(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0003581958.tif 000017
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立して水素および色素原性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）置換基からなる群から選択され、Ｘは、ヒドロキシル；ＯＲ６（Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群から選択される）；およびＯ−Ｍｅ＋（Ｍｅ＋は、有機または無機塩基に由来するカチオンである）からなる群から選択される］の潜在的蛍光原性化合物。
【請求項２】
前記塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム、ジエチルアミン、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、シクロヘキシルアミン、ピリジン、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン、Ｎ−メチル−モルホリン、Ｎ−エチル−モルホリンおよびｐ−トルイジンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記色素原性置換基が、必要に応じてアルキル鎖中に酸素原子を含むＣ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；ニトロ；カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４カルボキシアルキル；およびシアノからなる群から選択され、ここでどの前記アルキル基も１種以上のハロゲン原子を置換基として含み得る、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記ハロ置換アルキル基がトリフルオロメチル基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、必要に応じて１種以上のハロゲン原子を含む低級アルキルであり、Ｘがヒドロキシルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素原子である、請求項１に記載の化合物；および該化合物の有機または無機塩基との塩。
【請求項６】
４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートおよびその有機または無機塩基との塩。
【請求項７】
興味ある細菌を含むことが疑われるサンプル中の微生物活性を検出する方法であって、（ｉ）該サンプルを請求項１〜６のいずれかに記載の一般式（Ｉ）の化合物と混合する工程；および（ｉｉ）該一般式（Ｉ）化合物またはその塩と混合された該サンプルを蛍光透視的手段で検査する工程、を包含する方法。
【請求項８】
前記サンプルが、前記工程（ｉ）の前に前記微生物活性を増加するために予備増菌ブロスで処理される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記予備増菌ブロスが、前記微生物活性を示す興味ある細菌に関して選択的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを含む群の細菌の検出においてスクリーニングテストとして使用するための、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ホスファチジル−イノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素を産生し得る興味ある微生物を同定する方法であって、
（Ａ）該微生物を含むことが疑われるテストサンプルを提供する工程；
（Ｂ）興味ある微生物の増殖を支持するために該テストサンプルを予備増菌工程に供する工程；
（Ｃ）請求項１〜５のいずれかに記載の化合物と工程（Ｂ）で得られた産物の少なくとも一部を混合して、該微生物が該テストサンプル中に存在するとき陽性の蛍光透視的反応を示すスクリーニングサンプルを提供する工程；
（Ｄ）該スクリーニングサンプルが陽性の蛍光透視的反応を示す場合、工程（Ｂ）で得られた産物の少なくとも一部を該微生物培養に好適な培地に移す工程、該培地は該微生物にさらされたとき発色し得る少なくとも１種の化合物を含む；
（Ｅ）該色を呈する少なくとも１つのコロニーを発育させるために該培地を該転移部分と共に培養する工程；
（Ｆ）該着色したコロニーの少なくとも一部を最終同定のために回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記微生物にさらされたとき発色し得る前記少なくとも１種の化合物が、一般式ＩＶ
【化２】
0003581958.tif 000018
［式中、Ｒ１０は水素およびメチル、エチル、プロピルまたはブチルのようなＣ１−Ｃ４アルキルからなる群から選択され、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は水素および色素原性置換基からなる群から選択される］の化合物；または該一般式ＩＶ化合物の有機もしくは無機塩基およびスルホニルとの塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ６およびＲ７が塩素および臭素から選択され；Ｒ８およびＲ９が水素であり、Ｒ１０が水素である、及び／又は一般式ＩＶ化合物は有機もしくは無機塩基との塩の形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記興味ある微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを含む群からの細菌である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細菌活性の指標としてのホスファチジル−イノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素を検出するための基質であって、該基質は請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物を含む。
【請求項１６】
細菌活性の指標としてのホスファチジル−イノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素を検出するためのキットであって、該キットは請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも１種の一般式Ｉの化合物を含む。
【請求項１７】
請求項１２および１３のいずれかに記載の少なくとも１種の一般式ＩＶの化合物を更に含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
下記反応
【化３】
0003581958.tif 000019
