(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センチニクバエ胚の株化細胞由来ザーペシン前駆体をコードする遺伝子の制限酵素SalＩ及びBamH I断片部分を、ペニシリウム・カマンベルチイＦＥＲＭＰ−１０４５２由来のモノ及びジグリセロールリパーゼをコードする遺伝子の上流に位置するプロモーター並びにモノ及びジグリセロールリパーゼをコードする遺伝子のプレプロ及びマチュアーからなる領域とターミネーター領域との間に挿入してなるプラスミドを、糸状菌に導入して得られた形質転換体を栄養培地で培養し、培養物中にザーペシンを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするザーペシンの製造法。
【請求項２】
糸状菌が、ペニシリウム・カマンベルチイ又はアスペルギルス・オリゼである請求項１記載のザーペシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糸状菌もしくは酵母を宿主として有用蛋白質およびペプチドを分泌発現させるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術においては、目的とする蛋白質の生産量は、プロモーター、ターミネーターなどの転写に関わる因子、アミノ酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、蛋白質への糖鎖付加、発現した蛋白質の細胞内での存在様式（分泌過程における移動も含む）などの翻訳後に関わる因子、遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテアーゼなど発現蛋白質の安定性に関わる因子など、多くの因子により影響を受ける。
【０００３】
糸状菌におけるプロモーターを異種蛋白質高発現に利用した例は、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ５，  ３６９  （１９８７））、トリコデルマ・リーセイ由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子のプロモーター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７，  ５９６  （１９８９））、アスペルギルス・オリゼ由来のアルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  １４１９  （１９８８））の場合などがある。しかしながらペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のプロモーターを異種蛋白質高発現に利用した例はなかった。
【０００４】
また、使用する宿主は、一つのプロモーターに対し通常そのプロモーターの供与菌のみが使用できるのみであり、一つのプロモーターが複数の糸状菌を宿主として効率よく機能した例、あるいはさらに糸状菌と酵母両宿主において利用可能なプロモーターを用いた異種蛋白質の発現用プラスミドは存在しなかった。
【０００５】
更に、遺伝子工学技術を用いて異種蛋白質の生産を行う場合、単離・精製などのダウンストリーム・プロセスを容易にするため異種蛋白質を菌体外に分泌させることも重要な因子であり、このために、用いる宿主生物由来の分泌蛋白質のシグナルペプチド、もしくはその生物において機能するシグナルペプチドを、目的のポリペプチドの上流に導入する手法が用いられたり、あるいはまた、分泌蛋白質と目的のポリペプチドの融合蛋白質として発現させる方法も用いられている。
【０００６】
しかし、宿主としてアスペルギルス・ニドランス、分泌に必要シグナルとしてアスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼを用いた例（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ５，  ３６９  （１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ５，  ７１３  （１９８７））、宿主としてアスペルギルス・アワモリ、分泌に必要シグナルとしてアスペルギルス・アワモリ由来のグルコアミラーゼを用いた例（Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８，  ４３５  （１９９０））、宿主としてトリコデルマ・リーセイ、分泌に必要なシグナルとしてトリコデルマ・リーセイ由来のセロビオハイドロラーゼＩを用いた例（Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７，  ５９６  （１９８９））があるのみであり、属を異にした複数の糸状菌および酵母で使用可能な分泌に必要なシグナルを用いて異種蛋白質の分泌発現に成功した例はこれまでに存在していなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、発現宿主として糸状菌及び酵母のいずれにも適用可能で、且つ又、発現された異種蛋白質の菌体外への分泌を促進させ得る形質転換用プラスミドが創製されるならば、宿主の使い分けが可能となり、それによって、天然には微量にしか存在しない多くの生理活性物質の効率的な生産が可能となり、ひいては、これら物質の医薬への応用もより促進されうる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーターおよび分泌に必要なシグナルが、本菌株中においてのみならず他の糸状菌および酵母中において機能することを見いだし、これを用いて、複数の糸状菌および酵母において分泌発現せしめるための新規発現プラスミドを構築すると共に、またその分泌発現プラスミドを用いて目的の有用蛋白質およびペプチドを糸状菌および酵母により分泌生産させることに成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の新規分泌発現プラスミドは、糸状菌および酵母において機能するプロモーター、分泌に必要なシグナル、ターミネーターさらには大腸菌で複製および選択可能なＤＮＡ領域を有するものである。
【００１０】
プロモーターは、糸状菌および酵母において機能するものであればいずれでもよいが、具体的には、アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼ遺伝子（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｔ．，  １９４，  ４９４  （１９８４））、リゾプス・ニベウスのグルコアミラーゼ遺伝子（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５０，  ９５７  （１９８６））、リゾプス・ニベウスのアスパルティック・プロテイナーゼ遺伝子（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５４，  １７７１  （１９９０））、ペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ，  １０３，  ６１  （１９９１））のプロモーター等が挙げられる。
