(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波照射により生じる腫瘍治療効果を増強するキサンテン系色素構造を有する腫瘍治療用増感剤において、前記増感剤は分子内の同一の炭素原子に、親水基及び親油基が少なくとも一つずつ結合している構造を有し、下記の一般式（１）で示されるキサンテン系色素構造を有する化合物であることを特徴とする腫瘍治療用増感剤。
【化１】
0003565758.tif 000009
ただし、Ｘ及びＹはハロゲン原子もしくは水素原子、Ｚはアルカリ金属原子もしくは水素原子、Ｒ1はアルキル基、Ｒ2はカルボキシル基、Ｒ3は水素原子。
【請求項２】
前記一般式（１）のＸ及びＹはハロゲン原子であり、Ｚはアルカリ金属原子であることを特徴とする請求項１記載の腫瘍治療用増感剤。
【請求項３】
前記一般式（１）のアルキル基Ｒ1は、炭素数３〜２０の直鎖のアルキル基を含むことを特徴とする請求項１記載の腫瘍治療用増感剤。
【請求項４】
増感剤により生じた音響キャビテーションを検出する機構を備えた超音波治療装置において、前記増感剤を請求項１乃至３の何れか一つに記載の腫瘍治療用増感剤で構成したことを特徴とする超音波治療装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超音波照射による腫瘍などの疾患の治療に用いることのできる、腫瘍治療用増感剤及びそれを用いた超音波治療装置に係り、特にキサンテン系色素構造を有する増感剤を改良することによって両親媒性（親水性及び親油性）を保持させ患部組織への集積性が高い増感剤及びそれを用いた超音波治療装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年では、癌治療においても治療後の患者の生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を考慮し、腫瘍部位のみを選択的に処置でき、腫瘍部位以外の生体への損傷が少ない治療が望まれている。このような治療を目標として、超音波とその増感剤を用いた音響化学療法（文献Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８０，２１９，１９８９を参照）の研究が行われている。
【０００３】
この治療方法は、既に臨床応用がなされている光化学療法（文献Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３９，１４６，１９７９を参照）同様、予め投与した薬剤を波動によって局所的に抗腫瘍活性化し、腫瘍部位のみを治療するというものである。
【０００４】
光化学療法は、レーザー光の波長とその生体中での減衰係数の限界から、治療の対象が表層から数ミリ程度までの表在性癌に限定されるという原理的問題点を有している。一方、音響化学療法は、超音波が波長と減衰係数の関係が人体という媒体に対して適切であるため、表層はもとより、深部の癌組織にも比較的容易にフォーカスできるという特長を持っている。従って、実用化すれば、その得意とする治療領域で、光化学療法と共に低侵襲的治療法の一端を担って行くと考えられる。
【０００５】
上記音響化学療法に関し、様々な技術が物理的及び化学的アプローチにより研究されており、装置および薬剤の両面において新しい手法が開発されている。
【０００６】
音響化学療法では、その治療の機構に音響キャビテーションが重要な役割を果たすと考えられている。音響キャビテーションとは、超音波照射で発生した気泡が成長して圧縮破壊する現象であり、最後の圧縮破壊時に発生する極めて高い圧力と温度により、機械的および化学的な生体作用が生じる。
【０００７】
この音響キャビテーションを効率的に生成させる技術として、例えば、特開平２−１２６８４８号公報記載の音場を切り替えながら超音波を照射する方法や、国際公開番号ＷＯ９４／０６３８０の再公表公報記載の基本波にその二倍の周波数を持つ第２高調波を重畳する方法が開発されている。これらの技術を用いれば、より低い照射パワーで音響キャビテーションを生成させることができる。
【０００８】
一方、薬剤側のアプローチとしては、本発明者等が先に提案した国際公開番号ＷＯ９８／０１１３１の再公表公報にキサンテン系色素構造を有する増感剤を用い、キャビテーションを生成するのに必要な音響強度（キャビテーション閾値）を低下させる音響キャビテーション作用誘導剤が記載されている。
【０００９】
また、腫瘍治療の基本的な機構として特公平６−２９１９６号公報には、超音波の化学作用によって活性酸素を生成する物質を用いると、超音波の抗腫瘍効果が高められることが記載されている。音響キャビテーション作用誘導剤であるキサンテン系色素構造を有する増感剤も活性酸素を生成する物質であることが分かっている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記に加えて、薬剤に対しては、さらに、腫瘍集積性を備えることが重要である。音響化学療法では、治療部位の空間的な選択性は第一義的には収束超音波の照射によって得られる。しかし、治療対象として期待される生体深部の腫瘍或いは、浸潤性・播種性等の正常組織と患部組織との境界が複雑な腫瘍の治療等を念頭に置くと、投与する薬剤自身が腫瘍集積性を有することは、より安全で、効果的な治療の実現には欠かすことができないからである。
【００１１】
従って、理想的な音響化学療法用薬剤には
１）音響キャビテーション作用を誘導する
２）抗腫瘍効果を発現する
３）腫瘍集積性を有する
の三つの特性を併せ持つことが望まれる。
【００１２】
腫瘍組織はその旺盛な増殖を維持するために、脂質タンパクを取り込み易く、また、リンパ組織が未形成であるため、一度取り込んだ脂質タンパクを排出し難いという性質を持っている。親油性の高い薬剤は、脂質タンパクへの親和性が高いため、脂質タンパクと共に移動し、腫瘍へ集積し易いと考えられる。一方、薬剤を生体内に取り込むためには、親水性も不可欠である。
【００１３】
従って、腫瘍集積性の薬剤は、その親油性と親水性のバランスがとれ、双方の特性が高い、いわゆる両親媒性であることが望ましい。キサンテン系色素構造を有する増感剤は一般に親水性が極めて高い一方で、親油性が極めて低いため、腫瘍集積性を向上させる方法として親油性を高めることが考えられる。親油性を高めるには、アルキル基のような親油性の官能基を導入するのが一般的である。しかし、このようなタイプの化合物では、分子の中で親水的な部位と親油的な部位が離れてしまうため、体液中ではミセル状の形態を取ることが考えられ、元々備えていた上記１）、２）の特性が変化してしまう可能性が高い。
【００１４】
本発明は、上記１）、２）の特性を損なうこと無く、３）の腫瘍集積性をも付与されたキサンテン系色素構造を有する増感剤を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明で目的とする化合物を得るためのアプローチの一つは、前述の本発明者等が先に提案した国際公開番号ＷＯ９８／０１１３１の再公表公報に記載されている。これは、抗腫瘍効果を併せ持つ音響キャビテーション作用誘導剤であるキサンテン系色素構造を有する増感剤を二量化することによって親油化する方法である。
【００１６】
しかしながら、増感剤を二量化するには、単離に手間がかかるなどの合成上の問題点を有するため、本発明では、別のアプローチで目的とする化合物を得ることを検討した。以下に本発明を創出するに至った過程について詳述する。
【００１７】
単に親油基を導入して薬剤の親油性を高める場合、特に親水性の官能基をつぶして親油基を導入した時などに親水性が低下し、生体内への投与が困難となる可能性がある。親油基の導入で、親水性を低下させないために、新たに親水基を導入する方法も考慮されるが、このような場合においても、導入した親油基と親水基とが分子内で離れてしまえば、前述のように体液中でミセル状となり、その特性の変化でキャビテーション作用を誘導する効果が低下することが考えられる。
【００１８】
このような観点から、キサンテン系色素構造を有する増感剤として、次式（１）に示すような同一の炭素原子に、親油基（Ｒ１）と親水基（Ｒ２）を導入した誘導体を検討した。
【００１９】
【化２】
0003565758.tif 000002
【００２０】
ここでＸ及びＹはハロゲン原子もしくは水素原子、Ｚは例えばＮａ、Ｋ等のアルカリ金属原子もしくは水素原子、Ｒ１はアルキル基のごとき親油基、Ｒ２はカルボキシル基のごとき親水基、Ｒ３は親油基Ｒ１でも親水基Ｒ２でも水素でも構わない。
【００２１】
この際、親水基Ｒ２の効果を最大限に発揮するには、溶媒等の環境に応じて様々な三次元配置を取り得る直鎖のアルキル基などを親油基Ｒ１に用いる点が重要であることが明らかになった。
【００２２】
直鎖のアルキル基の炭素数は３〜３０が望ましく、最適な炭素数は、親水基Ｒ２の親水性の高さや、親油基Ｒ１が含む構造によって異なってくる。
【００２３】
さらに、親油基Ｒ１となるこのような直鎖のアルキル基が、部分的に分岐のアルキル基、二重結合、三重結合、ベンゼン環等の芳香環、エーテル結合、エステル結合、酸アミド基、硫黄等を含んでも同様の効果が得られることが分かった。
