(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製され、ヒトＶＥＧＦ１２１を特異的に認識し、ヒトＶＥＧＦ１６５を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５である請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いたヒトＶＥＧＦ１２１の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたＶＥＧＦの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管新生は、正常では胎児期の血管形成や組織の構築、黄体形成や子宮内膜の増殖期に関与するが、病的状態では炎症、創傷治癒、糖尿病性網膜症、関節性リュウマチ、固形癌の増殖に重要な役割を果たしている（実験医学  １５  ９９８−１００２  （１９９７）  ）。血管新生に関与する因子として血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）、血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ，  ＶＰＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−  α，  ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，    ＴＮＦ）、インターロイキン８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８，ＩＬ−８）等が知られているが、これらの中で最も中心的かつ重要な役割を果たしているのはＶＥＧＦである。その後、ＶＥＧＦとＶＰＦは同一因子であることが確認されている。
【０００３】
ＶＥＧＦは、腫瘍細胞の分泌する血管透過性因子として（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１９，  ９８３−９８５  （１９８３））、また、下垂体濾胞細胞培養上清中の内皮細胞増殖因子として見いだされた蛋白質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １６１，  ８５１−８５８  （１９８９））であり、１９８９年に遺伝子が単離された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６，  １３０６−１３０９  （１９８９）  、  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６，  １３０９−１３１２  （１９８９）  ）。その後の研究によりＶＥＧＦはアミノ酸残基数の異なる４つのアイソマーが存在することが明らかになった。アミノ酸残基数で１２１個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１２１と記載する）、１６５個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１６５と記載する）、１８９個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ１８９と記載する）、２０６個（以下、本明細書においてはＶＥＧＦ２０６と記載する）の４つのアイソマーは、遺伝子レベルの研究により、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５の２つが血管内皮細胞に対する作用が強いことが示唆された（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １３，  １８−３２  （１９９２）  ）。しかし、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５の間で、血管内皮細胞に対する作用に質的或いは量的な違いがあるかどうかは明らかにされてはいない。
【０００４】
ＶＥＧＦを蛋白質として捕らえようとする場合、抗ＶＥＧＦ特異的抗体による免疫測定法を用いるのが簡便である。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は既に取得されている（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，  ７，  ５３−６４  （１９９２）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  １４，  ４７５−４８０  （１９９５）  、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２，  １７７７−１７８４  （１９９６）、特開平８−１６９８９号、特開平８−５３４９８号、特開平７−３３０７９５号、特開平９−１２４６９７号）が、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５とを識別仕分けるような抗体は存在せず、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５それぞれの役割については、解明が進んでいなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５とを識別するようなモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用いた免疫測定法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の課題を解決すべく、ＶＥＧＦアイソマーに関する研究を重ねた結果、ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方法によりＶＥＧＦ１２１を測定することに成功して本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたＶＥＧＦの測定方法を提供するものである。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ＶＥＧＦ１２１のみを直接検出することができ、ＶＥＧＦ１２１の免疫測定、作用機序の解明等に広く応用することができる。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明においてＶＥＧＦ１２１とは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。ＶＥＧＦ１２１は、そのアミノ酸配列がＶＥＧＦ１６５の１〜１１４までと同一であり、１１５番目のアスパラギンはリジンに置換され、更にＣ末端の６アミノ酸残基はＶＥＧＦ１６５のＣ末端と同一である。
【００１１】
本発明のＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体を得るには、免疫原としてＶＥＧＦ１２１を用いるよりもＶＥＧＦ１２１固有の構造部分を用いるのが好ましく、具体的には、ＶＥＧＦ１２１固有の立体構造、エクソン５とエクソン８の連続から生じるＣ末端側のＶＥＧＦ１２１独特の連続したアミノ酸部分を含むペプチド等が挙げられる。更に好ましくは、ＶＥＧＦ１２１の１１０〜１２１番目のアミノ酸残基を免疫原とするのが望ましい。
【００１２】
