(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムを用いて各種測定を行う方法において、試料を測定して得られたクロマトグラムの基準時間から任意時間経過後に所定の複数の時点でサンプリングされた測定対象物に由来する測定データのすべて又は一部と、あらかじめ標準試料を測定して得た標準クロマトグラムの前記基準時間と同一の基準時間から前記任意時間と同一の時間経過後に同一の時点でサンプリングされた測定対象物に由来する測定データのすべて又は一部との相関係数を求め、当該相関係数に基づき試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常であるか異常であるかを決定する、データ処理方法。
【請求項２】
標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常クロマトグラムであることを特徴とする請求項１のデータ処理方法。
【請求項３】
標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が異常クロマトグラムであることを特徴とする請求項１のデータ処理方法。
【請求項４】
相関係数を得るために、下記式を使用することを特徴とする請求項１乃至３いずれかの項に記載のデータ処理方法。
【数１】
0003572327.tif 000007
（式中、ｎはデータ点数を、Ｘ及びＹは標準及び測定されたデータを、Ｃは相関係数をそれぞれ示す）
【請求項５】
得られた相関係数をあらかじめ設定したしきい値と比較することを特徴とする請求項１乃至５いずれかの項に記載のデータ処理方法。
【請求項６】
得られた相関係数の絶対値又は２乗値をしきい値０．８と比較することを特徴とする請求項５のデータ処理方法。
【請求項７】
液体クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムを用いて糖化ヘモグロビンの測定を行う方法において、血液試料を測定して得られたクロマトグラムの基準時間から任意時間経過後に所定の複数の時点でサンプリングされた測定対象物に由来する測定データのすべて又は一部と、あらかじめ正常な標準試料を測定して得た標準クロマトグラムの前記基準時間と同一の基準時間から前記任意時間と同一の時間経過後に同一の時点でサンプリングされた測定対象物に由来する測定データのすべて又は一部から相関係数を求め、当該相関係数に基づき試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常であるか異常であるかを決定する、糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【請求項８】
標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常クロマトグラムであることを特徴とする請求項７の糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【請求項９】
標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が異常クロマトグラムであることを特徴とする請求項７の糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【請求項１０】
相関係数を得るために、下記式を使用することを特徴とする請求項７乃至９いずれかの項に記載の糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【数２】
0003572327.tif 000008
（式中、ｎはデータ点数を、Ｘ及びＹは標準及び測定されたデータを、Ｃは相関係数をそれぞれ示す）
【請求項１１】
得られた相関係数をあらかじめ設定したしきい値と比較することを特徴とする請求項７乃至１０いずれかの項に記載の糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【請求項１２】
得られた相関係数の絶対値又は２乗値をしきい値０．８と比較することを特徴とする請求項１１の糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて各種測定を行う際のデータ処理方法に関するものであり、特に糖化ヘモグロビンを液体クロマトグラフィーを用いて測定するのに好適なデータ処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィーを用いて各種測定を行う場合、得られるクロマトグラムをそのまま使用することは少なく、例えばクロマトグラムピークのピーク高さ、ピーク面積、ピーク面積比などのピーク情報を利用するのが一般的であるが、クロマトグラム全体又はクロマトグラムの一部の形状に注目することは行われていない。
【０００３】
例えば糖化ヘモグロビンを液体クロマトグラフィーで測定する場合は、カルボキシメチル基を有するシリカゲル等の陽イオン交換体を充填したカラムを用い、血液試料を溶血剤で希釈後カラムに供して測定対象物である安定型糖化ヘモグロビンを吸着させ、コハク酸緩衝液を溶離液とし、溶出する糖化ヘモグロビンを４１５ｎｍの吸光度を検出して測定し、最終的に経過する溶出時間に対する吸光度の変化クロマトグラムとして得る。このクロマトグラムに基づく糖化ヘモグロビンの測定は、前述のように糖化ヘモグロビンによる吸光度ピークのピーク高さ、ピーク面積等を、既知濃度の糖化ヘモグロビンを含有する試料について同様の操作を行った場合のピーク高さやピーク面積と比較することで行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のデータ処理方法では、クロマトグラムの全体又はクロマトグラムの一部の形状が不自然な異常なクロマトグラムであっても、当該部分が目的とするピークでない場合には問題とされない可能性がある。