(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の不変領域およびヒト以外の哺乳動物種由来の可変領域を有する非ヒト／ヒトキメラ重鎖または軽鎖を含む免疫グロブリンの調製方法であって、
（ａ）非ヒト可変領域をコードする遺伝子およびヒト不変領域をコードする遺伝子が直接結合するよう作製されたキメラ重鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミド及び同様に作製されたキメラ軽鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミドによって大腸菌宿主細胞を同時形質転換し、
（ｂ）当該大腸菌宿主細胞を培養して宿主細胞培養物を調製し、
（ｃ）細胞溶解、次いで変性剤への溶解により不溶性粒子から成熟重鎖および軽鎖を取りだし、そして
（ｄ）前記成熟重鎖及び軽鎖から再構成して前記免疫グロブリンを得ることからなる調製方法。
【請求項２】
ヒト由来の不変領域およびヒト以外の哺乳動物種由来の可変領域を有する非ヒト／ヒトキメラ重鎖または軽鎖を含み、
（ａ）非ヒト可変領域をコードする遺伝子およびヒト不変領域をコードする遺伝子が直接結合するよう作製されたキメラ重鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミド及び同様に作製されたキメラ軽鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミドによって大腸菌宿主細胞を同時形質転換し、
（ｂ）当該大腸菌宿主細胞を培養して宿主細胞培養物を調製し、
（ｃ）細胞溶解、次いで変性剤への溶解により不溶性粒子から成熟重鎖および軽鎖を取りだし、そして
（ｄ）前記成熟重鎖及び軽鎖から再構成することによって調製される免疫グロブリン。
【請求項３】
非ヒト可変領域をコードする遺伝子およびヒト不変領域をコードする遺伝子が直接結合するよう作製されたキメラ重鎖をコードする融合遺伝子、又は非ヒト可変領域をコードする遺伝子およびヒト不変領域をコードする遺伝子が直接結合するよう作製されたキメラ軽鎖をコードする融合遺伝子を含有する大腸菌宿主用プラスミド。
【請求項４】
非ヒト可変領域をコードする遺伝子およびヒト不変領域をコードする遺伝子が直接結合するよう作製されたキメラ重鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミド及び同様に作製されたキメラ軽鎖をコードする融合遺伝子を含有するプラスミドによって同時形質転換された組換え大腸菌宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン産生の分野及び天然に生ずる免疫グロブリンアミノ酸配列の改変に関するものである。詳細には、本発明は、組換技術を使用して、脊椎動物系に通常見られるものと同類（ａｎａｌｏｇｏｕｓ）である双方の免疫グロブリンを産生すると共に、これら遺伝子改変技術を利用してキメラ型又はその他の改変型を作成することに関するものである。
【０００２】
Ａ．免疫グロブリン及び抗体
抗体は、外来蛋白質，糖蛋白質，細胞又はその他の抗原性外来物質による攻撃に反応して脊椎動物免疫系により産生される特異的な免疫グロブリンポリペプチドである。生物が外来細胞による侵入を克服し或るいは外来物質をその生物系から除去し得る一連の過程は、少なくとも部分的に理解されている。この過程の重要な部分は、特定の外来物質に対して特異的に結合する抗体の製造である。特定抗原に対するこの種のポリペプチドの結合特異性は極めて精巧なものであり、個々の脊椎動物により発生し得る特異性の多様性は著しく複雑で変化に富むものである。多数の抗原が反応を誘発し得るが、それらの反応は殆んどそれを誘発した特定抗原のみに対するものである。
【０００３】
免疫グロブリンは、上記したような抗体と抗原特異性を欠如した同類の蛋白物質との両者を包含する。後者はリンパ系では低レベルで産生されるが骨髄腫では高レベルで産生される。
【０００４】
Ａ．１．起源及び用途
現在、脊椎動物抗体の２種の主な起源が利用されている：即ち、哺乳動物Ｂリンパ球によるｉｎ  ｓｉｔｕ生成及びＢ細胞ハイブリッドによる細胞培養物（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における生成である。抗体は未熟のＢリンパ球がプラズマ細胞（形質細胞）へ分化する結果としてｉｎ  ｓｉｔｕで生成され、これは特異抗原による刺激に反応して生ずる。未分化のＢ細胞では、免疫グロブリン鎖上の種々の領域をコードしているＤＮＡ部分はゲノムＤＮＡ内で隔てられて存在している。これら配列は転写前に順次再配列される。この過程の概略はＧｏｕｇｈ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：２０３（１９８１）に記載されている。得られる再配列ゲノムは、成熟Ｂリンパ球内で発現し所望の抗体を産生することができる。然しながら、単一の抗原のみが特定哺乳動物の免疫系圏内に入る場合でさえ、均一な抗体群が生じるわけではない。特定抗原に対するｉｎ  ｓｉｔｕでの免疫反応は、抗原に存在する各種決定因子に対する反応のモザイクにより規定される。単一群（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のＢ細胞が相同抗体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の各サブセットに寄与し、従ってｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体の生成は「ポリクローナル」である。
【０００５】
この限られてはいるが固有の異質性は、多くの特定の場合に、ハイブリドーマ技術を用いて「モノクローナル」抗体を生成させることにより克服された（Ｋｏｈｌｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１（１９７６））。この方法に於いては、抗原を注射した哺乳動物に由来する脾細胞又はリンパ球を腫瘍細胞系（セルライン）と融合させてハイブリッド細胞即ち「ハイブリドーマ」を作製する。これらハイブリッド細胞は、不滅（永久的に増殖可能）であると共にＢ細胞の遺伝学的にコードされた抗体を産生することができる。このように生成されたハイブリッドを選択、希釈及び再増殖により遺伝的に単一の株に分離すると、各株は単一の遺伝系を示す。従って、これらは所望の抗原に対し免疫反応性の抗体を産生し、これら抗体は同質であることが確証され、その純粋な遺伝起源（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｒｅｎｔａｇｅ）に基いて「モノクローナル」と呼ばれる。細胞融合技術は現在まで主としてネズミ系の融合に集中しているが、ヒト−ヒトハイブリドーマ（Ｌ．Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５４２９（１９８０））、並びにヒト−ネズミハイブリドーマ（Ｊ．Ｓｃｈｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，同上，７７：６８４１（１９８０））及びその他数種の異種間ハイブリッド組合せも同様に作成されている。或いは抗体産生一次Ｂ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ）が、ウィルスＤＮＡでの形質転換によるｉｎ  ｖｉｔｒｏで永久株化されている。
【０００６】
ポリクローナル又は特に好ましくはモノクローナル抗体は、本発明の抗体と同様な多くの有用な性質を有する。例えばこれらは、Ｂ細胞ゲノムの初期プロセッシングを誘発する抗原の存在を、この抗原−抗体反応を適当な検出技術、例えば検定（ＲＩＡ，ＥＭＩＴ及びＥＬＩＳＡ）を可能にする放射性同位元素又は酵素による標識と組合せることによって、検出するための特異的免疫沈澱試薬として使用することができる。このように、抗体は多くの抗原物質に対する免疫診断試験の基礎となる。他の重要な用途において、抗体は問題とする抗原を含有する物質又は有機体による攻撃を受けた対象被検体に直接注射して、この攻撃に対処することができる。この方法は現在その実験段階にあるが、その有力性は明らかである。第３に、全身診断及び処置も可能となる。何故なら、注射された抗体は特定の標的病気組織に指向させられ、従って、これらと共に適当な標識を運ぶことにより病気の存在を決定し、或いは適当な薬剤を運ぶことにより病気組織を攻撃するために使用することができる。
【０００７】
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、理論的には上記したように有効であり且つその特異性によりポリクローナル抗体よりも明らかに好適であるが、或る種の欠点を有する。第１に、これらはハイブリドーマ（従って、哺乳動物）起源の他の蛋白質及び細胞物質で汚染される傾向がある。これらの細胞は更に、発癌性を高め、発生し又は媒介し得る物質、特に核酸断片を含有し、更に蛋白質断片も含有する。第２に、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ系は不安定な傾向があり、産生される抗体の構造が変化したり、抗体産生が完全に停止したりする（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：２１９７（１９８０）；Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：７９３（１９７９））。細胞系ゲノムは、現在その性質が未知であるような刺激に反応してそれ自体で変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）すると思われ、その結果誤った配列を産生し得る。第３に、ハイブリドーマ及びＢ細胞は共に或る種の抗体をグリコシル化型で産生することが避けられず（Ｆ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０：６５３（１９７１））、これは或る場合には望ましくないものである。第４に、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生はいずれも比較的高価である。第５に、恐らく最も重要なことであるが、現在の技術（ハイブリドーマ又はＢ細胞反応）による産生では、成熟Ｂ細胞由来抗原に反応してｉｎ  ｓｉｔｕで通常誘発されるものよりも有効な構成成分を有する抗体を産生すべくゲノムを操作することができない。本発明の抗体は上記の欠点をもたず、更に優秀な分子を提供する機会を与える。
【０００８】
抗体特異性を欠如している免疫グロブリンでさえ、抗体自身よりは小さい範囲の潜在的用途であるが有用である。現在まで理解されたこの種の免疫グロブリンの用途としては、グロブリン関連貧血に対する蛋白質補充治療がある。この意味で、抗原に結合し得ないことは実際に有益である。何故ならこれら蛋白質の治療価値はこのような機能により阻害されるからである。現在、この種の非特異性抗体は、適当に誘発された骨髄腫細胞培養物からのみ少量で誘導することができる。本発明は、それに代わる一層経済的な起源を提供する。更に、本発明は四元体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）の４つの鎖を別々に処理することにより特異性を消却する機会を与える。
【０００９】
Ａ．２．一般的構造特性
脊椎動物系に於ける基本的な免疫グロブリン構造単位は現在充分に理解されている（Ｇ．Ｍ．Ｅｄｅｌｍａｎ，  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：５（１９７１））。これらの単位は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一のＬポリペプチド鎖と分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一なＨ鎖とから構成されている。これら４つの鎖はジスルフィド結合により「Ｙ」形状で結合され、ここでＬ鎖は、図１に示すように、Ｙの口部から出発し分岐領域を通って連続するＨ鎖を包囲する。「枝」部分は、図に示したようにＦａｂ領域と呼ばれる。Ｈ鎖はγ，μ，α，δ又はεとして更にこれらのいくつかのサブクラスに分類され、この鎖の性質はこれが長い不変領域を有するためＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ又はＩｇＥとしての抗体の「クラス」を決定する。Ｌ鎖はκ又はλとして分類される。各Ｈ鎖のクラスはκ又はλのいずれのＬ鎖とも組合せて作成することができる。Ｌ鎖とＨ鎖とは互いに共有結合され、免疫グロブリンがハイブリドーマ又はＢ細胞により生成される際に２つのＨ鎖の「テイル（尾部）」部分は共有ジスルフィド結合により互いに結合される。然しながら、正確な配置に於いて、鎖の非共有的会合が起こっても、集合体は抗原との反応が同様に可能であり、或いは非特異的免疫グロブリンとして蛋白質補充に有用である。
【００１０】
アミノ酸配列は、Ｙの頂部のＮ−末端から各鎖の底部のＣ−末端まで延在する。Ｎ−末端は、抗体を誘発した抗原に対し特異的で且つ長さ約１００個のアミノ酸から成る可変領域であり、この可変領域はＬ鎖とＨ鎖との間及び抗体毎に僅かの変動がある。各鎖の可変領域は、鎖の残余の長さに亘って延在する不変領域と結合している。Ｌ鎖とＨ鎖の結合は、ゲノムレベルで見て、約１２個のアミノ酸をコードするＬ鎖遺伝子内の「Ｊ」領域として、並びに両方で約２５個のアミノ酸をコードするＨ鎖遺伝子内の「Ｄ」領域と「Ｊ」領域との組合せとして、現在知られている結合配列を介して生ずるものと思われる。
【００１１】
鎖の残余の部分は不変領域と呼ばれ、特定のクラス内では、抗体の特異性（即ち、これを誘発する抗原）と共に変化しない。
上記したように、５種の主要な公知クラスの不変領域が存在し、これらは免疫グロブリン分子のクラス（Ｈ鎖不変領域のγ，μ，α，δ及びεに対応するＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥ）を決定する。不変領域もしくはクラスは、補体の活性化（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第２版，ｐ．４１３−４３６，  Ｈｏｌｔ，  Ｒｉｎｅｈａｒｔ，  Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９７６））及びその他の細胞反応（Ｄ．Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．１−１８，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ（１９８０）；Ｓ．Ｋｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４８：１８７（１９８３））を含め、抗体のその後のエフェクター機能を決定する一方、可変領域はこれが反応する抗原を決定する。
【００１２】
Ｂ．組換ＤＮＡ技術
組換ＤＮＡ技術は、遺伝子配列のクローニング及び発現に関する技術が集積されて充分高度な状態に達している。各種のＤＮＡ配列をかなり容易に組換えて、形質転換微生物及び細胞培養物に於いて異種蛋白質産物を産生し得る新規なＤＮＡ配列を創成することができる。ＤＮＡの各種の平滑末端断片又は「粘着（付着性）」末端断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合して発現ベクターを産生させ且つ生物を形質転換させる一般的手段及び方法が現在使用できる。
【００１３】
必須要素（即ち、複製のオリジン、１種もしくはそれ以上の表現型選択特性、発現制御配列、異種遺伝子挿入物（インサート））及び残余のベクターのＤＮＡ組換えは、一般に宿主細胞の外部で行なわれる。得られる複製可能な組換発現ベクター即ちプラスミドを形質転換により細胞中へ導入し、多量の組換ベヒクルを形質転換体の増殖によって得る。コードされているＤＮＡメッセージの転写及び翻訳を支配する部分に関し、遺伝子が適正に挿入された場合、得られる発現ベクターは挿入遺伝子がコードするポリプペチド配列を産生するのに有用であり、この過程を「発現」と呼ぶ。得られる産物は、必要に応じ、宿主細胞の溶菌及び適当な精製による他の蛋白質からの産物の回収によって得ることができる。
