(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度に純粋なウィルス不活性化因子VIIIを、フォンウィルブラント因子とともに、血液血漿または寒冷沈降物からアニオン交換クロマトグラフィーによって回収するための方法であって、アニオン交換体材料として、ヒドロキシル基を含むキャリヤーをベースとする分離材料であって、前記キャリヤーの表面は共有結合されたポリマーにより被覆されており、該ポリマーは式Ｉ
0003556947.tif 000004
〔式中、R1はＨまたはCH3を表し、
Ｙは−CO−Ｘまたは−CH2NR2R3を表し、
R'およびR"はそれぞれＨまたはCH3を表し、
Ｘは−NR2R3を表し、
R2およびR3はそれぞれアルキル、フェニルアルキルもしくはアルキルフェニル基（これらはアルキル部分に10個までの炭素原子を有し、アルキル部分はトリアルキルアンモニウムによりモノ−あるいはポリ置換されており、かつ、アルコキシ、シアノ、アミノ、モノ−またはジアルキルアミノ、カルボキシル、スルホン酸、アセトキシまたはアセトアミノ部分によりモノ−あるいはポリ置換されていてもよい）を表し、R2及びR3の１つはＨを表してもよく、R2及びR3は両方の部分が酸性の基もしくは塩基性の基のいずれかを含むようにあるいは２つの部分の１つが中性であるように互いに調節され、
ｎは２〜100を表す〕によって表される同一であってもよく異なっていてもよい反復単位を含む分離材料を使用し、かつ、
フォンウィルブラント因子を含む因子VIII画分を、続いて増加するイオン強度を有するバッファーで洗浄し溶出する（但し、バッファーのイオン強度を、１〜６個の炭素原子を有し親水性置換基を有する少なくとも１つのヒドロカルビル鎖を有する４級アンモニウム塩単独またはこれと共通の塩との組み合わせにより調整する）ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
請求項１の式Ｉ中のＹが−CO−Ｘ〔Ｘ＝−NR2R3であり、
R2及びR3はそれぞれトリアルキルアンモニウムアルキル（アルキル部分に10個までの炭素原子を有する）、またはフェニル（トリアルキルアンモニウムアルキルにより置換されており、かつ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、シアノ、シアノアルキル、アミノアルキル、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホン酸、スルホン酸−アルキル、アセトキシまたはアセトアミノ基（これらはアルキル部分に10個までの炭素原子を有する）によるモノ−あるいはポリ置換されていてもよい）を表し、R2及びR3の１つはＨを表してもよく、R2およびR3は両方の部分が酸性の基もしくは塩基性の基のいずれかを含むようにあるいは２つの部分の１つが中性であるように互いに調節される〕を表す請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１の式Ｉ中のＹが−CH2NR2R3（R2およびR3は請求項１に定義した通りである）を表す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
４級アンモニウム塩が塩化コリンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
使用したバッファー系によって形成された塩勾配が、塩化ナトリウム及び／または請求項１〜４のいずれかに記載の４級アンモニウム塩の濃度の合計で0.1〜1Mであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アニオン交換体クロマトグラフィー（anion exchanger chromatography）により、血漿または寒冷沈降物（cryoprecipitate）から高度に純粋なウィルス不活性化（virus−inactivated）因子VIIIを回収する方法に関連する。
