(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン、キトサン及びそれらの誘導体のうちのいずれかからなる多糖類を１０００気圧から４０００気圧の高圧条件下で処理することにより解重合することを特徴とする低分子化方法。
【請求項２】
摂氏０度から２００度の温度条件下で前記多糖類を処理するものであることを特徴とする請求項１に記載の低分子化方法。
【請求項３】
蒸留水中で前記多糖類を処理するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の低分子化方法。
【請求項４】
前記多糖類に加水分解または、酸化分解を施すものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の低分子化方法。
【請求項５】
前記多糖類を過酸化剤で処理するものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の低分子化方法。
【請求項６】
前記過酸化剤は、過ホウ酸ソーダであることを特徴とする請求項５に記載の低分子化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キチン、キトサンなどの多糖類を低分子化する低分子化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロース、キチン、キトサン及びその誘導体は、保湿力が優れており、その他にキチン、キトサンとその誘導体には抗カビ性、抗細菌性、抗ウイルス性、生体適合性、金属イオン吸着性、低コレステロール剤など様々な作用が確認され、かつ、生分解性であり、この材料を利用した応用製品が数多く開発されている。
【０００３】
キトサンはカニやエビの甲殻類の外皮を形成しているキチンの脱アセチル化物である。脱アセチル化処理中にキチン主鎖の切断も起こるため、分子量低下を伴いながらキトサンが得られる。アミノ多糖であるキトサンは反応性に富むと同時に抗菌性やキレート形成能やその他多くの性能を持ち、特に、化粧料、医薬中間体、食品添加剤、農薬、固定化酵素担体（ビーズ）などへ低分子量キトサンが応用されてきた。例えば、キチン・キトサン研究会編「キチン、キトサンハンドブック」（技報堂、１９９５）に記載されている。一般に、酸加水分解により低分子キトサンを得ている。
【０００４】
例えば、特開平９−３１１０４号公報には、キトサンを酸溶液中に乳状コロイドとし、コロイド化した微粒子状のキトサンを、強酸により加水分解することを特徴とする低分子キトサン及びキトオリゴ糖の製造方法が記載されている。
【０００５】
一方、多糖類の一つであるセルロースやポリエステルの超臨界流体による分解過程が近年注目されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の多糖類の低分子化方法においては、濃塩酸等によって、単糖まで加水分解されていた。キトサンを濃塩酸で加水分解した場合、反応系が不均一であるために、キトサン鎖の端から分解が進みやすく、キトサンの大部分はＤ−グルコサミンの単糖まで分解されてしまい、重合度が比較的大きいオリゴ糖や低分子キトサンを効率よく製造することは困難であった。
【０００７】
また、従来の化学薬品及び酵素による低分子化方法においては、水系において常圧で室温から１００度までの温度条件下で数時間から約１日以上の長時間を要していた。
【０００８】
特開平９−３１１０４号公報のおいては、実施例においてキトサンを水に分散し、塩酸を添加し、５０〜８０度で２時間攪拌を行い、溶解活性化させ、その後、攪拌をしながら過酸化水素と濃塩酸を加え、乳状コロイドとした。次に遠心分離により脱水を行い、その脱水したキトサンゲルを、濃塩酸に強く攪拌しながら加え、８０度で５〜６時間分解反応させている。この方法においても、長時間を要していた。なお、圧力については、特に限定されていない。また、化学的処理を行っているため、脱塩、脱色などの精製を十分に行われなければならず、廃液の処理も行わなければならないなど、処理に困難を極めていた。
【０００９】
一方、キチン、キトサンは、熱による融解を起こさないため、酸や有機溶剤などに溶解させ溶液化して、成型、混合、塗布などを行い、利用している。しかし、該溶液は、その分子量によって粘度が異なるため、高分子量のものを溶液化すると高い粘度のため利用しにくいという問題を有していた。
【００１０】
