(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示す第600位の塩基から第671位の塩基までに存在する「gt」リピート領域より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する15〜30個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド又はその相補体、と前記リピート領域より下流に存在するヌクレオチド配列中連続する15〜30個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとからなる、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対。
【請求項２】
次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：5'-AAGTTTCCTTTCCGGTCTTA（配列番号：２）
リバーズプライマー：5'-CTACAAGCTTTACTGCACTAGC（配列番号：３）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
１型糖尿病にかかりやすい個体を同定するための請求項１又は２に記載のプライマー対。
【請求項４】
配列番号：４に示す第635位の塩基から第666位の塩基までに存在する「ca」リピート領域より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する15〜30個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド又はその相補体、と前記リピート領域より下流に存在するヌクレオチド配列中連続する15〜30個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとからなる、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対。
【請求項５】
次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：5'-AGGTGGGTTAGACAGAAATAG（配列番号：５）
リバーズプライマー：5'-GAGAGGTTTTGCTTGTCTT（配列番号：６）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項３に記載のプライマー対。
【請求項６】
１型糖尿病にかかりやすい個体を同定するための請求項４又は５に記載のプライマー対。
【請求項７】
配列番号：７に示す33位のヒスチジンのコドンCAC（塩基番号1900〜1902）より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する15〜30個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチド又はその相補体と、前記ヒスチジンのコドンより下流に存在するヌクレオチド配列中15〜30個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチド又はその相補体とから成る、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対。
【請求項８】
次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：5'-CAGTCTATGGATGAGGCAC（配列番号：８）
リバーズプライマー：5'-AAACTTGGACCACAACAGGTG（配列番号：９）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項５に記載のプライマー対。
【請求項９】
１型糖尿病にかかりやすい個体の同定のための請求項７又は８に記載のプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１型糖尿病感受性遺伝子又は１型糖尿病にかかりやすい個体の同定のためのプライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
１型糖尿病の発症に関与する遺伝的背景因子の同定に関しては、その発生頻度の高いコーカサス人集団を中心に研究が進められており、これまでに証明された遺伝子座位はＩＤＤＭ１−１５のほかいくつかの染色体上の位置が報告されている。しかしながらそれぞれの座位における疾患感受性遺伝子についてはＩＤＤＭ１（ＨＬＡ遺伝子）とＩＤＤＭ２のインスリン遺伝子を除きまだ証明されていない。
【０００３】
一方、１型糖尿病発症に関連する候補遺伝子疾患関連研究に関しては、これまで多くの遺伝子について報告がある。ＩＮＦ−γ、インターフェロン１受容体、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＴＮＦα、ケモカイン受容体などの関連性の報告があるが、民族集団により結果の相違を見るケースもある。
Ｔリンパ球には、そのサブセットとしてＴｈ１とＴｈ２という異なった２つのタイプが存在することが証明されており、１型糖尿病や多発性硬化症などの疾患はＴｈ１、アレルギーや全身性ルーブスエリテマトーデスなどはＴｈ２優位の疾患であると考えられている。
【０００４】
Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は、最近同定された転写因子でＴｈ１系の細胞に特異的に発現し、かつＴｈ２系細胞に強制的にＴ−ｂｅｔ遺伝子を発現させるとＴｈ１の性質を持つようになることから、Ｔｈ１系への分化に重要な働きを有することが示唆されている（Ｏ’Ｇａｒｒａ  Ａ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４０４  ：  ７１９−７２０  ；  Ｓｚａｂｏ  ＳＪ，  Ｋｌｍ  ＳＴ，  Ｃｏｓ  ｎ  ＧＬ，  ｅｔ  ａｌ．  ；  Ｃｅｌｌ．  １００  ：  ６５５−６６９）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子と１型糖尿病感受性との関係は知られていない。
