(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイを設置する手段と、
上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる駆動部と、
試料導入の際の上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を入力させ上記移動を制御する制御部とを有し、
上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部は底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径が１．４−２ｍｍであることを特徴とする両生類卵母細胞試料導入装置。
【請求項２】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイを設置する手段と、
上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる駆動部と、
試料導入の際の上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を入力させ上記移動を制御する制御部とを有し、
上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部の底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径は上記複数の両生類卵母細胞の直径の１０５−１５０％であることを特徴とする両生類卵母細胞試料導入装置。
【請求項３】
上記トレイ上の卵母細胞の表面位置を視覚情報、圧力変化、温度変化、電気変化、湿度変化、ｐＨ変化の少なくともいずれか１つによって検出することを特徴とする、請求項１又は２に記載の両生類卵母細胞試料導入装置。
【請求項４】
上記試料は遺伝子又は蛋白質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の両生類卵母細胞試料導入装置。
【請求項５】
上記試料は蛍光物質を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の両生類卵母細胞試料導入装置。
【請求項６】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイを設置する手段と、
上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる駆動部と、
上記移動を制御する制御部と、
導入時の上記両生類卵母細胞の視覚情報を得る情報取得部と、
上記情報を蓄積する記憶部とを有し、
上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部は底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径が１．４−２ｍｍであることを特徴とする両生類卵母細胞試料導入システム。
【請求項７】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイを設置する手段と、
上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる駆動部と、
上記移動を制御する制御部と、
導入時の上記両生類卵母細胞の視覚情報を得る情報取得部と、
上記情報を蓄積する記憶部とを有し、
上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部の底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径は上記複数の両生類卵母細胞の直径の１０５−１５０％であることを特徴とする両生類卵母細胞試料導入システム。
【請求項８】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイであって、上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部は底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径が１．４−２ｍｍであることを特徴とするトレイと、上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針を有する装置を用い、
上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を第１の深さに設定する工程と、
