(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項２】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Ile−Gly−Glu−His−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項３】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Ile−Gly−Glu−His−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項４】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項５】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項６】
ヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部である、Ｈ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OHで表されるアミノ酸配列からなる、ただし式中Tyr＊はリン酸化チロシン残基である、ペプチド。
【請求項７】
単一アミノ酸から及び／又は２個以上のアミノ酸残基より予備形成されたペプチドからペプチドを化学的に合成することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項８】
予備リン酸化保護チロシン残基を固相合成中に直接導入する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ペプチドを固体支持体に結合しながら予備形成保護ペプチドのチロシン残基をリン酸化する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と、活性成分として請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドを含有する新生物疾患治療用医薬組成物。
【請求項１１】
ヒト又は動物身体の治療に用いる請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
新生物疾患の治療に用いる請求項11に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は細胞生物学分野に関し、細胞内シグナルトランスデューサーと相互作用し、細胞増殖及び運動に至るシグナル伝達経路を妨害することが可能な新規ペプチドに係る。
背景技術の説明
ポリペプチド成長因子は、チロシンキナーゼ酵素活性を有する細胞表面レセプターと結合することによりその生理的応答を媒介する（Ullrich,A.及びSchlessinger,J.,Cell  61:203−211（1990）参照）。
これらのリガンドと結合後、成長因子レセプターは二量体化され、こうして特定のチロシン残基が自己リン酸化される。
タンパク質の細胞内媒体には、リガンドにより活性化されたチロシンキナーゼレセプターの基質として作用する明確な生物学的機能を有する分子が含まれる。
過去数年間に集積された実験データによると、レセプターと結合後、これらの基質分子は活性化形態に転換し、細胞増殖を制御するために成長因子により使用される重要なシグナル伝達経路の一部となる。
成長因子への細胞応答を媒介する多数の細胞質分子は、そのSRC相同領域２（SH2）ドメインを介して活性化レセプターと相互作用することが示されている（Koch,C.A.ら,Science  252:668−674（1991））。
SH2ドメインは種々多様の細胞質シグナル伝達タンパク質群に存在する約100アミノ酸からなる保存タンパク質モジユールである。
SH2ドメインを有するタンパク質は約50残基の別の配列であるSH3ドメインを有する場合が多く、このドメインもシグナル伝達中にタンパク質−タンパク質相互作用の調節に関与する（Clark.S.G.ら,Nature  356:340−344（1992）及び引用文献）。
リガンド結合後のレセプター自己リン酸化は分子スイッチとして機能し、細胞質シグナル伝達タンパク質のSH2ドメインの結合部位を生成し（Anderson,D.ら,Science  250:979−982（1990））、こうして該タンパク質は活性化のターゲットとなる。
SH2ドメインはホスホチロシンを直接認識する（Matsuda,M.ら,Science  248:1537−1539（1990））。
しかしながら、SH2結合部位の試験により最初に示唆されたように、SH2ドメインは結合親和性が高いため、ホスホチロシンは特定のアミノ酸配列中に埋め込まれていることが必要である（Cantley,L.C.ら,Cell  64:281−302（1991））。
例えば、SH2を含むタンパク質であるホスファチジルイノシトール（PI）３−キナーゼ、Ras  GTPase活性化タンパク質（Ras  GAP）及びホスホリパーゼＣ−γ（PLC−γ）は、各々血小板に由来する成長因子のβレセプターの異なる自己リン酸化部位と結合する（Kashishian,A.ら,EMBO  J.11:1373−1382（1992）;Fantl,W.J.ら,Cell  69:413−423（1992））。
PI  ３−キナーゼ、PLC−γ及びRas  GAPの特異的ドッキング部位として機能する自己リン酸化部位も表皮成長因子レセプター（EGF−Ｒ）、コロニー刺激因子１レセプター（CSF−1R）及び繊維芽細胞成長因子レセプター（FGF−Ｒ）で同定されている（Cantley,L.C.ら,Cell  64:281−302（1991）;Mohammadi,M.ら,Mol.Cell.Biol.11:5068−5078（1991）;Reedijk,M.ら,EMBO  J.41:1365−1372（1992）;Rotin,D.ら,EMBO  J.11:559−567（1992））。
PDGFレセプターリン酸化部位に対応する比較的短いペプチド配列は活性化PDGFレセプターとPI  ３−キナーゼとの相互作用を阻害することが立証されている（Escobedo,J.A.ら,Mol.Cell.Biol.11:1125−1132）。
ホスホチロシンのＣ末端の直近の残基、特に＋１、＋２及び＋３位の残基は特定のSH2ドメインに選択性を提供すると思われる。
こうしてPDGFレセプターでPI  ３−キナーゼのp85サブユニットの認識モチーフが同定され、配列はTyr−Met/Val−Xxx−Met（YMXM又はYVXM）であり、ここでXxx及びＸは夫々３文字及び１文字コードでアミノ酸残基を表す（Domchek,S.M.ら,Biochemistry  31:9865−9870（1992））。
SH2を含む分子ファミリーと夫々の認識モチーフの新規構成員の同定は迅速に進められている。
これらの分子のうちにはリガンドに対する生物学的応答の誘起に直接関与するものもあることが立証された。例えば、リガンド刺激後にそのSH2ドメインを介していずれのEGFレセプターとも会合するタンパク質Grb2がこれに該当する。
Grb2とＨ−rasタンパク質を哺乳動物細胞に微量注入すると、DNA合成を刺激し、従って、マイトジェン効果を生じた（Lowenstein.E.J.ら,Cell  70:431−442（1992））。
これらの結果から、Grb2はrasシグナル伝達の成長因子調節のメカニズムに極めて重要な役割を果たすと考えられる。過去数年間の研究の大半は、最も十分に特徴付けられているEGF及びPDGFレセプターと細胞質シグナル伝達タンパク質との相互作用の研究に集中しているが、本発明者らは肝細胞成長因子（HGF）レセプターに着目した。
HGFは分散因子（Scatter  Factor,SF）としても知られ、中胚葉起源の細胞により分泌されるヘテロ二量体タンパク質である（Stoker,M.ら,Nature  327:239−242（1987）;Weidner,K.M.,ら,J.Cell  Biol.111:2097−2108（1990））。
該因子は、細胞分裂促進、細胞運動の刺激及びマトリックス浸潤の促進を含む一連の生物活性を上皮細胞中で誘起する（Nakamura,T.ら,Biochem.Biophys.Res.Comm.122:1450−1459（1984）;Stoker,M.ら,Nature  327:239−242（1987）;Weidner,K.M.ら,J.Cell.Biol.111:2097−2108（1990）;Rubin,,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:415−419（1991））。
HGF/SFは更にin  vitroにおいてモルホジェンであり（Stern  C.D.ら,Development  110:1271−1284（1990）;Montesanoら,Cell  66:697−711（1991））、in  vitro及びin  vivoにおいて強力な脈管形成因子である（Bussolino,M.F.ら,J.Cell  Biol.119:629−641（1992））。
HGF/SFの生物学的効果はターゲット細胞により異なるが、HGF/SFシグナルはMETプロトオンコジーンによりコードされるチロシンキナーゼからなる単一レセプターにより媒介される（Comoglio,P.M.,I.D.Goldberg及びE.M.Rosen（編）,Hepatocyte  Growth  Factor−Scatter  Factor（HGF/SF）and  the  Ｃ−Met  Receptor,Birkhauser  Verlag  Basel/Switzerland参照）。
HGFレセプターはp190METとしても知られ、細胞外αサブユニット及び貫細胞βサブユニットから構成されるヘテロ二量体レセプターであり（Giordano,S.ら,Nature  339:155−156（1989）、これらのサブユニットはいずれも170kDaの共通単鎖前駆物質のタンパク分解により得られる（Giordano,S.ら,Oncogene  ４:1383−1388（1989））。
ヒトMET  cDNAでトランスフェクトしたNIH3T3繊維芽細胞は機能的レセプターを発現し、高い運動性と細胞外マトリックス浸潤を伴ってHGF/SFに応答する（Giordano  S.ら,PNAS,90:649−653（1993））。
染色体転位（Parkら,Cell  45:895−904（1986））、遺伝子過剰発現（Giordano  S.ら,Nature  339:155−186（1989））、欠陥翻訳後プロセッシング（Mondinoら,Mol.Cell.Biol.11:6084−6092（1991））及びオートクリンループ後に形質転換細胞系でHGF/SFレセプターの無制御なチロシンキナーゼ活性が観察された。
上皮起源の多数のヒト腫瘍でレセプターの過剰発現が観察された（Di  Renzoら,Oncogene  ６:1997−2003（1991）;Di  Renzoら,Oncogene  ７:2549−2553（1992）;Pratら,Int.J.Cancer  49:323−328（1991））。
これはHGF/SFレセプターの腫瘍形成能を裏付けるものである。
HGF/SFにより誘起されるシグナル伝達経路についてはほとんど知られていない。
前記因子により誘起される多面的生物応答は、２種以上のメカニズムが活性化され得ることを示唆している。本発明者らは、HGF/SFレセプターが自己リン酸化後にPI  ３−キナーゼ、ras−GAP、PLC−γ及びSrc関連チロシンキナーゼとin  vitroで会合することを先に報告した（Bardelli,A.ら,Oncogene  ７:1973−1978（1992））。
PI  ３−キナーゼと活性化レセプターとの会合もHGF/SFにより刺激した細胞でin  vivoで検出された（Graziani,A.ら,J.Biol.Chem.266:22087−22090（1991））。
最近になって前記著者らはグアニンヌクレオチド交換因子の刺激を介してGDP結合状態とGTP結合状態との間の回転率を増加させることによりHGF/SFがRasを活性化することも示している（Graziani,A.ら,J.Biol.Chem.印刷中（1993））。
