(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）試料、溶液および磁性担体を混合して反応する反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブを同一支持板に固定して形成された抽出容器、（２）該抽出容器に溶液を注入する分注手段、（３）該抽出容器内の磁性担体を含む試料液を混合する攪拌手段、（４）該磁性担体を抽出容器内の一定位置に保持させる保持手段、（５）該磁性担体の保持している間に該抽出容器中の試料液を排出除去する排出手段、（６）該抽出容器内の該磁性担体を含む試料液を加温する加熱手段、および（７）該分注手段、該攪拌手段、該保持手段、該排出手段、該加熱手段の各々が設置された位置に該抽出容器を搬送させる搬送手段とを少なくとも備えたことを特徴とする核酸抽出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を含有する種々の試料、特に生体試料から磁性担体を用いて核酸を抽出するための核酸抽出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、数多くの分野において、生体試料等からの核酸の抽出が盛んに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮＡプローブ作製においては、目的とする蛋白質を生産する細胞から該蛋白質をコードするＤＮＡやＲＮＡを抽出する操作が行われている。また、ＤＮＡプローブを用いてウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡを検出する臨床診断においては、生体試料から検出されるべきＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出する操作が行われている。
【０００３】
このように、核酸を抽出する操作は種々の分野において非常に重要なものである。従来から知られている核酸抽出方法としては、例えば苛性試薬を試料に添加し、次いでフェノールまたはフェノール／クロロホルム抽出を行い、最終的にエタノール沈殿を行うものや、細胞に界面活性剤とプロテアーゼＫを行う方法等が知られている（遺伝子工学Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，ｐ１１２〜１１９，１９９７）。
【０００４】
一方、これらの抽出に用いられる容器は，特公平４−３１９４５号公報に記載されるような、プラスチックで形成されたフタ付きのマイクロチューブと呼ばれているものがある。この容器では抽出処理操作時にフタを開放したままの状態で使用されるのが一般的である。
【０００５】
また、上記のような核酸抽出方法を基本にして、種々の核酸抽出装置が提案されている。例えば特開平３−１２５９７２号公報には、ウイルス感染防止と抽出工程処理の効率向上を狙い、産業用多関節ロボットを用いて、このロボットの周辺部にＤＮＡ抽出精製に必要なユニットを配する構造とした核酸抽出装置が記載されている。
【０００６】
特開平４−１３１０７６号公報には、核酸抽出容器の送り機構と遠心分離機間の搬送をコンパクトな構成とすることで、少量の血液などから核酸の回収効率向上を狙った抽出装置が記載されている。
【０００７】
さらに、特開平４−１８７０７７号公報においては、溶液吸引吐出手段にフィルターユニットを取り付けることにより簡便、迅速、恒温保持の処理と共に、混合や濃縮処理等を含めたＤＮＡ塩基配列分析を行うための全自動前処理装置システムが、特開平９−４７２７８号公報には、遠心分離を行わずに真空ポンプによるフィルター方式を採用した抽出装置構成を有するものが示されている。このように種々の抽出装置が提案されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
核酸抽出操作は、通常、赤血球溶血、白血球濃縮、細胞膜分解、核酸精製よりなり、上述した抽出に共通な操作をブロック図にまとめると図１のようになる。すなわち、試料や溶液などの注入操作、反応のための混合操作、固相−液相分離操作、不要成分液の除去もしくは核酸の回収操作よりなっている。
【０００９】
