(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）一方の脂質成分が両親媒性で、極性があり、かつホスファチジルコリンおよび他の燐脂質から選ばれる二層構造体であり、そして脂質系の１ないし90％（w/w）の量で存在し、
（ii）他方の脂質成分が非極性であって、６ないし18個の炭素原子の範囲内の特定の長鎖を有するモノ、ジ、またはトリグリセリドの種類から選択される少なくとも２つの脂質成分を有する特定の脂質系と、
ｂ）脂質系の関して１ないし200％（w/w）の量で存在する治療的に有効な量のヘパリン、またはその断片、またはその誘導体と、
ｃ）個々の脂質および離散脂質粒子が形成される量で存在し、経口、直腸、頬側、舌下、鼻側、皮下、または経皮に使用するために、または粘膜に投与するために適用され、かつ各投与ルートに適する賦形剤を含有する水含有溶媒とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
両親媒性および極性のある脂質成分が脂質系の１ないし50％（w/w）の量で存在することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
非極性の脂質成分が
ａ）8:0カプリレートおよび10:0カプラートの混合物を有するトリグリセルドおよび／または
ｂ）8:0カプリレートおよび10:0カプラートの混合物を有するジグリセリドおよび／または
ｃ）8:0カプリレートおよび10:0カプラートの混合物を有するモノグリセリド
からなることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
両親媒性および極性の脂質成分がホスファチジルコリンであり、非極性の脂質成分が8:0カプリレートおよび10:0カプラートから構成されているモノグリセリドであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ヘパリン、またはその断片、またはその誘導体が脂質系に関して４ないし80％（w/w）の量で存在することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヘパリンが2000−10000ダルトンの分子質量を有する低分子量断片であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物と適宜な賦形剤とを含有する局所製剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は少なくとも一方が両親媒性で極性でありかつ他方が非極性である少なくとも２つの脂質成分からなる特定された脂質系を含有し、生体活性化合物がヘパリンまたはその断片または誘導体である薬剤組成物に関するものである。該薬剤組成物はさらに離散脂質粒子が存在するような量において水性溶媒を含有し、そして前記薬剤組成物は直腸、経口、頬側、舌下、経皮等のごとき種々の投与形状に適合させることができる。
本発明は少なくとも一方の化合物が両親媒性および極性を有しかつ他方が非極性である異なる極性の種類から選ばれた少なくとも２つの脂質成分からなるスウェーデン特許出願第9003100−６号明細書に記載の特定の脂質系を基礎にしている。
両親媒性および極性を有する化合物は二層構造形成体であり、離散脂質粒子は脂質系が過剰な量の水または水含有溶媒と相互に作用するとき脂質系から自然に形成される。
特定された脂質成分はその化学的組成が知られかつ制御される脂質である。これは以下でかつ実施例においてより詳細に説明する。
特性「二層構造形成体」は公知の物理的パラメータでありかつ適宜な物理化学的方法（例えば表面バランス方法）により容易に確立することができる。そして形成された離散脂質粒子が偏光方法、画像分析方法または回析方法を使用する顕微鏡のごとき物理化学的方法により確立することができる。
脂質組成の変化は脂質粒子が形成される制御メカニズムと、関連の生体活性材料の直接または抑制させた解放のための制御要因として作用する脂質粒子形成率とを備える。
以下の定義を使用する。
脂質−１つまたはそれ以上の脂肪酸が結合されているかまたは結合され得るグリセロール、スフインゴシン、コレステロール、およびその他またはそれらの誘導体のようなアシル担体からなる天然または合成化合物についての一般的な用語である。また実質的な炭化水素部分を含有する同様の分子を包含することができる。
脂質粒子形成系に使用される脂質はそれらの極性に依存して、種々の脂質クラスに分類することができる。即ち、非極性の脂質クラス−これは極性をヘツド基を持たないかまたは水と相互作用できないように非常に小さいかまたは立体障害となる親水性部分を有するもの。非極性の構成成分の例は炭化水素、またはモノ−、ジ−およびトリグリセロール、コレステロール、脂肪アルコールまたはコレステロールエステルのごとき非膨張両親媒性の化合物である。
