(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成からなる飛行時間型質量分析計：
ａ）液体、若しくは固体試料からなるイオン源を供給する試料保持器
ｂ）イオン源をイオン化して試料イオンを形成するイオン化器
ｃ）試料イオンにエネルギーを課す第１の電場、この第１の電場は予め選択された非周期的、非ゼロの電場である、を調節可能な状態で発生させる手段
ｄ）試料イオンを抽出するための第２の電場、この第２の電場は前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場とは異なる電場である、を前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場の発生に次いで発生させる手段、及び
ｅ）イオン源が試料イオンを形成するイオン化に引き続いて予め決められた時間の後で第２の電場が発生するようにするため前記第２の電場の発生を遅延させる手段。
【請求項２】
前記予め選択された非周期的、非ゼロの電場である第１の電場を調節可能な状態で発生させる手段及び前記第２の電場を発生させる手段が；
ａ）試料保持器から空間的に離れている第１素子；及び
ｂ）ｉ）第１素子と試料保持器の電位が独立して変化でき、第１素子と試料保持器のいずれにもイオン抽出前に、前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場を形成するため第１の可変の電位をかけ、そして
ii）第１素子と試料保持器の電位が独立して変化でき、第１素子と試料保持器のいずれにもイオン抽出のために、前記第２の電場を形成するため第２の可変の電位をかける、
ように第１素子と試料保持器に電気的に接続されている電源、
とからなる請求項１記載の質量分析計。
【請求項３】
イオン抽出前に遅延した電場を確立するように電源を調節するための手段を含む請求項２記載の質量分析計。
【請求項４】
第１素子の電位を試料保持器の電位と比較して、イオン抽出前に陽イオンを測定するときはより陽性に、つまりより高電位に、陰イオンを測定するときはより陰性に、つまりより低電位にセットするように電源を調節するための手段をさらに含む請求項２記載の質量分析計。
【請求項５】
試料イオンを加速するために、電場を発生させる第１素子とは空間的に離れている第２素子をさらに含む請求項２記載の質量分析計。
【請求項６】
第１素子から空間的に離れているイオン反射器をさらに含む請求項２または５記載の質量分析計。
【請求項７】
イオン化器がパルス状エネルギーを発生するレーザーである請求項１記載の質量分析計。
【請求項８】
前記第１の非ゼロの電場を調節可能な状態で発生させる手段及び前記第２の電場を発生させる手段が以下の構成からなる請求項７記載の質量分析計：
ａ）試料保持器から空間的に離れている第１素子
ｂ）第１素子から空間的に離れている第２素子；そして
ｃ）パルス状エネルギーに反応し、第１素子、第２素子、及び試料保持器の各々に電位をかけるために第１素子、第２素子、及び試料保持器に電気的に接続された電源、ここで
ｉ）第１素子と試料保持器の間の電位差が前記予め選択された非周期的、非ゼロの第１の電場を特定し、
ii）第１素子と試料保持器の電位はイオン抽出前に独立して可変である、
iii）第１素子及び試料保持器の電位が予め決められた時間にイオン抽出を開始し、そして第２素子と第１素子との間の電位差が試料イオンを加速する。
【請求項９】
第１素子の電位を試料保持器の電位と比較して、イオン抽出前に陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセットするために電源を調節するための手段をさらに含む請求項８記載の質量分析計。
【請求項１０】
前記電源の高電圧下、高速で作動するスイッチの制動器の入力部に操作的に接続されており、パルス状エネルギー出力に応答する遅延発生器をさらに含み、前記遅延発生器が前記スイッチをパルス状エネルギーに合わせて操作する制動記信号を発生させる請求項９記載の質量分析計。
【請求項１１】
レーザーが遅延発生器を調節する手段を含む請求項10記載の質量分析計。
【請求項１２】
試料保持器と第１素子の間の電圧を比較する回路をさらに含む請求項８記載の質量分析計。
【請求項１３】
第２素子が接地されている請求項８記載の質量分析計。
【請求項１４】
飛行時間型質量分析計により、試料中の分子から発生したイオンの質量電荷比を測定する方法であって；
ａ）試料保持器へ第１電位をかけ；
ｂ）試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ、試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する；
ｃ）試料保持器の近位に置かれた試料をイオン化し、試料イオンを形成する、そして
ｄ）ステップｃ）に続き、予め決められた時間に第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させ、飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特定することを含む方法。
【請求項１５】
第１素子の電位および試料保持器の電位を独立して変化させることを含む請求項14記載の方法。
【請求項１６】
質量電荷比によりイオンを空間的に分離する遅延した電場を確立するために、第１素子の電位及び試料保持器の電位を独立して変化させることを含む請求項14記載の方法。
【請求項１７】
イオン抽出前に試料保持器の電位と比較して第１素子の電位を測定するときはより陽性に、つまりより高電位に、陰イオンを測定するときはより陰性に、つまりより低電位である請求項14記載の方法。
【請求項１８】
試料保持器の近位に置かれた試料をイオン化する段階が、
ａ）試料はレーザーのパルス状エネルギーに実質的に相当する波長で照射を吸収するマトリックス物質と混合され、そして、
ｂ）レーザーのパルス状エネルギーを用いた試料のイオン化であって、マトリックス物質は試料分子の脱着及びイオン化を容易にするものであることを含む請求項14記載の方法。
【請求項１９】
第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させるステップが次のステップからなる請求項14記載の方法。
ａ）第１素子から空間的に離れている第２素子に、ａ）からｃ）の段階に引き続いて、予め決められた時間だけ第３の電位をかけ、そして、
ｂ）ａ）からｃ）の段階に引き続いて、予め決められた時間だけ第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させて、試料保持器と第２素子との間に第２の異なった電場を特定し、それにより飛行時間の測定のためにイオンを抽出する。
【請求項２０】
第１、若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させるステップが、イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは試料のいずれかに第２電位をかけるステップを含み；
ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定し；そして
ii）イオン抽出の間の過剰な衝突エネルギーを与えるのを実質的に除去するのに十分なように、試料のイオン化によって発生したイオン雲を拡散させるのに十分長い時間である予め決められた時間の後イオンを抽出する、
請求項14記載の方法。
【請求項２１】
予め決められた時間が、イオン雲の中のイオンの平均自由経路が試料保持器と第１素子の間の距離より大きくなる時間よりも大きい時間である請求項20記載の方法。
【請求項２２】
予め決められた時間が、実質的に高速イオンの全てがフラグメント化する時間よりも大きい時間である請求項20記載の方法。
【請求項２３】
第１電場は、イオンが試料保持器の方へ、式により与えられるおよそ最適の大きさE1で加速されるように、遅延する請求項14記載の方法。
E1＝5mV0/Δｔ  ここで
ｍは問題の最小質量（ダルトン）、V0は最も確率の高い初期速度（メーター／秒）、及びΔｔは、イオン化と抽出の間の遅延時間（ナノ秒）である。
【請求項２４】
第１の電場は試料陽イオンの速度を遅らせ、陽イオンを試料保持器に向かって加速するものである請求項14記載の方法。
【請求項２５】
第１の電場は試料陰イオンの速度を遅らせ、陰イオンを試料保持器に向かって加速するものである請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は全般に質量分析の分野に関する。特に、本発明は飛行時間型質量分析のパルス化イオン源及び質量分析計の操作方法に関する。
発明の背景
質量分析は分子量の正確な定量、化学構造の同定、混合物の組成及び定量的な元素分析等のための分析技術である。操作において質量分析計は分析中に試料分子のイオンを発生させ、それらの質量電荷比に従ってイオンを分離し各イオンの相対的な量を測定する。
飛行時間型質量分析計（TOF）は発生したイオンが検出器に達するまでの時間を測定することにより質量電荷比に従ってイオンを分離する。TOF型質量分析計は実質的に質量電荷比範囲に制限のない、比較的単純な高価でない機器であるため有利である。TOF型質量分析計は各イオン化時に発生したイオン全てを記録するために走査機器より高感度になりうる。TOF型質量分析計は従来型の磁場質量分析計では感度不足の大きな有機分子の質量電荷比を測定するのに特に有用である。TOF型質量分析の先行技術としては、例えば、本明細書で参照することにより援用する米国特許番号５、045、694号及び５、160、840号に示されている。
TOF型質量分析計には分析中に試料からイオンを発生させるためのイオン化源がある。イオン化源にはイオンビームを加速し正確に方向付けをさせるために一若しくはそれ以上の電極、又は電界レンズ（electrostatic lens）がある。最も単純な場合は電極はグリッドである。検出器は時間の関数としてイオンを検出する最終グリッドから予め決められた距離に配置される。一般にドリフト領域は最終グリッドと検出器の間にある。ドリフト領域はイオンが検出器に衝突する前に、イオンを自由飛行で予め決められた距離を移動させる。
与えられた電位によって加速されたイオンの飛行時間はその質量電荷比に比例する。このように、イオンの飛行時間は質量電荷比の関数で質量電荷比の平方根におよそ比例する。単一電荷イオンのみが存在すると仮定するとイオンの最も軽い群が最初に検出器に到達し、次にそれより重い質量群のものが続く。
しかしながら、実際には、等しい質量及び電荷のイオンが正確に同時に検出器に到達するわけではない。これは主に発生したイオンの初期の時間的、空間的及び運動エネルギーの分布によるものである。これらの初期の分布が質量スペクトルのピークの幅を広くさせる。広がったスペクトルピークがTOF型分析計の分解能に限界を与える。
初期の時間的分布はイオン形成の不確定性の結果である。イオン形成の時間はプラズマ脱着、レーザー脱着のようなパルスイオン化技術を利用することにより、より確実にすることができる。これらの技術は非常に短い時間でイオンを発生させることができる。
初期の空間分布は飛行軸に垂直に特定された平面で発生させられなかったイオンからのものである。気相試料から生成されたイオンは最大の初期空間分布を有している。プラズマ脱着、若しくはレーザー脱着イオンのような脱着技術を利用すれば、試料表面上のよく特定された範囲からイオンが発生し、イオン形成の初期空間不確定性が無視しうるので、最小の初期空間分布になる。初期エネルギー分布はイオン形成時のイオンのエネルギーの不確定性の結果である。イオンの初期運動エネルギー分布を補償することにより質量分解能を改善するために、各種の技術が用いられている。二つの広く用いられている技術には、イオン反射器（イオン鏡ともリフレクトロンとも呼ばれている）とパルスイオン抽出が用いられている。
プラズマ脱着（PD）イオン化やレーザー脱着（LD）イオン化のようなパルスイオン化は空間及び時間の最小の不確定性を有するが、比較的広い初期運動エネルギー分布でイオンを発生させる。従来のLDは一般に時間不確定性を最小にするために十分短いパルス（しばしば、10ナノ秒以下）を用いている。しかしながら、ある場合にはレーザーパルスが終わった後、しばらくの間イオン発生が続き、時間不確定性のために分解能を下げる。また、ある場合には、イオンを発生させるレーザーパルスが所望される質量スペクトルピークの幅よりずっと長くなることがある（例えば、いくつかのIRレーザー）。より長いパルス長は質量分解能を著しく制限する。LDの性能はレーザーの波長で試料に有機マトリックス分子を添加する、即ち非常に吸収性をよくすることにより、実質的に改善される。マトリックスは試料の脱着及びイオン化を容易にする。マトリックス補助レーザー脱着／イオン化（MALDI）は、100、000Daを越える大きな生体分子をそのままの状態での脱着及びイオン化を容易にする。
