(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３記載の配列又はそれと相補的な配列で表されるオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることにより、マイコバクテリウム・カンサシイを検出することを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシイの検出方法。
【請求項２】
配列番号３記載の配列又はそれと相補的な配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシイの検出用キット。
【請求項３】
配列番号５記載の配列又はそれと相補的な配列で表されるオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることにより、マイコバクテリウム・ガストリを検出することを特徴とするマイコバクテリウム・ガストリの検出方法。
【請求項４】
配列番号５記載の配列又はそれと相補的な配列で表されるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイコバクテリウム・ガストリの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核並びに非結核性抗酸症の原因菌として多くの症例数のある遅発育性マイコバクテリアのＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードするＤＮＡ（以下、「ｇｙｒＢ遺伝子」という）の塩基配列を利用した同定・検出法に関するものである。本発明の同定・検出法は、各種産業分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトに結核並びに結核類似症を引き起こす抗酸菌種は遅発育性マイコバクテリアの属する種が複数知られている。その中でも臨床例としてはマイコバクテリウム・ツベルクローシス・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウム・アビウム・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）がその大半を占めている。最近では後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者等においてはこれらの細菌が全身播種性感染を引き起こし、ＡＩＤＳ患者の予後の重大な問題となっている。
【０００３】
従来これらの菌種の同定・検出は、培養に基づく生理生化学的な方法によって行われていた。例えば、遅発育性マイコバクテリアの中には、１）光を照射した後に暗所で培養した場合にのみ黄色に発色するグループ（光発色菌）、２）光を照射せずに培養しても発色するグループ（暗発色菌）、３）光を照射しても発色しないグループ（非発色菌）の３グループが存在するので、この発色の違いを利用して同定・検出を行うことが行われてきた。また、培養した細菌がカタラーゼ生産を行うかどうか、ウレアーゼ活性、トゥイーン加水分解活性あるいは硝酸塩還元活性を示すかどうか、などにより同定・検出を行う方法も知られていた。
【０００４】
しかし、これらの検査は純粋培養を必要とする上、比較の対象となる表現型は変化しやすく、判定が主観的になりがちであった。その結果、時間がかかる上に、正確な種の判定は極めて困難であった。この様な問題点を解決するために、近年になってポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という）法などを用いて遺伝子の特定の塩基配列の有無を判定する同定・検出の方法が考案され利用されるようになった。ＰＣＲ法は、培養を必要とせず迅速かつ客観的な判定を得るという点で、遅発育性のマイコバクテリアの同定・検出に適している。
【０００５】
その際、用いられる遺伝子は多くの場合、ｒＲＮＡ遺伝子である。Ｔ．  Ｒｏｇａｌｌら（１９９０．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３６，  １９１５−１９２０）は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を用いたＰＣＲに基づくマイコバクテリア種の同定法を提案した。しかしながら、これらのプライマーは、異なった表現型特性を示すマイコバクテリウム・ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）とマイコバクテリウム・カンサシイを区別できなかった。一方Ｂ．  Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓら（１９９０．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８：  １７５１−１７５９）は、ヒト型結核菌グループや鳥型結核菌−パラ結核菌およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）グループに特異的である１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドを報告した。このオリゴヌクレオチドを用いても種のレベルでの同定を行う為に必要な解像度は得られなかった。これらのｒＲＮＡ遺伝子配列を利用した同定法は、現在商品化され、日本ロッシュから「アンプリコア・マイコバクテリウム」という商品名の遺伝子診断キットとして販売されている。その他にも、東洋紡社（特開平１０−３２３１８９号公報）やベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー（特開平１０−０５７０９８号公報）からｒＲＮＡ配列を利用した検出あるいは同定法が開示されている。