(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１から１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６及び１００ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのインターロイキン−６レセプターを有効成分とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞の未分化性維持薬。
【請求項２】
１から１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６及び１００ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのインターロイキン−６レセプターを共存させることを特徴とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞の未分化性を維持する方法。
【請求項３】
１から１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６及び１００ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのインターロイキン−６レセプターを有効成分とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞をその未分化性を維持したまま培養するための培養液。
【請求項４】
１から１０００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６及び１００ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌのインターロイキン−６レセプターを共存させることを特徴とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞をその未分化性を維持したまま培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は胚性幹細胞の増殖及び／又は維持を行うために使用される培養液等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、発生工学並びに分子生物学における知識の蓄積と技術の発展に伴い、人為的に調製された外来遺伝子を初期胚に導入し、さらに個体に発生させるトランスジェニック動物（以下ＴＧ動物）の作製が可能となった（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７７，  ｐ７３８０，  １９８０  年参照）。このようなＴＧ動物の作製は、遺伝子工学的手法でクロ−ンされた遺伝子を実際に生体内において発現させることにより、導入された遺伝子の機能や作用を個体レベルで検討すること以外に、疾病モデルＴＧ動物や有用物質生産ＴＧ動物が開発されるにおよび、医学分野のみならず産業分野においても有用性が認識されつつある。
【０００３】
ＴＧ動物の作製方法としては、前核期胚に外来遺伝子断片を極微ピペットで直接注入するマイクロインジェクション法、外来遺伝子を組込んだレトロウイルスを初期胚に感染させるレトロウイルス法等が確立されている。しかしこれらの方法ではいずれも宿主染色体に対し外来遺伝子がランダムに組込まれるため、外来遺伝子の組込み部位を制御することは不可能である。このため再現性や外来遺伝子の効率的な発現等に問題を残している。
【０００４】
一方、発生工学上の新たな分野として、各種個体形成組織への分化能を保持しながら未文化状態のまま試験菅内で培養可能な株化細胞である胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  、以下ＥＳ細胞）が樹立された（Ｅｖａｎｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９２，  ｐ７６３４，  １９８１年参照）。ＥＳ細胞は正常二倍体の核型を保持した正常細胞であり、正常初期胚に移植することにより、初期胚由来の細胞とＥＳ細胞由来細胞が混在したまま一つの個体、すなわちキメラ動物を高率に形成することが確認されている（Ｂｒｅｄｌｅｙ  ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３０９，  ｐ２５５，  １９８６  年参照）。
【０００５】
ＥＳ細胞に対しては、他の株化細胞と同様に、従来法を用いて外来遺伝子を導入することができ、また外来遺伝子導入細胞の集団の中から後述するように相同組み換え体のみを選別できるようになったことで、マイクロインジェクション法等とは異なるＴＧ動物作製法が提案されている。
【０００６】
従来法による外来遺伝子の細胞への導入では、外来遺伝子は宿主染色体上のランダムな位置に組込まれるが、ある一定の確率で外来遺伝子と相同な宿主染色体上の内在性遺伝子との間で相同組換えと呼ばれる染色体異変を起こすことが知られている。すなわち目的とする内在性遺伝子と相同な配列部位を持つ外来遺伝子を導入すれば、ランダムな組換え体と同時に、標的とした内在性遺伝子配列に対して相同組換えを起こした相同組換え体をも生じさせることが可能である。またこのような相同組換え体を選別するために考案された外来遺伝子を導入することにより全組換え細胞集団より相同組換え体のみを選別し、最終的に宿主染色体上の任意の遺伝子を標的として変異を組込んだ相同組換え細胞クロ−ンを獲得することができる（Ｍａｎｓｏｕｒ  ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６，  ｐ３４８，  １９８８  年参照、Ｃａｐｅｃｃｈｉら、ＴＩＧ，  ５，  ｐ７０，  １９８９  年参照）。
【０００７】
