(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0003572115.tif 000019
（式中、Ｒは置換されていてもよい低級アルキルであるか又は−ＣＯＲ１、−ＣＯＯＲ２もしくは−ＣＯＮＨＲ３を表す。
ここでＲ１は置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル又は−Ａ−(ＮＨ)ｎ−ＣＯＯＲ４；ここでＡは置換されていてもよい低級アルキレン又は置換されていてもよい低級アルケニレン、ｎは０もしくは１の整数、そしてＲ４は水素、置換されていてもよい低級アルキル又は置換されていてもよいアリール低級アルキルであり；Ｒ２は水素、置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリール低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール又は置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル；そしてＲ３は水素、置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリール低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル、置換されていてもよいアミノ又は置換されていてもよいカルバモイルを表す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒがメチルである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−ＣＯＲ１、−ＣＯＯＲ２又は−ＣＯＮＨＲ３である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが−ＣＯＲ１であり、Ｒ１がハロゲンで置換されていてもよい炭素数２以上のアルキル、ハロゲンで置換されていてもよい低級アルケニル、低級シクロアルキル低級アルキル、キノリル又は−Ａ−(ＮＨ)ｎ−ＣＯＯＲ４；ここでＡは置換されていてもよい低級アルキレン又は置換されていてもよい低級アルケニレンであり、ｎは０もしくは１の整数であり、Ｒ４は水素、置換されていてもよい低級アルキル又は置換されていてもよいアリール低級アルキルである；である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がぺンチルである請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｒが−ＣＯＯＲ２であり、Ｒ２が置換されていてもよい低級アルキル又は置換されていてもよいアリールである請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒが−ＣＯＮＨＲ３であり、Ｒ３が置換されていてもよいアシルである請求項１記載の化合物。
【請求項８】
請求項１記載の化合物を有効成分とする免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、免疫抑制作用を有する新規な２−ピラノン誘導体、その製造方法、及び該化合物を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】
免疫抑制剤は、臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、骨髄移植によっておこる移植片対宿主反応の予防、慢性関節リウマチなどの数々の自己免疫疾患の治療には欠かせないものである。現在、種々の免疫抑制剤が開発され、実用化されているが、薬効や副作用などの点で必ずしも満足できるものではなく、新しい免疫抑制剤の創出が望まれている。
即ち、免疫反応の発現にはＴ細胞及びＢ細胞の両リンパ細胞を始め、様々な細胞及び因子が複雑に関与していることが知られている。従って、免疫反応の抑制を適切に行うためには、関連する免疫機構を幅広く、効果的に抑制することが重要である。現在臓器移植等に使用されているシクロスポリンやタクロリムスはＴ細胞のみに作用するにすぎず、より広範な免疫機構に作用する物質の開発が望まれている。しかし、臨床使用に適した、Ｔ細胞及びＢ細胞の両細胞に作用する低毒性で有効な免疫抑制剤は今のところ提供されていない。
【０００３】
本発明者らは、微生物の代謝物に様々な活性成分を有する物質があることに着目し、免疫抑制、腫瘍細胞増殖抑制作用等を有する医薬として有用な物質の開発のために、微生物代謝物を検索してきた。その結果、ストレプトミセス  プルニカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）種の微生物が産生するα，β−不飽和δ−ラクトン環を含む化合物、（５Ｒ，６Ｒ）−５−エチル−５，６−ジヒドロ−６［（Ｅ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，５−ジメチル−７−ノネニル］−２Ｈ−ピラン−２−オン（以下、ＰＡ−４８１５３Ｃと呼称する）が上記の活性を有することを見い出し、開示した（特開平５−３１０７２６）。しかしながら、この化合物は強い毒性のため臨床使用には問題を有していた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＡ−４８１５３Ｃから誘導される一連の２−ピラノン誘導体が、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方に作用して強い免疫抑制作用を現すと共に、低毒性であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
0003572115.tif 000002
（式中、Ｒは置換されていてもよい低級アルキルであるか又は−ＣＯＲ１、−ＣＯＯＲ２もしくは−ＣＯＮＨＲ３を表す。ここでＲ１は水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよい低級シクロアルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルケニル低級アルキル、置換されていてもよいアシル低級アルキル、置換されていてもよいアシルオキシ低級アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリール低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル又は−Ａ−（ＮＨ）ｎ−ＣＯＯＲ４；ここでＡは置換されていてもよい低級アルキレン又は置換されていてもよい低級アルケニレン、ｎは０もしくは１の整数、そしてＲ４は水素、置換されていてもよい低級アルキル又は置換されていてもよいアリール低級アルキルであり；Ｒ２は水素、置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリール低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール又は置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル；そしてＲ３は水素、置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリール低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル、置換されていてもよいアミノ又は置換されていてもよいカルバモイルを表す。）
で示される化合物を提供するものである。
【０００６】
本明細書において「置換されていてもよい低級アルキル」とは炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキルを意味する。具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、ｔｅｒｔ−ぺンチル及びヘキシル等を包含する。また、これらは任意に１以上の置換基を有していてもよく、置換基としては例えばヒドロキシル、ハロゲン、アミノ及び低級アルキルオキシ等が挙げられる。
「置換されていてもよいアルキル」とは炭素数１〜２０の直鎖状又は分枝状のアルキルを意味し、具体的には上記低級アルキルの他、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル及びイコシルを包含する。これらは任意に１以上の置換基を有していてもよく、その置換基は上記と同様である。
「置換されていてもよい低級アルケニル」とは炭素数２〜６の直鎖状又は分枝状のアルケニルを意味する。２以上の二重結合を有していてもよく、具体的にはエテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル及びヘキセジエニル等を包含する。また、これらは任意に１以上の置換基を有していてもよく、その置換基は上記と同様である。
【０００７】
「置換されていてもよい低級シクロアルキル」とは炭素数３〜６の環状の低級アルキルを意味し、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。これらは任意に１以上の置換基を有していてもよく、その置換基としてはヒドロキシル、ハロゲン、低級アルキル、低級アケニル及び低級アルキルオキシ等が挙げられる。
「置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル」という用語において、その低級シクロアルキル部分と低級アルキル部分は上記と同様である。
