(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのジスルフィド結合で一緒に結合されているインターロイキン−１２の２つのｐ４０サブユニットを含むｐ４０ホモダイマーであって、該ｐ４０サブユニットが配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるｐ４０ホモダイマー。
【請求項２】
細胞の増殖を媒介することなくインターロイキン−１２受容体に結合することができる、請求項１記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項３】
分子量が約８０ｋＤである、請求項１または２記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項４】
請求項1〜３のいずれか１項に記載したｐ４０ホモダイマーの生産方法であって、
a. インターロイキン−１２のｐ４０サブユニットをコードするクローン化遺伝子を含む発現ベクターで細胞を形質転換し；
ｂ. 該形質転換細胞内でｐ４０ホモダイマータンパク質を発現させ；そして
ｃ. 該ｐ４０ホモダイマーを回収する；
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記の細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記の真核細胞がＳＦ９またはＣＯＳ細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記の発現ベクターがｐＥＦ−ＢＯＳまたはｐＡＣＤ７−１から誘導される、請求項４〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
インターロイキン−１２のｐ４０ホモダイマーをイムノアフィニティーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより回収する、請求項４〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか1項に記載の方法により調製された請求項項1〜３のいずれか１項に記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項１０】
インターロイキン−１２受容体のアンタゴニストとしての請求項1〜３のいずれか１項に記載のｐ４０ホモダイマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、インターロイキン−１２  受容体のアンタゴニストとして作用する、インターロイキン−１２  のｐ４０サブユニットが２つ会合したタンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−１２  （ＩＬ−１２  ）は、以前は細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）またはナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）として知られていたものであるが、活性化したＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖刺激（１，２）、末梢血単核細胞によるＩＮＦ−γ産生の誘導、およびＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性の増進（２−４）を含む、多面的な活性を有するサイトカインである。
【０００３】
ＩＬ−１２  は、およその分子量が約７５ｋＤで、ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニット、すなわち分子量が約３５ｋＤのｐ３５と分子量が約４０ｋＤのｐ４０、からなっているヘテロダイマー分子である（２，４−６）。ｐ４０サブユニットはインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）とアミノ酸配列において相同性を有していることから、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属しており、一方ｐ３５はＩＬ−６／Ｇ−ＣＳＦサイトカインファミリーと遠いが有意な関連性を有している。ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーは、サイトカイン（ｐ３５）と可溶性のサイトカイン受容体（ｐ４０）の複合体として示すことができ、細胞性ＩＬ−１２受容体はＩＬ−６シグナル変換タンパク質のｇｐ１３０  と類似した機能を提供するものと推測されてきた（７，８）。
【０００４】
ＩＬ−１２  の生物学的活性は、活性化されたＴ細胞またはＮＫ細胞上の原形質膜受容体への無傷のＩＬ−１２  分子の結合によって仲介される（９，１０）。しかし、受容体結合およびシグナル変換に対するそれぞれのサブユニットの寄与については未解明のままである。ヒトＩＬ−１２  に対する中和抗体（１１）および部位特異的化学修飾（１２）を使用した研究により、ｐ４０サブユニットは、ＩＬ−１２  がその受容体に結合するのに重要なエピトープを含むことが示唆された。また、ヒト／マウスキメラ分子を使用した研究により、ｐ３５は生物学的活性に関してそのヘテロダイマーの種特異性を決定づけていることが示された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、インターロイキン−１２  受容体に結合することができるが細胞増殖を仲介することはできない、インターロイキン−１２  のｐ４０サブユニットのホモダイマータンパク質を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
初めに、本明細書で用いる用語について説明する。
用語「ホモダイマー」は２つのｐ４０サブユニットの相互会合を意味する。ｐ４０サブユニットの会合は共有結合または非共有結合性のもので、たとえば翻訳後修飾による適当な宿主細胞中でのｐ４０サブユニットの組換え発現によってｉｎ  ｖｉｖｏ  で、またはたとえば架橋剤などの化学的手段によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、形成させることができる。
【００１０】
次に、図面について説明する。
図１．フローサイトメトリーにより分析した、ヒトＩＬ−１２  およびＣＯＳ発現ｒｐ４０のＫＩＴ２２５  ／Ｋ６細胞への用量依存的結合。「材料および方法」に記載したように、種々の濃度の精製ヒトＩＬ−１２  またはｒｐ４０含有馴化培地（標準としてＩＬ−１２  を使用したＥＩＡ（酵素免疫検定法）によって測定）をＫＩＴ２２５  ／Ｋ６細胞とともにインキュベートし、ビオチニル化８Ｅ３ｍＡｂ続いてストレプトアビジン−ＰＥによって検出した。パネルＡ：曲線ａはビオチニル化８Ｅ３およびストレプトアビジン−ＰＥのみとインキュベートした細胞の非特異的染色を示す。曲線ｂおよびｃはそれぞれ１００  および５００ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２  とインキュベートした細胞を示す。パネルＢ：曲線ａは非特異的染色を示し、曲線ｂ，ｃ，ｄおよびｅはそれぞれ２．５  ，１２．５  ，１２５  ，および５００  ｎｇ／ｍｌ  のｒｐ４０とインキュベートした細胞を示す。
【００１１】
図２．ＦＡＣＳ分析によって検出したｒｐ４０のＫＩＴ２２５  ／Ｋ６細胞への結合特異性。精製ヒトＩＬ−１２  （Ａ）、ヒトｐ３５およびｐ４０ｃＤＮＡで同時トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化培地（Ｂ）、またはヒトｐ４０ｃＤＮＡのみでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化培地（Ｃ）を０．５μｇ／ｍｌ（ＥＩＡによって測定）に希釈し、ＫＩＴ２２５  ／Ｋ６細胞を添加する前に、最終濃度２５μｇ／ｍｌの４Ａ１中和モノクローナル抗ヒトＩＬ−１２  抗体（ｂ）または正常ラットＩｇＧ（Ｒ−ＩｇＧ）（ｃ）とともに室温で１時間インキュベートした。ｐＥＦ−ＢＯＳ野生型プラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養物からの馴化培地を対照として使用した（Ｄ）。非特異的染色を測定するため、細胞をビオチン−８Ｅ３およびストレプトアビジン−ＰＥのみとインキュベートした（ａ）。
【００１２】
図３．別々に発現させたｒｐ４０およびｒｐ３５、または同時に発現させたｒｐ３５／ｒｐ４０を含有する馴化培地に応答したＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球の増殖。ヒトＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）−芽球を、ヒトｐ３５およびｐ４０ｃＤＮＡ（−●−）、ｐ４０ｃＤＮＡのみ（−■−）、ｐ３５ｃＤＮＡのみ（−▲−）、またはｐＥＦ−ＢＯＳ野生型プラスミド（−○−）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞培養物から得た馴化培地の連続希釈物とともに培養した。４８時間後、「材料および方法」に記載したように［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
【００１３】
図４．ＣＯＳ発現ヒトｒｐ３５、ｒｐ４０、およびｒｐ３５／ｒｐ４０ヘテロダイマータンパク質のウェスタンブロット分析。馴化培地（０．５ｍｌ  ）をヤギ抗ヒトＩＬ−１２  抗血清から単離したＩｇＧタンパク質５μｇによって免疫沈降させ、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ウサギ抗ヒトＩＬ−１２  抗血清およびペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを使用したイムノブロットによって分析した。各レーンに添加した試料は図に記載した通りである。比較のため、ＣＨＯ細胞からのヒトＩＬ−１２  の２つの異なる量（それぞれ５０ｎｇおよび２００ｎｇ  ）を添加した。分子量標準（ｘ１０−３）の位置を左側に示す。
【００１４】
図５．ＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０タンパク質の脱グリコシル化。精製ヒトＩＬ−１２  （０．５μｇ  ）およびヤギ抗ヒトＩＬ−  １２抗血清によって免疫沈降させたＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０タンパク質を、「材料および方法」に記載したように、Ｎ−デグリコシダーゼＦによって脱グリコシル化した。脱グリコシル化タンパク質の２反復試料を、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、「材料および方法」に記載したように、イムノブロットによって分析した。分子量標準（ｘ１０−３）の位置を左側に示す。
