(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化された微小気泡調製物であって、
その中に分散した多数の浸透性の安定化された微小気泡を有する水性媒体を含み、
前記微小気泡は、少なくとも一種類の気体透過剤と少なくとも一種類の調節用気体とを含有するほぼ球形の微小気泡膜を含むことを特徴とする調製物。
【請求項２】
前記気体透過剤は25℃、１気圧で、水に対して約0.5mM以下の溶解度を有する、請求項１に記載の微小気泡調製物。
【請求項３】
前記気体透過剤は37℃、１気圧で液体である化合物の蒸気を含む、請求項１に記載の微小気泡調製物。
【請求項４】
前記気体透過剤はフルオロカーボンを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の微小気泡調製物。
【請求項５】
前記フルオロカーボン気体透過剤は、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオペンタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロヘプタン、パーフルオロシクロヘプタン、パーフルオロメチルシクロヘキサン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルアミンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の微小気泡調製物。
【請求項６】
前記調節用気体はフルオロカーボン気体である、請求項１〜５の何れか一項に記載の微小気泡調製物。
【請求項７】
前記調節用気体は非フルオロカーボン気体である、請求項１〜５の何れか一項に記載の微小気泡調製物。
【請求項８】
前記非フルオロカーボン調節用気体は、窒素、酸素、二酸化炭素およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の微小気泡調製物。
【請求項９】
前記非フルオロカーボン調節用気体は、空気である請求項７に記載の微小気泡調製物。
【請求項１０】
前記微小気泡膜は界面活性剤を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の微小気泡調製物。
【請求項１１】
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、中性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、中性フッ素化界面活性剤、アニオン性フッ素化界面活性剤およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項10に記載の微小気泡調製物。
【請求項１２】
前記界面活性剤は非ニュートン性の粘弾性界面活性剤である、請求項10に記載の微小気泡調製物。
【請求項１３】
前記界面活性剤は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコーポリマー、糖エステル、脂肪アルコール、脂肪族アミン酸化物、ヒアルロン酸脂肪族エステル、ヒアルロン酸脂肪族エステル塩、ドデシルポリ（エチレンオキシ）エタノール、ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、ヒドロキシエチル澱粉、ヒドロキシエチル澱粉脂肪酸エステル、デキストラン、デキストラン脂肪酸エステル、ソルビトール、ソルビトール脂肪酸エステル、ゼラチン、血清アルブミン、リン脂質、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエステル、ポリオキシエチレン化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシノーレート、エトキシ化大豆ステロール、エトキ化シヒマシ油、コレステロール、オレイン酸、オレイン酸ナトリウムおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項10に記載の微小気泡調製物。
【請求項１４】
前記微小気泡膜は蛋白質性の材料を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の微小気泡調製物。
【請求項１５】
前記蛋白質性の材料はアルブミンである、請求項14に記載の微小気泡調製物。
【請求項１６】
前記気体透過剤はパーフルオロプロパンであり、前記調節用気体は窒素である請求項15に記載の微小気泡調製物。
【請求項１７】
前記気体透過剤はパーフルオロペンタンである、請求項１に記載の微小気泡調製物。
【請求項１８】
前記調節用気体は窒素、酸素、二酸化炭素およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項17に記載の微小気泡調製物。
【請求項１９】
前記調節用気体は窒素である、請求項18に記載の微小気泡調製物。
【請求項２０】
前記微小気泡膜は界面活性剤を含む、請求項19に記載の微小気泡調製物。
【請求項２１】
前記気体透過剤はパーフルオロヘキサンである、請求項１に記載の微小気泡調製物。
【請求項２２】
前記調節用気体は窒素、酸素、二酸化炭素およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項21に記載の微小気泡調製物。
【請求項２３】
前記調節用気体は窒素である、請求項22に記載の微小気泡調製物。
【請求項２４】
前記微小気泡膜は界面活性剤を含む、請求項23に記載の微小気泡調製物。
【請求項２５】
前記界面活性剤はリン脂質を含む、請求項24に記載の微小気泡調製物。
【請求項２６】
請求項１〜25の何れか一項に記載の多数の安定化された微小気泡を含む調製物を含むコントラスト増強剤。
【請求項２７】
磁気共鳴画像又は超音波画像によって画像化することのできる請求項26に記載のコントラスト増強剤。
【請求項２８】
微小気泡前駆体組成物であって、
多数の平均直径が約100μｍ以下である、多数の空隙で定義される、空隙含有構造体と、
前記空隙中に分散した、25℃、１気圧で、水に対して約0.5mM以下の溶解度を有する気体透過剤を含有する気体と、を含み且つ
前記空隙含有構造体および前記気体は、液体と前記微小気泡前駆体組成物とを混合することによって微小気泡を形成させるように一緒に適用されることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
前記気体透過剤はフルオロカーボンを含む、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
前記フルオロカーボンは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオベンタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロヘプタン、パーフルオロシクロヘプタン、パーフルオロメチルシクロヘキサン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルアミンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
前記気体は更に調節用気体を含む、請求項28〜30の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記調節用気体は、窒素、酸素、二酸化炭素およびこれらの混合物からなる群から選択される非フルオロカーボン調節用気体である、請求項30に記載の組成物。
【請求項３３】
更に界面活性剤を含む、請求項28〜30の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記界面活性剤は前記空隙含有構造体と一緒に混合される、請求項30に記載の組成物。
【請求項３５】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤、中性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、中性フッ素化界面活性剤、アニオン性フッ素化界面活性剤およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項33または34に記載の組成物。
【請求項３６】
前記界面活性剤は、リン脂質、脂肪酸、ブロックコーポリマー、糖エステルおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項33〜35の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記空隙含有構造体は澱粉、澱粉誘導体および糖エステルからなる群から選択される、請求項28〜36の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記空隙含有構造体は炭水化物を含む、請求項28〜36の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記空隙含有構造体は蛋白質性の材料を含む、請求項28〜36の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記空隙含有構造体は粉体を含む、請求項28〜39の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記空隙含有構造体は多数の球体を含む、請求項28〜40の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記多数の球体は噴霧乾燥球体を含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
多数の微小気泡を有する微小気泡調製物を提供する、請求項28〜42の何れか一項に記載の微小気泡前駆体組成物と液体を含むコントラスト増強剤。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、超音波コントラストの増強のための安定で長期間存在する微小気泡（mivrobubbles）を調製する方法、およびそのようにして調製された気泡の組成物に関する。
背景技術
超音波技術は、イオン化放射を使用する画像形成技術に対して、重要でより経済的な代替物を提供するものである。多数の従来技術による画像形成技術が利用可能であり、例えば、磁気共鳴画像形成（magnetic resonance imaging,MRI）、コンピューター処理断層撮影（computerized tomography,CT）、陽電子放射断層撮影（positron emission tomography,PET）があるが、これらの技術のそれぞれでは、非常に高価な装置が使用されている。更に、CTおよびPETでは、イオン化放射が利用されている。これらの技術とは異なり、超音波画像形成装置は比較的安価である。更に、超音波画像形成は、イオン化放射を使用するものではない。
超音波画像形成では、組織による音波の反響に影響を与える組織の密度および組成の差が利用される。例えば組織の界面におけるように、組織の密度または圧縮性に明瞭な変化がある場合には、画像は特に鮮鋭となる。固体組織、骨格系、並びに種々の器官および／または腫瘍の間の界面は、超音波を用いて容易に画像形成される。
よって、多くの画像形成の用途において、超音波は、コントラスト増強剤を用いなくても適切に機能するが、他の用途、例えば流れる血液を視覚化するためには、コントラストの増強を与えるために、この種の薬剤を開発する努力が現在もなされている。この種のコントラスト剤についての１つの特に有意義な用途は、潅流画像形成の領域である。この種の超音波コントラスト剤は、心筋、腎臓、肝臓、および他の組織において、流れる血液の画像形成を改良し得るであろう。これは翻って、画像形成された組織に関連する研究、診断、手術、および治療を促進することとなろう。血液プールのコントラスト剤は、血液含有量に基づいた画像形成をも可能とし（例えば、腫瘍および炎症組織）、母体の血液循環のみを増強することにより、胎盤および胎児の視覚化を助成するものとなろう。
多様な超音波コントラスト増強剤が提案されている。最も成功を収めている薬剤は、一般に、静脈内に注射することのできる微小気泡からなるものであった。その最も単純な態様では、微小気泡は、空気のような気体を含有する極めて小さい気泡であり、発泡剤、界面活性剤、またはカプセル封入剤を介して形成される。かくして微小気泡により、周囲の流動組織および血液と比較すると、異なる密度および極めて高い圧縮性を有する流れる血液における物理的な対象物が与えられる。この結果、これらの微小気泡は、超音波を用いて容易に画像形成される。
しかしながら、大半の微小気泡組成物は、コントラストの増強については、数分はおろか数秒間持続するコントラストの増強にさえ失敗している。これによりその有用性は大きく制限されている。したがって、微小気泡は、その有効なコントラスト増強の寿命を増加させるための試みにおいて、種々の様式で「構成」されている。種々の方法が追求されており、異なる界面活性剤または発泡剤の使用、最初に液体懸濁物中で形成され、固化の際に気体を捕捉するゼラチンやアルブミンの微小球体（microspheres）の使用、およびリポソームの形成が挙げられる。これらの試みのそれぞれは、理論的には、より強力な気泡構造体を造成するよう作用する筈である。しかしながら、捕捉された気体（典型的には、空気、CO2等）は、ラプラスの式（ΔＰ＝２γ/r）により示されるように、囲繞する界面活性剤の表面張力のために、気泡内では増加した圧力下にある。
