(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ‐カゼイングリコマクロペプチド及び／又はκ‐カゼイングリコマクロペプチドの酵素分解物を有効成分とするカルシウム吸収促進剤。
【請求項２】
κ‐カゼイングリコマクロペプチド及び／又はκ‐カゼイングリコマクロペプチドの酵素分解物をカルシウム比（前記化合物／飲食品中のカルシウム（重量／重量））が0.1以上となるように配合することを特徴とするカルシウム吸収促進作用を有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なカルシウム吸収促進剤及びカルシウム吸収促進作用を有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い骨粗鬆症、骨折、腰痛などの各種骨疾患患者が増加している。これらの疾患は、カルシウムの摂取不足、カルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンのアンバランスなどが原因となり体内での骨形成と骨吸収のバランスが保たれないことに起因している。高齢化に伴う骨粗鬆症や骨折などの各種骨疾患を予防するためには、骨量をできるだけ増加させて最大骨量（個人の一生の中で到達する骨量の最大値）を高めて骨強化を図ることが有効であるとされている。
このような現状の中で、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム等のカルシウム塩や乳清カルシウム、牛骨粉、卵殻等の天然カルシウム剤を飲食品に添加して骨強化を図る試みもなされている。しかしながら、カルシウムは体内において腸管内で吸収されるが、前述のカルシウム塩やカルシウム剤の腸管内の吸収率は５０％以下であり、半分以上が吸収されずに体外に排出されてしまうという報告もある（上西ら、第５０回、日本栄養・食糧学会大会要旨集、Ｐ２２６（１９９６））。
【０００３】
従って、骨強化を目的としてカルシウムを摂取する場合、カルシウムの摂取量を増加させることのみならず、腸管内でのカルシウム吸収率を高めることが必要となる。腸管内でカルシウムの吸収性を高めることができる素材としては、カゼインホスホペプチド（以下、ＣＰＰと略す）が知られている。ＣＰＰは、カゼインにトリプシンを作用させ、加水分解した分解物中に得られるホスホペプチドで、親水性の高いアミノ酸やホスホセリンを多く含んでいるため、カルシウムと結合して可溶性複合体を形成する。このため、水溶液中でカルシウムが沈殿するのを抑制し、カルシウムを可溶化し、カルシウムの吸収率を高めると考えられている。実際ＣＰＰが腸管内においてもカルシウムを可溶化し、吸収性を高める作用があるという報告もされている（内藤、日本栄養食糧学会誌，  ３９，  ４３３  （１９８６））。このようなＣＰＰのカルシウム吸収促進作用を利用して、ＣＰＰを飲食品に配合させることも行われているが、ＣＰＰは、カゼインの酵素分解物であるため、原料であるカゼインを酵素反応させる必要があり、また酵素分解の際に副生するペプチドが苦味を呈するため、飲食品へ混合する場合にはこの苦味ペプチドを十分に分離する必要があるなど幾つかの問題点を有している。
ポリグルタミン酸も腸管内でカルシウムの吸収率を高める作用（Ｋ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５８，  １６６２−１６６５  （１９９４））が知られているが、これは合成品であり食品添加物として認可されていないので通常飲食品に添加することはできない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の状況に鑑み、カルシウムの吸収性を促進する物質について鋭意研究した結果、チーズ製造時に副生するホエー蛋白質含有溶液を原料として得られるκ−カゼイングリコマクロペプチドあるいはその酵素分解物が腸管内でカルシウムの吸収を促進する効果のあることを確認し、本発明を完成するに至った。従って、本発明は、新規なカルシウム吸収促進剤あるいはこのような作用を有する飲食品を提供することを課題とする。さらに具体的には、本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチド及び／又はκ−カゼイングリコマクロペプチドの酵素分解物を有効成分とするカルシウム吸収促進剤、及びそれらの化合物を配合したカルシウム吸収促進作用を有する飲食品を提供することを課題とする。
【０００５】
【発明を解決するための手段】
