(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するキメラ抗体の軽（Ｌ）鎖であって、ヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）、及び前記ポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖可変（Ｖ）領域を含んで成るキメラＬ鎖。
【請求項２】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求項１に記載のキメラＬ鎖。
【請求項３】
前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がCκである請求項１に記載のキメラＬ鎖。
【請求項４】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するキメラ抗体の重（Ｈ）鎖であって、ヒトＨ鎖定常領域（Ｃ領域）、及び前記ポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖可変（Ｖ）領域を含んで成るキメラＨ鎖。
【請求項５】
前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含んで成る請求項４に記載のキメラＨ鎖。
【請求項６】
前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がＣγである請求項４に記載のキメラＨ鎖。
【請求項７】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するキメラ抗体であって、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び前記ポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んでなるＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び前記ポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなるＨ鎖；
を含んでなるキメラ抗体。
【請求項８】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含んで成り、そして前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項７に記載のキメラ抗体。
【請求項９】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項１０】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項９に記載のDNA。
【請求項１１】
前記Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNAが配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項９に記載のDNA。
【請求項１２】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項１３】
前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項12に記載のDNA。
【請求項１４】
前記Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAが配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項12に記載のDNA。
【請求項１５】
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び
（２）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域；
を含んでなる、キメラＬ鎖をコードするDNA。
【請求項１６】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項15に記載のDNA。
【請求項１７】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び
（２）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域；
を含んでなる、キメラＨ鎖をコードするDNA。
【請求項１９】
前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含んで成る、請求項18記載のDNA。
【請求項２０】
前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項18に記載のDNA。
【請求項２１】
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のFR、及び
（２）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：３に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：４に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：５に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR；
を含んでなる、配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２２】
前記FRがHSGIのヒト抗体FRに由来する、請求項21に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２３】
前記FRがヒト抗体REIのFRに由来する、請求項21に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２４】
前記FRがヒト抗体REIのFRと同じである、請求項21に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２５】
配列番号：９又は10に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項21に記載の再構成ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする、請求項21に記載のDNA。
【請求項２６】
配列番号：９に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項21に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２７】
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のFR、及び
（２）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：６に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：７に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：８に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR；
を含んでなる、配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２８】
前記FRがHSGIのヒト抗体のFRに由来する、請求項27に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項２９】
前記FR1〜3がヒト抗体HG3のFR1〜3に由来し、前記FR4がヒト抗体JH6のFR4に由来する、請求項27に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３０】
前記FR1〜3がヒト抗体HG3のFR1〜3と同じであり、前記FR4がヒト抗体JH6のFR4と同じである、請求項27に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３１】
前記FR1においてKabat の規定による30位のアミノ酸がスレオニンであり、前記FR3においてKabat の規定による71位のアミノ酸がアラニンであり、前記FR3においてKabat の規定による78位のアミノ酸がアラニンである、請求項27に記載の再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３２】
前記FR3においてKabat の規定による73位のアミノ酸がリジンである、請求項27に記載の再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３３】
配列番号：11〜28又は102のヌクレイチド配列を含んで成る、請求項27に記載の再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３４】
配列番号：18、19、20、21、22、23、24、25、26、28又は102に示されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項27に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。
【請求項３５】
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）(ｉ）ヒトＬ鎖FR、及び(ii）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：３に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：４に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：５に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR、を含んで成るＬ鎖Ｖ領域；
を含んでなる、配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒトＬ鎖をコードするDNA。
【請求項３６】
前記ヒトＬ鎖Ｖ領域が配列番号：９又は10に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項35に記載のDNA。
【請求項３７】
前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる請求項35に記載のDNA。
【請求項３８】
前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がヒトＬ鎖Cκ領域である、請求項35に記載のDNA。
【請求項３９】
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）(ｉ）ヒトＨ鎖FR、及び(ii）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：６に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：７に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：８に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR、を含んで成るＨ鎖Ｖ領域；
を含んでなる、配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒトＨ鎖をコードするDNA。
【請求項４０】
前記ヒトＨ鎖Ｖ領域が配列番号：11〜28のいずれか又は102に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項39に記載のDNA。
【請求項４１】
前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：18、19、20、21、22、23、24、25、26、28又は102に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項39に記載の再構成ヒトH鎖をコードするDNA。
【請求項４２】
前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＨ鎖Cγ1領域である、請求項39に記載の再構成ヒトＨ鎖をコードするDNA。
【請求項４３】
請求項９〜42のいずれか１項に記載のDNAを含んでなるベクター。
【請求項４４】
請求項９〜42のいずれか１項に記載のDNAを含んでなるベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項４５】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するキメラ抗体の製造方法であって、請求項９、10、11、15、16および17のいずれかに記載のDNAを含んでなる発現ベクター及び請求項12、13、14、18、19および20のいずれかに記載のDNAを含んでなる発現ベクターにより同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、段階を含んでなる方法。
【請求項４６】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体であって、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに（２）(ｉ）ヒトＬ鎖FR、及び(ii）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：３に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：４に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：５に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR、を含んで成るＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる、再構成ヒトＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに（２）(ｉ）ヒトＨ鎖FR、及び(ii）配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合するマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDRであって、CDR1が配列番号：６に示すアミノ酸配列を含んで成り、CDR2が配列番号：７に示すアミノ酸配列を含んで成り、そしてCDR3が配列番号：８に示すアミノ酸配列を含んで成るCDR、を含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を含んでなる、配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒトＨ鎖；
を含んで成る再構成ヒト抗体、
の製造方法であって、請求項21、22、23、24、25、26、35、36、37および38のいずれか１項に記載のDNAを含んでなる発現ベクター及び請求項27〜42のずれか１項に記載のDNAを含んでなる発現ベクターにより同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、ことを含んでなる方法。
【請求項４７】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体のＬ鎖Ｖ領域であって、配列番号：10のアミノ酸番号１〜107に示すアミノ酸配列を含んで成る、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
【請求項４８】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体のＬ鎖であって、配列番号：10のアミノ酸番号１〜107に示すアミノ酸配列を含んで成るＬ鎖Ｖ領域と、ヒトＬ鎖Ｃ領域とを含んで成る再構成ヒトＬ鎖。
【請求項４９】
前記Ｌ鎖Ｃ領域がCκである、請求項48に記載の再構成ヒトＬ鎖。
【請求項５０】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域であって、配列番号：11〜27のいずれか一つの配列番号のアミノ酸番号１〜120に示すアミノ酸配列を含んで成る、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
【請求項５１】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体のＨ鎖であって、配列番号：11〜27のいずれか一つの配列番号のアミノ酸配列１〜120に示すアミノ酸配列を含んで成るＨ鎖Ｖ領域と、ヒトＨ鎖Ｃ領域とを含んで成る再構成ヒトＨ鎖。
【請求項５２】
前記Ｈ鎖Ｃ領域がCγ1である、請求項51に記載の再構成ヒトＨ鎖。
【請求項５３】
配列番号：103に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する再構成ヒト抗体であって、
（Ａ）配列番号：10のアミノ酸番号１〜107に示すアミノ酸配列を含んで成るＬ鎖Ｖ領域と、ヒトＬ鎖Ｃ領域とを含んで成る再構成ヒトＬ鎖；並びに
（Ｂ）配列番号：11〜28又は102のいずれか一つの配列番号のアミノ酸配列１〜120に示すアミノ酸配列を含んで成るＨ鎖Ｖ領域と、ヒトＨ鎖Ｃ領域とを含んで成る再構成ヒトＨ鎖；
を含んで成る再構成ヒト抗体（但し、Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：９のアミノ酸番号１〜107に示すアミノ酸配列からなり、且つＨ鎖Ｖ領域が配列番号：28又は102のいずれか一つの配列番号のアミノ酸番号１〜120に示すアミノ酸配列からなる再構成ヒト抗体を除く）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、並びにこれらをコードする遺伝子、該抗体の製造方法、及び該抗体の使用に関する。本発明の再構成ヒト抗体及びキメラ抗体は、骨髄腫の治療剤等として特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトＢ  細胞は、発現している表面抗原により分類されるいくつかの段階を通して最終的に抗体産生形質細胞へと成熟する。Ｂ  細胞の終末分化段階では、細胞質免疫グロブリン産生能を獲得する一方で、細胞表面免疫グロブリン、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、Ｆｃレセプターおよび補体Ｃ３レセプターなどのＢ  細胞関連抗原が消失する（Ｌｉｎｇ，  Ｎ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ＴｙｐｉｎｇＩＩＩ  （１９８６）  ｐ３２０，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ）。
【０００３】
これまで、形質細胞の細胞膜上の抗原を認識する抗ＰＣＡ−１  （Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｋ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８３）  １３０，  １１３２  ）、抗ＰＣ−１（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｋ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８３）１３２，  ３１７２  ）、抗ＭＭ４  （Ｔｏｎｇ，  Ａ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９８７）  ６９，  ２３８）等のモノクローナル抗体が報告されてきたが、形質細胞と骨髄腫細胞の検出には依然として抗ＣＤ３８モノクローナル抗体が使用されている（Ｅｐｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  （１９９０）  ３２２，  ６６４、Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，  Ｌ．  Ｗ．  Ｍ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９０）  ７６，  １７３９  、Ｌｅｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （１９９２）  ６４，  １３２、Ｓｈｉｍａｚａｋｉ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （１９９２）  ３９，  １５９  、Ｈａｔａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９３）  ８１，  ３３５７、Ｈａｒａｄａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９３）  ８１，  ２６５８、Ｂｉｌｌａｄｅａｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （１９９３）  １７８，  １０２３  ）。
【０００４】
しかしながら、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体は、Ｂ  細胞の分化に関連する抗原というよりもむしろ、Ｔ  細胞の活性化に関連する抗原であり、Ｂ  細胞以外の種々の細胞上にも発現する。さらに、ＣＤ３８はリンパ形質細胞様腫瘍細胞（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）の一部には発現しないにもかかわらず、造血前駆細胞上で強く発現している。これらの理由から、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体はヒトＢ  細胞の分化、成熟に関する研究および形質細胞の疾患の治療に適していないと考えられる。
【０００５】
Ｇｏｔｏ，  Ｔ．らはヒト形質細胞を免疫して得られた、Ｂ  細胞系列に特異的に発現する分子量が２９−３３ｋＤａの抗原を認識するマウスモノクローナル抗体ＨＭ１．２４を報告している（Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４，  １９２２−１９３０）。モノクローナル抗体ＨＭ１．２４が認識する抗原は、Ｂ  細胞の終末分化に関連した抗原であると考えられること（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．  （１９９２）  １６，  ６８８−６９１）、および形質細胞腫を移植したマウスにモノクローナル抗体ＨＭ１．２４を投与すると、この抗体が腫瘍に特異的に集積したこと（尾崎修治ら、第１９回日本骨髄腫研究会総会プログラム、一般演題３  ）から、モノクローナル抗体ＨＭ１．２４は、ラジオアイソトープで標識することによる腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピー（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）などのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。
【０００６】
また、上記Ｂｌｏｏｄ  には、モノクローナル抗体ＨＭ１．２４がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対して補体依存性細胞障害活性を有することが述べられている。
骨髄腫は、モノクローナルな形質細胞（骨髄腫細胞）の骨髄内集積を特徴とする腫瘍性疾患である。骨髄腫は免疫グロブリンを産生分泌する終末分化Ｂ  細胞、すなわち形質細胞がモノクローナルに主として骨髄に増加する疾患で、血清中にモノクローナルな免疫グロブリンもしくはその構成成分であるＬ  鎖、Ｈ  鎖などが検出される（小阪昌明ら、日本臨床  （１９９５）  ５３，  ９１−９９  ）。
骨髄腫の治療としては、これまで化学療法剤等が使用されているが、骨髄腫を寛解に導き、骨髄腫患者の生存期間を延長するような有効な治療剤は見いだされておらず、骨髄腫の治療効果を有する薬剤の登場が待たれていた。
【０００７】
マウスのモノクローナル抗体は、ヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス抗体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、血清病あるいは他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウモノクローナル抗体をヒトに頻回投与することはできない。
【０００８】
これらの問題を解決するため、非ヒト由来の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫原性を低減させる方法が開発された。その一つとして、抗体の可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法がある。
得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全な形で含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来するアミノ酸配列の比率が実質的に滅少しており、それ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体はもとのマウスモノクローナル抗体と同等に抗原に結合しそして免疫原性が低いが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，ｌ９８９）。
【０００９】
マウス抗体の免疫原性を低減させるための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト抗体可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体可変領域を作製する。
【００１０】
ただし必要によっては、再構成ヒト抗体可変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト抗体可変領域に移植する場合がある。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト抗体可変領域をヒト抗体定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分はＣＤＲ、および、極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。このため、マウスＣＤＲを担持するヒト型化抗体はもはやヒト抗体ＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１１】
ヒト型化抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，ｌ９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｌ５３４−ｌ５３６，ｌ９８８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．，４，７７３−７８３，ｌ９９ｌ；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２，ｌ２４−ｌ３４，ｌ９９ｌ；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４ｌ８ｌ−４ｌ８５，ｌ９９ｌ；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７ｌ，ｌ９９ｌ；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，ｌ９９ｌ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，ｌ９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｌ４８，ｌｌ４９−ｌｌ５４，ｌ９９２；およびＳａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３を参照のこと。
【００１２】
Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（国際特許出願公開番号ＷＯ９０−０７８６１）  には、抗ＩＬ−２レセプター抗体Ａｎｔｉ−Ｔａｃのヒト型化抗体の作成方法が記載されている。しかしながら、ＷＯ９０−０７８６１に記載されているヒト型化抗体の作成方法にしたがっても全ての抗体を完全にヒト型化することは困難である。すなわち、ＷＯ９０−０７８６１には一般的な抗体のヒト型化方法が記載されているのではなく、単に抗ＩＬ−２レセプター抗体の一つである特定の抗体であるＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体のヒト型化方法が記載されているに過ぎない。また、例えＷＯ９０−０７８６１の方法に従っても、完全に元のマウス抗体と同程度の活性を有するヒト型化抗体を作製することは難しい。
【００１３】
一般に、個々の抗体のＣＤＲ  ・ＦＲのアミノ酸配列は各々異なる。したがって、ヒト型化抗体の構築に必要な置換されるべきアミノ酸残基の決定とそのアミノ酸残基と置換するアミノ酸残基の選択は各々の抗体により異なる。したがって、ＷＯ９０−０７８６１に記載されたヒト型化抗体の作製方法は全ての抗体のヒト型化に適用することはできない。
Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８９）  ８６，  １００２９−１００３３にはＷＯ９０−０７８６１と同じ内容が記載されている。この文献にはＷＯ９０−０７８６１の方法にしたがってもヒト型化抗体の元のマウス抗体の約１／３  の活性しか得られなかったことが記載されている。すなわち、ＷＯ９０−０７８６１の方法自体が元のマウス抗体と同程度の活性を有する完全なヒト型化抗体を作製することができないことを示している。
【００１４】
Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９６）  ５６，  １１１８−１１２５  は上記Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ  のグループにより発行された。この文献にはＷＯ９０−０７８６１のヒト型化抗体の作成方法にしたがっても元のマウス抗体と同程度の活性を有するヒト型化抗体を構築することができなかったことが記載されている。すなわち、ＷＯ９０−０７８６１の方法自体が元のマウス抗体と同程度の活性を有する完全なヒト型化抗体を作製することができないことと共に、ＷＯ９０−０７８６１のヒト型化抗体の作製方法が全ての抗体のヒト型化に適用できないことを示している。
