(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素及びアミン化合物を作用させ、次いで該酵素反応によって生成するアルデヒド化合物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させて、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することによって塩素イオン量を決定することを特徴とする塩素イオンの定量方法。
【請求項２】
被検体が尿である請求項１記載の塩素イオンの定量方法。
【請求項３】
モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物とが互いに共存しないように分包された二つの試薬から構成されていることを特徴とする塩素イオン定量試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は被検体中の塩素イオンの新規な定量方法に関するものであり、例えば、体液中の塩素イオンの定量といった臨床検査などの医療の分野で広く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
体液中の塩素イオンは、水の平衡、酸塩基平衡、そして、浸透圧の調整などに関与する重要なイオンである。従来、体液中の塩素イオンの測定は、比色法、電量滴定法、電極法などにより行われてきた。
【０００３】
比色法は、塩素イオンとチオシアン第二水銀を反応させ、遊離したチオシアンイオンを第二鉄イオンで発色させて比色定量するものであるが、試薬中に毒性の強い水銀やシアンが含有されているという欠点があった。
【０００４】
電量滴定法は、電解液中で銀電極に一定の電流を流し、遊離した銀イオンと塩素イオンを反応させ塩化銀として沈殿させ、すべての塩素イオンが消費されると銀イオンが急速に増加し、この瞬間を指示電極でとらえて終点とし、これに要した時間から塩素イオンを定量するものであるが、専用の装置が必要で、試料の分析処理効率が悪いなどの欠点があった。
【０００５】
電極法は、イオン選択電極を利用して塩素イオンを定量するものであるが、専用の装置が必要であり、また、塩素イオンだけでなく、他のハロゲンイオンにも応答してしまうというイオン特異性の問題がある。
【０００６】
さらに、これらの様々な問題点を解決する方法として、アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量法がクリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３４巻、５５２頁（１９８８年）に報告された。しかし、この方法は確かに専用装置を必要とせず、広く一般に使用されている分光光度計を利用でき、また、試薬中に有害物質を含有していないという利点を有するが、一方、測定範囲が狭く、試薬の安定性が悪いという欠点を有している。
我々は、モノアミン酸化酵素を利用した酵素法による塩素イオンの定量法と定量試薬を提案した（特願平５−２７０４５７）。この方法は、モノアミン酸化酵素が塩素イオンによって阻害を受け、また、その阻害の程度が塩素イオン濃度に比例するという性質を利用して塩素イオンを決定する方法であり、具体的には、塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素とアミン化合物とを作用させ、生じた酵素反応生成物を定量することによって実施される。反応生成物として、アンモニア、過酸化水素、アルデヒド化合物が挙げられるが、アンモニアを反応生成物として定量する方法は、アンモニアが被検体中にも存在しているため、好ましくない。過酸化水素を反応生成物として定量する方法は、過酸化水素をペルオキシダーゼを利用して定量するもので、モル吸光係数の高い色素を生成させることができ、その結果、高感度に定量できる方法である。この方法では、血清を定量した場合、正確に塩素イオン濃度を定量することができたが、尿を定量する場合、尿中の何らかの還元性物質によりペルオキシダーゼが阻害を受け、正確に塩素イオン濃度を定量できない尿検体が出現するという問題が生じた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特別な装置の使用及び特別な廃液処理の必要がなく、分析処理効率、定量性及び試薬の安定性に優れた測定範囲の広い、尿検体も正確に定量できる塩素イオンの定量方法の開発を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、モノアミン酸化酵素が塩素イオンによって阻害を受け、また、その阻害の程度が塩素イオン濃度に比例し、モノアミン酸化酵素の触媒する反応の結果生成するアルデヒド化合物を定量することで尿検体においても正確に塩素イオン濃度を定量できるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、塩素イオンを含有する被検体にモノアミン酸化酵素及びアミン化合物を作用させ、次いで該酵素反応によって生成するアルデヒド化合物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させて、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することによって塩素イオン量を決定することを特徴とする塩素イオンの定量方法である。
【００１０】
他の発明は、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物とが互いに共存しないように分包された二つの試薬から構成されていることを特徴とする塩素イオン定量試薬である。
【００１１】