ところで、上述した核酸抽出装置では、抽出操作工程中の固相−液相分離操作を遠心分離あるいはフィルタ分離する構成として実現しているものがある。これらについては、自動化装置内に遠心分離機や真空ポンプなどの機器を用いる必要があり、装置が大型化、複雑化、コスト高になるという問題点を含んでいる。
【００１０】
また、核酸の特定領域の増幅技術が向上しており、核酸分子数が微量であっても増幅することにより、特定領域を検出できるようになってきた。したがって、多量の核酸を抽出するよりも、微量の生体試料を用いて信頼度よく核酸を抽出する方がより重要になりつつある。
【００１１】
ところが、臨床診断などで用いる場合の核酸抽出は、対象検体を同時に多数処理する必要がある。一つの検体ごとに１個の抽出容器を使用し、さらにこれら多数の抽出容器が限られたスペースの自動化装置内に並べられ、抽出処理が行われる。
【００１２】
このような状態で、例えば上述した開放系のマイクロチューブを使用して、試料や抽出用溶液などの注入・排出操作が行われると、これらのマイクロチューブ間にまたがって発生するキャリーオーバーのためのコンタミネーションといった臨床診断では最も注意しなければならない問題が発生する恐れがある。
【００１３】
本発明は、従来の核酸抽出装置が遠心分離機や真空ポンプの採用による大型化、複雑化、コスト高という問題と、臨床診断用装置として発生してはならないコンタミネーションの問題を解決せしめることを課題とするものであって、煩雑な操作を必要とする核酸抽出をコンタミネーションの恐れなく自動化できる装置を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した目的を達成するための手段として、磁性担体による核酸抽出方法（特開平９−１９２９２号公報）に適した抽出容器の構造に基づく核酸抽出装置を提供することにある。
【００１５】
すなわち、本発明は、（１）試料、溶液および磁性担体を混合して反応する反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブを同一支持板に固定して形成された抽出容器、（２）該抽出容器に溶液を注入する分注手段、（３）該抽出容器内の磁性担体を含む試料液を混合する攪拌手段、（４）該磁性担体を抽出容器内の一定位置に保持させる保持手段、（５）該磁性担体の保持している間に該抽出容器中の試料液を排出除去する排出手段、（６）該抽出容器内の該磁性担体を含む試料液を加温する加熱手段、および（７）該分注手段、該攪拌手段、該保持手段、該排出手段、該加熱手段の各々が設置された位置に該抽出容器を搬送させる搬送手段とを少なくとも備えたことを特徴とする核酸抽出装置である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明においては、抽出容器自体に、反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分と核酸を回収するチューブを備えた構造としたことにより、抽出処理中の容器間キャリーオーバーを防止してコンタミネーションを防ぐ構成が可能となる。
【００１７】
上記抽出容器において、反応槽部分とは、生体試料から目的成分の処理または分析の反応を行なう部分であり、ドレインカップ部分とは、該処理または分析の反応を行なった際の不要成分を含む液を回収する部分であり、回収チューブは目的とする反応液を回収する部分をいう。さらに、支持板は、該反応槽部分、該ドレインカップ部分および該回収チューブを保持させるための板状のものをいう。
【００１８】
また、生体試料とは、血液、血清、バフィーコート、尿、糞便、精液、細胞、培養物等の広く生体に由来するものを指すものである。
【００１９】
したがって、核酸抽出工程の各処理を迅速かつ安全に行え、微量の生体試料からでもコンタミネーションの不安なく信頼度の高い核酸を抽出することが可能である。なお、これらの抽出容器を使い捨てとすることで、洗浄処理の不安や生体試料に含まれている可能性のあるウイルス感染防止などの安全面でより信頼度の高い装置を提供できることになる。
【００２０】
また、上記のような手段によれば、核酸抽出工程で行われる溶液の注入・排出操作あるいは攪拌・加熱操作が抽出容器を各手段が設置された位置まで搬送して行わうことができるため、抽出処理全体も極めて効率よく行え、さらに磁性担体を利用した抽出法のために遠心分離機や真空ポンプ方式と比べて装置を簡単化、コンパクトに構成することができる。