上記複数の両生類卵母細胞のうちの第１の卵母細胞に上記導入針で試料を上記第１の深さに導入する工程と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を自動的に移動させる工程と、
続けて上記複数の両生類卵母細胞のうちの第２の卵母細胞に上記導入針で上記第１の深さに試料を導入する工程とを有することを特徴とする両生類卵母細胞試料導入方法。
【請求項９】
１つの両生類卵母細胞が載置される開口部を複数有するトレイであって、上記開口部の開口は上記両生類卵母細胞が自らの重心に従った安定方向を取るように自由に回転することを許容する大きさを有し、かつ上記開口部の底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径は上記複数の両生類卵母細胞の直径の１０５−１５０％であることを特徴とするトレイと、上記両生類卵母細胞に試料を導入する導入針を有する装置を用い、
上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を第１の深さに設定する工程と、
上記複数の両生類卵母細胞のうちの第１の卵母細胞に上記導入針で試料試料を上記第１の深さに導入する工程と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を自動的に移動させる工程と、
続けて上記複数の両生類卵母細胞のうちの第２の卵母細胞に上記導入針で上記第１の深さに試料を導入する工程とを有することを特徴とする両生類卵母細胞試料導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はカエル等の両生類の卵母細胞に遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料をピペット様の針を用いて導入する自動化装置に関する。また遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料を両生類卵母細胞の特定位置に導入する方法、試料の導入に関して質の保証された両生類卵母細胞、並びに特定位置及び深度に試料を導入した両生類卵母細胞を販売又は譲渡する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料を導入したアフリカツメガエル等のカエルの卵母細胞は、サイズが比較的大きく、また低コストで多量に得られるため、生細胞への色素、蛋白質、ぺプチド、薬物などの作用の確認、遺伝子機能の解析、遺伝子産物としての蛋白質の生産などの目的で広く使用されているが、従来は個々の研究者がカエルを飼育し、卵母細胞を採取することから行っていた。
【０００３】
従来、遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料をカエル等の両生類の卵母細胞に導入する際には、これらの試料を充填したピペットをマニピュレーターを用い、顕微鏡下にて、技術者が手動で卵母細胞に刺入していた。ピペットはインジェクターに装着し、油圧または空気圧などで細胞内に一定量の試料を吐出する。また、電圧を印可して細胞内に一定量の試料を吐出する方法として、特開平５−１９２１７１号や特開平６−３４３４７８号がある。いずれの方法も顕微鏡下で細胞を観察しながら、手動にて細胞に針を近づけ、試料の導入を行うという技術である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の手動による遺伝子等の導入は、技術者個人の技量、熟練度等によって、試料が導入できた卵母細胞の割合が変動するという問題があった。これは技術者毎に一定時間当たりの試料導入可能な卵母細胞数が異なるため、試料の継時的な変成度が技術者間でばらつくことが原因の一つである。本発明は技術者の技量、熟練度に関わりなく、時間当たりの処理数を一定にすることを目的の一つとしている。
【０００５】
また上記の従来技術は卵母細胞への試料導入深度を統一化することへの配慮がされておらず、熟練した技術者でも深度を制御することは困難であった。その結果、核など特定の細胞内小器官への試料導入は偶然に頼ることになっていた。本発明は、試料導入深度を統一化することにより、核などへの深さ方向での制御が可能な細胞内小器官への試料導入を容易にすることを目的の一つとしている。
【０００６】
さらに上記の従来技術では、試料を導入した際の細胞の情報を保存することへの配慮がされておらず、試料導入情報とその後の細胞反応との相関を得ることが困難であった。従って本発明の目的はこれらの相関を得ることにある。
【０００７】
また、従来は卵母細胞を個々に調達していたため、大量生産や需要に応じたタイミングの良い生産は不可能であった。
