(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦアクチベーター）と肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（ＨＡＩ−１）又は肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２（ＨＡＩ−２）とで形成された複合体を、抗肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１抗体（抗ＨＡＩ−１抗体）又は抗肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２抗体（抗ＨＡＩ−２抗体）と、抗肝細胞増殖因子活性化因子抗体（抗ＨＧＦアクチベーター抗体）を用いて、イムノアッセイにより検出することにより該複合体を形成している肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（ＨＡＩ−１）又は肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２（ＨＡＩ−２）を個別に定量することを特徴とする肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子複合体の測定方法。
【請求項２】
イムノアッセイが、酵素標識イムノアッセイである請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
イムノアッセイが、蛍光標識イムノアッセイである請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイである請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
イムノアッセイが、発光標識イムノアッセイである請求項１に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２種類の肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子（以下HAI-1またはHAI-2と記載する）と肝細胞増殖因子活性化因子との複合体を各因子特異的に測定できることを特徴とするアッセイ方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
肝細胞増殖因子活性化因子（特開平５−１０３６７０、同６−１４１８５９、同６−１５３９４６、および同６−１５３９６６各号公報参照；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を一本鎖から二本鎖へ変換する活性を有する因子；以下、ＨＧＦアクチベーターもしくはＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒと記載する）に対して阻害活性を持つ因子は２種類同定されており（ＨＡＩ−１及びＨＡＩ−２）、これら両因子は同じ細胞株によって産生されることが報告されている（特開平９−９５４９７号、特開平９−９５４９８号）。従って、従来のＨＧＦ前駆体とＨＧＦアクチベーター並びにサンプルを用いたＨＧＦ切断活性阻害の測定方法において溶液中の阻害活性を測定した場合、その活性がどちらの阻害因子に起因するのかは明らかにはできなかった。また、未知の阻害因子が存在した場合にもこれら全体の阻害活性を測定することになり、個々の阻害因子の阻害活性値を得ることは不可能であった。さらに、たとえば阻害因子に対する抗体だけを用いて酵素標識イムノアッセイ（ＥＩＡ）やドットアッセイなどで単に物理的量を測定した場合の値は、分解や修飾を受けた阻害因子が存在した場合には、その阻害活性を反映しないことになる。
【０００３】
そこで本発明は、ＨＧＦアクチベーターと各阻害因子の複合体を個別に定量化できる測定方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、ＨＧＦアクチベーターとその酵素活性を阻害しない抗ＨＧＦアクチベーター抗体、及び阻害因子（HAI-1、HAI-2）とその阻害活性を阻害しない各HAIに対する抗HAI-1抗体または抗HAI-2抗体を用いることで、ＨＧＦアクチベーターと各阻害因子の複合体を個別に定量化できることを見いだした。
【０００５】
すなわち本発明は、肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦアクチベーター）と肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（ＨＡＩ−１）又は肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２（ＨＡＩ−２）とで形成された複合体を、抗肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１抗体（抗ＨＡＩ−１抗体）又は抗肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２抗体（抗ＨＡＩ−２抗体）と、抗肝細胞増殖因子活性化因子抗体（抗ＨＧＦアクチベーター抗体）を用いて、イムノアッセイにより検出することにより該複合体を形成している肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（ＨＡＩ−１）又は肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−２（ＨＡＩ−２）を個別に定量することを特徴とする肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子複合体の測定方法である。
【０００７】
また、本発明の好ましい態様によれば、イムノアッセイが酵素標識イムノアッセイである該測定方法；イムノアッセイが蛍光標識イムノアッセイである該測定方法；イムノアッセイがラジオイムノアッセイである該測定方法；イムノアッセイが発光標識イムノアッセイである該測定方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳細に説明する。本発明の肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子複合体の測定方法は、アッセイ容器中で肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子（HAI-1、HAI-2）と該阻害因子に特異的な肝細胞増殖因子活性化因子とで形成された複合体を、それらを各々の抗体でイムノアッセイにより検出するものである。この方法において、測定サンプル中の各阻害因子特異的活性を定量することが可能となる。
【０００９】
