(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプルを固相の存在下で測定すべき抗体に対する２つの抗原と共にインキュベートし、このうち第１の抗原は少なくとも１つのマーカー基を担持し、第２の抗原は（ａ）固相に結合しているか、または（ｂ）固相と結合可能な形で存在し、そして測定すべき抗体が固相および／または液相中の該マーカー基を測定することによって検出される、液体サンプル中の特異的な抗体の免疫学的測定方法であって、２つの抗原の少なくとも一方が測定すべき抗体と反応する数個のエピトープ領域を含む、該方法。
【請求項２】
２つの抗原の少なくとも一方が同一のエピトープ領域を数個含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の標識された抗原が数個のエピトープ領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の固相抗原が数個のエピトープ領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
第１の標識された抗原および第２の固相抗原が数個のエピトープ領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
測定すべき抗体と反応しないキャリアーであって、数個のエピトープ領域が共有結合しているキャリアーからなる抗原が用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
一般式
（Ｐ−）nT（−Ｌ）ｍ  （I a）またはＴ（−Ｐ−Lm）ｎ  （I b）
（式中、Ｔはキャリアーを表し、Ｐは同一の、または異なる免疫学的に反応性のエピトープ領域を含み、かつ該キャリアーに共有結合しているペプチドまたはポリペプチド配列を表し、Ｌは該キャリアーまたは該ペプチドもしくはポリペプチド配列に共有結合している、マーカー基または固相に結合可能な基を表し、ｎは１より大きい40までの数であり、ｍは１から10までの数である）により表される抗原が用いられる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｐがエピトープ領域に加えて免疫学的に不活性なスペーサー領域を場合により含む、長さが６から50アミノ酸の合成ペプチド配列を表す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｐが、長さ1000アミノ酸までの組換えポリペプチド配列を表す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
相互に直接共有結合しているか、またはスペーサー領域を介して結合している数個のエピトープ領域を含む抗原が用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
一般式（II）
P1｛P2［P3（P4）ｔ］ｓ｝ｒ                  （II）
（式中、P1、P2、P3およびP4は長さが50アミノ酸までのペプチド配列を表し、このうち少なくとも２つのペプチド配列は同一の、または異なる免疫学的に反応性のエピトープ領域を含み、ｒは１または２であり、ｓは０から４までの整数であり、ｔは０から８までの整数である）により表される抗原が用いられ、該抗原は少なくとも１つの分枝（branching）部位および少なくとも１つのマーカー基または固相に結合可能な基を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
数個のエピトープ領域を含む抗原として、アミノ酸配列が免疫学的に不活性なスペーサー領域を介して結合されうる数個の免疫学的に反応性のエピトープ領域を含む組換え融合ポリペプチドが用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
−  反応性固相、および
−  測定すべき抗体に対する２つの抗原であって、このうち第１の抗原はマーカー基を担持し、第２の抗原は（ａ）固相に結合しているか、または（ｂ）固相と結合可能な形態で存在する抗原
を含んでなる、液体サンプル中の特異的抗体の免疫学的測定のための試薬であって、該２つの抗原の少なくとも一方が測定すべき抗体と反応する数個のエピトープ領域を含む、該試薬。
【請求項１４】
特異的抗体の測定のための免疫学的試験法における検出試薬としての多量体抗原の使用であって、該抗原が、測定すべき抗体との免疫学的反応性を有する数個の同一のエピトープ領域を有し、かつ少なくとも１つのマーカー基または固相に結合可能な基を担持するものである、該使用。
【請求項１５】
一般式
（Ｐ−）nT（−Ｌ）ｍ  （I a）またはＴ（−Ｐ−Lm）ｎ  （I b）
（式中、Ｔはキャリアーを表し、Ｐは同一の、または異なる免疫学的に反応性のエピトープ領域を含み、かつ該キャリアーに共有結合しているペプチドまたはポリペプチド配列を表し、Ｌは該キャリアーまたは該ペプチドもしくはポリペプチド配列に共有結合している、マーカー基または固相に結合可能な基を表し、ｎは１より大きい40までの数であり、ｍは１から10までの数である）により表される抗原。
【請求項１６】
一般式（II）
P1｛P2［P3（P4）ｔ］ｓ｝ｒ                  （II）
（式中、P1、P2、P3およびP4は長さが50アミノ酸までのペプチド配列を表し、このうち少なくとも２つのペプチド配列は同一の、または異なる免疫学的に反応性のエピトープ領域を含み、ｒは１または２であり、ｓは０から４までの整数であり、ｔは０から８までの整数である）により表される抗原であって、少なくとも１つの分枝部位および少なくとも１つのマーカー基または固相に結合可能な基を含む該抗原。
【発明の詳細な説明】
本発明は、エピトープ領域をいくつか有する抗原を使用して、特異的免疫グロブリンを測定する方法に関する。
体液、特にヒト血清中の免疫グロブリンの測定は、微生物、特にウイルス、たとえばHIV、肝炎ウイルスなどによる感染症を診断する際に使用される。検査試料中の特異的免疫グロブリンの存在は、通常、その特異的免疫グロブリンと反応する１種ないし数種の抗原との反応によって検出される。試料液中の特異的免疫グロブリンの測定方法は、感度ならびに信頼性が高く、簡便かつ迅速に実施しうるものでなくてはならない。
最近では、検査試料中の分析対象物質、たとえば特異的抗体の存在を、光学的（たとえば、発光あるいは蛍光）検出システム、NMR活性検出システム、あるいは金属沈殿検出システムで測定することのできる、非放射性マーカー基にもとづいた検出システムが次々を開発されるようになっている。
EP−Ａ−0 307 149には、２種の組換えポリペプチドを抗原として用いる抗体用免疫学的試験が開示されている。この２種のポリペプチドのうち、１種は固相上に固定され、もう１種はマーカー基を有しており、双方の組換え抗原とも、各種の生物で発現されて、この試験の特異性を高めている。
EP−Ａ−0 366 673には、抗体の検出を、精製した標識抗原と、固相に結合したかたちの同一の精製抗原との反応によって行う、試料中の抗体の検出方法が開示されている。ヒトI gGが、例えば抗原として開示されている。
EP−Ａ−0 386 713には、２種の固相担体を使用したHIV抗体の検出方法が記載されている。この方法では、この２種の固相担体上に各種のHIV抗原が固定化されており、そのそれぞれを、試料のアリコートならびに標識HIV抗原と接触させる。抗体の存在は、少なくとも一の試験で反応が陽性であることによって検出される。組換えによって生成したポリペプチドが、HIV抗原として開示されている。
EP−Ａ−0 507 586には、特異的免疫グロブリンについての免疫学的試験を実施する方法が記載されている。この方法では、免疫グロブリンと結合しうる２種の抗原、すなわち、固相担体との結合に適した基を有する第１抗原と、マーカー基を有する第２抗原とに、試料を接触させる。マーカー基は、直接的マーカー基、たとえば、酵素、色素原、金属粒子とすることも、また間接的マーカー基とすることもできる。間接マーカー基の場合には、抗原に結合されたマーカー基は、マーカー基に対する受容体と反応することができ、この受容体が、さらにシグナル発生基を有している。こうした間接的マーカー基の例としては、フルオレセイン誘導体を挙げることができ、この受容体は抗体で、この抗体が、さらに、酵素と結合する。ポリペプチド、たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原が、抗原として開示されている。この抗原に、抗原の誘導体化によってSH基が導入されており、このSH基が、フルオレセインとの結合に使用される。
EP−Ａ−0 507 587には、I gM抗体の特異的検出方法が開示されている。この方法では、検出対象抗体に対する標識抗原、ならびに、同じく検出対象抗体に対する抗体であって固相と結合しうる第２抗体とともに、試料をインキュベートする。
