(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡを酵母に導入し、これを発現せしめること、を特徴とする高アルコール生産酵母の育種法。
【請求項３】
該ＤＮＡが変異ＰＤＲ３遺伝子のＤＮＡを包含するものであること、を特徴とする請求項２に記載の育種法。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列で示されるＤＮＡを含有してなること、を特徴とするプラスミドベクター。
【請求項５】
プラスミドベクターがｐＡＵＲ１０１−変異ＰＤＲ３であること、を特徴とする請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のプラスミドベクターで酵母を形質転換してなる、形質転換高アルコール生産酵母。
【請求項７】
形質転換高アルコール生産酵母、Ｋ１０−ＰＤＲ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９４０）。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の酵母を使用して高アルコール酒類を製造すること、を特徴とする高アルコール酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の育種に関し、更に詳細には、清酒その他酒類製造工程のもろみでアルコールを高生産する高アルコール生産酵母の育種に関するものである。また本発明は、このような酵母の育種の他、それによって分離した酵母及び当該酵母を使用することによるアルコール含量の高い酒類（清酒、ブドウ酒、各種醸造酒、焼酎等蒸留酒製造用もろみ、アルコール製造用もろみ等をすべて包含する。）の効率的製造に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
これまでに、アルコールを高生産する高アルコール生産酵母を分離した育種例が知られてはいるが、今回本発明者らに係る変異ＰＤＲ３遺伝子を利用してアルコールを高生産する新規清酒酵母の育種に成功した例は従来全く報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
醸造酒製造において、より多くのアルコールの取得と、製造期間の短縮は、解決すべき課題として従来より重要視されているものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、短期間で多くのアルコールの収得を達成する目的でなされたものである。そこで本発明者らは、より短期間で多くのアルコールの収得量の増加を目的とし、その目的達成のために発酵速度を増大させた生産酵母の育種という新規な技術的課題を設定した。
【０００５】
上記目的達成のため、各方面から検討の結果、本発明者らが先に発明し、既に特許権が付与されたトリコセシン耐性清酒酵母（特許第３０６９６７９号）について研究をすすめ、改めてその多剤薬剤耐性に着目して更に鋭意検討した結果、高アルコール生産が、変異ＰＤＲ３遺伝子に起因するものであることをはじめてつきとめた。
【０００６】
本発明は、上記した新規にして有用な知見を基づき更に研究の結果完成されたものであって、特定の遺伝子を用いて、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母の中から、高アルコール生産を示す酵母を分離、育種する点を基本的技術思想とするものである。そして、特定遺伝子としては変異ＰＤＲ３遺伝子が挙げられる。
【０００７】
すなわち本発明は、多剤薬剤耐性に関与する遺伝子が高アルコール生産に大きく寄与していることを更に発見し、これら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成されたものであって、変異ＰＤＲ３遺伝子の導入による高アルコール生産となった酵母の効率的選択、同酵母の創製を包含する酒類を創製するトータルシステムにも関与するものである。
【０００８】
本発明においては、目的とする高アルコール生産酵母は、変異ＰＤＲ３遺伝子を導入した酵母から分離すればよいので（ポジティブセレクション）、分離作業が容易かつシンプルであり、この点においても本発明の育種方法は優れている。
【０００９】
本発明を実施するには、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母を用い、変異ＰＤＲ３遺伝子を導入し、変異ＰＤＲ３遺伝子が導入された株を選択、分離する。このようにして、目的とする高アルコール生産酵母が得られる。
更に、所望するのであれば、これら酵母を用いて小仕込試験を行い発酵力のよい酵母を分離すれば、発酵力のすぐれた高アルコール生産性実用酵母を選択、育種することができる。
【００１０】
本発明の実施は、遺伝子工学の常法にしたがって行えばよく、例えば、変異ＰＤＲ３遺伝子をＰＣＲ法等によって増幅した後ベクターに導入し、得られた発現プラスミドをリチウムクロライド法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等の常法にしたがって酵母等の宿主菌に導入し、得られた形質転体をベクター中のマーカーを利用したり、選択培地を利用したりしてスクリーニングすればよい。
【００１１】
変異ＰＤＲ３遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する協会１０号酵母よりトリコセシン耐性となり高アルコール生産となった酵母（例えば、Ｋ−１０  Ｔｒｉ８株：工業技術院（現、産業技術総合研究所）生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６０４０として寄託）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅させるほか、上記株のゲノムＤＮＡから直接切り出してもよい。このようにして得られた変異ＰＤＲ３遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１（図１、図２、図３、図４）に示す。変異ＰＤＲ３遺伝子は、ＰＤＲ３遺伝子の３アミノ酸をコードするコドンに変異がひき起こされていることがはじめて判った。すなわち、２２３３番目〜２２３５番目のコドンＴＴＧがＴＣＧに変異し（５５３番目のアミノ酸ロイシン→セリン）、２３１４番目〜２３１６番目のコドンＡＡＡがＧＡＡに変異し（５８０番目のアミノ酸リジン→グルタミン酸）、３４３３番目〜３４３５番目のコドンＴＴＴがＴＴＡに変異している（９５３番目のアミノ酸フェニルアラニン→ロイシン）。
