(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成するアミノ酸単位の少なくとも一部の側鎖アミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンの糖尿病もしくは糖尿病合併症用マーカーとしての使用。
【請求項２】
マーカーが、診断用もしくは薬効評価用マーカーである請求項１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は糖尿病または糖尿病合併症用マーカーの使用に関する。更に詳しくは、特定の置換基を有するタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸から成る糖尿病または糖尿病合併症用マーカーの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のタンパク質はグルコースと非酵素的に反応して糖化され、糖化タンパク質となることが知られている。該糖化反応はメイラード反応と呼ばれ、前期段階および後期段階の反応に分けられる。前期段階の反応は、タンパク質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基と糖のカルボニル基が反応し、シッフ塩基を経由してアマドリ転位化合物を生成するまでとされている。該前期段階反応生成物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃや糖化アルブミン等が知られており、糖尿病の臨床マーカーとして用いられているのは周知の事実である。
【０００３】
また、上記前期段階反応の後、生成したアマドリ転位化合物は２つの方向に変化することが知られている。１つは、蛍光性、褐色変化、或いは分子内または／および分子間架橋形成のうちの少なくとも１つを伴う反応（以下、「後期段階反応Ａ」とも言う。）であり、もう１つは、酸素と遷移金属が関与する酸化的開裂反応（以下、「後期段階反応Ｂ」とも言う。）である。
【０００４】
ところで、メイラード反応の最終生成物をＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼ぶこともあるが、該ＡＧＥという用語は一般に上記の後期段階反応Ａに見られる３つの特徴的な現象（蛍光性、褐色変化、或いは分子内または／および分子間架橋形成）の少なくとも１つを伴う反応生成物を総称するものとして使用されることが多く、上記３種類の現象のすべてを伴わない反応によって生成したものまでを含めてＡＧＥと呼ぶか否かについては意見の分かれるところである。即ち、ＡＧＥの定義に関しては、上記定義以外にも、インビトロでグルコースとタンパク質を３７℃で６０日以上インキュベーションしたとき（メイラード反応のモデル反応）の生成物すべてをＡＧＥとするという説や該生成物のうち糖尿病合併症を発症させるような生物学的活性を有するもののみをＡＧＥとするという説等があり、学会においてもその定義が統一されていないのが現状である。本明細書においては、上記のような混乱を避けるため、ＡＧＥという語を使用する場合には、メイラード反応のうち蛍光性、褐色変化或いは分子内または／および分子間架橋形成のうちの少なくとも１つを伴う反応生成物（即ち、後期段階反応Ａの生成物）のみを指してＡＧＥと称する。
【０００５】
上記後期段階反応Ａの生成物、即ちＡＧＥは、複数の化合物の集合体であると考えられている。現在のところ、ＡＧＥの構造体としては、ピラリン、ペントシジン、クロスリンＡ＆Ｂ、或いはＸ１等が提唱されており、これらの定性、定量は蛍光強度の測定、或いは抗原抗体反応により行われている。また、ＡＧＥを生成する後期段階反応Ａに関しては、該反応が生体内で起こり、血管障害合併症の発症に関与しているとの報告がなされ（Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ３１４，ｐ４０３，１９８６）、ＡＧＥは糖尿病患者における合併症の発症と進展に関与するものとして注目されるようになっている。そして、ＡＧＥには糖尿病合併症の発症と進展に関与する生物学的活性があるという報告もなされている（森崎ら、最新医学、第４９巻、２４８頁、１９９４年）。
【０００６】
一方、メイラード反応の後期段階のもう一つの反応（後期段階反応Ｂ）生成物については、Ｎ−ε−カルボキシメチルリジン（ε位のアミノ基がカルボキシメチル化されたリジン。以下、「ＣＭＬ」と略すこともある。）が同定され（Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２６１，ｐ４８８９，１９８６）、老人や糖尿病患者のレンズタンパク質、皮膚コラーゲン等に存在していることが報告されている（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ３０，ｐ１２０５，１９９１）。また、牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略す。）の側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換された（以下、「ＣＭ化」と略すこともある。）ものはＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体の反応を強く阻害するとの報告もある（第５５回アメリカ糖尿病学会議抄録集ｐ１１５Ａ，１９９５）。
【０００７】