［式中、Ｉｎｓはイノシトールを示し、Ｇは１−ヒドロキシを除くイノシトールの各ヒドロキシル上のＨＯ保護基を示す（ここで、ＸおよびＲ１−Ｒ５は請求項１〜５に示される意味を有する）］により、一般式ＩＩＩＡの化合物を一般式ＩＩＩＢの化合物に変換すること；ＨＯ−保護基を除去すること；およびＸがヒドロキシルを示すとき必要に応じて有機または無機塩基との反応により塩を形成すること、によって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、蛍光原性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）になる、従って、特定の微生物またはそのような微生物により産生される物質に接触すると蛍光透視的に検出可能となる新規な潜在性の蛍光原性化合物、並びに様々な細菌の検出および同定のためのそのような化合物の使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
細菌を同定するための慣用されているアッセイ手順は、伝統的な反応、例えば、特定の炭水化物からの酸産生、エスクリナーゼ（ｅｓｃｕｌｉｎａｓｅ）産生、ｐＨ指示薬、および硫化水素の生成の特異的性質に依拠する。そのような方法は、労力を要し時間がかかる傾向があり、従って、高価である。
【０００３】
「ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ」と称される酵素、即ち、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオ−イノシトールは、イノシトールホスホヒドロラーゼとしても公知で、本明細書中では短くＰＩ−ＰＬＣとしても示され、酵素分類ＥＣ３．１．４．１０であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ並びに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリア菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ（ノーヴィ菌）のような幾種かの病原性細菌を含む様々な細菌の培養上清中に見い出され得る（Ｓ．Ｇ． Ｒｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９） ５４６ ｆｆを参照）。
【０００４】
より最近、Ｎｏｔｅｒｍａｎｓら（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７（１９９１）， ２６６６）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコロニーを特定の基質Ｌ−α−ホスファチジルイノシトールで覆い、酵素の存在を示すコロニー周辺の濁ったハロー（ｈａｌｏｓ）を検査することにより、ＰＩ−ＰＬＣの分析に基づくアッセイ方法を報告した。この方法は、非連続的なものである。
【０００５】
ＰＩ−ＰＬＣに関する従来技術の連続的アッセイは、ＰＩ−ＰＬＣ活性の蛍光測定の基質としての２−ナフチルミオイノシトール−１−ホスフェートの使用に基づく（Ｍ．Ｓ． Ｓｈａｓｈｉｄｈａｒ、Ｊ．Ｊ． Ｖｏｌｗｅｒｋ、Ｊ．Ｆ．Ｗ． Ｋｅａｎａ、Ｏ．Ｈ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈ； Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８（１９９１）、１０を参照）。この基質は、しかしながら、２つの主要な欠点を有する、２−ナフトールは、ｐＨ１０．４でその最大蛍光強度を有するが、ＰＩ−ＰＬＣは、約ｐＨ７．４で至適ｐＨを有し、ｐＨ９．０超では活性でない。
【０００６】
（発明の目的および概要）
従って、本発明の主たる目的は、従来技術の不利な点を回避する新規で潜在的蛍光原性化合物を提供することである。
【０００７】
本発明による新規な化合物を参照すると、本明細書中で使用される用語「潜在的蛍光原性」は、「蛍光原性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）」になるこれらの化合物の能力、即ち、蛍光透視的方法−ＰＩ−ＰＬＣとの相互作用により蛍光透視的に活性で検出可能になる−能力を示す。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種のような様々な病原性細菌を検出し同定するための改善された手段を含む。
【０００９】
明細書から明らかである上記および更なる目的および利点は、本発明の第１の実施態様に従い、一般式（Ｉ）の潜在的蛍光原性化合物
【００１０】
【化４】
0003581958.tif 000002
【００１１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立して水素および色素原性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）置換基からなる群から選択されると同時に、Ｘは、ヒドロキシル；ＯＲ６（Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ４アルキルからなる群から選択される）；およびＯ−Ｍｅ＋（Ｍｅ＋は、有機または無機塩基に由来するカチオンである）からなる群から選択される］によって達成されるであろう。
【００１２】
いかなる理論的制限も意図するものではないが、ＰＩ−ＰＬＣ検出のための基質としての一般式（Ｉ）の化合物の有効性は、細菌性ＰＩ−ＰＬＣによる本発明に従う化合物の開裂が、イノシトール１，２−環式ホスフェートおよび蛍光原性である４−メチルウンベリフェロンの形成を主としてもたらす、という事実にあると考えられる。
【００１３】
第２の実施態様によれば、本発明は、例えばスクリーニングテストの様式で、一般式（Ｉ）の化合物またはその塩とサンプルを混合し、一般式（Ｉ）化合物またはその塩と組合せたサンプルを、好ましくはその得られた混合物として、蛍光透視的手段によって検査することによる、サンプル中の微生物活性を検出する方法を提供する。
【００１４】
第３の実施態様によれば、本発明は、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ酵素を産生し得る興味ある細菌性微生物を同定する方法を提供し、該方法は、
（Ａ）興味ある微生物を含むことが疑われるテストサンプルを提供すること；
（Ｂ）テストサンプルを、予備増菌工程に供すること；
（Ｃ）一般式（Ｉ）の化合物と、工程（Ｂ）で得られた産物の少なくとも一部を混合して、興味ある微生物またはそれが生産したＰＩ−ＰＬＣがテストサンプル中に存在するとき、陽性の蛍光透視的反応を示すスクリーニングサンプルを提供すること；
（Ｄ）スクリーニングサンプルが工程（Ｂ）において陽性の蛍光透視的反応を示すとき、工程（Ｂ）で得られた産物の少なくとも一部を、微生物培養に好適な培地に移す；該培地は、微生物にさらされたとき発色し得る少なくとも１種の化合物を含む；
（Ｅ）色を呈する少なくとも１つのコロニーを発育させるために、培地を転移部分と共に培養すること；
（Ｆ）着色したコロニーの少なくとも一部を最終同定のために回収すること、
による。
【００１５】
