(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と可溶性複合体を形成し、ヒトまたは動物の細胞に吸収される新しいタンパク質・ポリカチオン結合体であって、該結合体のタンパク質成分が標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体（Ｔ細胞表面タンパク質に向けられる抗体を除く。）またはそのフラグメントであって該細胞表面タンパク質に結合する能力を有し、その結果、形成された複合体が該細胞表面タンパク質を発現する細胞に吸収されることを特徴とする結合体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項１記載の結合体。
【請求項３】
前記抗体が腫瘍抗原を指向することを特徴とする請求項１または２記載の結合体。
【請求項４】
前記抗体が直接ポリカチオンに結合することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の結合体。
【請求項５】
ポリカチオンに結合し、かつ、修飾されていてもよいプロテインＡが結合した抗体を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の結合体。
【請求項６】
請求項５記載の抗体結合体を調製するためのプロテインＡ・ポリカチオン結合体。
【請求項７】
前記ポリカチオンが同種または異種の合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の結合体。
【請求項８】
前記ポリペプチドがポリリジンであることを特徴とする請求項７記載の結合体。
【請求項９】
前記ポリカチオンが修飾されていてもよいプロタミンであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１０】
前記ポリカチオンが修飾されていてもよいヒストンであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１１】
前記ポリカチオンが20乃至1000の正電荷を有することを特徴とする請求項７乃至10のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１２】
ポリカチオンに対する抗体のモル比が10:1乃至1:10であることを特徴とする請求項７乃至11のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の細胞に吸収される新しいタンパク質・ポリカチオン／核酸複合体であって、結合体のタンパク質成分が標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体（Ｔ細胞表面タンパク質に向けられる抗体を除く。）またはそのフラグメントであって該細胞表面タンパク質に結合する能力を有し、その結果、形成された複合体が該細胞表面タンパク質を発現する細胞に吸収され、また該抗体が直接ポリカチオンに結合しているか、または修飾されていてもよいプロテインＡを介して結合していることを特徴とする複合体。
【請求項１４】
前記結合体成分として請求項１乃至５または８乃至12に定義されている結合体の１つを含むことを特徴とする請求項13記載の複合体。
【請求項１５】
さらに、結合体のポリカチオンと同じ非共有結合ポリカチオンを含むことにより、該結合体によって達成される核酸のインターナリゼーションおよび／または発現が促進されることを特徴とする請求項14記載の複合体。
【請求項１６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはリボザイムの形の阻害性核酸または、キャリヤー遺伝子と共に該核酸をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項13乃至15のいずれか１項記載の複合体。
【請求項１７】
該核酸がウイルス阻害性核酸である請求項16記載の複合体。
【請求項１８】
HIV−１ウイルスまたは関連レトロウイルスの複製および発現を阻害する核酸を含むことを特徴とする請求項17記載の複合体。
【請求項１９】
トランスドミナント変異を有するウイルスタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項17または18記載の複合体。
【請求項２０】
オンコジーン阻害性核酸を含むことを特徴とする請求項16記載の複合体。
【請求項２１】
遺伝子または遺伝子断片の形で治療的または遺伝子治療的に活性な核酸を含むことを特徴とする請求項14または15記載の複合体。
【請求項２２】
高等な真核細胞に核酸を導入する方法（ただし、ヒト体内で導入する方法を除く。）であって、生理学的条件下で可溶性の請求項16乃至21で定義されている複合体の１つを、非共有結合ポリカチオンの存在下、請求項１乃至５または７乃至12のいずれか１項で定義されている抗体結合体および核酸から形成し、該抗体が指向する細胞表面タンパク質を発現する細胞を、細胞中の核酸の分解が阻害される条件下で該複合体と接触させる方法。
【請求項２３】
高等な真核細胞に核酸を導入する方法（ただし、ヒト体内で導入する方法を除く。）であって、複合体を修飾されたプロテインＡおよび請求項７乃至11で定義されているポリカチオンの１つからなるプロテインＡ・ポリカチオン結合体および請求項13乃至21で定義されている核酸の１つから形成し、ついで標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体（Ｔ細胞表面タンパク質に向けられる抗体を除く。）であって該複合体の結合体成分に結合している抗体の存在下、該複合体を該細胞表面タンパク質を発現する細胞と接触させる方法。
【請求項２４】
前記細胞をプロテインＡ・ポリカチオン／核酸複合体と接触させる前に該抗体で前処理することを特徴とする請求項23記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はポリカチオンに対するアフィニティーを有する化合物、特に核酸、をヒトまたは動物細胞に輸送するための新しい蛋白質・ポリカチオン結合体に関する。
近年、核酸は治療活性物質としての重要性を有するようになってきた。
アンチセンスRNAおよびDNAは、特定の遺伝子配列を選択的に阻害することを目的とする有効な試薬であることが分かった。これらの活性様式はこれらが生体内において特定の遺伝子（調節不能なオンコジーンまたはウイルス遺伝子等）を阻害する治療薬として使用されることを可能にした。既に、短いアンチセンス・オリゴヌクレオチドが細胞内に輸送され、核酸の強い負の電荷による細胞膜を介した取り込みの制限によりその細胞内濃度が低いにもかかわらず、それらが阻害活性を示すことが明らかにされた（Zamecnik等、1986）。
選択的に遺伝子を阻害する別の方法にはリボザイムの使用が含まれる。ここでも、細胞内への輸送が律速因子の一つであることから、細胞中の活性リボザイムの濃度を出来るかぎり高める必要がある。
治療を目的として使用の制限因子の一つである生細胞内への核酸の輸送を改善する多くの解決法が提案されている。
細胞内に阻害性核酸を輸送する問題を解決するための従来法の一つには、例えば、荷電リン酸ジエステル基を非電荷の基で置換する事による等、核酸の直接的修正が含まれる。直接的修正の別の方法にはヌクレオチド・アナログの使用が挙げられる。しかし，これらの提案には、標的分子への結合の減少、阻害効果の減少および毒性等の種々の欠点がある。
