(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核外遺伝子を持つ細胞小器官への移行シグナルペプチドを規定する塩基配列と、所定の塩基配列を認識する制限酵素のアミノ酸配列を規定する塩基配列とを結合させた融合遺伝子を備えたことを特徴とする融合蛋白質発現用組換えベクターであって、
前記細胞小器官がミトコンドリアであり、前記シグナルペプチドがチトクロームｃ酸化酵素の第４サブユニットのものであり、前記制限酵素がＳｍａＩであることを特徴とする融合蛋白質発現用組換えベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の融合蛋白質発現用組換えベクターを用いた非ヒト生物の核外遺伝子分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、格外遺伝子を持つ細胞小器官（例えばミトコンドリア等）の内部に存在するＤＮＡを分解するための融合蛋白質発現用組換えベクター等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に生物のＤＮＡのほとんどは、核内に存在する。しかしながら、例外的に真核生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、プラスチド等）には、その小器官に特有のＤＮＡ（核外ＤＮＡ）が存在することが知られている。
ミトコンドリアは真核細胞内に存在する細胞小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給している。このミトコンドリア内には、ヒトにおいて、核ＤＮＡとは独立した唯一の核外遺伝子であるミトコンドリアＤＮＡ（以下には、「ｍｔＤＮＡ」或いは「ＭｔＤＮＡ」と省略することがある。）が存在することが明らかにされている。ヒトのＭｔＤＮＡは１６，５６９塩基対からなる小さなゲノムであり（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ．，  Ｂａｎｋｉｅｒ  Ａ．Ｔ．，  Ｂａｒｒｅｌｌ  Ｂ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８１；  ２９０：  ４５７−４６５）、酸化的リン酸化系の酵素を構成する１３種のポリペプチドならびに２種のリボソームＲＮＡと２２種のトランスファーＲＮＡを規定している。
【０００３】
このｍｔＤＮＡ中の異常、すなわち点変異あるいは再配置（欠失・重複）は、現在多様な疾患の重要な病因であることが遺伝子解析から明らかになっている（Ｔａｎａｋａ  Ｍ．，  Ｉｎｏ  Ｈ．，  Ｏｈｎｏ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｙｏｐａｔｈｙ，  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｅ−ｌｉｋｅ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ  （ＭＥＬＡＳ）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９１；  １７４，  ８６１−８６８）。これらの疾患のうち、Ｈｏｌｔらが発表したＮＡＲＰ病（神経原性筋萎縮・小脳失調・網膜色素変性）がある（Ｈｏｌｔ，  Ｉ．  Ｊ．，  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｐｅｔｔｙ，  Ｒ．  Ｋ．  ＆  Ｍｏｒｇａｎ−Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｊ．  Ａ．  Ａ  ｎｅｗ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｙ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４６，  ４２８−４３３  （１９９０））。この疾患は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー（細胞における変異型ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡの混在）を伴うミトコンドリア病であり、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇなる点変異によって惹起される。このＭｔ８９９３Ｔ→Ｇは、ｍｔＤＮＡの８９９３番の塩基チミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換される変異であり、これによってＡＴＰ合成酵素（ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ）のａサブユニットの１５６番のアミノ酸であるロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換される。このＬｅｕ１５６Ａｒｇ置換によってＡＴＰ合成酵素のプロトン輸送能が失われ、ＡＴＰ合成が不能になるというものである。また、この変異は、Ｌｅｉｇｈ氏病（亜急性壊死性脳脊髄症）の患者でも検出される  （Ｓａｋｕｔａ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３２，  ５９７−５８９  （１９９２）．）。
【０００４】
ＮＡＲＰ病またはＬｅｉｇｈ氏病では、ｍｔＤＮＡにヘテロプラスミーが存在するために、疾患が生化学的にあるいは臨床的に顕在化するためには、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇを有するｍｔＤＮＡ（以下、「変異型ｍｔＤＮＡ」または、「Ｍｕｔａｎｔ  ｍｔＤＮＡ」と称することがある。また、この変異を持たないｍｔＤＮＡを「野生型ｍｔＤＮＡ」または、「Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｍｔＤＮＡ」と称することがある。）のレベルがある閾値を越える必要がある。また、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーが存在し、かつ、この変異が劣性を示すので、変異型ｍｔＤＮＡを選択的に破壊するか、あるいはその複製を阻止し、野生型ｍｔＤＮＡだけを増殖させることによって、ＮＡＲＰ病またはＬｅｉｇｈ氏病の患者を治療することが可能であると考えられてきている。
【０００５】
この考えを確認するためのアプローチとして、Ｔａｙｌｏｒらはペプチド結合を有する核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，  ＰＮＡｓ）を利用して、変異型ｍｔＤＮＡの複製を阻止しようとした（Ｔａｙｌｏｒ，  Ｒ．  Ｗ．，  Ｃｈｉｎｎｅｒｙ，  Ｐ．  Ｆ．，  Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．  ＆  Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ，  Ｒ．  Ｎ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５，  ２１２−２１５  （１９９７）．）。このアプローチでは、抗ゲノムＰＮＡｓは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系において野生型ｍｔＤＮＡの複製を阻害せず、変異型ｍｔＤＮＡの複製のみを選択的に阻害することが示されたものの、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における効果は未だ確認されていない。
