(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３´−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む発色液を牛乳と混合、反応させ、その発色度を測定することにより、牛乳の熱履歴または製造後経過日数を判定することを特徴とする牛乳の評価方法。
【請求項２】
発色液にメディエータとして２−メチル−１，４−ナフトキノンが添加されていることを特徴とする請求項１記載の牛乳の評価方法。
【請求項３】
波長４９２ｎｍにおける吸光度変化を測定することを特徴とする請求項１又は２記載の牛乳の評価方法。
【請求項４】
発色反応前後の色調変化を色彩色差計を用いてａ値の変化として測定することを特徴とする請求項１又は２記載の牛乳の評価方法。
【請求項５】
３´−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウムと２−メチル−１，４−ナフトキノンを含む発色試薬と、マイクロプレートと、マイクロピペットとを備えてなる牛乳の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、牛乳の熱履歴または製造後経過日数を判定するための評価方法に関するものであり、さらには、このような評価方法を簡便に実施するための評価用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
牛乳の製造プロセスにおいては、生乳の殺菌処理工程が不可欠であり、製品の品質を維持する上で厳しい工程管理が要求される。
【０００３】
例えば、加熱温度や加熱時間が適正なものであったか否か、常に熱処理工程の程度、すなわち熱履歴を的確に把握しておく必要がある。
【０００４】
一方、製造後においては、例えば貯蔵温度等によって牛乳のシェルフライフが変わってくることが予想され、製造後結果日数（残存品質保持期間）を判定することは、製品管理上、極めて有効である。特に、常温保存が可能な、いわゆるロングライフ牛乳においては、賞味期間が６０日以上にも及ぶことから、製品の製造後経過日数を正確に判定することが非常に重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みて提案されたものであって、牛乳の熱履歴を的確に把握することが可能な、あるいは牛乳の製造後経過日数を判定することが可能な評価方法を提供することを目的とし、さらには、このような評価を簡便に実施することができ、しかも経済性にも優れた評価用キットを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、加熱処理に伴い牛乳中に生成する還元物質の検出に適したテトラゾリウム塩の検索を行い、その最適反応条件を検索した。
【０００７】
その結果、還元型のホルマザンが水可溶性というユニークな特徴を有するテトラゾリウム塩、３´−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、ＸＴＴと呼ぶ。）が前記還元物質の還元性を極めて鋭敏に検出し得ること、さらには、バッチ法やマイクロプレートを利用した経済的アッセイ法の構築が可能であることを見い出した。
【０００８】
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の評価方法は、ＸＴＴを含む発色液を牛乳と混合、反応させ、その発色度を測定することにより、牛乳の熱履歴または製造後経過日数を判定することを特徴とするものである。
【０００９】
また、本発明の評価用キットは、ＸＴＴを含む発色試薬と、マイクロプレートと、マイクロピペットとを備えてなることを特徴とするものである。
【００１０】
上述のＸＴＴは、通常、メディエータと共に用いられ、例えばメディエータとしての２−メチル−１，４−ナフトキノン（ビタミンＫ３）が添加されて発色液とされる。
【００１１】
測定は、マイクロプレートを用いた場合には、波長４９２ｎｍにおける吸光度  変化を測定する。バッチ法の場合には、発色反応前後の色調変化を色彩色差計を用いてａ値の変化として測定する。
【００１２】
【作用】
本発明者は、これまでの研究により、加熱処理に伴い、生乳中にテトラゾリウム塩還元性の物質が生成することを明らかとした。また、カゼインとラクトースのみから成るモデル系にオートクレーブ処理を施した場合にも、生乳と同様、テトラゾリウム塩還元性物質が生成することを観察した他、その還元力はモデル系に添加したラクトース、カゼイン濃度に依存することを認めた。ラクトース、カゼイン単独をそれぞれ加熱処理した場合には、還元性物質の生成は認められなかったことから、このテトラゾリウム塩還元性物質は、カゼインとラクトースのメイラード反応で生じる物質であると推定される。
【００１３】
ＸＴＴは、このテトラゾリウム還元性物質の還元性を最も鋭敏に検出し得る物質であり、したがって、牛乳と混合、反応させた後、その発色度を測定することで、その熱履歴が的確に判定される。
【００１４】
また、前記テトラゾリウム塩還元性物質は、貯蔵の間にその還元力を失っていく。したがって、前記発色度を測定し、還元力の減少を把握することで、加熱牛乳の製造後経過日数も推定される。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を適用した実施例について、具体的な実験結果に基づいて詳細に説明する。
【００１６】
実験方法
１．試薬
ＸＴＴ（水和物）にはポリサイエンス社製の試薬を、またビタミンＫ３には和光純薬社製の試薬を用いた。その他の試薬は全て市販の特級試薬をそのまま用いた。また、本実験で使用した水は、全て蒸留水を、ミリポア社製の商品名Ｍｉｌｌ−Ｑ  Ｊｒ．で処理した超純水である。
【００１７】
２．試料
