(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることによって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする遺伝子工学用色素含有剤であって、使用する色素は、オレンジＧ、アミドブラックよりなる群から選択される色素を必須成分として含有し、ここで該色素の反応液中の終濃度が、オレンジＧは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、アミドブラックは０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように設定されていることを特徴とする遺伝子工学用色素含有剤。
【請求項２】
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法によって行われる遺伝子増幅反応に使用されることを特徴とする請求項１記載の遺伝子工学用色素含有剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子工学用色素含有剤を含有する遺伝子増幅反応液。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子工学用色素含有剤、又は請求項３記載の遺伝子増幅反応液を含有する遺伝子増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子増幅法や該方法で得られた核酸断片の解析に有用な遺伝子工学用色素含有剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子増幅法、特にポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法は試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、現在では遺伝子に関する研究のみならず生物学、医学、農業等幅広い分野において不可欠の手法となっている。遺伝子増幅法によって試料中に存在する特定の遺伝子、又はその断片を増幅することは、該遺伝子のみならず該遺伝子を有する生物そのものの存在を検出することにつながる。また増幅対象をｍＲＮＡとすることにより、該遺伝子の発現状態を知ることも可能である。
遺伝子増幅法のこのような特徴は、該方法を広範な分野において利用可能な遺伝子のスクリーニング方法とした。その例としては、例えば微生物遺伝子の検出による食品や飲料水の微生物汚染の検査や、組織適合性抗原遺伝子を調べる移植適合検査等が挙げられる。このような分野での遺伝子増幅法の利用は、非常に多数の試料を対象として該方法を実施することを必要とし、その操作全体を効率よく行うことが望まれるようになってきた。
遺伝子増幅反応において、その増幅効率は該反応の全体の質を左右する重要な因子である。遺伝子増幅反応効率が低い反応系では、必要な増幅産物を得るために反応のスケールを大きくする、すなわち使用する鋳型量や酵素量を増やすか、あるいは反応時間を延長するなどの配慮が必要となることがある。また、遺伝子の検出手段として行われる遺伝子増幅反応においては増幅反応効率が検出感度を左右する。
例えば、ＰＣＲ法による遺伝子増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼの活性を利用してある鋳型核酸に相補的な核酸を合成する工程の繰返しからなる。理想的には１工程の反応によって１分子の鋳型核酸から１分子の相補鎖核酸が合成されるはずであるが、実際には反応の中断等のためにこれよりも低い効率で相補鎖が合成される。したがって、その条件を改善することによって現行の反応よりも高い効率で遺伝子増幅を行うことが期待される。
【０００３】
一方、遺伝子増幅反応によって生成された増幅産物の解析法としては、増幅産物の鎖長とその量を同時に知ることができる電気泳動法がよく使用されている。電気泳動による増幅産物の解析は、反応後の溶液の一部をとってこれに試料用色素緩衝液（ローディング・バッファー）を添加し、電気泳動に供するのが一般的である。このような試料用色素緩衝液は、泳動距離の指標となる成分として色素（色素マーカー）、反応液をゲルのウエル内に容易にアプライできるように反応液の比重を増加させる成分としてグリセロール等を含んでいる。
多数の試料について遺伝子増幅法を実施し、その結果の解析を電気泳動によって行う場合、個々の反応液を試料用色素緩衝液と混合して電気泳動に供するのは非常に煩雑な作業である。この作業は増幅反応が終った容器からの反応液の採取、試料用色素緩衝液の添加、混合といった一連の操作を要し、また、混合のための新たな容器も必要である。更に操作中に試料を取り違えてしまう危険もある。