極性の脂質クラス−顕著な極性の構成成分のために表面溶融性を有する燐脂質または糖脂質のごときものである。水との顕著な相互作用に依存して、それらはさらにそれぞれ膨張および溶融可能な両親媒性の化合物に細分されている。
両親媒性の脂質クラス−表面活性を有する燐脂質および糖脂質のごときものである。
二層形成脂質クラス−水の存在において二層構造体を形成する分子ジオメトリーを有するPC（ホスフアチジルコリン）、スフインゴミエリン、PI（ホスフアチジルインシトール）またはPE（ホスフアチジルエタノールアミン）のような両親媒性脂質である。
本発明による担体系に使用される脂質はそれらの種々の極性により特徴付けられる脂質クラスの混合物からなっている。燐脂質または糖脂質のような極性の脂質およびモノ−、ジ−およびトリグリセリドのような非極性の脂質は系の主要成分である。けれども、コレステロール、脂肪酸、脂肪アルコールおよびそのエステルならびに他の脂質クラスをも使用することができる。上述したような種々のクラスからの脂質のこの混合物はダイズ油、トウモロコシ油またはダイズレシチンおよび卵レシチンのごとき市販製品と混同するべきではない。良好に特定された脂質クラスを得るために市販の油が分別され、そしてその後以下の実施例において詳細に説明されるごとく種々の脂質クラスが混合される。良好に特定された脂質を得るための他の方法は合成的に製造された脂質を使用することにある。
さらに、脂質の誘導体もまた上述した脂質と組み合わせて使用することができる。この例の１つはホスフアチジルエタノールアミンに結合されたポリエチレングリコールであり、ホスファチジルエタノールアミンは血流への注入後リポソームの循環時間を延長することを示した。かかる誘導体の他の例は腸内の生体活性物質用の吸収増強剤として作用するパルミトイルカルニチンである。
脂質担体系の形成を開始させるための好適な方法において、生体活性物質は選択された脂質に混合され、それに続いて、異なる極性の脂質を混合させる。この極性／非極性の変更は異なる極性を有する脂質の範囲を含み、特別な場合において必要であると同じ多数のサイクルだけ継続させることができる。
脂質担体系に生体活性物質を組み込むための好適な方法は両親媒性脂質の量が一般に１〜90％の合計範囲にある均質調合物を作るために生体活性物質を両親媒性脂質に混合することにある。かかる両親媒性脂質は自然発生的に二層構造体を形成にすることができる。その例はホスフアチジルコリン、ホスフアチジルグリセロール、ホスフアチジルイノシトールまたはホスフアチジルセリンまたはその混合物のような両親媒性でかつ極性を有する脂質クラスである。
脂質担体系の構成は各生体活性物質の可溶化の目的に合った脂質クラスの適切な選択および／または組み合わせを含むだけでなく、脂肪酸、すなわち使用される脂質クラスに付着されているアシル基の分布の適切な選択を含んでいる。アシル基の量の変化は以下の実施例に見られるように異なる物理化学特性を与える。
付与された水成環境において脂質粒子が系から形成される量は主要な二層構造体を形成する脂質クラスの幾何学的形状、すなわち炭化水素後部の立体配置に関して有効なヘッド基を変化させることにより左右されかつ制御することができる。
脂質粒子の形成を左右しかつ制御する第２の方法は脂質系の非極性部分の炭化水素鎖の構造を変化させること、したがつてその流動性を変化させることによる。これは内因性の両親媒性の脂質と外因性の水成媒体との相互作用の量に影響を及ぼす。
本発明によれば、上述の特定の脂質系は水含有溶媒とともにヘパリン、その断片または誘導体を含有する薬剤組成物において利用される。表現「ヘパリン」は天然、生体合成、合成または遺伝学的に処理される源からのヘパリンの断片またはクラス、ならびにあるゆる誘導体、すなわちヘパリンエステルを現し、そして「その断片」はヘパリンのあるゆる低分子量断片または化学的に変性された合成ヘパリン状オリゴ糖を含むそれらの誘導体を現す。
多くの非経口投与形態において、ヘパリンの不十分な生体吸収を克服することにかなりの困難が経験された。
本発明の目的はこの問題を解決するために上述した脂質系に基礎を置いた適応性のある薬剤組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は経口投与に代えるべき手段として、ヘパリンの長期間の自己投与の便利な形態に十分適する薬剤組成物を提供することにある。
本発明による薬剤組成物は各々適切な投与ルート用の賦形剤、溶媒または担体を添加することにより、経口、直腸、頬側、舌下、鼻側、皮下または経膜または経皮投与に適合される製剤の製造に使用することができる。
両親媒性でかつ極性を有する化合物は好ましくはホスフアチジルコリンでありそして非極性の脂質は好ましくはモノ、ジまたはトリグリセリドから選ばれている。
組成物中の水の量は離散脂質粒子が形成されるような量にすべきである。