「置換されていてもよい低級シクロアルケニル」とは炭素数３〜６の環状の低級アルケニルを意味し、具体的にはシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。これらは任意に１以上の置換基を有していてもよく、その置換基は上記低級シクロアルキルのものと同様である。
「置換されていてもよい低級シクロアルケニル低級アルキル」という用語において、その低級シクロアルケニル部分と低級アルキル部分は上記と同様である。「置換されていてもよい低級アルキルオキシ低級アルキル」という用語において、その低級アルキル部分は上記と同様である。
「置換されていてもよいアシル低級アルキル」という用語において、その低級アルキル部分は上記と同様であり、アシル部分は炭素数１〜６の直鎖状、分枝状又は環状のアシル及びアロイルを意味する。具体的にはアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、ヘキサノイル、シクロヘキシルカルボニル及びベンゾイルが挙げられ、これらは任意に置換基を有していてもよく、その置換基は上記低級シクロアルキルのものと同様である。
「置換されていてもよいアシルオキシ低級アルキル」という用語において、そのアシル部分と低級アルキル部分は上記と同様である。
【０００８】
「置換されていてもよいアリール」とはフェニル又はナフチルである。任意の位置に１以上の置換基を有していてもよく、その置換基としてはヒドロキシル、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキルオキシ、カルボキシル、低級アルキルオキシカルボニル、アシル、アシルオキシ、置換されていてもよいアミノ及び置換されていてもよいアミノ低級アルキル等が挙げられる。
「置換されていてもよいアリール低級アルキル」という用語において、そのアリール部分と低級アルキル部分は上記と同様である。
「置換されていてもよいヘテロアリール」とはＯ、Ｓ及びＮから任意に選択されるヘテロ原子を環内に１以上有するヘテロアリールを意味する。具体的には、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、イソキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリルイソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル及びチエニル等の５〜６員のヘテロアリールや、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、ブテリジニル、ベンズイソキサゾリル、ベンズオキサゾリル、キサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズチアジアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等の縮合ヘテロアリールが挙げられる。これらヘテロアリールは全て１以上の置換基を有していてもよく、その置換基は上記アリールのものと同様である。
【０００９】
「置換されていてもよいヘテロアリール低級アルキル」という用語において、そのヘテロアリール部分と低級アルキル部分は上記と同様である。
「置換されていてもよいアシル」という用語において、そのアシル部分は上記「アシル低級アルキル」のアシル部分と同様である。
「置換されていてもよいアミノ」とは非置換アミノ、モノ置換アミノ及びジ置換アミノを包含する。置換基としてはヒドロキシル、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、カルボキシル、等が例示される。
「置換されていてもよいカルバモイル」の置換基としては、低級アルキル、低級アルケニル、低級シクロアルキル、低級シクロアルキル低級アルキル、アシル、アリール、アリール低級アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール低級アルキル等が挙げられる。
「アシルオキシ」という用語において、そのアシル部分は上記「アシル低級アルキル」のアシル部分と同様である。
「ハロゲン」とはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。
「置換されていてもよいアミノ低級アルキル」という用語において、そのアミノ部分と低級アルキル部分は上記と同様である。
「製薬上許容し得る塩」とは、医学上許容し得る非毒性塩の全てを含有し、例えばナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩等が例示される。以下、本明細書中では、本発明の化合物という場合に本発明の化合物（Ｉ）の他にその製薬上許容し得る塩も含める。
【００１０】
化合物（Ｉ）は、ＰＡ−４８１５３Ｃの８位ヒドロキシル基における、エステル、エーテル、カルボネート又はカルバメート誘導体である。本発明の目的には式（Ｉ）で示される全化合物が適するが、中でもＲが置換されていてもよい低級アルキルである化合物；Ｒが−ＣＯＲ１であって、Ｒ１が置換されていてもよい低級アルキル、置換されていてもよい低級アルケニル、置換されていてもよい低級シクロアルキル低級アルキル、置換されていてもよいヘテロアリールもしくは−Ａ−（ＮＨ）ｎ−ＣＯＯＲ４（ここでＡは置換されていてもよい低級アルキレン又は置換されていてもよい低級アルケニレンであり、ｎは０もしくは１の整数であり、Ｒ４は水素、置換されていてもよい低級アルキル又は置換されていてもよいアリール低級アルキルである）である化合物；Ｒが−ＣＯＯＲ２であって、Ｒ２が水素、置換されていてもよい低級アルキルもしくは置換されていてもよいアリールである化合物；及びＲが−ＣＯＮＨＲ３であって、Ｒ３が置換されていてもよいアシルである化合物（Ｉ）が好ましく、以下の化合物がより好ましい。
【００１１】
【化３】
0003572115.tif 000003
【化４】
0003572115.tif 000004
【化５】
0003572115.tif 000005
これらの化合物の内、免疫抑制剤として特に好ましい化合物は、Ｉａ−２、Ｉａ−４、Ｉａ−９、Ｉａ−１３、Ｉａ−１８、Ｉａ−２４、Ｉｃ−２、Ｉｄ−１であり、腫瘍細胞増殖抑制剤として特に好ましい化合物は、Ｉａ−１、Ｉａ−５、Ｉａ−１５及びＩｂ−１である。
【００１２】
本発明の化合物（Ｉ）は、ＰＡ−４８１５３Ｃの８位ヒドロキシル基部位で、適宜、エステル、エーテル、カルボネート又はカルバメートを形成することにより製造することができる。
以下に本発明の製造法について、各工程ごとに詳しく説明する。下記の方法は本発明の化合物（Ｉ）の製造に特に適した方法であるが、これら以外の方法によって製造された化合物（Ｉ）も上記の目的に適し、本発明の範囲に包含される。
出発物質であるＰＡ−４８１５３Ｃは、例えば、特開平５−３１０７２６号記載の方法で、ＰＡ−４８１５３Ｃを産生するストレプトミセス  プルニカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）ＰＡ−４８１５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５４）を培養し、その発酵産物から単離することにより製造されるが、それ以外の方法で得られたＰＡ−４８１５３Ｃも同様に下記の方法に用いることができる。
【００１３】
（１）エステル体の製造
ＰＡ−４８１５３Ｃと酸クロリド（Ｒ１ＣＯＣｌ：例えば、プロパノイルクロリド、ヘキサノイルクロリド、クロロアセチルクロリド、ジクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルクロリド、４−クロロブチリルクロリド、６−ブロモヘキサノイルクロリド、３−シクロペンチルプロピオニルクロリド、２−キノキサロイルクロリド、メチルマロニルクロリド、３−カルボメトキシプロピオニルクロリド、３−カルボメトキシプロペノイルクロリド又は５−カルボメトキシペンタノイルクロリド）又は酸無水物［（Ｒ１ＣＯ）２Ｏ：例えば無水プロピオン酸］を、ピリジンもしくはピリジンとジクロロメタンの混合液中、必要ならば塩基［例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）］の存在下、約−２０℃〜加熱下、好ましくは約０℃〜約１５０℃、さらに好ましくは室温下で数分〜数十時間反応させる。
【００１４】
又は、ＰＡ−４８１５３Ｃとカルボン酸（Ｒ１ＣＯＯＨ：例えば、キナルジン酸、トランス−３−ヘキセン酸、４−ペンテン酸、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルアラニン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−４−アミノ酪酸又はＮ−ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸）を、適当な溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、ジメチルホルムアミド等）中縮合剤（例えば１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））と塩基（例えば、ＤＭＡＰ）の存在下、約−２０℃〜加熱下、好ましくは約０℃〜約１５０℃、さらに好ましくは室温下で数分〜数十時間反応させる。
