(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一試料中の、ある濃度範囲にわたる分析物を検出する方法であって、下記の工程：
少なくとも２種類のプローブを含むプローブ試薬を供給する工程、ここで、各プローブはターゲット結合部分および検出標識を含み、プローブ試薬が試薬中の単一プローブで検出可能な分析物濃度範囲より広い分析物濃度範囲を検出できるように、各プローブは試薬中の他のプローブにより検出できる分析物濃度範囲と異なる分析物濃度範囲を検出できる量で存在する；
単一容器内でプローブ試薬と分析物含有試料を接触させる工程；
各プローブのターゲット結合部分と分析物のターゲット領域が特異的に結合するのに好ましい条件下で、試料およびプローブ試薬をインキュベートし、これにより分析物および少なくとも１種類のプローブを含む特異的結合複合体を生成させる工程、ここで、各プローブが認識するターゲット領域はプローブ試薬中の他のプローブが認識するターゲット領域とは異なる；および
その特異的結合複合体中の少なくとも１種類のプローブの存在を示す標識からのシグナルを検出することにより、特異的結合複合体の存在を検出する工程、これによってその特異的結合複合体中のプローブにより検出できる分析物濃度範囲内の試料中の分析体の存在が示される；
を含む方法。
【請求項２】
供給工程において、プローブ試薬であって１プローブの検出標識がこのプローブ試薬中の他のプローブの検出標識から生じるシグナルと識別できるシグナルを生じるプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出工程において、反応動態に特徴的なシグナルを測定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
供給工程において、プローブ試薬であって１プローブの比活性がこのプローブ試薬中の他のプローブの比活性と異なるプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
供給工程において、プローブ試薬であって第１プローブの検出標識がこのプローブ試薬中の第２プローブの検出標識から生じるシグナルと識別できるシグナルを生じ、かつ第１プローブの比活性がこのプローブ試薬中の第２プローブの比活性と異なるプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第１プローブから生じるシグナルは、検出工程で反応動態を測定することにより、第２プローブから生じるシグナルと識別できる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種類のプローブの検出標識は直接標識であって検出工程でその標識から生じるシグナルを測定する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
供給工程で、蛍光標識、発光標識、放射性標識、発色団、酵素または酵素基質である標識を有する少なくとも１種類のプローブを供給する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
検出標識が化学発光標識である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
供給工程で、シグナルを生じる結合パートナーを特異的に結合しうるリガンドである検出標識を有する少なくとも１種類のプローブを供給する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出工程で、発光、吸光、放射性崩壊、沈殿、または酵素反応生成物であるシグナルを検出する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
接触工程で、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１０倍モル過剰に存在するプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
接触工程で、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１００倍モル過剰に存在するプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
接触工程で、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１，０００倍モル過剰に存在するプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
接触工程で、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１０，０００倍モル過剰に存在するプローブ試薬を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
接触工程に、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらを組合わせた化合物である分析物が含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
接触工程に核酸である分析物が含まれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
接触工程にＲＮＡである分析物が含まれる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
供給工程で、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらを組合わせた化合物である少なくとも１種類のプローブを供給する、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
供給工程で、核酸またはその類似体である少なくとも１種類のプローブを供給する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
供給工程で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体、またはその組合わせを含む分子である少なくとも１種類のプローブを供給する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
単一試料中の分析物を検出するプローブ試薬として使用するための、少なくとも２種類のプローブを含む組成物であって、
各プローブは、分析物のターゲット領域に特異的に結合するターゲット結合部分、および検出標識を含み、各プローブはプローブ試薬中の他のプローブのターゲット領域と異なるターゲット領域に結合し、各プローブは試薬中の他のプローブにより検出できる分析物濃度範囲と異なる分析物濃度範囲を検出できる量で存在し、したがってプローブ試薬は試薬中の単一プローブが検出できる分析物濃度範囲より広い分析物濃度範囲にわたって分析物を検出できる
ものである組成物。
【請求項２３】
プローブ試薬中の第１プローブがプローブ試薬中の第２プローブと比較して少なくとも約１０倍モル過剰の異なる量で存在する、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
各プローブは、
その比活性、
その検出標識に由来する特性、
またはその組合わせ
によってプローブ試薬中の他のプローブと識別できる、請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
各プローブが、塩基配列であるターゲット結合部分を有する核酸オリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２６】
各プローブが、アクリジニウムエステル誘導体である検出標識を有する、請求項２２記載の組成物。
【請求項２７】
試薬中の他のプローブと比較して各プローブが異なる検出標識を有し、かつ各プローブが異なる比活性を有する、請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】
試薬中の他のプローブと比較して各プローブが異なる検出標識を有し、かつ各プローブが異なる比活性を有する、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
各プローブが核酸オリゴヌクレオチドであり、そのターゲット結合部分が、核酸塩基配列であるターゲット領域に特異的に結合する、請求項２２記載の組成物。
【請求項３０】
各プローブが、アクリジニウムエステル誘導体である検出標識を有する、請求項２９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、広い推定濃度範囲で存在する可能性のある分析物を少なくとも２種類の標識された結合パートナーまたはプローブの使用により検出するための組成物および方法、詳細には同一分析物の互いに異なるターゲット領域に特異的に結合する標識された結合パートナーまたはプローブを使用し、したがって少なくとも２種類の標識された結合パートナーまたはプローブの使用することにより、分析物検出のためのアッセイのダイナミックレンジを拡張することに関する。
【０００２】
発明の背景
分析物の検出および定量のためのアッセイ法には、多種多様な形態およびフォーマットのものがある。多くの場合、試料中の分析物の量は直接に検出または定量するのに十分なほど多くない。そのような場合、試料中の分析物の存在または量を示すために、分析物と結合または相互作用しうる第２分子を使用しなければならない。第２分子を直接検出できないならば、第２分子が分析物に結合したとき検出される標識と第２分子を結合させなければならない。本発明の目的に関し、分析物と結合または相互作用しうるそのような第２分子を“結合パートナー”または“プローブ”と呼ぶ。検出できる分析物の例には、抗体、タンパク質、細胞表面受容体、サイトカイン、ホルモン、抗原、核酸、金属、分子複合体、たとえばタンパク質の高分子配列体（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）、または他の高分子となどが含まれる。また、それらの分析物を検出するための結合パートナーまたはプローブは、抗体、タンパク質、抗原、ハプテン、核酸プローブ、キレート化剤、酵素、酵素基質、およびこれらの類似体であってもよい。
【０００３】
慣用されるアッセイフォーマットのひとつは、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイフォーマットでは、分析物の少なくとも１つのドメインまたは“ターゲット領域”において結合しうる第１抗体と分析物を接触させる。得られた分析物：抗体複合体から過剰の抗体を洗浄除去した後、第１抗体を酵素標識第２抗体と特異的に結合させる。次いで色原体酵素基質を供給し、基質の酵素仲介反応に好ましい条件下でインキュベートする。反応時間後に得られた着色生成物およびその強度が、それぞれ試料中に最初に存在した分析物の存在および量の指標である。ＥＬＩＳＡに用いる適切な酵素は、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、酸性ホスファターゼ、およびアルカリホスファターゼであり、それらの酵素と共に用いるのに適した酵素基質には、ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）およびｐ−ニトロフェニルホスフェートが含まれるが、他の酵素および基質も当業者に周知である。ＥＬＩＳＡの変法がある；たとえば第１抗体を酵素と結合させることで、第２抗体の工程を除くことができる。ところがこれらのアッセイ法には、分析物と標識した結合パートナーとを接触させ、次いでこの分析物結合標識を分析物の存在または量の指標として検出する共通の工程が含まれる。
【０００４】
フレンゲン（米国特許第５，７３９，０４２号）は、２種類の独立して検出できる形態の固体支持された結合パートナー（たとえばモノクローナル抗体）を分析物および標識リガンドと順番に（同時にではなく）反応させる、バイナリーアッセイ系を記載している。分析物濃度は、これら２形態から得られた読みを二重標準曲線と比較することにより求められる。
【０００５】