【００１４】
実際上、組換ＤＮＡ技術の使用は、全く異種のポリプペチドを発現することができ（所謂直接的発現）、或いは同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ポリプペチドのアミノ酸配列の一部に融合した異種ポリプペチドを発現することもできる。後者の場合、目的とする生物活性産物は、しばしばそれが細胞外環境で開裂されるまで融合した同種／異種ポリプペチド内で生物不活性にされている。
【００１５】
遺伝学及び細胞生理学の研究のための細胞もしくは組織培養物並びに微生物系を維持する技術は充分確立されている。単離した細胞から順次トランスファーすることにより作成された永久細胞系を維持するための手段及び方法が使用できる。研究に使用する目的には、この種の細胞系は液体媒体中の個体支持体上に維持され、或いは支持栄養源を含有する懸濁物中での増殖により維持される。大量生産への規模拡大は、単に機械的問題を提起するだけと思われる。
【００１６】
本発明は、適当な宿主細胞培養物を用いる組換技術により生成される抗体及び非特異性免疫グロブリン（ＮＳＩ）に関するものである。これらの抗体及びＮＳＩは、純粋な「モノクローナル」形態で容易に製造することができる。これらをゲノムレベルで処理して互いに異なる種からの相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を引き出す変種のキメラを生成することができる。更に、４つの鎖全部を同じ細胞で生成する必要はないので、蛋白質レベルで処理することもできる。従って、多くの「タイプ」の免疫グロブリンが本発明に包含される。
【００１７】
第１に、哺乳動物Ｂ細胞によりｉｎ  ｓｉｔｕで又は適当な永続性腫瘍系と融合したＢ細胞、即ちハイブリドーマにより産生される天然に存在する抗体のアミノ酸配列に類似する免疫グロブリン特に抗体は、組換技術を用いて産生される。第２に、本発明方法により、従来性質が互いに関連するとは思われていなかったポリプペチドから成る免疫グロブリンが産生され、本発明はこのような免疫グロブリンに係る。この種の再編成は、２種以上の抗原を結合し得る「ハイブリッド」抗体を産生するのに特に有用であり、且つ異なる起源のＨ鎖とＬ鎖とが実質的に特異性を減弱化する「複合」免疫グロブリンを産生するのに有用である。第３に、遺伝子操作によって、例えば可変領域は１種の哺乳動物モデル系からのアミノ酸配列に対応し、不変領域は他の哺乳動物モデル系のアミノ酸配列に類似するような「キメラ」抗体を生成することができる。更に、これら２種の類似配列は、異なる種から誘導することができる。第４に、遺伝子操作により、特異性及びその他の特性が向上した「改変」抗体を生成することもできる。
【００１８】
２つの他のタイプの免疫グロブリン様の部分が産生され得る：即ち、標的組織に対するホーミングキャリア（ｈｏｍｉｎｇ  ｃａｒｒｉｅｒ）として有用な「単一価（ｕｎｉｖａｌｅｎｔ）」抗体及び免疫グロブリン分子の「Ｆａｂ」領域、即ち「Ｙ」の枝のみを含む「Ｆａｂ蛋白質」である。これらの単一価の抗体及びＦａｂ断片も「哺乳動物性（哺乳動物由来）」とすることができ、即ち哺乳動物由来のアミノ酸配列に類似する。例えば、不変配列パターン及び可変配列パターンが異なる起源であるような哺乳動物鎖もしくはキメラの新規な組立ても可能である。最後に、組換技術により産生されるＬ鎖もしくはＨ鎖のみ、或いはその部分のいずれも本発明に包含され、哺乳動物性であってもキメラであってもよい。
【００１９】
他の面に於いて、本発明は、上記のＮＳＩ，抗体及びその部分をコードするＤＮＡ並びに適当な宿主細胞に於いてこの種の免疫グロブリンの産生を行ない得る発現ベクター又はプラスミドに向けられる。本発明は、これらベクターにより形質転換して得られる宿主細胞及び細胞培養物も包含する。最後に本発明はこれらＮＳＩ及び抗体の製造方法並びにＤＮＡ配列、プラスミド及びそれらによる形質転換細胞に向けられる。
【００２０】
詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中に使用する「抗体」という用語は、特異的免疫反応活性を有する四元体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）又はその集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を意味し、通常図１の「Ｙ」形状に合体されたＬ鎖とＨ鎖とから成り、これら連鎖の間に共有結合を有し又は持たない。「免疫グロブリン」という用語は、特異的免疫反応活性があるかないかに拘らず、この種の集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）又はその一部を意味する。「非特異的免疫グロブリン」（「ＮＳＩ」）という用語は、特異性を持たない免疫グロブリン、即ち抗体でないものを意味する。
【００２１】
「哺乳動物抗体」という用語は、鎖のアミノ酸配列がｉｎ  ｓｉｔｕで又はハイブリドーマに於いて哺乳動物系により産生される抗体に見られるような配列と相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である抗体を意味する。これらの抗体は、不純な形態であるが慣用の系においても生成され得るような抗体に類似する。
【００２２】
「ハイブリッド抗体」という用語は、鎖が個別に対応の哺乳動物抗体の鎖と相同である新規な集合体を示し、従って２つの異なる抗原が四元体により沈澱し得るような抗体を意味する。ハイブリッド抗体に於いて一方のＨ鎖とＬ鎖との対は１つの抗原に対して生じた抗体と相同であり、Ｈ鎖とＬ鎖との他方の対は他の抗原に対して生じた抗体と相同である。この結果、「二価（ｄｅｖａｌｅｎｃｅ）」の性質が生じ、即ち２つの抗原に同時に結合する能力が生ずる。勿論、この種のハイブリッドは下記するようなキメラ鎖を用いて生成することもできる。
【００２３】
「複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）」免疫グロブリンという用語は、Ｈ鎖とＬ鎖とが異なる種の起源又は特異性のものに類似し、従って得られたものが非特異的免疫グロブリン（ＮＳＩ）になると思われ、即ち抗体特性を欠如すると思われるようなものを意味する。
【００２４】
「キメラ抗体」という用語は、Ｈ鎖とＬ鎖との各アミノ酸配列の１部が特定種に由来する又は特定クラスに属する抗体の対応配列と相同であり、且つ鎖の残部が他の対応配列と相同であるような抗体を意味する。典型的には、これらキメラ抗体に於いて、Ｌ鎖とＨ鎖との両者の可変領域は哺乳動物の１種に由来する抗体の可変領域に類似し、不変部分は他の哺乳動物に由来する抗体の配列と相同である。この種のキメラ型に対する１つの明らかな利点は、例えば容易に入手し得るハイブリドーマ又はヒト以外の宿主生物由来Ｂ細胞を、例えばヒト細胞調製物に由来する不変領域と組合せて使用することにより、現在公知の起源から可変領域を便利に誘導し得ることである。可変領域は製造が容易であるという利点を有し且つ特異性はその起源により影響されないが、不変領域がヒト由来であるために、抗体を注射した場合、ヒト以外の起源に由来する不変領域よりもヒト被験者に対する免疫反応を誘発しにくいと思われる。
【００２５】
然しながら、この定義はこの特定例に限定されない。即ち、Ｈ鎖もしくはＬ鎖の一方又は双方が異なる起源の抗体の配列に類似した配列の組合せから成る任意の抗体を包含し、これらの起源は異なるクラスであっても、異なる抗原反応であっても、或いは異なる種の起源があってもよく、融合点（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）が可変／不変領域の境界に存在するかどうかに関係ない。従って、不変領域も可変領域も公知の抗体配列に類似しないような抗体を産生することができる。このようにして、例えば可変領域が特定抗原に対しより高度の特異親和性を有するか、又は不変領域が向上した補体固定反応（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）を誘発させ得るような抗体を作成することができ、或いは特定の不変領域が有する性質を更に改善することができる。
【００２６】
「改変（変容）抗体（ａｌｔｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、アミノ酸配列が哺乳動物の抗体又はその他の脊椎動物の抗体とは変化している抗体を意味する。本発明に対して組換ＤＮＡ技術が適切であるため、天然抗体に見られるアミノ酸の配列に制限する必要はない。抗体を再設計して所望の特性を得ることができる。可能な変化は数多く、僅か１個もしくは数個のアミノ酸の変化から例えば不変領域の完全な再設計に至る範囲とすることができる。一般に、不変領域に於ける変化は例えば補体固定、膜との相互作用及びその他の作用機能のような細胞処理特性（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を改良させるために行なわれる。可変領域に於ける変化は、抗原結合特性を改良するために行なわれる。更に、抗体を工学的に処理して「魔法玉（ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔ）」概念に従って毒性剤（ｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）を特異的に放出する役に立てることもできる。改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は標準的組換技術により行なうことができ、又オリゴヌクレオチド−指向突然変異誘発技術（ａｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によっても行なうことができる（Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：６４０９（１９８２））。
【００２７】
「単一価の抗体（ｕｎｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、第２のＨ鎖のＦｃ（もしくはステム）領域に結合したＨ鎖／Ｌ鎖ダイマーから成る集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を意味する。この種の抗体は抗原に対し特異的であるが、特異抗原表面を有する組織を標的とする所望の性質を更に有し、その抗原有効性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）を損うことがなく、即ち抗原変調（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）がない。この点に関する単一価の抗体の現象及び性質はＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９５：７１２（１９８２）に示されている。従来、単一価の抗体は蛋白質分解により形成されていた。
【００２８】
「Ｆａｂ」領域とは、Ｈ鎖のＹ枝部分から成る配列に対し、及び全体的にＬ鎖に対しほぼ均等又は同様（ａｎａｌｏｇｏｕｓ）であり且つ全体（集合体）として抗体活性を有することが示されている鎖の部分を意味する。「Ｆａｂ蛋白質」（この蛋白質は本発明の一面を構成する）は、１つのＨ鎖と１つのＬ鎖との集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）（一般にＦａｂ’として知られる）並びに抗体Ｙの２つの枝部分に対応する四元体（一般にＦ（ａｂ）２として知られる）を包含し、これらはいずれも共有的に又は非共有的に集合される。但し、この集合は特定抗原又は抗原群（ａｎｔｉｇｅｎ  ｆａｍｉｌｙ）と選択的に反応することができる。Ｆａｂ抗体は単一価の抗体と同様に、従来蛋白質分解により生成されており、標的組織に対する抗原変調を誘発しないという性質を有する。然しながら、これらは「エフェクター」Ｆｃ部分を欠如するので例えばマクロファージによる標的細胞の溶菌を行なうことができない。
【００２９】
「Ｆａｂ蛋白質」は、一般的用語「抗体」もしくは「免疫グロブリン」と同様に本発明の定義に従う同様なサブセットを有する。即ち、「哺乳動物」Ｆａｂ蛋白質、「ハイブリッド」Ｆａｂ蛋白質、「キメラ」Ｆａｂ及び「改変（ａｌｔｅｒｅｄ）」Ｆａｂ蛋白質が種々のタイプの抗体につき上記に示した対応の定義と同様に規定される。
【００３０】
勿論、個々のＨ鎖もしくはＬ鎖は、上記に従って「哺乳動物」、「キメラ」又は「改変」とすることができる。発明の詳細な説明から明らかとなるように、開示技術を使用して特定的に定義したもの以外に、例えば、キメラＬ鎖及び哺乳動物Ｈ鎖を含有するハイブリッド抗体、哺乳動物Ｌ鎖と共にＨ鎖のキメラＦａｂ蛋白質を含有するハイブリッドＦａｂ蛋白質、等のような４ペプチド鎖の集合体のその他の組合せを製造することができる。
【００３１】
「発現ベクター」という用語は、そこに含有されるＤＮＡ配列を発現し得るベクターを包含し、即ちコード配列は発現を行ない得るその他の配列に有効に発現するように結合される。これは必ずしも明確に規定されないが、これらの発現ベクターは宿主生物に於いてエピソームとして、又は染色体ＤＮＡの一体的部分として複製し得るものでなければならないことを意味する。明らかに、複製可能性が欠如することは、有効に機能し得なくなる。有効な発現ベクターの有用であるが必ずしも必要でない要素は、マーカーコード配列であり、即ち容易に細胞を固定し得る蛋白質を含有する細胞の表現型特性（たとえばテトラサイクリン耐性）をもたらすような蛋白質をコードする配列である。要するに、「発現ベクター」には機能的定義が与えられ、特定の含有ＤＮＡコードを発現し得る全てのＤＮＡ配列がこの用語に包含され、同様に特定の配列に適用される。現在この種のベクターはしばしばプラスミドの形態であるので、「プラスミド」と「発現ベクター」とはしばしば互換的に使用される。然しながら、本発明は均等な機能を有し且つ時と共に当業界で公知となり得るような他の形態の発現ベクターをも包含することを意図する。
【００３２】
「組換宿主細胞」という用語は、組換ＤＮＡ技術を用いて作成されたベクターにより形質転換された細胞を意味する。本明細書に定義したように、組換宿主細胞により産生される抗体又はその改変物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、この形態転換のため未形質転換宿主で産生されるような少量でなく、より一般的には検出量以下のものでない。
【００３３】
組換宿主から抗体を単離する方法の説明に於いて、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、特記しない限り抗体の起源を示すために互換的に使用される。換言すれば、「細胞」からの抗体の回収は、遠心分離された全細胞からの回収又は培地と懸濁細胞との両者を含有する細胞培養物からの回収のいずれをも意味する。
【００３４】
Ｂ．宿主細胞培養物及びベクター
本明細書中に開示したベクター及び方法は、広範囲の原核生物及び真核生物に亘る宿主細胞に使用するのに適している。
【００３５】
一般的には勿論、本発明に有用なベクターを作成する際、ＤＮＡ配列をクローン化（クローニング）するには原核生物が好適である。例えばＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１４４６）が特に有用である。使用し得るその他の微生物菌株はＥ．ｃｏｌｉ菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉＢ及びＥ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）を包含する。これらの例は、勿論例示であって限定を意味するものでない。
【００３６】
発現用にも原核生物を使用することができる。上記の菌株並びにＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ−，λ−，原始栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）、桿菌例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ、及び他の腸内細菌例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ及び各種のＰｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ種を使用することができる。
