(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成するアミノ酸単位の少なくとも一部のアミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンの透析アミロイドーシス用マーカーとしての使用。
【請求項２】
構成するアミノ酸単位の少なくとも一部のアミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンに対して特異的に反応する抗体を用いた透析アミロイドーシスの診断用もしくは薬効評価用免疫試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定のタンパク質あるいはペプチドの透析アミロイドーシス用マーカーとしての使用および透析アミロイドーシスの診断用もしくは薬効評価用免疫試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
透析アミロイドーシス（ｄｉａｌｙｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ：以下、単に「ＤＲＡ」ともいう）は、透析治療を受けている患者に合併するアミロイド沈着症であり、骨および関節構造の破壊を主病変とする。
【０００３】
近年、沈着したアミロイドの主要成分がβ２ミクログロブリン（以下、β２Ｍと略記する。）であり、β２Ｍを前駆体タンパク質とするアミロイドが関節滑膜に沈着し、手根管症候群、多発性関節炎、破壊性脊椎関節症等を発症することが明らかになった。しかし、透析アミロイドーシスの発症と血中のβ２Ｍ濃度との間に相関が無く、血中β２Ｍ濃度以外の因子の関与が示唆されてきた。このうち、β２Ｍの修飾化物が特に注目され、該修飾化物についての研究が行われている。最近、宮田らは、沈着したアミロイド中にタンパク質のメイラード反応後期生成物（以下、「ＡＧＥ」と略す。）が存在することを明らかにしており、該ＡＧＥとしてペントシジン構造およびカルボキシメチルリジン構造を有するβ２Ｍ（以下、「ＡＧＥ−β２Ｍ」と略す。）を確認すると共に、該ＡＧＥ−β２Ｍが骨や関節の障害の進展に関与している可能性を示唆した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１２４３−１２５２，１９９３および臨床透析，第１２巻，第８号：１１６３−１１７０，１９９６）。
【０００４】
しかしながら、ＤＲＡの成因と病態の詳細は完全には解明されているとはいえず、根本的な予防と治療対策は確立されていない。そのため、正確な早期診断に基づく適切な治療により病状を遅延させることが重要視されている。
【０００５】
このように、ＤＲＡを早期に診断することは極めて重要であるが、従来の診断方法は、その精度や被験者に対する負担と言う点で問題を有している。
【０００６】
即ち、従来、ＤＲＡは、主に症状を呈した部位の組織を被検体として、コンゴレッド染色によって診断されている。しかし、この診断方法は生体の身体的な苦痛、損傷を伴うという問題があった。また、臨床的には明らかにＤＲＡの症状を呈していてもコンゴレッドによって被検体が染色されない場合もあるという問題もあった。
【０００７】
そこで、近年では、より正確で且つ非侵襲的な方法として、生体内のβ２Ｍを放射性同位元素で標識してシンチレーションカメラ等でアミロイド沈着部位を画像として得ることによる診断が試みられている。しかし、この診断方法においても、標識放射性同位元素の遊離や集積等の生体への影響が大きいこと、更にはそれに対応するための操作が煩雑であること等の問題がある。
【０００８】
前記したように、ＤＲＡの発症メカニズムに関する研究もいろいろ行われているが、これら研究で得られた知見を上記診断方法の問題点を解決する新たな診断方法に応用した例は知られていない。例えば、前記の宮田らの研究でも、ＡＧＥ−β２ＭがＤＲＡの発症に関与していると考察しているにとどまり、血液、尿、リンパ液等の体液中のＡＧＥ−β２Ｍ濃度とＤＲＡ発症との相関等については調べられていないのが現状である。即ち、ＡＧＥ−β２ＭがＤＲＡ用のマーカーとして有効に使用できるのか否かは全く不明であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように、被験者に対する負担も軽く、正確且つ簡単にＤＲＡを診断できる方法は未だ開発されていなかった。従って、本発明の課題
（目的）は、上記問題点のない新たなＤＲＡ診断法方を提供することにある。より具体的には、臨床検査に比検体として常用される体液中に存在し、且つＤＲＡ発症患者と健常者の間で何らかの有意差を呈する物質を見い出すこと、さらには、該物質を検知する試薬を開発してＤＲＡを正確且つ簡単に診断できる新たな診断システムを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、一般にＡＧＥが特異な生理活性を有することに着目し、ＡＧＥがＤＲＡ用のマーカーに成り得るのではないかと考え、生体内のＡＧＥとＤＲＡの発症との関連性について種々検討を行ってきた。その結果、特定の置換基を有するＡＧＥ（すなわち、特定の置換基を有するタンパク質）についてＤＲＡ発症患者と健常者の生体内の該特定のタンパク質濃度や該特定のタンパク質１分子中に存在する特定の置換基の平均個数との間に有意の差があるという新たな知見を得、さらに、該特定のタンパク質と特異的に反応する抗体を用いた試薬によって被検体中の該特定のタンパク質の量や該特定のタンパク質１分子中に存在する特定の置換基の平均個数が簡便に測定できることを見い出して本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、構成するアミノ酸単位の少なくとも一部のアミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンの透析アミロイドーシス用マーカーとしての使用である。
