【手続補正書】
【提出日】平成27年4月21日(2015.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
uPA遺伝子挿入用ベクター（uPA）DNA 25-30μｇを制限酵素で切断することにより線状化し、精製した。このDNAをマウスES細胞3×106個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（20mM HEPES pH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、6mM D-glucose、0.7mM Na2HPO4）に懸濁し、Field Strength 185V/cm、Capacitance 500μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入から24時間経過後、終濃度200μg/mLのG418(Geniticin)(SIGMA社 G-9516)で選択培養を行った。ES細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco/BRL社 11965-084)培養液に終濃度15％の牛胎児血清(Hyclone社SH30071)、終濃度2mMのL-グルタミン(Gibco/BRL社 25030-081)、終濃度がそれぞれ100μＭの非必須アミノ酸(Gibco/BRL社11140-050)、終濃度10mMのHEPES(Gibco/BRL社 15630-080)、終濃度がそれぞれ100U/mLのペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/BRL社 15140-122)、終濃度100μＭのβ−メルカプトエタノール(SIGMA社 M-7522)、そして終濃度1000U/mLのESGRO(LIF)(Gibco/BRL社 13275-029)を添加したものを用いた(以下ES培地と記す)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
実施例３．キメラマウスの作製
(１)免疫不全肝障害マウス
上記実施例２で作製したuPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）をSCID-bgマウスに2回バッククロスさせ、uPA-Tg(+/-)SCID(+/+)の遺伝子型を持つマウスを得た。そのマウスの雄より精子を採取し、SCIDマウス（homozygote, +/+）の未受精卵と体外受精後、仮腹に戻した。生まれた子マウスの内、Tg遺伝子の入ったマウスを選択し、自然交配にて、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、導入遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’（配列番号３）
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’（配列番号４）
また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法であって、該方法が以下の工程：
（ｉ）肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたuPAをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程；ならびに
（ｖ）少なくとも６週齢から８週齢にかけて血清ALT値が増大するトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、上記方法。
【請求項２】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法であって、該方法が以下の工程：
（ｉ）肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたuPAをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程； 
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程；ならびに
（ｖ）少なくとも６週齢又は８週齢における血清ALT値が、uPA遺伝子を有さないマウスの血清ALT値と比べて有意に高いトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、上記方法。
【請求項３】
前記工程（ｖ）において、少なくとも６週齢又は８週齢における血清ALT値が、uPA遺伝子を有さないマウスの血清ALT値と比べて少なくとも2倍高いトランスジェニックマウスを得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により作製された、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項５】
請求項４に記載の肝障害マウス又はその子孫と免疫不全マウスとを交配することによって得られる、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、免疫不全肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項６】
請求項５に記載の、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、免疫不全肝障害マウス又はその子孫に、ヒト肝細胞を移植することを含む、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウスの作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により作製された、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
【請求項８】
ヒト肝細胞がキメラ肝の肝細胞の少なくとも１０％を占めている、請求項７に記載のキメラマウス。
【請求項９】
血中ヒトアルブミン濃度が1mg/mL以上である、請求項７に記載のキメラマウス。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検物質を請求項７〜９のいずれか１項に記載のキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検物質のヒト肝細胞に対する毒性を評価する方法であって、
（ａ）被検物質を請求項７〜９のいずれか１項に記載のキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、該被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項７〜９のいずれか１項に記載のキメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程；
（ｂ）（ａ）において肝炎ウイルスが接種された該キメラマウスに被検物質を投与する工程；
（ｃ）（ｂ）において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｄ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、（ｃ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。
【請求項１３】
肝炎ウイルスが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
uPAをコードするcDNAを含むDNA断片がヘテロ接合型に導入されており、少なくとも６週齢から８週齢にかけて血清ALT値が増大することを特徴とし、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項１５】
uPAをコードするcDNAを含むDNA断片がヘテロ接合型に導入されており、少なくとも６週齢又は８週齢における血清ALT値が、uPA遺伝子を有さない野生型マウスの血清ALT値と比べて有意に高いことを特徴とし、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の肝障害マウスと免疫不全マウスとを交配することによって得られる、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、免疫不全肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項１７】
uPAをコードするcDNAを含むDNA断片がヘテロ接合型に導入されており、少なくとも６週齢から８週齢にかけて血清ALT値が増大することを特徴とし、免疫不全である、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項１８】
uPAをコードするcDNAを含むDNA断片がヘテロ接合型に導入されており、少なくとも６週齢又は８週齢における血清ALT値が、uPA遺伝子を有さない野生型マウスの血清ALT値と比べて有意に高いことを特徴とし、免疫不全である、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、肝障害マウス又はその子孫あるいはその一部。
【請求項１９】
請求項１６に記載のuPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、免疫不全肝障害マウス又はその子孫に、ヒト肝細胞を移植することによって得られる、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
【請求項２０】
移植されたヒト肝細胞を含むキメラ肝を有するキメラマウスであって、
該キメラマウスが、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する免疫不全マウスであり、かつヒト肝細胞の移植後少なくとも１０週にかけて血中ヒトアルブミン濃度が増大していることを特徴とする、上記キメラマウス。
【請求項２１】
移植されたヒト肝細胞を含むキメラ肝を有するキメラマウスであって、
該キメラマウスが、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する免疫不全マウスであり、かつ血中ヒトアルブミン濃度が1mg/mL以上であることを特徴とする、上記キメラマウス。
【請求項２２】
移植されたヒト肝細胞を含むキメラ肝を有するキメラマウスであって、
該キメラマウスが、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する免疫不全マウスであり、かつヒト肝細胞の移植から少なくとも１０週後のキメラ肝においてヒト肝細胞が肝細胞全体の１０％以上を占めることを特徴とする、上記キメラマウス。
【請求項２３】
ヒト肝細胞の移植から少なくとも１０週後のキメラ肝においてヒト肝細胞が肝細胞全体の６０％以上を占める、請求項２２に記載のキメラマウス。
【請求項２４】
請求項４に記載の肝障害マウス又はその子孫と免疫不全マウスとを交配する工程を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する、免疫不全肝障害マウスの作製方法。