次いでこの増加した圧力により、気体が高い圧力の領域（気泡内）から、低い圧力の環境へと（この上昇した圧力の気体で飽和されていない周囲の液体中へと、またはより大きい直径でより低い圧力の気泡へと）移動し、この結果気泡は速やかに収縮し消滅することとなる。
気体をカプセル封入する固相の殻は、一般に、極めて脆いかまたは気体に対して透過性が極めて高いために、満足し得る生体内での寿命を有さないことが示されている。更に、厚い殻（例えば、アルブミン、糖または他の粘性の材料）では、気泡の圧縮性が低減し、これにより気泡が存在し得る短い時間の間にも、その反響性（echogenicity）が低減する。注入された場合に気体に放出するか沸騰する固体粒子または液体エマルジョンは、気体または蒸気による血液の過飽和の危険性を伴う。このため、意図する多数の小さい気泡ではなく、少数の利用可能な凝集（nucleation）部位で形成される少数の大きな塞栓性の気泡が得られることとなろう。
この種の問題を取り扱う１つの提案が、QuayのPCT/US92/07250号に概説されている。Quayは、体温（37℃）で気体であること、並びに空気と比較して、低減した水に対する溶解性、高い密度、および低減した気体拡散性を溶液中で有することを基準として選択した気体を使用して気泡を形成している。水に対する溶解性および分散性が低減すると、気体が気泡から出て行く速度に影響を与え得るが、Quayの気泡には多数の問題が残っている。十分に小さい直径（例えば、３〜５μｍ）の気泡を形成するには、高いエネルギーの投入が必要である。これは、精巧な気泡製造装置を、使用する場所に設置しなければならないという点で不利である。更に、Quayの気体選択の評価基準は、気泡収縮のある種の主要な原因、すなわち気泡の表面張力の効果、界面活性剤および気体浸透効果（gas osmotic effect）を考慮していない点で不正確であり、これらの誤りの結果、ある種の不適切な気体が含まれ、ある種の最適な気体が除外されるに至っている。
よって、この分野では、生体適合性を有し、容易に調製され、超音波画像形成において優れたコントラストの増強を与える、より長い寿命のコントラスト増強剤を提供する、あるいは利用可能にする組成物、およびこのような組成物を調製する方法に対する必要性が存する。
発明の要旨
本発明によれば、生体内で延長された長い寿命を有する超音波コントラスト増強剤が提供される。これは、気泡の内側および外側の両者の分圧の考慮に基づいて、かつこの結果として気泡の収縮に対抗する気体浸透圧（gas osmotic pressure）の差に基づいて選択される捕捉される気体または気体混合物と組み合わせた、実質的に従来のあらゆる微小気泡処方物により構成される。低い蒸気圧および血液または血清中での限定された溶解度（すなわち、相対的に疎水性であること）を有する気体を、通常の血液または血清中に存在する気体によってより迅速に交換される他の気体と組み合わせて、有利に存在させることができる。高分子量の気体浸透圧剤（gas osmotic agent）の使用を可能とする界面活性剤の群、および気泡製造の改良された方法も開示する。
本発明の１つの観点は、安定化された気体で満たされた微小気泡調製物であって、微小気泡を形成するための概して球形の膜内にある、１または複数の第１の気体と、１または複数の第２の気体（気体浸透圧剤）との混合物を含み、第１の気体と第２の気体とが、それぞれ約1:100〜約1000:1のモル比で存在し、ｘを37℃での第２の気体の蒸気圧としたときに、第１の気体が、37℃で少なくとも約（760−ｘ）mmHgの蒸気圧を有し、第１および第２の気体のそれぞれの蒸気圧が、37℃で約75mmHgを超える（ただし、第１の気体および第２の気体は、水蒸気ではないものとする）微小気泡調製物である。１つの態様では、第２の気体はフルオロカーボンを含み、第１の気体は、非フルオロカーボン、例えば窒素、酸素、二酸化炭素、またはこれらの混合物である。
微小気泡は、有利には液体媒体、例えば水性媒体中に存在させることができ、この場合これは第１の平均直径を有し、微小気泡における第１の気体対第２の気体の比率は少なくとも1:1とし、微小気泡は、第１の気体が膜を通って失われる結果、第１の直径の約75％未満の第２の平均直径へと収縮した後、膜の両側の気体浸透圧の差の結果、少なくとも約１分間、第２の直径でまたはその近傍で安定化されて維持されるよう適合している。有利には、媒体は容器内にあるものとし、微小気泡は、実際には容器内で形成されたものとする。代替的に、媒体は生体内の血液とする。１つの態様では、液体媒体は、少なくとも約700mmHgの気体張力（tension）で溶解している１または複数の気体を含有し、第１の直径は少なくとも約５μｍとし、媒体に溶解した１または複数の気体の張力は、微小気泡内部の同じ１または複数の気体の分圧未満とする。
特に好適な態様では、気泡は最初に少なくとも３つの気体を含有する。すなわち、周囲の液体中の同気体の気体張力より遙かに大きい（例えば、周囲の液体より1.5、２、４、５、10、20、50または100倍以上大きい）分圧を有する第１の気体、気体に対する気泡膜の相対的に低い透過性、または周囲の媒体における気体の相対的に低い溶解度のために（本明細書中随所に記載するように）気泡中に保持される第２の気体、および相対的に膜透過性であって周囲の媒体中にも存在する第３の気体である。例えば、空気に露呈されるか、またはこれと少なくとも部分的に平衡化した水性の系（例えば血液）においては、第１の気体は、有利には空気または血液中には大量に存在しない二酸化炭素または他の気体とすることができ、第２の気体は、パーフルオロカーボンのようなフルオロカーボン気体とすることができ、第３の気体は、空気または空気の主要成分、例えば窒素または酸素とすることができる。
好ましくは、収縮の前の第１の直径は少なくとも約10μｍとし、直径が安定化された第２の直径は、約１μｍ〜６μｍとする。
ここに記載する全ての微小気泡調製物または方法について、１つの好適な態様では、第２の気体は、第１の気体の少なくとも４倍の平均分子量を有する。他の好適な態様では、第２の気体は、37℃で、約750または760mmHg未満の蒸気圧を有する。更に、第１の気体対第２の気体のモル比を、約1:10〜約500:1、200:1または100:1とするのが好適である。他の好適な態様では、第２の気体は、フルオロカーボンまたは少なくとも２もしくは３のフルオロカーボンの混合物を含むものとし、第１の気体は非フルオロカーボンとする。幾つかの有利な調製物においては、第２の気体は１以上のパーフルオロカーボンを含む。他の態様では、第１の気体および第２の気体が共にフルオロカーボンを含む。更に他の態様では、微小気泡は、第１の気体として、または第２の気体として、または第１および第２の気体のそれぞれとして、約1:10〜約10:1の比率で、気体状のパーフルオロブタンおよびパーフルオロヘキサンを含有する。代替的に、微小気泡は、第１の気体として、または第２の気体として、または第１および第２の気体のそれぞれとして、気体状のパーフルオロブタンおよびパーフルオロペンタンを、約1:10〜約10:1の比率で含有する。第２の気体が、第１の気体より遙かに遅く微小気泡から出て行くようにするのが有利であり、このために、第２の気体が、25℃で１気圧において約0.5mM以下の水に対する溶解度を有し、第１の気体が、第２の気体の少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも20、50、100または200倍以上の水に対する溶解度を有するのが好適である。同様に、第１の気体に対する膜の透過性は、第２の気体に対する膜の透過性の少なくとも約５倍、好ましくは10、20、50または100倍以上であるのが好適である。
微小気泡調製物は、有利には容器内に内蔵させ、微小気泡と混合した容器内の液体を有するようにすることができる。この場合、容器は、十分な超音波エネルギーを液体に伝達して、超音波処理による微小気泡の形成を可能とする手段を更に含む。このようにして、容器内の滅菌した調製物に対して外部の供給源から超音波エネルギーを適用することにより、使用の直前に医師（または他の専門家）により微小気泡を形成させることができる。伝達のためのこの手段は、例えば、約0.5mm未満の厚さを有する可撓性の重合体材料（これは、膜を過熱することなく超音波エネルギーの容易な伝達を可能とする）とすることができる。この種の膜は、この種の重合体、例えば天然もしくは合成ゴムまたは他のエラストマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート等から調製することができる。
本発明の微小気泡調製物においては、気体を封入する膜は、好ましくは界面活性剤とする。界面活性剤の好適な種類の１つとしては、非ニュートン性の粘弾性界面活性剤単独またはこれと他の界面活性剤との組み合わせを含む。他の好適な一般的および特殊な範疇の界面活性剤には、炭水化物、例えば多糖類、炭水化物誘導体、例えばショ糖のような糖の脂肪酸エステル（好ましくはショ糖ステアリン酸エステル）、およびアルブミンを含む蛋白質性界面活性剤が含まれる。代替的に、微小気泡の膜は流体（例えば界面活性剤）である必要はなく、これに代えて固体または半固体、例えば、硬化、増粘または変性させた蛋白質性材料（例えばアルブミン）、炭水化物等とすることができる。
本発明の１つの有利な形態は、好ましくは使用する場所で、微小気泡を調製するのに使用するためのキットである。このキットは、封止した容器（例えば、皮下注射器を使用して微小気泡を容易に取り出すための隔壁シールを備えたバイアル）、容器内の液体（例えば、水、または緩衝作用を付した等張の滅菌した水性媒体）、容器内の界面活性剤、および容器内のフルオロカーボン気体（フルオロカーボン蒸気を含む）を含むことができ、液体、界面活性剤、およびフルオロカーボン気体または蒸気は、これにエネルギーが与えられた際に微小気泡を形成するよう互いに適合している。エネルギーは、有利には、手動または機械による単純な振盪エネルギー、撹拌もしくはホイップ、または超音波エネルギーとすることができる。キットは、好ましくは容器内に、前記容器内で微小気泡を形成するのに十分な外部超音波エネルギーを液体へ伝達できるようにするための手段を備える。前記したように、伝達のための手段は、１つの態様では、約0.5mm未満の厚さを有する可撓性の重合体膜を含む。１つの態様では、キットは、容器内に非フルオロカーボン気体を更に含み、この場合は非フルオロカーボン気体対フルオロカーボン気体のモル比は、約1:10〜約1000:1とする（ただし、非フルオロカーボン気体は水蒸気ではないものとする）。本発明の全てのキットにおいて、界面活性剤、１または複数の気体、およびキットの他の要素は、幾つかの態様において、微小気泡調製物自体について前記したものと、同一のものであってもよい。
他の態様では、キットは、容器と、容器内の乾燥させた液体可溶性空隙含有構造体と、空隙内の気体と、界面活性剤とを含み、空隙含有構造体は、約100μｍ未満の平均直径を有する多数の空隙を画成し、空隙含有構造体、気体、および界面活性剤は、空隙含有構造体を溶解しうる液体を容器に添加した際に、微小気泡を形成するよう互いに適合している。このような空隙含有構造体は、少なくとも一部は、界面活性剤により、例えば空隙形成材料の凍結乾燥によって、または噴霧乾燥（spray drying）によって作製することができ、または他のいずれかの液体可溶性（好ましくは水溶性）膜形成材料、例えばアルブミン、酵素または他の蛋白質、単純もしくは複合炭水化物または多糖類等から形成することができる。キットで使用する界面活性剤は、有利には、微小気泡調製物自体に関連して前記したものとすることができる。
本発明は更に、微小気泡を形成する方法であって、第１の気体と、第２の気体と、膜形成材料と、液体とを用意し、第１の気体と第２の気体とを、約1:100〜約1,000:1のモル比で存在させ、ｘを37℃での第２の気体の蒸気圧としたときに、第１の気体が、37℃で少なくとも約（760−ｘ）mmHgの蒸気圧を有し、第１および第２の気体のそれぞれの蒸気圧が、37℃で約75mmHgを超えるものとし（ただし、第１の気体および第２の気体は、水蒸気ではないものとする）、膜形成材料により第１および第２の気体を囲繞して液体中で微小気泡を形成する工程を含む方法を含む。膜形成材料および気体は、前記したようなものとすることができる。好ましくはこの方法は、第１の平均直径を有する微小気泡を最初に形成し、微小気泡中の第１の気体対第２の気体の最初の比率を少なくとも約1:1とし、第１の平均直径を有する微小気泡を液体媒体と接触させ、第１の気体が膜を通って失われる結果として微小気泡を媒体中で収縮させた後、少なくとも１分間、第１の直径の約75％未満の第２の平均直径で微小気泡を安定化させる工程を更に含む。好ましくは、媒体中に溶解した１または複数の気体の張力が、微小気泡内部の同じ１または複数の気体の圧力以上となるよう、膜の両側にまたがる気体浸透圧の差を設けることにより、微小気泡を第２の直径で安定化させる。１つの態様では、第１の直径は、少なくとも約５μｍとする。
更に本発明は、微小気泡を形成する方法であって、乾燥させた液体可溶性の空隙含有構造体であって、約100μｍ未満の直径を有する多数の空隙を画成する空隙含有構造体を設け、空隙内に気体を存在させ、界面活性剤を存在させ、空隙含有構造体と、気体と、界面活性剤と、空隙含有構造体を溶解しうる液体とを互いに組み合わせ、空隙含有構造体を液体に溶解させ、これにより封入体中の気体が、界面活性剤によって囲繞された微小気泡を形成する工程を含む方法を包含する。キットについては、好適な空隙含有構造体は、蛋白質、界面活性剤、炭水化物、または前記した他の材料のいずれかにより形成される。