【００１２】
また、別の本発明は、構成するアミノ酸単位の少なくとも一部のアミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル化ヘモグロビンに対して特異的に反応する抗体を用いた透析アミロイドーシスの診断用もしくは薬効評価用免疫試薬である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明でマーカーとして用いるタンパク質としては生体内のタンパク質であれば特に限定されず、例えばアルブミン、β２Ｍ、ヒストン等の単純タンパク質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタンパク質等のリポタンパク質、ヘモグロビン、トランスフェリン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が挙げられるが、被検者から容易に検体を採取できる体液由来のタンパク質であることが好ましい。特に、体液由来のタンパク質のうち、タンパク質としての寿命が長く、且つ血中濃度も高いヘモグロビン、或いは沈着アミロイドの主要成分であるβ２Ｍであることがより好ましい。
【００１４】
また、本発明でマーカーとして用いるペプチドとしては、生体内のペプチドであればオリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上記タンパク質の分解産物が挙げられる。
【００１５】
本発明でいうカルボキシメチル化タンパク質またはカルボキシメチル化ペプチド（以下、単に「ＣＭ化物」ともいう）とは、タンパク質あるいはペプチドを構成するアミノ酸単位の少なくとも一部のアミノ基がカルボキシメチル化（以下、単に「ＣＭ化」ともいう）されたものをいう。ＣＭ化されるアミノ基は、リジン側鎖のアミノ基や、Ｎ末端のアミノ基等が挙げられ、アミド結合中の−ＮＨ−は含まない。
【００１６】
後述する実施例にも示されるように、ＤＲＡ患者の体内に存在するＣＭ化物の量や該ＣＭ化物１分子中に存在するカルボキシメチル基の平均個数（以下、単に「ＣＭ化率」ともいう）は健常者のそれに比べて有意に高かったことから（表１、２、３参照）、本発明で使用するＣＭ化物は、臨床検査の領域において、ＤＲＡのマーカーとなりうる。即ち、生体内、特に血液中のＣＭ化物のＣＭ化率や量を測定することにより、ＤＲＡにかかっているか否かを判断したり、ＤＲＡの発症や進行度合いを予測したりすることが可能となる。なお、後述する実施例１ではＣＭ化物としてＣＭ化ヘモグロビンを使用しており、ＤＲＡ患者は人工透析を受けているためヘモグロビンの量絶対量が健常者に比べて少ないという事情があるため、検体中のＣＭ化物濃度との相関は調べていない。しかし、実施例２に示すのように、ＣＭ化β２ＭではＤＲＡ患者の検体中のＣＭ化物濃度と健常者の検体中のＣＭ化物濃度との間に良好な相関が見られる。
【００１７】
生体内（例えば、血液中や尿中）のＣＭ化物の量やＣＭ化率を直接的に測定する方法は知られていないが、ＣＭ化物を分解してＣＭ化アミノ酸得、該ＣＭ化アミノ酸の量を測定することにより間接的にＣＭ化物の量を測定する方法は既に知られている。このような間接的な測定方法を例示すれば、ＣＭ化物を加水分解して液体クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ化されたアミノ酸を検出する方法、ＣＭ化物を加水分解してガスクロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ化されたアミノ酸を検出する方法等が挙げられる。しかしながら、これら間接的な測定方法は、操作が煩雑であり感度も低いという問題があることから、測定が容易であり感度も高い直接的な測定方法が求められていた。そこで、本発明者らは、ＣＭ化物に特異的に反応する抗体（以下、単に「抗ＣＭ抗体」ともいう）を用いて抗原抗体反応にて生体内のＣＭ化物を検出する方法を開発した。
【００１８】
かかる抗ＣＭ抗体は、有機合成的手法を用い合成したＣＭ化物を免疫原（抗原）として使用することにより得られる。このようなＣＭ化物を合成するための原料となるタンパク質としては特に限定されず、例えばアルブミン、β２Ｍ、ヒストン等の単純タンパク質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタンパク質等のリポタンパク質、ヘモグロビン、トランスフェリン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が挙げられる。
【００１９】
また、ＣＭ化物の合成原料としてペプチドを使用する場合には、原料となるペプチドは、オリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上記タンパク質の分解産物、上記タンパク質の特定領域を人工的に合成したもの等が使用できる。
【００２０】