本発明者らはHGF/SFレセプターがタンパク質Shc及びGrb2と会合することを茲に知見した。哺乳動物遺伝子Shcは、Ｃ末端SH2ドメインとＮ末端コラーゲン相同領域とを含む66、46及び52kDaの広く発現される３種のオーバーラップするタンパク質（p66Shc、p46Shc及びp52Shc）をコードする（Pelicciら,Cell  70:93−104（1992））。p46Shc及びp52Shcは２種の異なるATGを使用することにより同一転写物によりコードされる。p66Shcは択一的にスプライシングされた転写物によりコードされる（Migliaccioら，作成中）。実験データによると、Shcタンパク質はチロシンキナーゼレセプターにより生成されるシグナルの伝達に関与する。特に、Shcタンパク質はEGF（Pelicciら、前出）レセプター、PDGF（未公開データ）レセプター、Erb−Ｂ−２（Segattoら,Oncogene  2105−2112（1993））、Src及びFps（McGladeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  89:8869−8873（1992））の活性化に応答して迅速にチロシンリン酸化される。Shcタンパク質の過剰発現はPC12褐色細胞腫細胞における神経突起成長を誘発し、この作用は優性−負（dominant−negative）Ras突然変異体の発現により阻止される（Rozakis−Adcockら,Nature  360:689−692（1992））。特定の成長因子による細胞刺激後、Shcタンパク質はGrb2/Sem5アダプターとの安定な複合体を形成する（Lowensteinら,Cell  70:431−442（1992）;Rozakis−Adcockら，前出）。前記アダプターはグアニンヌクレオチド交換因子であるSoS（Liら,Nature  363:85−87（1993）;Galeら,Nature  363:88−92（1993）;Rozakis−Adcockら,Nature  363:83−85（1993）;Eganら,Nature  363:45−51（1993）;Simonら,Cell  73:169−177（1993）;Oliverら,Cell  73:179−191（1991））を膜に補給することによりRas機能を活性化することが知られている。
以上の記載から明らかなように、活性化チロシンキナーゼレセプターとシトソールトランスデューサー分子との相互作用は細胞増殖及び運動に至るシグナル伝達経路における重要な段階である。
これらの生物応答は腫瘍成長及び伝播の最も特有の特性を構成するので、このような相互作用を妨害する必要が業界で認められている。
発明の要約
本発明者らは、細胞内シグナルトランスデューサーと相互作用することが可能であり、従って細胞増殖、細胞運動及び細胞外マトリックス浸潤に至る経路を妨害するホスホペプチド群を合成した。
これらの生物学的特性を利用して新生物細胞の成長を阻害し、転移を予防することができる。
本発明者らは更に、（１）Shcタンパク質がSH2ドメインを介してチロシンリン酸化SF/HFGレセプターと結合し、（２）Shcタンパク質がSF/HFGレセプターテールのホスホチロシンY1349及びY1356と結合し、（３）Shcタンパク質の過剰発現がSF/HFGに対するモートジェン応答を増大させ、（４）Shcタンパク質がSF/HFGレセプターとの結合後にY317上でリン酸化され、（５）Y317上でリン酸化されたShcタンパク質がGrb2タンパク質との特異的複合体を形成し、（６）Shc上のGrb2ドッキング部位（Y317VNV）がHGF/SFレセプター上のシグナルトランスデューサー結合部位と同一配列（YVNV）を有するという事実を新規に知見した。こうして、本発明者らはShc上のGrb2ドッキング部位と、肝細胞成長因子レセプター上の認識モチーフY1349VHV及びY1356VNVを含むShcドッキング部位からペプチドを合成した。これらのペプチドは細胞増殖、細胞運動及び細胞外マトリックス浸潤に至る経路を妨害することが可能である。
従って、本発明はShcタンパク質の一部の配列を有しており、シトソールシグナルトランスデューサーと結合することが可能なペプチドを更に提供する。前記ペプチドは一般に、Shcタンパク質とGrb2タンパク質との結合又はGrb2と活性化肝細胞成長因子レセプターとの結合を阻害することが可能である。
更に、本発明はヒト肝細胞成長因子レセプターの細胞内領域の一部の配列を有しており、シトソールシグナルトランスデューサーと結合することが可能なペプチドを提供する。
前記ペプチドは一般に、Shcタンパク質もしくはホスファチジルイノシトール３−キナーゼのp85サブユニットと活性化肝細胞成長因子レセプターとの結合又はShcと他のシトソールシグナルトランスデューサーとの結合を阻害することが可能である。
発明の詳細な説明
本発明のペプチドは一般に、チロシンリン酸化部位を有するチロシン含有分子である。ペプチドは例えば４〜20アミノ酸、例えば８〜12アミノ酸長を有する。ペプチドは一般に細胞内シグナルトランスデューサーのSH2ドメインの潜在的認識モチーフを再現する。
ペプチドは４〜20アミノ酸長であり、配列XN−YVN（又はＨ）Ｖ−XC（式中、XN及びXCは各々０〜16アミノ酸の配列である）を有し得る。
好ましくは、XN及びXCはHGF/SFレセプター及びShcタンパク質におけるYVN（又はＨ）Ｖ配列の一方を取り囲む配列である。トランスデューサーと活性化チロシンキナーゼレセプターとの相互作用により、トランスデューサー自体を補強及び活性化することができる。
HGF/SFレセプターの活性化は（レセプターの二量体化を伴うリガンド結合の結果として）生理的でもよいし、構成的でもよい（即ちレセプターはリガンドの不在下でも永久的に活性化される）。構成的活性化は細胞外リガンド結合ドメインをもたないレセプターとして生じ得、例えば（本明細書に記載するTPR−MET融合の場合と同様に）腫瘍遺伝子レセプター内又は染色体転座後に生じる。大多数の細胞内シグナルトランスデューサーは細胞成長及び腫瘍転換に相関されている（Fantl,W.J.ら,Cell.69:413−423（1992）;Reedijk,M.ら,Mol.Cell.Biol.10:5601−5608（1990）;Lowenstein,E.J.ら,Cell  70:431−442（1992））。
従って、Shcタンパク質と活性化チロシンキナーゼレセプターとの結合又はShcタンパク質と他のトランスデューサーとの結合の阻害は細胞分裂促進及び細胞運動促進を阻害する手段を構成し、従って、本発明のペプチドは腫瘍の成長を妨害し得る。
本発明の好適態様は下表から選択されるペプチドである。
0003585044.tif 000002
上記表中、Tyr＊はリン酸化又は非リン酸化チロシン残基を表す。
公知細胞内シグナルトランスデューサーのうちで、PI  ３−キナーゼはリガンド刺激後にin  vitro又はin  vivoでHGFレセプターと結合することが立証された。HGF/SFレセプター上のその認識モチーフはまだ決定されていない。PDGFレセプターで実施された従来の研究によると、４種のアミノ酸配列Tyr−Xxx−Xxx−Met（YXXM）（式中、Xxx又はＸは夫々３文字コード又は１文字コードでアミノ酸残基を表す）がPI  ３−キナーゼの標準コンセンサス配列を構成することが示されている。
HGFレセプターにはPI  ３−キナーゼの結合部位に相当し得る潜在的認識モチーフTyr−Glu−Val−Met（Y1313EVM）が存在する。
驚くべきことに後記実験結果によると、コンセンサスY1313EVMを含む合成ホスホペプチドはPI  ３−キナーゼと結合することができるが、チロシン1313はPI  ３−キナーゼ結合に影響することなく除去され得る。
他方、ホスホペプチドＨ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OH、Ｈ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OH及びＨ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHを使用して得られた阻害データにより立証されるように、本発明者らは本発明の合成ホスホペプチドとレセプターTyr−Phe突然変異体を併用し、1349及び1356位の２つのホスホチロシンにPI  ３−キナーゼの結合部位を同定した。
これらの残基からTyr−Val−（Asn又はHis）−Val［YV（Ｎ又はＨ）Ｖ］がPI  ３−キナーゼの新規認識モチーフとして同定され、対応するホスホペプチドはHGFレセプターとPI  ３−キナーゼとの結合阻害剤として有用に使用することができる。
従って、本発明の特に好適な態様は式Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OH、Ｈ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OH又はＨ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OH（式中、Tyr＊はリン酸化チロシンの残基を表す）を有するホスホペプチドである。
本発明の別の好適態様は、ペプチドＨ−Asp−Asp−Pro−Ser−Tyr＊−Val−Asn−Val−Gln−OH（DDPSY＊VNVQ）（式中、Tyr＊（Ｙ＊）はリン酸化又は非リン酸化チロシンを表す）である。
本発明のペプチドは医薬的に許容可能な塩の形態で提供され得る。適切な塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム又はカリウム塩）やアンモニウム塩のような塩基性塩、及び酸付加塩（例えば塩酸塩及び酢酸塩）を含む。
本発明のペプチドは、Escobedo,J.A.ら,Mol.Cell.Biol.11:1125−1132（1991）又はTurck,C.W.Peptide  Res.５:156−160（1992）に記載されているような常法に従って、例えば保護予備リン酸化チロシン残基を使用して合成することができる。特に、前記ペプチドは当業者に公知の液相又は固相法により製造することができる（Schroederら，“The  Peptides",Vol.I,Academic  Press  1965,又はBodanszkyら，“Peptide  Synthesis",Interscience  Publishers,1966,又はMcOmie（編）“Protective  Group  in  Organic  Chemistry",Plenum  Press,1973,又はBaranyら，“The  Peptides:Analysis,Synthesis,Biology"２，第１章,Academic  Press,1980）。
従って、本発明は単一アミノ酸及び／又は２個以上のアミノ酸残基から予備形成されたペプチドからペプチドを化学的に合成することからなる、本発明のペプチドの製造方法を包含する。チロシン残基をリン酸化したペプチドを製造することが望ましい場合には、予備リン酸化保護チロシン残基を固相合成中に導入してもよいし、ペプチドを固体支持体に結合する間に予備形成保護ペプチドのチロシン残基をリン酸化してもよい。
固相合成の場合には、手動又は自動ペプチド合成器を使用することができ、Boc又はFmoc法を使用してペプチドを樹脂支持体に順次結合することができる。
出発物質として使用する全試薬は市販されており、あるいは当業者に公知の方法に従って製造及び精製することができる。
ホスホペプチドを製造する際には、保護ペプチドの脱保護中にリン酸基の開裂を避けるために、スカベンジャーの適切な混合物を含有するトリフルオロメタンスルホン酸−トリフルオロ酢酸溶液を使用する。
アセトニトリルの直線勾配を使用することにより0.1％トリフルオロ酢酸中でC18−Vydacカラム（Hesperia  Calif.）上で逆相高性能クロマトグラフィーにより脱保護ペプチドを精製し、凍結乾燥により単離する。全ホスホペプチドはポリ水和ポリトリフルオロ酢酸塩として得られる。全生成物のペプチド含有率は65〜90％であり、クロマトグラフィー純度はλ＝225cmでのHPLCピーク相対積分によると＞95％である。酸水解物でアミノ酸解析を実施した（6N  HCl＋0.1％フェノール中110℃で22時間）。あるいは非リン酸化チロシンを含有するペプチドをまず最初に合成した後、リン酸基を酵素的又は化学的方法によりチロシン残基に導入してもよい（その場合、リン酸化剤と反応し得る他の官能基は適切に保護しなければならない）。
