(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のシクロオキシゲナーゼ−２活性を測定するアッセイであって、
（ａ）（１）ヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞調製物、
（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び
（３）アラキドン酸
を添加するステップ、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ２の量を測定するステップを含むアッセイ。
【請求項２】
ヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞調製物の細胞部分が骨肉腫１４３．９８．２の全細胞から成ることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞調製物の細胞部分が骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームから成ることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
ミクロソームが内因性アラキドン酸を実質的に含有しないことを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
ミクロソームを、ミクロソーム中の内因性アラキドン酸の量を少なくとも約２倍減少させるのに有効な量の脱脂質化血清タンパク質と接触させることを特徴とする請求項３に記載のアッセイ。
【請求項６】
（ａ）（１）ヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞調製物、
（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び
（３）アラキドン酸
を添加するステップ、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジンＥ２の量を測定するステップを含み、前記細胞調製物に調製物１ｃｃ当たり１０３〜１０９個のヒト骨肉腫１４３．９８．２全細胞かまたは調製物１ｍｌ当たり５０〜５００μｇのヒト骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームを含有させ、アラキドン酸は細胞調製物１ｍｌ当たり０．１〜５０μｌの量で用いることを特徴とする、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
（ａ）細胞調製物１ｃｃ当たり１０３〜１０９個のヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞かまたは５０〜５００μｇのヒト骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームを含有するヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞調製物と、
（ｂ）細胞調製物１ｃｃ当たり０．１〜５０μｌのアラキドン酸と
を含有する組成物。
【請求項８】
細胞調製物１ｃｃ当たり８×１０４個から２×１０６個の骨肉腫１４３．９８．２全細胞かまたは１００〜４００μｇの骨肉腫１４３．９８．２ミクロソームと、細胞調製物１ｃｃ当たり１０〜２０μｌの、ペルオキシドを有しないアラキドン酸とを含有する請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ミクロソームが内因性アラキドン酸を実質的に含有しないことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ、並びにシクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を評価するアッセイに係わる。
【０００２】
非ステロイド性の抗炎症薬は、シクロオキシゲナーゼとしても知られるプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼの阻害によってその抗炎症、鎮痛及び下熱活性の大部分を発揮し、かつホルモン誘発性の子宮収縮及び或る種の癌増殖を抑制する。最近まで、シクロオキシゲナーゼは一つの形態のものしか特性を解明されておらず、その形態は最初にウシの精嚢腺において同定された構成酵素のシクロオキシゲナーゼ−１に対応した。最近、誘導形態のシクロオキシゲナーゼ（シクロオキシゲナーゼ−２）をコードする遺伝子がニワトリ、マウス及びヒト由来の遺伝子源からクローン化され、配列決定され、かつ特性解明された。このシクロオキシゲナーゼ−２は、これもヒツジ、マウス及びヒト由来の遺伝子源からクローン化され、配列決定され、かつ特性解明されたシクロオキシゲナーゼ−１とは区別される。第二の形態のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２は、マイトジェン、内毒素、ホルモン、サイトカイン及び成長因子を含めた幾つかの物質によって急速かつ容易に誘導され得る。プロスタグランジンには生理学的役割と病理学的役割とが有ることから、本発明者は、構成酵素であるシクロオキシゲナーゼ−１は主としてプロスタグランジンの内因性基礎放出の要因であり、従ってプロスタグランジンの、胃腸統合性及び腎血流量の維持などの生理機能において重要であると結論した。これに対して、炎症誘起物質、ホルモン、成長因子及びサイトカインなどの物質に応答して急速に誘導された誘導形態のシクロオキシゲナーゼ−２は主にプロスタグランジンの病理作用の要因となると結論した。即ち、シクロオキシゲナーゼ−２の選択的阻害剤は通常の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のものに類似の抗炎症、下熱及び鎮痛特性を有し、加えてホルモン誘発性の子宮収縮を抑制し、かつ潜在的抗癌作用を有するが、当該機構に基づく副作用の幾つかを起こす恐れは少ない。このような化合物は特に、胃腸に有毒である恐れ、また腎性副作用を起こす恐れが少なく、出血時への影響が小さく、かつアスピリン感受性の喘息患者において喘息発作を惹起する恐れが可能なかぎり少ないものであるべきである。
【０００３】
従って本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性の強力な阻害剤である薬理物質を同定及び評価するアッセイ及び物質を提供することを目的とする。
【０００４】
本発明はまた、シクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−１活性よりもシクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を優先的もしくは選択的に阻害する薬理物質を同定及び評価するアッセイ及び物質の提供も目的とする。
【０００５】
（図面の簡単な説明）
図１はヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す説明図である。
図２はヒト骨肉腫細胞から得たクローン化ヒトシクロオキシゲナーゼ−２相補的ＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す説明図である。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、ヒト骨肉腫細胞シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ及びヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を包含する。
【０００７】
本発明はまた、シクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性の強力な阻害剤である薬理物質を同定及び評価するアッセイを包含する。本発明は、シクロオキシゲナーゼ−１よりもシクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−２活性を優先的もしくは選択的に阻害する薬理物質を同定及び評価するアッセイも包含する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
一具体例において本発明は、試料のシクロオキシゲナーゼ−２活性を測定するアッセイであって、
（ａ）（１）ヒト骨肉腫細胞調製物、
（２）推定シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含有する試料、及び
（３）アラキドン酸
を添加するステップ、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジン
Ｅ２の量を測定するステップ
を含むアッセイを包含する。
【０００９】
本明細書の趣旨において、ヒト骨肉腫細胞は骨肉腫１４３Ｂ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８３０３）及び骨肉腫１４３ＢＰＭＬ  ＢＫ  ＴＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８３０４）などの、ＡＴＣＣ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤから入手可能なヒト骨肉腫細胞系を非限定的に含むものとする。本発明者は、本来ＭｃＡｒｄｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−ＭａｄｉｓｏｎのＤｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｕｇｄｅｎから得られた骨肉腫１４３．９８．２が有用であることを発見した。本発明者は１９９２年１２月２２日付でＡＴＣＣに骨肉腫１４３．９８．２を、“ヒト骨肉腫１４３．９８．２”という登録名の下にブダペスト条約に基づいて寄託した（付与された受託番号はＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２２６）。
【００１０】
本明細書の趣旨において、骨肉腫細胞調製物を、その一部がＰＧＥ２の合成を触媒するヒト骨肉腫細胞の水性単層または浮遊液として定義する。この調製物はハンクスの平衡塩類溶液などの緩衝液も含有する。
【００１１】
この第一の具体例の中にはヒト骨肉腫細胞を、骨肉腫１４３Ｂ及び１４３Ｂ  ＰＭＬ  ＢＫ  ＴＫを含めた一群の骨肉腫１４３型細胞から得るものが存在する。本発明者は骨肉腫１４３．９８．２を用いた。
【００１２】