EP−Ａ−0 238 701においては、高い純度の非感染性抗血友病因子の製造方法が記載されており、該方法においてはフィブリノゲン、グロブリン、アルブミン及びその他の妨害成分がエタノール沈澱によって寒冷沈降物から除去される。その材料には因子VIIIが非常に少量しか含まれていないので、その寒冷沈降物からの蓄積が必要である。しかし、この蓄積ステップは、最終的な生成物中のAHF含有物を損なう。今まで因子VIIIの製造に知られている方法は、非常に少量の活性物質しか製造できない。従って、従来のルートを通して製造された因子VIIIの適用によって、患者は多量の抗原物質の負担を受けることになる。この過程は危険なしではすまない。従って、分離操作によって因子VIIIをさらに蓄積するための多くの試みがなされてきている。例えば、因子VIIIに対する動物の抗体を使用したアフィニティクロマトグラフィーによって、より高い比活性を有する生成物を得ることが試みられている。しかし、この技術は、非常に高価であり、経費集約的である。一方、この技術においては各クロマトグラフィー分離においてカラムから一定量の動物タンパク質が常に溶出されることもあり、十分に申し分のないものとはいえない。
ヨーロッパ特許出願88 108 458.6号は、高度に純粋なウィルスを含まない抗血友病因子を製造するための方法を記載しており、該方法においては因子VIIIを含む寒冷沈降物が水酸化アルミニウム及び生物学上適合できる有機溶媒／洗剤で処理され、好ましい態様においてはその後イオン交換体材料を使用したゲル浸透クロマトグラフィーが行われる。ヨーロッパ特許出願88 118 478.2号は、非常に純度の高いウィルスを含まない因子VIIIを製造するのに特に適当なものとして、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレート及びペンタエリスリトールジメタクリレートのコポリマーをベースとするクロマトグラフィー材料を記載している。
WO 90/14886は、タンパク質を分離するための媒体を記載する。そこに開示された材料は、複数のポリアミン部分を有する水不溶性のマトリックスを記載しており、該ポリアミン部分は少なくとも３個の塩基性窒素原子を有し、その窒素原子はその間に位置する少くとも２個の炭素原子の鎖によって分離されており、各ポリアミド基が合計３個の窒素原子のを持つ場合にはそのような炭素原子が少くとも５個存在する。この分離媒体は、少なくとも因子VIIIの部分的な精製に適している。
EP 0 343 275 A1は、非常に純度の高い抗血友病因子（AHFまたは因子VIII）を製造するための方法に関し、該因子は、寒冷沈降物を精製する際に、生物学上適合できる有機溶媒／洗剤での処理によってウィルスを含まないようにされる。該方法は、寒冷沈降物をそこからウィルスを除去する前に解凍し、pH6.5−7.5で１〜3U/mlのヘパリンを含む水で抽出し、その後水酸化アルミニウム懸濁物を混合し、10℃〜18℃に冷却し、pH値を６〜７に調節した後に遠心分離と濾過にかけ、そしてそれ自体公知の方法により処理することを特徴とする。特に、ウィルスの除去の後に、イオン交換体材料上でのゲル浸透クロマトグラフィーにかけられることが有利である。
ヨーロッパ特許出願88 108 458.6号に記載された方法は、因子VIIIの収率の増加を提供することは事実であるが、生物学的に活性な因子VIIIの収率はまだ最適でない。
従って、本発明の目的を定義する技術的課題は、寒冷沈降物または血液血漿のソースから生物学的に活性な因子VIIIを回収することを改善することができ、そしてより経済的な工程を確保できる方法を提供することにある。
この課題は、請求項１の構成に従った方法によって驚異的に解決される。そのサブクレームは本発明の方法の好ましい態様に関連する。
