(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子形状鋳型を有するポリマーを利用してオキシトシンを選択的に識別する方法において、該分子形状鋳型を有するポリマーとして、識別すべきオキシトシンの化学構造の一部を主要構造とするも該オキシトシンとは別異の構造を有する蛋白質である、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２を溶出除去することにより得られ、かつ該オキシトシンがその内部に侵入するに充分な孔が形成された多孔質体を使用することを特徴とするオキシトシンの選択的識別方法。
【請求項２】
該分子形状鋳型を有するポリマーが、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と相互作用を有する物質を含有することを特徴とする請求項１記載のオキシトシンの選択的識別方法。
【請求項３】
該分子形状鋳型を有するポリマーが、孔径１０〜１００ｎｍの多孔質体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のオキシトシンの選択的識別方法。
【請求項４】
チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と機能性単量体と重合性架橋剤を、希釈剤の存在下で重合反応させることにより得られる複合ポリマーを粉砕して微粒子状のポリマーとした後、該微粒子状ポリマーからチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２を溶出除去することを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の方法に用いられる分子形状鋳型を有するポリマーの製造方法。
【請求項５】
上記反応系に更にチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と相互作用を有する物質を存在させることを特徴とする請求項４に記載の分子形状鋳型を有するポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、所定の蛋白質を選択的に識別する方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
近年、蛋白質の分離・精製・検出法はバイオテクノロジー、医薬品製造、治療、臨床分析及び化学分析等の分野において極めて重要な位置を占め始めている。このため、目的とする蛋白質のみを効果的に識別する材料及び識別方法が求められている。
【０００３】
このような要請に答える方法として、蛋白質共存下でモノマーと架橋剤をラジカル重合することにより蛋白質鋳型をもつ物質を得る方法が提案されている（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995年, 34巻, pp.1812-1832）。しかし、この方法は、ある特定の蛋白質に対して最適な分子識別能をもつ物質を合成するためにはどのようなモノマーをどれだけ用いるかについては目安がなく、試行錯誤の繰り返しを必要とする。
【０００４】
このような問題点を解消するために、本発明者らは先に、所望する蛋白質のゼータ電位を目安としてモノマー量を決めることにより、同じモノマーを用いても所望する蛋白質の選択的吸着能の高い材料を得る方法を提案した（特願平１０−７８３４１号）。
この方法は、選択性が高く、多種類の蛋白質から所望の蛋白質を効率的に分離することができる等の多くの利点を有するものであるが、蛋白質及び合成した材料のゼータ電位値を測定してモノマーの最適量を知る必要があり、その識別操作がやや煩雑であるといった難点がある。
【０００５】
また、前者の方法のみならず後者の方法においても、その分子形状鋳型の作成に当たっては、所望蛋白質の完全な分子形状鋳型の形成を余儀なくさせるものであるが、周知のように蛋白質は化学的に不安定な物質であるためそのような完全なモデルを作成するには高度の技術力を必要とし、加えて蛋白質は極めて高価な試薬であるから、その完全な分子形状鋳型の作成には膨大なコストがかかり、経済的に不利であるという問題点を包含する。
【０００６】
そこで、所望する蛋白質のみに高い分子識別性を有し、かつその識別操作が簡便でしかも廉価なコストで対応できる蛋白質の選択的識別方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、所望する蛋白質のみに作用してこれを簡便な操作で選択的に識別することができ、しかも低減されたコストでの識別操作が可能な、蛋白質の選択的識別方法を提供することをその目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記識別方法においては、分子形状鋳型を有するポリマーとして、意外にもオキシトシンの化学構造の一部を主要構造とするも該オキシトシンとは別異の蛋白質である、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２の分子形状鋳型を有するポリマーの利用が有効であることを知見し本発明に至った。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）分子形状鋳型を有するポリマーを利用してオキシトシンを選択的に識別する方法において、該分子形状鋳型を有するポリマーとして、識別すべきオキシトシンの化学構造の一部を主要構造とするも該オキシトシンとは別異の構造を有する蛋白質である、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２を溶出除去することにより得られ、かつ該オキシトシンがその内部に侵入するに充分な孔が形成された多孔質体を使用することを特徴とするオキシトシンの選択的識別方法。