。本発明で言う被検体とは、血液、血清、血漿及び尿等に代表される体液、培養物、あるいは細胞内液等の液体あるいは抽出液を言う。
【００１２】
本発明におけるモノアミン酸化酵素とは、塩素イオンにより阻害を受けるという性質を有し、次式に示すアミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモニア、過酸化水素の生成反応を触媒する酵素を指す。
【００１３】
アミン化合物＋酸素＋Ｈ２Ｏ  →  アルデヒド化合物＋アンモニア＋過酸化水素
モノアミン酸化酵素としては、上記の性質を有する酵素であれば特に限定されず、公知のものが使用でき、具体的には、アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２９巻、６４９頁（１９６５年）に記載のアスペルギルス・ニガー由来のアミン酸化酵素、特開昭５８−９６９８号公報に記載のタラロマイセス・フラバス・バリエタス・フラバス・Ｍ４１７５菌（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．  ｆｌａｖｕｓ  Ｍ４１７５）由来のアミン酸化酵素、ペトロミセス・アリアセウス・Ｍ４６４８菌（Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ  Ｍ４６４８）由来のアミン酸化酵素、ネオサルトルヤ・フイツエリー・Ｍ４６９０菌（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  Ｍ４６９０）由来のアミン酸化酵素、ユーロチウム・チエバリエリ・Ｍ４８０５菌（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｃｈｅｖｅｌｉｅｒｉ  Ｍ４８０５）由来のアミン酸化酵素、ユーベニシリウム・パルバム・Ｍ５０５１菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ  Ｍ５０５１）由来のアミン酸化酵素等が挙げられるが、塩素イオンに対する感受性と安定性という観点から、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素が好適に使用できる。この様なモノアミン酸化酵素生産菌から公知の方法により目的とする酵素を得る。
【００１４】
本発明におけるアミン化合物は、モノアミン酸化酵素により酸化をうけるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ベンジルアミン、ｐ−フルオロベンジルアミン、フェネチルアミン、１−アミノブタン、１−アミノペンタン、１−アミノヘキサン等が挙げられ、特にベンジルアミンが酵素との親和性の点で好ましい。
【００１５】
また、本発明において言うアルデヒド化合物とは、アミン化合物がモノアミン酸化酵素の作用を受けて生成するアルデヒド化合物を言い、上記例示されたアミン化合物に各々対応して生成するアミン化合物由来の、ベンズアルデヒド、ｐ−フルオロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、１−ブタナール、１−ペンタナール、１−ヘキサナールである。
【００１６】
本発明に使用される酸化型ニコチンアミド補酵素は、特に限定されるものではなく使用するアルデヒド脱水素酵素が基質として認識するものであればいかなるものでも良い。例示すれば、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋と略記する）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ＋と略記する）、チオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋と略記する）、及びチオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ＋と略記する）が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用するアルデヒド脱水素酵素は、１モルのアルデヒド化合物と１モルの酸化型ニコチンアミド補酵素に対して作用して、１モルのカルボン酸と１モルの還元型ニコチンアミド補酵素を生成するものであれば特に限定されず、かかる特性を有する酵素が制限なく使用される。かかるアルデヒド脱水素酵素の作用は以下の反応式で示すことが出来る。
【００１８】
酸化型ニコチンアミド補酵素  ＋  アルデヒド化合物  →還元型ニコチンアミド補酵素  ＋  カルボン酸化合物
かかる特性を示すアルデヒド脱水素酵素を例示すれば、ジャーナル・バクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、６６巻、５４８〜５５３頁（１９５３年）に記載のＮＡＤ＋依存性ベンズアルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２４２巻、５２９４〜５３００頁（１９６７年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性ベンズアルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２４７巻、２６７〜２７２頁（１９７２年）に記載のＮＡＤ＋依存性アルデヒド脱水素酵素、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２０１巻、６２９〜６３７頁（１９５３年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性アルデヒド脱水素酵素、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１７Ａ巻、５９３〜５５９６頁（１９７０年）に記載のＮＡＤ＋依存性フェニルアセトアルデヒド脱水素酵素、ビオヒミカ・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ）、１１８巻、２８５〜２９８頁（１９６６年）に記載のＮＡＤ＋依存性アリールアルデヒド脱水素酵素、及びユアロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、８巻、４１３〜４１９頁（１９６９年）に記載のＮＡＤＰ＋依存性アリールアルデヒド脱水素酵素等が挙げられる。