本発明の他の観点は、増加したバイアル内安定性を有する微小気泡を製造する方法であって、生体適合性の材料の液体処方物を噴霧乾燥し、これから中空の微小球体を生成し、第１の気体と混合した気体浸透圧剤（第２の気体）によって微小球体を透過させ、微小球体を気体混合物と共に容器内に保存した後、粉体に対して水相を添加し、この際に粉体が水相に溶解して液体界面活性剤膜内の気体混合物を捕捉して微小気泡を形成する工程を含む方法である。１つの態様では、微小球体は、約500,000を超える分子量、または約12未満のデキストロース等量値（dextrose equivalency value）を有する澱粉または澱粉誘導体を含む。１つの好適な澱粉誘導体は、ヒドロキシエチル澱粉である。好ましくは、気体浸透圧剤は、パーフルオロカーボンを含む。他の態様では、微小球体は、親水性−親油性バランス（hydrophilic−lipophilic balance）が約８未満の成分を有する糖エステルを含む。好ましくは、糖エステルはショ糖トリステアレートとする。
更に本発明は、微小気泡を形成する方法であって、気体浸透圧剤透過型の界面活性剤粉体を用意し、粉体と水相とを組み合わせる工程を含む方法を含む。
本発明の更に他の観点は、微小気泡の生体内での半減期を増加させる方法であって、処方物を透過する気体浸透圧剤と組み合わせた噴霧乾燥した処方物を用意し、処方物と水相とを組み合わせて、少なくとも約20秒の生体内での半減期を有する微小気泡を形成することを含む方法である。好適な態様では、噴霧乾燥した処方物は、澱粉または澱粉誘導体を含み、糖エステルはショ糖トリステアレートとする。
さらに本発明は、前記の多数の微小気泡を有する微小気泡調製物を含むコントラスト増強剤であって、磁気共鳴画像または超音波画像によって画像化することができ、また微小気泡前駆体組成物と液体を含むコントラスト増強剤である。
本発明の他の態様は、安定化された気体で満たされた微小気泡調製物であって、
容器と、
微小気泡を形成するための概して球形の膜内にある、１または複数の第１の気体と１または複数の第２の気体との、容器内の混合物とを含み、第１の気体と第２の気体とが、それぞれ約1:100〜約1000:1のモル比で存在し、ｘを37℃での第２の気体の蒸気圧としたときに、第１の気体が、37℃で少なくとも約（760−ｘ）mmHgの蒸気圧を有し、第１および第２の気体のそれぞれの蒸気圧が、37℃で約75mmHgを超える（ただし、第１の気体および第２の気体は、水蒸気ではないものとする）微小気泡調製物である。
好適な態様では、第２の気体はフルオロカーボンを含み、第１の気体は非フルオロカーボンとする。好ましくは、第１の気体は、窒素、酸素、二酸化炭素、またはこれらの混合物を含む。更に本発明は、前記した調製物であって、
微小気泡が液体媒体中にあって、第１の平均直径を有し、
微小気泡中の第１の気体対第２の気体の比率が少なくとも1:1であり、
微小気泡は、第１の気体が膜を通って失われる結果として、第１の直径の約75％未満の第２の平均直径へと媒体中で収縮した後、膜の両側にまたがる気体浸透圧の差の結果として、少なくとも約１分間第２の直径またはその近傍で安定化されて維持されるよう適合した調製物を含む。
有利には、媒体は水性とする。代替的な態様では、媒体は容器内にあるものとし、微小気泡は容器内で形成されたものとする。好ましくは、媒体は、生体内の血液とする。この好適な態様の他の観点では、液体媒体は、少なくとも約700mmHgの気体張力で溶解した１または複数の気体を含有し、第１の直径は少なくとも約５μｍとし、媒体に溶解した１または複数の気体の張力は、微小気泡内部の同じ１または複数の気体の圧力より小さいものとする。好ましくは、第１の直径は少なくとも約10μｍとし、第２の直径は、約１μｍ〜約６μｍとする。この態様の更なる観点では、第２の気体は、第１の気体の少なくとも約４倍の平均分子量を有する。有利には、第２の気体は、37℃で約750mmHg未満の蒸気圧を有し、第１の気体対第２の気体のモル比は、約1:10〜約500:1とする。第２の気体は、好ましくはフルオロカーボンを含み、第１の気体は非フルオロカーボンとする。代替的に、第２の気体は、少なくとも２つのフルオロカーボンまたは１つのパーフルオロカーボンを含むものとし得る。他の代替的な態様では、第１の気体および第２の気体の両者がフルオロカーボンを含む。この態様の他の観点では、微小気泡は、第１の気体として、または第２の気体として、または第１および第２の気体のそれぞれとして、気体状のパーフルオロブタンおよびパーフルオロヘキサンを、約1:10〜約10:1の比率で含有する。この態様の更なる観点では、微小気泡は、第１の気体として、または第２の気体として、または第１および第２の気体のそれぞれとして、気体状のパーフルオロブタンおよびパーフルオロペンタンを、約1:10〜約10:1の比率で含有する。本発明の他の観点によれば、第２の気体は、25℃で１気圧において約0.5mM以下の水に対する溶解度を有し、第１の気体は、第２の気体より少なくとも10倍大きい水に対する溶解度を有する。好ましくは、第１の気体に対する膜の透過性は、第２の気体に対する膜の透過性より、少なくとも約５倍大きいのが好適である。本発明の他の観点によれば、調製物は、微小気泡と混合した液体を容器内に更に含み、容器は、超音波処理による微小気泡の形成を可能とするために、十分な超音波エネルギーを液体に伝達する手段を更に含む。有利には、伝達のための手段は、約0.5mm未満の厚さを有する可撓性の重合体材料から構成される。好ましくは、膜は界面活性剤とし、最も好ましくは、界面活性剤は、非ニュートン性の粘弾性界面活性剤または炭水化物界面活性剤を含む。炭水化物は、好ましくは多糖類とする。代替的な態様では、界面活性剤は、糖の脂肪酸エステルとし、好ましくは、これはショ糖ステアリン酸エステルとする。代替的な態様では、界面活性剤は蛋白質性のものとする。本発明の他の観点によれば、膜は固体または半固体とし、有利には、これは蛋白質性の材料とする。蛋白質性の材料は、好ましくはアルブミンとする。
本発明の他の観点によれば、微小気泡を調製する際に使用するためのキットであって、
容器と、
容器内の乾燥させた液体可溶性の空隙含有構造体であって、約100μｍ未満の平均直径を有する多数の空隙を画成する空隙含有構造体と、
空隙内の気体と、
界面活性剤とを含み、空隙含有構造体、気体、および界面活性剤は、空隙含有構造体を溶解しうる液体を容器に添加した際に、微小気泡を形成するよう互いに適合したキットが提供される。
好ましくは、空隙含有構造体は、少なくとも部分的に界面活性剤を含む。有利には、界面活性剤は、非ニュートン性の粘弾性界面活性剤とする。好ましくは、界面活性剤は、糖の脂肪酸エステルとし、最も好ましくは、これはショ糖ステアリン酸エステルとする。代替的に、空隙含有構造体は、蛋白質状のものとし、または炭水化物により形成するものとする。
【図面の簡単な説明】
図１は、微小気泡形成調製物を内蔵する２つの隔室を有するバイアルの斜視図であり、水溶液が上部の隔室、固体および気体状構成成分が下部の隔室に入っている。
図２は、図１のバイアルを示したものであるが、この場合は水溶液が固体構成成分と既に混合され、患者への投与のために微小気泡が形成されている。
図３は、微小気泡形成調製物を内蔵する倒立型の２つの隔室のバイアルの斜視図であり、水溶液が下部の隔室、固体および気体状構成成分が上部の隔室に入っている。
図４は、図３のバイアルを示したものであるが、この場合は水溶液と固体構成成分とが既に混合され、患者への投与のために微小気泡が形成されている。
発明の詳細な説明
本明細書および請求の範囲で使用するように、「蒸気」および「気体」という用語は、互換性があるものとして使用する。同様に、液体中の溶解した気体の張力に言及する場合は、より一般的な用語である「圧力」を、「張力」と互換性があるものとして使用することができる。「気体浸透圧」については以下により十分に定義するが、単に近似的には、微小気泡の膜が気体に対して透過性である場合は、微小気泡の内側の気体の分圧と、微小気泡の外側の（気相中の、または液相中に溶解した）当該気体の圧力または張力の差として考えることができる。更に正確には、これは膜の両側にまたがる気体拡散速度の差に関連する。「膜」という用語は、界面活性剤、他の膜形成液体、または膜形成固体もしくは半固体に拘わらず、微小気泡を囲繞または画成する材料に言及するために使用する。「微小気泡」は、約0.5〜300μｍの直径を有する、好ましくは約200、100または50μｍ以下の直径、更に血管内での使用のためには、好ましくは約10、８、７、６または５μｍ以下の直径を有する（微小気泡組成物の平均数の重量による（average number weighted）直径として測定したものとする）気泡と考えられる。「気体」に言及する場合は、分脈上他の定義が要求されない限り、互いに必要な性質を有する気体の混合物は、この定義に該当することが理解されよう。よって、ここでは、空気は典型的には「気体」と考えられる。
本発明は、生体内で延長された長い寿命を有し、超音波および磁気共鳴画像形成（MRI）のコントラスト増強剤として使用するのに適切な微小気泡を提供するものである。典型的な超音波コントラスト増強剤は、動脈系を約１周通過する間のみの、または数秒乃至約１分間のコントラスト増強能力を示し、このために、静脈内注射をした後に患者の体内で大動脈を通過して存在することはできない。これに対して、本発明によって調製されたコントラスト増強剤は、静脈内注射の後に、患者の循環系全体を複数周通過する間に測定されたコントラスト増強の寿命を示し続ける。数分の気泡寿命は容易に示される。超音波処理の際のコントラスト増強能力のこのような延長は極めて有利である。加えて、本発明のコントラスト増強剤は、優れた画像形成を与えるものであり、例えば、心臓、肝臓および腎臓を通って流れる血液の明確で鮮明で明瞭な画像が達成される。よって、少量で毒性のない投与量を末梢血管に投与し、体全体の画像を増強するのに使用することができる。
米国特許第5,315,997号に開示されているように、気体およびパーフルオロカーボン蒸気は、組織および血液とは実質的に異なる磁気感受性を有する。したがって、本発明の微小気泡は、MRIの際に組織および血液に存在する局所的な磁場の変化をもたらすであろう。このような変化は、MRI画像上で識別することができ、コントラスト剤の存在を検出するのに使用することができる。本発明の薬剤は、血液プール中でより長く存在し、したがって体のより大きい部分のより感度の高い走査を可能とし得るものである。
気泡は、静脈内での超音波コントラスト剤に使用するための最も効果的な超音波散乱体であることが示されているが、その主要な実用上の欠点は、懸濁物として毛細管を通過するのに必要な小さい（典型的には直径５ミクロン未満の）気泡の寿命が極めて短いことである。この短い寿命は、気泡の内部の増加した気体圧力により生ずるが、これは気泡に作用する表面張力に起因するものである。この上昇した内部圧力は、気泡の直径が減少するにつれて増加する。増加した内部気体圧力は、気泡の内側の気体が溶解するよう駆り立て、この結果気体が溶液中に駆逐されると共に気泡が崩壊する。ラプラスの式、ΔＰ＝２γ/r（式中、ΔＰは気泡の内部で増加した気体圧力であり、γは気泡膜の表面張力であり、ｒは気泡の半径である）は、周囲の気泡表面または膜によって気体気泡に加えられる圧力を示している。ラプラスの圧力は、気泡の半径に反比例するため、気泡が収縮するにつれて、ラプラスの圧力は増加し、気泡から出る気体の拡散速度および気泡の収縮速度が増加する。
驚くべきことに、ラプラスの圧力に対抗する気体浸透圧を及ぼすことのできる気体および気体蒸気混合物が、このような小さい直径の気泡の崩壊を大きく遅延させ得ることを見出した。一般に、本発明は一次調節剤気体（primary modifiergas）または気体混合物を使用するものであり、これは調節剤気体が外部媒体中に通常に存在する気体と交換するまで、気体浸透圧剤を希釈して、気体浸透圧剤の蒸気圧未満の分圧にするものである。１または複数の気体浸透圧剤は、一般に相対的に疎水性で相対的に気泡膜不透過性であり、相対的に低い蒸気圧において、75または100トルを超える気体浸透圧を発揮する能力を有する。
本発明の方法は、水溶液に溶解した実質的に膜不透過性の溶質（例えば、PEG、アルブミン、多糖類、澱粉）を含む透析バッグが、外側相の純水に露呈される際に観察される周知の浸透圧効果に関連するものである。バッグの内側の溶質はバッグの内側の水を希釈し、これにより、バッグ内へと拡散する純水（十分な濃度）の速度に対して、バッグ外へと拡散する水の速度は減少したものとなる。バッグの容積は、水の外側への拡散流速を増加させて純水の内側への流速を均衡させるバッグ内の上昇した内圧との平衡が確立されるまで、膨張する。この圧力の差が、溶液間の浸透圧である。
前記した系において、溶質がバッグ外へと徐々に拡散するにつれて、内圧は徐々に降下し、これにより内部溶質濃度が減少する。バッグを囲繞する溶液中に他の材料が溶解していれば、この圧力は更に減少し、これらがより有効であるか、またはより高い濃度であれば、バッグは収縮する。