本発明に従って使用される分離材料は、EP−Ａ−O 337 144に記載されるように、キャリヤー粒子から成る。これらは、ヒドロキシル基を有するキャリヤー粒子であって、その上に前記ヒドロキシル基に対してα−位置にある炭素原子を介してポリマー材料がグラフトされたものである。このキャリヤー材料は、その表面の上に１級または２級脂肪族ヒドロキシル官能基を有する、一般に公知の多孔性または非多孔性のクロマトグラフィー支持体のいずれをも含むことができる。これらの中で好ましいものは、アクリレート類及び／またはメタクリレート類をベースとする親水性ポリマー、ポリビニルアルコールをベースとするポリマー、ジオール置換シリカゲル、アガロースをベースとする多糖類、セルロース、セルロース誘導体、デキスランをベースとするポリマーである。もちろんビニル化合物、アクリルアミド、（メタ）アクリル酸エステル類、ヒドロキシル化された形態の（メタ）アクリロニトリルのようなモノマーをベースとするその他のポリマーまたはコポリマーも使用することができる。
ヒドロキシル基に対してα−位置にある炭素原子を介してキャリヤー粒子に結合する、請求項１の式Ｉのポリマー材料は、式II及び／またはIIIによって示されるモノマーから誘導されたものであり、その置換基は以下に定義する。
0003556947.tif 000002
これらのモノマーは、（メタ）アクリル酸（Ｙ＝−COOH）、（メタ）アクリル酸誘導体（Ｙ＝−CO−Ｘ）、アクリルアミン（Ｙ＝−CH2NH2、−CH2NR2R3）、（メタ）アクリロニトリル（Ｙ＝−CN）、アクロレイン（Ｙ＝−CHO）、ビニルカルボキシレート（Ｙ＝−OCOCHR5R6）または式IIIのビニレンカーボネート類を表す。
これらのモノマーのすべては、フリーラジカルにより開始される重合により水溶液中で重合可能な物質であり、中性、酸性または塩基性であってよい可逆的に結合する基を有する。
式IIIのビニレンカーボネート類または式IIのビニルカルボキシレート類CR7R8＝CR1−OCOCHR5R6を使用する場合、結果として生ずる生成物をヒドロキシル基を有する分離材料に変換することが好ましい。このヒドロキシル相への変換は、それ自体公知の穏やかなアルカリまたは酸鹸化よって行うことができる。例えばその反応は、例えばY.Tezuka et al.,in Macromol.Chem.186,685〜694（1985）に記載されたように、室温でK2CO3のメタノール溶液を使用して行うことができる。
式Ｉ（請求項１参照）、II及びIII中のR1は、好ましくは水素を表し、即ちアクリル酸誘導体が好ましい。
式II中のＹは、好ましくは−CO−Ｘ、−OCOCHR5R6または−CH2NH2を表し、次に好ましいのは−CNまたは−CHOである。従って、式Ｉ中のＹは、まず第一に−CO−Ｘ、−OH（好ましくは部分（moiety）−OCOCHR5R6がヒドロキシル相に変換されるので）または
−CH2NH2を表し、次に好ましいものとして−CNまたは−CHOを表す。
R5及びR6は、独立してＨまたは５個までの炭素原子を有するアルキル基を表す。基R5及びR6の少くとも１つがＨであることが好ましい。特に好ましい部分は、アセチルオキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、バレリルオキシ、ヘキサノイルオキシ基である。
式Ｉ中のＸは式II中と同様に、−OR4、−OHまたは−NR2R3を表し、好ましくは−NR2R3を表す。
好ましい化合物は、Ｘが−NR2R3を表し、R2及びR3の１つがＨであるものである。
部分R2及び／またはR3は、好ましくはアルキル、フェニル、フェニルアルキルまたはアルキルフェニル基を表し、そのアルキル及び／またはフェニル基は、アルコキシ、シアノ、アミノ、モノ−またはジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、スルホン酸、アセトキシまたはアセトアミノ基によりモノ−あるいはポリ置換されていてもよく、好ましくはモノ−またはジ置換、特に好ましくはモノ置換されたものである。