しかし、標識抗原と、固相に結合可能な抗原とを使用するという、技術の現状から公知の架橋試験の概念にもとづいた免疫学的検出方法には、依然として、大きな弱点がある。特に、測定対象抗体と抗原との間のアフィニティが比較的低い場合には、こうした検出方法では感度が低くなってしまう。こうしたことは、セロコンバージョンがごく最近に生じた場合、および／または、感染性微生物の新たな亜型が生じた場合に、とくに生じがちである。これまでに公知となっている架橋試験の概念には、フック効果のせいで、高力価の試料を誤って陰性に判定しまう危険性があるという欠点もある。
したがって、本発明の目的は、技術の現状が抱えている種々の欠点を少なくとも部分的に克服し、特に、セロコンバージョンがごく最近起こったばかりの場合や、微生物の新たな亜型の場合にも感度が適切なものとなるような、特異的抗体の検出方法を提供することにある。また、本発明の方法は、フック効果の低減を意図したものでもある。
この目的は、試料液中の特異的抗体の免疫学的に検出するにあたって；試料液を、固相の存在下で、測定対象抗体に対する２種の抗原、すなわち、少なくとも１つのマーカー基を有する第１抗原と、（ａ）固相と結合した、あるいは、（ｂ）固相と結合可能な形態で存在する第２抗原とともにインキュベートし；そして、測定対象抗体を、固相中、あるいは／ならびに液相中のマーカー基を測定することによって検出する方法であって；上記２種の抗原のうち少なくとも一方が、測定対象抗体と反応するエピトープ領域をいくつか有していることを特徴とする方法によって達成される。
驚くべきことに、ブリッジ試験免疫測定法では、少なくとも１種のマルチマー抗原、すなわち、複数のエピトープ領域を有する抗原を使用すると、試験の感度、特に使用抗原に対するアフィニティが低い抗体を含む血清に対する感度が向上することが見いだされた。また、本発明の方法では、フック効果のせいで高力価試料を誤って陰性と判定してしまう危険性も、相当程度減らすことができる。架橋試験の概念で、エピトープの密度を増大させて抗原の提示を最適化すると、一般に、試料液、たとえば血清中で特異的な免疫グロブリンが生じた場合に、ポリクローナル抗体を含む血清中のそうした特異的な免疫グロブリンとの反応性が改善されることとなる。本発明のさらなる利点は、マルチマー抗原の方が、モノマー抗原より安定性が相当程度高いことである。
架橋試験の概念にもとづいた、特異的抗体の免疫測定のための方法では、２種の抗原を使用する。本発明の第１の好適実施態様では、マルチマー抗原を、標識抗原として使用し、モノマー抗原を、固相抗原として使用する。本発明の第２の実施態様では、マルチマー抗原を固相抗原として使用することができ、モノマー抗原を、標識抗原として使用することができる。第３の好適実施態様では、マルチマー抗原を、標識抗原としても、固相抗原としても、使用することができる。
マルチマー抗原は、複数のエピトープ領域、すなわち、測定対象抗体と免疫学的に反応する、好ましくはペプチドあるいはポリペプチド配列である複数の構造を有している。エピトープ領域同士は、免疫学的に不活性な領域を介して、たとえば、スペーサ領域を介して互いに連結されているのが好ましい。マルチマー抗原は、同一のエピトープ領域をいくつか有するものを使用するのが好適である。
本発明のマルチマー抗原は、好ましくは、１より大で80個以下の免疫学的に反応性のエピトープ領域を含み、そして特に好ましくは、１より大で40個以下の免疫学的に反応性のエピトープ領域を含む。エピトープ領域は、高分子の担体に結合することも、直接、あるいはスペーサ領域を介して互いに連結したものとすることもできる。
エピトープ領域は、好ましくは、長さがアミノ酸６−50個の、免疫学的に反応性の合成ペプチド配列、あるいは、長さが好ましくはアミノ酸1000個以下の組換えポリペプチド配列である。合成ペプチドエピトープは、実際のエピトープ領域だけでなく、他のエピトープあるいは担体との連結に使用可能であったり、または／ならびに、マーカー基あるいは固相結合基の連結に使用が可能であったりするスペーサ領域も含むものとするのが好ましい。
このスペーサ領域は、好ましくは、長さがアミノ酸１−10個の免疫学的に不活性なペプチド配列である。スペーサ領域のアミノ酸は、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酸、ε−アミノカプロン酸、リシン、ならびに構造式:NH2［（CH2）nO］ｘ−CH2−CH2−COOH（式中のｎは、２あるいは３、そしてｘは１−10）の化合物よりなる群から選ぶのが好ましい。スペーサ領域は、エピトープ領域のアミノ末端、あるいは／ならびにカルボキシ末端の、アミノ酸の連続した配列であるのが好ましい。
架橋試験の概念にもとづくイムノアッセイでは、第１の標識抗原を使用する。本発明の方法では、いずれのマーカー基を使用することもでき、たとえば、放射性マーカー基であっても、非放射性マーカー基であっても使用が可能である。好適な非放射性マーカー基は、直接に、あるいは／ならびに間接的に検出が可能である。直接の検出が可能な標識の場合には、検出可能な測定用シグナルを発生する基を、抗原上に直接局在させる。こうした直接的なシグナル発生基の例としては、公知の方法でペプチドあるいはポリペプチド抗原に結合された色素原（蛍光性あるいは発光性の基、染料）、酵素、NMR活性基、あるいは金属粒子がある。直接の検出が可能なマーカー基は、好ましくは、蛍光あるいは電気化学発光によって検出が可能な金属キレートであり、特に好ましくは、ルテニウムのキレート、レニウムのキレート、イリジウムのキレート、あるいはオスミウムのキレートであり、特に、ルテニウムのキレート、たとえば、ルテニウム−（ビス−ピリジル）32+キレートである。他の適当な金属キレートマーカー基は、たとえば、EP−Ａ−0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511、ならびにWO 92/14138に記載されており、本発明では、これらの文献が参照されるものである。
本発明の抗原に適した別のタイプの標識は、間接的に検出が可能な標識である。このタイプの標識の場合には、抗原に、間接的に検出が可能な基、たとえばビオチンあるはハプテン基を結合するが、こうした間接的に検出が可能な基は、適当な結合相手（ストレプトアビジン、アビジン、あるいは抗ハプテン抗体）との反応によって検出が可能で、この結合相手が、さらにシグナル発生基を有している。分子量が100−2000、好ましくは150−1000の有機分子を、ハプテンのかたちで間接的マーカー基として使用するのが好適である。
ハプテンは、それぞれのハプテンに対する特異的受容体に結合することができる。こうした受容体の例としては、抗体、ハプテンに対する抗体断片、あるいはハプテンに対するもっと別の特異的結合相手、たとえば、ハプテンがビオチンの場合であれば、ストレプトアビジンあるいはアビジンがある。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド、ステロイドサポゲニン、およびステロイドアルカロイドよりなる群から選ぶのが好適である。ハプテンは、カルデノリドおよびカルデノリド配糖体よりなる群から選ぶのが特に好適である。こうした一群の物質の代表的な例としては、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、ならびにストロファンチンがあり、このうち、ジゴキシゲニンならびにジゴキシンが特に好適である。他の適当なハプテンとしては、たとえば、フルオレセイン、あるいは適当なフルオレセイン誘導体がある。
ハプテンの受容体は、シグナル発生基に結合されており、このシグナル発生基は、好ましくは、酵素、たとえば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、あるいはＱ−β−レプリカーゼである。しかし、シグナル発生基は、色素原性の基、放射性の基、NMR活性の基、あるいは金属粒子（たとえば金粒子）とすることもできる。ハプテンの抗原への結合は、たとえば、活性エステル誘導体としたハプテンを、ペプチドあるいはポリペプチド抗原のアミノ末端あるいは／および遊離アミノ側基に結合させることによって行うことができる。
