(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する組成物であって、少なくともサイトカインと腫瘍抗原との組み合わせを発現するように遺伝子工学的に修飾された増殖不能腫瘍細胞を含む組成物。
【請求項２】
上記サイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、インターロイキン−２（IL−２）、腫瘍壊死因子α（TNF−α）、インターロイキン−４（IL−４）およびインターロイキン−６（IL−６）から選択される請求項１の組成物。
【請求項３】
腫瘍治療に使用する組成物であって、少なくとも１つのサイトカイン、補助分子または接着分子を発現するように遺伝子工学的に修飾された増殖不能腫瘍細胞を含む組成物。
【請求項４】
上記腫瘍細胞が黒色腫細胞である請求項２の組成物。
【請求項５】
樹立した腫瘍細胞への哺乳動物の全身性免疫応答を調節することによる上記哺乳動物の上記樹立した腫瘍を逆転する請求項２の組成物。
【請求項６】
上記遺伝子工学的に修飾された腫瘍細胞が顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）を発現する請求項２の組成物。
【請求項７】
増殖不能が細胞照射によってもたらされたものである請求項１の組成物。
【請求項８】
上記遺伝子工学的に修飾された腫瘍細胞がGM−CSFを発現し、上記細胞が第２のサイトカインを発現する請求項６の組成物。
【請求項９】
上記第２のサイトカインがIL−２、TNF−α、IL−４およびIL−６から選択される請求項８の組成物。
【請求項１０】
上記サイトカインがヒト由来である請求項８の組成物。
【請求項１１】
上記遺伝子工学的に修飾された腫瘍細胞がその中に組み込まれたサイトカインをコードする遺伝物質を有し、この細胞はその遺伝物質でコードされたサイトカインをインビボで発現することができる請求項８の組成物。
【請求項１２】
ヒト以外の哺乳動物の腫瘍細胞への免疫応答を強化する方法であって：
上記哺乳動物に少なくとも
ａ）サイトカイン；および
ｂ）腫瘍抗原
の組み合わせを発現するように遺伝子工学的に修飾された増殖不能腫瘍細胞を投与することを含む方法。
【請求項１３】
上記サイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、インターロイキン−２（IL−２）、腫瘍壊死因子α（TNF−α）、インターロイキン−４（IL−４）およびインターロイキン−６（IL−６）から選択される請求項12の方法。
【請求項１４】
上記サイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）である請求項13の方法。
【請求項１５】
上記腫瘍抗原が黒色腫細胞によって発現される請求項12の方法。
【請求項１６】
上記遺伝子工学的に修飾された腫瘍細胞が照射によって増殖不能になる請求項12の方法。
【請求項１７】
上記GM−CSFがヒト由来である請求項14の方法。
【請求項１８】
ヒト以外の哺乳動物の腫瘍細胞への免疫応答を強化する方法であって：
上記哺乳動物に少なくとも
ａ）第１のサイトカイン；および
ｂ）第２のサイトカイン
の組み合わせを発現するように遺伝子工学的に修飾された増殖不能腫瘍細胞を投与することを含む方法。
【請求項１９】
上記第１のサイトカインおよび上記第２のサイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、インターロイキン−２（IL−２）、腫瘍壊死因子α（TNF−α）、インターロイキン−４（IL−４）およびインターロイキン−６（IL−６）から選択される請求項18の方法。
【請求項２０】
上記第１のサイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）であり、上記第２のサイトカインがインターロイキン−２（IL−２）である請求項19の方法。
【発明の詳細な説明】
関連した出願の前後参照
これは1991年10月４日に提出された米国出願第07/771,194号の継続出願であり、その開示内容は参考文献として本明細書中に取り入れる。
発明の分野
本発明は、関連する側面すべてにおいて、標的抗原または抗原に対する個人の免疫応答を変化させる方法に関する。より具体的には、本発明は、個人の免疫応答を増加させるまたは減少させるように、標的抗原および少なくとも１つのサイトカインを同時に投与することに関するものである。可能な抗原としては腫瘍細胞、腫瘍細胞抗原、感染性薬品、外来抗原、または非外来性の化合物が含まれる。また発明は、抗原およびサイトカインを同時に投与する方法および組み合わせにも関するものである。
発明の背景
免疫体系は、感染、自己免疫、異系移植の拒絶、および腫瘍を含む広い範囲の重要な病気および状態の病原性に重要な役割を担っている。これらの不調において免疫体系の過ちは、広い意味で、有害な標的に対して十分に強力な応答ができないため、または望ましい標的に対して不適切に有害な応答をするためであると考えられる。化学療法、手術、および放射線療法を含むこれらの病気に対する標準的な医学的処置は、効率および毒性の両方に関して明らかに限界がある。病気または状態を回避することが理想であるが、典型的にはこれらの方法はほとんど成功したことがない。免疫応答を特別に細工することを基礎とした新しい方法が大いに必要とされている。
先の技術の記載
読者が便利なように、テキストで参照される参考文献は数字で括弧にいれて表した。これらの数字は、添えられた文献の中に数字で書かれた参考文献に相当する。これらの参考文献を通して、これらは明白に参考文献として本明細書中に取り入れる。
抗腫瘍免疫を昂進させるワクチンとしてがん細胞を利用することは今世紀を通じて開発された（１）。しかし、普通、がん細胞の免疫原性は病気に打ち勝つのに十分な明白な免疫反応を引き出すには弱すぎる。これらの未熟なワクチンに対する強い応答は普通部分的かまたは比較的一時的である。BCGおよびコリネバクテリウムパルバムのような非特異的免疫刺激剤を使用することを含む、このような予防接種の効能を改良する試みはほとんど進歩が見られなかった。
１つの方法は細胞を異なる方法で処理する事によって腫瘍細胞の免疫原性を増加させることであった。たとえば米国特許第4,931,275号は圧力、コレステリルヘムスクシネート、細胞膜、または自細胞の膜蛋白質で処理した細胞をワクチンとして用いることを記載している。これらの方法は抗原の免疫原性をより強くするために表面抗原の露出を促進とする試みである。
もう１つの方法はサイトカインと免疫体系の相互作用に焦点をあてている。サイトカインおよびサイトカインの組み合わせは免疫体系の刺激に重要な役割を果していることが示されている。たとえば米国特許第5,098,702号では、存在する腫瘍と闘うのに相乗的に効果的な量のTNF、IL−２、およびIFN−βの組み合わせを用いると記載している。米国特許第5,078,996号では、腫瘍をもつ患者を処置するのに、組み変えGM−CSFを注入する事によってマクロファージの非特異的腫瘍活性の活性化させることを記載している。
この方法をさらに発展させたものとして、腫瘍形成に関わるサイトカインの影響を評価するために遺伝学的に修飾した腫瘍細胞を用いるものがある。腫瘍発生に影響を与えるのに必要なサイトカインの量はたいてい全身に有害であるため、患者を直接処置することは適していないことが多い。（例えば（２）および（３）を参照）。従って、サイトカイン伝達の別の方法が発展してきている。遺伝学的に修飾された細胞で伝達することによってある種のサイトカインを局所的に高濃度にすると腫瘍の退行をひきおこすことが示されている（4,5）。このように、ネズミ腫瘍細胞をいろいろなサイトカイン遺伝子で形質導入することによって、同系の宿主による遺伝学的に修飾された細胞の拒絶が引き起こされることが示されている。例えば、マウスに注入された悪性のマウス神経芽腫細胞の増殖は、γ−IFNを恒常的に高発現させた細胞では強く抑圧された（4,6）。IL−４を発現している乳腺がん腫瘍細胞をいろいろなトランスフェクトしていない腫瘍細胞と混ぜて注入することによって、すべてのタイプの腫瘍形成が阻害または妨げられた（７）。似たような結果がIL−２（8,9）、TNF−α（2,10,11）、Ｇ−CSF（12）、JE（13）、およびIL−７（14）でも見られた。
また他の方法として遺伝学的に修飾された腫瘍細胞をワクチンとして使用するというものがある。IL−２を発現している腫瘍細胞を注入すると、第１に腫瘍形成を抑圧するだけでなく、一時的な全身の免疫をも付与する。このようにしてマウスは次に起こる腫瘍細胞の攻撃を拒絶するようになる（８）。例えば、マウスはワクチン注入後２週間では腫瘍細胞を拒絶することはできたが、４週間後はできなかった（８）。最初にワクチンを注入して２週間後、他の腫瘍細胞は普通に増殖しているという点でこの免疫は腫瘍特異的である。似た結果がTNF−αにおいてもみられた。すなわち、最初の腫瘍拒否反応を経験した動物は２週間後に攻撃を受け、少なくとも40日間は新しい腫瘍を作らなかった（２）。IFN−γではいくらか長い全身の免疫が見られる。即ち腫瘍細胞を産生するIFN−γを予防接種したマウスでは注入後６週間に修飾されていない腫瘍細胞を拒絶することができた。
ワクチンの最も望ましい特徴である、以前に成長している腫瘍を攻撃する免疫システムを刺激するワクチンの効能はそれほど明白ではない。IL−４、IFN−γ、およびIL−２に関しては、サイトカインを産生する腫瘍細胞を注入しても、動物の異なる部位において修飾されていない腫瘍細胞の増殖に影響を与えなかった。修飾されていない腫瘍細胞または、腫瘍細胞を産生する修飾されたサイトカインを同時に注入した細胞はすでに確立された腫瘍かどうかは証明されていない（それぞれ7,4,9および８）。最近の１つの例としては、IL−４を分泌するように作製された腫瘍細胞が、確立された腎臓がん細胞を拒絶することに成功した（15）。