【０００６】
また、Ｃｌａｒｋらは局所麻酔剤をＮＡＲＰ病の患者の骨格筋に注射し壊死を誘導すると、変異型ｍｔＤＮＡを含まない衛星細胞（休眠している筋芽細胞）から筋線維が再生すると報告した（Ｃｌａｒｋ，  Ｋ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ａ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎｈｕｍａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６，  ２２２−２２４  （１９９７）．）。Ｔａｉｖａｓｓａｌｏらは強い運動訓練を短期間行うことによって、筋の変異型ｍｔＤＮＡに対する野生型ｍｔＤＮＡの比が顕著に増加したと報告した（Ｔａｉｖａｓｓａｌｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ｓｈｉｆｔｉｎｇ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８，  １０４７−１０５２  （１９９９）．）。これらの結果は、変異型ｍｔＤＮＡを持たない衛星細胞が筋の成長や修復に関わるシグナルに反応して刺激され、細胞分裂を再開し既に存在している筋線維と融合することに依存している。
【０００７】
しかし、ＡｎｄｒｅｗｓらはｍｔＤＮＡの欠失を有する患者の眼瞼下垂を治療するためにブピバカインによって誘導される筋の再生を試みたが、治療された患者において、機能的回復を観察することはできなかった（Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｃｈｉｎｎｅｒｙ，  Ｐ．  Ｆ．  ＆  Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｓ−Ｓａｙｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｅｙｅ  １３，  ７６９−７７２  （１９９９）．）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、現在までのところ、ｍｔＤＮＡ変異を有する患者に対する有効な治療方法を提供するものはない。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、核外遺伝子を持つ細胞小器官内のＤＮＡを特異的に分解する融合蛋白質発現用組換えベクターを提供すること、及びその組換えベクターを用いて、非ヒト生物の核外遺伝子を分解する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討の結果、核外遺伝子を持つ細胞小器官への移行シグナルペプチドを規定する塩基配列と、所定の塩基配列を認識する制限酵素のアミノ酸配列を規定する塩基配列とを結合させた融合遺伝子を備えたことを特徴とする融合蛋白質発現用組換えベクターを開発し、基本的には本発明を完成するに至った。
上記のうち、「核外遺伝子を持つ細胞小器官」とは、ミトコンドリアおよびプラスチド等のように、核とは独立して分裂・増加する細胞内の小器官のことを言う。そのような細胞小器官は独自の核外遺伝子を持ち、独自の蛋白質を持っている。しかしながら、細胞小器官が持つ核外遺伝子には、その細胞小器官が必要とする蛋白質の全ての遺伝子が規定されているわけではなく、核遺伝子に規定されている蛋白質を必要とする。この核遺伝子に規定され、かつ核外遺伝子を持つ細胞小器官が必要とする蛋白質には、その細胞小器官への運搬がなされるように、「移行シグナルペプチド」が融合している。
そこで、ターゲットとなる「核外遺伝子を持つ細胞小器官」への「移行シグナルペプチド」を規定した塩基配列と制限酵素を規定する塩基配列とを融合させた融合蛋白質発現用組換えベクターを構築して、細胞内に遺伝子導入することにより、ターゲットである細胞小器官に、その融合蛋白質を移行させることが可能となる。
「移行シグナルペプチド」としては、例えば、酵母チトクローム酸化酵素の第４サブユニットの移行シグナルペプチド、ヒトチトクロームｃ酸化酵素のサブユニットＶＩＩＩ（Ｒｉｚｚｕｔｏ  Ｒ．，  Ｎａｋａｓｅ  Ｈ．，  Ｄａｒｒａｓ  Ｂ．，  Ｆｒａｎｃｋｅ  Ｕ．，  Ｆａｂｒｉｚｉ  Ｇ．Ｍ．，Ｍｅｎｇｅｌ  Ｔ．，  Ｗａｌｓｈ  Ｆ．，  Ｋａｄｅｎｂａｃｈ  Ｂ．，  ＤｉＭａｕｒｏ  Ｓ．，  Ｓｃｈｏｎ  Ｅ．Ａ．；”Ａ  ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＶＩＩＩ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１１  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ”；  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１０５９５−１０６００，１９８９．、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ；  Ｐ１０１７６；  ＣＯＸＲ＿ＨＵＭＡＮ．）の移行シグナルペプチド（配列番号１：ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫ）、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（Ｈｏｒｗｉｃｈ  Ａ．Ｌ．，  Ｆｅｎｔｏｎ  Ｗ．Ａ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．Ｒ．，  Ｋａｌｏｕｓｅｋ  Ｆ．，  Ｋｒａｕｓ  Ｊ．Ｐ．，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．，  Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ  Ｗ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｌ．Ｅ．；  ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｄｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ”；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１０６８−１０７４，１９８４．）の移行シグナルペプチド（配列番号２：ＭＬＦＮＬＲＩＬＬＮＮＡＡＦＲＮＧＨＮＦＭＶＲＮＦＲＣＧＱＰＬＱ）、ラットミトコンドリアオルニチントランスカルバミラーゼ（Ｋｒａｕｓ  Ｊ．Ｐ．，  Ｈｏｄｇｅｓ  Ｐ．Ｅ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｃ．Ｌ．，  Ｈｏｒｗｉｃｈ  Ａ．Ｌ．，  Ｋａｌｏｕｓｅｋ  Ｆ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．Ｒ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｌ．Ｅ．；”Ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ”；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：９４３−９５２（１９８５））の移行シグナルペプチド（配列番号３：ＭＬＳＮＬＲＩＬＬＮＫＡＡＬＲＫＡＨＴＳＭＶＲＮＦＲＹＧＫＰＶＱ）等が挙げられる。
