(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を含有する試料を、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラムを改良し得る逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行う生体試料の分析方法であり、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せが、オクタデシル基もつ充填剤とフェニル基をもつ充填剤の組合せであることを特徴とする生体試料の分析方法。
【請求項２】
生体試料を含有する試料を、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラムを改良し得るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行う生体試料の分析方法であり、充填剤（Ａ）はフェニル基をもつ充填剤であり、かつ、充填剤（Ｂ）は、−ＣＯＯＨをもつ充填剤であることを特徴とする生体試料の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体クロマトグラフィー法による生体試料の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料の分析において液体クロマトグラフィー分析は汎用されている分析手法の一つである。この液体クロマトグラフィー分析、例えば、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、一般に逆相分配系液体クロマトグラフィーがよく用いられている。逆相分配系液体クロマトグラフィーとは、極性の低い液体を固定相とし、これと自由に混ざらない、例えば、水やメタノールなどのように極性の高い液体を移動相とする液体クロマトグラフィーのことであり、固定相用の充填剤としては逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤が使用され、例えば、官能基として、オクチル基、オクタデシル基のような直鎖アルキル基をもつものや、フェニル基などをもつ充填剤が使用される。
【０００３】
この生体試料の分析で得られるクロマトグラムにおいて、分析時間を短くすると分離が悪くなるという問題があった。生体試料の分析において各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分離性等のクロマトグラムを改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことではない。
【０００４】
また、液体クロマトグラフィーの分析手法を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示されている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報には、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてアルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィーによる陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されているが、これは、カラムを交換することなく両方のイオン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。また、これは、イオン交換系液体クロマトグラフィーに関するものであり、逆相分配系液体クロマトグラフィーではなく、生体試料の分析には適用され得ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料を短時間で分離性良く分析し得る液体クロマトグラフィー法による分析方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】請求項１及び２記載の生体試料の分析方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１といい、請求項２記載の発明を本発明２という）は、生体試料を含有する試料を、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行うことを特徴とする。
【０００７】
本発明１及び２でいうクロマトグラムの改良とは、例えば、各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分離性、ピークのシャープさなどを言う。
【０００８】
本発明１及び２で使用される充填剤（Ａ）は、生体試料の分離に主に作用する充填剤であり、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。
【０００９】
上記充填剤（Ａ）としては、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はなく、公知のいずれもが使用可能である。逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤とは、前述の逆相分配系液体クロマトグラフィーに使用される充填剤のことであり、例えば、官能基として、オクチル基、オクタデシル基のような直鎖アルキル基をもつものや、フェニル基などをもつ充填剤である。上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としても、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１０】
本発明１及び２で使用される充填剤（Ｂ）は、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の生体試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限定される。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、上記のように限定された範囲内のものであり、具体的には。逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が挙げられる。また、上記充填剤（Ｂ）の骨格の素材としても、特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）の骨格の素材として例示したものが例示される。また、充填剤（Ｂ）は、２種類以上混合されて使用されてもよい。
【００１１】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとしては、上記充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤である場合としては、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の官能基同士が異なる例としては、例えば、オクタデシル基をもつ充填剤とフェニル基をもつ充填剤の組合せが挙げられる。
【００１２】
充填剤（Ｂ）が逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤以外である場合としては、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が好ましい。上記イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤としては、官能基として−ＣＯＯＨをもつ充填剤が挙げられる。
【００１３】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１４】
本発明１及び２で用いられるカラムは、従来から液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられているものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１５】