本明細書の趣旨において、骨肉腫細胞調製物はその一部がＰＧＥ２の合成を触媒するヒト骨肉腫ミクロソームも含有する。ミクロソームは、本明細書に開示したうちのいずれかの骨肉腫細胞系から後述のようにして得ることができる。
【００１３】
第二の具体例では本発明は、
（ａ）細胞調製物１ｃｃ当たり１０３〜１０９個の骨肉腫細胞を含有する骨肉腫細胞調製物と、
（ｂ）細胞調製物１ｃｃ当たり０．１〜５０μｌの、ペルオキシドを有しないアラキドン酸と
を含有する組成物を包含する。
【００１４】
典型的には、細胞調製物は単層として増殖させ、後出の“手順”に述べるように（作業容量約１ｃｃの）ウェル１個当たり８．２×１０４個から２×１０６個の細胞を含有するアリコートの形態で用いる。アラキドン酸は典型的には、作業容量約１ｃｃのウェル１個当たり１〜２０μｌの量で用いる。
【００１５】
全細胞の替わりに骨肉腫ミクロソームを用いる場合は細胞調製物に、典型的には細胞調製物１ｃｃ当たり５０〜５００μｇのミクロソームタンパク質を含有させる。アラキドン酸は典型的には、細胞調製物１ｃｃ当たり酸１〜２０μｌの量で用いる。
【００１６】
第三の具体例では本発明は、試料のシクロオキシゲナーゼ−１活性を測定するアッセイであって、
（ａ）（１）シクロオキシゲナーゼ−１は発現させ得るがシクロオキシゲナーゼ−２は発現させ得ない細胞の細胞調製物、
（２）推定シクロオキシゲナーゼ−１阻害剤を含有する試料、及び
（３）アラキドン酸
を添加するステップ、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたプロスタグランジン
Ｅ２の量を測定するステップ
を含むアッセイを包含する。
【００１７】
本明細書の趣旨において、シクロオキシゲナーゼ−１は発現させ得るがシクロオキシゲナーゼ−２は発現させ得ない細胞にＵ−９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９３）などのヒト組織球リンパ腫細胞が含まれる。上記のような細胞を以後“ＣＯＸ−１細胞”と呼称する。
【００１８】
本明細書の趣旨において、細胞調製物を、典型的には８×１０５個／ｍｌから１×１０７個／ｍｌの細胞濃度を有する水性細胞浮遊液として定義する。この浮遊液は先に規定した緩衝液を含有する。
【００１９】
第四の具体例では本発明は、第１図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２を包含する。このシクロオキシゲナーゼ−２は配列番号１０としても同定される。
【００２０】
第五の具体例では本発明は、第２図に示したヒトシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を包含する。このシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡは配列番号１１としても同定される。
【００２１】
この具体例の範囲内に、第２図に示した配列の、第１図に示したシクロオキシゲナーゼ−２をコードする読み取り枠部分が有り、この部分は塩基９７〜１９０９である。
【００２２】
当業者には理解されようが、特定のアミノ酸に翻訳されるコドンの組には相当量の重複（ｒｅｄｕｎｄｅｎｃｙ）が存在する。従って本発明は、（１個以上の）コドンが別のコドンに替わっているがＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列には変化を生じない代替塩基配列も包含する。本明細書の趣旨において、１個以上の代替コドンを含む配列を“縮重変種”として定義する。発現されるタンパク質に重大な影響を及ぼさない変異体（個々のアミノ酸を交換）も包含される。
【００２３】
第六の具体例では本発明は、第２図に示したシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡまたはその縮重変種の安定発現のための系であって、
（ａ）ワクシニアウイルス発現ベクターｐＴＭ１、バキュロウイルス発現ベクターｐＪＶＥＴＬＺ、ｐＵＬ９４１及びｐＡｃｍＰ１、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮベクターｐＣＥＰ４及びｐｃＤＮＡＩといった発現ベクター、及び
（ｂ）ヒトシクロオキシゲナーゼ−２をコードする第２図に示した塩基配列またはその縮重変種
を含む系を包含する。
【００２４】
この第六の具体例の一類型において、シクロオキシゲナーゼ−２はＳｆ９またはＳｆ２１細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）において発現される。
【００２５】
哺乳動物細胞における組み換えシクロオキシゲナーゼ−２の発現には様々な哺乳動物発現ベクターを用い得る。組み換えシクロオキシゲナーゼ−２の発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐＸＴ１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐＳＧ５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１１９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及びｇＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が非限定的に含まれる。
【００２６】
シクロオキシゲナーゼ−２をコードするＤＮＡを、組み換え宿主細胞において発現するように発現ベクターに挿入してクローン化することも可能である。組み換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、その例には細菌、酵母、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来の細胞系を非限定的に含めた哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ由来の細胞系を非限定的に含めた昆虫細胞が非限定的に含まれる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が非限定的に含まれる。
【００２７】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを非限定的に含めた幾つかの技術のうちのいずれか一つを介して宿主細胞に導入し得る。発現ベクター保有細胞をクローン増殖させ、得られたクローン細胞を個々に分析して当該細胞がシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を産生するかどうか決定する。シクロオキシゲナーゼ−２発現宿主細胞クローンの同定は、抗シクロオキシゲナーゼ−２抗体との免疫反応性、及び宿主細胞関連のシクロオキシゲナーゼ−２活性の存在を非限定的に含めた幾つかの手段によって行ない得る。
【００２８】
シクロオキシゲナーゼ−２ＤＮＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで製造された合成ｍＲＮＡを用いても実現可能である。合成ｍＲＮＡは、小麦胚抽出物及び網状赤血球抽出物を非限定的に含めた様々な無細胞系においても、またカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを非限定的に含めた細胞主体系においても効率的に翻訳可能であるが、好ましいのはカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションである。
【００２９】
最適レベルの酵素活性及び／またはシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質をもたらす（１種以上の）シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ配列を決定するべく、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡの完全長読み取り枠（塩基９７から塩基１９０９まで）を非限定的に有するシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ分子を構築し得る。いずれの構築物も、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡの３′側非翻訳領域（塩基１９１０〜３３８７）を全く有しないか、またはその全部もしくは一部を有するように設計できる。
【００３０】
シクロオキシゲナーゼ−２活性及びタンパク質発現レベルは、適当な宿主細胞に上記構築物を単独で導入しても、また幾つか組み合わせて導入しても測定し得る。過渡的アッセイにおいて最適発現を実現するシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡカセットを決定した後、このシクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、大腸菌及び酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを非限定的に含めた様々な発現ベクターに移入する。
【００３１】
哺乳動物細胞トランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）、昆虫細胞、及びマイクロインジェクションを行なった卵母細胞を、シクロオキシゲナーゼ−２酵素活性のレベルとシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質のレベルとの両方に関し次の方法で評価する。シクロオキシゲナーゼ−２酵素活性を評価する第一の方法は、細胞を２０μＭのアラキドン酸の存在下に１０分間インキュベートし、ＰＧＥ２産生量をＥＩＡによって測定することを含む。
【００３２】
シクロオキシゲナーゼ−２活性を検出する第二の方法は、シクロオキシゲナーゼ−２ｃＤＮＡでトランスフェクトした哺乳動物細胞かまたはシクロオキシゲナーゼ−２ｍＲＮＡを注入した卵母細胞から調製した細胞溶解物またはミクロソームのシクロオキシゲナーゼ−２活性を直接測定することを含む。このアッセイは、溶解物にアラキドン酸を添加し、ＰＧＥ２産生量をＥＩＡによって測定することにより行ない得る。
【００３３】
