(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表されるリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
【化１】
0003587390.tif 000009
式中、Ｂｚｌは、ベンジル基を表す。Ａは、−ＣＨ２  −、−ＣＨ（ＣＨ３  ）−又は
【化２】
0003587390.tif 000010
を表す。
【請求項２】
Ａが−ＣＨ２  −である請求項１記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
【請求項３】
Ａが−ＣＨ（ＣＨ３  ）−である請求項１記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
【請求項４】
Ａが
【化３】
0003587390.tif 000011
である請求項１記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩を用いることを特徴とするリン酸化ペプチドの合成方法。
【請求項６】
合成方法が、Ｎｐｙｓ法を用いて、固相法又は液相法によりするものである請求項５記載のリン酸化ペプチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、下記の一般式（Ｉ）
【０００２】
【化４】
0003587390.tif 000002
【０００３】
（式中、Ｂｚｌは、ベンジル基を表す。Ａは、−ＣＨ２  −、−ＣＨ（ＣＨ３  ）−又は
【０００４】
【化５】
0003587390.tif 000003
【０００５】
を表す。）で表されるリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体及びこれらを使用するリン酸化ペプチドの合成方法に関する。本発明に係るリン酸化ペプチドは、ガン遺伝子等の生体内蛋白質の部分構造であり、ガンの診断、薬理作用の検定等の分野に応用できるので、極めて有用である。
【０００６】
【従来の技術】
生体を構成する特定の蛋白質において、その一次構造上の一定のアミノ酸残基がリン酸化されることによって、生体内でのシグナル伝達等の制御が行われることが知られている。
【０００７】
例えば、Ｓｒｃ等のある種のガン遺伝子にはプロテインキナーゼ活性が発見され、その機能が研究されており（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７５巻、第３０２１頁以下、１９８０年）、また、脳内蛋白質（タウ蛋白質等）（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６７巻、第１０８９７頁以下、１９９２年）を始め情報伝達系に関与する様々な蛋白質（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９６巻、第６１３頁以下、１９８２年）がリン酸化、脱リン酸化の制御下にあることも知られている。
【０００８】
上記のことから、生体内蛋白質中のリン酸化基質となる部分を含むペプチドやその生産物であるリン酸化ペプチドを合成し、これをもとに研究を行うことが、当該生体内蛋白質の生理機能を解明するための重要な手法となっている。
上記リン酸化ペプチドを得る方法としては、（１）ペプチドを酵素を用いてリン酸化する方法、（２）化学的にリン酸化ペプチドを合成する方法の２つがある。
【０００９】
酵素を用いてリン酸化する方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）、第３３巻、第４６８頁〜４７６頁、１９８９年）は、ペプチドが特定のアミノ酸配列に限られているため適用範囲が狭く、充分な量のペプチドを調製することができないという欠点があった。
【００１０】
化学的にリン酸化ペプチドを合成する方法には、固相法で用いられているＢｏｃ法及びＦｍｏｃ法がある。
Ｂｏｃ法（ケミカル・レターズ（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）、第１４０１頁以下、１９９３年）においては、Ｏ−リン酸化ベンジル基等で保護したリン酸化アミノ酸を含むペプチド鎖を順次Ｎ末端側へ延ばしていくが、伸長過程でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いるので、ベンジル基等の保護基の脱離が部分的におこり、ペプチド鎖の延長が阻害される欠点があり、また、樹脂からのペプチドの回収には、強酸であるトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＡ）を用いなければならず、副反応が起こりやすく収率よくリン酸化ペプチドを回収することができない等の欠点がある。
【００１１】