上記原料タンパク質もしくは原料ペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基をカルボキシメチル化（ＣＭ化）する方法、即ち、上記各アミノ基の水素を−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基に置換する方法は、公知の方法が何ら制限無く使用される。例えば「新生化学実験講座１、タンパク質４」（日本生化学会編、第１３〜１６頁、東京化学同人、１９９１年３月２０日発行）に記されている還元アルキル化法のように、ＣＨＯ−ＣＯＯＨで示されるアルデヒド化合物とタンパク質またはペプチドをホウ酸緩衝液やリン酸緩衝液等の水溶液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下でｐＨ８〜１０で反応させればよい。これより高いｐＨだとタンパク質等が変性する恐れがあり、これより低いｐＨだと水素化物還元剤が不安定になる。該反応を特異的、且つ定量的に進行させるために、反応温度は０〜１０℃で行うのがよい。或いは、酸素存在下で還元糖とタンパク質を無菌的に３７℃で６０日間程度インキュベーションして得ることもできる。
【００２１】
得られたＣＭ化物は一般に水に可溶で、アセトン、アルコール、硫酸アンモニウム、重金属塩等の添加で沈澱する。また、上記のＣＭ化物の検出には、アミノ基を検出する方法以外の既知の方法であれば良く、例えば紫外吸収法、色素結合法、フェノール試薬法等が挙げられる。なお、上記方法においては一般に、タンパク質、脂質、糖質等、アミノ基の存在する物質はＣＭ化されやすいが、タンパク質もしくはペプチドにおいては、リジンの側鎖或いはＮ末端アミノ基が選択的にＣＭ化されやすい。
【００２２】
この様にして合成されたＣＭ化物を抗原として抗ＣＭ抗体を得る方法は特に限定されず、宿主動物にＣＭ化物を抗原として免疫する等の方法が任意に採用できる。
【００２３】
このとき、抗原はＣＭ化物であれば特に限定されないが、抗原としてＣＭ化ペプチドを用いる場合には免疫応答を誘導する能力が弱いことがあるため、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ等、従来知られているキャリアータンパク質にＣＭ化ペプチドを結合させたものを抗原とするのが好ましい。該ＣＭ化ペプチドのキャリアータンパク質への結合には、通常、本目的で行われている方法が何ら制限なく用いられる。
【００２４】
かかる抗原を用いて作成する抗体は、その由来を特に限定されるものではなく、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットなどの宿主動物に、透析、遠心濃縮、或いは液体クロマトグラフィー等によって精製したＣＭ化物を抗原として免疫することにより得られた抗血清、腹水液等を、そのままか或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製してポリクローナル抗体として用いることができる。或いは、抗原で感作した哺乳動物の脾細胞やリンパ節細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合して得たハイブリドーマから調製したモノクローナル抗体をそのままか、或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製して用いることができる。
【００２５】
これらの抗体は、免疫試薬化するに際し、そのまま使用することもできるが、これらの抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位を含む部分）を抗ＣＭ抗体として使用しても良い。
【００２６】
本発明の免疫試薬とは、抗ＣＭ抗体とＣＭ化物の抗原抗体反応を利用し、ＣＭ化物を検知出来る試薬であればその形態は特に限定されない。例えば、後述する非競合法、競合法およびサンドイッチ法等の各方法に対応するように、抗ＣＭ抗体、β２Ｍやヘモグロビン等の生体成分に対する抗体およびＣＭ化物を適宜不溶性担体に担持した形態をとることが出来る。この様な各免疫試薬を測定方法に応じて、検体中の抗原及び／又は抗ＣＭ抗体とを接触させることによって起こる抗原抗体反応を検出することによりＣＭ化物が測定できる。この様な抗原抗体反応の検出は、本発明の免疫試薬がいわゆる免疫凝集試薬である場合には不溶性担体の凝集等を利用して検出することができるし、本発明の免疫試薬がいわゆる標識免疫測定試薬である場合には比色、発光、蛍光等の物理量の変化として検出することができる。
【００２７】
本発明の免疫試薬の具体的な態様を例示すれば、定性用の試薬としては、ラテックス凝集試薬、マイクロタイター試薬等を、定量用の試薬としては、ラジオイムノアッセイ試薬、エンザイムイムノアッセイ試薬、蛍光イムノアッセイ試薬、化学発光イムノアッセイ試薬、ラテックス定量試薬等を、それぞれ例示できる。
【００２８】
抗ＣＭ抗体または生体成分に対する抗体、或いは検体中のＣＭ化物を担持する不溶性担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すればよく、例えば、ビーズ状、テストプレート状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が例示できる。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ガラス、多糖類又はその誘導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、赤血球、プロピレン、スチレン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、又はこれらに公知の方法によりスルホン基、アミノ基などの反応性官能基を導入したものが挙げられる。