【００１５】
図６．ｒｐ４０種のＨＰＬＣ分画化。組換えｐ４０タンパク質をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって部分精製し、ハイロード・スーパーデックス（ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ）７５ゲル濾過カラムに通した。画分をｐ４０ＥＩＡおよびＫＩＴ２２５  ／Ｋ６ＦＡＣＳ結合検定で評価した。ＥＩＡのデータ（−○−）はμｇ／ｍｌ（標準としてヒトＩＬ−１２  を使用）でプロットし、結合データ（−●−）は蛍光強度の平均ピークでプロットした（上部パネル）。ＥＩＡ陽性画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析で評価した（下部パネル）。レーン１から１２はそれぞれ画分４０，  ４４，  ４６，  ４８，  ５０，  ５２，  ５４，  ５８，  ６０，  ６２，  ６４，  および７０から得たタンパク質（約５０ｎｇ）を表している。
【００１６】
図７．ＣＯＳ発現ｒｐ４０タンパク質による、［１２５Ｉ］ヒトＩＬ−１２  のヒトＰＨＡ−芽球への結合に対する阻害。種々の濃度の精製ヒトＩＬ−１２  ヘテロダイマー    （−●−）、ＣＯＳ発現ｒｐ４０ホモダイマー（−○−）またはｒｐ４０モノマー（−■−）（標準としてＩＬ−１２  を使用したＥＩＡによって測定）を１００ｐＭ  の［１２５Ｉ］ヒトＩＬ−１２  の存在下、室温で１．５  時間、１ｘ１０６  個のＰＨＡ−芽球とともにインキュベートした。データは［１２５Ｉ］ＩＬ−１２  の特異的結合を示し、非標識ＩＬ−１２不在下での総特異的結合に対する、表示濃度の非標識ＩＬ−１２  またはｒｐ４０タンパク質存在下で細胞に結合した［１２５Ｉ］ＩＬ−１２  量のパーセンテージで表してある。
【００１７】
図８．ＣＯＳ発現ヒトｐ４０ホモダイマーはヒトＰＨＡ−芽球の増殖をほとんど誘発しない。精製天然ヒトＩＬ−１２  （−○−）、部分精製ＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０ホモダイマー（−●−）、またはＰＢＳ緩衝液（−□−）の連続希釈物を２ｘ１０４  個のＰＨＡ−芽球とともにインキュベートした。増殖を「材料および方法」に記載したように４８時間検定で測定した。ｒｐ４０の濃度は「材料および方法」に記載したように、標準として天然ヒトＩＬ−１２  を使用したサンドイッチＥＩＡによって決定した。
【００１８】
図９．ＣＯＳ発現ｐ４０ホモダイマーによるＩＬ−１２  の生物活性の阻害。種々の濃度のＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０ホモダイマーを２ｘ１０４  個のＰＨＡ−芽球とともにインキュベートする前に、天然ヒトＩＬ−１２  ０．１ｎｇ／ｍｌと混合した。ＣＯＳ発現ｐ４０ホモダイマーによるＩＬ−１２  の生物活性の中和を、「材料および方法」に記載したように、４８時間増殖検定で測定した。データは、同希釈のＰＢＳ緩衝液存在下での［３Ｈ］チミジンの取り込みに比較した、表示濃度のｐ４０ホモダイマー存在下での［３Ｈ］チミジンの取り込みの阻害％で表してある。ｐ４０の濃度は、「材料および方法」に記載したように、標準として天然ヒトＩＬ−１２  を使用したサンドイッチＥＩＡによって決定した。
【００１９】
図１０．ＩＬ−１２  ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーおよびｐ４０／ｐ４０ホモダイマーのＩＬ−  １２受容体への結合およびシグナル変換の模式図。ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットは、ＩＬ−１２  受容体への結合のために必要とされるエピトープの適切なコンホメーションをとるためには、ｐ３５サブユニットまたはもう１つのｐ４０分子と会合しなければならない。しかし、ホモダイマー（Ｂ）ではなく、ヘテロダイマー（Ａ）のみが、シグナルを誘発するための完全アゴニストとして作用する。
【００２０】
本発明の好適な実施態様は、好ましくは少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合した、インターロイキン−１２  の２つのｐ４０サブユニットからなる、ｐ４０ホモダイマータンパク質である。この化合物の分子量はおよそ８０ｋＤである。好適なｐ４０サブユニットは配列番号：１のものである。
本発明のｐ４０ホモダイマータンパク質は、インターロイキン−１２  受容体に結合することはできるが、細胞増殖を仲介することはできない。すなわち、これらはインターロイキン−１２  受容体のアンタゴニストとして作用する。この生物学的活性は当業界で知られた標準検定法（ＥＰ  ０  ４４３  ８２７）によって、たとえば下記のようにして、測定することができる。
【００２１】
本発明によるｐ４０ホモダイマータンパク質は純粋な形態で得られる。インターロイキン−１２  のｐ４０サブユニット（配列番号：１）は当業界で知られた方法（ＥＰ  ０  ４３３  ８２７）によって得ることができるが、この配列を土台にして、ｐ４０サブユニットおよびｐ４０ホモダイマータンパク質それぞれの生物学的に活性な類似体および断片を製造することができる。これらの生物学的活性タンパク質は、組換えＤＮＡ技術の標準的方法によって生物学的に生産するか、あるいはアミノ酸合成装置によるか、よく知られた液相または固相ペプチド合成法での手動合成によって、化学的に合成することができる。同様にして、ｐ４０のアミノ酸配列を他のアミノ酸とともに含んでいる類似体、断片、そしてタンパク質を製造することができる。その後これらすべてのタンパク質の対応する生物学的活性を試験する。
【００２２】
このように、本発明はｐ４０ホモダイマータンパク質とその使用、そしてこれらの製造方法に関するものである。
本発明の実施においては、他に示さないかぎり、当分野の技術者の技術範囲内の、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の一般的な技術を使用する。これらの技術は文献に十分に説明されている。たとえば以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ；  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ      ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）  ；  ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ，ＶＯＬＵＭＥＳ  Ｉ  ＡＮＤ  ＩＩ  （Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）  ；          ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．，１９８４）  ；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  （Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．，１９８４）  ；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．  ，  １９８６）  ；  ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）  ；  Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ          ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）  ；  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ  （Ｊ．Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ    Ｖｏｌ．１５４  ａｎｄ  Ｖｏｌ．１５５  （それぞれＷｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，ｅｄｓ．）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，１９８７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ），    Ｓｃｏｐｅｓ  ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ：            ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ    （１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．），および  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ，  ＶＯＬＵＭＥＳ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｄｓ．，１９８６）
【００２３】
本発明のｐ４０サブユニットをコードするＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は多種にわたる宿主−ベクターの組合せを使用して発現させることができる。たとえば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなっているものでもよい。こうしたベクターの例として、種々の既知のＳＶ４０誘導体などのウィルスベクター；ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２  、ｐＭＢ９およびＲＰ４を含むＥ．ｃｏｌｉからのプラスミドなどのバクテリアベクター；ファージλＭ１３および他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージの多くの誘導体などのファージＤＮＡ；２μプラスミドなどの酵母中で有効なベクター、真核細胞中で有効なベクター；より好ましくはＳＶ４０、アデノウィルスおよび／またはレトロウィルス由来の誘導ＤＮＡ配列を含んだものなどの、動物細胞中で有効なベクターがある。有効なベクターは、ファージＤＮＡを含むように改変されたプラスミドまたはその他の誘導体などのような、プラスミドＤＮＡとファージＤＮＡとを組み合わせたものから誘導することもできる。
【００２４】
