(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端がカルボキシメチル化されたヘモグロビンの糖尿病もしくは糖尿病合併症用マーカーとしての使用。
【請求項２】
Ｎ末端がカルボキシメチル化されたヘモグロビンに対して特異的に反応する抗体を用いた糖尿病もしくは糖尿病合併症用免疫試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は糖尿病または糖尿病合併症のマーカー並びに試薬に関する。更に詳しくは、糖尿病または糖尿病合併症の診断もしくは薬効評価に有用なマーカー並びに診断、治療もしくは予防のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のタンパク質はグルコースと非酵素的に反応して糖化され、糖化タンパク質となることが知られている。該糖化反応はメイラード反応と呼ばれ、前期段階および後期段階の反応に分けられる。前期段階の反応は、タンパク質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基と糖のカルボニル基が反応し、シッフ塩基を経由してアマドリ転位化合物を生成するまでとされている。該前期段階反応生成物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃや糖化アルブミン等が知られており、糖尿病の臨床マーカーとして用いられているのは周知の事実である。
【０００３】
また、上記前期段階反応の後、タンパク質の側鎖アミノ基に生成したアマドリ転位化合物は２つの方向に変化することが知られている。１つは、蛍光性、褐色変化、或いは分子内または／および分子間架橋形成のうちの少なくとも１つを伴う反応（以下、「後期段階反応Ａ」とも言う。）であり、もう１つは、酸素と遷移金属が関与する酸化的開裂反応（以下、「後期段階反応Ｂ」とも言う。）である。
【０００４】
ところで、メイラード反応の最終生成物をＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼ぶこともあるが、該ＡＧＥという用語は一般に上記の後期段階反応Ａに見られる３つの特徴的な現象（蛍光性、褐色変化、或いは分子内または／および分子間架橋形成）の少なくとも１つを伴う反応生成物を総称するものとして使用されることが多く、上記３種類の現象のすべてを伴わない反応によって生成したものまでを含めてＡＧＥと呼ぶか否かについては意見が分かれている。即ち、ＡＧＥの定義に関しては、上記定義以外にも、インビトロでグルコースとタンパク質を３７℃で６０日以上インキュベーションしたとき（メイラード反応のモデル反応）の生成物すべてをＡＧＥとするという説や該生成物のうち糖尿病合併症を発症させるような生物学的活性を有するもののみをＡＧＥとするという説等があり、学会においてもその定義が統一されていないのが現状である。本明細書においては、上記のような混乱を避けるため、ＡＧＥという語を使用する場合には、メイラード反応のうち蛍光性、褐色変化或いは分子内または／および分子間架橋形成のうちの少なくとも１つを伴う反応生成物（即ち、後期段階反応Ａの生成物）のみを指してＡＧＥと称する。
【０００５】
上記後期段階反応Ａの生成物、即ちＡＧＥは、複数の化合物の集合体であると考えられている。現在のところ、ＡＧＥの構造体としては、ピラリン、ペントシジン、クロスリンＡ＆Ｂ、或いはＸ１等が提唱されており、これらの定性、定量は蛍光強度の測定、或いは抗原抗体反応により行われている。また、ＡＧＥを生成する後期段階反応Ａに関しては、該反応が生体内で起こり、血管障害合併症の発症に関与しているとの報告がなされ（Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ３１４，ｐ４０３，１９８６）、ＡＧＥは糖尿病患者における合併症の発症と進展に関与するものとして注目されるようになっている。そして、ＡＧＥには糖尿病合併症の発症と進展に関与する生物学的活性があるという報告もなされている（森崎ら、最新医学、第４９巻、２４８頁、１９９４年）。
【０００６】
一方、メイラード反応の後期段階のもう一つの反応（後期段階反応Ｂ）生成物として、ε位のがカルボキシメチル化されたＮ−ε−カルボキシメチルリジン（以下、「ＣＭＬ」と略すこともある。）が同定され（Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２６１，ｐ４８８９，１９８６）、老人や糖尿病患者のレンズタンパク質、皮膚コラーゲン等に存在していることが報告されている（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ３０，ｐ１２０５，１９９１）。また、牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略す。）の側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換された（以下、「ＣＭ化」と略すこともある。）ものはＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体の反応を強く阻害するとの報告もある（第５５回アメリカ糖尿病学会議抄録集ｐ１１５Ａ，１９９５）。
【０００７】
