(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレトチド配置を含む、請求項１の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記タンパク質が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置121からヌクレオチド位置981までのヌクレオチド配列を含む、請求項３の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含む、請求項４の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるタンパク質のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなり、該ペプチド断片が、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までの少なくとも10個のアミノ酸残基からなり、かつ、抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体によって結合される少なくとも１つの部位を有し、そしてSEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
ペプチド断片が、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質と融合した融合相手を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
融合タンパク質が、β−ガラクトシダーゼ融合物、trpE融合物、マルトース結合タンパク質融合物、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合物、およびポリヒスチジン融合物からなる群から選択される、請求項８の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのタンパク質のアミノ酸配列が、SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項８の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるタンパク質のペプチド断片と融合した融合相手を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子であって、該ペプチド断片が、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までの少なくとも10アミノ酸残基からなり、かつ、抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体によって結合される少なくとも１つの部位を有し、そして、該融合タンパク質が、β−ガラクトシダーゼ融合物、trpE融合物、マルトース結合タンパク質融合物、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合物、およびポリヒスチジン融合物からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１１の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
ペプチド断片が、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１１の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
融合相手がＧＳＴである、請求項１３の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
高度に厳しい条件下において、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子、またはSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列の相補配列であるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチド分子であって、SEQ ID NO:13〜SEQ ID NO:27および当該配列の相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、オリゴヌクレオチド分子。
【請求項１６】
SEQ ID NO:13〜SEQ ID NO:27および当該配列の相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１５のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項１７】
宿主細胞におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する一またはそれ以上の制御因子と機能的に結合している請求項１ないし１４のいずれかのポリヌクレオチド分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１８】
選択可能なマーカーをさらに含む、請求項１７の組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８の組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
発現ベクターにコードされるポリヌクレオチドの生成に資する条件下において、請求項１９の宿主細胞を培養し、および細胞培養物からポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
(a)SEQ ID NO:4のアミノ酸配列のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質；または(b) (a)のタンパク質と融合した融合相手を含む融合タンパク質、の免疫学的に有効な量と、そして獣医学的に受容できる担体とを含む、そのタンパク質または融合タンパク質が、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、哺乳類の動物種を乳腺炎から保護するためのワクチン。
【請求項２２】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質が、SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によってコードされる、請求項２１のワクチン。
【請求項２３】
(a) SEQ ID NO:4からなるタンパク質のペプチド断片であって、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド断片；または(b) (a)のペプチド断片と融合した融合相手を含む融合タンパク質、の免疫学的に有効な量と、そして獣医学的に受容できる担体とを含む、そのペプチド断片または融合タンパク質が、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、哺乳類の動物種を乳腺炎から保護するためのワクチン。
【請求項２４】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質が、SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置196からヌクレオチド位置978までのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によってコードされる、請求項２３のワクチン。
【請求項２５】
哺乳類の動物種を乳腺炎、および哺乳類を苦しめる可能性のある一またはそれ以上の疾病または病理学的状態から保護するための混合ワクチンであって、(a)SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質；または(b) (a)のタンパク質と融合した融合相手を含む融合タンパク質、を含む免疫学的に有効な量の第一成分、その第一成分中の抗原とは異なり、哺乳類を苦しめる可能性のある疾病および病理学的状態に対する防御反応を誘導することができる抗原を含む免疫学的に有効な量の第二成分、および獣医学的に受容できる担体を含み、そのタンパク質または融合タンパク質が、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる混合ワクチン。
【請求項２６】
混合ワクチンの第二成分の抗原が、乳腺炎、ウシヘルペスウィルス、ウシ呼吸系発疹ウィルス（bovine respiratory syncitial virus）、ウシウィルス性下痢ウィルス（bovine viral diarrhea virus）、I型パラインフルエンザウィルス（parainfluenza virus）、II型パラインフルエンザウィルス、III型パラインフルエンザウィルス、レプトスピラ属（Leptospira spp.）、カンピロバクター属（Campylobacter spp.）、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、連鎖球菌属（Streptococcus spp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma spp.）、クレブシエラ属（Klebsiella spp.）、サルモネラ属（Salmonella spp.）、ロタウィルス、コロナウィルス、狂犬病、パスツレラ属（Pasteurella spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、破傷風トキソイド（Tetanus toxoid）、E. coli、およびネオスポラ属（Neospora app.）からなる群から選択される疾病、状態、あるいは病原体に対する防御反応を哺乳動物において誘導することができる、請求項２５の混合ワクチン。
【請求項２７】
哺乳類の動物種を乳腺炎、および哺乳類を苦しめる可能性のある一またはそれ以上の疾病または病理学的状態から保護するための混合ワクチンであって、(a) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるタンパク質のペプチド断片であって、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド断片；または(b) (a)のペプチド断片と融合した融合相手を含む融合タンパク質、を含む免疫学的に有効な量の第一成分、その第一成分中の抗原とは異なり、哺乳類を苦しめる可能性のある疾病および病理学的状態に対する防御反応を誘導することができる抗原を含む免疫学的に有効な量の第二成分、そして獣医学的に受容できる担体を含み、そのペプチド断片または融合タンパク質が、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる混合ワクチン。
【請求項２８】
混合ワクチンの第二成分の抗原が、乳腺炎、ウシヘルペスウィルス、ウシ呼吸系発疹ウィルス（bovine respiratory syncitial virus）、ウシウィルス性下痢ウィルス（bovine viral diarrhea virus）、I型パラインフルエンザウィルス（parainfluenza virus）、II型パラインフルエンザウィルス、III型パラインフルエンザウィルス、レプトスピラ属（Leptospira spp.）、カンピロバクター属（Campylobacter spp.）、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、連鎖球菌属（Streptococcus spp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma spp.）、クレブシエラ属（Klebsiella spp.）、サルモネラ属（Salmonella spp.）、ロタウィルス、コロナウィルス、狂犬病、パスツレラ属（Pasteurella spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、破傷風トキソイド（Tetanus toxoid）、E. coli、およびネオスポラ属（Neospora app.）からなる群から選択される疾病、状態、あるいは病原体に対する防御反応を哺乳動物において誘導することができる、請求項２７の混合ワクチン。
【請求項２９】
乳腺炎に対する哺乳類動物種の保護のためのワクチンの製造方法であって、獣医学的に受容できる担体を、(a) SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までのアミノ酸配列を含むタンパク質；または(b) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるタンパク質のペプチド断片であって、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド断片；または(c) (a)のタンパク質あるいは(b)のペプチド断片と融合した融合相手を含む融合タンパク質、の免疫学的に有効な量と混合させることを含み、そのタンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質が哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、前記製造方法。
【請求項３０】
Streptococcus uberisによる動物の感染を検出するための診断キットであって、SEQ ID NO:3のヌクレオチド位置121からヌクレオチド位置981のヌクレオチド配列からの少なくとも２０のヌクレオチド残基からなる核酸配列からなる、ポリヌクレオチド分子あるいはオリゴヌクレオチド分子を含む容器を含む、前記診断キット。
【請求項３１】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるタンパク質のペプチド断片であって、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置26からアミノ酸位置286までの少なくとも10アミノ酸残基からなり、かつ、抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体によって結合される少なくとも１つの部位を有し、Streptococcus uberis由来の天然PauAタンパク質に対して指向された抗体に特異的に結合するペプチド断片を含む第一容器、および抗PauAタンパク質特異的抗体に対して指向された二次抗体を含む第二容器を含む、S. uberisによる動物の過去あるいは現在の感染を検出するための診断キット。
【請求項３２】
ペプチド断片が、SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３１の診断キット。
【請求項３３】
SEQ ID NO:4のアミノ酸位置28から286、104から286、172から286、28から170、104から170、104から208、172から208、28から103、28から208、および149から286からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド断片に特異的に結合する一次抗体を含む容器、および一次抗体に特異的に結合する二次抗体を含む二次容器を含む、Streptococcus uberisによる動物の感染を検出するための診断キット。
【請求項３４】
二次抗体が、検出可能な標識をさらに含む、請求項３３の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は動物の健康の分野に属し、疾病のためのワクチン組成と診断法を目標としたものである。より具体的には、本発明は哺乳類における乳腺炎に対するワクチンに関連し、該ワクチンの生産に有用なプラスミノーゲン活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子である。
【０００２】
【従来の技術】
ウシ乳腺炎は乳牛の牛乳生産の著しい減少を引き起こし、酪農産業への厳しい経済的影響という結果を生む。乳腺炎は一またはそれ以上のバクテリア病原菌によって引き起こされうる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染はウシ乳腺炎の全ての臨床ケースの約３０％の原因であるとみられている。とりわけ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓの感染は、ウシ乳腺炎の全ての臨床ケースの約２０％の原因であるとみられている。
【０００３】
動物における乳腺炎の予防および治療のための慣用される方法は、衛生的搾乳法および化学的抗体投与法を使用すること含む。しかしながら、抗体残留物を含む牛乳はしばしば人間の消費にとって安全であるとみなされないという事実により、抗体の使用は制限されており、捨象されるべきである。動物における乳腺炎の治療または予防への特異的アプローチは、感染した動物の牛乳から培養された不活性化された乳腺炎病原菌を含む多価の抗乳腺炎ワクチンの使用を記述したＳｔｏｌｌｅらに対する米国特許第５，１９８，２１４号の研究を含む。さらに、Ｓｏｒｄｉｌｌｏらに対する米国特許第５，２３４，６８４号は、ウシのインターフェロンガンマの動物への投与を含む、乳牛における乳腺炎の治療と予防の方法を記述する。
【０００４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．が泌乳している乳腺へ感染する能力は、バクテリアが分泌物の中で生育することおよびウシの好中球による食作用をまぬがれる能力に依存している（Ｌｅｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｒｅｓ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．  ４９：  ８５−８７）。ウシの牛乳における窒素の大部分はタンパク質の形で存在し（Ａｓｔｏｎ，  １９７５，  Ａｕｓｔｒａｌ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｔｅｃｈ．  ３０：  ５５−５９）、タンパク質分解の非存在下では、牛乳中でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの成長は遊離アミノ酸の欠如により制限される。このことは、好乳性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの牛乳中での生育のための、細胞外で働くカゼイン分解性タンパク質分解酵素への依存によって強調される。さらに、牛乳中でのバクテリアの生育能力は、乳中のタンパク質を分解して遊離アミノ酸にするカゼイン分解酵素であるプラスミンの存在によって上昇する（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒａｍｅｌｅｙ，  １９８４，  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．  ５１：
１７−２２）。
【０００５】
ウシの牛乳は、通常タンパク質分解の性質が不活性の状態にあるが、プラスミノーゲン活性化因子の働きによりタンパク質分解されて活性化プラスミンに転化することができるプラスミノーゲンを含む。乳腺炎原因菌株であるＳ．ｕｂｅｒｉｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、ウシプラスミノーゲンをプラスミンに転化することのできるプラスミノーゲン活性化因子を生産するということが示されている。このプラスミノーゲン活性化因子の活動は牛乳タンパク質の分解による遊離アミノ酸の放出を生じさせ、遊離アミノ酸は乳腺におけるバクテリアの生育を支持する。この観察から、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプラスミノーゲン活性化因子に対する免疫に基づく応答、例えば中和抗体の産生は動物を乳腺炎から防御するのに役立つということが提案されている。参考文献として本明細書中に援用された国際特許出願公開ＷＯ  ９３／１４２０９はＳ．ｕｂｅｒｉｓの培養濾過液からのプラスミノーゲン活性化因子（「ストレプトキナーゼ」と呼ばれている）の精製を示し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．由来のそのようなプラスミノーゲン活性化因子に基づく抗乳腺炎ワクチンの組成をさらに教示している。
【０００６】
例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のプラスミノーゲン活性化因子のような、プラスミノーゲン活性化因子をコードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子の単離は、抗乳腺炎ワクチンの調製を非常に容易にするであろう。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、生物学的に活性なプラスミノーゲン活性化因子タンパク質（本明細書中では「ＰａｕＡタンパク質」と呼ばれ、以前には「ＰＡ」あるいは「ストレプトキナーゼ」と呼ばれていた）をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、ＰａｕＡタンパク質は例えば哺乳類の種に属する動物の乳腺炎を引き起こす、またはそれに寄与するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のバクテリアから由来する。より好ましい態様においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種はＳ．ｕｂｅｒｉｓまたはＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅである。
【０００８】
好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の、ほぼアミノ酸位置２６（Ｉｌｅ）からほぼアミノ酸位置２８６（Ｐｒｏ）までのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。限定的でない態様の一例においては、このようなポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のほぼヌクレオチド位置１９５からほぼヌクレオチド位置９７７まで、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のほぼヌクレオチド位置１９６からほぼヌクレオチド位置９７８までのヌクレオチド配列をそれぞれ含む。
【０００９】
さらに好ましい態様においては、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤＮＯ：４のほぼアミノ酸位置１（Ｍｅｔ）からほぼアミノ酸位置２８６（Ｐｒｏ）までのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。限定的でない態様の一例においては、このようなポリヌクレオチド分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のほぼヌクレオチド位置１２０からほぼヌクレオチド位置９８０のヌクレオチド配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のほぼヌクレオチド位置１２１からほぼヌクレオチド位置９８１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。限定的でないさらなる態様の一例においては、本発明のポリヌクレオチド分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。
【００１０】