上に記したような二つの種を判別できない問題を解決するために、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡの間の領域の配列を用いた同定・検出法がＡ．  Ｒｏｔｈらによって提案されている（１９９８．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３６：  １３９−１４７）。しかし、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡの間の領域は約２００塩基対しかなく、このような短い配列により精度の高い分子系統学的解析は困難で二菌種のどちらの配列とも一致しない中間的な配列を持つ新規株が現れた場合、どちらにより近縁かといった判断を下すことができない
一方、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属を始め、多くの細菌で、進化速度の速いタンパク質をコードする遺伝子、なかでもｇｙｒＢ遺伝子の１２００塩基対の配列を用いることによって、より詳細で正確な分類・同定ができることが示された（Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈａｒａｙａｍａ．  １９９５．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１：  １１０４−１１０９．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈａｒａｙａｍａ．  １９９６．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４６：  ５０６−５１１．  Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ．  １９９６．  ｐ２５０−２５８  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｔ．  Ｎａｋａｚａｗａ，  Ｋ．  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｄ．  Ｈａａｓ，  Ｓ．  Ｓｉｌｖｅｒ  （ｅｄｓ）  ＡＳＭ  ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  山本  敏、原山重明、化学と生物  １９９６  第３４巻  第３号  ｐ．  １４９−１５１．，  山本  敏、原山重明、農芸化学会誌  １９９７  第７１巻  第９号  ｐ．８９４−８９７．）。
【０００６】
ｇｙｒＢ遺伝子以外のタンパク質をコードする遺伝子を用いて遅発育性マイコバクテリアの同定を行う試みは行われている。例えば、Ｃ．  Ｔ．  Ｓｈｉｖａｎｎｖａｒらはスーバーオキシド・ディスムターゼ遺伝子を利用して遅発育性のマイコバクテリアの系統関係と抗原性の関係を論じ（１９９４．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２：  ２８０１−２８１２）、Ｄ．  Ｓ．  Ｓｗａｎｓｏｎらは６５  ｋＤ  熱ショックタンパク質遺伝子を用いて鳥型結核菌−パラ結核菌およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレグループの詳細な分類を試みた（１９９７．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４７：  ４１４−４１９）。米国アボット・ラボラトリーズは特表平１０−５００５６７（国際公開番号Ｗ０９５／３１５７１）としてｒＲＮＡ遺伝子以外にもマイコバクテリウム・ツベルクローシスのタンパク質抗原Ｂをコードする遺伝子や、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの６５  ｋＤ熱ショックタンパク質、１０ｋＤ熱ショックタンパク質等の遺伝子配列並びに挿入配列ＩＳ９８７やＩＳ６１１０の関連する配列を用いた検出法を開示している。他にもベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニーはマイコバクテリウム・パラツベルクロシスの７０ｋＤ熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に由来する検出・同定するプローブを特開平０６−３１９５６０として開示している。しかしながら、これらの遺伝子のうち、分子系統学的に得られるデーターと従来の分類学的な手法による種の同定と比較した場合、矛盾が認められないことが示されているのはｇｙｒＢ遺伝子のみであり（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｈａｒａｙａｍａ  １９９８．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４８：  ８１３−８１９．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．  １９９９．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４９：  ８７−９５．  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，  Ｋａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）、新規に分離された株についても正確な分子系統学的な位置を決定でき、更に他の遺伝子では区別できなかった近縁種の区別できることなどから他の遺伝子を用いた方法より有効な方法である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ｇｙｒＢ遺伝子を用いた細菌の同定・検出法については、既に本出願人により出願されている（特開平１１−１６９１７５号公報）。しかし、この公報中では、遅発育性マイコバクテリアの同定・検出を行うに当たってｇｙｒＢ遺伝子中のどの領域を利用すればよいかについては明らかにされていなかった。