しかしながら、Ｎ末端のみがカルボキシメチル化されたタンパク質またはペプチド（以下、「ＣＭ化物」と略すこともある。）についての報告例はなく、また、糖尿病患者、或いは腎症や網膜症等の合併症を発症している糖尿病患者（以下、「糖尿病合併症患者」ともいう。）と健常者における生体内、特に体液中のタンパク質またはペプチドにおいて、該置換タンパク質またはペプチドの割合や量の違いは明らかにはなっておらず、その使用においての有効性、特に糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用の有効性は認識されていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者の間で、生体内、特に体液中のタンパク質もしくはペプチドにおけるＣＭ化物の量や割合に有意な差が認められることを確認し、該ＣＭ化物が糖尿病または糖尿病合併症用マーカーと成りうることを実証すること、即ち糖尿病あるいは糖尿病合併症用の新規なマーカーとしての使用を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、体液中のＣＭ化物と免疫学的に反応する糖尿病または糖尿病合併症の診断用もしくは薬効評価用として有効な免疫試薬を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者の間で、体液中のある種のタンパク質について次に定義される「ＣＭ化率」に有意な差が認められることを見出し、ＣＭ化されたタンパク質が糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとして有効に使用できるという知見を得て本発明を完成するに至った。ここで、ＣＭ化率とは、検体となる体液中に存在する特定の種類の総てのタンパク質またはペプチド（該特定種のタンパク質またはペプチドがＣＭ化等により変性されているか否かに拘わらない）について下式で定義されるものであり、いわば該特定のタンパク質またはペプチドのＮ末端が平均してどの程度ＣＭ化されているかを示す指数である。
【００１１】
【数１】
0003542245.tif 000002
【００１２】
即ち、本発明は、Ｎ末端がカルボキシメチル化されたヘモグロビンの糖尿病もしくは糖尿病合併症用マーカーとしての使用である。
【００１３】
また、別の発明は、Ｎ末端がカルボキシメチル化されたヘモグロビンに対して特異的に反応する抗体を用いた糖尿病もしくは糖尿病合併症用免疫試薬である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のマーカーとして用いるタンパク質としては生体内のタンパク質であれば特に限定されず、例えばアルブミン、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）、ヒストン等の単純タンパク質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタンパク質等のリポタンパク質、ヘモグロビン、トランスフェリン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が挙げられるが、被検者から容易に検体を採取できる体液由来のタンパク質であることが好ましい。更に、体液由来のタンパク質のうち、タンパク質としての寿命が長く、且つ血中濃度も高いヘモグロビン、或いは沈着アミロイドの主要成分であるβ２Ｍであることがより好ましい。
【００１５】
また、本発明でマーカーとして用いるペプチドとしては、生体内のペプチドであればオリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上記タンパク質の分解産物が挙げられる。
【００１６】
生体内のタンパク質（例えば、血液中や尿中のタンパク質）もしくはペプチドのＣＭ化率を直接的に測定する方法は未だ存在しないが、ＣＭ化物を分解してＣＭ化アミノ酸を間接的に測定する方法は既に知られている。該測定方法を例示すれば、ＣＭ化物を加水分解して液体クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ化されたアミノ酸を検出する方法、ＣＭ化物を加水分解してガスクロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ化されたアミノ酸を検出する方法等が挙げられる。しかしながら、ＣＭ化物を間接的に測定する方法は操作が煩雑であり感度も低いという問題があることから、測定が容易であり感度も高い直接的な測定方法が求められていた。そこで、本発明者らは、ＣＭ化物に特異的に反応する抗体（以下、抗ＣＭ抗体と言う。）を用いて抗原抗体反応にて生体内のＣＭ化物を検出する方法を開発した。
【００１７】
かかる抗ＣＭ抗体は、有機合成的手法を用い合成したＣＭ化物を免疫原（抗原）として使用することにより得られる。このようなＣＭ化物を合成するための原料となるタンパク質としては特に限定されず、例えばアルブミン、β２Ｍ、ヒストン等の単純タンパク質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタンパク質等のリポタンパク質、ヘモグロビン、トランスフェリン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が挙げられる。
【００１８】
また、ＣＭ化物の合成原料としてペプチドを使用する場合には、原料となるペプチドは、オリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上記タンパク質の分解産物、上記タンパク質の特定領域を人工的に合成したもの等が使用できる。
【００１９】
