(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき被検物質を含有するサンプルを受容体Ａおよび発光原標識を含有するトレーサーに接触させる被検物質の測定方法において、被検物質は
ａ）トレーサーと複合体を形成し、この複合体が標識によって検出できるものである（イムノメトリーの原理）か、
ｂ）被検物質に向けられた受容体Ａへの結合でトレーサーと競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するものである（競合法の原理）か、または
ｃ）被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似する受容体Ａと競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するもの（競合法の原理）で、
さらに、
１）標識と相互作用することによって発光原標識と特異的に結合し、得られたシグナルを定性的および／もしくは定量的に変化させる受容体Ｂを添加し、ついで
２）標識によってもたらされるシグナルを測定することを特徴し、
この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に固定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れないか、またはその結合に加わってもその程度は僅かであって異なる被検物質濃度の検出および識別が保証される被検物質の測定方法。
【請求項２】
ａ）受容体Ａは被検物質に対する抗体であり、ｂ）トレーサーは被検物質の誘導体であって、受容体Ａおよび受容体Ｂの両者がこの被検物質の誘導体に向けられている競合原理による請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）トレーサーは被検物質および受容体Ａに向けられている受容体であり、ｂ）受容体Ａは被検物質ど構造的に同一であるかまたは被検物質の誘導体である競合原理による請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）受容体Ａは被検物質に向けられていて、ｂ）トレーサーは被検物質に向けられている受容体であり、この受容体は被検物質の受容体Ａのエピトープではない他のエピトープに向けられているかまたは被検物質が数個の同一のエピトープを有する場合は受容体Ａが認識するエピトープの他のエピトープもしくは同じエピトープを認識するイムノメトリーの原理による請求項１に記載の方法。
【請求項５】
受容体ＡおよびＢは異なる相に結合するかまたはその内部に存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
受容体ＡおよびＢは同一の相に結合するかまたはその内部に存在する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも一つの相は固体の内部または外部表面である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固体は膜、小チューブまたはマイクロタイタープレートもしくはその部分である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの相はプラスチック表面からなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの相は１または２以上の金属含有および／または金属イオン含有プラスチックビーズである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つの相は１または２以上の磁化可能なプラスチックビーズからなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
２つの相は異なるゲル相である請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
標識はルミネッセンス、蛍光、リン光、化学ルミネッセンス、生物ルミネッセンスまたはエレクトロルミネッセンスを発生できる基である請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標識はアクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド、ルミノール、イソルミノールもしくはこれらの物質の誘導体、ジオキセタン、ルシフェリン、シュウ酸エステルもしくはシュウ酸アミドである請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
標識はトレーサーに直接結合している請求項１〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標識は、標識すべき成分にに向けられている受容体により標識すべき成分に間接的に結合させる請求項１〜15のいずれか一項に記載の方法
【請求項１７】
受容体Ｂは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、化学的に修飾された抗体または化学杓に修飾された抗体フラグメントである請求項１〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
標識はアクリジニウム化合物であり、受容体Ｂは二重ヘリックスDNA構造を有し、それは受容体によって結合された標識からの発光を防止するかまたはより困難にする機能をもつ請求項１〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに受容体Ｂ′を加え、この受容体は標識に結合して、受容体Ｂによってもたらされるシグナルとは定性的および／または定量的に異なるシグナル変化を与える請求項１〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
受容体Ｂはいかなるシグナル変化も与えない請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
受容体Ａ、サンプル、トレーサーおよび受容体Ｂをインキュベートしたのち、標識によって誘発されるシグナルの測定時のサンプルの比率を低下させるために液体を加えるか、または受容体Ａ、サンプルおよびトレーサーをインキュベートしたのち、受容体Ｂは使用されたサンプルの容量より大きい液体容量中において添加される請求項１〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各場合において、標識に代えて受容体Ｂが、受容体Ｂに代えて標識が使用される請求項１〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
検出すべき被検物質を含有するサンプルを、発光原標識を含有するトレーサーおよび受容体Ａの予め形成された複合体と接触させる被検物質の側定方法において、被検物質は
ａ）被検物質に向けられた抗体Ａとの結合からトレーサーを置換するか、
ｂ）被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似している受容体Ａをトレーサーとの結合から置換し、
さらに、
１）トレーサーに結合する抗体Ｂを添加し、ついで
２）適当な分離工程後に、受容体Ａとトレーサーまたは受容体Ｂとトレーサーからなる複合体によって誘発きれるシグナルを測定することを特徴とし、
この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に固定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れないかまたはその結合に加わってもその程度はわずかで、異なる被検物質濃度の検出および識別は保証される被検物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、多相系においてイムノアッセイを行う方法に関する。
免疫学的検出方法は、インビトロ診断において極めて重要になってきている。この理由は、それらが高度に特異的で、極めて高感度であることによる。さらにこれらのアッセイは操作が容易である。この検出方法は、検出すべき被検物質とその１または２個以上の結合パートナーの間の免疫学的相互作用に基づくもである。
サンドイッチアッセイにおいては、被検物質はサンドイッチのように、２つの異なる抗体によって結合される。２つの抗体の１つは、その濃度の測定を可能にする標識（マーカー）をもっている。
サンドイッチ法は小さな被検物質には適当ではない。たとえば、立体的理由により２つの異なる抗体が同時に被検物質に結合できないからである。このような環境下には、一般に競合アッセイが使用される。これらのアッセイにおいては、被検物質と被検物質の合成誘導体が、たとえば抗体の結合部位で競合する。一般に、被検物質の誘導体（通常の競合法）もしくは抗体（たとえば、SPALT:固相抗原ルミネッセンス法）のいずれかが標識される。標識された成分はトレーサーと呼ばれる。
既知の競合法の欠点は、免疫測定アッセイにおける立場とは対照的に検出試薬を過剰に使用することができず、したがって、検出すべき免疫複合体側に有利な望ましい程度まで平衡位置を移動させることが不可能であるから、サンドイッチアッセイの場合に比較して感度が劣ることである。
一般に、標識によって放射されるシグナルを測定する前に、過剰の遊離トレーサー抗体（サンドイッチアッセイの場合およびSPALTを行う場合）または非結合被検物質トレーサー（通常の競合法の場合）の分離が必要である。
「均一系アッセイ」として知られている方法では、遊離トレーサーと結合したトレーサーからのシグナルは互いに異なるので、この種の分離は必要がない。
不均一系アッセイには、被検物質の濃度に相関するシグナルを測定する前に、通常は固相に結合している標識された免疫複合体を遊離の標識試薬から分離するために１もしくは２回以上の分離工程が要求されるという欠点がある。この付加的な工程は、アッセイが手作業で行われる場合には比較的労力を要し、その方法に誤差を生じる可能性を増大させる。自動分析装置によって実施する場合でも、この方法工程のために、一般にさらに付属装置を必要とするので、分離工程は不利である。
