(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースの存在下において、α−１，４−グルコシド結合を加水分解し、プルランからパノースを生成するα−アミラーゼをプルラン又はパノースに作用させることを特徴とする、
次式（Ｉ）：
【化１】
0003605410.tif 000005
で示される新規イソマルトオリゴ糖の製造法。
【請求項２】
α−１，４−グルコシド結合を加水分解し、プルランからパノースを生成するα−アミラーゼが、
以下に示す理化学的性質：
（１）作用
（ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。
（ｂ）プルランからパノースを生成する。
（ｃ）グルコースの存在下でプルランを加水分解し、
次式（Ｉ）：
【化２】
0003605410.tif 000006
で示されるイソマルトオリゴ糖及び次式（II）：
【化３】
0003605410.tif 000007
で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性
澱粉及びプルランのα−１，４−グルコシド結合を加水分解し、それぞれマルトース及びパノースを生成する。生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式（Ｉ）で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式（II）で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式（II）で示されるイソマルトシルマルトースを分解する。
を有するα−アミラーゼである請求項１記載の製造法。
【請求項３】
α−１，４−グルコシド結合を加水分解し、プルランからパノースを生成するα−アミラーゼが、
以下に示す理化学的性質：
（１）作用
（ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。
（ｂ）プルランからパノースを生成する。
（ｃ）グルコースの存在下でプルランを加水分解し、
次式（Ｉ）：
【化４】
0003605410.tif 000008
で示されるイソマルトオリゴ糖及び次式（II）：
【化５】
0003605410.tif 000009
で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性
澱粉及びプルランのα−１，４−グルコシド結合を加水分解し、それぞれマルトース及びパノースを生成する。生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式（Ｉ）で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式（II）で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式（II）で示されるイソマルトシルマルトースを分解する。
（３）至適pH及びpH安定性
プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜9 で安定である。
（４）至適温度及び熱安定性
プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃まで安定である。
（５）分子量は約60,000である（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル・スラブ電気泳動法による）。
を有するα−アミラーゼである、請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性の優れた食品素材として産業上有用である新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−１, ４−グルコシド結合のみからなるマルトオリゴ糖に対して、α−１,６−グルコシド結合を有するイソマルトオリゴ糖は分岐糖と称されており、近年、機能性食品として注目されている糖質である。本来、糖質は甘味源や栄養源として利用されてきたが、低甘味、低カロリー、非発酵性、ビフィズス菌増殖因子、難う蝕性等の機能性を有する糖が開発され、健康食品素材として利用されている。特に、イソマルトースやパノース (イソマルトシルグルコース、イソマルトトリオース) 、イソマルトシルマルトース (イソマルトテトラオース) 等のイソマルトオリゴ糖は機能性に優れたオリゴ糖として注目されている。
【０００３】
現在までに、イソマルトオリゴ糖としてはイソマルトース、パノース、イソマルトシルマルトース等が知られている。これらのイソマルトオリゴ糖は澱粉を通常のα−アミラーゼでα−１, ４−グルコシド結合を加水分解した時、アミロペクチン由来のα−１, ６−グルコシド結合が加水分解を受けにくいため、α−１, ６−グルコシド結合が残って生成する。あるいは、グルコアミラーゼの逆反応によってイソマルトース等が生成する。
【０００４】
しかしながら、本発明の新規イソマルトオリゴ糖（イソマルトシルイソマルトース、以下「ＩＭＩＭ」という。）のように、イソマルトース２個がα−１, ４−グルコシド結合で結ばれたオリゴ糖は全く知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、アミラーゼの酵素作用を詳細に検討している中で、α−１, ６−グルコシド結合を２個有する４個のグルコースからなるホモオリゴ糖であり、新規なイソマルトオリゴ糖であるＩＭＩＭを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、機能性が重要視される食品産業において注目されているオリゴ糖の中で、特に優れた機能性を示すことが知られるイソマルトオリゴ糖において、２個のα−１, ６−グルコシド結合を有する４個のグルコースからなる新規なイソマルトオリゴ糖であるＩＭＩＭ、及び新規α−アミラーゼ、並びに加水分解酵素を利用した該新規イソマルトオリゴ糖の製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記の発明を包含する。
