(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ（ＥＤＤＳアーゼ）活性を有する微生物またはその処理物を５〜１０００ｍＭの濃度の塩類の存在下にｐＨ８．０〜１０．５のアルカリ水溶液で処理することを特徴とする該微生物またはその処理物のフマラーゼ活性の除去方法。
【請求項２】
前記塩類が、ほう酸、りん酸、塩酸、硫酸、酢酸、蓚酸、フマル酸、マレイン酸およびエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジコハク酸のナトリウム、カリウム、アンモニアおよびアミン類の塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物またはその処理物が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属からなる細菌類；エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌宿主にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物またはその処理物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＴＮＯ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４７）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１７）およびＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６）；宿主としての大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株およびＲｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記処理物が、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体から抽出された粗酵素または精製酵素、固定化した菌体または酵素、安定化剤で処理された菌体または酵素からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記塩類の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ水溶液のｐＨが、８．５〜１０であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ水溶液のｐＨが、９〜９．５であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記処理の温度が、氷結温度〜５５℃の範囲であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記処理の時間が、約１分〜約１ヶ月の期間であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によりフラマーゼ活性を除去することによって得られる、ＥＤＤＳアーゼ活性を有しておりかつフマラーゼ活性が低減している微生物またはその処理物であって、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属からなる細菌類；エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌宿主にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択される、前記微生物またはその処理物。
【請求項１２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＴＮＯ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４７）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１７）およびＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６）；宿主としての大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株およびＲｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択される、請求項１１に記載の微生物またはその処理物。
【請求項１３】
ＥＤＤＳアーゼ活性とフマラーゼ活性の残存活性比が０．０３〜０．２７である、請求項１１または１２記載の微生物またはその処理物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の微生物またはその処理物からなる触媒の存在下で、フマル酸とエチレンジアミンとを反応させること、および、その結果得られた反応混合物からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジコハク酸を単離することを含む、Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物のフマラーゼ活性除去方法、該方法によって得ることができる、フマラーゼ活性が低減された微生物またはその処理物、ならびに、フマラーゼ活性が低減された該微生物またはその処理物の存在下でフマル酸とアミノ基を有する化合物とから光学活性アミノポリカルボン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼはフマル酸とアミノ基を有する化合物から光学活性アミノポリカルボン酸を製造する際に触媒として使用され、得られる光学活性アミノポリカルボン酸は重金属等の金属イオンを補足するという特異な性質を有し、しかも生分解を受け易いため、キレート剤、洗剤用ビルダーや写真用漂白剤などの用途が見込まれる。
【０００３】
本発明者らは、先に、フマル酸とエチレンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸に変換する微生物の新規なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作用を利用したフマル酸と各種アミンからの効率的な光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案している〔特開平９−１４０３９０号公報、米国特許第５７０７８３６号明細書参照〕。しかしながら、これらのＥＤＤＳアーゼ保有微生物は、生物界に幅広く存在するフマラーゼを合わせ持ち、共通の基質であるフマル酸の相当な部分をリンゴ酸へと水和するため、フマラーゼ活性を除去しない限り、満足な収率で目的の光学活性アミノポリカルボン酸を得ることは困難である。
【０００４】
フマラーゼ活性を除去する方法としては、アスパルターゼ活性を有する微生物について該微生物を酸処理する方法〔特公平３−５５１０３号公報参照〕、同じくアスパルターゼ活性を有するブレビバクテリウム属に属する微生物について該微生物をＬ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存在下にアルカリ条件下で処理する方法〔特公平４−８０６７８号公報参照〕が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前者の方法は、本発明の微生物に対しては、ＥＤＤＳアーゼの活性損失がフマラーゼの活性損失よりも大きいため採用できないことが実験的に確認された。また、後者の方法は、処理菌体をＬ−アスパラギン酸を多量に含む処理液ごと反応に供し得るＬ−アスパラギン酸の製造反応には有利であるが、それ以外の反応では操作性および経済性の面で難があった。
【０００６】
本発明のＥＤＤＳアーゼは、上記アスパルターゼとは異なる新規な酵素であり、それ故、如何にしてＥＤＤＳアーゼ活性を失うことなくフマラーゼ活性のみを選択的に除去し得るかは全く不明であった。
