(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すＧＲＢ−１タンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示すタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１に記載のＧＲＢ−１タンパク質の種々の部分をコードするオリゴヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有する、請求項２又は３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
発現運搬体内にある、請求項２又は３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
該運搬体が、発現プラスミドである、請求項５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞。
【請求項８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を調製するための方法であって、下記：
ａ）培養条件下で該タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養すること、
ｂ）該タンパク質を発現させること、及び
ｃ）該培養物から該タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸残基３３３〜４３０又はアミノ酸残基６２４〜７２０を有するSrcホモロジー２ペプチドドメインを含む単離されたタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸残基１０〜８０を含むSrcホモロジー３ペプチドドメインを含む単離されたタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基３３３〜４３０、（ii）アミノ酸残基６２４〜７２０、又は（iii）アミノ酸残基３３３〜４３０及び６２４〜７２０の両者を欠く、単離されたタンパク質。
【請求項１２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むが、請求項１０に記載のSrcホモロジー３ペプチドドメインを欠く、単離されたタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むが、そして
アミノ酸残基３３３〜４３０、アミノ酸残基６２４〜７２０又は配列番号２のアミノ酸残基１０〜８０
の少なくとも１つ、ただし多くとも２つを欠く、単離されたタンパク質。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項９に記載のタンパク質を調製するための方法であって、
下記：
ａ）培養条件下で、該タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養すること、
ｂ）該タンパク質を発現すること、及び
ｃ）該培養物から該タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載のタンパク質を調製するための方法であって、下記：
ａ）培養条件下で、該タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養すること、
ｂ）該タンパク質を発現すること、及び
ｃ）該培養物から該タンパク質を回収すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
分子及び細胞生物学の分野におけるこの発明は、レセプターチロシンキナーゼのカルボキシ末端ドメインに結合しかつ主要シグナル伝達経路内でこの酵素のための基質として役立つことのできる細胞タンパク質を識別するための、直接発現クローニングに基づく新しい方法に関する。本発明は同様に、この方法を用いて識別された新しいタンパク質にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
さまざまなポリペプチド性成長因子及びホルモンが、チロシンキナーゼ酵素活性をもつ細胞表面レセプターと相互作用することによってその細胞効果を媒介する（総説として、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｌ．Ｔ．  ｅｔ ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  １５６４−１５７０  （１９８９  年）；Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ６１：  ２０３−２１２  （１９９０  年）；  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：  ７７０９−７７１２  （１９９０年）を参照）。これらのリガンドとそのレセプターの相互作用は、レセプターの二量体化及びタンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激を含む一連の事象を誘発する。上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）ならびに血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）といったようなチロシンキナーゼ活性をもつその他のレセプターについては、キナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化反応の結果として、レセプターはいくつかの細胞質基質と物理的に会合することになる（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  前出）
【０００３】
ＥＧＦＲキナーゼのための２つの基質が現在最終的に生体細胞内で同定されている。すなわち、（ａ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ−ガンマ（ＰＬＣ−ガンマ）及び（ｂ）ｒａｓタンパク質のエフェクターループ内にある可能性のあるタンパク質であるＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）である（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５７：  １１０１−１１０７  （１９８９  年ｂ）；  Ｍｅｉｓｅｎｈｅｌｄｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ５７：  １１０９−１１２２  （１９８９  年）；  Ｍｏｌｌｏｙ，  Ｃ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ３４２：  ７１１−７１４  （１９８９年）；  Ｗｏｈｌ，  Ｍ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２６５：  ３９４４−３９４８（１９９０年）；  Ｅｌｌｉｓ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ ３４３：  ３７７−３８１  （１９９０年）；  Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ６１．  １２１−１３３  （１９９０年））。
【０００４】
同様に、活性化されたＰＤＧＦＲは、チロシンをリン酸化すること、又ｐｐ６０ｓｒｃ  といった細胞チロシンキナーゼ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰと会合した状態になることが示された。（Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． ８：  ３３４５−３３５６（１９８８年）；  Ｍｅｉｓｅｎｈｅｌｄｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ５７：  １１０９−１１２２  （１９８９年）；  Ｍｏｌｌｏｙ，  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ ３４２：  ７１１−７１４  （１９８９年）；  Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ６１：  １２１−１３３  （１９９０年）；  Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：  １５７８−１５８１  （１９９０年）；  Ｋｒｙｐｔａ，  Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ６２：  ４８１−４９２  （１９９０年）；  Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：    ６０７−６１０（１９９０年））。ＰＬＣ−ガンマ又はＧＡＰと、ＥＧＦＲとの会合に関与する正確な部位は完全に解明されているわけではないが、最近の研究は、この会合に寄与するレセプターと基質の両方の上のドメインを識別し始めてきた。
【０００５】
ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）  ドメインが、活性化された成長因子レセプターといくつかのチロシンキナーゼ基質との会合に関与するドメインであると思われる。ＳＨ２ドメインは、ｐｐ６０ｓｒｃ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰ及びｖ−ｃｒｋといった細胞質性非レセプターチロシンキナーゼの中に発見された、保存された約１００個のアミノ酸の配列である（Ｍａｙｅｒ，  Ｂ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ ３３２：  ２７２−２７５  （１９８８  年）；  Ｐａｗｓｏｎ，  Ｔ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３：  ４９１−４９５  （１９８８年））。異なる触媒ドメインを有するものの、これらの分子は全て、保存されたＳＨ２及びＳＨ３（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３）  ドメイン及びチロシンキナーゼ活性をもつレセプターと会合する能力を共有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：  ９７９−９８２  （１９９０年））。
【０００６】
チロシンキナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化反応は、成長因子レセプターとＳＨ２ドメイン含有タンパク質との間の会合の必須条件である（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １０：  ４３５−４４１  （１９９０  年）；  Ｋｕｍｊｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：  ８２３２−８２３９  （１９８９年）；  Ｋａｚｌａｎｓｋａｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：  １５７８−１５８１（１９９０  年））。特に、既知の自己リン酸化反応部位を全て含むＥＧＦＲのカルボキシ末端（Ｃ−末端）フラグメントは、特異的にＧＡＰ及びＰＬＣ−ガンマのＳＨ２ドメインに結合する（以下参照）。したがって、これらの基質タンパク質のＳＨ２ドメインとＥＧＦＲのチロシンリン酸化されたＣ末端テールの間に、主要な会合部位が存在する。
【０００７】
活性化されたチロシンキナーゼレセプターに対する結合がいくつかの基質タンパク質の間で保存されるということを認識した上で、これらの特性を共有するさらなる基質を同定するための努力が払われた。活性化されたレセプターに対して結合する標的タンパク質は、成長因子レセプターと共に免疫沈降するか又は固定化マトリックスに付着されたレセプターに結合するタンパク質の分析によって同定された（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｄ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ５８：  ６４９−６５７  （１９８９  年）；    Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ９：  ３２７９−３２８６  （１９９０年））。これらのタンパク質のいくつかのアイデンティティは既知であるものの、これらのアプローチを利用して検出されたその他のいくつかのタンパク質は、完全に特徴づけされていない。さらに、活性化されたレセプターと相互作用する希な標的分子が、これらの技術の限られた感度のために検出されなかったということも考えられる；実際の結合化学量論は低いものであってよく、タンパク質を可溶化するのに必要な界面活性剤溶液は結合を粉砕しうる。
【０００８】
これらのタンパク質を単離しクローニングするための従来のアプローチはマイクロシークエンシング及びそれに続く従来のｃＤＮＡクローニングのために充分な量のタンパク質を精製するべく、大量の組織又は株細胞の使用を必要とする骨の折れる方法であった。したがって、これらのタンパク質のクローニング及びそれに続く単離及び同定のための新しいアプローチに対する必要性が当該技術分野において認識されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
細胞の成長及び発がんの調節を理解しそれを制御できるようになろうという我々の研究努力における最も切迫した必要性の１つは、
チロシンキナーゼのための標的タンパク質を識別する能力をもつことである。
【００１０】
本発明者は、チロシンキナーゼタイプの細胞レセプターに対する標的タンパク質の迅速なクローニングのための新たな発現／クローニングシステムを開発してきた。このクローニング方法は、或る種のクラスの基質がもつ、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ末端）に特異的に結合する能力に基づいている（以下の例ＶＩ；  Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ． ９：  ４３７５−４３８０  （１９９０  年）参照）。
【００１１】
本発明者が考案したアプローチは、マイクロシークエンシング分析のために潜在標的タンパク質を精製する、骨が折れコストのかかる作業を回避することを含め、従来のクローニング方法に比べて重要な利点を有する。その上、本発明のアプローチは、従来の他の技術を用いては活性化レセプターとのその会合を検出することができなかったような希な標的分子を識別するための方法を提供する。さらに、この方法によると、ＤＮＡレベルでは相同性が低いものでしかないものの、チロシンキナーゼ活性をもつ活性化されたレセプターに対するその結合特性において類似のものであるような、構造的又は機能的に関連したタンパク質の識別が可能となる。後者の能力は、関連する遺伝子を識別するのに使用された従来のスクリーニング方法が、典型的にストリンジェンシーの低い核酸ハイブリダイゼーションに基づいていることから、重要なものである。実際、このようなハイブリダイゼーションに基づくスクリーニングは、ＤＮＡレベルでの類似性の欠如のために、本発明の新しいタンパク質すなわちＧＲＢ−１とＧＲＢ−２をクローニングし同定する上で成功しなかったであろうと思われる。
【００１２】
本発明者のアプローチの根源は、以前にＤＮＡ結合タンパク質及びｊｕｎ結合タンパク質をクローニングするのに利用されてきた方法にある（Ｓｉｎｇｈ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ５２：  ４１５−４２３  （１９８８年）；  ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  Ｐ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：  ４５１−４５８  （１９９０  年））。
【００１３】
本発明の方法は、チロシン残基がリン酸化されるＥＧＦＲタンパク質のＣ末端が基質を結合できるという発明者の考え及び観察を利用している（以下参照）。チロシンが３２Ｐでリン酸化されている標識プローブを作製することによって、本発明者は、ヒトのさまざまな組織からのλｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、ＥＧＦＲのリン酸化されたＣ末端と会合した状態となる数多くのタンパク質を同定した。本発明者は、この要領で発見したタンパク質を「ＧＲＢ」（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｏｕｎｄの略）と名付けた。本発明のクローニング方法は、「ＣＯＲＴ」（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ（レセプター標的クローニング）の略）と名付けた。
【００１４】
本発明の方法は、チロシンキナーゼに対する標的分子の識別及びクローニングのための一般性と迅速性の両方を有する新しいアプローチとして提案されている。
したがって本発明は、レセプターチロシンキナーゼの標的であり、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化されたポリペプチド部分に結合することができるタンパク質の発現を、発現ベクターを宿す細胞によって検出するための方法において、
（ａ）細胞、その抽出物、そのライセート（溶解物）又はその上清を、固相担体と接触させて、担体に対するタンパク質の結合をひき起こすこと；
（ｂ）チロシン−リン酸化されたポリペプチドと共に担体に結合したタンパク質をインキュベートし、ポリペプチドが担体結合タンパク質に結合できるようにすること；
（ｃ）担体に結合していない物質を除去すること；及び
（ｄ）担体に結合したチロシンリン酸化ポリペプチドの存在を検出するか又はその量を測定すること、
を特徴とし、かくしてそのタンパク質の発現を検出する方法に関する。
【００１５】
好ましい一実施態様においては、レセプターは、上皮成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター又は線維芽細胞成長因子レセプターである。
【００１６】
この方法は、好ましくは、原核細胞、最も好ましくはＥ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）といった細菌細胞を用いて行なわれる。細胞は同様に、酵母又は哺乳動物細胞といったような真核細胞であってもよい。
【００１７】
好ましくは、リン酸化されたポリペプチドは、例えば３２Ｐのような放射線標識を用いて、検出可能な形に標識付けされる。
【００１８】
固相担体は、好ましくはニトロセルロース膜であり、λｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングするときには溶菌された細菌細胞から放出されたタンパク質が、この膜にトランスファーされる。
【００１９】
本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸化されたポリペプチド部分に結合できるタンパク質をコードする遺伝子を、ヒト染色体にマッピングするための方法において、
（ａ）ヒト遺伝子発現ライブラリーで細菌細胞を感染させること；
（ｂ）請求項１に記載の方法を用いて、タンパク質を発現するクローンを検出すること；
（ｃ）クローンのＤＮＡを配列決定すること；及び
（ｄ）ヒト染色体に対しその配列をマッピングすること、
を特徴とする方法をも提供する。
【００２０】
本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化ポリペプチド部分に結合することのできるタンパク質の発現の検出に有用なポリペプチドプローブにも関する。このプローブは、レセプター分子のチロシンリン酸化部分から誘導されたアミノ酸配列又はその機能的誘導体を含み、チロシンキナーゼドメインが欠如しており、この配列は少なくとも１つのホスホチロシン残基、好ましくは４個又は５個のホスホチロシンを含んでいなければならない。プローブは、好ましくは３２Ｐで検出可能な形に標識されるべきである。
