(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ＩｇＧ産生細胞からＩｇＧ産生細胞を同定するための方法であって、
ａ）前記ＩｇＧ産生細胞および前記非ＩｇＧ産生細胞を、産生されたＩｇＧに対する捕獲試薬を包含するマトリックスに封入することと、
ｂ）該マトリックスを、ＩｇＧが産生され得る期間インキューベートすることと、
ｃ）該産生されたＩｇＧを蛍光ラベルすることと、
ｄ）蛍光ラベルされ封入されたＩｇＧ産生細胞および非ＩｇＧ産生細胞を、フローサイトメトリーを使用して識別することとを含み、
前記捕獲試薬がプロテインＡおよび／またはプロテインＧであり、前記マトリックスに付加される該プロテインＡおよび／またはプロテインＧの量は０．００１〜５ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、前記非ＩｇＧ産生細胞および前記ＩｇＧ産生細胞が哺乳動物細胞である方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、前記哺乳動物細胞がマウスのミエローマ細胞である方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記産生されたＩｇＧがヒトＩｇＧである方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、プロテインＡおよび／またはプロテインＧがビオチン化されている方法。
【請求項６】
請求項３記載の方法であって、ＩｇＧが産生され得る前記期間が１から１５分である方法。
【請求項７】
請求項３記載の方法であって、インキュベーションが２℃から１５℃の温度で実施される方法。
【請求項８】
ＩｇＧの捕獲試薬としてビオチン化プロテインＡおよび／またはプロテインＧを包含するビオチン化アガロースマトリックスであって、前記ビオチン化プロテインＡおよび／またはプロテインＧが、前記マトリックスにアビジン・リンカーにより０．００１〜５ｍｇ／ｍｌ結合されるビオチン化アガロースマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の記述】
本発明は、フローサイトメトリーを使用して蛍光ラベルされた封入性ＩｇＧ産生細胞と非ＩｇＧ産生細胞を識別することによって、非ＩｇＧ産生細胞からＩｇＧ産生細胞を同定するための新規プロセスに関する。
【０００２】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ヒト医療の診断的及び治療的な目的のために以前にも増して使用されている（Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｄ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｐ．Ｂ．，  ｉｎ  Ｂｉｒｃｈ，  Ｊ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ，  Ｅ．Ｓ．，  ｅｄｓ．，  １９９５，  Ｗｉｌｅｙ，  ４５−１０５）。
【０００３】
非ＩｇＧ産生細胞からのＩｇＧ産生細胞の識別を可能にするために、細胞の封入法を使用する同定方法は周知であり（Ｇｒａｙ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈ．，  １８２，  １５５−１６３；  Ｋｅｎｎｅｙ，  Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ  １３，  ７８７−７９０）、また、例えばＯｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ケンブリッジ、ＭＡ）から市販されている。しかし、この記載された方法は、それら方法が高産生細胞株の同定のために十分な分解能を発揮できないという点で若干の不利な点を有している。
【０００４】
本発明の課題は、高レベルの高産生細胞株を同定し得る、より高い分解能を有する改善されたプロセスを提供することである。
【０００５】
この課題は、請求項１による新規プロセスにより達成される。
本発明によれば、ＩｇＧ産生細胞が非ＩｇＧ産生細胞から同定され、その際に、
ａ） 前記ＩｇＧ産生細胞および前記非ＩｇＧ産生細胞は、産生ＩｇＧのための捕獲試薬を包含するマトリックス中に封入され、
ｂ）前記マトリックスは、ＩｇＧが産生される期間の間インキューベートされ、
