(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリクロロエチレンを分解することが出来る細菌MO7株（FERM BP−5624）、又はトリクロロエチレンを分解することが出来るその変異株MO715株（FERM BP−5928）。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌を有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物に作用せしめることを特徴とする有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物の分解方法。
【請求項３】
前記有機ハロゲン化合物がトリクロロエチレンであり、前記芳香族化合物がフェノール性化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
有機ハロゲン化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法であって、該土壌、排水又はその他の廃棄物に、請求項１に記載の細菌の培養物を添加することを特徴とする方法。
【請求項５】
前記有機ハロゲン化合物がトリクロロエチレンであり、前記培養物が培養菌体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌の培養物を得るための培養に当って培地に芳香族化合物を添加することを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記芳香族化合物がフェノール性化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物の培養物を得るための培養に当って培地に資化性炭素源を添加することを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記資化性炭素源が、MO7株のためにはグルコースであり、MO715株のためにはグルタミン酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養物が培養菌体である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養菌体が生菌体である請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養菌体が滅菌処理した培養菌体である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記滅菌処理が紫外線照射である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
有機ハロゲン化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法であって、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に請求項１に記載の細菌を接種し、且つ前記土壌、排水又はその他の廃棄物に、芳香族化合物もしくは資化性炭素源又はこの両者を添加し、そして前記接種された微生物の培養を行うことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記有機ハロゲン化合物がトリクロロエチレンである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記芳香族化合物がフェノール性化合物であり、そして前記資化性炭素源が、MO7株のためにはグルコースであり、MO715株のためにはグルタミン酸である、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物の分解方法において、請求項１に記載の細菌株の培養菌株の滅菌処理物を、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物に作用せしめることを特徴とする方法。
【請求項１８】
有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物の分解方法において、請求項１に記載の細菌株のの培養菌体の滅菌処理物を、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に添加することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記滅菌処理が紫外線照射である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記芳香族化合物がフェノール性化合物であり、前記有機ハロゲン化合物がトリクロロエチレンである、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の細菌の培養物を含んで成る、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物分解剤。
【請求項２２】
前記培養物が培養菌体である、請求項21に記載の分解剤。
【請求項２３】
前記培養菌体が生菌体である、請求項22に記載の分解剤。
【請求項２４】
前記培養菌体が滅菌処理された菌体である、請求項22に記載の分解剤。
【請求項２５】
前記滅菌処理が紫外線照射である、請求項24に記載の分解剤。
【請求項２６】
乾燥菌体の形態である、請求項21〜25のいずれか１項に記載の分解剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、トリクロロエチレンのごとき有機ハロゲン化合物を効率よく分解する新規微生物、及び該微生物を用いての有機ハロゲン化合物、特に土壌や排水中のトリクロロエチレンの分解方法に関する。
発明の背景
近年、有機溶媒の工業的利用にともない、このような物質或いはこのような物質のまじった廃液の流出による土壌の汚染が多くの地域問題となっている。特に有機塩素化合物による土壌汚染は大きな社会問題であり、汚染土壌の修復技術は必須とされている。汚染土壌の浄化技術としては物理的処理法と生物的処理法がある。
物理的処理法としては、エアストリッピング法（掘削した汚染土壌の空気を吹き込み有機塩素化合物を揮発させ、活性炭等で吸着除去する方法）、真空抽出法（汚染土壌にパイプを打ち込み減圧状態にすることで有機塩素化合物を気化させて土壌から抽出する方法）が存在する。しかしながらこれらの方法は空気吹き込み等に多大な動力が必要で、前者の場合は土壌の堀削を必要とし、後者の場合は汚染物質の濃度が低下すると抽出効率が低下して浄化が進まないという欠点がある。さらに、いずれの方法も汚染物質を活性炭等に吸着するだけなので別途汚染物質の無害化処理が必要となる。
近年、開発途上にある生物的処理法は、微生物の持つ物質の分解能力を利用して、汚染物質を完全に分解・無害化可能であり、投入エネルギーも物理的方法に比較して少ないのと報告がある。さらに低濃度の汚染でも浄化可能なので、低コストな土壌浄化技術として期待が大きい。この生物学的方法としては、固相処理法（堀削した土壌にリン・微生物等混合、微生物による汚染物質の分解を促進）、スラリー処理法（堀削した土壌に水・リン・窒素・微生物等混合、液体状で処理することにより微生物による汚染物質の浄化速度を促進）、及び原位置処理法（汚染土壌を堀削せず土壌中に中にメタン・空気・リン・窒素を注入し、土壌中の微生物による汚染物質の分解を促進）が知られている。
従来の生物処理技術のうち、固相処理法やスラリー処理法の場合は土壌の堀削が必要で適用範囲が狭い上、処理・設備コストも比較的高い。
一方、原位置処理法は上記方法に対し処理・設備コスト共に低く、広範囲にわたった処理が可能である。しかし、土壌微生物の絶対数が少ないため浄化速度が遅い。特に有機塩素化合物の様な難分解性の化合物では土壌中に汚染物質を分解できる微生物が生息していない可能性があり、その場合は浄化不可能である。これらの場合、有機塩素化合物の分解能力を持つ微生物を取得し土壌に接種することで浄化速度の向上や、汚染物質を分解できる微生物が生息していない土壌の浄化が可能とされている。
公知のトリクロロエチレンを分解する微生物としては、メタン資化性菌であるメチロシナス、トリコスポリウム（methylosinus tricosporium）OB3（特表平４−501667、特開平５−212371）やメチロシナス  トリコスポリウム（Mehylosinus tricosporium）TUKUBA（特開平２−92274、特開平３−292970）、シュードモナス属であるシュードモナス  プチダ（Pseudomonus putida）F1（特開昭64−34499）、シュードモナス  プチダ（Pseudomonus putida）BH（藤田ら；ケミカルエンジニアリング、39,6,p494−498,1994）、シュードモナス  プチダ（Pseudomonus putida）UC−R5,UC−P2（特開昭62−84780）、シュードモナス  プチダ（Pseudomonus putida）KWI−９（特開平６−70753）、シュードモナス  メンドシナ（Pseudomonus mendocina）KR1（特開平２−503866,5−502593）、シュードモナス  セパシア（Pseudomonus  cepacia）G4（特開平４−502277）、シュードモナス  セパシア（Pseudomonus  cepacia）KK01（特開平６−296711）、その他アルカリジーナス  ユートロフス（Alcaligenes eutropus）JMP134（A.R.Harker Appl.Environ.MIcrobiol.,56,4,1179−1181,1990）、アルカリジーナス  ユートロフス（Alcaligenes eutropus）KS01（特開平７−123976）、アンモニア酸化細菌であるニトロソモナス  ユーロパエア（Nitrosomonus europaea）（D.Arciero et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.,159,2,640−643,1989）、コリネバクテリウム属細菌（Corynebacterium）J1（特開平８−66182）等が知られている。
