(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元反応を利用した体液中の成分測定において、試料中のアスコルビン酸の影響を回避するために、アスコルビン酸酸化剤のヨウ素酸塩と共に、該アスコルビン酸酸化剤の補助剤として、リン酸化合物、ほう酸化合物、クエン酸化合物、リンゴ酸化合物、酒石酸化合物、及びシュウ酸化合物から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加することを特徴とする、アスコルビン酸影響回避の方法。
【請求項２】
酸化還元反応を利用した体液中の成分測定において、試料中のアスコルビン酸の影響を回避するために用いられる、アスコルビン酸酸化剤のヨウ素酸塩と、該アスコルビン酸酸化剤の補助剤として、リン酸化合物、ほう酸化合物、クエン酸化合物、リンゴ酸化合物、酒石酸化合物、及びシュウ酸化合物から選ばれた少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする、アスコルビン酸影響回避のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酸化還元反応（以下、レドックス反応と呼称する場合もある）を利用して体液中の物質を測定する際に、体液中に含まれるアスコルビン酸（以下、ＡｓＡと略する）が測定値に与える影響を少なくする方法と、それに用いる組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡｓＡは、食物中に天然に存在するビタミンであり、人体にとって必要不可欠のものであるが、人の体内では生合成されないため、野菜や果物から摂取している。
【０００３】
ＡｓＡが欠乏すると壊血病になるために、それを予防するために、一日に５０〜６０ｍｇ摂取することが望ましいとされている。しかし、今日の健康ブームによる大量摂取や、抗生物質・風邪薬などの医薬品中に処方されたり、ＡｓＡの強い還元力により食物の酸化を防止する目的の添加物として食物に添加されることが多く、一般の人々は、必要以上に過剰摂取しがちである。
【０００４】
ＡｓＡの過剰摂取に対しては、人体には無害であるが、摂取した分だけ血液や尿中のＡｓＡ濃度が高まるため、レドックス反応を利用する体外診断薬による測定に対して妨害要因となり、結果的に誤判定となる。特に、人体にとって不必要な余剰分は尿中へ排泄されるため、尿中成分を測定する際には尿中のＡｓＡには注意を要する。
【０００５】
尿や血液などを測定する試験系において、ＡｓＡによる反応妨害を除去するための各種の方法が数多く報告されている。それらのほとんどは、目的物質の反応が進む以前にＡｓＡを酸化することによりデヒドロアスコルビン酸に変化させてＡｓＡの還元力を低下させるものである。
【０００６】
例えば、ダニンガー（Ｄａｎｎｉｎｇｅｒ）らが報告したＡｓＡ酸化酵素によるＡｓＡの除去がある（特公昭５６−３９１９８）。しかし、この方法は、ＡｓＡ酸化酵素の安定性，温度影響，高濃度のＡｓＡ試料対策に対しては問題がある。この他、鉄，コバルト，セレン，銅，水銀，ニッケル等の有機錯体などによりＡｓＡを酸化させるものが報告されている（特公平１−４１２２３、特公昭６３−６７１３９、特公昭６３−３９８７１）。しかしこれらも、高濃度にＡｓＡを含有する試料に対しては効果が薄い。
【０００７】
さらに、ヨウ素酸塩などの過酸化物による方法は、ケーファー（Ｋｏｅｖｅｒ）らによって報告されている（特公平２−４８６１）。これは比較的効果はあるものの、やはり高濃度にＡｓＡを含有する試料に対しては効果が不十分である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＡｓＡの影響を回避するための従来の方法である『ＡｓＡを酸化させて除去する方法』の効果を向上させることである。それに伴って、従来のままでは十分な効果を得られない高濃度ＡｓＡに対しても、その効果を上げることにより測定対象物を満足に測定することもまた、本発明の目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、レドックス反応を利用した体液中の成分測定において、試料中のＡｓＡの影響を回避するために通常使用されるＡｓＡ酸化剤のヨウ素酸塩と共に、補助剤として、水素結合におけるプロトン受容基を２個以上有する一定の化合物を添加すれば解決できる。
【００１０】
すなわち本発明は、ＡｓＡ酸化剤の効果を向上させるために、一定のＡｓＡ酸化剤と共に、一定の補助剤を添加することを特徴とするＡｓＡ影響回避の方法である。
【００１１】
それらの補助剤となる物質（以下ＡｓＡ耐性補助剤と呼称することもある）は、リン酸化合物，クエン酸化合物，ほう酸化合物のような、水素結合におけるプロトン受容基を２個以上もつ物質である。その水素結合におけるプロトン受容基の好ましい例は、水酸基（−ＯＨ）か又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。
【００１２】
