(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリ属植物の組織片を感染培地中で液体静置培養又は固体培養してアグロバクテリウム菌に感染させた後に、感染した組織片を抗生物質を添加した除菌培地中で竪型回転培養することによって除菌し、次に感染した組織片を抗生物質を添加した選抜培地中で竪型回転培養することによって形質転換細胞集塊を選抜し、選抜によって得られた細胞集塊をさらに光照射下で竪型回転培養することによって形質転換された苗条原基を作出し、得られた苗条原基を介して形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法において、感染培地及び除菌培地に添加するナフタレン酢酸の濃度が０．２〜２ｍｇ／ｌであることを特徴とする形質転換されたユーカリ属植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アグロバクテリウム菌を用いて形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法に関し、さらに詳しくは、従来のアグロバクテリウム菌による形質転換方法によっては形質転換植物が得られなかったユーカリ属植物に対して、有効な形質転換植物の作出方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物育種技術として、従来より選抜あるいは交雑といった方法が広く利用されている。これらの方法は植物の遺伝子を大きな単位として扱う広義の遺伝子導入であると考えることができる。一方、遺伝子操作技術の進歩によって、特定の遺伝子の単離、その遺伝子の改変、及び植物への導入がいくつかの植物種で可能になってきている。これらの遺伝子操作技術を応用することによって、タバコ、イネ、トマト等の草本性植物において、実用性の高い育種が達成されつつある。しかしながら、一方では多くの植物において、遺伝子操作による植物育種が困難であり、その大きな理由として形質転換技術が未完成であることが考えられる。
【０００３】
植物の形質転換技術は、（１）アグロバクテリウム菌を介して遺伝子を導入する生物的方法、（２）植物細胞に対して物理的あるいは化学的処理を行い、遺伝子を直接的に導入する方法に大別される。両方法は、対象とする植物の再分化系によって、使い分ける必要がある。すなわち、生物的方法を用いる場合は、組織からの形質転換植物の再分化を行う必要があり、また直接的方法の場合は、プロトプラストから再分化を行う必要がある。このような状況において、再分化系の確立されていない植物の場合、組織からの再分化系を確立することは、プロトプラストからの再分化系を確立することより容易であることを考え合わせると、生物的方法によって形質転換する方が適用範囲が広いため、産業上有益であると考えられる。
【０００４】
これまで、組織培養が困難であると考えられてきた木本性植物でも、アグロバクテリウム菌を用いる生物学的方法によって、ロブロリーパイン（Ｓｅｄｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：６４７−６４９（１９８６））  、ポプラ（Ｆｉｌｌａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０６：１９２−１９９（１９８７））  、ウオールナット（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：８００−８０４（１９８８））、リンゴ（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ７：６５８−６６１（１９８９））  、プラム（Ｍａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８５３−８５７（１９９１））等で形質転換植物の作製に成功したことが報告されている。これらの木本性植物で形質転換植物の作出に成功した要因は、組織からの再分化系が確立されていることに起因していると考えられるが、これら以外の新たな植物種で再分化系を確立することは依然として困難である。
【０００５】
一方、本発明者らは、ユーカリ属植物のプロトプラストからコロニーを経て植物体を再生する方法を既に提案している（特開平２−１２８６３１号公報）。さらに、そのプロトプラストに対して、エレクトロポレーション法によって遺伝子を導入した形質転換植物の作出法も提案している（特開平４−５３４２９号公報）。しかしながら、これらの新規で有効な方法であっても、植物種が異なれば、新たにプロトプラストからの再分化系を確立しなければならない。さらに形質転換植物を得るまでに長期間を要するばかりでなく、形質転換植物が得られる頻度が低い等の点で改良の余地が残されていた。
【０００６】
本発明者らは、苗条原基にアグロバクテリウム菌を感染させる形質転換法についても提案している（特開平２−１３８９６６号公報）。さらにユーカリ属植物の様々な組織に対してアグロバクテリウム菌を感染させて最適組織を決定し、さらにアグロバクテリウム菌の感染によって形質転換された細胞を抗生物質を含む培地で竪型回転培養することで形質転換細胞から選別するとともに、形質転換苗条原基から容易に形質転換植物が再生されることを提案している（特願平６−２３０５０号明細書）。しかしながらアグロバクテリウム菌の感染によって得た形質転換された細胞の形質転換率は実験によって異なり、また形質転換苗条原基の作出も不安定であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アグロバクテリウム菌の感染性が低いユーカリ属植物を効率よく形質転換し、その形質転換細胞から効率よく形質転換植物を作出する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記特願平６−２３０５０号の発明における方法に関連して、さらに形質転換率の向上について鋭意検討した。その結果、アグロバクテリウム菌の感染に用いる感染培地及び除菌に用いる除菌培地におけるＮＡＡの濃度を、従来の方法の苗条原基誘導培地に比べ１０〜１００倍高い０．２〜２ｍｇ／ｌに高めることによって、形質転換率を４倍に向上させる安定かつ効率的に形質転換された細胞を得る方法を発明した。そして得られた形質転換された細胞からは上記方法（特願平６−２３０５０号明細書）と同じ形質転換苗条原基を誘導することができ、さらに容易に形質転換植物を得ることが出来た。
