(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）（化１）または（２）（化２）のハプテン化合物
【化１】
0003543846.tif 000019
【化２】
0003543846.tif 000020
（式中、Ｒ１  は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５  のハロアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５  のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５  のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６  のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２  はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３  は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６  は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚは−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨまたは  −Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を表わし、Ｙは−Ｈ２Ｃ−、−ＮＲ７−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７  は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｍおよびｎは１〜５を表わす。）と高分子化合物の結合体を免疫原として動物に免疫することにより得られるピレスロイド系化合物に対する抗体を第一抗体とし、該第一抗体と試料を反応溶液中で混合した後、未反応の第一抗体を担体の表面にコートした高分子化合物とハプテンの結合体（コーティング抗原）に結合させて抗原抗体結合体を得、該抗原抗体結合体に、標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体（第二抗体）を反応させることからなるピレスロイド系化合物の検出方法。
【請求項２】
反応溶液に２０％から５０％の濃度になるように水溶性有機溶媒を添加することを特徴とする、請求項１記載のピレスロイド系化合物の検出方法。
【請求項３】
水溶性有機溶媒がアルコール類、ジメチルスルフォキシド、またはアセトニトリルである、請求項１または２記載のピレスロイド系化合物の検出方法。
【請求項４】
検出されるピレスロイド系化合物が、レスメトリン、カデスリン、シハロトリン、ビフェントリン、フェンプロパトリン、アレスリン、トラロメスリン、フェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプロトリン、エトフェンプロックス、フブフェンプロックス、１−（３−フェノキシフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン、１−（３−フェノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン、ジメチル−（４−エトキシフェニル）−（３−フェノキシベンジルオキシ）メチルシラン、シラフルオフェンから選ばれた少なくとも１種である、請求項１〜３記載の何れか一項に記載のピレスロイド系化合物の検出方法。
【請求項５】
請求項１記載の一般式（１）または（２）のハプテン化合物。
【請求項６】
下記一般式（３）（化３）および（４）（化４）
【化３】
0003543846.tif 000021
【化４】
0003543846.tif 000022
（式中、Ｒ１  は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５  のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６  のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２  はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３  は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６  は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚ’は−Ｙ’−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７’  または−Ｙ’−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ８を表わし、Ｙ’は−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７’はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルキルチオ低級アルキル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、フェニル基、フェニルオキシ低級アルキル基、フェナシル基、ジアシルメチル基、Ｎ−フタルイミドメチル基、ベンジル基、シリル基を表わし、ｍは１〜５を表わし、Ｒ８  はホルミル基、アセチル基、ハロアセチル基、プロピオニル基、フェニルアセチル基、アルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、フルオレンメチルカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基、ピペリジニルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を表わす。Ｒ９  は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｎは１〜５を表わす。）で表される、請求項５のハプテン化合物を製造するための中間体。
【請求項７】
請求項５記載のハプテン化合物（１）または（２）と高分子化合物との結合体。
【請求項８】
請求項１において第１抗体として使用される抗体。
【請求項９】
アルコール類、ジメチルスルフォキシドまたはアセトニトリルの存在下に、ピレスロイド系化合物を認識し得る請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
