(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、固相及び抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に同時に接触させ、反応により生成した固相化試料に結合した抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と、未反応の抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体とを分離し、固相化試料に結合した抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体または未反応の抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を検出することを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定法。
【請求項２】
請求項１に記載の測定法において、試料の前処理を弱酸性条件下で行うことを特徴とする測定法。
【請求項３】
請求項２に記載の測定法において、弱酸性条件下がｐＨ３．０〜６．９であることを特徴とする測定法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の測定法において、試料の前処理に脂肪族カルボン酸緩衝液又は硼酸緩衝液を用いることを特徴とする測定法。
【請求項５】
請求項４に記載の測定法において、脂肪族カルボン酸緩衝液が、コハク酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フマル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液であることを特徴とする測定法。
【請求項６】
固相及び抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体とから成る、請求項１〜５いずれかに記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定法用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための１ステップ免疫測定法及びそのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）はヘモグロビンの１種であって、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端アミノ酸のバリンのアミノ基にグルコースのアルデヒド基がシッフ塩基を形成して結合し、さらにアマドリ転位を受けてケトアミンを形成したもので、１〜２カ月前の平均血糖値を反映するところから、糖尿病患者の血糖コントロールの指標として臨床的に広く用いられている。
【０００３】
従来ＨｂＡ１ｃの測定には、イオン交換クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣ法による測定機すなわちグリコヘモグロビン分析計が主に用いられていた。この方法は再現性に優れているが、専用の分析装置であること、検体処理数に制限があること、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビン画分を加味して測定してしまうこと、などの問題点が指摘されていた。また、装置のメンテナンスに多大な手間がかかることも問題である。
【０００４】
近年になって、この問題点を解決するために、ＨＰＬＣ以外の方法によるＨｂＡ１ｃの測定系の開発が行なわれ、いくつかの測定試薬が上市された。中でも免疫測定は、特異性が高いことから注目を集めている。
【０００５】
ＨｂＡ１ｃの免疫測定系としては、例えば２つの抗体を用いたサンドイッチアッセイなどが考えられるが、ヘモグロビンの固相への物理吸着を利用して、固相に吸着したＨｂＡ１ｃをＨｂＡ１ｃに特異性の高い抗体で検知する方法が知られている。この固相にヘモグロビンを直接吸着させる方法では、ヘモグロビンが固相に対して過剰量存在するときには、血液中のＨｂＡ１ｃの割合と等しい割合で固相上にＨｂＡ１ｃが吸着される。臨床現場においてはＨｂＡ１ｃは総ヘモグロビン量に対する割合（％）で表されるため、固相上に血液中と等しい割合でＨｂＡ１ｃが吸着されると、ＨｂＡ１ｃの絶対量を測定しなくても、血液中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）が求められることになる。この、ヘモグロビンを固相に吸着させる方法においては、固相上に十分にヘモグロビンが吸着することが必須である。従って、まずラテックスやポリスチレンなどの固相表面上にヘモグロビンを吸着させ、必要に応じて洗浄などにより未吸着のヘモグロビンを除去し、次にＨｂＡ１ｃを特異的に選択する抗ＨｂＡ１ｃ抗体により、ＨｂＡ１ｃのみを特異的に認識するという２段階を経ることとなり、この方法によるＥＩＡ用キットも市販されている。
【０００６】
