(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液親和性表面であって、該表面が、材料として、人工的及び／又は天然の有機及び／又は無機の化合物及び／又はこれらの混合物及び／又は血液及び／又は他の体液と観血法において接触をもつ材料及び／又は動物器官及び／又は器官の一部を含み、かつ、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層の複数の成分が、前記材料の表面の上に及び／又は中に適用され及び／又は組込まれることを特徴とする、血液親和性表面。
【請求項２】
非血栓性及び／又は非免疫原性である、請求項１に記載の血液親和性表面。
【請求項３】
前記複数の成分が、グリコホリンを含む、請求項１又は２に記載の血液親和性表面。
【請求項４】
前記複数の成分が、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層からの、糖タンパク質、糖脂質及び／又はプロテオグリカンのオリゴ糖、多糖及び／又は脂質を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の血液親和性表面。
【請求項５】
前記複数の成分が、スフィンゴ糖脂質を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の血液親和性表面。
【請求項６】
前記複数の成分が、プロテオグリカンヒアルロン酸のオリゴ糖及び／又は多糖タンパク質として、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はこれらの混合物を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の血液親和性表面。
【請求項７】
前記複数の成分が、動物及び／又はヒト起源の赤血球血漿膜のヘパラン硫酸を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の血液親和性表面。
【請求項８】
材料として、高分子有機化合物及び／又は金属、金属酸化物、合金、セラミック、ガラス、無機物及び／又はこれら材料の混合物を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の血液親和性表面。
【請求項９】
ａ）糖タンパク質、糖脂質及び／又はプロテオグリカンのグリコホリン及び／又はオリゴ糖、多糖及び／又は脂質タンパク質を含む複数の成分を、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層から単離する工程、及び
ｂ）前記複数の成分を、人工的及び／又は天然の有機及び／又は無機の化合物及び／又はこれらの混合物及び／又は血液及び／又は他の体液と観血法において接触をもつ材料及び／又は動物器官及び／又は器官の一部の材料の表面上及び／又は中に、物理的又は化学的結合によって適用し及び／又は組込む工程、
を特徴とする、血液親和性表面の生産方法。
【請求項１０】
前記複数の成分が、ヒト又は動物起源の全血液及び／又はそこから得られる細胞画分から単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の成分が、赤血球、白血球及び／又は血小板及び／又はこれらの混合物から単離される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の成分が、網、腹膜及び／又は内側器官から単離される、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
化学的固定化、光不活性化、接着、乾燥法又はこれらの組合せが、材料の表面の上に及び／又は中に前記複数の成分を適用及び／又は組込むために行われる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液親和性（ｈｅｍｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）表面であって、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層の成分を、材料の表面上に及び／又は中に、適用し及び／又は取り込むことを特徴とするものに関する。本発明は、さらに、血液親和性表面の製造方法、及びそれらの健康の広い分野、医薬、歯科、外科、化粧品において及び／又は血液、組織及び／又は他の体液と直接接触する分野における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脊椎動物の場合、血液凝固は、怪我をしたときにおける血液の重大な減少に対して一時的に保護する複雑なプロセスである。血液凝固システムは、中でも、非生理的な、即ち、この場合は「外来の」物質と接触することによって活性化される。血液凝固システムを積極的に抑制する物質は、抗血栓形成として言及される。血液凝固システムをまったく活性化しない物質は、非血栓形成として定義される。