【００２４】
親油基Ｒ１の具体例を表１に示すが、本発明はこれに限定されない。
【００２５】
【表１】
0003565758.tif 000003
【００２６】
本発明に使用する化合物の増感剤部分は、式（１）が示す構造の、例えばローズベンガル（Ｘ＝Ｃｌ，Ｙ＝Ｉ）、フロキシンＢ（Ｘ＝Ｃｌ，Ｙ＝Ｂｒ）、３，４，５，６−テトラクロロフルオレセイン（Ｘ＝Ｃｌ，Ｙ＝Ｈ）、エリトロシンＢ（Ｘ＝Ｈ，Ｙ＝Ｉ）及びそれぞれのナトリウム塩のようなキサンテン系色素構造を有する増感剤であることが望ましい。
【００２７】
同様なキサンテン系色素構造を有する増感剤を主構造とする音響キャビテーション作用誘導剤においては、ハロゲン、あるいは細胞膜のタンパクに含まれるチオール基あるいはアミノ基と化学結合できる官能基を分子内に有することにより効果が高まることが分かっており、本発明においてもこのような構造を有することで高い効果を得ることができる。
【００２８】
ハロゲンとしてはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）の少なくとも一つであることが望ましい。特に、式（１）中のＸあるいはＹのいずれかがハロゲンであることが望ましい。
【００２９】
タンパクと結合できる官能基としては、アジリン基、アミド基、イソチオシアネイト基、イミド基、スルホニルクロライド基の少なくとも一つであることが望ましい。また、式（１）では親油基Ｒ１と親水基Ｒ２が結合している炭素Ｃは、キサンテン系色素構造を有する増感剤とエステル結合しているが、本発明はこれに限定はされない。ただし、このような構造の化合物の場合は、エステル結合による導入が最も簡便である。
【００３０】
本発明に使用する化合物を得る方法として、キサンテン系色素構造を有する増感剤に、親油基Ｒ１として直鎖のアルキル基、親水基Ｒ２としてカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を導入した化合物（−α−カルボキシアルキルエステル）（以下−ＣＯＯＨ−Ｃｎと略す）の合成方法を示すが、本発明はこれに限定はされない。
【００３１】
これらの化合物は文献Ａｎｏｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ３９Ｂ，  ４８２，  １９８４を参考に、表２に示す経路で合成でき、次式（４）で表せる目的とするキサンテン系色素構造を有する化合物が得られる。
【００３２】
【表２】
0003565758.tif 000004
【００３３】
表２中のＸ及びＹは、それぞれ式（１）に示したものと同一であり、ｎはアルキル基の炭素数を示し、ｎ＝３〜２０のものが好ましいものとして挙げられる。
【００３４】
この反応は、式（２）で示したキサンテン系色素構造を有する増感剤のカルボン酸塩部分（ＣＯＯ−）と式（３）で示した脂肪酸のハロゲン化物によるいわゆる求核置換反応である。この合成の詳細については後で実施例１に示す。
【００３５】
なお、式（４）で示した親油基のアルキル基の炭素数のバリエーションは、反応に脂肪酸のハロゲン化物の炭素数の異なる物を用いれば得られる。この種のハロゲン化物は市販されている。
【００３６】
また、文献Ｏｒｇ．  Ｓｙｎｔｈ．，Ｉ，１１５，１９４１に記載の三塩化リンを触媒として用いる脂肪酸のα位の臭素化で、望みの炭素数の脂肪酸から合成できる。
【００３７】
本発明における親水基Ｒ２は、カルボキシル基もしくはその可溶塩、スルホン酸基もしくはその可溶塩、硫酸エステル基もしくはその可溶塩、ヒドロキシル基もしくはその可溶塩、アミン基もしくはその可溶塩、第４級アンモニウム基もしくはその可溶塩、及びリン酸基もしくはその可溶塩の少なくとも一つを含むことが望ましい。
【００３８】
また、アルキル基、エーテル結合、酸アミド基、エステル結合、及びベンゼン環等親油性の構造が含まれる場合もある。例えば、親水性の低いエーテル結合は複数のエーテル結合、アルキル基及びヒドロキシル基の組み合わせであるポリエチレングリコールとして高い親水性を示すことが知られている。上記の官能基やその可溶塩の例および官能基の組み合わせ例を表３に示すが、本発明はこれには限定されない。
【００３９】
【表３】
0003565758.tif 000005
【００４０】
表３中のＲは鎖状のアルキル基等の官能基を示し、第４級アンモニウム塩においてはピリジニウム塩のような環状Ｎ−化合物が好ましい。また、ｎはアルキル基の炭素数を示し、ｎ＝３〜２０のものが好ましい。
【００４１】
親水基Ｒ２がカルボキシル基である−ＣＯＯＨ−Ｃｎの合成経路を表２に示したが、その他の親水基の導入もそれぞれの親水基を含むハロゲン化物が得られれば、それを用いて同様の方法で合成できる。
【００４２】
例えば、親水基がスルホン酸塩のハロゲン化物は、文献Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ６２，  １０４４，  １９４０に記載の方法で合成できる。この合成経路を表４に示す。
【００４３】
【表４】
0003565758.tif 000006
【００４４】
表４中のＸ及びＹは、それぞれ式（１）に示したものと同一であり、ｎはアルキル基の炭素数を示し、ｎ＝１０〜３０のものが好ましいものとして挙げられる。
【００４５】
先ず、非等価なジハロゲン化アルキル（５）を亜硫酸塩（６）でスルホン化する。得られたスルホン化物（７）を式（２）のキサンテン系色素と反応させることにより、目的とする式（８）で表せるスルホン化されたキサンテン系色素構造を有する化合物が得られる。この合成の詳細については後で実施例２に示す。
【００４６】
なお、親水基Ｒ２がカルボン酸塩の化合物はアルカリを用いて、カルボン酸をカルボン酸塩に変換する方法で、−ＣＯＯＨ−Ｃｎから得られる（これについては実施例３で詳述する）。
【００４７】
以上まとめると、本発明におけるキサンテン系色素構造を有する超音波治療用増感剤の特徴は、同一の炭素原子に親水基Ｒ２及び親油基Ｒ１が少なくとも一つずつ結合している構造を有していることにある。この親油基Ｒ１としては、炭素数３〜３０の直鎖のアルキル基を含むことが望ましく、このアルキル基が部分的に分岐のアルキル基、二重結合、三重結合、ベンゼン環等の芳香環、エーテル結合、エステル結合、酸アミド基、硫黄等の少なくとも一つを含んでも良い。
【００４８】
また、親水基Ｒ２は、カルボキシル基もしくはその可溶塩、スルホン酸基もしくはその可溶塩、硫酸エステル基もしくはその可溶塩、ヒドロキシル基もしくはその可溶塩、アミン基もしくはその可溶塩、第４級アンモニウム基もしくはその可溶塩、及びリン酸基もしくはその可溶塩の少なくとも一つを含むことが望ましい。
【００４９】
本発明における超音波治療装置は、治療部位照準部、治療用超音波照射部、制御部、及び本発明における増感剤により生じた音響キャビテーションを検出し、超音波照射部位・強度などを適切に保つ音響キャビテーション監視部からなる。
【００５０】
この音響キャビテーションを検出する手段は、音響キャビテーションにより生じる物理現象を測定できれば制限はない。分調波・高調波などの音響的な現象を測定する手段、あるいは発光を測定する手段などを用いることができる。
【００５１】
【発明の実施の形態】
以上説明したように、本発明の腫瘍治療用増感剤を構成するキサンテン系色素構造を有する増感剤は、親油性と親水性との両特性を備えており、腫瘍集積性増感剤として優れた特性を有している。
【００５２】
なお、本発明における増感剤は、同一の炭素原子に親水基及び親油基が少なくとも一つづつ結合している構造を有していることにより腫瘍集積性が高まっているが、同時に親水基と親油基とのバランスにより界面活性剤的作用も有している。この作用により、気泡の安定剤としての効果も高い。この効果により、気泡を生成する手段と組み合わせて用いる超音波造影剤としても優れた特性を有している。  特に、試験例５、６及び７に示すように本発明における増感剤は超音波照射により音響キャビテーションを引き起こす作用を有するが、この音響キャビテーションは気泡生成を伴うことから、超音波照射を気泡を生成する手段として用いることができる。
【００５３】
以下、本発明の腫瘍集積性増感剤の合成例、その有効性を示す試験例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
【００５４】
〈実施例１〉
この実施例は、本発明のキサンテン系色素構造を有する増感剤−α−カルボキシアルキルエステル（−ＣＯＯＨ−Ｃｎ）の一合成例を示すものである。
【００５５】
（１）ローズベンガル−α−カルボキシヘプチルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７）：
攪拌子と冷却管を装備したなすフラスコにローズベンガルナトリウム塩（以下、ＲＢと略す）１．０ｇ（０．９ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略す）１０ｍｌを入れ、ＲＢが溶解するまで攪拌した。
【００５６】
