(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はこれらの類似体の電気化学的再生に適した電極であって、置換又は非置換の９Ｈ−アクリジン−２−オン類からなる群より選択される、１種又はそれ以上の媒介化合物を含ませることによって、電極表面に媒介作用を与えることを特徴とする電極であって、
媒介化合物が式：
【化１】
0003585552.tif 000012
（式中、Ｘは式：
【化２】
0003585552.tif 000013
（式中、Ｒ’及びＲ”は、炭素数１〜６の低級アルキルである）の基又は式：
【化３】
0003585552.tif 000014
の基（式中、Ｒ’は前記の通りである）であり、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して水素又は別の１価の置換基であり、そしてＱは（→Ｏ）n（ここで、ｎは０又は１である）である）で示されることを特徴とする、電極。
【請求項２】
Ｙ及びＺが、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ、ニトロ、置換アミノ、ケト、カルボキシ、アルコキシカルボニル又はアミドである請求項１記載の電極。
【請求項３】
１種又はそれ以上の酵素が電極表面に存在する請求項１記載の電極。
【請求項４】
酵素が脱水素酵素である請求項３記載の電極。
【請求項５】
電極材が、グラファイト、熱分解カーボン、ガラス質カーボン、プラチナ又は金からなる請求項１記載の電極。
【請求項６】
媒介化合物が、７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オンである請求項１記載の電極。
【請求項７】
触媒として脱水素酵素及びエネルギー移動性酸化還元対として補酵素を用いて作働する生化学的燃料電池の性能を改善する方法であって、該燃料電池において陽極として請求項１記載の電極を使用することからなる方法。
【請求項８】
媒介化合物が、式：
【化４】
0003585552.tif 000015
（式中、Ｘは式：
【化５】
0003585552.tif 000016
（式中、Ｒ’及びＲ”は、炭素数１〜６の低級アルキルである）の基又は式：
【化６】
の基（式中、Ｒ’は前記の通りである）であり、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して水素又は別の１価の置換基であり、そしてＱは（→Ｏ）n（ここで、ｎは０又は１である）である）で示される請求項７記載の方法。
【請求項９】
電極材が、グラファイト、熱分解カーボン、ガラス質カーボン、プラチナ又は金からなり、媒介化合物が７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オンである請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
酵素の選択性と電流測定による検出の感度とを組み合わせた分析法は、診断に関する業界にとっては、興味深い方法である。ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）の還元は、これらが脱水素酵素によって触媒される反応において産生されるため、特に重要である。以下の式：
【０００２】
【化７】
0003585552.tif 000002
【０００３】
に基づき脱水素酵素によって触媒される反応は、生物細胞及び分析反応において、重要な役割を果たしている。様々の基質の生成物への変換を選択的に触媒する数百もの異なる脱水素酵素が知られている。基質が酸化されると、補酵素であるＮＡＤ＋  及びＮＡＤＰ＋  が還元されてそれぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨとなる。これらの補酵素は、酵素と作用してエネルギー移動性酸化還元対を形成することができるため、この反応において必須な要素である。
【０００４】
補酵素ＮＡＤ＋  及びＮＡＤＰ＋  は、高価な化学物質であり、もし、低価格で使い捨て可能な分析具において経済的に使用するのであれば、これらを再酸化により元の状態に再生することが必要である。ＮＡＤＨは、様々なベースとなる電極物質において、１ボルトのオーダーの高過電圧によってのみ、直接酸化される。しかしこの過電圧は、ＮＡＤＨから電極への電子移動を媒介する機能を有する物質を電極表面において固定化することによって低下させることができる。このような媒介物質は、過剰な過電圧なしに電気化学的に再酸化される、電気化学的再生のための補助的システムとして有用である物質から典型的には選択される。本目的に適した様々な媒介化合物が公知である。米国特許４，４９０，４６４号においては、背景技術としてフェナジン−メトサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジン−エトサルフェート（ＰＥＳ）、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）及び１，２−ベンゾキノンなどの媒介物質が記載されている。この特許は、電極表面に、ヘテロ原子を含んでいても含まなくてもよい少なくとも３個、好ましくは４個又はそれ以上の縮合芳香族環からなる縮合芳香族環系化合物を媒介物質として付与することによって、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はその類似体の酸化を触媒するよう改変された電極に関して述べたものである。より詳細には、本引例は、アルキルフェナジニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノチアジニウムイオン又はフェノチアジノンのいずれか１からなる構造成分による補酵素又はその類似体との電子交換について記載している。
【０００５】
フルティ（Ｆｌｕｔｙ  ）らは、様々な媒介物質に関する文献のレビューを発表し、彼等はＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １４０  （１９８２）  Ｐｐ．  １−１８  において、この媒介物質を、電極と補酵素の酸化還元中心との間に酸化還元対をもたらす「電子シャトル」であると述べている。グラファイト電極に使用される最も良く知られた媒介物質は多分、式ＩＩ：