【００１２】
このようにして本発明者らは、すぐれた高アルコール生産酵母を育種するのに成功し、その内の１株をＫ１０−ＰＤＲ３と命名し、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７９４０として寄託した。
【００１３】
本発明において、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母、明利小川酵母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、ビール酵母、パン酵母等の実用酵母、その他アルコール発酵に常用される酵母を含めサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が有利に使用できる。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１４】
【実施例１】
（変異ＰＤＲ３遺伝子導入酵母の分離）
（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する協会１０号酵母よりトリコセシン耐性となり高アルコール生産となった酵母のＤＮＡより、プライマ−Ａ（配列番号２、図５）及びプライマーＢ（配列番号３、図６）を用いて、変異ＰＤＲ３遺伝子（配列番号１、図１〜４）をＰＣＲ法にて増幅した後、プラスミドベクターｐＡＵＲ１０１（宝酒造（株）より購入）及び増幅されたＰＤＲ３遺伝子を制限酵素Ｓａ１ＩとＸｂａＩで切断した後、ライゲーションを行い、ｐＡＵＲ１０１の中に変異ＰＤＲ３遺伝子が挿入されたものを選択して、ＰＤＲ３遺伝子を含むベクターｐＡＵＲ１０１−変異ＰＤＲ３（その制限酵素地図を図７に示す）を得た。
【００１５】
（２）サッカロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に属する協会１０号清酒酵母（Ｋ−１０）を、ＹＰＤ培地（イーストエクストラクト１％、ぺプトン２％、グルコース２％）に接種し、増殖させた後、無菌的に集菌洗浄し、変異ＰＤＲ３遺伝子を含むベクターｐＡＵＲ１０１−変異ＰＤＲ３（図７）を用いて形質転換を行い、オーレオバシジンＡ（０．０００５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーをオーレオバシジンＡ（０．０００５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に更に植え継いだ。
【００１６】
（３）すなわち、上記で得た変異ＰＤＲ３遺伝子を含む発現ベクターｐＡＵＲ１０１−変異ＰＤＲ３を制限酵素ＸｂａＩで切断した後、宝酒造（株）のＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性酵母形質転換システムの説明書にしたがい、Ｋ−１０にリチウムクロライド法により形質転換を行い、遺伝子導入酵母をオーレオバシジンＡを含むプレート上で選択した。
【００１７】
【実施例２】
実施例１で、分離したオーレオバシジンＡ耐性酵母株について、ＹＰＤ培地で培養後、シクロヘキシミド（０．０００５ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で培養し、生育した株を選択した。
【００１８】
【実施例３】
（変異ＰＤＲ３遺伝子を発現している酵母より発酵力の優れている酵母の更なる分離）
実施例２で分離した酵母株について、７０％精米の白米を使用して、下記の表１に示す仕込配合で三段仕込を行った。酵母には酵母懸濁液を用い（仕込水１ｍｌ当たり５×１０６個）、添は１５度、仲は１２度、留は９度で行い、翌日より１５度になるまで１度／日で品温を上げ、その後は１５度一定で発酵させた。発酵液中のエタノールは、振動密時計（京都電子（株））を用いて測定し、酸度は０．１Ｎ  ＮａＯＨで、アミノ酸度は０．１Ｎ  ＮａＯＨ、ホルマリン溶液（５０％水溶液）を用いて国税庁所定分析法にのっとり分析を行った。得られた清酒（上槽時）の成分を下記表２に示す。
このようにして高アルコール生産酵母を育種するのに成功した。そして本菌株をＫ１０−ＰＤＲ３と命名し、生命研にＦＥＲＭ  Ｐ−１７９４０として寄託した。
【００１９】
一例としてＫ−１０について記載したが、他の酵母からも同様の方法で変異ＰＤＲ３遺伝子導入酵母を分離することができる。
【００２０】
0003579716.tif 000002
【００２１】
0003579716.tif 000003
【００２２】
【発明の効果】
本発明によって高アルコール生産酵母の育種が可能となり、本発明によって育種された酵母を使用することによってアルコール含量の高い醸造酒、アルコール発酵もろみ等を効率よく製造することが可能となった。
【００２３】
【配列表】
0003579716.tif 000004
0003579716.tif 000005
0003579716.tif 000006
0003579716.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】変異ＰＤＲ３遺伝子のＤＮＡシーケンスを示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】プライマーＡを示す。
【図６】プライマーＢを示す。
【図７】プラスミドｐＡＵＲ１０１−変異ＰＤＲ３の制限酵素地図を示す。
【図１】
0003579716.tif 000008
【図２】
0003579716.tif 000009
【図３】
0003579716.tif 000010
【図４】
0003579716.tif 000011
【図５】
0003579716.tif 000012
【図６】
0003579716.tif 000013
【図７】
0003579716.tif 000014