また、上記移行シグナルペプチドを規定する塩基配列としては、チトクローム酸化酵素の第４サブユニットの移行シグナルペプチドを規定する塩基配列として例えば、（配列番号４：ＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＧＴＣＡＡＴＣＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡ  ＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴ）が、ヒトチトクロームｃ酸化酵素のサブユニットＶＩＩＩの移行シグナルペプチドを規定する塩基配列として、例えば（配列番号５：ａｔｇｔｃｃｇｔｃｃｔｇａｃｇｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇｃｔｔｇａｃａｇｇｃｔｃｇｇｃｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｇｔｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃａａｇ）が、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチドを規定する塩基配列として、例えば（配列番号６：ａｔｇｃｔｇｔｔｔａａｔｃｔｇａｇｇａｔｃｃｔｇｔｔａａａｃａａｔｇｃａｇｃｔｔｔｔａｇａａａｔｇｇｔｃａｃａａｃｔｔｃａｔｇｇｔｔｃｇａａａｔｔｔｔｃｇｇｔｇｔｇｇａｃａａｃｃａｃｔａｃａａ）が、ラットミトコンドリアオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチドを規定する塩基配列として、例えば（配列番号７：ａｔｇｃｔｇｔｃｔａａｔｔｔｇａｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｃａａｃａａｇｇｃａｇｃｔｃｔｔａｇａａａｇｇｃｔｃａｃａｃｔｔｃｃａｔｇｇｔｔｃｇａ  ａａｔｔｔｔｃｇｇｔａｔｇｇｇａａｇｃｃａｇｔｃｃａｇａａ）等が挙げられる。なお周知のように、一つのアミノ酸を規定する三つの塩基配列（トリプレット）には縮重があるので、上記の例のうち塩基配列で示されているものは、その塩基配列が規定するアミノ酸配列を規定する他の塩基配列を使用してもよい。
「制限酵素」としては、例えばＥｃｏＲＩ，  ＳｍａＩ，  ＳａｃＩ，  ＢｓｉＷＩ，  ＮｃｏＩ，  ＳｐｈＩ，  ＡａｔＩＩ，  ＢｇｌＩＩ，  ＨａｅＩＩ，  ＮａｅＩ，  ＸｈｏＩ等のように遺伝子及び、アミノ酸配列が決定されているものの中から任意に選択することができる。なお、上記の制限酵素は、マウスのミトコンドリアＤＮＡを一個所で切断するものとしての例示であり、この他にも、使用する生物および細胞小器官に含まれる核外遺伝子の塩基配列に応じて適宜選択することができる。
「融合蛋白質を導入するベクター」としては、特に限定はしないが、ベクターを導入する生物の細胞中において、融合蛋白質の遺伝子を発現させるプロモータを備えたものであればよい。例えば、発現用プラスミド、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、バキュロウイルス、または植物用ウイルスを使用することができる。
「非ヒト生物」においては、本発明の融合蛋白質発現用組換えベクターを遺伝子導入することにより、ターゲットとなる塩基配列を持つ核外遺伝子を特異的に分解することができる。このため、例えばミトコンドリア病の治療方法として用いる他、野生型ｍｔＤＮＡに含まれる塩基配列を認識する制限酵素を導入すると共に変異誘発剤を含有させた培地で培養細胞を培養することにより、その制限酵素が認識する部位に突然変異を持つ細胞株を創り出すこともできる。
【００１０】
Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇという点変異を持った変異型ｍｔＤＮＡでは、野生型ｍｔＤＮＡには存在しない塩基配列であるＣＣＣＧＧＧという配列が生じる。このため、この塩基配列を認識して切断する制限酵素（例えば、ＳｍａＩ）を用いることにより、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇを有するｍｔＤＮＡを選択的に分解できる可能性がある。そして、変異型ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとは、患者の細胞中で混在しており（ヘテロプラスミー）、変異型ｍｔＤＮＡのみが上記の制限酵素によって選択的に切断されるのに対し、野生型ｍｔＤＮＡはそのような制限酵素によって切断されないためである。
【００１１】
この目的のために、発明者は所定の制限酵素を規定する遺伝子と、ミトコンドリアへの移行シグナルを規定する塩基配列とを融合させた組換えベクターを構築し、この組換えベクターを変異型ｍｔＤＮＡを有するサイブリッド細胞株（Ｌｅｉｇｈ病患者の線維芽細胞のミトコンドリア（変異型ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとを共に有するミトコンドリア）を、ｍｔＤＮＡを有しない骨肉腫細胞株に細胞質融合によって導入した新規な細胞株）において一過性に発現させた。その結果、驚くべきことには、ミトコンドリアを標的とした制限酵素ＳｍａＩが、変異型ｍｔＤＮＡを特異的に排除することを見いだした。そして、変異型ｍｔＤＮＡの選択的な排除に続いて、野生型ｍｔＤＮＡが増殖し、結果としてミトコンドリア膜電位が正常化し、細胞内ＡＴＰレベルが回復した。
【００１２】
また、ミトコンドリアを標的とした制限酵素ＥｃｏＲＩを発現する組換えベクターを生体電気穿孔法によって、ハムスター骨格筋に遺伝子導入することによりチトクローム酸化酵素活性の低下を誘導できた。
このように制限酵素をミトコンドリアに送り込む手法及び、そのための組換えベクターは、ミトコンドリア病に対する遺伝子治療における新規の戦略である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本発明の技術的範囲は、以下の実施形態及び実施例によって、限定されるものではなく、様々に変形して実施することもできる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１４】
１．サイブリッド細胞株の確立
試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での組換えベクターの効果を確認するために、サイブリッド細胞株を確立する。このために、Ｌｅｉｇｈ病患者の線維芽細胞のミトコンドリアを、ｍｔＤＮＡを有しない骨肉腫細胞株（例えば、ρ０２０６）に細胞質融合によって導入する。この患者のミトコンドリアには、野生型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡとが共に含まれている。このため、サイブリッド細胞株のミトコンドリアもヘテロプラスミーの状態となっている。このようにして得られた細胞株として、例えばサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１、ＮＡＲＰ３−２がある。