好ましいプローブは約２５〜２５０個のアミノ酸残基を有する。
本発明のプローブは、上皮成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター及び線維芽細胞成長因子レセプターを含むレセプターチロシンキナーゼに対する標的タンパク質を検出するために有用である。
【００２１】
本発明は同様に、上述のプローブを調製するための方法において、
（ａ）チロシンキナーゼによってリン酸化されうる少なくとも１つのチロシン残基を含むチロシンリン酸化ドメインとチロシンキナーゼドメインを両方有する、レセプター又は遺伝子工学的に処理されたレセプター様の誘導体を実質的に純粋な形で提供すること、
（ｂ）チロシン残基のリン酸化を可能にする条件下で〔ガンマ−３２Ｐ〕アデノシン三リン酸と共にレセプター又はレセプター様の誘導体をインキュベートし、チロシン残基のリン酸化をひき起こすこと、
を特徴とし、かくしてプローブを産生する方法をも含んでいる。好ましい一実施態様において、この方法は
（ｃ）チロシンキナーゼドメインとチロシン−リン酸化ドメインの間で分子を切断することのできる作用物質で、リン酸化レセプター分子をさらに処理する、工程を含んでいる。
好ましい切断作用物質は、臭化シアンである。
【００２２】
また別の実施態様においては、上述の方法には、作用物質がその切断部位で切断できる酵素であり、チロシンリン酸化ドメインをコードするＤＮＡ配列に連結している選択的酵素的切断部位をコードするＤＮＡ配列に連結しているチロシンキナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドである、遺伝子工学的に処理されたレセプター様の誘導体が関与する。好ましい酵素は、Ｘａ因子とトロンビンである。
【００２３】
同様に提供されているのは、レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸化ポリペプチド部分に結合することのできるタンパク質を、複雑な混合物から精製するための方法において、
（ａ）プローブが結合されている固相担体と複雑な混合物とを接触させ、タンパク質のプローブへの結合を可能にすること、
（ｂ）担体に結合していない物質を除去すること、及び
（ｃ）担体から結合タンパク質を溶出することを特徴とし、かくしてタンパク質を精製する方法である。
【００２４】
本発明は同様に、図４に示されているアミノ酸配列をもつタンパク質ＧＲＢ−１にも関する。本発明は、図１７に示されているアミノ酸配列を含むタンパク質、ＧＲＢ−２を含む。
【００２５】
本発明は同様に、ＧＲＢ−１タンパク質をコードするＤＮＡ分子、及びＧＲＢ−２タンパク質をコードするＤＮＡ分子にも関する。これらのタンパク質の機能的誘導体をコードするＤＮＡ分子も本発明に含まれる。ＤＮＡ分子が天然のものである場合、それは、それが生来会合するヌクレオチド配列を実質的に有さない。
本発明のＤＮＡ分子はプラスミドといった発現運搬体であってよい。
同様に提供されるのは、上述のＤＮＡ分子の各々で形質転換された宿主である。
【００２６】
本発明は同様に、各々が天然に会合しているその他のタンパク質を実質的に含まないＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質、又はその機能的誘導体を調製する方法において、
（ａ）培養条件下でタンパク質を発現することのできる宿主細胞を培養すること、
（ｂ）タンパク質又は機能的誘導体を発現させること、及び
（ｃ）培養からタンパク質又は機能的誘導体を回収すること、
を特徴とする方法をも含んでいる。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、レセプターチロシンキナーゼ分子、特に上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化されたＣ末端テールに結合するという特徴をもつタンパク質をコードするＤＮＡの迅速な発現クローニングのための新しいプローブ及びその利用方法を開発した。
【００２８】
「発現」という語は、タンパク質分子を生み出すための、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写及び翻訳のことを意味する。発現クローニングは、クローニングされるＤＮＡがあるタンパク質をコードするような方法である。典型的にはｃＤＮＡライブラリーの形態の望ましいＤＮＡは、その発現及びそれがコードするタンパク質の直接検出を用いて検出される。発現クローニングシステムは、当該技術分野において周知のものである（参考：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９年）、なおこれは本明細書中に参考として組込まれる）。典型的には、タンパク質は、λｇｔ１１発現ベクターでの細菌感染を介して、λｇｔ１１ライブラリーといったライブラリーから発現される。バクテリオファージプラークの部域内に放出された発現タンパク質は、ニトロセルロースフィルターへとトランスファーされ、典型的にはフィルターを染色すべく抗体を用いて検出される。新しいタンパク質、抗体を調製するのに充分な量で入手できないタンパク質又は親和力に基づく検出のための既知のリガンドをもたないタンパク質については、このような従来の発現クローニング方法は使用できない。
【００２９】
本発明の発現クローニング方法は、その他の数多くのレセプターシステムに対し容易に適用できる。例えば、いくつかの標的分子は、ＰＤＧＦＲのチロシンリン酸化部分及びコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）に結合する（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，  Ｓ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  １１９１−１１９４  （１９８９  年）；  Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ５８：  １１２１−１１３３  （１９８９年）；  Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ． ９：  ２４１５−２４２１  （１９９０  年）；  Ｒｅｅｄｊｉｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １０：  ５６０１−５６０８  （１９９０  年））。これら２つのレセプターにおいて、チロシンリン酸化反応は、ＥＧＦＲの場合のようにＣ末端ドメイン内ではなく、キナーゼ挿入ドメイン内で起こる。したがって、ＰＤＧＦＲ又はＣＳＦ−１レセプターのいずれかのキナーゼ挿入ドメイン又はその機能的誘導体（以下に規定のもの）を利用する特異的プローブも、同様に、発現クローニングのために利用することができる。両者共ＰＬＣ−ガンマといったＳＨ２含有タンパク質と相互作用することもできる線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）レセプター（これはＣ末端ドメイン内でチロシンリン酸化される）又はＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターについても、類似のプローブを構築することが可能である。インシュリンレセプターといったようなその他のレセプターにおいては、チロシンリン酸化反応は、キナーゼドメイン自体の中で起こる。
【００３０】
かくして、例えばＥＧＦＲ内のＣ末端ドメイン、インシュリンレセプター内のキナーゼドメイン及びＰＤＧＦＲ内のキナーゼドメイン挿入物といったように、異なるタンパク質内で異なる部位がチロシンリン酸化されるということがわかると思われるものの、本発明は、これらの構造全ての共通の特徴、単数又は複数のホスホチロシンの存在及び単数又は複数のホスホチロシンを含むポリペプチドに対する親和力をベースとした或る種の細胞タンパク質の結合能力を認識する。一般的に以下ではＥＧＦＲを基準としてＣ末端ドメインであるプローブを基準にしているものの、この言葉は制限的な意味をもつものではなく、上述のその他全ての代替的チロシンリン酸化ドメインを内含すべく意図されたものである。
【００３１】
本発明の方法及びアプローチは、上述の活性化されたリン酸化レセプターなどのようなチロシンリン酸化ポリペプチドと、特異的な形で相互作用することのできる全ての標的分子のクローニング及び識別に適用することができる。例えば、Ｒ−ＰＴＰａｓｅｓといったようなチロシン特異的ホスファターゼなどのチロシンリン酸化された配列に対して結合するさらなるタンパク質（Ｓａｐ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ６１１２−６１１６  （１９９０  年）；  Ｋａｐｌａｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ７０００−７００４  （１９９０年））。これらの方法は同様に、セリン／トレオニン特異的ホスファターゼの場合のようにリン酸化されたセリン／トレオニン残基に結合するタンパク質のクローニング及び識別においても適用可能である。
【００３２】
本発明のプローブを使用すると、遺伝子発現ライブラリーからの、ＤＮＡのクローニング及びコードされたタンパク質の識別を迅速に行なうことが可能になる。この方法は、特に、バクテリオファージλｇｔ１１ライブラリーの場合に有用である。ヒトの胎児脳λｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明者は２つの遺伝子をクローニングし、それらがコードするタンパク質を特徴づけすることができた。そのうちの１つＧＲＢ−１と呼ばれるものは、完全に配列決定され、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳＨ３ドメインを含む約８５ｋＤａ  の分子量をもつ新しいヒトタンパク質をコードすることがわかった（図４及び図５）。部分的に配列決定されたＧＲＢ−２も同様にユニークＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含んでいる。
【００３３】
ＧＡＰ及びＰＬＣガンマタンパク質内にあるようなＳＨ２ドメインは、ＥＧＦＲのリン酸化されたＣ末端とこれらのタンパク質の会合に関与する（以下の第ＶＩ例参照）。したがって、ＳＨ２ドメインの１つの機能は、効果的なチロシンリン酸化反応を容易にするため、レセプターチロシンキナーゼ分子の細胞内部分とその基質を並置することである。
【００３４】
本発明の方法を用いて識別された本発明のｃＤＮＡクローンのうちのひとつ、ＧＲＢ−１を詳細に分析することにより、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳＨ３ドメインを含む新しい配列が明らかにされる。このタンパク質は、さまざまな組織及び細胞系統において発現される。その予想された分子量８５ｋＤａ  は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でのその移動と一貫性をもつ。
【００３５】
「レセプターチロシンキナーゼ」という語は、チロシンキナーゼ酵素活性をもつドメインを含む単数又は複数の細胞内ドメインと細胞外レセプタードメインをもつ膜貫通タンパク質を意味する。さらなる細胞内ドメインは、ＳＨ２に対する配列相同性を有しうる。これらの分子は、当該技術分野において周知のものである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｌ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：  １５６４−１５７０  （１９８９  年）；  Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ６１：  ２０３−２１２  （１９９０年）；  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．
２６５：  ７７０９−７７１２  （１９９０年））。
【００３６】
レセプターチロシンキナーゼと相互作用しこのレセプターチロシンキナーゼによってリン酸化されうるタンパク質は、細胞外レセプタードメインに結合するこれらのレセプターに対する「リガンド」とは区別して、これらのレセプターに対する「標的」タンパク質と呼ばれる。
【００３７】
本発明に従うと、発現クローニング方法は、λｇｔ１１といったような遺伝子発現ライブラリー上で直接実施される。好ましい実施態様においては、ＤＮＡはヒトｃＤＮＡである。より好ましくは、ＤＮＡはヒト胎児脳ＤＮＡである。ヒトの遺伝子のクローニングのための出発物質としてこのような供給源を使用することは、大量の組織を取って抗体を産生するか又はタンパク質を精製し部分的に配列決定しオリゴヌクレオチドプローブをこの配列から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いる代替的手段に比べ、著しい利点を有する。これらの工程を回避することの利点は、胎盤を除き、組織が一般に大量に入手できないことから、ヒト遺伝子の場合に最も適切である。
【００３８】
発現ライブラリーは、単一の工程でスクリーニングされる。好ましくは、λプラークは、感染した細菌内で発現され担体にトランスファーされるライブラリーＤＮＡにコードされたタンパク質のトランスファーを可能にするべく、固体担体、好ましくはニトロセルロース上にブロッティングされる。この担体は、次に、本明細書に記述しているように、本発明のプローブと共にインキュベートされる。プローブは、チロシン−リン酸化ポリペプチドに対する結合能力を有するタンパク質に結合することができる。プローブに用いられる標識、好ましくは放射性同位元素３２Ｐに基づいて、問題のタンパク質を含むプラークを識別するために適切な検出システムが用いられる。このときこれらのプラーク内のファージが選択され、それらの中のＤＮＡ挿入物を再クローニングし、切り出し、当該技術分野において周知のようにタンパク質の大規模な発現のために使用されるその他のベクター内などに入れることができる。
【００３９】
当業者であれば、使用されるシステムの精確な性質に応じて濃度、時間、温度を変化させることができることがわかるであろうし、又、過度の実験無しに該当するパラメーターを変化させる方法がわかるだろう。さらに、この分野における一般的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （前出）の中に記述されている。
【００４０】
固相担体を作製できる材料としては、ニトロセルロース、セルロース、紙、置換型ポリスチレン、アクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリペンテン、酸化シリコーンが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００４１】
本発明のプローブは、レセプターチロシンキナーゼ、好ましくはＥＧＦＲのＣ末端ドメインから誘導されたチロシンリン酸化ポリペプチド分子である。ポリペプチドは、約２５個から約２５０個のアミノ酸の長さを有していてよい。プローブは、リン酸化された天然配列又はその機能的誘導体（以下に規定）でありうる。１個から５個のチロシン残基でＣ末端ドメインを自己リン酸化するため、レセプター分子上に存在するチロシンキナーゼドメインを用いることによって、きわめて効率の良いリン酸化反応が得られる。チロシン残基をリン酸化するためには（例Ｉに詳細に記述されている）既知の方法及び条件が用いられる。好ましい基質は〔γ−Ｐ３２−アデノシン三リン酸〕である。プローブを作るために原材料として用いられるレセプター分子の供給源としては、組織又は細胞から化学的に精製された分子又は組換えＤＮＡ法により産生された分子が考えられる。
【００４２】
組換え技術を用いる場合、天然型レセプターを産生させてもよいし、或は又代替的には、レセプター様の誘導体を産生させてもよい。好ましいレセプター様の誘導体としては、Ｃ末端ドメインに連結されたチロシンキナーゼドメインが挙げられる。また別の実施態様においては、別々の分子として２つのドメインを産生させ、混合してＣ末端由来ポリペプチドのチロシンリン酸化を達成することができる。
【００４３】
本明細書に記述するようなレセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化されたＣ末端部分を含むプローブは、融合タンパク質の形で組換え手段によって産生されうる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」というのは、ＳＨ２ドメインを有するタンパク質といった、細菌性タンパク質及び問題のポリペプチドを含む融合されたタンパク質のことであってよい。代替的には、融合タンパク質は同様に、キナーゼによってリン酸化されうる単数又は複数のチロシン残基をもつレセプターチロシンキナーゼＣ末端ドメインに連結されている選択的酵素的切断部位に、チロシンキナーゼドメインをコードするＤＮＡ配列が連結されている、人工的に構築されたレセプターチロシンキナーゼ様誘導体であってもよい。このタイプの「融合タンパク質」をコードするこのような遺伝子構築物を、発現運搬体中に挿入して、細菌又は真核生物の宿主内で発現させることができる。ひとたび発現されると、このような融合タンパク質は自己リン酸化することができ、ここでキナーゼはＣ末端ドメイン内でチロシン残基をリン酸化するべく作用する。このリン酸化反応に続いて、適切な酵素を使用することによって選択的に切断部位における切断が起こり、かくしてＣ末端リン酸化ポリペプチドをＮ末端キナーゼから分離し、これをプローブとして役立てることができる。
【００４５】
Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：  １０５６−１０６３  （１９７７年））及びＲｉｇｇｓ（米国特許第４，３６６，２４６号（１９８２年））は、外来性タンパク質の細胞内崩壊を妨げる融合タンパク質の形での外来性タンパク質の細菌発現のための方法を教示した。さらに、過剰に発現された融合タンパク質は、往々にして細菌細胞内に細胞封入体として貯えられており、したがって単離及び精製が比較的容易である（Ｍａｒｓｔｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ． ２４０：  １−１２  （１９８６年））。これらの参考文献は、選択的切断部位の概念に基づく代替的切断方法を示唆していた。すなわち、メチオニンが望まれる接合部に挿入されて臭化シアンのための標的部位として役立つことができたのと全く同じように、アミノ酸特異性をもつタンパク質分解酵素による攻撃を受けうる特異的アミノ酸部位も導入することができた。Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ ３０９：  ８１０−８１２  （１９８４  年））は、血液凝固因子Ｘａのための切断部位として役立つ４つのアミノ酸の配列を導入することによる融合タンパク質における望ましい遺伝子産物の産生を開示していた。Ｘａ因子による切断は同様に、従来の方法によりＥ．ｃｏｌｉの中で発現された大部分の真核性タンパク質の中に存在する開始コドンによってコードされる余分なＮ末端メチオニンも除去した。Ｘａ因子又はトロンビンによって認識される酵素的切断部位を、望まれるタンパク質の細菌内での発現を強化しその精製をさらに容易にするために使用することを記述したその他の参考文献（Ｇｅｒｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８１：  ６９２−４６９６  （１９８４  年）；  Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ ６２：  ５５−６４  （１９８８  年）；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ ６７：  ３１−４０  （１９８８年）；  Ｋｎｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７４：  ４０５−４１０  （１９８８年）；及びＤｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７４：  ４１１−４１６  （１９８８年））。
【００４６】
