(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ホスファチジルコリンの含有率が30〜99重量％のリン脂質、および
（ｂ）酸素が負荷されたフッ化炭素またはフッ化炭素混合物−フッ化炭素の量は0.2〜100％重量／容積の範囲にある−
からなる非対称性層状凝集体であって、凝集体は、選択されたフッ化炭素またはフッ化炭素混合物の臨界溶解温度（ｎ−ヘキサン中）に応じた皮膚浸透力を有し、皮膚に使用するのに適当なキャリヤー中に存在することを特徴とする、皮膚中の酸素輸送を促進するための皮膚用剤。
【請求項２】
層状凝集体が、非対称性の、好ましくは三層の、フッ化炭素コアから生じる構造を有する、請求項１記載の皮膚用剤。
【請求項３】
フッ化炭素が、脂肪族直鎖または分枝状フルオロアルカン、単環式または二環式の、場合によりフルオルアルキル置換された、フルオロシクロアルカン、過フッ素化された脂肪族または二環式アミン、ビス（ペルフルオロアルキル）エテンおよびそれらの混合物から選択される、請求項１または２記載の皮膚用剤。
【請求項４】
使用される脂質フラクションが、ホスファチジルコリンに加えて、リゾレシチンを0.1〜５重量％の濃度範囲で含む、請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚用剤。
【請求項５】
ホスファチジルコリンの含有率が30〜99重量％のリン脂質を、酸素を負荷したフッ化炭素またはフッ化炭素混合物で乳化し、その際フッ化炭素の量は0.2〜100％重量／容積の範囲にあり、そしてこうして得られる粒度50〜1000nmの非対称性層状凝集体を、皮膚に使用するのに適したキャリヤー中に混和することを特徴とする、皮膚中の酸素輸送を促進するための皮膚用剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、皮膚の真皮領域および隣接組織中に浸透して、この領域中の酸素の供給を改善する皮膚用剤に関する。
米国特許第4366169号明細書（White）は、皮膚損傷（injuries,wounds）、特に熱傷の治療にフッ化炭素を使用することを請求している。この場合、酸素含有フッ化炭素を、直接またはエマルションとして、皮膚にまたは適当な包帯もしくは同様の手段にのせる。米国特許第4569784号明細書（Moore）は、皮膚上で使用するためのガス輸送性を有するゲルの製造を記載している。この複雑な方法は、水と混和しない有機液体、例えばフッ化炭素を乳化剤の存在下に乳化方法によって乳化させることからなる。次に濃縮して（例えば超遠心分離、限外ろ過）、ゲル相を形成させる。続く第三工程で、デカンテーション、ろ過または蒸発によって、のりのような固体（ゲル相）から透明液を分離する。このゲルを適当な配合物中で皮膚に適用すると、それはそこで角質層に浸透することなく作用する。
ヨーロッパ特許出願公開第296661号明細書（Borgarello）は、等方性または異方性配合物として化粧品分野において、また皮膚用剤として、酸素輸送体として作用し得るフッ化炭素含有単相系を開示している。この場合、50％の最大濃度を有するフッ化炭素を、水中でアルカンスルホンアミド型の過フッ素化乳化剤で補助乳化剤としての脂肪族アルコールの存在下に乳化させる。
国際公開第8908459号明細書は、血液代用品としてのリン脂質ベシクルを含む過フッ化炭素エマルションを開示しており、その際リン脂質モノマーを重合させる。国際公開第9100110号では、リン脂質を含むフッ化炭素エマルションが開示され、その際リン脂質は飽和炭素結合を有している。国際公開第9206676号明細書から、リン脂質からなる油が満たされたわずかに層状のベシクルが知られており、その構造は、慣用のベシクル構造に対応している。
開示された既知の方法の場合、フッ化炭素を含む記載された組成物は、系に関連した方式で皮膚上でその適用部位で作用する。
本発明の目的は、真皮領域およびその隣接組織中の酸素濃度を高め、新陳代謝過程を活性化するために、皮膚の角質層および表皮を浸透方法により通過させることである。
本発明によれば、皮膚中の酸素輸送を促進するための皮膚用剤は、コア中に、周知の水性リポソームとは対照的に、フッ化炭素またはその混合物を含む、ホスファチジルコリンの含有率が30〜99重量％のリン脂質から構成されている非対称性層状凝集体からなる。本発明による皮膚用剤は従って、皮膚に使用するのに適当なキャリヤー中の、ホスファチジルコリンの含有率が30〜99重量％のリン脂質および酸素が負荷されたフッ化炭素またはフッ化炭素の混合物からなり、フッ化炭素の量が１〜100％w/v（w/v＝重量／容積）である非対称性層状凝集体からなる。