従って、本発明は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の領域と１型糖尿病感受性との関連を解明し、１型糖尿病感受性に関連する遺伝子又は１型糖尿病にかかりやすい個体を同定するためのプライマーを提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべくゲノムＴ−ｂｅｔ遺伝子をクローニングし、その配列を決定した結果、ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子は６個のエキソンと５個のイントロンを有し、エキソン１にＧＴリピート（多型１と称する）が存在し、３’−非翻訳領域にＣＡリピート（多型２と称する）、そしてエキソン１のアミノ酸番号３３のコドン中に１塩基遺伝子多型が存在し、これらの多型が日本人集団における１型糖尿病と関連することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
従って本発明は、配列番号：１に示す第６００位の塩基から第６７１位の塩基までに存在する「ｇｔ」リピート領域より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する１０〜５０個のヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド又はその相補体、と前記リピート領域より下流に存在するヌクレオチド配列中連続する１０〜５０個のヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドとからなる、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対を提供する。
【０００８】
上記のプライマー対の具体例として、次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：５’−ＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＴＡ（配列番号：２）
リバーズプライマー：５’−ＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＣＴＡＧＣ（配列番号：３）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項５に記載のプライマー対が挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、配列番号：４に示す第６３５位の塩基から第６６６位の塩基までに存在する「ｃａ」リピート領域より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する１０〜５０個のヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド又はその相補体、と前記リピート領域より下流に存在するヌクレオチド配列中連続する１０〜５０個のヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドとからなる、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対が挙げられる。
【００１０】
上記プライマー対の具体例として、次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：５’−ＡＧＧＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧ（配列番号：５）
リバーズプライマー：５’−ＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴ（配列番号：６）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項３に記載のプライマー対が挙げられる。
【００１１】
本発明はさらに、配列番号：７に示す３３位のヒスチジンのコドンＣＡＣ（塩基番号１９００〜１９０２）より上流に存在するヌクレオチド配列中連続する１０〜５０個の連続するヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド又はその相補体と、前記ヒスチジンのコドンより下流に存在するヌクレオチド配列中１０〜５０個の連続するヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド又はその相補体とから成る、１型糖尿病感受性遺伝子同定用プライマー対を提供する。
【００１２】
上記プライマー対の具体例として、次のヌクレオチド配列：
フォワードプライマー：５’−ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣ（配列番号：８）
リバーズプライマー：５’−ＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧ（配列番号：９）
