(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
因子XII a、因子XI a、因子VII aおよびカリクレインから選ばれた少なくとも１種の賦活化した凝固因子を含有するフィブリノーゲン濃厚物よりなる生体グルーを製造する方法において、次の工程；
ａ）ドナーから血漿を取得し；
ｂ）該血漿を接触相活性剤と接触させて前記の少なくとも１種の凝固因子を賦活化させ；
ｃ）得られる血漿の分別、低温沈澱または濃縮により生体グルーを取得し；しかも
ｄ）所望ならば、得られた生体グルーを凍結乾燥にかけることからなる、生体グルーの製造方法。
【請求項２】
前記の工程ｂ）において、少なくとも15単位/lのカリクレイン含量を有する血漿を提供するに十分な期間血漿を活性剤と接触させ、前記の単位は7.35のpH値を有するベロナール−酢酸ナトリウム緩衝剤溶液に入れたＤ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロ−アニリドの0.52mM溶液を37℃で１マイクロモル／分の初期割合で加水分解し得るカリクレインの量を表わす、請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
前記の活性剤は不溶性の固体活性剤である請求の範囲１又は２記載の方法。
【請求項４】
固体の活性剤はカオリン、ガラス、セライト、炭酸カルシウム、サンゴ、酸化亜鉛及び炭酸亜鉛よりなる群から選ばれる請求の範囲３記載の方法。
【請求項５】
前記の活性剤は固体の支持体上に不溶性化した可溶性の活性剤を包含する請求の範囲３及び４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
十分な接触時間後に、活性剤を分離し且つ除去する請求の範囲３〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）は10℃以下の温度で行なう請求の範囲１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
賦活化前に及び／又は賦活化中に血漿を受容するように意図した第１の容器と、賦活化後の血漿を受容するように意図した第２の容器と、第１の容器から第２の容器へ血漿を殺菌状態で移送する手段と、血漿と接触相活性剤との間の接触を行なう手段と、所望ならば第２の容器に採取した血漿が活性剤無含有であるように賦活化した血漿を活性剤から分離する手段とを包含してなる、請求の範囲１〜７の何れかに記載の方法を実施する装置。
【請求項９】
前記の接触手段は活性剤を収容した管体よりなり、前記の移送手段は一方では第１の容器の出口開孔を接触手段の管体の一端に接続する管材と他方では第２の容器の入口開孔を接触手段の管体の他端に接続する管材とを包含してなり、こうして血漿が第１の容器と第２の容器との間で循環している時は血漿は接触手段の管体中で活性剤と接触しているものである、請求の範囲８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
本発明はカルシウムイオンの単なる添加により凝固することができる生物学的な接着剤（biologique colle:生体グルー）の製造方法に関する。
フィブリノーゲン及び因子XIIIを特に含有するタンパク質濃厚物は、トロンビンの添加により凝固してフィブリン網状組織を形成できしかも接着剤として使用されることは既知である。更に詳しく言えば、トロンビンの作用下では、フィブリノーゲンはフィブリンモノマーに転化される。フィブリンモノマーは集成してフィブリンポリマーとなる。トロンビンによって賦活化される因子XIIIの作用下では、カルシウムイオンの存在でフィブリン連鎖は架橋する。即ち、トロンビンを添加し、続いて得られる混合物を施用すると、血液凝固の最終段階を模倣するメカニズムにより、結合すべき部分状にフィブリンが形成されることによって凝固を生起する。フィブリノーゲン濃厚物は凝固により、止血作用を生じながら生体組織を接合でき且つ接合し続ける結合剤を成す：例えばフランス特許FR−2448900号参照。かゝる結合剤は普通「生物学的な接着剤（biological glue）」又は「フィブリン  グルー（接着剤）またはフィブリンシーラント」と呼ばれ、しかも外科分野で用いられ、特に出血の予防又は停止に、縫合糸の代用又は補強に、移植片を適所に保持し、例えば皮膚移植片を保持し、例えば肺又は胃腸管の外科手術で切除を受けた組織を結合させあるいは補綴部材を接着する等に用いられる。
