(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ：測定対象試料が含まれないブランク試料を注入し、分離カラムを介して分離した後に検出器で検出し、当該検出器の出力からブランククロマトグラムを作成し、且つ得られたブランククロマトグラムに対して平滑化処理を行う工程と、
ｂ：測定対象試料を注入し、前記測定対象試料を分離カラムを介して分離した後に検出器で検出して試料クロマトグラムを得る工程と、
ｃ：前記試料クロマトグラムから前記平滑化処理後のブランククロマトグラムを減算処理し、クロマトグラフを得る工程、
を有することを特徴とするクロマトグラフィ分析方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ブランククロマトグラムの平滑化処理は、複数の平滑化処理関数の中から任意に選択された関数を用いて行うことを特徴とするクロマトグラフィ分析方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記平滑化処理は、複数回測定したブランククロマトグラムを積算平均した後に行うことを特徴とするクロマトグラフィ分析方法。
【請求項４】
試料を移動相に注入して混合する試料注入手段と、前記試料を分離する分離カラムと、前記分離カラムからの溶出液を検出する検出器とを有するクロマトグラフィ分析装置において、
測定対象試料が含まれないブランク試料について検出器の出力を時間的に平滑化処理して作成したブランククロマトグラムを記憶した記憶手段を備え、測定対象試料を分析して得られる前記検出器の出力から前記記憶手段に格納されたブランククロマトグラムを減算処理することで、前記測定対象試料のクロマトグラムを得ることを特徴とするクロマトグラフィ分析装置。
【請求項５】
請求項４において、
前記ブランククロマトグラムの平滑化処理に用いる関数を選択するための選択領域を表示する表示手段を備え、当該表示領域には、複数の選択可能な平滑化処理関数が表示されることを特徴とするクロマトグラフィ分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィ分析方法及びクロマトグラフィ分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
未知試料の測定のために、クロマトグラフィ装置を用いて分析することが多い。このクロマトグラフィ装置では、ベースラインが水平にならない場合にしばしば遭遇する。それは、試料を注入しないブランクのクロマトグラムにおいても発生する。例えば、液体クロマトグラフィにおいてグラジエント溶出法を用いる際、検出手段に応じ、多様な原因によりベースラインが変化する。例えばＵＶ吸光度検出の場合、溶離液の吸光度が変化することによる。蛍光検出の場合、溶離液の蛍光強度が変化することによる。これらには吸光度あるいは蛍光スペクトルが、溶離液のｐＨなど溶媒和変化により波長シフトを起こす場合も含まれる。電気伝導度，電気化学，示差屈折率などの検出手段においても、グラジエント溶出を行う場合、同様にベースラインが変化することがある。またガスクロマトグラフィまたは液体クロマトグラフィでは、カラム温度をグラジエント変化させることがあり、同様なベースライン変化が見られる。このようにベースラインが変化する場合には、一定のベースラインを設定することが困難であり、経験的にユーザーがベースラインを試行錯誤により推定しているのが実際である。しかしこれでは、しばしば１０％以上の定量誤差を生じることがある。このようなベースラインの変動については、特開平６−１４８１６８  号公報に知られている。
【０００３】
そのために、例えば、ベースラインの設定による定量分析の誤差を低減するために、まずブランクのクロマトグラムを得るために試料を注入せずに溶出または温度のグラジエントプログラムを起動することで得られる検出器信号をブランククロマトグラムとする。試料の代わりに、溶離液，水，試料成分を溶かしている溶媒、あるいは空気を注入し、クロマトグラムとすることもある。このブランククロマトグラムをベースラインであるとみなし、試料注入された通常のクロマトグラムから同一時刻の信号強度を順に減算することにより、ベースラインの変動のない、言い換えれば水平なベースラインのクロマトグラムが得られる。このサブストラクトされたクロマトグラムからピーク面積・高さあるいはリテンションタイムを計算することにより定量・定性分析の精度が向上される。また分離度等特異性を表すパラメータも精度良く求めることができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような方法では、試料クロマトグラム（図６ｃ）の持っているノイズとブランククロマトグラム（図６ａ）のノイズを合わせ、ノイズを拡大することになる弊害が生じる（図６ｅ）。説明を簡単にするために試料側，ブランク側のノイズをいずれも統計学的なノイズσと仮定する。元々試料クロマトグラムにσしか載っていなかったノイズが、サブストラクトされたクロマトグラムでは√２×σのノイズに拡大されてしまうことになる。このように、ノイズが拡大され分析の精度が低下するという問題が生じる。（より正確なノイズ拡大の度合は次の式で表される。
【０００５】
σサブトラクト済２＝σ試料２＋σブランク２   …（数１）
ここで各ノイズσの添え字はそれぞれノイズのあるクロマトグラムを示す。）
本発明の目的は、精度向上が可能なクロマトグラフィ分析方法及びクロマトグラフィ分析装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明では、測定対象試料が含まれないブランク試料を注入し、分離カラムを介して分離した後に検出器で検出し、当該検出器の出力からブランククロマトグラムを作成し、且つ得られたブランククロマトグラムに対して平滑化処理を行う工程と、測定対象試料を注入し、前記測定対象試料を分離カラムを介して分離した後に検出器で検出して試料クロマトグラムを得る工程と、前記試料クロマトグラムから前記平滑化処理後のブランククロマトグラムを減算処理し、クロマトグラフを得る工程を有するように構成した。
【０００７】
