(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（qad）を含んで成り、下記の構造：
【化１】
0003550144.tif 000002
を有するプラスミドpTW6135。
【請求項２】
キネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（qad）を含んで成り、下記の構造：
【化２】
0003550144.tif 000003
を有するプラスミドpTW8090A。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が大腸菌である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
大腸菌AB2848aroD/pKD136/pTW8090Aである、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のプラスミドから得られるキネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
キネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（qad）の調製方法において、請求項１に記載のプラスミドpTW6135又は請求項２に記載のプラスミドpTW8090Aから、キネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（qad）を得ることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明はグルコースのような炭素源の転換によるキノイド化合物、特にキナ酸（キナ酸塩）並びにその前駆体及び誘導体の生成に関する。工業的に重要な有機化合物であるヒドロキノン及びベンゾキノンはともに、キナ酸の二酸化マグネシウム（ＩＶ）酸化により誘導され得る（Ｗｏｓｋｒｅｎｓｅｎｓｋｙ，  Ａ．，  Ｊｕｓｔｕｓ  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，  １８３８，  ２７：２５７参照）。キナ酸は、その多くが生物学的に重要な種々の合成試薬の合成のための鏡像体的に純粋な出発物質として用いられる重要な分子である。
【０００２】
例えばキナ酸は、臓器移植拒絶反応を防止するのに有用な免疫抑制剤であるＦＫ−５０６の合成のための有用な出発物質である（Ｒａｏ，  Ａ．  Ｖ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ３２（４）：５４７−５０参照）。それは、別の方法では得るのが難しい多数の天然物質（例えばマイコスポリン及びＤ−ミオ−イノシトール−１，４，５−トリホスフェート。それぞれＷｈｉｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９８９，  １１１（２４）：８９７０−２及びＦａｌｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９，  ５４（２５）：５８５１−２参照）の合成に便利な供給源としても用いられる。さらにキナ酸は食品添加分解剤として用いられるし、光学物質中に実験的に用いられている。
【０００３】
キナ酸は従来天然供給源（例えばキナ皮、タバコの葉、ニンジンの葉等）から単離されてきた。しかしながらこのような供給源からキナ酸を単離するコストが高いために、出発物質としてそれを用いると経済的に成り立たない。さらにキナ酸は化学的にも合成されてきたが、しかしこのような合成には溶媒、高反応性試薬及び危険廃棄物を伴い、それ自体環境上望ましくない。それゆえ、キナ酸の合成のための費用に見合った効果のある環境的に望ましい方法が必要である。
したがって本発明の目的は、トウモロコシ、サトウダイコン、サトウキビ又はバイオマスのような再生可能な供給源から得られる炭素源を出発物質として用いるキナ酸の製造方法を提供することである。
【０００４】
発明の要約
本発明は、生体触媒的に３−デヒドロキネートに転換され得る炭素源、例えばグルコースを用いる、宿主細胞の一般芳香族経路（図１及び２に示すような）からのキナ酸並びにベンゾキノン及びヒドロキノンのような関連キノイド有機化合物の製造方法に関する。本発明に有用な宿主細胞は、炭素源を３−デヒドロキネートに転換し得るあらゆる微生物である。
【０００５】
本発明の１つの方法態様では、以下の：
ａ）デヒドロキネートを合成し得る宿主細胞を選択し；
ｂ）デヒドロキネートの異なる化合物への転換が防止されるがしかしデヒドロキネートのキナ酸への酵素反応は遮断されないように宿主細胞の経路における１つ又はそれ以上の酵素反応を遮断し；
ｃ）任意にデヒドロキネートをキナ酸に転換する能力を、このような能力が宿主細胞に存在しない場合には宿主細胞中に導入し；そして
ｄ）宿主細胞の経路中への炭素の流量を増大する
工程から成り、但し工程ｂ），ｃ）及びｄ）が任意の順序で又は同時に実施されるキノイド化合物（即ちキナ酸）の製造方法を記載する。
【０００６】