【００１９】
本発明の定量方法において、被検体にアミン化合物、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる条件としては、生体中の成分を酵素的に定量する公知の条件が特に制限なく使用出来る。
【００２０】
通常、反応液量は、０．１〜５ｍｌの範囲で行われる。モノアミン酸化酵素は、反応液１ｍｌ当たり０．００１〜１０ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０１〜０．５ユニットの範囲で好適に使用される。アミン化合物は、０．０１〜１００ｍＭの範囲の濃度で使用されるが、特に０．５〜１０ｍＭの範囲の濃度で好適に使用される。
【００２１】
本発明の定量方法に用いられる酸化型ニコチンアミド補酵素の濃度は、使用するアルデヒド脱水素酵素の性質に依るが、一般にアルデヒド脱水素酵素の酸化型ニコチンアミド補酵素に対するＫｍ値の２〜２００倍の濃度範囲、すなわち通常は０．５〜２００ｍＭの濃度範囲で添加されが、特に４〜１００倍の濃度範囲、すなわち１〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。
【００２２】
本発明の定量方法に使用するアルデヒド脱水素酵素量は、酵素の活性、反応条件、定量対象となる被検体中の塩素イオン濃度等によって異なり、一概に限定できないが、好ましくは反応液で酵素反応によって生成したアルデヒド化合物が所定の時間内に完全にカルボン酸に変換され、同時にその化学当量の酸化型ニコチンアミド補酵素を還元型ニコチンアミド補酵素に変換せしめるに充分なアルデヒド脱水素酵素量に達していれば良い。かかるアルデヒド脱水素酵素量としては、通常反応液１ｍｌ当り０．０１〜１００ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０ユニットの範囲が好適である。
【００２３】
本発明における被検体とモノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を反応させる際の反応系のｐＨは、モノアミン酸化酵素及びアルデヒド脱水素酵素の活性が高く維持されるｐＨであれば特に限定されないが、具体的には、ｐＨ５〜９の範囲、特にｐＨ６〜８の範囲が好適である。ｐＨを維持するための緩衝液は、塩素イオンを含有していなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。
【００２４】
本発明の定量方法の反応温度条件は、通常１０〜４５℃の範囲で使用出来るが、特に２５℃〜３７℃の範囲が好適である。反応時間は、１〜３０分の範囲、特に３〜１０分の範囲が好適である。
【００２５】
本発明の方法による酵素反応に伴って生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量の定量方法は、既存の一般的な方法を用いることが出来る。例えば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨである場合は３４０ｎｍの吸光度の増加を、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＴｈｉｏ−ＮＡＤＨあるいはＴｈｉｏ−ＮＡＤＰＨである場合は４００ｎｍの吸光度の増加量を測定することによって定量出来る。また、高感度に定量したい場合は、生成する還元型ニコチンアミド補酵素をテトラゾリウム塩化合物とジアフォラーゼと作用させてホルマザン色素を生成せしめ、このホルマザン色素を比色定量することにより高感度に還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することが出来る。
【００２６】
本発明の塩素イオンの定量方法による代表的な塩素イオン濃度の測定は、モノアミン酸化酵素等を含む溶液に被検体を混合し、次いでアミン化合物等を含む溶液を加えて、最終的に、被検体、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素、アルデヒド脱水素酵素を共存させ、モノアミン酸化酵素の触媒する反応の結果生じたアルデヒド化合物と酸化型ニコチンアミド補酵素から、アルデヒド脱水素酵素の作用により生成した還元型ニコチンアミド補酵素を、前記の直接またはテトラゾリウム塩を用いた方法により比色定量することにより実施される。
【００２７】
本発明の定量方法において、定量性、酵素の安定性、操作の簡便性の点から、被検体にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素とベンジルアミンを作用させ、生成したベンズアルデヒドに酸化型ニコチンアミド補酵素とアルデヒド脱水素酵素を作用させ、生成した還元型ニコチンアミド補酵素を、直接またはテトラゾリウム塩を用いた方法で比色定量することにより被検体中の塩素イオン濃度を決定する方法が特に好ましい。
【００２８】