【００２９】
不溶性担体への抗ＣＭ抗体または生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原の固定化法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等の公知の方法が何ら制限なく使用できる。
【００３０】
標識免疫測定試薬におけるＣＭ化物の測定の基本操作は、通常の検定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法等の酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等に従うことができる。これら各検定法における操作、手順等は、一般に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競合法、競合法、サンドイッチ法等に準じることができる。非競合法においては、不溶性担体に検体中のＣＭ化物または抗ＣＭ抗体を担持した後に、抗ＣＭ抗体またはＣＭ化物を接触させればよい。競合法においては、例えば不溶性担体に人工的に作製したＣＭ化物を担持した後に、予め検体中のＣＭ化物と反応させた抗ＣＭ抗体を接触させればよい。サンドイッチ法においては、抗ＣＭ抗体、或いはβ２Ｍやヘモグロビン等の生体成分に対する抗体を不溶性担体に担持した後に、検体中の抗原を接触させ、更に生体成分に対する抗体、または抗ＣＭ抗体を接触させればよい。これらの測定方法により、タンパク質またはペプチドのＣＭ化率、あるいはＣＭ化物の量を測定することができる。
【００３１】
標識免疫測定試薬における標識剤としては、放射性ヨード、放射性炭素等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光物質、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素等をそれぞれ例示できる。かかる方法にて得られた抗原抗体反応生成物は放射能、比色、蛍光、発光等を利用して検出される。
【００３２】
例えば、抗ＣＭ抗体或いは検体中の抗原を不溶性担体に０．０１〜１０００μｇ／ｃｍ２の割合で担持し、０．００１〜１０００μｇの検体中の抗原或いは抗ＣＭ抗体を接触させて測定に供する。生体成分に対する抗体を不溶性担体に担持した場合には、上記したように、検体中の抗原を接触させた後、更に抗ＣＭ抗体を接触させる。不溶性担体に担持していない当該抗体は、標識剤で標識されたものを使用することが好ましい。
【００３３】
免疫凝集試薬におけるＣＭ化物の測定の基本操作は、通常の検定法、例えば赤血球凝集反応法、受身凝集反応法、免疫比蝋法、免疫比濁法等に従うことができる。例えば、粒子状の不溶性担体１ｇ当たり０．００１〜１００ｍｇの抗ＣＭ抗体を上記方法にて担持した粒子（以下、感作粒子と略す）を、０．００１〜１５重量％となるように水性媒体に分散させて免疫試薬の有効成分として使用すればよい。抗体を担持する不溶性担体の粒径は、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝集の判別のし易さなどの観点から平均粒径が０．０５〜１０μｍの不溶性担体を使用するのが好適である。かかる方法にて作成した感作粒子を検体中の抗原と接触させ、該感作粒子の凝集の度合を測定すれば良い。粒子の凝集の度合は、目視、光学的測定等従来の方法が制限なく使用できる。
【００３４】
本発明の免疫試薬を診断試薬として用いる場合は、抗ＣＭ抗体を用いて検体中のＣＭ化物濃度や該ＣＭ化物のＣＭ化率を測定する。この時、検体となる生体成分としては、例えば血液、尿、リンパ液、羊水、随液、唾液等の体液、皮膚コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックス、レンズタンパク質、動脈、腎臓等の組織等が挙げられるが、臨床検査に被検体として多用されている体液を用いる方がより好ましい。
【００３５】
また、本発明の免疫試薬を用いてＤＲＡ治療薬の投与によって、特定の生体成分に含まれるＣＭ化物の量あるいはＣＭ化率の減少度を測定すれば該治療薬の薬効を評価することもできる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明者らは、ヒト血清アルブミンのアミノ基をＣＭ化したＣＭ化タンパク質をウサギに免疫し、精製することによって抗ＣＭ抗体を得た。該抗体が認識する抗原はタンパク質の種類には依存せず、該タンパク質に付加されているカルボキシメチル基であることを確認した。さらに、該抗ＣＭ抗体は健常者の血液及び血清に比べてＤＲＡ患者の血液及び血清と有意に強く反応することを確認した。このことは、ＣＭ化物がＤＲＡの発症や進行を診断する新規な臨床マーカーとして有効に使用出来ることを示すと同時に本願発明の免疫試薬の有用性を示すものである。即ち、本発明は、ＤＲＡの診断において、上記の新規マーカーを利用した新たな診断システムを提供するものであり、その意義は大きい。
【００３７】
【実施例】
以下に本発明をより具体的に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
（１）  ＣＭ化タンパク質の作製
タンパク質のアミノ基をＣＭ化するために、ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、シグマ社製）１ｍｌに、ｐＨ９に調整した０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２時間放置した。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更に１２時間放置した。
