(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物のための分析方法であって、
ａ）分析物結合領域と標識とを含む標識された結合パートナーに上記試料を露出する工程；
ｂ）上記標識された結合パートナーに露出した上記試料を、上記標識された結合パートナーが上記分析物に結合しない場合に、上記標識された結合パートナーの上記標識を有する付加物を形成するシグナル変更リガンドで処理する工程であって、ここで、上記標識された結合パートナーの上記標識は、上記標識された結合パートナーが上記分析物に結合する場合に、上記シグナル変更リガンドを有する付加物を形成することから優先的に保護し、上記シグナル変更シグナルが、上記分析物に結合する上記標識された結合パートナーからシグナル産生を変更するよりも大きな程度で、上記分析物に結合しない上記標識された結合パートナーからのシグナル産生を変更するような工程；そして
ｃ）上記試料中の上記分析物の存在または量の指標として、変更されなかった標識から産生したシグナルを検出する工程
を含む上記の方法。
【請求項２】
上記結合パートナーが核酸プローブであり、上記分析物が標的核酸配列である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
試料中の核酸標的領域のための分析方法であって、
ａ）上記標的領域に結合することができる核酸配列を有するオリゴヌクレオチドと標識とを含む核酸プローブに上記試料を露出する工程で、上記標識が上記標的領域に結合したプローブ上に存在する場合、上記標識からのシグナル産生がシグナル変更リガンドによる変更から優先的に保護される工程；
ｂ）上記プローブに露出した上記試料を、上記プローブが上記標的領域に結合しない場合に、上記プローブの上記標識を有する付加物を形成するシグナル変更リガンドで処理する工程であって、ここで、上記プローブの上記標識は、上記プローブが上記標的領域に結合する場合に、上記シグナル変更リガンドを有する付加物を形成することから優先的に保護し、上記シグナル変更シグナルが、上記標的領域に結合する上記プローブからシグナル産生を変更するよりも大きな程度で、上記標的領域に結合しない上記プローブからのシグナル産生を変更するような工程；そして
ｃ）上記試料中の上記標的領域の存在または量の指標として、変更されなかった標識から産生したシグナルを検出する工程
を含む上記の方法。
【請求項４】
上記標的領域がRNAである、請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
上記分析を、上記分析物または上記標的領域にそれぞれ結合した結合パートナーまたはプローブを上記分析物または上記標的領域にそれぞれ結合していない結合パートナーまたはプローブから分離することなく実施する、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項６】
上記工程（ｃ）の前に上記分析物または上記標的領域にそれぞれ結合した結合パートナーまたはプローブを上記分析物または上記標的領域にそれぞれ結合していない結合パートナーまたはプローブから分離することをさらに含む、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項７】
上記工程（ｂ）および（ｃ）を本質的に一定な温度で実施する、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項８】
上記分析をほぼ室温で実施する、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
光吸収を上記工程（ｃ）で検出する、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項１０】
光放出を上記工程（ｃ）で検出する、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項１１】
上記標識が以下の化学構造を有する請求の範囲第10項記載の方法：
0003577085.tif 000023
（式中、上記アリール環系は１〜４個の環式基を含み、上記の基の１つは結合炭素「Ｃ」に結合しており、
R2は、Ｓ、Ｏ、およびNHから成る群から選択され；
R3は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換したリン、置換した硫黄、置換したホウ素、および置換したヒ素から成る群から選択され；
R4は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、アリールオキシから成る群から選択され、R3がハロゲンの場合には存在せず；そして
R5は、R3がＮでない場合には存在せず、R3がＮの場合にはR5は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、およびアリールオキシから成る群から選択される）。
【請求項１２】
上記アリール環系が正に帯電している、請求の範囲第11項記載の方法。
【請求項１３】
上記アリール環系が１〜４個の環式基を有し；
上記R3がＯ、Ｎ、およびＳから成る群から選択され；
上記R4がアリールであり；そして
上記R5が存在しない、請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項１４】
上記標識が以下の化学構造を有する、請求の範囲第13項記載の方法：
0003577085.tif 000024
（式中、R1は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリールから成る群から選択され；
ｎは０、１、２、３、または４であり；
ｍは０、１、２、３、または４であり；
各々のＸは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、アミド、アセチル、置換アセチル、およびアリールオキシから成る群から選択され；そして
各々のＹは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、アミド、アセチル、置換アセチル、およびアリールオキシから成る群から選択される）。
【請求項１５】
上記ｎが０、１または２であり；
上記ｍが０、１または２であり；
上記R3がＯであり；
上記R4がアリールであり：そして
上記R5が存在しない、請求の範囲第14項記載の方法。
【請求項１６】
上記Ｘの各々が独立してアルキルまたアルコキシであり；
上記Ｙの各々が独立してアルキルまたアルコキシであり；そして
上記R4が所望により置換されたフェニルである、請求の範囲第15項記載の方法。
【請求項１７】
上記R4が、オルト−メチルシンナメート−フェニル、オルト−ジメチル−フェニル、オルト−ジブロモフェニルおよび未置換フェニルから成る群から選択される、請求の範囲第16項記載の方法。
【請求項１８】
上記リガンドが、テトラヒドロチオペン、プロパンチオール、ベンジルメルカプタン、亜硫酸塩、亜硫酸グリコール、ヒドロ亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオリン酸塩、メタ亜ヒ酸塩、亜テルル酸塩、亜ヒ酸塩、およびチオシアネートから成る群から選択される、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項１９】
上記リガンドが、遊離電子対を有する硫黄原子、遊離電子対を有する亜テルル酸塩原子、または遊離電子対を有する亜ヒ酸塩原子のいずれかを含み、上記硫黄原子、上記亜テルル酸塩原子、または上記亜ヒ酸塩原子は芳香環またはニトリルに共役していない、請求の範囲第１項または第３項記載の方法。
【請求項２０】
上記付加物が可逆的な付加物である、請求項第１項ないし第19項のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、試料中の分析物の存在または量を分析するための方法を特色とする。
発明の背景
試料中の分析物の存在または量の分析により、特定の生物体、遺伝子またはタンパク質が試料中に存在するかどうか等の有用な情報を得ることができる。分析物の分析は、分析物の特徴的な部分を認識して結合することができる結合パートナーを使用して実施することができる。例えば、標識された抗体およびオリゴヌクレオチドプローブを診断分析に使用して、試料中の生物体、遺伝子またはタンパク質の存在を検出することができる。
オリゴヌクレオチドプローブは相補標的核酸配列にハイブリダイズでき、これにより標的核酸配列の検出が可能になる。標的核酸配列の存在または量の検出は以下のものを含む異なる形式の分析において使用することができる：微生物または微生物の群に特徴的な核酸配列をプローブ検索することによって試料中のその微生物または微生物の群の存在を検出する（例えば、Hogan他、表題「非ウイルス生物体の検出および／または定量のための核酸プローブ」、国際出願番号PCT/US88/03009、国際公開番号WO88/03957、引用により本明細書中に取り込まれる）；ウイルスに特徴的な配列をプローブ検索することによってウイルスの存在を検出する（例えば、McDonough他、表題「ヒト免疫不全ウイルス１型の検出」、国際出願番号PCT/US94/03130、国際公開番号WO94/23069、およびMcDonough他、表題「ヒト肝炎Ｂ型ウイルスに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ」、国際出願番号PCT/US93/04004、国際公開番号WO93/22469、これらの文献は共に引用により本明細書中に取り込まれる）；並びに、特定の核酸配列が相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションのために接近できるかどうかを検出する（例えば、Nelson他、表題「オリゴヌクレオチドスクリーニング分析」、国際出願番号PCT/US94/08024、国際公開番号WO95/03427、引用により本明細書中に取り込まれる）。