この理由から、初期段階には「均一系アッセイ」が開発された。EMIT（酵素増幅イムノアッセイ法;Biochem.Biophys.Res.Commun.47:846,1972）の名称で知られる均一系アッセイは、小分子たとえば薬物たとえばステロイド）の検出に有用であることがわかっている。改良されたEMITでは、標識として使用される酵素の活性は、被検物質／酵素接合体が被検物質に対する抗体に結合すると低下する。これは、抗体の存在下における酵素の活性中心に対する基質の親和性の低下もしくは立体障害、または酵素のコンホーメーションの変化によることが明らかである。
EMITの他の変法は、酵素に共有結合で結合する被検物質誘導体による酵素活性の阻害に基づくものである。この場合は、被検物質に向けられた抗体が酵素標識被検物質誘導体に結合したときに、その活性が回復する。この方法のさらに他の変法が比較的大きな被検物質、たとえばIgG用に開発されている（Anal.Biochem.102:167,1990）。しかしながら、この方法を用いて達成される感度はかなり低い。
FETIA（蛍光励起トランスファーイムノアッセイ;J.Biol.Chem.251:4172,1976）は、一方が抗体に連結し、他方が被検物質誘導体に連結する２つの蛍光分子の間のエネルギーの移動に基づく方法である。この場合は、検出すべき被検物質が標識抗体と標識被検物質誘導体の間の複合体の形成を妨害する。
ECIA（酵素チャネリング・イムノアッセイ;Anal.Biochem.1056:223,1979;Appl.Biochem.Biotechnol.6:53−64,1981）は、それぞれ異なる酵素をもつ抗体および被検物質トレーサーを使用する。第一の酵素反応の生成物が第二の酵素反応の基質を構成する。２つの反応の総速度はこの共固定化によって著しく増大する。
SEFIA（基質標識蛍光イムノアッセイ）においては、酵素基質で標識された被検物質誘導体が抗−被検物質抗体の結合部位で被検物質と競合する。抗体への基質標識被検物質誘導体の結合が基質の酵素との反応を妨害する（Burd J.F.,Feeney J.E.,Carrico R.J.,Bogulaski R.C.:Clin.Chem.23,1402,1977;Wong R.C.,Burd J.F.,Carrico R.J.,Buckler R.T.,Thoma J.,Bogulaski R.C.:Clin.Chem.25,686,1979）。
蛍光化合物が溶液中で偏光によって励起されると、観察される発光も偏光される。この偏光の程度は励起分子の移動度に依存する。蛍光トレーサーが抗体に結合した場合の蛍光トレーサーの移動度の低下が、蛍光偏光イムノアッセイにおいて、遊離および結合トレーサーの間の識別に使用される。
蛍光保護イムノアッセイ（H.E.Ullman:Tokai J.Exp.Clin.Med.,4巻，補遺,7−32頁,1979）は競合法に従って操作される均一系アッセイである。
慣用の競合アッセイでは、被検物質濃度が低い場合には、標識が抗−蛍光抗体にもう接近できなくなり、その結果、もう消光が起こらなくなるまでトレーサーを結合するのに十分な抗−被検物質抗体が遊離状態で残存する。この立体的遮蔽は抗−被検物質抗体を空間的需要の大きい成分とカップリングさせることによりさらに効果的にすることができる。
固相抗原法では、巨大な被検物質誘導体のトレーサー抗体への結合は、同様の様式で、それが抗−蛍光抗体に同時に結合することを妨害する。
蛍光保護イムノアッセイの変法においては、抗−蛍光抗体への活性炭のカップリングに基づく活性炭による光の非特異的な吸収が、消光効果（スカベンジング効果）の増強に利用される。
その他の方法としては、たとえばALFPIA（抗原標識蛍光保護アッセイ;Clin.Chem.25:1077,1979）またはSPA（シンチレーション近位アッセイ；米国特許第4,568,649号;WO 90/11524号）がある。この方法では、シグナルはシンチレーターに近接して結合する放射性トレーサーにより発生される。
本発明の基底にある目的は、即知の方法に比べてとくに感度、干渉による影響の可能性がないこと、および操作の容易性に関して優れたイムノアッセイを実施するための改良方法を提供することにあった。
この目的は、新規な本方法において、現在の技術水準から既知のイムノアッセイにおける慣用の成分、たとえば抗原、抗原誘導体または抗体とすることができる受容体Ａ、選択された試験構造とは独立にたとえば標識抗体または標識抗原とすることができるトレーサーに加えて、付加的成分として、標識に向けられ標識との相互作用によってシグナルを発生するかあるいはシグナルを定性的および／または定量的に変化させる受容体Ｂを用いることによって達成された。同時に、受容体ＡおよびＢを１または２以上の相に適当に固定化することにより、トレーサーが受容体ＡおよびＢに同時に結合しないことを保証できる。これには、受容体Ａに結合するトレーサーと受容体Ａに結合しないトレーサーが定性的および／または定量的に異なるシグナルを誘発するので、両者を直接識別できるという利点がある。その結果、現在の技術水準において既知のシステムと比較して、高い感度、干渉による影響の可能性の低下、および改良された操作性を示す試験系の確立が可能になる。
したがって、本発明は、検出すべき被検物質を含有するサンプルを受容体Ａおよびトレーサーに接触させる被検物質の測定方法において、被検物質は
ａ）トレーサーと複合体を形成し、この複合体が標識によって検出できるものである（イムノメトリーの原理）か、
ｂ）被検物質に向けられた受容体Ａへの結合でトレーサーと競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するものである（競合法の原理）か、または
ｃ）被検物質と構造的に同一であるかもしくは構造的に類似する受容体Ａと競合して、受容体Ａとトレーサーの複合体の形成に拮抗するもの（競合法の原理）で、
さらに、
１）標識と相互作用することによってシグナルを発生するかまたはシグナルを定性的および／もしくは定量的に変化させる受容体Ｂを添加し、ついで
２）標識によってもたらされるシグナルを測定することを特徴とし、
この場合、受容体ＡおよびＢは１または数個の相の上部または内部に適当に固定化して、トレーサーは、受容体ＡおよびＢが同時に参加する結合中に入れないか、またはその結合に加わってもその程度はわずかで異なる被検物質濃度の検出および識別は保証される、被検物質の測定方法に関する。
最も単純な場合、受容体Ｂは標識に対する抗体である。しかしながら、もちろん、標識が酵素である場合には受容体Ｂは酵素の基質または酵素の阻害剤とすることもできる。また、たとえば、標識はビオチン化酵素とし、受容体Ｂはビオチン残基に結合して酵素の触媒活性を阻害するアビジンまたはストレプトアビジンとすることもできる。常に重要なことは、標識と受容体Ｂがそれらの相互作用によってシグナルの発生またはシグナルの変化を生じるという意味で「対」を形成していることである。
当然、標識と受容体Ｂの位置を交換することもできる。たとえば、抗−被検物質抗体はついで、SPALTアッセイの場合、そうでない方が通常のように標識によって標識されるのではなく受容体Ｂに接合され、一方標識は、遊離の（すなわち固相結合被検物質（誘導体）に結合していない）抗−被検物質抗体と受容体Ｂの接合体のみが標識に結合できる位置に置かれてもよい。
本発明の範囲内において、トレーサーは最も一般的な形では標識された受容体であると理解すべきである。この場合、標識は共有結合または非共有結合によって受容体に結合することができる。トレーサーはすべて、受容体および標識も同様に、それらが有意義でありまた当業者に周知な様式で互いに組合わされる限り現在の技術水準で既知のものが本発明によって使用される。トレーサーの受容体部分は単一の受容体であってもまた互いに共有結合または非共有結合によって順次連結できる２以上の受容体から構成されていてもよい。
標識は、シグナルを放射できるか、または直接もしくは間接にシグナルを発生できる化合物、たとえば発光原グループまたは酵素を意味するものと理解すべきである。
慣用の競合アッセイの場合には、被検物質特異的な免疫反応の平衡は、上述の方法において、付加的な連結された免疫反応を用いて検出される免疫複合体の方向にシフトさせることができる。最も単純な場合、これは、被検物質が抗体Ａの結合部位から被検物質トレーサーを置換することによって達成され、このようにして「抽出」された被検物質トレーサーは、付加的な免疫反応において抗体Ｂにより結合される。
抗体Ａは被検物質および被検物質トレーサーの両者に向けられているのに対して、抗体Ｂは被検物質トレーサーとしか結合できない。その結果として、被検物質トレーサーは、平衡反応「抗体A/被検物質／被検物質トレーサー」に通常の様式で参加することはできない。
被検物質トレーサーのみに向けられている抗体Ｂのこの特異性によりならびに適当に高濃度の抗体Ｂを選択することによって、平衡位置を最も有利になるように変えることができる。これにより、通常の競合免疫反応の感度に関する欠点が低減される。トレーサーが抗体Ｂに結合した結果として標識によって放射されるシグナルが変化する場合には、この場合のシグナルの変化は測定すべき被検物質の濃度と相関することから、測定すべき成分を分離する必要はない。放射されるシグナルの変化は、抗体Ｂへの結合によって直接誘発するか、または抗体Ｂへの結合によりトレーサーをシグナル修飾環境に導入することによって誘発することができる。蛍光消光効果の場合には、これは、たとえば抗体Ｂを消光物質と接合することにより達成できる。
サンドイッチアッセイの場合、形成されるサンドイッチ複合体（捕捉抗体Ａ、被検物質およびトレーサー抗体から構成される）の数は被検物質の濃度に相関する。したがって、サンドイッチ複合体中に結合しないトレーサーの残存量もまた被検物質の濃度に相関する。遊離のトレーサーは抗体Ｂによって結合される。
本発明においては、２つの受容体ＡおよびＢの適当な固定化によって、トレーサーは受容体ＡおよびＢが同時に結合した安定な免疫複合体（たとえば抗体Ａ、被検物質トレーサーおよび抗体Ｂからなるサンドイッチ複合体）中には入れないことが保証する。これを達成するための一つの可能性には、受容体ＡとＢを異なる粒子にカップリングさせ、粒子のサイズおよび組成を、受容体ＡとＢが同時に参加するトレーサーの結合がさらに困難になるかまたは妨害されるように選択する方法がある。また、受容体ＡとＢの両者を同じ固相に結合させても、受容体ＡとＢが同時に関与する場合にはこのようなトレーサーへの結合がさらに困難になるかまたは妨害されるような十分の距離を置いて結合させることもできる。
