(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒルの種Hirudo medicinalisの組織または分泌物に由来する精製された蛋白質であって、
コラーゲン分子中に存在するペプチド結合を切断することなく、天然コラーゲンへ直接または間接的に結合可能であり；
コラーゲン分子のらせん領域におけるペプチド結合の加水分解的切断を起こすヒル由来のコラーゲナーゼを含まず；
還元型で60〜70キロダルトンの分子量を有し；
コラーゲン誘発血小板凝集もしくは付着またはガラス誘発血小板付着を阻害し；
補因子としてのCa++およびMg++の存在下で、pH8.0に活性の至適pHを有し、pH6.5では最初の活性の約20％が残存する；
前記蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載のヒル由来蛋白質の抽出方法において、ヒルの分泌物の単離またはヒル組織の抽出と、得られた組織抽出物または分泌物の陰イオン交換クロマトグラフィーによるヒルジン抗トロンビン活性の実質的な除去と、この精製物質の陽イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製とを含む方法。
【請求項３】
装置の表面への吸着による蛋白質のロスを実質的に防止するため、エタノール含有緩衝液を使用し、ついで、エタノールを単離された蛋白質から除去する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のヒル由来蛋白質の治療有効量と医薬的に許容される担体とを含む、血小板凝集もしくは付着が関与する病的状態の処置および／または血小板凝集もしくは付着の防止のための医薬用または動物薬用製剤。
【請求項５】
さらに血栓溶解剤または抗凝固剤を含有する請求項４に記載の医薬用または動物薬用製剤。
【請求項６】
血栓溶解剤はプラスミノーゲンアクティベーターまたはヘメンチンである請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
１種または２種以上の非毒性の医薬的に許容される担体、希釈剤、補助剤またはビヒクルを含有する単位用量剤形として患者に投与するのに適した請求項４〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
担体は、使用前に、留置カテーテル、血管シャフト、人工臓器または縫合材料をコーティングするのに適した、医薬的に許容されるゲルベースまたはクリームである請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
請求項１に記載の蛋白質を装置表面上に固定化し、装置表面を生体適合性および血栓抵抗性とした、体液と接触させて使用する移植用または体外用装置。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒル由来蛋白質の単独、１種もしくは２種以上の他の薬理学的活性物質との配合または１種もしくは２種以上のヒル成分との配合を含み、形成外科または顕微鏡を用いての外科手術後の長時間にわたる出血の維持に使用するための医薬用または動物薬用製剤。
【請求項１１】
血栓、または血小板凝集の阻止にあたり、ヒトを除く罹患した動物に請求項４〜８のいずれか１項に記載の動物薬用製剤を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は，生物学的基質たとえばコラーゲン，および他の基質（通常は強力に荷電した基質，たとえばイオン的に負に荷電した基質）に結合できる，ヒル由来の蛋白質またはポリペプチド，ならびに血小板の付着インヒビターに関する．
血小板の付着／凝集のレベルにおける治療的発明は，大部分の血栓性疾患の防止および処置に有用である．血小板機能の阻害作用を有する薬剤は多く知られていて，たとえば酵素シクロオキシゲナーゼの阻害によりアラキドン酸経路を妨害するアスピリンがある．この経路においてはアラキドン酸（ホスホリパーゼA2のコラーゲン誘発刺激により，血小板内で産生する）は，シクロオキシゲナーゼの活性により，トロンボキサンA2に変換される．
