(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材を、貫通孔を生じるために、網目状の骨格を有しその骨格上に突起物が配された支持体を用いて作製する工程、
ｂ）該基材に皮膚由来の細胞を播種培養する工程および
ｃ）培養皮膚が適用される前に該支持体により貫通孔が設けられる工程
からなり、工程ａ）およびｂ）は同時に行ってもよい培養皮膚の製造法。
【請求項２】
工程ｂ）が該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養する工程、該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工程または該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工程である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
工程ｃ）が前記支持体を取除くことにより成し遂げられる請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
前記支持体が、剥離シートとともに使用される請求項１、２または３記載の製造法。
【請求項５】
コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項１、２、３または４記載の製造法。
【請求項６】
培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含んでなる請求項１、２、３、４または５記載の製造法。 
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は培養皮膚およびその製造法に関する。さらに詳しくは、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損組織を早期に再建させるまたは治療するための培養皮膚用基材、培養皮膚およびそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より浅達性II度熱傷など真皮の浅い部分に達する皮膚欠損創の治療としては創傷被覆材の適用あるいは軟膏塗布ガーゼなどを適用するのが一般的に行われてきた治療である。しかしながら、深達性II度熱傷、III度熱傷あるいはII度以上の褥瘡など真皮の深い部分に達する皮膚欠損を負ったばあい、自己の表皮細胞増殖による皮膚組織の再建は期待できない。そこで、まず壊死組織あるいは不良肉芽組織を切除し、同種皮膚または創傷被覆材などを適用して良好な肉芽組織を再建したのち、自家分層植皮を行うことにより皮膚を再建するという治療が行われてきた。しかし、自家分層植皮を行うばあいには、自己の健全な部位から採皮するが、採皮した部位には傷跡が残るという整容についての問題が生じる。また患部が広範囲であるばあいには、自家分層植皮が困難である。
【０００３】
この問題を解決するために、わずかな皮膚片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取し、フラスコ中で大量培養する技術が開発され、これらの培養細胞を用いた種々の培養皮膚が開発されてきている。
【０００４】
ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅｅｎ）、ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）らが開発した培養表皮は、切手大の皮膚を採取し、表皮細胞をフラスコ中で大量培養して表皮シートをうるものであるが、該シートをフラスコから剥離する際の酵素処理によって最も重要な細胞である基底細胞が損傷を受けるために自家移植において生着率が低いという問題点が指摘されている（黒柳能光、生体材料９巻、１９９１年２月号参照）。
【０００５】
またユージーン・ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１１巻、１０５２〜１０５４頁、１９８１年参照）は、皮膚から分離、採取した表皮細胞および線維芽細胞を各々フラスコ中で大量に培養し、線維芽細胞を組み込んだコラーゲンゲル上に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発した。しかしコラーゲンゲルは、細胞培養中に極端に収縮するのが欠点であった。
【０００６】
さらに、スティーブン・ボイス（Ｓ．Ｂｏｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３巻、４２１〜４３１頁、１９８８年４月号参照）は、皮膚からえられる表皮細胞をフラスコ中で大量に培養し、コラーゲンにコンドロイチン−６−硫酸を少量添加してスポンジ状にした基材上に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発した。
【０００７】
また、アテロコラーゲンを基材として有する培養皮膚が、特開昭６２−２４６３７１号公報および特開平第４−３３２５６１号公報に記載されている。特開昭６２−２４６３７１号公報には、アテロコラーゲンシートを基材とする培養皮膚が記載されているが、シートに貫通孔がないので、適用創面からもたらされる細胞増殖などに欠かすことのできない栄養分がシートを透過してシート上の表皮細胞にまで供給され難いために自家移植においては、表皮の生着率が低いという問題があった。