本発明の一態様においては、トランスケトラーゼをコードする遺伝子、ＤＡＨＰシンターゼのアイソザイムをコードする遺伝子及び３−デヒドロキネートシンターゼをコードする遺伝子を包含する組換え体ＤＮＡ  で宿主細胞を形質転換することにより経路中への炭素の流量が増大される。プラスミドｐＫＤ１３６は、酵素トランスケトラーゼ、ＤＡＨＰシンターゼのチロシン感受性アイソザイム及び３−デヒドロキネートシンターゼをそれぞれコードする遺伝子ｔｋｔ，  ａｒｏＦ  及びａｒｏＢを保持する。プラスミドｐＫＤ１３６の構築及び大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉによるｐＫＤ１３６の発現はこれまでに記載されている（Ｄｒａｔｈｓ，  Ｋ．  Ｍ．；  Ｆｒｏｓｔ，  Ｊ．  Ｗ．；  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．；  １９９０；  １１２：９６３０参照。この記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）。
【０００７】
さらに本発明は、宿主細胞の一般芳香族経路（図１に示すような）における１つ又はそれ以上の酵素反応を遮断し、したがって経路中のデヒドロキネートの他の化合物への転換を妨げるが但しデヒドロキネートのキナ酸への転換は遮断しない（図２に示すように）ことを包含する。このような遮断作用は、デヒドロキネートデヒドラターゼをコードする遺伝子座（ａｒｏＤ）の（全部又は一部の）突然変異又は欠失により実行される。欠失又は突然変異によるこのような遮断作用は、経路中に最初に向けられる炭素流量のほとんど又はすべてが確実にキナ酸の合成に向けられるようにする。
【０００８】
さらに本発明は、デヒドロキネートをキナ酸に転換することを包含する。宿主細胞はデヒドロキネートをキナ酸に転換する内生的能力を有する（例えば宿主細胞はキネートデヒドロゲナーゼをコードする内生的遺伝子を有する）。あるいはこの能力はキネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例えばｑａｄ  遺伝子）を包含する組換え体ＤＮＡ  により宿主細胞の形質転換の結果であるかもしれない。宿主細胞がこの転換を実行する能力を欠く本発明の一態様は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  から単離されたｑａｄ  遺伝子で宿主細胞を形質転換することを包含する。
本発明の好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌株、特に大腸菌ＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐＴＷ８０９０Ａ株（ＡＴＣＣ  ＃６９０８６）  である。
【０００９】
本発明の詳しい説明
グルコースから出発する一般芳香族経路は、種々の芳香族化合物の生成（例えばグルコースから出発して、経路中で中間生成物又は前駆化合物を生じて最後にはコリスメートに至る経路を描いた図１参照）のための種々の微生物に関して公知である。このような経路に包含される酵素としては、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＦ）、ＤＨＱ  シンターゼ（ａｒｏＢ）、ＤＨＱ  デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、シキメートデヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥ）、シキメートキナーゼ（ａｒｏＬ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ａｒｏＡ）及びコリスメートシンターゼ（ａｒｏＣ）が挙げられる。この経路中にグルコース等価物を送り込むために及び／又はこの経路が進行してそれによりデヒドロキネート（ＤＨＱ）  が蓄積されるのを遮断するために宿主細胞は導入され得ることが判っている。
【００１０】
この発散経路又は一般芳香族経路酵素機能の導入を遂行又は制御し得るタンパク質をコードする遺伝子の発現増強は、宿主細胞中に伝達可能な遺伝体により仲介される。遺伝体としては、本明細書中に明記のように経路酵素機能を遂行又は制御し得る物質、例えばタンパク質、アポタンパク質又はアンチセンスＲＮＡ  に対する発現性コード配列を有する核酸（一般にＤＮＡ  又はＲＮＡ）が挙げられる。発現タンパク質は酵素として機能し、酵素活性を抑制又は脱抑制し、あるいは酵素の発現を制御し得る。
【００１１】
これらの発現性配列をコードする核酸は染色体性（例えば相同性組換えにより宿主細胞染色体中に組み込まれる）又は染色体外性（例えばプラスミド、コスミド等により保持される）であり得る。さらに遺伝体は、タンパク質、アポタンパク質又はアンチセンスＲＮＡ  に対するコード配列の発現又は脱抑制を制御するよう作用するプロモーター、リプレッサー及びエンハンサーを含む任意の発現制御配列を包含すると定義される。例えばこのような制御配列は宿主細胞ゲノム中にすでにコードされた選択酵素の過剰発現をプロモートするために野生型宿主細胞中に挿入され得るか、あるいは染色体外でコードされる酵素の合成を制御するために用いられる。
【００１２】
