(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ターゲットに対してハイブリダイゼーション可能な多種類の一本鎖核酸プローブが支持体上のそれぞれ異なる位置に固定化された核酸マイクロアレイにおいて、前記一本鎖核酸プローブがマレイミド基を有する化合物との共有結合で支持体上に固定化され、且つ、１本鎖核酸プローブを固定化した後該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域表面に、マレイミド基を有する化合物を加水分解することにより生成したマレイミド基の加水分解生成物が存在していることを特徴とする、核酸マイクロアレイ。
【請求項２】
多種類の一本鎖核酸プローブが支持体上のそれぞれ異なる位置にマレイミド基を有する化合物との共有結合で固定化され、且つ、一本鎖核酸プローブを支持体上に固定化した後、該支持体上の一本鎖核酸プローブが固定化されていない領域に、マレイミド基を有する化合物を加水分解することにより生じたマレイミド基の加水分解生成物が存在することを特徴とする核酸マイクロアレイを用いて核酸ターゲットをハイブリダイゼーションにより検出する、核酸検出方法。
【請求項３】
支持体上に核酸プローブが形成された核酸マイクロアレイの製造方法であって、前記支持体表面にマレイミド基を導入する工程と、前記マレイミド基が導入された前記支持体の第１領域に、一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化する工程と、前記固定化と、前記固定化する工程の後、前記第１の領域以外の、前記一本鎖核酸プローブが固定化されていない第２の領域の前記マレイミド基を加水分解する工程とを有することを特徴とする核酸マイクロアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸ターゲットをハイブリダイゼーションにより検出する核酸マイクロアレイ及びそれを用いた核酸検出方法に関わり、詳細には核酸ターゲットのハイブリダイゼーション量を増やすと同時に核酸プローブが固定化されていない領域への核酸ターゲットの吸着を抑制してノイズを減らすことで核酸ターゲットの検出感度を高めた核酸マイクロアレイ、及びそれを用いた核酸検出方法を提出するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ゲノムから転写されたトランスクリプトームを解析する技術として、マイクロアレイが注目を集めている。マイクロアレイは、数千または数万といった数の遺伝子についてその発現を同時に観察することができる。マイクロアレイの原理は、数種類の核酸プローブを支持体上に固定化し、そこに標識化した核酸ターゲットをハイブリダイズさせるものである。核酸プローブと相補的な塩基配列を持つ核酸ターゲットは、配列されたプローブ分子と特異的にハイブリダイズする。この後、核酸プローブ上でハイブリダイズしている標識化された核酸ターゲットのシグナルを測定することでハイブリダイズしている核酸ターゲットを同定するとともに、ハイブリダイズしている量を測定することができる。蛍光標識された核酸ターゲットを用いる場合は、ハイブリダイズしている領域の蛍光シグナル値からハイブリダイズしていない領域のシグナル値であるバックグラウンドを差し引いた値が検出量となるため、ハイブリダイズしている領域の蛍光シグナル値を高め、バックグラウンド値を低くすることで検出感度を高めることができる。このようなマイクロアレイを作成する方法として、ＵＳＰ第５８０７５２２号ではアミノ基を有する樹脂が塗布された支持体上に二本鎖ｃＤＮＡプローブをスポッタで高密度に張り付け、その後二本鎖ｃＤＮＡプローブを熱変性した後、ｃＤＮＡプローブが固定化されていない領域を無水コハク酸で処理してハイブリダイゼーション時の核酸ターゲットの吸着をブロッキングする方法が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＵＳＰ第５８０７５２２号では、二本鎖ｃＤＮＡプローブが支持体上のアミノ基とプローブ間の静電的結合で固定化されているのでその結合が弱く、鎖長の長いプローブを用いる必要があった。また、ブロッキング処理やハイブリダイゼーション時にｃＤＮＡプローブがはがれるため、核酸ターゲットの検出感度が低くなるという問題もある。また、ｃＤＮＡプローブを固定化した後熱変性を行っているため、支持体上には核酸プローブに由来するセンス鎖だけでなく、アンチセンス鎖も残ってしまう。アンチセンス鎖はそれぞれその対となっていたセンス鎖の近傍に固定された状態にあるため、検出のためのハイブリダイゼーション時に、センス鎖と核酸ターゲットのハイブリダイゼーションと共に、センス鎖とこのアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションも競合的に進み、ハイブリダイゼーションの効率が非常に低くなってしまう。
【０００４】
ハイブリダイゼーションの効率が高く、核酸プローブがはがれない方法が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、第２４巻、３０３１項（１９９６）に報告されている。これは、予め合成された一本鎖の核酸プローブを支持体上に共有結合で固定化するものであるが、核酸プローブが固定化されていない領域に核酸ターゲットが吸着するため、バックグラウンドが高くなる。特開平１１−１８７９００号では一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化されていない領域に牛血清アルブミンを吸着させて核酸ターゲットの吸着をブロッキングしているが、牛血清アルブミンは分子量が大きく、ハイブリダイゼーション時に核酸ターゲットが核酸プローブに近づくときの立体障害となりハイブリダイゼーション効率が低くなる。
【０００５】
このように、核酸プローブを支持体上に安定に結合させ、かつハイブリダイゼーション効率を上げると共に、検出感度を上げることは容易ではなかった。本発明は、一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化することで核酸プローブのはがれを防止すると同時にハイブリダイゼーションの効率を高め、さらに、核酸プローブが固定化されていない領域表面へ水溶液中で解離して負に帯電することが可能な官能基、または、加水分解されたことで負に帯電している官能基を導入することで核酸ターゲットの吸着を防止して核酸ターゲットの検出感度を高めた核酸マイクロアレイ、及びそれを用いた核酸検出方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の核酸マイクロアレイは、核酸ターゲットに対してハイブリダイゼーション可能な多種類の一本鎖核酸プローブが支持体上のそれぞれ異なる位置に固定化された核酸マイクロアレイにおいて、前記一本鎖核酸プローブが支持体上に共有結合で固定化され、且つ、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域表面に、水溶液中で解離することにより負に帯電することが可能な官能基が存在することを特徴とするものである。一本鎖核酸プローブを用いることでハイブリダイゼーションの効率を高めると同時に、一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化することでハイブリダイゼーション中の核酸プローブのはがれを防止する。また、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離することにより負に帯電することが可能な官能基を導入することで、負に帯電している核酸ターゲットと導入された官能基との間の静電的反発を利用して核酸ターゲットの吸着を防止することができる。
