(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
獣毛繊維からウシ種、ラクダ種、ヤギ種およびヒツジ種から選ばれた少なくとも１の獣毛繊維を同定するに際し、獣毛繊維試料から抽出したＤＮＡとチトクロムｂ塩基配列より設計した下記の（ａ），（ｂ），（ｃ）および（ｄ）から選ばれた少なくとも１の種特異的プライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクションによってＤＮＡを増幅し、次いで増幅生成分を分析することを特徴とする獣毛繊維の同定方法。
0003566570.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は獣毛繊維の同定方法に関し、特に複数の獣毛繊維またはそれらの混合物を構成する獣毛繊維を高精度で同定するための新規な方法、より詳しくはＤＮＡによる獣毛繊維の種の同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高級獣毛衣料として、繊維直径が細く、柔軟で、光沢がある山羊種のカシミヤやモヘヤ、ラクダ種のキャメル等を用いた製品の需要が増大している。これらは高価なため、時として牛種のヤクや羊種の羊毛が混合される場合がある。したがって、消費者保護の立場から、獣毛繊維を高精度で同定、定量し、品質管理または品質表示が適性に実施されていることを証明する方法が必要である。
現在、獣毛繊維の同定、定量方法は、主として熟練した専門家による光学顕微鏡または電子顕微鏡を用いた獣毛繊維の形態学的観察（直径、キューティクルの形状、髄の有無・構造等の観察）が行われているが、場合によっては困難性を感じる場合がある。また羊毛繊維改良のための後加工技術の検討も盛んで、キューティクルの厚みの減少・除去技術や、延伸による繊維直径の減少および繊維長の増大技術が開発されており、これら技術が商業化された場合は、従来の形態学的観察による獣毛繊維の同定は、ますます困難性を増している。したがって、形態学的同定方法を少なくとも補完する新しい同定方法の出現が望まれる。
【０００３】
近年、獣毛の毛根部分からのみでなく毛部分からもＤＮＡの抽出が可能であること、加工された獣毛製品の場合はＤＮＡの損傷を生じるためミトコンドリアのチトクロムｂのＤＮＡ配列を用いて種特異的プライマーを設計しポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によりＤＮＡ増幅を行い分析精度を高めることが有利であること等がＢＴＴＧにより明らかにされ、ＤＮＡによる獣毛繊維の同定方法の開発が進められている（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｓｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｆｉｂｒｅｓ  」Ｐａｕｌ  Ｆ  Ｈａｍｌｙｎ，  ｅｔ．ａｌ，  ＪＳＤＣ，ｖｏｌ．１１４，  ７８−８０，Ｍａｒｃｈ，  １９９８  ）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上記文献では例えば生化学事典に記載されているような一般的用語により工程の説明がなされているに過ぎず、その詳細、特に効率を左右するＰＣＲ増幅に重要な種特異的プライマーの設計に関しての情報は一切開示されていない。関連の文献（例えばＧｏｒｄｏｎ  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１１０−１１２，  １９９７）には別のＤＮＡ分析法について工程のより詳細な条件が記載されてはいるが、種特異的プライマーに関しての具体的情報は開示されていない。プライマーの設計にあたっては多分に経験によることが多く、プライマーの種類や長さに関して工夫する必要がある。特異的に鋳型ＤＮＡとアニールさせ、効率よく伸張反応を行わせることは、いかに良いプライマーを設計するかということにかかっている。したがって種特異的プライマーを新規に設計し、それが獣毛繊維の同定に役立つことを実証することが望まれる。
さらに前記文献では測定精度が向上し、従来は必要な試料量は２０ｇであったが、２ｇ〜２０ｍｇでの測定が可能となったとの記載があるが、工業的にはさらに少量の試料量で獣毛繊維を正確に同定する方法が望まれる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、獣毛繊維からウシ種、ラクダ種、ヤギ種およびヒツジ種から選ばれた少なくとも１の獣毛繊維を同定するに際し、獣毛繊維試料から抽出したＤＮＡとチトクロムｂ塩基配列より設計した下記の（ａ），（ｂ），（ｃ）および（ｄ）から選ばれた少なくとも１の種特異的プライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクションによってＤＮＡを増幅し、次いで増幅生成分を分析することを特徴とする獣毛繊維の同定方法である。