選択されたパーフルオロカーボンで飽和した空気の気泡は、液体に溶解した空気に露呈された場合、パーフルオロカーボン蒸気によって及ぼされる気体浸透圧のために、収縮するより寧ろ膨張することが観察された。パーフルオロカーボンの蒸気は、気泡の膜に対して相対的に不透過性であり、このために気泡の内側に止まる。気泡の内側の空気はパーフルオロカーボンによって希釈され、気泡を出る空気拡散流速を遅延させるよう作用する。この気体浸透圧は、気泡膜の両側にまたがるパーフルオロカーボン蒸気の濃度勾配、気泡を囲繞する空気の濃度、並びに空気およびパーフルオロカーボンに対する気泡膜透過性の比率に比例する。
上で論じたように、ラプラスの圧力は気泡の半径に反比例するため、気泡が収縮するにつれて、ラプラスの圧力が増加し、気泡を出る気体の拡散速度および気泡の収縮速度が増加し、場合によっては、ラプラスの圧力と外圧とが組み合わされて、その分圧が液体浸透圧剤の蒸気圧に達するまで浸透圧剤を濃縮するために、気泡中の気体の凝縮および実質的な消滅が導かれる。
我々は、いずれかの単一の気体を含有する従来の微小気泡は、血液中で所定長さの時間だけ存在するが、その時間は、一義的には、動脈圧力、気泡の直径、気泡表面を通る気体の膜透過性、気泡表面の機械的強度、血液または血清中に通常に存在する気体の存在もしくは不存在またはその濃度、および気泡の表面に存在する表面張力（これは一義的には気泡の直径に依存するが、二義的には気泡表面を形成する界面活性剤の種類および濃度に依存する）に依存することを見出した。これらのパラメーターのそれぞれは相互に関連しており、これらは気泡において相互に作用し、気泡が血液中で持続する時間の長さを決定する。
本発明は、単一の気体または気体の組合せが、これらを同伴または捕捉する微小気泡の構造を安定化させるよう互いに作用し得ることを見出したことを含む。本質的に、本発明は、適宜通常の血液および血清中に通常に存在する１または複数の第１の気体（「一次調節剤気体」）と、気泡内の浸透圧を制御するよう作用する１以上の追加的な第２の気体（「１または複数の気体浸透圧剤」または「第２の気体」）とを組み合わせて利用するものである。気泡の浸透圧を制御する際に、気体浸透圧剤（ここでは実在する化学物質の単一または混合物として定義する）が、気泡内で圧力を及ぼし、収縮を防止するよう助成する。必要に応じて、調節剤気体は、通常は血液または血清中に存在しない気体とすることができる。ただし、調節剤気体は、血液または他の囲繞する液体中の気体が気泡内へと拡散する一方で、１または複数の気体浸透圧剤の蒸気圧未満の分圧で、１または複数の気体浸透圧剤を希釈して維持できるものでなければならない。水性媒体においては、水蒸気は、問題とする「気体」の１つとしては考慮されない。同様に、気泡が非水性液体媒体中にある場合は、その媒体の蒸気は、「気体」の１つとしては考慮されない。
我々は、例えば、気泡の表面を通過する際の低減した膜の透過性、または外部の連続相液相での低減した溶解度を有する気体浸透圧剤を添加することにより、これにより形成される気泡の寿命が劇的に増加することを見出した。この安定化の影響は、ある種の理論的な気泡の考察により更に容易に理解することができる。最初に、空気のみを含有する仮説的な微小気泡に対する動脈圧力および表面張力の効果を考えることにする。
最初に、空気のみを含有する仮説的な気泡を調製する。考察の目的のために、この気泡は、最初はラプラスの圧力を有さないものとみなす。一般に、標準温度および標準圧力（STP）で平衡化された場合、これは760トルの空気の内圧を有し、囲繞する流体の空気濃度は、同様に760トルで平衡化される（すなわち、流体は760トルの空気張力を有する）。このような気泡は、収縮することもなければ膨張することもない。
次に、前記の仮説的な気泡を動脈系に導入した場合、血液中での空気の分圧（または空気張力）（血液が空気で飽和された場合の空気圧力）は、同様に約760トルであり、更に動脈圧力（この考察の目的のために100トルとする）が存在する。この合計により860トルの気泡に対する外圧が生成され、内圧が860トルに増加するまで、気泡内の気体は圧縮される。このようにして、気泡の内側の空気圧力と気泡を囲繞する流体の空気張力との間に、100トルの差が生ずる。この圧力差により、その空気透過性の表面膜を介して空気が気泡を出て拡散し、平衡に達するようせめぎ合うにつれて、気泡は収縮する（すなわち、空気を喪失する）。気泡は消滅するまで収縮する。
次に、気泡の表面張力を追加することによる、仮説的な気泡に対する、付加的でより現実的な効果を考察する。気泡の表面張力は、気泡の内側の気体に及ぼされるラプラスの圧力を導く。気泡の内側の気体に及ぼされる合計圧力は、大気圧と、動脈圧力と、ラプラスの圧力との和を足し合わせることにより計算される。３μｍの気泡においては、十分に選択した界面活性剤を用いることにより、平方センチ当たり10ダインの表面張力が達成可能である。よって、仮説的な３μｍの気泡に及ぼされるラプラスの圧力は約100トルであり、これに加えて、100トルの動脈圧力も気泡に及ぼされる。したがって、ここでの仮説的な気泡においては、気泡の内側の気体に加えられる合計の外圧は960トルである。
気泡の内側の空気の圧力が960トルに上昇するまで気泡は圧縮される。よって、気泡の内側の空気と血液に溶解した空気との間に、200トルの濃度差が生ずる。したがって、気泡は、平衡に達しようとする結果、前記した場合よりも更に迅速に、急速に収縮して消滅する。
本発明が見出したことは、空気と気体浸透圧剤または第２の気体とを含有する第３の仮説的な微小気泡を考察することにより説明される。最初は動脈圧力を有さず、ラプラスの圧力も有さない、684トルの分圧の空気と、76トルの分圧の気体浸透圧剤としてのパーフルオロカーボン（「PFC」）とにより構成される、760トルの合計圧力を有する理論的な気泡を想定する。更に、パーフルオロカーボンは、適切な気体浸透圧剤として作用するのを可能とする１以上の特性、例えば限定された気泡膜透過性または外部液相での限定された溶解度を有するよう選択されることを想定する。684トルの気泡内の空気と、760トルの気泡の外側の空気張力（STPを想定する）との間に76トルの最初の気体浸透圧差が存在する。この76トルの最初の圧力差は、最初の気体浸透圧であり、これにより気泡は膨張する。澱粉溶液を含有する透析バッグ内に水が拡散してバッグを膨張させる場合と同様に、浸透圧差に動かされて、気泡の外側からの空気は、気泡内に拡散してこれを膨張させる。
この気体混合物が発揮することのできる最大の気体浸透圧は、PFCの分圧と、周囲の流体中の空気の透過性に対するPFCの透過性の比率とに関連する。理論的には、また実験的に観察されたところでは、系が、気泡内の空気の濃度（空気の分圧と等価である）と気泡を囲繞する空気の濃度（空気張力）との間の浸透平衡に達しようとするにつれて、気泡は際限なく成長する。
血液が760トルの溶解した空気の張力を有する100トルの動脈圧力に、仮説的な混合気体の気泡がさらされた場合、合計の外圧は、860トルに等しくなる（760トルの大気圧と100トルの動脈圧力）。気泡は動脈圧力の下で圧縮し、気泡の内圧は860トルに達することとなる。空気の分圧は774トルに増加し、PFC（第２の気体）の分圧は86トルに増加する。空気は、血液に溶解した空気との浸透平衡（すなわち760トル）に達するまで気泡から出て拡散し、PFCの分圧は100トルに増加する。PFCの分圧は、動脈圧力のために及ぼされる圧力を相殺するよう作用し、気泡の収縮は停止する。それぞれの場合において、PFCに対する気泡の透過性は無視し得るものとする。
100トルの表面張力またはラプラスの圧力の成分が付加されると（空気気泡について前記論じたのと同様）、合計で200トルの追加圧力が、気泡内の気体に加えられる。ここでも同様に、気泡は、気泡の内側の圧力が960トルに増加するまで（864の空気の分圧と96のPFCの分圧）圧縮される。空気は、760トルに達するまで（血液中に溶解した空気の濃度と平衡）気泡から拡散し、PFCの分圧は200トルに増加するが、ここでも同様に、PFCによって誘導される気体浸透圧が、ラプラスの圧力および動脈圧力によって及ぼされる圧力を相殺するように作用する。ここでも同様に、PFCに対する気泡の膜透過性は無視し得ると想定する。
同様に、気泡中の空気の分圧が周囲の液体の空気張力よりも低い場合は、PFCが流入する空気によって十分に希釈され、これにより内側の空気の圧力と気泡の外側の空気張力とが同一となるまで、気泡は実際に成長する。
よって、気体の組合せを使用することにより、気泡を有効に安定化させることができる。気体を適切に組み合わせると、循環血液中にある気泡の内部の気体に及ぼされるラプラスの圧力および動脈圧力の効果を相殺するのに利用できる所定の気体浸透圧差が、結果的に得られるためである。
本発明の微小気泡の特定の使用の例には、心臓、心筋組織の潅流画像形成、並びにストレスまたは運動テストの際の心臓およびその組織の潅流特性や、心筋梗塞による潅流欠陥もしくは変化の測定がある。同様に、組織への血液の流れを増加させるよう設計された薬剤の経口または静脈投与の後に、心筋組織を観察することができる。また、種々の処置、例えば冠状組織静脈移植、冠状血管形成、または血栓溶解剤（TPAまたはストレプトキナーゼ）の使用の際の、またはこれらに起因する心筋組織の変化の視覚化を増強することもできる。これらのコントラスト剤は、末梢血管を介して簡便に投与し、循環系全体の視覚化を増強することができるため、これらは、超音波による一般的な血管病理の診断、および胎盤組織の生存性をモニターする能力を助成することもできる。
ただし、このような原理は、超音波画像形成を超える用途を有することを強調しなければならない。実際、本発明は十分に広いものであって、非生物的な用途を含むあらゆる系における使用のために、気泡を安定化するための気体浸透圧の利用を包含するものである。
好適な態様では、本発明の微小気泡は、界面活性剤を基材とする気泡膜を有する。ただし、本発明の原理は、実質的にあらゆる種類の微小気泡を安定化するのに適用することができる。よって、前記したような種類の混合気体または蒸気は、アルブミンを基材とする気泡、多糖類を基材とする微小気泡、噴霧乾燥された微小球体から誘導された微小気泡等を安定化させることができる。調節剤気体が、外部媒体に通常存在する気体で交換されるまで、気体浸透圧剤の蒸気圧未満の分圧へと気体浸透圧剤を希釈し得る気体、好ましくは一次調節剤気体または気体の混合物の組合せを、選択された気泡内に捕捉することにより、この結果が達成される。１または複数の気体浸透圧剤は、一般に相対的に疎水性であり、相対的に気泡膜不透過性であり、更にまた、50、75または100トルを超える気体浸透圧を発揮する能力を有する。１つの好適な態様では、気体浸透圧剤の気体蒸気圧は、好ましくは37℃で約760トル未満、好ましくは約750、740、730、720、710または700トル未満であり、幾つかの態様では、約650、600、500または400トル未満である。好適な態様では、一次調節剤気体の蒸気圧は、37℃で少なくとも660トルであり、気体浸透圧剤の蒸気圧は、37℃で少なくとも100トルである。生体内での画像形成のためには、１〜10μｍの平均気泡直径が好適であり、３〜５μｍが最も好適である。１つの態様では、本発明は、微小気泡を形成するための、概して球形の膜内にある１または複数の第１の気体と１または複数の第２の気体との混合物としても記述され、この場合は第１の気体および第２の気体は、約1:100、1:75、1:50、1:30、1:20または1:10〜約1000:1、500:1、250:1、100:1.75:1または50:1の分子比でそれぞれ存在し、ｘを37℃での第２の気体の蒸気圧としたときに、第１の気体は少なくとも37℃で約（760−ｘ）mmHgの蒸気圧を有し、第１および第２の気体のそれぞれの蒸気圧は、37℃で約75または100mmHgを超える。
本発明の１つの好適な態様により調製された微小気泡は、更なる有利な性質を有することもできる。この種の態様の１つでは、非浸透圧気体と浸透圧安定化気体（または気体浸透圧剤）との混合物を使用し、製造の際およびその直後の、得られる気泡の寸法分布を安定化させる。気泡の形成に際し、より小さい気泡中のより高いラプラス圧力により、液相を介してより低いラプラス圧力のより大きい気泡への拡散が生起する。これにより、平均寸法分布が、５ミクロンの毛細管寸法限界を遙かに越えて増加する。これは不均化と呼ばれる。非浸透圧気体（例えば空気）の混合物を浸透圧蒸気（例えばC6F14）と共に使用すると、空気が気泡を出るためにより小さい気泡の容積は僅かに減少し、これにより浸透圧気体が濃縮されてその浸透圧が増加し、これにより更なる収縮が遅延され、一方、より大きな気泡は僅かに容積を増加させ、浸透圧気体が希釈され、更なる成長が遅延される。
血液に極めて溶解性の高い気体（例えば87.5容量％CO2）および浸透圧気体混合物（例えば28％C6F14蒸気＋72％空気）の混合物を使用する更なる利点は、注射すると、CO2の血液への喪失のために、これらの気泡は迅速に収縮するというものである。気泡は、CO2の喪失のために、注射の際に、87.5％の容積の減少を受ける。このCO2の喪失は、気泡直径の半減に相当する。よって、単純化した機械的手段を使用して大きい直径の気泡（例えば９μｍ）を調製し、これを注射の際に５ミクロン未満に収縮させることができる。一般に、このような気泡は、第２の気体に対して少なくとも1:1、好ましくは少なくとも3:2、2:1、3:1、4:1、5:1または10:1の比率で第１の気体が存在するものとして、最初に調製する。微小気泡の膜が、第２の気体に対するよりも、第１の気体に対してより透過性であれば（例えば、膜は、少なくとも約2:1、3:1、4:1、5:1、または10:1、好ましくはそれより高い、例えば20:1、40:1または100:1の比率で、気体に対するそれぞれの透過性を有する）、気泡は、有利には、その元の第１の直径から、その元の直径の75％以下の第２の平均直径へと極めて迅速に収縮する（例えば、１、２、４または５分以内）。その後、少なくとも１つの相対的に膜透過性の気体が、微小気泡を囲繞する水性媒体中に存在する場合は、気泡は、少なくとも約１分間、好ましくは２、３、４または５分間、好ましくは第２の直径またはその近傍で安定化される。１つの好適な態様では、気泡は、気体浸透圧差によって安定化され、約５または６μｍ〜１μｍの大きさで、少なくとも１、２、３、４または５分間維持される。外部液体中の気体張力は、好ましくは少なくとも約700mmHgとする。更に、相対的に膜不透過性の気体も微小気泡中にあるものとして、このような浸透圧差を生成させるものとする。
