(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）  ：
【化１】
0003548194.tif 000010
により表される１２ａ−デオキシテトラサイクリン又はその医薬上許される塩を含むことを特徴とする過度のコラーゲン破壊防止剤。
［式中、
Ｒ１  は水素原子又はジメチルアミノ基を表し、
Ｒ２  は水素原子を表すか又はＣ−３  位の炭素原子と二重結合を形成し、
Ｘ１  、Ｘ２  、Ｘ３  及びＸ４  は各々ヒドロキシル基又はオキソ基を表し、かつ
所定の位置に示されている破線は各々の位置で炭素−炭素結合又は、Ｘ１  、Ｘ２  、Ｘ３  又はＸ４  及び環形成炭素原子により形成される結合が存在してもよいことを意味し、
前記破線の位置に存在する二重結合の数は下記の条件で４である：
Ｘ１  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合又はＣ１−Ｃ２  結合の一つが二重結合であり；
Ｘ２  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ２−Ｃ３  結合又はＣ３−Ｃ４  結合の一つが二重結合であり；
Ｘ３  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１１−Ｃ１１ａが二重結合であり；及び
Ｘ４  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合又はＣ１２−Ｃ１２ａ結合の一つが二重結合であり；
（但し、前記Ｃ１−Ｃ２  結合と前記Ｃ２−Ｃ３  結合、前記Ｃ１１−Ｃ１１ａ結合と前記Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合、又は前記Ｃ１２−Ｃ１２ａ結合と前記Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合が同時に二重結合とはなり得ない。）、また
Ｘ１  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合とＣ１−Ｃ２  結合が各々単結合であり；
Ｘ２  がオキソ基である場合には、前記Ｃ２−Ｃ３  結合とＣ３−Ｃ４  結合が各々単結合であり；
Ｘ３  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１１−Ｃ１１ａ結合が単結合であり；また
Ｘ４  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合とＣ１２−Ｃ１２ａ結合が各々単結合である。］
【請求項２】
前記１２ａ−デオキシテトラサイクリンが４−デジメチルアミノ−１２ａ−  デオキシテトラサイクリンである請求項１に記載の防止剤。
【請求項３】
前記１２ａ−デオキシテトラサイクリンが各々下記の二つの式：
【化２】
0003548194.tif 000011
により表される二種の化合物の混合物である請求項１に記載の防止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は結合組織破壊を特徴とする疾患を治療するための医薬、更に詳しくは結合組織の主要な成分であるコラーゲンの破壊を特徴とする関節疾患を治療するための医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の疾患は炎症及び結合組織破壊を特徴としている。これらの疾患の治療のために、抗炎症薬が殆どの場合に使用されていた。特に、非ステロイド系抗炎症薬（以下、“ＮＳＡＩＤ  類”  と称する）が、痛み及び炎症を抑制する目的で使用されていた。ＮＳＡＩＤ  類は、炎症部位に存在するアラキドン酸の代謝においてシクロオキシゲナーゼを抑制し、それによりプロスタグランジン合成を抑制する。それ故、ＮＳＡＩＤ  類は直接の鎮静活性及び抗炎症活性を有すると考えられる。
免疫調節物質が関節疾患の発病を抑制するのに使用される。症状が悪化した場合、アドレノコルチコイド、金化合物、免疫抑制物質等が使用される。しかしながら、アドレノコルチコイドの長期使用は骨多孔症を誘発し、一方、その他の薬剤は制限された効果しか有しない。
【０００３】
近年、上記薬剤の機構とは異なる機構により作用する新規な薬剤を開発することに関心がもたれている。幾つかの研究が、関節組織の破壊を抑制する薬剤を得るために行われてきた。研究の過程で、コラゲナーゼの如きマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）が結合組織を破壊するのに重要な役割を果たすことが発見された［Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．１５：４９５（１９９０）  ］。テトラサイクリン、ミノサイクリン及びドキシサイクリン、又はそれらの塩、例えば、塩酸塩の如き抗生物質テトラサイクリン類（以下、これらの化合物は時々“テトラサイクリン”と称される）は広範な抗菌スペクトルを有することが知られている。