【００１５】
このうち、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１では、野生型ｍｔＤＮＡの割合に比べ、変異型ｍｔＤＮＡの割合が高かった（約９８％）。また、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１のＡＴＰ含量は、野生型ｍｔＤＮＡのみを有する細胞株１４３ＢのＡＴＰ含量の７０％であった。サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１のミトコンドリア膜電位は、細胞株１４３Ｂよりも顕著に低かった（６９％）。このミトコンドリア膜電位の低値は、サイブリッド細胞株では、解糖系から供給されるＡＴＰがミトコンドリア膜電位の生成に利用できないためである。これは、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇ  の変異によって、ＦｏＦ１−ＡＴＰアーゼの第６サブユニット（ａサブユニットと同義である。）のアミノ酸置換Ｌｅｕ１５６Ａｒｇが起こり、この置換によって、プロトンチャンネルがブロックされているためである。
また、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−２では、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１に比べると、変異型ｍｔＤＮＡの比率が低かった。
【００１６】
２．組換えベクターの構築
制限酵素ＳｍａＩをミトコンドリアに送り届けるために、ＳｍａＩ遺伝子と、タンパク質のミトコンドリアへの移行を行わせるシグナルペプチド（チトクローム酸化酵素の第４サブユニットのシグナルペプチド）を規定する塩基配列とを融合し、図１に示したように、この融合遺伝子を哺乳類発現用ベクター（ｐＭＡＣＳＫｋＩＩ）に挿入することにより、組換えベクターを構築する。
【００１７】
３．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  試験系における組換えベクターの効果
（１）上記の組換えベクターをサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１に導入すると、制限酵素ＳｍａＩがシグナルペプチドによってミトコンドリアに移行され、そのＳｍａＩが働くことによって、変異型ｍｔＤＮＡが完全に排除され、痕跡程度の野生型ｍｔＤＮＡのみが検出される（図２中、Ｄａｙ  ２（遺伝子導入後、第２日））。
【００１８】
この段階では、組換えベクターを遺伝子導入されたサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１（遺伝子導入サイブリッド細胞株）の性質は、ρ０２０６細胞の性質に類似している。すなわち、遺伝子導入サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１は、低いミトコンドリア膜電位を示す（図３中、Ｄａｙ  ２）。これは野生型ｍｔＤＮＡの欠乏のためである。一方、変異型ｍｔＤＮＡの割合が低いサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−２に、組換えベクターの遺伝子導入を行った場合には、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１に遺伝子導入を行った時に観察されたミトコンドリア膜電位の一過性低下を経過せずに、膜電位の上昇が観察される（データ提示なし）。
【００１９】
変異型ｍｔＤＮＡの破壊の後に、野生型ｍｔＤＮＡが増殖するかどうかを調べるために、組換えベクターを遺伝子導入されたサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１の培養を３週間続けると、図２中Ｄａｙ  ２３（遺伝子導入後、第２３日）に示すように、野生型ｍｔＤＮＡは第２３日までに顕著に増殖する。この野生型ｍｔＤＮＡの増殖は、ミトコンドリア膜電位（図３中Ｄａｙ  ２１）と細胞のＡＴＰ含量（図４中Ｄａｙ  ２０）の正常化を伴う。
【００２０】
なお、制限酵素ＳｍａＩをコードする遺伝子とミトコンドリアへの移行を行わせるシグナルペプチドをコードする塩基配列とを融合させた融合遺伝子を挿入していない対照プラスミドｐＭＡＣＳＫｋＩＩとを用いて、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１に遺伝子導入した場合には、変異型／野生型ｍｔＤＮＡの割合、ＡＴＰレベル、ミトコンドリア膜電位に有意な変化は観察されない。
【００２１】
（２）次に、別の制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）が核ＤＮＡとｍｔＤＮＡに及ぼす影響を検討するために、制限酵素をコードする遺伝子とミトコンドリアへの移行を行わせるシグナルペプチドをコードする塩基配列とを融合させた融合タンパク質発現用組換えベクターを構築し、ミトコンドリアに導入する。
【００２２】
第１回目の遺伝子導入と選択のサイクルの後に、選択されたサイブリッド（図５中、記号＋で示されている細胞）、すなわち細胞表面のＨ−２Ｋｋ分子に対するモノクローナル抗体をコートされたマイクロビーズによって磁気カラムに保持された細胞は、選択されなかったサイブリッド（図５中、記号−で示されている細胞）と比較すると、ｍｔＤＮＡの量が減少している。つまり、制限酵素が働いて、ｍｔＤＮＡを切断している。
【００２３】
また、第２回目の遺伝子導入と選択のサイクルの後では、保持されたサイブリッド（＋）  と保持されなかった細胞（−）との両方の細胞でｍｔＤＮＡが枯渇していた。このことは第２回目の遺伝子導入の後にサイブリッドＮＡＲＰ３−２がρ０状態に転換されたことを示している。上記の試験においては、アポトーシス小体の出現あるいはＤＮＡラダーの形成のようなアポトーシスの兆候を検出できなかった。
【００２４】
これらの結果は、ミトコンドリアの中に運び込まれた制限酵素がミトコンドリアのマトリックス区画に安全に隔離され、少なくともここで使われた細胞培養条件下では、核ＤＮＡを攻撃しないことを示している。
【００２５】
興味深いことに、第１回の遺伝子導入と選択の後に制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断された中間段階のｍｔＤＮＡ断片は検出されず、ｍｔＤＮＡ量の低下のみが検出される（図５中、１ｓｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎの（＋）レーン）。この知見は切断されたｍｔＤＮＡの破壊がａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｎｅの過程（全て破壊されるか、あるいは全く破壊されないか）であることを示している。制限酵素によって切断されたｍｔＤＮＡ断片は、その一部はミトコンドリアに存在すると推定されているリガーゼによって修復される可能性もあるが、結局はミトコンドリア内のエクソヌクレアーゼによって消化されていると推定される。制限酵素によって切断されたｍｔＤＮＡは、ミトコンドリアゲノムに対する多様な酸化的損傷に抗してｍｔＤＮＡプールを無傷に保っている生理的過程の一部として、細胞から速やかに消滅していると推定される。
