(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛乳頭細胞を、その毛包再生能を保持した状態で長期継代培養する方法であって、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および／またはその培養上清とともに培養することを特徴とする毛乳頭細胞の長期継代培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、毛乳頭細胞の長期継代培養法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、毛包の分化誘導因子や成長因子の単離、解析を容易にすることや、移植材料としての毛乳頭細胞を短期間に多量に提供することを通して毛髪の分化、増殖の人為的制御に有用な、新しい毛乳頭細胞の長期継代培養法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
従来より、毛髪は皮膚の変化したもので、毛包上皮とそれらを裏打ちする毛乳頭細胞との相互作用の結果、毛母細胞が分化、増殖することにより毛幹（いわゆる毛の本体）が伸長することが知られている。
これまでにも、毛髪の増殖、成長については様々な観点より検討が進められてきているが、たとえばＯｌｉｖｅｒは毛包（毛髪基部の皮膚に埋まっている部分）を半分に切った切り口に毛乳頭細胞を詰めることにより毛包が再生することを示し、毛乳頭細胞が毛包の分化、増殖に重要な役割を担っていると推察している（Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．，１８：４３−、’６７）。つまり、毛乳頭細胞は、毛包の分化誘導因子や成長因子を分泌していると推定される。
【０００３】
しかしながら、これらの因子は毛髪の分化、増殖の人為的制御には大変に重要であると考えられるものの、その実体についてはいまだに明らかにされていない。
このような状況においては、これらの因子を探索し、解析するため、あるいは生体移植の材料とするためには多量の毛乳頭細胞が必要である。しかしながら、毛包に存在する毛乳頭細胞は少数であるため培養に頼らなければいけないが、これまで毛乳頭細胞の継代培養はなかなかうまくゆかず、細胞の増殖が遅く継代数も７代ほどに限られていた。また、継代数の多い培養毛乳頭細胞は半分に切った毛包に詰めても毛包が再生しないことから（Ｊａｈｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３１１：５６０−、’８４）、すでに本来の毛乳頭細胞の機能を失っているものと考えられる。
【０００４】
そこで、この発明は、以上の通りの従来技術の限界を克服し、毛包の分化誘導因子や成長因子の解明、そして毛髪の成長や生体移植材料としての開発にとって欠くことのできない手段として、毛乳頭細胞の長期の安定した継代培養が可能であって、しかも毛乳頭細胞の機能を失うことのない、新しい、毛乳頭細胞の長期継代培養法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞および／またはその培養上清とともに培養することを特徴とする毛乳頭細胞の長期継代培養法を提供する。
【０００６】
【作用】
すなわち、この発明は、毛乳頭細胞を足裏表皮細胞とともに培養すると細胞の増殖が著しく改善するとの新しい知見に基づいて完成されたものである。そして、この効果は、足裏表皮細胞の培養上清（コンディションドメディウム）でもみられるものである。また、このコンディションドメディウムを用いることにより、足裏表皮細胞の混入のない純粋な毛乳頭細胞を４０代以上安定して継代培養することが可能となる。さらに、３０代培養した毛乳頭細胞を半分に切った毛包に詰めると毛包が再生したことから、この方法によって毛乳頭細胞を本来の機能を維持したまま長期間培養することが可能となる。
【０００７】
以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明について説明する。
【０００８】
【実施例】
−細胞培養−
１）ラット足裏表皮細胞の単離
ラット足裏より皮膚を切り取りディスパーゼ処理（Ｄｉｓｐａｓｅ，１０００Ｕ／ｍｌ，４℃、一昼夜）して、表皮と真皮を分離する。得られた表皮をトリプシン処理（Ｔｒｙｐｓｉｎ，０．２５％、３７℃、１０分間）したのち、先曲がりピンセットの背中を用いて細胞を表皮片より掻き取る。ナイロンメッシュを通して細胞塊を除く。
２）足裏表皮細胞と毛乳頭との共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）
１）で得られた足裏表皮細胞（３．６×１０５  細胞）とラット頬髭毛包より単離した毛乳頭８個を、Ｄ−ＭＥＭ培地＋１０％牛胎児血清の入った３５ｍｍプラスチックシャーレに同時に播種し、５％ＣＯ２  ，３７℃のインキュベーター内で培養する。
３）足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの調製
１）で得られた足裏表皮細胞を４×１０４  細胞／ｃｍ２  の密度で１０ｃｍプラスチックシャーレに播種し、Ｄ−ＭＥＭ培地＋１０％牛胎児血清で培養する。播種後５日目と８日目に培地交換を行い、その際得られた培養上清を０．２２μｍメンブランフィルターで濾過滅菌してそれぞれＣＭ５、ＣＭ８とする。
４）ラット頬髭毛乳頭細胞の培養
実体顕微鏡下でラット頬髭毛包より毛乳頭を単離し、３５ｍｍプラスチックシャーレに８個ずつ入れる。これをＤ−ＭＥＭ培地＋１０％牛胎児血清のみ、あるいは、上述のＣＭ５またはＣＭ８をそれぞれ培地と１：１で混合したもの３種類の培養液で培養する。３〜４日おきに培地交換を行う。毛乳頭から遊走してきた細胞がシャーレいっぱい（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）  に達したところで継代し、以後、３〜４日おきの培地交換と１週間おきの継代を繰り返す。
