(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラスライクカーボンからなる板の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物を結晶化させるための支持板への使用。
【請求項２】
質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物を結晶化させるための支持板を備えた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化装置であって、支持板がグラスライクカーボンからなる、前記装置。
【請求項４】
質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
飛行時間型質量分析計に付置されていることを特徴とする、請求項３または４に記載の装置。
【請求項６】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物に試料を混合し、これをグラスライクカーボンからなる支持板に塗布、乾燥することにより、微細で均一な結晶を形成する方法。
【請求項７】
質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微細で均一な結晶を形成する技術、及びこれを利用したマトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization:MALDI）技術に関する。
【０００２】
【従来技術】
蛋白質、ペプチドなどの生体関連物質の質量分析は、蛋白質の迅速な同定を可能にすることから益々その重要性が増している。一般に質量分析計は試料をイオン化して、その質量を測定する方法が採用されているが、その典型例としてはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法が挙げられる。
【０００３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI）技術は、試料をイオン化する方法の一種であり、例えば｛Anal. Chem. 60,2299(1988),M.Karas and F.Hillenkamp}に記載されているが、一般的には次のような原理に基づいている。
【０００４】
まず、レーザー光を吸収する低分子化合物（マトリックス化合物）と予め混合した試料（蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖など）を試料塗布板上に塗布、乾燥して結晶化した後、これにレーザー光（一般には窒素レーザー、波長：337 nm）を照射する。マトリックス化合物は、レーザー光を効率よく吸収するので、レーザー照射時にマトリックス分子は励起され試料分子とを共に気化される。励起、気化されたマトリックス化合物と試料とのプロトンの授受があり、高電圧をかけた電場においてイオンとなった分子は加速され分析計へ導かれる。
【０００５】
MALDI法によるイオン化法は、通常、飛行時間型質量分析計と組み合わせて用いられるが、とりわけ複雑な構造を有する生体関連高分子（蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖など）の質量分析に汎用されていることから、微量の試料を用いて効率よく、より高精度に質量分析する必要があり、従ってより高度の技術が要求されている。ところがこれまでの技術では、マトリックス分子の結晶が比較的大きく、気化するためのレーザーの光エネルギーが多く必要であり、イオン化の効率、測定精度等、上記の要求を満足するものが得られているとは言い難い現状にある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、MALDI法による質量分析装置において、微量の試料を用いて効率よく、しかもより高精度に質量分析する技術を提供することにある。さらに本発明の課題は、かかる目的をも達成できる、微細で均一な結晶の形成を可能にする新規な支持板を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、MALDI法におけるイオン化の過程を、試料の気化とマトリックス分子から試料分子へのエネルギー移行の２つの段階でとらえ、各段階での効率を向上させることができれば、より高感度、高精度での測定を実現することができることに着目した。このようなイオン化の効率を改善・向上させることは、MALDI法が生体関連高分子（蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖など）の分析に主に利用されていることを考えれば、分析における微量化・精密化を達成させることができることから極めて重要である。
【０００８】
一方、気化効率は結晶の表面積に比例することから、結晶の大きさは重要な要素であること、また結晶の大きさが不均一であると、レーザーを照射する場所によって、感度や分解能に差が生じるため、質的に均一なデーターを得るには、一定サイズの結晶を再現性良く調製する必要があることに着目し、さらに研究を重ねた結果、驚くべきことに試料塗布板である支持板として、少なくとも表面がカーボンを含有する層からなる支持板とすることにより、従来のものに比べてはるかに高効率にイオン化が達成でき、かつ格段に高精度な分析を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、グラスライクカーボンからなる板の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物を結晶化させるための支持板への使用に関する。
さらに本発明は、質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、前記の使用に関する。