上記タンパク質もしくはペプチドを構成するアミノ酸のＮ末端に存在するアミノ基をカルボキシメチル化（ＣＭ化）する方法、即ち、上記アミノ基の水素を−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基に置換する方法としては、公知の方法が何ら制限無く使用される。例えば「新生化学実験講座１、タンパク質４」（日本生化学会編、第１３〜１６頁、東京化学同人、１９９１年３月２０日発行）に記されている還元アルキル化法のように、ＣＨＯ−ＣＯＯＨで示されるアルデヒド化合物とタンパク質またはペプチドをホウ酸緩衝液やリン酸緩衝液等の水溶液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下でｐＨ８〜１０で反応させた後、イオンクロマトグラフィー等によりＮ末端のアミノ基のみがＣＭ化されたもの（ＣＭ化物）を分取すればよい。
【００２０】
上記反応において、反応液のｐＨが１０より高いとタンパク質等が変性する恐れがあり、８より低いｐＨだと水素化物還元剤が不安定になる。該反応を特異的、且つ定量的に進行させるために、反応温度は０〜１０℃で行うのがよい。或いは、酸素存在下で還元糖とタンパク質を無菌的に３７℃で６０日間程度インキュベーションして得ることもできる。
【００２１】
上記反応で得られたＣＭ化されたタンパク質またはペプチドは、一般に水に可溶で、アセトン、アルコール、硫酸アンモニウム、重金属塩等の添加で沈澱する。また、上記のＣＭ化物の検出には、アミノ基を検出する方法以外の既知の方法であれば良く、例えば紫外吸収法、色素結合法、フェノール試薬法等が挙げられる。なお、上記方法においては一般に、タンパク質、脂質、糖質等、アミノ基の存在する物質はＣＭ化されやすいが、タンパク質もしくはペプチドにおいては、リジンの側鎖或いはＮ末端アミノ基が選択的にＣＭ化され易く、上記反応では、Ｎ末端のアミノ基のみがＣＭ化されたもの（ＣＭ化物）の他、リジンの側鎖に存在するアミノ基のみ或いはＮ末端とリジン側鎖のアミノ基がＣＭ化されたものが得られる。従って、上記反応生成物からイオンクロマトグラフィー等によってＣＭ化物を分取し、これを抗原として使用すれば抗ＣＭ抗体が得られる。また、上記反応において、ＣＭ化されるタンパク質もしくはペプチドとしてアミノ基がＮ末端にしか存在しないもの（側鎖にアミノ基を有しないもの）を用いれば純度の高いＣＭ化物を効率よく得ることが出来、より容易に抗ＣＭ抗体を得ることができる。
【００２２】
本発明によれば、抗ＣＭ抗体からなる糖尿病或いは糖尿病合併症の診断用もしくは薬効評価用用免疫試薬が提供される。該抗体を作成するための抗原は、ＣＭ化物であれば良いが、抗原としてＣＭ化ペプチドを用いた場合には免疫応答を誘導する能力が弱いことがあるため、抗体を作成するにあたり、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ等、従来知られているキャリアータンパク質にＣＭ化ペプチドを結合させたものを免疫原とする方が好ましい。該ＣＭ化ペプチドのキャリアータンパク質への結合には、通常、本目的で行われている方法が何ら制限なく用いられる。
【００２３】
かかる抗原を用いて作成する抗体は、その由来を特に限定されるものではなく、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットなどの宿主動物に、透析、遠心濃縮、或いは液体クロマトグラフィー等によって精製したＣＭ化物を抗原（免疫原）として免疫して得られた抗血清、腹水液等を、そのままか或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製してポリクローナル抗体として用いることができる。或いは、抗原で感作した哺乳動物の脾細胞やリンパ節細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合して得たハイブリドーマから調製したモノクローナル抗体をそのままか、或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製して用いることができる。
【００２４】
これらの抗体は、抗体分子自体でも良く、またこれらの抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位を含む部分）を使用しても良い。
【００２５】
本発明の免疫試薬とは、抗ＣＭ抗体とＣＭ化物の抗原抗体反応を利用し、ＣＭ化物を検知出来る試薬であればその形態は特に限定されない。例えば、後述する非競合法、競合法およびサンドイッチ法等の各方法に対応するように、抗ＣＭ抗体、β２Ｍやヘモグロビン等の生体成分に対する抗体およびＣＭ化物を適宜不溶性担体に担持した形態をとることが出来る。この様な各免疫試薬を測定方法に応じて、検体中の抗原及び／又は抗ＣＭ抗体とを接触させることによって起こる抗原抗体反応を検出することによりＣＭ化物が測定できる。この様な抗原抗体反応の検出は、本発明の免疫試薬がいわゆる免疫凝集試薬である場合には不溶性担体の凝集等を利用して検出することができるし、本発明の免疫試薬がいわゆる標識免疫測定試薬である場合には比色、発光、蛍光等の物理量の変化として検出することができる。
【００２６】
本発明の免疫試薬の具体的な態様を例示すれば、定性試薬としては、ラテックス凝集試薬、マイクロタイター試薬等を、定量試薬としては、ラジオイムノアッセイ試薬、エンザイムイムノアッセイ試薬、蛍光イムノアッセイ試薬、化学発光イムノアッセイ試薬、ラテックス定量試薬等を、それぞれ例示できる。
【００２７】
抗ＣＭ抗体または生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原を担持する不溶性担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すればよく、例えば、ビーズ状、テストプレート状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が例示できる。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ガラス、多糖類又はその誘導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、赤血球、プロピレン、スチレン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、又はこれらに公知の方法によりスルホン基、アミノ基などの反応性官能基を導入したものが挙げられる。
