(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の表面に生体試料を保持するための複数の窪みを有し、該窪みの各々に保持される生体試料が発生する信号の各々を別個に測定するセンサであって、
該窪みの各々には、該窪みと連通し該基板の裏面に貫通する貫通孔および該信号を測定する電極を備え、
該電極の各々が、該窪みの各々に保持された試料が互いに電気的に連絡するように配置されている、センサ。
【請求項２】
前記信号が、前記複数の電極の１つに保持される生体試料に与えられた刺激に応答する信号である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記電極の各々は、その中心が互いに少なくとも２０μｍの間隔を置いて配置される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記基板が、シリコンウエハ、テフロン（Ｒ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、アクリル、シリコンゴム、ＰＭＤＳおよびエラストマーからなる群から選択される材料から作製される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記生体試料を保持するための窪みが、１〜１０μｍの深さ、および１０〜５０μｍの開口部直径を有し、かつ前記貫通孔の直径が２〜１０μｍである、請求項１に記載のセンサ。
【請求項６】
前記生体試料が神経細胞であって、前記電極の各々に保持される神経細胞が、前記電極の配置に従って神経細胞のネットワークを再構成している、請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記刺激が、前記電極の少なくとも１つを通じて与えられる、請求項２に記載のセンサ。
【請求項８】
前記電極に対する対極をさらに備え、前記生体試料が神経細胞であるとき、該神経細胞の膜電位を固定し得る、請求項１に記載のセンサ。
【請求項９】
基準電極をさらに備える、請求項６に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記基準電極が、線幅１〜１０００μｍのリボン状部材から作製される直径１００〜１００００μｍのリング状電極である、請求項９に記載のセンサ。
【請求項１１】
前記電極および電極からの導出線が、前記基板の裏面にパターニングされて該基板の周縁に引き出される、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記電極内に前記生体試料を密着して保持させる手段をさらに備える、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記生体試料を密着して保持させる手段が吸引ラインである、請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記生体試料を密着して保持させる手段を制御する手段を備える、請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１５】
基板の表面に細胞を保持するための複数の窪みを有し、該窪みの各々に保持される生体試料が発生する信号の各々を別個に測定するセンサであって、該窪みの各々には、該窪みと連通し該基板の裏面に貫通する貫通孔および該信号を測定する電極を備え、該電極の各々が、該窪みの各々に保持された試料が互いに電気的に連絡するように配置されている、センサと、
該センサ上に配置される細胞収容手段と、
該細胞収容手段が配置されたセンサを細胞増殖条件に維持する手段と、
該センサの各々の電極に前記細胞を密着して保持させる手段と、
該センサの各々の電極からの電気的信号を得る手段と、
該電気信号を処理する手段を備える、細胞間ネットワーク解析装置。
【請求項１６】
基板の表面に細胞を保持するための複数の窪みを有し、該窪みの各々に保持される生体試料が発生する信号の各々を別個に測定するセンサであって、該窪みの各々には、該窪みと連通し該基板の裏面に貫通する貫通孔および該信号を測定する電極を備え、該電極の各々が、該窪みの各々に保持された試料が互いに電気的に連絡するように配置されている、センサと、
該センサ上に配置される細胞収容手段と、
該細胞収容手段が配置されたセンサを細胞増殖条件に維持する手段と、
該細胞収容手段が配置されたセンサを移動する手段と、
該センサの各々の電極に前記細胞を密着して保持させる手段と、
該センサの各々の電極からの電気的信号を得る手段と、
該電気信号を処理する手段を備える、高速薬品スクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の電気生理学的特性を測定するセンサに関する。本発明は、また神経細胞ネットワークを人工的に再構成し得るセンサデバイス、および簡易および高速な薬品スクリーニングに適用可能なセンサデバイス、ならびにこのセンサを備えた、細胞間ネットワーク解析装置および薬品スクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬品に曝された細胞の電気的活動を測定することによって薬品をスクリーニングすることが行われている。細胞の電気的活動は、通常、パッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法などによって測定されている。