【０００８】
また、線維芽細胞のみを組み込んだ培養皮膚を作製したばあいにおいても、やはり適用創面からもたらされる栄養分が培養皮膚基材全体へ供給され難いために線維芽細胞の増殖と代謝が不活発となること、生理活性物質の放出が円滑になされなくなることなどのために皮膚の再建または良性肉芽の形成に支障をきたすことがある。
【０００９】
さらに貫通孔がないことで、適用部に浸出液が過度に貯留し、この排出が適度になされず感染の温床となるという問題もあった。
【００１０】
特開平第４−３３２５６１号公報には、前記のような問題点を解決するために貫通孔を設けたアテロコラーゲンスポンジが記載されているが、貫通孔を設けると細胞を播種する際に細胞が落下逸脱してしまうので、これを防ぐために細胞播種前にあらかじめアテロコラーゲンゲルなどでスポンジをコーティングすることを必須としたものであり、こうした方法は、煩雑であるばかりでなくコストの高い培養皮膚となってしまうという問題がある。そのため、より安価で簡便な代替品または手法の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従来からコラーゲンを基材として用いた培養皮膚において課題とされていた点は、
１．細胞の培養中における培養皮膚の収縮、
２．皮膚欠損組織に適用後に、培養皮膚基材がバリアーとなり、適用創面から培養皮膚全体への栄養供給が円滑にいかないこと、
３．皮膚欠損組織への適用後に、培養皮膚適用部に浸出液が過度に貯留すること、および
４．前記２および３を防ぐために基材に貫通孔を設けたばあい、細胞播種時に細胞が落下逸脱してしまうことであった。
【００１２】
本発明はかかる１〜４の課題を解消するためになされたものであり、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚潰瘍など皮膚欠損創に用いて、皮膚欠損組織を早期に再建させるまたは治療するための培養皮膚を提供することを目的とする。さらに詳しくは、適用創面から培養皮膚の細胞への栄養分供給および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうる機能を有し、しかも同時に収縮をおさえて安価に作製しうる培養皮膚を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、培養皮膚用コラーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱の防止を目的とした処理を必要としない手段で、培養皮膚を適用する時点では貫通孔を設けられていることによって、培養皮膚に播種された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうると同時に収縮をおさえた培養皮膚を提供することである。
【００１４】
したがって本発明は、
ａ）コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材に貫通孔を生じるための突起物を有する手段内で作製する工程、
ｂ）該基材に皮膚由来の細胞を播種培養する工程および
ｃ）培養皮膚が適用される前に突起物を有する手段により貫通孔が設けられる工程
からなり、工程ａ）およびｂ）は同時に行ってもよい培養皮膚の製造法、
突起物を有する手段により培養皮膚が適用される前に貫通孔が設けられる、コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材の製造法に関する。
【００１５】
前記製造法において好ましくは、工程ｂ）が該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種する工程、該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工程または該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工程であり、工程ｃ）が該突起物を取除くことにより成し遂げられ、突起物を有する手段が突起物を有する支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲンはアテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含んでなる。
【００１６】
さらに本発明は、
中空の貫通孔を有するコラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材ならびに
中空の貫通孔を有するコラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材および線維芽細胞、表皮細胞またはこれらの組合せである皮膚由来の細胞からなる培養皮膚に関する。
【００１７】