これらの公知の微生物の多くはトリクロロエチレンの分離能力はそれほど高くなく、せいぜい初期濃度として5ppmのトリクロロエチレンを培養液中で分解する程度である。また、特に土壌という特殊な環境下でトリクロロエチレンの分解が必用となるため、生物的浄化に用いる微生物には十分なトリクロロエチレンの分解活性を持ち得るだけでなく、土壌中でもその分解能力を有効に発揮できることが要求されるが、公知の微生物の多くはその能力が十分とは言えない。
なお、シュードモナス  セパシア（Pseudomonus cepacia）KK01は初期濃度30ppmのトリクロロエチレンを培養液中で15ppmまで、初期濃度5ppmのトリクロロエチレンを土壌環境中で1ppm程度まで分解するとの報告がある（特開平６−296711）。また、アルカリジーナス  ユートロフス（Alcaligenes eutropus）KS01は初期濃度50ppmのトリクロロエチレンを培養液中で検出限界以下まで、初期濃度1ppmのトリクロロエチレンを土壌環境中で検出限界以下まで分解するとの報告がある（特開平７−123976）。
これらの微生物は培養液中では従来の微生物より高い分解能力を持ち、土壌環境中での分解能力の発揮も確認されているが、分解能力発揮のためには少なくとも１種類以上の芳香族化合物を土壌環境中に添加する必用がある。芳香族化合物それ自体が汚染物質であるため２次汚染を引き起こす懸念があり、芳香族化合物を添加してもトリクロロエチレンと共に完全に分解・除去されるか、または芳香族化合物を添加しなくてもトリクロロエチレンを分解できる微生物を取得することは実用上解決すべき大きな課題である。
従って、トリクロロエチレンの生物浄化法の実用化のためには、高い分解能力を持ち、且つ、芳香族化合物を添加してもトリクロロエチレンと共に完全に分解・除去されるか、または芳香族化合物を添加しなくても土壌中でトリクロロエチレンを分解できる微生物の取得が望まれている。
更に、汚染土壌等の環境中では原生動物による捕食や他の土着微生物との競合等の影響によって、散布した分解を行わせる微生物の密度は著しく押さえられてしまい、必用処理能力に見合うようにその密度を上げることは極めて困難な場合が多い。密度を上げるために、土壌中に空気や栄養素を圧そうするなどの方法が挙げられるが、何れの方法も多大なエネルギーを必用とするにも拘わらず、それだけでは菌体密度を高めることが難しく、その処理能力は全体として低いレベルに留まっている状況である。また、開放系と同時に反応器内等閉鎖系での処理でも高い菌体密度を維持するには栄養素の供給、エアレーション等多大なエネルギーを必用とする。
単位菌体量当たりの分解能力を高めることができれば、菌体密度が低くても十分な分解能力が得られるため、菌体密度維持の為に多大なエネルギーを投入する必要はなくなる。トリクロロエチレンを分解する微生物は、微生物がこのような物質を分解しうる酵素を発現させることでトリクロロエチレンを分解するが、この酵素を発現させるために誘導物質を必要とする。微生物の培養時に誘導物質を添加し接触させることで、微生物にトリクロロエチレンの分解能力を発揮させ得ることは既に知られているが、誘導物質と接触させる時間に着目し単位菌体量当たりの分解能力を高める方法を検討した従来例は全くない。
なお、現在、特定の微生物を環境中に放出することで生態系に大きな影響をもたらす可能性があると懸念され、分解菌を土壌に散布してトリクロロエチレン等の分解を行うBio  augmentationは社会的な受け入れが難しいとされている。しかし滅菌操作により完全に増殖能力を失った微生物の散布は単なる有機物の散布に等しく、生態系への影響が極めて小さいと考えられている。特許公報平８−3012に開示された発明においては、分解菌を破砕して土壌に散布することで生態系への影響を極めて小さくする効果を得るとしているが、微生物の破砕操作は装置的・時間的に多くに多くの手間を要する作業で、実際の汚染土壌に対し多量に分解菌を散布する場合は実施が難しいことが容易に想像される。
また、同発明においては菌体破砕物は菌体に比べ容易に土壌に浸透する効果を挙げているが、菌体破砕液がどの程度分解活性を持続できるのかは言及していない。また、公知のトリクロロエチレン酸化酵素は活性発現に補酵素としてNAD等を必要とするが、菌体破砕により菌体から遊離した酵素に分解反応に必要な濃度の補酵素を供給するのは、補酵素の価格が非常に高いこと等から極めて難しいと考えられる。
発明の開示
従って本発明は、トリクロロエチレンのごとき有機ハロゲン化合物を、従来から知られている微生物よりも効率よく分解することができる新規微生物、及び該微生物を使用しての有機ハロゲン化合物の分解方法を提供するものである。更には特定の微生物を環境中に放出した場合の生態系への影響を最小限にするための安価な方法を提供するものである。
本発明者らは、上記の改題を解決すべく種々検討した結果、従来知られている微生物よりも非常に高いトリクロロエチレン分解能を有する、既存のいずれの属にも属さない新規な微生物を単離することに成功し、本発明を完成させた。
従って本発明は、次の性質：
0003546888.tif 000002
を有し、且つトリクロロエチレンを分解することが細菌を提供する。この細菌の代表的な株は、MO7株（FERM  BP−5624）である。
本発明はさらに、前記細菌を、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物に作用せしめることを特徴とする、有機ハロゲン化アルキル及び／又は芳香族化合物の分解方法を提供する。この場合、有機ハロゲン化合物の重要なものはトリクロロエチレンであり、芳香族化合物は好ましくはフェノールである。
本発明はまた、有機ハロゲン化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法であって、該土壌、排水又はその他の廃棄物に、前記細菌の培養物を添加することを特徴とする方法を提供する。有機ハロゲン化合物の実用上重要なものはトリクロロエチレンである。
また、微生物の培養物として好ましいものは培養菌体である。この培養菌体は、生菌体であっても、滅菌処理した菌体であってもよい。
本発明はまた、有機ハロゲン化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法であって、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に本発明の微生物を接種し、且つ土壌、排水又はその他の廃棄物に芳香族化合物もしくは資化性炭素源又はこの両者を添加し、そして前記添加させた微生物を培養することを特徴とする方法を提供する。前記芳香族化合物は好ましくはフェノール性化合物、例えばフェノールであり、そして前記資化性炭素源は好ましくは糖類、例えばグルコースである。
本発明はまた、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物の分解方法において、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を分解することができる微生物の培養菌体の滅菌処理物を、前記有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物に作用せしめることを特徴とする方法を提供する。本発明はまた、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化物及び／又は芳香族化合物の分解方法において、前記有機ハロゲン化物及び／又は芳香族化合物を分解することができる微生物の培養菌体の滅菌処理物を、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に添加することを特徴とする方法を提供する。前記の方法において、滅菌処理とは、例えば紫外線照射である。
本発明はさらに、前記の本発明の細菌の培養菌体を含んで成る芳香族化合物及び／又は有機ハロゲン化合物分解剤を添加する。この場合の培養菌体は生菌体でも、又は滅菌処理した菌体でもよく、滅菌処理としては例えば紫外線照射が挙げられる。分解剤中の菌体は、貯蔵等の観点から凍結菌体もしくは乾燥菌体であることが好ましい。
図面の簡単な説明
図１は、本発明のMO7株の、NJ法（近隣接合法）により作成した系統樹中の位置を示す図である。
図２は、本発明のMO7株の、UPGMA法（平均距離法）により作成した系統樹中の位置を示す図である。
図３は、本発明のMO7株を用いて種々の濃度のトリクロロエチレンを分解する場合の初期トリクロロエチレン濃度と分解率との関係を示すグラフである。
図４は、本発明のMO7株を用いてトリクロロエチレン（初濃度30ppm）を分解する場合のpHと分解率との関係を示すグラフである。
図５は、本発明のMO7株を用いてトリクロロエチレン（初濃度30ppm）を分解する場合の温度と分解率との関係を示すグラフである。
図６は、本発明のMO7株の死菌体（紫外線滅菌）によりトリクロロエチレンを分解する場合の、トリクロロエチレンの初濃度と分解率の関係を示すグラフである。
図７は、本発明のMO7株の培養菌体を滅菌処理したもの（紫外線照射）と滅菌処理しなかったもの（生菌体）とを４℃にて貯蔵した場合の、トリクロロエチレン分解能の残存活性の経過を示すグラフである。
図８は、本発明のMO7株を、フェノール及びトリクロロエチレンを含有する培地中で培養した場合の菌体の増殖（OD）、フェノールの消費及びトリクロロエチレンの分解率の経時的変化を示すグラフである。
図９は、本発明のMO7株をフェノール含有培地で培養した場合の菌体の増殖（OD）及びフェノールの消費の経時的変化を示すグラフである。
図10は、図９における培養経過において、種々の時間まで培養した培養物の、菌体当たりのトリクロロエチレン分解能を示すグラフである。