「選択的切断部位」という語は、化学物質又は酵素のいずれかによって選択的に切断され、予想可能な形で切断を達成することのできる単数又は複数のアミノ酸残基のことを意味する。選択的酵素的切断部位は、タンパク質分解酵素により認識され、加水分解されるアミノ酸又はペプチド配列である。このような部位の例としては、トリプシン又はキモトリプシン切断部位が含まれる。本発明の好ましい一実施態様においては、選択的切断部位は、血液凝固Ｘａ因子によって認識され切断される配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇから成る。また別の実施態様においては、選択的切断部位は、トロンビンによって認識され切断される配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有する。
【００４７】
レセプター様の誘導体を構築するにあたっては、酵素認識部位をコードする配列に対して５′にあるオリゴヌクレオチド配列を含ませることができ、又長さを変化させてもよい。例えば、１つの実施態様においては、Ｉｌｅに対するコドン（Ｘａ因子認識部位の開始）とチロシンキナーゼドメインをコードする配列の３′末端の間に、１３のヌクレオチドを位置させている。
【００４８】
したがって、本発明の一実施態様においては、チロシンキナーゼドメインと
Ｃ末端ドメインの間に、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列が導入されている。また別の実施態様においては、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列が導入される。この切断部位をもつタンパク質は、標準方法を用いて細菌内で発現させられる。その後、好ましくは〔ガンマ３２Ｐ〕アデノシン三リン酸を用いたＣ末端ドメインの自己リン酸化反応が起こることができ、それに続いて、例えばＸａ因子といった適切な切断作用物質を用いたチロシンリン酸化Ｃ末端ドメインの選択的切断が起こる。
【００４９】
本発明は同様に、特定のヒト染色体に対して、レセプターチロシンキナーゼのための標的タンパク質（例えば本明細書に規定されているようなＧＲＢタンパク質）をコードする遺伝子、好ましくはヒト遺伝子をマッピングする方法も提供している。この方法は本明細書に記されている新しい発現クローニング方法と、特定の染色体にある遺伝子をマッピングするためのいくつかの既知の技術のうちの１つを組合わせている。かくして、本発明に従うと、λｇｔ１１クローンといったＧＲＢタンパク質をコードするＤＮＡ挿入物を含むクローンが、本明細書に開示されている発現クローニング方法を用いて識別される。挿入物は、望まれる場合、当該技術分野で周知の方法ならびに、クローンの核酸の直接標識か又はクローンの配列のユニーク部分に相応するオリゴヌクレオチドプローブを産生することによって構築されたプローブを用いて、さらにサブクローニングされうる（参考：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９年））。この標識されたプローブは、次に、ヒト−ハムスター体細胞ハイブリッドのパネルからのＤＮＡを含むＢｉｏｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）製のＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｂｌｏｔ  といった市販のブロットを用いたハイブリダイゼーション検定において使用できる（Ｋｏｕｒｉ，  Ｒ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ． ５１：  １０２５（１９８９年））。そのヒト−ハムスターハイブリッド細胞内にどのヒト染色体が残っているかと、問題のＧＲＢ遺伝子に特異的なプローブのハイブリダイゼーションとを比較することによって、遺伝子は特定のヒト染色体にマッピングされる。このようにして、この染色体上に存在する既知のヒト遺伝子（又はその中の突然変異によりひき起こされる疾病）に対するリンケージが立証される。より細かいマッピングのために当該技術分野において周知の方法、例えば既知のヒト欠失突然変異を使用して、
ＧＲＢ遺伝子をさらに精確にその他のヒト遺伝子に対してマッピングすることができる。
【００５０】
本発明のチロシンリン酸化されたレセプターチロシンキナーゼＣ末端プローブポリペプチド及び本発明のＧＲＢタンパク質、ならびに本発明の方法を用いて発見されるさらなるまだ未知のＧＲＢタンパク質は、レセプターチロシンキナーゼを通したシグナル伝達を介して起る細胞成長制御を調整することのできるその他の作用物質及び薬物をスクリーニングするための方法において有用である。チロシンリン酸化プローブポリペプチド又はＧＲＢタンパク質あるいはそれらのフラグメントを固相担体マトリックスに付着させることによって、その親和力プローブに結合することのできる複雑な混合物から分子を単離し精製するのに使用可能な親和力プローブが作り出される。さらに、このような親和力プローブは、チロシンリン酸化プローブ又はＧＲＢタンパク質を結合できる分子の生物学的流体中における存在を検出するためにも有用である。同様にして、このプローブ又は
ＧＲＢと相互作用するその能力について、化学的作用物質をテストすることも可能である。
【００５１】
固相に対してタンパク質及びペプチドをカップリングさせるための方法、これらの方法において有用な固相物質及び溶出手段は、当業者にとって周知のものである。
【００５２】
ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲを含む、レセプターチロシンキナーゼである成長因子レセプターの場合、チロシンリン酸化反応は細胞成長及び発がん性形質転換に連関している。細胞内のＧＲＢの作用の妨害は、成長を妨げるか又は抑制する可能性があり、又腫瘍の発達を妨げる手段としても役立ちうる。さらに、レセプターチロシンキナーゼ又はＧＲＢのＣ末端部分内の突然変異あるいはその相互作用の調節不良は、ガンの可能性を促進しうる。
【００５３】
インシュリンレセプター（ＩｎｓＲ）も同様にレセプターチロシンキナーゼであり、ＩｎｓＲを担持する細胞内のチロシンリン酸化反応は、正常な生理学的機能と結びつけられる。細胞成長及びガンの場合とは対照的に、ＧＲＢ及びレセプターのチロシンリン酸化部分の正常な相互作用の妨害はインシュリンの効果を妨げることになる。ＧＲＢタンパク質の正常以下のレベル又は活性は、正常な対調節メカニズムを無くするように作用しうる。恐らくは、ＧＲＢタンパク質の過剰発現又は過剰活性は、細胞に対するインシュリンの作用を抑制するか又は完全に妨げる可能性があり、かくして糖尿病（インシュリン抵抗性の）へと導きうる。したがって、糖尿病に対する罹病性は、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質の調節不良と結びつけることができる。
【００５４】
したがって、正常な又は突然変異体のＧＲＢタンパク質遺伝子を識別するためのあるいは細胞内のＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２の存在又はその量を検出するための本発明の方法は、レセプターチロシンキナーゼ経路によって媒介される細胞代謝における変化と関連するがん、糖尿病その他の病気に対する罹病性を識別するための方法として役立つことができる。
【００５５】
本発明は、被検者体内の正常又は突然変異体ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質の存在及びそのレベルを評価するための方法を提供する。被検者体内のこれらのタンパク質の変調した発現又は突然変異体ＧＲＢタンパク質の存在は、発ガン性形質転換及びガンの発病に対する罹病性の重要な予測物として役立ちうる。代替的には、ＧＲＢタンパク質の変調した発現は、糖尿病に対する罹病性の重要な予測物として役立つことができる。
【００５６】
ＧＲＢタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在について被検者からの細胞をテストするのに、ＧＲＢタンパク質のさまざまな部分をコードするオリゴヌクレオチドプローブが用いられる。好ましいプローブは、本発明のＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質の少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸残基をコードする核酸配列に対し向けられたものである。このようなプローブを使用して、定性的又は定量的検定を行なうことができる。例えば、細胞又は組織の調製物におけるＧＲＢタンパク質のｍＲＮＡの発現を測定するためには、ノーザン分析（以下の例ＩＩＩを参照のこと）が使用される。
【００５７】
このような方法は、選択的増幅技術の使用の後、被検者から得られるきわめて少量のＤＮＡを用いてさえ利用できる。精製された核酸フラグメントを増幅することのできる組換えＤＮＡ法が長い間認知されてきた。典型的にこのような方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内への核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン増幅、及び増幅された核酸フラグメントの回収を含む。このような方法論の例は、Ｃｏｈｅｎ  他（米国特許第４，２３７，２２４号）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前出）などによって提供されている。
【００５８】
最近、このような望ましい核酸分子の濃度を増大させることのできるインビトロ酵素法が記述されてきた。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖」反応又は「ＰＣＲ」として呼称されてきた（Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５１：  ２６３−２７３  （１９８６年）；  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＰ  ５０，４２４；  ＥＰ  ８４，７９６，  ＥＰ  ２５８，０１７，  ＥＰ  ２３７，３６２；  Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．，  ＥＰ  ２０１，１８４；  Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＳ４，６８３，２０２；  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．，  ＵＳ  ４，５８２，７８８；  及びＳａｉｋｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＳ  ４，６８３，１９４）。
【００５９】
ポリメラーゼ連鎖反応は、その配列が予め精製されておらずかつ特定の試料内に単一のコピーでしか存在しない場合でさえ、特定の核酸配列の濃度を選択的に増大させるための方法を提供する。この方法は、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡのいずれかを増幅するために使用できる。この方法の核心には、望まれる核酸分子の鋳型依存型のポリメラーゼ媒介複製のためのプライマーとして役立つ２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用が関与している。
【００６０】
ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプローブの精確さは、この方法の成功にとってきわめて重要である。周知のように、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子は、分子のリン酸基の５′−３′連鎖を通して付与される指向性を有する。ＤＮＡ又はＲＮＡの配列は、１つの配列の５′末端リン酸基と第２の配列の３′末端ヒドロキシル基の間のホスホジエステル結合の形成を通して連結される。核酸分子のポリメラーゼ依存型増幅は、核酸分子の３′ヒドロキシル末端に対する５′ヌクレオチド三リン酸の付加によって進行する。かくしてポリメラーゼの作用は、核酸分子の３′末端を伸長させる。これらの固有の特性は、ＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブの選択において活用されている。ＰＣＲ法のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、それが、増幅の望まれる特定の核酸配列のフランキング配列と同一の又はそれに相補的な配列を含んでいるように選択される。
【００６１】
さらに具体的に言うと、「第１の」プローブのオリゴヌクレオチド配列は、望ましい配列に対し３′に位置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできるように選択されており、一方「第２の」プローブのオリゴヌクレオチド配列は、それが望ましいドメインに対し５′のところに存在するものと同一のオリゴヌクレオチド配列を含むような形で選択される。両方のプローブは共に３′ヒドロキシル基を有し、したがって核酸合成のためのプライマーとして役立つことができる。
【００６２】
ＰＣＲにおいては、反応条件は、ハイブリダイゼーション及び核酸重合の助けとなる条件及び二重鎖分子の変性を結果としてもたらす条件の間で循環させられる。反応の第１段階では、試料の核酸は一時的に加熱され、次に冷却されて、存在しうるあらゆる２本鎖分子が変性される。次に「第１の」及び「第２の」プローブは、望まれる核酸分子の濃度をはるかに上回る濃度で試料に添加される。試料が、ハイブリダイゼーション及び重合の助けとなる条件下でインキュベーションされると、「第１の」プローブは、増幅されるべき配列に対して３′の位置で試料の核酸分子とハイブリダイズすることになる。試料の核酸分子が当初２本鎖であった場合、「第２の」プローブは、増幅が望まれている配列の相補体である配列に対して３′の位置において核酸分子の相補鎖とハイブリダイズすることになる。ポリメラーゼを添加した時点で、「第１の」及び（核酸分子が２本鎖である場合には）「第２の」プローブの３′末端は伸長されることになる。「第１の」プローブの伸長は結果として、望まれる核酸の正確な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらすことになる。「第２の」プローブの伸長は、結果として、望まれる核酸の相補体の正確な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。
【００６３】
ＰＣＲ反応は、「第１の」プローブの伸長産物が必然的に「第２の」プローブの配列に相補的な配列を含み、かくして「第２の」プローブの伸長産物の産生のための鋳型として役立つことから、特異的核酸配列の指数増幅を行なうことができる。同様に、「第２の」プローブの伸長産物は、必然的に、「第１の」プローブの配列に対して相補的な配列を含み、かくして「第１の」プローブの伸長産物の産生のための鋳型として役立つことができる。したがって、重合及び変性のサイクルを可能にすることにより、望まれる核酸分子の濃度の幾何学的増加を達成することが可能である。ＰＣＲに関する総説は、Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．  ５１：  ２６３−２７３  （１９８６年））；  Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：  １００８−１０１２  （１９８５年））；  及びＭｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：  ３３５−３５０  （１９８７年））に提供されている。
【００６４】
１つの実施態様においては、本発明は、天然のＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質に向けられている。また別の実施態様においては、本発明は、組換え型
ＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質に向けられている。本発明は、天然に関連しているその他のタンパク質を実質的に含まない天然のタンパク質分子を提供している。「その他のタンパク質又は糖タンパク質を実質的に含まない」というのは、そのタンパク質が少なくとも９０パーセント（重量ベースで）以上さらには望ましくは少なくとも９９パーセント以上の天然に関連するその他のタンパク質及び糖タンパク質から精製され切っており、したがって実質的にこれらを含まないことを意味している。これはＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質を含む細胞、組織又は流体を、そのタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体を担持する免疫吸着剤カラムといった標準的なタンパク質精製技術に付すことによって達成することが可能である。
【００６５】
ＧＲＢ−１遺伝子のヌクレオチド配列、及びＧＲＢ−１タンパク質のアミノ酸配列は、図４に示されている。ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び部分的アミノ酸配列は、図１６に示されている。
【００６６】
好ましい実施態様においては、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２あるいは未知のＧＲＢタンパク質は、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化Ｃ末端ドメイン、又はその機能的誘導体である本発明のプローブを、親和性プローブとして用いることによって、単離かつ精製することができる。
【００６７】
代替的には、硫酸アンモニウム沈殿、分子ふるいクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な方法の組合せにより、精製を達成することができる。
【００６８】
本発明のＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質が、さまざまな細胞又は組織供給源から生化学的に精製可能であることが理解できるだろう。天然のＧＲＢタンパク質の調製のためには、哺乳動物の胎盤又は脳といった組織が好まれる。
【００６９】
もう１つの方法として、ＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２の遺伝子が単離又は合成できるため、このポリペプチドは、要すれば、他のタンパク質すなわち原核生物中の哺乳動物起源又は非哺乳動物真核生物における糖タンパク質類を実質的に含まないように合成することができる。本発明において意図されているように、トランスフェクションによって生産されたＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞において生産される組換えＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２分子は、例えば、天然に存在するタンパク質配列であるか、あるいは、その機能的誘導体である。天然産のタンパク質又は糖タンパク質が組換え手法によって生産される場合、それは、それが本来結びついている他のタンパク質及び糖タンパク質を実質的に含まない形で提供される。
【００７０】
さらには、固相支持体上で所望の配列を有するポリペプチドを合成し、次いでその支持体から分離するいくつかの方法が良く知られている。特に、本発明のチロシン−リン酸化Ｃ末端ドメインプローブ又はその機能的誘導体は、ホスホチロシンがチロシンの代りに提供されるポリペプチド合成法を用いることによって合成することができ、その結果、ポリペプチドのリン酸化されたものが直接合成されることになる。
【００７１】
本発明は、チロシン−リン酸化Ｃ−末端ドメインポリペプチド及び／又はＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質の「機能的誘導体」を提供する。
【００７２】
「機能的誘導体」とはＧＲＢタンパク質の「断片」、「変種」、「類縁体」又は「化学的誘導体」を意味するが、これらの用語については、以下に定義する。機能的誘導体は、本発明による有用性を与える本来のタンパク質の機能を少なくとも一部分を保持している。
