(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
リンドウ花弁に由来する、請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
【請求項５】
請求項４記載の組換えプラスミドを有する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５記載の宿主細胞を培地に培養し、培養物よりＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを採取することを特徴とする、ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラボノイド配糖化酵素（ＵＦＧＴ）遺伝子に関する。さらに詳しくはフラボノイドの３位，５位にグルコースを転移することのできる酵素遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラボノイドは、植物に各種の色調を与える主要な色素化合物である。フラボノイド化合物の中で植物の色調発現の中心となるのが、種々のアントシアニン化合物であり、赤から青までの広い範囲の色調を呈することが知られている。アントシアニンは配糖体もしくはアシル化配糖体であり、それらの配糖体を除いた部分をアントシアニジンと呼ぶ。主なアントシアニジンはベラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンの３つである。アントシアニン色素の色調は種々の要因によって決まる。中でもアントシアニジン骨格のＢ環の水酸基の数は重要であり、水酸基の数が増すに従って橙赤色から青色に変わる傾向がある。青色を呈する花弁のアントシアニンについてはほとんどの場合デルフィニジンである。また、アントシアニンの色調は溶液のｐＨや共存する金属イオン、他の化合物などによっても著しい影響を受ける。
【０００３】
一方、アシル化配糖体において、そのアシル基がｐ−クマル酸やコーヒー酸などの芳香族系有機酸である場合、青色系の呈色を示すことが知られている。リンドウのアントシアニンであるゲンチオデルフィン  ［Ｇｏｔｏ，  Ｔ．    ｅｔ  ａｌ．    Ｔｅｔｒ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ    ２３：  （３６）  ３６９５−３６９８  （１９８２）］  や、キキョウのアントシアニンであるプラチコニン  ［Ｇｏｔｏ，  Ｔ．    ｅｔ  ａｌ．    Ｔｅｔｒ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ    ２４：  （２１）  ２１８１−２１８４  （１９８３）］  に代表されるアシル化アントシアニンは、分子内にコーヒー酸が結合した構造を持ち、一般的にアントシアニンが不安定であるとされるｐＨ弱酸性から中性領域においても安定に青色を呈する。
【０００４】
リンドウの青色アントシアニンであるゲンチオデルフィンは、デルフィニジン骨格の３位，５位，３’位にグルコースが結合し、３’位，５位にはグルコースを介してコーヒー酸が結合した糖鎖構造を持つ。従って、リンドウの花弁色素であるゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する酵素遺伝子を単離することができれば、該遺伝子を他の植物体に導入することにより花色を青系に操作できる可能性が期待される。これまでアントシアニンの３位にグルコース等の糖を転移する酵素遺伝子が知られているが [Ralston, E.J. et al. Genetics 119: 185-197 (1988) 、Wise, R.P. et al. Plant Mol. Biol. 14: 277-279 (1990)]、５位に糖を転移する酵素遺伝子は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ゲンチオデルフィン生合成遺伝子のうち、３位，５位の２位を配糖化しうる糖転移酵素遺伝子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リンドウの花弁よりＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離し、その配列決定をすることに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、実質的に配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【０００７】
本発明はまた、配列番号２で示される塩基配列を有する上記ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
さらに、本発明は、上記ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを有する宿主細胞、ならびに該宿主細胞を培地に培養し、培養物よりＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを採取することを特徴とする、ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼの製造方法である。
【０００８】
本発明において、「実質的に」とは、フラボノイドの３位，５位への糖転移酵素活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換されていてもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
［１］    ｍＲＮＡの抽出及び分離