組換えｐ４０ホモダイマータンパク質の生産に使用することのできる発現ベクターは、ベクター中に挿入されるｐ４０ＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結された、クローン化ｐ４０ＤＮＡ配列の発現を制御および調節するための発現制御配列を少なくとも１つ含むものとして特徴づけられる。有効な発現制御配列の例として、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターなどの酵母解糖プロモーター、Ｐｈｏ５などの酵母酸性ホスファターゼプロモーター、酵母α交配因子プロモーター、そしてＳＶ４０の初期および後期プロモーターなどの、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、レトロウィルスおよびシミアンウィルスから誘導されるプロモーター、また原核または真核細胞およびそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の配列があり、そして上記プロモーター／オペレーター配列の組合せも有効である。
【００２５】
ｐ４０サブユニットをコードするＤＮＡは既知である（２，４−６，１３）。このＤＮＡは、一般的なクローニング技術によって、またはｐ４０サブユニットのｃＤＮＡコード配列の始めと終わりに相補的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる（６，１３）。
本発明は、ｐ４０ホモダイマーの生産のための宿主細胞および発現ベクターを提供するものでもある。この方法は、既知の調節配列の制御下においてｐ４０モノマーをコードするＤＮＡ配列で形質転換された、好適な細胞または細胞系を培養することからなっている。好適な細胞または細胞系として、ＣＯＳ細胞、バキュロウィルス発現系のためのＳＦ９細胞などの真核細胞またはＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞がある。その他の宿主細胞、発現ベクター、また形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび目的物の生産の方法の選択については当業界で知られている（１７）。好適な発現ベクターは、ＣＯＳ発現にはｐＥＦ−ＢＯＳ（１６ａ）であり、バキュロウィルス発現系にはｐＡＣＤＺ−１である。
【００２６】
本発明はまた、たとえばイムノアフィニティー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などによるｐ４０ホモダイマータンパク質の回収方法をも提供する。さらに、本発明のＤＮＡ配列で形質転換された原核および真核宿主細胞の培養によって生産されたｐ４０ホモダイマーはその後、たとえば以下に示すような公知の方法によって、本質的に均質となるまで精製される：種々の速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる沈殿、（常圧または減圧での）透析、等電点電気泳動分離、ゲル電気泳動分離、あるいはゲル濾過、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、セファロース（商標）ブルーＣＬ−６ＢまたはＩＬ−１２  ホモダイマーに対する担体結合モノクローナル抗体を使用）などの種々のクロマトグラフィーの方法。
【００２７】
ＩＬ−１２  ホモダイマーを含有する医薬もまた、その医薬の製造方法とともに本発明の目的の１つである。そしてその方法は、ＩＬ−１２  ホモダイマーを、必要ならば１またはそれ以上の他の治療上有用な物質とともに製剤上の投与形態にすることからなるものである。
ｐ４０ホモダイマータンパク質またはこれを含む医薬組成物は、たとえば錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質または軟質ゼラチンカプセル、溶液剤、乳濁剤、懸濁剤などの形態で経口投与することができる。投与はまた、たとえば座薬を使用した直腸投与、たとえば軟膏、クリーム、ゲルまたは溶液を使用した局所または経皮投与、あるいは注射による非経口投与または時間をかけた緩やかな灌流で実施することもできる。その投与は静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下で実施することができる。
【００２８】
錠剤、被覆錠剤、糖衣錠または硬質ゼラチンカプセルの製造のためには、本発明の化合物を薬学的に不活性な無機または有機賦形剤と混合すればよい。錠剤、糖衣錠または硬質ゼラチンカプセル用の好適な賦形剤の例として、ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、タルクまたはステアリン酸またはその塩が含まれる。
【００２９】
軟質ゼラチンカプセルに使用する好適な賦形剤として、たとえば植物油、ワックス、脂肪、半固形または液状多価アルコールその他が含まれる。しかし、活性成分の性質によっては、軟質ゼラチンカプセルには一切賦形剤が必要でない場合もあり得る。
溶液剤およびシロップ剤の製造のためには、使用され得る添加剤として、たとえば水、多価アルコール、ショ糖、転化糖およびグルコースがある。
【００３０】
非経口投与のための薬学的に許容される製剤には無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤および乳濁剤が含まれる。非水性溶媒の例に、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。水性担体には、食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、水分および栄養補給剤、リンゲルデキストロースを基本としたものなどの電解質補給剤やこれらに類するものが含まれる。保存剤や、たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのその他の添加剤も存在させてもよい。一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｅｄｓ．，１９９０  を参照されたい。
【００３１】
坐薬および局所または経皮適用については、使用することのできる賦形剤として、たとえば天然または硬化油、ワックス、脂肪および半固形または液状多価アルコールが含まれる。
医薬組成物は保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味付与剤、着色剤、付香剤、浸透圧変化のための塩類、緩衝剤、被覆剤または抗酸化剤を含有してもよい。それらはまた、治療上有用な他の薬剤を含有してもよい。
【００３２】
生物学的応答を得るためにヒトに投与するｐ４０ホモダイマーは、好ましくは週に２から３回筋肉または静脈内に投与すべきである。ｐ４０ホモダイマーの投与量は、当業者が過度の実験をすることなく決定することができるが、その予想投与量は０．１  から２ｍｇ／ｋｇ体重である。
本発明は、本発明のｐ４０ホモダイマーを含有する医薬組成物を製造する方法にも関わるものである。
【００３３】
ＩＬ−１２  ｐ４０ホモダイマーは、病理学的免疫応答において、ＩＬ−１２  の生物学的活性をブロックするためのＩＬ−１２  アンタゴニストとして、有用である。  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  およびｉｎ  ｖｉｖｏ  での両方の研究による現在までの知見によれば、細胞性免疫応答を促進するＴｈ１型ヘルパーＴ細胞の発生（２２，２４）、成熟Ｔおよび／またはＮＫ細胞によるガンマインターフェロン生産の誘導（２５）、および特異的細胞溶解性Ｔリンパ球の応答の促進（２６）において、ＩＬ−１２  が重要な役割を果たしているとが示唆されている。Ｔｈ１細胞の過剰活性（２７，２８）および／またはガンマインターフェロンの過剰生産（２７−３１）がある種の自己免疫疾患および敗血症性ショックの病因に関連していると考えられることから、ＩＬ−１２  ｐ４０ホモダイマーは、リューマチ性および他の炎症性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発硬化症、全身性エリテマトーデス、敗血症性ショックその他などの疾患の治療に有用であることがわかる。さらに、ＩＬ−１２  ｐ４０ホモダイマーは同種移植の拒絶反応および移植片対宿主病を予防または遅延させるのにも有用である。ＩＬ−１２  ｐ４０ホモダイマーを病的免疫応答の予防または拮抗に使用するにあたっては、ＩＬ−２受容体や可溶性ＴＮＦ受容体に対する抗体またはＩＬ−１受容体アンタゴニストやそれに類する、別のサイトカインアンタゴニストと併用することができる。
【００３４】
【実施例】
材料および方法
細胞系
ヒトＴ細胞系ＫＩＴ２２５  （１４）から誘導された、ＩＬ−２依存性サブクローンの１つである、ＫＩＴ２２５  ／Ｋ６がＩＬ−１２  受容体を発現することは、すでにわかっている（１５）。ＫＩＴ２２５  ／Ｋ６細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン（  Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン、１００  μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  社、ニューヨーク州グランドアイランド）、１５％ＦＣＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  社、カンザス州レネクサ）および１００  Ｕ／ｍｌヒトｒＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットレー）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地  （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社、メリーランド州ウォーカーズビル）中で培養した。ＣＯＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０  または１６５１）細胞を、４５００ｍｇ／ｌグルコース、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  社）を加えたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  社）中で培養した。
【００３５】
ＩＬ−１２  サブユニットの発現
