(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品のテクスチャーを改良する方法であって、前記食品の弾性を増加させるのに十分な量で前記食品または前記食品の前駆物質にバイオエラスティックポリペプチドを組み込むことを含んで成り、前記バイオエラスティックポリペプチドがテトラペプチド、ペンタペプチドもしくはノナペプチド反復単位またはそれの混合物を含んで成り、そして前記反復単位がβ−ターンを有するコンホメーションの中に存在することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記バイオエラスティックポリペプチドが前記食品の製造中に前記前駆物質に添加される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記バイオエラスティックポリペプチドが組換えタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記組換えタンパク質がグルテニンを更に含んで成る、請求項３の方法。
【請求項５】
前記組換えタンパク質が前記食品への加工用に選ばれた宿主中で発現される、請求項３の方法。
【請求項６】
前記宿主が小麦、トウモロコシ、オート麦、ライ麦、キビおよび豆類から成る群より選ばれる、請求項５の方法。
【請求項７】
食品前駆物質を結着させるための方法であって、前記食品前駆物質を結着させるのに十分な量でバイオエラスティックポリペプチドを添加することを含んで成り、前記バイオエラスティックポリペプチドがテトラペプチドもしくはペンタペプチド反復単位またはそれの混合物を含んで成り、そして前記反復単位がβ−ターンを有するコンホメーションの中に存在することを特徴とする方法。
【請求項８】
食品添加物であって、テトラペプチドもしくはペンタペプチド反復単位またはそれの混合物を含んで成り前記反復単位がβ−ターンを有するコンホメーションの中に存在するバイオエラスティックポリペプチド、およびヒトまたは動物の消費に適当な食用材料を含んで成る食品添加物。
【請求項９】
前記バイオエラスティックポリペプチドがフォームとして使われる、請求項８の食品添加物。
【請求項１０】
前記バイオエラスティックポリペプチドが展性材料である、請求項８の食品添加物。
【請求項１１】
前記バイオエラスティックポリペプチドがゲルである、請求項８の食品添加物。
【請求項１２】
前記バイオエラスティックポリペプチドがシートである、請求項８の食品添加物。
【請求項１３】
前記バイオエラスティックポリペプチドが実質的に架橋されている、請求項８の食品添加物。
【請求項１４】
前記バイオエラスティックポリペプチドが実質的に未架橋である、請求項８の食品添加物。
【請求項１５】
前記バイオエラスティックポリペプチドがヘキサペプチド反復単位を更に含んで成る、請求項８の食品添加物。
【請求項１６】
前記食用材料がサッカリン、砂糖、ペパーミントおよびアスパルテームから成る群より選ばれる、請求項８の食品添加物。
【発明の詳細な説明】
序論
技術分野
本発明は、食品のテクスチャーを改良するのに適当な物質に関する。
背景
小麦から調製した小麦粉は、製パンおよび調理において常に特別な立場を有している。小麦粉からきめの細かな軽いパンやケーキ類を作ることができるが、他の穀物の粉砕調製物〔しばしば別の名称、例えばコーンミールと呼ばれる〕からは作れない。タンパク質弾力性は小麦粉および生地（ドウ）の機能性を決定するという点で重要である。関与するタンパク質は主要な貯蔵タンパク質、例えばグルテニンであり、これは穀粒の乾燥重量の約10％を占め、且つ小麦粉を湿らせ捏ねて生地を与える時にグルテンと呼ばれる連続した網目構造を形成する。この網目構造が生地の醗酵の間に酵母により生産される二酸化炭素を閉じ込め、生地が膨らんで軽く多孔性の団粒構造を形成する。従って、醗酵させたパンは、本質において、その他の小麦粉成分（そのうちの最も重要な成分は澱粉である）を支えるタンパク質フォームである。
二酸化炭素を閉じ込めてフォームを形成する小麦グルテンタンパク質の能力は、２つの物理的性質、即ち弾性と伸長性の組合せに依存する。パン生地が不十分に弾性である（弱く且つ低すぎる弾性率）かまたは過度に弾性である（強く且つ高すぎる弾性率）時には不良な品質のパンが生じることがあるため、それらの性質の適切なバランスが重要である。グルテン弾性はヌードルやパスタの製造を含む他の小麦用途にも重要である。
小麦グルテンは、ほぼ等しい量で存在する２つのグループに分類される50種以上の個別のタンパク質の複雑な混合物である。グリアジンは、強い非共有結合力（主に、水素結合と疎水的相互作用）により相互作用し、グルテンの伸長性に貢献する単量体タンパク質である。対照的に、グルテニンは鎖間ジスルフィド結合により安定化された高Mr（約１−10×106 Da）ポリマーを形成するサブユニットから成る。それらのポリマーはグルテン弾性の主な決定要因であるらしいが、これについての正確な分子的根拠はわかっていない。しかしながら、関連があるかもしれない２つの特徴は、ジスルフィド結合の数および分布、並びにグルテニンサブユニットの１つの群の中にβ−らせん様構造が存在することである。
それらのタンパク質はグルテニンの高分子量（HMW）サブユニットと呼ばれ、その組成の対立遺伝子変異が小麦の製パン性の差と関係があるために幾分詳細に研究されている〔Shewry他（1992）J.Cereal Sci.15:105−120〕。個々のタンパク質は長さが627から827残基まで（Mrが約67,500から88,100まで）異なり、そして非反復性のＮ末端（84〜104残基）とＣ末端（42残基）領域により隣接された中心の反復領域から成る。反復領域は、ノナペプチド（共通GYYPTSPまたはLQQ）、ヘキサペプチド（PGQGQQ）およびトリペプチド（GQQ）モチーフに基づいた縦列の散在した反復塩基配列から成り、反復したβ−ターンに基づいてβ−らせん構造を形成すると思われる〔Miles他（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:68−71〕。それらのらせん構造は本質的に弾性であると提唱されている（エラスチンとの相似により）〔Tatham他（1985）Cer.Chem.62:405−412;Tatham他（1984）FEBS Lett.177:205−208〕けれども、そのメカニズムは明らかに異なっている〔Belton他（1994）J.Cereal Sci.19:115−121〕。非反復性Ｎ末端およびＣ末端領域は球状であり、ジスルフィド結合を介して架橋を形成すると思われる。
