(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ないし９の嚢胞を有する活動性乳房グロス嚢胞性疾患（active breast gross cystic disease）を患う患者に於ける乳ガン発生のリスクを判定する方法であって、前記患者から採取された血漿中のGCDFP−15の濃度を測定する工程を有し、前記血漿中のGCDFP−15の濃度増加（increased level）が、前記患者に於ける乳ガン発生リスクの増加を示すことを特徴とする、乳ガン発生のリスクの判定方法。
【請求項２】
前記GCDFP−15の濃度増加が、血漿１ミリリットル当たり40ngのGCDFP−15以上である請求項１の方法。
【請求項３】
前記乳ガン発生のリスク増加が、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を有さない正常な対象における乳ガン発生のリスクより4.2倍高いことを特徴とする、請求項２の方法。
【請求項４】
前記乳ガン（breast cancer）が、上皮性の乳ガン（breast carcinoma）である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記患者が、過去に乳ガンの病歴のない患者である請求項１の方法。
【請求項６】
10以上の嚢胞を有する活動性乳房グロス嚢胞性疾患を患う患者に於ける乳ガン発生のリスクを判定する方法であって、前記患者から採取された血漿中のGCDFP−15の濃度を測定する工程を有し、GCDFP−15の濃度増加が、前記患者に於ける乳ガン発生リスクの増加を示すことを特徴とする、乳ガン発生のリスクの判定方法。
【請求項７】
前記GCDFP−15の濃度増加が、血漿１ミリリットル当たり40ngのGCDFP−15以上である請求項６の方法。
【請求項８】
前記乳ガン発生のリスク増加が、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を有さない正常な対象における乳ガン発生のリスクより7.1倍高いことを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項９】
前記乳ガン（breast cancer）が、上皮性の乳ガン（breast carcinoma）である、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記患者が、過去に乳ガンの病歴のない患者である請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、乳ガン（breast cancer:cancerは、ガン、悪性腫瘍の意）発生のリスクを評価する方法に関する。より詳しくは、本発明は、活動性乳房グロス嚢胞性疾患（active breast gross cystic disease）を有する患者に於ける将来の乳ガン発生のリスクを判定する方法に関する。乳ガン（breast carcinoma:carcinomaは、ガン腫、上皮性の悪性腫瘍の意）発生を予知するべく、前記患者の血漿中の糖タンパク質GCDFP−15の濃度を測定する。
発明の背景
人の乳房グロス嚢胞性疾患は、成人中年女性に於いて一般的な良性の乳房の状態である（ハーゲンセン（Haagensen）,Diseases  of  the  Breast,3rd  ed.,WB  Saunders  Publ.,pp.250−266（1986））。グロス嚢胞は、乳房の末端の小葉管単位（terminal ductal lobular units）に起こる、小嚢胞性（microcystic）アポクリン化生から進展する（ウェリングズ（Wellings）他,Hum.Path.,18:381−386（1987））。アポクリンミクロシストがマクロシストへと変化（transformation）する原因は知られていない。しかしながら、この変化がホルモンによって仲介されるものであるという証拠はある。グロス嚢胞性疾患は、先ず20歳代の女性に現れ、40−50歳代で発生率が増加し、その後、閉経期の後に於いて一つの疾患プロセスとしてほぼ消滅する（ハーゲンセン（Haagensen）,1986前出）。