「活性エステル」という用語は、本発明の場合、ペプチドの遊離アミノ基と、ペプチドのそれ以外の反応性の基との間で有害な副反応を生じることのないような条件で反応する、活性化されたエステル基を包含するものである。活性エステル誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用するのか好ましい。ハプテン−活性エステル誘導体の適当な例としては、ジゴキシン−4'''−ヘミグルタレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−ヘミスクシネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジギトキシン−4'''−ヘミグルタレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ならびにジギトキシゲニン−３−ヘミスクシネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルがある。これらのハプテン誘導体は、ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim Company GmbH）（ドイツ、マンハイム（Mannheim））から市販されている。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルだけでなく、類似したｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリル、あるいはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルを使用することも可能である。
本発明の方法では、第１の標識抗原だけでなく第２の抗原も使用し、この第２の抗原は、固相に結合しているか、固相に結合可能なかたちで存在するものとし、第１の抗原の場合と同じく、マルチマー抗原とすることもできる。固相抗原と固相との結合は、共有結合によるものとすることも、吸着によるものとすることも可能で、直接に生じるものとすることも、化学的リンカーを介して生じるものとすることも、特異的相互作用、たとえば、ビオチン−ストレプトアビジン／アビジン、抗原−抗体、炭水化物−レクチンを介して生じるものとすることもできる。固相抗原は、好ましくは、ビチニル化抗原であり、固相は対応してストレプトアビジンまたはアビジンで被覆されている。ビオチン基は、抗原に公知の方法、例えば、ビオチン活性エステル誘導体を導入することによって、抗原に結合することができる。このような方法は、当業者には公知である。
マルチマー抗原上のマーカー基、あるいは固相結合基の数は、さまざまなものとすることができ、すなわち、１ないし数個の基を存在させることができる。本発明の方法のいくつかの実施態様では、少なくとも３個以上、３−20個のマーカー基あるいは固相結合基が存在しているのが特に好適である。このようにすると、感度を驚異に改善し、フック効果（強度の陽性試料を、誤って陰性と判定してしまうこと）を有意に低減することが可能となる。
本発明は、試料液中の特異的抗体を測定する免疫学的試験では、試験で使用する２種の抗原のうち少なくとも一方が、マルチマー抗原、すなわち、いくつかのエピトープ領域、好ましくは、いくつかの同一のエピトープ領域を有する抗原であるのが有利であるという知見にもとづくものである。「エピトープ領域」という用語は、本発明の場合、測定対象の抗体に対して特異的な反応を示す構造、好ましくはペプチドあるいはポリペプチド配列を意味するものである。複数の抗原上でいくつかのエピトープ領域を配列することに関しては、いくつかの可能性がある。
第一の実施態様では、マルチマー抗原として、測定対象である抗体と反応せず、複数のエピトープ領域が共有結合によって結合される担体を使用する。適当な担体の例としては、ペプチド、ポリペプチド、あるいは合成担体、たとえばデキストランがある。適当なポリペプチドの例としては、アルブミン、たとえば、ウシ血清アルブミン、非特異的免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、β−ガラクトシダーゼ、ならびにポリリシンがある。担体を使用する場合には、担体が、試料液中の抗体と交差反応性を示すことのないよう注意することが必要である。
エピトープ領域は、二官能性のリンカーを介して、担体の反応性の基、たとえばNH2基あるいはSH基と結合しているのが好ましい。担体のNH2基を介しての結合が好適である。
本発明のこの実施態様では、一般式：
（Ｐ−）nT（−Ｌ）ｍ           （I a）、あるいは
Ｔ（−Ｐ−Lm）ｎ  （I b）
の抗原を使用するのが好ましく、この式中、Ｔは担体を示し;Pは、同一あるいは異なった免疫学的に反応性の複数のエピトープ領域を含み、担体に共有結合しているペプチドあるいはポリペプチド配列を示し;Lは、担体またはペプチドあるいはペプチド配列に共有結合している、マーカー基あるいは固相と結合可能な基を示し;nは、１より大で40以下の数;mは、１−10の数を示すものである。エピトープ基、またはマーカーあるいは固相結合基による担体の被覆度は、反応混合物中では統計的なものとなりうるので、記号ｎならびにｍは、整数である必要はない。ｎは、２より大、あるいは２であるのが好ましい。
担体と結合するペプチドあるいはポリペプチド配列は、アミノ酸６−50個の長さの合成ペプチド配列、あるいは、好ましくはアミノ酸1000個以下の長さの組換えペプチド配列を含むのが好ましい。
合成ペプチド配列は、実際のエピトープ領域に加えて、任意に、たとえば、エピトープと担体、および／またはエピトープとマーカー基あるいは固相結合基との間に局在し得る、上記定義のスペーサ領域を含んでいてもよい。
ペプチドあるいはポリペプチドエピトープは、Ｎ末端、Ｃ末端、あるいは側鎖中の反応性の基を介して、担体と結合することができる。結合の一方法では、担体分子のNH2基を公知のリンカー物質（たとえば、マレインイミドヘキサン酸、マレインイミドプロピオン酸、マレインイミド安息香酸）との反応によって活性化し、SH−活性化ペプチド誘導体を担体に共有結合する。マーカー基あるいは固相結合基は、通常、活性エステルのかたちで担体分子、あるいは／およびエピトープ領域に結合している。しかし、二官能性のフォトリンカーを介しての結合といった他の結合方法も想定可能である。
不活性担体と結合した、エピトープを複数有するマルチマー抗原を合成するためには、たとえば、さらなるシステイン残基を導入することによって反応性のメルカプト基を有する適当なペプチドを、合成するのが好ましい。この場合、このペプチドのＮ末端、Ｃ末端、あるいは配列中の任意の位置を、リンカーで修飾することができる。マルチマー抗原を形成する反応に際しては、一級アミノ基を含む担体に、たとえば、まず、マーカー基の適当な活性エステル誘導体を担持させ、ついで、マレインイミドアルキル基を担持させればよい。こうすることにより、担体中のリシン残基のε−アミノ側鎖のアミノ基が、マーカー基（たとえば、ジゴキシゲニンあるいはビピリジルルテニウム）あるいは固相結合基（たとえば、ビオチン）で部分的に標識され、他の部分が、マレインイミド基に転化される。
さらなる工程で、所望のエピトープ領域を含むペプチドあるいはペプチド混合物を、反応のメルカプト官能基を介して、マレインイミドで修飾した担体に結合する。マーカー基がペプチド上に直接位置している場合には、適切に標識されたSH−活性ペプチドを担体と反応させる以外は同様にしてマルチマー抗原の合成を行う。
本発明のさらなる実施態様では、直接、あるいはスペーサ領域を介して共有結合したいくつかのエピトープ領域を含むマルチマー抗原を使用することができる。エピトープ同士は、少なくとも部分的には三官能性のリンカー分子を介して結合させ、抗原が少なくとも１つの枝分かれ部位、そして好ましくは１−７つの枝分かれ部位を含むようにするのが好適である。
この実施態様では、一般式II:
P1｛P2［P3（P4）ｔ］ｓ｝ｒ                  （II）
の抗原を使用するのが好ましい。ここで、P1、P2、P3、P4は、アミノ酸50個以下の長さのペプチド配列を表し、このうち少なくとも２つのペプチド配列が、互いに同一、あるいは異なった免疫学的に反応性のエピトープ領域を含んでいる。
ｒは１あるいは２、ｓは０−４の整数、ｔは０−８の整数であり、この抗原は、少なくとも１つの枝分かれ部位、ならびに少なくとも１つのマーカー基あるいは固相との結合が可能な基を含んでいる。
式IIの抗原は、P1、P2、P3、P4が直鎖状のペプチド配列である場合には、最大で７つの枝分かれ部位を有する樹状構造を形成し、好ましくは、２−８個の互いに同一、あるいは異なった免疫学的に反応性のエピトープ領域を含んでいる。エピトープ領域は、直接ではなく、スペーサ領域を介して相互に結合しているのが好ましい。スペーサ領域は、アミノ酸１−10個の長さの免疫学的に不活性な上記定義のペプチド配列とするのが好ましい。ペプチド配列P1、P2、P3、P4のすべてがエピトープ領域を含んでいる必要はなく、これらの配列がスペーサ領域のみからなるような構造も可能である。三官能性のアミノ酸、たとえばリシンあるいはオルニチンを使用することによって、構造中に枝分かれを組み込むことができる。
また、一般式IIの抗原は、少なくとも１個の上記定義のマーカー基あるいは固相結合基を含んでいる。これらの基は、たとえば、ペプチド配列の末端および／または反応性側鎖に選択的に結合することができる。