したがって、本発明は、ＥＤＤＳアーゼ活性およびフマラーゼ活性を有する微生物からＥＤＤＳアーゼ活性を失うことなくフマラーゼ活性のみを選択的に除去することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を改善すべく鋭意研究を行った結果、ＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物またはその処理物を塩類の存在下に、アルカリ水溶液中で処理することによりＥＤＤＳアーゼ活性を損なうことなくフマラーゼ活性を選択的に除去する方法を見い出し本発明に到達した。  すなわち、本発明は、第１の態様において、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物またはその処理物を５〜１０００ｍＭの濃度の塩類の存在下にｐＨ８．０〜１０．５のアルカリ水溶液で処理することを特徴とする該微生物またはその処理物のフマラーゼ活性の除去方法を提供する。
ここで、該塩類は、ほう酸、りん酸、塩酸、硫酸、酢酸、蓚酸、フマル酸、マレイン酸およびエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸のナトリウム、カリウム、アンモニアおよびアミン類の塩からなる群から選択され得る。
【０００８】
該微生物またはその処理物は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属からなる細菌類；エシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌宿主にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択され、具体的には、それらは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＴＮＯ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４７）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｓｐ．  ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１７）およびＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６）；宿主としての大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株およびＲｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）にＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体；ならびに該細菌類または形質転換体の処理物からなる群から選択される。
【０００９】
本明細書中「処理物」とは、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体から抽出された粗酵素または精製酵素、固定化した菌体または酵素、安定化剤等の薬剤で処理された菌体または酵素を意味する。  本発明はまた、第２の態様において、フマラーゼ活性が低減されたことを特徴とする、ＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物またはその処理物を提供する。このような微生物またはその処理物には、上記の本発明方法によって得ることができる微生物またはその処理物も包含される。
【００１０】
本明細書中、フマラーゼ活性について「低減」とは、元の微生物または処理物と比べてそのフマラーゼ活性が減少しているか、あるいはフマラーゼ活性を実質的に含まないことを意味する。  本発明はさらに、第３の態様において、フマル酸とアミノ基を有する化合物とから光学活性アミノポリカルボン酸の製造における、フマラーゼ活性が低減された上記微生物またはその処理物の使用を提供する。
具体的に、本発明は、下記一般式［１］
【００１１】
【化１】
0003565727.tif 000002
【００１２】
で示される光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法であって、上記のフマラーゼ活性が低減された微生物またはその処理物からなる触媒の存在下で、フマル酸と、一般式［２］
【００１３】
【化２】
0003565727.tif 000003
【００１４】
で示されるアミノ基を有する化合物とを反応させること、および、その結果得られた反応混合物から該光学活性アミノポリカルボン酸を単離することからなり、上記式［１］および式［２］において、Ｒ１およびＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアリール基であり、但し、Ｒ１とＲ２は共に水素原子であることはなく、該置換基はアミノ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン、ヒドロキシル基、カルボキシル基およびエーテル基からなる群から選択され；Ｒ３およびＲ４はＲ１とＲ２と同一であるか、または、Ｒ１とＲ２のアミノ基の少なくとも１個がその窒素原子を介してコハク酸のエチレン基の炭素原子と結合した構造を有する基を表わす、前記方法を提供する。
【００１５】
ここで、アミノ基を有する化合物は、例えば、エチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、２−メチル−１，３−プロパンジアミン、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、１，２−シクロヘキサンジアミン、１，３−シクロヘキサンジアミン、１，４−シクロヘキサンジアミン等の炭素数２〜６のアルカン−またはシクロアルカン−ジアミン類；１，２−フェニレンジアミン、１，３−フェニレンジアミン、１，４−フェニレンジアミン等のフェニレンジアミン類；ならびにグリシン、３−アミノプロピオン酸、２−アミノプロピオン酸、イミノジ酢酸、３，３’−イミノジプロピオン酸、グルタミン酸等のモノアミン類からなる群から選択される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、前記の通り、光学活性アミノポリカルボン酸の製造における副反応を抑制することを目的として、該処理によりＥＤＤＳアーゼ活性を保持しながら、フマラーゼ活性を選択的に除去した微生物触媒を得ることを目的とする。したがって、フマル酸を原料とし、かつ該触媒を光学活性アミノポリカルボン酸製造に適用する限り、本発明の効果を得ることができる。
これら適用場面としては、具体的に、下記一般式〔２〕で示されるアミノ基を有する化合物とフマル酸の混合物から下記一般式〔１〕で示される光学活性アミノポリカルボン酸を製造する場合を挙げることができる：
【００１７】
【化３】
0003565727.tif 000004
【００１８】
【化４】
0003565727.tif 000005
【００１９】
式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子（但し、Ｒ１とＲ２は共に水素原子であることはない）、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアリール基、Ｒ３およびＲ４はＲ１とＲ２と同一またはＲ１とＲ２のアミノ基の少なくとも１個がその窒素原子を介してコハク酸のエチレン基の炭素原子と結合した構造を有する基等を表し、置換基はアミノ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エーテル基等である。
【００２０】
