(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖを特異的に認識し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５４、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５５、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５６又はＦＥＲＭ Ｐ−１６５５７のハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する、受託番号が、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５４、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５５、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５６又はＦＥＲＭ Ｐ−１６５５７であるハイブリドーマ。
【請求項３】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを免疫原に用いて得られたモノクローナル抗体を検体と反応させる工程、及び、モノクローナル抗体が結合した免疫複合体を測定することによって検体中のヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖを定量する工程からなることを特徴とするヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖの免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（以下、ＧｎＴともいう）−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、及び、このモノクローナル抗体を用いたヒトＧｎＴ−Ｖの免疫測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
癌を診断する臨床の現場においては、癌であるか否かの診断はもとより、その癌が良性か悪性かを診断することが重要な関心事である。悪性の癌とは、転移能、浸潤性、接着能、遊走性等の強さを言い、これらのリスクの高さを癌の悪性度と言う。悪性度の診断に関しては、いわゆる癌胎児性抗原等の癌関連物質の糖鎖構造を解析する研究が広く行われている。例えば、癌関連物質である糖脂質や糖タンパク質等を特異的に認識するモノクローナル抗体が作成され、これを用いた免疫反応により、それらの糖鎖構造の相違を検出することが試みられている。また、細胞の癌化をより早い段階で検知するために、糖鎖合成に関与する糖転移酵素そのものを検出することも検討されている。
【０００３】
癌の悪性度を診断するには、数ある糖転移酵素の中で、どの酵素が癌の悪性度と関係が深いかが重要な課題である。一般に、高等動物において、Ｎ−複合型糖鎖は、臓器種、組織型、細胞種等によって非常に多様な構造を示している。Ｎ−複合型糖鎖のコア構造を決定するのはＧｎＴ群である。このうち、癌の悪性度と深く関与があるのは、ＧｎＴ−ＩＩＩとＧｎＴ−Ｖとの活性のバランスであることが報告されており、特に、ＧｎＴ−Ｖが悪性度に深く関与していることが判明してきた。（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３６巻、５８２〜５８５頁、１９８７年、及び、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ・オブ・ジ・ユナイティド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、９２巻、８７５４〜８７５８頁、１９９５年）。
【０００４】
ＧｎＴ−Ｖ活性を測定する試みとしては、ＧｎＴ−Ｖの基質アクセプターを固定化したＥＬＩＳＡプレートに、検体と基質であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとを添加し、検体中のＧｎＴ−Ｖ活性により生じる糖鎖構造を抗血清により認識する酵素活性測定方法が報告されている（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１８５巻、１１２〜１１７頁、１９９０年）。しかしながら、この方法は、生じた生成物の量から酵素活性を測定する方法であり、抗血清の有する特異性に問題があった。従って、ＧｎＴ−Ｖをより一層特異的に検出することができる検出系の開発が望まれていた。
【０００５】
一方、特異性に優れた免疫学的検出系としては、モノクローナル抗体を用いる方法が知られている。しかし、モノクローナル抗体を作成するためには大量の抗原となるタンパク質が必要である。ヒトＧｎＴ−Ｖは、培養細胞や組織における存在量が少ないので、それらから精製して天然型のヒトＧｎＴ−Ｖを多量に調製することは困難である。
【０００６】
ヒトＧｎＴ−Ｖの遺伝子解析は、ラットの腎臓からＧｎＴ−Ｖを精製し、クローニングにより得られたラットの遺伝子解析データを元にして行われている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６８巻、１５３８１〜１５３８５頁、１９９３年、及び、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミニュケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９８巻、３１８〜３２７頁、１９９４年）。
【０００７】