層状凝集体は、それらのリン脂質構造−それは構造的および化学的に細胞膜に非常に類似しているかまたはと部分的に同一である−のために、また、凝集体の大きさ−それは製造の際に制御され得る−と組み合わせて、より深いところにある皮膚層に浸透し、そこを活性化することができる。このことは、先行技術において言及された発明記載−それは皮膚のより深いところにある領域へフッ化炭素を輸送しない−と対照的に起こる。既知の方法は、主張された効果に関して有効でない。
多数のフッ化炭素、例えば脂肪族直鎖および分枝フルオロアルカン、単環式または二環式の場合によりフルオロアルキル置換されたフルオロシクロアルカン、過フッ素化された脂肪族または二環式アミン、ビス（ペルフルオロアルキル）エテンまたはそれらの混合物が使用できる。特に好ましいフッ化炭素は、ペルフルオロデカリン、Ｆ−ブチルテトラヒドロフラン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロオクチルブロミド、ビス−フルオロ（ブチル）エテンまたはビス−フルオロ（ヘキシル）エテンまたはC6〜C9−ペルフルオロアルカンのようなものである。
この場合のフッ化炭素の量は、１〜100％w/v、好ましくは40〜100％の範囲にある。特に好ましい範囲は、70〜100％w/vである。
本発明により使用されるリン脂質は、天然リン脂質、例えば大豆レシチンおよび卵レシチン、ならびに合成リン脂質である。これらのリン脂質の中で、ホスファチジルコリンの含有率は、30〜99重量％、特に70〜99重量％である、すなわち、高いホスファチジル含有率を有するリン脂質が好ましい。
ホスファチジルコリンに加えて、レゾレシチンが0.1〜10重量％の濃度範囲で、および／または、荷電リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ｎ−アセチルホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジン酸が0.1〜30重量％の濃度範囲で存在することもできる。
既知の水性リポソーム（ベシクル）と比べて、本発明によるリン脂質安定化凝集体は、それらのコア中に、酸素を輸送できる疎水性フッ化炭素を持っている。それらの界面化学的安定化は、主として逆配列を有する単層によってそして副次的にそれに付着した二層フィルムの構造によって達成される。従って、既知の二層ベクシルとは対照的に、本発明によれば、非対称性層状凝集体は、常に少なくとも１つの三層構造を有する。これらの構造上の配列の特徴のため、これらの新規凝集体は、非対称性層状酸素キャリヤーと称される。それらの著しいコロイド化学安定性は、おそらく、層状構造におよび凝集体の表面電荷に帰することができる。後者は、天然のみならず合成起源の適当なリン脂質またはそれらの混合物の選択に帰することができる。まず第一に、リン脂質、特に0.1〜10％の濃度のリゾレシチンおよび／または0.1〜30重量％の濃度範囲の荷電リン脂質と場合により組み合わせた30〜99％の濃度範囲ホスファチジルコリンが、この意味で、有利な作用の原因である。リン脂質の主張した作用は、対応する負のゼータポテンシャルによって、また電荷密度の測定（カチオン性高分子電解質での滴定による）によって確かめられる。
浸透速度および浸透深さが凝集体の粒度に依存していることは、動物実験において標識化されたカプセル化フッ化炭素を用いて別個の研究によって実験的に測定することができた。これらの実験によれば、比較的小さい粒子は、比較的大きい粒子よりも、より速く、より深く皮膚組織に移動する。それらの脂質溶解性（それらの、ｎ−ヘキサン中の臨界溶解温度CSTによって表される）によるフッ化炭素またはその混合物の選択は、さらに別の重要な基準として、組織中の滞留時間の調節を可能にする。例えば、高いCST値と低い脂質溶解性を有するペルフルオロトリブチルアミン（Ｆ−TBA,CST59℃）は、ペルフルオロデカリン（PED,CST22℃）に比べて、比較的大きい滞留時間を有するが、Ｆ−ブチルテトラヒドロフラン、Ｆ−ヘキサンなども、対応して、組織からより素早く放出される。フッ化炭素混合物を用いて、所望のCST値、すなわち意図された用途に関する脂質および膜溶解性をもつ系が特に製造できる。
層状凝集体中の酸素キャリヤーとしてのフッ化炭素の含有率は、意図された適用に応じて１〜100％w/vの間で変化し得る。適当なフッ化炭素は特に：炭素原子数６〜12の脂肪族直鎖または分枝アルカン、例えばペルフルオロヘキサン、ペルフルオロノナン；
単環式または二環式の場合によりＦ−アルキル置換されたシクロアルカン、例えばペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロデカリン；
