０５０６】
好ましいある実施態様では、本発明の各核酸は、水あるいは食品サンプルのスクリーニングにおいて毒性バクテリア用のプローブとしても使用される。例えば、各サンプルは、バクテリアを溶解処理してその核酸を遊離させ、次いでバクテリア株を認識するようにプローブをデザインする。但し、該バクテリアは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ， Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ， Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ，  腸毒性のＥ． Ｃｏｌｉ株、およびレジオネア病バクテリア、などの病原性株を含むがそれらに限定はされない。同様にして、本発明の構成物を使用して生体治癒戦術を、評価できる。
【０５０７】
さらなる実施態様では、犠牲者や容疑者から採取したサンプルについて、犯罪−現場を一致させる法医学的「ＤＮＡ指紋鑑定」に使用される。
【０５０８】
さらなる実施態様では、あるアレイ配列のプローブは、ハイブリダイゼーションによる配列決定に使用される。
【０５０９】
このように、本発明は、ある実施態様においては、ハイブリダイズしていないプローブを除去することなく標的配列を検出し得る、極めて特異的で感受性の高いプローブを提供するものである。これは、自動的な遺伝子プローブアッセイの形成に有用である。
【０５１０】
あるいは、本発明の組成物は、ＰＣＲで成功した遺伝子増幅を検出するのに有用であり、かくして成功したＰＣＲ反応を標的配列の存在または不存在の指標とすることができる。ＰＣＲはこのような手法で数種の方法に使用される。例えば、ある実施態様では、このＰＣＲ反応は当技術分野で知られているようにして実施され、次いで、標的核酸とＥＴＭとを含む本発明の構成物に加え、伝導性オリゴマーを介して電極に共有結合させ、続いて標的配列を検出する。あるいは、ＥＴＭで標識化したヌクレオチドを用い、電極の存在下にまたは続いて電極を加えるかのいずれかで、伝導性オリゴマー及び標的核酸とともにＰＣＲを実施する。ＥＴＭを含有するＰＣＲ生成物の電極組成物との結合は、電子伝達により検出される。最終的に、伝導性ポリマーを介して電極に結合した核酸は、ＥＴＭで標識化した第２プライマーの添加により、ＰＣＲプライマーの１種となるだろう。伸長させると、ＥＴＭおよび共有結合した電極を有する２本鎖核酸を生じる。このような方法で、本発明は各標的配列のＰＣＲ検出に使用される。
【０５１１】
好ましいある実施態様では、これらの配列はｍＲＮＡ検出に使用される。好ましいある実施態様は、これらのｍＲＮＡの３’ポリアデニル化末端近くにハイブリダイズする捕獲プローブまたは捕獲伸長プローブのいずれかを利用するものである。これにより、標的結合プローブの１種、即ち、ｍＲＮＡ標的のポリ−Ａ末端と結合するポリ−Ｔ部分を含有するプローブ、を標的に使用することが可能となる。一般的に、このプローブは、好ましくは非ポリ−Ｔであり、検出プローブ（または他のプローブ）と結合する第２部分、を含有する。これにより、１種標的結合プローブの調製、および、異種プローブ合成実施量の減少が可能となる。
【０５１２】
好ましいある実施態様では、制限酵素およびライゲーション手法を使用することにより、「普遍的」アレイ配列の創製が可能となる。この実施態様では、図６に一般的に示した、制限エンドヌクレアーゼ末端を含む捕獲プローブを含む単層である。核酸の相補的部分を利用することにより、「粘着性末端」を残しつつ、制限エンドヌクレアーゼ部位のすべてを含むアレイ配列が調製される。これらの制限エンドヌクレアーゼの１種またはそれ以上で標的サンプルを処理することにより、それらの標的をアレイ配列に結合させることが可能となる。これは、標的の配列を知らなくても実施できる。それらの標的は、所望により、標準的手法例えばリガーゼを用いてライゲートされ得、そして標準的標識または本発明方法のいずれかを使用して標的配列を検出できる。
【０５１３】
本発明は、核酸類を感受性よく検出し得る方法を提供するものである。好ましい実施態様では、約１０×１０６個以下、好ましくは約１０×１０５個以下、より好ましくは約１０×１０４個以下、特に好ましくは約１０×１０３個以下、最も好ましくは約１０×１０２個以下の分子が検出される。これは標的配列とレポーター分子との１：１相関を推認するものであり、もし各標的配列に対して１以上のレポーター分子（即ち、電子伝達分子）を使用すれば、感受性がより高くなるはずであることは、当業者には明らかであろう。
【０５１４】