【０００３】
パッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分につけた細胞膜の微小部分（パッチ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を電気的に記録する方法である。パッチクランプ法は、細胞生物学の技術の中で、１個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の１つである（細胞の分子生物学、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社；非特許文献１）。細胞の電気的活動はまた、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する発光指示薬または蛍光色素と、最新の画像処理法とを組み合わせ（例えば、細胞の蛍光画像をＣＣＤカメラなどで撮影して、細胞内のイオンの移動をモニタする）て測定されている。
【０００４】
しかし、パッチクランプ法は、マイクロピペットの作製などに特殊な技術を必要とし、しかも大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングするのには適していない。また、蛍光色素などを利用する方法は、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要であり、測定において、色素の影響によるバックグラウンドが高い上に、時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点があった。細胞電位測定において、パッチクランプ法で得られるデータと同等の質のデータが得られ、しかも蛍光色素法のように簡易にしかも高速、自動で行えるデバイスが要望されている。
【非特許文献１】細胞の分子生物学、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上述のような従来の細胞の電気活動測定装置を改良し、簡便かつ迅速に、多数の細胞の電気的活動を一度に測定し得るセンサ、および被験体細胞間の信号伝達をも検出し得るデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、マイクロマシン技術を用い、直径または一辺が０．５〜５ｍｍの範囲の基板デバイスに微小な孔を形成し、従来のパッチクランプ法に近い精度で、多数の試料を一度に測定できる電気生理学的測定デバイスを実現した。
【０００７】
本発明は、基板上に配置された複数の電極を備え、この電極の各々に保持される生体試料が発生する信号の各々を別個に測定するセンサに関する。
【０００８】
上記電極の各々は、生体試料を保持するための窪み、この窪みと連通し上記基板の裏面に貫通する貫通孔、電極部、およびこの電極部からの導出線を備え、電極の各々は、上記窪みの各々に保持された試料が互いに電気的に連絡するように配置されている。
【０００９】
好ましくは、上記信号は、上記複数の電極の１つに保持される生体試料に与えられた刺激に応答する信号である。
【００１０】
好ましくは、上記複数の電極の各々は、その中心が互いに少なくとも２０μｍの間隔を置いて配置されている。
【００１１】
好ましくは、上記基板は、シリコンウエハ、テフロン（Ｒ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、アクリル、シリコンゴム、ＰＭＤＳおよびエラストマーからなる群から選択される材料から作製される。
【００１２】
好ましくは、上記電極部は、金、白金、塩化銀、および銀、白金黒、ＩＴＯからなる群から選択される材料から作製される。
【００１３】
好ましくは、上記生体試料を保持するための窪みは、１〜１０μｍの深さ、および１０〜５０μｍの開口部直径を有し、かつ上記貫通孔の直径は２〜１０μｍである。
【００１４】
好ましくは、上記生体試料は神経細胞であって、上記電極の各々に保持される神経細胞は、上記複数の電極の配置に従って神経細胞のネットワークを再構成している。
【００１５】
好ましくは、上記刺激は、上記複数の電極の少なくとも１つの電極部を通じて与えられる。
【００１６】
好ましくは、上記センサは、上記電極に対する対極をさらに備え、上記生体試料が神経細胞であるとき、この神経細胞の膜電位を固定し得る。
【００１７】
好ましくは、上記センサは、基準電極をさらに備える。
【００１８】
好ましくは、上記基準電極は、線幅１〜１０００μｍのリボン状部材から作製される直径１００〜１００００μｍのリング状電極である。
【００１９】
好ましくは、上記電極部および前記導出線は、上記基板の裏面にパターニングされて該基板の周縁に引き出される。
【００２０】
好ましくは、上記センサは、上記複数の電極内に前記生体試料を密着して保持させる手段をさらに備える。
【００２１】
