(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉを含むポリペプチド。
R1−R2−R3−R4−R5−Ｚ                        式Ｉ
式中、R1はイソセリン、2,3−ジアミノプロパノエート、又は2,3−ジヒドロキシプロパノエートであり、
R2はフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−メチルフェニルアラニン又はトリプトファンであり、
R3はロイシン又はフェニルアラニンであり、
R4はロイシンであり、
R5はアルギニンであり、
Ｚはカルボキシル、カルボキサミド、配列SFLLRNPNDKYEPFの６〜14アミノ酸の少なくとも１種のアミノ酸又は該ポリペプチドの細胞浸透能を高める部分であって、該細胞浸透部分が、脂質、ステロイド、長鎖アミン、及び糖からなる群から選ばれたものであり、
該ポリペプチドが血小板凝集を活性化し、且つアミノペプチダーゼＭによる分解を阻害することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
式Ｉが下記配列を有する請求項１記載のポリペプチド。
0003594597.tif 000012
【請求項３】
トロンビンレセプターペプチドの不活性化を阻害し、且つ血小板凝集を活性化する医薬組成物であって、アミノペプチダーゼＭの存在下で血小板凝集を誘発するのに有効量の下記式Ｉを有するポリペプチド化合物を含むことを特徴とする組成物。
R1−R2−R3−R4−R5−Ｚ                        式Ｉ
式中、R1はイソセリン、2,3−ジアミノプロパノエート、又は2,3−ジヒドロキシプロパノエートであり、
R2はフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−メチルフェニルアラニン又はトリプトファンであり、
R3はロイシン又はフェニルアラニンであり、
R4はロイシンであり、
R5はアルギニンであり、
Ｚはカルボキシル、カルボキサミド、配列SFLLRNPNDKYEPFの６〜14アミノ酸の少なくとも１種のアミノ酸又は該ポリペプチドの細胞浸透能を高める部分であって、該細胞浸透部分は、脂質、ステロイド、長鎖アミン、及び糖からなる群から選ばれたものである。
【請求項４】
式Ｉが下記式を有する請求項３記載の組成物。
0003594597.tif 000013
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、血小板上のトロンビンレセプターのペプチドリガンド内のＮ末端アミノ酸を置換し、もって、そのリガンドの酵素分解に対する耐性を付与し、そのリガンドによって仲介される血小板凝集活性の不活性化を回避することに関する。
2.関連技術の説明
止血は、外因性経路又は内因性経路に沿って進行する血液凝固を含む複雑な過程である。両経路とも、最終段階はフィブリノーゲン血漿タンパク質の不溶性フィブリンへの変換を触媒する酵素トロンビンの生成を含んでいる。内因性経路では、血小板は破綻した血管に粘着し、凝集を開始する。次いで、血液を凝固させる酵素トロンビンの生成を促進するために働く。
トロンビンは、また、より多くの血小板を凝集させ、より多くのトロンビンの生成を促進する。トロンビンは、試験管内で強力な血小板アゴニストである。血小板の形態変化、凝集及び顆粒内容物の放出が生じる。
トロンビンの重要性は、血小板を活性化する機序についての研究を刺激した。Vuら,Cell 64,1057−1068（1991）により、血小板膜表面の機能性トロンビンレセプターが同定された。
このレセプターのトロンビン切断により、血小板表面に新しいアミノ末端（SFLLRNPNDKYEPF,T−14）連結リガンドペプチドが生じる。このペプチドリガンドは、ゲルろ過した血小板を直接凝集させることができる。従って、トロンビンは、血小板上のレセプターを切断することにより少なくとも部分的に血小板の活性化を促し、その新しいアミノ末端が連結リガンドとして機能することを可能にし、レセプターの他の領域と相互作用して活性化シグナルを生じる。
続いての研究により、Ｔ−14の最初の５又は６個のアミノ酸を含むペプチドリガンドも活性であることが示された。（Vassalloら,J.Biol.Chem.267,6081−6085（1992）;Huiら,Biochem.Biophys.Res.Commun.184,790−796（1992）;Saboら,Biochem.Biophys.Res.Commun.188,604−610（1992）;Scarboroughら,J.Biol.Chem.267,13146−13149（1992）。ほとんどのグループは、６量体が14量体より活性であることを見出した。