いわゆるモザイクタンパク質も、マルチマー抗原のまた別の実施態様である。このモザイクタンパク質、すなわち、組換え型の融合ポリペプチドのアミノ酸配列には、いくつかの免疫学的に反応性のエピトープ領域が含まれ、これらのエピトープ領域は、任意に、免疫学的に不活性なスペーサ領域を介して相互に結合される。組換え型のモザイクタンパク質は、所望のタンパク質をコードするDNA配列を合成し、このDNA配列を組換え宿主細胞中で発現させることによって得ることができる。こうした手順は、分子生物学領域の当業者には公知のものであり、標準的な教科書類（たとえば、Sambrookら,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,第２版（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。マーカー基、あるいは固相結合基の組換えタンパク質への導入も、公知の方法によって行うことができる。
本発明のさらに別の好適実施態様では、エピトープ領域は、アミノ酸６個から最大で50個の長さの、特に好ましくは、最大でアミノ酸30個の長さの合成ペプチド配列である。こうしたエピトープ領域には、マーカー基あるいは固相結合基を、位置ならびに数に関して選択的に導入することができる。すなわち、使用するアミノ酸誘導体の反応性側基、たとえば一級アミノ基上の特異的保護基を使用した合成による生成に際しては、保護基を選択的に切断した後に、導入しておいたマーカー基との反応に有用なペプチドのこれらの位置を特異的に選択することができる。
このためには、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを、好ましくは市販のペプチド合成装置（たとえばアプライド・バイオシステム（Applied Biosystems）のA431あるいはA433）を使用して、固相上で合成する。合成は、公知の方法にしたがって行い、アミノ酸誘導体を使用し、好ましくはペプチドのカルボキシ末端から開始する。結合に必要とされるアミノ末端基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）残基で誘導体化されたアミノ酸誘導体を使用するのが好ましい。使用するアミノ酸の反応性側基は、ペプチド合成の完了後に容易に切断されうる保護基を含んでいる。保護基として好適な例としては、トリフェニルメチル（Trt）、ｔ−ブチルエーテル（tBu）、ｔ−ブチルエステル（Ｏ  tBu）、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）あるいは2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Pmc）がある。
後にハプテンで誘導体化しようとしているペプチドの位置にあるリシン残基、あるいは一級アミノ側基を有する他のアミノ酸誘導体のアミノ側鎖は、特異的反応条件、たとえば、酸の存在下で定量的に切断しうるよう選択された第一アミノ保護基を有している。酸に対して不安定な保護基の適当な例としては、Bocがある。ハプテンの結合が望ましくないリシン残基、あるいは一級アミノ側基を有する他のアミノ酸残基の側基は、第１の保護基が切断しうるような条件では切断することのないよう選択された第２のアミノ保護基を有している。この第２の保護基は、固相からペプチドが切断され、他の全ての保護基が切断されるような条件でも、安定であるのが好ましい。こうした第２の保護基の例としては、耐酸性の保護基、たとえばフェニルアセチルがある。ペプチドは、20種の天然のアミノ酸以外にも、人口のアミノ酸、たとえばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、あるいはノルロイシンを含むことができる。こうした人口のアミノ酸は、天然のアミノ酸同様、合成に際して保護されたかたちで使用される。
合成が完了したら、ハプテンの結合が生じるはずの位置にある第一アミノ保護基を含め、任意にペプチドを固相から切り離した後に、保護基を切断する。その後、以上のようにして得られた生成物を、好ましくはHPLCによって精製する。その後、ハプテン標識の導入を、ペプチドを、遊離の一級アミノ基、すなわちペプチドの末端アミノ基あるいは／およびアミノ側基と反応する、各事例で所望されるハプテン−活性エステル誘導体と反応させることによって行う。好ましくは、遊離の一級アミノ基当たり、1.5−2.5当量の活性エステルを使用する。その後、反応生成物を、好ましくはHPLCによって精製する。
ペプチドが、第２の保護基、たとえばフェニルアセチルで誘導体化されたアミノ基を依然として含んでいる場合には、こうした保護基は、最終工程で除去する。フェニルアセチル保護基は、たとえば、有機溶媒を含有する水溶液中で、固定化した、あるいは可溶性のペニシリンＧアミダーゼを用いて、室温で酵素的に除去することができる。
本発明の方法によって生成したペプチドが、分子内にジスルフィド架橋を含んでいる場合には、合成が終了し、なおかつ最後のアミノ酸のＮ末端のFmoc保護基の切断の前に、ペプチド配列の酸化を、たとえばヨウ素を溶解したヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン溶液を用いて固相上で行うことができ（Coberら,The Peptide,Academic Press,New York,1981,p145−147）、その後、Ｎ末端Fmoc保護基を切断する。
反応性のSH基は、たとえば、ペプチドのアミノ末端にシステイン残基を結合することによって導入することができる。
金属キレートのマーカー基の合成ペプチドへの導入は、（ａ）所望のペプチド配列を合成した後、そして好ましくは、ペプチドを固相から切り離す前、なおかつ、ペプチドの合成に使用したアミノ酸誘導体の反応性側基の保護基を切断する前に、活性化した発光性金属キレート、たとえば活性エステル誘導体を、ペプチドのＮ末端の一級アミノ基に結合することによって行うか、そして／または、（ｂ）ペプチドの合成中に、たとえばε−誘導体化リシンを用いて、発光性金属キレートのマーカー基に共有結合しておいたアミノ酸誘導体を導入することによって行う。
枝分かれマルチマー抗原の合成は、ジアミノカルボン酸、たとえば２つのFmoc基で保護されたリシンを使用することによって行うことができる。このペプチドは、たとえば、ペプチドを固相に結合したまま、Ｎ末端にビオチン誘導体を導入することによって、ビオチニル化することができる。
本発明の方法には、病原性微生物、たとえば、細菌、ウイルス、もしくは原生動物由来の、あるいは、自己免疫性抗原由来のペプチドエピトープあるいはポリペプチドエピトープを使用するのが好ましい。免疫学的に反応性のエピトープ領域は、ウイルス性抗原、たとえばHIV−Ｉ、HIV−II、HIVサブタイプＯ、あるいはＣ型肝炎ウイルス（HCV）のアミノ酸配列に由来するものが好ましい。
HIV−Ｉ、HIV−II、あるいはサブタイプＯのエピトープは、好ましくは、gp32、gp41、gp120、ならびにgp24の領域から選択する。HCVのエピトープは、好ましくは、Core/env領域、あるいは非構造タンパク質領域であるNS3、NS4、あるいはNS5から選択する。
HIV−Ｉ、HIV−II、あるいはHIVサブタイプＯのアミノ酸配列のエピトープ領域は、以下の一群のアミノ酸：
0003556228.tif 000002
あるいは、それらの部分配列であって、アミノ酸６個以上、好ましくはアミノ酸８個以上の配列から選択するのが特に好ましい。
アミノ酸配列Ｉ−IIIは、HIV−Ｉのgp120の領域に由来するものであり、アミノ酸配列IV−IXは、HIV−Ｉのgp41の領域に由来するものであり、アミノ酸配列Ｘは、HIV−IIのgp32の領域に由来するものである。アミノ酸配列Ｉ−Ｘは、配列表の配列番号１から配列番号10にも示してある。配列Ｖ、VIII、ならびにＸのそれぞれは、２つのシステイン残基を含んでおり、それらは、好ましくは、ジスルフィド架橋のかたちで存在している。
HCVのアミノ酸配列のエピトープ領域は、以下の一群のアミノ酸：
0003556228.tif 000003
あるいは、それらの部分配列であって、アミノ酸６個以上、好ましくはアミノ酸８個以上の配列から選択するのが特に好ましい。配列XIは、HCVのNS5の領域から、配列XII−XVIは、Core領域から、配列XIII、XIVおよびXVは、NS4の領域から、配列XVIIはNS3の領域に由来するものである。アミノ酸配列XI−XVIIは、配列表の配列番号11から配列番号17にも示してある。
