(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ)図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、
（ｂ）図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１９〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、及び
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒト白血病単球細胞株ＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦαの生産を誘発する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離核酸。
【請求項２】
（ａ）図４（配列番号：４）に示した位置５０〜６４０のヌクレオチドからなるＤＮＡ、
（ｂ）図４（配列番号：４）に示した位置１０４〜６４０のヌクレオチドからなるＤＮＡ、及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡと、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中、４２℃、２０時間の条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒト白血病単球細胞株ＴＨＰ１細胞からのＴＮＦαの生産を誘発する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
からなる群から選択される単離核酸。
【請求項３】
（ａ）図４（配列番号：４）に示したｃＤＮＡの全長コード配列、
（ｂ）その関連したシグナルペプチドコード領域を欠く、図４（配列番号：４）に示したｃＤＮＡの全長コード配列、及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のｃＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列と、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中、４２℃、２０時間の条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒト白血病単球細胞株ＴＨＰ１細胞からのＴＮＦαの生産を誘発する活性を有するポリペプチドをコードするコード配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸。
【請求項４】
請求項１の核酸を含んでなるベクター。
【請求項５】
ベクターで形質転換した宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に関連する請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項５のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞がＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞をＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養から前記ポリペプチドを回収することを含んでなるＰＲＯ１１２２ポリペプチドの生成方法。
【請求項９】
（ａ）図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、
（ｂ）図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１９〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、及び
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）において一若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒト白血病単球細胞株ＴＨＰ１細胞からのＴＮＦαの生産を誘発する活性を有する単離ポリペプチド、
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項３に記載の単離核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
異種性アミノ酸配列に融合した請求項９に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１２】
前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１１に記載のキメラ分子。
【請求項１３】
（ａ）図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、及び
（ｂ）図３（配列番号：３）に示したアミノ酸残基１９〜１９７の配列からなるＰＲＯ１１２２ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体又はヒト化抗体である請求項１３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、一般に、ここでＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２ポリペプチドと命名したサイトカインＩＬ−１７及び細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原８（ＣＴＬＡ−８）と配列同一性を有する新規なポリペプチドの新規なＤＮＡの同定と単離、治療的用途及び組換え生産に関する。
【０００２】
(発明の背景)
サイトカインインターロイキン１７(ＩＬ-１７)は上皮、内皮、及び線維芽細胞を刺激し、ＩＬ-６、ＩＬ-８のようなサイトカイン、及び顆粒球コロニー刺激因子、並びにプロスタグランジンＥ２を分泌することが報告されている。ＩＬ−１７の発現は活性化されたＴ細胞に制限されているが、ＩＬ−１７レセプターは広範に発現され、ＩＬ−１７の多面的な活性と一致した性質を持つ。更に、ＩＬ-１７の存在下で培養したとき線維芽細胞が好中球へのＣＤ３４＋優先成熟の増殖を維持しうることが示されている。しかして、ＩＬ-１７はＴ細胞依存性炎症反応の初期増強剤及び／又は免疫系を造血へ橋渡しするサイトカインネットワークの要素でありうる。Yao等, J.Immunol., 155(12):5483-5486 (1995); Fossiez等, J.Exp.Med., 183(6):2593-2603 (1996); Kennedy等, J.Interferon Cytokine Res., 16(8):611-617 (1996)を参照されたい。
より一般的には、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
【０００３】
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108-7113 (1996)；米国特許第５５３６６３７号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
インターロイキン-１７はその生物学的機能がようやく理解され始めたに過ぎない最近開示されたＴ細胞由来サイトカインである。Sprigg等, J.Clin.Immunol. 17:366(1997); Broxmeyer,H.E., J.Exp.Med. 183:2411(1996)。ＩＬ-１７がげっ歯類Ｔ細胞リンパ腫由来のｃＤＮＡとして最初に同定されたとき、それは霊長類ヘルペスウィルスであるHerpesvirus saimiriからのオープンリーディングフレームに類似の配列を有するものとして認識されていた。Rouvier等, J. Immunol. 150:5445 (1993), Yao等, Immunity 3:811 (1995)[Yao-1], Fossiez等, J. Exp. Med. 183:2593 (1996)。ついで、このウィルスタンパク質は宿主ＩＬ-１７に対して見出された免疫賦活活性の全てではないが多くを有していることが確認された。FleckensteinとDesrosiers, "Herpesvirus saimiri and herpesvirus ateles", The Herpesviruses, I.B. Roizman, ed, Plenum Publishing Press, New York, p253 (1982), Biesinger, B.I.等, Procl Natl Acad Sci. USA 89:3116 (1992)。
ヒトＩＬ-１７は、可変のグリコシル化の２０−３０ｋＤａのジスルフィド結合ホモ二量体タンパク質である。上掲のYao-１；上掲のFossier等。それは、１９−２３アミノ酸のＮ末端分泌シグナル配列を含む１５５のアミノ酸のオープンリーディングフレームによりコードされている。ＩＬ-１７のアミノ酸配列は上述のヘルペスウィルスタンパク質に類似しているだけで、他のサイトカイン又は他の既知のタンパク質の配列とは有意な同一性を示していない。また、ＩＬ-１７をコードしているｍＲＮＡは活性化されたＣＤ４＋メモリーＴ細胞及びＰＭＡ／イオノマイシン刺激ＰＢＭＣ細胞においてだけ検出されている。
【０００４】
その制限された組織分布にも拘わらず、ＩＬ-１７は、様々なタイプの細胞、例えば線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞に対して多面的な生物活性を示す。Spriggs, M.K.,上掲; Broxmeyer, H.E.,上掲。ＩＬ-１７は次の多くのサイトカインの生産を刺激することが見出された：マクロファージ由来のＴＮＦ-α及びＩＬ-１β[Jovanovic等, J. Immunol 160:3513(1998)]；ヒト線維芽細胞由来のＩＬ-６、ＩＬ-８及び細胞内接着分子(ＩＣＡＭ-１)Fossiez等,上掲, Yao等, J. Immunol. 155:5483(1995)[Yao-2]；滑膜細胞由来のプロスタグランジン(ＰＧＥ-２)及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＭ）、Fossiez,上掲。多数のサイトカインの誘発を通して、ＩＬ-１７は、殆どは炎症誘発性及び造血性の広い範囲の応答を媒介することができる。これにより、ＩＬ-１７は炎症反応を開始又は維持するのに中心的な役割を担っているという示唆が導かれる。Jovanovic等, 上掲。
ＩＬ-１７の広範囲の効果と一致してＩＬ-１７の細胞表面レセプターは多く組織及び細胞型において広く発現されることが見出された。Yao等, Cytokine 9:794 (1997)[Yao-3]。ｈＩＬ-１７レセプター（８６６a.a.）のアミノ酸配列は、単一の膜貫通ドメインと長い５２５アミノ酸細胞内ドメインを持つタンパク質を予測するが、レセプター配列は独特であり、サイトカイン／成長因子レセプターファミリーからの何れのレセプターのものとも類似していない。このことは、他の既知のタンパク質とのＩＬ-１７の類似性の欠如と併せて、ＩＬ-１７とそのレセプターがシグナル伝達タンパク質及びレセプターの新規なファミリーの一部でありうることを示している。
ＩＬ-１７は、更に細胞内シグナル伝達により、ヒトマクロファージにおいて一過性のＣａ２＋流入と[ｃＡＭＰ]ｉの減少を刺激することが示されている。Jovanovic等、上掲。ＩＬ-１７で処理された線維芽細胞とマクロファージはＮＦ-κＢの活性化を誘発する一方（Yao-１,上掲、Jovanovic等,上掲）、それで処理されたマクロファージはＮＦ-κＢと分裂促進因子活性化プロテインキナーゼを活性化させる。Shalom-Barek等, J.Biol.Chem. 273:27467 (1998)。
本発明は、ＰＲＯ１０３１（ＩＬ-１７Ｂ）及びＰＲＯ１１２２（ＩＬ-１７Ｃ）と命名した二つの新規なタンパク質と、ＩＬ-１７とアミノ酸配列が類似しているその活性な変異体のクローニングと特徴付けを記述する。
【０００５】
（発明の概要）
出願人は、ＩＬ-１７と配列同一性を有する新規なポリペプチドで、本出願において「ＰＲＯ１０３１」又は「ＰＲＯ１１２２」と命名したポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離核酸分子を提供する。
一側面では、単離核酸は、図１(配列番号：１)のアミノ酸残基約２１〜１８０、又は図３(配列番号：３)の約１９〜１９７をそれぞれ含むＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなり、あるいはそのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合によっては高度に緊縮性の条件下でそれに安定して結合したまま残る。
他の実施態様では、単離核酸は、（ａ）図１(配列番号：１)のアミノ酸残基１又は約２１〜１８０の配列、又は図３(配列番号：３)のアミノ酸残基１又は約１９〜１９７を、それぞれ含むＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有している。あるいは、単離核酸は、図３(配列番号：３)のアミノ酸残基１〜１８０を有するＰＲＯ１０３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。あるいは、単離核酸は、図１(配列番号：１)のアミノ酸残基約１〜約１９７の配列を有する１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。
【０００６】
他の側面では、本発明は、それぞれ残基：（ａ）図２（配列番号：２）に示された４２〜約５８１、又は（ｂ）図４（配列番号：４）の４９〜約６４０の間の核酸の相補鎖とハイブリッド形成するＤＮＡを含んでなるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする単離核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成範囲は、それぞれ、核酸残基（ａ）図２（配列番号：２）の約１０２〜約５８１、又は（ｂ）図４（配列番号：４）の約１０４〜約６４０まで至る。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で生じる。
他の側面では、本発明は、（ａ）図１(配列番号：１)のアミノ酸１又は約２１〜約１８０、又は（ｂ）図３（配列番号：３）の１又は約１９〜約１９７をコードする核酸配列の相補鎖とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含んでなる活性なＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする単離核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で生じる。
更なる側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号第２０９８６６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）又は２０３５５２（ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているＤＮＡを含んでなる単離核酸分子に関する。好適な実施態様では、核酸は、１９９８年５月１４日と１９９８年１２月２２日にそれぞれ寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０９８６６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）又は２０３５５２（ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。更に好適な実施態様では、核酸は１９９８年５月１４日に寄託されたＡＴＣＣ寄託ＤＮＡ５９２９４−１３８１（ＡＴＣＣ２０９８６６）又は１９９８年１２月２２日に寄託されたＤＮＡ６２３７７−１３８１−１（ＡＴＣＣ２０３５５２）のｃＤＮＡ挿入断片を含んでなる。
【０００７】
他の側面では、本発明は、（ａ）（１）ＡＴＣＣ寄託番号第２０９８６６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）で１９９８年５月１４日に又は（２）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５２（ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１）で１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡによりコードされる全長ポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸分子に関する。好適な実施態様では、単離核酸分子は、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６６又は２０３５５２のｃＤＮＡ寄託物と同じ全長ポリペプチドをコードする。
【０００８】
更なる側面では、単離核酸分子は、（ａ）図２(配列番号：２)のヌクレオチド約４２又は約１０２〜約５８１の配列、又は図４(配列番号：４)の約４９又は約１０４〜約６４０の配列を含んでなるＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
他の側面では、単離核酸分子は、（ａ）図２(配列番号：２)の約４２又は約１０２〜約５８１、又は図４(配列番号：４)の約４９又は約１０４〜約６４０のヌクレオチド配列；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含んでなる。
更なる側面では、本発明は、（ａ）（ｉ）図１(配列番号：１)の約１又は約２１〜約１８０のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１０３１ポリペプチド、又は（ｉｉ）図３（配列番号：３）の約１又は約１９〜約１９７のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリッド形成し、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する場合、試験ＤＮＡ分子を単離することにより、生産される単離核酸分子に関する。
【０００９】
また更なる側面では、本発明は、(ａ)（ｉ）図１(配列番号：１)の約２１〜約１８０、又は（ｉｉ）図３（配列番号：３）の１９〜約１９７の残基のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８１％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８９％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９１％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９９％のポジティブのスコアを示すポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離核酸分子に関する。
特定の側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たないＰＲＯ１０３２又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離核酸分子を提供し、あるいはそのようなコード核酸分子に相補的であるものを提供する。シグナルペプチドは、（ａ）図１（配列番号：１）の配列のアミノ酸残基約１からアミノ酸残基約２０まで、あるいは（ｂ）図３（配列番号３）の配列の１からアミノ酸残基約１８まで伸展するものとして試験的に同定された。しかし、シグナルペプチドのＣ末端の境界は変化するが、最も可能性があるのはここで最初に同定されたようなシグナルペプチドのＣ末端の境界の何れかの側の僅か約５のアミノ酸に過ぎないことに留意すべきであり、ここで、シグナルペプチドのＣ末端の境界は当該分野で日常的に使用されている基準に従って同定することができる。Nielsen等, Prot. Engin. 10:1-6 (1997), von Heinje等, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)。更に、ある場合には、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全には一様ではなく、一以上の分泌種を生じることもまた認識される。これらのポリペプチド、及びそれをコードするポリヌクレオチドは本発明によって考慮される。しかして、本出願の目的に対して、図１（配列番号：１）又は図３（配列番号：３）にそれぞれ示したＰＲＯ１０３２又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのシグナルペプチドは、アミノ酸１からＸまで延び、ここでＸは（ａ）図１（配列番号：１）の１５〜２５、又は図３（配列番号：３）の１３〜２３の任意のアミノ酸である。
【００１０】
他の実施態様は、例えばハイブリッド形成プローブとしての又は抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体に対する結合部位を含んでなるポリペプチドを場合によってはコードするＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの断片をコードするための用途が見出されるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード配列の断片に関する。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長さ、好ましくは少なくとも約３０のヌクレオチド長さ、より好ましくは少なくとも約４０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約６０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約７０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約８０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約９０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１１０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１２０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１３０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１４０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１６０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１７０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１８０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１９０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約２００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約２５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約３００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約３５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約４００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約４５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約５００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約６００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約７００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約８００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約９００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１０００のヌクレオチド長さであり、ここで、「約」は、その参照長さのプラスマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長さを意味する。好適な実施態様では、ヌクレオチド配列断片は、図４（配列番号：４）の約５０〜約３９０及び約６２１〜約６４０のヌクレオチドから取り出される。あるいは、ヌクレオチド配列断片は、少なくとも１つのヌクレオチドが領域の外（すなわち、５０−３９０、６２１−６４０）に含まれているものとして、３９１と６２０の間の領域内の断片から取り出すことができる。