例として、選択が可能な一部の原理を図１に図解的に示す。
このよな空間的配置の例は以下の通りである。
1.  抗体Ａと抗体Ｂを異なるプラスチックビーズに結合させ、ビーズのサイズまたは質量を十分大きく選択して、抗体Ａおよび抗体Ｂが共通に関与する結合によって２つのビーズを安定に架橋することを不可能にするか、または立体障害により抗体Ｂでコートされたビーズが抗体Ａによってコートされたビーズに十分結合できないようにする配置。
2.  抗体Ａはプラスチックビーズに結合させ、抗体Ｂは反応チューブの内壁に結合させる配置。
以下は、選択可能な不均一系アッセイの操作の例である。すなわち、予め被検物質トレーサーで飽和させた固定化抗体Ａ（抗−被検物質抗体）でコーティングしたプラスチックビーズを、抗体Ｂ（抗−標識抗体）でコーティングしたポリスチレンチューブに加える。被検物質を含むサンプルおよびインキュベーション緩衝液を加えたのち、懸濁液をインキュベートし、ついでプラスチックビーズを除去する。チューブ内に残ったシグナルを測定する。
3.  たとえば、OPUS（登録商標）システム（BDI,Westwood,MA,USA）において使用されているような試験要素の異なるゲル相への抗体Ａおよび抗体Ｂの固定（図２参照）。
3a.  OPUS試験モジュールを以下のように改変する。すなわち、抗−蛍光標識抗体（Ｂ抗体）をアガロースの最上層に包埋し、中間層は通常のように光学的フィルターとして用い、抗−被検物質抗体（抗体Ａ）および蛍光標識被検物質トレーサーからなる免疫複合体は最下層に包埋する。
負荷されたサンプルからの被検物質は、免疫複合体からトレーサー分子を置換し、トレーサーは最下層から拡散して最上層の抗−蛍光標識抗体によって結合される。最下層の蛍光シグナルを測定する。これから、被検物質濃度の増大とともに下降する標準曲線が得られる。
3b.  OPUS試験モジュールを以下のように改変する。すなわち、抗−蛍光標識抗体（Ｂ抗体）をアガロースの最下層に包埋し、中間層は通常のように光学的フィルターとして用い、抗−被検物質抗体（抗体Ａ）および蛍光標識被検物質トレーサーからなる免疫複合体は最上層に包埋する。
負荷されたサンプルからの被検物質は、免疫複合体からトレーサー分子を置換し、トレーサーは最下層に拡散して抗−蛍光標識抗体によって結合される。最下層の蛍光シグナルを測定する。これから、被検物質濃度の増大とともに上昇する標準曲線が得られる。
4.  抗体Ａと抗体Ｂを膜繊維に結合させ、繊維上の抗体Ａと抗体Ｂの距離は２つの抗体が同時にトレーサーとの結合に入れないことを保証する配置。
抗体Ｂへのトレーサーの結合がトレーサーによって放射されるシグナルに変化をもたらす場合には、アッセイはついで、分離および／または洗浄工程が不要になる様式で実施できる。この場合、シグナルの変化は測定すべき被検物質の濃度と相関する。シグナルの変化は、定性的なシグナル変化たとえば発光波長のシフトおよび／または定量的シグナル変化たとえばシグナルの消光であってもよい。後者は、アクリジニウムアシルスルホンアミド標識の例を用いて図３に示す。
標識／抗−標識抗体対が酵素／酵素基質対で置換された場合には、シグナルの変化に代えてシグナルを発生させることができる。
インキュベーション（工程）は様々な方式で実施できる。順序の選択は、不均一系の操作の場合のように、通常の至適化作業の一部である。例としては以下の方式がある。
1.  抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質トレーサーからなる予め形成された複合体を被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。シグナルは時間t2後に測定する（図４の上の列参照）。
2.被検物質誘導体（固相に結合されている）と標識された抗体Ａからなる予め形成された複合体を（SPALTの原理）被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。シグナルは時間t2後に測定する（図４の中央の列参照）。
3.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を、被検物質を含有するサンプルおよび抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）とともにインキュベートする。予め形成された複合体を不安定化してトレーサーの置換を促進するために、修飾された被検物質を予め形成されたサンドイッチ複合体中に被検物質に代えて使用することもできる（図４の下の列参照）。
4.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を添加し、シグナルを時間t2の経過後に測定する（図５の上の列参照）。
5.被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質の予め形成された複合体を添加する。時間t2の経過後に、抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後にシグナルを測定する（図５の中央の列参照）。
6.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、およびトレーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を加える。その結果、サンドイッチ複合体中に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂによって結合される（図５の下の列参照）。
7.抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質または被検物質誘導体の予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルおよび被検物質トレーサーとともにインキュベートする。抗体Ａによって結合されていないトレーサーの部分が抗体Ｂにより結合される。
これに加えて、アッセイの操作はトレーサーと抗体Ｂの間の免疫反応にトレーサーと付加的な抗体Ｂ′の間の付加的免疫反応を連結することによって改変することができる。たとえば、固相に結合されている抗体Ｂが、被検物質特異的免疫反応後または反応時に残存するトレーサーの遊離部分を結合する機能を有するとしても、このトレーサー部分のシグナルを何らかの変化から保護するために、被検物質特異的結合に包含されるトレーサーのシグナルを固相には結合しない抗体Ｂ′を添加することによって選択的に改変することができる。
この付加的インキュベーション工程は、たとえば、手作業で行われるアッセイではたとえば、抗体Ｂがその作用を発揮する時間をより正確に制御できること、および／または、たとえば存在するもしくは添加できる抗体Ｂの量はその抗体が固相に結合されていることにより限られる場合に、適当な高濃度の抗体Ｂ′によってシグナルにより迅速におよび／またはより明瞭に顕著な変化をもたらすことにより有利である。
関連する例の一部を以下に掲げる。
8.抗体Ａ（固相に結合されている）と被検物質トレーサーからなる予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（異なる固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後に、抗体Ｂ′を添加し、適当な時間t3後にシグナルを測定する。
9.被検物質誘導体（固相に結合されている）および標識抗体Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする。抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後に、抗体Ｂ′を添加し、さらに時間t3の間インキュベートしたのちにシグナルを測定する（図６参照）。
10.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を被検物質を含有するサンプルおよび抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）とインキュベートする。ついで抗体Ｂ′を添加し、シグナルを測定する。
11.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t2の経過後に抗体Ｂ′を添加する。ついでシグナルを測定する。
12.被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質からなる予め形成された複合体を加える。時間t2の経過後に、抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後に抗体Ｂ′を添加する。ついでシグナルを測定する。
13.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、その結果サンドイッチ複合体中に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂにより結合される。抗体Ｂ′を添加すると、この抗体はサンドイッチ複合体中に含まれるトレーサーに結合する。
トレーサーの標識基が酵素である場合には、抗体Ｂは酵素基質で置き換えることができる。この場合には、シグナルはトレーサーと酵素基質の間の接触の結果として発生する。この場合も、発生するシグナルは測定すべき被検物質の濃度に相関する。この例は以下の通りである。
14.抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質トレーサー（酵素で標識された被検物質誘導体）からなる予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベートする。異なる固相に固定化されている酵素基質は、このインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
