(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防しまたはウイルスの複製を制御するための医薬組成物であって、細胞膜に発現しているＣＤ４０と結合することができる組成物を、ＣＤ４０発現細胞を刺激するのに十分な量で含んでなり、ここにおいて、該組成物と細胞表面にあるＣＤ４０との結合は該細胞に対して刺激シグナルを生じるものであり、それによって、潜伏ウイルスの再活性化が予防されまたはウイルスの複製が制御され、さらに前記組成物が、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合するアゴニスト抗体、または細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の部分配列からなる組成物、を含んでなる、上記医薬組成物。
【請求項２】
前記細胞が免疫系の細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記細胞が上皮細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
個体が哺乳動物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
個体が免疫無防備状態である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
個体がヒト免疫不全ウイルスに感染している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
個体が免疫抑制されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
製薬上許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ウイルスがヘルペスウイルス科ウイルスである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヘルペスウイルス科ウイルスが、アルファヘルペスウイルス亜科ウイルス、ベータヘルペスウイルス亜科ウイルス、またはガンマヘルペスウイルス亜科ウイルスである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アルファヘルペスウイルス亜科ウイルスが、ヒトヘルペスウイルス１型、ヒトヘルペスウイルス２型、またはヒトヘルペスウイルス３型の水痘帯状疱疹ウイルスである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ベータヘルペスウイルス亜科ウイルスが、ヒトヘルペスウイルス５型のサイトメガロウイルスまたはヒトヘルペスウイルス６型のバラ疹ウイルスである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ガンマヘルペスウイルス亜科ウイルスが、リンホクリプトウイルス属である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
リンホクリプトウイルス属がヒトヘルペスウイルス４型のエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヘルペスウイルス科ウイルスがヒトヘルペスウイルス８型のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスまたはリスザルヘルペスウイルス（ＨＶＳ）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
医薬組成物および印刷物を含んでなるキットであって、該医薬組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合するアゴニスト抗体、または細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の部分配列からなる組成物、および製薬上許容される賦形剤を含んでなり、ここにおいて、該抗体または該組成物は細胞表面にあるＣＤ４０に結合して、該細胞に対して刺激シグナルを生じるものであり、さらに印刷物は該医薬組成物を使用するための説明書を含んでなり、ここにおいて、該説明書は潜伏ウイルスの再活性化を予防しまたはウイルスの複製を制御するための該医薬組成物の使用を指示するものである、上記キット。
【請求項１８】
個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防しまたはウイルスの複製を制御するために、抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ処理する方法であって、
（ａ）細胞膜に発現しているＣＤ４０と結合することができる組成物を提供すること、ここにおいて、該組成物と細胞表面上にあるＣＤ４０との結合は、細胞に対して刺激シグナルを発すること、
（ｂ）ＣＤ４０を発現している抗原提示細胞を提供すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の抗原提示細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させて、結果的に該抗原提示細胞を刺激すること、
を含んでなり、ここにおいて、刺激したＣＤ４０発現抗原提示細胞を個体に投与すると、該個体において潜伏ウイルスの再活性化が予防されまたはウイルスの複製が制御され、さらに前記組成物が、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合するアゴニスト抗体、または細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の部分配列からなる組成物、を含んでなる、上記方法。
【請求項１９】
ＣＤ４０発現抗原提示細胞がヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ４０発現抗原提示細胞がｉｎ ｖｉｖｏ源から単離されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ４０発現抗原提示細胞がヒトから単離されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
刺激したＣＤ４０発現抗原提示細胞が、それを単離したもとの同一個体に投与されるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞において潜伏ウイルスの再活性化を予防しまたはウイルスの複製を制御するための方法であって、
（ａ）細胞膜に発現しているＣＤ４０と結合することができる組成物を提供すること、ここにおいて、該組成物と細胞表面にあるＣＤ４０との結合は、細胞に対して刺激シグナルを発すること、および
（ｂ）ウイルスに感染したＣＤ４０発現細胞を、細胞を刺激することが可能な量の該組成物とｉｎ ｖｉｔｒｏ接触させ、それによって、細胞において潜伏ウイルスの再活性化を予防しまたはウイルスの複製を制御すること、
を含んでなり、前記組成物が、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合するアゴニスト抗体、または細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の部分配列からなる組成物、を含んでなる、上記方法。
【請求項２４】
前記細胞が免疫系の細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が上皮細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が抗原提示細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原提示細胞が樹状細胞、マクロファージ、またはＢリンパ球である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体としてウイルス学および医学に関する。詳細には、本発明は、個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、またはウイルスの複製を制御するための方法を提供する。本発明は、抗ＣＤ４０抗体や可溶性ＣＤ４０リガンドのようなＣＤ４０リガンドを、感染症においてＣＤ４＋ Ｔ細胞の代用として使用すること、および、より詳細には、ウイルスの再活性化を予防もしくは阻害し、またはウイルスの複製を制御するために、ＣＤ４０リガンド（可溶性ＣＤ４０リガンドおよび抗ＣＤ４０抗体）を使用することに関する。
【０００２】
発明の背景
慢性または持続感染は特定の個体、特に免疫系が十分に機能しない個体、たとえばヘルパーＴ細胞画分を欠く個体に重大な脅威をもたらす。機能性ヘルパーＴ細胞画分がない場合、細胞性免疫と体液性免疫の両方が損なわれる。個体は、遺伝的欠陥や疾病のために、たとえば癌の化学療法のような治療の副作用として、または臓器もしくは組織移植後の移植片拒絶を防ぐための免疫抑制のような、治療の意図した結果として、免疫無防備状態であることがある。
【０００３】
潜伏ウイルスの再活性化は、このような免疫抑制状態または免疫無防備状態でおこりうる。ウイルス再活性化は、結果としてさまざまな重大な疾病を上記の患者集団にもたらす可能性がある。現行の抗ウイルス薬（たとえばアシクロビルおよびホスカルネット）はウイルスの複製に必要な単一の酵素を標的とする。こうした薬剤に対するウイルスの耐性は生じやすく、毒性は高い。
【０００４】
ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）スーパーファミリーのリガンドおよび受容体に属する。このスーパーファミリーを構成するメンバーは、先天性および後天性免疫において数多くの役割を担い、上記ファミリーの一部のメンバーは共刺激活性を有する。ＣＤ４０は抗原提示細胞上に存在するが、抗原提示細胞はたとえば、Ｂ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞を包含する。ＣＤ４０Ｌは活性化されたＣＤ４０ Ｔ細胞上に存在する。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用がＢ細胞の増殖、Ｉｇクラスのスイッチング、生存および記憶に関与することが知られている。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＣＤ４０分子を刺激する抗体または同様の試薬を用いて持続感染および再発性感染、特にウイルス感染、を治療するための新規免疫療法のアプローチを包含する。こうしたアプローチは、免疫無防備および免疫不全の患者（たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者）に慢性感染を引き起こすヒトウイルスに対して重要な臨床的価値がある。免疫無防備および免疫不全の個体で慢性感染の原因となりうるウイルスとしては、たとえばヘルペスウイルスが挙げられるが、これにはサイトメガロウイルス（ＨＨＶ−５）、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−３）、エプスタインバールウイルス（ＨＨＶ−４）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＨＶ−１）および２（ＨＨＶ−２）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）がある。
【０００６】