本発明の塩素イオン定量試薬は、モノアミン酸化酵素、アミン化合物、酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素を含んでなり、これら試薬成分中、少なくともモノアミン酸化酵素とアミン化合物とは互いに分離されて含有され、別包形態の試薬として存在する。該定量試薬は、アルデヒド化合物に対するアルデヒド脱水素酵素の作用により生じた還元型補酵素の生成速度（量）を定量することにより塩素イオン濃度を定量する試薬である。以下更に詳しく説明する。
【００２９】
還元型ニコチンアミド補酵素を還元型補酵素自身の吸光度を測定して直接定量する場合は、モノアミン酸化酵素は、反応液１ｍｌ当たり０．００１〜１０ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０１〜０．５ユニットの範囲で好適に使用される。アミン化合物は、０．０１〜１００ｍＭの範囲の濃度で使用されるが、特に０．５〜１０ｍＭの範囲の濃度で好適に使用される。酸化型ニコチンアミド補酵素は、０．５〜２００ｍＭの濃度範囲で添加されるが、特に１〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。アルデヒド脱水素酵素は、反応液１ｍｌ当り０．０１〜１００ユニットの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０ユニットの範囲が好適である。
【００３０】
上記組成の試薬に、ジアホラーゼ及びテトラゾリウム塩化合物を配合することにより、還元型ニコチンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物から下記に示すジアホラーゼの作用によりホルマザン色素を生成させてこのホルマザン色素をその色素の極大吸収波長近辺で比色定量することにより高感度に塩素イオン濃度を定量する試薬とすることができる。
【００３１】
還元型ニコチンアミド型補酵素  ＋  テトラゾリウム塩化合物  →ホルマザン色素  ＋  酸化型ニコチンアミド補酵素
ジアホラーゼは市販の酵素が特に制限なく使用できる。テトラゾリウム塩は特に限定されるものではなく、種々のものが使用できる。例えば、（株）同人化学研究所総合カタログ（第１９版，平成６年７月３１日発行）１６６〜１７０頁記載のニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３等が使用できる。この場合、ジアホラーゼは反応液１ｍｌ当たり０．５〜５００ユニットの範囲で使用されるが、特に１〜１００ユニットの範囲で好適に使用される。テトラゾリウム塩化合物は０．０５〜５０ｍＭの範囲で使用されるが、特に０．１〜１０ｍＭの範囲で好適に使用される。
【００３２】
本発明の定量試薬は、モノアミン酸化酵素とアルデヒド脱水素酵素の活性が高く維持されるｐＨ、即ち一般的には、ｐＨ５〜９の範囲、特にｐＨ６〜８で定量に供されるので、少なくとも測定時にｐＨを維持するための緩衝液を使用するのが好ましい。該緩衝液は測定時に反応系に混合してｐＨ調整を行ってもよいが、試薬の活性維持、簡便性の観点から、本試薬中に予め含有させておくことが望ましい。該緩衝液としては、塩素イオンを含有していなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。
【００３３】
本試薬に含まれる上記必須成分の中で、モノアミン酸化酵素とアミン化合物は酵素反応が進行しないように互いに分離させて別試薬としておく必要があるが、その他の酵素、補酵素、化合物の配合形態には何ら制限はない。例えば、モノアミン酸化酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を緩衝液中に含有させた酵素溶液（高感度に測定したい場合には、さらにジアホラーゼとテトラゾリウム塩化合物も含有する）と、アミン化合物の水溶液からなる基質溶液をそれぞれ調製し、測定時に両者が被検体共々混合され定量に供される。
【００３４】
本発明の塩素イオン定量試薬において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミン酸化酵素、ベンジルアミン、酸化型ニコチンアミド補酵素、アルデヒド酸化酵素からなり、これら試薬成分中、当該アミン酸化酵素とベンジルアミンとは分離して二試薬形態で存在する定量試薬が保存安定性、定量性、操作性の点から特に好ましい。
【００３５】
本発明の定量試薬並びに定量方法を用いた塩素イオンの定量は、一般的には、検体の測定に先だち、塩化ナトリウム溶液、あるいは塩化カリウム溶液等の塩素イオン濃度既知標準溶液を試料として、本発明の定量法に従って検量線を作成し、還元型ニコチンアミド補酵素またはホルマザン色素の生成速度（量）と塩素イオン濃度との検量線を作製し、この検量線から被検体中の塩素イオン濃度を算出する。
【００３６】
【作用】
モノアミン酸化酵素は、アミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモニア、及び過酸化水素の生成反応を触媒するが、反応液中に塩素イオンが存在すると、その濃度に比例して活性が変化する。反応生成物であるアルデヒド化合物に酸化型ニコチンアミド補酵素及びアルデヒド脱水素酵素と作用させることによって生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量することでモノアミン酸化酵素活性を測定し、被検体中の塩素イオンを定量する。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の塩素イオン定量法により、汎用的な装置を使用し、簡便な操作で、還元性物質が含まれる尿検体においても正確に塩素イオンを定量する方法、並びに広い測定範囲と高い安定性を有する塩素イオン定量試薬が提供される。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、酵素活性値を示す単位として、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を生成させる酵素量を  １ユニットと示した。
