(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的RB腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠く新形成細胞を有する患者における新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、該抗新形成組成物は、治療有効投与量の組換えアデノウイルスを含み、ここで、該組換えアデノウイルスは、機能的RB腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な、発現したアデノウイルスE1aポリペプチドを欠き、このことにより正常細胞中で複製不能であるが、該新形成細胞中では複製可能である、抗新形成組成物。
【請求項２】
前記新形成細胞がp53(-)RB(-)である、請求項１に記載の抗新形成組成物。
【請求項３】
前記組換えアデノウイルスが、RBに結合可能なE1aポリペプチドをコードせず、かつp53に結合可能なE1b  p55ポリペプチドもコードしない、請求項１に記載の抗新形成組成物。
【請求項４】
前記組換えアデノウイルスが、Ad5  NT  dl  1110、Ad5  dl  312およびAd2  dl  1520からなる群より選択される、請求項１に記載の抗新形成組成物。
【請求項５】
前記組換えアデノウイルスが前記新形成細胞において感染ビリオンを形成し、該感染ビリオンは患者内でインビボにおいて隣接する細胞に拡散し、感染し得る、請求項１に記載の抗新形成組成物。
【請求項６】
前記組換えアデノウイルスがE1a/E1b二重変異体である、請求項１に記載の抗新形成組成物。
【請求項７】
前記アデノウイルスがプロモーターに作動可能に連結したネガティブセレクション遺伝子を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【請求項８】
化学療法剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【請求項９】
機能的p53腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠く新形成細胞を有する患者における新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、該抗新形成組成物は、治療有効投与量の組換えアデノウイルスを含み、ここで、該組換えアデノウイルスは、機能的p53腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合可能な、発現したアデノウイルスE1bポリペプチドを欠き、このことにより正常細胞中で複製不能であるが、該新形成細胞中では複製可能である、抗新形成組成物。
【請求項１０】
前記新形成細胞がp53(-)RB(-)である、請求項９に記載の抗新形成組成物。
【請求項１１】
前記組換えアデノウイルスが、RBに結合可能なE1aポリペプチドをコードせず、かつp53に結合可能なE1b  p55ポリペプチドもコードしない、請求項９に記載の抗新形成組成物。
【請求項１２】
前記組換えアデノウイルスが、Ad5  NT  dl  1110、Ad5  dl  312およびAd2  dl  1520からなる群より選択される、請求項９に記載の抗新形成組成物。
【請求項１３】
前記組換えアデノウイルスが前記新形成細胞において感染ビリオンを形成し、該感染ビリオンは患者内でインビボにおいて隣接する細胞に拡散し、感染し得る、請求項９に記載の抗新形成組成物。
【請求項１４】
前記組換えアデノウイルスがE1a/E1b二重変異体である、請求項９に記載の抗新形成組成物。
【請求項１５】
前記アデノウイルスがプロモーターに作動可能に連結したネガティブセレクション遺伝子を含む、請求項９から14のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【請求項１６】
化学療法剤をさらに含む、請求項９から15のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【請求項１７】
RB(-)新形成細胞を有する患者における新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、治療有効投与量の組換えE1a−RB(-)アデノウイルスを含む、抗新形成組成物。
【請求項１８】
p53(-)新形成細胞を有する患者における新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、治療有効投与量の組換えE1b−p53(-)アデノウイルスを含む、抗新形成組成物。
【請求項１９】
p53(-)RB(-)新形成細胞を有する患者における新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、治療有効投与量の組換えE1a/E1b二重変異体アデノウイルスを含む、抗新形成組成物。
【請求項２０】
前記アデノウイルスがプロモーターに作動可能に連結したネガティブセレクション遺伝子を含む、請求項17から19のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【請求項２１】
化学療法剤をさらに含む、請求項17から20のいずれか１項に記載の抗新形成組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新形成（neoplastic）哺乳動物細胞内で複製し、そして／又は後期領域遺伝子を発現することができるが、非−新形成細胞内で本質的に複製できない組換え細胞障害ウイルス（recombinant cytopathic viruuses）の組成物、このような組換えウイルスを構築し、そして増殖させるための方法、このような組換えウイルスにより新形成疾患を治療する方法、並びにこのような組換えウイルスを含んで成る治療組成物を提供する。
背  景
正常細胞の増殖は、成長−束縛性の（growth−constraining）腫瘍−サプレッサー遺伝子と釣り合った成長−促進性のプロト−オンコジーン（proto−oncogenes）により調節されていると考えられている。プロト−オンコジーンの活性を強化する突然変異は、新形成細胞の成長を駆動するオンコジーンを創り出す。反対に、腫瘍サプレッサー遺伝子を失活させる遺伝子病変は、一般的に、その失活した腫瘍サプレッサー対立遺伝子にホモ接合である細胞を導く突然変異（単数又は複数）を通じて、これらの遺伝子により課せられた正常な複製の束縛からその細胞を開放することができる。普通には、活性化されたオンコジーン（すなわち、活性な構造又は調節突然変異を含むプロト−オンコジーン）の形成との組み合わせにおける失活した腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、p53、RB、DCC、NF−１）は、本質的に束縛されない成長が可能な新形成細胞（すなわち、形質転換細胞）を産生することができる。
細胞のオンコジーン形質転換は、細胞の代謝、生理、及び形態における多くの変化を導く。オンコジーンにより形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は、細胞−成長調節遺伝子の適正な発現により正常に課せられた細胞増殖及び分化についての束縛に対する応答の損失である。
様々なタイプは遺伝子変化は全て、細胞−成長調節遺伝子の変更された発現又は働き及び異常成長を導くことができるけれども、１以上の事件が悪性細胞への正常細胞の新形成形質転換を導くために必要であるということが一般的に信じられている（Land et al.（1983）Nature 304:596;Weinberg RA（1989）Cancer Res.49:3713）。ほとんどの細胞タイプについて悪性形質転換を導く正確な分子経路及び二次的な変化は、明らかでない。推定の細胞−サイクル制御機能をもち、そして／又は機能転写の複合体の形成に含まれる幾つかのタンパク質、例えば、p53及びRBの変更された発現又は活性が細胞内の増殖制御の損失を導くことができる多数の事件が報告されている（Ullrich et al.（1992）J.Biol.Chem.267:15259;Hollstein et al.（1991）Science 253:49;Sager R（1992）Curr.Opin.Cell.Biol.４:155;Levine et al.（1991）Nature 351:453）。
いくつかのオンコジーンが、特定の癌のかなりのフラクション内に特徴的な活性な突然変異を有していることが見いだされている。例えば、rasHおよびrasKコーディング領域内の特定の突然変異（例えば、コドン12、コドン16;Parada et al.（1984）Nature 312:469）及びAPC遺伝子（Powell et al.（1992）Nature 359:235）は、培養細胞のオンコジーン形質転換に関係し、そして特定のヒト癌（例えば、結腸腺癌（colon adenocarcinoma）、膀胱癌、肺癌及び腺癌、悪性肝癌（hepatocarcinoma））のかなりのパーセンテージにおいて存在する。これらの発見は、このようなオンコジーンの活性形態（単数又は複数）を特異的に認識する診断及び治療試薬（例えば、ポリヌクレオチド・プローブ及び抗体）の開発を導いた（米国特許第4,798,787号及び米国特許第4,762,706号）。
他のオンコジーン、例えば、myc、erbB−２、及びpim−１の過剰又は不適当は発現は、そのコーディング領域内の活性突然変異（単数又は複数）の存在を必ずしも必要とせずにオンコジーン形質転換を強化することができるようである。erbB−２の過剰発現は、胸、胃、及び卵巣の腺癌においてしばしば見いだされ、そしてこれらの細胞タイプにおけるerbB−２レベルは、新形成についての診断マーカーとして役立つことができるかもしれず、そして／又は特異的な腫瘍表現型（例えば、特定の医薬、成長速度、分化状態に対する抵抗性）と相関することができる。
様々なオンコジーン（米国特許第4,736,866号及び米国特許第5,087,571号）又は機能的に破壊された腫瘍サプレッサー遺伝子（Donehower et al.（1992）Nature 356:215）を宿すトランスジェニック動物が、発癌物質スクリーニング検定における使用、とりわけ他の潜在的な用途について記載されている。
形質転換された表現型及び新形成の下にある分子機構のより詳細なモデルの開発におけるこの上記進歩にもかかわらず、慣用の化学療法を超える癌の治療に利用可能な重要な治療方法は、ほとんどもたらされなかった。多くの慣用の化学療法剤は、低い治療指数（the repeutic index）をもち、治療投与量レベルは、毒性を作り出す投与量レベルに又はその付近にある。ほとんどの慣用の化学療法剤の毒性副作用は、不快であり、そして他の副作用の中にあって、致死的な骨髄抑制を導く。
