【手続補正書】
【提出日】平成27年1月19日(2015.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電粒子システムであって、
試料の上に荷電粒子ビームを指向させる荷電粒子光学カラムと、
前記荷電粒子ビームの衝撃により前記試料から放出される二次電子を収集する二次電子検出器と、
前記試料から放出される光を検出する光検出器と、
導電性ミラーと、を備え、
前記導電性ミラーが、
前記試料から放出された前記光を前記光検出器に向けて反射させ、
前記試料からの前記二次電子を前記二次電子検出器へ偏向させる電界を与えるように構成されることを特徴とする荷電粒子システム。
【請求項２】
前記試料は、蛍光マーカーを含み、
前記導電性ミラーは、前記蛍光マーカーによって放出される蛍光を前記光検出器に向けて反射させるように構成されることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子システム。
【請求項３】
前記試料中の前記蛍光マーカーを励起する光源を備え、
前記導電性ミラーは、前記光源からの光を、前記試料に対する前記荷電粒子ビームの衝撃点を含む前記試料の領域へ指向させるように構成されることを特徴とする請求項２に記載の荷電粒子システム。
【請求項４】
前記導電性ミラーと前記光検出器との間に配置されるビームスプリッタを備え、
前記ビームスプリッタが、
前記導電性ミラーによって反射された前記蛍光を光検出器へ伝搬させ、
前記光源から前記導電性ミラーに向けて光を反射させるように構成されることを特徴とする請求項２又は３に記載の荷電粒子システム。
【請求項５】
前記ビームスプリッタと前記光検出器との間に配置されるカラーフィルタを備え、
前記カラーフィルタの透過率は、前記光源からの光の透過をほとんど遮断するが、前記蛍光マーカーによって放出される蛍光を通過させるように調整されることを特徴とする請求項４に記載の荷電粒子システム。
【請求項６】
前記蛍光マーカーは、標的遺伝子に連結された遺伝子によって発現される蛍光マーカー、又は特定の細胞内構成要素に選択的に付けられる無機蛍光マーカーを含むことを特徴とする請求項２乃至５の何れか１項に記載の荷電粒子システム。
【請求項７】
前記光検出器は、複数の検出器を備え、前記複数の検出器における各検出器が特定の種類の蛍光マーカーからの蛍光を収集するように構成されることを特徴とする請求項２乃至５の何れか１項に記載の荷電粒子システム。
【請求項８】
前記導電性ミラーは、前記試料の領域からの光を収集するための放物面鏡であって、焦点が前記荷電粒子ビームの前記衝突点の近傍にあることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の荷電粒子システム。
【請求項９】
前記試料から放出される光及び二次電子の両方についての収集立体角がπ／２ステラジアンより大きいことを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の荷電粒子システム。
【請求項１０】
前記光検出器及び前記導電性ミラーが前記試料の上方に配置され、
前記試料の下方に配置される透過電子検出器と、
前記試料から放出される光を検出する第２光検出器と、
前記試料と前記透過電子検出器との間に配置される第２ミラーとを備え、
前記第２ミラーは、前記試料に対する前記荷電粒子ビームの衝突点の近傍に位置する焦点を有し、前記試料から放出された光を前記第２光検出器に向けて反射させるように構成されることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の荷電粒子システム。
【請求項１１】
前記第２光検出器は、前記試料から放出される蛍光を検出し、
前記第２ミラーは、前記蛍光を反射するように構成されることを特徴とする請求項１０に記載の荷電粒子システム。
【請求項１２】
荷電粒子ビームシステムにおいて試料からの荷電粒子及び光を収集する装置であって、
荷電粒子ビームが通過する間隙を有するミラーであって、前記試料から光検出器へ光を反射させるように構成されたミラーと、
前記試料からの粒子を検出する荷電粒子検出器と、
前記ミラーと前記試料との間に電界を形成するように、前記荷電粒子検出器の入口に加えて、電気的にバイアスされ、その電界が前記試料からの荷電粒子を前記ミラーに衝突しないように妨げ、前記試料からの前記荷電粒子を前記荷電粒子検出器に向けて偏向させる導電体と、を備えることを特徴とする装置。
【請求項１３】
前記荷電粒子検出器は、前記荷電粒子ビームが前記ミラーから出射される位置より下方の平面に配置されることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記ミラーの導電部が前記ミラーと前記試料との間に前記電界を形成する前記導電体を備えることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記導電部が金属反射層を備えることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
試料中の蛍光マーカーを局在化する方法であって、
蛍光マーカーを励起させるように、導電性の第１ミラーによって前記試料の上に集束するよう前記試料に光を照射し、
荷電粒子ビームをパターンで試料表面上に指向させ、前記荷電粒子を試料において前記光の照射領域より小さい領域に衝突させ、
前記荷電粒子ビームを通過させる開口を有する前記第１ミラーによって検出器に向けて反射された前記蛍光マーカーから放出された光を検出し、
前記荷電粒子ビームが衝突したとき前記蛍光マーカーの少なくとも一部で蛍光が減少するように、前記荷電粒子ビームを前記試料の表面を横切るパターンで移動させ、
前記試料上への前記荷電粒子ビームの衝突によって生じた前記試料からの荷電粒子を前記第１ミラーから離れて前記検出器に向けて偏向させ、
前記荷電粒子ビームのパターン中の既知の位置から、前記試料中の前記蛍光マーカーからの光放出の合計において減少が検知された場合、前記蛍光マーカーの位置を決定することを特徴とする蛍光マーカー局在化方法。
【請求項１７】
前記荷電粒子ビームの画像上に重ね合わされた蛍光マーカーの位置を含む、前記荷電粒子ビームに基づく画像を表示することを特徴とする請求項１６に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項１８】
前記蛍光マーカーは、遺伝的な発現マーカーを備えることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項１９】