乳房グロス嚢胞性疾患は、嚢胞液の吸収によって確認される。個体群として、グロス嚢胞性疾患を有する女性群は、乳ガンの発生リスクが高いということが判っている（ジョーンズ（Jones）他,Brit.J.Surg.67:669−671（1980）；ハリントン（Harrington）他;Breast,7:13−17（1980）；チアット（Ciatto）他,Eur.J.Cancer,26;555−557（1990）；バントレッド（Bundred）他,Brit.J.Cancer,64:953−955（1991）；およびボディアン（Bodian）他,Cancer Det.Prev.16:7−15（1992）参照）。乳房グロス嚢胞内の含有液について多数の成分が分析され、この含有液が独得の分泌物であることが判った。主要な成分タンパク質が同定されている（ハーゲンセン（Haagensen）他,J.Natl,Cancer Inst.,62:239−247（1979））。単量体が15キロダルトンサイズの糖タンパク質でGCDFP−15と名づけられた、前記成分タンパク質の一つが、様々な臨床状態に於いてその循環血中濃度に関するマーカータンパク質として研究されてきた（ハーゲンセン（Haagensen）他,1979,前出：ハーゲンセン（Haagensen）他,1986,前出,pp.474−500;およびハーゲンセン（Haagensen）他,ann.N.Y.Acad.Sci.,586:161−173（1990）参照）。「正常」な閉経後の女性のGCDFP−15の血中濃度は、平均で17ng/mlである。
GCDFP−15タンパク質は、そのアミノ酸構造と、その遺伝子の第７染色体上の位置について、既に十分にキャラクタライズされている（ハーゲンセン（Haagensen）他,1986,前出；およびマイアル（Myal）他,Somatic and Mol.Genetics,15:256−270（1989）参照）。GCDFP−15は、すべてのアポクリン腺（離出分泌線）細胞（正常なものと化生性のもの）と、アポクリンの特徴を有するいくつかの外分泌腺（顎下（唾液）腺と気管（major bronchi）の小唾液腺の漿液細胞）とにおける正常な構成タンパク質である（ハーゲンセン（Haagensen）他,1986,前出；マゾウジアン（Mazoujian）他,Am.J.Pathol.,110−105−112（1983）参照）。アポクリン細胞がGCDFP−15を分泌する生物学的目的はまだ解明されていない。最近のデータに依れば、乳房細胞ラインは、培地中でGCDFP−15に対して晒されるとその増殖速度が増すということが示されている（カッソーニ（Cassoni）他,Int.J.Cancer,60:216−220（1995））。このタンパク質は、事実、フィブリノーゲンに対する結合アフィニティーを有し、フィブリノーゲンに結合した状態で血液中で輸送される（ハーゲンセン（Haagensen）他,1990,前出）。しかし、これまでのところGCDFP−15のフィブリノーゲンに対する酵素的作用は判定されておらず、従って、そのフィブリノーゲンに対する結合の目的も確証されていない。
GCDFP−15の分泌が種々のホルモンによって調節されることが、イン・ヴィヴォとイン・ヴィトロとの両方で示されている（チャルボス（Chalbos）他、Cancer Res.,47:2787−2792（1987）；シマード（Simard）他,Mol.Endocrinology,3:694−702（1989）；デジャーディン（Dejardin）他,J.Mol.Endocrinology,7:105−112（1991）；およびハーゲンセン（Haagensen）他,Br.Cancer.Res.Treat.,23:77−86（1992）参照）。アンドロゲンは、T47DとZR75との両方の乳ガン細胞ラインからのGCDFP−15の排出を顕著に促進する。このアンドロゲンのGCDFP−15に対する分泌効果は、基本的なメカニズムとしてmRNA合成の増加に依るものであることが示されている（シマード（Simard）他,1989,前出）。T47D細胞とZR75細胞との間で、GCDFP−15に対する分泌効果との比較に於いて、種々のステロイドの成長効果に関して、いくつかの相違点が観察されている。ZR75細胞ラインに於いては、GCDFP−15の分泌の増加と、増殖速度の低下との間に明確な相関関係が示されている（シマード（Simard）他,1989,前出）。これは、アンドロゲンが成長を遅延させ、GCDFP−15の分泌を増加させ、エストロゲンが、成長を促進させ、GCDFP−15分泌を減少させる、という両方向で示されている。
