(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖輸送体のコーディング領域を有するDNAにおいて、
ヌクレオチド配列（Seq−ID  No.1）
0003565845.tif 000017
0003565845.tif 000018
0003565845.tif 000019
0003565845.tif 000020
0003565845.tif 000021
かまたはヌクレオチド配列（Seq−ID  No.2）：
0003565845.tif 000022
0003565845.tif 000023
0003565845.tif 000024
0003565845.tif 000025
0003565845.tif 000026
に含まれている情報が、植物ゲノム中への配列組込みにより、RNAの形成を可能にし、かつこのRNAで植物細胞中への新しいオリゴ糖輸送活性を導入することができるかまたは内在性オリゴ糖輸送体活性を発現することができ、これにより貯蔵物質の形成および輸送が変化することを特徴とするオリゴ糖輸送体のコーディング領域を有するDNA。
【請求項２】
下記のヌクレオチド配列（Seq−ID  No.1）
0003565845.tif 000027
0003565845.tif 000028
0003565845.tif 000029
0003565845.tif 000030
0003565845.tif 000031
を有することを特徴とする請求項１記載のDNA。
【請求項３】
次のヌクレオチド配列（Seq−ID  No.2）：
0003565845.tif 000032
0003565845.tif 000033
0003565845.tif 000034
0003565845.tif 000035
0003565845.tif 000036
を有することを特徴とする請求項１記載のDNA。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のDNAを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項５】
請求項４に記載のプラスミドpSK−S21（DSM7115）。
【請求項６】
原核細胞および真核細胞の形質転換のために、請求項４または５に記載のプラスミドを使用する方法。
【請求項７】
請求項１から３までのいずれか１項記載のDNAを有する双子葉植物。
【請求項８】
請求項１から３までのいずれか１項記載のDNAを有する細菌。
【請求項９】
スクロースを取込むことのできる細菌の製造のために請求項１から３までのいずれか１項記載のDNAを使用する方法。
【請求項１０】
変化した特異性を有する輸送体のDNAの製造のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のDNAを使用する方法。
【請求項１１】
植物ゲノムから類似の配列を分離するために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のDNAを使用する方法。
【請求項１２】
細胞中のスクロース輸送体の合成を可能にする、翻訳可能ｍ−RNAの発現のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のDNAを使用する方法。
【請求項１３】
細胞中の内在性スクロース輸送体を妨げる翻訳不可能ｍ−RNAの発現のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のDNAを使用する方法。
【請求項１４】
原核細胞中での発現のために、かじ取エレメントと組合せて、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のDNAを使用する方法。
【請求項１５】
植物オリゴ糖輸送体をコードする請求項１から３までのいずれか１項に記載のDNAを同定するための方法において、
ａ）  最初に、欠陥SUC2遺伝子を有する酵母株を、相同組換えにより製造し、次にこれから
ｂ）  植物細胞からのスクロースシンターゼ活性のための遺伝子で形質転換することにより、細胞内スクロースを切断しうる酵母株を抽出し、かつ
ｃ）  この菌株を、酵母細胞の発現ベクター中の植物cDNAライブラリーで形質転換することを特徴とする、植物オリゴ糖輸送体をコードする請求項１から３までのいずれか１項に記載のDNAを同定する方法。
【請求項１６】
植物オリゴ糖輸送体をコードする請求項１から３までのDNAの同定のための酵母株において、
ａ）  最初に、欠陥SUC2遺伝子を有する酵母株を、相同組換えにより製造し、次にこれから
ｂ）  植物細胞からのスクロースシンターゼ活性のための遺伝子で形質転換することにより、細胞内スクロースを切断しうる酵母株を抽出し、かつ