特に観血法（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の場合、血液凝固システムの活性化は、患者に重大な問題である。これは、特に、移植に依存している人の場合、例えば、冠状管内ステント、心臓弁、補綴装具、人工血管システム、透析器、又は酸素処理器（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）、カテーテル、バイオセンサー等に依存している人の場合である。外科縫合材料と接触することも、問題を引き起こす。
【０００３】
これまで、血管の重大な閉塞の形成（血栓）を防止するために、血液凝固システムは、不活性化又は積極的に制限されてきた。これは、通常、抗血栓形成薬、いわゆる抗凝血剤の投与によって行われてきたが、これは、患者に対して多くの重大な副作用、例えば、血小板減少症、吐き気、嘔吐、脱毛症、出血性皮膚壊疽、出血の高傾向性等を有する。さらに、冠状管内ステント又は心臓弁を使用する場合、血液凝固の完全な薬物抑制でさえも、しばしば血栓症の形成を充分に抑制せず、死を引き起こし得る。
従って、健康の広い分野において、医薬、歯科、外科、化粧品で、又は一般に、観血法において血液及び／又は他の体液と接触する分野において、抗凝血剤によって引き起こされる上記重大な副作用を回避することが非常に重要である。
先行技術において、異なる材料でコーティングすることにより、非生理的な「外来表面」をより血液適合性（血液親和性）又は組織適合性にすることを目的とする、種々の方法が知られている。
【０００４】
例えば、ＤＥ ２８３１３６０は、医学装置の表面をこの凝血システムを積極的に抑制する物質（ヘパリン）、すなわち、抗血栓形成性の材料でコーティングする方法を記載する。しかしながら、この物質は、例示としてすでに述べた患者に対する重大な副作用の欠点がある。
ＤＥ ４４３５６５３において、材料は、ポリマーのラッカーの薄いコートでコーティングされ、そこに医薬を付加的に混合することができ、該ラッカーのコートは、体内で持続的に分解し、放出される。この方法の欠点は、第１に、コーティングの持続的分解が時間的に制限された効果しか達成できないことにある。第２に、ラッカー粒子の持続的な分離のために、血栓症の形成の高い危険性が存在することであり、これは、塞栓症を引き起こし得る。
ＤＥ １９６３０８７９は、コーティング物質のための多糖類の化学的に変性した誘導体を独占的に使用する。ヘパリンのような市販の抗血栓形成性物質と比べた場合、多くの段階、広い範囲にわたる所望でない副反応及び乏しい搾取作用（ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ）を含む合成工程に対する余剰準備支出から、すべての観点における誘導体の悪い特性までに及ぶ、この方法に関する種々の欠点が存在する。
【０００５】
Ｖｅｒｈａｇｅｎら（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９６， ９５：５４２−５４９頁）は、内皮又は中皮の完全生細胞を移植のコロニー形成に使用することを記載する。完全細胞（ｅｎｔｉｒｅ ｃｅｌｌ）を使用することの欠点は、特定細胞の表面タンパク質のために、免疫反応が起こり、患者に対するコーティングされた移植の拒絶反応を引き起こすことにある。このような免疫反応を示す物質は、免疫原性と呼ばれる。免疫反応による拒絶を防止するために、患者自身の内輪の（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）細胞材料が必要である。これは、かなりの時間とコストが、これらの細胞の培養に必要となるため、さらに欠点となる。完全細胞を使用することに関する更なる問題は、これらの細胞が血液流で受ける高い剪断力である。これにより、表面において細胞の分解が増加し、これは、コーティングされた移植片の持続性に悪影響となる。
同様に、ＷＯ ９３／０１８４３、ＷＯ ９５／２９７１２及びＤＥ １９５０５０７０は、生理的材料用の完全生内皮細胞の使用または人工材料における生内皮細胞の成長に寄与する物質の使用を記載する。しかしこの場合、全工程は、生内皮細胞の培養に基づくものであり、これは、時間的要求及び含まれるコスト、またはコーティングされた材料が汎用に使用できず、すべての患者に対して別々に生産されなければならないといった上記欠点を含む。
【０００６】