（２）該分子形状鋳型を有するポリマーが、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と相互作用を有する物質を含有することを特徴とする上記（１）に記載のオキシトシンの選択的識別方法。
（３）該分子形状鋳型を有するポリマーが、孔径１０〜１００ｎｍの多孔質体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のオキシトシンの選択的識別方法。
（４）チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と機能性単量体と重合性架橋剤を、希釈剤の存在下で重合反応させることにより得られる複合ポリマーを粉砕して微粒子状のポリマーとした後、該微粒子状ポリマーからチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２を溶出除去することを特徴とする上記（１）乃至（３）何れか記載の方法に用いられる分子形状鋳型を有するポリマーの製造方法。
（５）上記反応系に更にチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２と相互作用を有する物質を存在させることを特徴とする上記（４）に記載の分子形状鋳型を有するポリマーの製造方法。
【０００９】
本発明のオキシトシンの選択的識別方法は、分子形状鋳型を有するポリマーとして、該オキシトシンの化学構造の一部を主要構造とするも、該オキシトシンとは別異の蛋白質である、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２の分子形状鋳型を有するポリマーを用いたことを特徴とする。
以下、オキシトシンを蛋白質（Ａ）、チロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２  を所定蛋白質（Ｂ）という。
【００１０】
従来、この種の蛋白質（Ａ）の選択的識別方法においては、分子形状鋳型を有するポリマーとして、所定蛋白質（Ａ）の化学構造と同一構造すなわち所定蛋白質と同一物質の分子形状鋳型を有するポリマーでなければ、所定蛋白質（Ａ）の識別能がないとされてきたが、本発明者らの検討によれば、所定蛋白質（Ａ）と別異ものであってもその化学構造が所定蛋白質（Ａ）の一部好ましくは主要部と一致する蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーは、従来の観念を覆し、所定蛋白質（Ａ）を効率良く識別できることが判明した。
かかる知見は本発明者によって初めて見い出された意外性のある新規な事実であって、従来全く知られていないことである。
【００１１】
そして、このような分子形状鋳型を有するポリマーを利用する本発明の蛋白質の識別方法は、従来のように、分子形状鋳型を作成するための高度の技術力及び膨大な費用を講じることなく、所望する蛋白質（Ａ）を簡便な操作でしかも低廉なコストで選択的に識別することができるので、工業的に極めて魅力的な方法であるといえる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する蛋白質（Ｂ）とは、所定蛋白質（Ａ）とは別異の蛋白質であるが、その化学構造が所定蛋白質（Ａ）一部の構造好ましくは主要部の構造と一致するものを意味する。
従って、本発明においては、このような条件を満たすように蛋白質（Ａ）と蛋白質（Ｂ）を選定することが必要となる。
【００１３】
所定蛋白質（Ａ）として、ホルモンとしての生理活性をもつオキシトシンを選定した場合について説明すると、該オキシトシンは、システイン−チロシン−イソロイシン−グルタミン−アスパラギン−システイン−プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２の９個のアミノ酸からなり、かつ６個のアミノ酸からなる環状構造部分（１番目のシステインと６番目のシステインがＳ−Ｓ結合）と３個のアミノ酸からなるＣ末端部分構造を有するものであり、そしてこのＣ末端部分のアミノ酸配列が生理活性の発現に重要であり、該蛋白質の特徴部であることが報告されている。そこで、本発明においては、この所定蛋白質（Ａ）の化学構造の一部と同じ化学構造をもつ蛋白質（Ｂ）として、このＣ末端部分のアミノ酸配列と同じ配列のペプチドである、プロリン−ロイシン−グリシン−ＮＨ２を選定する。
