(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光の光軸上に、前記レーザー光の前記光軸を回転軸として回転可能に設けられる前記レーザー光を直線偏光に変換する偏光変換部材と、
前記光軸を回転軸として前記偏光変換部材と同期して回転可能に設けられる前記レーザー光の進行方向を変える偏向部材と、
集光レンズと、
対物レンズと、
を備え、
前記偏光変換部材、前記偏向部材、前記集光レンズ、前記対物レンズ及び前記レーザー光の全反射面の順序で配置されることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項２】
円偏光したレーザー光のレーザー光源と、
前記レーザー光の光軸上に、前記レーザー光の前記光軸を回転軸として回転可能に設けられる前記レーザー光を直接偏光に変換する偏光変換部材と、
前記光軸を回転軸として前記偏光変換部材と同期して回転可能に設けられる前記レーザー光の進行方向を変える偏向部材と、
集光レンズと、
対物レンズと、
を備え、
前記レーザー光源、前記偏光変換部材、前記偏光部材、前記集光レンズ、前記対物レンズ及び前記レーザー光の反射面の順序で配置され、
前記対物レンズの後焦点面は、前記集光レンズの焦点面の位置にあり、
前記全反射面は、前記対物レンズの焦点面の位置にあることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の全反射型蛍光顕微鏡であって、前記偏光変換部材が回転することにより前記集光レンズにドーナッツ型の全反射領域ができ、前記対物レンズにもできた全反射領域を透過して全反射面で全反射できることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の全反射型蛍光顕微鏡であって、全反射面のエバネッセント場におけるレーザー光の偏光方向が回転可能であることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記偏光変換部材は、１/４波長板であることを特徴とする請求項１乃至４記載の全反射型蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
この発明は、蛍光顕微鏡に関し、特に、蛍光色素分子1個の向きの観察が可能な全反射型蛍光顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光顕微鏡は、ある特定の色の光（特定の波長の光）が当たると、その光の波長より長い波長の光を出す色素を利用し、蛍光色素を光らせるための励起光を照射するための光学系と、それにより発生した蛍光を観察する光学顕微鏡を組み合わせたものである。観察したい細胞内の構造に蛍光色素結合させた試薬を結合させ、ある特定の光をこの蛍光色素分子に当てると、目的の細胞内の構造が暗黒を背景にして光ることになる。このような蛍光色素を顕微鏡標本の染色に応用し観察する方法が蛍光顕微鏡法である。
【０００３】
一般の蛍光顕微鏡で観察可能な蛍光色素分子の数は数１０個以上であり、蛍光色素分子1個の観察はできない。これは、蛍光色素分子1個から来る信号に比較して、ノイズ、即ち、周囲からの光の信号の方が大きいために1個の蛍光色素分子を識別できないためである。しかし、性能向上のために改良がなされ、フィルターの性質、対物レンズの品質向上等により、１個の蛍光色素分子を可視化できる蛍光顕微鏡が開発されている。
【０００４】
また、近年、蛍光色素分子1個の観察のために、図４に示すように、レーザー光源を用い、水溶液とガラス２７との境界面上の試料に、ガラス２７側から全反射角以上の角度で前記レーザー光２８を照射し、前記境界面近傍に発生する非伝播光であるエバネッセント場２９により前記試料を照明する方法（以下、全反射照明という）が利用されている。即ち、エバネッセント場による照明により、蛍光色素分子が蛍光を発することを利用する方法である。
【０００５】
エバネッセント場２９は、図４に示すように、前記境界面に垂直方向に対して指数関数的に減衰し、その減衰常数は屈折率と前記レーザー光の入射角に依存している。従って、エバネッセント場は、前記境界面から水溶液中約１５０ｎｍの深さの局所領域のみを照明するので、前記全反射照明は、通常光による照明と比較して、背景光が極端に少ない。
【０００６】
