(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の１又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とするNumbタンパク質発現抑制剤。
【請求項２】
ムサシ蛋白質がムサシ１（Musashi１）である請求項１記載のNumbタンパク質発現抑制剤。
【請求項３】
ムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の１又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とするNotch情報伝達活性増強剤。
【請求項４】
ムサシ蛋白質がムサシ１（Musashi１）である請求項３記載のNotch情報伝達活性増強剤。
【請求項５】
請求項３又は４記載のNotch情報伝達活性増強剤を有効成分とするNotch情報伝達系の異常に基づく神経幹細胞の自己複製および／又は生存不全の治療薬。
【請求項６】
ムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の１又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とする神経幹細胞増殖活性増強剤。
【請求項７】
ムサシ蛋白質がムサシ１（Musashi１）である請求項６記載の神経幹細胞増殖活性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はニューロン分化調節機能やＮｏｔｃｈ拮抗作用を有するＮｕｍｂタンパク質の発現を抑制し、Ｎｏｔｃｈ情報伝達系の異常に基づく疾患の治療薬として有用な医薬及び神経幹細胞増殖活性増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
Ｎｕｍｂタンパク質（Ｗａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２３（１９９９）：７１−８１）は哺乳類中枢神経細胞幹細胞の自己複製活動に必要なＮｏｔｃｈタンパク質のシグナル伝達カスケードを阻害することが知られている（Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．１８（１９９９）：２１９６−２２０７及びＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２０００）：２８３−２９３）。
【０００３】
そしてＮｏｔｃｈタンパク質を介した情報伝達系は、神経幹細胞の自己複製および／又は生存等に関与している。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、哺乳類の中枢神経経系の幹細胞に強く発現することが知られているムサシ蛋白質（Ｍｕｓａｓｈｉ）に着目し、その機能について検討してきたところ、ムサシ蛋白質がＮｕｍｂタンパク質の発現を翻訳段階で抑制すること、さらにＮｏｔｃｈ情報伝達の活性を増強する作用を有し、Ｎｏｔｃｈ情報伝達活性の異常に基づく疾患の治療薬として有用であることを見出した。また、本発明者はムサシ蛋白質の機能を検討する目的でムサシ蛋白質遺伝子を欠損させた動物を用いて検討したところ、ムサシ蛋白質が神経幹細胞の増殖活性を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明はムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の1又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とするNumbタンパク質発現抑制剤を提供するものである。
また本発明はムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の1又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とするNotch情報伝達活性増強剤を提供するものである。
また、本発明は、ムサシ蛋白質、ムサシ蛋白質のアミノ酸配列の1又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつNumbタンパク質発現抑制活性を有するポリペプチド、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分とする神経幹細胞増殖活性増強剤を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬の有効成分であるムサシ蛋白質は、哺乳類の中枢神経系幹細胞で強く発現するＲＮＡ結合タンパクである。そして、ムサシ蛋白質にはムサシ１（Ｍｕｓａｓｈｉ１又はＭｓｉ１）及びムサシ２（Ｍｕｓａｓｈｉ２又はＭｓｉ２）の２つがあることが知られている（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １７６（１９９６）：２３０−２４２）。これらのムサシ蛋白質のうち、ムサシ１（Ｍｓｉ１）が特に好ましい。
【０００７】
これらのムサシ蛋白質は、それが存在する細胞から分離することもできるが、ムサシ蛋白質をコードする遺伝子がすでにクローニングされているので、ＤＮＡ組み換え技術、すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
【０００８】
またムサシ蛋白質は、神経幹細胞で発現している蛋白質そのものでもよいが、同様の性質を有する限り、その一部のアミノ酸配列が改変されたものでもよい。例えばムサシ蛋白質のアミノ酸配列の1又は複数個が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも使用し得る。これらの置換、欠失、付加もしくは挿入の程度及びそれらの位置は、改変されたポリペプチドがムサシ蛋白質と同様の性質、すなわちNumbタンパク質発現抑制活性を有するものであれば特に制限されない。これらの改変ポリペプチドもまた、ムサシ蛋白質同様にDNA組み換え技術により調製できる。
【０００９】
また、ムサシ蛋白質又は上記改変ポリペプチドをコードする遺伝子を投与し、体内で当該蛋白質又は改変ポリペプチドを生成させてもよい。
【００１０】
後記実施例に示すようにムサシ蛋白質は、哺乳類のｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡと結合し、ｎｕｍｂ遺伝子の発現を翻訳段階で調節し、Ｎｕｍｂタンパク質の発現を抑制する。
また、ムサシ蛋白質の発現によって、Ｎｕｍｂタンパク質の発現が抑制される結果、Ｎｏｔｃｈ情報伝達の活性が増強される。従って、ムサシ蛋白質は、Ｎｏｔｃｈ情報伝達系の異常に基づく疾患、すなわち神経幹細胞の自己複製および／又は生存不全の治療薬として有用である。
また、Ｍｓｉ１遺伝子欠損マウス由来の神経幹細胞において、Ｍｓｉ２遺伝子の発現を減弱させると、ニューロスフェア形成能が著しく減少することから、ムサシ蛋白質は神経幹細胞の増殖活性を増強させる。
【００１１】
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、ムサシ蛋白質量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度であろう。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
Ａ．材料と方法
（１）Ｍｓｉ１融合タンパク質の調製
マウスのＭｓｉ１融合タンパク質（Ｍｓｉ１−２ＴＲ）を調製するために、ｍｕｓａｓｈｉ−１  ｃＤＮＡのコード領域の一部（アミノ酸残基７〜１９２に相当）をｐＥＴ２１ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入し、プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ−ｍｓｉ１２ＴＲを構築した。このプラスミドは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳに導入して増幅した。融合タンパク質の発現とアフィニティ精製は文献の方法で行った（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２２（２０００）：１３８−１５２）。
【００１４】
（２）Ｍｓｉ１のリガンドであるＲＮＡの選択
