(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築することを特徴とする機能性オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーの製造方法。
【請求項２】
ヒストンサブユニットの混合によるキャリアーの再構築過程において、機能性オリゴヌクレオチドを共存させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
機能性オリゴヌクレオチドをＨ２ａとＨ２ｂの混合液に添加する請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
請求項２または３の方法によって得られるヒストンキャリヤーと機能性オリゴヌクレオチドとの複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、機能性オリゴヌクレオチド用のキャリアーに関する。さらに詳しくは、本発明は各種疾患の原因となる遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対して配列特異的な抑制機能を有するオリゴヌクレオチドを、安定にかつ効率よく標的細胞へ運搬する新規キャリアーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、オリゴヌクレオチドを医薬品として用いるための基礎研究が活発に展開されてきており、ようやくその可能性を具体的に探索する段階にはいってきた。実際に、試験管レベルの実験においては、オリゴヌクレオチドの対溶媒安定性や標的塩基配列の選択等に関する化学的研究、細胞株を使用したオリゴヌクレオチドの膜透過性、安定性、細胞内分布等に関する基礎的研究の成果が数多く報告されている。
【０００３】
オリゴヌクレオチドはそれ自身の安定性が低い理由ために、ヌクレアーゼなどによって生体内で分解されやすい。そこで、これを安定に効率良く目的の部位へ送達するためのキャリアーの開発は、オリゴヌクレオチドを医薬品として有効に利用するためには不可欠であり、極めて重要であると指摘されている。具体的には、キャリヤーによる機能性オリゴヌクレオチドの細胞膜透過性向上を含めた効率の良いターゲティングシステムの確立、キャリアーによる薬物オリゴヌクレオチドの安定性向上および細胞への取り込み効率の増加等が重要な課題とされている。
【０００４】
従来の技術としては、生体膜類似の脂質二分子膜構造を有する構造体であるリポソームを利用したシステムが多く見られる。例えば、リポソームにオリゴヌクレオチド薬物を封入して安定性の向上をはかると同時に、リポソームを化学修飾することにより標的細胞に対する親和性を増したという報告例がある（Ａｌａｉｎ  Ｒ．  Ｔｈｉｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｎａｔｏｌｙ  Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌｏ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，  ５６９１−５６９８  （１９９２））。
【０００５】
さらに、オリゴヌクレオチド薬物が負電荷を有することを利用し、正電荷を有する合成高分子との間で複合体を形成させることにより、標的となる細胞もしくは細胞内へ送達させることを試みた研究報告もある（Ｎａｔｕｒｅ  ２７１，  １３０−１３５  （１９７８）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２，  ４４２９−４４３２  （１９８７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３，  １４６２１−１４６２４  （１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  ３４１０−３４１４  （１９９０））。
【０００６】
一方、生体由来のタンパク質をキャリアーとして利用する試みもある。例えば、下記文献においては、キャリアーとして核タンパク質であるヒストン等を用い、それをプラスミドＤＮＡ用のキャリアーとした研究を行なっている。
【０００７】
１）Ｍａｓａｒｕ  Ｙａｍａｉｚｕｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３，  ７８２−７８４    （１９７８）．
２）Ｙａｓｕｆｕｍｉ  Ｋａｎｅｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＣＩＥＮＣＥ  ２４３，  ３７５−３７８    （１９８９）．
３）Ｍｉｒｊａｍ  Ｂｒｅｅｕｗｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｓ．  Ｇｏｌｄｆａｒｂ，  Ｃｅｌｌ  ６０，９９９−１００８  （１９９０）．
４）Ｊｉａｎ  Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５，    ４２９−４３５  （１９９４）．
文献（１）においては、ヒストンの細胞核への移行が非常にスムーズに生じることが示されており、文献（２）においては、プラスミドＤＮＡを封入したリポソームに核タンパク質を導入することにより、培養細胞への取り込みの向上をはかっている。文献（３）においては、ヒストンＨ１へチトクロムＣを導入することにより、細胞核内への取り込みの向上をはかっている。文献（４）においては、ガラクトシル化したヒストンへプラスミドＤＮＡを結合させることにより、細胞内への取り込みおよび遺伝子発現の向上について検討している。
【０００８】
