【手続補正書】
【提出日】平成27年7月31日(2015.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】腫瘍壊死因子受容体関連因子７を全身性エリテマトーデスのバイオマーカーとする用途、全身性エリテマトーデスを患う人を検出する方法およびキット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質バイオマーカー、検出方法および検出キットに関するものであり、特に、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus, SLE）のバイオマーカー、全身性エリテマトーデスを患う人を検出する方法およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、非常に複雑な自己免疫疾患であり、リウマチ病学（rheumatology）の医師にとってかなり治りにくい病気である。また、ＳＬＥは、狼瘡（lupus）とも称し、女性に好発する全身性自己免疫疾患で、免疫応答を起こして遍在する自己抗原（大部分は細胞核内の核酸およびその結合タンパク質である）に対して様々な自己抗体を生成する。ｄｓＤＮＡ抗体は、ＳＬＥに対し特異的である。ＳＬＥの臨床症状は、総括的で変わりやすく、臨床疾患経過（disease course）は、良くなったり悪くなったりを繰り返す。例えば、発疹、光敏感症、口腔潰瘍、関節炎、肋膜炎、心膜炎、糸球体腎炎、神経症状（痙攣）、溶血性貧血、白血球減少症、血小板減少症等が挙げられる。現在のＳＬＥの診断は、主に、臨床症状と異常試験に基づいて行われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】MORITA ET AL., “TRAF7 Sequesters c-Myb to the Cytoplasm by Stimulating Its Sumoylation”, Mol Biol Cell 16(11), November, 2005, pp. 5433-5444.
【非特許文献２】SCUDIERO ET AL., “Tumor Necrosis Factor (TNF) Receptor-associated Factor 7 Is Required for TNFa-induced Jun NH2-terminal Kinase Activation and Promotes Cell Death by Regulating Polyubiquitination and Lysosomal Degradation of c-FLIP protein,” J Biol Chem 287 (8), Feb. 17, 2012, pp. 6053-6061.
【非特許文献３】TSIKITIS ET AL., “Traf7, a MyoD1 transcriptional target, regulates nuclear factor-κB activity during myogenesis” EMBO Rep 11(12), Oct. 15, 2010, pp. 969-976.
【非特許文献４】Xu et al., “TRAF7 potentiates MEKK3-induced AP1 and CHOP Activation and induces apoptosis” Journal of Biological Chemistry 279(17), March 4, 2004, pp. 17278-17282.
【非特許文献５】YOSHIDA ET AL., “The Tumor Suppressor Cylindromatosis (CYLD) Acts as a Negative Regulator for Toll-like Receptor 2 Signaling via Negative Cross-talk with TRAF6 AND TRAF7. Journal of Biological Chemistry 280(49), Oct. 17, 2005, pp. 41111−41121.
【非特許文献６】ZOTTI ET AL., “TRAF7 Protein Promotes Lys-29-linked Polyubiquitination of IκB Kinase (IKKγ)/NF-κB Essential Modulator (NEMO) and p65/RelA Protein and Represses NF-κB Activation,” J Biol Chem 286(26), April 25, 2011, pp. 22924-22933.
【非特許文献７】Hildebrand JM, Yi Z, Buchta CM, Poovassery J, Stunz LL, Bishop GA: Roles of tumor necrosis factor receptor associated factor 3 (TRAF3) and TRAF5 in immune cell functions. Immunol Rev 2011, 244:55−74.
【非特許文献８】Gravallese EM, Galson DL, Goldring SR, Auron PE: The role of TNF-receptor family members and other TRAF-dependent receptors in bone resorption. Arthritis Res 2001, 3:6−12.
【非特許文献９】Oda S, Schroder M, Khan AR: Structural basis for targeting of human RNA helicase DDX3 by poxvirus protein K7. Structure 2009, 17:1528−1537.
【非特許文献１０】Wang D, Fang L, Li P, Sun L, Fan J, Zhang Q, Luo R, Liu X, Li K, Chen H, et al:The leader proteinase of foot-and-mouth disease virus negativelyregulates the type I interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase. J Virol 2011, 85:3758−3766.
【非特許文献１１】Namjou B, Choi CB, Harley IT, Alarcon-Riquelme ME, Kelly JA, Glenn SB,Ojwang JO, Adler A, Kim K, Gallant CJ, et al: Evaluation of TRAF6 in a large multiancestral lupus cohort. Arthritis Rheum 2012, 64:1960−1969.
