(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、体液中の糖値の降下剤：
（１）配列表の配列番号１に記載の２１番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載の３４番目のＩｌｅから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号２に記載の２０番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；および
（６）配列表の配列番号２に記載の３３番目のＩｌｅから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列。
【請求項２】
前記体液が、血液または尿である、請求項１に記載の糖値の降下剤。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列である、請求項１に記載の糖値の降下剤。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列である、請求項１に記載の糖値の降下剤。
【請求項５】
以下のアミノ酸配列群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とするβ細胞の増殖剤：
（１）配列表の配列番号１に記載の２１番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載の３４番目のＩｌｅから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号２に記載の２０番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；および
（６）配列表の配列番号２に記載の３３番目のＩｌｅから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列。
【請求項６】
前記β細胞がランゲルハンス島である、請求項５に記載のβ細胞の増殖剤。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列である、請求項５に記載のβ細胞の増殖剤。
【請求項８】
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列である、請求項５に記載のβ細胞の増殖剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ｒｅｇタンパク質を有効成分とする薬剤、さらに詳細には、体液中の  糖値の降下剤および細胞の増殖剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｒｅｇタンパク質は、ｒｅｇ遺伝子にコ−ドされるポリペプチドである。ｒｅｇ遺伝子  は、ラットの再生膵ランゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される遺伝子として見出され、このラットのｒｅｇ遺伝子に対応するヒトのｒｅｇ遺伝子も既に単離され、酵母における発現も報告されている（特開平１−１３２３８８、特開平１−１３７９９４、特開平２−２００７００）。
【０００３】
しかし、このｒｅｇタンパク質の正確な生理活性は未だ報告されておらず、その  利用法も確立されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ｒｅｇタンパク質の正確な生理活性はいまだ報告されていないが、膵臓以外の種  々の組織でのｒｅｇ遺伝子の発現が報告されており、ｒｅｇタンパク質の正確な生理活性の解明と医薬への応用が望まれている。本発明の目的とするところは、ｒｅｇタ  ンパク質の生理活性を明らかにし、その生理活性を利用した医薬を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ｒｅｇタンパク質の正確な生理活性の解明を試みた。まず、９０％膵切除ラットにｒｅｇタンパク質を投与したところ、ｒｅｇタンパク質を投与しなかった９０％膵切除ラットと比較して、有意な血糖値および尿糖値の減少を認めた。さらに  、このことから、ｒｅｇタンパク質のランゲルハンス島細胞増殖への関与を予想し  、インビトロで培養したランゲルハンス島をｒｅｇタンパク質の存在下で培養し、ｒｅｇタンパク質の非存在下で培養した細胞と比較して、有意な細胞の増殖の増加を認めた。このような事実から、発明者らは本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、以下のアミノ酸配列群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする、体液中の糖値の降下剤：
（１）配列表の配列番号１に記載の２１番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載の３４番目のＩｌｅから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号２に記載の２０番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；および
（６）配列表の配列番号２に記載の３３番目のＩｌｅから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列
を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、以下のアミノ酸配列群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする細胞の増殖剤：