真核生物において、染色体のＤＮＡはヒストンと結合し、クロマチンと呼ばれる複合体を形成している。ヒストンは通常、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、Ｈ４の５種類のサブユニットからなり、塩基性アミノ酸の比率がきわめて高いことが知られている。ヒストンが多くの正電荷を有することは、この分子の１つの主要な特徴である。そのために、ＤＮＡ等負電荷を有する物質との間で相互作用することが可能となっている。Ｈ１以外のヒストンサブユニットの一次構造は、生物種が異なっても非常によく保存されており、異種の生物のヒストンサブユニットを組み合わせてもヒストン自体は再構成されることが知られている。また、ヒストンがタンパク質の一種であるにもかかわらず、特別な酵素活性をもたないことも広く知られており、これは、機能性オリゴヌクレオチド用キャリアーとしてヒストン利用する上で有利な特徴であると考えられる。さらに、ヒストンサブユニットのＨ１とＨ２ａの一次構造中には、細胞核移行性シグナルとしての機能をもつアミノ酸配列が存在しているとの報告もある（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂ．  Ｍｏｒｅｌａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ４０４８−４０５７  （１９８７））。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
リポソームキャリヤーの場合、生体内に投与されたリポソーム自体の安定性が低いという大きな欠点がある。そこで最近では、様々な手法を用いることにより、酸化安定性、化学的安定性、生物的安定性およびコロイド化学的安定性の改良がなされており、生体内半減期の長いステルスリポソームや、抗体を表面に埋め込んで標的特異性の向上をはかったイムノリポソーム等も開発されているが、未だ実用化には至っていない。
【００１０】
合成アミノ酸キャリヤーのような正電荷を有する高分子は、高い細胞毒性を有することが以前から指摘されている（Ｂｉｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １，  １４９−１５３  （１９９０））。それと同時に、これら合成高分子が生体内へ投与される場合は、異物として認識されることにより、アナフェラキシーショック等の免疫系への影響も懸念される。
【００１１】
天然タンパク質のヒストンの利用により先の２つの問題回避は予想される。しかしながら、オリゴヌクレオチドとヒストンとの単純な混合により形成される複合体は、生体内において非常に不安定であることが知られている。後の実施例でも示されるが、両者の単純な混合により形成した複合体は、高濃度の人血清中では数十秒のオーダーで分解した。この種の複合体は、既成の親ヒストンへオリゴヌクレオチドを添加することで形成するものであり、両者は単純な静電気的相互作用により表面的に結合していると考えられる。これはこ機能性オリゴヌクレオチド用キャリアーを開発する上で解決すべき課題として残されている。
【００１２】
上述した従来技術をふまえ、本発明者らは種々の検討を行い、ヒストンサブユニットから親ヒストンが再構築される過程で機能性オリゴヌクレオチドを共存させることにより、その安定性の向上が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明の目的は、核タンパク質であるヒストンをオリゴヌクレオチド薬物用キャリアーとして使用するにあたり、オリゴヌクレオチド自身の安定性を向上させるための技術を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、鋭意研究した結果、本発明者らは特定の順序でヒストンサブユニットを混合することにより安定な機能性オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーが得られることを発見して本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、ヒストンサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築することを特徴とする機能性オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、上記方法の過程において機能性オリゴヌクレオチドを共存させて得られるヒストンキャリヤーと機能性オリゴヌクレオチドとの複合体を提供する。
【００１６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の機能性オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーの製造方法は、ヒストンサブユニットの混合順序に特徴を有する。上述したように、ヒストンはＨ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３およびＨ４の５種類のサブユニットからなっており、これらのサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築する。ただし、Ｈ２ａとＨ２ｂとの順序は逆であってもよいが、まずＨ２ａとＨ２ｂとの混合物を作成することが必要である。次いでこの混合物にＨ３、Ｈ４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加する。サブユニットの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０通りが考えられるが、ヒストンの再構築においては本発明の方法以外の順序で混合した場合には、白濁や沈殿を生じてヒストンの生成が観察されなかった。本発明のヒストンキャリアーの製造方法を図１に模式図として示す。本発明の方法により調製した再構築ヒストンが天然のヒストンと同じ立体構造をとることを円偏光二色性（ＣＤ）測定を用いて確認した。
【００１８】
本発明のヒストンキャリアーシステムを構築するために用いるヒストンサブユニットの例としては、ベーリンガーマンハイム社製のヒストンＨ１、ヒストンＨ２ａ、ヒストンＨ２ｂ  、ヒストンＨ３  、ヒストンＨ４が挙げられる。また、正しい構造のヒストンが再構築されたかの確認に用いるため、同社製のヒストンズ（構築済みヒストン）も比較のために用いた。
