(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップウイルスフリー培養株を、発根培地にて発根させた後、糖類が単糖類の場合は０．１５〜１Ｍ、二糖類の場合は０．１〜０．５Ｍの濃度で含むホップ棒苗形成培地にて培養する工程を経て、ホップ棒苗を生成せしめることを特徴とするウイルスフリー化ホップ棒苗の製造方法。
【請求項２】
ホップ棒苗形成培地における糖類が、グルコース，フルクトースおよびスクロースから選ばれる一種以上の糖類である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ホップ棒苗形成培地における糖類が、グルコースを０．１５〜１Ｍの濃度で含むものである請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ホップ棒苗形成培地が、ＭＳ基本培地にグルコースを０．１５〜１Ｍ濃度で添加してなる培地である請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
ホップウイルスフリー培養株が、茎頂培養により得られたものである請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ  Ｌ．）  のウイルスフリー化棒苗の製造方法に関する。このホップ棒苗は、保存性に優れ、植付け後の根の活着や萌芽の生育が良好である。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、ホップの休眠芽を持つ栄養貯蔵組織（いわゆるホップ棒苗；本発明では明細書全体を通して、ホップの「棒苗」と称する。）を培養によって形成したとの報告はない。
従来、ホップのクローン個体の増殖（栄養繁殖）は主に以下の方法で行われてきた。
１．棒苗による方法
棒苗である主茎地下部を秋に切り取り、保存した後、育苗圃場または栽培圃場に植付ける。棒苗は休眠芽を持つ栄養貯蔵組織であるので、保存が可能であり、植付け後の活着および生育は良好であるとの特徴がある。
２．挿し木による方法
ホップの萌芽茎，主茎地上部または側枝を切り取り、少なくとも１節以上を付けた挿し木苗を発根させ、育苗圃場に植付け１年株の成長後、栽培圃場に定植する。
３．培養による方法
茎頂培養によるウイルスフリー化技術と共に、ウイルスフリー化した培養株を引き続き培養して増殖を行う。増殖した培養株は鉢上げ後、以下挿し木による方法と同様に育苗圃場を経て栽培圃場に定植する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
実際に、ホップの栽培においては、よく各種ウイルスの感染の危機にさらされることが報告されており、棒苗や挿し木苗等の栄養繁殖ではウイルスは次代の株に引き継がれていく。これまでに、わが国で検出されたウイルスにはアップルモザイクウイルス（ＡｐＭＶ），ホップ潜在ウイルス（ＨＬＶ），ホップモザイクウイルス（ＨＭＶ），プルヌスネクロチックリングスポットウイルス（ＰＮＲＶ）などがある。
【０００４】
茎頂培養によってウイルスフリーとした培養株は、一度試験管から出し、鉢上げや圃場に移植すると、アブラムシや線虫等のウイルス媒介生物により感染したり、剪定時の樹液伝染で感染する危険性が多々ある。そのため、ウイルスフリーの培養株を、ウイルス感染から守るためには、ウイルスフリー株専用の隔離圃場の設置、媒介生物の徹底的駆除・防除、頻繁なウイルス検定作業および感染株の早期除去等の多大な管理労力を要する。
【０００５】
また、新品種の導入，試験栽培等の目的で国際間でホップ苗を移動する場合、植物検疫の観点から、病害虫等が寄生していないことが条件とされ、特にホップ苗のウイルスについては、近年国毎に特定のウイルス種のウイルスフリーであることを証明することが要求されている。
このウイルス検定は、ＥＬＩＳＡ法によって行われるが、感染間もない時期では、ウイルス濃度が低いため、検定結果は陰性となり、この点で従来の棒苗，挿し木により得られたホップ苗では、実際上ウイルスフリーであることの証明が困難な場合がある。
この場合、理論的には、茎頂培養によってウイルスフリーとした培養株を用いれば、この問題は解決できるが、国際間移動後の鉢上げ、圃場栽培を行う場合の設備の問題、培養株での長時間移動による植物に与えるストレスから、植付け後のホップ苗の活着、萌芽の生育が悪いという新たな問題が生じる。