２０％から５０％のアルコール類、ジメチルスルフォキシドまたはアセトニトリルの存在下に、ピレスロイド系化合物を認識し得る請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ピレスロイド系化合物が、レスメトリン、カデスリン、シハロトリン、ビフェントリン、フェンプロパトリン、アレスリン、トラロメスリン、フェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプロトリン、エトフェンプロックス、フブフェンプロックス、１−（３−フェノキシフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン、１−（３−フェノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン、ジメチル−（４−エトキシフェニル）−（３−フェノキシベンジルオキシ）メチルシラン、シラフルオフェンから選ばれた少なくとも１種である請求項８〜１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
３−フェノキシベンジル  ２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピル  エーテルまたは３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピル  エーテルを抗原決定基として認識し得る請求項８〜１１の何れか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ピレスロイド系化合物と結合する抗体、並びに抗体を製造する上で必要とするハプテン化合物、該ハプテン化合物の中間体、並びにこれらの製造方法、並びに抗体を用いて水、土壌などの自然環境試料、および、穀物などの食料試料からピレスロイド系化合物を検出する免疫学的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピレスロイド系化合物の免疫化学的分析方法としては、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｍｏｃｋらによるＳ−Ｂｉｏａｌｌｅｔｈｒｉｎに対する特異的抗体の研究（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２６：１３２８−１３３３，１９７８）およびラジオイムノアッセイ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ  ３５：１６１９−１６２０，１９７９）がある。これらは免疫化学的分析方法を特定のピレスロイドに適用した基礎的な研究である。Ｌ．Ｈ．Ｓｔａｎｋｅｒらは食肉中のパーメスリンの免疫化学的分析方法について基礎的研究を報告している（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３７：８３４−８３９，１９８９）。これはフェノスリンのジメチルビニル基をオゾン酸化してカルボン酸誘導体とし、これをタンパク質と結合させたハプテン−タンパク結合体を使用して動物に免疫することで３種類のモノクローナル抗体を単離した。しかしながら、この抗体はフェノスリン、パーメスリン、サイパーメスリン、デルタメスリンのみが検出可能であり、その他の合成ピレスロイドに対しては検出感度が非常に低い。また、抗体と検出対象化合物とを反応させる場合、試料中化合物の溶解性を高め反応し易くするために、水溶性有機溶媒（アセトニトリルなど）が添加される。しかし、抗体の有機溶媒に対する安定性から添加量は６％以下と低濃度でなければならず、水溶解度の極端に低い化合物の検出が難しいことや、微量分析に伴い溶媒の除去または濃縮操作が必要になるなどの課題が残されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
自然環境下での残留農薬、および、最近とくに増加してきた輸入食料のポストハーベスト農薬などの残留問題には大きな社会的関心がよせられている。これらの安全性確保のためには、自然環境および食料の多くの試料について含有される農薬残留量を、正確かつ迅速に測定する必要がある。従来、残留農薬は、主に、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いて測定しているが、これらの方法は、分析試料の調製に多大の手間と時間を必要とし、また、測定機器や試薬類が高価であるという欠点があるため、簡便、経済的かつ迅速に行うことのできる新しい測定方法が望まれている。
【０００４】
本発明の分析対象であるピレスロイド系化合物は穀物、果物、野菜、綿、コーヒー、および茶、動物、森林の樹木、家庭の衛生害虫駆除などに広く使用されている広範なスペクトルを有する汎用殺虫剤である。ピレスロイド系化合物は、他の多くの殺虫剤に比べて哺乳動物に対する毒性が低く、また、抵抗性害虫の防除に効果があるためその用途が拡大している。しかし、これら化合物にはそれぞれ、大部分の食品中における残留量の上限が法的に定められており、また、ピレスロイド系化合物の多くは水棲生物に対し強い毒性を有するため自然環境への影響が憂慮されている。従って、本発明の目的は、今後も増加が予想される自然環境および食料の残留分析が必要となる試料中のピレスロイド系化合物を、簡便、経済的かつ迅速に分析する方法を提供することである。特に輸入農産物の残留農薬を従来法で分析するには、今後、規制対象農薬の増加に伴い試料が膨大になるため経費、労力の点から対応しきれないのが現状である。本発明は、残留農薬の成分分析を実施する前に、あらかじめ分析対象試料がどのようなタイプの農薬がどの程度残留しているか検査することも可能である。さらに、今まで製造されている抗体の持つ弱点である有機溶媒に対する不安定性を克服できれば、ＥＬＩＳＡ法を応用できるピレスロイド系化合物の数が増える可能性も高くなり、輸入農産物分析に係わる諸問題を始め、前述した多くの課題が解決される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは前述の課題を解決するためにピレスロイド系化合物の免疫化学的分析法を検討し、自然環境および食料試料でのピレスロイド系化合物の簡便かつ迅速な検出方法として、間接競合ＥＬＩＳＡ法が有効であることを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は（ａ）下記一般式（１）（化５）または（２）（化６）の化合物（以下、ハプテン化合物という。）
【０００７】
【化５】
0003543846.tif 000002
【０００８】
【化６】
