(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であるフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３１）。
【請求項２】
候補化合物を用意し、
前記候補化合物の存在下で請求項１に記載の細胞株を培養し、
前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定することを含む、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記候補化合物が、熱ショック蛋白質を阻害する化合物である請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィラデルフィア染色体陽性のヒト急性リンパ性白血病細胞から樹立された新規なメシル酸イマチニブ耐性細胞株、及びこの細胞株を用いるメシル酸イマチニブ耐性白血病治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、慢性骨髄性白血病に特徴的ながん細胞の増殖シグナルを遮断する薬剤に強い耐性を示すヒト細胞株が提供されるので、このシグナル伝達阻害剤とこれに対するがん細胞の耐性機構との関連性を明らかにして、新たな白血病治療薬の開発に貢献することができる。
【０００２】
【従来の技術】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者のほとんどには、フィラデルフィア染色体（以下「Ｐｈ」と称する。）と呼ばれる異常染色体が全ての白血病細胞に見出され、この異常染色体上のＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子によって生成されるＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質は非常に高いチロシンキナーゼ活性を示す。慢性骨髄性白血病における細胞の無限増殖は、この異常なＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質の持つ高チロシンキナーゼ活性によって引き起こされると考えられている。
【０００３】
選択的なチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（ＳＴＩ５７１、又はグリベック（登録商標））は、Ｐｈ陽性（Ｐｈ＋）慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療において極めて有効であることが証明されている（例えば、非特許文献１参照）。メシル酸イマチニブは、ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域においてＡＴＰの競合阻害剤として作用し、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現細胞特異的に増殖を阻害する。しかしながら、慢性骨髄性白血病患者やＰｈ陽性急性リンパ性白血病患者においてはかなりの割合でメシル酸イマチニブに対する耐性が観察される。このメシル酸イマチニブ耐性については、いくつかの機構が考えられている。例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子増幅、及び／又はＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域における点突然変異によって、ＢＣＲ／ＡＢＬチロシンキナーゼが再活性化されることが主な原因ではないかと考えられている。公知のヒト細胞株から作製されたメシル酸イマチニブ耐性株の生育能は２〜３μＭのメシル酸イマチニブに３日間接触させることによって約５０％阻害され、しかも、これらの耐性株の増殖能は、感受性株に比べて約３０％低いことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。更に、ＣＭＬ患者由来の細胞から得られた、より高濃度のメシル酸イマチニブに対して耐性となった細胞株ではＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子のコピー数増幅と共にＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域における点突然変異が見出されているが、これらの細胞株がメシル酸イマチニブ耐性の点で不安定なことから、メシル酸イマチニブ耐性機構が複数の原因によるのではないかと考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
つまり、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても高い増殖能を示すと共に、この薬剤耐性を安定して保持するヒト細胞株は未だ得られていない。そこで、メシル酸イマチニブ耐性株に効果のある薬剤を効率よくスクリーニングするためには、当該薬剤に対する耐性が安定し、且つ高い増殖能を有するヒト細胞株の樹立が強く望まれている。
【０００５】
【非特許文献１】
ビー・ジェイ・ドウルカー（Ｂ．  Ｊ．  Ｄｒｕｋｅｒ）外７名、「ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ）」、２００１年、第３４４巻、ｐ．１０３８−１０４２
【非特許文献２】
フランソワ・ザビエル・マホーン（Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｘａｖｉｅｒ  Ｍａｈｏｎ）外６名  「ブラッド（ＢＬＯＯＤ）」２０００年、第９６巻、ｐ．１０７０−１０７９
【非特許文献３】