（１）配列表の配列番号１に記載の２１番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の２３番目のＧｌｎから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号１に記載の３４番目のＩｌｅから１６６番目のＡｓｎまでのアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号２に記載の２０番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列；および
（６）配列表の配列番号２に記載の３３番目のＩｌｅから１６５番目のＡｌａまでのアミノ酸配列
を提供する。
【０００８】
「ｒｅｇタンパク質」とは、上記のアミノ酸配列群から選択されるいずれかのア  ミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【０００９】
上記アミノ酸配列のうち、（１）〜（３）はヒトｒｅｇタンパク質のアミノ酸配列であ  る。  ヒトｒｅｇタンパク質は、生体内で種々の分解を受けて、上記３種のアミノ酸配列を有するものが存在することが知られている。しかし、生体内での分解により、これら以外のアミノ酸配列を有するものが存在することがあるので、それらも本発明のｒｅｇタンパク質に包含される。
【００１０】
上記アミノ酸配列のうち、（４）〜（６）はラットｒｅｇタンパク質のアミノ酸配列で  ある。これはヒトｒｅｇタンパク質（１）〜（３）に対応するものであり、同じく本発明  に包含される。また、ラットｒｅｇタンパク質についても、生体内での分解により  、これら以外のアミノ酸配列を有するものが存在することがあるので、それらも本発明のｒｅｇタンパク質に包含される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様においては、（２）および（５）のアミノ酸配列が用いられる。
【００１２】
本明細書中、「体液」とは、血液、尿、眼房水など生体中の体液全てを意味し、血液または尿が代表的な例である。
【００１３】
本発明に用いるヒトｒｅｇタンパク質は、前記特開平１−１３７９９４に記載の方法によ  り製造することができる。ラットｒｅｇタンパク質は、この方法に従い、ヒトｒｅｇ遺伝子をラットｒｅｇ遺伝子に置き変えれば当業者は容易に製造することができる。
【００１４】
本発明のｒｅｇタンパク質を有効成分とする糖値降下剤は、注射剤として投与す  るのが好ましい。注射剤は、蒸留水、生理食塩水、酢酸水溶液、植物油、グリコ−ル類などにｒｅｇタンパク質を溶解または懸濁し、必要であれば、安定化剤、保  存剤、等張化剤、無痛化剤、緩衝剤などを加えて調製される。あるいは、安定化剤、保存剤、賦形剤などを加えて凍結乾燥品として、使用時に、蒸留水、生理食塩水、酢酸水溶液、プロピレングリコ−ルなどに溶解または懸濁すればよい。これを、非経口的に、好ましくは、皮下、筋肉内あるいは静脈内に投与すればよい。本発明のｒｅｇタンパク質の糖値降下作用は、例えば、９０％膵切除ラットに本  発明の糖値降下剤を投与して、血糖値あるいは尿糖値を測定することにより評価し得る。
【００１５】
後述の実施例１に示すように、ｒｅｇタンパク質を有効成分とする本発明の糖値  降下剤の投与により、尿糖値および血糖値が有意に減少する。
【００１６】
本発明の糖値降下剤の投与量は、健常成人のｒｅｇタンパク質の血中濃度が約１００ｎｇ／ｍｌと報告されているので、この値を維持する程度に投与すればよく、成人に  対しては１日あたりｒｅｇタンパク質として０．１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは、１ｍｇ〜５００ｍｇ投与すればよい。
【００１７】
本発明のｒｅｇタンパク質を有効成分とする細胞増殖剤は、インビトロおよびイ  ンビボの両方で用いられ得る。インビトロでの細胞の増殖に用いる場合は、ウシ胎児血清、グルコースなどを含む細胞の増殖培養液中に、ｒｅｇタンパク質を添加  する。ｒｅｇタンパク質は蒸留水、生理食塩水、酢酸水溶液、プロピレングリコー  ルなどに溶解あるいは懸濁して用いる。インビボで用いる場合は上記糖値降下剤と同様にして用いるのが好ましい。
【００１８】
増殖作用の評価は、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓ．  Ｐ．Ｊ．，Ｓｏｕｔｈｇａｇｅ，  Ｊ．Ｌ．，およびＢｏｎｅ，Ａ．Ｊ  （１９９２）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３５：２３８−２４２に記載のように単離したランゲルハンス島を  用いて増殖活性を測定することにより行なわれ得る。
【００１９】
後述の実施例２に示すように、ｒｅｇタンパク質を添加した培地中で培養した細  胞は、添加しなかった培地中で培養した時に比較して有意に増殖活性が高い。
【００２０】
本発明の細胞増殖剤は、０．１〜２０μｇ／ｍｌ培地の濃度で用いるのが好ましく、０．３〜１０μｇ／ｍｌ培地の濃度で用いるのが特に好ましい。
【００２１】
以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明を限定するものではない。
【００２２】
【実施例】
（実施例１）体液中の糖値の低下の測定
Ａ．ラットｒｅｇタンパク質を有効成分とする糖値降下剤の調製
ラットｒｅｇタンパク質は、前記特開平１−１３７９９４に記載の方法に従い、ヒトｒｅｇ遺伝子をラットｒｅｇ遺伝子に置き変えて発現させ、単離・精製した。このラットｒｅｇタンパク質は、配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ  酸配列を有する。精製したラットｒｅｇタンパク質を５０ｍＭ酢酸に０．９１ｍｇ／ｍｌに溶解し、投与用製剤とした。
【００２３】
Ｂ．９０％膵切除ラットの作成