以上のような方法は一般にジ−ンタ−ゲッティングと総称されているが、ジ−ンタ−ゲッティングの方法を相同組換えＥＳ細胞の選抜に応用することで、マイクロインジェクション法など従来のＴＧ動物作製方法では不可能であった、任意の位置に外来遺伝子を挿入した相同組換えＴＧ動物作製の可能性が示され、キメラ動物を介したＴＧ動物作製のためのＥＳ細胞に対する期待が高まっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ＥＳ細胞（株）の樹立においては支持細胞層として退仔繊維芽細胞を使用し、以下の過程により行われる。まず、支持細胞層上で初期胚を培養することで初期胚が支持細胞層に定着した後、胚外周の栄養芽細胞の伸展成長が始まる。さらに初期胚内部に存在する内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ：以下ＩＣＭ）  が伸展した栄養芽細胞上でド−ム状に増殖を開始し、十分にＩＣＭが増殖した時点でＩＣＭのみを分離・分散して新たな支持細胞層上に継代する。継代されたＩＣＭ由来細胞の内、未分化形態を維持したまま増殖を続けるものがごくわずかに出現するようになる。この未分化細胞をさらに継代していくことでＥＳ細胞（株）が樹立される（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ら、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ｐｐ７１−１１２，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍ．，  Ｏｘｆｏｒｄ．，  １９８７年参照）。
【０００９】
ＥＳ細胞株を樹立、維持するための培養液としてはＤＭＥ培養液を基礎培養液とし、これに非必須アミノ酸混合液・核酸混合液・メルカプトエタノ−ル・新生児牛血清及び／又は牛胎児血清を加えたものが利用されている。また、マウスＥＳ細胞（株）を樹立・維持する際に、胚性奇形腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ；ＥＣ細胞）培養上清またはバッファロ−ラット肝臓細胞培養上清（ＢＲＬ−ＣＭ）を一定量上記培養液に添加することで、分化抑制及び増殖促進が同時に起こることが報告され（Ｓｍｉｔｈ，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １２１，  ｐ１，  １９８７年参照）  、これらの培養上清に含まれる活性は分化抑制因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ；以下ＤＩＡ）と呼ばれる。さらにその後ＤＩＡは白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；  以下ＬＩＦ）という一種のサイトカインであることが判明している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６，  ｐ６８４，  １９８８  年参照）。
【００１０】
ＬＩＦは、特定のマウスの系統（１２９／ｓｖ系やＣ５７ＢＬ／６系）においては不存在の場合に比較してＥＳ細胞（株）の樹立効率を向上させ、また既に樹立されているＥＳ細胞（株）に対しては分化抑制活性及び増殖促進活性を示す
（Ｐｅａｓｅ，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １４４，  ｐ３４４，  １９９０年参照）。しかし、他のマウスの系統や他種動物において顕著な効果は見られず、なおも前記特定種マウス以外のＥＳ細胞の分化を抑制し、増殖を促進する有効な手法等は報告されていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
インタ−ロイキン−６（以下ＩＬ−６）は、標的細胞膜上のインタ−ロイキン−６レセプタ−（以下ＩＬ−６Ｒ）と結合し、さらにＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの複合体が細胞膜上の膜蛋白質ｇｐ１３０と結合することにより、種々の重要な生理活性を誘導する。また、標的細胞膜上にＩＬ−６Ｒが発現していない場合には、ＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ−６レセプタ−の細胞外領域）が標的細胞膜上のｇｐ１３０に結合することにより、生理活性が誘導される（Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ，  ５８，  ｐ５７３，  １９８９年参照）。近年、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害する抗体を用いた研究（Ｔａｇａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９，  ｐ１０９９８，  １９９２  年参照）により、ｇｐ１３０は、ＩＬ−６だけでなく、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ）等のシグナル伝達因子でもあることが示唆されている。
【００１２】
また、ＬＩＦレセプタ−やｇｐ１３０のｃＤＮＡを細胞に導入してＬＩＦの結合性を調べた研究（Ｇｅａｒｉｎｇ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５５，  ｐ１４３４，  １９９２  年参照）により、ＬＩＦがＥＳ細胞をも含めた標的細胞に作用するためには、標的細胞上にＬＩＦレセプタ−とｇｐ１３０がともに発現していることが必要条件であることも示唆されている。
【００１３】
本発明者らは、以上の知見に基づき、ｇｐ１３０のシグナル伝達に関係するＩＬ−６及び／又はＩＬ−６ＲによるＥＳ細胞の分化抑制及び／又は増殖促進効果について鋭意研究を行った結果、本発明を完成した。即ち本発明は、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを有効成分とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞に対する分化抑制及び／又は増殖促進薬であり、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを共存させることを特徴とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞の分化抑制及び／又は増殖促進方法である。また本発明は、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを有効成分として含有する、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞の増殖及び／又は維持用培養液であり、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを共存させることを特徴とする、多能性及び／又は全能性分化能を持つ胚性幹細胞を増殖及び／又は維持し得る培養方法である。以下本発明を詳細に説明する。
【００１４】
ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒは、いかなる動物種由来のものでも良い。また、自然界に存在する材料から精製又は抽出された天然型のものはもちろん、遺伝子工学的に生産された組換え型のいずれでも良い。更に、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒの基本構造及び／又はアミノ酸配列を基礎とする部分ペプチド、変異体又は修飾体であっても良い。遺伝子工学的ＩＬ−６の製造法は、公知の方法（Ｙａｓｕｋａｗａら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９０  年、Ｓａｉｔｏ  ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９２  年参照）に従うことが、また遺伝子工学的ＩＬ−６Ｒの製造法もまた、公知の方法（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０８，  ｐ６７３，  １９９０年、Ｓａｉｔｏ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８，ｐ１６８，１９９１年参照）に従うことが例示できる。なお、ＩＬ−６Ｒについては、前述の公知方法に記載されたように、細胞膜貫通領域及び細胞内領域の欠失した可溶型（細胞外領域のみの部分ペプチド）であっても良い。すなわち、ＩＬ−６Ｒは、約３６０アミノ酸で構成される細胞外領域だけが、ＩＬ−６との結合及びｇｐ１３０との結合に関与しているからである。
【００１５】
本発明の分化抑制及び／又は増殖促進薬は、ＩＬ−６やＩＬ−６Ｒの相互作用からも、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒを単独で含んでいることで効果を発揮する。しかしながら、目的とするＥＳ細胞がＩＬ−６Ｒを発現していないか、又は十分量のＩＬ−６Ｒを発現していないことが予想される場合等には、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの両方を含むことが必要である。従って、目的とするＥＳ細胞のＩＬ−６やＩＬ−６Ｒの発現が予想できない場合等に備え、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの両方を含む分化抑制及び／又は増殖促進薬を使用することが好ましい。良好な分化抑制及び／又は増殖促進効果を得るため、ＩＬ−６は１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように、ＩＬ−６Ｒは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度となるように含有量を調整することが好ましいが、この範囲以外であっても前記効果を得ることはできる。
【００１６】
ＥＳ細胞の分化抑制及び／又は増殖促進を行うためには、例えばＥＳ細胞の培養液等にＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを添加して、ＥＳ細胞とＩＬ−６等を共存させるのみで良い。ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒは単独で使用しても良いが、目的とするＥＳ細胞がＩＬ−６Ｒを発現していないか、又は十分量のＩＬ−６Ｒを発現していないことが予想される場合等には、特にＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒを使用することが好ましい。良好な分化抑制及び／又は増殖促進効果を得るために、ＩＬ−６は１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように、ＩＬ−６Ｒは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度となるように使用すると良いが、この範囲以外であっても前記効果を得ることはできる。
【００１７】
本発明の培養液は、ＥＳ細胞（株）の樹立、維持及び／又は培養のため、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを含むことを特徴とする。良好な分化抑制及び／又は増殖促進効果を得るために、ＩＬ−６は１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＩＬ−６Ｒは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ添加するが、この範囲以外であっても前記効果を得ることはできる。培養液は、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒを単独で含んでいても良い。しかしながら、目的とするＥＳ細胞が、ＩＬ−６Ｒを発現していないか、又は十分量のＩＬ−６Ｒを発現していないことが予想される場合等には、特にＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒを含むことが好ましい。  培養液は、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒ以外に、既知の培養液組成、例えば１９９、ＮＴＣＴ１３５、ＣＭＲＬ１０６６、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥ、ＭＢ７５２／１、５Ａ、ＲＩＴＣ８０−７、Ｆ−１０、Ｆ−１２、Ｌ−１５又はＭＣＤＢ１０４等の各種培養液及びその変法による培養液の組成、を含むことができる。中でも、好ましくは高グルコ−ス含有培養液、さらに好ましくは非必須アミノ酸混合液（ＮＥＡＡ）、核酸混合液（ＮＭＳ）、メルカプトエタノ−ル、セレン化合物、副腎皮質ホルモン及びその化合物、トランスフェリン、インシュリン等の内から選ばれる添加物を添加した高グルコ−ス含有培養液を用いると良い。このような培養液に、さらに新生児牛血清（ＮＣＳ）及び／又は牛胎児血清（ＦＣＳ）を１〜５０％、さらに好ましくは５〜３０％添加することで、より良好な培養を実現し得る培養液を得ることができる。
【００１８】