上記のような免疫原を、マウス、ラット、ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従って行うことができ、抗原は単独でまたはアジュバンドと共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して抗体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリエチレングリコール等のような融合剤で融合してハイブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡＴ培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析し、目的とするＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際には、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６等の他のアイソマーとの反応性の有無を確認することが好ましい。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６  ４９５  １９７５  ）、シェーラー（Ｎａｔｕｒｅ  ２８５  ４４６  １９８０  ）等の方法により行うことができる。また上述の手法により作製したモノクローナル抗体は、プリスタン処理したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清から、塩折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティークロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収することができる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、公知の免疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体を固相化し、液相に標識した公知の抗ＶＥＧＦ抗体を用いたサンドイッチ測定法や標識したＶＥＧＦ１２１を用いた競合測定法によるＶＥＧＦ１２１の免疫測定法を挙げることができる。免疫測定に用いる標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、本発明の免疫測定法はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
なお、測定検体には制限が無く、例えば血清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞組織抽出液等のＶＥＧＦ１２１の測定に適応できる。
【００１５】
更に、本発明のモノクローナル抗体は、常法に基づき組織免疫染色に用いることもでき、ＶＥＧＦ１２１の作用機序の解明に有用である。
【００１６】
【実施例】
本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
【００１７】
参考例１  大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５の調製
ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株ＨＬ−６０のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によりヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを単離した。これらをｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）より作製した４．６ＫｂのｐＷ６Ａベクター（特願平９−１２１８０３号）に組み込み、ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発現するベクターとしてｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１及びｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１及びｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５をそれぞれ宿主大腸菌に導入後、１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５培地（以下、本明細書においてＬＢ培地と記載する）、３７℃にて培養し、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（以下、本明細書においてＩＰＴＧと記載する）を添加し３時間培養して発現を誘導した。ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１２１で形質転換した大腸菌はトリス緩衝液中で超音波破砕した後遠心分離し、沈渣を６Ｍウレアを含むトリス緩衝液にて可溶化した後遠心分離した。この遠心上清をＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシア社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、リソースＲＰＣカラム（ファルマシア社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、純度９５％以上の大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１Ｅと記載する）を得た。一方、ｐＷ６Ａ−ＶＥＧＦ１６５で形質転換した大腸菌も同様に上記の方法で調製した後、更にスーパーデックス２００（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過により精製し、純度９５％以上の大腸菌由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１６５Ｅと記載する）を得た。
【００１８】
参考例２  抗ＶＥＧＦ１２１／ＶＥＧＦ１６５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
参考例１で調製したｒＶＥＧＦ１６５Ｅを免疫原として用いた。ｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１００μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約２週間後、同じくｒＶＥＧＦ１６５Ｅをフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗体価の上昇を確認した後、最終免疫としてｒＶＥＧＦ１６５Ｅ約４０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるＰ３−ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（大日本製薬から購入）（以下、本明細書においてＰ３Ｕ１と記載する）とを３：１の細胞数で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞はＨＡＴ（１ｘ１０−４Ｍヒポキサンチン、４ｘ１０−７Ｍアミノプテリン、１．６ｘ１０−５Ｍチミジン）及び１０％ウシ胎仔血清（以下、本明細書においてＦＣＳと記載する）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（以下、本明細書においてＨＡＴ培地と記載する）に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を以下のＥＬＩＳＡ法により調べ、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５ に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイブリドーマを選択した。
【００１９】
すなわち、参考例１で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｅ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅをそれぞれリン酸緩衝液（以下、本明細書においてＰＢＳと記載する）で希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩放置して固相に結合させた。次に、０．０５％ツィーン２０を含むＰＢＳ（以下、本明細書においてＰＢＳＴと記載する）で洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを分注し、１時間、３７℃に放置してブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をｒＶＥＧＦ１２１Ｅ結合プレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｅ結合ＥＬＩＳＡプレートそれぞれに分注し、１時間、３７℃に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、本明細書においてＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ダコ社製）を１０００倍希釈したものを分注し、１時間、３７℃に放置した。同様の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）を加え、室温、１０分間放置した後反応停止液を加え、４０５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養し、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＶＧＦ３−４を樹立した。ハイブリドーマＶＧＦ３−４は大量培養し、マウス腹腔内に投与し、腹水を回収した。さらに、アフィ−プレッププロテインＡマップスＩＩキット（バイオラド社）を用いて腹水より抗体を精製し、モノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体ＶＧＦ３−４と命名した。