Ｎ末端セリンの正電荷の重要性は、本発明者ら、Collerら,Biochem.31,11713−11720（1992）などによる研究から示された。また、Collerらなどにより、アミノ末端のアセチル化がペプチド活性の喪失を生じることが示され、ペプチド活性とＮ末端セリンの正電荷間の相関が同定された。Collerら、同書など（Vassalloら,J.Biol.Chem.267,6081−6085（1992）;Scarboroughら,J.Biol.Chem.267,13146−13149（1992））により、リガンドのＮ末端セリンを取り除くと活性の喪失を生じることが示された。しかしながら、Saboら,Biochem.Biophys.Res.Commun.188,604−610（1992）；及びChaoら,Biochem.31,6175−6178（1992）に示されるようにアラニンがセリンの代わりをするペプチドは実質的に活性を保持するので、Ｎ末端セリンのヒドロキシル部分は活性に決定的なものではない。
更に、Collerら、Biochem.31,11713−11720（1992）により、血漿と血清及び内皮細胞に天然に存在するアミノペプチダーゼＭがペプチドリガンドからＮ末端セリンを急速に切断してトロンビンレセプターの活性化能の喪失を生じることが証明された。マイクロモル濃度のペプチドで、多血小板血漿（PRP）において血小板凝集応答に影響するのに十分速やかに切断する。ミリモル濃度でさえ、50％血漿と37℃でインキュベートするとアミノペプチダーゼＭによるＮ末端セリンの重要な切断及び血小板凝集活性の喪失を生じる。
アミノペプチダーゼＭは、低分子量ペプチドからＮ末端中性／塩基性アミノ酸を切断する血漿の性能に関与する主要な酵素である（Wardら,Biochm.Pharmacol.40,1725−1732（1990）;Ahmad ＆ Ward,J.Pharmacol.Exp.Ther.252,643−650（1990）。内皮細胞、平滑筋細胞、白血球、単球及び他の細胞がアミノペプチダーゼＭを含有することは既知である（Lookら,J.Clin.Invest.83,1299−1307（1989）;Palmieriら,Biochem.Pharm.38,173−180（1989）;Semenza,Rev.Cell.Biol.2,255−313（1986））。
血漿と血清の存在下にペプチドリガンドが急速に分解及び不活性化すると、投与量応答関係を正確に評価することを困難にする。更に、アミノペプチダーゼ切断及び不活性化過程の評価は、無傷液体相ペプチド濃度が低下するにつれてペプチドのレセプターからの解離が急速に起こるので、認められるペプチドの効果が簡単なレセプターの活性化だけから生じたものがある可能性を高める。
アミノペプチダーゼＭはペプチドリガンドに対するPRPの血小板凝集応答を促進させるアマスタチンのような化合物によって阻害することができる（Collerら,Biochem.31,11713−11720（1992））が、アマスタチン及び他のアミノペプチダーゼＭインヒビターは細胞又は血漿タンパク質についての効果は未知である。Ｎ末端のアセチル化は、アミノペプチダーゼＭによる切断に抵抗するペプチドを生成する伝統的な方法であるが、このリガンドのアセチル化はレセプター活性化因子の活性を取り除くものである。
従って、本発明の目的は、トロンビンレセプターペプチドリガンドの不活性化を防止する手段を提供するものである。
更に、本発明の目的は、実質的な機能活性を保持するがアミノペプチダーゼＭによる切断に耐性のあるトロンビンレセプターペプチドを提供するものである。
更に、本発明の目的は、血小板凝集を活性化する天然に存在しないペプチドを提供するものである。
発明の要約
本発明は、ペプチド残基に対するアミノペプチダーゼＭの酵素作用を阻害し、もって、そのペプチドが血小板凝集活性を保持することを可能にする方法を提供するものである。
本発明のペプチドは、Ｎ末端の野生型セリン残基を置換したイソセリン又は他の残基を含むものである。従って、式Ｉのペプチドは次のように表される。
R1−R2−R3−R4−R5−Ｚ                      式Ｉ
