(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１核酸標的領域および第２核酸標的領域の構造の相違を検出する方法であって、下記工程：
ａ）該第１標的領域および該第２標的領域に対する検出可能ラベルを含む核酸プローブを提供して、該核酸プローブおよび該第１標的領域を含む第１複合体を形成し、次いで、該核酸プローブおよび該第２標的領域を含む第２複合体を形成すること（該第１複合体中の該ラベルは該第２複合体中の該ラベルとは安定性が異なる）、
ｂ）該第１複合体中の該ラベルの安定性が該第２複合体中の該ラベルの安定性と異なる条件下において、工程（ａ）で形成された該第１複合体および該第２複合体を処理して、該ラベルが該第１複合体中にある場合と該ラベルが該第２複合体中にある場合とを比較した場合に、検出されうる能力の差を該ラベルに生じさせるようにすること；次いで
ｃ）該ラベルの安定性の相違を、該第１標的領域と該第２標的領域との間の構造の相違として検出すること
を含み、該検出が化学ルミネッセント手段または生物ルミネッセント手段により行われるものである方法。
【請求項２】
該ラベルが化学ルミネッセント分子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ラベルがアクリジニウムエステルである請求項２記載の方法。
【請求項４】
電子的に励起されたアクリドンを生じさせるアクリジニウム種への攻撃に関連した化学ルミネッセンスが検出される請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）の前に、該第１複合体中または該第２複合体中の該核酸プローブを、該第１複合体中または該第２複合体中に存在しないプローブから分離することをさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１核酸に結合した化学ルミネッセントラベルまたは生物ルミネッセントラベルの安定性を変化させる方法であって、該第１核酸を第２核酸と接触させて複合体を形成させる工程を含む方法（該複合体中の該ラベルの安定性は、該複合体中に存在しない該第１核酸に結合した該ラベルの安定性とは異なる）。
【請求項７】
該第１標的領域と該第２標的領域とでは少なくとも１個のヌクレオチドが異なるものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
該プローブが、該第１標的領域に対して完全に相補的であり、該第２標的領域に対して完全には相補的でないものである請求項７記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１個のヌクレオチドプリンまたはピリミジン塩基構造により、該第１標的領域が該第２標的領域と異なるものである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該第１標的領域と該第２標的領域とではヌクレオチド骨格構造が異なるものである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該第１標的領域がＤＮＡであり、該第２標的領域がＲＮＡである請求項７記載の方法。
【請求項１２】
試料中の標的核酸配列の存在または量を検出する方法であって、下記工程：
ａ）該試料を第１核酸プローブ（その３’または５’末端に結合したラベルを含む）および第２核酸プローブと接触させること
［該第１プローブおよび該第２プローブは、隣接した領域おいて該標的配列とハイブリッドを形成するものであり；
該ラベルが該第１プローブの３’末端またはその付近に結合している場合には、該第２プローブが３’側の領域において該標的配列とハイブリッドを形成し、そこに該第１のプローブがハイブリッドを形成し、該ラベルが該第１プローブの５’末端またはその付近に結合している場合には、該第２プローブが５’側の領域において該標的配列とハイブリッドを形成し、そこに該第１プローブがハイブリッドを形成し；
該第１プローブ、該第２プローブおよび該標的配列からなる複合体中の該ラベルの安定性は、該複合体中に存在しない該ラベルの安定性と異なる］、
ｂ）該複合体中の該ラベルの安定性が該複合体中に存在しない該ラベルの安定性と異なる条件下において該試料を処理して、該複合体中に存在しない場合と比較して該複合体中に存在する場合に検出されうるように該ラベルの能力を相違させること、次いで、
ｃ）該複合体中に存在する該ラベルからのシグナルの存在、あるいは該複合体中に存在しない該ラベルからのシグナルの存在を、該標的核酸含有配列の存在または量を示すものとして検出すること
を含み、該検出が化学ルミネッセント手段または生物ルミネッセント手段により行われるものである方法。
【請求項１３】
該ラベルが化学ルミネッセント分子であり、工程ｃ）において、該プローブ：標的複合体中に存在する該ラベルからのシグナルの存在を、該標的核酸含有配列の存在または量を示すものとして検出する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ラベルがアクリジニウムエステルであり、工程ｃ）において、該プローブ：標的複合体中に存在する該ラベルからのシグナルの存在を、該標的核酸含有配列の存在または量を示すものとして検出する請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は診断方法および微少量の有機化合物を検知し、定量する技術の分野のものである。
さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立するものとしての結合形におけるラベルの安定性に差がある均一診断検定に関する。本発明はラベルがその非複合または非結合形と比べて、複合または結合形では異なって分解する診断検定システム用の環境の構成に関する。
【０００２】
診断検定はラベルされた結合試薬を用いて生物学的物質を検出し、位置を定め、または定量する一般的な分析技術である。ついで、ラベルされた試薬の存在を種々の公知の方法を用いて検出できる。本発明は直接結合検定およびコンペティションアッセイおよび逐次飽和（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を含め、制限なしに全ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つの具体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定である。ハイブリッド化検定システムは一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が適当な環境の下で相補的一本鎖核酸によりハイブリッド化または組換えされる事実に基づくものである。容易に検出できるラベルで相補的プローブ核酸をラベルすることにより、一本鎖核酸配列を含むテスト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出することが可能である。
検定システムは広範には、不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）または均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）として特徴づけられる。検定システムに適用される「不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質からラベルされた物質の分離を必要とする特異結合検定のシステムを意味する。一方、均一検定システムは何等、物理的分離工程を包含しない。均一検定システムは取扱い工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムよりも便利で、使用が容易である。
【０００３】
例えば、典型的なサンドイッチイムノアッセイは固定化抗体をテスト媒体と共にインキュベイションすることを包含する。もし、抗原が媒体中にあれば、抗体と結合する。インキュベイション後、分離工程で非結合抗原を除去する。ラベルされた抗体溶液との第２もしくは同時インキュベイションの後、結合抗原は固定化抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」される。第２の分離工程の後、培地中の抗原の量として、ラベルされた抗体の量を測定できる。このシステムは一連のインキュベイションおよび分離工程を包含するので時間がかかる。
診断検定に於ける従来の技術における努力の焦点は均一検定と、非結合の目的物質に対立するものとしての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラベルの開発に向けられている。本発明の一つの目的はラベル自体が、例えば、非結合のときに対して化学ルミネセンスの能力に検出できる変化を受ける検定システムである。本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もしくは非結合形のいずれかで実質的に分解もしくは破壊され、それにより、目的とする反応を同定し、定量するすぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
【０００４】
【従来の技術】
従来技術には複雑さの異なる種々の均一検定がある。幾つかのシステムでは、例えば、ラベルは、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例えば、酵素、補酵素およびコファクターである。関連するシステムであるが、他においては、ラベルは化学的もしくは生化学的反応の基質である。これらのシステムでは、特異的な容易に検出できる物質、例えば、グルコース、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモニターし、測定する。他の検定システムでは、ラベルが独特の物理的性質を有し、直接それを検出可能にしている。これらのラベルの例には、金属、ヘモグロビンおよびクロロフィルが包含される。
【０００５】
また、他の均一検定システムは酵素がカップリングした特異結合反応に基づくもので、分析物は特異結合反応のリガンドとなる。分析物が存在する場合、それは、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）との特異的結合反応を受ける。同時あるいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質を加える。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱合体が複合形と非複合形の場合で異なる。このようなシステムは典型的にはラベル試薬として酵素を、また、比色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる基質を用いている。均一エンザイムイムノアッセイの例には、米国特許第３６５４０９０号、第３８１７８３７号および第４１９０４９６号が包含される。蛍光発光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）／蛍光消光物質ペアを生じる発色団の使用を包含する均一検定の他の例は米国特許第４１９９５５９号、第４１７１３８４号および第４３１８７０７号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベルは酵素以外の物質、例えば、ビタミン、ＮＡＤ、ＦＡＤまたはビオチンであり、にもかかわらず、これらは「モニター」反応に連結できる。このタイプの例は米国特許第４３８３０３１号である。これらのシステムでは、モニター反応はラベルの活性を変化させる構造的変化に基づく。