0003566570.tif 000002
【０００６】
以下本発明をさらに詳細に説明する。本明細書中、獣毛繊維とは、動物より採取される毛繊維を意味し、ＤＮＡ分析が比較的容易な毛根を含む梳き取られた毛繊維と、ＤＮＡ分析が困難な毛根を含まない刈り取られた毛繊維とを含む。工業的には毛根を含まない刈り取られた毛繊維が用いられることが殆どである。また獣毛繊維には、刈り取られたままの原毛と、これに混入した夾雑物や付着した油脂等の分泌物を除去した洗毛とを含む。また特に断りのない限り獣毛繊維を加工した獣毛繊維製品も包含する。
尚、獣毛繊維製品とは、獣毛繊維を用いた製品のことを意味し、糸状物、織物、編物、フェルト等を含む。これらは精錬、漂白、染色、仕上げ等その製造工程中において、各種薬品処理や加熱処理を受けるとともに、残存するＤＮＡの量はさらに減少し、ＤＮＡ分析は一層困難になる。
【０００７】
商業的に用いられている獣毛の混紡繊維製品等を鑑別する場合、あるいは意図的に混合される獣毛繊維を鑑別する場合、古典的生物分類の種まで遡って分析する必要はあまりない。例えばヤギ属のカシミヤヤギ種とヒツジ属のメリノウール種あるいはウシ属のヤク種とが混合される場合が多い、すなわち異なる属に属する動物の獣毛が混合される場合が多い。同じヤギ属のカシミヤヤギ種とアンゴラヤギ（モヘヤ）種とが混合されることは殆どない。将来は種の鑑別を実施する可能性も勘案しつつ、本明細書中での種とは、古典的生物分類の属に準じた意味とする。すなわち例えばカシミヤヤギ、アンゴラヤギ（モヘヤ）はウシ科ヤギ属に属すがヤギ種、緬羊（メリノウール）はヒツジ属に属すがヒツジ種、ヤクはウシ属に属すがウシ種と称す。ラクダ科はラマ、キャメル、アルパカ、ビキューナ等を含むが、属の分類が困難なため、本明細書中ではキャメルをラクダ種と称す。
【０００８】
種特異的とは、上記で定義したそれぞれの種に特有で、他の種と同一では無いことを意味する。プライマーとは核酸の生合成の開始反応に要求されるオリゴヌクレオチド分子を意味し、詳細は生化学辞典等に記載されている。獣毛繊維または獣毛繊維製品から抽出できるＤＮＡの量は少ないので、この種特異的プライマーを用いて、種特異的塩基部分を増幅することが必要である。したがって、種特異的プライマーの設計が非常に重要となる。また鑑別の対象とする獣毛繊維の種の数が増加するにつれ、それぞれの種間で共通することがなくかつその種に確実に存在する塩基配列部分の設計は、益々困難となる。本発明はこれまでで最多の４種の獣毛を鑑別することを目的としているので、種特異的プライマーの設計は非常に困難なものである。
【０００９】
種特異的プライマーを設計する場合、対象とするＤＮＡは、細胞の核中に存在するゲノムＤＮＡではなく、細胞の中に多く存在するミトコンドリアＤＮＡ中のチトクロムｂ遺伝子を対象とする。チトクロムｂによるＤＮＡ分析に関しては、肉種鑑別の研究（千国幸一ら、日畜会報、ｖｏｌ．６５（６）５７１−５７９（１９９４））に記載されている。獣毛繊維、特に獣毛繊維製品の場合、抽出できるＤＮＡの量が肉類より少なく、また薬品処理、加熱処理を受けるためＤＮＡの長さが減少するため、肉類と同一のプライマーを用いることは出来ない。
プライマーの設計にあたっては多分に経験によることが多く、プライマーの種類や長さに関して工夫する必要がある。特異的に鋳型ＤＮＡとアニールさせ、効率よく伸張反応を行わせることは、いかに良いプライマーを設計するかということにかかっている。
【００１０】
本発明者等は同定に必要性の高いウシ種、ラクダ種、ヤギ種、ヒツジ種の種特異的プライマーを鋭意研究の結果、ウシ種、ラクダ種、ヤギ種、ヒツジ種の種特異的プライマーを
0003566570.tif 000003
とすることでこれら４種の同定が効率良くできることを発見した。
【００１１】
ここに増幅サイズはそれぞれのプライマーの長さのことであり、括弧内に示した。その単位ｂｐは塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）のことである。またこれらプライマーはそれぞれの種の標的ＤＮＡの上流（５’側）でセンス鎖（Ｓ）を、下流（３’）側でアンチセンス鎖（Ａ）を選ぶ。記号５’、３’はＤＮＡを構成する糖の炭素の位置を示す。また記号Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇは公知の塩基の種類を示す。またＤＮＡ中の上記各プライマーに相当する位置を、塩基鎖の後の括弧内に示した。これにより増幅サイズが計算できる。例えばウシ種の場合、４１２−１８４＝２２８（ｂｐ）となる。これら種特異的プライマーの設計が適切であることは、後に記す実施例で示す。