リンドウ等の花弁よりｍＲＮＡを抽出する。まず該組織より全ＲＮＡの粗抽出物を得、これよりタンパク質、多糖類、その他の夾雑物を除去し、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー、ポリＵ−セファロースカラムなどの吸着カラムを用いて更に精製する。ポリＡ（ポリＡ＋）鎖画分を溶出し集め、同様の精製を２〜３回繰り返すことによってｍＲＮＡを高度に濃縮することができる。
【００１０】
［２］    β糖転移酵素遺伝子配列プライマーによる３’ＲＡＣＥ    ＰＣＲ
本発明の目的とするリンドウの花弁色素ゲンチオデルフィン合成酵素遺伝子の一つであるアントシアニングルコース転移酵素遺伝子は、ゲンチオデルフィンの構造より、グルコースをβ位に転移する酵素の遺伝子であることが注目される。そこで、例えばトウモロコシとオオムギのＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼや動物のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼに代表される既知のβ−糖転移酵素遺伝子群の遺伝子配列相同領域より、これと共通の配列を有する遺伝子を目的遺伝子の候補とすることができる。
【００１１】
本発明においてはまず、リンドウの花弁より抽出したｍＲＮＡを試料とし、３’ＲＡＣＥ    ＰＣＲにて３’末端部分の増幅を行い、その塩基配列を決定する。プライマーとしては、上記既知のβ糖転移酵素遺伝子群の配列の情報を基に設計することができる。具体的には、既知のβ糖転移酵素のアミノ酸配列において見いだされる、高度に保存されたアミノ酸配列領域、即ち（Ｐｈｅ  Ｔｙｒ）（Ｖａｌ  Ｉｌｅ）（Ｔｈｒ  Ｃｙｓ）Ｈｉｓ（Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ）Ｇｌｙ  の６アミノ酸からなる配列から導かれる代表的な１６個のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列より合成した数種を用いる。この場合のプライマーはデジェネレート（ミックス）プライマーでも、そうでなくてもよい。また、ＰＣＲを行う場合、プライマーの配列は必ずしも獲得を目的とした遺伝子の塩基配列に完全に一致しなくても、ＰＣＲ反応による増幅が可能である。
【００１２】
続いてＰＣＲ産物を常套的な手段にてクローニングし、配列決定する。得られたＤＮＡ配列はアミノ酸配列に翻訳し、上記のβ転移酵素遺伝子群の配列の共通配列を持つＤＮＡ断片であれば、候補遺伝子とする。
【００１３】
［３］    β糖転移酵素遺伝子群の単離
候補遺伝子の単離は、一般的にはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって行うことができる。
［１］で得られたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、これをプラスミドベクターに組み込み、種々の組換え体プラスミドを得る。プラスミドベクターとしては、宿主細胞内で自立複製可能で該ｃＤＮＡを安定保持できるものであれば、いずれをも用いることができるが、具体的には、ｐＳＰＯＲＴ−１  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  社製）  等が挙げられる。
【００１４】
次に、組換え体プラスミドを大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーから候補遺伝子の翻訳領域を含む遺伝子をスクリーニングするには、［２］  で配列決定した候補遺伝子の３’側の配列を基に数種のプローブを作成し、これとのハイブリダイゼーションにより行う。
【００１５】
また、候補遺伝子の翻訳領域を単離するために、５’ＲＡＣＥ    ＰＣＲを行ってもよい。具体的には、［２］  で決定した候補遺伝子の配列を基に逆転写用のプライマーを作製し、特異的なｃＤＮＡを合成する。続いてｃＤＮＡの５’末端にアンカーを結合させ、そのアンカーに相補的なアンカープライマーと、逆転写プライマーと重ならない候補遺伝子特異的なプライマーとの間でＰＣＲを行う。１５００−２０００ｂｐ  のＤＮＡ断片を単離、クローニングし、３’末端の配列が候補遺伝子と一致することを確認した上で５’末端の塩基配列を決定する。
【００１６】
［４］    目的遺伝子の選抜
候補遺伝子の中から目的の遺伝子を選抜するために、  ［３］で単離した遺伝子断片を、ＰＣＲ  又は制限酵素処理により翻訳領域を取り出し、大腸菌発現ベクター系にクローニングし、候補遺伝子の産物を大腸菌で発現させる。その後、大腸菌を破砕し、得られた可溶性画分を試料としてグルコース転移酵素活性の有無を確認する。活性の測定はフラボノイドの３位及び５位に対する２種のグルコース転移酵素活性を測定し、活性が検出できれば大腸菌に導入したｃＤＮＡが目的とする遺伝子であると判断する。
本発明において塩基配列の決定は、ジデオキシ法  ［Ｓａｎｇｅｒ．  Ｆ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２０５−１２１０  （１９８１）］等により行うことができる。
【００１７】
［５］    宿主細胞への遺伝子導入および発現
上記で得られたＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子）は、適当な宿主細胞中に導入して高発現させることができる。具体的には、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位に本発明遺伝子を含むＤＮＡを挿入して組み換え体ＤＮＡを調製し、これを宿主細胞中に導入する。宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものであればよく、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができる。真核細胞としては動物、植物、酵母等の細胞が、また原核細胞としては大腸菌、枯草菌、放線菌等が挙げられる。
【００１８】