【０００６】
他の均一検定システムは偏光蛍光の技術を包含する。ここでは、分析物が低分子量蛍光抱合体と、高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は小さい分子が大きい分子の表面からずれるときに変化するので、溶液中の分析物の量を測定するのが可能である。このタイプの検定システムの例は米国特許第４６６８６４０号である。
【０００７】
均一検定システムのさらに他のタイプには非輻射性エネルギー転移を包含する。これらのシステムでは、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光の他への吸収をモニター反応として用いる。一般に、これらの方法は二通りに記載されている。一つの方法では、第１の分子が化学ルミネセントで、励起されると、発生した電磁気エネルギーの一部が、接近しているべき第２の「吸収体」分子に転移される。第２の分子がエネルギーを吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部が、吸収体分子に接近している化学ルミネセント分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
他のタイプの非輻射性エネルギー検定システムでは、第１の分子が蛍光体で、外部の光の「吸収体」となる。第２の蛍光分子の存在下、エネルギーの一部が転移し、異なる波長で発光する。該発光は互いに接近した「吸収体」および「発光体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
ダブル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第４６７０３７９号に見られる。第１のプローブは触媒でラベルされており、第２はアポ発光体（ａｐｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的とハイブリッド化したら、基質を加える。触媒は基質を転換ラジカルに変え、これは順次、第２のプローブ上のアポ発光体を発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）に変える。これはハイブリッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理を用いて、共通の分析物に同時に結合する二つのラベルされた物質に基づく検定が開発されている。
【０００８】
このエネルギー転移検定システムのタイプの具体例は１９８５年１０月３０日に発行されたイレイザーら（Ｅｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ）のヨーロッパ特許出願第８５１０５１３０．０号（公開番号第０１５９７１９号）であり、標的遺伝子物質の同一または対立鎖を相補する二つの一本鎖核酸プローブの使用を開示している。各プローブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生できる部分でラベルされている。本発明と異なり、イレイザーらダブル・ハイブリッドまたはマルチ・ハイブリッドの形成および検出を包含する。同様に、１９８３年１月２６日に発行されたヘラーら（Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ）のヨーロッパ特許出願第８２３０３６９９．１号（公開番号第００７０６８５号）および同日の関連するモリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）のヨーロッパ特許出願第８２３０３７００．７号（公開番号第００７０６８６号）は二つの発光体プローブを用いる均一検定システムを開示している。光ラベルの少なくとも一つが吸収体／発光体タイプのもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成すると、二つラベルの間でエネルギー転移が起こるようになっている。第２の発光がハイブリッド形成を検出する。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示されている。
【０００９】
大部分の生物学的物質はいずれの合理的な感度レベルでは容易に直接検出できず、あるタイプの結合反応が必要である。前記したところから明らかなように、従来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に区別できない。かかる検定は高濃度で存在する分析物の検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターのみ有用である。
臨床診断の分野においては、二つの結合相手のラベルの安定性を変える能力、例えば、結合または非結合形におけるラベルの選択的除去または破壊に基づく直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフィールド（ｈｉｒｓｈｅｆｉｅｌｄ）はフルオレセンス・バックグラウンド・ディスクリミネイション・バイ・プレブリーチング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｒｅｂｌｅａｃｈｉｎｇ）、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・シトケミストリー（Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７／１、９６ー１０１（１９７９）はラベル分子または少なくともそれらの蛍光を破壊しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子光学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチングまたは診断検定におけるラベルの選択的除去または破壊をおこなう他の技術の使用を教示または示唆するものではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良好なので診断検定における現在の要求を満たすものである。従来技術の感度範囲は１０−１３モルの範囲より良くはないが、本発明は１０−１６モル範囲の感度である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は均一検定フォーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法ならびにそのための組成物を開示することを目的とする。また、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法を組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分離を包含する検定の感度を増加させる改良法の提供も目的とする。本発明の原理はラベルの化学的もしくは生化学的試薬に対する安定性の差に基づく。本発明者は、ある種のラベルは結合相手と結合するときはいつも、該結合相手がそれに対する結合物質と結合するときに該ラベルの安定性が変化する、もしくは、しうることを見出した。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検定システムを用いる分析物の感度良好な検出に採用できる方法を開示することを目的とする。本発明のさらにもう一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在の感度良好な検出用の該均一診断検定における化学ルミネセント、アクリジニウムエステル−ラベルＤＮＡプローブの使用を開示することである。
【００１１】
【課題を解決するするための手段および発明の実施の形態】
要約すると、本発明は診断検定御および方法からなる。該方法は媒体中の分析物の検出に使用でき、該分析物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有すると思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合しているラベル物質は、分析物が該特異的結合相手と結合するたびに安定性の検出できる変化または相違する分解を受ける。具体例においては、一本鎖核酸プローブがその上の実質的にいずれの所望の部分または場所にラベルを含むように修飾されている。プローブラベルは標的核酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより安定性の異なるものまたは相違する分解に感受性のものである。
特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結合プローブに関して安定化されている検出システムからなる。この安定化は挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）によって促進される。アクリジニウムエステルを含め、ＤＮＡ挿入化合物は特に、しかし、専らではなく、本発明の検定システムに使用するのに適している。ＤＮＡ挿入物は二本鎖ＤＮＡと非共有的に結合することが知られており、ＤＮＡの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分子である。本発明者らは、アクリジニウムエステル類がアデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿入されるという証拠を持っている。
【００１２】
以下、特にアクリジニウムエステルでラベルされたプローブを参照して本発明を記載するが、本発明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違する分解または安定性の変化に感受性な均等なラベルおよび検定フォーマットの使用も意図していると理解されるべきである。本明細書にさらに詳しく説明するように、他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特に、非ハイブリッド化プローブ上のラベルの近傍のアミンにより不安定化される物質を包含する。さらに、疎水性環境と相互作用できる、例えば、塩基対の間への挿入によるラベル物質も使用できる。