先天性疾患、例えば、嚢胞性繊維症（cystic fibrosis）を引き起こす欠陥対立遺伝子を矯正し又は補う遺伝子治療を行うための最近のアプローチは、限定された開始の成功の報告をもって達成されている。幾つかの遺伝子治療は、複製−欠陥組換えアデノウイルスを使用してインビボにおける細胞内に欠陥対立遺伝子の機能性コピーを発現することができるポリヌクレオチド配列を形質導入することを含む（Rosenfeld et al.（1992）Cell 68:143）。これらの遺伝子治療法の中の幾つかは、患者から体外移植された単離細胞内にポリヌクレオチドを導入することにおいて有効であるが、インビボにおいて高く有効であることは示されなかった。腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor（TNF））及びインターロイキン−２（interleukin−２（IL−２））をエンコードするポリヌクレオチドによる体外移植腫瘍細胞のトランスフェクトに頼る癌への治療アプローチが記載されている（Pardoll D（1992）Curr.Opin.Oncol.４:1124）。
遺伝子治療方法がインビボにおける形質転換細胞内でオンコジーン又は腫瘍サプレッサー遺伝子の欠陥対立遺伝子を矯正するために改良されることが可能であることがいつか証明されることができるであろうが、現在の遺伝子治療の方法は、その場における新形成の実際の遺伝子治療のための十分なパーセンテージの新形成細胞を有効に形質導入し、そして（例えば、相同的組換えにより）正しく標的化することができると報告されていない。癌生物学の性質は、新形成細胞の実質的なフラクション、好ましくは、形質転換された細胞のクローンの子孫の全てが、有効な治療効果について除去されているということを、命令する。その上、現在の遺伝子治療方法は非常に高価であり、患者内への再導入に先立って体外移植された細胞をエクスビボ（ex vivo）において培養することを必要とする。たとえそれらが有効であったとしても、このような方法の広い適用は、極端に高価なものであろう。
従って、新形成疾患の診断及び治療のための方法及び組成物、特に、慣用の抗新形成化学療法の典型である非−新形成細胞の不所望の殺生を伴なわずに新形成細胞を選択的に除去する方法についての、本分野における必要性が存在する。本発明は、これらの及び他の必要性を満たす。
本明細書中に討議する文献は、本出願の出願日の前に単にそれらの開示について提供されている。本明細書中の何も、先の発明によって本発明者らがこのような開示に実際よりも前の日付を付与する資格がないと認めることとして解釈されてはならない。
本発明の要約
本発明は、非−新形成細胞内で実質的に複製欠陥であり、そして新形成細胞内で少なくとも部分的な複製表現型を示す組換えアデノウイルスにより新形成細胞を感染させることにより新形成細胞を除去するための幾つかの新規の方法及び組成物を、提供する。新形成と非−新形成細胞内での本発明に係るアデノウイルス構築物の複製表現型における差異は、癌のウイルス−ベースの治療のための生物学的基礎を提供する。アデノウイルス細胞障害効果の発現、及び場合により負の−選択性薬剤遺伝子（例えば、HSV tk）の表現は、本発明の組換えアデノウイルス構築物により感染された新形成細胞のアデノウイルス複製表現型特性により関連付けられ、これ故、新形成と非−新形成細胞との間を区別し、そして新形成細胞の選択性細胞毒性を提供する。本法は、特にアデノウイルス構築物について詳細に記載されているけれども、本法は、効率的な複製が、非−新形成細胞内に存在するが新形成細胞内では実質的に非存在であり又は非機能性である宿主細胞タンパク質（例えば、p53、RB）の結合及び／又は隔離及び／又は失活を必要とするような本質的にいずれかのウイルス・タイプに利用可能であると信じられる。
アデノウイルスが細胞内で効率的に複製するために、アデノウイルスE1b遺伝子生成物、p55は、宿主細胞のp53タンパク質と複合体を形成し、それにより、p53を隔離及び／又は失活させ、そしてp53において欠陥のある細胞を作り出す。p53機能において欠陥にされたこのような細胞は、アデノウイルスの複製を支援することができる。この方法で、野生型アデノウイルスは、p53を含む細胞内で複製することができる。なぜなら、アデノウイルスp55タンパク質が宿主細胞のp53タンパク質を失活させ、そして／又は隔離するからである。本発明の１つの態様においては、感染された細胞内でp53タンパク質との機能性複合体を実質的に形成することができない突然変異体のp55タンパク質をエンコードしているE1b座を含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えアデノウイルスにより感染されることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細胞集団に投与される。感染された非−新形成細胞内で効率的にp53タンパク質を隔離する組換えアデノウルスルの実質的な非能力は、導入された組換えアデノウイルスのポリヌクレオチド（単数又は複数）が非−新形成細胞内で複製表現型を発現することができないということをもたらす。反対に、機能性p53タンパク質を欠いた新形成細胞は、アデノウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の除去を導く導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の表現及び／又は複製表現型に結合した負の選択遺伝子の発現を支援する。これらの態様の好ましい変種においては、組換えアデノウイルスは、p53を実質的に結合することができず、そして場合により機能性p19タンパク質をも欠くことができる（すなわち、E1aポリペプチドの存在中でアデノウイルスの初期領域遺伝子の発現を阻害することができない）突然変異体p55をエンコードしているE1b座を含んで成る。本発明の組換えアデノウイルスは、さらに、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体p19遺伝子を含んで成ることができ；本分野において公知のこのような突然変異体は、p19 cyt突然変異体遺伝子である。しかしながら、感染の間のウイルスDNAの完全性を維持するために幾つかの突然変異体内で機能性p19を保持することが好ましくあることができる。
本発明の他の態様においては、感染された細胞内でRBタンパク質との複合体を実質的に形成することができないE1aタンパク質（例えば、p289R又はp243R）をエンコードしているE1a座を含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えアデノウイルスにより感染されることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細胞集団に投与される。感染された非−新形成細胞内で効率的にRBタンパク質を隔離するその組換えアデノウイルスの実質的な非能力は、その導入された組換えアデノウイルス・ポリヌクレオチド（単数又は複数）が非−新形成細胞内で複製表現型を発現することができないということをもたらす。反対に、機能性RBタンパク質を欠いた新形成細胞は、アデノウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の除去を導く導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現及び／又は複製表現型に結合した負の選択遺伝子の発現を支援する。これらの態様の好ましい変種においては、組換えアデノウイルスは、RB（及び／又はその300kDポリペプチド及び／又はその107kDポリペプチド）に結合することができるCR1及び／又はCR2ドメインを欠いているが、アデノウイルスの初期遺伝子のトランス作用（transactivation）させることができる機能性CR3ドメインを含んで成る突然変異体E1aタンパク質（例えば、p289R）をエンコードしているE1a座を含んで成る。これらの態様のさらなる変種は、その組み合えアデノウイルスが、RBに結合し且つこれを失活させるタンパク質を実質的に表現することができず、そして場合により、機能性p19タンパク質をも含んで成ることができる（すなわち、E1a機能の非存在中でアデノウイルスの初期領域遺伝子の発現を刺激することができる）非機能性E1a座を含んで成るようなものを含む。本発明の組換えアデノウイルスは、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体p19遺伝子を、さらに含んで成ることができ；本分野において公知のこのような突然変異体は、p19 cyt突然変異体遺伝子である。
本発明は、非−新形成細胞内で複製欠陥であるが、機能性p53及び／又はRBを欠いた新形成細胞内で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイルス構築物を提供する。新規の組換えアデノウイルス構築物は、E1a及び／又はE1b遺伝子領域内に、特に、E1b p55タンパク質をエンコードしている配列並びにE1a p289R又はp243Rタンパク質のCR1及びCR2ドメイン内に、突然変異、例えば、欠失又は点突然変異を含んで成る。幾つかの態様においては、負の選択遺伝子（negative selectable gene）、例えば、HSV tk遺伝子が、その負の選択遺伝子が、複製表現型を発現する感染細胞（すなわち、新形成細胞）内で優先的に転写され、そして負の選択剤（例えば、ガンシクロビル、FIAU）の有効投与量の投与によりこのような細胞の負の選択を提供するように、E1a又はE1b突然変異をも含んで成る組換えアデノウイルス構築物内で、初期領域（例えば、E2、E1a、E1b）エンハンサー／プロモーター、後期領域遺伝子エンハンサー／プロモーター（例えば、主要後期プロモーター）、あるいはCMVエンハンサーを含む初期又は後期領域プロモーター、に作用可能な状態で結合される。負の選択遺伝子は、E1a及び／又はE1b構成配列の代わりに挿入されることができ、それぞれ、E1a(-)複製欠陥突然変異体、E1b(-)複製欠陥突然変異体、又はE1a/E1b二重突然変異体を、同時に形成する。
インビボにおける新形成細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容される形態におけるこのような組換えアデノウイルスを含んで成る抗新形成組成物も提供される。
本発明は、p53及び／又はRBに結合し及び／又はこれを失活するための機能性タンパク質を欠いた、組換えパポバウイルス（papovaviruses）、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（human papillomavirus（HPV）、ポリオーマウイルス（polyomaviruses）（例えば、BK、JC）及びSV40をも、提供する。機能性E6タンパク質の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、p53を効率的に分解する能力を実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性p53を含む細胞内ではなくp53(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。機能性E7タンパク質の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、RBに効率的に結合する能力を実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性RBを含む細胞内ではなくRB(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。機能性E6タンパク質と機能性E7タンパク質の両方の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、RB及びp53に効率的に結合する能力を実質的に欠くであろうし、それ故、十分なレベルの機能性RB及び／又はp53を含む細胞内ではなくp53(-)RB(-)細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。