本発明においては、突起物を有する手段として、けんざんのようなもので、培養皮膚用基材作製後に貫通孔を設けることもできるが好ましくは、中空の貫通孔が突起物を有する手段により設けられ、突起物を有する手段が配された、該突起物を取除くことにより生じる中空の貫通孔を有し、突起物を有する手段が突起物を有する支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲンがアテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含んでなる。
【００１８】
【実施例】
本明細書において「中空」という語は、ゲルなどを含まない状態、たとえば前記突起物が取除かれた状態などを意味する。
【００１９】
本願発明の培養皮膚用基材には、コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、ポリグリコール酸、コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸などのムコ多糖類などを用いることができ、前記コラーゲンは、たとえばアテロコラーゲンなどのように生体適合性に優れたものであることが好ましい。
【００２０】
本発明に用いられるコラーゲンスポンジは、酸性に調製したコラーゲン溶液をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることにより充分に気泡を含ませたものを突起物を有する手段、すなわち突起物を有する支持体を設置したプラスチックなどの容器もしくは突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する支持体ないし容器に流し込み、アンモニアガス雰囲気中に静置してゲル化させたのち凍結乾燥を行い、ついで紫外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入することにより作製することができる。
【００２１】
本発明においてコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられる。ゲル化はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に応じて数分〜２時間程度行い、こののち、凍結乾燥を行う。
【００２２】
架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよい。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲンスポンジの大きさは患部の大きさにあわせて適宜選択される。また、コラーゲンスポンジの厚さおよび形状は適用される患部の状態によって変化するが、厚さ０．２〜３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、球状、紡錘状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
【００２３】
本発明に用いられるコラーゲンシートは、コラーゲン溶液を前記スポンジ作製と同様の容器に入れ、乾燥機の中で風乾してシートを形成させたのち、紫外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入することにより作製することができる。
【００２４】
前記コラーゲンシート作製に用いられるコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられる。
【００２５】
架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよい。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲンシートの大きさおよび厚さは患部の状態にあわせて適宜選択される。
【００２６】
本発明に用いられるコラーゲンゲルは、コラーゲン溶液を前記スポンジを作製するのと同様の容器に流し込み、熱をかけるかあるいはアンモニアガス雰囲気中に放置してゲル化させることにより作製することができる。
【００２７】
前記コラーゲンゲルを作製するのに用いられるコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とし、ゲル化はアンモニアなどのアルカリ性ガス雰囲気下で必要に応じて数分〜２時間行う。ゲル化後、緩衝液などでよくすすぐ。または、コラーゲンの中性溶液（ｐＨ６．５〜８）をゲル化させるばあい濃度０．１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは０．２〜０．５ｗ／ｖ％でアルカリ性ガスなどは用いずに３６〜４０℃（度）に静置してゲルをうる。
【００２８】
架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよい。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲンゲルの大きさは患部の大きさに合わせて適宜選択される。また、コラーゲンゲルの厚さおよび形状は適用される患部の状態によって適宜選択されればよいが、厚さ０．２〜３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、紡錘状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