本発明は一般に、結合形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的な実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用できる。さらに、いずれの分離または洗浄工程も含まず、検定システムが比較的単純な故に、従来のシステムよりも迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱合体形間の安定性に大きな差異がある場合、残余または非結合ラベル抱合体は実質的に全て破壊され、そのため、検出されないので、該システムは従来のシステムよりさらに感度が良くなる。最後に、該システムは非常に融通性があり、単独でも、また、他の分離方法と組み合わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズを達成できる。本発明は感染症、遺伝的およびウイルス病の検出および癌診断を含むプローブ診断に有用である。
【００１３】
本記載では以下の定義を用いる。
１．アクリジニウムエステル：第４級窒素中心を有し、その９−位で誘導体化され、不安定なフェニルエステル基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジアイニウム  ９−カルボキシレート  フルオロサルフェート：
【化１】
0003587762.tif 000002
【００１４】
２．アクリジニウムエステル類：次の一般式の部分：
【化２】
0003587762.tif 000003
Ｒ１＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシまたはＸ＝ハロゲンの場合はなし。
Ｒ２＝Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、もし、そしてＸ＝Ｎのときだけ。
Ｒ３＝Ｈ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。
Ｒ４＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール。
Ｘ＝Ｏ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。
Ｙ＝Ｏ、ＳまたはＮＨ。
Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３および／またはＲ４は化学的抱合を可能にする反応性部位を有する。
【００１５】
３．分析物−特に制限するものではないが、抗原およびそれに対する抗体、ハプテンおよびそれに対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補酵素および受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗体および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよびそれらとハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそれに対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手と結合反応する能力のあるあらゆる物質、特に、標的核酸含有配列。
【００１６】
４．結合相手（結合パートナー）−分析物と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または物質、特に、核酸プローブ。
【００１７】
５．二本鎖構造：二つの相補一本鎖核酸分子のアニーリングにより形成される二本鎖複合体。
【００１８】
６．ハイブリッド化：二つの相補一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子間またはＤＮＡと相補ＲＮＡ分子間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的塩基対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド化した特定の遺伝子の遺伝コードが再生される。
【００１９】
７．結合：結合相互作用が分子とその特異結合相手の間で生ずる条件。
【００２０】
８．安定な：化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する耐性のある。
【００２１】
９．安定性：化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する物質の耐性。
【００２２】
アクリジニウムエステル類は溶液中で対応する塩基と平衡して存在することが知られている。高いｐＨにおいて、塩基形成が優性であり、第４級窒素種は低いｐＨで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特に、過酸化水素を含む水酸化ナトリウム水溶液の添加により影響されることも知られている。化学ルミネセンスはアクリジニウム種に対するヒドロペルオキサイドイオンによる攻撃を包含し、電子的に励起したＮ−メチルアクリドンを生成する。総括的に、ウイークス（Ｗｅｅｋｓ）ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとしてのアクリジニウムエステル類」、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．）、２９１８、１４７４ー１４７９（１９８３）参照。該反応を以下に図式化する。
【００２３】
アクリジニウムエステル反応図
【化３】
0003587762.tif 000004
【００２４】
本発明は以下のように実施することができる。第１に、実施される検定用の結合物質と１以上の結合パートナーとからなる結合パートナーを選択する。これらの対は、抗原とその抗体；ハプテンとその抗体；ホルモン、薬剤、代謝産物、ビタミン、補酵素と受容体を包含するその結合パートナー；ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドと抗体およびその結合物質；ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそのハイブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド；金属とそのキレート化剤である。
第２に、用いられる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結合検定、競合検定、配列飽和法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）およびサンドイッチ検定からなるフォーマットから選択することができる。
第３に、実施される検定用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバイオルミネッセンス法により検出できるラベルであればよい。加えて、該ラベルは、その能力を修正し、検出されるように、化学的または生物学的に減成しうる特性を有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナーとその結合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パートナーとその結合物質の間の結合に悪影響を及ぼさない条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、塩基またはパーオキジデートまたは酵素のような選択的酸化剤を照射した後、その能力に影響を及ぼし、検出されるものである。
第４に、当業者に公知の化学方法を用い、化学または生物学的減成に対するラベル感受性が、ラベル化結合パートナーとその特異結合物質（類）との相互作用を修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させる。ある場合には、複数の異なる部位をラベル結合について試験し、最も特異的な減成を与える部位を用いることができる。
第５に、その結合物質と共に、またはなしでラベル化結合パートナーの最適検出識別を付与する化学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。
最後に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能力を試験し、一般に：
ａ．インキュベートし、
ｂ．選択的に減成し、
ｃ．検出するか、または
ａ．インキュベートと選択的減成を同時に行い、
ｂ．検出する
の工程を用い、分析物を定性的にまたは定量的に検出する。
【００２５】
本発明を用いる場合、化学ルミネッセンスのアクリジニウムエステルでラベル化したオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーションを介する特異的ポリヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。アクリジニウムエステルを、１９８７年９月２１日出願の米国特許出願（まだ番号が付与されていない）、アーノルドら（Ａｒｎｏｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．）による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、ＤＮＡプローブおよび／または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸塩バックボーン、糖残基、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端ならびに混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの非ヌクレオチドモノマー単位をラベル化する能力を包含する。
かかるアクリジニウムエステルラベル化プローブは、それらがハイブリッド化された場合と比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリーである場合には、有意な異なる化学安定性を示しうる。この異なる安定性は、プローブにおけるアクリジニウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌクレオチド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチドと安定したハイブリッド物を形成する他のプローブ分子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
【化４】
0003587762.tif 000005
【００２６】