ｃ）  この菌株を、酵母細胞の発現ベクター中の植物cDNAライブラリーで形質転換することにより、製造および形質転換される、植物オリゴ糖輸送体をコードする請求項１から３までのDNAの同定のための酵母株。
【請求項１７】
請求項16に記載の酵母株YSH2.64−1A−SUSY（DSM7106）。
【請求項１８】
請求項16に記載の酵母株YSH2.64−1A−INV（DSM7105）。
【請求項１９】
スクロース輸送体の過剰発現のための双子葉植物の形質転換のために、プラスミドpSK−S21（DSM7115）から製造された、プラスミドpBinAR−S21を使用する方法。
【請求項２０】
スクロース輸送体の発現の“アンチセンス”阻止のための双子葉植物の形質転換のために、プラスミドpSK−P62から製造された、プラスミドpBinAR−P62−antiを使用する方法。
【請求項２１】
双子葉植物中において、貯蔵物質の形成を増加させるような、育種特性を改善する目的での、請求項１から３までのいずれか１項に記載のDNAを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、植物ゲノム中への導入が形質転換植物中の貯蔵物質の生成および輸送を変更するオリゴ糖輸送体のコーティング領域を有するDNA配列、これらDNA配列を有するプラスミド、細菌および植物、本発明の植物オリゴ糖輸送体のDNA配列の同定を可能にする酵母株の製造および形質転換方法、ならびに本発明のDNA配列の使用に関する。
多数の植物、たとえばジャガイモ中の貯蔵エネルギーに対する最も重要な形質転換代謝生成物はスクロースである。他種における他のオリゴ糖もこの役割を果たすことができる。たとえば食用アザミ（japanese  artichokes）においては、スタキオースである。
植物のエネルギー含量におけるオリゴ糖輸送の中心部分は、既に形質転換植物において示されており、該植物においてはインベルターゼの発現によりスクロースが単糖に分解され、その性質のかなりの変化を生じる（ヨーロッパ特許第442592号）。貯蔵物質の生成におけるスクロースの重要性のため、二糖の生合成または代謝の研究において多くの実験が実施された。ドイツ国特許第4213444号から、収穫された部分の貯蔵性の改善は、アポプラストのインベルターゼの発現により、エネルギー富有化合物の生成根のヘテロトロピック部分への伝達が阻止される形質転換ジャガイモにおいて達成することができることは公知である。
多くの努力にも拘らず、貯蔵物質、たとえば植物におけるオリゴ糖の分配機構は明らかにされておらず、それに影響を及ぼすために、光合成を行なう葉において生成されたスクロースがどのようにして植物の篩部の輸送路に到達するかおよび貯蔵器官、たとえばジャガイモの塊茎または種子からどのようにして取込まれるかはまだ未知である。テンサイ（Beta  unlgaris）の分離された葉組織細胞の細胞膜に対して、該膜を通るスクロースの輸送は人工的なpH勾配を設けることによって惹起することができかつ電気化学的電位を設けることによって激化することができることが証明された（Lemoine  ＆  Delrot（1989年）FEBSletters  249:129〜133）。スクロースの膜通過はミカエルス・メンテン速度論に従い、該速度論におけるスクロース輸送のKm値は約1mMである（Slone  ＆  Buckhout、1991年、Planta  183:484〜589）。速度論のこの形は、輸送体タンパク質のかかわり合いを指示する。テンサイ、トウゴマ（Ricinus  communis）およびシクラメン（Cyclamen  persicum）に原形質膜に関する実験は、スクロースの輸送はプロトンの共輸送と関係があることを示した（Buckhout、1989年、Planta  178:393〜399;Williams等、1990年、Planta182:540〜545;Grimm等、1990年、Planta182:480〜485）。共輸送の化学量論は1:1である（Bush.1990年、Planta  Physicl  93:1590〜1596）。しかし、植物細胞のプラスモジウムを介するスクロース輸送の機構は提案されている（Robards  ＆  Lucas、1990年、Ann  Rev  Planta  Physicl  41:369〜419）。細胞がスクロースを輸送路に分配させる活性輸送系の存在の認識にも拘らず、この種の性質を有するタンパク質はまだ知られていない。スクロースの存在および不在におけるテンサイの原形質膜のＮ−エチルマレインイミド染色において、ギャレット（Gaiiet）等（1989年、Biochem  Biophys  Acta  978:56〜64）は、大きさ42kDaのタンパク質はスクロースと相互作用しうるという情報を得た。この大きさ範囲の原形質膜タンパク質の画分に対する抗体は、原形質膜を通るスクロースの輸送を阻止することができる（Lemoine等、1989年、Biochem  Biophys  Acta  978:65〜71）。これとは異なり、膜を通るスクロースの輸送における62kDaタンパク質の関与に対する情報が、スクロース類似体、デスオキシアジドヒドロキシベンズアミドスクロースでの大豆タンパク質の光親和性標識によって得られた（Ripp等、1988年、Plant  Physiol88:1435〜1445）。スクロース輸送体のアミノ酸配列は知られていない。