【０００８】
遅発育性マイコバクテリアには結核などの重要な疾病の原因細菌が含まれるため、この細菌群を正確に同定・検出するための方法が強く望まれている。一方、遅発育性マイコバクテリアは、生育速度が通常の細菌よりも遅いため、細菌の培養を必須とする生理生化学的方法では同定・検出が難しい。
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、ｇｙｒＢ遺伝子を利用した遅発育性マイコバクテリアの同定・検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは遅発育性マイコバクテリアの標準株のｇｙｒＢ遺伝子配列を決定した。それらの配列に対して臨床から分離された株の分類学的な位置づけを行った。分類学的位置づけが矛盾のないことを、細菌の種の同定の標準的方法であるＤＮＡ−ＤＮＡ  交雑法によって確認した。
【００１０】
また、遺伝子配列を利用した細菌の検出法として最も一般的に用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列では区別できない非結核性抗酸菌マイコバクテリウム・ガストリとマイコバクテリウム・カンサシイの標準株のＤＮＡからｇｙｒＢ  断片をＰＣＲ法によって増幅し塩基配列を決定した。得られた配列を比較したところ、両株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は同一であるにも関わらず、両株のｇｙｒＢ遺伝子配列１２５７塩基配列中６６箇所が異なっていることを見い出した（図１）。それらの配列の違いを利用して両菌種それぞれに特異的なＰＣＲ増幅を可能にしたプライマーを設計した。
【００１１】
本発明は、以上の知見により完成されたものである。
即ち、本発明は、遅発育性マイコバクテリアのｇｙｒＢ中の配列番号７〜２２に対応する領域を増幅し、その増幅断片の塩基配列を配列番号７〜２２記載の塩基配列と比較し、各配列からの遺伝学的距離を求め、その遺伝学的距離により前記遅発育性マイコバクテリアの同定を行うことを特徴とする遅発育性マイコバクテリアの同定方法である。
【００１２】
また、本発明は、配列番号４記載のアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含み、プライマー又はプローブとして実質的に機能するオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることにより、マイコバクテリウム・カンサシイを検出することを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシイの検出方法、及び前記オリゴヌクレオチドを含むマイコバクテリウム・カンサシイの検出用キットである。
【００１３】
更に、本発明は、配列番号６記載のアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含み、プライマー又はプローブとして実質低に機能するオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることにより、マイコバクテリウム・ガストリを検出することを特徴とするマイコバクテリウム・ガストリの検出方法、及び前記オリゴヌクレオチドを含むマイコバクテリウム・ガストリの検出用キットである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）同定方法
本発明の遅発育性マイコバクテリアの同定方法は、遅発育性マイコバクテリアのｇｙｒＢ中の配列番号７〜２２に対応する領域をＰＣＲにより増幅し、その増幅断片の塩基配列を配列番号７〜２２記載の塩基配列と比較し、各配列からの遺伝学的距離を求め、その遺伝学的距離により前記遅発育性マイコバクテリアの同定を行うことを特徴とする。
【００１５】
本発明において同定とは、分子系統学的な手法等によって細菌の分類学的な位置を定めることをいう。
ｇｙｒＢ中の配列番号７〜２２に対応する領域を増幅するためのプライマーとしては、例えば、配列番号３９及び配列番号４０により表されるプライマーを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
配列番号７〜２２記載の塩基配列と、対応するアミノ酸配列及び由来とする微生物の名称との関係は、下表の通りである。
【００１６】
【表１】
0003565752.tif 000002
【００１７】
遺伝学的距離は、例えば、Ｐｈｙｌｉｐ  プログラムの説明書にあるＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ記載の方法に従って求めることができる（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  １９９３．  ＰＨＹＬＩＰ（ＰｈｙｌｏｇｅｎｙＩｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５ｃ．  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｈｏｒ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
【００１８】
（２）特異的検出
