(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（II）の化合物
0003580825.tif 000012
（式中、Ｒはアルキル基である）
を、Beauveria、Candida、Kluyveromyces、TorulasporaまたはPichiaが産生する還元酵素の特性を有する還元酵素を用いて選択的に還元することにより、式（III）の化合物
0003580825.tif 000013
（式中、Ｒはアルキル基である）
を製造する方法。
【請求項２】
式（II）の化合物を、Beauveria bassiana、Pichia pastoris、Pichia haplophila、Pichia membranefaciens、Candida humicola、Candida solani、Candida diddensiae、Candida friedrichii、Kluyveromyces drosophilarum、Torulaspora hanseniiまたはPichia angustaが産生する還元酵素の特性を有する還元酵素を用いて選択的に還元することにより式（III）の化合物を製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元酵素がBeauveria、Candida、Kluyveromyces、TorulasporaまたはPichiaから得られる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
選択的還元に際して、還元酵素がBeauveria、Candida、Kluyveromyces、TorulasporaまたはPichiaの全細胞の存在により供給される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
還元酵素がPichiaの産生するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
還元酵素がPichia haplophilaまたはPichia angustaの産生するものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記還元酵素を産生する生物の全細胞の存在下に、該生物のための炭素源を含有する栄養培地中で実施される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
窒素源およびリン源ならびに微量元素が存在する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
好気性条件下で実施される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
式（II）の化合物
0003580825.tif 000014
（式中、Ｒはアルキル基である）
を、Candida pelliculosa、Neurospora crassa、Pichia trehalophila、または好ましくはHansenula anomolaが産生する還元酵素の特性を有する還元酵素を用いて選択的に還元することにより、式（IV）の化合物
0003580825.tif 000015
（式中、Ｒはアルキル基である）
を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はケトン基の還元に関する。
Brower et al.Tetrahedron Letters 1992,p.2279−2282から、式
0003580825.tif 000002
の化合物が、式
0003580825.tif 000003
の化合物をChen et al.Tetrahedron Letters 1987 28 155およびChem Lett 1987 1923の方法でジアステレオ選択的に還元し、次いでアセトニドとして保護することにより製造することは知られている。交差クライゼン法により化合物（Ｉ）を得ることも報告された。これらの経路は−90℃の温度を採用し、このためそれらの方法は経費のかかる不便なものとなっている。
化合物（Ｉ）はCI−981、すなわちヒトにおいて全血漿中および低密度リポタンパク質中のコレステロールを低下させるHMG  CoA還元酵素阻害薬の合成における中間体として使用できる。その重要な構造は次式の化合物からも誘導できる。
0003580825.tif 000004
上記式において、Ｒはアルキル基、好ましくは１〜６個の炭素原子をもつもの、より好ましくはｔ−ブチル基である。
本発明者らは、Beauveria、Pichia、Candida、KluyveromycesおよびTorulaspora属の菌種間に一般に見られるケトン還元酵素を用いると、化合物（II）を中程度ないし高い選択率で、かつ好都合な温度において還元して化合物（III）を製造しうることを見出した。ただしそれぞれの種において例外が生じることがあり、または酵素が逆の立体特異性のひとつを伴う可能性がある。
