(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の精製方法であって、
−  前記物質を含む材料、および磁性粒子であって該粒子を前記物質と結合させる試薬で被覆されたまたは処理された磁性粒子を第一の媒質に分配し、
−  結合反応を行わせ、該反応においては前記物質が前記粒子に結合され、そして
−  磁気プローブを前記媒質中に押し入れ、それにより前記粒子を該プローブに付着させ、そして前記プローブを前記粒子および該粒子に結合された前記物質と一緒に第二の媒質に移し、ならびに所望により、第二の媒質から分離しそして第三の媒質に移す方法であり、
−  前記プローブおよび前記粒子が媒質から移される前に、表面張力除去剤が前記媒質の少なくとも１つに、好ましくは少なくとも第一の媒質に、および最も好ましくは全ての媒質に分配されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記表面張力除去剤が界面活性剤、アルコール、タンパク質または、塩または炭化水素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記表面張力除去剤が、ディタージェントのような界面活性剤である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤の濃度が０．００１ないし０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５ないし０．１％（ｗ／ｖ）および最も好ましくは０．０１ないし０．０５％（ｗ／ｖ）である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記表面張力除去剤がタンパク質である請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質の濃度が０．１ないし１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２５ないし５％（ｗ／ｖ）および最も好ましくは０．５ないし２％（ｗ／ｖ）である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記表面張力除去剤が塩である請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
前記塩の濃度が０．１ないし１０Ｍ、好ましくは０．１ないし７Ｍである請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質または核酸材料の精製のための請求項１ないし８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
核酸材料の精製のための請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記磁性粒子の大きさが５０μｍより小さい、好ましくは０．１ないし１０μｍ、および最も好ましくは１ないし５μｍである請求項１ないし１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記磁性粒子の濃度が０．０１ないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５ないし３ｍｇ／ｍｌおよび最も好ましくは０．２ないし２ｍｇ／ｍｌである請求項１ないし１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
媒質から磁気プローブによって磁性粒子を分離する方法であって、前記粒子を分離する前に、表面張力除去剤を媒質に分配することを特徴とする方法。
【請求項１４】
液体媒質からの磁性粒子の、前記媒質中に押し入れられた磁気プローブへの付着性を向上させる方法であって、前記粒子が前記プローブに付着する前に表面張力除去剤を前記媒質中に分配することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、混合物から物質を特異的に結合する磁性粒子を使用するの生物物質の精製に関する。本発明は例えば、核酸ＤＮＡまたはＲＮＡを精製するために使用できる。
【０００２】
磁性粒子は所望の生物物質と特異的に反応する分離試薬で被覆することができる。前記粒子および結合された物質は混合物から分離され、そしてその後該物質はさらに次の操作遂行のため前記粒子から離される。現今これは、実際には磁石により粒子を混合物を含む容器の壁に対して引き寄せ、そして液体は容器から流し出されるかまたは吸い出される。その後新しい液体を容器に分配することができる。このような分離技術に対する手動装置または自動装置はまた、商業的に入手可能である（例えば、セフェロテック社（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）のオートマグプロセッサ（ＡｕｔｏＭａｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）（アメリカ合衆国）、メルクマグネティックラック（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒａｃｋ）（ドイツ、ダルムシュタット）、パーセプティブバイオシステムズ９６ウェルプレートセパレータ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）， マルチ−６セパレータ（Ｍｕｌｔｉ−６ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、ソロ−セプ  セパレータ（Ｓｏｌｏ−Ｓｅｐ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ）（アメリカ合衆国），ダイナルマグネティックパーティクルズコンセントレーターズ（Ｄｙｎａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ））。
【０００３】
旧式のＤＮＡ精製技術は濃厚な塩化セシウム勾配中における超遠心分離を必要とした。しかし、上述した磁性粒子技術もまた核酸の精製に使用されている。
【０００４】、