ＲＮＡの選択は、基本的に文献の方法で行った（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７（１９９７）：１１９７−１２０４、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１９９１）：４９３１−４９３６）。プライマー結合部位の間に５０ｂｐのランダム配列をはさむオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ−Ｎ５０−ＴＡＴＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡ−３’）をＤＮＡ合成装置（Ｎｉｓｓｉｎｂｏ）で合成した。このオリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロモーター配列を含むフォワードプライマー（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ−３’）とリバースプライマー（５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＧＣＡＣＡＴＡ−３’）を用いてＰＣＲ法で増幅した。ライブラリーＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した。得られたＲＮＡは、ニッケルアフィニティ樹脂を充填したカラムに添加した。このカラムにはあらかじめ１００μｇのヒスチジンタグをもつ精製Ｍｓｉ１融合タンパク質を吸収させておいた。ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒには０．５Ｍ  ＬｉＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いた。次にビーズを１０  ｍｌのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、結合ＲＮＡはｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，１Ｍイミダゾール）でカラムから溶出し、フェノールで抽出してエタノールで沈殿させた。このＲＮＡをモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で逆転写して得られたｃＤＮＡをＰＣＲに用いた。上記のフォワードおよびリバースのプライマーを用いて、９４℃１分間、５９℃１分間、７２℃１分間を１５サイクル行いＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物は次回のＲＮＡ選択に用いた。以上の手順を、さらに７回繰り返して行ったあとに、増幅産物をｐＵＣ１１９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。ＲＮＡの二次構造は、市販の配列解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．）のプログラムを使用し、Ｚｕｋｅｒ−Ｓｔｉｅｇｌｅｒ法で予測した。
【００１５】
（３）ゲルシフト法
ゲルシフト法は、Ｍｓｉ１融合タンパク質の量を変えて１６  μｌのＫＮＥＴ緩衝液を用いて行った（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ．ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １３（１９９３）：３４９４−３５０４）。１分あたり１万カウント（約４  ｆｍｏｌ）の３２Ｐ標識選択ＲＮＡリガンド（Ｓ８−１３とＳ８−１９）を、Ｍｓｉ１融合タンパク質を含む溶液に加えた。競合試験の場合は未標識ＲＮＡを３２Ｐ標識ＲＮＡ添加前に加えた。タンパク質とＲＮＡのサンプルは、室温に３０分静置して平衡化させた。保温後に混合液を８％または１５％のポリアクリルアミドゲル（０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液、５％グリセロール）に直ちに添加して電気泳動で分離した。ゲルを乾燥してＸＡＲオートラジオグラフィーフィルムを感光させた（Ｋｏｄａｋ）。
【００１６】
（４）ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の３’ＵＴＲを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合試験
［３５Ｓ］メチオニン標識した完全長のＭｓｉ１タンパク質を、プラスミドベクターｐＲＳＥＴｂ−ｍｓｉ１（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  １７６（１９９６）：２３０−２４２）、ｐＥＴ２１ａ−ｍｓｉ１２ＴＲ、ｐＲＳＥＴｂ−Ｃ１７（Ｃ末端半分）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む網状赤血球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系で調製した。Ｍｓｉ１タンパク質は、ビオチン−１４−ＣＴＰで標識したｍ−ｎｕｍｂ  ＲＮＡとともにｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，  ０．０５％  ＮＰ−４０，  ０．１％アジ化ナトリウム）中で３０分間保温した。次にＭｓｉ１とｍ−ｎｕｍｂ  ＲＮＡの混合液を、あらかじめｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁しておいたストレプトアビジン−アガロースビーズに添加した。ビーズは１ｍｌのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した。ビーズペレットを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）添加液に再懸濁し、５分間沸騰後に遠心した。上清を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに添加して電気泳動で分離した。電気泳動後にゲルを乾燥させ、Ｆｕｊｉ  ＲＸ−Ｕフィルムを−８０℃で１．５〜８時間感光させた。
【００１７】
（５）細胞培養とｉｎ  ｖｉｖｏ結合試験
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、１０％子ウシ血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Ｎｉｓｓｕｉ）を用いて培養した。培養には６０  ｍｍのシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ）を用いた（１０６細胞／シャーレ）。翌日、図１１の通りに１μｇのＭｓｉ１発現構成体（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧＭｓｉ１ＨＡＴ，  ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧＭｓｉ１ｍｕｔＲ１ＨＡＴ，  ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧＭｓｉ１）を、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞に導入した。２日後に導入細胞を１  ｍｌのＮＥＴ−Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液に懸濁し、ホモジナイズして微量遠心機で遠心した。ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下（０．５Ｕ／μｌ）、上清に含まれるヒスチジンアフィニティタグ（ＨＡＴ）をつけたＭｓｉ１−ＲＮＡ複合体を、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共沈させた。沈殿したＲＮＡの抽出、ＤＮａｓｅＩによる処理、逆転写は文献の方法で行った（Ｂａｃｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７（１９９９）：３１９４−３２０１）。続いてｍ−ｎｕｍｂ遺伝子に特異的なプライマー（５’−ＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧ−３’と５’−ＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧ−３’）を用いて、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の３２サイクルの条件で、また、β−アクチンに特異的なプライマー（５’−ＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＣ−３’と５’−ＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＣＡＣＧ−３’）を用いて、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００１８】