【非特許文献１２】Netea MG, Wijmenga C, O’Neill LA: Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility. Nat Immunol 2012, 13:535−542.
【非特許文献１３】Muppidi JR, Tschopp J, Siegel RM: Life and death decisions: secondary complexes and lipid rafts in TNF receptor family signal transduction. Immunity 2004, 21:461−465.
【非特許文献１４】Twohig JP, Cuff SM, Yong AA, Wang EC: The role of tumor necrosis factor receptor superfamily members in mammalian brain development, function and homeostasis. Rev Neurosci 2011, 22:509−533.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＳＬＥの症状は多様であるため、初期段階の患者を診断するのは容易ではなく、その結果、病気を発見した時には腎臓等の臓器障害を伴っている可能性があり、重症の場合には、腎透析が必要となることもある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、患者がＳＬＥを患っているかどうかを検出するために、腫瘍壊死因子受容体関連因子７（ＴＲＡＦ７）を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のバイオマーカーとする用途を提供する。
本発明は、人がＳＬＥを患っているかどうかを確定するために、ＳＬＥを患う人を検出する方法を提供する。
【０００６】
本発明は、人がＳＬＥを患っているかどうかを検出するために、ＳＬＥを患う人を検出するキットをさらに提供する。
【０００７】
本発明の１つの実施形態において、本発明の腫瘍壊死因子受容体関連因子７（tumor necrosis factor receptor-associated factor 7, TRAF7）は、ＳＬＥのバイオマーカーとして使用される。
【０００８】
本発明の１つの実施形態において、本発明のＳＬＥを患う人を検出する方法は、以下のステップを含む。まず、ＳＬＥの疑いのある患者から血漿試料を採取する。そして、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率と正常な人の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率を比較して、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率が正常な人の血漿試料中の比率よりも高い場合、その患者は、ＳＬＥを患っている可能性がある。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率は、正常な人の１．３〜１．５倍である。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、上述した方法は、患者のＳＬＥ疾患が活動期であるかどうかを検出するために使用される。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、上述した方法は、患者のＳＬＥ疾患が腎障害を伴っている可能性があるかどうかを検出するために使用される。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、上述した方法は、さらに、タンパク質定量法を用いてＴＲＡＦ７の濃度を測定することを含む。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、タンパク質定量法は、酵素結合免疫吸着法（an enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）を含む。
【００１４】
本発明のＳＬＥを患う人を検出するキットは、ＴＲＡＦ７およびその抗体（anti-TRAF7 antibody）を含む。
【発明の効果】
【００１５】
以上のように、本発明は、ＴＲＡＦ７をＳＬＥのバイオマーカーとして使用し、そのバイオマーカーを応用して、ＳＬＥを患う人を検出する方法およびキットを提供する。その結果、ＳＬＥを患っている人の可能性を迅速かつ容易に測定し、ＳＬＥを患う患者の疾患経過や特定の臓器障害を伴っている可能性を理解することができ、それにより、病気をコントロールして治療のタイミングが遅れるのを防ぐことができる。
【００１６】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点をより分かり易くするため、図面と併せた幾つかの実施形態を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の１つの実施形態に係るＳＬＥを患う人を検出する方法を示す概略的フロー図である。
【図２】本発明の１つの実施形態におけるＳＬＥを患う人を検出する方法に係る正常な人とＳＬＥ患者の血漿試料中の総タンパク質の電気泳動図である。
【図３】本発明の別の実施形態に係るＳＬＥを患う人を検出する別の方法を示す概略的フロー図である。
【図４】本発明の別の実施形態におけるＳＬＥを患う人を検出する方法に係る正常な人とＳＬＥ患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度を示すバーチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