本発明のいかなるタンパク質又はポリペプチド類の「断片」も、該分子のサブセットすなわち短鎖ポリペプチドのことを言う。
該タンパク質の「変種」とは、完全ペプチド又はその断片に実質的に類似した分子のことを言う。変種ペプチドは、当業界で周知の方法を用いることによって、変種ペプチドの直接化学合成によって好都合に調製することができる。
【００７３】
もう１つの場合として、該タンパク質のアミノ酸配列の変異種は、合成ペプチドをコードするＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。そのような変異種には、例えば、該アミノ酸配列内の残基の欠失体、又は、その挿入体もしくは置換体が含まれる。欠失、挿入及び置換のいかなる組合せも、最終構成体が目的とする活性を備えているかぎり、最終構成体に到達するために、適用することができる。明らかに変異ペプチドをコードするＤＮＡにおいて起きる突然変異は、リーディング・フレームを変化させてはならず、二次的なｍＲＮＡ構造を産出することが可能な相補性領域を創出しないことが好ましい（ヨーロッパ特許公報第ＥＰ７５，４４４参照）。
【００７４】
遺伝学的レベルにおいては、これらの変異種は、通常、ペプチド分子をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され（例えばＡｄｅｌｍａｎ  ら、ＤＮＡ  ２：  １８３  （１９８３））、それにより、該変異種をコードするＤＮＡを生成し、その後、組換え細胞培養中でＤＮＡを発現させ（下記参照）。これらの変異種は、通常、非変異ペプチドと同じ定性的な生物学的活性を示す。
【００７５】
チロシン−リン酸化ポリペプチド又はＧＲＢタンパク質の「類縁体」とは、完全分子又はその断片に実質的に類似した非天然分子のことを言う。
【００７６】
チロシン−リン酸ポリペプチド又はＧＲＢタンパク質の「化学的誘導体」は、通常はこのペプチドの一部分ではない付加的な化学的部分を含む。このペプチドの共有結合変異（体）も本発明の範囲に含まれる。そのような変異（修飾）は、該ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、その分子中に導入することができる。
【００７７】
システインニル残基は、殆どの場合、アルファ−ハロアセテート類（及び対応するアミン類）、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させられ、カルボキシメチル又はカルボキサミドメチル誘導体を与える。システインニル残基は、また、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジル・ジスルフィド、メチル・２−ピリジル・ジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロ−マーキュリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ダイアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【００７８】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルプロカーボネートとの反応によって誘導体とすることができる。というのは、この試薬が、ヒスチジル側鎖に対し比較的特異性があるからである。パラブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行うのが好ましい。
【００７９】
リジニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果がある。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するに適した他の試薬には、メチル・ピコリンイミデートのようなイミドエステル類、ピリドキサール・ホスフェート、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオンが含まれ、さらには、グリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒による反応を適用してもよい。
【００８０】
アルギニル残基は、一又は数種の従来の試薬、中でも、フェニルグルオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基の高ｐＫａ  値のために、アルカリ性条件で反応を行うことが必要である。さらには、これらの試薬は、リジンの基とも、あるいは、アルギニンのイプシロンアミノ基とも反応することができる。
【００８１】
チロシル残基そのものの特異的修飾については、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基中へスペクトルに掛る標識（ラベル）を導入する特定の関心を持って、広汎に研究が行われている。殆どの場合、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが用いられ、Ｏ−アセチル・チロシル体及び３−ニトロ誘導体を、それぞれ生成する。
【００８２】
カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類（Ｒ′−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ′）との反応によって、選択的に修飾される。さらには、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウム・イオンとの反応によって、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【００８３】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱アミノ化されて、相当するグルタミル及びアスパルチル残基となる。あるいはまた、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に入る。
【００８４】
二官能性試薬による誘導体化は、水不溶性支持体マトリックス又は他の巨大分子担体へ、ペプチドを架橋結合させるのに有用である。通常使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル類）、３，３′−ジ−チオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステル類をはじめとするホモ二官能性イミドエステル類、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド類が挙げられる。メチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。もう一つの方法として、シアノゲン・ブロミド活性化炭化水素のような反応性水不溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；及び４，３３０，４４０に記載された反応性基材がタンパク質の不溶化に用いられる。
【００８５】
他の修飾反応としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化（水酸化）、セリルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ｐｐ．  ７９−８６  （１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、そして、いくつかの場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
そのように誘導体化された部分は、溶解性、吸収、生物学的寿命（耐久性）などを改善しうるであろう。かかる部分は、一方で、該タンパク質等の望ましくない副作用を除去ないしは軽減する。このような効果をもたらす部分については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （１９８０）に開示されている。
【００８６】
本発明のための好ましい細菌宿主はＥ． ｃｏｌｉ．（イー・コリ）である。他の実施態様においては、他の細菌の種を使用することができる。さらに他の実施態様においては、真核細胞、例えば、酵母、糸状菌等を利用することができる。これらのタイプの細胞の使用は、当業界で周知である。いかなる宿主も、発現プラスミド中のレプリコン及び制御配列と適合性があるタンパク質を発現するために用いられる。一般的に、宿主細胞と適合する種から誘導された、レプリコン及びコントロール配列を含むベクターが、該宿主と関連付けて用いられている。ベクターは、通常、レプリコン部位及び感染されるか形質転換された細胞において表現型の選択を与えることができる特定の遺伝子を有している。融合タンパク質の発現もまた、形質転換されない状態にある生物に相同的でありうる他の調節配列の制御下に置くことができる。
【００８７】
本発明は、また、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質のエピトープに特異的な抗体、及び細胞、細胞もしくは組織抽出物、又は生物学的流体中のＧＲＢタンパク質の存在を検出するか、又はその量もしくは濃度を測定するための、かかる抗体の使用にも関する。
【００８８】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体及び抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体を含むことを意図している。
ポリクローナル抗体は、抗原により免疫された動物の血清から誘導された抗体分子の不均一集団である。
【００８９】
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団である。ｍＡｂｓは、当業者に公知の方法で得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ ２５６：  ４９５−４９７  （１９７５）並びに米国特許第４，３７６，１１０号参照。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びそれらのサブクラスをはじめとする免疫グロブリンのいかなるクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂｓを産生するハイブリドーマは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で培養することができる。生体内での高い力価のｍＡｂｓの産生は、この方法を、しばしば、現在のところ好ましい産生方法にしている。簡潔に言うと、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタンで感作したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、目的とするｍＡｂｓを高濃度で含む腹水を産生させる。ＩｇＭ又はＩｇＧイソタイプのｍＡｂｓは、そのような腹水から、あるいは培養上清から、当業者に周知のカラムクロマトグラフィーを用いることによって、精製することができる。
【００９０】
キメラ抗体は、その異なった部分が異なった動物種から誘導される分子、例えば、マウスｍＡｂｓから誘導される可変領域及びヒトイムノグロブリンの定常領域を有するものである。キメラ抗体及びその製造方法は、公知である（Ｃａｂｉｌｌｙ  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  ３２７３−３２７７  （１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８１：  ６８５１−６８５５  （１９８４）；  Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：  ６４３−６４６  （１９８４）；  Ｃａｂｉｌｌｙ  ら、ヨーロッパ特許出願第１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：  ２６８−２７０  （１９８５）；  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ヨーロッパ特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ら、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；  Ｋｕｄｏ  ら、ヨーロッパ特許出願第１８４１８７（１９８６年６月１１日公開）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ら、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；  Ｓａｈａｇａｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：  １０６６−１０７４；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開＃ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕ  ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ． ＵＳＡ８４：  ３４３９−３４４３  （１９８７）；  Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８４：  ２１４−２１８  （１９８７）；  Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：  １０４１−１０４８。これらの参考文献は、ここに引用によって、組み込まれる。
【００９１】
抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に関連している独特の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂのソースと同じ種及び遺伝学的タイプ（例：マウスの株）の動物を、それに対する抗−Ｉｄを作ろうとしているｍＡｂで免疫することにより調製することができる。免疫された動物は、イディオタイプの決定基に対する抗体（抗−Ｉｄ抗体）を産生することにより、免疫抗体のイデオタイプの決定基を認識し、それに応答する。
【００９２】
抗−Ｉｄ抗体は、また、さらに他の動物における免疫応答を誘起して、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗原を産生させる「免疫原」として用いることもできる。この抗−抗−Ｉｄは、抗−Ｉｄを誘起した元のｍＡｂに、エピトープ的に同一でありうる。かくして、ｍＡｂのイディオタイプの決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
【００９３】
したがって、本発明のＧＲＢタンパク質に対して産生したｍＡｂｓはＢＡＬＢ／ｃマウスのごとき適当な動物中で抗−Ｉｄ抗体を誘起するために用いることができる。そのような免疫されたマウスからの脾細胞は抗−ＩｄｍＡｂｓを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを産生するために使用される。さらに、この抗−ＩｄｍＡｂｓはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体に結合させて、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することができる。これらのマウスからの血清は、ＧＲＢタンパク質のエピトープに特異的な元のｍＡｂの結合性能（結合能）を有する抗−抗−Ｉｄ抗体を含むであろう。
【００９４】
この抗−ＩｄｍＡｂｓは、かくして、それら自身のイディオタイプのエピトープ、すなわち、ＧＲＢタンパク質−αのような評価さるべきエピトープに構造的に類似した「イディオトープ」を有する。
【００９５】
「抗体」という用語は、また、完全な分子はもとより、例えば、抗原に結合することができるＦａｂ及びＦ（ａｂ′）２のような、その断片（フラグメント）をも含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）２フラグメントは、完全抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環系からより速く除去され、そして、完全抗体よりもより少ない非特異的組織結合能を有することができる（Ｗａｈｌら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２４：  ３１６−３２５  （１９８３））。
【００９６】
本発明に有用な抗体のＦａｂやＦ（ａｂ′）２及びその他のフラグメントは、本明細書において、完全抗体分子について開示された方法に従って、ＧＲＢタンパク質の検出及び定量に使用することができる。このようなフラグメントは、通常、パパイン（Ｆａｂフラグメント類を産生する）又はペプシン（Ｆ（ａｂ′）２フラグメント類を産生する）のような酵素を用いる、タンパク質分解による切断によって産生される。
【００９７】
抗体は、もしそれがある分子と特異的に反応して、それにより、該抗体に該分子を結合させることができる場合に、該分子に「結合能を有する」と言われる。「エピトープ」なる用語は、抗体によって認識もされうる、抗体によって結合される分子のその部分のことを言うことを意味する。エピトープすなわち「抗原決定基」は、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面群からなり、特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を有する。
【００９８】
「抗原」は、抗体によって結合されることができる分子又は分子の部分であり、それは、さらに該抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生するように動物を誘起することができる。抗原は、一つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。上述した特異的反応とは、該抗原が、高度に選択的な形で、その対応する抗原と反応はするが、他の抗原によって誘発されうる他の抗体の多くのものとは反応しないことを示すことを意味する。
【００９９】
本発明において有用な抗体もしくは抗体のフラグメントは、ＧＲＢタンパク質を発現する細胞の存在を定量的又は定性的に検出するために用いることができる。これは、光学顕微鏡による測定、フローサイトメトリーによる測定又は蛍光分析による測定と一緒に、蛍光標識抗体（以下参照のこと）を用いる免疫蛍光技術によって達成される。
【０１００】
本発明において有用な抗体（又はそのフラグメント類）は、ＧＲＢタンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕ検出するために、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡的分析におけるように、組織学的に使用することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織標本を取り出してそのような標本に本発明の標識抗体を合わせることにより達成することができる。これらの抗体（又はフラグメント）は、生物学的試料に標識抗体（又はフラグメント）を塗るか、積層することによって提供するのが好ましい。そのような手法を使用することにより、ＧＲＢタンパク質の存在だけでなく、試験された組織におけるその分布をも検出することができる。本発明を用いるに当って、当業者は、そのような、その場での検出を達成するために広汎な組織学的方法（例えば、染色方法）を修正することができることを容易に了解するであろう。
【０１０１】
ＧＲＢタンパク質のこのような試験法は、通常、ＧＲＢタンパク質を同定することができる検出可能なように標識化された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、リンパ球もしくは白血球のごとき新たに摂取された細胞又は組織培養でインキュベートされた細胞のような生物学的試料をインキュベートし、数多くの周知技術のいずれかによって該抗体を検出することを特徴とする。