【００３９】
製造例１〔モノアミン酸化酵素の調製〕
モノアミン酸化酵素は、次の方法にて調製した。３．０％  グルコース、０．３％  硝酸ナトリウム、０．１％  リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％  塩化カリウム、０．００１％  硫酸第一鉄、０．１％  酵母エキス、０．０２％  消泡剤から成る前培養培地（ｐＨ５．０）１００ｍｌの入った坂口フラスコを１０本用意し、アスペルギルス・ニガー（ＡＴＣＣ  ２８３２５）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、攪拌回転数１１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この坂口フラスコ１０本分の培養液を、２０ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに移し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気２５Ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌した。次いで、１６０ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌し、３．０％グルコース、０．１％  ブチルアミン、０．１％  リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％  塩化カリウム、０．００１％  硫酸第一鉄、０．０２％  消泡剤から成る本培養培地（ｐＨ５．０）を１６０ｌ仕込んだジャーファーメンターに菌体を植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０ｌ／ｍｉｎで一晩本培養を行い集菌した。
【００４０】
得られた菌体の約５ｋｇ（湿菌体重量）を５０ｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミル細胞破砕機を用いて菌体破砕を行った。連続遠心分離機により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。
【００４１】
破砕上清液に、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）を３Ｌ加え、静かに攪拌しながら、４℃で一晩放置した。この溶液を吸引濾過し、タンパク質の吸着した樹脂を得、よく洗浄した後にカラムに充填した。０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、活性画分を回収し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより脱塩を行った。
【００４２】
次に、脱塩した活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した１ＬのＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し、タンパク質を吸着させ、同様の緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を０Ｍから０．２Ｍまで直線的に増加させてタンパク質を溶出し、活性画分を回収した。
【００４３】
活性画分を限外濾過により濃縮し、０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した  ３ＬのセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）カラムに通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。
【００４４】
約５ｋｇ（湿菌体重量）の菌体から、９００ユニット（比活性＝１．５ユニット／ｍｇタンパク質）のモノアミン酸化酵素を得た。
【００４５】
製造例２〔アルデヒド脱水素酵素の調製〕
アルデヒド脱水素酵素は、次の方法にて調製した。０．５％  グルコース、１．３６％  リン酸水素二カリウム、０．１％  塩化アンモニウム、０．１％  硫酸アンモニウム、０．００２％  硫酸マグネシウム、０．０００１５６％  硫酸アンモニウム鉄、及び０．０２％  消泡剤から成る培地（ｐＨ７．０）１Ｌを５Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌した後、２８℃下でシュードモナス・プチダ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ，  ＩＦＯ  １４１６４）を植菌した。２８℃で２４時間振盪培養を行った後、この培養液を予め０．１％  マンデル酸を含む上記と同様の組成を有する２０Ｌの培地を仕込み滅菌しておいたジャー・ファーメンターに植菌し、温度：２８℃、攪拌回転数：１５０ｒｐｍ、通気量：２０Ｌ／ｍｉｎにて本培養を行った。１８時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。
【００４６】
得られた菌体の内、約２００ｇ（湿菌体重量）を１，２００ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、冷却下で超音波破砕機を用いて菌体破砕を行った。遠心分離機により、破砕液から不溶物を除き、上清液を得た。
【００４７】