遺伝子増幅反応液に予め試料用色素緩衝液を加えておき、遺伝子増幅反応後の反応液を直接電気泳動に供することができれば、上記の煩雑さを解消し、能率よく作業を行うことができる。しかしながら、反応に悪影響を与えることなく、反応開始前の遺伝子増幅反応液に添加して使用可能な試料用色素緩衝液は存在しなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記の問題を解決することが可能な遺伝子工学用試薬を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は遺伝子工学用色素含有剤に関し、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることによって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする遺伝子工学用色素含有剤であって、使用する色素は、オレンジＧ、アミドブラックよりなる群から選択される色素を必須成分として含有し、ここで該色素の反応液中の終濃度が、オレンジＧは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、アミドブラックは０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように設定されていることを特徴とする。
次に、本発明の第２の発明は遺伝子増幅反応に使用するための反応液に関し、第１の発明の遺伝子工学用色素含有剤を含有することを特徴とする。
更に、本発明の第３の発明は遺伝子増幅反応を行うためのキットに関し、第１の発明の遺伝子工学用色素含有剤、又は第２の発明の遺伝子増幅反応液を含有することを特徴とする。
【０００６】
本発明者らは鋭意研究の結果、遺伝子増幅反応液中に色素を添加して反応を行った場合に反応が促進され、より多くの増幅産物が得られることを明らかにした。また、色素を予め反応液に添加することにより、反応液中の核酸の電気泳動による解析が簡便に行えるようになることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の遺伝子工学用色素含有剤は、その有効成分として色素を含有することを特徴とする。本発明に使用する色素のうち、必須成分である色素としては、オレンジＧ、アミドブラックがあり、これらは単独あるいは混合された形で使用することができる。
【０００８】
本発明の遺伝子工学用色素含有剤としては、遺伝子増幅反応においてその反応効率を向上させるもの、すなわち遺伝子増幅効率向上剤として使用されるものがある。該遺伝子増幅効率向上剤には遺伝子増幅反応の効率を向上させる成分として上記の色素を使用することができる。これらの色素のうちには高濃度で使用した場合に遺伝子増幅反応を阻害するものがあるが、本発明の遺伝子増幅効率向上剤には、該色素が遺伝子増幅反応の効率を向上させるのに効果のある濃度で反応液に添加されるような濃度で含有されていればよい。また、本発明の遺伝子増幅効率向上剤はｐＨを調整するための緩衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そのｐＨは、該遺伝子増幅効率向上剤が添加された反応液のｐＨが通常遺伝子増幅反応が実施される範囲、例えばｐＨ８．３〜ｐＨ９．２の範囲となるように調整されていることが好ましい。
【０００９】
本明細書記載の「遺伝子増幅反応の効率」は、一定の条件、すなわち一定の鋳型核酸やプライマーの量、反応温度、反応時間において得られる増幅産物の量を示す。本発明の遺伝子増幅効率向上剤を添加した反応液を用いて遺伝子増幅反応を行うことにより、添加しない場合に比べて得られる増幅産物の量が増加する。また、本発明の遺伝子増幅効率向上剤によって増幅可能な核酸の鎖長が延長されることもあるが、この場合にもこれまでわずかな量しか、あるいは全く得られなかった長鎖の増幅産物が豊富に得られるようになり、「遺伝子増幅反応の効率」の向上が認められる。
【００１０】
本発明の遺伝子増幅効率向上剤は、上記のように予め反応液に添加して遺伝子増幅反応に使用される。該向上剤が添加可能な遺伝子増幅反応としては、特に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ法等が挙げられる。該向上剤はそこに含有される色素の終濃度が遺伝子増幅反応に適した範囲となるような量を反応開始前の反応液に添加して使用すればよい。該向上剤の使用により、これまでよりも少量の鋳型核酸からも十分な量の増幅産物が得られるようになり、また、遺伝子の検出を行う場合においてもその感度を向上させることができる。
【００１１】
遺伝子増幅効率に優れ、かつ長鎖のＤＮＡ断片の増幅が可能なＰＣＲ技術としてＬＡ  ＰＣＲ法が知られている〔プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナルアカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９１巻、第２２１６〜２２２０頁（１９９４）〕。該方法は性質の異なる２種のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用するＰＣＲ法であり、その特徴の一つとして、１種のＤＮＡポリメラーゼの使用では増幅が困難な長鎖のＤＮＡを増幅可能なことが挙げられる。本発明の遺伝子増幅効率向上剤は該方法における増幅効率の向上に特に有用である。
【００１２】
