(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イ  グアニジノ基を有する化合物を含有する試料を高速液体クロマトグラフに付して、分析すべきグアニジノ化合物をカラムで分離する分離行程、
ロ  当該カラムからの溶出液に、塩基性環境かつ加熱環境下で還元末端を有する糖と混合する反応行程、
ハ  次いで、反応によって生じた発蛍光物質を蛍光光度計を用いて測定する蛍光測定行程、
の各行程よりなるグアニジノ化合物の分析方法において、
カラムからの溶出液に混合する緩衝液を、還元末端を有する糖を含有するものであって、混合後の還元末端を有する糖の濃度が５０ｍＭ以下でありかつ、混合後の当該混合液のｐＨ値が７以上のｐＨ緩衝能力を有する緩衝液とし、さらに、当該混合液を１００  ℃から１５０  ℃の間の任意の温度条件下で加熱しグアニジノ化合物を反応せしめる反応行程、
としたことを特徴とするグアニジノ化合物の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグアニジノ基を有する化合物を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グアニジノ基を有する化合物は生体成分や農薬などの薬物として広く知られており、多くは、動植物の生体内における生理活性や作物・土壌中における残効性が強いため、生化学および環境分野などにおいて広くその効果が調査されている。
【０００３】
従来、グアニジノ基を有する化合物の定量分析には、下記の方法が知られている。
【０００４】
▲１▼  ガスクロマトグラフ定量法：グアニジノ基を有する化合物をヘキサフルオロアセチルアセトン等の誘導体化試薬を用いてピリミジン・ＴＦＡ  化物に変換後ガスクロマトグラフにて定量を行う方法。
【０００５】
▲２▼  高速液体クロマトグラフ定量法：グアニジノ基を有する化合物をカラムで分離し、しかる後、カラムからの溶出液に、水酸化ナトリウムなどを含有する水溶液を、混合後のｐＨが塩基性になるように混合し、さらにしかる後、ニンヒドリンなどの蛍光指示薬を含有する反応試薬を混合し、５０℃以上の温度下でグアニジノ基を有する化合物を反応せしめ、反応によって生じた発蛍光性物質を蛍光光度計を用いて測定して分析する方法。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記した従来技術のうち▲１▼法（ガスクロマトグラフ法）では、装置に試料を注入するまでに必要な反応に伴う用手法的操作が煩雑で、かつ長時間を要するなどの問題を要し、さらにこれらに起因する回収率や再現性などの分析精度にも問題があった。
【０００７】
また、前期した従来技術の▲２▼法（高速液体クロマトグラフ法）では、操作が簡単であり検出特異性が高いが、該反応試薬溶液が化学的不安定であることに起因する分析精度の問題や、高感度分析が望めないなどの課題があった。
【０００８】
本発明は、前記従来技術の課題を解決するために、▲２▼法をさらに改良し、従来から当該方法が有する操作が簡単であり検出特異性が高いなどの特徴に加えて、感度と精度を増大したグアニジノ基を有する化合物の分析方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題を達成するため、本発明は、
イ  グアニジノ基を有する化合物を含有する試料を高速液体クロマトグラフに付して、分析すべきグアニジノ化合物をカラムで分離する分離行程、
ロ  当該カラムからの溶出液に、塩基性環境かつ加熱環境下で還元末端を有する糖と混合する反応行程、
ハ  次いで、反応によって生じた発蛍光物質を蛍光光度計を用いて測定する蛍光測定行程、
の各行程よりなるグアニジノ化合物の分析方法において、
反応行程においてカラムからの溶出液に混合する還元末端を有する糖を含有する緩衝液を、混合後の還元末端を有する糖の濃度が５０ｍＭ以下でありかつ、混合後の当該混合液のｐＨ値が７以上のｐＨ緩衝能力を有する緩衝液とし、さらに、当該混合液を１００  ℃から１５０  ℃の間の任意の温度条件下で加熱しグアニジノ基を有する化合物を反応せしめる反応行程としたことを特徴とする。
【００１０】
本発明において、混合後の還元末端を有する糖の濃度が５０ｍＭ以下の還元末端を有する糖濃度となる還元末端を有する糖濃度とは、例えば、カラム溶離液と還元末端を有する糖含有反応液を等量に混合する場合には、還元末端を有する糖含有反応液中の還元末端を有する糖濃度を１００  ｍＭ以下にすることをいい、さらに本発明において、混合後の当該混合液のｐＨ値が７以上となるｐＨ緩衝能力を有する緩衝液としては、ほう酸緩衝液の使用が望ましい。
【００１１】
上記した本発明の構成は、前述の従来技術と同様に、高速液体クロマトグラフによるグアニジノ基を有する化合物の分離と、該グアニジノ基を有する化合物を発蛍光化合物に導くポストカラム誘導体化検出からなる。
【００１２】
しかし従来のポストカラム誘導体化検出法では、使用する反応試薬溶液として２種類の溶液を調製する必要があり、それに伴う送液ユニットも２台必要であることや、反応試薬溶液そのものが化学的不安定であるという課題があったので、それを解決すべく本発明の発明者は反応試薬種類として還元末端を有するグルコースなどの糖類、ほう酸、水酸化ナトリウムなど化学的に安定な物質群を用いた蛍光誘導体化反応行程を見出し、それらの基礎実験を行った。その結果、各試薬濃度や反応時間、反応温度、検出波長などの最適値を求めることにより、単一の反応試薬溶液で、グアニジノ基を有する化合物の高感度、高選択性を有する高速液体クロマトグラフィ定量方法を見出した。これら事実は公知ではなく、発明者の一連の研究によって初めて知り得たものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