ｃ） 前記産生されたＩｇＧは、蛍光ラベルされ、
ｄ） 蛍光ラベルされ且つ封入されたＩｇＧ産生細胞および非ＩｇＧ産生細胞は、フローサイトメトリーを使用して識別され、
前記捕獲試薬はプロテインＡおよび／またはプロテインＧである。
【０００６】
［細胞］
ＩｇＧの発現および分泌の効率に応じて、本発明において使用される細胞は、ＩｇＧ産生細胞または非ＩｇＧ産生細胞として定義される。非ＩｇＧ産生細胞は、約０．１〜０．２ μｇ／ｍｌの低量のＩｇＧを発現および分泌するか、或いは、いかなるＩｇＧをも発現および分泌しないだろう。ＩｇＧ産生細胞は、０．２μｇ／ｍｌを越えたレベルでＩｇＧを発現および分泌するだろう。ＩｇＧ産生細胞および非ＩｇＧ産生細胞に識別され得る好適な細胞は、哺乳動物細胞である。
いずれの哺乳動物細胞も本発明に使用できる。使用できる哺乳動物細胞の例は、マウスもしくはヒト由来のプラストサイトーマ（ｐｌａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、ミエローマ、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、線維肉腫またはリンパ芽細胞である。本発明において使用される好適な哺乳動物細胞は、マウスのミエローマ細胞である。マウスミエローマ細胞の例は、ＮＳＯ、及びグルタミンシンセターゼで形質転換されたＮＳＯ（ＧＳ−ＮＳＯ）である。ＧＳ−ＮＳＯが特に有用である。
【０００７】
［ＩｇＧ］
本発明において、使用される細胞により産生されるＩｇＧは、ヒト、ブタ、モルモット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウマ、マウス、ラットまたはハムスターのＩｇＧであってよい。ヒト化およびキメラ化したＩｇＧも同様に産生される。好ましくは、ヒトＩｇＧが産生される。
さらに、前記細胞はＦｃ断片、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片の様なＩｇＧの断片を同様に産生し得る。
【０００８】
［封入］
ＩｇＧ産生細胞および非ＩｇＧ産生細胞の封入は、例えばＷＯ  ８２／０２５６１２記載されているような標準法、または、Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社により提供されるプロトコルに従った標準法を使用することによって実施できる。
通常、前記細胞はＯｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社により市販されるＣｅｌＢｉｏＧｅｌＴＭ封入マトリックスのような、封入マトリックスを含む液化ゲルに加えられる。封入マトリックスは、通常アガロースから成る。前記マトリックスは、ビオチン化されていてもよい。特に好適なものは、ビオチン化  アガロース  マトリックスである。
液化ゲルに加えられる好適な細胞数は、１０５〜１０８細胞／ｍｌ、特に５ｘ１０５〜１０７細胞／ｍｌである。
【０００９】
通常は油、好ましくはＣｅｌＭｉｘＴＭエマルション・マトリックス、及びＣｅｌｌＳｙｓ  １０１ＴＭ  微小液滴・メーカーのような鉱油から成るエマルション・マトリックスを使用することにより、液化封入マトリックス内の前記細胞を更に処理して、ＧＭＤあたり少なくとも一つの細胞を含んでいるゲル微小液滴（ＧＭＤ）を生成することができる。ＣｅｌＭｉｘＴＭエマルション・マトリックス、及び、ＣｅｌｌＳｙｓ  １０１ＴＭ  微小液滴メーカーは、Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から販売されている。
【００１０】
捕獲試薬であるプロテインＡおよび／またはプロテインＧは、ＧＭＤが生成される前、又は、後に前記マトリックスに結合できる。好ましくは、プロテインＡおよび／またはプロテインＧは、ＧＭＤが生成された後に結合される。通常、結合は、最初に前記マトリックスをリンカーと共にインキュベーションし、続いてプロテインＡおよび／またはプロテインＧと共にインキュベーションすることにより生じる。前記マトリックスがビオチン化される場合、好適なリンカーは、ストレプトアビジンの様なアビジンである。特に使用されるものはストレプトアビジンである。
前記リンカーがアビジンである場合、プロテインＡおよび／またはプロテインＧは、前記リンカーと結合可能にするためにビオチン化されてもよい。好ましくは、ビオチン化プロテインＡおよび／またはプロテインＧが使用され、特にビオチン化プロテインＡが使用される。マトリックスまたはＧＭＤｓに加えられるプロテインＡおよび／またはプロテインＧの通常量は、０．００１〜５ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌである。
