(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（IV）
0003565868.tif 000008
（式中、Ｐは活性化および保護基である）の実質的に鏡像異性体的に純粋なＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンの製造法であって、
Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（Ｖ）
0003565868.tif 000009
（式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物をアシラーゼ酵素で処理し、式（IV）の未反応鏡像異性体を慣用方法によって反応混合物から単離することを特徴とする、方法。
【請求項２】
Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（Ｖ）
0003565868.tif 000010
（式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物を鏡像異性体分割する方法であって、混合物をアシラーゼ酵素で処理することによって実質的に鏡像異性体に純粋なＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（IV）を生成する、方法。
【請求項３】
Ｐがアシルまたはオキシカルボニル基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｐがホルミルであるか、または１〜４個の炭素原子を有するアルカノイル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｐがアルキルオキシカルボニルまたはアラールオキシカルボニル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｐが第三ブチルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル基である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アシラーゼ酵素がBacillus sp.由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アシラーゼ酵素がSavinaseである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
反応を有機溶媒と水との混合物中で行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒が水相溶性媒体であり、70容積％未満の水を用いる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
水相溶性の有機溶媒がテトラヒドロフランまたは1,4−ジオキサンである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
反応を、６〜11のpH範囲内および20〜50℃の温度で行う、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
反応を、pHが約８および約30℃の温度で行う、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
式（IV）の未反応のＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンを溶媒抽出によって単離する、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、鏡像異性体的に濃縮したＮ−誘導体形成した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンの製造法に関する。
２−アミノプリンヌクレオシド類似体であり、下記の構造（Ｉ）
0003565868.tif 000002
を有し、EP0434450号明細書により知られているアバカビールは、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）およびＢ型肝炎ウイルス（HBV）に対して強力な活性を有する。
臨床試験を目的とする多量のアバカビールを合成する必要がある。将来において、アバカビールが国立医薬品調整局（national medicine regulatory agencies）によって承認されたならば、多量のアバカビールがHIV感染症の治療用の処方薬として発売することも必要になる。
アバカビールの製造における重要な段階は、鏡像異性体的に純粋な置換シクロペンタン環の調製である。現在用いられている方法は、式（II）
0003565868.tif 000003
のラクタムから開始する方法であることが知られている。
EP−Ａ−0424064号明細書には、シクロペンタをシアン化トシルとの反応によって調製したラセミ体ラクタム（II）をラクタマーゼと反応させて、開環化合物（III）
0003565868.tif 000004
単一のシス鏡像異性体、または鏡像異性体の一方が濃縮されたシス鏡像異性体と、一方または他の鏡像異性体が鏡像異性体に濃縮された未反応ラクタムとの混合物を生成することができる。
本発明者らは、式（IV）
0003565868.tif 000005