（式中、R1はイソセリン、2,3−ジアミノプロパノエート、2,3−ジヒドロキシプロパノエート又は求核置換基を有するその誘導体であり、
R2は環状又は芳香族基を有する疎水性アミノ酸であり、
R3は疎水性アミノ酸であり、
R4は疎水性アミノ酸であり、
R5はアミノ酸であり、
Ｚはカルボキシル、カルボキサミド、少なくとも１種のアミノ酸又は式Ｉの溶解度又は細胞浸透能を高める部分である。）
式Ｉの好ましいペプチドは、（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−NH2又は（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2である。６量体が最も好ましい。
アミノペプチダーゼＭによるトロンビンレセプター活性化ペプチドの不活性化に抵抗する方法は、式Ｉを有するポリペプチド化合物の有効量を投与することを含む。
本方法の好ましい実施態様は、下記配列を有する式Ｉを使用する。
0003594597.tif 000002
６量体が最も好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｔ−11、（DS）Ｔ−11、SFLLRN及び（iso−Ｓ）FLLRNによって生じた血小板凝集の投与量応答の図形比較である。
図２は、ペプチドの血小板凝集の誘導能に関してSFLLRN及び（iso−Ｓ）FLLRNを血漿中で種々の時間インキュベートすることの効果の図形比較である。
図３は、血漿インキュベーション中のSFLLRN及び（iso−Ｓ）FLLRNのHPLC溶離時間の比較である。
図４は、切断前後及びコンホメーション変化後のトロンビンレセプター部位の図である。
発明の詳細な説明
本発明のペプチドは、アミノペプチダーゼＭによる分解に抵抗する能力を特徴とするが、血小板凝集を誘導する活性は保持される。従って、本発明は血液凝固を促進し、限定しない例として、局所凝固が所望される体内の損傷領域に対する局所適用において有用である。更に、トロンビンは線維芽細胞のマイトジェンであるので、そのトロンビンレセプターを活性化するペプチドは創傷治癒を高めるものである。
本発明のペプチドを記載するために用いられる命名は、慣用的な実施に従い、アミノ基は各アミノ酸残基の左に示され、カルボキシ基は右に示される。アミノ酸に関して残基とは、対応するα又はβアミノ酸からカルボキシル基のヒドロキシル基及びα又はβアミノ基の水素１個を除去することにより誘導された基を意味する。
アミノ酸を示すために用いられる略号は、下記標準略号及び37 C.F.R.§1.822に準じる１文字表記又は３文字表記である。
0003594597.tif 000003
例えば、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｌ、Ｒ、Ｎ、Ｐ、Ｎ、Ｄ、Ｋ、Ｙ、Ｅ、Ｐ、Ｆ又はSer、Phe、Leu、Leu、Arg、Asn、Pro、Asn、Asp、Lys、Tyr、Glu、Pro、Pheは、Ｌ−セリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン及びＬ−フェニルアラニンの残基を示す。
アミノ酸は、イソセリンを除いて特に指示されない限りＬ立体配置をもち、アミノ酸残基、通常は対応するＮ−α保護アミノ酸を得るための出発物質は市販のものであるか又は慣用の方法で調製することができる。アミノ酸の塩基性アミノ基は溶液からのプロトンを結合してカチオンとなることができ、酸性カルボキシル基は溶液にプロトンを遊離してアニオンとなることができる。従って、アミノ酸はイオンであるので、塩として調製することができる。
イソセリンとは、式NH2CH2CHOHCOOHを有するセリンの異性体を意味し、２−ヒドロキシβアラニン又は３−アミノ−２−ヒドロキシプロパン酸と言うこともできる。イソセリンのＣ−２位はキラルであり、我々が最初に使用したイソセリンはラセミ体、即ち、Ｄ及びＬ異性体の等量混合物として記載される。しかしながら、そのＤ及びＬ命名法はイソセリンの場合多少あいまいである。
本明細書において天然でない置換基の絶対配置を記載する場合にあいまいであることから、更に正確に用いられる他の命名法は（R,S）である。Ｌ−セリンは、活性炭素の（Ｓ）配置を有すると言われる。我々は、Ｃ−２の（R,S）を有するラセミ体iso−Ser、即ち、イソセリンを試験した。好適実施態様の（2R）及び（2S）異性体は活性が異なる。