【０００７】
また、本発明の核酸マイクロアレイは、一本鎖核酸プローブを支持体上に共有結合で固定化した後、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域に解離することにより負に帯電することが可能な官能基を有する化合物を共有結合で固定化して、核酸プローブが固定化されていない領域に水溶液中で解離することにより負に帯電することが可能な官能基を導入することを特徴とするものである。共有結合で導入された官能基はハイブリダイゼーション中にはがれにくく、より効果的に核酸ターゲットの吸着を防止することができる。
【０００８】
また、本発明の核酸マイクロアレイは、一本鎖核酸プローブを支持体上に共有結合で固定化した後、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域に解離することにより負に帯電することが可能な官能基を有する化合物を疎水性結合で固定化して、核酸プローブが固定化されていない領域に水溶液中で解離することにより負に帯電することが可能な官能基を導入することを特徴とするものである。疎水性結合を用いるため、支持体上の官能基の種類によらず解離することにより負に帯電することが可能な官能基を導入することができる。
【０００９】
また、本発明の核酸マイクロアレイは、核酸ターゲットに対してハイブリダイゼーション可能な多種類の一本鎖核酸プローブが支持体上のそれぞれ異なる位置に固定化された核酸マイクロアレイにおいて、前記一本鎖核酸プローブが支持体上に共有結合で固定化され、且つ、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域表面に加水分解されたことで負に帯電している官能基が存在することを特徴とするものである。まず、支持体表面上に核酸プローブが有する官能基と反応可能な官能基を導入した後、導入された官能基と核酸プローブが有する官能基を反応させて核酸プローブを固定化する。核酸プローブを固定化後に未反応官能基を加水分解して水溶液中で負に帯電することが可能な官能基を生成する。この方法によると、新たな化合物を用いることなく負に帯電することが可能な官能基を導入することができるので、核酸マイクロアレイの作成コストを削減することができる。
【００１０】
また、本発明の核酸検出方法は、支持体上のそれぞれ異なる位置に多種類の一本鎖核酸プローブが共有結合で固定化され、且つ、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な官能基または加水分解されたことで負に帯電している官能基が存在している核酸マイクロアレイを用いることを特徴とするものである。検出感度が高い核酸マイクロアレイを用いて核酸ターゲットを検出するため、再現性や信頼性の高い検出データを得ることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、支持体上に一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域に水溶液中で解離することにより負に帯電することが可能な官能基または加水分解することで負に帯電した官能基を導入する。尚、本明細書において、官能基の解離または加水分解が生じる水溶液は、特に限定するものではないが、ｐＨ６．０〜８．０の範囲にあるものが好ましい。
【００１２】
本発明で用いられる一本鎖核酸プローブと核酸ターゲットは、核酸プローブと核酸ターゲット同士がハイブリダイズすることが可能であれば特に制限はない。ここで言うハイブリダイズとは相補的な塩基配列を持つ２本の核酸同士が水素結合を介してハイブリッド二本鎖を形成することである。この様な組み合わせとしては、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＰＮＡ等を挙げることができる。
【００１３】
本発明で用いられる一本鎖核酸プローブを支持体上に固定化する方法としては、核酸プローブと支持体との双方に互いに反応可能な官能基を導入してこれらを結合する方法が挙げられる（図１参照）。核酸プローブ末端に導入可能な官能基としてはアミノ基またはチオール基がある。一方、支持体上に核酸プローブと反応可能な官能基を導入する方法としては各種Ｌｉｎｋｉｎｇ試薬を用いる方法がある。Ｌｉｎｋｉｎｇ試薬は支持体が持つ第一の官能基（図１にＸで示す）と反応して、核酸プローブが有する官能基と反応可能な第二の官能基を導入するものである（図１にＹで示す）。第二の官能基としては、アミノ基が導入された核酸プローブを用いる場合はイソチオシアネート基、イソシアネート基、イミドエステル基、またはＮ−ヒドロキシスクシイミド基等がある。また、チオール基が導入された核酸プローブを用いる場合は、ハロアセチル基、マレイミド基、またはジスルフィド基等が挙げられる。用いられるＬｉｎｋｉｎｇ試薬としては、第一の官能基及び核酸プローブが有する官能基ともにアミノ基の場合は、ＤＳＧ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ）のような二価性のＮ−ヒドロキシスクシイミド類、１，４−フェニレンジイソシアネートのようなジイソシアネート類、１，４−フェニレンジイソチオシアネートのようなジイソチオシアネート類、またはこれらの官能基を一つずつ有する二価性のＬｉｎｋｉｎｇ試薬が挙げられる。一方、第一の官能基がアミノ基で核酸プローブが有する官能基がチオール基の場合はＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）のようなＮ−ヒドロキシスクシイミド基とマレイミド基を有する二価性の化合物、ＳＩＡＢ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）のようなＮ−ヒドロキシスクシイミド基とハロアセチル基を有する二価性の化合物、ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−  ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）のようなＮ−ヒドロキシスクシイミド基とジスルフィド結合を有する二価性の化合物等アミノ基またはチオール基と反応可能な官能基を持つ二価性のＬｉｎｋｉｎｇ試薬が挙げられる。
