【事件の表示】
　特願２００１−２８９８５７「原核細胞における活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴの産生方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１４年１０月２９日出願公開、特開２００２−３１５５８４〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は，２００１年９月２１日（パリ条約による優先権主張２０００年９月２２日，ドイツ）の出願であって，平成１７年５月１１日付けで拒絶査定がなされ，これに対し，平成１７年６月１０日付けで拒絶査定に対する審判請求がされたものである。
　そして，その請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，平成１６年１０月８日付けの手続補正書により補正された明細書及び図面の記載からみて，以下のとおりのものである。
　
「【請求項１】　（ｉ）ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／またはβ鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列を発現プラスミドにクローン化し，
(ii)発現プラスミドを原核細胞に形質転換し，
(iii)１０〜２５℃の増殖温度および０．１〜０．５ｍＭのインデューサー濃度でヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴの発現を誘導し，および
(iv)組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを細胞から単離する，
原核生物宿主細胞において可溶性の活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生する方法。」
　
　なお，ＡＭＶ，ＲＴはそれぞれ，トリ骨髄芽球腫ウイルス，逆転写酵素の略号である。
　
２．原査定の拒絶の理由
　一方，原査定の拒絶の理由は，この出願の請求項１に係る発明は，本願の優先権主張の日前に頒布された引用文献１−５に記載された発明に基づいて，その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないというものである。
　
３．引用例
　引用文献１（国際公開第００／４２１９９号）には，
　「一般に，RTには３つのタイプがある。　モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）は単量体型RTであり，HIV-RTと鳥類RTは，ヘテロ二量体である。　HIV-RTヘテロ二量体は，66kDaのβポリペプチドと51kDaのαポリぺプチドから構成される。鳥類RTヘテロ二量体は，これより大きい95kDaのβポリペプチドと63kDaのαポリペプチドから構成される。　HIV-RTと鳥類RTのαポリペプチドはHIV-RTαポリペプチドが，RNアーゼH活性を持たない点で相違している。　HIV-RTのβポリペプチドと鳥類RTのβポリペプチドとは，HIV-RTβポリペプチドが鳥類RTβポリペプチドのインテグラーゼ活性を持たない点で相違する。
　AMV-RTは，自然界には単量体，ホモ二量体およびヘテロ二量体などの複数の分子形態で存在する。　しかし，主要な活性天然型は構造的に関連する２本のポリペプチド鎖（すなわち63kDaのαサブユニットと95kDaのβサブユニット）のヘテロ二量体である。　これらの成熟サブユニットは，180kDaの前駆体タンパク質（Gag＋Pol）の翻訳後プロセッシングの産物である。　この180kDaタンパク質は，95kDaβサブユニットに切断される。　このβサブユニットは，さらに63kDaのαサブユニットと32kDaのエンドヌクレアーゼサブユニットに切断されうる。　このαサブユニットとβサブユニットは同じＮ末端を持つ（Rothら，J．Biol．Chem．260:9326-9335（1985），Gerardら，DNA5：271-279（1986））。
（略）
　AMVとMAV（注，骨髄芽球腫随伴ウイルス (myeloblastosis-associated virus）のこと。）のpol遺伝子のDNA配列を比較したところ，MAVの3'末端の約111bpがAMVでは宿主DNA配列によって置換されていることがわかった。　Kanら，Virology145:323-329（1985）。　RNA-およびDNA-依存性DNAポリメラーゼ活性とRNアーゼH活性をコードするDNAの残りの部分は無傷だった。この欠失にはβポリペプチドのインテグラーゼドメインのコード領域が含まれており，これがAMVを増殖欠損性にするので，感染性子孫ウイルスの産生にはヘルパーウイルスMAVが必要になる。　したがって，インテグラーゼドメインは感染性粒子の産生にとって不可欠である。　しかしながら，鳥類レトロウイルスとそれらのヘルパーウイルスはどちらもRNA-およびDNA-依存性ポリメラーゼ活性とRNアーゼH活性を持つ逆転写酵素をコードしている。」（３頁３２行〜５頁１２行）と記載され，
　例１には，全長RT前駆体ポリペプチドをコードするMAVのpol遺伝子をクローン化し，全長RT遺伝子を含有するpHベクター(pHRT)を構築したことが記載され，
　例３には，Ｃ-末端欠失を有するRTポリメラーゼ断片をコードする3'欠失誘導体として，BglII-PstI3'末端欠失を含有する組換え体分子pHBRT，KpnI-PstI欠失を含有する組換え体分子pHKRT(pH33ΔKP5)を構築したことが記載され，
　例４には，大腸菌をpHRT，pHBRTまたはpHKRTで形質転換し，30℃で増殖させた後，42℃までシフトしてプロモーターを脱抑制し組換え体タンパク質を発現させたところ，発現されたタンパク質の約10％が可溶性形態で回収され，発現されたタンパク質の90％が封入体中で見出されたことなどが記載されている。
　