本発明は、個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための方法に関するものであり、該方法は、（ａ）細胞膜に発現しているＣＤ４０に結合可能な組成物を提供すること、ここで、該組成物と細胞表面ＣＤ４０との結合は細胞に対して刺激シグナルを発すること；（ｂ）ＣＤ４０を発現している細胞を刺激するために十分な量の組成物を個体に投与し、それによって個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルス複製を制御すること、を含んでなる。
【０００７】
上記方法のある実施形態において、上記組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する抗体、または抗ＣＤ４０抗体の部分配列（この部分配列は細胞表面のＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む）からなる組成物、を含みうる。別の実施形態では、上記組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する可溶性ＣＤ４０リガンドポリペプチド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（この部分配列は細胞表面のＣＤ４０と特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含む）からなる組成物を含みうる。また別の実施形態では、該組成物は、細胞表面のＣＤ４０と特異的に結合する合成の小分子（たとえば有機分子）またはコンビナトリアルライブラリーから得られた分子を含んでなる。
【０００８】
本発明の方法は、ＣＤ４０を発現するあらゆる細胞を刺激することを含んでなる。もう一つの実施形態において、刺激を受けるＣＤ４０発現細胞は免疫系の細胞、および上皮細胞である。免疫細胞の例として、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗原提示細胞（たとえば、マクロファージ、樹状細胞、単球）を挙げることができる。
【０００９】
本発明の方法において、個体とは、たとえばヒトを含む哺乳動物とすることができる。その個体は過去にウイルス感染したことを知ることができるか、または過去のウイルス感染を疑うことができる。このようなヒト、もしくは患者は、たとえばＨＩＶ−１のようなヒト免疫不全ウイルスなどに感染した個体のように、免疫無防備状態である可能性がある。別の実施形態では、個体は、たとえば感染や疾病のために、放射線や癌の化学療法のような治療の副作用として、または組織もしくは臓器移植を補助するために免疫抑制状態を引き起こすといった治療の意図した結果として、免疫が抑制されている。
【００１０】
本発明の方法において、個体への投与に許容されるあらゆる方法で、たとえば製薬上許容される賦形剤をさらに含んでなる医薬組成物として、本発明の組成物を製剤化することができる。
【００１１】
本発明の方法においては、潜伏ウイルスの再活性化を予防し、あらゆる潜伏ウイルスの複製を制御するために上記組成物を投与する。ある実施形態において、ウイルスは、ヘルペスウイルス科のウイルスであって、これにはたとえばアルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、またはガンマヘルペスウイルス亜科のウイルスがある。アルファヘルペスウイルス亜科としては、ヒトヘルペスウイルス１型、ヒトヘルペスウイルス２型、またはヒトヘルペスウイルス３型の水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。ベータヘルペスウイルス亜科としては、ヒトヘルペスウイルス５型のサイトメガロウイルスまたはヒトヘルペスウイルス６型のバラ疹ウイルスがある。ガンマヘルペスウイルス亜科にはリンホクリプトウイルス属がある。リンホクリプトウイルス属としては、ヒトヘルペスウイルス４型のエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を挙げることができる。ヒトヘルペスウイルス８型のカポジ肉腫関連ウイルスやリスザルヘルペスウイルス（ＨＶＳ）もヘルペスウイルス科のウイルスである。
【００１２】
本発明はさらに医薬組成物および印刷物を含むキットを含んでなる。ここで医薬組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する抗体、または抗ＣＤ４０抗体の部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む）からなる組成物、および製薬上許容される賦形剤を含んでなる。ここにおいて、上記の抗体または組成物が細胞表面にあるＣＤ４０に結合すると、細胞に対して刺激シグナルを生じる。印刷物は上記医薬組成物を使用するための説明書を意味し、ここにおいて、この説明書は潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための上記医薬組成物の使用を指示する。
【００１３】
また、本発明はさらに医薬組成物および印刷物を含むキットを含んでなるが、この医薬組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する可溶性ＣＤ４０リガンドポリペプチド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含む）からなる組成物、および製薬上許容される賦形剤を含んでなる。ここにおいて、上記ポリペプチドまたは組成物は細胞表面にあるＣＤ４０に結合し、細胞に対して刺激シグナルを生じる。印刷物は上記医薬組成物を使用するための説明書を意味し、ここにおいて、この説明書は潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための上記医薬組成物の使用を指示する。
【００１４】
本発明は、さらに、抗原提示細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの処理および投与によって、個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための方法を含んでなる。この方法は、（ａ）細胞膜に発現しているＣＤ４０に結合する能力を有する組成物を提供すること、ここにおいて、上記組成物と細胞表面上にあるＣＤ４０との結合は、細胞に対して刺激シグナルを生じること；（ｂ）ＣＤ４０を発現している抗原提示細胞を提供すること；（ｃ）ステップ（ｂ）の抗原提示細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させ、その結果として該抗原提示細胞を刺激すること；（ｄ）個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するために十分な量の、刺激したＣＤ４０発現抗原提示細胞を個体に投与すること、を含んでなる。
【００１５】
ある実施形態において、本発明の組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する抗体、または抗ＣＤ４０抗体の部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む）からなる組成物、を含んで構成される。別の実施形態において、本発明の組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する可溶性ＣＤ４０リガンドポリペプチド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含む）からなる組成物、を含んで構成される。また別の実施形態では、本発明の組成物は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する小さな合成分子を含んでなる。
【００１６】
この方法のある実施形態において、ＣＤ４０発現抗原提示細胞はヒトの細胞である。ＣＤ４０発現抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｖｏ供給源から分離することができる。ある実施形態において、ＣＤ４０発現抗原提示細胞をヒトから分離することができる。別の実施形態においては、刺激を受けたＣＤ４０発現抗原提示細胞を、その細胞が分離されたもとの同一個体に投与する。
【００１７】
本発明の方法において、刺激した細胞を投与される個体は、ヒトを含む哺乳動物でありうる。その個体は過去にウイルス感染したことを知ることができるか、あるいは、その個体は過去のウイルス感染が疑われる。ヒト、もしくは患者は、ＨＩＶ−１のようなヒト免疫不全ウイルスなどの感染を受けた個体のように、免疫無防備状態でありうる。別の実施形態において、個体は、たとえば感染や疾病のために、放射線や癌の化学療法といった治療の副作用として、または組織移植もしくは臓器移植の補助として免疫抑制を引き起こすといった治療の意図した結果として、免疫抑制された状態にある。
【００１８】
また本発明は、細胞において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための方法を提供するが、その方法は、（ａ）細胞膜に発現しているＣＤ４０に結合する能力を有する組成物を提供すること、ここにおいて、上記組成物と細胞表面上にあるＣＤ４０との結合は、細胞に対して刺激シグナルを生じること；および（ｂ）ウイルスに感染したＣＤ４０発現細胞を、細胞を刺激することが可能な量の組成物と接触させ、それによって、細胞における潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルス複製を制御すること、を含んでなる。また別の実施形態において、本発明の組成物は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する抗体、もしくは抗ＣＤ４０抗体の部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する抗原結合部位を含む）からなる組成物；または細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合する可溶性ＣＤ４０リガンドポリペプチド、もしくはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（この部分配列は細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含む）からなる組成物；または細胞表面ＣＤ４０と特異的に結合する小さな合成分子、を含んでなる。
【００１９】
刺激を受けるＣＤ４０発現細胞は、ＣＤ４０を発現するあらゆる細胞を包含することができる。もう一つの実施形態において、刺激を受けるＣＤ４０発現細胞は、免疫系の細胞および上皮細胞である。免疫細胞には、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、あらゆる抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞、単球、活性化内皮細胞）などがある。ある実施形態において、接触はｅｘ ｖｉｖｏである。本発明の方法は、また、個体を、ＣＤ４０発現細胞を刺激することが可能な量の組成物と接触させることも包含しており、それによって個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御する。
【００２０】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明で述べる。本発明に関するその他の特徴、目的および効果は、説明および図面から、さらに請求の範囲から明白となるであろう。
【００２１】
本文に記載したすべての出版物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参考として本明細書に含めるものとする。