この市販のＥＩＡ用キットを用いた２ステップ測定においては、中間洗浄操作が必要となるため、操作が繁雑になることはもちろん、吸着、洗浄、抗体結合の３段階を経ることにより時間がかかり、また洗浄により固相化されたヘモグロビンが脱落する可能性がある。さらにこれらのキットにおいては、β鎖Ｎ末のグリケート化Ｎ末端ペプチド残基を抗体結合に利用するために、固相化時に血液試料に強い変性処理を施すことが多いが、酵素標識抗体がこの条件下で失活する可能性が高いため、１ステップにすることは難しいという問題がある。また、これらのキットにおいてはこの強い変性条件のため、変性血液試料は調製後ただちに用いることが要求されており、時間が経過すると、沈澱の生成などにより値がばらついたり正確な値が得られなくなることから、大量処理には不適当であると考えられていた。
【０００７】
他方、ＥＩＡ以外にラテックス凝集法を利用した免疫測定法も開発されている。未感作ラテックス液中に溶血検体を添加しヘモグロビンを物理吸着させて固相化し、次にＨｂＡ１ｃと反応するモノクローナル抗体と抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を添加して凝集を生じさせて、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定する方法である。本方法においては洗浄操作は必要としないが、抗原を吸着させるためのラテックスを大量に必要とするため、非特異的な凝集反応が生じる可能性があり、異常値が出現したり、あるいはＨｂＡ１ｃの抗原抗体反応による濁度増加が検出されにくくなる恐れがあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
糖尿病を初めとする成人病は、老年人口の増加とともに確実に増加している。それとともに老人検診が必要となると、ＨｂＡ１ｃのような血糖状態の指標として広く認知されている項目は検診の対象となるため、処理検体能力の向上は必須であり、簡便で正確にしかも大量に処理することが可能である測定試薬の開発は非常に求められるところである。従来の技術では、ＨＰＬＣ法では検体処理能力が小さく、簡便さの面で問題があり、専用機が必要であるという問題点があり、他方ＥＩＡ法やラテックス凝集法は操作が繁雑である、正確性に欠けるなどの問題点があった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特異性の高い免疫法を基本とし、かつより簡便で正確にＨｂＡ１ｃ濃度を測定できる系を検討した結果、固相へのヘモグロビンの吸着及び抗原ＨｂＡ１ｃと抗ＨｂＡ１ｃ抗体の結合を同時に行なわせる１ステップ系によりＨｂＡ１ｃを測定可能な系を構築し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、試料を、固相及び抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に同時に接触させ、反応により生成した固相化試料に結合した抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と、未反応の抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体とを分離し、固相化試料に結合した抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体または未反応の抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を検出することを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定法にある。
【００１１】
また本発明は、固相及び抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体とから成る、ヘモグロビンＡ１ｃの１ステップ免疫測定法用キットである。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１２】
本発明では、血液中のＨｂＡ１ｃを測定するため、試料となる血液はあらかじめ溶血させておく必要がある。溶血の方法には特に限定はなく、種々の方法を使用することができ、例えば水などの低等張液や界面活性剤を用いることができる。
【００１３】
溶血させた後、続いて試料の前処理を行う。この前処理によって、ＨｂＡ１ｃを変性させ、また不安定型ＨｂＡ１ｃを除去することができる。前処理の方法には特に限定はなく、種々の方法を使用することができ、例えばＫＳＣＮ塩などを用いることができる。しかしながら、次に行われる免疫測定系への悪影響を低減するため、すなわち、反応系に共存する前処理液により試料中に沈殿が精製するのを低減し、また酵素ラベル化抗体を用いた場合の酵素の失活を低減するため、前処理はよりマイルドな条件で、必要最小限の量を用いて行うことが好ましい。従って前処理は、例えば弱酸性条件下で行うことが好ましい。弱酸性条件下とは、好ましくはｐＨ３．０〜６．９、さらに好ましくはｐＨ４．０〜６．０である。このような条件下での前処理には、例えば脂肪族カルボン酸緩衝液またはほう酸緩衝液などを用いることが例示される。脂肪族カルボン酸緩衝液としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸などの緩衝液が例示され、具体的にはコハク酸緩衝液、マロン酸緩衝液、フマル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液などが例示される。この中でもコハク酸緩衝液、グルタル酸緩衝液又は酢酸緩衝液などが好ましく、特にコハク酸緩衝液が好ましい。
【００１４】
このような弱酸性条件下で前処理を行うことにより、ヘモグロビンのα２β２の構造を保持したままＨｂＡ１ｃを変性させ、かつ不安定型ＨｂＡ１ｃを除去することができる。なお溶血、前処理は順次行ってもよく、また同時に行ってもよい。