部分R2及び／またはR3は、好ましくはアルキル、アルコキシアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、モノ−またはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウムアルキル、カルボキシアルキルまたはスルホン酸アルキルを表し、これらはアルキル基中に多くとも10個の炭素原子、より好ましくは最高６個の炭素原子、特に好ましくは最高４個の炭素原子を有し、これらのアルキル基は直鎖あるいは分岐のものであってよい。従って、R2及び／またはR3は好ましい意味として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−メトキシエチル、２−、３−または４−オキサペンチル、２−、３−、４−または５−オキサヘキシル、２−、３−、４−、５−または６−オキサヘプチル、イソプロピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−オキサ−３−メチルブチル、３−オキサ−４−メチルブチル、２−メチル−３−オキサペンチル、２−メチル−３−オキサヘキシル、そしてさらに同様なヘプチル、オクチル、ノニルあるいはデシルの意味を有する。
さらに、シアノ、カルボキシ−またはスルホン酸基で置換されたアルキル基が同様に好ましい。従って、R2及び／またはR3は好ましい意味として、シアノメチル、シアノエチル、シアノプロピル、シアノブチル、シアノペンチル、シアノヘキシル、２−シアノプロピル、２−シアノブチル、カルボキシルメチル、カルボキシルエチル、カルボキシルプロピル、カルボキシルイソプロピル、カルボキシルブチル、カルボキシルペンチル、カルボキシヘキシル、カルボキシル−２−メチルプロピル、カルボキシル−２−メチルブチル、スルホン酸−メチル、スルホン酸−エチル、スルホン酸−プロピル、スルホン酸−ブチル、スルホン酸−ペンチル、スルホン酸−ヘキシル、スルホン酸−２−メチルプロピル、スルホン酸−２−メチルブチル、スルホン酸−３−メチルブチル、スルホン酸−２−メチルペンチル、スルホン酸−３−メチルヘキシルまたはスルホン酸−２−エチルペンチルの意味を有する。
さらにアルキル基がアミノ、モノ−またはジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウム基でモノ置換されることも好ましい。アルキル基は、同じであってもよいか、または異なってもよく、そして多くとも10個の炭素原子を有し、そして好ましくは多くとも６個の炭素原子を有し、特に好ましくは多くとも４個の炭素原子有することが好ましい。従って、これらは好ましい意味として、ジメチルアミノエチル、ジエチルアミノエチル、メチルアミノエチル、メチルアミノプロピル、ジメチルアミノプロピル、エチルアミノエチル、プロピルアミノエチル、プロピルアミノプロピル、ジプロピルアミノエチル、ジプロピルアミノブチル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルアンモニウムプロピル、トリメチルアンモニウムブチル、トリエチルアンモニウムエチル、トリエチルアンモニウムプロピル、トリエチルアンモニウムエチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルまたはアミノペンチルの意味を有する。これらのアルキル及び置換アルキル基の全てはまたフェニル基の置換基として好ましい。
同様にR2及び／またはR3として好ましいのは、
−（CH2）ｎ−SO2−（CH2）ｎ−Ｓ−（CH2）nOH（ｎ＝２、３、４、５または６、好ましくは２、３または４）の構造を有しているスルホンスルフィドである。
好ましくは、R2及び／またはR3はまた、フェニル基の意味を有し、このフェニル基は好ましくは、シアノ、シアノアルキル、アミノ、アミノアルキル、モノ−もしくはジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、モノ−もしくはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウム−またはトリアルキルアンモニウムアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホン酸またはスルホン酸−アルキルでモノ置換されたものである。これらの置換基の好ましい意味は、上記に好ましいものとして記載したアルキル基及び置換アルキル基に対応する。フェニル基の置換基は、好ましくはｐ−位置に結合する。
ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−アミノフェニルまたはｐ−アセトアミノフェニルも、R2及び／またはR3の好ましい意味である。さらに部分R2及び／またはR3として好ましいのは、アルキルフェニルまたはフェニルアルキル基であり、特定された好ましい意味は前記アルキル、置換−アルキルまたは置換−フェニル基に適用できることも意図するものである。
従って、例えば以下の置換フェニル基、４−シアノフェニル、４−アルキルフェニル、４−（N,N−ジメチルアミノ）−フェニル、４−（N,N−ジアルキルアミノエチル）−フェニル、４−エトキシフェニル、４−エトキシエチルフェニル、４−トリアルキルアンモニウムフェニル、４−カルボキシルフェニル、４−スルホン酸−フェニル、フェニルエチル、４−（Ｎ−エチルアミノ）フェニルプロピル、４−シアノフェニルエチルは特に好ましい。
さらに好ましいのは、式Ｉを有する部分及び／または式IIのモノマーであって、R2及び／またはR3が芳香族または飽和の、５〜10個の炭素原子を含む環式または二環式基で、環中１つ以上のCH−またはCH2−基がＮもしくはNH、ＮもしくはNH及びＳ、またはＮもしくはNH及びＯに置き換えられたものである。
従って、R2及び／またはR3は好ましくはピリジン部分、イミダゾリル基、インドリル基も表し、さらに好ましくはピロール、ピリミジン、ピラジン、キノリンまたはイソキノリン部分を表す。
R2及び／またはR3はまた、例えば、チアゾール、チアジアゾール、モルフォリン、トリアジン、ピペラジン、ベンゾチアゾール、プリン、ピラゾール、トリアゾール、ピロリジンまたはイソオキサゾール部分を表してもよい。
これらの中で芳香族ヘテロ環式基が特に好ましい。
適当な交換体を製造するために、基R2及びR3は、両方の部分が酸性基または塩基性基のいずれかを含むか、部分の１つが中性であるように互いに調節されなければならない。当業者が基を選択するにあたって、即ち、所望のイオン交換の機能と目的に応じて適当な部分をR2及びR3として組み合わせるのに何等困難はないであろう。
２個の部分R2及びR3の１つが中性の部分であることが好ましい。
R4の好ましい意味は、直鎖あるいは分岐していてもよいアルキル基中に多くとも10個の炭素原子、好ましくは多くとも６個の炭素原子、特に好ましくは多くとも４個の炭素原子を有している、アルキル、アルコキシアルキル、シアノアルキル、カルボキシアルキル及びスルホン酸−アルキルを含む。従って、R4は好ましくはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、メトキシメチル、エトキシメチル、２−メトキシエチル、２−、３−または４−オキサペンチル、イソプロピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−オキサ−３−メチルブチル、３−オキサ−４−メチルブチル、２−メチル−３−オキサペンチルまたは２−メチル−３−オキサヘキシルを表す。
さらに、シアノ、カルボキシまたはスルホン酸基で置換されたアルキル基も好ましい。従って、R4は好ましくは、シアノメチル、シアノエチル、シアノプロピル、シアノブチル、シアノペンチル、シアノヘキシル、２−シアノプロピル、２−シアノブチル、カルボキシルメチル、カルボキシルエチル、カルボキシルプロピル、カルボキシルイソプロピル、カルボキシルブチル、カルボキシルペンチル、カルボキシルヘキシル、カルボキシル−２−メチルプロピル、カルボキシル−２−メチルブチル、スルホン酸−メチル、スルホン酸−エチル、スルホン酸−プロピル、スルホン酸−ブチル、スルホン酸−ペンチル、スルホン酸−ヘキシル、スルホン酸−２−メチルプロピル、スルホン酸−２−メチルブチル、スルホン酸−３−メチルブチル、スルホン酸−２−メチルペンチル、スルホン酸−３−メチルヘキシルまたはスルホン酸−２−エチルペンチルを表す。
