(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型として核酸を用いたDNA合成中における連鎖停止ヌクレオチドではない非標準的ヌクレオチドのランダムとり込みにより、ヌクレオチドレベルで核酸分子を特性化する方法であって、
（ａ）下記の（ｉ）〜（ｖ）を含んでなる反応混合物の存在下でDNAを合成すること、
（ｉ）核酸鋳型
（ii）ヌクレオチド配列を含むプライマー分子であって、その少なくとも一部が、鋳型の１部分に対し、それとハイブリッド形成するに十分に相補的であるもの
（iii）DNA分子が合成されうるようにプライマーを伸長する酵素
（iv）四種の標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び
（ｖ）少なくとも１種の非標準的デオキシヌクオシドトリホスフェートであって、そしてこのものは唯一の標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの代わりに、合成されたDNAにとり込まれるもので
（ｂ）当該DNAと、この合成されたDNAを非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部分で切断し、それによって非塩基性部位を創生せしめるためのＮ−グリコシラーゼとを接触させること、
（ｃ）結果として全ての非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンの開裂を生じ、それによって少なくとも２つのDNA断片が創生されるような方法でDNAを処理すること、及び
（ｄ）この断片を大きさによって分離すること
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
この大きさで分離した断片を固体支持体上に移し、それからラベルされた相補的なプローブのそれとのハイブリッド形成によって、当該断片の存在をはっきり示すことによって、断片が検出される、請求項１の方法。
【請求項３】
鋳型がDNA分子であり、且つ工程（ａ）の酵素がDNA依存DNAポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項４】
鋳型がRNA分子であり、且つ工程（ａ）の酵素がRNA−依存DNAポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項５】
非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが2'−デオキシイノシン−5'−トリホスフェートであり、且つＮ−グリコシラーゼがヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼである、請求項１の方法。
【請求項６】
修飾された塩基が、合成したDNAをＮ−グリコシラーゼの処理で損失しやすい非標準的塩基になるように、この合成したDNAを処理することによって、非標準的塩基が合成したDNAへのとり込みの後に修飾される、請求項１の方法。
【請求項７】
異った非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが各反応で使われる、全部で４つのDNA合成反応を提供するために３つの追加DNA合成反応を提供する、更なる工程を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項８】
請求項７の核酸断片を分析することによって、核酸鋳型の完全なヌクレオチド配列を決定するための方法。
【請求項９】
工程（ｃ）がDNAを加熱して非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンを切断することを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１０】
合成工程に於いて少なくとも２つの異った非標準的ヌクレオチドを提供する工程を更に含んでなり、そして異ったＮ−グリコシラーゼが各アリコート用に提供されるように、反応が接触工程において別々のアリコートに分割される、請求項１の方法。
【請求項１１】
DNA合成が鋳型核酸の増幅方法の一部分である、請求項１の方法。
【請求項１２】
DNA分子が合成されうるように、核酸鋳型に結びつけられたプライマーを伸長することができる酵素、４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１つの非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、この合成されたDNAから各々の非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部分を切除することができるＮ−グリコシラーゼ、及びAPエンドヌクレアーゼを含んでなる、請求項１の方法に用いられる、核酸鋳型を特性化するためのキット。
【請求項１３】
更に少なくとも１つのプライマー分子を含んでなる、請求項12のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明の分野は、核酸分子の特性化方法である。特に、本発明は非標準的（ノン−キャノニカル）デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下でDNAを合成し、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部を取り除き、非塩基部位に於けるDNAのホスホジエステルバックボーンを切断し、且つその結果得られたDNAの断片を分析することによって、核酸分子の特性化をする（characterize）ことに関する。
発明の背景
核酸分子の特性化方法
核酸分子の特性化をすることに関しては多くの理由がある。例えば、人間や動・植物に多くの病気を引き起す、或いはこれらの病気に関係する遺伝子が直ちに同定され、且つ特性化られる。何か特定の遺伝子の中でも、特別な病気の状態の原因となる多数の変種（突然変異）が同定されている。このように既知および未知の突然変異を検出する多くの方法が開発されている（例えばコットン（Cotton）,1993年を参照）けれども、人間や他のゲノム類についての我々の知識が豊富になるにつれて、核酸を特性化するための新規で、より良く、且つより速い方法を開発することの重要性がいっそう増大している。診断に用いる他に、核酸を迅速に特性化するための改良方法は、人間の法廷論争、父であることのテスト、動・植物の品種改良、細胞組織の判定、危険に瀕した種をひそかに入手するスクリーニング、及び生物学上の研究を含む、多くの他の分野においても有用である。
DNA分子を特性化するための様々の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、DNA分子はアガロース、又はポリアクリルアミドのゲルを通過する電気泳動に基づく大きさによって特性化られる。この方法においては、マイナスに荷電したDNA分子がゲルを通ってプラスに荷電した電極の方向へ移動する。ゲル状のアガロース、或いはポリアクリルアミドの百分率が、電気泳動するDNA分子のサイズ範囲にとって適切であると仮定すると、DNA分子が小さいほど、より大きなDNA分子に比べて、もっと迅速にゲルの穴を通って移動する。DNA分子は大きさに依存する速度でゲル中を移動するために、DNAを色づけして目に見えるようにし、次に大きさがわかっている標識のDNA分子の移動と、標本（サンプル）のDNA分子の移動を比較することによって、分子の大きさを決定できる。適当な条件の下では、単一のヌクレオチドだけであっても、長さの異なる一本鎖のDNA分子が、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって区別できる。
DNA分子の特性化をする他の方法は、各DNA分子を１以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、次にこの処理の結果として生じた種々のDNA断片の大きさを、アガロースゲル電気泳動法によって決定することにある。制限エンドヌクレアーゼは、DNA中の塩基（各DNAストランド上に、しばしば４、５、６又は時々８個の塩基）の特定の配列を認識し、次にDNAのポリヌクレオチド鎖のホスホジエステル結合を認識した配列に従って切断する酵素である。異った認識配列をもった多くの制限エンドヌクレアーゼが手に入るために、他のどの制限酵素が与えられた制限酵素によって発生したDNAの断片を切断するか、またその結果生じた全断片の大きさはどれだけであるかを決定することによって、制限酵素認識部位の位置と、それらの間の距離とを示すDNA分子全体の制限地図を得ることができる。このような制限地図は、特定のDNA分子に関して特徴的であり、特定の配列をおおよそ同定するのに使える。更にDNAにおける突然変異によって引き起されるもののような変化が制限部位の消失（ロス）と増加（ゲイン）の結果になりうる、いわゆる“制限断片長さの多形現象”（RFLP）（カザジアンら（Kazazian,et  al.）,1989年）である。診断上重要なRFLPの例はベーターヘモグロビン遺伝子における単一塩基突然変異、即ちDde I制限部位を消去するＡからＴの変化であって、この変化によって鎌状細胞貧血症となる（カザジアンら（Kazazian,et  al.）,1989年）。
DNA分子を特性化するための最も情報を提供する方法の１つは、そのヌクレオチド配列を決定することである。DNAの配列を決める１つの方法（マキサムとギルバート（Maxam  and  Gilbert）,1977年）は、配列を決定するための５′−又は３′−末端にラベル化したDNA分子の１ストランドの４つのアリコートの各々を４つの異った化学試薬の１つで処理するとで達成される。即ち、１つ目の薬品がDNA中のグアニン塩基だけを特に修飾し、２つ目の薬品はシトシンだけを、また３つ目の薬品はグアニン又はアデニン塩基のいずれか、そして４つ目の薬品はチミン又はシトシン塩基のいずれかを修飾する。この化学処理は、修飾を受けやすい塩基の全体のうちの少しの割合いのものだけが現実に修飾されるような条件下で行われる。
特定の型の１つの塩基だけ異なる一組の断片を発生させるために、化学反応が制限されることが重要である。例えば全てのＧ残基が修飾されるならば、この残基は全てホスホジエステル結合開裂を受けやすくなる。それ故、部分的に修飾された核酸を集めることが配列を決定するために要求される。ピペリジンでの後処理では、非塩基性部位（abasic  site）でのDNA分子のホスホジエステル結合の開裂という結果となり、化学的な修飾の後、可能性のある有らゆる大きさのDNA分子の混合物を発生させ、且つ対応する感応性塩基の１つ１つの喪失という結果となる。その四つの反応の各々におけるDNA分子は、それからポリアクリルアミドゲルの隣接したレーンにおいて、電気泳動によって解析される。そしてDNA分子が放射線同位元素でラベルされれば、バンド模様がゲルをＸ線フィルムに暴すことによって明らかにされる。DNAの配列が、暴されたＸ線フィルムを分析することで明らかにされる。或いは、DNA分子が蛍光、化学発光、又は何か他の非放射性のものでラベルされている場合には、その配列は当業界で公知の適当な方法によって明らかにされる。