また、遺伝子治療における生細胞への核酸の導入に関する有効なシステムには特別の需要がある。ここでは、例えば遺伝的欠陥の場合、欠陥遺伝子を置換するために等、治療的に活性な遺伝子生産物の合成を生体内で行うために遺伝子を細胞内に閉じ込める。「古典的」遺伝子治療は単一の治療により長期間の救済を行うという原則にもとづいている。しかし、必要に応じて一回または反復して投与される医学（「遺伝子治療薬」）として治療的に活性なDNA（またはRNA）を使用しうる治療法も必要である。遺伝子治療が期待される遺伝的病気には、血友病、アデノシン・デアミナーゼの遺伝的欠陥により引き起こされるベータ・サラサミアおよび「重度合併免疫疾患」（SCID）がある。その他の応用には、分泌型蛋白質抗原、または非分泌型蛋白質抗原をコードする機能性核酸の投与がワクチン化により体液性または細胞内免疫を達成する免疫調節がある。欠陥遺伝子をコードする核酸の投与が、例えば、個々に特定の必要条件に応じて仕立てられた形で与えられる遺伝的欠陥の例には、筋ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子）、ジスティック・フィブロシス（システィック・フィブロシス・コンダクタンス調節遺伝子）、ハイパーコレステローラミア（LDLレセプター遺伝子）がある。また、遺伝子治療法は、ホルモン、成長因子または細胞毒性または免疫調節効果を有する蛋白質が体内で合成される場合にも潜在的に非常に重要である。
これまで、遺伝子治療に核酸を利用する目的で発展してきた技術は、細胞内への遺伝子の転移にレトロウイルス・システムを利用している（ウィルソン（Wilson）等、1990、カシド（Kasid）等、1990）。しかし、レトロウイルスの使用は、少なくとも低い割合でウイルス感染（内在的ウイルスとの組み換え、および引き続く病原型への突然変異による）またはガンの発生等の副作用を起こすことから当面の問題となっている。さらに、例えば、もし、副作用が起こるならば治療がより回復しがたい物にするかもしれないので、レトロウイルスにより行われる患者の体細胞のトランスホーメーションは、全ての場合に望ましいものではない。
さらに、細胞における非複製DNAの発現を可能にする別の方法が探究されてきた。
インビトロでの哺乳類細胞の遺伝的トランスホーメーションに関する種々の方法が従来から知られているが、それらのインビボにおける使用は制限されている（それらには、リポソームによるDNAの導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストランまたはリン酸カルシウム法が含まれる。）。
インビボにおける遺伝子転移に関する方法を開発するための最近の努力は、カチオン性脂質試薬リポフェクチンに集中している。この試薬によって注入されたプラスミドは、体内で発現しうることが示された（ナベル（Nabel）等、1990）。
最近開発された別の方法は、DNAを吸着したタングステンまたは金の微粒子を使用しており、これを高エネルギーで細胞に衝突させる（ジョンストン（Johnston）,1990、ヤング（Yang）,1990）。このDNAの発現は種々の組織で示された。
標的の細胞にDNA輸送するためにインビボで使用しうる可能なシステムが肝細胞で開発され、このシステムは、肝細胞表面に提供されているレセプターが応答する糖蛋白質にポリリジンを結合させ、これにDNAを添加して、細胞内に吸収させ、一度吸収されればDNAの発現が可能となる可溶性糖蛋白質・ポリリジン・DNA複合体を生成する原則に基づいている（ウ（Wu）およびウ（Wu）、1987）。
このシステムは肝細胞に特異的であり、その機能は、アシアロ糖蛋白質・レセプターによる比較的良く分かった吸収メカニズムにより限定される。
広く応用可能で有効な輸送システムは、細胞内に核酸を輸送するのにトランスフェリン・ポリカチオン結合体を使用するトランスフェリン・レセプターを利用している。このシステムはヨーロッパ特許出願A1 388 758の主題である。トランスフェリン・ポリカチオン/DNA複合体は、種々の重合度のポリリジンおよびプロタミンを該複合体のプリカチオン成分として使用し、細胞内に効率的に吸収およびインターナライズされる。取り分け、このシステムを使用することにより、erbB−オンコジーンを阻害するリボザイム遺伝子がニワトリのerbB−形質転換細胞に導入され、erbB−阻害効果が示された。
本発明の目的は、高等真核細胞への核酸の選択的輸送を可能とするシステムの構築である。
意外にも、細胞表面蛋白質と結合する抗体は、それらがポリカチオンと結合体を形成するなら高等真核細胞への核酸の輸送に使用しうることが分かった。
感染の際にHIVウイルスによって使用される細胞表面蛋白質CD4は、蛋白質部分がCD4に対する抗体である蛋白質とポリカチオンの結合体と、輸送すべき核酸の複合体を形成させ、ついで、生成した蛋白質・ポリカチオン/DNA複合体をCD4発現細胞と接触させることにより、細胞内に核酸を輸送するのに使用しうる。
また、CD7に対する抗体を含む抗体・ポリカチオン結合体により、DNAをＴ−細胞系列の細胞に導入し、これらの細胞内で発現させたことも本発明の中に示してある。（CD7は、胸腺細胞および成熟Ｔ−細胞上に検出される、まだ生理学的役割の分かっていない細胞表面蛋白質である。CD7は急性Ｔ−細胞白血病の信頼できるマーカーである（アルフォ（Aruffo）およびシード（Seed）、1987）。）。
ラットの膵臓ガン細胞の膜フラクションに対する抗体を含む抗体・ポリカチオン結合体に関して、その結合体と複合体を形成するDNAをそのような細胞に導入し、その中で発現させたことが示された。
本発明の範囲において、種々の抗体成分を用いた抗体・ポリカチオン結合体を使用して、該抗体が指向する特定の表面抗原を発現する細胞内でDNAのインターナリゼーションおよび発現を達成しうることが示された。
従って、本発明は、核酸と複合体を形成しうる新しい蛋白質・ポリカチオン結合体であって、該蛋白質成分が細胞表面蛋白質に結合しうる細胞表面蛋白質に対する抗体であり、その結果、形成される複合体がその細胞表面蛋白質を発現する細胞に吸収される結合体に関する。
以後標的細胞の細胞表面蛋白質に対する抗体を「抗体」と呼ぶ。
さらに、本発明は、抗体が指向する細胞表面抗原を発現する標的細胞に輸送すべき核酸と本発明の結合体との複合体である抗体・ポリカチオン／核酸複合体に関する。
本発明において、本発明に従う複合体の要素としてのDNAが該抗体が指向する特定の抗原を発現する細胞に効率的に吸収、かつ、発現され、並びに、該細胞へのDNAの取り込みは、結合体含量の増加とともに増加することが示された。
適当な抗体は、細胞表面抗原、例えば、Fab'フラグメントに結合する細胞表面抗原に対する全ての抗体、特にモノクローナル抗体、またはそのフラグメントである（ペルチェン・マチュース（Pelchen−Matthews）等、1989）。
従来のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの代わりに、重鎖および軽鎖のセグメントの組み合わせ、または重鎖自体のセグメントの組み合わせを含む抗体変異体またはその一部を使用することもできる。ポリメレース・チェーン・リアクションおよび大腸菌における発現を用いたクローニングによるこれらの「代替」抗体の調製法に関しては、簡単な報告がある（サストリー（Sastry）等、1989、オランジ（Orlandi）等、1989、チョーダリー（Chaudhary）等、1990）。特に、インビボ治療で長期間にわたりヒトの治療に使用する場合、免疫応答を避けるために、ヒューマナイズド抗体（例えば、コ（Co）およびクイーン（Queen）、1991）またはヒト抗体が望ましい。遺伝子工学で生産したモノクローナル抗体および抗体変異体の探索は、ワルドマン（Waldmann）、1991によって提供されている。ヒト白血球上の表面抗原に対する抗体は、ナップ（Knapp）等、1989に報告されている。
抗体の選択は、特に標的細胞、例えば、ある細胞型に特異的または概ね特異的であり、従って、このタイプの細胞に核酸を導入しうる特定の表面抗原またはレセプターによって行われる。