【０１０２】
生物学的試料は、ニトロセルロースのような固相支持体又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質類を不溶化することができる他の固体支持体によって処理することができる。該支持体を、次いで好適な緩衝液で洗浄し、検出可能なように標識されたＧＲＢタンパク質特異的抗体で処理することができる。該固相支持体は、次に、非結合抗体を除去するために、緩衝液で再度洗浄することができる。該固体支持体上の結合標識の量を、次に、従来法を用いて検出することができる。
【０１０３】
「固相支持体」とは、抗原又は抗体と結合することができるものならいかなる支持体であってもよい。周知の支持体もしくは担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然もしくは修飾セルロース、ポリアクリルアミド、はんれい岩（ｇａｂｂｒｏ）及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的に照らして、ある程度可溶性であってもよく、あるいは、不溶性であってもよい。この支持体の材料は、結合した分子が抗原又は抗体を結合することができるかぎり、実際上、いかなる可能な構造上の形態をとってもよい。かくして、支持体の形状は、ビーズのように球形であってもよく、あるいは、試験管の内側壁又はロッドの外壁のようにシリンダー状であってもよい。さらには、表面は、シート、試験片等々のごとく、平坦であってもよい。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者ならば、抗体又は抗原を結合するための他の多くの適当な担体を知っているであろうし、日常的実験によってそれを確認することができるであろう。
【０１０４】
抗−ＧＲＢ−１及び抗−ＧＲＢ−２抗体の与えられたロットの結合活性は、周知の方法によって測定することができる。当業者は、日常的な実験を用いて各測定用の操作上の最適条件を決定することができるであろう。
【０１０５】
洗浄、撹拌、震盪、濾過等のごとき他の操作を、個々の場合、通常行われるごとく、あるいはまた、必要に応じて、試験法に付加することができる。
【０１０６】
ＧＲＢ特異性抗原が検出可能であるように標識化できる一つの方法は、それを酵素に結合させて、酵素免疫試験法（ＥＩＡ）において使用することである。この酵素は、次に、後にしかるべき基質に触れた場合、該基質と反応して、例えば分光光度測定法、蛍光測定法あるいは、肉眼による方法によって検出できる化学的部分を生成する。抗体を検出可能なように標識するために用いることができる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、イーストアルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出は、酵素に対する色原性基質を用いる比色測定法によって遂行することができる。検出は、また、基質の酵素反応の程度を同様に調製された標準と目視比較することによってもなされる。
【０１０７】
検出は、種々の他の免疫試験法のいずれかを用いて行うことができる。例えば、放射能で抗体又は抗体のフラグメントを標識化することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰａｓｅを検出することができる。ＲＩＡについての良き記述は、Ｗｏｒｋ，  Ｔ．Ｓ．ら、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ＮＹ（１９７８）によるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  中に見出すことができる。特に、ここに参考文献として包含する、Ｃｈａｒｄ，  Ｔ．  による「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」の章を参照のこと。ラジオアイソトープは、ガンマー計数器又はシンチレーション・カウンターを用いるような手段あるいはオートラジオオートグラフィーによって検出することができる。
【０１０８】
抗体は、蛍光化合物によって標識することもできる。蛍光によって標識された抗体をしかるべき波長の光に曝すと、その存在は、蛍光によって測定することができる。最も普通に用いられる蛍光標識化合物の中には、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが含まれる。
【０１０９】
抗体は、また、蛍光を発する金属、例えば１５２Ｅｕやその他のランタノイド系列のものを用いても検出可能なように標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート剤を用いて抗体に着けることができる。
【０１１０】
抗体は、また、それを化学発光性化合物と結合させることによっても検出可能なように標識化することができる。化学発光部分をぶら下げた抗体の存在は、次に、化学反応の過程で発生する発光（ルミネッセンス）の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光性標識化化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）・アクリジウム・エステル、イミダゾール、アクリジウム塩及びシュウ酸エステルである。
【０１１１】
同様に、生物発光性化合物も、本発明の抗体を標識するために用いられる。生物発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、生物学的な系の中に見出される一種の化学発光（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）であり、この場合、触媒性タンパク質（酵素）が化学発光反応の効率を高める。生物発光性タンパク質は、ルミネッセンスの存在を検出することによって測定される。標識の目的に重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエークオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）である。
【０１１２】
本発明の抗体分子は、「二部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）」法もしくは「サンドイッチ」法としても知られる免疫測定試験に利用するために適合させてもよい。典型的な免疫測定試験法においては、ある量の非標識化抗体（又はその抗体のフラグメント）を固体支持体に結合させ、検出可能なように標識された可溶性抗体の一定量を加えると、固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成される三成分系コンプレックスの検出及び／又は定量ができる。
【０１１３】
典型的で、かつ、好ましい免疫測定試験法は、固相に結合していた抗体を先ず、テストされるべき試料と接触させ、二成分系固相抗体−抗原コンプレックスを形成することにより、試料から抗原を抽出する前進試験（”ｆｏｒｗａｒｄ  ａｓｓａｙ”）を含む。適当なインキュベーション時間の後、固体支持体を洗浄して、もし存在するならば未反応抗原を含む、流体試料の残部を除去し、次に未知量の標識抗体（それは「リポーター分子」として働く）を含む溶液と接触させる。標識抗体をして、非標識抗体を介して固体支持体に結合された抗原と複合体を形成させるための第二のインキュベーション時間の後、固体支持体を再び洗浄して、未反応の標識抗体を除去する。
【０１１４】
本発明の抗原についても有用でありうるもう一つの型の「サンドウィッチ（”ｓａｎｄｗｉｔｃｈ”）法」においては、いわゆる同時試験法（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）と逆試験法（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｓｓａｙ）が用いられる。同時試験法は、固体支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験さるべき試料に添加するため、単一のインキュベーション工程を要する。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄して流体試料及び複合体を形成しなかった標識抗体を除去する。固体支持体と結合した標識抗体の存在を、次に、従来の前進（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドウィッチ試験におけるように測定する。
【０１１５】
逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）試験法においては、段階的添加が行われる。すなわち、先ず流体試料への標識抗体の溶液の添加と、それに続いて適当なインキュベーション時間の後、固体支持体に結合した非標識抗体の添加が行われる。第２のインキュベーションの後、固相を従来のやり方で洗浄して、試験されるべき試料の残りと、未反応標識抗体の溶液を除く。固体支持体と結合した標識抗体の測定は同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）試験法及び前進（ｆｏｒｗａｒｄ）試験法におけるようにして行われる。
【０１１６】
例  Ｉ
ニトロセルロース・フィルター上に不溶化された、ＳＨ２ドメインを含むタンパク質に対するＥＧＦＲのＣ末端ドメインの結合の検出可能性を測定するために、研究を行った。この目的のために、細菌によって発現された融合タンパク質へのＣ−末端ドメインの結合について調べた（Ｆｉｇ．１、参照のこと）。
Ａ．ＥＧＦＲのカルボキシ末端ドメインの単離と標識化
チロシンキナーゼドメインとカルボキシ末端ドメインを含むＥＧＦＲの細胞内部分を、先に述べた様に、ヒトＥＧＦＲの細胞内ドメインに相補的なｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスから精製した（Ｈｓｕ，  Ｃ．Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １：  １９１−２００  （１９９０））。この組換えタンパク質（２μｇ）を、次に、〔ガンマー３２Ｐ〕ＡＴＰ（２００μＣｉ  、６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、４℃で、５ｍＭＭｎＣｌ２  を含むＨＮＴＧ（２００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％グリセリン）緩衝液中でリン酸化した。導入されなかった〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰを除去するために、１００μｇのＢＳＡを含むｐＨ７．５の２０ｍＭＨＥＰＥＳで１ｍｌにまで稀釈し、次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  −１０中で５０μｌの体積にまで濃縮した。この操作を３回繰返すと、９９％を超える未導入ＡＴＰが除去された。キナーゼドメインからＣ−末端ドメインを分離するために、濃縮されたタンパク質を、次に、シアノゲン・ブロミド（臭化シアン、ＣＮＢｒ）で、７０％ギ酸中、１４時間、室温で消化した（下記例ＶＩも参照のこと）。次いで、試料を３回水洗、乾燥し、結合用緩衝液中、
２×１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように再懸濁させた。
Ｂ．ニトロセルロース上に不溶化された細菌によって発現されたＴｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２融合タンパク質への、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインの結合
ＴｒｐＥ及びＴｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２を、Ｄｒ．  Ｔｏｎｙ  Ｐａｗｓｏｎ  の研究室から得、そして、以前に述べたようにして調製した（Ｍｏｒａｎ，  Ｍ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ８６２２−８６２６  （１９９０））。フィルターへの結合の研究を、発表された方法（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｗ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７６：  ５５７７−５５８１  （１９７９）；  Ｄａｎｉｅｌ，  Ｔ．Ｏ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２５８：  ４６０６−４６１１  （１９８３））を少し修正したものに従って行った。種々の濃度の、細菌によって発現したＴｒｐＥ融合タンパク質か、あるいは、細菌のタンパク質単独をニトロセルロースのフイルターにスポットした。５％カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）ドライミルクを含むＰＢＳ中、４℃で、１時間フィルターをブロックしたのち、ＥＧＦＲの３２Ｐ−標識Ｃ末端ドメインを添加し、一晩、４℃でインキュベーションを続けた。２４時間後、ニトロセルロース・フィルターを、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ    Ｘ−１００を含むＰＢＳで、室温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、−８０℃でＫｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに曝した。
Ｃ．結果
上述の方法は、細菌によって発現された５ｎｇ未満のＧＡＰ−ＳＨ２融合タンパク質に対するＥＧＦＲ  Ｃ末端ドメインの特異的結合の検出を可能にした。結合は特異的であった。というのは、プローブのチロシンリン酸化を必要としたし、関係がないタンパク質をニトロセルロース・フィルターに塗布しても何も起きなかった。
ＥＧＦＲ  Ｃ末端ドメインが、ニトロセルロース・フィルター上に不溶化されたＳＨ−２含有タンパク質に対し、特異的結合することが出来たという事実は、本発明者らを、元気づけて、新規なＥＧＦＲ結合性タンパク質の同定を最終目的にして本研究をλｇｔ１１発現ライブラリーへ応用させんとした。
【０１１７】
例ＩＩ
発現ライブラリーのスクリーニング及び新規なＳＨ２−含有タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＧＦＲのチロシンリン酸化Ｃ−末端尾部を、上述したいくつかの異ったヒト組織からの発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。スクリーニングの手法は、Ｆｉｇ．２にまとめてある。この手法を用いて多くの陽性のクローンが、今までに同定されているが、そのうちで二つを詳細に解析した。
Ａ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ヒト脳幹から単離されたｍＲＮＡから構成されたλｇｔ１１（ｌａｍｂｄａ  ｇｔ  １１）ライブラリーをＭ．  Ｊａｙｅ  から入手した。このライブラリーをスクリーニングするため、λｇｔ１１ファージを、１５０ｍｍの寒天プレート当り４×１０４  プラークが産生されるに充分な密度で、塗り付けた。全部で６つのプレートを最初にスクリーニングした。これらのプレートを６時間４２℃でインキュベートした後、これらのプレート上に、先に述べられたようにして（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  Ｐ．Ｆ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５：  ４５１−４５８  （１９９０））、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で含浸しておいたニトロセルロースフィルターを重ねた。インキュベーションを、３７℃で一晩続けた。次に、フィルターをとり出し、ｔＢＳＴ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、室温で洗浄し、次にＨＢＢ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  Ｍｇ／Ｃｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ）緩衝液（５％のカーネーション・ドライ・ミルクを含む）で、１時間、４℃で上に述べたようにして（上記ＭａｃＧｒｅｇｏｒ  らの文献）、洗浄した。ブロッキングに続いて、標識化チロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ−末端）ブローブを１．６×１０−４μｇ／ｍｌの濃度で添加し、インキュベーションを一晩続けた。フィルターを、次に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中、室温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、−８０℃でＫｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに曝した。
陽性のクローンに相当する寒天プラグをプレートから集め、それをＳＭ培地１ｍｌ中に入れた。寒天からファージを拡散させた後、ファージを再塗布し、上述したようにして再スクリーニングした。次のスクリーニングで富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を示したファージを単離し、配列を決めた。λｇｔ１１ファージＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓらに従ってプレート・ライセート法で単離し、ＥｃｏＲＩ−消化Ｍ１３ＭＰ１９（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８）へサブクローニングした。単鎖ＤＮＡを単離し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ配列決定キット（Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、ジデオキシ鎖終了法（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって配列を決めた。
一つの実験においては、ヒト脳幹λｇｔ１１ライブラリーからの２４０，０００ｐｆｕ  をスクリーニングした。単一のプラーク、クローンｋｉ４（Ｆｉｇ．３Ａ）を単離した。次のスクリーニングで、このクローンは富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を示し、第３回目のスクリーニングで全てのプラークがプローブに結合した（Ｆｉｇ．３Ｂ）。クローンｋｉ４は、約９００ヌクレオチドの挿入物を含み、この挿入物は、ＩＰＴＧを用いてｌａｃプロモーターを誘発すると、ＥＧＦＲに結合可能な融合タンパク質を産生した。融合タンパク質のサイズ（大きさ）から、ｃＤＮＡ挿入物が約３００アミノ酸のタンパク質（このサイズは、もしもｃＤＮＡが単一の大きなオープンリーディングフレームを含んでいるならば予想された大きさである）をコードしていることが予想された。クローンｋｉ４をより詳しく分析するために、ＤＮＡを単離し、ヒトｃＤＮＡ挿入物に相当するＥｃｏＲＩフラグメントをＭ１３中にサブクローニングし、配列を決めた。この挿入物からの配列の翻訳から単一の大きなオープンリーディングフレームが示され、これは、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）のデータベースによれば、他の公知のタンパク質のＳＨ２ドメインと配列ホモロジーを有する約１００アミノ酸の単一伸長部を含むことが判った（Ｆｉｇ．４及び５Ａ）。しかしながら、他のドメ
インには配列ホモロジーは記録されなかった。こうして、このスクリーニング法を用いて、ＥＧＦＲに結合可能な、新規なＳＨ２含有タンパク質が同定された。
Ｂ．完全長ｃＤＮＡの単離