図11は、図９における培養経過において、種々の時間まで培養した培養物の、総トリクロロエチレン分解能を示すグラフである。
図12は、本発明のMO7株をフェノール（500ppm）含有培地に培養し、フェノール濃度が０になった時にさらにフェノールを加えることにより培養した場合の、菌体濃度（OD）及びフェノール濃度の経時的変化を示すグラフである。
図13は、図12における培養経過において、種々の時間まで培養した培養物の、菌体当りのトリクロロエチレン分解能を示すグラフである。
図14は、図12における培養経過において、種々の時間まで培養した培養物の、総トリクロロエチレン分解能を示すグラフである。
図15は、トリクロロエチレンを含有する土壌に本発明のMO7株の培養菌体を添加してトリクロロエチレンを分解した場合の、菌体量とトリクロロエチレンの分解量との関係を示すグラフである。
図16は、図15に示す場合と同様な実験において、MO7株の培養菌体を１回に添加した場合、及び２回に分けて添加した場合のトリクロロエチレン分解量を示すグラフである。
図17は、種々の初濃度のトリクロロエチレンを含有する土壌に、本発明のMO7株の培養菌体を添加して分解を行った場合の、トリクロロエチレン初濃度及び培養菌体添加量と、トリクロロエチレン分解率との関係を示すグラフである。
図18は、トリクロロエチレンを含有する土壌に本発明のMO7株の培養菌体を添加してトリクロロエチレンの分解を行う場合の残存トリクロロエチレンの経時変化を示すグラフである。
図19は、塩化ビニル、1,1−ジクロロエチレン、cis−1,2−ジクロロエチレン及びtrans−1,2−ジクロロエチレンの分析法のフローシート図である。
図20は、ジクロロ酢酸及びトリクロロ酢酸の分析法のフローシート図である。
図21は、トリクロロエタノールの分析法のフローシート図である。
図22は、抱水クロラールの分析法のフローシート図である。
図23は、トリクロロエチレンを含有する土壌に、本発明のMO7株の培養菌体、又はその滅菌処理物を添加してトリクロロエチレンの分解を行った場合の結果を示すグラフである。
図24は、トリクロロエチレンを含有する土壌に、本発明のMO7株の培養菌体を加えてトリクロロエチレンの分解を行う場合の温度（20℃、30℃）の影響を示すグラフである。
図25は、トリクロロエチレンを含有する土壌に、本発明の少量のMO7株の培養菌体と誘導剤（フェノール）を加えてトリクロロエチレンの分解を行った場合の結果を示すグラフである。
図26は、トリクロロエチレンを含有する土壌に、本発明のMO7株又はMO715株をグルタミン酸で培養した培養菌体を加えてトリクロロエチレンの分解を行った場合の結果を示すグラフである。
具体的な記載
本発明の代表的な菌体であるMO7株は、次のようにして分離することができる。例えば、土壌、活性汚泥等の分離源をフェノールを含有する培地において培養し、増殖した微生物を単離し、次にこれをトリクロロエチレンを含有する培地中でインキュベートし、トリクロロエチレン分解能を有する微生物を選択する。微生物の分離方法は実施例１に詳細に記載する。
上記のようにして分離したMO7株は、次のような菌学的性質を有する。
0003546888.tif 000003
MO7株はさらに次の性質を有する。
集落の色調              特徴的集落色素を生成せず
集落の周辺細胞の伸長        −
細胞壁のアラビノ・          −（＃１）
ガラクタンポリマー
＃1:全菌体の酸加水分解物を用いて推定した。
本MO7株の形態学的及び生理学的な性質を調べたところ上記表２に示すような結果が得られた。その結果に基づき文献（N.R.Krieg and J.G.Holt,“Bergy's Manual of Systermatic Bacteriology"Vol.1（1984）Williams ans Wilkins及び、J.G.Holt,N.R.Krieg,P.H.A.Senath,J.T.Staley and S.T.Williams,“Bergey's Manual of Detaminative Bacteriology"Ninth edition（1994）Williams ans Wilkins）を参考に同定を行った結果、単離されたMO7株はいずれの属・種の菌にも合致しなかった。また、16SrRNA遺伝子を取得しその配列を決定して公知の菌の配列と比較したところ、図１及び２に示す様に最も近縁の菌はTerrabacter tumescesであった。しかし、この菌においても遺伝子の相同性は95％に留まり、同属でないと判断された。従って本菌株は、いずれの公知の菌とも異る新属の菌であることが確認された。
本発明の方法においては、本発明の細菌を有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物に作用せしめることにより、該有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を分解せしめる。本発明の細菌により分解され得る有機ハロゲン化合物としては、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、ビニルクロライドが挙げられるが、実用上の見地からトリクロロエチレンが最も重要である。また、芳香族化合物としては、フェノール性化合物、例えばフェノールが挙げられる。
本発明は、１つの態様において、有機ハロゲン化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法であって、該土壌、排水又はその他の廃棄物に、本発明の細菌の培養物を添加することを特徴とする方法を提供する。細菌の培養物としては、本発明の細菌を培養して得られる培養液それ自体、又は前記培養液から分離した培養菌体、あるいは前記培養液中の細菌又は分離された培養菌体を死滅されたもの、等が用いられる。
本発明の細菌を培養するには、該細菌が増殖することができる任意の培地を用いることができる。培地は炭素源として、例えばグルコース、シュクロース等を含有し、有機窒素源として酵母エキスペプトン、肉エキス等、又は無機窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩等を含有する。さらに、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオン及び塩素イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の陰イオンとから成る無機塩類を含有することができる。炭素源の濃度は、その種類により異るが0.1〜１％程度であり、窒素源の濃度はその種類により異るが0.01〜１％程度である。また、無機塩類の濃度は、種類により異るが0.001〜0.1％程度である。
培養は好気的液体培養によるのが好ましく、好気的条件は通気、撹拌、通気と撹拌、振とう等の常用の手段により確保される。トリクロロエチレン等の有機ハロゲン化合物分解能やフェノール等の芳香族化合物分解能を誘導するためには、培地中にフェノール等の芳香族化合物等を加えるのが好ましく、この場合他の炭素源に追加してフェノール等の芳香族化合物を添加してもよく、また唯一の炭素源としてフェノール等の芳香族化合物を用いてもよい。培地中のフェノール等の芳香族化合物の添加量は100ppm〜1000ppm程度が好ましい。
本発明の微生物を菌体の形で用いる場合、培養液から、細菌細胞を分離するため常用手段、例えば遠心分離により菌体を分離すればよい。菌体を一旦保存した後に使用するためには、凍結菌体もしくは乾燥菌体にすることもでき、この場合、菌体を乾燥するための常用手段、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥等を用いることができる。本発明の実施に当っては、環境（微生物相）への影響を最小に抑えるために、殺菌した培養物又は菌体を用いることができる。このための殺菌方法としては、生菌体に紫外線照射する方法等を用いることができる。このような殺菌された細胞や培養物も本発明における「培養物」に含まれる。
処理対象物に、本発明の培養物を添加する場合、処理対象物に対して106〜109個/gの生菌体、又はそれ相当する有機ハロゲン化合物分解能を有する殺菌された菌体を添加するのが好ましい。
本発明の微生物をトリクロロエチレン等の有機ハロゲン化合物に作用せしめる方法としては、土壌等の固体又は排水等の液体（処理対象物と称する）に含有される有機ハロゲン化合物を分解するためには、処理対象物に本発明の培養物を添加・混合すればよい。
本発明の他の態様によれば、土壌、排水、その他の廃棄物等の処理対象物に本発明の微生物を接種し、そこで増殖せしめることにより、処理対象物中のトリクロロエチレン等の有機ハロゲン化合物を分解せしめることができる。従って本発明はまた、有機ハロゲン化物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物の分解方法において、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に本発明の細菌を接種し、且つ前記土壌、排水又はその他の廃棄物に、芳香族化合物もしくは資化性炭素源又はこの両者を添加し、そして前記接種された微生物を培養することを特徴とする方法を提供する。
この場合、資化性炭素源としては、糖類、例えば、グルコース等が好ましい。この場合の炭素源の量は、処理対象物に対して0.1〜１％程度である。また、処理対象物に芳香族化合物を添加する場合には、芳香族化合物を添加する必要があり、芳香族化合物としてはフェノール、クレゾール等を使用することができる。この場合、添加した芳香族化合物が、有機ハロゲン化合物の分解後になお残存しておれば、新たな環境汚染の原因とからなる、あまり多くの芳香族化合物を添加するのは好ましくなく、芳香族化合物の添加量は処理対象物に対して100〜500ppm程度であるのが好ましい。