モノクローナル抗体の作成に当たっては、通常、遺伝子配列を決定し、その配列情報から短いペプチドを作成し、これを利用することが広く行われている。しかし、この手法で得られるモノクローナル抗体の親和性は期待するほど高くないことが多く、高感度に検出しようとする場合には不向きである。従って、ヒトＧｎＴ−Ｖに対する特異性の高いモノクローナル抗体は未だ報告されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記現状に鑑み、ヒトＧｎＴ−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、上記モノクローナル抗体を用いたヒトＧｎＴ−Ｖの免疫測定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高い親和性を有する抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体を得るべく鋭意努力した結果、クローニングにより得られたヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子から遺伝子組換え技術を用いて形質転換体を作成し、これから得たＧｎＴ−Ｖ部分ポリペプチドを免疫原として用いることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができ、更に、広く応用が可能な酵素免疫学手法も確立することができた。
【００１０】
本発明は、ヒトＧｎＴ−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体である。
本発明は、また、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明は、更に、上記モノクローナル抗体を検体と反応させる工程、及び、モノクローナル抗体が結合した免疫複合体を測定することによって検体中のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖを定量する工程からなることを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖの免疫測定方法である。
以下、本発明を詳述する。
【発明の実施の形態】
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＧｎＴ−Ｖに対する親和性が高く、ヒトＧｎＴ−Ｖ発現株として知られているＣｏｌｏ２０５細胞（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２３３巻、１８〜２６頁、１９９５年）に対する蛍光免疫染色法において、ヒトＧｎＴ−Ｖが局在するゴルジ体のみを染色し、核部分は全く染色しない特異性を発揮するものである。
上記モノクローナル抗体は、ヒトＧｎＴ−Ｖにのみ特異的に反応し、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩには反応しないので、転移性の癌を検出することができると期待され、免疫測定方法においてより有益であるので、好ましい。
【００１２】
上記モノクローナル抗体は、配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドを免疫原として使用して得ることができる。上記配列表の配列番号１のポリペプチドは、ヒトＧｎＴ−Ｖのアミノ酸番号４３１−７４１の領域に相当し、上記配列表の配列番号２のポリペプチドは、ヒトＧｎＴ−Ｖのアミノ酸番号３１４−７４１の領域に相当する。
【００１３】
本発明においては、上記配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドを免疫原として用いることによって、天然型のヒトＧｎＴ−Ｖに近い抗原性を有していると考えられるので、ヒトＧｎＴ−Ｖに高い特異性を有するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１４】
上記免疫原として用いるヒトＧｎＴ−Ｖは、配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドであり、また、必ずしも高純度に精製されたものでなくても、粗精製物であってもよい。なお、実質的に配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むとは、ヒトＧｎＴ−Ｖの機能又は立体構造に影響を及ぼさない範囲で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をも含むことを意味する。
【００１５】
上記免疫原として用いるヒトＧｎＴ−Ｖは、遺伝子組換え技術を用いた以下のような方法によって得ることができる。
ヒトＧｎＴ−Ｖの公知の塩基配列（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９８巻、３１８〜３２７頁、１９９４年）を参考に、ＧｎＴ−Ｖ領域をＰＣＲ法によって増幅させ、制限酵素で切断することによって、上記配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードする領域のＤＮＡ断片を得る。また、上記公知の塩基配列から、化学合成により、上記配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードする領域のＤＮＡ断片を得ることも可能である。こうして得たＤＮＡ断片を、アンピシリン耐性遺伝子等の適当な標識遺伝子を有するベクターに導入して得た組み換えＤＮＡで、大腸菌等の宿主を形質転換し、形質転換体を得ることができる。この形質転換体を培養し、培養物を精製することによって上記ＧｎＴ−Ｖを得ることができる。
【００１６】
上記モノクローナル抗体は、上記ポリペプチドを免疫原として用いて動物を免疫し、その抗ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合することによって得られるハイブリドーマにより産生させることができる。
【００１７】
上記ハイブリドーマは、以下の方法で得ることができる。即ち、上述のようにして得たヒトＧｎＴ−Ｖをフロイントの完全アジュバンドとともに、数回に分けて、マウス等の動物に、２〜３週間おきに、腹腔内又は静脈投与することによって免疫する。次いで、脾臓等に由来する抗体産生細胞と、骨髄腫ラインからの細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖可能な腫瘍細胞とを融合させる。
【００１８】
上記融合方法としては、ケーラーとミルシュタインの常法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁、１９７５年）に従ってポリエチレングリコールによって行うことができ、又は、センダイウイルス等によって行うこともできる。
【００１９】