クララ・リッチ（Ｃｌａｒａ  Ｒｉｃｃｉ）外７名  「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」２００２年、第６２巻，ｐ．５９９５−５９９８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、高濃度のメシル酸イマチニブに対する耐性を示し、且つ安定したヒト細胞株を樹立することを目的とする。また、かかるヒト細胞株を用いて、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、種々のヒト白血病細胞、例えば、慢性骨髄性白血病や急性リンパ性白血病患者から分離した細胞の増殖能や生化学的特性を詳細に調べた結果、急性リンパ性白血病患者から分離された一つの細胞株ＴＣＣ−Ｙが株化細胞として安定して継代可能であることを見出した。そして、このＴＣＣ−Ｙ細胞株を、メシル酸イマチニブの存在下、当該薬剤の濃度を徐々に増加させて数ヶ月以上にわたり培養を続けたところ、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても極めて生存能力が高く、かつ安定して増殖する複数のクローンを見出し、これらのメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株の生物学的な特性を明らかにすることによって本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の第一の視点において、少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であることを特徴とするフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株が提供される。好ましい実施形態において、前記染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子を含み、当該遺伝子産物のＡＴＰ結合部位の点突然変異であって、配列番号２のアミノ酸配列において３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換された点突然変異を有することを特徴とする。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ、及び細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒが提供される。
【０００９】
本発明の他の視点において、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病の治療薬をスクリーニングする方法であって、候補化合物を用意し、前記候補化合物の存在下で上記メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株を培養し、前記候補化合物が前記細胞株の増殖を阻害するか否かを判定することを特徴とする、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法が提供される。本発明の好ましい１つの実施形態として、前記候補化合物は熱ショック蛋白質を標的にしてこれを阻害する化合物である。従って、本発明の方法により前記細胞株の増殖を阻害することが見出された薬剤はメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病の治療薬として極めて有効であることが示唆される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株の樹立）
本発明のメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞株は、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞を段階的に濃度を上げたメシル酸イマチニブおよび牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地でＣＯ２存在下、３７℃で通常の細胞培養と同様に培養を行うことによって得ることができる。
【００１１】
３〜４日間ごとに培養液を交換しながら数ヶ月間細胞培養を行い、増殖してきた細胞を限界希釈法により９６ウェルマイクロプレートでクローニングする。種々の濃度のメシル酸イマチニブを添加して、さらに限界希釈法によりクローニングを行い、得られたクローンについて増殖速度と５０％増殖阻害に必要なメシル酸イマチニブ濃度（ＩＣ５０）等を測定することによって高濃度のメシル酸イマチニブ存在下において増殖能の優れた細胞株を得ることができる。
【００１２】
ここで、「フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）」とは、慢性骨髄性白血病の９０％以上、急性リンパ性白血病の１５〜３５％程度の症例において認められる、９番染色体と２２番染色体の相互転座によって形成される異常染色体のことをいう。９番染色体の転座切断点にはＡＢＬという名の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．  Ｍ１４７５２）が、２２番染色体の転座切断点にはＢＣＲという名の遺伝子が存在し、切断された９番染色体と２２番染色体が結合することによって、この２つの遺伝子が融合し、新たにＢＣＲ／ＡＢＬという融合遺伝子が形成される。このＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子はＢＣＲ遺伝子の切断部位によって大きさの異なる１９０、２１０、又は２３０ｋＤのＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質をコードしている（Ｍｅｌｏ，  Ｊ．Ｖ．  Ｂｌｏｏｄ１９９６，  ８８，  ２３７５−２３８４）。これらすべての融合蛋白質に共通の性質は、高いチロシンキナーゼ活性であり、インビトロ実験や動物実験で高い造腫瘍能を示す。
【００１３】
このような背景のもと、２１０ｋＤのＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質に対する分子標的治療薬として開発されたメシル酸イマチニブ（コード番号：ＳＴＩ５７１、商品名：グリベック（登録商標））は、多くの慢性骨髄性白血病患者に顕著な効果を示し、さらに抗がん剤が効きにくいＰｈ陽性急性リンパ性白血病でも効果が認められたが、耐性株の出現による再発が問題となっている。これまで、メシル酸イマチニブに対する耐性を示した患者のＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質のＡＴＰ結合部位において、数多くの突然変異（例えば、Ｍ２４４Ｗ，Ｇ２５０Ｅ，Ｑ２５２Ｍ，Ｙ２５３Ｈ，Ｙ２５３Ｆ，Ｅ２５５Ｋ，Ｅ２５５Ｖ，Ｆ３１１Ｌ，Ｔ３１５Ｉ，Ｆ３１７Ｌ，Ｍ３５１Ｔ，Ｅ３５５Ｇ，Ｈ３９６Ｐ及びＦ４８６Ｓ、なお、アミノ酸残基の位置は配列番号２に示したヒトｃ−ＡＢＬ蛋白質のアミノ酸配列に基づく）が報告されているが、最も頻繁に見つかる変異の一つは、配列番号１に示したヒトｃ−ＡＢＬ遺伝子の９４４番目のシトシンがチミンに置換（９４４Ｃ＞Ｔ）されることによって、配列番号２に示したアミノ酸配列の３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換を引き起こす変異（Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ）である。この３１５番目のトレオニン残基は、メシル酸イマチニブの類似化合物とＡＢＬ蛋白質との複合体の立体構造から、ＡＴＰ結合能という点では最も重要なアミノ酸残基であることが知られている（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０００，  ２８９，  １９３８−１９４２）。メシル酸イマチニブの類似化合物と複合体を形成したＡＢＬ蛋白質キナーゼドメインの結晶構造解析の結果、３１５番目のトレオニン残基の側鎖に存在する酸素原子がメシル酸イマチニブの第２級アミノ基と水素結合を形成しており、変異型（Ｉｌｅ３１５）では、この水素結合が消失すると共に、イソロイシン側鎖のメチル基がメシル酸イマチニブとの結合の立体障害になることが推測されている（Ｇｏｒｒｅ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＳｃＩｅｎｃｅ，  ２００１，  ２９３，  ８７６−８８０）。
