(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルを増幅する方法であって、
（ａ）沈積銀を有する基材を提供する工程と；
（ｂ）ナノ粒子−銀サンドイッチを有する基材を生産するために、沈積銀を有する基材を、オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を含む溶液と接触させる工程と；
（ｃ）前記サンドイッチを有する基材を洗浄する工程と；
（ｄ）前記サンドイッチのナノ粒子上への銀沈積を促進し、銀−ナノ粒子−銀サンドイッチを生産するために、前記サンドイッチを有する基材を銀イオンおよび還元剤と接触させる工程と；
（ｅ）銀−ナノ粒子−銀サンドイッチを有する基材を洗浄する工程と；から成る方法。
【請求項２】
ナノ粒子は金、銀、白金またはそれらの混合物から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または複合体から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
銀イオンが酢酸銀、乳酸銀または硝酸銀を含む銀塩に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
還元剤がヒドロキノン、ｎ−没食子プロピル、ｐ−フェニレンジアミン、またはホルムアルデヒドから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の接触が約５〜３０分間に及ぶ間行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の接触が約１０分間行なわれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）の接触が約５〜１０分間に及ぶ間行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）の接触が約５分間行なわれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
基材に結合された沈積銀が、アレイの形で配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）の洗浄が水で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
基材はガラスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
銀を含む表面上で銀沈積を促進する方法であって、
（ａ）銀が結合された表面を提供する工程と；
（ｂ）ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を生産するために、前記表面をオリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を含む溶液と接触させる工程と；
（ｃ）前記ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を洗浄する工程と；
（ｄ）前記ナノ粒子−銀サンドイッチの前記ナノ粒子上への銀沈積を促進するために、還元条件下で前記ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を銀イオンを含む溶液と接触させる工程と；
（ｅ）沈積銀を有する表面を洗浄する工程と；から成る方法。
【請求項１４】
前記表面が細胞または組織から成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ナノ粒子は金、銀、白金またはそれらの組み合わせから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、オリゴヌクレオチドを結合させた金ナノ粒子から成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドを結合させた金のナノ粒子は、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または複合体から成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
銀イオンが酢酸銀、乳酸銀または硝酸銀を含む銀塩に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
還元剤がヒドロキノン、ｎ−没食子プロピル、ｐ−フェニレンジアミン、またはホルムアルデヒドから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）の接触が約５〜３０分間に及ぶ間行なわれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）の接触が約１０分間行なわれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）の接触が約５〜１０分間に及ぶ間行なわれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）の接触が約５分間行なわれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