（式中、Ｐは活性化および保護基である）の鏡像異性体的に実質的に純粋な中間体をそれらのラセミ体から製造するための高収率で実費効果のよい方法を開発した。
本発明者らは、式（II）の化合物中のラクタム窒素原子の基Ｐによる誘導体形成（下記の式（Ｖ）におけるのと同様）により、ラクタム結合を活性化して加水分解することを見いだした。本発明者らは、意外なことにはEP−Ａ−0424064号明細書に記載されているものより容易に得られ、通常の条件下ではEP−Ａ−0424064号明細書に記載されている式（II）のラクタムに関して活性を持たないと思われる酵素を用いて、式（IV）の化合物を生成させることができることを見いだした。
従って、本発明の一態様によれば、Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（Ｖ）
0003565868.tif 000006
（式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物の鏡像異性体分割により、混合物をアシラーゼ酵素で処理することによって実質的に鏡像異性体的に純粋なＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（IV）を生成する方法が提供される。
本発明のもう一つの態様によれば、上記の式（IV）の実質的に鏡像異性体的に純粋なＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（式中、Ｐは活性化および保護基である）の製造法であって、上記の式（Ｖ）のＮ−保護した（±）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物をアシラーゼ酵素で処理し、式（IV）の未反応鏡像異性体を通常の手法によって反応混合物から単離することを特徴とする方法が提供される。
活性化／保護基は、アシルまたは置換オキシドかルボニル基であるのが好ましい。好ましいアシル基としては、ホルミルまたは低級アルカノイル（例えば、アルキル部分に１〜４個の炭素原子を有する）、特にアセチル基が挙げられる。好ましい置換オキシカルボニル基は、式ROC（Ｏ）−（式中、Ｒはアルキルまたはアラールキル基であることができる）を有するものである。好ましいアルキル基は、第三ブチルである。可能なアラールキル基は、ベンジルである。
これらのアシル保護した化合物の実質的な脱保護は、水性条件下で行うことができるので、反応は有機溶媒と水との混合物中で行うのが好ましい。環状エーテル、例えばテトラヒドロフランまたは1,4−ジオキサンのような水相溶性有機溶媒を用いるのが好ましい。脱保護を最小限にするには、70％未満の水を用いるのが好ましく、約50（容積）％以下の水を用いるのが更に好ましい。テトラヒドロフランと水が約50:50（容積／容積）の混合物が、最も適当であることが見いだされた。
上記と同様に用いると、反応は一般に単一相で行うことができる。しかしながら、二相系を創生する目的で、芳香族炭化水素のような有機溶媒の使用も成功しない理由はない。
反応が完結したならば、未反応および本質的に鏡像異性体的に純粋な式（IV）のＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンを、溶媒抽出のような通常の手法によって反応混合物から単離することができる。
ラクタムを鏡像異性体選択的に加水分解して、後に所望な異性体が残るようにする多数のアシラーゼ酵素が見いだされている。本発明者らは、Bacillus sp.由来の酵素が特に活性の正しいプロフィールを示すことを見いだした。例えば、Subtilisin carlsberg（ALTUS）は、ラセミ混合物（Ｖ）からＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン［（IV）,P＝第三ブチルオキシカルボニル］を73％の鏡像異性体過剰量で生成する。他の酵素としては、Bacillus sp.プロテアーゼ、Neutrase、Nocozyme 243、AlcalaseおよびSavinaseが挙げられ、ALTUSおよびNOVOから発売されている。ブタ肝臓エステラーゼ（ALTUS）、ブタ膵臓リパーゼ（Biocatalysts）、Flavorpro−192（ペプチダーゼ、Biocatalysts）、Flavorpro−373（グルタミナーゼ、Biocatalysts）、Promod−TP（エンドペプチダーゼ、Biocatalysts）、lipase−CE（Humicola lanuginosa,Amano）、protease−Ｍ（Aspergillus sp.,Amano）、prozyme−６（Aspergilus sp.,Amano）、lipase PGE（コウシ歯根および唾液腺,Amano）、およびAspergillus sp.アシラーゼ（Sigma）のような鏡像異性体選択的加水分解を示す他の供給源からの酵素を用いることもできる。
好ましくは、特に工業的規模での用途に適当なＮ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンの生物学的転換速度を示すことが見いだされているので、市販のアシラーゼ酵素であるSavinase（NOVO）が用いられる。Savinaseは、Bacillusの親アルカリ種の水中培養によって調製されるタンパク質分解酵素である。これは、セリン型のエンドプロテアーゼである。本発明者らが行った試験において、この酵素は、通常の使用条件下では式（II）のアシル化されていないラクタムのラセミ混合物を加水分解する能力を全く示さなかった。