この当時にDNAの配列を決定するために最も普通に使用している方法（サンガーら（Sanger,et  al.）,1977年）は、DNAポリメラーゼを使用して配列決定のためのDNA内の四つの標準的塩基（Ａ＝アデニン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアニン、及びＴ＝タミン）の位置（配列）に依存して異った大きさの断片を造るという方法である。この方法においては、配列を決めるためのDNAは試験管内でのDNA合成のための鋳型として使われる。全四種の標準的（キャノニカル）デオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP及びdTTP）に加えて、対応するジデオキシヌクレオチドによって少ない比率の標準的ヌクレオチドの無作為置換の結果となるような濃度で、２′,3′−ジデオキシヌクレオチドも又、各試験管内DNA合成反応に含められうる。このようにして、各DNA合成反応は、正常なデオキシヌクレオチドの替りにジデオキシヌクレオチドがどこに取り入れられようと、連鎖停止に対応して異った長さのDNA断片の混合物を産する。DNA断片は幾つかの方法の１つによって放射能を使って、或いは放射能を使わないでラベルされ、且つそのラベルは、ラベルされたプライマーの伸長によって、或いはラベルされたデオキシ又はジデオキシヌクレオチドの取り込みによって、DNAの中に取入れられる。４つのジデオキシヌクレオチド（ddATP、ddCTP、ddGTP、及びdTTP）の各々に関してDNA合成反応を実施することによって、それから変性ポリアクリルアミドゲルの隣接したレーンにおける各反応生成物を分離し、且つ幾つかの方法の１つでもって、これらの生成物を検査することによって、DNA鋳型の配列が直接読めるようになる。
循環（サイクル）配列決定は、熱的に安定なDNAポリメラーゼを使い、且つ鋳型DNAの変性の多ラウンドの各々を通じて、連鎖停止DNA合成を繰返し（例えば95℃で）、単一プライマー・オリゴヌクレオチドをアニールし（例えば55℃で）、そして当該プライマーの伸長（例えば70℃で）によって、配列シグナルの線状の増幅を成し遂げるサンガー配列決定のバリエーションである。
核酸配列決定は、特定の核酸が同一であるか、否かをみることに関して最も高い確度を提供する。又、突然変異の部位が知られていなくても、核酸配列決定によって遺伝子中に突然変異があるか否かを検出することができる。又、配列決定データは、特別の突然変異、又は配列における変化に関する臨床上の重要性が見積れるだけの十分な情報を与えてくれうる。
核酸を配列決定によって特性化するためには、核酸が特定の方法で使われるために、十分な量で単離されなければならない。核酸をプラスミド又は他のベクターに最初クローン化することによって、十分な量の核酸を得ることが可能であるけれども、この手続は時間がかかり過ぎ、且つ臨床上の診断のため、或いは他の目的で、標本のお定まりの分析をすることから、しばしば実用的でない。標本中の核酸の量が所定の方法での最適量より少ないときは、核酸分子の増幅部分用に開発されている幾つかの方法の１つを用いるのが好都合である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、自己抑制配列複製（3SR）、複写を介した増幅（TMA）、及びストランド転位増幅（SDA）、というのが核酸分子を試験管中で増幅するために開発された方法の幾つかの例である。
更に例示すると、DNA分子の特定の部位は、二つのプライマー（１つのプライマーはDNAストランドの各々に対して相補的であり、且つ重要なDNA配列に接している）、熱的に安定なDNAポリメラーゼ、及び４つの全ての標準的な２′−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート（dATP、dCTP、dGTP及びdTTP）とを含む緩衝液中での標本DNAの温度循環によってPCRを使って増幅されうる。特定の核酸配列は、約30サイクルの変性（例えば95℃で）、２つのプライマーのアニール（例えば55℃で）、及びDNAポリメラーゼによるこれらのプライマーの伸長（例えば70℃で）を通じて幾何学的に増幅され、その結果、核酸配列の約10億までのコピーが得られる。RNAはRT−PCRの幾つかのプロトコルの１つを使って、例えば逆転写酵素をも持つ熱的に安定なDNAポリメラーゼを使って反応を行うことによって、同様に増幅されうる（マイヤースとゲルファンド（MyersとGelfand）,1991年）。
上に論述したようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は以下のものを含む数多くの刊行物の主題である。
ムリスら（Mullis,KB,et  al）,U.S.Pat.No.4,683,202;U.S.Pat.No.4,683,195;ムリス（Mullis,KB）,EP201,184;エールリッヒ（Ehrlich,H.）,EP50,424,EP84,796,EP258,017及びEP237,362;エールリッヒ（Ehrlich,H.）,U.S.Pat.No.4,582,788;サカキら（Saiki,R.,et  al.）,U.S.Pat.No.4,683,202;コールドスプリングハーバーSymp.Quant.Boil,51:263におけるムリスら（Mullis,KB,et  al.）（1986）；サイキら（Saiki  R.,et  al.）（1985）Sience  230:1350;サイキら（Saiki,et  al.）（1985）Sience231:487;及びローら（Loh,EY,et  al.）（1988）Nature335:141.
二番目の例を挙げると、RNA分子の全体又は特定の部位がNASBA（ファイら（Fahy,et  al.）1991）を使い、下記のものを含む緩衝液中で標本RNAの等温温置によって増幅されうる。
「以下のもの」とは、２つのプライマー（RNA分子にとって相補的で、且つRNAポリメラーゼのプロモーター配列をコードする第１のプライマーと、RNA分子の逆転写から生じる第１のcDNA鎖の３′−末端体にとって相補的な第２のプライマー）、RNA分解酵素Ｈ活性（又は別個のRNA分解酵素Ｈ酵素）をも有するRNA−及びDNA−依存DNAポリメラーゼ、４つ全ての標準的２′−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート（dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP）、第１のプライマーのプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ、および４つ全てのリボヌクレオシド−５′−トリホスフェート（rATP、rCTP、rGTP及びrUTP）である。
第１のcDNAストランドは、逆転写によって第１のプライマーの伸長によって合成される。それから、RNA分解酵素Ｈは結果として生じたDNA:RNAハイブリッドのRNAを消化（ダイジェスト）し、且つ第２のプライマーが第２のcDNA鎖の合成を準備する。RNAポリメラーゼはそれから、もっと多くのRNAの複製をつくり、これらの複製が順次cDNAに逆転写され、結果として生じた二本鎖のDNA（ds−DNA）分子をRNAポリメラーゼプロモーター配列から転写する。そして、このプロセスは再びいたるところで始まる。RNA中間体を経由してds−DNAから、より多くのds−DNAへのこの一連の反応は、反応成分が消費され、又は酵素が不活性になるまで自己統一した方法で継続する。DNA標本はまた、NASBA又は3SRの他の変異によって増幅されうる。
ストランド置換増幅（SDA）は、もう１つ別の等温核酸増幅技術である（ウオーカー（Walker）,1994年）。SDAはプライマーの伸長、一本鎖の伸長生成物の置換、プライマーの伸長生成物（又は元の標的配列へのアニーリング、及びその後のプライマーの伸長が反応混合物中で同時に生じるような核酸増幅の方法である。これは反応の温度抑制の結果として反応のステップが不連続相又はサイクル中で生じるPCRと対称的である。SDAは以下の１）及び２）に基づいている。
１）二本鎖の認識部位をもったヘミホスホロチオエート体の未修飾ストランドに切れ目をつける制限エンドヌクレアーゼの能力
２）切れ目のところで複製を開始し、且つ川下の（ダウンストリーム）非鋳型ストランドを置き換える、或る種のポリメラーゼの能力
プライマーのアニーリングのために、二本鎖の標的配列を変性するべく昇温（約95℃）した状態での初めの温置の後、それに続いて新しく合成されたストランドのポリマー化や置換が一定の温度（通常約37℃）のところで起る。標的配列の各々の新しいコピーの生産は以下の５つの工程からなる。
１）増幅プライマーを、最初の標的配列に、又は予めポリマー化された一本鎖の伸長生成物であって置換されたものに、結合すること
２）α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含むエクソヌクレアーゼ−欠陥（exo-）クレノーポリメラーゼによるプライマーの伸長
３）ヘミホスホロチオエート二本鎖の制限部位に切れ目をつけること
４）切れ目部位から制限酵素の解離
５）川下の非鋳型ストランドの置換を伴うexo-クレノーによる切れ目の３′−末端からの伸長
切れ目からの伸長は、他の切れ目可能な制限部位を再生するために、一定の温度では、切れ目、ポリマー化及び置換が同時かつ連続的に生じる。二本鎖の標的配列の両方のストランドにハイブリッド化するプライマーが使われるときは、増幅は、センス及び抗センスストランドが後続回の増幅において、相対立するプライマーの鋳型として働くので、指数関数的である。
PCR、NASBAおよび核酸増幅の他の方法が、更なる特性化のためにもっと多量の核酸を入手することにとって非常に有用でありうる。しかしながら、一般に増幅した核酸分子は、配列のための使用に先立って、プライマーやヌクレオチドや不完全な増幅生成物や他の不純物を取り除いて精製されなければならない。その他、例えばPCRプライマーはラベルをつけた配列プライマーと競争しうるし、またPCRヌクレオチドがサンガージデオキシ配列決定のために使用される配列決定ヌクレオチド混合物と競争しうる。またサンガー配列決定はPCR又は他の増幅方法と同時には明らかになされえない、或いは少なくとも効率ではない。その理由は、配列決定のために利用されるジデオキシヌクレオチドは配列決定反応と同様に、DNAの増幅反応の終了という結果になるからである。
