(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞を含む検査試料が、腫瘍の進行能又は転移能を有するか否かを決定する方法であって、同一個体又は同一種の異なる個体から得た前記検査試料及び転移性のないガン細胞を含む試料を用いて、下記の過程を含んで成る前記方法：
(a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、各試料を下記から成る群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること：
(i)配列番号１及び３〜６のいずれかの配列を有する核酸；
(ii)上記(i)のいずれかの核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸；
(iii)ストリンジェントな条件下に上記(i)の核酸にハイブリダイズする核酸；及び
(iv)ストリンジェントな条件下に上記(ii)の核酸にハイブリダイズする核酸、
(b)各試料における前記プローブによるハイブリダイゼーションの概量を決定すること；並びに
(c)検査試料中に、上記の特定の核酸又は核酸混合物が、転移性のない試料中よりも多く含まれるか否かを決定するために、検査試料のハイブリダイゼーションの概量を、転移性のない試料のハイブリダイゼーションの概量と比較すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、診断、特にガンの診断のために、ＣＴｐ１１遺伝子（ガン／精巣関連１１ｋＤタンパク質）を使用する方法及びそれを使用することに関する。特に本発明は、転移能及び／又は進行能を有する悪性腫瘍におけるＣＴｐ１１遺伝子の同定に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンが転移するためには、いくつかの課題、例えば細胞外マトリクス及び基底膜の分解、血管及びリンパ管への浸入及びそこからの浸出、免疫系による攻撃からの回避、並びに遠隔臓器への定着及びコロニー形成を克服する必要がある（Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１９９４）２１３−２２７；  Ｐｏｎｔａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８（１９９４）１−１０）。異なる型のガンは、その転移のために異なる分子機構を利用し、しかも異なる転移親和性を有することから、転移は更に複雑になる。
【０００３】
転移性及び非転移性のヒトメラノーマ細胞株は、異なって発現される遺伝子を同定するために、そしてそれらの転移における役割を調べるために、重要な手段である（Ｗｅｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２（１９９２）１２９１−１２９６；  Ｗｅｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３（１９９３）２７８−２８４；  Ｖａｎ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５（１９９５）６２３７−６２４３；  Ｗｅｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０（１９９５）７３−８１；  ｖａｎ  Ｍｕｉｊｅｎ，  Ｇ．Ｎ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８（１９９１）８５−９１；  ｖａｎＭｕｉｊｅｎ，  Ｇ．Ｎ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ９（１９９１）２５９−２７２）。
【０００４】
細胞接着分子は、腫瘍細胞の浸入、拡散、浸出及び定着において重要な役割を果たす。拡散した腫瘍細胞と内皮及び組織支質との相互作用は、腫瘍の進行及び転移形成における必須過程の１つであると考えられる（Ｅｂｎｅｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４（１９９６）１５５−１７７；  Ｖａｒｎｅｒ，Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８（１９９６）７２４−７３０；  Ａｌｂｅｌｄａ，Ｓ．Ｍ．，  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ６８（１９９３）４−１７）。
【０００５】
ＣＴｐ１１は、ＥＭＢＬデータベースに記載のポリペプチド配列ＡＩ９６２７５１，  ＡＡ４１２６０５及びＡＡ４１２２７０、並びにＷＯ９９／４６３７４に記載の配列番号１８及び配列番号７５に相同なポリペプチドである。
【０００６】
【発明の概要】
本発明では、驚くことに、タンパク質ＣＴｐ１１（ガン／精巣関連１１ｋＤタンパク質）が、転移性ガン細胞において、それの非転移性ガン細胞種に比べて増加調節されていることが見出された。ＣＴｐ１１は、転移カスケードのいくつかの過程の進行に関与し得る。ＣＴｐ１１は、転移性ガン細胞の特異的マーカーである。このことは、ＣＴｐ１１は、細胞障害性Ｔ細胞上にはＭＨＣクラスＩ複合体を介して提示され得るが、ＣＴｐ１１が見出された非腫瘍細胞（精巣細胞）は、ＭＨＣクラスＩを介して抗原を提示しないので、ＣＴｐ１１は自然には提示されていないという事実に依る。ＣＴｐ１１遺伝子は、配列番号２のポリペプチドをコードする。
【０００７】
本発明は、少なくとも１つの特定の核酸又は核酸混合物の有無を検出する方法、すなわちその様な核酸を含むことが疑われる試料中で２つの異なる核酸配列を区別する方法を提供する。この方法は、下記の過程を順番で含んで成る：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記試料を下記の群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること：
（ｉ）配列番号１及び３〜６の配列を有する核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下に（ｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸；及び
（ｉｖ）ストリンジェントな条件下に（ｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーションの形成を検出すること。
【０００８】
更に本発明は、ガン細胞の検査試料が、腫瘍の進行能又は転移能を有するか否かを決定する方法を提供する。この方法は、検査試料と転移性のないガン細胞試料とを用い、この両試料は同一個体又は同一種の異なる個体から得たものであり、そして下記の過程を含んで成る：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、各試料を下記の群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること：
（ｉ）配列番号１及び３〜６の配列を有する核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下に（ｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸；及び
（ｉｖ）ストリンジェントな条件下に（ｉｉ）の核酸にハイブリダイズする核酸；
（ｂ）各試料における前記プローブとのハイブリダイゼーションの概量を決定すること；並びに
（ｃ）検査試料のハイブリダイゼーションの概量を、転移性のない試料のハイブリダイゼーションの概量と比較することによって、検査試料中に、上記の特定の核酸又は核酸混合物が、転移性のない試料中よりも多く含まれるか否かを決定すること。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、診断、特にガンの診断のために、ＣＴｐ１１遺伝子（ガン／精巣関連１１ｋＤタンパク質）を使用する方法及びそれを使用することに関する。特に本発明は、転移能及び／又は進行能を有する悪性腫瘍におけるＣＴｐ１１遺伝子の同定に関する。
【００１０】
非転移性メラノーマ細胞株１Ｆ６及び、それに由来する転移性細胞株１Ｆ６ｍに対して差分表示法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いた結果、転移性細胞株において少なくとも４０倍増加調節されたＣＴｐ１１が同定された（図１）。
【００１１】
本発明に依れば、本核酸分子（ＣＴｐ１１）は、転移性細胞において、特に悪性メラノーマ細胞及び乳房カルシノーマ細胞において増加調節され、そしてその腫瘍の進行及び／又は転移を誘導することができる。本核酸（ＣＴｐ１１）は、配列番号１の配列を有するか、又は遺伝子コードの縮重のために配列番号１の配列とは異なるが、配列番号１の配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸を有する。