これらの研究は抗腫瘍免疫を昂進させる方法として遺伝子変換を可能なかぎり利用することを指示するであろうが、これらのシステムには多くの問題がある。まず最初に、既に存在するがんを処置することは研究の最初の目的の１つである。この方法でワクチンは非常に重要であるが、例えば特に前癌性の患者において、またはある個人が決まった癌になるような場合（AIDS患者のような）は、全身に存在する癌を処置できるかどうかが特に興味となる。もう１つの問題点は、ワクチンの効能が比較的短時間であることである；即ち、一般的にこれらのワクチンは予防接種後２から６週間以下の腫瘍の攻撃に対してのみ有効である。
またサイトカインを発現するように作製する事によってこのような免疫が誘導されるメカニズムは目下不明である。たとえば現在までのところ、どんな遺伝子変換の研究を行っても、このような生きたワクチンの効能を、単に何も導入していない細胞で宿主を予防接種することによって促進されたり、γ照射または他の方法によって、または移植の後手術で除去された何も導入していない細胞によって不活性化される免疫応答になぞらえるこはできない。これは非常に重要なことであろう。なぜなら、このような予防接種計画のみで強力な抗腫瘍免疫を刺激することができることを多量の文献が示しているからである（16,17,18,19）。
発明の要約
本発明は、ある種のサイトカインおよびサイトカインの組み合わせを発現している腫瘍細胞がこれらの細胞の注入を受けた個人に対して長期間の特異的な全身の免疫を付与するという決定に基づくものである。この発見により、本発明は、有用な抗原に対する個人の免疫応答の、刺激的または抑圧的な方法での調節を提供する。本発明の方法は、治療上の実用法ばかりでなく予防的な目的にも有用である。即ち、腫瘍の発生または進行、AIDSのような細菌またはウイルスの感染、移植組織の拒否反応、または自己免疫状態から個人を守るのに有用である。本発明はまた、確立された腫瘍のような既に存在する腫瘍、状態、または病気の反転または抑圧、AIDSのような細菌またはウイルスの感染、移植された組織の拒否反応、または自己免疫応答において有用性を見いだすだろう。加えて本発明は、他の細菌、真菌、ウイルス、寄生虫および原生動物の感染ばかりでなくAIDSに関する２次感染のような慢性性の、および生命を脅かす感染の処理に有用性を見いだす。本発明の特に有利なことは、個人における効果を最大にし、理想的な結果を最大限に活用するために、サイトカインを選択できる点にある。
本発明の１つの側面として、標的抗原に対する個人の免疫応答を調節する方法が示されている。標的抗原および少なくとも１つのサイトカイン、接着または補助分子、またはその組み合わせを、全身の免疫応答が存在するような形で個人に同時に投与する事によって、調節することができる。抗原およびサイトカイン、接着または補助分子、またはその組み合わせは、全身の免疫応答を引き起こす治療上効果的な量を同時に投与する。
本発明のもう１つの側面は、そのままでまたは遺伝学的操作の結果、標的抗原に対する免疫応答が調節できるように個人に投与されるべき標的抗原および少なくとも２つのサイトカインを発現する細胞を利用するという点にある。例えば促進された免疫応答が理想的であるようなタイプの腫瘍細胞を、投与されたサイトカインが発現されるように作製することができる。結果的に遺伝学的に作製された腫瘍細胞は、さらなる腫瘍細胞の発生を防ぐようにワクチンとして使用されるか、または既に存在する腫瘍を反転させるために伝達小胞として使用される。
本発明の特別な点はGM−CSFおよびIL−２という２つのサイトカインを発現する腫瘍細胞を用いる点、および修飾される腫瘍細胞としてメラノーマ細胞を用いるという点にある。
本発明の別の側面は、個人に投与される以前に照射されているかまたは増殖不能となっていて、サイトカインを発現する修飾された腫瘍細胞を用いる点にある。これらの照射された修飾された細胞は治療上効果的な量投与される。これらの細胞を投与する事によって、刺激するような形でまたは抑圧するような形で、個人の全身の免疫応答を調節することができる。GM−CSFを発現する細胞、特にGM−CSFを発現するメラノーマ細胞はとりわけ有用である。GM−CSF、IL−４、IL−６、CD2およびICAMを発現する照射された腫瘍細胞は本発明において有用である。
本発明の別の側面は、存在する以前の腫瘍を反転または抑圧するためのサイトカインを発現する修飾された腫瘍細胞を使用することにある。腫瘍細胞は２つのサイトカイン、例えばIL−２およびGM−CSF、または３つのサイトカイン、例えばIL−２、GM−CSFおよびTNF−αを発現しているであろう。３番目のサイトカインはIL−４、CD−２またはICAMかもしれない。腫瘍細胞はまた投与される以前に照射されているかまたは増殖不能となっているであろう。
本発明は別の点で、サイトカインを発現する腫瘍細胞を遺伝学的に作製するために、レトロウイルスベクターを用いた点に触れている。本発明は１つのサイトカインをコードするレトロウイルスベクターによって腫瘍細胞を１つだけ感染させる方法、または異なるいくつかのサイトカインをコードするレトロウイルスベクターによって複数感染させる方法を利用している。
いくつかのレトロウイルスベクターを用いている。1991年10月31日（PCT/US91/08121、1991年10月31日提出）に提出された米国出願第07/786,015ではMFG、α−SGC、pLJ、およびpEmベクターをより取り入れている。参考文献として本明細書中で取り入れられており、本発明で特に利用されていることがわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に有用な組み換えレトロウイルスベクターの概略図を表す。図1AはMFGベクターの詳細絵図を示す。図1BはpLJベクターを示す。図1CはpEmベクターを示す。図1Dはα−SGCベクターを示す。
図2:
図2Aは、予防接種後さまざまな時間における野生型B16メラノーマ細胞による二次攻撃に対する、IL−２を発現するB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。
図2Bは、予防接種後の、野生型B16メラノーマ細胞による二次攻撃に対する、IL−２および第２のサイトカイン（示されている）を発現するB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図2Cは、野生型B16メラノーマ細胞による二次攻撃に対する、IL−２およびGM−CSF並びに第３のサイトカイン（示されている）を発現するB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。
図3:
図3Aは、野生型B16メラノーマ細胞による攻撃に対する、GM−CSFを発現する、放射線照射されたB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図3Bは、様々な量の、若しくは形質導入されていないB16メラノーマ細胞と混合したときの野生型B16メラノーマ細胞による攻撃に対する、GM−CSFを発現する、放射線照射されたB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図3Cは、GM−CSFを発現する、放射線照射されたB16メラノーマ細胞が、示されたような形質導入されていないB16メラノーマの生細胞（予め確立された腫瘍）を接種した後の免疫反応を増大させる能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図４は、野生型B16メラノーマ細胞による二次攻撃に対する、サイトカイン（示されている）を発現する、放射線照射されたB16メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図５は、B16メラノーマを予防接種した部位の組織学的分析を写真で表す。図5Aは、放射線照射され、GM−CSFを形質導入された腫瘍を予防接種した部位を示す。図5Bは、放射線照射され、形質導入されていない腫瘍を予防接種した部位を示す。図5Cは、放射線照射され、GM−CSFを形質導入された腫瘍の予防接種からの放出しているリンパ節を示す。図5Dは、放射線照射され、形質導入されていない腫瘍の予防接種からの放出しているリンパ節を示す。図5Eは、放射線照射され、GM−CSFを形質導入された腫瘍細胞で予防接種されたマウスの攻撃部位を示す。図5Fは、放射線照射され、形質導入されていない腫瘍細胞で予防接種されたマウスの攻撃部位を示す。図5Gは、予防接種を受けていないマウスにおける攻撃部位を示す。
図6:
図6Aは、放射線照射され、GM−CSFを形質導入されたB16メラノーマ細胞により生じた全身性免疫にリンパ球の一部が寄与することを、グラフで表す。
図6Bは、種々の効果器：標的比でガンマ−インターフェロン処理したB16標的細胞における、４時間後での51Cr放出アッセイにより決定された、CD8をブロックしうるCTL活性をグラフで表す。GM−CSF形質導入された若しくは形質導入されていない、放射線照射されたB16細胞を用いた予防接種後14日目に脾臓細胞を回収し、ガンマ−インターフェロン処理したB16細胞で５日間in vitroで刺激した。
図７は、以前のサイトカイントランスフェクション研究に使用された、放射線照射され、形質転換されていないマウス腫瘍細胞の抗原性をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
図８は、放射線照射された、示されたタイプの腫瘍細胞のGM−CSFが全身性免疫を高める能力を、形質導入されていない放射線照射された腫瘍細胞と比較して、グラフで表す。
図９は、IL−２、MG−CSFおよび示されているような第３のサイトカインを発現するB16メラノーマ細胞が、予め存在している腫瘍に及ぼす効果をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号●は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。
定義