しかしながら、後期段階反応Ｂの生成物の生物学的活性についての報告例はなく、また、糖尿病患者、或いは腎症や網膜症等の合併症を発症している糖尿病患者（以下、「糖尿病合併症患者」ともいう。）と健常者における生体内、特に体液中の後期段階反応Ｂ生成物濃度の違い等も明らかにはなっておらず、その使用において有効性、特に糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用の有効性は認識されていなかった。即ち、ＡＧＥを糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとして使用する有効性は、最近、明らかになりつつあるが、ＣＭＬ、ＣＭ化タンパク質またはＣＭ化ペプチド（以下、単に「ＣＭＬ等」ともいう。）の糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとして使用する場合、その有効性は認識されていなかった。更に、これらの物質が糖尿病合併症の原因物質か、或いは糖尿病合併症により蓄積した物質かも明確ではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、後期段階反応Ｂの生成物が糖尿病合併症の一原因物質ではないかと考え、該生成物がＡＧＥと同様の生物学的活性を有し、また、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者の生体内、特に体液中において該生成物濃度に有意な差が認められるのであれば糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとして使用できるのではないかと考えた。従って、本発明の課題
（目的）は、ＣＭＬ等がＡＧＥと同様の生物学的活性を有することを確認し、更に、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者の間で、生体内、特に体液中のＣＭＬ等濃度に有意な差が認められることを確認し、ＣＭＬ等が糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとなりうることを実証すること、換言すればＣＭＬ等の新規な用途を見出すことである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＭＬ等はＡＧＥと同様の生物学的活性を有し、更に、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者の間で、血液中のＣＭＬ等濃度に有意な差が認められることを確認し、糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとして有効に使用できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、構成するアミノ酸単位の少なくとも一部の側鎖アミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンの糖尿病もしくは糖尿病合併症用マーカーとしての使用である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に述べるが、本発明で使用する物質、製法は下記に限定されるものではない。
【００１２】
本発明で用いるタンパク質としては特に限定されず、例えばアルブミン、ヘモグロビン、β２ミクログロブリン、ヒストン、プロラミン等の単純タンパク質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタンパク質等のリポタンパク質、トランスフェリンやセルロプラスミン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が挙げられる。
【００１３】
また、本発明で用いるペプチドとしては、オリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上記タンパク質の分解産物、上記タンパク質の特定の領域を人工的に合成したもの、前駆体タンパク質から限定加水分解によって生合成されたもの等が挙げられる。
【００１４】
上記タンパク質もしくはペプチドを構成するアミノ酸の側鎖アミノ基またはリジンの側鎖アミノ基をカルボキシメチル化（ＣＭ化）する方法、即ち、上記各アミノ基の水素を−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基に置換する方法は、公知の方法が何ら制限無く使用される。例えば「新生化学実験講座１、タンパク質４」（日本生化学会編、第１３〜１６頁、東京化学同人、１９９１年３月２０日発行）に記されている還元アルキル化法のように、グリオキシル酸（ＣＨＯ−ＣＯＯＨ）の如きアルデヒド化合物とタンパク質またはペプチドをホウ酸緩衝液やリン酸緩衝液等の水溶液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下でｐＨ８〜１０で反応させればよい。これより高いｐＨだとタンパク質等が変性する恐れがあり、これより低いｐＨだと水素化物還元剤が不安定になる。該反応を特異的、且つ定量的に進行させるために、反応温度は０〜１０℃で行うのがよい。得られたＣＭ化されたタンパク質またはＣＭ化されたペプチドは一般に水に可溶で、アセトン、アルコール、硫酸アンモニウム、重金属塩等の添加で沈澱する。また、上記のＣＭ化されたタンパク質またはＣＭ化されたペプチドの検出には、アミノ基を検出する方法以外の既知の方法であれば良く、例えば紫外吸収法、色素結合法、フェノール試薬法等が挙げられる。なお、上記方法においては一般に、タンパク質、脂質、糖質等、アミノ基の存在する物質はＣＭ化されやすいが、タンパク質もしくはペプチドにおいては、リジンの側鎖或いはＮ末端が選択的にＣＭ化されやすい。特に、タンパク質もしくはペプチド１分子にＮ末端のアミノ基は１つしか存在しないが、リジンの側鎖アミノ基は複数個存在する場合が多く、カルボキシメチル基をタンパク質もしくはペプチドにより多く導入するためには該タンパク質もしくはペプチドを構成するアミノ酸がリジンであることが好適である。