従って本発明の他の目的は、特定の試料を導入した卵母細胞、または特定の試料を一定の位置に導入したことを保証した卵母細胞を、生産・販売及び輸送することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するために、ピペット様の針を用いて遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等の試料をカエル等の両生類の卵母細胞の任意の位置、任意の深度に自動制御にて導入する装置を提供するものである。
【０００９】
すなわち本発明は、複数の両生類卵母細胞を保持するトレイと、上記複数の両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる駆動部と、試料導入の際の上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を入力させ上記移動を制御する制御部とを有し、試料を上記深度で上記複数の両生類卵母細胞に導入することを特徴とする両生類卵母細胞試料導入装置を提供する。
【００１０】
また、本発明は、複数の両生類卵母細胞を保持するトレイと、上記複数の両生類卵母細胞に試料を導入する導入針と、上記トレイと上記導入針の相対位置を３次元方向に移動させる駆動部と、上記移動を制御する制御部と、導入時の上記両生類卵母細胞の視覚情報を得る情報取得部と、上記情報を蓄積する記憶部とを有し、上記試料を上記複数の両生類卵母細胞に導入することを特徴とする両生類卵母細胞試料導入システムを提供する。これにより、複数の両生類卵母細胞に対し、ほぼ一定の深度に試料を速く導入することが可能になった。
【００１１】
さらに、上記トレイは、底面が平面の円筒又は底部が円錐形で最大直径は上記複数の両生類卵母細胞の直径の１０５−１５０％であることを特徴とする穴を有する。これにより、他の特別な手段を用いることなく、トレイ上の複数の卵母細胞のほぼ８割について同一面への導入が可能になった。
【００１２】
本発明者等は、卵母細胞にｍＲＮＡを導入した場合、卵母細胞の黒面にｍＲＮＡを導入した場合と白面にｍＲＮＡを導入した場合では、蛋白質の機能発現効率が異なることを見出した。つまり、卵母細胞間での蛋白質の機能発現効率のばらつきを抑えるためには、同じ面にｍＲＮＡを導入した卵母細胞を集めることが重要となる。本発明では、試料を導入した際の細胞の情報を保存し、その後の細胞反応との相関を容易に導き出すことを可能にするものである。
【００１３】
さらに、本発明は、
複数の両生類卵母細胞を保持するトレイと、上記複数の両生類卵母細胞に試料を導入する導入針とを有する装置を用い、
上記トレイ若しくは上記両生類卵母細胞に対する上記導入針の深度を第１の深さに設定する工程と、
上記複数の両生類卵母細胞のうちの第１の卵母細胞に上記導入針で試料を上記第１の深さに導入する工程と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を自動的に移動させる工程と、
続けて上記複数の両生類卵母細胞のうちの第２の卵母細胞に上記導入針で上記第１の深さに試料を導入する工程とを有することを特徴とする、両生類卵母細胞試料自動導入方法を提供する。
【００１４】
さらにまた本発明は、
複数の両生類卵母細胞を保持するトレイと、上記複数の両生類卵母細胞に試料を導入する導入針とを有する装置を用い、
上記複数の両生類卵母細胞のうちの第１の卵母細胞に上記導入針で試料を導入する工程と、
上記トレイと上記導入針の相対位置を移動させる工程と、
続けて上記複数の両生類卵母細胞のうちの第２の卵母細胞に上記導入針で試料を導入する工程と、
上記試料導入時の卵母細胞の状態を視覚情報として入手する工程と、
上記視覚情報を蓄積する工程とを有することを特徴とする、両生類卵母細胞試料自動導入方法を提供する。
【００１５】
上記両生類卵母細胞試料導入装置または導入方法の発明により、本発明はさらに、試料の導入深度が実質的に等しい条件でそれぞれ上記試料が導入されたことを特徴とする、複数の両生類卵母細胞を提供する。
また、本発明は、さらに導入位置が実質的に同じ条件で上記試料が導入されたことを特徴とする、上記の両生類卵母細胞を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は以下のものを提供する。
複数の両生類卵母細胞を保持するトレイと、上記複数の両生類卵母細胞に試料を導入する導入針とを有する装置を用い、
上記トレイに対する上記導入針の相対的位置を移動させながら、
上記複数の両生類卵母細胞の各々に上記導入針で試料を導入し、