ＤＮＡプローブ分子におけるアクリジニウムエステルの異なる安定性に寄与する因子を測定する方法において、非ハイブリッド化プローブ（ヌクレオチドおよび混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドの両方）の塩基上の遊離アミンが、特にアルカリ性雰囲気下にてアクリジニウムエステルを不安定にすることが判明した。同時に、アクリジニウムエステルがプローブの末端に隣接している場合、いったんハイブリッド化が起こると、それはターゲット配列により寄与されたアミンによってアルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリヌクレオチド（結合物質）配列とハイブリッドを形成する場合、プローブアミンは相補性ヌクレオチドと対をなす塩基と関係し、特にアルカリ性条件下、アクリジニウムエステルを不安定にする能力は制限される。同時に、ハイブリッド・デュプレックス（ｈｙｂｒｉｄ  ｄｕｐｌｅｘ）、特に、アデニン／チミジン塩基対密度の部位に挿入することにより、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安定化することが判明した。以下のセクションにおいて説明されているように、多くの他の挿入部位もまた、良好な種々の加水分解を提供することが判明した。
【００２７】
本発明をハイブリダイゼーションに適用することができるいくつかの態様がある。これらは限定するものではない。
１．アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およびアデニン／チミジン塩基対の隣接部位に付着させる。好ましい方法は、１９８７年９月２１日出願の米国特許出願（まだ番号が付与されていない）、アーノルドら（Ａｒｎｏｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．）による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、アクリジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマー単位に付着させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のすぐ隣くにあるヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチドモノマー単位に挿入し、付着させることである。かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端におけるヌクレオチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供するのに役立つ。
【００２８】
２．アクリジニウムエステルをプローブの３’または５’末端のいずれかに付着させ、第２のプローブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与されたアミンの付近の作用を制限し、第１のプローブの付近をハイブリッド化する。該第２プローブが、デュプレックス形成に基づくＡ／Ｔ塩基対に富んだ部位をクリエートする場合、それもまた望ましいことである。たとえこのダブルプローブまたはサンドイッチ系が、１つだけではなく、２つのデュプレックスの形成に依存しているとしても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約５〜１５ヌクレオチドのプローブにより識別することができるマイナーな塩基対変化を敏感に検出する方法を提供する。正常な状況下、かかる短いプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下にて単一のミスマッチを識別する能力を有する。しかしながら、それらは常套手段としては用いられていない。すなわち、該短いプローブは、存在する多数の複合ＤＮＡまたはＲＮＡ配列内に含まれる複数の特異部位とハイブリッド形成するかもしれない。２つの異なるプローブが、すぐ隣のポリヌクレオチド部位とハイブリッド形成しなければならないという条件下では、かかる部位は特異的にターゲットとされ、同定することができる。したがって、短プローブ識別の利点は、両方のプローブによりスパンされた部位の特異性を維持しながら利用できることである。
【００２９】
３．アクリジニウムエステルを、所望のターゲットポリヌクレオチドでないポリヌクレオチド配列とのミスマッチ部位にて、または付近にて付着させる。このように、ミスマッチ部位のまわりのデュプレックス域は有意に不安定化され、アクリジニウムエステル（仮にそれがこの部位にて、または付近にて付着している場合）は減成に対して影響されやすくなるため、わずか１つのヌクレオチドだけが異なるポリヌクレオチド配列の間の識別をも達成することができる。
【００３０】
４．プローブがターゲットとするハイブリッドの局所的な安定性をモニターするために、プローブのある部位にアクリジニウムエステルを付着させる。
このように、アクリジニウムエステルは、全体がハイブリッド２本鎖を形成するのではなく局所的なハイブリッド部位が部分的に会合する条件下での、局所的なハイブリッドの安定性を着実にモニターするのに役立つ。
【００３１】
上記３つのフォーマットについて１つの好ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度、典型的には５０〜７０℃にて、異なる加水分解工程を行なうことである。
別の態様は、別の異なる加水分解工程を室温にて行なうことである。これは、１０〜１１の範囲のｐＨを用い、ハイブリッド化と非ハイブリッド化アクリジニウムエステルラベル化プローブの間の加水分解速度に、より大きな差異をもたらす。
【００３２】
実験法および物質
以下の実施例は、例示であり、限定されるものではない。これらの実施例は、一般に利用可能なデーターおよび最も適当な現象の説明に基づくものである。他の因子および方法が、さらなる研究により明らかになるかもしれない。本発明はアクリジニウムエステルラベルを用いる例示および実施例により詳細に記載されているが、ある変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他のラベル系もまた請求の範囲内で用いてもよい。
【００３３】
【実施例】
実施例１
アクリジニウムエステル−ラベル化プローブの組立て
Ａ．アミンリンカー−アームプローブの合成および精製
デオキシオリゴヌクレオチドプローブを、プローブ内部の５’−末端、ポリリン酸鎖に沿ったある予め選択した位置のいずれかに位置する、または１つのヌクレオチド塩基に付着するアミンリンカーアーム（すなわち、アクリジニウムエステルでラベル化する第１級アミンにて終止するもの）を有するように合成した。
（ｉ）
５’−アミンリンカー−アームをプローブに付着させるのに、以下の化合物を用いた：
【化５】
0003587762.tif 000006
0003587762.tif 000007
この化合物は、これまで、末端アミンリンカー−アーム試薬と称されている。この試薬を以下のように合成した：無水酢酸エチル中、６−アミノヘキサノールをＳ−エチルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応精製物が石油エーテル中にて沈澱し、水中１０％ピリジン混合物で１０分間処理し、形成したＯ−トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。ついで、この化合物を、文献（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１２（１１），４５３９（１９８４）参照）に記載されている標準的プロトコルに従ってホスフィチレート（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅ）し、所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカー−アーム試薬（１）を得た。
５’−アミンリンカー−アームを有するプローブを以下のように合成した。アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイション
（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のモデル・３８０Ａ  ＤＮＡシンセサイザーを用い、標準的ホスホルアミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学に従い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、３’末端から５’末端のプローブを形成した。所望の配列が完了した後、アミンリンカー−アームは、別のホスホルアミジトヌクレオシドがカップリングするのと同じように、末端アミンリンカー−アーム試薬を用いて自動的にプローブの５’−ヒドロキシル基にカップリングした。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体担体から切断し、ＮＨ４ＯＨを用いて脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５クロマトグラフィーにより精製した。
以下のプローブを合成し、この操作に従い精製した：
【化６】
0003587762.tif 000008
（ＮＨ２−（ＣＨ２）６はアミンリンカー−アームを示す）
（ｉｉ）
アミンリンカー−アームをプローブの内部に組入るため、内部アミンリンカー−アーム試薬、タイプ１（４原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ１参照）またはタイプ２（２原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ３参照）またはタイプ７（９原子スペーサ、下記引用特許出願中のＬ７参照）を、１９８７年９月２１日出願の米国特許出願番号第０９９０５０号（特表平２−５０３１４６号）、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように用いた。再度、プローブを標準的ホスホルアミジト化学を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびセファデックスＧ２５クロマトグラフィーを用いて精製した。
以下のプローブはこの操作に従い合成した：
１．）イー・コリー（Ｅ．Ｃｏｌｉ）からの１６ＳサブユニットｒＲＮＡに対する３０ｍｅｒコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー−アーム、タイプ１で、配列中の１８位のアデニン残基を置き換える：
【化７】
0003587762.tif 000009
２．）クラミディア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）からの１６Ｓサブユニットに対する３３ｍｅｒコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー−アーム、タイプ１で、配列中の２１位のアデニン残基を置き換えるか、
【化８】
0003587762.tif 000010
または残基２１と２２の間に挿入する：
【化９】
0003587762.tif 000011
（ｉｉｉ）
アミンリンカー−アームを有するヌクレオチド塩基を、以下のようにプローブに挿入した。以下の配列を有する鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドを合成した：
0003587762.tif 000012
（プライマーおよび伸長プライマーはシィ・トラコマティスの１６Ｓサブユニットに対して相補的である。）
クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いるプライマー伸長は、ＢＳＡが１０×ニック・トランスレーション・バファーから省略することを除いて、マニアティス（モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、ティー・マニアティス、１９８２、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、パブリッシング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  １９８２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐｕｂｓ．））に記載されているように行ない、アミンリンカー−アーム修正塩基アミノ（１２）ｄＵＴＰ（カルバイオケム、カリフォルニア）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を挿入した。したがって、得られたオリゴマーの配列は：
ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＡＴＡ（アミノ−１２−Ｕ）ＣＧ  ＣＣである。
プライマー伸長複合体の精製は、ＮＥＮＳＯＲＢ−２０カートリッジ（デュポン）（ＤｕＰｏｎｔ）を用い、製造業者の奨励する方法に従い実施した。（プライマー伸長反応体は、カラムに充填する前に、ＮＥＮＳＯＲＢ試薬Ａ９００μｌを加えて希釈した。該精製オリゴマーを５０％メタノールで溶出し、ついでスピード−バク（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ．）にて取り出した）。
Ｂ．アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー−アームプローブのラベル化および精製
アクリジニウムエステルの２５ｍＭストック溶液を、蒸留ＤＭＳＯ中にて調製した。所望量のプローブ（前記セクションＡにおけるラベル化した種々のプローブのリスト参照）を、１．５ｍｌの円錐形ポリプロピレン管にて蒸発乾固した。カクテルは以下の成分を列挙した順序にて加えることにより構成した：
３μｌ  水
１μｌ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）
４μｌ  ＤＭＳＯ（蒸留）
２μｌ  ＤＭＳＯ（蒸留）中、２５ｍＭアクリジニウムエステル
混合物を撹拌し、マイクロ遠心分離機において２秒間スピンに付し（内容物を管の底に集中させる）、３７℃にて２０分間インキュベーションした。ついで、以下の成分を、列挙した順序にて反応カクテルに加えた：
３．０μｌ  ＤＭＳＯ（蒸留）中、２５ｍＭアクリジニウムエステル
１．５μｌ  水
０．５μｌ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）
カクテルを再度撹拌し、スピンし、３７℃にてさらに２０分間インキュベーションした。未反応ラベルは、５倍過剰のリシンを用い、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５０％ＤＭＳＯ中、０．１２５Ｍリシンを加えることによりクエンチし、室温にて５分間インキュベートした。
ついで、アクリジニウムエステル−ラベル化オリゴマーを、以下の方法を用いて精製した。クエンチした反応混合物２０μｌに、担体として３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）３０μｌ、水２０μｌおよびグリコゲン５μｌ加えた（グリコゲンは予め処理し、いずれのヌクレアーゼ活性も除去した）。試料を簡単に撹拌し、無水エタノール６４０μｌを加えた。該試料を簡単に撹拌し、氷上にて５〜１０分間インキュベートし、ついでマイクロ遠心分離機において１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離に付した。上澄液を注意して除去し、ペレットを０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）２０μｌ、０．１％ＳＤＳに再度溶かした。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。
（ｉ）
５’および内部アミンリンカー−アームを有するＡＥ−ラベル化プローブを以下のように精製した：再度溶解したペレットを、
ＩＢＭＲ９５３３ＨＰＬＣ系に取り付けたヌクレオゲン−ＤＥＡＥ６０−７イオン交換ＨＰＬＣカラムに注入した。すべてのバファーは、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＨＰＬＣグレード水、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）および酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、試薬グレードの氷酢酸（ＨＯＡｃ）およびＬｉＣｌで調製した。すべてのバファーは、使用前に０．４５μｍ孔径のナイロン−６６フィルターを介して濾過した。試料を、第１図の記載（この場合、プローブは前記セクションＡにおいて記載された２６ｍｅｒを含有する５’−アミンリンカー−アームであった）のように溶出した。実験の直後、１０％ＳＤＳ５μｌを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した（これにより、アクリジニウムエステルラベル化プローブを、試験管壁にこびりつけないようにした）。フラクション２１〜４２から０．５μｌ部を取り出し、１２×７５ｍｍ試験管の水２００μｌに加えた（各部において分離ピペットチップを用い、キャリーオーバーの問題を回避した）。ついで、各部の化学ルミネッセンスを、次の自動注入および読み配列を用いるバートホルド・クリニルマット（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ）において測定した：０．２５Ｎ  ＨＮＯ３２００μｌ、０．１％Ｈ２Ｏ２の注入；１秒後；１Ｎ  ＮａＯＨ２００μｌの注入；１０秒間化学ルミネッセンス出力の読み。
ついで、フラクション２９〜３３を以下のようにＥｔＯＨ沈澱させた：各フラクションにグリコゲン５μｌを加え、撹拌し、ＥｔＯＨ１ｍｌを加え、撹拌し、氷上にて５〜１０分間インキュベーションし、マイクロ遠心分離機中、１５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、ペレットを０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ２０μｌ、ｐＨ５、０．１％ＳＤＳに再度溶かし、フラクションをプールした。
このようにして、高純度のアクリジニウムエステルラベル化プローブを得た。かかるプローブの特異活性は、典型的には、オリゴマー１ピコモル当たり、５〜１０×１０７化学ルミネッセンス光数（バートホルド・クリニルマット）であった。
（ｉｉ）
アミンリンカー−アーム修正塩基（アミノ−１２−Ｕ）を有するＡＥ−ラベル化プローブを、一般に、以下のことを除いて、前記のように精製した：バイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４逆相カラムをもちいた；緩衝液Ａは０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（アプライド・バイオシステムズ、インコーポレイション、カリフォルニア州、ホスター・シティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））、緩衝液ＢはＣＨ３ＣＮであった；ラベル化プローブは、１ｍｌ／分の流速にて２５分間において１０〜１５％溶媒Ｂの直線勾配を用い、ハイブリッドとして溶出した。ついで、主な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後処理した。
一般に、前記ディスカッションは、アクリジニウムエステルでプローブを合成し、ラベル化する方法を記載している。個々の実施例において、プローブは、末端および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基にてラベル化されている。
【００３４】
実施例２
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ６における安定性
クラミジア・トラコーマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対して特異的な内部標識化３３ｍｅｒプローブを前記したごとく調製した（アデニン置換、タイプ１リンカー−アーム）。以下の手法に従い該プローブをそのターゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマティス）でハイブリッド化した。
ハイブリダイゼーション混合物
２μｌＡＥ−プローブ（０．５ピコモル）
０．３μｌ  ４％（重量：容量）ＳＤＳ
５．８μｌ  １Ｍ  ＰＢ、ｐＨ５
４．４μｌ  シイ・トラコーマティス  ｒＲＮＡ（２μｇ）、または対照については４．４μｌ水
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃にて４０分間インキュベートし、その時点で、以下のごとくに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を用い、各混合物を、パーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。ハイブリッドまたは対照混合物の０．１μｌ分を、２％ＨＡＰを含有する０．１４Ｍ  ＰＢ、ｐＨ６．８、２００μｌに添加した。得られた各混合物を５秒間攪拌し、６０℃にて５分間インキュベートし、２０秒間攪拌し、次いで１５０００ｒｐｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、０．１４Ｍ  ＰＢ、ｐＨ６．８、２００μｌをＨＡＰペレットに添加し、混合物を１０秒間攪拌し、次いで１５０００ｒｐｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、ペレットを０．１４Ｍ  ＰＢ、ｐＨ６．８、２００μｌに再懸濁した。再懸濁ＨＡＰの５０μｌおよび２の上澄みの各々を以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析し、パーセントハイブリッド化プローブ、すなわちＨＡＰに伴うパーセント化学ルミネッセンス信号を計算した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を以下の手順に従ってｐＨ６にて試験した。  安定性試験混合物
１２．３μｌ  前記からのハイブリッドまたは対照
５０μｌ  １Ｍ  ＰＢ、ｐＨ６
２．５μｌ  ４％  ＳＤＳ
６５μｌ  水
これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに５μｌを取り出し（ｔ０）、以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析した。混合物の残りを６０℃でインキュベートし、各時間（後記参照）において５μｌを取り出し、直ちに化学ルミネッセンスについて分析した。
各試料の化学ルミネッセンスは、試料の一部を１２ｘ７５ｍｍ試験管中の水２００μｌに添加し、クリニルマート（Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ）（０．２５Ｎ  ＨＮＯ３  ２００μｌ、０．１％Ｈ２Ｏ２を自動注入、１秒遅れて２Ｍ  ＰＢカリウム２００μｌ、ｐＨ１３．２を自動注入、１０秒間の化学ルミネッセンスの読み取り）にて化学ルミネッセンスを測定することによって測定した。
結果：
１．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析）
ハイブリッド−９６％
対照−１．３％（非特異的結合）
２．安定性時間経緯
第２図参照
これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および続いての化学ルミネッセンスの喪失に対してよく保護されているが（化学ルミネッセンスの喪失の半減期は３３７０分に等しい）、非ハイブリッド化プローブは分解および化学ルミネッセンスの喪失に対して非常に敏感である（半減期は２９．２分に等しく、従って、ハイブリッド化および非ハイブリッド化の差は１１５倍に等しい）ことを示す。これらのデータは、本明細書中に記載する均一検定が、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それを測定することによって、ターゲットＤＮＡ配列の位置を決める能力を証明するものである。
【００３５】
実施例３
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ９における安定性
内部標識化プローブ（実施例１に記載したすべての３つの内部標識化３３ｍｅｒプローブを試験した）をそのターゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマティス）でハイブリッド化し、実施例２に記載したごとくにパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を以下のプロトコルに従ってｐＨ９にて試験した。
安定性試験混合物
５μｌ  前記からのハイブリッドまたは対照
４５μｌ  ０．２Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９
次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、実施例２に記載したごとくに化学ルミネッセンスについて分析した。
結果：
１．パーゼントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析）
ａ．アデニン置換、タイプ１リンカー−アーム
ハイブリッド−９５％
対照−０．５％（非特異的結合）
ｂ．挿入、タイプ１リンカー−アーム
ハイブリッド−９８％
対照−０．３％
ｃ．挿入、タイプ２リンカー−アーム
ハイブリッド−９８％
対照−０．２％
２．安定性時間経緯
第３〜第５図参照。第３図はアデニン置換、タイプ１リンカー−アームについてのグラフであり；第４図は挿入、タイプ１リンカー−アームについてのグラフであり；第５図は挿入、タイプ２リンカー−アームについてのグラフである。
実施例２におけるごとく、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブは保護されない。これは、内部標識化プローブのすべての３つのタイプについて当てはまる。本実施例においては、高いｐＨにおけるホウ酸ナトリウムが、ハイブリッド化プローブと非ハイブリッド化プローブとの間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、（実施例２と比較して）この過程を加速することが示される。
【００３６】
実施例４
隣接プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ６における安定性
本実施例は、本実施例で用いるＡＥ−標識プローブ（後記参照）の５’末端にすぐ隣接するイー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡにハイブリダイズし、それによってアクリジニウムエステル標識に近接するターゲットｒＲＮＡ中のすべてのアミンの「キャップ除去」に導く（標準的なホスホルアミデイト化学を用いて調製した）配列５’−ＣＣＧ  ＧＡＣ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣ−３’のプローブの使用を含む。
アクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端（実施例１に記載した調製）（以下、ＡＥ−プローブという）および前記した隣接プローブを以下の手順に従ってハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション混合物          対照混合物
１μｌ  ＡＥ−プローブ              １μｌＡＥ−プローブ
（．２５ピコモル）                （．２５ピコモル）
２μｌ  イー・コリ  ｒＲＮＡ            ５．４μｌ水
（２μｌｇ）
４．３μｌ隣接プローブ              ５．８μｌ１ＭＰＢ、ｐＨ５        （１２ピコモル）
０．３μｌ４％ＳＤＳ                  ０．３μｌ４％ＳＤＳ
７．５μｌ１Ｍ、ｐＨ５
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃にて４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を実施例２に記載したごとくにｐＨ６にて正確に試験した。
結果：
１．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析）
ハイブリッド−９３．５％
対照−２．７％（非特異的結合）
２．安定性時間経緯
第６図参照
実施例２におけるごとく、ハイブリッド化ＡＥ−プローブ（この場合はやはりハイブリッド化した隣接プローブをもつ）は分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。該保護は実施例２と同じ程度良好であった。何故なら、１つの代わりに２つのハイブリダイゼーションに依存するからである。
【００３７】
実施例５
「隣接」プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ９における安定性
実施例４に記載したごとくにハイブリダイゼーションを正確に行った。以下に示す安定性試験混合物の組成以外は、実施例２に記載したごとくに、隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性をｐＨ９において正確に行った。
５μｌハイブリッドまたは対照
５０μｌ０．２Ｍ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０
（やはりハイブリッド化された）隣接プローブをもつハイブリッド化ＡＥ−プローブは再び分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。実施例３におけるごとく、高い  ｐＨでのホウ酸ナトリウムは、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を加速した。これらの結果をグラフで示したものは第７図を参照されたい。
【００３８】
実施例６
ハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ６における安定性
以下の手順に従ってプローブをそのターゲットｒＲＮＡ（この場合はコー・コリ）にハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション混合物          対照混合物
１μｌ  ＡＥ−プローブ            １μｌＡＥ−プローブ
（．２５ピコモル）                （．２５ピコモル）
２μｌイー・コリ  ｒＲＮＡ        ５．４μｌ水
（２μｇ）
５．８μｌ１Ｍ  ＰＢ、ｐＨ５        ５．８μｌ１Ｍ  ＰＢ、ｐＨ５
０．３μｌ４％ＳＤＳ              ０．３μｌ４％ＳＤＳ
３．４μｌ水
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を６０℃にて４０分間インキュベートし、次いで、実施例２に記載したごとくヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を実施例２に記載したごとくにｐＨ６にて正確に試験した。
結果：
１．パーセントハイブリダイゼーション
ハイブリッド−９４％
対照−２．７％（非特異的結合）
２．安定性時間経緯
第８図参照。
非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例におけるほど分解の差は大きくなかったが、再び、ハイブリッド化プローブと比較してかなり分解した。これは、アミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で「キャップ除去」されたからである。事実、これは、さらに、ハイブリッド化隣接プローブの存在下におけると非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ間とを区別する能力を証明する。
【００３９】
実施例７
アクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基に標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのｐＨ７．６における安定性
実施例１に記載したアクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基（アミノ−１２−Ｕ）に標識化したプローブを、以下の手順に従って、そのターゲットｒＲＮＡ（この場合はシイ・トラコーマティス）にハイブリダイスした。
ハイブリダイゼーション混合物
０．１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ５．４
１０％ラウリル硫酸リチウム
２μｇ  （０．１ピコモルＡＥプローブ）シイ・トラコーマティスｒＲＮＡまたは対照用水
合計容量−３０μｌ
ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を８０℃にて５分間、続いて６０℃にて６０分間インキュベートした。得られた溶液を、０．１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ５．４、１０％ラウリル硫酸リチウムで各々３００μｌまで希釈し、実施例２に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の安定性を、以下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料とともにｐＨ７．６で試験した。
安定性試験混合物
１５μｌ  前記からのハイブリッドまたは対照
１００μｌ  ０．２％テトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００
次いで、これらの混合物を６０℃にてインキュベートし、試料を種々の時点で取り出し、０．１Ｍ  Ｈ２Ｏ２  ２００μｌの自動注入、１秒遅れての１Ｎ  ＮａＯＨ  ２００μｌの自動注入、および５秒間の化学ルミネッセンスの読み取りを使用するＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＬｅａｄｅｒＴＭ  Ｉ  ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて化学ルミネッセンスを測定した。これらのデータより、加水分解速度を回帰分析によって決定した。
結果：
１．パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析）
ハイブリッド−５３．８％
対照−０．５％
２．安定性
エステル加水分解の半減期（分）      半減期の比
ハイブリッド        対照            （ハイブリッド／対照）
１３．６          １．３                １０．５
これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブ（この場合はプローブの塩基に付着した標識をもつ）は保護されないことを示す。これは、ＡＥ付着について本明細書中にて記載する均一保護検定で使用できる原理を示す。
【００４０】
実施例８
ｒＲＮＡおよびＤＮＡターゲットをともに用い各種配列ダイマー部位にてアクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブのｐＨ７．６における安定性
種々の配列ダイマー部位（以下、参照）に挿入した内部リンカー−アーム、タイプ「Ｌ７」を含有するプローブを合成し、ＡＥで標識化し、実施例１に記載したごとくに精製した。これらのプローブの配列およびリンカー−アームの位置は以下のとおりである。
0003587762.tif 000013
８０℃インキュベーション工程を省略し、かつ用いるターゲット核酸が以下のものである以外は実施例７に記載したごとくにこれらのプローブをハイブリダイズした。
0003587762.tif 000014
実施例７に記載したごとく、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブの安定性をｐＨ７．６にて試験した。
0003587762.tif 000015
これらのデータは、リンカー−アーム（および、従って該ＡＥ）が広範囲の配列ダイマー部位に挿入でき、ハイブリッド化形態においてもエステル加水分解からなお実質的に保護されることを示す。さらに、本実施例は、これらの均一検定フォーマットで用いた場合、ＤＮＡターゲットがハイブリッド化ＡＥ−プローブの良好な保護を提供することを示す。また、本実施例は、ここで用いた長い（９原子）リンカー−アームが、広範囲のリンカー−アーム長が本明細書中に記載するＨＰＡフォーマットで用いることができることを確立したこの特許で前で引用した他のリンカー−アームと実質的に同等の微分加水分解比を生じることも示す。
【００４１】
実施例９
完全に対合するターゲットでハイブリッド化したおよび単一のミス対合のターゲットでハイブリッド化した内部標識化ＡＥ−プローブのｐＨ７．６における安定性
残基６および７の間に挿入された内部アミンリンカー−アーム、タイプ「Ｌ７」を有するイー・コリからのｒＲＮＡの１６Ｓサブユニットに相補的な２４ｍｅｒプローブを合成した。次いで、実施例１に記載したごとくに該プローブをアクリジニウムエステルで標識化し、精製した。その配列は以下のとおりである（＃＝リンカー−アーム位置）。
５’−ＣＡＡ  ＧＣＴ＃  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＧ−３’
このプローブはシイ・ディベルシウス（Ｃ．ｄｉｖｅｒｓｉｕｓ）の１６Ｓサブユニットとともに、位置６（プローブストランドの５’末端からの番号）に単一のＴ−Ｇミス対合を有する。
実施例８に記載した手順に従って、該プローブをターゲットｒＲＮＡ（この場合はコー・コリまたはシイ・ディベルシウスいずれか）でハイブリダイズした。得られたハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッド化プローブの試料の安定性を実施例７に記載したごとくにｐＨ７．６にて試験した。
0003587762.tif 000016
これらのデータは、完全に対合するターゲットでのハイブリッドの場合においても該ＡＥ−プローブは（これまでの実施例に記載したごとく）エステル加水分解から保護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットでのハイブリッドはほとんど保護されないことを示す。これは完全なターゲットと単一部位ミス対合ターゲットの間でＡＥ−プローブの加水分解速度に１７倍の差を生じさせる。従って、本明細書中にて記載する方法は単一の塩基の差を含む核酸ターゲット間を容易に識別区別できる。
【００４２】
実施例１０
種々の条件下、室温におけるアクリジニウムエステルで内部ラベル化されたハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性
内部ラベル化されたプローブ（挿入、タイプ１、実施例１参照）を実施例８に記載のシー・トラコーマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）  ｒＲＮＡ１μｇでハイブリッド化した。実施例７に記載の方法により、種々の試薬およびｐＨ条件（「結果」参照）下、室温でハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性を測定した。
0003587762.tif 000017
これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれば、ここに記載の均一保護検定が機能する種々の条件が存在することが示される。さらに、ホウ酸塩以外のフィチン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比が得られる室温でのフィチン酸系が挙げられる。
【００４３】
実施例１１
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた緩衝液中のクラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ｒＲＮＡの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ（実施例２と同様の）をハイブリッド化し、その標的ｒＲＮＡ（この場合、クラミジア・トラコーマティス）の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
０．５μｌ  プローブ（１２．５ｆｍｏｌ）
１μｌ  ＲＮＡ（１０−２、１０−３、１０−４または１０−５μｇ）
２μｌ  ２０％  ＳＤＳ
１．７μｌ  Ｈ２Ｏ
４．８μｌ  １Ｍ  ＰＢ、ｐＨ６．８
対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、ｐＨ９の０．２Ｍボレート９０μｌを各サンプルに添加し、６０℃で１４分間インキュベートした。ついで、インジェクション１が０．１％Ｈ２Ｏ２のみであり、インジェクション２のｐＨが１３．２の代わりに１３．８であり、読み取り時間が１０秒の代わりに７秒である以外は実施例２に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
0003587762.tif 000018
試薬ブランクおよび対照は３回平均を表し、その他はすべて２回平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は純粋の緩衝液系において約１０−４μｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
【００４４】
実施例１２
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアｒＲＮＡの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ（実施例２のような）を臨床試料中でハイブリッド化し、その標的ｒＲＮＡ（この場合、クラミジア・トラコマチス）の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
５０μｌスロート・スワブ（ｔｈｒｏａｔ  ｓｗａｂ）
６μｌ  ４．８Ｍ  ＰＢ、ｐＨ４．７
２μｌ  ｒＲＮＡ（３×１０−４、３×１０−３、３×１０−２または３×１０−１μｇ）
２μｌ  プローブ（１ｐｍｏｌ）
対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各混合物の１／３（２０μｌ）を最終ｐＨ９の  ０．２Ｍボレート５０μｌに添加し（ハイブリッド化混合物した混合物の添加後）、６０℃で４０分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例１１に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
0003587762.tif 000019
データは２回測定値の平均を表す。
これらのデータにより、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において約１０−３μｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
【００４５】
実施例１３
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた尿中の細菌ｒＲＮＡの希釈系列の検出
内部ラベル化されたイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して特異的な３０  ｍｅｒプローブ（実施例２と同様の）を前記のように調製した（アデニン置換、タイプ１のリンカー・アーム）。以下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化し、その標的ｒＲＮＡ（この場合、イー・コリ）の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
７９．６μｌ  尿