これまでＳＬＥを調べるためのバイオマーカーは、主に遺伝子レベルで検査されているが、発明者は、タンパク質の観点から研究を行い、ＴＲＡＦ７をＳＬＥのバイオマーカーとして使用することを初めて発見した。
【００１９】
特に、ＴＲＡＦ７は、腎障害を伴う活動期のＳＬＥのバイオマーカーとして使用される。以下、ＴＲＡＦ７を応用したＳＬＥを患う人を検出する方法について紹介する。
【００２０】
図１は、本発明の１つの実施形態に係るＳＬＥを患った人を検出する方法を示す概略的フロー図である。図２は、本発明の１つの実施形態におけるＳＬＥを患う人を検出する方法に係る正常な人とＳＬＥ患者（臨床的に腎障害を伴うと診断された患者）の血漿試料中の総タンパク質の電気泳動図である。図１を参照すると、本実施形態において、ＳＬＥを患う人を検出する方法は、ステップＳ１１０〜Ｓ１４０を含む。まず、ステップＳ１１０を実行し、ＳＬＥの疑いのある患者から血漿試料を採取する。本実施形態において、ＳＬＥ患者の血漿試料は、例えば、０．１ｍｌよりも少ない。
【００２１】
次に、ステップＳ１２０を実行し、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率を体外で測定する。本実施形態において、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率および正常な人の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率を体外で測定する方法は、例えば、タンパク質の電気泳動により血漿試料中のタンパク質を分析および分離する方法である。得られた電気泳動ゲルは、図２に示した通りであり、ＴＲＡＦ７のタンパク質バンドは「*」で示してある。しかしながら、血漿中のＴＲＡＦ７の存在を検出する方法は、タンパク質の同定または定量（quantification）に使用できるものであれば任意のタンパク質検出方法であってもよく、例えば、質量分析法（mass spectrometry）、ＥＬＩＳＡ法、他の周知のタンパク質分析技術がある。
【００２２】
そして、ステップＳ１３０を実行し、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率と正常な人の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率を比較する。詳しく説明すると、「総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率」は、総血漿タンパク質中のＴＲＡＦ７の相対変化量を示す。図２からわかるように、本実施形態において、ＳＬＥの疑いのある患者と正常な人の総血漿タンパク質中、患者のＴＲＡＦ７の量は、著しい増加がある。また、コンピュータイメージングソフトウェアをさらに使用して、ＴＲＡＦ７の濃度を分析する。本実施形態において、ＳＬＥ患者の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の平均比率は２．６％であり、正常な人の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の平均比率は１．９％である。したがって、本実施形態において、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率は、正常な人の１．４倍である。１つの実施形態において、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率は、正常な人の１．３〜１．５倍である。
【００２３】
そして、ステップＳ１４０を実行し、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率が正常な人の血漿試料中の比率よりも高い場合、その患者はＳＬＥを患っている可能性がある。１つの実施形態において、患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の比率が正常な人の１．３〜１．５倍である時、その患者がＳＬＥを患っていることを示し、さらに、患者のＳＬＥ疾患が活動期であることを示す。
【００２４】
図３は、本発明の別の実施形態に係るＳＬＥを患う人を検出する別の方法を示す概略的フロー図である。図４は、本発明の別の実施形態におけるＳＬＥを患う人を検出する別の方法に係る正常な人とＳＬＥ患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度を示すバーチャートである。本実施形態で説明する手順と前の実施形態で説明した手順の主な違いは、血漿中のＴＲＡＦ７の濃度を直接的に測定することである。詳しく説明すると、図３に示すように、まず、ステップＳ１１０を実行し、ＳＬＥの疑いのある患者から血漿試料を採取する。次に、ステップＳ１２０を実行し、ＴＲＡＦ７の標準試料から得られた濃度検量線（concentration calibration curve）を用いて、患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度を計算する。本実施形態において、タンパク質定量法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を用いて標準試料の濃度検量線を取得し、患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度を計算する。