(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌の新菌株エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７４９）
【請求項２】
請求項１に記載の連鎖球菌を含む魚類の連鎖球菌症予防・治療用ワクチン組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の連鎖球菌を含む魚類の連鎖球菌症予防乃至治療用ワクチン組成物を投与することを特徴とする魚類の連鎖球菌症の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は魚類の連鎖球菌疾患の予防乃至治療のためのワクチンに関する。さらに詳しくは、魚類の連鎖球菌症の原因菌が属するエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の新規な菌株、該新規株を利用した魚類の連鎖球菌症を予防治療するためのワクチンならびにワクチン組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
魚類の連鎖球菌症は１９７４年に高知県のブリ養殖場で初めて発生が報告され、以来、毎年水温の高い夏から秋にかけて全国的に流行をみている。ブリ以外にもマアジ、カンパチ等で発生することが確認されている。
連鎖球菌症の原因菌としては、現在までにアルファ溶血性のエンテロコッカス・セリオリシダ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｒｉｏｌｉｃｉｄａ）、ベータ溶血性のストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）およびストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ガンマ溶血性のストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）の４種類が報告されている。
【０００３】
本発明はこれらの細菌による疾病のうち、エンテロコッカス・セリオリシダによって魚類に発症する連鎖球菌症に関するものである。
本細菌は従来ストレプトコッカス属として扱われてきたが、１９９１年にエンテロコッカス属に分類され、エンテロコッカス・セリオリシダと命名された。さらに、１９９６年には、ラクトコッカス・ガルビアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）のシノニム（Ｓｙｎｏｎｙｍ）とするという報告がなされた（Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｌ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ４６，  ６６４−６６８，  １９９６）が、今なお、エンテロコッカス・セリオリシダと呼ばれることが多い。このような経緯から、本菌や本菌により発症する疾病には複数の呼称が混在しているが、本明細書中では現在でも使用されることの多い、エンテロコッカス・セリオリシダおよび連鎖球菌症と表記する。
【０００４】
本菌にはＫＧ抗原との反応性によって、２つの抗原型があることが知られている。莢膜がなくＫＧ抗原が細菌細胞の表面に露出しているものをＫＧ＋型細菌（以下ＫＧ＋と表記することもある）といい、莢膜を有しＫＧ抗原が露出していないものをＫＧ―型（以下ＫＧ―と表記することもある）細菌という。野生のものは通常ＫＧ―タイプであるが、人工培地で継代することによって、一代〜十数代の間に莢膜が消失しＫＧ＋に変化する。ＫＧ―タイプの株は莢膜を保有しており、この莢膜が毒性に関与しているとの報告がある（Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ，  ２５，  ８１−８６，  １９９６、Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ，  ２９，  ２３３−２３５，
１９９７）。
【０００５】
魚類の連鎖球菌症は一般型と脳炎型に大別される。一般型では眼球の腫大・突出、鰓蓋内側の発赤、鰭基部・鰓蓋部の膿瘍、心外膜炎等の症状・症候がみられる。脳炎型では一般型にみられるような症状は乏しいが、横転、旋回を伴う狂奔遊泳が特徴的である。
本症の発生初期には、マクロライド系やテトラサイクリン系の抗生物質が有効であるが、中期以降になると効果的な治療法はない。抗生物質の使用は魚体内への残留性の問題から制限される場合も多く、また、投与を繰り返すことによって耐性菌を発生させてしまうため、なるべくその使用を控える必要がある。既に、これらの抗生物質に対して耐性を獲得している菌が分離されたことが報告されている（魚病学概論，  宝賀清邦編，  恒星社厚生閣，  ｐ５８−６１，  １９９６）。したがって、魚類の連鎖球菌症への対処法として、今後はワクチン投与による予防治療がますます重要視されるものと考えられる。