【００１４】
本発明で用いられる支持体の材質としては、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子及びセラミックから選ばれる１種または２種以上が挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が、無機高分子としては、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル、及びグラファイトが、金属としては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石等の常温固体金属が、セラミックとしては、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素、及び炭化ホウ素等を例示することができる。上記支持体の形状としては特に制限はないが、核酸ターゲットを蛍光で評価する場合は励起光の散乱を防止するため、板状でより平滑であることが好ましい。
【００１５】
本発明で用いられるＬｉｎｋｉｎｇ試薬と反応可能な第一の官能基を支持体上に導入する方法としては、支持体上に官能基を有する樹脂を塗布する方法と支持体表面を化学的に処理する方法が挙げられる。塗布される樹脂としては特に制限はないが、具体的にはポリ−Ｌ−リジンの様なＬｉｎｋｉｎｇ試薬と安定な結合を形成するアミノ基を有する樹脂が良い。また、ポリイミドやポリスチレンの様にアミノ基がない樹脂を塗布した後に窒素雰囲気下でプラズマ処理を実施しアミノ基を導入しても良い。化学処理を用いて第一の官能基を導入する方法としては、ガラスや窒化ケイ素のようなケイ素化合物や金属酸化物上にシランカップリング剤を処理する方法や最表面に金の膜が存在する支持体をアルカンチオール類で処理する方法が挙げられる。
【００１６】
また、本発明ではＬｉｎｋｉｎｇ試薬を用いずに支持体上に導入された第一の官能基と核酸プローブが有する官能基を直接反応させて核酸プローブを固定化しても良い。具体的には、グルタルアルデヒドの様なアルデヒド基を有する化合物を支持体上に塗布した後、アミノ基を有する核酸プローブを固定化する。または、エポキシ基を有するシランカップリング剤で支持体を化学処理することでアミノ基を有する核酸プローブを固定化することができる。
【００１７】
また、本発明では核酸プローブを支持体に固定化した後、該支持体上の核酸プローブが固定化されていない領域に水溶液中で負に帯電することが可能な官能基（図１にＡで示す）を導入する。負に帯電することが可能な官能基を導入する方法としては次の３つの方法が挙げられる。１つ目は負に帯電することが可能な官能基を有する化合物を核酸プローブが固定化されていない領域に共有結合で固定化する方法である（図１の左側の流れ）。２つ目は核酸プローブが固定化されていない領域に界面活性剤などの両親媒性物質を疎水性結合で固定化する方法である（図１の左側の流れ）。また、３つ目では支持体上の官能基を加水分解することで負に帯電することが可能な官能基を導入する（図１の右側の流れ）。
【００１８】
１つ目の方法の共有結合で固定化される化合物（図１のＡ）としては、支持体上の官能基と反応するための官能基、及び負に帯電することが可能な官能基の両方を有するものを用いる。支持体上の官能基と反応するための官能基としては、支持体上の官能基と反応して共有結合を形成できれば特に制限はないが、より具体的にはＬｉｎｋｉｎｇ試薬を用いて導入された支持体上の官能基と反応してより安定な共有結合を形成できるアミノ基とチオール基が好ましい。一方、負に帯電することが可能な官能基は、水溶液中で解離して負に帯電することができれば特に制限はないが、より具体的には解離係数が大きいカルボキシル基が好ましい。この様な二つの官能基を持つ単分子としては、アミノ基とカルボキシル基を有するアラニンやグリシンのような各種アミノ酸や、チオール基とカルボキシル基を有するシステイン等が挙げられる。
【００１９】
２つ目の疎水性結合を用いる方法では、分子内に親水性原子団と疎水性原子団を持つ両親媒性物質（図１のＡ）の水溶液中に核酸プローブ（図１のＺ）が固定化された支持体を浸漬する。この時、支持体上の官能基と両親媒性物質の疎水性原子団が疎水性結合することで核酸プローブが固定化されていない領域に負に帯電することが可能な官能基を導入する。本発明で用いられる両親媒性物質としては、水溶液中で解離して負に帯電するような陰イオン性の解離基を持っていれば特に制限はなく、この様な陰イオン性の解離基としてカルボキシル基、スルホン酸基、硫化水素基またはこれらの塩が挙げられる。一方、疎水性原子団としては疎水性であれば特に制限なく、より具体的には長鎖のアルキル鎖、芳香環、またはこれらの中の一つ以上を含む疎水性原子団が挙げられる。
【００２０】
３つ目の加水分解を用いる方法では、まず支持体上に核酸プローブが有する官能基と反応可能な官能基（図１のＹ）を導入した後核酸プローブ（図１のＺ）を共有結合で固定化する。その後、支持体を適当なｐＨの水溶液に浸漬することで核酸プローブが固定化されていない領域の官能基を加水分解して水溶液中で負に帯電することが可能な官能基（図１のＹ’）を導入する。この様な官能基としては、核酸プローブを有する官能基と反応可能であり、且つ、加水分解を受けることで負に帯電することが可能な官能基に変換するものであれば特に制限はないが、具体的にはＮ−ヒドロキシスクシイミド基、マレイミド基が挙げられる。
【００２１】
本発明で用いられる核酸検出方法は、標識化された核酸ターゲットを検出することができれば特に制限はない。このような検出方法としては、蛍光、リン光、発光または放射線同位体を用いる方法が挙げられる。また、標識化されていない核酸ターゲットを検出する方法として、ハイブリダイゼーションで形成した二本鎖に特殊な化合物をインターキレートさせた後、これらの化合物を発光または電気的に検出することでハイブリダイゼーションの量を検出する方法を用いても良い。
以下実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
【００２２】
【実施例】
実施例１
（１）支持体洗浄
市販のスライドガラス（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｂｒａｎｄ社製）をアルカリ溶液（水酸化ナトリウム；５０ｇ、蒸留水；１５０ｍｌ、９５％エタノール；２００ｍｌ）に室温で２時間浸した。その後、スライドガラスを蒸留水中に移し、３回リンスしてアルカリ溶液を完全に除去した。
【００２３】
（２）核酸プローブを固定化するための官能基の導入