この赤桃色溶液に２−ブロモオクタン酸１．３ｇ（６．０ｍｍｏｌ）を加え、外温７０℃で６時間攪拌しながら加熱した。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル７６：ベンゼン１９：酢酸６の重量比）で追跡し、原料がなくなったことを確認して終了した。
【００５７】
反応終了物から約７０℃、減圧下でＤＭＦを除去し、室温にさましてからジエチルエーテルを加えて一晩攪拌した。その後減圧濾過により得られた固体をカラムクロマトグラフィ（固定相；シリカゲル、展開溶媒；ジエチルエーテル、アセトン）で精製し、赤紫色粉末として目的物（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７）を０．６４ｇ（０．５６ｍｍｏｌ）得た。収率６２％。
【００５８】
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７の１Ｈ及び１３Ｃ核磁気共鳴（以下、ＮＭＲと略す）スペクトルをジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略す）−ｄ６を溶媒および標準物質として測定した。
【００５９】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．４３（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）７．４４，７．４３（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）  ４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．３５−１．２５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  １．１７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，−ＣＨ２−）  １．０９−０．９７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９４−０．８８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７１．８，１７１．８（Ｃ−３，６）  １６９．４（−ＣＯＯＨ）  １６２．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．４，１５７．２（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．２，１３５．９（Ｃ−１，８）  １３９．３，１３５．２，１３４．５，１３２．９，１３１．９，１３０．２，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１０．９，１１０．７（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９７．３，９７．１（Ｃ−４，５）  ７６．０，７５．８（Ｃ−２，７）  ７４．０（−Ｏ−ＣＨ−）  ３０．８，３０．２，２８．１，２４．１，２２．１（−ＣＨ２−）  １４．０（−ＣＨ３）
（２）その他のキサンテン系色素増感剤のカルボン酸誘導体は、それぞれのナトリウム塩を出発物質として用い、上記と同様の操作で得た。以下にそのいくつかの例を示す。
【００６０】
（ａ）フロキシンＢ−α−カルボキシヘプチルエステル（ＰＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７）：
フロキシンＢナトリウム塩（以下、ＰＢと略す）０．１０ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）、２−ブロモオクタン酸０．１５ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ２ｍｌを用い上記（１）と同様の操作を行った。反応時間４時間。赤色粉末０．０５６ｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）。収率４９％。
【００６１】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．３０（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）  ７．３２，７．３２（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）  ４．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，７．４Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．４２−１．２６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  １．１７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，−ＣＨ２−）  １．１１−０．９９（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９８−０．９２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１６９．３（−ＣＯＯＨ）  １６８．７，１６８．６（Ｃ−３，６）  １６２．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５３．１，１５３．０（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １４１．３，１３５．２，１３４．５，１３２．８，１３１．９，１３０．１，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １２９．２，１２８．８（Ｃ−１，８）  １１９．３，１１９．２（Ｃ−８ａ，８ｂ）  １０９．３，１０９．０（Ｃ−４，５）  ９９．５，９９．３（Ｃ−２，７）  ７３．９（−Ｏ−ＣＨ−）  ３０．８，３０．１，２８．０，２３．９，２１．９（−ＣＨ２−）  １３．８（−ＣＨ３）
（ｂ）エリトロシンＢ−α−カルボキシヘプチルエステル（ＥＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７）：
エリトロシンＢナトリウム塩（以下、ＥＢと略す）０．１１ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）、２−ブロモオクタン酸０．１９ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ２ｍｌを用い上記（１）と同様の操作を行った。反応時間７時間。赤色粉末０．０６６ｇ（０．０６６ｍｍｏｌ）。収率５１％。
【００６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．４３（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）  ８．１２−８．０９（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）  ７．５７−７．５０（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ）  ７．２３（ｓ，２Ｈ，Ｈ−１，８）  ７．１５−７．１４（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ）  ４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．４１−１．２３（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−）  １．０１−０．７７（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．６４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７１．２，１７１．２（Ｃ−３，６）  １６９．４（−ＣＯＯＨ）  １６２．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．４，１５７．２（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３７．４，１３７．１（Ｃ−１，８）  １３９．３，１３５．２，１３４．５，１３２．９，１３１．９，１３０．２，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１１．７，１１１．５（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９５．２，９５．９（Ｃ−４，５）  ７４．９，７４．７（Ｃ−２，７）  ７４．０（−Ｏ−ＣＨ−）  ３０．９，３０．３，２８．３，２４．６，２２．１（−ＣＨ２−）  １３．９（−ＣＨ３）