（１）次式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
0003605410.tif 000002
【０００９】
で示される新規イソマルトオリゴ糖ＩＭＩＭ。
（２）以下に示す理化学的性質：
（イ）作用
（ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。      
（ｂ）プルランからパノースを生成する。
（ｃ）グルコースの存在下でプルランを加水分解し、次式（Ｉ）：
【００１０】
【化２】
0003605410.tif 000003
【００１１】
で示されるイソマルトオリゴ糖及び次式（II）：
【００１２】
【化３】
0003605410.tif 000004
【００１３】
で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。
（ロ）基質特異性
澱粉やプルラン等のα−１，４−グルコシド結合を加水分解し、マルトースやパノースを生成する。生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式（Ｉ）で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式（II）で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式（II）で示されるイソマルトシルマルトースを分解する。
【００１４】
プルランに対する活性よりも澱粉に対する活性は強いものの、高温放線菌Thermoactinomyces vulgaris R-47 の生産するα−アミラーゼ（澱粉から主にマルトースを生成する酵素、以下「ＴＶＡＩ」という。）に比べてプルランに対する活性が強い。
（ハ）至適pH及びpH安定性
プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜9 で安定である。
【００１５】
（ニ）至適温度及び熱安定性
プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃まで安定である。
（ホ）分子量は約60,000である（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル・スラブ電気泳動法による）。
を有するα−アミラーゼ。
（３）グルコースの存在下において、α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素をプルラン又はパノースに作用させることを特徴とする前記（１）に記載の新規イソマルトオリゴ糖ＩＭＩＭの製造法。
【００１６】
本発明の製造法に用いる加水分解酵素としては、α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素であれば特に制限はないが、好ましくはプルランからパノースを生成するα−アミラーゼが挙げられる。
かかる酵素としては、例えば、高温放線菌 Thermoactinomyces vulgaris R-47(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1681(1978))の生産するα−アミラーゼ、即ち本発明の新規α−アミラーゼが挙げられる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、新規イソマルトオリゴ糖を提供することができる。新規イソマルトオリゴ糖である本発明のＩＭＩＭは、近年、機能性食品として注目されているオリゴ糖の一つであり、低甘味、低カロリー、非発酵性、ビフィズス菌増殖因子、難う蝕性等の機能性を有し、健康食品素材として有用性の高い糖である。従って、本発明のＩＭＩＭは機能性が求められる食品工業において利用価値の高いオリゴ糖である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
清水らは高温放線菌Thermoactinomyces vulgaris R-47 の生産するα−アミラーゼＴＶＡＩがプルランを分解してパノースを生成することを見出した。次いで、本発明者はＴＶＡＩの酵素作用について詳細な研究を行い、その性質を明らかにしている (Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1121(1982); Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1423(1982); Y. Sakano et al., Agric.Biol. Chem., 47, 2211(1983); Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 49,3391(1985)) 。
【００１９】
更に、本発明者は本菌の遺伝子からショットガン方式でプラスミドを分取してクローン化した大腸菌の中にＴＶＡＩと異なるα−アミラーゼ（ＴＶＡII）が生成することを見出した (Y. Sakano et al., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。
その後、ＴＶＡIIの蛋白質合成能を高める発現系を構築して大腸菌の本酵素生産を大きく増加させると同時に、大腸菌を培養した後、加熱、超音波処理等の抽出操作によって容易に結晶化する高純度な酵素の生産方法を開発した。
【００２０】