（６）ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイと、ノーザンＥＬＩＳＡ系によるレポーターｍＲＮＡの定量
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（１回の試験につき３×１０５細胞／ｍｌ）を、０．２μｇのホタルルシフェラーゼレポーターベクター、２０ｎｇの対照用ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼベクターｐＲＬ−ＴＫ（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｋ）、０．３μｇのｐＥＧＥＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともに、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐＣＤＮＡ３−Ｔ７Ｍｓｉ１またはｐＣＤＮＡ３−Ｔ７Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１発現ベクターを組み合わせ（全体として１．５μｇ）、Ｆｕｇｅｎｅ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて導入した。２日間保温した後に細胞をルシフェラーゼレポーターアッセイ用ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｋ）に溶解した。ホタルルシフェラーゼ（レポーター）活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性（対照）は、メーカーから入手した反応基質混合液中で、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７ルミノメーターで測定した。相対発光量で表したレポーターのルシフェラーゼ活性を、対照となるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性で割った比を元にレポーターのルシフェラーゼ値を標準化した。
【００１９】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、上述のレポーターアッセイで導入・培養した。２日後に細胞を回収して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて総ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅＩ処理後、各２μｇのＲＮＡを用いて、レポータールシフェラーゼＲＮＡの定量と、対照としてエンハンスド緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＲＮＡの定量を、ノーザン酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）システム（Ｒｏｓｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行った。ジゴキシゲニン標識検出用プローブの調製には、基質としてジゴキシゲニン−１１−２’−デオキシ−ウリジン−三リン酸を、また鋳型として１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＧＶ−Ｐ２；  Ｐｒｏｍｅｇａ，  ｐＥＧＦＰ−Ｎ３；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたＰＣＲを行った。条件は、９４℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃３０秒の２５回のサイクル（最終伸張反応を２分間）とし、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、ルシフェラーゼ遺伝子特異的プライマーおよびＥＧＦＰ特異的プライマーを用いた。ルシフェラーゼ遺伝子のフォワードプライマーは５’−ＧＡＧＧＴＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＴＣＣＧＧ−３’、リバースプライマーは５’−ＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＣＣ−３’とし、ＥＧＦＰのフォワードプライマーは５’−ＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧ−３’、リバースプライマーは５’−ＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧ−３’とした。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中におけるルシフェラーゼ−ｍ−ｎｕｍｂ  ３’−ＵＴＲキメラｍＲＮＡと対照ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ペルオキシダーゼと３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いて測光強度（４５０ｎｍの吸光値）から決定した。
【００２０】
（７）組換えアデノウイルスの調製と感染実験
ｐＡｄｅｘ１ｐＣＡｗベクターを元に組換えアデノウイルスＡｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１を調製した。手順はほぼ文献通りにしたがった（Ｈａｓｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７（１９９６）：１４９−１５８）。高力価の組換えアデノウイルス株（Ａｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１，  ３×１０１０ＰＵＦ／ｍｌ；  Ａｄｅｘ−ＮＬＬａｃＺ，  ３×１０１０ＰＵＦ／ｍｌ）を入手して−８０℃で保管した。  ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（２．５×１０６細胞）に、１０００倍希釈したアデノウイルス溶液を、５％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地５  ｍｌ中で感染させた。２日後にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｃｋａｎｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７（１９９９）：３１９４−３２０１）で細胞を溶解し、ウェスタンブロットによる解析を文献の方法で行い（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２２（２０００）：１３８−１５２）、続けてノーザンブロットとショ糖密度勾配遠心法による分析を行った。マウスとニワトリのタンパク質でエピトープとして完全に保存されているアミノ酸配列を認識するウサギの対ニワトリＮｕｍｂポリクローナル抗体（Ｗａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２３（１９９９）：７１−８１）（アフィニティ精製）、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗チューブリンマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａクローン番号１Ａ２）は、それぞれ１：５００、１：１０００、１：１０００に希釈して、リン酸緩衝食塩水で３％に希釈したスキムミルク中でイムノブロットを行った。それぞれの免疫反応性はジアミノベンジジンで検出した。シグナルはＮＩＨ  Ｉｍａｇｅプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６２，  ＮＩＨ）で定量した。
【００２１】
（８）ノーザンブロットによるＲＮＡの定量
総ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、上記の方法でＡｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１を感染させたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞から抽出してエタノールで沈殿させた。このＲＮＡを、モルホリノプロパンスルホン酸−ホルムアルデヒド−アガロースゲルで泳動した後にＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移し、３２Ｐ標識ｍ−ｎｕｍｂ  ｃＤＮＡとβアクチンのｃＤＮＡをプローブとしてハイブリッドを形成させた。ハイブリッド形成シグナルは、ＸＡＲオートラジオグラフィー用フィルム（Ｋｏｄａｋ）で検出し、ＢＡＳ５０００（Ｆｕｊｉ）で定量した。βアクチンｍＲＮＡのハイブリッド形成シグナルに対するｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡのシグナルの比を算出し、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルの標準量とした。２回の独立した実験を行って平均値を算出した。
【００２２】
（９）ショ糖密度勾配遠心法
ショ糖密度勾配遠心法は文献の方法で行った（Ｓｉｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６（１９９６）：３８２５−３８３２）。Ａｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１を上述の方法で感染させたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を遠心して回収し、冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．３］、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌペプスタチン、０．５％アプロチニン）に再懸濁して氷中に１０分間静置した。ニードルを通して細胞を破砕し、２５００ｇで１０分間遠心してペレットと上清を得た。後者を細胞質溶解液と命名した。ＫＣｌ濃度は、この時点で１００ｍＭに調節した。細胞質溶解液は、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．３］、１ｍｌあたり２μｇのロイペプチン、１ｍｌあたり２μｇのペプスタチン、０．５％のアプロチニンを含む直線型ショ糖密度勾配（５〜３０％）溶液に溶解した。この溶液をＨｉｔａｃｈｉ  Ｐ４０Ｓｔ１２８６ローターに据えて、４００００ｒｐｍで１５０分間４℃で遠心した。遠心後、ピストン・グラジェント・フラクショネーター（Ｂｉｏｃｏｍｐ，  Ｉｎｃ．）を用いて、画分を勾配の最上部から回収した（１画分あたり３００μｌ）。一画分について３０μｌをウェスタンブロット法による分析に用いた。ＲＮＡをフェノールを用いて画分から抽出し、エタノールで沈殿させた後にＡ２５４を測定した。
【００２３】
（１０）ＨＥＳ１プロモータのトランス活性化試験
ＨＥＳ１プロモータ活性を測定するために、０．２μｇのｐＨＥＳ１ｐ−ルシフェラーゼ（Ｊａｒｒｉａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７７（１９９５）：３５５−３５８）単独、これに０．０２５μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＣＤＮ１（Ｎｏｔｃｈ１細胞内領域発現プラスミド［ＦＣＤＮ１，  ａａ１７４７〜２５３１］）（Ｎｏｆｚｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２６（１９９９）：１６８９−１７０２）を加えたもの、または、ｐｃＤＮＡ３−Ｔ７Ｍｓｉ１とｐＥＦ−ＢＯＳｎｅｏ−Ｒ２１８Ｈ（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２４（１９９７）：４１３３−４１４１）をさまざまな量で組み合わせたもの、または、１μｇのｐＣＤＮＡ３−ＨＡｍＮｕｍｂを量を変えて組み合わせたものをＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に導入した。この際、１００ｎｇのＳＶ４０−ＬａｃＺ融合遺伝子または２０ｎｇの対照用ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクターｐＲＬ−ＴＫ（Ｔｏｙｏ  Ｉｎｋ）を、個々の導入様式について内部標準として用いた。独立した実験を３回行った。ルシフェラーゼ活性は導入してから４８時間後にルミノメーターＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定し、βガラクトシダーゼ活性またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
【００２４】
Ｂ．結果
（１）Ｍｓｉ１に対する高親和性ＲＮＡリガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択
Ｍｓｉ１の標的となるＲＮＡ配列を特定するために、アフィニティ溶出に基づくＲＮＡ選択（ＳＥＬＥＸ）を行った。３２Ｐ標識したＲＮＡプールを、５０ヌクレオチドの不完全なランダム配列を鋳型としたＰＣＲで増幅したオリゴヌクレオチドライブラリを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。合成したＲＮＡプールを、あらかじめＭｓｉ１融合タンパク質Ｍｓｉ１−２ＴＲを吸収させておいたニッケル製アフィニティカラムに添加した。Ｍｓｉ１−２ＴＲには、２か所のタンデムＲＲＭ型（Ｂｕｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３（１９９４）：１１９７−１２０４）ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（ａａ１７〜１９２）のほかに、Ｃ末端にヒスチジンタグが、また、Ｎ末端にＴ７タグを含む（図１）。洗浄してＭｓｉ１−２ＴＲ融合タンパク質と結合しなかったＲＮＡを除去した後に、Ｍｓｉ１−２ＴＲ融合タンパク質−ＲＮＡ複合体を、１Ｍイミダゾールを含む緩衝液中に溶出した。初回選択の溶出プロファイルを図１Ｂに示す。ＲＮＡとタンパク質の溶出は、放射能をカウントして、またＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってそれぞれモニタリングした（図２）。結合したＲＮＡを各サイクル後に抽出し、ＳＥＬＥＸ用リバースプライマーを用いて逆転写後に最初のｃＤＮＡ鎖を得た。選択されたＲＮＡ配列をコードするｃＤＮＡはＰＣＲで増幅して、次の結合サイクルおよび増幅用のＲＮＡ合成の鋳型として再び用いた。アフィニティＲＮＡ−リガンド選択を繰り返すことで、Ｍｓｉ１に結合するＲＮＡ画分が初期ＲＮＡプールにおける０．２％から、８回の選択サイクル後には６０％まで上昇することが明らかとなった（図３）。以上の手順で、Ｍｓｉ１と強く結合するＲＮＡ配列が高濃度に含まれるＲＮＡプールを得た。
【００２５】
次に、８回の選択サイクルで得た独立した５０個のｃＤＮＡクローンの配列を決定し、その情報を元にＭｓｉ１が結合するＲＮＡコンセンサス配列を特定した（図４）。２０個の代表的なクローンを図４に示す。いずれのクローンにもＡまたはＡＧをはさむ１〜６塩基の短いＵの連続がみられた。ここに示していない他の３０個のクローンについても、同じコンセンサス対応配列がみられ、一部は重複しており、図４に挙げたクローンの一部と同じＲＮＡ配列が認められた。選択クローンの大半には、特に（Ｇ／Ａ）ＵｎＡＧＵモチーフが認められた（図４の下線部；多くの場合ｎは１〜３）。ウリジンに富む配列は２〜３回繰り返すことが多かった。Ｕの出現回数（ｎ）は、ｎ＝１が３１％、ｎ＝２が４０％、ｎ＝３が２１％、ｎ＝４が５％、ｎ＝５が２％であった。興味深いことに配列は多くの場合、ステムループ構造のループ領域内にみられた（図５）。これは、Ｚｕｋｅｒ−Ｓｔｉｅｇｌｅｒ法に基づく市販の配列解析ソフトウェア（ＤＮａｓｉｓ，  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ）で予測した。
【００２６】
（２）ＲＮＡ−タンパク質結合試験