本明細書中で“免疫反応を調節する”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、免疫反応に関わるいかなる細胞におけるいかなる変更である。本定義により意味されることは、細胞数の増加もしくは減少、細胞活性の増加もしくは減少、または免疫系内で起こりうる他のいかなる変化も含まれる。細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹枝状細胞（dendritic cell）もしくは好中球であってもよいが、それだけに制限されるわけではない。本定義には、有害な標的に対して十分強力な反応を展開させるために免疫系を刺激し若しくは高めることと共に、望ましい標的に対する破壊的な反応を避けるために免疫系を抑制することも含められる。免疫系を刺激する場合には、本定義は二次腫瘍攻撃に対する将来的な防御を含む。
本明細書中で“サイトカイン”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されるところは、免疫系の細胞からの一般的なクラスのホルモン、リンホカインおよびモノカインの両方、並びにその他である。本定義により意味されることは、局所的に作用し血液中を循環しないホルモンで、本発明に従って使用した場合、個体の免疫反応の変更をもたらすものが含まれるが、それだけに制限されるわけではない。サイトカインはIL−２、IL−４、IL−６、IL−７、GM−CSF、γ−IFN、TNF−α、CD2若しくはICAMであってもよいが、それだけに制限されるわけではない。さらに、ヒト型のIL−２、GM−CSF、TNF−αおよびその他に実質的に相同な、他の哺乳動物のサイトカインは、免疫系に同様の活性を表すことが示されている場合、本発明において有用であろう。同様に、特定のサイトカインのいずれかに実質的に類似しているが、蛋白質配列に比較的小さな変化を有す蛋白質も、本発明において用途を見出だすことだろう。蛋白質配列におけるある種の小さな変更を、その蛋白質分子の機能面の能力を妨げずに可能とすることができることはよく知られており、従って、本発明でサイトカインとして機能するが現在知られている配列と微妙に異なる蛋白質を作製することができる。最終的に、本出願における単数形もしくは複数形での“サイトカイン”という単語の使用は、断定的なものではなく、本発明および特許請求の範囲の解釈に制限されるべきではない。サイトカインに加え、接着分子、補助分子（accessory molecule）若しくはその組み合わせを、単独で、もしくはサイトカインと組み合わせて使用してもよい。
本明細書中で“腫瘍細胞からの抗原”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、免疫反応を引き出すことのできるいかなる蛋白質、炭水化物もしくは他の構成要素である。本定義により意味されることには、原形質膜、細胞表面もしくは膜から精製された蛋白質、または細胞表面に結合した独特な炭水化物分子の部分などの、細胞体から分離される構成要素のいずれかの他に、付随する抗原すべてと共に腫瘍細胞全体を抗原として使用することが含まれる。本定義には、対象となる細胞に特殊な処理を必要とする、細胞表面からの抗原も含まれる。
本明細書中で“全身性免疫反応”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、局所的でなく、個体全体に影響を及ぼし、従って同じ刺激に対して特異的な二次反応を可能にする免疫反応である。
本明細書中で“共投与”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、標的抗原および選択されたサイトカイン（群）が本質的に同時に個体の免疫系に行き当たるプロセスである。構成要素は同じ投与手段（vehicle）により投与される必要はない。それらが２つの独立した手段で投与される場合は、時間的にも投与経路的にも十分近くに投与され、求める特異性を達成するために、個体の免疫系に本質的に同時に行き当たるようにしなければならない。
本明細書中で“確立された腫瘍の逆転（reversal of an established tumor）”という用語もしくはそれと文法的に同等の用語により意味されることは、予め存在している腫瘍の抑制、退行、部分的若しくは完全な消滅である。本定義により意味されることは、予め存在している腫瘍の大きさ、効力、増殖速度、外見もしくは感触のいずれかにおける軽減が含まれる。
本明細書中で“治療に有効な量”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語によって述べられることは、個体の全身性免疫反応を刺激もしくは抑制のいずれかによって調節するのに十分な調製品の量である。この量は、異なる個体、異なる腫瘍タイプおよび異なるサイトカイン調製品について異なっていてもよい。
本明細書中で“拒絶”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、新たな腫瘍増殖の確立を許さない全身性免疫反応である。
本明細書中で“攻撃（challenge）”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語によって意味されることは、後に続いて（二次的に）腫瘍細胞を個体に導入することである。従って“予防接種後５日目の攻撃用量”とは、サイトカインを発現する腫瘍細胞もしくは放射線照射された腫瘍細胞、またはその両方による予防接種後５日目に、一服の非改変腫瘍細胞を投与したということを意味する。“攻撃腫瘍”とは、そのような攻撃から生じた腫瘍を意味する。
本明細書中で“死亡までの日数”という用語若しくはそれと文法的に同等な用語により意味されることは、マウスが死亡する前の期間である。一般的に、攻撃腫瘍の長径が２−３センチメートルに達するか、または深刻な潰瘍もしくは出血が発生した場合に、マウスは死亡した。
本明細書中で“放射線照射された細胞”若しくは“不活化された細胞”という用語またはそれらと文法的に同等な用語により意味されることは、放射線照射によって細胞を増殖不能にすることにより不活化された細胞である。この処理により、体細胞分裂を行うことができないがサイトカインなどの蛋白質を発現する能力は保持している細胞が生じる。放射線量は約30,000ラドまで許容され得るが、典型的には最小放射線量は約3500ラドで十分である。放射線照射は細胞不活化の１つのやり方だが、細胞分裂はできないがサイトカインを発現する能力は保持している細胞を生み出す、他の不活化法は本発明に含まれる。
本明細書中で“個体”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語によって意味されることは、哺乳動物のいずれかの個体である。
預託の記載
1991年10月３日、出願者はファクターVIII挿入物を持つMFGプラスミド（本明細書中でATCCアクセス番号68726にて記載）、tPA挿入物を持つMFGプラスミド（ATCCアクセス番号68727を与えられる）、本明細書で記載されるファクターVIII挿入物を持つα−SGCプラスミド（ATCCアクセス番号68728を与えられる）およびtPA挿入物を持つα−SGCプラスミド（ATCCアクセス番号68729を与えられる）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、ロックビレ、メリーランド州、USAに預託した。1991年10月９日、出願者は本明細書中で記載されるMFGプラスミド（ATCCアクセス番号68754を与えられる）、および本明細書で記載されるα−SGCプラスミド（ATCCアクセス番号68755を与えられる）をATCCに預託した。これらの預託は、特許手続きを目的とした微生物の預託に関する国際的認識に基づくブタペスト条約の条項およびその（ブタペスト条約下の）規定のもとでなされた。これにより、預託日から30年間、成育可能なカルチャーの維持が保証される。生物はATCCによりブタペスト条約の条件の下で入手可能とされ、関連のある米国特許の発行に際して無制限の有用性を保証する出願者とATCC間での同意の対象となるであろう。預託された株の有用性は、特許法に従ったいずれの政府の権威の下でも、保証された権利に矛盾して本発明を実施する許可証として解釈されるわけではない。
発明の詳細な説明
本発明は、標的抗原（群）およびサイトカイン（群）を、個体の免疫系を刺激もしくは抑制するような様式で投与することにより、個体の標的抗原に対する免疫反応を調節する方法に関する。免疫系の刺激もしくは抑制のいずれの場合においても、本発明は、サイトカイン活性を制御することでサイトカインが尋常でない防御効果もしくは治療効果を提供する成果を生じるための手段を提供する。
本発明のある態様においては、標的抗原および１つ若しくはそれ以上のサイトカイン、接着分子、補助分子またはそれらの組み合わせが、標的抗原と直接くっつけられて、若しくは組み合わせられた化学的構成物（サイトカイン、接着分子、補助分子もしくはそれらの組み合わせの輸送若しくは放出を提供する）として個体に投与される。２つの構成要素は同じ手段によって投与される必要はない。それらが２つの独立した手段で投与される場合、それらが本質的に同時に個体の免疫系に行き当たるのに、時間的にも投与経路的にも十分近くに投与されなければならない。即ち、サイトカイン、接着分子、補助分子もしくはそれらの組み合わせは、調節されるべき免疫反応に関連した標的抗原と共に、サイトカインの輸送もしくは配送を提供するいずれの様式によっても、標的抗原と共に共投与されることができる。このことは、例えば、ゆっくりとした若しくは持続的な放出配送系、または直接注射を用いることによって達成することができる。この共投与の結果、非特異的なサイトカインが、標的抗原に対する特定の免疫反応を増幅もしくは変更するという、特異的な効果を持つ。強調されるべきは、サイトカインおよび抗原の同時提示を生理学的に出現したものと模倣させる、サイトカインと標的抗原との局所的な相互作用であり、これにより効力が最大限にされ、毒性が最小限にされる。