したがって本発明は、式（II）の化合物
0003580825.tif 000005
を、Beauveria、好ましくはBeauveria bassiana、Pichia、好ましくはPichia pastoris、haplophilaまたはmembranefaciens、Candida、好ましくはCandida humicola、solani、diddenssiaeまたはfriedrichii、Kluyveromyces、好ましくはKluyveromyces drosophilarum、またはTorulaspora、好ましくはTorulaspora hansenii、好ましくはPichia angustaから選択される微生物が産生する還元酵素の特性を有する還元酵素を用いて選択的に還元することにより、式（III）の化合物を製造することを包含する。
また本発明は、式（II）の化合物を、前記の微生物、好ましくはBeauveria bassiana、Pichia pastoris、Pichia haplophila、Pichia membranefaciens、Candida humicola、Candida solani、Candida diddensiae、Candida friedrichii、Kluyveromyces drosophilarum、Torulaspora hanseniiまたは好ましくはPichia angustaの全細胞または抽出物を用いて選択的に還元することにより、式（III）の化合物を製造することを包含する。
本発明は好ましくは生物の全細胞を用いて実施される。これにより、目的酵素を分離する必要がなくなり、反応に必要な補因子が供給されるからである。
上記の種をいずれも使用できるが、高い転化率および高い選択性を得るためにはPichia haplophila、より好ましくはPichia angustaの酵素または全細胞を用いることが好ましい。
一般に補因子、普通はNAD（Ｐ）Ｈ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）および補因子を再生するための系、たとえばグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを、反応の誘導のために酵素を共に用いる。全細胞中には好適な補因子および還元機構が存在するので、好ましくは好適な炭素源を含有する栄養培地中の全細胞を用いるのが好ましい。炭素源には下記のうち１またはそれ以上が含まれる：糖、たとえばマルトース、スクロースまたは好ましくはグルコース、ポリオール、たとえばグリセリンもしくはソルビトール、クエン酸、または低級アルコール、たとえばメタノールもしくはエタノール。
全細胞を反応中に増殖させたい場合、窒素源およびリン源ならびに微量元素が培地中に存在しなければならない。これらは生物の培養に普通に用いられるものであってよい。
本方法は、増殖を支持しうる培地中で増殖している生物の培養物に、または好ましくは炭素源を含有するが、増殖に必要な栄養素の１つまたはそれ以上を欠如した培地中の生細胞懸濁液に、式IIの化合物を添加することにより実施できる。死細胞も、必要な酵素および補因子が存在する限り使用できる。必要ならばそれらを死細胞に添加してもよい。
所望により細胞を支持体に固定化し、これを好ましくは前記の好適な炭素源の存在下で、式IIの化合物と接触させてもよい。
pHは3.5〜９、たとえば４〜９、好ましくは最高6.5、より好ましくは最高5.5が好適である。４〜５のpHを用いるのがきわめて好適である。本方法は10〜50℃、好ましくは20〜40℃、より好ましくは25〜35℃の温度で実施するのが好適であろう。前記生物の生存全細胞が存在する場合、好気性条件下で操作するのが好ましい。標準温度および標準圧力で測定して、培地の容量当たり毎分0.01〜1.0容量の酸素通気速度を上記のpHおよび温度の条件下で用いるのが好適であるが、かなりの変更が可能であることは自明であろう。空気として酸素を供給してもよい。これを本方法と別個に行う場合にも、生物の増殖に際して同様なpH、温度および通気条件を採用できる。
精製した酵素は既知の手段で単離できる。好適には、破壊した細胞の懸濁液を遠心分離し、透明な溶液を細胞屑から分離し、たとえば好適には液体のイオン濃度を高めながらカラムから溶離するイオン交換クロマトグラフィーにより、および／またはイオン性物質、たとえば硫酸アンモニウムの添加による選択的沈殿により、この溶液から目的とする酵素を分離する。純度を高めるために、所望によりこのような操作を繰り返してもよい。
実施例１
式（III）の化合物の製造
41gの酵母および糸状菌用寒天を1Lの蒸留水に溶解し、オートクレーブで滅菌することにより調製したYM（オキソイド・カンパニー）寒天平板上で微生物を維持した。