この状態は、脂質粒子を形成するための系の実際の限界が脂質成分の性質および組成と系により投与される生体活性成分の性質とに依存するため、各脂質系について検査すべきである。
脂質系の成分を選択するときの最も重要な考慮は脂質の構成および系に組み込まれる生体活性薬剤の極性である。
６ないし18個の炭素原子の間の、好ましくは６ないし12個の炭素原子の間のグリセリドの鎖長さを変化させることによりその吸収を制御させることができる。極性の選択および構成成分の異なる電荷基の選択はまた脂質粒子形成に影響を及ぼすことができる。
脂質粒子は微胞、リポソーム、および高い多層構造体のような種々のモノ、ジおよびマルチ構造体を含んでいる混合集団にすることができる。
サイズの範囲と構造において集団を制御するための多数の方法が当該技術において良く知られており、それらは例えば音波処理装置、凍結−解凍制御攪拌装置およびサイズ範囲に影響を及ぼす種々の装置である。かかる装置の必要性は各投与形態および組成物により供給される各治療用活性化合物に関して別個に検討されるべきである。
脂質粒子集団の組成物は極性、炭素鎖の長さおよび上述した他の要因に基き脂質材料の選択により影響を受ける。
本発明による好適な実施例において、化合物はヘパリンまたはその断片であり、そして脂質系は両親媒性化合物としてホスフアチジルコリンおよび非極性の成分としてモノグリセリドからなっている。
組成物中の両親媒性化合物の量は脂質系において１ないし90％（w/w）、好ましくは１ないし50％（w/w）の間、そして最も好ましくは脂質系に対して５〜50％（w/w）の間の範囲にすることができる。
好適なヘパリン断片はフラグミン（商標）であり、これは亜硝酸解重合方法により豚ヘパリンからカビ・フアーマシア社により製造された低分子量ヘパリン断片である（ヨーロッパ特許第14184号参照）。
フラグミン（商標）は、組成物の他の成分に添加されるかまたはそれに混合されるとき、溶液または懸濁液の形態にすることができる。それは組成物の他の成分が添加される前に水のない脂質マトリクスと混合させることもできる。
フラグミン（商標）は非常に容易に水に可溶でかつかかる水溶液は安定であると認められている。
フラグミン（商標）の特性は適宜な試薬の添加により特定の脂質系に基づいて多くの製材を製造することを可能にする。かかる製剤は発泡剤、注液、カプセルおよび座薬、または経口、頬側、舌下、鼻側、経皮または皮下投与のためにまたは一般的なに粘膜投与のために特に製造された各種の製剤の形式において直腸使用に適用させることができる。フラグミン（商標）と特定の脂質とを含有する本発明の組成物はまた例えば皮下投与に関して抑制された解放を得るにデポー製剤の製造に適するか、または例えば頬側投与のための粘性接着特性を有する多孔性重合マトリクスの適用に適する。その製剤は血栓塞栓症、梗塞症、冠動脈性心臟病、炎症性疾患、血栓性静脈症、自己免疫症、動脈硬化症のごとき広範な病理過程を治療および／または阻止するためにまたはメタスタシスまたは血管形成関連疾患の治療に有用である。
上述した疾患の治療のために上述した投与ルート用の組成物の適合は当業者には自明である。
上述した投与形態におけるフラグミン（商標）の合計投与量はしたがつて非常に高くすることができ、そして生体有効性によつてのみ制限され、それにより治療的にかつ臨床的に投与するのに適しかつ十分に容認されている。
臨床的投与量の例は極度の静脈血栓症に関して１日２回120IU/kg体重であり、そして血栓症予防（危険の少ない患者に関して）に関しては2500IU/日または5000IU/日（危険の大きい患者に関して）である。例えば、脂質に対するフラグミン（商標）の相対的な量は１〜200（w/w）、好ましくは２〜80（w/w）の範囲にすることができる。しかしながらフラグミン（商標）と脂質の高い量はそれが臨床的に適するならば本発明の範囲内で考えることができる。脂質の量を組成物中で低くさせる場合に、高めた吸収作用は減少され、それは投与後同一の血清レベルを得るために増加した量のフラグミン（商標）により補償させることができる。
フラグミン（商標）対脂質の相対的な量を200（w/w）まで可能にするこの広い濃度範囲は各種の患者に供給させる適宜な投与形態用の組成物に適用させる成分が柔軟性があることを示す。
フラグミン（商標）の可溶性および安定性は適宜な投与形態に対する組成物の適合を容易にし、そのうえフラグミンがおそらくその高い負の電荷密度のために、組成物の脂質粒子集団について安定化作用を有している強力な証拠となる。
本発明の範囲を限定するものと判断すべきでない以下の実施例は両親媒性化合物として25％のホスフアチジルコリンと非極性の化合物として75％のモノグリセリドとの比率において実施例で特定した脂質を有する組成物中のフラグミン（商標）を示す。
組成物は各種の量の水を基礎にした溶媒を付加して生体内で直腸および十二指腸に投与された。十二指腸に付与された組成物において水含有量は組成物の脂質成分に対して１重量部ないし４重量部まで変化させることができる。