これに対して、T47D細胞ラインの場合には、アンドロゲンがGCDFP−15分泌を促進させるが、増殖速度にははっきりとした作用を及ぼさないことが示された（ハーゲンセン（Haagensen）他,1992,前出）。プロゲスチンは、T47Dの増殖速度を低下させ、かつ、GCDFP−15分泌を促進させる。しかしながら、抗プロゲスチンであるRU486も、又、T47D細胞ラインに於ける成長を遅延させ、同時に、GCDFP−15の分泌を顕著に抑制した（ハーゲンセン（Haagensen）他,1992,前出）。従って、GCDFP−15の分泌に関して乳ガン細胞ラインに対する種々のステロイドの相互作用は複雑であるが、中心効果としては、アンドロゲンに依って調節される促進効果を有していると考えられる。
発明の要旨
本発明は、少なくとも一つの吸引された嚢胞（aspirated cyst）を有する、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を患う患者に於ける乳ガン発生リスクを判定する方法に関する。嚢胞の吸引時に於いて、血漿中のGCDFP−15の濃度が測定される。血漿中のGCDFP−15の濃度増加は、乳ガン発生のリスク増加を示す。
１ないし９の吸引された嚢胞を有し、嚢胞吸引時に於いて血漿ミリリットル当たり40ng以上の濃度のGCDFP−15を有する患者は、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を有さない正常な対象と比べて4.2倍高い乳ガン発生リスクを有する。10以上の吸引された嚢胞を有し、嚢胞吸引時に於いて血漿ミリリットル当たり40ng以上の濃度のGCDFP−15を有する患者では、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を有さない正常対象と比べて7.1倍高い乳ガン発生リスクを有する。
発明の詳細な説明
活動性乳房グロス嚢胞性疾患を有する135名の患者について、GCDFP−15産生と、乳ガン発生について研究した。これらの患者から、嚢胞吸引時に、GCDFP−15の測定のために7mlの末しょう血液サンプルが提供された。これらの患者は、いずれも、過去に於いて乳ガンを経験したものはいなかった。活動性グロス嚢胞性疾患（GCD）は、乳房嚢胞液を吸引することによって確認された。
後日の乳ガンの追跡調査（経過観察）報告を、病理報告書の写しを入手することによって確認した。各患者に対する追跡期間は、活動性GCD時に最初の血液サンプルを入手した日から、乳ガンの診断（同定）日（12名の患者）、死亡日（２名の患者）、又は最終接触の日（121名の患者）のいずれかの早い方までとして測定した。その平均追跡期間は、10.1年間であった。
この135名の患者グループから、乳房嚢胞吸引時に214の血液サンプルが提供された。その内の100名は、１サンプルを提供し、35名は２ないし７サンプルを提供した。これらの血液サンプルはGCDの吸引時に採取した。
血液サンプルを、EDTA抗凝血vacutainerチューブ内に採取し、血漿へと処理し、そして、分析時まで70℃で冷凍した。GCDFP−15の血漿濃度の分析は、二段階式RIA（two stage RIA）によって行った（ハーゲンセン（Haagensen）他,1979,前出；ハーゲンセン（Haagensen）他,1986,前出；およびハーゲンセン（Haagensen）他,Proc.Am.Assoc.Clin.Chem.,26:980（1980）参照）。簡単に説明すると、精製GCDFP−15を、Freker et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,40:849−857（1978）によって記載されているように、Iodogenを使用して125Iで放射能標識した。得られた比放射能は、約20uCi/μｇタンパク質であった。前記二段階式RIAの為に、100μｌの特異的ウサギ抗−GCDFP−15抗血清（1mg/mlのウシ血清アルブミンを含有する0.01Mのアジ化ナトリウム中にて1/5000倍に希釈）を、800μｌのアッセイ用バッファー（1mg/mlのBSAを含む0.01Mのアジ化ナトリウム）を含むアッセイチューブ内にて、50μｌの前記テスト血漿サンプルに加えた。室温で一晩、インキュベートして反応させた。