【００１２】
単離されたＣＴｐ１１ポリペプチドには、個体間で異なる天然の対立遺伝子に基づく変種が存在し得る。この様なアミノ酸配列の変種は、通常アミノ酸置換によるが、全配列中のアミノ酸の欠失、挿入又は付加による場合もあり得る。本発明のＣＴｐ１１タンパク質は、程度及び種類の両方の点において発現に用いる細胞及び細胞の型に応じて、グリコシル化された又はされていない形に成り得る。転移活性を有するポリペプチドを、ＣＴｐ１１陰性の非転移性腫瘍細胞にＣＴｐ１１発現ベクターをトランスフェクションし、安定な形質転換体を確立し、そしてマトリゲル浸入検査によるインビトロ浸入性及びヌードマウスへの異種移植による転移性の評価を行うことによって、同定することができる。
【００１３】
「ＣＴｐ１１活性を有するポリペプチド又はＣＴｐ１１」とは、微小なアミノ酸変異を有するが、実質的に同一のＣＴｐ１１活性を有するタンパク質を意味する。「実質的に同一」とは、その活性が、同一の生物学的特性を有し、且つそのポリペプチドのアミノ酸配列が、相同である（少なくとも９０％、好ましくは９５％超）、好ましくは同一であることを意味する。相同性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１９９７）  ３３８９−３４０２）によって決定し得る。
【００１４】
「核酸分子又は核酸」とは、ポリヌクレオチド分子を意味し、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの活性誘導体である。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子が好ましい。
【００１５】
「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、２つの核酸断片が互いにハイブリダイズすることを意味し、この条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡに記載されている。詳しくは、「ストリンジェントな条件」とは、２５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、７％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ及び０．１ｍｇ／ｍｌの一本鎖化したサーモン精子ＤＮＡから成るハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃でハイブリダイゼーションすることを指す。最終洗浄は、１２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ中で６５℃で行われる。
【００１６】
「核酸又はポリペプチド」とは、ＣＴｐ１１活性を有する核酸又はポリペプチドであって、組換えＤＮＡ技術によって生産する場合には細胞性物質又は培地を、化学合成する場合には前駆体の化学物質又は他の化学物質を実質的に含まないものを意味する。この核酸は、当核酸が得られた生物体において天然に当核酸を挟んでいる配列（すなわち当核酸の５’及び３’端部に位置する配列）を含まないことが好ましい。
【００１７】
宿主細胞において発現ベクターを用いる組換え技術により、又は合成により本発明のポリペプチドを生産できる。原核生物中で組換え技術によって生産した場合、非グリコシル化ＣＴｐ１１ポリペプチドが得られる。本発明の核酸配列を利用すると、任意の希望の細胞（例えばヒト細胞、及び他の哺乳動物細胞）のゲノムにおいてＣＴｐ１１遺伝子又はその変異体を検索し、同定し、そしてＣＴｐ１１タンパク質をコードする所望の遺伝子を単離することができる。このための方法及び適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ及びＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９８５），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。本発明の実験のために、通常は前記文献に記載された標準的な方法を用いる。
【００１８】
本発明の核酸を利用すると、再現性のある方法によって、そして大容量でＣＴｐ１１タンパク質を生産することができる。原核生物又は真核生物中で、例えば原核宿主細胞又は真核宿主細胞中で発現させるために、当業者に周知の方法に従って本核酸を適当な発現ベクターに組み込む。この発現ベクターは、調節性／誘導性プロモーターを有することが好ましい。その発現のために、これらの組換えベクターを適当な宿主細胞に、例えば原核宿主生物として大腸菌、あるいは真核宿主生物としてサッカロミセス・セレビシエ、テラトカルシノーマ細胞株ＰＡ−１  ｓｃ  ９１１７（Ｂｕｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １１（１９９１）  ３５７３−３５８３）、昆虫細胞、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞に導入し、そして形質転換又は形質導入された宿主細胞を、当異種遺伝子が発現する条件下で培養する。既知の方法に従って、この宿主細胞又は宿主細胞の培養上清から当タンパク質を単離することができる。この様な方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  Ｉ．，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  （１９９２），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。また細胞培養において当タンパク質が可溶性でない場合、インビトロでのタンパク質再活性化が必要である。
【００１９】
組換え技術によって生産した後、既知のタンパク質精製法、例えば、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動、選択沈殿、又は電気泳動などを利用して、ＣＴｐ１１を精製することができる。
【００２０】
本発明は、ＣＴｐ１１遺伝子の核酸分子を検出する方法に関する。この方法は、試料（例えば血液などの体液、細胞溶解物）を、本遺伝子に特異的に結合する核酸分子とインキュベーションすること、そしてＣＴｐ１１遺伝子である核酸分子の存在を決定するために、ストリンジェントな条件下に、前記の単離核酸分子と標的核酸分子とのハイブリダイゼーションを測定することを含んで成る。従って本発明は、腫瘍細胞の転移能及び／又は進行を同定する方法にも関する。
【００２１】
ガン細胞の検査試料が、腫瘍進行性又は転移性を有するか否かを決定するために、当単離核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの概量を決定する。このハイブリダイゼーションを定量的に決定する必要はないが、この定量方法も本発明に含まれる。典型的にはハイブリダイゼーションの概量を、例えばハイブリダイゼーションの検出時に視覚的に検査することによって定性的に決定する。例えばゲルを用いて、試料中の標的核酸にハイブリダイズした標識化された核酸を分離した場合、生じたバンドを視覚的に検査することができる。同一種の個体に由来する転移性のないガン試料において当単離核酸のハイブリダイゼーションを行う場合、同一の方法を用いる。検査試料におけるハイブリダイゼーションの概量と、転移性のない試料におけるハイブリダイゼーションの概量を比較することによって、検査試料中に標的核酸が、転移性のない試料中よりも多量に含まれるか否かを決定することができる。特に視覚による検査の場合、視覚的に明白な差異によって、検査試料中により多量の標的核酸が存在することを評価することが薦められる。
【００２２】
本発明に従って示された通り、転移した腫瘍の試料中には、転移性のない試料に比べてより多量のＣＴｐ１１核酸が存在する。腫瘍進行性又は転移性を有する検査試料中には、転移性のないガン細胞試料に比べてより多量のＣＴｐ１１核酸が含まれるであろう。検査試料においてＣＴｐ１１核酸が増加調節されていること、すなわちそのガン細胞が腫瘍進行性又は転移性を有することを決定するために、その検査試料中のＣＴｐ１１核酸の概量が、非転移性試料中の概量よりも明白に多いことが好ましい。例えば、ＣＴｐ１１遺伝子が増加調節された検査試料中のＣＴｐ１１遺伝子量は、非転移性試料に比べて約１５〜６０倍多くなり得る。
【００２３】
本発明の核酸に基づいて、転移性ヒト腫瘍細胞において発現が増加調節された核酸を検出するための検査法が提供され得る。この様な検査を、核酸診断法を利用して行うことができる。この場合、検査試料を、
（ａ）配列番号１及び３〜６の配列、又はこれらの配列のいずれかに相補的な配列を有する核酸、及び