エラスチンは、高グリシン疎水性配列と交互に存在する高アラニンでリジン含有の架橋形成配列の連続整列を含む単一タンパク質より構成される。既知である全長ウシ配列では、長さと組成の両方の見地から、最も目立つ疎水性配列は、ポリペンタペプチド（PPP）を含むものとポリヘキサペプチド（PHP）を含むものである。エラスチンは数個のテトラペプチド（TP）単位も含む。本発明者らの１人が行った研究の結果として、架橋させた時、エラスチンのポリペンタペプチドは弾性であることがわかり、そしてそれのポリヘキサペプチドは非弾性であることがわかり、弾性発現の間に鎖を整列させそして絡み合わせる（interlocking）ための手段を提供すると思われる。エラスチンポリペンタペプチドおよびポリテトラペプチドは共に、逆温度転移を受けるとエントロピー弾性および強度を持つようになり規則的なβ−ターンを含む力学構造を形成する、コンホメーション依存型のエラストマーであることも発見された。
より重要なのは、一定の長さの架橋したPPP、PTPおよびそれの類似体が、数種の制御可能な変数に依存して約75℃までの範囲に及ぶ異なる温度で弾性活性（elastomeric force）を示すことである。更に、それらの架橋エラストマーは、比較的狭い温度範囲で最大に近い弾性活性を発現する。よって、様々なモル量の構成ペンタマーおよびテトラマーと共にヘキサマー反復単位により修飾されたそのような単位を有するバイオエラストマー材料を合成することにより、そして初めの粘弾性相を支持する特定溶剤を選ぶことにより、得られたバイオエラストマーが弾性活性を発現する温度を厳密に制御することが可能である。
一般に、上記弾性状態を生じる温度を高める工程は、典型的なゴムとは違い、特徴的な成分として疎水性分子内相互作用を使用する規則的な非ランダム構造をもたらす逆温度転移である。この規則的な構造は、らせんのターンの間にスペーサーとしてβ−ターンを有し、らせんのターンの間に疎水性結合を提供しそしてβ−ターンの間にぶら下がったペプチドセグメントを有する、水を含むゆるいヘリックス構造である、β−らせんであると提唱されている。それらの種々のバイオエラストマーの弾性活性は、それの規則的構造が発生するにつれて発現する。更に、高温変性による規則的構造の喪失は、弾性活性の低下をもたらす。モノマー単位の様々な位置について様々なアミノ酸を選択することにより、そして最終製品を作るのに用いる架橋方法（例えば化学的方法、光化学的方法、酵素的方法、放射線照射方法）を変えることにより、広範囲に異なる水分組成で、広範囲の疎水性で、ほとんど任意の所望の形態および多孔度で、そして変動できる架橋度で、それらのポリマーを調製することができる。
それらのバイオエラストマーポリペプチドは、本発明者らの１人の研究室から起こった比較的新しい発見であり、先願の一連の特許および特許出願明細書中に開示されている。例えば、米国特許第4,474,851号明細書は、バイオエラスティックポリマーを製造するのに用いることができる多数のテトラペプチドおよびペンタペプチド反復単位を記載している。特殊なバイオエラスティックポリマーは、米国特許第4,132,746号、同第4,187,852号、同第4,589,882号および同第4,870,055号明細書にも記載されている。米国特許第5,064,430号明細書は、ポリノナペプチドバイオエラストマーを開示している。バイオエラスティックポリマーは、別の目的で調製されるが最終ポリマー中に同じくバイオエラスティックポリマーを含み得るペプチド反復単位を含有するポリマーに向けられた関連特許においても開示されている。米国特許第4,605,413号、同第4,976,734号および同第4,693,718号；「テトラ／ペンタペプチド単位を含むバイオエラストマー」（“Bioelastomer Containing Tetra/Pentapeptide Units"）という発明の名称の米国特許第4,898,926号；「エラスチンポリテトラペプチドの温度に相関した力および構造の発生」（“Temperature Correlated Force and Structure Development of Elastin Polytetrapeptide"）という発明の名称の米国特許第4,783,523号明細書；「化学および機械仕事の相互変換のために変調性温度転移できるバイオエラストマーから構成される可逆性機械化学エンジン」（“Reversible Mechanochemical Engines Comprised of Bioelastomers Capable of Modulable Temperature Transitions for the Interconversion of Chemical and Mechanical Work"）という発明の名称の米国特許第5,032,271号、同第5,085,055号および同第5,255,518号明細書；「ポリペプチドを含むエラストマー複合材料」（“Elastomeric Composite Material Comprising a Polypeptide"）という発明の名称の米国特許第4,500,700号明細書；並びに米国特許第5,250,516号明細書。多数の他のバイオエラスティック材料およびそれらの使用方法は次のものを含む係属中の米国特許出願明細書中に記載されている：「生物学的材料の接着を防止するのに適するエラストマーポリテトラペプチドマトリックス」（“Elastomeric Polytetrapeptide Matrices Suitable for Preventing Adhesion of Biological Materials"）という発明の名称の1988年４月22日出願の米国出願第184,873号;1992年10月16日出願の米国出願第07/962,608号;1994年１月24日出願の米国出願第08/187,441号；および1994年５月20日出願の米国出願第08/246,874号明細書。それらの特許および特許出願はバイオエラストマーおよび／またはその成分並びにそれらの調製を詳細に記載しているので、それらは全て本明細書中に参考として組み込まれる。この情報を本発明の組成物の調製および使用並びに本発明の方法に利用することができる。
小麦の品種は食品の加工に好ましい性質について選別されている（穀物タンパク質は主として発芽に備えて保管された貯蔵タンパク質である）が、それらはパン、ヌードル、ケーキ類の製造に最適となる弾性、伸長性などの性質については進化の間に選別されなかった。小麦の日常的形質転換方法の最近の発展〔Vasil他（1992）Bio/Technology 10:667−675;Weeks他（1993）Plant Physiology 102:1077−1084〕は、遺伝子工学による小麦タンパク質の操作を考慮に入れる。農作物から作られるパン類、ケーキ類および他の香辛料のテクスチャーを改良するために、製粉ドウ、特にあまり常用されない別の経済的に価値ある穀物、例えばトウモロコシ、オート麦、ライ麦およびキビから製造された製粉の品質を改良する必要性がまだ残存している。
関連文献
Belton,P.S.,et al.,（1994）1H and 2H NMR relaxation studies indicate that the elasticity of the HMW subunits of glutenin is not elastin−like.J.Cereal Sci.19:115−121.
