(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
仔牛肝臓に由来する、下記の理化学的性質を有することを特徴とする精製されたα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ。
１）作用
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体として、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを生成する。
２）基質特異性
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体として、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを生成する。
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、フコースを全く転移しない。
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、非還元末端Ｇａｌの２位の水酸基にはフコースを全く転移しない。
ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、ＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にはフコースを全く転移しない。
３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０
４）ｐＨ安定性：３７℃、５時間の処理でｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定
５）温度安定性：２０分間の処理で４５℃付近まで安定
【請求項２】
請求項１記載のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼを使用することを特徴とする複合糖質糖鎖へのフコース導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は糖鎖の構造と機能の解析や、糖鎖構造の修飾、糖鎖の合成等の糖鎖工学に有用なα−１，３−フコシルトランスフェラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高等動物由来の糖蛋白質、糖脂質等の複合糖質中の糖鎖部分の構造と機能が研究されているが、このためには、特異性の高い糖加水分解酵素や糖転移酵素が重要な役割を果たす。糖転移酵素は受容体として２糖単位を要求しその構造に対する特異性が厳密であるだけでなく、通常一つのグリコシド結合は対応する一つの転移酵素によって形成されることから、糖転移酵素は糖鎖部分の構造研究に利用されている。更に糖転移酵素は、天然の糖鎖構造を修飾したり、特定の糖鎖構造を簡便に合成したりすることができる。
例えば、糖鎖の非還元末端には、しばしばＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−構造が見いだされる。従来この様な糖鎖構造の解析には、メチル化分析や核磁気共鳴スペクトル法などの分析法が用いられてきたが、試料を大量に用いなければならないという欠点を有していた。しかしながら、この構造のＧｌｃＮＡｃの３位に特異的にフコースを転移するαー１，３−フコシルトランスフェラーゼを使用し、該酵素とＧＤＰ−フコース及び構造未知の糖鎖とを反応させて、糖鎖にフコースが転移されれば、この糖鎖の非還元末端にはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−構造が存在すると容易に決定することができる。また糖蛋白質や糖脂質中の糖鎖構造を人工的に改変する、いわゆる糖鎖のリモデリング技術において、糖鎖にフコースを付加する方法として、該酵素を用いれば、フコースを特定の結合位置に導入することが可能となる。この様に糖鎖構造解析や、糖鎖構造の修飾、糖鎖の合成において、基質特異性の明確な糖転移酵素の開発が望まれている。αー１，３−フコシルトランスフェラーゼは、各種動物の体液あるいは臓器中に活性は検出されているものの、精製された酵素標品としてはヒト血清〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２６７巻、第２７４５〜２７５２頁（１９９２）〕及びヒト神経芽細胞腫由来細胞〔ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、第３５２６〜３５３１頁（１９９１）〕由来の酵素以外にはほとんど知られておらず、本酵素標品を安定的に供給することは事実上困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、基質特異性が明確でかつ糖鎖構造解析、糖鎖リモデリングを行うための糖鎖工学用試薬として安定供給可能なαー１，３−フコシルトランスフェラーゼを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、仔牛肝臓に由来する、下記の理化学的性質を有することを特徴とするαー１，３−フコシルトランスフェラーゼに関する。
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体として、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを生成する。
２）基質特異性
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体として、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを生成する。
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、フコースを全く転移しない。
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、非還元末端Ｇａｌの２位の水酸基にはフコースを全く転移しない。
ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを受容体とする場合、ＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にはフコースを全く転移しない。
３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０
４）ｐＨ安定性：３７℃、５時間の処理でｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定
５）温度安定性：２０分間の処理で４５℃付近まで安定
また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼを使用することを特徴とする複合糖質糖鎖へのフコース導入方法に関する。
【０００５】
本発明者らは、前記現状にかんがみ、フコシルトランスフェラーゼを探索中のところ、仔牛肝臓抽出液より本酵素を精製し、酵素学的性質を解明し本発明に到達した。
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に使用される酵素源としては、フコシルトランスフェラーゼ活性を有する動物の臓器であればいかなるものでもよい。また動物体液より採取してもよい。フコシルトランスフェラーゼ活性を有する臓器の具体例としては、例えば、牛肝臓、豚肝臓、馬肝臓、ヒツジ肝臓、ウサギ肝臓等が挙げられる。また、これらの動物体液、例えば血清より酵素を採取しても良い。本発明のフコシルトランスフェラーゼは、例えば牛肝臓、例えば仔牛肝臓から粗抽出物を調製し、該抽出物から酵素を分離することによって得ることができる。
【０００７】
仔牛肝臓中のフコシルトランスフェラーゼは膜結合型酵素であるので、肝臓破砕物より適当な界面活性剤を用いて粗酵素抽出液を得ることができる。次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥などにより精製を行い、夾雑する他のトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ活性のない精製酵素標品を得ることができる。
【０００８】
例えば、仔牛肝臓をリン酸緩衝液中でワーリングブレンダーを用いて破砕した後、この破砕物よりトリトン（Triton) ＣＦ−５４を含む同緩衝液で酵素を抽出し、遠心分離によって上清を集めて粗酵素抽出液を得ることができる。更にこの粗酵素抽出液をＤＥＡＥ−セルロース、Ｓ−セファロース、バイオ  ゲル（Bio gel)Ｐ−６ＤＧ、ＧＤＰ−アガロース等のカラムクロマトグラフィーに供し、活性画分を集めて本発明のフコシルトランスフェラーゼを精製することができる。
【０００９】
本発明により得られるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次のとおりである。
１）作用
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒを受容体として、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒを生成する酵素。
【００１０】
２）酵素活性の測定
フコシルトランスフェラーゼ活性の測定は次のようにして行った。基質として下記式（化１）：
【００１１】
【化１】
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ
【００１２】
〔式中ＰＡは２−ピリジルアミノ基を意味する〕で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖を用いた。本基質及びこれにフコースが転移した酵素反応生成物は還元末端をピリジルアミノ基で標識してあるために、蛍光検出器を備えた逆相系あるいは順相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで直接定性定量分析が可能である。上記の基質３００ｐｍｏｌ及びＧＤＰフコース５００ｐｍｏｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2 、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む５０ｍＭモプス（ＭＯＰＳ）緩衝液、ｐＨ７．０、６μｌに酵素液４μｌを加えて混合し、３７℃で１時間反応させた。アセトニトリル１０μｌを加えて反応を停止させた後、反応液を高速液体クロマトグラフィーに供した。この条件下で、１分間に１μｍｏｌのピリジルアミノ化ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII を生じる酵素量を１単位とする。
【００１３】
３）基質特異性
本発明により得られるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼは、２）の方法において受容体基質として、
〔１〕人乳由来のラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ）を用いる場合、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しルイスＸ  ペンタサッカライド（ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII 、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を生成する。
〔２〕ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ）を用いる場合、フコースを全く転移しない。
〔３〕ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを用いる場合、ＧＤＰフコースから非還元末端Ｇａｌの２位の水酸基にはフコースを転移しない。
〔４〕α−２，３−シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を用いる場合、ＧＤＰフコースからＧｌｃＮＡｃの３位の水酸基にフコースを転移しない。