本発明の結合体は、該結合体中に含まれる抗体が指向する表面抗原に依存して核酸で処理される細胞に関してより狭い、またはより広い選択性を許容し、治療的または遺伝子治療的に活性な核酸の柔軟な使用を可能にしている。
本発明の範囲において、該結合体成分は細胞に結合する抗体またはそのフラグメントを含み、その結果として、特にエンドサイトーシスにより結合体・DNA複合体がインターナライズするか、もしくは抗体（フラグメント）の結合・インターナライジングが細胞膜要素との融合によって行われる。
本発明における抗体（抗体フラグメント）の適性に重要な事は、
ａ）核酸を導入する特定の細胞によって認識され、かつポリカチオンと結合した時に結合能力が影響を受けないか、または実質的に影響を受けない事、および
ｂ）この性質の範囲で、これらが使用する経路により核酸を背負って細胞中に輸送しうる事、
である。
もしも、先のａ）およびｂ）の条件が満足されれば、理論的に表面抗原を指向するどの抗体も本発明の目的に使用しうる。これらには特定のタイプの細胞に特異的に発現される細胞表面タンパク質に対する抗体、例えば、本発明をＴ−細胞系列の細胞に応用する場合、この細胞に特徴的なCD4またはCD7抗原に対する抗体が含まれる。
本発明の目的に適した別の抗体は、本発明の範囲内で定義「細胞表面タンパク質」に則したレセプターに対する抗体である。レセプターの例には、トランスフェリン・レセプター、ヘパトサイト・アシアロ糖蛋白質レセプター、ホルモンまたは成長因子（インシュリン、EGFレセプター）に対するレセプター、TFNなどの細胞毒的に活性な物質に対するレセプターまたは、フィブロネクチンレセプターまたはビトロネクチンレセプター等の細胞外マトリクスに結合するレセプターがある。また、そのレセプターに結合するリガンドの能力が影響を受けないならば、細胞表面レセプターに対するリガンドを指向する抗体も適する。腫瘍細胞に関する指向的使用には、問題の腫瘍細胞に発現されている特異的細胞表面タンパク質、いわゆる腫瘍マーカーに対する抗体が特に適している。
本発明に適しているポリカチオンには、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン等の均一なポリカチオン、または２つ以上の異なる正電荷アミノ酸を有するポリカチオンであって、種々の鎖長の不均一なポリカチオン、およびポリエチレンイミン等のペプチド合成ポリカチオンが含まれる。その他の適当なポリカチオンには、ヒストンまたはプロタミン等の天然のポリカチオン性DNA結合タンパク質、またはそのアナログ、またはそのフラグメントがある。
ポリカチオンのサイズは重要ではない。ポリリジンの場合、正電荷の総計が約20乃至1000であり、かつ、輸送される特定の核酸に匹敵することが望ましい。所定の長さの核酸に対するポリカチオンの長さは重要ではない。例えば、もしDNAが6000塩基で12,000の負電荷を有している場合、ポリカチオンの量は、例えば60molのポリリジン200、または30molのポリリジン400、または120molのポリリジン100等である。また、平均的熟練者は、容易に行える所定の実験によりポリカチオンサイズおよびモル量の別の組み合わせを選択することが出来る。
本発明の抗体・ポリカチオン結合体はペプチドのカップリングに関する従来法を用いて化学的に調製しうるし、また、必要ならば各成分をリンカー物質（もしもメルカプト基またはアルコール基等のカップリングに適した官能基が無いならばこの手段が必要となる）とのカップリング反応の前に提供しうる。リンカー物質は、先ず各成分の官能基と反応し、その後修飾された各成分がカップリングする。
結合体の望ましい性質、特に安定性に関する性質に依存して、カップリングは
ａ）還元条件下で再び切断しうるジスルフィド結合（例えば、スクシンイミジル・ピリジルジチオプロピオネート（ジャング（Jung）等1981）、
ｂ）生物学的条件下で非常に安定な化合物の使用（例えば第２の成分に結合したリンカーのスルフィドリル基とマレイミド・リンカーを反応させることによるチオエステル）、
ｃ）生物学的条件下で不安定な結合、例えば弱酸性条件下で不安定なエステル結合、またはアセタール結合またはケタール結合、
以上ａ）乃至ｃ）のいずれかにより行いうる。
先に述べたように遺伝子工学で生産した抗体を使用する時、組み換え法により本発明に従う結合体を調製することも可能であり、この事は正確に定義された均一の化合物を入手しうるという利点を有している一方、化学的結合は分離しなければならない結合体の混合物を与える。
本発明の結合体の組み換え的調製は、キメラポリペプチドの調製法として知られている方法で行いうる。ポリカチオン性ペプチドのサイズおよびアミノ酸配列は変化しうる。また、遺伝子工学による生産は、例えば細胞表面タンパク質への結合能を増加すること、適当な突然変異、または細胞表面タンパク質への結合を担う分子の一部分に短縮された抗体成分を使用することにより結合体の抗体部分を修正しうる利点を有する。特に、抗体成分をコードする配列を含むベクター、およびポリカチオン性ペプチドをコードする所望される配列を挿入するポリリンカーを使用する事が本発明の結合体の組み換え的生産に適している。この様にして一組の発現プラスミドが得られ、この中から本発明の結合体の発現に必要なものを選択しうる。
もし抗体が適当な炭水化物鎖を含んでいるなら、これらの１つ以上の炭水化物鎖を介して抗体をポリカチオンに結合しうる。この種の結合体は、従来のカップリング法で調製した結合体よりも使用されるリンカー物質に由来する修飾を含まないという利点を有する。糖蛋白質・ポリカチオン結合体の適当な調製方法は、ドイツ特許出願P 41 15 038.4に公開されており、ワグナー（Wagner）等、1991に簡潔に報告されている。
ポリカチオンに対する抗体のモル比は、凝集物が生成することを頭に入れておく必要があるが10:1乃至1:10が望ましい。しかし、核酸の複合体化が起こる条件であり、形成された複合体が細胞表面タンパク質に結合し、細胞内に輸送されることが確認されるならば必要に応じてこのモル比の範囲を拡げることも可能である。この事は、例えば細胞表面抗原を発現する細胞系列を本発明の複合体と接触させ、ついで、例えばサザンブロット分析、放射能ラベルした相補的核酸分子によるハイブリダイゼーション、PCR増幅、またはレポーター遺伝子の遺伝子産物の検出により細胞中の核酸または遺伝子産物の存在を検定することにより個々のケースで行われる簡単なテストでチェックしうる。
特定の用途、特に適当な抗体を発見するためのスクリーニングに対しては、抗体をポリカチオンに直接結合させない方が望ましい。効率的な化学的カップリングには原料の抗体を大量（1mg以上）に使用する事が一般的であり、さらに、カップリングが場合によっては抗体の結合ドメインを不活性化することもあり得る。この問題を回避し適当な抗体を迅速にスクリーニングするためには、先ず、プロテインＡのFC結合ドメインにより、細胞のトランスフェクション直前に、続いて抗体を結合させるプロテインＡポリカチオンであって、場合によっては既に核酸と複合体を形成させたプロテインＡ・ポリカチオンを調製する（スロリア（Surolia）等、1982）。プロテインＡ結合体との核酸複合体は、処理した特定の細胞への核酸輸送の適性に関する抗体の迅速なテストを可能にする。関連するポリカチオンとプロテインＡとのカップリングは、抗体への直接的カップリングと同様に行う。プロテインＡ・抗体・ポリカチオン結合体を使用するとき、先ず、過剰の抗体から細胞を開放するために抗体で処理する細胞をインキュベートし、次いでプロテインＡ・ポリカチオン・核酸複合体で処理することが望ましい。場合によっては、抗体に対するアフィニティーを増加させるためにプロテインＡを例えば大量のプロテインＧで修飾する。