本発明は、非−新形成細胞集団内での発現と比較したとき、新形成細胞集団内で複製表現型を優先的に発現し、そして／又は細胞障害効果を発現することができる組換えウイルスを患者に投与する階段を含んで成る新形成疾患の新規の治療方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、アデノウイルスE1a−289Rポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質−タンパク質相互作用の略図を示す。
図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による1.0のMOIにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体dl 1010、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体dl 1520、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体dl 434、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、12日間；図２（ｆ）、14日間；図２（ｇ）、20日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、14日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をPBSにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。PBS単独により感染された各細胞系擬似物が、生存力についての対照として含まれた。
図３（ａ−ｃ）は、野生型及び突然変異体アデノウイルスによる正常ヒト肺２倍体繊維芽細胞系IMR90（ATCC CCL 186）の感染を示す。IMR90細胞は、0.1、1.0、10、及び100に一致するMOIsにおいて示されたウイルスにより感染された。感染後の所定の日に、細胞をPBSにより洗浄し、そして細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。それぞれの６−ウェル皿の中の１のウェルを、ウイルス感染についての陽性対照として役立つ293細胞により接種した。図３（ａ）は、感染後９日目に野生型Ad2により感染された細胞を示す。図３（ｂ）は、感染後９日目にdl 1010により感染された細胞を示す。図３（ｃ）は、感染後９日目にdl 1520により感染された細胞を示す。
定  義
特にことわらない限り、本明細書中に使用する全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書中に記載されたものと類似の又は等価な方法及び材料のいずれをも本発明の実施又は試験において使用することができるけれども、その好ましい方法及び材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
用語”天然の（naturally−occuring）”とは、本明細書中に使用するとき、対象物に適用するとき、対象物が天然に発見されることができることをいう。例えば、天然の源から単離されることができ、そして実験室内で人により意図的に修飾されていない（ウイルスを含む）生物内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然である。本明細書中に使用するとき、用語”組換え（recombinant）”は、ポリヌクレオチド構築物（例えば、及びアデノウイルス・ゲノム）が、部分的に、人による意図的な修飾により、生成されていることを示す。
本明細書中に使用するとき、用語”複製欠陥ウイルス（replication deficient virus）”とは、ウイルス複製表現型の発現を支援する所定の細胞集団（例えば、p53及び／又はRB機能を実質的に欠いている細胞）内、並びに非−複製性の非−形質転換細胞に特徴的な正常なp53及びRB機能レベルを含んで成る細胞内で細胞増殖を阻害し、アポプトシスを誘導し、又は複製表現型を発現することが実質的にできない所定の細胞集団内で、細胞増殖を優先的に阻害し又はアポプトシス（apoptosis）を誘導するウイルスをいう。典型的には、複製欠陥ウイルスは、正常RB及び／又はp53機能を含んで成る細胞に対してプラーク形成効率における実施的な減少を示す。
本明細書中に使用するとき、用語"p53機能（p53 function）”とは、そのp53ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1b p53タンパク質に結合することができるような、p53遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本質的に正常なレベル（すなわち、同一の組織学的タイプの非−新形成細胞と比較して）をもつ性質（property）をいう。例えば、p53機能は、p53の失活（すなわち、突然変異体）形態の産生により又はp53ポリペプチド（単数又は複数）の発現の実質的な減少又は全損失により、失われることができる。また、p53機能は、野生型p53タンパク質をエンコードしているp53対立遺伝子を含んで成る新形成細胞内に実質的に非存在であることができ；例えば、p53座の外側の遺伝子変更、例えば、p53の異常細胞下プロセシング又は局在化をもたらす突然変異（例えば、その核よりもむしろ細胞質内で優先的にp53の局在化をもたらす突然変異）は、p53機能の損失をもたらすことができる。
本明細書中に使用するとき、用語"RB機能”とは、そのRBポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1aタンパク質に結合することができるような、RB遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本質的に正常なレベル（すなわち、同一の組織学的タイプの非−新形成細胞と比較して）をもつ性質をいう。例えば、RB機能は、RBの失活（すなわち、突然変異体）形態の産生により又はRBポリペプチド（単数又は複数）の発現の実質的な減少又は全損失により、失われることができる。また、RB機能は、野生型RBタンパク質をエンコードしているRB対立遺伝子を含んで成る新形成細胞内に実質的に非存在であることができ；例えば、RB座の外側の遺伝子変更、例えば、RBの異常細胞下プロセシング又は局在化をもたらす突然変異が、RB機能の損失をもたらすことができる。
本明細書中に使用するとき、用語”複製表現型（replication phenotype）”とは、複製欠陥アデノウイルスのようなウイルスにより感染された細胞の１以上の以下の：（１）後期遺伝子生成物、例えば、キャプシド・タンパク質（例えば、アデノウイルス・ペントン塩基性ポリペプチド）の実質的な発現又はウイルス後期遺伝子プロモーター（単数又は複数）から開始されるRNA転写、（２）ウイルス・ゲノムの複製又は複製中間体の形成、（３）ウイルス・キャブシド又は包装されたビリオン粒子のアセンブリー、（４）感染細胞内での細胞障害効果（CPE）の出現、（５）ウイルス溶菌サイクルの終了、及び（６）機能性癌タンパク質（単数又は複数）をエンコードしている野生型複製コンピテントDNAウイルスにより感染された非−新形成細胞内でのp53又はRB機能の排除の間に典型的に付随する他の表現型の変更、のような表現型特性をいう。複製表現型は、少なくとも１の上記列記の表現型特性、好ましくは１以上の上記表現型特性を含んで成る。
用語”抗新形成複製欠陥ウイルス（antineoplastic replication deficient virus）”とは、本明細書中に使用するとき、同一の組織学的細胞タイプの感染非−複製性非−新形成細胞に対して感染新形成細胞の優先的な細胞死により、ヒトにおける新生物の顕出又は進行を阻害する機能的性質をもつ組換えウイルスをいう。
本明細書中に使用するとき、”新形成細胞（neoplastic cells）”及び”新形成（neoplasia）”とは、それらが細胞増殖の制御のかなりの損失を特徴とする異常細胞表現型を示すように、比較的自律的な成長を示す細胞をいう。新形成細胞は、活性に複製しているか又は一時的な非−複製休止状態（G1又はG0）にあることができる細胞を含んで成り；同様に、新形成細胞は、よく−分化した表現型、ほとんど−分化していない表現型、両タイプの表現型の混合物をもつ細胞を含んで成ることができる。従って、全ての新形成細胞が、必ずしも、所定の時間点において複製している細胞ではない。新形成細胞として定められたセットは、良性新生物における細胞及び悪性（又は明らかな（frank））新生物から成る。明らかに新形成の細胞は、しばしば、癌（cancer）といわれ、内胚葉（endodermal）又は外胚葉（ectodermal）の組織学的起源の細胞から生じる場合、典型的には、癌腫（carcinoma）といわれ、又は中胚葉（mesodermal）から誘導された細胞タイプから生じる場合、肉腫（sarcoma）といわれる。
本明細書中に使用するとき、用語”作用可能な状態で結合された（operably linked）”とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の結合をいう。核酸は、それが他の核酸配列との機能的な関係に置かれているとき、”作用可能な状態で結合されて”いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがそのコーディング配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作用可能な状態で結合されている。作用可能な状態で結合されたとは、結合されているDNA配列が典型的には隣接し、そして２つのタンパク質コーディング領域を接続する必要がある場合、隣接し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、一般的に、数キロ塩基によりそのプロモーターから隔てられた時に機能し、そしてイントロン配列は様々な長さを有することができるので、幾つかのポリヌクレオチド要素は、作用可能な状態で結合されているが隣接していなくてもよい。
本明細書中に使用するとき、”生理学的な条件（physiological condition）”とは、無傷の哺乳動物細胞内又は生きた哺乳動物の組織空間又は臓器内の条件と実質的に同様なイオン強度、pH、及び温度をもつ水性環境をいう。典型的には、生理学的条件は、約150mM NaCl（又は場合によりKCl）、pH6.5−8.1、及び約20−45℃の温度をもつ水性溶液を含んで成る。一般的には、生理学的条件は、生物学的な巨大分子の分子間会合に好適な結合条件である。例えば、150mM NaCl、pH7.4、37℃における生理学的条件が、一般的に、好適である。
詳細な説明