このことから、本発明は、従来技術の問題点を解決し、化学的処理を用いないで物理的処理を行う簡単な処理操作で、効率よく、かつ短時間に行う低分子化方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、請求項１に記載された発明は、キチン、キトサン及びそれらの誘導体のうちのいずれかからなる多糖類を１０００気圧から４０００気圧の高圧条件下で処理することにより解重合することを特徴とする低分子化方法に関する。キチン、キトサンなどの多糖類の高分子材料を低分子化し、その分子量を制御し、開発用途に合わせた加工性のよいものを製造することができる。また、従来、低分子化に長時間要していたが、本発明を用いることにより、数分から数十分程度の極めて短時間に低分子化できるため効率的に低分子化処理を行うことができるものである。さらに、低分子化に伴う、該分子量の制御を容易にすることもできる。
【００１２】
前記多糖類は、キチン、キトサン及びそれらの誘導体のうちのいずれかであることが好ましい。本発明は、高分子材料である多糖類に用いることができるが、その中でも天然に大量に存在している甲殻類の外皮を形成しているキチン、キトサン及びそれらの誘導体について低分子化を図るものである。
【００１３】
前記高圧条件は、１００気圧以上であることが好ましい。高圧処理法は常圧処理法と比較して極めて短時間で目的の低分子化を達成することができ、その制御も容易にすることができる。また、高圧処理法は、従来の化学的処理に変わって物理的処理方法で解重合できることになり、化学的処理により生じていた廃液が生じなくなるため環境面でも有効な処理方法であるということができる。
【００１４】
前記高圧条件は、１０００気圧から４０００気圧であることが好ましい。１０００気圧下の処理では、低分子化の時間依存性が大きく、換言するとキトサン分子量を制御し易く、収率も比較的大きい。より高圧になると数分から数十分という極めて短時間で更に低分子化を達成することができる。一方で、超高圧条件下では、大きな重量損失を伴う。重量損失の原因は超高圧処理中に単糖であるＤ−グルコサミンが生成するためである。
【００１５】
請求項２に記載するように、摂氏０度から２００度の温度条件下で前記多糖類を処理するものであることが好ましい。超臨界流体条件とはやや異なるが、常温、超高圧という極限状態においても、キチンやキトサンの解重合反応は容易に進行するものであった。
【００１６】
請求項３に記載するように、蒸留水中で前記多糖類を処理するものであることが、好ましい。蒸留水のみで、高圧処理した場合でも、解重合が生じ、分子量又は固有粘度の低下を引き起こすこととなった。
【００１７】
請求項４に記載するように、前記多糖類に加水分解または、酸化分解を施すものであることが好ましい。加水分解または、酸化分解には、硫酸、塩酸、ギ酸などの酸や、水酸化ナトリウム、過ホウ酸ソーダなどの塩基を用いる化学的処理を施すことによっても解重合反応を起こすことができる。
【００１８】
請求項５に記載するように、前記多糖類を過酸化剤で処理するものであることが好ましい。過酸化剤で処理することにより、超高圧条件でも解重合が生じ、低分子化が促進されるものである。
【００１９】
請求項６に記載するように、前記過酸化剤は、過ホウ酸ソーダであることが好ましい。
【００２０】
多糖類を含有した溶液は、その分子量によって粘度が異なるため、より効果的な利用を図るためには、高分子量の材料を低分子化し、またその分子量を制御し、その開発用途に合わせて加工性の良いものを選択することが重要となるため、本発明により低分子化に伴う副産物の生成を制御することにより、加工性の向上を図ることができるものである。
【００２１】
以上の低分子化方法は、極めて短時間に低分子化を効率よく処理し、しかもその分子量を容易に制御することができる有効的方法である。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるわけではない。
【００２３】
多糖類のキチンおよびキトサンを原試料とし、以下の方法により解重合を行うことができる。
【００２４】
キチンおよびキトサン粉末を過ホウ酸ソーダ水溶液の入った容器に入れ密封し、高圧条件下（１０００〜４０００気圧）で１０分から３０分処理して解重合した。これにより得られた固体試料を水洗後、凍結乾燥して目的の低分子化したキチン及びキトサンを得ることができる。また、過ホウ酸ソーダ水溶液に代えて蒸留水のみを使用することもできる。
【００２５】
過酸化剤としては、過ホウ酸ソーダのほか、過酸化ナトリウム、過酸化水素なども使用することができる。
【００２６】
得られた低分子化アミノ多糖類およびその誘導体は抗菌作用、各種医用材料、高分子医薬、化粧品材料、分離膜材料、粒状多孔質材料（液体クロマトグラフィー用坦体等）及び水処理剤として使用されつつある。
【００２７】