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）のいずれかの核酸とハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択されるプローブと接触させる。この方法では、前記核酸プローブを試料中の核酸とインキュベーションし、そして生じたハイブリダイゼーションを、場合によって試料中の核酸及び／又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、検出する。（ｂ）においてハイブリダイゼーションにより核酸を得るためには、配列番号３〜６の配列又はそれに相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズすることが好ましい。前記核酸プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションは、当タンパク質をコードするＲＮＡの存在を意味する。
【００２４】
プローブと試料中の核酸とをハイブリダイズする方法は、当業者に周知であり、例えばＷＯ８９／０６６９８，  ＥＰ−Ａ０２００３６２，  ＵＳＰ２９１５０８２，  ＥＰ−Ａ００６３８７９，  ＥＰ−Ａ０１７３２５１，  ＥＰ−Ａ０１２８０１８に記載されている。
【００２５】
好ましい態様では、前記検査の前に、例えば既存のＰＣＲ法によって、試料中のコード核酸を増幅する。一般的には核酸診断の範囲内で、誘導化（標識化）した核酸プローブを用いる。このプローブを、担体に結合した試料中の変性ＤＮＡ又はＲＮＡと接触させる。この時、標識ＤＮＡ又はＲＮＡが、相同なＤＮＡ又はＲＮＡに結合する様に、温度、イオン強度、ｐＨ及びその他の緩衝液条件を、核酸プローブの長さと組成、更に予想されるハイブリッド体の融解温度に応じて選択する（Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６（１９７９）  ３６８３−３６８７）。適当な担体には、ニトロセルロースを基にした膜又は担体物質（例えばＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ，  ＢＡ８５；  Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ）、強化又は結合されたニトロセルロース粉末、あるいは種々の官能基（例えばニトロ基）によって誘導化されたナイロン膜（例えばＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ，  Ｎｙｔｒａｎ；  ＮＥＮ，  Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｍ；  Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｄｙｎｅ）がある。
【００２６】
次に前記担体を十分に洗浄し、非特異的結合を抑えるためにその様な結合部位を飽和させた後に、それを抗体又は抗体断片とインキュベーションすることによって、ハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡを検出する。この抗体又は抗体断片は、ハイブリダイゼーションの際に核酸プローブに組み込んだ物質に対するものである。次にこの抗体を標識する。しかし直接に標識されたＤＮＡを用いることもできる。抗体とインキュベーションした後、特異的に結合した抗体複合体だけを検出するために再度洗浄を行う。次に抗体又は抗体断片上の標識を利用して、既存の方法に従って測定を行う。
【００２７】
発現の検出を、例えば以下の方法で行うことができる：
固定化細胞、固定化組織標本及び単離した中期染色体のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；
コロニーハイブリダイゼーション（細胞の場合）及びプラークハイブリダイゼーション（ファージ及びウイルスの場合）；
サザンハイブリダイゼーション（ＤＮＡ検出）；
ノーザンハイブリダイゼーション（ＲＮＡ検出）；
血清分析（例えばスロットブロット分析による血清中の細胞の種類分析）；
事後増幅（例えばＰＣＲ法）。
【００２８】
従って本発明は、メラノーマ及び乳房カルシノーマ細胞の転移能を検出する方法を含み、この方法は、
（ａ）ガン患者の体液、メラノーマガン細胞、乳房カルシノーマ細胞、又は前記ガン細胞の抽出物若しくは培養上清に由来する、核酸を有する試料を、
（ｉ）配列番号１及び３〜６に示した核酸、又はそれらの核酸配列に相補的な配列の核酸、及び、
（ｉｉ）（ｉ）のいずれかの核酸とハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択した核酸プローブとインキュベーションすること、
並びに、
（ｂ）試料中の核酸及び／又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、あるいはＸ線撮影法によって、ハイブリダイゼーションを検出すること、
を含んで成る。
【００２９】
好ましくは、核酸プローブを試料中の核酸とインキュベーションし、そして、場合により試料中の核酸及び／又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、ハイブリダイゼーションを検出する。
従ってＣＴｐ１１核酸は、患者の腫瘍細胞の転移能及び進行能の診断において、貴重な予測マーカーとなる。
【００３０】
更に本発明は、その発現が腫瘍転移と相関するタンパク質を生産する方法を提供する。当方法は、原核又は真核宿主細胞中で外来性ＤＮＡを発現させ、そして希望のタンパク質を単離することに依るものであり、当タンパク質は、本発明の核酸分子、好ましくは配列番号１のＤＮＡ配列によってコードされる。
当タンパク質を、前記細胞又は細胞培養上清から単離し、そしてクロマトグラフィー法、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーによって精製し得る。
更に本発明は、本発明の核酸分子、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされた単離されたタンパク質を含む。
【００３１】
ＣＴｐ１１は特に、腫瘍進行性遺伝子、及びメラノーマ細胞の転移能を示す増加調節性遺伝子として特徴づけられる。ＣＴｐ１１の機能は、腫瘍細胞における接触阻害及び足場依存性の損失を促進すること、並びに転移カスケードのその他の必須過程を促進することである。従ってＣＴｐ１１遺伝子の発現は、腫瘍細胞のより攻撃的な性質に、そしてまた転移形成能に相関する。
【００３２】
本発明では、腫瘍の進行／転移、好ましくは悪性メラノーマ及び乳房カルシノーマの進行／転移をインビボで、好ましくは体細胞遺伝子治療によって、抑制するために、ＣＴｐ１１の発現阻害剤、好ましくはアンチセンス核酸又は抗体を利用し得る。マウス又はラットを免疫化するために、前記通り精製したＣＴｐ１１タンパク質を用いて、従来技術通りにＣＴｐ１１タンパク質に対する抗体を作成し得る。
【００３３】
総合的な特性から当遺伝子は、ガン／精巣抗原（ＣＴＡｓ）ファミリーに分類される。当ファミリーの最初の構成員は、ＭＡＧＥｓ（メラノーマ抗原）であり、Ｂｏｏｎのグループによって報告された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４  （１９９１）  １６４３−１６４７）。
【００３４】
完全長ｃＤＮＡによってコードされる当タンパク質は、９７アミノ酸から成り、２部に分かれた核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ｅＧＦＰの前部に当ＯＲＦを融合させたところ、特異的な核局在が認められたことから、この２部性様の核局在化配列は実際に作用する。当２部性ＮＬＳの共通配列は、１０アミノ酸から成る領域によって塩基性クラスターから分離された２つの塩基性アミノ酸（リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ））を含んで成り、そのクラスターでは、隣接する５残基中３残基が塩基性でなければならない（Ｄｉｎｇｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｌａｓｋｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．  １６  （１９９１）  ４７８−４８１）。１０アミノ酸から成る間隙部が最適であることが示されたが、より長い間隙部を有する有効な２部性核局在化シグナルも見出された（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６４  （１９９１）  ６１５−６２３）。このことから、１２残基から成る間隙部を有するＣＴｐ１１の２部性配列（ａ．ａ．４０〜５７）が核内局在化の原因である可能性が示される。ガン／精巣抗原グループに属するＳＳＸファミリーのいくつかの構成員にも、２部性ＮＬＳ配列が見出されている（Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，Ｎ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．  ６  （１９９７）  １５４９−１５５８）。