試験されたフラグミン（商標）対脂質の相対的な量は２から200（w/w）までであつた。
以下の実施例１〜５は本発明の範囲を制限することなしに脂質およびその組み合わせの選択により、生体活性化合物の不存在において、脂質系の脂質成分の変化を示す。
実施例６〜７はホスフアチジルコリンと、グリセロールエステルと、フラグミン（商標）とからなる特定の脂質系を含む組成物の製造を示す。これらの組成物は脂質粒子形成が直接および自然に発生するような量における水を基礎にした溶媒を含むものではない。
実施例８は以下の実施例における実験に使用された動物モデルと、脂質系の存在において十二指腸または直腸投与後のフラグミン（商標）の生体有効性とを示す。
実施例９はフラグミン（商標）が脂質系に含有されているときフラグミン（商標）の十二指腸吸収が顕著に増加することを示す。
実施例10は外部の水が投与前に添加されるときフラグミン（商標）の十二指腸吸収が増加することを示す。
実施例11は実施例10の水が同一量の生理食塩水と交換されたとき十二指腸吸収が同様に増強することを示す。
実施例12は脂質系の存在において生理食塩水中に溶解されたフラグミン（商標）と比べてフラグミン（商標）が脂質系に組み込まれるときフラグミン（商標）の直腸吸収が著しく高いことを示す。
実施例13は脂質系に外部の水または生理食塩水を添加することが直腸吸収について積極的な作用を有することを示す。
実施例14および15は、十二指腸または直腸により吸収されるために、フラグミン（商標）が水または食塩水との溶解前に脂質系に必ずしも含有される必要がないことを示す。
実施例16は試験された市場で入手可能な加工してない脂質が特定された脂質より低い直腸吸収を付与することを示す。
実施例17は種々のフラグミン（商標）対脂質率の吸収の比較でありかつ脂質とフラグミン（商標）の広い濃度範囲にわたつて直腸吸収が高いことを示す。
実施例18は脂質系を含む製剤におけるヘパリンとフラグミン（商標）の吸収の比較である。
実施例19は組成物の形成後、吸収特性の顕著な影響なしに投与前に各種の時間の長さにおいて溶液を貯蔵できることを示す。
実施例20〜21は組成物の長期間の貯蔵後フラグミン（商標）活性が保持されかつその吸収がさらに高いことを示す。
その結果は特定の脂質系が十二指腸吸収を増強しかつ十二指腸に付与されたフラグミン（商標）の最大吸収が組成物の最大の試験水含有量により達成されることを示す。試験された成分の濃度は好都合な結果を示した。しかしながらさらに条件を最適化することも可能である。
増強された吸収の理由は組成物と腸膜との間に高い接触表面積が得られることにあり、またおそらくそのために脂質粒子集団が関連の希釈度において好都合な構造的組成を有することにある。
脂質粒子は脂質粒子が薬剤を支持するかまたは溶液中に存在する場合に、腸内の酵素の低下から薬剤を保護することもできる。存在する多量の脂質は酵素を減少させるフラグミン（商標）を阻止することができかつかかる場合においてフラグミン（商標）は脂質粒子の外部で十分に保護される。しかしながら、脂質の量が低いとき、脂質粒子内にフラグミン（商標）を封入するのが有利である。
酵素抑制剤が本発明の組成物に対する考え得る添加剤である。
フラグミン（商標）が溶液中に自由に存在するか又は脂質粒子中に取り込まれているかどうかに関係なく、その吸収が高いことを示している。広範囲の水又は食塩水で脂質系を有するフラグミン（商標）組成物を直腸に投与した後にすぐれた吸収結果を示した。この結果は今日一般的な投与ルートである皮下注射に匹敵する。その特定の脂質系は市販の脂質と比較して組成物の制御と安定及び吸収の再生において利点を有することを示している。
形成された粒子のサイズはフラグミン（商標）の好都合な吸収特性に影響を及ぼすことなく、相当変化させることができる。組成物はそれらの製造後短時間および長時間の期間後等しく有用であることが示されている。
本発明による組成物は脂質系とともに投与させたとき、ヘパリン吸収を増強させることができる。本発明において使用された特定の脂質系はまたその成分が生物学的吸収および薬剤の解放および可溶性をより正確に制御することがでるため利点を有している。
これは脂質クラスからの適切な脂質成分の選択が良好な吸収の制御を達成できることを意味する。フラグミン（商標）が製造中に脂質系に含まれていないが、攪拌または音波処理中に脂質組成物に溶液として添加されたとしても高い吸収が得られる。結論において特定の脂質系とヘパリンまたはヘパリン断片に基づいた組成物は増強された吸収において意外にも好適でありかつ吸収率を制御する有利な可能性を備えている。
当業者にとって各種の変形および変更は明らかであり、本発明の精神または範囲から逸脱することなしに各種の変形及び変更を本発明の化合物、組成物および方法において使用可能であり、そして本発明は特別な実施例に限定されるものではない。