【００２２】
詳細な説明
本発明は、個体または細胞において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための方法を提供する。この方法は、細胞膜に発現しているＣＤ４０（細胞表面上にある）に結合して細胞に対して刺激シグナルを生じるような組成物を投与することを含む。この方法によるＣＤ４０発現細胞の刺激もしくは活性化は、個体または細胞において、潜伏ウイルスの再活性化を予防、もしくは阻害し、さらにウイルスの複製を制御するであろう。本発明の方法は、従来の抗ウイルス薬を投与したときに見られるようなレベルの毒性は示さない。本発明の方法はいかなる作用機構によっても限定されないが、一つの実施形態において、細胞膜に発現しているＣＤ４０に結合して、ＣＤ４０発現細胞を刺激することによって、個体に投与されたその組成物は、機能的Ｔ細胞画分に依存する応答の代わりとなり、これを補い、または強めている。このような効果は、正常な免疫応答を生じるに十分な数のＴ細胞を欠く免疫無防備状態患者および免疫不全患者において、またはＴ細胞の機能が完全ではない上記のような個体において、特に重要である。
【００２３】
また、ウイルスの持続感染に関する、技術的に認知された動物モデル（マウスモデル）から得られた実験データも提示する。このデータは、ＣＤ４０リガンドである抗ＣＤ４０抗体の投与によって潜伏ウイルス、このモデルでは持続性ガンマヘルペスウイルス（ＭＨＶ−６８）の再活性化を予防することができることを証明する。正常なマウスでは、ＭＨＶ−６８ガンマヘルペスウイルスは免疫系によって制御されていて、初期急性感染後は潜伏したままである。しかしながら、機能的ヘルパーＴ細胞の欠損を示すような、応答可能な免疫系を欠いたマウスでは、ウイルスは潜伏状態から再活性化することとなるであろう。このモデルでは、マウスは免疫系の、機能的Ｔ細胞画分が不足している。処置しないと潜伏ウイルスが再活性化する。これはヘルパーＴ細胞の数が十分でないためであると考えられる。下記の実施例で説明するように、機能的ヘルパーＴ細胞を欠いたマウスを本発明の方法を用いて治療した；詳細には、マウスＣＤ４０に対する、刺激性モノクローナル抗体（ＦＧＫ４５）を用いた；陰性対照実験として、一組のマウスを対照抗体（ＣＤ４０と結合しない）で処理した。このような組成物の投与は、ＭＨＶ−６８ガンマヘルペスウイルスに感染させて１日後および１５日後に行なった。対照抗体で処理したマウスはすべて、感染の３５日後にウイルスの再活性化（潜伏期からの解放）が実証された。抗ＣＤ４０で処理した免疫不全マウスは、ウイルスの再活性化をまったく示さなかった。
【００２４】
定義
特に語義を示さない限り、本明細書で使用した全ての専門用語および科学用語は、この発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解される意味を有する。本明細書で使用される下記の用語は、特に指定しない限り下記で与えられた意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用される「増幅すること」および「増幅」という語は、通常の用法を組み込むが、以下に詳細に述べるように、組換え型の、または天然に発現している核酸を生成し、または検出するための任意の適当な増幅法を使用することを意味する。例えば、天然に発現している核酸（例えばゲノムまたはｍＲＮＡ）または組換え核酸（例えばｃＤＮＡ）を（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）増幅するための試薬（例えば、特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の方法を実施することができる。例えば、潜伏ウイルス 対 活性ウイルスの相対的なレベルを評価するために本発明の方法を実施する前後に、ＰＣＲを用いて、個体におけるウイルス核酸またはウイルスメッセージの量を測定することができる。
【００２６】
「抗体」という用語は、１または複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片によって実質的にコードされる、特異的なエピトープ（例、ＣＤ４０ポリペプチドエピトープ）結合能力を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版， Ｗ． Ｅ． Ｐａｕｌ編， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９９３）； Ｗｉｌｓｏｎ （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５： ２６７−７３； Ｙａｒｍｕｓｈ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５： ８５−９７を参照されたい。当業者であれば、抗体フラグメントを単離したり、またはｄｅ ｎｏｖｏで化学的に、もしくは組換えＤＮＡ技法を利用して合成することが可能であることを理解するであろう。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持している抗原−結合部分（例えば、フラグメント、部分配列）を含む。結合部分の例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントである）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ部でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでなる二価フラグメントである）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定部（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬおよびＶＨ領域の対が一価の分子を形成するような一本鎖のタンパク質として上記を作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて、２つのドメインを連結することができる；これは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている（例えば、Ｂｉｒｄ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３を参照されたい）。一本鎖抗体も参照により「抗体」という用語に含まれる。組換え技法によって、または完全な抗体を酵素的もしくは化学的に切断することによって、フラグメントを調製することができる。この用語は、多価抗原−結合タンパク質も含む（例えば第６，０２７，７２５号を参照されたい）。この用語は、また完全な抗体を修飾することによって産生される「キメラ」抗体、または組換えＤＮＡ方法論を用いてｄｅ ｎｏｖｏで合成されるキメラ抗体のいずれをも含む。このようなキメラ抗体を「ヒト化抗体」とすることができる。すなわち、この場合、エピトープ結合部位は、マウスのような免疫された哺乳動物から生成され、構造的骨格はヒト由来である。キメラ抗体、例えば「ヒト化」抗体の作製方法は、当技術分野では公知である（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，８１１，５２２；５，７８９，５５４；６，０５４，２９７、さらにＨｕｓｅ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５； Ｗａｒｄ （１９８９） Ｎａｔ���ｒｅ ３４１： ５４４； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： ６２−７０； Ｋａｔｚ （１９９７） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６： ２７−４５を参照されたい）。抗体という用語は、また、例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，９３９，５９８；５，８７７，３９７；５，８７４，２９９；５，８１４，３１８に記載のように、ヒト抗体をそのまま産生する能力を有する、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、ヒトＩｇ配列を含んでなるマウス）によって生成されたヒト抗ヒトＣＤ４０抗体をも含む。この用語は、例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，８５５，８８５号；６，０２７，９３０に記載のように、ファージディスプレイライブラリーを用いて生成されたエピトープ結合ポリペプチド、およびその変異体をも含む。
【００２７】
「ＣＤ４０」または「ＣＤ４０ポリペプチド」という用語は、十分に特性付けられ、かつ記述されているＩ型細胞表面受容体を意味する。この受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパー遺伝子ファミリーの一員であり、Ｂ細胞、樹状細胞、ケラチン細胞、単球、マクロファージ、活性化内皮細胞、胸腺上皮細胞を含めたあらゆる抗原提示細胞によって発現される。例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，８０１，２２７；５，８７４，０８２；５，６７７，１６５；６，００４，５５２；および６，０５１，２２８を参照として挙げるが、これらはＣＤ４０を説明し、およびＣＤ４０と特異的に反応する抗体、特にヒトＣＤ４０と反応する抗体の作製方法を説明している。
【００２８】
「ＣＤ４０リガンド」または「ＣＤ４０リガンドポリペプチド」という用語は、細胞に発現しているＣＤ４０と特異的に結合するあらゆるポリペプチドもしくはペプチド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（この場合、この部分配列は、細胞表面のＣＤ４０に特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含んでなる）を含んでなる組成物（例えばＣＤ１５４タンパク質）を意味する。このような組成物は、下記のような、例えば「ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）」および「ペプチドミメティック」および化学合成化合物を含む。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９８１，７２４；５，９６２，４０６；５，８１７，５１６；５，９１６，５６０、さらにＦｏｒｄ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２： ４０３７−４０４４； ＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号Ｐ２９９６５； ＡＡＡ３５６６２； Ｉ５３４７６を参照されたい。
【００２９】
「ポリペプチド」「タンパク質」および「ペプチド」という用語には、抗ＣＤ４０抗体および可溶性ＣＤ４０リガンド（これは可溶性ヒトＣＤ４０リガンドを含む）に実質的に対応する構造と活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「ミメティック」もしくは「ペプチドミメティック」をも含む本発明の組成物が含まれ、下記に詳細に説明する。
【００３０】
「医薬組成物」という用語は、被験者に医薬として使用するのに適した組成物を意味する。本発明の医薬組成物は、例えば、ＣＤ４０リガンドまたは抗ＣＤ４０抗体、および製薬上許容される担体を含んでなる組成物を、薬理学上有効な量含んでなる製剤である。
【００３１】