以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における、以下に使用する命名法及び実験室手順は、本分野においてよく知られたものであり、そして一般的に使用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス−相補することができる細胞系を含む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のための標準的な技術が、使用される。一般的な酵素反応及び生成段階が、製造者の仕様書に従って行われる。これらの技術及び手順は、一般的に、本分野における慣用法及び様々な一般的な文献に従って行われる（一般的には、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Virology,Second edition.eds.Fields BN and Knipe DM,（1990）Raven Press,New York,NY（引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。これらは、本明細書の全体に提供される。この中の手順は、本分野においてよく知られており、そしてその読者の便利のために提供されている。この中に含まれる情報のすべてを、引用により本明細書中に取り込む。
以下に使用する命名法並びに以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における実験の手続は、本分野においてよく知られ、かつ、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、組換え体核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス相補することができる細胞系を含む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のために使用される。一般的酵素的な反応及び精製段階を製造者の取扱説明書に従って実施した。これらの技術及び手続は、本分野における慣用法並びに本分野の全体にわたり提供されるさまざまな一般的な文献（一般的には、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Virology,Second edition,eds.Fields BN and Knipe DM,（1990）Raven Press,New York,NY,（引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）に従って一般的に行なわれる。
新形成は、変異体遺伝子型及び表現型をもつ新形成細胞の生成を部分的に特徴とする病因症状である。いくつかの腫瘍は、RB機能を欠いているが、p53機能を有する細胞の集団を含んで成ることができる；このような細胞はRB(-)と命名される。いくつかの腫瘍細胞は、p53機能を欠いているがRB機能をもつことができ；このような細胞はp53(-)と命名される。いくつかの腫瘍は、p53とRBの両方を欠く細胞を含んで成ることができ、P53(-)RB(-)と命名される。細胞系SAOS2（以下実験の実施例を参照のこと。）は、p53(-)RB(-)である新形成細胞型の一例である。また、p53及びRBの本質的に正常なレベルを含んで成る新形成細胞が存在することができ；正常なp53及び正常なRBの両方をもつこのような細胞は、このような新形成細胞において複製表現型を優位に顕出することができる新形成ウイルス構築物のための基礎を提供することができる他の癌タンパク質（例えば、p53又はRB以外の腫瘍サプレッサー遺伝子生産物）を欠くことができる。
本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのDNAウイルス（例えば、アデノウイルス；パポバウイルス、例えばBK及びJC,SV40、並びに乳頭腫ウイルス、例えば、HPV、等）がそのウイルスの複製サイクルを通しての効率的な発達に本質的であるウイルスのタンパク質をエンコードしているということであり；これらのウイルス・タンパク質のいくつかは細胞タンパク質、例えば、細胞−分裂制御及び／又は効率的なウイルス複製に必要な条件としての、転写複合体の形成に関係するものを隔離する。p53及びRBのような細胞タンパク質に結合し、これを隔離し、又は分解するウイルスタンパク質の非存在中、ウイルス複製は、実質的に阻害される。p53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を欠いた突然変異体ウイルスにより感染された正常な（すなわち、非−新形成の）細胞は、一般的に、その突然変異体ウイルスの複製を支援することができず、これ故に、このような突然変異体ウイルスは、複製欠陥（又は複製欠損）であると考えられる。しかしながら、p53又はRBの隔離又は分解は、機能的なp53又はRBを欠いた細胞（このような細胞はそれぞれp53(-)及びRB(-)と命名される。）におけるウイルス複製に必要ではないので、p53及び／又はRB隔離又は分解について欠損である複製欠陥突然変異体ウイルスが本質的に正常なp53及び／又はRB機能をもつ細胞よりも大きな程度まで、このようなp53(-)又はRB(-)細胞内で複製表現型を発現することができるということが可能である。新形成細胞は、しばしば、p53機能を欠き（p53(-)細胞）、RB機能を欠き（RB(-)細胞）、又は両方の機能を欠く（p53(-)RB(-)細胞）。これ故に、いくつかの複製欠陥ウイルス突然変異体は、新形成細胞において複製表現型を優先的に示すことができる。
機能的RB失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1a,HPV E7タンパク質）を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、RB(-)細胞及びRB(-)p53(-)細胞内で複製表現型を顕出するであろう。機能的p53失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1b p55、HPV E6タンパク質）を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、p53(-)細胞及びRB(-)p53(-)細胞内で複製表現型を顕出するであろう。機能的p53失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1b p55,HPV E6タンパク質）と機能的RB失活タンパク質（例えば、アデノウイルスE1a,HPV E7タンパク質）の両方を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、RB(-)p53(-)細胞内で複製表現型を顕出するであろう。複製表現型の発現に関連する細胞毒性が、それ故に、RB(-),p53(-)、又はRB(-)p53(-)表現型をもつ新形成細胞を優先的に殺生するための基礎として使用されることができる。いくつかの複製性の非−新形成細胞がその細胞分裂サイクルを通じての進行の間にRB(-)表現型、p53(-)表現型、又はRB(-)p53(-)表現型を過渡的に示すことができるけれども、本発明に係るウイルス突然変異体は、必らずしも完全に選択的でないにもかかわらず、優先的に、新形成細胞を殺し、それ故に、単独で又は他の治療のモダリティー（様相）との組み合わされて使用されるべき有用な抗新形成療法モダリティーを構築するために、使用されることができる。上記HPV E7ポリペプチドの37のアミノ−末端残基内の欠失（又は他の失活突然変異）が、RB(-)細胞への適用のための好ましいHPV突然変異体である。なぜなら、これらの残基は、RB結合のために重要であるからである。
以下に指示する方法及び組成物は複製欠陥アデノウイルス構築物に関係する方法のために特に記載されているけれども、本発明が、p53タンパク質又はRBタンパク質の分解を隔離し又は強化する癌タンパク質をエンコードしている他のDNAウイルス、例えば、複製欠陥乳頭腫ウイルス種（例えば、HPV型16,18,33の突然変異体）であって、それぞれp53及び／又はRB機能を実質的に排除するE6及び／又はE7遺伝子内に突然変異を含むものによって実施されることができると信じられている。アデノウイルス科のメンバー（特にマストアデノウイルス属）に加えて、パポバウイルス科のメンバー、特に乳頭腫ウイルス及びポリオーマウイルスであってp53又はRBを隔離し及び／又は失活するウイルス・タンパク質をエンコードしているものが、本発明に係る方法における使用に好適であると信じられている。
アデノウイルス及びパポバウイルス生物学の一般的な記載については、Virology,Second edition,eds.Fields BN and knipe DM,Vol.2,pp.1651−1740,Raven Press,New York,NY,（引用により本明細書中に取り込む）をガンダンスとして参照されることができる。以下の特定の記載は、これに限定されるものではないが、アデノウイルス血清型５及びアデノウイルス血清型２に言及する。他のアデノウイルス血清型も使用されることができると信じられているけれども、アデノウイルス５型は、そのE1aウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子の、ウイルスのポリヌクレオチドのヌクレオチド番号付け慣行及びウイルス−エンコード・ポリペプチドのアミノ酸番号付けのための一般的な引用点を提供する。アデノウイルス２型は、E1bウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子領域の番号付け慣行のための便利な引用を提供する。当業者は、他のアデノウイルス血清型内の対応の位置を容易に同定するであろうと信じられている。ヒト乳頭腫ウイルスに対する文献は、一般的に、新形成に関連した型（例えば、16型、18型、又は33型）に言及している。但し、非−オンコジーン型も使用されることができる。
E1a突然変異体