【００２１】
以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。
【００２２】
図２は、本発明の核酸抽出装置に用いる抽出容器の一実施例の構成を示す断面図である。抽出容器は、生体試料や試薬を混合させて反応する反応槽部分１と不要成分液を蓄えるドレインカップ部分２と核酸を回収するチューブ３、回収チューブ３へ核酸を排出する流路を形成するフタ８と、反応槽部分１の上方開口部に挿入して通路を形成する回転部材（バルブ）６、該回転部材（バルブ）６の回転時の上下ガタを抑えるキャップ９と、該反応槽部分１、該ドレインカップ部分２、該回収チューブ３を組立て、固定する支持板４とから構成されている。また、７はドレインカップ・フタ、１０は貫通パイプを示す。
【００２３】
図３は、回転部材６を示し、図３（ａ）は上面図、図３（ｂ）は側面図である。排出パイプ５は回転部材の通路１１に挿入接続することで連結され、排出通路を形成する。また、回転部材に設けられた貫通パイプ１０の内径は、反応槽部分の内側へいくほど小さくなるテーパー構造としている。
【００２４】
図２に示すドレインカップ部分２の上方開口部には、中央に小穴を設けたフタ７が挿入される。また、図３に示す回転部材（バルブ）６には、貫通パイプ１０が一体に形成されてなり、さらに回転用のとっ手（リブ）１２が設けられている。バルブ通路１１には排出パイプ５が挿入接続されて組み立てられ、液の排出流路を形成する。
【００２５】
本抽出容器の貫通パイプ１０は、反応槽部分１へ試料液や試薬の注入通路として、あるいは外部から圧力を加える通路として用いられる。核酸を回収するチューブ３は核酸抽出処理が完了した時点で取り外される必要があるので，支持板４に着脱自在できる構造となっている。
【００２６】
この抽出容器の材質としては、従来より用いられている、例えばガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルあるいは表面にシリコンコーティングが施された一般的な樹脂など種々のものを採用することが可能である。なかでも、ポリプロピレンが目的成分の吸着のない点から特に好ましい。また、形状としては、反応槽部分は円錐形、ドレインカップ部分は円筒形、回収チューブは通常用いられているマイクロチューブが好ましい。
【００２７】
次に本発明の核酸抽出装置の構成について説明する。図４、図５は、それぞれ本発明の核酸抽出装置の一実施例に関する平面図および側面図を示す。これらの図中、１３は抽出容器を装着設置する容器スタンド、１４は抽出容器に試薬液などを注入する分注ノズルと抽出容器の回転部材（バルブ）を回転させる回転アームを備えた分注手段である。１５は抽出容器内の溶液を混合させるための攪拌手段、１６は抽出容器反応槽内の溶液をドレインカップ部分もしくは回収チューブへ排出する排出手段、１７は抽出容器に接して磁性担体を保持する保持手段と抽出容器内の溶液を加温する加熱手段が一体で構成されているユニットである。
【００２８】
１８は核酸抽出処理に用いる試薬ボトル、１９、２０、２２は抽出容器を搬送する手段を構成するものであって、１９はモーター、２０はベルト、２２はプーリを示す。なお２１のレールに沿って容器スタンドが移動し、図５に示す分注手段（Ａ）、攪拌手段（Ｂ）、保持手段（Ｃ）、加熱手段（Ｄ）および排出手段１６の各位置に搬送できる構造となっている。
【００２９】
次に、各手段の詳細な構成を説明する。図６は抽出容器に溶液などを分注する分注手段１４を示す模式図である。該分注手段の各構成要素機構部は、リニアモーターの台座２６に取り付けられ、レール２５に沿って左右に移動する構造を備えている。各要素機構の動作は、モーター２３に接続されたボールネジ２９と、ボールネジの回転により上下する可動片３１、この可動片３１に接続されたＬ字形金具３３に分注ノズル３４が取り付けられている。
【００３０】
一方、可動片３１の反対側には同様のＬ字形金具に回転部材（バルブ）を回転させる回転アーム２７が取り付けられている。分注ノズル３４の先端は抽出容器注入口に接触させるため、樹脂で形成されたパッド３５が容器注入口形状に合わせて装着されている。３２はスプリング、３０は試薬液などを導くチューブであって、分注ノズルと接続されている。また、回転アーム２７の先端には抽出容器のバルブと勘合可能な形状をした取手２８が取り付けられ、モーター２４により回転駆動される。