これらのアルキル及び置換−アルキル基のすべては、フェニル基の置換基としても好ましい。
好ましくはR4はまた、フェニル基の意味を有し、そしてそれは好ましくはシアノ、シアノアルキル、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホン酸またはスルホン酸−アルキルでモノ置換されたものである。これらの置換基の好ましい意味は、上記に好ましいものとして特定したアルキル基及び置換アルキル基に対応する。好ましくは、フェニル基の置換基はｐ−位置において結合する。
式IIのモノマー中のR7及びR8は、好ましくはＨを表し、そして式Ｉ中R'及びR"も好ましくは水素を表す。
同様に好ましいのは、式Ｉ中のＹが−OHを表し、部分R'及びR"の１つも−OHを表す分離材料である。その場合、式IIIのビニレンカーボネートがモノマーとして使用され、得られる生成物はその後ヒドロキシル相に変換されなければならない。
式III中のR7及びR1は、好ましくはＨを表す。式Ｉ中、ｎは反復単位の数を示し、２〜100、好ましくは５〜60を表し、好ましい鎖長は10から30である。
Woods,K.,及びOrme,Th.,が、EP−Ａ−0239 859の中で、ウィルス除去または不活性化の後、クロマトグラフィー分離に先立ち、油、好ましくは大豆油、ひまし油及び／または綿実油で試料を抽出することが有利であると記載している。
本発明の工程は、初めて非常に純粋な抗血友病因子を高い収率で製造することを可能としたものであり、その因子は今まで達成されなかった比活性を有するものである。
市販の寒冷沈降物を、約１〜2cmのサイズの断片に分割し、３〜４時間室温で溶解させる。これらの断片を、10℃〜25℃の間の温度で１〜3U/mlのヘパリン−ナトリウムを含んでいるその約２倍容量の水中で攪拌しながら懸濁させる。懸濁物のpH値を、0.1M酢酸で少なくとも7.0〜8.0、好ましくは7.0〜7.1に調整する。攪拌を室温で、15〜60分、好ましくは30分継続する。そして、寒冷沈降物1kg当たり約108gの２％水酸化アルミニウム懸濁物を加え、混合物を１〜10分、好ましくは５分室温で攪拌する。それから、酸、好ましくは0.1M酢酸で、酸性度を、6.0〜7.0、好ましくは6.5〜6.6のpH値に調節する。試料を18℃〜10℃、好ましくは16℃〜14℃に冷却する。この温度で混合物を、例えばSharples AS−16（Cepa 61）遠心分離器中で、1.0L/分の速度で遠心分離にかける。その後、Pall AB−l UOlOZPフィルターを通してその上清を濾過する。ウィルス不活性化は、好ましくは遠心分離及び濾過の後に行う。Tween/TNBP（トリ−ｎ−ブチルホスフェート）によるウィルス不活性化が特に有用であることが判明した。よい結果は、コール酸ナトリウム/TNBPを使用することによっても得られた。Tween/TNBPまたはコール酸ナトリウム/TNBP混合物は次いで、例えば油による抽出により除去することができる。
試料を、EMD−TMAE−Fractogel（Ｍ）650の商品名によって知られているゲル浸透材料を含むクロマトグラフィーカラムの上へ注入する。前記材料はイオン交換体活性を示すものである。EMD−TMAE−Fractogel（Ｍ）650はすでに上記に特性化した。好ましくは、カラム容量は、寒冷沈降物の1kgにつきカラム材料の0.5kgがカラム中に存在するようにされる。試料をカラム上へ注入し、バッファーで洗浄する。より高いイオン強度のバッファーで試料を溶出した後、得られた生成物をより低い塩含量のバッファーで希釈し、そして必要であるならば、pH値を6.5〜7.5、好ましくは6.9〜7.1に調節する。その後、好ましくはニトロセルロース上で再度濾過し、さらに殺菌濾過を行う。
これらの分離バッファーは特に有利なことが判明したものであり、そのイオン強度は、塩化ナトリウム及び／または１個から６個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を少なくとも１つ有し、親水性の置換基を有する４級アンモニウム塩、例えば塩化コリンを使用して調整する。