0003543846.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１  は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５  のハロアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５  のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６  のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２  はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３  は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６  は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚは−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨまたは  −Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を表わし、Ｙは−Ｈ２Ｃ−、−ＮＲ７−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７  は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｍおよびｎは１〜５を表わす。）と高分子化合物の結合体を免疫原として動物に免疫することにより得られるピレスロイド系化合物に対する抗体を第一抗体とし、該第一抗体を試料溶液に混合した後、未反応の第一抗体を担体の表面にコートした高分子化合物とハプテンの結合体（以下、コーティング抗原と表す。）に結合させて抗原抗体結合体を得、該抗原抗体結合体に、標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体（以下、第二抗体と表す。）を反応させることからなるピレスロイド系化合物の検出方法、（ｂ）一般式（１）および（２）のハプテン化合物、（ｃ）一般式（１）および（２）を製造するための下記一般式（３）（化７）および（４）（化８）
【００１０】
【化７】
0003543846.tif 000004
【００１１】
【化８】
0003543846.tif 000005
【００１２】
（式中、Ｒ１  は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシ基、Ｃ１〜  Ｃ５のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５  のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３  〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６  のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２  はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３  は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表し、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６  は水素原子またたは低級アルキル基を表わし、Ｚ’は−Ｙ’−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７’  または−Ｙ’−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ８を表わし、Ｙ’は−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７’はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルキルチオ低級アルキル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、フェニル基、フェニルオキシ低級アルキル基、フェナシル基、ジアシルメチル基、Ｎ−フタルイミドメチル基、ベンジル基、シリル基を表わし、ｍは１〜５を表わし、Ｒ８  はホルミル基、アセチル基、ハロアセチル基、プロピオニル基、フェニルアセチル基、アルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、フルオレンメチルカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基、ピペリジニルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を表わす。Ｒ９  は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｎは１〜５を表わす。）で表わされるハプテン化合物中間体、（ｄ）一般式（１）または（２）のハプテン化合物と高分子化合物との結合体、（ｅ）アルコール類、ジメチルスルフォキシドまたはアセトニトリルの存在下に安定なピレスロイド系化合物を認識し得る抗体を提供するものである。
【００１３】
すなわち、ハプテン化合物と高分子化合物（例えばタンパク質）の結合体を免疫原として動物に免疫することによって得たピレスロイド系化合物に対する抗体を第一抗体とし、所定量の第一抗体とピレスロイド系化合物を含む試料溶液を混合し、反応液に含まれる未反応の第一抗体を、担体の表面にコートしたコーティング抗原に結合させ、標識酵素を結合した第二抗体を担体に結合した第一抗体に反応させた後、酵素の基質および酵素反応によって発色する発色試薬を含有する緩衝液を添加し、発色させた後に吸光度を測定し、その測定値から検量線をもとに試料中のピレスロイド系化合物の濃度を算出するものである。ここで使用する第一抗体は、免疫原として高分子化合物、例えばタンパク質と本発明のハプテン化合物との結合体を免疫原とし得たものである。一般式（１）において各種置換基の様々な組み合わせで多くの化合物を例示することができるが、好ましくはＡは炭素原子、Ｂは酸素原子である。さらに好ましくは、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ２およびＲ３はメチル基、ＺにおいてＹは酸素原子である。最も好ましくはＺはヒドロキシカルボニルメチルオキシ基であり、Ｒ２  およびＲ３  はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ４およびＲ５は水素原子である。
【００１４】
また一般式（２）においても同様に多くの化合物を例示することができるが、好ましくはＡは炭素原子、Ｂは酸素原子、ＺにおいてＹは酸素原子である。最も好ましくはＲ１  はアルコキシ基またはハロアルコキシ基、Ｒ２およびＲ３はメチル基、Ｒ４およびＲ５は水素原子、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｚは４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシ基である。
【００１５】
これらハプテン化合物は一般式（３）または（４）から製造することができる。一般式（３）または（４）の化合物を塩基または酸存在下で加水分解するか、あるいは還元することでそれぞれ相当する一般式（１）または（２）のハプテン化合物を得ることができる。ここで一般式（３）において各種置換基の組み合わせにより多くの化合物を例示することができるが、最も好ましくはＺ’  がメトキシカルボニルメチロキシ基であり、Ｒ２およびＲ３はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ４よびＲ５は水素原子である。
【００１６】
これら中間体（３）および（４）は既知の化合物より製造することができる。すなわち、一般式（５）（化９）
【００１７】
【化９】