（３）アルキル基の炭素数の異なる化合物は、炭素数の異なる脂肪酸の臭化物を用いて、上記と同様の操作で得た。以下にそのいくつかの例を示す。
【００６３】
（ｃ）ローズベンガル−α−カルボキシエチルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２）：
ＲＢ１．０１ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）、２−ブロモプロパン酸０．４５ｍｌ（５．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ  １０ｍｌを用い上記（１）と同様の操作を行った。反応時間４時間。赤紫色粉末０．７１ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）。収率６８％。
【００６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．２４（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）  ７．４４（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，Ｈ−１，８）  ４．７６（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  ０．９６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７２．１，１７２．０（Ｃ−３，６）  １７０．２（−ＣＯＯＨ）  １６２．４（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．６，１５７．４（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．５，１３６．２（Ｃ−１，８）  １３９．５，１３５．４，１３４．７，１３３．０，１３２．１，１３０．４，１２９．２（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１１．３，１１０．９（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９７．２，９７．１（Ｃ−４，５）  ７５．９，７５．８（Ｃ−２，７）  ７０．５（−Ｏ−ＣＨ−）  １６．１（−ＣＨ３）
（ｄ）ローズベンガル−α−カルボキシブチルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ４）：
ＲＢ１．０１ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）、２−ブロモペンタン酸０．９２ｇ（５．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ  １０ｍｌを用い上記（１）と同様の操作を行った。反応時間８時間。赤紫色粉末０．３２ｇ（０．３０ｍｍｏｌ）。収率３０％。
【００６５】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．４３（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）  ７．４４，７．４３（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）  ４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．３５−１．２５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９４−０．８８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７１．８，１７１．８（Ｃ−３，６）  １６９．４（−ＣＯＯＨ）  １６２．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．４，１５７．３（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．３，１３５．９（Ｃ−１，８）  １３９．２，１３５．２，１３４．５，１３２．９，１３１．９，１３０．２，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１１．０，１１０．７（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９７．２，９７．０（Ｃ−４，５）  ７５．９，７５．７（Ｃ−２，７）  ７３．８（−Ｏ−ＣＨ−）  ３２．２，１７．６（−ＣＨ２−）  １３．４（−ＣＨ３）
（ｅ）ローズベンガル−α−カルボキシペンタデシルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５）：
ＲＢ  １．００ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）、２−ブロモヘキサデカン酸１．５７ｇ（４．７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ１０ｍｌを用い上記（１）と同様の操作を行った。反応時間８時間。赤紫色粉末０．４１ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）。収率３４％。
【００６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：８．４３（ｂｒ．ｓ，−ＯＨ）  ７．４４，７．４３（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）  ４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．４４−１．３４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  １．２２（ｂｒ．ｓ，１８Ｈ，−ＣＨ２−）  １．０９−０．９７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９４−０．８８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７１．７，１７１．６（Ｃ−３，６）  １６９．４（−ＣＯＯＨ）  １６２．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．４，１５７．２（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．２，１３５．８（Ｃ−１，８）  １３９．１，１３５．１，１３４．４，１３３．０，１３１．９，１３０．２，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１０．８，１１０．６（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９７．１，９７．０（Ｃ−４，５）  ７５．９，７５．６（Ｃ−２，７）  ７４．１（−Ｏ−ＣＨ−）  ３１．２，３０．１，２８．９，２８．８，２８．８，２８．６，２８．５，２８．３，２４．１，２２．０（−ＣＨ２−）  １３．９（−ＣＨ３）
〈実施例２〉
スルホン酸塩誘導体（−ＣＨ２ＳＯ３Ｎａ−Ｃｎ）の合成
（ａ）ハロゲン化アルキルスルホン酸塩：
１，２−ジブロモヘキサン１．２２ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を、水：エタノールの１：１混合溶液２０ｍｌに亜硫酸ナトリウム０．６ｇ（５ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に加え、激しく攪拌しながら２４時間還流した。蒸留してエタノールを取り除き、室温に放置すると白色結晶が析出した。減圧濾過を行ない、エーテルで洗浄後、乾燥した。目的物である２−ブロモヘキシルスルホン酸ナトリウムを０．６７ｇ（２．５ｍｍｏｌ）得た。収率５０％。
【００６７】
（ｂ）ローズベンガル−α−メチルスルホン酸ナトリウムペンチルエステル（ＲＢ−ＣＨ２ＳＯ３Ｎａ−Ｃ５）：
ＲＢ０．１３ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）、２−ブロモヘキシルスルホン酸ナトリウム０．０３５ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ２ｍｌを用い実施例１の（１）と同様の操作を行った。反応時間７時間。赤色粉末０．０８４ｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）。収率５５％。