15.被検物質誘導体（固相に結合されている）および酵素標識抗体Ａからなる（SPALTの原理）予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする。異なる固相に結合されている酵素基質はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
16.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を、被検物質を含有するサンプルおよび酵素基質（同様に固相に結合されている）とインキュベートする。
17.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに酵素基質（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t2の経過後にシグナルを測定する。
18.被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質からなる予め形成された複合体を加える。時間t2の経過後に酵素基質（同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後にシグナルを測定する。
19.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、およびトレーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、酵素基質Ｂ（同様に固相に結合されている）を加え、その結果として、サンドイッチ複合体中に結合していないトレーサーの部分が酵素基質と反応できる。
20.抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質トレーサーからなる予め形成された複合体を被検物質を含有するサンプルとともにインキュベートする。酵素に向けられ、酵素活性を減弱または阻害する抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）はこのインキュベートの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後に酵素基質を加え、適当な時間t3後にシグナルを測定する。
21.被検物質誘導体（固相に結合されている）および標識抗体Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする。酵素に向けられた抗体Ｂ（同様に固相に結合されている）は、このインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後に酵素基質を添加し、さらに時間t3のインキュベーション後にシグナルを測定する。
22.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質およびトレーサー抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を被検物質含有サンプルおよび抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）とインキュベートする。ついで酵素基質を加え、シグナルを測定する。
23.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質トレーサーおよび被検物質を含有するサンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）を添加し、時間t2の経過後に酵素基質を加える。ついでシグナルを測定する。
24.被検物質を含有するサンプルおよびトレーサー抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質の予め形成された複合体を加える。時間t2の経過後に、抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後に酵素基質を添加する。ついでシグナルを測定する。
25.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプル、およびトレーサー抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば抗体Ｂ（酵素に向けられ、同様に固相に結合されている）を加えると、その結果サンドイッチ複合体中に結合していないトレーサーの部分が抗体Ｂによって結合される。酵素基質を添加することにより、サンドイッチ複合体中に包含されるトレーサーがシグナルを発生できる。
ここに挙げた例はすべて、もちろん、標識の位置と受容体Ｂの位置が交換された変法で操作することができる。この例は以下の通りである。
26.抗体Ａ（固相に結合されている）および受容体Ｂに接合された被検物質誘導体の予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベートする。標識（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
27.被検物質誘導体（固相に結合されている）および抗体Ｂに接合された抗体Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。標識（同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
28.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および抗体Ｂで標識された抗−被検物質抗体の予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を被検物質含有サンプルおよび標識（同様に固相に結合されている）とインキュベートする。
29.抗体Ａ（固相に結合されている）、抗体Ｂに接合された被検物質誘導体、および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに、標識（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t2の経過後にシグナルを測定する。
30.被検物質を含有するサンプル、および抗体Ｂと接合された抗−被検物質抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質の予め形成された複合体を加える。時間t2の経過後に、標識（同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後にシグナルを測定する。
31.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプル、および抗体Ｂと接合された抗−被検物質抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、標識（同様に固相に結合されている）を加えると、その結果サンドイッチ複合体中に結合していない抗体Ｂと接合された抗−被検物質抗体の部分が標識を結合できる。
32.抗体Ａ（固相に結合されている）および酵素基質によって標識された被検物質誘導体の予め形成された複合体を、被検物質含有サンプルとインキュベートする。異なる固相に固定化されている酵素はこのインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
33.被検物質誘導体（固相に結合されている）および酵素基質で標識された抗体Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。異なる固相に結合している酵素は、このインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後にシグナルを測定する。
34.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および酵素基質で標識された抗−被検物質抗体からなる予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を被検物質含有サンプルおよび酵素（同様に固相に結合されている）とインキュベートする。
35.抗体Ａ（固相に結合されている）、酵素基質によって標識された被検物質誘導体および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのちに、酵素（同様に固相に結合されている）を添加し、時間t2の経過後にシグナルを測定する。
36.被検物質を含有するサンプル、および酵素基質で標識されている抗−被検物質抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質の予め形成された複合体を添加する。時間t2の経過後に、酵素（同様に固相に結合されている）を加え、時間t3後にシグナルを測定する。
37.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質を含有するサンプル、および酵素−基質で標識されている抗−被検物質抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、酵素（同様に固相に結合されている）を加えるとその結果サンドイッチ複合体中に結合していない酵素−基質で標識されている抗体の部分が酵素と反応可能になる。
38.抗体Ａ（固相に結合されている）と酵素−基質で標識されている被検物質誘導体からなる予め形成された複合体を被検物質含有サンプルとインキュベートする。酵素基質に向けられた抗体Ｂ（酵素基質の酵素的変換をそれへの結合により阻害または防止する。抗体Ｂは同様に固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるかまたはある時間t1の経過後にはじめて添加する。時間t2後に酵素を添加し、適当な時間t3後にシグナルを測定する。
39.被検物質誘導体（固相に結合されている）および酵素−基質で標識された抗体Ａ（SPALTの原理）からなる予め形成された複合体を、被検物質を含有するサンプルとインキュベートする。酵素基質に向けられた抗体Ｂ（異なる固相に結合されている）はこのインキュベーションの最初から存在させるか、またはある時間t1を経過したのちにはじめて添加する。時間t2後に酵素を添加し、さらに時間t3のインキュベーション後にシグナルを測定する。（図７参照）。