ところで、オリゴ糖輸送体のコーディング領域を有しかつヌクレオチド配列に含有されているその情報が植物ゲノムへの配列組込みによってRNAの形成を許し、それにより、植物細胞中での新しいオリゴ糖輸送活性を惹起することができるかまたは固有のオリゴ糖輸送活性を発現することのできるDNA配列を記載する。オリゴ糖輸送体なる用語により、たとえばホウレンソウまたはジャガイモのような植物からのスクロース輸送体を表わす。
オリゴ糖輸送体のコーディング領域の同定は、酵母サッカロミセスセレビシェ（Saccharomyces  cerevisiae）の特殊な突然変異体における発現により輸送体分子をコードする植物DNA配列の分離を許す方法によって実施される。この方法には、輸送体分子のコーディング領域が植物遺伝子ライブラリーから分離すべき物質を取込むことのできない適当な酵母突然変異体を用意すべきである。酵母突然変異体におけるカリウム輸送欠失の相補性に関する方法は既に公知である（Anderson等、1992年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA89:3736〜3740）。この方法においては、植物mRNAに対する酵母cDNA配列は、発現ベクターの使用により酵母突然変異体に発現される。細胞中へ輸送すべき物質を取込むことのできるこれらの酵母は発現ベクター中の輸送体分子のコーディング領域を含有する。しかし、公知方法は、酵母が突然変異によって遮断することのできる固有のスクロース輸送を有しないので、スクロース輸送体のコーディング領域の同定には有用ではない。酵母は細胞外スクロースを切断して、細胞からヘキソース輸送体を介して取込むことのできる切断インベルターゼをコードする。
植物オリゴ糖輸送体を同定するのに役立つ酵母株の製造および形質転換のためには：
ａ）  第一に、欠陥suc2遺伝子を有する酵母株を相同的組換えにより製造し、次いでこれから
ｂ）  植物細胞からのスクロースシンターゼ活性遺伝子で形質転換することにより、かつ
ｃ）  この株を植物cDNAライブラリーで酵母細胞の発現ベクターに形質転換することによって、植物オリゴ糖輸送体をコードするDNA配列を同定する。
この方法から得られる、植物オリゴ糖輸送体同定のための酵母株は、たとえば酵母株YSH2.64−1A−SUSY（DSM7106）およびYSH2.64−1A（DSM7105）である。
酵母株YSH2.64−1A−SUSYを用いると、次の配列を有する植物スクロース輸送体のDNA配列が同定される。
ホウレンソウからのスクロース輸送体（seq.ID  No.1）：
0003565845.tif 000002
0003565845.tif 000003
0003565845.tif 000004
0003565845.tif 000005
0003565845.tif 000006
ジャガイモからのスクロース輸送体（Seq−ID  No.2）：
0003565845.tif 000007
0003565845.tif 000008
0003565845.tif 000009
0003565845.tif 000010
0003565845.tif 000011
同定されたDNA配列はプラスミドに導入し、これにより真核細胞における発現のためのかじ取エレメント（Steering  element）と結合することができる（例５参照）。これらのかじ取りエレメントは一方では転写プロモーターであり、他方では転写ターミネーターである。プラスミドに含有されている本発明のDNA配列を用いると、真核細胞を、細胞内でのスクロース輸送体合成を可能にする翻訳可能なmRNA発現の目的でまたは細胞内での固有のスクロース輸送体の合成阻止の目的で、形質転換することができる。オリゴ糖輸送体の発明的配列に相当するRNAの発現によって、植物炭水化物代謝の変更が可能であり、該変更は、収穫された部分における貯蔵物質の分配の改善が農業植物の収量増加を生じる点で重要である。個々の器官における貯蔵物質の取込み強制の可能性により、植物全体の変更が可能となり、これによって個々の組織、たとえば葉の成長が低下し、収穫される部分の成長が増加する。このため、収穫物の栄養期を延長し、貯蔵物質の形成を増加することを想定することができる。