【００１２】
つぎに、これら種特異的プライマーを用いた獣毛繊維の同定方法について説明する。その方法の概要は良く知られているとおり、獣毛繊維または獣毛繊維製品を洗浄し、それらからＤＮＡを抽出・精製し、抽出ＤＮＡと種特異的プライマーとを用いてＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行い、増幅生成物を分析することにより獣毛繊維を同定することよりなる。
洗浄は獣毛繊維の表面の汚れを落とす操作で、界面活性剤を含む水中に浸漬し、振とうする。その後、泡や水分をできる限り除去する。洗浄剤は、ＤＮＡ抽出用に市販されているドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。
洗浄後の獣毛繊維からのＤＮＡの抽出は、蛋白質分解酵素プロティナーゼＫの水溶液や、尿素水溶液や、例えばＤＥＸＰＡＴ（ＴａＫａＲａ  Ｃｏｄｅ９０９１）等の血液等からのＤＮＡ抽出用液や、苛性ソーダ水溶液等を基本成分として用いても良いが、プロティナーゼＫ等の蛋白質分解酵素水溶液を用いることが好ましい。好ましい抽出液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ＮａＣｌ、プロティナーゼＫで構成される。獣毛繊維をこの抽出液に良く浸漬し、獣毛繊維をチップの先でよく揉みほぐし、獣毛繊維についた液を搾り取り、獣毛繊維を取り除く。フェノール・クロロホルム抽出液と同量のイソプロピルアルコールと少量の酢酸ナトリウムを加えて良く混和後、氷点下に冷却し、低温で遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させることが好ましい。
【００１３】
ＤＮＡの精製は、グラスファイバー膜チューブ法（濾過）や、セロファン等を用いる方法（塩析）や、フェノール・クロロホルム法（抽出）や、シリカゲル樹脂法（吸着）等によってもよいが、目開き０．２２μｍ程度のグラスファイバー膜チューブ法によることが好ましい。上記沈殿ＤＮＡにＴＥバッファーを加え懸濁させ、グラスファイバー膜チューブを使用してＤＮＡを精製することが好ましい。
【００１４】
ＰＣＲによる核酸増幅の基本技術に関しては、ロシュ社等の特許公報、例えば特公平３−３１４３４号、特公平４−６７９６０号、特公平４−６７９５７号、特公２５０２０４１号、特公２５４６５７６号、特公２６２２３２７号各公報、あるいは生化学分野の専門書に詳細に記載されている。一般的には、ＤＮＡ鎖の両端に２０塩基ほどの相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー）を用意し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖伸張反応を行って、目的ＤＮＡを合成する。サイクルごとに二本鎖ＤＮＡが解けておのおのが鋳型となり、プライマーがハイブリダイズしてＤＮＡ鎖伸張反応が始まる。次のサイクルでは合成されたＤＮＡ鎖が鋳型となって合成反応に利用される。目的ＤＮＡ鎖は各サイクルごとに２倍になり、幾何級数的に増幅する。ＰＣＲ反応装置はＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ等数社から市販されている。ＰＣＲ反応液の組成は、緩衝液１０ＸＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、プライマー（Ｓ）、プライマー（Ａ）、耐熱性ポリメラーゼＴａＫａＲａＥｘＴａｑ、抽出ＤＮＡ液、および滅菌水で構成することが好ましい。ＰＣＲ反応は９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを数十サイクル行うことが好ましい。
【００１５】
本発明の目的とするウシ種、ラクダ種、ヤギ種、ヒツジ種の同定を行うためには、前述の肉腫の鑑別に用いるプライマーとは異なりかつプライマーの合成がより容易な、それぞれの種特異的プライマーとして、
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とすることでこれら４種の同定ができることを発見した。
【００１６】