40.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質、および酵素基質で標識されている抗−被検物質抗体の予め形成された複合体、すなわち予め形成されたサンドイッチ複合体を、被検物質含有サンプルおよび抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）とインキュベートする。ついで酵素を添加し、シグナルを測定する。
41.抗体Ａ（固相に結合されている）、酵素基質で標識されている被検物質誘導体および被検物質含有サンプルを一緒にインキュベートする。ある時間t1を経過したのち、抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）を加え、時間t2の経過後に酵素を添加する。ついでシグナルを測定する。
42.被検物質含有サンプルおよび酵素基質で標識されている抗−被検物質抗体を一緒にインキュベートし、ある時間t1を経過したのちに、抗体Ａ（固相に結合されている）および被検物質の予め形成された複合体を加える。時間t2の経過後に抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）を添加し、時間t3後に酵素を加える。ついでシグナルを測定する。
43.抗体Ａ（固相に結合されている）、被検物質含有サンプル、および酵素基質で標識されている抗−被検物質抗体をインキュベートする。サンドイッチ複合体が形成されたならば、抗体Ｂ（酵素基質に向けられ、同様に固相に結合されている）を加える。その結果として、サンドイッチ複合体中に結合していない酵素基質で標識されている抗体の部分が、抗体Ｂによって結合される。酵素を加えると、サンドイッチ複合体中に含まれるトレーサーがシグナルを発生できる。
本発明をさらに以下の実施例によって記述する。実施例は本発明をさらに詳細に説明することを意図するものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではなく、本発明は請求の範囲によって決定される。
実施例  １
PSAの測定のためのルミネッセンスイムノアッセイ（LIA）
試薬の調製：
固相Ａ：
Rhone−Poulenc（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子をモノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−283/029;Behringwerke AG,Marburg）により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら、Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,2部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Wey1,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液［50mM2−シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（CHES）,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0］中磁性粒子2.5mg/lの濃度とした。
固相Ｂ：
磁性粒子を、固相Ａの場合と同様に、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 541およびEP−Ａ−0 330 050）に対するモノクローナル抗体［BW 90−9/04;Behiringweke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germany寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によりコ−トした。
トレーサー：
モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−284/03,Behringwerke AG）をアクリジニウムＮ−アシルスホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 54,EP−Ａ−0 330 050）によりモル比１＋１で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実施した（NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応性基;A.K.Campbell,Chemiluminescence:Principles and Applications in Bioligy and Medicine,1版,VCH/Horowood,Weinheim/Chichester,1988,439頁）。精製にはゲル透過クロマトグラフィー（Sephadex G25）を用いた。トレーサーは、トレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム,150mM NaCl,2g/lウシ血清アルブミン,0.1％ Mergal K9N,pH5.0）中300ng/mlの濃度で保存した。
PSA標準：
PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成:50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN3、0.01％ Tween 20,0.5g/lウシIgG,40g/lウシ血清アルブミン、8mg/l Titriplex V,pH7.6とした。標準濃度は０、50、100、200および400ng/mlとした。
予め形成された複合体：
抗−PSA抗体（固相Ａに結合している）およびPSAからなる予め形成された複合体は以下のようにして形成された。1mlの固相Ａ懸濁液および1mlのPSA溶液［20mg/ml（1g/lのウシIgGおよび0.5g/lのナトリウムアジドと含有する10mMリン酸塩緩衝液,pH7.3）］を37℃で30分インキュベートし、ついで粒子を1mlの緩衝液で５分間洗浄し（磁性分離）、最終容量を1mlとした。
アッセイ操作：
PSA含有サンプル10mlを10mlのトレーサーとともに室温で２分間インキュベートした。ついで予め形成された複合体10mlを加え、さらに２分後に10mlの固相Ｂを加えた。ついでサンプルをルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で測定した（測定時間１秒）。
結果は図８に示す。アッセイ操作は図8aに図解的に示す。
実施例  ２
PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA）
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000002
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子をモノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−283/029;Behringwerke AG,Marburg）により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthesevon Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を使用してコ−トした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液1mlについて抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液［50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0］中磁性粒子濃度10mg/mlとした。
固相Ｂ：
磁性粒子を、固相Ａの場合と同様に、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 541およびEP−Ａ−0 330 550）に対するモノクローナル抗体［BW 90−9/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によりコ−トした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサー：
モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−284/03,Behringwerke AG）をアクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 54,EP−Ａ−0 330 050）によってモル比１＋0.5で標識した。標識化は文献記載のNHS法で行った（NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応基;A.K.Campbell,Chemiluminescence:Principles and Applications in Bioligy and Medicine,1版,VCH/Horwood,Weinheim/Chichester,1988,439頁）。精製にはゲル透過クロマトグラフィー（Sephadex G25）を使用した。トレーサーは、トレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム,150mM NaCl,2g/lウシ血清アルブミン,0.1％ Mergal K9N,pH5.0）中30mg/mlの濃度で保存した。
PSA標準：
PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成:50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN3、0.01％Tween20、0.5g/lウシIgG、40g/lウシ血清アルブミン、8mg/l Titriplex V、pH7.6とした。標準濃度は０、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.2および12.5mg/mlとした。