【００１１】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２又はその変異体をコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。ベクターは上述した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
他の実施態様では、本発明は上記ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを生産するための方法が更に提供され、これは、それぞれＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現に対して適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれ回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は上述の単離核酸配列の何れかによってコードされる単離ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを提供する。
他の側面では、本発明は、（ａ）図１(配列番号：１)の約１又は約２１〜約１８０のアミノ酸残基の配列、又は（ｂ）図３（配列番号：３）の１又は約１９〜約１９７のアミノ酸残基の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに関する。好適な側面では、ポリペプチドは、（ａ）図１(配列番号：１)の約１又は約２１〜約１８０、又は（ｂ）図３（配列番号：３）の１又は約１９〜約１９７のアミノ酸残基を含んでなる。
【００１２】
更なる側面では、本発明は、（１）ＡＴＣＣ寄託番号第２０９８６６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）で１９９９年５月１４日に、又は（２）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５２で１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに関する。
好適な実施態様では、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号第２０９８６６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）で１９９８年５月１４日に、又は（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５２（ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１）で１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現することにより得られ、あるいは得られうる。
【００１３】
更なる側面では、本発明は、(１)図１(配列番号：１)の約１又は約２１〜約１８０、又は（２）図３（配列番号：３）の約１又は約１９〜約１９７の残基のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８１％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８９％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９１％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９９％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに関する。
特定の側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離ＰＲＯ１０３２又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを提供し、上述されたようにそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを製造するための方法もまたここに記載され、この方法は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現に適した条件下で適切にコードする核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養からＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをそれぞれ回収することを含んでなる。
【００１４】
また更なる側面では、本発明は、（１）（ａ）（ｉ）図１(配列番号：１)の約２１〜約１８０のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１０３１ポリペプチド、又は（ｉｉ）図３（配列番号：３）の約１９〜約１９７のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリッド形成し；ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する場合、（２）ポリペプチドの発現に適した条件下で試験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を培養し、（３）細胞培養からポリペプチドを回収することにより、生産されるポリペプチドを提供する。
【００１５】
更に他の側面では、本発明は、（１）図１(配列番号：１)の約１又は約２１〜約１８０、又は（２）図３（配列番号：３）の約１又は約１９〜約１９７のアミノ酸残基の配列を有する単離ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又は生物活性であるか抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体に対して結合部位を提供するのに十分であるその断片に関し、ここで生物活性を有するか抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体に対して結合部位を提供するＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド断片のそれぞれの同定は、当該分野でよく知られている方法を使用して常套的な方法で達成することができる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含んでナルキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが含まれる。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。
更に他の実施態様では、本発明は、未変性のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の側面では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体、あるいは小分子である。
【００１６】
更に他の実施態様では、本発明は、未変性ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを候補分子に接触させ、上記ポリペプチドにより媒介される生物活性をモニターすることにより、未変性ＰＲＯ１０３１又は未変性ＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、担体と組み合わせて、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニストを含んでなる組成物に関する。好ましくは、担体は製薬的に許容可能である。
また更なる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト（例えば抗ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２）に対して応答性である症状の治療に有用な医薬を調製するための、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体の用途に関する。特定の側面では、本発明は、変性軟骨疾患を治療するためのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの用途に関する。
【００１７】
また更なる実施態様では、本発明は、疾患に罹っている哺乳動物にＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を投与することにより、変性軟骨疾患を治療する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、（１）ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２を発現する試験細胞又は組織を培養し；（２）ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変性シグナル伝達を阻害可能な化合物を投与し；（３）試験細胞におけるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２媒介表現型効果を測定することにより、変性軟骨疾患を診断する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２アンタゴニスト及び／又はアゴニスト分子に関する。一側面では、本発明はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２を模倣する化合物（アゴニスト）又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の効果を消滅させる化合物（アンタゴニスト）をスクリーニングする方法を提供する。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて、治療的有効量のＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、そのアンタゴニスト又はアゴニストを含んでなる治療組成物に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて、治療的有効量のＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、そのアンタゴニスト又はアゴニストを含んでなる製造品に関する。
【００１８】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯ１０３１ポリペプチド」、又は「ＰＲＯ１１２２ポリペプチド」及び「ＰＲＯ１０３１」、又は「ＰＲＯ１１２２」という用語は、それぞれ天然配列ＰＲＯ１０３１、天然配列ＰＲＯ１１２２及びそのポリペプチド変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯ１０３１ポリペプチド」又は「天然配列ＰＲＯ１１２２ポリペプチド」は、天然由来のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１２２ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯ１０３１ポリペプチド」又は「天然配列ＰＲＯ１１２２ポリペプチド」という用語は、特に、それぞれＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に生じる変異体型(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００１９】
本発明の一実施態様において、天然配列ＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、全長又は成熟天然配列の、（ａ）図１(配列番号：１)のアミノ酸１又は２１〜１８０を含むＰＲＯ１０３１ポリペプチド又は（ｂ）図３(配列番号：３)のアミノ酸１又は１９〜１９７を含むＰＲＯ１１２２ポリペプチドである。また、図１及び図３にそれぞれ開示されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド（すなわち、ＵＮＱ５１６及びＵＮＱ５６１）は、アミノ酸位置１と命名されたメチオニン残基で始まることが示されているが、図１又は図３のアミノ酸位置１から上流又は下流に位置している他のメチオニン残基が開始アミノ酸残基として使用することが考えられ可能である。
「ＵＮＱ５１６」又は「ＵＮＱ５６１」という用語は、それぞれ図１又は３にそれぞれ示された特定の天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２タンパク質を意味する。場合によっては、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、それぞれＡＴＣＣ寄託番号２０９８６６又は２０３５５２のベクターＤＮＡ５９２９４−１３８１又はＤＮＡ６２３７７−１３８１−１のｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られ又は得られうる。
【００２０】
「ＰＲＯ１０３１変異体」又は「ＰＲＯ１１２２変異体」とは、全長又は成熟天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対してそれぞれ図１（配列番号：１）に示された残基（１）１又は約２１〜約１８０、又は図３（配列番号：３）に示された残基（２）１又は約１９〜約１９７の推定上アミノ酸配列をそれぞれ有するＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義する「活性な」ＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド変異体には、例えば、図１（配列番号：１）又は図３（配列番号：３）の配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、置換もしくは欠失されたＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド変異体は、シグナルペプチドを持つか持たない（例えば配列番号：１のシグナルペプチドアミノ酸残基１〜１８０、配列番号：３の１〜１９７を持つ、配列番号：１のシグナルペプチド約２１〜１８０、配列番号：３の約１９〜１９７を持たない）図１（配列番号：１）又は図３（配列番号：３）のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ここに提供される変異体からは、天然配列ＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２配列並びにＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２ポリペプチドが１００％同一性を共有し及び／又は従来において既に知られているここに記載されたポリペプチド及び核酸は除かれる。
【００２１】
ここで同定されたＰＲＯ１０３１アミノ酸配列に対しての「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ１０３１ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の方法、例えばALIGN、ALIGN-２、Megalign(DNASTAR) 又はBLAST（例えばBlast、Blast-2、WU-Blast-2）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、ここで使用される％同一性の値は、WU-BLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて発生される。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの、すなわち調節可能なパラメータは次の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。％アミノ酸配列同一性の値は、（ａ）WU-BLAST-2により決定される対象のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアミノ酸配列と対象の比較アミノ酸配列（すなわち、対象のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが比較されている配列）の間の一致するアミノ酸残基の数を（ｂ）対象のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアミノ酸残基の全数でそれぞれ除することにより決定される。
【００２２】
「ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体ポリヌクレオチド」又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体核酸配列とは、それぞれ図２（配列番号：２）に示されたＰＲＯ１０３１コードヌクレオチド配列のヌクレオチド（１）約４２又は約１０２〜約５８９又は約６８７；あるいは図４（配列番号：４）に示されたＰＲＯ１１２２コードヌクレオチド配列のヌクレオチド（２）約５９又は約１０４〜約６４０又は約１０４３のヌクレオチド酸配列と少なくとも約６５％の核酸配列同一性を有する以下に定義する「活性な」ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドコード核酸分子を意味する。通常、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、それぞれ図２（配列番号：２）に示されたＰＲＯ１０３１コードヌクレオチド配列のヌクレオチド（１）約４２又は約１０２〜約５８９；あるいは図４（配列番号：４）に示されたＰＲＯ１１２２コードヌクレオチド配列のヌクレオチド（２）約５９又は約１０４〜約６４０のヌクレオチドの核酸配列と、少なくとも約６５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７０％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約７５％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８０％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体からは特に、天然ヌクレオチド配列、並びに本発明のヌクレオチド配列と１００％同一性を共有する従来の配列は除かれる。
【００２３】
ここで同定されるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばALIGN、ALIGN-２、Megalign(DNASTAR) 又はBLAST（例えばBlast、Blast-2）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的に対して、％核酸同一性の値は、WU-BLAST-2（ＢｌａｓｔＮモジュール）コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて発生される。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの、すなわち調節可能なパラメータは次の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的に対して、％核酸配列同一性の値は、（ａ）WU-BLAST-2により決定される対象のＰＲＯポリペプチドコード核酸分子の核酸配列と対象の比較核酸分子（すなわち、対象のＰＲＯポリペプチドコード核酸分子が比較されている配列）の間の一致する同一ヌクレオチドの数を（ｂ）対象のＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチドの全数で除することにより決定される。
【００２４】
他の実施態様では、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体ポリペプチドは活性なＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコード化し、図２（配列番号：２）又は図４（配列番号：４）にそれぞれ示された全長ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下でハイブリッド形成可能な核酸分子である。変異体ポリヌクレオチドのこの範囲には、本出願の出願日及び／又は優先日には知られている配列は特に含まれない。更に、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体ポリペプチドはまたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体ポリヌクレオチドによりそれぞれコードされるものでありうる。
上記のように実施された配列比較において、「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として）を含む。ポジティブの％値は、BLOSUM62マトリクス内でポジティブな値が付けられた残基のフラクションによって決まる。この値は、（ａ）WU-BLAST-2により決定される対象のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドアミノ酸配列と比較アミノ酸配列（すなわち、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド配列が比較されているアミノ酸配列）の間のWU-BLAST-2のBLOSUM６２マトリックスにおけるポジティブな値をつけるアミノ酸残基の数を（ｂ）対象のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアミノ酸残基の全数で除することにより決定される。
【００２５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは天然に付随するあらゆる成分が付随していないものである。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２６】
「単離された」ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、ＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される型あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをそれぞれコードする核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯ１０３１ポリペプチド又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをそれぞれコードする核酸分子を含む。