【００１５】
本発明に係る所定蛋白質（Ａ）の化学構造の一部好ましくは特徴部を主要構造とするも、該所定蛋白質（Ａ）とは別異の蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーは、例えば、蛋白質（Ｂ）と機能性単量体と重合性架橋剤を、希釈剤の存在下で重合反応させることにより得られる複合ポリマーを粉砕して微粒子状のポリマーとした後、該微粒子状ポリマーから蛋白質（Ｂ）を溶出除去する方法などによって作成される。
【００１６】
本発明に係る微粒子ポリマーは多孔質ポリマーとして形成されるが、その表面積は、多数の鋳型が形成されるように大きい方が望ましく、通常、微粒子ポリマー１ｇ当たり１０〜１０００ｍ２好ましくは５０〜６００ｍ２程度とされる。
また、その孔径は識別すべき蛋白質（Ａ）が内部に侵入するに充分な程度とすべきであり、蛋白質（Ａ）の種類によっても異なるが、通常１０〜１００ｎｍ好ましくは１０〜６０ｎｍ程度とされる。
表面積及び孔径があまり大きすぎると微粒子ポリマーの力学的強度が低下し、細粉される恐れがあるので好ましくない。
【００１７】
機能性単量体としては、ビニルモノマー類、たとえばアクリル酸、メタクリル酸、２−トリフルオロメチルアクリル酸、スチレンスルホン酸、これらの酸のアルカリ金属塩、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、４−ビニルピリジンなどが挙げられる。これらのビニルモノマ−類は単独又は２種以上の混合物の形で使用される。
機能性単量体の使用割合は、蛋白質（Ｂ）１モルに対して１０モル程度とするのがよい。
【００１８】
重合性架橋剤としては分子中にビニル結合を２個有する化合物例えばエチレングリコールジメタクリレート、エチレンビスアクリルアミド、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド等が使用される。
重合性架橋剤の使用割合は、機能性単量体１モルに対して３０モル程度とするのがよい。
【００１９】
本発明に係る希釈剤は、原料を希釈化すると共に得られる複合ポリマーの多孔質を促進化するために使用される。すなわち、本発明の希釈剤は、識別すべき蛋白質（Ａ）が複合ポリマーの内部に侵入するに充分な程度の孔径を該多孔質化された複合ポリマーに付与することを重要な機能とする。
従って、このような機能を有する化合物であればいずれの希釈剤も使用できるが、含窒素系有機溶剤、含ハロゲン系有機溶剤、炭化水素系有機溶剤などが好ましく使用される。
含窒素系有機溶剤としては、アセトニトリル等が、含ハロゲン系有機溶剤としては、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等が、炭化水素系有機溶剤としては、キシレン、トルエン等が挙げられ、これらは単独又は２種以上の混合物として使用される。
また、一般に蛋白質（Ｂ）がこれらの有機溶剤に難溶であるためその溶解性を増大させる目的で、これらの有機溶剤に０．１〜５０重量％程度の水を併用してすることが望ましい。
希釈剤の使用割合は複合ポリマーの孔径（識別すべき蛋白質（Ａ）の内部侵入性）及び蛋白質（Ｂ）の種類等を考慮することによって定められるが、通常、機能性単量体１重量部に対して１０〜５００重量部好ましくは５０〜１００重量部とされる。
【００２０】
また、本発明に係る蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーは、前記したように、蛋白質（Ｂ）と機能性単量体と重合性架橋剤を、希釈剤の存在下で重合反応させることにより得られる複合ポリマーを粉砕して微粒子状のポリマーとした後、該微粒子状ポリマーから蛋白質（Ｂ）を溶出除去する方法などによって作成されるが、この場合、蛋白質（Ａ）の捕捉率を高めるために、複合ポリマーに蛋白質（Ｂ）と相互作用を有する物質を含有させておくことが望ましい。
【００２１】
本発明でいう蛋白質（Ｂ）と相互作用を有する物質とは、正−負荷電間の静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、酵素−基質間類似相互作用、酵素−阻害剤間相互作用、酵素−補酵素間相互作用などの相互作用により蛋白質（Ｂ）となんらかの形で強い影響力を持つ物質を意味する。
【００２２】
ここで、正-負荷電間の静電的相互作用としては、蛋白質のもつアミノ基、イミダゾール基などの正荷電に対してカルボキシル基、リン酸基などの負荷電などが対応し、一方、蛋白質のもつカルボキシル基などの負荷電基に対してアミノ基、イミノ基、３級アミノ基などの正荷電が対応する。
この場合、本発明に係る、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸、これらの酸のアルカリ金属塩、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等の機能性単量体は蛋白質（Ｂ）と正-負荷電間の静電的相互作用を有する官能基を含有するものであるから、これらのビニル基を有する機能性単量体を蛋白質（Ｂ）と相互作用を有する物質として選定することができる。
