(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリン膠またはその成分、およびリポソームを含む生体接着剤組成物であって、該組成物は下記成分：
（ｉ）10〜90mg/mLのフィブリノーゲン、
（ii）１〜200単位/mLのトロンビン、および
（iii）１〜30mMのカルシウム
を、１〜20容量％のリポソームとの混合物として含み、このとき、上記フィブリン膠の凝固後には上記リポソームが上記フィブリン膠中に埋封されて、上記リポソームが上記フィブリン膠および上記生体接着剤組成物の投与部位またはその近傍に局在させられていることを特徴とする、生体接着剤組成物。
【請求項２】
リポソーム含有フィブリン膠組成物であって、フィブリン膠の生体接着性凝塊またはゲルを形成するために、１〜20容量％のリポソームを、10〜90mg/mLのフィブリノーゲン、１〜200単位/mLのトロンビンおよび１〜30mMのカルシウムと組み合わせて含み、上記リポソームが上記フィブリン膠凝塊またはゲル中に埋封および封鎖させられていることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
前記組成物が、フィブリノーゲンを30〜60mg/mLの濃度で、トロンビンを５〜100単位/mLの濃度で、リポソームを５〜15容量％で、そしてカルシウムを10〜15mMの濃度で含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、フィブリノーゲンを40mg/mLの濃度で、トロンビンを10単位/mLの濃度で、リポソームを10容量％で、そしてカルシウムを10mMの濃度で含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
フィブリノーゲンが、精製され、かつウィルスに関して不活性化されたヒトフィブリノーゲンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
トロンビンが、精製され、かつウィルスに関して不活性化されたヒトまたは牛のトロンビンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
フィブリノーゲンが、抗凝固全血中の蛋白質、血漿および血小板に富む血漿中の蛋白質、ならびに血漿の寒冷沈殿物から誘導される蛋白質からなる群より選択される他の蛋白質と混合されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
１種類またはそれ以上の生物学的に活性な成分が前記リポソームの水相中に含有されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記生物学的に活性な成分が、薬物、神経弛緩薬、ビタミン、ビタミン誘導体、生長因子、グルココルチコステロイド、ステロイド、抗生物質、殺菌薬および最近発育阻止薬を含む抗菌化合物、抗ウィルス化合物、抗カビ化合物、駆虫化合物、殺腫瘍化合物、腫瘍発育阻止化合物、トキシン、酵素、酵素阻害剤、蛋白質、ペプチド、無機質、神経伝達物質、リポ蛋白質、糖蛋白質、免疫調節物質、免疫グロブリンおよびその断片、色素、放射標識、ラジオパク化合物、蛍光化合物、脂肪酸誘導体、多糖、細胞受容体結合分子、抗炎症物質、抗緑内障化合物、散瞳化合物、麻酔薬、核酸、およびポリヌクレオチドからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生物学的に活性な成分がビタミンまたはビタミン誘導体であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記生物学的に活性な成分がアスコルベートであることを特徴とする、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記生物学的に活性な成分が抗生物質であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記生物学的に活性な成分が生長因子であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記生物学的に活性な成分がZn2+であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記リポソームが中性単ラメラ小胞であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームが荷電単ラメラ小胞であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リポソームが飽和脂質および不飽和脂質の混合物を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームがアミノ基またはカルボキシル基を有する芳香族成分をさらに含むことを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
１種類の生物学的に活性な成分が第１のタイプのリポソームの水性区画内に含有され、そして別の生物学的に活性な成分が第２のタイプのリポソームの水性区画内に含有されており、これら２つのタイプのリポソームがフィブリン膠内で混合および封鎖させられて前記組成物を形成し、該組成物内で上記生物学的に活性な成分が放出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記生物学的に活性な成分が、薬物、神経弛緩薬、ビタミン、ビタミン誘導体、生長因子、グルココルチコステロイド、ステロイド、抗生物質、殺菌薬および最近発育阻止薬を含む抗菌化合物、抗ウィルス化合物、抗カビ化合物、駆虫化合物、殺腫瘍化合物、腫瘍発育阻止化合物、トキシン、酵素、酵素阻害剤、蛋白質、ペプチド、無機質、神経伝達物質、リポ蛋白質、糖蛋白質、免疫調節物質、免疫グロブリンおよびその断片、色素、放射標識、ラジオパク化合物、蛍光化合物、脂肪酸誘導体、多糖、細胞受容体結合分子、抗炎症物質、抗緑内障化合物、散瞳化合物、麻酔薬、核酸、およびポリヌクレオチドからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１のタイプのリポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合された中性リポソームを含み、そして前記第２のタイプのリポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合された中性リポソームを含むことを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１のタイプのリポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合された中性リポソームを含み、そして前記第２のタイプのリポソームがその表面に露出するアミン基を含有するように配合されたアミノリポソームを含むことを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１のタイプのリポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合された中性リポソームを含み、そして前記第２のタイプのリポソームがその表面に露出するカルボン酸基を含有するように配合されたカルボキシルリポソームを含むことを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１のタイプのリポソームがその表面に露出するアミン基を含有するように配合されたアミノリポソームを含み、そして前記第２のタイプのリポソームがその表面に露出するカルボン酸基を含有するように配合されたカルボキシルリポソームを含むことを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リポソームが光感受性リポソームまたは光活性化可能なリポソームであることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が１容量％から20容量％のリポソームを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が５容量％から15容量％のリポソームを含むことを特徴とする、請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が10容量％のリポソームを含むことを特徴とする、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
In vitroでのリポソーム含有フィブリン膠生体接着性密封剤の製造方法であって、下記工程：
ａ）  ｉ）ウィルスに感染されたフィブリノーゲンの供給源、
ii）ウィルスに関して不活性化されたトロンビンの供給源、および
iii）１種類またはそれ以上の生物学的に活性な成分を含有するリポソーム、
を提供する工程、ならびに
ｂ）  工程ａ）の上記フィブリノーゲンを上記トロンビンおよび上記リポソームと混合して混合物を形成し、ここで該トロンビンは１〜200U/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該フィブリノーゲンは10〜90mg/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該リポソームは１〜20容量％にて第２混合物中に存在し、さらにここで該トロンビンは、上記フィブリン膠凝塊の形成を触媒し、該密封剤中に上記リポソームが包括される工程
を含む方法。
【請求項３０】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合された中性リポソームであることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するアミン基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するカルボン酸基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
In vitroでのリポソーム含有フィブリン膠生体接着性密封剤の製造方法であって、下記工程：
ａ）  ｉ）ウィルスに感染されたフィブリノーゲンの供給源、
ii）ウィルスに関して不活性化されたトロンビンの供給源、および
iii）１種類またはそれ以上の生物学的に活性な成分を含有するリポソーム、
を提供する工程、
ｂ）  工程ａ）ｉ）の上記フィブリノーゲンを工程ａ）iii）の上記リポソームと混合してフィブリノーゲンとリポソームとの第１混合物を形成する工程、ならびに
ｃ）  工程ａ）ii）の上記トロンビンを工程ｂ）の第１混合物に添加し、フィブリノーゲンとリポソームとトロンビンとを含む第２混合物を形成し；ここで該トロンビンは１〜200U/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該フィブリノーゲンは10〜90mg/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該リポソームは１〜20容量％にて第２混合物中に存在し、さらにここで該トロンビンは、上記フィブリン膠密封剤の凝固および形成を促進し、該密封剤中に上記リポソームが埋封される工程
を含む方法。
【請求項３４】
工程ａ）においてカルシウムを準備することをさらに含むことを特徴とする、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するアミン基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３７】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するカルボン酸基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３８】
In vitroでのリポソーム含有フィブリン膠生体接着性密封剤の製造方法であって、下記工程：
ａ）  ｉ）ウィルスに感染されたトロンビンの供給源、
ii）ウィルスに関して不活性化されたフィブリノーゲンの供給源、および
iii）１種類またはそれ以上の生物学的に活性な成分を含有するリポソーム
を提供する工程、
ｂ）  有効量の上記トロンビンを、工程ａ）の上記リポソームと混合して、トロンビンおよびリポソームの第１混合物を形成する工程、ならびに
ｃ）  工程ａ）の有効量の上記フィブリノーゲンを、工程ｂ）の第１混合物に添加し、トロンビンとリポソームとフィブリノーゲンとを含む第２混合物を形成し；ここで該トロンビンは１〜200U/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該フィブリノーゲンは10〜90mg/mLの濃度にて第２混合物中に存在し；該リポソームは１〜20容量％にて第２混合物中に存在し、さらにここで該トロンビンは、フィブリン膠密封剤の形成を促進し、該密封剤中に上記リポソームが埋封される工程
を含む方法。
【請求項３９】