キャンベルら（米国特許第４，４９６，９５８号）には、多重アッセイフォーマットにおいて結合パートナーを標識するのに用いる標識用化学発光性アクリジニウム化合物を記載している。欧州特許出願第０７０９４６６号には、単一試料中の多数の核酸分析物を同時に検出および定量するための組成物および方法が記載されている。他の標識用化合物、たとえば放射性核種、蛍光性、生物発光性、リン光性、発光性、化学発光性または電気化学発光性の化合物、発色団、および染料が当技術分野で知られており、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含めた直接および間接両方の多様なアッセイフォーマットに標識剤として慣用されている。
【０００６】
アッセイ法は、検出される分析物のタイプ、分析物が結合する結合パートナーのタイプ、および用いる標識のタイプに基づいて区別される。アッセイ法は、その方法が分析物の、または分析物：結合パートナー複合体の固定化を伴うか否かによっても分類できる。“不均一”または二相アッセイ系として知られる慣用のアッセイフォーマットでは、通常はプローブ過剰条件下でプローブをその分析物に結合させる。分析物またはプローブのいずれかを固体支持体に固定化することができ、したがって得られるプローブ：分析物複合体が固体支持体に固定化される。複合体が液相で形成され、次いで固定化されることが多い。プローブ：分析物複合体が固定化された後、複合体形成していない過剰のプローブを洗浄除去する。プローブが直接に標識されている場合、次いでこの標識を分析物存在の指標として検出する。あるいは、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、等電点泳動法、その他、プローブ：分析物複合体のサイズまたは電荷に基づいて分離する方法で、プローブ：分析物複合体を遊離プローブから分離することができる。
【０００７】
“均一”アッセイ法と呼ばれる他のアッセイ法は、プローブ：分析物複合体を遊離プローブから分離する工程なしに、全体が単一相で行われる。これらにおいては、複合体形成後、通常は遊離プローブの存在下で分析物を別個に検出できるようにプローブ：分析物複合体または遊離プローブを変化させる。遊離プローブを分析物に結合したプローブから識別する方法の１つは、遊離プローブ自体でなくプローブに結合した標識を変化または選択的不活性化することによる。アーノルドら（米国特許第５，２８３，１７４号）は、標識プローブがそのターゲットに結合しているか否かに基づいて選択的に不活性化または変化させることができる標識に結合したオリゴヌクレオチドを用いる、均一法を記載している。これらの方法は洗浄またはデカントの必要なしに、単一試験管内で使用できる。もう一つの均一アッセイ法ではエネルギー伝達系を用いる。この方法では、発光種と、その吸収スペクトルが発光種の発光スペクトルに重なる吸光種とが近接していることが要求される（カナダ特許第１１８５１７７号、モリソンら）。このアッセイ法は、多数の結合部位をもつ抗原を検出するために多数の抗体を用いる。すなわち、適切な化学発光試薬の存在下で発光する１つの抗体を化学発光触媒に結合させ、ある波長で吸光し、他の波長で発光する他の抗体（“吸光体／発光体”）をある部分に結合させる。これらの別個に標識した抗体が近接した状態で単一抗原に結合すると、化学発光触媒に結合した抗体から吸光体／発光体へ高い効率でエネルギー伝達が起き、抗原の量に関連する光シグナルが発せられる。
【０００８】
均一アッセイと不均一アッセイの両方の観点を利用する、“ハイブリッド”アッセイ法と呼ばれるアッセイ法がある。これらの方法ではたとえば、単一相でのプローブまたはプローブ：分析物複合体の選択的変更、次いでアッセイのバックグラウンドレベルをさらに低下させるための分離工程を採用できる（たとえばネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号参照）。
【０００９】
用いるアッセイフォーマットに関係なくすべてのアッセイ法に、それらの感度や正確に検出または測定できる分析物濃度範囲を制限する可能性のある要因が多数ある。１つの要因は、そのアッセイ法がもつバックグラウンドレベルである。“バックグラウンド”は、一般にアッセイに際し分析物に特異的に結合しておらず、低い分析物濃度では陽性の結果を遮蔽する可能性のあるプローブまたは標識を表す。たとえば不均一アッセイでは、遊離プローブからプローブ：分析物複合体を物理的に分離する際に除去されない少量のプローブによりバックグラウンドが生じる可能性がある。プローブが標識されている場合、この少量のプローブが残留レベルの検出シグナルとして検出されるであろう。均一アッセイでは、遊離プローブまたはプローブ結合標識分子すべてを完全には変化させられないことによりバックグラウンドが生じる可能性がある。いずれの場合も、低いレベルのシグナル、一般に全シグナルの０．００１〜１０％、より一般的には約０．０１〜１％が“ベースライン”として存在し、これより下では結果を正確に信頼することができない。したがって、そのアッセイ法に固有のバックグラウンドレベルが、検出および／または測定できる分析物の最低量を制限する。
【００１０】
アッセイにおいてバックグラウンドは、アッセイの“ダイナミックレンジ”を制限する役割をもつ。“ダイナミックレンジ”とは、アッセイ試料中に存在する分析物の濃度と分析物の存在を示す標識から得られるシグナルの量との、直線的対応または正確であると推定される対応を意味する。アッセイ法のダイナミックレンジが非特異的標識の検出によるバックグラウンドレベルより下方にはあり得ないことは、当業者に自明である。したがって、バックグラウンドが高いほどダイナミックレンジはより制限される。さらに、多量の分析物を検出したい場合、これに応じて多量のプローブを用いなければならず、このためバックグラウンドレベルはさらに高くなる。
【００１１】
他の要因がアッセイ法のダイナミックレンジを制限する可能性もある。制限は、そのアッセイに用いる標識検出機器が検出または報告できるシグナルの最大量であることが多い。したがって、計測器が正確に読みとることができるのがたとえば１００万カウント／秒（ｃｐｓ）であり、試料が２００万ｃｐｓを生じる場合、残りの１００万ｃｐｓはその計測器によって報告されず、そのアッセイのダイナミックレンジの上限は正確に試料を定量するのに必要な範囲の半分である。
【００１２】
また標識プローブ：分析物複合体の検出に用いる計測器が固有の電子“ノイズ”（時には同様に“バックグラウンド”と呼ばれる）をもつ場合があり、これも分析物検出の精度を制限する可能性がある。計測器の電子ＳＮ比は改善できるが、ノイズは上記に述べた固有のアッセイバックグラウンドに関連し、広範な濃度の分析物を検出または定量する能力をさらに制限する。これらの制限を克服するために、アッセイの専門家は通常は単一供給源から多数の試料を採取するか、または試料の系列希釈液につき試験して、未知量の分析物の存在を検出する。
【００１３】
ある種のアッセイ法では、反応のダイナミックレンジを広げることなくアッセイ感度を高める。すなわちこれらの方法によれば、同じ種類の反応において従来検出されたより単に少ない量の分析物を検出できる。感度を高めるある種の方法は、結合パートナー混合物の使用による。たとえばカンフィールドら（米国特許第４，５１４，５０５号）は、少なくとも２つの異なる抗原部位に同時に結合できる少なくとも２種類の抗体を含有するモノクローナル抗体混合物を用いる、高感度の抗原検出方法を記載している。各モノクローナル抗体の量は変更できるが、一般には他の抗体の量に対比した各抗体の好ましい量は、検出される抗原に対する抗体の結合定数の比と実質的に同じである。もう一つのアッセイ法では、１種類以上のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異性標識プローブを単一のサルモネラ染色体への結合に用いることにより食品の細菌汚染を調べるために、核酸結合パートナーを使用する（欧州特許出願第０１１４６６８号）。この系では、各染色体が多数の標識に結合するので、アッセイ感度を高めるために多数のプローブを用いる。
【００１４】
当技術分野では、試料希釈液の調製または二重試料試験の必要なしに、１回のアッセイで分析物を検出および／または定量するための方法および組成物が求められている。それらの方法および組成物は、異なる試料において数桁の範囲にわたって異なる可能性のある濃度の分析物を検出するために、１度でプローブ添加を行うものが好ましい。またそれらの方法は、分析物タイプ、プローブタイプ、標識タイプ、および分析物の検出に用いる計測器と無関係であり、したがって検出される分析物または用いる組成物もしくは機器について特異的に変更できるものが好ましい。
【００１５】
発明の概要
本発明の１態様は、単一試料中のある濃度範囲にわたる分析物を検出する方法である。この方法は以下の工程を含む：少なくとも２種類のプローブを含むプローブ試薬を供給する工程、ここで、各プローブはターゲット結合部分および検出標識を含み、各プローブは試薬中の他のプローブにより検出できる分析物濃度範囲と異なる分析物濃度範囲を検出できる量で存在し、したがってプローブ試薬は試薬中の単一プローブが検出できる分析物濃度範囲より広い分析物濃度範囲を検出できる；および単一容器内でプローブ試薬と分析物含有試料を接触させる工程。次いでこの方法は以下の工程を含む：各プローブのターゲット結合部分と分析物のターゲット領域が特異的に結合するのに好ましい条件下で、試料およびプローブ試薬をインキュベートし、これにより分析物および少なくとも１種類のプローブを含む特異的結合複合体を生成させる工程、ここで、各プローブが認識するターゲット領域はプローブ試薬中の他のプローブが認識するターゲット領域とは異なる；およびその特異的結合複合体中の少なくとも１種類のプローブの存在を示す標識からのシグナルを検出することにより、特異的結合複合体の存在を検出する工程：これによってその特異的結合複合体中のプローブにより検出できる分析物濃度範囲内の試料の存在が示される。１態様においては、プローブ試薬中の１プローブの検出標識は、試薬中の他のプローブの検出標識から生じるシグナルと識別できるシグナルを生じる。他の態様においては、反応の動態に特徴的なシグナルを検出工程で測定する。好ましい態様においては、供給工程で、１プローブの比活性が試薬中の他のプローブの比活性と異なるプローブ試薬を用いる。他の好ましい態様においては、供給工程で、第１プローブの検出標識が試薬中の第２プローブの検出標識から生じるシグナルと識別できるシグナルを生じ、かつ第１プローブの比活性が試薬中の第２プローブの比活性と異なるプローブ試薬を用いる。好ましくは、第１プローブから生じるシグナルは、検出工程で反応動態を測定することにより、第２プローブから生じるシグナルと識別できる。１態様においては、少なくとも１種類のプローブの検出標識は直接標識であり、したがって検出工程でその標識から生じるシグナルを測定する。他の態様においては、少なくとも１種類のプローブが、蛍光標識、発光標識、放射性標識、発色団、酵素または酵素基質である標識をもつ。好ましくは、検出標識は化学発光標識である。本方法の１態様においては、プローブ試薬の少なくとも１種類のプローブが、シグナルを生じる結合パートナーを特異的に結合しうるリガンドである検出標識をもつ。好ましくは、発光、吸光、放射性崩壊、沈殿、または酵素反応生成物であるシグナルを検出工程で検出する。本方法の１態様においては、接触工程で、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１０倍モル過剰に存在するプローブ試薬を用いる。他の態様においては、第１プローブが第２プローブと比較して少なくとも１００倍モル過剰に、または少なくとも１，０００倍モル過剰に、または少なくとも１０，０００倍モル過剰に存在する。好ましい態様においては、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらを組合わせた化合物である分析物が、接触工程に含まれる。好ましくは、接触工程に核酸である分析物が含まれ、より好ましくは分析物がＲＮＡである。他の態様においては、プローブ試薬中の少なくとも１種類のプローブが核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらを組合わせた化合物である。好ましくは、少なくとも１種類のプローブが核酸またはその類似体である。より好ましくは、少なくとも１種類のプローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体、またはその組合わせを含む分子である。
