(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸Ｃを含有することを特徴とするヒアルロン酸分解促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進するヒアルロン酸分解促進剤に関し、更にはヒアルロン酸の異常産生亢進又は異常分解抑制が伴う疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力への抵抗、及び、細菌感染の防止等多くの機能を有している（ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ、８巻、３４６頁、１９９１年）。
【０００３】
しかし、ヒアルロン酸の正常のレベルを逸脱した合成亢進は生体において生理的異常な状態を引き起こす場合があると考えられている。炎症や動脈硬化、乾癬等では細胞間に産生促進されたヒアルロン酸は炎症細胞の浸潤を容易にし、炎症を遅延化する（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４（４）：４０７−１４（１９９１））  。また、骨再生異常においてもヒアルロン酸の異常蓄積が見られ、骨の硬さに影響すると考えられている（Ｂｏｎｅ  １０（６）：４０９−１３（１９８９））。さらに軟骨細胞において、最終の軟骨細胞の分化に際し、ヒアルロン酸は細胞に吸収分解されることから、細胞の分裂ステージから分化ステージに移行する際はヒアルロン酸は積極的に分解され、細胞間のシグナル伝達が強化される必要があると考えられる。実際、細胞間のヒアルロン酸は細胞表層にヒアルロン酸リッチマトリクスとして存在しているため他の接着因子等の結合を抑制していると考えられる。さらに、ヒアルロン酸は悪性腫瘍においてヒアルロン酸マトリクスを形成促進し、みずからの分裂環境を最適にし、免疫細胞からの攻撃を防御すると考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１７）９８７５−９８７８（１９９６））。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸合成の異常亢進は動脈硬化、心筋梗塞、骨形成異常、乾癬、悪性腫瘍の症状悪化に密接に関連すると考えられ、従ってこれらの疾患の治療においてはヒアルロン酸の分解を促進することが有効であると思われる。
【０００５】
一方、生体内で重要な細胞外成分であるヒアルロン酸は正常な生理状態でも分解が促進されている場合がある。例えば、毛成長に伴うヘアーサイクルにおいて成長期では毛包は毛の成長とともに皮膚真皮内を貫通することが知られている。この部分では積極的なマトリクスの分解が起きていると考えられる。したがってマトリクスの主要成分であるヒアルロン酸の分解促進をする薬剤は成長期を延長することで育毛効果をもつと考えられる。
【０００６】
ところで、従来よりヒアルロニダーゼ阻害剤については数多くの報告がなされているが（特公平６−４５８４号公報、特開平５−１７８８７６号公報、特開平６−８０５５３号公報、特開平６−８０５７６号公報、特開平６−９４１５号公報、特開平６−９４１６号公報、特開平３−６８５１５号公報）、ヒアルロン酸の分解を促進する薬剤は全く開発されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らが鋭意研究を行った結果、結合組織由来の正常皮膚線維芽細胞がヒアルロン酸分解活性を持ち、さらにその分解はコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体添加によって著しく促進されることをことを見いだし、本発明を完成したものであって、その目的とするところは、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進し得るヒアルロン酸分解促進剤、更にはヒアルロン酸の異常な産生亢進が伴う疾患やヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患の治療効果に優れた疾患治療剤を提供するにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述の目的は、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及び／又はその塩を含有することを特徴とするヒアルロン酸分解促進剤、該促進剤を含有するヒアルロン酸産生異常亢進疾患治療剤、ヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患の治療剤によって達成される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳説する。
【００１０】
本発明で用いられるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体はコンドロイチン硫酸の構成糖であるＮ−アセチルガラクトサミンの６位が硫酸化されているものであり、コンドロイチン硫酸Ｃ，コンドロイチン硫酸Ｄ，コンドロイチン硫酸Ｅ及びこれらの塩が挙げられる。これらは単独でも、二種以上を組み合わせて用いることができる。コンドロイチン硫酸Ｃが、これらの中でも、効果，入手のし易さより特に好ましい。
【００１１】
また、本発明で用いられるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体は特に限定されるものではなく、例えばサメやイカの軟骨からプロナーゼ処理、アルコール分画した常法で得られるものでよい。
【００１２】
コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体の塩としては、特に限定されないが、特に薬学的に許容されているナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。さらに生体内ではコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体は種々のプロテオグリカンとして存在しているのでコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体を多く含むプロテオグリカンをグアニジン塩酸等を用いて常法により抽出したものでもよい。
【００１３】
これらのコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体プロテオグリカン及びそれらの塩は、１種類または２種類以上を混合して用いることが可能である。
【００１４】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤におけるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及びその塩の総含有量は、対象とする疾患の種類および程度、患者の年齢、体重、性別などにより異なり一概には規定できないが、一般的には適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１〜５０ｇが好ましく、特に０．００１〜５ｇが好ましい。０．００１ｇ未満では本発明の効果が達成できない場合があり、５０ｇを超えて配合してもその配合量に見合った効果が得られない場合がある。