次の朝、約4ngの前記標識タンパク質を含有するように希釈された前記125I  GCDFP−15の溶液を100μｌ加えた。アッセイチューブをおだやかにボルテックスし、次に、室温で４時間インキュベートした。Kynarの個体担体マトリクスに結合させたヤギ抗ウサギ抗体の１％溶液を500μｌ加えることによってこのアッセイを終了させた（ハーゲンセン（Haagensen）他,1980,前出；およびニューマン（Newman）他,Clin.Chem.,35:1743−1746（1989）参照）。アッセイチューブを10分間反応させ、次に、15分間2000rpmで遠心分離した。その上清をデカンテーションし、そのペレットを、Packard−Priasガンマ線計数器でカウントした。
０ないし5ngのGCDFP−15から阻害曲線を得た。5ngの点は、添加したカウントの約10％の値であった。この標準曲線を用いて、50μｌの血漿サンプルについて、０ないし100ng/mlのGCDFP−15の測定を行った。100ng/ml以上のGCDFP−15の血中濃度を有する血漿サンプルについては、ウマの血漿中に希釈し、そして、50μｌのアリクオットとして再びアッセイした。すべての血漿サンプルについて反復アッセイし、±２％以上の変動を有するすべての反復サンプルは、再アッセイした。このアッセイのGCDFP−15感度は±5ng/ml、アッセイ間のCVは±７％である。
データ分析の為に、血漿濃度を、三つのカテゴリー、即ち、正常なもの（40ng  GCDFP−15/ml血漿未満）、中程度に高いもの（40−49ng/ml）、そして非常に高いもの（50ng/ml以上）、に分類した。これらの範囲は、正常女性の多数のサンプルにおけるGCDFP−15血中濃度に関する過去の研究を元に経験に基づいて選択されたものである（ハーゲンセン（Haagensen）他,1986,前出；およびハーゲンセン（Haagensen）他,1990;前出を参照）。下記の表１に、GCDを患う135名の患者よりなる研究対象グループについて、吸引によって確認された乳房グロス嚢胞の総数を示す。
0003546334.tif 000002
吸引された嚢胞の総数とGCDFP−15血中濃度との関係を下記の表２に示す。患者間に於ける比較可能性を維持するために、これら患者を、そのGCDFP−15の初期値に従って分類した。吸引された嚢胞の数と、GCDFP−15血中濃度との間には、わずかな、但し統計的には有意ではない、逆関係がある。表２から理解されるように、吸引された嚢胞が一つしかない女性グループでは、その77％は、GCDFP−15血漿濃度が正常範囲内にあり、23％が高い濃度を有していた。10以上の吸引された嚢胞を有する女性グループでは、59％に於いてGCDFP−15血漿濃度は正常範囲内にあり、残りの41％においては高い濃度を有していた。
0003546334.tif 000003
前記135名の女性から成る研究対象グループの内、12名に於いて、前記追跡期間中に乳房の初期ガン腫が発生した。これらのガンの内10は、一つの血液サンプルを提供した女性グループに於いて発生し、２つは連続して（複数の）サンプルを提供した女性グループに於いて発生した。この研究の開始から、ガン腫発生までの間の経過時間は、１年以内から15年間の範囲であった。
GCDFP−15の高い血漿濃度と、乳ガン発生のリスク増加との相関関係を、下記の表３に示す。この分析の一部として、複数の血液サンプルを提供した35名の患者の追跡調査において、その最高の最新値（last−known value）に依って複数の血中濃度グループに割りふった。たとえば、ある患者は、40歳で、GCDFP−15血漿濃度が46である血液サンプルを提供し、その２年後、GCDFP−15血漿濃度が77である別の血液サンプルを提供した。最後の接触の時点ではいかなるガンもみられなかった。この患者の２年間の追跡調査では、中程度に高い血中濃度を示し、９年間の追跡調査では、非常に高い血中濃度を示した。このようにして、複数の濃度の血液を提供した前記35名の患者の内の８名が複数のカテゴリーに変更された。
0003546334.tif 000004