１つのグループが、核酸の配列決定をするために要求される工程を減らすことを目的とした方法を開発している（シャウとポーター（ShawとPorter）,PCT  WO95/06752）。この方法によると、エクソヌクレアーゼIII（exo III）消化に対して耐性があることがわかった５′−アルファーボラノ−デオキシヌクレオシドトリホスフェートが、４つのプライマー伸長反応の１つに於いて、標準ヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の１つの替りに、試験管内でのDNA合成を通じてDNA中に含有された。exo IIIでの処理は、アルファーボラノデオキシヌクレオシド含有の時点まで合成DNAを消化するであろう。exo IIIでの消化と、ポリアクリルアミドゲル上でのラベルをつけた断片の分解の後、核酸の配列が決定される。
アルファーボラノ/exo III法の利点は、それがPCR増幅にとり込ませられうるということである。しかしながら、これにはまた欠点もある。主な欠点は、マキサム−ギルバート又はサンガーの配列決定法に比べて、配列データの精確さの程度が低いことである。その理由は、アルファーボラノ/exo III法は、配列決定ゲル上に余分のバンドと欠損したバンドとの両方を与えるからである。これらの配列決定アーチファクトが発生する機構は未だ不確かではあるが、余分なハンドは多分DNAの非ホウ素化された部位のexo IIIによる不完全な消化によるものであろうと考えられ、他方、紛失したバンドは多分アルファーボラノ−ヌクレオを含む幾つかの配列を通して、exo IIIによる選択的消化によるものであろうと考えられる。アルファーボラノ/exo III法の他の重大な欠点は、exo IIIの基質要求に関係している。exo IIIは、各ストランドの３′−未満に始って、二本鎖のDNAだけを消化するために、配列がPCR生成物の各ストランドの３′−半分に関してだけで決定されうる。その結果、プライマーに近い配列を得ることができない。また、exo III消化がフルサイズのPCR生成物の長さの50％と100％の間にある断片だけを生成するために、この方法によって配列決定されるDNAのサイズ幅は多少制限される。例えば長さにおいて1000の塩基対をもつPCR生成物がアルファーボラノ/exo III法に従って配列決定されるならば、電気泳動にかけられる断片は、およそ500〜1000ヌチレオチドの長さであろう。そのような長さの断片は、DNA配列決定ゲル中に分解させることはもっと困難である。
ウラシルＮ−グリコシラーゼ
“ウラシルＮ−グリコシラーゼ”又は“ウラシル−DNAグリコシラーゼ”（UNG又はUDG）は、DNA中の塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のＮ−グリコシド結合を開裂するのに触媒作用を及ぼす酵素であり、前記DNAには非標準ヌクレオチド２′−デオキシウリジン−５′−トリホスフェート（dUTP）が標準的ヌクレオチドdTTPの代わりに含有されている（リンダール（Lindahl）,1979年）。UDGは遊離のdUTP、遊離のデオキシウリジン又はRNAからのウラシルの開裂に対して触媒作用を及ぼさない（ダンカン（Duncan）,1981年）。
U.S.特許5,035,996には、UDGが核酸増幅反応の汚染を抑制するために使用されるプロセスが記載されている（ハートリー（Hartley）,U.S.Pat.No.5,035,996）。この発明の目的は、他の標本の先の増幅に由来するウラシル含有DNAが破壊されてしまっており、もはや第２の増幅反応を汚染しないだろうという保証をするために、増幅がUDGと一緒に行われるような新しい標本を含む反応混合物を予め処理しておくことであった。第２の増幅反応を実施するに先立って、第２の増幅混合物を消化することは、第１の増幅の残りの生成物が、更なる増幅の鋳型として働く能力を奪っている。
ある程度、上と同様にUS特許5,418,149は核酸の不特定増幅を減らすためにグリコシラーゼの使用を開示している。
DNAに部位が特定された突然変異を導入するための方法が、また述べられている。この方法はDNA中においてチミンをウラシルで置換すること、及びウラシル−DNAグリコシラーゼで行う後処理に依存している。U.S.特許4,873,192及びクンケル（Kunkel）,1985年を参照。更に、ウラシル含有ファージが、遺伝子情報をウラシル−Ｎグリコシラーゼ欠陥細胞にだけ伝達し、自然に発生しているバクテリアに対しては伝達しないという生物学的封じ込めシステムの一部分として教唆された。ワーナーら（Warner,et  al.）,1979年参照。
分子生物学におけるUDGの他の用途は、ニッソンら（Nisson,et  al.）,1991年によって述べられている。ニッソンら（Nisson,et  al.）において、UDGはPCR生成物の指向性クローニングを促進するために使用される。このようにして、PCR増幅のために使用されるべくプライマーは、dTMPの替りにdUMPを含む特定の12−塩基５′配列を含むようにつくられる。それから、PCR増幅後（反応混合物中のdUTPなしに）、増幅生成物は各５′末端にdUMP残基を含むから、これらのPCR生成物をUDGで処理することは、５′−末端からウラシル残基を取り除いてしまう。熱による後処理は、ウラシルが消失させられる非塩基部位でのホスホジエステル結合の開裂という結果となり、更にそれによって相補的末端をもつベクターに容易にクローン化されうる12−塩基の結合性の強い末端を生じさせる。
当業界において必要とされるものは、核酸および核酸間の差異を検出し、且つ同定する際に、マキサム−ギルバート又はサンガー配列と同程度に精確で且つ具体的であり、しかしもっと容易で、もっと速く、もっと高感度で及び／又は標本のDNAが少なくて済む、そんな核酸の特性化方法である。この新しい方法は、また増幅生成物のような比較的不純な核酸標本用に、そしてこの標本からプライマーやヌクレオチドや他の不純物を取り除いて精製する必要なしに使われるべきである。この方法は、またアルファーボラノ/exo III法に似た方法で、但し、この方法の欠点を有さないて、PCRのような増幅法の中に結合されうるべきである。
発明の要約
本発明は、核酸ポリマーを特性化するための、簡素で信頼できる方法を提供する。一実施態様において、本発明によって核酸ポリマー中での突然変異の検出と局在が可能である。また他の実施態様において、本発明では核酸分子が類似しているか、違っているかを決定でき、また類似又は相違の程度を決定できる。また、他の態様において本発明では核酸分子の配列を決定できる。本発明の方法に用いられる配列の限界を定める非標準的ヌクレオチドは、DNA合成の連鎖ターミネーターではないがために、この方法は、またPCR、NASBA、又はSDAのような増幅法の一部又はこれと一対をなすものでありうる。
本発明において、DNA分子は４つ全ての標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートと同様、核酸の鋳型、プライマー、ポリメラーゼ及び非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で合成される。試験管内で合成されたDNAは、それから非標準的塩基をDNAから取り去る酵素で処理され、それによって非塩基性部位が創出される。合成されたDNAのホスホジエステル結合が非塩基性部位のところで切断され、そして長さの異った一連の分子が生じせしめられる。
分子の大きさのクラスは、非標準的ヌクレオチドがその最初の配列内の標準的ヌクレオチドにとって代わる部位に対応している。開裂したDNA分子のセットについてのゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の方法によるサイズ分析では、非標準的ヌクレオチドによる個々の置換の位置を示している。
一実施態様において、非標準的ヌクレオシドトリホスフェートはdUTPである。非標準残基を取り除く酵素は、好ましくはウラシルＮ−グリコシラーゼのようなＮ−グリコシラーゼである。
本発明の一実施態様において、DNA分子中のヌクレオチド配列が、４つの異った非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々の部分にとって代わる４つの異った反応を創出することで、またこれらの反応の生成物を比較することによって、導かれる。
本発明の目的は、ヌクレオチドレベルで核酸分子を比較することである。
本発明の他の目的は、突然変異を検出する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、増幅手順と適合しうる非標準デオキシヌクレオシドトリホスフェートを組入れる方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、核酸分子の配列を決定する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、増幅生成物の配列を直接に決定する方法を提供することにある。
その方法が正確で且つ再現性があることが、本発明の利点である。
その方法は欠損バンドや複製したバンドなどの不自然な結果にならないことが、本発明の他の利点である。
本発明の他の利点、特徴、及び目的は、明細書、特許請求の範囲および図面の審査の後で明らかになるであろう。
図面の説明
図１は、BESS法の模式図（構成図）である。
図２は、特定の突然変異の結果を評価するべくBESSの使用を示す模式図である。
図３は、一対となったPCRとBESSを示す模式図である。
図４は、BESSを使ったDNA配列決定の模式図である。
図５は、核酸分子が似ているか、違っているか、又どの程度似ているのか、違っているのかを決定すべくBESSの使用を示す模式図である。
発明の詳細な説明
定義
ここで使用されている“突然変異”（ミューテーション）という術語は、核酸のヌクレオチド組成物中における変化（変質）について言及しており、そして核酸配列における削除、挿入、単独又は複合の残基変化からなりうる。この変化は、普通には、ヌクレオチド残基を他の種類の普通に存在する（標準的な）ヌクレオチドによって置換することからなる。
“ヌクレオチド”は、塩基−糖ホスフェート化合物について言及している。又、ヌクレオチドはRNA及びDNAという２つのタイプの核酸ポリマーのモノマー成分（サブユニット）である。“ヌクレオチド”は、rATP、rGTP、rUTP及びrCTPのようなリボヌクレオシドトリホスフェート、及びdATP、dGTP、dTTP及びdCTPのようなデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートに言及している。“ヌクレオシド”はホスフェート基のない塩基−糖の組合せについて言及している。“塩基”は例えばアデニン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）のような含窒素塩基について言及している。