本発明はさらに、ＰａｕＡタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子と実質的に相同であるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子によってコードされるＰａｕＡタンパク質と実質的に相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のＰａｕＡタンパク質のペプチド断片あるいは実質的に相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。特定的であるが限定的でない態様では、本発明はアミノ酸位置約２８から約２８６、約１０４から約２８６、約１７２から約２８６、約２８から約１７０、約１０４から約１７０、約１０４から約２０８、約１７２から約２０８、約２８から約１０３、約２８から約２０８、および約１４９から約２８６のアミノ酸からなるグループから選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４由来のアミノ酸配列のサブシークエンスからなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明はさらに担体または融合相手と結合した本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、増幅技術におけるプライマーとして、および特異的な疾病の診断における診断用のプローブとして有用であるオリゴヌクレオチド分子を提供する。限定的でない態様の一例では、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７とその相補鎖からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる。限定的でないさらなる態様の一例では、本発明のオリゴヌクレオチド分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７とその相補鎖からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子の組換え発現のための組成物と方法を提供し、そのなかには組換えクローニングベクターおよびポリヌクレオチド分子を含む組換え発現ベクター、および該ベクターで形質転換した宿主細胞株が含まれる。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子によってコードされた組換え発現によるＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、または融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片または融合タンパク質の類似体および誘導体を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、免疫学的に効果的な量の本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子、および獣医学的に許容しうる担体を含む、乳腺炎に対して哺乳類の動物種を防御するためのワクチンを提供する。このワクチンは場合によりアジュバントまたは他の免疫調節的な成分を含むことができる。
【００１９】
限定的でない態様の一例では、本発明のワクチンは、乳腺炎、および、場合により、哺乳類を苦しめる可能性のある一又はそれ以上の他の疾病あるいは病理学的状態から哺乳類の動物種を防御するための混合ワクチンであり、この混合ワクチンは、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、免疫学的に有効な量の本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子を含む第一の成分；哺乳類を苦しめる可能性のある疾病または病理学的な状態に対する防御反応を誘導することのできる抗原を含む、免疫学的に有効な量の第二の成分；および獣医学的に許容しうる担体を含む。
【００２０】
本発明はさらに、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、免疫学的に有効な量の本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子を、獣医学的に許容しうる担体と混合することを含む、乳腺炎から哺乳類の動物種を防護するワクチンを調製する方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のワクチンを哺乳類へ投与することを含む、哺乳類に属する動物種に乳腺炎に対するワクチンを投与する方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、または誘導体に特異的に結合する抗体を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、ワクチンキットおよび診断用キットを提供する。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
１．プラスミノーゲン活性化タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子
本発明は、生物学的に活性なプラスミノーゲン活性化タンパク質（本明細書中では「ＰａｕＡタンパク質」、以前は「ＰＡ」または「ストレプトキナーゼ」と呼ばれた）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性な」という用語は、哺乳類のプラスミノーゲンをプラスミンに転化させる能力を指す。本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされるＰａｕＡタンパク質は、ＰａｕＡタンパク質を産生するいかなる有機体からも誘導されるＰａｕＡタンパク質と同じものでありうるが、哺乳類の動物種における乳腺炎をひきおこす、またはそれに寄与するバクテリアから得ることが好ましい。好ましい態様では、バクテリアの属はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓであり、より好ましくはＳ．ｕｂｅｒｉｓまたはＳ．ｄｙｓｇｅｌａｃｔｉａｅであり、そして、ＰａｕＡタンパク質はウシのプラスミノーゲンをプラスミンへ転化する能力がある。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド分子」、「コーディング配列」、「ポリヌクレオチド配列」、「オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）」等の用語は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子両方を指し、共に一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、適当な調節要素の制御下におかれた際の適当な宿主発現系において、対応するＰａｕＡタンパク質、またはＰａｕＡタンパク質に実質的に相同なポリペプチド、または前述したＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのペプチド断片、または融合タンパク質、または類似体へ転写、翻訳（ＤＮＡ）、または翻訳（ＲＮＡ）されうる。コーディング配列の境界は、一般に５（アミノ）末端の開始コドンと３（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンの存在によって決定される。コーディング配列は、原核細胞の配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、および化学的に合成されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含みうるが、それに制限されることはない。本明細書中で使用される場合、「ＯＲＦ」の用語は本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、または類似体をコードするのに必要とされる最小限度のヌクレオチド配列を指し、この配列には介在するいかなる終止コドンも含まない。
【００２６】
Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６および９５−１４０由来の天然のＰａｕＡタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として提示される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において提示される各々の推定アミノ酸配列の最初の２５アミノ酸は、各々のｐａｕＡ遺伝子によってコードされるシグナル配列を表すと考えられ、そのシグナル配列は、分泌された（成熟した）ＰａｕＡタンパク質を生産するために細胞内プロセシングの過程で除去される。このように、好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸位置２６（Ｉｌｅ）からほぼアミノ酸位置２８６（Ｐｒｏ）までのアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
二つの異なるポリヌクレオチド（ＤＮＡ）分子のヌクレオチドコーディング配列（すなわち第一のものはＳ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡタンパク質をコードし、第二のものはＳ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のＰａｕＡタンパク質をコードする）は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１２０−９８０由来のＯＲＦを有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列はヌクレオチド１２１−９８１由来のＯＲＦを有する。ペプチドシグナル配列の除去を考慮に入れると、限定的でない態様の一例では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のほぼヌクレオチド位置１９５からほぼヌクレオチド位置９７７の、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のほぼヌクレオチド位置１９６からほぼヌクレオチド位置９７８のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。
【００２８】
さらに好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチド分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸位置１（Ｍｅｔ）からほぼアミノ酸位置２８６（Ｐｒｏ）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。限定的でないさらなる態様の一例では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のほぼヌクレオチド位置１２０からほぼヌクレオチド位置９８０の、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のほぼヌクレオチド位置１２１からほぼヌクレオチド位置９８１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。限定的でないさらなる態様の一例では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチド分子は、本明細書中で提示されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のＯＲＦに隣接するヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【００３０】
本発明はさらに、ＰａｕＡタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子と実質的に相同な、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。ポリヌクレオチド分子を指すのに本明細書中で用いられる場合、「実質的に相同な」という用語は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド位置１９５からヌクレオチド位置９７７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド位置１９６からヌクレオチド位置９７８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子と同じＰａｕＡタンパク質をコードするが、この実質的に相同なポリヌクレオチド分子は遺伝暗号の縮重による一またはそれ以上のサイレント突然変異を含んでおり；および／または（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド位置１９５からヌクレオチド位置９７７、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド位置１９６からヌクレオチド位置９７８のヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％  さらに好ましい場合少なくとも約８０％、最も好ましい場合少なくとも約９０％同じであり、本発明の実施に有用である；および／または（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド位置１９５からヌクレオチド位置９７７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド位置１９６からヌクレオチド位置９７８のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に、適度に厳しい条件で、すなわち０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ，），  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ａｔ  ｐ．２．１０．３  参照）で、ハイブリッド形成し、本発明の実施に有用なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を指す。好ましい態様においては、実質的に相同なポリヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド位置１９５からヌクレオチド位置９７７、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド位置１９６からヌクレオチド位置９７８のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に、高度に厳しい条件で、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６８℃の洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記）でハイブリッド形成し、そして本発明の実施に有用である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド分子が（ａ）生物学的に活性なポリペプチドをコードする、すなわち哺乳類のプラスミノーゲンをプラスミンに転化することができ、または（ｂ）免疫原性のポリペプチドをコードする、すなわち哺乳類の動物種に投与された場合乳腺炎に対する防御反応を誘導することができ、または（ｃ）哺乳類の動物種に投与された場合ＰａｕＡタンパク質特異的抗体の生産を誘導することができるポリペプチドをコードし、または（ｄ）感染した哺乳動物由来の組織または体液試料中の病原体特異的ポリヌクレオチド分子の存在の検出により、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ等の乳腺炎をひきおこす病原体による感染を検出する診断用試薬として使用できる場合に、ポリヌクレオチド分子は「本発明の実施に有用である」。
【００３２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされるＰａｕＡタンパク質に実質的に相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００３３】
本明細書中でポリペプチドを指すのに使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６からアミノ酸位置約２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも８０％同じであり、本発明の実施に有用であり；および／または、（ｂ）そうでなければＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６からアミノ酸位置約２８６のアミノ酸を含むＰａｕＡタンパク質と同じであるが、その中で一またはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に保存的に置換されていて、このような保存的な置換は結果として本発明の実施に有用なポリペプチドを生じ；および／または、（ｃ）そうでなければＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６からアミノ酸位置約２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質と同じであるが、その中で一またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に非保存的に置換されていて、そのような非保存的な置換は結果として本発明の実施に有用なポリペプチドを生ずる、このようなアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００３４】
保存的アミノ酸置換は当該技術分野においてよく知られている。例えば、本発明の天然ＰａｕＡタンパク質の一またはそれ以上のアミノ酸残基は、類似の電荷、大きさ、極性を持ったアミノ酸残基に保存的に置換されることが可能であり、結果として生ずるポリペプチドはやはり本発明の実施に有用である。このような置換を生じさせる規則は、とりわけＤａｙｈｏｆ，  Ｍ．Ｄ．，  １９７８，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｖｏｌ．５，  Ｓｕｐ．３．により記述されたものを含む。より具体的には、保存的なアミノ酸置換は、一般に側鎖で関連しあう一群のアミノ酸の中でおこる置換である。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般に四つのグループに分けられる。（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；そして（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、また芳香性アミノ酸としても一緒に分類される。いずれかの特定なグループ中での一またはそれ以上の置換、例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、またはアスパラギン酸のグルタミン酸による置換、またはスレオニンのセリンによる置換、または、他のアミノ酸残基の、構造的に関係のあるアミノ酸残基による置換は、結果として生ずるポリペプチドの機能には一般に重要でない効果しかもたらさない。
【００３５】
いくつかの特異的な、以下の６．７節の表１に要約したように、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）および９５−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）由来のＰａｕＡタンパク質の推定アミノ酸配列を比較した場合、非保存的アミノ酸置換の例が観察される。例えば、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡのアミノ酸位置７３はアスパラギン酸（酸性）で、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のものはアスパラギン（中性、極性）である。さらに、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡのアミノ酸位置１１５および１２４はグルタミン（中性、極性）で、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のものはアルギニン（塩基性）である。さらに、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡのアミノ酸位置２１１はロイシン（非極性）であり、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のものはアルギニン（塩基性）である。さらに、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡのアミノ酸位置２４０はグルタミン（中性、極性）で、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のものはプロリン（非極性）である。さらに、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡのアミノ酸位置２４２はヒスチジン（塩基性）で、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来のものはアスパラギン酸（酸性）である。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドが（ａ）生物学的に活性、すなわち哺乳類のプラスミノーゲンをプラスミンに転化することができる；または、（ｂ）免疫原性である、すなわち哺乳類の動物種に投与された場合乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる；または、（ｃ）哺乳類の動物種に投与された場合抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体の産生を誘導することができ、この抗体は診断用試薬として有用である；または、（ｄ）Ｓ．ｕｂｅｒｉｓなどの乳腺炎をひきおこす病原体による感染の結果としての、または本発明のワクチンによるワクチン投与の結果としての哺乳類由来の血液または血清中の抗ＰａｕＡタンパク質特異的な抗体の存在を検出するための診断用試薬として用いることが出来る場合に、ポリペプチドが「本発明の実施に有用である」。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で使用される場合、「ペプチド断片」の用語は、本発明のＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのアミノ酸配列のサブシークエンスからなるポリペプチドを指し、そのサブシークエンスは全長のＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドより長さが短く、ポリペプチドについて有用性が上で述べられたように、本発明の実施に有用である。このように、ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドの全長が“ｎ”個のアミノ酸残基を有することが示される場合、そのペプチド断片は、ｎ−１個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む、ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドの全長より短いいずれかのポリペプチドであり、そこにおいてペプチド断片は本発明の実施に有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、少なくとも長さが約７から１０アミノ酸残基である。好ましい態様では、ペプチド断片はＰａｕＡタンパク質のエピトープを示すアミノ酸配列を含む。
【００３８】
特定的だが限定的でない態様の一例においては、本発明は、アミノ酸位置約２８から約２８６、約１０４から約２８６、約１７２から約２８６、約２８から約１７０、約１０４から約１７０、約１０４から約２０８、約１７２から約２０８、約２８から約１０３、約２８から約２０８、および約１４９から約２８６を含む群から選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４由来のアミノ酸のサブシークエンスからなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００３９】