本発明の遺伝体は、宿主細胞中への遺伝体の転位を仲介するプラスミド、コスミド、ファージ、酵母菌人工染色体又は他のベクターにより宿主細胞中に導入され得る。これらのベクターはベクター及びベクターに保持される遺伝体の複製を制御するシス作用制御体とともに複製のオリジンを含み得る。選択性マーカーはベクター上に存在して遺伝体が導入されている宿主細胞の同定の助けとなる。例えば選択性マーカーは、特定の抗生物質、例えばテトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【００１３】
宿主細胞中に遺伝体を導入するための好ましい手段は、本発明に従って遺伝体が挿入される染色体外性多複写プラスミドベクターを用いる。宿主細胞中への遺伝体のプラスミド保持導入は、本発明に従って、制限酵素によるプラスミドの初期開裂とその後のプラスミド及び遺伝体の結紮とを伴う。結紮組換え体プラスミドの再環化に際しては、プラスミド転移のための形質導入又は他のメカニズムを用いてプラスミドを宿主細胞中に転移させる。宿主細胞中への遺伝体の挿入に適したプラスミドとしてはｐＫＤ１３６，  ｐ４５，  ｐ１３５，  ｐＴＷ６１３５，  ｐＴＷ６２６４Ａ，  ｐＫＫ２２３−３及びｐＴＷ８０９０Ａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明に用いるのに適した宿主細胞は、所望の芳香族化合物の工業的生合成生産に用い得る属の成員である。したがって、宿主細胞炭素源を３−デヒドロキネートに転換し得る微生物を含み得る。好ましい宿主細胞は大腸菌である。
コリスメート経路から発する経路から得られるキナ酸及び他の代謝物質の工業的製造のために、代謝生合成経路中の１つ又はそれ以上の酵素のフィードバック阻害を欠く上記の属の脱調節突然変異体株を用いてもよい。
【００１５】
本発明の好ましい態様においては、キナ酸は大腸菌により合成される。大腸菌によるこの合成を図２で説明するが、この場合経路はａｒｏＤ酵素活性（図２のｃ）を除去し、ｑａｄ  遺伝子（図２のｄ）を宿主細胞中に導入してデヒドロキネート（ＤＨＱ）  をキナ酸に転換することにより遮断される。この経路のこの変更は、芳香族アミノ酸及び関連二次代謝物質の生体触媒的合成の設計において考慮すべき重要な変数を構成する。特に変更経路はグルコースのような炭素源をキナ酸に転換するのに有用な経路であり、このキナ酸からは種々の薬剤、農薬、風味料及び重合阻害剤が工業的に得られる。
【００１６】
宿主細胞（大腸菌）における一般経路又は芳香族アミノ酸生合成に送られる炭素の流量を増大するための成功した試みに基づいて、大腸菌中へのキネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の導入はシキメート経路中間生成物デヒドロキネートからのキナ酸の生成が引き起こすと考えられた。
【００１７】
この期待は、キナ酸の方を選んで存在するキネートデヒドロゲナーゼにより触媒されるデヒドロキネート及びキネートデヒドロゲナーゼの相互交換の平衡  （Ｄａｖｉｓ，  Ｂ．  Ｄ．；  Ｇｉｌｖａｒｇ，  Ｃ．；  Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｓ．；  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．；  １９５５；  ２：３００）  に基づいていた。それは大腸菌に固有のものではないため、キネートデヒドロゲナーゼコードｑａｄ  遺伝子は別の株から単離された。肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  突然変異体株Ａ１７０−４０  を用いた。肺炎桿菌のようないくつかの細菌株はその唯一の炭素源としてキナ酸を用い得る。デヒドロキネート異化作用によって、これらの株はキネートデヒドロゲナーゼにより触媒される反応の前述の平衡を熱力学的に嫌われる方向に置き換える。
【００１８】
プラスミドｐＫＤ１３６は芳香族アミノ酸生合成経路に送られるグルコース等価物（炭素流量）の総数を有意に増大することが示されている。このプラスミドはトランスケトラーゼコードｔｋｔ  遺伝子  （Ｄｒａｔｈｓ，  Ｋ．  Ｍ．；  Ｆｒｏｓｔ，  Ｊ．  Ｗ．；  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．；  １９９０；  １１２：１６５７；  Ｄｒａｔｈｓ，  Ｋ．  Ｍ．；  Ｐｏｍｐｌｉａｎｏ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｃｏｎｌｅｙ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｆｒｏｓｔ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｂｅｒｒｙ，  Ａ．，  Ｄｉｓｈｒｏｗ，  Ｇ．，  Ｓｔａｖｅｒｓｋｙ，  Ｒ．，  Ｌｉｅｖｅｎｓｅ，  Ｊ．，未発表結果）  、チロシン感受性ＤＡＨＰアイソザイムコードａｒｏＦ遺伝子  （Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｍ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｅｄ．，  Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ：  Ｒｅａｄｉｎｇ，  １９８３，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７；  Ｐｉｔｔａｒｄ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ，  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｆ．  Ｃ．，  Ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  １９８７，  Ｖｏｌ．１，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４；  Ｃｏｂｅｔｔ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｐｉｔｔａｒｄ，  Ｊ．，  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ，  １９８４，  １５７：３０３；  Ｇａｒｎｅｒ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８５，  ２６０：３８２０；  Ｃｏｂｂｅｔｔ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｄｅｌｈｒｉｄｇｅ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８７，  １６９：２５００；Ｏｇｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｇａｒｎｅｒ，  Ｃ．，  Ｍａｒｋｌｅｙ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  １９８２，  ７９：５８２８；  Ｗｅａｖｅｒ，  Ｌ．  Ｍ．，  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９０，  １７２：６５８１）、及びデヒドロキネート（ＤＨＱ）  シンターゼコードａｒｏＢ遺伝子（Ｄｒａｔｈｓ，  Ｋ．  Ｍ．；  Ｆｒｏｓｔ，  Ｊ．  Ｗ．；  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ；  １９９０；  １１２：９６３０）を包含する。これらの酵素は芳香族アミノ酸生合成のための一般経路（図１）における形質転換を触媒する。
【００１９】
上記の工程により製造されたキナ酸はベンゾキノンのような他の誘導体に、そして次にヒドロキノンに転換し得る。ベンゾキノンへの転換は、適切な条件下でキナ酸を二酸化マンガン及び硫酸のような適切な酸と反応させることにより達成できる。ベンゾキノンは、当業者に公知の標準方法によりヒドロキノンに転換し得る。
【００２０】
実験的所見：
大腸菌ＡＢ２８４８ａｒｏＤ、即ちａｒｏＤ株はいかなるデヒドロキネートデヒドラターゼ活性をも示さない。芳香族アミノ酸経路へのそのグルコース送入増大及び代謝遮断を示すＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６株はデヒドロキネートを蓄積する。この構築物は、キネートデヒドロゲナーゼコードｑａｄ  遺伝子を含有するプラスミドｐＴＷ８０９０Ａで形質転換した場合、Ｄ−グルコース（８０ｍＭ）から最高濃度のキナ酸（２４ｍＭ）を蓄積した。
【００２１】
ｑａｄ  遺伝子の単離
図３、図４及び図５に示すように肺炎桿菌Ａ１７０−４０  株からのｑａｄ  遺伝子の単離を達成した。標準プロトコール（Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｂｅｒｍａｎ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｘ  １００，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １１７２４，  １９８４）  によりゲノムＤＮＡ  を単離後、部分ＢａｍＨＩ  で消化し、コスミドｐＬＡＦＲ３中にクローニングした  （Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｌｏｎｇ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｂｕｉｋｅｍａ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ａｎｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．，  Ｇｅｎｅ，  １９８２，  １８：２８９）  。その結果生じたコンカテマーをラムダファージ中にパッケージングし、その後大腸菌ＢＪ５０２  株に感染させると、キナ酸を補充した最少培地上で正常成長速度を再獲得した構築物を生じた。
【００２２】
突然変異体ＢＪ５０２  は野生型株のトランスケトラーゼ活性の８５％を欠いている。その結果生じるＤ−エリトロース４−リン酸利用可能性の制限により、芳香族が補充されない最少培地上での成長が遅くなる。グルコース上でのＢＪ５０２  の成長は、キナ酸をデヒドロキネートに転換し、次いで生合成的にＢＪ５０２  が必要とする芳香族アミノ酸に転換するキネートデヒドロゲナーゼの能力により加速される。この選択計画を用いてプラスミドｐ４５  を単離した。