【００３１】
図７は、抽出容器内の溶液を混合させるための攪拌手段１５を示した模式図である。攪拌は永久磁石（リング磁石）３６の上下往復運動により実現する。３７はモーター、４０はボールネジ、３８、３９は攪拌機構を組み立てる固定板である。固定板３９がボールネジ４０の回転に従って、上下往復運動する構成となっている。
【００３２】
図８は、保持手段および加熱手段が一体に形成されたユニット１７を示す模式図である。該保持手段は、抽出容器内の磁性担体を容器壁面に保持するため、永久磁石４１を用いる。該加熱手段は、抽出容器の反応槽の形状に合わせ、アルミニウムなどの金属ブロックで構成され台座４４の中に面ヒーター（図示しない）が埋め込まれて温度制御される構造を備えてなる加熱ブロック４２である。なお、永久磁石４１、加熱ブロック４２ともに上下に移動させるため、モーター４５、ボールネジ４８、固定金具４３、４６、４７などから構成されている。
【００３３】
図９は、排出手段１６が抽出容器に設置されたところを示す模式図である。該排出手段も上下移動を必要とするため、モーター４９、ボールネジ５０、可動片５１で構成され、可動片に接続されたＬ字形金具５２に加圧ノズル５３と排気ノズル５７が取り付けられている。該加圧ノズルの先端には，容器注入口に合うように樹脂で形成されるパッド５４が装着され，加圧された空気を送るチューブ５５は、ジョイント金具５６により該加圧ノズルと接続される。
【００３４】
一方、排気ノズル先端には、ドレインカップ上部フタの小穴に合うように樹脂で形成されるパッド５８が装着され、排出される空気を廃棄ボトル（図示しない）へ導出するチューブ５９は、ジョイント金具６０とで排気ノズルと接続される構成である。上記の各手段と、これらの各手段を制御するコンピュータ（図示しない）により本核酸抽出装置は構成されている。
【００３５】
次に、上記核酸抽出装置を用いて核酸抽出を行う方法について説明する。ここで、核酸抽出方法は、特開平９−１９２９２号公報で示されている磁性担体を用いる方法に基づくものである。すなわち、超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子と核酸を含有する生物試料及び核酸抽出用溶液を容器に注入し混合する。核酸が結合した磁性シリカ粒子を磁界を用いて液体から分離し（Ｂ／Ｆ分離）、最終的に核酸を結合した磁性シリカ粒子から溶離させる工程からなっている。
【００３６】
上記核酸抽出方法に従った一連の処理工程（フローチャート）を図１０に示し、これに従った本核酸抽出装置の使用方法を説明する。また、図１１〜１６において、各工程に関する模式図を示す。
【００３７】
図１１に示すように、まず、抽出容器内に生体試料（例えば血液など）である検体と核酸を吸着させる磁性シリカ粒子を分注する。この操作は安全性を考慮して，通常は操作者がクリーンベンチなどの中で行う。同時に第１番目の抽出用試薬の分注を行う。
【００３８】
試料検体と試薬の入った抽出容器を核酸抽出装置内の容器スタンド１３（図４、５）に設置する。ここまでが装置を動作させるまでの準備段階であって、抽出容器設置後、スタートボタン（図示しない）を押すことにより、核酸抽出装置の処理が開始される。最初の処理は、特開平９−１９２９２号公報では、生体試料から核酸を取り出し，磁性シリカ粒子に吸着させるため、抽出容器内溶液を攪拌する工程である。
【００３９】
図５に示すように、容器スタンド１３は、搬送手段によって図５Ｂ位置の攪拌手段１５が設置されている所まで移動される。その場所に停止して一定時間、攪拌手段を有するリング磁石３６の上下往復運動により、抽出容器内溶液を攪拌・混合される。この状態を模式的に示したものが図１２である。なお、リング磁石の上下移動幅や攪拌時間長などは適宜設定することが可能である。
【００４０】
図５に示すように、攪拌処理が終了すると容器スタンドは搬送手段により保持手段１７のある図５Ｃ位置に移動される。この場所で停止し、次の処理であるＢ／Ｆ分離が行われる。この状態を図１３に示す。保持手段を構成する永久磁石４１が抽出容器底部に接触し、抽出容器内部の磁性シリカ粒子６１を容器底部に保持せしめる。