更に、前記水溶液中に多数の蛍光色素分子（濃度〜５０ｘ１０-9モル／リットル）が存在するような条件下でも、前記境界面近傍の水溶液側に前記蛍光色素分子が存在する確率は小さいので、前記境界上に固定されている１個の標的蛍光色素分子以外から発せられる蛍光は少ない。従って、背景光及び他の蛍光色素分子の蛍光によるノイズが極端に少ないので、前記標的蛍光分子1個からの蛍光の観察が可能となる。
【０００７】
前記全反射照明による１分子の観察では、例えば、蛍光色素で標的した蛋白質、ＤＮＡ、基質であるＡＴＰなどの生体分子をガラス面に結合させ、１個1個の分子を独立した輝点として観察する。前記蛍光色素を励起する場合、色素の振動面と励起光の偏光方向が一致していることが必要である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記従来の全反射照明では、色素の振動面と励起光の偏光方向が一致した分子は明るくて観察できるが、一致しない分子は暗くて観察できない、即ち、励起光の偏光方向に対して、振動面が任意の向きの色素を標的にした分子を観察できないという問題点があった。
【０００９】
また、色素の振動面に対し特定の偏光方向では一致せず、観察できないこととなるが、これでは目的の色素の向きが不明となる。本発明は、前記従来の問題点を解決するためになされたもので、振動面が任意の向きの色素を標的にした分子を観察することができる全反射型蛍光顕微鏡を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明は上記問題を解決するために、請求項１に係る発明は、レーザー光の光軸上に、前記レーザー光の前記光軸を回転軸として回転可能に設けられる前記レーザー光を直線偏光に変換する偏光変換部材と、前記光軸を回転軸として前記偏光変換部材と同期して回転可能に設けられる前記レーザー光の進行方向を変える偏向部材と、集光レンズと、対物レンズと、を備え、前記偏光変換部材、前記偏向部材、前記集光レンズ、前記対物レンズ及び前記レーザー光の全反射面の順序で配置されることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
請求項２に係る発明は、円偏光したレーザー光のレーザー光源と、前記レーザー光の光軸上に、前記レーザー光の前記光軸を回転軸として回転可能に設けられる前記レーザー光を直接偏光に変換する偏光変換部材と、前記光軸を回転軸として前記偏光変換部材と同期して回転可能に設けられる前記レーザー光の進行方向を変える偏向部材と、集光レンズと、対物レンズと、を備え、前記レーザー光源、前記偏光変換部材、前記偏光部材、前記集光レンズ、前記対物レンズ及び前記レーザー光の反射面の順序で配置され、前記対物レンズの後焦点面は、前記集光レンズの焦点面の位置にあり、前記全反射面は、前記対物レンズの焦点面の位置にあることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
請求項３に係る発明は、請求項１又は２に記載の全反射型蛍光顕微鏡であって、前記偏光変換部材が回転することにより前記集光レンズにドーナッツ型の全反射領域ができ、前記対物レンズにもできた全反射領域を透過して全反射面で全反射できることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の全反射型蛍光顕微鏡であって、全反射面のエバネッセント場におけるレーザー光の偏光方向が回転可能であることを特徴とする全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
請求項５に係る発明は、前記偏光変換部材は、１/４波長板であることを特徴とする請求項１乃至４記載の全反射型蛍光顕微鏡を提供する。
ここで、偏光変換部材とは円偏光を直線偏光とするもの、任意の直線偏光を特定の直線偏光とするもの、又はランダム偏光を特定の偏光に変換する機能を有するものが挙げられる。また、ここで偏光変換部材はレーザー光の光軸を軸として自動回転できる機能も付加されており、円偏光等を直線偏光に変換されるだけでなく、当該直線偏光の方向も同時に３６０°回転変化することができる。さらに、偏向部材とはプリズム等をいい、レーザー光の照射方向を変化させることができる。この偏光部材と偏光変換部材が同期して回転することで、特定の偏光方向及び照射方向により蛍光色素の観察できない向きを捕捉することができる。
【００１１】
