(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相を送液するための送液ポンプと、コンビナトリアルライブラリー中の試料を高速液体クロマトグラフィーに注入するオートインジェクターと、試料中の成分を分離するためのカラムと、カラムからの溶出液を２系統の流路に分けるスプリッターと、成分を検出する検出器と、成分を分取するフラクションコレクターと、マトリックスを注入するマトリックス添加システムと、質量分析装置とからなり、検出器とフラクションコレクターはスプリッターにより分けられた一方の流路につながり、マトリックス添加システムと質量分析装置はスプリッターにより分けられた他方の流路につながっているコンビナトリアルライブラリー中の化合物の精製、分取及び同定を同時に行うシステム。
【請求項２】
高速液体クロマトグラフィーに用いられる移動相が二種の溶媒である請求項１記載のシステム。
【請求項３】
検出器は、レコーダー及び／又はインテグレータを接続した紫外可視分光光度計検出器、蛍光検出器、示差屈折率検出器又は光散乱検出器である請求項１記載のシステム。
【請求項４】
マトリックス添加システムがシリンジポンプにより送られるマトリックス液を、Ｔ字管により溶出液に添加するシステムである請求項１記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コンビナトリアルライブラリーに含まれる種々の化合物の精製、分取及び同定を同時に行うシステムに関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】
近年、コンビナトリアルケミストリーが、製薬企業を始めとする精密化学の分野で盛んに用いられるようになってきた。コンビナトリアルケミストリーとは、種々の原料や反応の組合わせにより、多様な化合物を合成し、その生理活性等を調べることにより有用な医薬品等を短期間で探索する手法である。特に医薬品開発においては、数万におよぶ化合物の中から特定の疾病に有効で安全性の高い化合物を見出さなければならないことから、コンビナトリアルケミストリーがもたらす利点は極めて大きい。
一方、高速液体クロマトグラフィーと質量分析装置を組合わせて微量試料の分離と同定を同時に行うことが行われている。この場合、イオン化を補助するためにグリセリン等のマトリクッスを添加することが必要であるが、添加したマトリクスを高速液体クロマトグラフィーの移動相と十分に混合するために、Ｔ字管の一部が同心円状の二重構造であり、内側の管の終点近くにフィルターを設けることを特徴とするＴ字管が用いられている（特開平８ー２１１０１９号）。この様な工夫により、微量試料の分離、同定は迅速に精度良く行うことができるようになりつつある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
コンビナトリアル合成された化合物を種々の薬理活性のスクリーニングに提供するためには化合物の精製及び構造確認が必須であるが、この精製、構造確認に多くの時間と労力がかかる。コンビナトリアル合成の利点を十分に生かすためには、従来の微量試料の分離、同定だけでなく、試料の精製、構造確認も迅速に行う必要がある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、移動相を送液するための送液ポンプと、コンビナトリアルライブラリー中の試料をオートインジェクターにより高速液体クロマトグラフィーに注入し、カラムで試料中の各成分に分離後、溶出液をスプリッターにより２系統の流路に分け、一方の流路は検出器を経てフラクションコレクターに達し、各成分毎に分取され、もう一方の流路はマトリックス添加システムによりマトリックス液と混合後、質量分析装置に導入することにより、コンビナトリアルライブラリー中の化合物の精製、分取及び同定を同時に行うシステムである。
【０００５】
本発明におけるコンビナトリアルライブラリーとは、コンビナトリアルケミストリー技術の構成要素の一つであり、医薬品などの候補になる化学物質のデータベースの一種である。本発明においては、コンビナトリアルライブラリー中に含まれる多くの化合物の精製、分取及び同定を同時に行うことができるが、このシステムの構築が本発明の目的である。
本発明にかかるシステムによるとコンビナトリアルライブラリー中に含まれる化合物だけでなく、薬効成分そのもの、薬効成分中の不純物若しくは分解物、代謝物、天然物や生理活性物質などの未知化合物等の精製、分取、同定を行うことができる。