液体培地中での増殖のために、下記組成のミネラル塩類培地200mlを入れた1Lのバフル付きフラスコに、寒天平板から１ループ（loopful）の微生物細胞を無菌的に移植した：（1L当たり）K2HPO4（1.9g）、NaH2PO4.2H2O（2.02g）、（NH4）2SO4（1.8g）、MgSO4.7H2O（0.2g）、FeCl3（0.97mg）および微量元素溶液（1ml）。微量元素溶液は（1L当たり）CuSO4.5H2O（0.02g）、MnSO4.4H2O（0.1g）、ZnSO4.7H2O（0.1g）およびCaCO3（1.8g）からなっていた。この最小培地に0.2％（w/v）の酵母エキスおよび2.25％（w/v）のグルコースを補充した。
微生物を28℃でオービタルシェーカーにより150rpmにおいて24〜48時間増殖させた。
10℃で7000rpmにおいて20分間遠心分離することにより微生物細胞を収穫した。この細胞ペレットを100mlの50mM硫酸ナトリウム緩衝液（pH6.4）に再懸濁し、上記に従って遠心分離することにより細胞を洗浄した。この細胞ペレットを最終的に50mlの上記緩衝液に再懸濁した。
250mlのバフル付きフラスコ内の細胞懸濁液50mlにグルコース（10g/L）および式（II）の化合物（2g/L）を添加した。細胞を28℃で回転振盪機上、150rpmにおいて18〜48時間インキュベートした。
反応ブロス全体を１容量の酢酸エチルで２回抽出した。多くの場合、エマルションが生成し、これを28℃で10,000rpmにおいて５分間遠心分離することにより破壊した。プールした酢酸エチル抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を真空蒸留により除去して、金色の油を得た。
式IIの化合物から式IIIの化合物への変換の程度および式IIIの化合物の鏡像異性体組成を、HPLC（高圧液体クロマトグラフィー）により測定した。HPLCの条件を以下に示す：
HPLC      ：ウォーターズ（Waters）590プログラマブルポンプ
カラム：“キラルセル（Chiralcel）"OJ（250mm×4.6mm）（キラセルはダイアセル・ケミカル・インダストリーズ社の商標）、ガードカラム（50mm×4.6mm）付き、粒度10μｍ
溶剤  ：ヘキサン：エタノール（95:5）
流速     :1ml/分
温度  ：周囲温度
検出  ：屈折率、ウォーターズ示差屈折計R401
式II、式IIIの化合物、および式IIIの化合物のジアステレオ異性体であるIVの保持時間は、それぞれ43、27および21分であった。
得られた結果を表１にまとめる。
0003580825.tif 000006
実施例２
式IIIの化合物のジアステレオ異性体である化合物IVの製造
0003580825.tif 000007
実施例１の記載に従って微生物を維持し、増殖させた。生物変換および分析も実施例１の記載と全く同じに行った。
結果を表２にまとめる。
0003580825.tif 000008
以上の結果から、Candida属およびPichia属それぞれに属する特定の菌は両方のジアステレオ異性体を産生することが分かるであろう。一方ではたとえばPichia angusta、他方ではHansenula anomolaが異なるジアステレオ異性体に対して特異性を示すことは、反対の立体特異性をもつ２種類の酵素が存在することを示し、またある種には両方および／または立体特異性の低い他の酵素が存在する可能性がある。
実施例３
発酵槽内でのPichia angusta NCYC R320の増殖、および式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物のin situ製造
Pichia angusta NCYC R320を、ブラウン・バイオスタット（Braun Biostat）ED/ER5の5L発酵槽内でバッチ培養および補給式バッチ培養（fed−batch culture）の両方により増殖させた。
バッチ培養における増殖は下記組成の培地5L中で行われた：（1L当たり）グルコース,40g;MgSO4.7H2O,1.2g;K2SO4,0.21g;KH2PO4,0.69g;H3PO4（17M）,1ml;酵母自己溶解物,2g;FeSO4.7H2O,0.05g;ポリプロピレングリコール消泡剤,0.3ml;微量元素溶液,2ml。微量元素溶液は（1L当たり）ZnSO4.7H2O,10g;MnSO4.4H2O,10g;CuSO4.5H2O,1gおよびH3PO4（11.6M）,1mlを含む。培地を水道水中に調製した。7M  NH4OHの添加により、培地を目的pHに調整および制御した。
補給式バッチ培養における増殖はバッチ培養につき記載したものに従って行ったが、ただしグルコース濃度が10g/L未満に低下した場合には、1Lの発酵ブロスを無菌的に取り出し、グルコース濃度を２〜5g/Lに維持するのに十分な速度で下記組成の培地1Lを補給した：（1L当たり）グルコース,240g;酵母自己溶解物,7g;FeSO4.7H2O,0.175g;ポリプロピレングリコール消泡剤,1mlおよび微量元素溶液,7ml。