工程ａ）においてカルシウムを準備することをさらに含むことを特徴とする、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記カルシウムが１〜30mMの濃度で存在することを特徴とする、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出する非荷電化学物質基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項38または39に記載の方法。
【請求項４２】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するアミン基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項38または39に記載の方法。
【請求項４３】
前記フィブリノーゲンが精製されたヒトフィブリノーゲンであり、前記トロンビンが精製されたヒトまたはウシトロンビンであり、そして前記リポソームがその表面に露出するカルボン酸基を含有するように配合されたリポソームであることを特徴とする、請求項38または39に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、液体、ペーストまたはスプレーとして適用されてリポソームを含有するフィブリン膠のフィルムまたは膜を形成することを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記のフィルムまたは膜が、生体外で形成され、そして被術者に移植されることを特徴とする、請求項44に記載の組成物。
【請求項４６】
前記のフィルムまたは膜が、一時的または恒久的な移植のための移植可能な装置を含むことを特徴とする、請求項44に記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物が、液体またはスプレーとして生体外で適用されて、リポソームを含有するフィブリン膠の泡またはゲルを形成することを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記の泡またはゲルが、一時的または恒久的な移植のための移植可能な装置を含むことを特徴とする、請求項47に記載の組成物。
【請求項４９】
前記のフィルムまたは膜が、一時的または恒久的な移植のための移植可能な装置の表面を被覆することを特徴とする、請求項44に記載の組成物。
【請求項５０】
前記の泡またはゲルが、一時的または恒久的な移植のための移植可能な装置の表面を被覆することを特徴とする、請求項47に記載の組成物。
【請求項５１】
リポソームが１容量％から20容量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項44に記載の組成物。
【請求項５２】
前記リポソームが10容量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項51に記載の組成物。
【請求項５３】
リポソームが１容量％から20容量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項47に記載の組成物。
【請求項５４】
前記リポソームが10容量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項53に記載の組成物。
【請求項５５】
In vitroでのフィルムまたは膜の形成において柔軟なフィブリン膠とリポソームの組成物を形成する方法であって、下記工程：
ａ）  ｉ）ウィルスに関して不活性化されたフィブリノーゲン、
ii）ウィルスに関して不活性化されたトロンビン、および
iii）中性リポソーム、アミノリポソームおよびカルボキシルリポソーム、またはそれらの混合物、
を含む成分を提供する工程、
ｂ）  工程ａ）の成分を全て添加する工程、
ｃ）  これらの成分を基板または固体支持体上にスプレーして適用し、ここで該基板はこれらの成分が一時的に接着し、ゲル化して柔軟なフィブリン膠とリポソームのフィルムまたは膜を形成する表面を提供し、および
ｄ）  ゲル化後、該基板表面から該フィブリン膠およびリポソームのフィルムまたは膜除去する工程
を含む方法。
【請求項５６】
前記提供工程ａ）がカルシウムをさらに含むことを特徴とする、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記提供工程ａ）iii）のリポソームが、その水相中に生理活性材料を含有するように配合されていることを特徴とする、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記リポソームが、その表面の膜に露出する非荷電脂質または中性脂質を含有するように配合され、その結果として中性リポソームとなっていることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項５９】
前記の非荷電脂質または中性脂質が、レシチンまたはホスファチジルコリンであることを特徴とする、請求項58に記載の組成物。
【請求項６０】
前記リポソームが、リポソーム表面上に露出するアミン基を含有するように配合され、その結果としてアミンリポソームとなっていることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項６１】
前記アミンがステアリルアミンまたはジエチルステアリルアミンであることを特徴とする、請求項60に記載の組成物。
【請求項６２】
前記リポソームが、リポソーム表面上に露出するカルボン酸基を含有するように配合され、その結果としてカルボン酸リポソームとなっていることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項６３】
前記カルボン酸がステアリン酸であることを特徴とする、請求項62に記載の組成物。
【請求項６４】
前記第１のタイプの中性または非荷電リポソームがリポソーム表面上に露出するホスファチジルコリンまたはレシチンを含有するように配合され、そして前記第２のタイプのアミンリポソームがリポソーム表面上にステアリルアミンまたはジエチルステアリルアミンを含有するように配合されていることを特徴とする、請求項22に記載の組成物。
【請求項６５】
前記第１のタイプの中性または非荷電リポソームがリポソーム表面上に露出するホスファチジルコリンまたはレシチンを含有するように配合され、そして前記第２のタイプのカルボン酸リポソームがリポソーム表面上に露出するステアリン酸を含有するように配合されていることを特徴とする、請求項23に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第１のタイプのアミンリポソームがリポソーム表面上に露出するステアリルアミンまたはジエチルステアリルアミンを含有するように配合され、そして前記第２のタイプのカルボン酸リポソームがリポソーム表面上に露出するステアリン酸を含有するように配合されていることを特徴とする、請求項24に記載の組成物。
【請求項６７】
前記の、血液蛋白質および血漿蛋白質が、因子XIII、フィブロネクチン、免疫グロブリン、プラスミノゲンおよびアルブミンからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項６８】
前記の、光感受性化合物または光活性化可能な化合物が、レチノイン酸のレシチンおよびα−トコフェロールからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項25に記載の組成物。
【請求項６９】
前記レチノイン酸のレシチンが、1,2−ジレチノイル−sn−３−グリセロホスフォコリン、２−レチノイルイソレクチン、または１−パルミトイル−２−レチノイル−sn−３−グリセロホスフォコリンであることを特徴とする、請求項68に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、リポソームと組み合わせるかまたは混合したヒト起源成分からなるフィブリン膠（glue）を含有する生体接着性密封剤組成物および該組成物の製造方法に関する。本発明の組成物および方法は、止血の維持、およびヒトを含む哺乳動物における、種々のタイプの外科的および非外科的手順の後の治癒プロセスまたは創傷の治癒の促進および改善に適する。
発明の背景
生体接着性フィブリン膠
フィブリン膠の使用に関しては、種々の外科的研究において多くの経験が得られている（Lerner,R.and Binur,N.S.,1990,J.Surg.Res.,48:165−181;Gibble,J.W.and Ness,P.M.,1990,Transfusion,30:741−747;Sierra,D.H.1993,J.Biometer.Applic.,7,309−352;Brennan,M.,1991,Blood Reviews,5:240−244;Dresdale A.,et al.,1985,Surgery,97:750−755;Sponitz W.,et al.,1987,Amer.Surg.,59:460−462;Schlag G.and Redle H（Eds）,1986,Gynecology and Obstetrics−Urology.Fibrin Dealant in Operative Medicine,Vol 3,Springer Verlag（Berlin）;Burnouf−Radosevich,M.et al.,1990,Vox Sang,58:77−84参照）。例えば、外科医、歯科医および血液学者が、フィブリン膠は有効な生体接着剤であることを報告している。動物およびヒトにおける経験は、（例えばシアノアクリレート等の）合成プラスチックまたは縫合糸よりもフィブリン膠を使用する利点が、フィブリン膠が局所における凝固を促進することにより血友病者においてさえも出血を防ぐことにある、ことを示唆している。また、フィブリン膠は新生組織および細胞外マトリックスの再生を助けることが判明している。
フィブリン膠は２種類の成分、即ちヒトフィブリノーゲン（またはフィブリノーゲン／第XIII因子／フィブロネクチンの凍結乾燥血漿蛋白質濃縮物のようなフィブリノーゲンの供給源）とトロンビンのような活性化酵素を混合して形成される。使用に先立ち、血漿蛋白質濃縮物は塩化カルシウムの存在下に従来通り溶解される。フィブリノーゲンのトロンビン誘導活性化は、フィブリンの形成という結果を生む。第XIII因子およびカルシウムはフィブリンの架橋および安定にあずかり、重合性フィブリン膠の目の細かいメッシュを形成する。組織に適用したときに、フィブリン凝塊が適用部位に接着する。凝塊の凝固速度および機械的特性はフィブリノーゲンとトロンビンの濃度に依存する。従来のフィブリン膠製剤は、幾つかの国際特許出願明細書（Baxter International,Inc.のWO 93/05067;Fibratek,Inc.のWO 92/13495;およびCryolife,Inc.のWO 91/09641）に記載されている。
トロンビンは凝固の一般的な生理学的促進因子（instigator）である。種々の哺乳動物起源供給源、最も一般的にはウシから得られるトロンビンは、商業的に入手可能なフィブリン膠において慣習的に使用される。ヒトトロンビンは、レプチラーゼ（reptilase）のような他の適切な触媒酵素または選択毒液（select venoms）と同様に、リポソーム含有フィブリン膠生体接着剤の配合に採用され得る（Fenton II,J.W.et al.,1977,J.Bio.Chem.,252:3587−3598;Gaffney P.J.et al.,1992,Thrombos.Haemostas.,67:424−427;欧州特許出願公開第0439 156 A1号明細書,1991;Stocker K.,et al.,1982,Toxicon.,20:265−273;Pirkle H.and Stocker K.,1991,Thrombos.Haemostas.,65:444−450参照）。
フィブリノーゲンは、抗凝固全血、血小板に富む血漿、血漿、寒冷沈殿物、または血漿のコーン沈殿のような方法で得られる血漿沈殿物中に典型的に見出される他の蛋白質との親密な混合物中に存在することができる。そのような付加的蛋白質成分は、フィブロネクチン、免疫グロブリン、特に免疫グロブリンＧ、第XIII因子、プラスミノゲンおよびアルブミンを包含する。
フィブリン膠およびリポソームの組成物に使用されるフィブリノーゲン製剤は、本発明に採用される前に１つまたはそれ以上の方法によりウイルスに関して不活性化されることができる（例えば実施例１〜３参照）。
フィブリノーゲンおよびトロンビンは血漿の分画により血漿から誘導される。それぞれの調製技法に関する包括的な概論が出版されているが、それらは当業者により用いられている多くの商業的血漿分画手法の基礎であり、本発明に用いるに適している（フィブリノーゲンに関しては、Blomback,B.and Blomback,M.,1956,Ark Kemi,10:415−443;Stryker,M.H.＆ Waldman,A.A.,1978,Kirk−Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,Vol 4,3rd ed.,pp 25−61,Jhon Wiley;およびLowe G.D.O.et al.,1987,Fibrinogen 2:Biochemistry,Physiology and Clinical Relevance.Excerpta Medicus,Elsevier Science Publishers参照；トロンビンに関しては、Fenton II,J.W.et al.,1977,J.Biol.Chem.,252:3587−3598;Gaffney P.J.et al.,1992,Thrombos.Haemostas.,67:424−427;Ward,G.,1991,欧州特許出願公開第0 439 156 A1号明細書；およびKraus et al.の米国特許第5,143,838号明細書参照）。
