(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
π共役結合を有するポリマーを溶媒に溶かし、流動性を付与した後、基板上に該ポリマーの被膜を形成させる工程、該被膜上にＤＮＡ溶液を滴下する工程、及び滴下したＤＮＡ溶液を該被膜上に拡げる工程を含むＤＮＡ計測用基板の作製方法。
【請求項２】
π共役結合を有するポリマーが、ポリフェナザシリン、ポリビニルカルバゾール、又は、ポリエチレンジオキシチオフェンとポリスチレンスルホン酸の混合物である請求項１記載のＤＮＡ計測用基板の作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された方法によって作製されたＤＮＡ計測用基板。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ計測用基板の作製方法に関するものである。この方法によって作製されたＤＮＡ計測用基板は、表面の平坦性、ＤＮＡ吸着性、ＤＮＡ伸張性が高いため、この基板を用いることにより鮮明かつ大量のＤＮＡ像を得ることができる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ法においては、様々な標的遺伝子断片を有するＤＮＡをその種類ごとに基板上に吸着させておき、検査対象物の抽出液を基板上に展開することにより、標的遺伝子ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの有無を検出することができる。また、上記方法では結合状態のＤＮＡについて０．５μｍ程度の分解能を有する蛍光顕微鏡により検出している。一方、微細な探針先端と観察対象物との力学的、電磁気学的、もしくは化学的相互作用を利用して１ｎｍ以下の分解能を実現した走査型プローブ顕微鏡を用いることにより、標的遺伝子ＤＮＡの結合部位を高分解能で検出することができる。この顕微鏡を利用するために、ＤＮＡ観察用の平坦な面を有する基板としてマイカの劈開面を利用している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
標的遺伝子ＤＮＡの結合などの変化を高感度で計測するためには、基板に配置するＤＮＡが重ならないように伸張・整列させることが重要である。ＤＮＡを基板上に伸張・整列させる方法としては、例えば、特表平９−５０９０５７号公報記載の方法が知られている。しかし、この方法ではＤＮＡの一端のみを固定する方法を採用しているため、ＤＮＡが無秩序に絡み合い、重なり合ったＤＮＡ像しか観察できない。
【０００４】
また、微細な探針先端と観察対象物との力学的、電磁気学的、もしくは化学的相互作用を利用して１ｎｍ以下の分解能を実現する走査型プローブ顕微鏡を用いて、標的遺伝子ＤＮＡの結合部位を高分解能で検出するためには、凹凸が１ｎｍ以下の高度の平坦さを有する基板の作製が必要であるが、マイカの劈開面の利用以外に手段が存在しない。
【０００５】
さらに、高度に平坦な表面を、ポリマーで被覆することにより実現するためにはポリマー溶液の流動性が重要であり、ポリマーが可溶性であることが必要である。
【０００６】
この発明は、前述したような当該技術の有していた課題を解決して、かつ従来技術の欠点を克服した新規なＤＮＡ計測用基板の作製方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＤＮＡ計測用基板の表面を、溶媒に可溶でπ共役結合を有するポリマーで覆うことにより、凹凸のある基板表面を高度に平坦な表面に作り変えることができ、また、計測しようとするＤＮＡの吸着性と伸張性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、基板上に溶媒に可溶なポリマーの被膜を形成させる工程、該被膜上にＤＮＡ溶液を滴下する工程、及び滴下したＤＮＡ溶液を該被膜上に拡げる工程を含むＤＮＡ計測用基板の作製方法である。
【０００９】
また、本発明は、基板上にπ共役結合を有するポリマーの被膜を形成させる工程、該被膜上にＤＮＡ溶液を滴下する工程、及び滴下したＤＮＡ溶液を該被膜上に拡げる工程を含むＤＮＡ計測用基板の作製方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むＤＮＡ計測用基板の作製方法である。
【００１２】