WO92/13629はMALDI飛行時間型質量分析計を用いてそのような生物学的試料を分析する方法が示されている。この方法で、レーザーで蒸発した試料の分子は、試料と共有結合した発色団に吸収されるレーザー波長に暴露されてイオン化する。イオンは抽出され、多チャンネル検出器の方へイオン反射器により反射される。米国特許５、288、644はMALDI飛行時間型質量分析計を用いてDNAの配列分析をする方法を示している。この方法では、酵素的、若しくは化学的分解配列分析技術により作られた試料がレーザー波長を吸収するマトリックスに分散される。マトリックスと試料は照射されその結果蒸発した試料が質量分析計に導入される。試料が構成されるフラグメントの質量が決定され、この情報から、配列情報が得られる。
MALDIで試料は通常平滑な金属表面に添着され、試料表面にパルスレーザーを衝突させた結果として気相に脱着される。このように、イオンはレーザーパルスの時間におよそ相当する短い間隔で、蒸発するのに十分なエネルギーをレーザーから吸収する個体マトリックスと試料の部分に相当する非常に小さい空間領域で生成される。これは、初期イオン速度も小さい場合には飛行時間型（TOF）質量分析計の全く理想的なイオン源になるであろう。残念ながら、これはそうではない。レーザーによる早いマトリックスの除去はマトリックスと試料イオンを含有しているマトリックス分子の超音ジェットを生成する。電場がないとジェット中の分子種及びイオン種の全てがジェット中で起こる頻度の高い衝突の結果、殆ど同一の速度分布に達する。
MALDIのイオン放出過程についていくつかの研究グループで研究されている。RC  Beavis、B.T.Chait,Chem.Phys.Lett.,181,1991,479.J.Zhou、W.Ens,K.G.Standing、A.Verentchikov,Rapid  Commun.Mass  Spectrom.,6,1992,671−678.電場がなければ、MALDIで生成されるペプチド及び蛋白質イオンの初期速度分布は分析対象の質量やレーザー強度には殆ど全く依存しない。平均速度は約550m/秒で200から1200m/秒に殆どのものが入る速度分布である。マトリックスイオンからの速度分布はイラディアンス閾値に近いペプチド及び蛋白質のそれと本質的に同一であるが、より高いイラディアンスでは劇的に高速度側にシフトする。全イオン強度は閾値近くではショット当たり104から高イラディアンスでは108以上の範囲でレーザーイラディアンスが増加するに従って早く増加する。電場があれば、イオンはイオンと中性分子との衝突によるエネルギー損失を示す。このエネルギー損失はレーザー強度及び電界強度とともに増加し、マトリックスイオンより高い質量の分析対象物にとってより高い。
MALDIにより生成されるイオンの初期速度分布が質量に依存しないと云う観察結果は初期運動エネルギー分布の幅が加速された場での中性分子との衝突から生じるエネルギー損失のみならず質量の平方根にもおよそ比例するということを意味している。このように高い質量での従来型のMALDIでの質量分解能はイオンの質量電荷比とともに減少する。高い加速エネルギー（25−30kV）を用いると加速エネルギーの増加に直接的に比例して高い質量での分解能が増大する。
初期運動エネルギー分布の好ましくない効果はパルスイオン抽出により部分的に除去できる。パルス化され遅延化されたイオン抽出はイオン形成と加速場使用の間に導入される。加速領域で遅延時間と電場を正しく選択することにより、イオンの飛行時間を飛行時間が初期速度に一次に依存しないように調節することができる。
E.W.BlauthがDynamic  Mass  Spectrometers,1966、Elsvier  出版社、アムステルダム、ではイオンビームを空間的、エネルギー的に焦点を絞る飛行時間型質量分析計について議論されている。電子衝突により作られたイオンは、一般に、イオンがパルス電場をかけられ放出するまで無場空間領域に留まっている。
質量分解能の著しい改善がMALDIイオン源でのパルスイオン抽出を用いることによって達成された。研究者が小さい蛋白質の高速フラグメント化のみならず改善された分解能を、J.J.Lennon  ＆  R.S.Brown,Proceedings  of  the  42nd  ASMS  Conference  on  Mass  Spectrometry  and  Allied  Topics、1994年５月29日−６月３日、シカゴ、イリノイ州、501頁で報告している。また、パルスイオン抽出のできる小型MALDI機器でより小さい合成ポリマーを測定するときに著しい分解能の向上をBrueuker等により第13回国際質量分析会議、1994年８月29日−９月３日、ブタペスト、ハンガリーで報告されている。さらに、パルスイオン抽出MALDI源で低分子の蛋白質に関する質量分解能を著しく改善していることを、S.M.Colby,T.B.King,J.P.ReillyによりRapidCommun.,Mass  Spectrometry,8,1994,865−868に報告されている。
イオン反射器（イオン鏡とリフレクトロンとも呼ばれている）は初期運動エネルギー分布の影響を補償するために試用される。イオン反射器は自由飛行領域の最後に配置されている。イオン反射器は一若しくはそれ以上の均一な、遅延化の、静電場からなる。静電場に関しては、イオンが反射器を透過するので場方向の速度成分がゼロになるまでイオンは減速される。それで、イオンは方向を反転し反射器を通じて後方に加速される。イオンは入ってきたエネルギーと同一のエネルギーでしかしながら反対方向の速度で反射器から放出される。より大きなエネルギーを持ったイオンはより深く反射器に侵入し、結果としてイオン反射器により長い時間、留まることになる。正しくデザインされた反射器では、電位は質量及び電荷様のイオンが初期エネルギーにかかわらず同時に検出器に到達するようにイオンの飛行経路を修飾するように選択される。
質量分析計の性能は質量分解能により部分的に特定される。他の重要な要素は質量の精密さ、感度、シグナル／ノイズ比、動的範囲である。全体の性能を特定する各種の要因の相対的重要度は試料及び分析目的で異なるが、一般的にはいくつかのパラメーターが特定され、同時に特定の応用のための満足すべき性能を得ることができるよう最適化されなければならない。
残念なことに、従来技術を用いたTOF型質量分析計は多くの重要な型の化合物の分析には不適切である。これらの不適切さは特にMALDIでは明らかである。初期運動エネルギー分布と関連する質量分解能の損失に加えてTOF型質量分析計の性能に限界を与えてしまういくつかのメカニズムがある。発生したマトリックスイオンの余剰のものが検出器を飽和させる原因になる。多くの検出器の長い回復時間のために、飽和が、TOFスペクトルを実質的に構成する入ってくるイオン流の時間的プロファイルの真の再生を、大きく阻害する。
フラグメント化プロセスは、MALDITOFでは３つの異なる時間尺度で進むことがE.Nordhoff等、J.Mass  Spectrom,30、1995、95−112  に観察されている。極端に速いフラグメント化はイオン化の時間の間に本質的に起こりうる。このプロセスは即時フラグメント化と云い、そのフラグメントのイオンは連続イオン抽出MALDITOF測定での相関イオンシグナルを与える。即ちフラグメントイオンはそれらがあたかも試料に存在するかのように正確に挙動する。フラグメント化は加速段階でも、いくらか低い比率で（一般的には１μ秒以下の特性時間で）起こりうる。この種のフラグメント化は高速フラグメント化という。イオンと中性分子間の高いエネルギー衝突（熱衝突より大きなエネルギー）もまた高速フラグメント化に貢献しうる。これらの衝突は除去された物質が密な円錐状の柱（plume）になったときイオン加速の初期の段階で特に頻繁にある。高速フラグメント化プロセスからのフラグメントイオンは即時フラグメント化のものとは反対に、それらは一つのよく特定された運動エネルギーに加速されるもとの試料のイオンとは違って広い範囲の運動エネルギーに加速されるので、関連しないノイズ（化学ノイズ）の原因になる。
試料イオンのフラグメント化はイオンの飛行時間と比較しうるより長い時間尺度で起こる自由飛行領域でも起こりうる。これは、好ましいことかどうか分からないが、、飛行時間型質量分析から要求される特定の種類のデータに依存する。一般的に、フラグメント化は真の分子イオンによるシグナルの強度を減少させる。混合物の分析ではこれらのフラグメントイオンは問題のシグナルの検出を干渉する化学ノイズを著しく発生させる。また、反射器内でのフラグメント化はさらに問題のシグナルの強度を減少させさらに干渉バックグラウンドシグナルを増加させる。
フラグメント化がドリフト領域で起こった場合、分離したフラグメントの非常に小さい相対速度を除いてはイオンと中性フラグメントの両者とも、殆ど同じ速度でもとのイオンとして動き続け、フラグメント化が起ころうが、起こるまいが、本質的に同じ時間に無電界領域の末端に到達する。このように簡素化されたTOF型分析計は反射器もなく加速後のフラグメント化により分解能も感度も著しく低下する。
一方、反射分析計では事情が全く異なる。フラグメントイオンは本質的にもとのイオンとして、同じ速度を有するが、中性フラグメントの質量を損失し、比例的に低エネルギーを有する。このようにフラグメントイオンは反射場の中のより短い距離侵入し相当するもとのイオンよりも早く検出器に到達する。鏡エネルギーの適当な調節によりこれらのフラグメントは分子構造を決定するのに使用することができる高品質のポスト・ソース壊変（PSD）スペクトルを作るために焦点に集中される。
従って本発明の主たる課題は飛行時間型質量分析計の性能、特に表面からイオンを形成させることを含む応用に関して、分解能を改善し、質量精密さを上昇させ、シグナル強度を増大させ、バックグラウンドノイズを減少させることにより改善することである。他の課題はMALDI飛行時間型質量分析計のマトリックスイオンシグナルを減少させることである。さらに他の課題は核酸、ペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチドのような生体高分子の配列を化学的、若しくは酵素的に生じさせたはしご形混合物の分析により、迅速に知ることのできるTOF型質量分析計を提供することにある。さらに、他の課題はオリゴヌクレオチド、炭水化物、糖結合体等の生体分子に関する構造上の情報を得るために高速フラグメント化を利用する事にある。さらに他の課題は高速フラグメント化の程度をパルスイオン抽出TOF型質量分析計で最適の実験条件を選択することにより調節することである。
発明の要約
本発明は試料から発生したイオンの質量電荷比を測定するための飛行時間（TOF）型質量分析計を特徴とする。質量分析計は液体、若しくは固体試料からのイオン源を供給する試料保持器、試料イオンを形成させるためのイオン源をイオン化するイオン化器を含む。質量分析計はイオンを抽出する前に試料イオンにエネルギーを与える予め選択された非周期的で、非ゼロである電場を調節可能な状態で発生させる手段、及びイオンを抽出する異なる電場を発生させる手段を含む。イオン化器はパルス状エネルギーを発生させるレーザーであってもよい。
別の選択では質量分析計は試料保持器、試料イオンを発生させるために試料保持器に置かれた試料をイオン化する手段、及び試料保持器から空間的に離れている第１の素子を含む。質量分析計はドリフトチューブと検出器を含む。イオン化器はパルス状エネルギーを発生させ、それによって保持器に置かれた試料を照射しイオン化するレーザーでもよい。第１の素子はグリッド若しくは電界レンズでもよい。電源は第１の素子と保持器と電気的に接続していてもよい。その電源は第１の素子と保持器のエネルギーが独立して可変である。第１の素子と保持器の各々に可変のエネルギーを発生させる。保持器のエネルギーとともに第１の素子のエネルギーとが保持器と第１の素子の間の電場を特定する。質量分析計はさらに保持器と第１の素子の間の電圧を比較するための回路を含んでもよい。