「組換え」という用語は、合成された、さもなくばｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを用いて細胞内もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生するための方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）を意味する。例えば、組換えＣＤ４０結合抗体または可溶性ＣＤ４０リガンドを用いて、本発明の方法を実施することができる。また「組換え手段」という用語は、また本発明を実施するために使用するベクターにおいて、ポリペプチドコード配列を発現（例えば誘導的に、または構成的に発現）させるために、異なる起源に由来する、さまざまなコード領域もしくはドメイン、またはプロモーター配列を有する核酸を、発現カセットもしくはベクターに連結することを包含する。
【００３２】
核酸の生成および操作
本発明の方法は、ＣＤ４０に対するリガンド（抗ＣＤ４０抗体および可溶性ＣＤ４０リガンドを含む）の投与を提供する。これらの組成物は、組換えポリペプチドを含めたポリペプチドとしてだけでなく、ＣＤ４０結合リガンドをコードする核酸の形態でも投与することができる。このような投与様式を用いて、組換えＣＤ４０リガンドをｉｎ ｖｉｖｏで合成する。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの投与のために、このような組成物をコードする遺伝子を「裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ」の形態にしたり、またはベクターに組み込むことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４０リガンドを作製し、発現させることができるが、これらの遺伝子およびベクターを作製し発現させる様々な手段を使用することができる。本発明を実施するために使用するベクター内の遺伝子および核酸（例えば、プロモーター）の発現または活性をモジュレートすることによって、所望の遺伝子活性を得ることができることは、当業者に認識されるだろう。遺伝子の発現もしくは活性、または組織特異性を増大もしくは低減させることに関して記述された公知の方法はいずれも、本発明のために使用することができる。本発明を、科学文献および特許文献で詳細に記載されている、当技術分野で公知のあらゆる方法またはプロトコールと関連させて、実施することができる。
【００３３】
一般的技法
本発明を実施するために用いた核酸配列は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはこれらのハイブリッドのいずれであろうとも、さまざまな供給源から分離され、遺伝子工学的に操作され、増幅され、および／または組換え体として発現され得る。細菌細胞に加えて、例えば哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含めたあらゆる組換え体発現系を使用することができる。
【００３４】
あるいは、これらの核酸を、公知の化学合成技術（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ （１９８２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４７： ４１１−４１８； Ａｄａｍｓ （１９８３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５： ６６１； Ｂｅｌｏｕｓｏｖ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３４４０−３４４４； Ｆｒｅｎｋｅｌ （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９： ３７３−３８０； Ｂｌｏｍｍｅｒｓ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： ７８８６−７８９６； Ｎａｒａｎｇ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： ９０； Ｂｒｏｗｎ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： １０９； Ｂｅａｕｃａｇｅ （１９８１） Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２： １８５９； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，４５８，０６６に記載されているような）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。次いで、相補鎖を合成して、適当な条件下でそれらの鎖を一緒にアニーリングすることによって、あるいは適当なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えることによっても、二本鎖ＤＮＡ断片を得ることができる。
【００３５】
核酸を操作するための技法（例えば、配列中に突然変異を起させること、サブクローニング、プローブの標識化、配列決定分析、ハイブリダイゼーションなど）は、科学文献および特許文献に十分に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）， Ｖｏｌｓ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９）； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ａｕｓｕｂｅｌ編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）； ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ： ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ， Ｐａｒｔ Ｉ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｔｉｊｓｓｅｎ編 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ． Ｙ． （１９９３）を参照されたい）。
【００３６】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどは、当業者に公知の多くの一般的手法のいずれによっても、分析され、かつ定量され得る。これらには、例えば、分析生化学的方法（例えば、ＮＭＲ、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー）、様々な免疫学的方法（例えば、液体もしくはゲル沈降反応、免疫拡散法、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性標識、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【００３７】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅して、ＣＤ４０結合リガンドを生成させること、ウイルスレベルおよびウイルスの活性化状態（潜伏の程度）をモニターすること、感染したウイルスの属および種および株を確認すること、などが可能である。当業者は、適当なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。増幅方法は、また当技術分野において公知であって、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ， Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＭＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， Ｉｎｎｉｓ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９９０）およびＰＣＲ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ （１９９５）， Ｉｎｎｉｓ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ． Ｙ．）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ （１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４： ５６０； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０７７； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ （１９９０） Ｇｅｎｅ ８９： １１７を参照されたい）、転写増幅法（例えばＫｗｏｈ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １１７３を参照されたい）；および、自立的配列複製（例えばＧｕａｔｅｌｌｉ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼ増幅（例えば、Ｓｍｉｔｈ （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５： １４７７−１４９１を参照されたい）、自動化Ｑ−βレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Ｂｕｒｇ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ １０： ２５７−２７１を参照されたい）および他のＲＮＡポリメラーゼ介在技法（例えば、ＮＡＳＢＡ， Ｃａｎｇｅｎｅ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ）を含む（また、Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３０７−３１６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ； Ａｕｓｕｂｅｌ；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，６８３，１９５および４，６８３，２０２；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： ５６３−５６４を参照されたい）。
【００３８】
本発明のさまざまな実施形態において、本発明の組成物は、上記のように、例えば、ヘルペスウイルス科ウイルス（例えば、アルファヘルペスウイルス亜科ウイルス、ベータヘルペスウイルス亜科ウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス亜科ウイルス）またはその他のウイルスの潜伏からの再活性化を防ぎ、ウイルスの複製を制御するために投与される。これらのウイルスの配列は、当技術分野では公知であり、これを用いて種特異的な、または株特異的な診断用増幅プライマーを設計することができる。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７２１，３５４を参照されたい。
【００３９】
発現ベクターのクローニングおよび構築