反復（Ｇ／Ａ）ＵｎＡＧＵモチーフが、Ｍｓｉ１−ＲＮＡ相互作用に不可欠な配列であることを詳しく調べるために、Ｍｓｉ１−２ＴＲ融合タンパク質と、最も多く選択されたクローン―選択コンセンサスモチーフに対応する配列をそれぞれ２個または３個含むＳ８−１３とＳ８−１９（図６Ａ）―のＲＮＡ配列を用いて結合試験を行った。４  ｆｍｏｌの標識ＲＮＡと、さまざまな量のＭｓｉ１−２ＴＲタンパク質を保温してゲルシフト法で解析した。各試験で認められた遅延バンドの数は、選択クローンにみられるコンセンサス配列モチーフ（Ｇ／Ａ）ＵｎＡＧＵと対応する配列数と一致した。Ｓ８−１３  ＲＮＡには２つのコンセンサスモチーフがあり、Ｓ８−１９ＲＮＡには３つのモチーフがある。Ｍｓｉ１タンパク質は、選択コンセンサス配列を含まないＮＣ−４と命名したＲＮＡは認識しなかった（図６Ａ）。Ｍｓｉ１タンパク質が選択ＲＮＡに特異的に結合するか否かを調べるために、Ｍｓｉ１選択コンセンサス配列、または、完全なコンセンサス配列のない非特異的競合配列を含む未標識ＲＮＡを用いて競合結合試験を行った（図６Ｂ）。４ｆｍｏｌの３２Ｐ標識ＲＮＡ（Ｓ８−１３またはＳ８−１９）を１００ｆｍｏｌのＭｓｉ１タンパク質と１０、１００、１０００倍過剰量の非標識ＲＮＡと保温後にゲルシフト法で解析した（それぞれ図６Ｂのレーン１３〜１５、レーン１８〜２０、レーン２３〜２５、レーン２８〜３０に対応）。タンパク質−ＲＮＡ複合体を示す遅延バンドの強度は、競合配列としてＭｓｉ１認識配列（標識ＲＮＡと同じ配列）を含む過剰な未標識ＲＮＡを加えることで減衰した。しかしこの強度は、Ｍｓｉ１認識配列（ＮＣ−４）を含まないＲＮＡを添加しても減衰した。以上の結果から、Ｍｓｉ１タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択したコンセンサス配列に対応した配列を含むＲＮＡを特異的に認識することがわかった。Ｍｓｉ１に対する選択ＲＮＡ配列の結合親和性は、ゲルシフト法におけるＲＮＡ−Ｍｓｉ１複合体を示す遅延バンドの強度から決定した。解離定数Ｋｄは、ＲＮＡの５０％が結合するタンパク質濃度に等しい。図６Ａのレーン４とレーン９では、ＲＮＡの５０％がタンパク質と結合していることがデンシトメトリーによる評価から明らかとなった。ＫｄはＳ８−１３とＳ８−１９について約４ｎＭと算出された。したがってＭｓｉ１は、高い親和性でコンセンサス配列モチーフと対応する配列を含むＲＮＡと結合することがわかった。
【００２７】
（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｍｓｉ１はｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡとの結合
Ｍｓｉ１タンパク質に対する下流標的遺伝子群の候補を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択試験結果を元に探索した。Ｍｓｉ１は未分化のニューロン前駆細胞で強く発現するので、神経分化を（正または負に）調節する遺伝子群のｍＲＮＡがＭｓｉ１の標的の下流にある可能性が高い。Ｎｏｔｃｈ拮抗物質をコードするｍ−ｎｕｍｂ遺伝子は、以下に挙げる事実からＭｓｉ１標的遺伝子の候補と言える。第一に、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’未翻訳領域（ＵＴＲ）には、Ｍｓｉ１結合のコンセンサス配列モチーフが含まれる。第二に、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子が発現する領域は、神経管の脳室帯の神経上皮細胞でｍｓｉ１遺伝子が発現する領域と重複する。第三に、ｍ−ｎｕｍｂはニューロン分化の調節に関与する。
【００２８】
Ｍｓｉ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと結合するか否かについて調べた。この目的のため、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの各部分（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）を、ビオチン−１４  ＣＴＰの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した（図７）。Ｍｓｉ１結合部位はＮ２内にあると考えられた。完全長のＭｓｉ１タンパク質、Ｍｓｉ１の２か所のタンデムＲＢＤを含む短縮型タンパク質（ＳＥＬＥＸに使用したＭｓｉ１−２ＴＲ）、Ｍｓｉ１のＣ末端部分を含む短縮型タンパク質の３種を対象に、対Ｎ２結合能力を調べた（図９と１０）。完全長Ｍｓｉ１タンパク質とＭｓｉ１−２ＴＲは、生理的環境に近い中程度のイオン強度（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）でＮ２と結合することがわかった（図１０）。［３５Ｓ］メチオニンで標識した完全長のＭｓｉ１タンパク質は、Ｎ２と結合したビーズと共沈した一方で、ｍ−ｎｕｍｂのＲＮＡのＮ１とＮ３部分は、完全長のＭｓｉ１タンパク質との間で相互作用がみられなかった（図８）。ＵＶ架橋試験を行ったところ、Ｍｓｉ１−２ＴＲがＮ２のみと結合することが明らかとなり、完全長Ｍｓｉ１と、２か所のタンデムＲＢＤを含む短縮型タンパク質（Ｍｓｉ−２ＴＲ）の両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内でＮ２領域と強く結合することを示していた。したがってｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭｓｉ１タンパク質の標的である可能性があることが判明した。
【００２９】
Ｍｓｉ１が、ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにｉｎ  ｖｉｖｏで結合するか否かを判定するために、文献の方法を用いた（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７（１９９７）：３１９４−３２０１、Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏＬ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １３（１９９３）：３４９−３５０４、Ｓｔｅｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８０（１９８９）：４６８−４８１）。一連のＭｓｉ１発現ベクターをあらかじめ導入したＮＩＨ  ３Ｔ３細胞溶解液からＭｓｉ１−ＲＮＡ複合体を沈殿させた（図１１）。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞では、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子は内在的に発現するが、Ｍｓｉ１は発現しない。そこで、ＨＡＴタグをつけたＭｓｉ１タンパク質（図１２）−これはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞内でＴａｌｏｎ金属キレート化アフィニティ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と極めて選択的に結合する―を導入して発現を誘導し（図１２）、ＨＡＴタグをもつＭｓｉ１が、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡに結合するか否かを調べた。上記の手順で導入した細胞に由来する細胞溶解液を、Ｔａｌｏｎ金属キレート化アフィニティ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加してＭｓｉ１−ＲＮＡ複合体を精製した。次に、ＨＡＴタグをもつＭｓｉ１タンパク質に結合したＲＮＡをフェノールで抽出し、逆転写後にｍ−ｎｕｍｂ遺伝子または多くの細胞種で大量に発現するβアクチン遺伝子（内部標準として使用）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＨＡＴタグをもつＭｓｉ１タンパク質に結合したＲＮＡの逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ産物は、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子用プライマーを使用時には得られたものの、βアクチン遺伝子用プライマー使用時には認められなかった（図１３、レーンＨ［ＲＴ（＋）］）。Ｍｓｉ１タンパク質のＲＮＡ結合における必要条件を明らかにするために、ＲＮＡ結合に不可欠な３つの芳香族アミノ酸を置換した（６３Ｆ→Ｌ、６５Ｆ→Ｌ、６８Ｆ→Ｌ）変異型Ｍｓｉ１タンパク質ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１−ＨＡＴ（図１１）についても、内在性ｍ−ｎｕｍｂの対ＲＮＡ結合能力を調べた。その結果、変異型Ｍｓｉ１タンパク質（ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１−ＨＡＴ）では、ｍ−ｎｕｍｂのｍＲＮＡに対する結合がみられず（図１３、レーンＡ）、アフィニティ樹脂上にｍ−ｎｕｍｂのＲＮＡが保持されることが、Ｍｓｉ１タンパク質のＲＮＡ結合能力に必要であることを意味していた。別の対照試験として、ＨＡＴアフィニティタグのないＭｓｉ１タンパク質ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１（図１１）をＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で発現させて同じ結合試験を行ったところ、ｍ−ｎｕｍｂのｍＲＮＡが樹脂上に保持されていることは検出できなかった（図１３、レーンＦ）。以上の結果は、Ｍｓｉ１が内在性のｍ−ｎｕｍｂのＲＮＡとｉｎ  ｖｉｖｏで結合することを示している。