I.微小気泡の構成
A.膜形成液相
気泡が存する外側の連続液相は、典型的には界面活性剤または発泡剤を含む。本発明で使用するのに適切な界面活性剤には、相の間の界面で層を形成することにより、気泡膜の形成および維持を助成するあらゆる化合物または組成物が含まれる。発泡剤または界面活性剤は、単一の化合物、または共界面活性剤（co−surfactant）の場合のような化合物の任意の組合せを含み得る。
適切な界面活性剤または発泡剤の例には、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンのブロック共重合体、糖エステル、脂肪アルコール、脂肪族アミンオキシド、ヒアルロン酸脂肪族エステル、ヒアルロン酸脂肪族エステル塩、ドデシルポリ（エチレンオキシ）エタノール、ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、澱粉誘導体、ヒドロキシエチル澱粉脂肪酸エステル、市販の食品植物澱粉、デキストラン、デキストラン脂肪酸エステル、ソルビトール、ソルビトール脂肪酸エステル、ゼラチン、血清アルブミン、およびこれらの組合せが含まれる。特に好適な糖エステルには、８未満の親水性−親油性バランス（HLB）を有する成分を備えたものがあり、モノ−、ジ−、トリ−またはポリエステル化ショ糖、トレハロース、デキストロースおよびフルクトースが含まれ、ステアリン酸エステル、ベヘン酸エステル、パルミチン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ラウリン酸エステルおよびカプロン酸エステル（例えばショ糖トリステアレート）を生成するものとする。これらの糖エステルは、微小気泡の安定性を延長させるためである。本発明で使用するために企図する他の糖エステルには、不飽和脂肪酸でエステル化されたものが含まれ、オレイン酸エステル、リシノール酸エステル、リノール酸エステル、アラキドン酸エステル、パルミトール酸エステルおよびミリストール酸エステルを形成するものとする。HLBは、乳化剤および乳化される物質に対して選定された０〜40の数とする。HLBは、乳化挙動を示すものであり、分子の親水性部分と親油性部分との間のバランスに関連する（Rosen,M.,（1989）、「界面活性剤と界面現象」、第２版、John Wiley ＆ Sons,New York,pp.326−329）。
本発明では、好適な界面活性剤または発泡剤は、リン脂質、非イオン性界面活性剤、中性または陰イオン性界面活性剤、フッ素化界面活性剤（中性または陰イオン性とし得る）およびこの種の乳化剤または発泡剤の組合せよりなる群から選択する。
本発明で使用するのに適切な非イオン性界面活性剤には、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が含まれる。このような種類の化合物の例には、プルロニック（Pluronic）、例えばPluronic F−68がある。同様に企図するものには、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンステアレート、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリンポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセリンポリエチレングリコールリシノレエート、エトキシル化大豆ステロール、エトキシル化ヒマシ油、およびこれらの水素添加誘導体、並びにコレステロールがある。更に、８未満のHLBを備えた成分を有する非イオン性アルキルグルコシド、例えばツイーン（Tweens、商標名）、スパン（Spans、商標名）、およびブリッジ（Brijs、商標名）も、本発明の範囲内である。Spansは、ソルビタンテトラオレエート、ソルビタンテトラステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリパルミテート、ソルビタントリオレエートおよびソルビタンジステアレートを含む。Tweensは、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートを含む。Brijの系統は、もうひとつの有用な材料の範疇であり、ポリオキシエチレン10ステアリルエーテルを含む。陰イオン性界面活性剤、特に12〜24の炭素原子を有する脂肪酸（またはその塩）を使用することもできる。適切な陰イオン性界面活性剤の１つの例は、オレイン酸、またはその塩、オレイン酸ナトリウムである。
広い範囲の界面活性剤を使用できることが理解されよう。実際、微小気泡の形成を促進し得る実質的にあらゆる界面活性剤または発泡剤（なお開発されるものも含む）を本発明で使用することができる。与えられた用途のための最適な界面活性剤または発泡剤またはこれらの組合せは、過度の実験を要することなく、経験的な検討により決定することができる。結局、本発明の分野の当業者であれば、生体適合性またはその非ニュートン性挙動といった性質に基づいて、界面活性剤または発泡剤またはこれらの組合せを選択する筈である。
コントラスト剤の血中持続性は、気泡の表面張力に比例するラプラスの圧力に反比例する。したがって、表面張力が低下すれば、血中の持続性は増加する。溶液中で秩序ある構造（多層シートおよびロッド）を形成し、非ニュートン性の粘弾性表面張力を生成する界面活性剤が特に有用である。この種の界面活性剤には、糖を基材とする多くの界面活性剤、および蛋白質または糖蛋白質界面活性剤（ウシ、ヒトまたは他のものの肺の界面活性剤を含む）が含まれる。この種の界面活性剤の１つの好適な種類は、糖または他の炭水化物の頭部基と、炭化水素またはフルオロカーボンの尾部基とを有する。頭部基として作用し得る多数の糖が知られており、グルコース、ショ糖、マンノース、ラクトース、フラクトース、デキストロース、アルドース等が含まれる。尾部基は、好ましくは約２または４〜20または24の炭素原子を有し、例えば、エステル結合を介して糖に共有結合により結合した脂肪酸基（分岐または非分岐、飽和または不飽和）とすることができる。これらの界面活性剤を用いて製造した気泡の表面張力は、気泡の収縮によって表面が圧縮されるにつれて（例えば、気泡が収縮する場合）大きく減少し、気泡の表面積が増加するにつれて（例えば、気泡が成長する場合）増加する。この効果は不均化を遅延させ、これによりバイアル中で、および生体内で、狭い寸法分布と長い持続性を有する気泡が導かれる。非ニュートン性の粘弾性に随伴する性質を有する好適な界面活性剤混合物には、非イオン性界面活性剤または他の発泡性界面活性剤と、非ニュートン性粘弾性界面活性剤の１つ、例えば糖エステルの１つとの組合せ（例えば、２％のPluronic F−68プラス１％のショ糖ステアレート）が含まれる。多くの場合、非イオン性界面活性剤対非ニュートン性界面活性剤の比率は、約5:1〜約1:5とし、界面活性剤は互いに（非ニュートン性であるか、より従来のものであるかを問わない）、微小気泡形成液体混合物の0.5〜８％、更に好ましくは約１〜５％（w/v）を含むものとする。
典型的なラプラスの圧力に抗して小気泡の表面張力を低下させると、より効率的な気体浸透圧剤、例えば高分子量のパーフルオロカーボンを気体浸透圧剤として使用することが可能となる。従来の界面活性剤を用いた場合では、高分子量のPFCsは、高い気泡圧力では凝縮することとなろう。これらの効率的な界面活性剤を用いなければ、高い沸点で膜透過性のより少ないPFCs、例えばC6F14は極めて困難なものとなろう。
他の薬剤を水相に混和することもできる。この種の薬剤には、有利には、従来の粘度調節剤、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液または他の従来の生体適合性緩衝剤、またはpH調整剤、例えば酸または塩基、浸透圧剤（等張、高張または低張を与えるためのもの）が含まれ得る。好適な溶液は、約７のpHを有し、等張である。第１の大きさに迅速に収縮するよう意図して気泡中の第１の気体としてCO2を使用する場合は、塩基性のpHは、CO2を気泡から出る際に除去することにより迅速な収縮を促進し、水相での溶解したCO2の蓄積を防止することができる。
B.気相
本発明の主要な観点は、気相の選択にある。前記考察したように、本発明は、分圧の差を利用または生み出すと共に気体浸透圧を発生させる気体の組合せを使用することに立脚するものであり、これにより気泡を安定化させるものである。一次調節剤気体は、好ましくは空気または空気中に存在する気体とする。空気および／またはその画分は、通常の血液および血清中にも存在する。微小気泡を、血液とは異なる環境で使用すべき場合は、一次調節剤気体は、好ましくは外部媒体中に通常に存在する気体から選択する。他の評価基準は、一次調節剤気体が、気泡の内外に拡散する容易性である。典型的には、空気および／またはその画分は、従来の可撓性または剛性の気泡表面を介しても容易に透過可能である。これらの評価基準は、組み合わせることにより、必要に応じて、一次調節剤気体が気泡の内外へと迅速に拡散するのを可能とする。
外部媒体中に存在しない調節剤気体も使用することができる。ただし、この場合は、外部気体が本来の調節剤気体と置換するため、気泡は、（調節剤に対する外部気体の相対的な透過性および濃度に応じて）最初は膨張または収縮する。この過程の間に、気体浸透圧剤が凝縮されない場合は、気泡は安定なまま維持される。
気体浸透圧剤は、好ましくは調節剤より気泡の表面を介する透過性が小さい気体とする。また、この気体浸透圧剤は、血液および血清中でより溶解性が小さいことも好適である。したがって、ここで、気体浸透圧剤は、使用の温度で所望の浸透効果を与えるのに十分な分圧または蒸気圧を有する限り、室温または体温で気体とすることができ、または通常は体温で液体とすることができることが理解されよう。
よって、十分な蒸気圧、好ましくは体温で少なくとも約50〜100トル、または更に好ましくは少なくとも約150または200トルを有する限り、室温または体温で気体ではないフルオロカーボンまたは他の化合物を使用することができる。気体浸透圧剤が気体の混合物である場合は、関連する蒸気圧の尺度は、混合物の蒸気圧であり、必ずしも混合した気体浸透圧剤の個々の成分の蒸気圧ではないことを銘記すべきである。
パーフルオロカーボンを気泡内の浸透圧剤として使用する場合は、気泡内に存在する分圧および体温では、その特定のパーフルオロカーボンは凝縮しないことも重要である。一次調節剤気体および気体浸透圧剤の相対的な濃度に応じて、一次調節剤気体は迅速に気泡から出て行くことができ、これにより気泡は収縮し、二次気体浸透圧剤が濃縮される。このような収縮は、気体の浸透圧が、気泡に対する外圧（最大絶対動脈圧力）と気泡のラプラス圧力とを足したものから血液の空気張力または空気飽和張力（主として１気圧）を引いた圧力に等しくなるまで継続する。よって、37℃での得られる気体混合物の凝縮分圧は、浸透圧剤の前記考察した平衡分圧を超えるものでなければならない。
このような評価基準に合致する代表的なフルオロカーボン（微小気泡を安定化する能力の増加順）は、次の通りである。
0003559849.tif 000002
よって、８以下の炭素原子を有するPFC（37℃の蒸気圧が80mmHgを超える）が好適であることが理解されよう。ただし、ヘテロ原子等の付加により増加された揮発性を有するより大きい分子を構成できることも理解されよう。したがって、最適の１または複数の二次気体浸透圧剤の決定は大きさの制限を受けるものではなく、少なくとも動脈圧力とラプラスの圧力との和に等しい気体浸透圧を与えながら、体温でその蒸気相を保持するその能力に基づくものである。
適切な溶解性および蒸気圧の評価基準を有する幾つかの化合物の列挙を表Ｉに示す。
0003559849.tif 000003
当業者であれば、前記した溶解性および蒸気圧の両者の評価基準に合致しないが、本発明において適切に機能し得る他の化合物を容易に決定し得ることが理解されよう。寧ろ、ある種の化合物が、他の範疇における逸脱を補償し、優れた非溶解性または低い蒸気圧を与えるものであれば、その種の化合物は、溶解性または蒸気圧の好適な範囲外にあるものと考えられることが理解されよう。
医療的な使用のためには、気体、すなわち調節剤気体および気体浸透圧剤の両者は、生体適合性であるか、または生理的に有害ではないものとすべきことも銘記すべきである。最終的に、気相を含有する微小気泡は崩壊し、気相は、溶解した気体として、または凝縮した液体のサブミクロンの液滴として血液中へと放出される。気体は、主として肺の呼吸を介して、または呼吸と細網内皮系の他の代謝経路との組合せを介して、体から除去されることが理解されよう。
一次調節剤と二次気体との適切な気体の組合せは、過度の実験を行うことなく経験的に確認することができる。このような経験的な決定については、実施例で説明する。