細胞に輸送する核酸はDNAでもRNAでも良く、ヌクレオチド配列に制限はない。修正が核酸のポリカチオン性に影響しないならば核酸の修正が可能である。これらの修飾には、例えばホスホジエステル基のホスホロチオエートによる置換、またはヌクレオチドアナログの使用などがある。このような修正は当分野では一般的なものである。代表的様式で修正された核酸および一般に核酸アナログと呼ばれる核酸およびそれらの作用の原則はゾン（Zon）（1988）に報告されている。
また、核酸のサイズに関しても本発明は広い範囲を許容している。もし、抗体−ポリカチオン・核酸複合体が細胞内に輸送されることが保証されるならば本発明の結合体の理論的な上限は無い。下限は、例えば、約10ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドは特異性が低いことから使用できない事など、特定の用途に特異的な理由から提示される。本発明の結合体を用いてプラスミドも細胞内に輸送しうる。例えば、場合によってはタンデムでのアンチセンス的用途に使用する小さい核酸も細胞内で転写される大きい遺伝子構築物の統合要素として使用しうる。
また、本発明の結合体により同時に異なる核酸を細胞に輸送しうる。
阻害効果を有する核酸の例は、先に述べたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウイルス複製に重要な遺伝子断片への相補性によるウイルス阻害効果を有するリボザイムがある。相補性による阻害効果を有する本発明の抗体・ポリカチオン・核酸複合体の望ましい核酸成分は、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAまたはリボザイムまたはこれらをコードする遺伝子である。リボザイムおよびアンチセンスRNAを用いる時は、場合によってはキャリヤー遺伝子と共にこれらをコードする遺伝子を使用する事が望ましい。RNA自身を導入するよりも遺伝子を細胞に導入する方がかなりの該RNAの増殖をもたらし、結果的に目的の生物学的反応の阻害に十分な供給が保証される。特に適したキャリヤー遺伝子は、ポリメラーゼIIIによる転写に必要な転写単位、例えばtRNA遺伝子である。例えば、リボゾーム遺伝子をその中に挿入すると転写が行われたとき、リボザイムがコンパクトなポリメラーゼIII転写物の一部となっている。ポリメラーゼIIIによって転写されるリボザイム遺伝子およびキャリヤー遺伝子を含む適当な遺伝子単位はヨーロッパ特許出願A1 0 387 775に公開されている。本発明の輸送システムは、細胞中での該遺伝子の初期濃度の増加を保証することでこの遺伝子単位の効果を増強しうる。
原則として、その阻害がウイルス複製および発現の阻害を引き起こすHIV遺伝子の全ての配列は、AIDSの治療に使用しうる相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイムまたはこれらをコードする遺伝子を構築するための目標配列に適している。最も重要な目標配列は、調節機能を有する配列、特にtat−、rev−またはnef−遺伝子である。他の適当な配列には、開始、ポリアデニレーション、LTR配列のスプライシングtRNAプライマー結合部位（PBS）またはtar−配列がある。
ウイルス遺伝子への相補性の結果として阻害する核酸分子とは別に、例えば、所謂トランスドミナント突然変異を含むウイルスタンパク質をコードする遺伝子等別のメカニズムの活性を有する遺伝子を使用することも出来る。細胞中での該遺伝し産物の発現が、その機能により対応する野生型のウイルスタンパク質を抑制するタンパク質を生じ、その結果後者はウイルス複製に対する通常の機能を遂行できず、ウイルスの増殖が効率的に阻害される。基本的に、例えばHIV複製に関する阻害効果を有することが示されているgag−、tat−およびrev−変異体等（トロノ（Torono）等、1989、グリーン（Green）等、1989、マリム（Malim）等、1989）、複製および発現に必要なウイルスタンパク質のトランスドミナント変異体が適している。
治療的に活性な核酸の別の例にはオンコジーンへの阻害効果を有するものがある。
また、本発明に従い、例えば、CD4＋細胞、より特定するとＴ−細胞およびそれによるＴ−細胞の生存率の増加等、その発現産物が目標細胞へのシグナル・トランスミッションの正の効果を与えるためのシグナルの伝達に関する機能を遂行する遺伝子またはその断片を細胞に輸送することも可能である。
理論的に細胞表面タンパク質を発現し、細胞中で治療的、または遺伝子治療的効果を有する全ての遺伝子または遺伝子断片が本発明の目的に適している。
遺伝子治療に使用でき、かつ、本発明により細胞中に導入しうる遺伝子の例には、因子VIII（例えば、ウッド（Wood）等、1984）、因子IX（血友病で使用される。例えばクラチ（Kurachi）およびデビー（Davie）、1982）、アデノシン・デアミナーゼ（SCID、例えばバレリオ（Valerio）等、1984）、α−１−アンチトリプシン（肺気腫、例えばシリベルト（Ciliberto）等、1985）または「嚢胞性線維症トランスメンブレン調節遺伝子」（リョウダン（Riordan）等、1989）がある。これらの例はいかなる制限も構成していない。
結合体に対する核酸の比は広い範囲で変化でき、核酸の全ての電荷を中和する必要は、必ずしもない。この比は輸送される核酸のサイズおよび構造、ポリカチオンのサイズ、その電荷の数および分布などの基準に従い個々の場合で調節しなければならず、その結果、特定の用途に関して核酸の輸送性と生物学的活性との間で好ましい比が存在する。最初にこの比は、おそらくゲル中（例えばアガロースゲルにおける移動度シフト）または密度勾配遠心におけるDNAの移動速度の遅延などにより調節しうる。この予備的比を求めた後、細胞における核酸の最大使用活性を得、かつ、おそらく、残存する核酸の負電荷が細胞への輸送を妨害しないように結合体部分を減少する観点から放射能ラベルした複合体を用いたテストを行うことが望ましい。
抗体・ポリカチオン・核酸複合体の調製は、とりわけ、ポリイオン性化合物の複合体化に関する従来法で行いうる。制御不可能な凝集または沈殿を避ける１つの可能な方法には、高い希釈率（≦100μｇ）で両成分を混合する事が含まれる。
エンドサイトーシスにより高等真核生物に吸収されうる抗体・ポリカチオン・核酸複合体は、さらに、結合体によって達成される核酸のインターナリゼーションおよび／または発現を増加する目的で結合体中のポリカチオンと同じ非共有結合型の１つ以上のポリカチオンを含みうる。
未公開の国際特許出願No.92/00217の主題であるこれらの手段を用いることにより、少なくとも同等のトランスフェクション・発現効率を達成するための細胞に輸送される核酸の量に基づく抗体・ポリカチオン結合体の必要量はより少なくて済み、この事は合成の経費がより少ないことを意味している。また、複合体において大量の抗体分子により占有され、結果として、それらがもはや他の複合体に対して使用不能となる、いくつかの隣接する「ドッキング部位」を有する効果を避けたいときには、結合体が少量であることは望ましい。複合体中に含まれる抗体量を必要最小限に制限すること、即ち、結合体量を出来るかぎり少なく維持し、かつ、それを遊離のポリカチオンで希釈することは、処理する標的細胞上の細胞表面タンパク質の数が少ないときは特に都合がよい。
このような手段を用いることにより、特に効率的ではなかった結合体の性能が実質的に増加し、かつ、既に高い効率を示す結合体の性能をさらに増加することが出来る。
本発明の複合体の定性的組成に関しては、一般的に先ず、細胞に輸送される核酸および抗体が決定される。核酸は基本的に細胞中で達成される生物学的効果、例えば、阻害または欠陥遺伝子を置換する目的で発現される（遺伝子治療に使用する時）遺伝子または遺伝子断片の標的配列により限定される。場合によっては、特定の用途に関する安定性の必要等から核酸は修正されうる。核酸および抗体の決定から始まり、核酸のサイズが特に負電荷の実質的中和に関して重要であることからこれらのパラメーターにポリカチオンが対応付けられる。