網膜芽腫（retinoblastoma）腫瘍サプレッサー遺伝子（RB）の遺伝子機能の損失は、さまざまなタイプの腫瘍の病因論に関係している。この腫瘍サプレッサー遺伝子の生産物、pRB又はp105と言われる105キロダルトンのポリペプチドは、細胞分裂サイクル調節性タンパク質である。このpRBポリペプチドは、細胞分裂サイクルのG1期において細胞を休止させることにより細胞増殖を阻害する。このpRBタンパク質も、アデノウイルスE1a,SV40の大きなＴ抗原、及び乳頭腫ウイルスE7を含む、いくつかのDNAウイルス癌タンパク質の主要な標的である。これらのウイルス・タンパク質は、pRBに結合し、そしてこれを失活させ、そしてpRBを失活させる機能は、ウイルスの複製の容易化において重要である。このpRBタンパク質は、アデノウイルスE2遺伝子及びいくつかの細胞遺伝子の発現に関連するE2F転写因子と相互作用し、そしてこの転写因子の活性を阻害する（Bagchi et al.（1991）Cell 65:1063;Bandara et al.（1991）Natrue 351:494;Chellapran et al.（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）89:4549,（引用により本明細書中に取り込む））。このウイルス癌タンパク質、例えば、アデノウイルスE1aは、E2Fの活性化をもたらすpRB/E2F複合体を破壊する。しかしながら、このE2Fと複合体化するのに充分に機能的であるpRBを欠く細胞は、転写活性なE2Fを所有するために、機能的な癌タンパク質、例えば、E1aの存在を必要としないであろう。それ故、RBと複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的な複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、RB機能において欠陥のある細胞（例えば、実質的に欠失したRB対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合である細胞、本質的に非機能的である突然変異体RBタンパク質をエンコードしているRB対立遺伝子を含んで成る細胞、RBタンパク質の機能の欠如をもたらす突然変異を含んで成る細胞）において複製表現型を示すであろうが、非−複製性の非−新形成細胞においては複製表現型を実質的に示さないであろうと、信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本明細書中便利には、E1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルスとして言及される。
RB機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なRB機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染状態（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な状態、典型的には、生理学的状態）の下でE1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルスの感染性投与量を含んで成る組成物により接触されることができる。このような接触は、上記E1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。この感染は、RB機能を欠いた新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション中で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なRB機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団においては複製表現型の実質的な発現を作り出さない。感染されたRB(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞病理学上の効果（cytopathic effect（CPE））、細胞溶解、アポプトシス、等による細胞の死をもたらし、その細胞集団からの新形成RB(-)細胞の選択的排除をもたらす。
典型的には、RB(-)新形成細胞を選択的に殺すのに好適なE1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルス構築物は、E1aポリペプチドがRBタンパク質に効率的に結合する能力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで成る。このような失活突然変異は、典型的には、p105 RBタンパク質及びp107タンパク質の結合に関係する、E1a CR1ドメイン（Ad5内のアミノ酸30−85:ヌクレオチド位置697−790）及び／又はCR2ドメイン（Ad5内のアミノ酸120−139;ヌクレオチド位置920−967）内で生じる。好ましくは、（アミノ酸150−186にわたる）CR3ドメインが残り、そして切り詰められたp289Rポリペプチドとして発現され、そしてアデノウイルス初期遺伝子のトランス作用において機能的である。図１は、このE1a−289Rポリペプチドのドメイン構造を図示する。
本発明に係る方法及び組成物中における使用に好適なE1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルス構築物は、以下の実施例に限定されずに：（１）効率的なRB結合に必要なCR1及びCR2ドメイン（アミノ酸２〜150;ヌクレオチド560〜1009の欠失）を欠いているが、CR3ドメインを実質的に保持しているE1aタンパク質をエンコードしているアデノウイルス血清型5 NT dl 1010（Whyte et al.（1989）Cell 56:67,（引用により本明細書中に取り込む））、並びに（２）野生型アデノウイルス内のE1a領域の全体をエンコードしているヌクレオチド448−1349にわたる領域を欠いている欠失ウイルス・ゲノムを含んで成るアデノウイルス血清型5 dl 312（Jones N and Shenk T（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）76:3665（引用により本明細書中に取り込む））を含む。Ad5 NT dl 1010は、好ましいE1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルスであり、Dr.E.Harlow,Massachusetts General Hospital,Boston,MAから入手可能である。
E1a−RB(-)突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞における感染性ビリオンの形成を阻害するために、このようなアデノウイルス構築物内に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくない治療的モダリティーにおいて好ましいであろう。これらの充分に失活された突然変異体は、非複製性E1a−RB(-)突然変異体といわれる。このような非複製性突然変異体は、p53(-)RB(-)細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異体を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、本質的なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼにおける構成的な突然変異である。しかしながら、多くのモダリティーにおいては、突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がりそしてそれを感染させることができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、それにより、突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
RBに結合する能力を欠く追加のE1a(-)突然変異体は、典型的には、CR1及び／又はCR2ドメイン内で、E1aポリペプチドをエンコードしているE1a遺伝子領域内で突然変異を生成させ、その突然変異体E1aポリペプチドを発現させ、水性結合条件下、その突然変異体E1aポリペプチドをp105又はRBの結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補E1a(-)突然変異体として、RBに特異的に結合しない突然変異体E1aポリペプチドを同定することにより、当業者により生成されることができる。他の検定法は、上記突然変異体E1aポリペプチドをを水性結合条件下300kDタンパク質及び／又はp107タンパク質、又はそれらの結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補E1a(-)突然変異体として300kD及び／又はp107ポリペプチドと特異的に結合しない突然変異体E1aポリペプチドを同定することを含む。他の結合検定法は、E1a(-)突然変異体タンパク質（又はE1aタンパク質の非存在）が転写因子E2Fと複合体を形成する能力がないこと、及び／又は生理学的条件下でRB:E2F複合体からRBタンパク質を乖離する能力の欠如を測定することを含む（Chellapran et al.（1991）op.cit.,（引用により本明細書中に取り込む。））。
E1a機能を欠いた突然変異体、例えば、E1a−依存性転写調節配列に結合したさまざまなリポーター・ポリペプチドの転写のE1aによるトランス作用の損失、等を測定するための他の機能検定法が使用されるであろう。
E1b突然変異体
細胞リン脂質p53の機能は、その細胞分裂サイクルを通して哺乳動物細胞の進行を阻害することである。野生型アデノウイルスE1b p55タンパク質は、おそらく不活性形態におけるp53を隔離することにより、p53をもち、かつ、p53機能の実質的な失活を作り出す感染細胞においてp53に結合する。機能的なE1bタンパク質は、機能的p53を含む細胞における効率的なアデノウイルスの複製に不可欠である。これ故、p53に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体は、機能的p53の正常レベルをもつ非−複製性、非−新形成細胞においては複製欠陥である。
ヒト腫瘍細胞は、突然変異した（例えば、置換、欠失、フレームシフト突然変異した）p53対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、そしてその細胞分裂サイクルの正常な制御に必要なp53機能を欠いている（Hollstein et al.（1991）Science 253:49;Levine et al.（1991）op.cit.,（引用により本明細書中に取り込む））。従って、多くの新形成細胞は、p53(-)である。なぜなら、それらが、p53タンパク質の充分なレベルを欠いているか、そして／又は、それらが、実質的なp53機能が不可能であり、そして野生型p53が存在することができるときでさえ（例えば、機能的マルチマーの形成を阻害することにより）p53機能を実質的に取り除くことができるp53の突然変異体形態を発現するかのいずれかであるからである。いくつかの新形成細胞は、本質的に野生型のp53タンパク質をエンコードしている対立遺伝子を含んで成るが、p53機能を実質的に排除する第二の部位突然変異、例えば、その核内よりもむしろ細胞質内に局在化するp53タンパク質をもたらす突然変異を含んで成ることができ；このような第二部位突然変異体も、p53機能を実質的に欠いている。
p53と複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、p53機能において欠陥である細胞（例えば、実質的に欠失したp53対立遺伝子についてホモ接合である細胞、本質的に非機能的である突然変異体p53タンパク質を含んで成る細胞）の内で複製表現型を示すであろうが、非−複製性の非−新形成の細胞内で複製表現型を実質的に示さないであろうと信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、E1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルスとして適宜本明細書中で言及される。