Miles,M.J.,et al.,（1991）Scanning tunnelling microscopy of a wheat gluten protein reveals details of a spiral supersecondary structure.Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）88:68−71.
Moonen,J.E.,et al.,（1982）Use of the SDS−sedimentation test and SDS−polyacrylamide gel electrophoresis for screening breeder's samples of wheat for bread−making quality.Euphytica 31:677−690.
Payne,P.I.（1987）Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread−making quality.Plant Physiol.38:141−153.
Payne,P.I.,et al.,（1981）Correlations between the inheritance of certain high−molecular weight subunits of glutenin and bread−making quality in progenies of six crosses of bread wheat.J.Sci.Food Agric.32:51−60.
Pomeranz,Y and Willams.P.C.（1990）Advances in Cereal Science and Technology,10:492−501,Eds Pomeranz,Y.,American Association of Cereal Chemists Inc.,St.Paul,MN.
Shewry,P.R.,et al.,（1992）The high molecular weight subunits of wheat glutenin.（Critical Review Article）J.Cereal Sci.15:105−120.
Tatham,A.S.,et al.,（1985）The β−turn conformation in wheat gluten proteins:relationship to gluten elasticity.Cer.Chem.62:405−412.
Tatham,A.S.,et al.,（1984）Wheat gluten elasticity:a similar molecular basis to elastin?FEBS Lett.177:205−208.
Vasil,V.,et al.,（1992）Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus.Bio/Technology 10:667−675.
Weeks,J.T.,et al.,（1993）Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat.Plant Physiology 102:1077−1084.
発明の要約
本発明は、食品の弾性を増加させるのに十分な量で食品中にまたは食品の前駆物質中にバイオエラスティックポリマーを組み込むことにより食品のテクスチャーを改良する方法を提供する。
本発明は、食品前駆物質を結着せしめるのに十分な量で食品前駆物質にバイオエラスティックポリマーを添加することにより食品前駆物質を結着せしめる方法を提供する。
本発明はまた、テトラペプチドもしくはペンタペプチド反復単位またはそれの混合物を含んで成るバイオエラスティックポリマー、およびヒトまたは動物の消費に適当な食用材料から成る配合物を提供する。該配合物は構造を変更して様々な異なる性質を提供することができ、且つシート、ゲル、フォームまたは粉末のような様々な物理形態で利用可能であるので、食品産業における使用にかなりの可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
本発明は、本明細書の一部を構成する図面と共に下記の特定実施態様の詳細な記載を参照することにより、更に良く理解されるだろう。
図１は（GVGVP）ｎ遺伝子のクローニング段階の略図である。
A.  1.  隣接する外側のBamH1と内側のPflM1制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する（GVGVP）10のための合成遺伝子。該遺伝子とプラスミドpUC118を各々BamH1で開裂せしめ、リガーゼと一緒に混合して、該遺伝子が挿入されたプラスミドを再環化せしめた。クローン化遺伝子を有するプラスミドをE.コリ中で増幅させた。2.  大規模プラスミド調製物をPflM Iで開裂させ、遊離の（GVGVP）10断片を精製した。3.  精製したPflM1断片を自己連結せしめてコンカテマー遺伝子を作製した。4.  連結反応物にアダプターオリゴヌクレオチドを添加して、（GVGVP）10遺伝子を様々な発現プラスミド中でクローニングするのに必要な制限部位を含む末端配列を提供した。遺伝子は10の倍数で言及されるが、アダプターオリゴヌクレオチドが追加のペンタマー配列を与えるので結局［（10）ｎ］＋１となる。
B.  Ａに記載した工程の図解。
図２はタバコの（GVGVP）10遺伝子の配列を示す。
図３はプラスミドpHD203−GUS−EPSPS（EN/polyA）の略図である。
発明の詳細な説明
食品または食品前駆物質中へのタンパク質ベースの弾性ポリマーの導入は、テクスチャーおよびコンシステンシーの望ましい性質を提供するために、または脂肪、カロリー等の望ましくない性質を奪いそれに取って代わるために利用することができる。タンパク質ベースの弾性ポリマーは可食性であるだけでなく、様々な異なる物理形態を有するものを製造することもできる。例えば、それらはホイップクリームに代わる代用品である可能性を有しまたはメレンゲを作るのに用いられる、フォームとしてエアゾール缶から絞り出すことができる。それらは例えば、ペーストリー層およびコーティングにおいて利用することができるので、ゲル、フォーム、展性材料、例えばガム、シートおよび粘弾性基材として、ちょうど薬剤でドーピングできるように、それらにフレーバー（風味）をドーピングすることができる（1992年10月16日出願の米国特許出願第07/962,608号明細書を参照のこと。この明細書は参考として本明細書中に組み込まれる）。タンパク質ベースの弾性ポリマーの接着性は、ポリマーが他の加工された農作物を接着せしめる結着剤として働くように利用することができる。
今や食品におけるこれらのタンパク質ベースの弾性ポリマーの利用可能性がはっきりしたからには、無数の用途への拡張は想像に難くない。本発明を用いると、製造と廃棄の点で、更には脂肪の代わりにタンパク質であるという栄養面で、環境にやさしくなる。更に、タンパク質ベースの弾性ポリマーのバイオ生産が十分低い費用であることは、特に他の方法ではあまり望ましくない性質を有する製品を与えるだろう経済的に有効な作物と組み合わせて使った時に、消耗品のための安価な資源を提供する。