【００３０】
（４）Ｍｓｉ１によるｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の発現抑制（内在性ｍ−Ｎｕｍｂの発現とレポーターアッセイ）
Ｍｓｉ１タンパク質が内在性ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質発現におよぼす作用を調べるために、組換えアデノウイルスベクターを用いてＭｓｉ１をＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で異常に発現させた（図１４と１５）。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞には、Ａｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１またはＡｄｅｘ−ＮＬｌａｃＺアデノウイルスを細胞に無毒な条件下で感染させた。Ａｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１ベクターを感染させたところ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−１Ｅエンハンサーと修飾ニワトリβアクチンプロモーターの融合プロモーターであるＣＡＧプロモーターの制御下で高量のＦＬＡＧタグをもつＭｓｉ１タンパク質が発現した。Ｍｓｉ１発現はチューブリンの発現レベルに影響しなかったことから、チューブリンを内部標準として、ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質の発現レベルにＭｓｉ１がおよぼす作用を評価した。Ｍｓｉ１を過剰に発現させると、内在性ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質レベルがＡｄｅｘ−ＮＬｌａｃＺを感染させてＬａｃＺを発現する対照細胞におけるレベルと比べて３２％低下した（図１４と１５）。しかし、内在性ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、Ｍｓｉ１とＬａｃＺを異常に発現させても変わらなかった（図１４と１５）。以上の結果から、Ｍｓｉ１タンパク質は、ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質発現の翻訳段階を抑制することがわかる。
【００３１】
次に、Ｍｓｉ１タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで標的配列の発現を調節する機構を調べるために、多様なルシフェラーゼ合成遺伝子を含むレポーターアッセイ系を構築した。ホタルのルシフェラーゼレポータープラスミドとＭｓｉ１発現プラスミドを、Ｍｓｉ１が内在的に発現していないＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に一時的に同時導入した。ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の１．４ｋｂの３’−ＵＴＲ全体とつなげたルシフェラーゼレポーター遺伝子はＳＶ４０プロモーターの制御下においた（図１６）。レポーター遺伝子の発現レベルは、ルシフェラーゼの発光レベルを元に定量した。野生型ｍｓｉ１遺伝子とその非ＲＮＡ結合変異体（ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１）は、ＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。図１７に示すように、ルシフェラーゼの酵素活性レベルは、導入して発現させた野生型Ｍｓｉ１の存在下で用量依存的に低下した。これと対照的に、ＲＮＡ結合活性を欠くＭｓｉ１ｍｕｔＲ１では、ルシフェラーゼ酵素レベルの低下は認められなかった（図１７）。また、レポーター遺伝子にｍ−ｎｕｍｂの３’−ＵＴＲがないものや、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の３’−ＵＴＲと逆向きに結合してＭｓｉ１結合部位を除くと、野生型Ｍｓｉ１はルシフェラーゼレポーター活性を低下しなかった（図１７）。したがって、レポーター遺伝子発現の抑制にはＭｓｉ１のＲＮＡ結合活性が介在することがわかった。
【００３２】
またＭｓｉ１は、ルシフェラーゼ−ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の３’−ＵＴＲキメラレポーター遺伝子の発現を定常状態のＲＮＡレベルで調節するのではなく翻訳段階で抑制するようである。ノーザンブロットによるＲＮＡの定量では、ＮＩＨ  ３Ｔ３におけるｍｓｉ１遺伝子産物レベルの上昇が、レポーター−ｎｕｍｂ遺伝子３’−ＵＴＲ融合ｍＲＮＡの相対量に影響しないことが各試験から判明している（図１８）。
【００３３】
Ｍｓｉ１タンパク質による翻訳段階での抑制が起こる可能性をさらに調べるために、Ｍｓｉ１タンパク質の細胞内における局在について、Ａｄｅｘ−ＦＬＡＧＭｓｉ１を感染させたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の細胞質溶解液を直線型ショ糖密度勾配（５〜３０％）で分離することで調べた。各画分のＡ２５４を元に、リボソームとリボソームサブユニットをサイズマーカーとして観察した。リボソームサブユニットの分類は、総ＲＮＡを個々の画分から抽出して確認した。Ｍｓｉ１タンパク質の有無は、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットで各画分について判定した。２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でＭｓｉ１タンパク質は、ポリソーム、８０Ｓモノソーム、６０Ｓリボソームサブユニット、４０Ｓリボソームサブユニットに対応する位置に移動した（図１９）。この結果は、Ｍｓｉ１タンパク質がリボソームと直接的または間接的に結合することを示している。
【００３４】
これらすべてを考えあわせると、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡが、Ｍｓｉ１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的のひとつであることがわかる。Ｍｓｉ１は、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲと直接結合してｍ−Ｎｕｍｂタンパク質の発現を翻訳段階で抑制する。
【００３５】
（５）Ｎｏｔｃｈ情報伝達の活性に対するＭｓｉｌの増強作用
Ｍｓｉ１タンパク質によるｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の翻訳段階における発現抑制の生物学的意義を調べるために、ＨＥＳ１プロモーターを用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。極めて短いＨＥＳ１プロモーター配列には、２か所のＲＢＰ−Ｊκ結合部位があり、Ｎｏｔｃｈ情報伝達の誘導に伴いトランスに活性化される。Ｍｓｉ１を導入すると、ＨＥＳ１プロモーター活性が若干上昇した（基底状態から５．１倍の活性化）（図２０）。Ｍｓｉ１によるこのわずかな上方制御は、内在性Ｎｏｔｃｈの活性化によるものと解釈できる。Ｎｏｔｃｈの優性活性型のひとつであるＮｏｔｃｈ１の細胞内ドメイン（ＦＣＤＮ１）のトランス活性化が、Ｍｓｉ１をＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に導入することでどのように変化するかについて検討した。Ｎｏｔｃｈ１の活性化型を単独で発現させると、ＨＥＳ１プロモーターが基底状態と比べて２４．５倍活性化した（図２０）。この活性化は、標的となるＤＮＡに対して結合部位をもたず、Ｎｏｔｃｈ情報伝達の活性化を妨げるＲＢＰ−Ｊκ優性抑制型（Ｒ２１８Ｈ、図２０のＤＮ−ＲＢＰ−Ｊκ）の発現に伴い阻害される。