【００２９】
本発明の培養皮膚は、培養皮膚の収縮を抑え同時に適用創面から培養皮膚に播種された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうるよう突起物を配して貫通孔が設けられるように作製されるが、該貫通孔を設ける手段は、たとえばゲルによる被覆のように細胞播種時の細胞の落下逸脱を目的とした特定の前処理などを必要としないものである。
【００３０】
このような培養皮膚の収縮を抑え同時に貫通孔を設ける手段としては、基材を作製する際に用いられ、培養皮膚適用前に除去される、突起物を有する支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する支持体ないし容器などがあげられる。
【００３１】
支持体は、好ましくは網目状の骨格を有し、その骨格上に突起物が配されるものである。
【００３２】
前記支持体の骨格となる網目の形状はたとえば多角形、円形、楕円形などでよいがとくに限定されず、また必ずしも全体にわたって同一の形状である必要はない。また空隙の大きさも適宜変化してよいが、支持体の面積の少なくとも１／２以上を有して、均斉にあることが好ましい。網目が交差する各部位のあいだの距離は５〜３０ｍｍ、好ましくは７〜２０ｍｍとするとよい。支持体の厚さは破損しない程度に薄い方が好ましい。
【００３３】
突起物の形状、数、大きさもとくには限定されないが、作製および取扱い操作において簡便であるものがよい。突起物の高さは、えられる基材の厚さ以上であればよく、また搾設される面積が、０．００３〜０．２５ｃｍ2／ｃｍ2、好ましくは０．０１〜０．１２ｃｍ2／ｃｍ2を満たす太さまたは形状を有する。具体的には、円柱形、円錐形、多角柱形、多角錐形などのものが好適に用いられる。なお、これらの形状の先端は丸みを帯びていてもよい。
【００３４】
また、培養皮膚基材の片面および／または内部に細胞が播種、培養増殖されるばあい、支持体の骨格は網目などの空隙を含まない平板でよく、支持体は該平板の少なくとも片面に突起物が配されたものである。
【００３５】
一方、ここで培養皮膚作製に用いる容器は、その底部に前記支持体上に配したのと同様の突起物を有する。
【００３６】
前記支持体および容器およびそれらの突起物は、たとえばプラスチック、ステンレス、アルミニウム、ガラス、セラミックなどによって作製される。支持体は、創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が支持体から容易に剥がれうるように曲げやすい材質が好ましい。
【００３７】
前記支持体および容器の骨格は貫通孔が均斉に設けられる、突起物が均斉に配される構造となるように設計されることが培養皮膚の収縮を良好に抑え、培養皮膚全体にわたって栄養分がゆきわたり、適用部よりの浸出液の排出も効率よく行われうるため好ましい。
【００３８】
さらに、前記突起物を有する支持体ないし容器は、剥離シートを伴ったものを用いてもよい。剥離シートは創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が容器から容易にはがれるように端部が折り曲げられ（図４の５参照）るような材質が好ましい。たとえばプラスチックシート、ステンレス、アルミシートなどがあげられる。
【００３９】
しかしながら、本発明の培養皮膚用基材に播種された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうる貫通孔を設けうると同時に培養皮膚の収縮を抑え、細胞播種時の細胞の落下逸脱を目的とした特定の前処理などを必要としない手段であれば、本発明の製造法に用いることができるであろうことは理解される。
【００４０】
本発明の培養皮膚用基材には、その少なくとも片面において哺乳動物皮膚由来の表皮細胞および／または線維芽細胞が播種され培養増殖される。前記表皮細胞とは、基底細胞を含む角質化細胞および表皮細胞層に通常存在するその他の細胞を意味するが、このうち培養増殖させるのは角質化細胞である。前記線維芽細胞とは、真皮中の主要な細胞であり、コラーゲンをはじめとする結合組織成分を産生し、これらの成分と結合して結合組織を形成している細胞をいう。
【００４１】
本発明の培養皮膚は、播種される細胞に応じて以下の３種類を作製することが可能である：
▲１▼本発明のコラーゲン基材の好ましくは両面、少なくとも片面に線維芽細胞のみを播種培養した培養皮膚（複合培養真皮）、
▲２▼本発明のコラーゲン基材の片面に表皮細胞を播種培養した培養皮膚（複合培養表皮）および
▲３▼本発明のコラーゲン基材の少なくとも片面で線維芽細胞を播種培養して、該基材の片面に表皮細胞を播種培養した培養皮膚（複合培養皮膚）。このばあい、先に線維芽細胞を播種培養する工程を行う方が、表皮細胞の脱落を防ぐことができるのでより好ましいが、表皮細胞をまず播種培養増殖させたのち、線維芽細胞を播種培養する工程で行うこともできる。
【００４２】
前記の３種類の培養皮膚は、患部の面積、深さおよび患者の症状などによって適宜使い分けることでより効果が発揮される。また、これらの培養皮膚を自家、他家で適宜使い分けることもできる。
【００４３】