【００１５】
また、ＣＭＬについては、リジンを原料として上記のようなＣＭ化を行って得ることもできるが、上記方法で得られたＣＭ化タンパク質もしくはＣＭ化ペプチドを強酸を用いて加水分解することによって得ることもできる。
【００１６】
このような方法によって得られたＣＭＬ等は、透析、遠心濃縮、或いは液体クロマトグラフィー等によって精製した後に、生物学的活性の測定に供される。
【００１７】
ＣＭＬ等が糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとなり得るか否かは、上記方法で得られたＣＭＬ等を生体或いは生体成分に作用させたときに、腎症、網膜症、動脈硬化症等の糖尿病合併症が発症するか否かで判断することができる。例えば、モデル細胞にＣＭＬ等を作用させ、腎症や動脈硬化症の一因とされている毛細管の閉塞促進に関与している凝固能、網膜症の発症と進展に関与している透過性等を測定すればよい（森崎ら、最新医学、第４９巻、２４８頁、１９９４年）。
【００１８】
凝固能を測定するためには、例えば線溶能を有する内皮細胞のトロンボモジュリンの活性を測定すればよい。該活性の測定には、ＣＭ化したタンパク質を内皮細胞に作用させた後、トロンビンとプロテインＣを添加し、生成した活性化プロテインＣを測定する等の公知の方法が問題なく使用される。
【００１９】
透過性を測定するためには、例えばＣＭ化したタンパク質の内皮細胞への取り込み量を測定すればよく、標識したＣＭ化したタンパク質を内皮細胞に添加して培養し、内皮細胞に取り込まれた該ＣＭ化したタンパク質量を測定する等の公知の方法が用いられる。
【００２０】
後述する実施例にも示されるように、本発明で使用するＣＭＬ等は上記のような測定において生物学的な活性を示す。更に、糖尿病患者や糖尿病合併症患者の体内に存在するＣＭＬ等の濃度は健常者のそれに比べて有意に高かったことから（図２参照）、本発明で使用するＣＭＬ等は、臨床検査の領域において、糖尿病または糖尿病合併症のマーカーとなりうる。即ち、腎糸球体やコラーゲン等の組織、或いは尿、血液等の体液中のＣＭＬ等の濃度を測定することにより、糖尿病にかかっているか否かを判断したり、糖尿病の進行度合いや糖尿病合併症発症の可能性を予測したりすることが可能となる。
【００２１】
生体内のＣＭＬ等の濃度（例えば、血液中や尿中のＣＭ化タンパク質濃度）を測定する方法は特に限定されず、ＣＭＬ等を検出する公知の方法が任意に採用できる。検出方法を例示すれば、抗原抗体反応にて生体内のＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチドを検出する方法、液体クロマトグラフィーにてＣＭＬ等を検出する方法、ＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチドを加水分解して液体クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭＬを検出する方法、ＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチドを加水分解してガスクロマトグラフィー／質量分析にてＣＭＬを検出する方法等が挙げられる。
【００２２】
かかるＣＭＬ等は糖尿病または糖尿病合併症の罹患の有無あるいはその程度等を判定、予測する診断用マーカーとして使用できる。また、糖尿病または糖尿病合併症の予防薬あるいは治療薬等の薬効の評価用マーカーとして使用できる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明で使用されるＣＭＬ等は糖尿病合併症の発症と進展に関与していることが明確になったので、該ＣＭＬ等は、臨床検査の領域において糖尿病または糖尿病合併症の新規な臨床マーカーとして使用できることが明らかとなった。このことは、糖尿病または糖尿病合併症の診断において、上記新規マーカーを利用した新たな診断システムの構築の可能性を意味するものであり、その工業的意義は大きい。
【００２４】
【実施例】
以下に本発明をより具体的に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
タンパク質の側鎖アミノ基をＣＭ化するために、ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、シグマ社製）１ｍｌに、ｐＨ９に調整した０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２時間放置した。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更に１２時間放置した。
【００２６】
また、対象として、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法でヒト血清アルブミンを処理した。
【００２７】
上記の各処理後のヒト血清アルブミンのＣＭ化率を、未反応アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸（以下ＴＮＢＳと略す）を用いて次のような方法により測定して求めた。
【００２８】
