(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  穀物粒が分散または懸濁された液状の培地を調製する工程と、
（ｂ）バイオリアクター内で前記培地に色素生産能を有する紅麹菌の接種源を接種して発酵を行う工程と、
を備える、紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項２】
前記穀物粒は米粒である、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項３】
脱穀、蒸煮および滅菌された穀物粒を前記穀物粒として使用する、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項４】
工程（ａ）で用いられる前記培地は、窒素源、無機塩および微量元素をさらに含む、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項５】
前記紅麹菌の接種源は、工程（ａ）で調製された前記培地に前記紅麹菌を接種して培養することにより得られたものである、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項６】
前記紅麹菌の接種源は、
（１）保存培養物から前記紅麹菌を新しい寒天平板に接種し、インキュベーターで５〜７日培養する工程と、
（２）前記平板で成長した胞子および菌糸を無菌水に懸濁させる工程と、
（３）前記無菌水に懸濁させた前記胞子および菌糸を、穀物粒が分散または懸濁された液状の培地に接種し、前記培地を振とうすることにより培養する工程とによって得られるものであり、
工程（３）で３６〜４８時間培養したものを、前記紅麹菌の接種源として使用する、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項７】
前記バイオリアクターはエア式バイオリアクターである、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項８】
前記エア式バイオリアクターは網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターである、請求項７に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項９】
工程（ｂ）の前記発酵において、流加培養法をさらに行う、請求項１に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【請求項１０】
前記流加培養法において、窒素源および固体の栄養基質が補われる
、請求項９に記載の紅麹菌による色素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糸状菌（filamentous fungi）の培養方法、特に、固体栄養懸濁基質（suspended nutritionally solid substrate）（分散または懸濁された固体の栄養基質）を用いた糸状菌の培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、糸状菌の発酵方法には、固体培養（solid-state culture）と液内培養との２通りがある。従来の方法では、主に固体培養が用いられていた。例えば、紅麹菌（Monascus）から代謝物を生成させる方法では、米や麦といった穀物培地などの固体栄養培地に紅麹菌を直接接種して発酵を行う。紅麹菌の菌糸は固体栄養培地の表面に浸透し、発酵の間成長する。生成される色素を吸収することにより、培地の色が紫色に変わる。さらに、菌糸は穀物粒子内にも広がる。この現象は色素の生成を容易にする。１９９１年、ＪｏｈｎｓおよびＳｔｕａｒは、合成培地からなるカラギーナン（Carrageenan）粒子を用いて培養中の穀物の模擬実験を行った（Johns and Stuar, (1991) J.Industrial Microbiology, 8:23-28）。しかしながら、構造、栄養成分などの理由により、合成培地は固体培養による紅麹菌の生成には適していない。一般に、十分に培地を利用し最適な温度と湿度とを維持するには、従来の固体培養の操作手順では複雑であり時間の浪費である。さらに、酸素移動の制限、雑菌混入などといった問題によりスケールアップが困難である。
【０００３】
さらに、上述した固体培養は不利であるため、生成物の量と質とが安定していない。この問題を解決するため、発酵のための液内培養を開発する様々な研究がなされてきた。１９８２年、ＬｉｎおよびＬｉｚｕｋａは炭素源として糖類や穀物を用いることにより、スケールアップや操作制御（operation control）の問題を解決した（Lin and Lizuka, (1982) Appl. Environ. Microbiology, 43:671-676）。しかしながら、この方法では、色素の生成率が明らかに低下してしまう。１９８４年、ＥｖａｎｓおよびＷａｎｇはアルギン（養分を含まない不活性物質）を用いて紅麹菌を固定化し、液内培養を行った。その結果、菌糸の付着により色素を生成する現象が見られた（Evans and Wang, (1984) Applied and Environmental Microbiology 47(6):1323-1326）。１９９０年、Ｍａｋ他は、大量の酸素移動と低いずれ応力（シャー応力）といった特性により菌糸が付着する環境を提供するローラーボトル式培養法（roller bottle culture）を導入し、炭素源としてグルコースを用いて紅麹菌の培養を行った（Mak et. al., (1990) Enzyme Microbiol. Technol., 12:965-968）。