増幅生成物の分析をするためには、蛍光色素で標識をＤＮＡにつけたのち、アガロースゲル電気泳動を行い、紫外線を照射して発光する蛍光により視覚化できる。予想されるサイズの増幅ＤＮＡが得られた場合、その獣毛繊維は用いたプライマーの種由来であると同定する。
また並行してネガティブコントロールとして抽出ＤＮＡの代わりに滅菌水のみを用いた反応を必ず行う。この反応で、予想される増幅ＤＮＡが全く得られない場合に、同定可能となる。
【００１７】
【実施例】
以下に本発明の代表的実施例を説明する。
〔実施例１〕
各種につき設計した種特異的プライマーの特異性の確認
まず、各種につき設計した種特異的プライマーがその種に特異性であることを確認した。
【００１８】
試料
その確認のためには、試料が各種から確実に採取されたことが明確である必要があるため、ヒツジ種用の試料としては市販のヒツジ肉、ヤギ種用の試料としてはヤギ（埼玉県大宮市小動物公園）から直接抜き取った毛根付きのヤギの原毛、ウシ種用の試料としては市販の牛肉、ラクダ種用の試料としてはラクダ（鹿児島県平川動物園）から直接抜き取った毛根付きのラクダの原毛を用いた。なお原毛と肉とは性質が異なるため、それぞれからのＤＮＡの調整は別の方法によった。試料からのＤＮＡの調整（原毛）
試料約４０ｍｇを１５ｍｌのコニカルチューブに量り取った。これに１％ＳＤＳ２ｍｌを加え、良く振とうして表面の汚れを落とした。試料から泡や水分をできる限り除いて、試料のみを新しい１５ｍｌコニカルチューブに移した。これにＤＮＡ抽出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３／３０ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％ｓｄｓ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅ−ｉｎａｚｅ  Ｋ）を５ｍｌ加えて、試料を液に完全に浸した。
【００１９】
その後、６０℃で２時間インキュベーションし、次いで試料をチップの先で良く揉みほぐし、その後試料についた液を搾り取り、試料を取り去った。搾り取った液を５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、液に含まれる試料を除いた。
上清を新しい１５ｍｌコニカルチューブに移し、上清と同量のイソプロピルアルコールと、１／２０量の２Ｍ酢酸ナトリウムを加えて良く混和後、−８０℃で２０分間冷却した。その後、９，５００ｒｐｍ、４℃で２５分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。
ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに懸濁し、グラスファイバー膜チューブを使用し、ＤＮＡを精製した。
【００２０】
試料からのＤＮＡの調整（肉）
試料約１００ｍｇに５００μｌのＵｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ  Ｕｒｅａ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、次いで２．５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｋ（Ｕｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒの１／２００量）を加えた。その後、肉の大きさにより６０℃で１〜１６時間インキュベーションした。
上清にＵｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒと等量の５００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ８．０）を加え、転倒混和を１００回行い、１２，０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した。その上清にＵｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒと等量の５００μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、転倒混和を１００回行い、１２，０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した。さらにその上清にＵｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒと等量の５００μｌのイソプロピルアルコールを加え、次いでＵｒｅａ  ｂｕｆｆｅｒの１／２０量の２５μｌの２Ｍ酢酸ナトリウムを加え、転倒混和し、ＤＮＡを沈殿させた。この際、ＤＮＡの沈殿が確認出来なかった場合は、−８０℃で２０分間転倒混和し、ＤＮＡを沈殿させた。