双子葉および単子葉植物の遺伝変更方法は既に公知である（たとえばGrsser,C,S,Fraley,R.T.、1989年、Science244:1293〜1299;Potrykus,1991、Ann  Rev  Plant  Mol  Biol  Plant  Rhysicl  42:205〜225参照）。植物における発現のためには、コーディング配列は転写調節エレメントと共役しなければならない。プロモーターと呼ばれるかかるエレメントは公知である（ヨーロッパ特許第375091号）。
さらに、コーディング領域は、該領域を正確に転写することのできる転写終結シグナルを備えていなければならない。かかるエレメントも記載されている（Gielen等、1989年、EMBO  J8:23〜29）。転写出発領域は、宿主植物に対して天然および／または相同ならびに異種および／または異型の双方であってもよい。必要に応じ、終結領域は相互に交換可能である。転写出発および終結領域は合成により形成するかまたは天然に得ることができるか、または合成および天然DNA成分の混合物から得ることができる。高級植物における異種遺伝子の導入のためには、E.コリの複製シグナルおよび転写された細胞の選択が可能な遺伝標識を含有する多数のクローニングベクターが利用しうる。かかるベクターの例は、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184等である。植物中へ所望の遺伝子を導入する方法に依存して、他のDNA配列も適当である。たとえば植物細胞を形質転換するためにTi−プラスミドまたはRi−プラスミドを使用する場合には、導入される遺伝子に、フランキング領域として、Ti−およびRi−プラスミドＴ−DNAの少なくとも右境界が付着されるが、しばしば右および左境界が付着される。植物細胞の形質転換のためのＴ−DNAの使用は集中的に研究され、ヨーロッパ特許第120516号;Hoekama,In:The  Binary  Plant  Vector  System;Offset−drukkerij  Kanters  B.V.Alblasserdam、（1985年）、Ｖ章;Fraley等,Crit.Rev.Plant  Sci.,4:1〜46およびAn等（1985年）EMBO  J.4:277〜287に十分に記載されている。一度、導入されたDNAがゲノム中に組込まれると、一般に安定であり、もとの形質転換された細胞の子孫中にも残留する。通常、選択マーカーを含有し、これがカナマイシンG418、プレオマイシン、ハイグロマイシンまたはホスフィノトリシン等のような生物致死剤または抗生物質に対し形質転換された植物細胞中で耐性を惹起する。従って、使用される個々のマーカーは、導入されたDNAを欠如する細胞から形質転換された細胞の選択が可能である。
植物宿主細胞中へDNAを導入するためには、アグロバクテリウム菌を用いる形質転換のほかに、多数の他の技術が利用しうる。これらの技術は、プロトプラスト、DNAのマイクロ注入およびエレクトロポレーション、ならびにバリスティック法（ballistic  met−hods）およびウイルス感染を包含する。形質転換された植物材料から植物全体を、選択のための抗生物質または生物致死剤を含有する適当な培地中で再生することができる。次に、得られた植物は、導入されたDNAの存在を調べることができる。注入およびエレクトロポレーションにおいてプラスミドに対して特殊な要求は加えられない。たとえばpUC誘導体のような簡単なプラスミドを使用することができる。しかし、かかる形質転換された細胞から植物全体を再生する場合には、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。形質転換された細胞は植物中で普通に成長する（McCormick等（1986年）Plant  Cell  Reports  5:81〜84参照）。これらの植物は普通に成長しかつ同じかまたは異なる形質転換遺伝子を有する植物と交雑することができる。得られるハイブリッド個体は相応する表現型特性を有する。
本発明のDNA配列はプラスミドに導入することもでき、これにより原核細胞における発現のためにかじ取エレメントと結合することもできる。さらに、細菌からの原核マクロース輸送体の翻訳可能なRNAの形成は、原核生物および真核生物の膜構造における著しい相違にも拘らず、意外にもスクロースを取込みうる原核生物を生じる。これにより、比較的廉価な基質スクロース上で成長しうる工業的に重要な株の生産が可能となる（例５参照）。たとえば細菌アルカリゲネスユートロフス（Alkaligenes  eutrophus）中でのポリヒドロキシ酪酸の製造が記載されている（Steinbuechel  ＆  Schubert、1989年、Arch  Microbiol153:101〜104）。しかし、細菌単独では使用される基質選択が非常に制限される。そゆ故、なかんずくアルカリゲネスユーロフス中でのスクロース輸送体の遺伝子の発現は、極めて重要である。