ヒルの唾液は，血小板の凝集を阻害できる数種の既知物質を含んでいる．これらの中で著名なものは，
1.ヒルジン，ヒルHirudo medicinalisによって産生される天然のポリペプチド．ヒルジンは，トロンビンと1:1化学量論的複合体を形成して強固に結合することによりトロンビン誘発血小板凝集を防止する．この複合体は一方，フィブリノーゲンのフィブリンへのトロンビン触媒変換を阻害する．
2.凝集剤たとえばPAF−アセテルによって誘導される血小板凝集に対して阻害活性を有する,Hirudinidaeの唾液に由来する，低分子量受容体−仲介血小板活性化因子アンタゴニストがEP−Ａ−O348208Aに開示されている．
3.コラーゲン分子のらせん領域におけるペプチド結合の加水分解的切断によってコラーゲンを特異的に分解するコラーゲナーゼが,WO67/00680に開示されている．
4.ATP/ADP仲介現象を阻害するアピラーゼが,Rigbiらにより,Comp.Biochem.Pysiol.87B:567−573に記載されている．
しかしながら，生物学的基質たとえばコラーゲンの表面に結合できて，生物学的基質と非エンドペプチダーゼ作用を有し，コラーゲン誘発血小板凝集を阻害するような物質は，これまで開示されていない．
本発明は，ヒル組織またはヒル分泌物に由来し，コラーゲンとの非エンドペプチダーゼ結合機構を有する蛋白質に関する．
したがって，本発明によれば，コラーゲンに直接または間接的に結合可能な，ヒル組織またはヒル分泌物に由来する蛋白質またはポリペプチドを提供する．この蛋白質とコラーゲン結合相互作用の本質は，コラーゲン分子中に存在するペプチド結合の実質的切断をSDS−PAGE上で生じるようなものではない．結合は，コラーゲンへの直接結合，またはそれ自体コラーゲンに中間的に結合するリガンドまたはフォン・ビルブラント因子のような中間体への結合である．
ヒル組織またはヒル分泌物に「由来する」蛋白質といった場合は，ヒル組織またはヒル分泌物からの蛋白質の単離のみでなく，蛋白質の単離およびついでその単離物質の，均等蛋白質（相当する結合性を有する短縮ポリペプチド類縁体をも包含する）の大量生産のための出発原料としての使用を含む，組換えDNA合成のような技術による合成均等体の製造も包含することを意図している．
したがって，本発明はさらに，本発明のヒル由来の蛋白質の組換えまたは蛋白工学的均等体に関する．
本発明の蛋白質は還元型で約65キロダルトン（すなわち60〜70キロダルトン）の分子量を有し，それに限定されるものではないがHirudo medicinalisを含む吸血ヒルの唾液または組織に由来する．
本発明の蛋白質は，暴露されたコラーゲンに結合し，組織傷害および／または疾患部位における血小板付着／凝集の正常過程を防止する．この現象は，本発明の蛋白質がコラーゲンに対して急速な作用を有することの観察によって例証される．この蛋白質のコラーゲンに対する急速な非酵素的作用は，コラーゲン誘発血小板凝集およびコラーゲン被覆マイクロキャリヤービーズへの血小板の付着の抑制能，ならびにコラーゲン原線維懸濁液のフロキュレーションを生じる能力に反映されている．
本発明のヒル由来蛋白質は本質的にpH8.0に，活性の至適pHを有する．生理的pH（7.4）より低いpHでは活性は低下し,pH6.5では最初の活性の20％未満の活性しか検出されない．この蛋白質はまた，至適活性には補因子としてCa++を，程度は低いがMg++を要求することによっても特徴づけられる．
この蛋白質はコラーゲナーゼではなく，したがって既知のヒル由来コラーゲナーゼとは基本的に異なる．この蛋白質のＩ型コラーゲンとのインキュベーション後の生成物のSDS−PAGE分析では，コラーゲンのSDS−PAGEパターンに検知できる変化は認められず，この蛋白質がコラーゲナーゼではないことを指示している．驚くべきことに，この蛋白質は，長期のインキュベーションで起こることがある可溶化Ｉ型コラーゲンの自己融解性変性を明らかに防止することができる．