【００２１】
その後、上記転倒混和によりＤＮＡの沈殿が確認できれば５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上記転倒混和によりＤＮＡの沈殿が確認できず−８０℃で２０分間転倒混和してＤＮＡを沈殿させた場合は１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。その沈殿に３００ｍｌのＤＮＡ用８０％エタノールを加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。さらにその沈殿に３００ｍｌのＤＮＡ用８０％エタノールを加え、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。その沈殿からエタノールを脱気乾燥し、次いで３００μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、グラスファイバー膜チューブを使用し、ＤＮＡを精製した。
【００２２】
プライマーの合成
前述のプライマー設計に従い、
0003566570.tif 000005
のプライマーを合成した。合成および精製は宝酒造株式会社に委託した。
【００２３】
ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液の組成は
0003566570.tif 000006
とした。
ＰＣＲ反応条件は、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０サイクルとし、ＰＣＲ反応装置としてＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰを用いた。
【００２４】
増幅ＤＮＡの確認
反応終了後、３％ＮｕＳｉｅｖｅ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ電気泳動により、各増幅ＤＮＡを確認した。その結果を図１および表１に示す。電気泳動後のフラグメント図１において、試料Ｍは１００ｂｐＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、１はウシ肉由来ＤＮＡ、２はヒツジ肉由来ＤＮＡ、３はヤクシマヤギ原毛由来ＤＮＡ、４はカシミヤ原毛由来ＤＮＡ（中国産）、５はカシミヤ原毛由来ＤＮＡ（モンゴル産）、６はカシミヤ洗毛由来ＤＮＡ（中国産）、７はラクダ原毛由来ＤＮＡである。また図の上下には種特異的プライマーとして合成したプライマーを示す。
ウシ肉（試料１）より抽出したＤＮＡと前記４種の増幅用プライマーとを用いた場合は、ウシ用増幅プライマーの長さに相当する２２８ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅プライマーの長さに相当する場所には増幅フラグメントは確認されなかった。ラクダ原毛（試料７）より抽出したＤＮＡと前記４種の増幅用プライマーとを用いた場合は、ラクダ用増幅プライマーの長さに相当する１７３ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅プライマーの長さに相当する場所には増幅フラグメントは確認されなかった。
【００２５】
ヤギ原毛（試料３）、中国産カシミヤ原毛（試料４）、モンゴル産カシミヤ原毛（試料５）、中国産カシミヤ洗毛（試料６）より抽出したＤＮＡと前記４種の増幅用プライマーとを用いた場合は、ヤギ用増幅プライマーの長さに相当する３５１ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅プライマーの長さに相当する場所には増幅フラグメントは確認されなかった。
ヒツジ肉（試料２）より抽出したＤＮＡと前記４種の増幅用プライマーとを用いた場合は、ヒツジ用増幅プライマーの長さに相当する２８２ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅プライマーの長さに相当する場所には増幅フラグメントは確認されなかった。
【００２６】
【表１】
0003566570.tif 000007
これらの結果より、各種特異的なプライマーの特異性が確認され、各種特異的プライマーの設計が適切であり、実用上有効であることが明らかになった。
【００２７】
〔実施例２〕
繊維製品および洗毛から抽出したＤＮＡが、種に特異的なＤＮＡを含むことの確認