【００２６】
４．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  試験系における組換えベクターの効果
ミトコンドリアを標的とした制限酵素の一過性発現が生体への治療に安全に適用できるかどうかを検討するために、同じプラスミドを生体電気穿孔法によってハムスターの骨格筋に導入した場合の組換えベクターの効果を確認する。１回の注射と生体電気穿孔法の１ヶ月後に、ｐＣｏｘＩＶ−ＳｍａＩと共発現されたＬａｃＺ遺伝子の発現によってβガラクトシダーゼ活性を呈している筋線維（図６ａ）は、チトクロームｃ酸化酵素活性の低下を示す（図６ｂ）。ミトコンドリアを標的としたＳｍａＩあるいはＥｃｏＲＩを発現させるプラスミドＤＮＡ（組換えベクター）を生体電気穿孔法によってハムスターの骨格筋に導入した場合にも、核には変性所見は観察されなかった。
【００２７】
Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇ変異はＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅのプロトン輸送活性のみに影響を与えるので（例えば、Ｔｒｏｕｎｃｅ，  Ｉ．，  Ｎｅｉｌｌ，  Ｓ．  ＆  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｄ．  Ｃ．  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｔＤＮＡ  ｎｔ  ８９９３  Ｔ−−＞Ｇ  （ＡＴＰ６）  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｉｇｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎｔｏ  ｍｔＤＮＡ−ｌｅｓｓ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＡＤＰ／Ｏ  ｒａｔｉｏ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ８３３４−８３３８（１９９４）．，  Ｂａｒａｃｃａ，  Ａ．，  Ｂａｒｏｇｉ，  Ｓ．，  Ｃａｒｅｌｌｉ，  Ｖ．，  Ｌｅｎａｚ，  Ｇ．  ＆  Ｓｏｌａｉｎｉ，  Ｇ．  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｔ８９９３Ｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＡＴＰａｓｅ  ６  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５，  ４１７７−４１８２  （２０００）．，  Ｇａｒｃｉａ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｏｇｉｌｖｉｅ，  Ｉ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｂ．  Ｈ．  ＆  Ｃａｐａｌｄｉ，  Ｒ．  Ａ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ，  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔ８９９３Ｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｒｈｏ（０）  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍｔＤＮＡ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５，１１０７５−１１０８１  （２０００）．）、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１は呼吸鎖の異常を示さない。この呼吸鎖はミトコンドリア膜電位の形成に主要な役割を果たしているものである。サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１の場合には、遺伝子導入によって変異型ｍｔＤＮＡが急速に排除されるのに伴ってミトコンドリア膜電位が顕著に低下する。これとは対照的に、同じプラスミドを生体電気穿孔に用いた場合には、その効果はハムスターの骨格筋においては穏やかである。遺伝子導入の１ヶ月後にチトクロームｃ酸化酵素活性のわずかな低下を検出できたのみである。これはおそらく、骨格筋におけるこの酵素のサブユニットの代謝回転が緩徐であるためと推定される。
【００２８】
ここに提示した結果は、変異型ｍｔＤＮＡを特異的に認識する制限酵素をミトコンドリアに送り込むという手法が、ミトコンドリア病の遺伝子治療に向けた全く新しい戦略を提供するものであることを示している。この戦略の特長は、制限酵素の一過性発現によって変異型ｍｔＤＮＡの排除を十分に達成できる点である。ひとたび変異型ｍｔＤＮＡが排除されると、野生型ｍｔＤＮＡが細胞内の主要な集団となり、その結果ミトコンドリアゲノムが変異型から野生型に完全に転換される。
【００２９】
本発明者の試験により、培養サイブリッド細胞株とハムスター骨格筋との両者において、ミトコンドリアに運び込まれた外来性エクソヌクレアーゼが核ＤＮＡに毒性を示さないことを確認できる。この現象は、ミトコンドリアのマトリックスあるいは膜間腔に存在する内在性エクソヌクレアーゼあるいはプロテアーゼが、ある種の病的な条件下以外では核ＤＮＡあるいは細胞の蛋白質を攻撃しないという事実に関連しているであろう。
【００３０】
基礎生物学の観点から、ミトコンドリアの中に制限酵素を運び込むことは、ｍｔＤＮＡの修復や複製に関わる因子を同定するために有用な実験手段を提供することになろう。プラスチドもまた核外ＤＮＡ  を持っているので、本発明者はこの技法をクロロプラストＤＮＡの遺伝子操作に拡大適用することができる。
現在のところ、ある遺伝的異常を有する患者の全細胞に遺伝子を送り届けるための安全で効率の良い方法はない。殊に、ある遺伝子を脳に送り届けることは困難である。しかしながら、繰り返しプラスミドＤＮＡを注入し生体電気穿孔法を行えば、変異型ｍｔＤＮＡを骨格筋から排除することができ、これによって、高乳酸血症のような全身的代謝異常を改善することができると期待される。骨格筋における代謝の正常化によって神経症状が改善される可能性がある。また、局所的遺伝子治療は心筋症患者にも有用であるかもしれない（Ｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １２４，  １２６３−１２６９  （１９９２）．）。
【００３１】
【実施例】
次に、本発明者による実施例を説明する。
＜実施例１＞患者の線維芽細胞に由来するｍｔＤＮＡのヒトρ０細胞への導入
細胞株１４３Ｂ  （ＴＫ−）は、チミジンキナーゼを欠損したヒト骨肉腫細胞株であり、正常なｍｔＤＮＡ  を有している（ρ＋）（Ｋｉｎｇ，  Ｍ．  Ｐ．  ＆  Ａｔｔａｒｄｉ，  Ｇ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６４，  ３０４−３１３  （１９９６）．）。また、細胞株ρ０２０６  は、細胞株ρ＋１４３Ｂ  に由来するｍｔＤＮＡを欠如している細胞株であり、細胞株ρ＋１４３Ｂを長期にわたって低濃度の臭化エチジウムに暴露することによって得られたものである。