【００３５】
グルタミン酸残基の含有量が高い酸性Ｃ末端領域は、ＧＡＬ４ドメインに類似していて、ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインと相互作用又は融合した後、有効な転写活性を示すことが示された（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，Ｒ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５  （１９８９）  ３７１−３７８）。ＣＴｐ１１は、ＳＳＸタンパク質（Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，Ｎ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６  （１９９７）  １５４９−１５５８）及びメラノサイト特異的遺伝子１（ＭＳＧ１）（Ｓｈｉｏｄａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３  （１９９６）  １２２９８−１２３０３）と同様に、ＤＮＡ結合ドメインを欠失している。従ってこれは、推定上の転写調節を協調するために転写開始複合体と相互作用する。含有量の高い荷電アミノ酸が、その様なタンパク質複合体相互作用に寄与するであろう。
【００３６】
正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍試料中のＣＴｐ１１の発現様式から、当遺伝子はガン／精巣抗原グループに分類され、既に当グループには、ＭＡＧＥ（Ｌｕｃａｓ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８  （１９９８）  ７４３−７５２）、ＢＡＧＥ（Ｂｏｅｌ，Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２  （１９９５）  １６７−１７５）、ＧＡＧＥ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８２  （１９９５）  ６８９−６９８）、ＳＳＸ（Ｇｕｒｅ，Ａ．Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２  （１９９７）  ９６５−９７１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４  （１９９７）  １９１４−１９１８）、ＬＡＧＥ−１（Ｌｅｔｈｅ，Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６  （１９９８）  ９０３−９０８）、ＰＡＧＥ−１（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３  （１９９８）  １７６１８−１７６２５；  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  １０７５７−１０７６２）、及びＳＣＰ−１（Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  ５２１１−５２１６）がある。
【００３７】
ガン／精巣抗原ファミリーの構成員と見なすために遺伝子が満たすべき判断基準が、文献（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４  （１９９７）  １９１４−１９１８；  Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  ６９１９−６９２３）に定式化されている：（ｉ）精巣において優勢に発現していて、そして他の正常組織には通常発現していないこと、（ｉｉ）広範囲のヒト腫瘍においてそのｍＲＮＡの発現が誘導／活性化されていること、（ｉｉｉ）系統に非特異的な様式で、悪性腫瘍において発現していること、（ｉｖ）しばしば多重遺伝子族として存在すること、及び（ｖ）いくつかの例外はあるが、当遺伝子がＸ染色体上にマッピングされること。ＣＴｐ１１は、判断基準ｉ，  ｉｉ，  ｉｉｉ及びｖを満たすので、ＣＴＡファミリーの構成員として明らかに適格である。
【００３８】
ＣＴｐ１１遺伝子は、Ｘ染色体（Ｘｑ２６．３−Ｘｑ２７．１）上に存在し、ＰＣＲによって確認された通り、約６６５ｂｐのイントロンによって分離された２つのエキソンから成る。この位置は、ＭＡＧＥ−Ｃサブファミリー（Ｌｕｃａｓ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８  （１９９８）  ７４３−７５２）の直ぐ隣りであり（Ｘｑ２６）、ＣＴＡＧ（ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子）及びＭＡＧＥ−Ａクラスター（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ７９  （１９９７）  ２３７−２４９）の近くである（両方Ｘｑ２８）  。
【００３９】
ＣＴｐ１１発現は、検査したメラノーマ及び膀胱腫瘍の細胞株の２５〜３０％で認められたが、他の種類の腫瘍から確立された細胞株では、散発的な陽性が示された。ＣＴＡ発現に関して最も研究されているメラノーマ細胞株では、当陽性率は、ＮＹ−ＥＳＯ−１（１８％）（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４  （１９９７）  １９１４−１９１８；  Ｌｅｔｈｅ，Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６  （１９９８）  ９０３−９０８）、ＳＳＸ−２（２５％）（Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７  （１９９８）  １９−２３）、並びにＭＡＧＥ−Ｂ１及び−Ｂ２（２２％及び３３％）（Ｌｕｒｑｕｉｎ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６  （１９９７）  ３９７−４０８；  Ｍｕｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２  （１９９５）  ４９８７−４９９１）の陽性率に匹敵する。ＭＡＧＥ−Ａ１（６６％）（Ｋｉｒｋｉｎ，Ａ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．  １５  （１９９８）  １９−３２；  Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．，  Ｍｏｄ．Ｍｅｄ．  ３  （１９９７）  ７１６−７３１）は、メラノーマ細胞株で著しく高い発現を示し、そして他のヒト腫瘍細胞株では４１％で発現している。
【００４０】
正常組織においてＲＴ−ＰＣＲによって観察された精巣特異的な発現から、ＣＴｐ１１がただ精巣由来のＥＳＴ  のみと相同であることが保証される。新鮮なヒト腫瘍試料では、メラノーマが、最も高いＣＴｐ１１陽性率（７０％；  ｎ＝１０）を示した。比較し得る程度の陽性率が、原発性メラノーマ（４個中３個）、そして転移性メラノーマ（６個中４個）で観察された。この陽性率は、メラノーマにおけるその他のＣＴＡに比べて、最も高いものの１つであろう。ＳＣＰ−１，  ＧＡＧＥ，  ＢＡＧＥ，  ＭＡＧＥ−１，  ＳＳＸ−２，  ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＭＡＧＥ−３（Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８  （１９９８）  ３８７−３８９）の陽性率は、各々８，  １７，  ２２，  ３５，  ４４，  ４４及び５２％であった。膀胱細胞株における比較的高いＣＴｐ１１陽性率（３０％）は、膀胱腫瘍試料では検出されなかった。この場合、１１試料中１つだけが陽性であった。
【００４１】
興味深いことに、ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ後に１７個の腫瘍病巣中１０個だけが陽性であったことから、精巣腫瘍では、正常精巣組織に比べてＣＴｐ１１発現が減少調節されていることが示された。最初のＰＣＲ後には、いずれの精巣腫瘍試料でも陽性が認められなかった。セミノーマ及び非セミノーマのいずれでも、当精巣病巣の陽性は、存在する少量の正常精巣組織によって誘導され得た。その他のＣＴＡに関して、ＭＡＧＥ−１が、主に精巣中の生殖細胞に発現していることが知られていて（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５  （１９９５）  ３４７８−３４８２）、この事実は、セミノーマでは、非セミノーマ腫瘍に比べてＭＡＧＥ発現の陽性率が高いという事実に合致する（Ｈａｒａ，Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５３  （１９９９）  ８４３−８４７）。