即ち、前記各試料０．５ｍｌを０．１Ｍの四ほう酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌに各々加えた。次いで、再結晶化し、希塩酸で洗浄した１．１ＭのＴＮＢＳを２０μｌ加え、攪拌した。３０分後に１．５ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定したところ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンの吸光度は０．０３であり、グリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミン（対象）の吸光度は１．２５であった。上記のいずれのヒト血清アルブミンも含まない系で同様の測定を行ったところ、吸光度は０．０３であったので、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのＣＭ化率は１００％であることが解った。
【００２９】
かかる方法で得られたＣＭ化ヒト血清アルブミンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４℃にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、血液凝固能の亢進、即ち毛細管の閉塞促進を調べるためにトロンボモジュリン活性の測定に供された。測定は、次のようにして行った。
【００３０】
セミコンフルエントなヒト動脈内皮細胞（大日本製薬社製）に１０μＭになるように上記のＣＭ化ヒト血清アルブミンを添加し、３７℃で２０時間培養した。この培養したヒト動脈内皮細胞をアール平衡塩溶液で洗浄した後、１Ｕ／ｍｌとなるようにトロンビン、および１ｍｇ／ｍｌとなるようにプロテインＣを加え、更に３７℃で１５分間培養した。このヒト動脈内皮細胞を含む培養液にアンチトロンビンＩＩＩを加え、活性化プロテインＣの形成を停止した後に、リジン−プロリン−アルギニン−パラニトロアニリドから成る基質を１ｍＭになるように添加した。５分後、および１０分後の４０５ｎｍの吸光度を測定し、その吸光度差を求めた。動脈内皮細胞由来のタンパク質１ｍｇ当たりの吸光度差は、後述する比較例１で求めた吸光度差を１００％とすると、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのそれは６０％であった。
【００３１】
このことは、ＣＭ化ヒト血清アルブミンがトロンボモジュリン活性を４０％低下させることを表し、ひいては線溶能の低下、即ち血液凝固能の亢進により毛細管の閉塞を促進させることを意味する。また、後述する参考例１に示すように、参考例１で得られたＡＧＥはトロンボモジュリン活性を８０％低下させることから、本ＣＭヒト血清アルブミンは、該ＡＧＥと同様の毛細管の閉塞促進性を有することが明らかである。
【００３２】
比較例１
実施例１で作製したグリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミン（対象）を実施例１と同様の方法で透析した後、実施例１と同様にしてトロンボモジュリン活性の測定を行った。このときの５分後の４０５ｎｍの吸光度と１０分後の４０５ｎｍの吸光度の差は０．９１５であり、この値を１００％とした。
【００３３】
参考例１
０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに６０ｍｇのヒト血清アルブミンと１．７Ｍのグルコースを加え、０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌した後、３７℃で３ヶ月間放置し、ＡＧＥを得た（蛍光性、褐色変化、および分子内或いは分子間架橋形成を確認している。）。実施例１においてＣＭ化ヒト血清アルブミンの代わりに上記方法で得たＡＧＥを用いたこと以外は、すべて同様の方法でトロンボモジュリン活性の測定を行った。
【００３４】
その結果は、比較例１で求めた吸光度差を１００％としたときの上記ＡＧＥのトロンボモジュリン活性に基づく吸光度差の相対比は２０％であった。これは、ＡＧＥがトロンボモジュリン活性を８０％低下させることを表している。
【００３５】
実施例２
タンパク質であるヒトトランスフェリンの側鎖アミノ基をＣＭ化するために、ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン（和光純薬工業（株）社製）１ｍｌに、ｐＨ９に調整した０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２時間放置した。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更に１２時間放置した。また、対象として、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法でヒトトランスフェリンを処理した。
【００３６】
上記ＣＭ化ヒトトランスフェリンおよびグリオキシル酸処理をしていないヒトトランスフェリンをそれぞれ０．２ｍｌのバイオライト（レンジｐＨ３−１０、バイオラッド社製）、３ｍｌのグリセロールおよび６．８ｍｌの蒸留水から成る水溶液で５倍に希釈し、各希釈液の内の１０μｌをそれぞれ等電点電気泳動に使用した。等電点電気泳動はｐＨ３−１０用の市販ゲル（テフコ社製）にて、陰極液に０．０５Ｍの水酸化ナトリウム、陽極液に０．０１Ｍのリン酸を使用して、１００Ｖで３０分、２００Ｖで３０分、５００Ｖで６０分泳動した。電気泳動の結果、ＣＭ化ヒトトランスフェリンの等電点は４．６〜４．９であり、グリオキシル酸処理をしていないヒトトランスフェリンの等電点は５．２〜５．５であった。この結果は、上記ＣＭ化処理によってヒトトランスフェリンの側鎖アミノ基にカルボキシメチル基が導入されていることを示唆している。
【００３７】
