(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ズブチルスＴ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔ２）（寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−16759号）を含有してなるアブラナ科根こぶ病防除材。
【請求項２】
バチルス・ズブチルスＴ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔ２）（寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−16759号）を１０3ｃｆｕ／ｇ以上含有した培土からなるアブラナ科根こぶ病防除材。
【請求項３】
バチルス・ズブチルスＴ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔ２）（寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−16759号）がアルギン酸のアルカリ金属塩とカルシウム化合物とで固定化されたバチルス・ズブチルスＴ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔ２）である請求項２記載のアブラナ科根こぶ病防除材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
アブラナ科作物はハクサイ、キャベツ等に代表される重要な野菜として大量に生産されている。生産効率の追求、産地の指定化等により同一作物を長年にわたって栽培する連作が日常的に行われてきた。
【０００２】
【従来の技術】
その結果連作による弊害として土壌病害、要素欠乏症などが大きな問題となっている。そこでアブラナ科作物の根こぶ病の防除にはＰＣＮＢ（ペンタクロルニトロベンゼン）、ネビジン等の化学農薬散布、アルカリ資材の投入による土壌ｐＨの調整、品種改良による抵抗性品種の作出等の対策が採られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、化学農薬の使用は耐性菌の出現等で効果が不十分になってきた。更に残留毒性、散布時の吸入による障害などの問題が起こり、使用は限定されるようになっている。加えて消費者においても化学農薬に対する嫌悪感は増加する一方であり、化学農薬を使用した野菜もまた敬遠される様になってきた。また、土壌ｐＨの調整では充分な効果が得られず、抵抗性品種の作出も多大な時間を要するため幼苗価格が高価となるに加えて、舌ざわり、味もこれまでのものと微妙に異なる。
【０００４】
近年、微生物を用いる土壌病害防除方法が開発され、注目を集めバチルス・ズブチルスＳＣ−３を用いて植物病害を防除する方法（特開平５−５１３０５号公報）、バチルス・スフェリカスの芽胞含有培養物を用いた野菜類病害防除剤（特許第２５２６３６５号公報）が提案されている。本発明は後に詳述する特定の微生物を用いてアブラナ科根こぶ病を防除することを目的とするものである。
【０００５】
尚、本発明と前記特開平５−５１３０５号公報記載の菌とは、例えば分類学的性質に於いて食塩濃度での生育、Ｖ−Ｐ試験のｐＨが異なり、また病害防除に於いてはバチルス・ズブチルスＴ２はうどんこ病等の地上部病害に対しては効果がなく両者は全く別の菌株である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明はバチルス・ズブチルスＴ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔ２）を含有してなるアブラナ科根こぶ病防除材に関し、またバチルス・ズブチルスＴ２を１０3ｃｆｕ／ｇ以上含有した培土からなるアブラナ科根こぶ病防除材に関し、更にまたバチルス・ズブチルスＴ２をアルギン酸のアルカリ金属塩とカルシウム化合物とで固定化した固定化菌を用いたアブラナ科根こぶ病防除材に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するバチルス・ズブチルスＴ２は兵庫県加古川市別府町の圃場から分離した微生物であり、菌株コード番号をＴ２と命名した。この本発明菌は平成１０年４月１４日付で生命研寄託番号「Ｎｏ  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７５９号」として寄託されている。表１に本発明バチルス・ズブチルスＴ２（以下本発明菌という）の分類学的性状を示す。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