実施例１
ダイズ（Ｉ）からの1.25gの燐脂質を1.25gのグリセリド混合物（II）に添加させ、そして60℃で12時間静かに攪拌させた。次いで2.50gのトリグリセリド（III）を添加させそして合計混合物を60℃で１時間攪拌させた。
0003577312.tif 000002
実施例２
ダイズ（Ｉ）からの1.25gの燐脂質を1.25gのグリセリド混合物（II）に添加させ、そして60℃で12時間静かに攪拌させた。次いで2.50gのトリグリセリド（III）を添加されそして合計混合物を60℃で１時間攪拌させた。
0003577312.tif 000003
実施例３
ダウズ（Ｉ）からの1.25gの燐脂質を1.25gのグリセリド混合物（II）に添加させそして60℃で12時間静かに攪拌させた。
0003577312.tif 000004
実施例４
ダイズ（Ｉ）からの1.25gの燐脂質を1.25gのグリセリド混合物（II）と0.16gのエタノールに添加させた。合計混合物を60℃で６時間静かに攪拌させた。0.16gのトリグリセリド（III）を添加させそして合計混合物を上昇させた温度で更に１時間攪拌させた。
0003577312.tif 000005
実施例５
ダイズ（Ｉ）からの2.50gのホスフアチジルコリンと7.50gのモノグリセリド（II）とを60℃で６時間静かに攪拌させた。1.25gの水を添加させそして攪拌を上昇させた温度で更に１時間継続した。
0003577312.tif 000006
実施例６
ダイズ（Ｉ）からの2.50gのホスフアチジルコリンと7.50gのモノグリセリド（II）を60℃で６時間静かに攪拌させた。1.25gのフラグミン（商標）溶液（120mg/g水）を添加させそして攪拌を上昇させた温度で更に１時間継続した。
0003577312.tif 000007
実施例７
ダイズ（Ｉ）からの2.50gのホスフアチジルコリンと7.50gのモノグリセリド（II）とを60℃で６時間静かに攪拌させた。0.625gのフラグミン（商標）溶液（120mg/g水）を添加させそして攪拌を上昇させた温度で更に１時間継続した。
0003577312.tif 000008
37℃において水中で形成した脂質粒子のサイズ分布をマルバーン装置（Malvern eguipment）を使用して実施例15について測定した。その調合剤を17時間水中で静かに振動させ、そして次いで水成相から脂質相を分離させるように遠心分離した。以下の結果が得られた。
0003577312.tif 000009
実施例８
動物モデル
2.5〜3.5kgの重さの雌雄両方のニユージーランド産の白ウサギをすべての実験に使用した。12時間絶食後、各ウサギにはハイプノーム0.1ml/kg（ベルギー国所在のジヤンセン・フアーマシユーテイカルズ社製）を静脈注射で、アトロピン0.5mg/kg（スウェーデン国所在のカビ・フアーマシア社製）を皮下注射することにより鎮静剤を与えた。ウサギにはメブマル20mg/kgにより麻酔をかけた。麻酔はその後必要時に維持された。ウサギの毛を刈取りそして中央開腹を行った。そこで試験化合物を十二指腸に直接注入させ、その後ウサギの腹膜凹所を閉止させた。直腸投与はウサギの直腸に使用するために特別に形成したプラスチツク管に結合された注射器によつて実施した。投与量は試験化合物を投与する前後に注射器および接続管の重さを計測することによつてチエツクされた。
血液サンプル（1ml）を耳動脈に挿入されたカテーテルによつて0.25,0.5,0.75,1,1.5,2.2,2.5,3,4,5,6,7,8,9,および10時間の間隔で集め、そして0.04Mの最終濃度までクエン酸ナトリウムと混合させた。管を10分間800gで遠心分離させるまで氷上に保持させた。血漿内の抗FXa活性を牛FXa（カビ・フアーマシア）と色素基体Ｓ−2222を使用する初期量検定により測定した。
十二指腸または直腸投与後のフラグミン（商標）の明瞭な生体有効性を抗FXa活性曲線に基づく面積の部分、すなわち（AUC十二指腸／直腸）および（AUCS.C.）として現わし、後者を2mg/kgの投与量でフラグミン（商標）の皮下注射を受けている６匹のウサギにおいて5.14±0.34任意ユニツトになるように測定した。
脂質の不存在におけるフラグミン（商標）の生体有効性
脂質系の不存在における十二指腸投与後のフラグミン（商標）の生体有効性を４匹のウサギで試験した。これらのウサギの２匹には幽門レベルで十二指腸内に配置されたゼラチンカプセルに含まれた粉末として、フラグミン（商標）、25mg/kgを与えた。残りの２匹のウサギには生理食塩水中に溶解されたフラグミン（商標）を十二指腸に直接注射することにより付与した（合計投与量25mg/kg）。８〜10時間の観察期間にわたつてこれらのウサギのいずれにも抗FXa活性を検出できなかった。