上述の差に加えて，この蛋白質は，ヒルコラーゲナーゼの単離の場合とは全く異なる操作を用いて単離される．この点を明確に区別するために，ヒルコラーゲナーゼの単離に従来使用されていた精製操作（ゲル濾過）では，本発明の蛋白質の単離は生じないことを明らかにした．標準技術を用いると，この蛋白質はクロマトグラフィーマトリックスに強力に吸着され，したがって吸着を防止し，この蛋白質を単離するためには，本明細書に記載する特殊な技術が必要である．
これらの，また以下に述べる差が，本発明の蛋白質をヒル由来のコーラゲナーゼから区別し，これはそれ自体驚くべきことであり，新規である．
したがって，本発明はさらに，ヒルの分泌物の単離またはヒル組織の抽出，得られた組織抽出物または分泌物の陰イオン交換クロマトグラフィーによるヒルジン抗トロンビン活性の実質的な除去，およびこの精製物質の陽イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製からなる，コラーゲンとの非分解的結合機構を有するヒル由来蛋白質の製造方法を提供する．
この方法では，装置の表面への吸着による蛋白質のロスを実質的に防止するため，全工程を通じて，エタノール含有緩衝液を使用することが好ましい．エタノールは，ついで，単離された蛋白質から除去される．好ましいこの種の緩衝液は,20mMトリス塩酸塩,10mM  CaCl2,12％エタノール,pH7.5である．
本発明はまた，活性成分として，治療有効量の本発明のヒル由来蛋白質（その単独，または他の活性成分たとえばヒルジンもしくはヘパリンのような抗凝固剤，およびプラスミノーゲンアクティベーターもしくはヘメンチンのような血栓溶解剤とともに）と，医薬的に許容される担体とからなる，医薬用または動物薬用製剤を包含する．
本発明の医薬用または動物薬用製剤，血小板凝集が関与するある種の病的状態の処置および血小板凝集の防止のために使用できる．すなわち，本発明の医薬用または動物薬用製剤は，各種血栓塞栓性疾患たとえば静脈血栓症，末梢動脈血栓症，脳血栓および心筋梗塞の処置，ならびに動静脈短絡患者および冠動脈バイパス手術を受けている患者に使用できる．この製剤はまた，同種移植片（たとえば，腎臓，肝臓または心臓）の拒絶の防止，ならびにループスエリテマトデス，慢性関節リウマチおよび結節性多発関節炎を含む自己免疫疾患の処置にも使用できる．
本発明のさらに他の実施態様には，コラーゲンとの非エンドペプチダーゼ結合機構を有するヒル由来蛋白質の，その蛋白質を外科用デバイス上に固定化してその表面を生体適合性および血栓抵抗性とする使用がある．このようなデバイスは湿潤性の表面をもつことがあり，これが通常，血小板の凝集を誘導する．これは，体液と接触する移植可能な体外デバイス，たとえば義肢および縫合糸の意図された使用には不利である．
人工臓器，心臓弁および他の人工装具，人工血管セグメント，カテーテルおよび他の血液輸送チューブの，ヒル由来蛋白質での処置による保護も，本発明の意図するところである．
本発明の製剤はまた，ヒルに咬まれたのちに経験する長期の出血現象のシミュレートにも有用で，したがって，最近ヒルが適用されている形成外科およびマイクロサージェリーでのそれらの応用におけるヒルの全部または一部を置換することができる．
したがって，本発明はまた，形成外科およびマイクロサージェリーに続く長期の出血の維持に使用するため医薬用または動物薬用製剤の活性成分として混合できる，コラーゲンとの非分解的結合機構を有するヒル由来蛋白質を提供する．この場合，この蛋白質は単独で，または１種もしくは２種以上のヒル成分と配合して，使用することができる．
本発明の製剤は，所望により，通常は非経口投与用の，慣用の非毒性の医薬的に許容される担体，希釈剤，補助剤およびビヒクルを含有する，単位用量として投与される．本明細書で使用される「非経口」の語には，皮下，静脈内，動脈内および気管内注射および注入が包含される．本発明における単位用量は，本発明の蛋白質の１日所要量，または所望の用量を作れるその約数を包含する．ある患者に対する至適治療許容量は，様々な因子たとえば使用された特異的活性物質の活性，年齢，体重，一般的な健康度，性別，食事，時間および投与経路，クリアランスの速度等に依存する．