コードされたペプチド断片がＰａｕＡタンパク質またはその実質的に相同なポリペプチドの一より多くのサブシークエンスを含む場合、このようなペプチド断片をコードするポリヌクレオチド分子は、いくつかのサブシークエンスが、それらが前もって天然のＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチド中で隣接していない場合、ペプチド断片の中に一緒に入れられ、互いに隣接して作られるように形成することが可能である。本発明のＰａｕＡタンパク質の全長または実質的に相同なポリペプチドと比較して、一またはそれ以上の内部アミノ酸残基の欠失を有するポリプチドは、この定義によりペプチド断片とみなされ、本発明の範囲に含まれる。さらに、本発明のペプチド断片をコードするポリヌクレオチド分子は、サブシークエンスによりコードされるペプチド断片を含む異なるサブシークエンスが、天然のタンパク質または実質的に相同なポリペプチドで見出されるものと比べて、互いに異なる相対的順序を持つように改変されるように形成されることが可能である。好ましい態様においては、ポリヌクレオチド分子は、本発明のＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドの一またはそれ以上のサブシークエンスをコードし、そのサブシークエンスは、哺乳類の動物種において中和抗体が対抗して上昇しうる、ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドの一またはそれ以上のエピトープの領域を表す。本発明はまた、アミノ酸配列のサブシークエンスが互いに改変された全長（ｎ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含むことも企図する。
【００４０】
本発明はさらに、融合タンパク質を形成するようにポリペプチド担体または融合相手と融合した本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる融合タンパク質の限定的でない例は、βーガラクトシダーゼ融合物、ｔｒｐＥ融合物、マルトース結合タンパク質融合物、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物、およびポリヒスチジン融合物（担体領域）を含む。特定的であるが限定的でない態様の一例では、本発明は本発明のペプチド断片へのＧＴＳ融合物をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、該ペプチド断片は、アミノ酸位置約２８から約２８６、約１０４から約２８６、約１７２から約２８６、約２８から約１７０、約１０４から約１７０、約１０４から約２０８、約１７２から約２０８、約２８から約１０３、約２８から約２０８、および約１４９から約２８６を含む群から選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４由来のアミノ酸サブシークエンスからなる。当該技術分野において既知の方法は、これらの及びその他の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を構築するために使用しうる。
【００４１】
「ＰａｕＡポリペプチド」へのこれに続く全ての言及は、他の指示がなければ、本発明の前述のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片および融合タンパク質を含むことを企図する。
【００４２】
本発明はさらに、本発明の前述のポリヌクレオチド分子のいずれかとハイブリッド形成するか、または本発明の前述のポリヌクレオチド分子のどれかの相補鎖であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド分子を提供する。このようなオリゴヌクレオチド分子は、好ましくは、少なくとも長さが約１０から１５ヌクレオチドであるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のどれかのサブシークエンスの長さまで拡張することができ、そして適度にまたは高度に厳しい条件で、前述のポリヌクレオチド分子の一またはそれ以上とハイブリッド形成することができる。より短いオリゴヌクレオチド分子については、高度に厳しい条件の一例は、６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウム中、１４塩基オリゴヌクレオチドまでならば約３７℃、１７塩基オリゴヌクレオチドまでならば約４８℃、２０塩基オリゴヌクレオチドまでならば約５５℃、２３塩基オリゴヌクレオチドまでならば約６０℃での洗浄を含む。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち、オリゴヌクレオチド数１００以上）については、適度におよび高度に厳しい条件の例は、実質的に相同なポリヌクレオチド分子について上に記述されている。ハイブリダイゼーションの条件は、当該技術分野において知られているように、使用される特定のオリゴヌクレオチド分子に従って適当に調整することができる。
【００４３】
好ましい態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、高度に厳しい条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子と、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する。
【００４４】
限定的でない態様の一例においては、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と該配列の相補鎖からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる。限定的でないさらなる態様の一例では、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と該配列の相補鎖からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、例えば特異的疾病の診断に使われる、ＰａｕＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の増幅のプライマーとして、または遺伝子制御に有用なアンチセンス分子をコードする、またはアンチセンス分子として働くことを含む、様々な目的に有用である。遺伝子増幅は、感染した動物由来の組織や哺乳類の乳などの体液試料におけるＰａｕＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の存在を検出するのに用いることができる。特異的増幅産物の生産は、バクテリアの感染を示し、一方増幅産物がなければ感染していないことを示す。
【００４６】
当該技術分野で知られている他の増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応なども使うことができるが、増幅は、適当に設計されたオリゴヌクレオチド分子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的技術と共に用いて行うことができる。例えば、ＰＣＲに関しては、適当に設計されたプライマー、増幅すべきヌクレオチド配列を含む鋳型、および適当なＰＣＲ酵素および緩衝液を含む混合物を調製し、鋳型の特異的ｐａｕＡ関連ポリヌクレオチド配列を増幅するための標準的な手順に従って処理される。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分子の生産と操作は当該技術分野の方法中に存在し、また、様々な中でも特に、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．；  およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．に記載された組換え技術に従って行うことができ、これらすべては参考文献として本明細書中に援用される。ＰＣＲの作動方法は、これ以外の場所にも記載されているが、Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ），  １９９５，  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；およびＥｒｌｉｃｈ，  （ｅｄ），  １９９２，  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、これらは参考文献として本明細書中に援用される。
【００４８】
２．組換え発現系
２．１．  発現ベクター
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子を含む組換えクローニングベクターおよび組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子のコーディング配列（本明細書の以降では「ＰａｕＡコーディング配列」として指示される）がポリペプチドを生産するためにＰａｕＡコーディング配列の転写と翻訳に必要な一またはそれ以上の制御因子と機能的に結合しているように構築されるのが好ましい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「制御因子」という用語は、ポリヌクレオチドコーディング配列の発現を駆動しおよび／または制御するために働く、当該技術分野で既知の誘導性および非誘動性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび他の因子を含むがそれだけに限定されない。同様に、本明細書で使用される場合、ＰａｕＡコーディング配列は、一またはそれ以上の制御因子と「機能的に結合」しており、制御因子が効果的にＰａｕＡコーディング配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳、またはその両方を制御し、そして許容する。
【００５０】
様々な発現ベクター、好ましくはＰａｕＡコーディング配列の複製、転写、および翻訳を指向するための必要な制御因子を含む発現ベクターが知られており、ＰａｕＡコーディング配列の発現に使用することができる。発現ベクターには、バクテリアまたは酵母の形質転換のための、ＰａｕＡコーディング配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびコスミド発現ベクター；昆虫の細胞の形質転換のためのＰａｕＡコーディング配列を含むバキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）などの組換えウィルス発現ベクター；およびとりわけ動物細胞の形質転換のためのＰａｕＡコーディング配列を含むアデノウイルスまたはワクシニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）などの組換えウィルス発現ベクターなどが含まれる。
【００５１】
本発明のＰａｕＡコーディング配列を含むように設計することができる典型的な原核細胞発現ベクタープラスミドには、多くの中でも特に、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＣＡ）、およびｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などを含む。
【００５２】
適当な制御因子と機能的に結合している特定のコーディング配列を含む発現ベクターを構築する方法は当該技術分野でよく知られており、本発明の実施に用いることができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，上記に記載された技術等を参照）。
【００５３】
これらのベクターの制御因子は、その長さおよび特異性において多様でありうる。利用される宿主／ベクター系に従い、適当な転写および翻訳因子のいかなるものも用いられることができる。例えば、哺乳類の細胞系でのクローニングでは、マウスメタロチオネインプロモーター等の、哺乳類細胞のゲノムから単離された、または、ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーターまたはモロニーマウスサルコーマウィルスのロングターミナルリピート（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）などの、これらの細胞中で増殖するウィルスから単離されたプロモーターを使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成技術により獲得されたプロモーターは、挿入配列の転写のために提供するためにも使用することができる。さらに、特定のプロモーターからの発現は、特定な誘導因子例えばメタロチオネインプロモーターには亜鉛およびカドミウムイオンの存在下で上昇することができる。
【００５４】
限定的でない転写制御領域またはプロモーターの例は、バクテリアについては、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左及び右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターなどがあり；酵母については、ＡＤＨ−Ｉおよび−ＩＩプロモーターなどの解糖酵素プロモーター、ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロモーターがあり；哺乳類細胞ではＳＶ４０初期および後期プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーターなどがある。
【００５５】
特異的開始シグナルもまた、挿入されたＰａｕＡコーディング配列の十分な翻訳には必要とされる。これらのシグナルは一般的に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含む。それ自身の開始コドンと隣接配列を含むＰａｕＡ遺伝子の全体が適当な発現ベクターに挿入された場合、いかなる付加的な翻訳制御シグナルも必要ない。しかしながら、コーディング配列の一部だけが挿入された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルが必要とされうる。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な供給源から得ることができる。さらに、挿入部分全体のインフレーム翻訳を保証するために、開始コドンはＰａｕＡコーディング配列の読み枠に合わせておかれなければならない。
【００５６】
融合タンパク質発現ベクターは、担体または融合相手と融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片を含む融合タンパク質を発現するのに用いられることができる。精製された融合タンパク質は、例えば診断用試薬として用いられるための抗ＰａｕＡタンパク質抗血清を産生するため、ＰａｕＡタンパク質の生化学的諸特性の研究のため、生物活性を改変されたＰａｕＡ融合タンパク質を設計するため、または発現ＰａｕＡタンパク質の同定または精製を補助するために用いることができる。可能な融合タンパク質発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合物、マルトース結合タンパク質融合物、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物、およびポリヒスチジン融合物（担体領域）をコードする配列を組み込んだベクターを含むが、これだけに限定されない。ＧＳＴ−ペプチド断片融合物の特異的な例は、上記５．１節に記載されており、また本発明はこれらのそれぞれをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。このようなＰａｕＡ融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築するために、当該技術分野で既知の方法を使用することができる。
【００５７】
ＰａｕＡ融合タンパク質は、精製のために有用な領域を含むように設計することができる。例えば、ＰａｕＡ−マルトース−結合タンパク質融合物はアミロース樹脂を用いて精製することができ；ＰａｕＡ−ＧＳＴ融合タンパク質はグルタチオンーアガロースビーズを用いて精製することができ；そしてＰａｕＡーポリヒスチジン融合はニ価ニッケル樹脂を用いて精製することができる。別の方法では、担体タンパク質またはペプチドに対する抗体を融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いることができる。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターのなかに、制御因子と機能的に結合するように設計し、そして発現エピトープが融合タンパク質のＰａｕＡパートナーと融合するように位置することができる。例えば、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧＴＭエピトープタグ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をコードするヌクレオチド配列は、標準的な技術によって発現ベクター中のＰａｕＡパートナーのアミノまたはカルボキシル末端に対応する点に挿入することができる。発現されたＰａｕＡーＦＬＡＧＴＭエピトープ融合産物はその後、商業的に入手可能な抗ＦＬＡＧＴＭ抗体を用いて検出し、そしてアフィニティ精製することができる。
【００５８】
発現ベクターはまた、発現されたＰａｕＡパートナーが特異的プロテアーゼによる処理により担体領域または融合相手から解放されうるように、特異的プロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むように設計することもできる。例えば、融合タンパク質ベクターは、中でも特にトロンビンまたは第Ｘａ因子などの切断部位をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
【００５９】
ＰａｕＡコーディング配列の上流および読み枠内にあるシグナル配列が、発現タンパク質の通行および分泌を指向するために、既知の方法により発現ベクターに設計することができる。限定的でないシグナル配列の例は、中でも特に、α因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼ、Ｔ細胞受容体、および天然ＰａｕＡタンパク質そのもののシグナル配列から由来するシグナル配列などを含む。
【００６０】
本発明の発現ベクターにより形質転換または感染を受けた宿主細胞の選択において補助するために、発現ベクターは、リポーター遺伝子産物または他の選択マーカーについてのコーディング配列をさらに含むように設計することができる。このようなコーディング配列は、上に記載したように、制御因子コーディング配列と機能的に結合することが好ましい。本発明の実施に有用でありうるリポーター遺伝子は、当該技術分野でよく知られており、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質、ホタル・ルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモン等を含む。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野でよく知られており、抗体または抗代謝物への抵抗力を与える遺伝子産物または栄養要求に補給する遺伝子産物をコードする配列を含む。このような配列の例は、特にチミジンキナーゼ活性、または、メトトレキセート、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどへの抵抗性またはｚｅｏｃｉｎをコードする配列を含む。
【００６１】
２．２．  宿主細胞の形質転換
本発明はさらに、本発明の組換えクローニングまたは発現ベクターにより形質転換された宿主細胞およびそこから由来する細胞株を提供する。本発明の実施に有用な宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。このような形質転換された宿主細胞は、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換されたバクテリア、または組換え発現ベクターで形質転換された酵母などの微生物；またはバキュロウィルスなどの組換えウィルス発現ベクターに感染された昆虫細胞；または特にアデノウイルスまたはワクシニアウィルスなどの組換えウイルス発現ベクターに感染された哺乳類細胞などの動物細胞などを含むが、それだけに限定されない。
【００６２】
バクテリアの細胞は一般に、宿主細胞として好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉの株、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ；  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ３１３４３）または商業的供給源（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）から入手可能なＤＨ５α株、またはＴＡＰ５６またはＬＷ１４株（Ｅ．ｃｏｌｉのＰｆｉｚｅｒ内部の株）が典型的に用いられる。マウス、ハムスター、乳牛、サル、またはヒトの繊維芽細胞株もまた効果的に用いることができるが、好ましい真核生物の宿主細胞には酵母細胞を含む。本発明の組換えＰａｕＡポリペプチドを発現するのに使用することのできる真核生物の宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、およびＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（例えば、ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ．１６５８）を含む。
【００６３】
本発明の組換えベクターは、実質的に均質な細胞培養の一またはそれ以上の宿主細胞に形質転換されるかまたは感染されることが好ましい。ベクターは一般に、既知の技術、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、塩化カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換え体ウイルスとの接触による感染、リポソーム媒介感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン感染法、形質導入法、接合、ミクロ発射衝撃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）といった方法に従って宿主細胞に導入される。形質転換体の選択は組換えベクターと連結した抗生物質抵抗性などの選択マーカーを発現する細胞の選択などの標準的方法により行うことができる。
【００６４】
ひとたび本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムまたはエピソームにおけるＰａｕＡコーディング配列の融合および保存は、標準的技術、例えばサザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、逆転写ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むＰＣＲ分析、または免疫学的分析によって確認され、期待されるポリペプチド産物を検出することができる。組換えＰａｕＡコーディング配列を含むおよび／または発現する宿主細胞は、当該技術分野でよく知られている少なくとも四つの一般的方法により同定することができる。それらは（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、またはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｉｉ）“マーカー”遺伝子の機能の存在の検出；（ｉｉｉ）宿主細胞でのＰａｕＡ特異的ｍＲＮＡ転写の発現によって測定される転写水準の検定；および（ｉｖ）イムノアッセイまたはＰａｕＡの生物活性（すなわち適切な哺乳類のプラスミノーゲンからプラスミンへの転化）の存在により、測定された成熟ＰａｕＡポリペプチド産物の存在の検出である。
【００６５】