ＤＥ ３６３９５６１の特許明細書から、特定の内皮細胞表面プロテオ多糖ＨＳ−Ｉでコーティングされた物質の生産が知られている。この方法の欠点は、この場合も、かなりの量の患者自身の内皮細胞がこれらの成分を単離するために必要であるということである。これは、すべての患者に、時間を浪費しかつコストのかかる自己の内在性の内皮細胞の培養を要求し、加えて、プロテオ多糖ＨＳ−Ｉのコストのかかる調製が続く。従って、ＨＳ−Ｉの大量生産及びそれに従う移植片のコーティング方法の経済的使用が実現できない。
従って、本発明の目的は、上記欠点を示さず、同時に、大量生産に適した血液適合性（血液親和性）または組織適合性表面を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明に従い、この目的は、材料として、人工的及び／又は天然の有機及び／又は無機の化合物及び／又はこれらの混合物及び／又は血液及び／又は他の体液と観血法において接触をもつ材料及び／又は動物器官及び／又は器官の一部を含み、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層の成分が、この材料の表面の上に及び／又は中に適用され及び／又は組込まれることを特徴とする、血液親和性表面によって解決される。
従って、本発明の血液親和性表面は、血液及び／又は中皮細胞の外側表面を実質的に模倣し、これは、非血栓形成性細胞及び／又は組織の天然表面の模倣と同義である。従って、血液凝固システムは、血液親和性表面によって活性化も積極的抑制もされない。従って、例えば、二次的傷害（切り傷等）によって引き起こされる血液凝固は、完全に自然かつ平静な方法で起こり得る。
本発明の更なる利点は、血小板のような細胞の接着が本発明の血液親和性表面上に生じないことにある。これは、本発明にとって望ましい。血栓の形成のリスク、即ち、治療されるべき患者に対する血栓症（塞栓症）の危険性がこれによって少なくなるからである。本発明の血液親和性表面は、副作用を引き起こさない。
【０００８】
本発明に従い、血液親和性表面は、長期間非血栓形成性であることをさらに特徴とする。このことは、この有利な特性が、時が経っても使い果たされることがないことを意味し、これは、例えば、医薬的に活性なシステム（例えば、放出システム）である。この理由から、本発明の表面は、持続的な使用にも好適であり、そのため、移植片を再生するために繰り返される観血法による、患者に対する付加的な負担及びリスクが少なくなる。
本発明に従い、血液親和性表面は、材料として、人工的及び／又は天然の有機及び／又は無機の化合物及び／又はこれらの混合物及び／又は血液及び／又は他の体液と観血法において接触をもつ材料及び／又は動物器官及び／又は器官の一部を含み、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層の成分が、その表面の上に及び／又は中に適用され及び／又は組込まれる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の意味において、材料は、本発明において、細胞成分に詰め込まれる（ｌｏａｄ）のに適したすべての材料をいう。観血法の間に血液及び／又は体液と接触し得るか、又はそれぞれの手術後のケアと結びつき得るすべての材料も含まれる。
有機化合物は、例えば、合成的に生産するか又は天然に存在する高分子の物質及びその誘導体をいう。例えば、中でも、各種プラスチック、エラストマー、シリコーン又は繊維状物質がある。例えば、これらは、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリアミド（ＰＡ）、フェノール樹脂（ＰＦ）、アミノプラスト、ポリスチレン、ポリエステル、樹脂、シリコーン、ゴム、人工繊維、セルロース繊維、セルロース膜、タンパク質繊維、コラーゲン、及びこれらの誘導体又はこれらの組合せが含まれる。本発明には、さらにこれらポリマーの混合物、いわゆるポリマーブレンドが含まれる。
【００１０】
本発明の特定の態様において、材料として、本発明の血液親和性表面は、動物の器官、器官の一部又は血管のシステムを含み得る。例えば、これらは、心臓弁及び／又は血管システムであり得、ブタ又はウシが出所として特に好ましい。
本発明の血液親和性表面に含まれる無機化合物に対する例は、金属、金属酸化物、合金又はセラミック、ガラス及び／又は無機物（ｍｉｎｅｒａｌ）並びにこれらの誘導体又は考え得るすべての組み合わせ及び／又はこれらの混合物である。本発明により、すべての可能性ある材料の組み合わせが可能である。実施例は、本発明をより詳細に説明するが、これらに限定されることを意図するものではない。
【００１１】
本発明により、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層の成分は、材料の表面の中に及び／又は上に組込まれ及び／又は適用される。
本発明の一の態様において、血液親和性表面は、材料の表面中及び／又は上に糖タンパク質、好ましくは、グリコホリンを含む。このグリコホリンは、なかでも、非血栓形成性の特性によって特徴付けられるので、本発明の血液親和性表面を作るのに非常に好適である。