そして、ステップＳ１３０を実行し、患者と正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度を比較する。本実施形態において、図４に示すように、ＳＬＥの疑いのある２１人の患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度の中位数（median）は、例えば、１２５．２ｐｇ／ｍｌ（中位数は、太い水平線で示してある）であり、２４人の正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度の中位数は、例えば、８１．５ｐｇ／ｍｌ（中位数は、太い水平線で示してある）である。したがって、本実施形態において、患者の血漿試料中の総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率は、正常な人の１．５倍である。そして、ステップＳ１４０を実行し、患者の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度が正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の濃度よりも高い場合、その患者はＳＬＥを患っている可能性がある。
【００２５】
また、発明者は、ＴＲＡＦ７およびその抗体（anti-TRAF7 antibody）を含むＳＬＥを患う人を検出するキットを提供する。つまり、このキットは、ＴＲＡＦ７の抗体を使用することによって、ＴＲＡＦ７の存在および総タンパク質に対するＴＲＡＦ７の比率またはＴＲＡＦの濃度を検出し、その人がＳＬＥを患っているかどうかを判断する。ＳＬＥを患う人を検出するキットは、ＴＲＡＦ７の検出が可能で、ＴＲＡＦ７およびその抗体を含んでいれば任意のキットであってもよく、例えば、質量分析装置（mass spectrometer）、ＥＬＩＳＡキットおよびその他の周知のタンパク質分析キットがある。
【００２６】
上述した実施形態では、ＴＲＡＦ７をＳＬＥのバイオマーカーとして使用し、このバイオマーカーを応用して、ＳＬＥを患う人を検出する方法およびキットを提供する。大部分が遺伝子レベルで検査する従来のＳＬＥのバイオマーカーに比べ、上述した実施形態は、ＴＲＡＦ７タンパク質をＳＬＥのバイオマーカーとして使用する。ＴＲＡＦ７は周知のタンパク質であり、質量分析装置やＥＬＩＳＡ等のタンパク質検出技術が既に高度に発展しているため、ＳＬＥを患う人を検出する多くの方法およびキットを開発することが可能である。したがって、ＳＬＥを患う人を検出する方法およびキットは、操作しやすく、時間の節約ができるといった利点を有する。
【００２７】
一方、ＳＬＥの臨床症状は多様であり、初期段階の患者を診断するのは容易ではない。その結果、病気を発見した時には既に腎臓等の臓器障害を伴っている可能性があり、重症の場合には、腎透析が必要となることもある。しかしながら、上述した実施形態のＳＬＥを患う人を検出する方法は、患者の血漿試料を採取して、患者と正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の比率を検出することにより、ＳＬＥを患っている人の可能性を迅速かつ容易に測定し、ＳＬＥの疾患経過や特定の臓器障害を伴っている可能性を理解することができる。例えば、１つの実施形態において、患者と正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の比率の差により、腎障害を伴う活動期のＳＬＥの患者を判別することができる。そのため、ＴＲＡＦ７は、腎障害を伴う活動期のＳＬＥのバイオマーカーとして使用可能である。その結果、医師がＳＬＥを患う患者を判別してＳＬＥを患う患者の病状をコントロールする際に役に立ち、それによって、治療のタイミングが遅れるのを防ぐことができる。したがって、ＳＬＥのバイオマーカー、ＳＬＥを患う患者を検出する方法およびキットは、学術研究や臨床診断に幅広く応用することによって、ＳＬＥの研究進展およびＳＬＥ患者の病状のコントロールに大いに役立てることができる。
【００２８】
以上のように、本発明において、ＴＲＡＦ７をＳＬＥのタンパク質バイオマーカーとして使用し、このバイオマーカーを応用して、ＳＬＥを患う人を検出する方法およびキットを提供する。大部分が遺伝子レベルで検査する従来のＳＬＥのバイオマーカーに比べ、本発明は、ＴＲＡＦ７タンパク質をＳＬＥのバイオマーカーとして使用する。ＴＲＡＦ７は周知のタンパク質であり、質量分析装置やＥＬＩＳＡ等のタンパク質検出技術が既に高度に発展しているため、ＳＬＥを患う人を検出する多くの方法およびキットを開発することが可能である。本発明の１つの実施形態におけるＳＬＥを患う人を検出する方法は、患者と正常な人の血漿試料中のＴＲＡＦ７の比率を比較することにより、ＳＬＥを患っている人の可能性を迅速かつ容易に測定し、ＳＬＥの疾患経過や特定の臓器障害を伴っている可能性を理解することができる。その結果、医師がＳＬＥを患う患者を判別してＳＬＥを患う患者の病状をコントロールする際に役に立ち、それによって、治療のタイミングが遅れるのを防ぐことができる。したがって、ＳＬＥのバイオマーカー、ＳＬＥを患う患者を検出する方法およびキットは、学術研究および臨床診断に幅広く応用することによって、ＳＬＥの研究進展およびＳＬＥ患者の病状のコントロールに大いに役立てることができる。
【００２９】
以上のごとく、この発明を実施形態により開示したが、もとより、この発明を限定するためのものではなく、当業者であれば容易に理解できるように、この発明の技術思想の範囲内において、適当な変更ならびに修正が当然なされうるものであるから、その特許権保護の範囲は、特許請求の範囲および、それと均等な領域を基準として定めなければならない。
【符号の説明】
【００３０】
Ｓ１１０〜Ｓ１４０  ステップ