(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合面を形成した２種の植物体を上下に配置して当該接合面が水平になるように接ぎ木し、活着後、水平接合面に近い上部組織の部分をわずかに薄く残すように上に配置した植物体を水平に切断し、切断面の上部全面から発生する不定芽を育成し、選抜することを特徴とする植物の接ぎ木方法。
【請求項２】
２種の植物の組織を材料として、これらの組織を上部と下部になるよう配置し、その接合面は、水平に接ぎ木を行い、活着後、水平接合面に近い上部組織の部分をわずかに薄く残すように上に配置した植物の組織を水平に切断し、切断面の上部全面から発生する不定芽を育成し、合成キメラを効率的に作出／育成することを特徴とする合成キメラ植物の生産方法。
【請求項３】
植物材料に不定芽の発生を促進させる処理を行うことにより、２種の植物の接ぎ木接合面の真上の切断面の上部全面から効率よく不定芽を発生させて、効率的に合成キメラを作出／育成することを特徴とする請求項２記載の合成キメラ植物の生産方法。
【請求項４】
２種のミカン科植物により構成されている合成キメラ不定芽を育成／選抜する方法であって、請求項２又は３記載の方法により、切断面の上部全面から発生するすべての不定芽をキメラ候補不定芽として育成し、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により効率的に選抜することを特徴とする合成キメラ植物の生産方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法により、２種のミカン科植物を用いて作出された合成周縁キメラ新植物であって、茎頂起源層第１層がポンカンで茎頂起源層第２、３層がブラッドオレンジで構成されることを特徴とする植物体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の方法により、２種のミカン科植物を用いて作出された合成周縁キメラ新植物であって、以下の植物体；
（ａ）茎頂起源層第１層がブラッドオレンジで茎頂起源層２、３層がポンカンで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｂ）茎頂起源層第１層がウンシュウで茎頂起源層２、３層がブラッドオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｃ）茎頂起源層第１層がシークワシャーで茎頂起源層２、３層がオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｄ）茎頂起源層第１層がキンカンで茎頂起源層２、３層がオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
のうちから選択されるいずれか１種の植物体。
【請求項７】
以下の行程；
（ａ）キメラ植物体果実の所定の部分（果皮あるいは果肉）に発現させるべき２種の供試ミカン科植物を珠心胚実生起源の組織に限定することなく、予め設計／選択し、
（ｂ）該２種のミカン科植物を用いて、請求項２記載の方法により、切断面の上部全面から発生するすべての不定芽をキメラ候補として育成した後、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により合成キメラ植物を選抜し、
（ｃ）その中から所定の合成周縁キメラを早期選抜し、育成することによって、効率的かつ合理的に所定のキメラ植物体果実を発現する合成周縁キメラを作出／育成することを特徴とする合成周縁キメラの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の新しい接ぎ木方法、及びこの接ぎ木方法により新しい合成キメラ植物を生産する技術に関するものであり、更に詳しくは、成木の新梢組織を用いた新しい接ぎ木方法（水平上下接ぎ方法）、この接ぎ木方法により合成キメラ植物を効率的に作出する方法、該作出方法を利用して新しい合成キメラ植物を作出／育成し、生産する方法、及びその新植物体に関するものである。