０．４μｌ  ０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＥＧＴＡ
１０μｌ、４．８ＰＢ、ｐＨ６．８
５μｌ  ２０％  ＳＤＳ
５μｌ  プローブ（０．１２５  ｐｍｏｌ）
１μｌ  ＲＮＡ（１０−３、１０−２または１０−１μｇ）
対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は６０℃で３０分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各サンプルにｐＨ９の０．２Ｍホウ酸塩３００μｌを添加し、６０℃で１６分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例１１に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
0003587762.tif 000020
結果は２回測定値の平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は尿を含有する系において約５×１０−３μｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
【００４６】
実施例１４
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアｒＲＭＡの希釈系列の検出のための分離工程と組み合わせて用いる選択的分解
内部ラベル化されたプローブ（実施例２のような）を、対照およびブランク混合物を含む実施例８に記載するような臨床試料（スロート・スラブ）中でハイブリッド化した。ハイブリッド化後、各サンプルの１／３を取り除き、実施例８に記載のように正確に選択的分解に付し、一方、１／３を単純に取り除き、室温で保持した（すなわち、選択的分解を行わなかった）。すなわち、選択的分解を行ったサンプルと、行わなかったサンプルの両方を、以下の点で異なる以外は実施例２に記載のようにＨＡＰを用いて非ハイブリッド化プローブから分離した：
ａ．１ｍｌのＨＡＰ溶液を用いた（２００μｌの代わりに）、
ｂ．１ｍｌの洗浄液を用いた（２００μｌの代わりに）、
ｃ．３回洗浄した（１回の代わりに）、
ｄ．最終のＨＡＰペレットを洗浄液１００μｌ中で再懸濁させ、その全体について、ケミルミネッセンスを測定した（実施例２に記載のように）。
0003587762.tif 000021
結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての２回測定値の平均を表す。
Ｓ：Ｂはシグナルとバックグラウンドの比であり、すなわち、対照のケミルミネッセンスにより分割された特定のｒＲＮＡ濃度でのケミルミネッセンスである。
これらのデータにより、分離前の選択的デグラデーションの付加によって高いシグナル−バックグラウンド比をもたらす低バックグラウンドとなるため、感受性を改良する。
【００４７】
実施例１５
示差加水分解を用いる改良されたストリンジェンシー
以下のプローブをタイプ「Ｌ７」（以下の記号＃によって示される挿入位置）の内部リンカー・アームを含有するように構成させ、実施例１に記載のようにアクリジニウムエステルでラベル化し、そして精製した：
このプローブはナイセリア・ゴノルホエーエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏ−ｅａｅ）の１６Ｓサブユニットに正確に相補的である。しかしながら、それはエヌ・メニンギチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）と密接に関係し、実施例２および８で引用したハイブリッド化ストリンジェンシー条件下で交叉反応が典型的に観察される。実施例８に記載のように（２００μｌフォーマット中である以外は）、エヌ・メニンギティデイス０．５μｇを用いてこのプローブをハイブリッド化し、ｐＨ７．６の  ０．２Ｍ四ホウ酸塩ナトリウム、５％トリトン  Ｘ−１００  １ｍｌ中、６０℃で１０分間インキュベートして示差加水分解（＋Ｄ．Ｈ．）を行うか、またはこれらの示差加水分解条件（−Ｄ．Ｈ．）に付さなかった。得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離し、以下に記載のようにケミルミネッセンスを測定した。
磁気アミンマイクロスフェア（米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのアドバンスド・マグネチックス社製バイオマグ  Ｍ４１００（ＢｉｏＭａｇ  Ｍ１４００，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．））１５０μｇを含有するｐＨ６．０の０．４ＭＰＢ１ｍｌを添加する。１０秒間撹拌する。６０℃で５分間インキュベートする。１０秒間撹拌する。ペース・メート（Ｐａｃｅ−Ｍｔｅ）（登録商標）磁気分離ラック（米国カリフォルニア州、サンディエゴのゲン・プローブ社（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，    Ｔｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて溶液から球体を磁気的に分離する。液体を廃棄する。ｐＨ６．０の０．３Ｍ  ＰＢ  １ｍｌを添加し、１０秒間撹拌し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体を洗浄する。合計３回、洗浄を繰り返す。ｐＨ６．０の０．２Ｍ  ＰＢ  ３００μｌおよび５０％ホルムアミドを添加し、１０秒間撹拌し、６０℃で５分間インキュベートし、１０秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分離することによりハイブリッドを溶離する。該溶液をクリニルマット・チューブ（Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ  ｔｕｂｅ）に移し、実施例７に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。
0003587762.tif 000022
結論として、ここに記載の付加的なストリンジェンシー識別工程としての示差加水分解技術の適用により、所望でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少する。本実施例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブとエヌ・メニンギティディスの交叉反応は２００フォルド（ｆｏｌｄ）以上に低下した。示差加水分解工程は、非ハイブリッド化形態にある場合にプローブのケミルミネッセンスを絶えず減少させ（加水分解により）ることにより、非ハイブリッド化されたプローブと平衡にある不安定なハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがって、交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
【００４８】
実施例１６
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた慢性骨髄性白血病と合したキメラ標的配列の検出
以下のように挿入したタイプ「Ｌ７」の内部リンカー・アームを含有する２４ｍｅｒのプローブ（以上に示す配列）を、実施例１に記載のようにＡＥでラベル化し、精製した：
このプローブは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と合したキメラｍＲＮＡ転写（コモン・ブレーク）に相補的であり、ｂｃｒ／ａｂｌ  プローブと呼ばれている。このキメラｍＲＮＡは、ａｂｌ遺伝子の部位をｂｃｒ遺伝子を含有する他の染色体の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝子の産物である。
ｂｃｒ／ａｂｌ標的の切断個所接合部位を表す合成ＤＮＡ  ６０ｍｅｒ標的および同じ部位中の正常ｂｃｒおよびａｂｌ標的は、実施例１に記載のように合成された（以下の配列）。また、ｍＲＮＡ標的は、切断個所の中央付近に位置するキメラｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子の４５０  ヌクレオチド断片を含有するｐＧＥＭクローンの転写によって生成させる。プローブ・センス（ｐｒｏｂｅ  ｓｅｎｓｅ）中の同様の４５０ヌクレオチド断片の  ｍＲＮＡ転写を陰性対照として生成した。
ＢＣＲ／ＡＢＬプローブ配列
【化１０】
0003587762.tif 000023
合成標的配列
ＢＣＲ／ＡＢＬ標的
【化１１】
0003587762.tif 000024
ＡＢＬ標的
【化１２】
0003587762.tif 000025
前記のように挿入された星印（＊）はアクリジニウムエステル付加のためのリンカー・アーム挿入位置を示し、下線部分はａｂｌ配列を示す。
実施例８に記載のように、前記の各標的約１ｐｍｏｌでｂｃｒ／ａｂｌプローブをハイブリッド化し、実施例７に記載のようにｐＨ７．６でこれらのハイブリッドおよび非ハイブリッド化されたプローブの安定性を試験した。
0003587762.tif 000026
これらのデータにより、ＣＭＬと合したキメラｂｃｒ／ａｂｌ  ｍＲＮＡ転写の切断個所接合部位をつなぐために設計されたＡＥラベル化プルーブが、ここに記載のＨＰＡ技術によってキメラ標的と正常の配列（および非ハイブリッド化プローブ）を識別できることが示された。これは、正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的（典型的には遺伝子疾患と合した）を検出するのに使用できる証拠である。
さらに本実施例により、ｒＲＮＡ以外の標的（この場合、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ）は、ＡＥラベル化プローブにハイブリッド化された場合、ＡＥ加水分解に対する保護を与えることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、均一フォーマットを用いて標的核酸配列を感度良く検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】アクリジニウムエステルーラベルプローブのＨＰＬＣ精製を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】実施例３の結果を示すグラフである。
【図５】実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】実施例４の結果を示すグラフである。
【図７】実施例５の結果を示すグラフである。
【図８】実施例６の結果を示すグラフである。
【図１】
0003587762.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003587762.tif 000033
【図８】
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