【００２７】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に関連したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に関連」している。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に関連している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に関連している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に関連している。一般的に、「作用可能に関連している」とは、関連しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。関連は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２８】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合に変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細と説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％のホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって特定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように特定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーションに、１ｘＳＳＣ中約３７−５０℃でのフィルターの洗浄が続くといったものである。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは認識するであろう。
【００２９】
ここで用いられる場合の「エピトープタグ」という用語は、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又はそのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは抗体がそれに対して生成されるか、ある他の薬剤によって同定することができるエピトープを提供するのに十分であるが、ＰＲＯ１０３１またはＰＲＯ１１２２ポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い残基を有する。タグポリペプチドはまた好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは一般に少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜約２０残基）を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３０】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、単一抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２ポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体組成物、一本鎖抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体、及び抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体の断片を特に包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を意味する。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の形態を意味する。更に詳細には、「生物」活性は、未変性又は天然に生じるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２が保有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力以外の未変性又は天然に生じるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２により引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫」活性は未変性又は天然に生じるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２が保有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘発する能力のみを意味する。好ましい生物活性には、例えばＴＨＰ１細胞からのＴＮＦ-αの放出が含まれる。他の活性は、関節軟骨からのＩＬ-１α誘発ＮＯ（一酸化窒素）生産の減少である。
【００３１】
「変性軟骨性疾患」は主に軟骨基質の破壊によって特徴づけられる多くの疾患を記述している。更なる症状には、一酸化窒素生産及びプロテオグリカン分解の増加が含まれる。この定義に包含される疾患の例には、例えば関節炎（例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎）、敗血症、潰瘍性大腸炎及びシェーグレン症候群が含まれる。
「アンタゴニスト」という用語は最も広い意味に使用され、ここに開示された天然ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの生物活性を部分的又は全体的に阻止し、阻害し又は中和する任意の分子を含む。同様に、「アゴニスト」という用語は最も広い意味に使用され、ここに開示された天然ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に天然ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、ペプチド、小有機分子等々のアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片又はアミノ酸配列変異体を含む。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子に接触させ、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに通常伴う一又は複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含む。
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、また骨髄腫により増大したレベルで生産される。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、特に、制限なしに、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から生成された多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及び所望の生物活性を示す限り抗体断片が含まれる。
【００３２】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」という用語は、治癒的療法、予防的療法及び防止的療法を意味する。「防止的療法」の例は対象とする病理的症状又は疾患を防止あるいは低減させることである。治療が必要なものには、既に疾患に罹っているもの並びに疾患に罹っていると思われるもの又は疾患が防止されるべきものが含まれる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
ここで使用されるところの「哺乳動物」という用語は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
「治療的有効量」は、哺乳動物に治療的恩恵を付与するのに必要な活性剤（例えば、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、そのアンタゴニスト又はアゴニスト）の最小量である。例えば変性軟骨性疾患に罹っているか罹っている恐れがある哺乳動物への、あるいは哺乳動物がそれに罹ることを防止するための「治療的有効量」は、主に軟骨基質の破壊により特徴付けられる疾患に付随する病理的徴候、疾患の進行、生理的症状の改善又はその疾患に屈することへの抵抗を誘発、改善あるいは生じるような量である。
【００３３】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＲ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Engin. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ’)２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００３５】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３６】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えばＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はそれに対する抗体）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」は約５００ダルトン以下の分子量を有するものとここでは定義される。
「変調する」という用語は、シグナル伝達経路のレベルに影響を及ぼす（例えば、アップレギュレート、ダウンレギュレート又は他の調節）。シグナル伝達の制御下での細胞プロセスには、限定されるものではないが、特異的遺伝子の転写、正常な細胞機能、例えば代謝、増殖、分化、接着、アポトーシス及び生存、並びに異常なプロセス、例えば形質転換、分化及び転移の阻止が含まれる。
【００３７】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０３１（例えばＵＮＱ５１６、ＩＬ-１７Ｂ、配列番号：１）及びＰＲＯ１１２２（例えばＵＮＱ５６１、ＩＬ-１７Ｃ、配列番号：３）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２がＩＬ-１７と配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２ポリペプチドがサイトカインファミリーの新規に同定されたメンバーであり、よって炎症及び／又は免疫系機能に関与しうると考えられている。
先に示したように、「ＰＲＯ１０３１」又は「ＰＲＯ１１２２」という用語は天然配列と変異体を意味する一方、「ＵＮＱ５１６」又は「ＵＮＱ５６１」なる用語は、それぞれ図１（配列番号：１）及び図３（配列番号：３）の特定のアミノ酸配列、及び／又はそれぞれ寄託番号２０９８６６及び２０３５５２でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を意味する。
以下の実施例に開示するように、ＤＮＡ５９２９４−１３８１及びＤＮＡ６２３７７−１３８１−１とここで命名されたｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託された。クローンの実際のヌクレオチド配列は当該分野において常套的な方法を使用して寄託クローンを配列決定することにより当業者により容易に決定されうる。推定上アミノ酸配列は日常的な技量を用いてヌクレオチド配列から決定することができる。ここに記載されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド及びコート核酸に対して、本出願人はそのとき利用できる配列情報で最もよく同定可能なリーディングフレームであると信じられるものを同定した。
【００３８】
Ｂ．ＰＲＯ１０３１及びＰＲＯ１１２２変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに加えて、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２変異体は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コードＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２又はここに記載したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２と比較してＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。何れのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を（下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもの）のような活性について試験することにより決定される。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片はＮ末端又はＣ末端で切断されていてもよいし、例えば全長又は天然タンパク質と比較した場合、内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの所望の生物活性に対して必須ではないアミノ酸残基を欠く。
【００３９】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２断片は多くの一般的な方法の任意のものによって調製することができる。所望のペプチド断片を化学的に合成することもできる。他のアプローチ法は、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定まる部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理するか、適当な制限酵素でＤＮＡを消化させることによりＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。更に他の好適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)により所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいて５'及び３'プライマーとして使用する。好ましくは、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド断片は図１（配列番号：１）又は図３（配列番号：３）に示した天然ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を分かち持つ。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付け、又は以下にアミノ酸分類を参照して更に記載するような、より大幅な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
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【００４０】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：sys, ser, thr;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００４１】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ１０３１コード変異体ＤＮＡを生産することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するためにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見いだされることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００４２】
Ｃ．ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の修飾
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロプリオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００４３】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加及び／又はグリコシル化部位に結合した糖残基の比率及び／又は組成の変更を意味する。また、該語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質と割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達成することができる。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００４４】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法での結合を含む。
【００４５】
また、本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを容易に精製できるようにする。
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００４６】
他の実施態様では、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの融合を含みうる。キメラ分子の二価型では、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものでありうる。Ｉｇ融合は好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりにＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの可溶（欠失又は不活性化可溶型膜貫通ドメイン）型の置換を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の生産については１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号をまた参照されたい。
また更なる実施態様では、本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドはまたロイシンジッパーに融合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を生じるように修飾することもまたできる。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); ＷＯ９４／１０３０８；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに融合したロイシンジッパーの使用は溶液中で可溶性ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを二量体化又は三量体化するのを補助するのに望ましいと思われる。当業者であれば、ロイシンジッパーをＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２分子のＮ末端又はＣ末端の何れかに融合しうることは理解するであろう。
【００４７】
Ｄ．ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の調製
以下の説明は、主として、所望のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。所望のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを生産してもよい。
【００４８】
１．ＰＲＯ１０３１をコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡは、所望のＰＲＯポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コードＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は既知の合成法（例えば自動合成法、オリゴヌクレオチド合成法）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ１０３１をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００４９】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較しアラインメントすることができる。分子の定まった領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、（例えば、相同性を特定するために様々なアルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＩＮＨＥＲＩＴ及びＡＬＩＧＮ-２等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通してのような）当該分野で知られ、ここに記載された方法を使用して決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【００５０】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５１】
ここに記載のベクターに核酸（例えばＤＮＡ）をクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞には、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞が含まれる。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebisella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は例示であり限定ではない。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク分解性酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００５２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９９５年５月２日公開のＥＰ１３９３８３）；クルベロミセスホスツ(Kluyveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーサーモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070）; Seekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Balance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。メチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択される。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００５３】
グリコシル化ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００５４】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
所望のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コードＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００５５】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００５６】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード核酸配列に作用可能に関連し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００５７】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００５８】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コードＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００５９】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２を組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの性質に依存する。