本発明のDNA配列は、原核または真核系中でのDNA配列の組換えによる配列変更または突然変異誘発を許すプラスミド中へ導入することもできる。こうして、スクロース輸送体の特異性を変更することができる。
標準方法（Sambrook等、1989年、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、２版、Cold  Spring  Harbor  Press、NY,USA）を使用することにより、塩基交換を実施することができるか、または天然または合成配列を加えることができる。DNAフラグメントを互いに結合するためには、該フラグメントに対しアダプターまたはリンカーを導入することができる。さらに、適当な制限切断部位の形成または過剰のDNAまたは制限切断部位を除去する操作を実施することができる。たとえばトランジションおよびトランスバージョンのような挿入、欠失または置換を実施すべき場合には、成体内突然変異誘発、プライマー修復または連結反応を使用することができる。合成方法には、一般に配列分析、制限分析および他の生化学的分子生物学的分析方法を使用することができる。各操作後、使用したDNA配列を切断し、他のDNA配列と結合することができる。各プラスミド配列は、同じかまたは異なるプラスミド中へクローニングすることができる。
本発明のDNA配列およびプラスミドの誘導体または部分は、原核および真核細胞の形質転換のために使用することもできる。さらに、本発明のDNA配列は、スクロースまたは他のオリゴ糖輸送体分子をコードする種々の種の植物のゲノムにおける類似配列を分離する標準方法によって使用することができる。これらの配列を用いると、植物細胞を形質転換するための、形質転換した植物中での輸送法を変更する構築を形成することができる。
関連したDNA配列を特定するためには、まず、植物型の遺伝子中の含量または植物型における遺伝子の発現に代表的な遺伝子ライブラリーを製造しなければならない。前者はゲノムライブラリーであり、後者はcDNAライブラリーである。これから、関連する配列を、プローブとして本発明のDNA配列を使用して分離することができる。いったん関連する遺伝子を確認し、分離すれば、配列の決定およびこの配列からコードされたタンパク質の性質の分析が可能である。
本発明の基礎を形成する実施例を理解するため、これらの試験のために必要で自体公知のすべての方法を列挙する：
1.クローニング法
クローニングのためには、λファージZAP IIならびにベクターpBluescriptsk（Short等、1988年、Nucl  Acids  Res.16:7583〜7600）が使用された。
酵母の形質転換のためにはベクターYIplac128およびYEplac112（Gietz  ＆  Sugino、1988年、Gene74:527〜534）が使用された。
植物形質転換のためには、２成分ベクターpBinAR（Hoefgen  ＆  Willmitzer、1990年、Plant  Sci66:221〜230）中の遺伝子構築がクローニングされた。
2.細菌および酵母株
pBbluescriptskベクターならびにpBinAR構築のためには、E.コリ菌株XL1blue（Bullock等、1987年、Biotechniques、５、376〜378）が使用された。
本発明の酵母株YSH2.64−1A−susy製造のため出発株としては、株YSH2.64−1A（Gozalbo  ＆  Hohmann、1990年、Curr  Genet17:77〜79）が使用された。
ジャガイモ植物中のプラスミドの形質転換は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium  tumefaciens）菌株LBA4404（Bevan（1984年）Nucl  Acids  Res12:8711〜8720）を使用して実施された。
3.アグロバクテリウム  ツメファシエンスの形質転換
アグロバクテリウム属菌中でのDNAの伝達は、ヘフゲン（Hoefgen）およびウイルミッツァー（Willmitzer）（1988年、Nucleic  Acids  Res16:9788）の方法による直接形質転換によって実施された。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNAは、バーンボイム（Birnboim）およびドーリイ（Doly）（（1979年）Nucl  Acids  Res7:1513〜1523）の方法により分離され、適当な制限切断後、ゲル電気泳動によって分析された。
4.植物形質転換