【００１５】
このように溶血・前処理した試料を、固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体に同時に接触させる。この時に用いられる固相は、ヘモグロビンが物理的に吸着しうるものであれば特に限定はされないが、例えばガラス、ポリスチレン、ラテックス、濾紙などの素材による、チューブ、玉、プレート、微粒子などが挙げられる。いずれにしても固相は表面積が大きいもののほうがヘモグロビンの吸着量が増し、ひいては測定感度の向上につながるので好ましい。
【００１６】
一方、反応に用いられる抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨｂＡ１ｃを特異的に認識する物であれば、特に限定はなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体いずれであってもよく、またそれらをフラグメント化したものであってもよい。この抗ＨｂＡ１ｃ抗体には、免疫反応後の検出に便利なようにラベルをつけることが好ましい。このラベルは通常、免疫反応の検出に用いられるものであれば特に限定はなく、酵素、放射性同位元素、蛍光物質などが例示され、特に酵素標識が好ましい。具体的には、酵素としてはアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼなどが、放射性同位元素としては１２５Ｉなどが、蛍光物質としてはフルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。また抗ＨｂＡ１ｃ抗体がラベル化されない場合には、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を認識する抗体（第２抗体）をラベル化し、それを反応させ検出に用いればよい。この時のラベルも前述のものが用いられる。なお抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、固相化されたＨｂＡ１ｃと結合するのに十分な量を添加することが好ましい。
【００１７】
本発明において試料は、固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体に同時に接触させ反応を行わせる。このように試料の固相への反応及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体への反応を１ステップで実施することが特徴である。このためには、試料に対して固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体を同時に添加する方法や、また固相と抗ＨｂＡ１ｃ抗体をあらかじめ混合しそれらを試料に添加する方法などが挙げられる。試料の固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体への反応条件としては特に限定はなく、通常の免疫測定反応時の条件を採用すればよい。ただし検出に支障がない限り、反応時間は短い方がよく、通常５〜６０分、好ましくは５〜５０分、さらに好ましくは５〜１５分である。これは、測定効率の向上のためばかりでなく、反応系に共存する前処理液により試料中に沈殿が生成するのを低減し、また酵素ラベル化抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いた場合には、前処理液による酵素の失活を低減することができるからである。なお、抗ＨｂＡ１ｃ抗体がラベル化されていない場合は、ラベル化した第２抗体を添加し、反応させることが好ましい。
【００１８】
試料の固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体への反応後に、固相化試料に結合した抗ＨｂＡ１ｃ抗体と、未反応の抗ＨｂＡ１ｃ抗体とを分離し、必要に応じて洗浄を行ってもよい。次いで固相化試料に結合した抗ＨｂＡ１ｃ抗体、または、未反応の抗ＨｂＡ１ｃ抗体を検出し、試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めればよい。この時、抗ＨｂＡ１ｃ抗体がラベル化されている場合は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体上のラベルによって検出すればよく、また抗ＨｂＡ１ｃ抗体がラベル化されていない場合は、第２抗体のラベルを検出すればよい。検出にはラベルにあった方法が適宜採用できる。
【００１９】
本発明の測定法を実施するには、反応に使用する物をキット化することが好ましい。このキットは固相及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体から成り、ＨｂＡ１ｃの１ステップ免疫測定に用いられる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、ＨｂＡ１ｃの１ステップ免疫測定が可能となった。これにより従来法の２段階によるＨｂＡ１ｃの測定に比べて、測定に要する時間が短縮化できる。このため、免疫反応を実施する際に、反応系に共存する前処理液との接触時間が短縮されるため、試料中に沈殿が生成するのを低減でき、また、酵素ラベル化抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いた場合には、前処理液による酵素の失活を低減する事ができる。さらに、反応した抗ＨｂＡ１ｃ抗体と未反応の抗ＨｂＡ１ｃ抗体との分離操作が１回で済むため、固相化されたヘモグロビンの脱落の恐れが少なくなった。