宿主細胞内のシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質のレベルは免疫アフィニティー及び／またはリガンドアフィニティー技術によって測定する。シクロオキシゲナーゼ−２特異的アフィニティービーズまたはシクロオキシゲナーゼ−２特異的抗体を用いて、３５Ｓ−メチオニンで標識したかまたは標識していないシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を単離する。標識したシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。標識していないシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質は、シクロオキシゲナーゼ−２特異的抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによって検出する。
【００３４】
組み換え宿主細胞におけるシクロオキシゲナーゼ−２発現後、シクロオキシゲナーゼ−２タンパク質を回収して、ＰＧＥ２の産生に関与し得る活性形態のシクロオキシゲナーゼ−２を得ることができる。幾つかのシクロオキシゲナーゼ−２精製操作が有効で、かつ使用に適する。シクロオキシゲナーゼ−２の天然源からの精製に関して先に述べたのと同様に、組み換えシクロオキシゲナーゼ−２は細胞溶解物及び抽出物から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせて、または単独で適用することによって精製し得る。
【００３５】
加えて、組み換えシクロオキシゲナーゼ−２は、完全長の新生シクロオキシゲナーゼ−２に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて製造した免疫アフィニティーカラムの使用によって他の細胞タンパク質から分離することも可能である。
【００３６】
全部細胞アッセイ
シクロオキシゲナーゼ−２及びシクロオキシゲナーゼ−１アッセイのためにヒト骨肉腫細胞を培養し、典型的には８×１０４個／ウェルから２×１０６個／ウェルの細胞を含有するアリコートの形態で用いた。本発明者は、２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に収容した１ｍｌの培地中で細胞を、実質的に集密となるまで培養すると都合が好いことを発見した。アッセイ毎の細胞数は、標準的な操作を用いて事前に同型培養プレートから決定し得る。アッセイ前に細胞を、好ましくは予め３７℃に加温したハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；  ＳＩＧＭＡ）などの適当な緩衝液で洗浄する。その後、各ウェルに約０．５〜２ｍｌずつ添加する。
【００３７】
アッセイ前に適当数（１０５〜１０７個／ｍｌ）のＣＯＸ−１細胞を培養物から取り分け、３００×ｇで１０分間行なう遠心などによって濃縮する。上清をデカンテーションによって除去し、細胞を適当な緩衝液で洗浄する。好ましくは、細胞を３００×ｇで１０分間行なう遠心などによって再び濃縮し、かつ好ましくは予め加温したＨＢＳＳ中に再浮遊させて最終細胞密度を約１．５×１０６個／ｍｌとする。
【００３８】
ヒト骨肉腫細胞またはＣＯＸ−１細胞を適当な緩衝液中でインキュベートした後、試験化合物試料及び／または（ＤＭＳＯなどの）賦形剤試料を添加し、得られた組成物を穏やかに混合する。好ましくは、アッセイは３回行なう。次に、アラキドン酸を先に述べた比率で添加する。本発明者は、ＨＢＳＳなどの適当な緩衝液で稀釈した、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を添加する前に細胞を３０〜４０℃で約５分間インキュベートすることが好ましいと考える。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノールまたは他の賦形剤を含有させるべきである。総反応インキュベーション時間は、３７℃までの温度において５〜１０分で十分であると判明した。骨肉腫細胞を用いた場合の反応は、ＨＣｌまたは他の酸を添加し、好ましくは更に混合することによってか、または培地を細胞単層から直接、かつ急速に除去することによって停止させ得る。Ｕ−９３７細胞を用いた場合の反応は、マルチウェル培養皿またはマイクロ遠心管内で生起させ、かつＨＣｌまたは他の無機酸の添加によって停止させることが有利である。典型的には、２４ウェル−マルチ培養皿内でアッセイした試料をその後マイクロ遠心管に移し、総ての試料をドライアイス上で凍結させる。同様に典型的には、ＰＧＥ２レベル分析前の試料は−２０℃以下で保存する。
【００３９】
ＰＧＥ２濃度の測定
保存していた骨肉腫１４３試料及びＵ−９３７試料を、凍結していれば解凍し、酸中に保存したのであれば中和する。その後、好ましくは試料を渦動（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）などによって混合し、ＣＡＹＭＡＮから市販されているようなＰＧＥ２エンザイムイムノアッセイを用いてＰＧＥ２レベルを測定する。本発明者は平板培養、洗浄及び発色ステップを、ＢＩＯＭＥＫ  １０００（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて自動操作で有利に実施した。本発明者が行なった好ましい操作では、エルマン試薬添加後に発色を、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＭＡＮＡＧＥＲ／ＰＣＤＡＴＡ  ＡＮＡＬＹＳＩＳソフトウェアを具えたＢＩＯＲＡＤ  ３５５０型マイクロプレートリーダーを用いて４１５ｎｍで監視する。ＰＧＥ２のレベルは標準曲線から算出するが、場合によってはＢＥＣＫＭＡＮ  ＩＭＭＵＮＯＦＩＴ
ＥＩＡ／ＲＩＡ分析ソフトウェアを用いて決定してもよい。
【００４０】
外因性アラキドン酸を添加しない場合、ヒト骨肉腫細胞及びＣＯＸ−１細胞のいずれに由来する試料のＰＧＥ２レベルも典型的には細胞１０６個当たり約０．１〜２．０ｎｇである。アラキドン酸を存在させると、上記２細胞系由来の試料のＰＧＥ２レベルは骨肉腫細胞では約５〜１０倍、ＣＯＸ−１細胞では５０〜１００倍に上昇する。本明細書の趣旨において、各細胞系の細胞シクロオキシゲナーゼ活性はアラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとの差として定義され、その際検出レベルは１試料当たり約１０ｐｇとなる。試験化合物によるＰＧＥ２合成の抑制は、アラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとの差として計算する。
【００４１】
ミクロソームシクロオキシゲナーゼアッセイ
ヒト骨肉腫細胞は先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し得る。１０５〜１０７個の細胞を、ＮＵＮＣＬＯＮから入手可能であるような組織培養プレートに植え込み、２〜７日間培養状態に維持する。細胞はｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液で洗浄し得る。次に細胞を、好ましくはＰＢＳ中への掻き取りによってプレートから取り除く。得られた試料は、４℃において１０分間４００×ｇで遠心するなどして濃縮し得る。細胞ペレットまたは他の濃縮物を−８０℃などの適当な低温で保存するか、または直ちに処理する。以後の細胞の取り扱いは総て、好ましくは０〜４℃において行なう。二つの組織培養プレートから得られた細胞ペレットまたは濃縮物を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン及び２μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含有するｐＨ７．４のトリス塩酸塩などの標準的な保護緩衝液中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を３回実施することなどによりブレンドまたはホモジナイズする。次に、濃厚ミクロソーム調製物をもたらす分画遠心などによって濃厚ミクロソーム調製物を調製する。本発明者の行なった好ましい操作の第一ステップは、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する作業を逐次４回行なうことから成る。１０，０００×ｇでの各遠心後に上清を取り置き、再遠心する。４回目の遠心後、上清を４℃において６０〜９０分間１００，０００×ｇで遠心して、ミクロソーム画分をペレット化する。１００，０００×ｇ上清を廃棄して１００，０００×ｇミクロソームペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの脱脂ウシ血清アルブミン（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ）を含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させる。得られたミクロソーム懸濁液を４℃において９０分間１００，０００×ｇなどで再遠心してミクロソームを回収する。この遠心後、ミクロソームペレットを約２〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの安定化緩衝液中に再懸濁させる。骨肉腫ミクロソーム調製物のアリコートは、−８０℃などの低温で保存して使用前に解凍することが可能である。
【００４２】
当業者には理解されようが、ＢＳＡの代替物としてヒトその他の血清アルブミンまたは他のアルブミンを用いることも可能である。本発明者は、上述の操作は標準的なＢＳＡまたは他のアルブミンを用いても行ない得るが脱脂ＢＳＡを用いる方が好ましいことを発見した。特に、脱脂ＢＳＡを用いれば内因性ミクロソームアラキドン酸を、アッセイ中に生成するアラキドン酸が全体の少なくとも９０％を成すよう、半分以下に減少させることができる。当業者には理解されようが、他の脂質吸着剤または清澄剤を用いることも可能である。本明細書の趣旨において、含有する内因性アラキドン酸がほぼ半分以下に減少したミクロソームは内因性アラキドン酸を実質的に含有しないミクロソームであると看做される。
【００４３】
ＣＯＸ−１細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し、ＰＢＳなどの適当な緩衝液で洗浄し、細胞ペレットまたは濃縮物を好ましくは−８０℃で保存する。約１０９〜１０１０個の細胞に対応する細胞ペレットまたは濃縮物を、１０ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を２回、１０秒間の音波処理を１回行なうことなどによりブレンドまたはホモジナイズした。得られた細胞ホモジネートを濃縮し、再懸濁させた。本発明者の行なった好ましい操作では、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する。次に、上清画分を４℃において２時間１００，０００×ｇで再遠心し、得られたミクロソームペレットをタンパク質濃度が約１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるようにして、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩などの適当な緩衝液中に再懸濁させる。骨肉腫ミクロソーム調製物のアリコートは、低温で保存して使用前に解凍することが可能である。