質量分析計は試料イオンを加速する第１の素子から空間的に離れた電場を作るための第２の素子を含むことができる。第２の素子は保持器と第１の素子のエネルギーとは独立した電気エネルギーと接続しうる。第２の素子は接地されているか電源に接続することができる。第２の素子はグリッド、若しくは電界レンズでもよい。第２の素子のエネルギーは第１の素子のエネルギーとともに第１と第２の素子の間の電場を特定する。質量分析計は加速後のイオンのエネルギー分布を補償する第１の素子から空間的に離れているイオン反射器を含むことができる。
質量分析計は電源、第１高電圧入力、第２高電圧入力、第１、若しくは第２入力に接続できる高電圧出力からなる高電圧下、高速で作動するスイッチ、及びスイッチを操作する制動器を含むことができる。出力は、制動器信号が制動器入力へ電位をかける予め決められた時間、第１入力から第２入力へスイッチされる。第１及び第２高電圧入力は少なくとも1kVの電源と電気的に接続され、スイッチは１μ秒以下の作動立ち上がり時間を有する。
質量分析計はパルス状エネルギーに同調する高電圧下、高速で作動するスイッチを操作する制動器信号を発生させるスイッチの制動器入力に操作的に接続するレーザー出力パルス状エネルギーに反応する遅延発生器を含むことができる。この出力はスイッチの制動器入力に連結されていて、これは高電圧下、高速で作動するスイッチを操作する制動器シグナルを出してパルス状エネルギーに連動する。レーザーはレーザーパルスに反応する光検出器により同調の調節を開始することができる。若しくは、レーザー自身がパルス状エネルギーと同調した電気的信号を発生する回路を含んでもよい（例えば,Pockels電池ドライバー）。別の選択として、遅延発生器はパルス状エネルギー及び制動器入力を開始することができる。
質量分析計はイオン化器により発生させられたイオンを検出するイオン検出器を含まねばならない。質量分析計は小面積の検出器を使うことができるようにイオンビームの横断面積を制限する導線を含むことができる。質量分析計はコンピューターインターフェイス、電源や遅延発生器や特定の応用での最適電位や時間遅延を計算するコンピューターアルゴリズムを制御するコンピューターを含むことができる。
本発明は飛行時間型質量分析計により試料の分子の質量電荷比を測定する方法に特徴がある。本方法は第１電位を試料保持器にかける事が含まれる。第２電位は、試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子にかける。第１素子の電位は試料保持器の電位とは独立して可変である。
保持器に置かれた試料は試料イオンを発生させるためにイオン化される。この方法は試料をレーザーで、若しくはパルス状エネルギーを発生する光源でイオン化することを含むことができる。第１、若しくは第２の少なくとも一つの電位を、飛行時間測定のためにイオンを抽出する第１素子と試料保持器の間の第２の電場を特定するイオン化に続いて予め決められた時間で変化させる。イオン化パルスと第２電場（抽出場）をかける間の最適時間遅延は多くの因子に依存する；試料表面と第１素子との間の距離、第２電場の大きさ、最適分解能が要求される試料イオンの質量電荷比、及びイオンの初期運動エネルギーが含まれる。本方法は時間遅延や電場の最適値を計算するコンピューターアルゴリズム、電源や遅延発生器の出力を自動的に調節するためのコンピューターやコンピューターインターフェイスの使用が含まれる。
本方法は試料保持器の電位から第１素子の電位を独立して変化させることが含まれる。第１素子の電位はイオン抽出に先行して質量電荷比でイオンを空間的に分離するために遅延した電場を確立するために試料保持器の電位から独立して変化させることができる。
本方法は、イオンを加速する第１及び第２素子の間の電場を、第１素子の電位とともに特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。本方法は、また、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物からなる試料を分析することが含まれる。試料の一若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を容易にするレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含むことができる。
本方法を用いると、試料イオンの飛行時間に対する初期の時間的、及びエネルギー的分布の効果を減少させる事により飛行時間型質量分析計の分解能を改善する。本方法は第１、若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含む事ができる。反射器を用いることによりイオンビーム中のエネルギー拡散を高次の修正ができ、本方法で含まれる場合は高質量分解能さえ提供する。
本発明はイオン抽出中の高エネルギーの数を減少させる事により、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の分解能を改善する方法としても特徴づけられる。分析される一、若しくはそれ以上の分子からなる試料保持器に電位をかける。試料保持器と第１素子の間の第１電場を、試料保持器の電位とともに、特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位をかける。保持器の近位部に置かれている試料はレーザーでイオン化され、それでイオン雲を形成するパルス状エネルギーを発生させる。
試料と第１素子の間の第２電場を、試料保持器若しくは第１素子の電位とともに、特定するイオン化に続く予め決められた時間に、第２電位を試料保持器若しくは第１素子にかける。第２電場は予め決められた時間後にイオンを抽出する。予め決められた時間とは、抽出場が活性化されたとき、イオンや中性分子雲が多くの高エネルギー衝突を実質的に減少させることができるのに十分な程度に拡散するのを可能にするため十分に長いものである。予め決められた時間とは、円錐状の柱の平均自由経路が加速領域のサイズより大きくなる時間より長い時間であってもよい。
本方法はイオンを加速する第１、及び第２素子の間の電場を、第１素子の電位とともに、特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含んでもよい。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは、レーザーパルスに反応して生成された円錐状の柱の中性分子やイオンが、イオンと中性分子の更なる衝突が起こらないよう十分に真空中に拡散できるのに十分長いように遅延時間が選択される。選択された試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、また、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物からなる試料を分析することが含まれる。試料は一若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を容易にするレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含むことができる。
本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビーム中のエネルギー拡散の高次の修正ができ、本方法で含まれるとさらに高い質量分解能さえ提供する。
本発明はマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析のマトリックスイオンシグナルを減少させる方法にも特徴づけられる。本方法は試料中にマトリックス分子を取り込ませることも含まれる。第１電位を試料保持器にかける。試料保持器と第１素子との間の第１電場を作るのに試料保持器から空間的に離れた第１素子に電位をかける。保持器に近接して置かれた試料はパルス状エネルギーを産生するレーザーで照射される。マトリックスはエネルギーを吸収し、試料及びマトリックスの脱着とイオン化を容易にする。第１電場は遅延し、このようにしてイオンは試料表面に向かって加速する。
パルス状エネルギーに続いて、試料表面から離れてゆくようにイオンを加速する試料保持器と第１素子の間の第２電場を作る試料保持器に、第２電位が予め決められた時間にかけられる。第１電場は試料から発生するイオンを遅延するために選択される。この電場はイオンを減速し試料表面へもどるように方向付ける。
本方法はイオンを加速するために第１、及び第２素子の間の電場を作る第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは選択された質量より小さい質量のマトリックスイオンは抑制され、選択された質量より大きい質量の試料イオンが最適質量分解能で検出されるように選択される。選択された試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、また、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される１若しくはそれ以上の生体分子からなる試料を分析することが含まれる。
本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビームのエネルギー拡散の高次の修正ができ、本方法で含まれると高質量分解能さえ提供する。
本発明は高速フラグメント化プロセスをイオン抽出に先立って完了させる時間を許容することによりマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析でバックグラウンド化学ノイズを減少させる方法にも特徴がある。マトリックス物質が一若しくはそれ以上の分子のそのままでの脱着、イオン化を容易にするように、分析される一、若しくはそれ以上の分子からなる試料の中にマトリックス分子は取り込まれる。試料保持器に電位をかける。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れた第１素子に電位をかける。
保持器の近位部に置かれた試料を、マトリックス分子に吸収されるパルス状エネルギーを発生させるレーザーでイオン化される。第１素子の電位とともに、イオン抽出するために、試料と第１素子の間の第２電場を特定するイオン化に続く予め決められた時間に第２電位を試料保持器にかける。予め決められた時間とは、高速フラグメント化プロセスが実質的に完了するのに十分長い時間である。
本発明は第１素子への電位とともに、イオンを加速するための第１素子と第２素子の間の電場を特定する、第１素子から離れて置かれた第２素子に電位をかけるステップを含むこともできる。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは、時間遅延が高速フラグメント化プロセスが完了するのに十分長いよう選択される。選択された質料イオンが最適質量分解能で検出されるようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、また、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖蛋白質からなる群から選択される少なくとも一つの生体分子からなる試料を分析することが含まれる。
本方法は第１、若しくは第２素子と空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビームのエネルギー拡散の高次の修正ができ、本方法で含まれると高質量分解能さえ提供する。
本発明はロングパルスレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の分解能を改善する方法に特徴がある。第１電位は試料保持器にかけられる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に、第２電位がかけられる。保持器に近接して置かれる試料はロングパルスレーザーでイオン化される。パルス状エネルギーの時間は50ナノ秒より大きくてよい。
試料保持器に関する第１素子の電位を、イオン抽出に先立ってイオンの空間的、及び速度の拡散を減少させるために、陽イオンを測定するためにより陽性に、つまりより高電位に、陰イオン測定のためにより陰性に、つまりより低電位にすることができる。第１、若しくは第２の電位の少なくとも一つは、飛行時間測定のためのイオン抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特定するのに、イオン化に続く予め決められた時間に変化させる。予め決められた時間とは、レーザーパルスの時間より長くてよい。
