(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アースロバクター・グロビフォルミス由来であり、
下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ、
グルコデキストラナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子を含有する、
塩基対が4.8KbであるＤＮＡ断片。
0003577171.tif 000009
【請求項２】
以下の(a)または(b)のタンパク質をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子。
(a)  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)  アミノ酸配列(a)において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコデキストラナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１または請求項２記載のグルコデキストラナーゼ遺伝子または該遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物よりグルコデキストラナーゼを採取することを特徴とするグルコデキストラナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコデキストラナーゼ遺伝子、組み換え体ＤＮＡ、形質転換体または形質導入体及びグルコデキストラナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デキストランから環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の作用により合成される環状イソマルトオリゴ糖は、土壌より単離した１菌株のデキストラン含有培地での培養液から、本発明者等により初めて単離された新規な環状オリゴ糖であり、サイクロデキストリンと同様に低分子化合物と包接化合物を形成することにより、医薬品、食品等への利用が期待されている有用な環状オリゴ糖である（特開平６−１９７７８３号公報参照）。
【０００３】
この環状オリゴ糖は、また、虫歯の原因菌として知られているストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の生産するグルカン合成酵素の特異的な阻害剤でもあることから、歯垢形成を顕著に阻害する。従って、抗う蝕剤への応用も期待されている（特開平８−５９４８４号公報参照）。
【０００４】
一方、環状イソマルトオリゴ糖を効率良く製造するために、デキストランから環状イソマルトオリゴ糖を合成する酵素である環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を用いた該オリゴ糖の製造法を特許出願した（特開平７−８２７６号公報参照）。
【０００５】
更に、該環状オリゴ糖を分離精製する際に、不純物として混入してくる直鎖イソマルトオリゴ糖を特異的に除去するために、エキソ型デキストラナーゼであるグルコデキストラナーゼを作用させることにより、該環状オリゴ糖を簡単な操作で精製することが可能となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
グルコデキストラナーゼは、例えば、現在までに、アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の２菌株〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第４０巻、１２９３−１２９９  頁（１９７６），  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、第４３巻、７３−７８  頁（１９９６）〕から、また、類似の酵素として、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）〔Ｃａｒｂｏｈｙｒｄｏ．  Ｒｅｓ．、第２９巻、１−１４（１９７３）〕から夫々単離精製されているに過ぎない。
【０００７】
これらの菌の生産するグルコデキストラナーゼは、誘導酵素であるため、培地に高価なデキストランを添加しなければならず、かつ、培養時間が長いという難点があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、上記の点を解決すべく、鋭意検討した結果、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株からグルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を初めて単離しその構造を決定することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明の第１は、下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ、塩基対が４．８Ｋｂであるグルコデキストラナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ  断片である。
【０００９】
0003577171.tif 000002
【００１０】
本発明の第２は、  以下の（ａ）  または（ｂ）  のタンパク質をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子である。
（ａ）    配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）    アミノ酸配列（ａ）  において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコデキストラナーゼ活性を有するタンパク質
本発明の第３は、上記記載の組み換え体ＤＮＡである。
【００１１】
本発明の第４は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体である。
本発明の第５は、上記形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物よりグルコデキストラナーゼを採取することを特徴とするグルコデキストラナーゼの製造法である。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有する遺伝子の調製について述べる。
本酵素をコードする遺伝子のドナー微生物としては、本酵素を生産するものであれば、如何なるものでもよく、例えば、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株〔Ｊ．  ＡＰＰｌ．  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，  第４３巻、７３ー７８頁（１９９６）〕等が挙げられる。上記菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同様であり、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気撹拌培養法等が用いられる。
【００１３】
培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタミン、ミネラル及び本酵素の誘導基質であるデキストランを含んだものが用いられる。ｐＨは、本菌が成育するｐＨ領域であればいずれでもよく、通常は、６〜８の範囲が好ましい。
【００１４】
培養条件は、例えば、通常２０〜４０℃で、１６時間〜４日間振盪培養または通気撹拌培養を行う。この様にして得られる培養物を、例えば３０００ｒｐｍ以上、好ましくは８０００〜１００００ｒｐｍで５分以上、好ましくは１０〜２０分間遠心分離してアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４株の菌体を得る。この菌体より、例えば、斎藤、三浦の方法〔バイオケム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕の方法等により染色体ＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