“とり込み”（インコーポレーション）は、核酸ポリマーの一部になることについて言及している。核酸前駆体の“とり込み”については、術語学上において柔軟性があることが知られている。例えば、ヌクレオチドdGTPはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートである。DNAへの“とり込み”で、それはdGMP、或いはデオキシグアノシンモノホスフェート残基となる。DNA中にはdGTP分子はないけれども、dGTPをDNAにとり込ませると言ってもよい。
“標準的”（キャノニカル）という術語は、DNA中で普通に見い出される４つの通常の核酸塩基であるアデニン、シトシン、グアニン及びチミンについて言及しているか、又は標準塩基をそれぞれ含むデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２′−デオキシリボヌクレオシド−５′−トリホスフェートについて言及するために使われている。
“非標準的”（ノン−キャノニカル）という術語は、前記の４つの標準的塩基以外のDNA中の核酸塩基について、又は非標準的塩基をそれぞれ含むデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２′−デオキシリボヌクレオシド−５′−トリホスフェートについて言及するために使われている。ウラシルはRNA中の普通の核酸塩基であるけれども、ウラシルはDNA中の非標準的塩基である。“非標準的塩基”は非標準的ヌクレオチドの含有の結果として、又は存在する塩基（標準的又は非標準的）の修飾の結果として、核酸中に見い出される。
“アンプリコン”という術語は、PCR又は当業者に知られた、他の核酸増幅技術による増幅の生成物を記述するために登用した。
ここで記述した温度の全ては、それと違って特定されていなければ、摂氏で表現されている。
一般
我々は核酸を特性化するための新しい方法を、“塩基切除配列スクリーニング”或いは“BESS（商標）”として言及して開示する。図１はBESSの態様を記述している。
BESS法は、鋳型として特性化されるべく核酸を使って、試験管内でのDNA合成中に、DNAに非標準的ヌクレオチドをとり込ませることに基づいている。図１について言及すると、ラベルを付けたプライマーが、プライマーを伸長させることのできるポリメラーゼ、４つ全ての標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び非標準的ヌクレオチドの存在下で、核酸の鋳型にアニールされる。図１において例示された特定の非標準的ヌクレオチドはdUTPである。DNA合成の後、各非標準的塩基は、その塩基のための特定の酵素によってDNAから切除される。図１の例において、この酵素はウラシルDNAグリコシラーゼである。
更にまた図１について言及すると、DNA鎖はそれから各非標準的ヌクレオチドの位置に対応した非塩基性部位のところで破壊される。図１において説明された例は、APエンドヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼIVを使って非塩基性部位のところでDNAを破壊するものである。それから、その結果生じたDNA断片の分離は、非標準的塩基が除かれた位置で終る断片の模様を作り出す。試験管内で合成されたDNA内での各非標準的ヌクレオチドの位置は、特性化される核酸内の標準的ヌクレオチドの位置に対応している。
BESSは、単独の非標準的ヌクレオチドに適用されたときでも、特定の核酸配列又はそれと他の核酸配列とが関係あることの存在又は不存在を特性化するために、DNA断片の配列に関係するパターンを得るために使用できる（図２と５を参照）。BESS法に使用される非標準的ヌクレオチドはDNA鎖の終りをなさないために、BESSはPCR、RT−PCR、NASBA又はSDAのような増幅プロセス、又は試験管内でのDNA合成に係る他の方法の一部分でありうる（図３参照）。BESSは核酸分子の完全なヌクレオチド配列を決定するために使用されうる（図４参照）。BESS反応中のDNA合成の好ましい方法は、PCR  Technology,グリフィンとグリフィン（Griffin及びGriffin）,eds.,CRC  Press,Boca  Raton,FL（1994）に記載されている。DNA合成のための好ましい最小限の成分は、鋳型DNA（二本鎖又は一本鎖のもの）、鋳型部分の逆さ補充物である配列のプライマーオリゴデオキシヌクレオチド、50〜250マイクロモルの濃度での４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、pH6.5〜9.0の緩衝液、１〜10mMでのマグネシウムイオン、及びDNAポリメラーゼ酵素である。非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの濃度、及び対応する標準的ヌクレオチドに対しての反応混合物中でのその割合は、各非標準的ヌクレオチドとDNAポリメラーゼの組合せに関して経験的に決定される。本発明は、ポリヌクレオチドにそった、ある与えられた部位に関して全ての分子の断片だけがＮ−グリコシラーゼ酵素によって、その部位のところで開裂するように、多量の非標準的ヌクレオチドのとり込みを要求している。この非標準的ヌクレオチドは、DNAを合成するための４つの普通のヌクレオチド成分、即ちデオキシチミジントリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシシトシントリホスフェート、又はデオキシグアノシントリホスフェート、のいずれかの特定の置換体でありうる。幾つかの好ましい方法が以下の実施例で記述されている。
BESS法では、非標準的ヌクレオチドのとり込みは、標準的なDNA合成反応中に生じる。DNA又はRNA分子のいずれかが鋳型として働く。当業者はこの反応を修飾するための多くの方法を知っている。この反応は、ヌクレオチド配列を含むラベルを付けたプライマーを使って遂行するのが好ましい。但し、このプライマーはその少なくとも一部が、鋳型とハイブリッド形成するのに、この鋳型分子の一部分と十分に相補的であることが好ましい。鋳型がDNA分子である場合には、DNA依存DNAポリメラーゼがプライマー分子を伸長することが好ましい。そして、このDNA依存DNAポリメラーゼが熱的に安定なDNA依存DNAポリメラーゼであることが最も好ましい。また、RNA分子が鋳型である場合には、RNA依存DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）が使用される。この酵素は熱的に安定であることが好ましい。
放射能を利用してラベルを付けたプライマーを用いる場合には、分離した反応生成物をＸ線フィルム上に暴露することによって、この反応生成物を目で見えるようにすることができる。或いは、当業者に知られた放射能を利用しない方法でプライマーにラベルを付け、反応生成物を検出することもできる。
非標準的ヌクレオチドとしてのdUTP
本発明の一態様において、非標準的ヌクレオチドdUTPはDNAの合成中にDNA配列の中にとり込まれる。BESS法とそれを使った幾つかが、例示的な非標準的ヌクレオチドとしてdUTPを、そして例示的なＮ−グリコシラーゼとしてウラシル−DNAグリコシラーゼを用いて図解されている。例えば、デオキシチミジン（dT）残基の消失と増加が係わりをもつ特定の突然変異は、デオキシウリジン（dU）をDNAにとり込ませた後に検出できる。UDGでdU−置換された標本を消化したり、非塩基性部位（dU除去の地点）でホスホジエステル結合を加水分解することで、非塩基性部位の各々のところで終る入れ子形（ネスト）一そろいの断片ができる、この態様においては、突然変異によるdT残基の消失又は増加は、ゲル電気泳動、又は他の分離法に従って検出されるであろう核酸の同じストランドの上で生じなければならない。“とり込み”は、PCR、又は当業界で知られたDNA合成が係わる他の増幅中でありうる。デオキシヌクレオチドdGTP、dCTP、dTTP及びdUTPの混合物が、新しく合成されたDNAへのとり込みのための前駆体プールとして使用される。鋳型ストランド上でdAと反対側にとり込まれたヌクレオチドは、合成されたDNA分子の大部分に関してdTであるけれども、dUは合成されたDNA分子の断片に関して任意のそのような位置でヌクレオチドを構成する。
合成された核酸は、それからウラシルがdUとして含有されている部位からウラシルだけを取り除く、UDGのようなＮ−グリコシラーゼでもって処理される。この除去は“非塩基性部位”を創出する。ウラシルが可能な含有部位をもつ断片だけに存在するために、核酸は分子の断片中のその位置のUDGによって開裂させられる。dUがdTを通常含む位置で、核酸中に随意にとり込まれる場合には、UDG消化やホスホジエステル結合の切断によって、最初の核酸配列中にdT残基間の距離だけ長さが異なる分子のかたまりが生じる。そのような入れ子形の一そろえの分子は、それから電気泳動法による分離手段によって分析されうる。そして、初めの核酸中でのdT残基の精確な位置が推定されうる。
突然変異の分析
図２は、特定の突然変異を検査するためのBESS技術の使用を説明している。具体的には、図２は突然変異が野性型DNA中の単独Ｔ残基の突然変異を起しDNA中のＣ残基による置換の結果として生じる具体例を示している。この変化は、BESSを使って、標本と野性型DNAとの組に比べて、標本と突然変異を起したDNAとの組におけるPAGEゲル上でのバンドの消失として検出される。
図２について更に言及すると、野性型DNAと突然変異を起したDNAの両方がラベルしたプライマーで変性され、アニールされる。ＴからＣの転位を含むものに対して相補的なストランドは、DNA合成のための鋳型として働く。適当な非標準的ヌクレオチドが標準的なヌクレオチドの少しの部分に代えてDNA合成反応中にとり込まれる。図２は野性型鋳型と、ＡからＧの突然変異をもった鋳型の生成物を記述している。
更に図２について言及すると、生成物は適当なＮ−グリコシラーゼに暴露される。このＮ−グリコシラーゼはそれがとり込まれている全ての部位で非標準的塩基を切断する。DNAはそれから非塩基性部位でそれを開裂させるように処理され、そして断片が分離される。図２は野性型標本からのラベル付きの反応生成物と、突然変異を起した標本からのラベル付き反応生成物とを比較した結果を説明している。多様な断片が、非標準な塩基がＮ−グリコシラーゼによって取除かれた全ての非塩基性部位における開裂の結果として得られる。図２に示された例は、突然変異が観察される電気泳動法でのゲルの部分だけを描写している。
上のプロセスが（１）異った検出レベルをもった二つのPCRプライマーか、又は（２）２つの別個のPCR混合物か、のどちらかを使って、且つ各々がラベルを付けた２つのPCRプライマーの異ったものを使って行われる場合には、DNAの両ストランド中のdTの位置が決定されうる。
