(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロコッカス  フリオサスに属する菌株より得られる、下記の理化学的性質を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）作用及び基質特異性
鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的なデオキシヌクレオシド  ５′−１リン酸を導入する反応を触媒する。
本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸を必要とする。
ジデオキシチミジン  ５′−３リン酸に対して感受性を示す。
（２）熱安定性
ｐＨ７．５において、９０℃、３０分の処理では活性の低下は認められない。
（３）至適温度
ｐＨ７．５において、３７℃〜９０℃の測定範囲で活性を有し、至適温度は約８０℃である。
（４）至適ｐＨ
７５℃でトリス塩酸緩衝液の緩衝能の範囲であるｐＨ６．５から８．９において活性を有し、その至適ｐＨは約８である。
（５）アフィジコリンにより阻害を受けない。
【請求項２】
ピロコッカス属に属する菌体を培養し、培養物より請求項１に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子解析用として有用なＤＮＡポリメラーゼ、更に詳細に説明すればピロコッカス（Pyrococcus) 属に属する菌体由来の耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡポリメラーゼは、そのアミノ酸配列から大きく４つのファミリーに分類することができる。その中でこれまで遺伝子工学用試薬として一般に利用されているＤＮＡポリメラーゼは、主として大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩに代表されるファミリーＡ（ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ）と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIやヒトＤＮＡポリメラーゼαに代表されるファミリーＢ（α型ＤＮＡポリメラーゼ）である。ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が開発されて以来、耐熱性を示すＤＮＡポリメラーゼが注目されているが、最近超耐熱性古細菌由来のα型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが発見された。それらはジーン（Gene) 、第１０８巻、第１〜６頁（１９９１）やプロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 、第８９巻、第５５７７〜５５８１頁（１９９２）に記載されており、ＰＣＲ法に適した酵素として市販されている。
上記の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配列から、いずれもα型ＤＮＡポリメラーゼであり、ジデオキシヌクレオシド  ５′−３リン酸感受性が低いため塩基配列決定法の１つであるジデオキシ法には汎用されない。一方、現在ジデオキシ法に利用されているものは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼ修飾体、サーマスアクアティカスＤＮＡポリメラーゼ、バチルスカルドテナックスＤＮＡポリメラーゼなどすべてジデオキシヌクレオシド  ５′−３リン酸に感受性のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ジデオキシ法でシークエンシングを行う場合、高温で反応できる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは鋳型の２次構造形成の問題も少なく、また反応をＰＣＲ法のように繰返すことでシグナル強度を上げるサイクルシークエンシングも可能である。本発明の目的は、ジデオキシ法による遺伝子解析に有用な新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はピロコッカス  フリオサスに属する菌株より得られる、下記の理化学的性質を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
（１）作用及び基質特異性
鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的なデオキシヌクレオシド  ５′−１リン酸を
導入する反応を触媒する。
本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸を必要とする。
ジデオキシチミジン  ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ) に対して感受性を示す。
（２）熱安定性
ｐＨ７．５において、９０℃、３０分の処理では活性の低下は認められない。
（３）至適温度
ｐＨ７．５において、３７℃〜９０℃の測定範囲で活性を有し、至適温度は約８０℃である。
（４）至適ｐＨ
７５℃でトリス塩酸緩衝液の緩衝能の範囲であるｐＨ６．５から８．９において活性を有し、その至適ｐＨは約８である。
（５）アフィジコリンにより阻害を受けない。
また本発明の第２の発明は第１の発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関する発明であって、ピロコッカス属に属する菌体を培養し、培養物より第１の発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする。
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決するため、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで従来の超耐熱性古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが属するαタイプとは異なり、かつシークエンシングに有用な耐熱性ポリメラーゼを見出すことを目的として、鋭意研究を重ねた結果、ピロコッカス属に属する菌株から、よりｄｄＴＴＰ感受性の高い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見出すことに成功した。
すなわち、本発明はαタイプポリメラーゼが感受性を示すアフィジコリン（Aphidicolin)には耐性で、しかも塩基配列決定の１つの手段であるジデオキシ法に有用なｄｄＴＴＰに対して他の耐熱性ポリメラーゼより高い感受性を有する耐熱性ポリメラーゼ、及びその製造方法に関する。
【０００６】
本発明の酵素を生産する菌株としては、ピロコッカス属に属する菌株、例えばピロコッカス  フリオサス（ Pyrococcus furiosus )ＤＳＭ  ３６３８が挙げられ、該菌株はドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウントツェルクルチェウレンＧｍｂＨより入手可能である。該菌株を適当な増殖培地中で培養し、次いで、培養物より本発明の酵素を得ることができる。
【０００７】
以下、ピロコッカス属の菌株を例として説明する。