限定的でない例としては、組換え発現ＰａｕＡポリペプチドの生物活性は、例えば国際特許出願公開ＷＯ  ９３／１４０２９において記載されているようなアガロース／スキムミルク重層アッセイを用いた、ウシプラスミノーゲンのプラスミンへの転化の検出により検査することができる。簡単にいえば、ＰａｕＡ生物活性をモニターするための調製物は、例えば１μｇタンパク質／ｍｌリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）などの適当な濃度に希釈され、ＯｘｏｉｄＴＭスキムミルク（１％ｗ／ｖ，  Ｕｎｉｐａｔｈ  Ｌｔｄ．，  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）およびウシプラスミノーゲン（１０−３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を含むアガロースシート（ＰＢＳ中１％ｗ／ｖ）のウェルの切れ込みに加えられる。生物活性を持つＰａｕＡポリペプチドの存在は、ウシプラスミノーゲンからプラスミンへの転化に引き続いて牛乳タンパク質の破壊を示すスキムミルク層における透明区域の形成の観察により検出される。別の方法では、下記の７．３節に記載されたような色素分析を使用することができる。
【００６６】
２．３．  組換えポリペプチドの発現および性質決定
ひとたびＰａｕＡコーディング配列が安定に適当な宿主細胞に導入されると、形質転換された宿主細胞はクローン的に繁殖され、そして得られた細胞はＰａｕＡポリペプチドの最大限の生産を誘導する条件下で増殖させ、このような条件は一般的に細胞を高密度まで増殖することを含む。発現ベクターが誘導性プロモーターを含む場合、温度シフト、栄養枯渇、無償性誘導物質（非代謝性誘導物質）（例えばイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の炭水化物の類似体）の付加、過度の代謝副産物の蓄積等の適当な誘導条件が、発現を誘導するのに必要であるものとして用いられる。
【００６７】
発現されたＰａｕＡポリペプチドが宿主細胞の内部に保持された場合、細胞は集菌および溶解され、そして産物はタンパク質分解を最小限に抑えるための、当該技術分野で既知の抽出条件下、例えば４℃で、またはプロテアーゼ阻害剤の存在下で、またはその両方の条件で、溶解液から単離され精製される。発現されたＰａｕＡポリペプチドが宿主細胞から分泌されると、枯渇された栄養培地を簡単に収集することができ、生産物をそこから単離することができる。
【００６８】
発現されたＰａｕＡポリペプチドは、細胞溶解液または培養培地から、以下の方法、すなわち硫酸アンモニウム沈澱、大きさによる分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、およびアフィニティクロマトグラフィーのいずれかの組み合わせ（しかしそれだけに制限されない）を含む標準的方法を用いて適当なやり方で、実質的に精製または単離することができる。発現されたＰａｕＡポリペプチドが生物活性、すなわちプラスミノーゲンを活性化する能力を示す場合、上述したアガロース／スキムミルク重層アッセイまたは下記の７．３節に記載されたクロマトグラフィーアッセイ、などのアッセイの使用、またはプラスミノーゲンの活性を検出する他の関連したアッセイにより、調製物の純度の増加を精製過程の各段階で監視されることができる。もし発現されたポリペプチドが生物活性を欠くならば、発現ポリペプチドは、例えば、大きさ、またはＰａｕＡポリペプチドに対する他の特異的な抗体に対する反応性、または融合タグの存在に基づいて検出することができる。
【００６９】
このように、本発明はさらに、ＰａｕＡポリペプチドの生産に誘導的な条件下で組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養しおよび細胞培養からのＰａｕＡポリペプチドを回収することを含む、ＰａｕＡポリペプチドを調製する方法を提供し、該組換え発現ベクターは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置２６からアミノ酸位置２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質；または（ｂ）ＰａｕＡタンパク質に実質的に相同なポリペプチド；または（ｃ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのペプチド断片；または（ｄ）融合相手と融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞中でのポリヌクレオチド分子の発現を制御する一またはそれ以上の制御因子と機能的に結合しているようなポリヌクレオチド分子を含む。
【００７０】
ひとたび十分な純度のＰａｕＡポリペプチドが得られると、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、プラスミノーゲンからプラスミンへの転換の生物活性などを含む標準的方法によって性質決定することができる。ＰａｕＡポリペプチドのアミノ酸配列は、標準的なペプチド配列決定技術を用いて決定することができる。ＰａｕＡポリペプチドは親水度分析（例えばＨｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：３８２４を参照）、または類似のソフトウェアアルゴリズム（ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）を用いることによりさらに性質決定し、ＰａｕＡポリペプチドの親水性および疎水性領域を同定することができる。構造分析が、特異的二次構造を帯びたＰａｕＡポリペプチドの領域を同定するために行われることができる。Ｘ線結晶分析（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，  １９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １１：７−３）、コンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ（ｅｄｓ），  １９８６，  ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの生物物理学的方法が、ＰａｕＡタンパク質とその基質の間の相互作用の領域の位置づけおよび研究のために用いることができる。より効果的なワクチン合成物を設計するために、ＰａｕＡポリペプチドの特異的部分だけを含むワクチンを選択するために、または天然ＰａｕＡタンパク質によるプラスミノーゲンの活性化を阻止することができる治療学的または薬学的化合物を設計または選択するために、これらの研究から得られた情報を用いることができる。
【００７１】
本発明の実施に有用なＰａｕＡポリペプチドは、（ａ）生物学的に活性、すなわち哺乳類のプラスミノーゲンをプラスミンに転化でき；または（ｂ）免疫原性、すなわち哺乳類の動物種に投与された場合乳腺炎に対する防御反応を誘導することができ；または（ｃ）哺乳類の動物種に投与された場合、診断用試薬として有用である抗ＰａｕＡタンパク質特異的な抗体の生産を誘導することができ；または（ｄ）Ｓ．ｕｂｅｒｉｓなどの乳腺炎をひきおこす病原体による感染から生じるか、または本発明のワクチンの投与から生じる、哺乳類の血液または血清の試料中における、抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体の存在を検出するための診断用試薬として用いることができるものである。このようなポリペプチドは、一度調整されると、当該技術分野で既知の慣例的スクリーニング法を用いるだけで同定することができる。例えば、哺乳類のプラスミノーゲンをプラスミンに転換する能力はここに記載した生物学的定量法の一つを用いて決定することができる。乳腺炎に対する防御免疫反応を誘導する能力は、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのいくつかの種によりひきおこされる乳腺炎にかかりやすい哺乳類の種に属する動物に、ＰａｕＡポリペプチドを投与すること、およびＰａｕＡ中和抗体の存在、またはワクチン投与を受けた動物の、その後の乳腺炎原病原体の感染に対する抵抗能力の検定により、同定することができる。ＰａｕＡタンパク質特異的抗体の産生を誘導する能力は、マウス、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、乳牛などのモデル動物にＰａｕＡポリペプチドを投与すること、および標準的方法によりその動物の血清転換を試験することにより同定することができる。診断用試薬としてＰａｕＡポリペプチドを使用する可能性は、前もってＳ．ｕｂｅｒｉｓなどの乳腺炎原因病原体の感染を受けた、または本発明のワクチンを前もって投与された動物の血液または血清の試料にＰａｕＡポリペプチドをさらすこと、およびＥＬＩＳＡ分析などの標準的方法を用いて、試料のＰａｕＡタンパク質特異的抗体のＰａｕＡポリペプチドへの結合を検出することにより決定することができる。
【００７２】
特定的だが限定的でない本発明の実施に有用なＰａｕＡポリペプチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６からアミノ酸位置約２８６の、または、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約２８６のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【００７３】
特定的だが限定的でない本発明の実施に有用なＰａｕＡペプチド断片の例は、アミノ酸位置約２８から約２８６、約１０４から約２８６、約１７２から約２８６、約２８から約１７０、約１０４から約１７０、約１０４から約２０８、約１７２から約２０８、約２８から約１０３、約２８から約２０８、および約１４９から約２８６からなる群から選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸サブシークエンスからなるペプチド断片を含む。
【００７４】
特定的だが限定的でない本発明の実施に有用な融合タンパク質の例は、アミノ酸位置約２８から約２８６、約１０４から約２８６、約１７２から約２８６、約２８から約１７０、約１０４から約１７０、約１０４から約２０８、約１７２から約２０８、約２８から約１０３、約２８から約２０８、および約１４９から約２８６からなる群から選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸サブシークエンスからなるペプチド断片と融合したＧＳＴを含むＧＳＴ融合タンパク質を含む。
【００７５】
本発明はゆえに、精製されたまたは単離されたＰａｕＡタンパク質、その実質的に相同なポリペプチド、そのようなＰａｕＡタンパク質および実質的に相同なポリペプチドのペプチド断片、および該ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチドまたはペプチド断片（総括的に「ＰａｕＡポリペプチド」として本明細書において言及した）を含む融合タンパク質を提供する。
【００７６】
３．ＰａｕＡの類似体および誘導体
本発明はさらに、前述したＰａｕＡポリペプチドの類似体および誘導体を提供する。ポリペプチドについて有用性が上記で定義されたように、そのような類似体および誘導体は本発明の実施に有用である。
【００７７】
類似体の生産を生ずる操作は遺伝子レベルまたはタンパク質レベルかまたはその両方で起こりうる。遺伝子レベルでは、例えば、ＰａｕＡポリペプチドをコードするクローン化されたＤＮＡ分子は、一またはそれ以上の既知の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰａｕＡタンパク質の類似体をコードするように改変することができる。このような改変は、エンドヌクレアーゼ消化、翻訳、開始および／または終止配列を創造または破壊する変異、またはコーディング領域に変異を作る変異、またはそのどれかの組み合わせを含むが、それだけに限定されない（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，上記を参照）。Ｘ線照射または化学的変異原のような変異誘発剤に対する曝露、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの部位特異的変異誘発（例えばＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５３：６５５１参照）（しかし、それだけに限定されない）を含む当該技術分野で既知の変異誘発のいかなる技術も使用することができる。
【００７８】
ＰａｕＡポリペプチドの操作はタンパク質レベルでも行うことができる。タンパク質の一またはそれ以上の化学的改変は、以下の技術のいずれかの方法を含む、既知の技術を用いることにより行うことができる。すなわち、カルバゼート（ｃａｒｂａｚａｔｅｓ）または三次中心（ｔｅｒｉｔａｒｙ  ｃｅｎｔｅｒｓ）を生産するための、天然タンパク質の一またはそれ以上のＬ−アミノ酸の、対応するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体、またはアミノ酸模擬体による置換；または例えばトリプシン、キモトリプシン、パパイン、またはＶ８プロテアーゼによるタンパク質融解的な（ｐｒｏｔｅｉｏｌｙｔｉｃ）な切断、または例えばＮａＢＨ４または臭化シアンによる処理、またはアセチル化、ホルミル化、酸化または還元などの特異的化学的改変を含むがそれだけに制限されない。
【００７９】
ＰａｕＡポリペプチドは、一またはそれ以上の化学基の結合により誘導することができる。アセチル基、硫黄結合基、グリコシル基、脂質、およびリン酸、および／または、もう一つのＰａｕＡポリペプチド、または血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、または商業的な活性化されたＢＳＡ等の他のタンパク質、またはポリアミノ酸（例えばポリリジン）、または多糖（例えば、セファロース、アガロース、または改変または非改変セルロース）等を含む（しかし、それだけに限定さられない。そのような結合は、アミノ酸側鎖および／またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において共有結合されていることが望ましい。このような結合反応を行う方法は、タンパク質化学分野においてよく知られている。
【００８０】
本発明の実施に有用な誘導体は、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーがＰａｕＡポリペプチドまたはその類似体または他の誘導体に結合し、それにより少なくとも部分的にポリペプチドの免疫原性は残したまま付加的な望ましい性質を提供するものを含む。これらの付加的な望ましい性質は水溶液中の溶解性を増加すること、貯蔵中の安定性を増加すること、タンパク質の分解への抵抗性を増加すること、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加することなどを含む。ＰａｕＡポリペプチドへの結合に適した水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含むがそれだけに限定されない。該ホモポリマーおよびコポリマーは、片方の末端を置換されていないか、またはアルキル基、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、ポリビニルエチルエーテル、およびα、β−ポリ［２−ヒドロキシエチル］−ＤＬ−アスパルトアミドにより置換されている。ポリエチレングリコールが特に好ましい。タンパク質の水溶性ポリマーの複合体を作る方法は、当該技術分野で既知であり、特に米国特許第３，７８８，９４８号；米国特許第３，９６０，８３０号；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第４，０５５，６３５号；米国特許第４，１７９，３３７号；米国特許第４，２６１，９７３号；米国特許第４，４１２，９８９号；米国特許第４，４１４，１４７号；米国特許第４，４１５，６６５号；米国特許第４，６０９，５４６号；米国特許第４，７３２，８６３号；米国特許第４，７４５，１８０号；欧州特許（ＥＰ）第１５２，８４７号；ＥＰ第９８，１１０号；および日本特許（ＪＰ）第５，７９２，４３５号などに記載されており、これらの特許は参考文献として本明細書中に援用されている。
【００８１】
本発明の実用に有用な類似体および誘導体は、ＰａｕＡポリペプチドについて上に記載された方法を使用することにより同定することができる。
【００８２】
４．抗乳腺炎ワクチン
本発明はさらに、免疫学的に効果的な量の、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６から約２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質；または（ｂ）ＰａｕＡタンパク質の実質的に相同なポリペプチド；または（ｃ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのサブシークエンスからなるペプチド断片；または（ｄ）融合相手と融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片を含む融合タンパク質；（ｅ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、または融合タンパク質の類似体または誘導体；または（ｆ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、または類似体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み、そのタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子は哺乳類での乳腺炎に対する防護反応を誘導することができ；そしてワクチンはまた獣医学的に許容できる担体を含む、乳腺炎に対して哺乳類に属する動物を防御するためのワクチンを提供する。
【００８３】
限定的でない態様では、本発明のワクチンは、本発明の発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子を含む形質転換された宿主細胞を含み、発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子は、哺乳類での乳腺炎に対する防御反応を誘導することのできる本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、または類似体を生産するために、宿主細胞の中で発現される。宿主細胞は本発明の発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子を発現することができるいずれの細胞でもよく、そして哺乳類の動物にワクチン中で投与することができるいかなる細胞でもよい。限定的でない態様では、このような宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞である。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「免疫学的に効果的な量」という用語は、哺乳類に投与された場合乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる、例えば本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子の免疫原的量を指す。
【００８５】
「防御反応を誘導することができる」という句は、乳腺炎に対してワクチン投与された哺乳類を防御するのに役立つ、抗体性または細胞性免疫反応のどちらかまたはその両方を含む、ワクチン投与に反応して哺乳動物体内で免疫を基礎とした反応を誘導しまたは増加することを含むように、本明細書中で広く用いられる。本明細書中で使用されている「防御反応」「防御する」という用語は、乳腺炎の完全な予防または乳腺炎の原因病原体による感染の完全な予防に限定されず、ワクチン投与されていない感染された哺乳類と比べた場合に、病原体による感染の程度または速度を幾ばくか減少させ、または牛乳生産のいくらかでも検出できる増加を含む、病原体の感染に起因する疾患の重傷度または症候または症状のいくらかの軽減、または牛乳生産の減少のいかなる検出しうる阻害や遅速を含むことを企図する。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「哺乳類に属する動物種」および「哺乳類」という用語は、ウシの種類（乳牛、雄牛）、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、およびネコに属する動物を含めた、本発明のワクチンを使用することで乳腺炎に対して防御されうるいずれかの哺乳類の動物種、または哺乳動物の種類を指す。
【００８７】
本発明のワクチン組成物は、標準的緩衝液、担体、安定化剤、希釈剤、防腐剤、および／または可溶化剤を用いた、許容しうる慣習的方法を用いて作成することができ、持続的放出を容易にするように設計することもできる。希釈剤は水、塩類溶液、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含むことができる。等張性のための付加物としては、特に塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースなどを含むことができる。安定化剤としては特に、アルブミンなどを含む。
【００８８】
アジュバントは場合により、ワクチンにおいて用いることができ、限定的でない例として、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  ｉｎｃ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中スクアレンなどの水中油乳濁液、フロイントの完全および不完全アジュバントなどの油中水乳濁液、Ｂｌｏｃｋ  コポリマー（ＣｙｔＲｘ，  Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）またはＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）などの他の精製または半精製サポニン画分  、モノホスホリル脂質ＡおよびＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバントを含む。ワクチンはさらに、インターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインなどの一またはそれ以上の免疫調節剤を含むことができる。
【００８９】
適当な、獣医学的に許容しうるワクチンビヒクル、担体、および付加物が、知られているかまたは当業者に明らかになるであろう（例えば、参考文献として本明細書中に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照）。ワクチンは溶液として、または別の方法では投与前に滅菌希釈溶液で再構成されるような凍結乾燥の形で貯蔵される。
【００９０】
本発明はさらに、免疫原の持続的放出のためのワクチン製剤を提供する。このような持続的放出製剤の例は、例えばポリ（乳酸）や、ポリ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等の生物学的適合性のポリマーの合成物と組み合わせた免疫原を含む。薬剤伝達ビヒクルにおける分解可能なポリマーの構造、選択および使用は、本明細書中で参考文献として援用するＡ．Ｄｏｍｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３：  ２７９−２９２う含むいくつかの出版物においてレビューされている。薬学的製剤におけるポリマーの選択および使用についてのさらなる手引きは、本明細書中に参考文献として援用するＭ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），  １９９０，  ”Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ”  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．４５，  Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹの中に見ることができる。別の方法では、または付加的には、本発明のワクチンのＰａｕＡポリペプチド、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチドは、投与および効果を改善するためにマイクロカプセル化することができる。抗原のマイクロカプセル化の方法は当該技術分野でよく知られており、参考文献として本明細書中に援用する、米国特許第３，１３７，６３１号；米国特許第３，９５９，４５７号；米国特許第４，２０５，０６０号；米国特許第４，６０６，９４０号；米国特許第４，７４４，９３３号；米国特許第５，１３２，１１７号；および国際公開ＷＯ  ９５／２８２２７に記載されている技術を含む。