　引用文献２（Oncogene,1994,Vol.9,p.2761-2774）には，ＡＭＶ−ＲＴをコードする遺伝子の塩基配列が，α及びβサブユニットの位置と共に記載されている（Figure1）。
　
　引用文献３（J.Biol.Chem.,1989,Vol.264,No.24,p.13975-13978）には，「ヒト免疫不全ウィルスのタイプ1の逆転写酵素66-kDa形態の大腸菌の中での発現は，少量の2×66-kDaのホモダイマーと，多量のカルボキシル末端を短縮した51-kDa形態のものと複合した66-kDaタンパク質であるヘテロダイマー形態の単離に導かれる。後のものはプロテアーゼの汚染による蛋白質分解によって生じる。ヘテロダイマーは，ゲル濾過(120-130kDaのネイティブの分子量)によって特徴づけられるが，酵素の最も活性形態(比活性5000ユニット/mg，66-kDa断片では2000より小さい)であった。・・・・単一のプラスミド上の2つのタンパク質の共発現は１：１の割合の発現に導かれた。１：１の混合物はクロマトグラフィーの特性によって示されるように，ヘテロダイマーとしての性質を示した。生体内のヘテロダイマーの生産のメカニズムは，更なる蛋白質分解に対して安定しているヘテロダイマー形態を与える，51-kDaおよび66-kDa形態の迅速な二量化が続いて起こるような66-kDaモノマーの分裂を含んでいるだろう。」（要約の項）と記載され，
　発現において，７０ｍｇ／リットルのＩＰＴＧで６時間誘導したこと（１３９７５頁右欄最下行〜次ページにかけて）が記載されている。
　
　引用文献４（Protein Expression and Purification, 1999, Vol.16, p.103-108）には，「ポリメラーゼは３７℃で大量に生産されるが，ほとんど不溶性で不活性な形態となる。このような封入体の形成は，非生産的なフォールディング中間体の会合により引き起こされる(15)ので，フォールディング過程の減速や，適切なフォールディング中間体の形成を助けるような幾つかのアプローチが試みることができる(11,16)。そこで，この研究において，大腸菌での可溶のポリメラーゼの大量生産のために，細胞生育温度を下げ，分子シャペロニンの細胞内濃度の増加を行った。」と記載され，
　「クローン化されたＫ１１ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は，２５℃で，ほとんど可溶性形態で大腸菌で発現した。」（要約の項１５〜１７行）と記載され，
　０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導したこと（１０４頁右欄第２段落７〜８行）が記載されている。
　
　引用文献５（FEBS Letters, 1990, Vol.271, p.128-130）には，「細菌での外来遺伝子の高レベル発現は，しばしば不活性な発現産物を製造する結果を招くこととなる。この研究では，形質転換細胞の低温培養が封入体の形成を防止し，可溶形態のタンパク質生産物が高収率で得られる結果となった。幾つかの他のタンパク質の可溶性に関して，同様の温度依存が報告されている（レビューとして[17]参照）」と記載され，
　「・・・しかし，１５℃で１６時間誘導を行ったとき，総可溶タンパク質の３％の量で，活性のリポキシゲナーゼが生産された。・・・」（要約の項）と記載され，
　０．４ｍＭのＩＰＴＧの存在下で培養したこと（１２８頁右欄最初の段落１０〜１１行）が記載されている。　
　
４．対比
　本願発明と上記引用文献１に記載された発明を対比する。
　
　本願発明と引用文献１に記載された発明と比較すると，ＲＴをコードするＤＮＡ配列を発現プラスミドにクローン化し，発現プラスミドを原核細胞に形質転換し，ＲＴの発現を誘導し，ＲＴを産生する方法で一致しているが，
　（１）引用文献１においてはＭＡＶ−ＲＴを産生するものであるのに対し，本願発明においては，ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／またはβ鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列を発現プラスミドにクローン化し，ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生するものである点，（２）引用文献１においては30℃で増殖させた後，42℃までシフトして誘導しているのに対し，本願発明においては１０〜２５℃の増殖温度および０．１〜０．５ｍＭのインデューサー濃度でヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴの発現を誘導して，可溶性の活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生するものである点，及び（３）引用文献１においては昆虫細胞において発現させたＲＴを単離することが記載されてはいるが，大腸菌において発現させたＲＴを単離することは記載されていないのに対し，本願発明においては組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを細胞から単離するものである点で相違している。
　
５．当審の判断（進歩性）
　上記相違点について検討する。
　
（１）ＡＭＶ−ＲＴはよく利用されている逆転写酵素であり，引用文献２においてその配列も知られているのであるから，当業者であれば遺伝子工学により製造してみようと当然に考えるものであり，引用文献１においても，８頁３１行にＭＡＶと並んでＡＭＶが記載されている。そして，引用文献１にも説明されているように，AMVとMAVのpol遺伝子のDNA配列は，MAVの3'末端の約111bpがAMVでは宿主DNA配列によって置換されているもので，引用文献１の配列番号１の配列と引用文献２のFigure1の配列からも明らかなように，その他の部分は僅かな違いがあるだけのものであるから，当業者であれば，ＭＡＶ−ＲＴをコードするＤＮＡ配列に換えてＡＭＶ−ＲＴをコードするＤＮＡ配列とし，ＡＭＶ−ＲＴを産生することに何の困難もなく，容易になしえることにすぎないものである。
　