【００１６】
本発明の他の態様は、単一試料中の分析物を検出するためのプローブ試薬として用いるための組成物である。この組成物は少なくとも２種類のプローブを含有し、各プローブは、分析物のターゲット領域に特異的に結合するターゲット結合部分、および検出標識を含み、各プローブはプローブ試薬中の他のプローブのターゲット領域と異なるターゲット領域に結合し、各プローブは試薬中の他のプローブにより検出できる分析物濃度範囲と異なる分析物濃度範囲を検出できる量で存在し、したがってプローブ試薬は試薬中の単一プローブが検出できる分析物濃度範囲より広い分析物濃度範囲にわたって分析物を検出できる。１態様においては、プローブ試薬中の第１プローブがプローブ試薬中の第２プローブと比較して少なくとも約１０倍モル過剰な量で存在する。他の態様において各プローブは、その比活性、その検出標識に由来する特性、またはその組合わせにおいて、他のプローブと識別できる。他の態様の組成物は、塩基配列であるターゲット結合部分をもつ核酸オリゴヌクレオチドを、各プローブとして含有する。１態様において各プローブは、アクリジニウムエステル誘導体である検出標識をもつ。好ましくは、試薬中の他のプローブと比較して各プローブが異なる検出標識をもち、かつ各プローブが異なる比活性をもつ。他の態様においては、各プローブは核酸オリゴヌクレオチドであり、そのターゲット結合部分は、核酸塩基配列であるターゲット領域に特異的に結合し、好ましくは各プローブは、アクリジニウムエステル誘導体である検出標識をもつ。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、単一プローブを用いた場合または他のタイプのアッセイ法（たとえばテイバー、欧州特許第１１４，６６８号に記載の方法）で多重プローブを用いた場合に一般に可能な範囲より広い全濃度範囲にわたって、少なくとも１種類の分析物を検出できる方法および組成物に関する。一般に本方法は２種類以上の標識プローブを用い、各プローブは同一分析物の異なるターゲット領域を標的とする。各標識プローブは、異なる特定濃度範囲の分析物を検出するために用いられ、アッセイ中に一定の様式でその範囲内の最大モル量の分析物に対応する量で存在する。したがってこれらの標識プローブはアッセイ中に異なる濃度で存在し、これらは検出したい異なる分析物濃度範囲に対応する。本発明の１態様においては、同じタイプの特性変化を測定することにより（たとえば光検出）、各標識が生じるシグナルを検出する。好ましい態様においては、各標識が生じるシグナルを独立して識別できる（たとえば各標識に伴う異なる特性、たとえば光および放射性崩壊の検出によるか、または同一特性の識別可能な測定、たとえば異なる波長の光による）。さらに、各プローブを同一の、または好ましくは異なる比活性で標識できる。
【００１８】
本発明の目的の１つは、２種類以上のプローブを用いることにより分析物を検出する方法および分析物を検出できる濃度範囲を拡張する方法である。各プローブは検出標識で標識され、同一分析物の異なるターゲット領域を指向する。
【００１９】
好ましくは、これらのプローブに結合した標識は別個に検出できる。“別個に検出できる”とは、それらの標識が同一反応器内に存在でき、かつ他方の存在下でそれぞれ識別できることを意味する。そのような標識は同じ一般タイプのもの、たとえば放射性核種（たとえば３２Ｐと１２５Ｉ；最初のものはβ粒子放出により、他方はγ線の放出により検出できる）、化学発光標識および蛍光標識であってもよい。あるいは、１種類のプローブを特定のタイプの標識で標識し、他のプローブを異なるタイプの標識してもよい。たとえば第１プローブを放射性核種、第２プローブを蛍光標識で標識してもよい。他の態様においては、プローブ上の標識が各プローブ上に異なる比活性で存在するならば、別個に識別できなくてもよい（すなわち同一の測定特性を検出する）。
【００２０】
“標識（された）”とは、そのプローブが標識化合物に結合していることを意味する。標識を直接的または間接的に結合させることができる。間接標識の例は、架橋分子、たとえば第２抗体または架橋用オリゴヌクレオチドの使用によるものであり、それ自体が直接的または間接的に標識される。直接標識は、共有結合により、もしくは水素結合、疎水性およびイオン性相互作用などの非共有相互作用により、またはキレートもしくは配位錯体の形成により行うことができる。
【００２１】
プローブが検出するように設計された分析物の量に対応する特定のプローブの濃度または量について述べる場合、“対応する”とはプローブと分析物の濃度または量が推定可能なかつ再現性のある状態で（たとえばある一組のアッセイ条件下において特定の比率で）関連性をもつことを意味するのは理解されるであろう。
【００２２】
“オリゴヌクレオチド”または“オリゴマー”とは、核酸分析物を特異的に結合して安定なプローブ：分析物複合体を形成しうる、窒素塩基または塩基類似体を含むヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体からなる多量体化合物を意味する。ヌクレオシドはホスホジエステル結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成してもよく、またはターゲット核酸とターゲット特異的複合体を形成しうる他の任意の様式で結合してもよい。他の結合には、たとえばホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、およびペプチド結合が含まれる。本明細書中で用いるペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドと呼ばれる化合物に含まれる。糖部分（リボース、デオキシリボース）を、ハイブリダイゼーション反応の安定性に影響を与える（ただしプローブ：分析物複合体の形成を阻害しない）基、たとえば２′メトキシ置換基および２′ハライド置換基（たとえば２′−Ｆ）で置換してもよい。塩基は慣用される塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）またはその類似体であってもよい（たとえばＴｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，５−３６，Ａｄａｍｓら，第１１版，１９９２参照）。
【００２３】
“比活性”とは、プローブ測定単位当たりの、標識から得られる検出シグナルの単位を意味する。検出シグナルの単位は、カウント／分（ｃｐｍ）、特定波長における吸光単位、相対光単位（“ＲＬＵ”）、酵素活性の単位、その他、標識の存在量を測定する任意の単位で表すことができる。プローブ測定単位は、質量単位（たとえばμｇ）または分子数測定値（たとえばμｍｏｌ）として表すこともできる。
【００２４】
“結合パートナー”または“プローブ”という用語は、分析物と結合または相互作用しうる分子化合物を意味する。結合パートナーまたはプローブは、試料中の分析物の存在または量を示すために用いられる。結合パートナーまたはプローブが本来または直接に検出できるものでない場合、プローブに直接的または間接的に標識を結合させる。検出できる分析物には、たとえば核酸、抗体、タンパク質、酵素、脂質、炭水化物、細胞表面受容体、サイトカイン、ホルモン、抗原、金属、分子複合体、たとえばタンパク質の高分子配列体または他の高分子などが含まれる。同様に、それらの分析物を検出するための結合パートナーまたはプローブには、たとえば核酸プローブ、抗体、抗原、ハプテン、キレート化剤、酵素、酵素基質、タンパク質、およびこれらの類似体が含まれる。
【００２５】
“ターゲット領域”または“領域”とは、プローブまたは結合パートナーに特異的に結合する、分析物のいずれかの部分（連続または不連続）を意味する。たとえば分析物が核酸である場合、ターゲット領域はプローブに特異的に結合するヌクレオチド塩基配列を含むことができる。ターゲット領域は、プローブが特異的に結合する、分析物の第２または第３構造を含むこともできる。他の例で分析物がタンパク質またはペプチドである場合、ターゲット領域は、プローブが特異的に結合する、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列または立体配座ドメインであってもよい。多数のプローブを同時に分析物に接触させてもプローブ間の競合が起きることがないように、ターゲット領域は同一分析物の他のターゲット領域とオーバーラップしないことが好ましい。
【００２６】
本発明の目的は、広範囲のターゲット分析物濃度を検出する方法を提供することである。一般に本発明方法は、分析物を正確に検出する能力を少なくとも２桁は高める。別個に識別できる標識をもつ追加プローブを用いることにより、単一試料のアッセイのダイナミックレンジを３〜６桁以上拡張できる。これらの方法により、試料の希釈または異なる条件下での複数回の試験を行うことなく、単一試料中の分析物を検出できる。好ましくは、予想分析物濃度に対するアッセイの動的応答は演繹的に、ある範囲の分析物量を含むように設計される。本方法では、好ましくは単一試験管内で試料を分析できる。
【００２７】
本発明の他の目的は、医療、臨床または科学的方法における最少の専門的訓練を受けた者が使用できる、分析物の検出または定量のための組成物を提供することである。本発明は、広い潜在濃度範囲の濃度で試料中に存在する可能性のある分析物の試験を可能にすることにより、多くのアッセイ態様を自動化でき、一方では試料の取扱いおよび誤差リスクを最少にすることができる、組成物を提供する。したがって本発明は、アッセイの実施に必要な実験員訓練レベルを最小にし、アッセイを自動化でき、かつ結果の変動を少なくする、組成物を提供する。
【００２８】
本発明の他の目的は、試料中に存在する１種類以上の分析物を検出または測定する方法であって、試料と２種類以上のプローブを含有するプローブ試薬とを、プローブと分析物の結合に好ましい条件下で接触させる工程を含む方法を提供することである。各プローブを標識に結合させ、そして分析物の別個のターゲット領域に特異的に結合させる。各標識プローブは異なる分析物濃度範囲にわたって分析物を検出するように設計され、プローブ試薬中に存在する各プローブの量はそのプローブにより検出したい分析物量に対応する。次いで本方法は、少なくとも１種類の標識を試料中における分析物の存在または量の指標として検出する工程を含み、その際、プローブ試薬により検出または測定できる、試料中の推定分析物量の範囲は、単一プローブまたは先行技術に記載される組合わせプローブ（たとえば欧州特許第１１４，６６８号参照）により検出または測定できる試料中の分析物量の範囲より広い。好ましくは、接触工程および検出工程の両方を同一容器内で行う。１態様においては、本方法は別個に識別できる標識を利用する。他の態様においては、本方法は異なる比活性をもつ２種類以上の標識プローブを利用する。
【００２９】
各プローブはプローブ試薬中に異なる量で存在する。各プローブの量は、その標識プローブが特異的に結合して検出する分析物の濃度範囲の上限に対応し、それを定める。アッセイにおける各標識プローブの量が、存在するバックグラウンド量を定める可能性があるので、この特色は重要である。また、それらのプローブの比活性が異なる場合、最高比活性をもつプローブは一般に最低量で存在し、一方、最低比活性をもつプローブは一般に最高量で存在する。したがって、非結合プローブに伴う標識からのバックグラウンドが最小になる。
【００３０】
本発明の他の目的は、試料中に広範囲の推定濃度で存在する可能性のある分析物を検出するための組成物およびキットを提供することである。そのような組成物は、分析物の別個のターゲット領域に結合しうる２種類以上の標識プローブを含有するプローブ試薬を含む。試薬中の各プローブの濃度はそのプローブが検出すべき分析物の最高濃度に対応するので、試薬中の標識プローブは異なる推定分析物濃度範囲にわたって分析物を検出できる。分析物は２種類以上のプローブを結合でき、各プローブは分析物中のターゲット領域に特異的に結合できる。プローブおよび／または分析物は、核酸もしくはオリゴヌクレオチド、タンパク質（たとえば抗原、抗体、ホルモン、サイトカインまたは細胞性受容体）、またはペプチド核酸であってもよい。
【００３１】
本発明には、広い濃度範囲で試料中に存在する可能性のある分析物を検出および測定するための方法、キットおよび組成物が含まれる。本方法は、試料の希釈、または異なる条件下での単一試料の反復試験を必要としない。本発明は、２種類以上の結合パートナーに結合しうる分析物を検出するための、経費、時間および労力において効率的なフォーマットを提供する。