好ましくは、試料クロマトグラムの減算処理をする前にブランククロマトグラムに対し平滑化処理を実施する（図６ｂ）。あるいはブランククロマトグラムに対する最小自乗法による任意関数の回帰・あてはめ（カーブフィッティング）を実施する。この好ましい例では、ブランククロマトグラムを平滑化ないしはカーブフィティングすることによりノイズを除去することができる。これは溶離液でもカラム温度でもグラジエント変化によるベースライン変動は、ピーク幅に比べ十分長い時間をかけてゆるやかに変化する特徴があることによる。このため、ブランククロマトグラムでは比較的時間の短い信号変化は、成分ピークではなく、ノイズに限られ、簡単に除去することができる。このブランク側のノイズを除去するブランクサブトラクションではブランククロマトグラム由来のノイズ伝播をなくすることができる（図６ｄ）。
【０００８】
σブランク２＝０
σサブトラクト済２＝σ試料２ …（数２）
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００１０】
［アミノ酸分析計の構成］
図１はアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。１−４はそれぞれ第１−第４緩衝液（溶離液）、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって１つの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプラ９を経由して分離カラム１０に送られる。オートサンプラ９で導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離した各アミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、反応コイル１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によってクロマトグラム及びデータとして出力され、記録，保存される。
【００１１】
図５が本アミノ酸分析計により得られたクロマトグラムである。この例は特に劣悪なものではあるが、溶離液から蛍光物質が入り込みブランククロマトグラムに大きなベースライン変動が見られる。
【００１２】
［自動連続分析時の操作フロー］
ユーザーはサンプルテーブルにブランク注入を指定する。図２では最初にブランクを３回測定し、以降、標準試料ＳＴＤを３レベル、未知試料ＵＮＫを５検体の順に測定している。ブランク測定時は図３のグラジエントプログラムに従い、緩衝液およびカラム温度の切替を実施し、検出器１５の信号を記録する。これをブランククロマトグラムとしてデータ処理装置１６に記憶し、プリントする。この例では３回測定したブランククロマトグラムを積算平均し、自動的に平滑化処理し、平滑化済ブランククロマトグラムとしてデータ処理装置１６に記憶する。平滑化処理はユーザーが表１から選択できる。各方法については一般的に知られている（例えば、南  茂夫  編著「科学計測のための波形データ処理」（１９８６年  ＣＱ出版）に詳しい）ので、詳細な説明は省く。
【００１３】
【表１】
0003550479.tif 000002
【００１４】
次にＳＴＤ，ＵＮＫを同様に、試料クロマトグラムとしてデータ処理装置１６に記憶する。ユーザーがブランクサブトラクトされたクロマトグラムの出力を選択していれば、ここでサブストラクト済クロマトグラムを連続的にプリントする（図４）。
【００１５】
［マニュアル操作フロー］
一旦取得したクロマトグラムに対して、後処理としてもブランクサブトラクションが実行できる。この場合、ブランククロマトグラムは試料クロマトグラムを取得する以前に必ずしも測定する必要はない。ユーザーは試料クロマトグラムおよびブランククロマトグラムを一連のデータ群から選択し、ブランクサブトラクション処理を実行することになる。
【００１６】
［カーブフィティング法］
ブランククロマトグラムの平滑化法としてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ  法に代表される多項式適合法を前述した。これは最小自乗法に基づくカーブフィティングとみなすことができる。フィットされたカーブが得られると、単に平滑化としての機能だけではなく、ブランククロマトグラムと試料クロマトグラムの時間軸方向のずれを補正することが可能になる。このずれは主に溶離液およびカラム温度のグラジエントプログラムと送液のタイミングの微妙な差異による。ユーザーのマニュアル操作の場合、図５のような溶離液の切替による特徴点を一致させることができる。ブランク側はある関数にフィットされているため、特徴点間を伸縮することが可能である。自動化のためにはクロマトグラムの特徴点を微分計算処理を行い、探索することになる。
【００１７】
単純移動平均等多項式適合法以外の平滑化手法を用いる場合、ずれ補正は補間処理により実現することになる。特にスプライン補間が有効である。
【００１８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、分析精度の向上が可能となる。なお、好ましい例によれば、ブランク側のノイズを除去するブランクサブトラクションではブランククロマトグラム由来のノイズ伝播をなくすることができ、分析の精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アミノ酸分析計のシステム構成図。
【図２】サンプルテーブルを示す図。
【図３】グラジエントプログラムを示す図。
【図４】ユーザー選択画面。
【図５】ブランクと試料クロマトグラムの特徴点の説明図。
【図６】各種クロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１…第１緩衝液、２…第２緩衝液、３…第３緩衝液、４…第４緩衝液、５…カラム再生液、６…電磁弁シリーズ、７…緩衝液ポンプ、８…アンモニアフィルタカラム、９…オートサンプラ、１０…分離カラム、１１…ニンヒドリン試薬、  １２…ニンヒドリンポンプ、１３…ミキサ、１４…反応コイル、１５…検出器、１６…データ処理装置。
【図１】
0003550479.tif 000003
【図２】
0003550479.tif 000004
【図３】
0003550479.tif 000005
【図４】
0003550479.tif 000006
【図５】
0003550479.tif 000007
【図６】
0003550479.tif 000008