本発明者らは、前記のようにして製造した、本発明の微生物の培養菌体は、生菌体のみならず、滅菌処理した後においても有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物分解能を維持していることを見出した。従って本発明は、有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を含有する土壌、排水又はその他の廃棄物中の有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物の分解方法において、前記有機ハロゲン化合物及び／又は芳香族化合物を分解することができる微生物の培養菌体の滅菌処理物を、前記土壌、排水又はその他の廃棄物に添加することを特徴とする方法を提供する。
滅菌処理としては、紫外線照射、エチレンオキサイド処理、放射線照射等の方法が用いられる。この滅菌処理物は、生菌体よりも、有機ハロゲン化合物分解能に関して高い貯蔵安定性を有するという予想外の性質を有する。
本発明はまた、本発明の細菌の培養物を含んで成る有機ハロゲン化物及び／又は芳香族化合物分解剤を提供する。この培養物は好ましくは培養菌体であり、これは生菌体でもよく、又は滅菌処理した菌体であってもよい。滅菌処理は、前記のごとく、紫外線照射、エチレンオキサイド処理、放射線照射等により行われる。本発明の分解剤は、貯蔵等の観点から、凍結もしくは乾燥した形態のものが好ましく、乾燥物は、前記のごとき常法に従って得ることができる。
本発明の、代表的なトリクロロエチレン分解活性の誘導に芳香族化合物（例えばフェノールなど）を必要としない変異株（以後、構成変異株と記載）であるMO715株は次のようにして分離することができる。例えば、MO7株に変異作用を持つ紫外線・放射線または化学物質たとえばニトロソグアニジンなどを作用させ、生じた変異株の中から構成変異株を選択する。微生物の分離方法は実施例18に詳細に説明する。
本発明の構成変異株の培養はトリクロロエチレン分解活性の誘導に芳香族化合物を必要としない以外は親株のMO7株と同様の扱いでよいが、培養時に加える資化性炭素源としては、糖類、例えばグルコースの他、アミノ酸、例えばグルタミン酸が好ましい。また、使用方法にあってもトリクロロエチレン分解活性の誘導に芳香族化合物を必要としない以外は同様である。もちろん、有機ハロゲン化合物の分解能に関しては、生菌体であっても、滅菌処理した菌体であってもMO7株と同様の効果を有する。
なお、前記の微生物株MO7株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成８年（1996）年８月12日にFERM  BP−5624としてブダペスト条約に基き国際寄託されており、また前記微生物株MO715株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成９年（1997年）４月24日にFERM  BP−5928としてブタペスト条約に基き国際寄託されている。
実施例
以下に例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は以下に示す実施例によって限定されるものではない。
実施例1.  MO7株の単離とその16SrDNAのクローニングとシークエンシング
本発明に係る微生物は、愛知県内の排水処理場より採取した活性汚泥から以下の方法で単離した。採取した活性汚泥0.1mlは、30ml容積のバイアル瓶に入れた、１％（v/v）のビタミン溶液（組成は表４に記載）を含む6mlのNMS培地（組成は表３に記載）に接種し、そこに500ppmのフェノールを添加した。
バイアル瓶はブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールした後、30℃・160r.p.m.で数日から十数日間振とう培養した。わずかでも濁りが観察された培養液は、同じ培地に植継ぎ振とう培養した。この植継ぎは計４回繰り返した。４回目の培養終了後、培養液を適宜希釈して500ppmのフェノールを含むNYG培地（組成は表５に記載）に1.5％の寒天を加えた平板培地上に塗沫し、出現したコロニーの培養を繰り返し微生物を単離した。なお、微生物の培養には上記のNYG培地の他に肉汁培地等任意に至適条件を選択してこれを行うことが可能である。
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単離した微生物は、18cmの試験管に入れた0.05％の酵母エキスと500ppmのフェノールを含む10mlのNMS培地に、単離操作時の寒天培地からコロニーを白金耳にして釣菌して接種した。30℃・130r.p.m.で５日間振とう培養した後、菌体を5000r.p.m.・10分間の遠心分離にて回収し、4mlのNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液は20ml容積のバイアル瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて一晩振とう培養した後、バイアル瓶中の気相をFIDまたはECD検出器付きのガスクロマトグラフで分析した。
そして、それらの結果からトリクロロエチレンの分解能力の特に強い菌株を選別し、形態学的及び生理学的な性質を調べたとこを表２に示すような結果が得られた。
その結果に基づき文献（N.R.Krieg and J.G.Holt,“Bergey's Manual of Systermatic Bacteriology"Vol.1（1984）Williams and Wilkins及び、J.G.Holt,N.R.Krieg,P.H.A.Senath,J.T.Staley and S.T.Williams,“Bergey's Manual of Detaminative Bacteriology"Ninth edition（1994）Williams ans Wilkins）を参考に同定を行った結果、この菌株はいずれの属・種の微生物にも合致しなかった。この菌株はMO7株と命名され、平成８年８月12日にブタペスト条約に基く国際寄託として工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  BP5624として寄託されている。
また、本発明の微生物について16SrDNAの配列を決定して公知の微生物の配列と比較した。以下その概要を示す。
本微生物の16SrDNAは平石の方法（日本微生物生態学会誌、vol.10（１）,31−42,1995）に従いPCRで増幅した。PCRには５′−GAG TTT GAT CCT GGC TCA G−３′（配列番号:1）及び５′−AGA AAG GAG GTG ATC CAG CCG CAG GTT−３′（配列番号:2）の塩基配列を持つプライマーを使用し、以下のプログラムに従いサーマルサイクラー（パーキンエルマー社）で行った。すなわち前加熱を96℃30秒行い、96℃60秒/55℃12秒/72℃180秒のサイクルを30回繰り返した後、72℃で300秒加熱処理した。
増幅したPCR断片はQIAquick（キアゲン社）にて精製し、平石の方法（日本微生物生態学会誌、vol.10（２）,81−102,1995）に従い、PCR物産を直接鋳型とする方法でシークエンスを行った。シークエンス反応には５′−GAG TTT GAT CCT GGC TCA G−３′（配列番号:1）、５′−GGC CGG ACG GGT GAG T−３′（配列番号:3）、５′−TAC GGG AGG CAG CAG−３′（配列番号:4）、５′−GTG CCA GCA GCC GCG CG−３′（配列番号:5）、５′−G ATT AGA TAC CCT GGT AG−３′（配列番号:6）、５′−ACT CAA AGG AAT TGA CGG−３′（配列番号:7）、５′−GCA ACG AGC GCA ACC C−３′（配列番号:8）、又は５′−TGT ACA CAC CGC CCG T−３′（配列番号:9）の塩基配列を持つプライマーを各々使用し、Dye terminator cycle sequencing kit（パーキンエルマー社）を用いて、本キット指定のプログラムに従いPCRを行った。シークエンス反応を行ったサンプルはABI373Aシークエンサー（パーキンエルマー社）により電気泳動及び配列の解析を行った。これらの操作により決定された本微生物の16SrDNAの塩基配列を表６（配列表10）に示す。
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なお、得られた塩基配列は国立遺伝学研究所のデータベースDDBJ＋DDBJ  NEW中のデータと比較した。類似菌株の検索は検索プログラム（blast）を用い、その設定はデフォルト値で行い、先ず類似性の高い50種を選択した。そのうち生理的分類試験の結果から明らかに異なる菌株（ミコール酸生成能をもつMycobacterium属）を除いた残りや、近縁と考えられる属のType strain等と多重相同性比較（multiple alignment）解析を行った。
その結果からNJ（近接接合）法（図１）またはUPGMA（平均距離）法（図２）で系統樹を作成（５′末端側の配列をそろえてからalignmentした）したところ、最も近縁の菌はTerrabacter tumescens（系統樹には参考のためにMycobacterium sedimentalisを含めてある）であった。類縁性の高い菌株（同一クラスターに属する菌）については、再度Genetyx−Mac  8.0によってホモロジー検索を行った。しかし、最も近縁のTerrabacter tumescensにおいても遺伝子の相同性は95％に留まり、同族でないと判断された。従って本微生物は、いずれの公知の菌とも異なる新属の微生物であることが確認された。
この微生物は、培地に混入した100ppm程度の高濃度のトリクロロエチレンを50％程分解し、30ppm程度のトリクロロエチレンを24時間で完全に分解する。この微生物の増殖に伴ってトリクロロエチレンを分解させる際には、トリクロロエチレンを含む培養基（培地、土壌、水等）中にフェノール等の芳香族化合物を少なくとも１種類添加する必要がある。
以下、本発明に係る微生物を下記の実施例により更に詳しく説明する。
実施例2.