好ましくは、上記生体試料を密着して保持させる手段は吸引ラインである。
【００２２】
好ましくは、上記センサは、上記生体試料を密着して保持させる手段を制御する手段を備える。
【００２３】
本発明はまた、上記センサ、このセンサ上に配置される細胞収容手段、この細胞収容手段が配置されたセンサを細胞増殖条件に維持する手段、上記センサの各々の電極に前記試料を密着して保持させる手段、上記センサの各々の電極からの電気的信号を得る手段、および該電気信号を処理する手段を備える、細胞間ネットワーク解析装置に関する。
【００２４】
本発明はまた、上記センサ、このセンサ上に配置される細胞収容手段、この細胞収容手段が配置されたセンサを細胞増殖条件に維持する手段、および上記細胞収容手段が配置されたセンサを移動する手段、上記センサの各々の電極に上記試料を密着して保持させる手段、上記センサの各々の電極からの電気的信号を得る手段、およびこの電気信号を処理する手段を備える、高速薬品スクリーニング装置に関する。
【００２５】
本発明のセンサは、上記構成を有することにより、通常の細胞外記録では不可能であった、イオンチャンネルの開閉に伴うノイズの検出を可能とし、センサ上に人工的に再構成された神経細胞ネットワークにおける信号伝達の解析をも可能にした。
【発明の効果】
【００２６】
【発明を実施するための最良の形態】
図１に、本発明のセンサによる測定原理および電極構造の概略を模式的に示す。基板１上に配置された円筒状の器２には培養液が入れられ、細胞などの生体試料が収容される。図１の左は、その上に細胞を載せた従来の平板型微小電極６を備えた電極構造、そして図１の右は本発明の電極構造の一例であり、円筒状の器２の中央に楕円で示される被験体細胞は、基板１に設けられた細胞保持手段の一部である窪み３に捕捉または保持されている。この細胞保持手段は、基板１に形成された窪み３、開口部５を通じてこの窪み３に連通する貫通孔７、および吸引ライン（図示せず）を備えている。
【００２７】
図１の右に示す例では、貫通孔７の中に、信号検出手段である測定電極９が配置されて示されている。測定電極９は、配線８を経て信号検出部（図示せず）に連結される。貫通孔７は、吸引ポンプなどの吸引手段に連絡する吸引部分の一部を形成して、細胞の吸引手段（図示せず）と連結され、この細胞の吸引手段は、上記窪み３に保持された細胞の細胞膜と基板１とを、この窪み３内にある細胞膜を介して得られる電気的信号が、図中の矢印で示されるように、ウェル中の培養液に漏れないように密着して保持するように吸引する。
【００２８】
なお、本明細書では、上記のような基板上に配置された窪みとこの窪みを連通する貫通孔に配置された測定電極を備える構造の単位を「電極」または「電極構造」と定義し、このような「電極」構造に加え、それを支持する基板、細胞を収容する部材、電極に接続された導出線などを備えるデバイスの構成を「センサ」と定義する。
【００２９】
図１の右に示す例では、窪み３の開口部に細胞の一部がはまり込んで示されている。この細胞と基板１とが密着して保持されることによって、細胞から発生する電気的信号が培養液４中に漏れることはない。その一方、図１の左に示す従来例の平板型微小電極では、図中矢印で示されるように，細胞から発せられた電気的信号は、ほとんど培養液４中に漏れてしまい、信号検出感度が著しく低くなる。
【００３０】
図１の右に示す電極構造では、必要に応じて基準電極がさらに設置され、測定電極９は、この基準電極に付与される基準電位を対照として、細胞の電気信号を測定する。通常、この基準電極は、その断面が約１００μｍ〜約１０００μｍの直径の金、白金、銀−塩化銀などの材料の線材であるが、必要に応じて任意の大きさおよび形状であり得る。また、この基準電極は、必要に応じてウェルあたり１つ以上設置され、それによって細胞電位の測定精度を向上し得る。
【００３１】
このような、窪みを１つ以上備えたセンサは、従来のマイクロマシン技術により形成される。
【００３２】
（実施の形態）
図２に本発明のセンサの実施の形態の一例を示す。図２は、本発明の実施の形態の一例の平面図である。この実施の形態では、開口部の直径が約１０μｍである窪みを備えた電極が、その中心が各々約２０μｍの間隔で、８行×８列のマトリックス状に配置されている。参照番号２は、電極上に配置される培養液およびを細胞を収容するための器である。基板（サイズ３０ｍｍ×３０ｍｍ）の周縁には、各電極の測定電極から導出され、そして他の電極または配線と絶縁された合計６４個の基板ターミナル部１０が設けられている（なお、導出線は図示していない）。
【００３３】
図３は、本発明のセンサの実施の形態一例の電極構造を拡大して示す図である。図示される例では、個々の電極は、開口部の直径が約１０μｍの窪み３を備え、測定電極（本明細書では電極の電極部ともいう）９は、基板の裏面にスパッタなどによってパターニングされて、信号導出線８を通って、基板の周縁に引き出される。窪みの底面の中央部には、その開口部の直径が約３μｍの貫通孔７が設けられて示される。図３の右に示す３つの図は、センサを構成する電極の１つの拡大図であって、図３の左に点線で囲ったＡで示す部分を拡大して示し、上から順にその平面図、窪み３の中央を通る直線に沿った断面図および裏面図である。
【００３４】