上記融合した細胞からヒトＧｎＴ−Ｖ抗原を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては、以下のようにして行うことができる。
即ち、上記融合した細胞から、限界希釈法によって、ＨＡＴ培地及び／又はＨＴ培地中で、生存している細胞をハイブリドーマとして選択することができる。次いで、上記ハイブリドーマの培養培地を、高純度に精製したヒトＧｎＴ−Ｖを固定化したアッセイプレート上で反応させた後、抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）等と更に反応させるＥＩＡ法等によって、ヒトＧｎＴ−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００２０】
本発明のハイブリドーマとしては、ヒトＧｎＴ−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであれば特に限定されないが、例えば、本発明者らが上述の方法によって樹立した４種のハイブリドーマが挙げられる。
【００２１】
上記４種のハイブリドーマは、それぞれ、ハイブリドーマＧＮＴＶ１３Ｆ４、ハイブリドーマＧＮＴＶ２１Ｄ９、ハイブリドーマＧＮＴＶ２２Ｇ１２、及び、ハイブリドーマＧＮＴＶ２４Ｄ１１と命名された。
【００２２】
上記各ハイブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）〕に、ハイブリドーマＧＮＴＶ１３Ｆ４は、識別表示ＧＮＴＶ１３Ｆ４、受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１６５５４（受託日；平成９年１２月１６日）として、ハイブリドーマＧＮＴＶ２１Ｄ９は、識別表示ＧＮＴＶ２１Ｄ９、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５５５（受託日；平成９年１２月１６日）として、ハイブリドーマＧＮＴＶ２２Ｇ１２は、識別表示ＧＮＴＶ２２Ｇ１２、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５５６（受託日；平成９年１２月１６日）として、及び、ハイブリドーマＧＮＴＶ２４Ｄ１１は、識別表示ＧＮＴＶ２４Ｄ１１、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５５７（受託日；平成９年１２月１６日）として、それぞれ寄託されている。
【００２３】
上記各ハイブリドーマは、通常、細胞培養に用いられる培地において培養し、培養上清からモノクローナル抗体を回収することができる。また、ハイブリドーマが由来する動物に投与することによって、腹水を貯留させ、この腹水から回収することもできる。
【００２４】
上記モノクローナル抗体の回収方法としては、通常行われている精製方法を用いることができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００２５】
本発明の免疫測定方法は、上記モノクローナル抗体を、検体及び標識した抗原又は抗体と反応させる工程、及び、標識物を測定することによって検体中のヒトＧｎＴ−Ｖを定量する工程からなるものである。
上記免疫測定方法としては、酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、蛍光免疫測定法等が挙げられる。これらの測定法は、サンドイッチ法又は競合的結合測定法により、検体中の目的とする抗原の量を定量的に測定することができる。
【００２６】
上記サンドイッチ法による免疫測定法とは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を２種用意し、そのうち１種を常法によって酵素、放射線、蛍光物質等によって標識しておく。ＥＬＩＳＡプレート；ラテックス、ゼラチン粒子、磁性粒子等の通常用いられる不溶性担体等の表面に標識していない本発明のモノクローナル抗体を吸着させ、その後、測定すべき抗原を含む検体を反応させる。次いで、結合した抗原に標識したモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させ、不溶性担体に結合した標識物、即ち、標識モノクローナル抗体の量から測定すべき抗原の量を定量することができる。
【００２７】
上記競合的結合測定法による免疫測定法とは、例えば、一定量のモノクローナル抗体に対して、酵素、放射線、蛍光物質等によって標識した一定量の抗原と、測定すべき抗原を含む検体とを競合的に反応させ、抗体と結合した、又は、結合しなかった標識抗原の量から測定すべき抗原の量を定量する。抗体と結合した標識抗原を結合しなかったものと分離するためには、抗体と同種の免疫グロブリンを加え、これに対する抗体を加えて、抗体と結合した標識抗原を沈殿させ分離し、測定する二抗体法、チャーコール、ミリポアフィルターを用いる方法等によって行うことができる。
【００２８】
上記方法によって測定できる検体としては、ヒトＧｎＴ−Ｖを含むものであれば特に限定されず、例えば、ヒト由来の血清、血漿、及び、細胞又は組織のホモジネート等が挙げられる。
【００２９】
また、ヒト由来の種々の細胞、組織等を固定化し、本発明のモノクローナル抗体を反応させることによって、細胞、組織等に分布するヒトＧｎＴ−Ｖを直接測定することも可能である。更に、本発明のモノクローナル抗体を用いて、いわゆるウェスタンブロッティング、アフィニティクロマトグラフィー等を行うこともできる。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体を用いたヒトＧｎＴ−Ｖ抗体測定方法を、ヒト由来の種々の検体に適用することにより、癌の診断方法を実施することができる。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体を用いることによって、免疫化学的方法や免疫組織化学的方法により、ヒト由来の種々の体液、細胞、組織等におけるヒトＧｎＴ−Ｖを直接測定することが可能となる。
特に、サンドイッチアッセイ法を適用することにより、溶液中のヒトＧｎＴ−Ｖ抗原を特異的に感度良く測定できる等の極めて有用な効果を得ることができる。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３３】
実験例１  形質転換体の作成