また、本発明の遺伝子工学用色素含有剤としては、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることによって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする色素剤がある。該色素剤は遺伝子増幅反応を阻害しないことを特徴とする。該色素剤を反応開始前の遺伝子増幅反応液に添加することにより、反応終了後、反応液をそのまま電気泳動のゲルにアプライすることができる。すなわち、この場合には反応終了後、電気泳動に先立って反応液に試料用色素緩衝液を添加する必要がないため、増幅産物を電気泳動によって解析する際に有用である。
該色素剤に含有される色素としては、オレンジＧ、ブロモフェーノールブルー、アミドブラックよりなる群から選択される色素があり、１種、又は複数の色素を組合せて使用すればよい。
【００１３】
電気泳動後の増幅産物の解析は、通常、ゲルを適当な核酸染色用試薬で染色することによって実施される。例えば、エチジウムブロマイドを使用する場合には、染色したゲルを紫外線照射下に肉眼で観察、あるいは写真撮影するか、適当な装置を使用した画像解析を行う。色素のあるものは染色後のゲル中の増幅産物の確認を困難にすることがあるが、本発明の色素剤においてはこのような性質を示さない濃度で使用することが望ましい。また、該色素剤に含有される色素の濃度は、反応液中では遺伝子増幅反応を阻害せず、かつ電気泳動時には泳動距離の指標として目視可能な濃度であればよい。反応液中での終濃度が、例えばオレンジＧであれば０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、ブロモフェノールブルーでは０．０２〜０．２ｍｇ／ｍｌ、アミドブラックでは０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように設定されるのが適当である。更に、含有される色素が遺伝子増幅反応の効率を向上させる作用を有するものは特に有用である。
【００１４】
本発明の色素剤はｐＨを調整するための緩衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そのｐＨは、該色素剤が添加された反応液のｐＨが通常遺伝子増幅反応が実施される範囲、例えばｐＨ８．３〜９．２の範囲となるように調整されていることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の色素剤は反応液のゲルのウエルへの添加が容易となるよう、反応液の比重を高めるような成分を含有するものであってもよい。このような成分としては、例えばグリセロールやショ糖等を使用することができる。その反応液中での濃度は遺伝子増幅反応に悪影響を与えず、かつ反応液に適度な比重を与える範囲であれば特に限定はない。なお、下記に例示した本発明の遺伝子工学用色素含有剤はこのような成分を含有していないが、これを添加した反応液は十分な比重を有しており、電気泳動に供する上で不都合はない。更に、該色素剤を含有する反応液はアガロース、アクリルアミド等各種の電気泳動用ゲルに使用することが可能である。
【００１６】
本発明の色素剤が添加可能な遺伝子増幅反応としては、特に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ法が挙げられる。なお、本発明の色素剤は目的とする反応を阻害しない範囲で、遺伝子増幅以外の酵素反応、例えばＤＮＡの制限酵素消化反応等にも使用することが可能である。
【００１７】
本発明の遺伝子工学用色素含有剤の例としては、例えば、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１ｍｇ／ｍｌオレンジＧ、０．２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーという組成のものが挙げられる。該色素含有剤は遺伝子増幅反応液に、その全量に対して５〜１０％程度の量を添加して使用される。例えば、反応開始前のＰＣＲ反応液に該色素含有剤を添加して遺伝子増幅反応を行った場合には、該色素含有剤が添加されない場合に比べて増幅される産物の量が増加する。また、この反応液は反応終了後に直接電気泳動に供することが可能である。
【００１８】
上記のように、本発明の遺伝子工学用色素剤は、例えばその適量を遺伝子増幅反応液に添加して使用されるが、遺伝子増幅反応に必要な各種の成分と、本発明の遺伝子工学用色素剤とを混合した反応液を調製しておくことにより、簡便に遺伝子増幅反応を実施することができる。このような遺伝子増幅反応液としては、例えばＰＣＲ法に使用するものの場合は、反応に適したｐＨを維持するための緩衝成分（トリス−塩酸等）、ＭｇＣｌ２  、基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及び本発明の遺伝子工学用色素剤を含むものが例示される。更にＤＮＡポリメラーゼを含有するものでもよい。また増幅の対象となる遺伝子が特定のものであれば、該遺伝子を増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。これらの各成分の濃度は、最終的に反応液が調製された際に、それぞれ遺伝子増幅反応に適した濃度となるように設定されていればよい。
【００１９】