ＷＯ９４／１８５６５（ラブシステムズ  オイ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ＯＹ））は、磁性粒子が、垂直穴中で移動可能でかつその下端部に磁石を備えたロッドを含むプローブによって混合物から分離可能な、磁性粒子特異結合アッセイ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）のための方法および装置を提案する。前記プローブは、低位置にあるロッドとともに混合物中に押し入れられ、そこで粒子はプローブ上に収集される。次いでプローブを他の容器に移動しそしてそのロッドはその高位置に引き上げられ、そこで粒子が離される。従って、アッセイの全ての段階は液体を移動することなく別の容器で行うことができる。最後の容器では測定が実施される。
【０００５】、
ＷＯ９６／１２９５９（ラブシステムズ  オイ）は、凹状に先細にされた先端部を有する細長い本体よりなる磁性粒子移動器具を提案する。前記本体は、該本体の先端に粒子を収集するための縦方向の磁場を備えるための手段をさらに含む。前記磁場は前記粒子を放出するため除去できる。この器具は特に、大容積から粒子を収集し、そして非常に少ない容積中にそれを放出するのに使用できる。
【０００６】
発明の概括的説明
請求項１に記載された方法がいまや発明された。この発明の幾つかの好ましい態様は他の請求項において規定されている。
【０００７】
本発明によれば、精製されるべき材料は、材料のための結合試薬で被覆された磁性粒子を含む第一の媒質に、分配される。結合反応が行われ、その後該粒子は磁気プローブにより分離され、そして第二の媒質に移動され、そこで精製のために必要な所望の他の反応を行うことができる。粒子は、精製方法のより先の段階を遂行するために他の媒質を介して同様に移動することができる。粒子が容器中に移される場合、全ての容器は必要な反応媒質を前もって含むことができる。好ましくは粒子はまた第二およびその次の媒質においてプローブから放出される。
【０００８】
本発明によれば、媒質の少なくとも一つは表面張力除去剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む。これは粒子の完全な収集を促進する。
【０００９】
これらの薬剤の幾つかは、この分離されるべき物質の結合を促進することに関連して以前から使用されている。例えばＷｉｐａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）， １４０， ２０６７を参照。これらの公知の方法では、粒子は容器から他の容器へ移されず、しかし、それらは外側にある磁石によって容器の壁に保持され、同時に媒質は容器から除去される。
【００１０】
本発明は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびｍＲＮＡのような核酸を精製するために、特別に使用できる。
【００１１】
［図面の簡単な説明］
添付された図面は記載された明細書の一部となる。
図１は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェントの効果を示す。
図２は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示す。
図３は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示す。
図４は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果を示す。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は例えば細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質および、特に核酸材料の精製のために使用できる。
【００１３】
磁性粒子は好ましくは常磁性体である。粒子の大きさは通常５０μｍより小さく、好ましくは０．１ないし１０μｍ、および最も好ましくは１ないし５μｍである。粒子の濃度は例えば０．０１ないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５ないし３ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは０．２ないし２ｍｇ／ｍｌである。
【００１４】
粒子は結合試薬、例えばシリコン、レクチンによりおよび／または、オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、ストレプトアビジンまたはビオチンのような他の反応性官能性グループにより被覆されまたは処理されている。
【００１５】
粒子はまた、好ましくは、垂直方向の穴中で移動可能で、かつその下端部に磁石を備えたロッドを含むプローブを使用することによって一つの容器から他の容器へ移される。プローブは低位置あるロッドとともに混合物中に押し込まれ、それにより粒子がプローブ上に収集される。次いでプローブは他の容器に移され、そして前記ロッドが該プローブの高位置に引き上げられた時に、前記粒子が放出される。
【００１６】
様々な種類の表面張力除去化合物、特に水溶性化合物を、上記方法に使用できる。それらの例は以下のものである：
Ａ．界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅ）、例えば
−  セッケン
−  ディタージェント；アニオン性、カチオン性、非イオン性および両性イオン性化合物
Ｂ．アルコール、例えば
−  ポリエチレンおよびポリビニルアルコールおよびそれらのタンパク質等の誘導体。
Ｃ．タンパク質
Ｄ．高濃度の塩および炭化水素例えば
−  ＮａＣｌ
−  サッカロース
化合物の混合物もまた使用できる。
【００１７】
特にディタージェントような界面活性剤が好ましい。好ましいディタージェントはエトキシル化無水ソルビトールエステルである。該エステルは例えば約４ないし２０個のエチレンオキシド基を含む。
【００１８】
界面活性剤の濃度は例えば０．００１ないし０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５ないし０．１％（ｗ／ｖ）、および最も好ましくは０．０１ないし０．０５％（ｗ／ｖ）であってよい。
タンパク質の濃度は例えば０．１ないし１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２５ないし５％（ｗ／ｖ）、および最も好ましくは０．５ないし２％（ｗ／ｖ）であってよい。塩の濃度は例えば０．１ないし１０Ｍ、好ましくは０．１ないし７Ｍであってよい。
【００１９】