本発明に使用される標準品としてのHAI-1（HAI-I）は種々の細胞株の培養上清や遺伝子工学的手法やペプチド合成によって調製することができる。例えば、特開平９−９５４９７号公報に記載の、後記配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３７５番目のシステインから４２５番目のシステインを保持した形でバクテリア、酵母や動物細胞等に遺伝子組換え技術によって発現生産させることが可能である。また、特開平９−９５４９７号公報に記載の、後記配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、ＨＧＦアクチベーター阻害活性を担う第一Kunitzドメインである２５０番目のシステインから３００番目のシステイン部分を含む形で一部欠如させたHAI-1改変体なども用いることができる。このようにして発現されたHAI-1は、各種クロマトグラフィー、疎水性、ハイドロキシアパタイト、陰イオン交換、ターゲットプロテアーゼや抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供し得ることができる。必要に応じて、逆相カラムクロマトグラフィー等を精製ステップに組み込むこともできる。同様にHAI-2（HAI-II）も特開平９−９５４９８号に記載の方法等により調製可能である。
【００１０】
ＨＧＦアクチベーターは既に公表ずみの方法で組換え体としてまた天然物として得ることができる。前駆体として得られる場合はトロンビン処理することで活性型として得ることができる。
【００１２】
抗ＨＧＦアクチベーター抗体は、ＨＧＦアクチベーターまたはその断片を動物に免疫することでモノクローナル抗体やポリクローナル抗体として得ることができる。同様に各抗阻害因子抗体は、各阻害因子またはその断片を動物に免疫することでモノクローナル抗体やポリクローナル抗体として得ることができる。イムノアッセイとしては、例えば蛍光標識イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素標識イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、発光イムノアッセイ等が用いられる。この際に使用される標識の種類としては特に限定されないが、蛍光標識としては例えば、FIFC(Fluorecein Isothio cyanate)、AMCA(7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid)、Oregon Green 488、Texas Red、Bodipy、Umbelliferone、Lanthanide chelates等が挙げられる。酵素標識としては例えば、Lysozyme、Malate dehydrogenase、Peroxidase、Gulucose oxidase、Alkaline phosphatase、β-Galactosidase、Horseradish peroxidase等が挙げられる。ラジオイムノアッセイのラジオアイソトープとしては例えば、3H、14C、57Co、75Se、125I、131I等が挙げられる。発光標識としては例えばLuminol、Isoluminol、Pyrogallol、Protohaemin、ABEI(Aminobutylethyl-n-isoluminol)、AHEI(Aminohexylethyl-n-ethyl-isoluminol)、Acridinium esters、ATP(Adenosine triphosphate)、NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide)、Luciferase、Oxidoreductases等が挙げられる。磁気標識としては例えば、ビオチン磁気、ストレプトアビジン磁気等が挙げられる。
【００１３】
阻害因子の測定方法は大きく分けて次の二つの方法で行うことができる。例えば、一つは抗HGF activator抗体をアッセイプレートに吸着させ、非特異的吸着を防ぐ処理を行った後、HGF activatorをプレートに添加し抗体と反応させる。次に抗体に結合した状態のHGF activatorとサンプルを反応させ肝細胞増殖因子活性化因子・肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子複合体を形成させる。最後に酵素標識された抗阻害因子抗体を添加し、複合体に反応させる。場合によっては、ＡＢＣ法などの発色増幅などを行い感度を上げることも可能である。これら酵素による基質の発色を標準品での発色と比較することで、各サンプルの阻害活性を定量することが可能となる。もう一つの方法は、まず最初に阻害因子の抗体をプレートに結合させ、非特異的吸着処理後、サンプルをその抗体と反応させる。その後、HGF activatorを添加し、プレートに結合した阻害因子と複合体を形成させる。最後に、抗HGF activator抗体でその複合体を検出して、サンプル中の各肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子複合体を個別に定量できる。
【００１４】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はその趣旨を越えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１  精製ＨＡＩ−１の測定１
バッファーＡ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％  ｇｅｌａｔｉｎ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）バッファー）と洗浄液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）バッファー）を調製する。
【００１５】
EIA用96ウェル・アッセイフ゜レートに抗HGF activator抗体（A23抗体）を10μg/ml濃度で50μl/wellで添加。37℃で数時間インキュヘ゛ーション後、洗浄液でフ゜レートを洗浄し、ハ゛ッファーＡをウェル一杯に添加した。４℃で一昼夜静置後、再度洗浄液で洗浄後、ハ゛ッファーＡに溶解した200ng/ml濃度の34kDa活性型HGF activatorを50μl/well添加し４℃で一昼夜静置した。洗浄液でフ゜レートを洗浄後、ハ゛ッファーＡで精製標準品のHAI-1を100ng/mlから数ng/mlに調製後、50μl/wellを添加し、再度４℃で一昼夜静置した。フ゜レートを洗浄液で洗浄後、ビオチン標識抗HAI-1抗体（C76-18抗体）をハ゛ッファーＡで至適濃度に希釈し50μl/well添加後、３７度で２時間反応させた。再度洗浄ハ゛ッファーで洗浄し、ABCキット（Vectastain Elite ABC kit）の増幅試薬を添加して室温にて１時間反応させた後、Ｏーフェニレンジアミン発色溶液を添加し発色させた。結果を図１に示す。HAI-1濃度依存的な発色が認められた。
実施例２ 培養上清中のHAI-1の測定培養上清の調製は以下のようにして行った。HLC-1細胞（ヒト肺癌細胞株；Gann (1976) 67, 483-492 Akagi T & Kimoto T）、MKN45（ヒト胃癌細胞株；財団法人がん研究振興財団(Japanese Cancer Reserch Resources Bank)に登録番号JCRB0254として登録、免疫生物研究所から入手）を6 well培養プレートに５％血清含培地で播種した。コンフルエント後培地で洗浄し、再度無血清培地を添加し37度で培養を継続した。数時間後培養上清を回収し、フィルター濾過により細胞除去後、その培養上清中の阻害活性を測定した。