本発明のカルシウム吸収促進剤の有効成分として用いるκ−カゼイングリコマクロペプチドは、チーズ製造の副産物であるホエー中に遊離してくることは従来から知られている。また、κ−カゼイングリコマクロペプチドは従来、肥満防止用食品素材として利用されたり、大腸菌の腸管細胞への付着阻止やインフルエンザウィルスの感染を防止する効果や抗歯石効果のあることも確認されている。しかしながら、κ−カゼイングリコマクロペプチドが腸管内でカルシウムの吸収を促進させる効果に関しては未だ知られておらず、本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチドのこのような新規な用途を見出したものである。また、κ−カゼイングリコマクロペプチドを酵素分解したところ同様の効果があることを見出し、同様の用途に供することを見出したものである。
すなわち、本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチド又はその酵素分解物を有効成分とするカルシウム吸収促進剤に関する。また本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチド又はその酵素分解物を含有せしめたカルシウム吸収促進作用を有する飲食品に関する。
本発明においては、κ−カゼイングリコマクロペプチドとその酵素分解物とはそれぞれ単独で用いてもあるいは両者を併用してもよい。
本発明では、特にκ−カゼイングリコマクロペプチド及び／又はκ−カゼイングリコマクロペプチドの酵素分解物をカルシウム比（これらの化合物／飲食品中のカルシウム（重量／重量））が  ０．１以上となるように飲食品中に配合するとカルシウム吸収をさらに促進することができる。
【０００６】
κ−カゼイングリコマクロペプチド（以下、ＧＭＰと略す）は糖ペプチドの一種で、牛乳蛋白質の８０〜８５％を占めるカゼインのうちで唯一の糖蛋白質であるκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、κ−カゼインの１０６−１６９  残基に相当し、分子量は約７０００である。また、ＧＭＰはグルタミン酸残基を多くもつ他、糖鎖中にシアル酸残基を持つなどカルボキシル基に富んでいる。このため、ＧＭＰとカルシウムが共存すると、分子中のＧＭＰに隣接するカルボキシル基同士でカルシウムをキレート結合し、カルシウムが不溶性の塩を形成して沈殿するのを防止し、カルシウムを可溶化させる。
従って、ＧＭＰを経口摂取すると、前記したＧＭＰのカルシウム可溶化作用が腸管内で起こり、腸管内におけるカルシウムの吸収が促進される。
一般に、ガストリン、セクレチン、コレシストキニンなど消化管に受容体を持つ生理活性ペプチドの場合、経口摂取すると受容体に到達する前に消化酵素により分解されるため機能を失うことが問題となるが、ＧＭＰのカルシウム可溶化力はＧＭＰ分子中に数多く存在するカルボキシル基に依存するため消化酵素によって機能を喪失することはない。また、ＧＭＰの酵素分解物についても同様に消化酵素による影響は受けない。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明においてＧＭＰは公知の方法で分離したものを使用することができる。例えば、レンネットカゼインカードを調製する際に得られる排液（ホエー）を原料として用い該排液のｐＨを酸性領域に調整し、生成する沈殿を除去し、次いで得られる上澄みを脱塩処理する（特開昭６３−２８４１９９号公報）ことにより、またチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１００００  〜５００００  の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過液をｐＨ４以上に調整した後、分画分子量５００００  以下の膜を用いて脱塩し濃縮する（特開平２−２７６５４２号公報）ことにより、またホエー蛋白質含有溶液を原料として加熱、凍結及び解凍の操作を行う（特開平３−２９４２９９号公報）ことにより、またＧＭＰを含有する乳質原料物質を脱塩し、電気伝導度４ｍＳ／ｃｍ  以下のものを得て、これのｐＨを４未満に調整し、分画分子量  １００００〜５００００  の膜を用いて濃縮する（特開平６−１８００号公報）ことによりＧＭＰを分離することができる。上記方法により分離されるＧＭＰは、いずれも８０％以上の高純度のものとなる。しかも無味無臭であり、溶解性が良好で、耐熱性も具えている。
【０００８】