【００３２】
本発明は、分析物検出アッセイに共通の３つの所見を伴う。第１所見は、分析物検出に標識を用いるアッセイ系はいずれも“遊離”標識に起因するバックグラウンドレベルの非特異的シグナルを生じるということである。“遊離”標識とは、アッセイ実施後に結合していない形でアッセイ中に存在する標識、または分析物に結合できずに検出シグナルを生じる標識プローブを意味する。アッセイフォーマットは一般に固有のバックグラウンドレベルをもち、これはアッセイ毎に変動する可能性はあるが、一般にはアッセイに際して測定される全シグナルの約０．０１〜約１０％、より好ましくは約０．０１〜約１％である。バックグラウンドには、標識の検出に用いる計測器にある電子ノイズも含めることができる。
【００３３】
第２の所見は、標識の検出に用いるそれぞれの計測器または方法がそれ以上のシグナルは検出されないという最大シグナル検出レベルをもつことである。たとえばルミノメーターは２００万相対光単位（“ＲＬＵ”）の最大検出レベルをもち、４００万ＲＬＵの標識を含有する試料をこの計測器で読み取る場合、試料中に存在する標識の量を半分は少なく推定するであろう（すなわちそれは２００万ＲＬＵを示す）。この現象は“上端”におけるダイナミックレンジ損失と言われる。第１の所見と合わせると、標準アッセイ系において検出できる分析物の最小レベルと最大レベルの両方に限界があることは自明である。
【００３４】
第３の所見は、異なる標識を互いの存在下で別個に検出できることである。したがって、第１標識に起因するバックグラウンドは、通常は独立して検出できる他の標識と実質的に干渉しないであろう。異なる標識間の干渉は有利ではないが、実質的でない干渉は２種類以上の標識を独立して検出するのを妨害しない。
【００３５】
標識プローブに起因するバックグラウンドは、異なるプローブを識別できない場合は問題となる。多量に存在する１プローブに起因するバックグラウンドが少量存在する他のプローブからの低い量のシグナルを隠蔽する可能性がある。この問題は、後記に詳述するように２つの方法で解決できる。第１に、異なる比活性をもつプローブを用いることができる。これによって、多量に存在する１標識プローブはその比活性が低ければ有意のバックグラウンドを生じないであろう。第２に、同じ比活性をもつ標識プローブを独立して識別できる場合、１標識プローブに起因するバックグラウンドが少量存在する他のプローブにより得られるシグナルを覆うことはないであろう。
【００３６】
異なるプローブの集団がそれぞれ単一分析物の別個のターゲット領域をターゲティングする場合、異なるプローブが分析物結合に対し互いに競合することはないであろう。したがって、異なるプローブが別個に分析物に結合してその存在を示す。標識プローブを用いる場合、それぞれのプローブ：ターゲット領域複合体は分析物の存在を示す独立した指標であるので、各ターゲット領域を別個に検出できる。各標識プローブを互いの標識プローブと異なる濃度の混合物として供給することにより、各ターゲット領域はある濃度範囲の分析物濃度の指標となる。したがって、そのようなプローブの集まりは検出できる一連の濃度範囲を構成する。
【００３７】
本発明方法は、２種類以上のプローブまたは結合パートナーを用いて分析物を検出するアッセイの濃度範囲を拡張するために、類似するが異なる様式を採用する。これをより詳細に説明するために、３つのモデル系を以下に記載する。
【００３８】
モデル系１：異なる比活性をもつ識別不能なプローブ上標識の使用
これを説明するために、それぞれ同一分析物の異なるターゲット領域をターゲティングする３種類のプローブを用いる。本方法の他の用途において２以上の任意数のプローブを同等に使用できることは理解されるであろう。各プローブを単一タイプの標識で標識する。実際には、この標識は異なる放射性核種または異なる蛍光分子のようにプローブ毎に異なってもよいが、各標識が生じるシグナルは他の標識が生じるシグナルと識別できないと仮定する。
【００３９】
このモデルアッセイ法では、標識プローブ１、２および３の混合物を、すべてのプローブが分析物上のそれらの各ターゲット領域に結合するのに好ましい条件下で分析物と接触させる。結合後、結合したプローブを結合していないプローブと識別する工程が含まれる。そのような工程は、均一アッセイ系または不均一アッセイ系のいずれを用いるかに応じて、当業者が容易に決定できる（たとえば物理的分離工程、または結合していないプローブ上の標識を選択的に不活性化する加水分解工程）。次いで、結合した標識プローブを適切な条件下でそれぞれ検出する。これらの条件は用いた標識に応じて当業者が容易に判定できる（たとえば光、放射性崩壊、または酵素−基質反応生成物の検出）。以下の計算は検出効率１００％と仮定する。
【００４０】
提示したモデル系すべてにおいて、各プローブは各分析物ユニットにつき単一コピーで存在するターゲット領域、たとえばターゲット核酸にユニークなヌクレオチド配列領域、またはターゲットポリペプチドにユニークなドメインをターゲティングすると仮定する。個々のプローブが結合するように設計された各ターゲット領域について複数のこのような部位が存在しうることは、当業者に理解されるであろう。以下の計算はターゲット領域と分析物との１対１の対応を仮定するが、各分析物ユニットに２以上のターゲット領域が存在する場合、これらの計算はこの事実を考慮した簡単な補正が必要である点で異なるにすぎない。すなわち、分析物当たり２つのターゲット領域を含む分析物については後記の計算に２を掛け、分析物当たり３つのターゲット領域を含む分析物については後記の計算に３を掛ける（以下、同様）ことは、当業者に理解されるであろう。
【００４１】
この計算については、検出できる分析物の目的量が０．０１ｆｍｏｌ（１ｆｍｏｌ＝１０−１５ｍｏｌ）〜１０，０００ｆｍｏｌであると仮定する。アッセイには、異なる濃度の３プローブを用いる：１ｆｍｏｌのプローブ１、１００ｆｍｏｌのプローブ２、および１０，０００ｆｍｏｌのプローブ３。これらのプローブを、アッセイ中のプローブ量に反比例した異なる比活性で標識する。この説明については、プローブ１を１０８単位／プローブｐｍｏｌ（１０−１２ｍｏｌ）の標識で標識し、プローブ２を１０６単位／ｐｍｏｌの標識で標識し、プローブ３を１０４単位／ｐｍｏｌの標識で標識すると仮定する。その結果、各プローブは同一量の標識（１０５単位）を反応に与える。
【００４２】
この説明については、試料中に分析物が存在しない場合、バックグラウンドはアッセイ中の全検出シグナルの０．１％であると仮定する。前記に基づいて、この量は各プローブについて０．１％×１０５単位＝１００単位、３プローブすべてについて合計３００単位のバックグラウンドである。この比較的低いバックグラウンド量のため低濃度の分析物を検出できることは当業者に理解されるであろう。
【００４３】
たとえば３ａｔｔｏｍｏｌ（１ａｔｔｏｍｏｌ＝１０−１８ｍｏｌ）の分析物がアッセイ中に存在する場合、３ａｔｔｏｍｏｌのプローブ１が結合し、プローブ１：分析物複合体は３００単位のシグナルを生じる。アッセイのバックグラウンドと合わせると、検出される全シグナルは６００単位（バックグラウンドの３００単位およびプローブ１：分析物複合体からの３００単位）となり、この分析物濃度では２倍のＳ／Ｎ比を与えるが、当業者は２倍以上のＳ／Ｎ比を一般に陽性シグナルと受け取る。３ａｔｔｏｍｏｌの分析物が存在する場合、プローブ２およびプローブ３も３ａｔｔｏｍｏｌずつ分析物に結合する。しかし比活性が低いため、プローブ２は０．３単位のシグナル、一方プローブ３は０．０００３単位を与えるにすぎない。したがって、これらのプローブからのシグナルはこの分析物濃度ではプローブ１から得られるシグナルに有意に寄与することはない。
【００４４】
同一プローブを用い、分析物濃度を１ｆｍｏｌに高めると、プローブ１はすべて分析物に結合し、プローブ１：分析物複合体は１０５単位の検出シグナルを生じる。プローブ１からの１０５単位のシグナルのうちわずか０．１％（１００単位）がこのプローブについてのバックグラウンドによるものである。同様にこのアッセイで１ｆｍｏｌのプローブ２および３が分析物に結合して、プローブ２：分析物複合体とプローブ３：分析物複合体を生成する。これらのプローブはより低い比活性で標識されているので、検出に際しプローブ２の標識が生じるシグナルは１，０００単位、プローブ３の標識が生じるシグナルは１０単位である。すなわち、プローブ２の標識は全検出シグナルの約１％に寄与し、プローブ３の標識はバックグラウンドシグナル未満である。１ｆｍｏｌの分析物が存在する際に検出される全シグナルは、１００，０００＋１０００＋１０＝１０１，０１０単位となる。
【００４５】
アッセイ試料中に１〜１００ｆｍｏｌの分析物が存在する場合、標識プローブ２からの検出シグナルはターゲット濃度に比例して変化する。このような濃度ではプローブ１はすべてターゲット領域に結合し、その検出標識１００，０００単位に相当するシグナルを生じる。プローブ２：分析物複合体も検出される。たとえば１００ｆｍｏｌの分析物では、利用可能なプローブ２はすべて結合し、プローブ２の標識がさらに１００，０００単位のシグナルとして検出される；１００ｆｍｏｌのプローブ３も結合し、１，０００単位のシグナルを与える。したがって、１００ｆｍｏｌの分析物は１００，０００＋１００，０００＋１，０００＝２０１，０００単位のシグナルとして検出される。
【００４６】
同様に、分析物１００〜１０，０００ｆｍｏｌの範囲では、反応混合物中のすべてのプローブ１およびプローブ２が分析物に結合し、それぞれ１００，０００単位の検出シグナルを与える。プローブ３は最高１０，０００ｆｍｏｌの分析物に結合でき、結合した標識プローブ３の量に比例してプローブ３：分析物複合体からのシグナルを生じる。たとえば１０，０００ｆｍｏｌ（すなわち１０ｐｍｏｌ）の分析物が存在する場合、プローブ１、２および３がそれぞれ１００，０００単位の検出シグナルを与え、合計３００，０００単位の検出シグナルとなる。
【００４７】
上記に述べたように、アッセイに際し種々の量の分析物について標識プローブ１、２および３それぞれが与えるシグナルならびに全シグナルの単位の計算値を表１に示す。表１に示した計算値から、３種類の独立したプローブを用いると、検出シグナルはこれら３種類のプローブが与える計算値の累計であるから、１種類のプローブみを用いて得られるものよりアッセイ範囲が拡張することが分かる。これは、３種類のプローブが同一であるか、または分析物の同一ターゲット領域をターゲティングする場合には当てはまらず、こうした場合、各プローブはプローブ相互で競合し、そのようなプローブの混合物は本質的には３プローブの比活性を“平均化”し、多量になるほど比活性の低いプローブの方が優勢になる。
【００４８】
【表１】
0003550358.tif 000002
【００４９】
モデル系２：同一比活性をもつ識別可能なプローブ上標識の使用
モデル系１の場合と同様に３種類のプローブを用い、各プローブに分析物の異なるターゲット領域をターゲティングするため、これらのプローブは分析物への結合に対し競合しない。このモデル系では、各プローブは別個に識別できる異なる標識で標識され、各プローブは同一比活性で標識される。これらのプローブが同一タイプのものでも異なるタイプのものでもよいことは、当業者に理解されるであろう。たとえばすべての標識が化学発光標識であってもよく、あるいは１標識が放射性標識、１標識が蛍光標識、そして１標識が化学発光標識であってもよい。各標識に特異的である適切な検出系は当業者に周知であり、検出を最適化するためのルーティン試験が必要であるにすぎない。
【００５０】
モデル系１で用いたものと同じ基本アッセイ系および分析物検出濃度範囲を採用する。同様にプローブは各プローブについて検出できる異なる分析物濃度範囲と相関する異なる量で存在する。この説明について、たとえば１ｆｍｏｌのプローブ１が存在し、１００ｆｍｏｌのプローブ２が存在し、１０，０００ｆｍｏｌのプローブ３が存在する。各プローブは同一比活性で標識されているので（この場合、標識１０８単位／プローブｐｍｏｌとなるように任意に選ぶ）、反応混合物中には標識プローブ１からの１０５単位の検出シグナル、標識プローブ２からの１０７単位の検出シグナル、標識プローブ３からの１０９単位の検出シグナルがある。
【００５１】
