(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列で表わされる、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列で表わされる遺伝子であって、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクターを保有する形質転換体細胞。
【請求項４】
エッシェリキア  コリＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１１）である請求項３記載の形質転換体細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体ベクターを保有する形質転換体細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素は、植物成分など天然物中に大量に存在するリグニン、リグナン、その他の抽出成分のメチルエーテル構造を水酸基に転換する酵素であり、上記天然成分をカテコール、ピロガロール構造に転換する際に重要な役割を果たす。従って、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を見出し、該遺伝子にコードされるバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素を量産することはプロトカテキュ酸、カテコール、ピロガロールの生産に極めて重要である。
一方、酵素などのタンパク質の量産技術として組換えＤＮＡ技術の発展は近年めざましく、数多くの酵素、生理活性タンパク質等が組換えＤＮＡ技術を利用した量産化に成功している。しかしながら、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素は分離されていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、バニリン酸およびシリンガ酸をそれぞれプロトカテキュ酸および没食子酸に変換する際に重要な、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含有するＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片を組み込んだ形質転換体細胞を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはリグニンの構造モデル化合物を分解する微生物について鋭意研究を行った結果、組換えＤＮＡ技術を利用してバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含むＤＮＡを単離し、その塩基配列を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）  配列番号１で示されるアミノ酸配列で表わされる、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ、
（２）  配列番号２で示される塩基配列で表わされる遺伝子であって、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ、
（３）  上記１または２記載のＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクターを保有する形質転換体細胞、および
（４）  エッシェリキア  コリＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）（ＦＥＲＭ  −Ｐ１５３１１）である上記３記載の形質転換体細胞
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
次に本発明を詳述する。
微生物からバニリン酸及びシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離には、微生物の宿主−ベクター系を用いることができる。該ＤＮＡ断片は、例えば組換えＤＮＡ技術を利用して次の如くして製造される。すなわち、まずＤＮＡ供与体としてバニリン酸やシリンガ酸などのリグニンの構造モデル化合物分解能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断しＤＮＡ断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターＤＮＡを制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮＡ断片と直鎖状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、組換え体ＤＮＡを得る。該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に移入し、目的の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞を選択する。目的の組換え体ＤＮＡは該形質転換体細胞より分離することができる。ついで、目的に応じて該組換え体ＤＮＡよりあらたなる組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞へ移入する。該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞によってバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素を生産し、該酵素の作用によってバニリン酸からはプロトカテキュ酸が、シリンガ酸からは没食子酸が生産される。
【０００６】
本発明のＤＮＡ供与体としては、バニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を有する微生物であれば特に制限されず、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属の微生物等が挙げられる。具体的には、シュードモナス  ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＳＹＫ−６株等が挙げられるが、特にシュードモナス  ポーシモビリスＳＹＫ−６株が好ましい。
該微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、該微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコールによるゲノムＤＮＡの沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
分離されたゲノムＤＮＡを断片化するには、例えば該ゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行われる。
【０００７】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから組換えＤＮＡを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。かかるプラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−３等、シュードモナス  ポーシモビリスを宿主とするｐＫＴ２３０ＭＣ、ｐＶＫ１００等が好ましい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製し、必要に応じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。
ゲノムＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ等を用いて行うことができる。
【０００８】
得られる組換え体ＤＮＡを移入させる宿主微生物としては、該組換え体ＤＮＡが安定にかつ自立的に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発現するものであれば良いが、例えば大腸菌、シュードモナス  ポーシモビリスあるいはそれらの変異株を用いることができる。
宿主微生物に組換え体ＤＮＡを移入する方法としては、例えは接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等のいずれの方法も用いることができる。
【０００９】
形質転換体の選択は、用いたベクターの選択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質転換体の中から目的の組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体の選択は、例えば、本来バニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を有するシュードモナス  ポーシモビリスから得られるバニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を失った変異株にバニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を付与する性質を指標に、あるいは大腸菌を宿主とする場合、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。このプローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等のいずれも用いることができる。
【００１０】
このようにして選択された形質転換体細胞から組換え体ＤＮＡを抽出するには、常法により抽出すれば良く、例えば大腸菌の溶菌法（Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いることができる。
抽出される組換え体ＤＮＡは、必要に応じて再び組換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができる。得られる組換え体ＤＮＡから、本発明のＤＮＡ断片を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。
【００１１】
後記実施例に示すごとく、上述した方法に従って、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するもっともコンパクトな組換え体プラスミドとしてｐＤＥ０５（図１）を得た。プラスミドｐＤＥ０５から分離した該酵素をコードする遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列を配列表３に示す。また該塩基配列および該推定アミノ酸配列をそれぞれ配列表２および配列表１に示す。組換え体プラスミドｐＤＥ０５を保有する微生物、エッシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＦＥＲＭ  Ｐ−  １５３１１として寄託されている。
なお、上記遺伝子を含有するＤＮＡ断片の例としては、上記遺伝子そのもの、および上記組換え体プラスミドｐＤＥ０５のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ断片およびＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片、組換え体プラスミドｐＤＥ０１（図１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、組換え体プラスミドｐＤＥ０２（図１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片等が挙げられる。本発明の、上記遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、通常プラスミドベクターやファージベクター中に保存されるので、その配列の長さはおのずと規制される。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
（１）遺伝子ライブラリーの調製
シュードモナス  ポーシモビリス  ＳＹＫ−６株を試験管内のグルコースを含むＬＢ培地（トリプトン；１０ｇ／Ｌ、酵母エキス；５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）へ接種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製した。この前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と同様の培地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培養液の遠心により集菌した。
該菌体をＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、最終濃度０．５％  ＳＤＳおよび最終濃度１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫにて３７℃、１時間処理し、１／６容の５Ｍ食塩を混合した。ついで、１０％  ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６５℃で１０分間静置した。等量のクロロホルム−イソアミルアルコール液を加えてよく混和し、ついで遠心した。水層を等量のフェノール−クロロホルム液で抽出し、水層にエタノールを加えてゲノムＤＮＡを沈殿させ、減圧乾燥の後、ＴＥを加え溶解した。
【００１３】
該ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社、以下同様）により部分消化し、１％アガロースゲル（和光純薬工業社、アガロース１６００）にて電気泳動した。緩衝液としてＴＡＥ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いた。電気泳動後のアガロースゲルは１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドに１５分間浸漬した後水洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍光を確認した。サイズマーカーとしてλファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物（宝酒造社）を同時に電気泳動し、該ＤＮＡ断片の泳動距離からゲノムＤＮＡ消化物の分子量を求めた。
約２０ｋｂｐのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化物を含むアガロースゲルを切り出し、セシウムクロライドを用いた超遠心法にてＤＮＡ断片の精製を行った。