【０００６】
本発明は、ホップのウイルスフリー培養株のウイルス感染の危険性の排除と、棒苗の保存性と植付け後の良好な活着、生育という利点を活かし、それぞれが持つ上述の問題点を排除することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、長年にわたるホップの培養苗および育種の研究において、試験管内における棒苗化現象、特にその生成条件について研究を続けたところ、ホップウイルスフリー培養株を、発根培地にて充分発根させた後、糖類を高濃度で含む棒苗形成培地にて培養することによって、上記課題を解決できるホップ棒苗を製造できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本願の請求項１に係る発明は、ホップウイルスフリー培養株を、発根培地にて発根させた後、糖類が単糖類の場合は０．１５〜１Ｍ、二糖類の場合は０．１〜０．５Ｍの濃度で含むホップ棒苗形成培地にて培養する工程を経て、ホップ棒苗を生成せしめることを特徴とするウイルスフリー化ホップ棒苗の製造方法である。また、請求項２に係る発明は、ホップ棒苗形成培地における糖類が、グルコース，フルクトースおよびスクロースから選ばれる一種以上の糖類である請求項１記載の製造方法である。請求項３に係る発明は、ホップ棒苗形成培地における糖類が、グルコースを０．１５〜１Ｍの濃度で含むものであることを特徴とする請求項１記載の製造方法である。さらに、請求項４に係る発明は、ホップ棒苗形成培地が、ＭＳ基本培地にグルコースを０．１５〜１Ｍ濃度で添加してなる培地である請求項１記載の製造方法であり、請求項５に係る発明は、ホップウイルスフリー培養株が、茎頂培養により得られたものである請求項１記載の製造方法である。
【０００９】
本発明で用いられるホップウイルスフリー培養株は、ウイルスに感染した植物であっても、それを３５℃付近の温度で１０〜１８日間育てた後、茎先端の１〜５ｃｍを採取し、培養することでも得られる。しかし、より簡便かつ精度の高い方法として、茎の極先端の生長点組織を採取し、茎頂培養する方法により、ホップウイルスフリー培養株が得られる。
ホップがウイルスフリーであることの確認は、上記したように、ＥＬＩＳＡ法によるウイルス検定により実施することができる。
【００１０】
植物の頂芽あるいは腋芽には常に茎頂分裂組織があり、この部分を生長点又は茎頂組織と呼び、その部分を用いた組織培養を茎頂培養と称する。
この茎頂組織は、通常芽の最も内部にあり、多くは葉やリン片に包まれているので、無菌であることが多い。しかも、この組織の先端から０．３ｍｍまでの部分はほとんどウイルスが存在しないとされており、このような部分を取り出して培養することによって、ウイルスフリーホップを作り出すことができる。この茎頂培養によれば、ウイルスを除去できるだけでなく、菌類や細菌類も存在しないので、無菌化された材料が得られる。
【００１１】
茎頂培養の具体的な方法について述べると、ホップ頂芽あるいは腋芽を含む部分を適当な大きさに切り取り、採取する。その後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡等を用いて、茎頂組織を覆っているリン片や葉などの組織を除去して茎頂組織を露心し、無菌のメス等の鋭利な刃物で茎頂組織を０．１５ｍｍ〜０．３ｍｍ厚で切断して採取する。
採取した茎頂組織は刃物の先端部に乗った状態で採取され、これをすばやく培地に置床する。培地は、植物組織培養に一般的に使用されている培地、例えばムラシゲ・スクーグ培地，ホワイト培地，リンスマイヤー・スクーグ培地，ニッチ培地などを用いることができるが、通常はムラシゲ・スクーグ（以下、ＭＳと略記することがある。）寒天培地にオーキシン，サイトカイニン等の植物ホルモンを添加したものを用いる。具体的には、ＭＳ基本培地にベンジルアデニン（ＢＡ）２．０ｍｇ／リットル、ジベレリン（ＧＡ３）０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）が好適な例として挙げられる。
【００１２】
置床した茎頂の培養は、室温下約１か月行い、この時点で１個の茎頂組織が生長し、１０個体前後に分割可能になる（すなわち、１０個前後の頂芽や側芽を持った培養株）。分割した各個体は、さらに１か月の培養で１０個体前後に増殖することができるため、この後の増殖培養は必要とする個体数に応じて行えばよく、例えば１０００個体では茎頂置床から３か月程度、１００００個体であれば４か月程度の培養期間で増殖が可能である。