次いで、この染色体ＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばＳａｕ３Ａ１（宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度０．１〜１０ユニット／ｍｌ  で２０分以上、好ましくは３０分〜２時間作用させて部分消化し、種々の鎖長の染色体ＤＮＡ断片を得る。染色体ＤＮＡ断片は、必要によりフェノール抽出処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、エタノール沈殿処理等の既存の精製工程により精製する。
【００１６】
一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１１８ＤＮＡ（宝酒造社製）等が好ましい。
【００１７】
上記ベクターＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１０〜１０００ユニット／ｍｌで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。ベクターＤＮＡは、必要によりフェノール抽出処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、あるいはエタノール沈殿処理等の既存の精製工程により精製する。
【００１８】
次いで、上記のようにして得たアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来で、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物と切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）等、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７℃、好ましくは４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。本工程は市販のライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて行なうことも可能である。
【００１９】
この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、大腸菌ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）、大腸菌ＤＨ  Ｉ  （ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ−１７７６  （ＡＴＣＣ３１２４４）  、大腸菌ＸＬ１（東洋紡社製）等を形質転換あるいは形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換は、ディー・エム・モーリソン（Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕により行なうことができる。また形質導入は、ビー・ホーン（Ｂ．Ｈｏｈｎ）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができる。
【００２０】
そして、上記菌株よりグルコデキストラナーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、グルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルコデキストラナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を得ることができる。
【００２１】
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピー・グーリー（Ｐ．Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１６巻、第１０６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ．Ｃｌｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕等により得ることができる。
【００２２】
更に上記グルコデキストラナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを用いて、実施例の項目４に示すようにＴａｑポリメラーゼを用いたサンガー・ジデオキシ・ターミネーション（Ｓａｎｇｅｒ／ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によってグルコデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行ない（配列番号２参照）、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポチペプチドのアミノ酸一次配列を確定する。（配列番号１参照）。
【００２３】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつ、グルコデキストラナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子は、全て本発明に含まれる。
【００２４】
そして、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個の、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつ、グルコデキストラナーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするグルコデキストラナーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
【００２５】
上記の様にして得られたグルコデキストラナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルコデキストラナーゼ生産能を有する形質転換体または形質導入体、例えばエッシェリシア属に属する菌株を用いてグルコデキストラナーゼを生産するには、培養法は、原則的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気撹拌培養法等が好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、初発ｐＨは、７〜９に調製するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間実施するのが好ましい。
【００２６】
培養終了後、該培養物よりグルコデキストラナーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
例えば、常法により菌体を超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いてグルコデキストラナーゼを抽出するか、または、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化をおこなわせグルコデキストラナーゼを菌体外に排出させる。この溶菌液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、これを水に透析した後真空乾燥して粗酵素標品を得る。
【００２７】
更に、グルコデキストラナーゼの精製標品を得るには、例えばＤＥＡＥ−セファロース〔ジエチルアミンエチルセファロース、ファルマシア社製〕、ＤＥＡＥ−セファデックス〔ファルマシア社製〕等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、例えばセファデックスＧ−２００〔ファルマシア社製〕、バイオラッドＰ−１５０〔バイオラッド社製〕等のゲル濾過による各種クロマトグラフィーを行ない、必要により、例えばＴＳＫ  ｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ〔東ソー社製〕等のイオン交換クロマトグラフィーあるいは、例えば、ＴＳＫ  ｇｅｌ  エーテル５ＰＷ〔東ソー社製〕、ＴＳＫ  ｇｅｌ  フェニル５ＰＷ〔東ソー社製〕等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、例えばＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ〔東ソー社製〕等のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）操作を適宜組合せて実施することにより、高度に精製されたグルコデキストラナーゼ酵素標品を得ることができる。