かかる方法で得られたＣＭ化ヒトトランスフェリンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４℃にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、単球への透過性（網膜症の発症及び進展に関与している）を測定するために、取り込み量の測定に供された。該取り込み量の測定は、次のような方法によって行った。
【００３８】
マウスの単球由来の細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を２×１０５個ずつ１２穴プレートに播き、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３７℃にて１８時間培養した。次いで培地を除去した後、リン酸緩衝液で１回洗浄し、３％のＢＳＡを含む１ｍｌのＤＭＥＭ培地に交換した。３７℃にて１時間培養した後に、１２５Ｉで標識したＣＭ化ヒトトランスフェリンを１０μＭになるように添加し、更に３７℃で１２時間培養した。１２５Ｉで標識したＣＭ化ヒトトランスフェリンは、２．５μｇのＣＭ化ヒトトランスフェリン１０μｌに０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ水溶液を５μｌ加え、１５分間反応させて作製した。１２時間の培養の後、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で３回洗浄し、更にリン酸緩衝液で３回洗浄した。次いで、０．１Ｍの水酸化ナトリウム１ｍｌを加え、３７℃にて１時間培養した後に細胞を剥がして、シンチレーションカウンターで放射能を測定した。マウス単球由来のタンパク質１ｍｇ当たり０．４μｇのＣＭ化ヒトトランスフェリンがマウス単球に取り込まれた。後述する比較例２に示されるように、ＣＭ化されていないヒトトランスフェリンは単球にほとんど取り込まれず、一方、ＣＭ化ヒトトランスフェリンは単球に取り込まれたことから、ＣＭ化ヒトトランスフェリンが網膜症の発症や進展に関与している単球への透過性を亢進することが明らかになった。
【００３９】
また、後述する参考例２の結果から、本実施例のＣＭ化ヒトトランスフェリンは参考例１で得られたＡＧＥと同様、単球への透過性を亢進することが明らかである。
【００４０】
比較例２
実施例２で対象として得たグリオキシル酸処理をしていないヒトトランスフェリンを実施例２と同様の方法で透析した後、実施例２と同様の方法で単球への取り込み量を測定した結果、マウス単球由来のタンパク質１ｍｇ当たりに取り込まれたヒトトランスフェリンは０．０５μｇ以下であった。
【００４１】
参考例２
実施例２でＣＭ化ヒトトランスフェリンの代わりに参考例１で得られたＡＧＥを用いたこと以外は、すべて同様の方法で単球への取り込み量の測定を行った。その結果、マウス単球由来のタンパク質１ｍｇ当たりに取り込まれたＡＧＥは１．０μｇであった。
【００４２】
実施例３
（１）  ＣＭ化タンパク質に対する抗体の作成
体重が２ｋｇ以上のウサギに、実施例１で作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンを抗原として以下の要領で免疫した。
【００４３】
２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原溶液０．５ｍｌに、フロイントの完全アジュバント０．５ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌにフロイントの不完全アジュバント０．２５ｍｌを加えたものを追加免疫した。この間、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体が産生されたか否かを確認するために、２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血した。６週間後、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体が産生されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で確認し、全採血した。
【００４４】
（２）  アフィニティ精製カラムの作成
２５ｍｌのアフィゲル１５（バイオラッド社製）を７５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン溶液を６２．５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。次いで、未反応のヒト血清アルブミンを濾過にて除去し、１Ｍのエタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに攪拌し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングした。該ヒト血清アルブミンを固定化した支持体をカラムに詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水で洗浄した。更に、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。
【００４５】
（３）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体のアフィニティ精製