異なる標識および分析形態を使用して、試料中の分析物の存在または量を検出することができる。検出可能な標識の例には、ラジオアイソトープ、蛍光成分、化学発光成分、酵素、酵素基質およびリガンドが含まれる。
全般的に、分析の形態は、分析物に結合した結合パートナーが分析物に結合しない結合パートナーから物理的に分離されるかどうかに依存して「異質（heterogenous）」または「同質（homogenous）」であると特徴付けることができる。異質（heterogenous）分析には、分析物に結合しない結合パートナーからの分析物に結合した結合パートナーの物理的分離が含まれ、例えば、分析物に結合した結合パートナーまたは分析物に結合しない結合パートナーのいずれかを結合するための支持体を使用して行うことができる。例えば、Arnold他、国際出願番号PCT/US88/00550、国際公開番号WO88/06633は、ポリヌクレオチドを含む物理的分離工程で使用することができる多カチオン性支持体の使用を記載しており、ポリヌクレオチドの物理的分離のために使用することができる他の支持体にも言及している；そして、Harlow他、抗体、A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1998は、サンドイッチ分析を記載しており、この分析では支持体に結合した抗体は分析物を結合し、分析物は次いで別の抗体を使用して検出され、未結合の汚染物質は固体支持体から洗浄される（これらの文献は共に引用により本明細書中に取り込まれる）。
同質（homogenous）様式で行うことができる分析の例には以下のものが含まれる；米国特許第3,654,090号、第3,817,837号および第4,190,496号に記載された免疫分析；米国特許第4,199,559号、第4,174,384号および第4,318,707号に記載された蛍光物質／消光物質の対を含有するクロモフォアを使用する分析;Boguslaski他、米国特許第4,383,031号に記載されているような、化学発光反応体に結合した特異的な結合パートナー物質から形成した結合体を使用する分析、この分析では化学発光反応体の活性は、結合体中の特異的結合物質と特異的結合カウンターパートとの間の反応によって影響を受ける；米国特許第4,668,640号に記載されたような分極蛍光を含有する分析；米国特許第4,670,379号に記載されたような、触媒で標識された第１プローブとアポ発光物質（apoluminescer）を含有する第２プローブとを含む二重プローブを使用する分析;Elazar他、ヨーロッパ特許出願番号第85105130.0号、公開番号第0159719号に記載されたようなエネルギー移動システムを使用する分析;Heller他、ヨーロッパ特許出願番号第82303699.1号、公開番号第0070685号、並びにMorrison他、ヨーロッパ特許出願番号第82303700.7号、ヨーロッパ公開番号第0070686号に記載されたような、化学発光成分と吸収物／放出体成分を使用する分析；並びに、Arnold他、米国特許第5,283,174号、Nelson他、Nonisotopic DNA Probe Techniques，（Kricka ed.,Academic Press,1992）pp.275−311、中の「化学発光によるアクリジニウムエステルの検出」、Nelson他、Clin.Chem.Acta 194:73−90,1990およびArnold他、Clin.Chem.35:1588−1594,1989に記載されたような標識を使用する分析（この段階で言及した文献は各々引用により本明細書中に取り込まれる）。
発明の要旨
本発明は、標識された結合パートナーおよびシグナル変更リガンドの使用を含む付加物保護分析を特色とする。シグナル変更リガンドは、結合パートナー：分析物複合体の一部である標識から産生されたシグナルを変更する能力と比較して、結合パートナー：分析物複合体の一部ではない標識が検出可能なシグナルを産生する能力を優先的に変更できる。分析物の存在または量は、未変更の標識から産生したシグナルを検出することによって測定できる。付加物保護分析は非常に万能である。例えば、シグナルの変更は、広範な条件下で行うことができ（例えば、pH、温度、およびイオン強度）、標識の変更およびシグナル開始（triggering）は共に、本質的に一定の温度で行うことで高度の感度を達成できる。
付加物保護分析は、好ましくは開始（triggered）されることによって検出可能なシグナルを産生する標識を含有する結合パートナーを使用して行われる。「検出可能なシグナル」とは、測定できる標識によって生じる環境の変化を意味する。検出可能なシグナルの例には、光の放出および吸収の変化が含まれる。
「開始（triggering）」とは、標識から検出可能なシグナルを産生させることを意味する。好ましい態様においては、シグナル産生は開始剤によって生じる。異なる型の開始剤を使用して、標識から検出可能なシグナルを産生することができる。開始剤／標識対の例としては、以下のものが含まれる：吸収の変化を生じる、基質／酵素または酵素／基質；光放出を生じる過酸化水素／化学発光標識；および光放出を生じる光／蛍光標識。
好ましい標識は、開始して光を放出することができるものである。光放出物質の開始は、光を放出する励起した状態の分子の形成を発生させる。
シグナル変更リガンドによる付加物形成は、標識によるシグナル産生を変更し、好ましくはそれを防げる。「シグナル変更リガンド」とは、標識と会合して、標識からのシグナル産生を変更する付加物を形成することができる化合物のことを言う。好ましくは、付加物の形成は可逆的である。
「シグナル産生の変更」とは、標識から産生したシグナルの形式、量または動力学の変化のことを言う。好ましくは、産生したシグナルは光放出であり、光放出の変更は、以下の１以上を起こすことによって達成される：（１）異なる波長での光放出；（２）光放出の減少；および（３）光放出の動力学の変更。好ましくは、付加物の形成は光放出を妨げる。
「シグナル産生の優先的変更」および「区別」という用語は、分析物に結合した結合パートナー上に存在する標識（結合した標識）からのシグナル産生の変更よりも広範囲まで生じる、分析物に結合していない結合パートナー上に存在する標識（未結合標識）からのシグナル産生の変更のことを言う。結合または未結合の結合パートナー上に存在する標識によるシグナル産生の相違は、当業者が分析物の存在および／または量を検出することを可能にするのに十分なものである。シグナル産生の優先的変更は、分析物に結合した結合パートナー上に存在する標識から産生したシグナルの半分が変更する時間（ｔ1/2結合標識）を、分析物によって結合していない結合パートナー上に存在する標識の半分が変更する時間（ｔ1/2未結合標識）で割ることによって表された示差変更比率の観点から測定することができる。
即ち、本発明の第１の側面は、試料中の分析物の存在または量を分析するための方法を特色とする。本方法は以下の工程を含む：
ａ）試料を標識された結合パートナーに露出する；
ｂ）標識された結合パートナー：分析物複合体の一部でない結合パートナー上に存在する標識を優先的に変更することができるシグナル変更リガンドで試料を処理する；そして
ｃ）変更されなかった標識から産生したシグナルを検出する。
変更されなかった標識から産生したシグナルの検出は、標識を開始してシグナルを産生させ、変更されなかったシグナルの産生を測定することによって達成できる。例えば、リガンドによって変更しなかった光放出標識の存在は、標準技術によって標識を開始して光を放出させ、光放出の動力学、量または波長を測定することによって達成することができる。
好ましい態様においては、標識は、蛍光標識、化学発光標識、および生物発光標識などの光放出標識である。光放出は、発光測定器または蛍光測定器などの標識的装置を使用して測定することができる。好ましくは、シグナル産生および光放出の優先的変更は、本質的に一定温度の下で行われる。「本質的に一定温度」とは、250％、より好ましくは100％、より好ましくは25％、より好ましくは10％、最も好ましくは５％以内のの範囲内の温度の維持のことを言う。より好ましい態様においては、優先的な標識の変更および光放出の開始は本質的に一定な温度で室温（約20〜25℃）で行われる。
付加物保護分析は、異なる形態を使用して行うことができる。例えば、分析は分離工程とともにまたはそれなしで行うことができる。分離工程を回避すると分析は簡単になり、時間、試薬の省略、並びに自動化の単純化などのような利点が得られる。
分析物に結合していない標識結合パートナー又は汚染物質をさらに除去するための分離工程は、光放出を開始する前に行うことができる。分析が精製を経ていない臨床試料において使用される場合には、分離工程は好ましい。
即ち、本発明の特徴を有する分析は、分析物に結合していない結合パートナー上に存在する標識によって産生されたシグナルの優先的変更を含有する分析物の存在または量の検出を提供するものであり、それによって分析物に結合した結合パートナー上に存在する標識によって産生されたシグナルを明確に検出することが可能になる。本分析の万能性は、多数の有用な側面を有しており、広範囲な緩衝条件下で標識変更を行うことによって高い感度を達成できること、本質的に一定の温度を使用して本分析を行うことによって高度の感度を迅速に達成できること、並びに室温で本分析を行うことによって高度の感度を達成できることなどが挙げられる。そのような分析の利点としては、操作工程が少ないために使用が容易であること、時間が節約できること、自動化により適合し易いことなどが含まれる。