【００１５】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤の形態としては、特に限定されるものではない。例えば、適当な賦形剤、担体、希釈剤を用いて、錠剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤、坐剤、入浴剤等の剤形が挙げられ、またゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダー及び入浴剤等の剤形が挙げられる。
【００１６】
係る製剤の調製は常法によって行われ、例えば、固形製剤については通常の医薬添加物、例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、タルクなどを用いて製剤化される。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤、散剤等を適当なカプセルに充填して得られる。液剤は白糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、懸濁することにより調製される。
【００１７】
また本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤に配合される賦形剤または補助剤としては、本発明の効果を損なわない範囲において、化粧品、医薬品等に一般に使用されるものが配合可能であり、剤形等に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えば、ワセリン，スクワラン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン酸等の動物性油脂、グリセリン，プロピレングリコール等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル，モノステアリン酸ポリエチレングリコール，ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等の各種無機塩、酪酸，乳酸等の各種酸、水、およびエタノール等が挙げられる。
【００１８】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤は、ヒアルロン酸の合成が亢進している疾患やヒアルロン酸の分解が異常抑制されている疾患の治療剤の有効成分として配合することができる。更に、通常の医薬品、化粧品の有効成分として、その他、培養細胞系に添加する研究・試験用試薬等として用いることもできる。
【００１９】
本発明において治療剤とは、後述するような疾患の症状を取り去るいわゆる治療剤の他、その症状を軽減する改善剤，その他症状が現れるのを予防する防止剤をも含むものである。
【００２０】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸合成が生理的に正常時より亢進しているか又はヒアルロン酸分解が異常に抑制されている状態を言う。
【００２１】
ヒアルロン酸合成が生理的に正常時より亢進している疾患としては、乾癬、動脈硬化、骨異常形成、心筋梗塞等が挙げられる。本発明のヒアルロン酸異常合成亢進疾患治療剤をこれらの疾患に用いる場合は、防止剤または予防剤として正常人に適用することもできるが、ヒアルロン酸の合成が生理的に正常時より亢進している症状者に適用する方が効果的である。
【００２２】
一方、ヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患とは、ヒアルロン酸の分解が患部で異常抑制されていると考える脱毛症、若はげ等の疾患を言う。本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤をこれらの疾患に用いる場合は、症状の改善剤または治療剤として、ヒアルロン酸の分解が異常に抑制されている症状者に適用することができる。
【００２３】
今回、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体が結合組織に存在する線維芽細胞に作用し、その細胞間マトリクスの成分であるヒアルロン酸を分解促進する作用があることが明らかとなった。
【００２４】
本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤の１日当たりの投与量としては、通常経口投与では、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及びその塩の総量として０．０１ｇ〜５０ｇが好ましく、特に好ましくは１ｇ〜１０ｇである。非経口投与では、０．１ｇ〜５ｇが好ましい。０．０１ｇ未満では本発明の効果が達成できない場合があり、５０ｇを超えて投与してもその投与量に見合った効果が得られない場合がある。
【００２５】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、培養細胞に添加して高分子ヒアルロン酸を産生させる時は、培養液中にコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体が１μｇ／ｍｌ以上となるように添加するのが好ましく、更に好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。１μｇ／ｍｌ未満では効果を奏しない場合がある。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤は、加熱滅菌、濾過滅菌等の方法により、滅菌してから用いるのが好ましい。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。
尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。また後記表３〜表９に示す配合量は、いずれも重量％を表す。
【００２８】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （大日本製薬社製、１０−１０１）  １０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）  、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００２９】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）  を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００３０】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０５  個／ｍｌに調整し、２２５ｃｍ２  のフラスコに５０ｍｌ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍｌ）、さらに３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をＵｎｄｅｒｈｉｌｌ  らの方法（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、さらにゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性，０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００３１】