【００１４】
４）至適ｐＨ及びｐＨ安定性
本酵素の至適ｐＨは図１の曲線で表されるごとくｐＨ６．０〜７．５付近に高い活性を有している。同図において、ｐＨ４〜５．５は１００ｍＭ  酢酸緩衝液（黒四角）を、ｐＨ６は１００ｍＭ  メス（ＭＥＳ）緩衝液（白三角）を、ｐＨ７は１００ｍＭ  モプス緩衝液（白丸）を、ｐＨ７〜８は１００ｍＭ  ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（白四角）を、ｐＨ９〜１２は１００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム緩衝液（黒丸）を用いて測定を行った。
【００１５】
本酵素のｐＨ安定性は、図２に示すようにｐＨ５．５〜１１．５であり、特にｐＨ６〜１１の間において安定である。測定に用いた緩衝液は図１と同じであり、本酵素を各緩衝液中でそれぞれのｐＨにおいて、３７℃、５時間処理した後の残存活性の測定を行った。なお、図１は本発明により得られるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼのｐＨ（横軸）と相対活性（％、縦軸）の関係を表すグラフ、図２はｐＨ（横軸）と残存活性（％、縦軸）との関係を示すグラフである。
【００１６】
５）至適温度及び熱安定性
本酵素の作用至適温度は３７℃付近であり、２５〜４０℃の範囲で適用可能である。本酵素の熱安定性は３７℃で少なくとも一晩安定であり、４５℃で少なくとも２０分間安定である。凍結品は−２０℃で少なくとも数カ月間安定である。
【００１７】
本発明のフコシルトランスフェラーゼを利用して以下の事項を解明することができる。
（１）複合糖質の糖鎖に新たにフコースを導入し、糖鎖構造を人工的に改変することができる。そのことによって、細胞装置や複合糖質中の糖鎖、中でもルイスＸやシアリルルイスＸといったフコース含有糖鎖の役割を解明することができる。
（２）本酵素を用いれば、複合糖質中のＮ−アセチルラクトサミン構造の有無を直接推定することができ、タイプ１糖鎖とタイプ２糖鎖の識別が直接できる。
（３）糖鎖還元末端をあらかじめ還元ピリジルアミノ化法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry)、第９５巻、第１９７〜２０３頁（１９８４）〕にて蛍光標識した糖鎖を用いて、上記の酵素処理と２次元糖鎖マップ法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry)、第１７１巻、第７３〜９０頁（１９８８）〕を組合せることによって、Ｎ−アセチルラクトサミンを含めた糖鎖構造全体を、従来の数百倍の感度で推定することができる。
（４）還元末端を〔 3Ｈ〕標識した糖鎖、あるいは、末標識糖鎖を用いて、（２）の酵素消化を行い、酵素消化物をゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどで分析することによって、糖鎖構造を推定することができる。
【００１８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
（１）仔牛肝臓の破砕と粗抽出液の調製
仔牛肝臓、１２５ｇを２５０ｍＭ  スクロース、２５ｍＭ  塩化カリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中でワーリングブレンダーを用いて破砕した後、終濃度１．４％のトリトン  ＣＦ−５４を含む同緩衝液で酵素の抽出を行った。抽出操作後、遠心分離によって上清を集め、粗酵素抽出液とした。
【００２０】
（２）酵素の調製
上記に得た粗酵素抽出液４００ｍｌのうち１２ｍｌを以下の精製に用いた。０．０５％  トリトン  ＣＦ−５４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに供した。カラムをその３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、溶出してきた非吸着画分を集めた。活性画分を０．１％  トリトン  ＣＦ−５４及びプロテアーゼ阻害剤を含む１０ｍＭ  モプス緩衝液、ｐＨ７．０にて希釈後、同緩衝液で平衡化したＳ−セファロースのカラムに供した。溶出は０〜１ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配によって行った。０．３〜０．８Ｍの活性画分を集めて限外ろ過膜で濃縮後、０．０１％  トリトン  ＣＦ−５４、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び１０％  グリセロールを含む１０ｍＭ  モプス緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したバイオ  ゲルＰ−６ＤＧに供して脱塩した。溶出液を同緩衝液で平衡化したＧＤＰ−アガロースのカラムに供した。０．２ｍＭ  ＧＤＰ及び０．４Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、活性画分を集めることにより、本発明のα−１，３−フコシルトランスフェラーゼを得ることができる。この様にして得られたフコシルトランスフェラーゼ画分には、他のトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ等の活性はなく、精製標品は糖鎖研究用試薬として十分使用可能であった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明により、糖鎖の構造と機能の解明等、糖鎖工学に有用な新規フコシルトランスフェラーゼが提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により得られるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明により得られるα−１，３−フコシルトランスフェラーゼのｐＨ安定性を示した図である。
【図１】
0003543342.tif 000002
【図２】
0003543342.tif 000003