ヒトフィブリノーゲンの代替供給源も考慮されている。例えば、組み替え技法により製造されるフィブリノーゲンもフィブリン膠とリポソームの組成物に採用されることができる。組み替えフィブリノーゲンの製造に適用し得る分子技法は、正常または突然変異ヒトフィブリノーゲンをコードする単離遺伝子を含有するDNAベクターに感染した、COS−１細胞またはHep G2細胞の使用を包含する（Roy S.N.et al.,1991,J.Biol.Chem.,266:4758−4763;Roy S.N.et al.,1994,J.Biol.Chem.,269:691−695参照）。今後の発展により、この様な技法を用いて、他の細胞タイプにおいて使用可能な量のフィブリノーゲンが製造され得るようになることが期待される。正常または突然変異の組み替えフィブリノーゲンは、本明細書に記載されるようなタイプのリポソームと共にフィブリン膠組成物に採用されることができる。
欧州の医療実務家によるフィブリン膠の有効性および成功した使用にも関わらず、現時点ではフィブリン膠もその本質的成分であるフィブリノーゲンも共に米国においては広く使用されていないが、それはフィブリノーゲン製剤には脂質エンベロープを有するウイルスにより汚染されたプール血液製剤によって感染するという普遍的な危険および問題があるためである。そのようなウイルスとしては、AIDSに関わるHIV、（非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスとしても知られている）HCVとHBV等の肝炎誘因ウイルス、ならびにサイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン−バーウイルスおよび単純ヘルペスウイルス等が挙げられる。同様の理由により、米国では現在のところヒトトロンビンはヒトへの使用を認可されていない。ウシトロンビンは米国においてヒトへの使用が認可されており、HIVおよび肝炎の有意な危険はもたらさないと思われるウシ供給源から得られているが、それ以外のウシの病原菌は存在している可能性がある。
ヒトフィブリノーゲンおよびヒトトロンビンは共に、脂質外被ウイルスに対する有機溶媒と洗剤を用いた処理（SD法）によりウイルスに関して不活性化されることができる（Neurath A.R.およびHorowitz B.の米国特許第4,540,573号明細書,1985;Horowitz,B.et al.,1985,Transfusion,25:516−522;Horowitz,B.et al.,1992,Blood,79:826−831;Piet,M.P.J.et al.,1990,Tronsfusion,30:591−598;Burnouf−Randosevich et al.,1990,Vox Sang,58:77−84;Horowitz,B.et al.,1992,Blood,79:826−831参照）。フィブリノーゲンおよびトロンビン血液製剤のためのその他のウイルス不活性化手法は、紫外線照射または加熱を包含する（Miyano,K.et al.の米国特許第5,116,590号明細書参照）。
リポソーム
リポソームは単ラメラまたは多重ラメラの脂質小胞であり、種々の水溶液分画を詰め込んでいる。小胞状の微小貯蔵庫であるリポソームは、種々の水溶性材料を含有することができ、これらの材料はそのようにして乳液中に懸濁される（G.Gregorius（Ed.）,1991,Liposome Technology,Vols.I,II,III,CRC Press,Boca Raton,Floridaの概論;M.J.Ostro（Ed.）,1983,Liposome Preparations:Methods ＆ Mechanisms,Marcel Dekker Inc.New York;Davis S.S.and Walker I.M.,1987,Methods in Enzymology,149:51−64;Mayhew E.et al.,1987,Methods in Ezymology,149:64−77;Shafer−Korting M.et al.,1989,J.Am.Acad.Dermatol.,21:1271−1275;Szoka F.and Papahadjopoulos D.,1980,Ann.Rev.Biophys.Bioengin.,9:467−508;Harrigan P.R.et al.,1990,Chem.＆ Phys.Lipids,52:139−149;Patel H.M.,1985Trans.Biochem.Soc.,13:513−516;Ostro M.J.,1987（Jan.），Sci.Am.,91参照）。リポソームの調製および生物学的系内におけるリポソームの使用の多様性が、種々の文献（M.C.Popescu et al.の米国特許第4,708,861号明細書;M.Schneiderの米国特許第4,224,179号明細書;D.P.Papahadjopoulos and F.C.Szoka,Jr.の米国特許第4,235,871号明細書;P.R.Cullis et al.,1987,In:Liposomes as Pharmaceuticals,M.J.Ostro,Ed.,Marcel Dekker,New York,39−72;およびH.G.Weder et al.,1986,In:Liposomes as drug carriers,K.H.Schmidt,Ed.,Thieme,Stuttgart,26−39）に開示されている。
リポソームは、長鎖カルボン酸、アミン、コレステロールおよびリン脂質を水性緩衝液中で混合することにより形成される。有機成分が自然に多重ラメラ２層構造（即ちリポソーム）を形成する。その組成および貯蔵状態に応じてリポソームは種々の安定性を示す。リポソームは細胞膜のモデルとして働き、そして薬物送達システムとして使用される（M.Schafer−korting et al.,1989,J.Am.Acad.Dermatol.,21:1271−1275参照）。リポソームを薬物送達ベヒクルとして使用しようとする試みの多くは、リポソームを、血液内を循環し、特定の細胞または組織により取り込まれ、その中で崩壊してその水性薬含有内容物を徐々に放出するものとして考えている。所定の標的組織による取り込みを助けるための努力において、幾つかのリポソームはその外表面に特異的抗体または抗原を結合することにより「あつらえ」られている。また、リポソームは、生体内における内容物の送達のための調節された放出システムとしても工夫されている（H.M.Patel,1985,Biochem.Soc.Transactions、13:513−516参照）。生物学的に活性な薬物を含有するリポソームが、リポソーム内容物の徐放のために、メチルセルロース、コラーゲンおよびアガロース等のポリマーマトリックス内に保持および固定されている組成物が、ポペシューら（Popescu et al.）の米国特許第4,708,861号明細書に記載されている。
フィブリン膠
フィブリン膠は、溶媒−洗剤法（またはSD法）のようなウイルス不活性化法によってフィブリノーゲンおよびトロンビンを処理することによりウイルスに関して滅菌された形態で調製され得る。フィブリン膠、フィブリン膠組成物および創傷治癒におけるフィブリン膠の利用を改善する機会は十分にある。フィブリン膠組成物に水溶性成分を添加して、現行の商業的に入手可能なフィブリン膠の有効性を改善しようとする試みにおいて、種々の戦略が採られてきた。細胞生長および創傷治癒に影響を与え、そして感染を防ごうとする努力において、（例えばトブラマイシンまたはシソマイシン（sisomicin）等の）抗生物質、（例えばEGF、TGF−β等の）成長因子、ペプチド、蛋白質、脂肪酸誘導体、ビタミン、ホルモン、ステロイド、および（例えばリン酸カルシウムのような）微量要素等の選択的添加物が、フィブリン膠製剤中に直接的に含有されている。しかし、外来の添加物がフィブリン膠または接着剤中に直接的に供給されていたので、添加物の半減期がその影響を受ける可能性があった。フィブリン膠への添加物の直接の添加は、遅効性の、調節された、または長期に亘る薬剤放出にとって最適ではない可能性がある。フィブリン膠成分中に外来添加物を直接的に混合することにより遭遇する別の困難が生じるが、それは、添加された材料が完全に形成されたフィブリン膠のゲル化速度または機械的特性に影響する可能性があるためである。ペプチドのような添加物は膠と架橋する可能性があるので、架橋した形態では生物学的に有用または有効でない。幾つかの添加物は、トロンビンの酵素的または生物学的特性を変えるかもしれない。また、添加物はフィブリン膠マトリックスのプラスミン誘導崩壊の感受性を上昇させるかもしれない。さらに、幾つかの添加物は単純にフィブリンマトリックスの外へ急速に拡散することにより、それらの薬理学的効果の「窓口」を減少させるかもしれない。この様な問題は、フィブリン膠と外来的に添加される物質とを組合せるための別の技法が必要であることの証拠である。
本発明は、新世代の、フィブリン膠およびリポソームを含有するウイルスに関して不活性化された生体接着性密封剤組成物を提供するが、この組成物の利点および使用は下記の本発明の目的および開示から明らかとなるであろう。本発明は、広範な使用ならびに多くの外科的および非外科的用途のための、安全かつ独特なフィブリン膠およびリポソームの配合物を確立する。
さらに、典型的な治療法は、疾患部位に活性成分をより効果的に送達するための薬剤送達システムを必要としている。本発明は、薬剤送達の領域における種々の問題を解決して、現存の方法を改良する。本発明は、完全に生物学的に適合し得る生体接着剤システムを提供し、同時に、投与の必要な部位およびその近傍に直接的に治療薬の効果的かつ持続的な送達を提供する。
発明の要約
本発明の目的は、フィブリン膠とリポソームが共に組み合わされて、ヒトを含む哺乳動物に投与するための従来と異なる新規な生体接着剤を形成する、生物学的組成物を提供することである。フィブリン膠とリポソームの生体接着剤の最終的な配合物は、適用または投与に先だって少なくとも１つのフィブリン膠成分をリポソームと予備混合し、次いで残りの成分を添加してその場で最終的なリポソーム含有フィブリン膠を形成させる方法のような、種々の方法により製造されることができる。
また、本発明の別の目的は、フィブリン膠と共に使用するために種々の方式に適合させたリポソームを提供する。ある方式において、フィブリノーゲン溶液はリポソームと混合され、そして（例えば４℃で）冷蔵または（例えば−30℃で）凍結保存されるか、あるいは凍結乾燥されることができる。所望のときに、フィブリノーゲン／リポソーム混合物は緩衝液で溶かされるかまたは再構成され、次いで外科的または非外科的開口部または創傷部でトロンビンと混合され、それによりリポソーム含有フィブリン膠を形成する。または、リポソームはトロンビンの溶液と予備混合され、そして冷蔵、凍結保存、または凍結乾燥されることができる。所望のときに、溶かされ、暖められ、または再構成された後、そのトロンビンとリポソームの混合物とフィブリノーゲンとを投与部位で混合することにより、リポソーム含有フィブリン膠を形成する。
本発明のさらなる目的は、フィブリン膠とリポソームの安定な密封用マトリックスであって、安価かつ安全であり、そしてヒトを含む哺乳動物の、外科的または非外科的創傷部位または開口部位、損傷部位、あるいは移植部位の上に容易に適用されて、それらの部位またはその近傍の密封および治癒を促進し、速め、そして保護し得るマトリックスを提供することである。フィブリン膠とリポソームの配合物は、治癒プロセスを促進および保護するに充分に長く適用部位に残る。フィブリン膠は、通常は創傷治癒の間に代謝され、そして患者または患畜における副作用、毒性または免疫応答の引き金とはならない。
本発明の別の目的は、フィブリン膠を含有するリポソーム組成物であって、薬効成分または生理活性添加物がリポソーム内に封入されているかまたは捕獲されている組成物を提供することである。リポソームは、損傷部位、外科的または非外科的開口部、あるいは創傷において、薬効成分および添加物のベヒクルまたは担体として働く。リポソームの内容物は適用後に、連続的にまたは調節された方式で前記部位において放出される。
本発明の他の目的は、創傷および外科的または非外科的開口部の表面の保護および治療のための現存する方法を改善する、フィブリン膠の新規な配合方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、リポソームが膠成分に所望の特質を付与する、フィブリン膠およびリポソームの生体接着剤組成物を提供することである。トロンビンおよびフィブリノーゲン双方の貯蔵特質は、リポソーム成分により調節され、そして有意に改善されることができる。ゲル化速度、粘弾性および引張強さ等のフィブリン膠組成物の生物物理的特性も、組成物のリポソーム成分により調節され、さらには改善されることができる。