本発明は、一般の植物について、該方法を用いて、キメラ候補不定芽を効率的に発生させる方法、及びキメラ候補不定芽の選抜にかかる労力を大幅に削減することを可能とし、効率よく合成キメラを作出／育成し、生産する方法、更に、該方法で得られた新規植物体、特に、茎頂起源層第１層と茎頂起源層第２、３層が２種の既存の植物細胞により構成され、それぞれの種の各茎頂起源層由来の各組織における優良形質がほぼ元の種と同様に発現可能な合成周縁キメラ新植物、を提供するものである。
本発明は、例えば、ミカン科の合成キメラ植物の作出材料においては、珠心胚実生の胚軸を用いるほか、成木の新梢組織を用いることができるため、珠心胚実生を得ることが困難な多胚性の種、例えば、ネーブルオレンジや温州ミカン、並びに単胚性の種、例えば、ブンタンや清見等、を用いて合成キメラの作出を可能とする方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、広く一般の植物を対象とする技術であるが、以下、ミカン科植物を例として説明する。
ミカン科植物において、偶然発見されたキメラとして、国内では、小林ミカン（ナツダイダイと温州ミカン）、金柑子温州（金柑子と温州ミカン）が知られている。更に、イヨカンと温州ミカンのキメラも知られている。
また、このような偶発的なものではなく、人為計画的なものとして、Ｗｉｎｋｌｅｒ（Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｈ．，Ｕｅｂｅｒ  Ｐｆｒｏｐｆｂａｓｔａｒｄｅｕｎｄ  ｐｆｌａｎｚｌｉｃｈｅ  Ｃｈｉｍａｅｒｅｎ，Ｂｅｒ．ｄｔｓｃｈ．ｂｏｔ．Ｇｅｓ．，２５，５６８−５７６（１９０７））が、接ぎ木によりナス科植物のキメラを作出する方法を開発している。
ミカン科植物では、珠心胚実生の寄せ接ぎにより、川野ナツダイダイと福原オレンジから作出されたキメラがある（特許第１６８５３２４号及び特許第１６８５３２５号）。しかし、これらの特許の方法では、ミカン科植物の人為計画的な合成周縁キメラは、この１例の組合せしか作出されていない。
また、本発明者らは、温州ミカンとオレンジ並びにポンカンとオレンジの組合せで茎頂起源層第１層と茎頂起源層第２、３層が相互に異なる種から構成される合成周縁キメラを作出した（特開平１１−１０３７０６号公報）。
【０００３】
人為計画的に作出されたミカン科植物の合成周縁キメラは数例挙げられるが、これらを構成する２種のミカン科植物については、すべて珠心胚実生の胚軸組織を寄せ接ぎあるいは貼り接ぎした接ぎ木方法を用いたものであり、２種の組織が接する接合部分から発生した不定芽を選抜、育成させたものである。これ以外の部分から発生した不定芽については、キメラ不定芽ではないため、不定芽育成の非常に早い段階で実体顕微鏡等を用いて切除する必要があり、この作業に多大な時間と労力を要する。
【０００４】
このように、ミカン科植物のキメラ植物体を作出することは上述の方法により可能であるが、この方法では種子の得にくい多胚性ミカン科植物（例えば、ネーブルオレンジや温州ミカン等）を合成周縁キメラ植物体作出における構成種として用いる場合には、種子を得るための授粉等の作業に多大な労力が必要である。また、珠心胚実生の胚軸組織を用いた場合に、変異が認められることが知られている（西浦昌男・上野勇、単為生殖および珠心はいの利用による育種、果樹園芸大事典第２次訂正追補：１１１−１１３（１９９１））ため、作出に用いる元の種とまったく同様の形質を得ることは不可能である。単胚性ミカン科植物（例えば、ブンタンや清見等）については、珠心胚実生が得られないため、合成周縁キメラ植物体の作出に用いる構成種として利用することは不可能であった。しかし、単胚性ミカン科植物の中には、優良な形質を持っているものがあり、これらの種を合成キメラ植物体の構成種として用いることができれば、作出されるキメラ植物体は、相互の優良形質を持ち合わせた個体となる可能性が高い。
【０００５】