第３の実施態様によれば、本発明は、細菌活性の指標としてのＰＩ−ＰＬＣを検出するための基質を提供する；基質は、水性寒天−寒天のような好適な培地中に少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を含む。
【００１６】
第４の目的によれば、本発明は、細菌活性の指標としてＰＩ−ＰＬＣを検出するためのキットを提供する；該キットは、少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物を含む。
【００１７】
更なる目的によれば、本発明は、下記反応
【００１８】
【化５】
0003581958.tif 000003
【００１９】
［式中、”Ｉｎｓ”はイノシトールを示し、Ｇは１−ヒドロキシを除いてイノシトールの各ヒドロキシル上のＨＯ保護基を示す（ここで、ＸおよびＲ１−Ｒ５は、一般式（Ｉ）に関する上記意味を有する）］によって、一般式（ＩＩＩＡ）の化合物を一般式（ＩＩＩＢ）の化合物に変換すること；ＨＯ−保護基を除去すること；およびＸがヒドロキシルを示すとき、必要に応じて有機または無機塩基との反応により塩を形成することによる、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００２０】
（本発明の好ましい実施態様）
酵素とのそれらの相互作用に鑑みて本明細書中で「基質」とも称される一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、ラセミ形態で得られ及び使用され得、そのような混合物は、エナンチオマーを得るために分割され得る。しかしながら、エナンチオマーと共に通常得られるいかなる実質的な利点も得られないことが予想される。
【００２１】
従って、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）化合物のラセミ混合物の使用は、本発明の好ましい形態であろう。
【００２２】
Ｘがヒドロキシ、またはＯ−Ｍｅ＋それぞれ（ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）であるとき、一般式（Ｉ）を含むがそれに限定されない、その様々な実施態様における本発明による使用に好ましい好適な有機および無機塩基の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム、ジエチルアミン、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、シクロヘキシルアミン、ピリジン、ピペリジン、ピロリジン、モルホリン、Ｎ−メチル−モルホリン、Ｎ−エチル−モルホリンおよびｐ−トルイジンである。
【００２３】
一般式（Ｉ）の化合物の好ましい群は、色素原性置換基が：Ｃ１−Ｃ４アルキル基、即ち、その異性体形態を含み、必要に応じてアルキル鎖中に酸素原子を含むメチル、エチル、プロピルおよびブチル；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；ニトロ；カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４カルボキシアルキル；およびシアノであるものであり；必要に応じて、上述のアルキル基は、１種以上のハロゲン原子、好ましくは弗素、塩素および臭素を置換基として含み得る；トリフルオロメチル基は、一般式（Ｉ）中の色素原性置換基としての使用に好ましいハロ置換アルキルの具体的な例である。
【００２４】
一般式（Ｉ）化合物のさらにより好ましい群は、Ｒ３が、必要に応じて１種以上のハロゲン原子を含む低級アルキルであり、Ｘがヒドロキシルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素であるが、Ｒ３は低級アルキルまたはアルコキシ基であるものを含む。
【００２５】
一般式（Ｉ）の好ましい具体的な新規な化合物は、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートおよび上述のタイプの有機または無機塩基とのその塩であり、この化合物は、一般式：
【００２６】
【化６】
0003581958.tif 000004
【００２７】
を有する。
【００２８】
本発明に従う蛍光原性基質としての使用のための最も好ましい化合物は、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートのＮ−メチル−モルホリン塩である。それは、本明細書中で、簡略のために「ＭｅＵ−ホス−イノシトール（ＭｅＵ−ｐｈｏｓ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）」と称される。それは、無色で水溶性の物質であり、３１４ｎｍでそのＵＶ極大（７〜９のｐＨ範囲のＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中）を有し、約１０８００ ｌ ｍｏｌ−１ ｃｍ−１の吸収係数を有する。
【００２９】
ＰＩ−ＰＬＣと接触すると、本発明による一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の潜在的蛍光原性化合物は、それぞれ強力な蛍光体になり、それは例えば、３６６ｎｍのような実際的目的に好ましい紫外線範囲の波長での操作のために、例えば慣用されている手動式蛍光光度計によって、容易に検出され得る。このシンプルな検出アプローチは、より精巧な同定テストにおいて、スクリーニングテストとして及び／又は第１工程としてのいずれかで、本発明により使用され得る。スクリーニングテストでは、蛍光の欠如は、いかなる更なるテストも要求されず、一次サンプルの「陽性」反応のみが更なるテストによって証明される必要があるという意味で「陰性」反応であると考えられ得る。
【００３０】
より具体的には、４−メチルウンベリフェロン（ＰＩ−ＰＬＣによって一般式（ＩＩ）の開裂から生じる）は、８超のｐＨで３６０ｎｍの吸収極大を有するが、対応する一般式（Ｉ）化合物は、３６０ｎｍでごく僅かな吸収しか示さない。
【００３１】
換言すれば、４−メチルウンベリフェロン（４−メチル−７−ヒドロキシ−クマリン）は、非常に優れた蛍光原である。一般に、４−メチルウンベリフェリル基質の蛍光の強度は、ｐＨ７およびｐＨ１０で同じであるが、開裂産物の蛍光は、この範囲のｐＨ値で増加する。一般に、酵素的に開裂された物質は、好ましくは９．５近くのｐＨで蛍光光度計的に測定される。
【００３２】
ｐＨ９．５では、４−メチルウンベリフェロンを蛍光体として用いる代表的基質は、約３８０ｎｍで極大値を有する蛍光放射を示す（３２５ｎｍで励起極大）が、４−メチルウンベリフェロンは、４４８ｎｍでその蛍光極大を有する（３６４ｎｍで励起極大）。
【００３３】
本発明による検出方法について考えると、本明細書中で使用される用語「一次サンプル」は、疑われる源から直接得られた材料を指し、該源は、興味ある細菌を含み得る血液、排泄物、または感染された食物、水源、飲料または類似の材料のような、生理学的または他の源のものであり得る。本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを検出し単離するために特に有用である。本発明の重要な用途は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなヒト病原体の検出である。
