(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導された組織再生に使用するための吸収性コラーゲン膜であって、哺乳動物の体への移植に生理学的に許容され、そして実質的にその天然コラーゲン構造を保持している天然コラーゲン膜から誘導される精製されたコラーゲン膜から成り、その膜の一方の面は繊維性でその上での細胞の増殖を可能にし、その膜の逆の面は平滑で細胞の接着を阻害してそこを細胞が通過するのを防止する障壁として働く膜。
【請求項２】
哺乳動物の腹膜もしくは心膜、胎盤膿または基底膜から誘導される請求項１に記載の膜。
【請求項３】
子ウシまたは子ブタから誘導される請求項２に記載の膜。
【請求項４】
６〜７週齢の子ブタから誘導される請求項３に記載の膜。
【請求項５】
実質的に脂肪を含まない請求項１〜４のいずれかに記載の膜。
【請求項６】
乾燥時の厚さは0.1〜1.0mmである請求項１〜５のいずれかに記載の膜。
【請求項７】
コラーゲンは非吸収性にならない程度に架橋されている請求項１〜６のいずれかに記載の膜。
【請求項８】
繊維性の側にはグリコサミノグリカンが含浸されている請求項１〜７のいずれかに記載の膜。
【請求項９】
繊維性の側にはヒアルロン酸が含浸されている請求項８に記載の膿。
【請求項１０】
繊維性の側にはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸および／またはケラチン硫酸が含浸されている請求項８に記載の膜。
【請求項１１】
膜はグリコサミノグリカン0.1〜30.0重量％を含有する請求項８〜10のいずれかに記載の膜。
【請求項１２】
１種または２種以上の医薬を含有する請求項１〜11のいずれかに記載の膜。
【請求項１３】
タウロリジンを含有する請求項12に記載の膜。
【請求項１４】
平滑面と繊維性面を有する哺乳動物コラーゲン膜をアルカリ処理に付して脂肪の鹸化およびアルカリ感受性物質を除去し、ついで酸性にして酸感受性物質を除去し、続いて洗浄、乾燥、脱脂および所望により架橋を行うことにより、その天然コラーゲン構造を実質的に保持する膜を形成する、請求項１に記載の膜の製造方法。
【請求項１５】
膜の繊維性の側にグリコサミノグリカンを含浸させる請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は創傷の癒合に関し、さらに詳しくは誘導された組織再生におけるコラーゲン含有膜の使用に関する。
手術後、とくに口腔または歯科手術後のように創傷の癒合が望ましい場合に、再生が必要な領域内への他の組織の内方成長を防止する状態の提供は困難なことが明らかにされている。すなわち、たとえば齲食または疾病により歯根の実質的な部分が除去された場合、失われた骨組織を置換するために健康な骨の再生が起こることが望ましい。しかしながら、骨の除去によって残された空洞は結合組織によって速やかに充填され、この結合組織の内方成長が骨の再生を事実上防止することが見出されている。
このような問題を克服するために、「組織再生誘導」として知られる技術が開発されてきた。この方法では、創傷の空洞部の縁の周囲に膜が外科的に挿入される。膜は、望ましくない細胞種による創傷の空洞部の侵攻を防止または遮蔽し、かくして好ましい細胞が空洞部内で増殖し、このことにより創傷が癒合する。
組織再生の誘導には現在２種類の膜、すなわち、
１）  合成、非吸収性PTEE膜、たとえばGoretex（登録商標）、
ならびに
２）  グリコリドおよびラクチド共重合体から形成された合成吸収性膜
が使用されている。
しかしながら、これらの２種類の膜にはいずれも重大な欠点がある。PTEE膜は、適当な多孔性、強度および可撓性の特徴を示すが、非吸収性であるために膜の除去に再度の外科的手術が必要になる。さらに手術操作が必要なことは患者が外傷を受けることになり、再生された新しい組織も傷害され、したがって処置期間が長くなる。
第二の種類の膜はグリコリドとラクチド共重合体の繊維で織られている。この膜は吸収性ではあるが、分解生成物が刺激性で、この刺激は患者に望ましくない影響を与える場合がある。
いずれの従来技術の膜も、フィルターとして作用し、液体は自由に通過させるが、細胞には障壁を形成する。しかしながら、膜の表面は「細胞友好性」ではない。すなわち、それは血餅を安定化せず、また細胞の増殖を支持しない。したがって、いずれの従来技術の膜も細胞増殖および創傷癒合に至適な条件を提供するものではない。