【００１９】
本発明の方法でヒストンキャリアーを製造するには、まず、各ヒストンサブユニットをイオン強度０．０１〜０．１、好ましくは０．０２のリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度が約５×１０−６〜１×１０−４Ｍ、好ましくは１×１０−５Ｍになるように調整する。ヒストンの再構築は、Ｈ２ａ溶液とＨ２ｂ溶液を混合した後、これに対してＨ３溶液を、それからＨ４溶液を、最後にＨ１溶液を添加する順序で行う。これらサブユニット溶液の混合に際しては、各サブユニットが等モル数になるようにあらかじめ調製する必要がある。本発明により得られる再構築されたヒストンは機能性オリゴヌクレオチドのキャリアーとして有用である。
【００２０】
また、本発明のヒストンキャリアーと機能性オリゴヌクレオチドとの複合体を製造するには、上述したヒストンキャリアー製造の過程で機能性オリゴヌクレオチドを添加する。機能性オリゴヌクレオチドの添加はＨ２ａ、Ｈ２ｂを混合した後であって、かつＨ１を添加する前に行うことが必要である。Ｈ２ａとＨ２ｂの混合物に機能性オリゴヌクレオチドを添加し、次いでＨ３、Ｈ４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加するのが最も好ましい。
【００２１】
機能性オリゴヌクレオチドとは、生体内で一定の生物学的機能を果たすべく設計されたオリゴヌクレオチドをいい、例えば、各種疾患の原因となる遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対して配列特異的な抑制機能を有するアンチセンスＤＮＡやリボヌクレオチドなどが挙げられる。本発明で使用する機能性オリゴヌクレオチドの長さは１５〜４０塩基が好ましい。これらの機能性オリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて公知の方法で合成することができる。
【００２２】
なお、一連の操作は室温付近で行う。
【００２３】
機能性オリゴヌクレオチドとして用い得るモデルオリゴヌクレオチドの合成とその標識を以下の方法により行った。
【００２４】
［モデルオリゴヌクレオチドの合成］
図２に示した配列のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製タイプ３８０Ｂまたはタイプ３９２）を用いて合成した。アミダイト試薬には、全て、ミリポア社のものを用いた。図２ではアデノシンンヌクレオチドをＡ、グアノシンンヌクレオチドをＧ、シチジンヌクレオチドをＣ、ウリジンヌクレオチドをＵと記載している。これらは、２’ー水酸基の保護基としてｔーブチルジメチルシリル基を用いたホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１７７０５９−７０７１  （１９８９））により合成した。
【００２５】
これは、３２塩基からなるリボヌクレオチド（Ｒ３２）であり、部分的に特異な立体構造を形成することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３７２，  ６８−７４  （１９９４））。また、オリゴヌクレオチドの精製は文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．１９，  ５１２５−５１３０（１９９１））に記載された方法に従った。
【００２６】
［オリゴヌクレオチドの標識］
オリゴヌクレオチドの標識は、オリゴヌクレオチド（１．８３ＯＤ２６０ユニット，５ｐｍｏｌ）２７．３μｌ、オートクレーブした精製水１５．７μｌ、１０×キナーゼ緩衝液（２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＤＴＴ、Ｔ４ポリヌクレアーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、γー３２ＰーＡＴＰ１μｌを混合後、３７℃にて１時間反応させて行った。オリゴヌクレオチドへの３２Ｐのラベルには宝酒造株式会社のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼキット（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ２０３０）を用いた。
【００２７】
【実施例】
実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００２８】
【００２９】
実施例１：ヒストンキャリアーおよびヒストン複合体の調製
５種類のヒストンサブユニットをイオン強度０．０２のリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度が１×１０−５Ｍ／Ｌになるように調整する。各サブユニットおよびオリゴヌクレオチド溶液（約５ｐｍｏｌ／μｌ）を図３に示すように、様々な順序で混合した。
【００３０】
得られる生成物の白濁、沈殿生成を３６０ｎｍにおける吸光度測定により分光学的に行った。
【００３１】
吸光度測定の結果を図３に示す。横軸はヒストンサブユニットの混合順序を、縦軸はその混合における２８０ｎｍの吸光度すなわち系の濁りを示す。サブユニットの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０通りが考えられるが、ヒストンの再構築において、Ｈ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１以外の順序で混合した場合、その系は白濁した。これに対し、先の規則性を基に混合した場合、その系においては白濁、沈殿物の生成は全く観測されなかった。また、上記濃度のオリゴヌクレオチドをＨ２ａとＨ２ｂの混合溶液に添加後、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１の順で各サブユニットを混合することによりヒストンキャリヤーとオリゴヌクレオチドとの複合体（オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体）の調製を行ったが、その系においても白濁、沈殿物の生成は観測されなかった。これらの結果から、本発明の規則的な順序による混合により再構築ヒストンが得られることが示され、同時にそのオリゴヌクレオチド薬物用キャリアーシステムとしての利用の可能性が示された。