複合体中に含まれうる非共有結合ポリカチオンを選択する時、これらの物質の付加が結合体のみの場合に比べて核酸のインターナリゼーション・発現の増加をもたらすことは重要なことである。
定性的組成と同様に複合体の定量的組成も、例えば、核酸を濃縮する必要性およびその程度、複合体全体の電荷、特定の細胞に対する結合能およびインターナライジング能の程度およびその能力を増加する必要性の程度等、機能的に互いに関連する多くの基準により決定される。複合体の組成に関する他のパラメーターには、重要な因子は抗体が細胞と相対的な複合体内に存在する様式であることから細胞表面タンパク質に対する抗体の接近可能性が挙げられる。別の重要な性質は、所定の機能を行うための細胞内における核酸の接近可能性である。
複合体内に非共有結合的に含まれるポリカチオンは、結合体中に含まれる物と同じでも異なっていても良い。これらを選択する為の基本的基準は、特に凝縮に関する核酸のサイズである。小さい核酸分子の場合は一般に凝集する必要がない。結合体中に含まれるポリカチオンに特に配慮されるので性質や量に関するポリカチオンの選択も結合体に従って行われる。例えば、もし、ポリカチオンがDNA凝縮する能力を全くまたは少ししか持たないなら、複合体の効率的なインターナライジングを行う目的にはこの性質がより大きいポリカチオンを使用することが望ましい。もし、結合体中に含まれるポリカチオンがそれ自身核酸を凝縮する物質であり、かつ、もし効率的なインターナライジングのための核酸の適当な凝縮が達成されるならば、他のメカニズムで発現の増加をもたらすポリカチオンを使用することが望ましい。
場合によっては、複合体中に含まれうる非共有結合ポリカチオンにとって重要なことは、核酸を凝縮する能力、および／または細胞中での不都合な分解から核酸を保護する能力である。さらに、本発明はヒトまたは動物細胞に核酸を導入する方法に関し、その方法では生理学的条件下で可溶性の抗体・ポリカチオン・核酸複合体を細胞に接触させることが望ましい。
本発明の範囲において使用したDNA成分はレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼ遺伝子である（レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用したトランスフェリン・ポリカチオン・DNA複合体を用いた予備実験の結果に基づき、ルシフェラーゼ遺伝子の取り込み効率は他の核酸の有用性の指標となり、かつ、定量的には使用した核酸がタンパク質・ポリカチオン・DNA複合体の使用に関する制限因子ではない事が示された。
本発明の特定の態様に対しては、細胞中の核酸の分解が阻害される条件を作ることが有効である。
核酸の分解が阻害される条件は、いわゆるリソソマトロピック物質の添加で提供される。これらの物質はリソソーム中のプロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性を阻害し、核酸の分解を防ぎうることが知られている（ラスマン（Luthmann）およびマグヌソン（Magnusson）、1983）。
これらの物質にはクロロキン、モネンシン、ニゲリシン、塩化アンモニウムおよびメチルアミンが含まれる。
本発明の範囲においてリソソマトロピック物質の群から選択される物質を使用する必要性は特に処理する細胞のタイプに依存し、また、種々の抗体を使用する場合は複合体を細胞に吸収させる種々のメカニズムに依存する。従って、例えば本発明の範囲において種々の抗体（モノクローナル抗CD4抗体）を使用した場合の細胞へのDNAの取り込みはクロロキンにより様々な影響を受けることが分かった。
どの様な場合にも予備実験により本発明の物質の必要性または適性をテストする必要がある。
さらに、本発明は抗体・ポリカチオン結合体と複合体を形成した１つ以上の治療的または遺伝子治療的に活性な核酸を活性成分として含む医薬組成物に関する（抗体・ポリカチオン結合体と核酸は別々に存在し、治療直前に複合体を形成させることもできる）。例えば、食塩水、リン酸緩衝液等本発明の組成物が必要とされる溶解特性を有する全ての医薬的に許容されるキャリヤーも使用しうる。成形に関してはレミントン医薬科学（Remington's Pharmaceutical Science,1980）を参照せよ。
治療的に活性な核酸の例にはこれまで述べてきたアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはリボザイム、またはこれらをコードする遺伝子、または特定の標的細胞中に含まれる内在性または外来性遺伝子または遺伝子産物に関する阻害効果を有するトランスジミナント変異体をコードする遺伝子が含まれる。これらには例えば配列特異性により（トランスドミナント変異体をコードする標的配列に相補的な（ヘルスコウィッツ（Herskowitz）,1987）HIVに対して細胞内免疫をもたらし（バルチモア（Baltimore）,1988）AIDS治療や感染後のウイルスの活性化の予防に使用しうる遺伝子が含まれる。
この医薬製剤はヒトまたは動物体内の、例えばHIVまたは関連するレトロウイルスなどのウイルス配列の阻害に使用しうる。関連レトロウイルスの阻害による治療的用途の例は、HTLV−１ウイルスによって起こる増殖性Ｔ−細胞白血病の治療である。
また、ウイルス性Ｔ−細胞白血病の治療に加えて、本発明は非ウイルス性白血病の治療にも使用しうる。最近、リンパ性白血病の発病におけるオンコジーンの関連が示されてきた（abl,bcr,Ha,Ki,ras,c−myc,N−myc）。観察される特異的染色体トランスロケーションに基づき、その他のオンコジーンも存在すると考えられている。これらのオンコジーンのクローニングはオンコジーン阻害核酸の構築および本発明の治療的用途の拡大の基礎を与える。
他の重要な用途は遺伝子治療である。理論的に本発明による遺伝子治療では、例えば遺伝子に起こる欠陥の置換または免疫応答の刺激により、その発現が導入された細胞内で治療効果を上げる全ての遺伝子またはその断片を使用することが出来る。
治療的用途で使用する医薬製剤は静脈注射などにより全身的に投与しうる。標的組織には肺、脾臓、骨髄および腫瘍などがある。
局所的使用の例には、肺（注入用の本発明の医薬製剤または吸入用のエアロゾルの使用）、筋肉組織、腫瘍または肝臓への直接的注射、または消化器官または血管への局所的使用がある。
また、本物質は、例えば骨髄細胞または肝細胞等の処理細胞を再び体内に導入する体外治療にも使用できる（例えば、ポンダー（Ponder）等、1991）。
【図面の簡単な説明】
第１図:CD4+−CHO細胞への抗CD4−ポリリジン/pRSVS複合体の導入。
第２図:CD4+−CHO細胞への抗CD4−ポリリジン/pRSVS複合体の輸送。
第３図、第４図：抗CD7−ポリリジン190結合体によるH9細胞におけるDNAの転移および発現。
第５図:mAb1.1ASML−ポリリジン190結合体による膵臓癌細胞へのDNAの転移。
第６図：抗体プロテインＡ−ポリリジン結合体によるCD4+細胞へのDNAの転移。
第７図：抗体A/G−ポリリジン結合体によるK562細胞へのDNAの転移。
本発明を以下の実施例で説明する。
予備実験１
抗CD4−ポリリジン90結合体の調製
カップリングは文献で知られている方法と同様にスクシンイミジル−ピリジルジチオプロピオネート（SPDP、ジャング（Jung）等、1981）による修飾後のジスルフィド結合の導入により行った。