異なる標識構造およびシグナル変更リガンドなどの本発明の異なる側面および態様の様々な例を本明細書中に記載する。請求の範囲中に記載されない限り、本明細書中に記載されたこれらの例および他の例は、本発明を限定することを意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、発明の詳細な説明、並びに請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、亜硫酸ナトリウムおよびアクリジニウムエステル標識プローブを使用したシグナル産生の優先的変更をグラフにより示す。
図２は、過酸化水素を使用した化学発光分子の光放出の開始を示す。
図３は、標的の量を増加させた場合の、付加物保護分析を示す。
図４および５は、結合領域に結合したアクリジニウムエステル標識を含有する結合パートナーの例を提供する。結合領域は図中に「プローブ」によって示される。
発明の詳細な説明
付加物保護分析は、付加物形成を利用して、分析物に結合していない結合パートナー上に存在する標識からのシグナル産生を優先的に変更することによって分析物の検出を容易にするものである。標識された結合パートナーが分析物と複合体を形成する場合、分析には保護的マイクロ環境の形成が含まれる。分析物に結合した標識された結合パートナー上に存在する標識は、シグナル変更リガンドとの付加物の形成から優先的に保護される。付加物保護分析を使用して、分析物の存在および／または量を高度の感度で迅速に検出することができる。
分析物の存在または量の指標としてのシグナル産生は、優先的シグナル変更工程を開始させた後の異なる時点で測定することができる。一つの態様においては、シグナル産生は、安定な付加物形成を許容する時点後に、例えば平衡時に、測定される。結合または未結合の結合パートナー上に存在する標識との付加物形成が時間を通じて比較的一定である場合のシグナル産生の測定は、より長い時間範囲に渡って再現可能な結果を得ることを容易にし、多数の実験を一度に行って結果を後で読み取ることが可能になる。
他の態様においては、未結合のパートナー上に存在する標識によって産生されたシグナルに対する結合した結合パートナー上に存在する標識によって産生されたシグナルの比率が最大になる、開始後の時点においてシグナルを測定する。この点に関して、付加物保護分析は、未結合の結合パートナー上に存在する標識が脱離基を切断除去することによって優先的に変更される加水分解分析よりも迅速に進行することができる（下記実施例４及び５を参照）。Arnold他、米国特許第5,283,174号、Nelson他、Nonisotopic DNA Probe Techniques，（Kricka ed.,Academic Press,1992）pp.275−311、中の「化学発光によるアクリジニウムエステルの検出」、Nelson他、Clin.Chem.Acta 194:73−90,1990およびArnold他、Clin.Chem.35:1588−1594,1989には、未結合の結合パートナー上に存在する標識の優先的加水分解切断により好ましくは行うことができる分析が記載されている（これらの文献は各々本明細書中に引用により取り込まれる）。
結合または未結合の結合パートナー上に存在する標識により生じる付加物形成は方程式１および２によって示され、式中、「未結合標識」とは分析物と複合化していない結合パートナー上に存在する標識のことを意味し、「結合標識」とは分析物と複合化した結合パートナー上に存在する標識のことを意味し、「リガンド」とはシグナル変更リガンドのことを意味し、「標識★」は、標識が開始してシグナルを産生できることを示し、そして「標識−リガンド」は、シグナル変更付加物の形成を示す。
0003577085.tif 000002
0003577085.tif 000003
シグナル産生の優先的変更は、K1とK2の相違と、２反応が平衡に達する速度によって影響を受ける。方程式１の平衡定数が高くなると、未結合の結合パートナー上に存在するより多くの標識が平衡時に変更されるようになる。方程式２の平衡定数が低くなると、結合した結合パートナー上に存在するより少ない標識が平衡時に変更されるようになる。方程式１で表された反応は方程式２よりも早い速度で進むので、未結合の結合パートナー上に存在するより多くの標識が、シグナル変更リガンドとの最初の反応の間に優先的に変更される。
シグナル産生の優先的変更に影響を与える因子には、分析物の量と型、標識された結合パートナーの量と型、リガンドの量と型、分析の間に存在する他の成分との相互作用の可能性が含まれる。従って、特定の分析の設計と成分は、分析物の性質と源、使用するシグナル変更リガンドの型、標識された結合パートナーの性質、結合パートナーが分析物と複合化して標識のための保護的マイクロ環境を形成する能力、並びに分析を行う環境を考慮に入れるべきである。
1.感度
本発明を使用して、高度の感度で分析物の存在を検出することができる。感度は、分析が分析物の存在を正確に検出できる能力を反映する。感度は、変更されなかった未結合の結合パートナー中に存在する標識からのシグナル産生と、結合または未結合の結合パートナー上に存在する標識を区別するシグナル変更リガンドの能力の両方から生じるバックグラウンドを考慮に入れる。
図１は、シグナル産生の優先的変更とバックグラウンドとの関係を示す。各曲線は、シグナル変更リガンドの存在下における光放出の開始を示す。ハイブリッド曲線は、シグナル変更から保護された結合標識を意味する一方、プローブ曲線は未結合の結合パートナー上に存在する標識を意味する。示差変更比率を計算するためのｔ1/2値は、２つの曲線の傾きから得ることができる。２つの曲線が水平になる地点は、平衡に達したことを示す。プローブ曲線が水平になる地点はまたバックグラウンドノイズを示す。
核酸分析物を検出するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブに関しては、示差変更比率を、標識プローブのｔ1/2で割ったハイブリッドのｔ1/2を測定することによって決定する。好ましくは、示差変更比率は少なくとも２倍であり、より好ましくは少なくとも15倍であり、さらにより好ましくは少なくとも75倍であり、最も好ましくは少なくとも100倍である。
さらに好ましくは、本分析は、産生されたシグナルが、バックグラウンドの平均＋標準偏差の２倍と等しいかそれより大きい、高感度の条件下で行われる。標準偏差は標準的技術および以下の方程式を使用して計算することができる。
0003577085.tif 000004
式中、は
0003577085.tif 000005
は試料の平均であり、xiは特定の読み値であり、ｎは測定の総数である。
より好ましくは、本分析は、産生されたシグナルが、バックグラウンドの平均＋標準偏差の３倍、より好ましくは標準偏差の４倍、最も好ましくは標準偏差の少なくとも５倍と等しいかそれより大きい、条件下で行われる。
II.分析物
付加物保護分析を使用して、核酸配列および抗原エピトープを含む異なる型の分析物の存在および／または量を検出することができる。試料中に存在する分析物の量は、分析される試料およびどの技術を検出前に分析物の量を増加させるために行うかに依存する。例えば、核酸分析物の数を、PCR（例えば、Mullis他、米国特許第4,683,202号に記載されているようなもの）、および転写に基づく増幅（例えば、Kacian他、米国特許第5,399,491号に記載されているようなもの）などの技術を使用して増加させることができる（これらの文献は共に引用により本明細書中に取り込まれる）。
A.標的核酸の検出
標的核酸配列（例えば、検出または測定することが求められる核酸配列）の検出は、試料中に存在するかもしれない他の核酸配列から配列を区別するために標的核酸配列に対して十分に相補的な核酸プローブを使用して行うことができる。プローブ特異性は、プローブと標的核酸配列との間の相補性の程度、並びにハイブリダイゼーション条件などの当分野で既知の多数の因子によって影響を受ける（例えば、Sambrook他、Molecular Cloning;A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）（引用により本出願に取り込まれる）、並びにHogan他、PCT/US88/03009、上記）。
B.抗原検出
抗体を使用して、抗原上に存在する特定のエピトープの存在を検出することができる。Harlow他、抗体、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory,1988（引用により本明細書中に取り込まれる）は、抗体の作製と使用を記載している。
III.標識された結合パートナー
標識された結合パートナーは、結合パートナーに結合した標識を含む。結合領域は、結合パートナーが分析物に結合できるようにする一方、標識を開始させて検出可能なシグナルを産生することができる。
付加物保護分析は、過剰量の標識された結合パートナーまたは過剰量の分析物を使用して行うことができる。過剰量の標識された結合パートナーを提供することは、低い分析物濃度において感度を増加させるという利点をもたらす。過剰な標識を有することに対する欠点として考えられるのは、より多くの標識された結合パートナーが存在し、それによってバックグラウンドを減少するためにより多くのリガンドが必要になるということである。にもかかわらず、付加物保護分析により達成することができる高感度のために、過剰量の標識された結合パートナーが本分析を実施するためには好ましい。