【００３２】
一方、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇ変異を有するＬｅｉｇｈ氏病の患者から皮膚線維芽細胞を得た後、線維芽細胞の脱核操作と脱核されたサイトプラストを上記の骨肉腫細胞由来の細胞株ρ０２０６に融合させる操作は既報（Ｋｉｎｇ，  Ｍ．  Ｐ．  ＆  Ａｔｔａｒｄｉ，  Ｇ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｏ０  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６４，  ３１３−３３４  （１９９６）．）に従って行った。
【００３３】
また、すべての細胞株の培養には、高濃度グルコース（４．５ｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ，  Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）  に１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ  ，  Ｆｉｌｔｒｏｎ社Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）  ならびに１００  μｇ／ｍｌのウリジンと  １１０  μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウムを添加したものを用いた。なお、この培地では呼吸機能を欠如したρ０細胞も生育できる。
この方法により、前述したサイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１及びＮＡＲＰ３−２を得た。
【００３４】
＜実施例２＞遺伝子導入用組換えベクター（組換えプラスミド）の構築
酵母のチトクロームｃ酸化酵素の第４サブユニットのプレシークエンス（ｐＣｏｘＩＶ）を規定するｃＤＮＡをプラスミドｐＡＫ１から増幅した。このｐＡＫ１は名古屋大学の遠藤斗志也教授から恵与されたものである。この増幅にはプライマーｅｃｏＲＩ−ｐＣｏｘＩＶ−Ｕ（配列番号８：５’−ｇｇａ  ｔｃｃ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  Ａ−３’）  および  ａｐａＩ−ｘｈｏＩ−ｐＣｏｘＩＶ−Ｌ  （配列番号９：５’−ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＡＡ−３’）を用いた。ＳｍａＩ遺伝子（Ｈｅｉｄｍａｎｎ，  Ｓ．，  Ｓｅｉｆｅｒｔ，  Ｗ．，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｃ．  ＆  Ｄｏｍｄｅｙ，  Ｈ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳｍａＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７，  ９７８３−９７９６  （１９８９）．）をセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から単離した総ＤＮＡからプライマーａｐａＩ−ｘｈｏＩ−ＳｍａＩ−Ｕ  （配列番号１０：５’−ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣＡＡＣ  ＴＣ−３’）  および  ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−Ｌ  （配列番号１１：５’−ｇｇａ  ｔｃｃ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＡＡ−３’）を用いて増幅した。ＥｃｏＲＩ遺伝子（塩基配列を配列番号１２に、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。Ｎａｉｔｏ，  Ｔ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｋ．  ＆  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｉ．  Ｓｅｌｆｉｓｈ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７，  ８９７−８９９  （１９９５）．）は東京大学小林一三教授から恵与されたものであり、これをプライマーａｐａＩ−ｘｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｕ  （配列番号１４：５’−ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＣＡ−３’）および  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｌ  （配列番号１５：５’−ｇｇａ  ｔｃｃ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡ−３’）を用いて増幅した。融合した遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）あるいはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。作成した融合遺伝子を最終的に哺乳類発現ベクターｐＭＡＣＳＫｋＩＩ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）  のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このベクターｐＭＡＣＳＫｋＩＩにおいて、挿入された遺伝子は、遺伝子導入された細胞を選択するためにマウスの短縮されたＭＨＣクラス  Ｉ  分子Ｈ−２Ｋｋとともに発現される。こうして、融合遺伝子を発現するプラスミドｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＳｍａＩおよびｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＥｃｏＲＩを構築した。
【００３５】
＜実施例３＞細胞株への遺伝子導入
遺伝子導入の前日に、骨肉腫由来細胞株１４３Ｂ、細胞株ＮＡＲＰ３−１、または細胞株ＮＡＲＰ３−２をトリプシン処理によって、それぞれ約２  ｘ  １０６個ずつ集め、直径１０  ｃｍの培養用デスポーザルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社３５３００３）に播種した。各細胞株は、１２ｍｌの１０％  胎児仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ  （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）  中で培養し、遺伝子導入の当日に９０％−９５％  コンフルエントの細胞密度（約４．５  ｘ  １０６個）になるように調整した。
【００３６】