本発明の遺伝子工学用色素剤、並びに本発明の遺伝子工学用色素剤を含有する遺伝子増幅反応液は、種々の遺伝子増幅反応に利用することができる。したがって試験管内での遺伝子増幅を行うためのキット、例えば、ＰＣＲキット等に本発明の遺伝子工学用色素剤又は本発明の遺伝子増幅反応液を添付することにより、これらキットの性能を改善することができる。このようなキットとしては、例えばＤＮＡポリメラーゼや核酸合成の基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＭｇＣｌ２  と言った遺伝子増幅反応に必要な試薬と本発明の遺伝子工学用色素剤とを含むもの等が挙げられる。
【００２０】
以上に説明したとおり、本発明により、遺伝子増幅反応を始め種々の遺伝子工学的実験操作において有用な遺伝子工学用色素剤が提供される。
本発明の遺伝子工学用色素剤は、種々の遺伝子増幅反応に利用可能であり、例えばＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅等に利用できる。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子増幅を実施することにより、反応後に得られる増幅産物の量の増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成することができる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連の遺伝子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例をもって更に具体的に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  ＰＣＲ反応液中に添加可能な色素濃度の確認
オレンジＧ、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、アミドブラックの３種の色素に関して、その濃度がＰＣＲの効率、及び電気泳動に与える影響を調べた。
以下の組成の反応液にオレンジＧとブロモフェノールブルーはそれぞれ終濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ、またアミドブラックは終濃度０．００１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で反応液に添加した。反応液組成（最終容量５０μｌ  中）：１ｎｇのλ  ＤＮＡ（宝酒造社製）、各１０ｐｍｏｌのプライマーλ１及びプライマーλ２（配列表の配列番号１及び２にそれぞれプライマーλ１とλ２の塩基配列を示す）、５μｌ  のＥｘ    Ｔａｑ添付１０倍濃度反応緩衝液（宝酒造社製）、終濃度各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１．２５単位のＥｘ    Ｔａｑ（宝酒造社製）。こうして調製した反応液を９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクルとした３０サイクルの反応に付した。
反応終了後、反応液のうちの８μｌ  を直接１％アガロースゲル（アガロースＬ０３、宝酒造社製）にアプライし、泳動時の色素が目視できるかどうかを観察し、また、泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色してＤＮＡの増幅の状態を調べた。この結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
0003587284.tif 000002
【００２４】
0003587284.tif 000003
【００２５】
表１に示されるようにオレンジＧ、ブロモフェノールブルー、アミドブラックはそれぞれ反応液中の終濃度として０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０２〜０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲でＰＣＲを阻害せず、また、泳動中はこれらの色素を泳動状態の指標として利用可能であった。このように、これらの色素を使用することによって増幅反応の効率を低下させることなく、反応後の遺伝子増幅反応液を直接電気泳動に供すること可能であることが示された。
【００２６】
実施例２  反応液を直接電気泳動に供することを可能にする遺伝子工学用色素含有剤
ヒトβ−グロビン遺伝子の一部の１１０ｂｐの領域を増幅するためのプライマー対であるプライマーＰＣ０３とＰＣ０４（配列表の配列番号３及び４にそれぞれプライマーＰＣ０３とＰＣ０４の塩基配列を示す）、同じくヒトβ−グロビン遺伝子の一部の２６２ｂｐの領域を増幅するためのプライマー対であるプライマーＫＭ２９とＫＭ３８（配列表の配列番号５及び６にそれぞれプライマーＫＭ２９とＫＭ３８の塩基配列を示す）、同じくヒトβ−グロビン遺伝子の一部の４０８ｂｐの領域を増幅するためのプライマー対であるプライマーＧＨ２０とＧＨ２１（配列表の配列番号７及び８にそれぞれプライマーＧＨ２０とＧＨ２１の塩基配列を示す）、ヒトＮ−ｒａｓ／６１遺伝子の一部の１０３ｂｐの領域を増幅するためのプライマー対であるプライマー  Ｎ−ｒａｓ／６１  Ｆ  と  Ｎ−ｒａｓ／６１  Ｒ（配列表の配列番号９及び１０にそれぞれプライマー  Ｎ−ｒａｓ／６１  Ｆ  と  Ｎ−ｒａｓ／６１  Ｒ  の塩基配列を示す）、ヒトβ−アクチン遺伝子の一部の２６１ｂｐの領域を増幅するためのプライマー対であるプライマーβ−ａｃｔｉｎ  Ｆ１  とβ−ａｃｔｉｎ  Ｒ２（配列表の配列番号１１及び１２にそれぞれプライマーβ−ａｃｔｉｎ  Ｆ１  とβ−ａｃｔｉｎ  Ｒ２の塩基配列を示す）をそれぞれ合成した。