本発明菌の培養は一般的細菌における通常の培養方法に従って行えば良く、固体培養あるいは振とう培養、ジャーファメンター培養等の液体培養のいずれでも利用することができる。
【００１０】
本発明の培養培地としては通常細菌に使用され培養培地で良く、具体的には糖質としてはグルコース、蔗糖、果糖、デンプン等、窒素源としては肉エキス、ペプトンの他に酵母エキス、大豆粉末、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を利用することができ、また生育促進効果を持つエキス類として麦芽エキス、ジャガイモ煎汁等も用いることができる。さらに金属塩の補給、ｐＨ或いは浸透圧調整に塩化ナトリウム、りん酸カリウム塩、マグネシウム塩等の無機塩類を加えても良い。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃であれば良く、好気的培養であれば振とう、通気攪拌等の手段は問わない。ｐＨは５．５〜８．０好ましくは６．５〜７．５の範囲であれば良い。また固体培養を行った後殺菌水を添加・混合し菌懸濁液とすることもできる。
【００１１】
本発明の使用方法について云えば、本発明菌それ自体、あるいは培養液をそのまま使用することもできるが、一般的には固体あるいは液体担体と混合して使用することが望ましい。固体担体としてはカオリン、タルク、バーミキュライト、珪藻土、モンモリロナイト等の天然鉱物微粉末、合成微粉末シリカ、活性炭、炭酸カルシウム、酸性白土、酸化カルシウム等の人工鉱物微粉末、発泡ポリスチレン、発泡ポリエチレン、発泡ポリプロピレン、ポリウレタン等多孔性プラスチック等を使用することができる。また液体担体としては水、特に滅菌水が最も望ましい。
【００１２】
さて、本発明者らが固体担体と共に使用する別法として、最も望ましい使用形態として推奨する方法は、本発明菌を育苗培土と混合して使用する方法である。育苗培土としては、バーミキュライト、ピートモス、腐植土、山土、あるいは市販育苗培土をそのまま好ましくは通気性、通水性、保水性を考慮して混合使用することもできるが、更に望ましくは１００〜２００℃の範囲で０．５〜１時間焼成した焼成培土を使用することである。焼成することにより培土中の雑菌を死滅させ無菌化することにより、本発明菌を容易に増殖させることができる。また更に殖増を推進するために糖質等の炭素源、肉エキス、麦芽エキス等の生育促進剤を培土に添加混合しておくと良い。
【００１３】
このように調製した培土に本発明菌を混合し、無菌室で菌濃度が１０3ｃｆｕ／ｇ以上になるまで培養する。
培養は通常１５〜３０℃で１週間以上行えば良い。１０3ｃｆｕ／ｇ以上とする理由は、このような培土に播種して育苗したアブラナ科植物は根こぶ病発病率が極めて低いことによる。
【００１４】
次に更に望ましい育苗培土の製造方法について述べる。
先ず、本発明菌濃度が１０4ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０6ｃｆｕ／ｇ以上となるように本発明菌をアルギン酸のアルカリ金属塩水溶液に懸濁させる。
このときアルギン酸のアルカリ金属塩水溶液の濃度は、０．０１〜１重量％の範囲が良い。アルギン酸のアルカリ金属塩の使用割合は育苗培土に対しアルギン酸のアルカリ金属塩として０．０１〜１．０重量％である。この菌体懸濁液を焼成培土との混合により、アルギン酸のアルカリ金属塩は培土表面に存在する二価陽イオンとの置換によって、培土表面に水不溶性膜を形成する。菌体は水不溶性膜と共に培土表面に固定されて増殖する。
【００１５】
しかしながら、更に本発明菌の固定を安定化させるためにはアルギン酸のアルカリ金属塩添加混合後にカルシウム化合物を添加する。カルシウム化合物としては、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム等が好例として挙げられるが、とりわけ炭酸カルシウムが望ましい。カルシウム化合物の添加量は、使用するアルギン酸のアルカリ金属塩の量、本発明菌の量、育苗培土の物性等により異なるが大略育苗培土に対して０．０１〜１．０重量％である。アルギン酸のアルカリ金属塩とカルシウム化合物使用割合は重量で４：１〜１：１０の範囲が望ましい。
【００１６】
本発明に於いて本発明菌を育苗培土に固定化する理由は、灌水等による本発明菌の移動を防ぎ、本発明菌を効率よく利用するためである。尚、本発明菌とアルギン酸のアルカリ金属塩水溶液の混合液を土壌に施用した後、カルシウム化合物を加えて本発明菌を固定化しても良いし、土壌にカルシウム化合物を混合した後、
混合液を加えて本発明菌を固定化しても良い。
【００１７】