【００２８】
不溶性担体への抗ＣＭ抗体または生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原の固定化法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等の公知の方法が何ら制限なく使用できる。
【００２９】
標識免疫測定試薬におけるＣＭ化されたタンパク質またはペプチドの測定の基本操作は、通常の検定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法等の酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等に従うことができる。これら各検定法における操作、手順等は、一般に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競合法、競合法、サンドイッチ法等に準じることができる。非競合法においては、不溶性担体に検体中のＣＭ化物または抗ＣＭ抗体を担持した後に、抗ＣＭ抗体またはＣＭ化物を接触させればよい。競合法においては、例えば不溶性担体に人工的に作製したＣＭ化物を担持した後に、予め検体中のＣＭ化物と反応させた抗ＣＭ抗体を接触させればよい。サンドイッチ法においては、抗ＣＭ抗体、或いはアルブミン、β２Ｍやヘモグロビン等の生体成分に対する抗体を不溶性担体に担持した後に、検体中の抗原を接触させ、更に生体成分に対する抗体、または抗ＣＭ抗体を接触させればよい。これらの測定方法により、タンパク質またはペプチドのＣＭ化率、あるいはＣＭ化物の量を測定することができる。
【００３０】
標識免疫測定試薬における標識剤としては、放射性ヨード、放射性炭素等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光物質、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素等をそれぞれ例示できる。かかる方法にて得られた抗原抗体反応生成物は放射能、比色、蛍光、発光等を利用して検出される。
【００３１】
例えば、抗ＣＭ抗体或いは検体中の抗原を不溶性担体に０．０１〜１０００μｇ／ｃｍ２の割合で担持し、０．００１〜１０００μｇの検体中の抗原或いは抗ＣＭ抗体を接触させて測定に供する。生体成分に対する抗体を不溶性担体に担持した場合には、上記したように、検体中の抗原を接触させた後、更に抗ＣＭ抗体を接触させる。不溶性担体に担持していない当該抗体は、標識剤で標識されたものを使用することが好ましい。
【００３２】
免疫凝集試薬におけるＣＭ化されたタンパク質またはペプチドの測定の基本操作は、通常の検定法、例えば赤血球凝集反応法、受身凝集反応法、免疫比蝋法、免疫比濁法等に従うことができる。これら各検定法における操作、手順等は、一般に採用されているそれらに準じることができる。例えば、粒子状の不溶性担体１ｇ当たり０．００１〜１００ｍｇの抗ＣＭ抗体を上記方法にて担持した粒子（以下、感作粒子と略す）を、０．００１〜１５重量％となるように水性媒体に分散させて免疫試薬の有効成分として使用すればよい。抗体を担持する不溶性担体の粒径は、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝集の判別のし易さなどの観点から平均粒径が０．０５〜１０μｍの不溶性担体を使用するのが好適である。かかる方法にて作成した感作粒子を検体中の抗原と接触させ、該感作粒子の凝集の度合を測定すれば良い。粒子の凝集の度合は、目視、光学的測定等従来の方法が制限なく使用できる。
【００３３】
後述する実施例にも示されるように、糖尿病或いは糖尿病合併症患者の生体内に存在するタンパク質のＣＭ化率は健常者のそれに比べて有意に高かったことから（表１〜３参照）、本発明で使用するＣＭ化物は、臨床検査の領域において、糖尿病或いは糖尿病合併症のマーカーとなりうる。即ち、生体内、特に体液中のタンパク質もしくはペプチドのＣＭ化率を測定することにより、糖尿病或いは糖尿病合併症にかかっているか否かを判断したり、糖尿病の進行度合いを予測したり、或いは糖尿病合併症の発症や進行度合いを予測したりすることが可能となる。
【００３４】
また、上記免疫測定法を利用した糖尿病或いは糖尿病合併症用免疫試薬は、糖尿病或いは糖尿病合併症用診断試薬、或いは糖尿病或いは糖尿病合併症の治療もしくは予防用の薬剤の薬効評価試薬として有益に用いられる。
【００３５】
診断試薬として用いる場合は、抗ＣＭ抗体を用いて検体中の抗原、即ち特定の生体成分に含まれるＮ末端アミノ基がＣＭ化されたタンパク質またはペプチドの量あるいは割合を測定する。該生体成分としては、例えば血液、尿、リンパ液、羊水、随液、唾液等の体液、皮膚コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックス、レンズタンパク質、動脈、腎臓等の組織等が挙げられるが、臨床検査に被検体として多用されている体液を用いる方がより好ましい。
【００３６】
薬効評価試薬として用いる場合は、糖尿病或いは糖尿病合併症用治療薬の投与によって、特定の生体成分に含まれるＮ末端アミノ基がＣＭ化されたタンパク質またはペプチドの量あるいは割合の減少度を測定する。