一般式〔２〕で示されるアミノ基を有する化合物としては、例えば、エチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、２−メチル−１，３−プロパンジアミン、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、１，２−シクロヘキサンジアミン、１，３−シクロヘキサンジアミン、１，４−シクロヘキサンジアミン等の炭素数２〜６のアルカン−またはシクロアルカン−ジアミン類、１，２−フェニレンジアミン、１，３−フェニレンジアミン、１，４−フェニレンジアミン等のフェニレンジアミン類、ならびにグリシン、３−アミノプロピオン酸、２−アミノプロピオン酸、イミノジ酢酸、３，３’−イミノジプロピオン酸、グルタミン酸等のモノアミン類などを挙げることができ、エチレンジアミンが代表的である。
【００２１】
また、本発明で得られる一般式〔１〕で示される光学活性アミノポリカルボン酸の代表例としては、いずれも（Ｓ，Ｓ）−体のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，３−プロパンジアミン−Ｎ、Ｎ’−ジコハク酸、２−メチル−１，３−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，５−ペンタンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，６−ヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，３−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，４−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、１，２−フェニレンジアミンジコハク酸、１，３−フェニレンジアミンジコハク酸および１，４−フェニレンジアミンジコハク酸等のアルカンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、シクロアルカンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸またはフェニレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸；ならびに、いずれも（Ｓ）−体のアスパラギン酸−Ｎ−モノ酢酸、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸、アスパラギン酸−Ｎ−２−プロピオン酸、アスパラギン酸−Ｎ、Ｎ−ジ酢酸、アスパラギン酸−Ｎ、Ｎ−ジプロピオン酸、アスパラギン酸−Ｎ−２−グルタール酸などを挙げることができ、（Ｓ，Ｓ）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸が代表的である。
【００２２】
本発明のフマラーゼ活性除去処理の対象となる微生物は後記のとおりである。フマラーゼ活性除去処理は、培養により得られた菌体またはその処理物（菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安定化処理等）した菌体または酵素）に対して行うことができる。その他、培養終了後、培養液中の菌体に対して直接行うこともできる。また、フマラーゼ活性除去処理後に、別の処理を加えても差し支えない。
【００２３】
フマラーゼ活性の除去処理は、上記微生物菌体等を塩類の存在下にアルカリ水溶液に浸漬することにより行うことができる。また、該アルカリ水溶液としてはメタノール、エタノール等の水と自由に混和し得る有機溶媒や水と混和し得る範囲でその他の有機溶媒を併用したものでもよい。
塩類としては、本発明のアルカリ水溶液に溶解し得るものであれば、無機、有機、特に制限されない。例えば、ほう酸、りん酸、塩酸、硫酸、酢酸、蓚酸、前記フマル酸やマレイン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸等のナトリウム、カリウム、アンモニア、アミン類等の塩であり、アミン類としてはエチレンジアミン、プロパンジアミン、ブタンジアミン、ヘキサンジアミン等の炭素数２〜６のアルカンジアミン、トリエタノールアミン等のモノアミンが好適である。
【００２４】
塩類の濃度は５〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲である。５ｍＭ未満では効果が充分でなく、１０００ｍＭを越えると効果が頭打ちとなる。
アルカリ水溶液のｐＨは８〜１０．５、好ましくは８．５〜１０、より好ましくは９〜９．５の範囲であり、上記の酸および塩基の割合を変えることにより所定のｐＨに調整することができる。中でも、ほう酸、りん酸もしくはＧｏｏｄの緩衝液等の使用は塩濃度およびｐＨの調整の両面から好適である。
【００２５】
処理温度は通常氷結温度〜５５℃の範囲である。処理時間は諸条件により異なるが、約１分〜約１ヶ月間であり、処理温度をより高温に設定することにより処理時間を短縮することができる。また、処理時間は延長されるものの、上記条件下、冷蔵保存中にフマラーゼ活性を除去することも可能である。
これらの処理操作は、回分、連続のいずれの方法でも行うことができる。
【００２６】
本発明の微生物としてはＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象となる。例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細菌、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを例として挙げることができる。
【００２７】
具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−１３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１８）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＴＮＯ−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４７）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４１９）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−３０株（ＦＥＲＭＢＰ−５４１７）および同ＴＮ−３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８８６）、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ５３３２３）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）を用いた形質転換体を挙げることができる。
【００２８】
上記微生物のうち、ＴＮ−１３１株、ＴＮＯ−５株、ＴＮ−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。これらの菌株の菌学的性質は以下に示す通りである。
【００２９】
0003565727.tif 000006
0003565727.tif 000007
【００３０】
0003565727.tif 000008
【００３１】
0003565727.tif 000009
0003565727.tif 000010
【００３２】
0003565727.tif 000011
0003565727.tif 000012
【００３３】
上記菌学的性質を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１（１９８４）および  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ９版（１９９４）により分類するとＴＮ−１３１株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１（１９８４）により分類するとＴＮＯ−５株はパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ９版（１９９４）および  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４，９９（１９９０）により分類するとＴＮ−２８株はスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に、また、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ９版（１９９４）ならびにＩｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４４，４９９（１９９４）により分類するとＴＮ−３０株およびＴＮ−３株はブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細菌と同定される。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（ｄｉｍｉｎｕｔａ）種であることが確認されている。