また本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物を結晶化させるための支持板を備えた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化装置であって、支持板がグラスライクカーボンからなる、前記装置に関する。
さらに本発明は、質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、前記の装置に関する。
また本発明は、飛行時間型質量分析計に付置されていることを特徴とする、前記の装置に関する。
【００１０】
さらに本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用添加化合物に試料を混合し、これをグラスライクカーボンからなる支持板に塗布、乾燥することにより、微細で均一な結晶を形成する方法に関する。
また本発明は、質量分析用添加化合物が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴とする、前記方法に関する。
【００１１】
本発明の支持板を用いることにより、常温常圧下において極めて微細な結晶を均一に生成することが可能となり、本発明の所期の目的を達成することができる。本発明の支持板を用いることによる試料の微細で均一な結晶化及び分析の高感度化・高精度化のメカニズムについては、必ずしも明らかでない面もあるが、およそ次のとおりと考えられる。
【００１２】
現在汎用されているステンレスプレートやステンレスに金をコーティングしたプレート（金プレート）上で、結晶を形成させた場合、その結晶の直径は約10〜20ミクロン（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）とかなり大きなものになっている。このような大きい結晶を用いて気化させるためには、高いレーザー強度が必要とされるので感度や分解能の低下をもたらす。また、このような支持板上で結晶を形成させた場合、結晶の直径が不均一であり、また、人工的に一定のサイズに調製することもできないため、レーザーを照射する場所によって、感度や分解能が一定ではない。
【００１３】
これに対し、カーボン製支持板上で結晶を形成させた場合には、微細な結晶（約4〜8ミクロン）を均一に形成することができ、より低いレーザー強度で試料分子を気化でき、また、結晶間での感度や分解能のバラツキも極めて小さい。これにより、イオン化された試料を飛行時間型質量分析計にかける場合などに、微量の試料を用いて効率よく、高精度に質量分析できるという所期の目的を達成することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明における支持板は、典型的にはカーボンからなるプレートであり、炭素粉末を焼結させてなる、例えばグラスライクカーボン（ガラス状炭素）などの市販のものを使用することもできるが、さらにグラスライクカーボンからなる支持板上または他の支持板上にカーボンを蒸着させてなるものなどを挙げることができる。
【００１５】
また、本発明における支持板は、典型的にはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法における試料塗布板に用いることができるが、本発明の目的を達成するものであればこれに限定されない。
また本発明において適用される試料としては、蛋白質、ペプチド、核酸および糖鎖などの生体関連高分子の他、合成高分子や低分子有機化合物など、本発明の目的を達成するいかなる試料にも適用することができる。
【００１６】
本発明において使用される質量分析用添加化合物とは、試料と混合することにより、MALDI法において効率的な試料のイオン化を促進できる低分子マトリックス化合物であり、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸などが挙げられるが、本発明の所期の目的を達成するいかなる化合物も用いることができる。
また、本発明において、結晶化した試料をイオン化する手段としては、典型的にはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法が挙げられるが、本発明の所期の目的を達成するイオン化方法であればこれに限定されない。
【００１７】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
カーボン製支持板としてグラスライクカーボンを用いて以下の実験を行った。なお、試料塗布板の性能比較のために、汎用されている金プレートを用いる実験も行った。
（実験方法）
ペプチド試料溶液（1μL）に等量のマトリックス溶液（α-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸を0.1% TFAを含む30% MeCN溶液に飽和させた溶液）を混合した。試料とマトリックスとの混合溶液（1μL）を試料塗布板に塗布、乾燥して結晶化させた。試料塗布板をVoyager DE-STR MADLI-TOF-MSに装着し、分析した。ペプチド試料はAngiotensin I (MH+: 1296.6853, mono)、ACTH 18-39 (MH+: 2465.1989, mono)、β-Endorphin (MH+: 3463.822, mono)、ACTH 7-38 (MH+: 3657.9294, mono)を用いた。
【００１８】
結晶化
図１−１は、本発明の支持板を用いた場合のα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸の結晶を示す顕微鏡写真である。比較のために従来の金プレートを用いた場合の顕微鏡写真を図１−２として示す。グラスライクカーボンを用いた場合の結晶の直径は4〜8ミクロンであり、しかも均一に隙間なく広がっていることがわかる。一方、金プレートの場合では結晶の直径は10〜20ミクロンであり、結晶径が不均一である。