本発明の酵素を製造するに当っては、通常の超耐熱性菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであればよい。炭素源としては、例えばでんぷん等が利用でき、窒素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が利用でき、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよい。また例えば、本発明の実施例におけるごとく培地の調製に人工海水を用いることが有利である。また、培地は固形の硫黄元素を含んでいない透明な培地が望ましく、該培地を用いれば、菌体の増殖は光学密度を測定することにより容易に監視することができる。培養に当っては、静置培養又はかくはん培養で行うことができるが、例えば特表平４−５０３７５７号公報に記載のごとく、通気培養を行ってもよいし、例えばアプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー（ Appl. Env. Microbiol. )、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１９９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。一般に培養温度は、９５℃前後が好ましく、通常７．５時間程度で本発明のＤＮＡポリメラーゼが培養物中に蓄積する。
培養条件は、使用する菌体、培地組成に応じ本発明のＤＮＡポリメラーゼの生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
【０００８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼを採取するに当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過などによって菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素処理等があり、これらの方法を利用して菌体中より本発明のＤＮＡポリメラーゼを抽出することができる。
なお、酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽出効果の高い方法を採用して粗酵素液を調製すればよい。かくして得られた粗酵素液からＤＮＡポリメラーゼを単離するに当っては、通常の酵素の精製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等の方法を組合せて使用できる。
【０００９】
例えば、ピロコッカス  フリオサスＤＳＭ  ３６３８の培養菌体より調製される粗酵素液のフラクトゲルＴＭＡＥ（メルク社製）クロマトグラフィー、ホスホセルロースＰ−１１（ワットマン社製）クロマトグラフィー、ハイトラップヘパリン（ファルマシア社製）クロマトグラフィー、セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）クロマトグラフィー等を行うことにより、本発明のＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。
【００１０】
次に本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの理化学的性質について述べる。
（１）作用及び基質特異性
鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にジオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的なデオキシヌクレオシド  ５′−１リン酸を導入する反応を触媒する。
本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオシド  ５′−３リン酸を必要とする。
また、ジデオキシチミジン  ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ）に対して感受性を示し、α型のＤＮＡポリメラーゼではない。
【００１１】
（２）酵素活性測定方法
２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８、２４℃にての値）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．１％  トリトンＸ−１００、０．０１％  ＢＳＡ、４０μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０μＭ  〔 3Ｈ〕ＴＴＰ
上記液に最終濃度が０．２ｍｇになるように活性化した仔牛胸腺ＤＮＡを加えオートクレーブ水を反応液の全量が１００μｌになるように加える。この反応液に酵素液を添加し、ゆるやかに混和後、７５℃で７．５分間加温する。
反応終了後、速やかに氷づけにした後、ＤＥペーパー（ワットマン社製）にてろ過を行う。フィルターを５％リン酸水素２ナトリウムにて洗浄し、液体シンチレーションカウンタにて、フィルター上の〔 3Ｈ〕を測定し、酸不溶性画分への〔 3Ｈ〕ＴＴＰの取り込み量を計算する。
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性の表示は上記条件下で３０分間に１０ｎｍｏｌのＴＴＰの酸不溶画分への取り込みを１単位（Ｕ）とする。
【００１２】
（３）至適ｐＨ
本発明のＤＮＡポリメラーゼの反応へのｐＨの影響を求めた。
測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液をｐＨ６．５〜８．９に調製したものをそれぞれ用い（２）に示す条件下で７．５分反応させた。
本酵素は図１に示すごとく、約ｐＨ８で最大活性を示した。すなわち、図１は本発明により得られる酵素の至適ｐＨを示す図であり縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
【００１３】
（４）至適温度
測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、（２）に示す反応条件下で種々の温度で７．５分間反応を行った。
本酵素は図２に示すようにｐＨ７．５において３７℃〜９０℃の範囲で活性があり、その至適温度は約８０℃であった。すなわち図２は本発明により得られる酵素の至適温度を示す図であり縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
【００１４】
（５）熱安定性
測定には（２）に示す反応溶液から基質を除いたものに１００ｍＵの本酵素を加え９０℃で３０分間処理した後、基質を加えて残存する酵素活性を測定した。図３に示すとおり、ｐＨ７．５において本酵素は活性の低下を認めなかった。すなわち、図３は、本発明により得られる酵素の熱安定性を示し、縦軸は残存活性（％）、横軸には熱処理時間（分）を表す。
図中白丸印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中×印は対照のタックポリメラーゼ（アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、パーキンエルマー社製）の活性を示す。
タックポリメラーゼの活性は同様の処理により３５％の低下が認められた。
【００１５】
（６）至適Ｍｇ2+濃度
本酵素はＭｇ2+を要求する。本酵素１００ｍＵを用い（２）に示す反応条件の内ＭｇＣｌ2 濃度を終濃度２〜５０ｍＭで変化させそれぞれ７．５分間反応を行った。
本酵素は図４に示すごとく、至適ＭｇＣｌ2 濃度は約１０ｍＭであった。すなわち、図４は本発明により得られる酵素の活性とＭｇＣｌ2 濃度の関係を示し、縦軸は相対活性（％）を、横軸はＭｇＣｌ2 濃度（ｍＭ）を示す。
【００１６】
（７）至適塩濃度
本酵素１００ｍＵを用いて（２）に示す反応条件に終濃度５〜１００ｍＭのＮａＣｌを添加し、７．５分間反応を行った。
本酵素は、図５で示す通り０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌで活性を有し、中でも５０〜７５ｍＭ  ＮａＣｌ付近が最も活性が高かった。すなわち、図５は本発明により得られる酵素の活性とＮａＣｌ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はＮａＣｌ濃度（ｍＭ）を示す。
【００１７】
（８）アフィジコリン感受性