Ｆｍｏｃ法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）、第４０巻、第１３４頁〜１４０頁、１９９２年等）においては、ホスホセリン、ホスホスレオニンは、β脱離が起こるため基本的に合成ができず、そのためリン酸化導入部位だけ無保護にしたペプチドを合成後、ジベンジルホスホロアミダイト等を用いてリン酸基を導入するという複雑な方法を必要とする欠点がある。また、この方法では立体的な障害やリン酸化の過程で酸化の工程が含まれるために目的物を高収率で得ることも困難である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状に鑑み、本発明は、短い工程でしかも高い収率で、目的とするリン酸化ペプチドを取得する方法及びそのために必要なリン酸化アミノ酸を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、リン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体を先に取得し、これを用いて、以下に詳述するＮｐｙｓ法を用いて、固相法又は液相法によりリン酸化ペプチドを合成するところにある。上記リン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体は、本発明者らにより初めて見いだされたものであり、従って、本発明の要旨は、このリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体そのものにもある。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明に係る上記リン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体は、Ｌ−アミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の水酸基をリン酸化し、アミノ基を３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（本明細書において「Ｎｐｙｓ」ともいう）基で保護した誘導体であって、上記一般式（Ｉ）で表される。上記リン酸化アミノ酸誘導体は、下記に示した工程で合成することができる。
【００１５】
【化６】
0003587390.tif 000004
【００１６】
式中、Ａ、Ｂｚｌは前記と同じ。
上記合成において、出発原料は、Ａが−ＣＨ２  −の場合はＢｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ａが−ＣＨ（ＣＨ３  ）−の場合はＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ａが−ＣＨ２  −Ｃ６  Ｈ４  −の場合はＢｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）である。これらは、市販のものを用いることができる。
上記化合物はギ酸で処理してＢｏｃ基をはずし（工程ａ）、Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）を得、得られた化合物に３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロライドを反応させ、炭酸ナトリウムを加えて（工程ｂ）、α−アミノ基にＮｐｙｓ基の導入された上記リン酸化アミノ酸誘導体を得ることができる。
上記３つのリン酸化アミノ酸誘導体は、文献未記載の新規化合物であり、本発明者らにより初めて取得され、その物性を同定された物質である。
【００１７】
本発明の上記リン酸化アミノ酸誘導体は、後述するリン酸化ペプチドを合成する原料として極めて重要な化合物である。上記リン酸化ペプチドを合成するためには、上記リン酸化アミノ酸誘導体のほか、これらの塩も利用することができる。上記リン酸化アミノ酸誘導体の塩は、通常アミノ酸化学上考えられる塩であれば特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、ジシクロヘキシルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩等を挙げることができる。
【００１８】
本発明においては、上記リン酸化アミノ酸誘導体又はその塩を他のアミノ酸とペプチド結合させて、リン酸化ペプチドを合成する。
上記リン酸化ペプチドの合成は、公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験」、泉屋ら共著、１９８５年、丸善、「蛋白質の化学」、生化学実験講座（Ｉ）、第４巻、東京化学同人発行、１９７７年等）に準じて液相法又は固相法により行うことができる。本発明のリン酸化ペプチドの合成方法としては、固相法が好ましい。
【００１９】
上記リン酸化ペプチドを固相法により合成する場合は、まず、最初に目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸のα−アミノ基を保護した保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合させる。
【００２０】
上記アミノ酸のα−アミノ基の保護基は、Ｎｐｙｓ基である。本明細書においてＮｐｙｓ法とは、α−アミノ基の保護基としてＮｐｙｓ基を用いてペプチドを合成する手法をいう（松枝ら。インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）、第１６巻、第３９２〜４０１頁、１９８０年）。
【００２１】