【００１４】
従って、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質のアミノ酸残基に突然変異（Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ）を有することによって、メシル酸イマチニブのＡＴＰ結合阻害効果が抑制されるため、極めて高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても生育可能となったものと考えられる。培養液中のメシル酸イマチニブ濃度としては、０〜５０μＭにおいて耐性であるが、好ましくは、３〜２０μＭ、より好ましくは少なくとも約５μＭ、更に好ましくは少なくとも約２０μＭにおいて良好な増殖性を示す。
【００１５】
メシル酸イマチニブに対する耐性機構としては、上記ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質におけるアミノ酸置換のほかにも種々の原因が考えられる。例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅（コピー数の増加）や転写産物の増加、その他、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質の活性に影響を与えるような細胞内の因子の存在も考えられる。あるいは、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の作用機序に非依存的な細胞内の反応である可能性も存在する。従って、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、これらの他の原因を併せて有してもよいが、好ましくはこの耐性機構は白血病患者の生体内の条件ときわめて類似のものであり、且つ長時間安定して保持されるものである。従って、特に好ましくは、本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域においてＴｈｒ３１５Ｉｌｅの点突然変異を有し、且つＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の増幅や転写活性の増加を示さない細胞株である。本発明において、メシル酸イマチニブ耐性の安定性とは、当該薬剤を含まない培地中で長期間培養しても、上記ＡＢＬ蛋白質ＡＴＰ結合領域のＴｈｒ３１５Ｉｌｅ点突然変異が復帰せず、メシル酸イマチニブへの耐性が損なわれないことをいう。
【００１６】
本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、当該薬剤の耐性機構の研究に用いることができるほか、種々の用途が存在するが、例えば、次に述べるヒト白血病治療薬のスクリーニング方法に用いることによって、医薬品開発における極めて高い有用性が示される。
【００１７】
（メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法）
本発明のメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法は、（ａ）候補化合物を用意し、（ｂ）前記候補化合物の存在下で本発明に係るメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ急性白血病細胞を培養し、（ｃ）前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定することを含む。前記Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞は、本発明に係るメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ急性白血病細胞株に由来する細胞であれば、どのような細胞でも使用し得るが、好ましくは、スクリーニング実験の再現性や細胞培養の操作性を考慮すると試験管内で増殖が容易な株化細胞を用いる。さらに好ましくは、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ又はＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ（ｗｒ：低濃度耐性、ｓｒ：高濃度耐性）である。
【００１８】
前記候補化合物としては、蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられるが、これらに制限されない。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００１９】
前記候補化合物が前記細胞株の増殖を阻害するか否かの判定は、例えば、一定時間培養後に生存細胞数を測定することにより行うことができる。生存細胞数の測定は種々の方法があるが、例えば、トリパンブルー等の染色液の排出機能を測定する。あるいは、細胞内の蛋白質量やミトコンドリアにおける還元酵素の活性測定などにより代替することも可能である。
【００２０】
好ましい実施形態において、前記候補化合物は、ヒト熱ショック蛋白質を不安定化する化合物である。熱ショック蛋白質は細胞や個体が通常の生育温度よりも５〜１０℃高い環境におかれると合成が急激に誘導される一群の蛋白質のことをいう。温度のみならず，特定の化学物質などによっても誘導を受けるためストレス蛋白質とも呼ばれている。ヒトではＨＳＰ９０（分子量約９万）、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０等の低分子量の蛋白質が代表的である。例えば、ＨＳＰ９０は、ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質を初めとする細胞増殖・分化・発生に関与する多くの蛋白質の安定性と機能に影響を与える分子シャペロンであることが知られている（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ２０００，  ９５，  ３４９８−３５０５）。従って、ヒト熱ショック蛋白質、例えばＨＳＰ９０を阻害するような化合物を候補として本発明の方法によりメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞の治療薬をスクリーニングすることが極めて有効である。