バッチ培養および補給式バッチ培養下で行った発酵は両方とも、Pichia angusta NCYC R320接種物の添加により開始された。接種物を、実施例１に記載したミネラル塩類培地200ml中で調製し、28℃でオービタルシェーカーにより150rpmにおいて18〜20時間増殖させた。発酵槽に接種する前に、接種物を同一組成の無菌培地中に10倍希釈した。
発酵は下記のpH、温度、通気および撹拌条件下で、乾燥細胞重量10〜15g/Lになるまで行われた：
温度:28、34、40℃
pH  :4.5、5.5、6.5
通気:0.1、1.0vvm（空気の容量／培地の容量／分）
撹拌:600rpm
式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の産生は、式II（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物を濃度約65％w/wの粗製の油（残部は実質的にアセト酢酸ｔ−ブチル）として添加することにより開始された。式（II）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物は、その濃度を一般に１〜5g/L、好ましくは2g/Lに維持するのに十分な速度で連続供給物として添加された。固体グルコースを補助基質として、１〜5g/Lの濃度を維持するように発酵ブロスに添加した。各実験において式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の産生は、微生物の増殖段階の場合と同じ温度、pH、通気および撹拌条件下で行われた。
発酵ブロス中の式（II）（Ｒ＝ｔ−ブチル）および式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の濃度を、逆相HPLCにより測定した。HPLC条件を以下に記載する：
HPLC      ：ヒューレット・パッカードHP  1050
カラム：ウォーターズ、ノバ−パック（Nova−PakR）C18カラム、寸法（3.9×300mm）および粒度４μｍ。ノバ−パックはミリポア社の登録商標である。
溶剤  ：水：アセトニトリル（60:40）中の0.02Mリン酸
流速     :1ml/分
検出器：ヒューレット・パッカードHP  1047A屈折率検出器
温度  ：周囲温度
式（II）（Ｒ＝ｔ−ブチル）および（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の保持時間は、それぞれ4.0分および3.1分であった。
生物還元工程が完了した時点で、発酵ブロスを20〜22℃で5000rpmにおいて20分間、遠心分離した。式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物を上清から好適な有機溶剤、たとえばトルエン、酢酸イソアミル、２−ペンタノン、酢酸エチルまたは４−メチル−２−ペンタノン、好ましくは酢酸エチルまたは２−ペンタノンで抽出することにより単離した。溶剤抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を真空蒸留により除去して、式III（Ｒ＝ｔ−ブチル）の粗生成物を金色の油として得た。
式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物をそのジアステレオ異性体（IV）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の比率を実施例１に記載した方法で粗生成物のHPLCにより測定するか、または対応するイソプロピリデン誘導体（Ｉ）とそのジアステレオ異性体（Ｖ）：
0003580825.tif 000009
の比率を下記の条件下でHPLC測定することにより測定した：
HPLC      ：ヒューレット・パッカードHP  1050
カラム :YMC  ODS  AQ303  寸法4.6×250mmおよび粒度５μｍ。ハイクロム（Hichrom）社から入手できる。
溶剤  ：メタノール：水（50:50）
流速   :1ml/分
検出器：ヒューレット・パッカードHP  1047A屈折率検出器
温度  ：周囲温度
式（Ｉ）および式（Ｖ）の化合物の保持時間は、それぞれ31.0分および35.5分であった。
実施例４
イソプロピリデン誘導体（Ｉ）およびそのジアステレオ異性体（Ｖ）の製造式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）、式（IV）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物、および式（II）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の生物還元で得た粗生成物の試料を、乾燥アセトン中で触媒用メタンスルホン酸の存在下に2,2−ジメトキシプロパンとの反応により、対応するイソプロピリデン誘導体に変換した。典型的な反応では、生物還元で得た粗生成物3gを、メタンスルホン酸（５μｌ）を含有する乾燥アセトン（5ml）中において周囲温度で２時間、2,2−ジメトキシプロパン（7ml）と反応させた。次いでこの溶液を15mlの２％w/v炭酸水素ナトリウム水溶液に注入し、さらに５分間撹拌した。得られた化合物を30mlの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を分離し、15mlのｎ−ヘキサンと混和し、混和した有機抽出液を30mlの蒸留水で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸留により溶剤を除去して濃いオレンジ色の油を得た。これは冷却すると凝固した。