p53機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なp53機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な条件、典型的には生理学的条件）の下でE1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルスの感染投与量を含んで成る組成物と接触されることができる。このような接触は、上記E1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。この感染は、p53機能を欠く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なp53機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内での複製表現型の実質的な発現を作り出さない。感染されたp53(-)細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細胞病理学的効果（CPE）、細胞溶解、アポプトシス、等による細胞の死をもたらし、その細胞集団からの新形成p53(-)細胞の選択的排除をもたらす。
典型的には、p53(-)新形成細胞の選択的殺生に好適なE1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルス構築物は、E1b・p55ポリペプチドが効率的にp53タンパク質に結合する能力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで成る。このような失活性突然変異は、典型的には、p53に結合するp55の領域内で生じる。場合により、この突然変異体E1b領域は、そのE1b領域の残りによりエンコードされている機能的p19タンパク質をエンコードし、そしてこれを発現することができ、そして、それは、E1aポリペプチドの非存在中アデノウイルス初期遺伝子のトランス作用において機能的である。
本発明に係る方法及び組成物における使用に好適なE1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルス構築物は、以下の実施例に限定されないが：（１）p55タンパク質の翻訳の開始のために使用されるAUGコドンの３アミノ酸下流の終止コドンを生成するヌクレオチド位2022におけるＣ〜Ｔ突然変異及びヌクレオチド3336において第２の終止コドンを生成する小さなリンカー挿入により置換されたヌクレオチド2496〜3323間の欠失を含む、アデノウイルス２型dl 1520（Barker and Berk（1987）Virology 156:107,（引用により本明細書中に取り込む）並びに（２）少なくとも2022位の突然変異及び／又は2496−3323の欠失突然変異、又はその実質的な部分、及びp19 cyt突然変異体を産生するためのp19内の追加の突然変異を含んで成る複合アデノウイルス構築物、を含み；この複合ウイルス構築物は、p55を欠いており、そしてp19 cyt突然変異の増強された細胞病理学的効果を含んで成る。Ad2 dl 1520は、Dr.A.Berk,University of California at Los Angeles,Los Angeles,CAから入手可能であり、そしてBarker and Berk（1987）Virology 156:107,（引用により本明細書中に取り込む）を含む文献中に記載されている。
E1b−p53(-)突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内での感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルスの複製が望ましくない治療的モダリティーにおいて好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性E1b−p53(-)突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、p53(-)RB(-)細胞内においてさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ内の構成的な突然変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複数可能であり、そして他の細胞に拡がり、かつ、感染することができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
p53に結合する能力を欠いている追加のE1b(-)突然変異体は、p55をエンコードしているE1b遺伝子領域内に突然変異を生成し、突然変異体p55ポリペプチドを発現させ、水性結合条件下、突然変異体p55ポリペプチドをp53又はp53の結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補E1b(-)突然変異体としてp53に特異的に結合しない突然変異体E1bポリペプチドを同定することにより、当業者により生成されことができる。
より典型的には、機能的検定法が候補E1b(-)突然変異体を同定するために使用されるであろう。例えば、p53機能の測定のためのFriend検定法が、Frebourg et al.（1992）Cancer Res.52:6977,（引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に記載されているように行なわれるであろう。p53を失活させる能力を欠いているE1b突然変異体は、候補E1b(-)複製欠陥突然変異体として同定されるであろう。
E1a/E1b 2重突然変異
いくつかのヒト腫瘍細胞は、p53機能とRB機能の両方を、１又は両方のタンパク質種の突然変異性の失活又は欠失のいずれかにより、欠いている。このような細胞は、p53(-)RB(-)細胞と命名されている。
p53に結合する能力を欠いており、そしてRBに結合する能力も欠いているが、他の不可欠なウイルス複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、p53(-)RB(-)細胞内で複製表現型を優位に示すであろうと信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本明細書中適宜、E1a−RB(-)/E1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルス、又は単にE1a/E1b 2重突然変異体と言われる。このようなE1a/E1b 2重突然変異体は、E1a領域内の少なくとも１のE1a−RB(-)突然変異及びp55をエンコードしているE1b領域内の少なくとも１のE1b−p53(-)突然変異を併合して、E1a/E1b 2重突然変異体アデノウイルスを形成することにより、当業者により構築されることができる。このような複製欠陥２重突然変異体アデノウイルスは、p53とRB機能の両方において欠陥があるが非複製性の非−形質転換細胞内で複製表現型を実質に示さないであろうような細胞内で、あるいはp53又はRB機能のいずれかにおいて欠陥であるが両方の機能においては欠陥がないような細胞内で、複製表現型を示すであろう。例えば、Ad2 dl 434突然変異体（Grodzicker et al.（1980）Cell 21:454,（引用により本明細書中に取り込む）は、E1a座の欠失及びE1b座の部分的欠失を含んで成り、そして機能的E1a及びE1b p55タンパク質をエンコードする能力を実質的に欠いている。
p53及びRB機能を欠いている新形成細胞のサブ集団並びに本質的に正常なp53機能及び／又はRB機能を表現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な条件、典型的には生理学的条件）下で、複製欠陥E1a/E1b 2重突然変異体アデノウイルスの感染投与量を含んで成る組成物と接触されることができる。このような接触は、E1a/E1b 2重突然変異体複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。
この感染は、p53機能とRB機能の両方を欠いている新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なp53機能及び／又はRB機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内で複製表現型の実質的な発現を作り出さない。
感染したp53(-)RB(-)細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細胞病理学的効果（CPE）、細胞溶解、等による細胞死をもたらし、その細胞集団から新形成p53(-)RB(-)細胞の選択的排除をもたらす。
E1a/E1b 2重突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内で感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくないような治療のモダリティーにおいて好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性E1a/E1b 2重突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、p53(-)RB(-)細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ内の構成的な突然変異である。
しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がり、そしてそれを感染させることができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
負の選択のウイルス構築物
感染細胞内のアデノウイルス複製表現型の発現は、一般的に、細胞溶解、細胞病理学的効果（CPE）、アポプトシス、又は他の細胞死の機構により、ウイルス−誘導細胞毒性と相関するけれども、抗新形成治療のために使用されるべき組換え体アデノウイルスの細胞毒性を増大させることがしばしば好ましくあることができる。このような増大は、典型的には、複製表現型を発現する細胞内で正の転写調節を示すアデノウイルスのプロモーターに作用可能な状態で結合された組換え体アデノウイルス内に負の選択遺伝子を含む形態を呈することができる。例えば、HSV tk遺伝子カセットは、複製欠陥アデノウイルスのE3プロモーター、例えば、Ad5 NT dl 1110の直下流に作用可能な状態で結合されることができる。しばしば、この負の選択カセットに適合するようにアデノウイルス・ゲノムの（すなわち、ウイルス複製及びパッケージングのための）非必須部分を欠失させることが望ましく；従って、このE3遺伝子領域の実質的な部分が欠失され、そして負の選択カセット、例えば、E2プロモーター（及びエンハンサー）又は他の好適なプロモーター／エンハンサーに作用可能な状態で結合されたHSV tk遺伝子により置換されることができる。あるいは、負の選択遺伝子は、アデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能な状態で結合されて、後期遺伝子プロモーターの転写を特徴とする複製表現型を発現する細胞内でその負の選択遺伝子産物の効率的な発現を許容することができる。