【００３７】
【発明の効果】
本発明者らは、ヘモグロビンのβ鎖由来の配列からなるＮ末端以外にアミノ基を有さない合成ペプチドのＮ末端アミノ基をＣＭ化したＣＭ化ペプチドをウサギに免疫し、さらにアフィニティ精製して該合成ペプチドに対する抗体を含む抗ＣＭ抗体を得、該抗ＣＭ抗体が健常者の血液中の抗原に比べて糖尿病患者や糖尿病合併症患者の血液中の抗原の方が有意に強く反応することを明らかとした。このことは、ＣＭ化物が糖尿病およびその合併症の発症や進行を診断したり該合併症に対する新薬を開発する際の薬効を評価するためのマーカーとして有用であることを示すものである。
【００３８】
また、本発明の免疫試薬を使用すれば、体液や組織を被検体として糖尿病、糖尿病合併症の診断を迅速且つ正確にしかも簡便に行うことが可能となる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
（１）  ＣＭ化ペプチドの作成
ヘモグロビンのβ鎖由来の配列を持つ合成ペプチド（バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸−グルタミン酸）のＮ末端アミノ基をＣＭ化するために、ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌの該合成ペプチド１ｍｌに、ｐＨ９に調整した０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２時間放置した。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更に１２時間放置した。
【００４１】
また、対照として、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法で合成ペプチドを処理した。
【００４２】
上記の各処理後の合成ペプチドのＣＭ化率を、未反応アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸（以下、ＴＮＢＳと略す）を用いて次のような方法により測定して求めた。
【００４３】
即ち、前記各試料０．５ｍｌを０．１Ｍの四ほう酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌに各々加えた。次いで、再結晶化し、希塩酸で洗浄した１．１ＭのＴＮＢＳを２０μｌ加え、攪拌した。３０分後に１．５ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定したところ、ＣＭ化合成ペプチドの吸光度は０．０３であり、グリオキシル酸処理をしていない合成ペプチド（対照）の吸光度は１．２５であった。上記のいずれの合成ペプチドも含まない系で同様の測定を行ったところ、吸光度は０．０３であったので、ＣＭ化合成ペプチドのＣＭ化率は１００％であることが解った。
【００４４】
（２）  ＣＭ化ペプチドとウシ血清アルブミンとのカップリング
上記作成したＣＭ化ペプチドを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（シグマ社製）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（和光純薬工業社製）を使用して、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す。）とカップリングさせた。即ち、すべての原料を氷上で冷却した後、１０ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２２８μｌを、上記作成した２．４ｍｇ／ｍｌのＣＭ化ペプチド水溶液５００μｌに加え、混合した。次いで、２０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣＩ水溶液を１．５ｍｌ加え、すばやく攪拌し、氷上で１５分間反応させた。次いで、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液を１１６０μｌ加えて攪拌し、４℃で一晩放置した。更に、分画分子量が約１０，０００の透析膜（和光純薬工業社製）にて、カップリングしていないＣＭ化ペプチドを除去した。対照として、ＣＭ化ペプチドとＢＳＡのコンジュゲートの１０倍量となるように、Ｎ末端をＢｏｃ基で保護した合成ペプチド（Ｂｏｃ−バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸−グルタミン酸）を上記と同様の方法でＢＳＡとカップリングさせた。
【００４５】
（３）  ＣＭ化ペプチドに対する抗体の作成
体重が２ｋｇ以上のウサギに、上記作成したＣＭ化ペプチドとＢＳＡのコンジュゲートを抗原として以下の要領で免疫した。
【００４６】
２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原溶液０．５ｍｌに、フロイントの完全アジュバント０．５ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌにフロイントの不完全アジュバント０．２５ｍｌを加えたものを追加免疫した。この間、ＣＭ化ペプチドに対する抗体が産生されたか否かを確認するために、２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血した。６週間後、ＣＭ化ペプチドに対する抗体が産生されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で確認し、全採血した。
【００４７】
（４）  アフィニティ精製カラムの作成