次に、１枚のディッシュあたり、３０  μｇのプラスミドＤＮＡ  （ｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＥｃｏＲＩまたはｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＳｍａＩ）  を１．５  ｍｌの胎児血清を含まない液（ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ）に溶解し、１枚のディッシュあたり、３０μｌのＬＦ２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を１．５  ｍｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍに加え、５分間室温に置いた（３０分以内に使用した。）。
【００３７】
次に、希釈した  ＤＮＡ溶液と希釈したＬＦ２０００試薬を混合し、室温で２０分間放置し、ＤＮＡとＬＰ２０００試薬の複合体を形成させた（この状態において室温で少なくとも６時間は安定である。）。こうして形成されたＤＮＡとＬＰ２０００試薬の複合体（３  ｍｌ）を培養用ディッシュに直接加え、ディッシュを静かに揺り動かして混合した。なお、総液量は１５  ｍｌとなった。
【００３８】
次に、細胞をＣＯ２インキュベーターの中で３７℃で４８時間培養し、これを遺伝子導入された細胞の選択に供した。ＭＡＣＳｅｌｅｃｔキットに添付されているＦＩＴＣ標識抗Ｈ−２Ｋｋモノクロナル抗体を加えて観察すると、４０％−５０％の遺伝子導入効率が確認できた。
【００３９】
＜実施例４＞遺伝子導入された細胞の選択
遺伝子導入した細胞を４８時間培養した後、ディッシュから培地を除去し、ＥＤＴＡを含まないＴＤ溶液を用いて細胞を洗浄した。さらに、ＴＤ溶液を完全に除去した後、５００  μｌの０．０１％トリプシン溶液（１  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＴＤに溶解）をディッシュに加えた後、ディッシュを軽くたたき、細胞がディッシュから剥がれて、細胞同士が互いに離れるまで室温に置いた（約３分）。
【００４０】
次いで、１００  μｌの１００％  ＦＣＳをディッシュに加えトリプシン処理を停止させ、８０  μｌのＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  Ｋｋ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓをディッシュに加え、ディッシュを静かに揺り動かして細胞を分散させ、１５分間室温に置いた後、ＰＢＥを加え、最終溶液量を２  ｍｌにし、細胞を完全に懸濁し、単一細胞標品とした。
【００４１】
一方、ポジティブ選択カラムＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ＭＳ＋／ＲＳ＋を選び、カラムを磁気細胞分離装置ｍｉｎｉＭＡＣＳの磁界の中に置いた後、このカラムを５００  μｌのＰＢＥを用いて洗浄し準備した。次に、細胞を入念に再懸濁し、細胞懸濁液（一度に５００  μｌずつ）を準備したカラムに添加した。この操作により、遺伝子導入されていないネガティブ細胞はカラムを素通りする。
【００４２】
カラムを５００μｌのＰＢＥを用いて４回洗浄した後、カラムを分離装置からはずし、カラムを適当な分取用チューブの上に置き、カラムに１−２  ｍｌのＰＢＥを加え、カラムに添付されているプランジャーを用いて、遺伝子導入された細胞を勢いよく排出させた。
【００４３】
得られた細胞を遠心し、通常の培養液を加え、直径６  ｃｍのディッシュに播種し、培養した。なお、この時、細胞密度が高い方が細胞の生存がよい。また、翌日に９０％−９５％  コンフルエントとなるようにした。
なお、上記の遺伝子導入操作を繰り返す場合には、２枚の直径１０  ｃｍのディッシュで実験を開始し、遺伝子導入細胞を選択した後に、１枚の直径１０  ｃｍのディッシュに播種した。また、２回目の遺伝子導入細胞を選択した後に、直径６  ｃｍのディッシュに播種し、培養した。
【００４４】
［結果］
図５には、サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−２にｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＥｃｏＲＩを２回（第１回目を第１日に、第２回目を第３日に）遺伝子導入し、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔシステムを用いて２回（第１回目を第２日に、第２回目を第４日に）選択した結果を示した。総ＤＮＡをサイブリッド細胞株から抽出し、制限酵素ＡｆｌＩＩを用いて消化し、サザンブロット法によってｍｔＤＮＡを分析した。図中マイナス（−）記号を示したカラムは、遺伝子導入されなかったサイブリッド、すなわち磁性カラムを素通りした細胞を示し、プラス（＋）記号を示したカラムは、選択されたサイブリッド、すなわち抗Ｈ−２Ｋｋ抗体を付着させたマイクロビーズによって磁性カラムに結合した細胞を示す。第１回目の遺伝子導入後、カラムに結合したサイブリッドのｍｔＤＮＡの量（第１回目選択のレーン＋）は、カラムを素通りした画分のサイブリッド（第１回目選択のレーン−）よりも僅かに少なかった。第２回目の遺伝子導入後、素通り画分のサイブリッド（レーン−）と磁気カラムに結合したサイブリッド（レーン＋）のいずれもが、わずかに痕跡程度のｍｔＤＮＡを含んでいた。
【００４５】
＜実施例５＞サザンブロット解析
細胞から抽出した総ＤＮＡ（２−３μｇ）を制限酵素ＡｆｌＩＩまたはＳｍａＩによって消化した。切断されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移し、フルオレセイン−ｄＵＴＰでラベルしたヒトｍｔＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を洗浄し、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  Ｒａｎｄｏｍ−Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社，  Ｂａｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて製造者の指示に従って検出操作を行った。ＤＮＡ断片の化学発光をバイオイメージアナライザＦｕｊｉｘ  ＬＡＳ  １０００  （フジ写真フィルム，  東京）を用いて分析した。
【００４６】
［結果］
サイブリッド細胞株ＮＡＲＰ３−１にプラスミドｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＳｍａＩを導入し、遺伝子導入された細胞をＭＡＣＳｅｌｅｃｔシステムを用いて選択した。遺伝子導入と選択のサイクルを５回繰り返した。ＳｍａＩのミトコンドリアへの輸入前、２日後および２３日後にサイブリッドから総ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡサンプルをＡｆｌＩＩのみあるいはＡｆｌＩＩとＳｍａＩの両者を用いて消化し、サザンブロット分析に供した。図２中左側２レーン（Ｂｅｆｏｒｅ）に示すように、正常型ｍｔＤＮＡ（１６，５６９  塩基対）は制限酵素ＡｆｌＩＩによって直線化されるのに対して、Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇ変異を有する変異型ｍｔＤＮＡはＳｍａＩによってさらに２本の断片  （７５８６塩基対および  ８９８３塩基対）に切断された。
【００４７】
＜実施例６＞細胞のＡＴＰ含量の測定