【００３４】
大腸菌  ＪＭ１０９株（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ５３３２３）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。これらの菌株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドｐＥＤＳ０２０およびｐＳＥ００１を導入した形質転換体が、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１６１；１９９７年１１月１０日に国際寄託に移管）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５４８；１９９８年１０月１５日に国際寄託に移管）として、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。以下に、これら形質転換体の作製方法を示す。
【００３５】
（１）ＴＮ−３株染色体ＤＮＡの調製
ＴＮ−３株を１００ｍｌのＥＤＤＳ培地（０．２％エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、０．２％グルコース、０．１％バクトイーストエキス、０．０５％ポリペプトン、０．２８％硫酸ナトリウム、０．１％硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ、２．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５％（ｖ／ｖ）金属塩混合物溶液（１００ｍｌ中の組成；塩化マグネシウム・６Ｈ２Ｏ８ｇ，塩化カルシウム０．８ｇ，硫酸マンガン・４Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ，塩化第二鉄・６Ｈ２Ｏ０．１２ｇ，硫酸亜鉛０．０６ｇ））中、３０℃にて４日間振とう培養した後集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁しリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１時間振とうした後凍結する。次に１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１ＭＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０））を穏やかに振とうしながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社製）（終濃度１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振とうする。次に等量のＴＥ飽和フェノールを加え撹拌後（ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心し、上層を取り２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取り除く。次にＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の熱処理済み）を１０ｍｇ／ｍｌになるように加え３７℃で３０分間振とうする。さらにプロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振とうした後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離する。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロフォルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返す（以後この操作をフェノール処理と呼ぶ）。その後上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得る。
【００３６】
（２）精製酵素の調製
ＴＮ−３株を２リットルのＥＤＤＳ培地中、３０℃にて４日間振とう培養した後集菌し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０、１ｍＭジチオスレイトール含有）１００ｍｌに懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕し、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。得られた上澄に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃にて３０分間静置後遠心分離する。得られた上澄に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し４℃にて３０分間静置後遠心分離する。得られた沈殿を１０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０，１ｍＭジチオスレイトール含有）に溶解し、部分精製酵素液とする。
【００３７】
この部分精製酵素液をイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製する。すなわち、１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（ファルマシア社製）を充填したカラム（φ１０ｍｍ  ×  ２０ｃｍ）に、部分精製酵素液を流し吸着させた。４０ｍｌの同緩衝液でカラムを洗浄した後、０〜０．６Ｍ  ＫＣｌの直線勾配で本酵素を溶出させ、２ｍｌづつ分画する。ＥＤＤＳアーゼ活性の認められた画分を集めて精製酵素液とする。この画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ分子量約６万のほぼ均一な一本のバンドが検出される。
【００３８】
（３）精製酵素のＮ末端アミノ酸配列および内部ペプチドのアミノ酸配列の分析（２）の工程で得られた精製酵素を直接、あるいは  ｔｒｙｐｓｉｎで消化後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でポリペプチドを分画し、ＰＶＤＦメンブレン（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰｓｑ（ミリポア社製））にエレクトロブロッティングする。ブロッティングしたメンブレンをクマシーブリリアントブルーで染色し、染色されたバンドを切り取りアミノ酸配列の分析に供する。アミノ酸配列の分析は島津製作所社製  ＰＳＱ−１型アミノ酸分析装置により行う。結果を以下に示す。
【００３９】
ａ）無処理酵素のＮ末端アミノ酸配列：（分子量約６万）；
Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ
（配列番号６；ここでＸａａはＭｅｔまたは欠失を示す。）
ｂ）ｔｒｙｐｓｉｎ  部分分解物：（分子量約５万）；
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
（配列番号７；ここでＸａａは未同定アミノ酸残基を示す。）
【００４０】
ｃ）ｔｒｙｐｓｉｎ  部分分解物：（分子量約１万）；