【０００６】
【化８】
0003585552.tif 000003
【０００７】
で示されるメルドラブルーなどのフェノチアジニウム及びフェノキサジニウム塩である。
【０００８】
Ｊ．  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８７  （１９９０）  Ｐｐ．  ６１−８０  においては、式ＩＩＩ  ：
【０００９】
【化９】
0003585552.tif 000004
【００１０】
で示されるフェノチアジン誘導体である３−β−ナフトイル−トルイジンブルーＯに基づく還元型ＮＡＤの酸化のための化学的に改変されたグラファイト電極が記載されている。パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ）らは、Ｊ．  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２９２  （１９９０）  １１５−１３８において、ＮＡＤＨの電気触媒的酸化のためのいくつかの３，７−ジアミノフェノキサジン誘導体の比較研究について発表している。
【００１１】
米国特許第４，８１０，６３６号には、７−ヒドロキシ基が酵素により開裂可能な基により保護され、９位がアルキル又はアリール基により置換されている７−ヒドロキシ−９Ｈ−アクリジン−２−オン  色原体が記載されている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、補酵素ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適した電極であって、その表面に、１種又はそれ以上の、置換若しくは非置換の９Ｈ−アクリジン−２−オン又は１１Ｈ−ジベンズ−〔ｂ，ｆ〕〔１，４〕オキサゼピン−８−オン化合物を含む、媒介機能を有している電極に関する。
【００１３】
本発明は、式Ｉ：
【００１４】
【化１０】
0003585552.tif 000005
【００１５】
で示される７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オン及びその誘導体が、電極におけるＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）に有用な媒介物質であるとの発見に基づくものである。
【００１６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型、ＮＡＤ＋  ；還元型、ＮＡＤＨ）は、多くの脱水素酵素に化学的酸化還元能を与える補因子である。本補因子は、基質分子が酸化される際の酵素反応の過程において還元される。基質濃度を測定するための手段としてこれらの酵素を用いる電流測定バイオセンサーは、基質濃度と、補因子が電気化学的に再酸化される際に生じる電流とを関連づけたものである。ＮＡＤＨは、媒介物質がなくとも、グラファイト、熱分解カーボン、ガラス質カーボン、プラチナ又は金電極上で電気化学的に再酸化され得るが、この反応には、高い過電圧及び電極汚損など幾つかの問題がある。
【００１７】
本発明は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの補酵素又はこれらの誘導体の電気化学的再生において、アクリジノン類の色原体を初めて使用することを記載しており、従って広範囲のアクリジノン誘導体を含む。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの誘導体としては、ドラブドジアン（Ｄｏｌａｂｄｊｉａｎ）らにより、Ｇ．Ｂ．  Ｂｒｏｗｎ及びＧ．  Ｍａｎｅｃｋｅ編集のＥｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．  ４  、プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）社刊、ニューヨーク、１９７８年、  Ｐｐ．  ３９９−４００に示された、補酵素がポリマーに付着しているもの、またはＭ．  Ｐｅｒｓｓｏｎらにより、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  Ｐｐ．  ２８０−２８４  （１９９１）  に示された、補酵素が脱水素酵素に共有結合しているもの、又は脱水素酵素の補因子として作用する限り、その他の置換基を有する合成類似体等がある。
【００１８】
本発明において媒介物質として好ましく使用されるアクリジノン類は、式Ａ：
【００１９】
【化１１】
0003585552.tif 000006
【００２０】
で示される。これらの化合物は、以下に十分に述べる公知の方法によって調製される。上記の式においてＸは、式：
【００２１】
【化１２】
0003585552.tif 000007
【００２２】
の基（ここで、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して炭素数１〜６の低級アルキルである）又は式：
【００２３】
【化１３】
0003585552.tif 000008
【００２４】
の基（ここで、Ｒ’は上述した定義を有する）であり、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して水素又は別の１価の置換基であり、そしてＱは（→Ｏ）ｎ  （ここで、ｎは０又は１である）である。芳香族環が、その電子伝達性に悪影響を及ぼさないさまざまな置換基を、本発明の範囲から逸脱することなく有することができることは明らかであろう。このような置換基は、当業界における通常の技術を有する者の、電子伝達に必要な電気化学的特性を有する安定な化合物を調製する能力によってのみ制限されるものであり、置換又は非置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ（例えば、フッ素、塩素、臭素）、ニトロ、ジアルキルアミノなどの置換アミノ、ケト、カルボキシ、アルコキシカルボニル及びアミドが含まれる。
【００２５】