500ml容積の三角フラスコに入れた、0.05％の酵母エキスと500mのフェノールを含む100mlのNMS培地に、500mのフェノールを含むNYG培地に1.5％の寒天を加えた平板培地で植継ぎ保存した本微生物のコロニーを白金耳にて釣菌して接種するか、500mのフェノールを含むNYG培地で30℃にて本微生物を１晩振とう培養した前培養液1.0mlを接種した。30℃にて130r.p.m.で３日間振とう培養した後、菌体を5000r.p.m.にて10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のNMS培地に再懸濁した。
この時OD600は0.5（菌体数で１×109c.f.u./ml）であった。菌体懸濁は20ml容積のバイアル瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に100,50又は30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて振とう培養し、定期的にバイアル瓶中の気相をECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
この結果を図３に示す。本微生物は30ppmのトリクロロエチレンを24時間で完全に分解した。50ppm及び100ppmという高濃度のトリクロロエチレンに対しても24時間で70％及び50％分解した。また、０〜24時間目のトリクロロエチレン分解量は、初期濃度が50および100ppmと高くても、それぞれ30ppmの場合と比べ低下することが無く、本微生物は高濃度のトリクロロエチレン存在下でも分解阻害を受けないことが分かった。これまで、100ppmの高濃度のトリクロロエチレンを分解した報告はないことから、本微生物の分解能力は極めて高いと思われる。
実施例3.
実施例２と同様の方法で培養した菌体を5000r.p.m.にて10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のpHを幾通りかに調製したM9培地（Na2HPO4・7H2O  12.8g/l,KH2PO4  3g/l,NaCl  0.5g/l,NH4Cl  1.0g/l）にそれぞれ再懸濁した。菌体懸濁液4mlは20ml容積のバイアル瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて振とう培養し、定期的にバイアル瓶中の気相をECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。結果は図４に示すようにpH5以下では極めて活性が低下するがpH6〜９の間では分解率100％の高い値であり、pH10でも90％程度にしか分解活性が低下しなかった。従って、このMO7株は休止菌体反応におけるトリクロロエチレン分解の至適pHは６〜９の間にあり、高いpH条件下で高い分解活性を発揮すると分かった。トリクロロエチレンの好気分解において生成されるトリクロロエチレンオキシドは、アルカリ環境下においては自発的に分解し無害なグリオキシル酸等を生成する。一方、酸性条件下ではトリクロロエチレンオキシドは自発的に分解しジクロロ酢酸等のハロ酸を生成する。従って、微生物による好気的なトリクロロエチレンの分解はアルカリ環境下で行うのが好ましい。本微生物は高いpH条件下で高い分解活性を発揮するため、トリクロロエチレンのアルカリ環境下での分解に非常に有用である。
実施例4.
実施例２と同様の方法で培養した菌体を5000r.p.m.にて10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液4mlは20ml容積のバイアル瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、それぞれ異なる温度に設定した恒温相中で振とうした。トリクロロエチレンの残存濃度は定期的にバイアル瓶中の気相をECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
結果は図５に示すとおり、４℃ではTCEの分解は７日かけてゆっくり進んだ。37℃では１日で分解が停止し、かつ分解率は低い値となった。一方、20℃と30℃ではいずれも１日で80〜90％の分解が進んだが、30℃よりもむしろ20℃の方が10％近く分解活性が高かった。トリクロロエチレン等の汚染が問題となっている地下の土壌温度は15〜20℃で安定していると言われるが、これまでのトリクロロエチレン分解菌の報告等においては分解活性の評価を土壌温度よりも高い30℃で行っている例が多く、土壌環境と同じ温度での分解活性が、評価実験時と同様に維持されていることを証明した例は非常に少なかった。
一般に、微生物分解の基本的な反応である酵素反応は、温度が10℃低下すると反応速度1/2程度に低下することから、評価時よりも低い温度の土壌中では微生物のトリクロロエチレン分解速度が低下すると予測される。しかし、本微生物においては、機構は定かではないが土壌環境と同じ温度では分解活性は低下せず、高い実用特性を持つと証明された。
実施例5.
実施例２と同様の方法で培養した菌体を5000r.p.m.にて10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のNMS培地に再懸濁した。その菌体懸濁液をシャーレに入れ厚さが1mm程度となるように広げた後、光源から40cmの位置に置いて60秒以上、波長260nm・15Wの紫外線灯を照射し滅菌した。滅菌処理後の菌体懸濁液4mlは20ml容積のバイアス瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアス瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて振とう培養し、定期的にバイアス栓中の気相をECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
結果は図６に示すとおり、滅菌処理後の菌体でも生菌に対し80％以上のトリクロロエチレンの分解活性があった。また、滅菌処理した菌体懸濁液をNYG培地にその1/100量植菌するか、またはNYG寒天培地に原液のまま塗沫して30℃にて培養を行ったが、培養液濁度の上昇またはコロニーの形成は全く見られず、完全に滅菌されたことを確認された。
なお、滅菌処理した菌体懸濁液を４℃で保存したときの残存活性は、図７に示すとおり、保存３日後で生菌体の場合に比べほとんど変わらず、７日後では生菌体を７日間保存した場合に比べ非常に高い活性を維持していた。以上の結果から死菌体では当初の活性は生菌体に比べ80％に低下するものの、保存時の活性低下率が低いため、生菌体よりも高いトリクロロエチレン分解活性を維持できることが判明した。
微生物を菌体の細胞壁などの外界との境界構造を破壊せず滅菌することにより、トリクロロエチレン分解反応に必要な補酵素等を酵素活性の発現に必要な濃度のまま酵素の周囲に保つことが可能である。従って、トリクロロエチレン分解活性を維持するための補酵素等の供給は不要で培養菌体のみを散布すれば良く、安価にかつ生態系への影響を極力小さくしてトリクロロエチレン等の浄化を実施することが可能である。
実施例6.