本発明のさらなる目的は、損傷、手術または創傷部位における凝塊形成の基礎となるフィブリン膠を提供すると同時に、フィブリン膠／リポソーム配合物のリポソーム中に含有される生理活性成分の穏やかなまたは急速な放出を提供することである。この配合物は、それぞれ異なる生理活性薬剤を含有する多数の異なるタイプのリポソームを含むことができる。あるいは、この配合物は、それぞれ異なる添加物を含有する１種類の特定のタイプのリポソームを多数含むこともできる。
本発明の別の目的は、ヘパリン血症患者および凝固障害に苦しむ患者においてさえも、使用後に止血を援助および維持する、リポソームと組み合わせたフィブリン膠を含む生物学的に適合性の密封薬剤を提供することである。さらに、本発明のフィブリン膠とリポソームとを含有する生体接着剤システムは、フィステル形成の発生率を減少させること、および術後感染、組織壊死および毒性を減らすことを約束する。
本発明のさらなる目的は、ウイルスに関して不活性化されたフィブリン膠とリポソームの調製物を得るためにヒトおよび動物供給源からの他の膠成分とリポソームとが混合された、ウイルスに関して不活性化なフィブリノーゲンとトロンビンの調製物を含有する、フィブリン膠組成物を提供することである。そのようなウイルスに関して不活性化されたフィブリン膠とリポソームの組成物は、より安全で汚染の無い製剤を提供するが、この製剤は本発明に従い混合および採用されることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、コールター粒子分析器で測定した、中性リポソーム（タイプＡ）のサイズ（即ちミクロン単位の直径）分布を表す図である。調製リポソームのサイズ分布は、2mMの塩化亜鉛の存在下に緩衝液中でリポソームが形成されたときには、有意に変わらなかった。
図２は、フィブリン膠ゲルの破断強さまたは引張強さ（"BS"または"TS"）を実験的に測定するための図式的な線図である。図10も参照されたい。
図３は、フィブリノーゲンとトロンビンの供給源としての寒冷沈殿物（”クリオ”）、およびクリオにそれぞれ５％（v/v）の中性（タイプＡ）リポソーム（”リポA"）、アミン（タイプＢ）リポソーム（”リポB"）、またはカルボン酸（タイプＣ）リポソーム（”リポC"）を添加してもの、各々から製造したフィブリン膠の破断強さ（即ち引張強さ"TS"）を表す図である。フィブリン膠は、10単位/mLのトロンビンと10mMのCa2+を用いて配合した。
図４は、精製フィブリノーゲン（即ちコーン調製物の分画Ｉペースト）とトロンビン（”コーンI"）、およびコーンＩにそれぞれ５％（v/v）の中性（タイプＡ）リポソーム、”リポA";アミノ（タイプＢ）リポソーム、”リポB";またはカルボン酸（タイプＣ）リポソーム、”リポC"を添加したもの、各々を用いて配合したフィブリン膠の破断強さ（即ち引張強さ"TS"）を表す図である。フィブリン膠は、10単位/mLのトロンビンと10mMのCa2+を用いて配合した。
図５は、寒冷沈殿物（”クリオ”）とトロンビンの試料（白丸）、および該試料にそれぞれ５％（v/v）の中性（タイプＡ）リポソーム（”クリオ＋リポA"、黒丸）、アミノ（タイプＢ）リポソーム（”クリオ＋リポB"、黒三角）またはカルボン酸（タイプＣ）リポソーム（”クリオ＋リポC"、黒四角）を添加した試料の、各々を用いて配合したフィブリン膠の（増幅トロンボエラストグラフ（thromboelastograph、"TEG"）で表現された）粘弾性発達を表す図である。
図６は、精製フィブリノーゲン（”フィブ”、最終濃度3.6mg/mL）とトロンビン（白丸）試料、および該フィブリン膠混合物にタイプＡリポソーム（”リポA"）を、50μＬ添加した試料（”＋50μＬリポA"）と100μＬ添加した試料（”＋100μＬリポA"）（全量は300μＬ）の、各試料を用いて配合したフィブリン膠の（増幅トロンボエラストグラフ（thromboelastograph、"TEG"）で表現された）粘弾性発達を表す図である。
図７は、マウス皮膚の切傷を、ホッチキスで閉じたもの（”対照”）、フィブリノーゲン供給源としての寒冷沈殿物から配合したフィブリン膠で閉じたもの（”クリオ”）、およびフィブリノーゲン供給源としての寒冷沈殿物とタイプＡリポソームとの組合せから配合したフィブリン膠で閉じたもの（”クリオ＋リポA"）の各試料における平均創傷破断強さ（”創傷BS"）を表す図である。
図８は、それぞれ（８容量％の）タイプＡ、ＢまたはＣリポソーム（それぞれ”リポA"、”リポB"および”リポC"）を添加した、および全く添加しなかった（”純品”）フィブリン膠フィルムの破断強さ（BS）を表す図である。フィブリン膠フィルムの寸法は、厚さ2mm、幅1cmであった。また、フィブリン膠の配合は、28mg/mLまたは45mg/mLのフィブリノーゲン（”フィブ”）;15単位/mLのトロンビン;15mMのCa（II）であった。
図９は、それぞれ（８容量％の）タイプＡ、ＢまたはＣリポソーム（それぞれ”リポA"、”リポB"および”リポC"）を添加した、および全く添加しなかったフィブリン膠フィルムの破断前の％伸展（”％伸展”）を表す図である。フィブリン膠フィルムの最初の寸法は、厚さ2mm、幅1cmであった。また、フィブリン膠の配合は、28mg/mLまたは45mg/mLのフィブリノーゲン（”フィブ”）;15単位/mLのトロンビン;15mMのCa（II）であった。
図10は、フィルムに製剤された（８容量％の）タイプＡリポソームを含有するフィブリン膠（45mg/mLのフィブリノーゲン）の写真である。フィブリン膠とリポソームのフィルムのストリップは90度捻られている。
図11は、（８容量％の）タイプＡリポソームを含有し、固体支持体としてのアルミニウム箔に柔軟に被覆した、フィブリン膠（45mg/mLのフィブリノーゲン）の写真である。
図12は、８容量％のタイプＡリポソーム（”リポA"）を添加しない、または添加した、骨片（”骨”）と混合したフィブリン膠（"FG"）の破断強さ（BS）を表す図である。2mMを越えない量の骨片をリポソームと混合し、このときリポソームは添加されたかまたは添加されなかった。そしてマトリックスを37℃の湿性環境中に１時間放置した。フィブリン膠成分は組成は、フィブリノーゲン（45mg/mL）、トロンビン（２単位/mL）、Ca（II）（15mM）であった。
発明の詳細な説明
本発明のフィブリン膠含有リポソーム組成物の製造に用いるフィブリノーゲンは、種々の純度の出発材料を採用すること、およびそれに続く当業者に公知の種々の手順により調製されることができる（Blomback,B and M.blomback,1956,Ark.Kemi.,10:415−443;Stryker,M.H.and Waldman,A.A.,1978,Krik−Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,Vol.4,3rd ed.,John Wiley,pp 25−61;Lowe G.D.O.et al.,1987,Fibrinogen 2:Biochemistry,Physiology and Clinical Relevance,Excerpta Medicus,Elsevier Science Publishers;Dresdale A.,et al.,1985,Surgery,97:750−755;Sponitz W.,et al.,1987,Amer.Surg.、59:460−462;およびBurnouf−Radosevich,M.et al.,1990,Vox Sang 58:77−84参照）。フィブリノーゲンは、特定のヒトから得られた、または多くのヒトからプールされた、抗凝固化赤血球濃縮物の副生物としてヒト血漿から精製されることができる。新鮮な凍結血漿からの寒冷沈殿物は濃縮フィブリノーゲンの供給源として頻繁に用いられており（A.Dresdale et al.,1985,Surgery,97:750−755）、そして本発明に使用するに適している。本発明にとって好ましくはフィブリノーゲンはコーン技法（Blomback,B.and M.Blomback,1956,Ark.Kemi.,10:415−443;Stryker,M.H.and Waldman,A.A.,1978,Kirk−Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,Vol.4,3rd ed.,John Wiley,pp 25−61参照）の調節による血漿画分から調製される。この調節は、溶媒−洗剤技法または紫外線照射、凍結乾燥または加熱等のその他の技法を用いたウイルス不活性化を含む（Miyano,K.et al.の米国特許第5,116,950号明細書参照）。
注意深い、血液提供者の選抜および提供血液スクリーニングにもかかわらず、ヒト供給源からのフィブリノーゲン調製物において最も重要なことは感染性ウイルスの不活性化である。ヒト血漿蛋白試料中に不可分に存在する脂質被覆ウイルスは、有機溶媒と洗剤の混合液（即ちSD混合液）で血漿または血液成分を処理することにより効果的に不活性化される（Neurath A.R.and Horowitz B.の米国特許第4,540,573号明細書、1985;Horowitz,B.et al.,1985,Transfusioin,25:516−522;Horowitz,B.et al.,1992,Blood,79:826−831;Piet,M.P.J.et al.,1990,Transfusion,30:591−598;Burnouf−Radosevich et al.,1990,Vox Sang,58:77−84;Horowitz,B.et al.,1992,Blood,79:826−831参照）。所望であれば、SDプロセスにより滅菌されたフィブリノーゲンまたはトロンビンは付加的な殺ウイルス手順および滅菌技法、例えば高温処理（即ち約60〜68℃における96時間までの乾熱）または（ルチンのようなフラビノイドまたはβ−プロプリオラクトン等の）抑止剤による処理および紫外線照射等に供されることができる。さらに、非脂質被覆ウイルスを効果的に根絶または不活性化する手順も、フィブリノーゲン、トロンビンおよび血液蛋白質成分の処理に使用され得ることが考慮される。SDプロセスは非常に有効ではあるが、全ての殺ウイルス処理が同等に有効であるわけではなく、殺されなかったまたは不活性化されなかったウイルスは最終製品の安全性に対する脅威であることが警告される。フィブリン膠の物理的特性は、（例えばフィブリノーゲンおよびトロンビン等の）凝塊活性にとって非常に重要な蛋白質の崩壊または変性の欠如に依存しているので、ウイルス不活性化の間に起こる蛋白質崩壊を最小限に留めることを確実にするためにも注意を払わねばならない。
本発明によれば、ヒトから誘導される、ウイルスに関して不活性なフィブリン膠は、活性な脂質被覆ウイルスを事実上含有しないヒトフィブリノーゲンおよびトロンビン成分を含む種々の複合成分および相互作用成分から調製される。
本発明に用いるためのウイルスに関して不活性化されたフィブリン膠を配合するためには、ヒト供給源からのフィブリノーゲンおよびトロンビンはフィブリン膠組成物中に適切な濃度で存在する。例えば、下記表１は、リポソームが埋封されたフィブリン膠を配合するために使用されるフィブリノーゲンおよびトロンビン（または他の活性化酵素）、リポソームならびにカルシウムの量範囲および好ましい量ならびにより好ましい量を示している。最終的なフィブリン膠組成物において得られるフィブリン濃度は、約10〜90mg/mL、好ましくは約30〜60mg/mL、そしてより好ましくは約40mg/mLであるが、最終的な膠組成物中のトロンビンまたは他の酵素の濃度は、約１〜200単位/mL、好ましくは約５〜20単位/mL、そしてより好ましくは約10単位/mLである。
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本発明のフィブリン膠とリポソームの生体接着剤組成物は、新世代の生物学的かつ生理活性な、密封剤、接着剤、あるいはフィルムまたは被覆を製造するための材料を構成する。その結果、最終組成物中に見出される（例えばウイルスのような）汚染薬物の危険はより少ない。また、リポソームを含有する本発明フィブリン膠組成物の製造および使用は経済的である。
一般的にはフィブリン膠中で、特にはフィブリノーゲンとの混合物中で使用されるリポソームは、種々の技法により形成されることができる。製造されるリポソームは、膠中に埋封されたときにフィブリン膠の物理的特性を不利に改変しないことが重要である。本明細書の後記記載から明らかとなるように、フィブリン膠を含有するリポソーム組成物は、フィブリン膠の有する凝塊形成および生体接着性という属性を妨げないように設計される。実際、リポソーム自体は、必要または所望に応じて、凝塊形成およびゲル化の速度を増加または減少させる、凝塊を強固にするかまたは軟弱にする、あるいはフィブリン凝塊の粘弾性を改善する等により、フィブリン膠の生物物理的特性を有利に変え得る。フィブリン膠のこれらの生物物理的特性の試験に用い得る複数の技法が既に文献に述べられている（Marx G.,1988,Thrombos.Haemostas.,59:500−503;Marx G.and Blankenfeld,A.,1993,Blood Coag.and Fibrinolysis,4:73−78参照）。リポソームは、最終的なフィブリン膠の特質を変え得る１種類またはそれ以上の成分を内包するように配合され得ることが考慮される。例えば、本発明のフィブリン膠組成物に使用するためのリポソームの幾つかまたは全ては、その水相成分中に、アプロチニン、またはε−アミノカプロン酸（EACA）のようなその他の抗プロテアーゼを含有するように調製されることができる。これらの内容物は、膠の崩壊の間にフィブリン膠−リポソーム組成物の位置で放出されるときに、蛋白質崩壊の速度を遅くすることにより、フィブリン膠密封剤の耐用期間および生存度を延長する。