好ましい態様においては、腫瘍細胞などの標的抗原を発現する細胞は、それ自身に遺伝子工学を施し、投与されるべきサイトカインを発現するようにされる。生じた改変腫瘍細胞は、免疫反応が求められる抗原だけでなく、サイトカイン、接着分子、補助分子もしくはその組み合わせ（その発現は生じる免疫反応のタイプおよび程度を決定する）を、宿主の免疫系に提示する。または、標的抗原およびサイトカインを天然に発現する細胞を、招来の腫瘍発達に対する防御のためのワクチンとして使用する、または以前から存在している腫瘍の逆転をもたらす配送手段として使用することが可能である。逆に、免疫反応の減少が求められる標的抗原を適当なサイトカイン混合物と共に使用することができる。
ある態様においては、個体の全身性免疫反応を、共投与される分子がない場合に起こり得るものより増大もしくは上昇させる。全身性反応は、腫瘍細胞などの標的抗原を個体が拒絶するのに十分なものである。
別の態様においては、移植された細胞若しくは組織上の抗原などの標的抗原、または異物と誤って認識された個体中の細胞が、個体によって拒絶されない、もしくは本発明が用いられない場合に生じる拒絶よりも程度の低いものとなるように、個体の全身性免疫反応を、部分的もしくは完全に、減少もしくは抑制する。
本発明のある態様においては、標的抗原は、免疫反応の上昇が望まれる腫瘍細胞、腫瘍細胞抗原、感染性病原体もしくは他の外来性病原体であってもよい。例えば、AIDSウイルス若しくはAIDSに伴う第２感染症などの慢性的かつ生命を脅かす感染症の進行に関する抗原、または他の細菌性、真菌性、ウイルス性、寄生生物および原生動物の抗原を、本発明に利用してもよい。
好ましい態様においては、標的抗原は腫瘍細胞である。好ましい態様はメラノーマ細胞を利用するが、乳癌細胞、白血病細胞、癌性ポリープもしくは前新生物性患部などの（但し、これらに限られるわけではない）他の腫瘍細胞、または癌遺伝子（例、ras、p53）を発現するようにした細胞も使用することができる。改変された細胞は、生きている若しくは放射線照射された細胞、または他の手段によって不活化された細胞であってもよい。さらに、標的抗原として使用され、サイトカインを発現する腫瘍細胞は、選択されていない細胞集団であってもよいし、若しくは改変細胞の特定のクローンであってもよい。
好ましい態様においては、腫瘍細胞は改変されて、サイトカインIL−２およびGM−CSFを発現するようになる。この組み合わせは、野生型腫瘍細胞による二次攻撃に対して長期的な全身性免疫防御を生み出すので、特に望ましい。
本発明のある態様においては、標的抗原およびサイトカインを発現する腫瘍細胞は、個体に投与される前に、放射線照射される。生じた成育できない細胞を用いて、個体の免疫反応を調節することができる。そのような放射線照射され、サイトカインを生産する腫瘍細胞の投与は、恐らくワクチンのような機構によって、同じタイプの腫瘍の確立を阻害するのに有用であることが示されている。この操作は、腫瘍を生じる、生きている癌細胞の個体への導入が望ましくないので、特に重要性がある。初代の腫瘍外植体が新生物でない要素も含んでいる可能性があり、予防接種前の腫瘍試料の放射線照射は、自身の増殖因子を自己分泌合成することにより誘導される新生物でない細胞の自立的な増殖の可能性も防ぐので、このことはさらに有意性を持つ。
好ましい態様においては、個体の免疫反応を調節するのに用いられる、放射線照射された腫瘍細胞は、GM−CSF、IL−４、IL−６、CD2若しくはICAM、またはそれらの組み合わせを発現することができる。
最も好ましい態様においては、個体の免疫反応を調節するのに用いられる、放射線照射された腫瘍細胞は、GM−CSFを発現することができる。
ある態様においては、標的抗原およびサイトカインの組み合わせの投与は、確立された腫瘍の逆転に用いることができる。これは、予め存在している腫瘍を持つ個体から腫瘍細胞を採取し、これらの腫瘍細胞をサイトカインを発現するように改変することによって達成することができる。次いで改変された細胞を個体に再導入すると、予め存在している腫瘍を逆転することができる全身性免疫反応が生じる。または、予め存在している癌のタイプの腫瘍細胞を、他のソース（source）から得ることができる。発現されるべきサイトカインの同定は、腫瘍のタイプ、および他の要因に依存するであろう。
本発明の好ましい態様においては、腫瘍細胞は、IL−２およびGM−CSF、ならびにTNF−α、IL−４、CD2およびICAMのグループからの第３のサイトカインを発現する。
最も好ましい態様においては、腫瘍細胞は、IL−２、GM−CSFおよび／若しくはTNF−αを発現する。
別の態様においては、確立された腫瘍の逆転に用いられる改変腫瘍細胞は、個体への投与に先立って放射線照射される。
好ましい実施態様において、慢性腫瘍を転換するために用いられる放射線処理された腫瘍細胞は、GM−CSFを発現する能力を有する。
本発明の一つの実施態様において、ここで記載されるようなレトロウイルスのMFGベクターのようなベクターを、ワクチン細胞を遺伝学的に改質するために用いることができる。MFGベクターは、特殊な効用を有し、それはまず第１に系統的な免疫世代に影響を与える数多くの潜在的免疫調整剤を素速くふるい分け、そして複雑に組み合わさった分子の活動を評価するに適化するという効用である。MFGベクターの高い力価及び高い遺伝子発現を組み合わせることで、数多くの対象群からの形質転換細胞の選択が不要となる。この事は、ワクチン接種する以前の第１腫瘍細胞の培養に要する時間を最小にし、ワクチン接種材料中の抗原異質性の発現を最大にする。
本発明において、他のレトロウイルスのベクター類も又有効である。例えば、pLJ、pEm、及びαSGCである。（20）で記載されるpLJは、２つの型の遺伝子：対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型選択マーカー遺伝子、を発現することができる。PLJの構造を図（1B）に示す。pEmは、単独のベクター（ここで、対象となる遺伝子を、野生型ウィルス配列にコードするgag、pol、envsに置き換えることができる）である。pEmの構造を、図（1C）に示す。α−SGCは、対象遺伝子の発現を整えるために、α−グロビン遺伝子からの転写アクセプター配列を用いる。α−SGCの構造を図（1D）に示す。
これらの結果から、本発明におけるさまざまなサイトカイン類の用途が見い出された。例えば、本発明において、ヒト型IL−２、GM−CSF、TNF−αなどにかなり類似する他の哺乳動物のサイトカインは有効である（ただし免疫組織において同様の作用が示された場合）。さらに本発明において、ある特定のサイトカインにかなり類似するが、比較的小規模な蛋白質変化を有する蛋白質類の有用性が見いだされた。蛋白質分子の機能的作用を妨げることなく、蛋白質配列上で、いくつかの小さな改質は可能であることは公知であり、そしてこのようにして蛋白質類は、本発明におけるサイトカインと同様であるが、現在知られている配列とは若干異なるそのような機能を有効にする。
本発明の方法は、化学療法、放射線療法及び他の生物学的応答改質剤などの他の全身的療法と組み合わされた、抗原及びサイトカイン類、付着剤又は補足的な分子類或いはそれらの組み合わせによる治療を含むことができる。
更に本発明の方法は、さまざまな抗原に対する個別の全身的免疫応答も含むことができる。一つの実施態様においては、本発明は、慢性及び例えばエイズウィルス感染並びにエイズをともなった２次感染などの生命を脅かすような症状の治療に用いることができる。別の実施態様は、他の細菌、真菌、ウィルス、寄生虫及び原虫の感染を含む。
好ましい実施態様において、HIV関連症状の治療及び保護が達成された。例えば、ヒトの免疫不全ウィルス（HIV）、シミアン免疫不全ウィルス（SIV）の場合などは、少なくとも６つの公知標的抗原（21、22、23）が存在するが、本発明を用いることによりそれらウィルスに対する免疫応答が増大する。HIV標的抗原を発現する適切な宿主細胞は、一つ又はそれ以上のサイトカインを発現するまでに改質することができ、非感染個体にもワクチンとして投与することができ、及び免疫反応を引き出し増大し後のエイズによる感染に対する抵抗性を増大することができる。あるいは抗原及びサイトカインは、宿主細胞を用いることなく投与することができる。更に、HIV陽性個体に対し、現感染を抑制し又はそれに抵抗するために、標的抗原及びサイトカインを併用投与することができる。
標的抗原に対する系統的免疫応答を調整するために本発明において用いられる特定の方法を記述し、またこれらの方法をどのように応用するかを詳細し、及び全身的免疫応答の成功調整法を示したが、本発明の発見は、一般的に入手可能な技法を用いての同様の方法による最終結果を生み出すこれらの経験を用いた一つの優れた技術を得るに充分である。
下記の実施例は、上記発明の製造方法及び用途をより完全に記載するものであり、また本発明のさまざまな見地を実施する最善の態様を示すものである。これらの実施例は、本発明の実際の範囲を制限するものではなく、詳細な説明のためのものである。
【実施例】
実施例1:サイトカインをコード化する組換えレトロウイルスゲノムの製造
レトロウイルスベクターの製造には、標準の結紮及び公知技法である制限法を用いた。対象のサイトカインをコード化する遺伝子又は遺伝子類を含む各種レトロウイルスベクターを用いた。
MGF:このベクターは、共に特許出願中の、U.S.S.N.07/607,252（1990年10月31日書簡の表題”内皮細胞の遺伝学的改質（Genetic Modification of Endothelial Cells））、U.S.S.N 07/786,015（1991年10月31日書簡の表題”遺伝療法に有効なレトロウイルスベクター（Retroviral vectors Useful in Gene Therapy）及びPCT/US91/08121（1991年10月31日書簡）中に記載されており、それらの教えをここで例として合した。又それらを、サイトカインをコード化する遺伝子の合併及び発現という特別な例を有する特殊例として下記に記載した。更に、いくつかのMGFベクターは、上記ATCCに寄託した。