【００６８】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：７．３８，７．３７（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）５．０９（ｍ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−）  ３．６０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＳＯ３Ｎａ）  １．２５−１．１４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  １．０９−０．９７（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９４−０．８８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７１．７，１７１．７（Ｃ−３，６）  １６２．６（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．４，１５７．２（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．１，１３５．９（Ｃ−１，８）  １３９．３，１３５．２，１３４．５，１３２．９，１３１．９，１３０．２，１２９．１（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１２．４（−Ｏ−ＣＨ−）  １１１．２，１１１．０（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９７．１，９６．９（Ｃ−４，５）  ７６．０，７５．８（Ｃ−２，７）  ５４．４（−ＣＨ２−ＳＯ３Ｎａ）  ３４．２，３２．２，３１．９，２２．７（−ＣＨ２−）１３．９（−ＣＨ３）
（ｃ）その他のキサンテン系色素増感剤のスルホン酸塩誘導体は、それぞれのナトリウム塩を出発物質として用い、上記と同様の操作で得た。
【００６９】
（ｄ）アルキル基の炭素数の異なる化合物は、炭素数の異なるハロゲン化アルキルスルホン酸塩を用いて、上記と同様の操作で得た。
【００７０】
〈実施例３〉
カルボン酸塩誘導体（−ＣＯＯＮａ−Ｃｎ）の合成
（ａ）ローズベンガル−α−カルボン酸ナトリウムヘプチルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＮａ−Ｃ７）：
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７  １００ｍｇ（０．０８８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ２ｍｌに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（ＮａＣｌ）１８ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）をメタノール３ｍｌに溶かした溶液を加え、室温で、３日間激しく攪拌した。
【００７１】
ＤＭＦを３ｍｌ加えてメタノールを減圧蒸留で取り除き、析出した白色固体を減圧下で取り除いた。濾液から約７０℃、減圧下でＤＭＦを除去し、室温にさましてからジエチルエーテルを加えて一晩攪拌した。
【００７２】
その後、再び減圧下で濾過し、得られた固体をジエチルエーテルで２回洗浄し、赤紫色粉末として目的物（ＲＢ−ＣＯＯＮａ−Ｃ７）を７２ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）得た。収率７０％。
【００７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：  ７．４４，７．４３（ｓ，１Ｈ×２，Ｈ−１，８）  ４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７．２Ｈｚ，−Ｏ−ＣＨ−）  １．３５−１．２５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  １．１７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，−ＣＨ２−）  １．０９−０．９７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．９４−０．８８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−）  ０．８１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，−ＣＨ３）
１３Ｃ  ＮＭＲ（δｐｐｍ）：１７５．０（−ＣＯＯＮａ）  １７１．６，１７１．６（Ｃ−３，６）  １６４．５（−Ｃ＝Ｏ−）  １５７．３，１５７．０（Ｃ−４ａ，４ｂ）  １３６．９，１３６．８（Ｃ−１，８）  １４５．３，１４３．３，１３２．７，１３０．４，１２８．５，１２７．５，１２７．０（Ｃ−１’〜６’，Ｃ−９）  １１２．０，１１２．８（Ｃ−８ａ，８ｂ）  ９８．３，９８．１（Ｃ−４，５）  ７７．６，７７．４（Ｃ−２，７）  ７４．０（−Ｏ−ＣＨ−）  ３０．８，３０．２，２８．１，２４．１，２２．１（−ＣＨ２−）  １４．０（−ＣＨ３）
（ｂ）その他のキサンテン系色素増感剤のカルボン酸塩誘導体は、それぞれの−ＣＯＯＨ−Ｃｎを用いて、上記と同様の操作で得た。
【００７４】
（ｃ）アルキル基の炭素数の異なる化合物は、炭素数の異なる−ＣＯＯＨ−Ｃｎを用いて、上記と同様の操作で得た。
【００７５】
〈実施例４〉
この実施例は、上記各実施例に示したキサンテン系色素構造を有する増感剤を超音波治療用増感剤として用いる超音波治療装置の一例について示すものである。
【００７６】
図１は、本発明の超音波治療装置を模式的に示した概略図であり、これにしたがって説明する。装置の構成は、モニター１、制御部２、信号発生・増幅部３、照準部４、音響キャビテーション検出部５、治療用超音波トランスデューサ６、脱気水７を含むマッチング相８から構成される。そして照準部４により治療対象９に治療用超音波トランスデューサ６の焦点を設定できるよう構成されている。
【００７７】
また、超音波照射時には、音響キャビテーション検出部５により、目的の位置において音響キャビテーションが生じているかどうかを検出し、治療用超音波の強度あるいは焦点を変更可能なように構成されている。
【００７８】
照準部４は３〜１０ＭＨｚの超音波イメージング用プローブからなっている。音響キャビテーション検出部５は水中マイクロフォンからなっている。治療用超音波トランスデューサ６は共振周波数０．５〜４．５ＭＨｚの圧電素子を用いて超音波を生成するよう構成されている。
【００７９】
以下に、本発明における超音波治療用薬剤の特性に関する試験例を示す。
〔試験例１〕
ＲＢ及びＲＢ親油性誘導体の溶解度測定：
本発明の超音波治療用増感剤であるＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの水溶液及び有機溶媒への溶解度を調べた。水溶液としては、ｐＨ７．４のリン酸バッファ溶液（以下、ＰＢＳと略す）、有機溶媒としては、１−オクタノールを使用した。
【００８０】
まず、ＲＢ−ＣＯＯＨ−ＣｎのＰＢＳ及び１−オクタノール溶液の２５℃における飽和溶液を調製し、溶液の可視紫外吸収スペクトルを測定した。決まった濃度の溶液の可視紫外吸収スペクトルを測定して求めておいたモル吸光係数から、飽和溶液における薬剤の濃度を見積もった。
【００８１】
比較のために、出発物質であるＲＢ及び、本発明とは異なる方法でＲＢの親油化を試みた二種類のＲＢ誘導体であるローズベンガルアルキルエステル（以下、ＲＢ−Ｃｎと略す）、ローズベンガル脂肪酸エステル（以下、ＲＢ−Ｃｎ−ＣＯＯＨと略す）の溶解度も求めた。
【００８２】
それぞれの化合物の構造式は表５中に示す。
【００８３】
【表５】
0003565758.tif 000007
【００８４】
式（１０）で示したＲＢ−Ｃｎは、最も一般的な親油性の置換基である直鎖のアルキル基〔（ＣＨ２）ｎ−１ＣＨ３〕を式（９）で示したＲＢに導入した誘導体である。
【００８５】
式（１１）で示したＲＢ−Ｃｎ−ＣＯＯＨは、両親媒性の置換基である脂肪酸を導入した誘導体である。導入した親水性部分（ＣＯＯＨ）は親油性部分〔（ＣＨ２）ｎ〕の末端に結合した状態となっている。
【００８６】
これに対し、本発明における腫瘍治療用増感剤である式（１２）で示したＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎは、親水基（ＣＯＯＨ）と親油基〔（ＣＨ２）ｎ−２ＣＨ３〕をＲＢの側鎖の同一の炭素Ｃに導入した誘導体である。
【００８７】
溶解度の測定は、各誘導体、アルキル基の炭素数の等しい物を使用した（ｎ＝７）。結果は表６に示す。
【００８８】
【表６】
0003565758.tif 000008
【００８９】