洗浄したスライドガラスを１０％のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製）水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心してポリ−Ｌ−リジン水溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させ、スライドガラス上にアミノ基を導入した。さらに、アミノ基が導入されたスライドガラスを１ｍＭのＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）ジメチルスルホキシド溶液に２時間浸した後、スライドガラスをジメチルスルホキシドで洗浄してスライドガラス表面にマレイミド基を導入した。
【００２４】
（３）一本鎖核酸プローブの固定
ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてチオール基が導入された核酸プローブ１を合成した後、高速液体クロマトグラフィで核酸プローブを精製した。次に、合成・精製された濃度２μＭの核酸プローブ１μｌとＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；１０ｍＭ、ｐＨ６．５）４μｌと添加剤（エチレングリコール）５μｌを混合してスポッティング溶液を作成した。調製されたスポッティング溶液をスポッタ（日立ソフト社製  ＳＰＢＩＯ  ２０００）を用いてスライドガラス上の任意の点にスポッティングした後、スライドガラスを室温で２時間放置してスライドガラス上に核酸プローブを固定化した。
核酸プローブ１；ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−５’−ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１）
【００２５】
（４）負に帯電することが可能な官能基の導入
核酸プローブが固定化されたスライドガラスをＨＥＰＥＳ緩衝溶液でｐＨが６．５に調整された１００ｍＭシステイン（和光純薬社製）溶液に２時間浸して、核酸プローブが固定化されていない領域に共有結合を用いて解離することで負に帯電することが可能な官能基を導入した。
【００２６】
（５）ハイブリダイゼーション反応
ＤＮＡ自動合成機を用いて核酸プローブ１と相補的な塩基配列を持ち、５’がテキサスレッドで蛍光標識された核酸ターゲットを合成した。次に、濃度０．１μＭの核酸ターゲット８μｌと２０×ＳＳＣ（和光純薬社製）１．７μｌと１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（ライフテック  オリエンタル社製）０．３μｌを加えハイブリダイゼーション溶液を調製した。その後、スライドガラス上に調製したハイブリダイゼーション溶液を滴下しカバーガラスを乗せた後、４０℃の恒温槽内に１２時間放置してハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応後、２０×ＳＳＣの１０倍希釈液と１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液の３００倍希釈液との混合液中にスライドガラスを浸してカバーガラスをはずした後、２０×ＳＳＣの１００倍希釈液でスライドガラスを洗浄した。最後に、マイクロタイタープレート用遠心機を用いてスライドガラス上の水分を除いた後、マイクロアレイ用スキャナー（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製  Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  ５０００）を用いて核酸プローブが固定化された領域の蛍光強度（ハイブリダイゼーションシグナル）と核酸プローブが固定化されていない領域の蛍光強度（バックグラウンドシグナル）を測定して、結果を図２及び図３に示した。
【００２７】
本実施例では一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能なカルボキシル基を共有結合を用いて導入した。ハイブリダイゼーション時に核酸プローブがはがれることなく、且つ、核酸ターゲットの吸着も抑えることができたため、高いハイブリダイゼーションシグナルが得られると同時に、バックグラウンドシグナルも低くすることができた。
【００２８】
実施例２
実施例１における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を以下の様に変更した。
（４）負に帯電することが可能な官能基の導入
核酸プローブが固定化されたスライドガラスを１０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬社製）に２時間浸した。
【００２９】
本実施例では、一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な硫酸水素基を疎水性結合を用いて導入した。実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルを得ると同時に、バックグラウンドシグナルも抑えることができた。
【００３０】
実施例３
実施例１における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を以下の様に変更した。
（４）負に帯電することが可能な官能基の導入
核酸プローブが固定化されたスライドガラスをＥＰＰＳ緩衝溶液（３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸；５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に浸した。
【００３１】
本実施例では、一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化された支持体をアルカリ水溶液に浸すことでマレイミド基を加水分解して核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で負に帯電することが可能な官能基を導入した。実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルを得ると同時に、バックグラウンドシグナルも抑えることができた。
【００３２】
実施例４
実施例１における各工程のうち、（２）核酸プローブを固定化するための官能基の導入を以下の様に変更した。
（２）核酸プローブを固定化するための官能基の導入