上記導入時の上記複数の両生類卵母細胞各々の視覚情報を入手し、
上記視覚情報に基づいて上記複数の両生類卵母細胞のうち導入が卵母細胞の黒面に導入された複数の卵母細胞、又は卵母細胞の白面に導入された複数の卵母細胞を収集することを特徴とする、試料が導入された両生類卵母細胞群の製造方法。
【００１７】
試料の導入深度が実質的に等しい条件で試料がそれぞれ導入された複数の両生類卵母細胞をセットにし、上記複数の両生類卵母細胞への試料導入に関する情報を添付することを特徴とする、複数の両生類卵母細胞を販売又は譲渡する方法。
【００１８】
又は、試料の導入深度が実質的に等しい条件でそれぞれ導入された複数の両生類卵母細胞を容器に入れ、上記容器に上記複数の両生類卵母細胞への試料導入に関する情報を記したラベルを添付して複数の両生類卵母細胞を販売又は譲渡する方法。
【００１９】
ここで、上記複数の両生類卵母細胞への試料導入に関する情報は、導入の日時、卵母細胞の品質保証期間、試料を導入した位置、試料を導入した深度、発現の確率の少なくともいずれか１つに関するものである。
よって、本発明により、導入に関する条件を実質的に同じくする複数の卵母細胞群を、それらの情報と共に得ることが可能になった。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に、図面を参照しながら本発明を更に説明する。
図１に、この装置の原理を示す。
卵母細胞を整列配置させるトレイは、例えば水平方向に１２個、直行方向に８個の計９６個の深さ及び形状が均一な穴の開いたトレイが使用できるが、トレイの穴数は必ずしも９６個には限定しない。両生類卵母細胞は一般に白面の重量が黒面に比して大きい。よってトレイの穴径を用いる卵母細胞より多少大きくすることで、トレイに整列した卵母細胞は回転等によって向きを変えることなく、平均して約８割の細胞は黒面を上にして保持され、他に特別な手段を用いることなく同一面への導入確率を上げることができる。卵母細胞を整列させるための穴の形状は、底面が円形の平面であって底面から開口部までの底面に平行な断面形状が一定である円筒形、又は底部が円錐形の形が好ましい。上記穴の開口部の直径は、用いる両生類卵母細胞の直径以上である必要がある。また上気した理由から生理食塩水等を満たした上記穴中で卵母細胞が回転できる程度の余地があることが望ましく、具体的には用いる卵母細胞直径の１０５−１５０％を穴の最大直径とすることが望ましいことを実験的に確かめている。例えばアフリカツメガエルの卵母細胞の直径が約１．３ｍｍ程度であることから、穴の直径を１．４〜２ｍｍ程度とすることにより、細胞を傷つけることなく、特定の方向に固定することが可能になる。本発明において好適な穴の形状は、例えば図２に示すような、底の角度９０°、直径１．４ｍｍ、円柱部分の深さ０．５６ｍｍのすり鉢型のものである。また、上記トレイを用いる他にスポイト等を使用して、同一面への導入確率をさらに上げたり、また特定の面、例えば白面が上になるように操作することもできる。
【００２１】
導入する試料としては、遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物等が挙げられ、特に限定されるものではない。また、下記の実施例ではヒトヒスタミン受容体ｃＲＮＡを導入した卵母細胞について記載するが、導入に使用する遺伝子はｃＲＮＡに限定するものではなく、ＤＮＡ及びＲＮＡ、合成したオリゴヌクレオチドであっても良い。試料を導入するための針は、ピペット様の針であることが好ましいが、特に限定するものではない。また、卵母細胞の向き等の細胞情報を収得するためにデジタルカメラ８を、導入針６が卵母細胞表面が接触したことを検知するための手段として、ＣＣＤカメラ７を通した視覚情報を例としているが、これらの情報を得るために必要な手段はデジタルカメラ８やＣＣＤカメラ７に限定されるものではない。例えば、圧力、温度、電気、湿度、ｐＨ等の変化を感知するセンサーを導入装置にとりつけることで、これらの情報を基に細胞表面を検知することができる。
【００２２】
トレイ９の穴に試料導入前の卵母細胞を並べ、トレイ９に両生類用生理食塩水１４を満たした後、直行移動台１１と水平移動台１２の上に設置する。この直行移動台１１と水平移動台１２の移動を制御装置１によりＸ軸方向及びＹ軸方向に制御することによって、導入針６から試料を導入する卵母細胞１３の位置を決定することが好ましいが、図１の構成と逆に、トレイ９を固定し、導入針６を移動可能な構成とすることもできる。
【００２３】
トレイ９が破線の位置にあるとき、デジタルカメラ８で卵母細胞を撮影し、制御装置１にその撮影データを送ることにより、卵母細胞の良否及び向きなどの情報を蓄積することができる。