ＣＤ４０リガンドをコードする発現ベクターを使用して、このポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。科学文献および特許文献において詳細に記述されているさまざまな従来の技法によって組換え核酸は発現される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ７３１； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ （１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ６４３５： １０； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｔｉｊｓｓｅｎ またはＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。生物試薬および実験装置について製造者から得られる製品情報も、公知の生物学的方法に関する情報を提供する。ベクターは、天然供給源から単離され、ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供給源から入手され、または合成法もしくは組換え法によって調製され得る。
【００４０】
本発明を実施するために使用する核酸を、細胞において安定的に、または一過性に発現される発現カセット、ベクターまたはウイルスを用いて発現させることが可能である（例えば、エピソーム発現系）。選択マーカーは、発現カセットおよびベクターに組み込まれ、形質転換細胞および配列において選択可能な表現型を与えることができる。例えば、選択マーカーはエピソームの維持および複製をコードすることが可能で、その結果宿主ゲノムへの組込みは不要となる。例えば、マーカーは抗生物質耐性（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）もしくは除草剤耐性（例えば、クロロスルフロンまたはＢａｓｔａ）をコードすることで、望ましいＤＮＡ配列で形質転換された細胞を選択することができる（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ （１９９７） Ｇｅｎｅ １９０： ３１５−３１７； Ａｕｂｒｅｃｈｔ （１９９７） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８１： ９９２−９９７を参照されたい）。ネオマイシンやハイグロマイシンのような基質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子は、組織培養でしか利用できないので、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで選択マーカーとして化学療法抵抗性遺伝子も使用される。
【００４１】
ポリペプチド
さまざまな実施形態において、本発明は、細胞または個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するための方法を対象とするが、この方法は、細胞膜に発現しているＣＤ４０と結合可能なポリペプチドを提供すること（このポリペプチドが細胞表面のＣＤ４０と結合すると、細胞に対して刺激シグナルを発生する）、およびＣＤ４０発現細胞を刺激するために十分な量のポリペプチドを個体に投与すること（それによって個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御する）を含んでなる。このようなポリペプチドは、細胞に発現しているＣＤ４０に特異的に結合する、可溶性ＣＤ４０リガンドポリペプチド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列（ここでこの部分配列は、細胞表面のＣＤ４０に特異的に結合するＣＤ４０結合部位を含んでなる）を含んでなる組成物であることができる。また、ポリペプチドは下記で検討されるようなＣＤ４０と反応する抗体であってもよい。
【００４２】
上記のように、本発明の方法に用いられるＣＤ４０結合ポリペプチド（例えば、可溶性ＣＤ４０リガンドおよび抗−ＣＤ４０抗体）を意味する「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語には、抗ＣＤ４０抗体および可溶性ＣＤ４０リガンド（これは可溶性ヒトＣＤ４０リガンドを含む）に実質的に対応する構造と活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「ミメティック」もしくは「ペプチドミメティック」をも含む本発明の組成物が含まれる。上記の「保存的変異体」または「類似体」または「ミメティック」という用語は、またアミノ酸配列が改変されているがその変化がポリペプチド（保存的変異体）の構造および／または活性（例えば、ヒトＣＤ４０への結合能力および結合した細胞を刺激する能力）を実質的に変化させないような、ポリペプチドまたはペプチドを意味する。これらは、保存的に改変されたアミノ酸配列の変異、すなわちタンパク質の活性にとって重要でないアミノ酸残基の置換、付加もしくは欠失、またはたとえ重要なアミノ酸の置換であっても構造および／または活性を実質的には変化させないような、類似の性質（例えば、酸性、塩基性、正電荷もしくは負電荷、極性もしくは非極性、など）を有する残基によるアミノ酸の置換を含む。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野では公知である。例えば、保存的置換を選択するためのガイドラインの一例は、以下のものを含む：（もとの残基に続いて置換残基の例）：ａｌａ／ｇｌｙもしくはｓｅｒ； ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎもしくはｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ；ｇｌｙ／ａｌａもしくはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎもしくはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕもしくはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅもしくはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇもしくはｇｌｎもしくはｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕもしくはｔｙｒもしくはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔもしくはｌｅｕもしくはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；Ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ／ｔｒｐもしくはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅもしくはｌｅｕ）。また別のガイドラインの例としては、下記の６群を使用するが、各々は相互に保存的置換となるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ； Ｓｃｈｕｌｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｅｒ （１９７９） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）。当業者であれば、上記で規定した置換が、ありうるべき唯一の保存的置換ではないことを認識するであろう。例えば、ある一定の目的のためには、正もしくは負にかかわらず、あらゆる荷電アミノ酸を相互に保存的置換とみなすことがある。さらに、コード配列中の単一アミノ酸またはアミノ���の小部分を改変し、付加し、欠失させる個々の置換、欠失または付加を「保存的に改変された変異」とみなすこともできる。
【００４３】
「ミメティック」および「ペプチドミメティック」という用語は、本発明の方法を行なうために使用されるポリペプチド（例えばＣＤ４０リガンドまたは抗ＣＤ４０抗体）と実質的に同じ構造上および／または機能上の性質を有する化学合成化合物を意味する。ミメティックは、完全に合成の、アミノ酸の非天然類似体から成ることもあるが、一部は天然のペプチドアミノ酸で、かつ一部はアミノ酸の非天然類似体から成るキメラ分子であることもある。また、ミメティックは、天然アミノ酸の保存的置換を、そのような置換によってミメティックの構造および／または活性が実質的に変化しない限りいかなる量でも、組み込むこともできる。保存的変異体である本発明のポリペプチドに関しては、日常の実験法によって、ミメティックが本発明の範囲に包含されるかどうか、すなわちその構造および／または機能が実質的に変化していないことが決定されるだろう。
【００４４】
ポリペプチドミメティック組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有することも可能であるが、これらは典型的には以下の３つの構造グループに属する：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）連鎖以外の残基連鎖群；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりとなる非天然残基；またはｃ）二次構造の模倣をもたらす、すなわち二次構造（例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックスコンホメーションなど）を生じさせ、または安定化する残基。ポリペプチドは、その残基の全部もしくは幾つかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって連結されているときにミメティックであると特性付けられ得る。個々のペプチドミメティック残基は、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング法（例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））によって連結され得る。通常のアミド結合（「ペプチド結合」）連鎖の代わりとなることができる連結群には、例えばケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−のかわりに−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ （１９８３） ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ ２６７−３５７， 「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」， Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹを参照されたい）。また、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全部、または幾つかの非天然残基を含有することによって、ミメティックとして特性付けられ得る；非天然残基は、科学文献および特許文献に詳細に記述されている。
【００４５】
これらのポリペプチドの構造は、当技術分野で公知の、ヒトＣＤ４０を含めたＣＤ４０の配列に基づくことが可能であるが、例えば、ヒトＣＤ４０リガンドの配列は下記の通りである（例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１： ４３１３−４３２１を参照されたい）：
0003581660.tif 000002
【００４６】