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９８巻、３１８〜３２７頁、１９９４年に記載の方法でクローニングしたヒトＧｎＴ−ＶのｃＤＮＡを鋳型分子とし、配列表の配列番号１及び２に示したヒトＧｎＴ−ＶポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ法にて増幅した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した。次いで、１％アガロールゲル電気泳動により、ＧｎＴ−ＶのＣ末端側の領域を含むＤＮＡ断片１２９０ｂｐ及び９４０ｂｐを分離した。これらのＤＮＡ断片を図１に示す発現用プラスミドｐＷ６Ａ（富士レビオ株式会社製）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、１２９０ｂｐのＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及び９４０ｂｐのＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１を作成した。これらのプラスミドを用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（東洋紡株式会社製）を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１を得た。
【００３４】
上記形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１を、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、塩基配列を確認したところ、ヒトＧｎＴ−Ｖ由来の部分ポリペプチド（配列表の配列番号１に示すポリペプチドであって、ヒトＧｎＴ−Ｖのアミノ酸番号３１４−７４１に該当するポリペプチド（以下、ポリペプチド３１４−７４１という）、及び、配列表の配列番号２に示すポリペプチドであって、ヒトＧｎＴ−Ｖのアミノ酸番号４３１−７４１に該当するポリペプチド（以下、ポリペプチド４３１−７４１という））をコードする、配列表の配列番号３及び４に示すＤＮＡ断片であった。
【００３５】
実施例１  組換えタンパク質の発現と精製
実験例１で作成した形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍＬ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍで吸光度を０．６〜０．８にした後、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を添加し発現誘導を行い、更に２時間培養した。１．５ｍＬ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μＬの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ    ＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とした。
【００３６】
菌体試料８μＬに３倍濃度のポリアクリルアミドゲル緩衝液（０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、６％ＳＤＳ、２４％グリセリン、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％２−メルカプトエタノール、０．００３％ＢＰＢ）４μＬを加え、充分撹拌した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００３７】
泳動後ポリアクリルアミドゲルをタンパク染色し、菌体試料に含まれるタンパクの展開像を観察した。形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１試料中には、非形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）では認められない、分子量４７Ｋｄ及び３４Ｋｄのポリペプチドがそれぞれ存在した。これは、それぞれ、プラスミドｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１からの発現産物と考えられる。
【００３８】
次に、プラスミドｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びプラスミドｐＷ６ＡＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１を、それぞれ、宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入後、ＬＢ培地１Ｌ中で、３７℃の条件下で培養した。予備培養にて波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、発現誘導を行った。一晩培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に３Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２００ｍＬ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。こうして、形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ３１４−７４１及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＧｎＴ−Ｖ４３１−７４１について、それぞれ発現したタンパク質は、遠心後不溶性成分として沈澱に回収された。
【００３９】