【００２３】
ｐＴＷ８０９０Ａの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、発現ベクターｐＳＵ１８  に挿入することによりｐ４５  のサブクローニングを開始した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｅ．，  Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，  Ｂ．，  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ，  Ｆ．，  Ｇｅｎｅ，  １９８８，  ６８：１５９−６２；  Ｃｈａｎｇ，  Ａ．  Ｃ．  Ｙ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９７８，  １３４（３）：１１４１−５６）。ＡＢ２８４７ａｒｏＢを形質転換したのち成長／非成長選択して、プラスミドｐ１３５を得た。グルコース及びキナ酸上でのＡＢ２８４７ａｒｏＢ／ｐ１３５の成長は、ｑａｄ  遺伝子の存在及び発現を確証した。しかしＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐ１３５においてはデヒドロキネート又はキネートの蓄積は検出されなかった。これはｐ１３５もデヒドロキネートデヒドラターゼをコードする遺伝子（ａｒｏＤ）を保持することを示した。その結果、プラスミドｐ１３５を部分ＫｐｎＩ消化及び再環化によりサブクローニングしてｑａｄ＋  ａｒｏＤ−  であるプラスミドｐＴＷ６１３５  を得た。
【００２４】
その後ｐＴＷ６１３５  でＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６を形質転換し、富栄養培地で成長させて、細胞を採集し、これらの細胞を５６ｍＭグルコースを含有するＭ９最少培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｘ  １００，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １１７２４，  １９８９）  に再懸濁すると、デヒドロキネート（９．５ｍＭ）及びキナ酸（７．５ｍＭ）  が蓄積した。挿入物は約１１ｋｂで非常に大きかったため、さらにサブクローニングを完成させた。ｐＴＷ６１３５  を部分ＥｃｏＲＩ  消化し、次いで再環化して約８．１ｋｂ  を除去し、ｐＴＷ６２６４Ａを得た。
【００２５】
十分に多いクローニングＶを再確立するために、ｐＴＷ６２６４ＡをＥｃｏＲＩ  消化し、挿入物をｐＫＫ２２３−３中にクローニングした。その結果生じた  ｑａｄ＋  プラスミドｑａｄ−ｐＫＫ２２３−３を次にＥｃｏＲＩ  で消化し、挿入物をｐＳＵ１９  中にクローニングした。その結果生じたプラスミドをｐＴＷ８０９０Ａと名付けた。その後富栄養培地で成長させ、最少培地でインキュベーションして生じた構築物ＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐＴＷ８０９０Ａは今日までのところ最高レベルのキナ酸（２４ｍＭ）を蓄積した。培養上清中に最初に存在したＤ−グルコース（８０ｍＭ）はすべて消費され、デヒドロキネート生成は立証されなかった。
【００２６】
実施例１
ＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐＴＷ８０９０Ａを増殖させるために又はキナ酸を蓄積させるために用いられる溶液は、Ｍ９培地（１リットル当たり：Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ，ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ，ＮａＣｌ  ０．５ｇ及びＮＨ４Ｃｌ  １ｇ）及びＬＢ培地（１リットル当たり：Ｂａｃｔｏ  トリプトン  １０ｇ、Ｂａｃｔｏ  酵母菌抽出物５ｇ及びＮａＣｌ  １０ｇ）を含んでいた。アンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地１Ｌを加えたエーレンマイヤー  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ４Ｌに同一培地で増殖させたＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐＴＷ８０９０Ａの一夜培養を接種した（０．５容量％）。
【００２７】
細胞を攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１２時間培養した。細胞を採取し（１００００ｇ、１０分、４℃）、上清をデカントして、細胞ペレットをＭ９培地５０ｍＬ中に再懸濁した。細胞を再び採集し（１００００ｇ、１０分、４℃）、上清をデカントして、グルコース（８０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、チアミン（５０μｇ／ｍＬ）、アンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍＬ）を含有するＭ９培地１Ｌを加えたエーレンマイヤー  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ４Ｌ中に細胞を再懸濁した。