本発明では、このようにして得られたＧＭＰを糖衣錠やタブレットもしくはカプセルなど経口カルシウム吸収促進剤として用いることができる。またこれらを各種飲食品例えば、清涼飲料水、果汁飲料、発酵飲料等の飲料、ゼリー、アイスクリーム、クッキー、キャンディー等の菓子、パン、その他の飲食品にも配合してこれらの飲食品にカルシウム吸収促進作用を付与することができる。また、ＧＭＰをカルシウムを含有する食品、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品に配合するか、カルシウムを含有しない食品の場合には、ＧＭＰと共にカルシウムを配合することで、カルシウムの吸収促進効果を一層促進することができる。いずれの場合も配合比率はＧＭＰ／カルシウム（重量／重量）で  ０．１以上とすることが好ましい。ＧＭＰ／カルシウム（重量／重量）の比率が  ０．１以下では全カルシウムに対するＧＭＰ分子中のカルボキシル基の量が不足するために、ＧＭＰがカルシウムを完全に可溶化できない可能性があるため好ましくない。ＧＭＰ／カルシウム（重量／重量）の比率を０．１  以上にすることでＧＭＰによるカルシウムの可溶化率が良好になる  （試験例１及び試験例２）。本発明において、ＧＭＰのカルシウムの可溶化率はＧＭＰによるリン酸カルシウム形成阻止効果を調べることにより確認することができる。さらに、ＧＭＰ／カルシウム（重量／重量）の比率を０．１  以上にすることによりカルシウムの吸収が、統計的にも有意に促進される（試験例３）。
【０００９】
また、ＧＭＰの酵素分解物は、前記公報に記載された方法により分離されたＧＭＰを酵素により加水分解したものである。ここで使用可能な酵素は、蛋白質分解酵素としてペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン等、糖鎖を分解する酵素としてグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ等を挙げることができる。また、酵素処理方法や、酵素／基質については特に限定はない。例えば、ＧＭＰにペプシンあるいはシアリダーゼを加え、これらの酵素の作用温度で１０分〜２時間反応させてＧＭＰを酵素分解し、分子量７０００〜２００  程度の低分子ペプチドとしたものが用いられる。このＧＭＰの酵素分解物に関してもＧＭＰ同様に経口カルシウム吸収促進剤として、あるいはカルシウムを含有する飲食品又はカルシウムを含有しない飲食品にはカルシウムを共に配合し、ＧＭＰの酵素分解物／カルシウム（重量／重量）の比率を０．１  以上とすることで、腸管内でのカルシウム吸収を促進させることができる。また、ＧＭＰとＧＭＰの酵素分解物の両者を同時に配合することもできる。
なお、ＧＭＰ及びＧＭＰの酵素分解物は乳由来の物質であるため、経口的に摂取する場合には人体に及ぼす悪影響は何らみられず、その摂取量については特に制限はないが、腸管内でのカルシウム吸収促進効果を発揮するには、１１ｍｇ／ｋｇ／日以上が適当であり、望ましくは１８〜２５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００１０】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
ＧＭＰの調製
ホエー蛋白質濃縮物（サンラクトＮ−２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌ  に溶解し、濃塩酸により、ｐＨ３．５  に調整した。これを、分画分子量２０，０００の限外濾過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）用い、５０℃、圧力０．４  ＭＰａ、平均透過液流束５２．４Ｌ／ｍ２・ｈ  にて限外濾過を行った。透過液量が４０Ｌ  に達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌ  を加え、連続して限外濾過を行った。以上の様にして連続運転を行い、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０  とし、再度同じ条件、同じ限外濾過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外濾過を行い、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌ  に保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外濾過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌ  に達した時点で、濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外濾過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇ  を得た。このものをウレア−ＳＤＳ電気泳動法により分析した結果、純度は８２％であった。（ウレア−ＳＤＳ電気泳動法では、まずサンプルを電気泳動し、これをクマシーブルー染色し、得られた染色ゲルをデンシトメータ（ＧＥＬＭＡＮＡＣＤ−１２）にかけ、そのピーク面積からサンプル中のＧＭＰ純度を決定した。）
【００１１】
【実施例２】