この説明については、同様にバックグラウンドをアッセイに固有の最大検出シグナルの０．１％に任意に設定する。モデル系１に記載したのと異なり、このモデル系の標識は識別可能である。したがって、試料中に１ｆｍｏｌの分析物が存在する場合、プローブ１はすべて分析物に結合し、プローブ１：分析物複合体から１０５単位のシグナルを生じ、プローブ１のバックグラウンドは１００単位のシグナルとなる。この同じ分析物濃度で、１ｆｍｏｌのプローブ２および３が同様にターゲットに結合し、それらの標識それぞれから１０５単位のシグナルを生じる。各プローブの標識は独立して検出できるので、プローブ１を特異的に検出する際にはプローブ２または３は検出されず、逆も同じである。同様に、特異的な独立した検出方法を採用するので、プローブ２および３が与えるバックグラウンドは一般に標識１の検出に影響を与えず、逆も同じである。
【００５２】
１ｆｍｏｌより多い分析物量では、さらに結合するプローブ１はない。この反応には１ｆｍｏｌのプローブ１が存在するにすぎないからである。たとえば１００ｆｍｏｌ（０．１ｐｍｏｌ）の分析物が存在する場合、プローブ１はすべて分析物に結合し、１００ｆｍｏｌずつのプローブ２および３が分析物のそれぞれのターゲット領域に結合し、プローブ１：分析物複合体から１０５単位のシグナル、プローブ２：分析物およびプローブ３：分析物それぞれの複合体から１０７単位のシグナルを生じる。プローブ２および３に伴う各標識からのバックグラウンドは０．００１×１０７単位、すなわち１０，０００単位である。標識を独立して検出できるので、この場合も１標識が与えるバックグラウンドは通常は他の検出に干渉しない。
【００５３】
分析物濃度１００〜１０，０００ｆｍｏｌでは、プローブ１および２が完全に分析物に結合し、プローブ１：分析物から１０５単位のシグナルが生じ、プローブ２：分析物からの１０７単位のシグナルが検出される。プローブ３は最高１０５ｆｍｏｌ（１０ｐｍｏｌ）の分析物を結合するが、このプローブは他のプローブと同一比活性に標識されているので、プローブ３からの１０９単位のシグナルが検出される。プローブ３の標識が与えるバックグラウンドは１０９×０．００１、すなわち１０６単位のシグナルである。
【００５４】
上記で検討した、アッセイ中の種々の量の分析物について標識プローブ１、２および３それぞれが与えるシグナル、ならびに各検出標識の全シグナルの単位の計算値を表２に示す。
【００５５】
【表２】
0003550358.tif 000003
【００５６】
表２から分かるように、標識が識別不能であって比活性が異なるモデル系１に示した状況と異なり、この態様では用いる３プローブそれぞれについて試料中の分析物量と検出シグナル量との間に同じ直線関係が保たれる。モデル系２のアッセイ方法は有効であるが、表２に提示した全範囲内のシグナルを検出機器または検出方法が測定できない可能性がある。たとえば各標識の検出機器または方法が各標識のシグナルの上限（すなわち、標識１については１００，０００単位、標識２については１０，０００，０００単位、および／または標識３については１，０００，０００，０００単位、）を正確に測定しない場合、この方法の精度は低下する。１標識を検出するのに用いる方法または機器が他の標識を検出するのに用いるものと同じ機器または方法である必要がないことは、理解されるであろう。
【００５７】
検出方法および／または機器が標識の“有効検出範囲”（すなわち、分析物量の範囲、これはアッセイにおける個々の標識の測定に依存する）全体にわたって正確に各標識から生じるシグナルを測定でき、かつ各標識を他の標識と相互に実質的に識別できるならば、このアッセイフォーマットはモデル系１に示したフォーマットより明らかに優れた利点をもつ。モデル系２の標識の比活性は同一であるので、すべてのプローブについてアッセイのダイナミックレンジ全体にわたって、分析物の量と発生するシグナルとの間に同じ関係がある。したがって、このアッセイフォーマットは、モデル系１のものと比較して高い感度で分析物を検出できる。
【００５８】
モデル系３：異なる比活性をもつ識別可能なプローブ上標識の使用
このモデル系は、異なるプローブに結合した識別可能な標識で標識され、各プローブが異なる比活性をもつプローブを用いて、広範囲の潜在分析物量または濃度にわたって分析物を検出することを記載する。したがって、このモデル系は、モデル系１と２（それらの特色は前記に詳述）の条件のハイブリッドである。
【００５９】
モデル系１および２の場合と同様に、モデル系３を説明するために、分析物の異なるターゲット領域にそれぞれ特異的な３種類の標識プローブを用いる。前記のように、各プローブは異なる量で存在し（１ｆｍｏｌのプローブ１、１００ｆｍｏｌのプローブ２、１０，０００ｆｍｏｌのプローブ３）、各プローブは試料中の特定範囲の分析物を検出できる。モデル系１の場合と同様に、各プローブを他のプローブと比較して異なる比活性で標識され、プローブ１はシグナル１０８単位／ｐｍｏｌの比活性、プローブ２はシグナル１０６単位／ｐｍｏｌの比活性、プローブ３はシグナル１０４単位／ｐｍｏｌの比活性をもつ。その結果、アッセイに際しての各プローブの最大量は１０５単位のシグナルである。モデル系２の場合と同様に、各プローブを別個に識別できる。
【００６０】
異なる量の分析物を含有するアッセイにおいて各プローブにつき検出できるシグナル量を、前記モデル系１および２に述べたと同様に計算した。モデル系１および２につき上記で検討したように、アッセイ中の種々の量の分析物（ｐｍｏｌ）について標識プローブ１、２および３それぞれのシグナル、ならびに各検出標識の全シグナルの単位の計算値を表３に示す。
【００６１】
【表３】
0003550358.tif 000004
【００６２】
各標識は他の標識と別個に識別できるので、各プローブは他のプローブからのシグナルにマスクされることなく検出される。各標識プローブの比活性は異なるので、著しく少量の分析物を検出する際に得られるシグナル量は増加し、著しく大量の分析物を検出する際に得られるシグナル量は減衰する。この特色は、１種類以上のこれらの標識を検出するために用いる検出方法または機器が特定のダイナミックレンジに限定される場合、特に有利である。たとえば現在説明している状況では、３種類のプローブそれぞれが約１０３〜１０５単位の同じシグナル範囲の検出シグナルを生じる。したがって、このアッセイ法では６桁にわたって分析物が検出されるが、いずれのプローブ：分析物複合体の検出に用いる検出機器も、正確に２桁にわたる精度が要求されるにすぎない。
【００６３】
この後者の事実は、本発明の特定の側面で有利である。たとえば別個に検出できる標識を単一の機器または検出方法で検出できる。後記の特に好ましい本発明の側面においては、別個に検出できる化学発光標識を用いる。特異的な化学発光標識は、ルミノメーターにより同一波長の発光光線を異なる期間測定することにより、または同一期間にわたって測定し、数学的方法を用いてシグナルを解析することにより、検出できる。さらに、これらの標識は異なる比活性で存在し、このため広範囲の濃度にわたって分析物を検出するのに必要なルミノメーターダイナミックレンジは小さくなる。ルミノメーターのダイナミックレンジに固有のいかなる制限があっても、単一プローブを用いた場合に可能な範囲より広い濃度範囲にわたって分析物を検出できる本発明方法の能力は制限されない。この拡張した範囲をカバーするために、別個に検出できる標識を用いるからである。
【００６４】
以下の実施例は本発明の幾つかの好ましい態様を示す。
【００６５】
実施例１
核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける検出のダイナミックレンジの拡張  本発明方法はいずれか特定のフォーマットまたは特定の標識タイプの使用に限定されるものではないが、この実施例は化学発光性アクリジニウムエステル標識で標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションアッセイに関する。
【００６６】
混合物中の種々の発光、蛍光および化学発光標識を相互に別個に検出できることについては、これまでに詳細な記載がある。たとえばウッドヘッドらの米国特許第５，６５６，２０７号、およびネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号。後者の参考文献には、特に種々のアクリジニウムエステル（ＡＥ）誘導体を単一アッセイに使用すること、およびそれらを多数のフォーマットにおいて別個に検出できることが記載されている。これらのフォーマットには、異なる波長で発光する化学発光性ＡＥ誘導体を使用すること；発光反応において異なる速度で反応し、それらの標識を反応動態に基づいて別個に検出すること；および異なる反応条件下で（たとえばｐＨ、温度など）反応する標識を使用することが含まれる。
【００６７】
図１Ａ〜１Ｃには、リンカー部分が結合している幾つかのアクリジニウムアリールエステル化合物の構造を示す；これらのアクリジニウムエステル（“ＡＥ”）化合物は下記のように略号による名称で示される：標準−ＡＥ、ナフチル−ＡＥ、ｏ−ＡＥ、１または３−Ｍｅ−ＡＥ、２，７−ｄｉＭｅ−ＡＥ、４，５−ｄｉＭｅ−ＡＥ、ｏ−ｄｉＢｒ−ＡＥ、ｏ−ｄｉＭｅ−ＡＥ、ｍ−ｄｉＭｅ−ＡＥ、ｏ−ＭｅＯ−ＡＥ、ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥ、ｏ−Ｍｅ−ＡＥ、ｏ−Ｆ−ＡＥ、１または３−Ｍｅ−ｏ−Ｆ−ＡＥ、および１または３−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ（これらの化合物の完全な名称は、図１Ａ〜１Ｃの簡単な説明に挙げてある）。これらの名称を本明細書中で用いる場合それらが図１Ａ〜１Ｃに挙げた対応するアクリジニウムアリールエステルを意味することは、理解されるであろう。化合物１−Ｍｅ−ＡＥ、１−Ｍｅ−ｏ−Ｆ−ＡＥ、および１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥはそれらの３−メチル異性体との混合物として存在するが、本明細書中で用いる場合これらの名称が対応する１−および３−メチル誘導体の混合物を意味することは、理解されるであろう。ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥは時には“ｏ−ＭｅＯ（ｃ）−ＡＥ”とも表される。これらの化合物、それらの特性および製造方法は、欧州特許出願第０７０９４６６号に記載されている。これらの用語が化学発光性アクリジニウムエステル化合物自体を意味すること、および図示した、それらが結合しているリンカーは一般に、当技術分野で既知の他のリンカー（たとえばより長い、またはより短い鎖長をもつリンカー）と交換できることは、当業者に自明であろう。
【００６８】
本発明において検出標識を検出する方法を説明するために、前記標識のうち次の３種類を用いた、１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ、１−Ｍｅ−ＡＥ、およびｏ−ＭｅＯ（ｃ）−ＡＥ。これらの化合物が生じるシグナルは、それらの反応動態に基づいて独立して検出できる。図２に示すように、１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥは化学発光反応の開始後、著しく速やかに発光する；１−Ｍｅ−ＡＥはこれより若干遅い反応動態をもち、より緩慢に発光ピークに達し、１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥより長期間にわたって発光する；ｏ−ＭｅＯ（ｃ）−ＡＥはこれら３種類のうち最も遅い反応動態をもち、他の化合物のいずれより長期間にわたって発光する。
【００６９】
図２は、相対光単位（ＲＬＵ）で測定したこれらの化合物それぞれの発光を時間（０．２秒間隔）に対しプロットしたものを示す。化学発光反応はすべての標識化合物を同時にトリガー剤（アルカリ性過酸化水素）と反応させることにより開始された。図２は、１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥからの発光の大部分が最初の半秒の反応で生じることを示す。１−Ｍｅ−ＡＥは０〜３秒の間に発光し、その後生じる追加の発光はごくわずかである；０．５〜３秒間に１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥの発光により生じる干渉はほとんどない。ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥはこの３秒の時点後、少なくとも５秒間は発光し続ける。