前記培養液を使用するＥＳ細胞（株）の培養は、公知の方法により行うことができる。現在までにＥＳ細胞が樹立されていない動物種及び／又は系統においても、ＥＳ細胞（株）の樹立が可能となる。既にＥＳ細胞が樹立されている動物種及び／又は系統においても、新規なＥＳ細胞（株）の樹立効率の向上、培養維持の安定化及び増殖の促進を図ることができる。このようにして多種多様なＥＳ細胞（株）及びＥＳ細胞クロ−ンを容易に提供できるような培養液の開発は、ＥＳ細胞を用いたキメラ動物の作製及びキメラ動物を介するＴＧ動物の作製を大きく進展させることが期待される。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、従来特定の動物種及び／又は系統にのみ限定されていたＥＳ細胞（株）の樹立が、多種多様な動物種及び／又は系統において可能となり、また既にＥＳ細胞が樹立されている動物種及び／又は系統においても新規なＥＳ細胞（株）の樹立効率の向上、培養維持の安定化及び増殖の促進を図ることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１  ＩＬ−６とＩＬ−６ＲによるＥＳ細胞の維持培養−１
１０００ユニット／ｍｌの市販のＬＩＦ（Ａｍｒａｄ  社製）共存下、１５％牛血清含有ＤＭＥＭ培地で継代培養したマウス由来のＥＳ細胞をＡ、Ｂ、Ｃの３つのグル−プに分け、以下のような成分の共存下、２４穴ウエルプレ−トで２５０細胞／ウエルの条件で８日間培養した。
【００２２】
Ａグル−プ：それぞれ１０００、１００、１０又は１ユニット／ｍｌのＬＩＦを含む培地
Ｂグル−プ：それぞれ２００、２０、２又は０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む培地
Ｃグル−プ：それぞれ２００、２０、２又は０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と２μｇ／ｍｌの可溶型ＩＬ−６Ｒを含む培地（可溶型ＩＬ−６Ｒ濃度は常に一定）
培養後、細胞をアルコ−ル固定し、未分化型ＥＳ細胞マ−カ−であるアルカリフォスファタ−ゼの活性測定を市販の測定試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｋｉｔ  Ｎｏ．８６、シグマ社製）を用いて行った。この試薬に含まれるアルカリフォスファタ−ゼ基質は溶液状であるが、アルカリフォスファタ−ゼと反応することで不溶性色素に変換される。なお、前記可溶型ＩＬ−６Ｒは、特開平３−１３３３９０号公報に記載された、全長４６８アミノ酸残基のうち、Ｎ末端から１９アミノ酸残基、Ｃ末端から１２４アミノ酸残基が削除された３２５アミノ酸残基のものである。
【００２３】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、１００ユニット／ｍｌ以上のＬＩＦ存在下（図１のＡ）及び２ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方の共存下（図１のＣ）では、アルカリフォスファタ−ゼ活性が検出され、ＥＳ細胞の未分化性が保たれていることが分かる。一方、ＩＬ−６共存：可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下（図１のＢ）ではアルカリフォスファタ−ゼ活性は検出されず未分化性が保たれていないこと、及び本実施例で使用したＥＳ細胞上にはＩＬ−６Ｒが発現していないことが分かる。
【００２４】
実施例２  ＩＬ−６とＩＬ−６ＲによるＥＳ細胞の維持培養−２
１０００ユニット／ｍｌの市販のＬＩＦ（Ａｍｒａｄ  社製）共存下で、１５％牛血清含有ＤＭＥＭ培地で継代培養してきたマウス由来のＥＳ細胞を、１０００ユニット／ｍｌのＬＩＦ共存下、２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び２μｇ／ｍｌの可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下、２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６共存下、２μｇ／ｍｌの可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下、又はこれらの非存在下で、３．５ｃｍディッシュで９０００細胞／ディッシュの条件で６日間培養した。次に、未分化型ＥＳ細胞の表面マ−カ−であるＳＳＥＡ−１（Ｓｔａｇｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１）に対する抗体を使用して、通常の方法でＦＡＣＳ解析を行った。なお、本実施例で使用した可溶型ＩＬ−６Ｒは実施例１で使用したものと同一である。
【００２５】
結果を図２〜６に示す。これらから明らかなように、ＬＩＦ共存下（図２）及びＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方の共存下（図３）では、ＳＳＥＡ−１の発現が検出され、ＥＳ細胞の未分化性が保たれていることが分かる。一方、ＩＬ−６共存：可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下（図４）、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存：ＩＬ−６非共存下（図５）では、これらを共存させなかった場合（図６）と同様ＳＳＥＡ−１の発現は検出されず、未分化性が保たれていないこと及び本実施例で使用したＥＳ細胞上にはＩＬ−６Ｒが発現していないことが分かる。
【００２６】
実施例３  ＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−によるＥＳ細胞の維持培養−３
実施例２と同様の条件で継代培養してきたＥＳ細胞を、実施例２と同様の各種ファクタ−共存下、チャンバ−スライド（ヌンク社製）で、５００００細胞／チャンバ−の条件で６日間培養した。次に、ＳＳＥＡ−１に対する抗体と、該抗体に対する蛍光色素標識抗体を使用して、イムノステイニングを行った。結果を図７〜１１に示す。
【００２７】
これらから明らかなように、ＬＩＦ共存下（図７）及びＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方の共存下（図８）ではＳＳＥＡ−１の発現が検出され、ＥＳ細胞の未分化性が保たれていることが分かる。一方、ＩＬ−６共存：可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下（図９）、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存：ＩＬ−６非共存下（図１０）では、これらを共存させなかった場合（図１１）と同様にＳＳＥＡ−１の発現は見られず、未分化性が保たれていないこと及び本実施例で使用したＥＳ細胞上にはＩＬ−６Ｒが発現していないことが分かる。