表１にみられるように、DNAの12の可能な塩基置換突然変異のうちの10が、１つ又は他のストランド上のＴの消失又は増加に係っている。そのため、非標準的ヌクレオチドとしてdUTPを使う本発明の態様は、突然変異の最大の要所を検出するために使用できる。表１は種々の突然変異と、UDG消化後の突然変異の検出とを比較している。
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このように、12の可能な主要突然変異のうちの10が、dUTPのとり込みとUDG消化を用いる本発明の態様と、二つの異った方法でラベルしたプライマーをもったPCRとをカップリングさせることによって、非常に高い感度をもって検出できる。ラベルの付けられた１つのプライマーで、可能な突然変異の２分の１（12のうちの６）が、本発明のこの態様を使って決定できる。他の二つの突然変異、即ちdGからdC、及びdCからdGの検出には、具体的にはdG又はdCの代わりに置換する非標準的なヌクレオチドと、各々それぞれの非標準的塩基を取除くＮ−グリコシラーゼとの使用が求められる。これら二つの突然変異は、二つの異ってラベルされたプライマー（DNA鋳型の各ストランドを注入するためのもの）が使用されるならば、dGTP又はdCTPに代える１つだけの非標準的ヌクレオチドと、Ｎ−グリコシラーゼに対応するものを使用するだけで検出できる。
他の非標準的なヌクレオチドの使用
dUTP以外の非標準的ヌクレオチドに係わる本発明の態様に関しては、合成されたDNAストランドからそれぞれの非標準的塩基を選択的に開裂させるＮ−グリコシラーゼを選択することが必要である。当業界で知られた他のＮ−グリコシラーゼ（デンプルとハリソン（DempleとHarrison）,1994及びリンダール（Lindahl）,1979）であって、DNAから特定の非標準的ヌクレオチドを取り除くために使用できるかもしれないものがある。表２にこれらの酵素の幾つかが記載されている。
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本発明の非標準的デオキシヌクレオチドは、忠実にDNAにとり込まれなければならないし、また次回のDNA合成中に生成物であるDNAの成分として両立しうるものでなければならない。つまり、この非標準的デオキシヌクレオチドは生成物であるDNAストランドの伸長を終了させてはいけないし、或いはポリメラーゼをひるませてはいけないし、或いは相補的のストランド上で突然変異を起させる結果となるようでもいけない。或る場合に於いては、普通でない非標準的ヌクレオチドが存在することによってDNAの合成反応、或いはDNAの物理的性質を変えるかもしれない（このヌクレオチドはDNA合成パラメーターが最適化される必要があるようにDNAにとり込まれる）。
本発明用に画かれる幾つかの他の一般的要求がある。非標準的ヌクレオチドは、例えば化学合成によって、ポリヌクレオチドの分解によって、酵素によるヌクレオチドの修飾によって、或いはこれらのプロセスの組合せによって、という具合いに或る種の手段によって得られうるものでなければならないし、また、この方法によって得られた生成物は、それからデオキシヌクレオシドトリホスフェートに変換されなければならない。更に非標準的塩基がとり込まれる核酸から、これを切除する、この特定のＮ−グリコシラーゼがなければならない。
Ｎ−グリコシラーゼによって認識される非標準的ヌクレオチドのDNA合成中における直接のとり込みなしに、標準的ヌクレオチドの位置を特別に決定しうる想像された本発明のバリエーションがある。このように、DNA中の標準的又は非標準的なヌクレオチドが、適当なグリコシラーゼ酵素のための特定の基質である非標準的ヌクレオチドに、最初に、特定的に変換される。Ｎ−グリコシラーゼによって具体的に認識された非標準的ヌクレオチドへのそのような変換が、化学的または酵素による手段によって達成できる。グリコキシラーゼ活性によって生じた非塩基性部位でのホスホジエステル結合がそれから、ここに述べたように破壊される。例えば、非塩基性部位をもったDNAが、シトシンの脱アミド化と、それに続くUNGとの処理によって調製される（サガーとストラウス（SagherとStrauss）,1985）。
Ｎ−グリコシラーゼの使用
他の具体的なＮ−グリコシラーゼは入手可能になり、また当業者に知られるようになるであろう。或るＮ−グリコシラーゼが本発明にとって適当であるか否かを決定するために、最初、非標準的ヌクレオチドを合成中のDNAにとり込ませ、次に非標準的塩基が候補的Ｎ−グリコシラーゼによって特定的に除去できるかどうかを決定する。UDGの使用を記述している上の例は、比較用の対象として働くであろう。
“Ｎ−グリコシラーゼ”又は“DNA−グリコシラーゼ”とは、Ｎ−グリコシラーゼ活性をもつ酵素を意味しており、この酵素が形式的にグリコシラーゼと呼ばれていようが、或いは他の酵素活性と組み合わさったグリコシラーゼ活性をもっていようが、関係はない。グリコシラーゼは時々“グリコシダーゼ”として言及され、そしてそれ故にＮ−グリコシラーゼとは、Ｎ−グリコシダーゼをもカバーするように定義されていることを意味している。
ここに定義されるように、Ｎ−グリコシラーゼ又はDNAグリコシラーゼはDNA中の非標準的核酸塩基と糖と結合の加水分解に触媒作用を及ぼし、非塩基性（AP）部位を発生させる酵素である。そのような酵素は多くの種の中に存在する。Escherichia  coliからの例は、ウラシル−DNAグリコシラーゼであり（UDG）、またウラシルＮ−グリコシラーゼ（UNG）と呼ばれる。他の例はデンプルとハリソン（DempleとHarrison）（1994）によって、またダンカン（Duncan）（1981）によって記述されている。
非塩基性部位での開裂
一旦、非塩基性部位なるものが創出されると、本発明の方法では合成されたDNAストランドが、この部位で開裂されることが要求される。非塩基性部位を開裂するための種々の方法が当業者に知られている。加熱及び／又は塩基性の条件が非塩基性部位でDNA分子を破壊するのに使える。例えば下記のようなプロトコールが使える：
非標準的塩基の除去の後に、非塩基性（AP）部位を含む核酸がアミン、例えば25mMトリス−HCl及び１〜5mMマグネシウムイオンを含む緩衝液中で、10〜30分間、70〜95℃で加熱される。或いは、下記の処理が非塩基性部位でのDNAを破壊するために使える。1.0Mのピペリジン塩基が、エタノールとともに沈殿させられ、真空乾燥されているDNAに加えられる。この溶液はそれから90℃で30分間加熱され、そしてピペリジンを除去するために凍結乾燥される。
非塩基性部位でDNAポリマーを破壊するために酵素処理を利用するのが好ましい。例えばアプリン系又はアピリミジン系（AP）の部位でDNAのホスホジエステル結合を開裂することのできるアプリン系／アピリミジン系のエンドヌクレアーゼ（APエンドヌクレアーゼ）が記述されているリンダール（Lindahl）,1979;デンプルとハリソン（DempleとHarrison）,1994）。
E.coliからのエンドヌクレアーゼIVのようなAPエンドヌクレアーゼの使用は、ホスホジエステル結合の開裂のための好ましい方法であると考えられる。ここに定義されるように、APエンドヌクレアーゼは非塩基性（AP）部位でのDNA開裂に触媒作用を及ぼす任意の酵素である。そのような酵素は多くの種に存在している。Escherichia  coliからのAPエンドヌクレアーゼの例としては、エンドヌクレアーゼIIIとエンドヌクレアーゼIVが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。また、カルシウムイオンの存在におけるE.coliエクソヌクレアーゼIIIはAPエンドヌクレアーゼである。本発明に有用な酵素には、APエンドヌクレアーゼ様の活性をもつ任意の酵素（それがその名前で呼ばれていようと、他の名前で呼ばれていようと関係なく）が含まれる。
エンドヌクレアーゼIVはAP残基の５′−ホスフェート基と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボース環との間で開裂させ、遊離の３′−ヒドロキシル基を生じさせる。APエンドヌクレアーゼで触発させる開裂とは対照的に、ホスホジエステル結合の熱分解をAP残基の片側に起させ、開裂生成物上に３′−ホスホリレート末端の混合物を生じさせうる。このように、エンドヌクレアーゼIVのようなAPエンドヌクレアーゼでのAP  DNA開裂の結果は、熱分解で得られるものよりは、電気泳動後、一式のもっとシャープなバンドが得られることである。
BESS生成物の検査
一旦、開裂が非塩基性部位で生じれば、BESS生成物を分析したいと考えるであろう。この分析はゲル電気泳動法、又は毛細管電気泳動法によって行うのが好ましい。それから、断片の大きさは、DNA分子に色をつけるか、又は放射能を利用してラベルをつけたDNA分子をＸ線フィルムに暴露することによって、目に見えるようにされるであろう。断片は当業者に知られた非放射能検出法によっても同様に目に見えるようにされうる。１、２、３、４又はそれより多いBESS反応からの反応生成物が、もし異った識別しうる非放射能ラベルが各反応用に使われるならば、電気泳動に用いられるゲル又は単一の毛細管の同じレーン中で可視可できる。
BESS断片の電気泳動法用に提案されるプロトコールは、６又は８％ポリアクリルアミドの0.2〜0.4mmゲル、89mMトリス−ボレート、pH8.3、1mM  EDTA（TBE緩衝液）、及び7M尿素がDNAの断片を分離するのに用いられる。変性させ、負荷をかけた緩衝液（95％ホルムアミド、0.1％ブロモフェノールブルー、0.1％キシレンシアノール及び10mM  EDTA、pH7.6）が85〜95℃で５分間加熱した標本に加えられる。それから、標本がTBE緩衝液中、1200〜2500ボルトで電気泳動にかけられる。
BESSプロトコールの利点
BESS法には幾つかの利点がある。主要な利点はヌクレオチド・レベルで核酸分子を特性化することができることである。この方法ではヌクレオチド・レベルで分析のためにDNA又はRNAの特定部位を選ぶことができる。
図３は、BESSプロトコールと増幅反応との一体化を示している。図３がPCR増幅中に標準的ヌクレオチドの少しの部分に代えて非標準的なヌクレオチドを含有させる工程を含んでいることに注目されたい。非増幅生成物に関して上に記述したように、PCR生成物はＮ−グリコシラーゼが含有される全ての部位で非標準的塩基を切除するＮ−グリコシラーゼに暴露される。標本はそれから非塩基性部位でのストランドを開裂するように処理される。図３はストランド開裂後の予想される生成物と、分離された断片の分析結果を示している。