ほとんどの天然に存在するアミノ酸は、アミノ基（−NH2）及びカルボキシル基（−COOH）が同一炭素原子に結合していることを意味するαアミノ酸である。本発明は、天然に存在しないβアミノ酸、イソセリンを利用する。また、βアミノ酸の使用は、血小板活性化に生物活性を有するポリペプチドを生じる。
ペプチドでは、左の端はＮ末端と呼ばれ、右の端はＣ末端と呼ばれる。一般用法においてＣ末端の後に−NH2が続く場合には、Ｃ末端アミド化を示すものである。この慣例は、他のアミノ酸残基がこの端に続く場合に一般に用いられる。この慣例は、本明細書において用いられる。
血小板上のトロンビンレセプター部位のアミノ酸配列は、Vuら,Cell 64,1057−1068（1991）によって同定された。cDNAは、425アミノ酸のオープンリーディングフレームを含み、ヒドロパシープロットは７つのトランスメンブランドメインの存在を示す。トランスメンブランドメインを含むトロンビンレセプター部位及びトロンビン切断の結果は、図４に描写的に示されている。図4Aは、その７つのトランスメンブランドメインを含むトロンビンレセプターを示すものである。図4Bは、トロンビン切断後の連結リガンドを示すものである。図4Cは、トロンビンレセプターを活性化すると共に血小板凝集を与えるリガンド結合時のコンホメーション変化を示すものである。推定トロンビン切断部位は、次のようにR41とR42の間で同定された。
0003594597.tif 000004
新しいアミノ末端に似ている14アミノ酸ペプチド
0003594597.tif 000005
は、ゲルろ過した血小板を直接凝集することができる。Ｔ−14の最初の５又は６個のアミノ酸を含むペプチドリガンドも活性である。Ｄ及びＬ−セリンペプチドをスキームＩに示す。
0003594597.tif 000006
天然に存在するＬ−セリン残基は、式ａで表される。ほとんど不活性なＤ−セリンは式ｂで表される。
R41とS42の間のトロンビン切断は、Ｎ末端セリンを有する連結リガンドペプチドを生じる。血漿アミノペプチダーゼＭは、切断トロンビンレセプター部位に由来する連結リガンドペプチドからＮ末端セリンを切断することができ、血小板活性化活性の完全な喪失を招く。マイクロモルペプチドリガンド濃度で、多血小板血漿において血小板凝集に十分影響するだけ急速に不活性化が起こる。従って、ペプチドリガンド濃縮物は、血漿あるいは血清に露出した後に急速に変化し、投与量応答及び長時間実験を実施及び説明することを困難にする。
この課題を克服するために、Ｎ末端セリンの置換を確実にすることによりアミノペプチダーゼ切断及び不活性化に抵抗するペプチドリガンド類縁体が製造された。
イソセリン及びセリンの立体化学は、次のように表される。
0003594597.tif 000007
（Ｒ）及び（Ｓ）は、中心炭素原子に結合した基の空間配置に基づくあいまいであるが人為的な表記である。Serの場合、優先順位はＮ＞CO2＞Ｃ−Ｏであり、iso−Serの場合、優先順位はＯ＞Ｃ−Ｎ＞CO2である。
本発明においてR1に用いられる残基としては、（Ｒ）−イソセリン（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパン酸）、（Ｓ）−イソセリン（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパン酸）、2,3−ジアミノプロパノエート及び2,3−ジヒドロキシプロパノエートが挙げられる。R1の残基は、OH、NH、SH及びアシルのような求核置換基を有してもよい。R1の好ましいセリン類縁体は、（R,S）イソセリンである。
ラセミ体イソセリンを含む式ＩのペプチドはスキームIIに示される。
0003594597.tif 000008
天然に存在しない（Ｒ）及び（Ｓ）イソセリン類縁体は、式ｃ及びｄで表される。
R1の他の残基は、式ｅ及びｆで示される。
0003594597.tif 000009
実験は、R2のPhe残基が重要であることを示した（Chaoら,Biochem.31,6175−6178（1992））。適切な方向性のR2Pheフェニル基は、トロンビンレセプターとの必要な疎水性相互作用に重要でありかつそのレセプターがそのフェニル基に特異的な結合部位を有することが理論付けられた。Phe−２のフルオロフェニルアラニンによる置換がトロンビンレセプターの活性化を高めることがNoseら,Biochem Biophys.Res.Commun.193,694−699（1993）により見出された。