抗生物質としての活性以外の活性もまた研究されており、１９８３年にニューヨーク州立大学の研究グループが歯周疾患におけるミノサイクリンの抗コラーゲン分解活性を報告している［Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．１８：  ５１６（１９８３）  ］。それ以来、コラーゲン破壊を特徴とする種々の疾患に関する研究の進展により、テトラサイクリンがこれらの疾患を治療するための臨床上の適用につき研究されている。こうして、下記の疾患につきテトラサイクリンによる治療が報告されている。歯周炎［Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．  １９  ：６５１（１９８４）  及びＪ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．  ６８（Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ）、１６９１（１９８９）］；Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．  ２５：３２１−３３０（１９９０）；  角膜潰瘍［Ｃｏｒｎｅａ  ３：７５（１９８４）及びＡｎｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１７  ：７４２（１９８５）  ］；ライター病及びライム病［各々、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ７  ：１００（１９８９）及びＡｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．９９：２２（１９８３）］並びに慢性関節リウマチ［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：２８（１９８７）］。
【０００４】
また、慢性関節リウマチを患う患者に関するミノサイクリンの臨床試験の結果として、認められる効果が投与の開始後４ケ月で観察されたことが報告された［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１７：４３（１９９０）］。
テトラサイクリンのコラゲナーゼ抑制活性に関する知識の結果として、テトラサイクリン誘導体を合成する努力がなされてきた。ニューヨーク州立大学の研究グループは、化学的に修飾されたテトラサイクリン、例えば、４−デジメチルアミノテトラサイクリン（以下、時々“ＤＭＡＴ”  と称する）が慢性関節リウマチ、歯周疾患及び治療薬の長期投与を要するその他の疾患の治療に有益であると報告した。［米国特許第４，７０４，３８３  号明細書（特開昭第６１−２４３０２３  号公報）を参照のこと］。ＤＭＡＴは同様の抗菌活性を有しないでコラゲナーゼ抑制、骨吸収の抑制、等に関してテトラサイクリンと比較して有利であることがわかった［Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．  ６６：１３１０（１９８７）；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０５  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ．要約  Ｎｏ．１２２３  ｐ．２１６ａ（１９８７）  及びＴｈｅ  ３６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｏｒｔｈ．  Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．要約  ｐ．２６８（１９９０）］。
【０００５】
１９９１年に、ニューヨーク州立大学の研究グループは、抗コラゲナーゼ活性を有するが抗菌活性を有しない化学的に修飾されたテトラサイクリン、例えば、ＤＭＡＴと、ＮＳＡＩＤ  、例えば、フルルビプロフェン（ｆｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ）  との組み合わせによる治療が骨の欠損を抑制し、慢性関節リウマチの如き組織破壊疾患に有効であることが判明したと報告した［米国特許出願第０７／４４５，４１０号公報（特開平第３−２２７９３１号公報）］。
ＮＳＡＩＤ  （それらはプロスタグランジン合成を抑制することにより鎮静効果及び抗炎症効果を生じる）は関節疾患の痛み及び炎症を抑制するのに有効であるが、それらは疾患の組織破壊の進行を抑制又は遅延するための治療薬として知られていない。現在広く使用されているＮＳＡＩＤ  はプロスタグランジン合成の抑制を生じるが胃腸障害を引き起こす。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
それ故、本発明の目的は、優れた抗コラゲナーゼ活性を有し、毒性又は副作用が殆どなく、しかも長期治療で使用できる有効量の非抗菌性テトラサイクリン誘導体又はその医薬上許容される塩を含む結合組織破壊を特徴とする症状又は疾患を治療するための医薬を提供することにある。