【００４２】
相同性検索及び染色体位置の決定
全ての種類のデータベースを検討して、３つのヒトゲノムクローン（ＨＳ４３３Ｍ１９，ＨＳ３７６Ｈ２３，  ＨＳＧ１６４Ｆ２４）に対して９０％超の相同性が認められた。これらは全てＸ染色体上に位置した。ＨＳ４３３Ｍ１９との相同性から、当遺伝子の位置がＸｑ２６．３〜Ｘｑ２７．１に更に狭められた。一群のヒト染色体特異的な齧歯類動物／ヒトのハイブリッド細胞株に対するＰＣＲから、当遺伝子がＸ染色体に位置することが確認された。ゲノムＰＣＲ産物の長さ、及び前記の３つのヒトゲノムクローンの配列に基づいて、当遺伝子は、塩基対１１２番の隣りに位置する約６５５ｂｐのイントロンによって分離された２つのエキソンから成ることが推定された。
【００４３】
ｃＤＮＡレベルの相同性は、数個のヒトＥＳＴに限定され（ｚｔ９５ｂ０９，  ｑｇ５７ｂ０１，  ｑｅ０４ｈ１１，  ＥＳＴ９５６２８／ＥＳＴ９５６２９）、これらは全て精巣に由来するものであり、そして同一の推定上のタンパク質をコードした。相同性は、ＥＭＢＬデータベースＮｏ．ＡＩ９６２７５１，ＡＡ４１２６０５及びＡＡ４１２２７０、並びにＷＯ  ９９／４６３７４の配列番号１８及び７５に対しても認められた。
【００４４】
更に本発明は、ＣＴｐ１１のアンタゴニスト又はＣＴｐ１１の発現阻害剤（例えばアンチセンスヌクレオチド）を同定及び単離する方法を提供する。この様なアンタゴニスト及び阻害剤を、腫瘍の進行又は転移を抑制するために、並びに腫瘍細胞の大量アポトーシスをインビボで誘導するために、利用することができる。
【００４５】
本発明では、ガンを治療する際に、特に転移及び関連障害を抑制する際に利用できる化合物を同定及び単離する方法が提供される。当方法には、本発明のポリペプチドの発現を調節する方法、本発明のポリペプチドに選択的に結合する化合物を同定する方法、及び、当ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法が含まれる。更に当方法には、ＣＴｐ１１遺伝子のｍＲＮＡへの転写を調節する、好ましくは抑制する方法があり、この方法によって、好ましくは腫瘍細胞の転移能を減少調節する。当方法をインビトロ及びインビボで行うことができ、そして当方法では、本発明に関する細胞株及びトランスジェニック動物モデルを確立及び利用し得る。
【００４６】
ＣＴｐ１１アンタゴニストは、ＣＴｐ１１ポリペプチドの生物活性を減少又は抑制する、及び／又はＣＴｐ１１遺伝子の転写又は翻訳を阻害する物質又は化合物として定義される。一般的には、ＣＴｐ１１アンタゴニストをスクリーニングする方法は、ＣＴｐ１１活性を測定するために好ましい条件下で、ＣＴｐ１１の発現を介した侵襲性を呈する宿主細胞に候補物質を接触させることを含んで成る。
【００４７】
いくつかの方法で、ＣＴｐ１１活性を測定し得る。典型的にはその活性化は、細胞の生理学的な変化、例えばインビトロでの運動性及び侵襲性の増加から、又は分化状態の変化から、又は増殖促進を誘導する細胞代謝の変化から明白である。
腫瘍細胞の増殖及び拡散を阻害する薬剤を同定及び設計するために、ＣＴｐ１１遺伝子及びタンパク質を利用し得る。
【００４８】
本発明の理解のために、以下の実施例、参考文献、配列表及び図面を記載する。本発明の意図から逸脱することなく、本発明の修飾を行い得る。
配列番号１：ＣＴｐ１１のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列
配列番号２：ＣＴｐ１１のアミノ酸配列
配列番号３：センスプライマー
配列番号４：アンチセンスプライマー
配列番号５：ネストセンスプライマー
配列番号６：ネストアンチセンスプライマー
配列番号７：β２−ミクログロブリンのセンスプライマー
配列番号８：β２−ミクログロブリンのアンチセンスプライマー
【００４９】
【実施例】
実施例１
材料及び方法
細胞株及び初代培養
検査群の８種類のヒトメラノーマ細胞株５３０，  １Ｆ６，  ＭＶ１，  Ｍ１４，  Ｍｅｌ５７，  ＢＬＭ，  ＭＶ３及び１Ｆ６ｍは、以前に報告されたものである（Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７６（１９９７）５６１−５７０）。この細胞株検査群では、５３０及び１Ｆ６は、転移性の乏しい細胞株であり、一方ＭＶ３，  ＢＬＭ及び１Ｆ６ｍは、転移性の高い細胞株である。ＭＶ１，  Ｍ１４及びＭｅｌ５７は、中間的な転移能を有する細胞株である。１Ｆ６ｍは、１Ｆ６の転移性亜株である。その他の大部分の使用した細胞株は、以前に報告されたものである（Ｚｅｎｄｍａｎ，Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４６  （１９９９）  ２９２−２９８）。細胞株ＲＡＭＯＳ及びＲＡＪＩはＡＴＣＣから入手される。ＢＬＭは、ＨＬＡ−Ａ１陰性のメラノーマ細胞株である。全ての細胞株を、以前の報告通り、ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｔ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６  （１９９６）  １４３２−１４３９）。正常ヒト包皮メラノサイト及びヒト母斑細胞を、以前の報告通り培養した（Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｍ．Ｍ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １４４  （１９９４）  ３７２−３８２）。
【００５０】
ヒト組織
オランダＮｉｊｍｅｇｅｎ大学病院で、メラノサイト腫瘍進行の全段階の病巣（一般母斑、異型母斑、原発性メラノーマ及び転移メラノーマ）、及びその他の腫瘍標本を患者から切り出した。正常ヒト組織として、外科的に切り出した組織に由来する、又は死後４時間未満の検死試料に由来する疾病を含まない試料を用いた。組織試料を液体窒素中でスナップ式に凍結し、そして使用まで  −８０℃で保存した。
【００５１】
ＲＮＡの単離
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、その取扱説明書に従って培養細胞から総ＲＮＡを単離した。乳棒を用いて１ｍｌのＲＮＡｚｏｌＢＴＭ（Ｃａｍｐｒｏ，  Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、厚さ２０μｍの約２５個の凍結切片を破砕することによって、組織試料から総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡｚｏｌＢＴＭ工程に続いて、追加のＲＮｅａｓｙの洗浄工程を行った。
【００５２】
ｍＲＮＡ差異表示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）
差異表示ＰＣＲの開始前に、Ｍｅｓｓａｇｅ−ＣｌｅａｎＴＭキット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，  ＴＮ）によってＲＮＡ試料に対してＤＮアーゼＩ処理を行った。差異表示のために、いくつかの微小な変更を加えてＲＮＡｍａｐＴＭの方法を行った。元の方法とは異なり、［３５Ｓ］−ｄＡＴＰの代わりに［３２Ｐ］−ｄＡＴＰを用いた。このＰＣＲのために、４つのＴ１２ＭＮプライマー及び６つの任意プライマーＡＰ１，２，６，７，１１，１２（Ｂａｕｅｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１  （１９９３）  ４２７２−４２８０）の組合せを用いた。
【００５３】
ノーザンブロット分析
１０μｇの総ＲＮＡを、グリオキサール／ＤＭＳＯで処理し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ）、１．２％アガロースゲル上で分離し、そしてＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，  ＵＫ）に転写した。ランダムプライマーによるＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｃＤＮＡプローブを［３２Ｐ］−ｄＡＴＰで放射性標識した。この膜を標識プローブによって、ハイブリダイゼーション混合液（０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．２，  ７％  ＳＤＳ，  １％  ＢＳＡ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１ｍｇ／ｍｌ一本鎖のサーモン精子ＤＮＡ）中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。その後この膜を、段階的に低下させた量の塩を含有する緩衝液（１％  ＳＤＳ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １２５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７．２）によって６５℃で洗浄し、そしてＫｏｄａｋ  Ｘｏｍａｔ−Ｓフィルムでオートラジオグラフィーを行った。