破砕上清液を、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいた１ＬのＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）カラムに通し、タンパク質を吸着させ、同様の緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を０Ｍから０．２Ｍまで直線的に増加させてタンパク質を溶出して活性画分を回収した。
【００４８】
活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した  ３ＬのセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）カラムに通し、活性画分を回収し、最終精製標品とした。
【００４９】
約２００ｇ（湿菌体重量）の菌体から、３００ユニット（比活性＝１．２ユニット／ｍｇタンパク質）のアルデヒド脱水素酵素を得た。
【００５０】
実施例１
下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００５１】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ      リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．５）
１．２８１ｍＭ    ＮＡＤＰ＋
１３３ｍＵ／ｍｌ  モノアミン酸化酵素
１３３ｍＵ／ｍｌ  アルデヒド脱水素酵素
［基質溶液］
２５．６ｍＭ      ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００５２】
試料として、０  、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、及び５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、３４０ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ３４０）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ３４０の逆数（１／ΔＡ３４０）をとりプロットした。図１にその結果を示す。図１から明らかなように、塩素イオン濃度０〜５００ｍＭの範囲で良好な直線関係が得られた。
【００５３】
比較例１
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬として市販測定試薬Ａを使用して、実施例１と同様に、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を測定した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸に１分間当たりの４０４ｎｍの吸光度変化（ΔＡ４０４）をとりプロットした。図２にその結果を示す。
【００５４】
実施例１及び比較例１から、本発明の方法は、アミラーゼを用いた方法より広い塩素イオン濃度にわたって、直線性を有することが確認された。
【００５５】
実施例２
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、試薬調製直後、及び４℃で７、１４日間保存した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用した以外は実施例１に記載した方法により測定した。試薬調製直後の１／ΔＡ３４０を１００として、７日後、１４日後の１／ΔＡ３４０から相対値（活性残存率）を算出し、本発明の試薬の保存安定性を測定した。結果を図３に示す。
【００５６】
比較例２
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａを用いて、実施例２と同様に、試薬調製直後、及び４℃で７、１４日間保存した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して測定した。試薬調製直後のΔＡ４０４を１００として、７日後、１４日後のΔＡ４０４から相対値（活性残存率）を算出し、市販測定試薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図３に示す。
【００５７】
実施例３
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を、調製直後、及び３７℃で３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間保温した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して実施例２に記載した方法により活性残存率を算出し、本発明の試薬の保存安定性を測定した。結果を図４に示す。
【００５８】
比較例３
アミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａも実施例３と同様に、調製直後、及び３７℃で３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間保温した後、試料として１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液を使用して、比較例２に記載した方法により活性残存率を算出し、市販測定試薬Ａの保存安定性を測定した。結果を図４に示す。
【００５９】
実施例２、３と比較例２、３より、本発明の試薬は、アミラーゼを用いた市販試薬Ａより高い保存安定性を有することが確認できた。
【００６０】
実施例４