本明細書で用いられる「医薬的に許容される担体」の語は，活性成分および患者の両者に対して悪影響を与えない，不活性，非毒性固体または液体充填剤，希釈剤またはカプセル化剤を意味する．適当な担体は本技術分野の精通者にはよく知られている．本発明の製剤には，湿潤剤，乳化剤，徐放化剤，コート剤および防腐剤も添加することができる．単一剤形の製造のために担体とともに用いられる活性成分の量は，処置される患者および特定の投与様式に依存して変動する．
担体は医薬的に許容されるゲルベースまたはクリームで，使用前に，通常はプラスチック材料および合成繊維で作られている留置カテーテル，血管シャフトまたは人工臓器をコーティングするのに適している．このような装置を本発明の製剤でコーティングすることは，挿入後それへの血小板の付着を防止するのに有用である．
本発明はさらに，本発明の医薬用または動物薬用処方を患者に投与することからなる，血小板の凝集阻害ならびに上述の病的状態および血栓塞栓性疾患の処置方法を提供する．
本発明の組成物，医薬用および動物薬用製剤ならびに方法を，以下の実施例によって詳細に説明する．
例1.蛋白質の単離
本発明の蛋白質は，カラムマトリックスへの活性の吸着を防止するための特別の注意を払わない限り，粗製のヒル唾液から単離することはできなかった（以下の例4,5参照）．この理由から，少なくとも１種の遮断剤（たとえばエタノール）を精製緩衝液に含有させ，血小板に関連するすべての研究用には，ついで凍結乾燥してそれを除去した．用いられる精製緩衝液は,20mMトリス塩酸塩,10mM  CaCl2,12％エタノール,pH7.5である．「ヒルの唾液」の陰イオン交換物質による分画化により，蛋白質活性は３倍に増大し，ヒルジン抗トロンビン活性はゲルに吸着されて残り，除去された．陰イオン交換後の物質を限外濾過で濃縮し（５〜10倍），ついで高速陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製し（＞300倍）,NaCl勾配を用いて溶出した．その典型的な一例を図１に示す．
精製物は12.5％ポリアクリルアミドミニゲル上SDS−PAGEにより分析した．サンプルはメルカプトエタノールで還元した．ゲル上の蛋白バンドは銀染色によって可視化した．
例2.発色性基質に対する蛋白質の活性
本発明者らは，コラーゲナーゼ活性の測定に一般的に使用されている発色性基質,FALGPAまたは４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシン−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｄ−アルギニンに対する有意な活性を検出することはできなかった.37℃での長時間（12〜24時間）にわたるインキュベーションで生じる，発色性基質,S2251,S2586,S2288,SAPPまたはSAAAPの加水分解は，非特異的な性質のものであった．しかしながら，この蛋白質は数種の蛋白分解酵素に対する非特異的発色性基質であるAZOCOLLに対して活性を示した．好ましいアッセイ方法を以下に記述する．アッセイ用プレパレーションはアッセイ緩衝液:50mMトリス,0.2MNaCl,0.05％カゼイン（British Drug HousesからのHammerstan等級）,0.1％Briji35,0.01％ナトリウムアジド,pH8.0,中に再構築または希釈した．活性はマイクロタイタープレートに適合したAZOCCLLの改良法を用いて測定した．蛋白質サンプルの一部（100μｌ）をアッセイ緩衝液中ある範囲に希釈し，洗浄した基質の懸濁液（100μl:10mg/ml）と37℃においてインキュベートする．実験および蛋白質の用量に応じて変動するインキュベート終了時に，未消化基質を遠心分離により沈降させ，上清の一部（100μｌ）を他のプレートに移し，そこで560nmにおける吸収を測定する．蛋白質活性は同時に同一条件で検定した細菌コラーゲナーゼ（Clostridium histolyticum）のミリ当量単位として表示できる．
例3.本発明の蛋白質の特徴