A.標識
付加物保護分析は、比色、生物発光、蛍光および化学発光標識などの異なる型の標識を使用して行うことができる。標識の選択で考慮すべき因子には以下のものが含まれる：（１）標識は、開始してシグナルを産生する能力が付加物形成によって変更することができるように選択するべきである；（２）標識は、分析物に対する結合パートナーの結合によって形成される保護的マイクロ環境による付加物形成から保護することができる；そして（３）標識は結合パートナーが分析物を認識することを妨げない。
比色標識の例には、基質と組み合わさって吸収の変化を生じさせる生成物を産生することができる酵素を含有する標識、および酵素と組み合わさって吸収の変化を生じさせることができる基質を含有する標識が含まれる。例えば、シグナル変更リガンドは、酵素／基質を有する付加物を形成することによって酵素／基質からのシグナルを変更させて、それによって酵素により触媒された反応を変更することができる。もう一つの別の例は、所定の波長で光を吸収する標識であり、この吸収はリガンドとの反応によって変更する。
本発明は好ましくは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションによって付加物形成から保護される光放出標識を有する核酸プローブを使用して行われる。好ましい光放出標識は、化学発光物質または蛍光物質である。化学発光標識は、加熱または酸化などの化学反応によって開始することができる一方、蛍光標識は光によって開始することができる。光を放出する原因になり得る標識は一般的には蛍光を発することができるが、ある場合には、光による「化学発光」標識の開始は化学発光よりも弱い光放出を生じるかもしれない。
1.化学発光標識
化学発光標識は開始剤によって開始して光を放出するが、開始剤は励起した状態の分子の形成の原因になり、これが崩壊することによって光が放出される。化学発光標識は化学発光分子に結合した脱離基を含有してもよく、この脱離基は化学反応の間に切断され、光の放出が生じる。あるいは、化学発光標識は光放出の開始の間に切断される脱離基を含有しなくてもよい。光の放出の開始の間に切断することができる脱離基を有する化学発光分子の例を以下に記載する。開始の間に切断される脱離基を有さない化学発光分子の例には、ジオキセタン類（dioxetans）、オキサレート類、ジオキセタノン類（dioxetanones）、およびルテニウムキレート類が含まれる。異なる型の化学発光分子の例は、Campbell,Chemiluminescence:Principles and Application in Biology and Medicine,Ellis Horwood社、Chichester England,1988（引用により本明細書中に取り込まれる）により提供される。
図２は、開始剤として過酸化水素を使用した化学発光標識の光放出反応を示す。化学発光標識を開始するための好ましい条件および放出された光の検出方法は当分野で既知である。例えば、Nelson他、「化学発光によるアクリジニウムエステルの検出」（上掲）、およびArnold他、米国特許第5,283,174号（上掲）を参照。
化学発光標識の例、そのような標識の作製、結合パートナーへの標識の結合、並びに化学発光標識の安定性に一般的に影響を与える因子は当分野で既知である。Beheshti他、米国特許第5,290,936号;Campbell他、米国特許第4,946,958号;Law他、米国特許第4,918,192号；第4,745,181号、第5,110,932号および第5,241,070号;Mattingly他、表題「化学発光アクリジニウムおよびフェナントリジニウム塩」、ヨーロッパ特許出願第87114490.3号、公開番号第0273115号;McCapra他、米国特許第5,281,712号;McCapra他、米国特許第5,283,334号;McCapra他、米国特許第5,284,951号;McCapra他、米国特許第5,321,136号;McCapra他、表題「改良した化学発光エステル、チオエステルおよびアミドを利用する分析」、ヨーロッパ特許出願第88121915.8号、ヨーロッパ特許公開番号第0322926号;Ramakrishnan他、米国特許第5,284,952号;Reddy他、表題「化学発光化合物」、国際出願番号PCT/US91/06861、国際公開WO92/09580号;Sato他、表題「アクリジニウム化合物およびその結合体」、ヨーロッパ特許出願第94101664.4号、ヨーロッパ公開番号第0609885号；並びにSheehan他、米国特許第3,539,574号を参照（これらの文献は各々引用により本明細書中に取り込まれる）。これらの因子の中には、化学発光分子の構造、化学発光分子上および脱離基上の置換基の型および位置、並びに脱離基を化学発光分子に連結する結合基の構造が含まれる。例えば、エステル類、アミド類、チオエステル類およびスルホニルアミド類を含む異なる型の結合基が存在してもよい；化学発光分子の安定性は嵩高い基および電子吸引または供与基を一定の位置に置くことによって影響を受けることがある；そして効率的な化学発光のための好ましい脱離基はpKa≦11、好ましくは＜11、より好ましくは５〜８を有し、そしてより好ましくはアリール環または環系である。
Aizawa他、表題「アクリジニウム誘導体発光物の製造方法およびそれによる試験物質の検出方法」、ヨーロッパ特許出願第93919625.1、公開番号0617107A1には、アクリジニウム誘導体の光放出を開始するためのスーパーオキシドアニオン（O2-）の製造と使用が記載されている（この文献は引用により本明細書中に取り込まれる）。Aizawa他により記載された方法は、中性pHで光放出を生成するのに好適であることが示されている。
好ましい化学発光標識には、アリール環系および脱離基を有する化学発光分子が含まれる。好ましくは、アリール環系は１〜４個のアリール基を有し、正電荷を含む（例えば、正電荷は環上に局在することによって、または環置換基上に局在することによって存在する）。より好ましくは、正に帯電したアリール環系は置換した複素環式アリールを含む。
脱離基を有する好ましい化学発光分子は以下の構造を有する：
0003577085.tif 000006
式中、アリール環系は１〜４個の環式基を含み、基の１つは結合炭素「ｃ」に結合しており、より好ましくは、アリール環系は正に帯電しており、より好ましくは、アリール環系は「ｃ」に連結した正に帯電した複素環式アリールを含み；複素環式アリールの例には、アクリジニウム、ベンズ〔ａ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｃ〕アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環式置換キノリニウム、ピリジニウム、ピリミジニニウム、ピリダジニウム、ピラジニニウム、フェナトリジニウムおよびキノザリニウムが含まれ；
R2は、Ｓ、Ｏおよび、NHから成る群から選択され、好ましくはR2はＯであり；
R3は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換したリン、置換した硫黄、置換したホウ素、および置換したヒ素から成る群から選択され、好ましくはR3はＯ、Ｎ、またはＳのいずれかであり、より好ましくはR3はＯまたはＳであり、最も好ましくはR3はＯであり；
R4は、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、およびアリールオキシから成る群から選択され、R3がハロゲンの場合には存在せず、好ましくはR4はアリールであり、より好ましくはR4は所望により置換されたフェニルであり；そして
R5は、R3がＮでない場合には存在せず、R3がＮの場合にはR5は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、およびアリールオキシから成る群から選択され、好ましくはR5は存在しない。
正に帯電した構造Ｉの化合物はカウンターイオンとイオン的に会合している。ハロゲン、硫酸塩、アルキル硫酸塩、ハロ硫酸塩、ハロホウ酸塩、ハロ酢酸塩、ハロリン酸塩、およびリン酸塩などの様々な異なるアニオンをカウンターイオンとして使用することができる。
より好ましくは、化学発光標識は、構造IIで示されるような、脱離基に結合したアクリジニウムから構成される。
0003577085.tif 000007
式中、R1は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリールから成る群から選択され；好ましくはR1は低級アルキルであり、より好ましくはメチルであり；
ｎは０、１、２、３、または４であり、好ましくはｎは０、１、または２であり；
ｍは０、１、２、３、または４であり、好ましくはｍは０、１、または２であり；
各々のｘは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、アミド、アセチル、置換アセチル、およびアリールオキシから成る群から選択され、残りのＡ環置換基は水素であり、好ましくは各々のｘは独立してアルキルまたはアルコキシであり、より好ましくは各々のｘは独立して低級アルキルまたは低級アルコキシであり、最も好ましくは各々のｘは独立してメチルまたはメトキシであり；