【００１５】
Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９５）  ３２，  ４０７−４１６にはマウスＯＮＳ−Ｍ２１  抗体のヒト型化が記載されている。この文献にはＷＯ９０−０７８６１に記載のＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体のヒト型化で示唆されたアミノ酸残基は何ら活性に関係せず、ＷＯ９０−０７８６１に記載された方法は適用できないことを示している。
Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  （１９９１）  ４，  ７７３−７８３には、アミノ酸残基を置換することによりマウス抗体からいくつかのヒト型化抗体を作製したことを記載している。しかしながら、ＷＯ９０−０７８６１に記載のＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体のヒト型化方法で示唆された以上のアミノ酸残基の置換が必要だった。
これらの文献が示すのは、ＷＯ９０−０７８６１に記載されたヒト型化抗体の作製方法はその中に記載されたＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体のヒト型化にのみ適用可能な技術であること、及びその技術を使用しても元のマウス抗体と同程度の活性を得ることはできないことである。
【００１６】
これらの文献に記載された元のマウス抗体はＷＯ９０−０７８６１に記載されたＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体と異なるアミノ酸配列を有する。したがって、Ａｎｔｉ−Ｔａｃ抗体に適用可能なヒト型化抗体作製方法を他の抗体に適用することはできなかった。同様に本件発明のマウス抗ＨＭ１．２４抗体は、Ａｎｔｉ−Ｔａｃ抗体と異なるアミノ酸配列を有するためにＡｎｔｉ−Ｔａｃ抗体のヒト型化作製方法を適用することはできない。さらに、構築に成功した本件発明のヒト型化抗体は、ＷＯ９０−０７８６１に記載のヒト型化Ａｎｔｉ−Ｔａｃ抗体と異なるアミノ酸配列を有しており、このことも異なるＣＤＲ−ＦＲの配列を有する抗体をヒト型化するために全く同じ手法は適用できないことを示している。
【００１７】
したがって、ヒト型化の元となるマウス抗体が知られていたとしても、いかなるＣＤＲ  ・ＦＲの配列を有するヒト型化抗体が活性を示すのかは試行錯誤の実験により初めて成功する。ＷＯ９０−０７８６１には、そのＣＤＲ  の配列はおろか、本願発明で構築されたヒト型化抗体において組み合わされるＦＲの配列及びそのＦＲとの組み合わせにより活性を有するヒト型化抗体が得られることはいっさい記載されていない。前記のごとく、ヒト型化抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は知られておらず、示唆もなされていない。また、ヒト型化抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在せず、特定の抗原に対して十分な結合活性、結合阻害活性および中和活性を示すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３）。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用であるヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗体の断片を提供する。並びに本発明はキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造のための発現系を提供する。本発明はさらにまた、抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体およびそれらの断片の製造方法、及び抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造方法を提供する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
さらに具体的には、本発明は、配列番号：１０３  に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識するキメラ抗体及び再構成ヒト抗体を提供する。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡはｐＵＣ１９  ベクターのＸｂａＩ切断部位の間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  を含む大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  は平成５年（１９９３年）１０月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９）  として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。
【００２０】
このようなキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体の一つの態様として、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体が挙げられる。以下に、具体例としてキメラ抗ＨＭ１．２４抗体及び再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体について詳細に述べる。
すなわち、本発明はまた、
ヒト軽（Ｌ）鎖定常領域（Ｃ領域）、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖可変（Ｖ）領域を含んでなるキメラＬ鎖、並びにヒト重（Ｈ）鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなるキメラＨ鎖を提供する。
本発明はまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んでなるＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなるＨ鎖；
を含んでなるキメラ抗体を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域  （ＦＲ）  、及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに、
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域；
を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなるＨ鎖Ｖ領域、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖；
を提供する。
【００２３】
本発明はまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含んでなるＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなるＨ鎖Ｖ領域、を含んでなるＨ鎖；
を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体、
を提供する。
【００２４】
本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる、キメラＬ鎖をコードするＤＮＡ；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んでなる、キメラＨ鎖をコードするＤＮＡ；
を提供する。
【００２５】
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ；
を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及び抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んでなるＨ鎖Ｖ領域；を含んでなる抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ；
を提供する。
本発明はさらに、上記種々のＤＮＡのいずれかを含んで成るベクターを提供する。
本発明はさらに、上記のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体のキメラ抗体の製造方法であって、前にキメラＬ鎖をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクター及び前記Ｈ鎖をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、段階を含んでなる方法を提供する。
本発明はさらに、抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト抗体の製造方法であって、前記再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクター及び前記構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、ことを含んでなる方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、前記のキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を含んで成る医薬組成物、特に骨髄腫治療剤を提供する。
本発明はさらに、配列番号：１０３  に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識するキメラ抗体を有効成分として含有する医薬組成物、及び配列番号：１０３  に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する再構成ヒト抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物としては、特に骨髄腫治療剤を提供する。
【００２９】
【発明の実施の形態】
１．キメラ抗体の構築
（１）マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ  のクローニング
ｍＲＮＡの調製
マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニングを行うため、回収されたハイブリドーマから公知の方法、例えばグアニジン−超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９７９）、１８、５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐら（１９８７）、１６２、１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）添付のＯｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｐｕｎ  ｃｏｌｕｍｎ等によりｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いることにより、全ＲＮＡの抽出操作を経ずに、ｍＲＮＡの調製を行うこともできる。
【００３０】
ｃＤＮＡの調製及び増幅
上記ｍＲＮＡの調製で得たｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域におけるｃＤＮＡをそれぞれ合成する。Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて行う。合成したｃＤＮＡの増幅は抗体遺伝子のリーダー配列及びＣ領域とハイブリダイズする適当なプライマー（例えば配列番号２９−３９で表される塩基配列を有するＭＫＶプライマー及び配列番号４０で表わされる塩基配列を有するＭＫＣプライマー）を用いることが出来る。
【００３１】
Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡの合成と増幅は、５′−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２，１９８８、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来る。上記で合成したｃＤＮＡの５′末端にＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒを連結しＨ鎖Ｖ領域の増幅のためのプライマーとして例えばＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号７７）及びマウスＨ鎖定常領域（Ｃγ領域）に特異的にハイブリダイズするプライマー（例えば配列番号４２で表される塩基配列を有するＭＨＣ２ａプライマー）を用いることが出来る。
【００３２】
ＤＮＡの精製及び塩基配列の決定
ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した後、ＤＮＡの回収及び精製を行い、ベクターＤＮＡに連結する。
ＤＮＡの精製は、市販のキット（例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ；  ＢＩＯ１０１）  を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばｐＵＣ１９  、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）  を用いることができる。
【００３３】
前記ＤＮＡと上記ベクターＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０９  等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを調製する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）  。目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）  。本発明では、自動塩基配列決定装置（ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ；  ＡＢＩ  社）  を用いることができる。
【００３４】
相補性決定領域
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、抗原結合部位を形成し、その全般の構造は互いに類似性を有している。すなわち、それぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。ＦＲのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
【００３５】
前記４個のＦＲの多くの部分は、β−シート構造をとり、その結果３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部を形成することもある。３個のＣＤＲはＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
このような事実に基づき、マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見いだすことが出来る。
【００３６】
（２）キメラ抗体の発現ベクターの作製
マウスモノクローナル抗体のマウスＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ＨＭ１．２４抗体が得られる。
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んで成る。あるいは、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを含んで成る。
【００３７】
ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトＨ鎖Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３やＣγ４あるいはＬ鎖ＣλやＣκを各々挙げることができる。
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をインビトロ又はインビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−１６９２８）。
【００３８】
あるいは、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスリーダー配列及びＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をインビボ又はインビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００３９】
１）キメラ抗体Ｈ鎖の構築
キメラ抗体のＨ鎖発現ベクターは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｈ鎖Ｃ領域としては例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３あるいはＣγ４が挙げられる。
【００４０】
Ｃγ１ゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターの構築
Ｈ鎖Ｃ領域としてＣγ１のゲノムＤＮＡを有している発現ベクターとしては、例えばＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）あるいはＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）を用いることが出来る。
【００４１】
マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをこれらの発現ベクターに挿入するためには、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、５’−末端に適当な制限酵素の認識配列と、翻訳効率をよくするために開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列とゲノムＤＮＡの一次転写産物が正しくスプライスされｍＲＮＡとなるためのスプライスドナー部位を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を導入する。
こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理して、上記発現ベクターに挿入して、Ｃγ１ゲノムＤＮＡを含むキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。
【００４２】
ｃＤＮＡキメラＨ鎖発現ベクターの構築
Ｈ鎖Ｃ領域としてＣγ１のｃＤＮＡを有している発現ベクターは、以下のようにして構築することができる。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡ（Ｎ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２９，  ６７１−６７９  １９８２  ）をコードする発現ベクターＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）とヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードする発現ベクターＲＶｌ−ＰＭ１ａ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）を導入したＣＨＯ細胞からｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、適当な動物細胞発現用ベクターに適当な制限酵素部位を利用することで連結し構築できる。
【００４３】
マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡと直接連結するためには、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、５’−末端に適当な制限酵素の認識配列と、翻訳効率をよくするために開始コドン直前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端にＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１と直接連結するための適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を導入する。
【００４４】
こうして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で処理して、上記Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡと連結して、ｐＣＯＳ１またはｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することにより、ｃＤＮＡキメラＨ鎖を含む発現ベクターを構築することが出来る。
２）キメラ抗体Ｌ鎖の構築
キメラ抗体のＬ鎖発現ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとを連結し、適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。Ｌ鎖Ｃ領域としては例えばκ鎖あるいはλ鎖が挙げられる。
【００４５】
ｃＤＮＡキメラＬ鎖κ鎖発現ベクターの構築
マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを構築するためには、ＰＣＲ法により適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、５’−末端に適当な制限酵素の認識配列と、翻訳効率をよくするためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計したＰＣＲプライマー、及び、３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、これら適当な塩基配列を導入する。
【００４６】
マウスＬ鎖Ｖ領域と連結させるためのヒトＬ鎖κ鎖Ｃ領域は、例えばゲノムＤＮＡを含むＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）から構築することが出来る。ＰＣＲ法にてＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５’−末端および３’−末端に適当な制限酵素の認識配列を導入し、上記のようにして構築したマウスＬ鎖Ｖ領域とＬ鎖κ鎖Ｃ領域を連結し、ｐＣＯＳ１またはｐＣＨＯ１のごとき発現ベクターに挿入することにより、ｃＤＮＡキメラ抗体Ｌ鎖κ鎖の発現ベクターを構築することが出来る。
【００４７】
２．再構成ヒト抗体の作製
（１）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の設計
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。
【００４８】
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループＩＶ（ＨＳＧＩＶ）のコンセンサス配列に最も類似しており、６６．４％の相同性が存在する。一方、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ  とはそれぞれ５６．９％、５５．８％、６１．５％の相同性を示す。
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒト抗体ＲＥＩのＬ鎖Ｖ領域に６７．０％の相同性を示す。従って、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩのＦＲを使用した。
【００４９】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョンａを設計した。このバージョンにおいては、ヒト抗体ＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２，２１−２５，（１９８８）を参照、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のバージョンａに含まれるＦＲ）と同一であり、そしてマウスＣＤＲはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一とした。
【００５０】
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域はヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＨＳＧＩのコンセンサス配列に最も類似しており、５４．７％の相同性が存在する。一方、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ  とはそれぞれ３４．６％、４８．１％の相同性を示す。マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒト抗体ＨＧ３のＨ鎖Ｖ領域（Ｒｅｃｈａｖｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，８５５−８５９）に非常に類似しており、６７．３％の相同性を示す。
【００５１】
このため、ヒト抗体ＨＧ３のＦＲを、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として用いた。
しかしながら、ヒト抗体ＨＧ３のＦＲ４のアミノ酸配列は記述されていないために、ＦＲ４に関してはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖のＦＲ４と最も高い相同性を示すヒト抗体ＪＨ６（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ，２７，５８３−５９１）のＦＲ４のアミノ酸配列を用いた。ＪＨ６のＦＲ４は一つのアミノ酸を除いてマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖のＦＲ４と同一のアミノ酸配列を有する。
【００５２】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の第一のバージョンａにおいて、ヒトＦＲ１中の３０位およびヒトＦＲ３中の７１位のアミノ酸をマウス抗ＨＭ１．２４抗体のアミノ酸と同一とした以外、ＦＲ１からＦＲ３まではヒト抗体ＨＧ３のＦＲ１からＦＲ３と同一であり、そしてＣＤＲはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一とした。
【００５３】
（２）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲグラフティングにより作製する。この方法を図４に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体（バージョンａ）作製のために８個のＰＣＲプライマーを使用する。外部プライマーＡ（配列番号：４７）及びＨ（配列番号：４８）は、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκのＤＮＡ配列とハイブリダイズするように設計する。
【００５４】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＬ１Ｓ（配列番号：４９）、Ｌ２Ｓ（配列番号：５０）及びＬ３Ｓ（配列番号：５１）はセンスＤＮＡ配列を有する。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＬ１Ａ（配列番号：５２）、Ｌ２Ａ（配列番号：５３）及びＬ３Ａ（配列番号：５４）はアンチ−センスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーＬ１Ｓ、Ｌ２Ｓ及びＬ３Ｓの５′−末端のＤＮＡ配列に対する相補的ＤＮＡ配列（２０〜２３ｂｐ）を有する。
【００５５】
第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−Ｌ１Ａ、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｓ−Ｌ３Ａ、及びＬ３Ｓ−Ｈを行い、そして各ＰＣＲ生成物を精製する。第一ＰＣＲからの４つのＰＣＲ生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせる（ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーＡ及びＨを加えて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを増幅する（第２ＰＣＲ）。前記ＰＣＲにおいては、ヒト抗体ＲＥＩからのＦＲに基く再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａをコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ（国際特許出願公開番号ＷＯ９５−１４０４１を参照）を鋳型として用いることができる。
【００５６】
第一ＰＣＲ段階においては、鋳型ＤＮＡ、及び各プライマーを用いる。
ＰＣＲ生成物Ａ−Ｌ１Ａ（２１５ｂｐ）、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ（９８ｂｐ）、Ｌ２Ｓ−Ｌ３Ａ（１４０ｂｐ）及びＬ３Ｓ−Ｈ（１５１ｂｐ）を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二ＰＣＲでアッセンブリする。第二ＰＣＲにおいては、各第一ＰＣＲの生成物及び各外部プライマー（Ａ及びＨ）を用いる。
第二ＰＣＲにより生じた５１６ｂｐのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングする。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：９に示す。