赤血球の外層のグリコホリンは、なかでも、人間が属する血液型を決定する。異なる血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ及びＯに類似して、対応する赤血球は、グリコホリンＡ、グリコホリンＢまたはグリコホリンＯ又はこれらそれぞれの混合物を含む。
互いに適合性がない血液型の交差反応による可能性ある免疫学的応答、即ち、血液の凝固（凝血）は、治療される患者の血液型、及び明細書に意図された本発明の血液親和性表面の材料の表面の上に及び／又は中に適用され及び／又は組込まれるグリコホリンに関するマッチングによる単純な方法で回避し得る。ここで、このマッチングは、観血法の前に行われる。各血液テストは、研究室で一般的なプラクティスであるので、日常的に行われる。血液型の適合性が明白であることを条件に、グリコホリンを含む血液親和性表面も汎用的に使用され得る。即ち、これは、一人の患者だけに限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、更に、血液親和性表面であって、材料の表面上及び／又は中に、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層からの、糖タンパク質、糖脂質及び／又はプロテオグリカンのオリゴ糖、多糖及び／又は脂質の部分を含むものに関する。
本発明の更なる態様において、血液親和性表面は、材料の表面上及び／又は中にスフィンゴ糖脂質を含む。
本発明の血液親和性表面は、さらに、プロテオグリカンヒアルロン酸のオリゴ糖又は多糖タンパク質として、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はこれらの混合物を含み得る。本発明の好ましい態様として、血液親和性表面は、動物及び／又はヒト起源の赤血球血漿膜のヘパラン硫酸を含む。
本発明の血液親和性表面は、例えば、化学的又は医薬的活性コーティングによって引き起こされる副作用を示さない。
【００１３】
上記血液及び／又は中皮細胞の成分は、非免疫原性細胞成分である。従って、本発明の血液適合性表面も、同様に非免疫原性であることを特徴とする。これは、これらが患者に対して免疫反応を引き起こさないことを意味し、血液親和性表面の拒絶の危険性を最小にするものである。
本発明によれば、血液適合性表面は、非血栓形成性及び／又は非免疫原性である。
更なる利点は、血液親和性表面では、本発明の材料の上の、血液及び／又は中皮細胞の外層の非血栓形成性成分の固い付着物のために、分解がほとんど起こらないことにある。従って、血栓症による塞栓症の形成の危険性は小さくなる。さらに、本発明の血液親和性表面上での血小板のような細胞の蓄積はない。これも血栓症の危険性を小さくする。
【００１４】
本発明の主題は、さらに本発明の血液適合性表面の生産方法を含む。ここで、血液細胞及び／又は中皮細胞の外層から、糖タンパク質、糖脂質及び／又はプロテオグリカンのグリコホリン、オリゴ糖、多糖及び／又は脂質の部分が単離され、及びこれら細胞成分が人工的及び／又は天然の有機及び／又は無機の化合物及び／又はこれらの混合物及び／又は血液及び／又は他の体液と観血法において接触をもつ材料及び／又は動物器官及び／又は器官の一部の材料の表面上及び／又は中に、物理的又は化学的結合によって適用され及び／又は組込まれる。
本発明により、血液細胞の外層の成分は、ヒト又は動物起源の全血液及び／又はそこから得られた細胞画分から単離される。これは、細胞成分が、赤血球、白血球及び／又は血小板又はこれらの混合物から単離されることを意味する。好ましくは、赤血球と白血球の混合物である。特に好ましくは、赤血球である。
中皮細胞の外層の成分は、本発明によれば、網、腹膜及び／又は内側器官から単離される。
これらの出発材料の安価で容易に入手可能な出所は、例えば、屠殺場からの廃棄物であり得る。
【００１５】
血液細胞、中皮細胞の外層の成分又は中皮細胞における組織リッチな成分の単離は、この場合、一般的方法によって行われる。例えば、以下の方法又は組み合わせがあり得る：粉砕、抽出、濾過、沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、酵素又は化学分解、乾燥、溶解、透析、限外濾過等。
本発明によれば、材料の表面の上に及び／又は中に細胞成分を適用及び／又は組込むために、化学的固定化、光不活性化、接着、乾燥法又はこれらの組合せが行われる。共有結合、イオン、副原子価又は静電気又は接着結合又はこれらの組合せは、この場合、細胞の外層の成分及び材料の表面の間に形成され得る。好ましくは、外側細胞層の成分の材料の表面の上／中への適用又は組み込みは、共有結合によって行われる。
【００１６】