Ｎ−保護した（1R,4S）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンの生物学的転換は、６〜11、好ましくは７〜９のpH範囲内で行うのが望ましい。20〜50℃の範囲内の温度を用いるのが好ましい。工程を約８のpHおよび約30℃の温度で行うのが最も好ましい。Savinase:基質の比が1:1〜10:1、例えば2:1〜5:1（重量／重量）の範囲であれば、完全で速やかな反応が生じる。所定の酵素に対する最適比は、簡単な実験によって容易に決定することができる。
式（Ｖ）（式中、Ｐは第三ブチルオキシカルボニルである）の出発化合物は、式（II）の相当する保護されていないラセミラクタムからTayler et al.,Tet.Asymmetry,4,p.1117（1993）に記載の方法と同様な方法によって調製することができる。式（Ｖ）（式中、Ｐはホルミルまたは低級アルカノイルである）の化合物は、式（II）の相当する保護されていないラセミラクタムからT.W.Greene,「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」,Wiley,ニューヨーク,1981年,218〜287頁、およびJ.F.W.McOmie,「有機化学における保護基（Protective Groups in Organic Chemistry）」,Plenum Press,ニューヨーク,1973年,43〜93頁に記載の方法によって、または同様な方法によって調製することができる。
式（IV）の化合物は、加水分解によって相当するＮ−保護アミノ酸に容易に転換することができる。Ｎ−保護アミノ基は、カルボン酸をアルコールに転換することができる試薬、例えば水素化アルミニウムリチウムまたはボランによって、式（VI）の相当するアミノアルコールに容易に転換することができる。
0003565868.tif 000007
あるいは、式（IV）の化合物は、Tet.Asymm.,4,p.1117（1993）に記載されているような方法によって水素化ホウ素ナトリウムを用いて式（VI）の相当する開環したアミノアルコールに直接転換することができる。
下記の実施例は、例示のためだけのものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
実施例１
数種類の加水分解酵素を、ラセミ体の（±）第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレート［（Ｖ）,P＝第三ブチルオキシカルボニル］のラクタム結合を鏡像異性体選択的に加水分解する能力についてスクリーニングした。反応は、50％テトラヒドロフラン:50％リン酸緩衝液（容積／容積）（50mM,pH7）中にラセミ化合物1mg/mlを含む磁気攪拌したガラスバイアル（4ml作業容積）中、室温にて行った。それぞれの酵素を加えて、最終濃度を25mg/mlとした。これは、スクリーニング目的には、あらゆる可能な加水分解活性が検出される酵素対基質の比が25:1（重量：重量）であることを表している。酵素を含まないフラスコは、コントロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で1:2に希釈した後、hplc分析を行った。
hplc条件：
カラム:Spherisorb C6（15×0.46cm）。
室温にて1ml/分のイソクラティック溶離。
移動相:0.1％（容積／容積）ギ酸を含む30％（容積／容積）アセトニトリル。
検出波長200nm。
（±）第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレートの化学加水分解は、反応条件下では無視し得る程度であることが示された。数種類の酵素は、ラセミ体化合物を鏡像異性体的に加水分解して、キラライザー（chiralyser）（HPLCによる旋光度検出器）による旋光度が負の値を示すことから明らかなように、（−）−（1R,4S）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレートを生成すると思われた。Savinaseを選択して、更に検討を行った。出発材料約50％を含む反応混合物をキラルhplcによって分析し、残りのラクタムが96.3％の鏡像異性体過剰量を有することを示した。
更に、残りの基質は、アバカビールの合成について正確な絶対配置のものであった。
キラルhplc
カラム:Chiralcel OD−Ｈ（25×0.46cm）。
５℃にて0.5ml/分のイソクラティック溶離。
移動相:2％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。
検出波長205nm。
比較例１
ラセミ体ラクタム（±）−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オン（II）を1mg/ml含む溶液（4ml作業容積）を、50％テトラヒドロフラン:50％リン酸緩衝液（50mM,pH7）中Savinase（NOVOから入手可能）（25mg/ml）で処理した。酵素を含まないフラスコを、コントロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で1:2に希釈した後、hplc分析を行った。