工程（１）では、基板上に、溶媒に可溶なポリマー又はπ共役結合を有するポリマーの被膜を形成させる。溶媒に可溶なポリマーの場合、溶媒に溶かすことによりポリマーに流動性を付与することができるので、基板上に高度に平坦な表面を作り出すことができる。溶媒に可溶なポリマーとしては、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネートなどを挙げることができる。π共役結合を有する化合物とそれらポリマーは、ＤＮＡに対す特異的な相互作用が報告されており、このようなポリマーで基板を被覆することにより、ＤＮＡの固定が期待できる。π共役結合を有するポリマーとしては、例えば、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンなどを挙げることができるが、これらポリマーは溶媒に不溶である。ポリフェナザシリン（式（Ｉ））及びポリビニルカルバゾール（式（ＩＩ））は、一般的な有機溶媒（クロロホルム、テトラヒドロフラン、１，２−ジクロロエタン）に可溶で、なおかつπ共有結合を有する。従って、これらのポリマーを用いることにより、基板表面の平坦性、ＤＮＡ吸着性、及びＤＮＡ伸張性を高めることができる。ポリエチレンジオキシチオフェン（式（ＩＩＩ））やポリスチレンスルホン酸（式（ＩＶ））は水溶性のπ共役ポリマーであり、これらのポリマーの混合物を用いることで有害な有機溶媒を用いることなくガラス上へのコートが可能であり、ＤＮＡの固定と伸張を行うこともできる。
【００１３】
なお、本発明において使用するポリフェナザシリン、ポリビニルカルバゾール、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリスチレンスルホン酸は、それぞれ以下の式で表される。
【００１４】
【化１】
0003548803.tif 000002
一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、アリール基、アルコキシ基またはアリーロキシ基である。
【００１５】
上記のＲ１−Ｒ３におけるアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−またはｉｓｏ−プロピル、ｎ−、ｉｓｏ−またはｔｅｒｔ−プチル、ｎ−、ｉｓｏ−またはｎｅｏ−ペンチル、ｎ−へキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等の直鎖、分岐、環状の炭素数１〜２０、好ましくはｌ〜１０のアルキル基が挙げられる。また、アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−またはｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−、ｉｓｏ−またはｔｅｒｔ−プトキシ、ｎ−、ｉｓｏ−またはｎｅｏ−ペントキシ、ｎ−へキソキシ、シクロヘキシソキシ、ｎ−ヘプトキシ、ｎ−オクトキシ等の直鎖、分岐、環状の炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のアルコキシ基が挙げられる。また、アリール基としては、フェニル基、ｏ−、ｍ−、ｐ−トリル基、１−および２−ナフチル基、アントリル基等の炭素数６〜２０、好ましくは６〜１４のアリール基が挙げられる。アリーロキシ基としては、フェノキシ基、ｏ−、ｍ−、ｐ−トリロキシ基、１−および２−ナフトキシ基、アントロキシ基等の炭素数６〜２０、好ましくは６〜１４のアリーロキシ基が挙げられる。
【００１６】
【化２】
0003548803.tif 000003
一般式（ＩＩ）において、Ｃｚはカルバゾイル基を示す。
【００１７】
上記のＣｚにおけるカルバゾイル基は、１−カルバゾイル、２−カルバゾイル、３−カルバゾイル、４−カルバゾイル、９−カルバゾイル基があげられる。また、カルバゾイル基は置換されていてもよい。
【００１８】
【化３】
0003548803.tif 000004
【００１９】
【化４】
0003548803.tif 000005
ポリマーの被膜の形成は、どのような方法で行ってもよく、例えば、回転可能な台上に置いた基板の上に、ポリマー溶液（溶媒として１，２−ジクロロエタン、濃度２ｇ／ｌ）を５０μｌ滴下し、基板を回転させ、それによって生じる遠心力によりポリマーを基板上に拡張させ、その後、溶媒を乾燥させることにより、被膜を形成させることができる。
【００２０】
工程（２）では、被膜上にＤＮＡ水溶液を滴下する。
【００２１】
ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ濃度は特に限定されないが、５．２×１０−３μｇ／μｌぐらいが適当である。滴下するＤＮＡの量も特に限定されないが、５μｌぐらいが適当である。
【００２２】
工程（３）では、滴下したＤＮＡ溶液を該被膜上に拡げる。ＤＮＡ溶液を被膜上に拡げる方法は特に限定されず、人為的手段によって拡げてもよいし、また、ＤＮＡ溶液の自然な流動により拡げてもよい。被膜上に拡がった溶液中に含まれるＤＮＡは、気液界面移動法（特表平９−５０９０５７号公報）の原理により被膜表面上に伸張された状態で固定される。