アッセイ操作：
PSA含有サンプル10mlを10mlのトレーサーおよび10mlの固相Ａとともに37℃で20分間インキュベートした。ついで10mlの固相Ｂを加え、さらに15分後に、混合物をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した。
結果は図９に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。
実施例  ３
サイロキシンの測定のためのSPALTアッセイ
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000003
（カタログ番号:EM1−100/20）の磁性粒子をBeriLux T3に使用されている蛋白質/T3接合体により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液1mlあたり接合体0.3mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（50mM Tris/クエン酸緩衝液,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH7.0）中2.5mg/mlとした。
固相Ｂ：
0003580504.tif 000004
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子を、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 541 ならびにEP−Ａ−0 330 050）に対するモノクローナル抗体［BW 90−9/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物および培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託］により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成），第II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサー：
モノクローナル抗−T4抗体（BW 86−49/7/1,Behringwerke AG）をアクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標識（EP−Ａ−0 257 54,EP−A0 330 050）によりモル比１＋５で標識した。標識化は、文献記載のNHS法で実施した（NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応性基;A.K.Campbell,Chemiluminescence:Principles and Applications in Bioligy and Medicine,1版,VCH/Horwood,Weinheim/Chichester,1988,439頁）。精製にはゲル透過クロマトグラフィー（Sephadex G25）を使用した。トレーサーは、トレーサー緩衝液（100mMクエン酸／リン酸緩衝剤,2g/lポリエチレングリコール6000,2g/l Mowiol,pH6.3）中40mg/mlの濃度で保存した。
T4標準：
T4標準用緩衝液は以下の組成とした。10mMリン酸塩,1g/lウシIgG,0.5g/l NaN3,pH7.3。標準濃度は０、0.1、0.5、１、５、10ならびに50mg/mlとした。
予め形成された複合体：
予め形成された複合体（固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のようにして調製された。6mlの固相Ａを3mlに濃縮した（固相を磁性分離し、緩衝液に再懸濁する）。ついで0.2mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分インキュベートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝液、1g/lウシIgG、0.5g/l NaN3、pH7.3（洗浄緩衝液）で５分間洗浄した。粒子は3mlの洗浄緩衝液中に保存した。
アッセイ操作：
T4含有サンプル10mlを10mlの予め形成された複合体と室温で２分間インキュベートした。ついで10mlの固相Ｂを加え、さらに２分後に混合物をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した。
結果は図10に示す。アッセイ操作は図10aに図解的に示す。
実施例  ４
サイロキシンの測定のためのLIA（保護／消光法）
試薬の調整：
固相Ａ：
0003580504.tif 000005
（カタログ番号:EM1−100/200）の磁性粒子、モノクローナル抗−T4抗体（BW 86−49/7/1,Behringwerke AG）によりカルボジイミド法を用いてコ−トした［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体1.2mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液［10.36g/l CHES,0.5g/l NaN3,1g/lウシIgG,pH8.0］中2.5mg/mlとした。
固相Ｂ：
0003580504.tif 000006
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子を、アクリジニウムＮ−アシルスルホンアミド標準（EP−Ａ−0 257 541およびEP−Ａ−0 330 050）に対するモノクローナル抗体［保護抗体,BW 90−9/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物および培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germany に寄託番号DSM ACC 2183として寄託］によって、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチド合成），第II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度、は10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液［10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0］中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサー：
BeriLux FT3に使用されているトレーサーを、トレーサー緩衝液（10mMリン酸塩緩衝剤,1g/l IgG,pH7.3）中360ng/mlの濃度で保存した。
消光抗体：
抗−標識抗体BW 90−8/04［Behringwerke AG;Deutsche Sammlug von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC2184として寄託］を緩衝溶液（10mMリン酸塩,1g/l IgG,0.5g/lナトリウムアジド,pH7.3）中に0.1mg/mlの濃度で保存した。
T4標準：
血清メジウム中濃度０、18、40、85、175および340ng/mlのBeriLux（登録商標）T4標準（Behringweke AG）を用いた。
予め形成された複合体：
予め形成された複合体（固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のようにして調製した。2mlの固相Ａに2mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分インキュベートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝剤、1g/l IgG、0.5g/lナトリウムアジド、pH7.3で５分間洗浄し、2mlとした。ついでANS（８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸）2mgを加えた。
アッセイ操作：
10mlの予め形成された複合体およびT4含有サンプル10mlを15分間インキュベートした。ついで10mlの固相Ｂおよび10mlの消光抗体を各場合10分間の間隔を置いて加え、懸濁液をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。
結果は図11に示す。アッセイ操作は図11aに図解的に示す。
実施例  ５
サイロキシンの測定のためのLIA
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000007
（カタログ番号:EM1−100/20）の磁性粒子を、モノクローナル抗−T4抗体（BW 86−49/7/1,Behringwerke AG）によりカルボジイミド法を用いてコ−トした［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液中、抗体1.25mg/mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,1g/lウシIgG,pH8.0）中2.5mg/mlとした。
固相Ｂ：
0003580504.tif 000008
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子をBeriLux標識に対するモノクローナル抗体［消光抗体,BW 90−8/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物および培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によって、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチド合成），第II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保持緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサー：