20ml容積のバイアル瓶に入れた4mlの、0.05％の酵母エキスと500mのフェノールを含むPH培地（組成は表７に記載）に、500mのフェノールを含むNYG培地に1.5％の寒天を加えた平板培地地上から本微生物のコロニーを白金耳にて釣菌して接種するか、500mのフェノールを含むNYG培地で30℃にて本微生物を１晩振とう培養した前培養液0.04ml（菌体数にして約106個/ml）を接種した。
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接種と同時に全て液相中に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンと500ppmのフェノールを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて振とう培養した。トリクロロエチレン濃度は定期的にバイアル瓶中の気相をECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析し測定した。また、フェノール濃度は、培養液を0.45μのフィルターで濾過した後、1mlの濾液に0.1mlの５％  K3Fe（CN）6/0.1M  glycine水溶液と1mlの0.25％  ４−アミノアンチピリン水溶液を逐次加えた後混合し、505nmの吸光度を測定して定量した。
この結果は図８に示す様に、菌体の増殖と共にフェノールとトリクロロエチレンが減少し、培養31時間目で両者とも完全に分解された。従って、トリクロロエチレン分解活性を誘導するフェノール等の芳香族化合物存在下で本微生物を増殖させた場合、本微生物が高いトリクロロエチレン分解能を有することが確認された。公知の微生物と比較すると、シュードモナス  セパシアKK01が30ppmのトリクロロエチレンを２日で15ppm程度まで分解するという報告及び、アルカジェネス・エウトロフスKS01（特開平７−123976）は50及び25ppmのトリクロロエチレンを４日で完全分解するという報告以外は、何れも10ppm以下の低濃度のトリクロロエチレンについての分解しか報告されていない。
また、アルカジェネス・エウトロフスKS01（特開平７−123976）のトリクロロエチレン分解では培養液に接種される微生物の量は108個/mlで、本発明の実施例６に記載する場合の約100倍量が必要である。従って、本発明の微生物はアルカジェネス・エウトロフスKS01に比べ、所定量のトリクロロエチレンを分解するために必要な接種菌体量を大幅に減量できるため、菌体の培養コストを低減できる等の利点がある。なお、混合添加したフェノールも検出限界以下まで分解されるので、環境汚染物資であるフェノールによる環境汚染のおそれも無くなる。
なお、本発明者らは土壌中でトリクロロエチレンを分解する能力を持ちうる微生物の分解活性を高め、高濃度の汚染に対応しうる分解能力を持った微生物を調製するため、接種する前の培養方法に着目し検討を加えた。その結果、接種する前の微生物の培養時間に最適値があること、誘導剤を逐次培養液に添加することでトリクロロエチレンの分解活性が上昇することを見いだし本発明となった。以下実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例7.
500ml容積の三角フラスコに入れた、0.05％の酵母エキスと500ppmのフェノールを含む100mlのPH培地に、500ppmのフェノールを含むNYG培地に1.5％の寒天を加えた平板培地で植継ぎ保存した本微生物のコロニーを白金耳にて釣菌して接種するか、500ppmのフェノールを含むNYG培地で30℃にて本微生物を１晩振とう培養した前培養液1.0mlを接種した。30℃にて130r.p.m.で培養しながら培養液の濁度と、フェノールの濃度を実施例６と同様の方法で測定した。培養中の菌体を経時的に5000r.p.m.  10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のNMS培地に再懸濁した。この時OD600は0.2（菌体数で2.5×108c.f.u./ml）であった。
菌体懸濁液は20ml容積のバイアル瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30度にて24時間振とうした後、バイアル瓶中の気相をEID検出器付けのガスクロマトグラフィーで分析した。この結果を図９〜図11に示す。図９中の折れ線グラフは集菌前の培養段階での培養液濁度とフェノールの濃度を、図10の棒グラフはそれぞれの培養時間で集菌した本微生物の単位菌体量あたりの分解活性（比活性）を、図11の棒グラフはそれぞれの培養時間で集菌した本微生物の単位量当たりの培養液から得られる分解活性（総活性）を表す。
これよりトリクロロエチレン分解活性において、比活性は誘導期から対数増殖期にかけて著しく高くなり、その後はほぼ一定のレベルを維持したが、残存フェノールが０になってからは次第に低下した。しかし、総活性は、定常期の残存フェノールの濃度が０になるあたりで最高値を維持した。従って、土壌に接種する前の段階で培養液濁度とフェノールの濃度をモニターしながら培養を行い、濁度の上昇が停止し培養が定常期となり、さらにフェノールの濃度が０になるあたりで培養を終了すれば高いトリクロロエチレン分解能力をもった菌体が得られると判明した。
実施例8.
実施例７と同様な方法で本微生物の培養を行い、培養液の濁度とフェノールの濃度を実施６と同様の方法で測定した。また、培養途中でフェノールの濃度が０になった時に、再度500ppmのフェノールを追加し培養を継続した。培養中の菌体を経時的に5000r.p.m.  10分間の遠心分離にて回収し、培養液と等量のNMS培地に再懸濁した。
この時OD600は0.2（菌体数で2.5×108c.f.u./ml）であった。菌体懸濁液は20ml容積のバイアス瓶に入れ、同時にすべて液相に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて24時間振とうした後、バイアル瓶中の気相をEID検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
この結果を図12〜図14に示す。図12中の折れ線グラフは集菌前の培養段階での培養液濁度とフェノールの濃度を、図13の棒グラフはそれぞれの培養時間で集菌した本微生物の比活性を、図14の棒グラフはそれぞれの培養時間で集菌した本微生物の総活性を表す。培養45時間目の残存フェノールがほぼ０になった培養液に500ppmのフェノールを再添加した場合、フェノール濃度は再び減少し培養液濁度は増加した。そこで、69時間目に再度フェノールを添加したところ培養液濁度の上昇とフェノール濃度の減少は見られなかった。
トリクロロエチレン分解活性については、図13の41時間目〜60時間目のように増殖が定常期に達するあたりでフェノールが十分残っている場合は高い比活性が得られたが、その後フェノール濃度が減少すると比活性は低下した。93時間目でもフェノール添加を行ったが、この時は菌体量の減少がみられ、比活性も低下した。しかし、フェノールが残存している93時間目〜114時間目は、フェノールがほとんど分解された45時間目〜69時間目に比べ高い比活性を維持していた。一方、総活性は最も菌体量・比活性ともに高かった60時間目が最大であり、培養開始時にのみフェノールを加える場合に比べ2.5倍の高い総活性が得られた。
次に土壌中でのトリクロロエチレンの分解について実施例を挙げて説明する。
実施例9.
容積100mlのバイアル瓶に、人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えた1.5ml,4.5ml,7.5ml,15ml又は30mlのNMS培地でそれぞれ30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％になる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密封し30℃で一定期間静置した。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。結果は、図15に示すように菌体密度が約2.5×106cfu/g wet soil（培養液にして15ml）まではトリクロロエチレン分解と菌体量は比例的であるが、約５×108cfu/g wet soil（培養液にして30ml）以上では飽和していた。従って、本微生物を用いる場合約2.5×108cfu/g wet soilの菌体密度が完全にトリクロロエチレンを分解させるのに最適であり、かつ、本微生物は土壌の汚染濃度に対し浄化に必要な最低限の菌体液量を予測できる特性を持つと判明した。
実施例10.
容積100mlのバイアル瓶に、人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えた7.5mlのNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％になる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とう後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。結果は図16に示すように、7.5mlの培養液相当の菌体を２回に渡って土壌に添加した場合、15mlの培養液量相当の菌体を１回で添加した場合と同等の分解率であった。
汚染土壌に含まれるトリクロロエチレンを分解できる培養液を１度に供給することはスケール的に非常に難しい（実際の汚染土壌は数10m3以上）ので、段階的に分解菌を培養し土壌に添加する必要があるが、本菌株においては段階的な注入操作でも、必要な菌体量を一回で注入する場合と分解率は遜色が無いと判明した。従って、１回で菌体を培養・注入することが不可能な広範囲の汚染現場にも、少量の培養液を何回にも分けて添加することで十分対応できると考えられる。
実施例11.
容積100mlのバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで任意の濃度に汚染した砂粒土（風乾）を30g入れた。土壌の汚染濃度は、15,30,45,100及び150mg/kgに設定した。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えた15,30及び45mlのNMS培地でそれぞれを30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％になる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアルをテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。土壌中の菌体密度は、15,30及び45mlの培養液に対し、それぞれ9.4×108、1.9×109及び2.8×109cfu/g wet soilであった。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。結果は図17に示すように、土壌中濃度として約150mg/kgの非常に高い濃度のトリクロロエチレンの分解が可能であった。さらに、前述の結果から、土壌に添加する菌体量に比例してトリクロロエチレンの分解量が増すので、汚染濃度が高い場合（150mg/kg程度）でも添加する菌体量を増やす、あるいは逐次添加していけば浄化が可能であると判明した。
実施例12.