さて、以上詳しく述べたように本発明菌は、それ自体または本発明菌培養液自体あるいはこれらを水に懸濁させた懸濁液、更にまたこれらを固体担体と混合した混合物をそのまま土壌に混合することもできるし、散布することもできる。土壌に混合あるいは散布する場合の量としては、例えば使用濃度が１０5cell／ｍｌの場合100ｍｌ／ｍ2〜１０Ｌ／ｍ2、特に好ましくは１Ｌ／ｍ2〜５Ｌ／ｍ2である。
【００１８】
本発明菌濃度の調製は、水希釈により容易に行うことができる。土壌へ直接適用する場合、散布回数は植物の生育状況により１回〜５回行えば良い。また別法として本発明菌培養液に種子を浸漬して利用することもできる。かかる場合に於ける培養液中の菌濃度としては種子の種類により異なるが１０3ｃｆｕ／ｇ以上あれば良く、種子濃度としては１〜５０重量％が良い。浸漬時間は１〜２時間で充分である。浸漬温度は５〜２５℃が良い。
【００１９】
しかしながら、本発明菌がその効果を最も良く発揮するのは、先に記載した如く本発明菌を混合した培土または本発明菌を固定化した培土に播種し、育苗後定植する方法である。
【００２０】
本発明の対象とする植物はアブラナ科植物であるが、具体的には、キャベツ、チンゲンサイ、蕪、小松菜、ブロッコリー、水菜、コールラビ（蕪甘藍）、高菜、山東菜、壬生菜、からし菜、タアサイ、カリフラワー、体菜等であるがこれらに限定されるものではない。以下に実施例を記し、本発明を更に詳述する。
【００２１】
【実施例】
根こぶ病汚染土の調製
根こぶ病に感染したハクサイ肥大根に等量の水を加え磨砕し、２重のガ−ゼで濾す。さらにろ液を2500rpmで5分間遠心分離する。遠心分離後上澄液を捨て、沈殿を少量の殺菌水に懸濁する。この操作を３回繰り返した。こうして調製した休眠胞子懸濁液の休眠胞子数を顕微鏡で計数した。これを休眠胞子数が1.1×106／ｇの乾土になるように加古川沖積土壌に添加・混合し根こぶ病汚染土とした。この根こぶ病汚染土を用いて本発明の根こぶ病防除効果について対照および農薬等と比較を行った。なお以下の実施例でハクサイ等の栽培で「病土」と記載している場合すべてこの根こぶ病汚染土に定植することを示す。
【００２２】
（実施例１）
バ−ミキュライト２容に赤玉土と多木園芸培土（多木物産株式会社製品）を８：１で混合したもの１容を混合した培土22.5kgを150℃で1時間加熱殺菌した後、室温まで放冷した。肉エキス5g／ｌ、ペプトン10g／ｌ、塩化ナトリウム5g／ｌを含有する液体培地で30℃、40時間振盪培養した本発明菌培養液4Lとアルギン酸ナトリウムを１重量％含有した殺菌水3.5Lとを混合し本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液とした。これを上記の培土に加え混合（培土に対しアルギン酸ナトリウムとして0.12重量％）後、炭酸カルシウム１重量％を加えて良く混合し、これを4Lずつビニ−ル袋詰め後脱気し、25℃で1週間熟成し、本発明防除材１、（菌数６．７×１０7ｃｆｕ／ｇ）とした。またパ−ライト１容に真砂土（六甲山系花崗岩風化土）４容、ピ−トモス１容の割合で混合した培土7kgに本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液2.33Ｌを添加し、ついで炭酸カルシウムを１重量％加えた。更に本発明防除資材１と同様に袋詰め・脱気・熟成を行い本発明菌濃度の異なる本発明防除材２（２．４×１０3ｃｆｕ／ｇ）を作製した。また本発明防除材２に用いた培土を使用して本発明菌濃度の異なる本発明防除材３（５．２×１０4ｃｆｕ／ｇ）、本発明防除材４（８．１×１０5ｃｆｕ／ｇ）を作製した。
【００２３】
本発明防除材１〜４を各々128穴セルトレイに充填し、ハクサイ（品種「無双」：タキイ種苗(株)製）を播種した。温室で21日間育苗後病土に20株ずつ定植した。対照区、農薬区の育苗は本発明菌添加前の本発明防除材２の培土を用いた。農薬区はネビジン粉剤30Kg／10a相当量を植穴施用した。施肥等栽培管理は慣行に準じた。定植28日目に感染発病の程度を調査し、その結果を表２に示した。調査の結果発病株率が対照区100％、農薬区30％、本発明防除材１区は5％、本発明防除材２区は３０％、本発明防除材３区は２５％、本発明防除材４区は２０％であった。防除価は農薬区70に対し本発明防除材１〜４区はそれぞれ９５、７０、７５、８０であった。本発明防除材区は根こぶ病汚染土において化学農薬より安定した防除効果を示したことから、ハクサイ根こぶ病防除に有効な微生物資材として評価できる。
【００２４】
【表２】
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＊１）  発病株率：発病株数を栽培本数で除した値の百分率
＊２）  防除価：対照区の発病株率から本発明の発病株率を差し引いた値を対照区の発病株率で除した値に１００を乗じた値
【００２５】
（実施例２）