【００２１】
更に本発明により、患者を問診する前に患者から採血しておけば、問診までに最新のＡ１ｃ測定値を求めることが可能となり、また問診中に採血したとしても患者を待たせる事なく結果を入手できる。
【００２２】
本方法と市販の自動免疫診断装置を組みあわせて用いれば、最初の溶血操作以外は全く自動で結果を得ることができる。また、反応途中に洗浄などの操作が必要ないことから、測定時間の短縮化が可能であり、診断効率の飛躍的な向上が可能である。
【００２３】
さらに市販の全自動免疫診断装置にて測定が可能であるため、他の糖尿病のマーカー、例えばインスリンやＣ−ペプチドなどの検査を同時に行なうことができ、簡単に多くの情報を一度に得ることができる。
【００２４】
【実施例】
実施例１  ＨｂＡ１ｃ測定法の確立と検量線の作成。
【００２５】
アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体は以下のように作製した。すなわち、抗ＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体（ダコ社製）２ｍｇと市販のウシ小腸由来アルカリ性ホスファターゼ（バイオザイム社製）２ｍｇを用い、これをＳ−Ｓ結合により結合させた後、ゲル濾過（カラム：Ｇ３０００ＳＷ、東ソー（株）製；溶出：１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７））を行なって精製した（石川栄治ら編集、酵素免疫測定法第３版、医学書院、１１７頁〜参照）。次に５％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、及び０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に、調製したアルカリ性ホスファターゼ標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体を１．５ｍＡ（１ｍＡは２８０ｎｍにおける吸光度が０．００１）になるように加えた。この反応液１００μｌをカップに注入し、さらにポリスチレンビーズ（直径１．４〜１．６ｍｍ）１２個を加えた。
【００２６】
標準品は、６種のＨｂＡ１ｃ濃度の患者の血液より血球成分を分離し洗浄した後、精製水を用いて溶血し、これを凍結乾燥したものを作製し、これを精製水を用いて再溶解後市販のグリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩ型、東ソー（株）製）にて濃度決定を行なったものを使用した。この再溶解後の標準品２０μｌを、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０）５８０μｌに加えて撹拌後さらに室温で３０分放置して抗原溶液とした。
【００２７】
上記の標識抗体を含む反応液及びビーズを入れたカップに、抗原溶液１０μｌを加えて、市販の全自動免疫装置（ＡＩＡ−１２００、東ソー（株）製）を用いて１ステップ免疫測定を行なった。即ち、３７℃で４０分間反応後、酵素標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体と抗原ＨｂＡ１ｃとからなる抗原抗体複合物の吸着したビーズを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼの基質である４−メチルウンベリフェロンりん酸（４ＭＵＰ）を０．２６ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する基質溶液（ｐＨ１０）２２０μｌを添加し、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の生成速度を、励起波長３６２ｎｍ、測定波長４４７ｎｍにおいて測定した。なお、４ＭＵＰはアルカリ性ホスファターゼの作用により４ＭＵに変化し、蛍光を発する。
【００２８】
結果を図１に示す。横軸が標準品の濃度（グリコヘモグロビン分析計にて決定したもの）、縦軸が標識として用いたアルカリ性ホスファターゼによる基質分解速度を示す。ＨｂＡ１ｃ濃度（％）に依存して基質分解物である４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の生成速度が増加しており、標準曲線の作成が可能となった。
【００２９】
実施例２  従来法（ＨＰＬＣ法）との相関。
【００３０】
健常人及び糖尿病患者よりＥＤＴＡ採血により採取した全血検体は、この２０μｌを０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０）５８０μｌに加えて撹拌後、さらに室温で３０分放置して完全に溶血前処理を行ない抗原溶液として供した。患者全血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度については、あらかじめＨＰＬＣ法である市販のグリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩ型、東ソー（株）製）にて決定した。実施例１に従ってＡＩＡ−１２００上で１ステップ測定を行ない、ＨｂＡ１ｃ濃度を決定した。
