(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ（Klebsiella）属に属する細菌が生産するβ−ガラクトシターゼであって、以下の理化学的性質、
１）作用：β−Ｄ−ガラクトシド結合を有するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に作用し、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解するとともに、分解して生成したＤ−ガラクトース基を転移する、
２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨがｐＨ７．０〜７．５であって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６０分間処理）で安定である、
３）作用適温の範囲：３０〜４０℃である、
４）分子量：ゲル濾過法による測定で約３２万である、
を有することを特徴とするβ−ガラクトシターゼ。
【請求項２】
請求項１記載のβ−ガラクトシターゼを生産する細菌株クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）Ａ−５３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２６３）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、新規なβ−ガラクトシダーゼに関するものである。さらに詳しくは、この発明は、各種食品や医薬品の製造に有用な新規なβ−ガラクトシターゼに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
β−ガラクトシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素で、生物界に広く存在している。これまで、酵母、カビ、細菌等由来のβ−ガラクトシダーゼが広く研究されており、食品、医薬品用に利用されている。また、β−ガラクトシダーゼは加水分解と同時にガラクトシド結合を転移させる能力をも有しており、そのＤ−ガラクトース基転移能を利用したアスコルビン酸−Ｄ−ガラクトシル誘導体の製造に利用されている。具体的には、Ｌ−アスコルビン酸とラクトースまたはラクトース含有物との混合物にアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、エッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）等の微生物由来の酵素、牛肝臓等の動物由来の酵素、ジャック・ビーンズ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎｓ）等の植物種子由来の酵素を処理して６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を製造する方法（特開平２−３１１４９０号公報）が知られている。
【０００３】
さらに、β−ガラクトシダーゼはガラクトオリゴ糖の製造にも利用されている。すなわち、アスペルギルス・オリーゼが生産したβ−ガラクトシダーゼでラクトースを処理することにより、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ  −Ｇｌｃ（但し式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるガラクトオリゴ糖が得られ、このようにして製造されたガラクトオリゴ糖はビフィドバクテリウム菌の増殖因子として用いられている（特開昭５５−１０４８８５号公報）。
【０００４】
上記のほかにもβ−ガラクトシダーゼの転移作用によるＤ−ガラクトース基転移物の生成が多く報告されている。
しかしながら、従来報告されているβ−ガラクトシターゼの多くは、Ｄ−ガラクトース基転移率が悪く、収量が低いため糖転移物の大量生産に用いるには不適当なものであった。
【０００５】
特に、甘味料として利用されているステビオシドは、そのままでは味質が余りよくないが、ステビオシドにＤ−ガラクトース基を転移することにより味質が向上し、甘味料としての性質がよりよくなることが知られている。しかし、ステビオシドに対してＤ−ガラクトース基転移能の高いβ−ガラクトシダーゼが見つかっていなかったため、工業的に生産することはできなかった。
【０００６】
この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、糖転移能の高いβ−ガラクトシダーゼ、特にステビオシドに対する糖転移能の高い新規なβ−ガラクトシダーゼを提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者らは、Ｄ−ガラクトース基転移能を有する各種のβ−ガラクトシダーゼについて鋭意研究した結果、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属する細菌が、β−１，４ガラクトシド結合を有するＤ−ガラクトース基転移物を主に生成する転移作用の強いβ−ガラクトシダーゼを生産することを見いだし、そのβ−ガラクトシダーゼを精製し、性質を調べることにより、この発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、この発明は、クレブシエラ（Klebsiella）属に属する細菌が生産するβ−ガラクトシターゼであって、以下の理化学的性質、
１）作用：β−Ｄ−ガラクトシド結合を有するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に作用し、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解するとともに、分解して生成したＤ−ガラクトース基を転移する、
２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨがｐＨ７．０〜７．５であって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６０分間処理）で安定である、
３）作用適温の範囲：３０〜４０℃である、
４）分子量：ゲル濾過法による測定で約３２万である、
を有することを特徴とするβ−ガラクトシターゼを提供する。
【０００９】
また、この発明は、上記のβ−ガラクトシダーゼを生産する細菌としてクレブシエラ・オキシトカ(Klebesiella oxytoca)Ａ−５３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２６３）を提供する。
【００１０】
以下、この発明を詳細に説明する。
まず、この発明のβ−ガラクトシダーゼの理化学的性質を示す。
（１）作用および基質特異性
β−ガラクトシド結合を有するラクトース、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＯＮＰＧと略記する。）等のβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に作用し、そのβ−ガラクトシド結合を加水分解して、ガラクトースとグルコース、ガラクトースとＯ−ニトロフェノール等に分解すると同時に、生成したＤ−ガラクトース基を転移する。