ミカン科植物においては、交雑育種法が確立しており、これにより新植物が育成されてきている。一方、キメラ植物については、明らかになっていない点が多く、その育種法も十分といえるものが確立されていない。また、これまで人為計画的に作出された合成周縁キメラ植物は、すべて不定芽の発生の容易な珠心胚実生胚軸組織を用いた寄せ接ぎあるいは貼り接ぎによる数種類しか認められていない。珠心胚実生は、ほぼ元の種と同等の形質を発現することは知られているが、変異が起こる可能性があるため、成木の新梢組織等を用いることでこれを回避することが可能である。しかしながら、成木の新梢組織からの不定芽の発生は、ほとんど認められないので、この方法では、キメラ不定芽を得ることは極めて困難であるという問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、成木の新梢を用いた新しい接ぎ木方法により新たなキメラ候補個体を得る方法、また、不定芽の発生が困難な新梢組織からキメラ候補不定芽を発生させる処理方法、及びキメラ候補不定芽の効率的な選抜方法等を確立することを目標として種々検討を試みる中で、以下に説明する新しい方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明では、作出に用いる２種の植物の実生の胚軸組織の寄せ接ぎ又は貼り接ぎ以外の全く新しい接ぎ木方法、すなわち、本発明の水平上下接ぎ方法を開発すると共に、この方法を用いることにより、効率的に合成キメラ植物体を作出することを可能とした。
更に、本発明では、不定芽の発生の困難な組織を合成キメラ植物体の作出に用いる際に、材料を植物成長調整物質を含む溶液及び光条件による処理並びに水平上下接ぎ方法を行うことで合成キメラ個体を作出することを可能とした。
本発明は、これらの作出技術を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、これらの技術を用いて、広く一般の植物について、その合成キメラ植物を生産すること、特に、従来の寄せ接ぎ又は貼り接ぎ方法では得ることが困難であった両構成種の優良形質を合わせ持つ合成キメラを作出／育成し、生産する方法、及びその新植物を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明は、以下の技術的手段からなる。
（１）接合面を形成した２種の植物体を上下に配置して当該接合面が水平になるように接ぎ木し、活着後、水平接合面に近い上部組織の部分をわずかに薄く残すように上に配置した植物体を水平に切断し、切断面の上部全面から発生する不定芽を育成し、選抜することを特徴とする植物の接ぎ木方法。
（２）２種の植物の組織を材料として、これらの組織を上部と下部になるよう配置し、その接合面は、水平に接ぎ木を行い、活着後、水平接合面に近い上部組織の部分をわずかに薄く残すように上に配置した植物の組織を水平に切断し、切断面の上部全面から発生する不定芽を育成し、合成キメラを効率的に作出／育成することを特徴とする合成キメラ植物の生産方法。
（３）植物材料に不定芽の発生を促進させる処理を行うことにより、２種の植物の接ぎ木接合面の真上の切断面の上部全面から効率よく不定芽を発生させて、効率的に合成キメラを作出／育成することを特徴とする前記（２）記載の合成キメラ植物の生産方法。
（４）２種のミカン科植物により構成されている合成キメラ不定芽を育成／選抜する方法であって、前記（２）又は（３）記載の方法により、切断面の上部全面から発生するすべての不定芽をキメラ候補不定芽として育成し、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により効率的に選抜することを特徴とする合成キメラ植物の生産方法。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載の方法により、２種のミカン科植物を用いて作出された合成周縁キメラ新植物であって、茎頂起源層第１層がポンカンで茎頂起源層第２、３層がブラッドオレンジで構成されることを特徴とする植物体。
（６）前記（１）から（４）のいずれかに記載の方法により、２種のミカン科植物を用いて作出された合成周縁キメラ新植物であって、以下の植物体；