【００３４】
ＰＩ−ＰＬＣの存在により証明される細菌活性のためのスクリーニングまたは同定テストにおいて一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を使用するとき、蛍光透視分析の前に細菌活性を増加するために、一次サンプルが転移される予備増菌ブロスを提供することは有利であり得る。本発明方法の多くの適用のために、さらに興味ある細菌に選択的であり得る予備増菌ブロスを使用することは好ましい。選択的であっても良いが必要はない用語「予備増菌ブロス」は、興味ある細菌に関して最も好適である予備増菌ブロスを選択し得る（ｃａｐａｂｌｅ）当業者に理解される。一般に、ＰＩ−ＰＬＣ酵素を産生する他の細菌の増殖の阻害は、抗生物質および他の阻害剤を含む選択的化合物の様々な組合せを用いて達成され得、培地は、ＰＩ−ＰＬＣを含む又は産生する任意の病原体に関して特異的にされ得る。より具体的な実施例が、以下で示される。
【００３５】
スクリーニングおよび同定テストそれぞれとしてのその局面の両方において、本発明は、ＰＩ−ＰＬＣ活性を有する微生物の細菌活性を示すための手段を提供し、それら微生物には、非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ並びに病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉを含む。
【００３６】
上述のように、より完全な同定工程は、潜在的蛍光原性物質としての一般式（Ｉ）化合物の使用、並びに潜在的色素原性物質との相互作用を含む。細菌性ＰＩ−ＰＬＣが培養培地中の興味ある細菌によって産生される場合、そのような色素原性物質の存在下で色が形成され、コロニーを位置確認する。
【００３７】
ＰＩ−ＰＬＣにさらされたときに発色する一群の好ましい色素原性物質は、我々の共係属中の米国特許出願第６０／０３９４７９号に及び我々の国際特許出願ＷＯ９８／３８３３２号にそれぞれ開示されている。一般に、そのような物質は、下記一般式
【００３８】
【化７】
0003581958.tif 000005
【００３９】
［式中、Ｒ１１は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は水素および色素原性置換基から選択されると同時に、Ｒ１０は水素またはＣ１−Ｃ４アルキルである］を有する；再度、一般式（Ｉ）化合物の場合、一般式（ＩＶ）化合物の上述のタイプの有機または無機塩基との塩は、本発明に従うものとして使用され得る。
【００４０】
一般式（ＩＶ）の一群の好ましい化合物において、Ｒ６およびＲ７はハロゲン原子、好ましくは塩素および臭素であると同時に、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は水素である；再度、一般式（ＩＶ）化合物の上述のタイプの有機または無機塩基との塩は、潜在的蛍光体として使用され得、即ち、特にＲ１０が、水素またはメチルおよび他の置換基が、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ニトロ、カルボキシ、置換もしくは非置換アミノ、置換もしくは非置換アミノメチルまたはスルホニルである場合、ＰＩ−ＰＬＣによる開裂、二量体化およびその後の酸化により濃く着色したインジゴ染料を生じる。
【００４１】
本発明による色素原性基質として使用するための最も好ましい一般式（ＩＶ）化合物は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−１−ホスフェートの塩である。この化合物のアンモニウム塩は、本明細書中で以下で簡略のために「Ｘ−ホス−イノシトール（Ｘ−ｐｈｏｓ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）」と称される。
【００４２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを同定するための好ましいテスト方法が、ここでより詳細に説明され、傷害されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞を修復または復活させ得る予備増菌ブロスの使用を含む。細胞が修復した後、ブロスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞の迅速な増殖を支持し得る。この培地は、傷害されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞の修復を妨げることはないが、ブロス中の栄養素に関するＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞を競合（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）し得た幾種かのグラム陰性細菌の増殖を妨げ得る阻害剤を含む。
【００４３】
続いて、蛍光原性基質、好ましくは上記のように定義される一般式（ＩＩ）の４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートを含む選択的増菌ブロスが、予備増菌ブロスの少なくとも一部に接種される。この選択的増菌ブロスは、ＰＩ−ＰＬＣ酵素を含む他の細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ以外）およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに近縁のグラム陽性細菌の増殖を妨げる阻害剤を含む。
【００４４】
インキュベーションの後、選択的増菌ブロスを、ＵＶ蛍光測定器（３６６ｎｍの長波長）にさらし、蛍光を調べる。陽性の蛍光原性反応は、さらなるテストを要求する推定的な陽性テストを示し、無蛍光はＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓがテストされたサンプル中に存在しないことを意味する（さらなるテストは必要とされない）。
【００４５】
選択的増菌物のインキュベーションおよび蛍光発生の後、小部分、例えば、少量の液体を輸送するワイヤーループは、一般式（ＩＶ）の潜在的色素原性化合物を含む選択的プレーティング培地上で縞になる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが存在する場合、細胞は、ＰＩ−ＰＬＣと接触したときに色素原性化合物により発せられる色を呈するコロニーを生じるプレーティング培地上で増殖する。好ましくは、このプレーティング培地も、ＰＩ−ＰＬＣ酵素およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに最適な環境を与えるＬｉｓｔｅｒｉａ関連グラム陽性細菌を含み、Ｌｉｓｔａｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉを除く他の細菌の増殖を妨げるように、選択的にされ、単離されたコロニーを生じる。
【００４６】