【００３７】
一般に、レプリコン及び制御配列を含有し宿主細胞に適合性の種由来のプラスミドベクターを、これら宿主と関連して使用する。通常、ベクターは複製部位並びに形質転換細胞に表現型選択を与え得るマーカー配列を有する。例えばＥ．ｃｏｌｉは、典型的にはｐＢＲ３２２即ちＥ．ｃｏｌｉ種から得られるプラスミド（Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ２：９５（１９７７））を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有し、従って形質転換細胞を同定するための便利な手段を与える。ｐＢＲ３２２プラスミド又はその他の微生物プラスミドは、又、微生物がそれ自身の蛋白質を発現するように使用し得るプロモーターを含有し又は含有するよう改変されなければならない。組換ＤＮＡの作成に最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及び乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２７５：６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：１０５６（１９７７）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））並びにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰＯ出願公開第００３６７７６号）を包含する。これらが特に一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターも見出され且つ利用されており、これらヌクレオチド配列に関する詳細が公開されており、当業者はこれらをプラスミドベクターと機能的に結合させることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０：２６９（１９８０））。
【００３８】
原核生物の他に、酵母培養物のような真核微生物も使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ即ち一般的なパン酵母が真核微生物として最も一般的に使用されるが、他の多くの菌株も一般的に使用し得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに於ける発現については例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは既にトリプトファン中で増殖する能力を欠如した酵母の突然変異菌株、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６即ちＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））に対し選択マーカーを与えるｔｒｐ１遺伝子を含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてｔｒｐ１欠陥（ｌｅｓｉｏｎ）が存在するため、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換の検出用に有効な環境が得られる。
【００３９】
酵母ベクターに於ける適当なプロモーター配列は３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０））又はその他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｃ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８））例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼに対するプロモーターを包含する。適する発現プラスミドを作成する際、これら遺伝子に関連する停止配列も、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び停止を行なうように発現させたり配列の発現ベクター３’中へ結合させる。増殖条件により制御される転写の付加的利点を更に有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素並びに上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラクトースとの利用に関する酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ，上記）に対するプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーターと複製のオリジンと停止配列とを有するプラスミドベクターが適している。
【００４０】
微生物の他に、多細胞生物由来細胞の培養物も宿主として使用することができる。原則として、任意のこの種の細胞培養物は、脊椎動物由来であっても、或いは無脊椎動物の培養物であっても使用可能である。然しながら、最も興味があるものは脊椎動物細胞であり、脊椎動物細胞の培養（組織培養）による増殖が、近年日常の手法となった（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３））。この種の有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ細胞及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系並びにＷ１３８，ＢＨＫ，ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫ細胞系である。この種の細胞に対する発現ベクターは一般に、（必要に応じ）複製のオリジン、発現すべき遺伝子の前方に位置するプロモーター並びに任意の必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写停止配列を含む。
【００４１】
哺乳動物細胞に於いて使用するには、発現ベクターに対する制御機能がしばしばウィルス性材料により与えられる。例えば一般的に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２及び特にしばしばサルウィルス４０（ＳＶ４０）から得られる。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターが特に有用である。何故なら、これら両者は複製のＳＶ４０ウィルスオリジンをも含有する断片としてウィルスから容易に得られるからである。（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８），これを引用して本明細書に包含する）。より小さい又はより大きいＳＶ４０断片も使用し得るが、但しＨｉｎｄＩＩＩから複製のウィルスオリジン内に存在するＢｇｌＩ部位まで延びる約２５０ｂｐ配列が含まれることが必要である。更に一般に所望の遺伝子配列に関連するプロモーター又は制御配列を使用することもでき、且つ使用するのがしばしば望ましい。但し、この種の制御配列は、宿主細胞系に対し適合性であるものとする。
【００４２】
複製のオリジンは、例えばＳＶ４０又はその他のウィルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）源から得られるような外来オリジンを含むようにベクターを作成して供給するか、或いは宿主細胞の染色体複製メカニズムにより供給することができる。ベクターが宿主細胞の染色体中に組み込まれれば、これでしばしば充分である。
【００４３】
本発明を好適具体例につき本明細書中に説明するが、ここに記載したような宿主細胞、ベクター及び発現系のみに限定されるものでないことが了解されよう。
【００４４】
Ｃ．使用方法
Ｃ．１．形質転換：
強固な細胞壁バリヤーを持たない細胞を宿主細胞として使用する場合、トリンスフェクションはＧｒａｈａｍ及びＶａｎ  ｄｅｒ  ＥｂによりＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６（１９７８）に記載された燐酸カルシウム沈澱法により行なわれる。然しながら、例えば核注入又はプロトプラスト融合によるような細胞中へのＤＮＡの他の導入法も使用することができる。
【００４５】
原核細胞又は実質の細胞壁構造を含有する細胞を使用する場合、好適なトランスフェクション方法はＦ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）に記載されたように塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【００４６】
Ｃ．２．ベクターの作成
所望のコード配列と制御配列とを含有する適するベクターの作成は、標準的結合技術を使用する。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、適当に処理し且つ所望の形態に再結合して、所要のプラスミドを生成する。使用する方法は、ＤＮＡ源又は使用する宿主に依存しない。
【００４７】
開裂は、適当な緩衝液中で１種又はそれ以上の制限酵素により処理して行なわれる。一般に、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ断片を約２０μｌの緩衝溶液中で約１ユニットの酵素と共に使用する（特定制限酵素に対する適当な緩衝液及び基質の量は製造業者により特定されている）。３７℃にて約１時間インキュベーションする。培養後、フェノール及びクロロホルムでの抽出により蛋白質を除去し、且つ核酸をエタノールでの沈澱により水性フラクションから回収する。
【００４８】
平滑末端が必要ならば、この調製物を１０ユニットのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）と共に１５℃にて１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱する。
【００４９】
開裂した断片のサイズ分画はＤ．Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によりＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）（引用して本明細書に包含する）に記載された６％ポリアクリルアミドゲルを用いて行なわれる。
【００５０】
結合には、正確な整合性を与えるために適当に末端処理した所望の成分のほぼ等モル量を０．５μｇのＤＮＡ当り約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する。（開裂したベクターを成分として使用する場合、細菌のアルカリ性ホスファターゼで予備処理することにより開裂ベクターの再結合を防止するのが有用である。）
【００５１】
下記の実施例に於いて、プラスミド作成に対する正確な結合は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１４４６）を結合混合物で形質転換することにより確認される。成功した形質転換体は、プラスミドの作成様式に応じてアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性により選択した。次いで、形質転換体からのプラスミドを調製し、制限分析し及び／又はＭｅｓｓｉｎｇ等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１））又はＭａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８０））によって配列決定した。
【００５２】
Ｄ．方法の概略
Ｄ．１．哺乳動物抗体
本発明の一部を構成し且つその方法により製造される第１のタイプの抗体は、「哺乳動物抗体」であり、Ｈ鎖とＬ鎖とが成熟哺乳動物Ｂリンパ球によりｉｎ  ｓｉｔｕで、或いはハイブリドーマ培養物の部分として永久株化細胞と融合した場合に産生される抗体のアミノ酸配列に類似するものである。要するに、これらの抗体は次のようにして産生される。
【００５３】
Ｈ鎖もしくはＬ鎖をコードするメッセンジャーＲＮＡを適当な起源、即ち成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ培養物から単離する。その際ＲＮＡ単離の標準技術及びポリ−Ａ  ｍＲＮＡを分離するためのオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーを使用する。更にポリ−Ａ  ｍＲＮＡを分画して、場合により所望抗体のＬ鎖もしくはＨ鎖に於けるアミノ酸配列をコードするのに充分なサイズの配列を得る。
【００５４】
次いで、所望のｃＤＮＡに特徴的である適当なプライマー好ましくは核酸配列を用いて、ｍＲＮＡの混合物からｃＤＮＡライブラリーを作成する。配列が公知であれば、この種のプライマーを抗体のアミノ酸配列に基いて推定し且つ合成することができる。或いは、所望の抗体を産生する細胞系からの未分画ポリ−Ａ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡ又はポリ−ｄＴを使用することもできる。得られたｃＤＮＡを必要に応じポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、次いで適当な制限酵素（例えばＰｓｔＩ）により開裂し且つｄＧ残部で延長したｐＢＲ３２２又はその他の適当なクローニングベクターとアニールするために例えばｄＣ残基で延長する。勿論、他のテイル及び他のクローニングベクター残部を用いてｃＤＮＡ含有クローニングベクターを形成するその他の手段も使用し得るが、前記のものが標準的且つ好適な選択である。適する宿主細胞菌株、典型的にはＥ．ｃｏｌｉをアニールしたクローニングベクターで形質転換し、得られた形質転換体を例えばテトラサイクリン耐性により、或いはクローニングベクタープラスミド上に存在する他の表現型特性により同定する。
【００５５】
成功した形質転換体を釣り上げて、マイクロタイター皿又はその他の支持体に移し、更に増殖及び保存する。次いで、これら増殖する培養物のニトロセルロースフィルターのプリント物（ｉｍｐｒｉｎｔ）をｃＤＮＡ中の所望配列に相補的であることが知られた塩基を含有する適当なヌクレオチド配列でプローブする。数種のプローブを使用することができ、好ましくはＡＴＰ３２でキナーゼ処理することにより標識した合成単一鎖ＤＮＡ配列を使用する。ニトロセルロースフィルターに固定された細胞を溶菌し、ＤＮＡを変性し、固定した後にキナーゼ処理したプローブと反応させる。うまくハイブリダイズするクローンをフォトプレートへ接触させて検出し、プラスミドを増殖するコロニーから単離し、遺伝子の所望部分が存在することを証明するために当業界で知られた手段により配列決定する。
【００５６】
所望の遺伝子断片を切断処理して、適当な発現ベクター中へ挿入した場合の制御セグメントとの適当な解読枠を確保する。典型的には、ヌクレオチドを５’末端へ付加して開始信号と適当に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位とを含むようにする。
【００５７】
次いで、適当に処理した遺伝子配列を、遺伝子と共に解読枠にあるプロモーターを含有し且つ使用する宿主に対し適合性であるベクター中に配置する。例えば米国特許出願第３０７４７３号、第２９１８９２号及び第３０５６５７号（ＥＰＯ特許公開第００３６７７６号、第００４８９７０号及び第００５１８７３号）明細書に記載されたような多数のプラスミドは、適当なプロモーターと制御配列とリボソーム結合部位と転写停止部位と便利なマーカーとを既に含有する。
【００５８】
本発明に於いては、Ｌ鎖をコードする遺伝子及びＨ鎖をコードする遺伝子を上記の手法により別々に回収する。即ち、これらは、それぞれ適当なプロモーター及び翻訳制御の下にある限り、別々の発現プラスミド中へ挿入することができ、或いは一緒に同じプラスミドに挿入することができる。
【００５９】