（ａ）茎頂起源層第１層がブラッドオレンジで茎頂起源層２、３層がポンカンで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｂ）茎頂起源層第１層がウンシュウで茎頂起源層２、３層がブラッドオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｃ）茎頂起源層第１層がシークワシャーで茎頂起源層２、３層がオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
（ｄ）茎頂起源層第１層がキンカンで茎頂起源層２、３層がオレンジで構成されていることを特徴とする植物体、
のうちから選択されるいずれか１種の植物体。
（７）以下の行程；
（ａ）キメラ植物体果実の所定の部分（果皮あるいは果肉）に発現させるべき２種の供試ミカン科植物を珠心胚実生起源の組織に限定することなく、予め設計／選択し、
（ｂ）該２種のミカン科植物を用いて、前記（２）記載の方法により、切断面の上部全面から発生するすべての不定芽をキメラ候補として育成した後、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により合成キメラ植物を選抜し、
（ｃ）その中から所定の合成周縁キメラを早期選抜し、育成することによって、効率的かつ合理的に所定のキメラ植物体果実を発現する合成周縁キメラを作出／育成することを特徴とする合成周縁キメラの生産方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明するが、以下、代表的なものとして、ミカン科植物の場合を例として説明する。しかし、本発明は、広く一般の植物に適用されるものであり、ミカン科植物に限定されるものではない。
本発明において、接合面を形成した２種の植物体とは、２種の植物体を接ぎ木するために、人為的にその接合面を整形した２種の植物体を意味する。
本発明において、新しい植物を得るために、本発明者らは、２種のミカン科植物組織を材料として、これらの組織が上部と下部に水平に配置されるように水平上下接ぎ木（図１参照）を行って多数の接ぎ木個体を作成し、次に、水平接合面に近い上部の組織をわずかに残すように非常に薄く水平に切断し、その切断面の上部全面から発生するすべての不定芽をキメラ候補として育成した。
ここで、水平とは、略水平及びそれと実質的に同等のものを包括するものとして定義される。
２種のミカン科植物材料については、珠心胚実生の胚軸組織の他、新梢組織を供試することも可能である。また、これらの組織に限らず不定芽が発生する組織を用いれば、どんな組織でも供試可能である。新梢を材料として用いる場合には、新梢組織からの不定芽の発生率は、珠心胚実生の胚軸組織と比較して非常に低いため、不定芽の発生を促進させる処理を行う必要がある。この処理は、具体的には、新梢採取後、適当な長さに切断した新梢組織を植物成長調整物質を含む処理液中に浸漬し、例えば、冷暗所で１日静置することにより行われる。なお、珠心胚実生の胚軸組織同士を用いた水平上下接ぎについては、植物成長調整物質処理液による処理及び暗処理を行う必要はない。
【０００９】
この処理の後、新梢組織を楔形に切り出し、ユズ等の適宜の実生に切り接ぎを行う。活着後、新梢組織を水平に切断し、その断面にもう一方の構成種である珠心胚実生の胚軸組織あるいは前述の処理を行った新梢組織を水平上下接ぎし、更に活着させる。この組織同士が活着した後、上部の組織をわずかに残して水平に切断し、乾燥を防ぐために蒸留水等で直ちに切断面を覆い、透明のプラスティック容器をかぶせ、不定芽を発生させる。この場合、好適には、蒸留水が例示されるが、それに限らず、乾燥を防ぐ機能を有するものであれば、適宜のものが使用される。ここで材料に新梢組織を用いた場合には、暗処理を行った後、通常の育成条件により、不定芽を発生させる。このようにして育成を行ったすべての不定芽について、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析を行う。この場合、具体的には、例えば、展開する葉部からＳＤＳ法によりＤＮＡの抽出を行い、これをテンペレートＤＮＡとしてランダムプライマーにより増幅されるＤＮＡの検出を行うＲＡＰＤ分析法を用いてキメラ不定芽の選抜を行う方法が例示されるが、これらに制限されない。