ＣＯＳ発現のためのＩＬ−１２  発現構築物を、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）染色体遺伝子のプロモーターを含んでいるｐＥＦ−ＢＯＳベクター中で構築した（１６ａ）。文献（６，１３）にしたがって、サブユニットのｃＤＮＡコード配列の始めと終わりに相補的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成させた、ヒトまたはマウスのｐ４０またはｐ３５ｃＤＮＡの全コード領域を含むｃＤＮＡ断片を、平滑末端連結により、ｐＥＦ−ＢＯＳベクター中のＸｂａ１クローニング部位に、それぞれサブクローン化した（１７）。連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ−５アルファ（ＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏ  社）中に形質転換し、形成されたコロニーについて、ｐＥＦ−ＢＯＳプロモーター中の正プライマーおよびサブユニットのコード配列中の逆プライマーを使用して、正しい挿入方向のものを、ＰＣＲによりスクリーニングした。陽性クローンを選択し、適当なＥ．ｃｏｌｉ株、たとえばＭＣ１１６１中で増幅させた。プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州チャッツワース）を使用して、あらかじめ調製し、ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン法（１７）を使用して、ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトした。濃度２μｇ／ｍｌのこのＤＮＡを、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変必須培地）中の１０％ニュートリドーマ  （Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）  −ＳＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  社、インジアナ州インジアナポリス）、０．５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストランおよび０．０５ｍｇ／ｍｌクロロキンと混合し、１６時間前に接種したＣＯＳ細胞に加えた。２．５  〜３時間インキュベートした後、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地中の１０％ＤＭＳＯで３分間処理し、ＤＭＥＭ培地で洗浄し、つづいてＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地中で培養した。７２時間後、トランスフェクトＣＯＳ細胞の培養物から上清を採取した。ｐ４０およびｐ３５サブユニットの同時発現を、この２つのプラスミドＤＮＡを比１：１（Ｗ／Ｗ）でトランスフェクション用試薬中に混合することにより、実施した。ｐＥＦ−ＢＯＳ野生型プラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ培養物から取り出した上清を対照として使用した。
【００３６】
上記と同じ手順にしたがって、バキュロウィルス系での発現のためのヒトＩＬ−１２  ｐ４０構築物をｐＡＣＤＺ−１ベクター（１６ｂ，１６ｃ）中のＢａｍＨ１部位に構築した。ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ    ＣＲＬ１７１１）に野生型バキュロウィルスＤＮＡとｐ４０発現プラスミドｐＡＣＤＺ−１を同時トランスフェクションすることによって、ｐ４０鎖を発現する組換えバキュロウィルスを生成させた。ヒトＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットを発現する組換えバキュロウィルス１個を単離するのに、マイロタイタープレートでの限界希釈クローニング法を使用した。
【００３７】
ＩＬ−１２  受容体の結合と増殖の検定
ＣＯＳ発現ＩＬ−１２  分子のＩＬ−１２  受容体担持細胞への結合を、Ｄｅｓａｉ  らの記載（１０）に基本的に基づいたＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）検定法によって測定した。簡単に述べると、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（リン酸緩衝液）／２％ＦＣＳ／０．０５％アジ化ナトリウム）２５μｌ中に懸濁した１ｘ１０６  個のＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞をＩＬ−１２  調製物（２５μｌ）とともに室温で４０分間インキュベートし、次にビオチニル化ｍＡｂ８Ｅ３、非阻害性抗ヒトＩＬ−１２  ｐ４０特異的モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ，５０μｌ）（１１）と３０分間、さらにストレプトアビジン−ＰＥ（１．５μｇ／ｍｌ，５０μｌ；ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ  社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）と２０分間インキュベートした。染色した細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で検定した。細胞添加前に、ＩＬ−１２  調製物（０．５μｇ／ｍｌ）をラット阻害性抗ヒトＩＬ−１２  モノクローナル抗体の４Ａ１（２５μｇ／ｍｌ）とプレインキュベートすることによって、結合特異性を測定した。対照試料を正常ラットＩｇＧ（２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ＣＯＳ発現ＩＬ−１２  分子の受容体結合特性も、基本的に記載された（１１）ように実施した［１２５Ｉ］ＩＬ−１２競合受容体結合検定法によって測定した。培養上清または精製ＩＬ−１２  の連続希釈物の０．１ｍｌ  アリコートを、［１２５Ｉ］ＩＬ−１２（２ｘ１０６ｃｐｍ）を含有する結合用緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０  ，５％ＦＣＳ，２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．４  ）の０．０５ｍｌアリコートと混合した。混合物を活性化芽球（１ｘ１０７細胞／ｍｌ）０．１ｍｌ  に加え、２５℃の撹拌水浴中で１．５  時間インキュベートした。この検定では２０μｇ／ｍｌの非標識ＩＬ−１２  を入れることによって、非特異的結合を測定した。インキュベーションを２回反復実施した。２回反復の検定試料の０．１ｍｌ  アリコートをシリコーン油０．１ｍｌ  を通して、１０，０００ｘｇで９０秒間遠心分離することによって、遊離［１２５Ｉ］ＩＬ−１２  から細胞結合放射能を分離した。細胞ペレットを含有する先端部を切り取り、ガンマ計数管で細胞結合放射能を測定した。
【００３８】
ＣＯＳ発現ＩＬ−１２  分子の生物学的活性は、記載された（４，１３）とおりに、４日ＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球を使用した増殖検定によって評価した。
【００３９】
抗ＩＬ−１２抗体およびサンドイッチ酵素免疫検定法（ＥＩＡ）
ＣＨＯ細胞において発現させ、精製したヒトｒＩＬ−１２で免疫した動物から、ヤギおよびウサギ抗ヒトＩＬ−１２抗血清を得た（３５）。プロテインＧ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社、ニュージャージー州ピスカタウェー）アフィニティークロマトグラフィーによりメーカーの手順に従って１００ｍｌの抗血清からＩｇＧ画分を単離した。該ＩｇＧ画分から抗ヒトＩＬ−１２抗体をヒトＩＬ−１２結合ヒドラジド  ＡｖｉｄＧｅｌ  Ｆ（ＢｉｏＰｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）イムノアフィニティーカラム（１．５×２．０ｃｍ、０．５５ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂）で精製した。Ｂｉｏｔｉｎ  Ｘ−ＮＨＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンディエゴ）による該抗体のビオチニル化を記載のとおりに行った（１８）。モノクローナル抗体４Ａ１および８Ｅ３はヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに特異的なラット抗体である（ＥＰ  ０  ４３３  ８２７，１１  ）。
【００４０】
ＩＬ−１２サンドイッチＥＩＡは、捕捉抗体としてｍＡｂ４Ａ１を、検出抗体としてペルオキシダーゼ結合８Ｅ３を用いて、以前に記載されたとおりに行った（１１）。このアッセイではＩＬ−１２ヘテロダイマーとｐ４０サブユニットを検出できるが、ｐ３５サブユニットは検出できない。それ故、ｐ４０とｐ３５の両方を検出するために、ポリクローナル抗体を用いる第２のＩＬ−１２サンドイッチＥＩＡを開発した。このアッセイでは、９６ウェルＥＩＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  社、カリフォルニア州サザンオークス）にアフィニティー精製したヤギ抗ヒトＩＬ−１２抗体（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を４℃で一夜被覆し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＩＬ−１２および培養上清の連続希釈液を該プレートに加え、室温にて２．５時間インキュベートした。その後、該プレートをビオチニル化したアフィニティー精製ウサギ抗ヒトＩＬ−１２抗体（５００ｎｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）と、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、Ｓｉｇｍａ  社、ミズーリ州セントルイス）と共にインキュベートした。１００μｌの１ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）／０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を用いて発色させ、４０５ｎｍでの吸光度を  Ｖｍａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  社、カリフォルニア州パロアルト）により測定した。すべての値はＩＬ−１２標準曲線に基づくものであり、モノマーまたはダイマーの分子量の差についての補正は行わなかった。
【００４１】
免疫沈降