実施例５〜13
種々のpH、温度、通気条件および発酵方式での式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の製造
実施例５〜13は、Pichia angusta NCYC R320をそれぞれの場合10〜15g/Lの初期乾燥細胞重量で用いて、式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物を式（II）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物から製造する方法の操作を示す。この方法は、表３に示した点以外は実施例３の記載に従って実施された。
表３に示した条件下で本方法を操作した結果を表４にまとめる。
実施例13に詳述した条件下で本方法を操作することにより得られた反応プロフィルを図１に示す。この場合の初期乾燥細胞重量は12.67g/Lであった。
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実施例14
式（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）の化合物の解明
実施例５に記載した方法の操作で得た粗生成物（III）（Ｒ＝ｔ−ブチル）を、以下の方法でそのイソプロピリデン誘導体（Ｉ）に変換した。
粗生成物（145g;65g,0.28molのIIIを含有）を、マグネチックスターラーを備えた1Lの丸底フラスコに装入した。このフラスコに乾燥アセトン（200ml）、2,2−ジメトキシプロパン（294ml,2.39mol）およびメタンスルホン酸（1.5ml）を添加した。少量の試料を湿ったpH指示紙片にスポットすることにより溶液のpHを検査し、それが酸性であることを確認した。反応混合物を周囲温度で撹拌し、実施例３に記載した方法を用いるHPLCにより（III）の消失を監視した。反応は３時間で完了し、この時点で550mlの２％w/v炭酸水素ナトリウム水溶液を添加した。上記に従ってpHを再検査して、７〜９の範囲内であることを確認した。混合物を分液漏斗に移し、400mlの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを除去し、水相をさらに200mlの酢酸エチルで再抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、1Lのｎ−ヘキサンを添加した。この合わせた酢酸エチルとヘキサンの溶液を1Lの蒸留水で３回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶剤を真空蒸留により除去すると赤色の油が得られ、これは放置すると凝固した。
このイソプロピリデン（Ｉ）をｎ−ヘキサンから結晶化し、ｎ−ヘプタンから再結晶して、白色の結晶質生成物を81％の収率で得た。このイソプロピリデン（Ｉ）は化学的純度98.65％であり、化合物（II）、（III）および（Ｖ）（Ｒ＝ｔ−ブチル）を含有せず、赤外分光法および250MHz  1H  NMR分光測定法のいずれによっても（Ｉ）の基準試料と区別できなかった。
参考：
ATCC  アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、123031 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852 USA
CBS  セントラル・ビューロー・ボール・シンメル・カルチャーズ、Oosterstraat 1,Postbus 273,NL−3740 AG Baarn,Netherland
DSM  ドイッチュ・サムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルカルチュアレン社、Mascheroder Weg 1b,D−330 Braunschweig,Germany
NCYC  ナショナル・コレクション・オブ・イースト・カルチャーズ・インスティチュート・オブ・フード・リサーチ、ノルウィッヒ・ラボラトリー、Norwich Research Park,Colney,Norwich NR4 7UA
BPCC  ゼネカ社、バイオプロダクツ・カルチャー・コレクション、（一般には入手できない）
【図１】
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