【００２１】
例えば、ゲルダマイシン（ｇｅｌｄａｍｙｃｉｎ）は、ＨＳＰ９０蛋白質のアミノ末端部にあるＧＡ結合部位に結合することにより、ＨＳＰ９０蛋白に結合すべきｐ２１０ＢＣＲ／ＡＢＬやＲａｆ１及び細胞内のチロシンリン酸化蛋白質を不安定化させることが知られている。その他、大環状の抗真菌性抗生物質であるＲａｄｉｃｉｃｏｌやゲルダマイシンの誘導体１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏｇｅｌｄａｍｙｃｉｎ  （１７−ＡＡＧ）も同様な作用を有するＨＳＰ９０阻害剤である。
【００２２】
あるいは、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅの変異を有するＡＢＬ蛋白質のキナーゼドメインの立体構造座標と、三次元分子モデルアルゴリズムとを用いて、インシリコスクリーニング方法により化合物ライブラリーより選択された化合物を候補化合物とすることができる。このインシリコスクリーニング方法は、標的蛋白質と候補化合物の結合を分子動力学計算などのドッキングスタディにより計算し、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異体ＡＢＬ蛋白質のＡＴＰ結合ポケットに結合する可能性の高いリード化合物を提示するものであるが、その精度は未だ確実とはいえない。従って、このような方法によって大量の化合物ライブラリーから１次スクリーニングされた比較的少数の候補化合物を、本発明の細胞株を用いて実際にメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病細胞の増殖を阻害するか否かを検証することは極めて重要である。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、メシル酸イマチニブに耐性となったヒト白血病細胞の増殖を阻害する化合物であり、ヒト白血病の治療薬として用いることができる。特に、メシル酸イマチニブと組み合わせることが効果的な治療を行う上で有用である。この化合物をメシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬として用いる場合には、一般に製薬的に許容される担体と混合することによって、医薬組成物を調製することができる。医薬組成物用担体としては、特に制限はなく、例えば，乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルアルコール、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖，酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エアステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース，卵黄、界面活性剤、単シロップ、クエン酸、蒸留水、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等があり、目的とする製剤、例えば、注射薬や錠剤等の形態に応じて、本発明の方法によって同定された化合物と混合して使用される。
【００２４】
【実施例】
本発明は以下の実施例において、より具体的に説明される。実施例は、Ｐｈ陽性急性リンパ性白血病患者の骨髄細胞から樹立されたＴＣＣ−Ｙ細胞株（栃木ガンセンターにて樹立、Ｙａｓｕｈｉｋｏ  Ｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＬＯＯＤ，  ２００１，  ９７，  １９９９−２００７参照）を用いて、本発明者らがメシル酸イマチニブ耐性能を獲得した細胞株を樹立し、得られた細胞株の種々の性質を調べたものである。
【００２５】
（実施例１）メシル酸イマチニブ耐性細胞株の樹立
メシル酸イマチニブはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した１０ｍＭ溶液を保存液とし、これを種々の濃度になるように培養液に添加して用いた。培養液中のＤＭＳＯ終濃度は０．１％以下であり、細胞増殖に対する阻害作用はないことを確認した。ＴＣＣ−Ｙ細胞株は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、ＩＣＮ社）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＩＣＮ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。この培養条件において、ＴＣＣ−Ｙ細胞の２倍増殖時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は３１±１．５時間であった。ＴＣＣ−Ｙ細胞は、Ｐ２１０ＢＣＲ／ＡＢＬ  ｍＲＮＡと、Ｐ１９０ＢＣＲ／ＡＢＬ  ｍＲＮＡの両方の発現が確認されている。
【００２６】
ＴＣＣ−Ｙ細胞株を、メシル酸イマチニブの存在下、当該薬剤の濃度を徐々に増加させて（１００ｎＭ〜２００ｎＭ）数ヶ月以上にわたり培養を続けた。ＴＣＣ−Ｙ細胞の増殖を５０％阻害するメシル酸イマチニブ濃度（ＩＣ５０）は１．３７±０．６μＭであった。ＴＣＣ−Ｙ細胞を長期間メシル酸イマチニブに接触させたところ、１〜５μＭのメシル酸イマチニブ存在下において９０％以上の生存能力を示す細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ（ＩＣ５０＝５．１±０．９μＭ）が取得できた。このＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞を３μＭのメシル酸イマチニブ中で培養したときの倍加時間は３３±４．５時間であった。更に、このＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞株を種々の濃度のメシル酸イマチニブを添加して培養を行ったところ、更に高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても生育可能な一つのサブクローンＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ（ＩＣ５０＝２２．１±０．９μＭ）が得られた。このＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の２０μＭのメシル酸イマチニブ中で培養したときの倍加時間(doubling time)は３４±４時間であった。ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞は２０μＭのメシル酸イマチニブ存在下において、９０〜９８％の生細胞率で４ヶ月以上も増殖を続けた。このＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４８（寄託日は平成１４年１２月１０日）として寄託され、平成１５年１０月２７日に国際寄託へ移管された（国際寄託についての受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３１である）。