【００４１】
また、この図５Ｃ位置では、抽出容器上部に排出手段１６が備えられてあり、次の処理である不要成分液の排出を行うことができる。すなわち、図１３で示したようにＢ／Ｆ分離を保ったままの状態で排出手段である加圧ノズルと排気ノズルが下降し、抽出容器に設置される。この状態を図１４に示す。
【００４２】
図９に示すように、加圧ノズル先端５４は、抽出容器の注入口に設置され、ポンプ（図示しない）から送られてくる加圧空気を抽出容器内に加える。抽出容器内の不要成分液は排出パイプの流路を通してドレインカップ部分へ排出される。同時に、加圧導入された空気はドレインカップ上部のフタ小穴を通して、排気ノズル５８で接続された流路を通じて排気される。この一連の処理が図５Ｃ位置にて行われる。
【００４３】
不要成分液の排出が終了すれば、排出手段と保持手段は所定の位置に復帰し抽出容器スタンドは次の分注位置Ａに移動せしめられて停止する（図５）。図１０のフローチャートに従うと、これ以降が洗浄工程となる。
【００４４】
図５に示すように、洗浄液の分注は分注手段１４が容器スタンド１３に並べられている抽出容器に各々１個ずつ順次分注していく方法をとる。分注ノズル先端パッド３５が抽出容器注入口に設置し、試薬液（洗浄液）ボトル１８からチューブを介して抽出容器内に洗浄液が注入される。分注手段は１つの抽出容器に注入が完了すれば、次の容器に移動し全く同様に分注を行う。容器スタンドに並べられた抽出容器数に注入が完了すれば，分注手段は所定の位置に戻って停止する。
【００４５】
洗浄工程のこれ以降の攪拌処理、Ｂ／Ｆ分離処理、不要成分液の排出処理に関しては、上述した動作と全く同様に実行される。また核酸抽出処理における洗浄工程は、洗浄用試薬の変更あるいは同じ試薬で複数回洗浄を行うなど種々の形態がとられることもあるが，装置上での動作は上述した洗浄方法の動作と全く同じに執り行うことができる。
【００４６】
次に、磁性シリカ粒子の乾燥について説明する。図５に示すように、不要成分液（洗浄液）の排出が終了した後、抽出容器スタンド１３は図５Ｄ位置に移動される。Ｄ位置には加熱ブロック４２が設置してあり、容器反応槽部分に下から挿入し、接触設置されて抽出容器を加温する。磁性シリカ粒子表面に残存する洗浄液が完全に蒸発除去されるまで加温するのが乾燥である（図１５）。したがって、一定時間の加温を行うことにより磁性シリカ粒子の乾燥が行われる。
【００４７】
一方、乾燥が完了した後、滅菌水などの低イオン濃度の溶液（溶離液）を磁性シリカ粒子に添加する。すなわち、抽出容器内に溶離液を分注手段により分注し、これらの溶液を一定時間加温する。この溶離液加温も、この図５Ｄ位置にある加熱ブロックにて行う。この乾燥あるいは溶離液加温を示したのが図１５である。
【００４８】
図５に示すように、溶離液の加温が終了すると、加熱ブロックは所定の位置に復帰し、容器スタンド１３は攪拌位置（Ｂ位置）に移動して一定時間の攪拌を行う。攪拌が終了後最後の処理である核酸の回収に移る。そのために、容器スタンド１３は分注手段のある図５Ａ位置に移動される。そして抽出容器のバルブ６を１８０度回転せしめて容器の回収準備を行う。これにはバルブ回転アーム２８（図６）により、抽出容器のバルブを順次１個ずつ半回転を行う。
【００４９】
図５に示すように、バルブ回転が全ての抽出容器で完了した後、容器スタンド１３は保持手段のあるＣ位置に移動し、図１６に示すように、永久磁石４１でＢ／Ｆ分離され、加圧ノズル５４を通して加圧空気が抽出容器内に導入せられ、核酸を含む溶離液が回収チューブに排出されて、核酸の回収が行われる。
【００５０】
この回収処理が完了すれば、容器スタンド１３は図５Ｃ位置から所定の初期位置に移動し、すべての核酸抽出処理動作が完了し、装置の動作も停止する。操作者はこの時点で抽出容器を容器スタンド１３から取り出し、各々の抽出容器から回収チューブ３だけを取り外して冷蔵保存などの処置をすることになる。以上が本核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理の動作である。
【００５１】
【発明の効果】