本発明遺伝子を組み込むベクターＤＮＡは、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である場合のベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミドｐＵＣ１８／ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＲＩＴ２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社製）  ；ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ  社製）  ；ｐＭＡＬ−ｃ，ｐＭＡＬ−ｐ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  社製），  ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  社製）  等を用いることができる。
【００１９】
組み換え体ＤＮＡを宿主細胞を形質転換するには、Ｈａｎａｈａｎ  法  ［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）］、Ｃｈｕｎｇ  らの方法    ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ２１７２  （１９８９）］  等を用いて行うことができる。
上記のようにして得られた形質転換体の培養は、通常の形質転換体によるポリペプチドの生産に用いる培養方法に従って行われる。
【００２０】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主細胞として用いた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００２１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。  無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２２】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃がよく、培養時間は、通常１〜１０時間、好ましくは２〜５時間である。培養中ｐＨは、通常７〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００２３】
培養物から目的酵素の単離精製は公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈澱法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕
（１）      リンドウの花弁からの総ＲＮＡ抽出
リンドウ（品種：極晩）の花弁２０ｇを液体窒素存在下で乳棒乳鉢を用いて粉砕した。これにグアニジンイソチオシアネート溶液（２５  ｍＭ  クエン酸ナトリウム、０．００２５％  Ｎ  −ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、０．５  ｍＭ  ２  −メルカプトエタノール、４Ｍ  グアニジンチオシアネート）５０ｍｌを加え、室温で溶かしながら攪拌した。続いて、フェノール抽出、エタノール沈殿、ＬｉＣｌ沈殿により精製し、約５．５ｍｇの精製全ＲＮＡを得た。
次にこれをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｌａｔｅｘを用い、既知の手法〔実験医学Ｖｏｌ．７，  Ｎｏ．１７，  ２０６５−２０６８  （１９８９）〕により、ポリＡ（ポリＡ＋）鎖画分を高度に濃縮した。
【００２５】
（２）      β糖転移酵素遺伝子部分配列の増幅
（２−１）      逆転写反応
３’ＲＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）  を用いて行った。ｍＲＮＡ溶液１３０  μｌ（１０μｇ  ｍＲＮＡ）  に１０μＭ  のａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  社製）  溶液  １０  μｌ  を加え、６５℃１０分間インキュベートし、氷上に２  分間放置した。これに１０×ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０  μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ    １０μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ    ２０  μｌ  を加え、４２℃で２  分間インキュベートした。次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  １０  μｌ  を加え４２℃で３０分間反応を行った。その後、氷上にサンプルを移し、１０μｌ  のＲＮａｓｅ  Ｈ  を加え４２℃で１０分間インキュベートを行った。
【００２６】
（２−２）  ＰＣＲ反応
（２−１）  の逆転写反応液１μｌ  に、１．２５ｕｎｉｔ  ＡｍｐｒｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＣＥＴＵＳ社製）  、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＴＡＫＡＲＡ社製）  ５  μｌ  、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ４  μｌ  、１０μＭ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）１μｌ  、２０μＭ  のβ糖転移酵素特異的配列プライマー  ２．５μｌ  加え、滅菌水で総量を５０μｌ  とし、ＰＣＲ  反応液とした。これをサーマルサイクラーＰＪ４８０  を用いてＰＣＲ（ＰＣＲプログラム  ：  ９４  ℃  ７分間を１サイクル；  ９４  ℃  １分間→  ４２，  ４８，  ５０又は５５  ℃，  １  分間→  ７２  ℃，  １  分間を３０サイクル；７２℃，  ７  分間を  １サイクル）  を行った。