【００１６】
ＥＩＡ用９６ウェル・アッセイプレートに抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体（Ａ２３抗体）を１０μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加。３７℃で数時間インキュベーション後、洗浄液でプレートを洗浄し、バッファーＡをウェル一杯に添加した。４℃で一昼夜静置後、再度洗浄液で洗浄後、バッファーＡに溶解した１μｇ／ｍｌ濃度の活性型ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒを５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し４℃で一昼夜静置した。洗浄液でプレートを洗浄後、バッファーＡで精製サンプル標準品としてを１００ｎｇ／ｍｌから数ｎｇ／ｍｌに調製後、５０μｌ／ｗｅｌｌを添加、または培養上清を１／２ずつ希釈系列をつくり５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、再度４℃で一昼夜静置した。プレートを洗浄液で洗浄後、ビオチン標識抗ＨＡＩ−１抗体（Ｃ７６−１８抗体）をバッファーＡで至適濃度に希釈し５０μｌ／ｗｅｌｌ添加後、３７度で２時間反応させた。再度洗浄バッファーで洗浄し、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ）の増幅試薬を添加して室温にて１時間反応させた後、Ｏーフェニレンジアミン発色溶液を添加し発色させた。各培養上清中のＨＡＩ−１の活性値は標準品の発色との比較により、標準品換算でｎｇ／ｍｌとして表した。その結果図２に示すとおり、培養液中のＨＡＩ−１の活性が測定された。
実施例３  精製ＨＡＩ−１の測定２
ＥＩＡ用９６ウェル・アッセイプレートに抗ＨＡＩ−１抗体（Ｃ７６−１８抗体）を１０μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加。３７℃で数時間インキュベーション後、洗浄液でプレートを洗浄し、バッファーＡをウェル一杯に添加した。洗浄液でプレートを洗浄後、バッファーＡで精製標準品のＨＡＩ−１を５０ｎｇ／ｍｌから１／２希釈系列で数ｎｇ／ｍｌに調製後、５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、４℃で一昼夜静置した。再度洗浄液で洗浄後、バッファーＡに溶解した５００ｎｇ／ｍｌ濃度の３４ｋＤａ活性型ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒを５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し再度４℃で一昼夜静置した。プレートを洗浄液で洗浄後、ホースラディッシュ標識抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体（Ａ２３抗体）をバッファーＡで至適濃度に希釈し５０μｌ／ｗｅｌｌ添加後、室温で１時間反応させた。再度洗浄バッファーで洗浄し、Ｏーフェニレンジアミン発色溶液を添加し発色させた。結果を図３に示す。この系においてもＨＡＩ−１濃度依存的な発色が認められた。
実施例４  ＨＡＩ−２の測定
ＨＡＩ−２遺伝子のトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を調製した。その組換えＣＨＯ細胞５％ＦＢＳを含む培地を用いてをＴ２５フラスコに播種した。コンフルエント後、その培養上清を回収し、フィルターで細胞を除去後、アッセイに供した。
【００１７】
ＥＩＡ用９６ウェル・アッセイプレートに抗ＨＡＩ−２抗体（２Ｎ１２抗体）を１０μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加。３７℃で数時間インキュベーション後、洗浄液でプレートを洗浄し、バッファーＡをウェル一杯に添加した。洗浄液でプレートを洗浄後、バッファーＡで組換えＨＡＩ−２を含む培養上清中を１／２希釈系列で調製後、各ウェルに５０μｌ／ｗｅｌｌを添加し、４℃で一昼夜静置した。再度洗浄液で洗浄後、バッファーＡに溶解した５００ｎｇ／ｍｌ濃度の３４ｋＤａ活性型ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒを５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し再度４℃で一昼夜静置した。プレートを洗浄液で洗浄後、ホースラディッシュ標識抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体（Ａ２３抗体）をバッファーＡで至適濃度に希釈し５０μｌ／ｗｅｌｌ添加後、室温で１時間反応させた。再度洗浄バッファーで洗浄し、Ｏーフェニレンジアミン発色溶液を添加し発色させた。結果を図４に示す。この系においてもＨＡＩ−２濃度に比例する培地希釈依存的な発色が認められた。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、肝細胞増殖因子活性化因子と肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子の複合体のうち、HAI-1複合体とHAI-2複合体を測り分けることができるので、より詳細にＨＧＦやＨＧＦアクチベーター並びに各阻害因子の機能解析を行うことができるようになり、さらにはこれら因子が関わる疾病等の診断にも応用可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本願アッセイ系の一次抗体を抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体、二次抗体を酵素標識抗ＨＡＩ−１抗体を用いて精製ＨＡＩ−１の検量線を求めたものである。
【図２】本願アッセイ系の一次抗体を抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体、二次抗体を酵素標識抗ＨＡＩ−１抗体を用いて培養上清中のＨＡＩ−１の活性を定量したものである。
【図３】本願アッセイ系の一次抗体を抗ＨＡＩ−１抗体、二次抗体を酵素標識抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体を用いて精製ＨＡＩ−１の検量線を求めたものである。
【図４】本願アッセイ系の一次抗体を抗ＨＡＩ−２抗体、二次抗体を酵素標識抗ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ抗体を用いて精製ＨＡＩ−２の検量線を求めたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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