【０００９】
本発明は、ユーカリ属植物の組織片を感染培地中で液体静置培養又は固体培養してアグロバクテリウム菌に感染させた後に、感染した組織片を抗生物質を添加した除菌培地中で竪型回転培養することによって除菌し、次に感染した組織片を抗生物質を添加した選抜培地中で竪型回転培養することによって形質転換細胞集塊を選抜し、選抜によって得られた細胞集塊をさらに光照射下で竪型回転培養することによって形質転換された苗条原基を作出し、得られた苗条原基を介して形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法において、感染培地及び除菌培地に添加するナフタレン酢酸（ＮＡＡ）の濃度を０．２〜２ｍｇ／ｌとすることを特徴とする形質転換されたユーカリ属植物の作出方法である。
【００１０】
なお、形質転換されたユーカリ属植物を作出する方法において、感染培地及び除菌培地に含有させるＮＡＡの濃度を０．２〜２ｍｇ／ｌとする以外は、本発明者らが先に発明した方法（特願平６−２３０５０号明細書）と同じである。以下、本発明の形質転換されたユーカリ属植物の作出方法について詳しく説明する。
【００１１】
アグロバクテリウム菌を感染させるための組織片の作出：
本発明で用いる組織片は子葉又は胚軸で、次の方法によって作出する。すなわち、形質転換することを目的とするユーカリ属植物の種子を殺菌した後、植物の組織培養培地、例えばＢ５培地あるいはＭＳ培地等の寒天培地上に置床して発芽させ、ピンセットとナイフを用いて無菌的に子葉又は胚軸を摘出する。
【００１２】
アグロバクテリウム菌の調整：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無害化したもの、あるいは無害化していない菌株を用意する。導入する遺伝子は、植物細胞内で発現するように改良した後に、Ｔｉプラスミドベクターあるいはバイナリーベクターに結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用する（Ｍ．  Ｄ．  Ｃｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４０６０−４０６４（１９８０））  、（Ｌ．  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３（１９８３））  。上記の方法で得たアグロバクテリウム菌を、ベクターの適正量の選抜抗生物質を添加したＬ−液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （１９７２）  １０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ，  ５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）にて、３０℃、一晩でＯ．Ｄ．６００  が０．８以上まで培養する。
【００１３】
アグロバクテリウム菌の感染：
子葉又は胚軸の植物組織を、０．１％濃度の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）  で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断し、アグロバクテリウム菌感染培地、例えばＷＰＭ（Ｌｏｙｄ  ＆  ＭｃＣｏｗｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐ．  Ｓｏｃ．  ３０：４２１−４２７（１９８０））  、Ｂ５（Ｇａｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ５０：１５１−１５８（１９６８））  、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７（１９６２））培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として１−（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿素（４−ＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）あるいはカイネチン等を、またオーキシン類として苗条原基誘導培地に比べ１０〜１００倍高い０．２〜２ｍｇ／ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）あるいはインドール酢酸（ＩＡＡ）等と、ショ糖、ガラクトース、アセトシリンゴン及びアグロバクテリウム菌を添加した液体培地に植え付ける。さらに好ましくは、植物組織片をアグロバクテリウム菌培養液に漬けた後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固体培地に着床する。これを２０〜３０℃の温度、遮光条件下で１〜２日間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
【００１４】