0003543846.tif 000006
【００１８】
（式中、Ａ、Ｂ、Ｙ、Ｒ２〜Ｒ５は前記の意味を表わす。）の化合物と、一般式（６）（化１０）
【００１９】
【化１０】
0003543846.tif 000007
【００２０】
（式中、Ｘはハロゲン原子、ｍおよびＲ７’は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合させることにより一般式（３）の化合物を製造することができる。
【００２１】
また一般式（５）の化合物と一般式（７）（化１１）
【００２２】
【化１１】
0003543846.tif 000008
【００２３】
（式中、Ｘはハロゲン原子、ｎおよびＲ８  は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合させることで（ａ）と同様にして一般式（３）の化合物を製造することができる。
【００２４】
また一般式（８）（化１２）
【００２５】
【化１２】
0003543846.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ａ、ＢおよびＹ’  は前記の意味を表わす。）と一般式（６）または一般式（７）の化合物と塩基存在下縮合させることにより一般式（４）の化合物を製造することができる。
【００２７】
これらハプテン化合物中間体を製造する際の原料となる一般式（５）の化合物において、Ａが炭素原子でかつＢが酸素原子である化合物は、特開昭５８−３２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記載の公知化合物、またはそれら化合物の製造方法で容易に得ることができる。またＡおよびＢが共に炭素原子である化合物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の公知化合物により公知の反応で製造することができる。例えば化合物（９）（化１３）
【００２８】
【化１３】
0003543846.tif 000010
【００２９】
を極性有機溶媒中で塩基（例えばカリウムターシャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させることで相当するフェノール誘導体を製造することができる。また一般式（５）の化合物においてＡがケイ素原子である場合、特開昭６１−２６３９８８号公報、特開昭６２−１０６０３２号公報に記載された公知の有機ケイ素化合物より公知の反応で製造することができる。例えば化合物（１０）（化１４）
【００３０】
【化１４】
0003543846.tif 000011
【００３１】
を極性溶媒中で塩基（えばカリウムターシャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させることで相当するフェノール誘導体を製造することができる。
【００３２】
もう一方のハプテン化合物中間体を製造する際の原料となる一般式（８）の化合物においてＡが炭素原子、Ｂが酸素原子である化合物は、特開昭５８−３２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記載の公知化合物またはそれら化合物の製造方法で容易に得ることができる。またＡおよびＢが炭素原子である化合物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の公知化合物より公知の反応で製造できる。例えば化合物（１１）（化１５）
【００３３】
【化１５】
0003543846.tif 000012
【００３４】
のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当するフェノール誘導体を製造することができる。化合物（１１）は化合物（１２）（化１６）と化合物（１３）（化１７）を縮合し接触還元することで製造することができる。
【００３５】
【化１６】
0003543846.tif 000013
【００３６】
【化１７】
0003543846.tif 000014
【００３７】
またＡがケイ素原子である化合物は、特開昭６１−２６３９８８号公報、特開昭６２−１０６０３２号公報に記載された公知の有機ケイ素化合物より公知の反応で製造することができる。例えば化合物（１４）（化１８）
【００３８】
【化１８】
0003543846.tif 000015
【００３９】
のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当するフェノール誘導体を製造することができる。化合物（１４）は化合物（１５）（化１９）と化合物（１６）（化２０）とを塩基存在下縮合させることにより容易に製造することができる。
【００４０】
【化１９】
0003543846.tif 000016
【００４１】
【化２０】
0003543846.tif 000017
【００４２】
第一抗体を産生するための免疫原は、一般式（１）または（２）のハプテン化合物と高分子化合物（例えば血清タンパク質であるアルブミン、グロブリン、ヘモシアニンなどや、アゾフェニル酢酸、グルタミン−アデニン−チロシン共重合体など）とを結合試薬存在下で縮合させることにより製造できる。特にハプテン化合物がカルボン酸誘導体の場合、Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒらによる混合酸無水物法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２３４，１０９０−１０９４（１９５９））によってタンパク質と結合させることが一般的である。
【００４３】
本発明の検出法で使用する担体としては、ＥＬＩＳＡ法において通常用いられる担体を使用することができ、種々の形が可能である。例えば管、ウェルプレート、マイクロプレート、細長いスティック、薄いストリップまたはビーズなどがあげられる。このような固相の表面を形成する材料としてはポリスチレンもしくは他の適当なプラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、シリカなどがあげられる。特に限定されないが、ポリスチレンの９６穴マイクロプレートの使用が適している。
【００４４】
本発明の測定法において、コーティング抗原の担体表面へのコートは、ハプテン化合物と第一抗体を産生する動物種の血清アルブミンの結合体を、コーティング緩衝液で希釈し、担体に添加した後、インキュベーションすることによって行われる。ここで使用するコーティング緩衝液としては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ）の組成のものを使用するのが適してるが、コーティングを妨げる界面活性剤などを含まなければ、これのみに限定されるものではない。また、コーティング用結合体に用いるタンパク質は、免疫原に用いたもの以外のタンパク質を用いることが可能であり、免疫原の作製の場合と同様にして結合体を製造することができる。担体の抗原によるコーティングの条件について検討した結果、コーティング抗原の濃度は０．０１から０．１μｇ／ｍｌが適している。使用する量としては、９６穴マイクプレートを使用する場合には０．１ｍｇ／ｗｅｌｌ程度が望ましい。また、インキュベーションの条件としては、４℃で一晩のインキュベーションが適している。担体にコーティング抗原を吸着させた後、抗体の非特異的結合を防止するために抗原以外の蛋白質で抗原が吸着していない部分をブロックする必要がある。ブロッキングには３％のスキムミルク溶液と担体と２５℃で１時間インキュベーションする。担体はインキュベーション後、洗浄緩衝液（１０ｍＭン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。）で洗浄する。