本明細書中において、アミノ酸及び保護基に使用する略称は、生化学命名法に関するIUPAC−IUB委員会の推奨に基づく（Eur.J.Biochem.,vol  138,9−37,1984参照）。特に、明細書全体を通して以下の略称を使用した:Boc＝ｔ−ブチルオキシカルボニル;tBu＝ｔ−ブチル;Bzl＝ベンジル;ClZ＝４−クロロベンジルオキシカルボニル;DPCDI＝ジイソプロピルカルボジイミド;DCM＝ジクロロメタン;DMF＝ジメチルホルムアミド;Dnp＝ジニトロフェニル;Fmoc＝９−フルオレニルメトキシカルボニル;RP−HPLC＝逆相高性能液体クロマトグラフィー;Trt＝トリチル。
本発明のホスホペプチドが細胞内トランスデューサーとチロシンキナーゼレセプター又はShcタンパク質との結合を阻害する能力は、チロシンキナーゼレセプターとの結合に関する実験項に示すような競合実験により評価することができる。チロシンキナーゼレセプター上の自己リン酸化部位の生物学的意義は、実験項に記載するフォーカス形成アッセイにより立証される。
特にこのアッセイは、天然の活性化HGFレセプターの形質転換活性がレセプター自体上の特定の該当自己リン酸化部位を突然変異させることにより（Tyr−Phe突然変異）如何に有効に阻害できるかを立証するものである。
HGF/SFレセプター又はShcのリン酸化部位の１つを再現するペプチドはトランスデューサーとの結合を妨害し、こうしてマイトジェン及びモートジェンシグナルの下流伝達を阻害する。
従って、本発明のペプチドはヒト又は動物身体の治療、例えば新生物疾患の治療に使用することができる。
本発明のペプチドはリン酸化形態でも非リン酸化形態でもよい。ペプチドの活性形態は一般にリン酸化形態であるが、非リン酸化形態のペプチドを投与し、ペプチドを患者の体内でリン酸化させると有利である。これは、非リン酸化時のほうが細胞にペプチドを取り込み易いためである。
本発明のペプチドは適切な腸管外経路で患者にそのまま投与してもよいが、酵素安定性及び細胞透過性を増加するためには複合体として投与するのが適切である。
用量；投与頻度；皮下、静脈内又は筋肉内投与のいずれを採用するかの選択は種々の因子に依存する。これらの因子としては、投与目的、被治療患者の年齢及び体重、並びに患者の症状が含まれる。治療薬として有効な量を投与する。しかしながら、一般には各投与経路で10〜1000μg/用量、より好ましくは50〜500μg/用量のペプチドを投与する。
ペプチドは医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は更に医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含有する。投与経路に応じて任意の適切なキャリヤー又は希釈剤を使用することができる。
以下、実施例により本発明を説明する。
まず、添付図面を説明する。
図1.チロシン−リン酸化ペプチドによるp85とHGF/SFレセプターとの結合の阻害。ウサギポリクローナル抗血清を使用してバキュロウイルス感染Sf9細胞から免疫沈降により組換えGHF/SFレセプターを精製し、冷ATPでリン酸化した。p85を発現するSf9細胞の溶解物をホスホペプチド（10μＭ）の各々と共にプレインキュベートした。次に、溶解物を固定化組換えHGF/SFレセプターと会合させた。会合後、実施例４の材料と手法の項に記載するように複合体を洗浄し、in  vitroキナーゼアッセイによりレセプター結合p85を検出した。ホスホペプチドはアミノ末端チロシンの数により同定される。
図2.種々の濃度のチロシン−リン酸化ペプチドによるp85とHGF/SFレセプターとの結合の阻害。p85とHGF/SFレセプターとの結合を有効に競合阻害したホスホペプチド（図１）の濃度を増加させながら（左から右に向かって10nM、100nM、１μＭ）使用し、p85に対するその相対親和性を決定した。実験条件は図１と同様である。ホスホペプチド1365をp85相互作用の負の対照として使用した。
図3.チロシン−リン酸化ペプチドによるPI  ３−キナーゼホロ酵素とHGF/SFレセプターとの結合の阻害。p85を有効に競合阻害したホスホペプチド（図１）について、PI  ３−キナーゼホロ酵素とHGF/SFレセプターとの結合を妨害する能力をアッセイした。３日間飢餓させたA549細胞からのシトソール抽出物をホスホペプチド（10μＭ）の各々と共にプレインキュベートした後、固定化組換えHGF/SFレセプターと共にインキュベートした。免疫複合体中でレセプターに会合したPI  ３−キナーゼの存在を実施例４の材料と手法の項に記載するようにPI  ３−キナーゼ活性アッセイにより決定した。PI  ３−キナーゼ反応のホスファチジルイノシトール−３−ホスフェート（PIP）生成物の位置を示す。
図4.HGF/SFレセプターとp85との相互作用に及ぼすTyr−Phe突然変異の効果。野生型HGF/SFレセプター（wt）、又は指定位置のチロシンコドンがフェニルアラニンコドンに個々に又は組み合わせて変換されたレセプターをコードするプラスミドでCOS7細胞をトランスフェクトした。COS7細胞は内因性HGF/SFレセプターを発現する。他方、サルタンパク質はカルボキシル末端ヒト特異的ペプチドに対するモノクローナル抗体により認識されない。これらの抗体を使用して、トランスフェクトしたCOS7細胞からヒトHGF/SFレセプターを選択的に免疫沈降させた。p85を発現するSf9細胞の溶解物と共に固定化予備リン酸化レセプターをインキュベートした。パネルＡでは実施例４の材料と手法の項に記載するようにレセプターとp85の両者をin  vitroキナーゼアッセイにより標識した。パネルＢでは、抗p85モノクローナル抗体を使用するイムノブロットによりレセプター免疫複合体中のp85の存在を決定した。
図5.HGF/SFレセプターとPI  ３−キナーゼホロ酵素との相互作用に及ぼすTyr−Phe突然変異のin  vivo効果。野生型又は突然変異レセプターを発現するCOS7細胞をHGF/SFで刺激し、溶解させた。レセプターをヒト特異的モノクローナル抗体で免疫沈降させた。パネルＡ及びＢでは、実施例４の材料と手法の項に記載するように、レセプターに会合したPI  ３−キナーゼの存在をPI  ３−キナーゼ活性アッセイにより決定した。PI  ３−キナーゼ反応のホスファチジルイノシトール−３−ホスフェート（PIP）産物の位置を示す。パネルＣ及びＤは（ヒト特異的モノクローナル抗体を使用する）イムノブロットにより、PI  ３−キナーゼ活性を試験したサンプルが同等量の組換えレセプターを含有していたことを示す。1204位のアスパラギン酸をアスパラギン残基に変換することによりTK-レセプター突然変異体を得た。こうして、キナーゼ不活性HGF/SFレセプターを得た。
図6.トリプシンホスホペプチドマッピングによるHGF/SFレセプター中のin  vitroリン酸化部位としてのY1349及びY1356の同定。曲線Ａは、HGF/SFレセプター中のチロシンY1349及びY1356を含むトリプシンペプチドに対応する合成非リン酸化ペプチド（I24K）の214nmにおけるHPLC分析を示す。I24Kは65分後にHPLCカラムから溶出する。Ｂ及びＣはin  vitro［γ−32P］ATP−リン酸化野性型レセプター（Ｂ）及びPhe1349-1356レセプター突然変異体（Ｃ）に由来するトリプシンホスホペプチドの放射性HPLC溶離曲線を示す。
図7.p85のＮ−及びＣ−SH2ドメインに対するホスホチロシン1313、1349及び1356の相対親和性の評価。BIAcore装置を使用して生物特異的相互作用分析により親和性を決定した（Jonsson,U.,Fagerstam,L.,Roos,H.,Ronnberg,J.,Sjolander,Stenber,E.,Stahlberg,R.Urbaniczky,C.,Ostlin,H.,及びMalmquist.1991.Surface  plasmon  reasonance  and  microfluidics  for  real  time  biospecific  interaction  analysis.Biotechniques  11:520−528;Jonsson,U.及びM.Malmquist.1992.Real  time  biospecific  analysis.The  integration  of  surface  plasmon  reasonance  detection,general  biospecific  interface  chemistry  and  microfluidics  into  one  analytical  system  p.291−336.In  F.Turner（編）,Advances  in  Biosensors,vol.2  JAI  Press,London;Karlsson,R.,Michaelsson,A.,及びL.Mattsson.1991.Kinetic  analysis  of  monoclonal  antibody−antigen  interactions  with  ａ  new  biosensor  based  analytical  system.J.Immunol.Meth.145:229−246）。
ホスホペプチドが、SH2ドメインと、ヒトPDGFレセプター中のY751を含む固定化ホスホペプチド（DMSKDESVDY＊VPMLDMK）との相互作用を阻害する能力を測定することにより、相対親和性を決定した。パネルＡ及びＢはホスホペプチドY751との結合阻害％として表したこれらの測定結果を示す。パネルＣは結合の半最大阻害に達するために必要なホスホペプチド濃度を示す。
図8.種々のTPR−MET構築物によるフォーカス形成アッセイ。TPR−MET1349、TPR−MET  Phe1356及びTPR−MET  Phe1349-1356において、HGF/SFレセプターのTyr1349及び／又はTyr1356に対応するチロシン残基をフェニルアラニンへと突然変異誘発した。
図9.SF/HGFはSchのリン酸化、並びにSF/HGFレセプター及びGrb2との会合を誘発する。対照又はY317→Ｆ突然変異体Shc  cDNA（A549/Y317F）を発現するA549細胞を集密まで増殖させ、血清を24時間飢餓させ、溶解させた。（＋）で示す場合には、細胞を200U/mlの純粋SF/HGFで５分間刺激した。図面の表記に従い、第１の抗体（IPP）で沈降した免疫複合体を９％SDS−PAGE上で分離し、第２の抗体（WB）によるイムノブロットにより分析した。矢印は内因性Shcアイソフォーム（p46、p52、p56）、SF/HGFレセプターβ鎖（p145）、トランスフェクトした標識突然変異体Shcアイソフォーム（p53及びp58）及びGrb2タンパク質（p23）を示す。
図10.Shcの会合及びチロシンリン酸化はSF/HGFレセプターキナーゼ活性に依存する。図面の表記に従い、野生型SF/HGFレセプター（WT）又はキナーゼ欠損レセプター突然変異体（LYS-）を一時的に発現するCOS−１細胞の溶解物を抗Metモノクローナル抗体（Ａ及びＢ）又は抗Shcポリクローナル血清（Ｃ及びＤ）で免疫沈降させ、ウェスタンブロットし、抗Met又は抗Ｐ−Tyr抗体でプローブした。矢印は、COS−１細胞中でSF/HGFレセプターの完全に機能的な優性形態である前駆物質タンパク質（p170）を示し（Ponzettoら,Mol.Cell.Biol.13:4600−4608（1993））、p46、p52及びp56はShcアイソフォームである。
図11.Shc及びGrb2  SH2ドメインとSF/HGF処理細胞から可溶化したタンパク質との結合。非刺激（−）又はSF/HGF刺激（＋）A549細胞の集密的単層から溶解物を調製した。全細胞タンパク質をグルタチオンSepharoseに固定化した組換えGST−SH2.Shc（Ａ）又はGST−SH2.Brg2（Ｂ）と共にインキュベートすることにより会合実験を実施した。結合タンパク質を溶離し、指定抗体を使用してウェスタンブロット分析した。
図12.SF/HGFレセプター上のShc結合部位のマッピング。（WT）SF/HGFレセプター又は各レーンの横に示す残基でＹ→Ｆに突然変異させたSF/HGFレセプターを発現するCOS−１細胞を抗Shc抗体で同時免疫沈降させ、ブロットし、抗Met抗体により検出した。矢印はレセプター前駆物質（p170）を示す。
図13.Shc  SH2ドメインはSF/HGFレセプターのドッキング部位（Y1356）と結合するが、それ自体のドッキング部位（Y317）とは結合しない。２種のホスホペプチドを固定化しておいた２つのバイオセンサー表面に同一濃度のShc−SH2を注入した。Y1356Pはレセプターテールの配列VNATY1356VNVKに由来し、Y317Pは配列DDPSY317VNVQに由来する。両ペプチドは同一コア（YVNV）を含むが、上流配列は異なる。迅速な初期応答増加は、注入溶液の「バルク効果」に起因する。