【００１１】
より好適には、ペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００１２】
分泌に必要なシグナルも、糸状菌および酵母において機能するものであればいずれでもよいが、具体的にはペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼの、プレプロ領域、プレプロおよびそれに続くＮ末端領域、プレプロ領域および成熟蛋白質のコード領域あるいはプレプロ領域およびＣ末端に１アミノ酸残基欠失した成熟蛋白質のコード領域等が挙げられる。
【００１３】
またターミネーターは、プロモーターほど厳密に選択されるべきものではないが、具体的にはペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００１４】
そして、本発明の新規分泌発現プラスミドは、以下の条件をも備えている。
【００１５】
（１）発現させるべき目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、分泌に必要なシグナルとターミネーターの間に挿入するのを容易にするため、分泌に必要なシグナルとターミネーターの接続部に３つの制限酵素認識部位が導入されていること。
【００１６】
（２）目的のポリペプチドを挿入した後の［プロモーター−分泌に必要なシグナル−目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体をコードするＤＮＡ断片−ターミネーター］からなる発現カセットが構築され、そして該発現カセットを発現宿主として選択した菌株に対する形質転換プラスミドに挿入するのを容易にするための別の制限酵素認識部位が導入されていること。
【００１７】
（３）モノおよびジアシルグリセロールリパーゼのコード領域内の適当な制限酵素部位を利用して、任意の長さの分泌に必要なシグナルを有する発現カセットを構築することが出来ること。この場合の任意の長さの分泌に必要なシグナルとしては、例えばプレプロ領域、プレプロおよびＮ末端領域、プレプロおよび成熟体領域などが挙げられる。
【００１８】
（４）分泌に必要なシグナルと目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体の接合部のアミノ酸配列は、ＤＮＡ断片の接合のために人工のアミノ酸配列になる場合もあり、また、Ｌｙｓ−Ａｒｇなどのプロセッシングに必要なアミノ酸配列を意図的に導入することもあり、あるいは、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼのＣ末端から３番目および２番目にＬｙｓ−Ａｒｇ配列が存在し、この位置でプロセッシングが起こることが知られているので、分泌に必要なシグナルと目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体の接合部にこの配列を利用することも可能であること。
【００１９】
本発明の新規分泌発現プラスミドの構築は、例えば以下の様にして行うことが出来る。
【００２０】
遺伝子のプロモーターおよびコード領域、ターミネーター領域のそれぞれの両端に部位特異的変異導入法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  ４８８  （１９８５））により適当な制限酵素認識部位を導入後、プロモーターおよびコード領域、ターミネーター領域を制限酵素により切り出し、ＤＮＡ断片として単離し、両断片をもとの遺伝子と同じ順序で、大腸菌のベクターたとえばｐＵＣ１９に挿入して得られる。
【００２１】
プロモーターおよびコード領域、ターミネーター領域のＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０，  １３５０  （１９８５））により増幅し得ることも可能である。
【００２２】
本発明は、さらに酵素、ホルモン、生理活性ペプチドもしくは蛋白質を、糸状菌および酵母を宿主として製造する方法をも開示するものであり、例えば、次のステップにより成し遂げられる。
【００２３】
（１）発現カセットの構築（プラスミドｐＹ４’への目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体をコードするＤＮＡ断片の挿入）
（２）形質転換−発現プラスミドの構築（発現カセットの形質転換ベクターへの挿入）
（３）形質転換−発現プラスミドの宿主菌株への導入
（４）形質転換体の培養
以下に順を追って説明する。
【００２４】
（１）発現カセットの構築（プラスミドｐＹ４’への目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体をコードするＤＮＡ断片の挿入）
目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体をコードするＤＮＡのＮ末端アミノ酸コドンの上流に、および終止コドンの下流に適当な制限酵素部位を、部位特異的変異法もしくはＰＣＲ法によりそれぞれ導入し、これらの制限酵素付着部位を両端にもつＤＮＡ断片を、プラスミドｐＹ４’の適当な制限酵素部位に挿入する。
【００２５】
この場合分泌に必要なシグナルとして選択したアミノ酸配列即ちモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロ領域、プレプロおよびＮ末端領域もしくはプレプロ領域および成熟体のアミノ酸配列と、挿入される目的のポリペプチドの前駆体もしくは成熟体のアミノ酸配列は、読み取りフレームが合致するように留意する。
【００２６】
これはＰＣＲの際のプライマーのデザインや部位特異的変異を駆使することにより可能であり、目的のポリペプチド前駆体もしくは成熟体をコードするＤＮＡは、クローニングにより得られた遺伝子もしくはｃＤＮＡであっても、化学合成により得られたものであってもよく、またイントロンを含む遺伝子であっても、そのイントロン中に宿主中でスプライシングが起こる様な配列を有するものであれば使用可能である。
【００２７】
（２）形質転換−発現プラスミドの構築（発現カセットの形質転換ベクターへの挿入）