【００７０】
これらの標識は、３つの特定時間“ウインドウ”（各標識につき１つのウインドウ）中に発する光を測定することにより、実験で識別される。これらの化合物について好ましい一組のウインドウは以下のとおりである：１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥの検出について０．０〜０．６秒、１−Ｍｅ−ＡＥの検出について１．０〜３．６秒、ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥの検出について４．０〜１０秒。また、各化合物の反応のタイムコースが一定であるから、個々の標識のシグナルを測定するのに用いるウインドウにおいて他の標識から発する光を反復統計計算により推定し、差し引くことができる。２種類の標識について行ったこのような統計計算がネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号に示されている。前記のモデル系３において個々の標識プローブが与えるシグナルの単位の計算に説明したように、当業者は３種類以上の標識から得られるシグナルの分析および補正にこのような計算を採用できる。
【００７１】
実施例２
識別可能な標識を用いた推定シグナルと実験により測定したシグナルとの比較
この実施例では、均一アッセイ法（たとえば米国特許第５，２８３，１７４号に記載されたもの）に用いるのに適した３種類のＡＥ誘導体（１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ、１−Ｍｅ−ＡＥ、およびｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥ）を、化学発光による分析物検出の条件と同じ条件下で識別できることを示す。
【００７２】
１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ標識（標識１）を１０８ＲＬＵ／ｐｍｏｌという比較的高い比活性で用い、これは濃度範囲の下限の分析物の検出に有用である；１−Ｍｅ−ＡＥ標識（標識２）を１０６ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性で用いた；ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥ標識（標識３）は１０４ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性で存在した。そのほか標識およびアッセイプロトコルの詳細を下記の表４に示す。第２および第３標識に付加した実際のＲＬＵ量は、読み取りウインドウそれぞれにおいて１０５ＲＬＵの標識が確実に検出されるように、１０５より若干高かった。読み取りウインドウそれぞれについて、０．２秒間隔で反応速度を測定した。
【００７３】
【表４】
0003550358.tif 000005
【００７４】
表４に述べた加水分解速度はこの実施例に示した均一アッセイ法にのみ重要であり、一般法または本発明組成物には重大ではない。表５に、異なる量のターゲットにつき読み取りウインドウそれぞれにおける各標識について、それらの標識を完全に識別できるという仮定に基づいて計算したシグナルを示す。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
仮定したこの分析を証明するために、これら３種類のアクリジニウムエステル標識それぞれを前記に示した割合で、３０μｌの１０ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．０）および０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１００μｌの１００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．０）、８．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、および３００μｌの６００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１％（ｖ／ｖ）トリトン（ＴＲＩＴＯＮ、登録商標）Ｘ−１００（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を含有する溶液中で混合した。この溶液をルミノメーター（リーダー（ＬＥＡＤＥＲ、登録商標）５０）に入れ、１ｍＭ  ＨＮＯ３中の０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２  ２００μｌを注入し、次いで２００μｌの１．５Ｎ  ＮａＯＨを注入した後、検出した。化学発光反応の開始後、０．２秒間隔で発光を測定した。読み取りウインドウは表４の場合と同じであった。得られた実験結果を表６に示す。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
表６の結果は、標識を混合して別個の検出ウインドウで検出した場合、実際に得られたデータが、比較すると表５の理論値とよく一致することを示す。推定したように、標識１はそれが１０５ＲＬＵのレベルの飽和に達するまで直線的応答を生じた。標識２が生じるシグナルも約１０５ＲＬＵでプラトーに達したので、同様に標識２は０．１ｐｍｏｌのターゲット理論量を検出できる。最後に、標識３から発するシグナルは０．０１〜０．０４ｐｍｏｌのターゲット理論量でバックグラウンドより高くなり、ターゲット量に比例して増加し、１０ｐｍｏｌの最大ターゲット理論量に達した。
【００７９】
この実施例の実験はターゲットの不存在下で、各標識をオリゴヌクレオチドプローブに結合させずに行われた。しかし、プローブがターゲット分析物の異なる領域をそれぞれターゲティングする限り、０．０１〜１０ｐｍｏｌの範囲のターゲット分析物を実際にアッセイする際、これらの結果が各標識を前記の比活性でプローブに結合させた場合に得た結果と類似すると予想されることは、当業者に認識されるであろう。
【００８０】
実施例３
２種類以上の分析物のダイナミックレンジの拡張
多重分析物アッセイ系において２種類以上の分析物の検出のダイナミックレンジを拡張するために、本発明を４種類以上の別個に検出できる標識と連係して採用できる。標識はたとえば放射性、蛍光、化学発光、発色団および酵素結合または基質結合など、いかなるタイプの標識であってもよい。多重分析物アッセイ系の例はこれまでに詳述されている（たとえばウッドヘッドらの米国特許第５，６５６，２０７号、およびネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号）。これらの参考文献には特定の多重分析物アッセイ系が記載されているが、前記の考察で明らかなように、本発明は多様な既知のアッセイ系に採用できると推定される。
【００８１】
多数の分析物の存在を検出するアッセイにおいて、異なる分析物それぞれを検出するために、分析物の異なるターゲット領域に特異的な少なくとも２種類の標識プローブを用いる。分析物それぞれを検出するためのアッセイのダイナミックレンジは、それらの分析物それぞれの異なる領域をターゲティングする少なくとも２種類の標識プローブを用いることにより拡張される。実施例２の場合と同様に、好ましくは識別できる標識で標識した少なくとも２種類のこのようなプローブを用いて、分析物それぞれを検出する。好ましくは、同一分析物をターゲティングするプローブを異なる比活性で標識し、各プローブの量はそのプローブが検出しようとする分析物量範囲の上限に対応する。
【００８２】
この実施例では、２種類の異なる分析物（分析物１および分析物２）に結合する４種類のプローブ（プローブ１、２、３および４と表示）を用いる。プローブ１および２は、分析物１の別個のターゲット領域に特異的に結合する。プローブ１を、標準法により蛍光標識５−カルボキシフルオレセイン（４９２ｎｍで励起、５１８ｎｍで発光）で１０６相対蛍光単位（“ＲＦＵ”）／プローブｐｍｏｌの比活性に標識する。プローブ２を、異なる蛍光標識６−カルボキシローダミン（５１８ｎｍで励起、５４３ｎｍで発光）で同様に標識し、次いで標識していないプローブ２と混合して１０４ＲＦＵ／ｐｍｏｌの最終比活性にする。プローブ３および４はそれぞれ分析物２の別個のターゲット領域に特異的に結合する。プローブ３を、蛍光標識５−（および６−）カルボキシテトラメチルローダミン（５４０ｎｍで励起、５６５ｎｍで発光）で１０６ＲＦＵ／ｐｍｏｌの比活性に標識する。プローブ４を、スルホローダミン１０１酸塩化物（“テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、登録商標）”；５８７ｎｍで励起、６０２ｎｍで発光）で標識し、次いで標識していないプローブ４と混合して１０４ＲＦＵ／ｐｍｏｌの最終比活性にする。この実施例で用いたこれら４種類の標識は、それらの蛍光発光に基づいて独立して識別される。標識プローブの組合わせにおいて識別シグナルが得られる限り、他のタイプの標識もこれらのうちのいずれかと容易に交換できることは、当業者に理解されるであろう。
【００８３】
このアッセイにおいては、プローブを下記に従って混和する：
プローブ        量（ｐｍｏｌ）      発光波長での全ＲＦＵ
プローブ１      ０．１              ５１８ｎｍで１０５
プローブ２      １０                ５４３ｎｍで１０５
プローブ３      ０．１              ５６５ｎｍで１０５
プローブ４      １０                ６０２ｎｍで１０５
一方または両方の分析物を種々の量で含有する試料（すなわち分析物１、分析物２、または分析物１＋２）に、プローブがそれらの分析物ターゲット領域それぞれに結合するのに好ましい条件下で、これらの混合物を接触させる。結合後、当業者が容易に決定できる方法で、結合したプローブを結合していないプローブから識別する工程（たとえば洗浄）を実施する。次いで結合した標識プローブそれぞれの蛍光シグナルを適切な波長で検出する。
【００８４】
分析物それぞれとその特異的プローブが完全に結合したと仮定して、各標識プローブそれぞれについて検出できるシグナルを、試料中の種々の量の分析物（ｐｍｏｌ）につき表７に示す。各プローブについて、バックグラウンドは混合物に添加した全ＲＦＵの０．１％である（すなわち標識当たり１０２ＲＦＵ）。
【００８５】
【表７】
0003550358.tif 000008
【００８６】
この実施例では、各プローブは別個ではそのそれぞれの分析物を３ｌｏｇ濃度にわたって検出でき、１分析物に特異的な組合わせプローブは前記のように分析物を５ｌｏｇ濃度にわたって検出できる。さらに、表７のＲＦＵが示すように、４種類のプローブの組合わせにより両方の分析物を同時にかつ独立して、拡張されたダイナミックレンジの濃度にわたって検出および定量できる。したがって、このタイプのアッセイフォーマットにより、２種類以上の分析物を別個に検出および／または定量でき、分析物それぞれが広い濃度範囲にわたって正確に測定される。
【００８７】
この実施例はすべてのプローブ標識が蛍光標識であるアッセイを記載するが、他の標識または組合わせタイプの標識も同様に使用できることは理解されるであろう。１例においては、プローブ１および２上の標識がそれぞれ５−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシローダミンであり、プローブ３および４上の標識がそれぞれ３Ｈおよび３２Ｐである。前記のアッセイ工程を実施した後、蛍光シグナルを５１８ｎｍおよび５４３ｎｍで測定し、次いで異なる放射性標識を多様な周知の方法で検出および識別する。他の例では、プローブ１および２上の標識がそれぞれ５−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシローダミンであり、プローブ３および４上の標識がアクリジニウムエステル誘導体、たとえばそれぞれｏ−Ｆ−ＡＥおよび２−Ｍｅ−ＡＥである。前記のアッセイ工程を実施した後、蛍光シグナルを５１８ｎｍおよび５４３ｎｍで測定し、次いで２種類の異なるアクリジニウムエステル標識からのシグナルを識別する周知の方法で化学発光を測定する。
【００８８】