を有する２個のオリゴヌクレオチドから成る、請求項５に記載のプライマー対が挙げられる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まず、ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子はそのｃＤＮＡ情報しか登録されておらずゲノム情報は未発表のため、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているクローンをＴ−ｂｅｔ遺伝子ｃＤＮＡ情報を用いてスクリーニングした結果、ゲノムクローンを同定し（ｃｌｏｎｅ  ｈＣＩＴ．２１１＃Ｐ＃７，  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＣ００３６６５）この中にヒトｔ−ｂｅｔ遺伝子が存在することを確認した。その結果、遺伝子の構造としては、６個のエキソンと５つのイントロンからなると推定された。イントロン領域にはいくつかのマイクロサテライトの可能性があるリピート配列が存在し、我々はそれらの解析の結果、エキソン１にＧＴリピート（多型１）と３’ＵＴＲ領域にＣＡリピート（多型２）マイクロサテライト多型が存在することを同定した。
【００１４】
またエキソン１内のアミノ酸番号３３のヒスチジンはグルタミンに置換した１塩基遺伝子多型（多型３）があることが同定された。これらｔ−ｂｅｔ遺伝子内の３カ所を遺伝子多型を日本人集団における１型糖尿病への関与を疾患関連研究法で解析し、その結果、３カ所の遺伝子多型のそれぞれ特定の遺伝子多型が１型糖尿病患者において統計学的に有意に多く、疾患感受性遺伝子であることが強く示唆された。すなわち疾患感受性遺伝子と同定された。
【００１５】
従って、本発明における多型１のＧＴリピート数を決定するための増幅用プライマーとしては、ＧＴリピートの上流の任意の位置にあるヌクレオチド配列に対応するホワードプライマーとＧＴリピートの下流の任意の位置にあるヌクレオチド配列に対応するリバーズプライマーとから成るプライマー対が使用される。
同様に、多型２のＣＡリピート数を決定するための増幅用プライマーとしては、ＣＡリピートの上流の任意の位置にあるヌクレオチド配列に対応するホワードプライマーと、ＡＣリピートの下流の任意の位置にあるヌクレオチド配列に対応するリバーズプライマーとから成るプライマー対が使用される。
【００１６】
さらに、多型３の検出用プライマーとしては、塩基置換多型部位であるＣＡＣ（Ｈｉｓ）／ＣＡＧ（Ｇｌｎ）部位より上流の任意の位置のヌクレオチド配列に対応するホワードプライマーと、前記多型部位より下流にあるヌクレオチド配列に対応するリバーズプライマーとから成るプライマー対が使用される。
【００１７】
多型１及び多型２のリピート数を決定するためのホワードプライマーが対応するゲノム配列の位置としては、リピートの上流末端からおよそ６００塩基の位置にある塩基と、リピートの上流末端からすぐ上流の塩基との間にある任意の配列であることができる。また、多型１及び多型２のリピート数を決定するためのリバーズプライマーが対応するゲノム配列の位置としては、リピートの下流末端からおよそ６００塩基の位置にある塩基と、リピートの下流末端のすぐ下流の塩基との間にある任意の配列であることができる。
【００１８】
しかしながら、ホワードプライマーに対応するゲノム上の位置としては、リピートの上流末端から上流方向に３００塩基以内にあることが好ましく、１５０塩基以内にあることがさらに好ましく、例えば５０塩基以内にあることが好ましい。また、リバーズプライマーに対応するゲノム上の位置としては、リピートの下流末端から下流方向に３００塩基以内にあることが好ましく、１５０塩基以内にあることがさらに好ましく、例えば５０塩基以内にあることが好ましい。
【００１９】
多型３検出用のホワードプライマーに対応するゲノム上の位置としては、多型部位から上流１５００ヌクレオチドの範囲内が好ましく、１０００ヌクレオチドの塩基がさらに好ましく、例えば５００ヌクレオチド以内にあるのが好ましい。多型３検出用のリバーズプライマーに対応するゲノム上の位置としては、多型部位から下流１５００ヌクレオチドの範囲内が好ましく、１０００ヌクレオチドの範囲内がさらに好ましく、例えば５００ヌクレオチドの範囲内が好ましい。
【００２０】
プライマーの長さは、常用のＰＣＲ技術に関する知見に基いて定められ、通常１０〜５０ヌクレオチドの長さ、より一般的には１５〜４０ヌクレオチドの長さ、例えば１５〜３０ヌクレオチドの長さである。
プライマーの塩基配列としては、対応するゲノム上の配列と完全に同一であるか、又は正確な相補体であることが好ましいが、完全に一致しなくても特定の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得ることは明らかである。従って、ゲノム配列のある領域に「対応する」プライマーの配列としては、ゲノム配列の対応領域と完全に同一の配列及び正確な相補体である配列（これらを含めて、完全に一致する配列と称する）のほかに、これらの完全に一致する配列に対して１０ヌクレオチド当たり、１〜３ヌクレオチド異る程度の相同性ヌクレオチド配列も含まれる。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例
（１）多型１を同定するために、ゲノムクローンの塩基配列をもとにして、ＰＣＲプライマーセットの塩基配列を決定し、ＰＣＲでこの多型を含む領域を増幅後にアプライドバイオシステム社の３１０  ＰＲＩＳＭ装置並びに解析ソフトＧｅｎｅＳｃａｎを用いて、各個人のマイクロサテライトマーカーの長さを同定した。
【００２２】
（２）多型２を同定するために、多型１と同様にゲノムクローンの塩基配列をもとにして、ＰＣＲプライマーセットの塩基配列を決定し、ＰＣＲでこの多型を含む領域を増幅後各個人のマイクロサテライトマーカーの長さを同定した。
（３）多型３を同定するため、この多型を含む領域を増幅するＰＣＲプライマーセット塩基配列を決定し、ＰＣＲで増幅後に制限酵素Ｅｃｏ４７  ＩＩＩで処理することで多型を同定した。
【００２３】
まず、各試料から鋳型ＤＮＡを次のようにして調製した。末梢血約０．５ｍｌより、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ、キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ量は、吸光度を測定（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  、島津社製）することで定量した。