本発明の現行技術に対する他の利点は、増幅生成物の同定を確認するために使用しうるバンドの模様の発生であろう（例えば図３参照）。当該技術での或るケースにおいては、正しい分子サイズをもったPCR生成物は、望ましい鋳型配列から誘導されると推定される。DNAの一部分は実際、他の核酸鋳型の増幅生成物でありうる。そして、その結果はそれ故に“フォールス  ポジティヴ（false  positive）”である。もし、本発明によって生じたPCR生成物断片が、問題の配列から誘導される標準の一式の断片と比較されるならば、これらの断片は、たとえ突然変異があったとしても、ポジティブに同定されうる。突然変異は、バンドの通常の模様から逸脱として認識される。本発明では、アンプリコンの同定がＮ−グリコシラーゼ消化とホスホジエステル結合の切断の後での、その特徴的なバンド模様からチェックされうるので、フォールスポジディブの結果の発生を避けることができる。
本発明の他の利点は、増幅プロセス自体が、生成物中に後で検出される非標準的ヌクレオチドをとり込むことができることにある。
本発明の特に利点となる特徴は、増幅生成物が、非標準的ヌクレオチドが決定される前に、更なる精製を要求しないことにある。PCR生成物の配列を決める現行の方法は、精製に労力が多くかかる工程と、この工程に続く、ラベルと連鎖終結するヌクレオチドをとり込みする、更なる一本鎖の増幅工程をかかえている。
アンプリコンの精製では、通常、最初の増幅の成分、例えばヌクレオチド、プライマー、先端を切り取った伸長生成物や、望まない不特定の増幅生成物を取り除くことが必要である。本発明では、ヌクレオチドの配列の位置決めをする前の精製工程を行う必要がない。
エクソヌクレアーゼIII消化がアルファーボラノヌクレオチドとり込み部位の存在を決定するために使用できる、PCTWO95/06752に記述されている方法も又、PCR生成物の直接の配列決定を可能にする。しかしながら、この方法は配列決定ゲル中に余分な、又は喪失したバンドを生じさせる。これらのアーチファクトの理由は未だはっきりしていないが、余分なバンドはエキソヌクレアーゼIII（exo III）による不完全な消化によって引き起されうる。本発明は、DNAから特定の塩基を取り除くためのＮ−グリコシラーゼを使用し、そして、このことが次にAP部位における連鎖開裂を許す結果となる。WO95/06752法と共通の配列決定ゲル・バンドアーチファクトが、本件発明を利用して生じてはならない。
ヌクレオチド配列を決定するためのBESSの利用
４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの一部の代わりに、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートをとり込ませ、且つ適当なＮ−グリコシラーゼ酵素を使うことによって、４つ全ての標準的ヌクレオシドトリホスフェートの位置が、本発明を使って決定できる。そのために、ヌクレオチドの完全な配列が本発明を使って決定できる。この態様において、核酸中にとり込まれた各々特定の非標準的ヌクレオチドを取り除くための別々のＮ−グリコシラーゼがある（図４参照）。このようなケースでは、核酸の４つの変形の各々にとり込まれた独特の非標準的ヌクレオチドがある。これら４種の核酸はそれから、非標準的ヌクレオチドの各々にとって特有のＮ−グリコシラーゼによって別々に消化される。グリコシラーゼ消化とホスホジエステル結合開裂後、断片はゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の手段によって分離される。糖−ホスフェート残基のホスホジエステル結合の開裂が、酵素を使わないベーター除去、又は酵素を用いた手段によって行われる。もし、各非標準的ヌクレオチドが４つの普通のヌクレオチドの各々にとっての特定の置換体であれば、当該核酸の完全な配列が決定されうる。
図４は、ラベルを付けたプライマーがDNAの変性された標本に最初にアニールされるDNA配列決定法を記述している。別々のA,T,G及びＣの特定反応が、DNA合成中に標準的ヌクレオチドの少しの部分の代わりに、適当な非標準的ヌクレオチドをとり込ませるために創出される。異った方法でラベル化された複数の非放射性プライマーが、単一のレーンで検出可能にするべく各反応のために使用されることに我々は注目している。図４を参照して、記号のAm,Tm,Cm及びGmは、“修飾されたA"、“修飾されたT"、“修飾されたC"及び“修飾されたG"について述べている。これらの“修飾された塩基”は非標準的ヌクレオチドである。
更に図４を参照して、各ヌクレオチド−特定の反応の生成物は、それから非標準的塩基がとり込まれる全ての部位のところで適当な非標準的塩基を特定的に切り取るＮ−グリコシラーゼと接触される。非標準的塩基の切除の後、この生成物は非塩基性部位で開裂させるために、好ましくはE.coliエンドヌクレアーゼIVのようなAPエンドヌクレアーゼを使って処理される。これらの断片は、それから好ましくは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の手段によって分離され、そして分析される。鋳型分子の配列が、図４に説明されているように、その比較から決定される。図４はまた、もし異った方法でラベル化された複数の非放射性プライマーが各反応用に使われるならば、どのようにして配列が１つのレーンの電気泳動から決定できるのかを説明している。
或いは、とり込まれた非標準的ヌクレオチドが突然変異誘発性の結果を引き起さないと仮定すると、一つの大きな反応中で全てのヌクレオチドの特定の反応を遂行できる。この反応は適当なＮ−グリコシラーゼでの処理のための別々の反応に分割できる。生成物はそれから分離され、そして先に述べたように分析されうる。
非標準的ヌクレオチドは、四つのパラレル反応の各々が、４種の普通のヌクレオチドと一緒に一種の非標準的ヌクレオチドを含む、循環配列決定反応を使って、とり込まれうる。それから、とり込まれる非標準的ヌクレオチドが、それにとって特有のＮ−グリコシラーゼによって消化される。ホスホジエステル結合開裂後、得られた生成物は変性ゲル電気泳動法、又は先に述べたような他の方法を使って分析される。
核酸間の類似性又は差異を決定するためのBESSの使用
DNA分子の全体を異った制限酵素で消化することによって得られるDNA断片の電気泳動模様が、DNA分子を（制限地図によって）特性化し、且つ大雑把に同定するために使われるのとちょうど同じように、BESS法を使って生じるDNA断片の電気泳動模様が、もっと精確な分子レベル核酸分子を特性化し、且つ同定するために使用されうる。このように、BESS法は、単独の非標準的ヌクレオチド及び単独のＮ−グリコシラーゼを使う場合であっても、ヌクレオチドのレベルで核酸の標本が類似しているか、又は異っているかどうか、及びどんな程度に異っているかを決定するために使われる。
図５は、BESS法を使って核酸間の類似性及び差異を決定するための方法を説明している。この方法は、ラベルをつけたプライマーとラベルをつけていない、又は違った方法でラベル化したプライマー２をアニールして、変性DNA鋳型にすることから始まる（この反応は単独のプライマーだけを使ってもまた遂行される）。
非標準的ヌクレオチドは、それから試験管内のDNA合成において使用する標準的ヌクレオチドの少しの部分の代わりにとり込まれる。図５は、評価されるための４つの異ったDNA鋳型標本からの合成生成物の例を説明している。各反応生成物は、とり込まれる非標準的塩基を、それがとり込まれている部位の全てにおいて、特定的に切除するＮ−グリコシラーゼで処理される。DNAは、それから非塩基性部位のところで、好ましくはE.coliエンドヌクレアーゼIVのようなAPエンドヌクレアーゼを使って開裂するように処理される。
更に図５を参照して、４つ全ての標本の開連生成物が図解されている。これらの開裂生成物は、好ましくは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はここに記述されているような他の方法によって、分離され、且つラベルを付けた断片が検出される。多くのバンドは、ほとんどの標本から生成され、図５の標本は図解目的のためにほんの少しのバンドを示す。
核酸を特性化するためのキット（kit）
本発明はまた核酸を特性化するためのキットである。一実施態様において、このキットは核酸鋳型、４種の標準的デオキシヌクレオキシドトリホスフェート、少なくとも１種の非標準的デオキシヌクレオキシドトリホスフェート、各非標準的ヌクレオチドに対応するＮ−グリコシラーゼ及びAPエンドヌクレアーゼにハイブリッド化されたプライマーを伸長することのできる酵素を含んでなるであろう。このAPエンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼIVであることが好ましい。
キットの他の形は、特定のDNA鋳型上で特性化を遂行する者にとって有用であろう。キットのこの態様において、短いセクションの特定のDNA鋳型にハイブリッド化されるようにデザインされた少なくとも１つのプライマーがキット中に提供される。このキットはまたBESSと増幅法とを一対にするよう要求される他の成分を含んでもよい。例えば、BESSと、特定の核酸配列のPCR増幅とを一対化するためのキットは、重要な配列の側面である２種の異ったプライマー、即ちラベルをつけたもの及び／又はラベルをつけていないもの、を含みうる。
このキットの最も好ましい態様において、酵素は熱に安定なDNAポリメラーゼであろう。
このキットの他の態様も、DNA配列決定用に設計されるであろう。この態様において、キットは非標準的塩基がDNAにとり込まれた後に、４種の異った標準的ヌクレオチドの各々の一部分を置換するように設定された４種の異った非標準的ヌクレオチドと、これらの各々を特異的に除去することに触媒作用を及ぼす４種の異ったＮ−グリコシラーゼを含むであろう。或いは、このキットは、もし特定のDNAの両方のストランドが配列決定されるべきであれば、２又は３の非標準的ヌクレチドだけを含みうる。
例
例１
この例は、BESS法を用いた、診断上重要な単独塩基突然変異の検出を説明している。この例はまた、BESSとPCRとの一対化を説明している。BESSと増幅との一対化によって、いくつかの状況の下では制限される標本核酸を比較的少量使うことで結果を得ることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はプラスミドpHB又はpSiC2内に含まれる人間のβ−グロビン遺伝子の部位を増幅するために遂行された。プラスミドは人間のβ−グロビン遺伝子をベクターpT7ブルーに挿入することで構成されたノバゲン（Novagen）,Madison,WI）。これら二つのプラスミドは、pSiC2のグロビン遺伝子部分のセンスストランド中において、アデノシンをチミジンで置換することだけで異なる。人間のDNAにおける、そのような突然変異はβ５又は鎌状のグロビン欠陥という分子上の原因であるカザジアン（Kazazian）,1989）グロビン遺伝子を増幅するのに使われるプライマーは、それぞれ標準的フォワード（forward）及びリバース（reverse）MB配列決定24−merオリゴヌクレオチド、
0003561523.tif 000004
（SEQ  ID  Nos.:5及び６）であった。