基材に結合された沈積銀が、アレイの形で配置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
シグナル増幅のためのキットであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を入れた容器と；
（ｂ）銀塩を入れた容器と；
（ｃ）還元剤を入れた容器と；から成るキット。
【請求項２６】
ナノ粒子は金、銀、白金またはそれらの混合物から成る、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
ナノ粒子はオリゴヌクレオチドを結合させた金ナノ粒子から成る、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または複合体から成る、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
銀イオンが酢酸銀、乳酸銀または硝酸銀を含む銀塩に由来する、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
還元剤がヒドロキノン、ｎ−没食子プロピル、ｐ−フェニレンジアミン、またはホルムアルデヒドから成る、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２０００年７月１１日出願の米国仮出願第６０／２１７，７８２の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の属する技術分野）
本発明は、いくつかの分野、特に固体表面に固定された特定の核酸、タンパク質、炭水化物、または有機化合物の検出に関する。より詳細には、本発明は、固定化標的が金属ナノ粒子プローブに認識され、かつ検出シグナルがナノ粒子プローブ上への銀の還元的沈積により増幅される検出系に関する。
【０００３】
（発明の背景）
（ａ）金ナノ粒子プローブ
生体ポリマーの検出用のリポーターとしての金ナノ粒子プローブの使用については、表面抗原に対する免疫細胞化学プローブとしてナノ粒子を使用した、Ｗ．Ｐ．Ｆａｕｌｋ およびＧ．Ｍ．Ｔａｙｌｏｒによって初めて説明された［Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｔｒｙ， ８，１０８１（１９７１） ］ 。それ以来、粒子を観察するために電子顕微鏡検査または光学顕微鏡検査を使用して、様々なタンパク質の検出のために金コロイドが広く使用されている［概説としてはＨａｃｋｅｒ， Ｇ． Ｗ． のＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ． １， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９８） ｐ ２９７およびＧａｒｚｏｎ， Ｓ．およびＢｅｎｄａｙａｎ， Ｍ．  のＩｍｍｕｎｏ−Ｇｏｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｅｄ． Ｈｙａｔｔ， Ａ．Ｄ． ａｎｄ Ｅａｔｏｎ， Ｂ．Ｔ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， （１９９３） ｐ １３７を参照されたい］最近、オリゴヌクレオチドや核酸の検出用プローブとしての金ナノ粒子またはクラスター共役体の応用が示唆されており［Ｋｉｄｗｅｌｌ， Ｄ．Ａ．，  および Ｃｏｎｙｅｒｓ， Ｓ．Ｍ．， 米国特許第５，３８４，２６５ 号 （１９９５） ； Ｈａｉｎｆｅｌｄ， Ｊ．Ｆ．，ら、米国特許第５，５２１，２８９ 号 （１９９６） ］、また説明されてもいる ［Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｓ．，  ら， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７］， ２１７ （１９８８）； Ｍｉｒｋｉｎ ら， Ｎａｔｕｒｅ， １５， ６０７ （１９９６）；．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ， Ｊ．Ｊ．ら， Ｊ Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， １９５９ （１９９８）］。
【０００４】
（ｂ）シグナルの銀による増強