50mMリン酸ナトリウムバッファ（pH7.8）中1.7mgの抗CD4抗体（OKT4A、オルト・ダイアグノスチック・システムズ）の溶液を11μｌの10mM SPDP（ファルマシア）エタノール溶液と混合した。室温１時間後、混合物をセファデックスG 25ゲルカラムで濾過し（溶出液100mM HEPESバッファpH7.3）、75nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗CD4 1.4mgを得た。同様にポリ（Ｌ）リジン90（平均重合度90リジン残基（シグマ）、FITCによる蛍光ラベル）をSPDPで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過により遊離したメルカプト基で修飾された形にした。0.5mlの20mM酢酸バッファ中120nmolのメルカプト基で修飾された38nmolのポリリジン溶液を酸素を排除して上述の修飾した抗CD4と混合し、室温に一晩放置した。この結合体をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（スパロース12、500mM塩酸グアニジン、pH7.3）で単離した。25mM HEPES（pH7.3）に対する透析後、11nmolのポリリジン90で修飾された1.1mgの抗CD4抗体を含む結合体が得られた。
予備実験２
抗CD4−ポリリジン190結合体の調製
0.3mlの50mM HEPES（pH7.8）中、1.0mg（6.25nmol）の抗CD4抗体（OKT4A、オルト・ダイアグノスチック・システムズ）溶液を37μｌの1mMスクシンイミジル・ピリジルジチオ・プロピオネート（SPDS、フォルマシア）エタノール溶液と混合した。室温１時間後、混合物をセファデックスG 25カラム（溶出液100mM HEPESバッファ、pH7.3）で濾過し、30nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗CD4抗体0.85mg（5.3nmol）を得た。同様にポリ（Ｌ）リジン190（平均重合度190リジン残基（シグマ）、FITCで蛍光ラベル）をSPDPで修飾し、ジチオスレイトールにより処理およびゲル濾過により遊離したメルカプト基で修飾した形とした。0.13mlの30mM酢酸ナトリウムバッファ中、25nmolのメルカプト基で修飾された7.7nmolのポリリジン190の溶液を酸素を排除して上述の修飾された抗CD4（0.5mlの300mM HEPES pH7.9中）と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に5M NaClを添加して約0.6Mとした。結合体はイオン交換クロマトグラフィーで単離した（Mono S、ファルマシア、50mM HEPES pH7.3、塩濃度勾配0.6Mから3M NaCl）。10mM HEPES（pH7.3）に対する透析後、3.9nmolのポリリジン190で修飾された抗CD4抗体0.35mg（2.2nmol）を含む目的の結合体が得られた。
予備実験３
抗CD7−ポリリジン190結合体の調製
50mM HEPES（pH7.9）中、1.3mgの抗CD7抗体（イムノテク社）溶液を49μｌの1mM SPDP（ファルマシア）エタノール溶液と混合した。室温、１時間後、混合物をセファデックスG 25カラム（溶出液50mM HEPESバッファpH7.9）で濾過し、33nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗CD7抗体1.19mg（7.5nmol）を得た。同様にFITCで蛍光ラベルしたポリ（Ｌ）リジン190をSPDPで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過で遊離したメルカプト基で修飾された形とした。
0.2mlの30mM酢酸ナトリウムバッファ中、35nmolのメルカプト基で修飾された11nmolのポリリジン190の溶液を酸素を排除して上述の修飾された抗CD7（0.5mlの300mM HEPES pH7.9中）と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に5MのNaClを添加して約0.6Mに調整した。イオン交換クロマトグラフィーにより（Mono S、ファルマシア、50mM HEPES pH7.3、塩濃度勾配0.6Mから3M）単離した。10mM HEPES pH7.3に対する透析後、6.2nmolのポリリジン190で修飾された0.51mg（3.2nmol）の抗CD7抗体を含む目的の結合体を得た。
実施例１
mAb1.1ASML−ポリリジン190結合体の調製
本実施例では結合体の調製にmAb1.1ASMLと命名されたラット膵臓ガン細胞系列BSp73ASMLの膜タンパク質調製物に対するモノクローナル抗体（マヅク（Matzku）等、1983）を使用した。0.5mlの50mM HEPES pH7.9中、2.0mgのmAb1.1ASML溶液を75μｌの1mM SPDP（ファルマシア）エタノール溶液と混合した。室温、１時間後、この混合物をセファデックスG 25カラムで濾過し（溶出液50mM HEPESバッファpH7.9）、39nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾されたmAb1.1ASML 1.3mg（8nmol）を得た。FITCで蛍光ラベルしたポリ（Ｌ）リジン190を同様にSPDPで修飾し、ジチオスレイトール処理およびゲル濾過により遊離のメルカプト基で修飾された形にした。210μｌの30mM酢酸ナトリウムバッファ中、37nmolのメルカプト基で修飾された12nmolのポリリジン190の溶液を酸素を排除して上述の修飾されたmAb1.1ASML（0.9mlの100mM HEPES pH7.9中）と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に5M NaClを添加することで約0.6Mに調整した。結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Mono S、ファルマシア、50mM HEPES pH7.3、食塩濃度勾配0.6Mから3M）で単離した。分画および20mM HEPES pH7.3に対する透析後、0.45nmolのポリリジン190で修飾された0.16mg（1nmol）を含む結合体フラクションＡが得られ、また0.9nmolのポリリジンで修飾された0.23mg（14nmol）のmAb1.1ASML（フラクションＢ）または3.9nmolのポリリジン190で修飾された0.92mg（5.8nmol）のmAb1.1ASML（フラクションＣ）も得られた。
実施例２
プロテインＡ−ポリリジン190結合体の調製
0.5mlの100mM HEPES pH7.9中、4.5mgのプロテインＡ（ピアス、No.21182、107nmol）溶液を30μｌの10mM SPDPエタノール溶液と混合した。室温２時間後、反応液をセファデックスG 25カラムで濾過し（溶出液50mM HEPESバッファpH7.9）、245nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された3.95mg（94nmol）のプロテインＡが得られた。FITCで蛍光ラベルしたポリ（Ｌ）リジン190を同様にSPDPで修飾し、ジチオスレイトール処理およびゲル濾過により遊離のメルカプト基で修飾された形にした。0.8mlの30mM酢酸ナトリウムバッファ中、150nmolのメルカプト基で修飾された53nmolのポリリジン190溶液を酸素を排除して上述の修飾されたプロテインＡと混合し、この反応混合物に5MのNaClを添加することで約0.6Mに調整した。結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Mono S、ファルマシア、50mM HEPES pH7.3、塩濃度勾配0.6Mから3M）で単離した。分画および25mM HEPES pH7.3に対する透析後、各々5nmolポリリジン190で修飾された1.15mg（27nmol）のプロテインＡおよび40nmolのポリリジン190で修飾された2.6mg（6.2nmol）のプロテインＡを含む２つの結合体フラグメントＡおよびＢが得られた。
実施例３