【００３９】
また、対象として、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法でヒト血清アルブミンを処理した。
【００４０】
上記の各処理後のヒト血清アルブミンのＣＭ化率を、未反応アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸（以下ＴＮＢＳと略す）を用いて次のような方法により測定して求めた。
【００４１】
即ち、前記各試料０．５ｍｌを０．１Ｍの四ほう酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌに各々加えた。次いで、再結晶化し、希塩酸で洗浄した１．１ＭのＴＮＢＳを２０μｌ加え、攪拌した。３０分後に１．５ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、蒸留水で１０倍に希釈した後に４２０ｎｍの吸光度を測定したところ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンの吸光度は０．０３であり、グリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミン（対照）の吸光度は１．２５であった。上記のいずれのヒト血清アルブミンも含まない系で同様の測定を行ったところ、吸光度は０．０３であったので、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのＣＭ化率は１００％であることが解った。
【００４２】
かかる方法で得られたＣＭ化ヒト血清アルブミンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４℃にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、ＣＭ化タンパク質に対する抗体の作成のための免疫原として供された。
【００４３】
（２）  ＣＭ化タンパク質に対する抗体の作成
体重が２ｋｇ以上のウサギに、実施例１で作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンを抗原として以下の要領で免疫した。
【００４４】
２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原溶液０．５ｍｌに、フロイントの完全アジュバント０．５ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌにフロイントの不完全アジュバント０．２５ｍｌを加えたものを追加免疫した。この間、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体が産生されたか否かを確認するために、２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血した。６週間後、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体が産生されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で確認し、全採血した。
【００４５】
（３）  アフィニティ精製カラムの作成
２５ｍｌのアフィゲル１５（バイオラッド社製）を７５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン溶液を６２．５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。次いで、未反応のヒト血清アルブミンを濾過にて除去し、１Ｍのエタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに攪拌し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングした。該ヒト血清アルブミンを固定化した支持体をカラムに詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水で洗浄した。更に、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。
【００４６】
（４）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体のアフィニティ精製
作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体を１ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したものを、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０になるまで前記リン酸緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。カラムに結合しなかった抗体をＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体として回収した。２８０ｎｍの吸光度が０になったところでリン酸緩衝液から０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラムに結合している抗体を溶離させ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収した。この操作を、更に１回繰り返し、ビオチン標識用の抗体に供された。