【００４５】
本発明の方法は、ピレスロイド系化合物と第一抗体との反応溶液に高濃度の有機溶媒を加えることにより、ピレスロイド系化合物と第一抗体との反応をし易くくすることを特徴とする。一般にピレスロイド系化合物の水に対する溶解度は極めて低く、通常の条件下では第一抗体と十分に効率よく反応させることができない。そこで種々条件を検討した結果、反応系に有機溶媒を添加することで抗体とピレスロイド系化合物の反応を可能にすることができる。添加する有機溶媒としてはメタノール、エタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、ＨＭＰＡ、ＤＭＩ、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒があげられる。第一抗体の有機溶媒に対する安定性からアルコール類、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリルが適し、特にメタノールが適し、その溶媒濃度は２０％から５０％が適している。本発明の第一抗体が有機溶媒のこれらの濃度において安定であることは驚くべきことである。また第一抗体は希釈用緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ）で反応溶液中の抗体濃度が２０，０００から８０，０００倍希釈となるように調製する。水田水や水道水などの自然環境中の水類を試料とする場合には、試料に直接、第一抗体溶液や有機溶媒を所定の濃度になるように添加することにより、反応溶液を調製する。また、食料、植物および土壌などの試料では、有機溶媒で試料からピレスロイド系化合物を抽出した後、溶媒抽出溶液に抗体溶液を添加して反応溶液を調製することができる。この反応溶液を２５℃で１時間インキュベーションし反応させる。上記のように調製したピレスロイド系化合物と第一抗体の反応溶液中の未反応の第一抗体を、担体に結合したコーティング抗原と反応させる。反応溶液を担体に添加し２５℃で１時間インュベーションする。反応後、洗浄緩衝液で担体を洗浄して、第二抗体との反応に供する。
【００４６】
本発明の測定法において使用する第二抗体としては、酵素を結合した第一抗体に対する抗体を用いることができる。第一抗体としてウサギ抗血清を用いる場合、ペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ画分を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５，０００から１０，０００倍、好ましくは最終吸光度が１．０から１．５となるよう希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には洗浄用緩衝液を用いる。反応は２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩衝液で洗浄する。また、アビジン−ビオチン反応を利用して、第二抗体としてビオチンを結合した第一抗体に対する抗体と酵素を結合したアビジンを組み合わせて用いることもできる。担体に結合した第一抗体に約２，０００倍に希釈したビオチンを結合した抗ウサギＩｇＧロバＩｇＧ画分を反応させた後、洗浄し、約１，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼを結合したアビジンを加えるのが望ましいが、第二抗体を産生する動物、および、用いる酵素については他の動物および酵素であってもさしつかえない。希釈には洗浄用緩衝液を用い、反応はどちらも２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩衝液で洗浄して、酵素反応に供する。担体に結合した第二抗体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を加え、吸光度を測定することによって検量線からピレスロイド系化合物の量を算出することができる。
【００４７】
第二抗体にペルオキシダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてｏ‐フェニレンジアミンを使用することが望ましい。発色溶液を加え２５℃で１０分間反応させた後、直ちに４Ｎの硫酸を加えることにより、酵素反応を止める。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２および６３０ｎｍの吸光度を測定する。一方、アルカリフォスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００４８】
ピレスロイド系化合物を添加していない反応溶液の吸光度に対する、一定量のピレスロイド系化合物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として算出する。既知の濃度のピレスロイド系化合物を添加した反応液の阻害率により作成した検量線を用いて、試料中のピレスロイド系化合物濃度を算出することができる。
【００４９】
本願発明の第一抗体は、ハプテン化合物の構造にかかわらず、その反応性に差はあるが種々の他のピレスロイド系化合物と交叉反応性を示し、ピレスロイド系化合物を一般的に検出するのに有効に用いられる。
【００５０】
本発明で検出できるピレスロイド系化合物としてはレスメトリン、カデスリン、シハロトリン、ビフェントリン、フェンプロパトリン、アレスリン、トラロメスリンなどのシクロプロパンカルボン酸のエステル類、フェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプロトリンなどの芳香族基置換アルカンカルボン酸のエステル類およびエトフェンプロックス、フブフェンプロックス（ＭＴＩ−７３２）、１−（３−フェノキシフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン（ＭＴＩ−７９０）、１−（３−フェノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン（ＭＴＩ−８００）、ジメチル−（４−エトキシフェニル）−（３−フェノキシベンジルオキシ）メチルシラン（ＳＳＩ−１１６）、シラフルオフェン、ＰＰ−６８２などの非エステル系化合物類などがあげらる。
【００５１】
両抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を実施することにより分析試料中の種々のピレスロイド系化合物の総残留量の検出が可能である。無論、これらの化合物の中で、その散布または使用が一つに限定されている分析試料であれば、その定量結果は該化合物の残留量となる。さらに、数種類のピレスロイド系化合物が混在する試料についても、個々の化合物の残留値を定量したい場合には、液体クロマトグラフィ−などの既存の技術を利用し各成分への分画操作を加えればよい。