単離された最初のクローンはＳＨ２ドメインをコードしていたが、遺伝子の３′又は５′末端を含んでいなかった。完全長のｃＤＮＡを単離するために、ライブラリーを、最初の陽性ファージから単離されたＤＮＡを用いて再スクリーニングした。陽性のクローンを発現した組換えＭ１３バクテリオファージからのＤＮＡを、温度サイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）、ＴａｑＩポリメラーゼ、及びＭ１３ベクターのＥｃｏＲＩフランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中により多くの５′配列を含むクローンを得るために、最初の単離されたファージの最も５′側の２５０ヌクレオチドに相当する第２の増幅ＤＮＡ生成物もまた、この領域の両端における配列に相補的なオリゴヌレオチドを用いて生成させた。〔３２Ｐ〕−標識化ＤＮＡプローブを、次に、この増幅生成物のニックトランスレーションによって調製した。
ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするために、このライブラリーを上述の様にして再塗布した。プレートを３７℃で８時間インキュベートしたのち、プレートを１時間４℃に冷却、次いでファージＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。フィルターを０．２Ｎ  ＮａＯＨと１．５Ｍ  ＮａＣｌの溶液中で変性させ、次いで、減圧下、２時間、８０℃でベーキングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｕｎａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９））。このフィルターを、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションに付した後、３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを、４２℃で一晩、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６及び１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で続けた。これらのフィルターを、次いで、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄し、乾燥し、そして、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で曝した。次いで、陽性クローンを単離し、上述のようにして配列を決めた。
クローンｋｉ４からの挿入物は、遺伝子の３′及び５′末端を欠いていたため、ライブラリーを、クローンｋｉ４からのＤＮＡを増幅することによって生成した二つのＤＮＡプローブを用いて再スクリーニングした。この手法は、さらに５つのクローンの同定を可能にした。
これらのクローンのうち三つが最初のクローンｋｉ４から３′伸長しており、それらのうち二つ、すなわち、クローンｋｉ２．２及びｋｉ２．４は、ポリアデニル化シグナル及び長い３′非翻訳ドメイン（＞１，０００ヌクレオチド）を含んでいた。さらに、これらのクローンは、第２のＳＨ２ドメインを含むタンパク質をコードしていた（Ｆｉｇ．４及び５Ａ）。
他二つのクローン、すなわち、ｋｉ３．０及びｋｉ５．３は、クローンｋｉ４から５′伸長していた。両クローンは、長いオープンリーディングフレームとＫｏｚａｋ  によって定義された翻訳開始基準に合うＡＵＧコドンを含んでいた（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １０８：  ２２９−２４１  （１９８９））。しかしながら、クローンｋｉ３．０だけが、タンパク質に翻訳してジーンバンク中の公知の配列と比較したとき、他の公知のタンパク質中に存在するＳＨ３ドメインに相同な５０アミノ酸のドメインを含んでいることが見出された。重複クローン、ｋｉ２．２及びｋｉ３．０によってコードされた完全長タンパク質の予想された分子量は、約８４ｋＤａ  であった。この新しいタンパク質をＧＲＢ−１と名付けた。
【０１１８】
例ＩＩＩ
ＧＲＢ−１タンパク質は、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含んでいる。
ＧＲＢ−１タンパク質の配列を、ジーンバンクのデータベース中の配列と比較して分析したところ、アミノ酸３３３及び６２４のところから発する、約１００アミノ酸の２本の伸長部の存在が明らかとなったが、これらは、ＥＧＦＲと相互作用することが知られている他のタンパク質のＳＨ２ドメインと配列の相同性を示していた（Ｆｉｇ．５Ａ）。ＧＲＢ−１は、タンパク質のレベルでは、他のＳＨ２ドメインに驚くべき相同性を示したが、ＤＮＡレベルでは、有意な相同性は明らかにならなかった。ＧＲＢ−１は、また、Ｎ−末端ドメインに位置し、ＳＨ３ドメインに対する配列の相同性を有する５０アミノ酸のセグメントを含んでいた（Ｆｉｇ．４及び５Ｂ）。
ＧＲＢ−１の構造的機構の、いくつかの他のＳＨ２／ＳＨ３含有タンパク質との比較を、Ｆｉｇ．６に示した。この模式図から明らかなように、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインの局在化は、タンパク質毎に異なる。このことにもかかわらず、これらのＳＨ２含有タンパク質間には、ある類似性と相違が存在する。ＧＲＢ−１は、ＰＬＣ−ガンマ及びＧＡＰのようなＥＧＦＲと相互作用することが判っているいくつかの他の基質と、ＧＲＢ−１が２つのＳＨ２ドメインと一つのＳＨ３ドメインを含んでいるという点で相似ている。しかしながら、これらの基質とちがって、ＧＲＢ−１は、公知の触媒性ドメインには相同性を示さず、この点でトリ肉腫ウイルスによってコードされたタンパク質ｖ−ｃｒｋに似ている。
これらのドメイン以外では、ジーンバンクにある他のタンパク質配列とは何らの配列の相同性はなかった。特に、ＧＲＢ−１は、ＡＴＰ−結合共通ドメインを欠いており、セリン／トレオニン・キナーゼ又はチロシン・キナーゼと配列上の相同性を示さなかった。
このＳＨ２ドメインは、それによって酵素学的に明白なシグナル分子がチロシンキナーゼ活性を有する活性化レセプターに結合しうる共通のモチーフを与えるものと考えられている（Ｍｏｒａｎ，  Ｍ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ８６２２−８６２６  （１９９０）；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：  ９７９−９８２  （１９９０））。
ＧＲＢ−１中（Ｆｉｇ．４）及びＧＲＢ−２中のＳＨ２ドメインの存在は、このドメインが、ＥＧＦＲのＣ−末端尾部とこれらのタンパク質の相互作用を仲介しているという点で、このドメインの重要性を強調する。さらには、チロシン・レセプターと相互作用することができる多くのタンパク質が同定されずにいることから、このことは、このタンパク質のファミリーのさらなるメンバーが発見されるであろうことを示唆している。
ＧＲＢ−１は、２つのＳＨ２ドメインを含んでいる他に、ＳＨ３ドメインをも含んでいる。ＳＨ３ドメインは、多くのＳＨ２含有タンパク質に共通に見られる、約５０個のアミノ酸からなる非触媒ドメインである。ＳＨ３ドメインは、スペクトリン（ｓｐｅｃｔｒｉｎ）やフォドリン（ｆｏｄｒｉｎ）のような細胞骨格タンパク質中にも見出されているので、このドメインの機能は、これらのタンパク質を、それらが他の分子と相互作用するであろう膜もしくはサブメンブランの細胞骨格に、局在化させんとする点にあり得る。
ＧＲＢ−１の推定されるアミノ酸配列を、トリのガン遺伝子ｖ−ｃｒｋによってコードされたタンパク質生成物と比較することは、ＧＲＢ−１の機能を明らかにするかも知れない。遺伝子ｖ−ｃｒｋは、一次的にはＳＨ２及びＳＨ３ドメインに融合したウイルスのｇａｇタンパク質から構成されるタンパク質をコードする（Ｍａｙｅｒ，  Ｂ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：  ２７２−２７５  （１９８８））。ＧＲＢ−１及びＰ４７ｇａｇ−ｃｒｋ  タンパク質は公知の触媒ドメインとは相同性がない。しかしながら、Ｐ４７ｇａｇ−ｃｒｋ  で形質転換されたニワトリ胚繊維芽細胞は、高いレベルのホスホチロシン含有タンパク質を示す（Ｍａｙｅｒ，  Ｂ．Ｊ．ら、上記；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：  ２６３８−２６４２  （１９９０）；  Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｍ．ら、Ｓｃｉｎｃｅ ２４８：  １５３７−１５３９  （１９９０））。
ｖ−ｃｒｋ生成物が、ｖ−ｃｒｋ形質転換細胞中でいくつかのホスホチロシン含有タンパク質を結合させることが示されているからには、ｃ−ｃｒｋの機能は、おそらく、キナーゼと基質の橋渡しをすることであろう。この点で、ＧＲＢ−１が、ＧＡＰ及びＰＬＣ−ガンマと同様に、二つのＳＨ２ドメインを含み、これらの組合せが、他のタンパク質を活性化されたチロシンキナーゼレセプターに結合させるのに理想的に適しているということは、興味深い。
【０１１９】
例ＩＶ
ＧＲＢ−１発現のノーザン分析
Ａ．方法
全細胞性ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら（上述）によって記載されたグアニジウムイソシアナート／塩化セリウム法により、サルの組織から調製した。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィーによって調製した。ノーザン分析のために、ＲＮＡを１．２％アガロース／２．２Ｍホルムアルデヒドゲル中の電気泳動によって大きさ別に分画し、毛細管作用によってナイロン膜上に移し、８０℃で２時間加熱した。プレ（予備）ハイブリダイゼーションに続き、ブロットを、上述のようにして調製した〔３２Ｐ〕−ニックトランスレーションＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、４２℃で一晩、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓの存在下、行った。膜（メンブレン）を、次に、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、４２℃で洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲフィルムに、−７０℃で１２時間、強化スクリーンを用いて曝した。
Ｂ．結果
新たに単離されたｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの発現について試験するために、クローンｋｉ４からの挿入物に対応するＤＮＡをプローブとして用いる、異なったサル組織ｍＲＮＡのノーザン・ブロット分析によって、検討した多くの組織中に４．４ｋｂ及び７．０ｋｂの２つの主バンドの存在が示された（Ｆｉｇ．７）。発現は、脳において最も高く、心臓、脾臓、肝臓及び胸腺は、次第に低くなって行くレベルの発現を示した。４．４ｋｂのメッセンジャーは、単離されたクローンをコードするであろうトランスクリプト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の予想された大きさに対応する。多の組織において観察された４．４ｋｂ及び７．０ｋｂのトランスクリプトとは対照的に、皮膚は、３．６ｋｂ及び６．６ｋｂの２つのわずかに小さい大きさのｍＲＮＡを含んでいた。
３．６、６．６及び７．０ｋｂのトランスクリプトは、あるいは、ｍＲＮＡのスプライシングされた形のものを表わしている可能性もあり、また、別個の、しかしながら関連するｍＲＮＡの種をコードしている可能性がある。
【０１２０】
例Ｖ
抗−ＧＲＢ−１抗体の産生及びＧＲＢ−１融合タンパク質の分析
Ａ．方法
ポリクローナル抗体を、最初の単離されたファージクローンｋｉ４によって発現されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質で、ウサギを免疫することにより生産した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＣＡＧ  ４５６  細菌（Ｙａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｎｙｄｅｒより入手）を、組換えファージｋｉ４で、ｍｏｉ１０で感染させ、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を、１．５時間後、タンパク質ペレットから回収した。タンパク質抽出物を調製し、６％ＳＤＳ−ゲル上で分離し、融合タンパク質に相当するバンドをゲルから切り取り、これを免疫に使用した。
ヒトのグリオブラストーマ細胞株Ｕ１２４２、ラット膀胱ガン細胞株ＮＢＴＩＩ、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％の子ウシ血清を補足したＤＭＥＭ培地で密集状態になるまで成長させた。細胞は、０．５％子ウシ血清中、〔３５Ｓ〕−メチオニン（５０μＣｉ  ／ｍｌ）で標識し、先に述べられているようにして、１２時間後に溶解させた（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ ５７：  １１０１−１１０７  （１９８９））。タンパク質Ａ−セファロースにカップリングした抗体１０μｌで免疫沈殿を行った後、ビーズを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ及び１％ナトリウム・デオキシコーレートを含む溶液で３回洗浄した。試料緩衝液中で沸とうさせたのち、タンパク質を、８％ＳＤＳ−ゲル上で分離した。
Ｂ．結果
ポリクローナル抗体が、最初の単離されたファージによって発現されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質に対して誘起された。生合成的に標識した細胞を用いる免疫沈殿実験によれば、これらの抗体は、三つの異なった細胞株における８５ｋＤａ  のタンパク質を認識したことが明らかとなった（Ｆｉｇ．８、“Ｉ”と指定されたレーン）。この抗血清による８５ｋＤａ  タンパク質の認識は特異的である。というのは、プレ免疫血清はこのタンパク質を認識しなかったからである（“Ｐ”と指定されたレーン）。これらの結果は、クローン化ＧＲＢ−１のアミノ酸配列に基づく予測された分子量に支持を与えた。
Ｃ．検討
ＧＲＢ−１の遺伝子は予想された分子量８５ｋＤａ  を有するタンパク質をコードするという知見並びに、ＧＲＢ−１に対する抗体が三つの異なった細胞株からの８５ｋＤａ  タンパク質を免疫沈澱させたという事実は、ＧＲＢ−１が、以前、活性化成長因子レセプターと会合（結合）することが以前から示されている特定のタンパク質、すなわちｐ８５を表すことができることを示唆している。ｐ８５の正確な機能（役割）は未知であるが、それは、おそらく、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ３）−キナーゼであると思われる。というのは、ＰＩ３−キナーゼ活性が、ＰＤＧＦで刺激された細胞ならびにミドルＴ−抗原（ＭＴＡｇ）で形質転換された細胞中で見出された８５ｋＤａ  タンパク質と共に精製されたからである（Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：  １０２１−１０２９  （１９８７）；  Ｗｈｉｔｍａｎ，  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：  ２３９−２４２  （１９８５）；  Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，  Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：  １１９１−１１９４  （１９８９））。ＡＴＰ結合部位の欠除は、ＧＲＢ−１は、おそらく、十中八九、ホスホリピッドキナーゼではないことを示す。ＧＲＢ−１は、マウス及びウシｐ８５と９７％配列が一致している。したがって、ＧＲＢ−１は、ｐ８５のヒトの対応物である。組換えｐ８５は、活性化ＰＤＧＦＲ又はＥＧＦＲに結合することはできるが、それ自身本来的なＰＩ３キナーゼ活性を有さない。しかしながら、ｐ８５は、ＰＩ３キナーゼの触媒性サブユニットでありうる１１０ｋＤａ  のチロシンリン酸化タンパク質と関連を有することが判っている。ＰＩ３キナーゼとｐ８５間の厳密な関係は知られていないものの、ｐ８５の過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）はＰＩ３キナーゼとＰＤＧＦＲの間の相互作用を調節する。ｐ８５は、調節サブユニットとして、又は活性化されたレセプターとＰＩ３キナーゼ間の橋渡しとして働く可能性がある。
【０１２１】
例ＶＩ
ＥＧＦレセプターのチロシンリン酸化カルボキシ末端はＧＡＰ及びＰＬＣ−ガンマの結合部位である
以下に述べる研究は、ＰＬＣ−ガンマと、ＧＡＰのＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含む融合タンパク質（ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２）の結合が、ＥＧＦＲの自己リン酸化によって特異的に制御されていることを確認する。結果が示すところによれば、ＰＬＣ−ガンマのリン酸化は、そのＥＧＦＲとの会合を実際に減少させている。提示された証拠によれば、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質の両者は、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化Ｃ−末端に特異的に結合することが示されている。つまり、これらの結果は、ＳＨ２／ＳＨ３ドメインがＥＧＦレセプターのホスホチロシン含有ドメインと直接相互作用することを示している。
【０１２２】
Ａ．材料及び方法
１．細胞株、変異レセプター及び融合タンパク質
細胞株ＣＤ１２６（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．Ｌ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ． ２６４：  １０６６７−１０６７１  （１９８９ａ））、ＨＥＲ１４、Ｋ７２１（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５１：  １９９−２０９  （１９８７）；  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．Ｍ．  ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． ７：  ４５６７−４５７１  （１９８７））を、それぞれ野生型ＥＧＦレセプター、キナーゼ陰性（ｋｉｎ−）ＥＧＦレセプター及びＣ−末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）を短縮した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＥＧＦレセプターのソースとして用いた。ＥＧＦレセプターの細胞内ドメイン（ＥＧＦＲ−Ｃ）を、バキュロウイルスの発現システム（Ｈｓｕ，  Ｃ．  Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ． １：  １９１−２００  （１９９０））から精製した（Ｆｉｇ．９Ａ）。３ＴＰ１、すなわちトランスフェクションを受けたＰＬＣ−ガンマのｃＤＮＡを過剰に発現するが、ＥＧＦレセプターを持たない細胞株を、ＰＬＣ−ガンマのソースとして用いた（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：  ６０７−６１０  （１９９０ｂ））。