１−オクタノールへの溶解度は、三種類の誘導体ＲＢ−Ｃ７〔式（１０）に該当〕、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７〔式（１２）に該当〕、ＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ〔式（１１）に該当〕においてそれぞれ、ＲＢの５５０倍、１２０倍、２３倍といずれも高い値を示した。ＰＢＳへの溶解度は三種類の誘導体全て、ＲＢが持つ二つの親水基の一つであるカルボン酸塩部分に置換基を導入したため、ＲＢよりも二桁以上低くなった。
【００９０】
ＲＢ〔式（９）〕には、カルボン酸塩と水酸塩（Ｏ−）の２つの親水基が存在する。従って、表６に示した通り、水溶液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．４）〕への溶解度は２２０ｍｍｏｌ／ｌと高いが、有機溶媒（１−オクタノール）への溶解度は＜０．１ｍｍｏｌ／ｌと極端に低かった。
【００９１】
逆に、親油基のみを導入したＲＢ−Ｃ７〔式（１０）〕は、有機溶媒への溶解度は最も高くＲＢの５５０倍であった。しかし、水溶液への溶解度は最も低く、通常の方法では生体内に投与するための水溶液を安定に調製出来ない程であった（試験例２を参照乞う）。
【００９２】
両親媒性の置換基を導入したＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ〔式（１１）〕においては、水溶液への溶解度はＲＢ−Ｃ７〔式（１０）〕の１６０倍であったが、有機溶媒への溶解度はＲＢの２３倍であった。親油性部分であるアルキル基の末端に親水基がついているために、親油性が期待するほど高まらなかったものと考えられる。
【００９３】
一方、本発明における超音波治療用薬剤であるＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７〔式（１２）〕では、水溶液への溶解度はＲＢ−Ｃ７の８３倍であり、ＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨには若干劣るものの、生体へ投与する水溶液の調製はＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ〔式（１１）〕と同様に行える程度の高さであった（試験例２を参照乞う）。
【００９４】
また、有機溶媒への溶解度はＲＢの１２０倍と高く、親油性も併せ持つことが分かった。親水基（−ＣＯＯＨ）と親油基〔（ＣＨ２）ｎ−２ＣＨ３〕が同一の炭素Ｃに結合し、分岐型となっているために、それぞれの特性が活かせ、親水性と親油性を併せて発現することに成功したものと考えられる。
【００９５】
〔試験例２〕
ＲＢ及びＲＢ親油性誘導体の腫瘍集積性測定用溶液の調製：
ＲＢ〔式（９）〕、ＲＢ−Ｃｎ−ＣＯＯＨ〔式（１１）〕、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ〔式（１２）〕は１０ｍｇ／ｍｌ、ＲＢ−Ｃｎ〔式（１０）〕は１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。
【００９６】
ＲＢ：ＲＢ５０ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、全量を５ｍｌとした。
ＲＢ−Ｃｎ：ＲＢ−Ｃｎ４ｍｇをＤＭＳＯ  ０．４ｍｌに溶かし、エタノール０．４ｍｌ、０．１規定のＮａＣｌ水溶液０．３ｍｌ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１．０ｍｌを加え、更にｐＨが約７．４になるまで０．１規定の塩酸を加え、更にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて全量を４ｍｌとした。ＤＭＳＯは溶液全体の１０％である。
【００９７】
ＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ：ＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ３０ｍｇを０．１規定のＮａＣｌ水溶液１．２ｍｌに溶解し、ｐＨが約７．４になるまで０．１規定の塩酸を加え、更にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて全量を３ｍｌとした。
【００９８】
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ：ｎ＝２〜１０：ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ３０ｍｇを０．１規定のＮａＣｌ水溶液１．２ｍｌに溶解し、ｐＨが約７．４になるまで０．１規定の塩酸を加え、更にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて全量を３ｍｌとした。
【００９９】
ｎ＝１１〜２０：ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ３０ｍｇをＤＭＦ０．６ｍｌに溶解し、０．１規定のＮａＣｌ水溶液１．２ｍｌを加え、ｐＨが約７．４になるまで０．１規定の塩酸を加え、更にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて全量を３ｍｌとした。ＤＭＦは溶液全体の２０％である。
【０１００】
ＲＢはｐＨ７．４のＰＢＳにそのまま溶解するが、親油性が最も高い、ＲＢ−Ｃｎは、ＤＭＳＯとエタノールを用いないと溶解せず、しかもＲＢより一桁低い濃度の溶液しか調製できなかった。
【０１０１】
ＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨとｎ＝２〜１０のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎは親水基がカルボキシル基であるため、アルカリ性の水溶液にしか溶解しないが、一度溶解すれば酸でｐＨを戻し、ｐＨ約７．４の溶液が調製できた。
【０１０２】
ｎ＝１１〜２０のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎでは、ＤＭＦを用いないと溶液が調製できなかったが、ＲＢと同じ濃度の溶液が調製できた。なお、ＤＭＳＯおよびＤＭＦは、水溶液中２０％の濃度までは毒性の心配がないことを確認している。
【０１０３】
試験例１及び試験例２より、本発明のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７〔式（１２）〕は水溶液への溶解度はＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨ〔式（１１）〕に若干劣るが、生体へ投与する薬剤の水溶液はＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨと同等に調製できることが分かった。しかも、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７の有機溶媒への溶解度はＲＢ−Ｃ７−ＣＯＯＨの約５倍であり、親水基と親油基が分岐であるため、それぞれの性質が発現し易い環境になっていると考えられる。
【０１０４】
次に、親油性の向上が実際に腫瘍集積性に結びついているかどうかを確かめるために、親油性の明らかな向上が見られたＲＢ−Ｃｎ〔式（１０）〕、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ〔式（１２）〕、を担癌マウスに投与し、その組織中の薬剤の励起に基づく蛍光を測定する事により腫瘍への集積性を評価した。比較のため、ＲＢ〔式（９）〕の腫瘍集積性も評価した。
【０１０５】
〔試験例３〕
ＲＢ−Ｃｎの腫瘍集積性の評価：
腫瘍を有するマウスにＲＢ及びＲＢ−Ｃｎを静脈投与し、一定時間経過した後で腫瘍を採取した。その腫瘍から抽出した薬物の蛍光スペクトルを測定し、その強度から薬物濃度を見積もって腫瘍集積性を評価した。実験に供したマウスは、５周令のＣＤＦ１の雄の皮下にマウス実験腫瘍Ｃｏｌｏｎｅ２６の微小ブロックを移植して１〜２週間経過したものである。薬物の投与量は１０ｍｇｋｇ−１とし、抽出にはメタノールもしくはクロロホルムを使用した。
【０１０６】
ＲＢ及びアルキル基の炭素数が３，６，１８のＲＢ−Ｃｎ（ＲＢ−Ｃ３，ＲＢ−Ｃ６，ＲＢ−Ｃ１８）の、薬物をマウスへ投与してから腫瘍を摘出するまでの時間と薬物の腫瘍中の濃度との関係を図２に示す。ＲＢは薬物投与後１２０分まで腫瘍中にその存在はほとんど認められなかったが、ＲＢ−Ｃ３，ＲＢ−Ｃ６，ＲＢ−Ｃ１８はいずれもＲＢより腫瘍中の濃度が高く、アルキル基の炭素数の増加に伴ってその傾向は顕著となった。
【０１０７】
〔試験例４〕
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの腫瘍集積性評価：