末端にカルボン酸をもつ化合物は、対応するメチルエステル体を水−ジメトキシエタン中、水酸化リチウムで約０℃〜加熱下、好ましくは室温下で数分〜数十時間加水分解した後、同時に開環したラクトン環部を酸（例えばｐ−トルエンスルホン酸）と適当な溶媒（例えばベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等）中、約−２０℃〜加熱下、好ましくは約０℃〜約１５０℃、さらに好ましくは室温下で再閉環することにより得られる。
【００１５】
（２）エーテル体の製造
ＰＡ−４８１５３Ｃとハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｘ：例えば、ヨウ化メチル）を適当な溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等）中、塩基（例えば、水素化ナトリウム、リチウムジイソプロピルアミド等）の存在下、約１５０℃以下、好ましくは約−７０℃〜約１００℃、さらに好ましくは約−２０℃〜２０℃の温度で数分〜数十時間反応させる。
【００１６】
（３）カルボネート体の製造
ＰＡ−４８１５３Ｃとクロロ炭酸エステル（Ｒ２ＯＣＯＣｌ：例えば、クロロ炭酸ｎ−ブチル、クロロ炭酸フェニル）を適当な溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン等）中、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）の存在下、約−５０℃〜加熱下、好ましくは約０℃〜約１００℃さらに好ましくは室温下で数分〜数十時間反応させる。
【００１７】
（４）カルバメート体の製造
ＰＡ−４８１５３Ｃとイソシアネート（Ｒ３ＮＣＯ：例えばベンゾイルイソシアネート）を適当な溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等）中、塩基（例えば、ＤＭＡＰ）又はビストリブチルチンオキサイドの存在下、約−５０℃〜加熱下、好ましくは約０℃〜約１００℃、さらに好ましくは約４０℃の温度で数分〜数十時間反応させる。
【００１８】
上記の式（Ｉ）で示される化合物は、後述する実験例に記載の試験の結果から明らかなように、免疫抑制作用、腫瘍細胞増殖抑制作用等の生物学的活性を有しており、しかも低毒性である。従って、本発明の化合物（Ｉ）は、臓器あるいは、組織の移植に対する拒絶反応、骨髄移植により起こる移植片対宿主反応、各種自己免疫病、各種炎症、血液系腫瘍、固形癌等の腫瘍疾病等の治療及び予防に臨床上、有用と考えられる。
本発明の化合物（Ｉ）は免疫抑制作用と同時に抗腫瘍作用も併せ持つ、医薬として有用な化合物である。
化合物（Ｉ）を免疫抑制又は腫瘍治療のために投与するには、通常の経口又は非経口投与用の製剤として製剤化して用いる。本発明の化合物（Ｉ）を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口投与製剤、あるいは、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などの注射用溶液又は懸濁液もしくは軟膏剤などの経皮投与用製剤などの非経口製剤とすることもできる。
【００１９】
これらの製剤は当業者既知の適当な担体、賦形剤、溶媒、基剤等を用いて製造することができる。例えば、錠剤の場合、活性成分と補助成分を一緒に圧縮又は成型する。補助成分としては、製剤的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例、トウモロコシでん粉）、充填剤（例、ラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例、でん粉グリコール酸ナトリウム）又は滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム）などが用いられる。錠剤は、適宜、コーティングしてもよい。シロップ剤、液剤、懸濁剤などの液体製剤の場合、例えば、懸濁化剤（例、メチルセルロース）、乳化剤（例、レシチン）、保存剤などを用いる。注射用製剤の場合、溶液、懸濁液又は油性もしくは水性乳濁液の形態のいずれでもよく、これらは懸濁安定剤又は分散剤などを含有していてもよい。
【００２０】
化合物（Ｉ）の投与量は、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、体重１ｋｇあたり、１日０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜５０ｍｇ、より好ましくは１〜２５ｍｇを経口投与する。非経口投与の場合、体重１ｋｇあたり、１日０．００１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜３ｍｇ、より好ましくは０．２〜２．５ｍｇを投与する。これを１〜３回に分割して投与すればよい。
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは単なる例示であり本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
製造例１  ＰＡ−４８１５３Ｃの製造
ＰＡ−４８１５３Ｃは、特開平５ー３１０７２６号記載の方法に準じて製造した。
１．発酵
可溶性澱粉０．５％、グルコース０．５％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５％、牛肉エキス（ディフコ製）０．２５％、酵母エキス（ディフコ製）０．５％、食塩０．２５％、及び水道水よりなる培地８００ｍｌ（２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整）を含む２Ｌ容三角フラスコにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ  ＰＡ−４８１５３の種培養スラントから接種し、振幅７０ｍｍ、毎分１８０回転で、２８℃、４８時間振盪培養を行なった。この培養液８００ｍｌずつを、上記と同一組成を有する培地１６Ｌを入れた３０Ｌ容ジャーファメンターに植菌し、通気量１２．８Ｌ／ｍｉｎ、内圧０．３５ｋｇ／ｃｍ２、撹拌回転数２００ｒｐｍで、２８℃、２４時間培養した。次いでこの培養液８Ｌを、グルコース２．０％、馬鈴薯澱粉２．０％、脱脂大豆粉２．０％、酵母エキス（ディフコ製）０．５％、食塩０．２５％、硫酸亜鉛７水和物０．０００５％、塩化マンガン４水和物０．０００５％、硫酸銅５水和物０．０００５％、炭酸カルシウム０．３５％、消泡剤Ｐ−２０００（大日本インキ製）０．００３％、及び水道水よりなる培地１５０Ｌ（２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整）を含む２５０Ｌ容タンクに植菌し、通気量１２０Ｌ／ｍｉｎ．、内圧０．３５ｋｇ／ｃｍ２、撹拌回転数２８０ｒｐｍで、２８℃、９０時間培養した。
【００２２】
２．分離精製
（１）分離
（ａ）上記工程で得られた培養液９８Ｌから、Ｓ型超遠心分離機（Ｎｏ．６−Ｐ関西遠心分離機製作所株式会社製）（１５０００ｒｐｍ）によって上清液８３Ｌを得た。この上清液を、２Ｎ塩酸でｐＨ７．０に調整し、酢酸エチル４６Ｌで抽出した。抽出液４０Ｌを減圧濃縮し、粗物質（ｃｒｕｄｅ−１）１８．９１ｇを得た。一方、上記遠心で沈澱として得られた湿菌体８ｋｇは、アセトン２８Ｌで抽出した。溶媒を減圧留去して、水層６Ｌを得た。２Ｎ塩酸でｐＨ７．０に調整し、酢酸エチル１３Ｌで抽出した。抽出液１２Ｌを減圧濃縮し、粗物質（ｃｒｕｄｅ−２）２２．８６ｇを得た。
【００２３】
（ｂ）濾液抽出エキスである粗物質（ｃｒｕｄｅ−１）（１８．９１ｇ）をｎ−ヘキサン３００ｍｌで洗浄した。洗浄後のヘキサンを減圧留去し、残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ−１）５．１ｇを得た。一方、ヘキサンで洗浄された粗物質（ｒｅｓｉｄｕｅ−２）を酢酸エチル２０ｍｌで懸濁し、ヘキサン３００ｍｌで抽出した。ヘキサン層を減圧留去し、残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ−３）３．１ｇを得た。ヘキサン層を除去した残りの沈澱物（ｒｅｓｉｄｕｅ−４）は粗物質（ｒｅｓｉｄｕｅ−２）と同様に処理し、ヘキサン層からの残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ−５）と沈澱物（ｒｅｓｉｄｕｅ−６）を得た。
【００２４】
（ｃ）菌体抽出エキスである粗物質（ｃｒｕｄｅ−２）（２２．８６ｇ）をｎ−ヘキサン３００ｍｌで洗浄した。洗浄後のヘキサンを減圧留去し残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ−１１）１８．２ｇを得た。一方、ヘキサンで洗浄された粗物質（ｒｅｓｉｄｕｅ−１２）を酢酸エチル２０ｍｌで懸濁した後ヘキサン３００ｍｌで抽出し、ヘキサン層からの残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ−１３）０．６５ｇと沈澱物（ｒｅｓｉｄｕｅ−１４）２．１ｇを得た。
【００２５】
（２）精製