脂肪族第三アミン、Ｎ−含有多環、例えばペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン；
ペルフルオロエーテル、例えば脂肪族エーテルおよびポリエーテル、Ｆ−アルキルフラン、分子中に２または３個の酸素原子を有する二環式および置換された二環式エーテル、例えばペルフルオロジヘキシルエーテル、ペルフルオロブチルテトラヒドロフラン；
ペルフルオロアルキルハロゲン化物、例えばペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロヘキシルブロミド、ペルフルオロオクチルクロリド；
ビス−Ｆ（アルキル）エテン、例えばビス−Ｆ（ブチル）、ビス−Ｆ（ヘキシル）エテンである。
ここで使用される術語「フッ化炭素」は、過フッ素化または高度にフッ素化された炭素化合物または混合物−それらは気体、例えばO2およびCO2を輸送できる−を意味する。本発明の意味の中での高度にフッ素化された炭化水素化合物は、検出され得る限り化学的、生物学的に不活性、従って非毒性である、水素原子の大部分がフッ素原子と置換されているもの、例えばビス−Ｆ（アルキル）エテンである。このことは、ほぼ90％までの水素原子がフッ素原子によって置換されている場合に通常達成される。本発明の意味における好ましいフッ化炭素は、少なくとも95％、より好ましくは98％、最も好ましくは100％の水素原子が置換されているものである。
個々のフッ素原子は、別のハロゲン原子、例えば臭素または塩素によって置換されることもできる。
適当なリン脂質は、天然に発生するリン脂質、例えば大豆レシチンおよび卵レシチン、ならびに、合成で製造できるレシチン（リン脂質）であり、それらは全て皮膚適合性であると知られている。非対称性層状凝集体の安定性に及ぼす有利な作用のため、別の天然に発生する付随生成物に加えて、30〜99％のホスファチジルコリンを含有するリン脂質混合物を使用するのが好ましい。皮膚用配合物中のリン脂質含有率は、0.5〜20％、好ましくは10〜20％の間で変動する。
本発明はまた、ホスファチジルコリンの含有率が30〜99重量％のリン脂質を、酸素を負荷したフッ化炭素またはフッ化炭素混合物で乳化し、その際フッ化炭素の量は0.2〜100％w/vであり、そしてこうして得られる粒度50〜1000nmの非対称性層状凝集体を、皮膚に使用するのに適当なキャリヤー中に混和することからなる、リン脂質含有皮膚用剤の製造方法に関する。乳化は、水の存在下に場合により一価または多価脂肪族アルコールを添加して行なわれる。乳化はまた、フッ化炭素をリン脂質水溶液に、使用した出発物質に対応する温度で添加することによる粗分散体の予備乳化によって行なうこともできる。予備乳化は、比較的高い回転速度、例えば12,000〜15,000rpmで行なわれるのが適当である。次いで実際の均質化を、高圧ホモジナイザー中で行なう。均質化は、別の既知の方法、例えば超音波によっても行なうことができる。分散系へのエネルギー入力の程度は、粒度に間接的に比例する。
オートクレーブ中での熱滅菌は、粒度に及ぼす作用なしに可能である。天然脂質の不飽和脂肪酸基中の自己酸化過程を避けるために、酸化防止剤、例えばα−トコフェロールが添加され得る。
高いホスファチジルコリン含有率を有するリン脂質の使用は特に有利である。これらは、一般に、10〜99重量％、好ましくは30〜99重量％、特に70〜99重量％である。
使用されるフッ化炭素は、これらについて示された制限内の上述のフッ化炭素またはフッ化炭素混合物である。それらの既知のO2溶解性、蒸気圧および臨界溶解温度を用いて、酸素での負荷および浸透深さは、当業者によって制御して調整され得る。
フッ化炭素含有非対称性層状凝集体の作用方法は、局所適用を介する供給不足の組織への酸素の放出に基づいている。酸素供給不足の脂肪組織、および動脈硬化のために不足した酸素供給に、同様に有効に使用され得る。
活性物質としての非対称性層状凝集体を、軟膏、クリーム、ローションおよび別の水性またはアルコール性皮膚用配合物に混和することは、意図された用途に応じて行なわれ、その際、フッ化炭素含有率、従ってO2有効性を、広い範囲で変えることができる。全ての皮膚用の系、例えばゲル、ペースト、粉末、軟膏、クリームおよびローションに混和する前に、凝集体に気体酸素を部分的に負荷するかまたは凝集体を気体酸素で飽和させることができる。ヘンリーの法則に従って通常起こる平衡の確立による大気中の酸素での飽和さえ、全ての類似の既知の系より高い酸素容積を提供する。
本発明による皮膚用剤は、包帯、硬膏、損傷被覆、および他の、皮膚に接触する剤にも適用され得る。例えばスプレーとしても適用され得る。