【００１４】
コスミドベクターｐＶＫ１００（ＡＴＣＣ３７１５６株より取得）（図１）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により完全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造社）を添加し、制限酵素にて消化したコスミドベクターの末端の脱リン酸化を行った。
上記反応液に１／１０倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２と２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷却し、９，０００×ｇにて１０分間遠心し、ベクターＤＮＡのペレットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、このリンス液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥したベクターＤＮＡをＴＥに溶解した。
【００１５】
前記シュードモナス  ポーシモビリス  ＳＹＫ−６株の約２０ｋｂｐのＤＮＡ断片、および上記のごとく処理したベクターＤＮＡを、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社）を用いて結合した。
上記リガーゼ反応物をインビトロパッケージングキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＰＬＵＳ，  ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  社製）にてλファージにパッケージングした。１０ｍＭの硫酸マグネシウムと０．２％のマルトースを含むＴＢ培地（トリプトン；１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）で終夜培養した大腸菌ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４、以下同様）を１０ｍＭの硫酸マグネシウムを含むＴＢ培地４ｍＬに懸濁し、１５分間、３７℃で静置した。これをパッケージング反応液と混合し、ＬＢ培地を加え３７℃で３０分間放置した。該大腸菌は最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加したＬＢ平板培地（ＬＢに寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを、大腸菌ＨＢ１０１を宿主としたシュードモナス  ポーシモビリス  ＳＹＫ−６株の遺伝子ライブラリーとした。
【００１６】
（２）シュードモナス  ポーシモビリス  ＳＹＫ−６株からバニリン酸およびシリンガ酸を分解する能力を失った変異株の作製
シュードモナス  ポーシモビリス  ＳＹＫ−６株を０．２％のバニリン酸を含む２００ｍＬの表１に示す培地１に一白金耳接種して、４８時間、２８℃にて振とう培養した。この培養液を５０００×ｇで遠心集菌後、リン酸緩衝液１０ｍＬに再懸濁した。これに、最終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにＮＴＧ（＝Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を添加し、室温で２０分、３０分および４０分反応させ、ついでこれらの反応物を混合した。
上記のＮＴＧ処理菌懸濁液を５０００×ｇで遠心集菌後、リン酸緩衝液１０ｍＬに再懸濁した。この操作を３度繰り返した。最後にリン酸緩衝液１０ｍＬに再懸濁し、適当に希釈してＬＢ平板培地に塗布、２８℃で４８時間培養した。生じたコロニー約３０００個を０．２％のバニリン酸を含む培地１の平板培地（培地１に寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）および０．２％のプロトカテキュ酸を含む培地１の平板培地にピックアップし、２８℃で５日間培養した。
【００１７】
以上の操作で、バニリン酸では生育できず、プロトカテキュ酸で生育できる変異株シュードモナス  ポーシモビリス  ＤＣ４９株を得た。該変異株をＬＢ培地で培養し菌体集菌後、０．２％のバニリン酸、プロトカテキュ酸、シリンガ酸、３−メチルガリック酸をそれぞれ含む培地１に再懸濁し、２８℃で振とう培養した。培養２４時間後の各培養液のＵＶスペクトルを調べたところ、バニリン酸、シリンガ酸、はまったく減少していなかったが、プロトカテキュ酸、３−メチルガリック酸は完全に消失していた。
【００１８】
【表１】
表１    培地１
0003580926.tif 000002
【００１９】
（３）バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む形質転換体細胞の選択
上記（１）にて取得した大腸菌ＨＢ１０１の形質転換体細胞から成るシュードモナス  ポーシモビリスＳＹＫ−６株の遺伝子ライブラリーから目的のバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む形質転換体細胞の選択には、上記（１）のシュードモナス  ポーシモビリスＳＹＫ−６株のライブラリーを構成する大腸菌ＨＢ１０１から上記（２）の変異株シュードモナス  ポーシモビリス  ＤＣ４９株に接合伝達法を用いてプラスミドを移行し、バニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を回復したシュードモナス  ポーシモビリス  ＤＣ４９株の組換え株を選抜することによって行った。
【００２０】
シュードモナス  ポーシモビリスＳＹＫ−６株のライブラリーを構成する大腸菌ＨＢ１０１およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を有する大腸菌ＨＢ１０１をそれぞれ試験管に調整した２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に一白金耳植菌し、３７℃で振とう培養した。また、シュードモナス  ポーシモビリスＤＣ４９を試験管に調整した１０ｍＬのＬＢ培地に一白金耳植菌し、２８℃で振とう培養した。それぞれ十分に生育したら、試験管に調整した１０ｍＬのＬＢ培地に０．５ｍＬ植菌し、上記と同様の温度で振とう培養した。それぞれＯＤ５５０が０．５になるまで培養を続け、３つの培養液を等量ずつ混合した。この混合液を孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルター上に集菌し、ＬＢ寒天平板上において、２８℃で４時間培養した。培養後、フィルター上の菌体を１ｍＬの生理的食塩水に懸濁させた。
上記の菌懸濁液を適当に希釈して２５μｇ／ｍＬのカナマイシンと２５μｇ／ｍＬのナリジキン酸を含むＬＢ平板培地に塗布し、２８℃で３日間培養した。生じたコロニー約３０００個を０．２％のバニリン酸を含む培地１の平板培地および０．２％のプロトカテキュ酸を含む培地１の平板培地にピックアップし、２８℃で５日間培養した。この結果、バニリン酸での生育が回復した組換え体、１株を得た。
【００２１】
（４）バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＤＥ２０の分離