【０００６】
現在市販されている連鎖球菌症ワクチンとしては、不活化処理した連鎖球菌を飼料（餌料）に混合してブリに経口投与するタイプのものがあるが、効果の発現にばらつきがあり安定しない上、大量に使用しなければならないため、経済性に問題がある。そのため、不活化されかつ菌体外壁蛋白を含むエンテロコッカス属細菌溶出処理物を含有する魚類の腸球菌感染症用予防剤を使用することによって、投与量を減らす方法が提案されている（特開平８−２３１４０８号公報）が、未だ実用化されるには至っていない。
これに対して、注射または浸漬による投与方法も考えられる。注射による方法は、一個体ごとに魚を取り上げ投与しなければならないため手間を要するが、効果の発現の面では確実性が高く、またワクチンの使用量も少なくて済むという利点がある。
一方、浸漬による方法は、ワクチン液を懸濁させた飼育水中に魚を一定時間泳がせておく方法であり、魚を入れ替えることによって、同じワクチン懸濁液を数回から数十回程度繰り返して使用できるという点で、手間、経済性ともに、前記の２つの方法の中間に位置するといえる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の如く現在までに、ワクチンによって魚類の連鎖球菌症を予防乃至治療する方法が各種提案されてはいるが、何れも効果と経済性を満足させ得るものとは云えない。
したがって本発明は、従来知られているワクチンよりも高いワクチン効果を示し、安全性、経済性にも優れる新規連鎖球菌症予防乃至治療用のワクチンの提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鹿児島県出水郡東町の海域で、連鎖球菌症を発症した野外ブリを採取しこのブリから細菌を分離した。この細菌についてバージー（Ｂｅｒｇｅｙ，  Ｄ．  Ｈ．）のマニュアル第９版に照らして同定したところ、連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｒｉｏｌｉｃｉｄａ）であることが判明した。しかしながら、この菌株は６０代継代を重ねても、莢膜が消失しないという特異な特徴を有し、さらに病原性に関与すると考えられる繊毛を有していることから、新規株と判断しＫＧ９４０８株と命名した。
さらに本発明者らは、このエンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株を用いたときは、魚の連鎖球菌症に対して、継代を重ねることによって莢膜が消失する従来公知の連鎖球菌から調製したワクチンに比し遥かに優れた、高いワクチン効果を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、継代しても莢膜が消失しないエンテロコッカス属に属する連鎖球菌、その代表株である新規な連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８（  ＦＥＲＭ  ＢＰ―６７４９）、継代しても莢膜が消失しないエンテロコッカス属に属する連鎖球菌を含む魚類の連鎖球菌症ワクチン、さらに本ワクチンと薬理学的に許容される担体を含む魚類の連鎖球菌症ワクチン組成物、該ワクチンまたはワクチン組成物を魚類に投与することからなる連鎖球菌症の予防治療方法である。
なお、本発明に係る連鎖球菌ＫＧ９４０８株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年  ６月１０日に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ―６７４９である。
本発明において、継代培養しても莢膜が消失しないエンテロコッカス属に属する連鎖球菌とは、通常の培地において少なくとも４５代継代培養しても莢膜が消失しないもの、さらに好ましくは、６０代継代培養しても莢膜が消失しないものを云う。
【００１０】
本発明に係る連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株の菌学的性状は以下の通りである。
（１）グラム陽性球菌、数個の連鎖を形成
（２）通性嫌気性
（３）芽胞形成：−
（４）莢膜：＋
（５）繊毛：＋
（６）運動性：−
（７）硝酸塩の還元：＋
（８）ＭＲテスト：＋
（９）ＶＰテスト：＋
（１０）インドール産生：−
（１１）硫化水素産生：−
（１２）デンプン生成：−
（１３）クエン酸利用能（Ｋｏｓｅｒ培地）：−
（１４）クエン酸利用能（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地）：−