100ピコグラムのプラスミドpHB4又はpSiC2DNAが、50mMトリス−HCl  pH9.0、20mM硫酸アンモニウム、1.5mMの塩化マグネシウム、各0.2mMのdATP、dCTP、及びdGTP、0.16mMdTTP、0.04mMdUTP、0.1マイクグラムのラベルの付いていないフォワードプライマー、0.1のマイクログラムの32P−末端ラベル化されたリバースプライマー、及び2.5ユニットのTthDNAポリメラーゼ又はTaqDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Perkin−Elmes  Corporation）,Branchburg,NJ）を含む50マイクロリットルのPCR反応に加えられた。反応物は94゜で２分加熱され、更に95゜、30秒、55゜30秒及び72゜30秒で30回反復、循環され、最後に４゜に保たれた。
増幅の後、標本は37゜、20分間、１単位のUDG（エピセンターテクノロジー（Epicentre  Technologies）,Madison,WI）で処理された。更にアンプリコンのホスホジエステルバックボーンが、70゜10分間加熱することによってウリジン除去の部位で開裂された。この標本は95％ホルムアミド、10mM  EDTA、pH9.5、10mM  NaOH及び各々0.1％プロモフェノールブルー及びキシレンシアノールで希釈された。
反応生成物の精製は行われなかった。むしろ、反応生成物は可熱変性され、且つ８％ポリアクリルアミドと8M尿素ゲル中で直接に電気泳動させられた。ゲルは凝固させ、乾燥してＸ線フィルムに暴露された。同じプラスミドの配列決定反応を含んだ同種のサンプルが32P−末端でラベル化したリバースプライマー用の製造者の使用法に従ってシークイサーム（SequiTherm）（商標）循環配列決定キットを使ってつくられた。
このテスト結果から、デオキシウリジンを含むpHB4アンプリコンのUDG−消化された生成物において、鎌状グロビン遺伝子に特徴的なＡからＴの突然変異の部位のところに、追加のバンドが見られることがわかる。循環配列決定によって得られた対応する配列が、比較のために隣接するレーンにおいて電気泳動された。UDG−発生のレーンは、循環配列決定生成物の“T"レーンと同じバンドの模様を有する。但し、予想通りではあるが、UDG−処理材料からのバンドは、わずかにより速く移動する点で異っている。鎌状遺伝子の突然変異もまた循環配列決定レーン中にはっきりと目でみることができる。同じ結果がTth  DNAポリメラーゼ又はTaq  DNAポリメラーゼのいずれかについても得られた。
例２
以下の例は、増幅法と一対となったBESSが、突然変異が異型接合の個体の１つの対立遺伝子だけに存在しているときでも、診断上重要な単独塩基突然変異を検出できることを説明している。使用されたDNA標本は、正常な対立遺伝子に関して同型接合であるか、又は正常且つ突然変異対立遺伝子に関して異型接合である人間から得られた。BESSを使って得られた結果は、別途に標準的な方法を使って、正常および突然変異体を含む両DNA標本を配列決定することによって確認された。
アルファ１−抗トリプシン遺伝子が、例１のそれと類似したプロトコールを使って、人間のDNAから増幅された。アルファ１−抗トリプシン遺伝子のＺ遺伝子突然変異は、エクソン・ファイヴにおけるＧ−から−Ａ変移であり、このことは342ポジションでのグルタミン酸エステルからリシンへのアミノ酸変化へと導く。本発明の態様が異型接合のMZ個体の１つの対立遺伝子中にＺ遺伝子突然変異を検出するために使われた。
アルファ１−抗トリプシン遺伝子の“M"型は正常または野性型の状態である。増幅反応は、プラスミドDNAの代わりに鋳型として明らかに正常又はアルファ１−抗トリプシン異型接合人間（コリエル  インスチチュート  フォー  メディカル  リサーチ）（Coriell  Institute  for  Medical  Research）,Camde,NJ）からのものであることが明らかな1/2マイクログラムの人間のゲノムDNAを含んでいる。
プライマーである
0003561523.tif 000005
（SEQ  ID  NOs.:1と２）がアルファ１−抗トリプシン遺伝子（コックス（Cox）,1990）のイントロン・フォーとエキソン・ファイブの一部分を増幅するために選ばれた。反応（物）は50mMトリス−HCl  pH9.0、20mM硫酸アンモニウム、1.5mM塩化マグネシウム、各0.2mMのdATP、dCTP及びdGTP、0.16mM  dTTP、0.04mM  dUTP、各0.1マイクログラムの、上に記述したプライマー、及び2.5ユニットのTaq  DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー（Perkin−Elmer）,Bronchburg,NJ）を含む。
反応（物）に対し、91゜1.5分間、55゜30秒間、及び68゜１分間からなるサイクルを35回行い、最後に４゜に保持した。dUTPの存在下での増幅の結果として生じたアンプリコンは、例１に記述されるようにUDGで処理され、熱分解された。
更に精製工程なしに、UDG−処理したアンプリコンと循環配列決定反応標本の両方が、例１に記述したようにポリアクリルアミド−尿素ゲル中で電気泳動された。MZ異型接合のDNAは、他のＴバンドの強度の1/2である突然変異の位置での追加の“T"バンドを生み出した。BESSを使って、AAT  Ｚ突然変異は染色体異常のDNAにおける正常及び突然変異体対立遺伝子の混合物から得られた増幅生成物中において検出可能であった。
Ｚ突然変異の対照ディスプレーとして、正常及びMZ異型接合の遺伝子両方のPCR生成物の配列決定が行われた。dUTPなしに合成され、四種の標準的デオキシヌクレオチドだけを含むアンプリコンが、ドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む不連続な13％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。310bpアンプリコンが臭化エチジウムで色づけすることによって、局在化され、その後、ゲルから切除された。PCR生成物は、当業界で知られた方法を使って、ゲルを押しつぶし、更に0.5M酢酸アンモニウム、1mM  EDTA、及び0.1％  SDS中に浸すことによって精製した。このDNAは、シークイサーム（商標）循環配列決定キット（エピセンター  テクノロジー（Epicentre  Technologies））の生成物情報に記述されているような32P−末端でラベル化したプライマーを使って、循環配列決定データを生じせしめる鋳型として使われた。例１に記述したと同じようにして実施した（従来の）標準的循環配列決定によって、PCRと一対化したBESSを使って得られた、正常と突然変異体のDNA標本の配列が、確認された。
例３
BESSを使って生じたAP  DNAのエンドヌクレアーゼIV消化の有効性が、例３に説明されている。参照用の標準として、シークイサーム−配列決定AAT  PCR生成物（例２）のＴレーンが、その態様の幾つかにおいてBESSの結果と比較された。最初の態様は、dV−置換PCR生成物のUNG消化（37゜10分間）と、それに続く熱分解（90゜20分間）によって、AP部位におけるホスホジエステル結合を開裂することであった。２番目の態様は、エンドヌクレアーゼIVがUNGとともに添加され、且つ90゜の加熱工程がそれに続かないことを除いて、最初の態様と同じである。３番目の態様は、EDTAがUNGとエンドヌクレアーゼIVの添加前に、10mMの最終濃縮（物）に加えられたことを除いて２番目の態様と同じである。
この実験から幾つかの結論に達しうる：
（１）AP  DNAの熱分解生成物は、同じ増幅生成物のエンドヌクレアーゼIV開裂の結果から生じたものよりもシャープでない電気泳動によるバンドを生じる結果となる。
（２）エンドヌクレアーゼIV反応は、ポリメラーゼが、幾つかのケースでは開裂生成物の３′−ヒドロキシ末端を伸長させるままにしておく結果、にせのバンドが生じる。UNGやエンドヌクレアーゼIVの添加前、又はそれらとともに、EDTAのようなキレート化剤を添加すると、ポリメラーゼが開裂生成物の末端を伸長させるのを防止し、そしてにせのバンドを消失させることができる。
（３）予想されたように、BESS生成物はシークイサーム（商標）を使ってサンガー循環配列決定反応から生じる対応する生成物よりも、電気泳動中にもっと迅速に移動する。その移動差は、電気泳動ゲルの底でより明らかである。
（４）PCR生成物の循環配列決定に於いて得られたアーチファクトのバンドは本発明を使って削除できる。もっと精確な配列情報が、当業界で現在知られた方法を使うよりも、本発明を使って、その好ましい態様において得られうる。
例４
人間のHLAクラスII複とり込みのDQB1遺伝子の第二エキソンは、非常に多形の部位であるブガワンとエールリッヒ（BugawanとEhrhch）,1991;トルスビィとロンニンゲン（ThorsbyとRonningen）,1993）。HLA部位の分析は組織、又は臓器移植前に組織の型を決定したり、法廷での弁論または他の分野において、同定テストすることにとって有効である。QB1対立遺伝子と区別するBESSの有用性を説明するために、HLA遺伝子の幾つかの型がpUC19プラスミドベクターにクローンされ、そしてBESSを使って分析が行われた。この例においては、BESS手法によるDNAへの非標準的ヌクレオチドのとり込みが、単一のプライマーだけと熱サイクラー中での多数回のDNA合成を利用して行われた。このようにして、１ストランドだけの核酸鋳型の線状の増幅だけが循環配列決定に類似した方法で得られた。それ故、プラスミドからのDQB1遺伝子の一本鎖のコピーを線状に増幅するのにBESS手法が使われた。以前に記述したように、dUが一本鎖の増幅生成物において、dTの代わりに部分的に置換された。UNGとエンドヌクレアーゼIVでの消化の後、生成物が同じプラスミド標準的循環配列決定から得た“T"反応生成物に隣接した全てのレーンで電気泳動された。
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（SEQ  ID  NOs:3及び４）（ブガワンとエールリッヒ（BugawanとEhrlich）,1991）が、人間の末梢血液DNAノバゲン（Novagen）,Madison,WI）からのDQB1遺伝子のエキソン２を増幅するために使用された。５つの個体からの血液標本が、HLA遺伝子標的の多くの対立遺伝子を含むDNA調製のために使用された。50mM  トリス−HCL  pH9.0、20mM硫酸アンモニウム、1.5mM塩化マグネシウム、各0.2mMのdATP、dGTP、dTTP及びdCTP、各0.1ミリグラムのDB130及びGH29プライマー、0.5マイクログラムの人間DNA、及び１ユニットのTaq  DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー（Perkin−Elmer）Branchburg,NJ）が、MJ  リサーチ  DNA  エンジン熱サイクラー中で増幅された。標本は94゜３分間で変性され、それから93゜10秒間、60゜40秒間、及び次に75゜３分間のサイクルを30回、この標本中に対して行った。熱サイクラーは、標本が指定された温度に到達したときに時間測定を始めるべくプログラミングされた。