【００２４】
水平移動台１２と直行移動台１１を制御装置１の指示で動作し、トレイ９に並べられた卵母細胞のうち所定の位置にある最初の卵母細胞１３の中心を遺伝子導入針６の下方位置に移動する。ここで導入針のＺ軸方向の移動のために導入針移動台４が制御装置１の指示で動作し、導入装置５に装着された導入針６の先端を卵母細胞の表面よりわずかに離れた位置、例えば数１００ｍｍ手前まで下降させる。ここで、ＣＣＤカメラ７で撮影された画像をモニター３で観察しながら、制御補助装置２で指令を出し、導入針移動台４を低速で下降させる。視覚情報、圧力変化、温度変化、電気変化、湿度変化、ｐＨ変化等で卵母細胞１３の表面に導入針６の先端が接触したことを検知し、この位置で導入針移動台４を止める。この位置が以降の遺伝子導入操作の基準点となる。この位置を制御装置１に記憶させ、以下の操作を実施する。すなわち、上記基準点から試料を導入する位置までの、トレイの置かれている面に対して垂直方向の導入針の移動距離、深度を設定し、上記設定された深度で導入針６を刺入して試料を一定量吐出させる。試料導入のためには、例えば上記の卵母細胞１３表面に導入針６が接触した位置から０．２ｍｍ下方に導入針を下げるといったＺ軸制御を行うことができる。細胞への導入針６の最適な導入深度は、導入する試料の種類や導入の目的により異なり、適宜設定することができる。試料は導入深度が浅すぎると細胞中に広がらず、又深すぎると核を傷つけたり細胞を傷める確率が高くなる。よって、試料の導入にはほぼ一定の深度に導入することが発現効率の点からも望ましい。例えば、細胞質内にｍＲＮＡを導入し、蛋白質を発現させたい場合には、細胞表面から０．０２〜０．１ｍｍの深度に針を刺入することが望ましい。一方、核内にＤＮＡを導入し、蛋白質を発現させたい場合には、細胞表面から０．０５〜０．２ｍｍの深度に針を刺入することが望ましい。但し、導入時に卵母細胞の形状が針の接触によりわずかにゆがむため、実際には設定した深度よりも浅い位置に試料が導入される。試料導入のための時間は、細胞への注入量等に応じて、針が細胞内に注入されている時間を設定することにより制御する。尚、導入効率を更に向上させるために、導入針６は複数個にすることもできる。この場合、装置の駆動部は、導入針とトレイの相対的位置を１次元又は２次元方向に移動させることで十分とすることもできる。
【００２５】
この後、最初の卵母細胞の３次元的な位置情報を基に、自動制御によりトレイ９内の二つ目以降の任意の数の卵母細胞に、指示された時間と速度及び導入深度で試料を自動的に導入する。また、卵母細胞の大きさにばらつきがある場合があるため、導入の都度表面位置検出を行う機能も備えさせることもできる。また、卵母細胞の細胞情報をコンピュータに記憶させ、必要時にそれを引き出すこともできる。
【００２６】
更に、試料導入時の上記導入針６及び卵母細胞１３の動きや、導入時の卵母細胞の視覚情報等をコンピュータに記憶させ、導入操作終了後に試料導入位置、深度、細胞の特徴等を読み出すように設定することもできる。この場合、各卵母細胞に関する視覚情報は番号を付す等することによって上記トレイ上の位置と関連付けて行うことが望ましい。
【００２７】
また、両生類の卵母細胞には白面及び黒面があることが知られており、それぞれ機能が異なっていることが知られていたが、本発明者等は、卵母細胞にｍＲＮＡを導入した場合、卵母細胞の黒面にｍＲＮＡを導入した場合と白面にｍＲＮＡを導入した場合では、蛋白質の機能発現効率が異なることを見出した。すなわち、ヒスタミン受容体ｍＲＮＡを導入する場合には、黒面に導入した方が、白面に導入した場合よりも発現効率が高く、リガンド応答性の良い卵母細胞を得ることができる。一方、発色団を含む蛋白質、蛍光蛋白質、またはこれらの遺伝子、色素を導入する場合には、白面に導入した方が色や光の情報を感度高く得ることができる。上記したように上記トレイを用いることでトレイ上の細胞については約８割について黒面への導入が可能である。あるいは、細胞の特定面、例えば黒面のみ、または白面のみに試料を導入した細胞を得たい場合には、上記したように、試料導入前に予め特定の面のみが上になるように個々の細胞をスポイト等を用いて操作する。若しくは、試料を導入する際に視覚情報検出手段や白黒判別センサーにより細胞表面の試料導入位置情報を収得し、収得された情報から、目的の面が上になった細胞のみに試料が導入された細胞を収集することもできる。これにより導入位置の条件を実質的に同じくする卵母細胞群が得られる。本発明において、「特定の位置」とは、例えば卵母細胞の黒面側、白面側、又は赤道付近等の位置をいう。
【００２８】