効率的な界面活性剤、例えばウシ肺の界面活性剤を用いて、低い表面張力を有する大きい直径の気泡を生成した場合は、ラプラス圧力は極めて低くなる。パーフルオロオクチルブロミド（PFOB）飽和空気が気泡の内側にあり、空気または空気で殆ど飽和された（例えば、空気と平衡化した）液体に気泡を露呈した場合は、浸透圧は、ラプラス圧力より大きくなり、したがって気泡は成長する。小さい直径の気泡の場合は、ラプラス圧力はより高くなり、したがって気泡は収縮し崩壊する。この収縮は、低減した速度で、ラプラス圧力と気体浸透圧との間の差によって引き起こされるものである。低い表面張力の界面活性剤溶液、例えば、２％pluronic F−68プラス１％ショ糖ステアレート中で、気体または気体蒸気混合物を超音波処理することにより小さい直径の気泡を生成した場合は、顕微鏡により観察したものとしての試験管内での、および静脈注射の後のウサギ腎臓のドップラー超音波画像形成により観察したものとしての生体内での、気泡が持続する時間は、前記した気体浸透圧比較と相関していた。
ウサギ腎臓のドップラー実験（実施例III）では、純粋な空気の微小気泡の場合のコントラストの瞬間的な消失と比較して、気泡においてパーフルオロカーボン／空気混合物を用いた場合は、10分間までコントラストの増強が観察された。よって、これらのパーフルオロ化合物は、ラプラス圧力を殆ど相殺し、機能的な超音波微小気泡コントラスト剤を造成する気体浸透圧を及ぼすことができるものである。
驚くべきことに、PFCsの混合物、例えばC6F14蒸気（主要な気体浸透圧剤として）で飽和させたC4F10（調節剤気体および気体浸透圧剤の組合せとして）は、いずれかの成分単独の場合よりも、気泡をより長い時間安定化させ得ることを見出した。これは、C4F10が体温では気体であり（よって、調節剤気体および気体浸透圧剤の両者として作用することができる）、幾分低下した膜透過性を有し、これは体温ではC6F14に僅かしか溶解しないためである。この状況では、両剤の気体浸透圧が互いに加えられ、空気/C6F14のみの混合物の場合を越えて、増加した気泡の持続性が導かれる。より長い持続性の高分子量のC6F14成分の凝縮点を上昇させることが可能であり、より大きい最大気体浸透圧を及ぼすことができる。PFCsの他の混合物も同様に機能し得る。PFCsの好適な混合物は1:10〜10:1の比率を有し、パーフルオロブタン／パーフルオロヘキサンおよびパーフルオロブタン／パーフルオロペンタン等の混合物が含まれる。これらの好適なフルオロ化合物は、分岐または直鎖とすることができる。
前記考察したように、気体浸透圧剤と組み合わせた非浸透圧気体の混合物は、注射の前後で気泡の寸法分布を安定化させるよう作用することも見出した。気泡の生成に際し、小さい気泡中のより高いラプラス圧力により、液相を介してより低いラプラス圧力の大きい気泡へと拡散が起こる。これにより、平均寸法分布が、時間と共に５ミクロンの毛細管寸法限界を超えて増加する。これは不均化と呼ばれる。
しかしながら、調節剤気体の混合物（例えば空気または二酸化炭素）を気体浸透圧剤（例えばC6F14）と共に使用すると、気泡を出て行く調節剤気体の１つによる小さい気泡の容積の僅かな低減により、浸透圧気体が濃縮され、その浸透圧が増加し、よって更なる収縮が遅延される。一方、大きい気泡は容積が僅かに増加するが、浸透圧気体が希釈され、同様に更なる成長が遅延される。
極めて血液可溶性の気体（例えば75容量％〜87.5容量％のCO2）と浸透圧気体混合物（例えば28％のC6F14蒸気および72％の空気）との混合物を使用する更なる利点は、注射した場合に、血液中へのCO2の喪失のために、これらの気泡が迅速に収縮する点である。二酸化炭素は、その分解を触媒する特異的な血漿酵素のために、特に急速に出て行く。CO2の喪失による87.5％の容積の減少は、気泡直径の半減に相当する。よって、注射または塩基性もしくはアルカリ性pHの溶液に対する露呈の際に適切な大きさ（すなわち５ミクロン）に収縮し得る大きい直径の気泡を製造することができる。
よって、相対的に疎水性であり、相対的に低い膜透過性を有する気体の使用により、コントラスト粒子崩壊の速度を低減させることができることを見出した。よって、粒子の崩壊速度を低減させることにより、微小気泡の半減期が増加し、コントラスト増強能力が拡張される。
II.他の成分
本発明の微小気泡処方物に他の成分を含ませ得ることが理解されよう。例えば、浸透圧剤、安定化剤、キレート剤、緩衝剤、粘度調整剤、空気溶解度調節剤、塩、および糖を、最大の寿命およびコントラスト増強の有効性のために、微小気泡懸濁物に見事に調和させて添加することができる。滅菌性、等張性および生体適合性等を考慮して、注射可能な組成物に対するこの種の従来の添加物の使用を決定するものとなろう。この種の薬剤の使用は、当業者に理解されようし、薬剤の特定の量、比率および種類は、過度の実験を行うことなく、経験的に決定することができる。
III.本発明の微小気泡の形成
本発明に従う多様な微小気泡の調製方法がある。微小気泡の形成には、超音波処理が好適である。すなわち、超音波伝達隔壁を介するか、または超音波振動皮下注射針を備えた超音波プローブを用いて隔壁を貫通させるものである。ただし、気泡の形成のために、多様な他の技術が存在することが理解されよう。例えば、ベンチュリ管気体注入のような気体注入技術を使用することができる。
微小気泡を形成する他の方法には、Molecular Biosystems,Inc.によるヨーロッパ特許出願0,359,246号に記載されているようなアルブミンまたは他の蛋白質の超音波処理を介する微粒子微小球体の形成、米国特許第4,446,442号に記載されているようなテンシド（tensides）および粘度増加剤の使用、米国特許第4,684,479号に記載されているような脂質で被覆された非リポソーム性の微小気泡、米国特許第5,088,499号および第5,123,414号に記載されているような気体を捕捉したリポソーム、および米国特許第4,718,433号に記載されているような変性アルブミン微粒子微小球体の使用が含まれる。
前記したいずれの方法も、本発明の調節剤気体および気体浸透圧剤を同伴させるのに用いることができ、同様の成功を収めることができる。更に、生成された気泡の長い寿命の同様の増強が、本発明を使用することにより認められることが期待される。
超音波処理は、多数の様式で行うことができる。例えば、界面活性剤溶液とバイアルのヘッドスペース内の気体とを含有するバイアルを、薄い膜を介して超音波処理することができる。好ましくは、許容し得る伝達を得ると共に膜の加熱を最小とするために、膜は、約0.5または0.4mmの厚さ未満とし、更に好ましくは約0.3または更に0.2mmの厚さ未満、すなわち、材料中での超音波の波長よりも薄いものとする。膜は、ゴム、テフロン、マイラー（Mylar）、ウレタン、アルミニウム処理フィルムのような材料、または他の超音波透過性の合成または天然重合体フィルムまたはフィルム形成材料から作製することができる。超音波処理は、超音波プローブを用いて、または焦点を合わせた超音波「ビーム」を用いて、膜に接触させるか、またはこれを押圧することにより行うことができる。超音波プローブは使い捨てとすることができる。いずれの場合も、プローブは、膜に対して配置するか、またはこれを介して液体へと挿入することができる。超音波処理が一旦完了したならば、微小気泡溶液をバイアルから取り出し、患者に配送することができる。
超音波処理は、インクジェットプリンタと同様に、注射器に備えた低出力超音波振動吸引装置を用いて注射器内で行うこともできる。また、注射器またはバイアルを配置し、容器内の１地点にそのエネルギーを焦合する低出力超音波浴内で超音波処理することもできる。
微小気泡の他の種類の機械的な形成も考えられる。例えば、機械的高剪断バルブ（またはダブルシリンジニードル）および２つのシリンジまたはシリンジに備えたアスピレータ装置を用いて気泡を形成することができる。単純な振盪でも使用することができる。ここに記載する収縮気泡技術は、超音波処理による気泡よりエネルギーの投入が低い機械的に形成される気泡に特に適切である。このような気泡は、典型的には最終的に所望される生体適合性の画像形成剤より遙かに大きい直径を有するが、本発明に従って適切な大きさへと収縮するようにすることができる。
他の方法では、界面活性剤溶液に導入された、昇圧下の調節剤気体で過飽和した液体浸透圧剤エマルジョンを使用することにより、微小気泡を形成することができる。この製造方法は、ソーダ水を開ける場合と同様に作用し、圧力の開放の際に気体が発泡し、気泡が形成される。
他の方法では、シェービングクリームの発泡と同様にして気泡を形成することができ、この場合は、圧力が開放されると沸騰するパーフルオロブタン、フレオンまたは他の同様の材料を使用する。ただし、この方法では、水相の過熱および過飽和を防止するために、乳化した液体が十分に低い温度で沸騰するか、または多数の気泡核形成（nucleation）部位を含むことが肝要である。この過熱が起こると、所望の多数の小さい気泡（各液滴について１つ）ではなく、限定された数の核形成部位上で少数の大きい気泡が生成してしまう。
更に他の方法では、好ましくは水溶液中で、迅速に溶解または水和する、乾燥した空隙含有粒子または他の構造体（例えば、中空の球体またはハニカム構造体）、例えばアルブミン、超微細糖結晶、中空の噴霧乾燥糖、塩、中空の界面活性剤球体、乾燥した多孔質重合体球体、乾燥した多孔質ヒアルロン酸、または置換したヒアルロン酸球体、または更に市販の乾燥したラクトース微小球体を、気体浸透圧剤で安定化させることができる。
例えば、加熱した気体、例えば空気、二酸化炭素、窒素等の中へと界面活性剤溶液を霧化することにより、噴霧乾燥した界面活性剤溶液を処方し、乾燥した１〜10ミクロン以上の中空または多孔質の球体を得ることができ、ここに記載するように、これを浸透圧気体または所望の気体混合物で満たしたバイアルにパッケージする。気体は、球体の空隙へと拡散する。拡散は、圧力または真空サイクリングにより助成することができる。滅菌した溶液を用いて再構成すると、球体は迅速に溶解し、バイアル中には浸透圧気体で安定化された気泡が残る。更に、澱粉またはデキストリン、糖ポリエステルおよび／または膨張剤、例えば塩化メチレン、1,1,2−トリクロロトリフルオロエタン（フレオン113、EM Science,Gibbstown,NJ）またはパーフルオロヘキサンを含む場合は、生体内半減期が増加した微小気泡が得られる。微小気泡の形成に使用するのに特に好適な澱粉には、約500,000ダルトンを超える分子量を有するか、または約12未満のデキストロース等量（DE）を有するものが含まれる。DE値は、澱粉重合体加水分解の程度の定量的な尺度である。これは、デキストロースの基準100と比較した還元力の尺度である。DE値が高ければ高いほど、澱粉加水分解の程度は大きくなる。このような好適な澱粉には、食品工業で市販されている種類の食品等級の植物澱粉が含まれ、National Starch and Chemical Co.,（Bridgewater,NJ）により商標名Ｎ−LOKおよびCAPSULEとして販売されているもの、澱粉誘導体、例えばヒドロキシエチル澱粉（du Pont Pharmaceuticalsから商標名HETASTARCHおよびHESPANとして入手可能）（Ｍ−ヒドロキシエチル澱粉、味の素、東京、日本国）が含まれる。（十分に噴霧乾燥された短い鎖の澱粉は、微小気泡を製造するのに使用することができるが、約500,000未満の分子量のものは微小気泡を安定化させないため、好適ではないことを銘記すべきである。ただし、これらは、更なる安定化が必要でない用途では、本発明で使用することができる。）代替的に、微細な細孔構造を備えるものとして製造された界面活性剤およびバルク形成試薬の凍結乾燥ケーキを、滅菌した溶液を用いてバイアルに入れ、ヘッドスペースに浸透圧気体混合物を入れることができる。溶液を急速に凍結して微細な氷の結晶構造を形成することができ、したがって、凍結乾燥の際に微細な細孔（氷の結晶が除去された空隙）が形成される。
代替的に、あらゆる溶解性または可溶性の空隙形成構造体を使用することができる。この態様では、空隙形成材料が界面活性剤から作製されていないか、またはこれを含有していない場合は、構造体および所望の１または複数の気体と共に、界面活性剤および液体の両者を容器に供給する。これらの空隙は、再構成に際し、浸透圧気体を捕捉し、固体ケーキの溶解と共に、内部に１または複数の気体を有する微小気泡が形成される。
本発明の微小気泡調製物を作製するのに使用するために、キットを調製することができることが理解されよう。このようなキットは、微小気泡を形成するための前記した１または複数の気体、液体および界面活性剤を封入する容器を含むものとし得る。容器は、１つの隔室に、滅菌乾燥した成分の全て、および気体を含み、同じ容器の第２の隔室に滅菌した水性液体を含むことができる。適切な２つの隔室のバイアル容器は、例えば、Wheaton Glass Co.,（Millville,NJ）から、商標名WHEATON RS177FLWまたはＳ−1702FLとして入手可能である。この種の容器を図１〜４に示す。図１および２を参照すると、図示したWheaonの容器５は、水溶液25を内蔵し得る上部隔室20と、乾燥した構成成分35および所望の気体を内蔵し得る下部隔室30とを有する。上部隔室を環境から分離するストッパ10が設けられており、シール15は、噴霧乾燥した（粉体化した）中空の微小球体35および気体浸透圧剤を含む下部隔室30から上部隔室20を分離する。ストッパ10を押すと、相対的に非圧縮性の液体が加圧され、これによりシール15は、下部隔室30内へと下方に押される。これにより水溶液25が下部隔室30へと放出され、この結果粉体35が溶解し、捕捉された気体浸透圧剤を含有する安定化された微小気泡45が形成される。過剰の気体浸透圧剤40は、下部隔室30から上部隔室20へと放出される。この構成は使用者にとって便利であり、水溶液の厚い（0.5〜1.25インチ）層により隔室内シールを覆うことによって、少量の水不透過性気体浸透圧剤が下部隔室に封止されるという更なる予期しない利点を有し、更に粉体隔室内の圧力を約10％以上上昇させることなく、水溶液を下部隔室に導入することができるという利点を有する。よって、圧力ガス抜きを設ける必要はない。（対照的に、ガス抜きを用いることなく、針と注射器により単一隔室のバイアル中で溶質を従来のように再構成すると、結果的に微小気泡を崩壊させ得る相当な隔室内圧力が発生することとなり得る。）この方法による微小気泡の形成は、実施例XIIIに記載する。