作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体を１ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したものを、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０になるまで前記リン酸緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。カラムに結合しなかった抗体をＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体として回収した。２８０ｎｍの吸光度が０になったところでリン酸緩衝液から０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラムに結合している抗体を溶離させ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収した。この操作を、更に１回繰り返し、ビオチン標識用の抗体に供された。
【００４６】
（４）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体のビオチン標識
精製した抗体のビオチン標識はプロテインビオチレーションシステム（ギブコ社製）を用いて行った。
【００４７】
精製したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈または濃縮した溶液に、０．０５Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに、説明書に従って作成した５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、０．１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液を脱塩した。更に、キット付属のＡｖｉｄｉｎ／ＨＡＢＡで導入されたビオチンのモル数を計算したところ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体１モルに対してビオチンは１４モル結合していた。
【００４８】
（５）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性
ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性は競合法ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００４９】
１μｇ／ｍｌとなるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す）で希釈したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体に、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンをそれぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５０】
ＣＭ化ヒト血清アルブミンの調製と同様の方法で、ヘモグロビン（シグマ社製）より作成したＣＭ化ヘモグロビンを調製した。該ＣＭ化ヘモグロビンを１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５１】
競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンを１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ化ヒト血清アルブミン溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、該ＣＭ化ヒト血清アルブミンをイムノプレートに固定した。１時間後、イムノプレートに結合していないＣＭ化ヒト血清アルブミンを除去し、０．５％のゼラチンを含むＰＢＳを１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヒト血清アルブミンが結合していない部分をブロッキングした。１時間後、該ゼラチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、上記濃度のＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害された抗体溶液、又は上記濃度のＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼで標識された抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。更に、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質キット（バイオラッド社製）を用いて能書に従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライした。室温で５分間放置した後、０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ加え、アルカリホスファターゼの反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表１および図１に示す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
この結果から、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体は、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのみならず、ＣＭ化ヘモグロビンでもＣＭ化ヒト血清アルブミンとＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原抗体反応が阻害されたことから、ＣＭ化ヘモグロビンとも反応性を示すことが示唆された。
【００５４】