前記遺伝的な発現マーカーが緑色蛍光タンパク質を備えることを特徴とする請求項１８に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２０】
前記蛍光マーカーは、特定の細胞内構成要素に選択的に付着することが可能な機能化された無機蛍光マーカーを備えることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２１】
前記荷電粒子ビームが、電子ビーム又は集束イオンビームを備えることを特徴とする請求項１６乃至２０の何れか１項に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２２】
前記蛍光マーカーから放出される光を検出する際、前記試料内の複数の種類の蛍光マーカーからの光を別々に検出することを特徴とする請求項１６乃至２１の何れか１項に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２３】
前記荷電粒子検出器は、前記試料の前記第１ミラーと同じ側にあって、前記第１ミラーの下方に配置されることを特徴とする請求項１６乃至２２の何れか１項に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２４】
前記試料からの荷電粒子を前記第１ミラーから離れて前記検出器に向けて偏向させる際は、前記第１ミラー上に電気的なバイアスを提供することを含むことを特徴とする請求項１６乃至２３の何れか１項に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２５】
前記試料から放出された光が、前記試料に関して前記第１ミラーとは反対側にある第２ミラーによって収集されることを特徴とする請求項１６乃至２４の何れか１項に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２６】
格納された画像データの処理において、
前記画像データを平滑化関数と組み合わせて平滑化画像データを生成し、
前記平滑化画像データを導関数と組み合わせて導関数画像データを生成し、
前記導関数画像データの局所的な最小の位置を特定し、
前記局所的な最小の値を所定の最大しきい値と比較し、
前記局所的な最小の値が前記しきい値より低い場合、前記荷電粒子ビームの位置に対応する画像の位置を示す標示を前記画像上に表示することを特徴とする請求項１７に記載の蛍光マーカー局在化方法。
【請求項２７】
試料を分析する方法であって、
荷電粒子ビームをパターンで前記試料の表面上に指向させ、
前記荷電粒子ビームを通過させる開口を有するミラーによって検出器に向けて反射された前記試料からの光を検出し、
二次電子を前記ミラーから離れて偏向させるように、前記ミラー又は前記ミラーから離れた導電体に電気的なバイアスを印加し、
荷電粒子検出器に電気的なバイアスを印加し、
前記荷電粒子検出器によって前記二次電子を検出することを特徴とする試料分析方法。
【請求項２８】
前記試料の下方で、さらに電子を検出することを特徴とする請求項２７に記載の試料分析方法。
【請求項２９】
前記試料の下方で、さらに光を検出することを特徴とする請求項２７又は２８に記載の試料分析方法。
【請求項３０】
格納された画像データに対する画像処理方法であって、
試料の領域を横切るパターンで荷電粒子ビームを指向させ、
前記荷電粒子ビームの衝突により前記試料から放出された荷電粒子を検出して荷電粒子画像信号を生成し、
前記荷電粒子画像信号を用いて荷電粒子ビーム画像を生成し、
前記試料の領域から放出された光を検出し、画像曲線を形成する時間にかけて前記検出した光信号を増幅させ、
前記画像曲線を平滑化関数に畳みこんで平滑化画像データを生成し、
前記平滑化画像データを導関数と組み合わせて導関数画像データを生成し、
前記導関数画像データの局所的な最小に対応する値、及び前記導関数画像データの局所的な最小に対応する前記荷電粒子ビームの位置を決定し、
前記局所的な最小の値を所定の最大しきい値と比較し、
個々の局所的な最小の値が前記しきい値より低い場合、前記荷電粒子ビーム画像上に標示を表示することを備える画像処理方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の一実施形態によれば、荷電粒子システムは、蛍光マーカーを含む試料の上に荷電粒子ビームを指向させる荷電粒子光学カラムと、前記荷電粒子ビームの衝撃により前記試料から放出される二次電子を収集する二次電子検出器と、前記試料中の前記蛍光マーカーを励起する光源と、前記試料中の前記蛍光マーカーから放出される蛍光を検出する光検出器と、導電性ミラーと、を備え、前記導電性ミラーが、前記光源からの光を前記荷電粒子ビームの衝撃点を含む前記試料の領域へ指向させ、前記蛍光マーカーから放出された前記蛍光を前記光検出器に向けて反射させ、前記試料からの前記二次電子を前記二次電子検出器へ偏向させる電界を与えるように構成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
一実施形態において、荷電粒子システムは、さらに前記ミラーと前記光検出器との間に配置されるビームスプリッタを備え、前記ビームスプリッタが、前記ミラーによって反射された前記蛍光を光検出器へ伝搬させ、前記光源から前記ミラーに向けて光を反射させるように構成される。また、一実施形態において、さらに前記ビームスプリッタと前記光検出器との間に配置されるカラーフィルタを備え、前記カラーフィルタの透過率は、前記光源からの光の透過をほとんど遮断するが、前記蛍光マーカーによって放出される蛍光を通過させるように調整される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
一実施形態において、蛍光マーカーは、標的遺伝子に連結された遺伝子によって発現される蛍光マーカー、又は特定の細胞内構成要素に選択的に付けられる無機蛍光マーカーを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、荷電粒子ビームシステムにおいて試料からの荷電粒子及び光を収集する装置は、荷電粒子ビームが通過する間隙を有するミラーであって、前記試料から光検出器へ光を反射させるように構成されたミラーと、前記試料からの粒子を検出する荷電粒子検出器と、前記ミラーと前記試料との間に電界を形成するように電気的にバイアスされ、その電界が前記試料からの荷電粒子を前記ミラーに衝突しないように妨げ、前記試料からの前記荷電粒子を前記荷電粒子検出器に向けて偏向させる導電体と、を備える。