図４もまた、本発明のセンサの実施の形態の一例を示す。この実施の形態では、電極には、１つの測定電極９、１つの窪み３および貫通孔７が設けられ、測定電極９は、この貫通孔７と接触するように、ＳＯＩ基板の裏面にパターニングされている。生体試料を収容する器の壁には、線幅１００μｍのリボン状部材から作製される直径１００μｍのリング状の基準電極１１が配置されている。
【００３５】
図５は、基準電極が細胞を収容する器内に配置される例を、図６は、基準電極が細胞を収容する器の壁の一部の上および器の底部に配置される例を示す。基準電極の形態および配置は、測定の目的および測定対象となる生体試料に応じて適宜選択された形態をとり得る。
【００３６】
基準電極は、測定電極に対する対極として作用し、保持した細胞の膜電位を固定（細胞膜の電位を任意の値に設定）し得る。また、基準電極と、測定電極との間に微弱な電気パルス（例えば、１００Ｈｚの分極パルス）を付与し、ウェル内に保持された細胞の細胞膜のイオン透過性を向上させ得る。
【００３７】
図７は、本発明の、吸引ライン１５を備えたセンサの実施の形態を示す。吸引ライン１５は、基板の裏面に配置される吸引ラインアタッチメント２０内に形成されており、アスピレーターなどの吸引手段（図示せず）に連結されて、細胞と、電極構造との密着性を向上し得る。吸引ラインアタッチメント２０は、代表的には、アクリル、ＰＭＤＳ、シリコンゴムなどの材料から作製され、測定電極を覆って基板の裏面に接着される。
【００３８】
なお、本発明のセンサの裏面の、測定電極の近傍の空間には、吸引手段によって引き込まれる電解液（通常Ｋｒｅｂｓ  ｒｉｎｇｅｒ溶液）だけが存在する。従って、本発明のセンサの裏面に存在する電解質溶液は、貫通孔を満たしている電解質溶液に加え、多くとも１〜１０μｌ程度である。さらに、測定電極で細胞の電気的変化を検出し得る限り、特に吸引系全体を電解液で満たす必要はない。
【００３９】
本発明の上記のセンサを組み込んだ、細胞間ネットワーク解析装置または高速薬品スクリーニング装置の構成例を模式的に図８に示す。図８中の構成は、以下の通りである。Ａ：細胞収容手段を配置したセンサを細胞増殖条件に維持する培養装置である。被検対象である生物試料の増殖および維持に適した環境を提供する。Ｂ：培養装置からセンサを移動する手段であって、このセンサを信号検出装置Ｃに搬入する。例えば、ロボットアームを採用し得る。Ｃ：信号検出装置。被検薬液を注入または排出する手段、例えば、試薬分注マルチピペット、上記のマルチ電極を備えたセンサ、アスピレーターまたは吸引ポンプなどから構成される。Ｄ：信号導出ケーブル、Ｅ：信号処理装置（コンピュータ）。
【００４０】
なお、上記の各構成要素間の連結は、当該分野で公知の手段を用いて行うことができ、特に詳細は説明しない。
【００４１】
本発明の上記のセンサを組み込んだ細胞間ネットワーク装置は、上記センサと、上記センサ上に配置される細胞収容手段と、細胞増殖条件を維持する手段と、上記センサの各々の電極に上記試料を密着して保持させる手段と、上記センサの各々の電極からの電気信号を得る手段と、この電気信号を処理する手段とを備え得る。
【００４２】
上記細胞間ネットワーク装置は、さらに、上記センサ上の任意の電極に電流を印加する刺激印加手段、および上記センサ上で培養された細胞の状態を表示する顕微鏡または撮像手段を備え得る。上記細胞収容手段は、通常、細胞維持のための溶液を保持する。
【００４３】
上記細胞増殖条件を維持する手段は、通常、その細胞を収容する環境を、細胞増殖に最適となる温度、湿度、ｐＨ、ガス組成となるように維持する。上記電気信号を処理する手段は、通常、上記センサの各電極からの信号を取得する。
【００４４】
本発明の上記センサを組み込んだ高速薬品スクリーニング装置は、上記センサと、上記センサ上に配置される細胞収容手段と、細胞増殖条件を維持する手段と、上記細胞収容手段が配置されたセンサを移動する手段と、上記センサの各々の電極に上記試料を密着して保持させる手段と、上記センサの各々の電極からの電気信号を得る手段と、この電気信号を処理する手段とを備え得る。
【００４５】
上記高速薬品スクリーニング装置は、さらに、上記センサ上の任意の位置にある上記細胞収容容器に溶液を注入または排出する手段を備え得る。
【００４６】
上記細胞収容手段は、通常、細胞を維持するための溶液を保持する。上記細胞増殖条件を維持する手段は、通常、その細胞を収容する環境を、細胞増殖に最適となる温度、湿度、ｐＨ、ガス組成となるように維持する。
【００４７】
上記電気信号を処理する手段は、通常、上記センサの各電極からの信号を個別に取得し、そして統計処理する。
【００４８】
以下実施例により本発明を説明する。以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００４９】
胎生１７日目のラット大脳皮質より神経細胞を調製し、ダルベッコ変法培地に懸濁し、図３に示す６４個の電極および器を備えるセンサの器のそれぞれに５×１０５細胞／ｍｌの濃度になるように添加し、そして２週間培養することによりセンサ上に人工的神経細胞ネットワークを再構成した。
【００５０】