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。添付図面中、
図１は、出発点としてペルフルオロデカリンを用いたｎ−ヘキサン中の過フッ化炭素混合物の臨界溶解温度（CST）のグラフである。
図２は、出発点としてＦ−オクチルブロミドを用いたｎ−ヘキサン中の過フッ化炭素混合物の臨界溶解温度のグラフである。
いくつかの選択されたフッ化炭素およびそれらのO2溶解性、それらの蒸気圧ならびにそれらの臨界溶解温度を表１に示す。これらの値から出発して、フッ化炭素の混合物のために、皮膚用組成物を用いた皮膚への浸透の際の所望の特性が選択できる。
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例１
50mlの10％濃度リン脂質水溶液（大豆レシチン、40％ホスファチジルコリン（PC））をＨ原子を含まない非常に純粋なフッ化炭素混合物（90％ペルフルオロデカリン、10％Ｆ−ジブチルメチルアミン、臨界溶解温度26℃）80gと共に、超音波崩壊機を用いて氷冷しながら粒子の粒度が平均直径244nmになるまでホモジナイズする。フッ化炭素およびリン脂質の凝集体の多層状構造は、典型的なシグナル幅による31P−NMR測定および電子顕微鏡写真から検出できる。
この凝集分散体は、滅菌のために、適当なアルコール（エタノール、プロピレングリコール、グリセロール）と問題なくかつその安定性に影響を及ぼすことなく、混合できる。30mlのエタノールの添加は無菌状態を生じさせ、得られる分散体は次の組成を有している：
62％w/v  フッ化炭素；
9.7％  リン脂質；
19％  エタノール
−61mVのゼータポテンシャルは、分散体の静電安定化と共にリン脂質によって生じる負の表面電荷を証明する。気体酸素での飽和後、分散体を、非対称性層状凝集体と適合性の、相互に作用しない軟膏基剤に混和する。
例２
組成物［30％PC、30％PE（ホスファチジルエタノールアミン）、31％PI（ホスファチジルイノシトール）］の凍結乾燥したリン脂質18gを滅菌水90mlに溶解させ、未変性エタノール16mlで処理する。機械的な高速攪拌器（Ultra−Turrax,15,000rpm）を用いて、この分散体を攪拌し、同時に、20℃に温度制御された攪拌容器にペルフルオロデカリン（CST22℃）を連続的に添加する。粗分散体を500atmで不活性ガス流中でManton Gaulin型の高圧ホモジナイザー中でホモジナイズする。最後から２番目の通過の始めに、分散体に酢酸α−トコフェロールを、自己酸化過程を避けるために、皮膚組織中のフリーラジカルのためのスカベンジャーとして0.1％まで添加する。
光子相関分光計Ｎ−4MD（Coultronics）を用いて行なわれる測定により、単峰形の粒度分布の存在および128nmの平均粒子直径が確認される。「ネガティブ染色」法を用いる電子顕微鏡検査は、これと一致する。31P−NMR検査によると、非対称性層状凝集体は、−76mVのゼータポテンシャルで単層状の状態で存在する。この分散体の組成は
48％w/v  ペルフルオロデカリン
13％  リン脂質
９％  エタノール
例３
80gのｎ−Ｆ−ヘキサン−これはその過フッ素化異性体（CST20℃）との混合状態で存在する−を、47mlの脱イオン滅菌水中9.5gの卵黄３−sn−ホスファチジルコリンで不活性ガス状態下で0.2％のdl−α−トコフェロールを添加して機械的に予備乳化し、粗分散体とした。この粗エマルションを、圧力ホモジナイザー中で500atmの圧力で適当な温度管理下で、粒度を調べながら、ホモジナイズした。得られる分散体は、中位の粘度および294nmの粒子直径を有する。8mlのプロピレングリコールの添加後、長期の試験中、安定性および無菌（1gあたり100個より少ない微生物数）が、室温で観察された。希釈、例えばローションの製造の際の希釈は、重要なコロイド化学パラメータの変化なく、問題なく可能である。
光学顕微鏡を用いて偏光中でのこの分散体の検査は、液晶構造が存在しない等方性の単相系の存在を示す。
例４
リポソーム浸透の生体内検出
単離されたばかりの生理学的に無傷の皮膚を、その内側でO2センサー（Clark電極）に固定し、表皮を、非対称性層状凝集体を含むO2輸送分散体で濡らした。これらの条件下で、電極はO2分圧を示さない。57分の浸透期間後、凝集体は、電極の測定部分において真皮部分に到達した。O2分圧は、159mmHgの値に上昇した。皮膚への浸透速度は、凝集体の型および大きさによって決まる。
【図１】
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【図２】
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