上記の構成の装置を使用することにより、両生類卵母細胞の特定位置及び深度に試料を導入することができ、導入された試料の機能発現効率（導入効率）がほぼ同品質の卵母細胞を、迅速に、かつ大量に生産することができる。従って、本発明は、本発明の装置を使用して両生類卵母細胞の特定の位置及び深度に試料を導入する方法も提供する。
【００２９】
本発明の装置を使用することにより、試料導入効率は次のように向上することがわかった。すなわち、手動操作による試料導入の経験がない初心者の場合、２５個の細胞に試料を導入するために約３０分程度かかり、導入効率は、遺伝子を試料とした場合の発現率で約３０％であるが、本発明の装置の使用により、２５個の細胞に試料を導入するための時間はわずか３分間となり、導入効率は８０％程度にまで達する。手動操作による試料導入の熟練者の場合には、導入のためにかかる時間にそれ程の短縮は見られないが、導入効率は、例えば手動で８０％である場合には装置の使用により更に上昇して９０％にまで達することができる。
【００３０】
従って、本発明の装置及び方法を使用することにより、操作者の技量に依存することなく、約８０〜９０％の導入効率が達成され、本発明により、試料導入条件の制御された複数の卵母細胞を販売又は譲渡することが初めて可能になったのである。
従って別の観点において、本発明は特定の位置及び深度への試料の導入が保証された両生類卵母細胞を提供する。
【００３１】
また、特定の位置及び深度に試料を導入した卵母細胞のみを収集し、販売又は譲渡することができる。販売又は譲渡の際には、複数個の卵母細胞をパッケージングし、試料の種類、導入日時、品質の保証期間、試料を導入した位置及び深度に関する設定条件等の情報、保証される導入効率等を記載したラベル２２を付すことができる（図３）。
【００３２】
さらに、本発明は、特定の深度さらに位置、又導入した遺伝子がコードする蛋白質の発現等に関する情報も付して、卵母細胞を販売又は譲渡することができる。試料導入効率、又、発現効率を保証した卵母細胞を販売・譲渡する際は、例えば色素又は発色団を含む蛋白質や蛍光蛋白質、またはこれらの蛋白質をコードする遺伝子を試料と共導入し、有色又は蛍光を発する卵母細胞数を数え、その割合を試料導入効率の指標として、試料導入効率を保証することができる。共導入は混合形態で行っても良いが、共導入する試料及び検出のための蛋白質等が共に遺伝子の形態である場合は、融合蛋白質をコードする遺伝子とすることもできる。
【００３３】
試料の導入効率又は発現効率を、共導入した蛍光蛋白質からの蛍光を指標に算定する例について、図４を用いて説明する。本実施例では、オワンクラゲ由来緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現を指標にヒスタミン受容体遺伝子の導入割合を検定した例について述べるが、本発明は導入する試料を遺伝子に限定するものではない。また、試料の導入効率の指標として用いる物質も、ＧＦＰに限定するものではない。
【００３４】
上記機構を備えた装置、または上記原理を用いて、卵母細胞の白面にヒスタミン受容体遺伝子と緑色蛍光蛋白質遺伝子の混合物を導入する。遺伝子導入操作後、２４時間経過した卵母細胞に波長４８８ｎｍの光を照射すると、緑色蛍光蛋白質が発現したものは５０７ｎｍの蛍光を発する。５０７ｎｍの蛍光を発した細胞を明、蛍光を発さなかった細胞を暗として分類する。さらに、これらの細胞をヒスタミン刺激し、応答の有無で分類したものが図４である。図４に示したように、明の細胞では、８５％の細胞（４０個中３４個）がヒスタミンに応答した。すなわち８５％以上の細胞にヒスタミン受容体遺伝子が導入できている。逆に暗の細胞では、９０％以上の細胞がヒスタミンに応答しなかった（２８個中２７個）。すなわち９０％以上の細胞にヒスタミン受容体遺伝子が導入できていない。つまり、緑色蛍光蛋白質が発現している卵母細胞は、ヒスタミン受容体遺伝子も導入されている割合が高いことが明らかになった。
【００３５】
このことから明らかなように、目的の試料を蛍光蛋白質等と共導入すれば、その蛍光等の有無を指標として目的の試料の導入効率を算定することができ、試料導入効率を保証して卵母細胞を販売または譲渡することが可能である。
【００３６】
次に、ヒトヒスタミン受容体ｃＲＮＡを導入した卵母細胞を用いた例を用い、特定の用途のために本発明の方法によって得られた卵母細胞を生産し、販売又は譲渡する手段について記載するが、導入に使用する遺伝子はｃＲＮＡに限定するものではなく、またＤＮＡ及びＲＮＡ、合成したオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００３７】