この目的並びに本発明のその他の目的及び利点は、下記の詳細な説明から当業者に明らかである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（１）  ：
【０００８】
【化３】
0003548194.tif 000002
【０００９】
により表される１２ａ−デオキシテトラサイクリン又はその医薬上許容される塩（以下、１２ａ−デオキシテトラサイクリン又はその医薬上許容される塩は時々“テトラサイクリン誘導体”と称する）からなる過度のコラーゲン破壊防止剤に関する。
［式中、
Ｒ１  は水素原子又はジメチルアミノ基を表し、
Ｒ２  は水素原子を表すか、又はＣ−３  位の炭素原子と二重結合を形成し、
Ｘ１  、Ｘ２  、Ｘ３  及びＸ４  は各々ヒドロキシル基又はオキソ基を表し、かつ
所定の位置に示されている破線は、各々の位置において、炭素−炭素結合又はＸ１  、Ｘ２  、Ｘ３  又はＸ４  及び環形成炭素原子により形成される結合が存在してもよいことを意味し、
その破線の位置に存在する二重結合の数は下記の条件で４である：
Ｘ１  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合又はＣ１−Ｃ２  結合の一つが二重結合であり；
Ｘ２  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ２−Ｃ３  結合又はＣ３−Ｃ４  結合の一つが二重結合であり；
Ｘ３  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１１−Ｃ１１ａが二重結合であり；また
Ｘ４  がヒドロキシル基である場合には、Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合又はＣ１２−Ｃ１２ａ結合の一つが二重結合であり；
（但し、前記Ｃ１−Ｃ２  結合と前記Ｃ２−Ｃ３  結合、前記Ｃ１１−Ｃ１１ａ結合と前記Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合、又は前記Ｃ１２−Ｃ１２ａ結合と前記Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合が同時に二重結合ではあり得ない）、また
Ｘ１  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１２ａ−Ｃ１  結合とＣ１−Ｃ２  結合が各々単結合であり；
Ｘ２  がオキソ基である場合には、前記Ｃ２−Ｃ３  結合とＣ３−Ｃ４  結合が各々単結合であり；
Ｘ３  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１１−Ｃ１１ａ結合が単結合であり；また
Ｘ４  がオキソ基である場合には、前記Ｃ１１ａ−Ｃ１２結合とＣ１２−Ｃ１２ａ結合が各々単結合である。］
【００１０】
本発明に使用される１２ａ−デオキシテトラサイクリンは、１２ａ−デオキシテトラサイクリン（以下、時々“ＤＯＴＣ”  と称す）、即ち、Ｒ１  がジメチルアミノ基である式（１）  の化合物、及び４−デジメチルアミノ−１２ａ−  デオキシテトラサイクリン（以下、時々“ＤＯＤＭＡＴ”  と称される）、即ち、Ｒ１  が水素原子である式（１）  の化合物であり、これらの中でＤＯＤＭＡＴが更に好ましい。
ＤＯＴＣは、例えば、下記の式により表される異性体を含む。
【００１１】
【化４】
0003548194.tif 000003
【００１２】
一方、ＤＯＤＭＡＴは、例えば、下記の式により表される異性体を含む。
【００１３】
【化５】
0003548194.tif 000004
【００１４】
１２ａ−デオキシテトラサイクリン類の医薬上許容される塩の例は、酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、コハク酸、オレイン酸又はパルミチン酸との塩；アルカリ金属又はアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム又はアルミニウムの水酸化物又は炭酸塩との塩；及びトリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンとの塩、等である。
【００１５】
これらの１２ａ−デオキシテトラサイクリンは既知化合物であり、ａ）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：７４５（１９６０）、ｂ）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：３９４６（１９６０）  及びｃ）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：３９５０（１９６０）  に記載されている。
文献ａ）は上記の式ＤＯＴＣ−１及びＤＯＴＣ−２により表される異性体を記載しており、一方、ｃ）は式ＤＯＴＣ−３により表される異性体を記載している。文献ｂ）は式ＤＯＤＭＡＴ−１により表される異性体（これはＤＯＤＭＡＴ−２により示される構造を有していたかもしてない）を記載している。