（２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
ＯＮＰＧを基質として各ｐＨのリン酸緩衝液中で４０℃で１０分間反応させた結果、図１に示すとおり、至適ｐＨはｐＨ７．０〜７．５であった。また、各ｐＨのリン酸緩衝液中で４０℃で６０分間インキュベートした後の残存活性を測定した結果、図２に示すとおり、ｐＨ６．５〜７．５の範囲で９０％以上の残存活性を示した。ただし、ｐＨ８．０以上の条件ではホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液を、ｐＨ６．５以下の条件ではクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。  図１は、この発明の酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示している。なお、酵素活性は測定値が最高値を示したとき（ｐＨ７．０）の活性を１００とした相対活性率で表した。また、図２は、この発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示しており、残存活性は測定値が最高値を示したとき（ｐＨ６．５）の活性を１００とした相対活性率で表した。
（３）作用適温の範囲
ＯＮＰＧを基質としてリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で各温度において１０分間反応させた結果、図３に示すとおり、作用適温の範囲は３０〜４０℃であった。図３は、この発明の酵素の活性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示しており、酵素活性は４０℃での測定値を１００とした相対活性率で表した。
（４）分子量
分子量（ＭＷ）は、セファクリルＳ−４００ＨＲ（ファルマシア社製）のカラムを使用したゲルろ過法によって測定したところ、約３２万であった。分子量既知の試料としては、アルドラーゼ（ＭＷ１５８０００）、カタラーゼ（ＭＷ２３２０００）、フェリチン（ＭＷ４４００００）、チログロブリン（ＭＷ６６９０００）を使用した。平衡化および溶出は、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび５Ｗ／Ｖ％のグリセリンを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて室温で、流速１ミリリットル／分で行った。
（５）ｐＨによる失活
ｐＨ５．０以下またはｐＨ９．５以上の範囲で４０℃で１時間保つことにより失活する。
（６）阻害および活性化
ＯＮＰＧを基質として各種試薬を所定濃度（金属イオン１ｍＭ、アルコール６．２５Ｖ／Ｖ％）添加し、各種イオンおよびアルコールの活性に対する影響を調べた。結果は表１に示したとおりである。
【００１１】
【表１】
0003556704.tif 000002
【００１２】
表１に示すとおり、このβ−ガラクトシターゼは、銀イオン、銅イオン、ブチルアルコールにより阻害され、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、メチルアルコールにより活性化される。
次に、この発明のβ−ガラクトシターゼの製造方法について説明する。
この発明のβ−ガラクトシダーゼを得るには、クレブシエラ属に属する細菌を培養し、その培養物より目的とする酵素を採取すればよい。その具体的菌株として、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）Ａ−５３〔以下、Ａ−５３と略記する。（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２６３）〕が挙げられる。
【００１３】
このＡ−５３菌学的性質は次の通りである。
0003556704.tif 000003
【００１４】
0003556704.tif 000004
0003556704.tif 000005
以上の同定試験結果から、Ａ−５３株はクラブシエラ・オキシトカと同定された。
【００１５】
この他にも、Ａ−５３株の自然的および人工的変異株は勿論、クラブシエラ属に属する菌種でβ−ガラクトシダーゼ産生能を有する細菌はすべてこの発明において使用することができる。また、それらのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み入れた組換え微生物も生産菌として使用できるものと期待される。
これらの菌株の培養には一般によく用いられる培地を使用することができる。具体的には、炭素源としては、ブドウ糖、乳糖、でんぷん、糖蜜等の糖類が使用できる。また窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の有機の窒素源と共に塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機の窒素源も使用することができる。また、必要に応じてビタミン、ミネラルを添加してもよい。さらにβ−ガラクトシダーゼ生産性を上げるために、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド等の誘導物質を添加してもよい。
【００１６】
培養条件としては、好気培養が採用され、例えば培養温度２０〜４０℃、培養液のｐＨは２〜１０の範囲内で、１〜１２時間培養することにより菌体を得ることができる。さらに、新鮮な培地を一定速度で供給しながら培養する連続培養法も適用できる。培地および培養条件は上記の条件に応じて適宜選定することが可能であることは言うまでもない。
【００１７】
このように培養して得られる培養液から、ろ過あるいは遠心分離等の常法によって菌体を得る。このようにして得られる菌体を、例えば、ホモジナイザー、ブレンダー、音波処理装置、加圧型細胞破壊装置等を用いて菌体破砕処理を行うことにより粗酵素液を得ることができる。さらにゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、樹脂はファルマシア社製）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、樹脂はファルマシア社製）、疎水クロマトグラフィー（例えば、樹脂はトーソー社製）、高速液体クロマトグラフィー（例えば、カラムはウォーターズ社製）等の適当な分離精製方法によりβ−ガラクトシダーゼ精製酵素を得ることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。なお、以下の例において％はＷ／Ｖ％を表す。また、β−ガラクトシダーゼの活性は、ＯＮＰＧに対する加水分解力の測定による値で示した。すなわち、５ｍＭのＯＮＰＧ０．２５ミリリットルを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）０．７４ミリリットルに、酵素液０．０１ミリリットルを加えて４０℃で１０分間反応させた後、１．０ＭのＮａ２  ＣＯ３  ０．２５ミリリットルを加えて反応を停止させ、生成したＯ−ニトロフェノールを波長４２０ｎｍにおける吸収により測定した。１分間に１μモルのＯＮＰＧを分解する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。