ＣＯＳ発現させたＩＬ−１２サブユニットおよびヘテロダイマーの免疫沈降は記載のとおりに行った（１７）。簡単に述べると、トランスフェクションを行ったＣＯＳ培養物からの０．５ｍｌの上清を、ヤギ抗ＩＬ−１２抗血清から単離した５μｇのＩｇＧタンパク質と共に回転ミキサー上で４℃、一夜インキュベートした。免疫複合体をプロテインＧ−セファロース（５０％懸濁液、１０μｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社）に４℃で２時間吸着させ、ビーズを１ｍｌのＮＥＴ−Ｇｅｌ  バッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％（ｖ／ｖ）  ノニデットＰ−４０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．２５％（ｗ／ｖ）ゼラチンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム〕で２回、１ｍｌの０．１％（ｖ／ｖ）  ノニデットＰ−４０含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。ビーズを還元（１０％２−ＭＥ）または非還元ＳＤＳサンプルバッファー中９５℃で３分間加熱することにより、結合したタンパク質をビーズから解離させた。
【００４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは  Ｌａｅｍｍｌｉの方法（１９）に従って行った。ウエスタンブロット法はタンパク質をニトロセルロース膜（０．２μ）（ＭＳＩ社、マサチューセッツ州ウエストボーロ）に電気泳動移行させることにより実施した。移行させた膜は５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＰＢＳＴバッファー（０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０  含有ＰＢＳ）中でのインキュベーションによりブロックし、次いで抗ＩＬ−１２ウサギ抗血清（１：５００希釈）で釣り上げた。ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、該膜をペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  社、ペンシルバニア州ウエストグローブ）と共に室温でインキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．５）中の４−クロロ−１−ナフトール（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州リッチモンド）を用いて発色させた。
【００４３】
ＣＯＳ発現させたｐ４０の精製
約３μｇ／ｍｌのヒト組換えｐ４０（ｒｐ４０）を含有する馴化培地１リットルを、モノクローナル抗体４Ａ１結合ＮｕＧｅｌ（ＮＨＳ）イムノアフィニティーカラム（２．５×１０ｃｍ、ゲル１ｍｌあたり１．６ｍｇの抗体を含む）（３５）に２ｍｌ／分の流速で加え、２８０ｎｍでモニターした吸光度が０．０１より低くなるまで０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含有するＰＢＳで該カラムを十分に洗浄した。その後、結合したタンパク質を１００ｍＭグリシン／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）により２ｍｌ／分の流速で溶出し、２０ｍｌ画分を集め、すぐに１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。ＥＩＡ陽性画分をプールし、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析し、ＹＭ１０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ社、マサチューセッツ州ベバリー）を用いた限外濾過により５ｍｌに濃縮し、そしてダルベッコＰＢＳバッファーで平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社）カラム（１．６×６０ｃｍ）にかけた。該カラムは同一のバッファーを用いて１ｍｌ／分の流速で溶出し、１ｍｌ画分を集めた。それぞれの画分からのタンパク質をＥＩＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で検定した。
【００４４】
脱グリコシル化
５００ｎｇの純粋なヒトＩＬ−１２または免疫沈降させたｒｐ４０タンパク質を、１％２−ＭＥ含有または不含の０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．５％ＳＤＳ中９５℃で５分間加熱することにより変性した。サンプルを室温へ冷却し、１％ノニデット  Ｐ−４０  、２０ｍＭ  ＥＤＴＡに調整し、次いで０．１ＵのＮ−デグリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  社、インジアナ州インジアナポリス）を用いて３７℃で２４時間処理した。脱グリコシル化されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で調べた。
【００４５】
ＣＯＳ発現させたｐ４０のアミノ末端配列
イムノアフィニティー精製したｒｐ４０タンパク質を１０％非還元ＳＤＳゲル上で分離し、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ  ＰＶＤＦ  メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  社、マサチューセッツ州ベッドフォード）に電気泳動移行させた。クーマシーブルー染色により同定された約８０および約４０ｋＤａのバンドは、以前に記載された（２０）とおりにフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体のオンライン解析を備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａ  型気相シークエンサーで自動エドマン分解にかけた。
【００４６】
【表１】
0003546076.tif 000002
【００４７】
ヒトＩＬ−１２サブユニットの発現および特性決定
ヒトＩＬ−１２サブユニットｐ３５およびｐ４０、またはヒトＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーは、それぞれのサブユニットｃＤＮＡを別個にＣＯＳ細胞に導入するか、または両方のｃＤＮＡを１：１（ｗ：ｗ）の比でＣＯＳ細胞に同時に導入することにより発現させた。組換えタンパク質の分泌は２つの異なるＥＩＡにより評価した。ｐ４０特異的モノクローナル抗体に基づいたＥＩＡはｐ４０サブユニットとｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーを検出することができた。ＩＬ−１２特異的ポリクローナルＥＩＡはｐ３５サブユニットも検出可能であった。標品としてヒトＩＬ−１２を使うと、馴化培地中のｒｐ４０およびｒｐ３５／ｒｐ４０タンパク質の濃度範囲は０．５〜３．０μｇ／ｍｌであったが、ｒｐ３５のみの発現はおよそ０．２μｇ／ｍｌであった。ｐ３５の発現が低いのか、ｐ３５を検出するポリクローナルＥＩＡの感度が低いのかは不明のままである。
【００４８】
ＣＯＳ発現させたヒトＩＬ−１２組換えタンパク質は、初めに、ＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球への〔１２５Ｉ〕ヒトＩＬ−１２の結合を阻止するその能力について調べた。１：２希釈のｒｐ４０上清は３回の独立した実験において〔１２５Ｉ〕ヒトＩＬ−１２の結合を３０〜４０％阻止したが、ｒｐ３５上清は不活性であった。さらに、ＩＬ−１２受容体へのｒｐ４０の結合は、ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）を構成的に発現するＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞を用いたフローサイトメトリーにより特徴づけられた（１５）。ＫＩＴ２２５／Ｋ６へのヒトＩＬ−１２およびｒｐ４０の用量依存的結合が２．５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲で見られた（図１）。この結合の特異性は、ＩＬ−１２またはｒｐ４０と抑制性ラット抗ヒトｐ４０モノクローナル抗体４Ａ１とのプレインキュベーションにより結合が８０％以上阻止されることによって実証された（図２）。正常なラットＩｇＧはＩＬ−１２またはｒｐ４０の結合にまったく影響を及ぼさなかった。
【００４９】
ＣＯＳ発現させたＩＬ−１２サブユニットタンパク質を含有する馴化培地はヒトＰＨＡ−芽球増殖検定で評価した（図３）。ｒｐ３５／ｒｐ４０含有培地は８ｎｇ／ｍｌの見かけＥＣ５０でもって用量依存的にＴ細胞増殖を支持した。ｒｐ４０上清はｒｐ３５／ｒｐ４０上清と同じ濃度で増殖を誘導しなかった。
【００５０】
ｒｐ４０の４０ｋＤおよび８０ｋＤ種の特性決定
組換えヒトＩＬ−１２サブユニットを抗ヒトＩＬ−１２ヤギ抗血清により免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により特性決定を行った。ｐ４０ｃＤＮＡのみを導入したＣＯＳ細胞により発現されたｒｐ４０の分析から、非還元条件下において７０〜８５ｋＤおよび３５〜４５ｋＤの均一でない分子量を有する２組の多重バンドが明らかになった（図４のＡ）。還元条件下では、およそ３８〜４９ｋＤａのところに近接したバンドが３本だけ確認され、８０ｋＤタンパク質はジスルフィド結合したｒｐ４０ホモダイマーであることが示唆された（図４のＢ）。Ｎ−デグリコシダーゼＦでｒｐ４０免疫沈降物を処理すると、非還元条件下では両方の分子量がより小さい産物へとシフトし（図５のＡ）、還元した３本のバンドは脱グリコシル化されたヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに類似した単一の３６ｋＤａ産物に変換された（１２）。このことから、ＣＯＳ細胞により発現されたｒｐ４０の多重バンドはグリコシル化の不均質性によるものであることが検証された。
【００５１】
これに対して、ｒｐ３５タンパク質の免疫沈降は、還元条件下で３５ｋＤの分子量を有するただ１本のバンドを示した（図４のＢ）。非還元条件下では、１組の弱く染色されたバンドが６０〜７０ｋＤのところに存在し、これによりｒｐ３５も部分的にダイマーを形成しうることが示唆される。しかし、ポリクローナルヤギ抗ＩＬ−１２抗体はｒｐ３５タンパク質を十分には認識しなかった（図４のＡ）。ｐ３５とｐ４０の同時発現は、各サブユニットを別個に発現させたときに見られたバンドが入り混じったパターンをもたらした（図４）。
【００５２】