この再構成された神経細胞ネットワークを含むセンサを、図８に示す構成の装置を用い、６４個の電極の１つ（図９に示す（５行、６列）目の電極）にその電極部を通じて定電圧刺激（５０μＶ）を印加することにより、センサ上の一つの細胞に定電圧刺激を印加し、その刺激の伝達を、残りの６３個の電極で細胞電位を検出することにより測定した。
【００５１】
結果を図９に示す。図９は、信号処理装置（コンピュータ画面）のハードコピーである。図９に示したように円で囲んだチャンネル、つまり６３個の電極中２４個の電極において連動した信号の伝達が観察され、神経細胞ネットワークが再構成されていることが確認された。
【実施例２】
【００５２】
図１０に示すように（５行、５列）目の電極に定電圧刺激を印加したことを除いて実施例１と同様に、刺激の伝達を、残りの６３個の電極で細胞電位を検出することにより測定した。その結果、図１０に示したように、６３個中３８個に連動した信号の伝達が観察された。
【実施例３】
【００５３】
実施例１および２と同様に再構成した神経細胞ネットワークを、４０μＭのＤＮＱＸ（６，７−Ｄｉｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２，３（１Ｈ，４Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）で１０分間処理した。実施例２と同様に、センサ上の一つの細胞に定電圧刺激を印加し、その刺激の伝達を、残りの６３個の電極で細胞電位を検出したところ、いずれの電極においても応答は観察されなかった（図１１）。これは、ＤＮＱＸにより、定電圧刺激に伴うシナプスを介した反応を完全にブロックされたことを示す。
【００５４】
以上の３つの実施例の結果から、本発明のセンサは、人工的に再構成された神経細胞ネットワークにおける信号伝達を測定できることが示された。さらには、本発明のセンサは、細胞の膜電位を固定することにより、細胞の電位感受性イオンチャンネルの開閉頻度も測定できることを可能にした。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
簡便かつ迅速に、多数の細胞の電気的活動を一度に測定し得るセンサ、および被験体細胞間の信号伝達をも検出し得るデバイスが提供される。
【００５６】
本発明のデバイスは、従来の高度な技術を要するパッチクランプ法や試験工程が多くＳ／Ｎ比の悪い蛍光色素法の欠点を克服する。本発明のデバイスを利用することにより、簡単に高速で薬品候補化合物をスクリーニングできる装置を提供し、従来の薬品スクリーニングに要していた時間を劇的に短縮できる。さらに、高度な特殊技術を必要とせず、本装置が自動的にデータ収集と信号処理を行うことから、誰にでも簡単に細胞電位測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明のセンサの測定原理および構造を、従来の微小電極を用いたセンサと比較して示す図である。図１の右は、本発明のセンサの構造の一部を示し、図１の左は、従来の微小電極を用いたセンサを示す。
【図２】図２は、本発明のセンサの平面図である。
【図３】図３は、本発明のセンサの平面図、およびセンサの一部である電極の構造を拡大して示す、電極の平面図、断面図、および裏面図である。
【図４】図４は、本発明のセンサの改変例の概略を示す平面図、およびセンサの一部である電極の構造を拡大して示す、電極の断面図である。
【図５】図５は、本発明のセンサの改変例の概略を示す断面図である。
【図６】図６は、本発明のセンサの改変例の概略を示す断面図である。
【図７】図７は、本発明のセンサの改変例の概略を示す断面図である。
【図８】図８は、本発明の細胞間ネットワーク解析装置の構成を示す概略図である。
【図９】図９は、本発明の細胞電位測定用デバイスを用いて行った試験結果を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の細胞電位測定用デバイスを用いて行った試験結果を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の細胞電位測定用デバイスを用いて行った試験結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５８】
１  基板
２  細胞収容手段
３  窪み
５  孔の開口部
７  孔
８  配線
９  測定電極
１０  基板ターミナル部
１１  基準電極
１５  吸引ライン
２０  吸引ラインアタッチメント
Ａ  培養装置
Ｂ  移動手段
Ｃ  信号検出装置
Ｄ  信号導出ケーブル
Ｅ  信号処理部、
【図１】
0003570715.tif 000002
【図２】
0003570715.tif 000003
【図３】
0003570715.tif 000004
【図４】
0003570715.tif 000005
【図５】
0003570715.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0003570715.tif 000010
【図１０】
0003570715.tif 000011
【図１１】
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