抗体・ポリカチオン結合体とDNAとの複合体の調製
複合体はDNAの希釈溶液（150mM NaCl,20mM HEPES pH7.3中30μg/ml以下）を予備実験１、２および実施例１（100μg/ml以下）で得られた抗体・ポリリジン結合体と混合することで調製した。使用したDNAはTriton−Ｘ分解標準法（マニアチス（Maniatis）、1982）およびCsCl/EtBr平衡密度勾配遠心、ブタノール−１による脱色および10mMトリス/HCl pH7.5、1mM EDTAに対する透析で調製したpRSVLプラスミドDNAである（ドゥウェット（De Wet）等、1987）。DNA複合体の沈殿を防ぐために、無リン酸バッファを使用した（リン酸は結合体の溶解度を低下する）。
予備実験４
抗CD4・ポリリジン90結合体によるCD4+CHO−細胞へのDNAの転移および発現
本実施例および以下の実施例では、遺伝子転移および発現を調べるためにレポーター遺伝子としてフォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）のルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを使用した。実験結果を示す図では、ルシフェラーゼ活性を示す値が全細胞試料の活性と関係付けられる。
CD4+CHO−細胞（ラスキー（Lasky）等、1987）を10％FCS（ウシ胎児血清）を含むハムズＦ−12培地（ハム（Ham）、1965）のＴ−25バイアル当たり５×105個の割合で植種した。18時間後、細胞を血清を含まないハムズＦ−12培地を洗浄し、この培地中（5ml）37℃で５時間インキュベーションした。
抗CD4・ポリリジン/pRSVS複合体は、実施例３で述べたように最終濃度150mM NaCl,20mM HEPES pH7.5 500μｌあたり10μｇのDNAとなるよう調製した。抗CD4ポリリジン190（8.4nmolポリリジン190/mg抗CD4）は特定された質量比で使用した（抗CD4の質量で表して1.9乃至8.1）。サンプル１乃至４では、複合体は100μＭのクロロキンを含む無血清ハムズＦ−12培地中の細胞に添加した。サンプル５および６ではクロロキンを省いた。４時間のインキュベーション後、細胞を10％FCSを含む培地を２回洗浄し、この培地中でインキュベーションした。サンプル５および６では、等容量の血清含有培地を細胞に添加した。20時間後、全ての細胞を新鮮な血清含有培地で洗浄し、48時間後に収穫した。抽出物の一部（同量のタンパク質に対応する各サンプルの約1/5）のルシフェラーゼ活性を検定した（ドゥウェット（De Wet）等、1987）。クリニルメート（バーソールド、ワイルドバック、FRG）を用いて生物発光を測定した。この実験の結果は第１図に示す。本発明の結合体によりDNAがCD4+細胞に輸送され、輸送されたDNAが発現しており、またDNAの輸送効率は抗CD4/ポリリジン190リジン含量に比例することが分かった。
予備実験５
抗CD4−ポリリジン190結合体によるCD4+CHO細胞へのDNAの転移および発現
先ず、CD4+CHO細胞を予備実験４で述べたように培養した。第２図に示したように10μｇのpRSVL、および、2:1または3:1の過剰量抗CD4−ポリリジン90を含む実施例３で示したように調製した結合体/DNA複合体を100μＭのクロロキン有無の条件下で細胞に添加した。さらに37℃で４時間後、クロロキンを含むサンプルを10％FCSを含むハムズ培地で２回洗浄し、一方では同培地5mlをクロロキンを含まないサンプルに添加した。この細胞をさらに37℃で20時間インキュベーションし、その部分標本のルシフェラーゼ活性を予備実験４で述べたように検定した。このテストの結果を第２図に示す。
予備実験６
CD7−ポリリジン190結合体によるH9細胞へのDNAの転移および発現
ａ）Ｔ−細胞系列H9細胞（マン（Mann）等、1989）を20％FCS、ml当たり100ユニットのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび1mMのグルタミンを補ったRPM I1640培地で培養した。トランスフェクション直前に遠心で細胞を回収し、ml当たり100,000細胞となるように新鮮な培地に移して（サンプル当たり1,000,000細胞）これをトランスフェクションに使用した。抗CD7結合体との比較物としてはトランスフェリン結合体を使用した。トランスフェリン・ポリリジン結合体は、EP−A 1 388 758に示されているように調製した。使用したCD7結合体は予備実験３で述べたものである。DNAとの複合体形成は実施例３で述べたように行った。H9細胞での一時的なトランスフェクションのために、使用したDNAはルシフェラーゼをコードする配列と組み合わせたHIV−LTR配列とそれに続くSV40−イントロン／ポリＡ部位を含むプラスミドpHLuciである。pHIV/2A由来のプロテアーゼ2A遺伝子を含むHind IIIフラグメント（サン（Sun）およびバルチモア（Baltimore）、1989）は除去し、ルシフェラーゼをコードする配列を含むpRSVLのHind III/Sma Iフラグメント（ドゥウェット（De Wet）等、1987）で置き換えた。２つのフラグメントをHind III部位で連結し（クレノーポリメラーゼで平滑末端とした後）、次いで平滑Sma I部位を介して平滑化したHind III部位に結合した。正しい方向のルシフェラーゼ遺伝子配列を有するクローンを選択した。このプラスミドは強い転写活性にTAT遺伝子産物を必要とする。これは、CMV初期プロモーターの調節下にあるHIV−TAT遺伝子をコードするプラスミドpCMVTATをコントランスフェクションすることにより調製した（ヤコボビッツ（Jakobovits）等、1990）。トランスフェクションに使用したDNA複合体は、５μｇのpHLuciおよび１μｇのpCMVTATの混合物を含んでいる。10mlの細胞サンプルにDNA/ポリカチオン複合体（500μｌ）を添加し、100μＭのクロロキンの存在下で４時間インキュベーションした。その後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、40時間後収穫して先の実施例で述べたようにルシフェラーゼ活性を測定した。結果（ルシフェラーゼ光単位）を第３図に示す。６μｇのDNAと複合体を形成する抗CD7−ポリリジン結合体の量が増加するにつれルシフェラーゼ活性が増加することが分かった（サンプル１、２および３）。６μｇのDNAを複合体形成に用いた遊離のポリリジン１μｇと共に使用した時さらに活性の増加が見られ（サンプル４）、また、さらにポリリジンを添加すると遺伝子輸送が阻害された（サンプル５）。（トランスフェリン−ポリリジン結合体を用いて行った比較テストは、サンプル６および７である）
ｂ）さらに、プラスミドpSSTNEOを用いて抗体結合体によるトランスフェクションの一連のテストを行った。マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む該プラスミドを、抗CD4、抗CD7および（比較のため）トランスフェリン・ポリリジン190結合体を用いてH9細胞に導入した（106細胞当たり６μｇのDNAを使用した。至適トランスフェクション条件は、一時的なルシフェラーゼ検定による予備テストで決定した）。プラスミドpSSTNEOは、HSV TK−neo単位を含むpUCu部位の大きい方のSstフラグメントを含んでいる（コリス（Collis）等、1990）。単一のNde I部位を含む63bpのフラグメントをAsp718部位に導入した。トランスフェクトした細胞の一部（特定の細胞数を含む）を1000μg/mlのG418を含む半固形メチルセルロース培地で希釈した。これを行うためにDNAによるトランスフェクション後３日目に、細胞の一部を通常の要求物に加えて0.5−1mg/mlのG418および20mg/mlのメチルセルロースを含む半固形培地であってネオマイシン・マーカーを含む培地にプレーティングした。（半固形選択培地を調製するためには、460mlの水に20gのメチルセルロースを含む溶液を無菌状態で調製した。）また、二倍濃度の補填栄養培地500mlを無菌的に調製し、メチルセルロース溶液と合わせた後、容積を１リットルとし４℃で一晩攪拌した。場合によっては−20℃での保存後、この培地50mlを10mlの血清と混合し、血清を含まない完全な培地で100mlに調整した。この段階でG418を添加した。このメチルセルロース培地2.5mlを50−100μｌの細胞懸濁液と混合し、この混合物1mlを培養皿に注いだ。CO2雰囲気下、37℃でインキュベーションした。10−14日後、G418耐性細胞を計数した（200個以上の細胞を含むコロニーのみをポジティブとして計数した）。この結果を第４図に示す（これは抗生物質培地にプレーティング後10日目の1000個の細胞当たりのG418耐性コロニー数を示している）。
