(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)ＡＤ３０００２（生工研菌寄,第ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１８６号）に属する菌の抽出物又はそれらの培養液から得られた抽出物の一方又は両方を含む肌用の細胞賦活性化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は細胞賦活組成物を含有する保湿性を高め若々しい皮膚を保つ化粧料及び該細胞賦活成分を生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化粧品に使用されている細胞賦活剤としては単一成分原料（感光素、ビタミン、コラーゲンなど）及び抽出成分原料（プラセンタエキス（特願昭５９−１９０９０９）、ラクトバチルス・アシドフィルス（特願平３−１５６０３３）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（特願昭５７−８１２８７）からなる乳酸菌エキス、霊芝エキスなど）である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は安全性の高い細胞賦活作用を有し、かつ、保湿性が高く、皮膚を滑らかにし、若々しい皮膚を保つ性質の化粧料を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
皮膚には色々な皮膚常在菌が棲息しマイクロフローラを形成している。面白いことに健康な人の肌は一様に嫌気性菌のプロピオニバクテリウム・アクネス菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、好気性菌のスタフィロコッカス・エピデルミデイス菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｓ）がそれぞれ１０４−１０５個／ｃｍ２、１０３−１０４個／ｃｍ２という高密度な棲息を示し、皮膚常在菌の上位優勢菌種を成している。健康な肌に、実験的に外来菌を塗布したとしても外来菌は速やかに排除され元の菌叢が自然と回復するということがしばしば観察される。このことはあたかも常在菌が皮膚の感染防御機構の一端を担っているように見える。健康な皮膚が持つ常在菌叢のこれら生態系が構築されるためには、皮膚から供給される優勢常在菌の生産に必要な栄養因子と常在菌が分泌する抗菌様物質などの存在が考えられている。そこで本発明は、まず健康な人の正常皮膚に存在する細菌を採取し、分離培地プレート上で単コロニーを得、その単離皮膚常在菌純粋液培養を行い、その培養菌体及び培養液中にヒト線維芽細胞増殖作用物質があるかの否かの検索を試みた。その結果、プロピオニバクテリウムに属する菌の培養液中に細胞増殖作用を示す成分があること、さらにこれを含有する化粧料として有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明はプロピオニバクテリウム・アクネスに属し、線維芽細胞に対して細胞賦活作用を示す成分を産生する菌を培養して得られる培養液あるいはその該菌体に由来する物質で線維芽細胞の増殖能を高める成分を含有する化粧料並びに微生物を提供するものである。
【０００５】
本発明に用いられる培養液を生産する菌株はプロピオニバクテリウム・アクネスに属し、線維芽細胞に対して特異的に増殖作用を示す成分を生産する菌としては、例えばＡＤ３０００２株（以下本菌株と言う）が挙げられる。
本菌株の菌学的性質は以下の通りである。
（ａ）菌の性状：桿菌
（ｂ）運動性：無
（ｃ）胞子形成：観察されず
（ｄ）グラム染色性：陽性
（ｅ）ゼラチン：液化能あり
（ｆ）インドール生成：あり
（ｇ）硝酸還元反応：陽性
（ｈ）カタラーゼ反応：陽性
（ｉ）リパーゼ活性：あり
（ｊ）ガス生成：なし
（ｋ）ウレアーゼ反応：陽性
（ｌ）ヒアルロニダーゼ反応：陰性
（ｍ）生育範囲：ｐＨ５−９，温度２０−４０℃（最適生育温度３２−４０℃）（ｎ）酸素要求性：偏性嫌気性。但し菌数の多い場合，酸素耐性が認められる。
（ｏ）嫌気条件下での酸の産生能：マルトース（−）
（ｐ）エスクリン加水分解：なし
以上の性質をもとにＢｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８版，（１９７４年）の記載から、本菌株をプロピオニバクテリウム・アクネスＡＤ３０００２と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１８６）
【０００６】
本発明に用いる線維芽細胞に対して特異的に賦活作用を示す成分は、上記菌株を栄養源含有培地に接種し嫌気的に培養すれば培養中に生産される。かかる菌株としては、上記ＡＤ３０００２株はもとより、人工変異株あるいは自然変異株であっても上記成分を生産する能力を有するものであれば、全て本発明に使用することができる。
【０００７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これにより限定するものではない。
実施例１