また、上記の低分子化法により副産物として生成されるオリゴマーについては、セルロースはブドウ糖、セロビオースなどで食品、医療分野等の様々な分野で利用されており、キチン、キトサンのオリゴマーはキチン、キトサンと同様な作用並びに健康増進作用が知られておりその利用が期待されている。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例を具体的に説明する。
【００２９】
片倉チッカリン（株）製のキトサン（脱アセチル化度９６％）及びキチンを原試料とし、次の方法により解重合を行った。
【００３０】
まず、キトサン粉末（又は、キチン粉末）０．２５ｇを５％過ホウ酸ソーダ水溶液５０ｍｌの入ったポリエチレン袋に入れ密封し、超高圧装置（（株）杉野マシーン製，ＩＳＳＫ−１）のシリコン浴に挿入し５５℃で圧力１，０００〜４，０００ａｔｍ、時間１０〜３０分処理して解重合を行った。
【００３１】
その後、室温で処理液をガラスフィルター濾過して固液を分離し、濾液はＨＰＬＣ分析に供し、固体試料は十分水洗後、凍結乾燥して分子量や収率などを測定した。
【００３２】
また、５％過ホウ酸ソーダ水溶液に代えて蒸留水のみを使用した場合も併せて解重合を行った。
【００３３】
＜キトサンの分子量測定＞
０．１Ｍ酢酸／０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を溶媒に用いキトサンを溶解する。ウベローデ型粘度計でキトサン溶液の粘度を２５℃で測定し固有粘度を求め、以下のＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式（キチン・キトサン研究会編「キチン、キトサンハンドブック」（技報堂、１９９５））から粘度平均分子量Ｍ（又は、重合度ＤＰ）を算出した。
【００３４】
【数１】
0003593024.tif 000002
【００３５】
ここで、［η］の単位はｍｌ／ｇである。脱アセチル化度がほぼ１００％であると考え、重合度ＤＰは次式で与えられる。
【００３６】
【数２】
0003593024.tif 000003
【００３７】
＜高速液体クロマトグラフィー測定（ＨＰＬＣ）＞
東ソ（株）製高速液体クロマトグラフィーＨＬＣ８０３Ｄ、カラム：東ソＴＳＫ−ＧＥＬ  ＡＭＩＤＥ−８０（３００ｍｍ）を用いた。「食品新素材有効利用技術シリーズＮｏ．１」（菓子総合技術センター編、１９９９）に報告されている方法に準拠しオリゴ糖の分析を行った。２５℃で溶離液ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／５Ｍ  ＡｃＯＫ（７０／３０／０．２５）を流速０．７ｍｌ／ｍｉｎで流し、１回の測定に１００μｌ使用して示差屈折計検出器により測定した。標準キトサンオリゴ糖混合物（Ｃｈｉｔｏｓａｎ―Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｎｏ．８００１０５、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏ．）の５％水溶液の測定結果を基に各種解重合試料の濾液の分析を行った。また、キチンに関しては標準品として（Ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ｎｏ．８００１０４）を用い、キトサンの場合と同条件で測定した。
【００３８】
＜赤外線吸収スペクトル測定＞
Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＭＡＧＮＡ５６０を用いて原試料及び解重合試料のＦＴ―ＩＲ測定をＫＢｒ錠剤法により行った。
【００３９】
以下、その分析結果を説明する。
【００４０】
１．解重合による重量損失について説明する。
【００４１】
図１に超高圧解重合処理によるキトサンの重量損失を、図２にキチンの重量損失を示す。両者とも処理時間には依存しないが、圧力が高いほど損失量は大きくなり処理圧力に依存している。図１及び図２において、３０００ａｔｍ、５５℃、過ホウ酸ソーダ水溶液で処理を行ったところ、キトサンの重量損失は４４％であるのに対して、キチンは１６％と低い。この重量損失の原因は、主として解重合過程におけるオリゴマーの生成によるものである。このことから、キチンとキトサンを比較した場合に、キトサンは、重量損失が大きいため、オリゴマー生成量が多いが、それに対してキチンの方は、重量損失が小さいため、オリゴマー生成量が少ないことから、キチンはキトサンより解重合が進行していないものと考えられる。
【００４２】
２．解重合による分子量変化について説明する。
【００４３】
図３に超高圧解重合処理で得られたキトサンの分子量変化を、図４に超高圧解重合処理で得られたキチンの固有粘度を示す。過ホウ酸ソーダ水溶液、５５℃で処理を行った。