組織中のタンパク質［Ｄａｎｓｃｈｅｒ， Ｇ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７１， １ （１９８１） ； Ｈｏｌｇａｔｅ， Ｃ．Ｓ．ら Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３１， ９３８ （１９８３） ］、固定化生体系にてインサイチュで視覚化される核酸［Ｇａｓｓｅｌｌ， Ｇ．Ｊ．，ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２６， ８６３ （１９９４）；Ｚｅｈｂｅ， Ｉ． ら， Ａｍ Ｊ． ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １５０， １５５３ （１９９７）；Ｈａｃｋｅｒ， Ｇ． Ｗ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ４２， １１１ （１９９８） ］、およびガラス表面上のオリゴヌクレオチドアレイ上に捕捉されたオリゴヌクレオチドを標的とした金プローブ［Ｔ． Ａ． Ｔａｔｏｎ， ＣＡ． Ｍｉｒｋｉｎ， Ｒ．Ｌ． Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １７５７ （２０００）］に対して金マーカーを使用するアッセイの感度を、銀染色により著しく高めることができることが分かっている。このプロセスでは、表面に捕捉された金粒子を、銀イオンと還元剤（例えばヒドロキノン）を含む溶液で処理する。銀が金粒子上に沈積されるように金は銀イオンの還元を触媒し、初期に沈積された銀はそれ自体銀イオンのさらなる還元を触媒する。結果として、視覚化できる金属の量が大幅に増加する。しかしながら、不都合なことに、沈積銀により触媒される銀の還元は、ある時間が経過すると終わるため、達成可能な増幅の程度は限定される。ガラスプレート上での金ナノ粒子の視覚化を増強することに従事すると、標的配列によって捕捉された金プローブの特性であるスポットが暗く観察される。実際、初期に沈積した金の量が少なすぎて裸眼では見ることができない場合に、良好な銀スポットを観察することができる。一般に、銀染色工程の反応時間は、約５分またはそれ未満と短い。銀溶液への長時間の曝露は、銀金属の非選択的沈積と高いバックグラウンドにつながる。非触媒的還元を最小限にするために、使用に直前に銀イオン溶液と還元剤が混合される。
【０００５】
（ｃ）オリゴヌクレオチドアレイとポリヌクレオチドアレイ
生物学の最近の主な新機軸では、固体表面へ結合されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアレイを使用する。これらのオリゴマーは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を結合させるための捕捉プローブとして機能する。そのような捕捉された配列は、該配列に予め取り付けておいた蛍光標識によってまたは標的のセグメントに結合する蛍光もしくは比色プローブによって認識される。Ｅｒｉｃ Ｌａｎｄｅｒ［［Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ２１， ３ （１９９９）］に述べられているように、「アレイは…ＤＮＡおよびＲＮＡ変異型を観察する体系的方法を提供することにより、一番大きな希望を提供する。アレイは分子生物学的研究でも臨床診断でも標準ツールになっているように思われる。アレイの有望性は、公共セクターと民間セクターの両方からの大きな関心と投資を引きつけている。」
【０００６】
アレイ技術は実際に、遺伝変異と遺伝子発現についての我々の理解の進展を非常に加速している。しかしながら、現在の方法論にはいくつかの制限があり、そのうちの重要なものの１つは、チップアレイ上の蛍光標識標的を検出する際の感度が比較的低いことである。通常、ピコ（１０−１２）モルかそれより高い濃度範囲の標的を使用しなければならない。従って、アト（１０−１８）モルやゼプト（１０−２１）モルの天然標的の遺伝子分析では、ＰＣＲによる標的の増幅が必要となる。この手順には時間と労力が要求されると共に、標的の増幅が試験配列にエラーを生じさせることがある。
【０００７】
チップ上に配列されたポリヌクレオチドの、より感度が高く簡単かつ安価な検出方法が必要とされている。プローブとして金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を使用し、銀イオン還元によりシグナルを増幅することで、検出技術に進歩がなされており、これにより５０ｆＭ（フェムトモル、１０−１５）濃度のポリヌクレオチドの測定が容易に検出できる［この方法論についてはＴ． Ａ． Ｔａｔｏｎ， Ｃ．Ａ． Ｍｉｒｋｉｎ， Ｒ．Ｌ． Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １７５７（２０００）を参照されたい］。我々は本願において、金ナノ粒子と他の金属ナノ粒子を使用して、アッセイに必要な標的濃度をさらに大幅に減少させる発見について説明している。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、銀スポットの生成が生体ポリマー（例えばタンパク質と核酸）および小分子を含めた分子の存在を示すリポーターの役割を果たす、検出系での銀沈積の増強によるシグナルの増幅方法に関する。検出系には、インサイチュでの（例えば細胞上または組織サンプル中での）分子の検出と、検出すべき分子（標的分子）を基材に結合させるか、基材に結合させた別の分子（捕捉分子）によって捕捉するアッセイとを含む。本発明は、固体表面上の個別の位置に配列された複数の標的分子の検出に関する、診断用途およびスクリーニング用途に特に有用性がある。したがって、本発明は、マイクロアレイまたはマイクロチップ上で行なわれた試験の感度を大幅に向上する手段を提供する。そのプロセスは、実施の簡単さと経済性、ならびにシグナルの大幅な増強（したがって感度の実現）をその特徴とする。