５ｍｌのアフィゲル１５（バイオラッド社製）を１５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、５ｍｇ／ｍｌの上記Ｂｏｃ化ペプチドとウシ血清アルブミンのコンジュゲート溶液を１１．６ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。次いで、未反応のＢｏｃ化ペプチドとＢＳＡのコンジュゲートを濾過にて除去し、１Ｍのエタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに攪拌し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングした。該Ｂｏｃ化ペプチドとウシ血清アルブミンのコンジュゲートを固定化した支持体をカラムに詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水で洗浄した。更に、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。
【００４８】
（５）  ＣＭ化ペプチドに対する抗体のアフィニティ精製
作成したＣＭ化ペプチドに対する抗体を１ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したものを、１００ｍｇ程度になるように上記アフィニティ精製カラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０になるまで前記リン酸緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。カラムに結合しなかった抗体をＣＭ化ペプチドに対する抗体として回収した。２８０ｎｍの吸光度が０になったところでリン酸緩衝液から０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラムに結合している抗体を溶離させ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収した。この操作を、更に１回繰り返し、ビオチン標識用の抗体に供された。
【００４９】
（６）  ＣＭ化ペプチドに対する抗体のビオチン標識
精製した抗体のビオチン標識はプロテインビオチレーションシステム（ギブコ社製）を用いて行った。
【００５０】
精製したＣＭ化ペプチドに対する抗体を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈または濃縮した溶液に、０．０５Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに、説明書に従って作成した５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、０．１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液を脱塩した。更に、キット付属のＡｖｉｄｉｎ／ＨＡＢＡで導入されたビオチンのモル数を計算したところ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体１モルに対してビオチンは１４モル結合していた。
【００５１】
（７）  ＣＭ化ペプチドに対する抗体の抗原特異性
ＣＭ化ペプチドに対する抗体の抗原特異性は競合法ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００５２】
１μｇ／ｍｌとなるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略す）で希釈したＣＭ化ペプチドに対する抗体に、作成したＣＭ化ペプチドとＢＳＡのコンジュゲート（以下、ＣＭ−ＢＳＡと略す）をそれぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ−ＢＳＡで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５３】
ＣＭ化ペプチドの調製と同様の方法で、ヘモグロビン（シグマ社製）より作成したＣＭ化ヘモグロビンを調製した。該ＣＭ化ヘモグロビンを１μｇ／ｍｌのＣＭ化ペプチドに対する抗体溶液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液として使用した。
【００５４】
競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成したＣＭ−ＢＳＡを１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ−ＢＳＡ溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、該ＣＭ−ＢＳＡをイムノプレートに固定した。１時間後、イムノプレートに結合していないＣＭ−ＢＳＡを除去し、０．５％のゼラチンを含むＰＢＳを１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、ＣＭ−ＢＳＡが結合していない部分をブロッキングした。１時間後、該ゼラチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、上記濃度のＣＭ−ＢＳＡで阻害された抗体溶液、又は上記濃度のＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼで標識された抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。更に、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質キット（バイオラッド社製）を用いて能書に従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライした。室温で５分間放置した後、０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ加え、アルカリホスファターゼの反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。この結果から、作成したＣＭ化ペプチドに対する抗体は、ＣＭ化ペプチドのみならず、ＣＭ化ヘモグロビンでもＣＭ−ＢＳＡとＣＭ化ペプチドに対する抗体の抗原抗体反応が阻害されたことから、ＣＭ化ヘモグロビンとも反応性を示すことが示唆された。