ＧＭＰの酵素分解物の調製
（１）ＧＭＰのペプシン分解物の調製
実施例１で得られたＧＭＰを用い、０．１  ％ＧＭＰ溶液  １００μｌ  を調製した。これを０．１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に調整し、ブタ由来ペプシン（シグマ製）１ｍｇを加えた（酵素／基質比＝１／１００  ）。この溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、１００  ℃、５分間加熱して酵素反応を停止させた。反応液をマイクロフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ  ）に通して、沈殿物を除去し、この透過液を凍結乾燥してＧＭＰのペプシン分解物を得た。
【００１２】
（２）ＧＭＰのシアリダーゼ分解物の調製
実施例１で得られたＧＭＰ  １００ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）  １００ｍｌに溶解し、シアリダーゼ（シグマ製）  ５ｍｇ  を加えた（酵素／基質比＝１／２０）。この溶液を３０℃で３０分間インキュベートした後、１００  ℃、５分間加熱して酵素反応を停止させた。反応液をマイクロフィルター（ポアサイズ  ０．４５μｍ）に通して、沈殿物を除き、この透析内液を透析膜（スペクトラポア、分画分子量３５００、スペクトラム製）を用いて４℃以下で３日間透析し脱塩した。透析内液を凍結乾燥してＧＭＰのシアリダーゼ分解物を得た。
【００１３】
【試験例１】
リン酸カルシウム形成阻止効果
本試験においては、ＧＭＰ及びＧＭＰの酵素分解物によるリン酸カルシウム形成阻止効果を確認し、これをカルシウム可溶化率の指標とした。５ｍＭ  塩化カルシウム溶液１００ｍｌ  に表１に示す濃度で実施例１及び２で得られた試料を溶解し、この溶液と２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を等量混合した。また、比較のため５ｍＭ  塩化カルシウム溶液  １００ｍｌと２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を等量混合したものをコントロールとして用いた。溶液の最終濃度はカルシウム２．５ｍＭ  （１００μｇ／ｍｌ）、リン酸１０ｍＭとなった。これらの溶液を３７℃で２時間放置後、１０４Ｇで１０分間遠心分離し、上清と沈殿を分離し、上清中のカルシウム濃度をＩＣＰ発光分析装置（ＳＴ−３０００  、Ｌｅｅｍａｎ  Ｌａｂｓ  製）で分析し、以下に示す式でカルシウム可溶化率を算出した。カルシウム可溶化率  （％）  ＝（上清中のカルシウム濃度  （μｇ／ｍｌ））／１００×１００  結果を表１に示した。ＧＭＰ及びその酵素分解物は、いずれもカルシウムとの比率が  ０．１以上の場合、溶液中の全カルシウムを可溶化することができた。
【００１４】
【表１】
0003575724.tif 000002
【００１５】
【試験例２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  消化におけるリン酸カルシウム形成阻止効果
本試験においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化におけるＧＭＰによるリン酸カルシウム形成阻止効果を確認し、これをカルシウム可溶化率の指標とした。水５０ｍｌに目的量の実施例１で得られたＧＭＰとリン酸カルシウム２００ｍｇ  を溶解し、この溶液にＮａＣｌ  ２０  ％を含む０．９６Ｎ  ＨＣｌ  ５ｍｌ  を加え、さらにＮａＯＨでｐＨを  １．７とし、胃の中の状態を模擬的に作り出した。この溶液にブタ由来ペプシン（２３４５  Ｕ／ｍｇ  、シグマ製）８ｍｇ／ｍｌ  を１ｍｌ加え、３７℃で目的時間反応させた。その後、ＮａＯＨで溶液のｐＨを８に調整し、十二指腸の状態とした。ブタ由来のパンクレアチン（３６  Ｕ／ｍｇ  、和光純薬製）  ６６０ｍｇ／ｍｌを１ｍｌ加え、３７℃で目的時間反応させた。反応終了後、反応溶液をそのまま１０４Ｇで２０分間遠心分離し、上清と沈殿を分離し、上清中のカルシウム濃度をＩＣＰ発光分析装置（ＳＴ−３０００、Ｌｅｅｍａｎ  Ｌａｂｓ  製）で分析し、試験例１と同様にしてカルシウム可溶化率（％）を算出した。また、比較のためＧＭＰを加えない試料を調製し、これをコントロールとして同様に試験を行いカルシウム可溶化率を算出した。
結果を表２に示す。これによるとペプシンおよびパンクレアチンによる消化時間にかかわらず、ＧＭＰ／カルシウム（重量／重量）比が  ０．１以上の場合、ＧＭＰはカルシウムを全量可溶化することができた。
【００１６】
【表２】
0003575724.tif 000003
【００１７】