BeriLux FT3に使用されているトレーサーを、トレーサー緩衝液（10mMリン酸塩緩衝剤,1g/l IgG,0.5g/l NaN3,pH7.3）中360ng/mlの濃度で保存した。
T4標準：
血清メジウム中濃度０、18、40、85、175および340ng/mlのBeriLux（登録商標）T4標準（Behringwerke AG）を用いた。
予め形成された複合体：
予め形成された複合体（固相Ａに結合されているトレーサー）は以下のようにして調製した。2mlの固相Ａに2mlのトレーサーを加え、混合物を37℃で30分インキュベートした。粒子を10mMリン酸塩緩衝液、1g/l IgG、0.5g/lナトリウムアジド、pH3.7で５回洗浄し、2mlとした。ついでANS（８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸）2mgを加えた。
アッセイ操作：
10μｌの予め形成された複合体およびT4含有サンプル10μｌを15分間インキュベートした。ついで10μｌの固相Ｂを加えてさらに10分間インキュベートしたのち、懸濁液をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。
結果は図12に示す。アッセイ操作は図12aに図解的に示す。
実施例  ６
FT3の測定のためのLIA
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000009
（カタログ番号:EM1−100/20）の磁性粒子を、モノクローナル抗−T3抗体（BeriLux FT3抗体）によりカルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液中、抗体0.25mg/mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,1g/lウシIgG,pH8.0）中2.5mg/mlとした。
固相Ｂ：
0003580504.tif 000010
（カタログ番号:EM1−100/40）磁性粒子を、BeriLux標識に対するモノクローナル抗体［消光抗体,BW 90−8/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物および培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC 2184として寄託］によって、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチド合成），第II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサー：
トレーサー緩衝液（50mM Tris塩酸塩,150mM NaCl,0.5g/lナトリウムアジド,0.1g/l Tween 20,40g/lウシ血清アルブミン，ならびに8mg/l Titriplex V,pH7.6）中1ng/mlのハプテントレーサー（T3−アクチジントレーサー；図17参照）。
FT3標準：
血清メジウム中濃度０〜22pg/mlの濃度範囲のFT3標準を用いた。
アッセイ操作：
50μｌのサンプルを10μｌのトレーサーオよび10μｌの固相Ａと一緒に15分間インキュベートした。ついで10μｌの固相Ｂを加え、混合物をさらに10分間インキュベートしたのち懸濁液をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した。一定のインキュベーション温度37℃に保持した。
結果は図13に示す。アッセイ操作は図13aに図解的に示す。
実施例  ７
PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA）
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000011
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子をモノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−283/029;Behringwerke AG,Marburg）により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthesevon Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を使用してコ−トした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液1mlについて抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度10mg/mlとした。
固相Ｂ：
磁性粒子を固相Ａの場合と同様に、BeriLux標識に対するモノクローナル抗体［BW 90−8/04;Behringwerke AG;Deutsche Smmlungvon Mikroorganismen undZellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC2184として寄託］によりコ−トした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度5mg/mlとした。
トレーサー濃厚液：
モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−284/03,Behringwerke AG）をBeriLux（登録商標）標識によりモル比１＋10で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実施した（NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応基;A.K.Campbell,Chemiluminescence:Principles and Applications in Bioligy and Medicine,1版,VCH/Horwood,Weinheim/Chichester,1988,439頁）。精製はゲル透過クロマトグラフィー（Sephadex G25）で実施した。トレーサーはトレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム,150mM NaCl,2g/lウシ血清アルブミンおよび0.1％Mergal K9N,pH5.0）中30μl/mlの濃度で保存した。
トレーサー：
そのまま使用できるトレーサーの調製にはトレーサー濃厚液を0.1Mリン酸塩緩衝液（0.15g/l NaClおよび1g/lウシ血清アルブミン含有,pH6.3）で1:200の割合に希釈した。
PSA標準：
PSA（前立腺特異的抗原、Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成:50mM Tris,150mM NaCl,0.05％ NaN3,0.01％Tween20,0.5g/lウシIgG,40g/lウシ血清アルブミン,8mg/l Titriplex V,pH7.6とした。標準濃度は０、0.5、3.2、10.6、32,80および160ng/mlとした。
アッセイ操作：
PSA含有サンプル10μｌを10μｌの固相Ａおよび20μｌのトレーサーとともに37℃で15分間インキュベートした。ついで10μｌの固相Ｂを加え、さらに15分後に、混合物をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で0.7秒間測定した。発光試薬としては0.5％ H2O2および125mM NaOH含有20mM HNO3を使用した。
結果は図14に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。
実施例  ８
PSAの測定のためのイムノルミノメトリーアッセイ（ILMA）
試薬の調製：
固相Ａ
0003580504.tif 000012
（カタログ番号:EM1−100/40）の磁性粒子をモノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−283/029;Behringwerke AG,Marburg）により、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は、10％磁性粒子懸濁液中、抗体6mg/mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3および3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0］中磁性粒子濃度10mg/mlとした。
固相Ｂ：
磁性粒子を固相Ａの場合と同様に、BeriLux標識に対するモノクローナル抗体［BW 90−8/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH（ドイツ微生物ならびに培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC2184として寄託］によりコ−トした。そのまま使用できる懸濁液は、保存緩衝液（50mM CHES,0.5g/l NaN3,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度5mg/mlとした。
トレーサー濃厚液：
モノクローナル抗−PSA抗体（BW 92−284/03,Behringwerke AG）をBeriLux（登録商標）標識によりモル比１＋10で標識した。標識化は文献記載のNHS法で実施した（NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド反応基;A.K.Campbell,Chemiluminescence:Principles and Applications in Bioligy and Medicine,1版,VCH/Horwood,Weinheim/Chichester,1988,439頁）。精製はゲル透過クロマトグラフィー（Sephadex G25）で実施した。トレーサーはトレーサー緩衝液（10mM酢酸ナトリウム,150mM NaCl,2g/lウシ血清アルブミンおよび0.1％ Mergal K9N,pH5.0）中30μg/mlの濃度で保存した。