（４）正常ヒト線維芽細胞への高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０５  個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４，０００ＤＰＭ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。なお培地交換時、最終濃度１０μＭになるようにヒスタミンと各種アンタゴニストを添加した。
【００３２】
（５）リウマチ滑膜細胞への高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
ヒトリウマチ滑膜細胞の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０５  個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、１％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４，０００ＤＰＭ／ｍｌ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。なお培地交換時、最終濃度１０μＭになるようにヒスタミンと各種アンタゴニスト、コールドの高分子ヒアルロン酸を添加した。
【００３３】
（６）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍｌをセファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径１ｃｍ，長さ６０ｃｍ）にアプライし以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
分画：４ｍｌ／１Ｆｒａｃｔｉｏｎ
分画総数：２５
更に分子量１０万以下のヒアルロン酸が溶出するフラクション１０〜２５の１６本を集め、［３  Ｈ］放射活性を測定し分解したヒアルロン酸の量を求めた。
【００３４】
実施例１，比較例１〜４
コンドロイチン硫酸Ａ（比較例２）、コンドロイチン硫酸Ｂ（比較例３）、コンドロイチン硫酸Ｃ（実施例１）、ヘパラン硫酸（比較例４）を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにＭＥＭ培地に溶解した。また、ＭＥＭ培地のみを比較例１とした。
【００３５】
試験例１（ヒト正常皮膚線維芽細胞によるヒアルロン酸分解）
実施例１，比較例１〜４を用いて、前述した（６）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解量を算出した。結果を下記表１に示す。
【００３６】
【表１】
0003566043.tif 000002
【００３７】
その結果、コンドロイチン硫酸Ｃ添加によって無添加時よりヒアルロン酸の分解は促進され（実施例１）、他のグリコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ヘパラン硫酸、いずれの薬剤においても分解は促進しなかった（比較例１〜４）。
【００３８】
この結果からコンドロイチン硫酸Ｃはヒトのヒアルロン酸分解促進剤として非常に有効であることが判明した。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤はヒアルロン酸合成が異常に亢進している疾患やヒアルロン酸の分解が異常に抑制されている疾患に対する治療剤の有効成分として用いることができるものである。
【００３９】
実施例２〜４
コンドロイチン硫酸Ｃを培地中での濃度が２０、１００、５００ｍｇ／ｍｌになるようにＭＥＭ溶解した（実施例２〜４）。
【００４０】
試験例２
実施例２〜４、比較例１（ＭＥＭ培地のみ），を用いて、前述した（６）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解量を算出した。結果を下記表２に示す。
【００４１】
【表２】
0003566043.tif 000003
【００４２】
その結果、コンドロイチン酸Ｃは用量依存的にヒアルロン酸の分解を促進することが判明した（実施例２〜４）。
【００４３】
この結果からコンドロイチン硫酸Ｃはヒトのヒアルロン酸分解促進剤として非常に有効であることは明らかである。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を含有するヒアルロン酸合成異常亢進疾患治療剤は、ヒアルロン酸合成が異常に亢進している乾癬等の治療に有効である。
【００４４】
実施例５〜７（錠剤）
【００４５】
【表３】
0003566043.tif 000004
【００４６】
上記表３の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠３００ｍｇとなるように打錠した。
【００４７】
実施例８〜１０（カプセル剤）
【００４８】
【表４】
0003566043.tif 000005
【００４９】
上記表４の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の２００ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００５０】
実施例１１〜１２（液剤）
【００５１】
【表５】
0003566043.tif 000006
【００５２】
精製水に上記表５の各成分を溶解し、攪拌均一化して液剤とした。
【００５３】
実施例１４〜１７（ローション）
【００５４】
【表６】
0003566043.tif 000007
【００５５】
上記表６の各成分を常法により混合溶解して、ローションを調製した。
【００５６】
実施例１８〜１９（入浴剤）
【００５７】
【表７】
0003566043.tif 000008
【００５８】
上記表７中の各成分を混合し、入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００５９】
実施例２０〜２３（軟膏）
【００６０】
【表８】
0003566043.tif 000009
【００６１】
上記表８中において、（Ｂ）の各成分を湯浴で８０℃に加温しながら混合し、これに、８０℃に加温した上記（Ａ）の各成分の混合物中に攪拌しながら徐々に加えた。つぎに、ホモジナイザー（Ｔｏｋｕｓｙｕｋｉｋａ  Ｋｏｇｙｏｕ社製）で２．５分間激しく攪拌（２５００ｒｐｍ）して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却してコンドロイチン硫酸Ｃまたはコンドロイチン硫酸Ｄを含む軟膏を得た。
【００６２】
実施例２４〜２６（注射剤）
【００６３】
【表９】
0003566043.tif 000010
【００６４】
メスシリンダーに上記表９の処方にて、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、塩化ナトリウム、燐酸１水素ナトリウムをとり、注射用蒸留水を加え、溶解し、メンブランフィルター（０．２２μｍ）で濾過し、ガラスアンプルに分注し、注射剤を調製した。
【００６５】
【発明の効果】
以上の様に、本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進するヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成異常亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤を提供できることは明らかである。