（１５）無機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）：−
（１６）色素生成：−
（１７）オキシダーゼ：−
（１８）カタラーゼ：−
（１９）生育ｐＨ：４．５〜９．６、温度：１０〜４５℃
（２０）ＯＦテスト：Ｆ
（２１）糖からのガス産生：
Ｄ−アラビノース：−、Ｄ−キシロース：−、Ｄ−グルコース：＋、
Ｄ−マンノース：＋、Ｄ−フラクトース：＋、Ｄ−ガラクトース：＋、
マルトース：＋、シュークロース：−、ラクトース：−、トレハロース：＋、
Ｄ−ソルビトール：＋、Ｄ−マンニトール：＋、イノシトール：−、
グリセリン：−、デンプン：−、Ｄ−ラフィノース：−
（２２）エスクリンの分解：＋
（２３）セルロースの分解：−
（２４）馬尿酸の分解：−
（２５）アルギニンの分解：＋
（２６）コアグラーゼ：−
（２７）溶血性：α型
（２８）塩化ナトリウム耐性：０．０〜６．５％
（２９）抗酸性：−
（３０）４０％胆汁酸添加培地における発育：＋
（３１）０．１％メチレンブルー添加培地における発育：＋
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に係る連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株をワクチンとして使用する場合には、生菌のまま投与してもよいが、加熱、紫外線照射等の物理的処理、ホルマリン、クロロホルム、フェノール、ベータプロピオラクトン等の化学的処理など、公知の方法を用いて不活化させてから投与するのが好ましい。生菌のまま使用するときには、菌を継代培養、高温度培養等公知の方法で培養し、無毒化または感染しても発症しない程度に弱毒化することが望ましい。不活化させて用いる場合には、ゴマ油、菜種油等の植物油、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等の鉱物オイル、水酸化アルミニウムゲル、硫酸アルミニウムゲル等の公知のアジュバントとともに投与すると、ワクチン効果を高めることができる。
また、ビタミンＥ、ペプチドグリカン、レバミゾール等の公知の免疫増強剤を加えることによって、効果を一層高めることができる。
【００１２】
本発明に係るワクチンを投与する場合、投与経路は経口、浸漬、腹腔内または筋肉内等であり特に限定されないが、好ましくは筋肉内、腹腔内への注射投与または経口投与である。
本ワクチンは発症する前に予防的に投与することができ、また、発症後に投与することによって、治療剤としても効果を期待することができる。
投与量は不活化前の菌数で１×１０４〜１×１０１２ＣＦＵ／尾、好ましくは１×１０６〜１×１０１０ＣＦＵ／尾、さらに好ましくは１×１０７〜１×１０９ＣＦＵ／尾である。
【００１３】
ワクチン投与の対象魚は、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、マアジ、シマアジ、ヒラメ、イシダイ等、連鎖球菌症に罹患する魚種であれば特に限定されない。
また、投与するときの魚齢は特に限定されず、技術的に注射することが可能な大きさに成長したものであればよい。通常、魚種を問わず体重が１０〜２０ｇ以上に達したものであればよい。
投与回数は１回で十分であるが、さらに３〜１２ヵ月後に再免疫することが望ましい。
【００１４】
本発明に係る継代培養しても莢膜が消失しないエンテロコッカス属に属する連鎖球菌、例えばエンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株の培養方法は特に限定されず、一般的な連鎖球菌の培養方法を用いればよい。
肉汁培地、ミューラーヒントン培地、トリプチケース・ソイ培地、ハートインフージョン培地、ブレイン・ハートインフージョン（ＢＨＩ）培地、トッド・ヘーヴィッド（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）培地、血液寒天培地、血清加培地等で培養可能であるが、血液または血清、グルコースおよび海水（または食塩）を加えた培地でよく発育する。
培養温度は通常１０〜４５℃、好ましくは１５〜３７℃、さらに好ましくは２０〜３０℃である。また、培養時のｐＨは４．５〜９．６、好ましくは５．５〜８．５、さらに好ましくは７．０〜８．０である。
培養に当たっては、静置培養、振とう培養、攪拌培養等の何れの条件下でも良いが、緩やかに攪拌しながら培養すると良好な成育が得られる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  種々の連鎖球菌株の培養
表１に示した２５株の連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダを、トッド・ヘーヴィッド寒天培地で継代培養した。