異なる供給源からのＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、ＰＣＲ増幅からのＤＮＡ；血液、骨髄、培養細胞からのＤＮＡ；真核生物の全ＲＮＡからのまたは動物組織、細胞および植物の粗抽出物からのｍＲＮＡ）の精製のために、核酸は磁性粒子を使用して固定化される。結合はストレプトアビジンおよびビオチンの相互作用により媒介でき、それによりストレプトアビジンで被覆された粒子およびビオチニル化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌｅｄ）ＤＮＡが使用できる。加えて、ＤＮＡは粒子の表面に吸着できる。ｍＲＮＡの結合は粒子の表面と共有結合的に共役されるオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）２５によって媒介することができる。
【００２０】
固定化の後、増幅または他の汚染物および例えばＰＣＲインヒビターから生じる反応成分のすべてを除去するように、核酸は数回洗浄される。
洗浄は洗浄緩衝液中の複合体を放出しおよび収集することにより、および新らしい洗浄緩衝液を含む他のウェルに複合体を移動することにより行われる。
【００２１】
一本鎖ＤＮＡ精製のためには固定化された二本鎖ＤＮＡは、０．１Ｍ  ＮａＯＨトとのインキュベーションにより一本鎖に変換できおよび磁性分離を使用できる。
【００２２】
ｍＲＮＡの単離には低濃度塩緩衝液を使用することにより粒子から溶出することができる。
【００２３】
精製方法は、すべての媒質が別々の容器に用意される、磁性粒子プロッセッサによって行うことができる。表面張力除去化合物は好ましくは各々の媒質に使用される。必要な容器を含む適当な使い捨てのプレート、例えば微量滴定プレートを使用することができる。一つのプレートで、幾つかの並行精製を成し遂げることができる。
【００２４】
一本鎖ＤＮＡ精製のために使用される試薬例
１．  例えば、０．１％ＢＳＡ、１５ｍＭ  ＮａＮ３ならびに、表面張力除去剤として例えば０．０２％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（登録商標Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）を含むホスフェート、トリスまたはボレート緩衝性塩水、ｐＨ７．４中の粒子懸濁液。
２．  結合および洗浄緩衝液（ＴＥＮ）：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１５ｍＭ  ＮａＮ３、ｐＨ７．５。
３．  ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１５ｍＭ  ＮａＮ３、ｐＨ７．５
４．  融解溶液：０．１Ｍ  ＮａＯＨ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ。
５．  例えば蒸留水中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１５ｍＭ  ＮａＮ３。
【００２５】
ｍＲＮＡ直接精製のために使用される試薬例
１．  例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭおよび１５ｍＭ  ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４中のオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）２５粒子懸濁液。
２．  溶菌／結合緩衝液：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＬｉＤＳ、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１５ｍＭ  ＮａＮ３、（例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）。
３．  ＬｉＤＳ（ＳＤＳ）を伴う洗浄緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＬｉＤＳ、１５ｍＭ  ＮａＮ３、（例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）。
４．  洗浄緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１５ｍＭ  ＮａＮ３。
５．  溶出溶液：２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１５ｍＭ  ＮａＮ３、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ。
６．  回復溶液：０．１Ｍ  ＮａＯＨ、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ
７．  貯蔵緩衝液オリゴ（ｄＴ）２５：２５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１５ｍＭ  ＮａＮ３。
【００２６】
ｍＲＮＡ精製のために使用される試薬例
１．  結合緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．０Ｍ  ＬｉＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  ＮａＮ３、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ。
２．  洗浄緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  ＮａＮ３、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ。
５．  溶出溶液：２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１５ｍＭ  ＮａＮ３、例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ。
【００２７】
ｍＲＮＡ単離のために使用される試薬例
１．  ４Ｍグアニジンイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０１Ｍβ−メルカプトエタノール。
【００２８】
ＤＮＡ直接精製のために使用される試薬例