【００５７】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョンｂを、ＰＣＲを用いる変異誘発法によって作製することができる。変異原プライマーＦＴＹ−１（配列番号：５５）およびＦＴＹ−２（配列番号：５６）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計する。
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκを鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終生成物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκを得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１０に示す。
【００５８】
（３）再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
３−１．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョンａ−ｅの作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計することができる。ヒト抗体ＨＧ３のＦＲ１〜３およびヒト抗体ＪＨ６のＦＲ４をコードするＤＮＡ配列を、マウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつなげることにより、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計する。
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄＩＩＩ  認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにする。
【００５９】
こうして設計したＤＮＡ配列を４個のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析する。
４個のオリゴヌクレオチド配列ＲＶＨ１〜ＲＶＨ４を配列番号：５７〜６０に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１１９〜１４４塩基の長さを有し、２５〜２６ｂｐのオーバラップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内のＲＶＨ２（配列番号：５８）、ＲＶＨ４（配列番号：６０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＲＶＨ１（配列番号：５７）、ＲＶＨ３（配列番号：５９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これら４個のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアセンブリーの方法を図に示す（図５参照）。
【００６０】
４種のオリゴヌクレオチド並びにＲＨＰ１（配列番号：６０）及びＲＨＰ２（配列番号：６２）を外部プライマーとして用い、ＰＣＲを行う。
増幅した４３８ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  及びＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にクローニングする。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１１に示す。
【００６１】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｂ、ｃ、ｄ、ｅを以下のようにして作製する。なお、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｂ以降の各バージョンを作製する際、置換するアミノ酸残基の抗体分子中での位置を推察するために、マウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の立体構造モデルを構築することができる。
バージョンｂは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに変異するように設計したＢＳ（配列番号：６３）およびＢＡ（配列番号：６４）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１２に示す。
【００６２】
バージョンｃは、変異原プライマーとして７３位のトレオニンがリジンに変異するように設計したＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１３に示す。
バージョンｄは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに、７３位のトレオニンがリジンに変異するように設計したＤＳ（配列番号：６７）およびＤＡ（配列番号：６８）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１４に示す。
【００６３】
バージョンｅは、変異原プライマーとして６７位のバリンがアラニンに、６９位のメチオニンがロイシンに変異するように設計したＥＳ（配列番号：６９）およびＥＡ（配列番号：７０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１５に示す。
【００６４】
３−２．  Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域の作製
Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域を構築することにより、ヒト型化抗体Ｖ領域のどのＦＲが、ヒト型化抗体の結合活性および結合阻害活性に寄与するかを調べることができる。構築した２種類のうち、１つはＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるもの（マウス・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体）、もう１つはＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるもの（ヒト・マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体）である。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列はすべてマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来である。
【００６５】
２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域はＰＣＲ法により作製する。この方法を図６及び７に模式的に示す。２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域作製のために４種のプライマーを使用することができる。外部プライマーａ（配列番号：７１）及びｈ（配列番号：７２）は、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１のＤＮＡ配列とハイブリダイズするように設計される。Ｈ鎖ハイブリッド作製プライマーＨＹＳ（配列番号：７３）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｈ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡ（配列番号：７４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有しそしてたがいに相補的なＤＮＡ配列となるよう設計される。
【００６６】
ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製のために、第一ＰＣＲ段階においてプラスミドＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１を鋳型とし外部プライマーａとＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡを用いたＰＣＲと、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型としＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳと外部プライマーｈを用いたＰＣＲを行い、そして各ＰＣＲ産物を精製する。
【００６７】
第一ＰＣＲからの２つのＰＣＲ精製物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせる（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーａ及びｈを加えて、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡを第二ＰＣＲ段階で増幅する。
【００６８】
ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製のために、第一ＰＣＲ段階においてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型とし外部プライマーａとＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡを用いたＰＣＲと、プラスミドＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１を鋳型としＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳと外部プライマーｈを用いたＰＣＲを行い、そして各ＰＣＲ産物を精製する。
【００６９】
第一ＰＣＲからの２つのＰＣＲ精製物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせる（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーａ及びｈを加えて、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡを第二ＰＣＲ段階で増幅する。
【００７０】
第一ＰＣＲ、ＰＣＲ産物の精製、アッセンブリ、第二ＰＣＲ、及びＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１へのクローニングの方法は実施例９．再構成ヒトＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製に示す方法に準じ行うことができる。ＤＮＡ配列決定の後、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１と命名した。
【００７１】
本プラスミドＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：７５に示す。また、ＦＲ１とＦＲ２のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３とＦＲ４のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：７６に示す。
【００７２】
３−３．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョンｆ〜ｓの作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓを以下のようにして作製する。なお、再構成するヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｆ以降の各バージョンを作製する際、置換するアミノ酸残基の抗体分子中での位置を推察するために、前記の通りマウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の立体構造モデルを構築することができる。
【００７３】
バージョンｆは、変異原プライマーとして７５位のトレオニンがセリンに、７８位のバリンがアラニンに変異するように設計したＦＳ（配列番号：７８）およびＦＡ（配列番号：７９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１６に示す。
【００７４】
バージョンｇは、変異原プライマーとして４０位のアラニンがアルギニンに変異するように設計したＧＳ（配列番号：８０）およびＧＡ（配列番号：８１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１７に示す。
【００７５】
バージョンｈは、変異原プライマーとしてＦＳおよびＦＡを用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１８に示す。
バージョンｉは、変異原プライマーとして８３位のアルギニンがアラニンに、８４位のセリンがフェニルアラニンに変異するように設計したＩＳ（配列番号：８２）およびＩＡ（配列番号：８３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１９に示す。
【００７６】
バージョンｊは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに変異するように設計したＪＳ（配列番号：８４）とＪＡ（配列番号：８５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２０に示す。
【００７７】
バージョンｋは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに変異するように設計したＫＳ（配列番号：８６）およびＫＡ（配列番号：８７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２１に示す。
【００７８】
バージョンｌは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２Ｂ位のセリンがイソロイシンに変異するように設計したＬＳ（配列番号：８８）およびＬＡ（配列番号：８９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２２に示す。
【００７９】
バージョンｍは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２ｂのセリンがイソロイシンに、８７位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＭＳ（配列番号：９０）とＭＡ（配列番号：９１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２３に示す。
【００８０】
バージョンｎは、変異原プライマーとして８２Ｂ位のセリンがイソロイシンに変異するように設計したＮＳ（配列番号：９２）およびＮＡ（配列番号：９３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２４に示す。
【００８１】
バージョンｏは変異原プライマーとして８７位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＯＳ（配列番号：９４）およびＯＡ（配列番号：９５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２５に示す。
【００８２】
バージョンｐは、変異原プライマーとして７８位のバリンがアラニンに変異するように設計したＰＳ（配列番号：９６）およびＰＡ（配列番号：９７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２６に示す。
【００８３】
バージョンｑは、変異原プライマーとして７５位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＱＳ（配列番号：９８）およびＱＡ（配列番号：９９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２７に示す。
【００８４】
バージョンｒは、変異原プライマーとしてＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２８に示す。
【００８５】
バージョンｓは、変異原プライマーとして６９位のメチオニンがイソロイシンに変異するように設計した変異原プライマーＳＳ（配列番号：１００）および変異原プライマーＳＡ（配列番号：１０１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得る。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号１０２  に示す。
なお、作製したＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を表１に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を表２〜４に示す。
【００８６】
【表１】
0003587843.tif 000002
【００８７】
【表２】
0003587843.tif 000003
【００８８】
【表３】
0003587843.tif 000004
【００８９】
【表４】
0003587843.tif 000005
【００９０】
３．キメラ抗体及び再構成ヒト抗体の製造
キメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体の製造のためには、前記のようなそれぞれ２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、またはエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。
【００９１】
次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をインビトロ又はインビボで培養してキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を製造する（例えば国際特許出願公開番号ＷＯ９１−１６９２８）。また、ヤギなどの哺乳動物に抗体遺伝子を導入してトランスジェニック動物を作製し、その乳汁等からキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を得ることができる。
【００９２】
また、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域ならびにＬ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｃ領域を単一ベクターに連結し、適当な宿主細胞を形質転換し、抗体を産生させることができる。すなわち、キメラ抗体の発現には、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列及びＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスリーダー配列及びＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入する（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００９３】
再構成ヒト抗体の発現には、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入する（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をインビボ又はインビトロで培養して目的とするキメラ抗体または再構成ヒト抗体を生産させる。
以上のようにして目的とするキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することができる。
【００９４】
なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体の分離・精製を、アフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ，ＰＯＲＯＳ，ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．等が挙げられる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体は分離・精製することができる。
【００９５】
本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体又は再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞Ｈｅｌａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミエローマ細胞又はＢＨＫ細胞中で発現される。
【００９６】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣκ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）が含まれる。
【００９７】
また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７  １０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，１９９０）に従えば容易に実施することができる。
【００９８】
複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【００９９】
４．キメラ抗体及びヒト型化抗体の結合阻害活性
（１）抗体の濃度測定
精製抗体の濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ  または吸光度の測定により行う。
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製する。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（例えばＭａｘｉｓｏｒｐ，  ＮＵＮＣ  ）の各穴を例えば１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを固相化する。
【０１００】
１００μｌの希釈バッファー（例えば５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ＮａＮ３  、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．１）でブロッキングの後、キメラ抗体、ハイブリッド抗体または再構成ヒト抗体を発現させた細胞の培養上清、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体、ハイブリッド抗体または再構成ヒト抗体を段階希釈して各穴に加え、次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを加え、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定する。濃度測定のスタンダードとして、ヒトＩｇＧ１κ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いることができる。精製抗体の濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出する。
【０１０１】
（２）抗原結合活性
抗原結合活性の測定は、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ２５）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行うことができる。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートは次のようにして調製する。９６穴プレートに１０％ウシ胎児血清を含有するＰＲＭＩ１６４０培地により適切な濃度に調製したＷＩＳＨ細胞を加え、一晩培養した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後０．１％グルタルアルデヒド（ナカライテスク社製）にて固定する。
【０１０２】
ブロッキングの後、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を発現させた細胞、例えばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞の培養上清、あるいは精製したキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各穴に１００μｌ加え、室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を加える。
室温にて１時間インキュベーションおよび洗浄の後、基質溶液を加えインキュベーションする。次いで、６Ｎ硫酸５０μｌで反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定する。
【０１０３】
（３）結合阻害活性の測定
ビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体による結合阻害活性は、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ２５）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行うことができる。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートは上記（２）に従い調製できる。９６穴プレートに１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地により適切な濃度に調製したＷＩＳＨ細胞を加え、一晩培養した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後０．１％グルタルアルデヒド（ナカライテスク社製）にて固定する。
【０１０４】
ブロッキングの後、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を発現させた細胞、例えばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞の培養上清、あるいは精製したキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、ハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各穴に５０μｌ加え、同時に２μｇ／ｍｌのビチオン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体５０μｌを添加し、室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を加える。
室温にて１時間インキュベーションした後洗浄し、基質溶液を加えインキュベーションした後６Ｎ硫酸５０μｌで反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定する。
【０１０５】
ＡＤＣＣ活性の測定
本発明のキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体のＡＤＣＣ活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの抹消血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、エフェクター細胞として調製する。また、ヒト骨髄腫細胞、例えば、ＲＰＭＩ  ８２２６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５５）を５１Ｃｒにより標識して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞にＡＤＣＣ活性を測定するキメラ抗体あるいは再構成ヒト抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
【０１０６】
インキュベートした後上清をとり、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に１％のＮＰ−４０を用いることができる。細胞障害活性（％）は、（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０による遊離された放射活性（ｃｐｍ）、およびＣは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）である。
また、抗体Ｃ領域にＡＤＣＣ活性あるいはＣＤＣ活性を期待する場合、抗体Ｃ領域としてヒトＣγ１、ヒトＣγ３を用いることができる。さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なＡＤＣＣ活性あるいはＣＤＣ活性を誘導することができる。
【０１０７】
例えば、アミノ酸置換によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．Ｉ．  Ｆ．  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ，  ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９４）１２，  ６８３−６８８）、アミノ酸付加によるＩｇＧのＩｇＭ様ポリマー化（Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．  Ｉ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４，  ２２２６−２２３６）  、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Ｓｈｕｆｏｒｄ，  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２，７２４−７２７）、アミノ酸置換によるＩｇＧの二量体化（Ｃａｒｏｎ，  Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６，  １１９１−１１９５  、Ｓｈｏｐｅｓ，  Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４８，  ２９１８−２９２２）  、化学的修飾によるＩｇＧの二量体化（Ｗｏｌｆｆ，  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，  ２５６０−２５６５）および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）２１，  ２３７９−２３８４）  が挙げられる。これらは、プラマーを使用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