図14.Shcの過剰発現はSF/HGFに対するモートジェン応答を強化する。Blind−well  Boydenチャンバーをゼラチンで被覆したポリカーボネートフィルター（孔径８μｍ）と結合した。細胞を５−［125I］ヨード−2'−デオキシウリジンで標識し（手法の項参照）、上部チャンバーにプレーティングした。指定濃度の精製SF/HGFを補充した無血清培地を下部チャンバーに充填した。37℃で６時間インキュベーション後、フィルターの上側に結合した細胞を機械的に除去し、フィルターの下側に移動した細胞を固定し、γ−カウンターで定量した（Ｙ軸：結合CPM）。下パネルは40U/mlのSF/HGFの存在下でフィルターの下側に移動した細胞の低倍率顕微鏡写真（４×）である。SHC  cDNAを有するレトロウイルス（SHC−plXSN）又はエンプティウイルス（MOCK）を細胞に感染させた。
図15.Grb2  SH2ドメインはShcのY317ドッキング部位に結合する。パネルA:Shc配列DDPSY317VNVQに由来する固定化ホスホペプチドに一定範囲の濃度のGst−SH2.Grb2を注入することにより得られたセンサーグラム。パネルB:解離速度に及ぼす競合ペプチドの効果。Grb2注入後、緩衝液又は20M非ビオチン化ホスホペプチドを注入した。パネルC:パネルＡに示したデータの分析。左図は６種の異なるセンサーグラムの結合速度と相対応答の関係を示したプロットである。右図は、各線の傾きを濃度に対してプロットしたものであり、新しい傾きは一定の会合速度値を与える。
図16.SF/HGFレセプターと、アダプター分子Shc及びGrb2を含むSH2との相互作用のモデル。Grb2はレセプターテール上のドッキング部位Y1356VＮＶと高親和性で結合する。アダプター分子ShcはホスホチロシンY1349又はY1356と相互作用することができる。結合後、ShcはY317上のレセプターによりリン酸基転換され、Grb2の高親和性ドッキング部位を再生する。こうしてレセプターは、Grb2−SoSにより誘起されるRas媒介マイトジェン応答を妨害することなく、Shc経路を介してモートジェン応答を活性化することができる。
実施例１
Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OH（式Ｉ）の製造。
Fmoc−Tyr（tBu）−４−（オキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）樹脂（0.56mmol/g）0.89g（0.5mmol）をステップ（１）〜（５）からなる下記処理サイクルにかけた。
（１）DMF
（２）DMF中ピペリジン（20％）
（３）DMF
（４）DMF中Fmoc−アミノ酸の予備形成１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（2.0mmol）。
洗浄液及び試薬の容量は10〜20mlとした。樹脂を完全に反応させるため（ステップ2,4）又は樹脂から上記試薬を完全に除去するため（ステップ1,3,5）に必要な回数だけ各ステップを繰り返した。各サイクル後に樹脂サンプルを取り出し、ニンヒドリン試験により反応の完了度を調べた。Fmoc−アミノ酸の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、Fmoc−アミノ酸（2.0mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.0mmol）及びDPCDI（2.0mmol）をDMF中で反応させることにより使用直前に形成した。
反応サイクル（１）〜（５）を各アミノ酸残基で繰り返し、式Ｉの配列を得た。
以下の保護アミノ酸:Fmoc−Thr（tBu）−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asn−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Val−OH及びBoc−Tyr（PO3Bz12）−OHをこの順序で加えた。最終サイクル後、ペプチジル樹脂をDCMで数回洗浄し、乾燥した。
出発樹脂に対して0.54gの重量利得が得られた。
ペプチジル樹脂1.0gにトリフルオロメタンスルホン酸／トリフルオロ酢酸／硫化ジメチル／エタンジチオール（20:50:3:3:1）混合物20mlを加えて３時間０℃で撹拌した。脱保護ペプチドをジエチルエーテル１リットルで沈降させ、濾取した。
アセトニトリル０→65％直線勾配を使用して0.1％トリフルオロ酢酸中でC18−Vydac（Hesperia,CA）カラム（2.2×25cm）でRP−HPLCにより粗ペプチドを90分間かけて精製した。
純粋形態の生成物を含むフラクションを集めて、アセトニトリルを減圧下に蒸発させ、残留溶液を凍結乾燥した。95.7％のクロマトグラフィー純度（HPLC）で式Ｉの化合物132gを得た。
アミノ酸比:Ala  １（１）;Asp  1.07（１）;His  0.96（１）;Thr  0.91（１）;Tyr  1.88（２）;Val  2.03（２）。
ペプチド含有率:73.7％。
FAB質量スペクトロスコピー:m/z1044.4［Ｍ−Ｈ］−。
実施例２
Ｈ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OH（式II）の製造。
Fmoc−Ala−４−（オキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）樹脂0.5mmolから出発し、保護アミノ酸:Fmoc−Val−OH、Fmoc−Cys（Trt）−OH、Fmoc−Lys（Boc）−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Asn−OH、Fmoc−Val−OH、Boc−Tyr−OHをこの順序で加え、実施例１と同様にデホスホペプチドを樹脂に結合した。
最終サイクル後、1H−テトラゾール30当量及びジ−第３ブチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジト10当量のDMF溶液で１時間25℃で処理した後、第３ブチルヒドロペルオキシド20当量のトルエン溶液で１時間25℃で処理することにより、樹脂にまだ結合しているペプチド上でTyr残基のリン酸化を直接得た。ペプチジル樹脂1.0gで実施例１に記載したように開裂、保護基除去及び粗生成物の精製を実施した。
アミノ酸比:Ala  １（１）;Asp  1.02（１）;Cys  nd（１）;Lys  0.99（１）;Tyr  0.95（１）;Val  2.98（３）。
ペプチド含有率:68.9％。
FAB質量スペクトロスコピー:m/z973.4［Ｍ−Ｈ］−。
実施例３
Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OH（式III）の製造。
Boc−Lys（ClZ）−４−（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）樹脂（0.68mmol/g）0.74g（0.5mmol）をステップ（１）〜（７）からなる下記処理サイクルにかけた。
（１）DCM
（２）DDM中トリフルオロ酢酸（50％）
（３）DCM
（４）DMF中ジイソプロピルエチルアミン（５％）
（５）DMF
（６）予備形成１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（DMF中2.0mmol Boc−アミノ酸）
（７）DMF。
樹脂を完全に反応させるため（ステップ2,4,6）又は樹脂から上記試薬を完全に除去するため（ステップ1,3,5,7）に必要な回数だけ各ステップを繰り返した。
各サイクル後に樹脂サンプルを取り出し、ニンヒドリン試験により反応の完了度を調べた。
Boc−アミノ酸の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、Boc−アミノ酸（2.0mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.0mmol）及びDPCDI（2.0mmol）をDMF中で反応させることにより使用直前に形成した。
反応サイクル（１）〜（７）を各アミノ酸残基で繰り返し、式IIIの配列を得た。
以下の保護アミノ酸:Boc−Val−OH、Boc−Asn−OH、Boc−Val−OH、Boc−Tyr（PO3Bz12）−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Ala−OH、Boc−Asn−OH、Boc−Val−OH、Boc−His（Dnp）−OH、Boc−Val−OH及びBoc−Tyr（PO3Bz12）−OHをこの順序で加えた。His（Dnp）の合成が完了したら、DMF中の1Mチオフェノール15mlを使用して樹脂にまだ結合しているペプチドで上で直接保護基を除去した後、ペプチジル樹脂をDCMで数回洗浄し、乾燥した。
ペプチジル樹脂1.51gを得た。
開裂、保護基除去及び粗生成物の精製は、出発ペプチジル樹脂1.0gで実施例１に記載したように実施した。95.9％のクロマトグラフィー純度（HPLC）で式IIIの化合物196mgを得た。
アミノ酸比:Ala  １（１）;Asp  1.99（２）;His  1.05（１）;Lys  0.97（１）;Thr  0.93（１）;Tyr  1.85（２）;Val  4.01（４）。
ペプチド含有率:71.1％。
FAB質量スペクトロスコピー:m/z1564.62［Ｍ−Ｈ］−。
実施例４
材料と手法
試薬、細胞、抗体。全試薬は特に指定しない限り、Sigma  Chemical  Co.から購入した。Sepharoseに共有結合したプロテインＡはPharmacia  LKB  Biotechnology  Inc.から購入した。全放射性同位体はAmersham  Corp.から購入した。A549肺癌細胞及びCOS−７細胞はATCC（CCL185）（American  Type  Culture  Collection）から購入し、５％CO2−水−飽和雰囲気中で10％ウシ胎児血清（Flow  Laboratories,Inc.）を補充したDMEM培地中で成長させた。Spodoptera  frugiperda（Sf9）細胞はATCC（CRL  1711）から入手し、SF−900培地（GIBCO  BRL）を使用して単層培養で成長させた。ヒトMET配列の19個のＣ末端アミノ酸に対応する合成ペプチドに対する抗血清及びモノクローナル抗Met抗体を誘発した（Prat,M.ら,Mol.Cell.Biol.11（12）:5954−5962（1991））。p85に対する抗体はOtsuら（Otsu,M.ら,Cell  65:91−104（1991））により記載されている。
実施例１〜３に記載した手順を使用して合成ホスホペプチドを合成した。
バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞中でHGF/SFレセプター及びp85  cDNAを発現。組換えHGF/SFレセプター及びp85バキュロウイルスを従来の記載通りに構築し（Bardelli,A.ら,Oncogene  ７:1973−1978（1992）;Otsu,M.ら,Cell  65:91−104（1991））、Sf9細胞に感染させるために使用した（Piwnica−Worms,H.ら,J.Virol.64:61−６（1990））。
GST−SH2ドメイン融合タンパク質。ポリメラーゼ連鎖反応によりウシPI  ３−キナーゼp85サブユニット（アミノ酸314−431及び612−722）のＮ−及びＣ−SH2ドメインを得、pGEX−２細菌発現ベクター（Smith,D.B.,及びJohson  K.S.,Gene  67:31−40（1988））にクローニングした。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）−SH2融合タンパク質をグルタチオン親和性クロマトグラフィーにより細菌溶解物から精製した（Panayotou,G.ら,EMBO  J.,11:4261−4272（1992））。Applied  Biosystems  420Aアナライザーでのアミノ酸解析を使用して組換えタンパク質の濃度を決定した。