前記表皮細胞は以下の手順で調製される。清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および、真皮の一部または真皮全層）を消毒し、抗生物質を含有する生理食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ′ｓ）液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度を１０００Ｕ／ｍｌに調製したダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）（以下、「ディスパーゼ溶液」という）に浸漬したのち表皮と真皮に分離する。えられた表皮をトリプシン濃度０．２５ｗ／ｖ％、エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）濃度０．００５ｍＭ／ｍＬに調製したハンクス液（以下、「トリプシン溶液」という）中、３７℃で約１５分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（以下、「ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という）などの培地中に移し、振とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、５分間、遠心分離して採取させることによってうることができる。えられた表皮細胞は、たとえばグリーン（Ｇｒｅｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３培地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表皮細胞懸濁液とする。  前記グリーン培地とはＤＭＥＭとＨａｍ′ｓ  Ｆ−１２を３：１に混合し、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨードチロニン（０．００１３μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．０１μｇ／ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍＬ）、表皮増殖因子（０．０１μｇ／ｍＬ）と抗生物質を添加し、１０％ＦＣＳを含んでなる表皮細胞増殖培地である（セル（Ｃｅｌｌ）、４０巻、６７７〜６８３頁、１９８５年３月参照）。
【００４４】
前記表皮細胞を高効率で増殖させるには、たとえばマイトマインシン処理や放射線照射などによって増殖能を停止させたマウス由来の線維芽細胞である３Ｔ３細胞などを支持細胞として定着させたフラスコ中で培養を行うことが好ましい。
【００４５】
具体的には、この３Ｔ３細胞を培養したのち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去する。ついでマイトマイシンＣ  ４μｇ／ｍＬ含有ＤＭＥＭ溶液を細胞全体が充分漬かるように（７５ｃｍ2フラスコでは、２〜４ｍＬ程度が好ましい）加え３７℃にて２時間程度静置したのち緩衝液で洗浄し、マイトマイシンＣを除去する。こうして、３Ｔ３細胞は生きたままで増殖能のみが停止せしめられる。この増殖能を有さない３Ｔ３細胞を採取して、前記グリーン培地に懸濁し、１×１０3〜５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５×１０3〜３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度になるように調製したのちフラスコへ播種する。このフラスコに前記表皮細胞を３Ｔ３細胞を播種したのちに５×１０3〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは１×１０4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にて播種する。
【００４６】
たとえば約２×２ｃｍの分層皮膚からえた前記皮膚細胞を５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃にて培養する。３Ｔ３細胞はこの培養継続中に表皮細胞がコロニーを形成する過程においてフラスコ底面より培地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去されるので、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含まれない。
【００４７】
培養増殖した表皮細胞は、ディスパーゼ溶液を加え３７℃にて約２時間静置することにより剥す。これをトリプシン溶液に加え表皮細胞を分散させたのち、採取し、グリーン培地を添加して細胞懸濁液をえる。表皮細胞は、必要に応じて継代培養する。具体的には、前記支持細胞を必要数量作製し前記したように培養増殖した表皮細胞を採取して、支持細胞に播種培養する。この際、表皮細胞が角質化しないよう注意して継代培養する。えらえた表皮細胞は、突起物を有する支持体を設置した容器内で収縮を抑えて作製された、たとえば約６×９．５ｃｍ、厚さ１ｍｍのコラーゲンスポンジ基材に、５×１０4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にて播種する。