バイオエラスティックポリペプチドは以前に特徴づけられており、上述した多数の特許および特許出願明細書中に記載されている。それらの材料は、モノマー単位を含む全ポリペプチドの中に、個々にエラストマー単位として働くテトラペプチド、ペンタペプチドまたはノナペプチドモノマーのいずれかを含有する。このモノマー単位の弾性は、β−ターンの間にぶら下がった動的（硬質に反するものとして）架橋セグメントにより隔てられた、タンパク質二次構造（即ちそのペプチド鎖のコンホメーション）中の一連のβ−ターンの存在のためであると思われる。β−ターンは次の式の水素結合した10原子環により特徴づけられる：
0003581155.tif 000002
この式中、R1〜R5は各々のアミノ酸残基の側基を表す。10原子環は１番目のアミノ酸のカルボニル酸素、４番目のアミノ酸のアミノ水素、および２番目と３番目のアミノ酸の介在骨格原子から成る。示されるようなこのモノマー単位中、鎖の残りの骨格原子（４番目のアミノ酸の残り、５番目のアミノ酸、および次のペンタマー単位の１番目のアミノ酸の最初の部分）は隣のβ−ターンの間にぶら下がっている架橋セグメントを構成する。同様な構造が他の長さのエラストマーペプチド単位の中にも存在する。別のペプチド構造、例えばβ−バレルも、バイオエラスティックポリマーに弾性を付与することができる。生物弾性（bioelasticity）は、ポリマーを伸長した時の鎖の動力学の内部減衰（dampening）を付与する、即ち捩れ角もしくは結合の回りを回転する自由または振動が抑えられる、構造によって付与される。この減衰は延びた状態で得られる自由度を減少させる。
このβ−ターン含有構造は、上記に挙げた先行特許および特許出願明細書中に記載されているので、ここで再び詳細に記載する必要なない。弾性を保存するために介在性のぶら下がった架橋セグメントを有する多数のβ−ターンが保持される限り、反復単位中の様々な位置に存在するアミノ酸に相当な変異が可能である。それらのポリマーを製造する工程により課せられるものを除いて、本発明で使われるポリマーの分子量に上限はないと思われる。約250までのペンタマー単位を含むポリマーが組換えDNA法を使ってE.コリ中で合成されている。典型的なポリマーは少なくとも５、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも20のテトラペプチドまたはペンタペプチドモノマーを含み、そして水性溶剤中での粘度を増加させるという理由で、エアゾール缶からフォームを絞り出すためには普通は1000未満、普通は500未満のそのような単位を含むが、生地製造に使うためには任意の長さのものであることができ、得ることが可能な最大の長さが好ましいだろう。更に、それらのモノマー単位が、他の目的でデザインされたペプチドセグメントを含むより長鎖のポリペプチド全体に散在しているポリペプチドを調製することが可能である。例えば、弾性率を増加させるためにまたは特別な整列を達成するために、架橋のために、硬質セグメントを含めることができる。ポリマーの消化率を改善するために、トリプシン消化のためのリジンもしくはアルギニン部位またはペプシン部位のようなプロテアーゼ開裂部位をポリマーに導入することができる。本発明は、他の分子、例えばタンパク質もしくはペプチド、脂質、炭水化物、または他の有機化合物のセグメントの間に散在されたバイオエラストマー単位を有するポリマーを使用することもできる。
ポリマーに結合させることができる置換基の数および種類に対する上限は、弛緩状態でのβ−らせん構造要素を獲得するために正しく折り畳む／組み立てる弾性ポリマーの能力によって影響される。モノマー残基側鎖位置に関するポリマー中の置換基の位置は、弛緩状態でβ−ターンが形成されないようにする限り、重要でない。様々なペプチドについての好ましい位置は、参考として組み込まれる本発明者の研究室からのこの分野での特許および係属中の特許出願において教示される通りである。
原型のポリ（Val1−Pro2−Gly3−Val4−Gly5）〔本明細書中「ポリ（VPGVG）」と呼称する〕およびポリ（Val1−Pro2−Gly3−Gly4）分子並びに無数の類似体を包含するそれらのバイオエラストマー材料は、水と混合すると粘弾性相を形成し、その相は架橋せしめると軟質で、迎合性で、弾性のマトリックスをもたらす。弾性マトリックスを形成させるためのポリマー溶液の架橋は、様々な架橋方法、例えば化学的方法、酵素的方法、放射線照射方法を使って行うことができる。米国特許第4,589,882号明細書（参考として本明細書中に組み込まれる）は、酵素架橋性単位を有するブロックポリマーを合成することによる酵素的架橋を教示している。この特許の教示を組換えバイオエラスティックポリペプチドに応用することができる。米国特許第4,589,882号明細書で合成ポリマーについて記載されているようにリジンとグルタミン酸残基の所要比を有するバイオエラスティックポリペプチドをコードするベクターを作製するのに組換え技術が用いられる。この場合、酵素的架橋方法は本来細胞外の酵素であるリジルオキシダーゼの作用により生体内で進行する。あるいは、生体内での架橋は、グルテニンで結合が起こると思われる次第と同様にしてジスルフィド橋を介して起こることができる。この場合、バイオエラスティックポリペプチドは、互いに鎖間ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含むように工作される。
一般に、特定のモノマー単位中のアミノ酸の配列の選択およびモノマー単位の所要比率の選択は、既知のバイオエラストマーの性質を測定し（または調査し）、類似であるが異なるバイオエラストマーを作製し、そして引用した特許および特許出願に記載されたように転移温度（Tt）を測定することで始まる実験的方法により達成することができる。しかしながら、好ましくは、アミノ酸残基（天然のまたは修飾のいずれか）の相対疎水性の表を利用して実験せずに転移温度を計算する。例えば、Y.Nozaki ＆ C.Tanford,J.Biol.Chem.（1971）246:2211−2217またはH.B.Bull ＆ K.Breese,Archives Biochem.Biophys.（1974）161:665−670、並びに疎水性データの特に有用な編集物についてはD.Urry（1993）Angewandte Chemie Omt.Ed.Engl.32:819を参照のこと。例えば、ポリマーのモノマー単位中の各アミノ酸残基の平均疎水性を合計し、そしてその結果を既知の転移温度を有するポリマーについて得られた合計と比較することにより、またはTtに基づいた疎水性スケール（1994年１月24日出願の米国特許出願08/187,441号の表１を参照のこと）からの転移温度をそのまま合計し、そしてそれを割り算して平均値を得ることにより、転移温度の概算見積を得ることができる。