MET  cDNAのCOS7細胞における特定部位の突然変異誘発及び発現。MET  cDNAのクローニングは既に報告されている（Ponzetto,C.ら,Oncogene  ６:553−559（1991）,EMBL  Data−Bank  reference  no  X54559）。ヌクレオチド2355から末端に向かう3'末端フラグメントをpSELECTTM−１にサブクローニングした。in  vitroオリゴヌクレオチド特定部位突然変異誘発システム（Altered  SitesTM in  vitro  Mutagenesis  System,Promega）を使用して特定部位突然変異誘発を実施した。Applied  Biosystem  391装置を使用してオリゴヌクレオチドを合成した。突然変異体クローンを配列決定（Pharmacia社のT7配列決定キット）により同定した。主要な後期アデノウイルスプロモーターを含むPMT2ベクターで適当なTyr−Phe突然変異を有する完全長MET  cDNAを再構築した。全プラスミドをリポフェクチン（GIBCO  BRL）によりCOS7細胞にトランスフェクトした。
in  vitro会合実験。感染から36時間後に、0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/mlロイペプチン、0.1TIU/mlアプロチニン及び１μg/mlペプスタチンを補充した緩衝液Ａ（10mMTris−HCl緩衝液（pH7.5）、10％グリセロール、１％  Triton  Ｘ−100、150mM  NaCl、5mM  EDTA）中で、組換えHGF/SFレセプターを発現するSf9細胞（約４×106細胞／点）を溶解させた。溶解物を15,000×ｇで４℃で15分間清澄化し、プロテインＡ−Sepharoseに結合した抗Met抗体と共に２時間インキュベーションすると、上清は免疫沈降した。免疫複合体を緩衝液Ａで３回、緩衝液Ｂ（10mM  Tris−HCl（pH7.4）、100mM  NaCl、1mM  EDTA）で１回、緩衝液Ｃ（25mM  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH7.2）、100mM  NaCl、5mM  MgCl2）で１回洗浄した。10μＭの非標識ATPと共に緩衝液Ｃ中で25℃で15分間インキュベートすることによりサンプルを予備リン酸化した後、1mMナトリウムオルトバナデートを補充した冷緩衝液Ａで３回洗浄した。従来の記載（Bardell,A.ら,Oncogene  7:1973−1978（1992））に従って固定レセプターとバキュロウイルス発現p85を会合させた。PI  ３−キナーゼホロ酵素による会合実験では、３日間血清飢餓させたA549細胞（約２×106細胞／点）をPI  ３−キナーゼ源として使用した。0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/mlロイペプチン、0.1TIU/mlアプロチニン及び１μG/MLペプスタチンを補充したMOPS緩衝液（20mM  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（pH7.5）、1mM  MgCl2、0.1mM  EDTA、200mMスクロース、1mMナトリウムオルトバナデート）中でA549細胞をダウンスホモジナイザーによりホモジナイズした。ホモジネートを100,000×ｇで20分間４℃で遠心分離した。ホスホペプチドがレセプターとの会合を阻止する能力を調べる際には、細胞溶解物をホスホペプチドと共に１時間４℃でプレインキュベートした後、固定化組換えHGF/SFレセプターと共にインキュベートした。会合後、免疫複合体を緩衝液Ａで３回、緩衝液Ｄ（0.5M  LiCl、10mM  Tris−HCl（pH7.6））で２回、緩衝液Ｂで２回洗浄した。ｉ）レセプター及び会合タンパク質をin  vitroキナーゼアッセイにより［γ−32P］ATPで標識、ii）ウエスタンイムノブロッティング、iii）PI  ３−キナーゼ活性アッセイの各操作によりレセプター免疫沈降物中のPI  ３−キナーゼのp85サブユニットの存在を決定した。
in  vivo会合実験。HGF/SF突然変異体を発現するトランスフェクトCOS7細胞を10分間37℃でHGF/SF（12ng/ml）で刺激し、1mMナトリウムオルトバナデートの存在下で緩衝液Ａ中で溶解させた。溶解物を15,000×ｇで４℃で15分間清澄化し、プロテインＡ−Sepharoseに結合したヒトタンパク質に対して特異的な抗Met抗体と共に２時間インキュベーションすると上清は免疫沈降した。複合体を緩衝液Ａで２回、緩衝液Ｄで２回、緩衝液Ｂで２回洗浄した。複合体中でレセプターに会合したPI  ３−キナーゼの存在をWhitmanら（Whitman,M.ら,Nature  315:239−242（1985））により記載されているようなPI  ３−キナーゼアッセイにより決定した。
in  vitroキナーゼアッセイ。10μCi［γ−32P］ATP（比活性7,000Ci/Mm;Amersham）の存在下で25℃で15分間、20μｌの緩衝液Ｃ中でレセプター会合タンパク質を標識した。プロテアーゼインヒビターを含まない氷冷緩衝液A1mlを加えることにより反応を停止した。サンプルを冷緩衝液Ａで３回洗浄した。標識した免疫複合物を沸騰Laemmli緩衝液でプロテインＡ−Sepharoseから溶離させた。次に上清を８％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）にかけた。
ウェスタンイムノブロッティング。会合後の免疫沈降物を沸騰Laemmli緩衝液に可溶化させ、８％SDS−PAGE上で分離し、ニトロセルロースフィルター（Hi−bond,Amersham）に電気移行させた。次にフィルターを指示抗体と共にインキュベートし、高強度化学ルミネセンスシステム（ELCTM,Amersham）により特異的結合を検出した。
トリプシンホスホペプチドマッピング。in  vitroリン酸化野生型及び突然変異体HGF/SFレセプターに対応する32P標識バンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、従来の記載（Ferracini,R.ら,J.Biol.Chem.266:19558−19564（1991））に従って処理した。トリプシンペプチド消化物を100％ジメチルホルムアミドに溶解し、HPLC充填用緩衝液（水中0.1％トリフルオロ酢酸）で50％まで希釈し、流速1ml/分で0.1トリフルオロ酢酸の存在下にアセトニトリル勾配（70分間に０→32％）を用いて逆相C2/C18  Superpack  Pep−Ｓカラム（Pharmacia）上で高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により分離した。溶出した放射能をRadiomatic  Ａ−100放射能流量検出器（Packard  Instrument  Co.）によりモニターした。対照として合成ペプチド（I24K,neosystsm  Laboratories）を上記と同様にHPLC上で分離し、214nmで分析した。I24KはMetタンパク質配列のイソロイシン1337〜リシン1360の24アミノ酸を含み、従って、リン酸化されていないという事実を除いては、該当予想トリプシンホスホペプチドに対応する。
BIAcoreを使用したY1349及びY1356とp85N−及びＣ−SH2ドメインとの相互作用の分析。BIAcoreバイオセンサーの構成及び動作原理の詳細は既に報告されている（Jonsson,U.ら,Biotechniques  11:520−527（1991）;Jonsson,U.,及びM.Malmquist.1992.In  F.Turner（編）,Advances  in  Biosensor,vol.2  JAI  Press,London（1992）;Karlsson,R.ら,J.Immunol.Meth.145:229−246（1991）。これらの実験で使用したSH2ドメインはSMARTクロマトグラフィーシステムでPharmaciaカラムを通して脱塩し、20mM  Hepes（pH7.4）、150mM  NaCl、3.4mM  EDTA、0.005％  Tween  20及び4mM  DTTから構成されるBIAcore泳動用緩衝液に緩衝液を交換した。20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）中の50μg/mlのアビジン（Boehringer）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及びＮ−エチル−N'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）（Pharmacia）の1:1混合物で活性化後にセンサーチップ表面に固定化した。
過剰の反応基をエタノールアミン（1.0M）でブロックした。ビオチン化ホスホペプチドY751（DMSKDESVDYVPMLDMK）を50秒間５μg/秒の流速でアビジンに注入した。比特異的に結合した材料を0.1％SDSの短パルス（４秒）で除去した。
GTS−SH2ドメイン融合タンパク質を一定範囲の濃度のHGF/SFレセプターホスホペプチドと混合し、25℃の一定温度で５μl/分で40秒間表面に注入した。表面に結合した材料を0.1％SDSの４秒パルスで除去し、バックグラウンドレベルに対するシグナルをもたらした。
結果
合成ホスホペプチドとの競合実験。初期の研究において本発明者らは、組換えHGF/SFレセプターとのin  vitro会合実験でp85又はPI  ３−キナーゼを競合阻害するために合成ホスホペプチドを使用した。ホスホペプチドはHGF/SFレセプターの細胞質部分中に存在する可能な全チロシンを含むように設計した。ホスホペプチドのリストは上記「発明の詳細な説明」の項に示した。16種のホスホペプチドは８アミノ酸長であり、Ｎ末端のホスホチロシン残基から開始した。１種のホスホペプチドは12アミノ酸長であり、２個のホスホチロシンを含んでいた。PDGFレセプターで実施された従来の研究によると、ホスホチロシンのすぐ下流に位置する４個のアミノ酸はSH2認識部位を決定するのに重要であることが示されている（Fantl,W.J.ら,Cell  69:413−423（1992））。
図１に示す実験では、本発明者らはp85タンパク質源として組換えバキュロウイルスに感染した感染細胞（Sf9）の溶解物を使用した（Otsu,M.ら,Cell  65:91−104（1991））。このような溶解物を適当に希釈し（材料と手法の項参照）、ホスホペプチド（10μＭ）の各々と共にプレインキュベートした後、HGF/SF組換えレセプターと共にインキュベートした。完全長ヒトMET  cDNAを有する組換えバキュロウイルスに感染させたSf9細胞の溶解物からレセプターを免疫沈降させた（Bardelli,A.ら,Oncogene  7:1973−1978（1992））。これらの細胞において、レセプターは完全に機能的な非開裂前駆物質（図中、METBac）の形態で大量に合成される（Bardelli,A.ら,Oncogene  7:1973−1978（1992））。レセプターをプロテインＡ  Sepharoseビーズに固定化し、冷ATPで予備リン酸化した。会合後、ビーズを洗浄し、複合体を［γ−32P］−ATPでリン酸化した。リン酸化反応中にレセプターとp85は標識され、こうしてSDS−PAGEで検出可能になる。図１は、ホスホペプチドの３種のみ即ちＨ−Tyr＊−Glu−Val−Met−Leu−Lys−Cys−Trp−OH、Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OH、Ｈ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OHのみがp85を有効に競合阻害したことを示す。
ホスホペプチドＨ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHもp85結合を完全に阻止し、ホスホペプチドＨ−Tyr＊−Cys−Pro−Asp−Pro−Leu−Tyr−Glu−OHは部分的にしか有効でなかった。図２に示す実験では、本発明者らはp85に対するこれらのホスホペプチドの相対親和性を概算するように試みた。10nM〜１μＭのホスホペプチドを使用した以外は、図１の実験と同様に実験を実施した。p85との競合阻害効率が最も高かったのはＨ−Tyr＊−Glu−Val−Met−Leu−Lys−Cys−Trp−OHであり、次いでＨ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OH、Ｈ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr−OH及びＨ−Tyr＊−Cys−Pro−Asp−Pro−Leu−Tyr−Glu−OHであった。