【００９１】
リポソームもまた、本発明のＰａｕＡポリペプチド、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子のいずれかの保存的放出を提供するために用いることができる。リポソーム製剤をいかにして作り、そして使用するかに関する詳細は、特に、米国特許第４，０１６，１００号；米国特許第４，４５２，７４７号；米国特許第４，９２１，７０６号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，９４４，９４８号；米国特許第５，００８，０５０号；米国特許第５，００９，９５６号などにおいて見ることができ、これらすべては本明細書中で参考文献として援用する。
【００９２】
限定的でない態様においては、本発明のワクチンは、乳腺炎および場合により一またはそれ以上の、哺乳類を苦しめる可能性がある疾病または病理学的状態に対して哺乳類に属する動物種を防御するための混合ワクチンであることができ、該混合ワクチンは、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置約２６から約２８６のアミノ酸配列  を含むＰａｕＡタンパク質；または（ｂ）ＰａｕＡタンパク質に実質的に相同なポリペプチド；または（ｃ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのサブシークエンスからなるペプチド断片；または（ｄ）融合相手と融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片を含む融合タンパク質；または（ｅ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、または融合タンパク質の類似体または誘導体；または（ｆ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、または類似体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む免疫学的に効果的な量の第一成分を含み、このタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体、またはポリヌクレオチド分子は哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができ、哺乳類を苦しめる可能性がある疾病または病理学的状態に対する防御反応を誘導することのできる抗原を含む第二成分および獣医学的に許容しうる担体を含む。
【００９３】
混合ワクチンの第二成分の抗原は、乳腺炎または哺乳類を苦しめる可能性がある他の疾病または病理学的状態に対する、または哺乳類に感染することができる病原体に対する防御反応を誘導する能力に基づき、当該技術分野で知られているようなやり方で選択される。特定の哺乳類の種類におけるワクチン組成物において有用であると知られているいかなる免疫原性組成物も混合ワクチンの第二成分に用いることができる。このような免疫原性組成物はウシヘルペスウイルス（ｓｙｎ．，  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）、ウシ呼吸系発疹ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｉｔａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ウシウィルス性下痢ウィルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型パラインフルエンザウィルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅＩ，  ＩＩ，  ｏｒ  ＩＩＩ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、  カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどのブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅなどの連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ロタウィルス、コロナウィルス、狂犬病  、Ｐ．ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃａ  、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどのパスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、破傷風トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ａｐｐ．）、およびその他の真核寄生生物などに対する防御を提供するものを含むが、それだけに限定されない。
【００９４】
第二成分を含む抗原は、キメラ分子または融合タンパク質を作るために第一成分のＰａｕＡポリペプチド、類似体または誘導体に場合により共有結合することができる。限定的でない態様では、第二成分の抗原は一つのハプテンを含み、そのハプテンの免疫原性は第一成分のＰａｕＡポリペプチド、類似体、または誘導体に結合することで検出可能なほど増加する。
【００９５】
混合ワクチンの第一および第二成分の共有結合した抗原を含むキメラ分子は、当該技術分野で知られた一またはそれ以上の技術を用いて合成することができる。例えば、キメラ分子は、標準的化学合成法（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７を参照）を用いた、商業的に入手可能なペプチド合成機を用いて合成的に生産することができる。別の方法では、個々の成分を個々に合成し、その後化学的結合基を使用することにより一緒に結合することができる。別の方法では、キメラ分子は組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができ、その技術によると、例えばキメラ分子の異なる抗原をコードするヌクレオチド配列を含む別々のポリヌクレオチド分子が一緒に読み枠に合わせてスプライシングを受け、そしてその後のキメラ分子の単離のために適した、宿主細胞のなかで発現される。本発明のワクチンがポリペプチドではなくポリヌクレオチド分子を含む場合は、スプライシングを受けたポリヌクレオチド分子がワクチン組成物中に用いることができる。このような組換え技術を行うための多くの手引きがＭａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  上記；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）  １９９５，  上記；およびＥｒｌｉｃｈ，１９９２，  上記において提供されている。
【００９６】
上に記述したように、本発明のワクチンは本発明の発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子を含む形質転換された宿主細胞を含むことができ、その場合、哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体を生産するために、発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子を宿主細胞の中で発現する。限定的でないさらなる態様では、本発明の混合ワクチンは、病原体としてＳ．ｕｂｅｒｉｓによりひきおこされる乳腺炎以外のいずれかの疾病または病理学的状態と関連する宿主細胞を含み、その疾病または病理学的状態は哺乳類を苦しめる可能性があり、その宿主細胞は本発明の発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子をさらに含み、その発現ベクターまたはポリヌクレオチド分子は哺乳類における乳腺炎に対する防御反応を誘導することができる本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質または類似体を生産するために宿主細胞の中で発現され、そしてそのような宿主細胞はＳ．ｕｂｅｒｉｓによりひきおこされる乳腺炎以外の疾病または病理学的状態に対する免疫防御反応を誘導するのに役立つ。限定的でない態様においては、このような宿主細胞は、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、  カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｓｐ．）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどのブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅなどの連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｐ．ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃａ  、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａなどのパスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ａｐｐ．）、および他の真核寄生生物からなるグループから選択される。
【００９７】
本発明はさらに、免疫学的に有効量の（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置およそ２６からアミノ酸位置およそ２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質；または（ｂ）ＰａｕＡタンパク質に実質的に相同なポリペプチド；または（ｃ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのサブシークエンスからなるペプチド断片；または（ｄ）融合相手に融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片；または（ｅ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片または融合タンパク質の類似体または誘導体；または（ｆ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片または融合タンパク質または類似体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であり、これらのタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片または融合タンパク質、類似体、誘導体またはポリヌクレオチドは、哺乳類の乳房炎に対する防御性応答を誘導することができるものであり、これを獣医学的に受容可能な担体を組み合わせることを含む、乳房炎に対して哺乳類の動物種を防御するためのワクチンの製造方法を提供する。
【００９８】
本発明はさらに、本発明の免疫学的に有効量のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、乳房炎に対して哺乳類の動物種をワクチン化する方法を提供する。
【００９９】
哺乳動物に投与される免疫原の量は、ワクチン化される動物の動物種、年齢、体重、健康状態、および総体的な身体特性のような因子、および投与される特定の免疫またはワクチン組成物によって決定される。各パラメータの最適量の決定は、例えば経験的な研究のような慣用的方法を用いて行うことができる。特にウシ属の動物種に対する本発明のワクチンのＰａｕＡポリペプチドの投与に関しては、投与量は、好ましくはポリペプチドにして約０．０１μｇから約１００ｍｇまでの範囲であり、より好ましくは約０．１μｇから約１０ｍｇの範囲であり、もっとも好ましくは約１．０μｇから約１．０ｍｇである。特にウシ属の動物種に対する本発明のワクチンのポリヌクレオチドの投与に関しては、投与量は、好ましくはポリヌクレオチドにして約０．０５μｇから約５００ｍｇまでの範囲であり、より好ましくは約０．５μｇから約５０ｍｇの範囲であり、もっとも好ましくは約５．０μｇから約５ｍｇである。さらに、ワクチンの一般的な投与体積は、一個体当たり一回投与あたり約５０μｌから約５０ｍｌの範囲である。
【０１００】
ワクチン予防法もまた、上に記載された因子に基づいて選択することができる。動物は、離乳年齢、またはさらに若い年齢、または繁殖直前または繁殖時、分娩時、乳終了時、または乳房炎が群れの動物種の一頭または複数に最初に発症し始めた時を含む、いかなる適当な時期にもワクチン化することができる。完全な防御を達成するために、追加投与すなわち追加抗原刺激が必要とされる場合がある。適当な免疫防御が達成されたか決定する方法（例えば血清変換を決定することまたは中和アッセイを利用することによる）は、当該技術分野でよく知られている。
【０１０１】
本発明のワクチンは、例えば経口、鼻腔内、筋肉内、乳房内、リンパ節内、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、直腸または膣内投与のような適当な経路、または複数の経路の組み合わせによって投与することができる。当業者にとっては、選択された経路に従ってワクチン組成物を容易に製剤化することが可能であろう。
【０１０２】
本発明はさらに、免疫学的に有効量の（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸位置およそ２６からアミノ酸位置およそ２８６のアミノ酸配列を含むＰａｕＡタンパク質；または（ｂ）ＰａｕＡタンパク質に実質的に相同なポリペプチド；または（ｃ）ＰａｕＡタンパク質または実質的に相同なポリペプチドのサブシークエンスからなるペプチド断片；または（ｄ）融合相手に融合したＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、またはペプチド断片からなる融合タンパク質；または（ｅ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片または融合タンパク質の類似体または誘導体；または（ｆ）ＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質または類似体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む第一の容器および獣医学的に受容可能な担体または希釈剤からなる第二の容器を含み、これらのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、誘導体またはポリヌクレオチド分子は、哺乳類の乳房炎に対する防御性応答を誘導することができる、乳房炎に対して哺乳類の動物種を防御するためのワクチンキットを提供する。
【０１０３】
５．抗ＰａｕＡ抗体の生産
本発明は、本発明のＰａｕＡポリペプチド、類似体、または誘導体に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、天然または組換えＰａｕＡポリペプチドを精製するため、または例えば感染哺乳動物由来の組織切片中、若しくは細胞中、組織中、または液体試料中のＰａｕＡタンパク質の存在を、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット解析で検出するため、または感染動物中の天然のＰａｕＡタンパク質活性を治療的に中和するための親和性試薬として使用できる。
【０１０４】
抗体は、本発明のＰａｕＡポリペプチド、類似体または誘導体のいずれに対しても作製され得る。ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスを含む種々の宿主動物を（これらに限定されるものではないが）、抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体を生産するための既知の方法に従って使用できる。例えば上の５．４節に挙げた種々のアジュバントを、抗体生産を増強するために使用できる。
【０１０５】
ポリクローナル抗体は免疫化された動物から得られ、標準的な技術を用いて抗ＰａｕＡポリペプチド特異性を検定することができる。または、ＰａｕＡポリペプチドに対するモノクローナル抗体が、培養用の永続的な細胞株によって抗体生産を提供するいずれかの技術を用いて調製することができる。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，  １９７５，  ２５６：  ４９５−４９７）によって最初に記載されたハイブリドーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：  ７２；  Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ２０２６−２０３０）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）が含まれるが、これらに限定されるものではない。または、一本鎖抗体の生産について記載された方法（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照）を、ＰａｕＡポリペプチド特異的一本鎖抗体を生産するために採用することができる。これらの開示文献は、本明細書中で参考文献として援用する。
【０１０６】
本発明のＰａｕＡポリペプチド、類似体または誘導体に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も、本発明の範囲に含まれ、既知の方法によって生産することができる。このような断片には、完全な抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元して生成することができるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。または、ＰａｕＡポリペプチド、類似体または誘導体に対する目的の特異性を有するＦａｂ断片を迅速に同定するために、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：  １２７５−１２８１）。
【０１０７】
モノクローナル抗体および抗体断片の生産の方法は、当該技術分野ではよく知られ、さらに他の文献ではＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＪ．  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  １９８６，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。上に挙げた開示文献すべては、本明細書中で参考文献として援用する。
【０１０８】
６．アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム
本発明の範囲にはさらに、ＰａｕＡ  ｍＲＮＡを分解および／またはその翻訳を阻害するために結合して機能するアンチセンスオリゴヌクレオチド、チオりん酸、およびリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列がある。
【０１０９】
アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合してタンパク質の翻訳を妨げることでｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻害するように働く。例えば、少なくとも約１５塩基でＰａｕＡポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の固有の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用的なフォスホジエステル法によって合成することができる。
【０１１０】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒できる酵素的なＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構には、リボザイム分子の相補標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、次にヌクレオチド内溶解性切断が含まれる。ＰａｕＡ  ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド内溶解性切断を特異的・効率的に触媒するように設計されたハンマーヘッドモチーフ・リボザイム分子も、本発明の範囲に含まれる。
【０１１１】
可能性のあるＲＮＡ標的中の特異的なリボザイム切断部位も、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣという配列を含むリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５から２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る、二次構造のような予想される構造特性について評価することができる。標的候補の適合性もまた、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易さを例えばリボヌクレアーゼ防御アッセイを用いて評価することができる。
【０１１２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両者とも、既知の方法によって調製することができる。これらの方法には、例えば固相フォスホアミド化学合成のような化学合成についての技術が含まれる。または、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを援用する広範なベクターに導入することができる。
【０１１３】
本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々の修飾を、細胞内安定性および半減期を増大させるために導入することができる。可能性のある修飾には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を分子の５’および／または３’末端に付加すること、またはオリゴヌクレオチド骨格にフォスホジエステル結合ではなく、チオりん酸または２’−Ｏ−メチルを使用することが含まれるがこれらに限定されるものでは内。
【０１１４】
７．診断用キット
本発明はさらに、診断用キットを提供する。限定的でない態様においては、診断用キットは天然のＰａｕＡタンパク質に対して指向する抗体に特異的に結合する本発明のＰａｕＡタンパク質、実質的に相同なポリペプチド、ペプチド断片、融合タンパク質、類似体、または誘導体を含む第一コンテナ；および抗ＰａｕＡタンパク質特異的抗体に対して作製された二次抗体を含む第二コンテナを含む。二次抗体は、好ましくは検出可能な標識を含む。このような診断用キットは、現在ＰａｕＡ生産生物（例えばＳ．  ｕｂｅｒｉｓ）に感染している、または以前に感染していた哺乳動物、または本発明のワクチンでワクチン化された後に血清変換を受けた哺乳動物を検出するのに有用である。
【０１１５】
限定的でないさらなる態様においては、本発明の診断用キットは、天然のＰａｕＡタンパク質に特異的に結合する本発明の抗体（一次抗体）を含む第一コンテナ；および天然のＰａｕＡタンパク質上の異なるエピトープに特異的に結合するか、または一次抗体に特異的に結合する二次抗体を含む第二コンテナを含む。二次抗体は好ましくは検出可能な標識を含む。限定的でないさらなる態様においては、診断用キットは、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓのような病原体のＰａｕＡタンパク質コーディングポリヌクレオチド分子を特異的に増幅するために有用な本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含むコンテナを含む。これらの診断用キットの後者二つは、現在ＰａｕＡ生産生物（例えばＳ．  ｕｂｅｒｉｓ）に感染している動物を検出するために有用である。