同一原乳で、１３０℃、２秒の条件で殺菌処理されたもの（試料Ａ）と、１４０℃、３秒の条件で殺菌処理されたもの（試料Ｂ）を、加熱製造された翌日（この日を貯蔵０日とした。）から、５℃、３０℃、４０℃または室温（２５℃）にて貯蔵した。なお、試料は、各測定毎に新たな紙パックを使用することとし、測定直前に水浴で室温に戻した後、内容物を均一とするためよく振ってから開封した。
【００１８】
３．ＸＴＴとの発色反応
（１）バッチ法での測定
ビタミンＫ３を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、１５分程度攪拌した。これをろ過することにより、ビタミンＫ３飽和溶液を得た。
【００１９】
次いで、ＸＴＴを０．５ｍＭ濃度でこのビタミンＫ３飽和溶液に溶解し、ＸＴＴ発色液を調製した。ＸＴＴは常温では溶け難いため、高周波加熱装置で約４０℃に加熱して溶かした。得られたＸＴＴ発色液は、室温、暗所にて保存した。
【００２０】
測定は次の手順で行った。すなわち、直径４ｃｍのガラスシャーレに試料を１ｍｌ加え、これにＸＴＴ発色液１ｍｌを添加して軽く攪拌後、色彩色差計（ミノルタ社製、商品名ＣＲ−２００）でａ値を測定した。室温にて２０分経過後、再びａ値を測定し、その差を各試料の発色度とした。
【００２１】
（２）マイクロプレート法による測定
バッチ法と同様の原理で、マイクロプレートの各ウェルにそれぞれ牛乳試料４０μｌとＸＴＴ発色液６０μｌを注入した。マイクロプレートは、酵素免疫測定法あるいは組織培養に用いられている市販の９６穴のものを使用した。
【００２２】
各ウェルへのＸＴＴ発色液の添加には、８チャンネルのマイクロピペッターを使用し、添加時間の差が最小になるようにした。
【００２３】
ＸＴＴ発色液を添加した後、マイクロプレートシェーカー（ＩＫＡ社製）で７００分−１、５秒間振とうし、室温にて放置した。
【００２４】
ＸＴＴ発色液を添加していないビタミンＫ３飽和溶液に牛乳試料を添加したウェルを同時に調製し、このウェルの４９２ｎｍの吸光度をブランクとして各試料の２０分後の吸光度の差を求めた。測定に際しては、マイクロプレートリーダー（東ソー社製、商品名ＭＰＲ  Ａ４ｉ）を用いて４９２ｎｍの吸光度変化として記録した。
【００２５】
実験結果並びに考察
（１）加熱直後のＸＴＴ還元力
図１及び図２は、製造翌日の１３０℃、２秒殺菌乳（試料Ａ）と１４０℃、３秒殺菌乳（試料Ｂ）のバッチ法（図１）、並びにマイクロプレート法（図２）でのＸＴＴ還元力を示したものである。
【００２６】
この結果より明らかなように、加熱温度及び加熱時間の程度が過酷な試料Ｂにおいて高い還元力が観察された。
【００２７】
また、各試料において、バッチ法とマイクロプレート法との間で顕著な実験結果の差が認められなかったことから、両法共に加熱処理乳のＸＴＴ還元力測定に利用できることが示された。
【００２８】
本ＸＴＴ還元力試験は、熱処理工程の程度を推定するのに有用である。
【００２９】
（２）ＸＴＴ還元力の貯蔵における変化
先の実験で使用したものと同一のロットで製造された試料を異なる温度で貯蔵し、その貯蔵期間中のＸＴＴ還元力の変化を調べた。
【００３０】
図３及び図４は、試料Ａ（１３０℃殺菌乳）を６日間貯蔵した場合のＸＴＴ還元力の変化を貯蔵温度別にプロットしたものである。（なお、図３はバッチ法による測定結果を、図４はマイクロプレート法による測定結果をそれぞれ示している。）
両法共に、ＸＴＴ還元力が貯蔵温度が高くなるに従い急速に減少することを示している。
【００３１】
図５及び図６は、試料Ｂ（１４０℃殺菌乳）を種々の温度で保存した場合のＸＴＴ還元力の変化を示したものである。（なお、図５はバッチ法による測定結果を、図６はマイクロプレート法による測定結果をそれぞれ示している。）
試料Ａの場合と同様、ＸＴＴ還元力は貯蔵温度が低いほど保存されることが明らかとなった。
【００３２】
試料Ｂは、常温保存が可能で、その賞味期間が６０日とされている。（ロングライフ牛乳）
本実験で常温で６４日間保存された試料は、ＸＴＴ還元力がほぼ消失していた。したがって、この残存還元力を指標とすることにより、その製品の製造後経過日数の推定を行うことが可能である。
【００３３】
【発明の効果】
以上の説明からも明らかなように、本発明によれば、加熱処理に伴い生乳中に生成する還元性の物質を鋭敏に検出することができ、例えば牛乳の熱履歴を的確に把握することができる。したがって、本発明方法は、生乳の殺菌処理の工程管理法として有用であり、さらに貯蔵牛乳の製造後経過日数の推定に極めて実用的に利用することができる。
【００３４】
また、本発明の評価用キットによれば、前述の牛乳の評価を簡便に実施することができ、また経済的観点からも実用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造翌日の１３０℃、２秒殺菌乳と１４０℃、３秒殺菌乳をバッチ法により測定したときのａ値の相違を示す特性図である。
【図２】製造翌日の１３０℃、２秒殺菌乳と１４０℃、３秒殺菌乳をマイクロプレート法により測定したときのａ値の相違を示す特性図である。
【図３】１３０℃殺菌乳を６日間貯蔵した場合のａ値の変化を貯蔵温度別にプロットした特性図である。
【図４】１３０℃殺菌乳を６日間貯蔵した場合の４９２ｎｍにおける吸光度の変化を貯蔵温度別にプロットした特性図である。
【図５】１４０℃殺菌乳を種々の温度で貯蔵した場合のａ値の変化を貯蔵温度別にプロットした特性図である。
【図６】１４０℃殺菌乳を種々の温度で貯蔵した場合の４９２ｎｍにおける吸光度の変化を貯蔵温度別にプロットした特性図である。
【図１】
0003589313.tif 000002
【図２】
0003589313.tif 000003
【図３】
0003589313.tif 000004
【図４】
0003589313.tif 000005
【図５】
0003589313.tif 000006
【図６】
0003589313.tif 000007