生物学的な接着剤を用いる時には、ヒト又は動物の血漿混合物から調製したトロンビンを利用するのが都合良い。相同性の生成物即ち供与者と受容者とが相異なるヒト起源の生成物は、供与者からの病原体により受容者が汚染される危険を呈する。この危険は供与者の選定及び供与者における病原体マーカーの存在調査によりあるいは調製した生成物の毒性を破壊又は低減させる物理的／化学的処理によって減少させ得る。然しながら、相同性の生成物が無害であるという確実性もない。
動物組織から調製した生成物は、またヒトに感染し得る病原体の存在に関連する危険を呈し且つまた免疫の危険従ってアナフィラキシー反応の危険も呈する。
前記の危険は、オートローガス生成物即ち将来の受容者からのみ採取して調製した生成物を専ら用いるならば回避されるものである。
フィブリノーゲン基質の接着剤の製造に関する如く、オートローガス（自家）輸血の原理は既知であり、広く行われている。然しながら、言わゆる「オートローガス」接着剤は、フィブリノーゲン溶液に関する限りは真にオートローガスであるに過ぎない。実際上、トロンビン溶液は相同性の又は異種の血漿から得られるがオートローガスの血漿からでない：特にCederholm−Williams,Lancet 344,336〜337（1994）参照。
PCT特許出願公開WO94/07548号には、再石灰化した（recalcified）グルーにカオリンの如き血液凝固接触相活性剤を添加することによりトロンビンの添加なしに凝固し得る、血小板因子富化生体グルーが記載されている。然しながら、このPCT出願においては、生体グルーを用いる時点で接触相活性剤を配合しており、これは賦活化を不確実とさせ且つ困難とさせる。何故ならば、フィブリノーゲン濃厚物は取扱うのが難しい高度に粘稠な生成物であるからである。その結果として、凝固時間はコントロールするのが困難である。更には、凝固は賦活化時間と共に進行するので活性剤を賦活化したグルーから分離するのは困難である。
今般見出された処によれば、生物学的な接着剤（生体グルー）を用いる時点で接触相活性剤を添加することなくしかも知用前に又は使用時にトロンビン又はプロトロンビンを添加することなく、カルシウムイオンの単なる添加により凝固し得る生体グルーを得ることができる。また見出された処によれば、凝固因子含有フィブリノーゲン濃厚物を得る前にしかも生体グルーの製造中に凝固を見出すことなく、生体グルーを製造するのに用いた血漿を予備賦活化する（preactivate）ことができる。
特に、プレカリクレインを部分的に賦活化してカリクレインとさせるのに十分な期間凝血接触相活性剤で血漿を予備賦活化するのが必要であるに過ぎず、しかもかくして処理した血漿から比較的迅速に凝固し得る生体グルーを、簡単な再石灰化によりトロンビンの添加なしに自発的な凝固なしに得ることができることを見出した。
米国特許第4,427,650号はフィブリノーゲンとトロンビン及び／又はプロトロンビンとの混合物を含有する粉末の形でフィブリングルーを記載している。この種のグルーは賦活化を受けず、従ってカルシウムイオンに依存しない賦活化凝固因子を含有しない。