下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００６１】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ      リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．５）
０．１％            界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）
１．２８１ｍＭ      ＮＡＤＰ＋
２５．６Ｕ／ｍｌ    ジアフォラーゼ（ユニチカ社製）
３３．３ｍＵ／ｍｌ  モノアミン酸化酵素
３３．３ｍＵ／ｍｌ  アルデヒド脱水素酵素
０．２ｍＭ          ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ：同仁化学研究所社製）
［基質溶液］
２５．６ｍＭ    ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００６２】
試料として、０  、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、及び５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、５３０ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ５３０）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ５３０の逆数（１／ΔＡ５３０）をとりプロットした。図５にその結果を示す。この様にテトラゾリウム塩を使用する方法によると実施例１より少ない酵素量（約１／４）、すなわち高感度に実施例１と同様の結果が得られた。
【００６３】
実施例５
実施例１で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を実施例１と同様の方法により測定し、検量線を作製した。健常者随時尿検体（５検体）を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６４】
実施例６
実施例４で調製した酵素溶液と基質溶液を用いて、０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を実施例４と同様の方法により測定し、検量線を作製した。実施例５と同一の健常者尿検体を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６５】
比較例４
モノアミン酸化酵素の反応の結果生じる過酸化水素を定量することにより被検体中の塩素イオンを定量する試薬として、下記の組成の酵素溶液と基質溶液を調製した。
【００６６】
［酵素溶液］
０．１２８Ｍ    リン酸緩衝液  （ｐＨ６．８）
１．２８１ｍＭ      ４−アミノアンチピリン
１．２８１ｍＭ      Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）  −ｍ−トルイジン（同仁化学研究所社製）
２３．６Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ
３３．３ｍＵ／ｍｌ  モノアミン酸化酵素
［基質溶液］
２５．６ｍＭ    ベンジルアミン
基質溶液のｐＨは、リン酸を用いてｐＨ７．０に調整した。
【００６７】
０、８０、１２０、１６０、２００、３００ｍＭの塩化ナトリウム溶液調製し、測定を行った。３２０μｌの酵素溶液に１０μｌの試料を加えてよく混合し、３７℃で５分間保温した。次いで８０μｌの基質溶液を加え、３７℃で、５５５ｎｍの波長の吸光度を５分間測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ５５５）を算出した。横軸に塩素イオン濃度、縦軸にΔＡ５５５の逆数（１／ΔＡ５５５）をとりプロットし、検量線を作製した。実施例５と同一の健常者尿検体を測定し、先に作製した検量線を用いて尿検体中の塩素イオン濃度を定量した。結果を表１に示す。
【００６８】
比較例５
実施例５と同一の健常者尿検体をＰＶＡ−α（シノテスト社）を用いて、取扱説明書に従って、電量滴定法により測定した。結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
実施例５、６と比較例４、５より、本発明の方法は、尿検体において電量滴定法と良い相関性を示すことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は本発明の塩素イオンの定量法の塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化の逆数（１／ΔＡ３４０）との関係を示す図である。
【図２】本図はアミラーゼを利用した酵素法による塩素イオンの定量試薬である市販測定試薬Ａの塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化（ΔＡ４０４）との関係を示す図である。
【図３】本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販測定試薬Ａの４℃における保存安定性（活性残存率）を示す図である。
【図４】本図は本発明の塩素イオンの定量試薬と市販測定試薬Ａの３７℃における保存安定性（活性残存率）を示す図である。
【図５】本図はテトラゾリウム塩を使用した本発明の塩素イオンの定量法の塩素イオンと１分間当たりの吸光度変化の逆数（１／ΔＡ５３０）との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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