本発明の蛋白質（比活性10,000〜20,000単位/mg蛋白のプレパレーション500単位/ml）を,6〜8.5のpH範囲に調整したアッセイ緩衝液中，適当な基質とともに37℃で12時間インキュベートした．活性は至適pH8.0において得られた値の百分率として表示する．結果（表１）は,pHが生理的pHより低くなると，活性は，急速に低下し,pH6.5では検出された最初の活性の約20％しかないことを示している．
0003558292.tif 000002
蛋白質（比活性10,000〜20,000単位/mg蛋白のプレパレーション3000単位/ml）を，指示した濃度のMgCl2,CaCl2またはNaClを含有するアッセイ緩衝液中,37℃で12時間インキュベートした．活性を測定し，得られている最大値に対する百分率として表示した．結果（表２）は，蛋白質の活性にはCa++イオンの存在および程度は低いがMg++の存在が必要なことを示している．食塩は比較的高レベル（0.5M）でも，活性にほとんど影響しないようであった．
0003558292.tif 000003
活性の熱安定性は様々な温度で検討した．本発明蛋白質（比活性10,000〜20,000単位/mg蛋白のプレパレーション5000単位/ml）を，アッセイ緩衝液中,100℃までの温度で24時間までプレインキュベートし，ついで，さらに12時間,37℃で基質とともにインキュベートした．活性を測定し，プレインキュベートしなかった対照の値に対する百分率として表示した．結果（表３）は，この物質が,37℃までの温度では24時間にわたり比較的安定であることを示している．さらに高い温度では,Ca++イオンが保護的作用を発揮することが見出された．すなわち,60℃においては,Ca++が存在しない場合には活性は５分以内に破壊されるが,Ca++の存在下には１時間以上にわたって活性は保存された．
0003558292.tif 000004
一部の代表的なインヒビターの作用を検討した．蛋白質（比活性10,000〜20,000単位/mg蛋白のプレパレーション5000単位/ml）を，ある濃度範囲のDTT,システイン,EDTAおよびヒル抗−キモトリプシンとともに，基質とインキュベートした．活性に対して何らかの影響があれば，結果を，半最大阻害を与えるインヒビターの用量で表した．オルトフェナンスロリン（2mM）;APMA（0.5mM）およびプレインキュベーション（15分）とTIMP（メタロプロテアーゼの組織インヒビター）0.4μg;SBTI（7.5μｇおよびプレインキュベーション30分）；ならびにPMSF（2mMおよびプレインキュベーション30分）についても検討した．結果（表４）は，還元剤（ジチオスレイトールおよびシステイン）が，カルシウムキレート剤,EDTAと同様に，活性を破壊することを示している．オルトフェナンスロリンおよびTIMPは活性を阻害せず，またPMSF,大豆トリプシンインヒビター，ナトリウムアジド，ヒル抗−キモトリプシン／エステラーゼのプレパレーションも阻害作用を示さなかった．
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カゼイン分解プロテアーゼキット，または24時間37℃でインキュベートし，アルブミン，トランスフェリンまたはガゼインを沈殿（TCAで）させたのちの上清の240/280nmでの吸収を測定するアッセイを用いて評価した場合，本発明の蛋白質には，有意なレベルの中性プロテアーゼ活性は検出できなかった．
例4.本発明の蛋白質の表面活性作用
表５は，単一ゲル濾過マトリックス,SephadexG25に対する活性の結合と，カゼイン，界面活性剤またはエタノールの包含による活性の回収を示す．
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本発明の蛋白質は，ガラスや，フィルターの製造材料のような，様々な物質に吸着される．
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本発明の蛋白質をヒルコラーゲナーゼから識別する性質である，ゲルマトリックスへのこの蛋白質の他の吸着の例を例５に示す．
例5.本発明の蛋白質の非コラーゲン性