PCT出願WO91/09641号はフィブリノーゲンと添加したトロンビンとを含有するフィブリングルーを記載している。このグルーはトロンビン活性が抑制されるような仕方で調製される。１つの特定の具体例によると、このグルーはカルシウムイオンを有しない。何故ならば使用時までカルシウムイオンを添加しないからである。然しながら、添加したトロンビンを含有するかゝるグルーはカルシウムイオンを添加せずとも約90秒後に自発的に凝固する。カルシウムイオンを添加した時は２秒後に凝固する。別の具体例では、トロンビン活性を阻害する5.5以下のpHにフィブリングルーを酸性化することによりグルーの凝固を遅延させ、しかもpHを増大させ得る手段を使用時に用いて阻害効果を無効にする。別の具体例によると、光によって失活される光感作性のトロンビン阻害剤をフィブリングルーに暗所で添加する。かゝるグルーはその具体例が何であろうとも、カルシウムイオンに非依存性の賦活化凝固因子を含有しない。
これに反して本発明により得られた性グルーは安定なグルーであり、水溶液の形では明所中でさえ室温で自発的に凝固せず、しかもpH値を変えることなくカルシウムイオンの単なる添加により凝固し得る。生体グルーはカルシウムイオン非依存型の賦活化凝固因子を含有する。
本発明により得られた生物学的な接着剤（生体グルー）はフィブリノーゲンとその賦活化がカルシウムイオンに依存しない少なくとも１種の賦活化凝固因子とを含有する予備賦活化グルーである。該グルーは水溶液中で安定であり即ち水溶液は20℃の温度で少なくとも１時間は自発的に凝固せずしかも活性剤と接触せずともカルシウムイオンの単なる添加により５分以内に凝固し得る。
即ち、本発明により得られた生体グルーはトロンビン又はプロトロンビンの添加なしに凝固し得る。
このグルーは水溶液の形であり得る。このグルーは水溶液を使用時に再構成し得る凍結乾燥物の形でもあり得る。
血液凝固のメカニズムは本質的に知られている。初期の凝固賦活化メカニズムの１種は血漿を活性剤と接触させることにより試験管中で容易に再現できることは知られており、該活性剤はガラス又はカオリンの如き負に荷電した表面をもつ不溶性の固体であり得るか又は溶解した状態での可溶性の活性剤であり得る。この初期賦活化は幾つかの血漿タンパク質同志の相互作用から生ずる：因子XII,因子XI,プレカリクレイン及び高分子量キニノーゲン（KHPM）；例えばWachtfogelらの血栓症の研究（Thrombosis Research）,72,1〜21（1993）参照。賦活化表面と接触すると、因子XIIの空間形状は変化する。次いで因子XIIはプレカリクレインをカリクレインに賦活化し得るようになり、この反応はKHPKにより増大される。かくして形成したカリクレインは因子XIIに作用し且つこれを賦活化因子XII（即ち因子XII a）に転化させる。因子XII aは因子XIを賦活化する特性がある。
因子XII、プレカリクレイン、KHPM及び因子XIを包含するこれらの反応は「接触系反応」と呼ばれ、包含される凝固因子は「接触系因子」又は「接触因子」と呼ばれる。
接触系反応が生起する凝固相は「接触相」と呼ばれる。
凝固を生起するメカニズムはまた次の過程を伴なう：カルシウムイオンの存在を必要とする、因子XI aによる因子IXの賦活化；カルシウムイオンの存在下に因子IX a,VIII a及びPF3（血小板因子３）により形成される複合体の作用下に因子Ｘの賦活化；カルシウムイオンの存在下に因子X a,V a及びPF3の複合体の作用下にプロトロンビンのトロンピンへの賦活化。トロンビンはフィブリノーゲンを言わゆる「可溶性」フィブリンに転化できしかもカルシウムイオンの存在下ではまた因子XIIIを賦活化し得る。賦活化因子XIIIは可溶性フィブリンを血餅が生成される不溶性フィブリンに転化できる。
外因性経路と呼ばれる別の凝固経路は組織状トロンボプラスチンの作用下に因子VIIの賦活化を伴なうことが知られている。活性化因子VIIは因子Ｘを賦活化でき且つまた因子IXを賦活化できる。また活性化因子XIIは因子VIIを賦活化できることは知られている。即ち、因子VIIの賦活化は接触相の賦活化から得られる。