【００６０】
Ｅ．ＰＲＯ１０３１の用途
本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード化核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの調製に有用であろう。
全長ＤＮＡ５９２９４−１３８１ヌクレオチド配列（配列番号：２）、全長ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１ヌクレオチド配列（配列番号：４）又は全長天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ヌクレオチドコード化配列、又はその一部は、全長ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２遺伝子の単離又は図２（配列番号：２）又は図４（配列番号：４）にそれぞれ開示されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ヌクレオチド配列と所望の配列同一性を有する更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の天然に生じる変異体又は他の種からのものをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、それぞれ配列番号：２又は配列番号：４のＤＮＡ５９２９４−１３８１又はＤＮＡ６２３７７−１３８１−１ヌクレオチド配列から、又は天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード化ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００６１】
本出願で開示した任意のＥＳＴ配列（又はその断片）はプローブとして、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２核酸の一つの有用な断片には、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２（アンチセンス）配列の標的ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ｍＲＮＡ（センス）に結合可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡかＤＮＡの何れか）を含んでなるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明に係るアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ＤＮＡのコード領域の断片を含んでなる。そのような断片は一般に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを引き出す能力は例えばSteinとCohen, Cancer Res. 48:2659(1988)及びvan der Krol等, Bio Techniques 6:958 (1988)に記載されている。
核酸配列を標的とするアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合により、二重鎖の分解の増強、転写又は翻訳の早期停止を含む幾つかの手段の一つ、あるいは他の手段により標的配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖が形成される。しかしてアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２タンパク質の発現を阻止するために使用されうる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは更に変更された糖−ホスホジエステル骨格（あるいはＷＯ９１／０６６２９に記載されているもののような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖結合を持つそのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定である（すなわち、酵素分解に抗しうる）が、標的ヌクレオチド配列に結合可能である配列特異性を保持している。
【００６２】
センス又はアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１００４８に記載されているもののような有機部分及びポリ-Ｌ-リシンのような標的核酸配列に対して親和性を増加させる他の部分に共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。また更に、インカレート剤、例えばエリプティシン(ellipticine)、及びアルキル化剤又は金属錯体が、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変更させるためにアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドに付着されうる。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ４媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入法により、又はエプスタイン・バーウイルスのような遺伝子導入ベクターを使用して、標的核酸配列を含む細胞中に導入することができる。好適な手順では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは適切なレトロウィルスベクター中に挿入される。標的核酸配列を含む細胞がインビボかエキソビボで組み換えレトロウィルスベクターと接触させられる。限定されるものではないが、好適なレトロウィルスベクターには、マウスレトロウルスＭ-ＭｕＬＶ由来のもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕｌＶ由来のレトロウィルス）、又はＣＤＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクターが含まれる（ＷＯ９０／１３６４１を参照されたい）。
【００６３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまたＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との抱合体の形成により標的核酸配列を含む細胞中に導入することができる。限定されるものではないが、好適なリガンド結合分子には、細胞表面レセプター、成長因子、その他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の抱合体はリガンド結合分子のその対応する分子又はレセプターに結合し、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその抱合体バージョンの細胞内への侵入を阻止する能力を実質的に妨害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞内に導入されうる。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分離される。
また、プローブをＰＣＲ技術で用いて、密接に関連したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２配列の同定のための配列のプールを産生することができる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸配列は、また、そのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子障害を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブを作成するために用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００６４】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドがそれぞれレセプターとして機能する場合）、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、それぞれ、結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。そのような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に関与するタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは相関性のリガンド（類）を単離するために使用することができる。スクリーニングアッセイは、それぞれ天然ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２のレセプターの生物活性を模倣するリード化合物を発見するために設計できる。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、それらを小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考えられる小分子には、合成有機又は無機化合物が含まれる。アッセイは、当該分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００６５】
また、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその任意の修飾型の任意のものをコードする核酸は、治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用であるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するためにも使用できる。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。一実施態様では、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をコードするＤＮＡの発現の増加の影響を調べるために使用することができる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理症状からの保護をもたらすと思われる試薬に対するテスター動物として使用できる。本発明のこの態様では、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理症状の発症率が低ければ、病理症状に対する治療的処置の可能性が示される。
【００６６】
あるいは、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードする欠陥又は変更遺伝子を有するそれぞれＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をそれぞれコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用することができる選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)の数キロベースがベクターに含まれる［例えば、相同的組換えベクターの説明についてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。ついで、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性養育動物に移植し、胚を妊娠させて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を育種することができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが不在であることによるある種の病理症状及びその病理症状の進行に対する防御能力によって特徴付けることができる。
【００６７】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードする核酸はまた遺伝子療法に使用することができる。遺伝子療法の用途では、例えば欠陥遺伝子の置換のために治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞に導入される。「遺伝子療法」には、持続効果が単一の治療によって達成される一般的な遺伝子療法と、治療的有効量のＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療剤の投与の双方が含まれる。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを、ある種の遺伝子のインビボでの発現を阻止するための治療剤として使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された取り込みにより引き起こされるその低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用する細胞中に移入されうることは既に示されている。Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を無電荷基により置換することにより、その取り込みを亢進するように修飾することができる。
生細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。その技術は、核酸がインビトロで培養細胞中に移されるか、意図した宿主の細胞中にインビボで移されるかどうかに依存して変わる。哺乳動物細胞へのインビトロでの核酸の移送に好適な技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等々が含まれる。現在好適なインビボでの遺伝子移送技術には、ウィルス（典型的にはレトロウィルス）ベクターでの形質移入とウィルスコートタンパク質−リポソーム媒介形質移入（Dzau等, Trends in Biotechnology 11:205-210[1993]）が含まれる。ある状況では、核酸源に標的細胞をターゲッティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドを提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば特定の細胞型向けのキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的にし細胞内半減期を亢進するタンパク質を標的とする、及び／又は取り込みを容易にするために使用しうる。レセプター媒介エンドサイトーシスの方法は、例えばWu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414(1990)に記載されている。遺伝子標識及び遺伝子療法プロトコールについてはAnderson等, 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【００６８】
ここに記載したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドはまたタンパク質電気泳動法の目的のための分子量マーカーとして使用することもできる。
ここに記載したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体の同定のために有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体標識試薬はかなり少しのものしか現在は利用できないので、新しい染色体マーカーを同定する持続する必要性が存在する。本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２核酸分子は染色体マーカーとして使用することができる。
本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドと核酸分子はまた組織分類に対して使用することもでき、ここで本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは他のものと比較してある組織に差次的に発現されうる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２核酸分子はＰＣＲ法、ノーザン分析法、サザン分析法及びウェスタン分析法に対するプローブを産生するための用途が見出される。
ＩＬ-１７に関連した生物活性を持つ本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、治療用途に対してインビボでまたインビトロで使用することができる。当業者であればそのような目的のために本発明のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを如何にして使用するかはよく知っているであろう。
【００６９】
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２は、相対的な活性を決定するために、これらが同一性を有するポリペプチドでのアッセイにおいて使用することができる。結果は従って適用することができる。
ＩＬ-１７（配列番号：１１）の既知の配列とのＩＬ-１７Ｂ（例えばＵＮＱ５１６）（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）の予想アミノ酸配列のアラインメントは、これが３つのメンバーの間で２６−２８％のアミノ酸同一性を持つ関連した配列のファミリーであることを示している（図７）。全ての３つのポリペプチドは１８−２０のアミノ酸の分泌シグナル配列として機能することが期待される疎水性配列をＮ末端に含み、このファミリーの１５５〜１９７のアミノ酸（成熟ＭＷ１７〜２０ｋＤａ）のメンバーに対して予想されたサイズ範囲を与える。図７のアラインメントは、トリプトファン残基と５つのシステインをタンパク質のＣ末端の半分に含む、数個の保存アミノ酸を示している。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード核酸又はその断片はまた染色体局在化のために使用することができる。例えば、ＩＬ-１７Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）の染色体局在化は、ＩＬ-１７ＢとＩＬ-１７Ｃの３'未翻訳領域に設計されたＴａｑｍａｎプライマーとプローブを使用して決定されスタンフォード・レディエーション・ハイブリッド・パネルＧ３パネルでのＰＣＲにより実施された。ＩＬ-１７Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）はヒト染色体５ｑ３２−３４にマッピングする一方、ＩＬ-１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）は染色体１６ｑ２４に局在化した。ヒトＩＬ-１７自体は染色体２ｑ３１に見出される。Rouvier等, M. Immunol. 150:5445 (1993)。
【００７０】
ＩＬ-１７の二つの新しい関連物の単離と特徴づけにより、本出願人はこのファミリーのサイトカインが炎症誘発性の免疫及び他の応答において果たす潜在的な役割を確立し展開した。ファミリーの３つのメンバーであるＩＬ-１７（配列番号：１１）、ＩＬ-１７Ｂ（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）は、５の保存されたシステイン残基を含む約２７％の全体的アミノ酸同一性を持つ一次構造においてそこそこに関連している(図７)。３つのファミリーメンバーは多くの徳用を分かち持つ−それらは１５０−２００のアミノ酸残基長さであり、疎水性分泌シグナルを介して細胞から分泌され、ある場合にはグリコシル化されていると思われるジスルフィド結合ホモ二量体として発現される。
同じ遺伝子ファミリーのメンバーはアミノ酸配列類似性に基づいているが、３つのタンパク質は異なった組織において発現され、ゲノムに分散される。ＩＬ-１７の発現（配列番号：１１）は活性化されたＴ細胞においてのみ報告されている（Fossiez等, J. Exp. Med. 183:2593 (1996), Yao等, J. Immunol. 155: 5483 (1995)[Yao-3]）一方、ＩＬ-１７Ｂ（ＤＮＡ５９２９４）（配列番号：２）が正常なヒト成人膵臓、小腸、及び胃において発現されることがここで証明されている（図８）。しかし、ＩＬ-１７Ｃ（ＤＮＡ６２３７７）（配列番号：４）の発現パターンは、他の組織において確認された発現は未だ発見されていないので、更に制限されている。
【００７１】
ここに記載した特徴づけは、ＩＬ-１７Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）の生物活性が、ＩＬ-１７（配列番号：１１）に対して確立された活性とはかなり異なっていることを立証している。ＩＬ-１７Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）はそれぞれヒト包皮線維芽細胞においてＩＬ-６の生産の誘発に失敗している（実施例１０）（図９Ａ）。これは、ＩＬ-１７（配列番号：１１）に対して知られている顕著な誘発と対照的である。Yao等, Immunity 3:811 (1995)[Yao-1], Yao等, J. Immunol. 155:5483 (1995)[Yao-3]。逆に、ＩＬ-１７Ｂ（配列番号：１）とＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）は、それぞれ単球細胞株ＴＨＰ１からのＴＮＦ-αの放出を誘発するが、ＩＬ-１７は非常に小さな効果を有するのみである（図９Ｂ）。ＩＬ-１７Ｂ（配列番号：１）及びＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）によるＴＨＰ１細胞中におけるＴＮＦ-αの刺激された放出は、時間と濃度に依存し（実施例１０）（図１０）、ＩＬ-１７Ｂ（配列番号：１）はＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）よりも約１０倍以上強力である［ＩＬ-１７Ｂに対してＥＣ５０＝２．４ｎＭ対ＩＬ-１７Ｃに対して２５ｎＭ］。
【００７２】
ＩＬ-１７Ｂ又はＣ（配列番号：１及び３）と比較したＩＬ-１７（配列番号：１１）の異なった生物学的効果は、それらが、既知のＩＬ-１７レセプターとは異なった細胞表面レセプター（又はある種の異なったレセプター成分）を介して機能しうることを示唆している。Yao等, Cytokine 9:794 (1997)[Yao-3]。レセプター特異性の問題を直接調べるために、本出願人は、ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）の双方がＩＬ-１７レセプターＥＣＤ（配列番号：１６）（図１１Ａ）へ結合せず、またＩＬ-１７（配列番号：１１）のそのレセプターＥＣＤ（配列番号：１６）（図１１Ｂ）への結合に対して競合しないことを証明した。ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ（配列番号：３）はＴＨＰ１細胞の表面に結合し、そこでそれらは活性を有する（図１２）。相互作用は、少なくとも対照Ｆｃ融合タンパク質がこれらの細胞に結合しない程度に特異的である。その結果は、多くのサイトカインと成長因子ファミリーに対して見出されたレセプター／リガンドモデルである、結合しＩＬ-１７サイトカインのファミリーからのシグナルを伝達するレセプターの集合が存在しうることを示唆している。
ここに開示された新規なサイトカイン、ＰＲＯ１０３１（例えば５１６）とＰＲＯ１１２２（例えばＵＮＱ５６１）は、発現パターンと生物活性の点でＩＬ-１７（配列番号：１１）とは異なる。既知のＩＬ-１７レセプターとの相互作用のない状態で連関した差次的発現は、炎症誘発性免疫応答におけるＩＬ-１７ファミリーの拡大した役割を示唆している。
【００７３】
Ｆ．抗ＰＲＯ１０３１及び抗ＰＲＯ１１２２抗体