本発明は、また、試料液中の特異的抗体を免疫学的に測定するための試薬にも関するものであり、この試薬は、反応性の相として、特定対象抗体に対する２種の抗原を含んでおり、このうち第１の抗原は、マーカー基を有しており、第２の抗原は、（ａ）固相に結合しているか、（ｂ）固相と結合可能な形態で存在している。この試薬は、上記２種の抗原のうち少なくとも一方が、測定対象抗体と反応するいくつかのエピトープ領域を含んでいることを特徴とするものである。
本発明の一実施態様では、この試薬は、エピトープ領域をいくつか有する第１の標識抗原を含むものである。この標識抗原は、少なくとも１つのハプテンのマーカー基と、このハプテンの受容体を有しており、この受容体は、さらに、シグナル発生基を有している。また、この試薬は、好ましくは、いくつかのエピトープ領域を有する第２の固相抗原を有しており、この抗原は、少なくとも一つのビオチン基と、ストレプトアビジンあるいはアビジンでコーティングした反応性の固相とを有している。
本発明のさらなる主題は、免疫学的に反応性のエピトープ領域をいくつか含むマルチマー抗原を、試料液中の特異的抗体を測定する免疫学的試験方法に使用することである。
こうした抗体は、微生物、たとえば細菌、ウイルス、あるいは原生動物による感染を示唆するものであるので、測定を行うのが好ましい。抗ウイルス抗体、たとえば、抗HIV抗体、あるいは抗肝炎ウイルス抗体は、測定を行うことが特に好ましい。試料液は、血清、特に、ヒト血清であるのが好適である。また、本発明のマルチマー抗原は、架橋試験方式の免疫学的方法で使用するのが好ましい。
この試験方法では、試料液を、第１抗原ならびに固相上に第２抗原と混合して、第１抗原、抗体、ならびに固相結合第２抗原の標識固定化複合体を得る工程を含むことが好ましい。抗体検出用の他の試験方式と比較すると、この架橋試験を用いた場合には、感度が向上し（すなわち、I gG、I gM、I gA、ならびにI gEといった免疫グロブリンクラスのすべてが認識される）、なおかつ、特異性も向上する（すなわち、非特異的な反応性が低減する）。二重抗原架橋試験の特異性ならびに感度は、第一工程で、試料液を第１ならびに第２の抗原と混合し、その後、１−４時間、特に好ましくは1.5−2.5時間を経てから、シグナル発生基を有する、第１抗原のハプテン標識に対する受容体を加える２工程の試験方法を用いると、さらに向上させることができる。
本発明は最後に、上に定義した式（I a）、（I b）および（II）によって表される新規な抗原にも関連する。
本発明を以下の実施例、配列プロトコールおよび図によってさらに説明する。
配列番号1:HIV  Ｉのgp120領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号2:HIV  Ｉのgp120領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号3:HIV  Ｉ、サブタイプＯのgp120領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号4:HIV  Ｉのgp41領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号5:HIV  Ｉのgp41領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号6:HIV  Ｉのgp41領域由来のさらに別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号7:HIV  Ｉ、サブタイプＯのgp41領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号8:HIV  Ｉ、サブタイプＯのgp41領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号9:HIV  Ｉ、サブタイプＯのgp41領域由来のさらに別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号10:HIV  IIのgp32領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号11:HCVのNS5領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号12:HCVのCore領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号13:HCVのNS4領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号14:HCVのNS4領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号15:HCVのNS4領域由来のさらに別のエピトープのアミノ酸配列を示す；
配列番号16:HCVのCore領域由来の別のエピトープのアミノ酸配列を示す；そして
配列番号17:HCVのNS3領域由来のエピトープのアミノ酸配列を示す；
図1:組換えHIV  p24抗原のアミノ酸配列を示す、
図2:モノマー性およびマルチマー性ルテニル化（ruthenylated）HIV−gp120抗原を用いた場合の、二重抗原架橋試験（double antigen bridge test）において測定されたシグナルの比較を示す、および
図3:モノマー性およびマルチマー性ビオチニル化HIV−gp41抗原を用いた場合の、二重抗原架橋試験において測定されたシグナルの比較を示す。
実施例１
ペプチドエピトープ領域の合成
ペプチドエピトープ領域を、バッチペプチドシンゼサイザー（例えばApplied Biosystems A431またはA433）を用いて、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）固相ペプチド合成により合成した。この合成のため、表１に示す各アミノ酸誘導体の4.0当量を用いた。
0003556228.tif 000004
ペプチド配列中にシステイン残基が存在する場合は、合成の完了直後に、ヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン中のヨウ素を用いて固相上で酸化が実施される。
アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解した。400〜500mgの４−（2',4'−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（Tetrahedron Letters 28（1987）,2107）上で、0.4〜0.7mmol/gのローディング（loading）で（JACS 95（1973）,1328）ペプチドを合成した。Fmoc−アミノ酸誘導体に対して４当量のジクロヘキシルカルボジイミドおよび４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中で結合反応を20分間実施した。各合成工程後20分以内にジメチルホルムアミド中の20％ピペリジンを用いてFmoc基を切り離した。
合成樹脂からのペプチドの解放および酸に不安定な保護基の切り離し（ただし、フェニルアセチル保護基を除く）は、20mlのトリフルオロ酢酸、0.5mlのエタンジチオール、1mlのチオアニソール、1.5gのフェノール、および1mlの水を用いて40分以内に室温で実施した。次に、反応溶液を300mlの冷却ジイソプロピルエーテルと混合し、40分間０℃に保ち、ペプチドを完全に沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで再度洗浄し、少量の50％酢酸に溶解して、凍結乾燥させた。得られた粗製物質を、delta−PAK RP C18材料（カラム50x300mm,100Å,15μ）を用いた分取HPLCにより、適切な勾配を用いて（溶離液A:水、0.1％トリフルオロ酢酸、溶離液B:アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸）約120分間精製した。溶出した物質が何であるかを、イオンスプレー質量分光測定によりチェックした。
ハプテン標識（例えば、ジゴキシゲニンまたはジゴキシン標識）は、適切な活性エステル誘導体、例えばジゴキシゲニン−３−カルボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannheim GmbH,Hannheim,GER）をペプチドの遊離アミノ基に結合させることにより溶液に導入した。誘導体化すべきペプチドを、DMSOと0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.5）の混合物に溶解した。次に、遊離一次アミノ官能基（free primary amino function）あたり２当量の、少量のDMSOに溶解した活性なエステルを一滴ずつ加え、室温で攪拌した。分析HPLCにより反応をモニターした。生成物を分取HPLCにより精製する。