洗浄したスライドガラスを１％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の９５％エタノール水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心して反応溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、１２０℃で１時間ベークしてスライドガラス上にアミノ基を導入した。さらに、アミノ基が導入されたスライドガラスを１ｍＭのＧＭＢＳジメチルスルホキシド溶液に２時間浸した後、スライドガラスをジメチルスルホキシドで洗浄した。
【００３３】
本実施例では、実施例１〜３とは異なる方法で支持体上にＬｉｎｋｉｎｇ試薬と反応可能な官能基を導入した後、実施例１〜３同様にＬｉｎｋｉｎｇ試薬を介して一本鎖核酸プローブを固定化した。その後、実施例１と同様に核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能なカルボキシル基を共有結合を用いて導入した。本実施例でも実施例１と同様に核酸プローブのはがれを防止するとともに核酸ターゲットの吸着を防止することができ、高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成することができた。
【００３４】
実施例５
実施例４における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を実施２と同様の方法で行った。
本実施例では、実施例４の方法で支持体上に官能基を導入してから一本鎖核酸プローブを固定化した後、実施例２の方法で核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な硫酸水素基を疎水性結合を用いて導入した。実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成した。
【００３５】
実施例６
実施例４における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を実施例３と同様の方法で行った。
本実施例では、実施例４の方法で支持体上に官能基を導入してから一本鎖核酸プローブを固定化した後、核酸プローブが固定化された支持体をアルカリ水溶液に浸すことでマレイミド基を加水分解して核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で負に帯電することが可能な官能基を導入した。実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成した。
【００３６】
実施例７
実施例１における各工程のうち、（２）核酸プローブを固定化するための官能基の導入と（３）一本鎖核酸プローブの固定及び（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を以下の様に変更した。
（２）核酸プローブを固定化するための官能基の導入
洗浄したスライドガラスを１％の３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の９５％エタノール水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心して反応溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、１２０℃で１時間ベークしてスライドガラス上にエポキシ基を導入した。
【００３７】
（３）一本鎖核酸プローブの固定
ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、アミノ基が導入された核酸プローブ２を合成した後、高速液体クロマトグラフィにて核酸プローブを精製した。次に、合成・精製された濃度１０μＭの核酸プローブ５μｌと濃度０．２Ｍの水酸化カリウム水溶液５μｌを混合してスポッティング溶液を作成した。さらに、調整されたスポッティング溶液をスポッタ（日立ソフト社製  ＳＰＢＩＯ  ２０００）を用いてスライドガラス上の任意の点にスポッティングした後、スライドガラスを３７℃の飽和水蒸気下に６時間放置してスライドガラス上に核酸プローブを固定化した。
核酸プローブ２；ＮＨ２−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−５’−ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１）
【００３８】
（４）負に帯電することが可能な官能基の導入
核酸プローブが固定化されたスライドガラスをＣＨＥＳ緩衝溶液（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；１０ｍＭ）でｐＨが９．０に調整された３７℃の１００ｍＭ  ＤＬ−α−アラニン（和光純薬社製）溶液に６時間浸した。
【００３９】
本実施例では、実施例１〜６とは異なり支持体上に一本鎖核酸プローブが持つ官能基と反応可能な官能基を導入した後、Ｌｉｎｋｉｎｇ試薬を用いずに一本鎖核酸プローブを支持体上に直接固定化した。その後、実施例１と同様の方法で核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能なカルボキシル基を共有結合を用いて導入した。本実施例でも実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成した。
【００４０】
実施例８
実施例７における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を実施例２と同様の方法で行った。
本実施例では、実施例７と同様にＬｉｎｋｉｎｇ試薬を用いずに一本鎖核酸プローブを支持体上に直接固定化した後、実施例２の方法で一本鎖核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な硫酸水素基を導入した。本実施例でも実施例１と同様の効果で高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成した。
【００４１】
実施例９
実施例４に示した（１）〜（４）の方法を用いて、図４に示したようなスライドガラス１枚あたりに２００種類の一本鎖核酸プローブが固定化された核酸マイクロアレイを作成した。なお、核酸プローブとして実施例１に示した方法で合成した末端がチオール基で修飾された２５塩基長の一本鎖核酸プローブを用いた。また、上記２００種類の核酸プローブの塩基配列として、表１〜８に示した２００種類の各遺伝子断片がそれぞれ持つ固有の連続した２５塩基配列を用いた。
【００４２】
【表１】
0003605039.tif 000002
【００４３】
【表２】
0003605039.tif 000003
【００４４】
【表３】
0003605039.tif 000004
【００４５】
【表４】
0003605039.tif 000005
【００４６】
【表５】
0003605039.tif 000006
【００４７】
【表６】