本発明のマイコバクテリウム・カンサシイの検出方法は、配列番号４記載のアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含み、プライマー又はプローブとして実質的に機能するオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることを特徴とするものである。また、本発明のマイコバクテリウム・カンサシイの検出用キットは、前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするものである。
【００１９】
本発明のマイコバクテリウム・ガストリの検出方法は、配列番号６記載のアミノ酸配列の一部若しくは全部をコードする配列、又はそれと相補的な配列を含み、プライマー又はプローブとして実質低に機能するオリゴヌクレオチドを、プライマー又はプローブとして用いることを特徴とするものである。また、本発明のマコバクテリウム・ガストリの検出用キットは、前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするものである。
【００２０】
ここで、「プライマー又はプローブとして実質的に機能する」とは、特異的なアニール又はハイブリダイズが可能な程度の長さを有するという意味であり、検出対象とするＤＮＡとアニール又はハイブリダイズする配列を有しているが、その長さが短いため非特異的なアニール又はハイブリダイゼーションを頻繁に起こし、特異的な検出に使用できないようなオリゴヌクレオチドを排除する趣旨である。
【００２１】
マイコバクテリウム・カンサシイの検出に利用できるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号３により表されるオリゴヌクレオチドを例示でき、マイコバクテリウム・ガストリの検出に利用できるオリゴヌクレオチドとしては、配列番号５により表されるオリゴヌクレオチドを例示できるが、これらに限定されるわけではない。
【００２２】
検出の対象とするＤＮＡの調製、プライマーの作製及びそれを用いたＰＣＲ、プローブの調製及びそれを用いたハイブリダイゼーションは、常法に従って行うことができ、特別な方法を用いる必要はない。
【００２３】
なお、ＰＣＲに使用するプライマーは、両方が特異的にアニールするものである必要は必ずしもなく、一方は非特異的にアニールするものであってもよい。このような非特異的にアニールするプライマーの一例としては、配列番号１記載の塩基配列により表されるプライマーを挙げることができる。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕
配列番号３９及び配列番号４０記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドを利用して、臨床患者より分離された抗酸菌株８菌株（ＫＰＭ  ２２０１Ｔ、ＫＰＭ  ２２０２、ＫＰＭ  ２２０３、ＫＰＭ  ２０１３、ＫＰＭ  ２０１４、ＫＰＭ  １９８８−５、ＫＰＭ  ２２０９、ＫＰＭ  ２２１２）のｇｙｒＢ遺伝子配列を決定した。得られたｇｙｒＢ配列と遅発育性マイコバクテリア同定用ｇｙｒＢ配列セット（配列番号７−３８）を利用して分子系統学的解析により系統関係を推定した。分子系統学的解析は、分子系統学的解析用汎用プログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｊ．  Ｇｉｂｓｏｎ．  １９９４．  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  ４６７３−４６８０．）あるいはＰｈｙｌｉｐ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  １９９３．  ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５ｃ．  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｈｏｒ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）等を用い、両プログラムの使用説明書に従い、以下のように行った。配列番号３９及び配列番号４０記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドを使用して得られたｇｙｒＢ配列と配列番号７−３８の遅発育性マイコバクテリア同定用ｇｙｒＢ配列セットをＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムにより多重整列ファイルを作成する。多重整列させる際に用いるパラメーターの一例は”Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：  １５．００；Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ：  ６．６６；  ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ；  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ：０．５”である。得られた多重整列はアミノ酸配列から得られる多重整列ファイルと比較し、問題のある箇所は訂正する。次に、多重整列ファイルをもとに各配列間の遺伝学的距離を算出する。算出には、Ｐｈｙｌｉｐのｄｎａｄｉｓｔプログラムを使用する。算出はＫｉｍｕｒａ  ２−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｍｏｄｅｌ  に従って行う。得られた遺伝学的距離から近隣結合法により系統樹を作成する。系統樹の分岐の確からしさはｂｏｏｔｓｔｒａｐ確率を計算すること等により検定する。