また、Ｎｏｔｃｈ１優性活性型とともにＭｓｉ１を導入して発現させると、ＨＥＳ１プロモーターの活性は、優性活性化型のＮｏｔｃｈ１単独で引き起こされる活性化に対してさらに２．７倍上昇した（基礎レベルの６６倍の活性化）（図２０）。Ｍｓｉ１の発現がＨＥＳ１プロモーター活性を、優性活性型のＮｏｔｃｈ１の活性と相乗的に高めることを見出した（図２０）。Ｍｓｉ１によるＨＥＳ１プロモーターをもつルシフェラーゼレポーター活性の増強は、ＤＮ−ＲＢＰ−Ｊκを発現させても抑制される（図２０）。したがって、Ｍｓｉ１によるＨＥＳ１プロモーターの誘導は、ＤＮ−ＲＢＰ−Ｊκ依存性経路を介したＮｏｔｃｈ情報伝達の活性化によると考えられる。その一方で、Ｎｏｔｃｈ１によるＨＥＳ１プロモーターのトランス活性化がｍ−Ｎｕｍｂタンパク質の過剰発現によって阻害されることがわかった（図２１）。これらすべてを考えあわせると、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＭｓｉ１の異所的過剰発現が、内在性のｍ−Ｎｕｍｂタンパク質レベルを、ｍＲＮＡレベルに影響することなく低下させること（図１４と１５）と、ｍ−ＮｕｍｂがＮＩＨ  ３Ｔ３細胞においてＮｏｔｃｈ情報伝達の拮抗物質として作用することがわかる（図２１）。したがってＭｓｉ１は、ｍ−Ｎｕｍｂを翻訳段階で抑制してＲＢＰ−Ｊκ依存性経路を介してＮｏｔｃｈ情報伝達の活性化にかかわっている。
【００３６】
（６）アンチセンスＰＮＡ
ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡはＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社で常法にて合成、精製したものである。ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの配列は、翻訳開始コドン（５’ＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＧＡＧＣＣ３’−Ｌｙｓ）またはコード領域（５’ＡＣＣＴＡＡＴＡＣＴＴＴＡＴＣＴ３’−Ｌｙｓ）と一致している。ＰＮＡ（Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２６（１９９８）：６１５−６２１）の自己会合を防ぐためにリジンを３’端に添加した。これらの２つのａｓＰＮＡｓはニューロスフェア形成に同様の作用を有している。
【００３７】
（７）ニューロスフェアの培養（神経幹細胞の培養）
ニューロスフェア形成および分化アッセイの標準的手法、ならびにＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌおよびｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌを含む基礎培地の作製は、既述の方法（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０（２０００）：２８３−２９３）に従った。すなわち、神経幹細胞が自己複製して生じる１次球塊（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｐｈｅｒｅ）  形成（細胞５×１０５個／５ｍｌ／ウェル、６ウェルプレート）には、Ｅ１４．５の終脳の前半部位の細胞を用いた。１次球塊の細胞を個々の細胞に分離した時点で培地に（図２４）に図示してある量（０−１０μＭ）のｍｓｉ２  ａｓＰＮＡを添加し、２次球塊形成用プレート（細胞５００個／２００μｌ／ウェル、９６ウェルプレート）上に細胞を移し、培養した。継代の４日後に、２次球塊の数を数えた。Ｍｓｉ２の半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫細胞化学的解析に使用する細胞は、２０μＭのｍｉｓ２  ａｓＰＮＡで２４時間処理後、採集した。
【００３８】
（８）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡを添加して、または添加せずに２４時間インキュベートした細胞を収集した（１．５×１０５個）。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて単離した全ＲＮＡはＤＮａｓｅＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で処理し、第１鎖（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて合成した後、ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｔａｋａｒａ）で処理した。ＰＣＲ反応は、ｍｓｉ２（５’プライマー５’ＧＴＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡ３’および３’プライマー５’ＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＣ３’，３４０ｂｐ）およびｇ３ｐｄｈ（５’プライマー５’ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ３’および３’プライマー５’ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ３’，４５２ｂｐ）のプライマーセットを用いて、Ｅｘｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）により、変性（９４℃、４５秒間）、プライマーのアニーリング（５４℃、１分間）、およびＤＮＡ伸長反応（７２℃、２分間）を３５または３８サイクル繰り返した。鋳型ｃＤＮＡの量は、内部標準遺伝子として使用したｇ３ｐｄｈの量に従って基準化した。連続的に希釈したｃＤＮＡサンプルを、ｇ３ｐｄｈプライマーセットを用いてＰＣＲを３３サイクル繰り返して増幅した。独立に３回調整した細胞サンプルを用いて、上の実験を３回繰り返した。ＰＣＲ産物を、５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ）により染色後、ＦＭＢＩＯ  ＩＩマルチビュー（Ｔａｋａｒａ）を用いて可視化を行い、定量した。
【００３９】
ＣＮＳ幹細胞の機能に対するＭｓｉファミリーのタンパク質の関与を直接検討するためには、Ｍｕｓａｓｈｉ１，Ｍｕｓａｓｈｉ２の２遺伝子の二重ノックアウトが有意義であると考えられた。こうした目的のために、ｍｓｉ２遺伝子に特異的なアンチセンス化合物を、ｍｓｉ１−／−胚または同腹仔から調製したＣＮＳ幹細胞培養に添加し、得られたニューロスフェアの数を測定した。ｍｓｉ２の翻訳開始領域またはコード領域（１６または１７ｍｅｒ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＮＡとして合成した（ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡ）。ＰＮＡは同形のペプチドを骨格とする新しいタイプのＤＮＡ構造類似体であり、このため、標的ＤＮＡおよびＲＮＡへの配列特異性が高く、プロテア−ゼおよびヌクレアーゼに対して安定性が高く、さらに細胞毒性が低くなっている。胎仔前脳に由来する培養細胞にｍｓｉ２  ａｓＰＮＡを投与すると、Ｍｓｉ２抗体に関する半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析および免疫細胞化学的検出により示されたように（図２２、２３）、転写産物およびタンパク質の両者のレベルでｍｓｉ２発現の特異的かつ著明な低下が生じた。ｍｓｉ１−／−培養細胞において、ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの存在下でニューロスフェア形成アッセイを行ったところ、ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの用量に相関して、ニューロスフェア形成の激しい減少が明らかに認められた（図２４）。これとは反対に、野生型培養細胞では、ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの存在下でも正常にニューロスフェアが形成されたことから、野生型のＣＮＳ幹細胞のニューロスフェア形成能と生存能力は、少なくとも一定濃度のｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの存在下においてｍｓｉ２単独での抑制には影響されないという知見が確立された。全ての知見を考え合わせれば、Ｍｓｉ１およびＭｓｉ２の両者は、胚ＣＮＳ幹細胞の増殖および／または維持に重要な機能を果たしている。こうした機能は、これらの２遺伝子に割り当てられていると考えられる。一方、生後のＣＮＳ幹細胞では、これらの機能はＭｓｉ２よりも、むしろ主としてＭｓｉ１によって遂行されるものと考えられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によりムサシ蛋白質の新たな機能が解明された。すなわち、ムサシ蛋白質はニューロン分化調節機を有するＮｕｍｂタンパク質の発現を抑制し、またＮｏｔｃｈ情報伝達系の活性を増強するので各種中枢神経系疾患の治療薬として利用でき、さらに神経幹細胞の増殖活性増強剤としても利用できる。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】完全長Ｍｓｉ１タンパク質と細菌で発現させた融合Ｍｓｉ１タンパク質Ｍｓｉ１−２ＴＲ（Ｍｓｉ１が結合する至適ＲＮＡ配列の選択に使用したもの）のドメイン構造の略図である。