0003605039.tif 000007
【００４８】
【表７】
0003605039.tif 000008
【００４９】
【表８】
0003605039.tif 000009
【００５０】
次に、以下の方法でハイブリダイゼーション溶液を作成した。
ディッシュ内に約２×１０６個のすい臓ガン細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製、ＣＦＰＡＣ１）と１０ｍｌの培地を加え、二日に一度培地を交換しながら３７℃で一週間細胞を培養した。なお、培地としてＤ−ＭＥＭ（ライフテック  オリエンタル社製）とＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（ライフテック  オリエンタル社製）の９：１混合液を用いた。培養後、ディッシュから培地を取り除き、さらにＧＴＣ溶液（グアニジンチオシアネート；４Ｍ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；０．１Ｍ、２−メルカプトエタノール；１％、ｐＨ７．５）を加え培養細胞を溶解した。次に、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように加えた後、５０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心してから上清液を取り出した。得られた上清液に５．７Ｍの塩化セシウム溶液を上清液と塩化セシウム溶液の比が７：３になるように加えた後、さらに適量の軽質流動パラフィンを加え３５０００ｒ．ｐ．ｍ．で１２時間遠心した。遠心後、下層に沈殿しているＲＮＡペレットを取り出した。得られたＲＮＡペレットを適量のＴＥＳ溶液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸；５ｍＭ、ドデシル硫酸ナトリウム；１％、ｐＨ７．４）に溶解した後、エタノール沈殿を行ってＲＮＡペレットを濃縮・精製した。次に、精製されたＲＮＡペレットをＤＥＰＣ溶液（二酸化ジエチル；０．１％）に溶解した後、ｍ−ＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０  Ｋｉｔ）を用いてＲＮＡペレットからｍＲＮＡを取り出した。得られたｍＲＮＡを１μｇ／μｌに希釈した後、希釈液１μｌに０．５μｇ／μｌの  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（ライフテック  オリエンタル社製）１μｌとＤＥＰＣ溶液５μｌを加え７０℃で５分間保温した。次に、得られた溶液５μｌにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  バッファー（ライフテックオリエンタル社製、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２ｍＭ  ｄＵＴＰ、  ５ｍＭ  ｄＡＴＰ、５ｍＭ  ｄＧＴＰ、５ｍＭ  ｄＣＴＰ）  ２μｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）２μｌ、４０Ｕ  Ｒｎａｓｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ社製  Ｒｎａｓｅ阻害剤）２．５μｌ、１ｍＭ  ＦｌｕｏｒｉＬｉｎｋ  ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社製、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  Ｃｙ５−ｄＵＴＰ  ）２μｌ、及びＳＳ  ＩＩ（ライフテックオリエンタル社製、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）１μｌを混合した後、４２℃で３０分間保温した。その後、さらにＳＳ  ＩＩ（ライフテックオリエンタル社製、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を１μｌ加え再び４２℃で３０分保温した。保温後の溶液にＤＥＰＣ溶液２０μｌ、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸５μｌ、及び１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液１０μｌを加え６５℃で６０分保温した後、１Ｍ  のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液（ｐＨ７．５）を２５μｌ加え中和した。その後、中和したサンプル溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ社製）に入れ８０００ｒ．ｐ．ｍ．で４分間遠心した後１０〜２０μｌに濃縮して未反応のｄＮＴＰを除去した。得られた溶液、２０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ社製）、２０×ＳＳＣ  、及びドデシル硫酸ナトリウムを適量混合し、最終濃度が１００ｐｇ／μｌ核酸ターゲット、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｕｔｉｏｎ、  ４×ＳＳＣ、０．２％ドデシル硫酸ナトリウムとなるようなハイブリダイゼーション溶液２４．５μｌを作成した。
【００５１】
次に、前述の方法で得られた核酸マイクロアレイとハイブリダイゼーション溶液を用いて以下のようなハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション溶液を９５℃で一分間熱変性した後、スライドガラス上にハイブリダイゼーション溶液を滴下しカバーガラスを乗せた。その後、スライドガラスを４０℃の恒温槽内に１２時間放置してハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応後、２０×ＳＳＣの１０倍希釈液と１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液の３００倍希釈液との混合液中にスライドガラスを浸してカバーガラスをはずした後、２０×ＳＳＣの１００倍希釈液でスライドガラスを洗浄した。次に、マイクロタイタ−プレート用遠心機を用いてスライドガラス上の水分を除いた後、マイクロアレイ用スキャナー（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製  Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  ５０００）を用いて２００点のスポットの蛍光強度（ハイブリダイゼーションシグナル）と核酸プローブが固定化されていない領域の蛍光強度（バックグラウンドシグナル）を測定した。各スポットについて、得られたハイブリダイゼーションシグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いて２００点の発現量を求めた。上記ハイブリダイゼーション反応を合計２回行い、各点についてそれぞれ１回目の発現量を横軸に、また２回目の発現量を縦軸取って、図５に示すようなスキャッチャードプロットを得た。