容積100mlのテフロンコートされたゴム栓で密閉できるバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えたNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％、接種菌体量が108〜109cells/g−wet soilになる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。土壌中のトリクロロエチレン濃度の経時変化は、同時に多数サンプルを準備して、一定時間経過毎に一部のサンプルの全量について抽出操作を行い測定した。抽出操作に移るまでは４℃で保管した。
また、土壌中のトリクロロエチレン濃度の測定は、土壌の汚染に係る環境基準（土壌環境基準）に示された方法でも行った。すなわち、あらかじめ撹拌子を入れたねじ口付き三角フラスコに土壌試料と溶媒（純粋に塩酸を加え、pHが5.8〜6.3となるようにしたもの）とを重量体積比10％の割合となるようにとり、すみやかに密栓した。この時、混合液が500ml以上となるようにし、かつ、混合液に対するねじ口付き三角フラスコのヘッドスペースができるだけ少なくなるようにした。その調製した試料液を常温・常圧に保ちマグネティックスターラーで４時間連続撹拌した。
その試料液を30分程度静置後、ガラス製注射筒に静かに吸い取り、孔径0.45μｍのメンブレンフィルターを装着したろ紙ホルダーを接続して注射筒の内筒を押し、空気および始めの数mlを排出し、次に共栓付き試験管にろ液を分取し、定量に必要な量を正確に計り取ってこれを検液としてガスクロマトグラフィーで分析した。結果は図18に示すように、土壌中のトリクロロエチレンは菌体添加後１日で全量の90％程度が分解されていた。
従って本微生物を土壌に添加してトリクロロエチレンを浄化する方法は、土壌中の18mg/kg程度のトリクロロエチレンを１日でほぼ分解するくらいの高い浄化能力を有する技術であることが判明した。また、静置７日目の土壌サンプルを国の定める分析方法（土壌の汚染に係る環境基準、土壌環境基準）に従って測定した結果、トリクロロエチレンは基準値（0.03ppm）以下の0.005ppmであった。この結果、本微生物を用いて汚染土壌を浄化することで、環境基準をクリアーできるレベルまでトリクロロエチレンが浄化できると判明した。真空抽出法等の物理的な処理法では低濃度からの浄化が困難と言われているが、本菌株を用いることにより基準値以下までの浄化が可能となる。
実施例13.
容積100mlのテフロンコートされたゴム栓で密閉できるバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えたNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％、接種菌体量が108〜109cells/g−wet soilになる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。その後、土壌中のトリクロロエチレンの分解に伴い生成されるといわれる副生成物の分析を実施した。
土壌中の副生成物の分析は次のように実施した。塩化ビニル、1,1−ジクロロエチレン、cis−1,2−ジクロロエチレン及びtrans−1,2−ジクロロエチレンの分析は図19に記載の方法に従った。ジクロロ酢酸とトリクロロ酢酸・トリクロロエタノール・抱水クロラールはそれぞれ図20,21及び22に記載の方法に従った。結果は表８に示すように、何れの副生成物も検出限界以下であった。
嫌気的条件下でのトリクロロエチレンの脱塩素反応では、より毒性の高いジクロロエチレン類が蓄積する。また、好気的条件下でのトリクロロエチレンオキサイドの生成を初発とする分解過程では、ジクロロ酢酸等が中間生成物として生じることが知られている。本微生物が土壌中のトリクロロエチレンを分解するにあたり有害な物質の蓄積は見られなかった。測定した物質以外の存在は不明であるが、この技術の安全性は高いと示唆された。
0003546888.tif 000009
実施例14.
容積100mlのテフロンコートされたゴム栓で密閉できるバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えたNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％、接種菌体量が108〜109cells/g−wet soilになる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液はシャーレに入れ厚さが1mm程度となるように広げた後、光源から40cmの位置に置いて60秒以上、波長260nm・15Wの紫外線灯を照射し滅菌した。滅菌操作後の菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。また、滅菌処理した菌体懸濁液をNYG培地にその1/100量植菌またはNYG寒天培地に原液のまま塗沫して30℃にて培養を行ったが、培養液濁度の上昇またはコロニーの形成は全く見られず、完全に滅菌されたことが確認された。結果は図23に示す様に、死菌でも生菌と同等のトリクロロエチレンの分解が見られた。
微生物による汚染土壌の浄化に当たっては、生菌を土壌に添加している例がほとんどであるが、菌体を土壌へ添加する事は現時点ではパブリックアクセプタンスの上で困難な側面がある。また、特定の微生物を環境中に放出することで生態系に大きな影響をもたらす可能性があると懸念されている。しかし、滅菌操作により完全に増殖能力を失った微生物の散布は単なる有機物の散布に等しく、生態系への影響が極めて小さいと考えられている。そこで、土壌へ添加する直前にUVを照射することで分解菌を死滅させて土壌に添加した場合について検討した結果、死菌体の添加は極めて有効な方法であると判明した。
なお、特開平８−3012に開示された発明においては、分解菌を破砕して土壌に散布することで生態系への影響を極めて小さくする効果を得るとしているが、微生物の破砕操作は装置的・時間的に多くの手間を要する作業で、実際の汚染土壌に対して大量に分解菌を散布する場合は実施が難しいことが容易に想像される。また、公知のトリクロロエチレンの酸化活性を有する酵素は活性発現に補酵素としてNAD等を必要とするが、菌体破砕により菌体から遊離した酵素に分解反応に必要な濃度の補酵素を供給するのは、補酵素の価格が非常に高いこと等から極めて難しいと考えられる。一方、本菌株を用いた本方法で、そいういった問題はなく、安価に且つ生態系への影響を極力小さくしてクロロエチレン等の浄化を実施することが可能である。
実施例15.
容積100mlのテフロンコートされたゴム栓で密閉できるバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂粒土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えたNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％、接種菌体量が108〜109cells/g−wet soilになる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液はシャーレに入れ厚さが1mm程度となるように広げた後、光源から40cmの位置に置いて60秒以上、波長260nm・15Wの紫外線灯を照射し滅菌した。
滅菌操作後の菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。その後、土壌中のトリクロロエチレンを分解させた後、トリクロロエチレン分解に伴い生成するといわれている副生成物の分析を実施した。土壌中の副生成物の分析は実施例13と同様に行った。また、滅菌処理した菌体懸濁液をNYG培地にその1/100量植菌またはNYG寒天培地に原液のまま塗沫して30℃にて培養を行ったが、培養液濁度の上昇またはコロニーの形成は全く見られず、完全に滅菌されたことが確認された。
結果は表９に示すように、何れの副生成物も検出限界以下であった。嫌気的条件下でのトリクロロエチレンの脱塩素反応では、より毒性の高いジクロロエチレン類が蓄積する。また、好気的条件下でのトリクロロエチレンオキサイドの生成を初発とする分解過程では、ジクロロ酢酸等が中間生成物として生じることが知られている。本微生物が土壌中のトリクロロエチレンを分解するにあたり有害な物質の蓄積は見られなかった。測定した物質以外の存在は不明であるが、死菌体を利用した場合も、この技術の完全性は高いと示唆された。
0003546888.tif 000010
実施例16.
容積100mlのテフロンコートされたゴム栓で密閉できるバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂質土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.05％の酵母エキスを加えたNMS培地で30℃にて３日間振とう培養した後、遠心分離にて集菌し菌体懸濁液添加後の土壌の含水率が25％、接種菌体量が108〜109cells/g−wet soilになる適量のNMS培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し20℃で一定期間静置した。
その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
結果は図24に示すように、20℃の場合でも30℃の場合と同様にトリクロロエチレンが分解された。実際の土壌温度でも十分トリクロロエチレンの分解が進むと示唆されたことから、本菌株が他に比べ高い実用特性を持つことが判明した。
実施例17.