式Ｉのペプチドリガンドでは、R2は環状又は芳香族基を有する任意の疎水性アミノ酸残基であってもよい。この種類の天然に存在するアミノ酸としては、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられる。
フェニルアラニンの天然に存在しない類縁体は、ｐ−ベンゾイル、ｐ−フルオロ、ｐ−メチル、ｐ−メトキシ等の天然に存在しない置換が含まれる。R2に好ましい天然に存在しないアミノ酸残基ｐ−ベンゾイルフェニルアラニンは、下記スキームIIIに式ｈで表される。
0003594597.tif 000010
フェニルアラニンの天然に存在しない類縁体は、式IIで表される。
0003594597.tif 000011
R2に好ましいアミノ酸は、フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン及びｐ−メチルフェニルアラニンである。また、Ｘは任意の疎水基であり、Ｘはベンゼン環上オルト又はメタ位置に位置される。
R3は、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びバリンのような任意の疎水性アミノ酸である。ロイシン、フェニルアラニン及びアラニンが好ましい。ロイシンが最も好ましい。
R4は、R3に挙げたもののような任意の疎水性アミノ酸である。ロイシン及びアラニンが好ましい。ロイシンが最も好ましい。
R5は、任意のアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンであり、好ましくは塩基性のものである。アルギニン及びアラニンが好ましい。アルギニンが最も好ましい。
Ｚは、カルボキシ、カルボキシアミド、Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyr−Glu−Pro−Phe−NH2の配列のＮ末端で開始する少なくとも１個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、他のアミノ酸又は式Ｉの溶解度又は細胞浸透力を高める部分である。そのような部分は当該技術において既知であり、例えば、脂質、ステロイド、デシルアミンのような長鎖アミン、グルコサミン、グルクロン酸等の複合体の糖が挙げられる。
（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2のペプチドは、まずｔ−Boc化学を用いて自動ペプチドシンセサイザーでPhe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2を合成し、次にラセミ体ｔ−Bocイソセリンを手で加えることにより調製した。（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2は、天然に存在するペプチドと比べて大巾に活性が高いことがわかった。（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2のジアステレオマーの１つだけ活性であることはあり得る。
一方、血漿と37℃でインキュベートした場合、天然に存在するペプチドは漸進的な分解を受け、約２時間後にほとんど全部（96％）のペプチド切断を生じた。実際に、天然に存在するペプチドに関して、血小板凝集活性は15分以内に低下し、60分でほぼ喪失した。対照的に、（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−NH2は45分でさえ確認できる切断を受けず、２時間ではわずかに約17％の切断しか起こらず、血小板凝集活性は少なくとも２時間一定のままであった。従って、イソセリン置換ペプチドは切断及び血漿アミノペプチダーゼＭによる不活性化に耐性がある。イソセリン置換ペプチドの安定性は、血漿又は血清含有培地中で行われる実験を改良する。更に、置換されたペプチド断片は天然に存在するペプチドの作用を補足しかつ損傷の部位の局所凝固を高めるために外因的に加えることができる。
次の限定されない実施例によって、本発明を具体的に説明する。
実施例１