（ａ）粗物質（ｃｒｕｄｅ−１）から分離したＰＡ−４８１５３Ｃ含有分画（ｒｅｓｉｄｕｅ−１，３，５（計１０．４ｇ））をカラムクロマトグラフィー（カラム；ＳｉＯ２，１２０ｍｌ（メルク社製、溶媒；クロロホルム、１分画；２０ｇ）で精製し、９〜１７番目の分画からＰＡ−４８１５３Ｃの粗精製物４．２ｇを得た。これをカラムクロマトグラフィー（カラム；Ｌｏｂａｒ  ＳｉＯ２  ６０  Ｂ  ｓｉｚｅ  （メルク社製），溶媒；ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１，１分画；１０ｇ）にかけ、３８〜９０番目の分画から得られたＰＡ−４８１５３Ｃの精製物１．６ｇをさらにカラムクロマトグラフィー（カラム；Ｌｏｂａｒ  ＳｉＯ２  ６０  Ｂ  ｓｉｚｅ  （メルク社製），溶媒；クロロホルム：メタノール＝９８：２，１分画；１０ｇ）で精製して１５〜２１番目の分画からＰＡ−４８１５３Ｃの精製物１．３９ｇを得た。これをｎ−ヘキサン４ｍｌで再結晶し、ＰＡ−４８１５３Ｃの結晶９６５ｍｇを得た。ＨＰＬＣにおける純度は９８％であった。
【００２６】
（ｂ）粗物質（ｃｒｕｄｅ−２）から分離したＰＡ−４８１５３Ｃ含有分画（ｒｅｓｉｄｕｅ−１１，１３（計１８．８ｇ））をカラムクロマトグラフィー（カラム；ＳｉＯ２，１５０ｍｌ（メルク社製），溶媒；クロロホルム，１分画；２０ｇ）で精製し、１５〜５７番目の分画からＰＡ−４８１５３Ｃの粗精製物４．１４ｇを得た。これをカラムクロマトグラフィー（カラム；Ｌｏｂａｒ  ＳｉＯ２  ６０  Ｂ  ｓｉｚｅ  （メルク社製），溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝３：１，１分画；１０ｇ）にかけ、３３〜５７番目の分画から得られたＰＡ−４８１５３Ｃの精製物９２０ｍｇをさらにカラムクロマトグラフィー（カラム；Ｌｏｂａｒ  ＳｉＯ２  ６０  Ｂ  ｓｉｚｅ  （メルク社製），溶媒；クロロホルム：メタノール＝９８：２，１分画；１５ｇ）で精製して９〜１１番目の分画からＰＡ−４８１５３Ｃの精製物７５０ｍｇを得た。これをヘキサンで再結晶し、ＰＡ−４８１５３Ｃの結晶５３０ｍｇを得た。ＨＰＬＣにおける純度は９８％であった。以上の工程より、合計１４９５ｍｇのＰＡ−４８１５３Ｃ結晶が得られた。
【００２７】
実施例１  化合物Ｉａ−４（Ｒ１＝−Ｃ５Ｈ１１）
ＰＡ−４８１５３Ｃ  １．５１ｇとピリジン１．６ｍｌをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、氷冷下、ｎ−ヘキサノイルクロリド１．７ｍｌを加えた後、室温下に１時間撹拌した。反応液にアンモニア水を加え１０分間撹拌後、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル：ヘキサン＝１５：８５）により精製するとＩａ−４  １．９１ｇ（収率９７％）が油状物として得られた。
元素分析（Ｃ２５Ｈ４２Ｏ５として）
理論値：Ｃ，７１．０５；Ｈ，１０．０２
実測値：Ｃ，７０．７４；Ｈ，１０．０２
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：４２３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘ  ＣＨＣｌ３  ｃｍ−１：１７２０
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．６Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈｚ），５．２１−５．５６（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．５，９．６Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．６Ｈｚ）
［α］Ｄ：−９７．９°（Ｃ＝１．１４，ＣＨＣｌ３）
【００２８】
実施例２  化合物Ｉａ−１４（Ｒ１＝キノリル）
ＰＡ−４８１５３Ｃ  １．０１ｇ、キナルジン酸７４４ｍｇ、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド１．０６ｇ、４−ジメチルアミノピリジン５７３ｍｇをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、室温下に５時間撹拌した。不溶物を濾過し、濾液を酢酸エチルで希釈した。飽和重ソウ水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル：ヘキサン＝３：７）により精製するとＩａ−１４  １．４４ｇ（収率９７％）が粉末として得られた。融点：１０６−１０８℃。
元素分析（Ｃ２９Ｈ３７ＮＯ５として）
理論値：Ｃ，７２．６２；Ｈ，７．７８；Ｎ，２．９２
実測値：Ｃ，７２．６３；Ｈ，７．８３；Ｎ，３．００
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：４８０［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘ  ＣＨＣｌ３ｃｍ−１：１７２１
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．５９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６，９．４Ｈｚ），３．４１（３Ｈ，ｓ），４．６４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．５，６．６Ｈｚ），５．２６−５．５３（２Ｈ，ｍ），５．６８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．５，６．８Ｈｚ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ），７．６１−７．９５（３Ｈ，ｍ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）
［α］Ｄ：−８１．６°（Ｃ＝１．１８，ＣＨＣｌ３）
【００２９】
実施例３  化合物Ｉａ−５（Ｒ１＝−Ｃ１３Ｈ２７）
ＰＡ−４８１５３Ｃ  １．３０ｇと４−ジメチルアミノピリジン５０ｍｇをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、氷冷下、ピリジン１．６ｍｌとミリストイルクロリド２．２ｍｌを滴下後、室温下に２時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒；酢酸エチル：ヘキサン＝１：７）により精製すると化合物Ｉａ−５  ２．１４ｇ（収率１００％）が油状物として得られた。
元素分析（Ｃ３３Ｈ５８Ｏ５として）
理論値：Ｃ，７４．１１；Ｈ，１０．９３
実測値：Ｃ，７３．８６；Ｈ，１０．８９
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘＣＨＣｌ３  ｃｍ−１：１７１９
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．６Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．６，６．５Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．６，６．０Ｈｚ），５．３２−５．５３（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．７Ｈｚ）
［α］Ｄ：−６８．７°（ｃ＝１．０３，ＣＨＣｌ３）
【００３０】
実施例４  化合物Ｉｂ−１（Ｒ＝−ＣＨ３）
ＰＡ−４８１５３Ｃ７００ｍｇとヨウ化メチル１３．４ｍｌをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１３．５ｍｌに溶解し、−２０℃に冷却下、水素化ナトリウム１．０４ｇを加えた。反応液を１５〜２０℃の温度にて１時間撹拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液に加えた。酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水芒硝で乾燥後減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル：ヘキサン＝１：３）により精製するとＩｂ−１  ５３０ｍｇ（収率７３％）が得られた。本品をジクロロメタン−ヘキサンから再結晶すると、融点７０〜７１℃の無色結晶となった。
元素分析（Ｃ２０Ｈ３４Ｏ４として）
理論値：Ｃ，７０．９７；Ｈ，１０．１２
実測値：Ｃ，７０．６９；Ｈ，１０．０５
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：３３９［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘ  ＣＨＣｌ３ｃｍ−１：１７１５
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８３（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．０Ｈｚ），３．４５（３Ｈ，ｓ），３．４８（３Ｈ，ｓ），４．５９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，４．８，８．５Ｈｚ），５．３２−５．５９（３Ｈ，ｍ），６．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．７Ｈｚ）
［α］Ｄ：−１２９．６°（Ｃ＝１．００，ＣＨＣｌ３）
【００３１】
実施例５  化合物Ｉｃ−２（Ｒ２＝−Ｃ４Ｈ９）