本発明は特に、例えば原料血漿の接触系因子を部分的に賦活化することによりしかも何れの場合でも生体グルーを構成するフィブリノーゲン濃厚物を取得する前に、トロンビン又はプロトロンビンを添加せずともカルシウムイオンの単なる添加により迅速に凝固し得る生体グルーを最終的に得ることができるという事実の発見に基づくものである。初期段階で行なうかゝる部分的な賦活化は生体グルーを形成するフィブリノーゲン濃厚物を取得するのに行なう操作中に自発的な早過ぎる凝固を生起しないことが見出された。更に詳しく言えば、血漿が少なくとも15、特に少なくとも20カリクレイン単位/lを含有するに十分な量で且つ十分な時間血漿を賦活剤と接触させておくだけを必要とすることが見出された。かゝる予備賦活化した血漿で得られた生体グルーは、次いで賦活剤の添加なしに且つトロンビン又はプロトロンビンの添加なしに単なる再石灰化により５分以内に凝固し得るものである。
本明細書で用いたカリクレイン単位は次の如く定義される：カリクレイン単位は7.35のpHを有するベロナール−酢酸ナトリウム緩衝剤溶液に入れたＤ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドの0.52mM溶液を37℃で１マイクロモル／分の開始割合で加水分解し得る量である。
本発明により得られた生体グルーは、因子XII a、因子XI A、因子VII a及びカリクレインから選ばれしかもその賦活化がカルシウムイオンに依存しない少なくとも１種の賦活化した凝固因子を含有することを特に特徴とする。これらの賦活化因子は例えば次の方法により検出及び／又は検定できる：
因子XII a（「プレカリクレイン賦活剤」としても知られる）:European Pharmacopeia,（1994）Chapter V.2.1.11;
因子VII a:Morrisseyらの方法、Blood,Vol.81,pp.734〜744（1993）;Diagnostic Stago Ref.00281からのStaclot VII a−γTF市販調剤キットを特に用い得る；
0003559568.tif 000002
あるいはC.F.Scott及びR.W.Colmanの染色法,Proc.Natl.Acad.Sci.米国,Vol.89,pp11189〜11193（1992）；
カリクレイン：以下の実験部分参照。
室温での自発的な凝固が存在しないことによって証明される、本発明により得られた生体グルーの安定性が示す所によれば、実際上トロンビン無含有である。本発明により得られた生体グルーはまた、その低いフィブリノペプチドＡ含量によって証明される如く実際上フィブリン無含有である（一般に、本発明の方法後には、原料血漿に存在するフィブリノーゲンの0.5重量％以下がフィブリノペプチドＡを形成しながら分裂するものである；以下の実験部分参照）。他方、この生体グルーはその賦活化がカルシウムイオンに依存する凝固因子を非賦活化形で含有する。即ち生体グルーは特にプロトロンビンに加えて因子XIII,X,V及びPF3を含有する。一般に、生体グルーはまた賦活化因子VIIの不在下では、凝固に必要である因子VIII及びIXをも含有する。
従って本発明は、因子XII a、因子XI a、因子VII aおよびカリクレインから選ばれた少なくとも１種の賦活化した凝固因子を含有するフィブリノーゲン濃厚物よりなる生体グルーを製造する方法において、次の工程；
ａ）ドナーから血漿を取得し；
ｂ）該血漿を接触相活性剤と接触させて前記の少なくとも１種の凝固因子を賦活化させ；
ｃ）得られる血漿の分別、低温沈澱または濃縮により生体グルーを取得し；しかも
ｄ）所望ならば、得られた生体グルーを凍結乾燥にかけることからなる、生体グルーの製造方法に関する。
勿論、少なくとも15のカリクレイン単位の濃度を生成でき、又はより単純には本発明の生体グルー即ちカルシウムイオンの簡単な添加により５分以内に凝固することができる生体グルーを生成できる、活性剤施用量及び施用期間の条件は、１回で全部について決定できる。即ち方法に従う各回毎にカリクレインを定量することは必要ではない。