リシン誘導体K1は、ハプテン標識化が起こらない位置に用いられた。リシン誘導体K2は、ハプテン標識化が起こる位置に用いられた。リシン誘導体K3は、スペーサー領域においてε−アミノ基をペプチドに結合させるために用いられた。
ペプチドがフェニルアセチルにより保護されているリシンをまだ含んでいる場合は、最後の工程において一部分有機溶媒を含む水性媒体中のペニシリンＧアミダーゼを用いて、この保護基を室温で酵素的に切り離した。酵素を濾過し、ペプチドを分取HPLCにより精製した。溶出した物質が何であるかを、イオンスプレー質量分光測定によりチェックした。
ルテニウムマーカー基を、ルテニウム（ビスピリジル）３−カルボン酸誘導体（BPRu−COOH）、例えばRu−（ビスピリジル）32+−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてＮ末端に、またはε−誘導体化リシン残基K4（Fmoc−Lys（BPRu）OH）を用いて配列中に導入した。
ビオチン標識を樹脂（ビオチン活性エステル）を用いた誘導体化によりＮ末端へ、またはルテニウム標識の導入と同様に、ビオチンにより適切にε−誘導体化されたリシンを用いて配列中へ導入した。
分枝マルチマーペプチドを、直鎖状ペプチドの合成と同様に合成した。この場合、低ローディング密度の樹脂（例えば、ローディングが0.2mmol/gのもの）を固相として選択した。ビスFmocにより保護されたジアミノカルボン酸（例えば、Fmoc−Lys（Fmoc）−OH等）を分枝化に用いた。
調製したペプチドを表２および３に示す。
表2a〜2dに示すペプチド化合物は、HIV IおよびHIV IIのgp120、gp41およびgp32領域より調製された。
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下記の表3a〜ｄに示すペプチドは、HCVのNS5領域、NS4領域、Core領域およびNS3領域から合成された。
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実施例２
ペプチドエピトープを有するキャリアー結合マルチマー抗原（ポリハプテン）の合成
反応性メルカプト官能基を用いて、例えば付加的システインを導入することにより、適切なペプチドを合成した（表2aおよび2b参照）。このプロセスにおいて、所謂リンカーを用いてペプチドをＮ末端、Ｃ末端または配列中の所望の位置で修飾することが可能である。対応するペプチドを実施例１に記述するように合成した。
ポリハプテンを形成する反応のため、NH2基を含むキャリアーをまずマーカー基の適切な活性エステルでロードし、次に、好ましくはマレインイミドヘキシル−（MHS）またはマレインイミドプロピル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MPS）を用いて処理することにより、マレインイミドアルキル基でロードした。これにより、キャリアー中の一次アミノ基（例えば、リシン残基のε−アミノ側鎖）は部分的に標識され、他の部分はマレインイミド基に変換された。
キャリアーは好ましくは0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH7.0−8.5）中で活性エステルと２〜４時間室温で５〜20mg/mlの濃度を用いて反応させた。低分子量成分を透析またはゲルクロマトグラフィー（AcA 202−Gel、溶離液0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液pH7−8.5）により分離した。
次の工程において、ペプチドまたはペプチド混合物を６時間以内に室温で、反応性メルカプト官能基を用いて、0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液pH8.5中で、MHS−修飾標識化キャリアー上に結合させた。未反応ペプチドを透析またはゲルクロマトグラフィーにより分離した。
標識を直接ペプチド上に位置させる場合は、ポリハプテンを同様の方法で合成し、適切に標識したSH−活性化ペプチドを用いた。
ウサギI gG、ウシ血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ、アミノ−デキストランおよびウシFab抗体断片をキャリアーとして用いた。キャリアーへのペプチド配列のローディングは、モル基準1:2から1:20であった。キャリアーへのマーカー基のローディングは、モル基準で1:1から1:20であった。
実施例３
ポリ−p24−BSA−BPRuを例とする、ポリペプチドエピトープを含むキャリアー結合マルチマー抗原（ポリハプテン）の合成
1.原理
ウシ血清アルブミン（BSA）を以下に記載の順序でルテニウム−（ビス−ピリジル）32+−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BPRu）およびマレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MHS）と反応させ、いずれの場合も透析して遊離の非結合誘導体化試薬を分離した。
図１に示すアミノ酸配列を有する大腸菌由来の組換えp24抗原（GhrayebおよびChang,DNA5（1986）,93−99）を、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（SATP）と反応させ、アミノ基を介してチオール残基を導入し、そして透析して遊離の非結合SATPを分離した。
活性化p24抗原中のSH基を放出させた後、それをBSA−BPRuのマレインイミド官能基と結合させた。過剰な官能結合基をシステインおよびＮ−メチルマレインイミドを用いて捕獲し、このようにして反応を終了させた。
次に、Sephacryl S 200を用いたクロマトグラフィーにより反応混合物から生成物を分離した。
2.1  BSA（MH）−BPRuの合成
５倍モル過剰のBPRU試薬（DMSO中、mlあたりBPRUを47mg含有するBPRUストック溶液0.4ml）を、PBS緩衝液pH8.0中でタンパク質濃度20mg/mlで250mgのBSAに加えた。
添加後、混合物をさらに75分間25℃で攪拌した。次に、リシンを最終濃度10mmol/lまで添加することにより反応を停止させ、さらに30分間25℃で攪拌した。
ヨードアセトアミドを最終濃度10mmol/lまで添加することにより、存在するBSAのSH基を誘導体化した。この目的のため、混合物をさらに45分間25℃で、pH8.0で攪拌した。
遊離の非結合誘導体化試薬を、＞500倍容量のPBS緩衝液pH7.5（50mmol/lリン酸ナトリウム,150mmol/l NaCl,pH7.5）を外液とする透析（20時間、４℃）により完全に分離した。
BPRUの取り込みはBSA1モルあたり4.7モルであった。収量はBSA−BPRU 220mg（89％）であった。
次に、25倍モル過剰のMHS試薬（DMSO中、mlあたりMHSを50mg含有するMHSストック溶液0.5ml）を、PBS緩衝液pH7.1中でタンパク質濃度20mg/mlで220mgのBSA−BPRUに加え、さらに60分間25℃で攪拌した。
リシンを最終濃度10mmol/lまで添加することにより反応を停止させ、さらに30分間25℃で攪拌した。
遊離の非結合MHS試薬を、＞500倍容量のPBS緩衝液pH7.5を外液とする透析（20時間、４℃）により完全に分離した。収量:BSA（MG）−BPRU210mg（84％）。
2.2  p24抗原（SATP）の合成
３倍モル過剰のSATP試薬（DMSO中、mlあたりSATPを35mg含有するSATPストック溶液0.06ml）を、0.1Mリン酸ナトリウム、0.1％（w/v）SDS、pH7.1中でタンパク質濃度10mg/mlで100mgのp24抗原に加え、さらに60分間25℃で攪拌した。
次に、リシンを最終濃度10mmol/lまで添加することにより反応を停止させ、さらに30分間25℃で攪拌した。
次に、遊離の非結合SATP試薬を、＞500倍容量の0.1mol/lリン酸ナトリウム、0.1％（w/v）SDS、pH6.5を外液とする透析（20時間、室温）により完全に分離した。
収量:p24抗原（SATP）95mg（95％）。
2.3  ポリ−p24−抗原BSA−BPRUの合成
ヒドロキシルアミン（1mol/l;Merck）を最終濃度30mmol/lまで、0.1mol/lリン酸ナトリウム、0.1％（w/v）SDS、pH6.5中でタンパク質濃度10mg/mlでp24抗原（SATP）95mgに加えた。
18mgのBSA（MH）−BPRUを加え、混合物をさらに60分間、タンパク質濃度9mg/ml（pH7.1;25℃）で攪拌した。反応を停止させるため、システインを最終濃度2mmol/lまで加え、さらに30分間、pH7.1で攪拌した。次にＮ−メチルマレイミド（Sigma）を最終濃度5mmol/lまで加え、さらに30分間、pH7.1で25℃で攪拌した。