１成分だけを変更した一連の関連ポリマーについて転移温度を測定することにより、任意の所定のポリマーについてより正確な値を算定することができる。例えば、大部分VPGVGモノマーを含み可変量のVPGXGモノマー（例えば２％、４％および８％Ｘ、ここでＸはいずれかの選ばれたアミノ酸残基である）を含むポリマーを調製し、そして転移温度について試験することができる。この試験は、単にポリマーを未架橋の形で調製し、ポリマーを溶解し、そして溶液からのポリマーの沈殿を示す「濁り」が現れるまで溶液の温度を上昇させることから成る。転移温度をポリマー中のVPGXGモノマーの比率に対してプロットすると直線が得られ、そしてこのグラフから別の所望の温度に必要なVPGXGモノマーの比率（VPGXGモノマー０％から100％により指摘される限界の範囲内）を直接得ることができる。この技術を上述したような疎水性合計を概算見積できることと組み合わせると、液体の水の領域において任意の所望の転移温度を得ることができる。「Ｘ」の位置は上記記載における一例としてだけ選ばれると理解すべきである;Xは反復単位中のいずれの位置にあってもよく、バイオエラストマーの総合性質が保持される限り複数の位置に存在することができる。エラストマー単位およびそこから得られるポリペプチドを合成する個々のアミノ酸の選択は、その結果得られる構造が例えば米国特許第4,474,851号および同第5,064,430号明細書中に記載された特徴を有するエラストマー形成、特にβ−ターン構造を含んで成る限り、無制限である。こうして、エラストマー単位のアミノ酸配列は、得られる食品に所望の性質を提供するように選択される。
バイオエラストマー反復単位の合成は回りくどくなく、ペプチド化学により容易に達成することができる。合成バイオエラストマーは本発明者の特許および特許出願明細書中に記載された方法により製造しそして架橋せしめることができる。その場合、バイオエラストマーポリペプチドは食品の製造の間に食品前駆物質に添加される。バイオエラストマーポリペプチドは、食品の弾性を増加させるのに十分な量で添加されるだろう。用途に応じて普通は１重量％〜99.5重量％が添加され、生地の製造には約10％、そしてホイップクリームには100％に近い量が添加されるだろう。
タンパク質ベースのポリマーの有機合成に代わる方法は、流行の組換えDNA技術を使った生合成アプローチである。このアプローチを使って、所望のペプチド配列をコードする遺伝子を作製し、そして宿主生物中に人工的に挿入し、次いでその宿主生物がペプチドを生産する。宿主は原核生物、例えば細菌、または真核生物、例えば酵母、植物であることができる。組換えDNAを使って、与えられたペプチド配列の多重反復単位をコードする合成遺伝子を作製することができ、そしてそれらの合成遺伝子を自己重合せしめてもっと長いコード配列を作り、長鎖のタンパク質ベースのポリマーを生成することができる。適当な宿主生物中でのそれらの効率的発現に備えて遺伝情報（即ちDNA配列）を操作するには当業界で公知の分子生物学技術が使われる〔例えば、Sambrook他,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,New York（1989）;Deguchi他（1993）Mat.Res.Soc.Symp.Proc.,292:205−210;Capello,J.（1992）Review Protein Engineering Biomaterial,Curr.Opin.Struct.Biol.,2:582−586;McPherson他（1992）;Perbal,B.（1988）A Practical Guide to Molecular Cloning,第２版,John Wiley ＆ Sons NY;Ausubel,F.M.（1989）Current Protocols in Molecular Biology,第１＆２巻,John Wiley ＆ Sons NYを参照のこと〕。これを可能にする主な道具は当業界で公知であり、その例としてポリヌクレオチドを開裂、連結、複製および他の方法で修飾する酵素が挙げられる。加えて、発現に適する形でこの情報を宿主生物中に導入できるようにするベクターも当業界で知られている。宿主が微生物である時、生産されたタンパク質は醗酵槽中で増殖させた培養物から大量に精製することができ、合成によって製造されたバイオエラストマーと同様な方法で食品前駆物質に添加することができる。ポリ−VPGVGの生産の具体例は、本発明者らの１人の研究室からの刊行物であるMcPherson他,"Production and Purification of a Recombinant Elastomeric Polypeptide,G−（VPGVG）19−VPGV,form Escherichia coli",Biotechnol.Prog.,1992:347−352、並びに「バイオエラスティックポリペプチドの過剰生産」（"Hyperexpression of Bioelastic Polypeptides"）という発明の名称の米国特許出願および「バイオエラスティックポリマーの単純精製法」（"Simple Method for the Purification of Bioelastic Polymers"）という発明の名称の米国特許出願（共に本出願と同日に出願したもの）中に記載されている。それらは本発明の材料の遺伝子生産および精製のための手引きとして使用することができ、参考として本明細書中に組み込まれる。
ある種の作物は、染色体中へのプラスミド媒介DNA挿入を含む技術により、またはDNAでコーティングされた微小発射体を使った植物細胞系のランダム衝撃により、形質転換可能である。後者の方法はクロロプラスト並びに核ゲノムを形質転換せしめるのに使われている。クロロプラストゲノムの多重コピーが各植物細胞に存在するので、遺伝子増幅およびタンパク質過剰生産のためにクロロプラストをターゲッティングするのに有利である。植物により生産される外来タンパク質は、貯蔵タンパク質または細胞内タンパク質の生産を伴うことがあるが、より最近の研究はトランスジェニックタンパク質の分泌に適当なリーダー配列を使用している。
生産されたポリペプチドは当業界で周知の技術〔例えば、Scopes,R.K.（1987）Protein Purification,Springer Verlag,NY;McPherson他（1992）〕により単離することができ、そして微生物により発現されたタンパク質について上述したのと同様に利用することができる。あるいは、食品に加工するために選択された宿主、例えば小麦、トウモロコシ、オート麦、ライ麦、キビおよび豆類においてポリペプチドを発現させることができる。植物を形質転換させる方法は当業界で周知である〔Shimamoto,K.他（1989）Nature338:274−277;Datta,S.K.他（1990）Bio/Technology 8:736−740;Cristov,P.他（1991）Bio/Technology 9:957−962;Gordon−Kamm,W.J.他（1990）The Plant Cell 2:603−618;Fromm,M.E.他（1990）Bio/Technology 8:833−839;Vasil,V.他（1992）Bio/Technology 10:667−674;Weeks,J.T.他（1993）Plant Physiol.102:1077−1084;Somers,D.A.他（1992）Bio/Technology 10:1589−1594;Bower,R.およびBirch,R.G.（1992）Plant J.2:409−416;Kung,S.およびWu,R.（1993）Transgenic Plants Engineering and Utilization 1:382;Daniell,H.（1993）Methods in Enzymol.217:536−556〕。