直腸投与後のフラグミン（商標）の生体有効性を３匹のウサギで試験した。フラグミン（商標）を生理食塩水中に溶解させ、そして10mg/kgの投与量で直腸に直接注入した。これらのウサギの２匹は血漿中に検出し得る抗FXa活性を有していなかったが、１匹は１％以下の生体有効性に対応する45分間の0.21U/mlの活性を示した。
結論：増強添加物の不存在においてフラグミン（商標）の生体有効性は十二指腸または直腸投与後１％以下である。
実施例９
実施例５〜７による脂質系に含有されたフラグミン（商標）の十二指腸吸収を８匹のウサギで試験した。フラグミン（商標）／脂質系を離散脂質粒子が十二指腸に付与される10分前に形成されるような量で水と混合させた。混合物の組成は以下の通りであった。すなわち、１部（重量）フラグミン（商標）／脂質＋１部（重量）蒸留水。水／脂質系を５〜10分間勢いよく攪拌させかつ次いで十二指腸に注入させる前の更に10分間室温にある状態で放置させた。フラグミン（商標）の濃度は脂質重量の２％であつた。すべてのウサギには以下の投与量を与えた。すなわち、フラグミン25mg/kg、脂質1250mg/kgおよび蒸留水1250mg/kg。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。最大血漿濃度（Cmax）は0.5〜1.5時間に達しそして0.37IU/ml〜1.76IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は4.7±3.0％であつた。
結論：フラグミン（商標）の十二指腸吸収は系中の脂質の不存在に比較してフラグミン（商標）が脂質系に含まれるとき顕著に増加する。
実施例10
この実験はフラグミン（商標）／脂質系を多量の水と混合させた点を除き、実施例９に記載した研究と同一であつた。混合物の組成は以下の通りであつた。すなわち、１部（重量）フラグミン（商標）／脂質＋４部（重量）蒸留水。フラグミン（商標）の濃度は脂質重量の２％であつた。すべてのウサギ（ｎ＝９）には以下の投与量を与えた。すなわち、フラグミン25mg/kg、脂質1250mg/kgおよび蒸留水5000mg/kg（≒5ml）。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは0.75〜1.5時間に達しそして0.73IU/ml〜3.79IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は14.7±5.6％であつた。
結論：フラグミン（商標）の十二指腸吸収は脂質系（フラグミン（商標）を含有する）を十二指腸に注入させる前に水と混合させたとき著しく増加する。
実施例11
この実験はフラグミン（商標）／脂質系を４部の蒸留水に代えて４部の生理食塩水と混合させた以外は実施例10に記載された研究と同一であつた。これはフラグミン（商標）／脂質／水系のイオン強度がフラグミン（商標）の十二指腸吸収に何らかの作用を有するかどうかを研究するために行われた。混合物は以下の組成物を有していた。すなわち、１部（重量）フラグミン（商標）／脂質＋４部（重量）生理食塩水。フラグミン（商標）の濃度は脂質重量の２％であつた。すべてのウサギ（ｎ＝10）には以下の投与量を与えた。すなわち、フラグミン25mg/kg、脂質1250mg/kgおよび生理食塩水5000mg/kg。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは0.75〜1.5時間に達しそして0.62IU/ml〜2.60IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は13.7±7.3％であつた。
結論：フラグミン（商標）の十二指腸吸収はフラグミン（商標）／脂質系を生理食塩水と混合させたとき顕著に増加する。
実施例12
脂質系に含まれるフラグミン（商標）の直腸吸収を５匹のウサギで試験した。水なしで、脂質系を2mg/kgのフラグミン（商標）投与量に対応する100mg/kgの投与量で直腸に直接注入した。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは1.5〜2.5時間に達しそして0.53IU/ml〜1.98IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は67.0±18.2％であつた。
結論。水溶液の添加なしに脂質系中に含まれるフラグミン（商標）の直腸吸収は生理食塩水中に単に溶解されているフラグミン（商標）の直腸吸収より劇的に高い。
実施例13
脂質系に外部の水または生理食塩水を添加することは十二指腸吸収について積極的な作用を有していた（実施例9,10および11参照）。この実験は直腸投与後に同様の作用が認められるかどうかを試験するために実施した。フラグミン（商標）／脂質系を直腸に投与させる10分前に実施例11に記載したように生理食塩水の４部と混合させた。混合物の組成は以下の通りであつた。すなわち、１部（重量）フラグミン（商標）／脂質系＋４部（重量）生理食塩水。フラグミン（商標）の濃度は脂質重量の２％であつた。この組成物をそれぞれ２および5mg/kgのフラグミン（商標）投与量で７＋７匹のウサギで試験した。脂質の投与量は100および250mg/kgでかつ生理食塩水の量は400および1000mg/kgであつた。結果は以下の表に要約されている。