次いで、上記のように作成した発現ベクターを使用して適当な細胞を形質転換する。Ｌ鎖及びＨ鎖を同一種又は異なる種の別々の細胞培養物中に形質転換することができ、Ｌ鎖及びＨ鎖に対する別々のプラスミドを使用して単一の細胞培養物を同時形質転換することができ、或いは両遺伝子を含有し且つＬ鎖とＨ鎖との両者に対する遺伝子を発現し得る単一の発現プラスミドを単一の細胞培養物に形質転換することができる。
【００６０】
上記３つの選択のどれを選択するかに関係なく、細胞を所望蛋白質の産生に適する条件下で増殖させる。この種の条件は、主として所望蛋白質の性質ではなく、発現ベクター中に使用されるプロモーター及び制御系のタイプにより支配される。次いで、このように産生された蛋白質を当業界で公知の方法により細胞培養物から回収するが、方法の選択は必然的に蛋白質の発現された形態に依存する。例えばＥ．ｃｏｌｉで発現された成熟異種蛋白質を不溶性粒子として細胞内に沈着させるのが一般的であり、これは回収を可能にするための細胞の溶菌と変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）中への可溶化とを必要とする。他方、酵母及び細菌の菌株中の適切な合成条件下の蛋白質は培地中（酵母及びク゛ラム陽性菌）又はペリプラズム空間（グラム陰性菌）へ分泌することができ、それほど激しくない方法により回収することができる。一般に、宿主としての組織培養細胞は異種蛋白質の便利な回収を可能にすると思われる。
【００６１】
Ｈ鎖とＬ鎖とを同一宿主中で同時発現させる場合、単離法は再編成抗体を回収するように設計される。これは下記するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なうことができ、或いは細胞質の還元環境からＩｇＧ鎖を分泌する微生物中ｉｎ  ｖｉｖｏで行なうことも可能である。より詳細な説明は下記Ｄ．２．に示す。
【００６２】
Ｄ．２．鎖組換技術
Ｈ鎖及びＬ鎖又はその部分を互いに分離して産生する本発明の方法の能力は、独特且つ先例のない免疫グロブリン、Ｆａｂ領域及び単一価の抗体の集合体を得る機会を与える。このような製造は、単離した鎖を再組立てする技術の使用を必要とする。この種の手段は当業界で公知であり、従ってこれらにつきここで再検討するのが適当である。
【００６３】
単一鎖のジスルフィド結合を含有する蛋白質を還元し且つ再酸化して天然構造及び活性を高収率で再生させているが（Ｒ．Ｂ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｏｆ  Ｐｏｓｔ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１：１５７−２１２（１９８０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、ＮＹ．）、ジスルフィド結合により結合されている不連続ポリペプチド鎖より成る蛋白質は還元開裂の後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで再編成するのが困難である。精巧な場合であるインシュリンは永年に亘り多くの実験的注目を集めており、現在ではこれに関し工業的方法が確立されているほど効率的に再編成することができる（Ｒ．Ｅ．Ｃｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：第７回米国ペプチドシンポジウムのＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ（Ｄ．Ｈ．Ｒｉｃｈ及びＥ．Ｇｒｏｓｓ編）７２１−７２８．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．（１９８１））。
【００６４】
免疫グロブリンは、インシュリンよりも困難な問題を含むことが判明している。四元体は１５個もしくはそれ以上のジスルフィド結合により分子内及び分子間で安定化されている。鎖間ジスルフィドのみの開裂により分解されたＨ鎖とＬ鎖とを再結合して、鎖間ジスルフィドを復帰させなくても抗体活性を再取することが可能であった（Ｇ．Ｍ．Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，５０：７５３（１９６３））。更に、蛋白質分解により生成される活性なＩｇＧの断片（約５０，０００ＭＷのＦａｂ断片）をそれらの完全に還元したＨ鎖成分とＬ鎖成分とに開裂させ、これらをかなり効率的に再編成して活性抗体を与えることができる（Ｅ．Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，５２：１０９９（１９６４）；Ｐ．Ｌ．Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，５３：５２４（１９６５））。完全還元された天然ＩｇＧから活性抗体を再編成する試みは、恐らく還元鎖及び副産物又は中間物が再編成過程に於いて不溶解性であるため、完全に不成功であった（Ｍ．Ｈ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１：５２２５（１９６６））。然しながら、免疫グロブリンを完全還元の前にリジンのポリアデニル化によりランダムに改変すれば、分離される鎖は再酸化の際に抗原結合性の活性を回収する能力を有する（上記）。
【００６５】
免疫グロブリンの再編成に対して特に適した方法は、現在では古典的となったインシュリン組換技術から得られるものであり、ここでは出発物質を酸化スルフィトリシス（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）により調製し、蛋白質に於ける全てのシステインのチオール不安定性Ｓ−スルホン酸基を発生させ、ジスルフィドを非還元的に破壊する（Ｃｈａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。酸化スルフィトリシスは緩和なジスルフィド開裂反応であり（Ｇ．Ｅ．Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９７１））、これはしばしば還元より緩和であり、且つジスルフィド再生成がチオール−ジスルフィド相互交換を介して生じ得る緩和な還元剤に露呈されるまで安定であるような誘導体を生成する。本発明に於いて、酸化スルフィトリシスにより生成されるＨ鎖及びＬ鎖のＳ−スルホネートは、ジスルフィド結合生成を行なうために空気酸化とチオール−ジスルフィド相互交換との両者を用いて再編成された。一般的手順は、１９８２年１２月２２日付で出願された米国特許出願第４５２１８７号（ＥＰＯ出願第８３．３０７８４０．５号）明細書に詳細に示されており、これを参考のためここに引用して本明細書に包含する。
【００６６】
Ｄ．３．組換技術により可能な変種
上記Ｄ．１及びＤ．２に記載した技術を用いて、哺乳動物抗体の効率的産生を得るために用いた他の操作を全く簡潔に変化させて、この基本的抗体型の多くの変種を産生させることができる。これらの変種は組換技術の使用に本質的であり、通常見られる哺乳動物免疫グロブリン鎖に於けるアミノ酸配列の遺伝子レベルでの改変を可能にし、この方法の真価はこれら変種を得る能力を有すること並びに所望の珍しく、しばしば汚染された分子を経済的且つ特異的に産生する能力を有することにある。更に、これらの変種は個々の鎖を単離する能力を特徴とし、従って新規な集合体をもたらす。
【００６７】
要するに、遺伝子操作は発現ベクターの作成過程でゲノム材料の再編成を可能にするので、この種の再編成を行なって「天然」抗体、もしくは免疫グロブリンの成分に対し新規なコード配列を産生することができる。下記に詳細に説明するように、哺乳動物Ｈ鎖に対するコード配列は、単一起源又は単一クラスからは完全には得ることができず、配列の部分を例えばネズミ−ネズミハイブリドーマ、ヒト−ネズミハイブリドーマ或いは一連の抗原処理に呼応して分化させたＢ細胞のような種々異なるｍＲＮＡプールからＤ．１に記載した技術により回収することができる。各々の場合に於ける配列の所望の部分は、Ｄ．１に記載したプローブ及び分析技術を用いて回収され且つ同じモデル配列の部分について使用されると同じ結合法を用いて発現ベクターに組換えることができる。この種のキメラ鎖は任意所望の長さで作成することができ、例えば完全なＨ鎖を作成することができ、そのＦａｂ領域に対する配列のみを作成することもできる。
【００６８】
組換技術の使用により生ずる付加的な融通性は、別々の培養物に於いてＨ鎖とＬ鎖もしくはその断片或いは同じ培養物に於けるＨ鎖とＬ鎖との独特な組合せを産生し、且つ適当な成分が組立てられるまで抗体又は免疫グロブリン集合体の再編成を防止する能力から生ずる。例えば、通常の抗体産生はＬ鎖及びＨ鎖の部分が同じ細胞に於ける特定の決定子に呼応して作成されるので、自動的に「哺乳動物の交代」の生成をもたらすが、本発明の方法は完全に新規な混合物を組立てる機会を提供する。若干制限された量の「ハイブリッド」抗体が「クワドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）」、即ちこのように産生されたＨ鎖とＬ鎖とのランダム集合を可能にする２種のハイブリドーマ細胞培養物の融合体により産生されている。
【００６９】
本発明は、所望鎖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより、或いは同じ培養物を所望鎖に対するコード配列で形質転換させることにより一層制御された所望鎖の組立てを可能にする。
【００７０】
Ｄ．４．複合免疫グロブリン
哺乳動物抗体の組換体産生につき詳細に説明した上記の方法を若干改変して使用することにより、本発明に包含される他の種類の抗体又はＮＳＩを作成することができる。鎖の相同性が種々異なる特異性の免疫グロブリン配列に対応するような特定具体例の非特異性複合免疫グロブリンを作成するには勿論、Ｈ鎖とＬ鎖とを別々の培養物で作成し、これらを所望に応じて再組立てすることのみを必要とする。
【００７１】
例えば、抗−ＣＥＡＬ鎖／抗−肝炎Ｈ鎖の複合抗体を作成するには、Ｌ鎖クローンのための鋳型として使用するｍＲＮＡの適する原料は、例えばＥ．１に記載する抗−ＣＥＡ産生細胞系である。Ｈ鎖に対応するｍＲＮＡは肝炎感染に反応して生じたＢ細胞から、或いはＢ細胞がこの種の起源であるようなハイブリドーマから得られるであろう。この種の複合体は本発明の方法を用いて殆んど任意に組立てることができ、且つ各鎖に対する鋳型として使用するのに適したｍＲＮＡの入手し得る起源によってのみ制約されることが明らかである。この方法の他の特徴は、全て上記のものと同様である。
【００７２】
Ｄ．５．ハイブリッド抗体
ハイブリッド抗体は、２種以上の抗原と同時に反応し得るので特に有用である。例えば上記Ｄ．４に示したような種々異なる抗原に対する抗体の鎖に対応するＨ鎖とＬ鎖との対は、４つの別々の培養物で作成され、四元体の時期尚早な組立てを防止する。この後、別々に作成された４種のペプチドを混合することにより、所望の四元体まで組立てることができる。ランダムな集合は極めて望ましくない産生物の生成をもたらし得るが、同質（相同）のＬ鎖及びＨ鎖が互いに結合されて他の対とは一致しないような産生物のその部分は所望のハイブリッド抗体を与える。
【００７３】
Ｄ．６．キメラ抗体
キメラ抗体（例えば可変配列が不変配列とは別に誘導される）を作成するには、上記Ｄ．１及びＤ．２の手順を適当に改変及び付加して応用することができる。好適手順は、Ｈ鎖及びＬ鎖の部分をコードする遺伝子の所望部分を適当な種々異なる起源から回収し、これら断片を制限エンドヌクレアーゼにより再結合して各鎖をコードする遺伝子を再編成することである。
【００７４】
例えば、特に好適なキメラ構造に於いて、ネズミハイブリドーマ培養物により産生される抗体の可変配列をコードするＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子の部分をこの培養物から回収し且つクローニングし、そしてヒト抗体に対するＨ鎖及びＬ鎖の不変領域をコードする遺伝子断片を例えばヒト骨髄腫細胞から回収しクローニングする。次いで適する制限酵素を使用して、ネズミ遺伝子の可変部分をヒト遺伝子の不変領域へ２つの鎖のそれぞれにつき結合させることができる。キメラ鎖はＤ．１に示したように産生し、Ｄ．２に示したように合体させ、非キメラ型と同様に使用する。勿論、鎖に於ける任意の接合点を選択することができる。
【００７５】
Ｄ．７．改変抗体
改変抗体は、本質的にキメラ抗体の範囲内にある。ここでも、Ｄ．１及びＤ．２の技術を応用することができる。然しながら鎖の接合部分ではなく適するアミノ酸の改変、欠失又は付加を例えば突然変異のような可能な技術により作成する（上記）。例えば、減少した補体固定（結合）性を有する抗体をコードする遺伝子、或いは向上した金属結合能力を有する遺伝子をこの種の技術を用いて作成する。例えば、後者のクラスはメタロチオネインＩＩをコードする公知の遺伝子配列を利用することができる（Ｍ．Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２９９：７９７（１９８２））。この分子断片のキレート化特性は、重金属を腫瘍部位まで運ぶ際、腫瘍造影に於ける助剤として有用である（Ｄ．Ａ．Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５：１９（１９８２））。
【００７６】
Ｄ．８．単一価の抗体
他の好適具体例に於いて、第３の（Ｈ）鎖のＦｃ領域と結合した一対のＨ鎖及びＬ鎖から成る抗体を生成させる。これらの抗体は特に有用な性質を有する。これらは、通常の抗体と同様に、例えば腫瘍のような組織の抗原表面を標的として使用することができるが、通常の抗体とは異なり、これらは標的組織の抗原表面を後退させて非受容性とはならない。通常の抗体の使用は、数時間でこの種の表面抗原の集合及びその後の失活をもたらす。
【００７７】
単一価の抗体の作成方法は、本発明の簡潔な応用である。所望のＦｃ領域のＨ鎖に対する遺伝子を制限酵素により開裂させ、所望のＦｃ領域をコードするその部分のみを発現する。次いで、この部分をＤ．２の技術を用いて別々に作成したＨ鎖に結合し、所望対をＨ／Ｈ及びＦｃ／Ｆｃ組合せ物から分離し、別々に産生したＬ鎖を付加する。このようにして、２つのＨ鎖部分の予備結合は、通常の抗体が生成される可能性を減少させる。
【００７８】
Ｄ．９．Ｆａｂ蛋白質
同様にして、Ｈ鎖部分に対する完全遺伝子を含む必要はない。上記の変種を全てＦａｂ蛋白質の産生に対する方法に積み重ねることができ、全体的手順はアミノ末端２２０個のアミノ酸をコードするＨ鎖の部分を適当な発現ベクターで使用する点のみ相違する。
【００７９】
Ｅ．好適具体例の特定例
上記に本発明を一般的意味に於いて記載したが、所望抗体を産生させる実験手順の詳細を説明するために以下いくつかの特定具体例を示す。
【００８０】
例Ｅ．１は抗ＣＥＡ抗体成分を作成するための即ち「哺乳動物抗体」を作成するための一般的手順を示している。
【００８１】
例Ｅ．３は再編成方法を示しており、従って哺乳動物性複合ハイブリッド及びキメラ免疫グロブリン並びにＦａｂ蛋白質及び単一価の抗体を製造するために応用できる。
【００８２】
例Ｅ．４は、可変領域と不変領域とが種々異なる起源から得られるようにＨ鎖もしくはＬ鎖を処理するための手順を示している。
【００８３】
例Ｅ．５は短くしたＨ鎖ゲノムを得る方法を示しており、これはＦａｂ領域の産生を可能にし且つ同様にしてＦｃ領域の産生も可能にする。
【００８４】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらのみに限定されない。
【００８５】
