(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)の改変ピラノース・オキシダーゼ。
(ａ)配列番号１記載のアミノ酸配列において、542位のアミノ酸がリジンに置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(ａ)のタンパク質をコードする改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子。
(ａ)配列番号１記載のアミノ酸配列において、542位のアミノ酸がリジンに置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項２記載の改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物から改変ピラノース・オキシダーゼを採取することを特徴とする改変ピラノース・オキシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコースや１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの酵素的測定法に有用な改変ピラノース・オキシダーゼ、改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び改変ピラノース・オキシダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピラノース・オキシダーゼは、グルコースを最適基質とし、該グルコースを酸化してグルコソンを生成する反応を触媒する酵素であり、食品や体液等のグルコースの酵素的測定法に用いることができる。また、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用させることにより、糖尿病の診断用マーカーとして重要視されている１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの酵素的測定法にも用いることが可能である。
従来、コリオラス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）由来のピラノース・オキシダーゼ（特開平８−２０５８６１号公報記載）は、グルコースに対するＫｍ値が１．３７  ｍＭ、耐熱性は、５０℃程度、安定ｐＨは、ｐＨ  ４．０〜８．０であった。従って、より低いＫｍ値を示し、より高い温度に対し安定であり、より広いｐＨ安定性を有するピラノース・オキシダーゼが求められていた。また、グルコースだけでなく、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに対するＫｍ値が小さいことが期待されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、従来のものよりすぐれた改変ピラノース・オキシダーゼ及びその生産手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記目的に鑑み更に検討し、コリオラス・ベルシカラー由来のピラノース・オキシダーゼ遺伝子（特開平８−２０５８６１号公報記載）の遺伝子改変を行なった結果、Ｋｍ値、耐熱性及びｐＨ安定性が向上した改変ピラノース・オキシダーゼをコードする遺伝子、並びにＫｍ値、耐熱性及びｐＨ安定性が向上した改変ピラノース・オキシダーゼ等が得られること等を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本願の第１の発明は、以下の（ａ）の改変ピラノース・オキシダーゼであり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第２の発明は、以下の（ａ）の改変ピラノース・オキシダーゼであり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、５４２位のアミノ酸が置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第３の発明は、以下の（ａ）の改変ピラノース・オキシダーゼであり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、５４２位のアミノ酸がリジンに置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第４の発明は、下記の理化学的性質を有する改変ピラノース・オキシダーゼであり、
（１）  作用：グルコースを酸化してグルコソンにする。
（２）  基質特異性：グルコースに特異的に作用するが、ガラクトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールにも作用する。
（３）  安定ｐＨ：５０℃、３０分処理により、ｐＨ  ３．５〜１１．０
（４）  至適ｐＨ：ｐＨ  ６．５付近
（５）至適温度：約５５℃付近
（６）  温度安定性：約５５℃まで安定
本願の第５の発明は、以下の（ａ）のタンパク質をコードする改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子であり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第６の発明は、以下の（ａ）のタンパク質をコードする改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子であり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、５４２位のアミノ酸が置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第７の発明は、以下の（ａ）のタンパク質をコードする改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子であり、
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、５４２位のアミノ酸がリジンに置換されており、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質
本願の第８の発明は、上記ピラノース・オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであり、
本願の第９の発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体であり、
本願の第１０の発明は、上記形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物から改変ピラノース・オキシダーゼを採取することを特徴とする改変ピラノース・オキシダーゼの製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の改変ピラノース・オキシダーゼは、例えば、次のようにして得ることができる。