【００５２】
本実施例では、実施例４に示した方法の一本鎖核酸プローブが共有結合で固定化され、且つ核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な官能基が導入されたマイクロアレイを作成し、これを用いてすい臓ガン細胞の発現解析を行い解析データの再現性を確認した。本実施例のマイクロアレイは高いハイブリダイゼーションシグナルと低いバックグラウンドシグナルの両立を達成しているため核酸ターゲットの検出感度が向上しており、この効果で本実施例の結果である図５と比較例４の結果である図８を比較すれば明らかなように、蛍光強度が１０００以下である発現量が低い領域での再現性のばらつきを抑えることができた。
【００５３】
実施例１０
実施例５に示した（１）〜（４）の方法を用いて、図４に示したようなスライドガラス１枚あたりに２００種類の一本鎖核酸プローブが固定化された核酸マイクロアレイを作成した。なお、核酸プローブ、ハイブリダイゼーション溶液は実施例９に示したものを用い、ハイブリダイゼーション反応も実施例９と同様に行った。得られた結果を図６に示した。
本実施例では実施例５に示した方法でマイクロアレイを作成し、実施例９の方法で発現解析を行い再現性の確認を行った。本実施例でも実施例９と同様の効果で再現性のばらつきを抑えることができた。
【００５４】
実施例１１
実施例６に示した（１）〜（４）の方法を用いて、図４に示したようなスライドガラス１枚あたりに２００種類の一本鎖核酸プローブが固定化された核酸マイクロアレイを作成した。なお、核酸プローブ、ハイブリダイゼーション溶液は実施例９に示したものを用い、ハイブリダイゼーション反応も実施例９と同様に行った。得られた結果を図７に示した。
本実施例では実施例６に示した方法でマイクロアレイを作成し、実施例９の方法で発現解析を行い再現性の確認を行った。本実施例でも実施例９と同様の効果で再現性のばらつきを抑えることができた。
【００５５】
比較例１
（１）支持体洗浄
市販のスライドガラス（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｂｒａｎｄ社製；３０１０）をアルカリ溶液（水酸化ナトリウム；５０ｇ、蒸留水；１５０ｍｌ、９５％エタノール；２００ｍｌ）に室温で２時間浸した。その後、蒸留水中に移し３回リンスしてアルカリ溶液を完全に除去した。
（２）二本鎖ｃＤＮＡプローブを固定化するための官能基の導入
洗浄したスライドガラスを１０％のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製；Ｐ８９２０）水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタープレート用遠心機を用いて５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心してポリ−Ｌ−リジン水溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させスライドガラス上にアミノ基を導入した。
【００５６】
（３）二本鎖ｃＤＮＡプローブの固定
プラスミドＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法を用いて下記に示した配列を有する二本鎖ｃＤＮＡプローブを作成した。次に、作成したｃＤＮＡプローブとジメチルスルホキシドを混合しスポッティング溶液（ｃＤＮＡプローブ；０．１μｇ／μｌ、ジメチルスルホキシド；５０％）を作成した後、得られたスポッティング溶液をスポッタ（日立ソフト社製  ＳＰＢＩＯ  ２０００）を用いてスライドガラス上の任意の点にスポッティングした。二本鎖ｃＤＮＡプローブ配列；
ＧＧＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＴＡＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣ（配列番号２）
【００５７】
（４）ブロッキング処理
ｃＤＮＡプローブがスポッティングされたスライドガラスを６０℃の蒸留水が入ったトレイの上で一分間保持した後、水蒸気の曇りが消えるまで９５℃のホットプレート上に乗せた。その後、スライドガラスをＵＶクロスリンク機で６０ｍＪ照射してから、スライドガラスをブロッキング処理液（無水コハク酸；５ｇ、Ｎ−メチル−ピロリジノン；３１５ｍｌ、０．２Ｍ  四ホウ酸ナトリウム；３５ｍｌ）に１５分浸した。スライドガラスをブロッキング処理液から取り出した後、９５℃の蒸留水に２分間、さらに９５％エタノールに１分間浸した。その後、マイクロタイタープレート用遠心機を用いて、５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心してスライドガラス上のエタノールを除去した。
【００５８】
（５）ハイブリダイゼーション反応
逆転写反応を用いて上記のｃＤＮＡプローブ配列と相補的な配列を持つＣｙ３が取り込まれた核酸ターゲットを作成した。得られた核酸ターゲットと２０×ＳＳＣと１０％ドデシル硫酸ナトリウムを適量加えハイブリダイゼーション溶液（核酸ターゲット；１００ｐｇ／μｌ、３．４×ＳＳＣ、ドデシル硫酸ナトリウム；０．３％）を作成した。その後、スライドガラス上に調整したハイブリダイゼーション溶液を滴下しカバーガラスを乗せた後、６２℃の恒温槽内に１２時間放置してハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応後、２０×ＳＳＣの１０倍希釈液と１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液の３００倍希釈液との混合液中にスライドガラスを浸してカバーガラスをはずした後、２０×ＳＳＣの１００倍希釈液でスライドガラスを洗浄した。最後に、マイクロタイタープレート用遠心機を用いてスライドガラス上の水分を除いた後、マイクロアレイ用スキャナー（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製  Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  ５０００）を用いてｃＤＮＡプローブが固定化された領域の蛍光強度（ハイブリダイゼーションシグナル）とｃＤＮＡプローブが固定化されていない領域の蛍光強度（バックグラウンドシグナル）を測定して、結果を図２及び図３に示した。
【００５９】