２つのｒｐ４０種の同一性を確かめるために、ｒｐ４０タンパク質を４Ａ１イムノアフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製した。１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．８）で溶出することによりＥＩＡ陽性物質の６０％だけを回収した。その後、４Ａ１アフィニティー精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブランに電気泳動移行させ、そしてアミノ酸微量配列決定法に付した。８０ｋＤ付近の１本の幅広バンドと３５〜４０ｋＤの２本のバンドは、ＮＣ−３７細胞（４，１２）から精製した天然ヒトＩＬ−１２ｐ４０のアミノ末端配列と同じアミノ末端配列を与えた（表１）。ｒｐ４０種と同一であるとするｐ３５配列の形跡は全くなかった。この結果から、８０ｋＤタンパク質はｐ４０ホモダイマーであることが確かめられた。
【００５３】
イムノアフィニティー精製したｐ４０タンパク質はスーパーデックス  （Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５ゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに分画化した。２つのＥＩＡ陽性タンパク質のピークが８０ｋＤと４０ｋＤに対応する分子量のところに認められた（図６のＡ）。それぞれの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によりモノマーｒｐ４０からのダイマーの分離を確認した（図６のＢ）。モノマーとダイマーの比は実験ごとに変化したが、平均して、ＣＯＳ発現させたｒｐ４０のおよそ３０％がｐ４０ホモダイマーであった。
【００５４】
スーパーデックス７５カラム画分はＦＡＣＳ分析によりＫＩＴ２２５細胞への結合について試験した。結合活性は８０ｋＤａｐ４０−ＥＩＡ陽性タンパク質とのみ関連していた（図６）。８０ｋＤと４０ｋＤのピーク画分を別々にプールし、濃縮し、そして競合的放射性リガンド受容体結合検定法で調べた（図７）。８０ｋＤタンパク質のプールはヒトＩＬ−１２ヘテロダイマーのＩＣ５０（２０ｎｇ／ｍｌ）と同様の８０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でＰＨＡ−芽球への〔１２５Ｉ〕ヒトＩＬ−１２結合を阻止した。しかしながら、８０ｋＤホモダイマーによる競合曲線の勾配はＩＬ−１２ヘテロダイマーのそれと相違しており、受容体との異なる結合相互作用を示唆している。４０ｋＤタンパク質のプールは、おそらく少量のｐ４０ホモダイマーの混入によると思われるが、約１００倍高いＩＣ５０でもって〔１２５Ｉ〕ヒトＩＬ−１２結合を阻止した（図６のＢ）。
【００５５】
ＰＨＡ−芽球の増殖を支持するｒｐ４０モノマーおよびダイマーの能力も調べた（図８）。いずれのｒｐ４０種においても、５０％最大応答を引き出すのに要するヒトＩＬ−１２の濃度よりも１０，０００倍高い濃度でさえ増殖応答が観察されなかった。ｒｐ４０ダイマーについては、ＰＨＡ−芽球のＩＬ−１２依存性増殖を中和する能力を検討した。様々な濃度の８０ｋＤタンパク質を０．１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２と混合し、ＰＨＡ−芽球に加えた。ＰＨＡ−芽球のＩＬ−１２誘導増殖が用量に依存して阻害され、そのＩＣ５０は１μｇ／ｍｌであった（図９）。
【００５６】
個々のサブユニットの機能的役割を解明し、かつ生物学的活性および結合活性を仲介するエピトープの位置を決定するために、それぞれのサブユニットを単独でまたは互いと組み合わせてＣＯＳ細胞に発現させ、発現タンパク質を結合検定およびバイオアッセイで、あるいはウエスタンブロット分析で調べた。ｒｐ３５タンパク質は結合検定とバイオアッセイにおいて１００ｎｇ／ｍｌほどの高濃度でも不活性であった。ところが、ｒｐ４０タンパク質は生物学的活性を示すことなく結合活性を示し、これは再現性があった。ｐ４０ｃＤＮＡのみを導入したＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化培地の分析から、かかる培地は抗ｐ４０抗体と反応するモノマーｐ４０と８０ｋＤ分子の両方を含むことが確認された。イムノアフィニティークロマトグラフィーとＨＰＬＣゲル透過クロマトグラフィーによるｒｐ４０の部分精製は、４０ｋＤタンパク質ではなく、８０ｋＤタンパク質がＩＬ−１２Ｒと結合することを示した。
【００５７】
この８０ｋＤタンパク質がｐ４０のホモダイマーではなく、１つのＩＬ−１２ｐ４０サブユニットと第２の３５〜４０ｋＤの外因性ＣＯＳ由来タンパク質とからなるヘテロダイマーであるかもしれないという可能性を検討した。特に、多くの細胞系が構成的にＩＬ−１２ｐ３５のｍＲＮＡを発現するという報告（２１）は、この８０ｋＤタンパク質がＣＯＳ由来のＩＬ−１２ｐ３５と会合したヒトＩＬ−１２ｐ４０であり得る可能性を提起した。ｐ３５特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析および脱グリコシル化実験（図５）は、８０ｋＤタンパク質がｐ４０モノマーに還元されるだろうという見解を支持した。良好な結合活性にもかかわらず生物学的活性が消失していることから、（ヒト細胞へのサルＩＬ−１２の活性に種制限がないと仮定して）第２のタンパク質はＣＯＳ由来のｐ３５ＩＬ−１２サブユニットではないと予想された。また、バキュロウイルス系でのｐ４０の発現は受容体結合能を有するｐ４０の生物学的に不活性な８０ｋＤ形態をもたらした。昆虫細胞がＩＬ−１２様ｐ３５タンパク質を産生する可能性はないようだ。最も重要なことは、ｐ４０ホモダイマーと８０ｋＤタンパク質との同一性が該タンパク質のアミノ酸微量配列決定（ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに一致する単一のＮ末端配列を明らかにした）により確認されたことである。
【００５８】
競合的結合検定において、ｐ４０ホモダイマーはヘテロダイマーのＩＬ−１２とほとんど同じくらい強くＩＬ−１２Ｒに結合することがわかり、ＩＬ−１２の重要な結合エピトープはｐ４０サブユニットに存在することが示唆された。ヘテロダイマーとホモダイマーのＩＣ５０値はそれぞれ２０および８０ｎｇ／ｍｌで類似していたが、競合曲線の勾配は異なっていた。このことは２つのリガンドと受容体との相互作用に差があることを示唆している。ｐ４０の結合エピトープはコンホメーションが関係し、これはｐ３５または第２のｐ４０サブユニットとの会合により誘導される可能性が最も強い。
【００５９】
ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットは、活性化されたＢリンパ芽球様細胞系とＩＬ−１２を産生するように刺激されたヒトＰＢＭＣの両方によってヘテロダイマーのＩＬ−１２より多量に産生されることがこれまでに報告されている（１２，２３）。ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーを発現する細胞ではｐ４０ホモダイマーが形成される可能性がある。
【００６０】
結合およびシグナル発生におけるＩＬ−１２サブユニットの役割を検証したことに基づいて、ＩＬ−１２がその受容体に結合する模式図を図１０に示す。ｐ４０サブユニットは受容体結合エピトープを含むが、これはｐ４０が第２タンパク質（すなわち、ｐ３５またはもう１つのｐ４０分子）と会合しているときだけ機能する。両方のダイマー分子はＩＬ−１２Ｒと特異的に結合するが、ｐ３５を含むダイマーだけが細胞のシグナル変換を仲介するアゴニストとして作用する（図１０のＡ）。これに対して、ｐ４０／ｐ４０ダイマーはＩＬ−１２仲介応答を抑制するアンタゴニストとして作動する（図１０のＢ）。
【００６１】
文献
（１）    Ｇａｔｅｌｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｂ．Ｂ．  Ｄｅｓａｉ，  Ａ．Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ｃ．Ｍ．  Ｄｗｙｅｒ，  Ｆ．Ｊ．  Ｐｏｄｌａｓｋｉ，  Ｐ．Ｃ．  Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，  Ｆ．  Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｕ．  Ｇｕｂｌｅｒ，  ａｎｄ  Ａ．Ｓ．  Ｓｔｅｒｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：８７４（１９９１）．
ヘテロダイマーサイトカインＩＬ−１２（細胞障害性リンパ球成熟因子）によるヒトリンパ球増殖の調節。
【００６２】
（２）    Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｌ．  Ｆｉｔｚ，  Ｍ．  Ｒｙａｎ，  Ｒ．Ｍ．  Ｈｅｗｉｃｋ，  Ｓ．Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，  Ｓ．  Ｃｈａｎ，  Ｒ．  Ｌｏｕｄｏｎ，  Ｆ．  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｂ．  Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７０：８２７（１９８９）．
ヒトリンパ球に対して多くの生物学的作用を有するサイトカイン、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）の同定および精製。
【００６３】
（３）    Ｃｈａｎ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｂ．  Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  Ｊ．Ｗ．  Ｇｕｐｔａ，  Ｍ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  Ｐｏｓｐｉｓｉｌ，  Ｈ．Ａ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓ．Ｆ．  Ｗｏｌｆ，  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓ．Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：８６９  （１９９１）．
ナチュラルキラー細胞刺激因子によるインターフェロンγ生産の誘導：キラー細胞の特性決定および他の誘導物質との相乗作用。
【００６４】