ＰＡ−４８１５３Ｃ  １．５３ｇ、クロロ炭酸  ｎ−ブチル１．５ｍｌ、ピリジン１．５ｍｌをベンゼン１５ｍｌに溶解し、室温下に４時間撹拌した。反応液を実施例１と同様に処理し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル：ヘキサン＝１：３）により精製するとＩｃ−２  １．９３ｇ（収率１００％）が油状物として得られた。
元素分析（Ｃ２０Ｈ４０Ｏ６として）
理論値：Ｃ，６７．８９；Ｈ，９．５０
実測値：Ｃ，６７．６２；Ｈ，９．５２
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：４２５［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘ  ＣＨＣｌ３ｃｍ−１：１７２８
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．４Ｈｚ），３．４２（３Ｈ，ｓ），４．１５（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．５，６．７Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，５．５，７．７Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．２，６．８Ｈｚ），５．３０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ）
［α］Ｄ：−９０．９°（Ｃ＝１．０７，ＣＨＣｌ３）
【００３２】
実施例６  化合物Ｉｄ−１（Ｒ３＝−ＣＯＰｈ）
ＰＡ−４８１５３Ｃ  １．１０ｇ、ベンゾイルイソシアネート１．３ｍｌ、４−ジメチルアミノピリジン８２５ｍｇをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、４０℃で７時間撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル：ヘキサン＝１：２）により精製するとＩｄ−１  １．３６ｇ（収率８５％）が泡状物として得られた。
ＬＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：４７２［Ｍ＋Ｈ］＋
ＩＲνｍａｘ  ＣＨＣｌ３ｃｍ−１：１７８０，１７１６
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．４Ｈｚ），３．４３（３Ｈ，ｓ），４．５６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，５．７，７．４Ｈｚ），５．２７−５．５７（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１，９．８Ｈｚ），７．４２−７．６６（３Ｈ，ｍ），７．８０−７．９２（２Ｈ，ｍ），８．２８（１Ｈ，ｂｒｓ）
【００３３】
上記実施例と同様にして、下記の化合物を合成した。そのＮＭＲ値を示す。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：
Ｉａ−１（Ｒ１＝−ＣＨ３）
０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．６４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．２Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４２−４．５２（１Ｈ，ｍ），５．２２−５．５７（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ）
Ｉａ−２（Ｒ１＝−Ｃ２Ｈ５）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．３５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．６Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．６，７．０Ｈｚ），５．３４−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．７Ｈｚ）
Ｉａ−３（Ｒ１＝−Ｃ３Ｈ７）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．９，９．７Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．３９−４．５３（１Ｈ，ｍ），５．２２−５．３２（１Ｈ，ｍ），５．３２−５．４９（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，９．８Ｈｚ）
【００３４】
Ｉａ−６（Ｒ１＝−ＣＨ２Ｃｌ）
０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．４Ｈｚ），３．４０（３Ｈ，ｓ），４．０６（２Ｈ，ｓ），４．４２−４．５３（１Ｈ，ｍ），５．２９−５．５６（３Ｈ，ｍ），６．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．８Ｈｚ）
Ｉａ−７（Ｒ１＝−ＣＨＣｌ２）
０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），２．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，９．５Ｈｚ），３．４１（３Ｈ，ｓ），４．４８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．２，８．１Ｈｚ），５．２８−５．５６（３Ｈ，ｍ），５．９６（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ）
【００３５】
Ｉａ−８（Ｒ１＝−ＣＣｌ３）
０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．６５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，９．２Ｈｚ），３．４３（３Ｈ，ｓ），４．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．３，８．６Ｈｚ），５．２７−５．５０（２Ｈ，ｍ），５．４７−５．５７（１Ｈ，ｍ），６．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ）
Ｉａ−９（Ｒ１＝−Ｃ２Ｈ４ＣＨ２Ｃｌ）
０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．２Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．４０−４．５２（１Ｈ，ｍ），５．３１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．９，６．８Ｈｚ），５．３０−５．５３（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．８Ｈｚ）
【００３６】
Ｉａ−１０（Ｒ１＝−（ＣＨ２）５Ｂｒ）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．６Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），３．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６，６．２，７．４Ｈｚ），５．２８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．６，６．２，７．７Ｈｚ），５．３０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．７Ｈｚ）Ｉａ−１１（Ｒ１＝−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣ２Ｈ５）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．４Ｈｚ），３．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３８（３Ｈ，ｓ），４．４７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６，６．３，７．２Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．７，６．２，７．３Ｈｚ），５．３２−５．７３（４Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．７Ｈｚ）
【００３７】
Ｉａ−１２（Ｒ１＝−（ＣＨ２）２ＣＨ＝ＣＨ２）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，９．４Ｈｚ），３．３８（３Ｈ，ｓ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．１，６．７Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，７．２Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１４．３Ｈｚ），５．２８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．８，６．１，７．９Ｈｚ），５．３１−５．５３（２Ｈ，ｍ），５．７２−５．９４（１Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１，９．７Ｈｚ）