ホスホペプチドＨ−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OHは、P85に対する親和性がＨ−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−Cys−Val−Ala−OHと同等であると思われた。
p110触媒サブユニットとの相互作用はp85のコンホメーションに影響し得るので、これらの結果は複合体におけるp85のSH2ドメインの真の特性を反映しないと考えられる。この可能性を排除するために、本発明者らはPI  ３−キナーゼホロ酵素源としてA549細胞の溶解物を使用して同一種の競合実験を実施した。レセプター複合体中のPI  ３−キナーゼ活性を測定することによりホロ酵素と組換えレセプターとの会合を可視化した。図３は、p85を競合阻害し得ることが立証されたホスホペプチドが、３−キナーゼホロ酵素とHGF/SFレセプターとの結合をも妨害することを示す。特に、ホスホチロシン1349及び1356の両者を含むホスホペプチドは、これらの残基の一方しか含まないものよりも、HGF/SFレセプターからPI  ３−キナーゼホロ酵素を除去するのに有効であると思われる。
この第１組の実験の結果は、ホスホチロシン対1307−1313及び1349−1356から構成されるPI  ３−キナーゼの二重結合部位がHGF/SFレセプター中に存在する可能性を示唆している。Tyr740及びTyr751がPI  ３−キナーゼ結合部位を形成することがわかっているPDGFレセプターでは、１対のホスホチロシン残基が関与し得ることが立証されている（Fantl,W.J.ら,Cell  69:413−423（1992）;Kazlauskas,A.ら,Mol.Cell.Biol.12:2534−2544（1992））。
p85又はPI  ３−キナーゼホロ酵素とHGF/SFレセプターTyr−Phe突然変異体との会合。当業者に周知の常法に従って野生型レセプターcDNAの特定部位突然変異誘発により一連の構築物を作成した。これらの構築物をCOS7細胞で一時的に発現させ、対応するTyr−Pheレセプター突然変異体Phe1003、Phe1307、Phe1313、Phe1349、Phe1356及びPhe1365を得た。
単一アミノ酸置換以外に、いくつかの多重置換も行った。特に、本発明者らは競合実験の結果を更に解明するために必要な２種の二重部位突然変異体即ち突然変異体Phe1307-1313及び突然変異体Phe1349-1356を作成した。
図４は図１と同様の会合実験の結果を示し、この実験は（Sf9細胞を発現する）同一のp85源を使用すると共に野生型及び突然変異体HGF/SFレセプター源としてトランスフェクトCOS7細胞の溶解物を使用して実施した。トランスフェクトCOS7細胞は単鎖レセプター前駆物質とタンパク分解プロセッシングされた成熟形態とを1:1の比で発現する。会合反応後、サンプルを２分割し、別々にプロセッシングしてパネルＡ及びＢに示す結果を得た。パネルＡではレセプター及びp85の両者をキナーゼアッセイにより可視化した。このパネルは突然変異体レセプターが全て活性であり、同等量で存在することを示す。二重突然変異体Phe1349-1356を除く他の全突然変異体（特にPhe1307-1313）は依然としてp85と結合し、これをリン酸化する。パネルＢでは会合後にキナーゼアッセイを省略し、サンプルをSDS−PAGEで泳動させ、ニトロセルロースに移した。その後、p85に対して特異的なモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。この実験によると、突然変異体Phe1349-1356のみがp85に結合する能力を失ったことが確認される。パネルＡ及びＢを比較すると、突然変異体Phe1356は依然としてp85に結合可能であるが、リン酸化する能力は欠くと思われる。これは、このレセプター突然変異体との複合体において、p85が有効なリン酸化に適合するように正しく配置できないことを示している。
図５は、同様の結果がin  vivoでも得られることを示す。この実験では、HGF/SF刺激後にトランスフェクトCOS7細胞の溶解物からレセプターを免疫沈降させた。溶解及び免疫沈降は、レセプター脱リン酸化が生じないようにナトリウムオルトバナデートの存在下で実施しした。次に、Metタンパク質含有量を等しくしたレセプター免疫沈降物上でPI  ３−キナーゼアッセイを実施し、レセプターとの複合体中で共沈した内因性PI  ３−キナーゼの量を定量した。Phe1349-1356二重突然変異体のみが野生型レセプターに会合したものよりも低いPI  ３−キナーゼ活性で共沈した。Phe1349-1356二重突然変異体に結合した残留活性は恐らく、COS7細胞からの内因性Metタンパク質とのレセプター二量体の形成に起因すると思われる。この解釈は、キナーゼ不活性突然変異体（KT-、図５）でトランスフェクトしたCOS7細胞から得た免疫沈降物でも同一量の残留結合が存在するという事実により裏付けられる。
この第２組の実験の結果から、残基Y1349及びY1356はPI  ３−キナーゼとHGF/SFレセプターとの結合を媒介するが、残基Y1307及びY1313は媒介しないと考えられる。
野生型及び突然変異体レセプターのホスホペプチドマッピング。突然変異体レセプターを使用して得られた結果は、チロシン1349及び1356がin  vivoでリン酸化されることを意味する。これらの２つの残基を含むトリプシンペプチドに対応するような合成ペプチド（I24K）を構築した。このペプチドは回収を最良にするためには水性溶剤と有機溶剤を併用することが必要であり、分離に使用したHPLCカラムから非常に後期に溶出した（図６のパネルＡ参照）。in  vitroで予めリン酸化しておいた野生型レセプターから得たトリプシン消化物を同一手順で溶出させた処、非リン酸化I24Kペプチドと非常に近い時刻に溶出するピークが回収された（図６、パネルＢ）。この新規ピークは二重部位突然変異体（図６、パネルＣ）には存在せず、単一部位突然変異体（図示せず）では弱い。全レセプターはCOS7細胞で発現され、トリプシン消化前にin  vitroでリン酸化した。
これらの結果によると、チロシン1349−1356は確かにin  vitroリン酸化部位であり、図５に示す会合実験と組み合わせると、同一チロシン残基がin  vivoリン酸化部位にも存在することを示す有力な論拠となる。
p85のＮ−及びＣ−SH2ドメインに対するホスホチロシン1349及び1356の相対親和性の評価。p85分子における２つのSH2ドメインの存在と、PI  ３−キナーゼ結合を廃するためにHGF/SFレセプター中の２つのホスホチロシンを除去する必要から、各SH2ドメインが２つのチロシンの一方と相互作用するモデルが予想される（Kashishian,A.ら,EMBO  J.11:1373−1382;Kavanaugh,W.M.ら,Mol.Cell.Biol.12:3415−3424（1992））。
従って、p85のＮ及びＣ末端SH2ドメインに対する２種のホスホペプチドの相対親和性を測定することが有用である。本発明者らはまずBIAcore装置による生物特異的相互作用分析を使用してこれを実施しようと試みた（Jonsson,U.ら,Biotechniques  11:520−527（1991）;Jonsson,U.,及びM.,Malmquist.In  F.Turner（編）,Advances  in  Biosensors,vol.2  JAI  Press,London（1992）;Karlsson,R.ら,J.Immunol.Meth.145:229−246（1991））。しかしながら、直接又はビオチン化後にマトリックス固定化アビジンと結合することによりホスホペプチドをマトリックスにカップリングすると、有意応答はゼロになった。これは恐らく、これらのペプチド中のホスホチロシンがＮ末端に位置し、固定化がその結合能を妨げるという事実に起因すると思われる。そこで本発明者らは、ヒトPDGFレセプター中のホスホチロシン751（Y751）を含み且つ２つのSH2ドメインに対して高親和性を有することが示された固定化ホスホペプチドとSH2ドメインとの相互作用を阻止する能力を測定することにより、間接的に親和性測定を実施した。p85のＮ−及びＣ−SH2ドメインを一定範囲の濃度のMetホスホペプチドと混合し、固定化Y751ホスホペプチドに注入した。図７は、ホスホペプチドY751との結合の％阻害として表したこれらの測定の結果を示す。これらの相互作用の絶対親和性を得ることは不可能であるが、半最大阻害が観察される値を比較することにより、相対親和性に関する有用な情報が得られた。データの要約をパネルＣに示す。最高の見かけの親和性は、標準YXXMモチーフを含むY1313ホスホペプチドにより示される。非慣用結合部位YVXVを含むホスホペプチドY1349及びY1356は同様にp85  Ｎ−及びＣ−SH2ドメインとホスホペプチドY751との結合を阻害するがその濃度はもっと高い。全ホスホペプチド、特にY1313はＮ−SH2よりもＣ−SH2に対して高い親和性を示す。これらのデータは図２に示す実験から得られたデータに一致し、少なくともin  vitro及び本発明者らの実験条件下では新規結合モチーフTyr−Val−Xxx−Val（YVXV）がp85に対して標準コンセンサスの102分の１のオーダーの親和性を有することを示す。
実施例５
TPR−MET  tyr−Phe突然変異体の形質転換活性。
実施例４に記載した実験により、（METプロトオンコジーンによりコードされる）HGF/SFレセプターの1349及び1356位のチロシン残基は、PI  ３−キナーゼ及びおそらく付加的な細胞質トランスデューサーを補強及び活性化するのに関与するドッキング部位であることが確認された。永久的に活性化されるならば、トランスデューサーはマイトジェンシグナルの連続エフェクターとして機能し、こうして細胞の腫瘍遺伝子形質転換をもたらす。
腫瘍遺伝子形質転換に至るプロセスにおけるHGF/SFレセプターの1349及び1356位のチロシン残基の重要性を立証するために、本発明者らはMETプロトオンコジーンの永久活性化形態であるTPR−MET分子を利用した（Gonzatti−Hacesら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:21−25（1988））。TPR−METは、染色体１からのTPR配列と染色体７からのMET配列間のDNA転位により得られる。TR−MET産物は、NIH  3T3繊維芽細胞の形質転換に関与する構成的チロシンキナーゼ活性を有する。
特定部位突然変異誘発を介して、本発明者らはTPR−MET分子の1349及び1356位のチロシン残基をフェニルアラニンへと突然変異させた。
TPR−MET野生型プロトオンコジーン並びに突然変異形態TPR−MET−Phe1349、TPR−MET−Phe1356及びTPR−MET−Phe1349-1356を使用してフォーカス形成アッセイを実施した。このアッセイではpXMT2プラスミドにクローニングした種々のTPR−MET構築物でフィッシャーラット繊維芽細胞をリン酸カルシウムによりトランスフェクトした（Sambrookら,Molecular  Cloning.A  laboratory  manual（第２版）,16.22頁,Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（1989））。５％ウシ胎児血清を含有するDMEM中で細胞を成長させ、10日後にフォーカスを計数した。結果を下表に要約し、図８に図示する。
0003585044.tif 000003
上記表又は図８から明らかなように、Tyr1349、特にTyr1356の突然変異により形質転換フォーカスの数は著しく減少する。
更に、Tyr残基の双方をフェニルアラニンへと突然変異させると、TPR−METの形質転換活性は完全にゼロになる。
これらのデータは、マイトジェンシグナルの細胞内変換におけるこれらの部位の生物学的な重要性を更に立証するものである。
従って、細胞内トランスデューサーとHGF/SFレセプターのTyr1349及びTyr1356との結合を阻止することが可能な本発明のホスホペプチドは、腫瘍遺伝子形質転換の潜在的阻害剤である。
実施例６
材料と手法