【００２７】
（２−３）  ＰＣＲ産物のプラスミドＤＮＡへのクローニングとシーケンス解析
上記のＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＡクローニングキットを用い、ｐＣＲＩＩ  ベクターに導入し、ＩＮＶ  αＦ株にクローニングを行った。
シークエンスの読み取りはＤＮＡシークエンス装置４７３Ａ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＢＩ  社製）  を用いて行った。また、ＤＮＡシーケンスの解析はＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）とＳｅｑＥｄ  （（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＢＩ社製）  の両ソフトで行った。
【００２８】
シーケンス解析の結果得られたＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に翻訳し、図１に示すβ糖転移酵素遺伝子のコンセンサスアミノ酸配列と比較し、明らかにこの配列に当てはまるものだけを候補遺伝子の配列とした。
２８８  個のクローンについてＤＮＡ配列の一部をシーケンス解析した結果、５３個のβ糖転移酵素遺伝子配列を持つと推測されるクローンが得られた。得られたクローンは配列より１２種に分類できた。
【００２９】
（３）      β糖転移酵素遺伝子の翻訳開始領域の解析
（３−１）      ５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ用プライマーの作製
（２）で得られた１２種の候補遺伝子の３’側の配列からストップコドンを確定し、それぞれストップコドンを含む３０ｂｐの相補配列をＰＣＲプライマーとした。また、ＰＣＲプライマーに対応する配列の、すぐ下流の３０ｂｐの相補配列を逆転写プライマーとした。
【００３０】
（３−２）      ｃＤＮＡ合成
５’ＲＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）  を用いて行った。ｍＲＮＡ溶液１４μｌ  （１μｇ  ）  に２．５  μＭ  の逆転写プライマー溶液  １μｌ  を加え、７０℃１０分間インキュベートし、氷上に１  分間放置した。これに１０×ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２．５  μｌ  、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ  、逆転写酵素  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  １  μｌ  を加え、５０℃で３０分間、続いて７０℃で１５分インキュベートした。その後、１  μｌ  のＲＮａｓｅ  Ｈ  を加え５５℃で１０分間インキュベートした。
合成したｃＤＮＡは  ５’ＲＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  社製）  添付のカートリッジカラムを用い、添付のプロトコールにより精製した。
【００３１】
（３−３）      翻訳開始領域を含むＤＮＡ断片の増幅
（３−２）  で得たｃＤＮＡにアンカーＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）  をＴ４  Ｌｉｇａｓｅ  を用いて常法により結合させた。アンカーＤＮＡを結合させたｃＤＮＡをＧＥＮＥ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）  によリ、アンカープライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  社製）  、（３−１）  で設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ（ＰＣＲプログラム：  ９４  ℃，  ４５秒間→５５〜６５℃，  ４５秒間→  ７２  ℃，  ２  分間を３５サイクル）  を行った。
【００３２】
（３−４）      ５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物のプラスミドＤＮＡへのクローニングとシーケンス解析
上記の増幅産物について、（２−３）  と同様にクローニングを行った。
シークエンスは、（２−３）  と同様な装置を用いて行い、１２候補遺伝子の翻訳開始領域の塩基配列を決定した。
【００３３】
（４）      候補遺伝子の翻訳領域ＤＮＡ断片の単離
（４−１）      ＰＣＲ  プライマーの作製
１２候補遺伝子のアミノ酸配列のＮ末端の２〜９番目のアミノ酸残基に相当する２４塩基（または２３塩基）の５’端にベクターに組み込む為の制限酵素認識配列と、さらにその５’端にＧＣＧの３塩基を付けた配列を片側プライマーとした。もう一方のプライマーは、候補遺伝子の３’非翻訳領域の相補配列において、上記のプライマーとは相補構造を形成しない配列を有する２４塩基（または２３塩基）の５’端にベクターに組み込むための制限酵素認識配列と、さらにその５’端にＧＣＧの３塩基を付加した配列とした。
【００３４】
（４−２）    ＲＴ−ＰＣＲ  による候補遺伝子ＯＲＦ  領域ＤＮＡ断片の作製