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｌｅｕ
（配列番号８；ここでＸａａは未同定アミノ酸残基を示す。）
〔括弧内の分子量は分画したペプチドの分子量を示す。〕
【００４１】
（４）プローブの調製
（３）の工程で得られたアミノ酸配列情報を基に配列番号４および５に示されるような合成ＤＮＡを作製してプライマー（プライマー＃１、＃２）とし、（１）の工程で得られたＴＮ−３株の染色体ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う。
すなわち、ＴＮ−３株染色体ＤＮＡ１μｌ、１０倍濃度の反応緩衝液１０μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ４μｌ、プライマー＃１、＃２各々１μｌ（１００ｐｍｏｌ濃度相当）、ＥｘＴａｑ  （宝酒造社製）１μｌを加えて１００μｌとした。この溶液について、９５℃、３０秒間（変性ステップ）、５５℃、３０秒間（アニーリングステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを３０サイクル行う。反応終了後、クロロフォルム抽出を３回行い、エタノール沈殿により増幅されたＤＮＡを回収する。これを１．０％アガロース電気泳動で分離後、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ遺伝子をコードすると考えられる約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得る。こうして得られたＤＮＡ断片を  ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  （ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて標識し、プローブとする。
【００４２】
（５）ＤＮＡライブラリーの作製
ＴＮ−３株染色体ＤＮＡ１０μｌに１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液５μｌ、滅菌水３３μｌ、制限酵素  ＫｐｎＩ  ２μｌを加え、３７℃にて１６時間反応させた後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収する。アガロース電気泳動を行い、６．５Ｋｂから５．５ＫｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し  ＤＮＡ  ＰＲＥＰ（ダイヤトロン社製）を用いて回収する。このＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位に挿入し、組換え体ＤＮＡライブラリーを作製する。
【００４３】
ライゲーションに用いたｐＵＣ１８断片は次のように作製する。ｐＵＣ１８保存液２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液５μｌ、滅菌水４０μｌ、制限酵素  ＫｐｎＩ  ３μｌを加え、３７℃で２時間反応後、フェノール処理、エタノール沈殿させた後乾燥して５０μｌの滅菌水に溶解させる。さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後フェノール処理、エタノール沈殿を行い乾燥して滅菌水に溶解させる。
【００４４】
（６）大腸菌形質転換体の作製および組換え体ＤＮＡの選別
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物１００ｍｌをＳＯＢ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）４０ｍｌに加え、１８℃で２０時間培養する。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置後、再度遠心する。上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置する。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工程（５）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加して３７℃にて１時間振とう培養する。これを２００μｌずつアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、３７℃で培養する。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブリダイゼーション法にてＥＤＤＳアーゼ遺伝子を持つ形質転換体を選別する。すなわち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメンブレン（バイオダインＡ：日本ポール社製）上に移し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程（４）で作製したプローブ（約３００ｂｐ）で処理し、ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ベーリンガー・マンハイム社製）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを持つコロニーを選択する。
【００４５】
（７）組換えプラスミドの調製
工程（６）で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培地にて３７℃で一晩培養し、集菌後滅菌水により洗浄し、溶液Ｉ（２ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を５ｍｌ、リゾチームを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置する。溶液ＩＩ（１Ｎ  ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で５分間放置し、溶液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８））を７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置する。これを遠心し、その上澄に５０ｍｌのエタノールを加え、さらに遠心し上澄を取り除き５ｍｌの溶液ＩＶ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌ加え室温で２０分間放置する。これに１２ｍｌのエタノールを加え、遠心によりプラスミドを回収、７０％エタノールでリンスし、乾燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶解する。こうして得られた組換え体プラスミドをｐＥＤＳ００１と名付ける。
【００４６】
（８）制限酵素地図の作製およびＥＤＤＳアーゼ遺伝子領域の特定
工程（７）で得られたプラスミドｐＥＤＳ００１を数種の制限酵素を用いて切断し制限酵素地図を作製する（図１）。さらに、通常行われるようにサブクローニングを行う。すなわち、ｐＥＤＳ００１を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩとで切断し、ｐＵＣ１８を同制限酵素で切断したものとライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することにより、約３．９Ｋｂの断片が挿入されたプラスミド（ｐＥＤＳ００２）（図２）と約２．６Ｋｂの断片が挿入されたプラスミド（ｐＥＤＳ００３）（図３）を得る。各々のプラスミドについて制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩなどで切断後、アガロース電気泳動を行い、サザンハイブリダイゼーション法によりプローブがハイブリダイズする断片を特定する。
【００４７】
（９）塩基配列の決定
