(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のフィブリンモノマーを測定する方法であって、フィブリンモノマーで感作されたラテックス粒子と試料とを反応させ、光学的変化を測定することからなるフィブリンモノマーの測定法。
【請求項２】
光学的変化の測定が吸光度の増加、透過率の減少又は散乱光の増加を測定する方法であり、測定値に基づいて試料中のフィブリンモノマー濃度を測定する請求項１記載のフィブリンモノマーの測定法。
【請求項３】
単位時間当りの光学的変化量を測定する方法である請求項２記載のフィブリンモノマーの測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はフィブリンモノマーの測定法に関し、より詳細には、臨床検査などの分野で利用され、生体試料中のフィブリンモノマーを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内血液中でなんらかの原因により血液凝固が開始すると血液中にトロンビンが生成される。このトロンビンの作用によりフィブリノゲンが分解されてフィブリンモノマー（以下、ＦＭという）が形成される。ＦＭは、互いのＮ末端部とＣ末端部が重合してフィブリンポリマーとなり、さらに活性型ＸＩＩＩ因子とカルシウムイオンの存在下で架橋し安定化フィブリンへと変換される。ＦＭは、正常な場合には局所で止血栓を形成し止血を行うのに利用されるが、凝固の活性化が持続すると、ＦＭは全身を循環して各種臓器の微小血管で血栓形成をもたらし、播種性血管内凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）などへと進行する。
このように、血液中でＦＭが検出されることは、血液中でのトロンビン生成を示唆することとなり、ＦＭの検査は、臨床的には、ＤＩＣや各種血栓性疾患における凝固亢進状態の凝固学的スクリーニング指標として重要である。
【０００３】
このようなＦＭの測定法としては、下記のような方法が知られている。
エタノールゲル化法又は硫酸プロタミン試験法：この方法は、試料中のＦＭ（より具体的には可溶性フィブリンモノマー複合体）をエタノール又は硫酸プロタミンによりゲル化させる方法であるが、いずれも定性試験法であり、ＦＭの定量を行うことはできない。また、感度が低く、陰性・陽性の判定が難しく、特異性に欠けるという問題がある。
ＦＭ固定化赤血球凝集法：この方法は、ＦＭを固定化した赤血球を用い、これと試料を反応させ、試料中のＦＭにより赤血球を凝集させる方法である。この方法は上記方法と同様に定性試験法であり、また感度が不十分であるという問題がある。
放射標識法：この方法は、因子ＸＩＩＩを用いて、１４Ｃ−グリシンエステルをＦＭに導入し、その放射能を測定する方法である。この方法は高感度であるが、放射性物質を用いるため、取扱いの安全性に問題があり、また特別な装置・設備を必要とする。
合成基質法：この方法は、試料に、組織プラスミノゲンアクチベータ、プラスミノゲン及び色原性の合成基質を添加し、発色を測定する方法である（特公平４−１４７５０号公報参照）。この方法では、試料中のプラスミノゲンインヒビターが反応を妨害するので、事前にプラスミノゲンインヒビターを除去する操作が必要である。そのため、操作が煩雑であるとともに自動分析装置による測定に適さない。
疎水性ラテックス懸濁法：この方法は、試料と疎水性ラテックスをインキュベートし、凝集反応を測定する方法である（特公昭６３−６０８６２号公報参照）。この方法は簡便であるが、反応特異性に欠けるので測定精度が劣るという問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ＦＭの測定法としては種々の方法が知られているが、これらの方法は、操作が煩雑であったり、特別な装置・設備を必要としたり、またＦＭの定量を行うことができないなどの問題がある。
本発明は上記の問題に鑑みて本発明者らがＦＭの測定法、特に自動分析に適した定量法を種々検討した結果、極めて簡便にして短時間でＦＭを測定することができる方法を見出して完成したものである。即ち、本発明は、ＦＭを簡易な操作で迅速に測定することができる方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明のＦＭの測定法は、ＦＭで感作された担体粒子（以下、ＦＭ感作担体粒子という）と試料とを反応させ、光学的変化を測定することからなる。
なお、ＦＭは、フィブリノゲン、フィブリノゲン分解産物、フィブロネクチンなどとの親和性が強く、血液中において、これらと複合化して可溶性フィブリンモノマー複合体（以下、ＳＦＭＣという）を形成すること及びＳＦＭＣはＦＭと同様な生理学的挙動をすることが知られている。本発明において、ＳＦＭＣはＦＭと同様な凝集反応性を示すので、本発明において測定されるＦＭにはＳＦＭＣも包含される。
【０００６】
本発明において、担体粒子としてはラテックス粒子（ラテックス懸濁液）が使用される。当該担体の粒径としては０．０５〜１．５μ程度、好ましくは０．１〜１μ程度、より好ましくは０．２〜０．８μ程度のものが使用される。特に好適な担体粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス、ポリメタクリル酸ラテックス、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体ラテックスなどが挙げられ、更に好適にはポリスチレンラテックスが用いられる。
本発明においては、上記の担体粒子はＦＭで感作されている。ＦＭは常法に準じてフィブリノゲンにトロンビンを作用させることにより調製することができる（例えば、Ｂｌｏｏｄ  Ｖｏｌ．４７，  ｐ９９１−１００２，  １９７６、臨床血液第１９巻第３３１−３３７頁１９７８年など参照）。
【０００７】
ＦＭによる担体粒子の感作は、吸着法、化学結合法などの常法に準じて行うことができ、例えば、担体粒子とＦＭとを水又は適当な緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液など）中でインキュベートすることにより行うことができる。インキュベーション温度は特に限定されないが、０〜３０℃程度、好ましくは４〜２５℃程度で行われる。インキュベーション時間は、インキュベーション温度に応じて適宜調整されるが、０．５〜３６時間程度、通常１〜２４時間程度である。