また、レーザー光源からレーザー光は円偏光、直線偏光又はランダム偏光いずれでもよい。また、レーザー光の波長は目的の蛍光色素により適当な波長とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施形態に関して説明する。図１は、本発明による全反射型蛍光顕微鏡の実施形態を示し、（ａ）は構成図、（ｂ）はレーザー光の全反射領域を示す図である。
【００１３】
図１（ａ）に示すように、本発明の実施形態の全反射型蛍光顕微鏡１は、円偏光したレーザー光２のレーザー光源と、光軸３を回転軸として回転可能に設けられるレーザー光２を直線偏光に変換する偏光変換部材である１／４波長板４と、光軸３を回転軸として１／４波長板４と同期して回転可能に設けられるレーザー光２の進行方向を変える偏向部材であるプリズム５と、焦点距離ｆ１の集光レンズ６と、焦点距離ｆ２の対物レンズ７と、全反射面８とを備えることを特徴とする。
【００１４】
プリズム５は、集光レンズ６の後焦点面の位置、すなわち、１／４波長板４と、集光レンズ６の間にある。また、対物レンズ７の後焦点面は、集光レンズ６の焦点面９の位置にあるものである。従って、平行にプリズム５に入射するレーザー光２は、集光レンズ６に平行に入射し、集光レンズ６の焦点面９で焦点を結んで対物レンズ７に入射し、全反射面８に平行に入射する。ここで、プリズム５と集光レンズ６の間の距離（ｆ１）と集光レンズ６と焦点面９の間の距離（ｆ１）を同距離にした。また、焦点面９と対物レンズ７の間の距離（ｆ２）と対物レンズ７と全反射面８の間の距離（ｆ２）を同距離にした。尚、全反射面８を備えずに、観察する試料に付属するものを全反射面９の位置に設置して全反射面とする形態でもよい。
【００１５】
尚、試料が水中にある時には、集光レンズ６の開口数（以下、Ｎ．Ａ．という）が１．３３以上の時に、エバネッセント場による全反射照明となる。この場合、プリズム５は、垂直に入射するレーザー光２をｆ１だけ離れた場所で対物レンズ７にとってＮ．Ａ．＝１．３３以上に相当する距離だけ光路が変わるような角度のプリズムである必要がある。尚、プリズム５の代りに、ミラーを用いて偏向してもよい。
【００１６】
図１（ｂ）に示すように、集光レンズ６のドーナッツ型の全反射領域１０に入射するレーザー光１１は、対物レンズ７のドーナッツ型の全反射領域１２を透過して全反射面８で全反射する。全反射面８は、ガラスと水の境界面のような、高屈折率材料（図１（ａ）中で左側）と低屈折率材料（図１（ａ）中で右側）の境界面である。
【００１７】
低屈折率材料の屈折率をｎ１、高屈折率材料の屈折率をｎ２、即ち、ｎ１＜ｎ２とした場合、低屈折率材料と高屈折率材料の境界面である全反射面８では、高屈折率材料側からｓｉｎθ＝ｎ１／ｎ２を満たす全反射角θ以上の入射角度で入射した光は、全て全反射面８で全反射する。全反射角θは、全反射面を形成する材料の屈折率に依存する。
【００１８】
１／４波長板４とプリズム５は、レーザー光２の光軸３を回転軸として同期して回転可能に設けられており、これにより、プリズム５を透過したレーザー光１１は偏光方向も回転しながら集光レンズ６上で円を描くように偏向される。従って、レーザー光１１を、図１（ｂ）に示すドーナッツ型の全反射領域内１０、１２に移動させることができる。
【００１９】
即ち、図２（ａ）に示すように、円偏光１３のレーザー光２が１／４波長板４とプリズム５を透過した後のレーザー光１１は、例えば、直線偏光１４で表される方向に偏光しており、集光レンズ６上で円形の透過領域１５を透過する。このような状態において、例えば、１／４波長板４とプリズム５とを同期させて光軸３を回転軸として図中で左周りに回転させると、図２（ｂ）に示すように、透過領域１５は回転方向１７に回転し、偏光方向１６も同期して回転する。
【００２０】
尚、１／４波長板４とプリズム５とを同期させて回転させる場合、それぞれが所望の回転が得られるように同期の仕方を選択して同期させればよい。また、１／４波長板４を回転させて直線偏光のレーザー光の偏光方向を変える代りに、偏光子や、偏光方向を電気的に制御する素子であるＥｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓを用いて前記偏光方向を変えてもよい。また、プリズム５の代りに、光の方向を電気的に制御する素子であるＡｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓを用いることも可能である。
【００２１】