無菌ジャガイモ栽培の、スカルペル（Scalpel）で傷をつけた小さい葉を、アグロバクテリウム  ツメファシエンス30〜50μlを含有する、スクロース２％を有するMS培地10mlに入れ、夜どおし、選択下培養成長させた。３〜５分の穏和な振とうの後、葉を、グルコース1.6％、ゼアチンリボース2mg/l、ナフチル酢酸0.02mg/l、ジベレリン酸0.02mg/l、クラホラン（Claforan）500mg/l、カナマイシン50mg/lおよびバクトアガール0.8％のMS培地上に塗布した。25℃、300ルックスで１週間の保温後、培地中のクラホラン濃度は半分に減少した。
寄  託
次のプラスミドおよび酵母株は、1992年６月12日にドイツ国ブラウンシュワイグ在ドイツ微生物収蔵所（Deutsche  Sammlung  vor  Mikroorganismen（DSM）に寄託された（寄託番号）：
プラスミド  pSK−S21（DSM7115）
酵母株      YSH2.64−1A−SUSY（DSM7106）
酵母株      YSH2.64−1A−INV（DSM7105）
図面の説明
図  １
酵母細胞中でのスクロース取込みのタイムパターン
“pmol/mg細胞”＝酵母細胞の含湿重量mgに対する、14C標識スクロースの量pmolであり；“112"＝出発株（輸送体なし）を表わし；“＋グルコース”＝10mMグルコースの培地中での細胞の前保温を表わし；“−グルコース”＝細胞の前保温なしを表わし；“2.5μHCCCP"＝濃度2.5μＭの阻害剤カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）との共保温を表わし；“500μMPCMBS"＝濃度500μＭの阻害剤ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸（PCMBS）との共保温を表わし；“10μＭアンチマイシン”＝濃度10μＭの阻害剤アンチマイシンとの共保温を表わす。
図  ２
プラスミドpMA5−INVのクローニング。pSEYC306−１からの大きさ2.4kbのHing IIIフラグメントのpMA5−10中への挿入を示す。
図  ３
プラスミドpBinAR−S21を示す。
図中：
CaMV35sプロモーター：カリフラワーモザイクウイルスの35sRNAの遺伝子のプロモーター
A:ホウレンソウ中のスクロース輸送体のコーディング領域、読取り方向に配向
OCS:アグロバクテリウムツメファシエンスからのオクトピンシンターゼのターミネーター
Sma I.Not I,BamH I:制限酵素の切断位置
図  4:
プラスミドpBinAR−P62−antiを示す。
図中：
CaMV35sプロモーター：カリフラワーモザイクウイルスの遺伝子のプロモーター
OCS:アグロバクテリウムツメファシエンスからのオクトピンシンターゼのターミネーター
Sma I.Not I,BamH I,Xba I:制限酵素の切断位置
図  5:
葉中の種々の炭水化物のBinAR−P62−anti形質転換体の含量
図中：
fru:フルクトース
suc:スクロース
sta:デンプン
control:形質転換されてない出発物質
sp−５〜sp−43:個々の数字を有する形質転換体
図  6:
BinAR−P62−anti形質転換体のペチオール（petioles）からの炭水化物の流出
wt:野性型
sp−５ないしsp−43:個々の数字を有する形質転換体
次例は、酵母株の製造、同定ならびに植物スクロース輸送体の機能および用途を記載する。
例  １
酵母株YSH2.64−1A−SUSYおよびYSH2.64−1A−INVの調製
酵母株YSH2.64−1Aは特性suc−２−、malo、leu2、trp1を有する（Gozalbo  ＆  Hohmann、1990年、Curr  Genet17:77〜79）。この株中にスクロース切断酵素活性を導入するために、酵母からのアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子のプロモーターに融合するように、ジャガイモからのスクロースシンターゼのコーディング領域を含有する組込みプラスミドYIplac128A2−SUSYで形質転換した。プラスミドYIplac128A2−SUSYは次のように製造した。プラスミドYIplac128（Gietz  ＆  Sugino、1988年、Gene74:527〜534）をPst IおよびEcoR Iで切断し、分解および／または突出する１本鎖中へ充填およびポリリンカーの領域中での連結反応によって短かくした。残存Spa I切断位置において、728pbカセットを、プラスミドpVT102U（Vernet等、1987年、Gene52:225〜233）からのアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターを用いて挿入した。こうして、YIplac128A2が得られた。スクロースシンターゼのコーディング領域は、オリゴヌクレオチド
0003565845.tif 000012