アグロバクテリウム菌の除菌：
アグロバクテリウム菌を感染させた植物組織片を除菌培地、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４−ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類として苗条原基誘導培地に比べ１０〜１００倍高い０．２〜２ｍｇ／ｌ濃度のＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、例えばカルベニシリン、バンコマイシン、クラフォラン等とショ糖を添加した液体培地に植え付ける。これを２５℃の温度、０〜２，０００ルクスの照度下で３〜１４日間竪型回転培養し、アグロバクテリウム菌の除菌を行う。
【００１５】
形質転換された苗条原基の形成：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した植物組織片を、基本培地として、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４−ＰＵ、ＢＡあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するために、目的導入遺伝子と同時に導入される選抜遺伝子に対応する抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は１〜１０ｒｐｍの回転速度、最高２，０００〜２０，０００ルクスの照度、２０〜３０℃の温度とする。１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続すると、形質転換された細胞の選抜を始めてから１ヵ月程度で、植物組織片中に黄白色の形質転換したカルス形成が認められる。得られたカルスを植物組織片からナイフによって切り離し、さらに竪型回転培養を継続することによって、光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られる。
【００１６】
形質転換植物の再生：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基を、苗条を再生するための培地、例えば、Ｂ５培地、ＭＳ培地等に植物ホルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＡＡ等のオーキシン類、ＢＡ、４−ＰＵ、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン類及び炭素源、さらに形質転換された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した培地で培養する。培養は２０〜３０℃の温度、２，０００〜３，０００ルクスの照度で約６０日間行って苗条を再生させ、さらに、発根させて完全な形質転換植物を得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
供試植物：
ユーカリ属植物としてユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）  を使用した。
【００１８】
子葉又は胚軸の作出：
ユーカリ・カマルドレンシスの種子を、１０倍に希釈したアンチホルミンで１時間殺菌し、さらに、無菌的に７０％の濃度のエタノールに１５秒間、及び５倍に希釈したアンチホルミンに２０分間浸漬して殺菌した。これを植物の組織培養培地であるＢ５寒天培地上で無菌的に発芽させた。発芽した植物から子葉又は胚軸をピンセットとナイフを用いて無菌的に摘出し実験材料とした。
【００１９】
アグロバクテリウム菌の調整：
アグロバクテリウム菌は、そのＴｉプラスミドを無害化したＬＢＡ４４０４株（Ｍ．  Ｗ．  Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：８７１１−８７２１（１９８４））  を使用した。導入遺伝子としてはいかなる遺伝子であろうとも、そのプロモーターを植物用のプロモーターに置換することによって発現させ得る。ここでは、市販品として入手可能なβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をバイナリーベクターｐＢＩ１２１に結合し、アグロバクテリウム菌に形質転換して使用した（Ｒ．  Ａ．  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３９０１−３９０７（１９８７））  。上記のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１を、抗生物質であるカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬ−液体培地にて、３０℃で一晩培養した。
【００２０】
アグロバクテリウム菌のユーカリ属植物組織への感染：
Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ  ４−ＰＵを、さらに１ｍＭガラクトースと１μＭアセトシリンゴンを添加し、さらに１％の濃度になるように前記の方法で調整したアグロバクテリウム菌ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１の培養液を添加した感染培地を作製した。この培地に、ユーカリ属植物の子葉、胚軸の各組織片を０．１％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄処理した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断して移植し、２６℃の温度、遮光条件下で２日間静置培養して、アグロバクテリウム菌を感染させた。