しかしながら、ローラーボトルの性質により、この方法では、生産の規模が小さすぎてしまう。１９９５年、Ｌｅｅ他は、炭素源としてタピオカでんぷんを用い、培地中の高い初期澱粉濃度は、培地の粘度を高くするため、実用的でないと指摘した（Lee. et. al., (1995) J. Fermentation of Bioengineering, 79(5) :516-518）。彼らは、反応器の底部に糊化でんぷんブロック（gelatinized starch block）を、上部に希釈可溶性でんぷん（dilute soluble starch）をそれぞれ生じるような固液培養法（solid-liquid state cuture）を提供した。培養は攪拌タンク式バイオリアクター（stirred-tank bioreactor）内で行った。しかしながら、この方法は体積比に対する界面域が大規模システムにとって小さいため、スケールアップに問題が生じうる。
【０００４】
上述した糸状菌の液内培養例は、アルギンやタピオカでんぷんなどの栄養培地（nutritional medium）を用いているが、共に発酵収量（fermentation yield）が劣っている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上により、本発明は、上述の発酵収量を改善することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、菌糸が付着する条件下で液内培養を行い、バイオリアクターのずれ応力（シャー応力）による菌糸や付着物の破壊を防ぐことにより、糸状菌の生産方法を改良し、代謝物生成のスケールアップを図ることを他の目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、固体栄養懸濁基質（分散または懸濁された固体の栄養基質）を用いた糸状菌（紅麹菌など）の培養方法を提供する。本方法は、（ａ）固体栄養基質（nutritionally solid substrate）を含む培地を調製する工程と、（ｂ）バイオリアクター内で固体栄養基質を含む培地に接種源を接種して発酵を行う工程と、からなる。
【０００８】
また、本発明の方法は、工程（ａ）の後に糸状菌を接種して接種源を得、それからバイオリアクター内で固体栄養基質を含む培地に前記接種源を接種して発酵を行う工程を含むことができる。
【０００９】
本発明による方法で用いるバイオリアクターは、たとえば、エア式（送気式）バイオリアクター（pneumatic bioreactor）であり、特に、網状通気管（net draft tube）を備えたエアリフト式バイオリアクター（air-lift bioreactor）であるのが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明の方法は、流加培養（fed-batch）法を用いる糸状菌の培養工程を含んでもよい。流加培養において、バッチの培地は窒素源と固体栄養基質を含むことが好ましい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上述した本発明の目的、特徴、および長所をより一層明瞭にするため、以下に本発明の好ましい実施の形態を挙げ、図を参照にしながらさらに詳しく説明する。
【００１２】
以下に説明する本発明の具体例において用いる糸状菌は紅麹菌であるが、ペニシリウム属やアスペルギルス属など、同様の成長特性を有する他の糸状菌も本発明の応用に適している。
【００１３】
本発明によると、固体栄養懸濁基質を用いた糸状菌（紅麹菌など）の培養方法は、（ａ）固体の栄養基質を含む液状の培地を調製する工程と、（ｂ）バイオリアクター内で固体の栄養基質を含む液状の培地に接種源を接種して発酵を行う工程と、からなる。
【００１４】
ここで、「固体の栄養基質」とは、固体の形態（固形物）に維持することにより菌糸が付着できる空間を提供し菌の成長に必要な栄養源、特に炭素源を提供する基質のことである。炭素源には、例えば炭水化物などが含まれる。適した炭水化物には、米、麦や他の穀物が含まれる（但しこれらに限定されない）。穀物は、培地に加える前に、脱穀、蒸煮、滅菌の処理がなされることが好ましい。穀物（米、麦など）の構造は菌糸の付着に大変適しており、穀物は菌に主な栄養源を与えることができる。特に、本発明による紅麹菌の培養は、固体の栄養基質として米基質などの穀物（穀物粒）が分散または懸濁された液状の培地を用いることにより行われ、それによって培地は、菌糸の付着性や、懸濁物または分散物の流動性の特質を有することができる。
【００１５】
本発明による工程（ａ）で調製される培地は、窒素源、無機塩、および微量元素をさらに含むことが好ましい。
【００１６】
本発明は、工程（ａ）の後に糸状菌を接種して接種源を得る工程をさらに含んでもよい。この場合、工程（ａ）の後の工程は、（１）保存培養物から糸状菌を新しい寒天平板に接種し、インキュベーターで５〜７日培養する工程と、（２）前記平板で成長した胞子および菌糸を無菌水中に懸濁させる工程と、（３）無菌水に懸濁させた胞子および菌糸を、固体の栄養基質が分散または懸濁された液状の培地に接種し、固体の栄養基質を含む培地内の胞子および菌糸を振とうすることにより培養する工程と、（４）工程（３）で３６〜４８時間培養したものをバイオリアクターに接種する工程と、からなることが好ましい。
【００１７】