工程（８）で特定された領域周辺の塩基配列をファルマシア社蛍光シーケンサＡＬＦＩＩを用いて決定する。その結果、配列番号１に示される塩基配列が得られ、配列番号２に示されるアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレームが見いだされる。アミノ酸配列データーベース  ＮＢＲＦ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）との比較の結果本遺伝子は、ｄｅｌｔａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎあるいは  ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｙａｓｅと２０〜３０％のホモロジーを有しており、両酵素にはともにフマル酸とアミン（アミノ酸）の縮合あるいは分解反応を触媒する活性が知られている。また、このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号３に示す。
【００４８】
（１０）プラスミド  ｐＥＤＳ０２０と大腸菌形質転換体の作製、および形質転換体のＥＤＤＳアーゼ活性
工程（８）で得られたＥＤＤＳアーゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドｐＥＤＳ００３２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＫｐｎＩ１μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させる。エタノール沈殿によりプラスミドを回収し、乾燥後１７μｌの滅菌水、２μｌの１０倍濃度制限酵素緩衝液、制限酵素ＢａｍＨＩ１μｌを添加して３７℃にて２時間反応させる。この反応液からアガロース電気泳動により約２．６Ｋｂの断片を調製し、大腸菌ベクターｐＵＣ１１９に挿入する。作製したライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して目的のプラスミドを得る。ここで作製したプラスミドをｐＥＤＳ０２０（図４）と、また形質転換体をＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０と名付ける。
【００４９】
ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０をアンピシリン５０ｍｇ／ｌ含有するＬＢ培地１ｍｌに接種して３７℃にて８時間振とう培養後、全量を４０ｍｌのＬＢ培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン、１ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅを含有）に接種し３７℃、３０時間培養した。得られた培養物を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、２ｍｌの同緩衝液に懸濁する。得られた菌体懸濁液の一部を３４２ｍＭフマル酸と１７１ｍＭエチレンジアミンを含むｐＨ８．０の水溶液５０ｍｌに懸濁し２４時間反応させる。反応液から菌体を遠心分離により除いた後、ＨＰＬＣを用いて生成したエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を分析する（ＷＡＫＯＳＩＬ  ５Ｃ８（和光純薬社製）〔溶出液；１０ｍＭ水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕）。その結果、５０ｍＭのＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸が生成していた。
【００５０】
（１１）プラスミドｐＳＥ００１の作製
工程（１０）で作製したプラスミドｐＥＤＳ０２０、２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＸｈｏＩ  １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させる。エタノール沈殿によりプラスミドを回収し、乾燥後１５μｌの滅菌水、２μｌの１０倍濃度ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ用緩衝液、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液、１μｌの  ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを添加して３７℃にて２時間反応させる。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌのＸｂａＩリンカー溶液、１６μｌの  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （宝酒造社製）溶液Ａおよび４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後  ＪＭ１０９に形質転換させる。得られた形質転換体よりプラスミドを調製して、ｐＥＤＳ０２０のＸｈｏＩ部位がＸｂａＩ部位に変換されたプラスミドを得る。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ１μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させる。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌの  Ｓｓｅ８３８７Ｉリンカー溶液、１６μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （宝酒造社製）溶液Ａおよび４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後ＪＭ１０９に形質転換させる。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＶ部位がＳｓｅ８３８７Ｉ部位に変換されたプラスミド（ｐＥＤＳ０２７）を得る。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１４μｌ、制限酵素ＸｂａＩ１μｌおよびＳｓｅ８３８７Ｉ  １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させる。その後、０．７％アガロース電気泳動で分離し１．７Ｋｂのバンドを回収しロドコッカス細菌用の強力なプロモーター活性を有するプラスミドｐＳＪ０３４のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、組換え体プラスミドｐＳＥ００１を作製する（図５）。ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３（特願平９−６５６１８号明細書参照）より図６に示した工程により作製する。ｐＳＪ０２３は形質転換体  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２；１９９８年１月２１日に国際寄託に移管）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００５１】
（１２）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換および形質転換体のＥＤＤＳアーゼ活性
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁する。プラスミドｐＳＥ００１  １μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷する。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行う。電気パルス処理液を氷冷下、１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００ｍｌを加え、３０℃、５時間静置した後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有ＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養する。得られた形質転換体をＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１と名づける。