【００２７】
（実施例２）ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合ドメインの塩基配列の決定これまでメシル酸イマチニブ耐性患者のＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合領域に数多くの突然変異が検出されていることから、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞におけるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物のＡＴＰ結合領域部分のうちＡＴＰ結合ドメインから活性化ループにわたる９８９塩基対の配列を決定した。アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＡＳ−ＰＣＲ」という）により、ＢＣＲ／ＡＢＬアレル（対立遺伝子）のＡＴＰ結合ドメインを特異的に増幅して塩基配列を決定した。
【００２８】
すなわち、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞から、Ｓｅｐｈａｚｏｌ  Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、６塩基のランダムプライマーとＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて標準的なプロトコルにより、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＢＣＲ／ＡＢＬアレルのＡＢＬキナーゼドメインを増幅するために、正方向のプライマーＢＣＲ−Ｆ２：  ５’  ＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣ  ３’（配列番号３）と、逆方向プライマーＡＴＰ−Ｒ２：  ５’  ＣＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧ  ３’（配列番号４）を用いて長距離ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクル条件は、９４℃で１分間処理した後、９４℃、４５秒間の熱変性、６８℃３分間のアニーリング、及び７２℃１０分間の伸長反応を３０サイクル繰り返した。ＡＢＬ遺伝子のコード領域の６５７〜１６２１番目の塩基配列を増幅するために、以下の２つのプライマーセットを用いた。
【００２９】
１）ＡＴＰ−Ｆ１：  ５’  ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ  ３’（配列番号５）
ＡＴＰ−Ｒ１：  ５’  ＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ  ３’（配列番号６）
２）ＡＴＰ−Ｆ２：  ５’  ＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧ  ３’（配列番号７）
ＡＴＰ−Ｒ２：  ５’  ＣＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧ  ３’（配列番号４）
【００３０】
ＰＣＲの条件は、Ｇｏｒｒｅ，  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１；  ２９３：８７６−８８０に記載された方法に従って行った。増幅したＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いて精製し、自動シーケンサ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０、ＰＥアプライドバイオシステム社）により両方の鎖の塩基配列を決定した。
【００３１】
その結果、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞においては、９４４番目の塩基であるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に一塩基置換することにより、３１５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置き換わっていることが分かった（図１参照）。ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞には塩基の変異は検出されなかった。
【００３２】
（実施例３）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子コピー数の検査
ＬＳＩ  ｂｃｌ／ａｂｌエクストラシグナル（ＥＳ）二重染色転座プローブ（Ｖｙｓｉｓ社）を用いて、実施例１で得られた２種類のメシル酸イマチニブ耐性細胞株細胞（ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞とＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞）とＴＣＣ−Ｙ細胞から得られた分裂中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）細胞の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。当該プローブを製造業者のプロトコルに従ってｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞にハイブリダイズさせた。得られたｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞及び間期細胞画像をマックタイプｖｅｒ．５．５．３ソフトウエアで解析した。その結果、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞から得たｍｅｔａｐｈａｓｅ細胞及び間期細胞において、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子シグナルの数及び大きさには差がなく、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子のコピー数はこれら３種類の細胞株で変化しないことが分かった。従って、メシル酸イマチニブに対する耐性はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅やＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質の発現量が増加したためではないことが分かった。