　引用文献１には，ヘテロダイマーを産生することは記載されていないが，引用文献１にも記載されるように，AMV-RTは，自然界には単量体，ホモ二量体およびヘテロ二量体などの複数の分子形態で存在し，主要な活性天然型は構造的に関連する２本のポリペプチド鎖（すなわち63kDaのαサブユニットと95kDaのβサブユニット）のヘテロ二量体であることがよく知られているのであるから，当業者であればヘテロ二量体としても産生してみようと容易に想到するものである。そして，引用文献３にも，ヘテロダイマー形態で活性が高いことが知られたＨＩＶ−ＲＴのα鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列を１つの発現プラスミドに組み込んで共発現させることが記載されているように，ヘテロダイマーを構成するそれぞれのサブユニットを同じ宿主内で発現させ，ヘテロダイマーを産生することは周知の事項であって，ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／またはβ鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列を発現プラスミドにクローン化し，ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生することは当業者が容易に発明できたものである。
　
（２）引用文献１の例４に，発現されたタンパク質の90％が封入体中で見出されたことが記載されることからも，ＡＭＶ−ＲＴを大腸菌中で発現させて産生しても，可溶形態ではなく，不溶性の封入体として得られるであろうことは当業者が予測できることであり，そのようなときに，可溶性として得るための知られた技術を適用することは当業者であれば当然に行ってみることである。
　そして，引用文献４，５に記載されるように，封入体ができないように１０〜２５℃の温度で増殖することは，よく知られたことであり，封入体ができたり，できる可能性が高い場合に，このような温度範囲で増殖し，可溶性の目的タンパク質を得ることは当業者が容易になしえることである。
　また，引用文献３〜５にも同じ範囲のインデューサー濃度が記載されているように，０．１〜０．５ｍＭのインデューサー濃度で発現を誘導することも，当業者が普通に採用する程度のことにすぎない。
　
（３）大腸菌にタンパク質を産生させたときに，目的タンパク質を単離することは当然に当業者が行うことにすぎない。
　
　以上，本願発明は，引用文献１〜５に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
　なお請求人は，平成１６年４月６日付けの拒絶理由で通知された引用文献４（以下，「旧引用文献４」という。）に対して，培養温度２０℃のときに可溶性で活性な目的タンパク質の蓄積量は最低であり，温度を上昇させていくごとに蓄積量が急激に増大するものであり，３７℃では約１００倍もの活性増大が認められるので，大腸菌を用いて可溶性で活性なヘテロダイマーの組換え型タンパク質を発現させる場合，３０℃未満の生育温度を採用すべきでない，ということが強く教示され，本発明で３０℃未満の条件を選択することは旧引用文献４により阻害されることを主張しているが，
　旧引用文献４の記載においては，３７℃において封入体が形成されていないのであるから，３０℃未満の温度よりも生産性が上がる３７℃の培養が好ましいのは当然のことであり，このことが，３７℃において封入体ができるような場合にまで，３０℃未満の温度が好ましくないことを示唆するものでは全くなく，当業者が，封入体ができにくくする技術として知られた，低温で培養する方法を適用することを阻害しようもないものである。すなわち，引用文献４，５からは，高レベルの発現が封入体の形成を引き起こすものであるから，発現を抑えることによって封入体ができにくくなることが示され，旧引用文献４に接した当業者であっても，目的タンパク質の蓄積量が少ない３０℃未満の温度範囲は，封入体が形成しやすいタンパク質の発現に，より好ましいと思いこそすれ，そのような温度範囲を採用することを阻害するものではないのである。
　
　また請求人は，引用文献４，５に記載されるタンパク質は，機能のみならず構造が本発明のヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴと全く異なっており，先行技術として適切でないことを主張しているが，引用文献４，５において，Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼやリポキシゲナーゼが，他のタンパク質とは異なる機構により封入体の形成を行うもので，それに対して低温の生育温度を採用したことが示されているのではなく，他のタンパク質においても同様のことが行われていたことを前提に，低温の生育温度を採用したことが示されているのであるから，機能や構造が異なるタンパク質であっても，同様に封入体を形成するものにも適用可能な技術が開示されていると理解できるものである。
　さらに，拒絶査定で示された文献，「Protein Expr Purif.(1998), Vol.14 No.1, p.104-112」，「FEBS Lett.(1990), Vol.266, No.1/2, p.67-71 」，「Mol Gen Genet.(1989), Vol.216, No.1, p.149-155」，「Biochem.J.(1997), Vol.322, p.815-822」や，Novagen社が２０００年５月に発行した「ｐET  System Manual」９版などにも可溶性のタンパク質を得るために低温で生育することが示されており，当業者であれば何の困難もなく低温を採用するものである。
　
６．むすび
　以上のとおり，本願発明は，引用文献１〜５に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって，本出願に係る他の請求項について検討するまでもなく，本出願は拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。