とのポリメラーゼ連結反応によってジャガイモからのスクロースシンターゼのλクローンに増幅した（Salanoubat  ＆  Belliard、1987年、Gene60:47〜56）。生成物から、コーディング領域をBamH Iフラグメントとして製造し、カセットのポリリンカーのBamH I切断部位に挿入した。酵母株YSH2.64−1Aは、こうして製造したプラスミドYIplac128A2−SUSYで形質転換した。このプラスミドは２μ領域を有しないので、酵母中で自律複製することはできない。それ故、かかる形質転換細胞だけが、ロイシン栄養要求性を獲得し、プラスミドDNAを少なくとも部分的に染色体的に組込む。
ロイシン独立栄養生物コロニーを、スクロースシンターゼ遺伝子の発現のために分析した。このために5ml液体培養の細胞をガラスモを加え激しく振とうすることにより分解し、次いで遠心分離した後、上澄みからの全タンパク質を、酵素活性測定のために加えた。発現されたスクロースシンターゼの活性は25mU/mgタンパク質を有する。
類似に、インベルターゼ活性を酵母株YSH2.64−1A中へ導入し、この中でプラスミドYIplac128A1−INVの助けにより、サイトゾルの切断不能のインベルターゼの遺伝子を酵母ゲノム中に染色体的に組込んだ。YIplac128A1−INVは、スクロースシンターゼのコーディング領域の代りに、遺伝子産物の輸出のためのシグナル配列を欠如するインベルターゼ遺伝子を含有する。プラスミドの前駆体はプラスミドYIplac128A1であり、このものはYIplac128A2とはアルコールデヒドゲナーゼ遺伝体のプロモーターを有するカセット中のポリリンカーの配向が異なる。このプラスミドのカセットは、プラスミドpVT100U（Vernet等、1987年、Gene52:225〜233）から誘導される。このインベルターゼのコーディング領域は、suc2遺伝子のDNAにおいて、オリゴヌクレオチド
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とのポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。コーディング領域は、Pst IおよびXba Iを使用して線形化ベクターYIplc128A1den中へ結合した。酵母細胞中に発現したインベルターゼ活性の酵素活性の試験は、酵素細胞からの全タンパク質1mgあたり68mUの酵素活性を生じた。
例  ２
cDNA植物スクロース輸送体のクローニング
成長するホウレンソウおよびジャガイモ植物の葉組織からのポリアデニル化RNAから、λファージZAP IIライブラリー中のcDNAのライブラリーを製造した。500000PfuからDNAファージを製造し、塩化セシウムサルコシルグラジェントを使用して精製した。酵素Not IでDNAファージを切断した後、１％アガロースゲル上で上下1.5kbpの大きさ範囲からの挿入体を製造し、発現ベクターYEplc112A1NEのNot I切断部位で結合した。該ベクターは、ベクターYEplc112（Gozalbo  ＆  Hohmznn、1990年、Curr  Gent17:77〜79）の誘導体であり、それを用いて、例１に記載したように、ポリリンカーをアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターと交換した。カセットのポリリンカーは、再び酵素Pst IおよびXba Iで切断することにより除去し、Not IおよびEcoR I切断部位を導入する２本鎖オリゴヌクレオチドにより置換した
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E.コリ中での形質転換により、下方1.5kbpの大きさ範囲に対し約90000クローンおよび上方1.5kbpの大きさ範囲に対し約40000クローンが得られた。これらから、プラスミドDNAを製造した。２μgDNAを、酵母株YSH2.64−1Asuc−.susy中で14回形質転換した。形質転換細胞をグルコース２％を含有する媒地上で成長させ、それぞれ５〜10,000を寒天平板液体培地で洗浄し、スクロース含有培地上に塗布した。急速に成長しえたこれらのクローンをさらに分析した。ベクターYEplac112A1NE中への形質転換体S21またはP62の挿入（YEplac112A1NE−S21）を配列決定した。配列は上記に記載されている。
例  ３
スクロース代謝酵母形質転換体の分析
酵母形質転換体YEplac112A1NE−S21（例２において得られたものに一致）を、液体培地中で、培養が対数期に達するまで成長させた。培地を遠心分離した後、細胞を、グルコース含有培地中で５分間前保温し、次いで14C標識スクロース含有培地中に入れた。標識スクロースの取込み量をチリロ（Cirillo）（1989年、Meth  Enzymol174:617〜622）により記載された方法により測定した。グルコースとの前保温なしの標識スクロースの取込み量を、阻害剤カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸（PCMBS）およびアンチシアニンと同時保温したものと比較した。時間パターンは図１に示されている。阻害剤によるスクロース取込み量の減少計算値は表Ｉに示されている。標識スクロースの競合体として種々の糖を用いる比較実験（それから輸送体の特異性を読取ることができる）は表IIに示されている。