１．１５ｍＭ  ＮａＮ３を含む溶菌緩衝液中の粒子懸濁液（例えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％ＳＤＳ、１％  ２−メルカプトエタノール；５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０−２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．３、０．５  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１００μｇ／ｍｌプロティナーゼＫ；１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、５００μｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）
２．  １５ｍＭ  ＮａＮ３および例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含む洗浄緩衝液
３．  １５ｍＭ  ＮａＮ３および例えば０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含む再懸濁緩衝液
【００２９】
室温における磁性粒子プロセッサによるＰＣＲ生成物の精製方法の例
試薬はプレートの次のウェルに分配される。
試薬構成の例
ウェル１  試料（ビオチニル化ＤＮＡ、ＰＣＲアンプリコン）
ウェル２  洗浄緩衝液中のストレプトアビジンで被覆された磁性粒子
ウェル３ないし５  洗浄緩衝液
ウェル６  ＮａＯＨ
ウェル７  ＴＥ緩衝液
ウェル８  蒸留水
【００３０】
工程段階の例
ウェル２  粒子の混合、洗浄および収集、それらのウェル３中への移動
ウェル３  粒子の洗浄、それらのウェル４中への移動
ウェル４  粒子の洗浄、それらのウェル１中への移動
ウェル１  試料のインキュベーション１０分、粒子のウェル４中への移動
ウェル４  粒子の洗浄、それらのウェル５中への移動
ウェル５  粒子の洗浄、それらのウェル６中への移動
ウェル６  融解溶液中でのインキュベーション５分、粒子のウェル４中への移動
ウェル４  粒子の洗浄、それらのウェル５中への移動
ウェル５  粒子の洗浄、それらのウェル７中への移動
ウェル７  粒子の濯ぎ、それらのウェル８中への移動
ウェル８  粒子の放出
【００３１】
磁性化された粒子の収集および放出段階における表面張力除去剤（ＳＴＲＡ）の効果
ストレプトアビジン被覆された磁性粒子（大きさ：サイゲン（Ｓｃｉｇｅｎ）ストレプトアビジン３μｍ；サイゲン（Ｓｃｉｇｅｎ）社；スフェロ（ＳＰＨＥＲＯＴＭ）ストレプトアビジン４−４．５μｍ、スフェロテック（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃ）社、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）  Ｍ−２８０ストレプトアビジン２．８μｍ、ダイナルＤｙｎａｌ）社）を＋３７℃で１時間、ビオチニル化アルカリホスファターゼ（カルバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），カリフォルニア州サンディエゴ）により飽和にする。飽和化された粒子は最初に結合されていないアルカリホスファターゼを除去するため洗浄され、次いで磁性粒子プロセッサの収集段階および放出段階におけるＳＴＲＡの効果を試験するのに使用した。これらの実施例の装置の設定は２０μｌから２００μｌまでに調節され、プロセッサの収容力範囲は一回の運転当り１−２４試料であった。プロセッサはポリプロペンチューブ（外側幅４．５ｍｍ）中のロッド型磁石（長さ２ｍｍ、幅３ｍｍ、軸方向に磁性化された円筒状のＮｄＦｅＢ）を利用した。
【００３２】
簡単にいえば、粒子は全ての工程が１０段階からなるように、ウェルからウェルへそれらを放出および収集することにより加工された。収集後にウェル中に残っている粒子の量はアルカリホスフォターゼアッセイにて評価した。各ウェルからの試料（１０μｍ）は空の微量滴定プレート（丸底ウェル、幅６．５ｍｍ）に移された。
【００３３】
このアッセイでは、アルカリホスファターゼ飽和化粒子（０．０１６μｇないし１μｇ粒子／１０μｌ稀釈剤）を標準として使用した。１０μｌの試料および標準を含むウェル中へジエタノールアミン（ＤＥＡ）緩衝液（ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）製）で稀釈された１００μｌ  ｐＮＰＰ基質を加えた。基質を＋３７℃で１５分間ラブシステムスｉＥＭＳインキュベータ／シェーカー中で連続的に振とうした（９００ｒｐｍ）。反応は各々のウェルに１００μｌの１Ｍ  ＮａＯＨを加えることによって停止され、そして４０５ｎｍにおける吸光度を光度計にて測定した（ラブシステム  マルティスカン（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ））。
【００３４】
残存する粒子量を一次標準曲線から決定し、そして最終的な結果は粒子の初期量（０．２ｍｇ／ウェル）の百分率として表す。
【００３５】
図１は異なる濃度におけるディタージェント（Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）の効果を示す。
表面張力除去剤が収集および放出緩衝液中に添加されなかった場合、残存する粒子（サイゲン  ストレプトアビジン）の程度は３％／ウェルを超えた。ディタージェント濃度が≧０．００１２５％の場合、粒子は効果的に収集された。
図２は収集および放出緩衝液中の塩およびサッカロースの効果を示す。これらの成分を緩衝液に添加することによって、粒子（サイゲン  ストレプトアビジン）の収集はさらに効果的である。
図３はある程度粒子（スフェロ  ストレプトアビジン）の収集段階を向上させているタンパク質（カゼイン）の効果を示す。
図４は異なる供給元の磁性粒子が使用された場合のディタージェント（Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）の効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェントの効果を示すグラフである。
【図２】図２は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示すグラフである。
【図３】図３は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示すグラフである。
【図４】図４は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果を示すグラフである。
【図１】
0003546410.tif 000002
【図２】
0003546410.tif 000003
【図３】
0003546410.tif 000004
【図４】
0003546410.tif 000005