【００５４】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、配列決定及び相同性検索
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡに記載の通り、ｃＤＮＡプローブを標識し、そしてヒトメラノーマ細胞株（ＭＶ３）のλＺＡＰ  ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせた。完全長のｃＤＮＡを単離した後、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ）によって、その両鎖の配列を決定した。ＢＬＡＳＴ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５  （１９９７）  ３３８９−３４０２）によって、並びに以前に報告された通りに（Ｚｅｎｄｍａｎ，Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４６６  （１９９９）  ２９２−２９８）、ＤＮＡ及びタンパク質データベースに関する全ての公的サーバー上の他のプログラムによって、相同検索を行った。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＡＭＶ  ＲＴキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて、０．５−１．０μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った（２５℃１０分間後、４２℃５９分間）。当反応液に、０．０４単位のランダムヘキサデオキシヌクレオチドプライマー、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μｌのＲＴ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．３，  ５００μＭ  ＫＣｌ）、２５単位のＲＮａｓｉｎ、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、及び、最終容量を１０μｌにするための水を添加した。増幅のために、合成されたｃＤＮＡの１０分の１に、２．５μｌのＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，  ７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ），  ５μｌの１Ｍ  ｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌｅｓの各プライマー、２．５μｌの１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５単位のＴｈｅｒｍｏｐｅｒｆｅｃｔｐｌｕｓＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｔｅｇｒｏ，  Ｚａａｎｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び、最終容量を２５μｌにするための水を添加した。このＰＣＲでは、９４℃４５秒間、５９℃１分間及び７２℃１分３０秒間の反応のサイクルを３０回行った。この反応前に９４℃３分間の変性を行い、反応後に７２℃５分間の伸長を行った。下記のプライマーの組合せを用いた。
センス：５’−ＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号３）
アンチセンス：５’−ＴＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号４）
【００５６】
このＰＣＲ産物の長さは２９７ｂｐであった。ネストＰＣＲを行う場合、９０℃３０秒間、５９℃４５秒間及び７２℃１分間のサイクルを３０回行い、やはり最初のＰＣＲと同様に、反応前に変性過程、及び反応後に伸長過程を行った。このネストＰＣＲのために、最初のＰＣＲの産物溶液の１００倍希釈液２μｌを、やはり最終容量２５μｌ中で用いた。下記のネストプライマーを用いた。
センス：５’−ＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５）
アンチセンス：５’−ＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号６）
ネストＰＣＲの産物の長さは１８８ｂｐであった。
下記のβ２−ミクログロブリン用プライマーを用いた。
センス：５’−ＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号７）
アンチセンス：５’−ＴＧＴＣＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号８）
β２−ミクログロブリンのＰＣＲ産物の長さは１３６ｂｐであった。
【００５７】
染色体上の位置決定
当遺伝子の染色体上の位置を、検査群のハムスター／ヒト及びマウス／ヒトのハイブリッド細胞株（Ｋｏｎｄｏｈ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ３  （１９９３）  ２４１−２４５）に対するゲノムＰＣＲによって決定した。このＰＣＲのために、前記の最初のＰＣＲにおけるイントロン部分を含むプライマーを用いて、１ｋｂのＰＣＲ産物を増幅した。
【００５８】
プラスミド作成及びトランスフェクション
局在化を調べるために、停止コドンを含まない完全長の当ＯＲＦを含む断片（１〜３３０ｂｐ）を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）のＳａｃＩ／ＫｐｎＩ部位にクローン化した。これによって、アミノ酸ＲＳＩＡＴをコードするリンカーを介して前記断片をｅＧＦＰのＣ末端に融合させた。その配列を決定することにより、融合体の読み取り枠が連続であることを確認した。トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いてトランスフェクションを行った。要するに、ＢＬＭ細胞を６ウエルプレートにまき、全面密集になる手前まで増殖させた。２ｍｌの培地中で１μｇのプラスミド構成体及び３μｌのＦｕＧＥＮＥＴＭ６によってトランスフェクションした。４８時間以内に、当融合タンパク質の一過的な発現を確認した。ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）（５００μｇ／μｌ）によって安定な形質転換体を選択した。
【００５９】
当融合タンパク質の発現を視覚化するために、６ウエルプレート中でカバーグラス上で増殖させた細胞を、４％パラホルムアルデヒドによって室温で１５分間固定し、次に−２０℃でアセトン中に２分間浸けた。空気乾燥したカバーグラスをスライドグラスにのせ、１：４  Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）及び１：１０，０００  ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，  Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む１０μｌのグリセロール／Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍｌあたり９０ｍｌグリセロール、２ｍｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、８ｍｌ  Ｈ２Ｏ）を添加した。その蛍光画像を、ＣＣＤカメラ付きの蛍光顕微鏡によって得た。
【００６０】
ウエスタンブロット分析