従って、本発明の方法においては、上記のFractogel（Ｍ）650を含むカラムは、バッファーＡで洗浄され、平衡化される。バッファーＡは、塩化ナトリウムまたはコリンを50〜200mM、好ましくは120mMの濃度で含み、そして5.8〜7.8、好ましくは6.5〜7.0のpH値を有する。
試料は、200〜600mosm、好ましくは380〜520mosmのモル浸透圧濃度（osmolarity）を有し、5.8〜7.8、好ましくは6.5〜7.0のpH値を有するバッファーからカラムに適用される。カラムの容量は、1mlのゲルにつき因子VIIIが約50I.Uを越えないことが望ましい。カラムは試料注入後にバッファーＡで洗浄される。
次に、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンを含むが、バッファーＡより高いイオン強度を有するバッファーＢによりカラムを洗浄する。上記した種類の４級アンモニウム塩及び／または塩化ナトリウムの濃度は150mM〜250mM、好ましくは180〜200mMであり、そしてpH値は、5.8〜7.8、好ましくは約7.0でなければならない。
生成物のカラムからの溶出は、バッファーＢのイオン強度をさらに上回るイオン強度を有するバッファーＣにより行う。上記した種類の４級アンモニウム塩、特に塩化コリン、及び／または塩化ナトリウムの含有量は、5.8〜7.8、好ましくは約7.0のpH値において200mM〜500mM、好ましくは約400mMでなければならない。
出発材料としては、寒冷沈降物に換えて血漿を使用してもよい。この場合２ステップのクロマトグラフィー処理が望ましい。
本発明の方法により、因子VIIIの回収はより高い収率及びより高い生成物安定性をもって達成される。本発明の方法においては、いわゆるフォン・ビルブラント因子（von−Willebrand factor）は除去されず、因子VIIIフラクション中に残ることが有利である。従って、フォン・ビルブラント因子の欠如で苦しんでいる患者に対しても前記因子VIII調製物を使用することができる。さらに、因子VIIIはまた、因子VIIIの自然の安定化を容易にするフォン・ビルブラント因子の存在により、連続輸液法（continuous−infusion technique）に使用することができる。
前記方法を、以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１
寒冷沈降物からの因子VIIIの蓄積
市販の寒冷沈降物を、約１〜2cmのサイズの断片に分割し、３〜４時間室温で溶解させる。これらの断片を、20℃〜25℃の間の温度で2U/mlのヘパリン−ナトリウムを含んでいるその約２倍容量の水中で攪拌しながら懸濁させる。懸濁物のpH値を、0.1M酢酸で7.0〜7.1に調整する。攪拌を20℃〜25℃で30分継続する。寒冷沈降物1kg当たり108gの２％水酸化アルミニウム懸濁物を加え、混合物を５分室温で攪拌する。その後、0.1M酢酸でpH値を6.5〜6.6に調節する。試料を16℃〜14℃に冷却し、Sharples AS−16（Cepa 61）遠心分離器中で、1.0L/分の速度で遠心分離にかける。上清をPall AB−l UOlOZPフィルターを通して濾過する。
実施例２
クロマトグラフィーカラムの調製
寒冷沈降物の1kgにつき少くとも0.5lのイオン交換体樹脂を含んでいるカラムを抽出した寒冷沈降物の分離のために使用する。そのカラムの高さは直径以下でなければならない。そのカラムを樹脂で充填した後、クロマトグラフィーカラムを最初に５容量の0.1M塩化ナトリウム溶液で洗浄する。この後、以下の組成を有するバッファーＡで洗浄する。
120mMの塩化ナトリウム
10mMのクエン酸ナトリウム・5H2O
120mMのグリシン
1mMの塩化カルシウム・2H2O
pH値6.5〜7.0、1M HClで調整
その後の操作を寒冷沈降物のウィルスを含まない抽出物を使用して行わなければならないので、バッファーのすべてはウィルスを含まないものでなければならない。
実施例３