上記保護アミノ酸とは、官能基が公知の方法により保護されたアミノ酸であり、各種のものが市販されている。アルギニンのグアニジル基の保護基としては、例えば、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基等が挙げられる。アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基の保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。システインのメルカプト基の保護基としては、例えば、トリフェニルメチル基、Ｓ−アセトアミドメチル基等を挙げることができる。セリン、スレオニン、チロシンの水酸基の保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシ基等を挙げることができる。ヒスチジンのイミダゾリル基の保護基としては、例えば、トリフェニルメチル基等を挙げることができる。トリプトファンのインドリル基の保護基としては、例えば、ホルミル基等を挙げることができるが、保護しなくてもよい。
【００２２】
上記各保護基は、基本的には、最終脱保護の際、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で切断できるものが使用される。システイン残基のＳ−Ｓ結合を結ぶ際は、合成条件に応じ適切なものを選択することができる。
【００２３】
上記α−アミノ基を保護した保護アミノ酸を結合させる不溶性樹脂としては、アミノ酸との結合がＴＦＡ等で切断できる樹脂ならば特に制限されず、例えば、パラアルコキシベンジルアルコール樹脂、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酢酸樹脂等を挙げることができる。
【００２４】
上記不溶性樹脂に結合したα−アミノ基を保護した保護アミノ酸は、α−アミノ基の保護基をはずした後、ペプチド鎖の一次構造に従い、Ｃ末端側から、α−アミノ基にＮｐｙｓ基を導入した各種アミノ酸（以下Ｎｐｙｓ保護アミノ酸ともいう）又は上記リン酸化アミノ酸誘導体を順次結合させる。
【００２５】
保護アミノ酸の縮合は、Ｎｐｙｓ法に従って、すべて中性条件で鎖長を延ばすことができる。すなわち、Ｃ末端アミノ酸を不溶性樹脂に結合後、Ｎｐｙｓ保護アミノ酸、弱塩基、触媒存在下に縮合剤を用いて鎖長を伸ばす。
上記弱塩基としては、例えば、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等を挙げることができる。触媒としては、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等を挙げることができるが、なくてもよい。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリディノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）等を挙げることができる。溶媒としては、Ｎｐｙｓアミノ酸、触媒、縮合剤の溶解可能なものであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を挙げることができる。
【００２６】
上記リン酸化ペプチドの合成は、例えば、島津製作所製のペプチドシンセサイザーＰＳＳＭ８型のようなＦｍｏｃ方式の固相ペプチド合成機を使用して行うこともできる。この方法においては、得られたペプチド鎖と不溶性樹脂の結合、ペプチド鎖Ｎ末端側の保護基との結合、リン酸基の保護基であるベンジル基との結合等をＴＦＡ等を用いて切断して目的のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２７】
本発明においては、その後、溶媒にて洗浄後Ｎｐｙｓ基の脱保護を行う。脱保護は、トリフェニルホスフィン、２−ピリジンチオール−１−オキサイド等中性条件下で除去できる物質を用いてすることができる。洗浄後、弱塩基で中和洗浄し、再び縮合を行う。中和は、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等によりすることができる。
【００２８】
目的とする保護基が結合したペプチド樹脂を得た後、スカベンジャーの入ったＴＦＡにてペプチドを脱離する。スカベンジャーとしては、例えば、水、エタンジチオール、ジエチルサルファイド、チオアニソール、フェノール、アニソール等を挙げることができる。得られるペプチドの構成アミノ酸に応じて、上記の幾つかを組み合わせて使用することができる。
【００２９】
得られた粗製ペプチドは、ペプチド製造の公知の手段、例えば、逆相、ゲル濾過、イオン交換等の各種クロマトグラフィー、電気泳動等により単離、精製することができるが、例えば、逆相ＨＰＬＣによる手段が最適である。
【００３０】
本発明により得られるリン酸化ペプチドは、生理活性物質として利用することができる。
ホスホセリン含有蛋白質としては、例えば、ヒトとウシのβ−カゼイン（ムリナックス（Ｍｕｌｌｉｎａｘ），Ｔ．Ｒ．ら、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．）、第２４３巻、第６５５〜６５９頁、１９８５年）、グリコーゲン合成酵素（フォイル（Ｆｏｉｌ），Ｃ．Ｊ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６２巻、第１４０４２〜１４０４８頁、１９８７年）、Ｎ−ｍｙｃ蛋白質（ルッシャー（Ｌｕｓｈｅｒ），Ｂ．ら、ジ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第８巻、第１１１１〜１１１９頁、１９８９年）等を挙げることができる。
【００３１】