現今、検出限界は刊行物発表されたＤＮＡを介しての電子伝達率に基づいて評価されており、それは大まかに言って、８ベースペア分離につき１×１０６電子／秒／デュプレックスであり（Ｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｗ． Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｅｄ．， ３４：３５２ （１９９５）参照） 、高い推進力、約１００ｋＨｚの交流振動数を可能とするものである。予試験結果が示しているように、これらのシステムを介しての電子伝達は、極めて効率的であり、ほぼ１００×１０３電子／秒に達し、非常に僅かの分子に対してもフェムトアンペアレベルの感受性をもたらす。
【０５１５】
本明細書中に引用したすべての参照文献は、参照によりそれらの全部を本書中の記載として導入する。
【０５１６】
実施例
実施例１
基板および単層の一般的作製法
基板上のＳＡＭ形成−一般手法
自己集合単層を清浄金表面に形成した。金表面は様々な異なる方法で調製することができる；溶融または研磨金線；ガラスまたは雲母またはシリコン・ウエハーまたはある種の他の基板にスパッタもしくは蒸着した金；回路基板物質またはガラスまたはシリコンまたはある種の他の基板に電気メッキもしくは無電解メッキした金。真空蒸着金サンプル（減圧およびスパッタ）および溶液析出金サンプル（無電解および電気メッキ）双方について、好適な機械的安定性を保証するために、基板と金との間に粘着層を使用しなければならない。クロム、チタン、チタン／タングステンまたはタンタルが多くの場合スパッタおよび蒸着金と共に採用される。電気メッキしたニッケルは通常電気メッキおよび無電解メッキした金と共に採用され、他の粘着物質が使用し得る。
【０５１７】
金基板は単層を形成する前に清浄にする。様々な異なる手法が採用されている。化学溶液による浄化が最も一般的である。ピランハ溶液（過酸化水素／硫酸）または王水（塩酸／硝酸）清浄化が最も一般的であるが、電気化学的方法、火炎処理、プラズマ処理法なども採用されている。
【０５１８】
清浄化に続いて、金基板を析出溶液中でインキュベートする。析出溶液は溶媒中種々チオールの混合物を含む。エタノールなどの有機溶媒中アルカンチオールの混合物が最も一般的な手法であるが、様々な変法も開発されている。替わり得る手法としてはアルカンチオールの気相析出、微小接触プリンティング、ニート・チオールを使用する析出、水性溶媒からの析出などであるが、２工程手法が開発されている。析出溶液におけるアルカンチオールの濃度はモルないしミクロモル以下の範囲であり、０．５〜２．０ミリモルの範囲が最も一般的である。金基板はその手法に応じて１秒以下ないし数日間、析出溶液と接触させ、インキュベート／静置する。最も一般的な時間は１時間ないし一夜のインキュベーションである。インキュベーションは通常室温で実施するが、５０℃までの温度が一般的である。
【０５１９】
ＤＮＡを含む混合単層は通常２工程手法により調製する。チオール化ＤＮＡは第１析出工程に際して析出し、混合単層形成はＤＮＡを含まない第２チオール溶液を加える第２工程で完了する。第２工程は多くの場合緩和な加熱であり、単層の再構成を促進する。
【０５２０】
ＳＡＭ形成の一般手法−有機溶液からの析出
浄化金表面を浄化バイアルに入れた。ＤＮＡ析出有機溶媒溶液を調製し、総チオール濃度を４００μＭと１．０ｍＭの間とした。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡとチオール希釈分子とを含んでいた。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０：１と１：１０の間にあり、好ましくは１：１であった。好適な溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはその混合物である。十分な量のＤＮＡ析出溶液をバイアルに加え、電極表面が完全に覆われるようにする。金基板は外界温度または僅かに高い温度で５〜３０分間インキュベートする。最初のインキュベーションの後、析出溶液を除き、希釈分子のみの有機溶媒溶液（１００μＭ〜１．０ｍＭ）を加える。金基板は室温または室温より高い温度で完全な単層が形成されるまで（１０分ないし２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、浄化溶媒中ですすぎ、使用する。
【０５２１】
ＳＡＭ形成の一般手法−水性溶液からの析出
浄化金表面を浄化バイアルに入れる。ＤＮＡ析出水性溶液を調製し、総チオール濃度を１μＭと２００μＭの間とする。この水性溶液は多くの場合、塩を含む（約１Ｍ）が、精製水を使用してもよい。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡとしばしばチオール希釈分子とを含んでいる。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０：１と１：１０の間にあり、好ましくは１：１である。電極表面が完全に覆われる容量のＤＮＡ析出溶液をバイアルに加える。金基板は外界温度または僅かに高い温度で１〜３０分間インキュベートするが、通常５分で十分である。最初のインキュベーションの後、析出溶液を除き、希釈分子のみの水性溶液または有機溶媒溶液（１０μＭ〜１．０ｍＭ）を加える。金基板は室温または室温より高い温度で完全な単層が形成されるまで（１０分ないし２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、浄化溶媒中ですすぎ、使用する。