ＡＴＰ  ｂｉｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  アッセイキット  ＨＳ  ＩＩ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とルミノメーターＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０１  （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社，  Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてそれぞれの製造者の指示に従って、細胞中のＡＴＰ含量を測定した。
【００４８】
［結果］
サイブリッドＮＡＲＰ３−１を５回の遺伝子導入と選択の後に３週間培養した。細胞の総蛋白質あたりのＡＴＰ含量を遺伝子導入前と、選択終了後１０日目および２０日目に測定した結果を図４に示した。遺伝子導入された細胞のＡＴＰ含量をコントロール１４３Ｂ細胞のＡＴＰ含量（平均８４  ｎｍｏｌ／ｍｇ  蛋白質）のパーセントとして表現した。３回の異なる測定結果の平均をその標準偏差とともに示した。
【００４９】
＜実施例７＞ミトコンドリア膜電位の測定
ミトコンドリアの膜電位をフローサイトメーターＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ  （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー法によって測定した。直径６０  ｍｍの培養ディッシュ上で生育している培養細胞を１００  ｎＭの陽電荷親油性色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）  を用いて測定した（Ｐｅｔｉｔ，  Ｐ．  Ｘ．，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｇｒｕｎｗａｌｄ，  Ｄ．＆  Ｂｒｏｗｎ，  Ｓ．  Ｃ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｒａｔ−  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ−ｌｉｖｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９４，  ３８９−３９７  （１９９０）．）。色素を添加して３７℃、３０  分間培養した後の測定値は、ミトコンドリア膜電位に依存する（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｊ．  Ｋ．，Ｎａｒａｙａｎａ，  Ｒ．  ＆  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  １１２４５−１１２５２  （１９９９）．、Ｆｉｎｕｃａｎｅ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｂｏｓｓｙ−Ｗｅｔｚｅｌ，  Ｅ．，  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｃｏｔｔｅｒ，  Ｔ．  Ｇ．  ＆  Ｇｒｅｅｎ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｂａｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔａｂｌｅ  ｂｙ  Ｂｃｌ−ｘＬ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２２２５−２２３３  （１９９９）．）。色素で染めた後、サイブリッド細胞株を洗浄し、トリプシン処理によって回収し、フローサイトメトリーに供した。
【００５０】
［結果］
ミトコンドリア膜電位をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓを用いてフローサイトメトリーにより測定した。１０４個のサイブリッドの平均蛍光強度を決定した。遺伝子導入されたＮＡＲＰ３−１細胞のミトコンドリア膜電位を、対象細胞株１４３Ｂの蛍光強度（任意の単位で１１０−１３８）のパーセントとして表現した。３回の異なる測定結果の平均をその標準偏差とともに示した。
【００５１】
＜実施例８＞ミトコンドリアを標的としたＥｃｏＲＩを発現するプラスミドの生体電気穿孔法による遺伝子導入
発現プラスミドｐＭＡＣＳＫｋＩＩ−ｐＣｏｘＩＶ−ＥｃｏＲＩ  （１５μｇ）をレポータープラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＬａｃＺ  （１５μｇ）と共に、全身麻酔下に３．５週齢のハムスターの前脛骨筋に注射した。ＢＥＸ社  （東京）のＣＵＹ６４５ハンマーヘッド型電極（３  ｘ  ５  ｍｍ）およびパルス発生器ＣＵＹ２１を用いて電気パルス（電圧６０  Ｖ，  電流０．０２−０．０４  Ａ，  電極間距離  ６  ｍｍ，  ６回）を与えた。筋組織を生体電気穿孔の１ヶ月後に取り出し、凍結切片（厚さ８μｍ）を作成した。組織切片に対してβ−ガラクトシダーゼあるいはチトクロームｃ酸化酵素の活性染色を行った。
【００５２】
［結果］
図６には、組織切片についてβ−ガラクトシダーゼ活性染色（図６ａ）あるいはチトクロームｃ酸化酵素活性染色（図６ｂ）を行ったときの結果を示した。図中、星印（★）はチトクロームｃ酸化酵素活性減少を示しているβ−ガラクトシダーゼ活性陽性の筋線維を示す。このように、遺伝子導入の１ヶ月後にチトクロームｃ酸化酵素活性のわずかな低下を検出できたのみであった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の組換えベクターによれば、ｍｔＤＮＡ中に生じた変異を特異的に認識して、変異型ｍｔＤＮＡのみを選択的に破壊することが可能となるので、核ＤＮＡへの影響が少なく（すなわち、副作用が少なく）、かつミトコンドリア病を根治できる遺伝子治療法を提供することが可能となる。
【００５４】
【配列表】
0003561233.tif 000002
0003561233.tif 000003
0003561233.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍｔ８９９３Ｔ→Ｇ変異によって惹起されるＮＡＲＰ病に対する遺伝子治療の概略を示す図
【図２】ミトコンドリアへＳｍａＩを輸入した後の変異型ｍｔＤＮＡ（Ｍｕｔａｎｔ  ｍｔ  ＤＮＡ）の排除と野生型ｍｔＤＮＡ（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｍｔ  ＤＮＡ）の再増殖とを示すためのサザンブロットの写真
【図３】変異型ｍｔＤＮＡ排除後における野生型ｍｔＤＮＡの再増殖によるミトコンドリア膜電位の正常化を示すグラフ
【図４】変異型ｍｔＤＮＡの排除後のＡＴＰ含量の正常化の様子を示すグラフ
【図５】ミトコンドリアを標的としたＥｃｏＲＩによる総ｍｔＤＮＡの枯渇の様子を示すサザンブロットの写真
【図６】ミトコンドリアを標的とするＥｃｏＲＩを発現するプラスミドを生体電気穿孔法によって遺伝子導入した後におけるチトクロームｃ酸化酵素活性の減少を示す顕微鏡写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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