代替的に、倒立させた２つの隔室のバイアルを、微小気泡の調製のために使用することができる。図３および４を参照すると、前記したものと同じバイアルが使用されているが、ストッパ50が、押圧された場合に内部シール15を押し出すように延長されている点が異なる。この微小気泡の調製方法では、噴霧乾燥した中空の微小球体35および気体浸透圧剤40は、上部隔室20に内蔵されている。水溶液25および気体浸透圧剤40は、下部隔室30に内蔵されている。ストッパ50を押すと、これがシール15を押し出し、気体浸透圧剤40の存在下で、噴霧乾燥した中空の微小球体と水溶液25とが混合される。微小気泡形成のこの方法に随伴する１つの利点は、水相を最初に入れて、オートクレーブまたは他の手段により滅菌した後に、噴霧乾燥した微小球体を入れることができるというものである。これにより、滅菌の前の水相での潜在的な微生物の生育が防止される。
１つの特定の２つの部分からなる隔室容器を説明したが、他の適切な装置が公知であり、市販されている。例えば、２つの区画のガラス注射器、例えばＢ−D HYPAK Liquid/Dry 5＋5mlデュアル・チャンバー予備充填シリンジシステム（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ、米国特許第4,613,326号に記載されている）を、噴霧乾燥粉体を再構成するために有利に使用することができる。この装置の利点には次のものが含まれる。
1.使用の便利性、
2.一方側の水溶液の隔室により水不溶性の気体浸透圧剤が封止され、極めて小さい面積のエラストマーにより他方側で針が封止される、
3.溶解していない固体が注射されないことを確実にするために、Monoject ＃305（Sherwood Medical,St.Louis,MO）のようなろ過針を、製造の際に注射器に固定することができる。
２つの隔室の注射器を使用して微小気泡を形成することは、実施例XIVに記載する。
当業者であれば、滅菌した様式で噴霧乾燥した粉体と水溶液とを組み合わせることのできる他の２つの隔室の再構成装置も、本発明の範囲内であることを理解することができる。このような装置では、製品の保存寿命を増加させるために、水不溶性の浸透圧気体と環境との間に水相を挟持することができれば、特に有利である。
代替的に、容器は、空隙形成材料および１または複数の気体を含むことができ、界面活性剤および液体を添加して微小気泡を形成させることができる。１つの態様では、界面活性剤は、容器内で他の材料と共に存在させることができ、これにより微小気泡を形成するためには、液体のみを添加すればよい。微小気泡を形成するのに必要な材料が、容器内に予め存在していない場合は、好ましくはキットの他の成分と速やかに組み合わせる作業を促進するよう適合した形態または容器に、キットの他の成分と共にこれをパッケージすることができる。
キットで使用する容器は、ここに随所に記載する種類のものとすることができる。１つの態様では、容器は、従来の隔壁封止バイアルとする。他の態様では、これは、容器の内容物への十分な気泡形成エネルギーの付与を指向または許容する手段を有する。この手段は、例えば、先に記載した薄いウェブまたはシートを含むものとすることができる。
本発明の種々の態様により驚くべき利点が提供される。噴霧乾燥した澱粉処方物は、特に澱粉の分子量が約500,000を超える場合に、微小気泡の延長されたバイアル内安定性を与える。８未満のHLBを有する成分を含有する糖の脂肪酸エステルを使用すると、大きく増加した生体内およびバイアル内安定性が与えられる。糖の脂肪酸エステル、例えばショ糖モノステアリン酸エステル、並びにブロック共重合体、例えばPluronic F−68（12を超えるHLBを有する）により、再水和された瞬間に粉体が気泡を形成することが可能となる。構造剤、例えば澱粉、澱粉誘導体またはデキストリンを用いた噴霧乾燥処方物により、対比し得る超音波処理処方物と比較して、界面活性剤の合計投与量が有意に低くなる。フルオロカーボン気体のための追加的なシールを与える水と共に２つの隔室のバイアルを使用すると、増加した保存寿命、およびより大きい使用の便利性が得られる。構造剤（例えば澱粉またはデキストリン）および糖ポリエステルを用いた噴霧乾燥処方物により、大きく増加した生体内半減期を有する微小気泡が得られる。
噴霧乾燥させる溶液に膨張剤を含有させると、より多数の中空の微小球体が形成されることにより、噴霧乾燥した粉体のグラム当たりでより大きい超音波信号が得られる。膨張剤は、噴霧乾燥機に入る溶液の霧化した液滴内で、このような液滴が、乾燥機内の熱い空気流と混合する際に、蒸気気泡処方物を凝集させる。適切な膨張剤は、乾燥中の液滴の上昇した温度（約100℃）で、気体または蒸気により霧化した液滴内の溶液を過飽和させるものである。適切な薬剤には次のものが含まれる。
1.室温で溶液を飽和させるのに使用する、水溶液に対して限定された混和性を有する溶解した低沸点（100℃未満）溶剤、例えば塩化メチレン、アセトンおよび二硫化炭素。
2.室温および上昇した圧力（例えば３バール）で溶液を飽和させるのに使用される気体、例えばCO2またはN2。その後、１気圧100℃でその気体により液滴を過飽和させる。
3.非混和性低沸点（100℃未満）液体のエマルジョン、例えばフルオン113、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロブタン、ペンタン、ブタン、FC−11、FC−11B1、FC−11B2、FC−12B2、FC−21、FC−21B1、FC−21B2、FC−31B1、FC−113A、FC−122、FC−123、FC−132、FC−133、FC−141、FC−141B、FC−142、FC−151、FC−152、FC−1112、FC−1121およびFC−1131。
膨張剤は、噴霧乾燥過程の際に実質的に蒸発し、このため最終噴霧乾燥粉体中では、痕跡量以上は存在しない。
界面活性剤および湿潤剤を微小球体の殻に含ませることにより、より低い濃度で界面活性剤を使用することができる。微小球体の殻が溶解すると、これは界面活性剤で飽和された水相の層とともに、その内部に形成された微小気泡を一時的に囲繞し、微小気泡表面への界面活性剤の付着を増強させる。よって、微小球体を含む噴霧乾燥した界面活性剤については、局所的に高い濃度の界面活性剤のみが必要であり、水相全体における高い界面活性剤濃度に対する必要性は除かれる。
本発明の微小気泡調製物は、いずれも、超音波により脊椎動物の部分の画像形成を行うためのコントラスト剤として、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳動物に投与することができる。好ましくは、脊椎動物はヒトとし、画像形成する部分は、脊椎動物の脈管構造とする。この態様では、少量の微小気泡（例えば、脊椎動物の体重を基準として0.1ml/Kg［2mg/Kg噴霧乾燥粉末］）を動物に血管内導入する。他の量の微小気泡、例えば約0.005ml/Kg〜約1.0ml/Kgも使用することができる。心臓、動脈、静脈および血液に富む器官、例えば肝臓、肺および腎臓の画像形成は、この技術を用いて超音波により画像形成することができる。
前記した説明は、以下の実施例を参照してより十分に理解されよう。ただし、このような実施例は、本発明を実施する好適な方法の例示であり、本発明の範囲、またはこれに添付した請求の範囲を限定するものではない。
実施例Ｉ
超音波による微小気泡の調製
界面活性剤として２％のPluronic F−68および１％のショ糖ステアレート、調節剤気体として空気、および気体浸透圧剤としてパーフルオロヘキサンを含有する等張の水相を超音波処理することにより、平均数の重量による５ミクロンの寸法を有する微小気泡を調製した。
この実験では、0.9％のNaCl、２％のPluronic F−68および１％のショ糖ステアレートを含有する1.3mlの滅菌水溶液を、2.0mlのバイアルに添加した。バイアルは、最初は空気を含有する0.7mlの残余のヘッドスペースを有していた。25℃でパーフルオロヘキサンの蒸気により飽和した空気（220トルのパーフルオロヘキサンと540トルの空気）を使用し、バイアルのヘッドスペースをフラッシュした。薄い0.22mmのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）の隔壁でバイアルを封止した。バイアルを水平にし、Sonics ＆ Materialsから入手可能な50ワットの超音波装置モデルVC50に取り付けた1/8インチ（3mm）の超音波プローブを隔壁に対して穏やかに押しつけた。この位置では、隔壁によってプローブと溶液とは分離されている。その後、プローブに出力を付与し、溶液を15秒間超音波処理し、Horiba LA−700レーザー光散乱粒子分析装置により測定したものとして、５ミクロンの平均数の重量による寸法を有する微細に分割された微小気泡の白色の溶液を形成した。
実施例II
微小気泡の試験管内での寸法の測定
実施例Ｉで調製した微小気泡の試験管内での寸法を、レーザー光散乱により測定した。気泡の検討は、微小気泡を、Horiba LA−700レーザー光散乱分析装置を通って循環する４％デキストロース水溶液（1:50）に希釈した状態で行った。微小気泡の平均の寸法は５ミクロンであったが、25分で寸法が倍になった。
興味あることに、気体浸透圧剤を使用することなく、実施例Ｉと同様の方法によって調製した微小気泡（空気でパーフルオロヘキサン／空気混合物を置換）は、11ミクロンの平均寸法を有しており、粒子分析装置では10秒間でバックグラウンドの読みのみを与えた。
実施例III
微小気泡の試験管内での寿命の測定
５メガヘルツのトランスデューサを備えたAccuson 128XP/5超音波画像形成装置を用いて観察下のウサギの耳の周辺静脈に、0.2mlの新たに形成した微小気泡を注射することにより、実施例Ｉに従って調製した微小気泡の寿命を測定した。数回の試験を行い、観察可能なコントラスト増強の時間および程度を測定しながら、心臓、下位大静脈／大動脈、および腎臓の画像を得た。結果を以下の表IIに示す。
0003559849.tif 000004
表IIIに、浸透圧気体を使用することなく、同じ様式で調製した微小気泡の比較を示す（空気のみを使用した）。注射の際に、右側の心室のみで散発的な反響が観察されたが、投与の直後に消滅したことに注意されたい。
0003559849.tif 000005
浸透圧剤を使用することにより、微小気泡を視覚化し得る時間の長さが劇的に増加した。
実施例IV
混合した浸透安定化微小気泡の調製
界面活性剤として２％のPluronic F−68および１％のショ糖ステアレート、および気体浸透圧剤としてパーフルオロヘキサンとパーフルオロブタンとの混合物を含有する等張の水相の超音波処理により、平均数の重量による５ミクロンの寸法を有する微小気泡を調製した。
この実験では、0.9％のNaClおよび２％のPluronic F−68を含有する1.3mlの滅菌水溶液を、2.0mlのバイアルに添加した。バイアルは、最初は空気を含有する0.7mlの残余のヘッドスペースを有していた。220トルのパーフルオロヘキサンおよび540トルのパーフルオロブタンの浸透圧気体混合物を使用し、薄い0.22mmのPTFE隔壁で封止する前に、ヘッドスペースをフラッシュした。バイアルを実施例Ｉと同様にして超音波処理し、Horiba LA−700レーザー光散乱粒子分析装置により測定したものとして、５ミクロンの平均粒子寸法を有する微細に分割された微小気泡の白色の溶液を形成した。この手順を更に２回繰り返した。１回目は純粋なパーフルオロブタンを用い、次は540トルの空気＋220トルのパーフルオロヘキサン混合物を用いた。ウサギの静脈注射後の超音波画像形成により、３つの調製物の全ての血管持続性を測定した。これを以下に示す。
1.5分  パーフルオロブタン
２分  パーフルオロヘキサン＋空気
３分  パーフルオロブタン＋パーフルオロヘキサン
パーフルオロカーボンの混合物は、薬剤単独のいずれよりも長く持続した。
実施例Ｖ
可溶性噴霧乾燥球体からの気体浸透圧安定化微小気泡の調製
界面活性剤溶液中で、空気パーフルオロヘキサン蒸気混合物で満たした中空の噴霧乾燥ラクトース球体を溶解することにより、気体浸透圧安定化微小気泡を調製した。