またこのような異常がいかなる原因により生じたものであるかという判定等についても、もっぱら熟練者の経験による判断に頼らざるを得ないという課題があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる従来技術の課題に鑑みてこれを解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。クロマトグラムの全体又はクロマトグラムの一部の形状が不自然な異常なクロマトグラムを検出しえ、しかも異常がいかなる原因により生じたものであるかを定量的に示し得るデータ処理方法の提供を目的としてなされた本発明は、即ち、液体クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムを用いて各種測定を行う方法において、試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部と、あらかじめ標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部との相関係数を求め、当該相関係数に基づき試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常であるか異常であるかを決定する、データ処理方法である。
【０００６】
また本発明は、特に上記データ処理方法を糖化ヘモグロビン測定に利用したものであって、液体クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムを用いて糖化ヘモグロビンの測定を行う方法において、血液試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部と、あらかじめ標準試料を測定して得た標準クロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部から相関係数を求め、当該相関係数に基づき試料を測定して得られたクロマトグラム又はそのクロマトグラムの一部が正常であるか異常であるかを決定する、糖化ヘモグロビン測定におけるデータ処理方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明は、液体クロマトグラフィーによって得られた測定対象物に由来するクロマトグラム又はクロマトグラムの一部（以下、単にクロマトグラム等という）と、あらかじめ測定した標準試料のクロマトグラム等との相関係数を求め、これを例えばあらかじめ定めたしきい値と比較すること等により異常又は正常なクロマトグラムと判定することを特徴とする。ここで、本発明では、標準試料を測定して得た標準クロマトグラム等としては、正常な標準試料に由来する正常なクロマトグラム等に限らず、試料自体が劣化したり、或いは測定に際して何らかの不都合が生じた結果得られた異常なクロマトグラムをも使用される。
【０００８】
また本発明においては、例えば温調不良やカラムの劣化等、原因が判明している場合に測定され得る異常クロマトグラム等や試料の変質等に起因して得られる異常クロマトグラム等と試料を測定して得られたクロマトグラム等の相関係数を求めることで、異常クロマトグラム等が得られた場合にその原因を定量的に示すことができる。即ち、得られたクロマトグラムとあらかじめ測定した得た異常クロマトグラムとから相関係数を求め、この値が高い場合には当該異常クロマトグラムを生じた原因等が生じていると判定するのである。本発明において好ましくは、頻繁に生じ得る異常クロマトグラム等をあらかじめ測定しておき、試料について測定を行った後、得られたクロマトグラム等との相関係数を求め、相関係数を高い順に表示する等すれば、異常の原因の種類等を推定する等の定量的示唆が可能となる。
【０００９】
本発明において特に好ましくは、正常なクロマトグラム等と複数の典型的な異常クロマトグラム等をあらかじめ測定して標準クロマトグラム等としておき、試料について測定を行った後、これら全ての標準クロマトグラム等との相関係数を求め、その値の順に列挙する。これにより、試料について得られたクロマトグラム等が正常か否か、更には典型的な異常クロマトグラムの内のいずれと最も近似しているかということを一度に示すことが可能である。
【００１０】
なお異常クロマトグラム等については、それを生じる原因が明らかな場合以外に、いかなる原因により当該異常クロマトグラム等が生じるか不明な場合であっても、異常クロマトグラム等が一旦得られれば本発明における標準試料を測定して得た標準クロマトグラム等として利用することができる。
【００１１】
本発明のおける相関係数を取得するための手段として、例えば次式に従うことが例示できる。
【００１２】
【数３】
0003572327.tif 000002
【００１３】
式中、Ｃは相関係数を意味し、ｎはデータ点数、即ち、例えば糖化ヘモグロビン測定の場合等、測定対象物を一旦カラムに吸着させるような場合には、当該カラムから吸着した対象物を溶出させるための溶離液を送液し始めた時間や、例えば目的対象物をカラムに吸着させないような場合には試料をカラムに送液し始めた時間等を基準時間とし、基準時間から例えば０．１秒毎、１秒毎或いは１０秒毎等の任意時間経過後にサンプリングされた吸光度等のデータの数を意味する。異常クロマトグラムの判定等の正確性を向上させるために、本発明においてはｎの数を多くすることが好ましい。
【００１４】
式中、Ｘ及びＹは測定データであり、Ｘは標準クロマトグラム等における、前記基準時間から任意時間経過後での吸光度等のデータを、Ｙは試料を測定して得られたクロマトグラム等における、Ｘの場合と同一時間（前記基準時間から同一時間経過した時間）での吸光度等のデータを意味する。なおＸを試料を測定して得られたクロマトグラム等のデータとし、Ｙを標準クロマトグラム等における吸光度等のデータとしても良い。Ｘ及びＹは、クロマトグラムの全体から得ても良いし、その一部から得ても良い。後者は、特に、測定対象物に由来するクロマトグラムが得られたクロマトグラムの一部分に過ぎない場合等に有効である。
