(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールアミン類緩衝液にキレート剤又はその塩を含有させることを特徴とする、エタノールアミン類緩衝液の安定化方法。
【請求項２】
エタノールアミン類が、一般式（１）：
【化１】
0003598438.tif 000007
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子１〜４個のアルキル基であり、ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数である）
で表される化合物である請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
キレート剤又はその塩が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，２−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸、Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’，Ｎ”’−六酢酸、及びそれらのアルカリ金属塩からなる群から選択された１以上の化合物である請求項１記載の安定化方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法で安定化されたエタノールアミン類緩衝液を含有する試薬溶液であって、補酵素の変化量を吸光度変化量として測定する系、あるいは基質から遊離する物質の生成量を吸光度変化量として測定する系において用いる、前記の試薬溶液。
【請求項５】
試薬溶液が生物学的被検試料中の生理活性物質検出用の液状試薬である請求項４記載の試薬溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、緩衝液として汎用されているエタノールアミン類緩衝液の安定化方法に関する。また、安定化されたエタノールアミン類緩衝液を使用した試薬溶液にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、種々の疾病を正確に判断するための指標として、生体液中に含まれる各種の生理活性物質を測定することが行われており、測定項目毎に多数の診断用試薬が市販されている。これらの試薬は、生体液試料（例えば血清や血漿、尿など）を試薬と混合するだけで試料中に含まれる目的物質由来の信号を分光学的に容易に検出できるように構成されている。特に、酵素反応が関与する場合など、所望する反応系（例えば十分な酵素活性の発現や、発色反応の進行など）が維持できるように構成成分や雰囲気（ｐＨ）が設定されており、当然の如く各種緩衝液が用いられている。
【０００３】
例えば、乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨ）は、心臓、肝、筋肉などに多く分布する酵素で、各種疾患時に血中に遊出されることから、血液などの生体液中のＬＤＨの測定は心疾患、肝疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つである。ＬＤＨの測定法としては、乳酸を基質として、ＬＤＨによってピルビン酸に変え、共存させておいた酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ）が還元されて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨ）となる変化量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することによりＬＤＨを測定する方法が使用されており、日本臨床化学会（以下ＪＳＣＣ）や国際臨床化学連合（以下ＩＦＣＣ）からも勧告法として挙げられている〔臨床化学，第１９巻第２号２２８ページ〜２４６ページ（１９９０年６月）〕。
一般的に乳酸を基質としたＬＤＨの測定法はｐＨ８．０〜９．５付近のアルカリ性条件下で行われ、その付近に緩衝能のある緩衝液としてエタノールアミン類が汎用され、ＪＳＣＣ勧告法でもジエタノールアミン緩衝液が使用されている。
【０００４】
また、アルカリ性ホスファターゼ（以下ＡＬＰ）は、骨、小腸、肝、腎、胆管などに多く分布する酵素で、各種疾患時に血中に遊出されることから、血液などの生体液中のＡＬＰの測定は肝疾患、骨疾患などの診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つである。ＡＬＰの測定法としては、４−ニトロフェニル燐酸（以下４ＮＰＰ）を基質として、ＡＬＰによって加水分解され、遊離してくる４−ニトロフェノール（以下４ＮＰ）の増加量を、波長４０５ｎｍ付近で測定することによりＡＬＰを測定する方法が汎用されており、この方法がＪＳＣＣやドイツ臨床化学会（以下ＧＳＣＣ）からも勧告法として示されている〔臨床化学，第１９巻第２号２１３ページ〜２２７ページ（１９９０年６月）；ジャーナルオブ  クリニカルケミストリー  クリニカルバイオケミストリー，第１０巻２８１ページ〜２９１ページ（１９７２年）〕。