−８０℃で保存した菌を解凍し、その１滴を平板に白金耳で広げ、２５℃で２４時間培養した。その後、出現したコロニー１０個を抗血清で反応させた。抗血清を使用した抗原判定は５代継代ごとに行った。ＫＧ＋に変異していた場合はその継代数で培養を終え、ＫＧ―のままであった場合には、細菌が十分に繁殖しており、コロニーが密集している部分を白金耳でかきとり、さらに同様にトッド・ヘーヴィッド寒天培地に白金耳で植菌し、２５℃で２４時間培養し、以後同様の操作を繰り返した。
その結果、２５株中８株は１５代継代で、６株は３０代継代で、１０株は４５代継代でＫＧ＋に変異したが、ＫＧ９４０８株のみは６０代継代してもＫＧ―のままであり、莢膜に変化は認められなかった。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
注１：エンテロコッカス・セリオリシダＮＧ８２０６，ＳＡ９２０１，ＭＺ９２０１，ＫＧ７４０９は、吉田等；ディジージーズ・オブ・アクアティック・オーガニズムズ；第２５巻、８１−８６、１９９６年（Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ２５，  ８１−８６，  １９９６）に記載されている。
又、エンテロコッカス・セリオリシダＮＧ８２０６，ＫＧ７４０９，ＭＺ９５０１は、同上誌  第２９巻、２３３−２３５、１９９７年に記載されている。
【００１８】
実施例２  連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株の培養（１）
連鎖球菌ＫＧ９４０８株、１×１０２ＣＦＵ／ｍｌを、トッド・ヘーヴィッド液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を使用して、ｐＨ７．４、２５℃で２４時間、攪拌培養した。その結果、ＫＧ９４０８株は１×１０９ＣＦＵ／ｍｌに増殖した。
【００１９】
実施例３  連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株の培養（２）
連鎖球菌ＫＧ９４０８株、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌを、トッド・ヘーヴィッド液体培地（ＢＢＬ社製）を使用して、ｐＨ７．８、２５℃で１２時間培養した。その後、常法により、生菌数を測定したところ、ＫＧ９４０８株は２×１０９ＣＦＵ／ｍｌであった。
実施例４  生菌数と吸光度の関係
【００２０】
連鎖球菌ＫＧ９４０８株、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌを、トッド・ヘーヴィッド液体培地（ＢＢＬ社製）を使用して、ｐＨ７．４、２７℃で２、４、８、１２（２サンプル）、２４（２サンプル）、４８（２サンプル）または９６時間培養した。培養菌液に０．３％ホルマリンを加え、２５℃で４８時間不活化した後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、生菌数と吸光度の間には、図１に示した関係があることが明らかになった。
【００２１】
実施例５  ワクチンの作製（１）
トッド・ヘーヴィッド液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、ＢＨＩ培地に懸濁させた連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株の２×１０５ＣＦＵ／ｍｌを加え、２５℃で２４時間培養した。培養菌液に０．３％ホルマリンを加え、２５℃で４８時間不活化した後、遠心・集菌し、得られた菌体を６６０ｎｍにおける吸光値が約１（菌数として約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌに相当する）となるように調整して、リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．２）に再浮遊した。
【００２２】
実施例６  ワクチンの作製（２）
ＢＨＩ培地に懸濁させた連鎖球菌ＫＧ９４０８株の５×１０４ＣＦＵ／ｍｌを、血液寒天培地に加え、３０℃で４８時間培養した。培養菌液に０．３％ホルマリンを加え、２５℃で４８時間不活化した後、遠心・集菌し、得られた菌体を６６０ｎｍにおける吸光値が約１となるように調整して、リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．２）に再浮遊した。
【００２３】
実施例７  ワクチンの作製（３）
実施例５と同様の方法で調製したワクチン液を、５００ｍｌのアンプルに充填した後に６５℃で３０分間加熱滅菌し、ワクチン製剤とした。
【００２４】
実施例８  ワクチンの作製（４）