上記のように、本発明における核酸抽出装置は、遠心分離器や真空ポンプを使用することなく、核酸抽出が行えるコンパクトな装置構成を実現することができる。かつ抽出容器が、抽出処理のための分注、攪拌、保持、排出、加熱の各手段のある位置へ搬送されるために、各抽出処理操作と処理手段とが常に一対一に対応するよう制御されるため、迅速かつ効率よく煩雑な抽出を行なうことができる。さらに抽出処理中、抽出容器のフタが開放状態にならないので抽出容器間でのキャリーオーバーによるコンタミネーションの発生が防止でき、極めて信頼性の高い装置を提供することができる。
【００５２】
また、これらの抽出容器を使い捨てとすることで、洗浄処理の不安や生体試料に含まれている可能性のあるウイルス感染防止などの安全面で、より信頼性の高い装置を提供できる。したがって、本発明の核酸抽出装置は、特に多数の検体試料を扱う必要のある遺伝子診断用の臨床検査あるいは研究分野において、迅速簡便安全に核酸成分を抽出する装置として、その有用性は極めて大きいものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】一般的な核酸抽出の共通操作ブロック図である。
【図２】本発明の核酸抽出容器を示す図である。
【図３】本発明の核酸抽出容器の回転部材（バルブ）を示す図である。
【図４】本発明の核酸抽出装置の一実施例に関する平面図である。
【図５】本発明の核酸抽出装置の一実施例に関する側面図である。
【図６】本発明の分注手段の一例を示す模式図である。
【図７】本発明の攪拌手段の一例を示す模式図である。
【図８】本発明の保持手段および加熱手段の一例を示す模式図である。
【図９】本発明の排出手段の一例を示す模式図である。
【図１０】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理のフローチャートである。
【図１１】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理の注入模式図である。
【図１２】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理の攪拌模式図である。
【図１３】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理のＢ／Ｆ分離模式図である。
【図１４】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理の不要成分液の排出模式図である。
【図１５】本発明の核酸抽出装置を用いた核酸抽出処理の乾燥・溶離液加温の模式図である。
【図１６】本発明の核酸抽出処理の回収模式図である。
【符号の説明】
１  反応槽部分    ２  ドレインカップ部分    ３  回収チューブ
４  支持板    ５  排出パイプ    ６  回転部材（バルブ）
７  フタ    ８  流路フタ    ９  抑えフタ    １０  貫通パイプ
１１  バルブ通路    １２  とっ手（リブ）    １３  容器スタンド
１４  分注手段    １５  攪拌手段    １６  排出手段
１７  保持・加熱手段    １８  試薬ボトル    １９  モーター
２０  ベルト    ２１  レール    ２２  プーリ    ２３，２４  モーター
２５  レール    ２６  リニアモーター台座    ２７  回転アーム
２８  回転アームとっ手    ２９  ボールネジ    ３０  チューブ
３１  可動片    ３２  スプリング    ３３  Ｌ字形金具
３４  分注ノズル    ３５  パッド    ３６  リング磁石
３７  モーター    ３８，３９  固定金具    ４０  ボ−ルネジ
４１  永久磁石    ４２  加熱ブロック    ４３  取付け金具
４４  台座    ４５  モーター    ４６，４７  固定金具
４８  ボールネジ    ４９  モーター    ５０  ボールネジ
５１  可動片    ５２  Ｌ字形金具    ５３  加圧ノズル    ５４  パッド
５５  チューブ    ５６  ジョイント金具    ５７  排気ノズル
５８  パッド    ５９  チューブ    ６０  ジョイント金具
６１  磁性シリカ粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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