【０００９】
本発明は、（１）オリゴヌクレオチドでコーティングされた金ナノ粒子が、ガラス基板かプレート上にハイブリダイゼーションにより固定した金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体に予め沈積させておいた銀に結合するという発見および（２）結果として生じる金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−銀−（金−オリゴヌクレオチド）構造体が、銀イオンの還元による銀のさらなる沈積の触媒として機能するという発見に基づいている。１つ目の発見は驚くべきものである、というのは、表面に結合されたオリゴヌクレオチドは、ガラス表面やガラス表面上に固定されたオリゴヌクレオチドへのナノ粒子の非特異的結合を防ぐものであり、ナノ粒子の銀表面との相互作用も防ぐだろうと予想されるからである。実際に他の研究では、混合物を乾燥させたときでさえ、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が融合して個々のナノ粒子間の金−金結合を形成するのをオリゴヌクレオチドが防ぐことが示されている。２つ目の発見は、本来固定されたナノ粒子の部位で金属の量を本質的に増加させる手段を提供するため重要である。銀とのハイブリダイゼーションまたは相互作用により結合していない、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体をガラス表面から一掃する緩衝液の条件の開発と相まって、上記の知見は、非常に低い標的濃度でポリヌクレオチド標的を測定する機会を開いた。
【００１０】
従って、本発明の１つの目的は、検出シグナルを増幅する方法であって、
（ａ）沈積銀を有する基材を提供する工程と；
（ｂ）ナノ粒子−銀サンドイッチを有する基材を生産するために、沈積銀を有する基材を、オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を含む溶液と接触させる工程と；
（ｃ）前記サンドイッチを有する基材を洗浄する工程と；
（ｄ）前記サンドイッチのナノ粒子上への銀沈積を促進するために、前記サンドイッチを有する基材を銀イオンおよび還元剤と接触させる工程と；から成る方法を提供することである。
【００１１】
オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、金、銀、白金またはそれらの組み合わせから成る。それらのナノ粒子は、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または複合体の形をしていてよい。
【００１２】
本発明の別の目的は、銀を含む表面上で銀沈積を促進する方法であって、
（ａ）銀が結合された表面を提供する工程と；
（ｂ）ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を生産するために、前記表面をオリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を含む溶液と接触させる工程と；
（ｃ）前記ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を洗浄する工程と；
（ｄ）前記ナノ粒子−銀サンドイッチの前記ナノ粒子上への銀沈積を促進するために、還元条件下で前記ナノ粒子−銀サンドイッチを有する表面を銀イオンを含む溶液と接触させる工程と；
（ｅ）沈積銀を有する表面を洗浄する工程と；から成る方法を提供することにある。
【００１３】
この方法によれば、表面は、標的分子のインサイチュ検出用の細胞または組織から成ってよい。オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、共役体または複合体の形をしたオリゴヌクレオチドを結合させた金ナノ粒子から成ることが好ましい。本発明を実施するにあたっては、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が好ましい。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、検出シグナル増幅のためのキットであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子を入れた容器と；
（ｂ）銀塩を入れた容器と；
（ｃ）還元剤を入れた容器と；から成るキットを提供することである。
