(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
0003583465.tif 000005
で示される化合物エキソフィリンＡ（ＥｘｏｐｈｉｌｉｎＡ）。
【請求項２】
エキソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）に属する微生物を培養し、その培養物から式
0003583465.tif 000006
で示されるエキソフィリンＡを採取することを特徴とするエキソフィリンＡの製造法。
【請求項３】
エキソフィアラ属に属する微生物がエキソフィアラ・フィシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）である請求項２記載のエキソフィリンＡの製造法。
【請求項４】
エキソフィアラ・フィシフィラがエキソフィアラ・フィシフィラ ＮＩ １０１０２（微工研菌寄第１４２３２号）である請求項３記載のエキソフィリンＡの製造法。
【請求項５】
請求項１に記載された式で示される請求項１に記載されたエキソフィリンＡ（ＥｘｏｐｈｉｌｉｎＡ）を含有する抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、式
0003583465.tif 000002
で示されるエキソフィリンＡ（ＥｘｏｐｈｉｌｉｎＡ）に関するものである。本発明者らは、エキソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属に属する微生物の培養物から本化合物を採取したことから本化合物をエキソフィリンＡと命名した。以下エキソフィリンＡと記述する。詳細には、本発明は新規化合物エキソフィリンＡとその製造法及び用途に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする問題点】
現在、抗菌剤は臨床において広範に使用されているが、近年次々にこれらの抗菌剤に耐性を持った菌が出現しており大きな問題となっている。このような現象が起こっていることから新しい構造を持つ抗菌剤の開発が望まれてきた。
【０００３】
【問題点を解決するための手段】
そこで本発明者らは、新しい抗菌剤を開発するために抗菌化合物の探索を行った。そしてエキソフィリンＡを産生する微生物を培養し、その培養物より抗菌作用を有するエキソフィリンＡを得られることを見だしたことに基づき、本発明を完成した。以下に本発明について詳細を記述する。
【０００４】
本発明はエキソフィリンＡを生産する微生物を培養し、培養物中にエキソフィリンＡを蓄積させ、エキソフィリンＡを単離・採取することを特徴とするエキソフィリンＡの製造法に関する。本発明によればエキソフィリンＡはエキソフィリンＡを生産する微生物を培養し、培養物中にエキソフィリンＡを生産、蓄積させ、培養物から本化合物を採取することにより製造することができる。本化合物の製造に使用されるエキソフィリンＡを生産する微生物としては、たとえば本発明の発明者により、北海道臼尻で採集された海綿ミカーレ・アドヘレンス（Ｍｙｃ−ａｌｅ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）より分離された、エキソフィアラ・ピシフィラＮＩ  １０１０２株（微工研菌寄第１４２３２号）をあげることができる。以下にエキソフィアラ・ピシフィラ  ＮＩ  １０１０２株（微工研菌寄第１４２３２号）の菌学的性質を示す。
【０００５】
〈本菌の菌学的性質〉
＜形態＞  本菌株は、種々の培地で有性生殖が認められず、分生子が多様な形式で作られる不完全糸状菌である。菌糸は隔壁を持つ有隔壁菌糸で、長さ５〜２０μｍの円筒形の細胞が繋がってできており、幅は２〜５μｍである。分生子は２〜１０×２〜５μｍで、その生成形式は本菌株に特徴的な多様形（ｐｏｌｙｍ−ｏｒｐｈｉｃ）で（１）菌糸側壁から、（２）菌糸側壁突起部分（アンネライド）から、（３）すでに作られている分生子からの３通りがある。
【０００６】
＜生育＞  本菌株のコロニーは、ポテトデキストロース寒天培地、あるいはモルト寒天培地などで培養すると、始め白〜薄ピンク色の湿性の酵母のような形状に増殖する。数日間の培養で菌糸世代に移行し、酵母状のコロニーの周辺から寒天培地内部に栄養菌糸である基中菌糸を伸ばし、黒緑色の出芽型分生子を菌糸から多量に生ずる。１０日前後経つと寒天培地表面では白色の菌糸を放射状に伸ばし、コロニーの上部へは白色綿状の生殖菌糸である気中菌糸を伸ばして成熟したコロニーとなる。この間の重要な形態的変化は、（１）分生子の発芽、生育環境が変化することによって、（２）菌糸体の生育、（３）分生子化、（４）色素生成（ｍｅｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）、（５）気中菌糸の生育の順で起こる。生育温度は２５〜３５℃でよく生育し、４０℃ではほとんど生育がみられなくなる。
【０００７】
本菌株は通常、ブラック・イーストと呼ばれる菌の仲間に属し、「スタディーズ・イン・マイコロジー１５巻」（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５）のホッグ等（Ｈｏｏｇ，ｅｔ．ａｌ）の記載によるエキソフィアラ・フィシフィラと性状が一致した。
【０００８】
なお本菌株は平成６年３月２４日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されていおり、その受託番号は微工研菌寄第１４２３２号である。
【０００９】
〈培養〉  エキソフィリンＡを産生する微生物の培養は原則として一般微生物の培養法に準ずるが、通常は液体培地による深部培養が適している。
【００１０】