【０５２２】
Ａｕボール電極上の単層
Ａｕボール電極の創製：かみそりの刃を使用し、金線（直径１２７μｍ、９９．９９％純度、Ａｌｄｒｉｃｈ から）を１０ｃｍの長さに切断する。１６ゲージの針を使用し、金線を＃４天然ゴム隔壁（１／２ｍＬのＰＣＲエッペンドルフ・チューブに適合するサイズ）に通す（これは金線を支持し、析出に際しチューブを密封する。下記参照）。浄化焼成火炎（メタンまたはプロパン）を使用し、金線の１センチメートルを溶融して金線末端に付着した球体を形成する。金線の長さを調整し、ＰＣＲチューブに封入したときに、金ボールが底部近傍に位置して２０μＬの液体に没入し得るようにする。使用当日に、電極を王水（４：３：１のＨ２Ｏ：ＨＣｌ：ＨＮＯ３）に２０秒間浸け、次いで水で十分にすすぐ。
【０５２３】
誘導化：ＰＣＲチューブ中、析出溶液（ＤＭＦ中８３３μＭ総量で２：２：１ＤＮＡ／Ｈ６／Ｍ４４）２０μＬ量をＰＣＲブロック上で５０℃に５分間加熱する。次いで、各電極を析出溶液に浸け（金ボールが沈む程度−金線の「柄」はできるだけ短くする）、室温に移す。電極をＰＣＲチューブに移す前に、ＤＭＦ中２００μＬの４００μＭ−Ｍ４４で１５分間インキュベートする（金線の多くを同様に沈める）。Ｍ４４中に室温で５分間放置し、次いで、ＰＣＲブロック上に載せ、ＨＣＬＯＮＧを実施する。電極をＭ４４溶液から取出し、６×ＳＳＣに浸け、ハイブリダイゼーション溶液２０μＬを入れたＰＣＲチューブに入れる。ＡＣＶ測定に先立ち電極を６×ＳＳＣに浸ける。
ＨＣＬＯＮＧ：６５℃２’、−０．３℃／ｓ〜４０℃、４０℃２’、＋０．３℃／ｓ〜５５℃、５５℃２’、−０．３℃／ｓ〜３０℃、３０℃２’、＋０．３℃／ｓ〜３５℃、３５℃２’、−０．３℃／ｓ〜２２℃。
【０５２４】
回路基板の製造
両側に半オンスの銅箔をもつＦＲ−４の１８”×２４”×０．０４７”パネル（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）に明細（Ｇｅｒｂｅｒ ｆｉｌｅｓ）どおりに穿孔した。ＦＲ−４パネルは無電解銅でメッキ（５００マイクロインチ）して特定の穿孔を伝導性とし、次いでパネルにはさらに５００マイクロインチの電気メッキ銅を貼り付ける。銅メッキに続いて、パネルは塩化第２銅エッチング（酸エッチング）により明細どおりにエッチングする。次いで、エッチングしたパネルに光沢剤を有する４００マイクロインチの電気メッキニッケルを張付け、次いで５０マイクロインチの軟質金（９９．９９％純度）を貼り付ける。金パネルにはその両側に液状光画像形成蝋マスク（Ｐｒｏｂｉｍｅｒ ５２， Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｃｏ．）を被覆する。画像形成を明細どおりに実施する。直径２５０ミクロンの１４個のセンサー電極と２個のより大きい電極（直径５００ミクロン）を、基板の縁で金貼付け接点につながる絶縁リード線と共に創製する。次いで、蝋マスク化パネルに明細どおりに刻み目を入れ、１”×１”の個々のウエアーを創製する。銀／塩化銀のペーストを２個の大きい方の電極（ＥＲＣＯＮ Ｒ−４１４）の一方に塗付する。次いで、パネルをアルゴン／酸素プラズマ混合物でプラズマ浄化する。浄化に続いて、パネルは箔を内張りしたバッグに入れ使用時まで保存する。
【０５２５】
回路基板上の単層析出
回路基板を箔内張りバッグから取出し、１０％硫酸溶液中に３０秒間浸漬する。硫酸処理に続き、基板をミリ−Ｑ水に２回それぞれ１分間浸漬する。基板は次いで窒素気流下で乾燥する。基板を調湿チャンバー内のＸ−Ｙテーブルに置き、ＤＮＡ析出溶液の３０ナノリットル液滴を１４個の電極それぞれに載せる。ＤＮＡ析出溶液は、３３μＭチオール化ＤＮＡ、３３μＭ２ユニットのフェニルアセチレンワイヤ（Ｈ６）、および６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）ｗ／１％トリエチルアミン中の１６μＭ−Ｍ４４を含む。液滴を室温で５分間インキュベートし、次いで、液滴をミリＱ水浴中ですすぎ取除く。基板をアセトニトリル中Ｍ４４の４５℃浴に浸漬する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒、次いでミリＱ水浴に３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下に乾燥する。
【０５２６】
実施例２
標的配列の検出
回路基板上の単層析出