【００１５】
キットは銀染色検出シグナルを増幅する際に使用される説明書を含んでもよい。オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子は、共役体または複合体の形をしたオリゴヌクレオチドを結合させた金ナノ粒子から成ることが好ましい。本発明を実施するにあたっては、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が好ましい。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的物質を検出するためのシグナル増幅方法に関する。詳細には、本発明は、銀染色検出に基づく、シグナルの増幅と、微量の標的分子（例えば核酸）の検出のためのアッセイ感度の向上とを提供する。本発明を実施する際には、従来の銀染色の適用後に創作的方法を使用し、これが銀−金（オリゴヌクレオチド）−銀アセンブリ（本明細書では銀−金−銀サンドイッチアセンブリと称する）の生成につながる。
【００１７】
従来の銀染色につながり、従来の銀染色を含む前工程には、例えば以下のことが含まれ得る：ガラス表面に結合させたオリゴヌクレオチド捕捉プローブによる標的オリゴヌクレオチドの捕捉、洗浄、結合された標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の添加、洗浄、銀染色溶液（Ａｇ＋と還元剤（Ｓｉｇｍａ 社より入手可能）の添加、洗浄、乾燥、および裸眼または簡単な平床式スキャナ使用して得られた画像による観察。この手順はＴａｔｏｎ ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １７５７ （２０００） に説明された。Ｔａｔｏｎ らは、得られる金のスポットは弱すぎてオリゴヌクレオチド中の１００ｎＭの標的濃度では直接観察することができないが、従来の銀沈積が強い暗色のスポットを可能にすることを示した。従来の銀染色を使用するこの系の検出限界は５０ｆＭ濃度であり、この濃度では非常に弱いスポットが観察される。銀溶液に再び暴露しても、スポットの強度がさらに顕著に増強されることはなかった。
【００１８】
本発明の銀−金−銀サンドイッチ法による銀シグナルの増幅の場合、従来の染色の前もっての適用からの銀染色を含むガラスプレートを、オリゴヌクレオチドを結合させたナノ粒子、好ましくは金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体の増幅水溶液にさらに暴露する。オリゴヌクレオチド配列は、標的オリゴヌクレオチド配列や最初のプローブ上の配列に関連づける必要はない。金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体では、増幅溶液は通常約１ｎＭ〜５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を含む。増幅溶液は、緩衝液塩類のような塩類や、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＮＥＳのような界面活性剤を含んでよく、好ましくは約７のｐＨを有する。本発明を実施するにあたって、０．１Ｍの水性ＮａＣｌと１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）を含む水性増幅溶液が特に有用であることが分かった。金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体では、増幅溶液は同じである。銀染色を増幅溶液に暴露するいかなる適切な態様を使用してもよい。代表的な例としては、噴霧、浸漬などが含まれる。
【００１９】
約５〜３０分後、好ましくは約１０分後に、結合していないナノ粒子共役体または複合体は、プレートを適切な水溶液、好ましくは水で洗浄することにより除去される。任意選択で、プレートは空気乾燥のような任意の適切な方法で乾燥される。プレートはその後、適切な時間の間、一般に約５〜約１０分間、好ましくは約５分間、銀染色溶液に再び暴露される。いかなる適切な銀染色方法を使用してもよいことが理解されよう。有用な銀染色方法および組成物の適当ではあるが非限定的な例が、例えばＭ．Ａ． Ｈａｙａｔ， 編，祢ｍｍｍｕｎｏｇｏｌｄ−Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ   ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）に説明されている。一般に、銀染色溶液には、酢酸銀（好ましい場合）、乳酸銀および硝酸銀のような銀塩の形をした銀イオンが含まれる。これらの溶液には、使用の直前に溶液に混合される還元剤も含まれる。還元剤の適当ではあるが非限定的な例としては、ヒドロキノン、ｎ−没食子プロピル、ｐ−フェニレンジアミンおよびホルムアルデヒドが含まれる。所望の場合、銀染色プロセスを媒介するためにアラビアゴムのような他の作用物質を使用してもよい。銀染色溶液と基材を接触させるいかなる適切な態様を使用してもよい。代表的な例としては、噴霧、浸漬などが含まれる。