次に、全反射面８におけるレーザー光の全反射に関して説明する。図３（ａ）に示すように、図中下方から対物レンズ７の第１入射点１８に入射したレーザー光１９が、ガラス２０の上面である全反射面８において全反射して、対物レンズ７の第２入射点２１に入射する場合を考える。第１入射点１８における直線偏光のレーザー光の偏光方向２２が図に示す方向であったものが、１／４波長板４とプリズム５とを光軸３を回転軸として同期させて回転させると、レーザー光１９は第３入射点２３に移動すると共に、レーザー光１９の偏光方向２２も図に示す方向に変わる。また、全反射面８である試料面上に形成されたエバネッセント場２４の偏光方向２５は、レーザー光１９の偏光方向２２と同期して試料面に平行な面内で回転する。
【００２２】
即ち、対物レンズ７に入射するレーザー光１９が、対物レンズ７上で回転移動すると共に、レーザー光１９の偏光方向も回転する。
【００２３】
以上示したように、本発明の実施形態の全反射型蛍光顕微鏡１では、レーザー光１９の偏光方向２２及び全反射面８である試料面に対するレーザー光１９の入射方向を時間と共に変化させることができる。前記試料面でのエバネッセント場２４の偏光方向２５は、レーザー光１９の偏光方向及び前記試料面に対するレーザー光１９の入射方向により決定されるので、レーザー光１９が図３に示すように回転すると、前記試料面上でのエバネッセント場２４の偏光方向２５は、時間と共に試料面内で回転する。
【００２４】
前記試料面に置かれた蛍光色素分子は、その振動面がエバネッセント場の偏光方向と一致した時に最も明るく、９０度ずれた時に最も暗くなる。従って、試料面上のエバネッセント場２４内にある複数個の蛍光色素分子のうち、エバネッセント場の偏光方向２５とその振動面が一致した蛍光色素分子が観測され、図３に示すレーザー光１９の回転、即ち、前記試料面に対するレーザー光の入射方向及びその偏光方向２２が回転するにつれて、別の蛍光色素分子１個づつの観察が可能となり、且つ蛍光色素分子がどの方向を向いているのかを決定することができる。
【００２５】
例えば、回転分子モーターであるＦ1−ＡＴＰａｓｅを始めとして、ミオシンやダイニン、それらと共通する構造を持つ分解酵素であるプロテアソームに対して蛍光色素結合させ、全反射型蛍光顕微鏡１で観察すること等により、多様な機能を持つ蛋白質の複合体である生体超分子が動作するメカニズムを明らかにすることができ、それらを応用した様々な技術の利用が可能となる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、レーザー光の偏光方向及び全反射面である試料面に対するレーザー光の入射方向を時間と共に変化させることができる。
従って、前記試料面上の分子の該試料面内における方向を検出することが可能となるので、それを利用した技術の利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による全反射型蛍光顕微鏡の実施形態を示し、（ａ）は構成図、（ｂ）はレーザー光の全反射領域を示す図である。
【図２】図１に示すレーザー光の回転移動及び偏光方向の回転を説明するための図である。
【図３】図１の全反射型蛍光顕微鏡によるエバネッセント場の発生を示し、（ａ）はレーザー光の偏光方向及び試料面に対するレーザー光の入射方向に対するエバネッセント場の偏光方向を示す図、（ｂ）はレーザー光が回転移動及びその偏光方向が回転した時のエバネッセント場の偏光方向の変化を示す図である。
【図４】エバネッセント場の発生の説明図である。
【符号の説明】
１  全反射型蛍光顕微鏡
２  レーザー光
３  光軸
４  １／４波長板
５  プリズム
６  集光レンズ
７  対物レンズ
８  全反射面
９  焦点面
１０  全反射領域
１１  レーザー光
１２  全反射領域
１３  円偏光
１４  直線偏光
１５  透過領域
１６  偏光方向
１７  回転方向
１８  第１入射点
１９  レーザー光
２０  ガラス
２１  第２入射点
２２  偏光方向
２３  第３入射点
２４  エバネッセント場
２５  偏光方向
２６  回転方向
２７  ガラス
２８  レーザー光
２９  エバネッセント場
【図１】
0003577514.tif 000002
【図２】
0003577514.tif 000003
【図３】
0003577514.tif 000004
【図４】
0003577514.tif 000005