バイオリアクターは、混合システムによって、エア式（送気式）（pneumatic）と攪拌タンク式（stirred-tank）とに分類することができる。「エア式バイオリアクター」とはエアレーティング（aerating）（曝気）によって空気と培地とを混合するものであり、「攪拌タンク式バイオリアクター」とは攪拌翼（stirring wing）を用いて攪拌することにより空気と培地とを混合するものである。「エアリフト式バイオリアクター」とは、通気管を設けたエア式バイオリアクターであり、「網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクター」とは、網状の形態の通気管を設けたエア式バイオリアクターであり、「二重網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクター」とは、同心の二重網状通気管（以下に例を示す）を設けたエア式バイオリアクターである。菌糸および固体の栄養基質を完全に保持し、過大なずれ応力（シャー応力）による破壊を防ぐため、本発明はエア式バイオリアクターを使用して紅麹菌等の糸状菌の培養を行うことが好ましく、特に、二重網状通気管などの網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターを使用して行うことがより好ましい。
【００１８】
本発明の方法は、流加培養（fed-batch）法によって糸状菌を培養する工程をさらに含むことが好ましい。流加培養において、バッチの培地は上述した窒素源および固体の栄養基質を含むことが好ましい。
【００１９】
本発明は、特に、紅麹菌の培養から代謝物を生産する方法に適用できる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例について説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２１】
実施例１
異なる種類の栄養基質が色素の収量に与える影響
Ｍ１５菌株（Monascus purpureus、寄託番号：ＣＣＲＣ ３１６１５、新竹、台湾）および培地Ａ（炭素源として米粒２％又は米粉２％、グルタミン酸モノナトリウム１．２６％、ＫＨ２ＰＯ４０．２４％、Ｋ２ＨＰＯ４０．２４％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．８％、ＫＣｌ０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．００１％、およびＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．０００３％を含み、残部は水である。％は質量百分率である。）を用いて液内培養を行った。米粒には、米を脱穀、蒸煮および滅菌したものを使用した。
【００２２】
フラスコ振とう培養（shaken flask cultivation）を行う前に、紅麹菌を保存培養からポテトデキストロース寒天（Potato-Dextrose Agar；PDA）３９ｇ／Ｌを含む新しい平板培地に接種した。この平板を３０℃で６日間培養した。６日後、ＰＤＡ平板培地から胞子および菌糸を取り出して無菌水６ｍｌに懸濁し、これを接種源調製のための種として用いた。培地Ａが３００ｍｌが入った三角フラスコ（容積１Ｌ）に胞子と菌糸の懸濁液３ｍｌを接種し、２００ｒｐｍの回転振とう機（rotary shaker）上において３０℃で培養した。２日後の培養液を液内培養の接種源として用いた。それぞれ、振とうフラスコ（容積１Ｌ）に、２７０ｍｌの培地Ａを入れ、それに接種源である菌糸液３０ｍｌを接種し、色素の生産を行った。フラスコを２００ｒｐｍの回転振とう機上において３０℃で培養し、色素の収量を観察した。結果は図１に示されている。
結果：
米粒懸濁液を含む培地によって生産された赤の色素は、米粉を含む培地によって生産された色素の２倍であった。固体培養におけるような菌の穀物粒への付着がその原因である。
【００２３】
実施例２
接種源の培養時間が色素の収量に与える影響
培地Ａ（米粒２％を炭素源として用いた）を用いてフラスコ振とう培養を行った。２４、３６、４８、６０、７２、８４時間後の接種源をフラスコ振とう培養に用いる培地Ａ（米粒２％を炭素源として用いた）が入った三角フラスコ（容積１Ｌ）に接種した。結果は図２に示されており、そのうち、３６、４８時間後の接種源を用いたときの色素生産量が最も高かった（５０時間培養した後、ＯＤ５００の吸光度は１２ユニットに達することができた）。
【００２４】
実施例３
エア式バイオリアクターの流動特性
３種類のエア式バイオリアクター（直径１３ｃｍ、高さ２００ｃｍ）、すなわち、（１）通常のバブルカラム式バイオリアクター（bubble column bioreactor）（通気管を備えていない、バブルカラムと略す）、（２）エアリフト式バイオリアクター（高さ１００ｃｍ、直径８．５ｃｍの通気管を設けている）、および（３）二重網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクター（高さ１００ｃｍ、直径がそれぞれ６ｃｍと８．５ｃｍの同心の二重網状通気管を設けている。網状カラムと略す）を用いて流動特性を比較した。ここでは流動系として、２相系（空気-水）および３相系（米粒２％-空気-水）をそれぞれ用いた。
【００２５】
バイオリアクターの特性は、（１）ガス・ホールド・アップ、（２）酸素量輸送係数（oxygen mass transfer coefficient）、（３）液体混合時間（liquid mixing time）を含む輸送現象の観点から評価した。ガス・ホールド・アップ（ε）は体積膨張法によって、酸素量輸送係数（ｋＬａ）はダイナミック法（dynamic method）によって、液体混合時間はダイナミック熱伝導法（dynamic heat-tranfer method）によってそれぞれ測定した。
結果：