Ｅ．１．ネズミ抗−ＣＥＡ抗体鎖に対する発現ベクターの作成及びペプチド合成胎生期癌の抗原（ＣＥＡ）は、ヒトオリジンの或る種の腫瘍細胞の表面に関連する（Ｐ．Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２２：４６７（１９６５））。ＣＥＡに結合する抗体（抗−ＣＥＡ抗体）は、これら腫瘍の早期発見に有用であり（Ｔ．Ｒ．Ｖａｎ  Ｎａｇｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４０：５０２（１９８０））、表面にＣＥＡを支持すると思われるヒト腫瘍の処置に使用できる能力を有する。Ｉｇγ１型（クラス）の抗−ＣＥＡ抗体を分泌するネズミハイブリドーマ細胞系（ＣＥＡ．６６−Ｅ３）がＣ．Ｗａｇｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０：２３０８（１９８３）（この文献を引用して本明細書に包含する）に記載されているように調製されて、ｍＲＮＡ源として使用された。この細胞系による抗ＣＥＡ抗体の産生を決定した。これら細胞により産生された抗体のＮ−末端配列を次のようにしてモノクローナル抗−ＣＥＡのそれと比較した。精製したＩｇＧをＰＣＡ酵素で処理し（Ｄ．Ｎ．Ｐｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８１：１７６（１９７８）、次いで６Ｍグアニジン塩酸塩と１０ｍＭ２−メルカプトエタノールに於いて解離させた（１．０ｍｇの免疫グロブリン、５分間、１００℃の水浴）。解離した鎖をアルキルフェニルカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）に於いて１００％Ａ（０．１％、ＴＦＡ−水）〜９０％Ｂ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：０．１／９．９／９０）の直線勾配を用いて０．８ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で分離した。３つの主たるピークを溶出させ、銀染色によってＳＤＳゲルで分析した。最初の２つのピークは純粋なＬ鎖（ＭＷ２５，０００ダルトン）であり、第３のピークはＨ鎖とＬ鎖との７：３混合物であった。１．２ｎＭ（ナノモル）のＬ鎖をＪ．Ｅ．Ｓｈｉｖｅｌｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７９：３１（１９８１）の方法により０．４ｎＭのＮＨ２末端収率にて配列決定した。Ｈ鎖とＬ鎖との混合物（３ｎＭ）も配列決定し、Ｌ鎖の配列を二重配列から推定してＨ鎖の配列を得た。
【００８６】
以下の説明に於いて、ＣＥＡ．６６−Ｅ３により産生された抗ＣＥＡ抗体に対するＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子の単離及び発現につき記載する。これら鎖の不変領域はそれぞれγ及びκ型（ｆａｍｉｌｙ）に属するので、「Ｌ鎖」と「κ鎖」及び「Ｈ鎖」と「γ鎖」とをそれぞれ以下では互換的に使用する。
【００８７】
Ｅ．１．１．抗ＣＥＡのＬ鎖及びＨ鎖（κ及びγ鎖）に対するメッセンジャーＲＮＡの単離
ＣＥＡ．６６−Ｅ３細胞から全ＲＮＡをＬｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９８：２５１（１９７９）により報告されたように抽出した。これら細胞を遠心分離によりペレット化し、約１ｇ部分のペレットを１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１０ｍｌ中に再懸濁した。この再懸濁した細胞を最終濃度１％まで非イオン性表面活性剤ＮＰ−４０を添加して溶菌し、核を遠心分離により除去した。１％最終濃度までＳＤＳ（ｐＨ７．４）を添加した後、上清を３ｍｌずつのフェノール（再蒸溜）／クロロホルム：イソアミルアルコール２５：１にて４℃で２回抽出した。水相をＮａＣｌ中で０．２Ｍとし、２倍容量の１００％エタノールを添加し、−２０℃で１晩貯蔵することにより全ＲＮＡを沈澱した。遠心分離後、ポリ−Ａ  ｍＲＮＡをＡｖｉｖ及びＬｅｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：１４０８（１９７２）により記載されたオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより全ＲＮＡから精製した。１ｇの細胞から１４２μｇのポリ−Ａ  ｍＲＮＡが得られた。
【００８８】
Ｅ．１．２．Ｈ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ配列挿入物を有するプラスミドを含有したＥ．ｃｏｌｉコロニーライブラリーの作成
上記Ｅ．１．１で調製した未分画ポリ−Ａ  ｍＲＮＡの５μｇをＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）及びＷｉｃｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：２４８３（１９７８）（この文献を引用して本明細書に包含する）により、二重鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡのオリゴ−ｄＴプライム処理調製物に対する鋳型として使用した。このｃＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって寸法（サイズ）分画し、長さ６００塩基対より大きいｄｓ  ｃＤＮＡの１２４ｎｇを電気溶出によって回収した。２０ｎｇのｄｓ  ｃＤＮＡをＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１７（１９７８）（この文献を引用して本明細書に包含する）に記載された末端（ターミナル）デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてデオキシＣ残基で延長させ、予めＰｓｔＩにより開裂させ、デオキシＧで処理した２００ｎｇのプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））と共にアニールした。それぞれアニールした混合物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１４４６）に形質転換した。約８，５００種のアンピシリン感受性且つテトラサイクリン耐性の形質転換体が得られた。
【００８９】
Ｅ．１．３．合成プローブの作成
可変領域ＤＮＡ配列の２５塩基対３’で始まるネズミＭＯＰＣ２１κ鎖に対する不変領域のコード配列に補完（相補）的な１４元体、即ち５’ＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ３’をκ鎖プローブとして使用した。ネズミＭＯＰＣ２１γ鎖に対する可変領域ＤＮＡ配列の７２塩基対３’に位置するコード配列に補完的な１５元体、即ち５’ＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧ３’をγ鎖遺伝子プローブとして使用した。
【００９０】
両プローブは、ドイツ公開公報第２６４４４３２号（この文献を引用して本明細書に包含する）に記載されたホスホトリエステル法により合成し、次のようにキナーゼ処理して放射能活性にした。２５０ｎｇのデオキシオリゴヌクレオチドを６０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１００μＣｉ（γ−Ｐ３２）ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，５，０００Ｃｉ／ｍＭ）の２５μｌ中に入れた。５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、反応を３７℃にて３０分間進行させ、ＥＤＴＡを２０ｍＭまで加えることにより停止させた。
【００９１】
Ｅ．１．４．κ鎖又はγ鎖配列に対するコロニーライブラリーの選別
上記Ｅ．１．２に記載したように、調製した約２，０００個のコロニーをＬＢ（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐ．４３１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）＋５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するマイクロタイター皿の穴に個々に接種し、ＤＭＳＯを７％まで添加した後に−２０℃で貯蔵した。このライブラリーからの個々のコロニーを２組のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ  ＢＡ８５／２０のニトロセルロースフィルターに移し、ＬＢ＋５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する寒天板で増殖した。３７℃にて約１０時間増殖した後、これらのコロニーフィルターをＬＢ＋５μｇ／ｍｌテトラサイクリンと１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含有する寒天板に移し、３７℃にて１晩再培養した。次いで、各コロニーからのＤＮＡを変性させ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２：３９６１（１９７５）（この文献を引用して本明細書に包含する）に記載されたＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法の変法によってフィルターに固定した。各フィルターを０．５Ｎ  ＮａＯＨと１．５Ｍ  ＮａＣｌとの上に３分間浮遊させてコロニーを溶菌し、ＤＮＡを変性させ、次いで３Ｍ  ＮａＣｌと０．５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）の上に１５分間浮遊させて中和した。次いでこれらフィルターを２×ＳＳＣ上に更に１５分間浮遊させ、８０℃の減圧オーブン内で２時間焼成した。これらフィルターを０．９Ｍ  ＮａＣｌ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１Ｍ燐酸ナトリウム（二塩基性）、１ｍＭピロ燐酸ナトリウム、０．５％ＮＰ−４０及び２００μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉ  ｔ−ＲＮＡに於いて室温で２時間予備ハイブリゼーションした後、同じ溶液で１晩ハイブリゼーションし（実質的にＷｅｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：８７９（１９８１）に記載されている）、この場合、上記のキナーゼ処理したκプローブ又はγプローブの約４０×１０６ｃｐｍを使用した。６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中に於いて、３７℃で激しく洗浄した後、これらフィルターをＤｕｐｏｎｔ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓｇ強化スクリーンを用いてＫｏｄａｋ  ＸＲ−５  Ｘ線フィルムに−８０℃で１６〜２４時間露出した。κ鎖プローブとハイブリダイズした約２０種のコロニー及びγ鎖プローブとハイブリダイズした２０種のコロニーを特性化した。
【００９２】
Ｅ．１．５．κＤＮＡ配列プローブにハイブリダイズしたコロニーの特性化
κ鎖プローブにハイブリダイズした数種の異なる形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩにより開裂し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分画した。この分析により、多数のプラスミドＤＮＡが充分な長さのκ鎖をコード化するのに充分な大きさのｃＤＮＡ挿入物を含有することが示された。これらプラスミドの１種に於けるｃＤＮＡ挿入物の完全ヌクレオチド配列をＳｍｉｔｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：５６０（１９８０）（この文献を引用して本明細書に包含する）に記載されたジデオキシヌクレオチド鎖停止法により、制限エンドヌクレアーゼ開裂断片をＭ１３ベクター中へサブクローニングした後に決定した（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：３０９（１９８１））。図２、図３、図４および図５はｐＫ１７Ｇ４のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を示し、図６、図７および図８は対応するアミノ酸配列を有する遺伝子配列を示している。ネズミ抗−ＣＥＡκ鎖の全コード領域を、この１種の大型ＤＮＡ断片につき単離した。κ鎖のアミノ酸配列は、ｐＫ１７Ｇ４  ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列から推定して、成熟ネズミ抗−ＣＥＡκ鎖の最初の２３個のＮ−末端アミノ酸と完全に一致し、これは精製したネズミ抗−ＣＥＡκ鎖のアミノ酸配列分析により決定された。ｐＫ１７Ｇ４のコード領域は、予備配列の２７塩基対もしくは９個のアミノ酸と成熟蛋白質の６４２塩基対もしくは２１４個のアミノ酸を含有する。グリコシル化していない成熟蛋白質（ＭＷ２４，５５３）は、１２個のアミノ酸のＪ１結合領域を含め１１９個のアミノ酸から成る可変領域と１０７個のアミノ酸から成る不変領域とを有する。アミノ酸２１５の後の停止コドンの後にポリ−Ａ付加に至るまで３’未翻訳配列の２１２塩基対が始まる。ｐＫ１７Ｇ４を同定するために使用したκ鎖プローブは、ヌクレオチド３７４−３８８にハイブリダイズする（図、図３、図４および図５）。
【００９３】
Ｅ．１．６．γ１ＤＮＡプローブにハイブリダイズしたコロニーの特性化
Ｈ鎖γ１プローブとのハイブリダイズに対し陽性である数種の形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡを、上記Ｅ．１．５．に記載したようにＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ分析にかけた。最も大きいｃＤＮＡ挿入物断片を示すプラスミドＤＮＡを後の試験用に選択した。ネズミＨ鎖（γ−１鎖）をコード化するヌクレオチド配列は、可変領域と不変領域との間の接合部近くにＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有する。選択したプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩとＮｃｏＩとの両者により消化し、ポリアクリルアミドで寸法分画した。この分析はＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を有する多数のプラスミドＤＮＡの同定を可能にするが、このいずれもネズミ抗−ＣＥＡＨ鎖の全コード化領域をコードするのに充分大きいｃＤＮＡ挿入物断片を示さない。
【００９４】
単離した１種のプラスミド（即ちｐγ２９８）に於いて、約１３００ｂｐのｃＤＮＡ挿入物は５’未翻訳領域、信号配列及びＨ鎖のＮ−末端部分に対する配列情報を有する。ｐγ２９８はネズミ抗−ＣＥＡγ１鎖に対するＣ−末端配列をコードしなかったので、プラスミドＤＮＡを他のコロニーから単離してＰｓｔＩ及びＮｃｏＩで選別した。ｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物に於けるＣ−末端領域を配列決定して、停止コドンと３’未翻訳配列とｐγ２９８から喪失されたコード配列の部分とを含有することが示された。
【００９５】
図９、図１０、図１１、図１２、図１３及び図１４はネズミ抗−ＣＥＡＨ鎖の全ヌクレオチド配列を示し（Ｓｍｉｔｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：５６０（１９８０）のジデオキシヌクレオチド鎖停止法により決定する）、図１５、図１６、図１７、図１８および図１９は翻訳配列を含んでいる。
【００９６】
ｐγ２９８  ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列から推定したγ１（Ｈ鎖）のアミノ酸配列は、精製ネズミ抗−ＣＥＡγ１鎖のアミノ酸配列分析により決定して成熟ネズミ抗−ＣＥＡγ１鎖の最初の２３個のＮ−末端アミノ酸に完全に一致する。コード領域は予備配列の５７塩基対もしくは１９個のアミノ酸と、成熟蛋白質の１３４６塩基対もしくは４４７個のアミノ酸とより成っている。グリコシル化されていない成熟蛋白質（ＭＷ５２，２５８）は、１２個のアミノ酸のＤ領域を含め１３５個のアミノ酸より成る可変領域と、１３個のアミノ酸より成るＪ４結合領域とを有する。不変領域は３２４個のアミノ酸である。アミノ酸４４７の後の停止コドンに続いて、ポリ−Ａ付加まで９６ｂｐの３未翻訳配列が開始する。ｐγ２９８及びｐγ１１を同定するために使用したプローブは、ヌクレオチド５２８−５４２にハイブリダイズした（図９、図１０、図１１、図１２、図１３及び図１４）。
【００９７】