【０１０８】
骨髄腫体内診断薬
本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、ラジオアイソトープ等の標識化合物と結合させることにより、骨髄腫体内診断薬として用いることができる。
さらには、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２  、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）とラジオアイソトープ等の標識化合物を結合させたものも、同様に骨髄腫体内診断薬として用いることができる。
【０１０９】
具体的には、これら抗体の断片は、これら抗体の断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させるか、あるいはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体または再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を適当な酵素を用いて消化することで得られる。
上記の骨髄腫体内診断薬は、非経口的に全身に投与することができる。
医薬組成物および骨髄腫治療剤
本発明のキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体あるいはヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の治療効果を確認するには、前記抗体を骨髄腫細胞を移植された動物に投与し、抗腫瘍効果を評価することにより行われる。
【０１１０】
動物に移植する骨髄腫細胞としては、ヒト骨髄腫細胞が好ましく、例えば、ＫＰＭＭ２（特許出願公開番号特開平７−２３６４７５）、ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５５）、ＡＲＨ７７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６２１）、Ｓ６Ｂ４５（Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｈ．ら、  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２，  １９８９−１９９３）が挙げられる。移植される動物としては、免疫機能が低下または欠失した動物が好ましく、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ベージュマウス、ヌードラットが挙げられる。
また、評価する抗腫瘍効果の確認は、血清中のヒトイムノグロブリン量の変化、腫瘍体積・重量の測定、尿中のヒトベンズジョーンズタンパク質量の変化あるいは動物の生存期間等に従い行うことができる。
【０１１１】
本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含む医薬組成物および骨髄腫治療剤は、非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
有効投与量は、一回につき体重１ｋｇ  あたり０．０１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり５ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは５０−１００ｍｇ／ｂｏｄｙ  の投与量を選ぶことができる。
本発明のキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいは再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含む医薬組成物および骨髄腫治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【０１１２】
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ  ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．   マウス抗ＨＭ１．２４抗体可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
１．  メッセンジャーＲＮＡ  （ｍＲＮＡ）の単離
マウス抗ＨＭ１．２４抗体を産生する２  ｘ  １０８  個のハイブリドーマ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３）からＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてキット添付の指示書に従い、ｍＲＮＡの単離を行った。
【０１１４】
２．  抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ  法による増幅
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製）を用いてＰＣＲ  を行った。
２−１．  マウスＬ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子の増幅および断片化
単離したｍＲＮＡよりＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ  に用いた。また、ＰＣＲ  法に使用するプライマーは、マウスカッパ型Ｌ  鎖リーダー配列とハイブリダイズする配列番号：２９〜３９に示すＭＫＶ  （Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．  Ｔ．  ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９，  ８８−８９，  （１９９１））を用いた。
【０１１５】
ＰＣＲ  溶液１００  μｌ  は、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ  、０．１  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ）  、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ユニットのＤＮＡ  ポリメラーゼＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製）、０．２５  ｍＭ  の配列番号：２９〜３９に示すＭＫＶ  プライマーと３  ｍＭの配列番号：４０に示すＭＫＣ  プライマーおよび一本鎖ｃＤＮＡ  １００  ｎｇ  を含有し、これを５０μｌ  の鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて３分間そして次に９４℃にて１分間、５５℃にて１分間および７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。増幅したＤＮＡ  断片を低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ  社製）にて精製し、ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  社製）およびＳａｌＩ（宝酒造製）により３７℃にて消化した。
【０１１６】
２−２．  マウスＨ  鎖Ｖ  領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
マウスＨ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子は５’−ＲＡＣＥ  法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ；  Ｆｒｏｈｍａｎ，  Ｍ．Ａ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ８９９８−９００２，  （１９８８）  、Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｊ．Ｂ．Ｄ．Ｍ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  ５２２７−５２３２，  （１９９１）  ）により増幅した。マウスＩｇＧ２ａ  定常領域に特異的にハイブリダイズするプライマーＰ１（配列番号；４１）を用いてｃＤＮＡを合成した後、５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  ＫＩＴ  （ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  社製）を用いてマウスＨ  鎖Ｖ  領域をコードするｃＤＮＡの増幅をマウスＩｇＧ２ａ  定常領域に特異的にハイブリダイズするプライマーＭＨＣ２ａ  （配列番号：４２）およびキット添付のアンカープライマー（配列番号：７７）を用いて行った。増幅したＤＮＡ  断片を低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ  社製）にて精製し、そしてＥｃｏＲＩ  （宝酒造社製）およびＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  社製）により３７℃にて消化した。
【０１１７】
３．  連結および形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ  断片を、ＳａｌＩおよびＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９  ベクターと、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．６）、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０  ｍＭ  ジチオスレイトール、１  ｍＭ  ＡＴＰ、５０  ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコール（８０００）および１ユニットＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を含有する反応混合物中で、１６℃にて２．５  時間反応させ連結した。同様にマウスＨ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ  断片を、ＥｃｏＲＩ  およびＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９  ベクターと１６℃にて３  時間反応させ連結した。
【０１１８】
次に、１０μｌ  の上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５  αのコンピテント細胞５０μｌ  に加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００  μｌ  の２ｘＹＴ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）  ）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌ  のアンピシリンを含有する２ｘＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）  ）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１１９】
この形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１０  ｍｌ  中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）  ）に従ってプラスミドＤＮＡ  を調製した。
こうして得られた、抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマに由来するマウスカッパ型Ｌ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣＨＭＶＬ９と命名した。上記の方法に従って得られた、抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマに由来するマウスＨ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣＨＭＶＨＲ１６と命名した。
【０１２０】
実施例２．   ＤＮＡ  の塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、自動ＤＮＡ  シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．製）およびＴａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．  製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。
プラスミドｐＵＣＨＭＶＬ９に含まれるマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。また、プラスミドｐＵＣＨＭＶＨＲ１６に含まれるマウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖Ｖ  領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２に示す。
【０１２１】
実施例３．     ＣＤＲの決定
Ｌ  鎖およびＨ  鎖のＶ  領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ  ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方ＣＤＲ  領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９８３）。
このような事実に基づき、抗ＨＭ１．２４抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔ  らにより作製された抗体のアミノ酸配列のデータベースに当てはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ  領域を表５に示すごとく決定した。
【０１２２】
【表５】
0003587843.tif 000006
【０１２３】
実施例４．   クローニングしたｃＤＮＡの発現の確認（キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の作製）
１．発現ベクターの作製
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれのマウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ  鎖およびＨ  鎖Ｖ  領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＵＣＨＭＶＬ９およびｐＵＣＨＭＶＨＲ１６をＰＣＲ  法により修飾した。そしてＨＥＦ  発現ベクター（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）に導入した。
【０１２４】
Ｌ  鎖Ｖ  領域のための後方プライマーＯＮＳ−Ｌ７２２Ｓ  （配列番号：４３）およびＨ  鎖Ｖ  領域のための後方プライマーＶＨＲ１６Ｓ（配列番号：４４）は、各々のＶ  領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡ  にハイブリダイズし且つＫｏｚａｋ  コンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ，  ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６，  ９４７−９５０，  （１９８７）  ）およびＨｉｎｄＩＩＩ  制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｌ  鎖Ｖ  領域のための前方プライマーＶＬ９Ａ（配列番号：４５）およびＨ  鎖Ｖ  領域のための前方プライマーＶＨＲ１６Ａ（配列番号：４６）は、Ｊ  領域の末端をコードするＤＮＡ  配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列およびＢａｍＨＩ  制限酵素認識部位を有するように設計した。
【０１２５】
１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ  、０．１  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００  ｐｍｏｌｅ  ずつの各プライマー、１００  ｎｇの鋳型ＤＮＡ  （ｐＵＣＨＭＶＬ９又はｐＵＣＨＭＶＨＲ１６）、および５  ｕｎｉｔのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  酵素を含有する１００  μｌ  のＰＣＲ  反応混合物を５０μｌ  の鉱油で覆い、９４℃にて最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
ＰＣＲ  生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  およびＢａｍＨＩ  で消化し、そしてＬ  鎖Ｖ  領域についてはＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに、Ｈ  鎖Ｖ  領域についてはＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１  にそれぞれクローニングした。ＤＮＡ  配列決定の後、正しいＤＮＡ  配列を有するＤＮＡ  断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−１．２４Ｌ−ｇκ及びＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  と命名した。
【０１２６】
前記プラスミドＨＥＦ−１．２４Ｌ−ｇκ及びＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  からそれぞれの可変領域をコードする領域を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ  により制限断片とし、これらをプラスミドベクターｐＵＣ  １９のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ  部位に挿入し、各々、ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ及びｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１  と命名した。
なお、それぞれのプラスミドｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ又はｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１  を含有する大腸菌は、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１  ）と称し、それぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４６及びＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４４として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成８年８月２９日にブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１２７】
２．ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１  ）細胞において試験した。ＨＥＦ−１．２４Ｌ−ｇκ及びＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ  （１０μｇ  ）を、ＰＢＳ  中１  ｘ  １０７  細胞／ｍｌ  の０．８ｍｌ  のアリコートに加え、１５００Ｖ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ  社製）３０  ｍｌ  に加えた。ＣＯ２  インキュベーターＢＮＡ１２０Ｄ  （ＴＡＢＡＩ  社製）中で７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、これを以下の実験に用いた。
【０１２８】
３．  ＦＣＭ  解析
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性は、ＫＰＭＭ２細胞を用いたＦＣＭ  （フローサイトメトリー）解析で行った。４．７  ｘ  １０５  個のＫＰＭＭ２細胞（特許出願公開番号  特開平７−２３６４７５）をＰＢＳ（−）  で洗浄した後、上記キメラ抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＯＳ−７細胞培養液５０μｌおよびＦＡＣＳ緩衝液（２  ％ウシ胎児血清、０．１  ％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））５０μｌ  、または５００  μｇ／ｍｌの精製マウス抗ＨＭ１．２４抗体  ５μｌ  およびＦＡＣＳ緩衝液９５μｌ  を加え、氷温下１時間インキュベートした。
【０１２９】
コントロールとしてキメラ抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＯＳ  細胞培養液の代わりに２  μｇ／ｍｌのキメラＳＫ２  （国際特許出願公開番号ＷＯ９４−２８１５９）５０μｌ  およびＦＡＣＳ緩衝液５０μｌ  、または精製マウス抗ＨＭ１．２４抗体の代わりに５００  μｇ／ｍｌの精製マウス  ＩｇＧ２ａκ（ＵＰＣ１０  ）（ＣＡＰＰＥＬ社製）５  μｌ  およびＦＡＣＳ緩衝液９５μｌ  を加え、同様にインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト抗体（ＧＡＨ  ）（ＣＡＰＰＥＬ社製）、または１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ  ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１００  μｌ  を加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、１  ｍｌ  のＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。
【０１３０】
図１に示す通り、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を添加した細胞では、マウス抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合同様、コントロールと比較して蛍光強度のピークが右側にシフトしたことから、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体がＫＰＭＭ２細胞と結合したことが明らかになった。このことより、クローニングしたｃＤＮＡはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＶ領域をコードしていることが確認された。
【０１３１】
実施例５．   キメラ抗ＨＭ１．２４抗体安定産生ＣＨＯ  細胞株の樹立
１．  キメラＨ  鎖発現ベクターの作製
前記プラスミドＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  を制限酵素ＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ  にて消化し、ＥＦ１  プロモーターおよびマウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖Ｖ  領域をコードするＤＮＡ  を含む約２．８ｋｂｐの断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製した。次に、ＤＨＦＲ遺伝子およびヒトＨ  鎖定常領域をコードする遺伝子を含むヒトＨ  鎖発現ベクターＤＨＦＲ−  △Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９参照）に使用されている発現ベクターをＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩ  にて消化することにより調製した約６ｋｂｐの断片内に上記ＤＮＡ  断片を挿入し、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖発現ベクター  ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  を構築した。
【０１３２】
２．  ＣＨＯ細胞への遺伝子導入
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体安定産生系を樹立するために、ＰｖｕＩで消化して直鎖状にした前記発現ベクターＨＥＦ−１．２４Ｌ−ｇκおよび  ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  をエレクトロポレーション法により前述と同様（前記ＣＯＳ−７  細胞へのトランスフェクション）の条件下で同時にＣＨＯ  細胞ＤＸＢ１１  （Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  より供与）に遺伝子導入した。
【０１３３】
３．  ＭＴＸによる遺伝子増幅
遺伝子導入したＣＨＯ  細胞は５００  μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）および１０％  のウシ胎児血清を添加したヌクレオシド不含α−ＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）中ではＬ  鎖およびＨ  鎖発現ベクターが共に導入されたＣＨＯ  細胞のみが生存でき、それらを選別した。次に、上記培養液中に１０  ｎＭ  のＭＴＸ  （Ｓｉｇｍａ  社製）を加え、増殖したクローンの内、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の産生量が高いものを選択した結果、約２０μｇ／ｍｌのキメラ抗体産生効率を示すクローン＃８−１３  を得、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体産生細胞株とした。
【０１３４】
実施例６．   キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の作製
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の作製は以下の方法で行った。上記キメラ抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＨＯ  細胞を、培地として５％γ−グロブリンフリー新生仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）含有  Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を用い、高密度細胞培養装置Ｖｅｒａｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ２０  （ＣＥＬＬＥＸ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  Ｉｎｃ．社製）で３０日間連続培養した。
【０１３５】
培養開始後１３、２０、２３、２６及び３０日目に培養液を回収し、加圧式ろ過フィルターユニットＳＡＲＴＯＢＲＡＮ  （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  社製）を用いてろ過した後、抗体大量分取システムＡｆｉ−Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （日本ガイシ社製）およびＳｕｐｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ：  １００  ｍｌ  、日本ガイシ社製）を用いて、付属の説明書に基づき吸着／  洗浄緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３  ）を用いてキメラ抗ＨＭ１．２４抗体をアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ）を添加して、ｐＨ７．４  付近に調整した。抗体濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ  を１．３５ＯＤとして算出した。
【０１３６】
実施例７．   キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の活性測定
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体は下記の結合阻害活性にて評価を行った。
１．  結合阻害活性の測定
１−１．  ビオチン標識抗ＨＭ１．２４抗体の作製
マウス抗ＨＭ１．２４  抗体を０．１  Ｍ  重炭酸緩衝液で４  ｍｇ／ｍｌ  に希釈した後、５０  ｍｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ−Ｎ−  ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＹ  ＬＡＢＳ  Ｉｎｃ．社製）４  μｌ  を添加し、室温で３  時間反応させた。その後、０．２  Ｍ  グリシン溶液１．５  ｍｌを加え室温で３０分間インキュベートし反応を停止させ、ＰＤ−１０  カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  社製）を用いてビオチン化ＩｇＧ  画分を分取した。
【０１３７】
１−２．  結合阻害活性の測定
ビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体による結合阻害活性は、ヒト羊膜細胞株ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２５  ）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行った。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ  プレートは次のようにして調製した。９６穴プレートに１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地により４  ｘ  １０５  細胞／ｍｌ  に調製したＷＩＳＨ細胞懸濁液１００  μｌ  を加え、一晩培養した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後０．１  ％グルタルアルデヒド（ナカライテスク社製）にて固定した。
【０１３８】
ブロッキングの後、アフィニティー精製により得られたキメラ抗ＨＭ１．２４抗体あるいはマウス抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各穴に５０μｌ  加え、同時に２  μｇ／ｍｌのビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体５０μｌ  を添加し、室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製）を加えた。室温にて１時間インキュベーションした後洗浄し、基質溶液を加えインキュベーションの後、６Ｎ  硫酸５０μｌ  で反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）を用いて４９０  ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、図２に示す通り、ビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体に対してキメラ抗ＨＭ１．２４抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体と同等の結合阻害活性を示した。このことより、キメラ抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体と同じＶ  領域を有することが示された。
【０１３９】
実施例８．   キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性の測定はＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９３の方法に従った。
１．  エフェクター細胞の調製
健常人および多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄より比重遠心法で単核球を分離した。すなわち健常人および多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄に等量のＰＢＳ（−）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社製）−  Ｃｏｎｒｅｙ（第一製薬社製）（比重１．０７７  ）に積層し、４００  ｇ  で３０分間遠心した。単核球層を分取し、１０％  ウシ胎児血清（Ｗｉｔａｋｅｒ  社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ  社製）で２回洗浄後、同培養液で細胞数が５  ｘ  １０６／ｍｌになるように調製した。
【０１４０】
２．  標的細胞の調製
ヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ  ８２２６  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５５）を０．１ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅとともに１０％  ウシ胎児血清（Ｗｉｔａｋｅｒ  社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ  社製）中で３７℃にて６０分インキュベートすることにより放射性標識した。放射性標識の後、細胞をＨａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＨＢＳＳ）  で３回洗浄し、２  ｘ  １０５／ｍｌに調製した。
【０１４１】
３．  ＡＤＣＣアッセイ
９６ウエルＵ  底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  社製）に放射性標識した２  ｘ  １０５／ｍｌの標的細胞を５０μｌ  と、アフィニティー精製によって得られた１  μｇ／ｍｌのキメラ抗ＨＭ１．２４抗体、マウス抗ＨＭ１．２４抗体、あるいはコントロールヒトＩｇＧ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ  社製）５０μｌ  加え、４  ℃で１５分間反応させた。
その後、５  ｘ  １０６／ｍｌのエフェクター細胞を１００  μｌ  を加え、炭酸ガス培養器内で４  時間培養した。その際、エフェクター細胞（Ｅ  ）と標的細胞（Ｔ  ）の比（Ｅ：Ｔ  ）を  ０：１、：５：１、２０：１又は５０：１とした。
【０１４２】
１００  μｌ  の上清をとり、ガンマカウンター（ＡＲＣ３６１，  Ａｌｏｋａ  社製）で培養上清中に遊離された放射活性を測定した。最大遊離放射能測定用には１  ％ＮＰ−４０  （ＢＲＬ  社製）を用いた。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ  ）／（Ｂ−Ｃ  ）ｘ１００で計算した。なおＡ  は抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ  ）、Ｂ  はＮＰ−４０  により遊離された放射活性（ｃｐｍ  ）および  Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ  ）を示す。
図３に示す通り、ヒトコントロールＩｇＧ１と比較してキメラ抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、Ｅ：Ｔ  比の上昇に従い細胞障害活性が上昇したことから、このキメラ抗ＨＭ１．２４抗体がＡＤＣＣ活性を有することが示された。さらに、マウス抗ＨＭ１．２４抗体を添加しても細胞障害活性は全く見られないことから、エフェクター細胞がヒト由来の細胞の場合、ＡＤＣＣ活性を得るためにはヒト抗体のＦｃ部分が必要であることが示された。
【０１４３】
実施例９．   再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の作製
１．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｖ領域の設計
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲ  がヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  を用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較した。
【０１４４】
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩＶ（ＨＳＧＩＶ  ）のコンセンサス配列に最も類似しており、６６．４％の相同性が存在する。一方、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ  及びＨＳＧ  ＩＩＩ  とはそれぞれ５６．９％、５５．８％及び６１．５％の相同性を示した。
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩ  に６７．０％の相同性を示した。従って、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩ  のＦＲを使用した。
【０１４５】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョンａを設計した。このバージョンにおいては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩ  に基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．  ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２，  ２１−２５，（１９８８）を参照、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９に記載の再構成ヒトＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のバージョンａに含まれるＦＲ）と同一であり、そしてマウスＣＤＲ  はマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲ  と同一とした。
【０１４６】
マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のＨＳＧ  Ｉのコンセンサス配列に最も類似しており、５４．７％の相同性が存在する。一方、ＨＳＧＩＩ  及びＨＳＧＩＩＩとはそれぞれ３４．６％及び４８．１％の相同性を示した。マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１  からＦＲ３  までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩの一つであるヒト抗体ＨＧ３  のＨ鎖Ｖ領域（Ｒｅｃｈａｖｉ，  Ｇ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ８５５−８５９  ）に非常に類似しており、その相同性は６７．３％であった。
【０１４７】
このため、ヒト抗体ＨＧ３  のＦＲを、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として用いた。しかしながら、ヒト抗体ＨＧ３  のＦＲ４  のアミノ酸配列は記述されていないために、今回ＦＲ４  に関してはマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖のＦＲ４  と最も高い相同性を示すヒト抗体ＪＨ６  （Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｊ．  Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ，  ２７，  ５８３−５９１  ）のＦＲ４  のアミノ酸配列を用いた。ＪＨ６  のＦＲ４  は一つのアミノ酸を除いてマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖のＦＲ４  と同一のアミノ酸配列を有する。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域の第一のバージョンａにおいて、ヒトＦＲ１  中の３０位およびヒトＦＲ３  中の７１位のアミノ酸をマウス抗ＨＭ１．２４抗体のアミノ酸と同一とした以外、ＦＲ１  からＦＲ３  まではヒトＨＧ３  のＦＲ１  からＦＲ３  と同一であり、そしてＣＤＲ  はマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＣＤＲ  と同一とした。
【０１４８】
２．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ  法によるＣＤＲ  グラフティングにより作製した。この方法を図４に模式的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ  由来のＦＲを有する再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体（バージョンａ）の作製のために８個のＰＣＲ  プライマーを使用した。外部プライマーＡ（配列番号：４７）及びＨ（配列番号：４８）は、ＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκのＤＮＡ  配列とハイブリダイズするように設計された。
ＣＤＲ  −グラフティングプライマーＬ１Ｓ  （配列番号：４９）、Ｌ２Ｓ  （配列番号：５０）及びＬ３Ｓ  （配列番号：５１）はセンスＤＮＡ  配列を有し、そしてＣＤＲ  −グラフティングプライマーＬ１Ａ  （配列番号：５２）、Ｌ２Ａ  （配列番号：５３）及びＬ３Ａ  （配列番号：５４）はアンチ−センスＤＮＡ  配列を有しそしてそれぞれプライマーＬ１Ｓ  、Ｌ２Ｓ  及びＬ３Ｓ  の５′−末端のＤＮＡ  配列に対する相補的ＤＮＡ  配列（２０〜２３ｂｐ）を有する。
【０１４９】
第一ＰＣＲ  段階において４つの反応Ａ−Ｌ１Ａ  、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ  、Ｌ２Ｓ−Ｌ３Ａ  、及びＬ３Ｓ−Ｈ  を行い、そして各ＰＣＲ  生成物を精製した。第一ＰＣＲ  からの４つのＰＣＲ  生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマーＡ及びＨを加えて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡ  を増幅した（第２ＰＣＲ  ）。前記ＰＣＲ  においては、ヒト抗体ＲＥＩ  からのＦＲに基く再構成ヒトＯＮＳ−Ｍ２１  抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａをコードするプラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｍ２１ａ（国際特許出願公開番号ＷＯ９５−１４０４１を参照）を鋳型として用いた。
【０１５０】
第一ＰＣＲ  段階においては、１０  ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．３  ）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ  、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００  ｎｇの鋳型ＤＮＡ  、１００  ｐｍｏｌｅ  の各プライマー及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  を含有するのＰＣＲ  混合物を用いた。各ＰＣＲ  チューブは５０μｌ  の鉱油で覆膜した。最初に９４℃で変性した後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応サイクルを行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
ＰＣＲ  生成物Ａ−Ｌ１Ａ  （２１５ｂｐ  ）、Ｌ１Ｓ−Ｌ２Ａ  （９８ｂｐ）、Ｌ２Ｓ−Ｌ３Ａ  （１４０ｂｐ  ）及びＬ３Ｓ−Ｈ  （１５１ｂｐ  ）を１．５  ％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二ＰＣＲ  でアッセンブリした。第二ＰＣＲ  においては、１μｇ  の各第一ＰＣＲ  の生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  を含有する９８μｌ  のＰＣＲ  混合物を、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間で２サイクルインキュベートし、そして次に１００  ｐｍｏｌｅ  の各外部プライマー（Ａ及びＨ）を加えた。ＰＣＲ  チューブを５０μｌ  の鉱油で覆い、そして前記と同一の条件で３０サイクルのＰＣＲ  を行った。
【０１５１】
第二ＰＣＲ  により生じた５１６ｂｐ  のＤＮＡ  断片を１．５  ％低融点アガロースゲルで精製し、ＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ  断片をＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングした。ＤＮＡ  配列決定の後、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：９に示す。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョンｂを、ＰＣＲ  を用いる変異誘発法によって作製した。変異原プライマーＦＴＹ−１  （配列番号：５５）およびＦＴＹ−２  （配列番号：５６）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計した。
【０１５２】
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκを鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終生成物を精製し、ＢａｍＨＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ  断片をＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１０に示す。
【０１５３】
３．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
３−１．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョンａ−  ｅの作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ  を次の様にして設計した。ヒト抗体ＨＧ３  のＦＲ１  〜３  およびヒト抗体ＪＨ６  のＦＲ４  をコードするＤＮＡ  配列を、マウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ  をコードするＤＮＡ  配列とつなげることにより、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡ  を設計した。
次に、このＤＮＡ  配列のそれぞれ５′−側及び３′−側にＨｉｎｄＩＩＩ  認識部位／Ｋｏｚａｋ  コンセンサス配列及びＢａｍＨＩ  認識部位／スプライスドナー配列を付加して、ＨＥＦ  発現ベクターに挿入できるようにした。
【０１５４】
こうして設計したＤＮＡ  配列を４個のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。４個のオリゴヌクレオチド配列ＲＶＨ１〜ＲＶＨ４を配列番号：５７〜６０に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１１９  〜１４４  塩基の長さを有し、２５〜２６ｂｐのオーバラップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内のＲＶＨ２（配列番号：５８）、ＲＶＨ４（配列番号：６０）はセンスＤＮＡ  配列を有し、そして他のＲＶＨ１（配列番号：５７）、ＲＶＨ３（配列番号：５９）はアンチセンスＤＮＡ  配列を有する。これら４個のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ  法によるアセンブリーの方法を図に示す（図５参照）。
【０１５５】
１００  ｎｇずつの４種のオリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  を含有する９８μｌ  のＰＣＲ  混合物を、９４℃にて２分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間のから成る２サイクルのインキュベーションを行った。１００  ｐｍｏｌｅ  ずつのＲＨＰ１（配列番号：６１）及びＲＨＰ２（配列番号：６２）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ  チューブを５０μｌ  の鉱油で覆い、そして９４℃にて１分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３８サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１５６】
４３８ｂｐ  のＤＮＡ  断片を１．５  ％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ  及びＢａｍＨＩ  により消化し、そして次にＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１  にクローニングした。ＤＮＡ  配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１１に示す。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｂ、ｃ、ｄ及びｅを以下のようにして作製した。
【０１５７】
バージョンｂは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに変異するように設計したＢＳ（配列番号：６３）およびＢＡ（配列番号：６４）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１２に示す。
バージョンｃは、変異原プライマーとして７３位のトレオニンがリジンに変異するように設計したＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１３に示す。
【０１５８】
バージョンｄは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに、７３位のトレオニンがリジンに変異するように設計したＤＳ（配列番号：６７）およびＤＡ（配列番号：６８）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  としてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１４に示す。
バージョンｅは、変異原プライマーとして６７位のバリンがアラニンに、６９位のメチオニンがロイシンに変異するように設計したＥＳ（配列番号：６９）およびＥＡ（配列番号：７０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１５に示す。
【０１５９】
３−２．  Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域の作製
Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域を２種構築した。１つはＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４  抗体由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるマウス・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体、もう１つはＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるヒト・マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体である。ＣＤＲ  領域のアミノ酸配列はすべてマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来である。
【０１６０】
２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域はＰＣＲ  法により作製した。この方法を図６及び７に模式的に示す。２種のＨ鎖ハイブリッドＶ領域作製のために４種のプライマーを使用した。外部プライマーａ（配列番号：７１）及びｈ（配列番号：７２）は、ＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１  のＤＮＡ  配列とハイブリダイズするように設計された。Ｈ鎖ハイブリッド作製プライマーＨＹＳ  （配列番号：７３）はセンスＤＮＡ  配列を有し、Ｈ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡ  （配列番号：７４）はアンチセンスＤＮＡ  配列を有しそしてたがいに相補的なＤＮＡ  配列となるよう設計された。
【０１６１】
ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製のために、第一ＰＣＲ  段階においてプラスミド  ＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  を鋳型とし外部プライマーａとＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡ  を用いたＰＣＲ  と、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型としＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳ  （配列番号：７３）と外部プライマーｈ（配列番号：７２）を用いたＰＣＲ  を行い、そして各ＰＣＲ  産物を精製した。第一ＰＣＲ  からの２つのＰＣＲ  生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【０１６２】
次に、外部プライマーａ（配列番号：７１）及びｈ（配列番号：７２）を加えて、ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡ  を第二ＰＣＲ  段階で増幅した。
ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の作製のために、第一ＰＣＲ  段階においてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型とし外部プライマーａとＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＡ  を用いたＰＣＲ  と、プラスミド  ＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  を鋳型としＨ鎖ハイブリッドプライマーＨＹＳ  と外部プライマーｈを用いたＰＣＲ  を行い、そして各ＰＣＲ  産物を精製した。第一ＰＣＲ  からの２つのＰＣＲ  生成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【０１６３】
次に、外部プライマーａ及びｈを加えて、ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４  抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域をコードする全長ＤＮＡ  を第二ＰＣＲ  段階で増幅した。
第一ＰＣＲ  、ＰＣＲ  産物の精製、アッセンブリ、第二ＰＣＲ  、及びＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１  へのクローニングの方法は実施例  ９．  再構成ヒトＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製に示す方法に準じた。
【０１６４】
ＤＮＡ  配列決定の後、ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列がマウス抗ＨＭ１．２４抗体由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：７５に示す。また、ＦＲ１  とＦＲ２  のアミノ酸配列が再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンａ由来であり、ＦＲ３  とＦＲ４  のアミノ酸配列がマウス抗体ＨＭ１．２４  抗体由来となるＨ鎖ハイブリッドＶ領域の正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ  断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  に  含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号：７６に示す。
【０１６５】
３−３．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョンｆ〜ｓの作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョンｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓを以下のようにして作製した。
バージョンｆは、変異原プライマーとして７５位のトレオニンがセリンに、７８位のバリンがアラニンに変異するように設計したＦＳ（配列番号：７８）およびＦＡ（配列番号：７９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１６に示す。
【０１６６】
バージョンｇは、変異原プライマーとして４０位のアラニンがアルギニンに変異するように設計したＧＳ（配列番号：８０）およびＧＡ（配列番号：８１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１７に示す。
バージョンｈは、変異原プライマーとしてＦＳ（配列番号：７８）およびＦＡ（配列番号：７９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１８に示す。
【０１６７】
バージョンｉは、変異原プライマーとして８３位のアルギニンがアラニンに、８４位のセリンがフェニルアラニンに変異するように設計したＩＳ（配列番号：８２）およびＩＡ（配列番号：８３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｉ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１９に示す。
バージョンｊは、変異原プライマーとして６６位のアルギニンがリジンに変異するように設計したＪＳ（配列番号：８４）とＪＡ（配列番号：８５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｊ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２０に示す。
【０１６８】
バージョンｋは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに変異するように設計したＫＳ（配列番号：８６）およびＫＡ（配列番号：８７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｋ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２１に示す。