ペプチド：トロンビンレセプターからのアミノ酸配列42−52を表すSer−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyrの11アミノ酸ペプチド（Ｔ−11）;L−セリンの代わりにＤ−セリンを含む同じペプチド（（ds）Ｔ−11）；及びSer−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnの６アミノ酸ペプチド（アミノ酸42−47を表す）を、慣用のペプチド合成法によって合成した。Beerら,Blood 79,117−128（1992）に記載されているようにｔ−Boc化学、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂及びカップリング溶媒としてＮ−メチルピロリドンを用いて自動ペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems 430A,Foster City,CA）によりＣ末端アミドとして合成した。保護基は、アスパラギン酸に対してβ−ベンジル、セリンに対してベンジル、チロシンに対して２−ブロモベンジルオキシカルボニル、リシンに対して２−クロロベンジルオキシカルボニル及びアルギニンに対してトシルとした。アルギニン、アスパラギン、チロシン及び使用したプロリン及びフェニルアラニン残基を二重に結合した。ジメチルスルフィド及びアニソールは、フッ化水素切断溶液の全てに含まれた。ペプチドを、逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によって評価し、使用したペプチドをこの方法で精製した。使用したペプチドの質量は、Beerら,Blood 79,117−128（1992）に記載されているように高速原子衝撃質量分析法で求めた。
Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−AsnのＮ末端セリンをイソセリンに置き換えたペプチド、即ち、（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnは、まずPhe−Leu−Leu−Arg−Asnのペプチドを自動の方法で合成し、次にジクロロメタン＋ジメチルホルムアミド（2:1）中ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Boc）保護ラセミ体イソセリンをそのイソセリンとN,N′−ジイソプロピルカルボジイミドを活性化する１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて樹脂上のペプチドに加えてペプチドに結合することにより調製した。次いで、このペプチドをフッ化水素で樹脂から切断し、ジアステレオマーの混合物として直接使用した。HPLC分析により、220nmの吸光度の約68％が（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−AsnとＴ−11ペプチドの主ピークにあり、52％が（Ｄ−Ser）Ｔ−11ペプチドの主ピークにあり、約75％がSer−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnの主ピークにあった。結果に示したペプチド濃度は、これらの数値を修正した。
実施例２
血小板凝集。多血小板血漿（以後“PPP"）は、クエン酸ナトリウム（0.01容量の40％クエン酸三ナトリウム）又は酸−クエン酸塩−デキストロース（以後“ACD"）溶液Ａ（ACD−A;8.5mlの血液:1.5mlのACD−Ａ）で抗凝固したヒト血液から700g、22℃で3.5分間遠心することにより得た。貧血小板血漿（以後“PRP"）は、PRPを2000g、22℃で８分間遠心することにより得た。調製後クエン酸塩を加えたPRPはpH約7.7であり、ACD−APRPはpH約7.0であった。必要な場合には、PRPのpHを1M NaOH又は1M HClで調整し、約7.70に維持した。血小板凝集を適合スターバーを用いて二重チャンネルアグリゴメータ（Chronolog,Havertown,PA）で行った。
ペプチド誘導凝集の投与量応答。クエン酸塩を加えた多血小板血漿（PRP;307,000血小板／μｌ、pH7.0;0.45ml）を37℃でキュベット中で攪拌し、次に、10mlのSer−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyr（Ｔ−11）、（Ｄ−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyr（（DS）Ｔ−11）、Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn又は（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnペプチドを加えて次のような最終濃度を得た。Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyrは最大濃度2.9μＭまで加え、（Ｄ−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn−Pro−Asn−Asp−Lys−Tyrは最大濃度940μＭまで加え、Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnは最大濃度1.7μＭまで加え、（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asnは最大濃度4.9μＭまで加えた。
Ｔ−11、（DS）Ｔ−11、SFLLRN及び（iso−Ｓ）FLLRNによって生じた血小板凝集の投与量応答の比較は、図1A、Ｂ、Ｃ及びＤに示されている。図1Bの結果は、（DS）Ｔ−11が最小凝集活性しか有しないことを示すものである。
940μＭ（DS）Ｔ−11の投与量でさえ2.9μM T−11より凝集活性が低かった。最大凝集を行わない試料中に確認できる末期血小板離解相の勾配は、等価なピーク凝集応答を示す投与量のＴ−11ほど（DS）Ｔ−11で急激でなかった（1.8μＭのＴ−11の場合15U/分及び680μＭの（DS）Ｔ−11の場合5U/分）。Ｄ−セリンによる離解勾配の低下はＤ−セリンペプチドのアミノペプチダーゼＭ切断の減少と一致する。
図1Cは、SFLLRNが最も活性なペプチドであり、1/2最大凝集を達成するのに〜0.8μＭを要することを示すものである。図1Aは、SFLLRNPNDKY（Ｔ−11）が図1Dに示されている（iso−Ｓ）FLLRNと効力が各々1/2最大凝集濃度〜3.3μＭ及び4.0μＭで同じであったことを示している。DSFLLRNPNDKY（（DS）Ｔ−11）は最小の活性しかなく、図1Bに示されるように1.8μＭでさえ最大凝集を得ることができなかった。
これらのデータは、前の観察によれば、６アミノ酸ペプチドSFLLRNがより長いＴ−11より活性であり、図１に示されるように前者は〜0.8μＭで1/2最大凝集を生じ、後者は〜2.2μＭを要する。Ｔ−11と同様にSFLLRNによって生じた凝集は、急激な離解勾配を示した。（iso−Ｓ）FLLRNペプチドは、1/2最大凝集を得るのに〜４μＭを要した。即ち、（iso−Ｓ）FLLRNは、SFLLRNの血小板活性化活性の〜15〜20％である。等価なピーク凝集応答を示す投与量において、離解相勾配はSFLLRNほど（iso−Ｓ）FLLRNで急激でなかった（0.7μＭのSFLLRNの場合13U/分及び3.7μＭの（iso−Ｓ）FLLRNの場合4U/分）。これもまた、（iso−Ｓ）FLLRNがアミノペプチダーゼＭによって急速に切断されないことを示すものである。
実施例３
ペプチド凝集活性の血漿による不活性化。我々は、Ｔ−11及びＴ−14ペプチドが血漿中でインキュベートした場合、Ｎ末端セリンの切断のために凝集活性を喪失すること；内皮細胞アミノペプチダーゼＭもＴ−11を切断することができること；及びアミノペプチダーゼＭをアマスタチンで阻害するとＴ−11で生じた凝集を高めるがトロンビンで高めないことを前に示した。B.Collerら,Biochemistry 31,11713−11720（1992）。更にペプチド消化実験を次のように行った。
ペプチド消化実験。Ｔ−11及び（Ｄ−Ser）Ｔ−11消化の場合、0.15M NaCl、0.01トリス/HCl、pH7.4中0.11容量の20mMペプチドをクエン酸塩を加えた貧血小板血漿に加えて最終濃度2mMを得た。試料を37℃で２時間インキュベートし、次に血漿タンパク質を９〜10％トリクロロ酢酸で４℃において少なくとも30分間沈澱した。12000g、22℃で３分間遠心した後、上清を分析して逆相HPLC（C8;Applied Biosystems 300RP Aquapore;220×4.6mmカラム）でペプチド切断を求めた。溶離は、０〜60％勾配を有する0.1％トリフルオロ酢酸を用いた。