【００２８】
実施例４．ＩＬ−６とＩＬ−６ＲによるＥＳ細胞の維持培養−４
実施例２と同様の条件で継代培養してきたＥＳ細胞を、実施例２と同様の各種ファクタ−存在下、実施例３と同様の培養条件で培養した。次に細胞を固定化し、顕微鏡観察を行った。結果を図１２〜１６に示す。
【００２９】
図４から明らかなように、ＬＩＦ共存下（図１２）及びＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方の共存下（図１３）では、ＥＳ特有の形態（細胞が密に凝集しており細胞中の大部分を核が占めている）が観察され、ＥＳ細胞の未分化性が保たれていることが分かる。ＩＬ−６共存：可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下（図１４）、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存：ＩＬ−６非共存下（図１５）では、これらを共存させなかった場合（図１６）と同様にこのような形態は観察されず、未分化性が保たれていないこと及び本実施例で使用したＥＳ細胞上にはＩＬ−６Ｒが発現していないことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１により得られた生物の形態を示す写真であり、培養したＥＳ細胞培養上清中のアルカリフォスファタ−ゼ活性を示す。図中、ＡはＬＩＦ存在下、ＢはＩＬ−６共存：可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下、ＣはＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方の共存下を示す。ウエル中の黒点は、アルカリフォスファタ−ゼ活性に関連して出現した不溶性色素を示す。なお、Ａにおいては、左から順に、ＬＩＦ濃度がそれぞれ１００００、１０００、１００、１０ユニット／ｍｌの場合を、Ｂ及びＣにおいては、左から順にＩＬ−６濃度がそれぞれ２００、２０、２、０．２ｎｇ／ｍｌの場合を示す（ＣにおいてＩＬ−６Ｒ濃度は常に一定）。
【図２】図２は、実施例２中、ＬＩＦ共存下で培養したＥＳ細胞についてのＦＡＣＳの結果を示すクロマトグラフ写真である。縦軸は相対細胞数を示す。
【図３】図３は、実施例２中、ＩＬ−６及び可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞についてのＦＡＣＳの結果を示すクロマトグラフ写真である。縦軸は相対細胞数を示す。
【図４】図４は、実施例２中、ＩＬ−６共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下で培養したＥＳ細胞についてのＦＡＣＳの結果を示すクロマトグラフ写真である。縦軸は相対細胞数を示す。
【図５】図５は、実施例２中、ＩＬ−６非共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞についてのＦＡＣＳの結果を示すクロマトグラフ写真である。縦軸は相対細胞数を示す。
【図６】図６は、実施例２中、ＩＬ−６と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方を非共存下で培養したＥＳ細胞についてのＦＡＣＳの結果を示すクロマトグラフ写真である。縦軸は相対細胞数を示す。
【図７】図７は、実施例３中、ＬＩＦ共存下で培養したＥＳ細胞についてイムノステイニングを行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図８】図８は、実施例３中、ＩＬ−６及び可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞についてイムノステイニングを行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図９】図９は実施例３中、ＩＬ−６共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下で培養したＥＳ細胞についてイムノステイニングを行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１０】図１０は、実施例３中、ＩＬ−６非共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞についてイムノステイニングを行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１１】図１１は、実施例３中、ＩＬ−６共存と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方を非共存下で培養したＥＳ細胞についてイムノステイニングを行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例４中、ＬＩＦ共存下で培養したＥＳ細胞について顕微鏡観察を行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１３】図１３は、実施例４中、ＩＬ−６及び可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞について顕微鏡観察を行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１４】図１４は、実施例４中、ＩＬ−６共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ非共存下で培養したＥＳ細胞について顕微鏡観察を行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例４中、ＩＬ−６非共存、可溶型ＩＬ−６Ｒ共存下で培養したＥＳ細胞について顕微鏡観察を行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１６】図１６は、実施例４中、ＩＬ−６共存と可溶型ＩＬ−６Ｒの両方を非共存下で培養したＥＳ細胞について顕微鏡観察を行った場合の生物の形態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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