血漿を活性剤と接触させる工程は10℃以下の温度で行うのが好ましい。例えば１〜８℃の温度で操作し、特に約４℃で操作する。
活性剤（賦活剤）が不溶性である時は、所望ならば予備賦活化した血漿を活性剤から分離できる。この目的のため、十分な接触時間後に例えば濾過により活性剤を分離且つ除去する。プレカリクレインをカリクレインに少なくとも部分的に転化させるのを達成する十分な接触時間は活性剤の種類及び活性剤の量に応じて決まるのは明らかである。この接触時間は各々の場合に簡単な定常実験によって決定できる：例えば以下の実験部分参照。
カルシウムイオンを錯化させ得る薬剤は知られている。これらは例えばクエン酸ナトリウムの如きクエン酸塩又はEDTA塩（例えばEDTAナトリウム塩）の如きキレート化剤である。
原料血漿は、例えば約10-4M〜10-2Mの亜鉛イオン濃度を得るために可溶性の亜鉛塩例えば硫酸亜鉛又は酢酸亜鉛をも含有できる。亜鉛イオンは接触系反応促進剤として作用することは知られている。
不溶性の固体活性剤の場合には、血漿と活性剤との間の接触は適当な容器中で行うことができる。血漿を導入する前に又は後に活性剤を容器に装入する。活性剤は容器の内壁に接着させ得る。例えば、内壁を活性剤で被覆させ得る。活性剤が容器の内壁に接着しない時は、十分な接触時間後に活性剤と賦活化した血漿とを分離する工程を設けるのが都合良い。この目的のために例えば容器は、血漿を通送させしかも活性剤を保留するフィルターを内部又は外部に設けて、接触工程後に活性剤から賦活化した血漿を分離できる。
別の具体例によると、この接触法は活性剤含有カラム中で前記の血漿を循環することにより行なう。例えば、前記の血漿は出口開孔までカラム中で循環させることができ、前記の出口開孔は活性剤を保留するフィルターを設けてある。十分な接触時間後に、賦活化した血漿を次いで回収し、然るにフィルターは活性剤を保有している。
生体グルーの製造が例えば水及び低分子量成分を通過させるがタンパク質を保留する膜を用いて、血漿を濃縮することからなる工程を包含する時は、この濃縮工程中は血漿を活性剤と接触させておくことができる。活性剤が不溶性の固体であるならば、次いでこれを例えば濾過により濃縮した又は部分的に濃縮した血漿から分離しなければならない。
血液凝固接触相活性剤は周知である。これらは特にその表面が負に荷電した固体生成物例えばガラス、カオリン、セライト、酸化亜鉛、炭酸亜鉛等である。
デキストラン硫酸塩及びエラジン酸の如き可溶性活性剤もまた用い得る。
炭酸カルシウム（アラゴナイト又はカルサイト）の如き別の生成物も接触系を賦活化し得ることが見出された。即ち、例えばサンゴ粒子の形で本質的にアラゴナイト製の活性剤を用い得る。例えば、0.3〜2mmの粒度の粒子を用い得る。
炭酸カルシウムによる賦活化は血漿のカルシウム濃度をわずかに増大させるが、生体グルーを製造した時早過ぎる凝固を惹起するには十分ではないことが見出された。
共有結合又は親和力の如き伝統的な技術により固体支持上に固定した可溶性の活性剤も用い得る。可溶性の活性剤を固定したかゝる支持体は不溶性の活性剤と同等視されしかも不溶性の活性剤の様に用いる。
本発明の方法で用いた活性剤は顕著は割合（固体活性剤の場合）の凝固因子を保持すべきではなくまた抑制すべきではなく、該凝固因子の活性化はカルシウムイオンに応じて決まりしかも該凝固因子はフィブリンの生成とフィブリンの凝固とを生起する反応順序に必要である。この反応順序に必要な因子はプロトロンビンに加えて本質的に因子V,VIII,IX,X,PF3及びXIIIである。
実際上、適当な活性剤の選択は定常実験により容易に行うことができ；前述した定義の生体グルー即ちカルシウムイオンの簡単な添加により５分以内に凝固する安定な生体グルーを生成するならば活性剤は適当である。
凝固接触相の予備賦活化は血小板を殆んど賦活化せず；血小板の10％以下が賦活化されることを見出した。従って、血小板を含有しないか少数の血小板を含有する血漿あるいは血小板含有又は血小板富化血漿の何れかを原料として用い得る。