実施例１
クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）Ａ−５３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２６３）を酵母エキス０．５％、ペプトン１．０％、塩化ナトリウム１．０％からなる液体培地に接種し、３０℃で、１６時間前培養した後、培養液１．８ミリリットルを１ｍＭのＩＰＴＧを含む同培地１８０ミリリットルに植菌し、３０℃で９時間培養した。
【００１９】
この培養液を遠心分離し、得られた菌体の３０ｇを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した後に遠心分離（２００００ｇで６０分間）して粗β−ガラクトシダーゼ液を得た。この粗β−ガラクトシダーゼ液は、総活性３９００Ｕ、総タンパク質１４３００ｍｇであった。
実施例２
実施例１で得た粗β−ガラクトシダーゼ液を出発原料として、（１）ＤＥＡＥ−セファロースファストフロー（ファルマシア社製）による精製、（２）ブチルトヨパール（東ソー社製）による精製、（３）ＤＥＡＥ−セファロースファストフローによる再精製を順次行い、酵素標品を得た。
【００２０】
以下各精製工程について詳述し、併せて、各精製工程における酵素の総活性、総タンパク質、比活性、回収率を示す。
（１）ＤＥＡＥ−セファロースファストフローによる精製
実施例１で得た粗酵素液１２０ミリリットルを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースファストフローのカラム（直径３．６×１０ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２００ミリリットルで洗浄した後、塩化ナトリウムの直線勾配（０〜５００ｍＭ）で溶出し、β−ガラクトシダーゼ活性画分１４ミリリットルを回収した。
【００２１】
この精製段階の酵素液は、総活性１８００Ｕ、総タンパク質６５４ｍｇ、比活性２．７４Ｕ／ｍｇ、回収率４６．２％であった。
（２）ブチルトヨパールによる精製
上記（１）で得た粗酵素液１４ミリリットルに０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したブチルトヨパールのカラム（直径１．６×１５ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄後、硫酸アンモニウムの直線勾配（５００ｍＭ〜０ｍＭ）で溶出し、β−ガラクトシダーゼ活性画分を回収した。この溶液に硫酸アンモニウムを終濃度が６０％飽和になるまで添加し、生じた沈澱を遠心分離（２００００ｇで３０分）で回収した。得られた沈澱を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２０ミリリットルに溶解し、粗酵素液２２ミリリットルを得た。
【００２２】
この精製段階の酵素液は、総活性７１３Ｕ、総タンパク質１１８ｍｇ、比活性６．０Ｕ／ｍｇ、回収率１８．３％であった。
（３）ＤＥＡＥ−セファロースファストフローによる再精製
上記（２）で得た粗酵素液の２０ミリリットルを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液．ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースファストフローカラム（直径１．６×１５ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１２０ミリリットルで洗浄した後、塩化ナトリウムの直線勾配（０〜５００ｍＭ）で溶出し、β−ガラクトシダーゼ活性画分を回収した。得られた酵素液をセントリプレップ−１０（アミコン社製）を用いて濃縮し、グリセロールを終濃度が２０％となるように加えた。
【００２３】
この精製段階の酵素液は、総活性７２３Ｕ、総タンパク質８２．６ｍｇ、比活性８．８Ｕ／ｍｇ、回収率１８．５％であった。
また、このβ−ガラクトシダーゼは前記した理化学的性質を有していた。
実施例３
実施例２で得られた酵素標品と市販の酵素（大和化成社製  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来）を用いて、ステビアに対するＤ−ガラクトース基転移反応の比較実験を行った。
【００２４】
反応液は最終濃度で、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍラクトース、０．０２５Ｍステビオシド、酵素２０Ｕ／ミリリットルとなるように混合した。この反応液を、４０℃で３時間インキュベートした後、１００℃で１０分間処理することにより酵素反応を停止した。
反応生成物を以下の条件で高速液体クロマトグラフィ（以下、ＨＰＬＣと略記する）で分析を行った。
【００２５】
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＮＨ２（２５０ｍｍ  ｘ  ４ｍｍ）
検出器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−６Ａ
移動相：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−Ｗａｔｅｒ  （８０：２０）
流速  ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度  ：４０℃
この結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は、この発明の酵素を用いたときの生成物を示すチャートであり、図５（ｂ）は、市販の酵素を用いたときの生成物を示すチャートである。また、１０分付近に見られるピークがステビオシドのピークであり、２２分付近に見られるピークが糖転移物のピークである。この図５に示した結果から、この発明のβ−ガラクトシダーゼは、市販のβ−ガラクトシダーゼと比べてステビオシドに対する糖転移能が高いことが確認された。
【００２６】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明のβ−ガラクトシターゼは特にステビオシドに対して優れた糖転移能を有しているため、この酵素を利用してステビオシドの糖転移物を工業的に生産することができる。また、その優れた糖転移能を利用して各種食品や医薬品の原料等となる糖転移物を大量生産することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】この発明の酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図３】この発明の酵素の活性に及ぼす温度の影響を示すグラフである。
【図４】この発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示すグラフである。
【図５】（ａ）（ｂ）は、各々この発明の酵素および市販の酵素のステビオシドに対するＤ−ガラクトース基転移反応後のＨＰＬＣチャート図である。
【図１】
0003556704.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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