0003577312.tif 000010
結論。脂質系に含まれかつ外部食塩水と混合させたフラグミン（商標）の直腸吸収は今日フラグミン（商標）を投与する最も普通に使用されているルートである皮下注射後に観察されたものとはほぼ同じ程度であった。フラグミン（商標）の直腸吸収は吸収量が一定でありながら投与量において2.5倍の増加がAUCおよびCmaxにおいて同様の増加を生じるので良好の投与比例を示す。
実施例14
上述したすべての実験において系に水または生理食塩水を添加させる前にフラグミン（商標）を脂質系に含有させた。以下の実験において、正確には同一の脂質系を使用したが、フラグミン（商標）を含有していかった。フラグミン（商標）なしの、この脂質組成物は以下の説明においては「プラセボ脂質」と称する。
プラセボ脂質と混合させたフラグミン（商標）の十二指腸吸収を７匹のウサギで試験した。フラグミン（商標）粉末を5mg/ml（0.5％）の最終濃度まで生理食塩水中に溶解させた。このフラグミン（商標）溶液の４部（重量）をプラセボ脂質の１部（重量）と混合させた。この混合物中のフラグミン（商標）の濃度は実施例11〜15におけるものと同一のフラグミン（商標）／脂質比である脂質重量の２％である。混合物を５〜10分間勢いよく攪拌させるかまたはそれに代えて十二指腸に注入させる前に適切な時間だけにわたつて音波処理させる。すべてのウサギには以下の投与量を与えた。すなわち、フラグミン（商標）25mg/kg、脂質1250mg/kgおよび蒸留水5000mg/kg。この実施例においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。最大血漿濃度（Cmax）は0.5〜2.0時間に達しそして0.53IU/ml〜3.35IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は13.8％であつた。
結論：この実験はフラグミン（商標）を十二指腸から吸収させるために、水を添加する以前に脂質系に含有させる必要がないことを示す。溶解させたフラグミン（商標）を含有するプラセボ脂質および水または食塩水の混合物は同様な程度に吸収される。組成物を攪拌および音波処理することにより好適な結果が得られる。
実施例15
プラセボ脂質と混合されたフラグミン（商標）の直腸吸収を６匹のウサギで試験した。混合物を実施例14に記載したように製造しかつ以下の投与量、すなわちフラグミン2mg/kg、脂質100mg/kgおよび生理食塩水400mg/mlで直腸に注入させた。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは0.5〜2.0時間に達しそして0.59IU/ml〜1.95IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は64.2±31％であつた。
結論：この実験は実施例14にしたがつてフラグミン（商標）を直腸から吸収させるために脂質系に必ずしも最初に含有させる必要がないことを示す。溶解させたフラグミン（商標）を含有するプラセボ脂質および食塩水の混合物は脂質なしのフラグミン（商標）よりも高い程度で吸収される（実施例13と比較）。
実施例16
市場で入手できる脂質と混合させたフラグミン（商標）の直腸吸収を４匹のウサギで試験した。以下の市場の脂質を使用した。インヴイトールMG742（MGフルスアクチエンゲゼルシャット製、約50％のモノグリセリドと主としてカプリル酸およびカプリン酸から誘導されたアシル基を有する50％のジ−およびトリグリセリドとを含有する）およびホスフアチジルコリンジグマPC（シグマ製のＰ−5394、84％PC、13％PEおよび３％の他の成分を含有する）を使用した。市場の脂質を実施例14および15に記載したように生理食塩水と混合させかつ以下の投与量で、すなわち、フラグミン2mg/kg、脂質100mg/kgおよび生理食塩水400mg/mlで直腸に注入させた。この実験において４匹のウサギの２匹が血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していなかったが、２匹は0.13IU/ml〜0.25IU/mlの間の範囲の低いレベルを有していた。この実験における平均吸収は0.7±1.5％であつた（検出不能な吸収を有する２つを含む）。
結論：非常に限定された脂質系が純化させた粗脂質と交換されたとき、直腸吸収の劇的な増加が観察され、それは上記の多数の実施例に記載された増強された吸収が一般的な脂質の作用に帰因するものではなく、特定の脂質系の作用に基づくものであることを示している。