【００４８】
表皮細胞が基材に接着したのち、グリーン培地を加えて５％のＣＯ2インキュベーター中３７℃にて３日ごとに培地を交換しながら７〜２１日間培養する。このようにして複合培養表皮がえられる。
【００４９】
前記線維芽細胞は、採取された皮膚を前記と同様に表皮と真皮に分離したのち、えられた真皮をハサミ、ホモジナイザーなどを用いて砕き、０．５ｗ／ｖ％のコラゲナーゼのＤＭＥＭ溶液（以下、「コラゲナーゼ溶液」という）に加えて、約６時間、約３７℃にて振とうして結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜約１，０００×ｇ、好ましくは約６００×ｇ〜約８００×ｇで遠心分離して採取する。えられた線維芽細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳなどを培地としてＣＯ2インキュベーター中３７℃にてサブコンフルエントとなるまで培養し、必要に応じて多くの線維芽細胞をうるように継代培養する。
【００５０】
培養した線維芽細胞をトリプシン溶液を用いてフラスコからはがし、採取して、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で調製する。この線維芽細胞懸濁液を５×１０3〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５×１０4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にてコラーゲン基材に播種する。細胞が基材に接着したのち、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて３日ごとに培地を交換しながら１〜１４日間培養を行う。このようにして複合培養真皮をうることができる。複合培養真皮は基材の少なくとも片面に線維芽細胞を培養増殖させてえられる。
【００５１】
表皮細胞および真皮細胞の両方を併せて有する複合培養皮膚は、以下のように作製される。前記した複合培養真皮の作製工程にて線維芽細胞を播種し、細胞を良好に基材に接着させたのち該基材を支持体ごと裏返し、複合培養表皮の作製における工程を行い複合培養皮膚をうる。
【００５２】
このようにしてえらえた培養皮膚は、創面に適用される前に、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ＦＣＳを除いた同様の培地に置き換えておくことが好ましい。
【００５３】
貫通孔を設けられていない基材を用いた培養皮膚では、その適用部に浸出液などが過度に貯留し、感染の温床となることがあるのに対し、本発明の基材を用いた培養皮膚においては、前記のように患部への適用前に貫通孔を設けることによって患部における浸出液の排出が良好に行われ、良好な肉芽組織を形成するうえで極めて有用である。
【００５４】
本発明の培養皮膚に用いられるヒアルロン酸は、創傷などを負ったばあいに初期の段階で細胞から産出される生理活性物質であり、患部の治癒過程において表皮細胞および線維芽細胞のいずれもがコラーゲン基材上で良好に移動する上で必要なものであるといわれている。ヒアルロン酸は細胞の足場をゆるやかにすることにより細胞を移動しやすくするという機能を果たしていると考えられている。ヒアルロン酸は、コラーゲン基材を作製する際にコラーゲンの０．１％〜５％の濃度で用いられる。
【００５５】
細胞を基材に良好に接着させるために、細胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンなどを本発明の基材に被覆しておくとさらに良好な培養皮膚がえられる。
【００５６】
以下に本発明を実施例をあげてさらに詳細に説明するが、本発明はもとよりこれら実施例に限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔が設けられたアテロコラーゲンゲルの作製
０．２ｗ／ｖ％アテロコラーゲンＤＭＥＭ溶液（ｐＨ７．４（株）高研製）２０ｍｌを、縦８ｍｍ、横８ｍｍの間隔にて長さ７ｍｍ、一辺１ｍｍの正四角柱形の突起物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目構造を有するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃｍ）を設置したプラスチックケース（６×９．５ｃｍ、高さ２．８ｃｍ）に注加し、３７℃、１時間静置してゲル化させ、ＵＶを２ｍＷ／ｃｍ2、３０分間照射して厚さ０．３ｃｍのアテロコラーゲンゲルをえた。
【００５８】
実施例２
本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔を設けた複合培養真皮（ゲル状）の作製
清潔な環境下で採取されたヒトの皮膚片（約２×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液に浸漬し、ハンクス液で洗浄後ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）を混合したハンクス液に室温、３０分間浸漬した。
【００５９】