【図２】Ｍｓｉ１−２ＴＲタンパク質と結合ＲＮＡの結合を示す図である。
【図３】各選択過程において、用いた総ＲＮＡ中における結合ＲＮＡの割合を放射能活性を指標に示した図である。
【図４】Ｍｓｉ１選択によるＲＮＡの配列を示す図である。
【図５】Ｍｓｉ１で選択されたＲＮＡ配列の代表的な二次構造を示す図である。（影をつけた部分が選択配列を示す。）
【図６】Ｍｓｉ１タンパク質のゲルシフト法による分析（Ａ）［０  ｆｍｏｌ（レーン１，６，１１）、１  ｆｍｏｌ（レーン２，７，１２）、１０  ｆｍｏｌ（レーン３，８，１３）、１００  ｆｍｏｌ（レーン４，９，１４）、１０００  ｆｍｏｌ（レーン５，１０，１５）］及び非標識ＲＮＡを用いた競合ＲＮＡ結合試験（Ｂ）［４ｆｍｏｌの標識ＲＮＡを単独で（レーン１６，２１，２６，３１）、また、１０  ｆｍｏｌのＭｓｉ１−２ＴＲタンパク質および、０  ｆｍｏｌ（レーン１７，２２，２７，３２）、４０  ｆｍｏｌ（レーン１８，２３，２８，３３）、４００  ｆｍｏｌ（レーン１９，２４，２９，３４）、４０００  ｆｍｏｌ（レーン２０，２５，３０，３５）の非標識ＲＮＡとともに保温］を示す。
【図７】ｎｕｍｂ遺伝子の構造を示す図である。（矢印は（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで個別に転写される領域を示す。縦方向の楔印は、Ｍｓｉ１結合配列と考えられる配列（ＵＡＧＧＵＡＧＵＡＧＵＵＵＵＡ）を含む領域を示す。
【図８】ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに由来するさまざまな転写産物に対するＭｓｉ１タンパク質との結合試験を示す。Ｎ１とＮ３は、ｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のＲＮＡ。（−）はビオチンで標識したＲＮＡを含まないレーン。右側の写真の長方形の部分は、１回の試験で得られる総タンパク質量を示す。
【図９】Ｍｓｉ１融合タンパク質の略図である。Ｆは完全長のマウスＭｓｉ１を、ＲはＲＮＡ結合ドメインが２個並列した領域を含む短縮型タンパク質（Ｍｓｉ１−２ＴＲ）を、ＣはマウスＭｓｉ１のＣ末端部分を含む短縮型タンパク質を示す。
【図１０】完全長のＭｓｉ１タンパク質（Ｆ）及び短縮型Ｍｓｉ１−２ＴＲタンパク質（Ｒ、ＳＥＬＥＸに使用）と、選択Ｍｓｉ１結合配列を含むＮ２ＲＮＡとの結合を示す図である。
【図１１】Ｍｓｉ１タンパク質ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１−ＨＡＴ（Ｈ）、ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１−ＨＡＴ（Ａ）およびＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１（Ｆ）の略図である。Ｃ末端にあるＨＡＴタグは、Ｔａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に結合させるためのアフィニティタグである。ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１−ＨＡＴは、Ｎ末端のＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸を置換したＭｓｉ１の非ＲＮＡ結合型である。
【図１２】ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＭｓｉ１タンパク質Ｈ、Ａ、Ｆの発現と、ＨＡＴタグを介したアフィニティー沈殿を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたイムノブロットで分析した結果を示す図である。
【図１３】ＲＴ−ＰＣＲとアフィニティー沈殿法を組み合わせたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡ結合試験を示す図である。ＲＴ（−）のレーンは、ＲＴ−ＰＣＲがＲＮＡ依存性であることを確認する際の対照。右のパネルは、アフィニティー樹脂と混合共存させる前の初期抽出物に由来するＲＴ産物を用いたプライマーの忠実度を確認するための増幅対照試験。レーンＨ＝ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１−ＨＡＴ、レーンＦ＝ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１、レーンＡ＝ＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１−ＨＡＴ。
【図１４】組換えアデノウイルスによるＭｓｉ１の異所的過剰発現、ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質のイムノブロットによる分析およびノーザンブロットによる分析を示す図である。
【図１５】ｍ−Ｎｕｍｂタンパク質（白いバー）とｍ−ｎｕｍｂ遺伝子のｍＲＮＡ（黒いバー）の相対量を示す図である。
【図１６】Ｍｓｉ１エフェクターとｍ−ｎｕｍｂ遺伝子の３’−ＵＴＲを含むおよびレポーターの略図である。α＝ｐｃＤＮＡ３−Ｔ７ｍｓｉ１、β＝ｐｃＤＮＡ３−Ｔ７ｍｓｉ１ｍｕｔＲ１（αとβはＣＭＶのプロモーターの制御下においた）。ａ＝ｐＧＶＰ２−ｎｕｍｂ３’−ＵＴＲ、ｂ＝ｐＧＶ−ｐ２、ｃ＝ｐＧＶＰ２−ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｎｕｍｂ３’−ＵＴＲ（ａ，ｂ，ｃは、ＳＶ４０のプロモーターの制御下においた）。
【図１７】ルシフェラーゼレポーターアッセイを示す図である。
【図１８】ノーザンＥＬＩＳＡ法で定量したレポーターｍＲＮＡの相対レベルを示す。ｍＲＮＡ上にＭｓｉ１結合部位がないＥＧＦＰの転写産物のｍＲＮＡレベルを内部対照として用いた。キメラｍＲＮＡ量とＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量の比（対照に対する％）（３回の独立した実験の平均と平均の標準誤差）で示した。
【図１９】ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の細胞質分画中のリボソーム粒子を含むＭｓｉ１タンパク質のショ糖密度勾配プロファイルを示す。曲線は、各画分のＡ２５４と４０Ｓ、６０Ｓ、８０Ｓのリボソーム粒子およびポリソームの位置を示す。下のパネルは、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いたＦＬＡＧ−Ｍｓｉ１タンパク質の免疫検出法による分析の結果を示す。
【図２０】Ｍｓｉ１発現とＮｏｔｃｈ１によるＨＥＳ１プロモーターの活性化との関係を示す。
【図２１】Ｎｕｍｂ過剰発現とＮｏｔｃｈ１によるＨＥＳ１プロモーターの活性化との関係を示す。
【図２２】ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの存在下（＋）および非存在下（−）におけるｍｓｉ２および対照ｇ３ｐｄｈ  ｍＲＮＡの判定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図２３】Ｍｓｉ２タンパク質発現に対してｍｓｉ２  ａｓＰＮＡが及ぼす作用、Ｍｓｉ２抗体に関する免疫細胞化学的シグナルで視覚化した図である。
【図２４】ｍｓｉ２  ａｓＰＮＡの存在下におけるｍｓｉ１−／−および野生型同腹仔に由来するニューロスフェアの数の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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