ＧＡＰ  ＳＨ２ドメイン（ＧＡＰ残基１７１−４４８、Ｆｉｇ．９Ｂ）を含むｔｒｐＥ融合タンパク質の調製については、すでにＭｏｒａｎ  らによって記載されている（Ｍｏｒａｎ，  Ｍ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ８６２２−８６２６  （１９９０））。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質を含むバクテリアのライセートは、１ｇのバクテリアを３ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＰＭＳＦに再懸濁させることによって調製した。１ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び０．２％ＮＰ−４０中、４℃でインキュベーションを行ったのち、細胞を５秒間、５回超音波処理し、ライセートを１０，０００ｇで３０分間遠心することにより清澄にした。バクテリアのライセートを、上述したような、プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む１％Ｔｒｉｔｏｎリシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液中で１：１００に稀釈し、プロテインＡ−セファロースで予めクリアにした。
２．抗体、免疫沈澱及び免疫ブロッティング
次の抗−ＥＧＦＲ抗体（Ｆｉｇ．９Ａ）を用いた。すなわち、
（ａ）ｍＡｂ１０８、細胞外ドメインのドメインＩＩＩ（ｄｏｍａｉｎＩＩＩ）に対するモノクローナル抗体（Ｌａｘ，  Ｉ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．  ８：  ４２１−４２７  （１９８９））；
（ｂ）残基９８４−９９６に特異的な抗ペプチド抗体ＲＫ２；
（ｃ）残基１１７６−１１８６に特異的な抗ペプチド抗体Ｃ；及び
（ｄ）残基６５６−６７６に特異的な抗ペプチド抗体Ｆ
ｔｒｐＥ融合タンパク質を免疫沈澱させるために、アガロースに結合した抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）に結合したｔｒｐＥに対するマウスのモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を利用した。免疫ブロッティング用には、ｔｒｐＥに対するウサギのポリクローナル抗体を用いた（Ｍｏｒａｎ，  Ｍ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：  ８６２２−８６２６  （１９９０））。ＰＬＣ−ガンマを、先に述べたウサギのポリクローナル抗−ペプチド抗体を用いて免疫ブロッティング及び免疫沈澱に付した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ ５７：  １１０１−１１０７  （１９８９ｂ））。
手法については、本発明者らの研究室から出たいくつかの文献に記載されている（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．Ｌ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２６４：  １０６６７−１０６７１  （１９８９）；  Ｃｅｌｌ ５７：  １１０１−１１０７  （１９８９））。刺激されていない細胞を１０％子ウシ血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  培地中で密集状態になるまで成育させ、プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００リシス用緩衝液中で溶菌する前に１％ウシ胎児血清中で一晩飢餓状態にした。ＥＧＦレセプターを、プロテインＡ−セファロースに結合した抗体を用いて免疫沈澱させた。レセプター材料をＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％グリセリン）で洗った後、５ｍＭＭｎＣｌ２  及び３０μＭＡＴＰを添加することによって自己リン酸化を誘発した。対照（コントロール）は、Ｍｎ２＋のみと共にインキュベートした。ＨＮＴＧでさらに洗浄したのち、ＰＬＣ−ガンマ（３ＴＰ１細胞から）か、細菌の融合タンパク質のどちらかを含むライセートを添加した。９０分間結合反応を進行させたのち、ＨＮＴＧによる洗浄をさらに３回行い、そして試料をＳＤＳゲル上に流し、免疫ブロッティングに付した。
３．臭化シアン（ＣＮＢｒ）分解
ＥＧＦＲ−Ｃを、４℃で、ＭｎＣｌ２  及びＡＴＰを用いて、時には、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（ＮＥＮ／Ｄｕｐｏｎｔ、６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下でリン酸化した。レセプター調製物を、次に、１００μｇＢＳＡを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中に再懸濁させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０（Ａｍｉｃｏｎ）中で５０μｌに濃縮した。次いで、２４０μｌの８８％ギ酸を、２粒のＣＮＢｒと共に添加し、試料を、窒素雰囲気下、暗所に、室温で、１４時間保存した。試料をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ  （Ｓａｖａｎｔ）中で乾燥させ、３回水洗し、次いで１％Ｔｒｉｔｏｎリシス緩衝液中に再懸濁した。
【０１２３】
Ｂ．結果
天然型ＥＧＦＲ及び変異ＥＧＦＲに対するＰＬＣ−ガンマの結合について比較を行った（Ｆｉｇ．９Ａ）。先ず、天然型レセプター及びトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞からの変異レセプターを免疫沈澱させ、レセプターの免疫沈澱のいくつかを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＴＰ及びＭｎ２＋を用いて自己リン酸化させた（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ． １０：  ４３５−４４１  （１９９０ａ））。次に、ＰＬＣ−ガンマを過大発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞からのライセート（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：  ６０７−６１０  （１９９０ｂ））を添加し、結合反応を４℃で９０分間進行させた。免疫沈澱をＨＮＴＧで洗浄したのち、結合したＰＬＣ−ガンマの量を免疫ブロッティングによって調べた。
Ｆｉｇ．１０に例証されているように、ＰＬＣ−ガンマはチロシンリン酸化天然型レセプターにのみ結合し、非リン酸化レセプターには結合しなかった。
次に、自己リン酸化の重要性を検証するために、変異レセプターを用いた２つの研究を行った。最初に調べるべきことは、Ｃ−末端から１２６のアミノ酸を欠き（ＣＤ１２６、Ｆｉｇ．９Ａ）、かつ、４つの主要な自己リン酸化部位を欠いた短縮型ＥＧＦレセプター（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，  Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１１：  ４８３−４８５  （１９８４））に対するＰＬＣ−ガンマの結合であった。この短縮型レセプターは、おそらくは、チロシン９９２のところで自己リン酸化された（Ｗａｌｔｏｎ，  Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２６５：  １７５０−１７５４  （１９９０））。しかしながら、このレベルのチロシンの自己リン酸化にもかかわらず、ＰＬＣ−ガンマの結合は、完全長レセプターに比べて著しく減少した。減少した結合は、また、２個の自己リン酸化部位を含むＣ−末端の６３残基を欠く欠失変異ＥＧＦレセプターであるＣＤ６３についても観察された。これらの結果は、レセプターのＣ−末端が、ＰＬＣ−ガンマがＥＧＦレセプターに結合したり、あるいは、ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦレセプターへの結合を調節する際に果す役割を示唆している。
Ｆｉｇ．１０は、また、ＰＬＣ−ガンマがｋｉｎ−  変異レセプターに結合することができないことを示している。この点に関する自己リン酸化の重要性を精査するために、ｋｉｎ−  レセプターをＣＤ１２６レセプター（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：  ９２５−９２９  （１９８９））と交差リン酸化させた。この結果、ＰＬＣ−ガンマの結合は、天然型レベルまで平準化された。このことは、ｋｉｎ−  レセプターのリン酸化は、ＰＬＣ−ガンマへの結合を平準化するに充分であることを示した。
ｋｉｎ−  レセプター単独でも、リン酸化ののちには、ＰＬＣ−ガンマと結合することができることを確認するために、このレセプターを、ｍＡｂ１０８には結合しない可溶性の、バキュロウイルス発現ＥＧＦＲ細胞質ドメイン（ＥＧＦＲ−Ｃ）と交差リン酸化させた（Ｆｉｇ．９Ａ）。
交差リン酸化は、ＣＤ１２６変異体の場合に比べて強いものではなかったけれども、Ｋ７２１Ａ変異体のチロシンのリン酸化及びＰＬＣ−ガンマの結合は明らかに検出された。この知見は、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化がＰＬＣ−ガンマの結合を促進することを確認している。
天然型ＥＧＦＲとＰＬＣ−ガンマ間の相互作用におけるＰＬＣ−ガンマのチロシンリン酸化の役割りを調べた。チロシンリン酸化ＰＬＣ−ガンマは、ＥＧＦＲから、非リン酸化ＰＬＣ−ガンマよりも容易に解離しうる（Ｆｉｇ．１１）が、このことは、チロシンリン酸化ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦＲに対するアフィニティーが低いことを示している。
【０１２４】
これらの知見を、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２ドメイン（Ｆｉｇ．９Ｂ）を含む融合タンパク質の、バキュロウイルスによって発現されたＥＧＦＲ−Ｃへの結合に関する検討にまで拡げた。完全長ＥＧＦＲ及びＰＬＣ−ガンマの場合のように、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質ドメインは、チロシンリン酸化ＥＧＦＲ−Ｃにのみ結合した（Ｆｉｇ．１２Ａ）。ｔｒｐＥタンパク質単独では、ＥＧＦＲ−Ｃに結合しなかった。同様に、リン酸化ＥＧＦＲ−ＣはｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２にのみ結合した。しかしながら、非リン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非特異的結合は高い（Ｆｉｇ．１２Ｂ）。これらの結果は、ＥＧＦＲの結合部位がその細胞内ドメインに位置することを示している。
一般に、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質は、ＰＬＣ−ガンマよりもより高い化学量論で、完全長のＥＧＦＲに結合した。しかしながら、この融合タンパク質はＥＧＦＲによってチロシンリン酸化がなされなかった。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２タンパク質は、ＣＤ１２６欠失変異体（Ｆｉｇ．１３Ａ）に比べて、リン酸化完全長レセプターに対し、はるかに良い。Ｆｉｇ．１３Ｂに示されるように、ＥＧＦＲ−Ｃによるｋｉｎ−  完全長ＥＧＦレセプターの交差リン酸化によって、それがｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２タンパク質に結合できるようになった。
対照群においては、ＥＧＦＲ−Ｃは、おそらくは、このレセプターがすでに最大限にチロシンがリン酸化されているためであろうが、ＣＤ１２６レセプターへの結合能を向上させないことが示された（Ｆｉｇ．１３Ａ）。また、ＥＧＦレセプター（Ｆｉｇ．１３Ｂ）を含まない細胞からのｍＡｂ１０８免疫沈澱の存在下でＥＧＦＲ−Ｃを試験したところ、結合は観察されなかった。このことは、ＥＧＦＲ−Ｃの効果は、セファロースに対するチロシンリン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非特異的結合のせいではあり得ないことを示している。これらの研究は、結合を仲介する際の自己リン酸化の重要性を確認し、かつ、ＥＧＦレセプター結合については、ＧＡＰ  ＳＨ２ドメインは、そのままのＰＬＣ−ガンマに類似した挙動を示すことを示している。
ＣＤ１２６欠失変異体に対する弱い結合は、分子に対する結合部位の少なくとも一部分がＣ−末端にあることを示唆している。レセプターの全体のコンホメーションに対するこの欠失の効果、おそらくは、アロステリックな効果を除外することはできなかった。したがって、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２の、ＥＧＦＲのＣ−末端フラグメントへの結合を調べた。
ＥＧＦＲにおいては、大抵のＣ−末端メチオニン残基は９８３位に見出される。したがって、ＣＮＢｒ分解は、すべての公知のリン酸化部位を含む２０３アミノ酸のフラグメントを生成する。このタンパク質フラグメントは、ＥＧＦＲ  Ｃ−末端に特異的な抗体、すなわち抗−Ｃ（Ｆｉｇ．９Ａ）によって認識される。
このＣ−末端フラグメントを特異的に免疫沈澱に付し、チロシンをリン酸化すると、それは、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質に結合した（Ｆｉｇｕｒｅ１４）。ＣＮＢｒ分解は完全であった。したがって、結合の原因となりうる完全長のＥＧＦＲ−Ｃは、タンパク質分解の後では検出できなかった。繰り返すが、非リン酸化Ｃ−末端ＣＮＢｒフラグメントに対する結合は見られなかった。ＥＧＦＲ−ＣのＣＮＢｒ分解は、また、抗体Ｆによって同定された９７アミノ酸のＮ−末端ペプチドを生成した（Ｆｉｇ．９Ａ、ＥＧＦＲ残基６４５−７４２）。抗体Ｆによって免疫沈澱されたこのフラグメントは、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２と結合しなかった。さらに、ＥＧＦＲ−Ｃを〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰを用いて自己リン酸化し、３２Ｐ−標識化ＣＮＢｒ  Ｃ−末端フラグメントが生じた。Ｆｉｇ．１５に示されているように、このフラグメントはｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２融合タンパク質に結合したが、ｔｒｐＥには結合しなかった。総括すると、これらの知見から、チロシンリン酸化Ｃ−末端への直接結合は、少なくとも部分的には、ＥＧＦＲへのＳＨ２及びＳＨ３ドメインタンパク質の特異的結合に寄与していることが示される。
【０１２５】
Ｃ．検討
総合して考えると、上記の知見及びいくつかの付加的な一連の証拠から、ホスホチロシン残基がＥＧＦＲのＳＨ２ドメインに対する実際の結合部位の一部であることが強く主張される。先ず、Ｐ４７ｇａｇ−ｃｒｋ  が、ｖ−ｃｒｋ形質転換細胞中の殆ど全てのホスホチロシン含有タンパク質に結合することが見出された（Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：  １５３７−１５３９  （１９９０））。第２に、ＰＤＧＦレセプターにおける２つの自己リン酸化部位の変異は、ＧＡＰの結合を大きく減少させた  （Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，  Ａ．  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：  １５７８−１５７１  （１９９０））。最後に、上に示した結果から、ＥＧＦＲのＣ−末端に対する特異的結合は、ホスホチロシンが存在する場合にのみ示される。したがって、ホスホチロシン残基は、結合部位の一部を構成するか、あるいは、このドメインの立体配座を極部的に変化させて、結合を可能にしていることが結論付けられる。ホスホチロシン単独で結合部位を形成しているとは言えない。例えば、ホスホチロシン単独ではＰ４７ｇａｇ−ｃｒｋ  のホスホチロシン−含有タンパク質への結合を干渉することができない（Ｍａｔｓｕｄａら、上述）。さらに、ＰＬＣ−ガンマは、ＣＳＦ−１レセプターのようなホスホチロシン残基を含む活性化された全ての分子に結合するわけではない（Ｄｏｗｎｉｎｇ，  Ｊ．Ｒ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ． ８：  ３３４５−３３５０  （１９８９））。同様に、ＰＬＣ−ガンマのＰＤＧＦＲへの結合は、ＧＡＰ結合と同一であるとは思えない。異なったＳＨ２とＳＨ３ドメインを含むタンパク質では、結合の特異性が異なる可能性があるからである（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓら、上述）。
上記に引用した引例は、特に断りがなくとも、引用により全て本明細書中に組み込まれる。
【０１２６】
ここまで本発明を充分に記載したけれども、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、また、不当な実験なしに、広範囲の等価なパラメータ、濃度、条件の内で同じようなことを行うことができるということが当業者によって考えられるであろう。
【０１２７】
本発明は、具体的な実施態様と関連づけて記載したが、さらなる修正が可能であることが理解されるであろう。本発明は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が係っている技術における公知かつ慣用のプラクティスに当るような、本明細書の開示からの離脱を含み、かつ、添付したクレームの範囲に述べた必須の特徴事項に適用しうる、本発明のいかなる変形、用途、適用をもその範囲に含むものである。本書において用いた言葉使い、用語は、記載するためのものであって、限定のためのものではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニトロセルロースフィルター上に固定化されたＧＡＰ−ＳＨ２とＥＧＦＲのカルボキシ末端が相互作用するのを示すフィルターブロットパターンである。細菌により発現されたｔｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２融合タンパク質又は対照としてのｔｒｐＥを、さまざまな濃度でニトロセルロースフィルター上にスポットした。フィルターを〔３２Ｐ〕−標識されたＥＧＦＲのＣ−末端ドメインを用いて一晩ハイブリダイゼーションに付した。オートラジオグラフィは２時間であった。
【図２】レセプター標的のクローニング方法（ＣＯＲＴ）を表わす概略図である。ＥＧＦＲのＣ末端ドメインを、放射線標識されたリンでリン酸化させる。λｇｔ１１ライブラリーを１５０ｍｌのプレートあたり４×１０４  プラークの密度でプレーティングした。プラークに、ＩＰＴＧ含浸したニトロセルロースフィルターを１２時間かぶせ、その後プラークをニトロセルロースへとトランスファーし、標識されたプローブと共にインキュベートした。次にさらなる分析のため陽性コロニーを選択する。
【図３Ａ】ＧＲＢ−１タンパク質を発現するファージのオートラジオグラムを示す。Ａ）プレーティングされた４０，０００ファージのうちの１つの陽性シグナル（矢印）を立証する一次スクリーン。Ｂ）ＧＲＢ−１を発現するファージのプラーク精製。全てのプラークが〔３２Ｐ〕標識されたＥＧＦＲのＣ末端ドメインに結合した。
【図３Ｂ】ＧＲＢ−１タンパク質を発現するファージのオートラジオグラムを示す。Ａ）プレーティングされた４０，０００ファージのうちの１つの陽性シグナル（矢印）を立証する一次スクリーン。Ｂ）ＧＲＢ−１を発現するファージのプラーク精製。全てのプラークが〔３２Ｐ〕標識されたＥＧＦＲのＣ末端ドメインに結合した。