１０倍濃度の遺伝子工学用色素含有剤〔１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１ｍｇ／ｍｌオレンジＧ、０．２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー〕を調製し、これを上記の標的遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応液に添加し、その反応への影響を調べた。ＰＣＲ反応液の組成（最終容量は５０μｌ  、濃度による表示は終濃度を示す）を以下に示す。：それぞれ１０ｐｍｏｌの上記の各プライマー対、１００ｎｇの精製ヒトゲノムＤＮＡ、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２  、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μｌ  の１０倍濃度遺伝子工学用色素含有剤、及び１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）。各反応液について９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。また、コントロールとして、各標的遺伝子について上記の遺伝子工学用色素含有剤を添加しない反応も並行して行った。
反応後、増幅産物の解析をヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）３：１アガロース（ＦＭＣ社製）を使用した３％アガロースゲル電気泳動により行った。本発明の遺伝子工学用色素含有剤が添加された反応液はその８μｌ  を直接、またコントロールの反応液はその８μｌ  をサンプリングして１．６μｌ  の試料用色素緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、２．５ｍｇ／ｍｌキシレンシアノール、３０％グリセロール）と混合した後ゲルにアプライした。この際、遺伝子工学用色素含有剤を含むＰＣＲ反応液は直接ゲルにアプライしても不都合なくウェル内に沈降し、また、電気泳動中は反応液に含まれる２種類の色素も目視可能であり泳動距離の指標とすることができた。
電気泳動終了後のゲルをエチジウムブロマイド染色して増幅されたＤＮＡを検出した。遺伝子工学用色素含有剤を添加した反応液と添加しなかった反応液について増幅されたＤＮＡ断片の量を比較したところ、５種類のプライマー対すべてで遺伝子工学用色素含有剤の添加の有無による増幅ＤＮＡ量の差は見られなかった。このように、上記の遺伝子工学用色素含有剤はＰＣＲを全く阻害しないことが確認された。
【００２７】
実施例３  色素の添加による遺伝子増幅の反応効率の向上
各種の色素がＰＣＲ反応液に添加された場合の遺伝子増幅反応の効率への影響を、反応液中に添加する鋳型ＤＮＡ量を減らした反応系を用いて確認した。色素としてオレンジＧ、ブロモフェノールブルー、アミドブラックを、またＰＣＲに使用する酵素としてはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を使用した。
鋳型として２．５ｎｇ、２５０ｐｇ、あるいは２５ｐｇのλ  ＤＮＡ（宝酒造社製）を含む以下の組成の反応液（最終容量は５０μｌ  ）を調製した。：各１０ｐｍｏｌのプライマーλＬ３６及びプライマーＭＢＲ２０２（配列表の配列番号１３、１４にそれぞれプライマーλＬ３６、ＭＢＲ２０２の塩基配列を示す）、５μｌ  のＥｘ    Ｔａｑ添付１０倍濃度反応緩衝液、終濃度各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μｌ  の色素水溶液、１．２５単位のＥｘ  Ｔａｑ。なお各色素水溶液の濃度は、その反応液中の終濃度がオレンジＧについては０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌの３通り、ブロモフェノールブルーについては０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．００５ｍｇ／ｍｌの３通り、アミドブラックについては０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌの２通りとなるよう調製した。また、コントロールとして色素水溶液を添加しない反応液も調製した。こうして調製した反応液を９４℃、１分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜６８℃、１５分を１サイクルとした３０サイクルの反応を行い、更に７２℃、１０分の処理に付した。