一般的に４ＮＰＰを基質としたＡＬＰの測定法はｐＨ９．０〜１０．５付近のアルカリ性条件下で行われ、その付近に緩衝能のある緩衝液としてエタノールアミン類が汎用され、ＪＳＣＣ勧告法でも２−エチルアミノエタノール緩衝液が、またＧＳＣＣ勧告法ではジエタノールアミン緩衝液が使用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
近年、特に試薬形態を供給時から液状とし、ユーザーの作業性を向上させることが求められている。そのため、多くの場合、自動分析機にて使用されるために試薬構成を二試薬系とし、且つ試薬組成物の安定性を長期間（例えば半年から１年間）維持する必要がある。
【０００６】
しかし、エタノールアミン類の緩衝液は、アルカリ性条件下で酸化され経時的に溶液が黄褐色に変色する。ＬＤＨやＡＬＰの測定は上記のように波長３４０ｎｍ付近や４０５ｎｍ付近で目的物由来の信号を検出することから、緩衝液自体の変色は試薬の初期吸光度を上昇させＬＤＨやＡＬＰの測定精度を低下させる結果となり、溶液状態で長期間安定な性能を維持させるには不都合であった。例えば、上記のＪＳＣＣの勧告法では、ＬＤＨについて試薬調製日から１８日後までの安定性を確認しているが、それ以上の長期間の安定性については触れていない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、エタノールアミン類緩衝液を用いる液状検出系、例えばＬＤＨやＡＬＰの測定用液状試薬を、長期間安定に保存する手段を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、本発明による、エタノールアミン類緩衝液にキレート剤又はその塩を含有させることを特徴とする、エタノールアミン類緩衝液の安定化方法によって達成することができる。
また、本発明は、上記の方法で安定化されたエタノールアミン類緩衝液を含む試薬溶液にも関する。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明においては任意のエタノールアミン類を用いることができるが、特には、下記一般式（１）で示される化合物が好ましい。
【００１０】
【化２】
ＲＨｍ  Ｎ（ＣＨ２  ＣＨ２  ＯＨ）ｎ          （１）
式中、Ｒは水素原子又は炭素原子１〜４個のアルキル基、好ましくはメチル基若しくはエチル基であり、ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数である。
【００１１】
特に好ましいエタノールアミン類は、モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、メチルアミノエタノール（ＭＡＥ）、又はエチルアミノエタノール（ＥＡＥ）である。これらのエタノールアミン類を単独又は複数の組み合わせで公知の手段により所望の濃度（例えば０．０１〜１Ｍ）に調整し、目的に応じてｐＨを調整する。
【００１２】
本発明方法においては、前記エタノールアミン類の緩衝液を、必要により無機酸（例えば、塩酸又は硫酸）及び／又は有機酸（例えば、酢酸又はコハク酸）などで、反応系で設定されたｐＨ約８．０〜１１．０に調整し、その中にキレート剤を添加する。酸を添加する理由は、エタノールアミン類溶液のｐＨが１０以上になるので、酸を添加して、使用するｐＨに調整するためである。
【００１３】
キレート剤としては、具体的には、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（以下ＣｙＤＴＡ）、１，２−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（以下Ｍｅ−ＥＤＴＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（以下ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸（以下ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルグリシン（以下ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（以下ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（以下ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸（以下ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（メチレンホスホン酸）（以下ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）（以下ＥＤＤＰＯ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（以下ＧＥＤＴＡ）、ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（以下ＨＤＴＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（以下ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（以下ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（以下ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（以下ＮＴＡ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（以下ＮＴＰＯ）、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’，Ｎ”’−六酢酸（以下ＴＴＨＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、若しくはエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）など、又はそのアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）を用いることができる。