MGFベクターは、下記及び図（１）で示されるpEmベクターと類似するが、MoMuLのための、1038個のgag配列の塩基対を有し、組み換えゲノムのパッケージング細胞株への封入を増加させ、MO−９（スプライスアクセプター配列および転写開始因子を含む）から誘導した350個の塩基対を含んでいた。Anは、直接MOV−９配列に続くNco及びBamH I部位を含むオリゴヌクレオチドの塩基対であり、それは好都合にも適合性部位を有する遺伝子の挿入を可能にした。それぞれの場合において、遺伝子のコード領域は、Nco及びBamH I部位においてMGFベクターの骨格中に導入された。それぞれの場合において、ATG開始因子−メチオニンコドンを、枠内、Nco I部位中に補足的にクローンし、そして万が一の場合に生成物の破壊を防ぐため及び潜在部位を導入するために、少量の配列過剰停止コドンを含んだ。結果として、挿入されたATGは、野生型ウィルスATGの発生する地点の部位においてベクター中に存在した。このようにしてスプライスは、特にはモロニーマウス白血病ウィルス（Moloney Murins Leukemia virus）における発生と同様であり、ウィルスの活動は旺盛であった。MoMuLV LTRは、転写を調整し、そして得られたmRNAは、すぐ後で挿入遺伝子の開放型読み込み枠へと続く原型gas転写のS'非転換領域を明らかに含んでいた。このベクターにおいて、モロニーマウス白血病ウィルス（Mo−MuLV）の長い末端の繰り返しの配列を、両、全長ウィルス性RNA（ウィルス粒子中に被包するための）及び挿入された配列の発現に応答する補足遺伝的なmRNA（Mo−MuLV env mRNAに類似）を生成するために用いた。このベクターは、ウィルス性RNA（24）の被包を促進すると思われるウィルス性gas領域中の、及びenv mRNAの生成に必要である正常5'及び3'のスプライス部位中の両配列を保有した。全てのオリゴヌクレオチドの接合部は、ジデオキシ末端法（25）及びT7−DNAポリメラーゼを用いた配列であった。MFGの構造を図1Aに示した。
下記の蛋白質のための遺伝子を含むMFGベクターを製造した：マウスIL−２、GM−CSF、IL−４、IL−５、γ−IFN、IL6、ICAM、CD2、TNF−α及びILi−RA（インターロイキン−１−受容アンタゴニスト）。更に、TNFr−α、GM−CSF及びIL−２をコード化するヒト配列を製造した（表１を見よ）。また、以下:VCAN、ELAN、マクロファージ炎症性蛋白質、熱衝撃性蛋白質（例えばhps60）、Ｍ−CSF、Ｇ−CSF、IL、IL−３、IL−７、IL−10、TGF−β、B7、MIP−２、MIP−１α及びMIP−１β、の一つ又はそれ以上をコード化する遺伝子を含むMGFベクターを製造することも可能であった。
MGF中に補足クローンされた正確なcDNAは、以下のとおりである：マウスIL−２（26）塩基対49−564;マウスIL−４（27）塩基対56−479;
マウスIL−５（28）塩基対44−462;マウスGM−CSF（29）塩基対70−561;マウスICAM−１（30）塩基対30−1657;マウスCD2（31）塩基対48−1079;マウスIL−１受容アンタゴニスト（32）塩基対16−563;ヒトTNF−α（33）塩基対86−788。
実施例2:サイトカインの測定
感染型、非選択的B16集団により分泌されたサイトカインを、10mlの培地を含む10cm平皿に、１×106細胞を接種して48時間後に測定した。10mlの培地を含む10cm平皿に１×106細胞を接種して24時間後に、感染型、非選択的3T3細胞からIL−1RAの分泌を測定した。測定したサイトカインを、以下に示す:CTLL細胞（34）及びELISA（提携的生物学的医薬品）を用いたマウスIL−2;CT4R細胞（35）及びELISA（エンドゲン・Endogen）を用いたマウスIL−4;ELISA（エンドゲン・Endogen）を用いたIL−5;Tl165細胞（41）及びELISA（エンドゲン・Endogen）を用いたTL−6;FDCP−１細胞（37）及びELISA（エンドゲン・Endogen）を用いたマウスGM−CSF;小胞性口内炎ウィルス抑制剤（38）及びELISA（Endogen）を用いたマウスγ−IFN;L929細胞（39）及びELISA（Ｌ＆Ｄ組織）を用いたヒトTNF−α；抑制剤と結合した123I−IL1βを用いたマウスIL−1RA。
B16標的細胞におけるマウスICAM及びCD2の発現を、EPICS−CFCS分析器（カルター型）上で、各、YNl/1.47（42）及びRN2/1を用いて、標準の手順（41）により測定した。
実施例3:サイトカインをコードしている配列を含むB16黒色腫細胞の製造
得られたベクター構成物を、標準の方法により、Psi CRIP及びpsi CRE（43）として知られるパッケージング細胞株中に導入した。これらの細胞株は、高いレトロウィルスとそれぞれ両生及び転移性宿主領域との再結合力価を安定して提供するクローン類を単離するのに有効であることを示した。両生宿主を有するCRIPパッケージング細胞株を、両、転移及び電気泳動により生成した（両法は効率にあまり差がない）。リン酸カルシウム−DNA共沈を、ベクター20μｇ及びpSVZNEO:1μｇ（45）を用いて行った（44）。ベクター40μｇ及びpSVZNEO:8μｇを線状にした後に、遺伝子パルサー電気泳動装置（Gene Pulser electroporator:Bio−Rad）を用いて電気泳動を行った。（条件:190V及び960μＦ）。
DNA導入後、操作手順を、G418（GIBCO）の選択値中の1mg/ml−36時間に設定した。両クローン及び生成物群を生成した。
ウィルス力価をサザーンブロット分析装置（Southern blot:46）により測定し、次いで1ml当り８μｇのポリブレンを含む培地中で、B16及び3T3細胞の感染を測定した。標的DNA及び適切な複写数基準にスパイクする調整DNA10μｇをNha I（LTR裁断装置）により獲得し、アガロースゲル中の電気泳動により溶解し、そして標準の手順（48）を用いてサザーン法により測定した。各ブロットは、用いた先の任意の方法（49）により高い［33P］dCTPの特定活性をまでに級される適切な配列を用いて判別した。判別群には、マウスIL−２（Sac I/Rsa I片（221−564塩基対）である）を除外した全長cDNAを用いた。細胞当りの１つの複写の力価は、細胞当り１×106レトロウイルス粒子とほぼ同値である。
これらの生成物の生成する過程において、それの鋭敏なＤ代謝測定（43）で測定されるような結合感染の代謝を時折り誘発するMGFベクターを有する結合ライン（CAEないしCRIP又はCRIPないしCRE）の交差感染を観察した。そのような交差感染は本来的には避けるべきである。直接の転移又は電気泳動により生成される生産物に伴う結合機能の代謝は、観察されなかった。
ウィルス力価及び発現レベルを下表に示した。
0003580371.tif 000002
研究の初めに、B16黒色腫腫瘍モデル（50）を選択した。ヒト黒色腫は、各種の免疫治療（51、52）に対して感受性を示した。表１中で示されるすべての遺伝子生成物が、試験管内又は試験管外のB16細胞の増殖に影響を及ぼしたかどうかを検討するために、細胞をウィルス上澄みに曝し、転換された細胞を、それらの感染効果及び分泌の遺伝子生成物に特長された。表１に、B16黒色腫細胞株（細胞当りの１つの複写力価は、おおよそ106個の感染粒子の力価に相当する）及び分泌型遺伝子生成物の対応レベルに対するそれぞれのウィルスのおおよその感染効率を示した。
MGF γ−IFN構成（細胞あたりおよそ0.1コピーを送り込む）を除外することにより、ほとんどのウィルスは、多くの腫瘍細胞への形質転換が可能となった。γ−IFN分泌細胞の増殖は、非感染細胞よりも低速であり、それらの野生型対象群と比べて平らであった。対照的に、他の形質転換細胞は、試験管内において増殖特性にまったく変化が見られなかった。細胞を生成するウィルスの両、集団及び特定クローンを、これらの研究に用いた。
実施例4:ワクチン接種
注入の前に、腫瘍細胞をトリプシン化し、血清を含む培地中で１回、次いでマンクス調整生理食塩水（Manks Balanced Saline Solutin:GIBCO）中で２回洗浄した。トリパンブルーに抵抗性を有する細胞を適切な濃度まで沈殿させ、HBSS:0.5ccを注入した。次いでワクチンを腹部皮下に投与し、麻酔を投与した後に腫瘍誘発剤をメタファンで消毒処理されたマウス（ピットマン・ムーア症候群）の背部正中線に注入した。マウスを、触知腫瘍が記録されるまで２ないし３日おきの間隔で試験した。腫瘍が直径２ないし3cmに達した時点もしくは重症性外陰腫瘍又は出血が展開した時点で、マウスを犠牲とした。抗体枯渇実験のために、マウスの右後脚にワクチン（0.1cc）を接種し、そしてマウス左後脚に誘発剤（0.1cc）を投与した。肺転移を生成するために、尾血管に細胞0.2ccを注入した。実験動物は、B16、ルイス肺及びC15B1/6の実験には生後６ないし12週間の雌マウス（ジャクソンラブズ）、及びCT−26、RENCA及びCMS−５の実験には生後６ないし12週間のBalb/c雌マウス（ジャクソンラブズ）を用いた。
放射線処理されたワクチンを用いる場合は、腫瘍細胞（HBSS中で沈殿後）を、124ラド／分に放電するCasium−137源を用いて3500ラドで被爆した。
実施例5:組織学
組織学的試験のために、組織を中性に緩衝された10％ホルマリン中に固定し（パラフィン実験態様までの過程として）、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。染色された免疫ペルオキシダーゼのための組織を、溶液N2中で急速冷凍し（凍結部分として調整）、アセトン中に10分間固定し、−20℃で保管した。凍結部を第１次抗体次いで抗IgG抗体（特定種）で感染処理し、そして抗原−抗体の複合を、アビジン−ビオチン過酸化物複合体（ベクター染色体、ベクターラボラトリー製）及びジアミノベンジジンで視覚化した。第１次抗体には、500A2（ハムスター抗CD31）、GK1.5（ラット抗CD4）及びGK2.43（ラット抗CD8）を用いた。
実施例6:生体形質転換腫瘍細胞を用いたワクチン研究