プロピオニバクテリウム・アクネスＡＤ３０００２株を下記のＧＡＭ液体培地に接種し、３７℃で嫌気培養を行い、得られた培養液を１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離に付し、菌体上清を０．２２ミクロンのフィルターを用いて無菌ろ過し培養上清液を得た。一方、菌体は生理的食塩水でよく洗い洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を８０％アセトンで抽出し、次いで酢酸エチルで抽出したものをエバポレーターで蒸発乾固し菌体抽出物を得た。
ＧＡＭ液体培地の組成（１リットル当たり）
ペプトン                                １０．０ｇ
ダイズペプトン                    ３．０ｇ
プロテオーゼペプトン    １０．０ｇ
消化血清末                            １３．５ｇ
酵母エキス                              ５．０ｇ
肉エキス                                  ２．２ｇ
肝臓エキス末                          １．２ｇ
ブドウ糖                                  ３．０ｇ
リン酸二水素カリウム          ２．５ｇ
塩化ナトリウム                      ３．０ｇ
溶性デンプン                          ５．０ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩          ０．３ｇ
チオグリコール酸                  ０．３ｇ
ｐＨ  ７．３±０．１
【０００８】
実験例 １（細胞賦活作用）
ヒト繊維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ、理化学研究所より購入）を予め、１０％ＦＣＳ加ＲＩＴＣ−８０培地にて５％ＣＯ２，３７℃の条件下で４日間培養した。その培養細胞は、その後、ＰＢＳ緩衝液で２度洗浄し、０．２５％トリプシン処理にて細胞をはがし、同培地で  ８  ×  １０３細胞／ｍｌ細胞浮遊液に調製した。これを９６穴マイクロプレートに０．１ｍｌずつ分注し同培養条件下で前培養（４時間）を行った。サンプルは同培地（無血清）で１．０％，０．３％，０．０３％（濃度は実施例１の容量％、但し菌体抽出液は培養液１ｍｌ相当量の容量％）に希釈したものを各々０．０１１ｍｌずつ９６穴に添加して培養した。判定はニュ−トラルレッドで生細胞を染色（３７℃，１時間）し、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ：エタノール（１：１）で溶出後、分光光度計を用いて波長５４０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞増殖能を算出した。その結果を表１に示した。
【表１】
0003580453.tif 000002
上記のごとく、培養上清液（Ｐ＜０．０５）及び菌体抽出液（Ｐ＜０．０１）には明らかに線維芽細胞に対して有意に増殖効果が認められた。一方、皮膚常在菌であるスタフィロコッカス・エピデルミデス菌や皮膚有害菌であるスタフィロコッカス・アウレウス菌及びマイクロコッカス菌属には増殖効果が認められず、本菌株の細胞賦活作用の有用性が示された。
【０００９】
安全性
実施例１で得られた菌体培養液をソニケーション処理（氷冷で２０分間）し、その上清液を０．２２ミクロンのフィルターを用いて無菌ろ過したものにグリセリンを加えて試験液とした。これを成人男子（ｎ＝１）前腕曲内側皮膚に貼付し、２４時間後の皮膚刺激性について観察を行い表２に示す結果を得た。
【表２】
0003580453.tif 000003
上記のように、安全性になんら問題はない。
【００１０】
実施例２ （ローション）
上記実施例１で得られた培養菌体（１０９細胞／ｍｌ相当量）を８０％アセトンで抽出後、アセトンを除去する。この溶液を０．２２ミクロンのフィルターでろ過し精製水で１０倍に希釈したもの９４．９ｇにグリセリン５．０ｇ、パラオキシ安息香酸０．１ｇを攪拌添加してローションを得た。（配合量は重量％）
【００１１】
実施例３ （クリーム）
上記実施例２で得られた培養菌体抽出液５ｇ、グリセリン５ｇ、ポリエチレングリコール（４００）  ２ｇ及び精製水７０ｇを７０℃加熱混合溶解した中へ、予めセタノール４ｇ，スクワラン５ｇ，ステアリン酸１ｇ，ミツロウ１ｇ，ワセリン２ｇ、グリセリンモノステアレート２ｇ、パラオキシ安息香酸エチルエステル０．１ｇと少量の香料を加熱混合溶解させたものを攪拌混合して、ホモジナイザーで乳化し室温まで冷却してクリームを得た。（配合量は重量％）
【００１２】
【発明の効果】
本発明のプロピオニバクテリウム・アクネスの培養上清あるいは菌体抽出液を含む化粧料は線維芽細胞の増殖効果を有する。従ってこれを含有する化粧料は皮膚の保湿性を高め、皮膚を滑らかにし、若々しい皮膚を保つ効果が期待され、かつ安全性についても問題はない。