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １．６μｌ  、２０μＭ  ＰＣＲ  両プライマー各２．０  μｌ  を混合し、滅菌水で総量を１０μｌ  とし、Ａｍｐｌｉ  Ｗａｘ  ＰＣＲ  Ｇｅｍｓ  １００  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）  を加え、サーマルサイクラーＰＪ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  社製）  で８０℃、１０分さらに２５℃、５  分インキュベートした。これに、１０×ＵｌＴｍａ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  社製）  １０μｌ  、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ６μｌ  、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）  １  μｌ  、（２−１）  で作製した逆転写産物溶液１  μｌ  、滅菌水７２μｌ  加え、サーマルサイクラーＰＪ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  社製）  を用い、ＰＣＲ（ＰＣＲプログラム：  ９６℃，  １  分間を  １サイクル；９５  ℃，  １  分間→５５℃，  １  分間→  ７２  ℃，  １  分間を３５サイクル；７２  ℃，  ７  分間を１  サイクル）  を行った。
【００３５】
反応液は、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、各々のプライマーに適した制限酵素で処理し、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行った。次に、１％  Ｓｅａｋｅｍ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ  （ＦＣＭ社製）  で電気泳動し、検出されたＤＮＡバンドを常法に従い回収し、発現ベクターに組み込むＤＮＡ断片とした。
【００３６】
（５）  大腸菌発現系を用いた目的遺伝子のスクリーニング
（５−１）  候補遺伝子ＯＲＦ  領域の発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ  への組み込み
上記で作製した候補遺伝子ＯＲＦ  領域のＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＴＡＫＡＲＡ社製）  を用い、発現ベクターｐＥＴ１５ｂに組み込み、大腸菌ＪＭ１０９  株にクローニングした。組み換え体の確認は、ＤＮＡシークンスにより行った。
【００３７】
（５−２）  候補遺伝子発現ベクターのタンパク質発現宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  株への導入
上記で作製した候補遺伝子発現プラスミドＤＮＡを単離し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  株に形質転換した。
【００３８】
（５−３）  糖転移活性検出による目的遺伝子のスクリーニング
形質転換した大腸菌をＬＢ培地でＯ．Ｄ．＝０．６まで３７℃で振とう培養後、ＩＰＴＧ  （イソプロピルチオ−β−ガラクシド，終濃度１ｍＭ）を加え、３７℃でさらに３  時間振とう培養した。集菌後、菌体ペレットをバッファー  ［５０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ−Ｋ  （ｐＨ７．０）］  １ｍｌ  に懸濁し、２０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５μｌ  、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  １μｌ  を加えて３０℃で１５分間放置した後、凍結（−８０℃）  、融解を３  回繰り返した。続いて超音波処理を懸濁液が透明によるまで行い、マイクロ遠心機で１５０００ｒｐｍ，  １５分，  ４  ℃で遠心し、上清の可溶性画分を得た。
【００３９】
続いて、可溶性画分を脱塩カラムとしてＨｉ−Ｔｒａｐ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  （ファルマシア社製）を用い、バッファー    ［５０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ−Ｋ  （ｐＨ７．０），  ２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．２ｍＭ  ＤＴＴ，  １ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ５０  μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，  ０．５４ＴＩＵ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ］  ２０ｍｌ  をカラムの前処理として５ｍｌ／ｍｉｎ．で流し、続いて該画分を１ｍｌ  流すことによって脱塩した。さらに３ｍｌ  のバッファーを流し、８００  μｌ  ずつ分画し、２  番目の流出画分を活性検出に用いた。
【００４０】
上記の脱塩を行った可溶性画分４０μｌ  に、９２５  ｋＢｑ／μｌ  の［１４Ｃ］−ＵＤＰＧ  ５μｌ  、基質色素溶液  ［Ｄｅｌ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ），  Ｄｅｌ−３Ｇ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  ３−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），  Ｃｙａ（Ｃｙａｎｉｄｉｎ），  Ｃｙａ−３Ｇ（Ｃｙａｎｉｄｉｎ  ３−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を各々溶解した５ｍＭ塩酸、基質色素なしのコントロールには５ｍＭ  塩酸］  ５  μｌ  を加え、３０℃で３０分間インキュベートし、クロロホルム：５％  塩酸／メタノール＝２：１を５０μｌ  を加えて水層を分取した。