（６）  糖尿病患者由来血液中のＣＭ化ヘモグロビンの測定
合併症を発症していない糖尿病患者１５人よりＥＤＴＡ−２Ｋを含む真空採血管にて採血した血液５０μｌを、２５０μｌの生理食塩水で１回洗浄した後、１ｍｌの精製水を加え溶血させたものを被検体とした。該患者の平均年齢は５５．７歳であった。
【００５５】
被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定はドットブロッティング法にて行った。ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン法にて測定した後、該ヘモグロビンが５００ｎｇとなるようにドットブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いてＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に吸着させた。該膜を１０％のスキムミルクを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で１時間浸せきし、該膜を取り出し、前記ビオチン標識した１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶液を５ｍｌ加えた。室温で１時間のインキュベーションの後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した。次いで、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチン複合体溶液（ベクタステインＡＢＣキット：フナコシ社製）を５ｍｌ加え、室温で１時間のインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜における発光強度の検出は、バイオラッドＧＳ−３６３モレキュラーイメージャーを用いて行った。
【００５６】
対象として市販のヘモグロビン（シグマ社製）を被検体として上記と同様の方法にてＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。その結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
また、上記市販ヘモグロビンの発光強度を１として、上記糖尿病患者由来のヘモグロビンの発光強度を、被検体１つが白抜きの丸１つに対応するように図２にプロットした。
【００５９】
実施例４
実施例３で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病の他に腎症または網膜症を併発している糖尿病合併症患者１２人から得た血液を被検体としたこと以外は、実施例３の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。その結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
上記患者の平均年齢は５６．５歳であった。実施例３と同様、上記市販ヘモグロビンの発光強度を１として、上記糖尿病合併症患者由来のヘモグロビンの発光強度を、被検体１つが白抜きの丸１つに対応するように図２にプロットした。
【００６２】
比較例３
実施例３で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病ではない健常者４７人から得た血液を被検体としたこと以外は、実施例３の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
健常者の平均年齢は５２．３歳であった。実施例３と同様、上記市販ヘモグロビンの発光強度を１として、上記健常者由来のヘモグロビンの発光強度を、被検体１つが白抜きの丸１つに対応するように図２にプロットした。
【００６５】
健常者群と実施例３で測定した糖尿病患者群の発光強度を統計学的に比較（ｔ検定）したところ、危険率５％未満で、糖尿病患者群の発光強度の方が健常者群の発光強度に比べて有意に高かった。このことは、糖尿病患者由来の血液中には、健常者由来の血液中よりも、有意にＣＭ化ヘモグロビンが多いことを意味する。
【００６６】
また、健常者群と実施例４で測定した糖尿病合併症患者群の発光強度をｔ検定にて比較したところ、危険率５％未満で、糖尿病合併症患者群の発光強度の方が健常者群の発光強度に比べて有意に高かった。このことは、糖尿病合併症患者由来の血液中には、健常者由来の血液中よりも、有意にＣＭ化ヘモグロビンが多いことを意味する。
【００６７】
上記の結果からも、ＣＭＬ等が糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用が有効であることが明確になった。
【００６８】
更に、実施例３で測定した糖尿病患者群の発光強度と実施例４で測定した糖尿病合併症患者群の発光強度をｔ検定にて比較したところ、危険率５％未満で、糖尿病合併症患者群の発光強度の方が健常者群の発光強度に比べて有意に高かった。このことからも、ＣＭＬ等が糖尿病の進行度合いや糖尿病合併症発症の可能性を判断する臨床マーカーとしても使用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性を競合法ＥＬＩＳＡにて調べた結果で、縦軸が４０５ｎｍの吸光度、横軸が各阻害剤の添加量である。
【図２】本図は、健常者と糖尿病患者、および糖尿病合併症患者の血液中のＣＭ化ヘモグロビン濃度との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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