実施例６と同様の方法で調製したワクチン液を、２５０ｍｌのアンプルに充填した後に７２℃で１５分間加熱滅菌し、ワクチン製剤とした。
【００２５】
実施例９  ワクチンの作製（５）
実施例５と同様の方法で調製したワクチン液を、凍結乾燥してワクチン製剤とした。本製剤は投与時に、リン酸緩衝食塩液で１×１０９ＣＦＵ／ｍｌとなるように覆水して使用した。
【００２６】
次に、本発明に係るワクチンの有用性を、実験データを挙げて、以下に詳述する。
試験例１  カンパチにおける免疫原性
４０尾のカンパチを水温２３±０．５℃、循環式飼育槽で５日間飼育した後、外観検査で異常がみられず、体重が２０ｇ以上に達したものを３２尾選択した。これらの魚を各群間の平均体重がほぼ等しくなるように、ワクチン注射群および攻撃対照群の２群、各１６尾に群分けした。
ワクチン注射群の魚には、実施例５の方法で調製したワクチン液を１尾当たり０．２ｍｌ、腹腔内に注射投与した。攻撃対照群には、リン酸緩衝食塩液を１尾当たり０．２ｍｌ、同様に投与した。その後、それぞれ飼育温度２３±０．５℃、循環式で１４日間飼育し観察した。最終日に飼育水温を約１日かけて２５±０．５℃に上昇させた。その結果、観察期間中、全ての試験魚に異常は認められなかった。
【００２７】
連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダの強毒株（ＫＧ９４０８株）を、トッド・ヘーヴィッド液体培地で２４時間培養し、菌液をリン酸緩衝食塩液で希釈して、攻撃用菌株液を調製した。菌濃度は予備試験でへい死率が約８０％となった濃度とした。
ワクチン注射群および攻撃対照群の全ての魚の腹腔内に、攻撃用菌液０．１ｍｌを注射投与した後、飼育水温を４時間かけて２７±０．５℃に上昇させ、１４日間観察した。  その結果、攻撃対照群のへい死率が８７．５％であったのに対し、ワクチン注射群ではへい死例はみられなかった（表２―実験１）。
さらに同様の条件で試験を繰り返したところ、攻撃対照群、ワクチン注射群のへい死率は、それぞれ９３．８％、６．３％であった（表２―実験２）。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
試験例２  ブリにおける免疫原性（１）
試験例１とほぼ同様の方法で、ブリにおける攻撃試験を実施した。攻撃菌量は５．１×１０３ＣＦＵ／０．１ｍｌ／尾とした。ワクチンとしては実施例５の方法で作製したものを、１尾当たり０．１ｍｌ投与する群を３群、ワクチン液をリン酸緩衝生理食塩液でそれぞれ２または４倍希釈したものを、１尾当たり０．１ｍｌ投与する群を各１群設定した。攻撃対照群にはワクチン液の代わりにリン酸緩衝生理食塩液を０．１ｍｌ投与した。
その結果、攻撃対照群のへい死率が８７．５％であったのに対して、各ワクチン群の死亡率はいずれも０％であった（表３）。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
試験例３  ブリにおける免疫原性（２）
試験例２と同様の方法で、ブリにおける攻撃試験を実施した。攻撃菌量は５．１×１０４ＣＦＵ／０．１ｍｌ／尾とした。
その結果、攻撃対照群のへい死率が１００％であったのに対して、ワクチン投与群のへい死率は０から６．３％と、高いワクチン効果がみられた（表４）。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
比較試験例１  連鎖球菌ＮＳ株ワクチンによる効果
継代によって莢膜および繊毛が消失した連鎖球菌エンテロコッカス・セリオリシダＮＳＳ９３１０株を用いて、実施例５と同様の方法でワクチン液を調製した。このワクチン液を使用して、試験例１と同様の方法で免疫原性を調べた。
その結果、攻撃対照群として設定した２群のへい死率が、９３．８％、８７．５％であったのに対して、ＮＳ株ワクチン注射群（２群設定）におけるへい死率は、６２．５％、６８．８％であり、本発明のエンテロコッカス・セリオリシダＫＧ９４０８株を使用して調製したワクチンよりも効果は遥かに低かった。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
【発明の効果】
本発明の、継代培養によっても莢膜が消失しないエンテロコッカス属の連鎖球菌から調製したワクチンは、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、マアジ、シマアジ、ヒラメ、イシダイ等、連鎖球菌症に罹患する魚種の連鎖球菌症の予防治療に高い効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生菌数と吸光度の関係を示した図である。
【図１】
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