得られた組織についてＥＬＩＳＡ法によるウイルス検定を行い、ウイルスフリーであることを確認する。
増殖した個体は、さらに１か月の培養により生長させ、伸長培養に移る。
【００１３】
次に、この組織の伸長培養を行って頂芽優勢相を促進する。すなわち、培養株を早生分枝相から頂芽優勢相に効率よく転換させる。このときの培地としては、上記ＭＳ寒天培地にインドール酢酸０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）が好ましい。
培養は、室温下約２か月行い、頂芽優勢相への転換が促進されたことを確認した後、発根培養に移る。
発根培養は、ＭＳ寒天培地にインドール酪酸０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）を使用し、これに前記培養組織を置床し、室温下２週間乃至約１か月培養を続けて充分に発根させる。
【００１４】
このようにして作出したホップウイルスフリー培養株（発根株）を棒苗形成培地で培養してホップ棒苗を生成せしめる。
棒苗形成培地は、基本培地としてＭＳ液体培地のような前記した一般的な植物組織培養用液体培地が用いられ、これに糖類を高濃度で含有させたものが好適である。培地に加える糖類としては、グルコース，フルクトースおよびスクロース等が適当で、これら糖類の一種もしくは二種以上を用いる。培地中の糖類の濃度はグルコース，フルクトース等の単糖類は０．１５〜１Ｍ、好ましくは０．２〜０．４Ｍ、スクロース等の二糖類は０．１〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．２Ｍである。糖類の濃度が下限未満であると、培養株は生存し続けても棒苗の形成率が極端に低下し、一方上限を越えると、培養株の生長阻害や枯死が認められる。
好適な培地は、ＭＳ液体培地にインドール酪酸０〜２．０ｍｇ／リットル、好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／リットルとグルコース３０〜１５０ｇ／リットル、好ましくは４０〜６０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８）である。
また、培地のｐＨについてはｐＨ５．５〜６．０、好ましくは５．７〜５．８である。
【００１５】
培養は、試験管を用いて行うが、試験管は１０〜３０×８０〜２００ｍｍ、好ましくは１５〜２５×９０〜１２０ｍｍ程度のものを用いる。これよりも小さな試験管では培養株が充分に生育できないために、栽植後も生育の不良な小さい棒苗しか形成されず、また大きな試験管では棒苗の形成率が低下する。
ホップウイルスフリー培養株を試験管内の培地に移植し、２０〜３０℃、好ましくは２５℃で３，０００〜２５，０００ルクス、好ましくは１５，０００〜２０，０００ルクスの連続照明下で培養するか、または２０〜３０℃、好ましくは２５℃で３，０００〜２５，０００ルクスの照明下、１４〜２０時間培養したのち、暗黒条件に切り替えて、１０〜２０℃、好ましくは１５℃にて４〜１０時間培養するというサイクルを繰り返し、１〜３か月培養を行う。なお、ホップウイルスフリー培養株は、前記発根培地を充分に取り除いてから移植すべきである。
【００１６】
培養後、１か月経過した頃から培養株の主茎基部から上部のいずれかの部位で肥大が始まり、約２か月経過した時点で殆どの培養株に棒苗の形成が認められるようになる。この後、培養株の先端茎および葉が枯れ始め、形成された棒苗は、その肥大度を増して行く。約３か月経過し、棒苗の形成率にあまり変化がないことを確認したのち、培養を終了する。
この培養により、７０〜１００％の培養株で主茎基部から上部のいずれかの部位に肥大したホップ棒苗が形成される。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