一方、上記８菌株を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を利用した手法及び生化学的手法によっても同定した。以上の結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0003565752.tif 000003
【００２６】
表が示すように、上記８菌株のうち、ＫＰＭ  ２２０１Ｔ、ＫＰＭ  ２２０２、ＫＰＭ  ２２０３の３菌株は、マイコバクテリウム・ゴルドナエに属するものと同定されたが、残りのＫＰＭ  ２０１３、ＫＰＭ  ２０１４、ＫＰＭ  １９８８−５、ＫＰＭ  ２２０９、ＫＰＭ  ２２１２の５菌株は、マイコバクテリウム・ゴルドナエと近縁ではあるが別種（新種）であることが示唆された（図３）。この結果を、検証するためにＤＮＡ−ＤＮＡ交雑試験（Ｅｚａｋｉ，  Ｔ．，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｔ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｓｈｕ−Ｌｉｎ  Ｌｉｕ，  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｋ．，  ＆  Ｙａｂｕｕｃｈｉ，  Ｅ（１９８８）．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２６，  １７０８−１７１３．  Ｅｚａｋｉ，  Ｔ．，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ＆  Ｙａｂｕｕｃｈｉ，  Ｅ（１９８９）．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ３９，  ２２４−２２９）を行ったところ新種であることが支持された。この結果は、遅発育性マイコバクテリア同定用ｇｙｒＢ配列セットが既知の株のみならず新種の株に対しても信頼性の高い結果を与えることを示している。
【００２７】
〔実施例２〕
マイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を比較し（図１）、マイコバクテリウム・カンサシイのｇｙｒＢ遺伝子に特異的にアニールするプライマー（配列番号３）とマイコバクテリウム・ガストリに特異的にアニールするプライマー（配列番号５）を作製した。また、両菌種のｇｙｒＢ遺伝子にアニールするプライマー（配列番号１）も作製した。
【００２８】
これらのプライマーを用いて、臨床患者より単離された株  ＫＰＭ  １００４，  ＫＰＭ  １００７，  ＫＰＭ  ＫＹ２５６，  ＫＰＭ  ＫＹ７６１，  ＫＰＭ  ＫＹ７６８，  ＫＰＭ  １９８８−１，  ＫＰＭ  ３５０２，  ＫＰＭ  ３５０３の菌体破砕液をついてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ法による増幅条件は次のとおりである。
【００２９】
９５  ℃  １０分    １サイクル
９５  ℃  １分、６８  ℃  １分３０秒    ３０サイクル
７２  ℃  １０分    １サイクル
プライマー濃度  各１  μＭ
ｄＮＴＰ            各  １００  μＭ
Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＧＯＬＤＴＭ及び添付のＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｉを使用（米国Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）
【００３０】
増幅されたＤＮＡ  断片を電気泳動法により解析したところ、ＫＰＭ  １００４，  ＫＰＭ  １００７，  ＫＰＭ  ＫＹ２５６，  ＫＰＭ  ＫＹ７６１，  ＫＰＭ  ＫＹ７６８，  ＫＰＭ  １９８８−１は配列番号１と３に示した組み合わせでのみ増幅断片が観察されたので（表３）、これらの株は  マイコバクテリウム・カンサシイと同定された。また、  ＫＰＭ  ３５０２，  ＫＰＭ  ３５０３は配列番号１と５に示した組み合わせでのみ増幅断片が観察されたので（表３）、これらの株はマイコバクテリウム・ガストリ  と同定された。判定に用いた電気泳動像は図２に示すとおりである。これらの同定結果はＤＮＡ−ＤＮＡ  ハイブリダイゼーション法による同定結果と一致した。
【００３１】
【表３】
0003565752.tif 000004
【００３２】
【発明の効果】
本発明は、これまで同定することが困難であった遅発育性マイコバクテリアの分類同定を正確に行うことを実現するものである。また非結核性抗酸菌のうち１６Ｓ  ｒＲＮＡ  遺伝子配列に基づく同定法では鑑別が困難であった菌種、例えばマイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリイの迅速同定が可能となる。
【００３３】
【配列表】
0003565752.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】マイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を示す図。
【図２】配列番号１、３、５により表されるプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す図。
【図３】分子系統解析により作製された遅発育性マイコバクテリアの系統樹を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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