異なる識別標識を用いる他の例では、プローブ１および２上の標識がそれぞれアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼであり、プローブ３および４上の標識がそれぞれ５−（および６−）カルボキシテトラメチルローダミンおよびテキサス・レッド（登録商標）である。前記のアッセイ工程を実施した後、適切な酵素基質を添加し、分析物結合したプローブ１および２の標識と反応させる（たとえばアルカリホスファターゼにはリン酸ｐ−ニトロフェニルを供給し、４０５ｎｍでの吸収を測定することにより可溶性最終生成物を測定する；西洋ワサビペルオキシダーゼにはｏ−フェニレンジアミンを供給し、４５０ｎｍでの吸収を測定することにより可溶性最終生成物を測定する）。結合した酵素標識を検出した後、結合したプローブ３および４の蛍光シグナルを５６５ｎｍおよび６０２ｎｍで測定する。前記および表７の情報により示されるように、これらの各例についてプローブを検出するために各プローブに必要な比活性の調整を当業者は容易に決定できる。
【００８９】
４種類の標識プローブの使用について上記に述べたように、当業者は異なる組合わせの標識（たとえば放射性核種、化学発光標識、蛍光標識）を２種類の標識プローブを用いるアッセイに容易に使用できる。すなわち、ダイナミックレンジの拡張された単一分析物検出には、分析物の異なるターゲットを特異的に認識する２種類の識別標識プローブの任意の組合わせを用いて、前記アッセイを行う（たとえばプローブ１と２のみ）。
【００９０】
実施例４
異なるオリゴヌクレオチドプローブを用いるダイナミックレンジ拡張の証明
この例は、本発明の１態様が広範囲の分析物量または濃度にわたって特異的に分析物を検出できることを証明する。試料中の分析物を検出するために、識別標識をもつ２種類の異なるプローブを用いた。その際、分析物濃度は５桁の範囲にわたった。まず、各プローブを独立して解析し、次いでこれらのプローブを単一分析物検出アッセイにおいて組合わせる。
【００９１】
ターゲット分析物としては合成４８塩基ＲＮＡオリゴマーを用いた。ターゲットＲＮＡのオーバーラップしないユニーク領域に相補的な２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（２２ヌクレオチドのプローブ１、および１８ヌクレオチドのプローブ２）を、異なる化学発光標識で標識した。プローブ１はフェニル環のオルト位にフッ素置換基をもつＮ−アクリジニウムフェニルエステル（すなわちｏ−Ｆ−ＡＥ）で標識され、プローブ２はアクリジニウム環の２′位にメチル基をもつＮ−アクリジニウムフェニルエステル（すなわち２−Ｍｅ−ＡＥ）で標識された。フェニル部分の４位にＮＨＳリンカーを含む非置換アクリジニウムエステルは、４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム９−カルボキシレートフルオロスルホネートである。プローブ１および２の両方とも修飾された糖部分を含み、環の２′位が−Ｈ（デオキシリボース）または−ＯＨ（リボース）ではなくメトキシ基で置換されていた。ただし修飾オリゴヌクレオチドの使用は本発明方法にとって重要ではなく、本発明は非修飾オリゴヌクレオチドを用いても実施できる。
【００９２】
ｏ−Ｆ−ＡＥ標識を用いる化学発光反応は２−Ｍｅ−ＡＥ標識の反応と比較して十分に速やかな反応動態をもつので、化学発光を開始する反応の後、生じる発光を規則的間隔で、ある期間にわたって監視することにより、これら２化合物からのシグナルを相互に識別できる。簡単な数学的手法の反復を用いて、２標識から得られる各シグナルをさらに正確に定量できる。これらの方法および代表的な標識は、これまでにウッドヘッドらの米国特許第５，６５６，２０７号およびネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号に詳述されている。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプローブ１および２を、図１Ａ〜１Ｃに示すようにフェニル環に結合したリンカーアームを用いてＡＥ標識に結合させた。リンカーを非ヌクレオチドリンカーによりオリゴヌクレオチドに結合させた。リンカーは、先にアーノルドらの米国特許第５，２８３，１７４号に詳述された方法でオリゴヌクレオチド鎖に取込まれた。この方法では、標識が結合するリンカーアーム部分をオリゴヌクレオチド内の予定位置に合成中に挿入する。オリゴヌクレオチドは周知の固相合成法で合成された（たとえばＢｒｏｗｎ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，“近代的な機械援用オリゴデオキシリボヌクレオチド合成法”、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１））。アクリジニウムエステル誘導体は当技術分野で周知の方法によりプローブのリンカーアームに結合させることができるが、好ましい方法は先にＮｅｌｓｏｎら、“化学発光によるアクリジニウムエステルの検出”、Ｎｏｎ−Ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（アカデミック・プレス、１９９２）、およびアーノルドらの米国特許第５，６５６，７４４号に記載されている。
【００９４】
好ましい方法においては、アクリジニウムのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（“ＮＨＳ”）エステル（たとえば４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム９−カルボキシレートフルオロスルホネート）を、実質的にＷｅｅｋｓら，１９８３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１４７４−１４７８、およびネルソンらの米国特許第５，６５８，７３７号の記載に従って合成する。リンカーアーム：ハイブリダイゼーションプローブ結合体の第一級アミンと選択したＮＨＳ−アクリジニウムエステルとの反応を下記により行う。上記により合成したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ：リンカーアーム結合体を乾燥遠心機（たとえばサバント、スピード−ＶＡＣ（ＳＰＥＥＤ−ＶＡＣ、商標））で真空乾燥させ、次いで５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の０．１２５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）８μｌに溶解する。これに目的とするＮＨＳ−アクリジニウムエステルの２５ｍＭ溶液２μｌを添加し、混合し、３７℃で２０分間インキュベートする。次いでＤＭＳＯ中の２５ｍＭ  ＮＨＳ−アクリジニウムエステル３μｌを溶液に添加し、穏やかに混合し、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２μｌを添加し、混合し、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。ＤＭＳＯ中０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中における０．１２５Ｍ  リシン５μｌと穏やかに混合することにより、反応を停止する。
【００９５】
下記により標識オリゴヌクレオチドを回収する。３０μｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、２４５μｌの水、および５μｌの４０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを添加し、次いで６４０μｌの冷１００％エタノールを添加し、混合し、ドライアイス上で５〜１０分間インキュベートする。沈殿した標識核酸を、冷蔵マイクロ遠心機により標準ローターヘッドを用いて１５，０００ｒｐｍで沈降させる。上清を吸引除去し、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）２０μｌにペレットを再溶解する。
【００９６】
実質的に上記に従ってＡＥ標識に結合させたプローブ１および２を、異なる比活性で用いた。プローブ１をｏ−Ｆ−ＡＥで約７×１０７ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性に標識した。プローブ２を２−Ｍｅ−ＡＥで約１×１０８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性に標識し、次いで非標識プローブ２（後記）と混合してより低い比活性にした。その結果、プローブ１とプローブ２の検出シグナルに約１００倍の差が生じた。
【００９７】
これら２種類の別個のプローブおよび標識の組合わせをアッセイにおいて試験するために、１１ｆｍｏｌの標識プローブ１を種々の量（０．００、０．０１、０．０２、０．０５、０．２０、０．５０、２、５、２０、５０、２００、５００、２０００および５０００ｆｍｏｌ）のターゲットＲＮＡにハイブリダイズさせた。同時に５ｆｍｏｌの標識プローブ２＋１５ｐｍｏｌの非標識プローブ２を、別個の反応混合物中で上記と同一量のターゲットにハイブリダイズさせた。プローブおよびターゲットＲＮＡのほか、ハイブリダイゼーション反応物それぞれ１００μｌが１００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．０）、８．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１．５ｍＭ  ＥＧＴＡを含有していた。これらの反応混合物を５０℃で５０分間インキュベートし、次いで１％（ｖ／ｖ）トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含有する１５０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ８．６）３００μｌを各反応に添加し、混合物を５０℃で１１分間インキュベートした。次いで反応混合物をルミノメーター（リーダー（登録商標）５０）に入れ、２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２および１ｍＭ  ＨＮＯ３を注入し、次いで２００μｌの１．５Ｎ  ＮａＯＨを注入すると、各混合物において化学発光反応が開始した。２回目の注入後、３００〜６５０ｎｍの波長範囲の化学発光を２秒間測定した。
【００９８】
結果を下記の表８に示し、図３Ａおよび３Ｂにｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りのグラフで示す。
【００９９】
【表８】
0003550358.tif 000009
【０１００】
表８および図３Ａの結果が示すように、別個の反応でアッセイすると、プローブ１のｏ−Ｆ−ＡＥ標識は反応物中の分析物量の増加に伴って増加する量の光を発した。この応答は約０．０１〜約５ｆｍｏｌのＲＮＡ分析物では直線的であり、５ｆｍｏｌの分析物を超えると反応はプラトーになり始めた。同様にプローブ２の２−Ｍｅ−ＡＥ標識は反応物中に存在する分析物の量が増加するほど多量の光を発したが、プローブ２の２−Ｍｅ−ＡＥ標識の検出シグナルはプローブ１のｏ−Ｆ−ＡＥ標識のシグナルより１００倍低かった。したがってターゲット結合プローブ２が発する光はより多量の分析物が存在する場合にのみ検出でき、分析物が約２０ｆｍｏｌから約２，０００〜５，０００ｆｍｏｌの範囲で存在する場合は直線応答（図３Ｂ参照）がみられた。これらの実験から、異なる比活性で存在する２標識それぞれについて標準曲線を作成した。
【０１０１】
次いで前記プローブ１およびプローブ２の両方を、それぞれ異なる量のＲＮＡ分析物を含有する別個のハイブリダイゼーション混合物中で結合させた。各反応において、プローブ２の検出シグナルはプローブ１の検出シグナルより約１００倍低かった。１１ｆｍｏｌのｏ−Ｆ−ＡＥ標識プローブ１および５ｆｍｏｌの２−Ｍｅ−ＡＥ標識プローブ２を、実施例４に記載したように、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．０）、８．５％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）、ならびに種々の量のＲＮＡターゲットを含有する反応物１００μｌ中で、１５ｐｍｏｌの非標識プローブ２と混和した。各反応混合物を５０℃で５０分間インキュベートした；次いで１％（ｖ／ｖ）トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含有する１５０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ８．６）３００μｌを各反応物に添加し、これらを５０℃で１１分間インキュベートした。次いで反応物をルミノメーター（リーダー（登録商標）５０）に装入し、各反応物に２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２および１ｍＭ  ＨＮＯ３を注入し、次いで２００μｌの１．５Ｎ  ＮａＯＨを注入することにより、化学発光反応を開始した。次いで化学発光を２秒間測定し、この期間中４０ミリ秒間隔で光を集めた。