バージョンｌは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２Ｂ  位のセリンがイソロイシンに変異するように設計したＬＳ（配列番号：８８）およびＬＡ（配列番号：８９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｌ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２２に示す。
【０１６９】
バージョンｍは、変異原プライマーとして８１位のグルタミン酸がグルタミンに、８２ｂ  位のセリンがイソロイシンに、８７位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＭＳ（配列番号：９０）とＭＡ（配列番号：９１）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｍ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２３に示す。
バージョンｎは、変異原プライマーとして８２Ｂ  位のセリンがイソロイシンに変異するように設計したＮＳ（配列番号：９２）およびＮＡ（配列番号：９３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  としてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｎ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２４に示す。
【０１７０】
バージョンｏは、変異原プライマーとして８７位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＯＳ（配列番号：９４）およびＯＡ（配列番号：９５）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  としてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｏ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２５に示す。
バージョンｐは、変異原プライマーとして７８位のバリンがアラニンに変異するように設計したＰＳ（配列番号：９６）およびＰＡ（配列番号：９７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２６に示す。
【０１７１】
バージョンｑは、変異原プライマーとして７５位のトレオニンがセリンに変異するように設計したＱＳ（配列番号：９８）およびＱＡ（配列番号：９９）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｑ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２７に示す。
バージョンｒは、変異原プライマーとしてＣＳ（配列番号：６５）およびＣＡ（配列番号：６６）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｐ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型ＤＮＡ  として、ＰＣＲ  法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：２８に示す。
【０１７２】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｓを、ＰＣＲ  を用いる変異誘発法によって作製した。変異原プライマーＳＳ（配列番号：１００）およびＳＡ（配列番号：１０１）は、６９位のメチオニンがイソロイシンに変異するように設計した。
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を鋳型とし、上記プライマーを用いて増幅した後、最終生成物を精製し、ＢａｍＨＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩ  で消化し、得られたＤＮＡ  断片をＨＥＦ  発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１  にクローニングし、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：１０２  に示す。
【０１７３】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ及びＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  からそれぞれの可変領域をコードする領域を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  およびＢａｍＨＩ  により制限断片とし、これらをプラスミドベクターｐＵＣ１９  のＨｉｎｄＩＩＩ  およびＢａｍＨＩ  部位に挿入した。それぞれのプラスミドはｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ及びｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  と命名した。
なお、それぞれのプラスミドｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκおよびｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を含有する大腸菌は、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成８年８月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４３としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１７４】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  からの可変領域をコードする領域を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  およびＢａｍＨＩ  により制限断片とし、これをプラスミドベクターｐＵＣ１９  のＢａｍＨＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩ  部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  と命名した。
プラスミドｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成９年（１９９７年）９月２９日にＦＥＲＭ  ＢＰ−６１２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１７５】
４．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体、及びＨ鎖ハイブリッド抗
体の作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の各鎖を評価するために再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体とポジティブコントロール抗体としてキメラ抗ＨＭ１．２４抗体を発現させた。そして再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｂ以降の各バージョンを作製する際、どのＦＲ内のアミノ酸残基を置換すべきかを検討するためにＨ鎖ハイブリッド抗体を発現させた。また、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖バージョンａの評価のためにキメラＨ鎖との組合せで発現させた。
【０１７６】
４−１．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の発現（１）
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖のための発現ベクター（ＨＥＦ−ＲＶＨａ−ＡＨＭ−ｇγ１  〜ＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）と再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖のための発現ベクター（ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκあるいはＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ＡＨＭ−ｇκ）各１０μｇ  をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ  （１０μｇ  ）を、ＰＢＳ  中１  ｘ  １０７  細胞／ｍｌ  の０．８ｍｌ  のアリコートに加え、１５００Ｖ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【０１７７】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液３０  ｍｌ  （ＧＩＢＣＯ  社製）に加えた。３７℃、５％ＣＯ２  の条件下で７２時間の培養をＣＯ２  インキュベーターＢＮＡ１２０Ｄ  （ＴＡＢＡＩ  社製）を用いて行った後、培養上清を集め、遠心ローター０３（ＨＩＴＡＣＨＩ  社製）を装着した遠心機１５ＰＲ−２２（ＨＩＴＡＣＨＩ  社製）により１０００  ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い細胞破片を除去し、マイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００  、Ａｍｉｃｏｎ社製）を遠心ローターＪＡ−２０  ・１  （ＢＥＣＫＭＡＮ  社製）を装着した遠心器Ｊ２−２１  （ＢＥＣＫＭＡＮ  社製）により２０００  ｒｐｍの条件下で限外濾過濃縮をおこない、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに用いた。
【０１７８】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の発現（２）
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖バージョンｓのための発現ベクター（ＨＥＦ−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１）と再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖のための発現ベクター（ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ）  各１０μｇ  をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ  細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ  中１  ｘ  １０７  細胞／ｍｌ  の０．８ｍｌ  のアリコートに加え、１，５００Ｖ、２５μＦ  の容量にてパルスを与えた。
【０１７９】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液３０ｍｌ（ＧＩＢＣＯ社製）に加えた。３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で７２時間の培養をＣＯ２  インキュベーターＢＮＡ１２０Ｄ  （ＴＡＢＡＩ社製）を用いて行った後、培養上清を集め、遠心ローター０３（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を装着した遠心機０５ＰＲ−２２  （ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により１０００ｒｐｍ  、５分間の遠心分離を行い細胞破片を除去し、マイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００、Ａｍｉｃｏｎ社製）を遠心ローターＪＡ−２０  ・１  （ＢＥＣＫＭＡＮ社製）を装着した遠心器Ｊ２−２１  （ＢＥＣＫＭＡＮ社製）により２０００ｒｐｍ  の条件下で限外濾過濃縮をおこない、濾過フィルター、マイレクスＧＶ１３ｍｍ（ミリポア社製）用いて濾過滅菌したものをＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに用いた。
【０１８０】
４−２．  キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の発現
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖のための発現ベクター  ＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇγ１  とキメラ抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖のための発現ベクター  ＨＥＦ−１．２４Ｌ−ｇκ各１０μｇ  を用い、上記再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の発現の方法にしたがってＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに用いるためのキメラ抗ＨＭ１．２４抗体を調製した。
【０１８１】
４−３．  ヒト型化Ｌ鎖バージョンａとキメラＨ鎖からなる抗ＨＭ１．２４抗体の発現
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−１．２４Ｈ−ｇ  γ１  と再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖バージョンａのための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−Ｇκ各１０μｇを用い、上記再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の発現の方法に従って、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに用いるためのヒト型化Ｌ鎖バージョンａとキメラＨ鎖からなる抗ＨＭ１．２４抗体を調製した。
【０１８２】
４−４．  Ｈ鎖ハイブリッド抗体の発現
Ｈ鎖ハイブリッドＶ領域のための発現ベクター（ＨＥＦ−ＭＨ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  或いはＨＥＦ−ＨＭ−ＲＶＨ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）と再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ各１０μｇ  を用い、上記再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の発現の方法にしたがってＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに用いるためのＨ鎖ハイブリッド抗体を調製した。
【０１８３】
４−５．  抗体濃度の測定
得られた抗体の濃度測定はＥＬＩＳＡ  により行った。ＥＬＩＳＡ  用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，  ＮＵＮＣ社製）の各穴にコーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３，  ０．０２％  ＮａＮ３，ｐＨ９．６  ）により１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ  抗体（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社製）１００μｌを加え、室温で１時間のインキュベーションを行い固相化した。１００  μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，  ０．０２％ＮａＮ３，  １％牛血清アルブミン（ＢＳＡ），ｐＨ８．１）でブロッキングした後、限外濾過濃縮を行った再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体、及びＨ鎖ハイブリッド抗体を順次段階希釈して各穴に１００  μｌずつ加え室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄の後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  抗体（ＤＡＫＯ社製）１００  μｌを加えた。
【０１８４】
室温にて１時間のインキュベーションおよび洗浄の後、基質バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８））  に溶解した１ｍｇ／ｍｌ  の基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４，  ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ  社製）１００  μｌを加え、４０５ｎｍ  での吸光度をＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。濃度測定の標品としてヒトＩｇＧ１κ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を用いた。
【０１８５】
５．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体安定産生ＣＨＯ細胞株の樹立
５−１．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖発現ベクターの作製
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を制限酵素ＰｖｕＩ及びＢａｍＨＩ  にて消化し、ＥＦ１  プロモーター及び再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ  を含む約  ２．８  ｋｂｐの断片を  １．５％低融点アガロースゲルを用いて精製した。次に、ＤＨＦＲ遺伝子およびヒトＨ鎖定常領域をコードする遺伝子を含むヒトＨ鎖発現ベクターＤＨＦＲ−  ΔＥ−ＲＶｈ−  ＰＭ１ｆ（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）に使用されている発現ベクターをＰｖｕＩ及びＢａｍＨＩ  にて消化することにより調製した約６ｋｂｐ  の断片内に上記ＤＮＡ  断片を挿入し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖発現ベクターＤＨＦＲ−  ΔＥ−ＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  を構築した。
【０１８６】
５−２．  ＣＨＯ  細胞への遺伝子導入
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体安定産生系を樹立するために、ＰｖｕＩで消化して直鎖状にした前記発現ベクターＤＨＦＲ−  ΔＥ−ＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  及びＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκをエレクトロポレーション法により前述と同様（前記ＣＯＳ−７  細胞へのトランスフェクション）の条件下で同時にＣＨＯ  細胞ＤＸＢ−１１に遺伝子導入した。
【０１８７】
５−３．  ＭＴＸ  による遺伝子増幅
遺伝子導入した  ＣＨＯ細胞は５００  μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）及び１０％のウシ胎児血清を添加したヌクレオシド不含α−ＭＥＭ培養液中（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）ではＬ鎖及びＨ鎖発現ベクターが共に導入されたＣＨＯ  細胞のみが増殖でき、それらを選別した。次に、上記培養液中に１０  ｎＭ  のＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ  社製）を加え、増殖したクローンのうち再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の産生量が高いものを選択した結果、約３μｇ／ｍｌの再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体産生率を示すクローン＃１を得、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体産生細胞株とした。
【０１８８】
５−４．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の作製
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の作製は以下の方法で行った。上記再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＨＯ  細胞を、培地として１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を含有する５００  μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を添加したヌクレオシド不含α−ＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２  の条件下で１０日の培養をＣＯ２  インキュベーターＢＮＡ１２０Ｄ  （ＴＡＢＡＩ  社製）を用いて行った。培養開始後８、１０日目に培養液を回収し、ＴＳ−９ローターを装着した遠心機ＲＬ−５００ＳＰ（トミー精工社製）を用いて２０００ｒｐｍ  、１０分間の遠心分離を行い培養液中の細胞破片を除去した後、０．４５μｍ  径のメンブレンをもつボトルトップフィルター（ＦＡＬＣＯＮ社製）により濾過滅菌した。
【０１８９】
この再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体産生ＣＨＯ  細胞培養液に等量のＰＢＳ（−）を加えた後、高速抗体精製装置ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）およびＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラム（日本ガイシ社製）を用い、付属の説明書に基づき吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３  ）を用いて再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体をアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ）を添加してｐＨ７．４  付近に調整した後、遠心限外濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）を用いて濃縮およびＰＢＳ（−）への緩衝液置換を行い、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）を用いて濾過滅菌し精製再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を得た。精製抗体の濃度は、２８０ｎｍ  の吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ  を１．３５０Ｄとして算出した。
【０１９０】
実施例１１．   再構成ヒト抗ＨＭ１．２４  抗体の活性測定
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は下記の抗原結合活性および結合阻害活性にて評価を行った。
１．抗原結合活性および結合阻害活性の測定法
１−１．  抗原結合活性の測定
抗原結合活性の測定は、ＷＩＳＨ細胞を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行った。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ  プレートは前記実施例７．１−２で記載の通り作製した。
【０１９１】
ブロッキングの後、ＣＯＳ−７  細胞の培養上清を濃縮して得られた、またはＣＨＯ  細胞の培養上清より精製された再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各穴に１００  μｌ  加え、室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ  抗体（ＤＡＫＯ社製）を加えた。室温にて１時間インキュベーションおよび洗浄の後、基質溶液を加えインキュベーションの後、６Ｎ  硫酸５０μｌ  で反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）を用いて４９０ｎｍ  での吸光度を測定した。
【０１９２】
１−２．  結合阻害活性の測定
ビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体による結合阻害活性は、ＷＩＳＨ細胞を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで行った。Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ  プレートは前述の通り作製した。ブロッキングの後、ＣＯＳ−７  細胞の培養上清を濃縮して得られた、またはＣＨＯ  細胞の培養上清より精製された再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を段階希釈して各穴に５０μｌ  加え、同時に２  μｇ／ｍｌのビオチン標識マウス抗ＨＭ１．２４抗体５０μｌ  を添加し、室温にて２時間インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製）を加えた。室温にて１時間インキュベーションした後洗浄し、基質溶液を加えインキュベーションの後、６Ｎ  硫酸５０μｌ  で反応を停止させ、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）を用いて４９０ｎｍ  での吸光度を測定した。
【０１９３】
２．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の評価
２−１．  Ｌ鎖
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖バージョンａの評価は、前記の抗原結合活性の測定により行った。図８に示す通り、Ｌ鎖バージョンａはキメラＨ鎖と組合わせて発現させると、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合活性を示した。しかし、さらなる活性の上昇またはＨ  鎖との相性を考慮し、新たにＬ鎖バージョンｂを作製した。そして、Ｈ  鎖のバージョンａ、ｂ、ｆ又はｈと組み合わせたときの抗原結合活性および結合阻害活性の測定を行いＬ  鎖バージョンａ、ｂを共に評価した。図９、１０、１１及び１２に示すとおり、Ｈ  鎖ａ、ｂ、ｆ及びｈの全てのバージョンで、Ｌ鎖バージョンａがバージョンｂに比べて両活性とも強かった。従って、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＬ鎖バージョンａを以下の実験に用いた。
【０１９４】
２−２．  Ｈ鎖バージョンａ−  ｅ
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンａ−  ｅの評価はＬ鎖バージョンａとの組合せで、前記の抗原結合活性および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図１１、１３、１４及び１５に示す通り、全てのバージョンにおいてキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と比較して両活性とも弱く、さらなるアミノ酸の変換が必要であると考えられた。
【０１９５】
２−３．  Ｈ鎖ハイブリッド抗体
Ｈ鎖ハイブリッド抗体の評価は前記の抗原結合活性の測定により行った。その結果、図１６に示す通り、抗原結合活性はヒト−  マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体ではキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同等の活性を有している一方、マウス・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体はキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と比較してその活性が弱かった。従って、マウス抗ＨＭ１．２４抗体、あるいはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同等の抗原結合活性を有する再構成ヒトＨＭ１．２４抗体を作成するためには、Ｈ  鎖Ｖ  領域のうち、ＦＲ３  あるいはＦＲ４  に含まれるアミノ酸を変換する必要があることが示された。
【０１９６】
２−４．  Ｈ鎖バージョン  ｆ−  ｒ
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｆの評価は前記の抗原結合活性測定により行った。その結果、図１７に示す通り、抗原結合活性はキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と比較すると劣るが、上記バージョンａ−  ｃと比較して活性が向上したことから、本バージョンで新たに変換した６７、６９、７５及び７８番目の４つのアミノ酸のうちいずれかが再構成ヒト抗体の活性に関与していることが示唆された。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｇの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図１８及び１９に示す通り、本バージョンは上記バージョンａと同程度の活性しか示さなかったことから、上記Ｈ鎖ヒト・マウスハイブリッド抗体の評価で示した通り、本バージョンで変換した４０番目のアミノ酸は再構成ヒト抗体の活性の向上には寄与していないことが示された。