科学文献および特許文献（例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ， Ｇｉｌｍａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ）に詳細に記述された、さまざまな手順および方法論を用いて、個々の合成残基およびポリペプチドを組み込んだミメティックを合成することができることは、当業者には理解されるであろう。ポリペプチドを組み込んだミメティックは、また例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，４２２，４２６に記載されたような、固相合成法を用いて作製することもできる。本発明のペプチドおよびペプチドミメティックは、コンビナトリアル方法論を用いて合成することも可能である。ペプチドおよびペプチドミメティックライブラリーを生成するためのさまざまな技法は公知であり、これらには、例えば、マルチピン法、ティーバッグ法、およびスプリット−カップル−ミックス法が挙げられる（例えば、ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ （１９９８） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９： ２０５−２２３； Ｈｒｕｂｙ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １： １１４−１１９； Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ （１９９７） Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ３： １７−２７； Ｏｓｔｒｅｓｈ （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７： ２２０−２３４を参照されたい）。修飾されたポリペプチドおよびペプチドを、さらに化学的修飾法によって作製することができる（例えば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３４４０−３４４４； Ｆｒｅｎｋｅｌ （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９： ３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： ７８８６−７８９６を参照されたい）。
【００４７】
このようなペプチドを、当技術分野でよく知られた化学的方法を用いて、全体または部分的に合成することも可能である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２１５−２２３； Ｈｏｒｎ （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２２５−２３２； Ｂａｎｇａ， Ａ． Ｋ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９９５） Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， ＰＡ （“Ｂａｎｇａ”））。たとえば、さまざまな固相法（Ｒｏｂｅｒｇｅ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８９：３−１３）を用いてペプチド合成を行なうことが可能であり、さらに、たとえばＡＢＩ ４３１ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、製造元による取扱説明書にしたがって、自動合成を行なうこともできる。
【００４８】
本発明の方法において、ＣＤ４０リガンドが細胞表面にあるＣＤ４０に結合することによって、細胞に対して刺激シグナルが生じる。ＣＤ４０リガンド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列からなる組成物が、細胞に対して刺激シグナルを発するかどうか、およびその程度を判定するための方法および客観テストは、当技術分野で周知であり、たとえば、増殖、サイトカインの分泌、細胞表面の分子の発現、および他の測定可能な表現型の変化の測定を包含する。
【００４９】
さまざまな実施形態において、この細胞刺激が結果として、個体において潜伏ウイルスの再活性化の予防、またはウイルス複製の制御をもたらす。ＣＤ４０リガンド、またはＣＤ４０リガンドポリペプチドの部分配列からなる組成物が、潜伏ウイルスの再活性化を予防するかどうか、およびその程度を判定するための方法および客観テストは、当技術分野で周知であり、下記の実施例で説明するように、たとえばウイルス力価もしくはウイルスメッセージの測定、または動物モデルを包含する。下記の実施例で述べるように、潜伏感染リンパ球の頻度は、感染中心アッセイを用いて測定し、複製ウイルスの力価はプラークアッセイによって測定することができる。
【００５０】
抗体ならびに免疫原性ペプチドおよびポリペプチド
さまざまな実施形態において、本発明の方法を実施するために、ＣＤ４０ポリペプチドに対する抗体を使用する。さまざまな抗−ＣＤ４０抗体が当技術分野で知られており、たとえば、米国特許第６，０５１，２２８号、第６，００４，５５２号、第５，９６２，４０６号、第５，８１７，５１６号、第５，９１６，５６０号、第５，８７４，０８２号、第５，８０１，２２７号、第５，６７７，１６５号、第５，５４０，９２６号、を参照とするが、これらはＣＤ４０を説明し、ＣＤ４０と特異的に反応する抗体、特にヒトＣＤ４０と反応する抗体、を作成する方法を記述する。
【００５１】
あるいはまた、日常的な方法を用いて、当業者はＣＤ４０に対する抗体を作成することができる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成する方法は当業者に公知であり、科学文献および特許文献に記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ （１９９１）； Ｓｔｉｔｅｓ （ｅｄｓ．） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｎｏｇｙ （７ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， ＣＡ （“Ｓｔｉｔｅｓ”）； Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９８６）； Ｋｏｈｌｅｒ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５； Ｈａｒｌｏｗ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５２】
ＣＤ４０に対して特異的に免疫応答を引き起こす、特にＣＤ４０に対して特異的な抗体を産生することができる免疫原性ペプチドは、公知のＣＤ４０ポリペプチド配列に基づいて設計することができる。たとえば、ヒトＣＤ４０ポリペプチド配列は下記の通りである（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８： １４０３−１４１０； ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号００１２４１）。
【００５３】
0003581660.tif 000003
【００５４】
このようなペプチドは、天然起源から単離することもできる（たとえば、単離されたＣＤ４０ポリペプチドの断片として）が、上記のように、合成もしくは組換えによって作成することもできる。
【００５５】
本発明の方法において、細胞表面にあるＣＤ４０に対して抗体が結合することによって、細胞に向けて刺激シグナルが生じる。ＣＤ４０と反応する抗体、またはＣＤ４０抗体の部分配列からなる組成物が、細胞に対して刺激シグナルを発するかどうか、およびその程度を判定するための方法および客観テストは、当技術分野で周知であり、たとえば、増殖、サイトカインの分泌、細胞表面の分子の発現、および他の測定可能な表現型の変化の測定を包含する。
【００５６】
さまざまな実施形態において、このような細胞刺激が、細胞または個体において潜伏ウイルスの再活性化の予防、またはウイルス複製の制御をもたらす。抗−ＣＤ４０抗体、またはＣＤ４０抗体の部分配列からなる組成物が、潜伏ウイルスの再活性化を予防するかどうか、およびその程度を判定するための方法および客観テストは、当技術分野で周知であり、下記の実施例で説明するように、たとえばウイルス力価もしくはウイルスメッセージの測定、または動物モデルを包含する。下記の実施例で述べるように、潜伏感染リンパ球の頻度は、感染中心アッセイを用いて測定し、複製ウイルスの力価は、プラークアッセイによって測定することができる。
【００５７】
ＣＤ４０に対して反応性の小分子
さまざまな実施形態として、細胞または個体においてＣＤ４０と結合して細胞に対して刺激シグナルを生じ、潜伏ウイルスの再活性化を予防し、またはウイルスの複製を制御する組成物は、たとえば、有機分子またはコンビナトリアルライブラリー由来の分子のような、細胞表面ＣＤ４０に特異的に結合する合成小分子を含んでなる。こうした化合物は、常法によってスクリーニングすることが可能で、たとえば、ＣＤ４０結合能を有する化合物に関するアッセイはいずれもハイスループットスクリーニングを適用できる。ハイスループットスクリーニングシステムは市販のものを購入することができる（たとえば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ； Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｍｅｎｔｏｒ， ＯＨ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ； Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ、など）。このシステムは一般に、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の分配、時間を指定したインキュベーション、およびアッセイに適した検出器によるマイクロプレートの最終的な読みとりを包含する全工程が自動化されている。このような可変システムは、大量処理および迅速な始動、ならびに高度の融通性およびカスタマイズが可能である。こうしたシステムの製造者は、さまざまなハイスループットの詳細なプロトコールを提供する。たとえば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．は遺伝子転写、リガンド結合、などの改変を検出するためのスクリーニングシステムを説明した技術告示を提供する。
【００５８】
こうした組成物のための供給源は、たとえばコンビナトリアルケミカルライブラリーを包含する。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のような多数の化学的「ビルディングブロック」を組み合わせて、化学合成または生物合成のいずれかによって作成された多様な化合物の集合である。たとえば、ポリペプチドライブラリーのような直鎖コンビナトリアルケミカルライブラリーは、一定の化合物の長さ（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、アミノ酸という一揃いの化学的ビルディングブロックを、あらゆる可能な方法で組み合わせて形成される。何百万もの化合物が、こうした化学的ビルディングブロックを組み合わせた混合によって合成できる。たとえば、１００個の交換可能な化学的ビルディングブロックを規則正しく組み合わせて混合することによって、理論的には１億個の４量体が合成され、あるいは５量体は１００億個合成される（Ｇａｌｌｏｐ （１９９４） ３７（９）： １２３３−１２５０）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者によく知られている（米国特許第６，０５４，０４７号、第６，０４６，０５６号、第６，０４５，６７１号、第５，７９２，４３１号、第５，７８０，７５４号、第５，６４６，０４６号）。