本発明者らは、組織再生の誘導に理想的な特性を有する膜を発見した。
本発明は、組織再生の誘導に使用するための吸収性コラーゲン膜であって、その膜の一方の面は繊維性でその上での細胞増殖を可能にし、膜の逆の面は平滑でその上への細胞の接着は阻止される膜を提供する。
すなわち、膜の２つの反対の側もしくは面が、細胞増殖に異なる影響を与える異なる組織を有する。
平滑な側は、細胞の内方増殖を遮蔽するための障壁またはフィルターとして働き、物理的な分離を介して膜によって囲まれた空洞部に望ましくない種類の細胞が侵入することを防止する。これと対照的に、膜の繊維性の側は止血性で（血餅を安定化する）、新たな細胞に対して適当な支持体を提供することにより細胞の増殖を補助する。したがって、使用に際しては、膜は、平滑な面が外側に、繊維性の面が再生の望まれる細胞に面するように挿入されなければならない。
誘導された組織再生に使用される本発明の膜は、天然のコラーゲン膜に由来するものとすることができる。天然の原料に由来することから、本発明に使用される膜は生体内において完全に吸収され、毒性の分解生成物を形成することはない。
しかもこの膜は、乾燥および湿潤のいずれの状態でも、繊維材料の場合に匹敵する引き裂き力および引き裂き伝播抵抗性を有する。したがって、この膜は、必要があれば外科的に縫い綴じることができる。この膜材料は親水性が強く、湿潤した場合に良好な接着性を有するので、互いにいくつかの層に重ね合わせることが可能である。湿気を含んだ場合には伸縮性に富み、不規則な形状のまたは凹凸のある創傷を適切に被覆することが可能である。
ヒトおよび動物のいずれにおいても、重要な臓器を取り囲み、異なる組織および細胞を分離する膜はコラーゲンからできている。このような膜の例には、大規模なものでは心膜および胎盤膜が、小規模なものでは基底膜がある。
コラーゲンの製品は現在、医用に広く用いられている。可溶性コラーゲン、コラーゲン繊維、スポンジ、膜および骨インプラントを含めて様々なコラーゲン材料が利用可能で、この材料の多様な利用、たとえば止血用のコラーゲン繊維およびスポンジ、創傷の保護または移植体用のコラーゲン膜、ならびに形成外科における可溶性コラーゲンの注入などが可能になっている。それにもかかわらず、コラーゲン膜が組織再生の誘導に適当であることは、これまで認識されたことはなかったのである。
様々な人工のコラーゲン含有膜が、従来のカットに記載されてきたし、創傷の包帯または被覆材として提案されている。すなわち、WO−Ａ−88/08305（TheUniversity of California理事）には、ヒト表皮細胞層とコラーゲンおよびムコポリサッカライドから形成できる生合成膜の層とを合体させた組成の複合皮膚代替物が記載されている。しかしながら、コラーゲン／ムコポリサッカライドの部分は全体を通じて均一な性質であって、組織再生の誘導のために本発明で提案される膜の性質は示さない。さらに、この種類の膜は免疫反応性が強くて、細胞のドナーに対してしか使用できない。他の人工コラーゲン含有膜が、DE−Ａ−2631909（Massachusetts Institute of Technology）に記載されている。この膜は最低限２層からなり、第一の層はコラーゲンとムコポリサッカライドの配合物であり、第二の層はポリアクリレートのような合成ポリマーである。しかしながらこの膜は全体として非吸収性である。コラーゲン層は内部で極めて強固に架橋されているので吸収が起こらない。
本発明に使用される膜は、天然に存在する膜から可能な限りそれらの天然のコラーゲン構造を残して直接誘導することができる。膜の原料には、銀面側を有する獣皮の切片、腱、動物の各種の膜等が包含される。膜の好ましい原料は、とくに子ウシまたは子ブタから採取される天然の腹膜である。６〜７週齢の子ブタ（体重60〜80kg）からの腹膜がとくに好ましい。
本発明に使用される膜の材料は、好ましくは純粋な、ネイティブの（変性していない）不溶性コラーゲンから構成される必要がある。しかしながら動物の体内では、コラーゲンは、望ましくない化学的、物理的および生理学的性質を有する多数の物質を伴っている。したがって、コラーゲンは、精製してこれらの物質を除去しなければならない。このような物質の性質は千差万別であることから、酵素的な精製は事実上不可能である。したがって、精製は化学的に、コラーゲンの化学的構造の変化を最小限に抑え、その本来のネイティブな性質が保持されるように注意して行うことが好ましい。