その結果生じた250bpPCR生成物は、そのプライマーによって記号化された部位（region）以内の生成物を開裂させる、制限エンドヌクレアーゼ  Bam  H IとPst Iによって消化された。PCR生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルフラグメントからの溶出液によって精製された。プラスミドpUC19がBam  H I及びPst Iでもって消化され、HKホスホターゼでもって処理されたエピセンター  テクノロジー（Epicentre  Technologies）,Madison  WI）、及びPCR生成物でもってしばられた。アンピシリン耐性のあるコロニーが、標準的フォワード
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M13プライマー（SEQ  ID  NO5:5及び６）を使って、プラスミド中でのPCR生成物の存在に関して選別された。候補としてのバクテリア・コロニーが、ポリプロピレン・ピペットの先端ですくいとられて、DNAエンジン熱サイクラー中で、上に述べたように循環させられたPCR混合物に加えられた。HLA遺伝子をコード化するPCR生成物が、制限エンドヌクレアーゼ消化によって地図で表されたミツナガら（Mitsunaga,et  al）,1995）。三種の独特のクローンがBESSを使う更なる分析のために選択された。
BESS分析のために、DNA合成が、循環配列決定に類似した方法で、但しジデオキシ末端混合物の代わりに、以前に述べたようなdGTP、dCTP、dTTP、dATP及びdUTPの混合物とともに、３つのHLAクローンから準備された。30回の線状増幅の一本鎖の生成物に対して、以前に述べたような10mM  EDTAの存在下で、UNGとエンドヌクレアーゼIVとでの消化が行われ、更にこの結果生成したものが変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。比較のために、同じ三つのクローンのヌクレオチド配列がシークイサーム  サイクル  シークエンシング  キット（SeqiTherm  Cycle  Sequencing  Kit）エピセンターテクノロジー（Epicentre  Technologies）,Madison,WI）を使って決定された。
BESS技法は、各クローンを循環配列決定することによって得られるＴ配列レーンと良い関係をもった各HLA遺伝子型用の独特の１セットのバンドを与えた。但し、予測されたように、また先の例におけるように、BESSに由来したバンドは、対応する配列決定のバンドよりもゲル中でもっと迅速に移動した。BESSを使って得られた配列関係のデータは、標準的循環配列決定を使って得られたものよりも、もっと精確でさえあった。このように、BESS生成物レーンに存在しない（ゲルの１つの部位における）ジデオキシ配列アーチファクトの存在が、DNA配列データの正しい解決を助けた。この例から、本発明がPCR生成物又は二本鎖のDNA分子を選別する配列に限られないことは明らかである。
キットは、BESSを使って人間のDNA標本のHLA遺伝子型を決定するためにつくられるであろう。以下にリスト化された試薬を含むキットが、PCRを遂行するために、Tth又はTaq  DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Perkin−Elmer  Corp.））のような熱に安定なDNAポリメラーゼとともに使用できる。キットは下記のものを含みうる：マイクロリットル当り0.1マイクログラムでのHLA−特定プライマー；各2.5mMのdGTP、dCTP及びdATP、2mM  dTTP及び0.5mM  dUTP、1.0mM  トリス−HCl、pH9、及び400mM硫酸アンモニウムを含むDNAポリメラーゼ緩衝液；、マイクロリッター当り１ユニットのウラシル−DNAグリコシラーゼ;50mM  EDTA;25mM塩化マグネシウム；マイクロリッター当り１ユニットのE.coliエンドヌクレアーゼIV;及び95％ホルムアミド、10mM  EDTA、pH9.5、10mM  NaOH及び各0.1％のブロモフェノール・ブルー及びキシレンシアノールを含むDNAポリメラーゼ停止緩衝液。
キットは例１〜４及び図１〜５に記述された方法と類似した方法で使用できる。具体的には、HLA遺伝子のDQB1基は、以下のものを含む50マイクロリットルの混合物中の、末梢血液又はほお（ほおの）スワブから得られた人間のDNAから増幅されうる。即ち混合物中には50mMトリス−HCl、pH9.0、20mM硫酸アンモニウム、1.5mM塩化マグネシウム、各0.2mMのdATP、dGTP及びdCTP、0.16mM  dTTP、0.04mM  dUTP、各0.1マイクログラムのプライマーDB130及びGH29（SEQ  ID  NOs:3及び４）、約0.5マイクロプログラムの人間のDNA、及び１ユニットのTaq  DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー（Perkin−Elmer）が含まれる。そして、この混合物は３分間94℃で変性せられ、更にそれから93℃10秒間、60℃40秒間、及びそれから75℃で10分間の順で30回、循環させられうる。それからEDTAを10mMの最終濃縮物に添加した後、増幅生成物が室温で10分間、ウラシル−DNAグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼIVの各１ユニットで処理して開裂されうる。停止緩衝液の添加後、標本は90℃５分間温置することによって変性され、そしてそれから８％ポリアクリルアミドゲル−8M尿素ゲル中で電気泳動によって分析されうる。BESS手法を使って標本から生じたバンドの移動が、多分キット中の対照として、又はキット中に含められうるDNAサイズ標準（いっしょにクローンされたDQB1遺伝子からのBESS反応生成物と比較されうる。）キット中のプライマーは、幾つかの方法、好ましくは非放射能手段によってラベルされる。そしてオートメーション化されたスキャナー及び／又は画像分析システムが対照といっしょに標本のバンド模様を比較するために使われうる。
参照文献
US特許文書
U.S.特許4,683,202;
U.S.特許4,873,192;
U.S.特許5,035,996;
U.S.特許5,418,149;
国際特許出願
WO95/06752;シャウとポーター（ShawとPorter）;3/1995
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配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジエンドリサク，ジエローム  ジエー．
ホフマン，レスリー  エム．
スミス，ロバート  イー．
（ii）発明の名称：拡散分子を特性化する方法
（iii）  配列の数：
（iv）通信住所：
（Ａ）受信人：クオーレルス  アンド  ブラデイ
（Ｂ）通り:411  イースト  ウイスコンシン  アベニユー
（Ｃ）市：ミルウオーキー
（Ｄ）州：ウイスコンシン
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:53202−4497
（ｖ）コンピューター判読形態：
（Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PC  コンパーチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ＃1.0,バージョン  ＃1.25
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁護士／弁理士情報：
（Ａ）氏名：ベーカー，ジーン  シー．
（Ｂ）登録番号:35,433
（Ｃ）参照／名簿番号:310307.90053
（ix）電気通信情報：
（Ａ）電話：（414）277−5709
（Ｂ）FAX:（414）271−3552
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:1:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（オグリオヌクレオチド（oglionucleotide））
（xi）配列：配列番号:1:
0003561523.tif 000008
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:2:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（オグリオヌクレオチド）
（xi）配列：配列番号:2:
0003561523.tif 000009
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:3:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）DNA（オリゴヌクレオチド）
（xi）配列：配列番号:3:
0003561523.tif 000010
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:4:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:27  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（オリゴヌクレオチド）
（xi）配列：配列番号:4:
0003561523.tif 000011
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:5:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（オリゴヌクレオチド）
（xi）配列：配列番号:5:
0003561523.tif 000012
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:6:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（オリゴヌクレオチド）
（xi）配列：配列番号:6:
0003561523.tif 000013
【図１】
0003561523.tif 000014
【図２】
0003561523.tif 000015
【図３】
0003561523.tif 000016
【図４】
0003561523.tif 000017
【図５】
0003561523.tif 000018