【００２０】
水（好ましい場合）または他の適切な溶液（例えば０．１Ｍ  ＮａＣｌと１０ｍＭ  リン酸塩（ｐＨ７．０）を含む水溶液）で洗浄して、未反応の銀染色溶液を除去した後、再び暴露したプレートを視覚的に観察するか、または平床型スキャナによってコピーする。この処理は、スポットの暗さの大幅な増大につながる。そのプロセスを望ましいだけ繰り返して、沈積銀の量とスポットの暗さをさらに増強する。この創作的増幅方法により、２５ｆＭの標的濃度を使用するアッセイに対して暗い銀スポットを容易に観察することができる。２サイクルの新しいナノ粒子−銀サンドイッチ手順により、１ｆＭの標的溶液を認識することができる。また、３サイクルで、０．１ｆＭの溶液が陽性〜弱いスポットを与える。各場合で１μｌの標的溶液を使用して、上記実験を実行した。０．１ｆＭ溶液のアッセイの場合、これは適用サンプル中の約６０個の標的分子に相当する。
【００２１】
検出できる変化として銀染色を観察できるいかなる基材を使用してもよい。適切な基材としては、透明な固体表面（例えばガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）が挙げられる。基材は任意の形または厚さであってよいが、一般に平坦で薄い。ガラス（例えばガラススライド）またはプラスチック（例えば微量定量プレートのウェル）のような透明基材が好ましい。
【００２２】
本発明の銀染色シグナル増幅方法は、特定の特性を満たすナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体または複合体の使用に依存している。第１に、ナノ粒子は試験中のチップの表面にくっつかない。Ｆｒｅｎｓ （Ｆｒｅｎｓ， Ｇ．， Ｎａｔ． Ｐｈｙｓ． Ｓｃｉ．， ２４１， ２０−２２ （１９７３）のクエン酸塩還元法によって調製された通常のナノ粒子は、上記アッセイ用の基材として使用されるオリゴヌクレオチド誘導化ガラスプレートに無差別に結合するため、十分ではない。その場合、後続の銀増強により暗色領域として偽陽性が生じてしまう。第２に、ナノ粒子は、後に洗浄した時に、付着したナノ粒子が銀領域に結合したまま溶液中に懸濁されたナノ粒子はきれいに除去されるよう、沈積銀の表面に結合する。第３に、ナノ粒子は、銀染色条件下で銀イオンを還元するための作用物質として機能する。本発明を実行するにあたっての有用なナノ粒子は、Ｓｔｏｒｈｏｆｆら Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０， １９５８（１９９９）に説明されているような硫黄を介して表面にリンクされたオリゴヌクレオチドでコーティングされたナノ粒子（特定の例としては、例えば以下の実施例１の共役体Ｉを参照）（ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体）や、実施例１で説明されている共役体ＩＩＩ のような表面に吸着された天然型オリゴヌクレオチドでコーティングされたナノ粒子（ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体）である。いずれのタイプのナノ粒子も、低い塩溶液または中程度の塩溶液（例えば０．１Ｍ以下）で十分に機能するが、高い塩濃度（高い塩濃度ではオリゴヌクレオチドの単なる吸着によって形成された複合体は不安定であり、凝集する）で行われる試験には、硫黄アンカーを含む共役体が特に好ましい。当業者には、上記に列挙した基準を満たす任意のナノ粒子調製物がサンドイッチアセンブリを形成する際の中間作用物質として有用であり、上記方法を最初の銀沈積により視覚化された任意の標的に対する銀シグナルの増幅に適用できることが理解されるであろう。金ナノ粒子が特に好ましいが、銀ナノ粒子や白金ナノ粒子を含めた銀の還元を触媒するいかなるナノ粒子も使用できる。
【００２３】
本発明の実施に使用するのに適したナノ粒子の調製、該ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの取付、平床型スキャナ技術、ならびに従来の銀染色を使用した核酸検出のための種々のアッセイ形式が、同時係属出願である２００１年１月１２日出願の第０９／７６０，５００号、２０００年６月２６日出願の第０９／６０３，８３０号、１９９９年６月２５日出願の第０９／３４４，６６７号、１９９９年１月２９日出願の第０９／２４０，７５５号、１９９６年７月２９日出願の第６０／０３１，８０９号；２０００年４月２６日出願の第６０／２００，１６１号、１９９７年７月２１日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号、２０００年６月２６日出願の第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号、および２００１年１月１２日出願の第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号、発明の名称「ナノ粒子を付着したオリゴヌクレオチドおよびその使用方法（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ Ａｔｔａｃｈｅｄ Ｔｈｅｒｅｔｏ Ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ）」に説明されており、これらの内容全体は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