ホスホスレオニン含有蛋白質としては、例えば、ｔａｕ蛋白質（Ｋ．イシグロ（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６７巻、第１０８９７〜１０９０１頁、１９９２年）、ガン抑制遺伝子ＲＢ蛋白質（Ｙ．タヤ（Ｔａｙａ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１６４巻、第５８０〜５８６頁、１９８９年）等を挙げることができる。
【００３２】
ホスホチロシン含有蛋白質としては、例えば、ラウス・ザルコーマ・ウイルスの遺伝子産物であるｐｐ６０ｓｒｃ  （ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ），Ｔ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７７巻、第１３１１〜１３１５頁、１９８０年）、ＥＧＦレセプター（ウシロ（Ｕｓｈｉｒｏ），Ｈ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５４巻、第８０８３〜８０８６頁、１９８０年）等を挙げることができる。
【００３３】
本発明により得られるリン酸化ペプチドの１種であるＬｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ｐＳｅｒはホスホセリンを表す）は、Ｎ−ｍｙｃ蛋白質の部分アミノ酸配列であり、Ｎ−ｍｙｃ蛋白質は、ヒトのガンで発現異常がみられる蛋白質である。
【００３４】
本発明により得られるリン酸化ペプチドの１種であるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ｐＴｈｒはホスホスレオニンを表す）は、リン酸化ｔａｕ蛋白質の部分アミノ酸配列であり、アルツハイマー病患者の脳中には、ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦｓ）と称される不溶性の繊維が蓄積することが明らかにされており、このＰＨＦｓ中にはリン酸化されたｔａｕ蛋白質が存在する。
【００３５】
本発明により得られるリン酸化ペプチドの１種であるＧｌｕ−ｐＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ（ｐＴｙｒはホスホチロシンを表す）は、ｐｐ６０ｓｒｃ  の部分アミノ酸配列であり、ｐｐ６０ｓｒｃ  は代表的なレトロウイルスであるラウス・ザルコーマ・ウイルスの遺伝子産物である。
【００３６】
本発明により得られるリン酸化ペプチドは、生体上に発見される上記生理物質又は生理活性物質の部分アミノ酸配列を構成するので、これらと同じ生理活性を有する物質又はその物質の構成成分として利用することができる。また、これら物質の同定に利用することができる。上記同定は、蛋白質から目的とする特定のアミノ酸配列を検出する方法、例えば、エライザ（ＥＬＩＳＡ）法等の公知の方法を、上記リン酸化ペプチドに応用することにより、することができる。この方法により、例えば、ヒトのガンの診断及び治療、アルツハイマー病の診断及び治療、ラウス・ザルコーマ・ウイルス感染の診断及び治療をすることができる。
【００３７】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、Ｎｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）、Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）以外のＮｐｙｓ保護アミノ酸は、国産化学社製のものを使用した。
【００３８】
実施例１
Ｎｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）〔Ｎｐｙｓ保護セリン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）１ｇ（２．１ｍｍｏｌ、渡辺化学社製）に０℃下、ギ酸２０ｍｌを加え、１時間反応後、溶媒を留去し、真空にて乾燥させた。蒸留水２０ｍｌを加え等電点沈殿を行い沈殿を遠心にて集め乾燥させ、Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）を得た。収量５４６ｍｇ、収率７０％。
【００３９】
Ｒｆ値＝０．７６（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝３６６［Ｍ＋Ｈ］＋  （日本電子社製ＪＭＳ−ＤＸ３０２型質量分析装置を使用）
上記で得たＳｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）５４６ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）に水３．９ｍｌ、ＤＭＦ４．１ｍｌ、炭酸ナトリウム２７５ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）を加えて溶解後、０℃下、Ｎｐｙｓ−Ｃｌを５３０ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）加え、１時間後及び２時間後に再び炭酸ナトリウム３０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）及びＮｐｙｓ−Ｃｌを５０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）加えた。