トレーサー：
そのまま使用できるトレーサーの調製にはトレーサー濃厚液を0.1Mリン酸塩緩衝液（0.15g/l NaClおよび1g/lウシ血清アルブミン含有,pH6.3）で1:200の割合に希釈した。
測定用緩衝液：
12,1gのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、8.8gの塩化ナトリウム、0.1gのナトリウムアジドおよび10gのTween 20を990mlの脱イオン水に溶解し、この溶液のpHを25％塩酸で8.0に調整した。
測定用緩衝液に適当な発光試薬を配合して使用することにより（アッセイ操作の項参照）溶媒効果を減弱することができる。
PSA標準：
PSA（前立腺特異的抗原,Behringwerke AG）を溶解した緩衝液は以下の組成:50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ NaN3、0.01％ Tween20、0.5g/lウシIgG,40g/lウシ血清アルブミン,8mg/l Titriplex V、pH7.6とした。標準濃度は０、3.2、10.6、32、80および160ng/mlとした。
アッセイ操作：
PSA含有サンプル10μｌを10μｌの固相Ａおよび20μｌのトレーサーとともに37℃で15分間インキュベートした。ついで10μｌの固相Ｂ、さらに５分後に200μｌの測定用緩衝液を添加した。混合物を、ルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中0.7秒間測定した。発光試薬として0.5％H2O2および125mM NaOH含有20mM HNO3を使用した。
結果は図15に示す。アッセイ操作は図9aに図解的に示す。
実施例  ９
T3の測定のためのLIA
試薬の調製：
固相Ａ：
0003580504.tif 000013
（カタログ番号:EM1−100/20）の磁性粒子を、モノクローナル抗−T3抗体（BeriLux FT3抗体）によりカルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチドの合成）,II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング高度は10％磁性粒子懸濁液中、抗体0.25mg/mlとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中2.5mg/mlとした。
固相Ｂ：
0003580504.tif 000014
（カタログ番号:EM1−100/60）の磁性粒子をBeriLux標識に対するモノクローナル抗体［消光抗体,BW 90−8/04;Behringwerke AG;Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物および培養細胞保存機関）,Braunschweig,Germanyに寄託番号DSM ACC 2184 として寄託］によって、カルボジイミド法［G.Wendlbergerら,Synthese von Peptiden（ペプチド合成）、第II部,Methoden Org.Chem.（有機化学的方法）,Houben−Weyl,4版,1952,XV/2巻,1974］を用いてコ−トした。コーティング濃度は10％磁性粒子懸濁液1mlあたり抗体6mgとした。そのまま使用できる懸濁液は保存緩衝液（10.36g/l CHES,0.5g/lナトリウムアジド,3g/lウシ血清アルブミン,pH8.0）中磁性粒子濃度2.5mg/mlとした。
トレーサーの合成：
工程1:ストレプトアビジンーT3接合体の調製：
ａ）3mgのストレプトアビジンを1.7mlの0.1M四ホウ酸塩緩衝液（10％ジオキサン含有）pH8.0中に溶解する。28μｌのGMBS溶液（ジオキサン中5mg/mlのγ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル）を加えた。混合物を室温において１時間反応させたのち、PD10/G25mカラムにより0.1Mリン酸緩衝液（5mM EDTA含有）中に再緩衝化した。得られた溶出液（「溶液１」）は容量2ml、ストレプトアビジンの濃度0.9mg/mlである。
ｂ）7mgのトリヨードサイロニン（T3）を700mlのDMSOに溶解する。Ｎ−エチルモルホリン10μｌおよびSAMSA（Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸）を80μｌのDMSOに溶解して加える。30分後に1Mのヒドロキシアミン水溶液100μｌをピペットで添加する。得られた溶液（「溶液２」）は温室で15分間インキュベートする。
ｃ）1.76mlの溶液１および41.5μｌの溶液２を混合し、温室に１時間放置した。ついで、PD10/G25mカラムにより0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.2（「溶液２」）中で再緩衝化した。再緩衝化後、ストレプトアビジン−T3接合体の濃度は0.6mg/mlである。
工程2:ストレプトアビジン−T3接合体のBeriLux標識による標識
ａ）ビオチン基を有するBeriLux標識の合成
BeriLux標識（NHS−反応基を有する）200mg（0.26mmol）を最初にアセトニトリル30ml中に導入し、98ml（0.26mmol）のＮ−ビオチン−1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタン（Boehringer Mannheim）および46μｌ（0.3mmol）のトリエチルアミンのアセトニトリル5ml中溶液を温室で滴下して加える。反応混合物を室温で12時間攪拌すると、この間に反応混合物は緑色に変化する。混合物をろ過し溶媒を真空中で留去する。残留物（400mg;緑色油状物）を逆相カラム上［静止相:LichroPrep C−18（Merck）；移動相：アセトニトリル／水＝33:67＋0.1容量％トリフルオロ酢酸〜アセトニトリル／水＝45:55＋0.1容量％トリフルオロ酢酸の勾配］製造用中圧クロマトグラフィー
0003580504.tif 000015
によって精製する。アセトニトリルを真空中で留去し、凍結乾燥して水を除去すると、黄色の粉末170mgが単離される。MS（FAB）：［C47H55N6O9S2］＋（計算値:911.347;分析値:911.350）［CF3CO2］−（113）。
ｂ）182μｌの溶液３（0.1mgのストレプトアビジン−T3接合体）、718μｌの0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.2、14μｌのアセトニトリルおよび86μｌの標識溶液［アセトニトリル中BeriLux標識（ビオチン基を含有する）10mg/ml］を一緒にピペットで取り、温室で30分インキュベートする。このトレーサーはPD10/G25mによりゲルクロマトグラフィーで精製する。
トレーサー溶液の調製：
トレーサー緩衝液中トレーサー6ng/ml。
トレーサー緩衝液:0.2％ウシIgG,0.1％ Mergalおよび0.025％ANS含有100mM PBS、pH6.3。
T3標準：
血清メジウム中濃度０〜7.5ng/mlの濃度範囲のT3標準を用いた。
測定用緩衝液：
150mM NaCl、１％Tween 20および0.01％のナトリウムアジドを含有する100mM Tris緩衝液。
アッセイ操作：
50μｌのサンプルを100μｌのトレーサーオよび20μｌの固相Ａと一緒に37℃で30分間インキュベートした。ついで10μｌの固相Ｂを加え、混合物を室温で10分間インキュベートしたのち測定用緩衝液200μｌをピペットで加える。懸濁液をルミノメーター［BeriLux（登録商標）アナライザー］中で１秒間測定した（発光試薬:R1＝0.5％過酸化水素含有20mM硝酸;R2＝125mM水酸化ナトリウム）。
結果は図16に示す。アッセイ操作は図13aに図解的に示す。
図３の説明：
この図はBeriLux（登録商標）標識（アクリジニウムアシルスルホンアミド標識）（抗−標識抗体を添加しない場合の活性＝100％）で標識されたトレーサー抗体に対する３種の異なる抗−標識抗体の消光効果を示す。
抗体BW 90−9/016はシグナル改変試薬から標識を保護するのにとくに適しているが、BW 90−8/04はシグナル改変（この場合はシグナル消光）抗体として使用できる。BW 89−191/019抗体かこれらの適用のいずれでも適性は劣っている。
BeriLux（登録商標）アナライザー中での測定時間は１秒である。
【図１】
0003580504.tif 000016
【図２】
0003580504.tif 000017
【図３】
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【図４】
0003580504.tif 000019
【図５】
0003580504.tif 000020
【図６】
0003580504.tif 000021
【図７】
0003580504.tif 000022
【図８】
0003580504.tif 000023
【図８ａ】
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【図９】
0003580504.tif 000025
【図９ａ】
0003580504.tif 000026
【図１０】
0003580504.tif 000027
【図１０ａ】
0003580504.tif 000028
【図１１】
0003580504.tif 000029
【図１１ａ】
0003580504.tif 000030
【図１２】
0003580504.tif 000031
【図１２ａ】
0003580504.tif 000032
【図１３】
0003580504.tif 000033
【図１３ａ】
0003580504.tif 000034
【図１４】
0003580504.tif 000035
【図１５】
0003580504.tif 000036
【図１６】
0003580504.tif 000037
【図１７】
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