色素原性コロニーの証明（例えば、一般式（ＩＶ）の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−１−ホスフェートを含む基質に関する）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコロニー色が青緑から青になることである）。コロニーは、要求されれば、さらなるテストのために単離され得る。
【００４７】
色素原の色は、コロニーの色が色素原の色を生じさせるように、細胞内で維持されるので、色素原性基質は、固体表面上で最良に働く。色素原は、水に不溶性であり、色をコロニー中で維持させる。従って、色素原の色はブロスの色に変化を生じさせないので、色素原性基質は、ブロス中で有効ではないであろう。
【００４８】
色素原性基質としてＸ−ホス−イノシトールを含むプレーティング培地は、非常に優れた安定性を有する傾向がある。４℃で１２週間貯蔵した後、プレーティング培地の色および選択性は、新らしく調製された培地のものと同じである。
【００４９】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコロニーは、青緑から青で凸面であるように見え、青緑から青のハローを含まない又は含む、直径１．０−２．５ｍｍである。
【００５０】
一般式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩は、第１プロセス工程において、４−メチルウンベリフェリル−ジクロロホスフェート（ＩＩＩＡ）を反応性のイノシトール化合物、例えば、１位に遊離のヒドロキシル基を有するＯＨ−保護されたイノシトール（以下で”Ｇ−Ｉｎｓ−ＯＨ”と称する）で処理することにより、上記の反応スキームに従って得られ得、その結果、数時間（例えば、１−１０時間）の間周囲温度で反応媒体として、例えば、ピリジン、Ｎ−メチル−モルホリンまたはトリエチルアミンのような有機塩基中で反応物を攪拌することによって、中間産物を得る。
【００５１】
Ｇは、１−ヒドロキシを除き（ｅｘｃｅｐｔ）イノシトールの各ヒドロキシル上の保護基である；Ｇに関する代表的例は、必要に応じて置換されたベンジル、必要に応じて置換されたＣ３−６アルキリデン（例えば、イソプロピリデン、シクロペンチリデンまたはシクロヘキシリデン）；および必要に応じて置換されたテトラヒドロピラニルを含む。
【００５２】
その後の反応工程で、中間体上の全ての保護基Ｇは、例えば、ＯＨ−保護基の性質に依存した水素化分解または酸性開裂によって除去される。最後に、好ましい塩は、イオン交換によって得られ得る。
【００５３】
そのような合成法は、標準的スクリーニング手順での適用に要求されるように、新規な一般式（Ｉ）化合物を充分に多量に効果的に産生し得ることが明らかである。
【００５４】
４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートのリチウム塩および−Ｎ−メチル−モルホリン塩で為された貯蔵テストに基づくと、本発明による新規な基質（Ｉ）は、約−１５℃未満の温度で固体状態で貯蔵され、光から保護されるとき、延長された時間安定であることが予想される。
【００５５】
一般式（Ｉ）の蛍光原性基質は、選択的増菌ブロス培地中で、優れた安定性を示す。代表的な選択的増菌ブロス中で４℃で暗所で貯蔵されたとき、蛍光原性基質の貯蔵寿命は４週間であった。
【００５６】
他方、慣用されている緩衝溶液（クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）中で数週間、５〜７の範囲のｐＨ値で室温で、一般式（Ｉ）の化合物は、中程度にのみ安定であることが証明され、アルカリ性ｐＨ値で安定でない。分解の速度は、ｐＨと共に増加する。８．５のｐＨ値では、ＰＩ−ＰＬＣによる開裂の速度は、分解の速度と類似している（１ｍＭ溶液中で〜０．３５μＭｏｌ ｌ−１ ｍｉｎ−１の速度）。ｐＨ９では、分解は急速に進み、１０超のｐＨで分解は極めて速い。
【００５７】
結果として、ＰＩ−ＰＬＣによる一般式（Ｉ）基質の開裂の連続的な分光光度計によるモニタリングは、好ましくない。
【００５８】
他方、一般式（Ｉ）の新規な基質を用いたＰＩ−ＰＬＣの比色分析アッセイは、６〜７範囲のｐＨ値で効果的に為され得、そこでは、緩衝溶液中の自己分解は非常に遅い。さらに、酵素は、約７のｐＨ値で最良に働き、活性は、ｐＨ５と８．５との間で余り変化しない。
【００５９】
３６０ｎｍでの４−メチルウンベリフェロンの吸光度は、ｐＨ６でごく僅かであるので、酵素的に生じた４−メチルウンベリフェロンは、非連続的様式で最良に検出される。
【００６０】
従って、一般式（Ｉ）の新規な基質の酵素的開裂は、好ましくは約６または７のｐＨで行われ、生じた４−メチルウンベリフェロンの量は、例えば、充分な量の１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液を加えてサンプルのｐＨを約９．５まで上昇させ、４−メチルウンベリフェロンのアニオンの吸光度を分光光度計を用いて直ちに測定することにより、定められた時間の後に測定される。
【００６１】
本発明のこの実施態様により、一般式（Ｉ）の新規な基質、好ましくはＮ−メチル−モルホリン塩は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓからのＰＩ−ＰＬＣの鋭敏な比色分析アッセイのために使用される；この目的のために、基質を、血清アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と組合せて使用する。
【００６２】
上述の従来技術の基質２−ＮＩＰと比較すると、ＢＳＡと組合せたＭｅＵ−ホス−イノシトールは、ＰＩ−ＰＬＣで開裂されるとき、高いターンオーバー速度を示す。
【００６３】
一般式（Ｉ）の新規な基質は、ＰＩ−ＰＬＣの連続的蛍光光度アッセイのために使用され得ることが予想される：４−メチルウンベリフェロンの蛍光の強度は、１０超のｐＨ値でその最大値を有するが、蛍光強度は、６または７のｐＨで、ＰＩ−ＰＬＣの鋭敏なアッセイに利用されるのに充分に高い。
【００６４】
結果として、蛍光原性基質（Ｉ）は、寒天のような固体培地上でよりも、ブロス培地中でより有効である傾向があり、そこでは、蛍光はコロニーから寒天培地に浸出して、他の近くのコロニーの誤読を生じ得る。
【００６５】
結果として、蛍光原性基質の存在下での陽性反応（ブロス培地中での細菌種によるＰＩ−ＰＬＣ酵素の分泌）は、ブロスが蛍光を示すようにさせ、ＰＩ−ＰＬＣを分泌する細菌種が、有意な細胞密度でブロス中にいることを示す。
【００６６】
これは、ＰＩ−ＰＬＣ酵素の色素原性基質（ＩＶ）を上記のように用いて、固体寒天表面上でコロニー形態での細菌種のさらなる単離を保証する、興味ある（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような）細菌種に関する推定的な陽性反応である。
【００６７】
一般式（Ｉ）の蛍光原性基質および一般式（ＩＶ）の色素原性基質の両方の、全体的な単離手順における使用は、ブロス中の推定的陽性反応（蛍光原性基質の使用）、続いて、確認反応以上のものとして色素原性基質を用いた固体培地上でのコロニーの単離を可能にする。