【００３３】
（実施例４）定量的ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の検出
ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株においてＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子の増幅が認められなかったことから、次に、当該遺伝子のｍＲＮＡ量を定量的ＰＣＲによって調べた。７７００塩基配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、Ｔａｑｍａｎ法（アプライドバイオシステムズ社）によりＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子  ｍＲＮＡ量の測定を行った。ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子  ｍＲＮＡ検出のための主要なプライマー及びプローブは、それぞれ以下のとおりである。
【００３４】
ＢＣＲ−Ｆ：  ５’  ＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧ  ３’（配列番号８）
ＡＢＬ−Ｒ：  ５’  ＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＧＣ  ３’（配列番号９）
ＡＢＬ−Ｐ：  ５’  ＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴ  ３’（配列番号１０）
【００３５】
一方、対照としたＧＡＰ遺伝子ｍＲＮＡ量測定のためのプライマー及び検出用プローブは、それぞれ以下のとおりである。
【００３６】
ＧＡＰ−Ｆ：  ５’  ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ  ３’（配列番号１１）
ＧＡＰ−Ｒ：  ５’  ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ  ３’（配列番号１２）
ＧＡＰ−Ｐ：  ５’  ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号１３）
【００３７】
その結果、ＴＣＣ−Ｙ，ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞におけるＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ量とＧＡＰ遺伝子ｍＲＮＡ量の比は、それぞれ０．１３３０、０．１６０３、及び０．０８７０であった。ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子ｍＲＮＡ量は、親株であるＴＣＣ−Ｙ細胞に対して、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞では若干増加していたが、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞では逆に少し減少していた。
【００３８】
（実施例５）ウエスタンブロット法による蛋白質量の検査
実施例１で得られた２種類のメシル酸イマチニブ耐性細胞株細胞（ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ細胞とＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞）とＴＣＣ−Ｙ細胞をそれぞれ２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、２０Ｕ／ｍｌアプロチニン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１００ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、及び０．０５％ＳＤＳを含む溶解バッファー中で溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、細胞内のＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白質及びアクチン蛋白質をそれぞれモノクローナル抗体Ａｂ−３（オンコジェン社製）又はウサギ抗アクチン抗血清を用いて検出し、ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＧを２次抗体として用いて可視化した。その結果、ＴＣＣ−Ｙ細胞と比較して、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ，及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞中のＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白質の発現量は同等であった。
【００３９】
（実施例６）ＭＤＲ１遺伝子の発現
Ｐ−糖蛋白質（ＰＧＰ）をコードするＭＤＲ１遺伝子の発現がガン細胞における薬剤耐性機構の一つとして知られている。このＰＧＰは細胞膜を介して薬剤を細胞外に排出するトランスポーター蛋白質である。そこで、フローサイトメトリーにより、メシル酸イマチニブ感受性及び耐性細胞の細胞膜にＰＧＰが発現しているかどうか測定した。
【００４０】