各々のｙは独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオール、およびアリールオキシから成る群から選択され、残りのＣ環置換基は水素であり、好ましくは各々のｙは独立してアルキルまたはアルコキシであり、より好ましくは各々のｙは低級アルキルまたは低級アルコキシであり、最も好ましくは各々のｙは独立してメチルまたはメトキシであり；そして
R2、R3、R4およびR5は構造Ｉの化合物についての上記と同様に定義される。
脱離基に連結した他のより好ましい化学発光分子は、ベンズ〔ａ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｃ〕アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環式置換キノリニウム、ピリジニウム、ピリミジニニウム、ピリダジニウム、ピラジニニウム、フェナトリジニウムおよびキノザリニウムから成る群から選択される複素環式環系を有し；環系の各々の環は、各々の利用可能な炭素が各々独立してX/Y置換基を有する構造IIの化合物と同様に置換されており、より好ましくは各々の環は０〜２個の置換基を有し；そして環の一つは、R1に結合したＮと結合基に結合した炭素原子とを含有する正に帯電した複素環式環である。
2.蛍光標識
蛍光標識は典型的には、光によって励起して励起した状態の分子を産生することができる芳香族基を含有する。シグナル変更リガンドの結合は蛍光を変更させることができる。上記のように、アクリジニウムエステルのような化学発光標識は蛍光標識にもなり得る。即ち、蛍光標識の例には、上記のセクションIII.A.1中の化学発行物質として記載したような標識が含まれる。蛍光標識の例にはまた、ローダミン、フルオレセイン、ルテニウム、エチジウムハロゲン化物、およびアクリジンなどの挿入剤または溝（groove）結合剤が含まれる。
好ましい蛍光標識は共役したpi電子系、好ましくは芳香環を有する。芳香環からの蛍光は、芳香環の芳香性を、例えば付加物形成によって、破壊することによって変更することができる。
3.化学的定義
以下は、異なる標識中に存在してもよい化学基の幾つかの説明である。本明細書中に提供される異なる基本化学構造は異なる基によって置換することができる。以下に記載した異なる基の各々の置換は、非反応性である（即ち、分析物と反応せず、シグナル変更付加物形成の妨げず、またはシグナル産生を妨げない）原子（単数または複数）により行うことができる。基本構造への置換の例はまた以下に記載される。
「アセチル」は、Ｃ（＝Ｏ）−CH3を意味する。
「アミノ」は、−NH2を意味する。
「アミド」は、Ｃ（＝Ｏ）−NH2を意味する。
「アルキル」基は、所望により置換された飽和脂肪族炭化水素を意味し、直鎖、分枝鎖、および環式アルキル基を包含する。好ましくは、アルキル基は１〜25個の炭素を有し、20以下のヘテロ原子を含有する。より好ましくは、それは１〜12個の炭素、さらに好ましくは１〜４個の炭素の低級アルキルである。ヘテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素から成る群から選択される。
「アルケニル」基は、少なくとも１個の二重結合を含有する所望により置換された炭化水素を意味し、直鎖、分枝鎖、および環式アルケニル基を包含し、これらは全て所望により置換されていてもよい。好ましくは、アルケニル基は２〜25個の炭素を有し、20以下のヘテロ原子を含有する。より好ましくは、それは２〜12個の炭素、さらに好ましくは２〜４個の炭素の低級アルケニルである。へテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素から成る群から選択される。
「アルキニル」基は、少なくとも１個の三重結合を含有する所望により置換された未飽和の炭化水素を意味し、直鎖、分枝鎖、および環式アルキニル基を包含し、これらは全て所望により置換されていてもよい。好ましくは、アルキニル基は２〜25個の炭素を有し、20以下のヘテロ原子を含有する。より好ましくは、それは２〜12個の炭素、さらに好ましくは２〜４個の炭素の低級アルキニルである。ヘテロ原子は好ましくは、窒素、硫黄、リン、および酸素から成る群から選択される。
「アリール」とは、共役したpi電子系を有する少なくとも１個の環を有する所望により置換した芳香族基を意味し、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール、ビアリール、およびトリアリール基を含む。アリール置換置換基の例には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、置換アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、スルホニル、ハロゲン、チオールおよびアリールオキシが含まれる。
「炭素環式アリール」とは、芳香環上の全ての原子が炭素原子であるアリールを意味する。炭素原子はアリールについて上記したように所望により置換されている。好ましくは、炭素環式アリールは所望により置換したフェニルである。
「ヘテロ環式アリール」とは、芳香環中に環原子として１〜３個のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素原子であるアリールを意味する。好適なヘテロ原子には、酸素、硫黄および窒素が含まれる。ヘテロ環式アリールの例には、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、およびイミダゾリルが含まれる。ヘテロ環式アリールはアリールについて上記したように所望により置換されている。
「アルコキシ」とは、「アルキル」が上記定義したものであり、「Ｏ」が酸素である、「−Ｏ−アルキル」を意味する。好ましくは、アルコキシはＯ−低級アルキルである。
「アリールアルキル」は、「アリール」が上記定義したものであり、「Ｏ」が酸素である、「−Ｏ−アリール」を意味する。
「ニトロ」は、NO2を意味する。
「スルホニル」は、Ｓ（Ｏ）２−Ｒを意味し、式中Ｒは非反応性の原子（単数または複数）である。Ｒの例には、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロゲン、アミノ、および置換アミノが含まれる。
「置換アセチル」は、Ｃ（＝Ｏ）−CH（Ｒ）２を意味し、式中各々のＲは非反応性化学原子（単数または複数）であり、但し少なくとも１個のＲは水素ではない。そのような置換基の例には、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、カルボキシ、およびアルコキシが含まれる。
「置換アミノ」は、−NH−Ｒを意味し、式中Ｒは任意の非反応性化学原子（単数または複数）である。そのような置換基の例には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アミノ、カルボキシ、およびアルコキシが含まれる。
「置換されたリン」とは、−Ｐ（Ｒ）３を意味し、式中各々のＲは任意の非反応性化学原子（単数または複数）である。Ｒの例には、Ｏ、＝Ｏ、Ｓ、CH3、Se、およびAsが含まれる。
「置換された硫黄」とは、化学量論に従い非反応性である水素以外の任意の原子（単数または複数）の存在を意味する。
「置換されたホウ素」とは、化学量論に従い非反応性である水素以外の任意の原子（単数または複数）の存在を意味する。
「置換されたヒ素」とは、化学量論に従い非反応性である水素以外の任意の原子（単数または複数）の存在を意味する。
B.結合領域
結合領域は分析物の一部を認識して、付加物形成によるシグナル変更から標識を保護する分析物によるマイクロ環境の形成を可能にするように設計される。好ましくは、結合領域は、標的核酸配列にある程度相補的な核酸配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを、特定の微生物に特徴的な標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。一方、高度の特異性を有さないハイブリダイゼーションプローブを異なる分析において使用することができる。プローブの高度の特異性が必要でない応用の例には、１より多くの関連配列にハイブリダイズするようにプローブが設計される場合、標識核酸が汚染物から分離される場合などが含まれる。標的核酸は、例えば捕捉プローブ（例えば、Collins、表題「アフィニティー分析のための標的およびバックグラウンド捕捉法および装置」、ヨーロッパ特許出願第87309308.2号、ヨーロッパ公開番号第0265244B1号を参照、これは引用により本明細書中に取り込まれる）を使用することによって汚染物から分離することができる。
結合領域の他の例は、抗体エピトープ結合ドメインである。抗体を使用して抗原の上に存在する特定のエピトープの存在を検出することができる。例えば、抗体を使用して特定の免疫原性タンパク質を検出することができる。Harlow他、Antibodies;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988（引用により本明細書中に取り込まれる）には抗体の製造と使用が記載されている。
C.標識された結合パートナー合成
標識を含有する結合パートナーは、標準技術を使用して製造することができる。全般的に、標識は、分析物への結合パートナーの結合によって形成される保護的マイクロ環境中に存在することを許容する一方、同時に開始剤がシグナル産生を生じることを許容するような構造を有するべきである。例えば、化学発光分子の光放出が酸化的攻撃によって開始する場合には、結合基は、マイクロ環境中に存在する場合に酸化的攻撃を受けやすい状態であるべきである。
