(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有するＦＯ−４２５９物質またはその薬学的に許容し得る塩。
（１）融点      ：＞３００℃
（２）推定分子式：Ｃ28Ｈ32Ｏ8 （高分解能ＥＩマススペクトルによる）
（３）分子量    ：４９６
（４）比旋光度  ：〔α〕D 23＋７２°（Ｃ＝０．１、クロロホルム中）
（５）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：２１７、３３４ｎｍ付近に特徴      的な吸収極大を示す
（６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：３４５０、２３６２、１６８６、１      ６３５、１５６０、１５４１、１５００、１４７３、１４５７、１４０８      、１２６９、１１４４ｃｍ-1に吸収帯を有する
（７）呈色反応  ：５０％Ｈ2 ＳＯ4 で発色する
（８）溶媒に対する溶解性：クロロホルム、メタノール、エタノールに可溶、水      に難溶
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性
（１０）物質性状：白色粉末
【請求項２】
ペニシリウム属に属し、請求項１に記載されるＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中にＦＯ−４２５９物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−４２５９物質を採取することを特徴とするＦＯ−４２５９物質並びにそれらの薬学的に許容し得る塩の製造法。
【請求項３】
ペニシリウム属に属し、請求項１に記載されるＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有する微生物が、ペニシリウム  エスピー  ＦＯ−４２５９（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＯ−４２５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８０））である請求項２に記載の製造法。
【請求項４】
ペニシリウム属に属し、請求項１に記載されるＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有するペニシリウム  エスピー  ＦＯ−４２５９（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＯ−４２５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８０））である微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬等の製造分野において有用なＦＯ−４２５９物質およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経伝達物質アセチルコリンはコリン作動性神経終末から遊離され、アセチルコリン受容体に作用し、多様な生体内情報の伝達をつかさどっているが、アセチルコリンエステラーゼ（以下、時としてＡＣｈＥと呼称することもある）によって速やかに分解され不活性化される。この酵素の阻害剤はアセチルコリンの不活性化を妨げ、作用部位でのアセチルコリン濃度を高めることにより、緑内症、重症筋無力症、消化管機能障害の治療剤あるいは殺虫剤等として開発されている。また、近年、老人性アルツハイマー型痴呆症において脳内のアセチルコリン量の減少が原因であるとする考えから、該酵素阻害剤がこの疾患の治療薬として注目され、研究開発されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これまで見出された合成品のＡＣｈＥ阻害剤は、生体内コリンエステラーゼ（以下、時としてＣｈＥと呼称することもある）に対して特異性がなく、肝臓への副作用等の問題を有し、その利用が制限されており、従って、ＡＣｈＥを特異的に阻害し、副作用の少ない新規な構造を有するＡＣｈＥ阻害剤が強く要望されている。
【０００４】
従って、本発明の目的は、上記のごとく事情から生体内ＣｈＥのうち、特に神経系由来のＡＣｈＥに対し特異的に阻害し、肝臓由来の偽ＣｈＥに対して無効な、選択性の高い薬剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記のごとく問題点を解決すべく、微生物代謝産物中に該活性を示す生理活性物質を広範に探索した。その結果、新たに土壌から分離されたＦＯ−４２５９菌株の培養液中に特異的にＡＣｈＥを阻害する物質が産生されることを見出した。
【０００６】
次いで、該培養物からＡＣｈＥ阻害活性物質を分離、精製した結果、後記の物理化学的性質を有するＦＯ−４２５９物質は、従来まったく知られていない物質であることを見出した。
本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって、後記の物理化学的性状を有するＦＯ−４２５９物質またはその薬学的に許容し得る塩を提供するものである。
【０００７】
更に、本発明は、ペニシリウム属に属し、ＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中にＦＯ−４２５９物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−４２５９物質を採取することを特徴とするＦＯ−４２５９物質またはそれらの薬学的に許容し得る塩の製造法を提供するものである。
【０００８】
本発明のＦＯ−４２５９物質の物理化学的性状を述べると次の通りである。
（１）融点：＞３００℃
（２）推定分子式：Ｃ２８Ｈ３２Ｏ８  （高分解能マススペクトルによる）
（３）分子量：４９６（高分解能ＥＩマススペクトルによる測定値は次のとおりである）
計算値：４９６．２０９８
実測値：４９６．２１０７
（４）比旋光度：〔α〕Ｄ  ２３＋７２°（Ｃ＝０．１、クロロホルム中）
【０００９】
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２１７、３３４ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外線吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、３４５０、２３６２、１６８６、１６３５、１５６０、１５４１、１５００、１４７３、１４５７、１４０８、１２６９、１１４４ｃｍ−１に吸収帯を有する
（７）呈色反応：５０％Ｈ２  ＳＯ４  で発色する
（８）溶媒に対する溶解性：クロロホルム、メタノール、エタノールに可溶、水に難溶
【００１０】
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性