本方法は、第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１、及び第２素子との間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。
試料は試料分子の脱着及びイオン化を容易にするためにレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含有することができる。サンプルはDNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物からなる。
本発明はマトリックス補助・レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計を用いて、生体分子のフラグメント化を特定する配列を生じさせる方法に特徴がある。本方法は分子の脱着、イオン化、励起を容易にするために分析される一、若しくはそれ以上の分子からなる試料にマトリックス物質を取り込むことが含まれる。試料に電位がかけられる。試料の電位とともに、試料及び第１素子の間の第１電場を特定する試料から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。
マトリックスの吸収エネルギーに実質的に相当するパルス状レーザーを発生させるレーザーで分子はイオン化されフラグメント化される。イオン化に続く予め決められた時間に第１素子の電位とともに、試料と第１素子の間の第２電場を特定する試料に第２電位がかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオンを抽出する。本方法は、第１素子の電位とともに、第１素子、及びイオンを加速する第２素子との間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは時間遅延が十分長くて高速フラグメントプロセスが完了するように選択される。これらのパラメーターはまた最適な質量分解能で選択した質量を検出できるように選択される。パラメーターは、マニュアルで、もしくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、生じた特定のフラグメントの配列の質量電荷比を検出するステップ及び生体分子がDNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物である試料中の生体分子の少なくとも一種類の配列を同定するステップを含むことができる。
本方法はイオン化の間に生体分子へのエネルギー移動を増加させることにより生じるフラグメントの収率を増加させるステップを含むことができる。エネルギー移動は生体分子が吸収するレーザー波長を選択することにより増加できる。フラグメントイオンの収率はマトリックスに添加剤を取り込ませる事により増加できる。添加剤はレーザーの波長で吸収するかも知れないししないかも知れないが、それ自身としてはマトリックスとしては有効ではない。添加剤はマトリックスから試料へのエネルギー移動を容易にする事ができる。マトリックスは特に生体分子のフラグメント化を促進するのに選択される。生体分子はオリゴヌクレオチドでもよく、マトリックスは少なくとも２、５−ジヒドロキシ安息香酸とピコリン酸を含有することができる。生体分子はポリヌクレオチドでもよい。
本方法は第１、若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器に電位をかけるとイオンビームのエネルギー拡散を高次に修正することを提供し、本方法で含まれるときは高質量分解能さえも提供する。
本発明は特に本明細書にも引用している米国出願番号08/796、598（代理人書類番号:SYP−115、本件とも同様に提出されている）に完全に記載され、請求されているように請求されている質量分析計の新規な型の試料保持器にも特徴がある。簡単に云うと試料保持器はポリマー試料と加水分解剤の濃度比を変えながら保持するように適合された空間的には分離された領域からなる。加水分解剤が各領域、のポリマー試料のモノマー結合間を加水分解する適切なインキュベーション時間の後で、種を含む領域の複数、一般的には全部がイオン化され、一般的には順次、質量分析計で領域の種の質量電荷比の代表的なデータが得られる。
他の態様では本発明は本明細書で引用している米国出願番号08/447、175（代理人書類番号SYP−115、本件とも同様に提出されている）に完全に記載され、請求されている様に既知の質量の複数のモノマーからなるポリマーについての配列情報を得ることができる方法を提供する。
当業者は、ポリマーを分解し、各組は一、若しくはそれ以上のモノマーで異なる一組のフラグメントを最初に提供する。少なくとも一組のフラグメント質量電荷比の差が分析される。一若しくはそれ以上の異なるモノマーの既知の質量電荷比に相当する平均質量電荷比が仮定される。仮定された平均は要求される信頼度のレベルで二つの値が統計的に差があるか、どうかを決定するために測定された平均と比較される。統計的な差があれば、言明された平均の差は実際の測定された差と帰せられない。いくつかの態様では一組のフラグメントの間の差をさらに測定し、測定された平均の差の精度を高める。方法のステップを一対のフラグメントの間の単一差が全ての要求されるマイクロ秒言明されるまで繰り返される。
【図面の簡単な説明】
本発明の前述、及び他の課題、特徴、有用性については以下の本発明の好ましい実施の態様に関するより詳細な説明、添付した図面に示されているように明らかになるであろう。本発明の原理を示すことを強調するために図面は必ずしも同一の縮尺で描かれてはいない。
図１は先行技術のパルス２段階加速レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の概要図である。
図２は本発明のいくつかの原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の概要図である。
図３は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の一実施の態様である。
図４は本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計でオリゴヌクレオチドの質量分解能の改善を示したものである。図4aは従来のMALDITOF型の質量分析計で記録したDNA22マー試料のスペクトルである。図4bは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録したDNA22マー試料のスペクトルである。
図５は単一段階のイオン反射器を含む本発明の態様のレーザー脱着／飛行時間型質量分析計の概要図である。
図６は図５で示された型のMALDITOF型質量分析計で記録したm/z3839でのRNA12マー試料の７、000を越える質量分解、およびm/z5154でのRNA16マーの約５、500質量分解能を示している。
図7a−ｃは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計でマトリックスシグナルをの減少と除去を示している。
図8a−ｃはフラグメントイオン型の命名法を含むMALDITOF型質量分析計でのオリゴヌクレオチドの構造的同定のために誘導されたフラグメントを示している。
図9a−ｃは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で非常に複雑なオリゴヌクレオチドの混合物を分析する能力を示したものである。
詳細な説明
図１は先行技術のパルスイオン２段階加速レーザー脱着／飛行時間型質量分析計の概要図である。高電圧電源11が出力13で可変の高電圧を発生させる。第２高電圧電源10は高電圧電源11の出力13を参考にした出力12で可変の高電圧を発生させる。電力供給出力12と13はパルス発生器16の入力14と15に接続されている。パルス発生器16の出力を制御する制動器信号を発生させる制御回路18はパルス発生器16の制動器入力20に電気的に、若しくは任意に接続されている。パルス発生器16は制動器入力が作動していない時、電源11の高電圧出力をパルス発生器出力22へと変えて伝える。パルス発生器は、制動器入力が作動しているとき、予め決められた時間、パルス発生器出力22で高電圧電源10の高電圧出力によりその振幅が決められる高電圧パルスを発生する。パルス発生器出力22は保持器24に電気的に接続されている。分析される試料26は保持器24の平滑な表面28に添着される。保持器24は試料26が一般的に置かれている導電体である。パルス状エネルギーで試料26を照射するレーザー30は試料26に向けられた出力32で配置されている。試料26の分子は試料26の表面にパルスレーザーを衝突させた結果、イオン化され気層へ脱着される。レーザー30の波長で高度に吸収するマトリックス物質は試料26の脱着とイオン化を容易にするために試料に加えることができる。プラズマ脱着、粒子射突などの試料物質をイオン化させる他の方法も用いることができる。
電源出力13は保持器24から空間的に離れた第１素子34にも接続されている。第１素子34はグリッド、若しくは電界レンズでよい。保持器24と第１素子34の電位は保持器24と第１素子34の間の電場を特定する。第１素子34と空間的に離れた第２素子36は接地されている。第２素子はグリッド、若しくは電界レンズでよい。第２素子36から空間的に離れている検出器38は時間の関数としてイオン化された試料物質を検出する。
操作では、制動器入力20はパルス状エネルギーで試料26をレーザー30で照射する前、及びしている間、作動しない。保持器24と第１素子34の電位は電源電位と等しい。レーザーパルスに続く予め決められた時間に、制動器入力20が作動し、パルス発生器16が予め決められた振幅の高電圧パルスを保持器に発生させる。パルスの間、保持器24の電位は陽イオン、若しくは陰イオンのどちらが分析されているかによって、第１素子34より陽性か陰性の方向にずれている。保持器24と第１素子34の間の電場は非ゼロになりイオンは第２素子36及び検出器38の方向へ加速される。
このように従来技術のパルスイオンLDTOF型質量分析計では、試料イオンがイオン抽出する前に試料保持器24と第１素子34に同じ電位をかけられている領域で発生させられる。初期イオン形成に続く予め決められた時間遅延に予め決められた振幅のパルスをかける無場領域の場からイオンが抽出される。初期の運動エネルギー効果は予め決められたパルス振幅及び時間遅延を適当に選択することにより減少させることができる。
図２は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の概要図である。第１高電圧電源50は第１出力52で第１可変高電圧を発生させる。第２高電圧電源54は第２出力56で第２可変高電圧を発生させる。第１及び第２電源は独立していて、マニュアルで制御され、若しくはプログラムできる電源であってもよい、若しくは単一で多出力可能なプログラムできる電源であってもよい。
第１及び第２電源出力は高電圧下、高速で作動するスイッチ62の第１入力58と第２入力60に接続されている。スイッチ出力64は第１スイッチ入力58と第２スイッチ入力60と接続が可能である。スイッチを作動させる制御信号を発生させる制御回路66はスイッチの制動器入力68に電気的に接続されている。スイッチ出力64は保持器70に電気的に接続されている。
保持器70は試料が置かれている導電体である。分析中の試料72は保持器70の平滑な表面74に添着される。絶縁層（示されていない）を試料と保持器の間に入れることができる。別の実施の態様では、試料は保持器で発生させられる電場に直交するように位置される。
パルス状エネルギーで試料72を照射するレーザー76は試料72の方に向けられた出力78で配置される。試料72は試料72の表面にパルス状レーザービーム80が衝突する結果イオン化され気層に脱着される。レーザー76の波長で高度に吸収するマトリックス物質は試料72の脱着及びイオン化を容易にするために試料72に加えることができる。プラズマ脱着、粒子射突などの試料物質をイオン化させる他の方法も用いることができる。
第３電源82は保持器70と空間的に離れた第１素子84に電気的に接続されており第３高電圧を発生させる。第１素子84はグリッド、若しくは電界レンズでよい。保持器70と第１素子84の電位は保持器70と第１素子84の間の電場を特定する。第１素子84と空間的に離れている第２素子86は接地されている。第２素子86はグリッド、若しくは電界レンズである。第２素子86から空間的に離れている検出器88はイオン化された試料物質を時間の関数として検出する。