前記のキレート剤は単独で又は任意に組み合わせて添加することができる。
【００１４】
キレート剤として、好ましくは、ＣｙＤＴＡ、Ｍｅ−ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＤＨＥＧ、ＥＤＤＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＴＰＯ、ＥＤＤＰＯ、ＧＥＤＴＡ、ＨＤＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、又はそのアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はリチウム塩）を用いることができる。
【００１５】
添加するキレート剤又はそのアルカリ金属塩の濃度は適宜選択することができるが、具体的には２μｍｏｌ／リットル〜２５０ｍｍｏｌ／リットル、好ましくは５μｍｏｌ／リットル〜１２５ｍｍｏｌ／リットル、更に好ましくは１０μｍｏｌ／リットル〜５０ｍｍｏｌ／リットルの濃度となるように添加すればよい。こうすることで、エタノールアミン類緩衝液の安定性（変色の防止）を飛躍的に向上させることが可能となった。キレート剤又はそのアルカリ金属塩の濃度が２μｍｏｌ／リットル未満になると変色を充分に防止することができず、２５０ｍｍｏｌ／リットルを越えると溶解性が不十分となるために吸光度が最初から高くなる。５μｍｏｌ／リットル以上になると変色をほぼ防止することができ、更に１０μｍｏｌ／リットル以上になるとキレート剤の添加量の増加に関係なく変色を防止することができ、１２５ｍｍｏｌ／リットル以下になるとキレート剤の濃度に応じた吸光度の変化がなくなり、更に５０ｍｍｏｌ／リットル以下になるとキレート剤の濃度に関係なく変色防止効果を得ることができる。
【００１６】
このように安定化されたエタノールアミン類の緩衝液を用いることにより、長期間安定な試薬を提供することができる。従って、本発明は、安定化されたエタノールアミン類緩衝液を含有する試薬溶液にも関する。
前記の試薬溶液は、エタノールアミン類緩衝液を含有する溶液であれば特に限定はされないが、例えば、生化学実験用試薬溶液、又は好ましくは臨床検査用試薬溶液である。特に、各種診断用試薬は正確な測定結果を求められるので、本発明方法が好適に用いられる。
臨床検査で用いる各種診断用試薬溶液は、生物学的被検試料（例えば、血液試料、特には血清又は血漿、尿、髄液、唾液、膿又は細胞抽出液）中の生理活性物質（例えば、酵素、ホルモン又は化学物質）の検出用試薬である。
【００１７】
例えば、前記のＬＤＨ測定用試薬の場合には、上記キレート剤又はそのアルカリ金属塩を添加したエタノールアミン類緩衝液（例えば、ジエタノールアミン緩衝液）に基質としての乳酸を添加して第一試薬とし、ＮＡＤを精製水や適当な緩衝液に溶解して第二試薬とすることで、ＬＤＨ測定用試薬を構成することができる。
【００１８】
このように構成されたＬＤＨ測定用試薬を用いて、検体（例えば、血清試料又は血漿試料）にＬＤＨの基質である乳酸と補酵素であるＮＡＤを作用させると、ＬＤＨの作用により乳酸がピルビン酸に変換される。この時共存させておいたＮＡＤは、共役的にＮＡＤＨとなる。この反応で還元されて生成されるＮＡＤＨに由来する吸光度変化を、波長３４０ｎｍ付近にて測定することで、検体中のＬＤＨ活性を求めることができる。更に本発明の液状試薬は、長期間安定に保存することができるので、臨床検査の分野で有利に用いることができる。
【００１９】
同様にＡＬＰ測定試薬の場合は、上記キレート剤又はそのアルカリ金属塩を添加したエタノールアミン類緩衝液（例えば、ジエタノールアミン緩衝液）を第一試薬とし、４ＮＰＰを精製水や適当な緩衝液に溶解して第二試薬とすることで、ＡＬＰ測定用試薬を構成することができる。
このように構成されたＡＬＰ測定用試薬によって、検体にＡＬＰの基質である４ＮＰＰを作用させると４ＮＰが生成される。この生成された４ＮＰに由来する吸光度変化を、波長４０５ｎｍ付近にて測定することで、検体中のＡＬＰ活性を求めることができる。更に本発明の液状試薬は、長期間保存可能なもので、臨床検査の分野で有利に用いることができる。
【００２０】
【作用】
本発明の作用については以下の記載に限定するものではないが、キレート剤又はその塩を添加することで、広義には抗酸化作用が発現しているものと考えられる。即ち、アルカリ性のエタノールアミン類緩衝液中でエタノールアミン類が種々の要因によって酸化されることに由来する緩衝液の変色を、本発明方法により効果的に防止することができ、また、キレート剤又はその塩を添加することで、エタノールアミン類の酸化反応に対して触媒的に作用し得る溶液中に混在する微量の金属（例えば、鉄、銅、マグネシウム等）が隠蔽され、エタノールアミン類の溶液状態での安定化にとって不都合な雰囲気が抑制されているものと考えられる。従って、本発明方法では、前記のメカニズムに基づく変色防止作用を示すキレート剤をすべて用いることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