リポソームの存在下に配合されるフィブリン膠は、破断強さまたは引張強さの研究および粘弾性研究によって測定された（例えば図２〜６参照）ように、その機械的特性を維持する。本発明においては、生理活性組成物中のリポソームにより生物物理的変数の質が有意に改変されることはない。実際、リポソームは、そのようなリポソームを含むように配合されたフィブリン膠の質を改善するのに非常に適している。
リポソームの基本構成成分は、種々の飽和または不飽和の脂質またはリン脂質であり、これらにコレステロール、およびアミノ基またはカルボキシル基のどちらかを有する芳香族化合物のようなその他の構成成分が添加されたり添加されなかったりする。リポソームの配合に用いるに適したリン脂質としては、これにより些かも制限さるものではないが、ホスファチジルコリンまたはレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、およびそれらの水素添加製造物等が例示される。本発明に用いるに適した種々のタイプのリポソームは種々の技法により調製されることができるが、製造技法得はリポソームの形態、タイプおよびサイズに多大な影響を与え得る。リポソームを調製する多くの技法が文献に記載されている（Szoka Jr.and Papahaddjopoulos,D.（1980），Ann.Rev.Biophys.Bioengineering,9:467−508;Gregorius G.（Ed）．（1983）Liposome Technology,Vols.I,II,III.,CRC Press,Boca Raton,FL.（1991）;Ostro（Ed）.,Liposome Preparations:Methods ＆ Mechanism,Marcel Dekker Inc.NY;Davis,S.S.and Walker,I.M.,（1987），Methods in Enzymology 149:51−64参照）。これらの方法は、フィブリン膠内に埋封して特定の組織部位に適用するリポソームの製造に適用することができる。１つだけ例示すれば、本発明に用いるリポソームを製造する技法は、エタノール注入によるものである。この方法において、等モル量のコレステロールと水素添加レシチンがエタノール中で混合され、60℃に加温されて溶液を形成し、そしてこの溶液が、封入される材料を含有する60℃の水性緩衝液中に注入される。得られた乳液は60℃で１時間インキュベーションされ、2000×ｇで５分間遠心された後、上澄みが除去される。リポソームはトリス食塩水緩衝液中に懸濁されて４℃で貯蔵される。
種々のタイプのリポソームが、本発明に用いるに適している。例えば、タイプＡとして示される（実施例５に記載された）中性リポソームは、等モル量のコレステロールと水素添加レシチンを用いて配合され、そして中性リポソームと称される。実施例６に述べるように、タイプＢリポソームは、モル基準で50％のコレステロール、40％の水素添加レシチンおよび10％のステアリルアミンを用いて配合される。これらの組成の結果として、タイプＢリポソームはその表面に遊離アミン基を有し、タイプＢリポソーム上のそのような基は潜在的にフィブリン膠組成物のある種の生物物理的変数に影響し得る。実施例７で述べられるタイプＣリポソームは、モル基準で50％のコレステロール、40％の水素添加レシチンおよび10％のステアリン酸を用いて配合される。タイプＤリポソームは、モル基準で50％のコレステロール、40％の水素添加レシチンおよび10％のジエチルステアリルアミンを用いて配合される。pHによれば、ＢおよびＣタイプの典型的なリポソームはその表面上に荷電された化学成分を含有している。
大きなリポソーム（例えば、0.1〜５〜＞10μｍの直径サイズ範囲を有する多重ラメラ小胞、および≧0.06μｍの直径サイズを有する単ラメラ小胞）および小さなリポソーム（例えば、約0.02〜0.05μｍの直径サイズを有する小さな単ラメラ小胞）は、本発明に採用されることができ、そして既述のように従来方法により製造され得る。当業者はリポソームの殆ど全てのタイプが本発明に用いるに適していると判断するかもしれないが、幾つかのリポソームタイプは、特定の特質を有することができ、その特質がそれらのリポソームタイプを安定かつ有効なフィブリン膠−リポソーム生体接着剤の形成に特に適したものとしている。例えば、下記のように（例えば少なくとも10〜20％水相の）良好な積載量を有する直径５μｍの中性リポソームは好ましいものであり得るが、それは、作用部位に適切な量の捕獲材料を提供し、そしてその部位への適用後、フィブリン膠の架橋特性に実質的に干渉しないからである。
本発明によれば、リポソームの内容物はリポソームの膜２重層内よりもむしろ水相内に慣習的に捕獲される。本発明に有効に用いられるリポソームの水性内部区画内に取り込まれた生理活性材料を含有する水相の量が、2mMのZn2+を含有するトリス緩衝液（トリス食塩水緩衝液、pH7.4）中でタイプＡリポソームを形成することにより調査された。リポソーム洗浄後に残っていたZn2+を、Ｘ線蛍光法により測定した（Gorodetsky,R.,Mou,X.,Blankenfeld,A.,and Marx,G.,1993,Amer.J.Hematol.,42:278−283参照）。これらの測定から、リポソームは、容量当たりの容量基準でリポソームの”積載”の指標である水相を約10〜20％含有していたと見積もられた。積載したリポソームは、４℃および22℃の双方で安定で、それらは数週間の期間に亘ってその水相を極めて良く保持した。そのようなZn2+含有リポソームが、本発明による生体内研究（実施例10）において使用された。
リポソームの積載量を知ることは、創傷または開口部位への積み荷の効果的な送達および貯留のための、水相内に捕獲（即ち含有）される薬物の有効な濃度または画分の計算を可能にする。典型的な積載量は、使用される水性出発材料の初期量およびリポソーム内に含有される材料の最終的な量に基づき計算される。具体的しかし非限定的な例として、Zn2+溶液がリポソームの捕獲内容物の計量可能なマーカーとして働く。従って出発溶液中のZn2+の量（例えば130ppm）が測定される。リポソームがZn2+溶液の一部を捕獲するように配合される。粒度計測器により分別リポソーム容量が測定される。そのようにして配合されたリポソームは緩衝液中で洗浄される。洗浄後に水相を除去し、リポソーム内に捕獲されていたZn2+の量が測定される。
その内部に2mMのZn2+溶液を含有する300μＬのリポソームを用いれば、創傷部位およびその近傍の1mLのフィブリン膠中で、全部で60μＭのZn2+となる。リポソームは創傷部位で細胞と融合し、それによりその水性内容物を細胞の内容物に取り込ませることができる。従って、リポソームの水相は創傷部位に送達され、そこから、適用部位内およびその近傍に直ぐに拡散する。
本発明の他の主題は、一定期間に亘って環境内へのその内容物のより調節された放出を提供し得る光感受性または光活性化可能なリポソーム（LSL）を含有するフィブリン膠の使用を包含する。そのようなリポソームも、生理活性材料、添加物および薬効成分を含有するように調製されることができ、そして使用されるまで（例えばフィルターなどで）光保護された容器内に保管される。フィブリン膠中で使用するときには（例えば紫外線またはレーザー等の）光源でLSLを照射し、それによりLSLに内容物の適用部位周囲への放出を起こさせる。光感受性および光活性化可能なリポソームは、非光感受性リポソームに関して述べたと本質的に同様にして調製され、これらは非光感受性リポソームと殆ど同一ではあるが、その内容物の、処置され、かつ光調節された放出を提供する。光感受性リポソームは、少なくとも１つの光感受性化学二重結合を有する化合物をその表面上に含有するように配合されることにより調製され得るが、そのような光感受性化学二重結合は、露光されたときに、化合物の立体配置の変化を起こさせ易くし、それにより結果的に光活性化可能なリポソームとさせる。例えば、そのような光感受性リポソームは、文献（Pidgeon,C.and Hunt,C.A.,1987,Methods in Enzymol.149:99−111）に記載されているように、脂質中の（1,2−ジレチノイル−sn−３−グリセロホスフォコリン（DRPC）、２−レチノイルイソレクチン（LRPC）または１−パルミトイル−２−レチノイル−sn−３−グリセロホスフォコリン（PRPC）等の）レチノイン酸のレシチンとコレステロールの混合物を用いることにより調製されることができる。約70:30から約30:70の割合範囲のDRPC/LRPCの混合物が、光感受性リポソームを配合するために使用される。幾つかの配合物は、光感受性リポソームの配合の補助として、40％までのα−トコフェロール（α−Ｔ）の添加を包含する。LSLの調製は暗黒中に維持されて、光により誘導されるリポソーム構造の崩壊およびその水性区画成分の放出を防ぐ必要がある。光感受性リポソームは、フィブリン膠とリポソームの組成物のフィブリン膠成分（即ちフィブリノーゲンとトロンビン）と混合されて、所望のときに、選択された光源に暴露されることによりその水性区画成分が放出されることを可能にする。
または、膠成分であるトロンビンがLSL内に取り込まれる。そのようなトロンビン含有リポソームは、次いで遮光容器内でフィブリノーゲンと直接的に混合される。トロンビンの放出は、混合物を適切な光源に暴露することにより誘発される。従って、フィブリン膠用途のための、活性化光源への暴露によってのみ凝固が開始される、単一区画の送達システムが案出され得る。
フィブリン膠含有リポソーム組成物のリポソーム内に含有される生理活性薬物
本発明のリポソームは、リポソームの内部積載量または内部積載能力に応じて生理活性薬物を含有し、担持し、そして放出するように設計される。生物学的に活性な物質および薬効成分を含有し、かつフィブリン膠内に埋封されるリポソームは、その内容物を担持し、そしてヒトを含む動物の創傷部位または外科的または非外科的開口部でその内容物を放出して、外科的または創傷治癒のための手順および用途に続く、治癒および保護プロセスを補助する。フィブリン膠内の「積載」リポソームの用途の例示は、これらに限られるわけではないが、皮膚移植、熱傷または潰瘍、あるいは外科的または非外科的開口部における縫合糸の部分的または完全な置換；神経および血管融着；肝臓、肺または脾臓の実質組織等の軟組織の手術；身体全てにおける顕微手術；腱修復および骨または軟骨の移植；切開および裂創修復等の一般的な手術；血管移植および融着のための心臓血管手術；管路漏出および食道融着を密封するための胸部手術；耳鼻咽喉科の頭部および頸部手術；眼科手術、一般歯科的使用および手術；種々の解剖学的身体部分および部位における一般的手術を包含する。
生理活性薬剤、薬効成分および医薬の広い範囲のものが、フィブリン膠−リポソーム配合物のリポソーム中に含有されることができる。リポソームに捕獲されるべき薬物の種々の例示は、これらに限定される訳ではないが、薬物、神経弛緩薬、（例えば、ビタミンＣ（即ちアスコルビン酸またはアスコルベート）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＢまたはそれらの誘導体尚どの）ビタミン、（例えばリンホカイン、サイトキニン等の）生長因子、ホルモン、ステロイド、グルココルチコステロイド、（例えばペニシリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、アドリアマイシン、トブラマイシン等の）抗生物質、殺菌薬および細菌発育阻止薬を含む抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗カビ化合物、駆虫化合物、殺腫瘍化合物、腫瘍発育阻止化合物、トキシン、酵素、酵素阻害剤、蛋白質、ペプチド、（亜鉛または銅等の）無機質、神経伝達物質、リポ蛋白質、糖蛋白質、免疫調節物質、免疫グロブリンおよびその断片、色素、放射標識、ラジオパク化合物、蛍光化合物、脂肪酸誘導体、多糖、細胞受容体結合分子、抗炎症物質、抗緑内障化合物、散瞳化合物、麻酔薬、（例えばRNAおよびDNA断片等の）核酸、およびポリヌクレオチドを包含する。実施に当たっては、上記例示の幾つかまたは全ての選択された断片、一部分、誘導体または類似物が、本発明のリポソームの水相内の添加物として、使用されることができることも考慮される。さらに、親油性の薬物または他の化合物が、リポソームのリン脂質膜内に取り込まれることもできる。