【００５２】
【実施例】
以下にエトフェンプロックスに対する抗体の製造方法、本抗体を用いたピレスロイド系化合物の検出法を実施例によって詳細に説明するが、本発明は本化合物や実施例のみに限定されるものではない。
【００５３】
実施例１  ハプテン化合物（Ｉ）中間体の合成
３−フェノキシベンジル  ２−４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇ、水素化ナトリウム０．３６ｇ、アセトニトリル２０ｍｌを約２０分間加熱還流した後、室温でブロモ酢酸メチル  ２ｍｌを滴下し、６０℃で２０分間攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル約５０ｍｌを加え、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−フェノキシベンジル  ２−｛４−（メトキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），３．４０（２Ｈ，ｓ），３．７９（３Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．３５（１３Ｈ，ｍ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７６３，１５８５，１４８８，１２５２，１２１３，１０８０
屈折率  ：１．５６４１（２１．６℃）
【００５４】
実施例２  ハプテン化合物（Ｉ）の合成
３−フェキシベンジル  ２−｛４−（メトキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル２．２ｇ、水酸化ナトリウム２．５ｇ、水７．５ｇ、エチレングリコール１０ｍｌを２．５時間加熱還流した。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．９ｇの３−フェノキシベンジル２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），３．４１（２Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６２（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．３５（１３Ｈ，ｍ），９．１０−９．９０（１Ｈ，ｂｒ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４１，１７３３，１５８５，１４８８，１２５０，１１８８，１０７６
屈折率  ：１．５６８０（２１．６℃）
【００５５】
実施例３  ハプテン化合物（ＩＩ）中間体の合成
３−（４−ヒドロキシフェノキシ）ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．１ｇ、水素化ナトリウム０．１７ｇ、アセトニトリル１０ｍｌを約２０分間、６０℃で攪拌した後、室温でブロモ酢酸エチル１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０分間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３９（３Ｈ，ｔ，    Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｓ），４．２１−４．３１（４Ｈ，ｍ），４．４２（２Ｈ，ｓ），４．６０（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．２７（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７５９，１５０５，１２４８，１１９２，１０８５
屈折率  ：１．５４６１（２０．４℃）
【００５６】
実施例４  ハプテン化合物（ＩＩ）の合成
３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水酸化ナトリウム０．９ｇ、水３．０ｇ、エチルアルコール１２ｍｌを１．５時間加熱還流した。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．７５ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｓ），  ４．００（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６６（２Ｈ，ｓ），６．８０−７．２７（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４４，１７３７，１５０５，１２４７，１２０５，１０８１
屈折率  ：１．５４４９（０．４℃）
【００５７】
実施例５  ハプテン化合物（ＩＩＩ）中間体の合成
３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニルオキシ｝ベンジルクロライド０．９ｇ、２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝  ２−メチルプロピルアルコール０．９ｇ、トリエチルベンジルアンモニウムクロライド０．１ｇ、水酸化ナトリウム３．５ｇ、水４．０ｇを４０〜５０℃で４時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して１．２ｇの３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニロキシ｝ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを得た。
【００５８】
３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニロキシ｝ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸０．０５ｇ、アセトン３０ｍｌを２時間加熱還流した。反応液を濃縮し３−（４−ヒドロキシフェニルオキシ）ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを油状物として得た。
【００５９】
３−（４−ヒドロキシフェニルオキシ）ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水素化ナトリウム０．１３ｇ、アセトニトリル１０ｍｌを約２０分間、６０℃で攪拌した後、室温でブロモ酢酸エチル１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０分間攪拌した。反応液をろ過し、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル  １．０ｇを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３３（６Ｈ，ｓ），３．４３（２Ｈ，ｓ），  ４．２８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６１（２Ｈ，ｓ），６．８３−７．３９（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７６０，１５０５，１１９８，１００８