【００５２】
こうして作製した形質転換体をＭＹＫ培地（５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有）１０ｍｌに接種し、３０℃で７２時間振とう培養する。このうち１ｍｌを培地１００ｍｌ（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％バクトイーストエキス、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％硫酸マグネシウム、ｐＨ７．２、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有）に接種し、３０℃で６０時間培養する。次に、得られた菌体を用い、工程（１０）記載の方法にて反応、分析を行ったところ、３６ｍＭのＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸が生成していた。
【００５３】
式［１］で示される光学活性アミノポリカルボン酸を製造するための反応は、水または緩衝剤溶液（例えばりん酸緩衝液、炭酸緩衝液またはほう酸緩衝液）中で、上述した本発明の微生物株またはその処理物（即ち、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体から抽出された粗酵素または精製酵素、固定化した菌体または酵素、安定化剤等の薬剤で処理された菌体または酵素から選択される）を、フマル酸と式［２］で示されるアミノ基含有化合物との混合物と接触させることによって行われる。
【００５４】
一般に、この反応は、０〜５０℃、好ましくは５〜３５℃の温度、および５〜１１、好ましくは６〜１０のｐＨで行うことができる。フマル酸および式［２］で示されるアミノ基含有化合物の濃度は使用する反応温度やｐＨに応じて変化し得るが、それらの濃度は各々０．１％〜飽和濃度の範囲であり得る。また、使用する微生物またはその処理物の量は、通常、基質の量に基づいて０．０１〜５．０％である。反応は回分式または連続式のいずれかで行うことができる。
【００５５】
反応の完結時に反応混合物から生成アミノポリカルボン酸を単離するために、微生物の除去、濃縮、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、結晶化などの公知の技術を使用することができる。
アミノポリカルボン酸の製造の具体的手順に関しては、特開平９−１４０３９０号公報または対応の米国特許第５７０７８３６号明細書に記載される手順と同様の仕方で行うことができる。これらの特許公開公報、米国特許の内容は本明細書に参考として含めるものとする。
【００５６】
【実施例】
次に、本発明を以下の実施例により具体的に説明する。
＜実施例１＞
（１）培養
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−１３１株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＴＮＯ−５株、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−３０株および同ＴＮ−３株を斜面培地から１白金耳取り、下記の培地に接種し、３０℃、４日間好気的に振とう培養した。
【００５７】
培地組成（ｐＨ７．５，１００ｍｌ）：
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸              ０．２ｇ
グルコース                                  ０．２ｇ
酵母エキス                                  ０．１ｇ
ポリペプトン                                ０．０５ｇ
硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ                        ０．１ｇ
硫酸ナトリウム                              ０．２８ｇ
燐酸緩衝液                                  ２５ｍＭ
金属塩混合物溶液＊                          ０．５ｍｌ
［＊金属塩混合物溶液（１００ｍｌ）：  塩化マグネシウム・６Ｈ２Ｏ  ８ｇ，塩化カルシウム  ０．８ｇ，硫酸マンガン・４Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ，塩化第二鉄・６Ｈ２Ｏ  ０．１２ｇ，硫酸亜鉛  ０．０６ｇ］
【００５８】
（２）フマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄し、同緩衝液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈し、４５℃、６時間、水浴中で処理を行った。なお、２時間経過後にサンプリングを行った。
【００５９】
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
上記フマラーゼ除去処理を施した菌体は、ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定を行い、未処理菌体の活性を１００％として残存活性を求めた。
ＥＤＤＳアーゼの活性測定は６８４ｍＭフマル酸、３４２ｍＭエチレンジアミン、３４２ｍＭ水酸化マグネシウムを含み、６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ８．５に調整した反応液を用い、処理液の１／１０の菌体濃度にて３０℃、一昼夜反応させ、生成する（Ｓ，Ｓ）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳという）を下記操作にて定量した。
【００６０】
フマラーゼの活性測定は６８．４ｍＭ  Ｌ−リンゴ酸ナトリウム、５０ｍＭほう酸緩衝液を含み、６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ８．５に調整した反応液を用い、処理液の１／１０の菌体濃度にて３０℃、一昼夜反応させ、生成するフマル酸を下記操作にて定量した。
【００６１】
反応生成物の定量：
Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ、フマル酸およびＬ−リンゴ酸の分析は、反応液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーにて行った。定量用カラムとしては  ＷＡＫＯＳＩＬ  ５Ｃ８（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ  水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また光学分割カラムとしてＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＲＳ  １０Ｗ（三菱化学社製）〔溶出液：１０ｍＭ  ＣｕＳＯ４〕を使用した。
（４）結果
【００６２】
【表１】
0003565727.tif 000013
【００６３】
＜実施例２＞
（１）形質転換体の培養
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０
斜面培地から１白金耳とり、５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／ｌアンピシリン、１ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅを含有）に、２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう培養した。