３時間後、水１００ｍｌを添加し、エーテル洗浄（１００ｍｌ×２回）を行い、０．２Ｎクエン酸で酸性化後、酢酸エチルにてＮｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）を抽出した。硫酸ナトリウムにて一夜乾燥後、溶媒を留去し、アセトニトリル−水にて再結晶を行った。収量４００ｍｇ、収率５０％。
Ｒｆ値＝０．４（クロロホルム：メタノール：酢酸＝９５：５：３）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５２０［Ｍ＋Ｈ］＋  
【００４０】
融点１３４〜１３６℃
１Ｈ−ＮＭＲ（δ  ＣＤＣｌ３  ）：３．７（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），４．４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，ＣＨ２  Ｏ），５．０（４Ｈ，ｍ（ＯＣＨ２  ）２  ），７．４（１１Ｈ，ｍ，（Ｃ６  Ｈ５  ）２  ，Ｈ−５  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，  Ｈ−４  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−６  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ）
元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｏ８  Ｎ３  ＳＰ）
理論値  Ｃ：５０．８７  Ｈ：４．２４  Ｎ：８．０９
実測値  Ｃ：５０．６６  Ｈ：４．０８  Ｎ：８．２８
【００４１】
実施例２
Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）〔Ｎｐｙｓ保護スレオニン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）の代わりにＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）０．５ｇ（２．１ｍｍｏｌ、渡辺化学社製）を使用したこと以外は、実施例１と同様にしてＮｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）を合成した。Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）は、再結晶できなかったので逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍乾品とした。
Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）  収量５４６ｍｇ、収率７０％。
Ｒｆ値＝０．７（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝３８０［Ｍ＋Ｈ］＋  
Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）  収量７５ｍｇ、収率３４％。
Ｒｆ値＝０．２５（クロロホルム：メタノール：酢酸＝９５：５：３）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５３４［Ｍ＋Ｈ］＋  
【００４２】
融点６４〜６７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（δ  ＣＤＣｌ３  ）：１．５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ３  ），３．４（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），５．０（４Ｈ，ｍ，（ＯＣＨ２  ）２  ），５．２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ−Ｏ），７．３（１１Ｈ，ｍ，（Ｃ６  Ｈ５  ）２  ，Ｈ−５  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−４ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−６  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ）
元素分析値（Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８  Ｎ３  ＳＰ）
理論値  Ｃ：５１．７８  Ｈ：４．５０  Ｎ：７．８８
実測値  Ｃ：５１．５４  Ｈ：４．４８  Ｎ：７．８４
【００４３】
実施例３
Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）〔Ｎｐｙｓ保護チロシン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）の代わりにＢｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）０．３ｇ（０．５５ｍｍｏｌ、渡辺化学社製）を使用したこと以外は、実施例１と同様にしてＮｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）を合成した。但し、Ｎｐｙｓ−Ｃｌを反応させる際、Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）の溶解性が悪いためジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）１ｍｌを加え反応を行った。また、Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）は、再結晶できなかったので逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍乾品とした。
【００４４】
Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）  収量１３７ｍｇ、収率５６％。
Ｒｆ値＝０．３９（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝４４２［Ｍ＋Ｈ］＋  
Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）  収量６２ｍｇ、収率３４％。
Ｒｆ値＝０．２９（クロロホルム：メタノール：酢酸＝９５：５：３）
ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５９６［Ｍ＋Ｈ］＋  
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲ（δ  ＣＤＣｌ３  ）：２．９−３．３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２  ），３．８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），５．１（４Ｈ，ｍ，（ＯＣＨ２  ）２  ），７．３（１５Ｈ，ｍ，（Ｃ６  Ｈ５  ）２  ，Ｃ６  Ｈ４  ，Ｈ−５  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｈ−４  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−６  ｏｆ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ）
元素分析値（Ｃ２８Ｈ２６Ｏ８  Ｎ３  ＳＰ）
理論値  Ｃ：５６．４７  Ｈ：４．３７  Ｎ：７．０６
実測値  Ｃ：５４．８４  Ｈ：４．３０  Ｎ：６．７６
【００４６】
実施例４
Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇの合成
（ｐＳｅｒはホスホセリン（リン酸化セリン）を表す）
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）アルコキシベンジルアルコール樹脂を３０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍｌ×２）で２０分間処理後、ＤＭＦ、メタノール（各１０ｍｌ×２回）で洗浄し、真空下で乾燥させた。このようにして調製した樹脂２５ｍｇをＤＭＦにて膨潤、洗浄後、最初のアミノ酸であるＮｐｙｓ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、及び、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロフォスヘート（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰｙＢＯＰ）を、各５当量用い縮合を行った。次いでＤＭＦで再度樹脂を洗浄、脱保護は、中性条件の３％トリフェニル基ホスフィン（Ｐｈ３  Ｐ）、１．２％ピリジン・塩酸（Ｐｙｒ・ＨＣｌ）／ＤＭＦ溶液を用いて行った。
【００４７】
ＤＭＦで再び樹脂を洗浄後、１０％ＮＭＭ／ＤＭＦ溶液で中和を行い、最後にＤＭＦで洗浄した後、次のアミノ酸の縮合に移った。以下、同様の方法で鎖長を延ばした。
【００４８】
各アミノ酸の保護基としては、実施例４〜６を通して、α−アミノ基の保護基としてはＮｐｙｓ基を、セリン、スレオニンの水酸基の保護基としてはｔ−Ｂｕ基を、アルギニンのグアニジノ基の保護基としてはＰｍｃ基を、グルタミン酸のカルボキシル基の保護基としては、ｔ−Ｂｕ基を用いた。
合成機は、島津ＰＳＳＭ８を使用した。操作条件は表１に示した。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
合成完了後、樹脂をメタノールで洗浄し、真空にて乾燥した。樹脂１５ｍｇにリージェントＫ（フェノール６２．５ｍｇ、水６２．５μｌ、チオアニソール６２．５μｌ、エタンジチオール（ＥＤＴ）３１．３μｌ、ＴＦＡ１ｍｌ）を加え、室温８時間で放置した。これにより樹脂からのペプチドの切断、リン酸基の保護基であるベンジル基の脱保護、各種保護アミノ酸の脱保護を行った。フィルターで樹脂を除去後、エーテルを加え、遠心にてペプチドを集めた。真空にてペプチドを乾燥後、水１ｍｌに溶解し、以下ＨＰＬＣにて生成物の分析を行った。
【００５１】
ペプチドのＨＰＬＣによる分析は以下のようにして行った。