つぎに、ディスパーゼ（合同酒精（株）製）溶液１０ｍｌに４℃にて１２時間浸漬し、ピンセットを用いて表皮と真皮に分離し、えられた真皮部分をハサミでペースト状に砕いてコラゲナーゼ溶液１０ｍｌで約６時間、３７℃にて処理して結合組織を除去したのち、約７００×ｇ、５分間の遠心分離にて線維芽細胞をえた。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ギブコ社製）＋１０％ＦＣＳを用いて５％のＣＯ2インキュベーター中３７℃にてプラスチック製培養フラスコ中で３日ごとに培地を交換しながら継代培養し、増殖させた。
【００６０】
こののち、トリプシン溶液を用いて細胞をフラスコから剥がし、５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にて実施例１で作製したアテロコラーゲンゲルに播種した。そのまま、細胞をゲルに接着させるため播種後、室温にて１２時間静置したのち前記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ１５ｍｌを加え、５％のＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて７日間、３日ごとに培地を交換しながら培養し、支持体が装着された状態にある複合培養真皮をえた。
【００６１】
本発明の複合培養真皮は、培養皮膚用コラーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱の防止を目的とした処理を必要としない手段で作製され、著明に収縮率が抑えられており、また該培養皮膚は、適用の際支持体のまま患部に貼設でき、そののち支持体を剥がすことにより貫通孔が設けられ、細胞への栄養分の供給および移植部よりの浸出液の排出が良好にできた。
【００６２】
実施例３
本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔を設けたアテロコラーゲンスポンジの作製
１ｗ／ｖ％となるよう調製したアテロコラーゲン（（株）高研製）の水溶液（塩酸でｐＨ４に調整）１００ｍｌをホモジナイザー（（株）日本精機製作所製）を用いて１分間撹拌することにより気泡をいれ、縦８ｍｍ、横８ｍｍの間隔にて長さ８ｍｍ、直径１ｍｍの円柱形の突起物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目構造を有するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃｍ）を設置したプラスチックケース底部（６×９．５ｃｍ、高さ２．３ｃｍ）に２５ｍｌ注加し、これをアンモニアガス雰囲気下に１時間静置したのち、凍結乾燥を行って厚さ約１ｍｍのアテロコラーゲンスポンジをえた。ついで、このスポンジの片面にＵＶを１ｍＷ／ｃｍ2、３０分間照射したのちプラスチックケースに入れたままエチレンオキサイドガス滅菌を行った。
【００６３】
実施例４
本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔を設けた複合培養皮膚（スポンジ状）の作製
表皮細胞は、清潔な環境下にて採取されたヒトの皮膚（約２×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）から実施例２に記載したのと同様に分離した表皮を、トリプシン溶液１０ｍｌに移し、この中で１５分間、３７℃にて処理したのち実施例２で用いたものと同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に移し、振とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させることによって集め、前記の組成よりなるグリーン培地に懸濁した。表皮細胞を高効率で増殖させるために、以下の支持細胞を用いた。マウス由来線維芽細胞である３Ｔ３細胞は前記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、サブコンフルエントとなるまで５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて培養した。ついで、培地を除去してハンクス液ですすぎ、実施例２と同様のＤＭＥＭを加えて最終濃度が０．０００４％になるようにマイトマイシンＣ（和光純薬工業（株）製）含有生理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。このフラスコを３７℃で２時間静置したのち、ハンクス液を用いて洗浄してマイトマイシンＣを除き、増殖能が停止した３Ｔ３細胞を採取した。えられた細胞を、グリーン培地に懸濁し、計数後２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度となるよう調製してフラスコに播種した。
【００６４】
このようにして調製した３Ｔ３細胞を播種した翌日、前記表皮細胞をこれに播種し、３７℃にて５％のＣＯ2インキュベーター中で培養増殖させた。
【００６５】