ホップの茎先端の茎頂（生長点組織）を０．２ｍｍ厚で採取し、１７×１０５ｍｍの試験管に入ったＭＳ基本培地（組成、数値はｍｇ／リットル：ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２Ｏ  ３７０；  ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２Ｏ  ４４０；  ＫＮＯ３  １９００；  ＮＨ４ＮＯ３  １６５０；  ＫＨ２ＰＯ４  １７０；  ＦｅＳＯ４  ・７Ｈ２Ｏ  ２７．８；  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ３７．３；  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ２２．３；  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．６；  ＣｕＳＯ４  ・５Ｈ２Ｏ  ０．０２５；  ＣｏＣｌ２  ・６Ｈ２Ｏ  ０．０２５；  ＫＩ  ０．８３；  Ｈ３ＢＯ３  ６．２；  Ｎａ２ＭｏＯ４  ・２Ｈ２Ｏ  ０．２５  ；  ミオイノシトール１００  ；  ニコチン酸  ０．５  ；    塩酸ピリドキシン  ０．５；  塩酸チアミン  ０．１〜１  ；  グリシン  ２）  にベンジルアデニン    ２．０ｍｇ／リットル、ジベレリン０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）に置床し、２５℃で照明１６時間（５，０００〜２０，０００ルクス）、暗黒８時間のサイクルの条件下で約３か月間茎頂培養を行った。この間ＥＬＩＳＡ法により、この培養株がウイルスフリーであることを確認すると共に、２回の分割移植、継代培養により１００個体のホップウイルスフリー培養株を得た。この後、さらに１か月培養し、培養株の生長を待った。
【００１８】
次いで、上記ＭＳ基本培地にインドール酢酸０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加した培地（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）に上記のホップウイルスフリー培養株１００株を置床し、室温下約２か月間培養を行い、頂芽優勢相への転換を促進させた。
【００１９】
この培養株１００株をＭＳ基本培地にインドール酪酸０．２ｍｇ／リットルとグルコース２０ｇ／リットルを添加したもの（ｐＨ５．８，寒天８ｇ／リットル）に置床し、室温下２週間乃至約１か月培養を続けて充分に発根させた。
次に、充分に発根させたホップウイルスフリー培養株の根などに付着している培地を無菌条件下で丹念に除去したのち、該培養株１００株を用いて棒苗の形成を行った。すなわち、ＭＳ基本培地にインドール酢酸０．２ｍｇ／リットルとグルコース４０ｇ／リットルを添加した液体培地（ｐＨ５．８）４ｍｌを分注した試験管（１７×１０５ｍｍ）に該ウイルスフリー培養株を移植し、２５℃で照明下（５，０００〜２０，０００ルクス）１６時間、１５℃で暗黒下８時間のサイクルで培養を行った。
【００２０】
培養開始後１か月経過した頃より、ウイルスフリー培養株の主茎の基部から上部の何れかの部位で肥大が始まり、２か月経過時点では該培養株１００株の内８２株（８２％）で棒苗の形成が確認された。その後、該培養株の先端茎および葉が枯れ始め、形成された棒苗は、その肥大度を一段と増した。３か月経過後も棒苗の形成率に目立った変化が認められなかったので、培養を終了し、棒苗を回収した。得られた棒苗の生重量は平均０．２６ｇ（最小値０．１４ｇ、最大値０．４２ｇ）であった。
【００２１】
実施例２
実施例１において、茎頂培養を２５×１２０ｍｍの試験管を用いて行い、かつ棒苗形成培養も２５×１２０ｍｍの試験管を用いて行ったこと以外は実施例１と同様にして行った。その結果、培養３か月目の棒苗の形成率は７９％であり、生重量は平均０．５１ｇであった。
【００２２】
実施例３
実施例１において、茎頂培養を３０×２００ｍｍの試験管を用いて行い、かつ棒苗形成培養も３０×２００ｍｍの試験管を用いて行ったこと以外は実施例１と同様にして行った。その結果、培養３か月目の棒苗の形成率は２６．７％であった。なお、棒苗の生重量は平均０．７９ｇであった。
【００２３】
【発明の効果】
圃場で採取するウイルスフリーのホップ棒苗は、ウイルス媒介生物や農作業によりウイルスに再感染する危険性があるが、本発明により無菌条件下で形成せしめたホップ棒苗はウイルスに感染したり、他の病害虫の感染や寄生の危険がなく、安全性が高い。また、保存性も優れており、植付け後の根の活着、萌芽の生育なども良好である。