本発明は、さらに抗ＰＲＯ１０３１及び抗ＰＲＯ１１２２抗体を提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２ポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで産生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００７４】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００７５】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００７６】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００７７】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００７８】
３．ヒト化抗体
本発明の抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００７９】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００８０】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウス中にヒト免疫グロブリン座位を導入することにより産生されうる。投与時に、遺伝子再構成、構築及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。
【００８１】
４．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００８２】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ、グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒトリゾシーム(lysosyme)、ヒトグルクロニダーゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（例えばカルボキシペプチダーゼＧ２及びカルボキシペプチダーゼＡ）及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、そのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた知られている酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００８３】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより、抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該分野においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【００８４】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯ１０３１ポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望まれるならば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００８５】
国際公開９６／２７０１１号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同一又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要な他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００８６】
Ｆａｂ'断片は大腸菌から直接回収され得、化学的に結合されて二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)では、Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させている。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して利用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供している。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【００８７】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体はここに記載した所定の「Ｐｒｏ」タンパク質上の二つの異なったエピトープに結合しうる。あるいは、抗「ＰＲＯ」タンパク質アームは、特定の「ＰＲＯ」タンパク質を発現する細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のようなＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定の「ＰＲＯ」ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体は「ＰＲＯ」結合アーム及び細胞障害剤又は放射性核種キレーター、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。他の対象の二重特異性抗体は「ＰＲＯ」ポリペプチドに結合し、更に組織因子（ＴＦ）に結合する。
【００８８】
６．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されているものが含まれる。
【００８９】
７．エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合の形成を許容する。このようにして産生されたホモ二量体抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J.Exp.Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes,B. J.Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモ二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。別法として、二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevenson等, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【００９０】
８．免疫コンジュゲート
また本発明は、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒又はその断片)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に抱合した抗体を含有する免疫コンジュゲートに関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述した。使用可能な酵素的に活性なタンパク質毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、サポリン(saporin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。小分子毒素には、例えばカリケアミシン(calicheamicins)、マイタンシノイド(maytansinoids)、パリトキシン及びＣＣ１０６５が含まれる。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の生成に利用できる。具体例には２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【００９１】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６号を参照されたい。
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体がコンジュゲートされ得、ここで、抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００９２】
９．免疫リポソーム
ここで開示されている抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含むリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19):1484(1989)を参照されたい。
【００９３】
１０．抗体の製薬組成物
ここに同定されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに特異的に結合する抗体並びに上に開示したスクリーニングアッセイにより同定した他の分子は、製薬組成物の形態で様々な疾患の治療のために投与することができる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが細胞内であり、全抗体がインヒビターとして使用される場合は、内部移行抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームを、細胞中に抗体、又は抗体断片を送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術により生産することができる。例えばMarasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993)を参照されたい。
ここに記載した製剤はまた治療される特定の効能に対する必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでいてもよい。あるいは、又は加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば細胞毒性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤を含有しうる。このような分子は意図した目的に対して効果的な量で組み合わせて存在せしめるのが好適である。
活性成分はまたコロイド状薬剤送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)、又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルに捕捉されている。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal編 (1980)に開示されている。
【００９４】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により直ぐに達成される。
徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放製剤の好適な例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸γ-エチル-Ｌ-グルタマート、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴTM（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。酢酸エチレンビニル及び乳酸-グリコール酸のようなポリマーにより１００日以上にわたって分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは短い時間の間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長い間身体中に残る場合、抗体は３７℃での水分にさらされる結果、変性又は凝集し、生物活性の喪失と免疫原生の可能な変化が生じる。合理的な方策を関連する機構に依存して安定化するために案出することができる。例えば、もし凝集機構がチオスルフィド交換を通じての分子間Ｓ-Ｓ結合形成であることが発見されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成されうる。
【００９５】
Ｇ．抗ＰＲＯ１０３１及び抗ＰＲＯ１１２２抗体の用途
本発明の抗ＰＲＯ１０３１及び抗ＰＲＯ１１２２抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの診断アッセイ、例えば特定の細胞、組織、又は血清中での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
【００９６】
また、抗ＰＲＯ１０３１又は抗１１２２抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２１ポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含有する試料と接触させた後、固定された抗体に結合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００９７】
Ｈ．ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２及びＩＬ-１７アンタゴニスト／アゴニスト
この発明には、化合物をスクリーニングしてＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ０１７ポリペプチドを模倣するもの(アゴニスト)、又はＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドの影響を防止するもの(アンタゴニスト)を同定する方法が含まれる。アンタゴニスト候補薬剤のスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によりコードされるＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、ＩＬ-１７ポリペプチドと結合又は複合体を形成するか、又はコードされたポリペプチドの他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子候補薬剤の同定のために特に適したものにするアッセイを含む。
アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施することができ、それらはこの分野で良く特徴付けされている。例えば、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、ＩＬ-１７のシグナル伝達のアンタゴニスト及び／又はアゴニストをスクリーニングするために、アッセイ混合物は、候補となる製薬剤が存在しなかった場合、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７が参照活性でＴＨＰ-１細胞からのＴＮＦ-αの放出を誘発する条件下でインキュベートされる。また試験される活性は、ＩＬ１７及び／又はＩＬ-１α処理関節軟骨からのプロテオグリカン及び一酸化窒素(ＮＯ)の放出とできる。
【００９８】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離するかあるいは反応混合物中で検出することができる。特定の実施態様において、ここで同定された遺伝子によりコードされるＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチド又は候補薬剤は固相、例えばマイクロタイタープレートに、共有結合又は非共有結合により固定される。一般的に非共有結合はＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドの溶液で固体表面を塗布し、乾燥させることで達成される。別法として、固定化されるべきＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、固体表面にそれをアンカーすることもできる。アッセイは検出可能な標識で標識されうる非固定化成分を、検出可能な標識で標識されうる固定化成分、アンカー成分を含有する被覆表面等の固定化成分に添加することにより行われる。反応が完了した時に、非反応成分を、例えば洗浄することにより除去し、固体表面にアンカーされた複合体を検出する。当初は非固定化の成分が検出可能な標識を担持している場合、表面に固定された標識の検出は複合化が生じたことを示している。当初は非固定化の成分が標識を担持していない場合、複合化は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することにより検出することができる。
【００９９】
候補化合物が、ここで同定された遺伝子によりコードされる特定のＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１３２又はＩＬ-１７ポリペプチドと結合はしていないが相互作用するならば、そのポリペプチドとの相互作用はタンパク質-タンパク質相互作用を検出するためによく知られた方法でアッセイすることができる。このようなアッセイには、伝統的なアプローチ、例えば勾配又はクロマトグラフィーカラムによる共精製、共免疫沈降及び架橋が含まれる。加えて、タンパク質-タンパク質相互作用は勾配又はクロマトグラフィーカラムによりモニターすることもできる。さらにタンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5789-5791(1991)により開示されているようにして、Fields及び共同研究者(Fields and Song), Nature 340：245-246(1989)；Chienら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：9578-9582(1991)に記載されている酵母ベースの遺伝子系を使用することによりモニターすることができる。多くの転写アクチベータ、例えばＧＡＬ４は、２つの物質的に別々のモジュラードメインからなり、一つはＤＮＡ-結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして作用する。前述の刊行物に記載された酵母発現系(一般的に「２-ハイブリッドシステム」と呼称される)はこの性質を利用しており、２つのハイブリッドタンパク質、すなわち、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合したものと、活性化候補タンパク質が活性化ドメインに融合したものを使用する。ＧＡＬ４活性化プロモータのコントロール下でのＧＡＬ１-ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーはβ-ガラクトシダーゼに対する発色性基質を用いて検出される。２-ハイブリッド技術を使用して２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完成したキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontech社から商業的に入手可能である。またこのシステムは、特定のタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれらの相互作用に対して重要なアミノ酸残基の正確な特定に拡張することができる。
【０１００】
ここで同定されたＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内-又は細胞外成分の相互作用を妨害する化合物は、次のようにして試験することができる：通常、遺伝子産物と細胞内-又は細胞外成分を含む反応混合物が、相互作用し２つの生成物が結合し得る条件と時間の下で調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するため、被験化合物の不存在下と存在下で反応を起こさせる。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加し、正の対照にしてもよい。混合物中に存在する被験化合物と細胞内-又は細胞外成分の間の結合性(複合体形成)は上述したようにしてモニターされる。被験化合物を含有する反応混合物においてではなく、対照反応において複合体が形成されることは、被験化合物が被験化合物とその反応相手との相互作用を妨害することを示している。
【０１０１】
アンタゴニストは、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドと、膜結合性ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的なアンタゴニストを、競合阻害アッセイに適した条件下で組合せることにより検出されうる。ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドは放射能などで標識することができ、レセプターに結合したＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチド分子の数を使用して潜在的なアンタゴニストの効果を決定することができる。レセプターをコードする遺伝子は当業者に公知の多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定することができる。Coliganら, Current Protocols in Immun. 1(2)：Ch.5(1991)。好ましくは発現クローニングが使用され、ここでポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対して反応性の細胞から調製され、このＲＮＡからつくられたｃＤＮＡライブラリーがプールに分割され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞とそれぞれ形質移入させるために使用される。ガラススライド上で増殖している形質移入細胞を標識ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドに暴露する。ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異性タンパク質キナーゼに対する認識部位の封入を含む、種々の方法で標識することができる。固定化とインキュベートに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールが同定され、相互作用するサブプーリング及び再スクリーニング方法を使用し、サブプールが調製されて再度形質移入され、推定レセプターをコードする単一のクローンを最終的に生じる。
【０１０２】
レセプターの同定のための別のアプローチ法として、標識されたＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドを、レセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物と光親和結合させることができる。架橋物質をＰＡＧＥにより展開し、Ｘ線フィルムに露光する。レセプターを含む標識複合体を励起させ、ペプチド断片中に溶解し、タンパク質のミクロシークエンシングにかける。ミクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列を使用し、１組の縮重したオリゴヌクレオチドプローブを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
アンタゴニストに対する他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、標識されたＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドと共に、候補化合物の存在下でインキュベートする。ついでこの相互作用を高める又は阻止する化合物の能力を取り除く。
潜在的なアンタゴニストのより特定の例には、限定するものではないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化バージョン、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体等の、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドと免疫グロブリンの融合体に結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えばレセプターを認識するが、何の効果も付与せず、よってＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドの変異型であってよい。
【０１０３】