Ｉａ−１３（Ｒ１＝２−シクロペンチルエチル）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．６Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．６，６．８Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２．０，６．８Ｈｚ），５．３２−５．５８（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．８Ｈｚ）
【００３８】
Ｉａ−１５（Ｒ１＝２−キノキサリル）
０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．６０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３，９．３Ｈｚ），３．４１（３Ｈ，ｓ），４．５６−４．６８（１Ｈ，ｍ），５．２８−５．５２（２Ｈ，ｍ），５．７５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．８Ｈｚ），６．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１，９．８Ｈｚ），７．８４−７．９８（２Ｈ，ｍ），８．１７−８．３６（２Ｈ，ｍ），９．５０（１Ｈ，ｓ）
Ｉａ−１６（Ｒ１＝−ＣＨ２ＣＯ２ＣＨ３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．６Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｓ），３．４（３Ｈ，ｓ），３．７４（３Ｈ，ｓ），４．４２−４．５５（１Ｈ，ｍ），５．３３−５．５４（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９，９．９Ｈｚ）
【００３９】
Ｉａ−１７（Ｒ１＝−（ＣＨ２）２ＣＯ２ＣＨ３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），２．６４（４Ｈ，ｓ），２．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．４Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），３．６８（３Ｈ，ｓ），４．４２−４．５３（１Ｈ，ｍ），５．２７−５．３８（１Ｈ，ｍ），５．３６−５．４９（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．７Ｈｚ）
Ｉａ−１８（Ｒ１＝−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２ＣＨ３）
０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，９．３Ｈｚ），３．３６（３Ｈ，ｓ），３．８２（３Ｈ，ｓ），４．４７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，５．５，８．０Ｈｚ），５．３１−５．５２（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．７Ｈｚ），６．８７（２Ｈ，ｓ），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１，９．７Ｈｚ）
【００４０】
Ｉａ−１９（Ｒ１＝−（ＣＨ２）４ＣＯ２ＣＨ３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．２０−２．４０（４Ｈ，ｍ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９，９．３Ｈｚ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．６７（３Ｈ，ｓ），４．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，６．０，７．８Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．８，６．９Ｈｚ），５．３２−５．５３（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．８Ｈｚ）
Ｉａ−２０（Ｒ１＝−（ＣＨ２）４ＣＯ２Ｈ）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，９．４Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．４０−４．５２（１Ｈ，ｍ），５．２１−５．３５（１Ｈ，ｍ），５．３０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．７，９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，９．８Ｈｚ）
【００４１】
Ｉａ−２１（Ｒ１＝−ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．４５（９Ｈ，ｓ），１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．４Ｈｚ），３．３９（３Ｈ，ｓ），３．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．７，４．７，８．１Ｈｚ），４．９６−５．１０（１Ｈ，ｍ），５．３０−５．５５（３Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．９Ｈｚ）
Ｉａ−２２（Ｒ１＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＮＨＣＯ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ｐ−ＯＣＨ３）
０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．４１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．８２−２．９１（１Ｈ，ｍ），３．３７（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），４．３７−４．５１（１Ｈ，ｍ），５．０３（２Ｈ，ｓ），５．２１−５．５５（３Ｈ，ｍ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９，９．８Ｈｚ），７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）
【００４２】
Ｉａ−２３（Ｒ１＝−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ｐ−ＯＣＨ３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．４Ｈｚ），３．１３−３．３０（２Ｈ，ｍ），３．３７（３Ｈ，ｓ），３．８１（３Ｈ，ｓ），４．３９−４．５１（１Ｈ，ｍ），４．８０−４．９６（１Ｈ，ｍ），５．０２（２Ｈ，ｓ），５．２２−５．３５（１Ｈ，ｍ），５．３０−５．５５（２Ｈ，ｍ），６．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，９．８Ｈｚ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，９．８Ｈｚ），７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）
Ｉａ−２４（Ｒ１＝−（ＣＨ２）５ＮＨＣＯ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ｐ−ＯＣＨ３）
０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．６６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．６Ｈｚ），３．１０−３．２５（２Ｈ，ｍ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．８１（３Ｈ，ｓ），４．４５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６，６．２，７．５Ｈｚ），４．６５−４．８０（１Ｈ，ｍ），５．０２（２Ｈ，ｓ），５．２６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．７，６．８Ｈｚ），５．３０−５．５５（２Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．６，９．８Ｈｚ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１，９．７Ｈｚ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）