α型ＤＮＡポリメラーゼの共通の性質としてそのＤＮＡ合成がアフィジコリン感受性であることが挙げられる。
本酵素は図６で示す様に（２）に示す反応条件下に本酵素を１００ｍＵ用いてアフィジコリンの終濃度が０．５〜４ｍＭになるよう添加したところ、アフィジコリン耐性でありα型ＤＮＡポリメラーゼの特徴を有さない。すなわち図６は本発明により得られる酵素の活性とアフィジコリン濃度を示し、縦軸は、相対活性（％）を横軸はアフィジコリン濃度（ｍＭ）を示す。
図中、白丸印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印は対照のピロコッカス  フリオサスのα型ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）の活性を示す。
α型のＤＮＡポリメラーゼ活性はアフィジコリンの添加量に伴い減少するが、本発明のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は影響されない。
【００１８】
（９）Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）感受性
測定には（２）に示す反応条件下に１００ｍＵの本酵素を用い、終濃度０．５〜４ｍＭになるようにＮＥＭを加え、７．５分間反応させた。
本酵素は図７で示す通り、ＳＨ基修飾試薬であるＮＥＭに対して強い感受性を示した。すなわち、図７は本発明により得られる酵素の活性とＮＥＭ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はＮＥＭ濃度（ｍＭ）を示す。
図中、白丸印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印は対照のピロコッカス  フリオサスのα型ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）の活性を示す。
本発明の酵素はＮＥＭによって酵素活性が阻害される。
【００１９】
（１０）ｄｄＴＴＰ感受性
測定には、（２）に示す反応条件下に１００ｍＵの本酵素を用い、終濃度１０〜４００μＭになるように添加して７．５分間反応させた。
本酵素は図８に示す通り、ｄｄＴＴＰに高感受性を示す。すなわち、図８は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性とｄｄＴＴＰ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性（％）を横軸はｄｄＴＴＰ濃度（μＭ）を示す。
図中、白丸印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中×印は前出のアンプリタックＤＮＡポリメラーゼの活性を示す。
タックポリメラーゼ活性のｄｄＴＴＰによる影響は明らかに本酵素が受ける影響より弱く、本発明の酵素はｄｄＴＴＰにより感受性が高い。
【００２０】
以上、詳細に説明したように本発明により新規ＤＮＡポリメラーゼ及びその製造方法が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼは耐熱性が高く、かつｄｄＴＴＰ高感受性であり、種々の遺伝子操作実験、特に高温下におけるジデオキシ法による遺伝子解析に好適である。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
ピロコッカス  フリオサス  ＤＳＭ  ３６３８の培養は以下の通りに行った。トリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、可溶性でんぷん１．０％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ4   ０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ4 ０．０００１％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ4   ０．０００１％、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2   ０．１ｐｐｍ、Ｈ3 ＢＯ3   ０．１ｐｐｍ、Ｎａ2 ＭｏＳＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ  ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ  ０．２５ｐｐｍの組成の培地１０リットルを５本の２リットル容のメディウム瓶に分注し、１２１℃、１５分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酸素を除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、遠心分離により集菌した。
次に、集菌体を１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
超音波破砕機にて３０秒間、５回処理し、遠心分離してその上清液を得た。上清液を硫安塩析後、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、緩衝液Ａとする）に対して透析した。この透析液を緩衝液Ａにて平衡化したフラクトゲルＴＭＡＥ（メルク社製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ溶出画分にＤＮＡポリメラーゼ活性を得た。活性画分を１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、緩衝液Ｂとする）に対して透析した。この透析液を緩衝液Ｂにて平衡化したホスホセルロースＰ−１１（ワットマン社製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂにて平衡化したハイトラップヘパリン（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ溶出画分中のポリメラーゼ活性画分を濃縮した。その活性画分を１０ｍＭ  ２−ＭＥ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにてゲルろ過を行い、約１０ＵのＤＮＡポリメラーゼを得た。
【００２３】
【発明の効果】
本発明では、よりジデオキシヌクレオシド  ５′−３リン酸に高感受性を示す新規耐熱性ポリメラーゼが得られた。本酵素は遺伝子塩基配列の解析、その他遺伝子操作実験において有効に利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度を示す図である。
【図３】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示す図である。
【図４】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適ＭｇＣｌ2 濃度を示す図である。
【図５】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適ＮａＣｌ濃度を示す図である。
【図６】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアフィジコリン感受性を示す図である。
【図７】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＮ−エチルマレイミド感受性を示す図である。
【図８】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＴＴＰを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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