上記の本発明に係る装置及び方法を使用して、卵母細胞にヒスタミン受容体ｃＲＮＡを導入する。この際、白黒判別センサまたはＣＣＤカメラ／デジタルカメラなど視覚情報を得る手段を用いれば、黒面にｃＲＮＡを導入した卵母細胞と、白面にｃＲＮＡを導入した卵母細胞を分別することができる。
【００３８】
遺伝子導入操作後、２４時間以内で卵母細胞にヒスタミン受容体が発現する。ヒスタミン受容体遺伝子導入操作後、２４時間以上経て、ヒスタミン受容体が発現したと考えられる卵母細胞の膜電位を二電極膜電位固定法により、―６０ｍＶに固定する。このような条件下において、卵母細胞にヒスタミンを含んだ試料を添加すると、試料中のヒスタミンとヒスタミン受容体が相互作用し、卵母細胞内の情報伝達系が活性化し、イオン流が発生するため、卵母細胞はヒスタミンに対して電気的応答を示す。２４時間を経た卵母細胞を１μＭヒスタミンで刺激し、その電流応答を測定する。黒面または白面に遺伝子を導入した卵母細胞の電流応答の大きさを比較したものが図５である。図５に示したように、遺伝子導入部位により、ヒスタミン刺激への電流応答の違いが見られた。つまり、黒面に遺伝子を導入した場合の方が、白面に遺伝子を導入した場合よりも、よりリガンド応答性の良い卵母細胞が得られることが示された。
【００３９】
従って、例えば黒面のみにヒスタミン受容体ｃＲＮＡを導入された卵母細胞集団は、ヒスタミンに対する感度の良いセンサとして使用することができる。さらに、本発明により、特定の位置及び深度に試料を導入した卵母細胞をセンサに用いることを目的として販売又は譲渡することができる。当業者には容易に認識されるように、本発明によって得られる卵母細胞をセンサとして使用するために導入し得る試料は、ヒスタミン以外の任意のリガンドに対する受容体の遺伝子、特定の抗原に対する反応性を有する抗体、特定の糖鎖を有する糖蛋白質等が挙げられ、特に限定されるものではない。
【００４０】
上記機構を備えた装置、または上記原理を用いて、卵母細胞１３にヒスタミン受容体遺伝子３１を導入する。図６には便宜的に白面に導入する場合について記載した。ヒスタミン受容体遺伝子導入操作後、２４時間以内で卵母細胞１３にヒスタミン受容体３２が発現する。上記と同様に、ヒスタミン受容体遺伝子導入操作後、２４時間以上経て、ヒスタミン受容体３２が発現したと考えられる卵母細胞の膜電位を二電極膜電位固定法により、―６０ｍＶに固定する。このような条件下において、卵母細胞１３にヒスタミンを含んだ試料３３を添加すると、試料中のヒスタミンとヒスタミン受容体が相互作用し、卵母細胞内の情報伝達系が活性化し、イオン流が発生するため、卵母細胞１３はヒスタミンに対して電気的応答３４を示す。ヒスタミンを含まない試料３５を添加した場合は、受容体と相互作用する物質が存在しないため、卵母細胞１３はヒスタミンに対して応答しない３６。
【００４１】
すなわち、ヒスタミン受容体遺伝子を導入した卵母細胞に試料を添加し、その細胞応答の有無を指標にして、試料中のヒスタミンの有無をセンシングすることができる。従って本発明である試料導入装置を用いることで試料の導入条件を同じくする卵母細胞を大量に生産できるようになったことで両生類卵母細胞をある受容体、抗体に反応するリガンド、又は抗原等のスクリーニング用に用いることが可能になった。すなわち、実質的に同一な条件のもとで遺伝子等の導入を行い、蛋白質等を発現させた複数の卵母細胞各々に異なるリガンド等を反応させることでその結果を比較し、スクリーニングを行うことができる。
【００４２】
また、別の用途として、蛋白質等を発現している卵母細胞をつぶす等することによって発現している蛋白質等を抽出することができるが、本発明の導入装置を用いて導入条件を制御し、例えば黒面に試料を導入した細胞を用いることで効率よく所望の蛋白質等を抽出することが可能である。
【００４３】
次に、本発明に係る試料を導入した卵母細胞を輸送する方法について、図６に従って記載する。上記の卵母細胞を販売・輸送する際には、両生類の卵母細胞用に通常使用される緩衝液に、例えば硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を加えた溶液を満たした容器２１に卵母細胞１３を入れ、発泡スチロール等の梱包材を使用し、衝撃を避けながら、図３に示すように、保冷剤２３の使用等により温度を４〜２５℃、好ましくは１８〜２２℃に保ち、輸送することが好ましい。
【００４４】
上記溶液の組成は特に限定されるものではないが、例えば以下の組成のものを好適に使用することができる。この溶液のｐＨは７．５である。
ＮａＣｌ                        ９６ｍＭ
ＫＣｌ                          ２ｍＭ
ＣａＣｌ２                        １．８ｍＭ