（４）    Ｓｔｅｒｎ，  Ａ．Ｓ．，  Ｆ．Ｊ．  Ｐｏｄｌａｓｋｉ，  Ｊ．Ｄ．  Ｈｕｌｍｅｓ，  Ｙ−Ｃ．  Ｐａｎ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ａ．Ｇ．Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｃ．  Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，  Ｄ．Ｌ．  Ｓｔｒｅｍｌｏ，  Ｔ．  Ｔｒｕｉｔｔ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６８０８  （１９９０）．
ヒトＢリンパ芽球様細胞からの細胞障害性リンパ球成熟因子の均質精製および部分的特性決定。
【００６５】
（５）    Ｗｏｌｆ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｐ．Ａ．  Ｔｅｍｐｌｅ，  Ｍ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｍ．  Ｄｉｃｉｇ，  Ｌ．  Ｌｏｗｅ，Ｒ．  Ｄｚｉａｌｏ，  Ｌ．  Ｆｉｔｚ，  Ｃ．  Ｆｅｒｅｎｚ，  Ｒ．Ｍ．  Ｈｅｗｉｃｋ，  Ｋ．  Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，  Ｓ．Ｈ．  Ｈｅｒｍａｎｎ，  Ｓ．Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，  Ｌ．  Ａｚｚｏｎｉ，  Ｓ．Ｈ．  Ｃｈａｎ，  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４６：３０７４  （１９９１）．
Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞に対して多くの生物学的作用を示すヘテロダイマーサイトカインであるナチュラルキラー細胞刺激因子のｃＤＮＡクローニング。
【００６６】
（６）    Ｇｕｂｌｅｒ，  Ｕ．，  Ａ．Ｏ．  Ｃｈｕａ，  Ｄ．Ｓ．  Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔ，  Ｃ．Ｍ．  Ｄｗｙｅｒ，  Ｗ．  ＭｃＣｏｍａｓ，  Ｒ．  Ｍｏｔｙｋａ，  Ｎ．  Ｎａｂａｖｉ，  Ａ．Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ｐ．Ｃ．  Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：４１４３  （１９９１）．
分泌型の生物活性細胞障害性リンパ球成熟因子を生産するためには２つの異なる遺伝子の同時発現が必要である。
【００６７】
（７）    Ｇｅａｒｉｎｇ，  Ｄ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ｃｏｓｍａｎ，  Ｃｅｌｌ  ６６：９  （１９９１）．
ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）のｐ４０サブユニットとインターロイキン−６受容体の細胞外ドメインとの相同性。
【００６８】
（８）    Ｍｅｒｂｅｒｇ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｓ．Ｆ．  Ｗｏｌｆ，  ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：７７  （１９９２）．
ＮＫＳＦとＩＬ−６／Ｇ−ＣＳＦファミリーとの配列類似性。
【００６９】
（９）    Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｒ．，  Ｔ．  Ｔｒｕｉｔｔ，  Ｂ．Ｂ．  Ｄｅｓａｉ，  Ｐ．  Ｎｕｎｅｓ，  Ｆ．Ｊ．  Ｐｏｄｌａｓｋｉ，  Ａ．Ｓ．  Ｓｔｅｒｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：３１１７  （１９９２）．
ＩＬ−１２受容体：Ｉ．フィトヘムアグルチニン活性化ヒトリンパ芽球上の受容体の特性決定。
【００７０】
（１０）  Ｄｅｓａｉ，  Ｂ．Ｂ．，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ａ．Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｋ．Ａ．  Ｍｏｎｇｉｎｉ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：３１２４  （１９９２）．
ＩＬ−１２受容体：ＩＩ．  受容体発現の分布および調節。
【００７１】
（１１）  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｒ．，  Ｔ．  Ｔｒｕｉｔｔ，  Ｆ．Ｊ．  Ｐｏｄｌａｓｋｉ，  Ａ．Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ｐ．  Ｎｕｎｅｓ，  Ａ．Ｓ．  Ｓｔｅｒｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：１５４８  （１９９０）．
ＩＬ−１２：４０−ｋＤａサブユニットに特異的なモノクローナル抗体は活性化リンパ芽球上の受容体結合および生物学的活性を阻止する。
【００７２】
（１２）  Ｐｏｄｌａｓｋｉ，  Ｆ．Ｉ．，  Ｖ．Ｂ．  Ｎａｎｄｕｒｉ，  Ｊ．Ｄ．  Ｈｕｌｍｅｓ，  Ｙ−Ｃ．Ｅ．  Ｐａｎ，  Ｗ．  Ｌｅｖｉｎ，  Ｗ．Ｄａｎｈｏ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  ａｎｄ  Ａ．Ｓ．  Ｓｔｅｒｎ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  ２９４：２３０  （１９９２）．
インターロイキン−１２の分子特性決定。
【００７３】
（１３）  Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔ，  Ｄ．Ｓ．，  Ａ．Ｏ．  Ｃｈｕａ，  Ａ．Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  Ｃ．Ｍ．  Ｄｗｙｅｒ，Ｗ．  ＭｃＣｏｍａｓ，  Ｐ．Ｃ．  Ｆａｍｉｌｉｅｔｔｉ，  Ｍ．Ｋ．  Ｇａｔｅｌｙ，  ａｎｄ  Ｕ．  Ｇｕｂｌｅｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：３４３３  （１９９２）．
マウスＩＬ−１２のクローニングおよび発現。
【００７４】
（１４）  Ｈｏｒｉ，  Ｔ．，  Ｔ．  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｍ．  Ｔｓｕｄａ，  Ｈ．  Ｕｍａｄｏｍｅ，  Ｈ．  Ｏｈｎｏ，  Ｓ．  Ｆｕｋｕｈａｒａ，  Ｋ．  Ｋｉｔａ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｕｃｈｉｎｏ，  Ｂｌｏｏｄ  ７０：１０６９  （１９８７）．
ヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染していないがＴ細胞慢性リンパ球白血病を患う患者から得たインターロイキン２依存性ヒトＴ細胞系の樹立。
【００７５】
（１５）  Ｄｅｓａｉ，  Ｂ．Ｂ．，  Ｔ．  Ｔｒｕｉｔｔ，  Ｓ．  Ｈｏｎａｓｏｇｅ，  Ｒ．  Ｗａｒｒｉｅｒ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  ａｎｄＭ．  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５０：２０７Ａ  （１９９３）．
ヒトＩＬ−２依存性Ｔ細胞系上の機能性ＩＬ−１２Ｒの発現。
【００７６】
（１６）  （ａ）  Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｎａｇａｔａ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：５３２２  （１９９０）．
ｐＥＦ−ＢＯＳ、強力な哺乳動物発現ベクター。
【００７７】
（１６）  （ｂ）  Ｓｕｍｍｅｒｓ，  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｇ．Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，  Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  １９８７．
【００７８】
（１６）  （ｃ）  Ｚｕｉｄｅｍａ，  Ｄ．，  Ａ．  Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，  Ｍ．  Ｕｓｍａｎｙ，  Ａ．Ｊ．  Ｍａｕｌｅ，  Ｇ．Ｊ．  Ｂｅｌｚｈａｍ，  Ｊ．  Ｒｏｏｓｉｅｎ，  Ｅ．Ｃ．  Ｋｌｉｎｓｅ−Ｒｏｏｄｅ，  Ｊ．Ｗ．Ｍ．  ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｖｌａｃｋ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：２２０１−２２０９  （１９９０）．
新規なポリヘドリン系バキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞でのカリフラワーモザイクウイルス遺伝子Ｉの発現。
【００７９】
（１７）  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ．  ｅｄｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．
【００８０】
（１８）  Ｇｕｅｓｄｏｎ，  Ｊ−Ｎ．，  Ｔ．  Ｔｅｒｎｙｎｃｋ，  ａｎｄ  Ｓ．Ａ．  Ａｖｒａｍｅａｓ，  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，  ２７：１１３１  （１９７９）．
免疫酵素的技法におけるアビジン−ビオチン相互作用の使用。
【００８１】
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バクテリオファージＴ４の頭部アセンブリーの際の構成タンパク質の開裂。
【００８２】
（２０）  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｋ．  Ｇｒａｎｌｕｎｄ−Ｍｏｙｅｒ，  ａｎｄ  Ｎ．Ｗ．  Ｗｈｉｔｅｌｙ，  １９８６，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  （Ｓｈｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｅｄ），  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ，  ｐ．３１５．