培養に用いられる培地はエキソフィリンＡを産生する微生物が利用する培養源を含有する培地、合成培地、半合成培地、あるいは天然培地であればよい。培地組成は炭素源として例えばグルコース等、窒素源として例えばＬ−アスパラギン等が用いられる。その他無機塩類として塩化ナトリウム塩化カリウムりん酸二水素カリウム等が必要に応じて用いられる。
【００１１】
培養条件はｐＨ：４〜９、温度：１０〜３５℃で２〜１４日間、望ましくはｐＨ：６〜７、温度：２２〜２７℃で５〜１０日間培養する。
【００１２】
〈抽出および精製〉  培養して得られるエキソフィリンＡは、発酵生成物を採取する一般的な方法に準じて抽出、精製される。エキソフィリンＡは通常培養液の菌体に蓄積されることが多いので例えば遠心分離、あるいはろ過等の手段によって菌体と上清に分離する。
【００１３】
その後、その性質を利用した通常の分離手段を用いて目的の化合物を得る。例えば、溶剤抽出、イオン交換樹脂、吸着または分配カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、透析法、沈殿法等を単独あるいは適宜組み合わせて抽出、精製する。
以下に上記の製造法で得たエキソフィリンＡの理化学的性質を示す。
【００１４】
0003583465.tif 000003
以下に、本化合物の試験例を示す。
【００１５】
試験例
抗生物質の力価試験に一般的に行われるペーパーディスク法でエキソフィリンＡの力価試験を行った。供試菌としてバチルス・サティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）  ＩＦＯ  １２６８９、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の４種を用いた。また使用したペーパーディスクは直径６ｍｍのものである。表１に試験結果を示すが表中の数値は本化合物１００μｇを含むペーパーディスクを供試菌を混釈した寒天培地上に載せ、２４時間培養した後に形成された阻止円の直径を示す。試験結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
0003583465.tif 000004
【００１７】
【実施例】
以下に本発明実施例を示すがエキソフィリンＡの性状が本発明によって明らかにされたのでこれに基づき、エキソフィリンＡの製造法を種々考案することができる。従って本発明は実施例に限定されるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明らかにされたエキソフィリンＡの性状に基づいて公知の手段を施してこれらを生産、濃縮、抽出、精製する方法を全て包含する。
【００１８】
実施例
〈培養および集菌〉
培地としてグルコース  １％、Ｌ−アスパラギン  ０．０５％、りん酸二水素カリウム  ０．０５％を海水に溶解しｐＨ７．０に調整したものを用いた。上記の液体培地５０ｍｌにエキソフィリンＡを生産するエキソフィアラ・ピシフィラを一白金耳接種し、２５℃で４日間振とう培養した（１）。さらに同じ組成の液体培地５００ｍｌに（１）を加え、２５℃で４日間振とう培養した（２）。最後に同じ組成の培地１５Ｌに（２）を加え２５℃で１０日間培養した。このようにして得られた培養液１５Ｌを遠心分離により菌体と上清に分離した。
【００１９】
〈菌体抽出〉
上記の菌体に５倍量のクロロホルム：メタノール（２：１）を加え、ディスパーサーで５分間（３回）、超音波で５分間抽出を行った。抽出液をろ過した後ろ液の４分の１量の蒸留水を加え、２層分配した。クロロホルム層を脱水後、濃縮乾固し、菌体クロロホルム画分とした。この画分は黒色の部分と褐色の油状部分から成っていた。
【００２０】
〈精製〉
クロロホルム画分をアセトンに溶解し、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＨＷ−４０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社製）を充填した耐圧ガラスカラム（３０ｍｍＩＤ×５００ｍｍ）の中圧分取液体クロマトグラフィーに供試した。こうして得た活性画分を、移動相；アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（３：１：０．００２）、カラム；ＯＤＳ  Ｈｉｂａｒ  ＲＴ２５０−１０  ＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂＲＰ−１８（Ｍｅｒｋ社製）、流量；２．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出器示差屈折計ｒａｎｇｅ  ２５６という条件でＨＰＬＣにより溶出時間約１５分にピークを示すエキソフィリンＡ（１０．８ｍｇ）得た。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のエキソフィリンＡは表１に示したように抗菌活性を有する。したがってエキソフィリンＡは抗菌剤としての利用が期待される。
【００２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】エキソフィリンＡのＦＡＢマススペクトルを示す。
【図２】エキソフィリンＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】エキソフィリンＡエキソフィリンＡの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
0003583465.tif 000007
【図２】
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【図３】
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