【０１０２】
下記により、標識混合物が発したシグナルから各標識が発したシグナルを分離した。先に詳述され（ネルソンら、米国特許第５，６５８，７３７号、２２欄、３７−６５行参照）、下記に略記するように、期間内の２間隔範囲中に発せられた光の和を用いて、粗データを反復数学計算処理した（間隔１〜５および間隔３０〜５０、それぞれ“ＲＬＵ１〜５”および“ＲＬＵ３０〜５０”と略記）。これらの間隔は、化学発光反応開始後の４０ミリ秒間隔の数で表わされる。
【０１０３】
１種類の標識プローブのみを含有する試料をデータ分析の基準として用いた。各基準について、第１の時間間隔中に得られたＲＬＵ値の和と第２の時間間隔中に得られたＲＬＵ値の和との比率を決定した（ΣＲＬＵ３０〜５０／ΣＲＬＵ１〜５）。両方の標識プローブを含有する反応混合物について、間隔３０〜５０のＲＬＵ値の和（ΣＲＬＵ３０〜５０）を２−Ｍｅ−ＡＥ基準について得た比で割った。その結果、２−Ｍｅ−ＡＥ標識プローブが間隔１〜５に与えたＲＬＵ計算量が得られる。この量を間隔１〜５の全ＲＬＵから差し引くと、ｏ−Ｆ−ＡＥがこれらの間隔に与えたＲＬＵ量が得られる。後者の数値にｏ−Ｆ−ＡＥについて得た２期間の基準比を掛けると、ｏ−Ｆ−ＡＥ標識プローブが与えた間隔３０〜５０内のＲＬＵが得られる。この数値を間隔３０〜５０の全ＲＬＵから差し引くと、この間隔に２−Ｍｅ−ＡＥが与えたＲＬＵの補正値が得られる。この数値を用いて、ｏ−Ｆ−ＡＥが間隔３０〜５０に与えたＲＬＵが選ばれた数の有意数値内で変化しなくなるまで、上記の計算を繰り返した。プローブ１および２についてＲＬＵの計算量（“ＲＬＵ出力”）を表９に示す。
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
これらのデータは、本発明方法が分析物のダイナミックレンジを拡張しうることを証明する。図４に示したように、この実験の結果は図３Ａおよび３Ｂにグラフで示した結果を合わせたものに類似する。ここに示した方法、すなわちプローブが同一分析物の異なるターゲット領域に向けられた方法では、単一容器アッセイにおいて少なくとも６ｌｏｇの推定ターゲット濃度にわたって分析物の検出および／または定量ができる。したがって、このアッセイフォーマットは、試料中の分析物濃度が予め分かっていなくても、この拡張された分析物濃度範囲内の分析物を検出または測定に用いることができるだろう。
【０１０６】
同様に図４は、本発明方法により、独立して検出できる標識を異なる比活性で用いると、ルミノメーターの報告範囲内で少なくとも６ｌｏｇの分析物濃度を検出できることを示す。たとえば、独立して検出できる標識に結合したプローブをさらに多数用いることにより、アッセイのダイナミックレンジをさらに拡張できる。ただし選択した計測器のルミノメーター報告範囲内においてである。したがって、用いる計測器または検出方法の最も正確な報告範囲を利用してアッセイを注文設計できる。
【０１０７】
実施例５
同一検出標識で標識した異なるプローブを用いるダイナミックレンジ拡張
この実施例は、同一分析物の異なるターゲット領域に特異的に結合する２種類のプローブを、同一検出標識で、ただし異なる比活性に標識した場合、拡張された濃度範囲の分析物を検出できることを示す。
【０１０８】
この実施例に用いるプローブは２−メトキシ骨格をもつ合成ＤＮＡオリゴマーであり、プローブ３（２２ｍｅｒ）およびプローブ４（１９ｍｅｒ）と表示される。両プローブとも、同一分析物の、ただし別個のオーバーラップしない分析物ターゲット領域に特異的に結合するヌクレオチド塩基配列を含む。分析物は４８塩基からなる合成ＲＮＡオリゴマーであった。プローブ３および４を、実質的に実施例４の記載に従って標準ＡＥで標識した。標識プローブ４を非標識プローブ４と混合して、プローブ３の比活性より低い比活性にした。高い方の比活性をもつプローブ（プローブ３）を低い方の濃度範囲の分析物の検出に用い、低い方の比活性をもつプローブ（プローブ４）を高い方の濃度範囲の分析物の検出に用いた。
【０１０９】
各プローブについて、実質的に実施例４の記載に従い、プローブ３（プローブ４なし）；プローブ４（プローブ３なし）；またはプローブ３と４の組合わせに結合したＲＮＡ分析物を用いて、一連のハイブリダイゼーションおよび化学発光検出反応を行った。反応に添加した分析物の量は、反応当たり０．１、１．０、１０、１００、１，０００、１０，０００および１００，０００ｆｍｏｌであった。各反応条件につき３回の実験を行い、これら３試料から平均ＲＬＵ結果を計算した。分析物を含有しない３つの試験管を用いてバックグラウンドＲＬＵを測定し、これを平均して各実験の平均ＲＬＵ結果から差し引いた。
【０１１０】
反応混合物１００μｌ中に下記量のプローブを用い、実質的に実施例４の記載に従って反応を設定し、プローブ３単独またはプローブ４と組合わせたものを含有する反応に、５０ｆｍｏｌの標識プローブ３を添加；プローブ４単独またはプローブ３と組合わせたものを含有する反応に、５０ｆｍｏｌの標識プローブ４および２０ｆｍｏｌの非標識プローブ４を添加した。これらのハイブリダイゼーション反応物を５９℃で３０分間インキュベートし、次いで１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含有する１５０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ８．７）３００μｌを各試験管に添加し、次いで５９℃で９分間インキュベートした。次いで実質的に実施例４の記載に従って化学発光反応を開始し、検出した。これらの実験の結果を表１０に示す。
【０１１１】
【表１０】
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【０１１２】
表１０の結果を試料中に存在する分析物の関数として、検出されたＲＬＵのｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りのグラフで図５Ａ〜５Ｃに示す。図５Ａには、ターゲットに結合したプローブ３を単独で用いて得た結果を示す。これは約３ｌｏｇの分析物濃度範囲（０．１〜１００ｆｍｏｌ）にわたって明らかに直線応答を示す。図５Ｂには、ターゲットに結合したプローブ４を単独で用いて得た結果を示す。これは約３ｌｏｇの分析物濃度範囲（１０〜１０，０００ｆｍｏｌ）にわたって明らかに直線応答を示す。図５Ｃについては、両プローブがハイブリダイゼーション反応に際し存在した場合、データ点が２つの異なる線上にある。図５Ｃは、同じ検出シグナルを生じ、同一分析物上の異なるターゲット領域に特異的に結合する２種類のプローブを単一反応に用いると、少なくとも５桁の範囲にわたって試料中に存在する分析物の濃度と相関しうる検出シグナルが得られることを示す。したがって、同一標識で、ただし異なる比活性に標識され、この実験に示したフォーマットで用いた異なるプローブの組合わせは、いずれかのプローブを単独で用いた場合に検出されるより拡張された分析物濃度範囲にわたって分析物の存在を検出できる。さらに、プローブの組合わせを用いて、この拡張された範囲にわたって試料中に存在する分析物の量を定量できる。
【０１１３】
以上の実施例は請求の範囲に定義される本発明を説明するものであって、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、多数のアクリジニウムエステル（“ＡＥ”）誘導体の構造を示す。これらは異なる化学発光反応特性をもち、したがってこれらの標識の特定の組合わせを識別標識として使用できる。図示した化合物は以下のものである：図１Ａ、標準−ＡＥ、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ（“ｏ−ＡＥ”）、１−または３−メチル−ＡＥ（“１または３−Ｍｅ−ＡＥ”）、２，７−ジメチル−ＡＥ（“２，７−ｄｉＭｅ−ＡＥ”）、および４，５−ジメチル−ＡＥ（“４，５−ｄｉＭｅ−ＡＥ”）；図１Ｂ、オルト−ジブロモ−ＡＥ（“ｏ−ｄｉＢｒ−ＡＥ”）、オルト−ジメチル−ＡＥ（“ｏ−ｄｉＭｅ−ＡＥ”）、メタ−ジメチル−ＡＥ（“ｍ−ｄｉＭｅ−ＡＥ”）、オルト−メトキシ−ＡＥ（“ｏ−ＭｅＯ−ＡＥ”）、オルト−メトキシ−（シンナミル）−ＡＥ（“ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥ”）、およびオルト−メチル−ＡＥ（“ｏ−Ｍｅ−ＡＥ”）；ならびに図１Ｃ、オルト−フルオロ−ＡＥ（“ｏ−Ｆ−ＡＥ”）、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ（“１または３−Ｍｅ−ｏ−Ｆ−ＡＥ”）、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ（“１または３−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ”）、および２−メチル−ＡＥ（“２−Ｍｅ−ＡＥ”）。
【図２】１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥ（□）、１−Ｍｅ−ＡＥ（◇）、およびｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥ（□）についての発光反応動態のプロットであり（ｙ軸は相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ，“ＲＬＵ”）、ｘ軸は時間間隔（０．２秒））、１−Ｍｅ−ｍ−ｄｉＦ−ＡＥが最も速やかに反応し、次いで１−Ｍｅ−ＡＥが反応し、ｏ−ＭｅＯ（シンナミル）−ＡＥは長期間にわたって反応することを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、同一ターゲットＲＮＡ分析物に対する２種類の、かつ異なる標識をもつオリゴヌクレオチドプローブ（図３Ａはｏ−Ｆ−ＡＥ標識プローブ１（●、〇）、図３Ｂは２−Ｍｅ−ＡＥ標識プローブ２（黒四角、□））から、２つの別個の実験で得た化学発光シグナル（ｙ軸、ｌｏｇＲＬＵ）を、ターゲット量（ｘ軸、ｌｏｇ分析物ｆｍｏｌ）の関数として示すｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りのグラフである。プローブ２（図３Ｂ）は、プローブ１（図３Ａ）のものより１００倍低い比活性で存在した。得られたすべてのデータ点を示すが、最適ラインを計算するためには一部（〇、□）のみを用いた。
【図４】図３Ａおよび３Ｂの場合と同じプローブを用いて得た化学発光シグナルのｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りのグラフであるが、アッセイ全体（同一反応混合物中のプローブと分析物の結合、および化学発光）を同一容器内で実施した。データ点について用いた記号は図３Ａおよび３Ｂの場合と同じである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、同一ターゲットＲＮＡ分析物に対する、同一の化学発光標識で標識した２種類の異なるプローブ（プローブ３および４）を用いて、２つの別個の実験で得た化学発光シグナル（ｙ軸、ｌｏｇＲＬＵ）を、ターゲット量（ｘ軸、ｌｏｇ分析物ｆｍｏｌ）の関数として示すｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りのグラフである。下記を用いた：プローブ３単独（図５Ａ）、プローブ４単独（図５Ｂ）、およびプローブ３と４を一緒に（図５Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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