前記した本発明の構成によれば、グアニジノ基を有する化合物を含有する試料を高速液体クロマトグラフに付して、分析すべきグアニジノ化合物を分離し、しかる後、カラムからの溶出液に、還元末端を有する糖を含有する緩衝液を、混合後の還元末端を有する糖濃度およびｐＨが、各々、５０ｍＭ以下、ｐＨ７以上、となるように混合し、１００  ℃から１５０  ℃の間の任意の温度下でグアニジノ基を有する化合物を反応せしめ、該反応によって生じた発蛍光性物質を蛍光光度計を用いて測定して分析する。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００１５】
まず、分析装置について説明する。
【００１６】
図１は本発明で用いる高速液体クロマトグラフの流路図を示す。図において、１は移動相送液ポンプ、２は試料導入器、３はカラム恒温槽、４はカラム、５は試薬送液ポンプ、６は反応恒温槽、７は反応器、８は蛍光検出器、９はデータ処理機である。
【００１７】
次に、図１に示した分析装置を用いた本発明の一実施例について、その作用を説明する。
【００１８】
まず、送液ポンプ１によって移動相を送液し、グアニジノ化合物を含有する試料を試料導入器２からマイクロシリンジなどを用いて導入し、分析すべきグアニジノ化合物を、カラム恒温槽３によって一定温度に置かれたカラム４内で分離する。カラムから連続的に溶出する移動相に、試薬送液ポンプ５により、還元末端を有する糖を含有する反応試薬を送液して混合し、反応恒温槽６内で１００  ℃から１５０  ℃の間の任意の温度下に置かれた反応器７に送る。ここでグアニジノ基を有する化合物を発蛍光性物質に導き、当該発蛍光物質を蛍光検出器１０にて測定し、これをデータ処理機１１で処理するものである。
【００１９】
カラム４には、例えば、逆相クロマトグラフィー用カラム「ＳＴＲ  ＯＤＳ−ＩＩ」（内径４ｍｍ  ×長さ１５０ｍｍ  ）が用いられる。ただし、カラム４は分析すべきグアニジノ化合物を分離することができるものであれば、どのようなものであってもよい。
【００２０】
移動相には、一例として、１００ｍＭ  過塩素酸ナトリウムを含有する２０ｍＭくえん酸（ナトリウム）緩衝液＜ｐＨ３．２  ＞とアセトニトリルの混合液（混合比１６：５（ｖ／ｖ））を用いる。ただし、移動相は、分析すべきグアニジノ化合物を分離することができるものであれば、その種類や濃度などに何ら制約はない。
【００２１】
グアニジノ基を有する化合物を発蛍光性化合物に導く反応試薬溶液には、例えば、グルコースを含有する、２００ｍＭ  ほう酸（ナトリウム）緩衝液＜ｐＨ９．２  ＞を用い、カラム溶出液と混合して、１００  ℃〜１５０  ℃下で、３０秒〜９０秒間、反応させる。グルコースは、カラム溶出液との混合後の濃度が５０ｍＭ以下となるような濃度で用いることが好ましい。また、緩衝液は、カラム溶出液との混合後のｐＨが７以上になるように調製しているほう酸緩衝液を用いる。
【００２２】
検出波長は、励起波長３１３ｎｍ  、蛍光波長４０３ｎｍ  であることが好ましいが、反応によって生成した発蛍光性化合物が検出できる波長であれば、どの波長によっても構わない。
【００２３】
次に、具体的な分析例を示す。
【００２４】
（１）  分離条件
カラム：ＳＴＲ  ＯＤＳ−ＩＩ  （内径４ｍｍ  ×長さ１５０ｍｍ  ）
移動相：１００ｍＭ  過塩素酸ナトリウムを含有する２０ｍＭくえん酸（ナトリウム）
緩衝液＜ｐＨ３．２  ＞とアセトニトリルの混合液（混合比１６：５（ｖ／ｖ））
流  量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
温  度：４０℃
（２）  検出条件
反応試薬：４ｍＭ  グルコースを含有する２００ｍＭ  ほう酸（ナトリウム）緩衝液＜ｐＨ９．２  ＞
流    量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
反応温度：１３０℃
検    出：蛍光光度  Ｅｘ：３１３ｎｍ  、  Ｅｍ：４０３ｎｍ
（３）分析結果
以上の分析結果を図２に示す。図２は上述の具体的分析により得られたグアニジノ基を有する化合物の標準試料のクロマトグラムである。グアニジノ基を有する化合物として  ［１、１’−ｉｍｉｎｏｄｉ（ｏｃｔａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｄｉｇｕａｎｉｄｉｎｅ］の標準試料溶液１．０２ｐｐｍ  の１０μＬ  をカラムに導入した分析結果である。
【００２５】
【発明の効果】
本発明に係るグアニジノ基を有する化合物の分析方法によれば、グアニジノ化合物を含有する試料を、従来の高速液体クロマトグラフィ法より簡単な装置構成でかつ、より安定な反応試薬を用い、高感度で高精度な分析を行うことができる。また従来法の高速液体クロマトグラフィ法が有していた、操作が簡単でかつ高い検出特異性を持つという特長も損なわれない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例で用いる分析装置（高速液体クロマトグラフ）を示す図である。
【図２】本発明の一実施例であるグアニジノ基を有する化合物［１、１’−ｉｍｉｎｏｄｉ（ｏｃｔａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｄｉｇｕａｎｉｄｉｎｅ］の分析結果を示すクロマトグラムである。
【符号の説明】
１：送液ポンプ
２：試料導入器
３：カラム恒温槽
４：カラム
５：試薬送液ポンプ
６：反応恒温槽
７：反応器
８：蛍光検出器
９：データ処理機
【図１】
0003570135.tif 000002
【図２】
0003570135.tif 000003