【０１９７】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｈ−  ｊの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図２０、２１、２２、２３に示す通り、全てのｖｅｒｓｉｏｎ  で両活性ともキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と比較すると弱く、上記バージョンｆと同程度であることから、バージョンｆで新たに変換した４アミノ酸のうち、６７及び６９番目のアミノ酸は再構成ヒト抗体の活性の向上に寄与していないことが示唆された。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｋ−  ｐの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図２４、２５、２６及び２７に示す通り、全てのバージョンで両活性ともキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と比較すると弱く、上記バージョンｈと同程度であることから、これら６つのバージョンで新たに変換した８０番目以降のアミノ酸は再構成ヒト抗体の活性の向上に寄与していないことが示唆された。
【０１９８】
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｑの評価は前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図２５及び２７に示す通り、本バージョンは両活性とも上記バージョンｈあるいはバージョンｐと比較すると弱く、上記バージョンａと同程度の活性しか持たなかったことから、７８番目のアミノ酸の置換が再構成ヒト抗体の活性の向上に必須であることが示唆された。
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｒの評価は前記の測定により行った。その結果、図１５及び２８に示す通り、バージョンｒはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合活性および結合阻害活性を有することが示された。
【０１９９】
以上の結果より、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がマウス抗ＨＭ１．２４抗体あるいはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合能を持つための、Ｈ  鎖における必要で最小の変換は３０、７１及び７８番目、さらには７３番目のアミノ酸であることが示された。
なお、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ鎖バージョンａ−  ｒについて、その抗原結合活性、および結合阻害活性を表６にまとめた。
【０２００】
【表６】
0003587843.tif 000007
【０２０１】
２．５．  Ｈ鎖バージョンｓ
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＨ鎖バージョンｓの評価は、Ｌ鎖バージョンａとの組合せで前記の抗原結合活性、および結合阻害活性の測定により行った。その結果、図２９、３０に示すようにバージョンｓはバージョンｒと同程度の抗原結合活性および結合阻害活性を有することが示された。
また、上記のごとく、本発明の再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体はＦＲ中の１個又は複数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換してもなお、抗原に結合する能力を維持している。したがって、本発明は、その本来の性質を維持している限り、Ｈ鎖又はＬ鎖のＶ領域において、１個又は複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体をも包含する。
【０２０２】
３．  精製再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の評価
前記精製再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は前記の抗原結合活性および結合阻害活性にて評価を行った。その結果、図３１及び３２に示す通り再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合活性および結合阻害活性を有することが示された。このことより、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体と同じ抗原結合能を持つことが示された。
【０２０３】
実施例１２．   キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
１．  投与抗体の調製
１−１．  キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の調製
前記実施例６で得られた精製キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を、遠心限外濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）で濃縮およびＰＢＳ（−）への緩衝液置換を行い、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）を用いて濾過滅菌した。これを濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて２００  μｇ／ｍｌに調製し、以下の実験に用いた。抗体濃度は、２８０ｎｍ  の吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ  を１．３５０Ｄとして算出した。
【０２０４】
１−２．  コントロールヒトＩｇＧ１の精製
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のコントロールとして用いるヒトＩｇＧ１は以下のように精製した。Ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｋａｐｐａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＢＩＮＤＩＮＧ  ＳＩＴＥ社製）に等量のＰＢＳ（−）を加えた後、高速抗体精製装置ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）およびＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラム（日本ガイシ社製）を用い、付属の説明書に基づき吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３  ）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ）を添加してｐＨ７．４  付近に調整した後、遠心限外濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）を用いて濃縮およびＰＢＳ（−）への緩衝液置換を行い、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  社製）を用いて濾過滅菌した。これを濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて２００  μｇ／ｍｌに調製し、以下の実験に用いた。抗体の濃度は、２８０ｎｍ  の吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ  を１．３５０Ｄとして算出した。
【０２０５】
２．  マウス血清ヒトＩｇＧ  定量法
マウスの血清中に含まれるヒトＩｇＧ  の定量は以下のＥＬＩＳＡ  で行った。０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６  ）で１  μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  （ＴＡＧＯ社製）１００  μｌ  を９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希釈したマウス血清あるいは標品としてヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ社製）１００  μｌ  を添加し、室温にて１時間インキュベーションした。洗浄後、２０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ社製）１００  μｌ  を加え、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社製）を用いて４０５ｎｍ  での吸光度を測定した。
【０２０６】
３．  キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対する抗腫瘍効果
３−１．  ヒト骨髄腫移植マウスの作製
ヒト骨髄腫移植マウスは以下のように作製した。ＳＣＩＤマウス（日本クレア）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ  継代したＫＰＭＭ２  細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  社製）で３  ｘ  １０７  個  ／  ｍｌ  になるように調製した。あらかじめ前日抗アシアロＧＭ１  （和光純薬社製）１００  μｌ  を腹腔内投与したＳＣＩＤマウス（オス、８週令）（日本クレア）に上記ＫＰＭＭ２  細胞懸濁液  ２００μｌ  を尾静脈より注入した。
【０２０７】
３−２．  抗体投与
上記ヒト骨髄腫移植マウスよりＫＰＭＭ２  細胞移植後１２日目に血清を採取し、上記２  のＥＬＩＳＡ  を用いて、血清中のヒトＩｇＧ  を定量した。血清中のヒトＩｇＧ  の上昇によりＫＰＭＭ２  細胞の骨髄生着を確認した。これらマウスに対し、ＫＰＭＭ２  細胞移植後１４、２１、２８日目に上記１で調製した抗体をそれぞれ１００  μｌ  腹腔内投与した。
３−３．  キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対する抗腫瘍効果の評価
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗腫瘍効果については、マウスの生存期間で評価した。図３３に示す通り、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を投与したマウスではコントロールヒトＩｇＧ１を投与したマウスと比較して、生存期間の延長が認められた。従って、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体がヒト骨髄腫移植マウスに対して抗腫瘍効果を有することが示された。
【０２０８】
実施例１３． 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＡＤＣＣ  （Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）  活性の測定はＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９３の方法に従った。
１．  エフェクター細胞の調製
健常人の末梢血より比重遠心法で単核球を分離した。すなわち健常人の末梢血に等量のＰＢＳ（−）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に積層し、  ４００ｇで４０分間遠心した。単核球層を分取し、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ  １６４０  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で４回洗浄後、同培養液で細胞数が５  ｘ  １０６／ｍｌになるように調製した。
【０２０９】
ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の骨髄細胞よりＬＡＫ  （Ｌｉｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）を誘導した。すなわちマウスの大腿骨より骨髄細胞を分離し１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ  １６４０  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で２回洗浄後、同培養液で細胞数が２  ｘ  １０５／ｍｌになるように調製した。５０ｎｇ／ｍｌ  のリコンビナントヒトＩＬ−２（Ｒ  ＆  Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）および１０ｎｇ／ｍｌ  のリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ  ＆  Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）とともに、炭酸ガス培養器（ＴＡＢＡＩ社製）内で７日間培養した。同培養液で細胞数が２  ｘ  １０６／ｍｌになるように調製した。
【０２１０】
２．  標的細胞の調製
ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２（特開平７−２３６４７５）あるいは形質細胞腫由来ＡＲＨ−７７  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６２１）を０．１ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（ＩＣＮ社製）とともに１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ  １６４０  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）中で３７℃にて６０分インキュベートすることにより放射性標識した。放射性標識の後、細胞を同培養液で３回洗浄し、２  ｘ  １０５／ｍｌに調製した。
【０２１１】
３．  ＡＤＣＣアッセイ
９６ウエルＵ底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に放射性標識した２  ｘ  １０５／ｍｌの標的細胞を５０μｌ  と、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体、マウス抗ＨＭ１．２４抗体、コントロールヒトＩｇＧ１（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社製）、あるいはコントロールマウスＩｇＧ２ａ（ＵＰＣ１０  、ＣＡＰＰＥＬ社製）５０μｌ  を加え、４℃で１５分間反応させた。
その後、エフェクター細胞１００  μｌ  を、炭酸ガス培養器内で４時間培養した。その際、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比（Ｅ：Ｔ）を  ０：１、３．２：１  、８：１  、２０：１又は５０：１とした。
【０２１２】
１００  μｌ  の上清をとり、ガンマカウンター  （ＡＲＣ−３００  、Ａｌｏｋａ  社製）で培養上清中に遊離された放射活性を測定した。最大遊離放射能測定用には１％ＮＰ−４０  （半井社製）を用いた。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）Ｘ  １００  で計算した。なおＡは抗体存在下において遊離された放射活性（ｃｐｍ）、ＢはＮＰ−４０  により遊離された放射活性（ｃｐｍ）およびＣは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（ｃｐｍ）を示す。
【０２１３】
図３４にエフェクター細胞として健常人末梢血より調製した細胞を用い、標的細胞にＫＰＭＭ２  を用いた場合の結果を示す。図３５にエフェクター細胞として健常人末梢血より調製した細胞を用い、標的細胞にＡＲＨ７７  を用いた場合の結果を示す。コントロールヒトＩｇＧ１と比較して再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、抗体濃度の上昇に従い細胞障害活性が上昇したことから、この再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がＡＤＣＣ活性を有することが示された。
【０２１４】
また、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、マウス抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合と比べて明らかに細胞障害活性が上昇したことから、この再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がマウス抗ＨＭ１．２４抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を有することが示された。さらに、標的細胞がＫＰＭＭ２  の場合、  ０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、細胞障害活性が変わらないことから、  ０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で十分なＡＤＣＣ活性を有することが示された。標的細胞がＡＲＨ７７  の場合、１μｇ／ｍｌ以上の濃度で再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、細胞障害活性が変わらないことから、１μｇ／ｍｌ以上の濃度で十分なＡＤＣＣ活性を有することが示された。
【０２１５】
図３６にエフェクター細胞としてＳＣＩＤマウス骨髄より調製した細胞を用いた場合の結果を示す。コントロールヒトＩｇＧ１と比較して再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、抗体濃度の上昇に従い細胞障害活性が上昇したことから、この再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がＡＤＣＣ活性を有することが示された。また、  ０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体を添加した場合、細胞障害活性が変わらないことから、  ０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で十分なＡＤＣＣ活性を有することが示された。
これらの結果から再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、エフェクター細胞としてヒト由来、あるいはマウス由来の細胞を用いた場合でもＡＤＣＣ活性を有することが示された。
【０２１６】
実施例１４． 再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
１．  投与抗体の調製
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκとプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１を細胞に導入して得られた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体については、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて４０、２００  、１０００μ／ｍｌ  に、また、実施例１２．１−２で得たコントロールヒトＩｇＧ１については、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて  ２００μｇ／ｍｌに調製し、投与抗体とした。
２．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対する抗腫瘍効果
２−１．  ヒト骨髄腫移植マウスの作製
ヒト骨髄腫移植マウスは、実施例１２．３−１に従い作製した。マウスは、ＳＣＩＤマウス（５週令）（日本クレア）を用いた。
【０２１７】
２−２．  抗体投与
上記２−１  で作製したヒト骨髄腫移植マウスよりＫＰＭＭ２  細胞移植９日目に血清を採取し、実施例１２．２のＥＬＩＳＡ  を用いて、血清中のヒトＩｇＧ  を定量した。血清中のヒトＩｇＧ  の上昇によりＫＰＭＭ２  細胞の骨髄生着を確認した。これらマウスに対し、ＫＰＭＭ２  細胞移植後１０日目に上記１で調製した抗体をそれぞれ  １００μｌ  静脈内投与した。
【０２１８】
２−３．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対する抗腫瘍効果の評価
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の抗腫瘍効果については、マウスの血清ヒトＩｇＧ  量の変化、および生存期間で評価した。
マウスの血清ヒトＩｇＧ  量の変化については、ＫＰＭＭ２  細胞移植３５日目に血清を採取し、実施例１２．２のＥＬＩＳＡ  を用いてヒトＩｇＧ  を定量した。その結果、図３７に示すようにコントロールヒトＩｇＧ１投与群では、ＫＰＭＭ２  細胞移植３５日目の血清ヒトＩｇＧ  量は移植９日目（抗体投与前日）と比較して約１０００倍程度まで増加しているのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与群ではいずれの投与量でも、移植９日目とほぼ同じかあるいはそれ以下であり、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がＫＰＭＭ２  細胞の増殖を抑制していることが示された。
【０２１９】
一方、生存期間についても図３８に示す通り、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与群ではコントロールヒトＩｇＧ１投与群と比較して、生存期間の延長が認められた。以上より、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与がヒト骨髄腫移植マウスに対して抗腫瘍効果を有することが示された。
【０２２０】
実施例１５． ヒト骨髄腫マウスモデルにおける、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体と既存薬剤メルファランとの抗腫瘍効果の比較
１．  投与薬剤の調製
１−１．  投与抗体の調製
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκとプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１を細胞に導入して得られた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体については、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて４０、２００  μｇ／ｍｌに、また、実施例１２．１−２で得たコントロールヒトＩｇＧ１については、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて  ２００μｇ／ｍｌに調製し、投与抗体とした。
１−２．  メルファランの調製
骨髄腫に対する既存薬剤であるメルファラン（ＳＩＧＭＡ製）は、  ０．２％カルボメチルセルロース（ＣＭＣ）（ダイセル化学工業製）を用いて、０．１ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
【０２２１】
２．  ヒト骨髄腫移植マウスに対する再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびメルファランの抗腫瘍効果
２−１．  ヒト骨髄腫移植マウスの作製
ヒト骨髄腫移植マウスは、実施例１４．２−１に従い作製した。
２−２．  薬剤投与
上記２−１  で作製したヒト骨髄腫移植マウスよりＫＰＭＭ２  細胞移植９日目に血清を採取し、実施例１２．２のＥＬＩＳＡ  を用いて、血清中のヒトＩｇＧ  を定量した。血清中のヒトＩｇＧ  の上昇によりＫＰＭＭ２  細胞の骨髄生着を確認した。これらマウスに対し、ＫＰＭＭ２  細胞移植後１０日目に上記１−１  で調製した抗体をそれぞれ  １００μｌ  静脈内投与した。さらに、移植後１０日目から１日１回、５日間  ０．２％  ＣＭＣ溶液  ２００μｌ  を経口投与した。一方、メルファラン投与群については、上記１−２  で調製したメルファラン溶液をＫＰＭＭ２  細胞移植後１０日目から１日１回、５日間体重１０ｇ  あたり  １００μｌ（メルファランとして１ｍｇ／ｋｇ）  を経口投与した。
【０２２２】
２−３．  再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のヒト骨髄腫移植マウスに対する抗腫瘍効果の評価
再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の抗腫瘍効果については、マウスの血清ヒトＩｇＧ  量の変化、および生存期間で評価した。
マウスの血清ヒトＩｇＧ  量の変化については、ＫＰＭＭ２  細胞移植３５日目に血清を採取し、実施例１２．２のＥＬＩＳＡ  を用いてヒトＩｇＧ  を定量した。その結果、図３９に示すようにコントロールヒトＩｇＧ１投与群では、ＫＰＭＭ２  細胞移植３５日目の血清ヒトＩｇＧ  量は移植９日目（抗体投与前日）と比較して１０００倍程度増加し、マウス中でＫＰＭＭ２  細胞が増殖しているものと思われた。
【０２２３】
また、既存薬であるメルファランを投与した群でも、コントロールヒトＩｇＧ１投与群ほどではないものの、血清ヒトＩｇＧ  量は薬剤投与前より増加しており、メルファランの投与ではマウス中のＫＰＭＭ２  細胞の増殖を完全には抑制できないと思われた。一方、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与群ではいずれの投与量でも、移植９日目より血清ヒトＩｇＧ  量が減少しており、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体がＫＰＭＭ２  細胞の増殖を抑制していることが示された。
【０２２４】
一方、生存期間についても図４０に示す通り、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与群ではコントロールヒトＩｇＧ１投与群、あるいはメルファラン投与群と比較して、生存期間の延長が認められた。以上より、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体投与がヒト骨髄腫移植マウスに対して抗腫瘍効果を有すること、さらに本抗体の抗腫瘍効果は既存薬剤のメルファランよりも強いことが示された。
以上より、ヒト由来のエフェクター細胞を用いた場合、マウス抗ＨＭ１．２４抗体は殆どヒト骨髄腫細胞に対して、細胞障害活性を示さなかったのに比して、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗ＨＭ１．２４抗体は強い細胞障害活性を示した。この事実は抗体をヒト型化することの重要性を示し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のヒトでの有用性を期待させる。
【０２２５】
ヒト骨髄腫移植ＳＣＩＤマウスにおいて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体が非常に強い抗腫瘍効果を示したが、ヒトにおいては当然エフェクターはヒト由来であり、リンパ球も正常に存在していることから、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体のさらに強い抗腫瘍効果が期待できる。
骨髄腫モデルにおいて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は既存の骨髄腫治療薬に比べ強い抗腫瘍効果を示したことより、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体が画期的な骨髄腫治療薬になることが期待される。
【０２２６】
参考例１． マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４，  １９９２−１９３０  に記載の方法にて、マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製した。
ヒト多発性骨髄腫患者の骨髄に由来するエプスタインーバーウィルスー核抗原（ＥＢＮＡ）ー陰性形質細胞株ＫＰＣ−３２（１ｘ１０７  個）（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （１１９９１）  ３２，  １４００）をＢＡＬＢ／Ｃマウス（チャールスリバー製）の腹腔内に６  週間おきに２  回注射した。
【０２２７】
このマウスを屠殺する３  日前にマウスの抗体産生価をさらに上昇させるために、１．５  ｘ  １０６  個のＫＰＣ−３２細胞をマウスの脾臓内に注射した（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （１９９０）  ３７，  ８９  ）。マウスを屠殺した後に脾臓を摘出し、Ｇｒｏｔｈ，  ｄｅ  Ｓｔ．  ＆  Ｓｃｈｒｅｉｄｅｇｇｅｒの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９８１）  ４１，  ３４６５  ）に従い摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／０  を細胞融合に付した。
【０２２８】
ＫＰＣ−３２細胞をコートしたプレートを使用するＥＬＩＳＡ  （Ｐｏｓｎｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８２）  ４８，  ２３  ）によりハイブリドーマ培養上清中の抗体のスクリーニングを行った。５  ｘ  １０４  個のＫＰＣ−３２細胞を５０  ｍｌ  のＰＢＳ  に懸濁し、９６ウエルプレート（Ｕ  底型、Ｃｏｒｎｉｎｇ  、Ｉｗａｋｉ  製）に分注した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ）を含むＰＢＳ  でブロックした後、ハイブリドーマ培養上清を加え４  ℃にて２  時間インキュベートした。次いで、４  ℃にて１  時間ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ  ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  製）を反応させ、一度洗浄して、室温にて３０分間ｏ−フェニレンジアミン基質溶液（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  製）を反応させた。