【００４１】
水層を逆相カラム・μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８  を用いたＨＰＬＣで分離し、２８０ｎｍ  の吸光度をモニターした。さらにフラクションコレクターで３０秒間づつ分取したサンプルに液体シンチレータ２．５ｍｌ  を加え液体シンチレーションカウンターＬＳ６０００ＴＡ（ベックマン社製）で各分画の放射能を測定した。インサートなしのｐＥＴ１５ｂを含むクローンの可溶性画分では基質色素への糖転移反応が起こらないことを確認したのち、候補遺伝子を含むクローンの糖転移活性を調べたところ、候補遺伝子のうちの一つのクローンで４種の基質への糖転移反応が認められた。基質別の反応結果を図２に示す。
【００４２】
（６）    ｃＤＮＡ  ライブラリーからの目的遺伝子ｃＤＮＡの単離
（６−１）      リンドウ花弁ｃＤＮＡの作製
試料となるｍＲＮＡは、リンドウ花弁よりＱｕｉｃｋ  Ｐｅｐ  （ファルマシア社製）を用い精製した。ｃＤＮＡ合成はｍＲＮＡを１  μｇ  を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ＢＲＬ社製）  で行った。
【００４３】
（６−２）    ｃＤＮＡ  ライブラリーの作製
上記で作製したｃＤＮＡを、１％  ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ  （ＦＭＣ社製）  で電気泳動し、約１．３  〜２．５ｋｂｐの長さの領域を泳動ゲルから回収し、ＳＵＰＲＥＣ−０１  （ＴＡＫＡＲＡ  社製）  で精製した。このＤＮＡ  をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）  でプラスミドｐＳＰＯＲＴ１  にライゲーションし、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂコンピテントセル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）  にＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  （Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）  を用いて形質転換した。
【００４４】
（６−３）  目的遺伝子ｃＤＮＡのスクリーニング
ＧＥＮＥＴＲＡＰＥＲ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）  を用いて行った。得られたｃＤＮＡクローンの確認は、ＤＮＡシーケンスにより行った。プローブは５’−ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＡＴＣＡ−３’  を、複製プライマーは５’−ＣＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＴＴＧＧ−３’  の配列をもつ合成ＤＮＡを用いた。
【００４５】
（６−４）  候補遺伝子ｃＤＮＡの配列決定
上記で得られたクローンは一部分のＤＮＡ配列を決定し、目的遺伝子の配列に一致するクローンであることを確認した上、全塩基配列を決定した（配列番号１）。またこれより予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４６】
【配列表】
0003585329.tif 000002
0003585329.tif 000003
0003585329.tif 000004
【００４７】
0003585329.tif 000005
0003585329.tif 000006
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、リンドウの花弁色素であるゲンチオデルフィンの糖鎖構造の生合成に関与する酵素遺伝子であるＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３，５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供される。本発明の遺伝子を公知の方法に従い植物体に導入すれば、花色の色彩の調節、特にバラ等の青色花弁をもたない品種においてゲンチオデルフィンを発現させることによる青色花弁の創出が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種β糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】糖転移酵素活性の認められた１クローンの基質別  ［Ａ．Ｄｅｌ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ），  Ｂ．Ｄｅｌ−３Ｇ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  ３−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），    Ｃ．Ｃｙａ（Ｃｙａｎｉｄｉｎ），    Ｄ．  Ｃｙａ−３Ｇ（Ｃｙａｎｉｄｉｎ  ３−０−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）］の反応結果を示す。
【図１】
0003585329.tif 000007
【図２】
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