標識は、結合パートナーが分析物に結合して汚染物から分析物を区別することを妨げるべきではない。例えば、標識された核酸プローブが特定の生物体の存在を指示する能力は完全な状態にあるべきである。
特定の核酸配列および塩基組成を有する核酸プローブは、標準技術を使用して構築することができる。塩基組成の修飾を行って、例えば、2'−Ｏ−位のアルキル化によって（例えば、2'−メトキシ基）オリゴヌクレオチドの安定性を高めることができる。（Miller他、表題「酸性pHでの安定性を改良するために修飾されたオリゴヌクレオチド」、国際出願番号PCT/US94/00157、国際公開番号WO94/15619（引用により本明細書中に取り込まれる）を参照）。オリゴヌクレオチドの有機合成はヌクレオチドを１個ずつの様式で追加していくことによって行うことができる。Eckstein,F.,Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach,1−５章、1991、はオリゴヌクレオチドの有機合成を概説している;Caruthers他、Methods In Enzymology vol.154 p.287（1987）は、標準ホスホルアミダイト固相化学を使用するホスホジエステル結合を含有するオリゴヌクレオチドの有機合成の方法を記載している;Bhatt、米国特許第5,252,723号は、ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドの有機合成の方法を記載している；そしてKlem他、表題「オリゴマーの合成の改良法」、PCT  WO92/07864は、メチルホスホネート結合を含む異なるヌクレオチド内結合を有するオリゴヌクレオチドの有機合成を記載している。（これらの文献は各々引用により本明細書中に取り込まれる。）
標識は、Arnold他、表題「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」、EPO出願番号88308766、公開番号EP313219;Arnold他、米国特許第5,185,439号；およびNelson他、「化学発光によるアクリジニウムエステルの検出」、Nonisotopic DNA Probe Techniques,（Kricka ed.,Academic Press,1992）pp.275−311に記載されているような技術を使用して核酸結合パートナーに結合することができる。これらの文献は、核酸結合領域に結合したアクリジニウムエステルを含有する結合パートナーを製造することに焦点を当てている。しかしながら、同様の技術を使用して他の標識を他の結合パートナーに結合することができる（標識に結合した結合パートナーを製造するためのさらに別の文献は、上記セクションIII.A.1に記載されている）。
光放出分子は、Weeks他、アクリジニウムエステルを使用する免疫分析、Methods Enzymol 133:366−368（1986）並びに、光放出標識の抗体への結合に関する上記セクションIII.A.1に記載した文献に記載されているような技術を使用して抗体に結合することができる。抗体はHarlow他（上掲）に記載されているような標準技術を使用して製造することができる。
IV.シグナル変更リガンド
付加物保護分析に好適なシグナル変更リガンドは、未結合の結合パートナー上に存在する標識と、分析物に結合した結合パートナー上に存在する標識とを区別することができる。分析で使用するリガンドの量は異なる様式で分析に影響を与えうる。例えば、より多量のリガンドを提供すると、結合したまたは未結合の結合パートナー上に存在する変更した標識の数を増加させることができる。
好ましいリガンドは、未結合の結合パートナー上に存在する標識と速やかに反応し、および／または高い方程式１の平衡定数を与える一方で、分析物に結合した結合パートナー上に存在する標識と非常にゆっくり反応し、および／または低い方程２の平衡定数を有するものである。より好ましくは、シグナル変更リガンドは、分析物に結合していない結合パートナー上に存在する標識と急速に反応し、高い方程式１の平衡定数を与え、結合した結合パートナー上の標識とゆっくり反応し、低い方程式２の平衡定数を与える。
好ましいシグナル変更リガンドは、分析条件下で結合したまたは未結合の結合パートナー上に存在する標識を区別することができ、未結合の結合パートナー上に存在する標識と強力な付加物を形成する求核試薬である。例えば、脱離基に結合した結合基を有する好ましい光放出標識の場合、形成した付加物は、過酸化水素およびスーパーオキシドイオンなどの酸化性試薬によって酸化されることから結合基を阻害するべきである。Arnold他、米国特許第4,950,613号およびHammond他、J.Biolumin.Chemilumin.6:35−43,1991には、光放出を妨げるアクリジニウムエステルとの保護付加物を形成することができるリガンドが記載されている（これらの文献は共に引用により本明細書中に取り込まれる）。
好ましいリガンドは、リガンドが強力な求核試薬として作用することを可能にする電子の孤立対を有する。さらに好ましくは、電子の孤立対はVI族の元素上に存在し、最も好ましくはその元素は硫黄である。好ましくは、電子の孤立対を含有する元素は、共役したpi電子系またはニトリル基に隣接していない。例えば、電子の孤立対を含有する元素は芳香環に隣接するべきではない。好適なシグナル変更リガンドの例としては、テトラヒドロチオペン、プロパンチオール、ベンジルメルカプタン、亜硫酸塩、亜硫酸グリコール、ヒドロ亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオリン酸塩、メタ亜ヒ酸塩、亜テルル酸塩、亜ヒ酸塩およびチオシアネートが含まれる。
V.核酸標的配列の検出
付加物保護分析は好ましくは、標的核酸配列の存在を検出するための核酸プローブを使用して行われる。標識プローブ：標的ハイブリッドにより標識に与えられる保護の程度は、存在するヌクレオチド塩基の型、プローブおよびハイブリッドのヌクレオチド配列を含み因子によって影響を受ける。
付加物保護分析を使用して、DNAおよびRNAなどの異なる核酸標的を検出することができる。分析は好ましくは、RNA標的を使用して行われる。RNAの製造およびDNAで開始するRNA標的の増幅、またはRNAで開始するRNA標的の増幅の方法は当分野で既知である。例えば、Kacian他、米国特許第5,399,491号を参照。
VI.実施例
本発明の異なる側面および態様を例示するために実施例を以下に記載する。これらの実施例は、標識としてアクリジニウムエステルを使用して本発明を例示する。多くの他のカチオン性ヘテロ芳香族種と同様にアクリジニウムエステルは、求核試薬と可逆的に反応して付加物を形成する。付加物の形成の結果として、アクリジニウムエステルの幾つかの重要な特性が著しく変更する。アクリジニウムエステル上の付加物形成のための好ましい部位は、Ｃ−９位である。付加物形成はアクリジニウムエステルの可視スペクトルを変更し、アクリジニウムエステル蛍光を強く阻害し、加水分解に対してアクリジニウムエステルのエステル結合を安定化し、そして過酸化物イオンまたはスーパーオキシドイオンなどの開始剤とアクリジニウムエステルとの反応を阻害して化学発光を生成させる。
これらの実施例は、開示された本発明を限定することはいかなる点においても意図していない。実施例は、異なる標識およびシグナル変更リガンドを通常の方法によって容易に同定して、それらが所望の活性を有することを確認するための方法を例示するものである。例えば、本明細書中に記載した式の範囲内の標識をスクリーニングして最も好適な活性を有する標識を決定することができる。
実施例1:結合したまたは未結合の結合パートナー上の標識の優先的区別
芳香環またはニトリル基に共役していない自由電子対を有する硫黄原子を含有する化合物は、アクリジニウムエステルで標識された一本鎖プローブと強力な付加物を形成するが、標的核酸分析物にハイブリダイズした同一のプローブとは形成しないことが判明した。この実施例は、未結合の結合パートナー上に存在する標識を優先的に変更するシグナル変更リガンドの使用を例示する。
ハイブリダイゼーション
15μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（100mMのコハク酸リチウム（pH5.2）、8.5％（w/v）のラウリル硫酸リチウム、1.5mMのEDTA、1.5mMのEGTA）に、1pmolのアクリジニウムエステル（AE）−標識プローブ（７×107RLU/pmol）および4pmolの標的を添加した。AE−標識プローブの配列は配列番号1:5'−GGGGTTCTT＊Ｔ  TCGCCTTTCC  CTCACGG（式中＊はアクリジニウムエステル標識の位置を示す）に記載される。標的配列は配列番号2:5'−CCGTGAGGGA  AAGGCGAAAA  GAACCCCに記載される。
得られた溶液を水で30μｌに調整し、60℃で30分間加熱し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液で500μｌに希釈した。
付加物保護
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、２μｌのAE−標識プローブまたはハイブリッド（400,000RLU）を添加した。この溶液に、100μｌの付加物形成緩衝液（10mMの亜硫酸ナトリウム、30mMのホウ酸緩衝液（pH8.7）、1.5％のTriton  TX100）を添加した。溶液を次いでボルテックスし、室温（約22〜25℃）で異なる時間放置した。得られた溶液の化学発光を、検出Ｉ（0.001NのNHNO3の0.1％（v/v）のH2O2）の注入と、その0.5〜２秒後の検出II（200μｌの1NのNaOH）の注入とによって測定した。光放出を５秒間隔に渡って積分した。