【００１５】
以上のようにして、ｎ個のデータ（Ｘ）と、ｎ個のデータ（Ｙ）によるｎ組のデ−タに基づき、相関係数Ｃを算出する。
【００１６】
本発明によれば、相関係数をあらかじめ定めたしきい値を比較することにより、得られたクロマトグラムが異常クロマトグラムであるか否かを極めて容易に判定することが可能となる。むろん、しきい値を使用せず、算出された相関係数からケースバイケースで判定することも可能であるが、測定装置の自動化等や、測定者の熟練に依存しない判定を得るという観点で、しきい値を使用することが好ましい。
【００１７】
前述の式に基づけば、相関係数Ｃは−１と１のあいだの値をとるが、特にＸがＹの定数倍の場合、即ち２つのクロマトグラムの規格化した形状が同一の場合は−１又は１となり、ＸとＹが独立の場合、即ち２つのクロマトグラムの形状が全く異なる場合は０となる。従って、前述式で求めた相関係数Ｃの絶対値又は２乗値とあらかじめ定めたしきい値の大小を比較し、相関係数Ｃの絶対値又は２乗値がしきい値よりも大きい場合は正常クロマトグラム、しきい値より小さい場合は異常クロマトグラムと判定することにより、迅速且つ正確に異常クロマトグラムの検知を行うことができる。
【００１８】
ここで、相関係数を求める際に使用する標準クロマトグラム等として異常クロマトグラムを使用した場合には、例えば前記と逆の判定を行う等すれば良い。
【００１９】
更に、試料について測定されたクロマトグラム等をＸとし、あらかじめ測定しておいた１つ以上の典型的異常クロマトグラム等Ｙとして前記式により相関係数Ｃを計算し、相関係数Ｃの絶対値又は２乗値の大きい順に並べる等すれば、当該クロマトグラムがどの典型的異常クロマトグラムとどの程度近似しているかを即座に判定することができる。また類似の程度を相関係数の数値によって表わすことができるため、相関の高い順に可能性のある異常を迅速且つ定量的に判定・推測することができる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、あらかじめ標準試料を測定して得た標準クロマトグラム等との相関係数を求めることにより、試料を液体クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラム等が正常であるか異常であるかを迅速に決定することが可能である。この決定に際しては、しきい値等を使用することにより、測定者の主観を排除した、客観的な判定が可能である。
【００２１】
また本発明によれば、得られたクロマトグラム等とあらかじめ求めた異常クロマトグラム等との相関係数求めることにより、当該クロマトグラムが異常クロマトグラムとどの程度近似しているかを即座に判定することができる。また類似の程度を相関係数の数値によって表わすことができるため、異常の原因等を推定することも可能である。
【００２２】
以上、本発明によれば、（１）異常クロマトグラムの判定を熟練者の経験的な判断によらずに、迅速且つ正確に行うことができ、（２）異常クロマトグラムの分類を、熟練者の経験的な判断によらずに、迅速且つ定量的に行うことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれら図面に記載された発明に限定されるものではない。
【００２４】
図１は、本発明を全自動糖化ヘモグロビン測定装置に適用した一実施例の構成を示したブロック図であり、図２はデータ処理部分のフローチャートを示す図である。
【００２５】
サンプリング部１により収集した血液試料２は、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを含む液体クロマトグラフィー分離系３により成分が分離され、系外に溶出する。溶出した成分については、検出器４により吸光度変化として検出される。検出された吸光度はＡ／Ｄ変換器５によりデジタル信号に変換された後ＣＰＵ６に送られ、データ処理が行われる。
【００２６】
データ処理部６では、図２のフローチャートに従って、まず、測定したクロマトグラム及びあらかじめ測定しておいた正常な標準試料のクロマトグラム（図３）のデータの中、糖化ヘモグロビンに特徴的な変化が現れる部分抽出し、先に説明した式を用いて相関係数を計算する。なお、糖化ヘモグロビンの測定により得られるクロマトグラムにおいて、糖化ヘモグロビンに特徴的な変化が現れる部分は内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍの陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用い、溶離液としてコハク酸緩衝液を用いて流速１．５ｍｌ／分で送液した場合は溶出時間約０．２分〜１．５分の部分である。
【００２７】
計算された相関係数を２乗して得られた値は、あらかじめ設定されたしきい値と比較される。しきい値としては、一般的に精度の高い測定を実施する上で０．８程度とすることが好ましく、糖化ヘモグロビンの測定においても、本発明者らの知見によれば、しきい値を０．８と設定することが好ましい。比較の結果、前記値が０．８より大きければ正常クロマトグラムと判定し、０．８より小さければ異常クロマトグラムと判定する。
【００２８】
以下、５つの血液試料を測定して得られたクロマトグラム（データ１から４それぞれを図４〜図７に示す）について本発明のデータ処理を施した場合の結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
0003572327.tif 000003
【００３０】