他の潜在的なＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドアンタゴニストはアンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、ここで、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質におけるその翻訳を妨げて、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス技術は３重らせんの形成を通して発現する遺伝子又はアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをコントロールするために使用することができ、その両方の方法はＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドに結合に基づいている。例えば、ここで成熟ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分は、ここで成熟ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドをコードし、約１０〜４０塩基対長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であるように設計され(３重らせん-Leeら, Nucl. Acids Res. 6：3073(1979)；Cooneyら, Science 241：456(1988)；Dervanら, Science 251：1360(1991)を参照)、よってＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの転写及び生成が妨げられる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする(アンチセンス-Okano, Neurochem. 546：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press：Boca Raton, FL. 1988))。また、前掲のオリゴヌクレオチドを、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボ発現して、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、ＩＬ-１７ポリペプチドの生成を阻害するように細胞に送達させることもできる。アンチセンスＤＮＡが使用される場合、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約-１０〜＋１０の部分である、翻訳開始部位から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１０４】
潜在的なアンタゴニストには、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子、又は他の関連した結合部位に結合する小分子が含まれ、よってＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はＩＬ-１７ポリペプチドの正常な生物学的活性がブロックされる。限定するものではないが、小分子の例には、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成の非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。
リボザイムはレセプターの特定の切断を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補性標的ＲＮＡに対し配列特異的にハイブリダイズし、endonuclytic的に切断することにより作用する。ポテンシャルＲＮＡ標的内における特定のリボザイム切断部位は、公知の技術で同定することができる。さらなる詳細は、例えばRossi, Current Biology 4：469-471(1994)及びＰＣＴ公報、国際公開第９７／３３５５１号(1997年9月18日)を参照のこと。
転写阻害のために使用される３重らせん形成における核酸分子は、一本鎖であり、デオキシヌクレオチドからなるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、それが、一般的に重複ストランドの一方にプリン又はピリミジンのかなり大きな伸長が必要とされる、フーグスティーン型塩基対法則を介して３重らせんの形成が促進されるように設計される。さらなる詳細は、例えば上掲のＰＣＴ公報である国際公開第９７／３３５５１号を参照のこと。
【０１０５】
Ｉ．診断的用途
ここに記載した本発明の化合物(例えばＰＲＯ１０３１-ＰＲＯ１１２２-変異体及び抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体)の他の用途は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２調節シグナル伝達により疾患が幾分進行したか否かの診断を助けることである。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２シグナル伝達によって特定の疾患(例えば変性軟骨疾患)が導かれるか否かを決定する診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：(１)ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２を発現する細胞又は組織の培養；(２)ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２調節シグナル伝達を阻害できる化合物の投与；及び(３)テスト細胞におけるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２媒介フェノタイプ効果の測定。工程は、本開示に照らして標準的な技術を用いて実施できる。例えば、細胞又は組織の単離及び培養又はインビボで標準的な技術を使用できる。
【０１０６】
選択性の程度が変化した化合物は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の役割を診断するのに有用である。例えば、他の形態のアダプター分子に加えてＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２に対する化合物は、幾つかのアダプター分子が疾患を導くか否かを決定する最初のテスト化合物として使用できる。選択的化合物は、次いで、疾患の誘導における他のアダプタータンパク質の可能な役割をさらに排除するのに使用できる。テスト化合物は、細胞毒性効果の発揮よりも、細胞内シグナル伝達活性の阻害において有力であるべきである(例えば、ＩＣ５０／ＩＤ５０が１より大きい)。ＩＣ５０及びＩＤ５０は、ＭＴＴアッセイ等の標準的技術、又はＬＤＨ放出量の測定により測定できる。化合物のＩＣ５０／ＩＤ５０の程度は、診断アッセイの評価を考慮すべきである。一般的に、比率が大きくなると情報がより相対的になる。適切な対照は、化合物の起こりうる毒性効果を考慮し、例えば、増殖疾患を伴わない細胞(例えば対照細胞)の試験化合物での処理は、診断アッセイの一部として用いることができる。本発明の診断方法は、変性軟骨疾患に対するＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の効果を調節する薬剤についてのスクリーニングを含む。例示的な検出技術は、放射性標識及び免疫沈降を含む(米国特許第５３９５９１５号)。
【０１０７】
例えば、抗体断片を含む抗体は、疾患関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を定量的又は定性的に検出するために使用することができる(「マーカー遺伝子生成物」)。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を担持し、その結合性を光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、あるいは他の当該分野で知られている方法によりモニターすることができる。
マーカー遺伝子生成物に結合する抗体のインシトゥー検出は、例えば免疫蛍光法又は免疫電気顕微鏡法により行うことができる。この目的のために、患者から組織標本を取り出し、標識抗体を、好ましくは生物サンプル上に抗体をオーバーレイさせることにより、適用する。また、この手順により、検査される組織におけるマーカー遺伝子生成物の分布を測定することもできる。当業者において、幅広い多様な組織学的方法がインシトゥー検出で容易に使用できることは明らかである。
【０１０８】
Ｊ．製薬用組成物
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２、それらのアンタゴニスト又はアゴニスト(例えば抗体)、並びにここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定された他の分子は、治療剤として使用することができる。このような治療剤は、製薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従い調製され、それによりＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２、それらのアンタゴニスト又はアゴニストが製薬的に許容可能な担体媒体との混合物として組み合わされる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２のアンタゴニスト又はアゴニスト抗体の場合、増幅遺伝子によりコードされるタンパク質が細胞内にあり、全抗体がインヒビターとして使用されるならば、内部移行抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクション又はリポソームを抗体、又は抗体断片を細胞内に送達させるために使用することもできる。抗体断片が使用されるならば、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、ペプチド分子を標的タンパク質配列に結合する能力が保持されるように設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成及び／又は組換えＤＮＡ技術により生成することができる(例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：7889-7893[1993])。
【０１０９】
治療用調製物は、所望の純度を持つ活性成分を任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980))と、凍結乾燥した調製物又は水溶液の形態で混合することにより調製され保管される。許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１０】
ここで、調製物は、治療される特定の指示に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。あるいは、又は加えて、組成物は細胞障害剤、サイトカイン又は成長阻害剤を含有してもよい。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組合せて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol編(1980)に開示されている。
【０１１１】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで治療用組成物は滅菌アクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。放出を持続させるために組換えタンパク質をマイクロカプセル化することは、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン-(rhIFM-)、インターロイキン-２、及びＭＮ ｒｐｇ１２０で成功裏になされている。Johnsonら, Nat. Med. 2：795-799(1996)；Yasudaら, Biomed. Ther. 27：1221-1223(1993)；Horaら, Bio/Technology 8：755-758(1990)；Cleland, 「Design and Prodection of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere System」, Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman.編,(Penum Press：New York, 1995), 439-462頁；国際公開第９７／０３６９２号；国際公開第９６／４００７２号；国際公開第９６／０７３９９号；及び米国特許第５６５４０１０号。
【０１１２】
これらのタンパク質の持続放出調製物は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」:  Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), M. Chasin及び R. Langer (編), 1-41頁。
エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化抗体は、長時間体内に残存すると、３７℃の水分に曝されることで変性又は凝集し、生物学的活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。関連するメカニズムに応じて安定性を得るための合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリックス組成物を開発することで安定化を達成することができる。
【０１１３】
Ｋ．  治療方法
本発明の化合物を、ここで同定されている疾患関連遺伝子の過剰発現及び／又は活性化により特徴付けられる種々の病状の治療に使用することが考えられている。限定するものではないが、小さな有機及び無機分子、ペプチド、アンチセンス分子等を含むこのような抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、炎症及び免疫性疾患、特に関節炎等の軟骨マトリックス障害(例えば、骨関節症、乾癬性関節炎、慢性関節リューマチ)又は他の変成炎症疾患が含まれる。
本発明の活性剤、例えば抗体は、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、眼内、病巣内、経口、局所的、吸入又は持続放出により、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。
他の治療摂生を、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２、アンタゴニスト、又はアンタゴニスト、抗ガン剤、例えば本発明の抗体の投与と組合せてもよい。
病気の予防又は治療のための活性剤(例えば抗体)の適切な投与量は、上述するように、治療される病気の種類、病気の重症度及び過程、薬剤を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び薬剤の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。薬剤は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１１４】
本発明の製薬用組成物の用量及び望ましい薬剤濃度は、特に考慮される用途に応じて変化する。適切な用量と投与経路の決定を行うことは、通常、当業者の技量の範囲にある。動物実験で、ヒトの治療に有効な容量を決定するための信頼性のある指針が提供される。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti J.及びChappell. W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら編, Pergamon Press, New York 1989, 42-46に開示されているような原理に従い実施することができる。
ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、もしくはそれらのアンタゴニスト又はアゴニストをインビボ投与に使用する場合、通常の用量は投与経路に依存し、一日当り哺乳動物の身体の体重に対し約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上まで、好ましくは一日当り哺乳動物の身体の体重に対し１μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上までで変わり得る。特に、用量及び送達方法に対する指針は文献にて提供されており；例えば米国特許第４６５７７６０号、同５２０６３４４号又は同５２５５２１２号を参照のこと。異なる調製物が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが、これは本発明の範囲に含まれる。さらに、用量は一又は複数の別の投与、又は連続注入により投与される。病状に依存して、数日又はそれ以上、繰り返し投与して、病気の徴候が所望するように抑制されるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量摂生も有用である。この治療の進行具合は従来からの技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０１１５】
Ｌ．  製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の診断又は治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、ガラス瓶、シリンジ及びテスト用チューブ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の診断又は治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも１つの活性剤は典型的にはＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２ポリペプチド、それらのアンタゴニスト又はアゴニストである。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の診断又は治療に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及びパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【０１１６】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
(実施例)
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【０１１７】
実施例１：ヒトＰＲＯ１０３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)配列(必要ならな、分泌シグナル配列を含む)を、発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース(例えば、GenBank、Merck/Wash U.)及び独自に開発したＥＳＴデータベース(LIFESEQＴＭ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対して、初期仮想配列断片(コンセンサスアセンブリ)を構築した。さらに、初期コンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。結果得られたこのアセンブリはＤＮＡ４７３３２とも称されており、図５(配列番号：５)に示す。
【０１１８】
コンセンサスアセンブリを含有する一方の配列、Ｗ７４５５８(クローン３４４６４９)(配列番号：６)をさらに調査した。配列はＩＭＡＧＥconsortiumから得られたもので、これを分析した。Lennonら, Genomics 33：151(1996)。ＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０３１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＤＮＡ５９２９４-１３８１と命名される］(配列番号：２)及びＰＲＯ１０３１の誘導タンパク質配列(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)を与えた。
ＤＮＡ５９２９４-１３８１の全核酸配列を図２(配列番号：２)に示す。クローンＤＮＡ５９２９４-１３８１は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２-４４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８２-５８４の停止コドンで終端する(図２)(配列番号：２)。予測されるポリペプチド前駆体は１８０アミノ酸長である(図１)(配列番号：１)。図２(配列番号：１)に示した全長ＰＲＯ１０３１(ＵＮＱ５１６)タンパク質は、約２０４３７の見かけ分子量及び約９．５８のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９２４９-１３８１(配列番号：２)はＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９８６６が付与されている。ここで提供された配列にいくつかの配列化における不規則性又は誤りがある場合、寄託されたクローンはＤＮＡ５９６２４(配列番号：２)として正しい配列を含むと理解される。更に、ここで提供された配列は既知の配列決定法の結果である。
全長ＰＲＯ１０３１ポリペプチドのアミノ酸配列(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)の分析は、それが新規なサイトカインであることを示唆している。
配列番号：２のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：２のおよそアミノ酸１-２０であることが明らかである。Ｎ-グリコシル化部位は配列番号：２のおよそアミノ酸７５-７８である。ＩＬ-１７と配列同一性を有する領域はおよそアミノ酸９６-１８０である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０１１９】
実施例２：ヒトＰＲＯ１１２２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ(ＥＣＤ)ＤＮＡデータベース(LIFESEQＴＭ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ＥＳＴを同定した。ＥＳＴはＤＮＡ４９６６５とも称されるＩｎｃｙｔｅ１３４７５２３(配列番号：７)であった。ＤＮＡ４９６６５(配列番号：７)に基づいて、１)ＰＣＲにより興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２)ＰＲＯ１１２２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。[Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、約１００-１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計されることが多い。プローブ配列は典型的には４０-５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１-１．５ｋｂｐより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡをAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology,のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
【０１２０】
ＰＣＲプライマー(正方向、逆方向及びハイブリッド形成)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-ATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCG-3'(配列番号：８)
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GGGACGTGGATGAACTCGGTGTGG-3'(配列番号：９)