【００４４】
アッセイ操作
ヒト骨肉腫細胞及びＣＯＸ−１細胞由来のミクロソーム調製物を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩（緩衝液Ａ）などの緩衝液で稀釈してタンパク質濃度を５０〜５００μｇ／ｍｌとする。２〜５０μｌの緩衝液Ａに、１０〜５０μｌの試験化合物またはＤＭＳＯもしくは他の賦形剤を添加する。次いで５０〜５００μｌのミクロソーム懸濁液を添加し、好ましくはその後混合し、かつ室温で５分間インキュベートする。典型的には、アッセイは２回または３回行なう。次に、緩衝液Ａ中の、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を添加して最終アラキドン酸濃度を２０μＭとし、その後好ましくは室温で１０〜６０分間インキュベートする。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノールまたは他の賦形剤を含有させた。インキュベーション後、ＨＣｌまたは他の無機酸の添加によって反応を停止させた。ＰＧＥ２レベルの分析前に試料を中和した。試料のＰＧＥ２レベルは、全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイの説明で述べたようにして測定し得る。
【００４５】
試験化合物を存在させない場合のシクロオキシゲナーゼ活性を、アラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとエタノール賦形剤の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとの差として測定し、タンパク質１ｍｇ当たりのＰＧＥ２のｎｇ数として報告した。試験化合物によるＰＧＥ２合成の抑制は、アラキドン酸の不在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとアラキドン酸の存在下にインキュベートした試料のＰＧＥ２レベルとの差として計算する。
【００４６】
（実施例１）
全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイ
ヒト骨肉腫１４３．９８．２細胞を、３．７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３（ＳＩＧＭＡ）、１００μｇ／ｌのゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）、２５ｍＭのｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ（ＳＩＧＭＡ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（ＦＬＯＷ  ＬＡＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＦＬＯＷ  ＬＡＢＳ）、２ｍＭのグルタミン（ＦＬＯＷ  ＬＡＢＳ）及び１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコ改質イーグル培地（ＳＩＧＭＡ）中で培養した。細胞を複数の１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）内で温度３７℃、ＣＯ２６％の下に維持した。事後の継代培養のため、細胞の集密培養物から培地を除去し、次いで前記培養物を０．２５％のトリプシン／０．１％のＥＤＴＡ（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）と共に室温で約５分間インキュベートした。その後、トリプシン溶液を吸引し、細胞を新鮮培地中に再浮遊させて新しいフラスコに１：１０または１：２０の比で分配した。
【００４７】
Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５９３）は、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン（ＦＬＯＷ  ＬＡＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＦＬＯＷＬＡＢＳ）及び２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３（ＳＩＧＭＡ）を含有する、８９％がＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）で１０％がウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）である培地中で培養した。細胞を、温度３７℃、ＣＯ２６％の下に複数の１ｌ容攪拌（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）内で密度０．１〜２．０×１０６個／ｍｌに維持した。事後の継代培養のため、細胞を新鮮培地で稀釈して新しいフラスコに移した。
【００４８】
アッセイ手順
シクロオキシゲナーゼアッセイのために骨肉腫１４３．９８．２細胞を、２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に収容した１ｍｌの培地中で集密となるまで培養した。アッセイ毎の細胞数は、標準的な操作を用いて事前に同型培養プレートから決定した。シクロオキシゲナーゼアッセイ直前に培地を細胞から吸引し、細胞を、予め３７℃に加温した２ｍｌのハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；  ＳＩＧＭＡ）で１回洗浄した。その後、予め加温したＨＢＳＳを各ウェルに１ｍｌずつ添加した。
【００４９】
シクロオキシゲナーゼアッセイ直前に適当数のＵ−９３７細胞を攪拌培養物から取り分け、１０分間３００×ｇで遠心した。上清をデカンテーションによって除去し、細胞を、予め３７℃に加温した５０ｍｌのＨＢＳＳで洗浄した。細胞を、３００×ｇで１０分間行なう遠心によって再びペレット化し、かつ予め加温したＨＢＳＳ中に再浮遊させて最終細胞密度を約１．５×１０６個／ｍｌとした。細胞浮遊液の１ｍｌアリコートを１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管または２４ウェルのマルチ培養皿（ＮＵＮＣＬＯＮ）に移した。
【００５０】
骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞を洗浄し、かつ１ｍｌのＨＢＳＳ中に再浮遊させた後１μｌの試験化合物またはＤＭＳＯ賦形剤を添加し、これらの試料を穏やかに混合した。いずれのアッセイも３回行なった。次に、試料を３７℃で５分間インキュベートしてから、ＨＢＳＳで１μＭに稀釈した、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）を１０μｌ添加した。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノール賦形剤を含有させた。試料を再び穏やかに混合し、かつ３７℃で更に１０分間インキュベートした。骨肉腫細胞の場合は次に反応を、１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して混合するか、または培地を細胞単層から直接、かつ急速に除去することによって停止させた。Ｕ−９３７細胞の場合は、マルチウェル培養皿またはマイクロ遠心管内で生起させた反応を、１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して混合することにより停止させた。２４ウェル−マルチ培養皿内でアッセイした試料をその後マイクロ遠心管に移し、総ての試料をドライアイス上で凍結させた。ＰＧＥ２レベル分析前の試料は−２０℃で保存した。
【００５１】
ＰＧＥ２濃度の測定
骨肉腫１４３．９８．２試料及びＵ−９３７試料を解凍し、凍結前に１Ｎ  ＨＣｌを添加した試料には１００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。その後、試料を渦動によって混合し、ＰＧＥ２エンザイムイムノアッセイ（ＣＡＹＭＡＮ）を製造元の指示どおりに用いてＰＧＥ２レベルを測定した。この操作の平板培養、洗浄及び発色ステップはＢＩＯＭＥＫ  １０００（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いて自動化した。エルマン試薬添加後に発色を、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＭＡＮＡＧＥＲ／ＰＣ  ＤＡＴＡ  ＡＮＡＬＹＳＩＳソフトウェアを具えたＢＩＯＲＡＤ  ３５５０型マイクロプレートリーダーを用いて４１５ｎｍで監視した。ＰＧＥ２のレベルは、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＩＭＭＵＮＯＦＩＴ  ＥＩＡ／ＲＩＡ分析ソフトウェアを用いて決定した標準曲線から算出した。
【００５２】
結果
外因性アラキドン酸を添加しなかった場合、骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞のいずれに由来する試料のＰＧＥ２レベルも通常細胞１０６個当たり２ｎｇであった。アラキドン酸を存在させると、上記２細胞系由来の試料のＰＧＥ２レベルは骨肉腫細胞では約５〜１０倍、Ｕ−９３７細胞では５０〜１００倍に上昇した。
【００５３】
表Ｉに、一連の非ステロイド性抗炎症化合物が外因性アラキドン酸に応答してヒト骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞によるＰＧＥ２合成に及ぼす影響を示す。
【００５４】
【表１】
0003573743.tif 000002
【００５５】
（実施例２）
ミクロソームシクロオキシゲナーゼアッセイ