【００１０】
本発明においては、水平切断面の上部全面から発生するすべての不定芽がキメラ候補となるため、寄せ接ぎの場合の接合部分と比較すると発生する面積が非常に大きく、また、接合部分以外から発生したキメラではない片方の元の種の不定芽を切除する必要がないため、不定芽育成に伴う作業効率は飛躍的に向上する。例えば、ＲＡＰＤ分析により、キメラ不定芽として選抜された個体は、鉢上げ育成した後、幼植物の段階において特開平１１−１０３７０６号公報の方法により、茎頂起源層構成の確定を行う。
すなわち、具体的には、選抜された個体について、葉部の表皮細胞と葉肉細胞を酵素処理によって分離した後、これらの細胞から別々にＤＮＡを抽出し、例えば、ＲＡＰＤ法を用いてそれぞれの元の種由来のＤＮＡであることを確認し、その茎頂起源層構成を明らかにすることにより、キメラ性の確定を行う。
この方法によれば、キメラ個体の構成種の優れた形質を計画的に選択し、組合せることにより、幼植物の段階で期待するキメラ植物体果実のどの部位（果皮あるいは果肉）に発現するかを知ることができるため、期待する組合せのキメラ植物体を選抜・育成することが可能である。それにより、栄養成長期の段階でキメラ性が確定した植物体を得ることができる。
【００１１】
本発明により作出されたキメラ個体は、試験圃場に高接ぎを行い、約１年間高接ぎ個体のキメラ構成の調査を行い、高接ぎ後もキメラ構成を維持していることを確認した。また、一方では、キメラ個体から得られた穂木をカラタチ台に高接ぎし、これらの個体から発生した側枝についてもキメラ性を維持していることを確認した。
以上のことから、これらの個体は安定した周縁キメラであり、高接ぎによる増殖が可能であることも確認した。本出願人は、この新植物（後記する実施例の系統番号５５、６５、６６、７１、ならびに８３）が、株式会社愛媛柑橘資源開発研究所（所在地；愛媛県松山市安城寺町４７８番地）に存在（図２、４、６、８、ならびに１０）するとともに、必要により分譲可能な状態で保存、管理されていることを宣言する。
【００１２】
本発明による実施例として、ミカン科合成周縁キメラを表１に示す。
本発明によるミカン科植物周縁キメラ新植物は、茎頂起源層第１層と茎頂起源層第２、３層が異なるミカン科植物により構成されている。構成種として用いたポンカンとブラッドオレンジ系統のモロの組合せにより得られた周縁キメラ植物体の果実は、ブラッドオレンジが茎頂起源層第１層の植物体では、果肉がブラッドオレンジ特有の果肉色を有するモロで、果皮がポンカンというまったく新しい果実が結実することが予想される。反対に、茎頂起源層第１層がポンカンの果実では、果肉がポンカンで果皮がブラッドオレンジのそれぞれの性質を受け継ぐまったく新しい果実が結実することが予想される。
【００１３】
本発明により得られた系統番号５５の、キメラ新植物は、果皮がブラッドオレンジ特有の果皮色で果実の貯蔵性がよく、オレンジ香を有し、果肉は、ポンカンの香味を有する植物体となることが予想される。
本発明により得られた系統番号６５の、キメラ新植物は、果皮がポンカン特有の果皮色で剥皮性がよく、果肉はオレンジの香味を有する植物体となることが予想される。
本発明により得られた系統番号６６の、キメラ新植物は、果皮がオレンジ特有の果皮色で貯蔵性がよく、果肉はウンシュウの香味を有する植物体となることが予想される。
本発明により得られた系統番号７１の、キメラ新植物は、果皮がオレンジ特有の果皮色で貯蔵性がよく、果肉はシークワシャーの香味を有する植物体となることが予想される。
本発明により得られた系統番号８３の、キメラ新植物は、果皮がオレンジ特有の果皮色で貯蔵性がよく、果肉はキンカンの香味を有する植物体となることが予想される。