図３および４を参照すると、網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターの流動特性がより優れていることが分かる。一般に、バブルカラム式バイオリアクター内の培養液が固体粒子を含むと、ガス・ホールド・アップ、酸素量輸送係数、および液体混合時間が減少するため、バイオリアクターの効率に大きく影響する。
【００２６】
米粒を加えた場合、バブルカラム式バイオリアクターであっても網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターであっても、全ての輸送現象が減少するが、図４に示されるように、網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターの流動特性はバブルカラム式バイオリアクターよりも優れている。このため、網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターはずれ応力（シャー応力）が低く、好気性微生物などの発酵に適している。
【００２７】
実施例４
エア式バイオリアクターにおける紅麹菌（M.purpureus）の培養
米粒２％の懸濁液（米粒を用いた培地Ａ）を用いたM.purpureusのバッチ培養を３種類のエア式バイオリアクター内で行い、紅麹菌色素の収量を比較した。通気率２ＶＶＭ（表面気流速度（superficial air velocity）３．７６８ｃｍ／秒）、温度３０℃の条件下で１５Ｌの培地を用いて培養を行い、４８時間後の接種源である８．５％の菌糸液を接種した。色素収量は、分光測光法（ＤＵ−５３０、Beckman Instruments、米国）によって、赤、オレンジ、黄の色素に対応する５００、４７５、４００ｎｍの吸光度をそれぞれ測定して求めた。結果は図５に示されている。
結果：
３種類のエア式バイオリアクターのうち、網状通気管を備えたエア式バイオリアクターにおける紅麹菌色素の収量が最も優れていた。６０時間培養した後、ＯＤ５００の吸光度は１８ユニットに達することができ、これはフラスコ振とう培養よりも優れている（図１参照）。バブルカラム式バイオリアクターおよびエアリフト式バイオリアクターにおける紅麹菌色素の収量は、フラスコ振とう培養よりも高くないことが観察された。フラスコ振とう培養の規模が小さいため（バイオリアクター内の培養液の比は約３００ｍｌ対１５Ｌである）、振とうによって気体が液体と容易に混合することが理由の一つである。一方、バブルカラム式バイオリアクターとエアリフト式バイオリアクターとは共にスケールアップ後の混合がうまくいかないという欠点がある。本発明による網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターの３相システムは、混合に優れているという長所を有しているため、糸状菌の培養に適している。
【００２８】
実施例５
網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターにおけるM.purpureusの流加培養（fed-batch cultivation）
発酵の間、菌糸の浸透およびずれ応力（シャー応力）の影響により、米粒が破壊され、米粒の成分が減少したため、流加培養法によって発酵液に米粒を補い、３相発酵システムを維持した。発酵条件は実施例４で述べたバッチ培養と同じであり、流加培養で用いた培地も米粒２％およびグルタミン酸モノナトリウム１．２６％（窒素源）を含んだ。全体の培養時間は２００時間であり、３５時間目および１００時間目に米粒を補った。結果は図６に示されている。ＯＤ５００の吸光度は３６ユニットに達することができ、実施例４で述べたバッチ培養の２倍であった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明は、液内発酵において、紅麹菌色素などの代謝物の収量を改善する。本発明は、固体発酵および液内発酵の両方の特徴を有しており、菌糸付着性と懸濁物または分散物の流動性の特性とを達成することにより、固体発酵におけるスケールアップと操作上の問題を解決することができる。本発明は、網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターを用いることにより、菌細胞の成長に必要な溶存酸素を提供し、バイオリアクターのずれ応力（シャー応力）による菌糸および米（固体の栄養基質である穀物）の構造の破壊を防ぐことができる。さらに、本発明は、流加培養法を用いて発酵の間消費される米や栄養を補うことにより、紅麹菌色素の収量を上昇させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なる種類の栄養基質を用いた紅麹菌の培養および発酵により生成される色素の時間経過を示す線図である。
【図２】異なる期間の接種源による紅麹菌の培養および色素への影響を示す線図である。
【図３】流動システムとして空気−水を用いることによる２相エア式バイオリアクターの流動特性を示す線図である（そこにおいて、液体の初期の高さは１２０ｃｍ、温度は３０℃に設定されている）。
【図４】流動システムとして米粒２％−空気−水を用いることによる３相エア式バイオリアクターの流動特性を示す線図である（そこにおいて、液体の初期の高さは１２０ｃｍ、温度は３０℃に設定されている）。
【図５】３種類のエア式バイオリアクターによる紅麹色素の収量を示す線図である。
【図６】網状通気管を備えたエアリフト式バイオリアクターにおいて、流加培養法による紅麹色素の収量を示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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