【００１６】
１２ａ−デオキシテトラサイクリンは上記の文献に記載された方法に従って合成し得る。ＤＯＤＭＡＴは下記の式により表されるＤＭＡＴを水性アンモニア中で亜鉛で還元することにより得ることができる。
【００１７】
【化６】
0003548194.tif 000005
【００１８】
１２ａ−デオキシテトラサイクリンの医薬上許容される塩は、既知の塩生成反応を使用することにより調製される。
合成例１で得られるようなＤＯＤＭＡＴ−２とＤＯＤＭＡＴ−３の混合物、及び本明細書で後記される合成例２で得られるようなＤＯＴＣは、後記される試験例に示されるように、優れた抗コラゲナーゼ活性を有する。
後記される試験例に示されるように、ＤＯＤＭＡＴ−２とＤＯＤＭＡＴ−３の混合物は、ウサギの骨関節炎モデルを使用して関節軟骨の破壊のかなりの抑制を示した。
毒物学的研究は本発明に使用されたテトラサイクリン誘導体の低毒性を示し、副作用が長期投与後に殆ど観察されなかった。
【００１９】
こうして、本発明に使用されるテトラサイクリン誘導体は、結合組織の破壊を特徴とする関節疾患の治療に有効である。
これらのテトラサイクリン誘導体は、経口投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与もしくは関節内投与されてもよく、又は噴霧化及び座薬を含む外部適用により投与されてもよい。ＤＯＴＣ又はＤＯＤＭＡＴの異性体、もしくはその異性体の二種以上の混合物を投与し得る。
テトラサイクリン誘導体は確立された製剤操作により投与用の組成物に製剤化され、調製し得る。このような医薬組成物が経口投与を目的としている場合、それらは胃腸道からの吸収に適した投薬形態で与えられることが好ましい。経口投与用の単位投薬形態である錠剤及びカプセルは、結合剤、例えば、結晶性セルロース、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゲル及びポリビニルピロリドン；賦形剤、例えば、ラクトース、ソルビトール、トウモロコシ澱粉及びリン酸カルシウム；滑剤、例えば、ステアリン酸カルシウム及びタルク；崩壊剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、等を含んでいてもよい。これらの錠剤は当業界で知られている方法で被覆し得る。
【００２０】
経口投与用の液体製剤は、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤等であってもよく、もしくは凍結乾燥物（これらは使用前に水又はその他の適当なビヒクルで即時に再構成される）であってもよい。このような液体製剤は、懸濁剤、例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／蔗糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル及び水添された食用油及び脂肪；乳化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエート及びアラビアゴム；非水性ビヒクル、例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール及びエタノール；防腐剤、例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート及びソルビン酸；等を含む通常の添加剤を含んでいてもよい。
【００２１】
注射液を調製するために、テトラサイクリン誘導体は既知の方法で注射用の生理塩類溶液及びグルコース溶液の如き適当な溶媒中で懸濁されて皮下投与、筋肉内投与又は関節内投与用の注射液を得る。上記の注射液を調製する際に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤、可溶化剤等を、必要により、その水溶液に添加してもよい。外部適用に関して、テトラサイクリン誘導体は軟膏、薬用液、クリーム、等に製剤化してもよい。これらの製剤は、普通使用される希釈剤、例えば、動物又は植物の脂肪、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛を単独で、または組み合わせて含んでいてもよい。スプレーを調製するために、通常の噴霧剤、例えば、クロロフルオロカーボンが混入されてもよい。座薬に関して、カカオ脂肪、マクロゲル等のベースが使用され、更に表面活性剤、防腐剤、香料、安定剤等が混入されてもよい。
【００２２】
テトラサイクリン誘導体の投薬量は、疾患の種類、疾患の重度、患者の寛容性及びその他の因子に依存する。しかしながら、成人に関する通常の毎日の投薬量は、経口又は注射による場合、１回の投薬又は数回に分けた投薬で１〜１０００ｍｇである。外部適用において、０．００１  〜１０％、好ましくは０．０５〜５％のテトラサイクリン誘導体を含む組成物が毎日１〜３回で疾患部分に適用される。
本発明のその他の特徴は、例示の実施態様の下記の記載の過程で明らかになり、これらは本発明の説明のために示されるものであり、本発明を限定することを目的とするものではない。
【００２３】