先ず、単離したコリオラス・ベルシカラーｐｓ４ａ株由来ピラノース・オキシダーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドｐＰＲＭＥ１０（特開平８−２０５８６１号公報記載）を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＭＥ１０）  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８３１）から、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（フナコシ社製）を利用することにより抽出、精製する。
なお、本発明において用いることができるベクターＤＮＡとしては、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的にはｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等が好ましい。
【０００７】
次いで、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするピラノース・オキシダーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、この組み換え体プラスミドＤＮＡに、例えば、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤やＰＣＲ法を用いてランダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去または付加し、連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【０００８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質としては、例えば、ピラノース・オキシダーゼ中のグルタミン酸残基を、他のアミノ酸残基に置換されたものが挙げられる。そして、他のアミノ酸としては、例えば、リジン等が挙げられる。その具体例としては、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列中の５４２位のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されたものが挙げられる。
配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつピラノース・オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするピラノース・オキシダーゼ遺伝子としては、例えば、ピラノース・オキシダーゼ中のグルタミン酸残基をコードする塩基を、他のアミノ酸残基をコードする塩基に置換されたものが挙げられる。そして、他のアミノ酸をコードする塩基としては、例えば、リジンをコードする塩基等が挙げられる。その具体例としては、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列中の５４２位のグルタミン酸残基をコードする塩基がリジン残基をコードする塩基に置換されたものが挙げられる。
【０００９】
上記処理後の組み換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（フナコシ社製）等を用いて精製し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。
このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ社製）等を形質転換または形質導入し、種々のピラノース・オキシダーゼ遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体を得ることができる。
そして、例えば、形質転換体の場合、得られた形質転換体（その中に種々のピラノース・オキシダーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドＤＮＡを含有している）より、耐熱性、Ｋｍ値等が向上した改変ピラノース・オキシダーゼを生産する株を得るには、次のような方法を用いることができる。
【００１０】
先ず、得られた上記形質転換体を寒天培地上で培養してコロニーを形成させ、各コロニーをフィルターにレプリカする。そのフィルターを寒天培地（誘導基質を含む）に乗せて各コロニーを培養し、組み換え体プラスミドＤＮＡに含まれる種々の改変ピラノース・オキシダーゼを誘導生産させる。そのフィルターを適当な条件で熱処理した後、ピラノース・オキシダーゼ活性を検出できるように調製したアッセイプレート上でインキュべートし、残存活性を示す変異株を選択する。選択した変異株は、野生株（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＭＥ１０））とともに液体培養し、種々のピラノース・オキシダーゼを誘導生産させ、得られた培養物に対し超音波破砕を行なう。その粗酵素抽出液を用いて、Ｋｍ値を測定し、優良なＫｍ値を示す形質転換体を選択する。
上記のようにして得た優良形質転換体の組み換え体ＤＮＡに挿入されている改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定は、例えば、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １０１，  ２０−７８，  １９８３）により行なうことができる。
【００１１】
上記のようにして得られた改変ピラノース・オキシダーゼ生産能を有する形質転換体または形質導入体、好ましくは、エッシェリシア属に属する菌株を用いて改変ピラノース・オキシダーゼを生産するには、下記のようにして行なうことができる。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するのが好ましい。上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当である。また培養は、２５〜４２℃で６〜２４時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【００１２】
培養終了後、該培養物より改変ピラノース・オキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から改変ピラノース・オキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から改変ピラノース・オキシダーゼを採取するのが好ましい。このようにして得られた粗酵素液から改変ピラノース・オキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法、等電点沈殿法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。
【００１３】
このようにして得られたピラノース・オキシダーゼの理化学的性質は、以下の通りである。
（１）  作用