（１０）物質性状：白色粉末
（１１）核磁気共鳴スペクトル：バリアンＸＬ−４００、４００ＭＨｚ  、ＮＭＲスペクトロメータを用いて重ピリジン溶液中で測定した  １Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフトは下記表１に示すとおりである
【００１１】
【表１】
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【００１２】
本発明で使用される上記のＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有する微生物（以下、ＦＯ−４２５９物質生産菌と称する）は、ペニシリウム属に属するが、その中で例えば本発明者らが分離したペニシリウム属に属するペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−４２５９菌株は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと次のとおりである。
【００１３】
Ｉ．形態的性質
本菌株は、ツァペック・イースト寒天培地、麦芽汁寒天培地、２５％グリセリン・硝酸塩寒天培地などで良好に生育し、分生子の着生も良好である。麦芽汁寒天に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると菌糸は透明で隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸より直生している。
【００１４】
ペニシラスは複輪生でラミー、メトレ、フィアライドに分岐している。分生子柄〜メトレにかけてその表面はしばしば粗面である。
フィアライドはアンプル型で２〜３個群生し、大きさは７．５〜１０．０μｍ×２．５〜３．０μｍである。
はじめはフィアロ型分生子がフィアライドの頂端に一個着生し、培養時間の経過とともに連鎖状となる。
分生子は球形で大きさは２．５〜３．０μｍであり、表面は粗面である。
【００１５】
ＩＩ．培養の諸性状
各種培地上で２５℃、１４日間培養した場合を肉眼的に観察した。その結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
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尚、これらの培地において、菌の生育に伴う菌核の形成は観察されなかった。
【００１７】
ＩＩＩ．  生理的、生態的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件はｐＨ６〜９、温度１１〜２５℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲はｐＨ３〜１０、温度３．５〜２９℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
【００１８】
上記ＦＯ−４２５９株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株をペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する一菌株と同定し、ペニシリウム  エスピー  ＦＯ−４２５９と命名した。本菌株はペニシリウム  エスピー  ＦＯ−４２５９（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ＦＯ−４２５９）として、平成６年１１月３０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８０である。
【００１９】
以上のとおり、ＦＯ−４２５９物質生産菌について説明したが、菌の一般的性状としての菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異も含め、ペニシリウム属に属し、ＦＯ−４２５９物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株もＦＯ−４２５９物質生産菌として包含される。
【００２０】
本発明においては、先ず、ペニシリウム属に属するＦＯ−４２５９物質生産菌が培地に培養される。本菌の培養においては、通常真菌類の培養法が一般に用いられる。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源、さらには必要に応じて無機塩類などを含有させた栄養培地が使用される。すなわち、炭素源としては、例えばグルコース、シュークロース、グリセロール、フラクトース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、リボース、デキストリン、糖密、澱粉またはその加水分解物等の炭水化物が使用できる。
【００２１】
また、その濃度は、通常培地に対して０．１％〜５％が望ましい。また、グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸、さらにはメタノール、エタノール等のアルーコール類やノルマルパラフイン等の非芳香族炭化水素、あるいは植物もしくは動物性の各種油脂等を添加してもよい。
【００２２】
資化し得る窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の各種無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩類、尿素、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フイッシュミールあるいはその消化物、大豆粉あるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物、加水分解物などの含窒素有機物質、さらには、グリシン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能である。
【００２３】
無機物としては、例えば各種リン酸塩、硫酸塩、食塩、さらには微量の重金属塩が添加される。また、栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然その栄養要求性を満足させる物質を培地に加えなければならないが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合は、とくに添加を必要としない場合がある。
【００２４】
培養は通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培養のｐＨはたとえば５．０〜８．０であるが、中性付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は２０〜３０℃で行い得るが、通常は２５〜２７℃（好ましくは２７℃付近）に保つのがよい。培養時間は液体の場合、通常７〜１０日間培養を行うと、本ＦＯ−４２５９物質が蓄積されるので、培養中の蓄積量が最大に達した時に、培養を終了すればよい。