（１）試薬の調製
ＤＥＡ３７．４９ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２２２．１ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液１リットルに、ＣｙＤＴＡ、Ｍｅ−ＥＤＴＡ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸２Ｎａ（以下ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸２Ｋ（以下ＥＤＴＡ・２Ｋ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸２Ｌｉ（以下ＥＤＴＡ・２Ｌｉ）、ＧＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＨＩＤＡ、ＮＴＡ、ニトリロ三酢酸３Ｎａ（以下ＮＴＡ・３Ｎａ）、又はＴＴＨＡを２．５ｍｍｏｌ／リットルになるよう添加し、ｐＨを８．８（３０℃）として各キレート剤添加基質緩衝液を調製した。ＮＡＤ３．９８１ｇを精製水に溶解し、全体を１００ｍｌとしてＮＡＤ溶液とした。
【００２２】
（２）初期吸光度の測定
各キレート剤添加基質緩衝液を３７℃にて保存し、保存開始の当日、保存から１０日後、２２日後、３０日後及び９０日後の安定性を、以下の初期吸光度を測定することにより確認した。キレート剤無添加の基質緩衝液も対照用として同様に保存した。
初期吸光度は、キレート剤添加基質緩衝液２．５ｍｌとＮＡＤ溶液０．３ｍｌとを混合して３４０ｎｍで吸光度を測定した。この結果を表１に示す（表中の−−は測光不可を表す）。
【００２３】
【表１】
0003598438.tif 000002
【００２４】
実施例２
（１）試薬の調製
ＤＥＡ３７．４９ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２２２．１ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液に、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を１リットルあたり、０．０１ｇ、０．１ｇ、１ｇ、又は１０ｇの量で添加し、ｐＨを８．８（３０℃）としてＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質緩衝液を調製した。ＮＡＤ３．９８１ｇを精製水に溶解し、全体を１００ｍｌとしてＮＡＤ溶液とした。
【００２５】
（２）初期吸光度の測定
ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質緩衝液を３７℃にて保存し、保存開始の当日、保存から６日後、１０日後、２２日後、３０日後及び９０日後の安定性を、以下の初期吸光度を測定することにより確認した。ＥＤＴＡ・２Ｎａ無添加の基質緩衝液も対照用として同様に保存した。
初期吸光度は、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質緩衝液２．５ｍｌとＮＡＤ溶液０．３ｍｌとを混合して３４０ｎｍで吸光度を測定した。この結果を表２に示す（表中の−−は測光不可を表す）。
【００２６】
【表２】
0003598438.tif 000003
【００２７】
実施例３
（１）試薬の調製
ＥＡＥ１１２．５ｇを精製水に溶解し、２Ｍ塩酸３３０ｍｌを加えた。この溶液に５０．５ｍＭ−ＭｇＣｌ２  １１．２５ｍｌを加えて混合した後、ｐＨを９．９（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして緩衝液とした。この緩衝液１リットルに、ＥＤＴＡ・２Ｎａ０．１ｇを添加し、ｐＨを９．９（３０℃）として、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加ＥＡＥ緩衝液を調製した。４ＮＰＰ２．８ｇを精製水に溶解し、全体を１００ｍｌとして基質溶液とした。
【００２８】
（２）初期吸光度の測定
ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加ＥＡＥ緩衝液を３７℃にて保存し、保存開始の当日、保存から１０日後、２０日後、３０日後及び９０日後の安定性を、以下の初期吸光度を測定することにより確認した。ＥＤＴＡ・２Ｎａ無添加のＥＡＥ緩衝液も対照用として同様に保存した。
初期吸光度は、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加ＥＡＥ緩衝液２．０ｍｌと基質溶液０．５ｍｌを混合して４０５ｎｍで吸光度を測定した。この結果を表３に示した。
【００２９】
【表３】
0003598438.tif 000004
【００３０】
実施例４
（１）試薬の調製