本発明のさらに他の態様においては、本発明は、平滑な面と繊維性の面を有する哺乳動物のコラーゲン膜をアリカリ処理に付して脂肪の鹸化とアルカリ感受性物質の分解を行い、次に酸性にして酸感受性物質を分解し、続いて洗浄、乾燥、脱脂および所望により架橋を実施することによる上述のような膜の製造方法を提供する。
精製時に以下の変化が起こる。
−非コラーゲン性タンパク質は除去される。
−グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンは溶解され除去される。
−脂肪は部分加水分解され、完全に除去される。
この種の処理時に、以下のような望ましくない変化が起こる可能性がある。
−アスパラギンおよびグルタミンのアミド基の加水分解
−等電点の変化
−架橋結合の切断
−イソペプチドの形成を伴うアミド基転移
−アミノ酸のラセミ化
−ペプチド結合の切断。
膜中のアミド窒素のレベルは、これらの変化の指標として有効である。たとえば、アミド窒素含量が約半分に（すなわち、0.7mmol/gから0.35mmol/gに）低下しても、コラーゲンの95％以上はまだ、そのネイティブな状態で存在することが見出されている。この測定は、アミノ酸のアスパラギンとグルタミン中のアミド基の加水分解に基づくものである。
0003577083.tif 000002
コラーゲンの精製の程度はアミノ酸分析によって測定できる。コラーゲンは加水分解されてアミノ酸を形成する。これは、この分析が純粋なコラーゲンおよび非コラーゲン性タンパク質の除去を指示するものであるが、コラーゲンの変性を指示するものではないことを意味する。
コラーゲンのアミノ酸分析とともに、グリコサミンおよびプロテオグリカン含量も分析できる。これらの夾雑物は加水分解され、モノマーのグリコサミンおよびヘキソサミンの膜中の含量がクロマトグラフィーによって測定される。精製後のグリコサミンおよびガラクトサミンの量はアミノ酸10,000分子に対して約１分子であることが明らかにされている。
膜の製造の一方法においては、原料物質を最初にアルカリで処理する。この工程には、NaOHの溶液を0.2〜４重量％の濃度で使用する。脂肪は鹸化され、アルカリ感受性の夾雑タンパク質はアルカリに感受性の他の物質たとえばグリコサミノグリカン、プロテオグリカン等とともに除去される。この過程はアミド窒素の測定によって制御される。アルカリ処理の終了時には、アミド窒素のレベルは0.3〜0.5mmol/gでなければならない。
第二の工程は材料の、無機酸、通常は塩酸による処理である。酸感受性夾雑物が除去され、繊維は著しく膨潤し、この方法で繊維構造がゆるめられる。酸処理は材料が均一に酸性になるまで継続される。
この後に、材料を洗浄する。材料の洗浄は、pHが0.5〜1.5（HClによる酸処理時）から2.5〜3.5に変化するまで行うのが有用であることがわかっている。洗浄は好ましくは蒸留水で行われる。
膨潤した材料は、この時点で平担にして（分割させて）均一の厚さにすることができる。以後の工程は材料の解膨潤操作、中和および完全な洗浄を包含する。このために、材料をまず酸性（pH2.8〜3.5）食塩溶液（濃度５〜10重量％）で処理する。こうして材料は完全に解膨潤される。ついで過剰のわずかにアルカリ性の蒸留水で、材料のpHが5.8〜6.5に達するまで洗浄する。次に、材料を蒸留水（pH6.0）で完全に洗浄する。これで製造の最初の段階、すなわち精製は終了する。これに続いて乾燥と脱脂が行われる。
この材料をアセトンで反復洗浄して乾燥する。これによってコラーゲン繊維の収縮が起こり、その結果として、目の粗い構造が維持される。脱脂はｎ−ヘキサンで行われる。これによって最後の痕跡の疎水性物質が材料から除去される。
本発明による誘導された組織再生に使用される膜の乾燥時の厚さは理想的には0.1〜1.0mmであるが、これは材料の膨潤性によっても変動する。
したがって、膜は、所望の厚さを達成するために膜の二重構造が維持されることを条件に、分割または切断させることができる。