骨肉腫１４３．９８．２細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持した。３×１０６個の細胞を２４５×２４５×２０ｍｍの組織培養プレート（ＮＵＮＣＬＯＮ）に植え込み、５日間培養状態に維持した。細胞を１００ｍｌのｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで滅菌ゴムスクレイパーでプレートからＰＢＳ中へと掻き取った。得られた試料を４℃において１０分間４００×ｇで遠心した。細胞ペレットを使用時まで−８０℃で保存し、または直ちに処理した。以後の細胞の取り扱いは総て０〜４℃で行なった。二つの組織培養プレートから得られた細胞ペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン及び２μｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含有する５ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させ、かつ仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間ずつ３回音波処理した。次に、細胞ホモジネートに分画遠心操作を施すことによって濃厚なミクロソーム調製物を得た。第一のステップは、細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心する作業を逐次４回行なうことから成った。１０，０００×ｇでの各遠心後に上清を取り置き、再遠心した。４回目の遠心後、上清を４℃において６０〜９０分間１００，０００×ｇで遠心して、ミクロソーム画分をペレット化した。１００，０００×ｇ上清を廃棄して１００，０００×ｇミクロソームペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの脱脂ウシ血清アルブミン（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ）を含有する８ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。得られたミクロソーム懸濁液を４℃において９０分間１００，０００×ｇで再遠心してミクロソームを回収した。この遠心後、ミクロソームペレットを約２〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。骨肉腫ミクロソーム調製物の５００μｌアリコートを−８０℃で保存し、使用直前に氷上で解凍した。
【００５６】
Ｕ−９３７細胞を先に述べたように増殖させ、かつ培養状態に維持し、ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。約４×１０９個の細胞に対応する細胞ペレットを１０ｍｌのｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させ、これに、仕事サイクル７５％、パワーレベル３に設定した４７１０シリーズ超音波ホモジナイザー（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ）を用いて５秒間の音波処理を２回、１０秒間の音波処理を１回施した。得られた細胞ホモジネートを４℃において１０分間１０，０００×ｇで遠心した。次に、上清画分を４℃において２時間１００，０００×ｇで再遠心し、得られたミクロソームペレットをタンパク質濃度が約４ｍｇ／ｍｌとなるようにして、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩中に再懸濁させた。骨肉腫ミクロソーム調製物の５００μｌアリコートを−８０℃で保存し、使用直前に氷上で解凍した。
【００５７】
アッセイ手順
骨肉腫１４３細胞及びＵ−９３７細胞由来のミクロソーム調製物を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１Ｍトリス塩酸塩（緩衝液Ａ）で稀釈してタンパク質濃度を１００μｇ／ｍｌとした。試験化合物のストック溶液の稀釈を含めた以後のアッセイステップは総て、ＢＩＯＭＥＫ  １００（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて自動処理した。９６ウェルのミニチューブプレート（ＢＥＣＫＭＡＮ）に収容した２０μｌの緩衝液Ａに、５μｌの試験化合物またはＤＭＳＯ賦形剤を添加して混合した。次いで２００μｌのミクロソーム懸濁液を添加し、その後混合し、かつ室温で５分間インキュベートした。アッセイは２回または３回行なった。次に、緩衝液Ａ中の、ペルオキシドを有しないアラキドン酸（ＣＡＹＭＡＮ）２５μｌを添加して最終アラキドン酸濃度を２０μＭとし、その後混合し、続いて室温で４０分間インキュベートした。対照試料にはアラキドン酸の替わりにエタノール賦形剤を含有させた。上記インキュベーション期間後、２５μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して混合することにより反応を停止させた。ＰＧＥ２レベルの分析前に、２５μｌの１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって試料を中和した。試料のＰＧＥ２レベルを、全細胞シクロオキシゲナーゼアッセイの説明で述べたエンザイムイムノアッセイ（ＣＡＹＭＡＮ）によって測定した。
【００５８】
【表２】
0003573743.tif 000003
【００５９】
（実施例３）
逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応
骨肉腫１４３．９８．２細胞内に存在するシクロオキシゲナーゼｍＲＮＡの種類を確認するべく、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析技術を用いた。培養物が集密状態に到達した１〜２日後に収穫した骨肉腫細胞から全ＲＮＡを調製した。細胞ペレットを、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのｐＨ７．４のトリス塩酸塩、及び８％（ｗ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含有する６ｍｌの５Ｍグアニジンモノチオシアネート中に再懸濁させた。４２ｍｌの４ＭＬｉＣｌの添加によってＲＮＡを選択的に沈澱させ、溶液を４℃で１６時間インキュベートしてから、ＲＮＡを４℃において９０分間１０，０００×ｇで遠心することにより回収した。得られたＲＮＡペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含有するｐＨ７．５の１０ｍＭトリス塩酸塩中に４μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させ、これを直接、ＲＴ−ＰＣＲによるＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの定量に用いた。
【００６０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術では、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、または対照のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のｍＲＮＡからｃＤＮＡ断片を特異的に増幅する合成オリゴヌクレオチド対を用いる。合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｉｅｒ、Ｈｌａ及びＭａｃｉａｇ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ｐｐ．１０８０５−１０８０８，  １９９０）；  Ｈｌａ及びＭａｃｉａｇ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  ｐｐ．２４０５９−２４０６３，  １９９１）；  並びにＨｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８９，  ｐｐ．７３８４−７３８８，１９９２）が開示しており、次の順序で合成した。
【００６１】
ヒトＣＯＸ−１特異的オリゴヌクレオチド
５′−ＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＴ−３′  （配列番号１）
５′−ＧＴＧＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＴＣ−３′  （配列番号２）
ヒトＣＯＸ−２特異的オリゴヌクレオチド
５′−ＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴ−３′  （配列番号３）
５′−ＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ−３′  （配列番号４）
ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ特異的オリゴヌクレオチド
５′−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ−３′  （配列番号５）
５′−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ−３′  （配列番号６）
【００６２】