【００３１】
結果を図２に示す。患者検体５０例についての測定結果であり、横軸はＨＰＬＣ法により決定されたＨｂＡ１ｃ濃度（％）を、縦軸は本発明方法により決定された濃度を示す。両者の間には、相関式ｙ＝１．６３＋０．６９ｘ、相関係数ｒ＝０．９０７と良好な相関を認め、本方法と従来法（ＨＰＬＣ法）の挙動は一致することが示された。
【００３２】
実施例３  同時再現性及び測定間再現性。
【００３３】
前述の１ステップ免疫測定法による同時再現性を４種の異なる濃度のＨｂＡ１ｃを含む患者検体を用いて評価した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003551678.tif 000002
【００３５】
どの濃度域においても同時再現性は３．５〜４．３％であり良好であった。また２種の濃度の検体を用いて測定間再現性を検討したところ、表２に示すように４％以下の良好な結果を得た。
【００３６】
【表２】
0003551678.tif 000003
【００３７】
実施例４  １０分測定系の構築。
【００３８】
実施例１〜３の１ステップ免疫測定法は、いずれも４０分のインキュベーションを行なっているが、検体処理効率を高めるために、インキュベーションを１０分間に短縮した１ステップ免疫測定系を構築した。すなわち、実施例１におけるアルカリ性ホスファターゼ標識抗ＨｂＡ１ｃ抗体を５ｍＡになるように加えた反応液を用いて免疫測定を行った。本方法における検量線を図３に示す。横軸が標準品の濃度（グリコヘモグロビン分析計にて決定したもの）、縦軸が標識として用いたアルカリ性ホスファターゼによる基質分解速度を示す。また、実施例２に従って、患者検体を用いて従来法と１０分測定系の相関を検討した結果を図４に示す。患者検体５０例についての測定結果であり、横軸は従来法（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩ型）による測定結果、縦軸は本発明方法による測定結果を示す。ＨＰＬＣ法との相関は回帰式ｙ＝０．５７９ｘ＋１．１２５、回帰係数ｒ＝０．９３３と良好な相関が得られた。
【００３９】
また、実施例３に示した４０分測定系と同様に１０分測定系における同時再現性を検討した結果を表３に、測定間再現性を検討した結果を表４に示す。
【００４０】
【表３】
0003551678.tif 000004
【００４１】
【表４】
0003551678.tif 000005
【００４２】
同時再現性２．７〜４．０％、測定間再現性４％以下と良好な結果を示した。実施例２に示す４０分系と本実施例に示す１０分系の相関はｙ＝０．４９３＋０．７２１ｘ、ｒ＝０．９２１と良好であった。
【００４３】
実施例５  異常ヘモグロビンとの反応性。
【００４４】
入手した異常ヘモグロビン６種（ＵＢＥ２、ＨＡＭＡＤＥＮ、ＴＡＫＡＭＡＴＳＵ、ＣＡＰＥＴＯＷＮ、ＲＩＹＡＤＨ、及びＨＩＫＡＲＩ。ＵＢＥ２及びＣＡＰＥ  ＴＯＷＮはα鎖変異体、他はβ鎖変異体。）につき実施例１に記載の本発明の方法でＨｂＡ１ｃ濃度測定を試みた。結果を表５に示す。
【００４５】
【表５】
0003551678.tif 000006
【００４６】
変異ヘモグロビンは本方法においてはほとんど認識されないことが示されており、本方法は正常ＨｂＡ１ｃのみに特異的であり、異常ヘモグロビンの影響はほとんど受けないことが示された。
【００４７】
実施例６  前処理液の比較
健常人よりＥＤＴＡ採血により採取した全血検体２０μｌに、前処理液Ａとして０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ５．０３）、または、前処理液Ｂとして０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．１％ＮａＮ３を含む蒸留水（ｐＨ７．１５）を５８０μｌ加えて撹拌後、さらに室温で３０分放置して溶血前処理を行い抗原溶液とした。これを実施例４と同様にＡＩＡ−１２００上で１ステップ測定を行い、ＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
0003551678.tif 000007
【００４９】
表６から明らかなように、弱酸性条件下の前処理を行ったほうが１ステップ測定において高い測定値が得られた。
【００５０】
なお全血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度については、グリコヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩ型、東ソー（株）製）にて５．４％と測定された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行った１ステップ免疫反応を用いた測定系における標準曲線を示す図である。
【図２】実施例２で行った１ステップ免疫測定方法と従来法との相関を示す図である。
【図３】実施例４で行ったインキュベーションを１０分に短縮した１ステップ免疫測定系における標準曲線を示す図である。
【図４】実施例４で行ったインキュベーションを１０分に短縮した１ステップ免疫測定系と従来法との相関を示す図である。
【図１】
0003551678.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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