接触相を賦活化する時点で又は生体グルーの製造に伴なう操作中にプラスミノーゲンはプラスミンに有意な程には賦活化されないことが見出された。即ち、予期されることとは反対に、プラスミンのフィブリン分解活性による早過ぎる接着破壊の危険はない。
本願においては、用語「生体グルー」は、前述した必要な凝固因子を保持しながらフィブリノーゲンを濃縮するために血漿の分別又は濃縮によって得られた水溶液を表わし、しかも場合によってはアルブミンの如きタンパク質を生体グルーに過負荷させるのが望ましくない時は別の血漿タンパク質の少なくとも若干を除去することにより得られた溶液を表わす。血漿は２〜4g/Lのフィブリノーゲンと50〜60g/Lのアルブミンとを含有する。本発明により得られた生体グルーは例えば少なくとも10g/L、特に少なくとも30g/Lのフィブリノーゲンを含有できる。生体グルーは50g/L以下のアルブミン、特に35g/L以下、特に30g/L以下のアルブミンを含有するのが好ましい。
本発明により得られた生体グルーは粘度増大剤又は施着を肉眼で監視する着色剤の如き種々の添加した二次成分を含有できる。
本発明の方法において、生体グルーそれ自体を取得すること即ち凝固因子含有フィブリノーゲン濃厚物を取得することは、何れか既知の分別法によって成され、特にエタノール又はポリエチレングリコールの如き沈澱剤を用いて既知の方法による分別沈澱によって成される。勿論、各々の使用沈澱剤は必要な凝固因子がフィブリノーゲンとして同じフラクション中に存在するかを見るために前もって点検せねばならない。この目的のため、実際上得られたフィブリノーゲン濃厚物がカルシウムイオンの単なる添加により５分以内に凝固し得ることを点検する必要があり、これは定常実験を必要とするに過ぎない。
別の既知方法は低温沈澱物を調製することからなる。この目的のため、血漿を例えば−20℃以下の又はこれに等しい温度に凍結させ、次いで得られた凍結生成物を例えば０〜５℃の温度特に２〜４℃に解凍させる。これによって血漿液体と低温沈澱物と呼ばれる不溶性生成物を生じ、不溶性生成物はフィブリノーゲンと種々の凝固因子とから本質的になる。この低温沈澱物は遠心分離又は濾過により分離できる；例えばフランス特許FR−2,718,033号参照。
別の既知方法は、水及び低分子量成分を通過させるが然るにタンパク質を保留する膜を用いて血漿を濃縮することからなる。
本発明はまた活性剤が不溶性の固体である場合に前述の方法を実施する装置に関する。
これは限定されないが１つの具体例においては、この装置は、賦活化前及び／又は賦活化中の血漿を受容するのに意図した第１の容器と、賦活化後の血漿を受容するのに意図した第２の容器と、血漿を第１の容器から第２の容器へ殺菌状態で移送する手段と、血漿と接触相活性剤との間の接触を生起する手段と、所望ならば第２の容器に収集した血漿が活性剤無含有であるように活性剤から賦活化血漿を分離する手段とを包含することを主として特徴とする。
１つの特定の具体例によると、前記の接触手段は活性剤を収容した管体よりなり、前記の移送手段は、第１の容器における出口開孔を管体の端部の一方と接続する管材と、第２の容器の出口開孔を管体の別の端部に接続する管材とよりなり、こうして血漿が第１の容器と第２の容器との間で循環している時は血漿は活性剤と接触しているものである。
別の具体例によると、血漿と活性剤との間の接触を生起する手段で賦活化した血漿を活性剤から分離する手段は、活性剤を収容した区室よりなり、該区室は第１の容器内に定置してある。該区室は、血漿が第１の区室中にある限りは活性剤との接触を可能とし且つまた予備賦活化した血漿が第２の容器に進行する時に活性剤からの血漿の分離を可能とする液体透過性の壁面を有する。
別の具体例においては、血漿と活性剤との間の接触を生起する手段は、第１の容器内部に、例えば被覆層として活性剤を施用することにより活性剤を接着させた壁面を包含する。この場合には活性剤から賦活化血漿を分離するのに設けた手段は必要としない。