【００４７】
（５）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体のビオチン標識
精製した抗体のビオチン標識はプロテインビオチレーションシステム（ギブコ社製）を用いて行った。
【００４８】
精製したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈または濃縮した溶液に、０．０５Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに、５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、０．１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液を脱塩した。更に、キット付属のＡｖｉｄｉｎ／ＨＡＢＡで導入されたビオチンのモル数を計算したところ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体１モルに対してビオチンは１４モル結合していた。
【００４９】
（６）  ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性
ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性は競合法ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００５０】
１μｇ／ｍｌとなるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す）で希釈したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体に、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンをそれぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５１】
ＣＭ化ヒト血清アルブミンの調製と同様の方法で、ヘモグロビン（シグマ社製）より作成したＣＭ化ヘモグロビンを調製した。該ＣＭ化ヘモグロビンを１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５２】
ＣＭ化ヒト血清アルブミンの調製と同様の方法で、β２ミクログロブリン（生化学工業社製）より作成したＣＭ化β２Ｍを調製した。該ＣＭ化β２Ｍを１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化β２Ｍで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５３】
競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンを１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ化ヒト血清アルブミン溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、該ＣＭ化ヒト血清アルブミンをイムノプレートに固定した。１時間後、イムノプレートに結合していないＣＭ化ヒト血清アルブミンを除去し、０．５％のゼラチンを含むＰＢＳを１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヒト血清アルブミンが結合していない部分をブロッキングした。１時間後、該ゼラチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、上記濃度のＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害された抗体溶液、又は上記濃度のＣＭ化ヘモグロビンやＣＭ化β２Ｍで阻害された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼで標識された抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。更に、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質キット（バイオラッド社製）を用いて能書に従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライした。室温で５分間放置した後、０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ加え、アルカリホスファターゼの反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１および図１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
この結果から、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体は、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのみならず、ＣＭ化ヘモグロビンやＣＭ化β２ＭでもＣＭ化ヒト血清アルブミンとＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原抗体反応が阻害されたことから、ＣＭ化ヘモグロビンおよびＣＭ化β２Ｍとも反応性を示すことが示唆された。