【００２３】
以上の方法によって作製されるＤＮＡ計測用基板は、ＤＮＡ計測のための種々の用途に用いられるが、その表面の平坦性から、特に走査型プローブ顕微鏡を用いてＤＮＡの結合部位を検出する場合に用いるのが好ましい。
【００２４】
以下に本発明の方法の一態様を図１を用いて説明する。
【００２５】
図１において、１はポリマー溶液、２は被覆対象基板、３は基板回転台、４はポリマー被覆部、５はＤＮＡ溶液、６は伸張したＤＮＡをそれぞれ表す。
【００２６】
最初に清浄な状態のカバーガラス２を高速回転可能な回転台３上に固定し、回転台を回転させた状態で被覆剤であるポリマー溶液１を滴下することにより、遠心力でポリマー溶液はガラス上に薄く展開される。溶媒を乾燥させることによりポリマー被覆部４が形成され、ＤＮＡ溶液５を該被覆部に５μｌ滴下し、自然な流動で展開させた後にＤＮＡ溶液を除去し、伸張・固定されたＤＮＡ６を得ることができる。
【００２７】
以上の操作により、十分に伸張した状態のＤＮＡが基板上に多数吸着したガラス基板を得ることができる。
【００２８】
【実施例】
１０ｍｇのポリフェナザシリン（一般式（Ｉ）、Ｒ１およびＲ２＝ｎ−オクチル、Ｒ３＝メチル）そしてポリビニルカルバゾール（一般式（ＩＩ）、Ｃｚ＝９−カルバゾイル）を、５ｍｌの１，２−ジクロエタンに溶解させ、それぞれ濃度２ｇ／ｌのポリフェナザシリン溶液とポリビニルカルバゾール溶液を調製した。各々の溶液５０μｌをカバーガラス表面に滴下し、展開・乾燥させ、カバーガラスの表面の被覆を行なった。
【００２９】
蛍光色素ラベルしたλファージＤＮＡ溶液（濃度５．２×１０−４μｇ／μｌ）５μｌを、カバーガラス上のポリフェナザシリンまたはポリビニルカルバゾールで被覆した部分に滴下し、自然な流動で展開させ、溶液中のλファージＤＮＡを固定させた。また、比較のため、ポリフェナザシリンやポリビニルカルバゾールで被覆していないカバーガラスにも、λファージＤＮＡ溶液を滴下し、ＤＮＡの固定を行った。蛍光観察を行った結果、図２のように被覆されていないカバーガラス上では凝集した状態にあるＤＮＡが多数存在し、伸張・固定が十分でないのに対して、ポリフェナザシリン又はポリビニルカルバゾールにより被覆されたガラス表面においては、図３ならびに図４のように直線性の高い状態で伸張したＤＮＡが多数得られることが確認された。
【００３０】
また、微細な探針先端と観察対象物との力学的相互作用を利用して観察する走査型応プローブ顕微鏡（オリンパス光学製、ＮＶＢ１００）を用いて、ポリマーコートしたガラス基板表面の凹凸を比較した結果、図５のように被覆のないガラス上では約２５ｎｍの凹凸が存在しているのに対して、図６のようにポリビニルカルバゾールで被覆したガラス上では基板表面にあった凹凸がポリマーに覆われて平坦になっていることが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のＤＮＡ計測用基板の作製方法によれば、溶媒に可溶なポリマーで基板表面を覆うことにより、凹凸のある基板表面を高度に平坦な表面を作り変えることができ、また、π共役結合を有するポリマーで基板表面を覆うことにより、基板表面におけるＤＮＡの吸着性や伸張性を高めて、効率よく計測対象のＤＮＡを伸張・整列させることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】基板のポリマー被覆並びに該被覆部のへのＤＮＡ伸張固定に関する方法の流れ図。
【図２】ポリマー被覆のないガラス基板に固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真。
【図３】ポリビニルカルバゾールで被覆したガラス基板に固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真。
【図４】ポリフェナザシリンで被覆したガラス基板に固定したＤＮＡの蛍光顕微鏡写真。
【図５】ポリマーで被覆していないガラス基板表面の走査型プローブ顕微鏡による凹凸計測結果を示す図。
【図６】ポリビニルカルバゾールで被覆したガラス基板表面の走査型プローブ顕微鏡による凹凸計測結果を示す図。
【符号の説明】
１  ポリマー溶液
２  被覆対象基板
３  基板回転台
４  ポリマー被覆部
５  ＤＮＡ溶液
６  伸張したＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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