本発明１及び２で用いられる液体クロマトグラフィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を混合してから充填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層状態でカラム内に存在することになる）してもよい。また、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的には、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合った量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は低圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明１及び２で分析される生体試料としては、動物や植物などの生体に含まれる試料であれば、特に限定されず、例えば、ヒト又は動物の血液、尿などの体液；植物も含む生物一般の組織中の物質やその代謝物などが挙げられる。また、その生体試料中の具体的に測定される物質としては、例えば、蛋白質、ペプチド、核酸、酵素、脂質、色素などが挙げられる。
【００１７】
本発明１及び２の生体試料の分析方法は、分析に使用するカラムとして、上述の液体クロマトグラフィー用カラムとして、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用することの他は、従来の液体クロマトグラフィー法による生体試料の分析方法と同様である。以下、本発明１及び２の生体試料の分析方法について詳述する。
【００１８】
図１は、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して生体試料の分析をする際の装置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー４から生体試料を導入する。液体クロマトグラフィー用カラム１によって分離された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記録計６に記録される。なお、生体試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
【００１９】
上記移動相としては、逆相分配モードにおける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。また、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが用いられる。また、水と有機溶媒の混合系も用いられる。移動相の通液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれる。
【００２０】
上記の分離については、公知の方法が採用され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマトグラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもできる。
【００２１】
上記の検出についても公知の技術が用いられ、例えば、紫外可視分光光度計などが好適に使用される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例における分析装置は、前記図１のように構成して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。
送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。
サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０。
検出器５：紫外可視分光光度計。島津製作所社製、ＳＰＤ−６ＡＶ。
【００２３】
実施例において使用した充填剤は、以下の通りである。
充填剤  逆相−１
市販の逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ｍｉｃｒｏｎｅｘ  ＲＰ−３０、積水化学工業社製）。骨格の素材として、スチレン系ポリマーが使用され、官能基としてフェニル基を有している。
【００２４】
充填剤  逆相−２
市販の逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ、東ソ−社製）。骨格の素材として、シリカが使用され、官能基としてオクタデシル基を有している。
【００２５】
充填剤  カチオン−１
以下のように、特開平３−７３８４８号公報の方法によりカチオン交換充填剤を製造した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）２００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１ｇを溶解し、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成社製）水溶液に添加した。攪拌しながら窒素を導入し、８０℃で２時間重合した。室温まで冷却した後、アクリル酸４０ｇを添加して再び８０℃に加熱して２時間重合した。得られた粒子を水およびアセトンで順次、洗浄し、乾燥した後、空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤カチオン−１とした。充填剤カチオン−１は、官能基として−ＣＯＯＨを有する。
【００２６】
（実施例１、２、比較例１）
▲１▼液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの５０重量％エタノール水溶液に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００２７】
【表１】
0003561352.tif 000002
【００２８】
▲２▼生体試料の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、生体試料として蛋白質標品（リボヌクレアーゼ、チトクロームＣ、リゾチーム、牛血清アルブミン、ミオグロビン及びオブアルブミンを含有）を水に溶解したものを分析した。溶出は、５容量％アセトニトリル水溶液（ｐＨ２．３）に、８０容量％アセトニトリル水溶液（ｐＨ２．０）を混合するリニアグラジエント法にて溶出し、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。検出は２２０ｎｍの吸光度測定にて行った。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを図３に示した。なお、実施例２のクロマトグラムも実施例１のクロマトグラムとほぼ同様であった。なお、図２及び３における各ピークは、１１リボヌクレアーゼ、１２チトクロームＣ、１３リゾチーム、１４牛血清アルブミン、１５ミオグロビン、１６オブアルブミンである。
【００２９】
【発明の効果】
本発明１及び２の生体試料の分析方法の構成は上記の通りであり、生体試料のクロマトグラムの改良がなされ得、生体試料を短時間で分離性良く分析し得る。また、本発明１及び２の生体試料の分析方法に使用される液体クロマトグラフィー用カラムは、逆相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記生体試料に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムであり、その製造が容易である。従って、本発明１及び２の生体試料の分析方法は、簡便な方法でより正確に生体試料を分析できる方法である。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の生体試料の分析を行う際の装置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１  液体クロマトグラフィー用カラム
２  移動相
３  送液ポンプ
４  サンプラー
５  検出器
６  記録計
【図１】
0003561352.tif 000003
【図２】
0003561352.tif 000004
【図３】
0003561352.tif 000005