このようにして反応を停止させた混合物を、＞500倍容量の0.1mol/lリン酸ナトリウム、0.1％（w/v）SDS、pH6.5を外液として18時間室温（RT）で透析し、そしてSephacryl S 200カラムに通して精製した。カラム操作の最も重要な一般的条件は、カラム容量340ml、適用容量12ml、流速13.0cm/時間、移動緩衝液0.1mol/lリン酸ナトリウム、0.1％（w/v）SDS、pH6.5、操作温度：室温である。
カラム操作をフロースルー（flow−through）光度計により波長280nmでモニターし、画分を回収した（画分サイズはカラム容量の約0.5％）。
UV記録後、高分子溶出プロフィールの画分を集めてプールし、生成物をYM30membrane（Amicon）を備えたAmicon stirred cell中でタンパク質濃度10mg/mlまで濃縮し、−80℃で凍結した。
取り込み:p24抗原−BSA−BPRU  １モルあたりp24抗原５モル。収量:19mg。
実施例４
マルチマー抗原を用いることによる架橋試験方法の感受性改善
ａ）キャリアー結合マルチマー抗原（ポリハプテン）
二重抗原イムノアッセイにおいて、ビオチニル化ポリハプテンの種々の変形を、モノマー性ジゴキシゲニル化ハプテンと組み合わせて、すなわち同一モル量のビオチニル化またはジゴキシゲニル化ハプテンと組み合わせて使用した。HIVのgp120領域由来のアミノ酸配列NNTRKSISIGPGRAFYTをエピトープとして用いた。実施例１および２に記述するようにハプテンを合成した。天然の抗HIV血清の種々のビオチニル化ポリハプテンに対する相対的反応性を、対応するビオチニル化モノマー性ハプテンに対する血清の反応性（＝反応性100％）に対して標準化した。
この実験の結果を表４に示す。
0003556228.tif 000013
ｂ）マルチマー性分枝抗原
モノマー性またはマルチマー性分枝エピトープを有するビオチニル化およびルテニル化抗原を、架橋試験方法を用いて二重抗原イムノアッセイで比較した。
HCVのNS4領域由来のエピトープ（配列SRGNHVSPTHYVPESDAA）の場合は、モノマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせを、マルチマー性分枝ビオチニル化抗原（表3d、２行目参照）とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせを架橋試験において比較した。シグナル差異（differentiation）、すなわち陽性サンプルと陰性サンプルの間の測定されたシグナルの比を測定した。より高いシグナル差異は、より良い感受性を意味する。モノマー抗原２つを組み合わせた場合はシグナル差異は208に過ぎなかったのに較べ、マルチマー性ビオチニル化抗原を用いた場合、シグナル差異386が得られた。
HIVのgp120領域由来の抗原配列を用いて、二重抗原架橋試験を同様に実施した。用いたエピトープはアミノ酸配列NTTRSISIGPGRAFYを有する。モノマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせを、マルチマー性分枝ビオチニル化抗原（表2d、２行目参照）とマルチマー性ルテニル化抗原（表2d、４行目参照）の組み合わせを比較した。２個のマルチマー抗原の組み合わせを用いた試験の場合は、陽性および陰性サンプルの間のシグナル差異は12であった。対照的に、２個のモノマー抗原を組み合わせた場合は、シグナル差異は10に過ぎない。
実施例５
マルチマー性キャリアー結合抗原を用いることによる架橋試験方法の感受性改善
モノマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせを、モノマー性ビオチニル化抗原とキャリアー結合マルチマー性ルテニル化抗原（キャリアー分子：ウシ血清アルブミン；エピトープ:HIV−p24抗原；実施例３に記述するように調製）の組み合わせ、およびキャリアー結合マルチマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせと共に架橋試験において調べた。２つの異なる陽性サンプル（HIV血清）において、２個のモノマー抗原の組み合わせについてはそれぞれの場合において陽性／陰性シグナル差異は２であったが、モノマー性ビオチニル化抗原とマルチマー性ルテニル化抗原の組み合わせは19および７という差異をもたらし、またマルチマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせは４および３という差異をもたらした。
モノマー性ビオチニル化抗原と別のマルチマー性ルテニル化抗原（キャリアー分子：ウサギ免疫グロブリン）の組み合わせを用いた場合においても、３つの異なる陽性サンプルにおいて、モノマー抗原のみを組み合わせた場合のシグナル差異２、９および８に較べ、陽性／陰性のはるかに大きいシグナル差異３、22および10が見いだされた。
別のエピトープ（HIV−gp41領域由来の組換えタンパク質）を用いた場合においても、モノマー抗原に較べマルチマー抗原の優越性を立証することが可能であった。モノマー性ビオチニル化およびジゴキシゲニル化抗原を組み合わせた場合は、架橋試験において陰性と陽性の間で何ら差異が見いだされなかったのに対し、マルチマーポリハプテンの組み合わせは非常に良好な差異を示した。
実施例６
マルチマー抗原を用いることによる架橋試験方法の感受性改善
固定化モノマー抗原と標識化マルチマー抗原の組み合わせは、特定の免疫グロブリンの広い濃度範囲にわたって最大の感受性を達成する上で特に好ましい。使用される好ましい量は、0.2〜10、特に0.2〜８当量の標識化エピトープに対し、１当量の固定化エピトープである。
図２は、エピトープ比が1:1（曲線１）であるモノマー性ビオチニル化抗原とモノマー性ルテニル化抗原の組み合わせと、エピトープ比が1:2（曲線２）および1:4（曲線３）であるモノマー性ビオチニル化抗原とマルチマー性ルテニル化キャリアー結合抗原の組み合わせの比較を示す。
実施例4aに記載の、HIVのgp120領域由来の配列をエピトープとして用いた。マルチマー抗原のキャリアー分子はBSAであった。キャリアーへのエピトープ基のローディングは、BPRu基を用いて、それぞれモル基準で、5:1および3:1であった。
図２より、マルチマー抗原の使用はフック効果（Hook effect）の減少をもたらし、そして感受性の全般的増加をもたらすことが明らかである。
実施例７
マルチマー抗原を用いた場合にマーカー基の数を増やすことによる架橋試験方法の感受性改善
エピトープ領域をマスキングすることなく、または疎水性を増大させることによって非特異的バックグラウンド値を増大させることなく、マーカーおよび固相結合基の数を大幅に増やすことが可能であるという事実により、試験感受性のさらなる改善が達成される。
ウシFab抗体断片キャリアーに結合した、HIVのgp120領域由来のエピトープ（実施例4b参照）を含むジゴキシゲニル化マルチマー抗原を比較した。それぞれの場合において、モル基準で1:6から1:7の範囲でキャリアーをペプチドエピトープでローディングした。キャリアーへのジゴキシゲニン基のローディングは、1:2および1:4であった。
この実験の結果を表５に示す。マーカー基の数を増やすことにより、感受性の非直線的改善およびフック効果のかなりの減少が達成された。
0003556228.tif 000014
実施例８
マルチマー抗原を用いることによる安全性の改善
モノマーおよびマルチマー抗原の安定性を試験した。この目的のため、最初のシグナル強度に対する、35℃で３日間インキュベートした後のシグナル回復（recovery）を測定した。
HIVのgp120領域由来のモノマー性ルテニル化抗原（配列は実施例４参照）を新鮮なビオチニル化モノマー抗原と組み合わせた場合、２つのサンプルに関して、3.0および4.0％というシグナル回復が測定された。キャリアー結合マルチマー性ルテニル化抗原（キャリアー：ウサギI gG、キャリアー分子１個あたり４個のマーカー基および３個のエピトープ）を用いた場合、同一の試験条件下で73.1および73.6％というシグナル回復が測定された。
同一のエピトープ配列を有するビオチニル化モノマー抗原を同様の方法でキャリアー結合ビオチニル化マルチマー抗原（キャリアー：ウサギI gG、キャリアー分子１個あたり18のビオチン基および３個のエピトープ）と共に、モノマー性ルテニル化抗原と組み合わせて試験した。モノマー性ビオチニル化抗原について25.0および37.0％のシグナル回復が測定され、またマルチマー抗原については120.3および79.9％のシグナル回復が測定された。
実施例９
低親和性の抗原との反応性に関する感受性改善