（１）で構築した発現カセットを宿主糸状菌もしくは酵母細胞中へ導入するため、形質転換体の選択に必要なマーカー遺伝子を有するプラスミドすなわち形質転換ベクターに、発現カセットを挿入する。形質転換ベクターはそれぞれの宿主に応じて適宜選択する。糸状菌の場合、コ−トランスホーメーション（Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が可能であるので、糸状菌を宿主とする場合は必ずしもこのステップは必要としない。
【００２８】
（３）形質転換−発現プラスミドの宿主菌株への導入
（２）で得られた形質転換−発現プラスミドを用いて、公知の方法で糸状菌（例えば  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｔ．，  ２１８，  ９９  （１９８９））もしくは酵母（例えばＪ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３，  １６３  （１９８３））を形質転換する。コ−トランスホーメーションを行う場合は、形質転換−発現プラスミドの代わりに（１）で得られた発現カセットのＤＮＡ断片もしくは発現カセットを有するプラスミドと形質転換プラスミドの混合液を用いる。
【００２９】
（４）形質転換体の培養
（３）で得られた形質転換体を、適当な培地・培養条件で培養し目的のポリペプチドを生産させる。この場合、プロモーターが最も機能する培地・培養条件で培養を行うのが好ましい。生産された組換え型の目的のポリペプチドは、適当な方法で定性、定量し、また必要に応じて単離・精製される。
【００３０】
目的のポリペプチドは、いかなるものであってもよいが、例えばザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシンが挙げられる。
【００３１】
以下に実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記載しない限り成書（例えば「モレキュラー・クローニング」第２版、サンブルック、フリッシュ、マニアチス編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ出版、（１９８９））に従って行った。
【００３２】
【実施例】
実施例１
プラスミドｐＹ４’の構築
ペニシリウム・カマンベルチイ  Ｕ−１５０株のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子  ２．０−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を大腸菌ベクターｐＵＣ１９（東洋紡社製、Ｇｅｎｅ，  ３３，  １０３  （１９８５））のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入したプラスミドｐＬＧＧ１００、ｐＬＧＧ３００（これら両プラスミドは、２．０−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片が互いに逆方向に挿入されている）および約１．０−ｋｂ  ｃＤＮＡ断片（Ｇｅｎｅ，  １０３，  ６１  （１９９１））を材料に用いた。
【００３３】
このモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子およびｃＤＮＡは、ペニシリウム・カマンベルチイ  Ｕ−１５０株（ペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）  Ｕ−１５０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４５２。この菌株は後にペニシリウム・カマンベルチイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）と同定された（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３４，  ７２０  ［１９９１］）。）より公知の方法（Ｇｅｎｅ，  １０３，  ６１  （１９９１））により取得することが可能である。
【００３４】
まずイントロンを含まないモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子を構築した。ｐＬＧＧ３００を制限酵素ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩで部分分解し分解混合物を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、２つのイントロンを含む領域  ０．７３−ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ断片が除かれた約４．０−ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片と、ｃＤＮＡ由来の０．６３−ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ断片をライゲーションしｐＬＧＲ８０を得た（図１）。
【００３５】
プロモーターおよびコード領域を含むＤＮＡ断片は、ｐＬＧＲ８０を鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
Ｍ４’：      ５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ−３’
下流プライマーとして、
Ｓａｌ：      ５’−ＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧ−３’
をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ  ＡｍｐＴＭ  ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りである。
【００３６】
Ｈ２Ｏ                                  ６３．０  μｌ
［１０ｘ］  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ                １０．０  μｌ
ｄＮＴＰｓ，  Ｍｉｘ．，  １．２５  ｍＭ                  １６．０  μｌ
上流プライマーＭ４’，  ２０  μＭ              ５．０  μｌ
下流プライマーＳａｌ，  ２０  μＭ              ５．０  μｌ
ｐＬＧＧ３００，  ２  ｎｇ／μｌ                      ０．５  μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ              ０．５  μｌ