【００６８】
本発明は、ここで、実施例により、および添付の図面を参照して、より詳細に説明される。
【００６９】
しかしながら、具体的実施例は、いかなる意味でも本発明を限定することは意図しないことが注目されるべきである。
【００７０】
（実施例）
新しい基質の調製
実施例１：４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートのリチウムおよびＮ−メチルモルホリン塩の調製
２，３：５，６−ジ−イソプロピリデン−４−（４−メトキシ−テトラヒドロピラン−４−イル−）−ミオ−イノシトール（Ｍ．Ｓ． Ｓｈａｓｈｉｄａｒら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐｉｄｓ ６０（１９９１）， １０１を参照）を、この参照文献に記載されるように調製した。
【００７１】
粗製４−メチルウンベリフェリル−ジクロロホスフェート（約１当量の塩酸ピリジンを含む）を、Ｊ．Ｐ． Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３（１９７０）， １０２４による１−アセチル−５−ブロモ−４−クロロ−インドキシル−３−ジクロロホスフェートに関して記載された方法によって調製した。
【００７２】
工程１：４−メチルウンベリフェリル［２，３：５，６−ジ−イソプロピリデン−４−（４−メトキシ−テトラヒドロピラン−４−イル）−ミオ−イノシトール］−１−ホスフェートのピリジン塩の調製
粗製４−メチルウンベリフェリル−ジクロロホスフェート（１．８０ｇ、純粋な物質１．２８ｇ、４．３７ｍＭｏｌに対応する）を、窒素下に乾燥ピリジン（１３ｍｌ）に懸濁し、２，３：５，６−ジ−イソプロピリデン−４−（４−メトキシ−テトラヒドロピラン−４−イル−）−ミオ−イノシトール（０．９３ｇ， ２．４８ｍＭｏｌ）を２０分後に加えた。混合物を、終夜、充分に攪拌した。
【００７３】
いくらかの固体物質を含む灰茶色の溶液を、氷浴中で冷却した；続いて、水（４ｍｌ）を加え、それにより、温度を１６℃に上げ、固体を迅速に溶解させた。氷浴を取り除いた後、クロロホルム（２５ｍｌ）を加えた。続いて、溶液を、さらに１０分間攪拌した。有機相を分離し、水性相はクロロホルム（１０ｍｌ）で抽出され、その後、棄てられた。
【００７４】
混合した有機相を水で２回抽出し、混合した水性抽出物を、クロロホルム（１０ｍｌ）で３回抽出した。混合した有機相および抽出物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空で留去した。得られた僅かに黄色い固体を、クロロホルム（１０ｍｌ）に溶解し、真空で再度留去し、ベージュ色の結晶固体を残し、それを更に真空で乾燥した（１．４５ｇ， 収率８４％）。Ｃ３３Ｈ４２ＮＯ１３Ｐ（ＭＷ＝６９１．６７）。
【００７５】
４００ ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ１．１４（ｓ，３Ｈ）， １．３４（ｓ，３Ｈ）， １．３６（ｓ，３Ｈ）， １．４７（ｓ，３Ｈ）， １．７０−１．９５（ｍ，４Ｈ）， ２．３９（ｄ，３Ｈ）， ３．２８（ｓ，３Ｈ）， ３．６３（ｍ，２Ｈ）， ３．７４（ｍ，２Ｈ）， ３．９７−４．０８（ｍ，４Ｈ）， ４．６８（ｔ，１Ｈ）， ４．８３（ｍ，１Ｈ）， ６．１６（ｄ，１Ｈ）， ７．３２（ｄｄ，１Ｈ）， ７．４１（ｄ，１Ｈ）， ７．４８（ｄ，１Ｈ）， ７．７５（ｔ，２Ｈ）， ８．２４（ｔ，１Ｈ）， ８．８３（ｄ，２Ｈ）。
【００７６】
工程２：４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートの粗製ピリジン塩の調製
ピリジン塩の形態での４−メチルウンベリフェリル［２，３：５，６−ジ−イソプロピリデン−４−（４−メトキシ−テトラヒドロピラン−４−イル）−ミオ−イノシトール］ホスフェート（１．０４ｇ， １．５ｍＭｏｌ）を、酢酸／水 １：１（１０ｍｌ）に懸濁し、５０℃で３時間攪拌した。殆ど透明な溶液を、真空で留去した；得られた淡黄色オイルを水（８ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（１０ｍｌ）で４回抽出し、淡黄色水溶液を濾過し、エタノール（１０ｍｌ）で同時留去した。エタノールを、その黄色く透明なオイル（１０ｍｌ）に加えた；得られた溶液を再び留去して、粗製ピリジン塩を明るい黄色の樹脂として得た（０．６８ｇ， 収率９１％）。Ｃ２１Ｈ２４ＮＯ１１Ｐ（ＭＷ＝４９７．３９）。
【００７７】
工程３ａ：４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートのリチウム塩の調製
Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０×８カチオン交換樹脂（２．２ｇ）を、水（１．６ｍｌ）に懸濁し、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートの上記粗製ピリジン塩（０．７５ｇ）の水（４．５ｍｌ）中溶液を加えた。懸濁液を５分間攪拌し、続いて、樹脂を濾過によって取り除いた。
【００７８】
得られた淡黄色濾過物に、水酸化リチウム一水和物（水１ｍｌ中０．０５ｇ）を、ｐＨが６に達するまで滴下した（約０．７２ｍｌを必要とした）。
【００７９】
溶液を、酢酸エチル（６ｍｌ）で３回抽出して、水性相を真空で留去した。得られた黄色オイルをメタノール（３ｍｌ）中に溶解し、充分に攪拌したアセトン（６０ｍｌ）に滴下した。細かい沈殿物を、さらに１時間攪拌し、続いて、冷蔵庫に終夜置いた。白い固体を、濾過により集め、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した（０．５８ｇ， 収率９１％）。
【００８０】
Ｃ１６Ｈ１８Ｏ１１ＰＬｉ（ＭＷ＝４２４．２２）について計算された分析：Ｃ ４５．３０， Ｈ ４．２８， Ｐ ７．３０， Ｌｉ １．６４；
実測値（乾物で）：Ｃ ４４．５１， Ｈ ４．３９， Ｐ ７．１３， Ｌｉ １．６６， （含水量７．７％）。
【００８１】
４００ ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ２．３０（ｄ，３Ｈ）， ３．１７（ｔ，１Ｈ）， ３．３９（ｄｄ，１Ｈ）， ３．４９（ｔ，１Ｈ）， ３．６３（ｔ，１Ｈ）， ３．９５（ｍ，１Ｈ）， ４．１１（ｔ，１Ｈ）， ６．１３（ｄ，１Ｈ）， ７．１０（ｍ，２Ｈ）， ７．６０（ｄ，１Ｈ）。
ＵＶ（１００ｍｌ緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７中４ｍｇ）：λ ｍａｘ＝３１４ｎｍ； ε＝１０１００ ｌ ｍｏｌ−１ ｃｍ−１。
【００８２】
工程３ｂ：４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェート（ＭｅＵ−ホス−イノシトール）のＮ−メチル−モルホリン塩の調製
Ｄｏｗｅｘ ５０×８カチオン交換樹脂（２．２ｇ）を水（１．６ｍｌ）に懸濁し、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−ホスフェートの上記粗製ピリジン塩（０．７５ｇ）の水（４．５ｍｌ）中溶液を加えた。懸濁液を５分間攪拌し、続いて、樹脂を濾過によって取り除いた。