上記実施例１の結果が工業的に役立つことを実証するために、市販の繊維製品、およびその原料としての洗毛より抽出したＤＮＡが、種に特異的なＤＮＡを含むことを確認した。
ヤク洗毛（（財）毛製品検査協会）、羊毛洗毛（大東紡績）、カシミヤ洗毛（東洋紡績）、ラクダ洗毛（大東紡績）、羊毛織物（茶色、市販品）、羊毛織物（白色、市販品）、カシミヤ織物（大津毛織）、ラクダ織物（大津毛織）を試料とし、実施例１の原毛と同じＤＮＡの抽出、精製、ＰＣＲ増幅処理を行った。
【００２８】
増幅断片をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００（ＴａＫａＲａ  ＡＭ００１）で処理後、ダイレクトシークエンシングを行った。電気泳動のフラグメント図を図２に示す。
図２において、試料Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ、１はヤク洗毛由来ＤＮＡ、プライマーＢＯＶＩＮ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ２２８ｂｐ、２は羊毛洗毛由来ＤＮＡ、プライマーＳＨＥＥＰ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ２８２ｂｐ、３はカシミヤ洗毛由来ＤＮＡ、プライマーＧＯＡＴ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ３５１ｂｐ、４はラクダ洗毛由来ＤＮＡ、プライマーＣＡＭＥＬ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ１７３ｂｐ、５は羊毛織物（茶）由来ＤＮＡ、プライマーＳＨＥＥＰ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ２８２ｂｐ、６は羊毛織物（白）由来ＤＮＡ、プライマーＳＨＥＥＰ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ２８２ｂｐ、７はカシミヤ織物由来ＤＮＡ、プライマーＧＯＡＴ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ３５１ｂｐ、８はラクダ織物由来ＤＮＡ、プライマー  ＣＡＭＥＬ（Ｓ），（Ａ）、増幅サイズ１７３ｂｐでの結果である。
【００２９】
ヤク洗毛（試料１）はウシ用増幅プライマーの長さに相当する２２８ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅フラグメントは確認されなかった。
羊毛洗毛（試料２）、羊毛織物（茶、試料５）、羊毛織物（白、試料６）はヒツジ用増幅プライマーの長さに相当する２８２ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅フラグメントは確認されなかった。
カシミヤ洗毛（試料３）、カシミヤ織物（試料７）はヤギ用増幅プライマーの長さに相当する３５１ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅フラグメントは確認されなかった。
ラクダ洗毛（試料４）、ラクダ織物（試料８）はラクダ用増幅プライマーの長さに相当する１７３ｂｐに増幅フラグメントが確認され、その他の増幅フラグメントは確認されなかった。
【００３０】
このダイレクトシークエンシングの結果、市販の繊維製品、およびその原料としての洗毛より抽出したＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡ断片が、それぞれの種に特異的な塩基配列を持っていることが確認でき、獣毛繊維の同定ができることが判った。
【００３１】
〔実施例３〕
混紡品中の獣毛繊維の同定
混紡品の場合、種間の相互作用を起こさず、正確な同定ができるか否かを確認した。
実施例２に記載のヒツジ洗毛（ヒツジ種）、カシミヤ洗毛（ヤギ種）、ラクダ洗毛（ラクダ種）につき、Ａ：これら試料からそれぞれＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ重量比が５０：５０、および９５：５となるように２種類を配合調整した試験と、Ｂ：これら試料を重量比が５０：５０、および９５：５となるように２種類を混合したのちにＤＮＡを抽出した試験を行った。この場合、鋳型量（ＰＣＲ反応液中の抽出ＤＮＡ量）として１５〜２０ｎｇ／５０μｌを用い、実施例１に準じて試験を行った。
【００３２】