例えば、最近のセロコンバージョンの場合および新規なウイルスサブタイプの場合のように、低親和性の特定の免疫グロブリンを検出するためには、好ましくはマルチマー抗原が用いられる。
ａ）ルテニル化マルチマー抗原
HCVのNS4/3領域由来のエピトープ配列を有する抗原を用いて、陽性／陰性シグナル差異を試験した。モノマー性ルテニル化抗原とモノマー性ビオチニル化抗原の組み合わせは、２個の異なる陽性セロコンバージョンサンプルにおいて、陽性／陰性シグナル差異３および１をもたらした。すなわち、陽性サンプルは陽性と認識されなかった。マルチマー性I gGキャリアー結合ビオチニル化およびルテニル化抗原を用いると、各場合についてシグナル差異21が測定された。マルチマー抗原の使用のみが、陽性サンプルが正しく分類されることを可能とする。
ｂ）ビオチニル化マルチマー抗原
HIVのgp41領域由来の同一のペプチドエピトープ（gp41/3）を、キャリアー結合マルチマー抗原として、およびモノマー抗原として、各場合を比較した。それぞれの場合について、50ng/mlのビオチニル化およびジゴキシゲニル化モノマーペプチドを用いた。マルチマー抗原の場合、ポリハプテンのローディングの度合からペプチドの量を計算した、50ng/mlの「ペプチド等価物」を用いた。試験はES700自動アナライザーを用いて実施した。
試験は、サンプルとして種々のセロコンバージョン標本（panel）を用いて実施した。図３は、ジゴキシゲニル化ポリハプテンを用いた試験において標本が正しく陽性として分類されたことを示す。他方、モノマー抗原を用いた場合は、誤った陰性の結果が得られた。カットオフ指数（cut−off index）は、実験における陰性と陽性の評価の境界である。これは陰性対照の２倍の数値と定義される。
配列表
（２）配列番号:1:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:17アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp120
（xi）配列：配列番号:1
0003556228.tif 000015
（２）配列番号:2:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:16アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp120
（xi）配列：配列番号:2
0003556228.tif 000016
（２）配列番号:3:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:19アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（Ｂ）株名：サブタイプ０
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp120
（xi）配列：配列番号:3
0003556228.tif 000017
（２）配列番号:4:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:24アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:4
0003556228.tif 000018
（２）配列番号:5:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:23アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:5
0003556228.tif 000019
（２）配列番号:6:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:15アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:6
0003556228.tif 000020
（２）配列番号:7:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:15アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（Ｂ）株名：サブタイプ０
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:7
0003556228.tif 000021
（２）配列番号:8:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:15アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（Ｂ）株名：サブタイプ０
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:8
0003556228.tif 000022
（２）配列番号:9:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:19アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型
（Ｂ）株名：サブタイプ０
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp41
（xi）配列：配列番号:9
0003556228.tif 000023
（２）配列番号:10:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:27アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ヒト免疫不全ウイルス２型
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:gp32
（xi）配列：配列番号:10
0003556228.tif 000024
（２）配列番号:11:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:15アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:NS5
（xi）配列：配列番号:11
0003556228.tif 000025
（２）配列番号:12:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:16アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名：コア
（xi）配列：配列番号:12
0003556228.tif 000026
（２）配列番号:13:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:12アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:NS4
（xi）配列：配列番号:13
0003556228.tif 000027
（２）配列番号:14:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:9アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:NS4
（xi）配列：配列番号:14
0003556228.tif 000028
（２）配列番号:15:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:18アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:NS4
（xi）配列：配列番号:15
0003556228.tif 000029
（２）配列番号:16:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:28アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名：コア
（xi）配列：配列番号:16
配列番号16の配列を入れる
0003556228.tif 000030
（２）配列番号:17:
（ｉ）配列の特色
（Ａ）配列の長さ:25アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル配列:No
（vi）起源：
（Ａ）生物名:C型肝炎ウイルス
（viii）ゲノム内での位置：
（Ａ）染色体／セグメント名:NS3
（xi）配列：配列番号:17
0003556228.tif 000031
【図１】
0003556228.tif 000032
【図２】
0003556228.tif 000033
【図３】
0003556228.tif 000034