本比較例では二本鎖ｃＤＮＡプローブが支持体上に静電的に結合したマイクロアレイを作成し、実施例との比較を行った。比較例ではブロッキング処理やハイブリダイゼーション時に核酸プローブがはがれてしまうためハイブリダイゼーションシグナルが低くなった。また、ブロッキング処理も不十分であるためバックグラウンドシグナルも高くなった。
【００６０】
比較例２
実施例４における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を以下に示した（４’）ブロッキング処理に変更した。
（４’）ブロッキング処理
牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、ＡＬＵＢＵＭＩＮ  ＢＯＶＩＮＥ）が１０ｍｇ／ｍｌ、ＳＳＣ濃度が３．５×ＳＳＣであるブロッキング処理液を作成した。核酸プローブが固定化されたスライドガラスを４０℃のブロッキング処理液中に６時間浸した。
【００６１】
本比較例では一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化されていない領域に牛血清アルブミンを導入して核酸ターゲットの吸着を防止するためのブロッキング処理を行った。バックグラウンドシグナルは牛血清アルブミンを導入することで若干低くなったが、牛血清アルブミンの分子量が大きく核酸ターゲットが核酸プローブに近づく時の立体障害となるためハイブリダイゼーションシグナルは低くなった。
【００６２】
比較例３
実施例４における各工程のうち、（４）負に帯電することが可能な官能基の導入を以下に示した（４’）ブロッキング処理に変更した。
（４’）ブロッキング処理
核酸プローブが固定化されたスライドガラスをＨＥＰＥＳ緩衝溶液でｐＨが６．５に調整された１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（和光純薬社製）溶液に２時間浸した。
【００６３】
本比較例では一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化した後、核酸プローブが固定化されていない領域に２−メルカプトエタノールを用いてアルコール性水酸基を導入し、核酸ターゲットの吸着を防止するためのブロッキング処理を行った。一本鎖核酸プローブを共有結合で固定化することで核酸プローブのはがれを防止することができ、高いハイブリダイゼーションシグナルを得ることができたが、導入されたアルコール性水酸基が水溶液中でほぼ中性であるため、ブロッキング効果が不十分でありバックランドシグナルが高くなった。
【００６４】
比較例４
比較例１に示した（１）〜（４）の方法を用いて、図４に示したようなスライドガラス１枚あたりに２００種類の核酸プローブが固定化された核酸マイクロアレイを作成した。なお、核酸プローブとして比較例１に示したＰＣＲ法を用いて塩基長が２００〜４００である二本鎖ｃＤＮＡプローブを作成した。また、２００種類のｃＤＮＡプローブが持つそれぞれの塩基配列として、表１〜８に示した２００種類の各遺伝子断片がそれぞれ持つ固有の連続した２００〜４００塩基配列を用いた。次に、実施例９に示したハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイゼーション反応を行い、各スポットについて、得られたハイブリダイゼーションシグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いた２００点の発現量を求めた。上記ハイブリダイゼーション反応を合計２回行い、各点についてそれぞれ１回目の発現量を横軸に、また２回目の発現量を横軸取って、図８に示すようなスキャッチャードプロットを得た。
【００６５】
本比較例では比較例１に示した方法の二本鎖ｃＤＮＡプローブが支持体上に静電的に結合したマイクロアレイを作成し、これを用いてすい臓ガン細胞の発現解析を行い解析データの再現性を確認した。本比較例のマイクロアレイは核酸ターゲットの検出感度が低いため、これを用いた核酸ターゲットの検出では蛍光強度が１０００以下である発現量が低い領域での再現性のばらつきが大きかった。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明した様に、本発明では共有結合で支持体上に固定化された一本鎖核酸プローブと核酸ターゲットをハイブリダイズすることで、核酸プローブのはがれを防止すると同時にハイブリダイゼーションの効率を高め、核酸ターゲットの検出量を増やすことができる。また、核酸プローブが固定化されていない領域表面に水溶液中で解離して負に帯電することが可能な官能基または加水分解することで負に帯電している官能基を導入することで核酸ターゲットの吸着を抑制してノイズを減らすことができる。上記二つの効果により核酸ターゲットの検出感度を高めることができる。また、これを用いた核酸検出では検出感度を高めることにより解析データの再現性を高め信頼性の高い解析データを得ることができる。
【００６７】
【配列表】
0003605039.tif 000010
0003605039.tif 000011
【００６８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：核酸プローブ
配列番号２：二本鎖ｃＤＮＡプローブ配列
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸マイクロアレイの製法及び構造の一例を模式的に示す。
【図２】実施例１〜８及び比較例１〜３で得られたハイブリダイゼーション後の核酸プローブが固定化された領域の蛍光強度を示したグラフである。
【図３】実施例１〜８及び比較例１〜３で得られたハイブリダイゼーション後の核酸プローブが固定化されていない領域の蛍光強度を示したグラフである。
【図４】本発明の核酸マイクロアレイの一実施例を概略的に示した図である。
【図５】実施例９で得られた２００スポットの蛍光強度について、一回目の実験の蛍光強度を横軸に二回目の実験の蛍光強度を縦軸に取ったスキャッチャードプロット図である。
【図６】実施例１０で得られた２００スポットの蛍光強度について、一回目の実験の蛍光強度を横軸に二回目の実験の蛍光強度を縦軸に取ったスキャッチャードプロット図である。
【図７】実施例１１で得られた２００スポットの蛍光強度について、一回目の実験の蛍光強度を横軸に二回目の実験の蛍光強度を縦軸に取ったスキャッチャードプロット図である。
【図８】比較例１で得られた２００スポットの蛍光強度について、一回目の実験の蛍光強度を横軸に二回目の実験の蛍光強度を縦軸に取ったスキャッチャードプロット図である。
【符号の説明】
１・・・スライドガラス、２・・・スポット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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