本発明は、フィブリン膠組成物に用いられるリポソームに複数の生理活性薬剤を含有させるに適している。そのような利用が望まれるときには、２種類またはそれ以上の生理活性薬剤が、フィブリン膠の要部を形成し、その後膠凝塊内に埋封されるかあるいは貯留される１種類のリポソームタイプ内に捕獲されることができる。または、それぞれが同一または異種の生理活性薬剤を捕獲する、リポソームの２種類またはそれ以上の異なるタイプあるいはリポソーム集団の混合物が、フィブリン膠−リポソーム組成物内に埋封されることもできる。リポソームの異種調製物は、単相脂質小胞（即ち単ラメラ脂質二重層を有するもの）または複ラメラ小胞（即ち多重ラメラ脂質二重層を有するもの）を含むことができ、このことは既に記載がある（M.Schafer−Korting et al.,1989,J.Am.Acad.Dermatol.,21:1271−1275;M.C.Popsecu et al.の米国特許第4,708,861号明細書参照）。本発明のフィブリン膠とリポソームの組成物に使用するために、あるタイプのリポソーム（例えば中性リポソーム）を特定の生理活性材料を捕獲するように配合し、そして第２のタイプのリポソーム（第１のタイプと同じかまたは異なるタイプ）を別の生理活性材料を捕獲するように配合する。それぞれ生理活性内容物を含有するリポソームの双方のタイプをフィブリン膠を含む成分と混合する。得られるフィブリン膠とリポソームの組成物は、切開部、創傷部または開口部にそれぞれの生理活性内容物を送達し得るリポソームの２つのタイプを含有する。種々の生理活性材料を含有するリポソームの異なるタイプの混合物が配合され、そして本発明の組成物中に埋封され得ることは明らかである。
フィブリン膠含有リポソーム配合物
下記に述べる通り、リポソームは、使用前に、フィブリノーゲン溶液またはトロンビン溶液のどちらかに懸濁され、そして約４℃から約37℃の温度で貯蔵されることができる。または、リポソームと、フィブリノーゲン調製物またはトロンビン調製物のどちらか一方とのそれぞれの混合物が、−70℃で凍結されるか、または真空下約−30℃での乾燥により凍結乾燥されることもできる。使用前に、混合物は水またはトリス−食塩水のような緩衝液中で再構成される。全ての貯蔵法は、貯蔵材料の再構成後に活性で耐久性のリポソーム膠組成物という結果を与える。
本発明によれば、種々の方式でフィブリン膠と配合されるリポソームは、凝塊したフィブリン膠の生体接着剤中にリポソームが埋封および封鎖させられる、リポソーム含有フィブリン膠という結果を与える。フィブリン膠はリポソームの封鎖する環境を形成するので、この膠がリポソームを適用部位に局在させる。
本発明のフィブリン膠の利点は、生体内での使用において生物学的系と生理学的に適合性であるので、フィブリン膠自体およびその内部に含有するリポソームが毒性を伴わずに被術動物に有用な効果を提供することである。同様に、フィブリン膠−リポソーム組成物の別の利点は、リポソーム−膠が、本発明のこの組成物配合により、投与または適用された環境内に凝塊の形態で留まり、生体における生理学的体温および宿主環境条件に耐えることである。これらはリン脂質およびコレステロールを含むので、組成物のリポソームも細胞および組織による吸収によって時間の経過と共に自然に代謝される（Schater−korting M.,Korting HC.and Braun−Falco,O.J.,1989,Amer.Acad.Dermatol.21:1271−1275により概説されている）。フィブリン膠が、調節された局在化および埋封リポソーム内容物の所望の組織部位への放出を可能ならしめることは明らかである。
本発明の１つの態様において、フィブリノーゲン、トロンビンおよびリポソームはそれぞれ別々に貯蔵され、そして所望のときに、外科的または非外科的創傷または開口部にフィブリン膠−リポソーム組成物を形成して使用するために共に混合される。例えば、凍結乾燥された（約50〜70mgの）フィブリノーゲンと（約20〜40単位の）トロンビンが（例えばpH7.4、1mLの10mMトリス−食塩水のような）適切な緩衝液中でそれぞれ再構成されてフィブリノーゲン溶液およびトロンビン溶液を形成した。その後、約200μＬのリポソームがフィブリノーゲン溶液に添加され、穏やかに攪拌されてフィブリノーゲン−リポソーム溶液を形成した。上記溶液は注射器内で配合され、そして成分溶液を混合する工程が注射器内で実施された。フィブリノーゲンとリポソームの懸濁液はトロンビン溶液と同時に創傷部位に適用された。数分以内に形成されたフィブリン膠は、約10％の埋封リポソームを含有し、創傷部位にリポソーム含有生体接着剤を提供した。平均して、約１容量％から約20容量％、より好ましくは約２容量％から約15容量％、そして最も好ましくは約５容量％から約10容量％のリポソームがフィブリン膠中に埋封されて、本発明のフィブリン膠とリポソームの組成物が製造される。組成物中のリポソームの量は、フィブリン膠とリポソームの最終的な組成物におけるリポソームの容量／容量％で表される。
別の態様において、リポソームはフィブリノーゲン溶液と予備混合されて４℃で貯蔵される。リポソームとフィブリノーゲンの混合物は、所望であれば、貯蔵前に凍結乾燥されることができる。使用前または使用時に、リポソームとフィブリノーゲンの混合物は37℃まで加温され、そして損傷部位または開口部においてトロンビン溶液と混合されてフィブリン膠組成物を形成し、リポソームがその内部に捕獲される。
別の態様において、リポソームはトロンビン溶液と予備混合されて４℃で貯蔵される。使用前または使用時に、リポソームとトロンビンの混合物は再構成フィブリノーゲン溶液と外科的または非外科的創傷または開口部において混合されてリポソーム含有フィブリン膠を形成する。
本発明によれば、フィブリノーゲンとトロンビンの溶液は、フィブリン膠−リポソーム組成物の使用および混合作製前に、それぞれ別の貯蔵容器または（注射器のような）入れ物内に貯蔵される。リポソームは第１の注射器内のフィブリノーゲン溶液中に懸濁され、次いで創傷部位または開口部、あるいはその近傍で第２の注射器からのトロンビン溶液と混合されることができる。または、リポソームは第１の注射器内のトロンビン溶液中に懸濁され、次いで創傷部位または開口部、あるいはその近傍で第２の注射器からのフィブリノーゲン溶液と混合されることができる。
フィブリン膠含有リポソーム組成物の生体内での使用およびその他の使用
本発明のフィブリン膠−リポソーム組成物は、生体内外の双方で生物学的に活性な物質または薬効成分の急速なまたは持続する放出のために、使用されることができる。外科的または非外科的部位における生体内での使用のために、フィブリン膠−リポソーム組成物が上述の種々の方法で配合されることができる。簡潔には、フィブリン膠組成物とリポソームは、これらは予備混合されているが、所望の使用時点に創傷部またはその上に共に添加されることができる。従って、フィブリン膠−リポソーム生体接着剤は、前記部位に全ての成分が混合および投与された後に、その場で形成される。投与は好ましくは典型的には、しかしこれらに制限されるものではないが、目、皮膚、耳等の領域、あるいは創傷、熱傷、外科的または非外科的開口、裂溝、潰瘍、疱疹、骨折およびその他等の病気の位置、その周辺またはその近辺への適用を包含する。本発明は、抗生物質あるいは治癒、予防または治療のための薬効成分の長時間の放出が治癒および回復プロセスを助けるであろう処置に特に有用である。さらに、フィブリン膠の生化学的作用が正常な生物学的プロセスの一部を擬態するので、フィブリン膠−リポソーム組成物は、出血を調節して止血を促進すること、組織を密封および結合すること、および創傷治癒を支持することのために使用されることができる。同様に、フィブリン膠含有リポソーム組成物は、典型的には熱傷部位に投与されるが、そのような部位では、抗菌剤、細胞生長因子および／または薬効成分の放出も治癒プロセスの促進および加速に決定的に重要である。
リポソームを含有するフィブリン膠も、骨断片を結合するために使用されることができる。フィブリン膠とリポソームの組成物の骨結合能力は、形成外科または多くの骨折の修復におけるような骨再構築に非常に有用である。例えば、骨破損は、フィブリン膠とリポソームの組成物を用いて密封されることができるが、このとき、フィブリン膠は、破損部および捕獲物を密封し、かつ骨特異的生長因子を含有するように配合されたリポソームを局在させる。骨破損部でフィブリン膠が徐々に溶解するに連れ、リポソームがその捕獲生長因子を放出して骨の治癒の速度および質を改善する。
顔面修復術のために、患者由来の自己の骨がすり砕かれるかまたは粉等にされて、リポソームと混合したフィブリノーゲンに添加され、そして混合されてペーストにされることができる。次いで、トロンビンが、フィブリン膠とリポソームの組成物が最終的に凝固する所望の場所にペーストが適用されることを可能にするに充分な量で、フィブリノーゲンとリポソームのペーストと混合される。組成物の凝固が生じるための時間は、使用するトロンビンのレベルを調整することにより調節され得る。リポソームは、（例えばSampath T.K.et al.,1992,J.Biol.Chem.,267:20352およびWang E et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:220に記載のようにして）骨生長因子または抗生物質をその水相中に含有するように配合されることができる。（例えば中性または荷電等の）リポソームのタイプおよび水相成分の選択は所望に応じて選択され得ることは、当業者には明らかであろう。
リポソームを含有するフィブリン膠は、フィルムまたは膜として製造されることもできる。そのようなフィルムまたは膜は、広範な表面領域を被うのに有利である。さらに、フィブリン膠とリポソームの組成物は、フィブリン膠とリポソームの凝固した組成物のフィルムのみならず、その泡または塊を包含する移植可能な装置の製造に採用されることができる。フィルムおよび装置は、液体またはスプレーとしての適用によって生体外で形成され、そしてその後、ゲル化してから生体内で移植または使用されることができる。そのようなフィブリン膠含有リポソーム組成物は、患畜または患者内に一時的に挿入されるかまたは永久に移植される、人工装具、カテーテル、弁またはその他等の装置を被覆するためにも使用されることができる。
本発明の目的のために、フィブリン膠フィルム（または膜）は、厚さが0.1mmから5mmの範囲であり得る薄膜として定義される。そのようなフィブリン膠フィルムは高度な粘弾性を発揮し、破壊前にその内部寸法を４回まで、裏返され、捻られ、そして伸展されることができる。その水相内に生理活性化合物を捕獲するタイプＡ、Ｂ、またはＣのリポソームを含有するフィブリン膠フィルムが、本発明に用いるに適している。例えば、タイプＡ、Ｂ、またはＣのリポソームを含有するフィブリン膠フィルムは、パラフィルム（Parafilm、American Can Co.）のような疎水性表面上にスプレーされて、その表面上に一時的に接着する、フィブリン膠とリポソームの組成物のフィルムまたは膜を形成することができる。約１時間かけて固化または架橋した後、フィルム内に捕獲されたリポソームと配合されたフィブリン膠フィルムは、パラフィルム表面から剥がされ、そしてリポソームと配合されていないフィブリン膠フィルムと殆ど同一の物理的性質を発揮する。フィブリン膠とリポソームの組合せは、その場での形成のために上記のように使用されるようなフィルムに、有益な生物学的効果を導入することができる。フィブリン膠とリポソームの組成物を含むフィルムの製造の結果は、後記実施例12にて述べられる。
リポソームを含有するフィブリン膠フィルムは、移植用人工装具の製造に用いる種々の材料を被覆したり、またはそれらを被う層とするためにも使用されることができる。本発明の１態様において、リポソームを含有するフィブリン膠は、その上に組成物が緊密に接着する金属表面またはその他の基板上に液体としてスプレーされたりまたは適用されることができる。例えば、アルミニウム箔上にスプレーされた、タイプＡリポソームを含有するフィブリン膠が非常に緊密に接着した。または、フィルムは、フィブリン膠とリポソームの組成物を前記表面または前記基板上の層とすることにより形成されることができる。基板としてアルミニウム箔が使用されたときには、（約1mm厚の）フィルムはアルミニウム表面から容易に剥離または除去され得なかった（図10参照）が、疎水性表面上に付着した同じフィルムは容易に除去された。これらの例は、これらに制限されるものではないが、動物またはヒトにおいて使用される前に合成表面上に付着させられたフィブリン膠フィルム内にタイプＡ、Ｂ、またはＣのリポソームが取り込まれている、本発明のさらなる態様を説明するために供される。
実施例
本明細書において、実施例は本発明を実施するための種々の態様を例示するためのものであり、本発明を制限することは些かも意図されていない。
実施例１
寒冷沈殿物からのフィブリノーゲンの調製
既述のように本発明の生体接着剤組成物に用いるフィブリノーゲンは種々の技法によって調製され得るが、フィブリノーゲン調製の具体的かつ非制限的な例示が提供される。フィブリノーゲン供給源として寒冷沈殿物を使用することは、本発明のフィブリン膠とリポソームの組成物を配合するに適している。または、そしてしばしばより好ましくは、フィブリノーゲンはより精製または濃縮された形態であることが望ましく、従って、フィブリノーゲンは後記実施例２に記載のコーン分画法に従い調製される。
寒冷沈殿物を、マニュアル（Walker,R.H.et al.,1990,Technical Mannual,American Association of Blood Banks,10th Edition,Arlington,VA.）として出版されているアメリカ血液銀行協会のプロトコール（the American Association of Blood Bank（AABB）protocol）に従い調製した。簡潔には、１単位の新鮮凍結ヒト血漿を１〜1.5時間（または解凍されるまで）０〜４℃の水浴中においた。解凍された血漿を、４℃にて５分間、5000×ｇで遠心した。上澄みを除去して、フィブリノーゲン、アルブミン、抗血友病因子およびその他の蛋白質を包含する（下記表２参照）、寒冷沈殿物または凝固蛋白質の複合混合物を含有する濃縮画分と混合した約10〜20mLの血漿を残した。フィブリン膠とリポソームの組成物において使用する前に、寒冷沈殿物を37℃で15分間暖めた。