試料をカラムに注入し、フローの吸光度を280nmの波長で観察する。濾液を集め、因子VIIIの活性について試験し、カラム分離を受ける前の生成物についても行った。その後、吸光度が再び初めの値になるまでカラムをバッファーＡで洗浄する。そして吸光度が再びベースラインに戻るまで、カラムをバッファーＢで洗浄する。
バッファーＢは、以下の組成を有する。
180〜200mMの塩化ナトリウム
10mMのクエン酸ナトリウム・5H2O
120mMのグリシン
1mMの塩化カルシウム・2H2O
pH値6.9〜7.0
生成物の溶出はバッファーＣで行う。バッファーＣの添加の後現れるタンパク質フラクションを集める。
バッファーＣは、以下の組成を有する。
400mMの塩化ナトリウム
1mMのクエン酸ナトリウム・5H2O
120mMのグリシン
1.0mMの塩化カルシウム・2H2O
pH値6.9〜7.0
所望の生成物が溶出された後、カラムを５容量のバッファーＤで洗浄する。バッファーＤは1M塩化ナトリウム溶液を含む。
カラムの再生は、それを0.1N NaOH（３カラム容量）で洗浄し、その後カラムを0.1N塩酸（３カラム容量）で洗浄し、５容量の水中の25％アルコールでカラムを洗浄することにより行った。
実施例４
集めたフラクションを、
20mMのクエン酸ナトリウム
80mMのグリシン
2.5mMの塩化カルシウム・2H2O
pH値6.9〜7.1
を含むバッファーＥで、26または35U/mlの活性を有するようになるまで希釈する。そして必要であるならば、pH値を6.9〜7.1に調整し、その後0.45μm Sealklean Filterを通して濾過する。さらに殺菌濾過を続いて行う。
実施例５
ヒト血漿を因子VIIIソースとして使用する場合は、以下の工程を使用する。
新鮮または低温凍結した（deep−frozen）ヒト血漿を、任意に水浴を使用して20℃の温度にする。血漿を50％容量の水によって希釈し、そして濾過する。血漿濾液をEMD−TMAE−Fractogel（Ｍ）650を含むイオン交換体カラム上に注入する。このカラムは以下の組成を有するバッファーで予め平衡化したものである。
50mMの塩化ナトリウム
10mMのクエン酸ナトリウム
120mMのグリシン
100U/Lのヘパリン
pH値6.5〜6.9
試料を注入した後、イオン交換体樹脂を洗浄バッファーで数回洗浄する。そして、共通の塩の濃度を漸増的に増加させ、最初に100mMの塩化ナトリウムを含んでいるバッファーを洗浄に使用し、その後160mMのナトリウムを含んでいるバッファー、その後200mMの塩化ナトリウムを含んでいるバッファーでの洗浄を行う。因子VIIIを含むフラクションを集め、そして1.0mg/mlのヒト血清アルブミンをそれに加えることによって安定化させる。市販の寒冷沈降物をこの得られたカラムフラクションに代えた以外は、実施例２〜４と同様に得られた生成物をさらに処理した。
実施例６  比較実験
２種の実験のそれぞれにおいて全く同じ血漿から得られた寒冷沈降物の0.3kgを処理したが、１つの工程は本発明によるものであり、もう１つのものはEP 0 343 275 A1によるものである。フラクションを分析し、成分に関する結果を以下の表に示す。
0003556947.tif 000003
本発明の方法による製造（workup）の結果では、33個の調製部分（dispensed portion）のそれぞれは、270 I.U.の因子VIIIを含んでおり、寒冷沈降物の1kg当たり29,700 I.U.の因子VIIIの収率、または血漿1kg当たり297 I.U.の収率に一致している。
EP 0 343 275 A1に従った方法による製造の結果では、23個の調製部分のみがそれぞれ270 I.U.の因子VIIIを含んでおり、寒冷沈降物の1kg当たり20,700 I.U.の因子VIIIの収率、または血漿1kg当たり207 I.U.の収率に対応している。従って、EP 0 343 275 A1の製造方法に対してほぼ51％の収率に関する利点が得られた。
本発明の方法においては、フィブリノゲン及びイムノグロブリンＭ（IgM）のような望ましくないタンパク質が、より効率的に除去される。