細胞系。肺癌A549細胞及びCOS−１細胞は10％FCSを補充したRPMI培地で通常通りに培養した。10％FCSを補充したダルベッコの修正イーグル培地にPA317アンホトロピックウイルスパッケージング細胞系（Miller及びButtimore（1986）Mol.Cell.Biol.６:2895−2902）及びエコトロピックウイルスパッケージング細胞系Psi−２（Mannら（1983）Cell  33:153−159）を維持した。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清。細菌中で発現されたShc  SH2ドメインでウサギを免疫感作することにより、抗Shcポリクローナル抗血清を産生させた。PMLペプチドに対する抗TAG血清を製造した（Pandolfiら,Oncogene  ６:1285−1292（1991））。ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体はUpstate  Biotechnologyから購入した。ヒトMetタンパク質の19C末端アミノ酸に対応する合成ペプチドに対する抗Met抗体を誘発した（Data  Bank  reference  no.X54559）。
免疫沈降及びウェスタンブロッティング手順。血清飢餓及びSF/HGF処理したA549細胞から溶解物を調製した。新たに加えたプロテアーゼインヒビター（1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10mg/mlロイペプチン及び5mg/mlアプロチニン）を含有するPY緩衝液（20mM  Tris  HCl（pH7.8）,50mM  NaCl,50mM  NaF,30mM  Na4P2O7,5mM  EGTA,1mMナトリウムオルトバナデート、１％vol/vol  Triton  Ｘ−100）中で細胞を氷上で溶解した。溶解物を４℃に遠心分離により清澄化し、タンパク質濃度をBCA試薬（Pierce）により決定した。免疫沈降実験では、適当な抗体をプロテインＡ  Sepharose（Pharmacia）に吸着させた後、細胞溶解物と共に1.5時間４℃でインキュベートした。免疫複合体を氷冷NET緩衝液（50mM  Tris  Hcl（pH7.5）,150mM  NaCl,0.1％NP−40,1mM  EDTA（pH8.0）,0.25％ゼラチン）で３回洗浄し、溶離し、還元Laemmli緩衝液中で３分間95℃で加熱することにより変性させ、その後、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分離した。イムノブロットアッセイでは、特異的免疫沈降物又は20〜50mgの全細胞溶解物をSDS−PAGE後にニトロセルロースフィルターに移行させた。TBST（20mM  Tris−HCl（pH7.8）,150mM  NaCl,0.02％  Tween20）に溶解した２％脱脂粉乳との非特異的反応性をブロッキング（22℃で１時間インキュベーション）後、TBSTで希釈した特異抗体を用いてフィルターを２時間22℃でプローブした。十分に洗浄後、免疫複合体を西洋ワサビ−ペルオキシダーゼに結合した種特異的二次抗血清（Bio  Rad）、次いで高強度化学ルミネセンス反応（ECLTM,Amersham）で検出した。
cDNA特定部位突然変異誘発及び発現。MET  cDNAのクローニングは既に報告されている（Ponzettoら,Oncogene  ６:553−559（1991）,EMBL  Data−Bank  reference  no.X54559）。ヌクレオチド2355から末端に向かう3'末端フラグメントをpSELECTTM−１にサブクローニングした。in  vitroオリゴヌクレオチド特定部位突然変異誘発システム（Altered  SiteTM in  vitro  Mutagenesis  System,Promega）を使用して特定部位突然変異誘発を実施した。オリゴヌクレオチドはApplied  Biosystem  391装置を使用して合成した。突然変異体クローンは配列決定（PharmaciaのT7配列決定キット）により同定した。主要後期アデノウイルスプロモーターを含むPMT2ベクターで適当なTyr→Phe突然変異を有する完全長MET  cDNAを再構築した。全プラスミドをリポフェクチン（GIBCO  BRL）によりCOS1細胞にトラクスフェクトした。突然変異Y317→Ｆを有するShc  cDNAを哺乳動物発現ベクターLXSNにクローニングした。突然変異cDNAをPML  cDNAの162bpフラグメントとのインフレーム融合により外来エピトープで標識した（Pandolfiら，前出）。標識したcDNAは別の開始使用の結果として53及び58kDaのPML標識Shcタンパク質をコードする。この構築物の詳細な説明は別途報告されている（Salciniら，作成中）。リン酸カルシウムによりA549細胞中でネオマイシン耐性遺伝子で発現ベクターを同時トランスフェクトした。標識Shcタンパク質を発現する安定な細胞系をG418により選択した。
GST−融合タンパク質を使用するin  vitro結合試験。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して（ヌクレオチド256位〜ヌクレオチド551位の）そのSH2ドメインに対応するGrb2  cDNAの領域を単離し、細菌発現プラスミドpGEX−2TのBamHI−EcoRI部位にクローニングした（GST−Grb2）。GST、GST−Grb2又はGST−Shc（Segattoら,Oncogene  2105−2112（1993））を発現する細菌の培養物を、1mM  IPTGを含有するLB培地で３〜４時間37℃で成長させた。細菌を遠心分離し、TritonTMを含まない氷冷PY緩衝液1/100容量に再懸濁し、音波処理により溶解させた。Triton  Ｘ−100を１％まで加えた後、溶解物を遠心分離により除去した。組換えタンパク質をグルタチオンSepharoseTM（Pharmacia）で精製し、結合アッセイにそのまま使用した。各反応毎に、グルタチオンSepharoseに結合したGST、GST−Grb2又はGST−Shc約５μｇを、PY緩衝液中で調製した適当な細胞溶解物300mgと共に２時間４℃でインキュベートした。タンパク質複合体を氷冷PY緩衝液で５回洗浄し、溶離し、Laemmli緩衝液中で95℃で３分間加熱することにより変性させ、SDS−PAGEで分離し、イムノブロットにより分析した。
Shcタンパク質の過剰発現。LXSNレトロウイルスプラスミド（Millerら，（1989）;D.Millerから寄贈）のEcoRI制限部位にShcコーディング配列（Pelicciら,Cell  70:93−104（1992））をクローニングすることによりLSHCSNプラスミドを構築した。LXSN又はLSHCSNプラスミドをリン酸カルシウム沈降法によりPA317レトロウイルスプラスミドパッケージング細胞系のY2にトラクスフェクトした（Sambrookら,Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual,第２版,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,Cold,Spring  Harbour,NY（1989））。48時間後、Ｙ−２上清を使用してPA317に感染させた。次いで制限希釈条件下でG418を含有する培地で細胞を選択した。高レベルの外来Shc発現及びウイルス力価に基づいて１個のウイルス産生クローンを選択し、ターゲット細胞に感染させるために使用した。
BIAcore分析。BIAcore装置（Pharmacia）を使用してSH2ドメイン相互作用の動力学的測定を得るための基本操作原理及び方法は既に詳細に記載されている（Panayotouら,Mol.Cell.Biol.13:3567−3576（1993）,Ponzettoら,Mol.Cell.Biol.13:4600−4608（1993））。
精製GST−SH2ドメイン又は無傷のタンパク質をBIAcore作動用緩衝液（20mM  Hepes（pH7.4）,150mM  NaCl,3.4mM  EDTA,0.005％  Tween  20及び4mM  DTT）で脱塩し、アビジン固定化ビオチン化ホスホペプチド上に注入した。抗ホスホチロシン抗体の結合を測定することにより、固定化ホスホペプチドの量を標準化した。一定範囲のタンパク質濃度にわたって会合を測定し、結合した材料を緩衝液流中又は20μＭ競合非ビオチン化ホスホペプチドの注入後に解離させた。Applied  Biosystemアミノ酸アナライザーでアミノ酸解析によりペプチド及びタンパク質濃度を計算した。
細胞成長及び運動のアッセイ。10％FCS（Flow）を含有するDMEM培地中で96穴プレート（Costar）に2.5×103個の細胞を播種した。24時間後に培地を除去し、広範なSF/HGF濃度（１〜10ng/ml）の５％FCSを含有するDMEMに交換した。クリスタルバイオレットで染色後に比色アッセイ（Kuengら,Anal.Biochem.182:16−19（1989））により細胞数を推算し、ウェルをMicroplate  Reader（Model  3550,Bio−Rad）で595nmで読み取った。走化性試験に使用したブラインドウェルBoydenチャンバー及び無ポリビニルピロリドンカーボネートフィルター（13mm、孔径８μｍ）はNucleoporeから購入した。走化性アッセイは従来記載されているように実施した（Albiniら,Cancer  Research  47:3239−3245（1987））。細胞を５−［125I］ヨード−2'−デオキシウリジン（RPMI  1640培地＋10％FCS中３μCi/ml）で標識した。16〜20時間インキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、無FCS培地で３回洗浄した。無FCS培地に再懸濁した３×105個の細胞をBoydenチャンバーの上部に播種し、下部チャンバーにはSF/HGF（５〜40U/ml）を含むか又は含まない無FCS培地を加えた。Boydenチャンバーを５％CO2−水飽和雰囲気中で６時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後に、フィルターの上側に結合した細胞を機械的に除去し、下側に移動した細胞を含むフィルターを固定し、γ−カウンターで計数した。
結果
Shcタンパク質はSH2ドメインを介してチロシンリン酸化SF/HGFレセプターと結合する。
肺癌A549細胞は機能的SF/HGFレセプターと46、52及び66kDaの３つのShcアイソフォームとを発現する。チロシンリン酸化SF/HGFレセプター及びShcがin  vivoで安定な複合体を形成するか否かを試験するために、溶解物型SF/HGF処理細胞を抗Metで免疫沈降させ、抗Shc抗体でイムノブロットした。Shcタンパク質はSF/HGFレセプターと共沈した（図9A）。SF/HGFで処理したA549細胞の溶解物からの抗Shc免疫沈降物を抗レセプター（抗Met）抗体でプローブしたミラー実験でも同様の結果が得られた。Shcタンパク質はSF/HGFレセプターと共沈した（図9B）。これらの結果は、SF/HGFレセプターとShcがSF/HGF刺激細胞中で会合していることを立証するものである。
SF/HGFレセプターとShcタンパク質との会合がレセプターチロシンリン酸化に厳密に依存することを更に証明するために、野生型SF/HGFレセプター又はキナーゼ欠損レセプター突然変異体（Lys1110→Ａ）のcDNAを一時的に発現するCOS−１細胞溶解物を使用して同様の実験を行った。従来記載されているように（Longatiら，印刷中）、COS−１細胞で過剰発現される野生型レセプターはin  vivoで構成的にリン酸化されるが、キナーゼ不活性Lys1110→Ａ突然変異体はリン酸化されない（図10A及びＢ）。トランスフェクトしたレセプターと内因性Shcとの安定な複合体は、野生型チロシン−リン酸化レセプターを発現するCOS−１細胞でしか形成されなかった（図10C）。GST−融合タンパク質として細菌中で発現されるShc  SH2ドメインを使用してin  vitroで複合体を再構成することにより、Shc−SF/HGFレセプター相互作用も試験した。固定化Shc−SH2ドメインはSF/HGF処理A549細胞から可溶化したチロシン−リン酸化レセプターとの間で安定な会合を形成したが、対照細胞から可溶化した非リン酸化レセプターとは会合しなかった（図11A）。対照GSTタンパク質との間で実施した結合アッセイは陰性であった。これらの結果は、ShcのSH2ドメインが自己リン酸化SF/HGFレセプターとin  vitroで結合するために十分であることを示す。