上記手段により得られる精製グルコデキストラナーゼの理化学的性質は、親株由来のグルコデキストラナーゼの性質と全く同様である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
（１）アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡの調製
１％デキストラン４０（名糖産業社製）、１％ペプトン（極東製薬工業社製）、０．５％  ＮａＣｌ及び０．１％イーストエキストラクト（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使用、ｐＨ  ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、１２０℃で２０分間、滅菌処理を行なった。これに、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８１２）保存スラントより１白金耳接種し、３０℃で１日間振盪培養した。本培養液１ｍｌを上記と同一の培地組成と滅菌条件により調製した１０ｍｌの培地を含有する大型試験管に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で２日間振盪培養を行ない、培養終了後、培養液から８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により菌体を分離し、湿潤菌体約５０ｍｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕により染色体ＤＮＡ溶液１ｍｌを得た。
【００３０】
次いで、この染色体溶液３６０μｌ（約２００μｇ染色体ＤＮＡ）及び制限酵素Ｓａｕ３Ａ１（宝酒造社製）０．２ユニットを、５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有）（ｐＨ７．４）に混合し、３７℃で１時間反応させて部分消化液を得た。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理した後、このＳａｕ３Ａ１で部分消化されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁記載の方法で子牛ホスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理により、ＤＮＡ断片の脱燐酸化反応を行ない、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して、Ｓａｕ３Ａ１で部分消化されたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡ断片１６０μｇを得た。
【００３１】
（２）プラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡを利用したアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製及びエンドデキストラナーゼ遺伝子の検索
プラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ（宝酒造社製）２０μｇ及び制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）１０ユニットを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有）（ｐＨ７．４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得た。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理して、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８を得た。
【００３２】
次いで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８ＤＮＡ断片１μｇ、上記項目（１）で得られたＳａｕ３Ａ１で部分消化されたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及びＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を常法に従って混合後、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。
【００３３】
このようにして得た組み換え体プラスミドＤＮＡ含有液１０μｌを大腸菌コンピテントセル（ＸＬ２）（東洋紡社製）１００μｌと混合し、氷中で２０分間静置することにより形質転換を行なった。本形質転換液１１０μｌを前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）イーストエキストラクト（ディフコ社製）及び０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）〕３ｍｌに接種し、３７℃で３０分間振盪培養した後、培養液を２００μｌずつ滅菌済ブルーデキストラン含有Ｘ−Ｇａｌプレート〔０．５％（Ｗ／Ｖ）ブルーデキストラン（ファルマシア社製）、１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）イーストエキストラクト（ディフコ社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ、１．５％寒天（ｐＨ７．２）を前記と同様の滅菌条件により滅菌処理したものに、滅菌済フィルター（孔径  ０．２２μｍ）（ミリポア社製）で無菌濾過したＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ベーリンガーマンハイム社製）、Ｘ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ベーリンガーマンハイム社製）及びアンピシリン（シグマ社製）を無菌的に添加して夫々、５０μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）ＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）Ｘ−Ｇａｌ及び２５μｇ／ｍｌ（Ｗ／Ｖ）アンピシリンの濃度に調製した培地を直径９ｃｍのシャーレに２０ｍｌずつ分注したプレート〕に塗布し、３７℃で２４時間静地培養した。生じたコロニーのうち、白色コロニーのものを染色体ＤＮＡライブラリーとし、ライブラリーの中でコロニーのまわりにクリアーハローを生じる菌株を検索した。その結果、染色体ＤＮＡライブラリー約１００００コロニーより陽性コロニーを１０株得た。
【００３４】
該陽性株を前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地にアンピシリン及びＩＰＴＧを各々終濃度５０μｇ／ｍｌになるように、無菌的に添加して調製した液体培地３ｍｌに１白金耳接種後、３７℃で１６時間振盪培養を行ない培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約２ｍｇを得た。該菌体から、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、第２５〜２８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載のアルカリ法によりエンドデキストラナーゼ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製した後、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）  緩衝液に溶解した。該組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＤＸ１〜ｐＤＸ１０と命名した。該プラスミドＤＮＡを用いて〔ジェイ．  バクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１９巻、第１０７２頁〜１０７４頁  （１９７４年）〕記載の形質転換法により大腸菌ＸＬ２株（東洋紡社製）を形質転換し、エンドデキストラナーゼ活性を検討し、形質転換株を得た。
【００３５】