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新鮮凍結血漿から調製した寒冷沈殿物も、（これに制限されるわけではないが）前述のそして当業者には公知のコーン分画法の画分Ｉペーストから得られるような、より精製されたフィブリノーゲン調製物と同様に、リポソームを含有する生体接着剤組成物に用いるに適していることは、当業者には明らかであろう。
実施例２
コーン分画法の画分Ｉペーストからのフィブリノーゲンの調製
冷エタノール血漿分画法による画分Ｉペーストからフィブリノーゲンを調製した（Blomback,B.and Blomback,M.,1956,Ark Kemi,10:415−443;Stryker,M.H.＆ Waldman,A.A.,1978,Kirk−Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,Vol 4,3rd ed.,pp 25−61,John Wiley;Lowe G.D.O.et al.,1987,Fibrinogen 2:Biochemistry,Physiology and Clinical Relevance.Excrpta Medicus,Elsevier Science Publishers）。画分Ｉペーストを2mMのEDTAを含有する冷（４℃）トリス−食塩水緩衝液（pH6.5）内に懸濁し、そして上澄みを除去した。残ったペーストを2mMのEDTAを含有する温（37℃）トリス−食塩水緩衝液に溶解して溶液を形成し、そしてその溶液を濾過するか、あるいは5000×ｇで15分間遠心した。溶液を14℃まで冷却した。次いで50％の冷エタノールを穏やかに添加し、エタノール含有混合物を１時間以上の時間をかけて４℃まで冷却した。3000×ｇで15分間の遠心により沈殿フィブリノーゲンを収集し、pH7.4のトリス−食塩水緩衝液に溶解した。本工程に次いで、精製フィブリノーゲンを−30℃で貯蔵するか、あるいは凍結乾燥した。解凍フィブリノーゲン、あるいは水または緩衝液を添加することにより再構成したフィブリノーゲンを、所望に応じてタイプＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤのリポソームと混合したが、このとき、得られるフィブリノーゲンとリポソームの混合物の沈殿またはゲル化が生じないようにした。
実施例３
ウイルスに関して不活性な（VI）フィブリノーゲンとトロンビンの調製
脂質被覆ウイルスのウイルス不活性化を、溶媒洗剤（SD）法の採用により達成した。SDによるウイルス不活性化を達成するために、（トリトン（Triton）Ｘ−100、ソディウムコレート（sodium cholate）、または他の非イオン性洗剤も使用され得るが）１％ツイーン（Tween）80および0.3％トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（TNBP）をフィブリノーゲン調製物に添加し、４時間にわたって24〜30℃に維持して、その結果としてSDフィブリノーゲンを得た。画分Ｉペースト法においては、ウイルス不活性化は７〜10容量％の冷エタノールを用いた沈殿の前に行った。TNBP溶媒およびツイーン80洗剤試薬は、７〜10容量％の冷エタノールを用いたフィブリノーゲンの沈殿を（２回）繰り返すことにより除去し（Burnouf−Radosevich et al.,1990,Vox Sang,58:77−84）、そして生理学的pHおよびイオン強度の緩衝液中に再溶解した。完全なSD手順は、その結果として、許容され得る、（105logsを越える桁の）ウイルス殺傷および最終的なSDフィブリノーゲン調製物中のウイルス不活性化試薬の低い残余量をもたらした。
生体接着性の、リポソームとフィブリン膠の組成物に用いる、SDフィブリノーゲンを包含するフィブリノーゲンの研究室規模の調製物は、典型的には下記に示す成分を含有していた。このフィブリノーゲン成分は説明案内のために供されるものであり、本発明を些かも制限するものではない。例えば、フィブリノーゲン（フィブ）:20〜80mg/mL;第XIII因子（F XIII）:2〜12単位/mL;フィブロネクチン（FN）：＜１％；アルブミン（Alb）：＜１％。
ウシまたはヒトのトロンビンを、フィブリン膠のゲル化または凝固を誘導するために採用した。現時点の米国において、ウシトロンビンは商業的に入手可能であり、かつ米国において臨床的使用が認可されているトロンビンのタイプであることは、当業者には明らかであろう。しかし、ヒトトロンビン供給源も、ヒトトロンビンが適切に精製され、かつウイルスに関して不活性化される本発明に用いるに適している。
本発明においてフィブリン膠の成分の架橋を促進するために使用されるヒトトロンビンは、確立されている技法によりコーン画分IIIペーストからのプロトロンビンを活性化することによって得た（Fenton II,J.W.et al.,1977,J,Biol.Chem.,252:3587−98;Crowley,C.,欧州特許出願公開番号0 439 156 A1明細書;Silbering S.B.et al.の米国特許第4,696,812号明細書（1987）;Silbering S.B.et al.の米国特許第4,965,023号明細書（1990）参照）。簡潔には、コーン画分IIIペーストから調製したプロトロンビンを、20〜30mMのCa（II）およびプロトロンビンを活性化する量のトロンボプラスチンと共にインキュベーションして活性化した。得られた溶液を濾過し、そしてDEAE−セファロースカラムに通して汚染蛋白質を除去した。次いで、溶出液をCM−セファロースカラムに通し、その溶出液を廃棄した。結合トロンビンを（例えばPBS中の0.5NのNaCl（pH6.5〜8.0）等の）高いイオン強度の緩衝液を用いて溶出させた。このプロセスの他の変法が記載されている（欧州特許出願公開番号0 439 156 A1、Crowley et al.参照）。プロトロンビンを活性化するその他の方法が採用され得る。得られた精製トロンビンは、抑止剤を用いたまたは用いない、SD、加熱、または紫外線照射を包含する種々の方法によりウイルスに関して不活性化することができる。精製トロンビンは、ウイルスに関して不活性化する処理の後でさえも、その酵素活性を維持していた。さらに、本明細書に開示した通りに、精製トロンビンを単独でタイプＡ〜Ｃのリポソームと混合することは、その酵素活性または凝固誘導活性を有意に変えなかった。
共に混合したときに、ウイルスに関して不活性なフィブリノーゲンとトロンビン成分は凝固してフィブリン膠を形成する。
実施例４
リポソームの調製
エタノール注入技法により異なる脂質およびコレステロールを含有するリポソームを調製するために、等モル量のコレステロール（コル）と水素添加レシチン（HL）を100μＬの無水エタノールと100μＬのクロロホルムに溶解し、60℃で10分間かけて混合し、次いで、リポソームの水相内に捕獲されるべき材料を含有する10倍濃縮のトリス−食塩水緩衝液（pH7.4）内に注入した。幾つかのリポソームは、ステアリルアミン（Ｂ）またはステアリン酸（Ｃ）またはジエチルステアリルアミンを、使用されたコルとHLの量の1/10のモル量でアルコール相に添加して製造した。全てのリポソーム試薬を水相に添加した後、混合物をさらに60℃で１時間インキュベーションし、そして５分間に亘って超音波浴中で処理した。超音波処理後、リポソームを１時間かけて22℃にまで冷却して2000×ｇで10分間遠心し、トリス−食塩水緩衝液（pH7.4）中で洗浄し、そして再び２回遠心に供してから４℃で貯蔵した。コールター粒子サイズ測定器（the Coulter Company）による調製リポソームの評価は、0.9〜10ミクロンの直径範囲を有し、平均直径約2.5ミクロンを有する粒子の単峰形の分布を示した。
実施例５
”中性”または”タイプA"リポソームの調製
亜鉛を含有する、中性またはタイプＡリポソームの調製のために、160mgの水素添加ホスファチジルコリン（HPC）またはＬ−α−レシチン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）を40mgのコレステロール（コル）、無水エタノール（100μＬ）、およびクロロホルム（100μＬ）と混合し、そして60℃で15分間インキュベーションした。リポソーム内に捕獲されるべき外生材料の調製のために、（例えば2mMの塩化亜鉛等の）捕獲されるべき材料を含有する（例えば、トリス−食塩水緩衝液（20mMトリス、0.15N NaCl、pH7.4）等の）水性緩衝液の5mL溶液を60℃に加温した。この溶液を磁石攪拌子を用いて攪拌しながら、HPCとコルの溶液を添加し、そして約１分間攪拌した。得られた混合物を60℃で約１時間インキュベーションした。次いで、混合物を22℃まで冷却し、2000×ｇで５分間遠心してリポソームを遠心管の底に沈降した。遠心後上澄み溶液を除去し、リポソームをトリス−食塩水緩衝液（pH7.4）で洗浄した。洗浄後、リポソームを再度遠心して洗浄上澄みを除去した。調製したリポソームを細胞計測器または粒子分析器にて分析してそのサイズが（即ちリポソーム容積に換算して）約４〜12fLの範囲内であり、平均約7fLであることを測定した。洗浄したリポソームの亜鉛含量をＸ線蛍光分光法により測定した。リポソームがその14容量％を占めていたリポソーム懸濁液は、約3ppm亜鉛の亜鉛値を与えた洗浄緩衝液対照上澄みと比較して、20.5ppm亜鉛の亜鉛値の結果であった。調製した中性リポソームは、使用するまで４℃で貯蔵した。
実施例６
”アミン”または”タイプB"リポソームの調製
アミンまたはタイプＢリポソームの調製のために、160mgの水素添加ホスファチジルコリン（HPC）またはレシチン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）を40mgのコレステロール（コル）、および2.7mgのステアリルアミン、無水エタノール（100μＬ）、およびクロロホルム（100μＬ）と混合した。得られた混合物を60℃で15分間インキュベーションした。リポソーム内に捕獲されるべき外生材料の調製のために、（例えば塩化亜鉛等の）捕獲されるべき材料を含有する（例えば20mMトリス、0.15N NaCl、pH7.4等の）水性緩衝液の5mL溶液を60℃に加温した。この溶液を磁石攪拌子を用いて攪拌しながら、HPCとコルの溶液を添加し、そして約１分間攪拌した。得られた混合物を60℃で約１時間インキュベーションした。次いで、混合物を22℃まで冷却し、2000×ｇで５分間遠心してリポソームを遠心管の底に沈降した。遠心後上澄み溶液を除去し、リポソームをトリス−食塩水緩衝液（pH7.4）で洗浄した。洗浄後、リポソームを再度遠心して洗浄上澄みを除去した。調製したリポソームを細胞計測器または粒子分析器にて分析してそのサイズが（即ちリポソーム容積に換算して）約４〜12fLの範囲内であり、平均約7fLであることを測定した。調製したアミンリポソームは、使用するまで４℃で貯蔵した。
実施例７
”カルボン酸”または”タイプC"リポソームの調製
カルボン酸またはタイプＣリポソームの調製のために、160mgの水素添加ホスファチジルコリン（HPC）またはＬ−α−レシチン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）を40mgのコレステロール（コル）、および2.7mgのステアリン酸、無水エタノール（100μＬ）、およびクロロホルム（100μＬ）と混合した。得られた混合物を60℃で15分間インキュベーションした。リポソーム内に捕獲されるべき外生材料の調製のために、（例えば2mMの塩化亜鉛等の）捕獲されるべき材料を含有する（例えば、トリス−食塩水緩衝液（20mMトリス、0.15N NaCl、pH7.4）等の）水性緩衝液の5mL溶液を60℃に加温した。この溶液を磁石攪拌子を用いて攪拌しながら、HPCとコルの溶液を添加し、そして約１分間攪拌した。最終混合物を60℃で約１時間インキュベーションし、22℃まで冷却し、そして2000×ｇで５分間遠心してリポソームを遠心管の底に沈降した。遠心後上澄み溶液を除去し、リポソームをトリス／食塩水pH7.4緩衝液内で洗浄した。洗浄後、リポソームを再度遠心して洗浄上澄みを除去した。調製したリポソームを細胞計測器または粒子分析器にて分析してそのサイズが（即ちリポソーム容積に換算して）約４〜12fLの範囲内であり、平均約7fLであることを測定した。洗浄したリポソームの亜鉛含量をＸ線蛍光分光法により測定した。調製したカルボン酸リポソームは、使用するまで４℃で貯蔵した。
実施例８
フィブリン膠の破断強さBS（または引張強さ）におけるリポソームの効果
本発明のフィブリン膠とリポソームの組成物の破断強さを、プラスティック管内でフィブリン膠成分を混合し、まだ液体状の混合物を２つの粗合成メッシュ（厚さ0.4、幅1cm）の界面内にピペッティングすることにより計測した（図２参照）。配合されたままで得られた膠を２つの粗メッシュの間で全体的に混ぜ合わせて、フィブリン膠がゲルとなるようにした（Marx,G.and Blanckenfeld,A.,1993,Blood Coag.Fibrin.,4:73−78）。２時間後、第XIII a因子に誘導される架橋反応が既に生じており、そのメッシュ−フィブリン−メッシュ集合体を引き離した。破断強さを0.4cm2切片当たりのグラム数として計測した。そのような試験システムにおいて、トロンビンにより活性化されたフィブリン膠の破断強さはフィブリノーゲン濃度（即ち「フィブ」）と、下式：