【００５９】
ポリペプチド医薬組成物の製剤化および投与
本発明のさまざまな実施形態において、ＣＤ４０リガンドポリペプチドおよびＣＤ４０に対する抗体を包含するポリペプチドは、個体において潜伏ウイルスの再活性化を予防し、ウイルスの複製を制御するために十分な量、個体に投与される。別の実施形態において、上記ポリペプチドは医薬組成物として投与される；すなわちこのポリペプチドは製薬上許容される担体（賦形剤）とともに製剤化されて医薬組成物を生成する。
【００６０】
製薬上許容される担体ならびにペプチドおよびポリペプチドのための製剤は、当業者に公知であり、科学および特許文献に詳細に記載されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅの最新版、Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ”）； Ｂａｎｇａ； Ｐｕｔｎｅｙ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： １５３−１５７； Ｐａｔｔｏｎ （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６： １４１−１４３； Ｅｄｗａｒｄ （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １８６８−１８７１； 米国特許第５，７８０，４３１号、第５，７７０，７００号、第５，７７０，２０１号）。
【００６１】
本発明の方法に使用するポリペプチド組成物は、単独に、または医薬組成物として、当技術分野において既知のあらゆる方法によって、たとえば動脈内、鞘内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、腸管外、胸膜腔内、局所、経口、または局所投与、すなわち皮下、気管内（たとえば噴霧による）、もしくは経粘膜的（頬側、膀胱、膣内、子宮、直腸、鼻粘膜）投与によって、全身に、限局的に、または局所に送達することができる。組成物を送達するための実際の方法は当業者には明白かつ周知であり、科学および特許文献に詳細に記載されている（例、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、他の抗ウイルス剤または薬剤が投与されるかどうかといった投与法に依存するさまざまな単位剤形で、およびあらゆるプロトコールによって、投与することができる。典型的なペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の投与は、当業者に広く知られている。このような投与は一般に事実上勧告的であり、種々のファクター、たとえば、初期応答（初期免疫化後のウイルス力価）、特定の治療状況、患者の健康状態および耐性に応じて調整する。望ましい応答を得るのに適した医薬組成物の量は、「治療上有効な用量」として規定される。このような使用に有効な投与スケジュールおよび投与量、すなわち「投与計画」は、たとえば、免疫抑制または免疫不全の重症度もしくは程度、感染したウイルスとそれに伴う疾病または症状、患者の健康にかかわる全身状態、患者の体質、年齢、医薬製剤および医薬組成物の濃度などを包含するさまざまなファクターに依存することになる。また、投与計画は、薬物動態学、すなわち医薬組成物の吸収速度、バイオアベイラビリティー（生物学的利用性）、代謝、クリアランスなども考慮する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ参照）。たとえば、症状の減少や改善を評価することによって、または、血液または組織病理標本の分析を含む、ウイルスキャプシド（たとえばウイルス力価）もしくはウイルスメッセージのレベルの測定（たとえば上記のようにＰＣＲによる）といった客観的な基準によって、経験的に投与量を決定することができる。上記のように、患者に必要とされ、さらに患者に耐容されるような、投与量および頻度に応じて単回または多回投与を施すことができる。医薬組成物は、単独で、または他の治療処置とともに投与することができる。
【００６３】
ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏ処理および再投与
本発明のさまざまな実施形態において、抗原提示細胞ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏ処理および投与によって、個体での潜伏ウイルスの再活性化が予防されウイルスの複製が制御される。ＡＰＣは、細胞膜に発現しているＣＤ４０と結合する能力を有する組成物によって刺激を受け、細胞に対する刺激シグナルを発する。細胞はＭＨＣ−適合細胞（組織に類別された細胞）とすることができる。細胞は組織培養された細胞であり、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激後に処理および再投与を受ける個体から分離されたＡＰＣであってもよい。上記のようにあらゆるＡＰＣを使用することができる。ＡＰＣの単離、培養時のｅｘ ｖｉｖｏ処理、および再投与の方法は当技術分野では周知である（米国特許第５，１９２，５３７号、第５，６６５，３５０号、第５，７２８，３８８号、第５，８８８，７０５号、第５，９６２，３２０号、第６，０１７，５２７号、第，６，０２７，４８８号を参照されたい）。
【００６４】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するために使用される医薬組成物を含有するキットを提供する。このキットは、組換えの、または合成のＣＤ４０結合組成物を含有することができる。あるいはまた、キットは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４０結合リガンドを産生するために患者に投与されるべき、たとえばベクターのような組換え核酸を含有してもよい。キットは、方法論を教示する説明資料、たとえば本発明を実施するために使用する組成物を投与するための手段、患者または動物を治療用ベクターに感染させる手段、ウイルスのレベルをモニターし、ウイルスの活性化およびウイルスの潜伏に関する相対的な状態を評価する手段などを含むことができる。
【００６５】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、説明のみを目的とするのであって、これらを考慮してさまざまな改良または変更が当業者に示唆されるであろうが、こうした改良または変更はこの出願の精神および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲に包含されるものであると考えられる。
【００６６】
実施例
下記の実施例は、説明のために提示されるが、特許請求の範囲に係る発明を制限するものではない。
【００６７】
実施例１：ＣＤ４０結合リガンドの投与はヘルペスウイルス潜伏感染の再活性化をを予防する
下記の実施例は、業界に認知された動物モデル（マウスモデル）から得られたウイルスの持続感染に関する実験データを提示することによって、本発明の方法が潜伏ウイルス感染の再活性化を予防することを実証する。ここで、この実験データは、ＣＤ４０リガンド、抗−ＣＤ４０抗体の投与によって、このモデルの潜伏ウイルスである、持続感染したガンマヘルペスウイルス（ＭＨＶ−６８）の再活性化を予防することが可能なことを示す。ＣＤ４ Ｔ細胞と同様に抗−ＣＤ４０処理が潜伏ウイルスの制御を助けるが、潜伏期の発達を妨げないことも示す。
【００６８】
マウス ガンマヘルペスウイルス−６８（ＭＨＶ−６８）は天然に存在する齧歯類の病原体であり、これはエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫−関連ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ−８）およびリスザルヘルペスウイルス（ＨＶＳ）と近い関係にある。構造的には、このウイルスはＨＨＶ−８およびＨＶＳにより近い関係にある。ＭＨＶ−６８の鼻内（ｉ．ｎ．）投与によって、肺胞上皮細胞の急性増殖性感染を生じ、さらにＢリンパ球、肺上皮細胞、および、おそらくは他の一部のタイプの細胞に潜伏感染を引き起こす。このウイルスは、肺に炎症性の浸潤を引き起こし、リンパ節および脾臓の腫大、さらに血中の活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数の増加をもたらす。ＭＨＶ−６８はまた、免疫抑制マウスにリンパ球増殖性疾患（たとえばリンパ腫）を引き起こすことが報告されている。このように、上記動物モデルにおける上記ウイルスの病理発生に関わる重要な症状は、ヒトにおけるＥＢＶ感染のそれと類似している。
【００６９】
感染性ウイルスはＴ細胞−媒介プロセスによって初期感染から１０〜１３日後に肺から取り除かれる（Ｅｈｔｉｓｈａｍ （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ５２４７−５２５２）。正常なマウスでは、肺は、その後も感染性ウイルスのない状態のままである。これに対して、機能性ＣＤ４ Ｔ細胞を欠失しているＭＨＣクラスＩＩ−／−マウス、または抗体処理によって後者を欠いた状態にしたマウスは、最初は肺から感染性ウイルスを取り除いた。しかしながら、これらの動物は潜伏感染の再活性化を予防することができず、感染性ウイルスは１０〜１５日後に肺に再び現われ、徐々にウイルス力価を増加させる（Ｓａｒａｗａｒ （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ３９１６）。ＣＤ４ Ｔ細胞が作用する正確な段階、および作用のメカニズムは現在のところ明らかではない。ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ８ Ｔ細胞の記憶の作成、または維持に必要とされるが、クラスＩＩ−／−マウスは、Ｔ依存性抗原に対する抗体を産生しないことが知られている（Ｃａｒｄｅｌｌ （１９９４） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５５： ４２３）。体液性免疫および細胞性免疫はいずれも、潜伏ＭＨＶ−６８の長期間の制御において機能しうる。ＣＤ４ Ｔ細胞は、抗−ウイルス免疫の発生および／または維持にとって重要であると考えられる。
【００７０】
材料および方法
マウス：Ｈ−ＩＡｂ遺伝子（Ｇｒｕｓｂｙ （１９９５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ４１７−４３５）の破壊に関してホモ接合型である１２９／Ｂ６マウスをＬａ Ｊｏｌｌａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （ＬＩＡＩ）のＨｉｌｄｅ Ｃｈｅｒｏｕｔｒｅ博士より譲り受けた。この系統は、もともとＭａｒｋ Ｇｒｕｓｂｙ博士（Ｈａｒｖａｒｄ、上記Ｇｒｕｓｂｙ （１９９５）参照）によって誘導された。マウスはＬＩＡＩの飼育器内で一定の病原体のない状態のもとで飼育された。ＭＨＣクラスＩＩ−／−および＋／＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいくつかもＴａｃｏｎｉｃｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から購入した。ＦＡＣＳ分析によって、脾細胞集団に占めるＣＤ４ Ｔ細胞の割合を測定することによって、マウスの遺伝子型を確認した。６〜１５週齢の雌性ＭＨＣクラスＩＩ ＋／＋および−／−マウスを全ての実験に使用した。
【００７１】