Ｔ−11及び（Ｄ−Ser）Ｔ−11の消化産物のアミノ酸配列を求めかつ血小板の凝集能を評価するために、ペプチド（2mM）をクエン酸塩を加えたPPPと37℃で２時間インキュベートし、血漿タンパク質をトリクロロ酢酸で沈澱し、遠心後の上清を分析用逆相カラムで分析及び分別の双方に供した。ピーク画分を真空遠心分離後（Speed−Vac,Savant,Farmingdale,NY）で乾燥し、凝集実験用バッファー（0.15M NaCl及び0.01Mトリス/HCl、pH7.4）あるいはアミノ酸分析用0.1％トリフルオロ酢酸に溶解した。ペプチドのアミノ酸定量分析は、市販の試薬及び装置（Pico−Tag Workstation ＆ C−18 Pico−Tagカラム;Waters−Millipore,Bedford,MA）で行った。次いで、アミノ酸配列を各ピークのアミノ酸含量から推測した。
Ｔ−11を血漿中37℃で前インキュベートすると、血小板凝集能の漸進的な喪失をもたらした。10分くらいの短いインキュベーション時間が顕著な阻害を生じるのに十分であった。Ｔ−11ペプチド（2mM）を貧血小板血漿と37℃で２時間インキュベートした後、34％のペプチドのみが無傷のままであった。対照的に、（DS）Ｔ−11ペプチドは同一条件下で確認できる切断を受けなかった（データは示されていない）。
Ser−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn（SFLLRN）及び（iso−Ser）−Phe−Leu−Leu−Arg−Asn（（iso−Ｓ））FLLRN実験の場合、バッファー（0.15M NaCl、0.01Mトリス/HCl、pH7.4）中2mMペプチドは同量のクエン酸塩を加えた貧血小板血漿（1:1）及び別個に同量のバッファーと混合し、37℃で可変時間インキュベートした。15、30、45、60及び120分に分割量を取り出し、血小板凝集能及びペプチド切断の双方を分析した。SFLLRNの場合、最終濃度2.2μＭ及び（iso−Ｓ）FLLRNの場合、8.8μＭを選択することを除いて二重チャンネルアグリゴメータを用いる実施例２に記載される方法に従って血小板凝集を求めた。結果を図２に示す。
SFLLRN及び（iso−Ｓ）FLLRNのペプチド消化実験の場合、試料を種々の時間に取り出し、血漿タンパク質をトリクロロ酢酸で沈澱した後にHPLCでペプチド消化を分析した。結果を図３に示す。
血漿インキュベーション中のペプチド凝集活性喪失の時間的経過
SFLLRNペプチドは、血漿中でインキュベートした場合に血小板凝集活性を急速に喪失したが、（iso−Ｓ）FLLRNペプチドは活性が存在する場合には２時間後でさえもほとんど喪失しなかった。図2Bでの光学濃度の低下は、血小板が凝集したことを示すものである。
即ち、（iso−Ｓ）FLLRNペプチドは、血漿とインキュベートした場合、SFLLRNより非常に大きい程度までその血小板凝集活性を保持する。同様に、（DS）Ｔ−11は血漿と１時間インキュベートした場合には1/2を超えてその凝集活性を保持するが、Ｔ−11は１時間以内にその凝集活性の全てを喪失した（データは示されていない）。
SFLLRNあるいは（iso−Ｓ）FLLRNを血漿よりむしろバッファーとインキュベートした場合には、２時間後にペプチド活性が低下しなかった（データは示されていない）。低濃度のペプチド（125μＭ）を血漿とインキュベートした。SFLLRNペプチドは、18分以内にその凝集活性の全てを喪失した。（iso−Ｓ）FLLRNは、45分インキュベートした後にその全凝集活性を保持したが、１時間後に活性が多少低下した。しかしながら、２時間でさえ多少凝集活性が残った。
血漿インキュベーション中のペプチド消化の時間的経過
図３における血漿消化のHPLC溶離時間結果は、SFLLRN（最終濃度1mM）を50％貧血小板血漿と37℃でインキュベートした場合、SFLLRNペプチドは約29分で溶離し、（iso−Ｓ）FLLRNペプチドは約30分で溶離したことを示すものである。約22分で溶離するピークは、血漿に由来しかつ内部調節として働く。SFLLRNは、10分以内に検出可能な切断を受け、２時間でほぼ完全な消化まで進行した。対照的に、（iso−Ｓ）FLLRNは沈澱の２時間後でさえ消化が最小であった。更に詳細には、SFLLRNに関しては、ちょうど15分後には35％のペプチドがもはや無傷でなかった。消化は、無傷のままの％が30、45、60及び120分で49％、23％、16％及び４％まで減少したように時間と共に急速に進行した。実際に、（iso−Ｓ）FLLRNペプチドは全て最初の60分間、120分のインキュベーション後でさえ無傷のままであり、〜83％のペプチドが無傷のままであった（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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