【００１１】
［ＩｇＧ産生のためのインキュベーション］
その間にＩｇＧが産生されるインキュベーション期間は、使用される細胞の種類に加えて、細胞の特異的なＩｇＧ産生力に依存する。マウスミエローマ細胞が使用される場合には、前記期間は通常は１〜１５分間であり、特に３〜１２分間である。
前記インキュベーション温度は、同様に使用される細胞の種類に加えて、細胞の特異的ＩｇＧ産生力に依存する。マウスミエローマ細胞が使用される場合には、前記インキュベーションは２℃〜１５℃、好ましく２℃〜８℃の温度で実施される。
捕獲試薬の結合を検証するために、通常はコントロールＩｇＧがインキュベーションの間に加えられる。
【００１２】
［ラベル化及びフローサイトメトリーによる選択］
蛍光ラベルとしては、産物ＩｇＧ（ｐｒｏｄｕｃｔ  ＩｇＧ）を認識することができ、且つ蛍光化合物に結合されたものであれば何でも使用できる。通常、蛍光化合物に結合され且つ産物ＩｇＧに特異的な抗体、或いは、蛍光化合物に結合され且つ産物ＩｇＧに特異的な抗原を使用できる。好ましくは、蛍光化合物結合され且つ産物ＩｇＧに特異的な抗体が使用される。産物ＩｇＧに特異的な抗体は、イムノグロブリン  クラスＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭから選択されるイムノグロブリンであってもよく、また産物ＩｇＧを発現及び分泌する細胞と関連しない宿主細胞に由来すべきである。好ましくは、産物ＩｇＧに特異的な抗体は、同様にＩｇＧである。産物ＩｇＧを発現及び分泌する細胞がマウス細胞である場合には、ラベル化抗体は例えばヤギ由来のＩｇＧであってもよい。
【００１３】
蛍光化合物の例は、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フルオレセイン・イソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミンまたはシアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）色素である。好適な蛍光ラベルとして、フィコエリスリンに結合され且つ産物ＩｇＧに特異的なＩｇＧが使用される。蛍光化合物を含み、且つ産物ＩｇＧに特異的なＩｇＧ類は市販されている。
産物ＩｇＧに特異的な抗体がラベルとして使用される場合には、付加的な分泌産物が結合するのを防止するため、並びに非特異的結合を減らすために、好ましくは、ラベル化の前にブロッカーが封入細胞に添加される。好適なブロッカー血清として、特にウシ胎仔血清、またはスキムミルク（例えばＭａｒｖｅｌ）の溶液が使用される。
【００１４】
非ＩｇＧ産生細胞からＩｇＧ産生細胞を識別するための通常のフローサイトメトリー条件は、Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社により提供されるプロトコルに従って選択される。
通常、空のＧＭＤｓ、及び少なくとも一つの細胞を包含するＧＭＤｓは、リニアの前方散乱（ＦＳｃ）、及びログの側面散乱（ＳＳｃ）のプロット上に表示される散乱特性によって検出される。最初にネガティブコントロール（捕獲試薬なし）が流され、そして占有集団（ｏｃｃｕｐｉｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）がほぼＦＳｃ／ＳＳｃプロットの中心に現れるまで、ＦＳｃ及びＳＳｃが調整される。閾値ディスクリミネーターを調節して、空のＧＭＤｓの出現を低減させる。単独占有亜集団がゲートされ、蛍光色素に適切な検出用ＰＭＴ（光電子増倍管）のログ設定を使用して蛍光を分析する。集団が蛍光ヒストグラムの最初のログ１０単位に位置するように、蛍光検出用ＰＭＴを調整する。次いで、ポジティブサンプル、及びテストサンプルが流される、通例はサンプルあたり１０，０００イベントが収集される。フローサイトメトリーによる識別は、分析的または調製的（分取的）に行うことができる。オプションとして、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）のような染色化合物に細胞を暴露することによって生細胞を選択するために、フローサイトメトリーの前にＧＭＤを染色してもよい。
【００１５】