操作では、レーザー76が試料72をパルス状エネルギーで照射する前、及びしている間は制動器入力68は作動しない。保持器70の電位は第１高電圧電源により発生させられる第１高電圧と等しい。第１素子の電位は第３高電圧電源82により発生させられた第３高電圧と等しい。第１高電圧と第３高電圧が異なる場合は、保持器70と第１素子84の間は非ゼロ静電電場になるであろう。
パルスレーザーに続く予め決められた時間に、制御回路66は制動器入力68を作動させるようにする。スイッチ62は保持器70から第１高電圧電源を切り予め決められた時間保持器70に第２高電圧電源54を素早く接続させる。保持器70の電位は素早く第１高電圧から第２高電圧に変化する。第２高電圧は陽イオン、若しくは陰イオンが分析されているかどうかによって、第３高電圧より陽性、若しくは陰性の方向にずれている。保持器70の電位が高いので保持器70と第１素子84の間の電場は確立され、イオンを抽出し第２素子86及び検出器88の方向に加速する。
このように、本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計ではイオン抽出の前に保持器70と第１素子84の間の領域に、変化し得る非ゼロ、非周期的である電場ができる。本発明の質量分析計は、従って、イオン抽出の前でも最中でも発生したイオンにかける電場を制御する事ができる。
図３は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着飛行時間型質量分析計の一実施態様を示している。この態様は三つの独立する電源と、イオン抽出の前及び間に試料保持器と第１素子の電位を独立して制御できる高電圧下、高速で作動するスイッチを利用している。
第１電源100は高電圧下、高速で作動するスイッチ104の第１入力102に電気的に接続されている。スイッチはBehlkeで製造され、Eurotek,Inc.,モーガンビル、ニュージャージー州より入手でき、約150ナノ秒の作動遅延、約20ナノ秒の立ち上がり時間、約10マイクロ秒の作動時間のHTS300−02を使用することができる。第２電源106はスイッチ104の第２入力108に電気的に接続されている。スイッチ104の出力110は第１入力102、若しくは第２入力108のいずれとも接続可能であるが、制動器信号がなければ通常は第１入力102と接続されている。制動器入力112は第１電源100をスイッチ出力110から切り、予め決められた時間の間第２電源をスイッチ出力110に接続させる様にスイッチ104を作動させる。スイッチ出力110は試料保持器114と電気的に接続されている。分析中の試料116は電気的に保持器と同調するように保持器の平滑な表面に置かれる。レーザー120の波長によく吸収されるマトリックス物質を試料116の脱着及びイオン化が容易になるように試料116に加えることができる。
試料をパルス状エネルギーで照射するレーザー120は試料116の方に向けられた出力122を配置する。レーザーパルスはパルスエネルギーと時間的に同調された電気信号を発生させる光検出器124で検出される。遅延発生器126は同調された信号に反応する入力128及びスイッチ112の制動器入力と電気的に接続された出力130有する。遅延発生器126は同調された信号に関してはあらかじめ決められた時間により遅延制動器信号を発生させる。このようにパルスエネルギーに合わせてスイッチ104はスイッチ出力110から第１電源100を切り放し、予め決められた時間の間スイッチ出力110に第２電源106を接続する。
第３高電圧を発生させる第３電源103は保持器114から空間的に離れている第１素子132と電気的に接続されている。第１素子132はグリッド、若しくは電界レンズであってもよい。保持器114と第１素子の電位は保持器114と第１素子132の間の電場を特定する。第１素子と空間的に離れている第２素子は接地されている。第２素子はグリッド、若しくは電界レンズであってもよい。第２素子134から空間的に離れているチャンネルプレート検出器のような検出器136はイオン化された試料物質を時間の関数として検出する。第１及び第２素子について質量分析の操作に重要なことは保持器114の特定の電位ではなく、相対的な電位であることに注意する必要がある。
比較回路138は第１電源100と第３電源130の電圧を測定し、比較し第１と第３の電圧差を指示する。電圧差はイオン抽出前の保持器114と第１素子の間の電場強度を表している。
操作ではレーザー120で試料を照射する前に保持器114はスイッチを通じて第１高圧電源100と電気的に接続され、第３高圧電源103は第１素子132と電気的に接続されている。このように、イオン化前に第１電場は保持器114と第１素子の間に確立される。電場は比較回路138により指示され第１及び第３電圧を変化させることにより調節可能である。
質量電荷の測定を開始するのにレーザー120は試料116をパルス状エネルギーで照射する。レーザー120はパルス状エネルギーに時間的に同調した電気信号を発生する。遅延発生器126は信号に反応する。信号に続いて予め決められた時間に遅延発生器126は制動器信号を発生する。高速高電圧スイッチは制動器信号に反応しスイッチ104を素早く第１電源100から切り、予め決められた時間の間素早く第２電源106をスイッチ出力110に接続する。予め決められた時間の間、保持器114、若しくは第１素子132の電位の大きさが変化し、イオンを第２素子134及び検出器136の方向へ加速させる電場を作る。
本発明は本発明の原理を取り入れたレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計を用いて試料中の分子の質量電荷比を測定する方法にも特徴がある。本方法は分析される一、若しくはそれ以上の分子を含む試料保持器の近位部に置かれた試料を有する試料保持器に第１電位をかける事が含まれる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかける。第１素子の電位は試料保持器の電位から独立して変化させることができる。試料はイオン化され試料イオンを生じる。この方法はパルス状エネルギーを発生するレーザーまたは光源で試料をイオン化することを含んでもよい。第１若しくは第２電位の少なくとも一つをイオンを飛行時間測定するために抽出する試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定するイオン化に続き予め決められた時間に変化させる。
イオン化パルスと第２電場に電圧をかける間の最適時間遅延は試料表面と第１素子の間の距離、第２電場の大きさ、最適分解能が要求される試料イオンの質量電荷比、及びイオンの初期運動エネルギー等の多数のパラメーターに依存する。もし第１電場が第２と比較して小さい場合は初期速度のある時全飛行時間での変化を最小限にする時間遅延は概略
△＝144.5da（m/Va）1/2［1/w＋（V0/V）1/2］  （１）
で与えられる。そこで時間はナノ秒で、試料と第１素子の間の距離ｄはミリメータで、質量ｍはダルトンで、電位差Ｖはボルト、質量イオンの初期運動エネルギーｍはＶ電子ボルトである。無次元パラメーターＷはTOF分析機の幾何学に依存する。TOF分析機の幾何学的パラメーターはｗが一単位より大きくなるように選択されなければならない。飛行時間分析機が試料板、第１素子、無場ドリフト空間、検出器のみからなる場合はｗの値は、
ｗ＝d/da−１                              （２）
であたえられる。ここでｄは第１素子と検出器の間の無場領域の長さである。
本方法は初期の時間分布、エネルギー分布が試料イオンの飛行時間に及ぼす影響を減少させることにより飛行時間型質量分析計の分解能を改善する。本方法は、第１素子の電位とともに、第１素子とイオンを加速する第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップが含まれる。
この場合、時間遅延は式（１）により与えられるが幾何学的パラメーターは、
0003580553.tif 000002
で与えられる。ここでχ＝Va/V、Ｖは第１及び第２素子との電位差でd0は第１素子と第２素子の間の距離である。試料イオンの初期時間分布が比較的広がっている時、例えば、比較的長いレーザーパルスを使用したときには、時間遅延が全イオン化時間より長いことが必要である。特定の質量についてVa値を減じればこれはできる。このように、特定の質量荷電比のイオンに与えられた初期時間、及びエネルギー分布については、そしてあたえられたTOF分析機幾何学については、第２電場の大きさと試料にレーザーパルスをかけるのと第２電場をかけるのとの時間差を最適質量分解能を得るために決定することができる。
第１電場は遅延し、イオンを試料表面に加速する。この電場の大きさは自由に選んでよい。第１電場E1でのおよその最適値は
E1＝5mvo／△ｔ                            （４）
で与えられる。ここで、ｍは問題の最小の質量をダルトンで、voは最も確率の高い初期速度をメーター／秒で、△ｔはイオン化パルスと第２電位をかける間の遅延時間をナノ秒で表したものである。遅延方向へかけられた第１電場のこの大きさで、最も確率の高い速度の半分に等しい速度を有する選択された質量のイオンは第２電位がかけられたときに止められる。最も確率の高い速度の四分の一以下の速度のイオンは試料表面に戻り中性化される。MALDIでは、ほんの僅かの分画のイオンしか最も高い確率の速度の四分の一以下の速度を有しない。このように、選択された高い質量のイオンは高い効率で抽出され、検出される。一方、選択された質量の約四分の一以下より小さい質量のイオンは、それらは第２電場がかけられる前に試料に戻り中性化されるために、殆ど完全に抑制される。
本方法は電場や時間遅延の最適な値を計算するコンピューターアルゴリズム、電源や遅延発生器の出力を自動的に調整するコンピューターやコンピューターインターフェイスの利用も含まれる。
本方法は、生体分子がDNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも１つの化合物からなる試料を測定することが含まれる。試料はレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を一、若しくはそれ以上の分子の脱着及びイオン化を容易にするために含むことができる。
性能の最も重要な改善はオリゴー、もしくはポリヌクレオチドのような非常に極性の高い生体高分子で観察される。この改善された分解能はDNA配列はしごの質量分析計での評価には必須である。
図4a−ｂは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計でオリゴヌクレオチドの質量分解能の改善を示したものである。図4aは従来のMALDITOF型の質量分析計で記録したDNA22マー試料のスペクトルである。281という質量分解能が得られた。図4bは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録したDNA22マー試料のスペクトルである。図4bの質量分解能は同位元素の限られた値に相当する。同じ分子質量500、若しくは600の小さい蛋白質には、従来型のMALDI質量分析計での質量分解能がきまりきっている。このように、本発明の原理を取り入れることにより、DNAや炭水化物のMALDITOF型質量分析計の分解能に著しい改善がみられる。
本発明の特徴を取り入れたMALDITOF型質量分析計の一つの有利な点は質量分析計についているイオン反射器を用いて操作パラメーターを選択することにより初期運動エネルギーの広がりを高次に修正することができる点である。
図５は本発明の原理を取り入れ、一段階イオン反射器150を含むレーザー脱着／飛行時間型質量分析計の概要図である。この実施例は保持器154がある二場イオン源152と第一素子156と第二素子158が含まれる。電源（示されていない）は保持器154、第１素子156と第２素子158に、図２と関連するテキストに説明してあるようにイオン抽出前に第１素子156と第２素子の間の電場が可変になるように、電気的に接続されている。この実施例は試料イオンとイオン化し、脱着するレーザー159を含んでいる。試料160は保持器154に添着される。試料160はレーザー158の波長でよく吸収するマトリックス分子を含有することができる。マトリックスは試料160の脱着とイオン化を容易にする。