膜はさらに、特定の創傷の種類に好都合なように、その性質を適合させる処理を行うこともできる。すなわち、膜のコラーゲンを架橋して膜を安定化し、生体による吸収速度を低下させることもできる。
これまで知られている医療用製品に用いられるすべての架橋剤が膜に使用できる（たとえば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）。物理的には架橋は熱の適用によって実施できる。この場合には、架橋効果は明らかに低いが、大部分の適用においてこれで十分である。膜のコラーゲンは100〜120℃に加熱することにより（30分〜５時間）物理的に架橋するのが便利で、これにより分解時間は延長される。
導入される架橋結合の程度は、膜の再吸収の速度が新しい組織の成長および創傷の癒合に相関するようにするのが有利である。たとえば、骨細胞が歯の空洞に再生されるのには約６週を要し、したがってその種類の創傷の内張りには８〜12週の間に吸収される膜が適当であろう。膜が強度に架橋されてはならないことは明らかで、そうでないと吸収速度が遅すぎて、極端な場合には膜は非吸収性になってしまう。
膜に実施できる他の修飾には、繊維性側へのグリコサミノグリカン（GAG）たとえばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸またはケラチン硫酸のコーティングまたは含浸がある。
ヒアルロン酸のようなグリコサミノグリカンは、組織構造に影響する調整分子として重要である。それらは、
−細胞の浸潤
−フィブリンマトリックスの形成および分解
−マトリックスの膨潤
−貪食作用
−血管新生
に好ましい影響を与える。
傷害の直後には、創傷内のGAG含量は増大する。ヒアルロン酸ならびに関連GAGはフィブリンに結合して三次元マトリックス（血餅）を形成し、これがフィブリンマトリックス内に織り込まれる。これによって元のフィブリンマトリックスは変形し、膨潤し、さらに多孔性になる。これが、マトリックス内への細胞の浸潤および移動の改善および促進をもたらす。
ヒアルロン酸およびフィブリノーゲンは、一方または他方の分子が固体状態であっても、互いに特異的に反応する。
傷害の炎症段階では、ヒアルロン酸は顆粒球の機能を刺激し、多形核白血球の表面の性質を変化させ、細胞の貪食活性を調整する。
ヒアルロン酸フィブリンマトリックスの変換および分解段階では、ヒアルロン酸の小さなフラグメントが産生される。ヒアルロン酸の小フラグメントは新たな血管の構築を刺激する。
それらに加えてヒアルロン酸のようなGAGには、宿主動物においてコラーゲンが免疫反応を誘発できなくする作用がある。これが達成されるためには、コラーゲンは、少なくとも１重量％のGAG酸と反応しなければならない。
GAGは構造タンパク質および生物活性タンパク質の担体である。GAGタンパク質複合体は、胎児において無瘢痕創傷治癒に重要な役割を果たしていることが明らかにされている。
この理由から、コラーゲン膜にGAGたとえばヒアルロン酸を含浸させると、創傷または骨損傷内における組織再生の改善を生じる。
さらに他の態様として、本発明は、誘導された組織再生に使用するための膜であってその膜の一方の面は平滑な構造で、逆の面は繊維性の構造を有し、膜には１種またはそれ以上のGAGが含浸されている膜を提供する。
GAGの濃度は膜の厚み方向に向かって上昇し、GAGの濃度は膜の繊維性の側で最高になることが好ましい。
GAG材料はゲルとして膜の繊維性の面上に広げ、ついで乾燥させることによって膜内に導入することができる。このアプローチによれば、膜内に向けて低下する濃度勾配が達成され、GAGが膜全体に完全に浸透することはない。
理論的考察に限定することを意図するものではないが、高分子量GAGの鎖は新しい細胞を膜表面下に導く働きを示し、ついで細胞増殖の支持体として作用するものと考えられる。
したがって、膜の繊維性の面はGAGを包含する複合マトリックスの形態であることがとくに有利である。
ヒアルロン酸および他のGAGは生体内に天然に存在し、皮膚には19％、腹膜には13％のヒアルロン酸（重量％）が含まれている。天然に存在する物質としてGAGには毒性および吸収に関して何の問題も生じないばかりか、むしろ細胞に対する天然の栄養物質として働くことが考えられる。ヒアルロン酸ならびに他のGAGは工業的に製造されていて、したがって容易に大量を入手できる。