反応終了後、実施例１同様に反応液を１％アガロースゲル（アガロースＬ０３）電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色することにより増幅されたＤＮＡを検出した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
＋＋：多量の増幅産物が見られる
＋  ：増幅産物が見られる
±  ：わずかな増幅産物が見られる
−  ：増幅産物は見られない
【００３０】
表２に示されるように、色素の種類やその濃度によって強弱はあるが、いずれの色素においてもコントロールの反応液に比べて遺伝子増幅反応の効率の向上が見られた。すなわち、これらの色素が遺伝子増幅反応の効率を向上させる作用を有していることが明らかとなった。
【００３１】
実施例４  ２種の色素を含有する遺伝子工学用色素含有剤による遺伝子増幅の反応効率の向上
実施例２で調製された２種類の色素を含有する遺伝子工学用色素含有剤について、その遺伝子増幅反応効率への影響を以下の実験により確認した。ＰＣＲに使用する酵素としてはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを使用した。
鋳型として２．５ｎｇ、２５０ｐｇ、あるいは２５ｐｇのλ  ＤＮＡを含む以下の組成の反応液（最終容量は５０μｌ  ）を調製した。：各１０ｐｍｏｌのプライマーλＬ３６及びプライマーＭＢＲ２０２、５μｌ  のＥｘ    Ｔａｑ添付１０倍濃度反応緩衝液、各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μｌ  の１０倍濃度遺伝子工学用色素含有剤〔１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１ｍｇ／ｍｌオレンジＧ、０．２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー〕、２．５単位のＥｘ    Ｔａｑ。また、コントロールとして遺伝子工学用色素含有剤を添加しない反応液も調製した。こうして調製した反応液を９４℃、１分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜６８℃、１５分を１サイクルとした３０サイクルの反応を行い、更に７２℃、１０分の処理に付した。
反応終了後、実施例１同様に反応液を１％アガロースゲル（アガロースＬ０３）電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色することにより増幅されたＤＮＡを検出した。コントロールの反応液では２．５ｎｇのλ    ＤＮＡを含む反応液のみで約３５ｋｂの増幅産物が見られるのに対し、本発明の遺伝子工学用色素含有剤を添加されたものでは２５ｐｇのλ    ＤＮＡでも増幅産物が確認された。この結果より、上記の遺伝子工学用色素含有剤において、優れた遺伝子増幅効率向上効果が見られることが明らかとなった。
【００３２】
実施例５  遺伝子増幅用キットの作製
ＰＣＲ法により高い効率で標的遺伝子の増幅を行うことが可能であり、また、反応後の反応液を直接電気泳動に供することが可能な、本発明の遺伝子工学用色素含有剤を含む遺伝子増幅用キットを作製した。
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１ｍｇ／ｍｌオレンジＧ、０．２ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーの組成の試薬を調製し、これをＡ剤（遺伝子工学用色素含有剤）とした。
次にＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）より１０μｌ  をとり、これをＢ剤（酵素剤）とした。また、該製品添付の１０倍濃度反応緩衝液、及びｄＮＴＰ混合液よりそれぞれ１００μｌ  をとり、これらをそれぞれＣ剤、Ｄ剤とした。これらＡ剤〜Ｄ剤を組合せて、５０μｌ  の反応液にして２０反応分の遺伝子増幅用キットを作製した。５０μｌ  のＰＣＲ反応液当りのＡ剤〜Ｄ剤の使用量はそれぞれ５μｌ  、０．５μｌ  、５μｌ  、５μｌ  である。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子増幅反応等の遺伝子工学的実験操作において有用な遺伝子工学用色素剤が提供される。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子増幅を実施することにより、反応後に得られる増幅産物の量の増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成することができる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連の遺伝子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
【００３４】
【配列表】
【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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