【００５６】
（７）  ＤＲＡ患者の血中ＣＭ化ヘモグロビンの測定
ＤＲＡ患者２０人よりＥＤＴＡ−２Ｋを含む真空採血管にて採血した血液５０μｌを、２５０μｌの生理食塩水で１回洗浄し赤血球を得た後、該赤血球に１ｍｌの精製水を加え溶血させたものを被検体とした。
【００５７】
被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定はドットブロッティング法にて行った。ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン法にて測定した後、該ヘモグロビンが５００ｎｇとなるようにドットブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いてＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に吸着させた。該膜を１０％のスキムミルクを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で１時間浸せきし、該膜を取り出し、前記ビオチン標識した１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶液を５ｍｌ加えた。室温で１時間のインキュベーションの後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した。次いで、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチン複合体溶液（ベクタステインＡＢＣキット：フナコシ社製）を５ｍｌ加え、室温で１時間のインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜における発光強度の検出は、バイオラッドＧＳ−３６３モレキュラーイメージャーを用いて行った。
【００５８】
対照として市販のヘモグロビン（シグマ社製）を被検体として上記と同様の方法にてＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。該市販ヘモグロビンの発光強度を１００として、上記ＤＲＡ患者由来のヘモグロビンの発光強度の相対値を表示した。また、発光強度の実測値も併せて表示した。測定結果を表２および図２に示す。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
比較例１
実施例１でＤＲＡ患者の代わりに、健常者２０人から得た血液を被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。実施例１と同様、上記市販ヘモグロビンの発光強度を１００として、上記健常者由来のヘモグロビンの発光強度の相対値を表示した。また、発光強度の実測値も併せて表示した。測定結果を表３および図２に示す。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
健常者群と実施例１で測定したＤＲＡ患者群の発光強度を統計学的に比較（ｔ検定）したところ、危険率５％未満で、ＤＲＡ患者群の発光強度の方が健常者群の発光強度に比べて有意に高かった。このことは、ＤＲＡ患者由来の血液中には、健常者由来の血液中よりも、有意にＣＭ化ヘモグロビンが多いことを意味する。
【００６３】
上記の結果から、ＣＭ化ヘモグロビンがＤＲＡ用マーカーとしての使用が有効であることが明確になった。
【００６４】
実施例２
実施例１でのＤＲＡ患者の血液の代わりに、該患者血清をフィルター濾過にて分子量３万以上の物質と分子量１万以下の物質を除去した溶液をを被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化β２Ｍの測定を行った。発光強度の実測値を表示した。測定結果を表４および図３に示す。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
比較例２
実施例２でＤＲＡ患者の代わりに、健常者５人から得た血清を被検体としたこと以外は、実施例２の方法に従って被検体中のＣＭ化β２Ｍの測定を行った。発光強度の実測値を表示した。測定結果を表４に示す。
【００６７】
健常者群と実施例２で測定したＤＲＡ患者群の発光強度を比較したところ、健常者血清由来の被検体では検出感度以下であったのに対し、ＤＲＡ患者群の発光強度は有意に高かった。このことは、ＤＲＡ患者由来の血清中には、健常者由来の血清中よりも、有意にＣＭ化β２Ｍが多いことを意味する。
【００６８】
上記の結果から、ＣＭ化β２ＭがＤＲＡ用マーカーとしての使用が有効であることが明確になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性を競合法ＥＬＩＳＡにて調べた結果で、縦軸が４０５ｎｍの吸光度、横軸が各阻害剤の添加量である。
【図２】本図は、健常者とＤＲＡ患者の血液中Ｍ化ヘモグロビンのＣＭ化率との関係を示すグラフである。
【図３】本図は、健常者とＤＲＡ患者の血液中ＣＭ化β２Ｍ濃度との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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