ＣＥＴＵＳ−ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲから入手したＲＴ−ＰＣＲキットを製造元の指示どおりに用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を生起させた。即ち、逆転写酵素と、プライマーとしてのランダムヘキサマーとを２３℃で１０分間、４２℃で１０分間用いて４μｇの骨肉腫全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて９９℃での５分間のインキュベーションを行なった。骨肉腫ｃＤＮＡ試料を三つの等量アリコートに分割し、これらを、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２またはＧ３ＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチド対を１０ｐｍｏｌ用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲサイクルプログラムは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間とした。第２０、第２５及び第３０サイクル後に反応混合物からアリコートを取り出し、５ｍＭのＥＤＴＡの添加によって反応を停止させた。対照反応体は、ＲＮＡを含有しないＲＴ−ＰＣＲ反応体、及びＲＮＡは含有するが逆転写酵素は含有しない反応体などとした。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲ後、反応体を、トリス−酢酸ナトリウム−ＥＤＴＡ緩衝系を用いた１．２％アガロースゲル中で１１０Ｖで電気泳動させた。上記ゲルをまずエチジウムブロミドで染色することにより、ＰＣＲで生じたＤＮＡ断片の位置を確認した。増幅したＤＮＡ断片が、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２またはＧ３ＰＤＨをコードするＤＮＡ断片と同等であることをサザンブロッティングで、標準的な操作を用いて確認した。ニトロセルロース膜を、放射性標識したＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２またはＧ３ＰＤＨ特異的プローブとハイブリダイズさせた。プローブとのハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィーによって検出し、またニトロセルロースから切片を得、これを液体シンチレーション計数により計数して結合放射能を測定することによっても検出した。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲ／サザンハイブリダイゼーション実験は、ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡが骨肉腫細胞の全ＲＮＡ中に容易に検出されることを明示した。Ｇ３ＰＤＨに関するものなど、他のｍＲＮＡ種も検出されるが、ＣＯＸ−１  ｃＤＮＡ断片は骨肉腫細胞全ＲＮＡからＰＣＲによって生じ得なかった。このような結果は、ＲＴ−ＰＣＲの感度レベルにおいて骨肉腫細胞は、ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡは発現させるがＣＯＸ−１  ｍＲＮＡは発現させないことを明示している。
【００６５】
Ｕ−９３７及び１４３．９８．２細胞ＲＮＡのウェスタンブロッティング
本発明者は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２のアミノ酸５８９からアミノ酸６００までに対応するペプチドのチログロブリン複合体に対するウサギポリクローナル抗ペプチド抗血清（“ＭＦ−１６９”と呼称）を開発した。上記アミノ酸の配列：
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ
（本明細書中では配列番号７によっても同定）はヒトシクロオキシゲナーゼ−１のいずれのペプチド配列にも類似しない。１：１５０の稀釈比において上記抗血清は、骨肉腫１４３細胞由来のミクロソーム調製物中に、シクロオキシゲナーゼ−２に対応する分子量のタンパク質をイムノブロッティングにより検出する。このような研究に用いるイムノブロッティング操作は以前に開示されている（Ｒｅｉｄ等，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ｐｐ．１９８１８−１９８２３，  １９９０）。抗血清の採取に用いたウサギに由来する免疫前血清の１：１５０稀釈液を用いた場合には、シクロオキシゲナーゼ−２の分子量に対応するバンドは観察されない。シクロオキシゲナーゼ−２の分子量に対応するバンドは、シクロオキシゲナーゼ−２に対する市販のポリクローナル抗血清（ＣＡＹＭＡＮ）の１：１５０稀釈液を用いて骨肉腫１４３細胞由来のミクロソーム調製物においてイムノブロッティングを行なっても観察される。上記抗血清はシクロオキシゲナーゼ−１と交叉反応しないことが報告されている。このような結果は明らかに、骨肉腫１４３細胞がシクロオキシゲナーゼ−２を発現させることを証明している。そのうえ、これらの抗血清を用いるイムノブロット分析、及びＣＯＸ−２特異的プローブを用いるノザンブロット分析から、骨肉腫１４３細胞内のシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質及び対応するｍＲＮＡのレベルは前記細胞が集密状態を過ぎて増殖するにつれて上昇することが明らかとなった。３時間の期間内に、かつ１％の血清の存在下にヒト組み換えＩＬ１−α（１０ｐｇ／ｍｌ；  Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、ヒト組み換えＩＬ１−β（１０ｐｇ／ｍｌ；  Ｒ  ａｎｄＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、ヒトＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ；  ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）、及び集密状態を越えて増殖した細胞から得た馴らし培地も、骨肉腫１４３細胞によるアラキドン酸に応答してのＰＧＥ２合成のレベルをこれらの物質の不在下に増殖した細胞のものより上昇させた。
【００６６】
（実施例４）
ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２を排他的に発現させる細胞系のノザンブロット分析による同定
ノザンブロット分析を用いて、Ｕ−９３７細胞がＣＯＸ−１  ｍＲＮＡのみを発現させ、一方骨肉腫１４３．９８．２細胞はＣＯＸ−２  ｍＲＮＡのみを発現させることを確認した。上記分析の実施ではまず、ヒト骨肉腫１４３細胞系の全ＲＮＡに由来するヒトＣＯＸ−２  ｃＤＮＡをクローン化した。全ＲＮＡは約１×１０８個の骨肉腫１４３細胞から、４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネートを用いて調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２）。公表されているＣＯＸ−２  ｃＤＮＡ配列（Ｈｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ｐｐ．７３８４−７３８８，  １９９２）の５′及び３′末端部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。これらのプライマーは次のとおりである。
【００６７】
ＨＣＯＸ−１  ５′ＣＴＧＣＧＡＴＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＴＧ３′
５′プライマー
ＨＣＯＸ−２  ５′ＣＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣ３′
３′プライマー
【００６８】
これらのプライマー（以後配列番号８及び配列番号９としてもそれぞれ同定）を、骨肉腫１４３細胞全ＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ反応に用いた。反応体に１μｇの骨肉腫１４３細胞全ＲＮＡを含有させ、この全ＲＮＡをまずランダムヘキサマー及び逆転写酵素を用いて逆転写した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２）。次に、上記反応からの生成物を上述のＨＣＯＸ−１及びＨＣＯＸ−２プライマー及びＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  ｐｐ．４８７−４８８，  １９８８）を用いて増幅した。増幅に用いた条件は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で２分１５秒間のサイクルが３０回というものであった。増幅生成物を１％低融点アガロースゲル上に流し、ヒトＣＯＸ−２  ｃＤＮＡの予測した大きさに対応する１．９ｋｂのＤＮＡ断片を切り取り（ｅｘｃｉｓｅｄ）、回収した。回収したＣＯＸ−２  ｃＤＮＡのアリコートを上述のようにして（逆転写酵素反応は生起させず）再増幅し、増幅生成物を再び１％低融点アガロースゲル上に流し、回収した。
【００６９】
Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２に教示されている標準的操作により、上記１．９ｋｂ  ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥから入手）のＥｃｏＲＶ部位に挿入してクローン化し、これをコンピテント細菌ＤＨ５α（ＢＲＬから入手）に導入して該細菌を形質転換し、一晩ＬＢ寒天／アンピシリン上でコロニーを選択した。ヒトＣＯＸ−２  ｃＤＮＡにとって適正なＰｓｔＩ及びＨｉｎｃＩＩ制限消化を実現する３個のクローンを完全に配列決定し、これらのクローンが適正であることを証明した。これは、ヒト骨肉腫１４３細胞系がＣＯＸ−２  ｍＲＮＡを発現させることの最初の示唆であった。
【００７０】
ノザン法分析
先に述べたグアニジニウムイソチオシアネート法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）を用いて、様々な細胞系及び組織に由来する全ＲＮＡを調製した。オリゴｄＴセルローススピンカラムを用いてポリＡ＋ＲＮＡを調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２）。ＲＮＡ、即ち１０μｇの全ＲＮＡまたは５μｇのＵ−９３７ポリＡ＋ＲＮＡを、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する０．９％アガロースゲル上で電気泳動させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，  １９８２）。電気泳動後、ゲルを蒸留水で１０分間ずつ３回洗浄し、次いで１０倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）で３０分間ずつ２回洗浄した。１０倍ＳＳＣ中で一晩、毛管移動を利用してＲＮＡをニトロセルロースに移した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２）。翌日、フィルターを真空乾燥器において８０℃で１．５時間加熱し、それによってＲＮＡをニトロセルロース上に固定した。次に、フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５０％のホルムアミド、６倍ＳＳＣ、５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液、１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．