【００３２】
【００３３】
実施例２：円偏向二色性（ＣＤ）測定
溶液中のヒストンタンパク質の立体構造はＣＤ測定により検討した。ＣＤ測定装置には日本分光工業株式会社のＪー７２０型を、セルには光路長１ｍｍの円筒型セルを用い、２５℃の条件で２００〜２５０ｎｍの波長領域において４回のスキャンを行い、ＣＤスペクトルを求めた。
【００３４】
αーヘリックス等の二次構造の含量は、Ｙａｈｎらの参照スペクトルを使ったＣＤスペクトルのカーブ・フィッティッング法により求めた。
【００３５】
図４は、市販の構築済みヒストン（ａ）、実施例１により調製した本発明のＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順序で再構築された再構築ヒストン（ｂ）、実施例１により調製したモデルオリゴヌクレオチド薬物のＲ３２を共存させた再構築ヒストンすなわちオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体（ｃ）のＣＤスペクトルを示す。３つのＣＤスペクトルは、この測定装置の精度内で完全に一致した。この結果から、再構築ヒストンの立体構造は、構築済みヒストンのそれと少なくとも二次構造レベルで同じ立体構造であることが示された。さらに、オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体は、オリゴヌクレオチドを含まない再構築ヒストンと同じ立体構造をとることも示された。この結果は、再構築ヒストンが構築済みヒストンすなわち天然ヒストンと似た生理活性機能を持つことを示唆するものである。
【００３６】
【００３７】
実施例３：オリゴヌクレオチドの安定性
再構築ヒストンをキャリアーシステムとして利用した際の、オリゴヌクレオチドの安定性への効果に関する検討は、以下の方法によりヒト血清中で評価した。
【００３８】
まず、３２Ｐで標識したＲ３２を実施例１に記載した方法で共存させてヒストンキャリヤ−を再構築した。次に、再構築ヒストン溶液の適当量を最終的に９０％のヒト血清濃度になるように添加し、調製した。この溶液は３７℃でインキュベート後、適時適量のサンプリングを行った。
【００３９】
また、再構築ヒストンからのオリゴヌクレオチドＲ３２の遊離は次の操作により行った。ヒストンサブユニットは透過せず、Ｒ３２のみを透過する分画能を有する限外ろ過用チューブ（日本ミリポアリミテッド製ウルトラフリーＣ３ーＧＣＵＦＣ３ＴＧＣ００）に、あらかじめ３２Ｐ−ＡＴＰで標識したＲ３２を薬物モデルとしたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体溶液の適量を添加した。そして、その溶液に対して終濃度が７．２Ｍ以上になるように塩酸グアニジン（和光純薬工業株式会社  ０７５−２４３１）溶液を添加した後、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。この時、塩酸グアニジンの添加によりＲ３２が遊離し、結果としてヒストンから遊離したＲ３２のみがろ過される。ろ過したサンプル液は分析するまでー８０℃にて保存した。分析時には、それらサンプルを室温にて溶解後、それを２０％のポリアクリルアミドにアプライして電気泳動した。そして、フジ写真フィルム社製のバイオイメージングアナライザＢＡＳ２０００により残存Ｒ３２を定量し、これから未分解のＲ３２の量を算出した。これらの検討結果を図５に示す。
【００４０】
最終濃度９０％のヒト血清中において、Ｒ３２は非常に短い時間で分解した。また、ヒストンに共存させていないＲ３２は、やはり、非常に短い時間で分解した。構築済みヒストンもしくは再構築ヒストンの溶液に対して、後からＲ３２の溶液を添加して形成させた場合、Ｒ３２は、それら表面へ単純にイオン結合していた可能性の高いことが予想される。
【００４１】
これに対し、ヒストン再構築時にＲ３２を共存させたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体におけるＲ３２の分解は、高濃度のヒト血清中でも全く観測されず、その様子は２４時間後まで続いた。これは、ヒストンに共存したオリゴヌクレオチドが外部からの影響（例えばリボヌクレアーゼによる分解等）を受けにくくなったためと考えられる。
【００４２】
この結果から、本発明のタンパク質性ヒストンキャリアーシステムは、オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成できるばかりでなく、生体内におけるオリゴヌクレオチドの安定化にも大きく寄与することが明らかとなった。
【００４３】
【発明の効果】
以上、詳しく説明した通り、本発明により、均一状態でオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成し、しかも複合体を形成したオリゴヌクレオチドを外部条件から保護することが可能となる新規のオリゴヌクレオチド薬物キャリアーシステムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】サブユニットの混合によるヒストン再構築の概念図である。
【図２】モデル薬物として用いたオリゴヌクレオチドの二次構造である。
【図３】吸光度測定図である。
【図４】円偏向二色性スペクトルである。
【図５】オリゴヌクレオチドの安定性試験の結果図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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