ＨＰＬＣ装置として島津ＬＣ−６Ａシステムを使用し、データ処理は、島津ＣＲ−７Ａを使用して行った。カラムは、コスモシル（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ）を使用した。溶出は、４０℃にて、０．０５％ＴＦＡ溶液中のアセトニトリル濃度を０−５０％（５０分間で）上昇させることにより行った。移動相の流速は、１ｍｌ／分で、２１４ｎｍの吸収を測定することにより、試料の溶出位置をモニターした。
合成反応物をＨＰＬＣで分析したところ、図１に示したように一本のメインピークが観測された。この分画を回収してアミノ酸分析、ＦＡＢ−ＭＳ分析を行った。
【００５２】
ペプチドの酸加水分解及びアミノ酸組成分析は、以下のように行った。
乾燥試料（ペプチド約２ｎｍｏｌ）の入った試験管を加水分解用バイアルに入れ、０．１％フェノール含有５．７Ｎ塩酸２００μｌを加え、減圧密閉後、１１０℃、２４時間加水分解した。試料を減圧乾燥後、０．０２Ｎ塩酸に溶解し、日立Ｌ−８５００にてアミノ酸分析を行った。表２にその結果を示した。なお、表２の実測値は、Ａｒｇとのモル相対比で表した。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
ＦＡＢ−ＭＳは、日本電子社製ＪＭＳ−ＤＸ３０２型質量分析装置を使用し、グリセリン又はｍ−ニトロベンジルアルコールをマトリックスとし、試料に混入することにより測定した。理論質量６３８、ｍ／ｚ＝６３９［Ｍ＋Ｈ］＋  。
上記の結果から、ＨＰＬＣ溶出のメインピークの分画として回収されたペプチドが目的物であることが判明した。なお、アミノ酸分析の結果より、保護ペプチド樹脂１３．８ｍｇから目的ペプチドは、２５５μｇ得られた。収率は４５％であった。
【００５５】
実施例５
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇの合成
（ｐＴｈｒはホスホスレオニン（リン酸化スレオニン）を表す）
実施例４と同様の手順を用いて合成し、合成完了後、ＨＰＬＣ分析を行った。図２にそのクロマトグラムを示した。
【００５６】
主成分として１、２、３の３本のピーク分画を分取し、各々に対してアミノ酸組成分析、ＦＡＢ−ＭＳ分析を行った。アミノ酸分析の結果を表３に示した。なお、表３の実測値は、Ａｒｇとのモル相対比で表した。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
表３から目的ペプチドは、ピーク１の分画に含まれることが判明した。ピーク１の分画のＦＡＢ−ＭＳ分析は、理論質量７５０、ｍ／ｚ＝７５０［Ｍ＋Ｈ］＋  であった。
アミノ酸分析の結果より、保護ペプチド樹脂１０ｍｇから目的ペプチドは、２１４μｇ（２８６ｎｍｏｌ）得られた。収率は３６％であった。
なお、アミノ酸分析の結果から、ピーク２はＴｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）以降のアミノ酸が縮合せずペプチド鎖の伸長が止まってしまったペプチドであることがわかった。ピーク３は、Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）だけ縮合せず、そのまま伸長が進んだペプチドと判断された。Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ３  Ｂｚｌ２  ）のダブルカップリングを行う等すれば、目的ペプチドの収率は、さらに向上する。
【００５９】
実施例６
Ｇｌｕ−ｐＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇの合成
（ｐＴｙｒはホスホチロシン（リン酸化チロシン）を表す）
実施例４と同様の手順で合成し、合成完了後、ＨＰＬＣ分析を行った。図３にそのクロマトグラムを示した。
主成分として１本のメインピークが観測され、この分画を分取し、アミノ酸組成分析、ＦＡＢ−ＭＳ分析を行った。アミノ酸分析の結果を表４に示した。なお、表４の実測値は、Ａｌａとのモル相対比で表した。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
表４から目的ペプチドは、メインピークの分画に含まれることが判明した。また、この分画のＦＡＢ−ＭＳ分析では、理論質量７１８に対し、ｍ／ｚ＝７１９［Ｍ＋Ｈ］＋  であった。
アミノ酸分析の結果より、保護ペプチド樹脂９．２ｍｇから目的ペプチドは、６３０μｇ（８７８ｎｍｏｌ）得られた。収率は６９％であった。
従来、Ｂｏｃ法を使用する方式のペプチド合成機でしかリン酸化ペプチドを直接合成することができなかったが、本発明の方法を使用することにより、Ｆｍｏｃ法を使用する方式のペプチド合成機でもリン酸化ペプチドの合成が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４で得たペプチドのクロマトグラム。縦軸は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を表す。
【図２】実施例５で得たペプチドのクロマトグラム。縦軸は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を表す。
【図３】実施例６で得たペプチドクロマトグラム。縦軸は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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