本発明の特別な利点は、本発明の生産方法が、これまで知られている方法と比べて非常に大きな経済的利点を兼ね備えているため、本発明の血液適合性表面が大量生産に好適であることである。
この理由は、例えば、本発明によると、細胞成分及び生きていない細胞が使用され、患者の内在性の（内皮の）細胞を使用する必要がなく、この細胞成分の単離のための出発材料は、安価で大量に入手可能（屠殺場からの廃棄物）であり、そのため、非常に時間を浪費し及びコストのかかる細胞培養が必要なくなるためである。本発明の血液適合性表面の更なる利点は、汎用的に使用され、及び一人の患者だけのための使用に限定されないことにある。特に、緊急手術の場合、この利点は患者の生命に重要である。
【００１７】
本発明が使用され得る適用分野は広域にわたる。本発明は、健康、医薬、歯科、外科又は化粧品及び／又は観血法の間の血液、組織及び／又は他の体液と接触する広範な分野における、血液適合性表面の使用に関する。
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に記載するが、これは限定することを意図するものではない。
【００１８】
【実施例】
１）赤血球血漿膜へパラン硫酸
血清のない洗浄した赤血球１リットルを、１リットルの０．１５４モルリン酸緩衝液ｐＨ７に懸濁し、１Ｕ／ｍｌパパインを加えた。２時間５６℃での培養後、３０００ｇで２０分間遠心分離し、次いで、上澄みをデカンテーションした。この上澄みに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂイオン交換ゲル１００ｍｌを懸濁した。この方法で詰め込んだゲルを０．１モル塩水で３回洗浄し、クロマトグラフカラムに充填した。溶出は、０．１〜０．８モル／リットルの範囲の直線状塩化ナトリウム勾配を２リットルの全溶出容積にわたって用いることによって行った。１０ｍｌずつの容積の２００の画分を集めた。Ｆｌｕｋａ社のジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）を用い、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒらによって述べられた方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６１ （１９８７年）：１３０−１０８）に従って、陽性の着色反応を示す画分を一緒にした（ｕｎｉｔｅ）。集められた画分の溶液は、２６．７ｈＰａ（２０Ｔｏｒｒ）及び４０℃で圧縮し、水に対して透析した。透析は、１００ｍｌの容積、及び酢酸ナトリウム０．０３モル／リットル、トリス（Ｆｌｕｋａ社のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）０．０７３モル／リットルの濃度、及びｐＨ８．０にセットし、１Ｕのコンドロイチン分解酵素ＡＢＣを加え、及びインキュベーションを３７℃で１５時間行った。水に対する透析及び水ジェット吸引下で圧縮した後、得られた溶液を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂの１００ｍｌを用いたカラムに再度適用し、前述したように溶出した。ＤＭＭＢ陽性勾配画分を透析し、水ジェット吸引下で１ｍｌの容積まで圧縮し、分離用ゲル濾過用のカラム（６０ｃｍ×２ｃｍ）で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてクロマトグラフにかけた。各２ｍｌの容積の６０画分を集め、ＤＭＭＢで検出し、陽性画分を一緒にした。透析と凍結乾燥を繰り返した後、精製した赤血球血漿膜ヘパラン硫酸を得た。
【００１９】
２）血球表面プロテオ−コンドロイチン硫酸の分離：
クエン酸血液１リットルを１０分間、スウィングアウトローターを備えた遠心分離機で３０００ｇ遠心分離し、上澄み血漿を抜いた。細胞沈降物を４℃に冷却した２リットルの１％酸化アンモニウム溶液と混合し、同じ温度で３０分間インキュベートした。５００ｇで５分間遠心分離した後、赤色の上澄みを廃棄し、ペレットを４℃に冷却した１％酸化アンモニウム溶液２リットルに懸濁し、５分間５００ｇで遠心分離し、上記洗浄工程をさらに２回繰り返した。現在無色の上澄みを廃棄し、洗浄した細胞沈降物（収率：２リットルのトリトンＸ−１００緩衝液（０．５％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ 三重ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中、１２×１０７−１０×１０９細胞）を２時間２５℃、一定撹拌下で溶解した。界面活性剤抽出物を６０分間１００００ｇで遠心分離し、デカンテーションし、上澄みに、Ｐａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０イオン交換ゲル１０ｍｌを懸濁し、沈降した。