上記のように、回路基板を箔内張りバッグから取出し、１０％硫酸溶液中に３０秒間浸漬する。硫酸処理に続き、基板をミリ−Ｑ水に２回それぞれ１分間浸漬する。基板は次いで窒素気流下で乾燥する。基板を調湿チャンバー内のＸ−Ｙテーブルに置き、ＤＮＡ析出溶液の３０ナノリットル液滴を１４個の電極それぞれに載せる。ＤＮＡ析出溶液は、３３μＭチオール化ＤＮＡ、３３μＭ２ユニットのフェニルアセチレンワイヤ（Ｈ６）、および６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）ｗ／１％トリエチルアミン中の１６μＭウンデセン−１−エン−１１−イルトリ（エチレングリコール）（（ＨＳ−ＣＨ２）１１−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＨ）を含む。３個の電極にＤＮＡ１（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴ（ＣＨ２）１６ＳＨ−３’）含有溶液をスポットした。４個の電極にはＤＮＡ２（５’ＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣＡ（ＣＨ２）１６ＳＨ−３’）含有溶液をスポットした。４個の電極にはＤＮＡ３（５’ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ（ＣＨ２）１６ＳＨ−３’）をスポットした。３個の電極にはＤＮＡ４（５’−ＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴ（ＣＨ２）１６ＳＨ−３’）をスポットした。析出溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで、液滴をミリＱ水浴中ですすぎ取除く。基板をアセトニトリル中Ｍ４４の４５℃浴に浸漬する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒、次いでミリＱ水浴に３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下に乾燥し、窒素ガスを吹き込んだ箔内張りバッグに使用時まで保存する。
【０５２７】
ハイブリダイゼーションおよび測定
修飾した基板を箔内張りバッグから取出し、射出成形サンプル・チャンバー（カートリッジ）を取付けた。チャンバーは両面粘着テープで基板に接着したが、その総容量は２５０マイクロリットルであった。ハイブリダイゼーション溶液を調製した。この溶液は１０ｎＭのＤＮＡ標的（５’−ＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴ−３’）（Ｄ−９９８）、３０ｎＭシグナル・プローブ（Ｄ−１０５５）および１０ｎｍ ５’−ＴＣＴＡＣＡＧ（Ｎ６）Ｃ（Ｎ６）ＡＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（Ｎ６はＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５の図１Ｄに示されている；ヌクレオシドのリボース２’酸素に４炭素鎖により連結したフェロセンを含む）を含む。
【０５２８】
シグナリング・プローブは以下のとおりである：
【化４４】
0003548159.tif 000047
Ｎ８７はリング構造を含む分枝点である。Ｃ２３はＰＣＴ ＵＳ９９／０１７０５の図１Ｆに示されている。２５％キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）溶解バッファーＡＬ、４５５ｍＭ−ＮａＣｌＯ４、１９５ｍＭ−ＮａＣｌ、１．０ｍＭメルカプトヘキサノールおよび１０％仔ウシ血清を含む溶液中、２５０マイクロリットルの混成溶液をカートリッジに注入し、１２時間ハイブリダイズさせた。１２時間後、ハイブリダイズしたチップは切換え回路構成をもつ自家製相互コンダクタンス増幅器に挿し込んだ。相互コンダクタンス増幅器はコンピューターＤＡＱからの直流ランプおよびロックイン増幅器（ＳＲ８３０ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からの交流正弦波を組合わせる加算回路構成を備えていた。各電極は連続的に走査し、データをセーブし、ラブビュー（Ｌａｂｖｉｅｗ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い設計した自家製プログラムにより操作した。チップは直流−１００ｍＶと５００ｍＶ（疑似Ａｇ／Ａｇ／Ｃｌ参照電極）間で、２５ｍＶ（５０ｍＶピーク対ピーク）、１０００Ｈｚ重畳正弦波により走査した。出力電流はロックイン増幅器に供給し、１０００Ｈｚシグナルを記録した（ＤＣＶ技法）。パッド各セットのデータを蓄積し、平均した。
【０５２９】
【表１】
0003548159.tif 000048