インビボにおいて感染性ビリオンを形成するウイルス複製が望ましくない態様のためには、非複製性であるアデノウイルス複製欠陥構築物が使用される。このような非複製性突然変異体は、E1a(-)及び／又はE1b(-)突然変異を含んで成り、そして好適な新形成細胞（例えば、p53(-)細胞、RB(-)細胞、又はp53(-)RB(-)細胞）内での複製表現型の生成に必要な遺伝子機能の全てを含んで成るが、感染性ビリオンの形成に、例えば、構造コート・タンパク質、プロテアーゼ、等に、必要な少なくとも１の必須遺伝子機能を欠失している。あるいは、このウイルスにより誘発された顕出免疫応答が、そのウイルスの感染性ビリオンを中和し、そしてその拡がりを緩和することができる。E1a及び／又はE1b突然変異に加えて相補性トランス−作用機能を欠いている非複製性突然変異体は、その欠失されたトランス−作用性の機能（単数又は複数）を提供することができる相補性ヘルパー・ウイルス又はヘルパー細胞系と共に増殖されることができる。例えば、トランスにおいてE1aとE1b機能を提供する293細胞系（ATCC ＃ CRL 1573;Graham et al.（1977）J.Gen.Virol.36:59、（引用により本明細書中に取り込む）は、トランスにおける追加の機能、例えば、ビリオン・コート・タンパク質等を提供するために修飾されることができ、ウイルス株を開発するために“非複製性”突然変異体の増殖を許容する。細胞内でのHSV tk遺伝子の発現は、その細胞が負の選択剤、例えば、ガンシクロビル又はFIAUに晒されない場合には、その細胞に直接的には毒性でない。負の選択遺伝子が実質的に発現されるような複製表現型を発現する感染細胞は、その負の選択剤（例えば、ガンシクロビル）が、そのtk遺伝子を発現する感染細胞が選択的に排除されるであろう時に、有効な選択的投与量において投与されるまで、本質的に全く追加の細胞毒性を作り出さない；従って、負の選択は、増強された細胞病理学的殺生のために、及び／又は複製表現型を示す細胞を殺すことによりさらなるウイルス複製を静める（damp out）ために使用されることができる。さらに、この負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを調整することにより、この負の選択遺伝子を発現する感染細胞集団の部分的排除のみを作り出すことが可能である。一般的に、ガンシクロビルの投与量は、標準的投与量−応答曲線を作成し、そして感染した新形成細胞の排除の所望のレベルが観察される投与レベルを測定することにより換算される。動物へのガンシクロビル（GANC）の投与に関する情報は、パッケージ挿入物からヒト処方箋を含む本技術分野におけるさまざまな源において入手可能である。細胞培養において使用されるとき、ガンシクロビルの選択濃度は、典型的には、0.05μＭ〜50μＭのレンジ内、典型的には、約１μＭのレンジにあり、約0.2μＭがインビトロ適用において使用され、そして約１−５μＭがインビボ適用において投与される（典型的には、水溶液中125ms/mlのガンシクロビルをロードされた浸透ポンプからの連続輸注により約24時間にわたり投与される）。インビボにおける投与のための投与量スケジュールは、７日間にわたり静脈中に与えられた5mg/kg体重B.I.D.の投与量においてガンシクロビルを含んで成ることができる。
負の選択遺伝子は、E1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルス構築物、E1ba−p53(-)複製欠陥アデノウイルス構築物、E1a/E1b 2重突然変異体複製欠陥ウイルス構築物、等の中に取り込まれることができる。
好ましい態様は、tk発現カセットを作るためのポリアデニレーション部位を含む、Ad5 NT dl 1110のE2プロモーター又は他のプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば、大きな後期プロモーター、E1aプロモーター／エンハンサー、E1bプロモーター／エンハンサー）に作用可能な状態で結合されたHSV tk遺伝子カセット（Zjilstra et al.（1989）Nature 342:435;Mansour et al.（1988）Nature 336:348;Johnson et al.（1989）Science 245:1234;Adair et al（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）86:4574;Capecchi,M.（1989）Science 244:1288,（引用により本明細書中に取り込む）である。このtk発現カセット（又は他の負の選択発現カセット）は、例えば、そのE3遺伝子の実質的な欠失のための代わりとして、アデノウイルスのゲノム内に挿入される。他の負の選択遺伝子及び複製欠陥アデノウイルス構築物は、当業者に自明であろう。E2プロモーターに作用可能な状態で結合された負の選択遺伝子は、E1a(-)複製−欠陥アデノウイルス突然変異体内への取り込みのための特に好ましい態様であると信じられている。なぜなら、そのE2プロモーターが、多数のE2F部位を含むからである。一方、RB(-)とp53(-)RB(-)は、RB機能を欠き、そしておそらくE2プロモーターからのより効率的な転写を示すであろう。
診断及びインビトロにおける用途
本発明に係る複製欠陥アデノウイルスは、p53及び／又はRB機能を欠く細胞の存在を検出するために使用されることができる。例えば、p53及び／又はRBを欠く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞サンプルが、好適な複製欠陥アデノウイルス種により感染される。好適なインキュベーション期間の後、複製表現型（例えば、Trypanブルーを排除する能力の損失、ビリオン形成、ウイルスDNA内への3H−チミジンの取り込み）を発現する細胞サンプル中の細胞を、その細胞サンプル中の複製性及び／又は新形成性細胞の数又は比率の測定を提供するために定量することができる。このような方法は、体外移植細胞サンプル（例えば、リンパ球白血病のための化学療法を経験する患者からのリンパ球サンプル）に基づき、患者内の化学療法後に、新形成を診断し、そして／又は腫瘍細胞負荷を評価するために使用されることができる。
他の診断用途及び変法は自明である；例えば、リポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）を、複製欠陥アデノウイルス内の負の選択遺伝子と置換することができ；形質転換された細胞は、リポーター遺伝子の発現により（例えば、細胞サンプル又は形質転換検定法において）等級付けし、これを、細胞内でのp53及び／又はRBの欠如を示す複製表現型の発現と関連付ける。
治療法
新形成疾患の治療は、E1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルス、E1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルス、E1a/E1b 2重突然変異体、及び負の選択遺伝子をさらに含んで成る複製欠陥アデノウイルスを含む、本発明の複製欠陥アデノウイルスを含んで成る組成物を患者に投与することにより与えられることができる。
p53及び／又はRB機能を欠いた細胞を含んで成るさまざまなヒト新形成が、複製欠陥アデノウイルス構築物により治療されることができる。例えば、これらに限定されないが、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、小細胞及び非−小細胞肺癌腫、肺腺癌、肝癌、膵臓癌腫、膀胱癌腫、大腸癌腫、胸癌腫、子宮癌腫、卵巣癌腫、又はリンパ球白血病をもつヒト患者又は非ヒト哺乳動物を、適当な複製欠陥アデノウイルスの有効抗新形成投与量を投与することにより治療することができる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液を、静脈内、腹膜内、筋中、皮下、及び表在局所的に含むさまざまな経路をもって新形成組織に適用することができる。1ml当り約103〜1012以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁液を、（例えば、気管支癌腫、小細胞肺癌腫、非−小細胞肺癌腫、肺腺癌、又は喉頭癌を治療するために肺デリバリーのために）ミストとして吸入させ、又は、腫瘍（例えば、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、子宮癌腫）を治療するために腫瘍部位に直接的に綿棒で塗ることができ、又は輸注により（例えば、卵巣癌の治療のためには腹膜腔中に、肝癌又は他の非−肝臓一次腫瘍のためには門脈中に）、あるいは腫瘍塊（例えば、胸腫瘍）内への直接的注入、浣腸（例えば、結腸癌）、又はカテーテル（例えば、膀胱癌）を含む他の好適な経路により、投与することができる。
候補抗新形成アデノウイルス突然変異体を、新形成細胞の等価な移植片を宿す未処理マウスと比較して、p53及び／又はRB機能を欠いた新形成細胞の移植片を宿すnu/nuマウスにおける腫瘍形成又は新形成細胞負荷を減少させるそれらの能力により、さらに評価することができる。
抗新形成複製欠陥アデノウイルス突然変異体を、新形成疾患をもつ患者への治療的及び診断的投与のために配合することができる。治療的又は予防的用途のために、抗新形成複製欠陥アデノウイルス変異体の１以上の種の薬理学的有効投与量を含む滅菌組成物を、新形成症状の治療のために、ヒト患者又は獣医学的非ヒト患者に投与する。一般的には、本組成物は、水性懸濁液中に約103〜1015以上のアデノウイルス粒子を含んで成るであろう。医薬として許容される担体又は賦形剤が、このような滅菌組成物中でしばしば使用される。さまざまな水溶液、例えば、水、緩衝液、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、等を使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、そして所望のアデノウイルス・ビリオン以外の粒状物を一般的に含まない。これらの組成物は、生理学的な条件に近づけるのに必要な医薬として許容される補助的物質、例えばpH調整及び緩衝化剤、毒性調整剤、等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含むことができる。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤を含むことができる。
複製欠陥ウイルスは、リポソーム又は免疫リポソーム・デリバリーにより新形成細胞にデリバリーされることができる；このようなデリバリーは、新形成細胞集団上に存在する細胞表面特性（例えば、免疫リポソーム内の免疫グロブリンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて、新形成細胞に対して選択的に標的化されることができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又は免疫リポソーム内に包み込まれる。例えば、複製欠陥アデノウイルス・ビリオンの懸濁液は、常法により免疫リポソームを形成するためにミセル内に包み込まれる（米国特許第5,043,164号、米国特許第4,957,735号、米国特許第4,925,661号;Connor and Huang（1985）J.Cell.Biol.101:582;Lasic DD（1992）Nature 355:279;Novel Drug Delivery（eds.Prescott LF and Nimmo WS:Wiley,New York,1989）;Reddy et al.（1992）J.Immunol.148:1585;（引用により本明細書中に取り込む））。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原（例えば、CALLA,CEA）に特異的に結合する抗体を含んで成る免疫リポソームを、これらの細胞に対してビリオンを標的化するために使用することができる。
本抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又はそれらのカクテルを、新形成疾患の予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的用途においては、組成物を、その症状及びその合併症を治癒し又は少なくとも部分的に休止させるのに充分な量において、特定の新形成疾患を既に患った患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、“治療的有効投与量（therapeutically effective dose）”又は“有効投与量（efficacious dose）”と定義される。この用途のために有効な量は、その症状の重度、その患者の一般的な状態、及び投与の経路に依存するであろう。
予防的な適用においては、抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又はそのカクテルは、新形成の再発に対する患者の抵抗性を強化し又は緩解時間を遅延化するために、現在は新形成疾患状態にはない患者に投与される。このような量は、“予防的有効投与量（prophytactically effective dose）”であると定義される。この用途においては、適正な量は、再び、その患者の健康及び免疫の一般的レベルに依存する。
これらの組成物の単一又は多数の投与は、その治療内科医により選択される投与量レベル及びパターンにより行なわれることができる。いずれの事件においても、医薬配合物は、患者を有効に治療するのに充分な量の本発明に係る抗新形成複製欠陥アデノウイルスを提供すべきである。
本発明に係る抗新形成複製欠陥アデノウイルス治療は、他の抗新形成プロトコール、例えば、慣用の化学療法と組み合わされることができる。
突然変異体アデノウイルスの増殖
本発明に係るアデノウイルス突然変異体（例えば、E1a−RB(-)複製欠陥アデノウイルス、E1b−p53(-)複製欠陥アデノウイルス、及びE1a/E1b 2重突然変異体）は、典型的には、感染性突然変異体ビリオンの複製及び形成を支援するためにトランスにおいて、それぞれ、E1a機能、E1b機能、又は両E1a及びE1b機能を提供することができる細胞系（例えば、293細胞系ATCC ＃ CRL 1573,American Type Culture Collection,Rockville,MD;Graham et al.（1977）J.Gen.Virol.36:59）内でウイルス株として増殖される。
以下の実施例を、限定ではなく実施例として提供する。変法及び他の態様は、当業者に自明であろう。
実験的実施例
以下の実験的実施例は、p53及び／又はRb機能を欠いた新形成細胞に複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物を投与することが新形成細胞を効率的に殺すことができるということを立証する。また、本実施例は、p53及びRb機能を含む非−新形成細胞が複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物による殺生に対し比較的抵抗性であるということを示す。それ故、以下に示すデータは、複製−欠陥組換えアデノウイルスが新形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるという実験的証明を提供する。この選択的殺生は、突然変異体アデノウイルスが新形成細胞内で複製表現型を誘導するが、非−新形成細胞内で複製表現型（又は関連の細胞病理学的効果）を実質的に誘導しない差異的能力を発揮することにより提供される。対照の非−新形成細胞及びさまざまな新形成細胞型を提案する細胞系を、DMEM（高グルコース）中集密において又はその付近で６−ウェル培養皿内にプレートし、そして標準的な培養条件下37℃、５％CO2においてインキュベートした。細胞をプレートして５×105細胞／ウェルの密度においてスクリーンした。テストした新形成細胞系は：ヒト１次骨肉腫から得られたSAOS−２（ATCC HTB85）；ヒト骨肉腫から得られたＵ−2OS（ATCC HTB96）；膵臓又は腸内に起源をもつヒト転移性腺癌腫から得られたHS700T（ATCC HTB147）；形質転換されたヒト胎児腎臓、293（ATCC CRL1573）；及びヒト大腸腺癌腫から得られたDLD−１（ATCC CCL221）であった。これらの細胞系のそれぞれは、American Type Culture Collection,Rockville,MDから入手可能である。対照の非−新形成細胞は、IMR90（ATCC CCL186）及びWI−38（ATCC CCL75）、両方２倍体ヒト肺繊維芽細胞系であった。
これらの細胞カルチャーを、順番に、平行して、野生型アデノウイルス２型、並びに複製−欠陥組換え体アデノウイルス突然変異体dl 11010,dl 434及びdl 1520により感染させた。余った培養皿を、細胞をカウントする目的のためにプレートした。これらの細胞は、上記ウイルス感染のために使用した細胞の同一懸濁液から生じたものであった。細胞を、所望の感染的重度（MOI）のためにその細胞カルチャーに添加すべきウイルス・プラーク−形成単位（PFU）の数を決定するためにカウントした。上記野生型アデノウイルス２型及び上記突然変異体アデノウイルスを、0.1,1.0,10、及び100のMOIsにおいて上記平行細胞カルチャーに添加した。PBS中に懸濁されたウイルスを、1mlの容量において上記細胞ウェルに添加した。接種された培養皿を、接種直後及び37℃、５％CO2において約１時間の吸収時間を通じての半分あたりでＸ−軸及びＹ−軸の両方においてロックした。
１時間の吸収期間の後、高グルコース及び２％ウシ胎児血清を含む2mlのDMEMを添加し、そしてそのカルチャーを、標準的な培養条件下37℃、５％CO2においてインキュベートした。
感染後の各時間において、図２（ａ−ｉ）を参照のこと、細胞カルチャーを、ウイルス調製物による細胞殺生の効果を測定するために20％メタノール中0.5％クリスタル・バイオレットにより染色した。死んだ細胞を脱着し、そしてウェルから濯ぎ出し、一方、生きた細胞は、ウェル内に残り、そして上記染料により染色された。これらの効果は、上記複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物が、非−新形成細胞に対して新形成細胞を優先的に殺すこと、並びに野性型アデノウイルス２型が新形成細胞と非−新形成細胞の両方をほとんど等しく良好に殺すことを示している。これらの結果は、dl 11010突然変異体が新形成細胞の殺生において特に有効であり、そしてdl 1520突然変異体及びdl 434突然変異体も有効であるということを立証した。これらの結果の例を図2a−ｉ中に示す。これらは、野生型アデノウイルス２型、突然変異体;dl 1010（E1A(-)）、dl 1520（E1B(-)）、又はdl 434による感染後の各時間において得られた染色された細胞ウェルの写真である。図2aは、ウイルスの非存在中、細胞カルチャーのそれぞれが集密まで成長し、そして培養ウェルに付着したことを示している。図2b−ｃは、野生型アデノウイルス２型が、少なくともいくつかの細胞がそれぞれのウェル内で染色され、変動した効力及び不完全性を伴うけれども、各培養ウェル内で細胞を殺すことができたということを示している。WI−38及びSAOS−２系が、アデノウイルス感染のための良好な宿主ではないこと、並びにIMR90（図3a−ｃ）がヒト２倍体繊維芽細胞のための代替対照細胞系として役立つということが注目される。図2d−ｅは、dl 1010突然変異体が、感染−抵抗性SAOS−２以外のすべての新形成細胞系を効率的に殺すことができたということを示している。dl 1010は、感染12日後までに、293、U2OS,HS700T、及びDLD−１系を殺し、そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI−38）を実質的に殺さなかった。図2f−ｇは、dl 1520突然変異体が、感染14−20日後までに５の新形成細胞系の中の３（293、HS700T、及びDLD−１）を効率的に殺すことができたが、２倍体トヒ肺繊維芽細胞（WI−38）を実質的に殺さなかったということを示している。dl 1520は、E1B(-)突然変異体であり、そして細胞系USOSはこのようなE1B(-)突然変異体ウイルスが複製することを許容せず、これは、予測されるように、突然変異体組換え−欠陥アデノウイルスによる感染についての各形質転換細胞系の特異性を示している。図2h−ｉは、dl 434突然変異体（２重−突然変異体:E1A(-)E1B(-)）が感染の14−20日後までに５新形成細胞系の中の３（293,HS700T、及びDLD−１）を効率的に殺すことができ、そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（WI−38）を実質的に殺さなかったことを示している。DLD−１及びU2OS系は、dl 434の複製についての部分的に抵抗性の表現型を示した。
図３（ａ−ｃ）は、IMR90ヒト２倍体肺繊維芽細胞が野生型Ad2,dl 1010、及びdl 1520により差別的に殺されたことを示している。293細胞系は、陽性対照として役立つ。図３（ａ）は野生型Ad2が10又は100のMOIにおいてIMR90細胞を効率的に殺したことを示している。図３（ｂ）は、たとえ、dl 1010が図２（ｄ−ｅ）中に示すように、新形成細胞系293,U2OS,HS700T、及びDLD−１を殺したとしても、dl 1010が、テストした最高MOIにおいてIMR90細胞内で複製することができなかったことを示している。図３（ｃ）は、dl 1520ウイルスが100のMOIにおいてのみIMR90細胞を効率的に殺すことができたことを示しており；この高いウイルス投与量において、複製よりもむしろウイルス過負荷の結果として細胞が死ぬ可能性を除外することができない。
従って、図２（ａ−ｉ）及び３（ａ−ｃ）中に示すデータは、複製−欠陥組換え体アデノウイルス突然変異体が、予測されるように、p53及び／又はRb機能を欠く新形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるということを示している。
本発明を、理解の明瞭さの目的をもって説明によりいくぶん詳細に記載してきたけれども、特定の変更及び修正がクレームの範囲内で行われることができるということは自明であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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