ＩｇＧ産生細胞及び非ＩｇＧ産生細胞の集団において、ＩｇＧ産生細胞の通常達成される検出限界は、総細胞数の９５〜９９．９９％、好ましくは９９〜９９．５％である。
【００１６】
本発明の更なる対象は、ビオチン化プロテインＡおよび／またはプロテインＧが前記マトリックスに対してアビジン  リンカーにより結合されることによる、ＩｇＧの捕獲試薬としてのビオチン化プロテインＡおよび／またはプロテインＧを包含するビオチン化アガロースマトリックスである。好ましくは、前記マトリックスはＩｇＧの捕獲試薬としてプロテインＡを包含し、且つ前記アビジンリンカーはストレプトアビジンである。
【００１７】
【実施例】
［実施例１］
＜細胞及びマトリックスの調製＞
１５ｍｌのＣｅｌＭｉｘＴＭ  ２００ｃｓエマルションマトリックスを、滅菌したガラス製シンチレーションバイアル中で３７℃に平衡化した。１０６のＧＳ−ＮＳＯ生細胞を２００ｘ  ｇ、１０分間の遠心分離により収穫した。前記細胞を１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。２５μｌ  プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）酸（濾過滅菌された）を４００μｌの液化ＣｅｌＢｉｏＧｅｌＴＭに添加し、そしてゲルを３７℃で３分間平衡化した。再懸濁された細胞をＣｅｌＢｉｏＧｅｌＴＭに添加して、そして若干混和し、そして３７℃で３分間インキューベートした。ＣｅｌＢｉｏＧｅｌＴＭ細胞混合液を、気泡の混入を避けるため１ｍｌピペット  チップを使用して、バイアル中の暖められたエマルション  マトリックス  オイルに対してらせん状パターン（底部から最上部まで）で滴下して添加した。この混合液を、ＲＴで２１００  ｒｐｍの１分間、アイスバス中で２１００  ｒｐｍの１分間、及びアイスバス中で１１００  ｒｐｍの１０分間の遠心分離により２５μｍ 微小液滴を生産するＣｅｌｌＳｙｓ  １０１ＴＭ  微小液滴  メーカーを使用して乳状化した。封入混合物を２つの１５ｍｌ円錐形チューブに分配して、そして乳状液を５ｍｌ  ＰＢＳで慎重にオーバーレイした。溶液を６００ｇで１０分間回転し、その結果ＧＭＤペレットが可視化される。オイル相をピペットで除去し、上澄みを吸引し、そして２つのチューブのペレットを混合し、そして２ｍｌ  ＰＢＳを添加した。１０ｍｌ  ＰＢＳを１５ｍｌ円錐形チューブに等分し（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）、そしてＧＭＤ’ｓでオーバーレイした。前記混合物を４００ｘ  ｇ、５分間回転する（必要ならこのステップを繰り返す）。上澄みを除去し、そして細胞を適切な溶液中に再懸濁した。
【００１８】
＜Ａ．  ストレプトアビジン  ブリッジ＞
ＧＭＤペレットを２．３ｍｌの冷却ＤＭＥＭ培地中で再懸濁し、そして１０μｌアリクォットの占有率（％  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）を評価した。０．３ｍｌを「非染色」ネガティブコントロールとして保存した。１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトアビジンの８０μｌを２ｍｌの冷却Ｌ１５細胞培養培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で希釈し、そしてＧＭＤｓの２ｍｌに添加し、そして１５分間ローテーター上でＲＴにてインキューベートした。前記混合物を１０ ｍｌの冷却ＰＢＳ中で洗浄した（５分間、４００ｘ  ｇで二度回転した）。
【００１９】
＜Ｂ．  ビオチン化捕獲ＩｇＧ結合＞
ＧＭＤｓを２．３ｍｌのＬ１５中に再懸濁した（０．３ｍｌを「無捕獲」ネガティブコントロールとして保存した）。１．０ｍｇ／ｍｌ  ビオチン化プロテインＡ捕獲試薬（ピアス社）の８０μｌを２ｍｌの冷却Ｌ１５中で希釈した。希釈した捕獲物をＧＭＤｓの２ｍｌに添加し、そして溶液を１５分間、ローテーター上でＲＴにてインキューベートし、そして冷却ＰＢＳ中で洗浄し（５分間、４００ｘ  ｇで二度回転した）、そして３．３ ｍｌの冷却Ｌ１５中に再懸濁した（０．３ ｍｌをポジティブ  コントロールとして保存した）。
【００２０】
＜Ｃ．  封入細胞の分泌インキュベーション＞