この方法で詰め込んだゲルを０．１モル塩水で３回洗浄し、クロマトグラフカラムに充填した。カラムの溶出は、０．１〜０．８モル／リットルの範囲の直線状塩化ナトリウム勾配を２リットルの全溶出容積にわたって用いることによって行った。２ｍｌずつの容積の１００の画分を集め、Ｆｌｕｋａ社のジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）を用い、陽性の着色反応を示す画分を一緒にした。この溶液は、２６．７ｈＰａ（２０Ｔｏｒｒ）及び４０℃で圧縮し、水に対して透析した。透析は、１００ｍｌの容積、及び酢酸カルシウム０．１ミリモル／リットル及び酢酸ナトリウム０．１モル／リットルの濃度にセットし、及び酢酸でｐＨ７に滴定し、へパリナーゼＩ、へパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩをそれぞれ１Ｕ添加し、インキュベーションを３７℃で１５時間行った。
水に対する透析及び水ジェット吸引下で圧縮した後、得られた溶液を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０の１０ｍｌを用いたカラム上に再度適用し、前述したように溶出した。ＤＭＭＢ陽性勾配画分を透析し、水ジェット吸引下で１ｍｌの容積まで圧縮し、分離用ゲル濾過用のカラム（６０ｃｍ×２ｃｍ）で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＩ−４Ｂゲルを用いてクロマトグラフにかけた。各２ｍｌの容積の６０画分を集め、ＤＭＭＢで検出し、陽性画分を一緒にした。透析と凍結乾燥を繰り返した後、清浄した白血球表面プロテオ−コンドロイチン硫酸を得た。
【００２０】
３）ヘパラン硫酸／コンドロイチン硫酸混合物の網からの単離
新鮮なウシの網１ｋｇを０．９％ ＮａＣｌ溶液で洗浄し、フリーズドライし、粉砕し、及び１リットルのアセトンで、一晩室温で攪拌することによって脱脂した。濾過及び乾燥後、得られた粉末を６モル尿素溶液中で懸濁し、一晩室温で撹拌した。３０００ｇで１時間遠心分離した後、粘膜の上澄みをデカンテーションし、４℃に冷却し、同容積の４℃の１モルＮａＯＨと混合し、及び１５時間４℃でインキュベーションした。次いで、希ＨＣｌで中和し、水に対して透析し、１時間３０００ｇで遠心分離を行い、上澄みをデカンテーションした。上澄みに、Ｐａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂイオン交換ゲル１００ｍｌを懸濁し、沈降した。この方法で詰め込んだゲルを０．１モル塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、クロマトグラフカラムに充填した。カラムの溶出は、０．１〜０．８モル／リットルの範囲の直線状塩化ナトリウム勾配を２リットルの全溶出容積にわたって用いることによって行った。１０ｍｌずつの容積の２００の画分を集め、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）を用いて陽性の着色反応を示す画分を一緒にした。この溶液は、２６．７ｈＰａ（２０Ｔｏｒｒ）及び４０℃で圧縮し、水に対して透析した。水ジェット吸引下、圧縮を５ｍｌの容積まで再度行い、分離用ゲル濾過用のカラム（６０ｃｍ×５ｃｍ）で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲルを用いてクロマトグラフにかけた。各１０ｍｌの容積の６０画分を集め、ＤＭＭＢで検出し、陽性画分を一緒にした。透析と凍結乾燥を繰り返した後、精製した中皮細胞表面グリコサミノグリカン混合物を得た。
【００２１】
４）中皮細胞表面コンドロイチン硫酸を中皮細胞における細胞リッチからの単離  新鮮なウシの腎臓１ｋｇを０．９％ ＮａＣｌ溶液で洗浄し、フリーズドライし、粉砕し、及び１リットルのアセトンで、一晩室温で攪拌することによって脱脂した。濾過及び乾燥後、得られた粉末を４モルの塩化グアニジウム溶液中で懸濁し、一晩室温で撹拌した。３０００ｇで１時間遠心分離した後、粘膜の上澄みをデカンテーションし、４℃に冷却し、同容積の４℃の１モルＮａＯＨと混合し、及び１５時間４℃でインキュベーションした。次いで、希ＨＣｌで中和し、水に対して透析し、１時間３０００ｇで遠心分離を行い、上澄みをデカンテーションした。上澄みに、Ｐａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ イオン交換ゲル１００ｍｌを懸濁し、沈降した。この方法で詰め込んだゲルを０．１モル塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、クロマトグラフカラムに充填した。カラムの溶出は、０．１〜０．８モル／リットルの範囲の直線状塩化ナトリウム勾配を２リットルの全溶出容積にわたって用いることによって行った。１０ｍｌずつの容積の２００の画分を集め、ＤＭＭＢで陽性の着色反応を示す画分を一緒にした。この溶液は、２６．７ｈＰａ（２０Ｔｏｒｒ）及び４０℃で圧縮し、水に対して透析した。透析は、１００ｍｌの容積、及び酢酸カルシウム０．１ミリモル／リットル及び酢酸ナトリウム０．１モル／リットルの濃度にセットし、酢酸でｐＨ７に滴定し、へパリナーゼＩ、へパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩをそれぞれ１Ｕ添加し、及びインキュベーションを３７℃で１５時間行った。