【０２２９】
２Ｎ硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）で４９２ｎｍ  における吸光度を測定した。ヒト免疫グロブリンに対する抗体を産生するハイブリドーマを除去するために、陽性ハイブリドーマ培養上清をヒト血清にあらかじめ吸着させ、他の細胞下部に対する反応性をＥＬＩＳＡ  にてスクリーニングした。陽性のハイブリドーマを選択し、種々の細胞株およびヒトの標本に対する反応性をフローサイトメトリーで調べた。最後に選択されたハイブリドーマクローンを二度クローン化し、これをプリスタン処理したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に注射して、腹水を取得した。
【０２３０】
モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウムによる沈澱とプロテインＡ  アフィニティクロマトグラフィーキット（Ａｍｐｕｒｅ  ＰＡ  、Ａｍｅｒｓｈａｍ製）によりマウス腹水より精製した。精製抗体は、Ｑｕｉｃｋ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣ結合キット（ベーリンガーマンハイム製）を使用することによりフルオロセイニチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合させた。
その結果、３０のハイブリドーマクローンが産生するモノクローナル抗体がＫＰＣ−３２およびＲＰＭＩ  ８２２６  細胞と反応した。クローニングの後、これらのハイブリドーマの培養上清を他の細胞株と末梢血由来単核球との反応性を調べた。
【０２３１】
このうち、３  つのクローンが形質細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体であった。これらの３  つのクローンのうち、最もフローサイトメトリー分析に有用であり、かつＲＰＭＩ  ８２２６  細胞に対する補体依存性細胞障害活性を有するハイブリドーマクローンを選択し、ＨＭ１．２４と名付けた。このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを、サブクラス特異的抗マウスウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  製）を用いたＥＬＩＳＡ  にて決定した。抗ＨＭ１．２４抗体は、ＩｇＧ２ａ  κのサブクラスを有していた。抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマＨＭ１．２４は、工業技術院生命工学工業研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成７年９月１４日にＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０２３２】
参考例２． ＨＭ１．２４抗原ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニング
１．  ｃＤＮＡライブラリーの作製
１）全ＲＮＡ  の調製
マウスモノクローナル抗体ＨＭ１．２４が特異的に認識する抗原ポリペプチドであるＨＭ１．２４抗原をコードするｃＤＮＡを以下のように単離した。
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２  から、全ＲＮＡ  をＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ，  １８，  ５２９４  （１９７９））の方法に従って調製した。すなわち、２．２  ｘ  １０８  個のＫＰＭＭ２  を２０ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネート（ナカライテスク製）中で完全にホモジナイズさせた。
【０２３３】
ホモジネートを遠心管中の５．３Ｍ塩化セシウム溶液層状に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０ローター中で３１，０００ｒｐｍ  にて２０℃で２４時間遠心分離することによりＲＮＡ  を沈殿させた。ＲＮＡ  沈殿物を７０％エタノールにより洗浄し、そして１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び  ０．５％  ＳＤＳを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）  ３００μｌ  中に溶解し、それにＰｒｏｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した後、３７℃にて３０分間インキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＲＮＡ  をエタノールで沈殿させた。次に、ＲＮＡ  沈殿物を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）  ２００μｌ  に溶解した。
【０２３４】
２）ｐｏｌｙ（Ａ）  ＋ＲＮＡ  の調製
前記のようにして調製した全ＲＮＡ  の約  ５００μｇ  を材料としてＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０ｍ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてキット添付の処方に従ってｐｏｌｙ（Ａ）  ＋ＲＮＡ  を精製した。
３）ｃＤＮＡライブラリーの構築
上記ｐｏｌｙ（Ａ）  ＋ＲＮＡ  １０μｇ  を材料としてｃＤＮＡ合成キットＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いてキット添付の処方に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成し、更にＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いてキット付属のＥｃｏＲＩ  アダプターをキット添付の処方に従って連結した。ＥｃｏＲＩ  アダプターのカイネーション及び制限酵素ＮｏｔＩ処理はキット添付の処方に従って行った。更に、約５００ｂｐ  以上の大きさのアダプター付加二本鎖ｃＤＮＡを  １．５％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ製）を用いて分離、精製し、アダプター付加二本鎖ｃＤＮＡ約４０μｌ  を得た。
【０２３５】
このようにして作製したアダプター付加二本鎖ｃＤＮＡを、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ  、ＮｏｔＩ及びアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）処理したｐＣＯＳ１  ベクター（特願平８−２５５１９６）とＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）を用いて連結し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。構築したｃＤＮＡライブラリーは、大腸菌細胞株ＤＨ５  α（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に形質導入され、全体のサイズは約２．５  ｘ  １０６  個の独立したクローンであると推定された。
【０２３６】
２．  直接発現法によるクローニング
１）ＣＯＳ−７  細胞へのトランスフェクション
上記の形質導入した大腸菌約５  ｘ  １０５  クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２−ＹＴ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））  にて培養することによりｃＤＮＡの増幅を行い、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））  により大腸菌からプラスミドＤＮＡ  を回収した。得られたプラスミドＤＮＡ  はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いてエレクトロポレーション法によりＣＯＳ−７  細胞にトランスフェクションした。
【０２３７】
すなわち、精製したプラスミドＤＮＡ  １０μｇ  を１  ｘ  １０７  細胞／ｍｌ  でＰＢＳ  中に懸濁したＣＯＳ−７  細胞液０．８ｍｌ  に加え、１５００Ｖ  、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞は、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）を含むＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）にて、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で３日間培養した。
【０２３８】
２）パンニングデイッシュの調製
マウス抗ＨＭ１．２４抗体をコーティングしたパンニングデイッシュを、Ｂ．Ｓｅｅｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ３３６５−３３６９  （１９８７））  の方法に従って調製した。すなわち、マウス抗ＨＭ１．２４抗体を１０μｇ／ｍｌになるように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ９．５）に加えた。このようにして調製した抗体溶液３ｍｌ  を直径６０ｍｍの細胞培養皿に加え、室温にて２時間インキュベートした。０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液にて３回洗浄した後、５％牛胎児血清、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＮａＮ３  を含むＰＢＳ  を加え、ブロッキングした後、下記クローニングに用いた。
【０２３９】
３）ｃＤＮＡライブラリーのクローニング
前述のようにトランスフェクトしたＣＯＳ−７  細胞は、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ  にて剥がし、５％牛胎児血清を含むＰＢＳ  で一回洗浄した後、約１  ｘ  １０６  細胞／ｍｌ  となるように５％牛胎児血清及び０．０２％  ＮａＮ３  を含むＰＢＳ  に懸濁し、上記のように調製したパンニングデイシュに加え、室温にて約２時間インキュベートした。５％牛胎児血清及び０．０２％  ＮａＮ３  を含むＰＢＳ  で３度緩やかに洗浄した後、  ０．６％  ＳＤＳ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  を含む溶液を用いてパンニングデイシュに結合した細胞からプラスミドＤＮＡ  の回収を行った。
【０２４０】
回収したプラスミドＤＮＡ  を再び大腸菌ＤＨ５  αに形質導入し、前述のようにプラスミドＤＮＡ  を増幅後、アルカリ法にて回収した。回収したプラスミドＤＮＡ  をＣＯＳ−７  細胞にエレクトロポレーション法によりトランスフェクトして前述と同様に結合した細胞よりプラスミドＤＮＡ  の回収を行った。同様の操作を更に１回繰り返し、回収したプラスミドＤＮＡ  を制限酵素ＥｃｏＲＩ  およびＮｏｔＩで消化した結果、約０．９ｋｂｐのサイズのインサートの濃縮が確認された。さらに、回収したプラスミドＤＮＡ  の一部を形質導入した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２−ＹＴアガープレートに接種し、一晩培養後、単一のコロニーよりプラスミドＤＮＡ  を回収した。制限酵素ＥｃｏＲＩ  およびＮｏｔＩにて消化し、インサートのサイズが約０．９ｋｂｐを示すクローンｐ３．１９  を得た。
【０２４１】
本クローンについては、ＰＲＩＳＭ，  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、キット添付の処方に従い反応を行い、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）にて塩基配列の決定を行った。このアミノ酸配列および塩基配列を配列番号１０３  に示す。
配列番号：１０３  に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡはｐＵＣ１９  ベクターのＸｂａＩ切断部位の間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  を含む大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  は平成５年（１９９３年）１０月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  （ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９）として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。
【０２４２】
【発明の効果】
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体の可変領域とヒト抗体定常領域からなり、再構成抗ＨＭ１．２４抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体の相捕性決定領域とヒト抗体フレームワーク領域およびヒト抗体定常領域からなることから、ヒトにおける抗原性が低く、それ故に医薬組成物、特に骨髄腫治療剤として期待される。
【０２４３】
【配列表】
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【０２４４】
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【０２４５】
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【０２４６】
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【０２４７】
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【０２４８】
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【０２５０】
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【０２５１】
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【０２５８】
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【０２７２】
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【０２７３】
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【０２７５】
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【０２７６】
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【０２７７】
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【０２７８】
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【０２７９】
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【０２８０】
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【０２８１】
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【０２８３】
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【０２９０】
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【０２９３】
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【０３００】
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【０３１５】
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【０３１６】
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【０３１９】
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【０３２４】
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【０３２５】
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【０３２６】
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【０３２９】
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【０３３０】
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【０３３１】
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【０３３２】
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【０３３３】
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【０３３４】
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【０３３７】
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【０３３９】
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【０３４０】
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【０３４１】
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【０３４２】
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【０３４３】
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【０３４４】
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【０３４５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２  を用いたＦＣＭ  解析において、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の蛍光強度がマウス抗ＨＭ１．２４抗体の蛍光強度と同様に、コントロール抗体に比べシフトしていることを示すグラフである。
【図２】図２は、ＷＩＳＨ細胞を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにおいて、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体はマウス抗ＨＭ１．２４抗体と同様に、ビオチン化マウス抗ＨＭ１．２４抗体のＷＩＳＨ細胞への結合を濃度依存的阻害していることを示すグラフである。
【図３】図３は、コントロールヒトＩｇＧ１、あるいはマウス抗ＨＭ１．２４抗体は、ＲＰＭＩ８２２６細胞に対する細胞障害活性を持たないのに対し、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体はＥ／Ｔ  比の上昇に伴い、ＲＰＭＩ  ８２２６  細胞に対する細胞障害活性が上昇していることを示すグラフである。
【図４】図４は、ＰＣＲ  法によるＣＤＲ  グラフティングにより再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ  鎖を、作製する方法を示す模式図である。
【図５】図５は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖の作製において、ＰＣＲ  法によりＲＶＨ１、ＲＶＨ２、ＲＶＨ３及びＲＶＨ４のオリゴヌクレオチドをアセンブリーする方法を示す模式図である。
【図６】図６は、ＰＣＲ  法によりヒト・マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖Ｖ  領域を作製する方法を示す模式図である。
【図７】図７は、ＰＣＲ  法によりマウス・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖Ｖ  領域を作製する方法を示す模式図である。
【図８】図８は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ  鎖バージョンａはキメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合活性を有することを示すグラフである。なお、−１，  −２はロットの違いを示す。
【図９】図９は、Ｌ  鎖バージョンａとＨ  鎖バージョンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｌ  鎖バージョンｂとＨ  鎖バージョンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体の結合活性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ｌ  鎖バージョンａとＨ  鎖バージョンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Ｌ  鎖バージョンｂとＨ  鎖バージョンａ、ｂ、ｆ又はｈを組み合わせた再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗体ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｂ、ｃ、ｄ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｅ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。なお、−１，  −２はロットの違いを示す。
【図１５】図１５は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｃ、ｐ、ｒ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ヒト・マウスハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体、マウス・ヒトハイブリッド抗ＨＭ１．２４抗体およびキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図１７】図１７は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｂ、ｃ、ｆ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図１８】図１８は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｇ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｇ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｈ、ｉ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図２１】図２１は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｆ、ｈ、ｊ及びにキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示す。
【図２２】図２２は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｈ、ｉ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図２３】図２３は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｆ、ｈ、ｊ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図２４】図２４は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図２５】図２５は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｈ、ｐ、ｑ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンｈ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＷＩＳＨ細胞への結合阻害活性を示すグラフである。
【図２７】図２７は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｈ、ｐ、ｑ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の結合阻害活性を示すグラフである。
【図２８】図２８は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体Ｈ  鎖バージョンａ、ｃ、ｐ、ｒ及びキメラ抗ＨＭ１．２４抗体の抗原結合活性を示すグラフである。
【図２９】図２９は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体バージョンｓが、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体バージョンｒと同程度の抗原結合活性を有することを示すグラフである。
【図３０】図３０は、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体バージョンｓが、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体バージョンｒと同程度の結合阻害活性を有することを示すグラフである。
【図３１】図３１は、精製再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の抗原結合活性を有することを示すグラフである。
【図３２】図３２は、精製再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体と同程度の結合阻害活性を有することを示すグラフである。
【図３３】図３３は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体の投与により、コントロールヒトＩｇＧ１投与に比べて、生存期間が延長していることを示すグラフである。
【図３４】図３４は、エフェクター細胞としてヒト健常人末梢血由来細胞を用いた場合、コントロールヒトＩｇＧ１はＫＰＭＭ２  細胞に対して細胞障害活性を示さず、また、マウス抗ＨＭ１．２４抗体も細胞障害活性が弱いのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、ＫＰＭＭ２  細胞に対して強い細胞障害活性を示していることを示す表すグラフである。
【図３５】図３５は、エフェクター細胞としてヒト健常人末梢血由来細胞を用いた場合、コントロールヒトＩｇＧ１はＡＲＨ−７７細胞に対して細胞障害活性を示さず、また、マウス抗ＨＭ１．２４抗体も細胞障害活性が弱いのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は、ＡＲＨ−７７細胞に対して強い細胞障害活性を示していることを示す表すグラフである。
【図３６】図３６は、エフェクター細胞としてＳＣＩＤマウス骨髄由来細胞を用いた場合、コントロールヒトＩｇＧ１はＫＰＭＭ２  細胞に対する細胞障害活性を持たないのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体は抗体温度の上昇に伴い、ＫＰＭＭ２  細胞に対する細胞障害活性が上昇していることを表すグラフである。
【図３７】図３７は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、コントロールヒトＩｇＧ１では投与前に比べ投与後も血清ヒトＩｇＧ  量が増加しているのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体では、抗体投与により、血清ヒトＩｇＧ  量の増加を抑制していることを示すグラフである。
【図３８】図３８は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の投与により、コントロールヒトＩｇＧ１投与に比べ、生存期間が延長していることを示すグラフである。
【図３９】図３９は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、メルファラン、およびコントロールヒトＩｇＧ１では投与前に比べ投与後も血清ヒトＩｇＧ  量が増加しているのに対し、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体では、抗体投与により、血清ヒトＩｇＧ  量の増加を抑制していることを示すグラフである。
【図４０】図４０は、ヒト骨髄腫移植マウスにおいて、再構成ヒト抗ＨＭ１．２４抗体の投与により、メルファラン、あるいはコントロールヒトＩｇＧ１投与に比べ、生存期間が延長していることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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