【実施例】
合成例１
４−デジメチルアミノ−１２ａ−  デオキシテトラサイクリン（ＤＯＤＭＡＴ）の合成
４−デジメチルアミノテトラサイクリン２０．０ｇ（５０ミリモル）  を１５％のアンモニア水溶液５００  ｍｌに溶解することにより溶液を調製した。得られる溶液に、亜鉛微粉４０ｇ  を添加し、その混合物を激しく攪拌した。２２時間攪拌した後、その反応混合物を濾過して過剰の亜鉛微粉を除去した。濾液を、氷で冷却しながら濃塩酸で中和した。沈殿した固体を濾過により回収し、水洗し、乾燥し、次いでカラムクロマトグラフィーにより精製、単離して４−デジメチルアミノ−１２ａ−  デオキシテトラサイクリン３．５ｇ（  収率１８％）  を２種の異性体の混合物として得た。その混合物をＨＰＬＣにより分離して異性体Ａ及び異性体Ｂを得た。それらの性質を以下に示す。
0003548194.tif 000006
異性体ＡのＵＶ吸収スペクトルは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：３９４６（１９６０）  に記載されたＤＯＤＭＡＴ−２のＵＶ吸収スペクトルと同一であった。異性体Ｂの構造は上記の式ＤＯＤＭＡＴ−３であると推定される。
【００２４】
合成例２
１２ａ−デオキシテトラサイクリン（ＤＯＴＣ）の合成
テトラサイクリン２ｇを１５％のアンモニア水溶液５０ｍｌに溶解することにより溶液を調製した。得られる溶液に、亜鉛微粉４ｇを添加し、その混合物を激しく攪拌した。２時間攪拌した後、その反応混合物を濾過して過剰の亜鉛微粉を除去した。濾液を、氷で冷却しながら濃塩酸で中和した。沈殿した固体を濾過により回収し、次いで水４５０  ｍｌと混合した。その混合物を塩酸の使用によりｐＨ１．８  に調節した。得られた溶液を液液抽出法によりエーテルで抽出した。抽出液を濃縮して粗生成物４５０ｍｇ  を得、これをジメチルホルムアミド−メタノールで再結晶して１２ａ−デオキシテトラサイクリン４００ｍｇ（収率２１％）  を得た。ＨＰＬＣは、この生成物が二種の異性体の混合物であることを明らかにした。分子量ＦＤ質量スペクトル［Ｍ  ］＋  ４２８  。
【００２５】
実験例
本発明に使用されるテトラサイクリン誘導体を、コラゲナーゼ抑制（試験管内）及びウサギ骨関節炎モデルを使用する関節軟骨の破壊の抑制（生体内）につき試験した。試験法及び結果を以下に示す。試験したテトラサイクリン誘導体は合成例１で得られたＤＯＤＭＡＴ−２とＤＯＤＭＡＴ−３の混合物（以下、この混合物を“ＤＯＤＭＡＴ混合物”と称する）及び合成例２で得られたＤＯＴＣ（異性体の混合物）であった。ＤＭＡＴを対照として使用した。
１．コラゲナーゼ抑制試験実験
Ａ．コラゲナーゼの調製
日本白ウサギ（生後４週）の膝関節軟骨を無菌で取り出した。軟骨細胞をコリエー（Ｓ．Ｃｏｌｌｉｅｒ）  らの方法［Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４８：  ３７２（１９８９）  ］に従って分離した。ハムＦ１２  培地（１０％のウシ胎児血清を含む）３０ｍｌ中で、４  ｘ  １０６  個の軟骨細胞を懸濁させ、その培地を、５％の二酸化炭素蒸気を含む空気雰囲気下で１５０ｃｍ２のインキュベーション・フラスコ（日本のイワキ・ガラス社製）中で３７℃でインキュベートした。培地を３〜４日毎に交換した。細胞が集密状態まで増殖した時（インキュベーションの開始の７〜９日後）、その培地を、血清を含まないハムＦ１２  培地（米国ゲンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏ．）  により製造されたヒト組換えインターロイキン−１α３０単位／ｍｌ）及び０．４  ％のラクトアルブミン加水分解物（米国シグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）  により製造）で交換し、インキュベーションを４日間行った。培養上澄みを採取し、試験されるコラゲナーゼ溶液として使用した。
【００２６】
Ｂ．コラゲナーゼ活性の測定
上記コラゲナーゼ溶液をナガイらの方法［Ｅｎｓｈｏ  ４  ：  ２４７（１９８４）  ］に従ってトリプシンで処理することにより活性化し、次いで添加したトリプシンを大豆トリプシンインヒビター（シグマ社により製造）で失活して活性化コラゲナーゼ溶液を得た。コラゲナーゼ活性をナガイらの方法［Ｅｎｓｈｏ  ４  ：  １２３（１９８４）  ］（この方法はＦＩＴＣ標識コラーゲンの分解活性を測定することを含む）に従って測定した。コラゲナーゼ活性を１分間で３５℃におけるコラーゲン１μｇ  の分解（１単位に等しい）に基いて表した。
【００２７】
Ｃ．コラゲナーゼ抑制の活性
被検薬剤の溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いでコラゲナーゼ・アッセイ溶液に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は５％である。薬剤の抑制比を、それを添加しないコラーゲン分解活性（１００  ％である）に基いて計算した。  結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