実施例17
脂質の量に関してフラグミン（商標）の量は上述した実施例において常に100mg/kg体重につき2mg/kg体重であつた。以下の実験はフラグミン（商標）／脂質比の関数として直腸吸収を研究するために行われた。プラセボ脂質系の１部を16時間の貯蔵期間を有して、実施例16に記載したような溶解フラグミン（商標）を含有する４部の生理食塩水と混合させた。食塩水中に溶解されたフラグミン（商標）の量を増加させることにより高いフラグミン（商標）／脂質比を得た。直腸吸収に関して以下の組成物を試験した。
0003577312.tif 000011
以下の結果が得られた。
0003577312.tif 000012
結論：試験されたすべてのフラグミン（商標）／脂質組成物は高い直腸吸収を付与し、それは上述した系中のフラグミン（商標）／脂質の濃度が脂質なしのフラグミン（商標）に比して増加した吸収を付与することを示す。脂質組成物はフラグミン（商標）の直腸吸収について増強作用を有する。
実施例18
フラグミン（商標）は制御された亜硝酸解重合法により豚ヘパリンから製造された低分子量ヘパリン断片である。多数の研究者はヘパリンが経口または十二指腸吸収後には吸収が乏しい（＜１％）ことを示した。本研究の目的は脂質系がヘパリンの直腸吸収を増加できるかどうかを研究することにあつた。実験はフラグミン（商標）がヘパリンと交換されたことを除いて実施例14に記載された処理と同一であつた。８匹のウサギに以下の投与量、すなわちフラグミン2mg/kg、脂質100mg/kgおよび蒸留水400mg/kgを与えた。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。最大血漿濃度（Cmax）は0.5〜2.0時間に達しそして0.12IU/ml〜0.53IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は15.7±８％であつた。
結論：ヘパリンの直腸吸収はその溶液を脂質系と混合させたときに顕著に増加した。しかしながら、吸収度は、同一の条件により比較されるときフラグミン（商標）の吸収度より著しく低い。これは投与される製剤を構成しかつ制御する可能性を付与するヘパリン起源のサイズ依存性又は分子の吸収パターンの特別な相互作用があることを示す。
実施例19
上述したすべての実施例はフラグミン（商標）／脂質／水組成物を製造後10分で注入させた。
４％フラグミン（商標）を含有する脂質／食塩水組成物を与えた３匹のウサギが組成物製造とこの投与との間の時間の経過が吸収に影響を及ぼしたかどうかを確認するためにチエツクされた。
混合物を実施例14におけるように製造し、加えてフラグミン2mg/kg、脂質50mg/kgおよび生理食塩水200mg/kg体重の投与量において直腸に注入させる前に16時間そのままの状態で放置させた。この実験においてすべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは0.5〜2.0時間に達しそして1.12IU/mlの平均をもって0.72IU/ml〜1.90IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は65％であつた。
結論：データは組成物が形成された後吸収特性についての重大な影響なしに各種の時間間隔を置いた後でも投与できることを示す。
実施例20
貯蔵時間に関してフラグミン（商標）の抗FXa活性についての脂質組成物の影響を研究するために生体外実験を実施した。フラグミン（商標）を上記の実施例において特定させた脂質系に組み込んだ。フラグミン（商標）の濃度は脂質重量の２％であつた。１部（重量）フラグミン（商標）／脂質および４部（重量）蒸留水を攪拌により混合物させかつ次いで６週間そのままで放置させた。この期間に規則的にフラグミン（商標）活性を試験した。初期の活性はそれぞれ85IU/mg（シリーズ１）および78IU/mg（シリーズ２）、そして６週間後の活性は96IU/mg（シリーズ１）および85IU/mg（シリーズ２）であつた。
結論：結果は組成物の貯蔵期間中にフラグミン（商標）活性が保持されていることを示す。
実施例21
実施例19におけると同一の処理を２％フラグミン（商標）の脂質／食塩水組成物で４匹のウサギについて行った。フラグミン（商標）の投与量は脂質100mg/kgおよび食塩水200mg/kgとともに2mg/kgであつた。すべてのウサギが血漿中に抗FXa活性の検出可能なレベルを有していた。Cmaxは0.75〜1.5時間に達しそして平均値0.86IU/mlで、0.82IU/mlおよび〜0.86IU/mlの間の範囲であつた。この実験における平均吸収は48％であつた。
結論：離散は計算された容量を調整しかつ投与することを容易にしそしてフラグミン（商標）の増強された吸収を示した。