それぞれの細胞株におけるＭＤＲ１遺伝子の発現を検出するためにＦＩＴＣ融合ネズミ抗ヒトＧＰＧモノクローナル抗体を用いた。それぞれの細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、２ｘ１０６個の細胞を１％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ５０μｌに懸濁した。この細胞を５０μｌの抗ＭＤＲ１で染色後、暗所で４℃、３０分間インキュベートした。１％ＦＢＳを含むＰＢＳ１ｍｌで細胞を２回洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。このようにして染色した細胞はＦＡＣＳスキャンによりＣｅｌｌ  Ｒｅｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて解析した。
【００４１】
その結果、メシル酸イマチニブ感受性のＴＣＣ−Ｙ細胞に比べて、耐性株であるＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒの何れの細胞にも大きな違いは無かった。
【００４２】
（実施例７）Ｒａｄｉｃｉｃｏｌによる細胞増殖阻害
Ｒａｄｉｃｉｃｏｌはシグマ−アルドリッチ社から購入した。これをジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１０ｍＭ溶液として保存した。ＴＣＣ−Ｙ、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞を、それぞれ種々の濃度のＲａｄｉｃｉｃｏｌと共に１．５〜２ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で３ｍｌプレートで培養した。細胞数と生細胞率は、トリパンブルー染色液の排出能により、Ｒａｄｉｃｉｃｏｌの添加後２４時間ごとに測定した。培養開始後、２４，４８及び７２時間後のＴＣＣ−Ｙ、ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及びＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株の細胞数と生細胞率を図２（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示した。図２に示された結果より、Ｒａｄｉｃｉｃｏｌによる細胞増殖阻害効果は、上記３種類の細胞株において有意差はないことが分かった。これらの結果をまとめると以下の表１のようになる。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
表１に表示した濃度は３回の実験の結果得られたＩＣ５０の平均値と標準偏差を表す。この結果より、全ての細胞はＲａｄｉｃｉｃｏｌに対して感受性であり、メシル酸イマチニブ感受性細胞株と耐性細胞株とで差は認められなかった。
【００４５】
（実施例８）メシル酸イマチニブ耐性株の安定性
実施例１で得られたＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株の安定性を調べるために、メシル酸イマチニブを含まず、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、ＩＣＮ社）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＩＣＮ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社）で１ヶ月半継代培養し、２６継代めで一部の細胞をサンプリングした。この細胞から、実施例４と同様の方法によりＢＣＲ／ＡＢＬアレルのＡＴＰ結合ドメインを特異的に増幅して塩基配列を決定した。その結果、ＡＢＬの３１５番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＴＴ（イソロイシン）のままであり、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株において検出された一塩基置換変異が保存されていることが分かった。また、この細胞を用いて、メシル酸イマチニブに対する耐性濃度を測定したところ、ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の保存株との間で差は認められなかった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明のメシル酸イマチニブ耐性Ｐｈ陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、高濃度のメシル酸イマチニブ存在下においても安定して増殖することができる。したがって、これらの細胞株は、メシル酸イマチニブの耐性機構の解明やＳＴＩ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニングを行うために極めて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞株で見出されたＡＢＬ遺伝子のＡＴＰ結合部位における点突然変異（ＡＴＣ→ＡＴＴつまり、Ｔｈｒ→Ｉｌｅ）を示した図である。
【図２】種々の濃度のＲａｄｉｃｉｃｏｌ存在下における（ａ）ＴＣＣ−Ｙ、（ｂ）ＴＣＣ−Ｙ／ｗｒ、及び（ｃ）ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒ細胞の増殖曲線を示したグラフである。
【要約】【課題】
高濃度のメシル酸イマチニブに対する耐性を示し、且つ安定したヒト細胞株を樹立すること。また、かかるヒト細胞株を用いて、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病治療薬のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】
少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であることを特徴とするフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株を提供する。好ましい実施形態において、前記染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子を含み、当該遺伝子産物のＡＴＰ結合部位の点突然変異であって、配列番号２のアミノ酸配列において３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換された点突然変異を有することを特徴とする。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒが提供される。
【選択図】
なし【図１】
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【図２】
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