Ｅ．１．７．ネズミ成熟抗−ＣＥＡ  κ鎖遺伝子を直接発現させるためのプラスミドの作成、ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊
図２０、図２１および図２２はｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊の作成を示している。
【００９８】
まず、単一のｔｒｐプロモーターを有する中間プラスミドｐＨＧＨ２０７−１＊を次のように作成した：
プラスミドｐＨＧＨ２０７（１９８１年１０月１日付出願の米国特許出願第３０７，４７３号（ＥＰＯ公開第００３６７７６号）に記載）は、二重ｌａｃプロモーターに続いてＥｃｏＲＩ部位に整列（フランキング）するｔｒｐプロモーターを有し、これを使用してｐＨＣＨ２０７−１を作成した。ｐＨＧＨ２０７をＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩで部分消化した。完全ｔｒｐプロモーターを含有する最も大きい断片を単離し、これをｐＢＲ３２２からの最も大きいＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に結合し、この結合混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ２９４を形質転換した。ＴｅｔＲ  ＡｍｐＲのコロニーを単離し、これらの殆んどはｐＨＧＨ２０７−１を含有した。ａｍｐＲ遺伝子とｔｒｐプロモーターの間にＥｃｏＲＩ部位を欠如するｐＨＧＨ２０７−１＊をＥｃｏＲＩでのｐＨＧＨ２０７−１の部分消化、末端に於けるＫｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰの充填及び再結合によって得た。
【００９９】
５μｇのｐＨＧＨ２０７−１＊をＥｃｏＲＩで消化し、これら末端を６０ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び１ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する５０μｌの反応液中で１２ユニットのＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃にて１時間延長し、次いでフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出しエタノールで沈澱させた。沈澱したＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、大ベクター断片（断片１）を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出及びエタノール沈澱によって精製した。
【０１００】
このＤＮＡを１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡの５０μｌ中に再懸濁し、５００ユニットの細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で６５℃にて３０秒間処理し、フェノールＣＨＣｌ３抽出し、エタノール沈澱させた。
【０１０１】
Ｌ鎖配列１部を含有するＤＮＡ断片を次のように作成した：７μｇのｐＫ１７ＫＧ４ＤＮＡをＰｓｔＩで消化しｃＤＮＡ挿入物を含有するκ鎖を６％ゲル電気泳動及び電気溶出によって単離した。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出、エタノール沈澱及び水中への再懸濁の後、この断片をＡｖａＩＩによって消化した。３３３ｂｐのＰｓｔＩ−ＡｖａＩＩ  ＤＮＡ断片を単離し、６％ポリアクリルアミドゲルから精製した。
【０１０２】
１５ヌクレオチドＤＮＡプライマーをホスホトリエステル法（Ｇ．Ｏ．２，６４４，４３２（上記））により合成し、次の配列を有した：
0003559795.tif 000002
【０１０３】
５’メチオニンは開始コドンとして作用する。５００ｎｇのこのプライマーを０．５ｍＭ  ＡＴＰを含有する２０μｌの反応液中で１０ユニットのＴ４ＤＮＡキナーゼにより５’末端で燐酸化した。約２００ｎｇのＰｓｔＩ−ＡｖａＩＩ  ＤＮＡ断片を２０μｌの燐酸化したプライマーと混合し、９５℃まで３分間加熱し、ドライアイスエタノール浴中で急速に凍結させた。変性したＤＮＡ溶液を６０ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４），１２ｍＭの各ｄＮＴＰと成し、１２ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ−大断片を加えた。３７℃にて２時間培養した後、このプライマー修復反応物をフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させてＳａｕ３Ａで完全に消化した。次いで、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、電気溶出の後にＳａｕ３Ａに対し平滑末端の１８２塩基対アミノ末端断片（断片２）の約５０ｎｇを得た。
【０１０４】
１００ｎｇの断片１（上記）と５０ｎｇの断片２とを２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，２．５ｍＭ  ＡＴＰ及び１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼの２０μｌに於いて合せた。１４℃にて１晩結合させた後、この反応物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４で形質転換した。多数のアンピシリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化は適正な作成を示し、ＤＮＡ配列分析はこの新規なプラスミドｐＫＣＥＡＩｎｔ１の開始コドンを介して所望のヌクレオチド配列を証明した（図２０、図２１および図２２）。
【０１０５】
κＬ鎖遺伝子のコード化配列の残部は次のように作成した：
７μｇのＫ１７Ｇ７ＤＮＡからのＰｓｔＩ  ｃＤＮＡ挿入物断片をＡｖａＩＩで部分消化させ、ＡｖａＩＩ付着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ大断片反応に於いて平滑末端部まで延長させた。６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続き、６８６塩基対のＰｓｔＩ−平滑末端ＡｖａＩＩＤＮＡ断片を単離し、精製し、ＨｐａＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化にかけた。４９７塩基対のＨｐａＩＩ−平滑末端ＡｖａＩＩ  ＤＮＡ断片（断片３）を単離し、ゲル電気泳動の後に精製した。
【０１０６】
１０μｇのｐＫＣＥＡＩｎｔ１ＤＮＡをＡｖａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片で延長化し、ＸｂａＩで消化した。大平滑末端ＡｖａＩ−ＸｂａＩベクター断片と、小平滑末端ＡｖａＩ−ＸｂａＩ断片とを単離し、６％ポリアクリルアミドゲルから電気泳動の後に精製した。大ベクター断片（断片４）を細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理し、小断片をＨｐａＩＩで消化させ、６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、１６９塩基対のＸｂａＩ−ＨｐａＩＩＤＮＡ断片（断片５）を精製した。約７５ｎｇの断片４と約５０ｎｇの断片３と約５０ｎｇの断片５とをＴ４ＤＮＡリガーゼ反応物中であわせ、１４℃にて１晩培養し、反応混合物をＥ．ｃｏｌｉＫ１２菌株２９４で形質転換した。６種のアンピシリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ消化により分析した１種のプラスミドＤＮＡは適正な作成を示し、これをｐＫＣＥＡＩｎｔ２と命名した。
【０１０７】
最終的な作成は、ｐＫＣＥＡＩｎｔ２からのｔｒｐプロモーターを含むＫ−ＣＥＡ断片をｐＢＲ３２２（ＸＡＰ）中へ結合することにより行なった（ｐＢＲ３２２（ＸＡＰ）は１９８２年１２月２２日付出願の米国特許出願第４５２，２２７号明細書に記載されたように、ｐＢＲ３２２からＡｖａＩ−ＰｖａＩＩ断片の削除（欠失）に続く結合によって作成した）。
【０１０８】
Ｋ−ＣＥＡ断片は、ｐＫＣＥＡＩｎｔ２をＡｖａＩで処理し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）によりｄＮＴＰの存在下で平滑末端化させ、ＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動と電気溶出とにより所望断片を単離して作成した。
【０１０９】
ｐＢＲ３２２（ＸＡＰ）からの大型ベクター断片は、ＥｃｏＲＩによる処理、ポリメラーゼによる平滑末端化及びＰｓｔＩによる再消化に続いて、電気泳動と電気溶出とによる大型ベクター断片の単離という順序の処理によって作成した。
【０１１０】
上記のように作成したＫ−ＣＥＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ、結合混合物をＥ．ｃｏｌｉに上記のように形質転換させた。数種のアンピシリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを分析用に選択し、１種のプラスミドＤＮＡが適正な作成を示し、これをｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊と命名した。
【０１１１】
Ｅ．１．８．ネズミ成熟抗体−ＣＥＡＨ鎖（γＩ鎖）遺伝子を直接発現するためのプラスミドベクターの作成、ｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊
図２３、図２４および図２５はｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊の作成を示している。このプラスミドは、γ１遺伝子のＣ−末端領域の作成で始まる２つの部分に於いて作成した。
【０１１２】
５μｇのプラスミドｐＨＧＨ２０７−１＊をＡｖａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ大型断片（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で平滑末端まで延長化し、フェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させた。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰで処理し大型断片（断片Ａ）を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び電気溶出により精製した。
【０１１３】
約５μｇのｐγ１１をＰｓｔＩにより消化し、そして遺伝子のＣ末端部分を有するγ鎖ｃＤＮＡ挿入物切断片を精製し、ＡｖａＩＩで消化し、次いでＡｖａＩＩ付着端部をクノールで延長化し、次いでＴａｑＩの消化を行なった。３７５塩基対の平滑端ＡｖａＩＩ−ＴａｑＩ断片（断片Ｂ）を単離し、そしてゲル電気泳動および電気溶出により精製した。
【０１１４】
９μｇのｐγ２９８をＴａｑＩ及びＢａｍＨＩで消化して４９６塩基対断片（断片Ｃ）を単離した。
【０１１５】
ほぼ等モル量の断片Ａ，Ｂ及びＣを２０μｌの反応混合物中で１４℃にて１晩結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株２９４に形質転換させた。６種のアンピシリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ分析にかけ、ｐγＣＥＡＩｎｔと命名した１種のプラスミドＤＮＡはγ１のＣ−末端部分の正確な作成を示した（図１５、図１６、図１７、図１８および図１９）。
【０１１６】
Ｎ−末端配列を得るため、３０μｇのｐγ２９８をＰｓｔＩで消化し、ネズミ抗−ＣＥＡγ鎖のＮ−末端領域をコード化する６２８塩基対のＤＮＡ断片を単離し、精製した。この断片を更にＡｌｕＩ及びＲｓａＩで消化して２８０塩基対断片を単離した。１５ヌクレオチドＤＮＡプライマー、即ち
0003559795.tif 000003
をホスホトリエステル法（上記）により合成した。
【０１１７】
５メチオニンは開始コドンとして作用する。
５００ｎｇのこの合成オリゴマーであるプライマーを０．５ｍＭ  ＡＴＰを２０μｌの反応混合物中に含有する１０ユニットのＴ４ＤＮＡキナーゼと反応させて５末端で燐酸化した。５００ｎｇの２８０塩基対ＡｌｕＩ−ＲｓａＩ  ＤＮＡ断片を燐酸化したプライマーと混合した。この混合物を９５℃で３分間熱変性させ、ドライアイスエタノール中で急冷した。変性したＤＮＡ溶液を６０ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４），１２ｍＭの各ｄＮＴＰとなし、１２ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ−大型断片を加えた。３７℃で２時間培養した後、このプライマー修復反応物をフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＨｐａＩＩで完全消化させた。予想された１２５塩基対の平滑末端−ＨｐａＩＩ  ＤＮＡ断片（断片Ｄ）５０ｎｇをゲルから精製した。
【０１１８】
第２の部分のｐγ２９８ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、６２８塩基対のＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、更にＢａｍＨＩ及びＨｐａＩＩで消化した。得られた３８０塩基対断片（断片Ｅ）をゲル電気泳動により精製した。
【０１１９】
５μｇのｐγＣＥＡＩｎｔ１をＥｃｏＲＩで消化し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）と整列させ、ＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰで処理し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。大型ベクター断片（断片Ｆ）を単離し、精製した。
【０１２０】
３つの断片の結合に於いて、５０ｎｇの断片Ｄと１００ｎｇの断片Ｅと１００ｎｇの断片Ｆとを４℃にて２０μｌの反応混合物中で１晩結合させ、これを使用してＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４を形質転換させた。１２種のアンピシリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを正確な作成につき分析し、開始コドンを包囲するヌクレオチド配列がｐγＣＥＡＩｎｔ２と命名したプラスミドにつき正確であることが証明された。
【０１２１】
Ｈ鎖遺伝子の発現に使用した発現プラスミドｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１は、ｐＢＲ３２２（ＸＡＰ）（上記）からの大型ベクター断片と、ｐγＣＥＡＩｎｔ２から作成した２種の断片とを用いて３つの結合により作成する。
【０１２２】
ｐＢＲ３２２（ＸＡＰ）を上記のようにＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）によりｄＮＴＰの存在下で平滑末端化させ、次いでＰｓｔＩにより処理し、ゲル電気泳動で大型ベクター断片を単離することにより処理した。Ｈ鎖遺伝子のＮ−末端コード化領域と結合したｔｒｐプロモーターを含有するｐγＣＥＡＩｎｔ２からの１５４３塩基対断片を単離し、その際ｐγＣＥＡＩｎｔ２をＰｓｔＩに続き、ＢａｍＨＩで処理し、所望の断片をＰＡＧＥにより単離した。遺伝子のＣ−末端コード化部分を含有する８６９塩基対断片をＡｖａＩによるｐγＣＥＡＩｎｔ２の部分消化、Ｋｌｅｎｏｗによる平滑末端化及びＢａｍＨＩによる消化、次いでゲル電気泳動による所望断片の精製によって作成した。
【０１２３】