ウイルス感染およびサンプリング
ＭＨＶ−６８ウイルス（クローンＧ２．４）は、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ， ＵＫ（Ｄｕｔｉａ，（１９９９）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ， ８０：２７２９−２７３６）のＡＡ Ｎａｓｈ博士より入手し、ウイルス株はヨザル腎（ＯＭＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５５６）中で増殖させた。マウスはアベルチン（２，２，２−トリブロモエタノール）で麻酔し、（特に言及しない限り）リン酸バッファー（ＰＢＳ）中の２ ｘ １０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスを、鼻内に（ｉ． ｎ．）感染させた。感染の３５日後、マウスをアベルチンで最終的に麻酔する。肺を取り除き、ウイルス力価の測定の前にＴｉｓｓｕｅ ＴｅａｒｏｒＴＭホモジナイザーを用いて氷上にて、培地中でホモジナイズした。Ａｌｌａｎ （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ３９８０−３９８６に記載のように、脾臓から単細胞懸濁液を調製した。トリパンブルー排除試験によって細胞生存率を判定した。
【００７２】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４０に対する抗体による処理
マウスを、マウスＣＤ４０に対するラットモノクローナル抗体であるＦＧＫ４５（たとえば、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ２４７０−２４７７）１００μｇを用いて、または対照のラット免疫グロブリンを用いて処理した。抗体は、ＭＨＶ−６８に感染させた１日後および１５日後に、滅菌ＰＢＳで希釈して静脈内に投与した。
【００７３】
ウイルス力価の測定および感染中心アッセイ
Ｃａｒｄｉｎ （１９９６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ８４： ８６３−８７１に記載のように、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＴ １６５８）上でのプラークアッセイによって、複製したウイルスの力価を測定した。簡単に述べると、ストックウイルスまたは音波処理したマウス組織の希釈物を３７℃で１時間かけて、ＮＩＨ−３Ｔ３単層上に吸収させ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）で覆う。６日後、ＣＭＣの上層を除去し、単層をメタノールで固定して、プラーク数の測定を容易にするためにギムザ染色した。このアッセイの検出限界は、既知量のウイルスを加えた非感染組織のホモジネートから回収されたプラークに基づいて、１０％組織ホモジネートについて１０ ｐｆｕ／ｍｌである。
【００７４】
感染中心アッセイを用いて、潜伏感染したリンパ球の頻度を測定した。リンパ節または脾臓から調製した白血球懸濁液をさまざまな細胞密度でＮＩＨ−３Ｔ３細胞単層上に塗布し、一晩インキュベートした後、ＣＭＣで覆った。細胞を５−６日間共培養した後、上層を除去し、プラーク数を上記のように測定した。
【００７５】
結果：肺のウイルス力価
ＭＨＶ−６８に感染させて３５日後に肺のウイルス力価を測定した。予想通り、対照のラット免疫グロブリンで処理した３匹のマウスすべてが、この時点で有意なウイルスの再活性化を示した（図１／表１）。しかしながら、ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体で処理した２匹のマウスは、この時点でウイルスの再活性化を示さなかった。第３の抗−ＣＤ４０処理マウスは死亡した。はじめに、この処理に関連して、ある程度の毒性があることは明らかである。しかしながら、抗−ＣＤ４０で処理した非感染ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスおよび非処理ＭＨＶ−６８−感染マウスについてさらに研究した結果、抗−ＣＤ４０で処理するかどうかに関わらず、ウイルス感染がマウスに散発的な死を引き起こすことが明らかになった。したがって、非処理ＭＨＣクラスＩＩ−／− ＭＨＶ−６８感染マウスの２／９が死亡したが、ＦＧＫ４５で処理した非感染マウスの死亡は０／６であった。肺におけるウイルス感染に伴う二次的な細菌感染が、上記の免疫無防備状態のマウスに死を引き起こしている可能性が高い。これらのデータは、抗−ＣＤ４０ ｍＡｂが、上記ウイルスモデルにおいて免疫刺激機能を有することを示唆する。別の実験において、マウスは死亡せず、抗−ＣＤ４０処理は潜伏ウイルスの再活性化の予防に、同様に有意に効果的であった。
【００７６】
感染中心アッセイ
潜伏ウイルスのレベルも、感染中心アッセイを用いて測定した。潜伏のレベルは、抗−ＣＤ４０処理ＭＨＣクラスＩＩ −／−（３３±１７ ｐｆｕ／１０７脾細胞）マウスとラットＩｇ処理した同マウス（１８±７ ｐｆｕ／１０７脾細胞）に、有意な相違はなかった。このことは、ＣＤ４ Ｔ細胞と同様に、抗−ＣＤ４０処理は潜伏ウイルスの制御を助けるが、潜伏の発生を予防しない。
【００７７】
考察：
初回の細胞傷害性Ｔ細胞産生の際に、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用によって、ＣＤ４ Ｔ細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を刺激することができる（Ｒｉｄｇｅ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ４７４−４７８； Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ４８０−４８３； Ｂｅｎｎｅｔｔ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ４７８−４８０）。これによって、ＡＰＣがＣＤ８キラーＴ細胞を活性化する際にＣＤ４細胞が存在する必要なしに、ＡＰＣがＣＤ８ Ｔ細胞を活性化することが可能となる（ＡＰＣのＣＤ４刺激後）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験は、ＡＰＣのウイルス感染によってＣＤ４細胞の助けの必要性を回避できることを示唆する（Ｒｉｄｇｅ （１９９８） 上記）。これにより、ＣＤ８ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４ Ｔ細胞の助けを借りずに、初回のウイルス感染を除去する能力を説明することができる。しかしながらｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４細胞の助けの必要性は、研究対象の特定のウイルスに依存して変化し、さらに急性感染、持続感染、または再発性感染の制御によって変化すると思われる。ＬＣＭＶ−感染ＣＤ４欠損またはＣＤ４０Ｌ−／−マウスは、強い細胞傷害性Ｔ細胞の一時応答を起すことができるが、Ｔ細胞記憶およびＢ細胞の応答は著しく損なわれる可能性がある（Ｍａｔｌｏｕｂｉａｎ （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ８０５６； Ｗｈｉｔｍｉｒｅ （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ８３７５； Ｂｏｒｒｏｗ （１９９６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： ２１２９）。
【００７８】
ＭＨＶ−６８モデルに関する上記の研究は、ＣＤ４ Ｔ細胞が感染ウイルスの初回の除去には必要とされないが、持続する潜伏ウイルスの長期間の制御のためには必須であることを示唆する。ＣＤ４ Ｔ細胞が作用する正確な段階およびその作用メカニズムは、現在のところ明らかではない。体液性免疫および細胞性免疫の両方が潜伏ＭＨＶ−６８の長期間の制御に機能すると考えられる。
【００７９】
Ｂ細胞−欠損マウスは、正常な動態で複製ＭＨＶ−６８を肺から排除し、ウイルス再活性化を示さない；しかしながら、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の減少は、Ｂ細胞欠損マウスにウイルスの再活性化を引き起こすが、野生型マウスでは再活性化を起さない。これはおそらく、後者に中和抗体が存在するためである。低レベルのウイルス再活性化は、ＣＤ８ Ｔ細胞のみ減少したＢ細胞欠損マウスでも観察された。さらに、ＣＤ８ Ｔ細胞の減少したクラスＩＩ−／−マウスは、ウイルス再活性化の増加を示した。したがって、ＭＨＶ−６８の長期間の制御についてＴおよびＢ細胞の役割は重複している、ＣＤ４ Ｔ細胞は双方のタイプの抗ウイルス免疫（体液性および細胞性免疫）の発生および／または維持に重要である（Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ （１９９６） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７７： ２８１９−２８２５； Ｓｔｅｗａｒｔ （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１８７： １９４１； Ｃａｒｄｉｎ （１９９６） 上記）。
【００８０】
本発明はいかなる作用メカニズムによっても限定されないが、この研究はＣＤ４０に対するアゴニスト抗体が、ＭＨＶ−６８ウイルスの再活性化の予防に際してＣＤ４ Ｔ細胞を代替する能力を立証する。驚くべきことに、種々多様な共刺激分子がＣＤ４ Ｔ細胞上に存在するが、ＭＨＶ−６８の再活性化の予防には、ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体で十分であった。したがって、抗−ＣＤ４０で処理したＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスは、ウイルス再活性化を示さなかったが、ラットＩｇで処理した対照マウスは有意なウイルス再活性化を示した（図１／表１）。こうした作用のメカニズムは、現在のところ不明である；抗ＣＤ４０抗体はＢ細胞およびＣＴＬ応答をいずれも刺激することができる。しかしながら、上記Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ （１９９８）によれば、抗ウイルス性ＣＤ８「キラー」、すなわち「細胞傷害性」Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）の抗−ＣＤ４０を介した刺激が重要であると考えられる。
【００８１】
これらのデータは、ＣＤ４０を介した免疫刺激が、ウイルス再活性化を予防する免疫機構の発生および維持のためには十分であることを示す。さらに、この研究は、ヘルペスウイルスの再活性化を予防するための新規の免疫治療法を明らかにする。ヘルペスウイルスの再活性化は、ＣＤ４ Ｔ細胞数の減少したエイズ患者のような免疫抑制状態の個体において、特に難しい問題を提示する。
【００８２】
本発明の多数の実施形態を説明した。しかしながら、さまざまな変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は表１であって、下記の実施例で検討した、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスにおけるＭＨＶ−６８の再活性化に関する、ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体の影響を示すデータをまとめたものである。
【図１】
0003581660.tif 000004