発癌性B16細胞におけるサイトカインの有効性を直接評価するために、それらの同質遺伝子宿主であるC57B1/6マウスの皮下に非改質（野生型）B16黒色腫細胞又は形質転換改質細胞のいずれかを接種し、マウスの腫瘍形成を数日おきに検討した。典型的には、ワクチン投与量は５×105であり、それをB16感染細胞に接種した。
驚くべきことに、IL−２を分泌する腫瘍細胞のみが、腫瘍を形成しなかった。他全ての９種のサイトカイン検体が、腫瘍を形成した。腫瘍形成における中程度の遅延は、IL−４、IL−６、γ−INF及びTNF−αの発現に関連するものであった。いくつかのサイトカイン検体では、全身的症候（たぶん細胞の急速な増加によるものと思われる）が生じた。GM−CSF形質転換細胞は、急速な白血球増加（多核白血球、単球及び好酸球）、肝臓腫大、肺出血、及びIL−５を発現する細が顕著な末梢性好酸球増加を示したことで明示される致命的な毒性を誘発した。IL−６を発現する細胞は、肝臓腫大及び死を引き起こした。TNF−αを発現する細胞は、消耗、震え及び死を引き起こした。
実施例7:サイトカイン形質転換腫瘍細胞により生ずる全身的抗腫性瘍免疫
IL−２転換型細胞の拒絶により、それらの潜在的な系統免疫生成の検討を可能にした。まずマウスに、B16黒色腫細胞を発現するIL−２を接種し、次いで１箇月に及ぶ過程中において、非改質型B16細胞を用いて誘発を行った。典型的には、初回の及び誘発剤の投与量は、双方とも５×105生細胞（細胞は、培養皿から収穫し、後に広範囲に洗浄したものを用いた）を用いた。次いで、細胞を、5cc（ハンス緩衝生理食塩水（HBS）中の）においてを注入した。次いで、５頭のマウス群に、ワクチン投与地点の別の地点に誘発処理を行った。誘発剤投与群５検体に対する測定の時間割りは、３ないし４日おきで行い、ワクチン投与後の３日間に誘発剤の初回投与を行い、ワクチン投与してから一箇月間までの期間において誘発剤を継続的に投与した。
結果では、IL−２の全身的保護誘導機能がわずかに示された（非改質腫瘍誘発剤が拒絶された能力を測定することにより）。典型的な実験において、ほとんどのマウスは、そのワクチン投与後40日間の腫瘍誘発剤に対して屈服した。この結果は、時折り腫瘍形成に遅延が生じた（図2A）のみで、誘発の期間にかかわりなく、マウスが誘発に対して屈服したということから、Fearonらの結果（８）とは真さに対照的であった。感染型B16細胞の有効性の評価は、マウスの自然死若しくは人為的な殺傷の時期を確認することにより行なわれた。
実施例8:多発性サイトカイン形質転換細胞により生じる全身的抗腫瘍免疫
IL−２のみを用いて形質転換した細胞の効率的な拒否能力の結果として、サイトカインの併用を検討した。この測定のために、IL−２及び２次的な遺伝子生成物の双方を発現するB16細胞の集団を、IL−２形質転換細胞を過剰に感染されることにより生成した。検体動物を、二重に感染した細胞によりワクチン処理し、次いで７ないし14日後に、非転換細胞を用いて誘発処理を行った。典型的には、初回及び誘発剤の投与量は、５×105生細胞であり、細胞は、培養皿から獲得した後、広範囲に洗浄した。次いで、細胞（HBS約0.5cc）を皮下に注入した。
B16黒色腫細胞を、IL−２陽性がを発現するに改質した（それに次いで、GM−CSF、IL−４、γ−IFN、ICAM、CD2、IL1−RA、IL−６又はTNF−α）。
図2Bで示される結果は、両、IL−２及びGM−CSFを発現する細胞が、潜在的な統学的免疫を生ずることを示しており、多くのマウスが、長期間の腫瘍誘発において生存した；例えば、120日間の期間においてもマウスは生き残った（その時点で、マウスを犠牲とした）。合計で、マウス50又は60匹に、この併用を用いたワクチン投与をしたところ、マウスが、10 5非改質細胞（およそマウス７割が保護に成功）ないし、５×106非改質細胞（より低い結果ではあったが、はっきりとした保護効果がみられた）の範囲の投与量の誘発剤から保護されたという結果が示された。
この結果は、GM−CSFのみに感染した腫瘍細胞が、宿主中で急速に増殖した事実が明白になったことは、特に驚くべきことであり、事実宿主は、全身的に分泌されているＭ−CSFの毒性に対し屈服した。小程度の保護が、他ののいくつかの併用において観察された。TNF−α及びIL−４は、IL−２及びIL−６との併用においてごくわずかな効果しかなかった。また、IL−６も、IL−２との併用においてごくわずかな効果しかみられなかった。γ−IFN、ICAN、CD2及びIL−２を用いた条件の下に、受容アンタゴニストは不活性であった。感染型B16細胞の有効性の評価は、自然死又は人為的な死が生じた時点で確認した。
更なる実験において、３つ目のサイトカイン（IL−２及びGM−CSFに加え）の野性型投与に対する保護のための併用作用に対する影響力を評価した。IL−２、GM−CSFを発現し、γ−IFN、IL−４のいずれか若しくは両方を発現するB16黒色腫細胞を製造した。
予備結果では、GM−TNFを伴ったIL−２に、IL−４を添加したところ、この試みの効果を促進することが示された（図２を見よ）。更なる試みとして、GM−TNFを伴ったIL−２に、γ−IFNを添加してワクチンに対するこの併用効果を確実にする試みも予想される。このデータは、サイトカインの各種の併用は、免疫応答の強さを増大し、そして減少するという両方の効果があるという可能性を示した。
実施例9:放射線処理細胞に関するワクチン研究（非転換及び放射線処理された細胞の免疫性）
両、IL−２及びGM−CSFは発現するが、IL−２のみは発現しない細胞が、ワクチン処理された宿主に全身的保護効果を提供し、そしてGM−CSFのみを分泌する細胞の増殖が活発であるという事実は、Il−２が、第一にワクチン処理細胞の拒絶を媒体する働きをもつ可能性が示唆された。
先の多くの研究では、放射線処理された腫瘍細胞が、かなりのワクチン作用を有することが示されており（16、17、18、19）、重要な調整として、非転換型放射線処理細胞のワクチン能力を評価が必要となった。放射線処理及びワクチン接種は、上述のように行われた。図3Cのデータは、非転換型で放射線処理されたB16細胞は、ワクチン及び誘発剤投与量が検討された時点で、誘発細胞の増殖にわずかな効果しか引き出せなかったことを示している。
しかしながら、特定のサイトカインの抗腫瘍作用を同定するために、前もって用いられた数多くのマウス腫瘍細胞株は、本質的に免疫遺伝性を有していた（放射線処理の非転換細胞でのワクチン接種を含む研究で発見されたような）。更に、放射線処理のみの細胞は、生体転換細胞により誘導されたそれらと比較したレベルにおいて、全身的免疫性を提供した。これらの実験のために、先の腫瘍拒否又は腫瘍誘発測定において、サイトカインが有する能力を同定するための研究において用いられたような、いくつかの腫瘍型を用いた。これらの腫瘍を以下に示す：（ｉ）CT25、細胞株（53）（IL−２（８）の作用を同定する研究において用いられた）から誘導したクローン癌；（ii）CMS−５、細胞株（54）（IL−２（９）及びγ−IFN（４）の作用を同定するために用いられた）誘導した繊維肉腫；（iii）RENCA、細胞株（55）（IL−４（15）の作用を同するために用いられた）から誘導した腎臓細胞癌；及び、（iv）WP−４、細胞株（２）（TNF−α（２）の作用を同定するために用いられた）から誘導された繊維肉腫。これらの初期研究として、ワクチン及び誘発剤の投与量を、先のサイトカイン遺伝子転移研究で用いられたそれらと比較した。腫瘍誘発の測定において、放射線処理細胞でワクチン処理されたマウスを、その後に腫瘍細胞により７ないし14日間誘発処理した（図７を見よ）。驚くべきことに、それぞれの場合において、放射線処理した細胞は、上で検討された各種のサイトカインを発現する生細胞を用いた先の記録されたそれと比較して、強いワクチン作用を有していた。対照的に、先の図3Cで示されるように、放射線処理B16細胞は、わずかではあるが全身的免疫性を誘導した。先の試験の誤認の可能性も示唆され、この結果は、特に重要な意味を有した。先の研究において用いられた多くの腫瘍細胞は、本質的に免疫遺伝性を有していたが、生腫瘍細胞の致死率がそのような特性を示していた。サイトカインの発現は、まれに生腫瘍細胞の死を媒介する。従ってこのことは、本来の免疫遺伝性の発現を可能にする。対照的に、本発明の全身的免疫応答は、実際の、免疫組織とサイトカイン及び抗原の相互作用に依存する。
放射線処理された転換型B16細胞を用いたワクチン接種
上述のように、IL−２及びGM−CSFの両方を発現する放射線処理されたB16細胞は、試験管内におけるサイトカインの分泌、若しくは試験管外におけるワクチン作用のいずれも妨げることはなかった（データはなし）。この結果に基づいて、GM−CSFのみを発現する放射線処理されたB16細胞を、ワクチン接種したマウスに投与し、次いでその後７ないし14日間誘発処理を行った。細胞は、3500ラドで放射した。典型的には、放射線処理された細胞は、５×105、続く誘発には同量の生細胞を用いた。図3Aで示されるように、そのようなワクチン処理は、強い抗腫瘍免疫性を引き起し、ほとんどのマウスは、それらの誘発に対し生き残った。ワクチンとして放射線処理されていない細胞を用いた場合には、最終的には19中の１頭の検体が保護された：放射線処理した細胞を用いた場合は、20中16頭のマウスが保護された。いずれのマウスも、生体GM−CSFを発現する細胞を注入したマウスにおいて見られた毒性を示すことはなかった、そしてワクチン接種したマウスの血清中に、環状GM−CSFを検知することができた（10pg/mlに感受可能なELISAを用いた）。また全身的免疫性のかなり長い持続性も観察され、GM−CSFを発現する放射線処理細胞でワクチン処理し、その後２箇月間で非転換細胞を投与されたほとんどのマウスは、腫瘍を発現することはなかった（データなし）。
また全身的な免疫性も特殊であり、GM−CSFを発現するB16細胞は、ルイス肺癌細胞（56）、他種癌（C57B1/6原型）の誘発からマウスを保護することはなく、GM−CSFを発現するルイス肺癌細胞は、非転換B16細胞の誘発からマウスを保護することはなかった（データなし）。