実施例
実施例１：オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
オリゴヌクレオチドと５’−メルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドを、Ｓｔｏｒｈｏｆｆら［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， １９５９−９６４ （１９９８） ］に説明されているようなホスホアミダイト化学を使用して調製した。金ナノ粒子（直径約１３ｎｍ）はＦｒｅｎｓ， Ｇ．，Ｎａｔ．Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，２４１， ２０−２２（１９７３）に説明されているように調製した。
【００２５】
サンドイッチ銀−金−銀増幅図式で使用されるナノ粒子共役体（Ｉ） を調製するために、５’−メルカプトアルキルオリゴヌクレオチドＩＩを製造し、Ｓｔｏｒｈｏｆｆら［Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， １９５９−９６４ （１９９８） ］に説明されている一般的なリンク法により金ナノ粒子につないだ。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体（ＩＩＩ ）を、０．２６Ａ２６０ユニットのオリゴヌクレオチドＩＶを含む１μＬの水溶液を１００μＬのクエン酸塩安定化金コロイド（Ｇｒａｂａｒら［Ｊ．Ａｎａｌｙｔ． Ｃｈｅｍ．， ６７， ７３５−７４３ （１９９５） ］に説明されているように調製）と混合し、溶液を一晩静置することにより調製した。
【００２６】
Ｉ．  金ナノ粒子とＩＩから形成された共役体
ＩＩ． ５’−ＨＳ（ＣＨ２）６ＯＰ（Ｏ）（Ｏ）Ｏ−（Ａ）２０ＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣ（配列番号１）
ＩＩＩ．金ナノ粒子とＩＶから形成された複合体
ＩＶ． ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号２）
【００２７】
実施例２：銀シグナルのサンドイッチ増幅
本実施例では、実施例１のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（Ｉ） または複合体（ＩＩＩ） と、Ｔ．Ａ． Ｔａｔｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １７５７−６０ （２０００）に説明されている銀染色法を使用して行ったオリゴヌクレオチドアッセイからの銀スポットを含むガラススライドとを使用して、４つの別個の実験を行った。銀スポットを担持したガラスプレートを、金ナノ粒子共役体Ｉ （図２，４，５）または金ナノ粒子複合体ＩＩＩ （図３）の溶液に１０分間暴露し、１Ｍ  ＮａＮＯ３ナノピュア水溶液で洗浄し、室温で５分間、２つの市販のＳｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ 溶液（カタログ番号５５０２０および５５１４５、Ｓｉｇｍａ 社、ミズーリ州セントルイス）の５分間新たに混合した試料の１：１混合物に暴露し、ナノピュア水、チオ硫酸ナトリウム溶液、ナノピュア水による最終洗浄を含めた銀染色工程についてのＳｉｇｍａ 社のプロトコルに従った。プレートを乾燥させ、視覚的におよびＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｎｅｒ ［５２００Ｃ型］を使用した記録用コピーの両方により観察した。スポットの直接の目視観察は、スキャナを使用して得られた印刷と一致した。図は拡大してある。
【００２８】
図２は、ナノ粒子オリゴヌクレオチド共役体Ｉ を使用した最初の実験の結果を示す。この実験では、２枚のプレート（各々が、薄い標的溶液の予めのハイブリダイゼーションおよび銀染色から得られた非常に弱い銀スポットを含んでいる）を使用した。スポットをさらに増強しようとして、プレート（ａ）を第２ラウンドの従来の銀染色に供したが、シグナルの増強はわずかで、ほとんど起こらなかった。プレート（ｂ）を金サンドイッチ増幅のための条件に供した。これは、弱い銀スポットを含むプレートをナノ粒子共役体Ｉ の溶液に１０分間暴露し、その後水で洗浄し、４分間従来の銀染色を行う必要がある。プレート（ａ）に対するプレート（ｂ）のスポットの暗さは、新しい金属サンドイッチまたはシグナル増強法の能力を明らかに実証している。
【００２９】