化合物Ａの７種類の類似体の構造は、式Ｉ及び式ＩＶ〜ＩＸ：
【００２６】
【化１４】
0003585552.tif 000009
【００２７】
により示され、これらの合成法は、以下の実施例に記載する。
【実施例】
【００２８】
実施例Ｉ
本発明の化合物の合成操作又はその合成に関する記載は以下のとおりである。
【００２９】
化合物Ｉ及びＩＶ〜ＶＩ
これらの化合物の合成法は、米国特許第４，８１０，６３６号に記載されており、その開示内容は、この引用をもって代えることとする。
【００３０】
化合物ＩＸ
文献中では「メチルパープル（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｕｒｐｌｅ  ）」として知られているこの化合物の合成法は、ヒル（Ｈｉｌｌ）らによってＮｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｙ  ７７，  １−９  （１９７６）に記載されており、その開示内容は、この引用をもって代えることとする。
【００３１】
化合物ＶＩＩ
７−メトキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オンを、以下のように合成した。
まず、６０％ＮａＨ含有油０．８８ｇ（２２ｍｍｏｌ、１．１等量）を、ｎ−ペンタン２０ｍｌずつで２回洗浄した。油分を除いたＮａＨを室温で無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌに懸濁させ、不活性ガス雰囲気下で７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オン（Ｉ）４．７８ｇ（２０ｍｍｏｌ、１．０等量）で少しずつ処理した。これを加えることにより混合物は暗青色に変色し、ガスを放出し、やや不透明になった。約１０分後、ＣＨ３  Ｉを１．６ｍｌ（２５ｍｍｏｌ、１．２５等量）加え、その後反応物を室温で７０分間撹拌した。反応混合物を、Ｈ２  Ｏの５００ｍｌ及び酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）の１００ｍｌと混合し、５％ＮａＨＣＯ３  水溶液により塩基性化して、相を分離させた。有機相を５％ＮａＨＣＯ３  水溶液により２回、次いでブラインにより２回洗浄し、Ｎａ２  ＳＯ４  により乾燥し、結晶が析出し始めるまで真空中で濃縮した。混合物を沸騰するまで加熱し、等量のｎ−ヘキサン（約２０ｍｌ）で希釈し、放置して冷却した。析出した結晶をろ過により分離し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）で洗浄し、真空乾燥して、２回の収穫により、標記の化合物（４．８ｇ、収率９４％）を、融点１４０〜１４１℃の赤錆色のずんぐりしたプリズム状晶として得た。
【００３２】
分析値
ＩＲ  （ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１  １６３２，  １６１４，  １５６９，  １５０４，  １４６２，  １４３１，  １３１５，  １２９０，  １２４３，  １０３７，  ８９８，  ８１８；  １Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ  ７．６４  （ｄ，  Ｊ＝８．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ＝７．９Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０３  （ｄ，  Ｊ＝２．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｄ  ｏｆ  ｄ，  ＪＡ＝２．７Ｈｚ及びＪＢ＝８．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．６０−６．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．５４  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  ｐｐｍ  １８７．１，  １６１．９，  １５０．４，  １４７．６，  １４１．７，  １３９．６，  １３６．８，  １３３．８，  １３１．０，  １２７．３，  １１２．４，  １１２．３，  ５５．６，  ３７．４，  ３２．４．
0003585552.tif 000010
【００３３】
化合物ＶＩＩＩ
７−メトキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オン−Ｎ−オキシドを、以下のように合成した。
７−メトキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オン（ＶＩＩ  ）０．２５３３ｇ（１ｍｍｏｌ）を氷酢酸（ＨＯＡｃ）４．０ｍｌに溶解した溶液を、過剰３７％過酢酸により処理し、６０℃の槽中で温めた。出発物質が消費され終わったとき、その反応物を、薄層クロマトグラフィ（アセトン／ＣＨＣｌ３  〔１５：８５、容積比〕溶媒により展開させるシリカゲルプレート）にかけ、冷却した。反応物を真空中で蒸発乾固させ、残渣を、３ｃｍＩＤカラムに充填したシリカゲル１００ｇ（２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）によるクロマトグラフィにより精製し、アセトン／ＣＨＣｌ３  （４：９６、容積比）溶媒により展開した。主要生成物のバンドを集め、真空中で溶媒を除去し、最少量の沸騰しているＥｔＯＡｃから結晶させて、標記化合物２８．４ｍｇ（１０．５％）を、光沢のある黒色結晶として得た。
【００３４】
分析値