ＭｇＣｌ２                        １ｍＭ
ＨＥＰＥＳ                        ５ｍＭ
硫酸ゲンタマイシン          ５０μｇ／ｍｌ
ピルビン酸ナトリウム        ２．５ｍＭ
ペニシリン                  １０Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン          １０μｇ／ｍｌ
【００４５】
販売・輸送のために好適な容器としては、容器２１内で細胞が比較的自由に移動でき、開閉できる蓋のある密閉可能なものであれば特に限定されるものではなく、その容積の９割５分程度まで上記の溶液を満たすことが好ましい。例えば５０ｍｌのコニカルチューブの場合には、約１００〜２００個の卵母細胞、好ましくは約１３０〜１８０個の細胞を入れることが好ましい。この割合は卵母細胞１個に対して約０．３〜０．５ｍｌ程度に相当するが、卵母細胞の種類、容器の種類等によって変動し得る。
【００４６】
図７に示すように、試料を導入した卵母細胞１３はトレイ９から、スポイト４１等を用いて回収する。この際、先に記録した情報を基に、黒面又は白面に試料が導入された卵母細胞のみを回収することもできる。回収した卵母細胞を容器２１に移す。両生類用緩衝液４２を当該容器２１に満たし、数回、液を交換する。交換後、再度、両生類用緩衝液４２を容器２１に満たし、さらに適量の抗生物質４３を加える。チューブの蓋を閉め、保冷剤入りの外容器４４に入れる。外容器４４に梱包材４５等を入れ、容器２１を固定し、一般的な運搬手段で、購入先まで運搬する。
【００４７】
この方法により、試料を導入した卵母細胞の機能を損なうことなく購入先まで運搬することができる。
また、販売・譲渡の際には導入日時・試料を導入した場所、深度等の導入条件、再現率、品質保証期間等の情報を一緒に提供する。その方法としては例えばそれらの情報を記載した紙面を添付したり、ラベル２２を複数の卵母細胞を有する容器２１に添付すること等がある（図３）。
【００４８】
遺伝子を導入した場合には発現までに約２４時間程度かかり、又卵母細胞の寿命としては導入後７日間程度、より好ましくは５日間程度が目安となるため、導入した日時や、それに対応して有効な導入後の期間を明示するために「○月○日までの使用が望ましい」等の記載をすることが好ましい。
導入面については、上記のトレイを用いることで約８割の卵母細胞については黒面への導入が可能であり、また上記装置に蓄積される卵母細胞の情報を基に発現効率については共発現を利用してその程度を高めることも可能である。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、カエル等の両生類の卵母細胞に一定の深度で精度良く、試料を導入することができ、導入効率等が同品質の卵母細胞を迅速かつ大量に得ることができる。卵母細胞の良否、あるいは針が挿入された位置は情報として保存できる。
また、本発明の方法によって得られた、特定位置及び深度に試料を導入した卵母細胞のみを回収し、あるいは試料導入効率を保証して販売又は譲渡することが可能である。更に、導入した試料の種類に応じ、用途を特定して販売又は譲渡することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置構成図を示す。
【図２】本発明に使用するトレイの形状の一例を示す。
【図３】本発明に使用する容器の一例を示す。
【図４】卵母細胞に導入したＧＦＰからの蛍光の有無と、共導入により発現したヒスタミン受容体のリガンド応答性の相関性を示す。
【図５】遺伝子導入位置（黒面又は白面）と電流応答によるリガンド応答性の関係を示す。
【図６】ヒスタミンセンサーとしての卵母細胞の使用を示す。
【図７】試料導入後の卵母細胞の輸送方法を示す。
【符号の説明】
１：制御装置、２：制御補助装置、３：モニター、４：導入針移動台、５：導入装置、６：導入針、７：ＣＣＤカメラ、８：デジタルカメラ、９：トレイ、１０：光源、１１：直交移動台、１２：水平移動台、１３：卵母細胞、１４：両生類用生理食塩水、
２１：容器、２２：ラベル、２３：保冷剤、
３１：ヒスタミン受容体遺伝子、３２：ヒスタミン受容体、３３：ヒスタミンを含んだ試料、３４：ヒスタミン応答（あり）、３５：ヒスタミンを含まない試料、３６：ヒスタミン応答（なし）、
４１：スポイト、４２：両生類用緩衝液、４３：抗生物質、４４：外容器、４５：梱包材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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