結果
図１に示すように、亜硫酸ナトリウムはAE−プローブと非常に急速に反応し、150秒後に反応は平衡に達する。対照的に、同一のAE−プローブが相補核酸標的にハイブリダイズする場合、得られたAE−ハイブリッドは非常にゆっくりと亜硫酸ナトリウムと反応する。
亜硫酸ナトリウムの濃度がより低い場合、アクリジニウムエステルとの付加物の形成は少なくなるが、付加物の形成は、AE−プローブ対AE−ハイブリッド上では依然としてより強くて速い。亜硫酸ナトリウムの濃度がより高い場合（200mM）、より多くの付加物がアクリジニウムエステル上に形成するが、AE−プローブとAE−ハイブリッドとの区別は減少する。
実施例2:標的配列の検出
標的配列の存在を検出できる付加物保護分析の能力を、多過剰のアクリジニウムエステル標識プローブを使用し、相補標的の量を減少させて試薬した。
ハイブリダイゼーション
20μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に、様々な量の標的と0.05pmolのプローブを添加した。AE−標識プローブの配列は配列番号3:5'−ATCATCCATG  TATTGAT＊AGA  TAACTATGTC  TGG（式中＊はアクリジニウムエステル標識の位置を示す）に記載される。標的配列は配列番号4:5'−CCAGACATAG  TTATCTATCA  ATACATGGAT  GATに記載される。得られた溶液を次いで60℃に30分間加熱した。
付加物保護
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、200μｌの付加物形成溶液（60mMのテトラホウ酸ナトリウム（pH8.8）、２％（v/v）のTX100、20mMの亜硫酸ナトリウム）を添加した。溶液をボルテックスし、室温で15秒間インキュベートした。得られた溶液の化学発光を、検出Ｉの注入と、その0.5秒後の検出IIの注入とによって測定した。光放出を５秒間の期間に渡って積分した。
結果
図３に示すように、付加物形成分析は、多過剰のアクリジニウムエステル標識プローブを使用し、相補標識の量を減少することによって標的配列の存在を検出することができた。
実施例3:異なるアクリジニウムエステル構造
この実施例は、付加物保護分析における異なるアクリジニウムエステル誘導体の使用と、異なるアクリジニウムエステル誘導体の構造が付加物形成速度に及ぼす効果を例示する。アクリジニウム環上における電子供与基の効果は、１−メチル−AEおよび2,7−ジメチル−AEを使用して調べた。核酸に結合した異なる脱離基の効果はｏ−AE、ナフチルAE、ｏ−Me−Cin−AE、ｏ−ジMe−Ae、およびｏ−ジBr−AEを使用して調べた。これらの異なるアクリジニウムエステルの構造は図４および図５に示す。亜硫酸ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムをシグナル変更リガンドとして使用した。
ハイブリダイゼーション
15μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（0.2Mのコハク酸リチウム（pH5.2）、1.0MのLiCl、0.2％のTriton  Ｘ−100）に、0.1pmolのプローブ（７×107RLU/pmol）および0.1pmolのDNA標的を添加した。AE−標識プローブの配列は配列番号5:5'−GCTCGTTGCG  GGACTT＊AACC  CAACAT（式中＊はアクリジニウムエステル標識の位置を示す）に記載される。標的配列は配列番号6:5'−ATGTTGGGTT  AAGTCCCGCA  ACGAGCに記載される。得られた溶液を水で30μｌに調整し、60℃で60分間加熱し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液で500μｌに希釈した。
付加物保護
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、30μｌのホウ酸緩衝液（30mMのホウ酸塩（pH8.8）、１％のTriton  X100）と３〜５μｌのプローブまたはハイブリッド（200,000〜300,000RLU）を添加した。この溶液に、10μｌの0.1Mの亜硫酸ナトリウムまたは0.1Mのメタ重亜硫酸ナトリウムを添加した。溶液を次いでボルテックスし、室温で異なる時間放置した。得られた溶液の化学発光を、検出Ｉの注入と、その0.5〜２秒後の検出IIの注入とによって測定した。光放出を５秒間に渡って積分した。
結果
プローブまたはハイブリッドのいずれかに付着した場合、未置換のアクリジニウム環を有するアクリジニウムエステル（AE、ｏ−AE、ナフチルAE、ｏ−Me−Cin−AE、ｏ−ジMe−Ae、およびｏ−ジBr−AE）は、ほぼ同じ速度で（10の因子の範囲内で）亜硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムと付加物を形成した。対照的に１−Me−AEおよび2,7−ジ−Me−AEは、未置換のアクリジニウムエステル誘導体よりも10倍以上遅い速度で付加物を形成した。これらのメチル化誘導体によって付加物形成速度が遅くなることは、アクリジニウムエステルのＣ−９位での正電荷を減少し、それによって付加物形成速度を減少することができる、メチル基の電子供与特性によって説明することができる。
これらの実験の結果を表Ｉに示す。
0003577085.tif 000008
即ち、標識の構造は付加物を形成するその能力に影響を与える。例えば、プローブまたはハイブリッドに付着した標識については、ｏ−ジBr−AEによる付加物形成の速度は各々、同一のプローブまたはハイブリッドに付着した2,7−ジMe−AEによる付加物形成の速度よりも24倍および45倍速い。
実施例4:単一塩基ミス対合の検出
この実施例は、付加物保護分析が単一塩基対ミス対合を検出できる能力を例示する。プローブを、TW（野性型標的）、TM1（ミス対合標的１）およびTM2（ミス対合標的２）と命名された３種の異なる標的配列にハイブリダイズさせた。プローブのTWへのハイブリダイゼーションは、ミス対合を有さないハイブリッドを産生し、プローブのTM1へのハイブリダイゼーションは１個のミス対合を有するハイブリッドを産生し、プローブのTM2へのハイブリダイゼーションは２個の隣接するミス対合を有するハイブリッドを産生する。
TW、TM1、およびTM2とハイブリダイズしたプローブの付加物形成速度を測定した。比較目的のために、各プローブおよび標的の加水分解速度もまた加水分解分析においてアルカリ溶液を使用して測定した。
プローブおよび標的配列
以下のプローブおよび標的配列をこの実施例で使用した（ここで、＊はアクリジニウムエステル標識の位置を示す）：
0003577085.tif 000009
ハイブリダイゼーション
60μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（100mMのコハク酸リチウム（pH5.2）、8.5％のラウリル硫酸リチウム、1.5mMのEDTA、1.5mMのEGTA）に、2.5pmolの標的および0.05pmolのプローブを添加した。得られた溶液を60℃で30分間加熱し、次いで500μｌの50mMのコハク酸リチウム（pH5.2）、および250mMの塩化リチウム中に希釈した。
付加物保護
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、100μｌのホウ酸緩衝液（60mMのホウ酸塩（pH8.8）、２％（v/v）のTX100）および10μｌのプローブまたはハイブリッドを添加した。この溶液に100μｌの20mMの亜硫酸ナトリウムを添加した。溶液を次いでボルテックスし、室温で異なる時間放置した。得られた溶液の化学発光を、検出Ｉの注入と、その0.5秒後の検出IIの注入とによって測定した。光放出を５秒間に渡って積分した。
加水分解
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、100μｌのホウ酸緩衝液（190mMのテトラホウ酸ナトリウム（pH7.6）、6.9％（v/v）のTX−100、0.02％の魚ゼラチン（Fisher））および10μｌのプローブまたはハイブリッドを添加した。得られた溶液を60℃で加熱し、様々な時点で試料を採取し、0.1％（v/v）H2O2を含有する200μｌの0.4  NHClに添加した。得られた溶液の化学発光を検出IIの注入によって測定し、光放出を５秒間に渡って積分した。
結果
結果を表IIに示す。
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加水分解分析において、ミス対合したハイブリッドは、ミス対合を欠く同一のハイブリッドよりも早く加水分解し、分析中の単一塩基対ミス対合はミス対合したハイブリッドからのシグナル産生を有意に減少させた。
付加物保護分析におけるミス対合の効果は、加水分解分析におけるミス対合の効果とは著しく異なる。加水分解分析に関して得られた結果とは対照的に、単一ミス対合は、付加物保護分析において結合したまたは未結合のプローブ上に存在する標識の区別を多少なりとも生じうる。即ち、付加物保護分析に対するミス対合の影響は、特定のミス対合したプローブ：標的ハイブリッドに関して再現可能である一方、異なるプローブ標的ハイブリッドについては変化することができる（即ち、保護を増加または減少することができる）。