ＴＶＡIIはＴＶＡＩと遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が異なり、従来の酵素と理化学的性質の異なるα−アミラーゼである (Y. Sakano et al., Biosci.Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。ＴＶＡIIの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を図１に示す。
【００２１】
本発明者は、ＴＶＡIIの酵素作用を調べる内、グルコースの存在下でプルランに作用させると薄層クロマトグラフィーでパノースよりも展開距離の短い２つのオリゴ糖が生成すること（図２）を見出した。両者は４個のグルコースからなるオリゴ糖であり、その一つは既知のイソマルトシルマルトース（以下「ＩＭＭ」という。）と同じ位置に展開され、もう一つの未知の糖はＩＭＭより展開距離の短い糖であり、明らかにＩＭＭと異なる糖であった。そこで、未知の糖を単離してＮＭＲを測定すると、13Ｃ−ＮＭＲでα−１, ４−及びα−１, ６−グルコシド結合のシグナルを示すピークがほぼ同じ高さで得られ（図３）、α−１, ６−結合のシグナルは２つのピークに分かれていた。従って、グルコシド結合はα−１, ４−結合：α−１, ６−結合＝１：２の割合で存在することが明らかとなった。次いで、ＩＭＭにイソマルトデキストラナーゼを作用させるとマルトースとイソマルトースが生成し、未知の糖に同じ酵素を作用させるとイソマルトースのみが生成された（図４）。なお、図２及び図４に示した薄層クロマトグラフィーにおいて、展開溶媒としては１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：３を用い、薄層としてはメルク社のシリカゲルＧ60を用いた。
【００２２】
これらの実験事実から未知のオリゴ糖は前記式（Ｉ）で示されるＩＭＩＭであり、これまで見出されていない全く新規なイソマルトオリゴ糖であることが判明した。
本発明のＩＭＩＭは、プルラン又はパノースとグルコースとを溶解してα−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素を作用させることにより容易に製造できる。
【００２３】
ここで用いる酵素としては、例えば、前述したＴＶＡIIが挙げられるが、その他、ネオプルラナーゼ(N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 170, 1554(1988); N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 173, 6147(1991))等のプルランからパノースを生成するα−アミラーゼを用いることができる。
例えば、ＴＶＡIIを用いる場合、プルランとグルコースを共に５％濃度でリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）1.5Lに溶解し、ＴＶＡIIを60mg加えて40℃で72時間反応させる。この反応液を経時的に採取し、薄層クロマトグラフィーにかけると図２に示すように、ＩＭＩＭとＩＭＭが生成した。この時、ＩＭＭはＴＶＡIIによって加水分解を受けるため、反応24時間以降は減少する。
【００２４】
反応の一方の基質はプルラン又はパノースであり、パノースの原料となる澱粉やアミロペクチン等も基質となる。プルラン又はパノースの濃度については濃度が高い程良いが、１〜30％の範囲が好ましい。勿論、プルラン又はパノースを反応途中で添加して生成するＩＭＩＭの濃度を高くすることもできる。他方の基質であるグルコースは、通常、反応の始めから反応液に添加するが、反応の途中から添加してもさしつかえない。即ち、ＴＶＡIIはパノースを加水分解できず、グルコースの転移反応はパノースの存在下でも進行するため、高濃度のプルラン溶液が酵素分解を受けて粘度が低下してからグルコースを加えてＩＭＩＭの濃度を高くすることもできる。また、酵素濃度は、酵素の種類により異なるが、通常0.0001〜1.0 ％である。
【００２５】
ＩＭＩＭを生成する反応条件としては、酵素の作用pH及び温度範囲であれば、如何なる条件でもよく、好ましくはpH 4.0〜7.0 で、温度20〜80℃の条件が用いられる。更に、必要に応じて有機溶媒等の添加も可能である。反応時間は生成物の利用目的に応じて適宜設定されるが、多くの場合30分〜72時間が好ましい。
反応で得られるＩＭＩＭを含む糖液は、常法に従い活性炭による脱色及びイオン交換樹脂による脱塩等の精製操作を経て、そのままシロップとして利用できる。また、還元処理すれば糖アルコールとしても利用することができる。
【００２６】
更に、必要に応じてゲル濾過クロマトグラフィー、カーボンカラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いたり、膜分画法や晶析法等を用いることにより、高純度のＩＭＩＭを調製することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は下記実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
（実施例１）
Thermoactinomyces vulgaris R-47を清水らの方法(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1681(1978)) により培養し、Marmurの方法(J. Marmur, J.Mol. Biol., 3, 208(1961))により本菌の培養菌体からゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを制限酵素 Sau3AI で部分消化し、得られた４〜10kbのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９プラスミドの BamHIサイトに導入した。こうして得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM83 株を形質転換した。