乳ガン発生のリスクは、複数の嚢胞吸引を受けた女性に於いては、高くなる。従って、発ガンリスクに関するデータは、患者が10以上の乳房嚢胞吸引の経歴を有するか、否かによって別々に示されている。乳ガンのリスクを考慮するに当たって、複数のグループ間に於ける、追跡期間、年齢および発覚年（calendar years of exposure）の違いについて調整することも重要である。これは、各グループについて乳ガン発生の相対危険率（相対リスク）、即ち、前記グループ中の乳ガンが発生した女性の数と、コネチカット州腫瘍登記所（Connecticut Tumor Registry）から得られる、同等の年齢と発覚年における発症率に従って、正常な女性に於いて予測される（乳ガンが発生した女性の）数、との比率、を計算することによって行われた。
表３は、吸引された乳房嚢胞の総数に拘わらず、高い濃度のGCDFP−15を有する女性に於いて、正常なGCDFP−15血中濃度を有する女性よりもかなり高い率で乳ガンが発生する、ということを示している。10未満の吸引された乳房嚢胞を有する女性では、正常な範囲のGCDFP−15血中濃度を有する女性の相対危険率（相対リスク）が1.8であったのに対して、高いGCDFP−15血中濃度を有する女性の相対危険率（相対リスク）は4.2であった。これらの相対危険率（相対リスク）の差は、10以上の吸引された乳房嚢胞を有する女性では、より顕著であった。即ち、高いGCDFP−15の血中濃度を有する女性では相対危険率（相対リスク）7.1であるのに対して、正常な範囲のGCDFP−15血中濃度を有する女性では相対危険率（相対リスク）2.0であった。
表３の最後の行は、研究された135名の女性のグループにおける、各女性グループの総合の乳ガン発生の相対危険率（相対リスク）を示す。10未満の吸引された乳房嚢胞を有する女性に於いて、そのリスク（危険率）は正常な女性の2.5倍高い。10以上の吸引された乳房嚢胞を有する女性に於いて、そのリスクは正常な女性の4.4倍高い。これらの結果は、GCDを患う1770名の患者の研究に於いて行われた嚢胞吸引研究によって判定された乳ガン発生リスクと相関している（ボディアン（Bodian）他,Cancer Det.Prev.,16:7−15（1992）参照）。
ここに提示されたデータは、活動性乳房嚢胞性疾患を患う女性は、GCDFP−15血中濃度によって、乳ガン発生のリスクの程度が異なるサブグループに分類されることを示している。乳房嚢胞吸引によって明かとなる、活動性乳房グロス嚢胞性疾患を患っており、かつ、40ng/ml以上の高いGCDFP−15血中濃度を有する女性は、乳ガン発生の相対危険率（相対リスク）が増加していた（表３）。この相対危険率（相対リスク）の増加の程度は、それが10以上の乳房嚢胞を生じた女性に於いてより高いものであった点で、臨床的にみて、活動性グロス嚢胞性疾患の程度と関連していた。このサブグループ（10以上の乳房嚢胞を生じた女性のうち、40ng/ml以上の高いGCDFP−15血中濃度を有する女性群）に於いて、相対危険率（相対リスク）の増加は、7.1倍高いものであり、その程度に於いて、異型上皮過形成の発生（デュポン（Dupont）他,New England J.Med.,312:146−151（1985））、又は、上皮内小葉ガン（ボディアン（Bodian）他,Epidemiological Reviews,In Press（1995））に関してみられる相対危険率（相対リスク）の増加と、類似していた。乳房グロス嚢胞性疾患は、臨床的に、異型上皮過形成、あるいは、上皮内小葉ガンよりもはるかに一般的であるので（ボディアン（Bodian）他,1992,前出；およびボディアン（Bodian）他,Cancer,71:3896−3907（1993）参照）、GCDFP−15血中濃度の測定は、乳ガンリスクの判断に於いて重要な評価工程である。
恐らく、GCDFP−15血中濃度は、アポクリン化生の乳房組織に対する分泌シグナルと、分泌シグナルに応答可能なアポクリン組織の存在量、との両方を反映していると考えられる。これらの変化は共に、乳ガン発生の罹病性の増加と相関しているものと考えられる。乳ガン発生のリスクを反映するGCDFP−15の血中濃度を利用することは、この疾患プロセスのより良い理解と、このリスクを変える為の方法に、新たな道を開くものである。
以上、本発明を特定の実施例を参照して説明したが、これらの実施例は本発明の様々な態様を例示するものに過ぎない。従って、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これらの例示的実施例に於いて様々な改変を行い、他の構成を考案することが可能であることが理解されるべきである。