【００２５】
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用できる。
【００２６】
このようにして得られた培養物に蓄積されるＦＯ−４２５９物質は、菌体内および培養濾液中に含有されるので、培養物を遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、各々から本ＦＯ−４２５９物質を採取するのが有利である。
【００２７】
ＦＯ−４２５９物質を採取するには、通常微生物の培養物から代謝物を採取するのに用いられる手段が、単独あるいは組み合わせて、または反復して用いられる。すなわち、例えば抽出濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する例えば沈澱、結晶化、再結晶、転溶、向流分配法、クロマトグラフイー等の手段が用いられる。
【００２８】
培養液からＦＯ−４２５９物質を採取するには、先ず培養濾液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非親水性有機溶媒で抽出するか、あるいは培養濾液あるいは菌体抽出液を活性炭、アルミナ、多孔性合成高分子樹脂、イオン交換樹脂等に吸着させ、メタノール等の溶出溶媒で溶出し、得られた抽出液を減圧濃縮後、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。
【００２９】
得られた粗物質は、さらに脂溶性物質の精製において通常用いられている公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナ等の担体を用いるカラムクロマトグラフイーあるいはＯＤＳ担体を用いる逆相クロマトグラフイーにより精製することができる。又、本ＦＯ−４２５９物質の薬学的に許容し得る塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等の塩を常法により製造することができる。
【００３０】
【発明の効果】
次に、本発明のＦＯ−４２５９物質のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）に対する阻害活性について述べる。
ＣｈＥに対する阻害活性：
基質としてアセチルコリン又はブチルコリンを用い、各々の酵素としてヒト赤血球由来のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）又はウマ血清由来の偽コリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ：ブチリルコリンエステラーゼ）に対する阻害活性を岡部らのコリンオキシダーゼ法（岡部ら：臨床病理、２５巻、７５５−７５８（１９７７））を改変して測定した。その結果を表３に示した。
【００３１】
【表３】
0003580875.tif 000005
【００３２】
本ＦＯ−４２５９物質によるＡＣｈＥ阻害性濃度（ＩＣ５０）は、０．５ｎｇ／ｍｌであるが、その３６，０００倍以上の濃度でもＢＣｈＥに対して阻害活性を示さず、ＣｈＥのうちＡＣｈＥを特異的に阻害する物質である。
【００３３】
一方、既知のＣｈＥ阻害剤のフィゾスチグミン及びアルツファイマー痴呆症の治療薬のタクリンのＣｈＥに対する阻害効果を同様に測定した。その結果を上記表３に示した。フィゾスチグミンはＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの両者の酵素を同程度の濃度で阻害した。タクリンはＡＣｈＥよりもＢＣｈＥの方を約１／３６の濃度でやや特異的に阻害した。これらの既知の阻害剤よりＦＯ−４２５９物質は低濃度で特異的にＡＣｈＥを阻害していた。
【００３４】
以上のように、本ＦＯ−４２５９物質は、生体内ＣｈＥのうち神経系に多く分布するＡＣｈＥに対し低濃度で特異的に阻害し、肝臓に多く分布するＢＣｈＥに対して阻害が見られない選択性の高い物質である。更に、肝臓への副作用が問題となっているタクリンのこれらの酵素に対する選択性の低さに比べれば、ＦＯ−４２５９物質は従来のＣｈＥ阻害剤と異なるタイプの作用を有することから、アルツハイマー痴呆症の治療薬として優れた治療効果を示すものと期待される。
【００３５】
【実施例】
実施例１
５００ｍｌ容三角フラスコに、グルコース２．０％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、リン酸２水素カリウム０．１％、寒天０．１％を含む液体培地（ｐＨ６．０）１００ｍｌを分注し、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。これに寒天斜面培地上に生育させたペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−４２５９株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８０）の菌体を白金耳にて無菌的に接種し、２７℃、３日間培養して種培養液を得た。
【００３６】
次いで、３０Ｌ容ジャー培養槽にスクロース２％、グルコース１．０％、コーンスチープパウダ０．５％、肉エキス０．５％、リン酸２水素カリウム０．１％、炭酸カルシウム０．３％、寒天０．１％及び微量金属塩たとえば鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルトを含む液体培地（ｐＨ６．０）２０Ｌを仕込み、１２１℃、２０分間蒸気滅菌した。これに上記の種培養液２００ｍｌを接種し、２７℃、８日間通気攪拌培養した。
【００３７】
この培養液１８Ｌに１８Ｌの酢酸エチルを加えて良く攪拌した後、遠心分離して酢酸エチル層を分離した。この酢酸エチル抽出液を減圧濃縮乾固して粗抽出物３．２ｇを得た。この粗抽出物をシリカゲルクロマトグラフイー（クロロホルム１．５Ｌで洗浄後クロロホルム：メタノール（２００：１〜１００：１）３Ｌ）で活性物質を溶出させ粗精製物３０４ｍｇを得た。
次いで逆相（ＯＤＳ）系の高速液体クロマトグラフイー（展開溶媒：４５％アセトニトリル）により、ＦＯ−４２５９物質３．８ｍｇを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＯ−４２５９物質の紫外線吸収スペクトルである（２０μｌ／ｍｌメタノール溶液）。
【図２】ＦＯ−４２５９物質の赤外線吸収スペクトルである（ＫＢｒ法による）。
【図１】
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【図２】
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