２％のＳＤＳ、及び２５０μｇ／ｍｌの剪断し、かつ変性させたサケ精子ＤＮＡ）中で、４０℃で約４時間平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａｔｅ）した。市販キット（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を用い、３２Ｐ  ｄＣＴＰと、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでプライミングするランダムヘキサマーとを用いてＣＯＸ−２  ｃＤＮＡプローブを調製した。プレハイブリダイゼーションで用いたのと同じ緩衝液に１〜３×１０６ｃｐｍ／ｍｌの変性ＣＯＸ−２  ｃＤＮＡプローブを加えたものを用いて、４０℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ブロットを５０℃において１倍ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳで３０分間ずつ２回洗浄し、これをサランラップに包んだもので、スクリーンを伴ったＫｏｄａｋ  ＸＡＲフィルムを−７０℃において１〜３日間露光した。同じブロットを沸騰水に入れ、かつ室温まで冷却することによって該ブロットからＣＯＸ−２プローブを剥ぎ取った。このブロットでフィルムを再露光してハイブリダイゼーションシグナルが総て除去されたことを確認し、その後このブロットを、プローブとしてヒトＣＯＸ−１  ｃＤＮＡを用いて先に述べたのと同様にプレハイブリダイズ及びハイブリダイズさせた。ヒトＣＯＸ−１  ｃＤＮＡはＶａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＤｒ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｆｕｎｋから得たが、その配列は当業者に公知である。Ｃ．  Ｄ．  Ｆｕｎｋ，  Ｌ．  Ｂ．Ｆｕｎｋ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ａ．  Ｓ．Ｐｏｎｇ  ａｎｄＧ．  Ａ．  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ５，  ｐｐ．２３０４−２３１２，  １９９１を参照されたい。
【００７１】
このノザンブロッティング操作を用いて、本発明者は、ヒト骨肉腫１４３細胞系ＲＮＡがＣＯＸ−２プローブにのみハイブリダイズし、ＣＯＸ−１プローブにはハイブリダイズしないことを確認した。ＣＯＸ−２プローブを用いて得られたハイブリッドバンドの大きさはＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの正確な値（約４ｋｂ）に対応し、骨肉腫１４３細胞がＣＯＸ−２  ｍＲＮＡのみを発現させ、ＣＯＸ−１ｍＲＮＡは発現させないことを示唆した。このことは先に述べたＲＴ−ＰＣＲによって確認したところである。同様に、ヒトＵ−９３７細胞系ポリＡ＋ＲＮＡはＣＯＸ−１プローブにのみハイブリダイズし、ＣＯＸ−２プローブにはハイブリダイズしなかった。ハイブリダイゼーションシグナルはＣＯＸ−１  ｍＲＮＡの正確な値（約２．８ｋｂ）に対応し、Ｕ−９３７がＣＯＸ−１  ｍＲＮＡのみを発現させ、ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡは発現させないことを示唆した。このこともＲＴ−ＰＣＲによって確認したが、なぜならＣＯＸ−２プライマーを用いた場合Ｕ−９３７ポリＡ＋ＲＮＡからは生成物が得られなかったからである（上段参照）。
【００７２】
（実施例５）
ヒトシクロオキシゲナーゼ−２  ｃＤＮＡ及びＣＯＸ−２  ｃＤＮＡの発現を明示する例でのシクロオキシゲナーゼ−２活性を評価するアッセイ
ヒト骨肉腫全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られたＣＯＸ−２  ｃＤＮＡ配列を公表されている配列（Ｈｌａ及びＮｅｉｌｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ｐｐ．７３８４−７３８８，１９９２）と比較したところ、コドン１６５の２番目の塩基が相違していることが判明した。公表配列のコドン１６５はＧＧＡで、アミノ酸のグリシンをコードするとされているが、骨肉腫ＣＯＸ−２  ｃＤＮＡのコドン１６５はアミノ酸のグルタミン酸をコードするＧＡＡである。
【００７３】
骨肉腫ＣＯＸ−２  ｃＤＮＡが１６５位においてグルタミン酸をコードすることを証明するべく本発明者は、骨肉腫ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を繰り返し、ヒトゲノムＤＮＡから得た上記塩基変化の周囲の領域を増幅、クローン化及び配列決定し、かつ部位特異的変異処理を用いてＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５をＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５に変化させ、これらの活性をＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション後に比較した。
【００７４】
１．  ヒト骨肉腫全ＲＮＡ由来のＣＯＸ−２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
コドン１６５を含む３００ｂｐのＣＯＸ−２  ｃＤＮＡ断片を、ヒト骨肉腫１４３全ＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。上記領域に跨る２個のプライマー
ＨＣＯＸ−１３  ５′ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＧＡＡＡＴＧＣＡＡＴＴＡ３′（配列番号１２）及び
ＨＣＯＸ−１４  ５′ＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧ３′（配列番号１３）
を調製し、ＰＣＲ反応に用いた。即ち、ランダムプライミング及び逆転写酵素を用いて１μｇの骨肉腫１４３全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８２）。調製したｃＤＮＡを、ＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４プライマー並びにＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｋｉ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，ｐｐ．４８７−４８８，  １９８８）を用いる増幅のための鋳型として用いた。用いた反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間のサイクルが３０回というものであった。反応体を２％低融点アガロースゲル上で電気泳動させた後、予測した３００ｂｐの増幅生成物を得、これをゲルから切り取り、かつ融解、フェノール抽出及びエタノール沈澱によってアガロースから回収した。３００ｂｐ断片をＴＡＩＩクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に連結して大腸菌（ＩＮＶαＦ′；  ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に導入し、該大腸菌を形質転換した。コロニーが得られ、３００ｂｐ挿入断片を含むクローンを５個任意に取り出して配列決定した。５個のクローンのいずれにおいても、コドン１６５の配列はＧＡＡ（グルタミン酸）であった。増幅したＤＮＡ配列の大きさが僅か３００ｂｐであり、一方Ｔａｑポリメラーゼは比較的小型の断片の増幅に関しきわめて高い確実性を有するので、コドン１６５としてＧＡＡが得られた前記配列の第二の増幅反応は、骨肉腫由来のＣＯＸ−２  ｍＲＮＡがコドン１６５としてＧＡＡを有することを確証している。
【００７５】
２．  ゲノムＤＮＡ由来のＣＯＸ−２コドン１６５領域の増幅
骨肉腫ＣＯＸ−２配列が骨肉腫細胞系の産物（ａｒｔｅｆａｃｔ）でなく、正常細胞内に存在することを確認するべく、正常血から調製したヒトゲノムＤＮＡからコドン１６５を含むＤＮＡ配列を増幅した。増幅反応に用いたプライマーはＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４であった。ヒトＣＯＸ−２遺伝子のゲノム構成は未だ決定されていない。ヒトＣＯＸ−２遺伝子のエキソン−イントロン配置のためのモデルとしてマウスＣＯＸ−２遺伝子構成を用いれば、プライマーのＨＣＯＸ−１３はエキソン３に、ＨＣＯＸ−１４はエキソン５に配置されよう。増幅生成物の大きさは、マウスＣＯＸ−２遺伝子構成に基づき２０００ｂｐ前後となろう。ＰＣＲ反応体は１μｇのヒトゲノムＤＮＡ、ＨＣＯＸ−１３及びＨＣＯＸ−１４プライマー並びにＴａｑポリメラーゼを含有した。用いた反応条件は、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間のサイクルを３５回というものであった。反応生成物のアリコートを１％低融点アガロースゲル上で分離した。しかし、反応生成物は幾つか存在し、適正断片を同定するべくＤＮＡをサザンブロッティングによってナイロン膜に移し、３２Ｐで標識したヒトＣＯＸ−２内部オリゴ
ＨＣＯＸ−１７  ５′ＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＴ３′（配列番号１４）
で探索した。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは１．４ｋｂのＤＮＡ断片に対して生起し、この断片をＰＣＲ反応体の残部から、先に述べた０．８％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって回収した。得られた断片をＴＡＩＩクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に連結して、（先に述べた）細菌の形質転換に用いた。上記挿入断片を含むクローンを回収し、配列決定した。コドン１６５の配列はＧＡＡ（グルタミン酸）で、この配列はヒトＣＯＸ−２遺伝子に由来したが、なぜならコーディング領域がイントロンによって中断されたからである。（ヒトにおけるイントロン４の３′スプライシング部位はマウスのものと同じである）。このことは、１６５位にグルタミン酸を有するヒトＣＯＸ−２が存在することの非常に確実な証拠である。