本発明における高速液体クロマトグラフィーとは、通常用いられる高速液体クロマトグラフィーであり、送液ポンプ、インジェクター、カラム及び検出器等からなる。本発明において高速液体クロマトグラフィーに注入するとはオートインジェクターを用いて、本発明にかかる装置に試料を注入することである。試料注入の時間間隔、注入量は任意に定めることができる。
【０００６】
本発明におけるカラムとは、高速液体クロマトグラフィーに接続できるカラムであれば特に限定されず、分析用、分取用いずれのカラムでも使用でき、また、いわゆる順相、逆相どちらのカラムも使用できるが、その後の操作において化合物の分取量を多く得るためには分取用カラムを使用することが好ましい。
また、高速液体クロマトグラフィーに使用する移動相は一種以上を用いることができるが、コンビナトリアルライブラリー中に含まれる多くの化合物を短時間に分離するためには、２種以上の溶媒の混合比を徐々に変化させるいわゆるグラジエント法によることが好ましい。
【０００７】
本発明におけるスプリッターとは、カラムから流出した移動相を二系統の流路に分割する装置であり、二系統の流路の流量は任意に調整できる。本発明においては一方の流路は分取装置へとつながり、他の一方は質量分析系へとつながるが、両者の流量の比率は、分取装置へとつながる流路の流量を１０００とすると、質量分析計へとつながる流路の流量は０．１〜１０、好ましくは０．５〜５である。
【０００８】
本発明における検出器とは、カラムにより分離されたコンビナトリアルライブラリー中に含まれる化合物を検出するための装置であり、検出手段は紫外可視分光光度計検出器、蛍光検出器、示差屈折率検出器、光散乱検出器等いずれでもよく、予想される化合物を最も感度良く検出できる手段を適宜選択することができるが、通常は紫外可視分光光度計検出器が最も良く使用される。検出器には、通常、化合物を検出したことを記録するレコーダーが接続され、さらに、必要に応じてインテグレーターを接続してもよい。もちろんインテグレータ単独で接続することもできる。
【０００９】
本発明におけるフラクションコレクターとは、カラムにより分離された化合物を試験管等に分取するための装置である。一般にフラクションコレクターは一定時間毎に試験管等の分取管が移動することにより流出液を分取するが、本発明においては検出器により検出された成分を効率よく捕捉するために、検出器からの電気信号に連動して分取管が移動する様にコンピュータにより制御することができる。
【００１０】
本発明におけるもう一方の流路に連結されるマトリックス添加システムとは、シリンジポンプから送られるマトリックス液をＴ字管により移動相に添加する装置である。マトリックス液を移動相と十分に混合するために、Ｔ字管は特開平８ー２１１０１９号において開示されるＴ字管を使用することが好ましい。マトリックス液とは質量分析装置のＦＡＢ（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：高速原子衝撃法）イオン化法において試料のイオン化を促進するために添加するために用いられるものであり、その成分は質量分析装置の分析条件により異なるが、通常、グリセロール、ニトロベンジルアルコール、トリエタノールアミン等が用いられる。マトリックスの濃度は移動相に対して通常１〜５ｖ／ｖ％であり、好ましくは２〜３ｖ／ｖ％である。シリンジポンプの流量は、マトリックスが上記濃度になるように適宜調整されるが、通常、２μＬ／ｍｉｎである。
【００１１】
本発明における質量分析装置は、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：高速原子衝撃法）、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：エレクトロスプレーイオン化法）、ＡＰＣＩ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：大気圧化学イオン化法）、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ：マトリックス支援レーザー脱離法）などができる装置を用いることができるが、好ましくは、Ｆｒｉｔ−ＦＡＢインターフェースを装着した装置である。Ｆｒｉｔ−ＦＡＢインターフェースとは、高速液体クロマトグラフィーにより送られてきた試料をフリットと呼ばれる金属上にしみ出させ、そこにＦＡＢガスを衝突させることにより試料をイオン化するための装置である。
【００１２】
【実施例】
以下、図１に示す実施例により本発明を詳細に説明する。