サーマル・サイクラーの条件は、以下の通りである。
【００３７】
９４  ℃        ０．５  分
５５  ℃        ２．０  分
７２  ℃        ０．５  分
この条件下で反応を５０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間インキュベートした。反応液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、増幅された約１．６−ｋｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで処理し、同じく両酵素で処理したｐＵＣ１９にクローニングし、ｐＰＭＳａｌを得た。
【００３８】
次にターミネーター領域のクローニングを行った。ｐＬＧＧ１００を制限酵素ＤｒａＩおよびＨｉｎｃＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ターミネーター領域である約０．４８−ｋｂ  ＤｒａＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ９のＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＴ７を得た。
【００３９】
更にプロモーターおよびコード領域とターミネーター領域の連結を行った。ｐＴ７を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ターミネーター領域である約０．４９−ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでｐＰＭＳａｌを部分分解処理して得た約４．３−ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片にクローニングし、ｐＹ４’を得た（図２）。
【００４０】
実施例２
ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシン発現カセットｐＳ２の構築
ザーペシンの遺伝子はセンチニクバエ胚由来の株化細胞であるＮＩＨーＳａｐｅー４細胞を培養し、公知の方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３，  １７１１７ー１７１２１  （１９８８））により取得することが可能である。ザーペシン前駆体をコードするＤＮＡをｐＹ４’のペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロコード領域とターミネーターの間に挿入するため、ＰＣＲ法を用いてそのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
Ｓ２−ａ：    ５’−ＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡ−３’
下流プライマーとして、
Ｓ−ｂ：    ５’−ＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＡＴＴＧＣＧＡＣＡＴＡＣＧＣＡＧ−３’
をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ  ＡｍｐＴＭ  ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りである。
【００４１】
Ｈ２Ｏ                                  ６２．５  μｌ
［１０ｘ］  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ                １０．０  μｌ
ｄＮＴＰｓ，  Ｍｉｘ．，  １．２５  ｍＭ                  １６．０  μｌ
上流プライマー  Ｓ２−ａ，  ２０  μＭ            ５．０  μｌ
下流プライマー  Ｓ−ｂ，  ２０  μＭ            ５．０  μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ，  １  ｎｇ／μｌ                    １．０  μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ              ０．５  μｌ
サーマル・サイクラーの条件は、以下の通りである。
【００４２】
９４  ℃        １．０  分
４５  ℃        ２．０  分
７２  ℃        ２．０  分
この条件下で反応を２５サイクル行った後、さらに７２℃で７分間インキュベートした。反応液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、増幅された約０．２２−ｋｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。
【００４３】
次にこのＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで処理し、またｐＹ４’を制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで部分分解処理した後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ＰＣＲ産物である約０．２２−ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＹ４’由来の約３．８ーｋｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離・精製した。得られた２つのＤＮＡ断片をライゲーションすることによりプラスミドｐＳ２’を得た。
【００４４】
更にｐＳ２’におけるモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロのコード領域と前駆体ザーペシンのコード領域の接合部に見られる不必要な塩基（シトシン）の欠失を  ＭｕｔａｎーＫ（宝酒造社製）を用いた部位特異的変異導入法により行いプラスミドｐＳ２を得た（図３）。
【００４５】
実施例３
ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシン発現カセットｐＳ３の構築
ザーペシン前駆体をコードするＤＮＡをｐＹ４’のペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロおよびＮ末端コード領域とターミネーターの間に挿入するため、ＰＣＲ法を用いてそのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