以下の実験は，本発明の蛋白質の性質が,WO87/00860に記載されたコラーゲナーゼとは異なることを，さらに示すものである．
本発明の蛋白質で処理したＩ型コラーゲンのSDS−PAGE
Ｉ型コラーゲン（ウシ皮膚）を蛋白質で処理した精製物をSDS−PAGEで調べた（図２）.I型ウシ皮膚コラーゲン（約1mg片）（ａ）を，本発明の蛋白質（１〜5000単位/ml）の存在下（ｂ）または非存在下（ｃ）,37℃で24時間インキュベートした．アッセイ緩衝液は,20mMトリス,10mMCaCl2,0.2mM  NaCl,0.1％Briji35,pH8.0とした．インキュベート後，反応管（ｂおよびｃ）を遠心分離して（10,000g），不溶性の物質があれば除去し，上清をSDS−PAGEにより，還元条件で分析した（7.5％ゲル）．結果（図２）は，蛋白質処理後（37℃で24時間），認められた主要コラーゲンバンド（α，βおよびγ）の数およびサイズは非処理対照の場合（ａ）と同一であった．これはエンドペプチダーゼ活性（低分子量フラグメントを生成する筈である）が生じなかったことを指示した．蛋白質を加えない他のインキュベーションで,37℃において長時間にわたりインキュベーションを続けると（１〜２日），可溶化コラーゲンバンドの低分子量フラグメントへの分解がしばしば生じた．
この分解の時間経過は，コラーゲンプレパレーションによって変動した．本発明の蛋白質の添加により，非切断コラーゲンバンドの保存，および可溶化コラーゲンの自己溶解の遅延が可能であった．この意味は不明であるが，コラーゲンと本発明の蛋白質の間のある種の非分解的相互作用の証拠をさらに提供するものである．
本発明の蛋白質のゲル濾過
本発明蛋白質を含有する粗製ヒル唾液を準備し，ゲル濾過カラム（Superdex200）に適用し，ヒルコラーゲナーゼの精製についての記載（WO87/00860）と同様に,0.2M炭酸水素アンモニウム,pH7.8で溶出した．分画を集め（10ml），発色性基質と37℃で72時間インキュベートして活性を検討した（図３）．対照は，負荷サンプルをさらに８倍に希釈して，カラムによる希釈を補償した．
対照サンプル中には５時間以内に最大活性（溶出緩衝液中８倍希釈における）が検出されたにもかかわらず,37℃で３日間の長時間にわたるインキュベーションでもカラムからの溶出分画には本発明の蛋白質の活性は全く検出されなかった．これから，ヒルコラーゲンの単離に用いられた条件下では，本発明の蛋白質は，吸着して，単離できなかったが明らかであった．
例6.コラーゲン原繊維懸濁液への本発明の蛋白質の結合
以下に記載の実験は，本発明の蛋白質がＩ型コラーゲンに速やかに結合できることを示し，これは，生物学的条件における本発明の蛋白質の表面活性を例証するものである．プレパレーションまたは対照（100μｌ）を,I型コラーゲン原繊維（900μｌ）の食塩水中懸濁液（10μg/ml）に加え，室温で１〜10分間穏やかに振盪しながらインキュベートした．対照は，
a.煮沸した本発明の蛋白質；
b.20mMトリス,pH8.0;
c.2OmM  CaCl2;
d.20mMトリス,2OmM  CaCl2,1.2M  NaCl,pH8.0;
e.20mMトリス,1OmM  EDTA,0.15M  NaCl,pH7.5;
f.1Mトリス,1M  NaCl,pH8.0
結果は，本発明の蛋白質が，血小板凝集計で測定すると，懸濁液内にコラーゲン粒子の時間依存性のフロキュレーションを起こすことを示した．このフロキュレーションの結果は，これらの同一の懸濁液でのコラーゲン誘発血小板凝集の完全な阻害であった（下記参照）．凝集したコラーゲンの沈降後の上清のSDS−PAGE分析により，フロキュレーション反応の結果として有意なコラーゲンの消化フラグメントは生じていないことが明らかにされた．この実験を当量もしくはより高濃度の細菌性コラーゲナーゼ（Clostridium hystolyticum）を用いて反復したが，粒子のフロキュレーションは観察されず，混合物による血小板の凝集は４〜５分のインキュベーション後でも，依然として誘発された．