グルコースを酸化してグルコソンにする。
（２）  基質特異性
グルコースに特異的に作用するが、ガラクトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールにも作用する。
（３）  安定ｐＨ
５０℃、３０分処理により、ｐＨ  ３．５〜１１．０の範囲で安定である。
（４）  至適ｐＨ
至適ｐＨは、ｐＨ  ６．５付近である。
（５）至適温度
至適温度は、約５５℃付近である。
（６）  温度安定性
約５５℃まで安定である。
（７）Ｋｍ値
グルコースに対するＫｍ値は、０．７  ｍＭ、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに対するＫｍ値は、１５  ｍＭである。
以上の理化学的性質を公知のピラノース・オキシダーゼと比較検討した結果、本酵素のように至適ｐＨが６．５付近、至適温度が５５℃付近であり、かつ５０℃、３０分の処理を行なってもｐＨ  ３．５〜１１．０の範囲で安定である酵素は知られていないことから、本酵素を新規酵素と認定した。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
（実施例１）
（１）  変異操作
先ず、コリオラス・ベルシカラーｐｓ４ａ株由来ピラノース・オキシダーゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドｐＰＲＭＥ１０（特開平８−２０５８６１号公報記載）を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＭＥ１０）  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８３１）から、ＱＩＡＧＥＮ（フナコシ社製）を用いることにより抽出、精製した。組み換え体プラスミドｐＰＲＭＥ１０を用いて、大腸菌ＸＬ１−ＲＥＤ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製；増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こし易く変異を生じ易い）をＤ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８，  ３２６−３３１，  １９７９）に従って形質転換し、形質転換株を得た。得られた形質転換株２００コロニーをＴＹ培地（１％バクト・トリプトン、０．５％バクト・イースト・エクストラクト、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０  ｍｌに植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した。培養後、この培養物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（フナコシ社製）を用いて変異の入った組み換え体プラスミドを抽出し、精製した。このプラスミドを用い、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８，  ３２６−３３１，  １９７９）に従って大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ社製）を形質転換し、変異を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。この形質転換体６０００株に対し、項目（２）に記載の方法で耐熱性及びＫｍ値向上株のスクリーニングを行なった。
【００１５】
（２）  耐熱性及びＫｍ値向上株のスクリーニング
（１）の変異操作で得られた上記形質転換体をＴＹ寒天培地上で３７℃、一晩培養してコロニーを形成させ、各コロニーをフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ；アマシャム社製）にレプリカした。そのフィルターを１  ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含むＴＹ培地寒天培地に乗せて３０℃で４時間培養し、種々の改変ピラノース・オキシダーゼを誘導生産させた。このフィルターをプラスチックバッグ中にシールし、水浴中で６５℃で３０分の熱処理を行ない、ピラノース・オキシダーゼ活性を検出できるように調製したアッセイプレート（３３  ｍＭ  グルコース、０．５  Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ、０．０１％  ジアニシジンを含む１％  寒天）にのせ、３７℃でインキュべートした。その結果、４株が残存活性を有し、茶色の呈色を示した。
得られた４つの形質転換株及び野生株（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＭＥ１０））を、各コロニー毎に２  ｍｌのＴＹ培地（１  ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む）で液体培養し、プラスミドに含まれる遺伝子を発現させ、種々のピラノース・オキシダーゼを誘導生産させた。培養後、得られた培養物に対し超音波破砕処理を行ない、その粗酵素抽出液を用いてグルコース及び１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに対するＫｍ値の測定を行なった。その結果、変異株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＯＤ−５４２Ｋ）が、グルコース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの両方に対して最もＫｍ値が小さい改変ピラノース・オキシダーゼを生産していた。
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＯＤ−５４２Ｋ）は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５９８８として寄託されている。
【００１６】
（３）  変異箇所の解析
上記の如く得られた優良変異株に含有される改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子に対し、遺伝子のどの部位が変異操作により置換されたのかを確認すべく、次のような解析を行なった。変異株大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＯＤ−５４２Ｋ）に含まれる組み換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いて精製した。該組み換え体ＤＮＡに含まれる変異を受けた改変ピラノース・オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）及び３７０ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社製）を用いて決定した。  その結果、該塩基配列をコードするアミノ酸配列を野生型ピラノース・オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１記載）と比較したところ、５４２位のグルタミン酸残基（ＧＡＧ）がリジン残基（ＡＡＧ）に置換されていた（特開平８−２０５８６１号公報、野生型ピラノース・オキシダーゼの塩基配列参照）。