電気泳動のフラグメント図を図３に示す。図３において、試料Ｍは１００ｂｐＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ、１はヒツジ種：ヤギ種＝５０：５０、２はヒツジ種：ラクダ種＝５０：５０、３はラクダ種：ヤギ種＝５０：５０、４はヤギ種：ヒツジ種＝９５：５、５はラクダ：ヒツジ＝９５：５、６はネガティブコントロールとしての滅菌水であり、１から５までの試料の調整法は上記Ａである。
また試料７はヒツジ種：ヤギ種＝５０：５０、８はヒツジ種：ラクダ種＝５０：５０、９はラクダ種：ヤギ種＝５０：５０、１０はヤギ種：ヒツジ種＝９５：５、１１はラクダ：ヒツジ＝９５：５、１２はネガティブコントロールとしての滅菌水であり、７から１１までの試料の調整法は上記Ｂである。
ヒツジ種とヤギ種のＤＮＡ混合比率５０：５０（試料１）、混合比率５０：５０のヒツジ種とヤギ種の洗毛の混合物から抽出したＤＮＡ（試料７）、ヤギ種とヒツジ種のＤＮＡ混合比率９５：５（試料４）、混合比率９５：５のヤギ種とヒツジ種の洗毛の混合物から抽出したＤＮＡ（試料１０）それぞれとラクダ種特異的プライマーとを用いた場合は増幅プライマーは確認されず、それぞれとヤギ種特異的プライマーとを用いた場合はヤギ種のプライマーの長さに相当する３５１ｂｐに増幅フラグメントが確認され、またそれぞれとヒツジ種特異的プライマーとを用いた場合はヒツジ種のプライマーの長さに相当する２８２ｂｐに増幅フラグメントが確認された。
【００３３】
ヒツジ種とラクダ種のＤＮＡ混合比率５０：５０（試料２）、混合比率５０：５０のヒツジ種とラクダ種の洗毛の混合物から抽出したＤＮＡ（試料８）、ラクダ種とヒツジ種のＤＮＡ混合比率９５：５（試料５）、混合比率９５：５のラクダ種とヒツジ種の洗毛の混合物から抽出したＤＮＡ（試料１１）それぞれとラクダ種特異的プライマーとを用いた場合はラクダ種のプライマーに相当する１７３ｂｐに増幅フラグメントが確認され、それぞれとヤギ種特異的プライマーとを用いた場合は増幅プライマーは確認されず、またそれぞれとヒツジ種特異的プライマーとを用いた場合はヒツジ種のプライマーに相当する２８２ｂｐに増幅フラグメントが確認された。
ラクダ種とヤギ種のＤＮＡ混合比率５０：５０（試料３）、混合比率５０：５０のラクダ種とヤギ種の洗毛の混合物から抽出したＤＮＡ（試料９）それぞれとラクダ種特異的プライマーとを用いた場合はラクダ種のプライマーの長さに相当する１７３ｂｐに増幅フラグメントが確認され、それぞれとヤギ種特異的プライマーとを用いた場合はヤギ種のプライマーの長さに対応する３５１ｂｐに増幅フラグメントが確認され、またそれぞれとヒツジ種特異的プライマーとを用いた場合は増幅プライマーは確認されなかった。なお、ネガティブコントロール（試料６および試料１２）からは増幅プライマーは確認されなかった。
【００３４】
この試験の結果、繊毛を混合してのちＤＮＡを抽出した場合（Ｂ）でも、各種から抽出したＤＮＡを混合した場合と同等のフラグメント図が得られた。すなわち本発明の種特異的プライマーを用いることにより、混紡品試料においても、それぞれのターゲットとする増幅産物を得ることができ、これにより混紡品中の獣毛種を同定することができることが判った。
また４０ｍｇの獣毛複合繊維を用いて重量比で５％（すなわち２ｍｇ）配合されている獣毛繊維の同定ができたということは、１００％の純品であれば２ｍｇで同定可能であるということで、短時間でこれまでの公知技術の１０倍の高精度で獣毛の同定ができることが判った。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば従来の目視判定の困難性を解決し、従来ＤＮＡで同定できた以上の多種の獣毛繊維またはそれらの混合物を構成する獣毛繊維を客観的にかつ高精度で同定することができる。したがって、獣毛繊維製品が１種類のみの獣毛で構成されているか、他の獣毛が混合されているかを客観的にかつ高精度で検査することができる。
この技術と、これら種に共通のプライマーとを用いるいわゆるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、獣毛の組成が未知の獣毛繊維製品の複数の種の同定を同時に行う技術の開発や、チップ化によるコストダウン技術の開発に応用することができる。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】種特異的プライマーの特異性確認フラグメント図。
【図２】繊維製品等から抽出したＤＮＡが、種特異的ＤＮＡを含む確認フラグメント図。
【図３】混紡品中の獣毛繊維の同定フラグメント図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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