この作用が緩衝液が塩による人為的なものかどうかを確かめるため様々な緩衝液組成，イオン強度（2Mまで）およびpHを試みたが，室温に24時間放置した場合にある程度フロキュレーションが認められたリン酸緩衝食塩溶液を除いて，影響はみられなかった．蛋白質プレパレーションを１〜２分間煮沸するとコラーゲンフロキュレーション能が破壊されたことは，さらに，それが蛋白質の性質によるもので，ビヒクル溶液の性質によるものではないことを支持する証拠である．フロキュレーションが起こったのちインキュベーション液を遠心分離し，上清および再懸濁ペレットについて蛋白質活性を検定した（表７）．上清には活性は認められなかったが，再懸濁ペレットは活性を保持していた．これも，蛋白質がコラーゲンに結合していることを証明するものであった．
0003558292.tif 000008
本発明の蛋白質（5000単位/ml）を室温で,50mMトリス,10mMCaCl2,0.1％Briji35,0.05％カゼイン,0.01％ナトリウムアジド,pH8.0中Ｉ型コラーゲン懸濁液（10μg/ml）とともに，フロキュレーションが完了するまで（10分）インキュベートし，ついで粒子を沈降させ，上清および再懸濁ペレットを37℃で24時間インキュベートして活性を検定した．
例7.コラーゲン誘発血小板凝集に対する蛋白質の作用
本発明の蛋白質をＩ型コラーゲン原繊維と混合し（２分），血小板に富む血漿（0.5ml）に加え，血小板凝集の経過を追跡した（それぞれ1000単位/mlおよび２μg/ml）．処理サンプルに,10分後，さらにアゴニスト，ウシトロンビン（２単位/ml）またはADP（１μＭ）を加え，血小板の反応性を確認した．血小板の凝集は凝集計を用いて測定した．
図５は，蛋白質の添加（1000〜5000単位）が２分以内にコラーゲンに作用し，その結果，ヒト血漿で血小板凝集を誘発できなかったことを示している．対照（ビヒクル緩衝液中コラーゲン）は正常な凝集パターンを示した．
さらにADP（１μＭ）またはトロンビン（１〜５単位/ml）を添加すると正常な血小板凝集を生じ，血小板はインデューサーに依然として反応し，血小板自体は蛋白質によってもまた緩衝液ビヒクルによっても影響されなかったことを示した．
例8.コラーゲン被覆マイクロキャリアービーズへの血小板付着に対する本発明の蛋白質の影響
コラーゲン被覆マイクロキャリアービーズ（Sigma）を本発明の蛋白質で前処置しまたはしないで，プラスチック管に充填し，それにヒト全血をポンプで送り（Adeplat），ついで血小板数をコールターカウンターで計数した．
コラーゲンマイクロキャリアービーズのカラムを，蛋白質の２種のプレパレーション（5000単位/mlおよび１〜2000単位/ml脱塩）で予め被覆すると,PRP中の血小板のカラムへの付着は半分に防止された（図８）．この現象は，ビーズを蛋白質に約30分または２分未満暴露したときに認められ，コラーゲンに対する迅速な非酵素的作用が血小板への付着を防止することを指示している．
0003558292.tif 000009
コラーゲン被覆ビーズを,Adeplatポンプ装置に接続したプラスチック管に充填し，それに，緩衝液または蛋白質（脱塩した本発明の蛋白質，実験1,2:5000単位/ml;実験3:1〜2000単位/ml）を，ついで直ちに新鮮な全血をポンプで送った．通過して捕集された血小板の数をコールターカウンターで計数した．
例9.ガラスビーズへの血小板付着の防止
ガラスビーズを含む管を，本発明の蛋白質存在下または非存在下に上述のように処理し，血小板の付着を上述のように測定した．結果は以下の表９に示す．本発明の蛋白質はガラスビーズへの血小板の付着を有意に減少させることができた．
0003558292.tif 000010
予め本発明の蛋白質（5000単位/ml）で処理もしくは非処理または煮沸（１〜２分）蛋白質で処理したガラスビーズカラムに，ポンプ（Adeplat）で全血を送った．カラムを通過した血小板の数を上述のようにコールターカウンターで計数した．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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