上記３種の断片を標準条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、結合混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ菌株２９４を形質転換させた。数種のテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを分析し、そのうち１種のプラスミドＤＮＡが適正な作成を示し、これをｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１と命名した。
【０１２４】
Ｅ．１．９．Ｅ．ｃｏｌｉによる免疫グロブリンの鎖の産生
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｗ３１１０−ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）を標準技術によりｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１又はｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１で形質転換させた。
【０１２５】
二重形質転換体を得るため、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０細胞を予めａｍｐ遺伝子からのＰｓｔＩ−ＰｖｕＩ断片の開裂及び再結合によって改変させた改変ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１及びｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１△で形質転換させた。ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１△で形質転換させた細胞はアンピシリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに対し耐性である。成功した形質転換体をアンピシリンに対する耐性を付与するがテトラサイクリンに対する耐性を付与しないｐγＣＥＡＩｎｔ２を用いて再び形質転換させた。ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１△及びｐγＣＥＡＩｎｔ２の両者を含有する細胞は、アンピシリンとテトラサイクリンとの両者を含有する培地中での増殖により同定した。
【０１２６】
形質転換細胞に於けるＨ鎖及び／又はＬ鎖の産生を確認するため、細胞試料を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有し、トリプトファンを含有しないＭ９培地に接種し、ＯＤ５５０が０．５の読みとなるまでインドールアクリル酸（ＩＡＡ）で誘発させた。誘発細胞を種々の時間に亘り、３７℃で増殖させ、次いで遠心分離し、２％ＳＤＳと０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールとを含有するＴＥ緩衝液中に懸濁させ、５分間煮沸した。１０倍容量のアセトンを加え、細胞を２２℃に１０分間保ち、次いで１２，０００ｒｐｍにて遠心分離した。沈澱物をＰ．Ｈ．ＯＦａｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４００７（１９７５）によるＳＤＳ試料緩衝液に懸濁させた。３分間煮沸し、再び遠心分離し、ＳＤＳのＰＡＧＥ（１０％）を用いて分画し、銀染色剤により染色し（Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１１：１４３７（１９８１））、又はＬ鎖とＨ鎖とを同定するため、ウサギ抗−ネズミＩｇＧを用いてウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）にかけた（Ｗ．Ｎ．Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２：１９５（１９８１））。
【０１２７】
ｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１で形質転換させた細胞は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに於いてＨ鎖の分子量に相当するバンドを示し、これは銀染色により展開された。ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１で形質転換させた細胞はＬ鎖に対する適正な分子量バンドを示し、ウェスタンブロットにより同定された。二重形質転換細胞は、ウェスタンブロットによりウサギ抗−ネズミＩｇＧを用いて展開した場合、Ｈ鎖とＬ鎖との両者の分子量蛋白質に対するバンドを示した。これらを図２６、図２７及び図２８に示す。
【０１２８】
図２６は、ｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１で形質転換させた細胞から銀染色により展開した結果を示している。レーン１はＣＥＡ．６６−Ｅ３からのモノクローナル抗−ＣＥＡＨ鎖（標準）である。レーン２ｂ−５ｂはＩＡＡ添加後２時間、４時間、６時間及び２４時間の経時試料である。レーン２ａ−５ａは対応する未形質転換比較であり、レーン２ｃ−５ｃは対応する未誘発形質転換体である。
【０１２９】
図２７は、ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１で形質転換させた細胞からウェスタンブロットにより展開した結果を示している。レーン１ｂ−６ｂはＩＡＡ添加直後、１時間、３．５時間、５時間、８時間及び２４時間後の誘発細胞からの抽出物であり、１ａ−６ａは対応する未誘発比較であり、レーン７はｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１比較からの抽出物であり、レーン８、９及び１０はＣＥＡ．６６−Ｅ３細胞からの種々な量の抗ＣＥＡ−κ鎖である。
【０１３０】
図２８は、ＩＡＡ添加後２４時間の二重形質転換細胞の４種のコロニーからウェスタンブロットにより展開した結果を示している（レーン４−７）。レーン１−３は種々の量のモノクローナルγ鎖比較であり、レーン８及び９はそれぞれ未形質転換細胞抽出物及びｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１形質転換細胞抽出物である。他の定量分析に於いて、Ｅ．１．１０（下記）に従って増殖させた凍結形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／β−メルカプトエタノール細胞溶菌緩衝液中で１００℃にて加熱することにより溶菌させた。１部を種々の量のハイブリドーマ抗−ＣＥＡを加えたレーンに隣接するＳＤＳポリアクリルアミドゲルに加えた。このゲルをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社からのＩ１２５−標識したヒツジ抗−ネズミＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロット（Ｂｕｒｎｅｔｔ，上記）により展開させた。これら結果を図２９に示す。この図は、Ｅ．ｃｏｌｉ産生物が標準ハイブリドーマ鎖と共に移動することを示し、Ｅ．ｃｏｌｉに於ける検出し得る蛋白質分解を示さない。哺乳動物細胞からのＨ鎖はＥ．ｃｏｌｉ材料よりも前者がグリコシル化されているため僅かに重いと予想される。ハイブリドーマレーンを標準として使用し、Ｈ鎖及びＬ鎖の産生につき次の推定を行なった：
【０１３１】
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【０１３２】
Ｅ．１．１０．組換κ鎖及びγ鎖からの抗体の再編成
再編成用のＨ鎖及びＬ鎖調製物を得るため、形質転換細胞を大型バッチで増殖させ、収穫し、凍結させた。種々形質転換させた細胞の増殖条件は次の通りとした：
【０１３３】
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｗ３１１０／ｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊）を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地に接種し、回転振盪器で８時間増殖させた。次いで、培養物を酵母栄養分、塩、グルコース及び２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０ｌの発酵培地に移した。増殖の際にグルコースを追加し、ＯＤ５５０＝２０にてインドールアクリル酸（ＩＡＡ）、即ち、ｔｒｐデプレッサーを５０μｇ／ｍｌの濃度まで加えた。細胞に追加グルコースを最終ＯＤ５５０＝４０まで供給し、これはＩＡＡを加えてから約６時間で達成された。
【０１３４】
ｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊で形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ（Ｗ３１１０）細胞とｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊△及びｐγＣＥＡＩｎｔ２で二重形質転換させたものとを上記と同様に増殖させた。但し、ＩＡＡ添加後６時間に於ける収穫時のＯＤ５５０は２５−３０であった。
次いで、これらの細胞を遠心分離により収穫し凍結した。
【０１３５】
Ｅ．２．再編成抗体の分析方法
抗−ＣＥＡ活性を再編成の成功に対する基準としてＥＬＩＳＡにより測定した。マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ社製）のウェルにＣＥＡを飽和させ、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．３）中の２〜５μｇＣＥＡ／ｍｌ溶液１００μｌを室温で１２時間培養することにより行なった。次いで、これらのウェルを燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で４回洗浄し、ＰＢＳに於ける０．５％ＢＳＡ２００μｌを３７℃で２時間培養し、ＰＢＳで４回洗浄することによりＢＳＡで飽和させた。５０μｌの各試料を各ウェルに加えた。ＰＢＳに於ける０．５％ＢＳＡ中１０μｇ，５μｇ、５００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの抗−ＣＥＡ／ｍｌの５０μｌ試料と、ブランクとしてのＰＢＳに於ける０．５％ＢＳＡ５０μｌのみとから成る標準曲線（図３０に示す）を作成した。全ての試料をプレート中で３７℃にて９０分間培養した。
【０１３６】
次いで、これらのプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ヒツジ抗−ネズミＩｇＧ−アルカリホスフェート（ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．）をＰＢＳに於ける０．５％ＢＳＡ中の２４ユニット／ｍｌの酵素濃度１０μｌを加えることにより各ウェルに施した。この溶液を３７℃にて９０分間培養した。これらプレートをＰＢＳで４回洗浄した後、基質へエタノールアミン緩衝塩（ｐＨ９．５）に於けるｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）の０．４ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌを加えた。この基質を３７℃にて９０分間培養した発色させた。
【０１３７】
各ウェルのＡ４５０を１．５の閾域、１．０の較正値及び０．０００１に設定したＰＢＳ（Ｂｌａｎｋ）ウェルに於ける０．５％ＢＳＡにセットしたマイクロエリサ・オート・リーダー（Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ  Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）により読み取った。Ａ４５０のデータをＶＡＸ系に於けるＲＳ−１で表にし、標準曲線データを４パラメータのロジスチックモデルに当てはめた。未知試料の濃度をＡ４５０データに基いて算出した。
【０１３８】
Ｅ．３．組換抗体の再編成及び分析
上記Ｅ．１．１０に記載したように、作成した凍結細胞を冷溶菌緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））に於いて解凍させ、音波処理で溶菌させた。溶菌物を３，０００ｒｐｍにて２０分間の遠心分離により部分清澄化させた。１ｍＭＰＭＳＦを追加して蛋白質分解酵素から上清を保護し、直ちに使用するか又は−８０℃で凍結保存した。凍結溶菌物は、決して２回以上解凍させなかった。
【０１３９】
Ｅ．ｃｏｌｉで産生した抗−ＣＥＡＨ鎖（γ）のＳ−スルホン化物を次のように作成した：
不溶性物体としてＨ鎖を含有するｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊で形質転換させた組換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を溶菌し、上記と同様に遠心分離した。ペレットを同じ緩衝液中に再懸濁させ、音波処理し、再遠心分離した。このペレットを緩衝液で１回洗浄し、６Ｍグアニジン塩酸塩，０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍｇ／ｍｌ亜硫酸ナトリウム及び１０ｍｇ／ｍｌテトラチオン酸ナトリウムに懸濁させ、２５℃にて約１６時間反応させた。反応混合物を８Ｍ尿素，０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）に対し、透析し、４℃で貯蔵してγ−ＳＳＯ３の３ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。
【０１４０】
各種のＩｇＧ鎖を産生する各種のＥ．ｃｏｌｉ菌株の細胞から得られる細胞溶菌物６５０μｌを５００ｍｇの尿素に加えた。これに２０ｍＭまでのβ−メルカプトエタノールと５０ｍＭまでのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）と、１ｍＭまでのＥＤＴＡとを加え、また或る実験ではγ−ＳＳＯ３を０．１ｍｇ／ｍｌまで加えた。２５℃で３０〜９０分間静置した後、この反応混合物を４℃にて０．１Ｍグリシン酸ナトリウム（ｐＨ１０．８），０．５Ｍ尿素，１０ｍＭグリシンエチルエステル，５ｍＭ還元グルタチオン，０．１ｍＭ酸化グルタチオンから成り、緩衝液に対して透析した。この緩衝液をＮ飽和した水から調製し、透析を蓋付ウィートン瓶にて行なった。１６〜４８時間後、透析袋を１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する４℃の燐酸塩緩衝液に移し、更に１６〜２４時間透析を続けた。透析物をＥ．２に記載したようにＣＥＡを結合する能力につきＥＬＩＳＡによって分析した。下記の結果は標準曲線と比較して得られた数値をｎｇ／ｍｌ抗−ＣＥＡとして示す。更に、ＥＬＩＳＡ反応マイナスκ鎖のみを産生する細胞のバックグラウンド（１０８ｎｇ／ｍｌ）から、及び反応混合物に於けるγ及びκ鎖のレベルの推定値から計算した再編成効率をも示す。
【０１４１】
0003559795.tif 000005
【０１４２】
Ｅ．４．キメラ抗体の作成
図３１及び図３２はネズミ抗ＣＥＡ可変領域とヒトγ２不変領域とから成るキメラＨ（γ）鎖のための発現ベクターの作成を示している。
【０１４３】
ヒトγ２Ｈ鎖をコード化するＤＮＡ配列は次のように作成される：ヒト多発性骨髄腫細胞系から標準技術により得たｃＤＮＡライブラリーを５’ＧＧＧＣＡＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡ３’で検索して、ヒトγ２鎖に対するｃＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを得（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：６７１（１９８２））（この文献を引用して本明細書に包含する）、分析してヒトγ２に於ける公知配列によりこれを同定する（Ｊ．Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，７９：１９８４（１９８２））（この文献を引用して本明細書に包含する）。