これら補助剤は、ＡｓＡ影響を回避させるために単独で添加しても、ＡｓＡを回避する効果は得られない。しかし、本発明者らは、ＡｓＡを酸化させるに適当な酸化還元電位をもつヨウ素酸のようなＡｓＡ対策用の酸化剤中へこれらを適当量添加することにより、効果を上げることを発見した。
【００１３】
つまり、グルコース，潜血，コレステロール，トリグリセライド，トランスアミナーゼ，尿酸，乳酸脱水素酵素，クレアチンホスホキナーゼ等を定量する際に、測定の誤差を与えやすいＡｓＡの影響を少なくすることができる。本発明は、低濃度・中濃度のＡｓＡの影響は言うに及ばず、非常に高濃度（一般的には、１００ｍｇ／ｄｌ以上とされている）のＡｓＡにも影響を受けない。
【００１４】
これらの効果の理由について、原因は明確にされてはいないものの、次のような作用が考えられる。
【００１５】
試料測定においては、脱酸素を目的に、ＡｓＡの還元力と発色剤（たとえばクロモーゲン）との反応が競合的に進む。ＡｓＡの酸化は一般的に発色剤の酸化より速いために、発色剤の発色阻害として試験系に出現する。よって、ＡｓＡの酸化よりも酸化反応の速い発色剤を使うことがひとつの方策だが、ＡｓＡほど酸化速度の速い発色剤は少ない上に、目標とする耐性も得られなかった。
【００１６】
ＡｓＡは水に溶かす際、３位のＯＨ基のＨ＋がはずれて水溶液となり、水溶液が酸性を示すことが知られている。このとき、２位のＯＨ基からはＨ＋を放出しない。一方、還元作用に関与する原因は、２位のＨ＋放出による（図３を参照のこと）（ＦＯＯＤＳ  ＆  ＦＯＯＤ  ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳ  ＪＯＵＲＮＡＬ
Ｎｏ．１５８−１９９３，３０−４１）。
ここで、本発明の補助剤となる物質の種類の検討を行った際、種類によりＡｓＡの影響度合いの変わるものがあった。たとえばリン酸化合物を添加した場合、ＡｓＡの影響度合が大きく減少することを見い出した。本発明は、その発見をさらに追求して完成されたものである。
【００１７】
原因としては、リン酸化合物のようにＯＨ基を二個以上持っており、構造的に立体障害もなく、その二個のＯＨ基間の間隔と、ＡｓＡの２，３位のＯＨ基間の間隔が近い物質が、水溶液中でＡｓＡの２，３位のＯＨ基の間に弱い水素結合をするためと考えられた。リン酸化合物であれば、Ｐのまわりの二つの「＝０」がプロトン受容基となる。
水素結合については、水の沸点が分子量に比べ異常に高いことで示されるように、Ｈ−Ｏの分子間や、Ｈ−Ｎの分子間や，−Ｏ−Ｈとπ電子間で起こる弱い結合である。
【００１８】
本発明は、上記発見に係わる物質を、ＡｓＡ耐性補助剤へ応用したものである。つまり、試薬系にＡｓＡ耐性補助剤として、特定の緩衝液を加えておけば、ＡｓＡの混入した試料が入ってきた際、まずＡｓＡと耐性補助剤が弱い水素結合をし、そのために本来ＡｓＡがもっている還元作用が一時的に遅れ、この間に目的とする主なる反応が進む。
【００１９】
なお、耐性補助剤として例をあげたものは、殆どが溶液状態で強い緩衝能を有していることから、緩衝剤の形として反応系へ添加・導入すればよい。しかし、これら緩衝剤は多量に試薬中に処方すると、反応速度を遅くしてしまうことから得策ではない。そこで、緩衝剤としては、少量で緩衝作用の強いＧｏｏｄ’ｓ緩衝液を用いることが望ましい。
【００２０】
本発明は、液系でも乾式でも作動する。グルコース測定を例に挙げれば、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼが関連する反応系では、溶液中で同様の方法を試みても、効果は一応あるものの、顕著な効果は現れない。これは、上記反応系では、反応途中に酸素が必要な過程があるためである。つまり溶液状態では酸素供給源が少ないために目的の反応（水素結合）が微妙に遅くなり、結果的にＡｓＡと脱酸素競合反応に打ち勝つことができないことによる。
よって、反応系に酸素が必要な系に限っては、本発明の方法及び組成物は、酸素が十分に供給される乾式試薬（いわゆるドライアッセイ）で特に有効である。もちろん、反応系に酸素を必要としない反応、或いはごく少量の酸素でよい反応（グルコース測定を例にとれば、ＡＴＰとグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを使用する反応系）については、液系でも乾式でも問わない。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明による組成物を乾式試薬へ加工した際の実験例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
尿中グルコース量を測定する試験系（グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼが関連）を組み、以下のような処方で試薬を調製し濾紙に含浸させて試験片とし、評価した。
評価は、比較例にＡｓＡ耐性補助剤を添加しないものを作製し、実施例１〜３において３種のＡｓＡ耐性補助剤を添加したものを作製し、比較評価した。図１と２に比較のグラフを示す。