実施例４
mAb1.1ASML−ポリリジン190結合体による膵臓ガン細胞へのDNAの転移
10％FCSを含むRPM I1640培地2ml中の転移性ラット膵臓ガン細胞系列BSp73ASML（マズク（Matzku）等、1989）の細胞をファルコン製の24穴プレートに５×105個の割合でプレーティングした。この細胞を実施例１で調製したmAb1.1ASML−ポリリジン190結合体（または比較としてトランスフェリン・ポリリジン200結合体またはポリリジン自体）と接触させ、100μＭのクロロキン存在下、以下に示す結合体・DNA比でpRSVL−DNAと複合体を形成させた。37℃、４時間の複合体とのインキュベーション後、培地を除き、新鮮な血清含有培地（クロロキン無し）を添加してさらに37℃、20時間インキュベートした後細胞を収穫した。細胞抽出物から同じタンパク質含量で標準化した部分標本のルシフェラーゼ活性を検定した。第５図から示されている光単位の値は６μｇのDNAでトランスフェクトした細胞５×105個のルシフェラーゼ活性に匹敵する（図中、mAb−pL190Cは18μｇのpAb1.1ASML−pL190C結合体を示す。mAb−pL190C＋pLは９μｇのmAb1.1ASML−pL190C結合体＋1.5μｇの非結合ポリ（Ｌ）リジン90を示す。TfP1200は18μｇのTfpL200C（トランスフェリン・ポリリジン200結合体）を示し、pLは2.5μｇ（または１−４μｇ）のポリリジン（Ｌ）リジン90を示す。）。
実施例５
抗体プロテインＡ・ポリリジン結合体によるCD4+細胞のトランスフェクションT25バイアル当たり６×106細胞の割合でCD4発現HeLa細胞（予備実験４参照）を植種し、10％のFCSを含むDMEを培地で培養した。第６図に示したように、細胞を抗体（抗CD4gp55kD、IOT4、イムノテク社、サンプル当たり３μｇ）と室温で１時間プレ・インキュベーションした。その間に６μｇのpRSVLおよび実施例３に示したようにさらに遊離のポリリジンを含む指定量のプロテインＡ・ポリリジン190を含む500μｌのHBS中でプロテインＡ・ポリリジン190/DNA複合体を調製した。１時間のインキュベーション後、細胞を新鮮な培地4.5mlに移し、37℃で500μｌのDNAサンプルを細胞に添加した。４時間後、100μＭのクロロキンを含むサンプル（サンプル９−12）を新鮮な培地を洗浄し、一方、１−８のサンプルは収穫するまでDNAとインキュベートした。ルシフェラーゼ検定のため20時間後に細胞を収穫した。検定結果は第６図に示す。ルシフェラーゼ活性は、DNA複合体中のプロテインＡ・ポリリジンの存在に依存する事が分かった（サンプル１−４、５、６）。サンプル５−８、11、12では、抗体での前処理無しにプロテインＡ複合体によりDNAの輸送が起こっている。しかし、細胞表面タンパク質CD4を認識する抗体で細胞を前処理した場合にはDNAの導入が約30％増加した（サンプル１−４、９、10）。また、クロロキンの存在がDNA発現の増加の原因とはならないことが分かった（サンプル１−８とサンプル９−12の比較）。
実施例６
抗体・プロテインA/Gポリリジン190結合体によるK562細胞のトランスフェクション
ａ）プロテインA/Gポリリジン190結合体の調製
0.5mlの100mM HEPES（pH7.9）中4.5mgの組み換えタンパク質A/G（ピアス、No.21186,102nmol）溶液を30μｌのSPDP（ファルマシア）10mMエタノール溶液と混合した。室温２時間後、この混合物をセファデックスG25ゲルカラムで濾過し（溶出液50mM HEPESバッファ（pH7.9））、290nmolのピリジルジチオプロピオネート基で修飾されたプロテインA/G 3.45mg（75nmol）を得た。FITCで蛍光ラベルしたポリリジン190を同様にSPDPで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過で遊離したメルカプト基で修飾された形とした。
0.8mlの30mM酢酸ナトリウムバッファ中、130nmolのメルカプト基で修飾された42nmolのポリリジン190溶液を酸素を排除して上述の修飾されたプロテインA/Gと混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に5MのNaClを添加して約0.6Mに調整した。結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Mono S、ファルマシア、50mM HEPES（pH7.3）、塩濃度勾配0.6M乃至3M Nacl）で単離した。分画および25mM HEPES（pH7.3）に対する透析後、12nmolのポリリジン190で修飾された1.02mg（22nmol）のプロテインA/Gを含む結合体フラクションが得られた。
ｂ）抗体−プロテインA/G−ポリリジン190/DNA複合体の調製
HBS中７μｇのａ）で調製したプロテインA/G結合体の溶液を攪拌しながらトランスフェリン・レセプターを指向するCD7モノクローナル抗体（３μｇ、クローンBU55、IgG1、ザ・バインディング・サイト・リミテッド社、バーミンガム、イギリス）に結合させた。DNA複合体は、200μｌのHBS中の抗CD71結合プロテインA/G−ポリリジン結合体溶液を300μｌのHBS中の６μｇのプラスミドDNA（レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む、先の実施例参照）溶液と混合して調製した。
ｃ）K562細胞への遺伝子転移
トランスフェリン遺伝子に富むK562細胞（ATCC CCL243）を10％ FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミンを含むRPM I1640培地（ギブコBRL、2g/lの炭酸水素ナトリウム添加）に懸濁し、細胞密度500,000細胞/mlとなるまで培養した。トランスフェクション20時間前、細胞に50μＭのデフェリオキサミン（シグマ）を含む新鮮な培地を添加した。細胞を収穫し、250,000細胞/mlとなるように10％ FCS（および50μＭデフェリオキサミン）を含む新鮮な培地に懸濁してから24穴プレートにプレーティングした（ウェル当たり2ml）。この実験の最初の４時間までは培地に100μＭのクロロキンを含ませた。細胞をクロロキンを含まない新鮮な培地で洗浄し、24時間後に収穫した。先の実施例に示した方法でルシフェラーゼ活性を測定した。その実験結果を第７図に示す。
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【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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