被検薬剤                          ５０  ％の抑制を示す薬剤の濃度、ＩＣ５０（Ｍ）  
ＤＯＤＭＡＴ混合物                              ２．５  ｘ  １０−６
合成例２で得られたＤＯＴＣ                    ２．２  ｘ  １０−５
ＤＭＡＴ ３．０  ｘ  １０−４ 
【００２９】
表１から明らかであるように、ＤＯＤＭＡＴ混合物及び合成例２で得られたＤＯＴＣの両方はＤＭＡＴのコラゲナーゼ抑制活性の１０倍以上の強いコラゲナーゼ抑制活性を有することが確認された。
２．ウサギ骨関節炎モデルを使用する関節軟骨の破壊の抑制に関する試験
Ａ．ウサギ骨関節炎モデルの調製
ウサギ骨関節炎モデルをコロンボ（Ｃ．Ｃｏｌｏｍｂｏ）  らの方法［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２６：  ８７５（１９８３）  ］に従って部分側方半月切除操作により調製した。体重約３ｋｇ  の成体の雄のニュージーランド白ウサギを各々使用した。これらの動物を外科手術の前に４０ｍｇ／ｋｇ  のケタミン及び１．６ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉内注射により麻酔した。外科手術を以下のように行った。右膝を横方向に開き、外側側副靱帯を露出し、３〜４ｍｍを取り出した。続いて、種子状靱帯３〜４ｍｍを取り出し、その後、露出した半月の前側方領域４〜５ｍｍを取り出した。次いで被膜及び皮膚を縫合した。外科手術後に、各々の動物には、感染から保護するために１週間にわたって２ｍｇ／ｋｇ／日のジベカシンスルフェートの筋肉内注射を毎日行った。実験中、動物を通常のウサギペレット及び随時の水道水で養った。
【００３０】
Ｂ．関節軟骨の破壊の抑制に関する試験
被検薬剤（ＤＯＤＭＡＴ混合物）又はビヒクルを手術後１週間で投与を開始し、５週間にわたって１週間当たり７日おきに続けた。１％のメチルセルロース、０．８  ％の塩化ナトリウム、及び０．１  ％のポリソルベート８０を含むビヒクル水溶液中に懸濁させたＤＯＤＭＡＴを強制飼養により経口投与した。手術６週後に、動物を殺し、手術した右膝及び対照の左膝の大腿軟骨の試料を得、１週間にわたって２０％のホルマリン及び２０％のメタノールを含む溶液中で直ちに固定し、その後、０．５ＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．５）中で完全に脱灰した。各々の大腿試料を三つの断面として採取した。一つを外側顆中の関節の中心から仮想線に沿って得、そして他の二つを前者の両面で５ｍｍの間隔で平行線に沿って得た。これらの部分を組織評価用のサフラニンＯ−ファースト・グリーンで染色した。左膝からの試料は右膝の関節軟骨の破壊の評価のための正常な対照として利用できた。組織スライドをコードし、コロンボら［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２６：  ８７５（１９８３）  ］により記載されたように各々の型の異常につき＋１〜＋４の評価を使用して１１のパラメーター（これらを表２に示す）につき盲検で評価した。一つの大腿軟骨試料からの三つの部分の評価を合わせた。これらのデータを片側ウィルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）ランク合計法により分析した。これらの結果を表３に示す。
【００３１】
【表２】表２
0003548194.tif 000007
【００３２】
【表３】表２（続き）
0003548194.tif 000008
【００３３】
【表４】表３
0003548194.tif 000009
【００３４】
これらの結果は、少なくとも約４７％の改良がＤＯＤＭＡＴによる治療により生じることを示す。
活性物質の投与用の組成物の実施例
製剤例１
錠剤
ＤＯＤＭＡＴ混合物                    １００ｇ
トウモロコシ澱粉                  ８０ｇ
カルボキシメチルセルロース        １５ｇ
ポリビニルピロリドン              ３ｇ
ステアリン酸カルシウム            ２ｇ
合計                            ２００ｇ
上記の製剤を混合して粉末形態を形成し、各々２００ｍｇ  の錠剤を調製した。各々の錠剤はＤＯＤＭＡＴ混合物１００ｍｇ  を含んでいた。
【００３５】
製剤例２
粉末及びカプセル
ＤＯＤＭＡＴ混合物                    １００ｇ
結晶性セルロース                １００ｇ
合計                            ２００ｇ
上記の表中の製剤実施例２に示された二種の粉末を混合して粉末薬をつくった。その粉末薬を硬質Ｎｏ．３カプセルに入れてカプセル投与系を形成した。
明らかに、多数の改良及び変化が上記の教示に鑑みて可能である。それ故、特許請求の範囲内で、本発明が本明細書に特別に記載された以外に実施し得ることが理解されるべきである。