これら沈澱物を、それぞれ６Ｍ尿素及び２０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００ｍＬに可溶化後、６Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシア社製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムによる濃度勾配法で溶出したところ、約０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶出画分にヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチドを回収した。次いで、これらＱＦＦ精製画分を、セントリプレップ１０（アミコン社製）にて各々濃縮後、６Ｍ尿素及び０．  ５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．  ６）で平衡化したスーパーデックス２００ゲルろ過カラム（ファルマシア社製）で精製した。分子量約５０Ｋｄに精製ヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチド３１４−７４１、分子量約３５Ｋｄに精製ヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチド４３１−７４１を回収した。
【００４０】
実施例２  ハイブリドーマの作成
実施例１で得られたヒトＧｎＴ−Ｖ由来のポリペプチド３１４−７４１及びポリペプチド４３１−７４１の各１００μｇをフロイントの完全アジュバンドとともにＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雌性）に腹腔内投与した。２週間間隔でこれを３回繰り返し、更に３週間後、最終免疫として上記ヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチド３１４−７４１及びポリペプチド４３１−７４１の各１００ｍｇを静脈内投与した。３日後摘出した脾臓をケーラーとミルシュタインの常法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁、１９７５年）に従って、細胞融合に供した。融合相手の親細胞に、マウス骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用い、融合剤としてはポリエチレングリコールを用いた。
【００４１】
このようにして融合した細胞は、ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。約２週間後、ハイブリドーマが増殖したウエルの培養上清について、以下のような方法によって、ヒトＧｎＴ−Ｖに特異的なモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。即ち、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に上記実施例１で調製したヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチド３１４−７４１及びポリペプチド４３１−７４１を５００ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解し、９６穴マイクロアッセイプレートに１００μＬ／ウエルとなるように分注し、４℃で一晩放置して抗原固定化プレートを作成した。次に、非結合のヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチドを含む溶液を除去し、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、１．０％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳを分注し、３７℃にて２時間放置してブロッキングした。同様にして洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を１００μＬ／ウエルとなるように分注し、３７℃にて１時間放置した。続いて、同様にして洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）  を１０００倍に希釈したものを１００μＬ／ウエルとなるように分注し、３７℃にて１時間放置した。最後に、同様にして洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を１００μＬ／ウエルとなるように加え、吸光度を測定した。
【００４２】
以上のようにして選択されたハイブリドーマのうち、クローンＧＮＴＶ１３Ｆ４、ＧＮＴＶ２１Ｄ９、ＧＮＴＶ２２Ｇ１２、ＧＮＴＶ２４Ｄ１１由来のモノクローナル抗体が、ヒトＧｎＴ−Ｖと特異的に反応した。
【００４３】
実施例３  抗ヒトＧｎＴ−Ｖ抗体の調製
実施例２で得られたそれぞれのハイブリドーマ１×１０７  個を、プリスタン０．５ｍＬ投与後２週間のＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雌性）にそれぞれ腹腔内投与した。約１０日後、マウス腹腔中に腹水が貯留し、この腹水中に抗ヒトＧｎＴ−Ｖ抗体が高濃度に含まれていた。採取した腹水は、クローンＧＮＴＶ１３Ｆ４及びＧＮＴＶ２１Ｄ９由来のものは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、また、クローンＧＮＴＶ２２Ｇ１２、ＧＮＴＶ２４Ｄ１１由来のものは、プロテインＡによるアフニティクロマトグラフィーで精製した。以下、ハイブリドーマＧＮＴＶ１３Ｆ４、ＧＮＴＶ２１Ｄ９、ＧＮＴＶ２２Ｇ１２及びＧＮＴＶ２４Ｄ１１から調製したモノクローナル抗体を、それぞれ、ＭＡｂ１３Ｆ４、ＭＡｂ２１Ｄ９、ＭＡｂ２２Ｇ１２及びＭＡｂ２４Ｄ１１という。
【００４４】
抗ヒトＧｎＴ−Ｖ抗体は以下の特徴を有していた。
ＭＡｂ２２Ｇ１２、ＭＡｂ２４Ｄ１１
ｉ）免疫グロブリンのタイプ：ＩｇＧ
ｉｉ）  分子量：約１５万ダルトン，
ｉｉｉ）分子吸光係数：Ｅ２８０ｎｍ＝１４．０
ＭＡｂ１３Ｆ４、ＭＡｂ２１Ｄ９
ｉ）免疫グロブリンのタイプ：ＩｇＭ
ｉｉ）  分子量：約５０万ダルトン，
ｉｉｉ）分子吸光係数：Ｅ２８０ｎｍ＝１４．０
【００４５】
実施例４  抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング
ＧｎＴ−Ｖ発現株であるヒト株化細胞Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣから入手）のライセイトを１０％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール及び５％グリセリン溶液で溶解した後、１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、これを更にニトロセルロース膜に転写して転写膜を作成した。このように調製した転写膜を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に室温で２時間放置し、ブロッキングした。この転写膜と、実施例３で得られた抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体ＭＡｂ１３Ｆ４、ＭＡｂ２１Ｄ９、ＭＡｂ２２Ｇ１２及びＭＡｂ２４Ｄ１１を、それぞれ２時間反応させた。０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで転写膜を洗浄後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン抗体（ベクタスティンＡＢＳキット、ベクター社製）と３０分間反応させた。同様にして洗浄後、アビジンＤＨ及びビオチン化ペルオキシダーゼの複合物と３０分間反応させた。同様にして洗浄後、ペルオキシダーゼ不溶性基質（４−クロロナフトール−過酸化水素系）を加えて発色させた。
その結果、ヒト株化細胞Ｃｏｌｏ２０５ライセイトの転写膜には、得られたモノクローナル抗体ＭＡｂ１３Ｆ４、ＭＡｂ２１Ｄ９、ＭＡｂ２２Ｇ１２及びＭＡｂ２４Ｄ１１に対して反応する、ＧｎＴ−Ｖとして報告されている分子量に相当する約７０〜８０Ｋｄのメジャーバンドと分解産物と思われる低分子量のマイナーバンドが得られた。
【００４６】
次に、ＭＡｂ２２Ｇ１２を用いて、癌患者の肝癌組織検体及びその癌組織周辺部の非癌組織検体のライセイトに対して、同様のウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングの結果は、スキャナー（パワールックＩＩ、ユーマックス社製）で取込み、インテリジェントクオンティファー（日本バイオイメージリミテッド社製）でバンドの相対強度を測定した。表１に、各検体のバンドの相対強度の測定結果を示す。いずれのライセイトに対しても、ＧｎＴ−Ｖとして報告されている分子量に相当する約７０〜８０Ｋｄのバンドが得られたが、発色は肝癌組織検体ライセイトの方が明らかに強かった。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
実施例５  細胞に対する蛍光免疫染色
ＧｎＴ−Ｖ発現株として知られているＣｏｌｏ２０５細胞をスライドグラス上にアルコール固定し、これに得られた抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体ＭＡｂ１３Ｆ４、ＭＡｂ２１Ｄ９、ＭＡｂ２２Ｇ１２及びＭＡｂ２４Ｄ１１を、それぞれ湿潤箱中で３７℃にて２時間反応させた。冷ＰＢＳで４回洗浄後、抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）−ＦＩＴＣ標識抗体を湿潤箱中で室温にて１時間反応させた。冷ＰＢＳで４回洗浄の後、蛍光顕微鏡にて、その染色像を観察した。その結果、どのモノクローナル抗体においても、ＧｎＴ−Ｖが局在するゴルジ体と思われる細胞質部分が特異的に染色され、核部分は全く染色されなかった。
【００４９】
実施例６  抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ測定法
実施例３で得られたＭＡｂ２４Ｄ１１抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬの濃度に調整し、９６穴アッセイプレート（ヌンク社製）に１００μＬ／ウエルとなるように分注し、４℃にて一晩放置して、抗体固定化プレートを作成した。次に、非結合のＭＡｂ２４Ｄ１１抗体を含む溶液を除去し、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、１．０％のＢＳＡを含むＰＢＳを１００μＬ／ウエルに分注し、３７℃２時間放置してブロッキングした。
【００５０】
次に、実施例１で調製したヒトＧｎＴ−Ｖポリペプチド４３１−７４１を０、０．３１、０．６３、１．２５、２．５及び５ｎｇ／ｍＬとなるように含む１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製し、抗体固定化プレートに１００μＬ／ウエルとなるように分注した。３７℃にて２時間放置の後、同様にして洗浄し、アルカリフォスファターゼを結合させた酵素標識ＭＡｂ２２Ｇ１２抗体を、１００μＬ／ウエルとなるように分注した。３７℃にて１時間放置後、同様にして洗浄し、アルカリフォスファターゼ基質ＰＮＰＰ（４−ニトロフェニルフォスフェイト）を１００μＬ／ウエルとなるように加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示した。このサンドイッチ測定法は、数ｎｇ／ｍＬのヒトＧｎＴ−Ｖを充分に検出することができた。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＧｎＴ−Ｖに対する特異性が極めて高いので、高感度な免疫測定方法に利用することができる。本発明のハイブリドーマは、ヒトＧｎＴ−Ｖを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する手段を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いたＧｎＴ−Ｖの免疫測定方法は、肝癌、大腸癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、胃癌、膵臓癌、骨髄腫、リンパ腫等の癌の悪性度の診断に寄与することが期待される。
【００５２】
【配列表】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１で使用した発現用プラスミドの制限酵素地図を示す図である。
【図２】実施例６における本発明のモノクローナル抗体を用いてのＥＬＩＳＡの試験結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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