表IIはまた、付加物保護分析および加水分解分析についてのシグナル産生速度の変化の相違を示す。表IIにおいて、付加物保護分析についてのシグナル産生の異なる変更の速度は秒で測定されている一方、シグナル産生速度の加水分解変更は分で測定されている。全般的に、シグナル産生速度の変更は、加水分解分析と比較して、付加物保護分析においては12〜32倍速かった。
実施例5:異なる核酸構造
付加物形成速度とプローブまたは標的中に存在する核酸（RNAまたはDNA）の型との間の関係がこの実施例中に要約される。これらの実験では、小さいRNAまたはDNA  AE標識プローブを小さい相補RNAまたはDNA標的に、または大きなリボソームRNA標的にハイブリダイズさせた。比較目的のために、各プローブおよび得られたハイブリッドの加水分解速度も測定した。他に断らない限り、分析は以下のオリゴヌクレオチドを使用して実施例３に記載したように実施した。
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tRNA標的へのハイブリダイゼーション：
15μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液に２μｇ（1.25pmol）のE.coli  rRNAを添加した。得られた溶液を水で30μｌに調整し、70℃で10分間加熱した。16/17位置でアクリジニウムエステルで標識した配列番号５のプローブ1/10pmolを次いで溶液に添加した。溶液を60℃で１時間加熱し、室温に冷却し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液で500μｌに希釈した。
結果
結果を表IIIに示す。
0003577085.tif 000012
表IIIに見られる挙動は、異なる核酸ハイブリッドの立体配置に関連しているのかもしれない。DNA/DNAハイブリッドはＢ立体配置で存在し、RNA/RNAハイブリッドはＡ立体配置で存在し、１個のDNA鎖と１個のRNA鎖を含有する核酸ハイブリッドはＡ状の立体配置を採用すると考えられる。
区別に対するRNA標的および／またはRNAプローブの影響は、付加物保護分析と加水分解分析に関して相違する。付加物保護分析においては、区別は標的とプローブの両方がRNAである場合には増加する。対照的に、加水分解分析については、最大量の区別がDNAプローブとRNA標的について観察された。さらに、付加物保護分析は、実施例で使用した実験条件下において加水分解分析よりも大きな区別を与えた。
全般的に、Ａ状の立体配置は、Ａ立体配置と同様の付加物形成速度を示した。対照的に、これらのＡ状の立体配置の加水分解速度は、標的鎖がDNAである場合にはＢ立体配置の加水分解速度に似ている一方、標的鎖がRNAである場合にはＡ立体配置の加水分解速度に似ている。即ち、付加物形成速度は、プローブおよび／または標的がDNAまたはRNAであるかに依存し、これらの速度は、これらの分子に同一に関連した標識の対応する加水分解速度とは直接的には相関していない。
実施例6:AE−標識を使用する標識設置効果
アクリジニウムエステルリンカー部位の位置に対する付加物形成速度の依存性を調べるために、プローブに沿って異なる位置にアクリジニウムエステルリンカー部位を含有するプローブのセットを作製した。次いで、このプローブのセットを相補標的にハイブリダイズさせ、得られたAE−標識ハイブリッドおよびAE−標識プローブを亜硫酸ナトリウムと反応させた。比較目的のために、プローブおよびハイブリッドの同一セットの加水分解速度を加水分解分析によって測定した。以下に要約するように、付加物形成速度は、ハイブリッドについては１塩基から次の塩基までに大きく（10倍）変化し、プローブについては１塩基から次の塩基までに少しだけ（2.6倍）変化する。対照的に、ハイブリッドまたはプローブについての加水分解速度の変化はより小さい（各々、２倍および1.6倍）。即ち、AE−標識プローブとAE−標識ハイブリッドを区別する付加物の能力は、AEリンカー部位の位置を変化することによって大きく増強することができる。
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実施例7:異なるシグナル変更リガンドの性能
未結合標識からのシグナル産生の優先的変更による分析物の検出を容易にするためには、付加物形成化合物が標識と強く反応することが重要である。表Ｖは、多様な求核試薬が未結合AE−標識プローブと反応する実験を要約する。
各々の求核試薬について、付加物を形成しなかったプローブの百分率を一定範囲の求核試薬濃度について測定した。硫黄以外の原子上に電子の遊離対を含有する化合物（硫酸塩、次亜リン酸塩）は、アクリジニウムエステルと強い付加物を形成しなかった。
対照的に、電子の遊離対を有する硫黄原子を含有する化合物（テトラヒドロチオフェン、プロパンチオール、亜硫酸ナトリウム、ベンジルメルカプタン、ヒドロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸グリコール、メタ重亜硫酸、チオリン酸ナトリウム、およびチオ硫酸ナトリウム）は、アクリジニウムエステルと強い付加物を形成した。一つだけの硫黄を含有する化合物、プロピルジスルフィドは、限定された水溶解度のために、アクリジニウムと強い付加物を形成することができなかった。硫黄に加えて、別のVI b族の原子を含有する化合物（亜テルル酸カリウム）またはVI b族の原子を含有する化合物（メタ亜ヒ酸塩）もアクリジニウムエステルと強い付加物を形成した。
シグナル変更リガンドが未結合AE−標識プローブを優先的に阻害する能力を測定するために、等しい量の未結合および結合したプローブ（AE−ハイブリッド）を、実施例１に記載した方法を使用して、異なる濃度の各々のシグナル変更リガンドと反応させた。区別をDA比率を計算することによって動力学的に、あるいは平衡時に付加物を形成しなかったハイブリッドとプローブの百分率（％ハイブリッド／％プローブ）を計算することによって熱力学的に測定した。未結合のAE−プローブとAE−ハイブリッドとを区別しないシグナル変更リガンドはDAまたは（％ハイブリッド／％プローブ）比率１を示す一方、未結合および結合プローブ上に存在する標識を区別するものは１より大きい比率を示す。
表Ｖに要約するように、未結合プローブ上に存在する標識と強い付加物を形成したほぼ全ての化合物は、結合プローブ上に存在する標識とよりも、未結合プローブ上に存在する標識とより容易に付加物を形成した。区別しなかった化合物は芳香環に共役した硫黄原子（チオフェノール、５−メルカプト−１−メチルテトラゾール、または２−メルカプトイミダゾール）かニトリル基に共役した硫黄原子（チオシアネート）のいずれかを含有した。
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実施例8:APAに対する配列の影響
核酸の配列に対する付加物形成速度の依存性を調べるために、DNAプローブ配列番号１（7/8位置でAEで標識）、配列番号５（16/17位置でAEで標識）、および配列番号13（配列番号13:5'−CTAAAGCGCT T＊TCCACCACA AGAC,ここで＊はアクリジニウムエステル標識の位置を示す）を相補DNA標的（配列番号２、配列番号６、または配列番号14（5'−GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG））
とハイブリダイズさせ、亜硫酸ナトリウムと反応させた。
方法Ａ
方法Ａは実施例３に記載されているように実施した。
方法Ｂ
方法Ｂは以下の通り実施した。
ハイブリダイゼーション
15μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液に、1pmolのAE−標識プローブ（７×107RLU/pmol）および4pmolの標的を添加した。得られた溶液を水で30μｌに調整し、60℃で30分間加熱し、１×ハイブリダイゼーション緩衝液で500μｌに希釈した。
付加物保護
12×75mmのチューブ（Sarstedt）に、２μｌのAE−標識プローブまたはハイブリッド（400,000RLU）を添加した。この溶液に、100μｌの付加物形成緩衝液（10mMの亜硫酸ナトリウム、30mMのホウ酸緩衝液（pH8.7）、1.5％のTriton  TX100）を添加した。溶液を次いでボルテックスし、室温で異なる時間放置した。得られた溶液の化学発光を、検出Ｉの注入と、その0.5〜２秒後の検出IIの注入とによって測定した。光放出を５秒間に渡って積分した。
結果
これらの実験の結果を表VIに示す。
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３種の異なるAE標識プローブ配列並びにそれらの対応ハイブリッドは、亜硫酸ナトリウムと異なる程度で反応する。プローブ配列番号５はプローブ配列番号１よりゆっくり反応し、後者はプローブ配列番号13よりゆっくり反応する。即ち、付加物形成速度は、AE標識プローブの配列並びに対応するハイブリッドの配列によって影響を受ける。
他の態様が以下の請求の範囲の中に含まれる。即ち、幾つかの態様を示して説明してきたが、多様な改良を本発明の精神および範囲から離れることなく行うことができる。
【配列表】
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0003577085.tif 000021
0003577085.tif 000022
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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