イオン反射器150は無場ドリフト領域162の末端に配置され、初期運動エネルギー分布の効果をイオンの飛行経路を変化させることによりうめあわせるのに利用される。第１検出器164は脱エネルギー化されたイオン反射器でイオンを検出するのに使用される。第２検出器166はエネルギーを与えられたイオン反射器150とともにイオンを検出するのに使用される。
イオン反射器150は無場ドリフト領域162の末端で、第１検出器164の前に配置される。イオン反射器150は加速電圧より僅かに大きいレベルまで増加させる電位でバイアスをかけられた一連のリング168からなっている。操作では、イオンが反射器に侵入すると、場の方向の速度がゼロになるまで減速される。速度ゼロのところでイオンは方向を反転し、反射器150を通って後ろに加速される。イオンははいってきたエネルギーと同一のエネルギーをもって反対方向の速度を持って反射器150から放出される。より大きなエネルギーを有するイオンは反射器により深く侵入し結果として反射器の中により長時間留まることになる。質量及び電荷様イオンが第２検出器166に同時に到達するようにイオンの飛行経路を変えるのに電位を選択する。
図6a−ｂは反射器を有し、本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録されたRNA  12マーの試料の約８、000の質量分解能を、RNA  16マー試料の約５、500の質量分解能を示したものである。これらの例で観察された分解能は低いほうの限度であった、というのは検出器のエレクトロニクスのデジタル化速度がこの分解範囲での本当のピークプロファイルを検出するのに十分でなかったからである。同様の結果がペプチドや蛋白質について得られた。本発明はこのように全ての種類の生体高分子の分解能を改善する。これは、従来型のオリゴヌクレオチドの分解能や感度がペプチドや蛋白質と比較して著しく劣っているMALDIとは対照的である。
本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計の他の有利な点は高エネルギー衝突の数を減少させることができることである。連続イオン抽出下でイオンはイオン化の直後に除去された物質の比較的密な円錐状の柱を通して抽出される。高エネルギー（熱エネルギーより高い）衝突は相関性のないイオンシグナルを生じる加速過程での高速フラグメント化プロセスという結果をひきおこす。この相関性のないイオンシグナルは質量スペクトルに著しくノイズを増加させる。本発明の原理を質量分析計に取り入れることによりイオン抽出前、及びその間の電場や、抽出遅延時間のようなパラメーターは除去された物質の円錐状物が高エネルギー衝突の数を減少させるのに十分なように拡散するように選択することができる。本発明はイオン抽出の間に起こる高エネルギー衝突の数を減少させることによりMALDITOF型質量分析計の分解能を改善する事にも特徴がある。試料保持器の近位部に置かれた試料を有している試料保持器に電位をかける。試料は分析される一若しくはそれ以上の分子からなる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。試料はイオンや中性分子の雲を除去するためのパルス状エネルギーを発生させるレーザーでイオン化される。
試料保持器、若しくは第１素子の電位とともに、試料と第１素子の間の第２電場を特定するイオン化に続く予め決められた時間に第２電位を試料保持器、若しくは第１素子にかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオンを抽出する。予め決められた時間は、イオン抽出の間イオンに衝突エネルギーを付加するのを実質的に除去するのに十分に、イオン及び中性分子の雲を拡散させるのに十分な時間である。予め決められた時間とは、雲中のイオンの平均自由経路が保持器と第１素子の間の距離を超える時間より大きくてもよい。
本方法は、第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子へ電位をかけるステップを含むことができる。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターはレーザーパルスに反応して生成された円錐状の柱の中性分子やイオンが、イオンと中性分子の更なる衝突が起こらないよう十分に真空中に拡散できるのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された質量の試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、生体分子がDNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物である試料を分析することを含むことができる。試料は生体分子の脱着及びイオン化を容易にするためにレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含有することができる。
本発明はマトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計でマトリックスシグナルの強度を減少させる方法にも特徴がある。本方法は試料にマトリックス物質を取り込む事も含まれる。第１電位は試料保持器にかけられる。抽出パルスの前に試料に逆バイアスをかける試料保持器と第１素子の間の第１電場を作るために試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。逆バイアスは試料保持器と比較して第１素子の電位を陽イオンを測定する場合はより陽性に、陰イオンを測定する場合はより陰性にすることで達成できる。
保持器の近位部に置かれた試料はパルス状エネルギーを発生するレーザーで照射される。マトリックス物質はエネルギーを吸収し、試料とマトリックスの脱着及びイオン化を容易にする。第１電場は試料から生成したイオンを減速するように選ばれる。この場は殆ど均一な初期速度で試料表面にもどるようにイオンを方向付け、減速する。最小の質量電荷比を有する最も軽いマトリックスは最初に方向転換し試料保持器に戻ってきて中性化するのに対し、生体分子からのより重いイオンが質量分析のために抽出されうる。
試料表面からイオンが離れてゆくように加速する試料保持器と第１素子の間の第２電場を作るパルス状エネルギーに続く予め決められた時間に試料保持器に第２電位がかけられる。レーザーパルスと第２電位をかける間の時間は本質的にマトリックスイオンの全てがそれらが中性化させられる試料表面に戻ってくるように選択される。このようにマトリックスイオンは抑制され、試料イオンが抽出される。
本方法はイオンを加速する第１素子と第２素子の間の電場を作る第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは選択された第２質量より大きな質量を有する試料イオンが最適質量分解能で検出でき、一方選択された第１質量より小さい質量を有するマトリックスイオンが抑制されるように選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、生じた特定のフラグメントの配列の質量電荷比を検出するステップ及び生体分子がDNA、RNA、ポリヌクレオチド、若しくはその合成変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物を含む試料を分析することを含むことができる。
本方法は第１若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器を用いることによりイオンビームのエネルギー拡散に高次の修正を提供し、本方法で含まれるとより高質量分解能さえ提供する。
図7a−ｃは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計でマトリックスシグナルをの減少と除去を示している。図7aは試料の電位がおよそグリッドの電位に相当する殆ど無場状態を示している。
試料ピークは2867と5734で標識されている。400以下の質量電荷比のピークはマトリックスイオンに相当する。図7bは、試料電位が第１グリッドと比較して25V逆バイアスされている。この結果、質量電荷比200以下のより軽いマトリックスイオンの量が見えるほど減少している。図7cは、試料電位が第１グリッドと比較して50V逆バイアスされている。この結果マトリックスイオンシグナルが完全に除去された。
本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計の他の利点は高速フラグメント化のバックグラウンドノイズと質量分解能にたいする影響を除去する事ができることである。高速フラグメント化は連続イオン抽出条件下での加速の間起こるフラグメント化を特定する。高速フラグメント化の時間尺度は一般的には１マイクロ秒以下である。高速フラグメント化はエネルギーが特定できないイオンや関係のないイオン（化学ノイズ）を生成させる。
本発明は実質的に全ての高速フラグメント化をイオン抽出前に完了させることによりマトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計のバックグラウンド化学ノイズを減少させる方法にも特徴がある。マトリックス物質が脱着及びイオン化を容易にするように、分析される一若しくはそれ以上の分子を含有する試料にマトリックス分子を取り入れる。試料保持器に電位がかけられる。試料保持器の電位とともに、試料と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電場がかけられる。
マトリックスがレーザーの波長で吸収するパルス状エネルギーを発生させるレーザーで試料はイオン化される。第１素子の電位とともに、イオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定する試料保持器にイオン化に続く予め決められた時間に第２電位がかけられる。予め決められた時間とは実質的に全ての高速フラグメント化プロセスが完了するのに十分長い時間である。
本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速するために第１素子と第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは実質的に全てのフラグメント化プロセスが完了するのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された質量の試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は、生体分子がDNA、RNA、ポリヌクレオチド若しくはその合成変種からなる群から選択される、又はペプチド、蛋白質、PNA、炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択される生物学的関心のある少なくとも一つの化合物である試料を分析するステップを含むことができる。
本方法は第１若しくは第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器を用いることによりイオンビームのエネルギー拡散に高次の修正を提供し、本方法で含まれるとより高い質量分解能を提供する。本発明の原理を取り入れたMALDITOC型質量分析計の他の利点は高速フラグメント化に対する修正されたイオンシグナルを発生することができる。
本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計の他の利点はイオン抽出前の試料保持器と第１素子の間の逆バイアス電場、エネルギーレーザーパルスとイオン抽出との間の遅延時間、及びレーザーエネルギー密度等の実験的パラメーターを正しく選択することによりフラグメントイオンの収率を増加できる事である。これは、抽出前にイオン源のイオン前駆体の保持時間を増加させたり、高速フラグメント化を受けている試料分子にさらにエネルギー移動を促進させることにより達成できる。イオン前駆体の保持時間は電場抽出を適当に調整することにより引き延ばすことができる。一般的には、より低い抽出場はより長い最適抽出遅延ができ従ってより長い保持時間になる。試料へのエネルギー移動は非常に高いレーザーエネルギー密度を使用することにより高めることができる。遅延イオン抽出は従来のMALDIより過剰なレーザー照射により耐性である。マトリックス物質と、場合によっては添加剤の適当な選択も試料分子へのエネルギー移動に影響する。