放射処理転換細胞のワクチンとしての有効性は、広範囲のGM−CSF濃度においてあきらかであり、感染細胞は100倍過剰の非転換細胞と混合可能であったが全身的免疫応答をほとんど期待できないことがあきらかであった。（図3B）。この結果は、MFGベクターに寄与するかなり高レベルのGM−CSF発現に反映している。反対に、保護は、ワクチン処理細胞の総接種量に対して高い感受性を有し、10分の１量という少量のワクチン処理細胞使用に際しても、その作用はかなり確定的であった（図3B）。
非転換細胞を用いた誘発に対して強い保護効果を提供したことに加え、GM−CSFを発現する放射線処理B16細胞は、前もって生成された腫瘍の拒絶を媒介する能力において、放射線処理のみの細胞を用いた場合よりも高い能力を有した（図3C）。また同様の結果が、慢性メタスターゼを、非転換型細胞の静脈内注入により生成する研究において得られた（データなし）。
驚くべきことに、B16の結果により裏付けられるように、ワクチン細胞の局部的な破壊は、必ずしも全身的免疫を引き起こす訳ではない。生体IL−２を発現するB16細胞は、系統学上の宿主に拒否され、このワクチン接種は後の非転換型B16細胞の誘発に対し保護作用を発現しなかった。同じように非転換型放射線処理B16細胞によるワクチン接種においても、全身的保護に失敗した。非、又は貧弱な免疫遺伝性腫瘍模型の全身的免疫の発生には、このようにして、この免疫を含めたより免疫遺伝性のある腫瘍模型における応答のそれより質的に相違する機序が求められる。
B16模型における抗腫瘍作用のための多くの遺伝子生成物をふるい分けることは、この仮説に同調するものであり、例えば、そのような免疫性増大が可能である他の体系において、すべての分子を同定することなどがあげられ、以上の事から事前に同定されていないサイトカイン、GM−CSFは、まさに強力であることが示された。
更に、GM−CSF形質転換の有利性が、幾分免疫遺伝性を有する腫瘍模型においてさえ発現されるという事実は、他の、腫瘍免疫遺伝性の発見手段と比べて、GM−CSFの比較的強い能力を示唆している。
最後に、他の遺伝子生成を発現する放射線処理型細胞も又、ワクチン処理された宿主上において全身的免疫性を提供するかどうかを検討するために、異種遺伝子生成物（放射線処理の後の）を発現するさまざまな細胞集団にも、ワクチン作用があるかどうかを検討した。IL1RA、IL−２、IL−４、IL−５、IL−６、GM−CSF、γ−TNF、TNF、ICAM及びCD2を発現するB16細胞を、上述のように製造した。ワクチン及び誘発剤の投与量及び方法は、前述と同様である。
図４に示される結果では、GM−CSFを発現するB16細胞は、放射線の照射の前には、最も強力に思え、IL−４及びIL−６に改質された細胞に関しては、幾分作用に減少がみられた。
他のマウス腫瘍型における、放射線処理されたGM−CSFを発現する細胞を用いたワクチン接種
他のマウス腫瘍型の放射線処理された顕著なワクチン作用のみが、GM−CSFを発現する細胞の実験上の作用を妨げたということから、比較的効果的であるGM−CSFを発現する非転換放射線処理細胞及び放射線処理細胞の基本条件を評価するために、上で試験された多くの腫瘍の誘発剤又はワクチンの投与量のそれぞれを検討した。これらの条件は、図3Bに関連して用いられた条件と同じ条件であった。これらの条件により、図８で示される非転換型で放射線処理された細胞とGM−CSFを発現するで放射線処理された細胞の比較が可能となった。比較的効果的なGM−CSFを発現する細胞は、系統において幾分変化に富んでいるが、すべての場合においてGM−CSFを発現する細胞は、唯一放射線処理したものと比較して全身的免疫性の引き出しにおいてより効果的であった。
上記概説のように、この実験はルイス肺癌細胞線（56）を含んでおり、これは、先のサイトカインの遺伝子転移研究において用いられたことはない腫瘍である。代表的実験であるGM−CSF形質転換の効果を図解により示したが、正確な投与量によりこれらの有効性は幾分変化に富んでいることが示された。
しかし結果では、放射線処理をする前に、GM−CSFを発現するルイス肺癌細胞の特殊な全身的免疫性が示された、すなはちマウスは、後の非改質ルイス癌細胞による誘発では保護されたが、非改質B16黒色腫細胞ではその効果はなかった（データなし）。
非転換細胞によるワクチン接種後の、かなり大量の誘発剤投与が事実上拒否されたという理由から、この実験は、WP−４細胞株を含まない。
実施例10:サイトカイン導入腫瘍細胞を用いた前もって存在する腫瘍の反転
サイトカインの混合物を発現するB16黒色腫細胞の、前もって存在する腫瘍に与える作用を検討した。すべての試験においてマウスが用いられ、次いで非改質B16細胞が注入したところ（１日１回、７日）、顕微鏡で確認できる程度の大きさの腫瘍が生成された。７日間において、さまざまなサイトカインを発現するＢ黒色腫細胞を、皮下部に異地点に注入した。典型的には、両、初回及び誘発剤投与量は、５×105生体細胞であり、細胞は培養皿から収穫し、次いで広範囲に洗浄した。次いで細胞に、HBS約5ccを注入した。
B16細胞は改質され、その結果以下のサイトカインの組み合わせを発現した:IL−２及びGM−CSF;IL−２、GM−CSF及びTNF−α;IL−２、GM−CSF及びIL−4;IL−２、GM−CSF及びIL−6;IL−２、GM−CSF及びICAM;IL−２、GM−CSF及びCD2;及びIL−２、GM−CSF及びIL1−RA。図９にその結果を示す。
実験では、前もってマウスが腫瘍をもっている場合、IL−２及びGM−CSFを含む改質されたB16細胞で処理したところ、対照検体と比較してそのマウスにわずかな延命がみられた。しかし、治療効果は認められなかった。しかし、IL−２、GM−CSF、TNF−αの併用を用いたマウスでは、５頭中３頭のマウスに治療効果がみられた（120日以上の生存により証明される）。３頭中２頭のマウスには、ひき続く野生型B16細胞に誘発においても生き残りがみられた。IL−２及びGM−CSFを発現する細胞に、Il−４、ICAM又はCD2を個々に添加したところ、５頭中１頭のマウスに治療効果がみられた。改質型Il−２、GM−CSF及びTMF−α細胞を投与した場合には、投与の３日後に腫瘍が生成されるが、多くのマウスに腫瘍症状はみられず、及びいくつかの群においては、10頭中10頭に治療効果がみられた。
又、放射線処理された細胞を用いた場合（実施例９で解説）には、慢性腫瘍の反転がみられた。図３で示されるように、GM−CSFを発現する放射線処理されたB16細胞では、前もって存在する腫瘍拒絶を媒介する能力がみられたが、放射線処理した非転換細胞ではみられなかった（少なくともこれらの実験の投与量において）。
図3Cは、保護の範囲が、誘発細胞の投与量及び治療の開始時期の双方に依存することを示している。同様の結果が、慢性メタスターゼを非転換細胞の静脈内注入により生成するという研究においても得られた（データなし）。
実施例11:GM−CSFを発現する腫瘍細胞により引き出される免疫応答の特性
GM−CSFを発現する放射線処理されたB16黒色腫により引き出される免疫応答を、さまざまな方法において特徴した。放射線処理されたGM−CSFを発現する細胞を注入した地点の組織学的実験では、注入の５ないし７日後に未熟分割単球、顆粒球（好酸球が優勢）及び活性リンパ球（図５、区画Ａ）の広範囲な局所流入が見いだされた。注入して１週間後に、排出リンパ様式が劇的に拡大し、傍皮質過形成及びいくつかの幼芽芯形成が示された（図５、区画Ｃ）。対照的に、非転換放射線処理細胞でワクチン処理されたマウスでは、炎症性細胞の軽度の流入のみがみられたが（図５、区画Ｂ）、それは主にリンパ球、及び比較的小さな排出リンパ様の拡大を形成した（図５、区画Ｄ）。放射線処理されたGM−CSFを発現する細胞でワクチン処理された誘発マウスでは（図５、区画Ｅ）、５日後に数多くの好酸球、単球及びリンパ球がはっきりと見られたが、放射線処理された細胞でワクチン処理された誘発マウスでは、リンパ球斑のみであった。実際、B16生細胞で誘発された意図を有しない検体において、非応答細胞は観察されなかった（図５、区画Ｇ）。
どの細胞が全身的免疫上重要であるかを決定するために、一連のマウスから、CD4＋、CD8＋又は試験管外における抗体投与による本質的なキラー細胞を除去し、次いで放射線処理されたGM−CSFを発現する細胞でワクチン処理を行った。特に、最初、ワクチン投与の１週間前に、マウスから、それぞれMabGK1.5を用いてCD4＋細胞を、MabGK2.43を用いてCD8＋細胞を、そしてPK136を用いてNK細胞を除去した。抗体を硫酸アンモニウム沈降により部分的に精製した：脱脂した腹水を飽和硫酸アンモニウムと1:1で混合し、沈殿物を回転除去し、乾燥し、そして再び元の腹水と同じ容量の水中に沈殿させた。抗体を、PB5に対し、0.45μｍフィルターで広範囲に透析した。抗体の力価は、スタイミン（staimin）１×106巨大球により、連続的に希釈した抗体を用いて試験し、FACSCAN測定により飽和度を測定した。
すべての調整物は、1:2000に基づいて力価を測定した。抗体を、0.15ml i.u.及び0.1ml i.p./日１回、その後１週間毎に、0.1ml i.p.で除去した。リンパ球の部分的除去は、ワクチン接種日（早期除去）、野生型腫瘍誘発剤投与日（早期及び後期除去）その後は週末において査定した。2.43又はGK1.5に次いでフルオレスセインイソチオシアン酸（ヤギ抗体ないしラットDgGを標識）、又はPK136に次いでフルオレスセインイソチオシアン酸（ヤギ抗体ないしマウスDgGを標識）で染色されたリンパ節胞及び巨大球の流入細胞を測定することにより、他の部分が正常値で存在したのに対し、除去部分がリンパ球の合計より＜0.5％を示したことが明らかになった。ワクチン接種の前にそれぞれのＴ細胞の小部分の除去が、全身的免疫の発展を妨げる一方で、NK細胞の除去は、わずか又はまったく影響を有しない（図６、区画Ａ）という理由から、両、CD4＋及びCD8＋のＴ細胞には、効果的なワクチン接種が必要であった。更に、各種Ｔ細胞の小部分を除去し、次いで誘発剤投与前に免疫処理をする時点で、両、CD4＋及びCD8＋のＴ細胞の重要性が再び発見され（データなし）、またこのようにして、両、エフェクターにおける小部分及び応答の開始段階の双方の役割りが示された。