【０１１６】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１１７】
【実施例】
実施例１：  ＰａｕＡをコードするＤＮＡ分子の同定およびクローニング
１．１．  アミノ酸配列分析
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６（Ｌｏｔ  Ｎｏ．０５３１９６ｗ）由来のＰａｕＡタンパク質を、国際特許出願公開ＷＯ  ９３／１４２０９に記載された方法、すなわち無細胞培養濾過液からの硫安沈澱、次に分子ふるいクロマトグラフィー、次に１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）上での分離、そしてＮ末端エドマン配列決定法のためのＰｒｏＢｌｏｔｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）への電気ブロットを使用して精製した。ＰａｕＡバンドに対応するブロット領域（計算上３５ｋＤａ）が切り出され、ＡＢＩ  ４９４  タンパク質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるアミノ酸配列分析が行われた。内部配列決定のため、精製されたＰａｕＡは上述のように１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、改変銀染色（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６８：８５０−８５８）によって染色した。ＰａｕＡバンドを切り出し、ゲル切片をＤＴＴで還元し、アクリルアミドでアルキル化し、５０％アセトニトリル／ＮＨ４ＨＣＯ３中で洗浄し、そして真空乾燥した。ゲル切片は体積５０μｌで０．１μｇの改変トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）で処理し、３７℃で一晩インキュベーションした。トリプシン切断由来のペプチドは１５０μｌの６０％アセトニトリル／ＮＨ４ＨＣＯ３中で超音波処理して二度抽出し、次に１×２５０ｍｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏ，  ＭＡ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。２２０ｎｍ吸光のペプチドのピークが回収され、ＡＢＩ  ４９４タンパク質シークエンサーによる解析に供された。得られたアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として示す。Ｐｅｐ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＰｅｐ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）はＮ末端配列決定で得られ、一方Ｐｅｐ−３からＰｅｐ−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は精製されたＰａｕＡのトリプシン酵素処理の結果得られた。
【０１１８】
１．２． Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓからの染色体ＤＮＡの単離
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および９５−１４０は、それぞれ１００ｍｌの静的脳心臓浸出ブロス（ＢＨＩ，  Ｄｉｆｃｏ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ．  ＭＩ）中において３７℃で２４時間保温され、そしてその後回収した（７，７００ｘｇ、２０分）。湿った細胞ペレットは、使用まで−２０℃にて保存された。細胞は、湿った細胞ペレットの５ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （１０  ｍＭ）／ＥＤＴＡ  （１  ｍＭ）（ＴＥ）における再懸濁により洗浄し、回収し（２，０００ｘｇ、１５分）、そして２ｍｌのＴＥに再懸濁した。洗浄された細胞は、６５℃にて２０分間加熱処理され、−２０℃にて一晩冷凍され、その後２５０Ｕ  ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ，  Ｓｉｇｍａ）、１００ｍｇ  リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）、および５０μｇ  ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）の添加、および３７℃、１０５分間のインキュベーションにより溶解された。プロテナーゼＫ（５００μｇ）（Ｓｉｇｍａ）が添加され、かつ溶解を完全にするための終濃度２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ添加まで、さらに３時間インキュベーションは続行された。溶解された細胞は、３７℃にてさらに３０分間インキュベーションし、トリス飽和フェノールにより１回抽出し、そしてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）により２回抽出した。染色体ＤＮＡは、２．５倍体積の１００％エタノールおよび０．１倍体積の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ  ５．２）の添加、−２０℃における２４時間の冷却、および遠心分離（１５，０００ｘｇ、１５分、４℃）によるペレット化により沈澱させた。ＤＮＡは、７０％エタノールによりすすぎ、乾燥し、ＴＥに再懸濁し、かつ２６０ｎｍの吸光度により定量化した。
【０１１９】
１．３． Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ由来ｐａｕＡ遺伝子の部分クローニング
縮重オリゴヌクレオチド（図１）は、精製されたＳ．  ｕｂｅｒｉｓ  ＰａｕＡのアミノ酸配列を基に設計された。オリゴヌクレオチドＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）は、Ｐｅｐ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸１１−１８をコードするｐａｕＡ遺伝子の部分にハイブリッド形成するように設計された。オリゴヌクレオチドＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびＥＲ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）は、Ｐｅｐ−５内部配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のアミノ酸１３→５をコードするｐａｕＡ遺伝子の部分にハイブリッド形成するように設計され、そして縮重の度合において異なっている。
【０１２０】
ｐａｕＡ遺伝子断片のＰＣＲ増幅のため、１ｘＰＣ２緩衝液（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、２００μＭの各デオキシ−ＮＴＰ、１００ｐ  ｍｏｌの各プライマー、７．５Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、および０．１５Ｕ  クローン化Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）温度安定性ポリメラーゼを含む５０μｌ反応物において、オリゴヌクレオチドＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）は、単独で、または、ＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）またはＥＲ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と同時に用いられた。ＤＮＡ鋳型は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６または系統９５−１４０より精製された染色体ＤＮＡ５００ｎｇであった。増幅は下記のように行われた：すなわち、変性（９４℃にて５分）；変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（６０℃にて１分）、および重合（７２℃にて２分）を１サイクルとして３０サイクル；それに続く７２℃、７分間の最終伸長により行う。
【０１２１】
増幅された産物は、２％（ｗ／ｖ）  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）における分離により可視化された。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来のＤＮＡを鋳型とし、ＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のみを用いた反応の結果、明瞭な６４０ｂｐ産物が増幅された。ＰＣＲ反応においてＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６または系統９５−１４０由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）をＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）またはＥＲ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と同時に用いた際には、６４０ｂｐおよび５６０ｂｐの２つの産物が常に増幅された。このデータは、縮重オリゴヌクレオチドＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）が、ｐａｕＡ領域内部への結合能を有し、そして、その結合部位はＰｅｐ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のＣ−末端側、すなわちＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびＥＲ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）の標的結合領域へ向けられていることを示唆した。
【０１２２】
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来ＤＮＡおよびＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）（６４０ｂｐ）、または、ＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）（６４０および５６０ｂｐ）を用いた反応により得られたＰＣＲ産物を、さらに解析した。プライマーのペアＲＡ９／ＥＲ３５によるＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来ＤＮＡの増幅により得られたＰＣＲ反応産物（６４０および５６０ｂｐ）も、これらの系統のｐａｕＡ領域が類似しているかどうかを決定するために解析された。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来の６４０ｂｐおよび５６０ｂｐの産物、およびＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来の６４０ｂｐの産物は、適切な制限エンドヌクレアーゼ（ＫｐｎＩ  （ＲＡ９）、または、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ（ＲＡ９／ＥＲ３５））によるＰＣＲ産物の消化の後に、それぞれｐＵＣ１８にクローニングされた。得られたプラスミドの配列解析により、ＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）の二次的結合部位は、オリゴヌクレオチドＥＲ３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）の結合部位（内部Ｐｅｐ−５の３’末端側（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のアミノ酸１３→５）に位置することが確認された。さらに、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および系統９５−１４０より増幅された６４０ｂｐのＤＮＡ断片内部の３６０ヌクレオチド領域の比較は、これら２系統由来の部分ｐａｕＡ遺伝子の間には、非常に高い（９９．２％）ヌクレオチド相同性があることが示された。配列の解析は、ｐａｕＡのＯＲＦ内部におけるＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、およびＳａｌＩに対する制限エンドヌクレアーゼ部位の存在を示し、従って、特異的な制限断片に位置するｐａｕＡ領域全体を得るために設計されるプラスミドゲノムライブラリーの構築における、これらの酵素の利用を排除する。
【０１２３】
１．４．  プラスミドゲノムライブラリーの構築およびスクリーニング
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来および系統９５−１４０由来の１０μｇの染色体ＤＮＡを、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩにより３７℃にて８時間消化し、フェノール／クロロホルム（２４：１）により抽出し、そして−２０℃にて保存した。１μｇのプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＵＣ１８）は、ＢａｍＨＩによる消化、および提供業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）の推奨するウシ腸管ホスファターゼを用いた脱リン酸化により調製された。線状で脱リン酸化されたベクター（０．５μｇ）は、提供業者（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）により推奨されるように、５μｇのＢｇｌＩＩ消化染色体ＤＮＡにライゲーションし、そしてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を形質転換するために利用された。
【０１２４】
ＰａｕＡ活性の検出を容易にするため、スキムミルク寒天プレートアッセイが用いられた。Ｅ．  ｃｏｌｉ中のライブラリースクリーニングのため、プレートアッセイ材料は、脱脂粉乳（１％  ｗ／ｖ；  Ｏｘｏｉｄ（登録商標））、ウシプラスミノゲン（０．０１５Ｕ／ｍｌ；  Ｓｉｇｍａ  カタログ番号  Ｐ−９１５６）、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ；  Ｓｉｇｍａ）を添加したＢＨＩ寒天（Ｇｉｂｃｏ）を含んだ。ライブラリースクリーニングは、ｐＵＣ１８のラクトース・プロモーターを誘導するために、これらのプレートにさらに０．１  ｍＭ  ＩＰＴＧを添加したものを用いても行われた。このプレートアッセイでは、対照プレートからプラスミノゲンを除去することにより、非特異的なプロテアーゼ活性とプラスミノゲン依存性のＰａｕＡ活性とを区別することが可能である。この改変は、ライブラリースクリーニングにおいて得られる、陽性と予想されるクローンに関して、プラスミノゲン依存的なスキムミルクの分解を確認するために用いられた。
【０１２５】
上述のスキムミルクプレートにおいて分解領域を形成する形質転換Ｅ．  ｃｏｌｉ系統ＤＨ５αの単離株は、さらなる解析のために選択された。図２は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来ＤＮＡにより形質転換され、上記のように単離株の一例を示す。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来ＤＮＡを含む１単離株、および、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来ＤＮＡを含む１単離株が選択され、単一に精製され、そして、個々のコロニーをプラスミノゲンを含まないスキムミルクプレートプレート上で成長させても分解領域を形成できないことにより、それらのプラスミノゲン依存的ＰａｕＡ活性の発現能が確認された。プラスミノゲン依存性は、単離株それぞれを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａブロス（Ｄｉｆｃｏ）において成長させ、その後、濾過しない培養液の上清の一部分を、０．０１５Ｕ／ｍｌウシプラスミノゲンの存在下または非存在下でスキムミルク（１％  ｗ／ｖ）を添加したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）上にスポットすることにより確認された。これらの単離株は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来ＰａｕＡを発現する系統Ｐｚ３１８、およびＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来ＰａｕＡを発現する系統Ｐｚ３１９と表記され、それぞれに対応するプラスミドはｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９と表記された。
【０１２６】
１．５． ｐａｕＡコード領域の予備的解析
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来ＰａｕＡをコードする遺伝子の一部分に対応し、ＰＣＲにより増幅された６４０ｂｐ内部ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列解析に基づき、ライブラリースクリーニングにより得られたプラスミドの挿入配列の同一性を、ＰＣＲにより確認した。従って、ｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９は、ｐａｕＡ由来プライマーＲＡ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のみ、または、それをＥＲ３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）またはＥＲ４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）と同時に用いたＰＣＲにおける鋳型として用いた。５０μｌの反応混合液は、１ｘＰＣ２緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００ｐ  Ｍｏｌの各プライマー、７．５Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑ１、および０．１５Ｕ  クローン化Ｐｆｕポリメラーゼを含んだ。合成は下記の通り行われた。変性（９４℃にて５分）；変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（６０℃にて１分）、および重合（７２℃にて２分）を１サイクルとして３０サイクル；それに続く７２℃、７分間の最終伸長により行う。すべての反応において、予想される６４０ｂｐ（ＲＡ９による増幅）、５００ｂｐ（ＲＡ９／ＥＲ３７による増幅）、および３００ｂｐ（ＲＡ９／ＥＲ４０による増幅）に対応する産物の増幅に成功し、これらのＤＮＡ断片は、ｐａｕＡ遺伝子の既知の部分配列により予想されるものであった。このデータは、ｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９の内部に存在する挿入配列が、機能活性を有するＰａｕＡをコードすることができることを強く示唆した。
【０１２７】
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および系統９５−１４０それぞれのｐａｕＡ領域の構造をより完全に決定するため、プラスミドｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ．において自動ＤＮＡ配列分析機（ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供された。オリゴヌクレオチドＥＲ４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）およびＥＲ４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）は、過去に決定された部分ｐａｕＡヌクレオチド配列に由来し、そしてこの６４０ｂｐ領域より外側の配列決定のために用いられた。６４０ｂｐの部分遺伝子配列と組み合わせた場合、このさらなる配列決定の結果、ｐａｕＡ  ＯＲＦ全長だけにとどまらず、クローン化されたｐａｕＡ遺伝子に直接隣接する領域の予備的な配列決定がなされた。さらに、ベクター特異的Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーが、クローン化Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ  ＤＮＡ領域の終点を決定するために用いられた。図３に示されたように、これらの配列解析は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質に高い相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子が、ｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９にクローン化された挿入配列の内部に存在することを示した。ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質は、それぞれ、いくつかの原核生物種およびヒトを含む真核生物種に広く存在するＭｕｔＳおよびＭｕｔＬ相同物と比較して高度に保存されている。ＨｅｘＡおよびＨｅｘＢタンパク質は、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでの形質転換およびＤＮＡ複製の過程におけるミスマッチＤＮＡ修復において機能している。興味深いことに、ＨｅｘＡは、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて過剰発現された場合には、優性陰性表現型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を付与し（Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３：  ７１９６−７２０３）、従って自然発生的突然変異率の増加を引き起こす。
【０１２８】
１．６． Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ  ｐａｕＡ遺伝子の特異的ＰＣＲ増幅
ＰＣＲにより増幅されたｐａｕＡの６４０ｂｐ領域、および、プラスミドｐＥＲ３１８およびｐＥＲ３１９を用いたこの領域の外側配列の決定の両方による予備的な配列決定の結果は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ染色体ＤＮＡから直接正常のｐａｕＡ遺伝子を特異的に増幅するための、オリゴヌクレオチド・プライマーの設計のために用いられた。このアプローチは、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける正常ｐａｕＡのクローニングの過程において発生する可能性のある突然変異による、配列エラーの導入を排除する要求に基づくのが好ましい。このことは、他で報告されたように（Ｅｓｔｒａｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．  １０：  １１３８−１１４２）Ｅ．  ｃｏｌｉにおける他の正常ストレプトキナーゼの既知の毒性、および、Ｅ．  ｃｏｌｉ中で発現された場合にＨｅｘＡが示すと報告された優性陰性表現型（ミューテーター表現型）（Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  上記）の観点から特に考慮されたものである。
【０１２９】