図３は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体ＩＩＩ を使用した実験の結果を示す。プレート（ａ）は、従来の銀染色を使用したサンプルについて得られたシグナルを示す。プレート（ｂ）は金サンドイッチ技術によって達成可能な増強を示す。各場合に２つのサンプルスポットを示すことに注意する。いずれの場合も２つのサンプルスポットが示されていることに留意する。プレート（ｂ）では、プレート（ａ）に対応する弱い銀スポットを含むプレートを、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体ＩＩＩ の溶液に暴露し、洗浄後、従来の銀染色に供した。この場合、上述のように調製した３部のコロイドＩＩＩ を７部の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）と混合した。その後、プレートをこのコロイド溶液に１０分間暴露し、ナノピュア水で洗浄し、上述のように４分間銀染色混合物に暴露した。
【００３０】
図４は、２５ｆＭ濃度の６３ヌクレオチドから成る標的オリゴヌクレオチド５’ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ３’（配列番号３）のアッセイから得られた弱い銀シグナルを増強するための金ナノ粒子−オリゴヌクレオチドＩ を用いた実験の結果を示す。銀増幅のみを使用する本発明者らの標準アッセイは、非常に弱いスポット（プレート（ａ））を与えることに留意する。プレート（ａ）は、２５ｆＭの標的オリゴヌクレオチドの２５溶液を使用した試験についての従来の銀染色の結果を示す。プレート（ｂ）は、最初の銀染色の後に、ナノ粒子−共役体Ｉのコロイド溶液に１０分間暴露し、その後銀染色した場合の同じ試験についての結果を示す。この場合、金溶液は０．１Ｍ  ＮａＣｌ−１０ｍＭ  リン酸緩衝液で６倍に希釈された。金属サンドイッチ増強法の後の、２５ｆＭ濃度で捕捉された標的に対する強いシグナルに留意する。
【００３１】
図５は、１ｆＭ濃度の６３ｍｅｒ標的［配列番号３］を使用して行ったアッセイから得られた銀染色を増強するためのナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体Ｉ を使用した実験の結果を示す。この場合、銀染色用の本発明者らの標準法ではいかなるスポットも示されなかった。しかしながら、金−銀処理を使用した二重増強は、図に示すように強いシグナルを示した。この実験は、標準法で銀増幅に暴露したプレートを、連続して、（１）金ナノ粒子共役体Ｉ（１０Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１．５ｎＭナノ粒子） で１０分間処理し、（２）１Ｍ  ＮａＮＯ３で洗浄し、（３）Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ 溶液（カタログ番号５０２０およびＳ５１４５（Ｓｉｇｍａ 社）の混合物でＳｉｇｍａ 社のプロトコルにより処理し、（４）１Ｍ  硝酸ナトリウムで洗浄し、（５）工程（１）〜（４）を繰り返し、（６）チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、（７）水で洗浄することにより行った。
【図面の簡単な説明】
【図１】固体表面に固定された金ナノ粒子の検出シグナルの増幅の略図。工程（ａ）は従来の銀染色である。工程（ｃ）で、オリゴヌクレオチドを担持する金ナノ粒子を銀表面に結び付ける。工程（ｅ）は、先の銀表面に結合された金ナノ粒子の従来の銀染色である。
【図２】本発明の増幅方法を適用するかまたは適用しない、２枚のプレートの例証図。プレート（ａ）はさらにスポットを増強するために第２ラウンドの従来の銀染色に供した。シグナルの増強はわずかで、ほとんど起こらなかった。プレート（ｂ）は本発明のシグナル増幅方法に供した。
【図３】本発明の増幅方法を適用するかまたは適用しない、２枚のプレートの例証図。プレート（ａ）は従来の銀染色を使用したサンプルについて得られたシグナルを示す。プレート（ｂ）は本発明のシグナル増幅方法の適用によって達成可能な増強を示す。
【図４】本発明の増幅方法を適用するかまたは適用しない、２枚のプレートの例証図。プレート（ａ）は２５ｆＭの標的オリゴヌクレオチド溶液を使用した試験についての従来の銀染色の結果を示す。プレート（ｂ）は最初の銀染色に続いて本発明のシグナル増幅方法を行った同じ試験についての結果を示す。
【図５】本発明のシグナル増幅方法の適用後のプレートの例証図。ガラス板上に金ナノ粒子プローブとオリゴヌクレオチド標的（６３ｍｅｒ）を固定した時の、２サイクルのナノ粒子−オリゴヌクレチド（共役体Ｉ）／銀染色法の後に得られたスポット。標的オリゴヌクレオチドの濃度はこの場合たった１ｆＭであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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