【００４３】
Ｉｃ−１（Ｒ２＝フェニル）
０．８５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．６８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．２Ｈｚ），３．４７（３Ｈ，ｓ），４．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５，５．５，７．８Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．９，６．８Ｈｚ），５．３２−５．５８（２Ｈ，ｍ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．８Ｈｚ），７．１０−７．４８（５Ｈ，ｍ）
本発明化合物（Ｉ）の生物学的活性、即ち、免疫抑制作用、抗腫瘍細胞増殖作用等の活性を下記の実験例に示す方法で試験した。
【００４４】
実験例１  マウス脾細胞の試験管内マイトジェン反応に対する抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス脾細胞５×１０５個を０．１ｍｌの１０％牛胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地（炭酸水素ナトリウム２ｍＭ、ペニシリン５０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、及び２−メルカプトエタノール５×１０−５Ｍを添加）に浮遊させたものを加え、その各ウェルにマイトジェンとしてコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）５μｇ／ｍｌ、又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍｌと、化合物Ｉａ−４を種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を０．２ｍｌとした。化合物Ｉａ−４は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、上記ＲＰＭＩ１６４０培地にて希釈し最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ以下になるように添加した。９６ウェルマイクロタイタープレートは、湿度１００％、二酸化炭素５％、空気９５％に保持された培養器内で３７℃、３日間培養した。その後、６ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ｛３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド｝（シグマ製）溶液２５μｌを各ウェルに加え、３７℃にて４時間同一条件下で培養した。培養終了後、生成したホルマザンを、２０％ドデシルナトリウムスルホン酸（ＳＤＳ）の０．０２Ｎ−塩酸溶液５０μｌを加え、３７℃で２４時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成したホルマザンの吸光強度（ＯＤ）を５７０ｎｍのフィルターを装着したイムノリーダーで測定した（ザ．ジャーナル．オブ．イムノロジカル．メソッド、６５巻、５５〜６３頁、１９８３年参照）。化合物Ｉａ−４の濃度と吸光強度との相関より５０％の細胞増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）を算出した。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
0003572115.tif 000006
表１に示すように、化合物Ｉａ−４はマウス脾細胞のＣｏｎ  Ａ反応及びＬＰＳ反応の両反応を抑制した。また、両反応に対して幅広い抑制濃度範囲を示した。
【００４６】
実験例２  ＥＬ４細胞に対する抗細胞増殖効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにマウス胸腺腫株ＥＬ４細胞を４×１０４個／０．１ｍｌのスケールで加え、化合物Ｉａ−４を０〜５０００ｎｇ／ｍｌとなるように０．１ｍｌ添加した。３日間培養し、実験例１で示したＭＴＴ法によりそのＩＣ５０値を算出した。対照としてＰＡ−４８１５３Ｃを用い、同様に実験してＥＬ４細胞に対する毒性を試験した。結果を表２に示す。
【表２】
0003572115.tif 000007
上記の各実験例と同様の方法で一連の本発明化合物のＣｏｎ  Ａ反応抑制作用、リポポリサッカライド反応の抑制作用、及びＥＬ４細胞に対する毒性を試験した。これらの結果、及びＣｏｎ  Ａ反応抑制作用と、ＥＬ４細胞に対する毒性のＩＣ５０値の比を表３にまとめて示す。
【００４７】
【表３】
0003572115.tif 000008
【００４８】
実験例３  試験管内アロ混合リンパ球反応（アロＭＬＲ）に対する抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス脾細胞（Ｈ−２Ｋ、応答細胞）５×１０５個と、マイトマイシンＣ処理（５０μｇ／ｍｌ，３７℃，３０分処理後、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄する）したＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞（Ｈ−２ｄ、刺激細胞）５×１０５個を０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に加えた。更に、化合物Ｉａ−４を１００ｎｇ／ｍｌ以下になるように添加した。９６ウェルマイクロタイタープレートは、上記実験例１と同じ条件下の培養器内で６日間培養し、収穫の１８時間前に３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）でパルスラベルした。培養終了後、セルハーベスターにて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定し、ＩＣ５０値を算出した。対照としてＰＡ−４８１５３Ｃについても同様に実験してＩＣ５０値を求めた。結果を表４に示す。
【表４】
0003572115.tif 000009
【００４９】
上記実験例１−３から、化合物Ｉａ−４は、ＰＡ−４６１５３Ｃと比較してＥＬ４細胞に対する抗細胞増殖効果が約１００倍低下し、一方マイトジェン反応及びアロＭＬＲに対する抑制効果はほぼ同等であることが分かる。また、表３で示される通り、その他の本発明の化合物（Ｉ）についても、毒性が低く、Ｔ細胞及びＢ細胞両方に対して増殖抑制作用が強いことが分かる。これらの結果より、本発明化合物（Ｉ）は、ＰＡ−４８１５３Ｃに比較して、毒性が低く、かつ免疫反応に対する抑制効果が上昇していることが明らかである。
【００５０】
実験例４  マウスでのヒツジ赤血球に対する抗体産生抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４及びＩａ−５を用いた。
（１）化合物Ｉａ−４の、マウスでのヒツジ赤血球に対する抗体産生抑制効果
マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を１×１０８個を静脈内投与することにより免疫した。４日後に心採血して血清を回収し、血清中に産生されたＩｇＭ抗体価を赤血球凝集反応によりＨＡタイターとして測定した。化合物Ｉａ−４は、Ｏ／Ｗエマルジョンビークルに溶解し、免疫した日と２日後、及び免疫の翌日と３日後に腹腔内投与した。結果を表５に示す。
【表５】
0003572115.tif 000010
表５に示すように化合物Ｉａ−４は、ＳＲＢＣに対するＩｇＭ抗体産生を抑制した。
【００５１】
（２）化合物Ｉａ−５のマウスでのヒツジ赤血球に対する抗体産生抑制効果
マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を１×１０８個静脈内投与することにより免疫した。７日後に心採血して血清を回収し、血清中に産生されたＩｇＧ抗体価を赤血球凝集反応によりＨＡタイターとして測定した。化合物Ｉａ−５は、Ｏ／Ｗエマルションビークルに溶解し、免疫の翌日に静脈内投与した。結果を表６に示す。
【表６】
0003572115.tif 000011
表６に示すように化合物Ｉａ−５は、ＳＲＢＣに対するＩｇＧ抗体産生を抑制した。
【００５２】
実験例５  遅延型過敏症反応に対する抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。抗原としてＳＲＢＣ  １×１０５個をマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）に静脈内投与により免疫し、４日後に右足蹠にＳＲＢＣ  ５×１０７個を皮内チャレンジしてＤＴＨを誘発した。チャレンジ４８時間後に抗原投与足と非投与足の腫れを測定し、両足の腫れの差をＤＴＨとした。化合物Ｉａ−４は、Ｏ／Ｗエマルジョンビークルに溶解し、免疫当日と２日後に腹腔内投与した。ビークル投与群のＤＴＨが５８．３±２０．４の時、化合物Ｉａ−４投与群は、４０ｍｇ／ｋｇの投与量でＤＴＨ９．０±９．６（×０．０１ｍｍ）とＳＲＢＣに対する遅延型過敏症を抑制した。
【００５３】