実施例１−（３）記載のバニリン酸やシリンガ酸を分解する能力の回復を指標に選択した、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含むシュードモナス  ポーシモビリスＤＣ４９の形質転換体を最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加したＬＢ液体培地１ｍｌへ接種して２８℃で終夜培養した。遠心により集菌し、ＴＥ  １００μｌに懸濁し、室温で５分間放置した。溶液Ｉ（１％ＳＤＳ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム）２００μｌを添加し、氷中にて５分間冷却した。さらに溶液ＩＩ（５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８）１５０μｌを添加し、氷中にて５分間冷却した。遠心分離にて、上清をデカンテーションにより分離した。Ｒｎａｓｅを添加し、３０分間静置し、ついでフェノールクロロホルムを加えてよく混和し、遠心した。水層に２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷却した。１５，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥し精製プラスミドｐＤＥ２０（図１）を得た。
【００２２】
（５）組換えプラスミドｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０４、ｐＤＥ０５およびｐＤＥ０６の作製。
（５）−１．    組換えプラスミドｐＤＥ２０を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社、以下同様）で完全に消化し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化しアルカリフォスファターゼで末端脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社）を混合し、ライゲーションキット（宝酒造社）を用いて結合反応を行った。
次にハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６６，  ｐ５５７−５８０，  １９８３）にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、ＢａｍＨＩによる消化で約６ｋｂｐの断片を生じる１種類の組換えプラスミド、ｐＤＥ０１（図１）を確認した。
【００２３】
（５）−２．    組換え体プラスミドｐＤＥ２０を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで完全に消化し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ（宝酒造社、以下同様）で完全に消化したプラスミドベクターｐＵＣ１１９を混合し、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反応を行った。
次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩによる消化で約５ｋｂｐの断片を生じる１種類の組換えプラスミド、ｐＤＥ０２（図１）を確認した。
【００２４】
（５）−３．    組換えプラスミドｐＤＥ２０を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社、以下同様）で完全に消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造製）を用いて平滑末端化したＤＮＡ断片と、制限酵素ＳｍａＩで完全に消化し、アルカリフォスファターゼで末端脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵＣ１１９を混合し、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反応を行った。
次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社、以下同様）とＥｃｏＲＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩによる消化で約４ｋｂｐの断片を生じる１種類の組換えプラスミド、ｐＤＥ０３（図１）を確認した。
【００２５】
（５）−４．    組換え体ＤＮＡ、ｐＤＥ０２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで完全に消化した。生じた約５ｋｂｐの断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。次に、制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化したプラスミドベクターｐＵＣ１１９を同じくＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇキットを用いて平滑末端化し、アルカリフォスファターゼで末端脱リン酸化した。これらのＤＮＡを混合し、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反応を行った。
次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを２０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＰｓｔＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、図１に示す１種類の組み換えプラスミド、ｐＤＥ０４を確認した。
【００２６】
（５）−５．    組換えプラスミドｐＤＥ０４を制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社、以下同様）およびＳｍａＩで完全消化し、キロシークエンスキット（宝酒造製）を用いて、３０℃、１０−３０分間のデリーション反応に付した。それぞれのデリーション反応液を、該キットに従いｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ処理に付した。次に、これらの処理液を用いて、それぞれライゲーションキット（宝酒造製）にて結合反応を行った。それぞれの反応液を大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセルに形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを、それぞれの培養について１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの消化で、約１．９ｋｂｐの断片を生じる組換えプラスミド、ｐＤＥ０５（図１）および約１．５ｋｂｐの断片を生じる組換えプラスミド、ｐＤＥ０６（図１）を確認した。
【００２７】
（６）バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、ｐＤＥＭＣ０５の分離