【００２１】
アグロバクテリウム菌の除菌：
アグロバクテリウム菌を感染させた子葉及び胚軸より、アグロバクテリウム菌を除くために、Ｂ５基本培地に３％のショ糖を加え、植物ホルモンとして２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡと０．２ｍｇ／ｌ  ４−ＰＵを、さらにアグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質として、２５０μｇ／ｍｌカルベニシリン、１００μｇ／ｍｌバンコマイシンを添加した除菌培地に移植した。これを２５℃の温度、遮光条件下、２ｒｐｍの回転速度で７日間竪型回転培養して、アグロバクテリウム菌の除菌を行った。
【００２２】
形質転換された苗条原基の形成：
アグロバクテリウム菌を完全に除菌した子葉及び胚軸を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ  ４−ＰＵ、３％ショ糖、及び抗生物質であるジェネチィシン（Ｇ４１８）を３０μｇ／ｍｌで添加した液体培地に、１本の試験管に対し３片の割合で植え付けた。２５℃の温度、遮光条件下７日間、さらに下辺が２，０００ルクス上辺が２０，０００ルクスの光照射下、２ｒｐｍの回転速度で１ヵ月竪型回転培養することによって、組織片中に黄白色で２〜３ｍｍの形質転換したカルスの形成が認められた。得られたカルスを１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続した。結果、光照射下で竪型回転培養をはじめてから４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が得られた。
【００２３】
形質転換植物の再生：
回転培養して得られた形質転換された苗条原基より、形質転換された苗条を再生させるためにＢ５培地に０．０２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ  ＢＡ、１％ショ糖、０．２％ゲランガム（和光純薬）及び３０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加した固体培地に５ｍｍ程度の大きさに調整した苗条原基を移植した。そして、２５℃の温度、照度４０００ルクス、１６時間光照射下で培養した結果、移植後１ヵ月後には苗条の再生が認められた。得られた苗条はＢ５培地に０．０１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、１％ショ糖、０．１５％ゲランガム及び３０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加した発根培地に移植することによって、１ヵ月後には発根が認められ完全な植物体となった。すなわち、本方法の場合、植物組織片への感染から形質転換植物の作出まで５〜１２ヵ月を要した。
【００２４】
形質転換植物における導入遺伝子の存在確認：
抗生物質による選抜によって得られた複数個体について、サザンハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法を用いて導入遺伝子の存在を確認したところ、全個体において遺伝子が導入されていることが確認された。このことより本方法によるユーカリ属植物の形質転換が有効であることが証明された。
【００２５】
形質転換植物における導入遺伝子の発現確認：
サザンハイブリダイゼーション法及びＰＣＲ法によって導入遺伝子の存在を確認された個体について、ＧＵＳ遺伝子の発現を組織染色（Ｓ．  Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７０：１３３−１４０（１９９０））によって調べたところ、葉の周囲、根端及び根毛において強いＧＵＳ遺伝子の発現が確認された。
【００２６】
実施例２
ユーカリ・カマルドレンシスの胚軸断片を材料にして、感染培地及び除菌培地の最適ＮＡＡ濃度について検討した。実施例１と同様に感染培地においてＮＡＡの濃度だけを種々に変化させたアグロバクテリウム菌を感染させた後、さらに実施例１と同様の除菌培地においてＮＡＡの濃度だけを種々に変化させて除菌した後、実施例１と同様の方法によって形質転換カルスの作出を行った。このようにして、感染培地及び除菌培地におけるＮＡＡの濃度が形質転換率に与える影響を比較した。なお形質転換の有無は、組織染色によって確認した。その結果、表１に示したように感染及び除菌においてＮＡＡの濃度を０．２及び２ｍｇ／ｌにした時の形質転換率がともに３０％で最も高かった。
【００２７】
【表１】
0003565284.tif 000002
【００２８】
実施例３
ユーカリ・カマルドレンシスの胚軸片を材料に、実施例１に従ってアグロバクテリウム菌による形質転換実験を行い、感染、除菌及び選抜の各操作におけるＮＡＡの濃度について検討した。なおＮＡＡの濃度は０．０２及び２ｍｇ／ｌを用いた。その結果、表２に示したように感染及び除菌操作に用いる培地のＮＡＡの濃度を２ｍｇ／ｌとし、選抜操作に用いる培地のＮＡＡ濃度を０．０２ｍｇ／ｌとして形質転換コロニーを作出することによって形質転換率を４１％と最も高くすることが出来た。
【００２９】
【表２】
0003565284.tif 000003
【００３０】
【発明の効果】
本発明によって、これまで形質転換植物の作出が困難であったユーカリ属植物においても、効率よく安定的にしかも短期間に形質転換植物の作出が可能となった。さらに、有用遺伝子導入によって、ユーカリ属植物の優良新品種を作出し、その新品種を、形質転換過程で得られる苗条原基を用いことによって、短期間にしかもより安価に有用遺伝形質をもつ苗木として供給することが可能となった。