１はオートインジェクターであり、高速液体クロマトグラフィーの送液ポンプ２、３が接続している。ポンプ２、３にはそれぞれ異なる移動相４、５が流れ、４、５の混合比はオートインジェクターに組込まれたコンピュータにより任意に変化させることができる。１にはコンビナトリアルライブラリーの試料溶液が収められており、任意に設定された時間間隔により、任意の液量が自動注入される。
【００１３】
オートインジェクター１は、カラム６に接続されており６はさらにスプリッター７に接続されている。７により流路は２系統に分かれ、一方の流路は検出器８に接続され、さらにフラクションコレクター９に接続される。８には、レコーダー１０、インテグレーター１１が電気的に接続されている。１０は９とも電気的に接続されており、検出器で得られた電気信号によりフラクションコレクターのサンプリング時間を制御することができる。フラクションコレクター９によりカラム６で分離されたコンビナトリアルライブラリーの化合物が分取される。
【００１４】
スプリッター７により分かれたもう一方の流路は、Ｔ字管１２に接続している。Ｔ字管には、シリンジポンプ１３が接続しており、マトリックス溶液が一定速度で移動相に混合される。Ｔ字管はさらに、質量分析装置１４に接続しており、移動相と混合したマトリックスが質量分析装置に注入される。７により分かれた２系統の流路の流量比は、（フラクションコレクターに通じる流路の流量）：（質量分析装置に通じる流路の流量）＝２９９５：５である。  実施例１において用いられた分析条件等は以下の通りである。
【００１５】
オートインジェクター：島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ
送液ポンプ：島津製作所製、ＬＣ−６ＡＤ
カラム：ＧＬサイエンス社製、イナートジル−ＰｒｅｐＯＤＳ（内径１０ｍｍ長さ２５０ｍｍ）
検出器：島津製作所製、ＳＰＤ−６Ａ（紫外可視分光光度計検出器）
インテグレータ：島津製作所製、ＣＲ−４ＡＸ
レコーダー：パントス製、ＵｎｉｃｏｒｄｅｒＵ２２８
フラクションコネクター：ギルソン製、ＦＣ２０４Ｂ
質量分析装置：ＪＥＯＬ製、ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ
【００１６】
高速液体クロマトグラフィー条件
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
カラム温度：室温
移動相Ａ：トリフルオロ酢酸：メタノール：水＝１：１００：９００
移動相Ｂ：トリフルオロ酢酸：メタノール：水＝１：９００：１００
グラジエント（移動相ＡとＢの混合比と速度）：０〜１００％（０〜２５ｍｉｎ）
注入量：３００μＬ
試料濃度：１〜１０ｍｇ／ｍＬ
移動相流量：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
質量分析インターフェイス
マトリックス：２％グリセロール
シリンジポンプ流量：２μＬ／ｍｉｎ
【００１７】
質量分析条件
イオンモード：ＦＡＢ＋
スキャンレンジ：１０〜１０００
流量：５μＬ／ｍｉｎ
スキャンスピード：１０．０ｓｅｃ
サイクリックタイム：５．７８ｓｅｃ
レゾリューション：１０００
【００１８】
フラクションコレクター条件
モード：時間（１フラクション／ｍｉｎ、１５〜３５ｍｉｎ）
【００１９】
【発明の効果】
本発明にかかるシステムにより得られた、コンビナトリアル合成された化合物（Ｃ２５Ｈ２７Ｎ３Ｏ４、［Ｍ＋Ｈ］＋＝４３４）のマスクロマトグラム、ＵＶスペクトル及びマススペクトルを図２に示す。各装置はオンラインで接続しているため、すべての操作は自動で行われ、測定時間は１試料につき４７分であった。分取された化合物の純度は９９％以上であった。
本発明にかかるシステムを利用することにより、全自動で１日あたり３０化合物の分析が可能となった。また、マススペクトルにおいて（Ｍ＋Ｈ）＋に加えて各化合物の構造特有のフラグメントイオンも同時に確認でき、より確度の高い構造情報を得ることができた。さらに、分取された化合物は高純度であるため、直ちにバイオアッセイなどのスクリーニングに供することができた。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一実施例を示すシステムの説明図である。
【図２】図２は、上からコンビナトリアル合成により得られた化合物、本発明にかかるシステムにより得られたＵＶクロマトグラム、マスクロマトグラム及びマススペクトログラムである。
【図１】
0003575663.tif 000002
【図２】
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