上記組換えプラスミドｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０５およびｐＤＥ０６をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化したプラスミドｐＫＴ２３０ＭＣ（図２）と混合し、ライゲーションキット（宝酒造）を用いてそれぞれ結合反応を行った。
なお、プラスミドｐＫＴ２３０ＭＣは、以下のような操作で得られる。
▲１▼広宿主プラスミドベクターＲＳＦ１０１０を制限酵素ＰｓｔＩで消化して得られる約８ｋｂｐの断片と、大腸菌プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＡＴＣＣ３７０３１株より取得）を同じく制限酵素ＰｓｔＩで消化して得られる３．７ｋｂｐの断片とをＴ４リガーゼを用いて連結させる。こうして得られる１１．９ｋｂｐのサイズを有するプラスミドのうちストレプトマイシン耐性遺伝子を発現するものを選んでプラスミドｐＫＴ２３０を得る。
（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６，ｐ−２３７（１９８１））。
▲２▼該プラスミドｐＫＴ２３０を制限酵素ＳａｃＩで消化後、平滑末端化したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化する。
▲３▼プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化して得られる約２００ｂｐの小断片を調製する。
▲４▼上記▲２▼および▲３▼で得られるＤＮＡをＴ４リガーゼで連結する。
【００２８】
次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液それぞれを形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。それぞれから出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、組換えプラスミドｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０５およびｐＤＥ０６にそれぞれ対応する、組換えプラスミドｐＤＥＭＣ０１、ｐＤＥＭＣ０２、ｐＤＥＭＣ０３、ｐＤＥＭＣ０５およびｐＤＥＭＣ０６（図２）を確認した。
【００２９】
次に上記５種のプラスミドを（４）記載の接合伝達法で変異株シュードモナスポーシモビリス  ＤＣ４９株に移行し、該組換え体を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンと２５μｇ／ｍｌのナリジキン酸を含むＬＢ培地で培養し、菌体集菌後、０．２％のバニリン酸および０．２％のシリンガ酸をそれぞれ含む液体培地に再懸濁し、２８℃で振とう培養した。培養２４時間後の各培養液のＵＶスペクトルを調べたところ、上記５種の組換えプラスミドのうち、ｐＤＥＭＣ０１、ｐＤＥＭＣ０２およびｐＤＥＭＣ０５を導入した変異株シュードモナス  ポーシモビリスＤＣ４９株では、バニリン酸およびシリンガ酸は完全に消失していた。この結果、変異株シュードモナス  ポーシモビリスＤＣ４９株のバニリン酸およびシリンガ酸を分解する能力を回復させる活性を有する最小の組換えプラスミド、ｐＤＥＭＣ０５を得た。該組換えプラスミドｐＤＥＭＣ０５の構造を図２に示す。
【００３０】
（７）バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子の塩基配列解析
組換えプラスミドｐＤＥ０２を制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化して、フェノール−クロロホルムを加えてよく混和し、ついで水層を取り、２倍量のエタノールを添加して、−２０℃で静置して沈殿を生じさせ、該沈殿から制限酵素を除去した後、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反応を行った。
次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｍａＩによる消化で約１ｋｂｐの断片を生じる１種類の組換えプラスミド、ｐＤＥ０２１（図１）を確認した。
【００３１】
次に上記プラスミドｐＤＥ０２１および上記５で得られた組換えプラスミドｐＤＥ０３、ｐＤＥ０５およびｐＤＥ０６を用いて、組換えプラスミドｐＤＥ０５に含まれる約２ｋｂｐＤＮＡ断片の塩基配列の解析を行った。塩基配列の解析は、Ｍ１３ダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔｃ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７４，  ５４６３−５４６７（１９７７））にてシークエンシング反応を行い、そのための装置として自動レーザー蛍光シークエンシング装置（ファルマシアバイオテク社）を用いた。塩基配列解析の結果、該ＤＮＡ断片上にシュードモナス  ポーシモビリスＳＹＫ−６のコドンユーセイジに適合する唯一のオープンリーディングフレーム（１６７１ｂｐ）が見出された。
該オープンリーディングフレームを完全に含むｐＤＥ０５で形質転換された形質転換細胞エッシェリキア  コリＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）は、既述のごとく、工業技術院生命工学工業技術研究所にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１１として寄託されている。
以上のようにして得られたバニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子の塩基配列（＝上記１６７１ｂｐのオープンリーディングフレーム）とコードされているアミノ酸配列を、既述のごとく、配列番号３に示す。また、既述のごとく、該塩基配列を配列番号２に、該アミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を保有するベクターで形質転換した細胞を用いれば、該酵素を大量に生産することができ、バニリン酸からはプロトカテキュ酸が、シリンガ酸からは没食子酸を効果的に生産できる。
【００３２】
【配列表】
0003580926.tif 000003
0003580926.tif 000004
0003580926.tif 000005
【００３３】
0003580926.tif 000006
0003580926.tif 000007
【００３４】
0003580926.tif 000008
0003580926.tif 000009
0003580926.tif 000010
0003580926.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えプラスミドｐＤＥ２０、ｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０４、ｐＤＥ０５、ｐＤＥ０６およびｐＤＥ０２１の構造図、およびそれらの組換えプラスミドの作製過程を示す。各制限酵素認識部位は説明に必要なもののみを記載している。
【図２】組換えプラスミドｐＤＥＭＣ０５の構造図、および該組換えプラスミドの作製過程を示す。各制限酵素認識部位は説明に必要なもののみを記載している。
【図１】
0003580926.tif 000012
【図２】
0003580926.tif 000013