【００２３】
【比較例】
●ＡｓＡ耐性補助剤を添加しない場合
（試薬Ａの処方）
０．２Ｍ−ＡＤＡ（※），ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）    １００ｍｌ
ヨウ素酸ナトリウム                                      ３００ｍｇ
１−ナフトール−３，６−ジ  スルホン酸２ナトリウム      ２．０ｇ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤと略）                          ４万  Ｕ
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤと略）                  １６万  Ｕ
※注：Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄの略称であり、Ｇｏｏｄ’Ｓ緩衝液の一種。以下同じ。
（試薬Ｂの処方）
エタノール                            １００ｍｌ
４−アミノアンチピリン                ２．０ｇ
酢酸タリウム（※）                    １．０ｇ
※注：酢酸タリウムは、ＡｓＡを処理した際に発生するＩ２対策として添加する。
●作製方法
ｉ）原反作製
まず、試薬Ａを３０×２０ｃｍワットマン濾紙３ＭＭＣｈｒに含浸させた後、すばやく５０℃の乾燥炉（相対湿度；ＲＨ５％）に入れ、微風で１５分間乾燥させた。次に、乾燥の終わった濾紙に試薬Ｂを含浸させ、さらに同条件で１０分間乾燥させた。
ｉｉ）試験片への加工
乾燥の終わった上記原反の片面に両面テープを貼り付け、５ｍｍ幅に裁断し５ｍｍ幅の短冊を得た。これを、厚さ１８８μｍの白色ＰＥＴフィルムの先端に貼り付け、さらに、５ｍｍ幅に裁断した。こうして５ｍｍ×７０ｍｍのＰＥＴフィルムの先端に５ｍｍ×５ｍｍの試験片がついたものを作製した。
ｉｉｉ）測定
グルコース濃度が１００，５００ｍｇ／ｄｌの水溶液溶液に、ＡｓＡを０，２０，５０，１００，２００ｍｇ／ｄｌの各濃度となるように添加したものを用意し、作製した試験片へ８μｌ点着後の発色を測定した。
測定は、色差計Σ９０（日本電色製）を用い、測定は、点着後１分後の反射率を、４００ｎｍから７００ｎｍの波長まで求めた。比較するデータは、５６０ｎｍにおける波長を用いて比較した。
ｉｖ）測定結果；表１に示す。（単位；反射率（％））
【表１】
0003574937.tif 000002
【００２４】
【実施例１】
0003574937.tif 000003
【表２】
0003574937.tif 000004
【００２５】
【実施例２】
0003574937.tif 000005
【表３】
0003574937.tif 000006
【００２６】
【実施例３】
0003574937.tif 000007
【表４】
0003574937.tif 000008
【００２７】
以上の実施例の結果では、各グルコース濃度（１００，５００ｍｇ／ｄｌ）においてＡｓＡ濃度が変化した際の反射率の変化を示している。反射率が低いほど、発色剤が正常に発色することを示す。
ＡｓＡの影響を受けない理想的な状態では、ＡｓＡの濃度が高くなっても反射率の変化はない。しかし、実際にはＡｓＡの還元力により、濃度が高くなると試験片の反射率が順次高くなって現れる。
比較例においては本発明による処理を施していないため、グルコース濃度が１００ｍｇ／ｄｌの溶液でＡｓＡ濃度が１００ｍｇ／ｄｌ以上になると発色をしないことが判る。一方実施例１〜３においては、耐性補助剤を添加しているため、グルコース濃度１００ｍｇ／ｄｌの溶液でＡｓＡ濃度が２００ｍｇ／ｄｌ以上でも反射率が低く、発色剤が正常に発色していることが判る。
図１，２に比較例と実施例１〜３までを同時に示すが、比較例に比べて実施例１〜３の耐性補助剤の追加効果が現れていることが判る。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の補助剤を用いると、従来の酸化剤を用いてＡｓＡの妨害を回避する方法の効果を上げることができ、酸化剤のみでは十分に除去できなかった高濃度ＡｓＡの妨害に対しても、確実な測定を行うことができる。
【００２９】
【図面の簡単な説明】
図１は、比較例と実施例１〜３において、グルコース濃度１００ｍｇ／ｄｌの溶液に関してアスコルビン酸の影響を示すグラフである。
図２は、比較例と実施例１〜３において、グルコース濃度５００ｍｇ／ｄｌの溶液に関してアスコルビン酸の影響を示すグラフである。
図３は、アスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸に変化する際の模式図である。
【図１】
0003574937.tif 000009
【図２】
0003574937.tif 000010
【図３】
0003574937.tif 000011