ＩＲ  （ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１  ３００１，  １６１１，  １５９４，  １４８８，  １４６８，  １４４５，  １４１１，  １３７１，  １２９４，  １２４８；１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）δ  ８．２７  （ｄ，  Ｊ＝９．１Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２３  （ｄ，  Ｊ＝９．７Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０５  （ｄ，  Ｊ＝２．６Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．００  （ｄ  ｏｆ  ｄ，  ＪＡ＝９．１Ｈｚ及びＪＢ＝２．６Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．６８−６．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６９  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  ｐｐｍ  １８５．９，  １６２．６，  １４７．２，  １４１．４，  １３６．１，  １３２．７，  １３０．７，  １２８．５，  １２３．７，  １２３．１，  １１３．１，  １１１．６，  ５５．８，  ３６．２，  ３２．９．
【００３５】
実施例ＩＩ
媒介物質の評価
グラファイトの桿状電極（直径３ｍｍ、マサチューセッツ州、ウオードヒル、ジョンソンマッセーエレクトロニクス（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍａｔｔｈｅｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ）社製）の表面を、まず微細グリットサンドペーパーにより、次いで粒子径≦１μｍ  のアルミナ粒子の懸濁物により研磨して、電極を調製した。媒介物質の１ｍＭメタノール溶液を調製し、電極を本溶液に２分間浸漬した。次に電極を水で濯ぎ、０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に短時間浸漬した。この時点で電流対電圧プロフィルを測定して、陰極及び陽極のピーク位置  対  Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極を求めた。次いで、酸化ピークよりも典型的には１００ｍＶ高い電位を用いて、２０〜１００μＭ  の濃度でＮＡＤＨを含むｐＨ７の溶液中で電流を測定し、電流対ＮＡＤＨ濃度データの最少自乗法より得られた直線の傾きにより、μＡ／μＭ  ＮＡＤＨにおける各媒介物質の相対的感度を求めた。これらの相対的感度を、表１に示す。
【００３６】
【表１】
0003585552.tif 000011
【００３７】
表１に記載した化合物の相対的感度は、媒介物質のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとの反応性の基準として解釈することができる。得られる値が高ければ、媒介物質はＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとより反応する。これらの化合物は、有用であるための下限である０．０００９μＡ／μＭ  を超える感度を示すため、いずれも、前述したバイオセンサー系において媒介物質として有用であろう。これより低いレベルでは、ＮＡＤＨに対する応答が、バックグラウンドと区別できないため、この値が下限となるのである。
【００３８】
実施例ＩＩＩ
化合物Ｉ、すなわち７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジン−２−オン（ＤＭＡ）を、その２ｍＭのメタノール溶液から、実施例Ｉで用いた種類のグラファイト電極に吸収させた。２ｍＭのＤＭＡのメタノール溶液を含む２種類の試験溶液を調製し、次に電極をその溶液中に配置し、１００ｍＶ／  秒の周期性ボルタンメトリーを用いてスキャンを行い、接触波を探した。第一試験液では、３ｍＭの濃度まで量を引き上げながらＮＡＤＨを添加した。３００〜４００ｍＶ  対  Ａｇ／ＡｇＣｌの間で接触波が現れた。還元型媒介物質の酸化を示すこの接触波を、図１に示す。２番目の実験では、コントロールとして、４ｍＭのＮＡＤ及び４００ｍｇ／ｄｌ  グルコースを用いた。次に少量のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（１ｍｇ／ｍｌ  を添加した。ＮＡＤＨのみを用いた実験において出現したのと同一の接触波が観察された（図２）。酵素反応によって産生されたＮＡＤＨは、検出に十分な高濃度で存在するため、これにより、媒介物質としてＤＭＡが有用であることが確認された。
【００３９】
実施例ＩＶ
グラファイト／炭素作用電極を有する印刷センサーカードと銀／塩化銀基準電極からなる印刷電極を用いた実験を行った。ピペットを用い、ＧＤＨ７５ｍｇ／ｇを含むポリマー溶液処方物（２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液）を用いてＧＤＨ酵素により作用電極を処理し、５ｍＭＤＭＡのメタノール溶液を含む槽中に作用電極を４分間浸して、電極に媒介物質を導入し、次いで電極を槽から引き出し、乾燥した。電極をキャピラリーギャップを有するフォーマットで組み立て、１ｍＭＮＡＤ＋  ／グルコースの緩衝液溶液（１００ｍＭＰＯ４  ＝／１００ｍＭＫＣｌ）により処理し、＋０．６Ｖ  対  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位で電流を測定した。グルコース濃度の関数としての電流密度を、図３に図示するが、これにより、本発明の媒介物質を用いて調製されたセンサーが、検討中の種類のバイオセンサー系で用いられた場合、適切な濃度反応相関を示すと理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡＤＨのみ系での、ＤＭＡ添加時の接触波の観察を示す。
【図２】ＮＡＤ＋グルコース、及びＮＡＤ＋グルコース＋ＧＤＨの系での、ＤＭＡ添加時の接触波の観察を示す。
【図３】グルコース濃度と電流密度との関係を示す。
【図１】
0003585552.tif 000017
【図２】
0003585552.tif 000018
【図３】
0003585552.tif 000019