水に対する透析及び水ジェット吸引下で圧縮した後、得られた溶液を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌの１０ｍｌを用いたカラムに再度適用し、前述したように溶出した。ＤＭＭＢ陽性勾配画分を解析し、水ジェット吸引下で１ｍｌの容積まで圧縮し、分離用ゲル濾過用のカラム（６０ｃｍ×５ｃｍ）で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲルを用いてクロマトグラフにかけた。各１０ｍｌの容積の６０画分を集め、ＤＭＭＢで検出し、陽性画分を一緒にした。透析と凍結乾燥を繰り返した後、精製した赤血球血漿膜ハプテン硫酸を得た。
【００２２】
５）中皮細胞表面コンドロイチン硫酸と（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチルトシラート（ＣＭＥ−ＣＤＩ）の、機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）セルロース表面上への固定化：
１００ｍｇのセルロース膜を、３−アミノプロピル−トリエトキシシランの２％エタノール／水（５０：５０）溶液に加え、２４時間４５℃で攪拌した。次いで、膜を多量の水で洗浄し、乾燥した。この用法で膜を処理し、１ｍｇ中皮細胞表面コンドロイチン硫酸を８０ｍｌの０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ４．７５に入れた溶液中に浸した。６時間４℃にして、Ｓｉｇｍａ社の （Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−モルホリノエチル）カルボキシイミドメチルトシラート（ＣＭＥ−ＣＤＩ） ２００ｍｇを１０ｍｇの部分に加え、さらに一晩４℃で撹拌した。次いで、２時間４モルＮａＣｌ溶液中で撹拌し、多量の水で洗浄し、新鮮な空気中で乾燥した。
【００２３】
６）スフィンゴ糖脂質のガラス上でのＣＮＣｌ固定化：
ガラス、例えば、顕微鏡用のカバーガラスを６時間、クロモ硫酸（ｃｈｒｏｍｏｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）５ｍｌ中で撹拌した。次いで、多量の水で洗浄し、空気乾燥し、及び５０℃、ジオキサン１５ｍｌ中で加熱した。次いで、ジオキサン中、２モルのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン溶液２．５ｍｌを加え、３０分間撹拌した。次いで、ジオキサン中、１モルＣＮＣｌ溶液２．５ｍｌを添加し、更に２時間撹拌した。次いで、最初にジオキサンで、次いでジオキサン／水、最後に純粋で洗浄した。このようにして変化させたガラスをエチレンジアミンを１モル／リットルとＮａＨＣＯ３を０．１モル／リットルの溶液２０ｍｌに入れ、次いで５０℃に加熱し、７２時間この温度で撹拌した。次いで、ヒト赤血球のスフィンゴ糖脂質０．１ｍｇを０．１モルＮａＨＣＯ３２０ｍｌに溶解し、１１０時間６０℃で代わりのガラスと一緒に攪拌した。次いで、エタノールアミン２．５ｍｌを加え、更に３０分間撹拌した。コーティングしたガラスを４モルＮａＣｌ溶液で洗浄し、次いで多量の水で洗浄し、空気中で乾燥した。
【００２４】
７）赤血球血漿膜ヘパラン硫酸の、ニッケル、チタン、アルミニウム、又は類似の金属の酸化物層の上での固定化：
金属素材（ｗｏｒｋｐｉｅｃｅ）を４時間温水の超音波浴中で清浄し、アセトンで洗浄し、１時間、クロロホルムを使用するソックレー抽出器で脱脂した。この方法できれいになった素材を乾燥し、０．０１−０．１モルω−ヘキサデセニルトリクロロシランのビシクロヘキシル溶液中に、２−１５分撹拌しながら浸し、クロロホルムと水で２回洗浄し、ソックレー抽出器中でクロロホルムで１５分抽出した。素材を２ｍｌのアセトン及びＫＭｎＯ４１００ｍｇを水１８ｍｌに入れた溶液に４５分浸し、ＣＯ２流をそこに通した。次いで、１５秒間、亜硫酸ナトリウム２０％水溶液中に浸し、水で洗浄し、乾燥した。