【００６４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１
斜面培地から１白金耳とり、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）に接種し、３０℃、７２時間、振とう培養した。これを、ＧＧＹ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％バクトイーストエキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％硫酸マグネシウム、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％量接種し、３０℃で６０時間、好気的に振とう培養した。
【００６５】
（２）フマラーゼ活性除去処理
実施例１と同様。
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
実施例１と同様。
（４）結果
【００６６】
【表２】
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【００６７】
＜実施例３＞
（１）形質転換体の培養
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＥＤＳ０２０を実施例２と同様に培養した。
（２）グルタルアルデヒド処理およびフマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄した。この菌体を、最終濃度１ｍＭのグルタルアルデヒドを含む同緩衝液中で、最終濃度５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌにて、４℃、２時間処理した後、１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄し、同緩衝液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈した。このグルタルアルデヒド処理菌体と、同濃度に希釈した未処理菌体に対して、４５℃、６時間、水浴中でフマラーゼ活性除去処理を行った。
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
実施例１と同様。
（４）結果
【００６８】
【表３】
0003565727.tif 000015
【００６９】
＜実施例４＞
（１）形質転換体の培養
実施例３と同様。
（２）フマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、６Ｎ  ＮａＯＨまたは５Ｎ硫酸にて表４に記載のｐＨに調整した５０ｍＭほう酸緩衝液で２回洗浄し、各々の緩衝液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈し、４５℃、２時間、水浴中で処理を行った。
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
実施例１と同様。
（４）結果
【００７０】
【表４】
0003565727.tif 000016
【００７１】
＜実施例５＞
（１）形質転換体の培養
実施例３と同様。
（２）フマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、表５に記載の塩溶液（各々、６Ｎ  ＮａＯＨまたは５Ｎ硫酸にてｐＨを９．２に調整した）で２回洗浄し、各々の塩溶液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈し、４５℃、２時間、水浴中で処理を行った。
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
実施例１と同様。
（４）結果
【００７２】
【表５】
0003565727.tif 000017
【００７３】
＜実施例６＞
（１）形質転換体の培養
実施例３と同様。
（２）フマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄し、同緩衝液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈し、表６記載の温度、時間にて水浴中で処理を行った。
（３）ＥＤＤＳアーゼおよびフマラーゼの活性測定
実施例１と同様。
（４）結果
【００７４】
【表６】
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【００７５】
＜実施例７＞
（１）形質転換体の培養
実施例３と同様。
、２）フマラーゼ活性除去処理
菌体培養液を遠心管に取り１０，０００ｒｐｍ、５℃、１５分間の遠心分離にて集菌した後、１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄し、同緩衝液液で５ｍｇ乾燥菌体／ｍｌに希釈し、４５℃、４時間、水浴中で処理を行った。
（３）反応
反応液は１２３２ｍＭフマル酸、６１６ｍＭエチレンジアミン、９２４ｍＭの水酸化マグネシウム、２０ｍｇ乾燥菌体／ｍｌの上記処理菌体または同濃度の未処理菌体を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによってｐＨ８．５に調整したものを用い、３０℃、２０日間反応させた。また、６Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。
反応液中のＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ、Ｌ−リンゴ酸の定量は実施例１記載の方法で行った。
（４）結果
【００７６】
【表７】
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【００７７】
【発明の効果】
本発明により、ＥＤＤＳアーゼ活性とフマラーゼ活性を含む微生物についてＥＤＤＳアーゼ活性を低下させずにフマラーゼ活性のみをを選択的に除去することができ、フマル酸損失の少ない光学活性アミノポリカルボン酸製造用微生物触媒を提供し得る。
さらに、アルカリ処理された該微生物またはその処理物は、たとえ該処理によりＥＤＤＳアーゼ活性が部分的に損失していたとしても、相対的にフマラーゼ活性除去割合が大きければ、フマル酸損失の少ない光学活性アミノポリカルボン酸製造用触媒となり得るため、本発明の効果を得ることができる。
【００７８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、プラスミドｐＥＤＳ００１の制限酵素地図である。
【図２】この図は、プラスミドｐＥＤＳ００２の制限酵素地図である。このプラスミドは、プラスミドｐＥＤＳ００１を制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで切断して得た約３．９ｋｂの断片をｐＵＣ１８に挿入したものである。
【図３】この図は、プラスミドｐＥＤＳ００３の制限酵素地図である。このプラスミドは、プラスミドｐＥＤＳ００１を制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで切断して得た約２．６ｋｂの断片をｐＵＣ１８に挿入したものである。
【図４】この図は、プラスミドｐＥＤＳ０２０の制限酵素地図である。このプラスミドは、プラスミドｐＥＤＳ００３を制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで切断して得た約２．６ｋｂの断片をｐＵＣ１１９に挿入したものである。
【図５】この図は、プラスミドｐＳＥ００１の構築図である。
【図６】この図は、プラスミドｐＳＪ０３４の構築図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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