屈折率  ：．４９８２（２３．８℃）
【００６０】
実施例６  ハプテン化合物（ＩＩＩ）の合成
３−｛４−（エトシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．０ｇ、水酸化ナトリウム０．９ｇ、水４．０ｇ、エチルアルコール２０ｍｌを６０℃で１．５時間攪拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで洗浄後、希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．７２ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ  ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３３（６Ｈ，ｓ），３．４４（２Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６６（２Ｈ，ｓ），６．８４−７．３９（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ    ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４９，１７３３，１５０６，１２０２，１０８２，１００８
屈折率  ：１．５５０１（２３．５℃）
【００６１】
実施例７
免疫原として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と実施例２および４で得たカルボン酸誘導体の２種の結合体を混合酸無水法を用いて作製した。３−フェノキシベンジル  ２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチロキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン化合物（Ｉ））、もしくは、３−４−（ヒドロキシカルボニルメチロキシ）フェノキシ｝ベンジル  ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン化合物（ＩＩ））の２５ｍｇを２ｍｌの無水ジオキサンに溶解し、０．０５ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加えて１０℃で２０分間撹拌し、０．０２ｍｌのイソブチルクロロカーボネートを添加し１５分間撹拌して、ハプテンの酸無水物溶液を調製した。一方、８０ｍｇのＢＳＡを４．３ｍｌの蒸留水に溶解して、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．０に調整した後、２．６ｍｌの無水ジオキサンを少しずつ添加した。このＢＳＡ溶液に１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９に保ちながら、先に調製したハプテンの酸無水物溶液を各々少しずつ加え、４℃で４時間撹拌して反応させた。得られた反応物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いたカラムで精製し、蒸留水で２４時間透析した後、凍結乾操して免疫原として使用した。また、抗原として用いるウサギ血清アルブミンとハプテン化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）との結合体も各々同様に調製した。
【００６２】
２種の各々の免疫原を２００μｇ／ｍｌになるように生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．９％ＮａＣｌ）に溶解し、フロイントの完全アジュバントと等量混合して油中水型エマルジョン状態にしたもの１ｍｌをウサギ（ＮＺＷ、雌、１３令）に皮下投与した。その後２週間毎に免疫原とフロイントの不完全アジュバントの混合エマルジョンを同様に追加免疫した。免疫後、採血して得られた血液を遠心分離して血清を取得し、更に血清を３３％の硫安で塩析したものを第一抗体として使用した。ハプテン化合物（Ｉ）とＢＳＡの結合体を免疫して得られた抗体を抗エトフェンプロックス抗体Ｉ（以下、Ｅ抗体Ｉと略す。）、ハプテン化合物（ＩＩ）とＢＳＡの結合体を免疫して得られた抗体を抗エトフェンプロックス抗体ＩＩ（以下、Ｅ抗体ＩＩと略す。）とする。
【００６３】
実施例８
Ｅ抗体Ｉを用いた以下のようなＥＬＩＳＡ法により、エトフェンプロックスを測定できた。
１．ポリスチレンの９６穴マイクロプレートに、コーティング抗原としてウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）とハプテン（Ｉ）の結合体を０．０３μｌ／ｗｅｌｌになるようにコーティング緩衝液（ｌ０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）に溶解したものを０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で添加し、４℃で一晩インキュベーションしてプレートに吸着させた。残った溶液を除去し、３％のスキムミルク溶液を０．３ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で添加し、２５℃で１時間インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣ１、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄して抗原吸着プレートを得た。
【００６４】
２．Ｅ抗体Ｉを希釈緩衝液（ｌ０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ）で２０，０００倍に希釈し、メタノールに溶解したエトフェンプロックス溶液と１：１の割合で混合し、反応溶液中の抗体濃度が４０，０００倍希釈、メタノール濃度が５０％になるようにして、２５℃で１時間インキュベーションして反応させた。この反応液を０．１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し、２５℃で１時間反応させた後、洗浄緩衝液でこのプレートを３回洗浄した。
【００６５】
３．西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を洗浄緩衝液で１０，０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し２５℃で１時間インキュベーションした後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【００６６】