素材を、パラトルイルスルホニルクロライド２９．２５ｇをアセトン９００ｍｌ及びピリジン１８０ｍｌに入れた溶液中で、４０℃で一晩攪拌した。次いで、素材を水及びメタノールで洗浄し、４０時間６０℃で１ミリモル／リットルジアミノドデカンをジメチルホルムアミド１リットルに入れた溶液中で撹拌した。次いで、素材を水、１モル／リットルソーダ溶液、１ミリモル／リットル塩化水素酸及び水で成功裡に洗浄した。このように準備した素材を、９０分間、ホウ酸塩緩衝溶液（テトラホウ酸ナトリウム０．０６５モル／リットル、ｐＨ９．５）中で撹拌した。最後に、一晩、４−アジド−１−フルオロ−２−ニトロベンゼン０．３ｇを１リットルのエタノールに入れた溶液に、３７℃で攪拌した。赤血球血漿膜へパラン硫酸の０．５ｇを、１リットルの０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸−（ＥＭＳ）−緩衝液ｐＨ４．７５中で溶解し、この素材を４℃で４８時間攪拌した。赤血球血漿膜へパラン硫酸を高圧水銀ランプによる１０分間の照明によって共有結合的に固定化した。４モルの生理食塩溶液で４０分洗浄した後、この素材を水洗し次いで乾燥した。
【００２５】
８）白血球血漿膜コンドロイチン硫酸のセルロース上への光化学的固定：
セルロース膜３ｇを４モルのＮａＯＨで２時間膨潤させ、水で３回、水／アセトンで１回、アセトンで１回洗浄した。この方法で活性化されたセルロースを、パラトルイルスルホニルクロライド２９．２５ｇをアセトン９００ｍｌ及びピリジン１８０ｍｌに入れた溶液中で、４０℃で一晩攪拌した。次いで、セルロース膜を水及びメタノールで洗浄した。得られたエステル化セルロース膜を、４０時間６０℃で１ミリモル／リットルジアミノドデカンをジメチルホルムアミド１リットルに入れた溶液中で撹拌した。次いで、膜を水、１モル／リットルソーダ溶液、１ミリモル／リットル塩化水素酸及び水で成功裡に洗浄した。このようにして得られたアミノセルロースを、９０分間、ホウ酸緩衝溶液（テトラホウ酸ナトリウム０．０６５モル／リットル、ｐＨ９．５）中で撹拌した。最後に、膜を４−アジド−１−フルオロ−２−ニトロベンゼン０．３ｇを１リットルのエタノールに入れた溶液中で一晩、３７℃で攪拌した。白血球表面コンドロイチン硫酸の０．５ｇを、１リットルの０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ４．７５中で溶解し、上記のごとく調製されたアジドセルロース２．５ｇを４℃で４８時間攪拌した。白血球表面コンドロイチン硫酸を高圧水銀ランプによる１０分間の照明によって共有結合的に固定化した。４モルの生理食塩溶液で４０分及び水で洗浄した後、セルロース膜を乾燥した。
【００２６】
９）グリコホリンＡとグルタルジアルデヒドのシリコーン上への固定化：
シリコーンフィルム１ｇに対し、２０ｍｌの水及び２ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシランを加え、ｐＨ値を３．５にセットした。次いで、２時間７５℃に加熱し、水洗し、乾燥した。得られたアミノ基含有シリコーンに対し、グルタルジアルデヒドを０．０５モルリン酸ナトリウム緩衝液に入れた２．５％溶液を加え、ｐＨ７にセットした。６０分間室温で攪拌した後、このようにして調製した活性化したシリコーンをグリコホリンＡ（Ｓｉｇｍａ）の０．１％溶液と共に、２〜４時間撹拌して反応させ、水洗した。
【００２７】
１０）赤血球血漿膜ヘパラン硫酸のポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）上への固定化：
硫酸イオン（ＩＩ） ０．５ｇ、濃硫酸１００μｌ及びメタクリル酸２ｍｌを水２５０ｍｌに溶解した。二硫酸ナトリウム１２５ｍｇ及びペルオキソ二硫酸カリウム１２５ｍｇをこの溶液に加えた。次いで、この溶液を２時間室温で、長さ１ｍ、内径３ｍｍのリング状ＰＶＣチューブを通してポンプでひいた。行われているグラフト重合は、ヒドロキノンを１００ｍｇ加えることによって停止した。次いで、チューブを入念に水洗した。４℃に冷やした、ＣＭＥ−ＣＤＩ（（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチルトシラート）２５０ｍｇを２５０ｍｌの０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ４．７５に入れた溶液を、４℃で３０分間、このチューブを通してポンプで循環した。この方法で活性化されたチューブを、０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ４．７５で洗浄した。
次いで、１ｍｇの赤血球血漿膜へパラン硫酸を０．１モル２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液ｐＨ４．７５に入れた溶液を、４℃で１５時間、このチューブを通してポンプで循環した。
最後に、チューブを４モル生理食塩溶液、次いで水で洗浄した。