BS＝勾配×［フィブ］
により記述されるような、直線関係を示した。フィブリン膠破断強さにおけるイオン強度とpHの効果を試験した。破断強さは、0.1NのNaClを越えるとプラトーとなり、かつpH7.4で最大となったことが見出された。また、精製フィブリノーゲンよりも精製度が低いことが知られている寒冷沈殿物を用いてさえ、破断強さはフィブリノーゲンのレベルに直接的に関係していたことも測定された。
フィブリン膠の破断または引張強さを計測または測定するこのシステムは、寒冷沈殿物から形成したフィブリン膠、または（例えばコーン画分Ｉペーストからの）純粋なフィブリノーゲンを用いて形成したフィブリン膠の機械的特性におけるリポソームの種々のタイプの効果の計測に有用である（図３および４参照）。これらの結果は、リポソームの特定のタイプを製造し、そしてフィブリン膠組成物の機械的特性および結着性に実質的に影響しないレベルで、フィブリン膠成分に添加してフィブリン膠組成物を形成したことを示している。従って、リポソームをフィブリン膠に添加して、組成物内の膠が創傷および切開の閉鎖および治癒に適した特定の機械的強度を有する本発明の組成物を製造することができる。
実施例９
フィブリン膠内のリポソームの粘弾効果
ゲル化開始後、フィブリン膠は粘弾特性を発達させるが、それはTEG増幅としてトロンボエラストグラフでモニターすることができる。既述のように、タイプＡ、Ｂ、およびＣのリポソームを用いた試験は、フィブリン膠の最終的な組成物中の成分の組成および割合に応じて、リポソームがフィブリン膠の粘弾性に実質的に影響することができたりできなかったりすることを示している。
例えば、寒冷沈殿物からのフィブリノーゲンと混合した（例えば0.5単位/mL最終濃度等の）トロンビンの低いレベルを用いたときには、タイプＡ、ＢおよびＣのリポソームは粘弾性の発達の初期相を有意に上昇させなかった。しかし、60分間後、タイプＡおよびＣのリポソームはフィブリン膠の最終的な粘弾性を上昇させたが、タイプＢリポソームは有意な効果を有さなかった（図５参照）。この結果は、タイプＢのリポソーム表面上のアミン基が、恐らくは第XIII a因子により促進されるフィブリンの架橋を妨害することによって、フィブリン膠の機械的特性を減少する可能性のあることを示している。トロンビンの（例えば、＞20単位/mL最終濃度等の）高いレベルにおいて、凝固は本質的に即時に行われ、計測可能なTEG増幅は最大限２分間以内であり、そしてフィブリン膠とリポソームの複数の配合物の間で何らの有意な違いも検出できなかった。これらの結果は、例えばタイプＢとＣのリポソームのアミン基またはカルボン酸基それぞれのような、異なる表面成分を有するリポソームを所望に応じて配合して、生体接着性のリポソーム含有フィブリン膠組成物に用いる際の所望または必要に応じて、フィブリン膠の機械的特性に影響を与えることができることを示している。
別の一連の研究において、純粋なフィブリノーゲン、即ち（50μＬまたは100μＬの）異なる量のタイプＡリポソーム懸濁液と混合したコーン画分Ｉの精製フィブリノーゲン（最終濃度:3.6mg/mL、最終容量:300μＬ）に関して粘弾性の発達を計測した。凝固（即ちゲル化）をトロンビンの（例えば0.5単位/mLの）低いレベルで開始した。このとき、添加リポソーム量に伴う、TEG増幅の小さいが有意な上昇を観察した（図６参照）。これらの結果は、最終的なフィブリン膠とリポソームの組成物の粘弾特性に有意に干渉しないやり方で添加リポソームの量を変えて、フィブリン膠を配合し得ることを示している。
フィブリン膠の粘弾性特性を調節するまたは干渉しないリポソームの能力は、使用中柔軟性が維持されることが必要なフィルムまたは膜の調製にフィブリン膠とリポソームの組成物を用いるとき、または意図した使用の間それ自身が柔軟であるかまたは形状を変える人工装具の表面を被覆するために組成物を使用するとき等に、利点となり得る。しばしば、そのような装置、被覆または膜は、長期間に亘って生体内に滞在することが望まれる。しかし、通常の分解プロセスはかなり急速にフィブリン膠を崩壊し得る。そのような使用のために、リポソームを、その水性区分内に詰め込む蛋白質分解阻害剤を用いて調製することができる。膠の崩壊の開始と共に、リポソームが露出し、そして捕獲した蛋白質分解阻害剤を徐々に放出する。それにより、このプロセスはフィブリン膠とリポソームのフィルムまたは膜の崩壊速度を減少させる。従って、リポソームは、フィブリン膠の所望の機械的特性に最小限に影響し、かつ増大さえして、フィブリン膠の膜、被覆またはフィルムの有効寿命を大いに増大させる。
実施例10
生体内動物研究
皮膚切開の創傷治癒に使用されるリポソームとフィブリン膠の組成物
フィブリン膠内に捕獲され、動物において使用されるリポソームの有用性を示すために、生体内研究を実施した。外科的切開により、長さが2cmで厚みが皮膚全体と同じ脊柱近傍の切開を、（例えば６〜８週齢の）成熟Sprague−Dawleyマウスの背側領域に作った。皮膚から帯状切片（fascia）を切除し、その皮膚を生理食塩水で洗浄し、ガーゼで拭いて当該部位から全ての血液を除去した。この切開を、ホッチキスでかがるか、あるいは、本発明に従い、生物学的添加物タイプとして捕獲亜鉛を含有するように調製したリポソームを含むまたは含まないフィブリン膠を用いて密封した。
基本的には、既述の通り、2mMのZn（II）塩を含有するトリス−食塩水緩衝液（pH7.4）中にコレステロールとレシチンの加温溶液を注入してタイプＡリポソーム（即ち中性）を作製し、得られたリポソームをインキュベートして洗浄した。リポソーム内に捕獲したZn（II）溶液を、リポソームの水性区分内の例示的な生物学的添加物として使用した。本明細書の「発明の詳細な説明」に記載の通り、この他の添加物、およびそのような添加物を含有する溶液が、本発明の組成物のリポソーム内の捕獲物のために、同様にそして特に、適していることは、当業者には明らかであろう。Zn（II）付与リポソームをＸ線蛍光法により分析し、その全量の約10〜20％水相を捕獲していたことを見出した。切開部位でトロンビンと混合する前、即ち創傷部位でフィブリン膠とZn（II）付与リポソームとのマトリックスを形成する前に、寒冷沈殿物中のフィブリノーゲンにZn（II）付与リポソームを添加した（10容量％）。
動物を治癒させ、そして14日後に殺した。フィブリン膠とリポソームを含有する組成物またはホッチキスのいずれかを用いて密封した皮膚切開を切り取って分析した。文献（Gorodetsky R.,Sheskin J.,and Weinreb,1986,Int.J.Determatol.25:440−445）に記載されたと全く同じようにしてＸ線蛍光技法を利用して、傷領域内における亜鉛の存在について、切開領域を分析した。正常背景レベルとして６±2ppmの亜鉛を含有していたホッチキスでかがった対照創傷とは対称的に、亜鉛捕獲リポソームを含むフィブリン膠を適用した創傷組織は２倍の亜鉛レベル（即ち15±2ppm）を含有していた。ホッチキスでかがった創傷部位、およびフィブリン膠と亜鉛含有リポソームの組成物の適用部位で見出された亜鉛レベルと、動物の皮膚または組織の非切開領域に普通に存在する亜鉛レベルとを比較した。その結果は、普通の対照および普通の非傷害皮膚における亜鉛レベルに比べて、非常に上昇したレベルの亜鉛がリポソームから放出されていたことを示した。
この実験は、リポソームが、治癒中の切開を有する動物組織に亜鉛（または他の捕獲材料）を送達したことを明示した。これらのデータは、フィブリン膠内に捕獲されたリポソームが、フィブリン膠の接着および密封機能に干渉することなく、詰め込まれた水性内容物を組織部位に送達したことを示した。リポソーム内への生理活性材料の詰め込み、およびフィブリン膠による組織部位へのそれらの固定の双方が、既述の通り本発明に従い機能することが示された。
実施例11
創傷作製および創傷部位におけるフィブリン膠の引張強さ
亜鉛の存在に関して検定したと同じ組織について、治癒創傷切開の破断強さの分析を付随的に実施した。マウス（C3H系統）を毛剃りし、その背側に（約2cmの長さで）完全な深さの切開を作った。創傷腔をフィブリン膠で密封した:1mLのフィブリノーゲン（20mg/mL）を１つの注射器内に入れ、そして1mLのトロンビン（0.5単位/mL）、2mMのCa（II）および200μＬまでのリポソームを第２の注射器内にいれた。フィブリン膠の調製のためのフィブリンノーゲン供給源は寒冷沈殿物からのものであった。対照として、リポソームが存在しないフィブリン膠も配合し、そして使用して切開を密封した。注射器の内容物を切開部位で放出し、その場で、添加リポソームを有するまたは有しないフィブリン膠を配合した。他の対照動物において、上記と同様に切開を作り、創傷を４本の外科用ホッチキスで閉じ、３日後にそのホッチキスを除去した。全てのマウスを３日後に殺した。殺害直後に治癒創傷または対照切開の周りの皮膚を四角く切り取り、多刃剃刀装置を用いて同じ大きさの８つの切片に、創傷に対して垂直に、切り分けた。細片の創傷引張強さを、アキュホース（Accuforce）M100引張強さ装置（Ametek）にて計測したが、このとき計測値は細片の幅2mm当たりのグラム数で表した。それぞれの点は通常は（例えば４〜６マウスにおける７創傷細片などの）約28〜42計測の平均を表し、誤差を示す棒は平均の標準偏差（SEM）を表している。ホッチキスでかがった切開を有する対照動物から得られたWTSの結果、リポソームを有しないで配合したフィブリン膠で密封した創傷を有する動物から得られたWTSの結果、およびリポソームを有して配合したフィブリン膠で密封された創傷を有する実験動物から得られたWTSの結果を比較した（図７参照）。これらの知見は、リポソームがフィブリン膠の創傷治癒特性を増大させ得ることを示している。
実施例12
フィブリン膠とリポソームの組成物により製造されるフィルムまたは膜
フィブリン膠へのリポソームの添加は、本明細書に記載の通り、フィブリン膠とリポソームの組成物から形成されるフィルムまたは膜の物理的性質を有意かつ有利に改変することができる。例えば、28mg/mLのフィブリノーゲン、10単位/mLのトロンビン、15mMのCa（II）溶液および（10容量％の）リポソームを含有するフィブリン膠から作られた、厚さ1mmで幅1cmのフィブリン膠フィルムは11グラムの破断強さを発揮し、200％を越えて伸展した。便宜のために、フィブリン膠とリポソームの組成物を配合するために使用される成分は適当な入れ物または容器内に入れられ、そしてフィルムまたは膜上にスプレーされたが；それらを支持体に適用する前に、スプレープロセスにおいて成分を混合した。フィブリン膠とリポソームの組成物のゲル化または凝固後、フィブリン膠とリポソームのフィルムまたは膜を、支持体への固着または除去中の破れの問題無しに支持体フィルムまたは膜からきれいに剥離した。フィブリン膠含有リポソームフィルムが接着する合成表面に関して、イオン性相互作用が恐らくは包含されているが、その接着機構は完全には説明されていない。45mg/mLのフィブリノーゲン、10単位/mLのトロンビンおよび15mMのCa（II）を用いて配合されたフィルムに関して、フィルム破断強さの（例えば18gまでの）増大が認められた（図８参照）。さらに、フィブリン膠組成物中に配合されたタイプＡリポソーム（即ち中性リポソーム）およびタイプＣリポソーム（即ちカルボン酸リポソーム）は相対的な破断強さならびに伸展の割合または程度を増大させたが、タイプＢリポソーム（即ちアミンリポソーム）は相対的な破断強さならびに破断前の伸展の割合を減少させた（図８および９）。この実施例は、フィブリン膠フィルム中に取り込まれたリポソームが、調節されたやり方で、フィルムの物理的変数を増大させ得ることを明示し、かつ創傷被覆物または膜装置として使用されるフィルムを、リポソームを含有するフィブリン膠フィルムから製造し得ることも示している。
実施例13
骨折を密封するためのフィブリン膠とリポソームの組成物
フィブリン膠含有リポソーム組成物を骨折の密封および修復に使用する技法を説明するために、50mgのヒツジ大腿骨骨片を（2mMを越えない量で）、５容量％のタイプＡリポソームを有しないまたは有する1mLの50mg/mLフィブリノーゲン、300μＬのトロンビン（10単位/mL）、および50mMのCa（II）からなるフィブリン膠と混合した。フィブリン膠、リポソーム、および骨のマトリックスを１時間放置し、上記技法を用いて破断強さ（BS）を計測した。その結果は、骨片と混合した、フィブリン膠とリポソームの組成物の機械的特性を、リポソームは有意に減少させないことを示している（図12参照）。
本明細書に記載および含まれる特許および資料の内容は全て、ここに参考として取り入れられる。
理解を明確にする目的で、説明および例示により本発明について詳細に述べてきたが、本明細書に述べられかつ添付請求の範囲に規定される本発明の精神および主題から離れることなく、ある種の変更および改変をなし得ることは当業者には明らかであろう。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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