【００４４】
キチンの固有粘度（ｄｌ／ｇ）はＤＭＡｃ／ＮＭＰ／ＬｉＣｌ（１／１／０．１）混合溶媒を用いて２５℃の粘度測定から求めた。キチンの場合、固有粘度から分子量を算出するＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式が報告されていないので、固有粘度の変化を示した。
【００４５】
超高圧解重合処理で得られたキチン及びキトサンの分子量と固有粘度の反応前後の変化を表１に示す。
【００４６】
キトサン原試料の分子量は約１，０９０，０００である（表１参照）。図３より、１０００ａｔｍ、１０分処理すると約１３８，０００となり、分子量は約１／８に低下する。１０００ａｔｍで処理した場合、分子量は処理時間とともに大きく低下するが、３０００ａｔｍおよび４０００ａｔｍで処理した場合は、圧力が大きくなるにしたがって、最初の１０分間で大きな分子量低下が起こる。これより、分子量は、３０００ａｔｍおよび４０００ａｔｍのときの方が、１０００ａｔｍのときよりも処理時間に依存する割合が低い。
【００４７】
その一方で、図１から重量損失は各処理圧力においてほぼ一定で時間に依存しない。しかし、図３で見られるように分子量は、一様に低下し、特に１０００ａｔｍの場合は、時間に依存しているのが顕著である。したがって、オリゴマー生成に起因すると思われる重量損失はどの処理圧力の場合でも短時間内に起こり１０分以後ではほとんど起こらないと考えられる。一方、常圧で過ホウ酸ソーダ水溶液中で、８時間処理したキトサンの分子量は約１００，０００となり、図１の結果を参照すると１０００ａｔｍ、１８分処理で得られる分子量に対応している。これからわかるように同程度の分子量を生成するのに、常圧下では、８時間かかるのに対し、時間に依存する１０００ａｔｍ処理下では、１８分という極めて短時間で同じ効果を得ることができる点で、本方法は有用である。
【００４８】
キチン原試料の固有粘度は約５．１（ｄｌ／ｇ）（表１参照）であったが、図４に見られるように解重合（３０００ａｔｍ）すると固有粘度は処理時間とともに減少し、１０分後では約１．９（ｄｌ／ｇ）、３０分後では約１．４（ｄｌ／ｇ）と、約１／３前後まで低下した。ここで得た固有粘度と粘度平均分子量の関係が、キトサンのＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式（１）の指数α＝０．９３と同一であると仮定すると、次式の関係が成り立つ。
【００４９】
【数３】
0003593024.tif 000004
【００５０】
これは、１／３への固有粘度の低下はキチン分子量が約０．３（３０％）に低下することに対応する。
【００５１】
キトサンの原試料は、１，０９０，０００であったのに対し、３０００ａｔｍ、３０分処理後では、分子量は５５，０００となり、処理後の分子量が原試料の約１／２０程度に低下している。したがつて、キトサンよりキチンの分子量低下度合いの方が小さい。これは、キチンはキトサンよりも分子内及び分子間水素結合が多く存在し、このためキチンの解重合が低くなったと考えられる。
【００５２】
表１には、５％過ホウ酸ソーダ水溶液に代えて蒸留水のみを使用し、４０００ａｔｍ、３０分処理したときの解重合結果を示す。
【００５３】
【表１】
0003593024.tif 000005
【００５４】
表１の結果から、重量損失について、キトサンの分子量は、約１／３程度の３６９，０００減少した。これを、同条件下における過酸化剤である過ホウ酸ソーダを用いたときと比較してみると、図１より過ホウ酸ソーダを用いたときは、キトサンの分子量は、約１／２１程度の１，０４０，０００減少している。これより、低分子化においては、過ホウ酸ソーダのような過酸化剤の存在が必要であることがわかった。
【００５５】
また、キチンは、固有粘度の低下が観測された。原試料と処理後の固有粘度の差は、約１．０８（ｄｌ／ｇ）で約１／５減少している。
【００５６】
したがって、キチン、キトサンいずれの場合においても、過酸化剤に代えて蒸留水のみを使用しても分子量低下が生じ、低分子化が起こっている。つまり、超高圧水中処理（ＮａＢＯ３なし）のみでも解重合が生じている。
【００５７】
しかし、分子量低下度合いは、分子量比からキトサンで約３３％、固有粘度比からキチンでは約２１％が解重合したこととなり、蒸留水のみで高圧処理するよりも過酸化剤を使用し高圧処理した場合の方が、より低分子化を引き起こす割合が大きいことを示している。
【００５８】
３．解重合によるオリゴマーの生成について説明する。
【００５９】