本発明はマトリックス補助レーザー脱着・イオン化飛行時間型質量分析計を使用する高速フラグメント化プロセスから生じる生体分子の配列決定用のフラグメントイオンの収率を増加させる方法にも特徴がある。本方法は分析される一若しくはそれ以上の分子を含有する試料の中に分子の脱着、イオン化及び励起が容易になるようにマトリックス物質を取り込むことを含むことができる。試料保持器に電位がかけられる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。
分子はマトリックスにより吸収されるパルス状エネルギーを発生させるレーザーでイオン化されフラグメント化される。第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定する試料保持器に、イオン化に続く予め決められた時間に、第２電位がかけられる。第２電場は予め決められた時間の後にイオンを抽出する。予め決められた時間とは実質的に全ての高速フラグメント化を完了するのに十分長い時間である。
本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子２電位をかけるステップを含むことができる。
第１及び第２電場の大きさや方向、イオン化パルスと第２電場に電位をかける間の時間遅延等のパラメーターは実質的に全てのフラグメント化プロセスが完了するのに遅延時間が十分長いよう選択される。選択された試料イオンが最適質量分解能で検出されるのを確実にするようにパラメーターは選択される。パラメーターは、マニュアルで、若しくはコンピューター、コンピューターインターフェイス、及びコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。
本方法は生じる配列特異的フラグメントの質量電荷比を検出するステップ、及び生体分子がDNA,RNA,ポリヌクレオチド及びその合成変種からなる群から選択された試料中の少なくとも一つの生体分子、若しくはペプチド、蛋白質、PNA,炭水化物及び当蛋白質からなる群から選択された少なくとも一つの生体分子の配列を同定するステップを含むことができる。
本方法はイオン化の間生体分子にエネルギー移動を増加させることにより生じるフラグメントの収率を増加させるステップを含むことができる。エネルギー移動は生体分子が吸収する波長におよそ等しいレーザー波長を選択することにより増加できる。エネルギー移動はマトリックスに添加剤を取り込むことにより増加できる。
マトリックスは特に生体分子のフラグメント化を促進するように選択される。生体分子はオリゴヌクレオチドであってもよく、マトリックスは少なくとも２、５−ジヒドロキシ安息香酸及びピコリン酸を含有することができる。第２物質をマトリックスにフラグメント化を促進するために加えることができる。添加物はレーザーの波長で吸収するが、マトリックスそれ自身として必ずしも有効である必要はない。別の選択としては、添加剤はレーザーの波長で吸収しなくてもよく、マトリックス自身として有効でなくともよいが、マトリックスから試料へのエネルギー移動を促進し、これによりフラグメント化を促進する。
本方法は第１及び第２素子から空間的に離れているイオン反射器をエネルギー化するステップを含むことができる。反射器を用いることによりイオンビームのエネルギー拡散の高次の修正を提供し、本方法に組み込まれたときにはより高い質量分解能を提供する。
図8aは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録された殆ど一つ及び二つの電荷を持ったそのままのイオンを発生させる11マーのDNA試料を示しており、ここでの課題はフラグメント化を抑制し、最小のフラグメント化で高分解能、及び高感度を得ることである。
図8bはフラグメントイオンの収率を増加させるために、本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録した11マーのDNA試料を示している。試料は比較的長い抽出遅延（500ナノ秒）及び比較的高いレーザーエネルギー密度を許容するイオン抽出の前に試料保持器と第１素子の間の逆バイアス電場で測定される。フラグメント化はさらに２、５−ジヒドロキシ安息香酸を使用すると促進される。これらの実験的パラメーターは大量のフラグメントイオンを発生させる。このフラグメントイオンスペクトルの解釈でオリゴヌクレオチドの配列がわかる。"w"イオンシリーズは殆ど完全で、最も右の二つの残基まで配列を特定し、また、そのジヌクレオチド片の組成（配列ではないが）をも提供する。図8cはフラグメントイオンの命名法を説明している。
当業者ではイオン化に赤外レーザーを利用する有利な点があるMALDITOF型質量分析計の重要な応用がある。残念ながら、CO2レーザーのような好ましい特性を有する多くの赤外レーザーはパルス幅が100ナノ秒より長いものである。一般的に、従来型のMALDITOF型質量分析計でそのような長いパルスを使用すると、質量スペクトルピークがより長いイオン形成プロセスのために過剰に広くなり好ましくない結果となる。しかしながら、遅延抽出型のMALDITOF型質量分析計を使用すると長いイオン化レーザーパルスの好ましくない効果を除去できる。レーザーパルスの初期相で形成されるイオンは遅い相のレーザーパルスで形成されるものより早く試料表面から放出される。抽出の間、初期相イオンは遅い相のイオンより試料表面から遠く離れている。結果として遅い相のイオンは抽出パルスで少し高エネルギー側に加速されるであろう。最適条件下では遅い相のイオンは検出器で初期相イオンに追いつく。本発明の特徴を取り入れたMLDITOF型質量分析計の他の利点はロングパルス赤外レーザーを利用して高質量分解能を達成することができることである。ロングパルスとは検出されるときイオン束の好ましいピーク幅より長い長さのパルスとして定義される。パルス化されたイオン抽出装置で、好ましいピーク幅は、一般的には５−100ナノ秒である。好ましいピーク幅はイオンの質量電荷比で変化する。例えば、同位元素的に分解した小さいペプチドには５ナノ秒、質量電荷比30、000の蛋白質には100ナノ秒のように。
本発明はロングパルスレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計で分解能を改善する方法にも特徴がある。試料保持器に第１電位がかけられる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位がかけられる。試料保持器の近位部に置かれた試料は長時間パルス状エネルギーを発生させる赤外レーザーでイオン化されイオンを形成する。パルス状エネルギーの継続時間は50ナノ秒以上である。
試料保持器と比較して、第１素子の電位はイオン抽出前にイオンの質量により空間的に分離するため、陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定するときにはより陰性にすることができる。少なくとも第１、若しくは第２電位は飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特定するために、イオン化に続く予め決められた時間で変化する。予め決められた時間とはレーザーパルスの時間より長い時間である。
本方法は第１素子の電位とともに、イオンを加速する第１及び第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れた第２素子に電位をかけるステップを含むことができる。
試料は試料分子の脱着とイオン化を容易にするレーザーパルスの波長を吸収するマトリックス物質を含有することができる。試料はDNA,RNA,ポリヌクレオチド、及びそれらの変種からなる群から選択された生物学的に関心のある少なくとも１化合物、若しくはペプチド、蛋白質、PNA,炭水化物、糖結合物、糖蛋白質からなる群から選択された生物学的関心のある少なくとも１化合物を含有することができる。
図9a−ｃは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で非常に複雑なオリゴヌクレオチド混合物を分析することができる事を示したものである。図9aは従来型のMALDITOF型質量分析計で記録された配列特異的な不純物を含有する60マーDNA試料の質量スペクトルである。配列は読めない。
図9bは本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で記録された配列特異的な不純物を含有する60マーDNA試料の質量スペクトルである。配列の半分以上がスペクトルから読みとれる。図9Cは図9bで示された質量スペクトルの拡大部分を示す。図9cに示された性能のレベルは一バイアルのDNA配列用はしご状化合物を分析するのに適している。このように本発明の原理を取り入れたMALDITOF型質量分析計で４シリーズが全て存在するサンガー混合物を分析することができる。不純物のあるDNAの配列を分析する能力はDNA配列分析用混合物をプロファイルする可能性には必須である。
本発明は質量分析計でDNAの配列を測定する方法にも特徴がある。本方法は未知の配列のDNA片を含有する試料保持器に第１電位をかける事が含まれる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子との間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位がかけられる。試料はイオン化され試料イオンを形成する。第１若しくは第２電位の少なくとも一つが飛行時間を測定するためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特定するためイオン化に続く予め決められた時間に変化させられる。発生したイオンの測定された質量電荷比はDNA片の配列を得るために使用される。
試料中のDNAは分解され一群のDNAフラグメントになり、それぞれ共通のオリジンを持ちDNA配列に沿った特定の塩基端で終わっている。試料は試料の脱着及びイオン化を容易にレーザーパルスの量子エネルギーに実質的に相当する波長で吸収するマトリックス物質と混合された異なる群のDNAフラグメントの群れを含有含有していてもよい。一群のDNAフラグメントの１ピークの検出された分子量と他の群のDNAフラグメントの１ピークとを比較して質量差が決定される。
本発明はレーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析計の核酸の質量の分解能をイオン抽出の間、高エネルギー衝突とイオン電荷交換を減少させることにより改善する方法にも特徴がある。核酸を含有する試料保持器に電位がかけられる。試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する試料保持器から空間的に離れている第１素子に電位がかけられる。試料はパルス状エネルギーを発生させるレーザーでイオン化されイオン雲を形成する。第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定し、イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器に第２電位をかけ、予め決められた時間の後にイオンを抽出する。第１素子の電位とともに、第１、及び第２素子の間の電場を特定する第１素子から空間的に離れている第２素子に電位をかけてもよい。
予め決められた時間はイオン抽出の間衝突エネルギーの付加とイオンからの電荷移動を実質的に除去するのに十分なように、イオン雲を拡散するのに十分な長さが選択される。予め決められた時間は、雲の中のイオンの平均自由経路が保持器と第１素子との間の距離におよそ等しくなる時間より長いように選択される。予め決められた時間は実質的に全ての高速フラグメント化が完了する時間より長いように選択される。
試料は試料の脱着及びイオン化が容易になるようにレーザーパルスの波長で吸収するマトリックス物質を含有することができる。
本発明はMALDITOF型質量分析の正確な分子量を得る方法にも特徴がある。MALDITOF型質量分析の主要な問題は未知化合物を含有する試料に対して既知化合物を含有する内部標準を使用しないで正確な分子量を得ることは難しいことである。残念ながら、異なる試料では感度が大きく異なって反応するので、内部標準の適正な量を含有する試料を調整できるまでに、何回も試みることが必要になる。また、内部標準は未知の試料と同じ質量のイオンを生じることにより測定を干渉することもある。このようにMALDITOF型質量分析の多くの応用には内部標準を用いないで測定された飛行時間を非常に高精度で正確に質量に変換する事ができることが重要なことである。