Ｓ３−ａ：    ５’−ＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡ−３’
下流プライマーとして、Ｓ−ｂ  を実施例２と同様に合成し、ＰＣＲ反応を行った。反応液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、増幅された約０．２２−ｋｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。
【００４６】
次にこのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理し、またｐＹ４’を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで部分分解処理した後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ＰＣＲ産物である約０．２２−ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＹ４’由来の約３．９ーｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離・精製した。得られた２つのＤＮＡ断片をライゲーションすることによりプラスミドｐＳ３を得た（図４）。
【００４７】
実施例４
ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシン発現カセットｐＳ４の構築
ザーペシン前駆体をコードするＤＮＡをｐＹ４’のペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロおよび成熟蛋白質コード領域とターミネーターの間に挿入するため、実施例２と同様にＰＣＲ法を用いてそのＤＮＡ断片を作製した。
【００４８】
次にこのＤＮＡ断片とｐＹ４’を制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ＰＣＲ産物である約０．２２−ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＹ４’由来の約４．７ーｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離・精製した。得られた２つのＤＮＡ断片をライゲーションすることによりプラスミドｐＳ４を得た（図５）。
【００４９】
実施例５
ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシン発現カセットｐＳ５の構築
ザーペシン成熟体をコードするＤＮＡをｐＹ４’のペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロおよび成熟蛋白質コード領域とターミネーターの間に挿入するため、ＰＣＲ法を用いてそのＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
Ｓ５−ａ：    ５’−ＣＴＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＣＧＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧ−３’
下流プライマーとして、Ｓ−ｂ  を実施例２と同様に合成し、ＰＣＲ反応を行った。反応液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、増幅された約０．１３−ｋｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。
【００５０】
次にこのＤＮＡ断片とｐＹ４’を制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ＰＣＲ産物である約０．１３−ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＹ４’由来の約４．７ーｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離・精製した。得られた２つのＤＮＡ断片をライゲーションすることによりプラスミドｐＳ５’を得た。
【００５１】
更にｐＳ５’における成熟体モノおよびジアシルグリセロールリパーゼのコード領域と成熟体ザーペシンのコード領域の接合部に見られる不必要な塩基（５’ーＧＴＣＧＡＣー３’）の欠失を実施例２と同様に部位特異的変異導入法により行い、プラスミドｐＳ５を得た（図６）。
【００５２】
実施例６
▲１▼形質転換プラスミドｐＨ１の構築
実施例１に記載した、プラスミドｐＬＧＧ３００およびｐＬＧＧ１００［Ｇｅｎｅ，  １０３，  ６１（１９９１）］の両プラスミドは、約２．０−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片が互いに逆方向に挿入されている。このモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子は、ペニシリウム・カマンベルチイより公知の方法［Ｇｅｎｅ，  １０３，  ６１（１９９１）］により取得することが可能である。また薬剤耐性マーカー遺伝子としては大腸菌のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＨｐｈ０（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いた。
【００５３】
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片は、ｐＬＧＧ３００を鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
ＬＧＰ−ａ：      ５’−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＣ−３’
下流プライマーとして、
ＬＧＰ−ｂ：      ５’−ＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣＡＴ−３’
をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ  ＡｍｐＴＭ  ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りである。
【００５４】
Ｈ２Ｏ                                  ６２．５  μｌ
［１０ｘ］  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ                １０．０  μｌ