本発明はまた前述した生体グルーを用いる方法に関する。この方法は、トロンビンを添加することなくカルシウムイオン含有水溶液を生体グルーに添加することを特徴とする。次いで生体グルーは既知の様式で外科領域に又は処置すべき負傷部に施用できる。
カルシウムイオンは特に水溶液の形で例えば塩化カルシウム水溶液の形で生体グルーに添加される。添加したカルシウムイオンの量は得られた生成物が「遊離」カルシウムイオンを含有するに十分な量であり即ちカルシウムイオンは錯化剤によってキレート化されない。この操作は「再石灰化（recalcification）」と呼ばれる。遊離カルシウムイオンの量は生体グルーを十分に短時間で凝固させるに十分な量でなければならない。この量は簡単な定常試験により前もって決定できる。
本発明を次の実施例により例証する。
実施例１
原料として用いたクエン酸塩加血漿は全血を2200×ｇで６分間遠心分離することにより得られた血小板富化血漿である。この血漿はクエン酸ナトリウム（17mM）を含有する。
４℃に冷却した前記血漿の270ccに0.1M硫酸亜鉛溶液2ccを添加する。血漿は630〜1000μの粒度のサンゴ粒子10ccを含有するポリ塩化ビニル  カラム中で循環させる（INOTEB,ST−GONNERY、フランス）。カラムの寸法は次の通りである：直径:1.4cm;高さ:14cm。
カラムは竪形に設置し、その際その上部開孔は管材を介して、硫酸亜鉛を添加した血漿含有小袋に接続させながら設置する。該小袋はカラムの上方に定置してあり、血漿は重力流により循環する。カラムの下方端はサンゴ粒子を採取するフィルターを有する。この下端は管材により、予備賦活化血漿を採取する柔軟な小袋に接続してある。
全ての血漿がカラムを通過するのに要した時間は45分である。
血漿中のカリクレインは次の如く分析する:7.35のpHを有するベロナール−酢酸ナトリウム緩衝剤（Diagnostic Stago,Ref.360）の50μｌを微量滴定板の凹みに装入し、標準のカリクレイン溶液（Chromogenix,スウェーデン,Ref.820845）の50μｌあるいは分析すべき試料の50μｌの何れかを添加する。温度を37℃に昇温させ、次いで37℃に予熱した基質Ｓ−2302（Chromogenix,Ref.820340）の1.04mM溶液の100μｌを添加する。光学密度の変化は405nmで１分間測定し、カリクレイン活性はこの光学密度の変化を標準カリクレインで観察された変化と比較することにより推論した。
サンゴ粒子を通過させた後の血漿のカリクレイン含量は20単位/lである。
次いで血漿を−30℃に凍結させ次いで24時間＋４℃で包囲体中で解凍した。得られた血漿を遠心分離した（2000×ｇ）。遠心分離残渣即ち低温沈澱物を収集し、37℃に加熱した。
得られた生成物（低温沈澱物）の凝固時間は「ｒ＋ｋ」パラメーターを用いてトロンボエラストグラフィーにより決定する：例えばS.V.Mallet及びD.J.A.Cox,British Journal of Anaesthesia.69;307〜313（1992）参照。この目的のため、温度37℃の低温沈澱物175μＬをトロンボエラストグラフィータンク（Hellige）に装入した。37℃で、36mMの塩化カルシウム水溶液175μＬを添加した。該装置はトロンボエラストグラフィー曲線を自動的に記録する。「ｒ＋ｋ」パラメータはこの曲線から測定する。曲線を描写した記録紙は2mm/分の速度で移動するので、凝固時間（分）はmmで表わした「ｒ＋ｋ」長さの半分に等しい。
見出された凝固時間は２分である。
低温沈澱物は凍結により貯蔵でき、次いで使用直前に解凍できる。
前述の如く調製した低温沈澱物即ち形成したてのあるいは凍結し次いで解凍した低温沈澱物は20℃の温度で数時間安定であり、自発的な凝固は見出されなかった。
得られた低温沈澱物はまた凍結乾燥によって貯蔵できる。
実施例２
サンゴ粒子の代りに直径200〜300μのガラス球14g（Sigma,Ref.G.1277,L'Isle d'Abeau,フランス）を用いる以外は実施例１の如く方法を反復する。血漿がガラス球カラムを通過するに要した時間は30分である。ガラス球通過後の血漿カリクレイン含量は19単位/lである。