【試験例３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＭＰのカルシウム吸収促進作用
カルシウム吸収性試験は、体重約  ３００ｇの  ８週齢雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系のラットを１群６匹とし、表３に示すＧＭＰを配合した飼料及び水を自由摂取させ、１２時間毎の明暗サイクルで飼育した。飼育開始から１０日後に各ラットを代謝ゲージに入れ、７２時間の飼料摂取量と糞排泄量を求め、糞中に排泄されたカルシウム量をＩＣＰ発光分析装置（ＳＴ−３０００、Ｌｅｅｍａｎ  Ｌａｂｓ  製）で定量した。見かけのカルシウム吸収率は、以下の式で求め、コントロール群に対する各群のカルシウム吸収性をＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  法により多重比較した。
見かけのカルシウム吸収率（％）＝［（摂取した飼料中のカルシウム量）−（糞中に排泄されたカルシウム量）］／［（摂取した飼料中のカルシウム量）］×１００
図１に結果を示す。ＧＭＰ／カルシウム比が  ０．１以上の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ  でもＧＭＰによるカルシウム吸収促進効果が認められた。
【００１８】
【表３】
0003575724.tif 000004
【００１９】
【実施例３】
実施例１により得られたＧＭＰを配合した飲用牛乳を製造した。生乳１００ｍｌ  あたり２０ｍｇのＧＭＰ粉末を添加し、１２０ｋｇ／ｃｍ２  でホモゲナイズした後、  １２０℃で４秒間殺菌した。その後常法に従って冷却、充填を行った。得られた飲用牛乳は、ＧＭＰを含んでいても風味は通常の飲用牛乳と全く同様であった。また、飲用牛乳中のカルシウム含量は、１３０ｍｇ／１００ｍｌ  なのでＧＭＰ／カルシウム比は０．１５であった。
【００２０】
【実施例４】
実施例２で得られたＧＭＰのペプシン分解物を配合したヨーグルトを製造した。脱脂乳を固形率が１２％となるように水に溶解し、１００ｍｌ  あたり実施例２で得られたＧＭＰ粉末６００ｍｇ  を添加し、Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  とＳ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを接種した。乳酸酸度が  １．０％、ｐＨが  ４．３になった時点で５℃に冷却した。この様にして得られたスターターカルチャーを殺菌した脂肪分  ３．５％の生乳に５％接種した。スターターを接種後、発酵、フレーバリング、冷却を常法どおり行った。得られたヨーグルトはＧＭＰを含有していても、風味、物性、食感には全く影響を及ぼさなかった。ヨーグルトのカルシウム含量は１３０ｍｇ／１００ｇであり、ＧＭＰ／カルシウム比は０．２３であった。
【００２１】
【実施例５】
実施例２で得られたＧＭＰのシアリダーゼ分解物を配合したプロセスチーズを調製した。原料チーズとして、ゴーダチーズとチェダーチーズを１：１の割合で混合し、これに溶融塩としてクエン酸ナトリウムを原料チーズに対して２％、水を１０％、実施例２で得られたＧＭＰのシアリダーゼ分解物を  ０．１％配合し、乳化温度８５℃で常法に従って乳化した。乳化後、チーズをカルトンに充填し、２昼夜５℃で冷却した。得られたプロセスチーズのカルシウム含量は、６３０ｍｇ／１００ｇでＧＭＰ／カルシウム比は、０．１６であった。また、得られたプロセスチーズは、ＧＭＰを含有していても風味、物性、食感は通常のチーズと同様であった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のＧＭＰ及び／又はＧＭＰの酵素分解物を有効成分とするカルシウム吸収促進剤及びこれらの化合物を含有する飲食品は、腸管内におけるカルシウムの吸収を促進し、骨強化に有効である。さらにＧＭＰ及び／又はＧＭＰの酵素分解物をカルシウムと共に摂取することにより、腸管内でのカルシウム吸収率を高め、骨強化が可能となるため、高齢者に多い骨粗鬆症の予防及び治療や成長期の学童にも有効である。
また、ＧＭＰは、牛乳由来の物質であるため、副作用の心配が無い。また、溶解性も良好で、無味無臭であるため、どのような飲食品にも適用できる。さらに、ＧＭＰはチーズ製造時の副産物であるチーズホエーから得られるため安価に入手することができるので比較的安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例３のＧＭＰのカルシウム吸収促進効果を示す。
＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【図１】
0003575724.tif 000005