【００２３】
酵素−基質間類似相互作用の例としては、酵素グルコースオキシダーゼに対してその基質であるグルコースにビニル基などの重合性官能基を導入した化合物、例えばメタクリル酸グルコシルオキシエチル等、が挙げられる。
また、酵素−阻害剤間相互作用の例として、酵素トリプシンに対してその阻害剤であるパラアミノベンズアミジンにビニル基などの反応性官能基を導入した化合物等が挙げられる。
酵素−補酵素間相互作用の例として、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼに対してその補酵素であるピリドキサルリン酸にビニル基などの反応性官能基を導入した化合物等が挙げられる。
【００２４】
本発明において、蛋白質（Ｂ）と相互作用を有する物質を複合ポリマーに含有させると、正−負荷電間の静電的相互作用のみならず、酵素−基質間類似相互作用、酵素−阻害剤間相互作用等により蛋白質（Ｂ）特有の形精度の高い蛋白質の分子形状鋳型を形成することができる。
【００２５】
本発明において、蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーを用いて所定蛋白質（Ａ）を識別する方法としては、該蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーを液体クロマトグラフ用担体として使用する方法、水晶発振子の表面に固定化させてセンサーを構築して蛋白質（Ａ）の吸着による振動数の変化から識別する方法等の種々の方法がある。
【００２６】
一例として、蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーをクロマトグラフ担体として蛋白質（Ａ）を識別する方法について述べると、蛋白質（Ａ）を含む他種類の蛋白質混合物を種々の移動相の存在下で蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーを担体とした充填カラムに導入すると、蛋白質（Ａ）のみが効率よく分子形状鋳型を有するポリマー担体によって分離される。
この場合、移動相としては例えば水−アセトニトリル、水−アセトニトリル−酢酸、あるいはこれらにクエン酸ナトリウム−リン酸を加えたものなどが使用される。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
【００２８】
参考例１
［本発明に係る蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有する識別用試料（ポリマー）の作成］
所望する蛋白質としてオキシトシンを選び、この化学構造の一部と同じ化学構造をもつペプチドとしてプロリン−ロイシン−グリシン−NH２を選んだ。このペプチドに対する分子形状鋳型をもつ微粒子を作成するにおいて、実験の都合上、ＵＶ吸収基をもつアミノ酸としてのチロシンを結合したチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−NH２を以下に用いた。
鋳型分子として10mg（0.022ミリモル）のチロシン−プロリン−ロイシン−グリシン−NH２（YPLG),機能性単量体として0.019mL(0.22ミリモル）のメタクリル酸、架橋剤として1.3mL（6.6ミリモル）のエチレングリコールジメタクリレート、希釈剤として1.3mLのアセトニトリルを混合した。この場合、鋳型分子と機能性単量体との割合は１対１０で、機能性単量体と架橋剤との割合は１対３０に設定した。YPLGを完全に溶解するため、この混合液に少量の水（最終体積の3%）を加えた。重合開始剤として25mgの2,2−アゾビス（2,4−ジメチルバレロニトリル）をこの混合液に加えた後、超音波を照射しながら真空にして脱ガスを行い、３分間窒素ガスで置換した。その後、この混合液を16時間40℃に保つことにより重合した。
得られた塊状重合物を乳鉢で砕き、ふるいを通して0.020〜0.045mmの粒径範囲のポリマーを分別、収集した。そのポリマーをアセトニトリル、アセトニトリルと水との混合溶液（同体積%、純水、5%酢酸水溶液の順に３回洗浄を繰り返し、鋳型分子がその上澄み液中に含まれていないことを確認した。このようにして蛋白質識別用試料（ポリマー）を調製した。
【００２９】
参考例２
［参照用試料（ポリマー）の作成］
参考例１において、鋳型分子を加えない以外はまったく同様に行い、参照用試料（ポリマー）を調製した。
【００３０】
実施例１
参考例１及び２で得られた試料をそれぞれ液体クロマトグラフィ用のステンレスカラム（内径4.6mm、長さ10cm）に充填し、カラム温度40℃で、水（10%体積%）とアセトニトリル（90体積%）との混合溶液に酢酸を加えて（最終濃度1mM）調製した。混合溶液を移動相として毎分3mLの流速で流し、YPLGと蛋白質（オキシトシン）と比較用溶質アセチルチロシンアミド（Ac-Tyr-NH２）の分離分析実験を行い、ポリマー試料の蛋白質識別能をＵＶ検出器を用い、275nmにてのモニター法により評価した。その結果を表１に示す。