【０１４４】
図３１に示したように、クローン化ヒトγ２プラスミド（ｐγ２）から２つの断片が得られる。第１の断片は、ＰｖｕＩＩによる消化に続きＡｖａＩＩＩでの消化及び不変領域の部分を勧誘する小さいＤＮＡ断片の６％ＰＡＧＥを用いる精製によって生ぜしめる。第２の断片は、ｐγ２をγ２の３’未翻訳領域に於いて開裂する（ヌクレオチド配列から推定される）制限酵素で消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰを充填し、ＡｖａＩＩＩで開裂させて、６％ＰＡＧＥを用いて小さい方の断片を単離することにより得られる。（ＰｖｕＩＩ−３’未翻訳断片を供給するための２工程且つ２断片の組成物の選択は、３末端に対しＡｖａＩＩＩ部位が近接するため産生物に対する明確な経路を与え、従って３’未翻訳領域部位に適合する遺伝子配列に於ける制限部位を更に必要としない。）ｐγＣＥＡ２０７−１をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで処理して付着性末端充填し、ＰｖｕＩＩで消化し、この場合大きいベクター断片は６％ＰＡＧＥにより単離されたプロモーターを含有する。
【０１４５】
ネズミγ１遺伝子に於けるＰｖｕＩＩ部位を包囲する位置及びＤＮＡ配列は、ヒトγ２遺伝子に於けるＰｖｕＩＩ部位を包囲する位置及びＤＮＡ配列と同一である。
【０１４６】
上記断片の３方向結合から得られるプラスミド（ｐＣｈｉｍ１）は、ｔｒｐプロモーターの影響下で、ネズミ抗−ＣＥＡγ１鎖の可変領域及び不変領域の１部並びにγ２ヒト鎖の１部を含有する。事実、ｐＣｈｉｍ１は、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させた場合、キメラＨ鎖を発現するが、ネズミからヒトへの変化は可変領域対不変領域の接合部に於いて生じないものである。
【０１４７】
図３２は発現により生ずる蛋白質がネズミ抗−ＣＥＡ抗体からの可変領域とヒトγ２鎖からの不変領域とを含有するようにｐＣｈｉｍ２を作成するためのｐＣｈｉｍ１の改変を示している。まず、ＮｃｏＩで処理し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで平滑末端化させ、ＰｖｕＩＩにより開裂させ、ネズミ抗−ＣＥＡに対する一定コード化領域に於ける短セグメントを除き、殆んど完全プラスミドである大型ベクター断片を単離することにより、ｐＣｈｉｍ１から断片を作成する。ＰｖｕＩＩで処理し、可変領域で開裂する任意の制限酵素で処理し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで平滑末端化し、この連鎖の可変領域と不変領域との間の接合部から成る短い断片を単離することにより、上記のｐγ２から第２の断片を作成する。
【０１４８】
上記２つの断片を結合すれば、中間的プラスミドが得られ、このプラスミドはネズミ抗−ＣＥＡ抗原の不変領域の小部分と、ヒトγ鎖の可変領域の小部分とを含有する外来ＤＮＡ断片以外には正確である。この修復はＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩの断片を切断しＭｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１）に記載されたＭ１３ファージ中へクローン化させ、次いでＡｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）に記載されたように試験管内に於ける部位指向性の削除突然変異によって行なった。このように改変させたＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩ断片を再び中間プラスミドに結合してｐＣｈｉｍ２を生成させる。このプラスミドは適当な宿主に於いて、明確に作成されたネズミ可変領域／ヒト不変領域キメラＨ鎖を発現することができる。
【０１４９】
同様にして、γ鎖でなくヒトκ鎖に対するｃＤＮＡ作成のためのｍＲＮＡ鋳型を使用してキメラＬ鎖のための発現プラスミドを作成する。
【０１５０】
次いで、上記２つのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に二重形質転換させ、これら細胞を増殖させ、上記Ｅ．１−Ｅ．３に示したように連鎖を再編成する。
【０１５１】
Ｅ．５．改変ネズミ抗−ＣＥＡ抗体の作成
Ｅ．５．１．改変ネズミ抗−ＣＥＡＨ鎖遺伝子の直接発現用プラスミドベクターの作成
ネズミ抗−ＣＥＡＨ鎖の不変領域に於けるアミノ酸２１６−２３０の区域のシステイン残基及び得られるジスルフィド結合は、補体結合に対し重要であると思われる（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：５２４（１９８１））が、得られる抗体の抗原結合性にとっては重要でない。本発明の方法による再編成の際、不正確なジスルフィド結合形成の可能性を減少させるため、３個のシステインに対するコドンを含むアミノ酸残基２３６−２３２をコードするヌクレオチドを次のようにして欠失する：
【０１５２】
「デリーター（ｄｅｌｅｔｅｒ，欠失剤）」デオキシオリゴヌクレオチド即ち５’ＣＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＧＧＴを使用して、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１３９６（１９８０）の方法又はＡｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，２：１８３（１９８３）の方法によってｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊から遺伝子の適切な部分を欠失させる。要するに、「デリーター」デオキシオリゴヌクレオチドを変性ｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊ＤＮＡと共にアニールし、プライマー修復合成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ない、次いでＰ３２標識したデリーター配列と推定欠失クローンとのハイブリゼーションにより選別（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）する。
【０１５３】
Ｅ．５．２．システイン欠如改変抗体の産生
Ｅ．５．１．で作成したプラスミドを用いて、上記のように予めｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ菌株を形質転換する。これら細胞を増殖させ、組換抗体鎖を抽出し、Ｅ．１．１０．に記載したように改変抗体を再編成する。
【０１５４】
Ｅ．６．Ｆａｂの作成
Ｅ．６．１．ネズミ抗−ＣＥＡγ１Ｆａｂ断片遺伝子の直接発現用プラスミドベクターの作成：ｐγＣＥＡＦａｂｔｒｐ２０７−１＊
図３３はｐγＣＥＡＦａｂｔｒｐ２０７−１＊の作成を示している。５μｇのｐＢＲ３２２をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで処理して付着性末端を平滑化し、ＰｓｔＩで消化し、ＢＡＰで処理した。大ベクター断片、即ち断片Ｉを６％ＰＡＧＥを用い、電気溶出することにより回収した。
【０１５５】
５μｇのｐγＣＥＡｔｒｐ２０７−１をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩの両者で消化し、ｔｒｐプロモーターと、可変領域をコードし不変領域まで続き更に抗−ＣＥＡγ１鎖のヒンジ領域まで続く遺伝子配列とを含有する約１５７０ｂｐのＤＮＡ断片（断片ＩＩ）を単離し、電気泳動の後に精製した。
【０１５６】
完全Ｈ鎖でなく、抗−ＣＥＡγ１鎖Ｆａｂ断片が発現されるためには、停止コドンが遺伝子中の適当な位置に作成されることが必要である。このため、２０μｇのｐγ２９８から２６０ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ  ＤＮＡ断片を単離し、精製した。１３ヌクレオチドＤＮＡプライマー、即ちその相補鎖がＦａｂ遺伝子の最後の３個のＣ−末端アミノ酸と停止コドンに対し必要とされる３個のうち２個の塩基とをコードするものをホスホトリエステル法（上記）によって合成した。このプローブはヌクレオチド７５４−７６７（図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４）にハイブリダイズし、これは次の配列を有する：
0003559795.tif 000006
【０１５７】
停止コドンの第３塩基を上記のｐＢＲ３２２開裂物の充填ＨｉｎｄＩＩＩ部位の末端ヌクレオチドにより供給する。このプライマー５００ｎｇを、２０μｌ中に０．５ｍＭのＡＴＰを含有する１０ユニットのＴ４ＤＮＡキナーゼを用いる反応液中の５’末端の燐酸化によりプライマー修復反応に使用し、これを約２００ｎｇのＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ  ＤＮＡ断片と混合した。混合物を９５℃で３分間加熱変性させ、ドライアイスエタノール中で急冷した。この変性したＤＮＡ溶液を６０ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４），１２ｍＭの各ｄＮＴＰとなし、１２ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ−大断片を加えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、このプライマー修復反応物をフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱し、ＢａｍＨＩで消化し、反応物を６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。１８１ｂｐ平滑末端−ＢａｍＨＩのＤＮＡ断片、即ち断片ＩＩＩの約５０ｎｇを単離し、精製した。
【０１５８】
約１００ｎｇの断片Ｉとそれぞれ約１００ｎｇの断片ＩＩ及びＩＩＩを１晩結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４に形質転換した。数種のテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを適正な構成のものにつき分析し、修復平滑末端充填ＨｉｎｄＩＩＩ接合部を介するヌクレオチド配列を決定してＴＧＡ停止コドンを証明した。
【０１５９】
Ｅ．６．２．Ｆａｂ蛋白質の産生
Ｅ．６．１で作成したプラスミドを上記のように予めｐＫＣＥＡｔｒｐ２０７−１＊で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ菌株を形質転換する。これら細胞を増殖させ、組換抗体鎖につき抽出し、Ｆａｂ蛋白質をＥ．１．１０に記載したように再編成する。
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫グロブリンの一般的構造図を示す図である。
【図２】κ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐＫ１７Ｇ４のｃＤＮＡ挿入物の詳細な配列を示す図である。
【図３】κ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐＫ１７Ｇ４のｃＤＮＡ挿入物の詳細な配列を示す図である。
【図４】κ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐＫ１７Ｇ４のｃＤＮＡ挿入物の詳細な配列を示す図である。
【図５】κ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐＫ１７Ｇ４のｃＤＮＡ挿入物の詳細な配列を示す図である。
【図６】対応するアミノ酸配列と共に示した図２、図３、図４および図５の断片のコード配列を示す図である。
【図７】対応するアミノ酸配列と共に示した図２、図３、図４および図５の断片のコード配列を示す図である。
【図８】対応するアミノ酸配列と共に示した図２、図３、図４および図５の断片のコード配列を示す図である。
【図９】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１０】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１１】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１２】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１３】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１４】γ抗ＣＥＡ鎖をコードするｐγ２９８及びｐγ１１のｃＤＮＡ挿入物の結合詳細配列を示す図である。
【図１５】図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４の断片によりコードされた対応アミノ酸配列を示す図である。
【図１６】図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４の断片によりコードされた対応アミノ酸配列を示す図である。
【図１７】図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４の断片によりコードされた対応アミノ酸配列を示す図である。
【図１８】図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４の断片によりコードされた対応アミノ酸配列を示す図である。
【図１９】図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４の断片によりコードされた対応アミノ酸配列を示す図である。
【図２０】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２１】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２２】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２３】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２４】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２５】κ及びγ抗−ＣＥＡ鎖に対する発現ベクターの作成概略を示す図である。
【図２６】γ鎖，κ鎖及びこれら両者に対する遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ抽出物につき行なったサイジングゲル操作の結果を示す薄膜上に形成された微細なパターンを表している写真である。
【図２７】γ鎖，κ鎖及びこれら両者に対する遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ抽出物につき行なったサイジングゲル操作の結果を示す薄膜上に形成された微細なパターンを表している写真である。
【図２８】γ鎖，κ鎖及びこれら両者に対する遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ抽出物につき行なったサイジングゲル操作の結果を示す薄膜上に形成された微細なパターンを表している写真である。
【図２９】図２６、図２７および図２８と同様に形質転換された細胞抽出物のウェスタンブロットの結果を示す薄膜上に形成された微細なパターンを表している写真である。
【図３０】抗ＣＥＡ活性のＥＬＩＳＡ分析に対する標準曲線図である。
【図３１】キメラＨ鎖をコードする遺伝子の発現に対するプラスミドの作成図である。
【図３２】キメラＨ鎖をコードする遺伝子の発現に対するプラスミドの作成図である。
【図３３】Ｈ鎖のＦａｂ領域をコードする遺伝子の発現に対するプラスミドの作成図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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