【００５５】
（８）  糖尿病患者由来血液中のＣＭ化ヘモグロビンの測定
合併症を発症していない糖尿病患者８人よりＥＤＴＡ−２Ｋを含む真空採血管にて採血した血液５０μｌを、２５０μｌの生理食塩水で１回洗浄した後、１ｍｌの精製水を加え溶血させたものを被検体とした。該患者の平均年齢は６２．１歳であった。
【００５６】
被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定はドットブロッティング法にて行った。ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン法にて測定した後、該ヘモグロビンが５００ｎｇとなるようにドットブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いてＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に吸着させた。該膜を１０％のスキムミルクを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で１時間浸せきし、該膜を取り出し、前記ビオチン標識した１μｇ／ｍｌのＣＭ化ペプチドに対する抗体溶液を５ｍｌ加えた。室温で１時間のインキュベーションの後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した。次いで、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチン複合体溶液（ベクタステインＡＢＣキット：フナコシ社製）を５ｍｌ加え、室温で１時間のインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜における発光強度の検出は、バイオラッドＧＳ−３６３モレキュラーイメージャーを用いて行った。
【００５７】
対照として市販のヘモグロビン（シグマ社製）を被検体として上記と同様の方法にてＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。該市販ヘモグロビンの発光強度を１００として、上記糖尿病患者由来のヘモグロビンの発光強度を表示した。また、発光強度の実測値も併せて表示した。測定結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
実施例２
実施例１で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病の他に腎症または網膜症を併発している糖尿病合併症患者７人から採取した血液を被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。該患者の平均年齢は６６．３歳であった。測定結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
比較例１
実施例１で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病ではない健常者１０人から採取した血液を被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を行った。該健常者の平均年齢は６０．５歳であった。測定結果を表３に示す。
【００６２】
健常者群と実施例１で測定した糖尿病患者群の発光強度を統計学的に比較（ｔ検定）したところ、危険率５％未満で、糖尿病患者群の発光強度と健常者群の発光強度の間には有意に違いがあった。このことは、糖尿病患者由来の血液には、健常者由来の血液よりも、有意にＮ末端がＣＭ化されたヘモグロビンが多いことを意味する。
【００６３】
また、健常者群と実施例２で測定した糖尿病合併症患者群の発光強度をｔ検定にて比較したところ、危険率５％未満で、糖尿病合併症患者群の発光強度と健常者群の発光強度の間に有意差があった。このことは、糖尿病合併症患者由来の血液には、健常者由来の血液よりも、有意にＮ末端がＣＭ化されたヘモグロビンが多いことを意味する。
【００６４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、作成したＣＭ化ペプチドに対する抗体の抗原特異性を競合法ＥＬＩＳＡにて調べた結果で、縦軸が４０５ｎｍの吸光度、横軸が各阻害剤の添加量である。
但し、図中のＰｅｐｔｉｄｅ−ＢＳＡは、Ｎ末端がＢｏｃ基で保護された合成ペプチドとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のコンジュゲートを表す。また、ＣＭ−ＢＳＡは、Ｎ末端がカルボキシメチル化された合成ペプチドとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のコンジュゲートを表す。
【図１】
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