ｄＮＴＰｓ，  Ｍｉｘ．，  １．２５  ｍＭ                  １６．０  μｌ
上流プライマーＬＧＰ−ａ，  ２０  μＭ            ５．０  μｌ
下流プライマーＬＧＰ−ｂ，  ２０  μＭ            ５．０  μｌ
ｐＬＧＧ３００，  ２  ｎｇ／μｌ                      １．０  μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ              ０．５  μｌ
サーマル・サイクラーの条件は、以下の通りである。
【００５５】
９３  ℃        １．０  分
５５  ℃        １．０  分
７２  ℃        １．０  分
この条件下で反応を５０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間インキュベートし、反応液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、増幅された約０．６−ｋｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで処理し、同じく両酵素で処理したｐＵＣ１９にクローニングし、ｐＰ２を得た。
【００５６】
次にターミネーター領域を、以下のようにしてｐＨｐｈ０のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。ｐＬＧＧ１００を制限酵素ＤｒａＩおよびＨｉｎｃＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ターミネーター領域である約０．４８−ｋｂ  ＤｒａＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片を単離・精製し、このＤＮＡ断片をのｐＨｐｈ０のＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＴ６を得た。
【００５７】
更にモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片を、以下のようにしてｐＴ６のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子中の蛋白質のＮ末端コーディング領域に存在する制限酵素部位にクローニングした。ｐＰ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、約０．５７−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片を単離・精製し、このＤＮＡ断片を同じく制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩよびＳａｌＩで処理したｐＴ６にクローニングし、ｐＨ１を得た。
【００５８】
この様にして得られたｐＨ１は、ｐＨｐｈ０がコードしていたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ蛋白質の翻訳開始コドンから１０残基目までのアミノ酸配列が、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼの翻訳開始コドンから７残基目までのアミノ酸配列と置き変わった融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを有している。そしてこの融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの上流および下流にペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネーターがそれぞれ配置されている。
【００５９】
▲２▼形質転換プラスミドｐＨ４の構築
ｐＨ１へのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子の挿入を容易にするため、以下のようにしてｐＨ１を改変し、ｐＨ４を作製した。ｐＨ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、融合薬剤耐性遺伝子を含む約２．２−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離・精製し、このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、ｐＵＣ１９の制限酵素ＳｍａＩ部位にサブクローニングし、ｐＨ４を得た。
【００６０】
このプラスミドは、約２．２−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片が互いに逆方向に挿入されており、また、ｐＨ１において２ヶ所存在した制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位が１ヶ所になっている。
【００６１】
▲３▼ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシンのペニシリウム・カマンベルチイでの発現
ペニシリウム・カマンベルチイに対する形質転換−発現プラスミドを構築するため、ｐＳ２、ｐＳ３、ｐＳ４およびｐＳ５を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ザーペシン発現カセットであるそれぞれ約１．３，  １．４，  ２．２，  ２．１−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離・精製した。これらのＤＮＡ断片をペニシリウム・カマンベルチイに対する形質転換ベクターｐＨ４のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＳＨ２、ｐＳＨ３、ｐＳＨ４およびｐＳＨ５を得た（図７）。
【００６２】
これらｐＳＨ２、ｐＳＨ３、ｐＳＨ４およびｐＳＨ５を用いて、ペニシリウム・カマンベルチイを、以下に示す方法で形質転換した。
【００６３】