実験例６  ラットでのアジュバント関節炎に対する抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。７−８週令、体重１５０−１７０ｇのＣｒｊ／ＬＥＷ系雌性ラットの左足蹠部に、流動パラフィンに懸濁したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（Ｄｉｆｃｏ社）０．５ｍｇ／０．０５ｍｌを皮下投与し、アジュバント関節炎を発症させた。アジュバント投与後、経日的に容積測定器（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）により両足の浮腫容積を測定した。化合物はＯ／Ｗエマルションビークルに溶解してアジュバント注射の翌日から毎日、１２日間腹腔内投与した。アジュバント投与１８日後のアジュバント非投与足の浮腫容積に対する作用を検討した。。対照群の浮腫容積すなわち測定容積から正常ラットの足容積１．２ｍｌを差し引いた値を１００％にとり、その値からの抑制％を抑制率としＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定で有効性を判定した。
【表７】
0003572115.tif 000012
表７に示すように化合物Ｉａ−４はラットアジュバント関節炎に対し強い抑制効果を有するので、抗リウマチ剤として有用である。
【００５４】
実験例７  細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導に対する抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−４を用いた。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈ−２κ）マウスにＥＬ４（Ｈ−２ｂ）細胞を１×１０７個腹腔内移入し、１０〜１１日目に脾細胞を採取し、ＥＬ４細胞に対する細胞障害活性を４時間のクロム５１遊離法で測定した。即ち、ＥＬ４細胞をクロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ標識）で１時間ラベルし、洗浄後、一定の比率［エフェクター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）：標的（Ｔａｒｇｅｔ）比］で脾細胞と混合培養し、上清中に遊離される５１Ｃｒをガンマーカウンターで測定した。化合物Ｉａ−４は、Ｏ／Ｗエマルションビークルに溶解し腹腔内投与した。結果を表８に示す。
【表８】
0003572115.tif 000013
表８に示すように化合物Ｉａ−４は、ＥＬ４細胞に対するＣＴＬの誘導を抑制した。
【００５５】
実験例８  各種細胞に対する細胞増殖抑制効果
本実験には化合物Ｉａ−１、Ｉｂ−１及びＩａ−１５を用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに下記の表９で示した各細胞の細胞数を０．１ｍｌのスケールで加え、上記実験例１と同じ培養条件下、下記の表９で示した培地で１日前培養し、０〜５０００ｎｇ／ｍｌとなるように化合物Ｉａ−１を０−１０μｇ／ｍｌの濃度で０．１ｍｌ添加した。そして３〜４日間培養を続け、培養終了後、上記実験例１で示したＭＴＴ法によってＩＣ５０値を算出した。同様にして、化合物Ｉｂ−１及びＩａ−１５についても試験した。結果を表９に示す。
【００５６】
【表９】
0003572115.tif 000014
細胞名：
ＣＣＤ−１９Ｌｕ：ヒト正常肺細胞
Ｐ３８８：マウス白血病
Ｐ３８８／ＡＤＭ：耐性腫瘍
Ｌｕ−９９：ヒト大細胞肺癌
培地：
ＭＥＭはイーグルＭＥＭに１０％牛胎仔血清を加えた培地であり、ＲＰＭＩ  １６４０は、実験例１で示した培地であるが、ヒト由来の細胞には２−メルカプトエタノールは含まれていない。
上記結果から、本発明の化合物（Ｉ）は、腫瘍細胞増殖抑制作用を有しており、正常肺細胞ＣＣＤ−１９Ｌｕに対するＩＣ５０値と大細胞肺癌Ｌｕ９９細胞に対するＩＣ５０値との間に大きい差を有することが示された。また、化合物Ｉａ−１５が、免疫抑制作用と、腫瘍細胞増殖抑制作用の両作用を有することも示された。
【００５７】
実験例９  腹水型腫瘍（マウス白血病Ｐ３８８）に対する治療効果
本実験例には化合物Ｉａ−５を用いた。ＤＢＡ／２系マウスの腹腔内で移植継代されたＰ３８８細胞を取り出し、１０６個の細胞を含む生理食塩水０．１ｍｌをそれぞれの試験マウス（ＢＤＦ１系、雌マウス）の腹腔内に移植した。Ｏ／Ｗエマルションビークルに溶解した化合物Ｉａ−５を、癌細胞の移植の翌日、即ち第１日（移植日を第０日とする）に種々の投与量で尾静脈内に投与した。対照マウスには化合物を含まないビークルのみを注射した。薬剤の有効性は生存日数に基き、延命効果の有無で評価した。延命率は対照の生存日数に対するパーセント（％）であり、下記式に従って算出される。有効性の基準は３０％以上と決定した。
【数１】
延命率（％）＝（Ｔ／Ｃ−１）×１００％
Ｔは化合物投与群の平均生存日数、Ｃは対照群の平均日数を表す。
また、副作用の指標として体重測定を経日的に行ない、治療前から４ｇ以上の体重減少を伴う場合には毒性と判定した。
結果を表１０に示す。
【表１０】
0003572115.tif 000015
表１０に示すように化合物Ｉａ−５の腹水型腫瘍であるマウス白血病Ｐ３８８に対する抗腫瘍効果は、投与量２５ｍｇ／ｋｇでは弱いが、５０ｍｇ／ｋｇでは有効である。
【００５８】
実験例１０  固形腫瘍（マウス肺癌Ｌｅｗｉｓ及びマウス扁平上皮癌ＳｑＣ−ＮＨ  Ｆ−３）に対する治療効果
本実験には化合物Ｉａ−５を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの皮下に移植継代されたＬｅｗｉｓ肺癌の腫瘍塊を取り出し、コラゲナーゼ処理によって細胞を１個ずつ分散させた。調製された細胞２×１０５個を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．１ｍｌをそれぞれの試験マウス（ＢＤＦ１系、雌マウス）の背部皮下に移植した。またマウス扁平上皮癌ＳｑＣ−ＮＨ  Ｆ−３の実験では、その培養細胞株を用いた。即ち、１０％牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で十分に増殖したＳｑＣ−ＮＨ  Ｆ−３培養細胞をトリプシン処理により細胞を１個ずつに分散させた。調製された細胞１０５個を含むＰＢＳ０．１ｍｌを試験マウス（ＤＳ系、雌マウス）の背部皮内に移植した。
Ｌｅｗｉｓ及びＳｑＣ−ＮＨ  Ｆ−３の各腫瘍細胞を移植された試験マウスに対し、第１日あるいは第１０日（移植日を第０日とする）に種々の投与量の本化合物を尾静脈内に投薬した。対照マウスには化合物を含まないビークルのみを注射した。治療実験中、各マウスの腫瘍のサイズと体重の測定を行なった。薬剤の有効性を投薬後１４日目の腫瘍径の測定値に基き、下記式に従って求められる増殖抑制率で評価した。
【数２】
増殖抑制率（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００％
Ｔ＝化合物投与群の平均腫瘍径
Ｃ＝対照群の平均腫瘍径
但し、腫瘍径＝（ａ＋ｂ）／２［ａは長径（ｍｍ）、ｂは短径（ｍｍ）を表す］
また、Ｌｅｗｉｓ肺癌を用いた治療実験では実験例９と同様、延命率についても評価した。
結果を表１１及び表１２に示す。
【００５９】
【表１１】
0003572115.tif 000016
【表１２】
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表１１及び１２に示すように化合物Ｉａ−５は固形腫瘍であるマウス肺癌Ｌｅｗｉｓとマウス扁平上皮癌ＳｑＣ−ＮＨ  Ｆ−３に対して２５ｍｇ／ｋｇの投与量では効果が弱いが、５０−１００ｍｇ／ｋｇでは強い抗腫瘍活性を有する。
【００６０】
実験例１１  ヒト結腸癌ＨＴ−２９（固形腫瘍）に対する治療効果
本実験には化合物Ｉａ−５を用いた。化合物Ｉａ−５の無胸腺ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍に対する有効性を試験した。１０％牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養されたヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞１０６個を含有するＰＢＳ０．１ｍｌを試験マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕｄｅ、雌マウス）の背部皮内に移植した。腫瘍が増殖し、そのサイズが３ｍｍ程度に達する移植後８日目に種々の投与量の本化合物を尾静脈内に投薬した。対照マウスには化合物を含まないビークルのみを注射した。治療実験中、各マウスの腫瘍のサイズと体重の測定を行なった。実験例１０と同様、薬剤の有効性を、投薬後１４日目の腫瘍径に基く増殖抑制率で評価した。結果を表１３に示す。
【表１３】
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表１３に示すように本化合物Ｉａ−５はヌードマウスにおいてＨＴ−２９ヒト結腸癌の増殖を抑制する活性を有する。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の２−ピラノン誘導体（Ｉ）は免疫抑制作用、腫瘍細胞増殖抑制作用を有していることから、臓器あるいは、組織の移植に対する拒絶反応、骨髄移植により起こる移植片対宿主反応、各種自己免疫病、各種炎症、血液系腫瘍、固形癌等の腫瘍疾病等の治療及び予防に有用である。