一方、実施例３でえられたアテロコラーゲンスポンジに実施例２と同様に線維芽細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、前記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で２日間培養した。つぎに培地を除去し、アテロコラーゲンスポンジをケース中で支持体ごと反転させ、前記で培養増殖させた表皮細胞を支持体の裏側からスポンジの裏側へ２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種した。これをクリーンベンチの中で８時間静置したのち、グリーン培地を加えて５％のＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて３日毎に培地を替えながら、１４日間培養し、複合培養皮膚をえた。
【００６６】
実施例５
ヒアルロン酸を含有する培養皮膚用基材（スポンジ状）の作製
塩酸でｐＨ３に調整した蒸留水にアテロコラーゲン（（株）高研製）１ｇを溶解したのち、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５に調整した水溶液をえた。ついでヒアルロン酸（分子量約２００万）０．０１ｇをこのアテロコラーゲン水溶液に溶かし、これにｐＨ４．５に調整した蒸留水を加えて１００ｍＬとした（アテロコラーゲン１ｗ／ｖ％、ヒアルロン酸０．０１ｗ／ｖ％溶液）。これを１分間ホモジナイズしたのち突起物を有する支持体を設置した６×９．５ｃｍ、高さ２．３ｃｍのケース底部にこのアテロコラーゲン−ヒアルロン酸水溶液２５ｍＬを流し込んだ。突起物を有する支持体において、突起物は支持体からの長さ８ｍｍ、一辺２ｍｍの正四角柱であり、相互に７ｍｍ間隔で配置されたものを用いた。これをアンモニアガス雰囲気下にて２時間静置してゲル化させ、水洗したのち、凍結乾燥を行った。
【００６７】
これに１ｍＷ／ｃｍ2でＵＶを３０分間照射した後、エチレンオキサイドガス滅菌を行ってヒアルロン酸を含有したアテロコラーゲン基材をえた。
【００６８】
えられた基材に実施例２と同様、線維芽細胞を播種し培養増殖させ、支持体より取出すことにより貫通孔を有する収縮度の小さい複合培養真皮を作製した。
【００６９】
この複合培養真皮を２×２ｃｍの全層皮膚欠損を作製したヌードマウスの背部に欠損の大きさに合わせて切り取り移植した。適用後、２週間では、適用部に浸出液の貯留は認められず、肉芽組織が良好に形成され、順調な治癒経過を示した。
【００７０】
実施例６
剥離シートを伴う突起物を有する容器を用いて貫通孔を設けた複合培養真皮の作製
底面に四角柱（一辺２ｍｍの正四角柱、高さ７ｍｍ）の突起物を配した容器を準備して、この容器（６×９．５ｃｍ）の底部上に突起物部分をくり抜いたポリエステルシートを設置した。なお、このシートには取っ手が造作されている。
【００７１】
０．２％コラーゲンＤＭＥＭ中性溶液（セルゲン（ＣＥＬＬＧＥＮ）、（株）高研製）２０ｍＬと線維芽細胞を混合し、播種密度１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように調製した。
【００７２】
この混合液を前記容器に流し込んで、ふたをして３７℃に５時間静置した。こののち、実施例２と同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、１週間培養して複合培養真皮をえた。適用の際には、ふたをとり、シートの取手部を持ち上げることにより複合培養真皮およびシートが容器から容易にはずれた。こうして貫通孔ができ、複合培養真皮もシートから簡単にはずすことが可能であった。
【００７３】
比較例１
実施例６において突起物を設置してない容器を用いて同様に実施したところ細胞を播種培養開始したのち５日目までには、コラーゲンゲルは著しく収縮し、実施例６で作製した複合培養皮膚の面積で２５％、体積で約１５％となった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、コラーゲン基材に細胞を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を目的とした前処理を必要としない手段を用いて、培養皮膚を創面に適用する前に該培養皮膚に貫通孔を設けることによって、培養増殖された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうると同時に収縮をおさえた培養皮膚を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の支持体を用いて貫通孔が設けられた複合培養皮膚の作製手順を示す図である。
【図２】本発明にしたがった突起物を有する容器および剥離シートの上面（ａ）ならびに断面（ｂ）を示す図である。
【図３】前記の容器に設置された剥離シートの上面（ａ）および断面（ｂ）を示す図である。
【図４】前記の容器に培養皮膚を完成させた横断面（ａ−ｂ）および前記の容器からはずされた培養皮膚の付いた剥離シートの断面（ａ´−ｂ´）を示す図である。
【符号の説明】
１  突起物
２  孔
３  容器
４  剥離シート
５  取手
６  培養皮膚
【図１】
0003543869.tif 000002
【図２】
0003543869.tif 000003
【図３】
0003543869.tif 000004
【図４】
0003543869.tif 000005