【００２８】
この蓄積培地を攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で７２時間培養した。７２時間目に培養上清を分光分析（１ＨＮＭＲ）  した結果、グルコースは存在せずそしてキナ酸（２４ｍＭ）が合成されていたことが示された。培養上清中に存在するキナ酸は、市販供給源から得られたキナ酸と分光分析（１ＨＮＭＲ）  的に同一であることが確かめられた。
【００２９】
実施例２
ＡＢ２８４８ａｒｏＤ／ｐＫＤ１３６／ｐＴＷ８０９０Ａ（０．５ｍＬ）  の保存培養を用いて、３Ｌフェルンバッハ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  フラスコ中の酵母菌抽出物培地（酵母菌抽出物１５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４２４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ９．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５．０  ｇ／Ｌ、アンピシリン  ０．１ｇ／Ｌ）５００ｍＬに接種した。細胞を攪拌（１５０ｒｐｍ）しながら３５℃で１２時間培養した。次にフェルンバッハ培養を、最少培地（グルコース  ５．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／Ｌ、クエン酸  ２．０ｇ／Ｌ、Ｈ２ＳＯ４  １．２ｇ／Ｌ、  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．０ｇ／Ｌ、クエン酸アンモニウム第二鉄  ０．３２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳＯ４  ０．０２  ｇ／Ｌ、  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．００４ｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２  ０．００４ｇ／Ｌ、  ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．００４ｇ／Ｌ、  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００６ｇ／Ｌ、  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３２ｇ／Ｌ、ＨＣｌ  ０．００３ｇ／Ｌ、アンピシリン  ０．１ｇ／Ｌ）５．５Ｌを含有する１４Ｌ攪拌曝気発酵器中に移した。
【００３０】
発酵物を１０Ｌ／ｍで曝気したる２８％塩化アンモニア水溶液を用いてｐＨを７．０  に制御した。温度は３５℃に保った。攪拌速度を変えることにより溶解酸素濃度を空気飽和状態の２０％に制御した。必要な場合には消泡剤を加えて発泡を防止した。初期量のグルコースが使い果たされたならば、濃縮グルコース溶液（７００ｇ／Ｌ）を０．３２ｍＬ／ｍで開始して供給した。グルコース供給速度を指数関数的に増大して次の１２時間には１．４４ｍＬ／ｍとし、その後１．４４ｍＬ／ｍで一定に保った。ブイヨン中のキナ酸濃度は発酵器中での培養２４時間後には１０．７ｇ／Ｌに達した。
【００３１】
実施例３
細胞除去（１００００ｇ、１０分、４℃）後、キナ酸（４．８ｇ，２５ｍｍｏｌ）を含有する粗製培養上清を濃硫酸（２５ｍＬ）及び工業銘柄二酸化マンガン（２００ｇ，２．４ｍｏｌ）  と一緒に還流冷却器、頭上攪拌機及び温度計を装備した３Ｌ丸底フラスコに加えた。フラスコ内容物の温度を１００℃に挙げて、この温度を１時間保持した。室温に冷却後、反応混合物を濾過して酢酸エチルで抽出した。ガスクロマトグラフィーによる分析に基づいて、収率４０％のベンゾキノンを得た。生成物ベンゾキノンは、１ＨＮＭＲ  及びガスクロマトグラフィー同時注入に基づく真正物質と同一であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、芳香族生合成の一般経路の略図である。
【図２】図２は、一般芳香族経路の生成物としてのキナ酸を示す略図である。
【図３】図３は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  からｑａｄ  遺伝子を単離してｐＴＷ８０９０Ａを生じる地図である。
【図４】図４は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  からｑａｄ  遺伝子を単離してｐＴＷ８０９０Ａを生じる地図である。
【図５】図５は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  からｑａｄ  遺伝子を単離してｐＴＷ８０９０Ａを生じる地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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