【００７７】
３．  トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５とＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５の活性の対比
ＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５がシクロオキシゲナーゼ活性を有するかどうか決定し、かつその活性をＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５と比較するべく、両ｃＤＮＡ配列を真核発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に挿入してクローン化し、これをＣＯＳ−７細胞に導入して該細胞をトランスフェクトした（下記参照）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２０μＭのアラキドン酸と共にインキュベートし、かつＥＩＡ（ＣＡＹＭＡＮ）によってＰＧＥ２産生を測定することによって活性を測定した。ＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５配列はＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５の部位特異的変異処理によって得た。即ち、１００ｍｌのＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に１ｍｌの一晩細菌培養物［ＣＯＸ−２プラスミドを含有するＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）］を添加することによって、多クローニング領域のＥｃｏＲＶ部位に挿入してクローン化されたＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５配列を含む一本鎖ＫＳ＋プラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）ＤＮＡを調製し、３７℃で１時間増殖させた。その後、１ｍｌのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を添加し、培養物を更に７時間インキュベートした。細菌を１０，０００×ｇでの１０分間の遠心によってペレット化し、上清に１／４体積量の２０％  ＰＥＧ、３．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩ファージを沈澱させた。翌日、１７，０００×ｇで１５分間の遠心を行なって一本鎖ファージを回収し、付加的なＰＥＧ沈澱後に前記ファージから一本鎖ＤＮＡを、フェノール及びフェノール：クロロホルム抽出並びにエタノール沈澱によって調製した。ＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５配列を含む一本鎖ＤＮＡを、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手したＴ７−ＧＥＮ  ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異処理キットを用いる部位特異的変異処理のための鋳型として用いた。上記一本鎖ＤＮＡ（１．６ｐｍｏｌ）を、コドン１６５をＧＡＡからＧＧＡに変化させるホスホリル化オリゴＨＣＯＸ−１７（１６ｐｍｏｌ）にアニールし、５−メチル−ｄＣに他の標準的なデオキシヌクレオシド三リン酸を加えたもの、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下に第二鎖の合成を行なった。合成後、親の鎖に制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩを用いてニックを形成し、その後エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化によって前記鎖を除去した。メチル化した変異鎖を大腸菌ｍｃＡＢ−の形質転換によって回収した。コロニーを取り出して配列決定し、今やコドン１６５としてＧＡＡの替わりにＧＧＡを有する幾つかのクローンを得た。このＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５配列をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳベクターからＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化により切り離して回収し、やはりＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化した真核発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に挿入してクローン化した。ＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５配列も厳密に同じ方法でｐｃＤＮＡ−１ベクターに挿入してクローン化した。得られた２個のプラスミドは、コドン１６５の１個の塩基が変化している点でのみ相違した。
【００７８】
ＣＯＸ−２  ｐｃＤＮＡ−１プラスミドを用い、かつＣｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａが述べている改良リン酸カルシウム法（Ｃ．  Ａ．  Ｃｈｅｎ及びＨ．  Ｏｋａｙａｍａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６，  ｐｐ．６３２−６３８，  １９８８）を用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。即ち、５×１０５個のＣＯＳ−７細胞を、１０ｍｌの培地を収容した１０ｃｍ培養皿内に植え込んだ。翌日、トランスフェクションの１時間前に培地を交換した。プラスミドＤＮＡ（１〜３０μｌ）を０．５ｍｌの０．０２５Ｍ  ＣａＣｌ２及び０．５ｍｌの２倍ＢＢＳ（５０ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ−エタンスルホン酸、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。次に、混合物を細胞に、プレートに渦を生じさせながら滴下し加え、ＣＯ２３％のインキュベーター内で３５℃で一晩（１５〜１８時間）インキュベートした。翌日培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌの新鮮培地を加え、細胞を５％のＣＯ２下に３７℃で更に４８時間インキュベートした。
【００７９】
上記細胞を、２．５、５または１０μｇのＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５／ｐｃＤＮＡ−１もしくはＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトした。各ＤＮＡ濃度に関して２個のプレートを用い、また対照として細胞をｐｃＤＮＡ−１プラスミドでトランスフェクトした。４８時間後に細胞から培地を除去し、プレートをハンクス培地で３回洗浄し、その後２０μＭのアラキドン酸を含有する２ｍｌのハンクス培地を細胞に添加した。３７℃で２０分間インキュベートした後、プレートから培地を取り出し、培地中に放出されたＰＧＥ２の量をＥＩＡによって測定した。ＰＧＥ２ＥＩＡは、市販キット（ＣＡＹＭＡＮ）を製造元の指示どおりに用いて行なった。表ＩＩＩに、ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、ＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、及びＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５／ｐｃＤＮＡ−１でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から培地中に放出されたＰＧＥ２の量を示す。ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトしたＤＮＡの量にもよるが、ＣＯＸ−２ｇｌｕ１６５はＣＯＸ−２ｇｌｙ１６５の１．３〜２．３倍高活性である。
【００８０】
【表３】
0003573743.tif 000004
【００８１】
【配列表】
【００８２】
【化１】
0003573743.tif 000005
0003573743.tif 000006
0003573743.tif 000007
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0003573743.tif 000011
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0003573743.tif 000013
0003573743.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す説明図である。
【図１Ｂ】ヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す説明図である。
【図１Ｃ】ヒトシクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す説明図である。
【図２Ａ】ヒト骨肉腫細胞から得たクローン化ヒトシクロオキシゲナーゼ−２相補的ＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す説明図である。
【図２Ｂ】ヒト骨肉腫細胞から得たクローン化ヒトシクロオキシゲナーゼ−２相補的ＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す説明図である。
【図２Ｃ】ヒト骨肉腫細胞から得たクローン化ヒトシクロオキシゲナーゼ−２相補的ＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す説明図である。
【図１Ａ】
0003573743.tif 000015
【図１Ｂ】
0003573743.tif 000016
【図１Ｃ】
0003573743.tif 000017
【図２Ａ】
0003573743.tif 000018
【図２Ｂ】
0003573743.tif 000019
【図２Ｃ】
0003573743.tif 000020