【００１７】
（実施例２）
ＴＹ培地１００  ｍｌを坂口コルベンに入れて、１２１℃で１０分間殺菌した。大腸菌ＸＬ
１−Ｂｌｕｅ  （ｐＰＲＯＤ−５４２Ｋ）の保存スラントより１白金耳接種し、これを振とう機にて３７℃で１４時間振とう培養し、種培養とした。
次に１  ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む前記ＴＹ培地（殺菌条件同上）２０Ｌを含む３０Ｌ容ジャーファメンターへ、前記種培養液１００  ｍｌ接種し、回転数３００  ｒｐｍ、通気量１０  Ｌ／ｍｉｎ、３０℃で約１６時間培養した。培養終了後、ピラノース・オキシダーゼ活性を過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、０．３  Ｕ／ｍｌであった。
培養終了後、培養液４０  Ｌ（２０  Ｌ＊２回分）から限外濾過膜（ＡＨＶ−３０１０、旭化成社製）を用いて菌体を集め、水道水にて菌体を洗浄した後、菌体を約１０Ｌに濃縮した。
ステップ１（粗酵素液の調整）：上記菌体濃縮液に、５  ｇ卵白リゾチーム、０．５５  Ｍ  ＥＤＴＡ  ２Ｎａ（ｐＨ  ８．０）１  Ｌ、０．１１  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）１  Ｌを添加、混合し、３７℃で２４時間放置した後、凍結融解法にて溶菌した。溶菌液に対し、５％プロタミン水溶液（ｐＨ  ８．０）を攪拌しながら滴下して除核酸処理を行なった。この上澄液を限外濾過膜を用いて５０  ｍＭ塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．５）に対して透析、濃縮を行ない、約５００  ｍｌの粗酵素液を得た。
ステップ２（熱処理）：前記透析液（約５００ｍｌ）を湯浴中にて５０℃に加温、３０分間保持し、夾雑タンパク質を熱変性させた。熱処理後、冷却遠心分離器（日立ＣＲ２２形機）を用い、変性タンパク質を除去した。得られた上清液４９０  ｍｌについて、限外濾過膜を用いて５０  ｍＭ塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）に対する透析を行ない、約５００  ｍｌの酵素液を得た。
【００１８】
ステップ３（ＤＥＡＥ−セルロース処理）：前記処理液（約５００  ｍｌ）に、湿重量で約１  ｋｇのＤＥＡＥ−セルロースを添加、混合して、本酵素を吸着させた後、５０  ｍＭ塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）にてＤＥＡＥ−セルロースを洗浄し、次に、０．５  Ｍ塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）にて本酵素を溶出させた。得られた溶出液について、限外濾過膜を用いて５０  ｍＭ塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対する透析、濃縮を行ない、約５００  ｍｌの酵素液を得た。
ステップ４（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０  カラムクロマトグラフィー）：前記酵素液（５００ｍｌ）を、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０  のカラム（７．８×４０  ｃｍ）に吸着させ、０．２６  Ｍ  塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）にてＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０のカラムを洗浄し、次に、０．２８  Ｍ  塩化カリウムを含む１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）にて本酵素を溶出させた。
以上の精製操作により、精製純度９０％以上の酵素標品１５０  ｍｇ（約３０００  Ｕ、２０  Ｕ／ｍｇタンパク質）を得た。
【００１９】
（実施例３）
実施例２で得られた本発明の酵素について以下の事項について分析した。
（１）  力価の測定法
０．１  Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０  ｍｌ、発色液（４−アミノアンチピリン及びフェノールを各１０  ｍＭ含む０．１  Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）にパーオキシダーゼを該溶液１００  ｍｌあたり２０００  Ｕ含有させたもの）０．２  ｍｌ、１  Ｍグルコース溶液  ０．１  ｍｌ、ピラノース・オキシダーゼ溶液０．１  ｍｌ及び水１．６  ｍｌから成る全量３．０  ｍｌの酵素含有液を３７℃で反応させ、５００  ｎｍの吸光度の増加をＵ２０００  形ダブルビーム分光光度計（日立製作所製）にて測定した。
酵素活性の１単位は、３７℃、ｐＨ  ７．０において１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量と定義し、また、力価の算出は、上記の条件下で生成するキノイミン色素の分子吸光係数を５．３×１０３とし、次式に従って行なった。
酵素活性＝（△ＯＤ５００／５．３）×（３．０／０．１）×酵素の希釈率
なお、△ＯＤ５００は、単位時間（１分間）あたりの５００  ｎｍの吸光度増加量である。
【００２０】
（２）  安定ｐＨ及び至適ｐＨ範囲
安定ｐＨは、１００  ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ  ２．５〜３．５）、１００  ｍＭ酢酸ナト  リウム−酢酸緩衝液（ｐＨ  ３．５〜５．５）、１００  ｍＭメス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５〜７．０）、１００  ｍＭヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０〜８．０）、１００  ｍＭ  タプス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０〜９．０）、１００  ｍＭチェス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．０〜１０．０）、１００  ｍＭチャプス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  １０．０〜１１．０）、１００  ｍＭリン酸二カリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ  １１．０〜１２．０）、１００  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．０）、１００  ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．５〜９．０）を用い、ｐＨ  ２．５〜１２．０において、５０℃で３０分間夫々処理した後本酵素の残存活性を測定して求めた。その結果は、図１に示す通りであり、本酵素の安定ｐＨは、３．５  〜１１．０であった。