【００１９】
感度比較
Angiotensin I（156 fmol）とACTH 7-38（2.5 pmol）を用い、支持板としてグラスライクカーボンと金プレートとを夫々用いた場合の感度をS/N比によって比較評価した。S/N比とはシグナル（S）とノイズ（N）との比であり、この値が大きい程感度の良い分析であるといえる。
【００２０】
まずAngiotensin Iを試料として、グラスライクカーボンを支持板とした場合（図２）、シグナル（S）は、約6652.02（ピークの最大値約6864.95と裾野部の値約212.93との差）であり、ノイズ（N）は、約246.515（最大値約330.49と最小値約83.975との差）であり、従って、S/N比は約27.0であった。一方、同じ試料について、金プレートを支持板とした場合（図３）では、同様の計算により、S/N比は5.4であった（表１）。即ち、グラスライクカーボンを支持板とした場合と金プレートを支持板とした場合との感度比は5.0であった。次に、ACTH 7-38を試料とした場合、グラスライクカーボン（図４）ではS/N比が22.7であるのに対して、金プレート（図５）ではS/N比が4.0であり（表２）、両者の感度比は5.7であった。
このように、いずれのペプチドにおいても感度は5倍程度向上することが分かった。
【００２１】
【表１】
表１：グラスライクカーボンと金プレートとの感度比較
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グラスライクカーボンと金プレートとの感度比較： 27.0／5.4＝5.0
【００２２】
【表２】
表２：
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グラスライクカーボンと金プレートとの感度比較： 22.7／4.0＝5.0
【００２３】
分解能比較
ペプチド(5 pmol)を用い、グラスライクカーボンと金プレートの分解能を比較した。分解能を表す数字は質量をピークの半値幅で除したものであり、大きな値程高分解能である。
まずAngiotensin Iを試料として、グラスライクカーボンを支持板とした場合（図６）、ピーク中心の質量は約1296.3862であり、またピークの半値幅、即ち、ピークの裾野部からピークの頂点までの高さの半分の高さにおけるピークの幅は、約1296.5204−約1296.2688＝0.2516である。この場合、分解能は、5152となった。金プレートを支持板とした場合（図７）では、同様の計算により、分解能は2842であった（表３）。
【００２４】
以下、同様にACTH 18-39及びβ-Endorphin を夫々試料とした場合についての分解能の比較を表３に示す。表３中の括弧内の数字は、測定に用いたレーザーステップ値（レーザー強度）を示している。なお、金プレートを支持板とした場合、グラスライクカーボンの場合に適用されるのと同程度のレーザー強度では、ピークを得ることはできなかった。
以上の結果から、いずれのペプチドにおいても、グラスライクカーボンを支持板とした場合、金プレートを支持板とした場合に比べ、より低いレーザー強度で十分なイオン量が得られ、また分解能は1.5倍程度向上することが分かった。
【００２５】
【表３】
表３：グラスライクカーボンと金プレートの分解能比較
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【図面の簡単な説明】
【図１−１】本発明の支持板を用いた場合のα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸の結晶の顕微鏡写真（X200）。
【図１−２】金プレートを用いた場合のα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸の結晶の顕微鏡写真（X200）。
【図２】グラスライクカーボンプレートを用いたAngiotensin I（156 fmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図３】金プレートを用いたAngiotensin I（156 fmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図４】グラスライクカーボンプレートを用いたACTH 7-38（2.5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図５】金プレートを用いたACTH 7-38（2.5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図６】グラスライクカーボンプレートを用いたAngiotensin I（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図７】金プレートを用いたAngiotensin I（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図８】グラスライクカーボンプレートを用いたACTH 18-39（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図９】金プレートを用いたACTH 18-39（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図１０】グラスライクカーボンプレートを用いたβ-Endorphin（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図１１】金プレートを用いたβ-Endorphin（5 pmol）のMALDI-TOF/MSスペクトル。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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