約100ミクロンの平均直径を有し、多数の10〜50ミクロンのキャビティを含む噴霧乾燥したラクトースの球体は、PHARMATOSE DCL−11の商標名によりDMV Internationalから取得した。90ミリグラムのラクトース球体を2.0mlのバイアルに入れた。５分間かけて合計12回、１気圧と1/2気圧との間でバイアル中で気体圧力を周期的に変えることにより、220トルのパーフルオロヘキサンと540トルの空気との混合物により多孔質球体を満たした。1.5mlの加温した溶液をバイアルに注入する前に、ラクトースの溶解を加速するために、0.9％の塩化ナトリウム、２％のPluronic−F68および１％のショ糖ステアレートを含有する界面活性剤溶液を約45℃で加温した。その後、このようにして調製した微小気泡をHoriba LA−700粒子分析装置に注入する前に、ラクトースを溶解させるために、約30秒間転倒させて、バイアルを穏やかに撹拌した。溶解の約１分後に、7.7ミクロンという容積重量による直径の中央値が測定された。これらの微小気泡の直径は殆ど一定に維持され、10分で7.1ミクロンという直径中央値に変化した。空気で満たしたラクトースを用いて実験を繰り返すと、粒子分析装置は、溶解の１分後にバックグラウンドの読みのみを示した。これにより、気体で満たしたキャビティ含有構造体の溶解によって、気体浸透圧安定化微小気泡を製造することができることが示される。
実施例VI
所望の寸法に収縮する大きい気泡の調製
界面活性剤として２％のPluronic F−68、希釈剤気体としてCO2、および気体浸透圧剤としてパーフルオロヘキサンを含有する等張の水相の超音波処理により、平均容積の重量による20ミクロンの寸法を有し、２ミクロンに収縮する微小気泡を調製した。
この実験では、0.9％のNaCl、２％のPluronic F−68および１％のショ糖ステアレートを含有する1.3mlの滅菌水溶液を、2.0mlのバイアルに添加した。バイアルは、最初は空気を含有する0.7mlの残余のヘッドスペースを有していた。CO2を用いて10の係数で希釈した25℃のパーフルオロヘキサンで飽和した空気の混合物（684トルのCO2＋54トルの空気＋22トルのパーフルオロヘキサン）を使用し、ヘッドスペースをフラッシュした。薄い0.22mmPTFEの隔壁によりバイアルを封止した。バイアルを実施例Ｉと同様にして超音波処理し、Horiba LA−700レーザー光散乱分析装置により測定したものとして、28ミクロンの平均粒子寸法を有する微細に分割された微小気泡の白色の溶液を形成した。Horibaの４％デキストロース＋0.25mM NaOH溶液中で、気泡の平均直径は、２〜４分で28ミクロンから５〜７ミクロンへと急速に収縮し、その後は相対的に一定に維持され、27分後に2.6ミクロンに達した。これは、水相への溶解により、CO2が微小気泡を出たためである。
実施例VII
パーフルオロヘプタン安定化微小気泡の試験管内実験
パーフルオロヘプタン飽和空気（75トル、及び685トルの空気を足したもの）を用いて、前記実施例Ｉと同様にして微小気泡を調製し、前記実施例IIと同様にして測定を行った。これらの微小気泡の平均数の重量による直径は、循環の１分後に7.6ミクロンであり、循環の８分後に2.2ミクロンであった。空気のみを含有する微小気泡が殆ど直ちに消滅したのと比較して、この持続性は、パーフルオロヘプタンの気体浸透圧安定化を示すものである。
実施例VIII
パーフルオロトリプロピルアミン安定化微小気泡の生体内実験
パーフルオロトリプロピルアミン飽和空気を用いて、前記実施例Ｉと同様にして微小気泡を調製し、前記実施例IIと同様にして測定を行った。これらの微小気泡の使用可能な血管持続性は2.5分と認められ、よってパーフルオロトリプロピルアミンの気体浸透圧安定化が示された。
実施例IX
非ニュートン性粘弾性界面活性剤−ショ糖ステアレートの効果
0.9％NaCl、界面活性剤として２％のPluronic F−68および２％のショ糖ステアレートを用い、パーフルオロプロパン飽和空気およびパーフルオロヘキサン飽和空気（ヘッドスペース中）を用いて、前記実施例Ｉと同様にして微小気泡を調製した。ショ糖ステアレートを除いた同じ界面活性剤溶液を用いて、これら２つの調製物を同様に調製した。４つの微小気泡調製物の全てを、前記実施例IIIと同様にして評価した。これらの微小気泡の使用可能な血管持続性を以下に示す。
＜２％Pluronic F−68＋２％ショ糖ステアレートの持続性＞
２分  パーフルオロプロパン
４分  パーフルオロヘキサン
＜２％Pluronic F−68のみの持続性＞
２分  パーフルオロプロパン
１分  パーフルオロヘキサン
前記したように、ショ糖ステアレートの非ニュートン性粘弾性特性により可能となった低減した表面張力により、揮発性の低いパーフルオロヘキサンの凝縮が防止され、より長い持続性を有するパーフルオロヘキサンの微小気泡の製造が可能となった。
実施例Ｘ
澱粉含有エマルジョンの噴霧乾燥
以下に示す溶液のそれぞれ１リットルを、注射のために、水を用いて調製した。溶液A:4.0％w/v N/Lok植物澱粉（National Starch and Chemical Co.,Bridgewater,NJ）および1.9％w/v塩化ナトリウム（Mallinckrodt、セントルイス、MO）を含有する。溶液B:2.0％Superonic F−68（Serva,Heidelberg、ドイツ）および2.0％w/v菱糖ショ糖ステアレートＳ−1670（三菱化成食品、東京、日本国）を含有する。溶液Ｂを高剪断ミキサーに添加し、氷浴で冷却した。40mlの1,1,2−トリクロロトリフルオロエチレン（フレオン113、EM Science,Gibbstown,NJ）の粗製懸濁物を、１リットルの溶液Ｂ中で作製した。ミクロ流動化装置（Microfluidizer,Microfluidics Corporation,Newton,MA、モデルＭ−110F）を使用し、10,000psi、５℃で５回通過させて、この懸濁物を乳化させた。得られたエマルジョンを溶液Ａに添加し、噴霧乾燥のために以下の処方物を製造した。
2.0％w/v N−Lok
1.0％w/v Superonic F−68
1.0％w/vショ糖ステアレートＳ−1670
0.95％w/v塩化ナトリウム
2.0％v/v 1,1,2−トリクロロトリフルオロエタン
その後、以下の設定を用いて、２つの流体アトマイザー（Niro Atomizer、コペンハーゲン、デンマーク）を備えたニロアトマイザーポータブル噴霧乾燥装置により、このエマルジョンを噴霧乾燥させた。
熱空気流速＝39.5CFM
入口空気温度＝235℃
出口空気温度＝10℃
アトマイザー空気流＝110リットル／時間
エマルジョン供給速度＝１リットル／時間
乾燥した中空の球状生成物は、約１μｍ〜約15μｍの直径を有し、この乾燥装置の標準品であるサイクロン分離器により回収した。粉体の画分（250mg）を秤量して10mlのチューブバイアルに入れ、13℃でパーフルオロヘキサン飽和窒素を散布し、封止した。窒素は、パーフルオロヘキサンを満たして13℃の水浴に浸漬した３つのガス洗浄ボトルを通過させることにより、パーフルオロヘキサンで飽和させた。
水が注入される際に圧力を開放するためのガス抜きとして18ゲージ針を挿入した後に、注射のために5mlの水を用いてバイアルを再構成した。頚動脈のドップラー超音波信号をモニターするよう装置を付けた約3kgのウサギに対して、1mlの得られた微小気泡懸濁物を静脈内注射した。システム６ドップラーフローモジュール（Triton Technology Inc.）に接続した10MHzのフローカフス（flowcuff,Triton Technology Inc.,San Diego,CA、モデルES−10−20）により、RFドップラー信号をLeCroy 9410オシロスコープ（LeCroy,Chestnut Ridge,NY）に送った。オシロスコープにより計算された信号の二乗平均（root mean square,RMS）電圧をコンピュータに送り、ピーク反響性信号強度および血液中の微小気泡の半減期を得るのに適合した曲線が得られた。コントラスト形成の前の信号は、0.1ボルトRMS未満であった。52.4秒の半減期で1.6ボルトRMSのピーク信号が観察され、これにより生体内で延長された半減期を有する血管内反響性微小気泡を生成する噴霧乾燥粉体の能力が示された。
実施例XI
ヒドロキシエチル澱粉を含有する微小気泡の製造
実施例Ｘと同様にして噴霧乾燥のためのエマルジョンを調製し、次の最終組成を与えるものとした。
2.0％w/v m−HESヒドロキシエチル澱粉（味の素、東京、日本国）
2.0％w/v塩化ナトリウム（Mallinckrodt）
1.74％リン酸ナトリウム、二塩基（Mallinckrodt）
0.26％w/vリン酸ナトリウム、一塩基（Mallinckrodt）
1.7％w/v Superonic F−68（Serva）
0.2％w/v菱糖ショ糖ステアレートＳ−1670（三菱化成食品）
0.1％w/v菱糖ショ糖ステアレートＳ−570（三菱化成食品）
4.0％w/v 1,1,2−トリクロロトリフルオロエタン（フレオン113,EM Science,Gibbstown,NJ）
以下のパラメーターを使用し、実施例Ｘと同様にしてこのエマルジョンを噴霧乾燥させた。
熱空気流速＝39.5CFM
入口空気温度＝220℃
出口空気温度＝105℃
アトマイザー空気流＝110リットル／時間
エマルジョン供給速度＝１リットル／時間
実施例Ｘと同様にして、400mgの噴霧乾燥した粉末を用いてサンプルバイアルを調製し、散布した。実施例Ｘと同様にして、注射のために5mlの水を用いて再構成し、ウサギに対して1.0mlを静脈内投与した後に、70.9秒の半減期で2.4ボルトRMSのピーク信号が観察された。これは、標準的な植物澱粉（実施例Ｘ）と比較して、より長く持続するより高い生体内信号を生成する、高分子量の誘導された注射可能等級の澱粉および糖ポリエステルの能力を示すものである。またこれは、最適の噴霧乾燥処方物が必要とする低い界面活性剤濃度、およびフレオン113のような噴霧乾燥膨張剤の使用を示すものである。
実施例XII
澱粉含有微小気泡の安定性
実施例Ｘに記載した噴霧乾燥した粉体を、記載したようにして再構成した。比較のために、実施例Ｉからの超音波処理した微小気泡を調製し、調製の２分以内、および調製の10分後に再度、光学顕微鏡により両者を調べた。超音波処理した生成物は、再構成した噴霧乾燥粉体（約３〜約15μｍ）より広い初期気泡直径分布（約１〜約30μｍ）を有することが見出された。10分後にバイアルを撹拌し、再度サンプルを取り、光学顕微鏡によって再度観察した。再構成した噴霧乾燥生成物が本質的に変化していなかったのに対し、超音波処理した微小気泡は、観察し得る微小気泡の殆ど全てが直径10μｍを超えるまで、不均化によって成長していた。この実験は、噴霧乾燥により製造した微小気泡の拡張されたバイアル内安定性、および試験管内安定性を増加させる澱粉の能力を示す。
実施例XIII
２つの隔室のバイアルを使用する微小気泡の形成
実施例XIIからの800mgの噴霧乾燥粉体を秤量し、20mlのWheaton RS−177FLW 2隔室バイアル（図１）の下部隔室に入れた。隔室間シールを挿入する前に、13℃で、パーフルオロヘキサン飽和窒素でバイアルをフラッシュした。注射のために、10mlの滅菌水で上部隔室を満たした。上部隔室ストッパを挿入し、上部隔室内の全ての空気の気泡を除去した。上部ストッパを押すと、隔室間シールは下部隔室へと押し下げられ、水が下部隔室へと流入し、粉体が再構成された（図２）。光学顕微鏡により示されたように、多数の安定な微小気泡が形成された。この手順は、この形態のパッケージの便利性を示し、水相を粉体に添加する際の圧力の蓄積を除去するためにガス抜きを設ける必要性が除かれることを示す。
実施例XIV
２つの隔室の注射器を使用する微小気泡の形成
実施例XIからの100mgの噴霧乾燥した粉体を秤量し、5ml＋5mlのHYPAK Liquid/Dryデュアルチャンバーシリンジ（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）に入れ、粉体（針側端部）隔室へと振盪させた。その後、隔室間シールをバイパス通路の真上に位置させた。その後、５μｍのフィルターを内蔵する針を注射器に固定した。その後、装置を真空室に配置し、真空室を排気し、13℃で気体浸透圧剤、パーフルオロヘキサン飽和窒素を用いて真空室を再充填することにより、粉体内蔵隔室を気体浸透圧剤で満たした。フィルター針により、粉体内蔵隔室の雰囲気の排気および再充填が可能である。その後、シール針カバーを針の上に載置した。その後、注射のために液体隔室を4mlの水で満たし、一時的なガス抜き（空気の気泡を全て除去するためにガラス注射器バレルとプランジャとの間に挿入したワイヤ）を使用してプランジャを着座させた。
再構成するために、針シールカバーを取り外し、粉体隔室の圧力の蓄積を除去した。その後、プランジャを押して、隔室間シールをバイパス位置へと押し進め、これにより隔室間シールの周りに水を流し、粉体内蔵隔室へと流入させた。全ての水が粉体隔室に入った時点で、プランジャの動きを止めた。注射器を撹拌して粉体を溶解させた。針側の端部を上にして注射器を保持し、プランジャを更に押圧することにより、過剰の気体およびあらゆる大きい気泡を排出させた。その後、プランジャを限界まで押すことにより、多数の安定化した微小気泡（光学顕微鏡によって観察される）を含有する溶液を注射器から排出させた。
前記した説明は、本発明の所定の好適な態様を詳細に示し、企図する最良の形態を記載するものである。しかしながら、前記説明が本文中において如何に詳細に示されようとも、本発明は多くの様式で実施することができるものであり、更に、本発明は、添付する請求の範囲およびそのあらゆる等価物によって解釈すべきものであることが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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