トロンボエラストグラフィーにより決定される低温沈澱物の凝固時間は３分である。
実施例３
サンゴ粒子の代りにカオリン粉末（Sigma,Ref.K7375）を用いる以外は実施例１と同様な方法を行なう。原料として血小板富化血漿（PRP）又は血小板貧化血漿（PPP）の何れかを用いて、種々の試験を行なう。
PRP血漿及びPPP血漿は以下に示した如く得られた。
PRPは採取した血液を2200×ｇで６分間遠心分離することにより得られた。
PPPは2500×ｇで15分間遠心分離することにより得られた。
PRPを原料として得られた低温沈澱物について、凝固時間は100±30秒（４回の試験手段）である。
PPPを原料として得られた低温沈澱物について、凝固時間は190±35秒（３回の試験手段）である。
実施例４
用いた方法は、血小板富化血漿の種々の試料について、実施例１に記載した方法と同様である。
結果を次の表に要約する。
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次の実験（試料４〜９）において、原料血漿中の血小板の個数もまた測定し、プラスミンは該方法の種々の工程で分析した。結果を表IIに要約した。
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（ａ），（ｂ）及び（ｃ）の意味は先の表Ｉで与えたのと同じである。
プラスミノーゲンは接触系の賦活化時間で又は低温沈澱物の製造中の何れかで有意な程にはプラスミンに賦活化されなかったことが見られる。
フィブリノペプチドＡ放出の研究
フィブリノーゲンはそのモノマー分子が３つの連鎖Ａα,Bβ及びγを有する二量体であることは知られている（このモノマーの総分子量は大体170,000である）。トロンビンの作用により、この分子は部分的に加水分解されてモノマー分子当り１個のfpA分子と１個のfpB分子との割合でフィブリノペプチドＡ（fpA）とフィブリノペプチドＢ（fpB）とを放出する。fpA及びfpBをもはや含有しない分子はフィブリンモノマーを構成し、該モノマーは水素結合によって互いに結合し次いで可溶性フィブリンを形成する。本発明の生体グルーは例えば商標名アサーラクロム（Asserachrom）（Stago社）分析キットを用いてfpA分析により示される如く実際上フィブリン無含有である。
生体グルーのフィブリノーゲン含量:50g/l（５つの製剤手段）。
FpA含量:365ng/ml（５つの製剤手段）。
血漿のfpA含量は大体０〜2.3ng/mlであり、標準血小板濃厚物のfpA含量は大体14ng/mlである（Bode及びMiller,Vox Sanguinis 51,192〜196,1986）。
pfAの分子量は大体1500であるので、加水分解されてfpAを放出するフィブリノーゲンの重量割合は大体0.08％であると容易に算出できる。これによって証明する所によれば本発明の生体グルーは実際上フィブリン無含有であり従って実際上トロンビン無含有である。
実施例５
活性剤との接触時間を変更させしかも賦活後に各回に血漿のカリクレイン含量を分析して、実施例１の如く方法を反復する。カリクレイン含量は活性剤の接触時間と共に増大することが見出されら。次いで各々の血漿を研究しながら低温沈澱物を調製し、次いで再石灰化後に得られた凝固時間を測定した。結果を添附の図面に要約し、該図面は賦活化後の対応の血漿のカリクレイン含量の関数として低温沈澱物の凝固時間を表わす。カリクレイン含量が約20IU/Lに少なくとも等しい時は凝固時間は５分以内であることが見られる。より実質的な賦活化（活性剤とのより長い接触時間による）は血漿のカリクレイン含量を増大させるが、凝固時間には影響しないものである。
【図１】
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