この様にして得られたエンドデキストラナーゼ遺伝子を含む形質転換体より、再度アルカリ法によりプラスミドを抽出し、次いで、組み換え体プラスミドＤＮＡｐＤＸ７及びｐＤＸ１を用いてキロシークエンス用欠失キット（宝酒造社製）を用い、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）の方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２８巻、第３５１〜３５９頁、（１９８４年）〕に従い、エンドデキストラナーゼ遺伝子及びその近傍の遺伝子に種々の欠失が導入されたプラスミドＤＮＡを作製し、項目（２）と同様にして大腸菌ＸＬ２を形質転換した。再度アルカリ法によりプラスミドを抽出し、得られた２本鎖ＤＮＡによるシークエンシングはタックポリメラーゼシークエンシングキット（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕及びＤＮＡシークエンサー〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕を用いて、常法に従って行なった。得られたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のエンドデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列及びその近傍の塩基配列を解析したところ、ｐＤＸ１の挿入ＤＮＡ断片のエンドデキストラナーゼ遺伝子の上流に、約２．４ｋｂのオープンリーディングフレームが存在していることが確認され、その塩基配列から翻訳されるアミノ酸一次配列中に、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼのリジルエンドペプチダーゼ処理により得られたペプチド断片の配列と一致する箇所が、数箇所確認された。すなわち、この約２．４ｋｂのオープンリーデイングフレームは、グルコデキストラナーゼのＣ末端側約８００アミノ酸残基をコードしていることが明かとなった。
【００３６】
（３）プローブＤＮＡの作製
そこで、本オープンリーデイングフレーム上の、中間部分約１．２ｋｂをプローブとして、プローブ法により、グルコデキストラナーゼ遺伝子の全長が挿入された組み換え体ＤＮＡを検索した。中間部分の塩基配列より、２０残基のセンスプライマー、アンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕により合成し、ｐＤＸ１を鋳型にして、ＬＡＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により中間部分約１．２ｋｂの配列を増幅させた。増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を含んだ反応溶液を１．５％アガロースゲル電気泳動操作に供し、目的のＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、エタノール沈殿処理後、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）緩衝液に溶解した。該ＤＮＡ溶液を、ＤＮＡラベリング＆ディテクションキット〔Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、（ベーリンガー社製）〕を用いてラベリングし、非放射性プローブＤＮＡを作製した。
【００３７】
（４）グルコデキストラナーゼ遺伝子の検索及びグルコデキストラナーゼ遺伝子の塩基配列の解析
項目（３）で調製した非放射性プローブＤＮＡを用いて、項目（２）で作製した染色体ＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーション処理を〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓａｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）第９０〜９９頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載の方法により行なった。対合した非放射性プローブＤＮＡの検出は、ＤＮＡラベリング＆ディテクションキット〔Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、（ベーリンガー社製）〕を用いて行なった。その結果、染色体ＤＮＡライブラリー約５０００コロニーより陽性コロニーを４株得た。該陽性株を前記と同様の滅菌条件により調製した滅菌済Ｔ−Ｙ培地３ｍｌに１白金耳接種後、３７℃で１６時間振盪培養を行ない培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約２ｍｇを得た。
【００３８】
該菌体から、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓａｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）第２５〜２８頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年〕記載のアルカリ法によりグルコデキストラナーゼ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製した後、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）緩衝液に溶解した。得られた４株の組み換え体ＤＮＡをｐＧＤ７、ｐＧＤ８、ｐＧＤ９、ｐＧＤ１１と命名した。該プラスミド上の挿入断片の塩基配列を解析は、２本鎖ＤＮＡを調製後、ダイプライマータックポリメラーゼシークエンシングキット及びダイターミネータータックポリメラーゼシークエンシングキット（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕及びＤＮＡシークエンサー〔アプライド・バイオシステム・インスツルメント（ＡＢＩ社製）〕を用いて、常法に従って行なった。その結果、ｐＧＤ８には、アースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼのＮ末端側のアミノ酸一次配列と完全に一致する配列が確認され、グルコデキストラナーゼ遺伝子を全長含んでいることが明かとなった。得られたアースロバクター・グロビフォルミスＴ−３０４４菌株由来のグルコデキストラナーゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号２に、また該塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号１に夫々示した。更に、これら２種類のプラスミド１μｇを制限酵素を組み合わせて処理することにより切断した後、常法に従い、０．７％及び１．５％アガロースゲル電気泳動を行ない各ＤＮＡ断片の長さを調べることにより、制限酵素開裂地図を作成した。
【００３９】
（５）大腸菌ＸＬ２（ｐＧＤ８）の培養及び粗グルコデキストラナーゼ酵素液の調製
大腸菌ＸＬ２（ｐＧＤ８）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５８１３）を、Ｔ−Ｙ培地３ｍｌ中で温度３７℃で１６時間振盪培養した後、培養液を氷中で２分間超音波処理して得た粗酵素液中のグルコデキストラナーゼ活性は、約４．４ｍＵ／ｍｌであった。尚、比較の為ｐＵＣ１１８ベクターＤＮＡを有する大腸菌ＸＬ２を用いて、上記と同様の処理を行なって得た細胞抽出液中のグルコデキストラナーゼ活性を測定した結果、活性は検出されなかった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、グルコデキストラナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体及びこの形質転換体または形質導入体を用いてグルコデキストラナーゼを製造する方法を提供する。又、この方法によりグルコデキストラナーゼを高価なデキストランを培地に添加することなく短時間に、かつ、効率的に生産することができる。したがって、本発明は産業上きめて有用である。
【００４１】
【配列表】
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【００４２】
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