人工のタンパク質ベースのポリマー、例えばエラストマーポリ（VPGVG）〔ポリ（GVGVP）、ポリ（GVPGV）または他の順列として等価に表記される〕のバイオ生産には、細菌中で行われるか植物中で行われるかのいずれにせよ、次のことが有利である：（ｉ）選ばれた発現宿主のコドン選択性に適したコドンを使って、ペプチドコード単位の多数の縦列コピーを有する遺伝子を合成すること、（ii）合成遺伝子がベクタープラスミド中に容易にクローニングでき且つ別の発現ベクターにカセットとして伝達可能であるべきであること、（iii）合成遺伝子が発現宿主に適当な転写および翻訳調節シグナルを使って所望のポリペプチド産物に発現されること、好ましくは（iv）ポリペプチドが精製を可能にする形で発現されること、および（ｖ）VPGVG反復配列に対して外来のアミノ酸が回避されるかまたは発現後に除去されること。
簡単に言えば、例えばエラストマーペプチドの10反復単位をコードする遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドを使って作製し、そして発現ベクター中にクローニングする。バイオエラストマーポリペプチドの遺伝子は、追加のオリゴヌクレオチドとPCR（例えば米国特許第4,683,202号明細書）を使って或る追加の反復単位に更に拡張し、10マー遺伝子を重複せしめることができる。この技術は、該単位の各々の縦列付加を挿入するのに、単位遺伝子（この場合は10マー）の３′末端のところの適当な制限酵素認識部位の存在に頼っている。このモジュールアプローチを使って、追加の１単位ごとにサイズを増加させて連続遺伝子を構築することができる。多重反復コピーを有する遺伝子を作製する際の本質的な問題点の１つは、E.コリ中での組換えと欠失の可能性である。反復配列を使った遺伝子作製方法は、適当な宿主株（例えばrecA-）中で使用した時はポリ（GVPVG）に対して問題とならない。
あるいは、高分子量ポリマータンパク質の作製には「コンカテマー」ルートが可能である。１つは各々がバイオエラストマーペプチド単位をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドモノマーの使用を含み、そのモノマーを粘着末端を通して連結せしめ、ポリペプチドをコードする多重体配列（コンカテマー）を形成せしめる方法である。別のルートは、モジュールアプローチをコンカテマールートと組み合わせて、開裂させると非回文式粘着末端を残す末端制限酵素部位を有する、ペプチド単位の多重反復配列（例えば10マー）をコードする遺伝子を作製するというルートである。それらの遺伝子モノマーを連結せしめて高分子量ポリマーをコードする多量体（マルチマー）を作製することができる。この別法は、モジュールクローニングアプローチよりも容易で且つ迅速に高分子量遺伝子の作製を可能にする。
最も広い面によれば、本発明は、食品の弾性を増加させるのに十分な量で食品または食品前駆物質にバイオエラスティックポリペプチドを組み込むことにより食品のテクスチャーを改良するための食品添加物および方法を提供する。本発明はまた、食品前駆物質を結着せしめるのに十分な量で食品前駆物質にバイオエラスティックポリペプチドを添加することにより、食品を結着せしめる方法も提供する。
本明細書中で使用される食品添加物は、ヒトまたは動物の消費に適当な食用材料、例えば合成または天然のフレーバー、例えばペパーミント、レモンまたはバニラエッセンス、および甘味料、例えばサッカリン、アスパルテームまたは砂糖の任意の含有を伴って、様々な物理形態に成形することができそして食品またはそれらの前駆物質と共に使用することができる。
本発明の方法により食品またはそれの前駆物質の弾性および伸長性を増加させることにより食品のテクスチャーが改良される。例えば、生地製造における小麦の品質は、水と混合して生地を作る時のそれの伸長性と弾性（これらは主にそれのタンパク質によって付与される性質である）に依存する。それらの品質は一般に、製パン性を調べることにより、例えば製パン性の間接尺度としてSDS沈降速度を測定することにより、測定されている〔Moonen他（1982）Enphytica 31:677−690〕。標準ベーキング試験およびミクロベーキング試験は、例えば、Smak,C.（1972）Cer.Chem.49:554−560またはMeppelink（1981）Getreide,Mehl und Brot 35:107−109により記載されたように行われる。あるいは、生地の粘弾性を直接測定することができる。
改良された生地粘性は次いで改良された食品テクスチャーをもたらし、例えば団粒化（crumbling）や崩壊しにくい食品を作る。これは現在のところ一般に高品質の生地に加工することができない製粉、例えばトウモロコシ、コーンおよびオート麦からの製粉に適する。
この場合、バイオエラストマーは、製粉に直接添加することができ、または作物から得られた製粉にそれらの特定性質（即ち、弾性および伸長性）を導入するためにトランスジェニック植物により発現せしめることができる。VPGVGペンタペプチドモチーフまたは例えばVPGVG,IPGVGおよびVPAVGの組合せに基づいた本質的に弾性のサブユニットは、好ましい弾性モジュールを生じることができる。ベーキングがポリマーのTtよりも高い温度で行われるように反復単位が選ばれるということのみが重要である。
そのようなサブユニットを鎖間ジスルフィト結合によって天然のタンパク質、例えばグルテンに組み込むことは、パン製造および他の用途に最適な増加された弾性および改善された品質をもたらすだろう。
更に、ポリヘキサペプチド単位をバイオエラストマー中に組み込んで弾性高次構造、例えば（ペンタペプチド）ｎ（ヘキサペプチド）ｎ（ペンタペプチド）ｎの構築を提供することができる。例えば、（GVGVP）ｎ（GVGIP）ｎ（GFGVGP）ｎは、チューインガム基剤として用いることができる軟質ポリマーを提供する。反復単位の比は、ガムを更に軟らかくし得る使用するフレーバーにしばしば依存するだろう。しかしながら、その比は本出願の教示に照らして当業者により容易に決定することができる。
バイオエラストマーは本発明者の特許出願および特許明細書の教示に従って結着性を有するように工作することもできる。それらの性質は食品前駆物質を結着せしめるために使われ、その場合、食品前駆物質に対して約１重量％から99.5重量％のバイオエラストマーが存在し、好ましくは約10重量％〜90重量％、より好ましくは約30重量％〜70重量％存在する。
実施例
実施例１
バイオエラスティックポリマーをコードする遺伝子構成物の発現
図１に描写される配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使って（GVGVP）120を作製した。該オリゴヌクレオチドを、BamH1（G'GATCC）およびPflM 1（CCAGGCGTTGG）制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む配列により隣接させた。この核酸をプラスミドpUC118中に挿入し、そしてE.コリを形質転換せしめるのに使った。増幅させたプラスミドを単離した後、遺伝子挿入断片の配列をDNA配列分析〔Sambrook他,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,New York（1989）〕により確認した。