培養細胞をＳＤＳ溶解緩衝液（１％  ＳＤＳ，  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １０μｇ／ｍｌロイペプチン（Ｓｉｇｍａ），２００μｇ／ｍｌ  ＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）及び１０μｇ／ｍｌキモスタチン（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳ）中で溶解した。それを遠心した後、等量の上清タンパク質を、非還元性試料用緩衝液によって１：１に希釈し、そして沸騰水中で５分間熱処理した。これらの試料を、マーカータンパク質と共に１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサイズ分画し、次にブロティング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．６，  １９２ｍＭグリシン，  ２０％メタノール及び０．０２％  ＳＤＳ）中でニトロセルロース膜に電気的に転写した。分子量の指標として、マーカーのレーンを切り離し、アミドブラック（０．１％アミドブラック／４５：１０：４５のメタノール：酢酸：水）によって染色した。ブロット膜をＰＢＳＴ中で１５分間洗浄してから、ブロッキング溶液中で室温で一晩インキュベーションした。その際、５％低脂肪粉乳及び０．０１％消泡剤Ａ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳＴを用いた。このブロット膜を、１次抗体として抗ｅＧＦＰポリクローナル抗体と、そして２次抗体としてペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗血清（Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）と各々１時間インキュベーションした。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行われ、そして各工程の後にブロット膜をＰＢＳＴによって１０分間３回洗浄した。ＥＣＬ化学発光系（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）によって、取扱説明書通り検出を行った。次にブロット膜をＫｏｄａｋ  Ｘｏｍａｔ−Ｓフィルムに露光し、そして現像した。
【００６１】
実施例２
ＣＴｐ１１の単離及びクローニング
プライマーＴ１２ＭＡとＡＰ１（Ｂａｕｅｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１  （１９９３）  ４２７２−４２８０）との組合せを用いた差異表示法によって、ヒトメラノーマ細胞株１Ｆ６と１Ｆ６ｍとの間でｍＲＮＡ発現を比較した。その結果、発現差のある３００ｂｐのｃＤＮＡバンドが生じた。このバンドは、１Ｆ６ｍのレーンには多量に存在するが、１Ｆ６のレーンには存在しなかった。ヌードマウスに皮下接種した後の転移性が判明しているヒトメラノーマ細胞株の広範囲な検査群において発現を調べるために、前記の３００ｂｐのｃＤＮＡをプローブとしてノーザンブロット分析を行った。その結果、約０．５ｋｂのｍＲＮＡが、転移性の高い細胞株ＭＶ３、ＢＬＭ及び１Ｆ６ｍにおいて特異的に発現していることが判明した（図１）。転移性が中位の細胞株及び低い細胞株では、その様な発現は認められなかった。
【００６２】
完全長のｃＤＮＡクローンを単離するために、前記の３００ｂｐのｃＤＮＡ断片をプローブとして、メラノーマ細胞株ＭＶ３のλＺＡＰ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。４０８ｂｐのｃＤＮＡが単離された（ＥＭＢＬ：  ＡＪ２３８２７７）。配列決定の結果、当ｃＤＮＡは、３’側で前記プローブと完全に一致し、そして９７アミノ酸から成るタンパク質をコードするＯＲＦを有することが判明した。この推定タンパク質は、潜在的な２部性の核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ａ．ａ．  ４０〜５７）を有するが、このシグナルは完全な共通配列を有するものではない（Ｄｉｎｇｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｌａｓｋｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．  １６  （１９９１）  ４７８−４８１）。もう１つの著しい特徴は、グルタミン酸残基の含有量が高いこと（１４％）であり、それらによって酸性のＣ末端クラスター（ａ．ａ．  ８３〜８９）が形成されている。全残基の３分の１が荷電性（１８残基陰性、１４残基陽性）であり、推定分子量は１１ｋＤである。当タンパク質のｐＩは５．０と計算される。
【００６３】
実施例３
ＣＴｐ１１の発現様式
転移性が判明しているヒトメラノーマ細胞株の検査群に対するノーザンブロット分析に加えて、それらの細胞株のＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ分析も行った。このＰＣＲの結果、ノーザンブロット分析で認められたメラノーマ細胞株の発現パターンが確認された（表１）。
【００６４】
0003561229.tif 000002
【００６５】
特異的な産物を、転移性の高い細胞株である１Ｆ６ｍ、ＭＶ３及びＢＬＭにおいてのみ検出することができた。対応する異種移植物に対するＲＴ−ＰＣＲ分析から、培養細胞での発現様式に完全に一致する発現様式が示された。ヌードマウスモデルによって調べられていないより多様なヒトメラノーマ細胞株の一群の分析から、その１５細胞株中３つ（ＢＲＯ，  Ｅ１０及び５１８Ａ２）で発現が認められた（表２）。
【００６６】
0003561229.tif 000003
ａ  表１に挙げたメラノーマ細胞株を含む。
【００６７】
その他の種類の悪性腫瘍に由来する細胞株における発現に関して（表２）、膀胱カルシノーマ細胞株１７個中５個で発現が認められ、一方腎臓カルシノーマ細胞株６個、及び前立腺カルシノーマ細胞株７個では、当遺伝子の発現は無かった。最後に、既に記載したもの以外の他の組織学的に異なる種類に由来する細胞株１６個中、たった２個だけが陽性を示した（線維肉腫ＨＴ１０８０及び骨肉腫Ｕ２ＯＳ）。
正常ヒト組織における当遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を、図３に示す。検査した１７種類の組織中、精巣のみが陽性であった。
【００６８】
腫瘍進行の全段階を網羅する一連のメラノサイト病巣を、当遺伝子転写に関して検査した（図４）。ネストＲＴ−ＰＣＲ分析から、メラノサイト腫瘍進行度の高い段階でのみ、ＰＣＲ産物が検出された。原発性メラノーマ（ＰＭ）４個中３個、及び転移メラノーマ（ＭＭ）６個中４個が陽性であった。正常皮膚（ＮＳ）、細胞増殖型一般母斑（ＮＮ）及び異型母斑（ＡＮ）では発現は認められなかった。正常包皮メラノサイトの初代培養及び母斑細胞の培養もまた陰性であった。
追加の新鮮な正常ヒト組織試料、及び同一種類の組織に由来する腫瘍病巣での発現も決定した。この結果を表３に要約する。
【００６９】
0003561229.tif 000004
ａ  正常皮膚；ｂ  陽性は、混入した正常組織によるものであろう。
【００７０】
正常組織のネストＰＣＲでは、３個の精巣試料のみで発現が見られたが、これらは、最初のＰＣＲ（３０サイクル）後に既に陽性であった。その他の正常組織では、ＰＣＲ産物は全く無かった。腫瘍組織では、肺（５個中１）、乳房（４個中１）、結腸（９個中２）及び膀胱（１１個中１）で、散発性に発現が見られただけであった。膵臓（ｎ＝５）及び食道（ｎ＝６）は陰性であった。検査した精巣病巣では、１７個の腫瘍試料中１０個が、ネストＰＣＲ後にのみ陽性を示したが、３個の正常精巣試料は、最初のＰＣＲ後に既に陽性を示した。
【００７１】
実施例４
ＣＴｐ１１の分子量の決定及び細胞内局在
当タンパク質の分子量を決定するために、ＢＬＭ形質転換体の細胞溶解物に対して、融合タンパク質を検出する抗ｅＧＦＰポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。図５から、トランスフェクションした細胞が、当融合タンパク質を発現することが明白である。トランスフェクションしていないＢＬＭ細胞の溶解物のレーンには、特異的なバンドは見られない。ｅＧＦＰ（２７ｋＤ）と当融合タンパク質（３８ｋＤ）との分子量の差から、当タンパク質の大きさが約１１ｋＤであると推定された。ｍＲＮＡの発現様式及び分子量に基づいて、当タンパク質をＣＴｐ１１：ガン／精巣関連１１ｋＤタンパク質と名付けた。
【００７２】
ＣＴｐ１１の細胞内局在を調べるために、完全長の当ＯＲＦをｅＧＦＰの前に融合して、それをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、ｅＧＦＰのみをコードする構成体をＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。ｅＧＦＰのみをトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ｅＧＦＰタンパク質は、予想通り細胞質及び核の両方に存在することが判明した（図６Ａ〜Ｃ）。一方融合タンパク質を発現するＣＯＳ−１細胞では、この発現タンパク質は特異的に核に局在した（図６Ｄ〜Ｆ）が、核小体には明らかに検出されなかった。ヒトメラノーマ細胞株ＢＬＭにトランスフェクションした場合にも、同様の核局在を示す匹敵する結果が示された。
【００７３】
実施例５