【００８３】
得られた淡黄色濾過物に、Ｎ−メチル−モルホリン（約０．１８ｍｌ）を、ｐＨが６に達するまで滴下した。溶液を、酢酸エチル（６ｍｌ）で３回抽出して、水性相を真空で留去した。得られた黄色オイルをメタノール（３ｍｌ）中に溶解し、充分に攪拌したアセトン（６０ｍｌ）に滴下した。沈殿物を、さらに１時間攪拌し、続いて、冷蔵庫に終夜置いた。白い固体を、濾過により集め、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した（０．７４ｇ， 収率９５％）。
【００８４】
Ｃ２１Ｈ３０ＮＯ１２Ｐ（ＭＷ＝５１９．４４）について計算された分析：Ｃ ４８．５６， Ｈ ５．８２， Ｎ ２．７０， Ｐ ５．９６；
実測値（乾燥：Ｃ ４８．２５， Ｈ ５．９３， Ｎ ２．６６， Ｐ ５．９０、 （含水量４．１％）。
【００８５】
４００ ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ２．３２（ｄ，３Ｈ）， ２．７５（ｓ，３Ｈ）， ３．０３（ｍ，２Ｈ）， ３．１７（ｔ，１Ｈ）， ３．３０（ｍ，２Ｈ）， ３．３９（ｄｄ，１Ｈ）， ３．４９（ｔ，１Ｈ）， ３．６２（ｍ，２Ｈ）， ３．６３（ｔ，１Ｈ）， ３．９３（ｍ，２Ｈ）， ３．９５（ｍ，１Ｈ）， ４．１１（ｔ，１Ｈ）， ６．１５（ｄ，１Ｈ）， ７．１１（ｍ，２Ｈ）， ７．６２（ｄ，１Ｈ）。
ＵＶ（１００ｍｌ緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７中４ｍｇ）：λ ｍａｘ＝３１４ｎｍ； ε＝１０９００ ｌ ｍｏｌ−１ ｃｍ−１。
【００８６】
実施例２：異なるｐＨ値の緩衝溶液中での蛍光原性基質の安定性
この実施例では、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒラムダ１５分光光度計を実験に使用し、実験は周囲温度（約２５℃）で行われた。
【００８７】
新しい蛍光原性基質Ｍｅ−ホス−イノシトールの安定性を、３ｍｌキュベット中で、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝溶液中で、様々なｐＨ条件（ｐＨ５および６の０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７、８および８．５の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液）下で調べ、続いて、下記の実施例３に記載されるように、連続的測定（ｐＨ値＜８に関して）による又は非連続的測定（ｐＨを９．５に上げる）によるのいずれかで、３６０ｎｍで４−メチル−ウンベリフェロンの分光光度計的検出をした。
【００８８】
結果（表１を参照）は、ｐＨがアルカリ性であったとき、蛍光原は、酵素アッセイの条件下で生じたことを示す。時間および基質濃度に対してプロットされた場合、この非酵素的加水分解は直線的で、ｐＨ値の上昇と共に顕著に上昇した。
【００８９】
【表１】
0003581958.tif 000006
【００９０】
これらの結果は、酵素溶液（２μｌ、実施例３を参照）添加により、速度が増加し、ｐＨ８．５でＰＩ−ＰＬＣによる基質の酵素的開裂を示すことを確認する。
【００９１】
加水分解の速度は、酵素的開裂の速度に比肩し得るか又はより高いものでさえあるので、ＰＩ−ＰＬＣのアッセイは、アルカリ性ｐＨで行なわれる場合は、有意味な結果を生じない。
【００９２】
実施例３：ＭｅＵ−ホス−イノシトールを用いたＰＩ−ＰＬＣの比色分析アッセイ
この実施例では、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒラムダ１５分光光度計を実験に使用し、実験は周囲温度（約２５℃）で行われた。
【００９３】
ＰＩ−ＰＬＣ検出のための手順は、以下の通りであった：
ＭｅＵ−ホス−イノシトールを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ６．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液２５ｍｌに溶解した。
【００９４】ＰＩ−ＰＬＣのストック溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＃ １１４３ ０６９；比活性６００Ｕ／ｍｇ， １０．００２ ｋａｔ／Ｋｇに対応する， ５Ｕ／１００μｌ溶液， ８．３３μｇ／１００μｌに対応する）からのアリコートを加えた。
【００９５】
決められた時間後、３ｍｌの溶液をキュベットに移した。
【００９６】
酵素的に生じた４−メチルウンベリフェロンを、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．０５ｍｌを加えることによって、アニオン形態に変換した（ｐＨは約９．５に上昇した）。３６０ｎｍでの光度計の読みは、異なる酵素濃度について直ちに記録された。
【００９７】
図１は、１ｍＭの基質濃度での、異なる酵素濃度に関する吸光度を時間の関数として示す。開裂速度 ［ｎＭｏｌ ｌ−１ ｍｉｎ−１］および酵素比活性を表２に示す。
【００９８】
【表２】
0003581958.tif 000007
【００９９】
新しい基質の比活性（ｐＨ６で）は、上述の従来技術の基質２−ＮＩＰの場合よりも、少なくとも３０倍高かった。ＰＩ−ＰＬＣのターンオーバー速度は、約ｐＨ７でその最大値を有するので、アッセイがｐＨ７で行われるとき、比活性はさらに増加する。
【０１００】
ｐＨ６では、１ｍＭの基質濃度での検出または感度の限界は、酵素１００ｎｇ以下である。
【０１０１】
検出限界は、アッセイがｐＨ７で行われるとき、さらにより低くなるであろう。さらに、基質濃度は、増加され得る。
【０１０２】
添加された酵素量に対する速度のプロット（図２を参照）は、満足し得る直線性を示した。
【０１０３】
実施例４：Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの単離のための予備増菌ブロス
この実施例は、予備増菌ブロスの接種、調製および効力を含む。予備増菌培地は、下記のものからなっていた：
0003581958.tif 000008
全ての成分を、１リットルの（脱イオン化または蒸留された）水に溶解した。キャップを容器の上端に置き、フラスコの内容物を１５分間１２１℃でオートクレーブ処理した。
【０１０４】
ブロスを、室温に冷却した。ブロスの安定性は明所または暗所のいずれかで、室温で１２週間維持された。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出のために、検体を予備増菌ブロスで１：１０の比率で再水和し、完全に混合した。接種された予備増菌ブロスを、３０℃で２２−２４時間インキュベートした。
【０１０５】
ブロスは、傷害されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞の修復およびその後の増殖を妨げることなく、様々なグラム陰性細菌（これらの細菌は、ブロス中でＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを増殖し得た）および幾種かのグラム陽性細菌（表３に示す）の増殖を可能にさせないことにより、選択的である（表４を参照）。