本発明菌培養液（菌数4.2×108cfu／ｇ）を水で菌数5.1×106cfu／ｇに希釈した。これを植穴（直径４ｃｍ）当たり100ml直接病土に施用し、直ちにハクサイの苗（「無双」：21日間育苗）を20株ずつ定植した（直接区）。本発明菌培養液（菌数4.2×108cfu／ｇ）40mlとアルギン酸ナトリウムを１重量％の濃度に溶解した殺菌水35mlとを混合し本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液とした。これを水で希釈し、菌数5.1×106cfu／ｇの希釈液とした。炭酸カルシウム5gを植穴施用した部分へ本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液希釈液100mlを施用し、固定化を行なった。30分以上経過後ハクサイの苗（「無双」：21日間育苗）を20株ずつ定植した（土壌固定化菌体区）。上記の本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液75mlを２重量％の塩化カルシウム溶液200mlに滴下し拮抗菌の固定化を行った。塩化カルシウム溶液中で30分以上固定化を行った後1mm目のステンレス網で固定化菌体を濾過捕集した。
【００２６】
この固定化菌体2mlを植え穴に添加しハクサイの苗（「無双」：21日間育苗）を20株ずつ定植した（固定化菌体区）。対照区は植穴に水100mlを施用した後ハクサイの苗（無双：21日間育苗）を20株ずつ定植した。定植28日目に感染発病の程度を調査し、表３に示した。調査の結果発病株率は対照区100％、直接区は25％、土壌固定化菌体区、固定化菌体区は15％であった。防除価は直接区75、土壌固定化菌体区、固定化菌体区は85であった。本発明はいずれも対照より低い発病株率で、防除効果が認められた。土壌処理の方法でもハクサイ根こぶ病防除に有効な微生物資材として評価できる。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
（実施例３）
本発明菌培養液（菌数4.2×108cfu／ｇ）とアルギン酸ナトリウムを１重量％の濃度に溶解した殺菌水とを混合し本発明菌−アルギン酸ナトリウム混合液（5.5×１０7ｃｆｕ／ｇ）とした。この混合液100mlにハクサイ（無双）の種子100粒を室温で1時間浸漬した。この種子を取り出し、２重量％の塩化カルシウム溶液200mlに滴下し本発明菌の固定化を行った（固定化菌体区）。また本発明菌培養液希釈液100ml（５．５×１０7ｃｆｕ／ｇ）にハクサイ（無双）の種子100粒を室温で1時間浸漬した（菌体区）。対照として水100mlにハクサイ（無双）の種子100粒を室温で1時間浸漬した（対照区）。以上3種類の処理を行ったハクサイ（無双）の種子を市販野菜用培土に50粒播種し、21日間育苗した。この苗20株ずつを病土に定植し、28日間栽培した。28日後に各処理区の感染発病株率を調べ、表４に示した。調査の結果発病株率が対照区100％、固定化菌体区は15％、菌体区は25％であった。防除価は固定化菌体区85、菌体区75であった。本発明防除材は種子処理でもハクサイ根こぶ病防除に有効な微生物資材として評価できる。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
（実施例４）
実施例１の本発明防除材１を128穴セルトレイに充填し、これにキャベツ（松波：石井種苗）、ブロッコリ−（ハイツ：タキイ種苗）を播種した。同様に200穴セルトレイに充填後チンゲンサイ（青帝：タキイ種苗）、蕪（金町小かぶ：サカタの種）、晩生小松菜（小林種苗）を播種した。チンゲンサイ、蕪、小松菜は育苗14日目に病土に20株ずつ定植した。キャベツ、ブロッコリ−は育苗21日目に病土に20株ずつ定植した。チンゲンサイ、蕪、小松菜は定植後21日目に、キャベツ、ブロッコリ−は定植後28日目に感染の程度を調査した。また対照区はバーミキュライト２容に赤玉土と多木園芸培土（多木物産株式会社製品）を８：１で混合したもの１容を混合した培土を、育苗培土として使用し各作物を本発明と同期間育苗後、定植し感染の程度を調査した。その結果を表５に示した。いずれの作物においても本発明のほうが対照より低い発病株率で根こぶ病防除効果が認められた。
【００３１】
【表５】
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以上から明らかなように、本発明のアブラナ科根こぶ病防除材はハクサイを始め各種のアブラナ科作物の根こぶ病の防除に有効であることが判る。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のアブラナ科根こぶ病防除材は化学農薬のような環境上の問題を引き起こすことがなく優れた防除効果を発揮する。