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCGAGTGCCTGTGCAGAG-3'(配列番号：１０)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅してスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１２２遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
【０１２１】
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端(blunt)でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１１２２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＤＮＡ６２３７７-１３８１-１)と命名される］(配列番号：４)及び誘導タンパク質ＰＲＯ１１２２配列(ＵＮＱ５１６)(配列番号：３)が得られた。
【０１２２】
ＤＮＡ６２３７７-１３８１-１(配列番号：４)の全ヌクレオチド配列を図４Ａ-４Ｂ(配列番号：４)に示す。クローンＤＮＡ６２３７７-１３８１-１(配列番号：４)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：４(図４Ａ-４Ｂ)のヌクレオチド位置５０-５２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６４１-６４３の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は１９７アミノ酸長である(図３)(配列番号：３)。図３に示した全長ＰＲＯ１１２２タンパク質(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)は、約２１７６５の見積もり分子量及び約８．５３のｐＩを有する。クローンＤＮＡ６２３７７-１３８１-１は１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０３５５２が付与されている。ここで提供された配列にいくつかの配列化における不規則性又は誤りがある場合、正しい配列は寄託された配列である。さらにここで提供された全ての配列は公知の配列化技術の結果によるものである。
単離された全長ＰＲＯ１１２２(ＵＮＱ５６１)のアミノ酸配列の分析は、それがＩＬ-１７と類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１１２２(ＵＮＱ５６１)が新規なサイトカインとなりうることが示されている。また図３(配列番号：３)には、ＩＬ-１７と配列同一性を有する領域、ロイシンジッパーパターン、シグナルペプチドのおよその位置が示されている。対応するヌクレオチドは、例えば図４Ａ-４Ｂを参照にして、日常的に決定できる。
【０１２３】
実施例３：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２コード化ＤＮＡの使用
以下の方法は、ＰＲＯ１０３１をコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長ＰＲＯ１０３１(図２に示すもの、配列番号：２)、ＰＲＯ１１２２(図４に示すもの、配列番号：４)又はそれらの断片のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類(ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の天然発生変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１２４】
実施例４：大腸菌におけるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
全長ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１１２２又はそれらの断片又は変異体をコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅される。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例はｐＢＲ３２２(大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列を次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー(最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２コード領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離するこで採取する。遠心分離で得られた細胞ペレットは、当該技術で公知の種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１２５】
実施例５：哺乳動物細胞におけるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現によるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５(1989年3月15日発行の欧州特許第３０７２４７号参照)を用いた。場合によっては、ＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等, 上掲に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、それぞれｐＲＫ５-ＰＲＯ１０３１又はｐＲＫ５-ＰＲＯ１１２２と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を補足したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯ１０３１又はｐＲＫ５-ＰＲＯ１１２２ＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．３５)、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間沈殿させた。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１２６】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地(単独)又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞を、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯ１０３１又はｐＲＫ５-ＰＲＯ１１２２ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌのウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、馴化培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含む試料は濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製することができる。
【０１２７】
他の実施態様では、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯ１０３１又はｐＲＫ５-ＰＲＯ１１２２ベクターは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(単独)又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで馴化培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法により精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてよい。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで(上記のように)形質移入できる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０１２８】
実施例６：酵母菌でのＰＲＯ１０３１ポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。興味あるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを選択したプラスミドにおいて、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び(必要ならば)ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母細胞は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１２９】
実施例６：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの組換え発現を記載する。
ＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ(ＩｇＧのＦｃ領域など)を含む。ｐＶＬ１３９３(Navogen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡ又はＰＲＯ１０３１-又はＰＲＯ１１２２-コード化ＤＮＡの所望の部分(膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など)が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Ｓｆ９」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４から５日インキュベートした後、放出されたウイルスを収集し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１３０】
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、例えばＮｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ)中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８)で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagenから市販)を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０)で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０-タグＰＲＯ１０３１ポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ(又はＦｃタグ)ＰＲＯ１０３１ポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１３１】
実施例７：ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は当該技術で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１-１００マイクログラムで注入したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ１０３１又は抗-ＰＲＯ１１２２ポリペプチド抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を(３５％ポリエチレングリコールを用いて)、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０１３２】
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当該技術の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＰＲＯ１０３１又は抗-ＰＲＯ１１２２ポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１３３】
実施例８：ＲＮＡ発現
種々のヒト組織からのポリＡ＋ＲＮＡ(レーン当り２μｇ)を含有するマルチ-組織ブロットをClontechから購入した(Palo alto, CA)。ヒトＩＬ-１７Ｂの全コード配列(ＵＮＱ５１６)(７００ｂｐ)(配列番号：１７)とＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(１．１ｋｂｐ)(配列番号：１８)をハイブリッド形成プローブとして使用した。ＤＮＡプローブをランダムプライムＤＮＡラベルビーズ(Pharmacia Biotech)により[α-３２Ｐ]-ｄＣＴＰでラベルした。ハイブリッド形成は放射能標識されたプローブを含有するExpresshyb(Clontech)を使用し、６８℃で１時間行った。ついで、ブロットを２ｘＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ溶液を用い、室温で４０分間洗浄し、次に新鮮な溶液に変えて、０．１ｘＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ溶液を用い、５５℃で４０分間洗浄した。ブロットをホスホリマガー(phosphorimager)にさらし、得られた映像をここで図８にて報告する。
ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１)において、８００ｂｐのｍＲＮＡ転写が成人ヒト組織の胃、小腸、膵臓で見出され；より弱いバンドが精巣で検出された(図８)。ＩＬ-１７(配列番号：２)発現を成人ヒト組織の同様のセットで検査したが、検出可能なシグナルは観察されなかった。
【０１３４】
実施例９：Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質の生成
ＩＬ １７Ｂ(配列番号：１７)とＩＬ １７Ｃ(配列番号：１８)のコード配列をＰＣＲにより増幅し、ｐＢＰＨ.Ｈｉｓ.cのＳｍａＩ及びＥｃｏＲ１部位でサブクローンし、Ｃ-末端 ＧＨＨＨＨＨＨＨＨタグ(配列番号：１９)又はｐＢＰＨ.ＩｇＨのＳｔｕ及びＥｃｏＲ１部位を生成させ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とのＣ-末端融合体を生成した。ベクターｐＢＰＨ.Ｈｉｓ.cとｐＢＰＨ.ＩｇＨはバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３(Pharmingen)の誘導体である。コントロールＦｃ又はｈｉｓ-タグタンパク質を、膵臓関連タンパク質(１７５アミノ酸)をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分又はｈｉｓ８タグにＣ-末端で結合させるのに似た方法で構成した。
融合タンパク質を、製造者が推奨する手順(Invitrogen)を用いてＨ５細胞中で発現させた。簡単に言えば、ＤＮＡ構造体を、粘着性Ｓｆ９細胞において７：１の比で、バキュロゴールド・バキュロウイルスＤＮＡ(Pharmingen)と同時形質移入させる。細胞を２８℃で４日間インキュベートし、上清を収集した。形質移入上清を増幅させ、融合タンパク質にはプロテインＡセファロースビーズ(Pharmingen)、又はＨｉｓ-タグタンパク質にはＮｉ-ＮＴＡアガロースビーズ(QIAGEN)によりアフィニティクロマトグラフィーにかけた。
タンパク質発現を検査するために、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を、非還元及び還元条件下で親和精製された組換えタンパク質において行い、続いて銀染色を行った。
【０１３５】
実施例１０：ＩＬ-６及びＴＮＦ-α放出の誘導
ＩＬ-６(配列番号：１４)放出のための、Yaoら, J. Immunol. 155：5482(1995)(Yao-2)に概説された手順を使用し、ヒト包皮繊維芽細胞(ATCC CRL-2091)をテスト用サイトカインを有するＭＥＭ培地(１０％ＦＢＳ)で培養した。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、馴化培地をＥＬＩＳＡキット(R & Dシステム)を使用しＩＬ-６アッセイした。ＴＮＦ-α分泌のために、ヒト白血病単球ＴＨＰ-１細胞を、テスト用サイトカインを有するＲＰＭＩ培地(１０％ＦＢＳ)で培養した。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、馴化培地をＥＬＩＳＡアッセイキット(R & Dシステム)を使用し、ＴＮＦ-α(配列番号：２０)の定量を行った。
ヒト包皮繊維芽細胞(ATCC)をＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)及びＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)が存在するＭＥＭ培地(１０％ＦＢＳ)において別個に培養した。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、馴化培地をＥＬＩＳＡキット(R & Dシステム)を使用しＩＬ-６(配列番号：１４)アッセイした。高レベルのＩＬ-６(配列番号：１４)がＩＬ-１７(配列番号：１１)により誘発されるのに対し、ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１)及びＩＬ １７Ｃ(配列番号：３)の両方共が、繊維芽細胞におけるＩＬ-６(配列番号：１４)分泌を刺激することができない(図９Ａ)。
【０１３６】
Yaoら, Cytokine 9：794(1997)[Yao-3]に概説された手順を使用し、ヒト白血病単球細胞系、ＴＨＰ-１を、ＲＰＭＩ培地(１０％ＦＢＳ)において培養させることにより、ＩＬ-１７(配列番号：１１)、ＵＮＱ５１６(配列番号：１)及びＵＮＱ５６１(配列番号：３)によるＴＮＦ-α(配列番号：２０)放出刺激のためのアッセイに使用した。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、馴化培地をＥＬＩＳＡアッセイキット(R & Dシステム)を使用し、ＴＮＦ-α(配列番号：１９)の定量を行った。ＴＨＰ-１細胞において、ＩＬ-１７(配列番号：１１)は低レベルのＴＮＦ-α(配列番号：１９)のみを誘発したが、ＩＬ-１７Ｂ及びＩＬ-１７Ｃ(Ｆｃ融合タンパク質として)のいずれもＴＨＰ-１細胞においてＴＮＦ-αの生成を刺激した(図９Ｂ)。コントロールＦｃ融合タンパク質は何の効果も有さなかった。
ＩＬ-１７Ｂ及びＩＬ-１７ＣによるＴＮＦ-α放出刺激をさらに特徴付けるために、反応における時間と濃度との依存性をＴＨＰ-１細胞でアッセイした。図１０にはＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)が、時間-及び濃度依存性方式でＴＮＦ-α(配列番号：１９)の放出を刺激していることが例示されている。ＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)のＥＣ５０は２．４ｎＭであるが、ＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)では２５ｎＭであった。
この実験で使用されたＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)調製物は検出不可能なレベルのエンドトキシン(１ＥＵ／ｍｌ未満)を含有しており、付加的な対照実験を行って、ＴＨＰ-１細胞から放出されるＴＮＦ-α(配列番号：１９)が実物で、人工物ではないことを確認した。ＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)活性はポリミキシンＢによる影響を受けず、熱処理により破壊され、よってタンパク質それ自体が活性の原因であり、汚染エンドトキシンではないという考えを裏付けている。
【０１３７】
実施例１１：ＩＬ-１７レセプター結合
ｈＩＬ-１７レセプターのＥＣＤのクローニング：
ヒトＩＬ-１７レセプターのＥＣＤをクローンするために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、公表されている配列に基づき、ＩＬ-１７ＥＣＤ(配列番号：１５)の５'及び３'末端に設計した。Yaoら, 上掲(Yao-3)。２つのプローブは次の配列を有する：
プライマー１：5'-CTG TAC CTC GAG GGT GCA GAG-3'(配列番号：２０)
プライマー２：5'-CCC AAG CTT GGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG CCA CAG GGG CAT GTA GTC C-3'(配列番号：２１)
上述したプライマーをＰＣＲ反応に使用し、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ(Promrga)を用いて、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリから全長ｃＤＮＡを増幅させる。Ｃ-末端ｈｉｓタグを、８つのヒスチジンをコードするヌクレオチドの添加を通し、ＰＣＲにより３'末端プライマーに導入した。ついで、ＰＣＲ生成物を発現プラスミドベクターｐＲＫ５Ｂ中でサブクローンした。配列分析により、挿入物が、公表されているｈＩＬ-１７レセプターの細胞外ドメイン(１-３２０アミノ酸)をコードするＤＮＡフラグメント(配列番号：１５)を含有していることが確認された。
【０１３８】
ＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤの免疫沈降
ＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)及びＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)と比較した場合のＩＬ-１７の差異がある活性は、それらが異なる細胞表面に結合し活性化していることを示唆している。ＩＬ-１７Ｂ(ＵＮＱ５１６)(配列番号：１)又はＩＬ-１７Ｃ(ＵＮＱ５６１)(配列番号：３)が、直接反応に結合してるか否かテストするために、ＩＬ-１７Ｒ(Ｃ-末端ｈｉｓタグ)(配列番号：２２)を含有する発現プラスミドを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ形質移入試薬(Quiagen)を使用して２９３細胞に形質移入した。５０μＣｉ／ｍｌ[３５Ｓ]-Ｃｙｓ／Ｍｅｔ混合物を６時間使用した形質移入後に、２９３細胞の代謝ラベリングを１６時間行った。馴化培地を収集し、濃縮した(Centricon-10, Amicon)。ＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤ(配列番号：１５)の発現を検査するために、Ｎｉ-ＮＴＡビーズ(Quiagen)を使用して、馴化培地からｈｉｓ-タグＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤ(配列番号：２２)を親和沈降させた。
馴化培地をＲＩＰＡバッファー(１％のＮＰ４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＰＢＳに入ったＳＤＳ)で希釈し、ＩＬ-１７(配列番号：１１)及びＦｃ融合タンパク質と共に、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡ-アガロースビーズ(Pierce)を添加し、Ｆｃ融合タンパク質を沈殿させた。沈殿物を３回洗浄し、Ｆｃ融合タンパク質を沈殿させた。沈殿物をＲＩＰＡバッファー中で３回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーで変性させ、ＮｕＰＡＧＥ ４-１２％ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓゲル(Novex)上で電気泳動にかけた。ＩＬ-１７(配列番号：１１)の免疫沈降のために、抗ＩＬ-１７抗体(R & Dシステム)を添加した。競合結合実験において、ＩＬ-１７(配列番号：１１)によるＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤ(配列番号：１５)の免疫沈降を、５倍モル過度のＩＬ-１７Ｂ.ｈｉｓ(配列番号：２３)、ＩＬ-１７Ｃ.ｈｉｓ(配列番号：２４)及び対照ｈｉｓタグタンパク質の存在下で行った。
ＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤ(配列番号：１５)は、そのヒスチジンタグを介して精製する際に、６０ｋＤａのバンドとして移動した(図１１Ａ、レーン１)。さらにＩＬ-１７Ｒ ＥＣＤ(配列番号：１５)はＩＬ-１７(配列番号：１１)(レーン３)と組み合わされて沈殿した。しかしながら、ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１)とＩＬ-１７Ｃ(配列番号：３)の両方とも、ラベルされたＩＬ-１７レセプターＥＣＤ(配列番号：１５)に対するＩＬ-１７(配列番号：１１)の結合に競合することができなかった(図１１Ｂ、レーン１５及び１６)。
【０１３９】
実施例１２：ＴＨＰ-１細胞に対する結合の蛍光-活性化細胞選別(FACS)分析
ＴＨＰ-１細胞(５ｘ１０５)を５％のウマ血清を含有するＰＢＳ中で、４℃でプレ-インキュベートし、非特異的結合をブロックした。ＩＬ-１７(配列番号：１１)、ＩＬ-１７Ｂ.fc(配列番号：１２)、ＩＬ-１７Ｃ.Ｆｃ(配列番号：１３)又は対照Ｆｃ(各１μｇ)を添加し、０．２５ｍｌ容量のＴＨＰ-１細胞と共に、氷の上で１時間インキュベートした。ＩＬ-１７結合実験において、第１の抗ｈＩＬ-１７抗体(１：１００ダルトン)と、ＦＩＴＣに接合させた第２のヤギ抗-マウス抗体(Jackson Immunology Lab, １：１００ダルトン)を添加し、各添加前には連続して３０-６０分間のインキュベーションとかなりの洗浄をしておいた。Ｆｃ融合タンパク質用に、細胞をＦＩＴＣ接合ヤギ抗-ヒトＩｇＧ(Fc特異性、Jackson Immunology Lab, １：１００ダルトン)で染色した。完全に洗浄した後、最小の５０００細胞をＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson)を使用して分析した。
上述した手順の結果、ＩＬ-１７Ｂ(配列番号：１３)及びＩＬ-１７Ｃ(配列番号：１５)Ｆｃ融合タンパク質のいずれもが、対照Ｆｃ融合タンパク質と比べて、ＴＨＰ-１細胞に結合することが示された(図１３)。
【０１４０】
実施例１３：特異的抗体を用いたＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、タンパク質精製技術の多様な標準的な方法によって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯ１０３１又はプロ-ＰＲＯ１１２２ポリペプチド、成熟ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又はプレ-ＰＲＯ１０３１又はプレ-ＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、興味あるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯ１０３１又は抗ＰＲＯ１１２２抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースＭ(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０１４１】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、細胞が成長する培地中に油様な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体-ＰＲＯ１０３１又は-ＰＲＯ１１２２ポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約２-３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドが回収される。
【０１４２】
実施例１４：薬剤スクリーニング
本発明は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験用いられるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されても、細胞内に局在化していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片と試験される薬剤の間での複合体形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
すなわち、本発明は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片に接触させ、(ｉ)試薬とＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ｉｉ)ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、フリーのＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、フリー又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに結合する又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１４３】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に発行されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２は当該技術でよく知られた方法により検出される。精製したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに結合可能な中和抗体が、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイに使用されることも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１４４】
実施例１５：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、興味ある生物学的活性ポリペプチド(例えばＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例は、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
１つの方法において、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド、又はＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つのアプローチの組合せにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２の構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチド様分子の設計又は有効なインヒビターの設計に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１４５】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。このアプローチは、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idsは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯ１０３１又はＰＲＯ１１２２ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる指針を提供する。
【０１４６】
実施例１６：関節軟骨の外植アッセイ
はじめに：
上述したように、ＩＬ-１７は前炎症反応の開始又は持続における役割を担っていると思われる。ＩＬ-１７はＣＤ４＋Ｔｈ細胞により発現するサイトカインであり、滑膜細胞(synoviocytes)及びマクロファージを含む数種の細胞における前炎症及び血液生成サイトカインの分泌を誘発する(例えば、ＩＬ-β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＧＭ-ＣＳＦ。Aarvakら, J. Immunol 162：1246-1251(1999)；Fossiezら, J. Exp. Med. 183：2593-2603(1996)；Jovanovicら, J. Immunol.160：3513-3521(1998))。ＩＬ-１７の存在下で、繊維芽細胞はＣＤ３４＋血液生成原種の増殖を支持し、好中球における優先的成熟を誘発する。結果として、ＩＬ-１７はＴ細胞依存性炎症反応の初期の開始剤を構成し、血液生成に免疫系を架橋させたサイトカイン網状組織の一部となる。
ＩＬ-１７の発現は、慢性関節リュウマチ又は骨関節症患者の滑膜で、正常な結合組織ではないものにおいて見出される。ＩＬ-１７は単球誘導、前炎症サイトカインＩＬ-β又はＴＮＦ-αを相乗効果を起こし、ＩＬ-６及びＧＢ-ＣＳＦを誘発する。滑膜細胞に直接作用することにより、ＩＬ-１７はインビボで炎症誘発性サイトカインの分泌性を高め、よって関節の炎症及び破壊が悪化する。
ＩＬ-１７の可能性のある役割をさらに理解するために、本出願人は軟骨マトリックス代謝におけるＩＬ-１７の影響をテストした。軟骨における一酸化窒素(ＮＯ)の公知の異化作用、及び関節におめる高レベルのＮＯに鑑みて、さらにＮＯ生成を測定した。
【０１４７】
方法：
関節軟骨外植：４〜６ヶ月の雌豚の中手指関節を無菌状態で切開し、下骨を避けて、関節軟骨を注意深く、フリーハンドでスライスして取り出した。軟骨を細かく切断し、０．１％のＢＳＡ及び抗生物質を有する無血清(ＳＦ)培地で、９５％の空気と５％のＣＯ２の湿った雰囲気下で、少なくとも２４時間培養した。３回洗浄した後、約８０ｍｇの関節軟骨をマイクロニクスチューブ中で等分し、上述したＳＦ培地で少なくとも２４時間インキュベートした。ついで、テストタンパク質を単独で、又はＩＬ-１α(１０ｎｇ／ｍｌ)(配列番号：２５)と組合せて添加した。培地を集め、種々の時間点(０、２４、４８、７２時間)で交換し、Farndale及びButtle,  Biochem. Biophys. Acta 883：173-177(1985)に記載された１,９-ジメチル-メチレンブルー(ＤＭＢ)比色分析を使用し、プロテオグリカン含有量をアッセイした。３５Ｓ-硫黄でラベルした後(一晩)、チューブを計量して、組織の量を測定した。続いて一晩消化させ、組織中に残存するプロテオグリカン、並びにプロテオグリカン合成(３５Ｓ-取り込み)の量を測定する。
【０１４８】
ＮＯ生成の測定：アッセイは２,３-ジアミノナフタレン(ＤＡＮ)が酸性条件下で亜硝酸塩と反応し、蛍光物質である１-(Ｈ)-ナフトトリアゾールを形成するという原則に基づいている。ＮＯが亜硝酸塩(ＮＯ２−１)及び硝酸塩(ＮＯ３−１)に素早く代謝されたとき、亜硝酸塩の検出は、(たとえ、実際よりも少なく計測しても)実際に生成したＮＯの一つの検出手段である。１０μＬのＤＡＮ(０．６２ＭのＨＣｌ中に０．０５ｍｇ.ｍＬ)を１００μＬのサンプルに添加して混合し、室温で１０〜２０分間インキュベートした。反応は２．８ＮのＮａＯＨ５ｍＬで停止させる。２,３-ジアミノナフトトリアゾールの形成を、３６０ｎｍで励起して、４５０ｎｍで放射読み取りをするサイトフロー蛍光プレートリーダーを使用して測定した。蛍光密度の光学測定のために、透明な底部を有する黒板を使用した。
【０１４９】
結果及び議論：
ＩＬ-１７(配列番号：１１)がプロテオグリカンの放出を増加させ、合成を低減することが見出された(図１３)。さらにこの効果はＩＬ-１αで見られる効果にも付加的である(図１３)(配列番号：２５)。ＩＬ-１７の効果は一酸化窒素の生成によって媒介されないし、一酸化窒素放出の阻害によってマトリックス破壊を増大させることもない。ＵＮＱ５６１(配列番号：３)はマトリックス破壊を増加させ、マトリックス合成を阻害する。よって、ＰＲＯ１１２２の発現は変成軟骨疾患に関連してると思われる。他方、ＵＮＱ５１６(配列番号：１)はマトリックス合成を増加させ、関節軟骨外植による一酸化窒素の放出を阻害する。
結論として、ＩＬ-１７は関節における関節軟骨の損失に寄与し、よって活性阻害により、炎症及び軟骨破壊が制限されるように思われる。ＩＬ-１及びＩＬ-１７は、異なったレセプターの使用と下流のオーバーラップしているシグナル伝達機構のために、類似しているが区別できる活性を有する。
【０１５０】
関節軟骨外植におけるＩＬ-１７の有効異性化効果、及びＩＬ-１７に対するＵＮＱ５１６及びＵＮＱ５６１の相同性が見出され、任意の又は全てのこれらタンパク質のアンタゴニストは炎症状態及び軟骨欠損、例えば関節炎の治療に有用である。しかしながら、ＵＮＱ５１６がＮＯ生成を阻害し、マトリックス合成を高めているといったこれらの発見により、このタンパク質及びそれらのアゴニストは関節において有用な効果を発揮し、よってそれ自体又は内部において、上述した疾患の治療に有用であることが示唆される。
最後に、成長因子は二相効果を有し、病気になった組織が、in vivoにおいて付与された因子に対し、正常な組織とは異なる反応を起こし得る。このため、ＵＮＱ５１６、ＵＮＱ５６１又はＩＬ-１７のアンタゴニスト又はアゴニスト(例えばタンパク質それ自体)は炎症状態及び軟骨欠損、例えば関節炎の治療に有用である。
【０１５１】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,１０８０１ ブルバール大学、マナッサス、ＶＡ ＵＳＡ ２０１１０-２２０９(ＡＴＣＣ)に寄託した：
0003577586.tif 000003
【０１５２】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】配列番号：２のヌクレオチド４２−５８１から取り出されたアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。図１に示されているのはまた、シグナルペプチド、Ｎグリコシル化部位、ＩＬ−１７と配列同一性を有する領域、分子量、及びおよそのｐＩである。
【Ｆｉｇ２】ヌクレオチド配列（配列番号：２）が「ＵＮＱ５１６」及び／又は「ＤＮＡ５９２９４−１３８１」とここで命名したクローンである天然配列ＰＲＯ１０３１ｃＤＮＡ（配列番号：２のヌクレオチド４２−５８１）のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：２）を示す。
【Ｆｉｇ３】配列番号：４のヌクレオチド５０−６４０から取り出されたアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。また示されているのは、シグナルペプチドのおよその位置、ＩＬ−１７と配列同一性を有する領域におけるロイシンジッパーパターンである。およそのダルトン量、及びおよそのｐＩがまた示されている。
【Ｆｉｇ４】ヌクレオチド配列（配列番号：４）が「ＵＮＱ５６１」及び／又は「ＤＮＡ６２３７７−１３８１−１」とここで命名したクローンである天然配列ＰＲＯ１１２２ｃＤＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド５０−６４０）のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。相補的配列及び推定アミノ酸配列もまた示されている。
【Ｆｉｇ５】ＤＮＡ５９２９４（配列番号：２）の単離に用いられる仮想的ＤＮＡ断片であるＤＮＡ４７３３２（配列番号：５）を示す。
【Ｆｉｇ６】ＤＮＡ６２３７７（配列番号：４）の単離に用いられる仮想的断片であるＤＮＡ４９６６５（ＩｎｃｙｔｅＥＳＴ１３４７５２３）（配列番号：７）を示す。
【Ｆｉｇ７Ａ−７Ｂ】図７Ａは、ＤＮＡ５９６２４（ＩＬ１７−Ｂ）（配列番号：１）、ＤＮＡ６２３７７（ＩＬ１７−Ｃ）（配列番号：３）及びＩＬ−１７（配列番号：１１）によりコードされるタンパク質配列間のアラインメントを示す。推定シグナル配列には下線を引き、潜在的なＮ関連グリコシル化部位には二重下線を引き、保存されたトリプトファン及びシステイン残基に星印を付す。ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｂ及びＩＬ−１７Ｃは互いに２６−２８％のアミノ酸同一性を共有する。図７Ｂは、ＤＮＡ５９６２４（配列番号：１）及びＤＮＡ６２３７７（配列番号：３）からのコードタンパク質の間のアラインメントを示す。
【Ｆｉｇ８】ＩＬ−１７Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）のＲＮＡブロット分析である。ノーザンブロットは、実施例８に記載されたようなヒトＩＬ１７Ｂ特異的放射標識プローブにハイブリダイズせしめたヒト組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのｍＲＮＡを示す。ＲＮＡサイズマーカーは左に示す。ヒトβアクチンｃＤＮＡプローブでの同じブロットの再ハイブリッド形成は底部に示す。
【Ｆｉｇ９Ａ−９Ｂ】ＩＬ１７（配列番号：１１）、ＩＬ１７−Ｂ（ＵＮＱ５１６）（配列番号：１）及びＩＬ１７Ｃ（ＵＮＱ５６１）（配列番号：３）の生物活性を示す棒グラフである。図９Ａは、１００ｎｇ／ｍｌで１８時間の間、対照Ｆｃ融合タンパク質、ＩＬ−１７，ＩＬ−１７Ｂ．Ｆｃ（配列番号：１２）又はＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃ（配列番号：１３）で培養されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞を示しており、馴化培地が実施例１０に記載されたようにＩＬ−６（配列番号：１４）に対して検定されている。図９Ｂは、ヒト白血病細胞株ＴＨＰ１を示しており、これは上述と同じサイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ）で同じ条件下で処理されており、上清をＴＮＦ−αの放出レベルについて検定した。結果は、一つの代表的な実験からの３通りの定量の平均＋／−ＳＥとして表されている。
【Ｆｉｇ１０Ａ−１０Ｂ】ＴＨＰ１細胞からのＩＬ１７Ｂ及びＩＬ１７Ｃ活性化ＴＮＦ−αの放出の依存性を表す時間経過である。図１０Ａにおいては、ＴＨＰ１細胞は１００ｎｇ／ｍｌ（２．２ｎＭ）のＩＬ−１７，ＩＬ−１７Ｂ．Ｆｃ（配列番号：１２）又はＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃ（配列番号：１３）と共に０．５〜３２時間の間インキュベートし、馴化培地を収集し、実施例１０に記載しているようにしてＴＮＦ−α濃度を定量した。図１０Ｂにおいて、ＴＨＰ１細胞は、０〜１２０ｎＭの濃度範囲で１８時間の間、ＩＬ−１７Ｂ．ＦｃとＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃで処理し、ＴＮＦ−αの放出を測定した。
【Ｆｉｇ１１Ａ−１１Ｂ】ＩＬ−１７（配列番号：１１）、ＩＬ−１７Ｂ（配列番号：１）及びＩＬ−１７Ｃ（配列番号：３）でのＩＬ−１７Ｒ ＥＣＤ（配列番号：１５）の免疫沈降である。ＨｉｓタグＩＬ−１７レセプターＥＣＤは２９３細胞において発現され、実施例１１に記載されているように３５Ｓで代謝標識された。上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡビードを使用して上清中にｈｉｓタグＩＬ−１７Ｒ ＥＣＤ（配列番号：１５）を親和沈殿させた（レーン１）。図１１Ａにおいて、ＩＬ−１７（配列番号：１１）、ＩＬ−１７Ｂ．Ｆｃ（配列番号：１２）及びＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃ（配列番号：１３）、又は対照Ｆｃ融合タンパク質を上清と共にインキュベートし、プロテインＡアガロースビーズを添加してＦｃ融合タンパク質を沈殿させた。ＩＬ−１７免疫沈降反応に対しては、抗ＩＬ−１７抗体が含められた。図１１Ｂは競合結合実験の結果を示しており、ＩＬ−１７Ｒ ＥＣＤ（配列番号：２２）のＩＬ−１７（配列番号：１１）による免疫沈降を、５倍の過剰のＩＬ−１７Ｂ．ｈｉｓ（配列番号：２３）と対照ｈｉｓタグタンパク質の存在下で実施した。図１１Ａと図１１Ｂの双方における沈殿物をＮｕＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）ゲル上での電気泳動により分析した。分子量マーカーは各パネルの左に示されている。
【Ｆｉｇ１２Ａ−１２Ｂ】ＴＨＰ−１細胞へのＩＬ−１７Ｂ．Ｆｃ（配列番号：１２）及びＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃ（配列番号：１３）の結合のＦＡＣＳ分析を示している。ＴＨＰ−１細胞は、ＰＢＳ（５％ウマ血清）中のＩＬ−１７Ｂ．Ｆｃ（Ａ）又はＩＬ−１７Ｃ．Ｆｃ（Ｂ）又は対照Ｆｃ融合タンパク質と共にインキュベートされ、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｆｃ二次抗体が続いて添加された。
【Ｆｉｇ１３】間接軟骨に対するＩＬ−１７（配列番号：１１）の効果を示している。軟骨外植体を、示した濃度のＩＬ−１７単独（固体）又は示した濃度のＩＬ−１α（ハッチング）（配列番号：２５）又はＩＬ１ｒａ（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１μｇ／ｍｌ）（配列番号：２６）の存在下で７２時間処理した。培地へのプロテオグリカン（ＰＧ）の放出（上部パネル）は、マトリックス崩壊を示している。マトリックス合成は組織中への３５Ｓ−サルフェートの導入により決定した。
【Ｆｉｇ１４】一酸化窒素の放出に対するＩＬ−１７（配列番号：１１）の効果を示している。外植体を、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）単独（左のカラム）又はＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）（配列番号：２５）（右のカラム）の存在下で処理した。４８時間後、亜硝酸塩濃度について培地を検定した。
【Ｆｉｇ１５Ａ−１５Ｃ】マトリックス代謝におけるＩＬ−１７誘発変化に対するＮＯの効果を示している。外植体を、ＩＬ−１７（５ｎｇ／ｍｌ）（配列番号：１１）単独（＋）又は一酸化窒素シンターゼの不可逆的インヒビター、ＮＯＳ（Ｌ−ＮＩＯ，Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ０．５ｍＭ）で処理した。７２時間の処理後に、（Ａ）亜硝酸塩濃度と（Ｂ）プロテオグリカン（ＰＧｓ）について培地を検定した。（Ｃ）プロテオグリカン合成は組織中への３５Ｓ−サルフェートの導入により決定した。
【Ｆｉｇ１６】プロテオグリカン（ＰＧ）の代謝におけるＩＬ−１α誘発変化に対するＮＯの阻害の効果を示している。関節軟骨外植体をＩＬ−１α（５ｎｇ／ｍｌ）（配列番号：２５）だけ（＋）又はＮＯＳ（Ｌ−ＮＩＯ又はＬ−ＮＩＬ）のインヒビター（Ｌ−ＮＩＬ，可逆的ＮＯＳインヒビター，Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）あるいはＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１μｇ／ｍｌ）（配列番号：２６）で処理した。７２時間の処理後に、（Ａ）亜硝酸塩濃度と（Ｂ）プロテオグリカン量について培地を検定した。（Ｃ）マトリックス合成は組織中への３５Ｓ−サルフェートの導入により決定した。
【Ｆｉｇ１７】関節軟骨に対するＵＮＱ５１６（配列番号：１）の効果を示している。外植体を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１α（配列番号：２５）の不存在下（最も左の３つのカラム）又は存在下（最も右の３つのカラム）において１％又は０．１％のＵＮＱ５１６で処理した。
【Ｆｉｇ１８】関節軟骨に対するＵＮＱ５６１（配列番号：３）の効果を示している。外植体を、ＩＬ−１α（＋）（１０ｎｇ／ｍｌ）（配列番号：２５）の不存在下（最も左の３つのカラム）又は存在下（最も右の３つのカラム）において１％又は０．１％のＵＮＱ５６１で処理した。プロテオグリカン（ＰＧ）の放出と合成は対照を越える量として示されている。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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