ＧＭＤｓを２５ｍｌ冷却Ｌ１５に添加し、そしてＴ７５フラスコ中で４℃にて平衡化し、そして１０分間４℃でインキューベートした。コントロールＩｇＧ（ＣｈｒｏｍｅｐｕｒｅヒトＩｇＧ）の６μｌを０．８ｍｌのＬ１５中で希釈した。希釈されたコントロールＩｇＧの０．４ｍｌを各々のコントロールに添加した、そして、この溶液を１５−３０分間ローテーター上でＲＴにてインキューベートした。これらのインキュベーションの終わりに、全サンプルを冷却ＰＢＳ／２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で二回洗浄した。（５分間、４００ｘ  ｇで回転した）。分泌サンプルを２ ｍｌ、コントロールを１ ｍｌの冷却Ｌ１５ ＋ ５％ＦＢＳ中で各々再懸濁した。
【００２１】
＜Ｄ．  検出抗体による染色＞
サンプルに対しては０．５ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−抗−ｆ（ａｂ’）２−Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）検出抗体４０μｌを２ ｍｌ冷却Ｌ１５ ＋ ５％ＦＢＳ中で希釈し、そしてコントロールに対しては４μｌを２ ｍｌに希釈した。４０μｌ調製液をＧＭＤに添加し、そして４μｌ調製液の１ｍｌを各々のコントロールに添加した。混合物をＲＴ、１５分間回転した（遮光下で）。それを１０ｍｌの冷却ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で２回洗浄し、（５分間、４００ｘ  ｇで回転した）、そして各々のサンプルをフローサイトメトリーのために２．０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【００２２】
＜Ｅ．  封入細胞のフローサイトメトリー＞
使用される機器は、４８８ｎｍアルゴン  イオン  レーザを備えるＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥセルソータであり、予めフローチェック蛍光球体（Ｆｌｏｗｃｈｅｃｋ  ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）で調整した。空の及び占有ＧＭＤｓを散乱特性により検出し、リニア前方散乱（ＦＳｃ）及びログ側面散乱（ＳＳｃ）のプロット上に表示した。ネガティブコントロール（捕獲試薬なし）を最初に流し、そしてＦＳｃ及びＳＳｃを占有集団がＦＳｃ／ＳＳｃプロットのほぼ中心に現れるまで調整する。閾値ディスクリミネータを空のＧＭＤｓの出現を減らすために調整した。単独占有の亜集団をゲートして、そして蛍光色素に適切な検出ＰＭＴ（光電子増倍管）のログ設定を使用して蛍光を分析した。前記集団が蛍光ヒストグラムの最初のログ１０単位に位置するように、蛍光検出ＰＭＴを調整した。それから、ポジティブサンプル及びテストサンプルを流し、通例はサンプル毎に１０，０００イベントを収集した。
【００２３】
［実施例２］
＜捕獲試薬として、それぞれプロテインＡ及び抗体を使用した産物キメラＩｇＧ捕獲の比較＞
産物キメラＩｇＧの異なる希釈物をビオチン化プロテインＡ捕獲試薬又はビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃガンマ  フラグメント特異抗体捕獲試薬のいずれかを有する空のＧＭＤｓに暴露した。プロテインＡを取り入れたＧＭＤｓは、産物の全ての濃度で捕獲試薬としての抗体と比較して非常に高い蛍光を示した（図２を参照）。
【００２４】
［実施例３］
＜プロテインＡのワーキング濃度の決定＞
ＧＳ−ＮＳＯ細胞株をＩｇＧ産物を産生する封入テスト細胞として使用した。ネガティブコントロールとして、ビオチン化プロテインＡを有さない封入細胞を使用した。ＦｃポジティブなコントロールとしてＩｇＧを産生している封入細胞に、ヒトＩｇＧを加えた。１ｍｇプロテインＡ／ｍｌ・ＰＢＳのストック溶液を使用した（図３を参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は封入細胞により産生されるＩｇＧ捕獲の模式図を示す。
【図２】図２は捕獲試薬としての抗体と比較したプロテインＡ使用によるＩｇＧ捕獲を示す図である。
【図３】図３はプロテインＡのワーキング濃度を示す図である。
【図４】図４はフローサイトメトリーによるパーセンテージ推定と、培養物中のＧＳ−ＮＳＯ非生産者のパーセンテージの比較を示す図である。
【図１】
0003577040.tif 000002
【図２】
0003577040.tif 000003
【図３】
0003577040.tif 000004
【図４】
0003577040.tif 000005