最後に、GM−CSFを発現する非転換放射線処理細胞又は放射線処理細胞のいずれかでワクチン処理されたマウス中の腫瘍である特定CD8＋細胞毒Ｔ細胞の世代を検討した。放射線処理GM−CSF転換又は非転換B16細胞でワクチン処理した後14日間に及ぶこの一連の実験において、巨大球を収穫し、そしてそれを試験管内で、５日間にわたりB16細胞で処理したγ−インターフェロンにより刺激した。
CD8阻害CTL活性を、４時間の54Cr放出実験において、B16標的細胞で処理したγ−インターフェロン上で、各種エフェクター：標的比において測定した。無処理のC57B1/6からの巨大球及び対照群としてBalb/cマウスを用いた。日程を、図6Bで示した（ここで、□は、GM−CDF、・は、Allo、◇は、無処理、及び△は、放射線処理B16を表す）。非転換細胞でワクチン処理したマウスでは、わずかなCD8＋阻害剤殺傷を検知したのに対し、GM−CSFを発現する細胞でワクチン処理したマウスから単離した細胞標本においては、CD8＋阻害殺傷の顕著な増加が示された。
先の研究では、腫瘍細胞を発現するサイトカインが、サイトカインのＴ介助細胞まで迂回する発現能力により全身的な抗腫瘍免疫を増大する可能性が示唆された。その様式は、IL−２を発現する腫瘍細胞が、両、CT−26クローン癌及びB16黒色型において、全身的免疫を引き出すこと、及び腫瘍免疫が、CD8＋細胞のみに依存しているという発見に基づいている。しかし、IL−２を発現するB16細胞による全身的免疫生成、及びGM−CSFがCD4＋に影響を与えている事実は、GM−CSFを発現する細胞が炎症性の別の様式において全身的免疫を引き出す可能性を示唆している。GM−CSFを発現する放射線処理細胞を用いたワクチン接種により誘導されたいくつかの免疫応答の特性は、基本的な機序が、宿主抗原が存在する細胞による腫瘍特定抗原の発現を増大する可能性を含んでいる事を示唆している。GM−CSFを発現する細胞により誘導された全身的免疫の範囲が試験されたGM−CSF分泌の度合いにほんとんど影響されなかった（図3B）のに対し、ワクチン腫瘍細胞の絶対数は臨界的であつた。この発見は、ワクチン処理のために入手可能な腫瘍特定抗原の絶対量は、通常は制限されることを示唆している。また、GM−CSFを発現する細胞の注入は、単球細胞の劇的な流入を誘導し、より少数の他の細胞型と共に潜在的な抗原が細胞を発現していることが解かった。更に、両CD4＋及びCD8＋細胞は、免疫応答には必要であった。本発明において用いられたB16細胞は、γ−IFN処理の後でさえ検知可能な量のII−MHC分子を発現しなかった（未公開結果）。従って宿主抗原が存在する細胞、というよりもむしろ腫瘍細胞それ自身は、CD4＋Ｔ細胞の起爆に対して応答可能であると思われた。このデータは、GM−CSFの局所的な生成は、腫瘍抗原の発現を改質し、従ってCD4＋ヘルパー及びCD8＋、細胞毒性キラーＴ細胞間における共同研究は、確立されるか又は改善されるかした（試験管内）。
実施例12:他のレトロウイルスベクターの用途
pLJ:このベクターの特性は、（20）、1991年10月31日書簡のU.S.S.N.07/786,015及び1991年10月31日書簡のPCT.US91.08121中でに記載されている。このベクターは、２つの型の遺伝子を発現する能力を有する：対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型選択マーカー遺伝子。マウスIL−２、GM−CSF、IL−４、IL−５、IL−６、ICAN、CD2、TNF−α及びIL1−RA（インターロイキン−１−受容アンタゴニスト）を含むpLJベクターを製造した。更に、TNF−α、GM−CSF及びIL−２にコードされるヒト配列を製造した。対象の遺伝子を、5'LTRのちょうど末端部にクローン化するBamH I/Sma I/SaI I中に直接に配置した。ネオ遺伝子を、内部活性剤（SV40から）の末端に配置した（つまり、内部活性剤は、クローン地点よりも3'遠い位置に配置されており、すなはち、それをクローン位置の3'に配置したということである）。pLJからの転写を、２つの地点:5'LTR（対象遺伝子に応答可能）及び内部SV40促進剤（選択マーカー遺伝子に応答可能）から開始した。pLVの構造を、図1Bに示した。
pEm:この単純なベクターは、1991年10月31日書簡のU.S.S.N.07/786,015及び1991年10月31日書簡のPCT/US91/08121中に記載されている。野生型ウィルスのgag、pol及びenvにコードするすべての配列を、唯一の遺伝子のみが発現される対象遺伝子と置き換えた。pEmの構成部分を下記に示した。5'側面配列、5'LTR及び接触配列の400の塩基対（BaH I部に達する）は、pZIPからのものである。3'側面配列及びLTRも又、pZIPからのものである；しかし、上方の、3'LTRからのCIa I部の150の塩基対は、BamH Iクローンリンカーと結合し、ベクター内に存在するBamH Iクローン部の半分を形成した。pBR322のHind III/EcoR I片は、ピラミッド型の骨格を形成した。このベクターは、モロニーマウス白血病ウィルスの菌株からクローンされた配列から誘導したものである。
マウスIL−２、GM−CSF、IL−４、IL−５、γ−IFN、IL−６、CD2、TNF−α及びIL1−RA（インターロイキン−１−受容アンタゴニスト）を含むpEmベクターを製造した。更に、TNF−α、GM−CSF及びIL−２をコード化するヒト配列を製造した。
αSGC:1991年10月31日書簡のU.S.S.N.07/786,015及び1991年10月31日書簡のPCT/US91/08121中に記載されるα−SGCベクターは、α−グロブリン遺伝子からの転移アクセプター配列を用いてサイトカインがコード化する遺伝子の発現を整列させる。促進因子を含む600個の塩基対片は、更に転移開始因子剤及び確実なα−グロブリンmRNAの5'非転移領域を含む。サイトメガロウィルスからの転写エンハンサーを含む360個の塩基対片は、α−グロブリンプロモーターを先導し、そしてこの因子からの転写を増大する。更に、MMLVエンハンサーを、3'LTRから除去した。この除去は、感染において5'LTRに転移し、そして特に転写的に活性である因子の作用を不活性とした。α−SGCの構造を図D1に示した。
マウス、IL−２、GM−CSF、IL−４、IL−５、γ−IFN、IL−６、ICAN、CD2、TNF−α及びIL1−RA（インターロイキン−１−受容アンタゴニスト）α−SGCベクターを製造した。更に、TNF−α、GM−CSF及びIL−２をコードするヒト配列を製造した。
実施例13:ウィルス抗原及びサイトカインの併用投与
適切なワクチン細胞（繊維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、単球、dentritic細胞を含むが、これに制限しない）に、HIV抗原（gag、env、pol、rav、nef、tat及びvifを含むが、これに制限しない）の個別又は組み合わせ及び放射線処理型又は増殖不能化されたサイトカイン（例えばGM−CSF）の単独又は組み合わせを発現するレトロウィルスを感染させ、そして患者に投与した。
このベクターは、２つの型の遺伝子：対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型選択マーカー遺伝子、を発現する能力を有するという仮説に同調するものである。
実施例14:免疫応答の抑制
適切なワクチン細胞（実施例13を見よ）及び同種移植片（腎臓内の腎管上皮の細胞）の特定細胞を、放射線処理又は増殖不能化されたサイトカイン（例えば、γ−インターフェロン）の単独又は組み合わせを発現するウィルスに感染させ、そして同種移植片に対する免疫反応を減少するために患者に投与した。
更に、本発明は、自己免疫欠損を抑制するために用いることができる。宿主標的抗原に対する自己免疫応答も又、同様の方法により改質できる。例えば、本発明は、多発性硬化症に用いることができる。適切な細胞（実施例13を見よ）は、ミエリン塩基蛋白質及びサイトカイン（例えばγ−インターフェロン）を表現するレトロウィルスに感染し、患者のミエリン塩基蛋白質に直対する免疫応答を減少させる。
実施例15:免疫応答の増大
更に、本発明は、さまざまな感染疾患に対する免疫応答を増大するために用いることができる。例えば、本発明はマラリアの治療に用いることができる。適切なワクチン細胞（実施例13を見よ）は、環状スポロゾイト表面の蛋白質からの遺伝子及び、放射線処理又は増殖不能化されたサイトカイン（例えばGM−CSF）を表現するレトロウィルスに感染させ、そしてそれらをマラリアに対する治療応答を減少するために患者に投与した。
先の例中に記載されたような本発明のさまざまな改質は、本発明の範囲内において用いることができるということは、それらの優れた技術により理解することができる。それらの多くの変異及び改質が技術的に優れたものであることは明らかであり、又それらは、ここで解説された本発明の精神及び範囲内にある。
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均等性
当業者は、これ以上の実験を行う事なく、特に解説した本発明に特有の実施態様に対する均等の範囲を確認できるであろう。また、そのような均等の範囲は、下記の請求の範囲内に含まれるものと思われる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0003580371.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
0003580371.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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