解重合処理した濾液中に損失重量に対応するオリゴマーが存在するかを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で解析した。図５に標準キトサンオリゴ糖混合物の５％水溶液の測定結果を示す。１、２、３量体は鋭いピークで現れているが、４量体以上のオリゴマーはやや分離が悪くブロードな曲線として現れた。
【００６０】
図６に３０００ａｔｍ、１０〜３０分処理液のＨＰＬＣ曲線を示す。いずれも保持時間４分付近からベースラインが負側に振れ、分析物の終了を意味すると考えられる。したがって、分析曲線は保持時間３．６分付近のブロードなシングル・ピーク（保持時間の近接する２つのピークの重なり）のみ観測された。これは、標準試料の１量体、すなわち、Ｄ−グルコサミンに相当している。したがって、Ｄ−グルコサミンの末端基の僅かな違いか、または、Ｄ−グルコサミン分子内の水酸基やアミノ基の配置（コンホメーション）の僅かな違いのある混合物が生成したものと思われる。
【００６１】
図７に４０００ａｔｍ、３０分水中処理濾液のＨＰＬＣ曲線を示す。この場合もＮａＢＯ３水溶液処理濾液と同様の結果を得た。
【００６２】
図８にキチンオリゴ糖の標準試料、キチン解重合処理（４０００ａｔｍ、２０分処理及び３０分水中処理）濾液のＨＰＬＣ曲線を示す。いずれの結果もキトサン解重合過程と同様に単糖であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのみが観測された。
【００６３】
これらの結果は、キトサン及びキチンとも解重合初期にオリゴマーを生成して水溶液中に溶解し、５５℃の超高圧下で単糖まで引き続き解重合することを示唆している。
【００６４】
４．原試料及び解重合試料のＦＴ−ＩＲについて説明する。
【００６５】
図９に原試料、常圧８時間処理試料、１０００ａｔｍ、１０分処理試料（１０００ａｔｍ、１０分）、及び４０００ａｔｍ、３０分処理試料（４０００ａｔｍ、３０分）のそれぞれのキトサンについて赤外吸収スペクトル測定を行った結果を示す。キトサン原試料に見られる特徴的な吸収帯として１６５５ｃｍ−１のアミド１吸収、１６００ｃｍ−１にアミノ基の吸収、及び１１５５ｃｍ−１と１２６０ｃｍ−１に糖特有のエーテルによる吸収バンドがすべての処理試料にも現れている。また、それぞれの赤外吸収曲線は全波数領域にわたり違いはほとんど見られなかった。したがって、解重合処理においてグルコサミン環構造を破壊することはなく、エーテル結合部位で解重合が起きていると推測される。
【００６６】
５．以上の実験結果から、常圧下でキチン、キトサンを処理するよりも、高圧、特に３０００〜４０００ａｔｍの超高圧条件下で処理を行うことにより、極めて短時間で低分子化を行えることとなった。また、キチン及びキトサンともに解重合初期にオリゴマーを生成して水溶液中に溶解し、超高圧下で単糖まで引き続き解重合することが可能となった。これにより、解重合を制御することが容易になった点で極めて有用である。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、化学的処理を用いないで物理的処理を行うため処理操作が簡単で、かつ極めて短時間で多糖類の低分子化を図ることができる。また、本発明の低分子化方法により低分子化することにより粘度を低くすることが可能となり、解重合を制御することが容易になった点で極めて効果的である。その結果、低分子化アミノ多糖類およびその誘導体は抗菌作用、各種医用材料、高分子医薬、化粧品材料等に応用できることとなった。また、低分子化法により副産物として生成されるオリゴマーについては、様々な分野で利用されることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】超高圧解重合処理によるキトサンの重量損失を示すグラフである。
【図２】超高圧解重合処理によるキチンの重量損失を示すグラフである。
【図３】超高圧解重合処理で得られたキトサンの分子量変化を示すグラフである。
【図４】超高圧解重合処理で得られたキチンの固有粘度変化を示すグラフである。
【図５】標準キトサンオリゴ糖混合物の５％水溶液のＨＰＬＣ曲線である。
【図６】３０００ａｔｍ、１０〜３０分処理液のＨＰＬＣ曲線である。
【図７】４０００ａｔｍ、３０分水中処理濾液のＨＰＬＣ曲線である。
【図８】キチンオリゴ糖の標準試料、キチン解重合処理（４０００ａｔｍ、２０分処理及び３０分水中処理）濾液のＨＰＬＣ曲線である。
【図９】キトサンについての赤外吸収スペクトル測定結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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