原理的には、どのような質量のイオンの飛行時間も電位や距離のような関連パラメーターの様に正確に計算することは可能である。しかし、従来のMALDITOF型質量分析計では、正確な計算は加速後のイオン速度が正確には分からないので一般的には可能ではない。試料表面から脱着した物質の円錐状の柱の中でイオンと中性分子の間の衝突するためにこの不確定性が生じる。そのような衝突で損失するエネルギーはレーザー強度及び質量のようなパラメーターで変化する。このように、測定された飛行時間と質量の相関性はスペクトル毎に異なる。正確な質量を得るためには、スペクトルを正確に測定し未知の質量を決定するために未知試料の質量と類似の質量を有する既知の化合物が含まれることが必要である。
本発明では、イオンは電場が弱いかゼロの領域で最初イオンを産生する。初期の場はイオンが最終的に抽出され検出される方向とは反対の方向にイオンを加速する。この方法で、衝突による著しいエネルギー損失をなくすように、円錐状柱が十分なくなるように抽出場に電位をかけるのを遅らせる。結果として、質量分析計のいなかる位置の、いかなるイオンの速度も正確に計算でき質量と飛行時間との相関性も正確に分かり、スペクトルの内部標準が不必要になる。
パルス化イオン抽出で、イオンの質量は以下の式で非常に高度の近似で与えられる：
Ｍ1/2＝A1（ｔ＋A2）（１−A3△ｔ＋A4t＋A5t2）                                            （５）
ここでｔは測定されたナノ秒の飛行時間である。A1はイオンの初期速度がゼロの時、質量と飛行時間を相関する比例常数である。A2はレーザーパルスと一時的なディジタル化のはじめの間の遅延時間でナノ秒で表される。A3は遅延走査が用いられたとき以外は小さい。遅延時間△ｔはレーザーパルスと誘導場に電位をかける間の時間である。他の用語は初期速度、第１素子の電圧、及び装置の幾何学にのみ依存する補正である。
上記の係数は以下の方法で装置パラメーターで説明できる：
A1＝Ｖ1/2（１＋αGw）/4.569DC］           （６）
DC＝Dzg（ｙ）                             （７）
ここでＶはキロボルトでの電源電圧、Ｄはmmでの無場距離、Gwは導線セッティング（％電源電圧）、αは実験的に決定された常数。
0003580553.tif 000003
daはmmでの最初のイオン加速領域、d0はmmでの第２加速領域、dmは電子増強機の前面の加速領域の長さ、Vmは電子増強機の前面にかける電圧をキロボルトで表している。
ｙ＝＝Vs/（Vs/Vg）＝100/（100−GR）       （10）
GR電源電圧の％でのグッリドセッティング。導線補正は線のまわりのイオンの最も確率の高い軌道に依存する。正確に導線電位でのドリフトチューブを通って移動するイオンに相当するδの最大値は0.005である。δの実際値はこれよりいくらか小さくレーザー設定に依存する。高次の補正項は
A3＝v0wy1/2/2De                           （11）
で与えられる。
A4＝v0day/2De                             （12）
Ａ５＝v02dawy3/2/8De3                     （13）
v0はミリメーター／ナノ秒での初期速度で、ｗは
0003580553.tif 000004
で与えられここで
ｘ＝（Vs−Vg）/Vg＝（100−GR）/GR         （15）
これらの値は誘導パルスをかける前にゼロの最初の場で操作するときにのみ厳密に利用できる。
イオン検出器を用いた場合、有効なドリフト距離は
Ｄ＝Dzg（ｙ）＋4dR/R                      （16）
ここでdRはmmで鏡の長さ、Ｒは電源電圧に対する鏡電圧の比である。反射器の通常操作では量ｗは
ｗ＝ｘ（d0/da）−１                       （17）
これらの変化で較正式は線形分析で使用されるものと全く同じである。ｙとｗは反射器については一般的にはずっと小さく、このように補正項もまた小さい。
本発明の実施の態様は次のとおりである。
1.以下の構成からなる飛行時間型質量分析計：
ａ）液体、若しくは固体試料からなるイオン源を供給する試料保持器
ｂ）イオン源をイオン化して試料イオンを形成するイオン化器
ｃ）試料イオンにエネルギーを課す第１の電場、この第１の電場は予め選択された非周期的、非ゼロの電場である、を調節可能な状態で発生させる手段
ｄ）試料イオンを抽出するための第２の電場、この第２の電場は前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場とは異なる電場である、を前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場の発生に次いで発生させる手段、及び
ｅ）イオン源が試料イオンを形成するイオン化に引き続いて予め決められた時間の後で第２の電場が発生するようにするため前記第２の電場の発生を遅延させる手段。
2.前記予め選択された非周期的、非ゼロの電場である第１の電場を調節可能な状態で発生させる手段及び前記第２の電場を発生させる手段が；
ａ）試料保持器から空間的に離れている第１素子；及び
ｂ）ｉ）第１素子と試料保持器の電位が独立して変化でき、第１素子と試料保持器のいずれにもイオン抽出前に、前記第１の予め選択された非周期的、非ゼロの電場を形成するため第１の可変の電位をかけ、そして
ii）第１素子と試料保持器の電位が独立して変化でき、第１素子と試料保持器のいずれにもイオン抽出のために、前記第２の電場を形成するため第２の可変の電位をかける、
ように第１素子と試料保持器に電気的に接続されている電源、
とからなる前記１記載の質量分析計。
3.イオン抽出前に遅延した電場を確立するように電源を調節するための手段を含む前記２記載の質量分析計。
4.第１素子の電位を試料保持器の電位と比較して、イオン抽出前に陽イオンを測定するときはより陽性に、つまりより高電位に、陰イオンを測定するときはより陰性に、つまりより低電位にセットするように電源を調節するための手段をさらに含む前記２記載の質量分析計。
5.試料イオンを加速するために、電場を発生させる第１素子とは空間的に離れている第２素子をさらに含む前記２記載の質量分析計。
6.第１素子から空間的に離れているイオン反射器をさらに含む前記２または５記載の質量分析計。
7.イオン化器がパルス状エネルギーを発生するレーザーである前記１記載の質量分析計。
8.前記第１の非ゼロの電場を調節可能な状態で発生させる手段及び前記第２の電場を発生させる手段が以下の構成からなる前記７記載の質量分析計：
ａ）試料保持器から空間的に離れている第１素子
ｂ）第１素子から空間的に離れている第２素子；そして
ｃ）パルス状エネルギーに反応し、第１素子、第２素子、及び試料保持器の各々に電位をかけるために第１素子、第２素子、及び試料保持器に電気的に接続された電源、ここで
ｉ）第１素子と試料保持器の間の電位差が前記予め選択された非周期的、非ゼロの第１の電場を特定し、
ii）第１素子と試料保持器の電位はイオン抽出前に独立して可変である、
iii）第１素子及び試料保持器の電位が予め決められた時間にイオン抽出を開始し、そして第２素子と第１素子との間の電位差が試料イオンを加速する。
9.第１素子の電位を試料保持器の電位と比較して、イオン抽出前に陽イオンを測定するときはより陽性に、陰イオンを測定するときはより陰性にセットするために電源を調節するための手段をさらに含む前記８記載の質量分析計。
10.前記電源の高電圧下、高速で作動するスイッチの制動器の入力部に操作的に接続されており、パルス状エネルギー出力に応答する遅延発生器をさらに含み、前記遅延発生器が前記スイッチをパルス状エネルギーに合わせて操作する制動記信号を発生させる前記９記載の質量分析計。
11.レーザーが遅延発生器を調節する手段を含む前記10記載の質量分析計。
12.試料保持器と第１素子の間の電圧を比較する回路をさらに含む前記８記載の質量分析計。
13.第２素子が接地されている前記８記載の質量分析計。
14.飛行時間型質量分析計により、試料中の分子から発生したイオンの質量電荷比を測定する方法であって；
ａ）試料保持器へ第１電位をかけ；
ｂ）試料保持器から空間的に離れている第１素子に第２電位をかけ、試料保持器の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第１電場を特定する；
ｃ）試料保持器の近位に置かれた試料をイオン化し、試料イオンを形成する、そして
ｄ）ステップｃ）に続き、予め決められた時間に第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させ、飛行時間測定のためにイオンを抽出する試料保持器と第１素子の間の第２の異なる電場を特定することを含む方法。
15.第１素子の電位および試料保持器の電位を独立して変化させることを含む前記14記載の方法。
16.質量電荷比によりイオンを空間的に分離する遅延した電場を確立するために、第１素子の電位及び試料保持器の電位を独立して変化させることを含む前記14記載の方法。
17.イオン抽出前に試料保持器の電位と比較して第１素子の電位を測定するときはより陽性に、つまりより高電位に、陰イオンを測定するときはより陰性に、つまりより低電位である前記14記載の方法。
18.試料保持器の近位に置かれた試料をイオン化する段階が、
ａ）試料はレーザーのパルス状エネルギーに実質的に相当する波長で照射を吸収するマトリックス物質と混合され、そして、
ｂ）レーザーのパルス状エネルギーを用いた試料のイオン化であって、マトリックス物質は試料分子の脱着及びイオン化を容易にするものであることを含む前記14記載の方法。
19.第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させるステップが次のステップからなる前記14記載の方法。
ａ）第１素子から空間的に離れている第２素子に、ａ）からｃ）の段階に引き続いて、予め決められた時間だけ第３の電位をかけ、そして、
ｂ）ａ）からｃ）の段階に引き続いて、予め決められた時間だけ第１若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させて、試料保持器と第２素子との間に第２の異なった電場を特定し、それにより飛行時間の測定のためにイオンを抽出する。
20.第１、若しくは第２電位の少なくとも一つを変化させるステップが、イオン化に続く予め決められた時間に試料保持器、若しくは試料のいずれかに第二電位をかけるステップを含み；
ｉ）第１素子の電位とともに、試料保持器と第１素子の間の第２電場を特定し；そして
ii）イオン抽出の間の過剰な衝突エネルギーを与えるのを実質的に除去するのに十分なように、試料のイオン化によって発生したイオン雲を拡散させるのに十分長い時間である予め決められた時間の後イオンを抽出する、
前記14記載の方法。
21.予め決められた時間が、イオン雲の中のイオンの平均自由経路が試料保持器と第１素子の間の距離より大きくなる時間よりも大きい時間である請求項20記載の方法。
22.予め決められた時間が、実質的に高速イオンの全てがフラグメント化する時間よりも大きい時間である前記20記載の方法。
23.第１電場は、イオンが試料保持器の方へ、式により与えられるおよそ最適の大きさE1で加速されるように、遅延する前記14記載の方法。
E1＝5mV0/Δｔ  ここで
ｍは問題の最小質量宇（ダルトン）、V0は最も確率の高い初期速度（メーター／秒）、Δｔは、イオン化と抽出の間の遅延時間（ナノ秒）である。
24.第１の電場は試料陽イオンの速度を遅らせ、陽イオンを試料保持器に向かって加速するものである前記14記載の方法。
25.第１の電場は試料陰イオンの速度を遅らせ、陰イオンを試料保持器に向かって加速するものである前記14記載の方法。
等価物
本発明は特定の好ましい実施の態様で特に示され、説明されているが、添付されているクレームにより特定されるように本発明の真意及び範囲から離れることなく形式や詳細の各種の変化ができるのは当業者には理解できることである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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