結果を図１４に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】２組の電極セット、電気泳動セットおよび検出セットの代表的な形状を描出する。
【図１Ｂ】２組の電極セット、電気泳動セットおよび検出セットの代表的な形状を描出する。
【図１Ｃ】図１Ａの側面図を表す。
【図１Ｄ】個々の電気泳動電極の使用を描出する。
【図１Ｅ】図１Ｄの側面図である。
【図１Ｆ】サンプルが１つの検出電極から他の電極に順次移動する構図を示す。
【図２】サンプルの空間的標的化ならびに結合速度を上げる「混合」用に多次元配列した電気泳動電極の使用を描出する。
【図３Ａ】標的核酸配列を電極に結合させる好ましい実施態様を示す。
【図３Ｂ】標的核酸配列を電極に結合させる好ましい実施態様を示す。
【図３Ｃ】標的核酸配列を電極に結合させる好ましい実施態様を示す。
【図４Ａ】可能なメカニズム−１のシステムを描出する。
【図４Ｂ】可能なメカニズム−１のシステムを描出する。
【図４Ｃ】可能なメカニズム−１のシステムを描出する。
【図４Ｄ】可能なメカニズム−１のシステムを描出する。
【図５Ａ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｂ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｃ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｄ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｅ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｆ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｇ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図５Ｈ】核酸メカニズム−２の態様を示す。
【図６Ａ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｂ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｃ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｄ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｅ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｆ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｇ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図６Ｈ】可能な非核酸メカニズム−２の態様を描出する。
【図７Ａ】標識プローブとＥＴＭ付着の可能な構成を描出する。
【図７Ｂ】標識プローブとＥＴＭ付着の可能な構成を描出する。
【図７Ｃ】標識プローブとＥＴＭ付着の可能な構成を描出する。
【図７Ｄ】標識プローブとＥＴＭ付着の可能な構成を描出する。
【図７Ｅ】標識プローブとＥＴＭ付着の可能な構成を描出する。
【図８Ａ】技術上既知の「分枝」点ホスホラミダイトを用い、核酸に同時に多数のＥＴＭを付加する代替法を図示する。
【図８Ｂ】技術上既知の「分枝」点ホスホラミダイトを用い、核酸に同時に多数のＥＴＭを付加する代替法を図示する。
【図９Ａ】「分枝」点ヌクレオシドを用いて複数のＥＴＭを核酸に同時に取り込ませる合成について図示する。
【図９Ｂ】「分枝」点ヌクレオシドを用いて複数のＥＴＭを核酸に同時に取り込ませる合成について図示する。
【図９Ｃ】「分枝」点ヌクレオシドを用いて複数のＥＴＭを核酸に同時に取り込ませる合成について図示する。
【図１０】ＥＴＭポリマーの付加を可能とする「分枝」点の合成を描出する。
【図１１】予め形成されたＳＡＭに、一級アミンで機能化した核酸を付加させるために活性化カルボン酸エステルを使用した図である。
【図１２】代表的なヘアピン構造を描出する。
【図１３Ａ】本発明のある実施態様を描出する。
【図１３Ｂ】本発明のある実施態様を描出する。
【図１３Ｃ】本発明のある実施態様を描出する。
【図１３Ｄ】本発明のある実施態様を描出する。
【図１４】実験例の結果を描出する。
【図１５Ａ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｂ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｃ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｄ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｅ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｆ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１５Ｇ】２電極システムの可能な配置を描写している。