Shcタンパク質はSF/HGFレセプターテールのホスホチロシンY1349及びY1356と結合する。
野生型及び突然変異体SF/HGFレセプターのホスホペプチドマッピングによると、レセプターのＣ末端テールに位置する２つの残基（Y1349及びY1356）はリガンド結合に応答してリン酸化されることが判明した（Ponzettoら,1993（前出））。これらのチロシンの一方又は両方をフェニルアラニンへと突然変異させた（Y1349→Ｆ、Y1356→Ｆ又はY1349'1356→Ｆ）レセプター突然変異体との会合実験により、Shcとの相互作用の媒介におけるこれらの部位の関与の可能性を検討した。従来報告されているように、これらの部位に個々に又は組み合わせて突然変異を有するレセプター分子は天然のチロシンキナーゼ活性を有する（Ponzettoら,1993（前出））。レセプター突然変異体を発現する構築物でCOS−１細胞をトランスフェクトし、抗Shc抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物を抗Metレセプター抗体でブロットした。単一突然変異体レセプターY1349→Ｆ又はY1356→Ｆが内因性Shcと会合する能力は、野生型レセプター又は該当（Y1003→Ｆ）突然変異を有する対照レセプターよりもほんの僅かに低かった。逆に、Y1349'1356→Ｆ二重突然変異体はShcタンパク質と結合する能力を完全に失った（図12）。
ShcのSH2ドメインとホスホチロシンY1349又はY1356との直接相互作用をリアルタイムバイオセンサー分析により確認した（Panayotouら，前出:Felderら,Mol.Cell.Biol.13:1449−1455（1993））。レセプターテール配列に由来する合成ホスホペプチドVNATY1356＊VNVKはShcのアフィニティ精製GST−SH2ドメインと特異的に結合した（図13）。ペプチドIGEHY1349＊VHVNでも同様の結果が得られた。どちらの場合も解離速度定数（Kdiss）と会合速度定数（Kass）の比から計算した親和性定数は著しく高く、正確に決定することができなかった。
これらのデータは、ShcがSF/HGFレセプターテールのチロシン1349又はチロシン1356に低親和性で結合することを示す。
Shcタンパク質の過剰発現はSF/HGFに対するモートジェン応答を増大させる。
SF/HGFは、刺激後にブラインドウェルBoydenチャンバーのフィルターを通って移動する上皮細胞のモートジェンである（Giordanoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:649−653（1993））。A549細胞でタンパク質を過剰発現させることにより、モートジェン応答に及ぼすShcの効果を調べた。Shc  cDNAを有するアンホトロピックレトロウイルスを細胞に感染させ、抗Shc抗体を用いるウェスタンブロット分析により多数の異なる感染大細胞集団から高レベルのShc発現を選択した。
Shcタンパク質を過剰発現するA549細胞のモートジェン応答は対照非感染細胞又はベクター単独に感染した細胞で誘起されるよりも著しく高かった（図14、下部パネル）。試験した全リガンド濃度でShcを過剰発現する細胞によりSF/HGFに対する高い応答が観察された（図14、上部パネル）。
細胞計数又はチミジン取り込みによりマイトジェン応答を測定した。A549細胞におけるShc過剰発現はSF/HGF又は血清に応答して細胞成長に何らの効果も及ぼさなかった。更に、RasでのSF/HGF誘発グアニンヌクレオチド交換活性を従来記載されている通りに（Grazianiら,J.Biol.Chem.268:9165−9168（1993））測定した処、この活性も外因性Shcの過剰発現によりさほど影響されなかった。
Shcタンパク質はSF/HGFレセプターとの結合後にY317上でリン酸化される。
ShcがSF/HGFレセプターキナーゼの活性化に応答してリン酸化されるか否かを決定するために、A549細胞を組換えSF/HGFで刺激し、溶解させ、抗Shcで免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いてイムノブロットした。５分間刺激後にp46Shc、p52Shc及びp66Shcのチロシンリン酸化の著しい増加をA549細胞で検出することができ（図9C）、これは、ShcがSF/HGFレセプターの基質であることを示す。SF/HGFレセプターでトランスフェクトしたCOS−１細胞で同様の実験を実施した。野生型（構成的に活性な）レセプターキナーゼを過剰発現する細胞において、内因性Shcタンパク質はチロシンリン酸化された。他方、ShcはLys1110→Ａキナーゼ陰性レセプターでトランスフェクトしたCOS−１細胞ではリン酸化されなかった（図10D）。
ホスホペプチドマッピング及び突然変異分析によると、EGFで処理した細胞におけるShcの主要リン酸化部位はY317であることが判明した（Salciniら，作成中）。同一残基がSF/HGF処理後もリン酸化されることを確認するために、Y317→Ｆ突然変異を有する標識SHC  cDNAをA549細胞に発現させた。これらの細胞では、SF/HGF処理後に抗標識抗体により選択的に免疫沈降したY317→Ｆ突然変異体はチロシンでリン酸化されなかった（図9D）。
Y317上でリン酸化されたShcタンパク質はGrb2“アダプター”との特異的複合体を形成する。
抗Grb2抗体と抗Shcとの免疫沈降物のウェスタンブロットをプローブすることにより、SF/HGFがSF/HGF刺激後にA549細胞中でShc−Grb2複合体の形成を開始する可能性を試験した。図9Eに示すように、SF/HGFに応答してリン酸化されるShcタンパク質はGrb2と会合する。この会合は、（GST融合タンパク質として細菌中で発現される）Grb2の固定化SH2ドメインと、対照又はSF/HGF刺激A549細胞から調製した細胞質溶解物とを使用するin  vitro実験により示されるように、Grb2のSH2ドメインにより媒介される。Grb2融合タンパク質と結合するShcの量はSF/HGF刺激後に著しく増加する（図11B）。
Grb2  GST−SH2融合タンパク質と固定化チロシンリン酸化ShcペプチドDDPSY317＊VNVQとのリアルタイム結合を測定するためにバイオセンサーを使用して動力学的パラメーター及び平衡解離定数又はこの相互作用を得た（図15）。得られたデータを使用して図15Cに示すようにKass（2.6×105M-1s-1）を計算した。Kdissは再結合を阻止するように緩衝液中と競合ホスホペプチドの存在下との両方で測定した。図15Bに示すように、競合ホスホペプチドの添加は他のSH2ドメイン−ホスホペプチド相互作用で従来観察されているように（Panayotouら,1993（前出）;Felderら,1993（前出））解離速度に劇的な効果があった。得られたKdissの値は0.04S-1であり、総親和性は153nMであった。
これらのデータは、SF/HGFに応答するチロシンY317上のShcタンパク質のリン酸化がGrb2“アダプター”の高親和性ドッキング部位の形成を決定することを示す。こうして、リン酸化Shcタンパク質は活性化SF/HGFレセプターとGrb2の架橋分子として機能し得る。注目すべき点として、Grb2のShcドッキング部位のアミノ酸配列Y317VNVは、SF/HGFレセプターテールに位置する配列Y1356VNVと同一であり（図16）、該配列はリガンド刺激後にGrb2と直接結合することが示されている（Ponzettoら，出願中）。
Shcはコンカタマーを形成しない。
Shc配列Y317VNVはSF/HGFレセプター中に存在する２つのShc結合部位の一方と同一である（図16）。この所見は、Shcが別のShc分子のホスホチロシンY317と結合することによりコンカタマーを形成し得ることを示唆している。バイオセンサーを使用して、ShcSH2ドメインとShc分子上に存在するホスホペプチドDDPSY317VNVQとの結合と、ShcSH2ドメインとSF/HGFレセプター上に存在するホスホペプチドVNATY1356VNVKとの結合とを比較した。Shc−SH2はSF/HGFレセプターに由来するホスホペプチドよりもShcに由来するホスホペプチドとの結合が著しく弱かった（図13）。これらのデータは、（Shcにおける）Y317及び（SF/HGFレセプターにおける）Y1356のＮ末端のアミノ酸がShcのSH2ドメインにより認識されることを示すものである。従って、Shc−Shc会合はin  vivoでは好ましくなく、Shcホスホチロシン残基Y317はコンカタマーの形成を媒介するよりも他の分子と結合するのに利用される。
結論
結論として、Shcのドッキング部位（Y317VNV）を含む例えば４〜20アミノ酸長を有するペプチド、特にペプチドＨ−Asp−Asp−Pro−Ser−Tyr＊−Val−Asn−Val−Gln−OH（DDPSY＊VNVQ）及び肝細胞成長因子レセプターのTyr1356認識モチーフ（Y1356VNV）を含む例えば４〜20アミノ酸長を有するペプチド、特にペプチドＨ−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OH（VNATY＊VNVK）（式中、Tyr＊（Ｙ＊）はリン酸化又は非リン酸化チロシン残基を表す）は、Grb2−SH2ドメインと結合することが可能である。従ってこれらのペプチドはGrb2タンパク質と、活性化肝細胞成長因子レセプター（HGF/SFレセプター）、PDGFレセプター、EGFレセプターのようなチロシンリン酸化レセプター又はShcもしくはIRS−タンパク質のような他のシトソールチロシンリン酸化トランスデューサーとのSH2会合を競合阻止し、細胞分裂促進、ひいては腫瘍増殖を阻止するために有用である。
他方、肝細胞成長因子レセプターのTyr1356又はTyr1349認識モチーフ（夫々Y1356VNV又はY1349VHV）を含むペプチド、特に上記ペプチドＨ−Val−Asn−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OH（VNATY＊VNVK）及びペプチドＨ−Ile−Gly−Glu−His−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−OH（IGEHY＊VHVN）、又は上記チロシン残基のいずれをも含むペプチド、例えばＨ−Ile−Gly−Glu−His−Tyr＊−Val−His−Val−Asn−Ala−Thr−Tyr＊−Val−Asn−Val−Lys−OH（IGEHY＊VHVNATY＊VNVK）（式中、Tyr＊（Ｙ＊）はリン酸化又は非リン酸化チロシン残基を表す）はShc−SH2ドメインと結合することが可能である。従って、これらのペプチドはShcタンパク質と、例えば活性化肝細胞成長因子レセプター、EGFレセプターのようなチロシンリン酸化レセプター又はIRS−１もしくはシトソールチロシンキナーゼ（例えばSrc）のような他のシトソールチロシンリン酸化トランスデューサーとのSH2会合を競合阻止し、細胞分裂促進、特に細胞運動促進を阻止し、従って、腫瘍細胞の伝播を阻止するのに有用である。従って、これらのペプチドは抗腫瘍及び抗転移作用を有する。
上述のように、本発明のペプチドはプロドラッグとして非リン酸化形態で投与すると有利であり得、この場合、ペプチドは薬理的作用を及ぼす細胞の内側でそのリン酸化形態に生化学的に変換され得る。
【図１】
0003585044.tif 000004
【図３】
0003585044.tif 000005
【図２】
0003585044.tif 000006
【図４】
0003585044.tif 000007
【図５】
0003585044.tif 000008
【図６】
0003585044.tif 000009
【図７】
0003585044.tif 000010
【図８】
0003585044.tif 000011
【図９】
0003585044.tif 000012
【図１０】
0003585044.tif 000013
【図１１】
0003585044.tif 000014
【図１２】
0003585044.tif 000015
【図１３】
0003585044.tif 000016
【図１４】
0003585044.tif 000017
【図１５】
0003585044.tif 000018
【図１６】
0003585044.tif 000019