９０％膵切除ラットは、特開平１−１３２３８８に記載の方法により作成した。すなわち  、Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットを、Ｆｏｇｌｉａ，  Ｖ．  Ｇ．の方法  （Ｒｅｖ．  Ｓｏｃ．  Ａｒｇｅｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２０，  ２１−３７，  １９４４）に従い、膵臓の９０％を切除した。
【００２４】
Ｃ．糖値降下剤の投与
上記９０％膵切除ラット各々に、１日１回、上記製剤０．１ｍｌ  （ｒｅｇタンパク質とし  て９１  μｇ）  を、９０％膵切除後２０日間連続して腹腔内に投与した。コントロ−ル群  として、９０％膵切除ラットに０．１ｍｌの５０ｍＭ酢酸を同様に投与した。ラットの飼育条件は、投与群、コントロ−ル群共に、以下のとおりである。
【００２５】
温度：２６±２℃、湿度：５５±５％、水：水道水、飼料：チャ−ルズリバ−ＣＲＦ１−１。
【００２６】
Ｄ．血糖値、尿糖値の測定
９０％膵切除後、２０日間上記製剤または５０ｍＭ酢酸をこのラットに投与し、２１日目  に体重、尿糖値、血糖値、尿量を測定した。尿糖値、血糖値はグルコ−ス・オ  キシダ−ゼ法で測定した。尿量は、９０％膵切除ラットを１匹ずつ代謝ゲ−ジに入  れ測定した。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
0003570557.tif 000002
【００２８】
表１から明らかなように、９０％膵切除後２１日目に、ｒｅｇ投与群では対照群と比較して、体重では有意差は認められず、尿糖値（Ｐ＜０．０１）および血糖値（Ｐ＜０．０５）で有意な減少が認められた。
【００２９】
（実施例２）ラット単離ランゲルハンス島初代培養系を用いた増殖活性の測定
Ａ．ラットｒｅｇタンパク質を有効成分とする細胞増殖剤の調製
ラットｒｅｇタンパク質は、前記特開平１−１３７９９４に記載の方法に従い、ヒトｒｅｇ遺伝子をラットｒｅｇ遺伝子に置き変えて発現させ、単離・精製した。このラットｒｅｇタンパク質は、配列番号２に記載の２２番目のＧｌｎから１６５番目のＡｌａまでのアミノ  酸配列を有する。精製したラットｒｅｇタンパク質を５０ｍＭ酢酸に０．９１ｍｇ／ｍｌに溶解し、細胞増殖剤とした。
【００３０】
Ｂ．ランゲルハンス島の単離および培養
ウィスター系雄ラット（体重２５０ー３５０ｇ）からランゲルハンス島を単離し、１０％のＦＣＳおよび１１．１ｍＭのグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩培養した。培養後  、実体顕微鏡下でピックアップし、外分泌細胞や状態の悪いランゲルハンス島を除き、１０％のＦＣＳおよび１１．１ｍＭのグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、さらにも  う一晩培養した。
【００３１】
Ｃ．細胞増殖剤を添加した培地中での培養
２％のＦＳＣおよび２．７ｍＭのグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地に、Ａで調製した細胞増殖剤を種々の濃度で添加した培地と、対照としてｒｅｇタンパク質無添加の培地を  調製し、これをテスト用培地とした。
【００３２】
２４ウェルの培養皿の各ウェルに上記Ｂ項で培養した、培地中のランゲルハンス  島を５０個ずつ分配した。
【００３３】
直ちにこの培地をテスト用培地に交換し（１ｍｌ／ウェル）、４８時間培養した。
【００３４】
Ｄ．トリチウム・チミジンの添加
テスト用培地を新しいテスト用培地に交換し、さらにトリチウム・チミジンを加え（１０μＣｉ／ｍｌ）、２４時間培養した。
【００３５】
Ｅ．ランゲルハンス島の回収および破砕
ランゲルハンス島を回収し、ハンクス液で洗浄した後、５ｍＭ  ＥＤＴＡを３５０ｍｌ含有  する１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）で超音波破砕した。これを定量時まで凍  結保存した。
【００３６】
Ｆ．トリチウム・チミジン取り込みの定量
上記Ｅ項で得られた超音波破砕物にトリクロロ酢酸を加えて沈澱させ、不溶画  分に取り込まれたトリチウムのカウントをフィルター法で測定した。その結果を図１および図２に示す。
【００３７】
図１および図２から明らかなように、細胞増殖剤を添加した培養液で培養した群は、対照群と比較してチミジンの取り込み量が多く増殖活性が高い。さらに増殖活性は、用いたｒｅｇタンパク質濃度に依存することがわかる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により提供される、ラットまたはヒトｒｅｇタンパク質を有効成分とする  薬剤は、細胞の増殖に関与し、インスリン産生膵β細胞の再生を可能にする。このことにより、従来のインスリン投与という対症療法にかわり、糖尿病患者自身の膵β細胞の再生賦活という原因療法が可能になる。
【００３９】
さらに本発明のラットまたはヒトｒｅｇタンパク質を有効成分とする薬剤を投与  することによって、体液中の糖値を降下させ得る。
【００４０】
【配列表】
【００４１】
【配列番号：１】
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【００４２】
【配列番号：２】
0003570557.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】種々のｒｅｇタンパク質濃度におけるチミジン取り込みの計数を示す。
【図２】種々のｒｅｇタンパク質濃度における細胞の増殖率を濃度  ０μｇ／ｍｌの増殖率を基  準にして表す。
【図１】
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【図２】
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