【０１０６】
【表３】
0003581958.tif 000009
【０１０７】
【表４】
0003581958.tif 000010
【０１０８】
）ａ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｇｅｎｅｓｉｓ細胞は、非選択的栄養素ブロス（コントロール）およびナリジクス酸を３０ｍｇ／リットルで含む予備増菌ブロスを加える前に、細胞を５４℃に３０〜４５分間供することによって傷害された。
）ｂ ｌｏｇ１０傷害されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞／ｍｌの数。ブロス中で細胞をインキュベーションすると、傷害された細胞は修復する。１０時間後、傷害されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞は増殖を開始し、修復期間の終わりを示した。
【０１０９】
実施例５：選択的増菌ブロスの接種、調製および効力
この実施例では、選択的増菌ブロスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属を除く特定の細菌の増殖を妨げ、蛍光原性ＰＩ−ＰＬＣ基質を組込んで、３５℃で２４−４８時間インキュベーション後に蛍光によって示される（手動式ＵＶ蛍光光度計によって検出される−３６６ｎｍ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉによる推定的陽性反応を生じた。
【０１１０】
ＰＩ−ＰＬＣ酵素を含む他の細菌は、選択的増菌ブロス中で増殖を妨げられ、インキュベーション後に蛍光試験管中でＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの優れた特異性を生じた。
【０１１１】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ種の中では、表５に示されるように、病原性Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ種のみが、インキュベーション後に選択的増菌ブロス中で蛍光を生じ得る。
0003581958.tif 000011
全ての成分を、１リットルの（脱イオン化または蒸留された）水に溶解し、１０ｍｌの量に分配し、１５分間１２１℃でオートクレーブ処理した。
0003581958.tif 000012
補足物を、トータル３０ｍｌの滅菌した蒸留水または脱イオン水に無菌的に溶解し、上記の培地に無菌的に加えた（基礎培地１０ｍｌ当り０．３ｍｌ）。
【０１１２】
暗所で４℃での選択的増菌物の安定性は、４週間であった。
【０１１３】
【表５】
0003581958.tif 000013
【０１１４】
実施例６：選択的プレーティング培地の調製、接種および効力
この実施例は、本発明による固体プレーティング培地の調製、接種、効力、および安定性を示す。
0003581958.tif 000014
全ての成分を、９７０ｍｌの（脱イオン化または蒸留された）水に溶解し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。
0003581958.tif 000015
補足物を、トータル３０ｍｌの滅菌した蒸留水または脱イオン水に無菌的に溶解し、水浴中で５０−５５℃に冷却した後、上記の培地に無菌的に加えた。
【０１１５】
完全培地をペトリ皿に注ぎ、プレートを室温で２日間暗所で貯蔵して表面を乾燥させた。過剰のプレートは、４℃で１２週間まで暗所で貯蔵し、新しく注がれたプレートのように更に機能し得る。
【０１１６】
プレーティング培地は、蛍光選択的増菌ブロスからのループフルな液体を用い、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコロニーの単離を促進する寒天上に縞をつけて接種した。
【０１１７】
プレーティング培地を、３５℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、下記の特色を示すコロニーは、推定的にＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓと考えられ、標準的Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ同定法：青緑から青色、凸面、コロニー周囲の青緑から青のハローを有する又は有しない直径１．０−２．５ｍｍ、を用いる更なるテストを要求した。
【０１１８】
表６は、インキュベーション後に、選択的／示差的プレーティング培地上で様々な細菌のコロニー特性を示す。
【０１１９】
Ｌｉｓｔｅｒｉａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコロニーの青緑から青色は、濃く着色した５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インジゴ水に不溶性の、コロニー内で維持され培地中に拡散しない複合体を形成することによってＰＩ−ＰＬＣ酵素の存在を示した。この不溶性複合体は、ブロス中でよりも固体培地中で、それを好適にさせる。
【０１２０】
【表６】
0003581958.tif 000016
【０１２１】
上記の実施例は、一般式（Ｉ）および（ＩＶ）それぞれの好ましい基質であるＭｅＵ−ホス−イノシトールおよびＸ−ホス−イノシトールに関してであるが、非常に類似した結果が、一般式（Ｉ）および（ＩＶ）それぞれの他の基質により得られることが、上記の一般的開示から明らかであることが注目されるべきである。従って、上記実施例の様々な修飾が、明らかであろう。
【０１２２】
一般に、本発明は、生理学的サンプルまたは食品および飲料のような消費可能な物品を含む潜在的に感染された材料中の、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよび様々なＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ株のような微生物の潜在的な病原性の細菌活性の安全で、鋭敏で、市販しても有効な検出を提供する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に基づき解釈される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１ｍＭの基質濃度で非連続的測定によって得られたｐＨ６．０の緩衝溶液中の様々な酵素濃度での、時間（横軸上）に対する吸光度（縦軸上）の依存性を示すグラフである。および、
【図２】図２は、酵素の量（横軸、ナノグラム）の関数としての、基質開裂の速度（縦軸、ｎＭｏｌ ｌ−１ ｍｉｎ−１）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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