【００２８】
ＴＶＡII遺伝子を持つ大腸菌の探索は、ヨウ素澱粉反応の有無を指標にして行った。約30,000株より５株のＴＶＡII遺伝子を持つ大腸菌を得、このうち最も短い４kbの遺伝子をｐＴＯ１と名付け、以下、図５に示す手順に従い、ＴＶＡIIの大量生産系の構築を行った。
【００２９】
先ず、不要な部分の削除を行った。ｐＴＯ１のＴＶＡII遺伝子部分の2.8kb のPstI-PstI 断片をｐＵＣ１１９にサブクローニングしたプラスミドｐＴＯ１２４ではＴＶＡII活性がみられた。次に、エキソヌクレアーゼIII とマングビーンヌクレアーゼを用いる方法により、ｐＴＯ１２４のＴＶＡII遺伝子部分の下流側0.2kb を削ったｐＴＯ４２４、及び、更に上流の0.5kb を削ったｐＴＮ１を構築し、これらのプラスミドについてもＴＶＡII活性がみられることを確認した。こうして得られた2.1kb のＴＶＡII遺伝子を含むプラスミドｐＴＮ１のプロモーター、及びShine-Dalgarnoリボソーム結合配列として、ｐＵＣ１１９由来のβ−ガラクトシダーゼ由来のプロモーターの直下に、ＴＶＡII遺伝子由来のShine-Dalgarnoリボソーム結合配列をつないだものをクンケル法による部位指定突然変異の方法で構築した。得られたプラスミドｐＴＮ３０２−１０で大腸菌 MV1184 株を形質転換した。この形質転換体は、培養液１Ｌ当たり100mg 以上のＴＶＡIIを生産した。
【００３０】
なお、本形質転換体は、Escherichia coli NK699311 (FERM P-13717)として工業技術院生命工学工業技術研究所に平成５年７月２日付けにて寄託されている。
前記形質転換体１白金耳を培地（１％ペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％食塩を含む）に接種し、37℃で16時間培養して種培養を行った。得られた種培養液１mLを1.6gペプトン、1.0g酵母エキス、 0.5g 食塩、５mgアンピシリンを含む培地 100mLに加えて、500mL 容坂口フラスコで37℃で16時間往復振盪して本培養（培地 100mL×10）した。なお、培養５時間で0.5Mイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド0.1mL を培地に添加した。菌体は培養液を遠心分離（2,000g, 20分）して回収し、5mM CaCl2を含む100mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）に懸濁した。懸濁菌体は80℃で30分間加熱処理してから超音波処理により破砕され、遠心分離（7,500g, 10分）により上清液が回収された。得られた上清液をＴＶＡIIの粗酵素液とし、反応に用いた。酵素蛋白質の測定はLowry の方法により行った。
【００３１】
プルランとグルコースを共に５％濃度で20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）２L に溶解し、ＴＶＡIIを85mg加えて40℃で72時間反応させてＩＭＩＭを含む糖液を得た。得られた糖液の１／10をトヨパール HW40Sカラム（10cm×2m）を用いて分離した。流速は10ml／分、検出は示差屈折計を用いた。分離したときのパターンを図６に示す。（１）の画分を分取し、エバポレーターで濃縮乾固させたところ、ＩＭＭを含まないＩＭＩＭが0.5ｇ得られた。（２）の画分については薄層クロマトグラフィーによって若干のＩＭＭが含まれていることが判明した。この若干のＩＭＭを含む粗ＩＭＩＭの量は約２ｇであった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＴＶＡIIの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図２】グルコースの存在下でプルランにＴＶＡIIを作用させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示す図である。
【図３】ＩＭＩＭの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】ＩＭＩＭにイソマルトデキストラナーゼを作用させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示す図である。
【図５】ＴＶＡIIの大量生産系の構築の手順を示す図である。
【図６】糖液をカラムクロマトグラフィーで分離したときのパターンを示す図である。
【符号の説明】
【００３３】
Ｐ  ＴＶＡIIによるプルラン分解物
ＭＯＳ  一連のマルトオリゴ糖
１  イソマルトース
２  ＩＭＭ
３  １％ＩＭＭを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶かしたもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 Unit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの
４  ＩＭＩＭ
５  １％ＩＭＩＭを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶かしたもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 Unit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの
【図１】
0003605410.tif 000010
【図２】
0003605410.tif 000011
【図３】
0003605410.tif 000012
【図４】
0003605410.tif 000013
【図５】
0003605410.tif 000014
【図６】
0003605410.tif 000015