４．ｏ−フェニレンジアミン発色溶液（０．２％（ｖ／ｖ）ｏ−フェニレンジアミン、１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．００３％（ｖ／ｖ）過酸化水素）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し、２５℃で１０分間インキュベーションしたのち、４Ｎ硫酸を０．０５ｍｌ／ｗｅｌｌづつプレートに添加して酵素反応を止め、その後、４９２および６３０ｎｍの吸光度を測定した。この方法により、１０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスの測定が可能であった。
【００６７】
一方、Ｅ抗体ＩＩを用いたＥＬＩＳＡでは、コーティング抗原としてハプテン化合物（ＩＩ）とＲＳＡの結合体の０．０１μｇ／ｍｌ溶液を用い、Ｅ抗体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液とエトフェンプロックスのメタノール溶液を４：１の割合で混合し、反応溶液中の抗体濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が２０％となるように混合して反応させた後、抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を５，０００倍希釈したものを用いることにより、先のＥＬＩＳＡと同様の方法で３ｎｇ／ｍｌから１，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスの測定ができた。
【００６８】
実施例９
試験例１の方法を用いて、水田土壌、作物（穀物、野菜、果実など）および水道水に含まれるエトフェンプロックスの測定が可能であった。すなわち、４０から４，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む土壌５ｇに水５ｍｌとメタノール１５ｍｌを添加して３０分間振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈したＥ抗体Ｉを３：１の割合で混合し、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法で測定できた。同様に、４０から４，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む作物１０ｇに水１０ｍｌとメタノール３０ｍｌを添加して３０分間振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈した抗体を３：１の割合で混合し、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法で測定できた。一方、３０から３，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む水道水８０ｍｌ、４０，０００倍希釈のＥ抗体ＩＩ溶液２００ｍｌ、および、メタノール８０ｍｌを混合し、反応溶液中抗体濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が２０％となるようにして２５℃で１時間反応させてＥＬＩＳＡ法で測定した。この方法で土壌及び作物中のエトフェンプロックスは４０から４，０００ｎｇ／ｍｌを測定でき、また、水道中のエトフェンプロックスは３０から３，０００ｎｇ／ｍｌを測定できた。
【００６９】
実施例１０
実施例８の方法と同様にして、コーティング抗原としてハプテン化合物ＩまたはＩＩとＲＳＡの結合体を９６穴マイクロプレートにコーティングし、試料中のエトフェンロックスと反応させたＥ抗体ＩまたはＥ抗体ＩＩをコーティング抗原と反応させた後、下記の方法でもエトフェンプロックスを検出できた。すなわち、ビオチンを結合した抗ウサギＩｇＧロバＩｇＧを洗浄用緩衝液で２，０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し２５℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。アルカリフォスファターゼを結合したアビジンを洗浄用緩衝液で１，０００倍に希釈して０．１ｍｌ／ｗｅｌｌず添加し、２５℃で１時間反応させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。アルカリフォスファターゼ発色溶液（０．１％ｐ−ニトロフェニルリン酸、９．７％ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）、０．００５％塩化マグネシウム）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で３０分間インキュベーションして発色させ、２Ｎの水酸化ナトリウムを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を止め、４１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定した。このアビジン−ビオチン法を用いた方法では、約１０ｎｇ／ｍｌ以上のエトフェンプロックスの測定ができた。
【００７０】
実施例１１
Ｅ抗体ＩとＥ抗体ＩＩを用いて実施例８の方法により各種ピレスロイド系化合物に対する交又反応性を測定した。ピレスロイド系化合物の各々のメタノール溶液（濃度２〜２０，０００ｎｇ／ｍｌ）と、希釈用緩衝液で２０，０００倍に希釈したＥ抗体Ｉの溶液を１：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベーションして反応させた。この反応液を用いて、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法による測定を行った。そして、ピレスロイド系化合物を加えずに反応させた場合の吸光度を１００％としてその５０％を阻害するエトフェンプロックスの濃度をＩＣ５０濃度とし、さらにエトフェンプロックスのＩＣ５０濃度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロイド系化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表（表１）に示した。
【００７１】
また、ピレスロイド系化合物の各々のメタノール溶液（濃度５〜５０，０００ｎｇ／ｍｌ）とＥ抗体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液を１：４の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベーションした反応液を用いて実施例８と同様に行ない、交又反応性を求めた。結果を上記と同様にしてエトフェンプロックスのＩＣ５０濃度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロイド系化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表（表１）に示した。
【００７２】
【表１】
0003543846.tif 000018
【００７３】
【発明の効果】
以上の各実施例から明らかなように、本発明によって、環境中の水、土壌、植物および食料に残留するピレスロイド系化合物の量を簡便かつ迅速に測定することが可能であった。