（１）多型１を解析するためのＰＣＲプライマーセットの塩基配列
ホワードプライマー：５’−ＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＴＡ（配列番号：２）
リバーズプライマー：５’−ＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＣＴＡＧＣ（配列番号：３）
上記のプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物は、ＧＴリピートの繰り返し数により、日本人集団では配列番号：１に示す多型を含めて２６種類の多型性を有していた。
【００２４】
結果を次の表１及び表２に示す。
【表１】
0003551312.tif 000002
【００２５】
【表２】
0003551312.tif 000003
【００２６】
表１及び表２は、正常者からの試料２００個（対立遺伝子数４００個）、１型糖尿病患者からの全試料１５３個（対立遺伝子数３０６個）、及び発病が１０歳以下の１型糖尿病患者からの試料１０９個（対立遺伝子数２１８個）について、多型１の各対立遺伝子型（ＧＴ反復数）に属する対立遺伝子の個数及び頻度分布（％）、並びにこれらを正常者からの試料と１型糖尿病患者からの試料について比較したＰ値を示す。なお、検定は、カイ自乗検定にて行い、Ｐ値が０．０５以下を有意と判定した。
【００２７】
以上の結果から、対立遺伝子１４における対立遺伝子頻度において、正常者と１型糖尿病者間、また正常者と１０歳以下の発症の１型糖尿病者間で統計学的に有意な差異を認めた。
【００２８】
（２）多型２を解析するためのＰＣＲプライマーセットの塩基配列
ホワードプライマー：５’−ＡＧＧＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧ（配列番号：４）
リバーズプライマー：５’−ＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴ（配列番号：５）
上記のプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物は、ＣＡリピートの繰り返し数により、日本人集団では配列番号：３に示す多型を含めて６種類の多型性を有する。
結果を次の表３に示す。
【００２９】
【表３】
0003551312.tif 000004
【００３０】
表３は、正常者からの試料２００個（対立遺伝子数４００個）、１型糖尿病患者からの全試料１５３個（対立遺伝子数３０６個）、及び発病が１０歳以下の１型糖尿病患者からの試料１０９個（対立遺伝子数２１８個）について、多型２の各対立遺伝子型（ＡＣ反復数）に属する対立遺伝子の個数及び頻度分布（％）、並びにそれらを正常者からの試料と１型糖尿病患者からの試料について比較したＰ位を示す。
以上の結果から、対立遺伝子２における対立遺伝子頻度において、正常者と１型糖尿病者間、また正常者と１０歳以下の発症の１型糖尿病者間で統計学的に有意な差異を認めた。
【００３１】
（３）多型３を同定のＰＣＲプライマーセットの塩基配列
ホワードプライマー：５’−ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣ（配列番号：８）
リバーズプライマー：５’−ＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧ（配列番号：９）
上記のプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物は、ヒスチジン対立遺伝子型はＥｃｏ４７  ＩＩＩで消化されないがグルタミン対立遺伝子型は２本に消化される。このことを利用して、アミノ酸番号３３のヒスチジン・グルタミン遺伝子多型の区別が可能である。
【００３２】
ＰＣＲ法にて上記の下線の塩基配列で増幅される１４８４塩基対のフラグメントは、制限酵素Ｅｃｏ４７  ＩＩＩ処理にて、Ｈｉｓ対立遺伝子は６８０塩基対と８０４塩基対に消化されたが、Ｇｌｎ対立遺伝子は新たなＥｃｏ４７  ＩＩＩ消化部位の出現により３３０塩基対、３５０塩基対と８０４塩基対に消化された。
【００３３】
【表４】
0003551312.tif 000005
Ｈｉｓ（３３）型対立遺伝子及びＧｌｎ（３３）型対立遺伝子のヌクレオチド配列の例を配列番号：１０及び配列番号：１１に示す。
結果を、表５に示す。
【００３４】
【表５】
0003551312.tif 000006
表５は、正常者からの試料２００個（対立遺伝子数４００個）、１型糖尿病患者からの全試料１５３個（対立遺伝子数３０６個）、発病が１０歳以下の１型糖尿病患者からの試料１０９個（対立遺伝子数２１８個）及び発病が１０歳以上の糖尿病患者からの試料４４個（対立遺伝子数８８個）について、遺伝子型Ｈｉｓ３３／Ｈｉｓ３３、Ｈｉｓ３３／Ｇｌｎ３３、及びＧｌｎ３３／Ｇｌｎ３３に属する遺伝子型の数及び頻度（％）、並びにそれらの比較により得られるＰ値を示す。検定は、カイ自乗検定にて行い、Ｐ値が０．０５以下を有意と判定した。
【００３５】
上記の表より、正常患者に比べて１型糖尿病患者において、Ｈｉｓ３３／Ｇｌｎ３３の比率が高いことがわかる。
以上の結果から、多型１においてＧＴ反復数が４９の個体、多型２においてＡＣ反復数が１２の個体、及び多型３において遺伝子型Ｇｌｎ３３を有する個体は、１型糖尿病にかかる可能性が高いと予想される。
【００３６】
【配列表】
0003551312.tif 000007
0003551312.tif 000008
0003551312.tif 000009
0003551312.tif 000010
0003551312.tif 000011
0003551312.tif 000012
0003551312.tif 000013
0003551312.tif 000014