次いでこの10マー遺伝子を、高分子量の（GVGVP）ｎをコードする長鎖遺伝子を作製するためのモジュール単位として使用した。10マー遺伝子を含むプラスミドを調製し、PflM 1で消化した。次いでPflM 1（GVGVP）10遺伝子断片を精製し、〔（GVGVP）10〕ｎのポリマーを作製するためのその後の連結反応において使用した。また、連鎖した遺伝子断片のその後のクローニングを可能にするために、ユニーク制限部位を有する別個のアダプターオリゴヌクレオチドをこの連結反応に加えた。それらのアダプターオリゴヌクレオチドは高分子量「コンカテマー」の回収に好ましいだろう比率で添加した。この工程は図1Bに概略的に表される。
個々の長さのコンカテマー遺伝子の回収およびクローニングのために、連結混合物をBamH1で消化し、次いでアガローススラブゲルを通して電気泳動して様々な分子量サイズを分画した。次いで様々なサイズ範囲に相当する切片をゲルから切り取り、DNAを回収し、そしてプラスミドpUC118中にクローニングした〔Urry他，“Elastic and Protein−based Polymers:Potential for Industrial Uses"（Am.Chem.Soc.）Div.Polym.Mat.,Sci.＆ Engr.,“Industrial Biotechnological Polymers,"Washington,D.C.,1994〕。このプラスミド中の遺伝子挿入断片を制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、コンカテマー「はしご（ladder）」に隣接したアガロースゲル電気泳動により正確にサイズ分画した。生来のタンパク質ベースのポリマーをE.コリ中で発現させるために、（GVGVP）120をコードするコンカテマー遺伝子を、６連ヒスチジンをコードする配列の後ろの遺伝子融合体としてpUC118から発現ベクターpQE−32（Quiagen,Inc.）中にサブクローニングした。このプラスミドを使った発現は、アミノ末端ポリヒスチジン融合を有するタンパク質、具体的にはMRGSH6GIQTM−（GVGVP）ｎの生産をもたらした。この融合成分は、金属キレートクロマトグラフィーによりタンパク質をアフィニティー精製する能力を与える。数種類の異なるサイズのコンカテマー遺伝子をpQE−32ベクター中にサブクローニングしそしてE.コリ中で発現させた。生産されたポリ（GVGVP）ポリマーを細菌細胞からアフィニティー精製し、そして逆相クロマトグラフィーにより分離されたアミノ酸のフェニルイソチオシアネート（PITC）誘導体のアミノ酸分析により、ポリ（GVGVP）に期待される比で必要なグリシン、バリンおよびプロリンを有することが証明された。このことにより、高分子量のタンパク質ベースのポリマー、例えば（GVGVP）250をコードする遺伝子を作製することができ、そしてE.コリ宿主生物中で効率的に発現せしめることができることが確立された。遺伝子融合および精製アプローチを使って、組換えタンパク質を高純度に精製しそしてそれが所望の生成物であることを証明することも可能であった。
発現産物の精製
アフィニティー精製したMRGSH6GIQTM−（GVGVP）ｎを使って、温度を上昇または低下せしめることにりタンパク質ベースのポリマーが可逆的に沈殿する（すなわちコアセルベートとなる）ことが示された。この溶液からの出入りは、液体が濁り次いで透明になるのを観察することにより目視で決定することができる。
この性質を使って、（GVGVP）ｎ（ここでｎ＝40,140および250）を含んで成るヒスチジン融合タンパク質を精製した。まず、タンパク質ベースのポリマーを含むE.コリ細胞の冷却（氷上）懸濁液を音波破壊により溶解せしめ、細胞成分を分散させた。低い温度では、ポリ（GVGVP）は広がった可溶性状態のままであり、不溶性細胞破片を遠心により除去することができる。まだ冷却したままで、細胞溶解物を高速遠心して不溶性細胞破片を除去した。次いで回収した上澄み液を37℃に温め、タンパク質ベースのポリマーから目に見える凝集物を形成させ、その時点でそれを遠心分離により可溶性画分から分離した。37℃のそれの転移温度より上に加熱すると、ポリ（GVGVP）種は、残りの溶質からの遠心による選択的除去を考慮に入れた新たな相を形成する。この操作をもう１回洗浄として繰り返すと、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した時にアフィニティー精製材料と同じくらい純粋である生成物をもたらした。こうして、細菌エンドトキシンが90％以上取り除かれた。
実施例２
E.コリ中での未変性ポリ（GVGVP）120の発現および精製
E.コリ中での未変性のタンパク質ベースのポリマーの発現を達成するために、（GVGVP）120をコードするコンカテマー遺伝子を実施例１に記載したpUC118からNco1−BamH1断片として発現ベクターpET−11d（Novagen,Inc.）中にサブクローニングした。前に記載されたアミノ末端親和性成分なしでもこのプラスミドから高レベルでタンパク質が発現された。そのタンパク質も同様に温度誘発凝集方法を使って実施例１に記載した通りに効率的に精製された。
実施例３
タバコクロロプラスト中でのタンパク質ベースの弾性ポリマー、ポリ（GVGVP）の発現
150の縦列ペンタペプチド単位の範囲のポリ（GVGVP）タンパク質をコードする遺伝子を、10反復単位のGVGVPをコードする合成オリゴヌクレオチドとPCRを使ってタバコ系での発現用に作製する。図２は、最大のコード縮重を維持しながらタバコに最適なコドンを含んで成る遺伝子の配列を示す。該遺伝子は、各々が該遺伝子の半分を少し超えたものを表す２つのオリゴヌクレオチドを使って作製する。それらのオリゴヌクレオチドは相補的な25塩基の重複を有し（図面中の点線の下線）、それをPCR反応により伸長して全長二本鎖配列を形成する。配列の確認と連続した維持のために、PCR生成物をBamH1で消化し、プラスミドpUC119中に挿入した。PflM 1を使ってpUC119から断片を切除し、所望のサイズ範囲で多量化を終わらせるためにアダプター断片を含めて自己連結せしめてコンカテマーを形成させる。
Daniell〔Methods Enzymol.217（1993）536−556〕により本質的に記載された通りに、培養したタバコ細胞のクロロプラスト中にGene Gunを使って合成遺伝子を導入する。35S−メチオニンの存在下でMS塩類培地中で形質転換細胞を連続培養した後、ミニビーズビーダー〔Daniell他（1993）Nucleic Acids Res.21:1503−1504〕を使ってクロロプラストを単離する。高張緩衝液中でクロロプラストを破裂させることにより、可溶性クロロプラストタンパク質を得る。本質的に実施例１に記載されたのと同様にしてバイオエラストマーを精製する。
実施例４
タバコからのタンパク質ベース可塑性ポリマー、ポリ（AVGVP）の発現