容積100mlのバイアル瓶に人工的にトリクロロエチレンで汚染した砂粒土（風乾）を30g入れた。本菌株を500ppmのフェノールと0.02％の酵母エキスと1mMのグルコースを加えたNMS培地で30℃にて１日間振とう培養した。土壌中でそれぞれ500ppm・0.02％・1mMとなるフェノール・酵母エキス・グルコースを含んだ適量のNMS培地（あるいはPH培地）に培養液1/100量を加えてから土壌に添加した。培養液添加時の土壌中の菌体密度は108cells/g−wet soil、含水率は25％とした。
バイアル瓶はテフロンコートされたゴム栓で密閉後、30℃で所定期間静置した。その後、30gの土壌が入ったバイアル瓶に、活性炭を通過させた空気でばっ気した50mlのイオン交換水、10mlのｎ−ヘキサンを加え密栓した。それを超音波洗浄器中で10分間超音波処理してから、振とう機で10分間振とうした後、分離したｎ−ヘキサンをECD検出器付きのガスクロマトグラフィーで分析した。
結果は図25に示したように、NMS培地でもPH培地でも同様に14mg/kg程度から1mg/kg程度まで土壌中のトリクロロエチレンが減少した。土壌中にフェノールを添加したことで土着の微生物によりトリクロロエチレンが減少したが、それ以上にMO7株を添加したことの効果が示された。従って、滅菌状態の培養液中では効果を示すが、自然界では土着の微生物に駆逐されて、その土壌中での活性化が誘導されないといったことはないことが判明した。MO7株は自然環境下でも106cells/g−wet soil程度の添加でフェノールにより十分な活性化が誘導されることを確認した。
実施例18.  構成変異株の創成
12ml容試験管に入れた2mlの1/3LB培地（組成は表10に記載）に1.5％の寒天を加えた平板培地で植継ぎ保存した本微生物のコロニーを白金耳にて釣菌して接種した。30℃・130r.p.m.で一晩振とう培養した後、培養液の一部を適宜希釈して1/3LB培地に1.5％の寒天を加えた平板培地上に塗沫し、30℃で培養し菌数を測定した。残りの培養液をシャーレに広げ、光源からの照射距離が30cmの位置に置き、波長260nm・15Wの紫外線灯により、照射時間最長３分間の条件で紫外線を照射した。
0003546888.tif 000011
その後、その培養液を適宜希釈して1/3LB培地に1.5％の寒天を加えた平板培地上に塗沫し、30℃で培養し、菌数を測定した。これにより、死滅率を求めた。99％以上の死滅率が得られた場合に、十分な変異がかかったとみなし、この時の菌体培養液から目的の変異株の選抜を行った。
カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ（C23O）は、カテコールに酸素を導入し、カテコールをメタ開裂し、２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを生成する。この物質は黄色であり、コロニーにカテコールを噴霧し、このC23Oが発現すればコロニーは速やかに黄変する。フェノール資化性トリクロロエチレン分解菌のトリクロロエチレン分解酵素は、フェノールをカテコールに変換するフェノールヒドロキシラーゼ（PH）でることが知られている（M.fujita et al.,J.Ferment.Bioeng.,79,100（1995）,V.Shingler et al.,J.Bacteriol,174,711（1992））。
C23O自体は、直接トリクロロエチレンの分解には関与してはいないが、C23O遺伝子とPH遺伝子が隣接して、１つのオペロンから発現している例が知られている（M.Fujita et al.,J.Ferment.Bioeng.,79,100（1995）,V.Shingler et al.,J.Bacteriol,174,711（1992））。C23OがこのPHと連動して発現するのであれば、このC23Oの発現を指標にして、トリクロロエチレン分解酵素構成発現株の選抜が可能となる。本微生物は、フェノールを唯一の炭素源として培養すると、フェノールの分解、菌の増殖につれて培養液が黄色くなるため、本選抜方法が適用できると考えられる。
そこで、変異処理後の菌体懸濁液を適宜希釈し、1/3LB培地に1.5％の寒天を加えた平板培地上に塗沫し、30℃で１日から３日培養後のコロニーに、カテコール溶液（0.1％（w/v）エーテル溶液）を噴霧した。
その結果、99.99％の死滅率であった時、UV照射後に出現した約10,000コロニーを検索した中から、16個の黄色を示すコロニーを選抜した。
そのコロニーを1/3LB液体培地で培養後、1/3LB培地に1.5％の寒天を加えた平板培地上に塗沫し、30℃で培養後、出現したコロニーに対して、カテコール溶液を噴霧し、黄色のコロニーを再度分離し、C23℃構成発現変異株を得た。
20ml容積のバイアル瓶に入れた4mlのグルタミン酸ナトリウム（0.1％）を含むＭ培地（組成は表11に記載）に、これらC23O構成発現変異株を白金耳にて釣菌して接種した。バイアル瓶はテフロンコートブチルゴム栓をしてアルミキャップでシールし、30℃にて２日間振とう培養した。その後、全て液相中に溶解した場合に30ppmとなる量のトリクロロエチレンを添加した。30℃にて５日間振とう培養後、トリクロロエチレン濃度を実施例６のように測定した。
0003546888.tif 000012
その結果、親株であるMO7株は、ほとんど分解しなかったが、C23O構成発現変異株のいくつかは、30ppmトリクロロエチレンを52〜34％分解した。これらの微生物は、親株MO7株由来のフェノールを必要とせずにトリクロロエチレンを分解可能な変異株であることが明らかとなった。
次に、この変異株のうち最もトリクロロエチレンの分解活性が高かったMO715株を用い、土壌中でのトリクロロエチレンの分解について実施例をあげて説明する。
実施例19.  構成変異株によるトリクロロエチレンの分解
実施例９のように、トリクロロエチレン人工汚染土壌（11mg/kg）を作製した。MO715株をグルタミン酸ナトリウム（0.1％）を含む100mlのＭ培地で、30℃にて２日間振とう培養した後、遠心分離により集菌し、添加後の土壌の含水率が25％になる適量のＭ培地に再懸濁した。菌体懸濁液（フェノールは含まず）を土壌に添加後、バイアル瓶をテフロンコートされたゴム栓で密閉し30℃で一定期間静置した。トリクロロエチレンの分析は、実施例９と同様の方法で行った。フェノールで培養した培養液および、MO7株についても同様に行なった。
その結果、グルタミン酸ナトリウムで培養したMO715株菌体懸濁液を添加後、12時間で35％程度、48時間で60％程度のトリクロロエチレンの分解を示した。この時、グルタミン酸ナトリウムで培養したMO7株はほとんど分解能を示さなかった。従って、本微生物は、誘導のためにフェノールを必要とせずに、土壌中でもトリクロロエチレンを分解することが明らかとなった。
よって本発明は環境中にフェノール等の有害物質を散布することなく、トリクロロエチレンを分解しうるので環境に対する安全性が極めて高い技術である。
ブタペスト条約に基く微生物の国際寄託への言及
国際寄託当局：工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番７号（郵便番号  305）
微生物の表示     寄託番号         寄託日
MO7            FERM BP−5624  1996年８月12日
MO715          FERM BP−5928  1997年４月24日
配列表
配列番号:1
配列の長さ:19
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:2
配列の長さ:27
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:3
配列の長さ:16
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:4
配列の長さ:15
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:5
配列の長さ:17
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:6
配列の長さ:18
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:7
配列の長さ:18
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:8
配列の長さ:16
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:9
配列の長さ:16
配列の種類：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成DNA
配列
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配列番号:10
配列の長さ:1422
配列の種類：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の型：合成cDNA
配列
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【図１】
0003546888.tif 000023
【図２】
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【図３】
0003546888.tif 000025
【図７】
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【図４】
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【図９】
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【図５】
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【図１０】
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【図６】
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【図１１】
0003546888.tif 000032
【図８】
0003546888.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
0003546888.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２４】
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【図２５】
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