ＤＥＡ３７．４９ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２２２．１ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液１リットルに、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１ｇを添加しｐＨを８．８（３０℃）としてＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＤＥＡ緩衝液を調製した。
同様にモノエタノールアミン（以下ＭＥＡ）２１．７８ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２５０．１ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液１リットルに、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１ｇを添加しｐＨを８．８（３０℃）としてＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＭＥＡ緩衝液を調製した。
同じくトリエタノールアミン（以下ＴＥＡ）５３．２０ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２１０．６ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液１リットルに、ＥＤＴＡ・２Ｎａを１ｇ添加しｐＨを８．８（３０℃）としてＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＴＥＡ緩衝液を調製した。ＮＡＤ３．９８１ｇを精製水に溶解し、全体を１００ｍｌとしてＮＡＤ溶液とした。
【００３１】
（２）初期吸光度の測定
ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＤＥＡ緩衝液、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＭＥＡ緩衝液、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＴＥＡ緩衝液を３７℃にて保存し、保存開始の当日、保存から１０日後、２０日後、３０日後及び９０日後の安定性を、以下の初期吸光度を測定することにより確認した。ＥＤＴＡ・２Ｎａ無添加の基質ＤＥＡ緩衝液、基質ＭＥＡ緩衝液、及び基質ＴＥＡ緩衝液も対照用として同様に保存した。
初期吸光度は、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質ＤＥＡ緩衝液２．５ｍｌとＮＡＤ溶液０．３ｍｌとを混合して３４０ｎｍの吸光度を測定した。同様にＭＥＡ緩衝液、ＴＥＡ緩衝液についても行った。この結果を表４に示す（表中の−−は測光不可を表す）。
【００３２】
【表４】
0003598438.tif 000005
【００３３】
実施例５
（１）試薬の調製
ＤＥＡ３７．４９ｇを精製水に溶解し、１Ｍ塩酸２２２．１ｍｌを加えた。この溶液にＬ（＋）−乳酸リチウム６．９１２ｇを加えて溶解した後、ｐＨを８．８（３０℃）に調整し、全体を１リットルとして基質緩衝液とした。この基質緩衝液１リットルに、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１ｇを添加し、ｐＨを８．８（３０℃）としてＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質緩衝液を調製した。ＮＡＤ３．９８１ｇを精製水に溶解し、全体を１００ｍｌとしてＮＡＤ溶液とした。
ＥＤＴＡ・２Ｎａ無添加の基質緩衝液、又は、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加基質緩衝液を第一試薬とし、ＮＡＤ溶液を第二試薬として以下の試験により、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加による、ＬＤＨ活性の変化を確認した。
（２）ＬＤＨ活性の測定
管理血清８μｌに第一試薬２５０μｌを添加し、３７℃で５分間、予加温した後、第二試薬３０μｌを混合して、１分半経過後から３４０ｎｍの吸光度の変化量を測定した後、次式によりＬＤＨ活性を算出した。その結果を図１に示した。ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加による、ＬＤＨ活性の変化はなかった。
【００３４】
【式１】
0003598438.tif 000006
ΔＯＤ／ｍｉｎ  ：１分間当たりの吸光度の変化量
０．２８８      ：総液量（ｍｌ）
１０００        ：リットル当たりへの換算
６．３          ：ＮＡＤＨの分子吸光係数
０．００８      ：血清量（ｍｌ）
【００３５】
【発明の効果】
本発明方法によれば、エタノールアミン類緩衝液を用いる液状検出系、例えばＬＤＨやＡＬＰの測定用液状試薬を、測定値に実質的な影響を与えず、長期間安定に保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５で行った、キレート剤添加試薬とキレート剤無添加試薬とを用いたＬＤＨ活性測定の相関関係を示すグラフである。
【図１】
0003598438.tif 000008