本発明のタンパク質の活性調節因子を同定する方法
実施例１に記載した発現ベクターを、当分野の標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）によってＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションする。当ベクターを取り込んだ細胞を、選択条件下、すなわちジェネティシン存在下での増殖能によって同定する。ＣＴｐ１１をコードするＤＮＡを発現する細胞は、そのＲＮＡを生産するので、それを実施例１に記載の通りノーザンブロット分析によって検出する。あるいは当タンパク質を発現する細胞は、特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるタンパク質の同定を介して同定される。当発現ベクターから当タンパク質を発現する細胞は、実施例３に従って測定される通り、転移能を発揮するだろう。
【００７４】
当タンパク質を発現する細胞を、推定調節因子の存在下又は非存在下で培養する。細胞増殖を調べるための高処理量の細胞検査を行って、化学薬品及び天然物のライブラリーをスクリーニングすることによって、前記化合物を同定し得る。前記検査には、発色性基質としてテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１，  ＭＴＴ又はＸＴＴを用いた細胞増殖検査、あるいはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いた細胞死検出用ＥＬＩＳＡがある（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８８，  ｐｐ．７０−８４参照）。
【００７５】
当調節因子化合物は、ＣＴｐ１１タンパク質活性を介する細胞応答を低下させるであろうから、ＣＴｐ１１機能の抑制因子となるであろう。
あるいは、抑制因子候補を培養腫瘍細胞に添加すると、その細胞の転移能が低下変動する。推定調節因子を、ＣＴｐ１１タンパク質を有する又は有さない細胞に加え、その細胞応答を、その細胞の増殖特性から検査する。
【００７６】
実施例７
抗ＣＴｐ１１抗体
組換え生産したＣＴｐ１１ポリペプチドをＢＳＡに結合する。初回免疫のために、この免疫原を別々に皮間に免疫接種し（５００μｇ免疫原＋フロイントアジュバント）、更に免疫増幅のために静脈内に免疫接種する（５００μｇ免疫原＋フロイントアジュバント）。各免疫増幅の１週間後に血液を試験採取し、抗原としての当免疫原及び完全長のＣＴｐ１１タンパク質に対する結合を検査した。
【００７７】
参考文献
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ＥＭＢＬ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＡＡ４１２２７０
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Ｓａｈｉｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７８  （１９９８）  ３８７−３８９
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ
Ｓｈｉｏｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３  （１９９６）  １２２９８−１２３０３
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５  （１９９５）  ３４７８−３４８２
Ｔｕｒｅｃｉ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７  （１９９８）  １９−２３
Ｔｕｒｅｃｉ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  ５２１１−５２１６
ＵＳＰ  ２９１５０８２
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８２  （１９９５）  ６８９−６９８
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４  （１９９１）  １６４３−１６４７
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Ｗａｈｌ，  Ｇ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６  （１９７９）  ３６８３−３６８７
Ｗａｎｇ，  Ｒ．Ｆ．，  Ｍｏｄ．  Ｍｅｄ．  ３  （１９９７）  ７１６−７３１
Ｗｅｓｔｐｈａｌ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７６  （１９９７）  ５６１−５７０
Ｗｅｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２  （１９９２）  １２９１−１２９６
Ｗｅｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５３  （１９９３）  ２７８−２８４
Ｗｅｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６０  （１９９５）  ７３−８１
ＷＯ  ８９／０６６９８
ＷＯ  ９９／４６３７４
Ｚｅｎｄｍａｎ，  Ａ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４６  （１９９９）  ２９２−２９８
【００７８】
【表１】
0003561229.tif 000005
【表２】
0003561229.tif 000006
【表３】
0003561229.tif 000007
【００７９】
【配列表】
0003561229.tif 000008
【００８０】
0003561229.tif 000009
0003561229.tif 000010
【００８１】
0003561229.tif 000011
0003561229.tif 000012
【００８２】
0003561229.tif 000013
【００８３】
0003561229.tif 000014
【００８４】
0003561229.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】ヌードマウスへ皮下注射した後に異なる転移能を示す検査群のヒトメラノーマ細胞株のノーザンブロット分析。当ブロットは、差分表示法による３００ｂｐのｃＤＮＡによりハイブリダイズする。矢印は、転移性の高い細胞株にのみ存在する０．５ｋｂのバンドを示す。レーン１：５３０；レーン２：１Ｆ６；レーン３：Ｍ１４；レーン４：Ｍｅｌ５７；レーン５：ＭＶ３；レーン６：ＢＬＭ；レーン１：１Ｆ６ｍ。
【図２】ＣＴｐ１１のｃＤＮＡ配列及び推定したアミノ酸配列。ＰＣＲに用いたプライマーを矢印で示す（最初のＰＣＲ：太矢印；ネストＰＣＲ：細矢印）。ポリアデニル化シグナルを下線で、推定した核局在化シグナルを箱枠で、そしてポリＥ酸性ドメインを二重下線で示す。停止コドンを星印で示す。
【図３】（Ａ）１７種類の新鮮な正常ヒト組織から単離されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ。精巣のみが陽性である（２９７ｂｐのｃＤＮＡバンド）。数種の試料で、弱いゲノムＤＮＡバンドが視認される（１ｋｂ）。（Ｂ）コントロールとしてのβ２−ミクログロブリンのＲＴ−ＰＣＲ（１３６ｂｐ）。
【図４】（Ａ）正常ヒト皮膚の試料から単離されたＲＮＡ、及びメラノサイト腫瘍進行の種々の段階の病巣を含む組織試料から単離されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ（１８８ｂｐ）。ＮＳ＝正常皮膚；ＮＮ＝細胞増殖型一般母斑（ｃｏｍｍｏｎ  ｎａｅｖｕｓ  ｎａｅｖｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）；ＡＮ＝異型母斑；ＰＭ＝原発性メラノーマ；ＭＭ＝転移性メラノーマ。（Ｂ）コントロールとしてのβ２−ミクログロブリンのＲＴ−ＰＣＲ（１３６ｂｐ）。
【図５】ＢＬＭ（レーン１）、ｅＧＦＰのみを有する構成体をトランスフェクションしたＢＬＭ（レーン２）、及び当該完全長ｃＤＮＡ／ｅＧＦＰ融合体を有する構成体をトランスフェクションしたＢＬＭ（レーン３）から調製した細胞抽出物のウエスタンブロット分析。ｅＧＦＰに対するポリクローナル抗体によってバンドを検出した。２７及び３８ｋＤのバンドは特異的であり、５０ｋＤのバンドは非特異的である。
【図１】
0003561229.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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