【図１６Ａ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１６Ｂ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１６Ｃ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１６Ｄ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１６Ｅ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１６Ｆ】図１５のシステムに似たシステムを描写する。
【図１Ａ】
0003548159.tif 000049
【図１Ｂ】
0003548159.tif 000050
【図１Ｃ】
0003548159.tif 000051
【図１Ｄ】
0003548159.tif 000052
【図１Ｅ】
0003548159.tif 000053
【図１Ｆ】
0003548159.tif 000054
【図２】
0003548159.tif 000055
【図３Ａ】
0003548159.tif 000056
【図３Ｂ】
0003548159.tif 000057
【図３Ｃ】
0003548159.tif 000058
【図４Ａ】
0003548159.tif 000059
【図４Ｂ】
0003548159.tif 000060
【図４Ｃ】
0003548159.tif 000061
【図４Ｄ】
0003548159.tif 000062
【図５Ａ】
0003548159.tif 000063
【図５Ｂ】
0003548159.tif 000064
【図５Ｃ】
0003548159.tif 000065
【図５Ｄ】
0003548159.tif 000066
【図５Ｅ】
0003548159.tif 000067
【図５Ｆ】
0003548159.tif 000068
【図５Ｇ】
0003548159.tif 000069
【図５Ｈ】
0003548159.tif 000070
【図６Ａ】
0003548159.tif 000071
【図６Ｂ】
0003548159.tif 000072
【図６Ｃ】
0003548159.tif 000073
【図６Ｄ】
0003548159.tif 000074
【図６Ｅ】
0003548159.tif 000075
【図６Ｆ】
0003548159.tif 000076
【図６Ｇ】
0003548159.tif 000077
【図６Ｈ】
0003548159.tif 000078
【図７Ａ】
0003548159.tif 000079
【図７Ｂ】
0003548159.tif 000080
【図７Ｃ】
0003548159.tif 000081
【図７Ｄ】
0003548159.tif 000082
【図７Ｅ】
0003548159.tif 000083
【図８Ａ】
0003548159.tif 000084
【図８Ｂ】
0003548159.tif 000085
【図９Ａ】
0003548159.tif 000086
【図９Ｂ】
0003548159.tif 000087
【図９Ｃ】
0003548159.tif 000088
【図１０】
0003548159.tif 000089
【図１１】
0003548159.tif 000090
【図１２】
0003548159.tif 000091
【図１３Ａ】
0003548159.tif 000092
【図１３Ｂ】
0003548159.tif 000093
【図１３Ｃ】
0003548159.tif 000094
【図１３Ｄ】
0003548159.tif 000095
【図１４】
0003548159.tif 000096
【図１５Ａ】
0003548159.tif 000097
【図１５Ｂ】
0003548159.tif 000098
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
0003548159.tif 000100
【図１５Ｅ】
0003548159.tif 000101
【図１５Ｆ】
0003548159.tif 000102
【図１５Ｇ】
0003548159.tif 000103
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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