腫瘍を有するマウスにＲＢ及びＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎを静脈投与し、一定時間経過した後で腫瘍を採取した。その腫瘍の切片の蛍光強度を測定し、内部標準物質の蛍光強度との比から腫瘍集積性を評価した。実験に供したマウスおよび、薬物の投与量は、試験例３と同じである。結果の一例としてＲＢ及びアルキル基の炭素数が２，３，７，１５のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ３，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５）の、薬物をマウスへ投与してから腫瘍を摘出するまでの時間と薬物の蛍光強度比との関係を図３に示す。
【０１０８】
ＲＢおよびＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２は、薬物投与後１２０分まで腫瘍中にその存在はほとんど認められなかったが、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ３，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５はいずれもＲＢより腫瘍中の濃度が高く、アルキル基の炭素数の増加に伴って、その傾向は顕著となった。
【０１０９】
上記試験例３及び試験例４より、アルキル基の炭素数の増加に伴い腫瘍集積性が向上することが確認できた。一般に、直鎖のアルキル基ではその炭素数が多くなるに従って、その親油性は高くなると考えられることから、この結果は親油性の向上に伴い腫瘍集積性も向上することを示していると考えられる。
【０１１０】
以上、本発明における超音波治療用薬剤において、親油性の向上により、腫瘍集積性が付与されたことが確認できた。また、ある程度の腫瘍集積性を示すにはアルキル鎖の炭素数が３以上であることが望ましいことも分かった。続いて、このような修飾による超音波増感剤としての特性への影響について説明する。
【０１１１】
〔試験例５〕
ＲＢ−Ｃｎの音響キャビテーション作用を誘導する効果の評価：
ＲＢ−Ｃｎの０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＤＭＦ１％含）溶液をポリエチレン製のバッグ（３０×２５ｍｍ、厚さ０．０３ｍｍ）に密封し、図４に示す構成の実験装置を用いて、音響強度５，１０Ｗ／ｃｍ２，照射時間１分間の条件で０．５ＭＨｚ及び１ＭＨｚの超音波を同時に照射した。
【０１１２】
図４の１０は脱気水、１１は水槽、１２はポリエチレンバッグ、１３は試料溶液、１４はピンチコック、１５は固定具、１６は水中マイクロフォン、１７は支持棒、１８は超音波トランスデューサ、１９は支持棒、２０は信号処理装置、２１はアンプ、２２はスペクトルアナライザ、２３はアンプ、２４は波形発生装置をそれぞれ示している。
【０１１３】
収束型のハイドロフォンを用いて音響キャビテーション特有の分調波（２５０ｋＨｚ）の音響信号を１秒毎に計測し、照射時間中の信号振幅の二乗平均を求め、音響キャビテーションの指標とした。超音波照射時に試料から得られる典型的な音響信号を図５に示す。
【０１１４】
比較のため、ＲＢ０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液の分調波信号も測定した。溶液にＤＭＦを１％含んでも分調波強度が影響を受けないことは予備検討で確認済みである。ＲＢとアルキル基の炭素数が３，６，１８のＲＢ−Ｃｎ（ＲＢ−Ｃ３，ＲＢ−Ｃ６，ＲＢ−Ｃ１８）の音響強度と分調波強度の関係を図６に示す。
【０１１５】
ＲＢ，ＲＢ−Ｃ３，ＲＢ−Ｃ６では５Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で分調波の生成が認められ、音響強度の増加に伴い、分調波強度も増加した。しかし、ＲＢ−Ｃ１８では１０Ｗ／ｃｍ２の超音波強度でも分調波の生成が認められなかった。
【０１１６】
〔試験例６〕
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの音響キャビテーション作用を誘導する効果の評価：
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を用い試験例５と同様の方法で音響キャビテーションを誘導する効果を評価した。
【０１１７】
結果の一例としてＲＢとアルキル基の炭素数が７，１５，２０のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２０）の音響強度と分調波強度の関係を図７に示す。
【０１１８】
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２０全てで５Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で分調波の生成が認められ、音響強度の増加に伴い、分調波強度も増加した。
【０１１９】
〔試験例７〕
キサンテン系色素増感剤−ＣＯＯＨ−Ｃｎの音響キャビテーション作用を誘導する効果の評価：
キサンテン系色素増感剤−ＣＯＯＨ−Ｃｎの０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を用い試験例５と同様の方法で音響キャビテーションを誘導する効果を評価した。
【０１２０】
結果の一例としてＰＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＥＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７及び、それぞれの出発物質であるＰＢ，ＥＢの音響強度と分調波強度の関係を図８に示す。いずれの化合物においても５Ｗ／ｃｍ２の超音波強度で分調波の生成が認められ、音響強度の増加に伴い、分調波強度も増加した。
【０１２１】
試験例５〜試験例７により、親水基と親油基が分子の中で離れているタイプのＲＢ−Ｃｎでは、アルキル基の炭素数が多く、親油性にバランスが傾きすぎた化合物では音響キャビテーション作用を誘導する特性が損なわれるが、本発明のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎでは親水性も併せ持つため、アルキル鎖の炭素数が２０（ｎ＝２０）の化合物でもこの特性は保持されることが分かった。また、ＲＢ以外のキサンテン系色素増感剤を原料として用いた場合にも、本発明の化合物は出発物質が備えている音響キャビテーション作用を誘導する効果を保持することが確認できた。
【０１２２】
続いて、ＲＢが有するもう一つの特性である、抗腫瘍効果を発現する能力（特性２）をＲＢ−ＣｎおよびＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎが保持しているかどうかをその光増感能から検討した。抗腫瘍の機構は光化学療法で考えられている機構と一致し、また、これまでに見つかった音響化学活性剤はいずれも光増感能を有する。キサンテン系色素増感剤も代表的な光増感剤であり、特に、一重項酸素が関与する反応によく用いられている。従って、光増感能の保持から抗腫瘍効果の発現を推察することができる。
【０１２３】
〔試験例８〕
ＲＢ−Ｃｎの光増感能の評価：
ＲＢ−Ｃｎの存在下で次式（１３）に示すヨウ素の光酸化反応を行い、化合物の光増感能を評価した。
【０１２４】
【化３】
２Ｉ−  →  Ｉ２，  Ｉ２  ＋  Ｉ−  →  Ｉ３−        …（１３）
ヨウ化カリウムの０．１ｍｏｌ／ｌ  ＤＭＦ溶液２ｍｌと  ＲＢ−Ｃｎの１ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＭＦ溶液１ｍｌの混合溶液をガラス製シャーレ（直径４８ｍｍ）に入れて３６５ｎｍの光を一定時間照射し、照射前後の試料の３５０ｎｍにおける吸光度を測定した。３５０ｎｍはＩ３−の吸収極大波長である。吸光度から次式（１４）を用いてＩ３−の濃度を算出した。
【０１２５】
【化４】
ε  ＝  １／７７  ｍｍｏｌ・ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ…（１４）
ＲＢとアルキル基の炭素数が３，６，１０，１４，１８のＲＢ−Ｃｎ（ＲＢ−Ｃ３，ＲＢ−Ｃ６，ＲＢ−Ｃ１０，ＲＢ−Ｃ１４，ＲＢ−Ｃ１８）の存在下で行った、ヨウ素の光酸化反応の光照射時間と収量の関係を図９に示す。いずれの場合も、収量は照射時間にほぼ比例した。
【０１２６】
薬物を添加しない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較すると、ＲＢ、あるいはＲＢ−Ｃｎを添加した場合の収量は、光照射時間３０分で約２〜３倍であった。ＲＢとＲＢ−Ｃｎを比較するとＲＢ−Ｃｎの収量は、光照射時間３０分でＲＢの約１．２〜１．４倍と若干多かった。ＲＢ−Ｃ３〜ＲＢ−Ｃ１８の比較により、炭素数３〜１８においては、アルキル基の炭素数と収量には規則性は見られなかった。
【０１２７】
〔試験例９〕