hplc条件：
カラムSpherisorb C6（15×0.46cm）。
室温にて1ml/分のイソクラティック溶離。
移動相:0.1％（容積／容積）ギ酸を含む４％（容積／容積）アセトニトリル。
検出波長200nm。
室温で４日間インキュベーションを行ったところ、反応は見られなかった。
実施例２
Savinase（30g、NOVO）を、50:50（容積／容積）テトラヒドロフラン/50mMリン酸,pH8.0,30℃中にラセミ体の（±）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレート［（Ｖ）、Ｐ＝第三ブチルオキシカルボニル］10gを含む溶液（500ml）に加えた。反応を、キラルHPLCによって２日間まで観察した。
反応が完結したならば（約51％転換、（−）−（1R,4S）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレートの鏡像異性体過剰量）＞99.8％）、酵素を濾過して、透明になった溶液のpHを重炭酸ナトリウム溶液で９に上げた。次いで、これをシクロヘキサン３×200mlで抽出した。合わせた有機相を重炭酸ナトリウム溶液100mlで逆抽出した後、塩水100mlで洗浄した。蒸発および乾燥により、自由流動性の白色固形物を得た（4.2g、84％理論単離収率）。これを、NMRにより（−）−（1R,4S）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレートと確認し、鏡像異性体過剰量は、キラルHPLCによれば、＞99.8％であった。
キラルhplc:
カラム:Chiralcel OD−Ｈ（25×0.46cm）。
0.5ml/分でイソクラティック溶離。
移動相:2％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。
検出波長205nm。
温度５℃。
実施例３
上記の（−）−（1R,4S）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレート（3.5g）をテトラヒドロフラン（10ml）に溶解したものを、水素化ホウ素ナトリウム（1.27g）をメタノール（10ml）の懸濁液に加え、混合物を約20℃で約18時間攪拌した。追加量のテトラヒドロフラン（10ml）および水素化ホウ素ナトリウム（1.27g）を加え、攪拌を更に約２時間継続した。２モル塩酸（30ml）を慎重に加えた後、トルエン（20ml）を加えた。２層を分離し、水層をトルエン（２×25ml）で更に抽出した。合わせた有機抽出物を塩水（20ml）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させて、1R,4S）−（４−ヒドロキシメチル）−シクロペンタ−２−エン−１−イルカルバミン酸第三ブチルエステル（3.23g）をキラルhplcによれば99.2％の鏡像異性体過剰量で淡黄色ガム状生成物として得て、これは、分光分析およびクロマトグラフィ的に真正試料と同一であった。
キラルhplc:
カラム:Chiralcel OD−Ｈ（25×0.46cm）。
流速:1.0ml/分。
移動相:3％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。
検出波長205nm。
温度35℃。
実施例４
Savinaseを、ラセミ体のシス−２−アセチル−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンのラクタム結合を鏡像異性体選択的に加水分解する能力について試験した。反応は、50％テトラヒドロフラン:50％リン酸緩衝液（容積／容積）（50mM,pH7）中に基質1mg/mlを含む磁気攪拌したガラスバイアル（4ml作業容積）中で、室温にて行った。反応は、Savinaseを最終濃度25mg/mlまで加えることによって開始した。酵素を含まないフラスコは、コントロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で1:2に希釈した後、hplc分析を行った。
hplc条件：
カラム:Spherisorb C6（15×0.46cm）。
20℃にて1ml/分のイソクラティック溶離。
移動相:0.1％（容積／容積）ギ酸を含む５％（容積／容積）アセトニトリル。
検出波長210nm。
キラルhplc:
カラム:Chiralpak AD（25×0.46cm）。
20℃にて1ml/分のイソクラティック溶離。
移動相:2％（容積／容積）エタノール／ヘプタン。
検出波長215nm。
酵素が含まれていなければ、基質の化学加水分解は、反応条件下では無視し得る程度であることが示された。しかしながら、テトラヒドロフランを反応混合物から除くと、基質の有意な非酵素的加水分解が見られた。Savinaseは、キラライザーによる旋光度が負の値を示すことおよびキラルhplc分析から明らかなように、シス−２−アセチル−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンを鏡像異性体選択的に加水分解して、（−）−（1R,4S）−２−アセチル−２−アザビシクロ［2.2.1］ヘプタ−５−エン−３−オンを生成した。出発材料約50％を含む反応混合物を２日後にキラルhplcによって分析し、残りのラクタムが真正試料と比較して＞99.8％の鏡像異性体過剰量を有し、アバカビールの合成について正確な絶対配置を有するものであった。