タバコ中での発現用の150反復単位の範囲のポリ（AVGVP）をコードする遺伝子の作製には、異なるアプローチを使用する。詳細には、各々が（AVGVP）モノマーをコードする二本鎖単位の一方の鎖を表し、タバコに適したコドン選択を有する２つの15塩基縮重オリゴヌクレオチド、5'−CCNGCNGTNGGNGTN−3'と5'−CNGGNACNCCNACNG−3'を合成する（ここでＮ＝G,A,TまたはＣ）。この２つの鎖は、それらがアニールすると相補的である４〜５塩基の重複末端を残し、５′末端と３′末端との連結を可能にするように、オフセットである。（GVGVP）10遺伝子について上述したように、アニールしたオリゴヌクレオチド、またはカテマーをそれらの相補的末端を通して連結せしめ、長鎖多量体、即ちコンカテマーを形成せしめる。バイオエラストマーポリペプチドの発現および精製は上記と本質的に同様であるが、ただしポリ（AVGVP）の転移温度を使用する。
実施例５
安定なクロロプラストまたは核形質転換後のポリ（VPGVG）の発現
プラスミドpHD203−GUS−EPSPS（EN/polyA）（図３参照）は、aroA遺伝子（グリフォセートに対する耐性を付与するEPSPシンターゼをコードする）を指令し且つ転写物を安定化するためのポリＡ断片により３′末端が隣接されたCaMVの35Sプロモーター／エンハンサー要素を含有する。gstコード配列と融合せしめたＧ−（VPGVG）19−VPGV（20マー）コード配列を、アダプターを使うことによってまたはE.コリDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を使って凹んだ３′末端をフィルインすることにより、pHD203−GUS−EPSPS−（EN/polyA）中のBgl II部位のところに挿入する。gst−EG20マーコード配列を含むEPSPSベクターをタバコ培養細胞中に衝撃し、そしてそれらをグリフォセートの存在下で増殖させることにより、安定な発現が達成される。コード配列は、高頻度の形質転換を達成するためにタバコクロロプラストゲノムのrbcLとORF 52の間の領域に挿入される〔SvabおよびMaliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913−917〕。
クロロプラストの内側でポリマーを発現するトランスジェニックタバコ植物は、無菌増殖させた植物からの葉をクロロプラストベクターで射撃することにより得られる。タバコクロロプラストトランスジェニック植物の選択および再生のための最適条件は当業界で周知である〔Svab他（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526−8530;StaubおよびMaliga（1992）The Plant Cell 4:39−45;StaubおよびMaliga（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913−917〕。
クロロプラスト形質転換の分子および生化学分析
当業界で既知の方法によりトランスジェニック植物からクロロプラストDNAを単離する。制限酵素消化したctDNA調製物の臭化エチジウム染色ゲルを調べて、追加のctDNA断片を検出する。タバコctゲノム中へのクロロプラストベクターからのEPSPS/gst−EG20マー断片の挿入は、トランスジェニック植物のctゲノム中への追加の制限部位を導入する。ctDNAを制限酵素で消化し、アガロースゲル上での電気泳動により分離し、そしてナイロン膜上にブロットする。EPSPSまたはgstまたはポリマーコード配列を含む断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用する。全てのトランスジェニック系を、タバコクロロプラストゲノム中のEPSPS−gst−ポリマーコード配列の存在について試験する。実施例３に記載した通りにクロロプラスと抽出物を調製し、タンパク質を精製する。
実施例６
トランスジェニックタバコ中でのタンパク質ベースのポリマーの安定核内発現
合成gst−Ｇ−（VPGVG）19−VPGV遺伝子カセット（Mc Pherson他）を次のようにしてpKYLXベクター〔Schardl他（1987）Gene 61:1−11〕中に挿入する。該カセットを含むMae I/EcoR1断片を変更して、５′末端へのXho1/Nco1アダプター（5'−TCGAGCCATGG−3'/3'−CGGTACC−5'）の付加によって新規ATGコドンを組み込み、そしてXho1/EcoR1断片としてpKLYX7.1中に移す。Xba1部位がEcoR1部位で置き換えられている、pKYLX7.1〔Daniell他（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:248−255〕の誘導体であるpKLYX7.2を、合成gst−Ｇ−（VPGVG）19−VPGVカセットを収容するために使用する。
若い完全に開いたタバコの本葉〔ニコチアナ・タバカム（Nicotiana  tabacum）cv KY 14〕を８週齢植物から採集し、表面を10％クロロックス（chlorox）で10分間、次いで70％％アルコールで３分間滅菌し、そして無菌蒸留水で３回洗浄する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）が媒介する葉面形質転換および茎再生は、Horsch他（1985）Science 227:1229−1231により記載された通りに実施する。簡単に言えば、Svab他〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87:8526−8530〕により記載された通りに、300mg/lのカナマイシンと500mg/lのメフォキシンを含有するMS培地上で推定上の形質転換体を選択する。カナマイシン耐性の茎を発根培地に移す。約50のカナマイシン耐性小植物を分析用に選択する。対照植物はpKYLX7.2のみを用いて形質転換させる。
推定上の形質転換体をサザンハイブリダイゼーションにより確認し、そしてNPT IIホスホトランスフェラーゼ活性並びにgst−Ｇ−（VPGVG）19−VPGVタンパク質（McPherson他）生産についてアッセイする。選択した個々の形質転換体を、野外実験で使用する予定の種子の最初の祖先として使われる同型接合個体の作製のために選択する。約１エーカー（約4047平方メートル）に各タイプのトランスジェニックタバコを栽培する。ベクターのみで形質転換した植物と未形質転換植物を栽培した小試験区は、成長の比較対照としてまたは他の評価対照として役立つ。苗を温室で繁殖させ、検査区に移植物を植えた。実施例１に記載した通りに細胞抽出物を調製し（Scopes他）、ポリマーを精製する。
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたのと同じ程度に参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明を十分記載してきたが、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変更および修正を行い得ることは当業者にとって明白であろう。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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