−細胞機能検査−
１）腎臓皮膜下移植
ラットの頬髭毛包を単離し、下半分を切断除去する。残った上半分の毛包から毛幹を取り除き、切り口の毛幹を抜いたあとの隙間に４）の培養毛乳頭細胞をペレット状にして詰め込む。また、陽性対照として切り口の隙間に毛包から単離した毛乳頭を詰め込んだものを用意する。これらをラットの腎臓皮膜下に移植する。８週間後に開腹し腎臓を摘出して観察するとともに免疫組織化学的に調べる。
−免疫組織化学−
１）培養細胞の抗体染色
培養毛乳頭細胞をＳＵＭＩＬＯＮセルデスク上に培養し、セルデスクごとアセトン固定したのち我々の作製した１３ｘｘ抗体と反応させ、パーオキシダーゼ標識２次抗体とジアミノベンジジン（３，３′−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させる。
２）腎臓皮膜下移植した毛包の抗体染色
開腹後回収した毛包を５μｍの凍結切片とし、１３ｘｘ抗体、パーオキシダーゼ標識２次抗体と反応させジアミノベンジジンで発色させる。
−結果−
単離した毛乳頭をプラスチックシャーレに入れて初代培養すると、シャーレに接着した毛乳頭から細胞が遊走を始める。図１に例示した通り、この毛乳頭細胞の遊走も遊走した細胞の増殖速度も、足裏表皮細胞と共培養した場合の方が明らかに良かった。つぎに、足裏表皮細胞の効果が細胞間の相互作用によるのか細胞から分泌された液性因子によるのかを知るために、図２の足裏表皮細胞のコンディションドメディウムを加えて初代培養を行った。その結果、図３に例示した通り、なにも加えていないコントロールに比べＣＭ５、ＣＭ８のどちらのコンディションドメディウムを加えたものも毛乳頭細胞の遊走、増殖ともに優れていた。このことから、足裏表皮に由来する何らかの液性因子が、毛乳頭細胞の遊走および増殖を活性化するものと思われる。
【０００９】
また、毛乳頭細胞がシャーレいっぱいに達したところで継代し、そのさい細胞数を数えて集団倍加時間（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ  Ｔｉｍｅ）を計算したところ、図４に示した通り、コンディションドメディウムを加えて培養したものでは継代１０代目以降ほぼ安定して増殖したのに対し、なにも加えないで培養した毛乳頭細胞は徐々に増殖速度が鈍り、継代５代目でほとんど細胞数の増加がみられなくなった。コンディションドメディウムを加えて培養している毛乳頭細胞は現在までに４０代以上継代しているが、正常細胞の指標の一つである接触阻止（ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）がみられる。図５に示した通り、細胞の形態は培養初期のものとは若干異なるが、およそ１０代目以降安定し、ＣＭ５とＣＭ８とではやや異なった形態を示した。
【００１０】
足裏表皮細胞のコンディションドメディウムによる毛乳頭細胞の遊走および増殖の活性化は再現性があり、継代後の細胞形態の変化もそれぞれのコンディションドメディウムに特異的であった。
コンディションドメディウムにより長期継代培養した毛乳頭細胞が本来の毛乳頭細胞の機能を保持しているかどうかを調べるために、図６に示したように、毛包の腎臓皮膜下移植法による細胞機能検査を行った。その結果、図７に例示したが、３０代継代された培養毛乳頭細胞を詰めた毛包でも陽性対照と同様に毛包が再生し毛幹の伸長がみられた。毛包の各組織を染め分けるモノクローナル抗体（Ｋ１３ｘｘシリーズ）で染色したところ、図８に例示した通り、再生した毛包は正常な毛包と同等の組織分化がみられた。
【００１１】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、これまでは毛乳頭細胞を効率よく遊走、増殖させることができず、毛乳頭細胞の長期継代培養が不可能で、毛乳頭細胞を本来の機能（毛包再生能）を維持したまま継代培養することが困難であったが、この発明によって、足裏表皮細胞と共培養することあるいは足裏表皮細胞のコンディションドメディウムを加えることにより、毛乳頭細胞を効率よく継代培養する方法が確立され、しかも、この培養法により、毛乳頭細胞を本来の機能（毛包再生能）を維持したまま継代培養することが可能となる。
【００１２】
このため、この発明の毛乳頭細胞を細胞機能を維持したまま長期培養する技術によって、毛乳頭細胞が分泌していると考えられる毛包の分化誘導因子や成長因子の単離、解析が容易となり、移植材料としての毛乳頭細胞を短期間に多量に提供することを通して毛髪の分化、増殖の人為的制御に大変に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】毛乳頭と足裏表皮細胞との初代共培養を例示した培養８日後の状態図である。
【図２】足裏表皮細胞のコンディションドメディウムの調製法を示したプロセス図である。
【図３】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、コンディションドメディウム無添加、ＣＭ５、ＣＭ８添加の初代培養を例示した培養状態図である。
【図４】継代培養の結果を示した継代数と集団倍加時間（ＰＤＴ）との相関図である。
【図５】（ａ）（ｂ）は、各々、ＣＭ５およびＣＭ８添加の場合の、継代による細胞形態の変化を示した状態図である。
【図６】腎臓皮膜下移植法を示した概要図である。
【図７】毛包の再生状態を示した図である。
【図８】再生した毛包の抗体染色図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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