本発明の膜には、0.1〜30重量％のGAG、たとえばヒアルロン酸たとえば２〜10重量％を含有させるのが有利である。
所望により、他の医薬、たとえば抗生物質（たとえば、テトラサイクリン）、化学療法剤（たとえば、タウロリジン）および他の薬剤を膜内に導入することもできる。
本発明はまた、組織再生を誘導する移植体として使用するため複合マトリックスの製造における添加物として所望により１種またはそれ以上のGAGたとえばヒアルロン酸を含有する上述の吸収性の膜の使用を提供する。
誘導された組織再生における膜のとくに有利な適用の一つは、口腔顔面または歯科外科手術後の適用である。この領域では、たとえば歯根の部分除去または顎部の切断後に、骨の再生を起こさせることが重要な場合が多い。狭い口腔顔面領域は外科手術が難しく、したがって、誘導された組織再生のための非毒性の完全に吸収性の移植体は極めて有利である。さらに膜の性質は、骨細胞（骨組織）の成長の促進にとくに適している。
本発明はさらに、ヒトまたは非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）生体の創傷または損傷の処置方法において、上述の膜をその繊維性の側が組織再生の要求される領域に面するように配置して創傷または損傷部に膜を適用することからなる方法を提供する。この方法は口腔顔面領域の創傷または損傷の処置にとくに適している。
図１は、歯（１）の根（２）の周囲に著しい骨損傷を生じ、通常は健康な根が充填されている部分に空洞（３）を生じた歯の骨再生のために使用された本発明の膜を示している。根（２）は結合組織もしくは歯肉（４）の層を通って歯槽骨（５）中に突出している。結合組織（４）の空洞（３）内への内方成長を防止するため、創傷の最外縁部の周囲に膜の被覆（６）が配置される。膜（６）は創傷の空洞部（３）の全周囲に適用される。膜（６）は空洞部（３）の反対側に面する平滑面（７）と空洞部（３）に面する繊維性の面（８）を有する。繊維性の面（８）は歯根（２）の外側に新しい細胞が成長するための支持表面を提供し、一方、膜（６）の平滑面側（７）は結合組織（４）の細胞が創傷空洞部に侵入することを防止する。膜（６）は徐々に生体に吸収され、膜の吸収は創傷の治癒に要する時間と相関することが最適である。
本発明をさらに以下の非限定的実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例
若い子ウシからの腹膜から機械的手段で肉および脂肪を完全に除去し、流水で洗浄し、２％NaOH溶液で12時間処理する。ついで膜を流水下に洗浄し、0.5％のHClで酸性にする。この材料がその全厚みを通じて完全に酸性化されたのち（約３時間）、材料をpHが3.5になるまで洗浄する。次に材料を７％食塩溶液で収縮させ、１％NaHCO3で中和して、流水下に洗浄する。この材料をついでアセトンで脱水し、ｎ−ヘキサンで脱脂する。この材料のアミド窒素含量は0.47mmol/gである。
アミド窒素含量の測定
（Eastoe,E.＆ Courts,A.:Practical Analytical Methods for ConnectiveTissue Proteins,1963）
試剤
1.  2N HCl（160mlの濃塩酸を１リットルにする）
2.  0.05Mホウ砂−0.15N NaOH溶液（19.1gのNa2B4O7・10H2Oと6gのNaOHに冷蒸留水を加えて１リットルにする）
3.  指示薬−エタノール中に混合（0.33％メチレンブルー＋0.05％メチレンレッド）
4.  指示薬含有１％ホウ酸
１リットルの蒸留水中10gのホウ酸
8mlの指示薬
0.7mlの0.1N−NaOH
5.  0.01N HCl
方法
1.  1gのコラーゲン塊を50mlの2N HClに分散して１時間煮沸する。容量を20℃で50mlにする。
2.  この分散液5mlをミクロキエルダールフラスコに、20mlの溶液２とともに取り混合物を20mlの溶液４中で蒸留する．蒸留には６分を要す。
分を要す。
3.  この溶液を試剤５で滴定する。
計算
酸消費量（ml）×20＝mmol％アミドＮ
例
0.01N HClの1.36ml×20＝27.2mmol％
＝0.27mmol/gアミドＮ
【図１】
0003577083.tif 000003