【図４Ａ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｂ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｃ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｄ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｅ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｆ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｇ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｈ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図４Ｉ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残基を有する。
【図５】類似のモチーフをもつその他のタンパク質とＧＲＢ−１のＳＨ２ドメインの配列を比較する。Ａ）ＧＲＢ−１、ｃ−ｓｒｃ、ｖ−ａｂ１、ウシＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰ、及びｖ−ｃｒｋのＳＨ２ドメイン。Ｎ及びＣは、それぞれＮ末端及びＣ末端ＳＨ２ドメインを表わしている。保存アミノ酸置換は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ  により定義づけされている通りである：すなわち（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）；（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）；（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ）；（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；及びＣ。太字はこれらの位置が同じであったか、又は５カ所以上に保存的アミノ酸置換が存在していることを識別している。囲みは、保存されたモチーフを識別している。Ｂ）ＧＲＢ−１のＳＨ３ドメインの類似の比較。
【図６】ＳＨ２及びＳＨ３ドメインの構造組織を比較する概略図である。この図には、ｃ−ｓｒｃ、ｖ−ｃｒｋ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰ１及びＧＲＢ−１といった、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含む既知のタンパク質が含まれている。
【図７】ＧＲＢ−１プローブを用いたサルｍＲＮＡのノーザンブロットである。さまざまなサルの組織から得たポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ５μｇを、１．２％／２．２Ｍのアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ブロットを、クローンｋｉ４からの挿入物に相応する〔３２Ｐ〕−ニックトランスレーションを受けたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションした。
【図８】生合成的に標識された細胞からの８５ｋＤａ  のタンパク質をＧＲＢ−１に対する抗体が免疫沈降させることを示すゲルパターンである。細胞を、〔３５Ｓ〕メチオニンで代謝的に標識し、その後ライセートを調製し、免疫（Ｉ）又は前免疫（Ｐ）血清のいずれかで免疫沈降させた。免疫沈降されたタンパク質を、８％のＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で分離した。オートラジオグラフィは一晩行なった。使用した細胞系統には、ヒトのグリオブラストーマ（多形性神経膠芽腫）細胞系統、Ｕ１２４２、ラット膀胱がん細胞系統、ＮＢＴ−ＩＩ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれている。
【図９Ａ】研究に使用したいくつかの野生型及び突然変異タンパク質を描いている。（Ａ）その既知の又は予想された自己リン酸化部位を伴うＥＧＦレセプター構築体。野生型（Ｗ．Ｔ．）、キナーゼ陰性（Ｋ７２１Ａ）、及びカルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）が、−３００，０００ＥＧＦレセプターを発現する前述のトランスフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降された。ＥＧＦＲ−Ｃは、バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞によって産生されたＥＧＦレセプターの細胞質ドメインを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）ＳＨ２及びＨ３ドメイン及びＰＬＣ−ガンマチロシンリン酸化部位の場所を示すＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２タンパク質の構造。
【図９Ｂ】研究に使用したいくつかの野生型及び突然変異タンパク質を描いている。（Ａ）その既知の又は予想された自己リン酸化部位を伴うＥＧＦレセプター構築体。野生型（Ｗ．Ｔ．）、キナーゼ陰性（Ｋ７２１Ａ）、及びカルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）が、−３００，０００ＥＧＦレセプターを発現する前述のトランスフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降された。ＥＧＦＲ−Ｃは、バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞によって産生されたＥＧＦレセプターの細胞質ドメインを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）ＳＨ２及びＨ３ドメイン及びＰＬＣ−ガンマチロシンリン酸化部位の場所を示すＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２タンパク質の構造。
【図１０】ＥＧＦＲ突然変異体とＰＬＣ−ガンマの会合を示すゲルパターンである。野生型（ＨＥＲ１４）、カルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）又はキナーゼ陰性（Ｋ７２１Ａ）ＥＧＦＲを、抗ＥＧＦＲｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。レセプターを、〔ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰで自己リン酸化させた。同時にＥＧＦＲ−Ｃをタンパク質Ａ−セファロースビーズ単独、又はＡＴＰを含むかもしくは含まない免疫沈降されたＫ７２１Ａレセプターに添加した。ＡＴＰを除去するためさらに洗浄した後、ＰＬＣ−ガンマを過剰発現する−１５×１０６  個の３Ｔ−Ｐ１細胞のライセートを添加し、９０分間４℃で混合した。未結合のＰＬＣ−ガンマを除去するため洗浄した後、６％のＳＤＳ−ゲル上でタンパク質を分離し、免疫ブロット法のためニトロセルロースにトランスファーした。抗−ＰＴｙｒブロット法のためには試料の８分の１を利用し、残りを抗−ＰＬＣ−ガンマブロット法のために利用した（露出時間１４時間）。
【図１１】ＰＬＣ−ガンマのリン酸化がＥＧＦレセプターに対するその結合を低減させることを示すゲルパターンである。ｍＡｂ１０８で全長ＥＧＦＲを免疫沈降させ、自己リン酸化させた。ＰＬＣ−ガンマを過剰発現する３Ｔ−Ｐ１細胞のライセートを添加し、９０分間４℃で混合した。結合後、試料の２分の１に対してＡＴＰを添加し、ＰＬＣ−ガンマ分子がＥＧＦレセプターによってリン酸化されうるようにした。次にＥＧＦＲ−ＰＬＣ−ガンマ複合体の半分に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し（「洗浄なし」、左側パネル）、直接６％のゲル上に負荷した。もう半分はＨＮＴＧで３度洗浄し、次にゲル上に負荷した（「洗浄あり」、右側パネル）。試料を重複してＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、タンパク質をニトロセルロースにトランスファーし、抗−ＰＬＣ−ガンマ及び〔  １２５Ｉ〕タンパク質Ａでプローブ探査した。ひき続きニトロセルロースからバンドを切り出し、ガンマカウンターで定量した。ＨＮＴＧで３回洗浄した後、５０±５％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）のリン酸化されていないＰＬＣ−ガンマがＥＧＦＲに結合した状態で残り、一方残ったリン酸化されたＰＬＣ−ガンマは２２±４％にすぎなかった（露出時間：１２時間）。
【図１２Ａ】ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥタンパク質に対する結合を示すゲルパターンである。（Ａ）ＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μｇ）を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄した。次に単独のＭｎＣｌ２  又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰを添加して自己リン酸化を容易にした。ｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２（約２μｇ）。免疫沈降物を１０％のＳＤＳ−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗−ｔｒｐＥを用いて免疫ブロット法を行なった。比較を目的として、約０．１μｇのｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２のライセートを直接ゲルに負荷した（Ａの右側パネル）。（Ｂ）抗−ｔｒｐＥ抗体を用いてｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を免疫沈降させ、洗浄した。次に、リン酸化された又はリン酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μｇ）を添加して上述のとおり結合させた。洗浄の後、１０％のゲル上で試料を分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試料は、直接ゲル上に負荷したリン酸化された及びリン酸化されていないキナーゼ０．５μｇを表わす（露出時間：２時間）。
【図１２Ｂ】ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥタンパク質に対する結合を示すゲルパターンである。（Ａ）ＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μｇ）を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄した。次に単独のＭｎＣｌ２  又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰを添加して自己リン酸化を容易にした。ｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２（約２μｇ）。免疫沈降物を１０％のＳＤＳ−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗−ｔｒｐＥを用いて免疫ブロット法を行なった。比較を目的として、約０．１μｇのｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２のライセートを直接ゲルに負荷した（Ａの右側パネル）。（Ｂ）抗−ｔｒｐＥ抗体を用いてｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を免疫沈降させ、洗浄した。次に、リン酸化された又はリン酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μｇ）を添加して上述のとおり結合させた。洗浄の後、１０％のゲル上で試料を分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試料は、直接ゲル上に負荷したリン酸化された及びリン酸化されていないキナーゼ０．５μｇを表わす（露出時間：２時間）。
【図１３Ａ】野生型及び突然変異ＥＧＦＲに対するｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２の結合を示すゲルパターンである。（Ａ）野生型レセプター（ＨＥＲ１４）又はカルボキシ末端欠失ＣＤ１２６レセプターをｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。次にＭｎＣｌ２  単独又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰをレセプター含有試料の自己リン酸化された半分に対して添加した。１セットのＣＤ１２６を同様に０．５μｇのＥＧＦＲ−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で９０分間、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を添加し、さらに３回洗浄した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ニトロセルロースに対するトランスファーの後、抗−ｔｒｐＥ（左側パネル）、抗−ＥＧＦＲＲＫ２（中央パネル）又は抗−ＰＴｙｒ（右側パネル）を用いてブロットをプローブ探査した。ＲＫ２及び抗−ＰＴｙｒは両方共総試料の８分の１であり、７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。残りの試料を、抗−ｔｒｐＥブロットのため１０％のゲル上に負荷した（露出時間１４時間）。（Ｂ）ＥＧＦＲを全く含まないＮＩＨ３Ｔ３２．２細胞（３Ｔ３）又はキナーゼ陰性レセプターを有する細胞（Ｋ２１Ａ）からのライセートを、ｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。全ての免疫沈降物に対して、０．５μｇのＥＧＦＲ−Ｃを添加し、次に単独ＭｎＣｌ２  又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰを添加した。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を添加し、（Ａ）の場合と同じように試料を調製し、免疫ブロットに付した（露出時間：１９時間）。
【図１３Ｂ】野生型及び突然変異ＥＧＦＲに対するｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２の結合を示すゲルパターンである。（Ａ）野生型レセプター（ＨＥＲ１４）又はカルボキシ末端欠失ＣＤ１２６レセプターをｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。次にＭｎＣｌ２  単独又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰをレセプター含有試料の自己リン酸化された半分に対して添加した。１セットのＣＤ１２６を同様に０．５μｇのＥＧＦＲ−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で９０分間、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を添加し、さらに３回洗浄した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ニトロセルロースに対するトランスファーの後、抗−ｔｒｐＥ（左側パネル）、抗−ＥＧＦＲＲＫ２（中央パネル）又は抗−ＰＴｙｒ（右側パネル）を用いてブロットをプローブ探査した。ＲＫ２及び抗−ＰＴｙｒは両方共総試料の８分の１であり、７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。残りの試料を、抗−ｔｒｐＥブロットのため１０％のゲル上に負荷した（露出時間１４時間）。（Ｂ）ＥＧＦＲを全く含まないＮＩＨ３Ｔ３２．２細胞（３Ｔ３）又はキナーゼ陰性レセプターを有する細胞（Ｋ２１Ａ）からのライセートを、ｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。全ての免疫沈降物に対して、０．５μｇのＥＧＦＲ−Ｃを添加し、次に単独ＭｎＣｌ２  又はＭｎＣｌ２  とＡＴＰを添加した。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を添加し、（Ａ）の場合と同じように試料を調製し、免疫ブロットに付した（露出時間：１９時間）。
【図１４】ＥＧＦＲのＣＮＢｒ切断Ｃ末端フラグメントに対するＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２の結合を示すゲルパターンである。ＥＧＦＲ−Ｃ（１０μｇ）を、担体タンパク質として１００μｇのＢＳＡを含むｐＨ７．５の２０ｍＭＨＥＰＥＳ中でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０の中でインキュベートした。次に、リン酸化された及びリン酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃを、各々２つに分割し、半分を緩衝液中に保管する一方、もう半分をＣＮＢｒで切断した。次にＡＴＰを含む又は含まない、又ＣＮＢｒを含む又は含まない４つの試料を、各々５００μｌの１％トリトンＸ−１００溶菌緩衝液中にもって行き、２つに分け、抗−Ｃ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄した後、ＰＬＣ−ガンマ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２を含むライセートを添加した。次に、抗−ｔｒｐＥ又は抗−ＰＬＣ−ガンマを用いて上述のとおり試料について免疫ブロット法を実行した。右側パネルについては、切断された及び切断されていない、ＥＧＦＲ−Ｃの１分画（０．１μｇ）を、免疫沈降無しに直接ゲル上に負荷し、ＲＫ２で免疫ブロットに付した（露出時間１４時間）。抗−ｔｒｐＥプロットの全てのラインに見られる黒いバンドは、およそ４０ｋＤａ  あたりにあり（図１３にも見られる）、免疫沈降抗体の重鎖に結合する〔  １２５Ｉ〕タンパク質Ａを表わす。
【図１５】ｔｒｐＥに対してではなくｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２に対するチロシンリン酸化されたＣ末端ＥＧＦＲフラグメントの結合を示すゲルパターンである。ＥＧＦＲ−Ｃ（５μｇ）を、〔ガンマ−３２Ｐ〕ＡＴＰ１の添加によって自己リン酸化させた。リン酸化されたＥＧＦＲ−ＣをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０の中で濃縮し、次に７０％蟻酸中のＣＮＢｒで切断させた。試料の半分（３５０，０００ｃｐｍ  ）を図１２Ｂにある通りにｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ  ＳＨ２に結合させ、洗浄して、１０％のＳＤＳ−ゲルで泳動した。（Ａ）リン酸化されたＣＮＢｒ切断ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥに対する結合、（Ｂ）リン酸化されたＣＮＢｒ切断ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥ  ＧＡＰ  ＳＨ２に対する結合、（Ｃ）３，０００ｃｐｍ  のＣＮＢｒ−切断ＥＧＦＲ−Ｃ、（Ｄ）比較のための３，０００ｃｐｍ  の切断ＥＧＦＲ−Ｃ（露出時間２０時間）。ＥＧＦＲ９８４／１１８６は、ＣＮＢｒによって生成されたチロシン自己リン酸化フラグメントの配列を示している。
【図１６Ａ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１６Ｂ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１６Ｃ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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