【００８３】
（２１）  Ｗｏｌｆ，  Ｓ．，  Ｄ．  Ｓｅｉｂｕｒｔｈ，  Ｂ．  Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  Ｊ．  Ｙｅｔｚ−Ａｄａｌｐｅ，  Ａ．  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｅｉｎｃｈｉｅｒｉ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ６：Ａ１３３５  （１９９２）．
ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ／ＩＬ−１２）転写物の細胞源およびサブユニット発現。
【００８４】
（２２）  Ｈｓｅｉｈ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｓ．Ｅ．  Ｍａｃａｔｏｎｉａ，  Ｃ．Ｓ．  Ｔｒｉｐｐ，  Ｓ．Ｆ．  Ｗｏｌｆ，  Ａ．  Ｏ’Ｇａｒｒａ，  ａｎｄＫ．Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：５４７−５４９  （１９９３）．
リステリア  （Ｌｉｓｔｅｒｉａ）  誘導マクロファージにより産生されたＩＬ−１２を介するＴＨ１ＣＤ４＋  Ｔ細胞の発生。
【００８５】
（２３）  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．，  Ｍ．  Ｒｅｎｇａｒａｊｕ，  Ｎ．Ｍ．  Ｖａｌｉａｎｔｅ，  Ｊ．  Ｃｈｅｈｉｍｉ，  Ｍ．  Ｋｕｂｉｎ，  Ｍ．Ａｓｔｅ，  Ｓ．Ｈ．  Ｃｈａｎ，  Ｍ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｅ．  Ｎｉｃｋｂａｒｇ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｓ．Ｆ．  Ｗｏｌｆ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１３８７  （１９９２）．
末梢血単核細胞によるナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２）の産生。
【００８６】
（２４）  Ｍａｎｅｔｔｉ，  Ｒ．，  Ｐ．  Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ，  Ｍ．Ｇ．  Ｇｉｕｄｉｚｉ，  Ｍ．Ｐ．  Ｐｉｃｃｉｎｎｉ，  Ｅ．  Ｍａｇｇｉ，  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７７：１１９９  （１９９３）．
ナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２〔ＩＬ−１２〕）はＴヘルパー１型（Ｔｈ１）特異的免疫反応を誘発し、ＩＬ−４産生Ｔｈ細胞の発生を抑制する。
【００８７】
（２５）  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．，  Ｍ．  Ｒｅｎｇａｒａｊｕ，  Ｎ．Ｍ．  Ｖａｌｉａｎｔｅ，  Ｊ．  Ｃｈｅｈｉｍｉ，  Ｍ．  Ｋｕｂｉｎ，  Ｍ．Ａｓｔｅ，  Ｓ．Ｈ．  Ｃｈａｎ，  Ｍ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｅ．  Ｎｉｃｋｂａｒｇ，  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｓ．Ｆ．  Ｗｏｌｆ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１３８７  （１９９２）．
末梢血単核細胞によるナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２）の産生。
【００８８】
（２６）  Ｇａｔｅｌｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｇ．  Ｗｏｌｉｔｚｋｙ，  Ｐ．Ｍ．  Ｑｕｉｎｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：１２７  （１９９２）．
インターロイキン１２によるヒト細胞溶解性リンパ球応答の調節。
【００８９】
（２７）  Ｂｒｏｄ，  Ｓ．Ａ．，  Ｄ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｈａｆｌｅｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：８１０  （１９９１）．
ヒト炎症でのＩＬ−２／ＩＦＮ−γｍＲＮＡの制限されたＴ細胞発現。
【００９０】
（２８）  Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．，  Ｅ．  Ｈｅｒｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｒｉｎｇｈｏｆｆｅｒ，  Ｐ．  Ｐｒｏｂｓｔ，  Ｈ．  Ｇａｌｌａｔｉ，  Ｋ−Ｈ．Ｍ．  ｚｕｍ  Ｂｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：２７７１  （１９９２）．  エルジニア  （Ｙｅｒｓｉｎｉａ）  誘導炎症性関節炎を患う患者の滑液中で主要部を占めるＴｈ１型Ｔ細胞。
【００９１】
（２９）  Ｊａｃｏｂ，  Ｃ．Ｏ．，  Ｐ．Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｉｄｅ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｏ．  ＭｃＤｅｖｉｔｔ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：７９８  （１９８７）．
γインターフェロンに対するモノクローナル抗体による  （ＮＺＢ  ｘ  ＮＺＷ）Ｆ１ループス様腎炎のｉｎ  ｖｉｖｏ  治療。
【００９２】
（３０）  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｉ．Ｌ．，  Ｔ．Ｗ．Ｈ．  Ｋａｙ，  Ｌ．  Ｏｘｂｒｏｗ，  ａｎｄ  Ｌ．Ｃ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８７：７３９  （１９９１）．
ＮＯＤ／Ｗｅｈｉマウスの自己免疫インシュリン依存性糖尿病でのインターフェロンγおよびインターロイキン６の重要な役割。
【００９３】
（３１）  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｊ．Ｒ．  Ｌａｎｇｅ，  Ｈ．Ｎ．  Ｌａｎｇｓｔｅｉｎ，  Ｈ．Ｒ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｃ．Ｍ．  Ｂｕｒｅｓｈ，  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．  Ｎｏｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：１６６６  （１９９２）．
エンドトキシンおよび腫瘍壊死因子αの致死性の媒介物質としてのＩＦＮ−γの知見。
【００９４】
（３２）  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．
【００９５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３０６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【００９６】
【化１】
0003546076.tif 000003
【００９７】
0003546076.tif 000004
【００９８】
配列番号：２
配列の長さ：１０アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【００９９】
【化２】
0003546076.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】フローサイトメトリーにより分析したヒトＩＬ−１２およびＣＯＳ発現ｒｐ４０のＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞への用量依存的結合を示す図である。
【図２】ＦＡＣＳ分析によって検出したｒｐ４０のＫＩＴ２２５／Ｋ６細胞への結合特異性を示す図である。
【図３】別々に発現させたｒｐ４０とｒｐ３５、または同時に発現させたｒｐ３５／ｒｐ４０を含有する馴化培地に応答したＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球の増殖を示す図である。
【図４】ＣＯＳ発現させたヒトｒｐ３５、ｒｐ４０およびｒｐ３５／ｒｐ４０ヘテロダイマータンパク質のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図５】脱グリコシル化したＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０タンパク質のイムノブロット分析を示す図である。
【図６】ｒｐ４０種のＨＰＬＣ分画化を示す図である。
【図７】ＣＯＳ発現ｒｐ４０タンパク質による〔１２５Ｉ〕ヒトＩＬ−１２のヒトＰＨＡ−芽球結合に対する阻害を示す図である。
【図８】ＣＯＳ発現ヒトｐ４０ホモダイマーがヒトＰＨＡ−芽球の増殖を誘導しないことを示す図である。
【図９】ＣＯＳ発現ヒトｐ４０ホモダイマーによるＩＬ−１２の生物学的活性の阻害を示す図である。
【図１０】ＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーおよびｐ４０／ｐ４０ホモダイマーのＩＬ−１２受容体への結合およびシグナル変換を示す模式図である。
【図１】
0003546076.tif 000006
【図２】
0003546076.tif 000007
【図３】
0003546076.tif 000008
【図４】
0003546076.tif 000009
【図５】
0003546076.tif 000010
【図６】
0003546076.tif 000011
【図７】
0003546076.tif 000012
【図８】
0003546076.tif 000013
【図９】
0003546076.tif 000014
【図１０】
0003546076.tif 000015