至適ｐＨは、１００  ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ  ３．５〜５．５）、１００  ｍＭメス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．５〜７．０）、１００  ｍＭヘペス−水酸化ナトリ  ウム緩衝液（ｐＨ  ７．０〜８．０）、１００  ｍＭタプス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０〜９．０）、１００  ｍＭチェス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．０〜１０．０）、１００  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０〜９．０）を用い、各ｐＨにおける本酵素の活性測定を行なって求めた。その結果は、図２に示す通りであり、本酵素の至適ｐＨは、６．５付近であった。
【００２１】
（３）  至適温度
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）１．０  ｍｌ、上記と同様の発色液０．２  ｍｌ、１  Ｍグルコース溶液０．１  ｍｌ、１．０  Ｕ／ｍｌのピラノース・オキシダーゼ溶液０．１  ｍｌ及び水１．６  ｍｌから成る全量３．０  ｍｌの酵素含有液を恒温槽を用い、各温度にて１分間反応させ、５００  ｎｍの吸光度差をＵ２０００形ダブルビーム分光光度計（日立製作所製）で測定し、酵素活性を算出した。図３より本酵素の至適温度は、約５５℃にあった。
（４）  温度安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）に酵素標品（４００  Ｕ／ｍｌ）を９：１の割合で混合し、これらの溶液を図４で示す各温度で３０分間保持した。冷却後１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５０倍希釈し、１０分間室温放置後、残存活性を測定した。図４より本酵素は、約５５℃まで安定であった。
（５）  基質特異性
上記の力価の測定法における反応液中のグルコースの代わりに表１に示した各種の糖溶液（０．１  Ｍ）用いて、本発明の酵素の基質特異性を調べた。なお、ピラノース・オキシダーゼは、反応液中に２．５  Ｕ含まれるようにした。活性は、グルコースを１００  ％としたときの相対活性で表した。表１より本酵素は、グルコースに対する特異性が高く、他にガラクトース、Ｄ−キシロース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに作用した。
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（６）  Ｋｍ値
ラインウエーバー・バークのプロットによるＫｍ値の測定を行なった。グルコースに対するＫｍ値は、０．７  ｍＭ、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに対するＫｍ値は、１５  ｍＭであった。
【００２２】
（実施例４）
本発明の酵素の反応における優位性を示すため、本酵素と野生型酵素（特開平８−２０５８６１号公報記載）の一定量を、一定量の基質と反応させ、その反応経過を経時的に追うことで両者の比較を行なった。この測定においては、生成される過酸化水素を発色試薬により発色させ、５００  ｎｍの吸光度により定量した。ここで用いる基質（グルコース及び１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール）の濃度は希薄であるため、１０〜４０分の反応で完全に分解され、ＯＤ  ５００  ｎｍは最終的に一定値に達することとなる。従って、ＯＤ  ５００  ｎｍが一定値に達するまでの時間が短ければ短いほど、その基質特異性及び酵素反応性は優れているといえる。
【００２３】
（１）グルコースに対する反応性
実施例３の（１）力価の測定法において、グルコースを０．０２７  ｍｇ、ピラノース・オキシダーゼを１  Ｕ加え、３７℃下でＯＤ  ５００  ｎｍを測定した。その結果を図５に示した。図５において、本発明の酵素が反応開始後１０分で一定値に達しているのに対し、野生型酵素は、反応開始後１５分においても一定値に達していないことがわかる。この結果は、本酵素が野生型酵素より基質特異性、基質との反応性の点で優れていることを示す。
（２）  １，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールに対する反応性
実施例３の（１）力価の測定法において、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを０．０２７  ｍｇ、ピラノース・オキシダーゼを３０  Ｕ加え、３７℃下でＯＤ  ５００  ｎｍを測定した。その結果を図６に示す。図６において、本発明の酵素が反応開始後２０分で一定値に達しているのに対し、野生型酵素は、反応開始後３０分においても一定値に達していないことがわかる。この結果は、本酵素が野生型酵素より基質特異性、基質との反応性の点で優れていることを示す。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、改変ピラノース・オキシダーゼ、特に、Ｋｍ値、耐熱性及びｐＨ安定性に優れたピラノース・オキシダーゼが効率よく製造できる。特にＫｍ値が小さいため、測定時間の短縮化、使用酵素量の低減化を図ることができ、本発明は、産業上有用である。
【００２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の安定ｐＨを示す図である。
【図２】本発明の酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明の酵素の至適温度を示す図である。
【図４】本発明の酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】本発明の酵素と野生型酵素の反応性の違いを示すため、一定量の酵素で一定量のグルコースを分解する過程を経時的に追った図である。
【図６】本発明の酵素と野生型酵素の反応性の違いを示すため、一定量の酵素で一定量の１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを分解する過程を経時的に追った図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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