【００２０】
参考例３  バキュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５の調製
ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株    ＨＬ−６０のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により単離したヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡをｐＢａｃＰＡＫ８トランスファーベクター（クローンテック社製）に組み込み、ｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１２１及びｐＢａｃ−ＶＥＧＦ１６５を作製した。これらをそれぞれＢａｃＰＡＫ６  ＤＮＡ（クローンテック社製）と共にＳｆ２１細胞（クローンテック社製）にリポフェクチン法でコトランスフェクションし、組換え型バキュロウイルスＡｃＶＥＧＦ１２１及びＡｃＶＥＧＦ１６５を構築させた。組換え型バキュロウイルスはプラーク法にて純化した後、Ｓｆ２１細胞にインフェクションして組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１及びヒトＶＥＧＦ１６５を発現させ、精製した。すなわち、ＳＦ９００−ＩＩ無血清培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）で培養したＳｆ２１細胞にＡｃＶＥＧＦ１２１またはＡｃＶＥＧＦ１６５を添加してインフェクションさせ、２７℃で３日間培養した後、その培養上清を回収した。さらに、参考例２で調製したモノクローナル抗体ＶＧＦ３−４をＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ファルマシア社製）に結合させたアフィニティーカラムを用いて、培養上清からバキュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトＶＥＧＦ１２１（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１２１Ｂと記載する）及びヒトＶＥＧＦ１６５（以下、本明細書中においてｒＶＥＧＦ１６５Ｂと記載する）を精製した。
【００２１】
実施例１  抗ＶＥＧＦ１２１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
配列番号２に記載するペプチド（以下、本明細書中においてＰ２と記載する）を合成し、これをＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ  ）に結合して複合体（以下、本明細書においてＰ２−ＫＬＨと記載する）を作製し、免疫原として用いた。
【００２２】
参考例２と同様の方法で免疫し、同様の方法でハイブリドーマを作製した。
【００２３】
参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂを結合させたＥＬＩＳＡプレートを用い、参考例２と同様のＥＬＩＳＡ法でＶＥＧＦ１２１に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。単一コロニーを含むウェルの培養上清は参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂを結合したＥＬＩＳＡプレートを用いて参考例２と同様の方法で調べ、ＶＥＧＦ１２１に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイブリドーマＶＧ２Ｐ３−５を樹立した。参考例２と同様にしてハイブリドーマからモノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５と命名した。
【００２４】
尚、このハイブリドーマはＶＧ２Ｐ３−５生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６５５３である。
【００２５】
実施例２  抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の反応特異性
参考例３で調製したｒＶＥＧＦ１２１Ｂ及びｒＶＥＧＦ１６５ＢをＰＢＳで０．１μｇ／ｍｌの濃度にし、参考例２と同様の手法でｒＶＥＧＦ１２１Ｂ結合ＥＬＩＳＡプレート及びｒＶＥＧＦ１６５Ｂ結合ＥＬＩＳＡプレートを調製した。これに、それぞれ１％ウシアルブミンを含むＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５、モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４を加え、参考例２のＥＬＩＳＡ法と同様の測定を行った。結果を表１に示す。モノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５はＶＥＧＦ１２１に特異的に、モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４はＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５の両方に反応した。
【００２６】
【表１】
0003591264.tif 000002
【００２７】
実施例４  ＶＥＧＦ１２１の測定
モノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、参考例２と同様の方法でモノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５結合ＥＬＩＳＡプレートを調製した。これに、それぞれｒＶＥＧＦ１２１Ｂ、ｒＶＥＧＦ１６５Ｂ、組換え体ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄシステム社製）、組換え体ヒトＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄシステム社製）を加え、３７℃で１時間反応させた。続いて同様に洗浄後、ＰＯＤ標識したモノクローナル抗体ＶＧＦ３−４を加え、３７℃で１時間反応させた。同様の洗浄後、ＰＯＤ基質（ＯＰＤ−過酸化水素系）を加え、室温で２５分間放置した後反応停止液を加え、４９２ｎｍの吸収を測定した。結果を図１に示す。固相化したモノクローナル抗体ＶＧ２Ｐ３−５とＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＶＧＦ３−４とのサンドイッチＥＬＩＳＡ法はＶＥＧＦ１２１を測定することができるが、アイソフォームＶＥＧＦ１６５やアミノ酸配列で相同性のあるＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰｌＧＦを測定することはできず、ＶＥＧＦ１２１特異的であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、ヒトＶＥＧＦ１２１に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたヒトＶＥＧＦ１２１の測定方法を提供し、ヒトＶＥＧＦ１２１を特異的に測定することができる。
【００２９】
【配列表】
0003591264.tif 000003
【００３０】
0003591264.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】抗ＶＥＧＦ１２１モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の測定結果を示す図である。
【図１】
0003591264.tif 000005