従って、正常ｐａｕＡ遺伝子に隣接する、オリゴヌクレオチドＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびＥＲ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）が、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および９５−１４０からＰａｕＡをコードする１．１８ｋｂ領域を特異的に増幅するために用いられた。ＰＣＲ増幅は、それぞれの系統につき３回行われた。反応混合液は、２００ｎｇの精製染色体ＤＮＡ、１ｘＰＣ２緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００ｐ  ＭｏｌのプライマーＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、１００ｐ  ＭｏｌのプライマーＥＲ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、および７．５Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑ１、および０．１５Ｕ  クローン化Ｐｆｕ温度安定性ポリメラーゼを、１００μｌの最終試料体積中に含んだ。増幅は下記の通り行われた。変性（９４℃にて５分）；変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（５０℃にて１分）、および重合（７２℃にて２分）を１サイクルとして３０サイクル；それに続けて、標的である正常ｐａｕＡ遺伝子領域の増幅を完結させるための、７２℃、７分間の最終伸長を行った。増幅に引き続き、３回の試料それぞれより等量の一部分（７０μｌ、２．８μｇ）がプールし、そしてアガロースゲル電気泳動およびグラスミルク・マトリックス（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（登録商標）、  Ｂｉｏ１０１、  ＬａＪｏｌｌａ、  ＣＡ）による抽出により１．１８ｋｂの産物が精製され、それについて、ＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定機（Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、  Ｈｏｕｓｔｏｎ、  ＴＸ）によるダイデオキシ終止反応（ＤｙｅＤｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を用いた直接配列解析が行われた。合成オリゴヌクレオチド・プライマーＡＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＥＲ３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＥＲ３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＥＲ４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＥＲ４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＥＲ４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＥＲ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、およびＥＲ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）（図１）が、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および９５−１４０由来の増幅産物の両ＤＮＡ鎖の配列決定のため用いられた。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来の１．１８ｋｂ領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示されている。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来の１．１８ｋｂ領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示されている。
【０１３０】
１．７． ｐａｕＡ  ＯＲＦの分子解析
Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６のｐａｕＡ  ＯＲＦは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２０から９８０まで伸長し、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたように推定２８６アミノ酸のタンパク質をコードし、理論的に約３３，４１９ダルトンの分子量を有する。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０のｐａｕＡ  ＯＲＦは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド１２１から９８１まで伸長し、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されたように異なる推定２８６アミノ酸のタンパク質をコードする。Ｎ−末端配列解析に基づくと、両アミノ酸配列のアミノ酸１−２５は、天然ＰａｕＡの成熟の過程で除去されるようである。上記の２５アミノ酸からなるペプチド（２、７６７  Ｄａ）が、疎水性でかつ正電荷を有し、これはシグナル配列の特徴である（ＶｏｎＨｅｉｊｍ，  １９８５，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８４：  ９９−１０５）という観察結果は、このことと合致する。予想される両方向転写ターミネーター（図４）が、系統ｃ２１６の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）における、逆方向ｐａｕＡおよびＨｅｘＡ  ＯＲＦ群の間のヌクレオチド９７８−１、０８８に位置する。このステム−ループ構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の基礎を形成すると予想される、逆方向対称的な領域が、ヌクレオチド１，０１５から１，０３２まで、および１，０５４から１，０７１まで伸長する。さらに、ほぼ同一の両方向転写ターミネーターと予想されるものが、系統９５−１４０の配列における、逆方向ｐａｕＡおよびＨｅｘＡ  ＯＲＦ群の間のヌクレオチド９７９−１、０８９に位置する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。このステム−ループ構造の基礎を形成すると予想される、逆方向対称的な領域は、ヌクレオチド１，０１６から１，０３３まで、および１，０５５から１，０７２まで伸長する。対応するｍＲＮＡにおける、これらのステム−ループ構造の会合に関して算出された自由エネルギーは、約−１９ｋｃａｌである（Ｔｉｎｏｃｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２４６：  ４０−４１）。
【０１３１】
配列解析は、１．１８ｋｂ断片領域内部におけるＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６および系統９５−１４０の間の高いヌクレオチチド相同性を示す。この領域における、ヌクレオチドとコードされるアミノ酸との間の相違点は、下記の表１に要約されている。
【０１３２】
【表１】
0003577219.tif 000002
【０１３３】
実施例２：Ｅ．  ｃｏｌｉにおける組換えＰａｕＡの発現
２．１．  発現プラスミドの構築
オリゴヌクレオチド・プライマーＥＲ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）（図１）は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来のＰａｕＡタンパク質全長をコードするヌクレオチド配列全体を特異的に増幅するために設計された。この配列は、上述６．７節に記載された天然の転写ターミネーターと予想される領域、およびＨｅｘＡ遺伝子の短い３’部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ヌクレオチド１２１−１，１８１）をも含む。さらに、プライマーＥＲ４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）が、シグナル配列をコードすると予想される部分（アミノ酸１−２５）を欠く、ｐａｕＡ遺伝子の５’短縮部分を特異的に増幅するために用いられた。この短縮ＤＮＡ断片は、ヌクレオチド１９６から１，１８１まで伸長する共通３’領域を含むが、引き続くＥ．  ｃｏｌｉにおける発現により、細胞質局在ＰａｕＡタンパク質をコードすると予想される。ＰＣＲ増幅は、それぞれ１００μｌ反応物において、２００ｎｇのＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来の精製染色体ＤＮＡを用いて３回行われた。試料はまた、１ｘＰＣ２緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００ｐ  Ｍｏｌの各プライマー、７．５Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼ、および０．１５Ｕ  クローン化Ｐｆｕポリメラーゼを含んだ。増幅条件は、下記の通りであった：変性（９４℃にて５分）；変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（５０℃にて１分）、および重合（７２℃にて２分）を１サイクルとして３０サイクル；それに続けて、７２℃、７分間の最終伸長を行った。
【０１３４】
ＥＲ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）およびＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、またはＥＲ４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＥＲ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を用いたいずれかの増幅の後にも、３回の試料は、それぞれ反応混合液７μｌずつを合わせ最終体積２１μｌとして個別に保存された。合成ＤＮＡ断片は、１％（ｗ／ｖ）アガロースにおいて分離され、そして１，００１ｂｐ（ＥＲ４４／ＥＲ４５）および１，０７３ｂｐ（ＥＲ４３／ＥＲ４５）産物が精製された（ＪｅｔＳｏｒｂ（登録商標），  ＧｅｎｏＭｅｄ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ）。精製されたＤＮＡをＫｐｎＩおよびＸｂａＩにて消化した後、約０．３μｇの断片は、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩにて切断され、脱リン酸化されたｐＥＡ１８１ベクターＤＮＡにライゲーションされた。組換えプラスミドは、Ｈａｎａｈａｎの方法（１９８３，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６６：５５７）によりＥ．  ｃｏｌｉ  ＴＡＰ５６コンピテント細胞（Ｐｆｉｚｅｒ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ系統）に形質転換した。細胞は１ｍｌのＳＯＣ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において３０℃にて７５分間培養した。形質転換体は、温度感受性ｃＩ８５７リプレッサーの不活性化に起因するＰＬプロモーターの誘導を防止するため、３０℃以下にて培養され、維持された。この方法により単離された２系統は、組換えＰａｕＡの発現を保持していた。系統Ｐｚ３３０は、プラスミドｐＥＲ３３０を保持し、それはプライマーＥＲ４３／ＥＲ４５による染色体ＤＮＡの増幅の結果であるｐａｕＡ遺伝子全長を発現する。系統Ｐｚ３３２は、プラスミドｐＥＲ３３２を保持し、それはプライマーＥＲ４４／ＥＲ４５による増幅の結果である、短縮（シグナルペプチドが除去された）ｐａｕＡ遺伝子を発現する。
【０１３５】
さらなる実施例として、プライマーＥＲ４３／ＥＲ４５またはＥＲ４４／ＥＲ４５を用いた、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０由来染色体ＤＮＡの増幅の結果であるＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩにて消化された後、ｐＵＣ１９のＬａｃＺαペプチドにイン・フレームでクローニングされた。得られたプラスミドは、ｐＥＲ３２６およびｐＥＲ３２８と表記されるが、それぞれ全長および短縮型（シグナルペプチドが除去された）ＰａｕＡをコードし、そしてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに導入され、それぞれ系統Ｐｚ３２６およびＰｚ３２８を構成した。
【０１３６】
２．２．  組換えＰａｕＡ（ｒＰａｕＡ）の発現
上述の７．１節に記載された４系統について、全長組換えＰａｕＡタンパク質（ｒＰａｕＡ）（即ち、シグナル配列を含む）（Ｐｚ３２６、  Ｐｚ３３０）、またはシグナル配列を欠くｒＰａｕＡ（Ｐｚ３２８、  Ｐｚ３３２）のいずれかの発現能が試験された。各系統の一晩前培養液は、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）またはカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬｕｒｉａブロスのフラスコにおいて振盪培養され、その後新鮮な成長培地にて１：１０に希釈された。４−６時間の後に、培養液は０．５  ｍＭ  ＩＰＴＧの添加（Ｐｚ３２６、  Ｐｚ３２８）、または３０℃から４２℃への温度変化（Ｐｚ３３０、  Ｐｚ３３２）のいずれかにより誘導を受けた。組換えタンパク質の発現誘導は、細胞の回収に先立ち２時間行われた。全細胞ペレットが回収され、Ｌａｅｍｍｌｉ溶解緩衝液に再懸濁され、そして溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロットにより解析された。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０の細胞ペレットは、ＢＨＩブロス培養液による２２時間の培養の後に同様に得られ、そして比較のためウエスタン・ブロットにより解析された。
【０１３７】
誘導前および誘導後の全細胞ペレット試料は、１４％ポリアクリルアミドゲルにおいて分離され、そしてクーマシー・ブリリアント・ブルーにより染色されるか（図５）、またはＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統ｃ２１６由来の天然ＰａｕＡに対して作製されたマウス・モノクローナル抗体ＥＣ−３によるウエスタン・ブロットにより解析された（図６）（Ｍａｂ  ＥＣ−３の詳細に関してはＷＯ  ９３／１４２０９を参照）。示された実施例は、発現に関しては最適化されていないものの、全長およびシグナル配列欠損型ｒＰａｕＡ双方の有意な生成が、形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉ系統Ｐｚ３３０およびＰｚ３３２をそれぞれ用いて、４２℃のインキュベーション後に得られた。系統Ｐｚ３３０において低い割合で切断型ｒＰａｕＡが検出されたこと（図６、レーン７）から、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ  ｐａｕＡの異種シグナル配列が、Ｅ．  ｃｏｌｉの分泌装置により認識され、そして切断されることが示唆される。しかしながら、Ｐｚ３３０における組換えタンパク質の発現誘導が、細胞増殖に有害であったことから、ｒＰａｕＡ全長の過剰発現が、異種の宿主であるＥ．  ｃｏｌｉにおける通常の分泌過程を阻害した可能性があることが示唆される。
【０１３８】
２．３． ｒＰａｕＡの酵素活性
ｒＰａｕＡの活性は、以下に記載されたように、ウシプラスミノゲンの活性化を測定する発色アッセイを用いて決定された。上述のＥ．  ｃｏｌｉ培養液（Ｐｚ３２６、Ｐｚ３２８、Ｐｚ３３０、Ｐｚ３３２）およびＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０の全細胞ペレットの一部分が解析された。活性は異種宿主において発現される組換えタンパク質の相対量と合致した。最高力価は系統Ｐｚ３３２より得られた（表２）。
【０１３９】
【表２】
0003577219.tif 000003
【０１４０】
発色アッセイは、下記の通り行われた。発色アッセイに用いた緩衝試薬は、ＴＴ緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、  ｐＨ８．０）およびＮａＴ緩衝液（１．７７  Ｍ  ＮａＣｌ、  ５２  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−  ＨＣｌ、  ｐＨ  ７．０）を含む。これらの緩衝液は、室温において安定であり、そして使用に先立ち１か月まで保存できると思われる。ウロキナーゼのワーキングストック（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｕ−８６２７）は、水への再溶解により調製され、−７０℃にて保存された。冷凍ワーキングストックの濃度は０．５１Ｕ／ｍｌであり、そしてＴＴ緩衝液を用いて１：１０に希釈され、０．０５１Ｕ／ｍｌの開始濃度とされた。ウシプラスミノゲン（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ−９１５６）は、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ水により１．５Ｕ／ｍｌとなるように溶解され、−７０℃にて保存された。基質は、Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ  ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｉ−６８８６）およびＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ  ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｖ−０８８２；Ｆｌｕｋａ  カタログ番号９４６８０、  Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，  ＮＹ）を含んだ。これらの基質のワーキングストック溶液は、水への溶解により１  ｍｇ／ｍｌに調製され、−７０℃にて保存された。
【０１４１】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２アッセイプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）は下記の通り調製された。ＴＴ緩衝液（２０μｌ）およびウシプラスミノゲン（２０μｌ）は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２プレートへ事前に分注された。Ｖ底プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）において、ＴＴ緩衝液（ウェル当り５０μｌ）はＢ−Ｈ列に添加された。培地対照、陽性対照、および試料は、Ａ列に添加された。試料、培地対照、および陽性対照は、すべてデュプリケートのウェル中で行った。１００μｌの対照または１００μｌの試料いずれかが適切なウェルへ添加され、その後、プレートの後列へ向けて段階的に希釈され、最後の列からは５０μｌ捨てた。事前に分注したＴＴ緩衝液およびウシプラスミノゲンを含む、対応するＩｍｍｕｌｏｎ  ２プレートへ、Ｖ底プレートの各ウェルから１０μｌを移動した。プレートは蓋をされ、よく混合され、そしてウシプラスミノゲンを活性化させるため、３７℃にて２時間インキュベーションされた。アッセイ対照は、ウロキナーゼが介在するウシプラスミノゲンの活性化により構成した。
【０１４２】
基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ  ｐ−ニトロアニリド、およびＤ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ  ｐ−ニトロアニリド）は室温まで加温された。アッセイ基質は、ストック基質を、ＮａＴ緩衝液を用いて４００μｇ／ｍｌに希釈すること（１：２．５希釈）により調製され、そして１００μｌ／ｗｅｌｌのアッセイ基質溶液が添加され、そしてプレートは蓋をされ、混合された。その後プレートは３７℃にて２分間インキュベーションされた。活性型ＰａｕＡは、プラスミノゲンのプラスミンへの変換を触媒し、次にそれはｐ−ニトロアニリドから３量体ペプチドを切断し、これをＡ４０５により測定する。
【０１４３】
プレートは、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｖｅｒ．  １．２．０ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いたＥＬＩＳＡプレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を用いて読み取られた。アッセイプレート試料は、混合され、４０５ｎｍにおける吸光度が決定された。妥当な試験は、Ａ４０５が１．３０から１．５０Ｏ．Ｄ．である陽性対照を示す。
【０１４４】
力価（希釈係数の逆数）の算出のため、希釈系列試料は、希釈率を対数軸にとった離散プロット・グラフを用いてグラフ化された。試料が、陽性対照に基づくカットオフ値と交差する点が真の力価として算出された。カットオフ値を決定するため、陽性対照（０．０５１Ｕ／ｍｌ）の平均Ｏ．Ｄ．の５０％が用いられた。例えば、もし試料が０．００７においてカットオフ線と交差したとすれば、その希釈係数は１／１４２．８６となり、そしてその力価は１４２．８６と表現されるであろう。さらに、もし試料が０．０１５においてカットオフ線と交差したとすれば、その希釈係数は１／６６．６７となり、そしてその力価は６６．６７であろう。
【０１４５】
実施例３：ＰａｕＡペプチド断片の酵素学的および免疫学的評価
３．１．  組換えＧＳＴ−ＰａｕＡペプチドの発現
オリゴヌクレオチド・プライマーＥＲ７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）およびＥＲ７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）が、コードされるＰａｕＡのアミノ酸２７−２８６を含む領域をコードするｐａｕＡ遺伝子を特異的に増幅するために設計された。この領域は、成熟型（分泌される）ＰａｕＡのアミノ酸２−２６１に対応する。ＰＣＲ合成は、各１００μｌ反応物中で２５０ｎｇの精製されたＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０染色体ＤＮＡを用いて、２回行われた。試料はまた、１ｘＰＣ２緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１００ｐ  Ｍｏｌの各プライマー、７．５Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼ、および０．１５Ｕ  クローン化Ｐｆｕポリメラーゼを含んだ。増幅条件は以下の通りであった：変性（９４℃にて５分）；変性（９５℃にて３０秒）、アニーリング（６０℃にて３０秒）、および重合（７２℃にて１分）を１サイクルとして３０サイクル；それに続けて、７２℃、７分間の最終伸長を行った。増幅後に、両試料は混合され、そして８１５ｂｐ断片が精製された（ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）キット、  Ｑｉａｇｅｎ、  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、  ＣＡ）。精製ＤＮＡのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩによる消化後に、断片はｐＧＥＸ５ｘ−２またはｐＧＥＸ５ｘ−３ベクターＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）にクローン化された。得られた組換えプラスミドであるｐＥＲ３５４およびｐＥＲ３５５は、それぞれ、発現ベクターのＮ−末端にコードされるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード領域とずれた読み枠に位置する、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ  ９５−１４０においてコードされるＰａｕＡのアミノ酸２７−２８６コード領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を参照）を含んだ。