このように、データ１、データ２及びデータ３は、標準クロマトグラムと形状の異なる異常クロマトグラムであること判定された。事実、データ１、データ２及びデータ３のクロマトグラムを示した図４、図５及び図６を、正常な標準クロマトグラムである図３のクロマトグラムと比較すると溶出時間１分強の部分のピークが大きく異なる異常クロマトグラムであることが分かる。これに対してデータ４のクロマトグラムを示した図７を正常な標準クロマトグラムである図３のクロマトグラムと比較すると、図７では溶出時間１分強のピークが減少しているのみで正常クロマトグラムと考えられる。
【００３１】
次に、異常クロマトグラムと判定されたデータについて、あらかじめ測定しておいた異常ヘモグロビンによる典型的異常クロマトグラムＡ（図８）及びクロマトグラムＢ（図９）との相関係数、更には前記正常な標準試料のクロマトグラム（図３）との相関係数を、糖化ヘモグロビンで特徴的な形状変化が現れる部分である０．２分〜１．５分の部分を抽出して計算した。得られた相関係数を２乗した後、大きい順に並べて異常クロマトグラムの分類の候補を相関の高い順に上げた。なお、クロマトグラムＡは糖化ヘモグロビン測定において、新生児の血液を試料とした場合に観察される典型的異常クロマトグラムであり、クロマトグラムＢは糖化ヘモグロビン測定において異常ヘモグロビンを含む試料を測定した場合に観察される典型的異常クロマトグラムである。
【００３２】
データ１に関する結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0003572327.tif 000004
【００３４】
表２に示したように、データ１（図４に示したクロマトグラム）は典型的異常クロマトグラムＡと非常に高い相関を示す一方で、正常なクロマトグラム（図３）及び典型的異常クロマトグラムＢ（図９）との相関は低いことが分かる。この結果から、データ１を得るために使用された試料には、典型的異常クロマトグラムＡを生じさせたのと同様の障害があることが推定される。
【００３５】
データ２に関する結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
0003572327.tif 000005
【００３７】
表３に示したように、データ２（図５に示したクロマトグラム）は典型的異常クロマトグラムＢと比較的高い相関を示す一方で、正常なクロマトグラム（図３）及び典型的異常クロマトグラムＡ（図８）との相関は比較的低いことが分かる。この結果から、データ２を得るために使用された試料には、典型的異常クロマトグラムＢを生じさせたのと同様の障害があるか、或いは典型的異常クロマトグラムＡ又はＢを生じさせた以外の障害があることが推定される。
【００３８】
データ３に関する結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
0003572327.tif 000006
【００４０】
表４に示したように、データ３（図６に示したクロマトグラム）は正常なクロマトグラム（図３）、典型的異常クロマトグラムＡ（図８）及び典型的異常クロマトグラムＢ（図９）とほぼ同様の相関を示すことが分かる。この結果から、データ３を得るために使用された試料には、典型的異常クロマトグラムＡ又はＢを生じさせた以外の障害がある可能性の高いことが推定される。
【００４１】
以上、異常ヘモグロビンによる典型的異常クロマトグラムとして２例を例示したが、より多くの異常クロマトグラムや、吸引不良などのハード的要因による異常クロマトグラムを使用することにより、異常クロマトグラムが測定された場合の分類が容易となり、かつ、原因究明や適切な処置を容易に講ずることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明を糖化ヘモグロビン測定に適用した、全自動糖化ヘモグロビン測定装置の構成を図示したものである。
【図２】図２は、図１に示した全自動糖化ヘモグロビン測定装置におけるＣＰＵでのデータ処理のフローチャートを示す図である。
【図３】正常な試料について適切な糖化ヘモグロビン測定が行われた場合に得られるクロマトグラムを示す図である。
【図４】任意の血液試料について、糖化ヘモグロビン測定を実施して得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】任意の血液試料について、糖化ヘモグロビン測定を実施して得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】任意の血液試料について、糖化ヘモグロビン測定を実施して得られたクロマトグラムを示す図である。
【図７】任意の血液試料について、糖化ヘモグロビン測定を実施して得られたクロマトグラムを示す図である。
【図８】糖化ヘモグロビン測定において新生児の血液を測定した場合に得られる、典型的異常クロマトグラムを示す図である。
【図９】糖化ヘモグロビン測定において異常ヘモグロビン血液を測定した場合に得られる、典型的異常クロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
１  サンプリング部
２  血液試料
３  液体クロマトグラフィー分離系
４  検出器
５  Ａ／Ｄ変換器
６  ＣＰＵ（処理部）
【図１】
0003572327.tif 000009
【図２】
0003572327.tif 000010
【図３】
0003572327.tif 000011
【図４】
0003572327.tif 000012
【図５】
0003572327.tif 000013
【図６】
0003572327.tif 000014
【図７】
0003572327.tif 000015
【図８】
0003572327.tif 000016
【図９】
0003572327.tif 000017