表１の結果からYPLGのI値が5.7（23.48/4.12）であることから、参考例１の識別用試料にはYPLGの分子形状鋳型ができていることが確認された。更に、オキシトシンのα値が1.63（23.48/14.39）であることから、この識別用試料はオキシトシンを識別する機能を有することが判った。
【００３１】
【表１】
0003543107.tif 000002
t :溶質の保持時間(分）
to：アセトン（ボイドマーカー）の保持時間（分）
ｋ：容積係数（＝（t-to)/to）
α：分離係数（＝（鋳型分子のｋ）／（他の溶質のｋ））
I ：鋳型効果（ｋ(i)／ｋ(n)）
【００３２】
実施例２
実施例１において、移動相の混合溶液中の水の割合を、5体積%、10体積%、20体積%に変えた以外は実施例１と同様にして実験を行った。その結果を表２に示す。
表２から、移動相の水の割合を増すといずれの溶質もｋ値が小さくなる結果が得られているが、これは識別用試料と溶質との間の水素結合が水により弱められたためと推定される。
【００３３】
【表２】
0003543107.tif 000003
【００３４】
実施例３
実施例２において、移動相の混合溶液中の酢酸の最終濃度を0.5mMから15mMまで変えた以外は実施例２と同様にして実験を行った。その結果を表３に示す。
表３の結果から、酢酸の濃度を増すとｋ値が減少することから識別用試料と溶質との間に静電的相互作用が働いていることが判る。また、酢酸の濃度が低い方がα値が大きくなりオキシトシンの識別機能が増大することが判った。
【００３５】
【表３】
0003543107.tif 000004
【００３６】
実施例４
実施例１において、移動相の混合溶液として、水を７０体積％、８０体積％、８５体積％、９０体積％含むアセトニトリル混合溶液にクエン酸ナトリウム−リン酸を加えて（最終ｐＨ５．２、イオン濃度２．５ｍＭ）に調製した混合溶液を用い毎分１ｍＬの流速で流す以外は実施例１と同様にして実験を行った。なお、比較用溶質としてはアセチルチロシンエチルエステル（Ａｃ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ）を用いた。その結果を表４に示す。
表４の結果から、移動相の緩衝液の量を増すにつれてｋ値は増大することから、識別用試料と溶質との間の疎水的相互作用が働いていることが判った。
【００３７】
【表４】
0003543107.tif 000005
【００３８】
実施例５
実施例４において、水を80体積%含むアセトニトリル混合溶液にクエン酸ナトリウム−リン酸を加えて（最終pH6.1でイオン強度を0.5mMから218mM）調製した混合溶液の移動相を用いる以外は実施例４と同様にして実験を行った。なお、イオン強度、68mMから218mMまでの溶液については、イオン強度18mMの溶液にNaClを所定量加えて調製した。その結果を表５に示す。
表５の結果から、イオン強度が増すと、YPLGとオキシトシンは保持時間が短かくなることから、これらの溶質と識別用試料との間にはイオン的相互作用が働いていることが判った。よって、移動相のイオン強度を調節することにより、YPLGとオキシトシンとの識別分離性を著しく高めることができる。
【００３９】
【表５】
0003543107.tif 000006
【００４０】
実施例６
実施例５において、イオン強度を2.5mMにしてpHを3.6から8.4まで変えた移動相を用いる以外は実施例５と同様にして実験を行った。その結果を表６に示す。表６から、移動相のpHを変えると分離係数α値が変化する。従って、移動相のpHを適宜に選定することにより、YPLGとオキシトシンが高度に識別分離できることが判った。
【００４１】
【表６】
0003543107.tif 000007
【００４２】
【発明の効果】
本発明の蛋白質の識別方法は、従来のように所定蛋白質（Ａ）の化学構造と同一構造すなわち所定蛋白質と同一物質の分子形状鋳型を作成することなく、その化学構造が所定蛋白質（Ａ）の一部好ましくは主要部と一致する蛋白質（Ｂ）の分子形状鋳型を有するポリマーを利用するだけで、所定の蛋白質（Ａ）を識別することが可能となる。
従って、本発明方法によれば、従来のように鋳型分子作成のための高度の技術力及び膨大な費用を講じることなく、所望する蛋白質（Ａ）を簡便な操作でしかも低廉なコストで選択的に識別することができる。
そして、本発明方法は、他種類の蛋白質混合物からの所定蛋白質（Ａ）の液体クロマトグラフ法による識別分離方法に適用できる他、所定蛋白質（Ａ）を検出するための検出方法、所定蛋白質（Ａ）のセンサ用官能物質としての応用方法、医薬、食品産業における有害蛋白質の吸着除去方法等に利用できる。
また、現在、ある種の低分子量蛋白質は、アミノ酸を逐次的に化学的に結合させるという方法により合成されているが、この化学的合成法においては、常に未反応物、副生成物あるいは原料等として複数の蛋白質が混在し、このためこれらの蛋白質と目的とする蛋白質との分離が必要とされ、これに多くの時間と費用が投入されている。本発明方法の識別法は、このような、未反応物、副生成物及び目的生成物等を含む蛋白質混合物からの所望の蛋白質の分離方法としても有効に機能する。