担体粒子上へのＦＭの感作量は特に限定されず、使用される条件などにより適宜調整することができるが、通常、担体粒子に対して０．０５〜０．５重量％程度とされる。
【０００８】
本発明の方法は、上記のＦＭ感作担体粒子と試料とを混合し、担体粒子上のＦＭと試料中のＦＭとの反応により担体粒子の凝集を生じさせ、この凝集による光学的変化を測定することに行われる。
ＦＭ感作担体粒子と試料との反応は適当な緩衝液中で行われ、緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液などが例示される。反応液の液性としては、ｐＨ４〜９程度、好ましくはｐＨ５〜７程度とされる。反応温度としては、０〜５０℃程度、好ましくは室温〜４０℃程度にて実施される。反応は１０分間以内、通常５分間以内に終了する。
反応系におけるＦＭ感作担体粒子の濃度としては、０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．２〜０．６ｍｇ／ｍｌ程度とされる。
【０００９】
光学的変化の測定は、定性試験においては凝集を目視などの手段により観察することにより行われる。定量試験においては、反応系に４００〜１４００ｎｍ程度、好ましくは５００〜１０００ｎｍ程度の波長の光を照射し、ＦＭ感作担体粒子の凝集による光学的変化（例えば、吸光度の増加、透過率の減少、散乱光の増加など）を測定することにより行われる。かかる測定は、分光光度計、濁度計、比ロウ計などを用いる慣用の方法にて行うことができる。測定は、一定時間反応後の光学的変化量の測定、光学的変化量が一定値に達するまで時間の測定、単位時間当りの光学的変化量の測定（即ち、反応速度の測定）などにより行われる。特に、反応速度の測定による方法は、迅速且つ簡便であり、対照を要しない点で好適である。なお、測定法は上記の方法に限定されるものではなく、例えば、凝集粒子数を光学的に測定する方法などでもよい。
より具体的に例をもって説明すると、本発明の測定法によりＦＭの定量を行うに際して、まずＦＭ濃度既知の標準試料を用いてＦＭ感作担体粒子と反応させ、その光学的変化を測定し、当該測定値とＦＭ濃度との関係を示す標準曲線を作成する。次いで、ＦＭ濃度未知の試料について、上記標準曲線を作成したときと実質的に同様な条件でＦＭ感作担体粒子と反応させて光学的変化を測定し、その値を標準曲線と比較することにより、試料中のＦＭ濃度を定量することができる。また、本発明の方法は、前述のように、ＦＭ感作担体粒子と試料とを反応させて凝集の有無を目視などの手段で観察する定性法、ＦＭ濃度既知の希釈列の凝集と対比する半定量法にも応用することができる。
測定試料としては、血清、血漿、血液などが挙げられる。
【００１０】
【発明の効果】
本発明の方法においては、簡単な操作で短時間にＦＭを測定することができ、しかも試料の前処理を要しないなどの利点を有するので、自動分析に好適な方法である。さらに、担体粒子としてＦＭで感作された担体粒子が用いられており、非特異的反応を抑制することができるので、測定精度の向上を図ることができる。従って、本発明の方法によれば、ＦＭを簡便且つ高精度で測定することができるという効果を奏する。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
▲１▼ＦＭの調製
ＦＭは、ヒトフィブリノゲンよりＬａｒｇｏらの方法（Ｂｌｏｏｄ，  Ｖｏｌ．４７，  ｐ９９１−１００２，  １９７６）に準じて調製したものを用いた。
▲２▼ＦＭ感作ラテックスの調製
上記で調製したＦＭ［１〜４００μｇ／ｍｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］とポリスチレンラテックス［粒径０．１〜０．２μ、ラテックス濃度：１０重量％、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］とを１：１の容量比で混合し、室温で１〜５時間又は低温室で一昼夜感作させた。次いで、上記緩衝液で洗浄した後、トリス緩衝液に分散させてＦＭ感作ラテックスを得た。
▲３▼ＦＭの測定
ＦＭ含有標準試料［ＦＭ濃度：１００μｇ／ｍｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１０μｌと上記ＦＭ感作ラテックス［ラテックス濃度：５ｍｇ／ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）］１０μｌを混合し、３７℃でインキュベートし、波長７００ｎｍの吸光度変化を経時的に測定した。なお、比較例として、ＦＭを含有しない試料を用いて同様な試験を行った。その結果を図１に示す。
図１に示されるように、ＦＭを含有しない試料においては吸光度の変化は認められない。それに対し、ＦＭ含有標準試料においては経時的に吸光度の増加が観察され、試料中のＦＭによりラテックス粒子の凝集が生じていることが認められた。
【００１２】
実施例２
ＦＭ含有標準試料［ＦＭ濃度：０〜１００μｇ／ｍｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１０μｌと上記ＦＭ感作ラテックス［ラテックス濃度：５ｍｇ／ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）］１０μｌを混合し、３７℃でインキュベートし、波長７００ｎｍの吸光度変化を経時的に測定し、一定時間（２．５分）当りの吸光度変化量とＦＭ濃度との関係を求めた。なお、比較例として、ＦＭ非感作ラテックスを用いて、同様な試験を行った。その結果を表１に示す。
表１に示されるように、非感作ラテックスを用いる方法（比較例）においては、ＦＭ濃度の上昇に伴い、むしろ吸光度の減少が認められる。それに対し、ＦＭ感作ラテックスを用いる本発明の方法においては、ＦＭ濃度の上昇に伴い、吸光度の増加が認められた。このことから、本発明の方法によれば、ＦＭを定量できることが判明した。
【００１３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法によりＦＭ含有試料及びＦＭ非含有試料を測定したときの吸光度変化を示す図である。
【図１】
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