【０１４６】
プラスミドｐＥＲ３５４は、成熟型ＰａｕＡのＣＯＯＨ−末端領域を欠失するように改変されるのと同時に、ベクターにコードされるＧＳＴ配列との融合点における読み枠を復元した。成熟型ＰａｕＡ、または成熟型ＰａｕＡのＮ−末端断片（即ち、カルボキシル末端欠失型）のいずれかを生成するプラスミドは、ＸｍａＩおよびＡｇｅＩによりｐＥＲ３４５を消化し、ＧＳＴ−ＰａｕＡ融合点におけるフレームの第一の修復により構築され、ｐＥＲ３４６を作製した。このプラスミドは、コードされるＰａｕＡのアミノ酸２８−２８６に翻訳的に融合され、２６ｋＤａのＧＳＴペプチドを発現し、そしてその産物は成熟型ＰａｕＡと表記される。成熟型ＰａｕＡのＣＯＯＨ−末端の欠失は、このプラスミドをさらにＳｐｅＩ、ＮｒｕＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩのいずれかにより処理し、その後ＮｏｔＩにて消化することにより生成された。平滑末端を生成するのに適切なＫｌｅｎｏｗ断片による処理の後、プラスミドは再びライゲーションされ、それぞれｐＥＲ３６３、ｐＥＲ３６４、およびｐＥＲ３６５が作製された。これらのプラスミドは、表３に記載されたように、コードされるＰａｕＡのそれぞれアミノ酸２８−１０３、２８−１７０、および２８−２０８と融合した２６ｋＤａのＧＳＴペプチドを発現する。
【０１４７】
プラスミドｐＥＲ３５５はさらに、ＰａｕＡのＮＨ２−またはＣＯＯＨ−末端領域のいずれかを欠失するように改変するのと同時に、ベクターにコードされるＧＳＴ配列との融合点における読み枠を復元された。ＮＨ２−末端欠失は、ＳａｌＩのみ、またはＳｍａＩおよびＮｒｕＩによるｐＥＲ３５５の処理に続いて、ＧＳＴ−ＰａｕＡ融合結合を修復するために再びライゲーションすることにより作製された。得られたプラスミドであるｐＥＲ３５８およびｐＥＲ３５９は、コードされるＰａｕＡのそれぞれアミノ酸１０４−２８６および１７２−２８６と融合したＧＳＴペプチドを発現する。続いて、ＰａｕＡ内部ペプチド断片を有する２種のプラスミドが、ｐＥＲ３５８をＮｒｕＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによる処理に続いてＮｏｔＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗ処理、および再ライゲーションすることにより生成された。これらの組換えプラスミドｐＥＲ３６６およびｐＥＲ３６７は、コードされるＰａｕＡのそれぞれアミノ酸１０４−１７０および１０４−２０８と融合したＧＳＴペプチドを発現する。最後に、短いＰａｕＡ断片（コードされるＰａｕＡのアミノ酸１７２−２０８）と融合したＧＳＴを発現することができるプラスミドが、ｐＥＲ３５９をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩによる消化に続きＫｌｅｎｏｗ処理、および再ライゲーションすることにより生成された。このプラスミドは、ｐＥＲ３６８と命名された。コードされる断片、およびＧＳＴとの融合タンパク質として発現されるＰａｕＡ特異的ペプチドの概算分子量は、表３に要約されている。
【０１４８】
【表３】
0003577219.tif 000004
【０１４９】
ｐＥＲ３６３によりコードされるものを除くすべてのＧＳＴ−ＰａｕＡ融合タンパク質は、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて発現され、そして製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により推奨される方法によりアフィニティー・クロマトグラフィーにて精製された。ｐＥＲ３６３によりコードされるタンパク質の発現は、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）形成を引き起こすため、これらのタンパク質集合体は、続くリゾチームによる細胞分解により精製された。細胞は氷上において１０分間インキュベーションされ、次に１０倍体積の２ｘＲＩＰＡ／ＴＥＴ（５：４  ｖ／ｖ）が添加された。２ｘＲＩＰＡは、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ  ７．４）、０．３  Ｍ  ＮａＣｌ、２％デオキシコール酸ナトリウム、および２％（ｖ／ｖ）  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０を含む。ＴＥＴ緩衝液は、０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ  ８．０）、５０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。懸濁された細胞混合物は、ボルテックスされ、そして氷上において５分間インキュベーションされ、その後懸濁物の粘性がなくなるまで超音波処理された。封入体は遠心分離（１５，０００Ｘｇ、２０分間）により回収され、水に再懸濁され、そして−８０℃にて保存された。
【０１５０】
３．２．  タンパク質切断分解によるＰａｕＡ断片の生成
約１３ｍｌのＳ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０から精製した天然ＰａｕＡ（ロット番号９７００７１０Ａ）（０．５５  ｍｇ／ｍｌ）は、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓに対して、ｐＨ  ８．８、４℃にて透析された。停留物は、ＹＭ１０膜および撹拌された細胞（ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ）を用いて〜２．５ｍｌにまで濃縮された。タンパク質の終濃度は２．６４  ｍｇ／ｍｌであった。この濃縮物は、１２０Ｕのトロンビン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）により室温にて３日間処理され、そしてその消化物は−２０℃にて冷凍された。消化物からの〜１６ｋＤａ断片の精製は、２ｍｌの消化物を注入したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（１６／６０）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により達成された。適切な画分がＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づき回収され、保存された。２．５ｍｌにおけるタンパク質の終濃度は０．１６５  ｍｇ／ｍｌであった。Ｎ−末端配列分析により、１６ｋＤａのペプチドはＰａｕＡのカルボキシル末端部分の半分を有することが確認された。得られた配列（ＫＲＶＥＥＰＩＴＨＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）は、Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ系統９５−１４０においてコードされるＰａｕＡのリジン１４９から開始されていた。従って、このタンパク質分解に由来するペプチドは、ＰａｕＡ１４９−２８６と表記される。
【０１５１】
３．３． ＰａｕＡペプチド断片の酵素学的活性
表３に記載された９種のＧＳＴ−ＰａｕＡ融合タンパク質、および上述８．２節に記載されたＰａｕＡタンパク質分解断片（ＰａｕＡ１４９−２８６）の酵素学的活性は、主として上述７．３節に記載された発色アッセイを用いて、天然ＰａｕＡと比較された。精製されたＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−２８６融合タンパク質（力価＝３４４８）の酵素学的活性は、残存するＰａｕＡペプチド断片が酵素活性を欠損していたにもかかわらず、天然ＰａｕＡ（力価＝３２５６）の活性と類似していた。力価を、精製されたタンパク質調製物中に存在するＰａｕＡ特異的タンパク質量で割ることにより、ＰａｕＡ特異的活性が算出された。この補正が行われた場合、天然ＰａｕＡに対する特異的活性は５．９発色単位／μｇであり、そしてＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−２８６の特異的活性は１．４であった。このデータは、組換えにより生成されたＧＳＴ−ＰａｕＡは、精製された天然ＰａｕＡに比べ酵素学的にやや低い活性しか示さないにもかかわらず、前者は実際有意な酵素活性を示すことを示唆する。
【０１５２】
３．４．  マウスにおける免疫反応の特性
３．４．１． ＰａｕＡペプチド断片によるマウスの免疫化
上述のように調製されたＰａｕＡペプチド断片の免疫原性を評価するため、ワクチン化に関するマウスモデル系が用いられた。端的には、１０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１６−１８ｇ）を含む実験グループが、０、２１、および４２日目に免疫化された。血液試料は、実験０、２１、３５、および５６日目に得られた。これらの試料由来の血清は、実験グループ毎に収集され、そして固相精製天然ＰａｕＡに対するＥＬＩＳＡ反応性、および精製天然ＰａｕＡの発色活性の血清中和により解析された。
【０１５３】
天然ＰａｕＡおよび多様なペプチド断片の製剤は、マウスに対する毒性のないレベルの免疫刺激体としての、Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）を含む水中スクアレンエマルジョンビヒクル中に存在する。タンパク質は、１回の投与量１００μｌにつき３−５μｇ処方され、そして皮下に投与された。対照である、抗原なしのワクチンは、抗原成分なしのビヒクル／免疫刺激体を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（ＤＰＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から構成された。
【０１５４】
３．４．２． ＰａｕＡペプチド断片の免疫原性
上述の免疫化実験により得られた多様なマウス血清は、ＰａｕＡ特異的抗体が産生されたかどうかを決定するため、および産生された抗体の特性を決定するため解析された。ＰａｕＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは、ＰａｕＡタンパク質分解断片（ＰａｕＡ１４９−２８６）および各ＧＳＴ−ＰａｕＡ融合タンパク質による免疫化後の血清の特異性を決定するため用いられた。１００μｌの精製天然ＰａｕＡ（国際特許出願公開ＷＯ  ９３／１４２０９に記載され、かつその中において「ストレプトキナーゼ」と表記された）（ＰＢＳ中で１．８ｍｇ／ｍｌ）は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の各ウェルに添加され、かつ４℃にて一晩インキュベーションされた。プレートの内容物はデカンテーションされ、かつプレートは吸収乾燥された。プレートは、各ウェルに２５０μｌのＰＢＳ溶解（１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ）ポリ（ビニルアルコール）（８７−８９％加水分解；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）（１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ）を添加することによりによりブロックされ、そして３７℃にて１時間インキュベーションされた。プレートは再びデカンテーションされ、かつ吸収乾燥された。
【０１５５】
実験血清は、１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ中において１：１００に希釈され、その後試料ウェルより１００μｌを順に移動することにより３倍希釈された。陽性対照は、ＰａｕＡ特異的モノクローナル抗体であるＥＣ−３であり、この抗体は、固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを用いてアフィニティー精製されたものであった。このモノクローナル抗体は、１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ中において２μｇ／ｍｌに希釈され、その後１００μｌが適切なウェルへ添加された。陰性対照は、プールされ、１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ中において１：１００に希釈された、ワクチン前のマウス血清を含んだ。１００μｌの陰性対照血清が適切なウェルへ添加された。
【０１５６】
実験および対照試料の添加後に、プレートは穏やかに叩かれて混合され、その後３７℃にて１時間静置された。試料ウェルは、自動マイクロプレート洗浄機（モデルＥＬ４０３；  ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，  ＶＴ）を用いて０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳにより５回洗浄された。結合した抗体の検出は、１％  ＰＶＡ／ＰＢＳ中において１：１０，０００に希釈された、共役抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＨおよびＬ鎖、１．０ｍｇ／ｍｌ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）１００μｌの添加により行われた。プレートは穏やかに叩かれて混合され、３７℃にて１時間静置され、そして上述のように洗浄された。１００μｌのＡＢＴＳ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ）がプレートに添加され、次いで室温にて１５分間発色された。プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘプレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）およびＳｏｆｔＭａｘ  ＰＲＯ  Ｖｅｒ  １．２プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、４０５／４９０ｎｍにおいて読み取られた。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価は、陽性対照のＯＤ４０５／４９０の５０％を与える希釈率の逆数として算出された。
【０１５７】
表４に示されたように、９種のＧＳＴ−ＰａｕＡ融合タンパク質それぞれを用いたマウスの免疫化の結果、ＰａｕＡ特異的免疫グロブリンＧが産生された。ＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−２８６、ＧＳＴ−ＰａｕＡ１０４−２８６、またはＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−１７０のいずれかによる免疫化は、天然ＰａｕＡにより誘導された場合と同等の、またはそれより高いＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価を誘導した。タンパク質分解由来ペプチドであるＰａｕＡ１４９−２８６は、組換えＰａｕＡペプチド断片に比べ、比較的低い力価を示した。３回目の免疫化の後、このペプチド断片は、最も類似した比較ペプチド、すなわちＧＳＴ−ＰａｕＡ１７２−２８６に比べ約１／１０のＰａｕＡ特異的力価を誘導した。この特定のペプチド（ＰａｕＡ１４９−２８６）が、低いＩｇＧ応答を誘導するものの、天然ＰａｕＡの他の断片も、組換えペプチドに関して示された免疫反応に匹敵する免疫反応を誘導できることが予想される。
【０１５８】
３．４．３．  血清中和活性
上述の免疫化による血清は、ＰａｕＡによるウシプラスミノゲンからプラスミンへの変換を妨害できる抗体を含むかどうかを決定するため、さらに解析された。血清中和アッセイは、１０％ウシ胎児血清を含むＴＥＡ緩衝液（ＴＥＡ／ＦＢＳ；  Ｎｏｖａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＥ）中において、血清試料を１：５０に希釈することにより行われた。１リットルのＴＥＡ緩衝液は、３．３４ｇのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、３．５４ｇ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５．８ｇ  ＮａＣｌ、１．１ｇ  ＥＤＴＡ（４ナトリウム水和物）、４２．２ｇ  （Ｌ）−アルギニン塩酸塩、および１．０ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ８０を含んだ。緩衝液のｐＨは８．０に調整され、その後使用まで室温にて保存された。ＦＢＳは、中和アッセイにおいて使用する直前にＴＥＡ緩衝液に添加された。ＴＥＡ／ＦＢＳ中の血清試料は、その後Ｖ底プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）においてＴＥＡ／ＦＢＳにより２倍ずつ段階希釈された。２５μｌの試験試料は、その後Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に移動された。Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓより単離された精製天然ＰａｕＡ（ロット番号９７００７１０Ａ）は、ＴＥＡ緩衝液中において７６μｇ／ｍｌに希釈され、その後事前に分注された血清を含む各ウェルに２５μｌが添加された。プレートは穏やかに叩かれて混合され、３７℃にて１時間静置された。陽性対照は、血清陽性ウシ由来の凍結乾燥されたＩｇＧ画分であった。このＩｇＧ画分は、水に再溶解され３．８ｍｇ／ｍｌとなり、ＴＥＡ／ＦＢＳ中において１：５０に希釈され、そしてＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレートに移動された。２５μｌの陽性対照、およびＴＥＡ／ＦＢＳ中において１：５０に希釈された２５μｌのＦＢＳが、適切なウェルに分注された。
【０１５９】
ＰａｕＡ活性の中和は、基質の添加により検出された。基質は、プラスミノゲン（１  Ｕ／ｍｌ；  Ｐ−９１５６，  Ｓｉｇｍａ）、クロモザイム（１ｍｇ／ｍｌ；  Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、およびＴＥＡ緩衝液の２：３：１の比率での混合により調製された。この基質の１５０μｌが各試料ウェルに添加され、プレートは穏やかに叩かれて混合され、その後３７℃にて９０分間インキュベーションされた。プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘプレート読取機およびＳｏｆｔＭａｘ  ＰＲＯ  Ｖｅｒ  １．２コンピュータプログラムを用いて、４０５／４９０ｎｍにおいて読み取られた。この力価は、陰性対照の５０％に相当する希釈率の逆数として算出された。
【０１６０】
中和アッセイの結果は、いくつかのペプチド断片が、天然ＰａｕＡへ方向づけられる中和反応を誘導することができることを示した。組換えタンパク質ＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−２８６、ＧＳＴ−ＰａｕＡ１０４−２８６、ＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−１７０、またはＧＳＴ−ＰａｕＡ２８−２０８のマウスへの投与後に得られた血清は、天然ＰａｕＡのマウスへの投与により得られた血清と類似した中和力価を示した。従って、マウスに投与した場合、これらのペプチド断片は、天然精製ＰａｕＡの酵素学的活性を妨害する能力のある抗体の産生を誘導した。
【０１６１】
【表４】
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【０１６２】
全ての特許、特許出願、および上述の参照文献は、本明細書中において、特許参照文献として全てまとめて含まれる。
【０１６３】
本発明は、発明の個別的側面の一例を提示する目的で記載された、特異的態様により範囲を限定されない。機能的に同等な組成物および手法は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６４】
【配列表】
【０１６５】
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0003577219.tif 000008
【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６由来のＰａｕＡタンパク質からのペプチド断片に基いて設計されたオリゴマープローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）。小文字のヌクレオチドは染色体ＤＮＡ配列に対合しない。
【図２】ウシのプラスミノーゲンをさらに含むスキムミルクアガロースプレート上で培養したＳ．ｕｂｅｒｉｓ株９５ー１４０由来のｐａｕＡ遺伝子により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの単離。透明区域はプラスミノーゲンの活性化によりプラスミンへ転化し、その後に続いておこる牛乳タンパク質の分解によって生じた結果である。
【図３】ｐＥＲ３１８とｐＥＲ３１９は、フランキングＤＮＡのＨｅｘＡとＨｅｘＢ遺伝子とともに挿入を受けた、クローン化されたｐａｕＡを示す。
【図４】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド番号９７８から１０８８において、ｐａｕＡ遺伝子のＯＲＦに隣接した、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株ｃ２１６の二方向の末端配列。ｐａｕＡのＯＲＦの終止コドンには下線がひいてある。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、およびクーマシーブリリアントブルーで染色された、誘導前および誘導された全細胞ペレット溶解物のサンプル。レーン１＝分子量標識（ＲＡＩＮＢＯＷ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、  Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；２＝誘導前株Ｐｚ３２６（プラスミドｐＥＲ３２６をシグナル配列とともに含む）；３＝誘導後株Ｐｚ３２６；４＝誘導前株Ｐｚ３２８（プラスミドｐＥＲ３２８を含む。シグナル配列を含まない。）；５＝誘導後株Ｐｚ３２８；６＝誘導前株Ｐｚ３３０（プラスミドｐＥＲ３３０をシグナル配列とともに含む。）；７＝誘導後株Ｐｚ３３０；８＝誘導前株Ｐｚ３３２（プラスミドｐＥＲ３３２を含む。シグナル配列は含まない。）；９＝誘導後株Ｐｚ３３２；１０＝Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来の、精製されたＰａｕＡタンパク質。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、およびウェスタン・ブロット分析された、前誘導および誘導された全細胞溶解物ペレットサンプル。レーンは、レーン１０＝Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ株９５−１４０由来の、全細胞溶解物ペレットである以外は、図５における者と同一である。一次抗体はマウスモノクローナル抗体ＥＣ−３であり、二次抗体はＢＣＩＰと結合されたヤギ抗マウス抗体である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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