ペニシリウム・カマンベルチイの胞子懸濁液（２×１０８／ｍｌ）１００μｌを１００ｍｌのぶどう糖・ペプトン培地（栄研化学社製）に接種し３０℃で４８時間振とう培養後、培養物をろ過し菌体を集めた。この菌体を１０  ｍｌのプロトプラスト化バッファー［０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  りん酸緩衝液（ｐＨ６．０）］に懸濁しろ過することにより、洗浄菌体を集めた。この洗浄菌体を、５ｍｇ／ｍｌのライジング・エンザイム（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ−２２６５、シグマ社製）を含むプロトプラスト化バッファーに懸濁し、３０℃で２時間振とう後、ガラスフィルター３Ｇ２でろ過し、ろ液を２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離に供し、プロトプラストを沈澱物として得、この沈澱物を１０ｍｌのソルビトール溶液［１．２Ｍ  ソルビトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］に懸濁し、２０００ｒｐｍ、５分の遠心分離し沈澱物を集めた。この操作を再度繰り返した後、沈澱物を２×１０８／ｍｌとなるようソルビトール溶液に懸濁し、プロトプラスト溶液を得た。
【００６４】
次にプロトプラスト溶液５０μｌに、４μｌのＤＮＡ溶液（１μｇ／μｌ）、６．７５μｌのＰＥＧ溶液：５０％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］を加え混合後、氷上に３０分静置し、０．５ｍｌのＰＥＧ溶液を加え混合し、さらに１．０ｍｌのソルビトール溶液を加え混合した。この混合液３００μｌを、１７ｍｌの１．５％アガロースを含むＰＤＳ［０．２５／大豆油、０．２５％モノオレイン、１．２Ｍソルビトール、２．４％ポテト・デキストロース・ブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）］からなるプレート上に載せ、さらに予め４８℃に保温しておいた０．７％アガロースを含むＰＤＳ  ３．０ｍｌを注ぎ、混合後固化させた。３０℃で２４時間放置後、６１３μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（シグマ社製）、０．７％アガロースを含むＰＤＳ  ３．０ｍｌを重層し、３０℃で４日間放置し、プレート上に出現したコロニー１０株をランダムにピック・アップし、それぞれ１００ｍｌの大豆油培地（３％大豆油、０．５％酵母エキス、０．３％  ＮａＮＯ３、０．１％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％  ＫＣｌ、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００３％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１％  ＦｅＳＯ４・１２Ｈ２Ｏ）に接種し、３０℃で６日間振とう培養し、得られた培養物をろ過し菌体を除去した。
【００６５】
得られた培養液について、ウサギ抗ザーペシン抗体を用いてウエスタンブロッティング分析を行ない、それぞれｐＳＨ２、ｐＳＨ３、ｐＳＨ４およびｐＳＨ５形質転換体のうち最もザーペシン生産性の高かった株ＳＨ２ー９、ＳＨ３ー２、ＳＨ４ー５、ＳＨ５ー３培養液のウエスタンブロティングの結果を示す（図８）。
【００６６】
尚、ここでＨ−１株は、形質転換ベクターｐＨ４を用いて得られた形質転換体であり、Ｈー１培養液にはザーペシンと同じ抗原性および分子量を持つ蛋白質の分泌は、見られないが、ＳＨ２ー９、ＳＨ３ー２、ＳＨ４ー５およびＳＨ５ー３培養液にはザーペシンと同じ抗原性および分子量を持つ蛋白質の分泌が見られた。
【００６７】
これらはペニシリウム・カマンベルチイ  が発現したザーペシンと思われ、その生産性は、それぞれ約０．５、５、１０および７ｍｇ／ｌであることが推算された。そして、ペニシリウム・カマンベルチイのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロおよび成熟蛋白質コード領域とターミネーターの間にザーペシン前駆体をコードする遺伝子を挿入した場合に最もザーペシンの高生産が見られた。
【００６８】
ＳＨ４−５は、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロ領域および成熟蛋白質をコードするＤＮＡの下流に前駆体ザーペシンをコードするＤＮＡ断片を連結した遺伝子を導入したもので、産生されたザーペシンは、ザーペシン本来のプロセッシング部位で切断されたものと考えられる。
【００６９】
一方、ＳＨ５−３は、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼのプレプロ領域およびＣ末端アミノ酸１残基が欠失した成熟蛋白質をコードするＤＮＡの下流に成熟体ザーペシンをコードするＤＮＡ断片を連結した遺伝子を導入したもので、産生されたザーペシンは、融合蛋白質の接合部に存在するＬｙｓーＡｒｇ部位でプロセッシングされたものと推定される。
【００７０】
ＳＨ４ー５およびＳＨ５ー３の培養液中には、それぞれ約４６および４３ｋＤａのプロセッシングされずに残っていると思われる、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼとザーペシンの融合蛋白質に相当する分子量の蛋白質の分泌が見られた。
【００７１】
実施例７
リコンビナントザーペシンの精製とその抗菌活性の測定
先ず、ＳＨ４ー５株培養液２００ｍｌを（特開平４ー３３５８８３）の方法に従いＣＭセルロースカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより処理し、得られた各分画のスタフィロコッカス・アウレウスに対する抗菌活性を測定した。次に、活性分画を（特開昭６３ー１８５９９７）の方法に従いＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーを用いて吸着、分離および分画処理することにより精製し、約１．４ｍｇの精製標品が得られた（約７ｍｇ／ｌ）。得られたサンプルをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行って、そのゲルを銀染色した（図９）。
【００７２】
図から明かなように、精製サンプルは天然型ザーペシンと同じ分子量の位置に一本のバンドが見られるのみで他にはいかなるバンドも観察されず、充分に精製されたことが確認され、この精製サンプルの天然型ザーペシンに対する比活性を測定した（図１０）。
【００７３】
その結果、精製サンプルの抗菌活性は天然型ザーペシンほぼ同じであったことから、ペニシリウム・カマンベルチイ  Ｕ−１５０株にザーペシン遺伝子を導入することによりリコンビナントザーペシンが分泌発現されたことが示唆された。
【００７４】
実施例８
▲１▼プラスミドｐＮ３の構築
アスペルギルス・オリゼに対する形質転換ベクターｐＳＴＡ１４［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９−１０４（１９８９）］を以下のように改変しｐＮ３を作製した。ｐＳＴＡ１４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ｎｉａＤ遺伝子を含む約５．５−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、ｐＵＣ１９の制限酵素ＳｍａＩ部位にサブクローニングし、ｐＮ３を得た（図１１）。