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの光増感能の評価：
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの存在下で試験例８と同様の操作を行った。
結果の一例としてＲＢとアルキル基の炭素数が２，７，１５のＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７，ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ１５）の存在下で行った、ヨウ素の光酸化反応の光照射時間と収量の関係を図１０に示す。いずれの場合も、収量は照射時間にほぼ比例した。
【０１２８】
薬物を添加しない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較すると、ＲＢ、あるいはＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎを添加した場合の収量は、光照射時間３０分で約２〜３倍であった。
【０１２９】
ＲＢとＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎを比較するとＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの収量は、光照射時間３０分でＲＢよりも若干多かった。ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ２〜Ｃ１５の比較により、炭素数２〜１５においては、アルキル基の炭素数と収量には規則性は見られなかった。
【０１３０】
上記試験例８及び試験例９よりＲＢ−Ｃｎ、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの存在下では、いずれも光酸化反応による生成物の収量はｃｏｎｔｒｏｌよりも高くなり、ＲＢの場合と同等であった。アルキル基の炭素数と生成物の収量には規則性は見られなかった。
【０１３１】
以上の結果から、アルキル基の導入や、今発明のタイプの親水、親油両基の導入では、光増感能には影響がなく、従って、抗腫瘍効果を発現する特性にも影響はないことが推察できた。
【０１３２】
以上の試験例で示されたように、本発明における親水基と親油基が同一の炭素Ｃから分岐している構造の化合物は、増感剤本来の特性を損なうこと無く、腫瘍集積性が付与した化合物である。
【０１３３】
〈実施例５〉
この実施例は、上記各実施例に示したキサンテン系色素構造を有する増感剤を超音波造影剤および超音波治療用増感剤として用いる超音波治療装置の一例について示すものである。
【０１３４】
図１１は、本発明の超音波治療装置を模式的に示した概略図であり、これにしたがって説明する。装置の構成は、モニター１、制御部２、信号発生・増幅部３、気泡発生用超音波トランスデューサ２５、超音波撮像用プローブ２６、治療用超音波トランスデューサ６、脱気水７を含むマッチング相８から構成される。制御部２は超音波撮像用プローブ２６により得られた超音波断層像により治療用超音波トランスデューサ６に焦点を設定できるよう構成されている。
【０１３５】
気泡発生用超音波トランスデューサ２５は０．１〜４ＭＨｚの圧電素子を用いて構成されており、１ｍｓ以上のパルス波および連続波を生成できるよう構成されている。超音波撮像用プローブ２６は特に制限はないが、特に３〜１０ＭＨｚの周波数の中から治療部位に適した周波数のものを選択して用いることが多い。治療用超音波トランスデューサ６は、共振周波数０．５〜４．５ＭＨｚの圧電素子を用いて超音波を生成するよう構成されている。
【０１３６】
治療用超音波照射時には、まず、超音波撮像用プローブ２６により得られた超音波断層像により治療用超音波トランスデューサ６の焦点を決定し、気泡発生用超音波トランスデューサ２５により超音波を照射して本発明におけるキサンテン系色素構造を有する増感剤により安定化された気泡を生成する。そして、超音波撮像用プローブ２６により該気泡により造影された超音波断層像を得、治療位置の確認を行った後治療用超音波トランスデューサ６により治療用超音波を照射するよう構成されている。
【０１３７】
なお、キサンテン系色素構造を有する増感剤を予め体外でシェーキング等により空気等のガスと混合することにより安定化バブルを形成することにより、気泡発生用超音波トランスデューサ２５による気泡生成と同等の効果を得ることができる。
【０１３８】
〔試験例１０〕
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの気泡安定性の評価：
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７の０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を用い、泡沫の安定性を測定した。直径約１０ｍｍ、長さ約１２ｍｍの試験管にＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７溶液４ｍｌを入れ、振とう器にて５分間振とうした後、泡沫が消えるまでの時間を測定した。対照としてＰＢＳを用いた。ＰＢＳがほとんど泡沫を安定化できないのに対し、ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７では振とう後約１２０秒泡沫が残っており、気泡を安定化する効果をもつことが示された。
【０１３９】
〔試験例１１〕
ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎによる造影効果の評価：
５ＭＨｚの中心周波数をもつリニア式プローブを取り付けた超音波画像診断装置を用いて犬（体重１２ｋｇ、２歳）の肝臓部をＢモードでスキャンしながら、試験例１０で得られたＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃ７溶液を５ｍｌ静脈内投与した後、直ちに生理食塩水５ｍｌ  を投与した。投与後、肝動脈、大動脈が造影され、約３０秒間造影が持続した。
【０１４０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明により、１）音響キャビテーション作用の誘導、及び２）抗腫瘍効果の発現の特性を損なうこと無く、３）腫瘍集積性を併せ持つキサンテン系色素構造を有する超音波治療用増感剤を得ると言う、所期の目的を達成することができた。この増感剤は腫瘍への選択性が高く、超音波を用いた悪性腫瘍の治療を効果的に行なうことができる。
【０１４１】
また、本発明により超音波断層像を得る際の造影を行うことができ、より効果的な治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例となる超音波治療装置の概略説明図。
【図２】ＲＢ及びローズベンガルアルキルエステル（ＲＢ−Ｃｎ）の薬物投与後時間に対する腫瘍組織中の試薬濃度を示す特性図。
【図３】ＲＢ及びローズベンガル−α−カルボキシアルキルエステル（ＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ）の薬物投与後時間に対する腫瘍組織中の薬物の内部標準に対する蛍光強度比を示す特性図。
【図４】音響キャビテーション作用を誘導する効果を評価する超音波照射装置を示す概略断面図。
【図５】超音波照射時に試料から得られる典型的な音響信号を示す特性図。
【図６】ＲＢ及びＲＢ−Ｃｎの音響強度に対する分調波強度を示す特性図。
【図７】ＲＢ及びＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎの音響強度に対する分調波強度を示す特性図。
【図８】キサンテン系色素増感剤及びその−ＣＯＯＨ−Ｃｎの音響強度に対する分調波強度を示す特性図。
【図９】ＲＢ及びＲＢ−Ｃｎ存在下のヨウ素の光酸化反応の光照射時間に対する生成物の収量を示す特性図。
【図１０】ＲＢ及びＲＢ−ＣＯＯＨ−Ｃｎ存在下のヨウ素の光酸化反応の光照射時間に対する生成物の収量を示す特性図。
【図１１】本発明の一実施例となる超音波治療装置の概略説明図。
【符号の説明】
１…モニター、
２…制御部、
３…信号発生・増幅部、
４…照準部、
５…音響キャビテーション検出部、
６…治療用超音波トランスデューサ、
７…脱気水、
８…マッチング相、
９…治療対象、
１０…脱気水、
１１…水槽、
１２…ポリエチレンバッグ、
１３…試料溶液、
１４…ピンチコック、
１５…固定具、
１６…水中マイクロフォン、
１７…支持棒、
１８…超音波トランスデューサ、
１９…支持棒、
２０…信号処理装置、
２１…アンプ、
２２…スペクトルアナライザ、
２３…アンプ、
２４…波形発生装置、
２５…気泡発生用超音波トランスデューサ、
２６…超音波撮像用プローブ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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