類似の測定を、酵母株YEplac112A1NE−P62を用いて実施した。
例  ４
スクロース輸送体活性の発現のためのDNA配列を有する細菌菌株の形質転換
スクロースを取込み代謝しうるためには、単糖の酵素切断活性を有する細菌細胞が必要である。かかる活性を導入するために、細菌をプラスミドpMA5−INVにより形質転換し、インベルターゼ活性を調べた。プラスミドpMA5−INVは次のように製造した。プラスミドpMA5−10（Stanssens等、1989年、Nucl  Acids  Res17:4441〜4454）を、ポリリンカーのHind III切断部位で線形化した。プラスミドpSEYC306−１（Taussing  ＆  Carlson、1983、Nucl  Acids  Res11:1943〜1954）の2.4kb  Hind IIIフラグメントを、Hind III切断部位中へクローニングした。プラスミドの相応するカットアウトは表IIに示されている。プラスミドpMA5−INVで形質転換した細菌細胞中のインベルターゼの酵素活性を、ゲル電気泳動活性試験において公知方法で測定した。細菌細胞中での植物cDNAの発現による官能スクロース輸送体形成の可能性を、プラスミドpSK−S21でのE.コリの形質転換によって調べた。該プラスミドは例３に記載されている。pSK−S21での細菌細胞の形質転換後、スクロース取込み量の試験を実施した。
例  ５
スクロース輸送体のコーディング領域の過剰発現のための構築を有する植物の形質転換
ホウレンソウおよび／またはジャガイモからのスクロース輸送体のcDNAを挿入体として、含有するベクターYEplac112A1NE−S21およびYEplac112A1NE−P62（例２および例３参照）から、該挿入体をNot I切断後に分離し、プラスミドpBluescript−SKのNot切断部位に結合した（pSK−S21および／またはpSK−P62）。pSK−S21に対しては、挿入をSac I/Xba Iフラグメントとして行ない、突出する１本鎖DNA中に充填した後、あらかじめ酵素Sma IおよびXba Iで切断したpBinAR（Hoefgen  ＆  Willmitzer、1990年、Plant  Sci66:221〜230）中に“センス（Sense）”配向でクローニングした。得られるプラスミドpBinAR−S21（図３参照）は、スクロース輸送体を過剰発現（over−express）するため、植物の形質転換のために挿入することができる。pSK−P62に対しては、挿入体を1.7kb  Not Iフラグメントとして分離し、２成分ベクターpBinARのSma I切断部位中へ“アンチセンス”配向でクローニングした（図４参照）。このプラスミドは、スクロース輸送体発現の“アンチセンス”阻止を目指す植物の形質転換のために適当である。
次いで、形質転換アグロバクテリアを、タバコおよびジャガイモの葉セグメントの感染のために使用した。
独立に得られた形質転換体（この中に組換えられていないもとのキメラタンパク質の存在がサザンブロッティング分析により証明された）を、スクロース、ヘキソースおよびデンプン含量における変化をそれぞれ調べた。
pBinAR−P62−antiからのＴ−DNAを含有する形質転換体は葉におけるデンプン、ヘキソースおよびスクロースの著しく増加した濃度を示した（図５参照）。植物から採取した葉柄からの炭水化物の流出は水性媒体中では著しく減少する（図６参照）。これらのデータから、光合成活性器官からの光同化体の輸送路のスクロース輸送体の有意性は明瞭に認められる。輸送体の活性阻止は炭水化物の輸送路を制限するので、これはたとえばプラスミドpBinAR−S21を用いる過剰発現の場合における貯蔵器官への光同化物の輸送低下から生じる。さらに、pBinAR−S21からのＴ−DNAが組込まれているタバコ植物は減少した頂芽優性を示す、つまり該植物はブシー成長（bushy  growth）を示す。かかる表現型変化は、たとえばトマト植物において非常に望ましい。それ故、本発明のDNA配列（Seq  ID  No.1）を有するプラスミドpBinAR−S21はブシー成長のような重要な育種改善の目的で植物を変更するのに適当である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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