【００７５】
▲２▼ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシンのアスペルギルス・オリゼでの発現
形質転換−発現プラスミドを構築するため、実施例４で得られたｐＳ４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ザーペシン発現カセットである約２．２−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼに対する形質転換プラスミドｐＮ３のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＳＮ４を得た（図１２）。
【００７６】
次にこのｐＳＮ４を用いて、アスペルギルス・オリゼＡＯ１．１株（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，２１８，  ９９−１０４  （１９８９））を、アンクルスらの方法（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９−１０４  （１９８９））に準じて形質転換した。選択培地に生育してきた形質転換体１０株（ＳＮ４−１〜ＳＮ４−１０）をランダムにピック・アップし、それぞれ１００ｍｌの大豆油培地（３％大豆油、０．５％酵母エキス、０．３％  ＮａＮＯ３、０．１％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％  ＫＣｌ、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００３％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１％  ＦｅＳＯ４・１２Ｈ２０）に接種し、３０℃で４日間振とう培養し、得られた培養物をろ過し菌体を除去し、得られた培養液について、ウエスタンブロッティング分析を行った。
【００７７】
その結果、培養液にはザーペシンと同じ抗原性および分子量を持つ蛋白質の分泌が見られ、ザーペシン生産性は、最も高生産株（ＳＮ４ー３）で約３  ｍｇ／ｌであることが推算された。
【００７８】
実施例９
ザルコファーガ・ペレグリナ由来のザーペシンの酵母サッカロマイセス・セレビシエでの発現
酵母サッカロマイセス・セレビシエに対する形質転換−発現プラスミドを構築するため、実施例４で得られたｐＳ４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、分解混合液を１．０％低融点アガロース電気泳動に供し、ザーペシン発現カセットである約２．２−ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をサッカロマイセス・セレビシエに対する形質転換ベクターｐＬ１（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６，  ３１５−３１９  （１９９２））のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ｐＳＬ４  （図１３）を得た。
【００７９】
次にこのｐＳＬ４を用いて、サッカロマイセス・セレビシエＳＨＹ２（ＡＴＣＣ  ４４７７０）を、伊藤らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））で形質転換した。選択培地に生育してきた形質転換体１株をピック・アップし、２０ｍｇ／ｍｌのウラシル、２０ｍｇ／ｍｌのトリプトファン、２０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンを含む最小培地（２％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ））５０ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌを、０．００３％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含むＹＰＧａ１培地（２％ガラクトース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）５０ｍｌに接種し、３０℃で４８時間振とう培養し、得られた培養物を遠心分離し菌体を除去し、得られた培養液を限外ろ過膜（ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ、日本ミリポア社製）を用いて２０倍に濃縮し、ウエスタンブロッティング分析を行った。
【００８０】
その結果、濃縮培養液にはザーペシンと同じ抗原性および分子量を持つ蛋白質の分泌が見られ、ザーペシン生産性は、約０．０２  ｍｇ／ｌであることが推算された。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、産業上有用な酵素、ホルモン、生理活性ペプチドもしくは蛋白質を糸状菌により菌体外に大量に製造することが可能となった。また、同時に酵母によっても発現せしめることが出来、機能改変ポリペプチドの創製を企図する蛋白工学的手法の適用が容易となり、産業上寄与するところ大である。
【００８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＬＧｒ８０の構築手順を示す。
【図２】プラスミドｐＹ４’の構築手順を示す。
【図３】ブラスミドｐＳ２の構築手順を示す。
【図４】プラスミドｐＳ３の構築手順を示す。
【図５】プラスミドｐＳ４の構築手順を示す。
【図６】プラスミドｐＳ５の構築手順を示す。
【図７】プラスミドｐＳＨ２、ｐＳＨ３、ｐＳＨ４およびｐＳＨ５の制限酵素地図を示す。
【図８】各種形質転換体のザープシン生産性を示す。
【図９】リコンビナントザーペシンのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動図を示す。
【図１０】リコンビナントザーペシンの天然型ザーペシンに対する比活性測定した図を示す。
【図１１】プラスミドｐＮ３の構築手順を示す。
【図１２】プラスミドｐＳＮ４の制限酵素地図を示す。
【図１３】プラスミドｐＳＬ４の制限酵素地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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