このように、本発明による周縁キメラ植物から得られる果実は、生産性、流通性及び嗜好性に関して、既存種にはない優れた点を有する可能性がある。更に、本発明の周縁キメラ新植物は、既存種特有の優良形質を組合せて有しており、ミカン科植物の周縁キメラ新植物としての新規性も高く、また、果実の品質及び栽培特性が良好な系統である場合には、新しい栽培植物となる可能性は非常に高いと云える。
以上、本発明について、ミカン科植物を例として説明したが、本発明は、広く一般の植物、例えば、バラ科植物、ブドウ科植物、マタタビ科植物等に好適に適用されるものであり、ミカン科植物に限定されるものではないことは云うまでもない。
【００１４】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は該実施例によって何ら限定されるものではない。
以下、本発明に係る合成キメラ個体の作出方法、新植物の育成過程及びその特性等を説明する。
実施例１
（１）新梢組織と珠心胚実生の胚軸組織の水平上下接ぎによるモロ（新梢組織）と今津ポンカン（珠心胚実生の胚軸組織）のキメラ個体の作出及び選抜
１）水平上下接ぎ・活着
モロの新梢の採取は、新梢先端の成長が停止した時期に行った。新梢採取後、適当な長さに切断し、この植物材料を植物成長調整物質を含む処理液に浸漬し、冷暗所で１日静置した。植物成長調整物質を含む処理液の組成は、ベンジルアミノプリン２０μＭ、α−ナフタレン酢酸１０μＭ、ジベレリン酸（ＧＡ3 ）１００μＭ、Ｌ−プロリン１０ｍＭ、ＭＥＳ−カリウム塩５．０ｍＭとし、ｐＨ６．４に調整したものを用いた。
処理後、あらかじめ鹿沼土入りのプラスティック容器に播種し、育成したユズ実生上胚軸に楔形に切りだしたモロの新梢組織を切り接ぎした。活着後、新梢組織の楔形の約半分の位置を水平に切断し、切断した新梢組織の上部に、今津ポンカンの珠心胚実生の胚軸組織を密着させ、接合部を固定した後、接ぎ木苗を透明のプラスティック容器で覆った。
この接ぎ木苗を恒温恒湿室（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）で１６日間育成し、接ぎ木部の活着を完了した。
【００１５】
２）切断・暗処理
活着後、上部の実生上胚軸組織をわずかに残して、水平に切断し、切断面にパスツールピペットで蒸留水を滴下し、透明プラスティック容器をシュート部全体に被せ、切断面が乾燥しないようにした。この切断した苗を暗黒下（２６℃、湿度７０％）で数日間暗処理を行った。
暗処理を行った後、通常の育成条件（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）で育成した。水平上下接ぎ木苗の水平切断面の上部全面から発生するすべての不定芽は、キメラ候補として育成し、一方、ユズの台木から発生した不定芽については切除した。
【００１６】
３）ＲＡＰＤ法によるキメラ個体の選抜
本発明においては、実体顕微鏡による不定芽の選抜は行わず、水平上下接ぎ切断面の上部全面から発生したすべての不定芽を約２か月間育成し、特開平１１−１０３７０６号公報の実施例１に記載した「ＲＡＰＤ法によるキメラ個体の選抜」と同様の手順でキメラ個体の選抜を行った。
すなわち、育成した幼苗から葉部の一部を採取し、ＳＤＳ法を１／５にスケールダウンした改変法により該葉部からＤＮＡを抽出した後、３０ｎｇ／μｌに調整し、テンペレートＤＮＡ溶液として用いた。
このテンペレートＤＮＡ溶液０．５μｌに、１２ｍｅｒのプライマー（（株）ＢＥＸ社製の動植物および微生物に存在する遺伝子（アミノ酸）配列に基づいてデザインされたコモンプライマー（ランダムプライマー））１０ｐｍｏｌ／０．５μｌ及びＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）社製）０．５ユニットを加え、最終の反応液の量を１２．５μｌとした。この反応系でＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡバンドは、１．５％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線照明下で観察した。分子量マーカーとしては、Ｍａｒｋｅｒ  ４（φ×１７４／Ｈａｅ III  Ｄｉｇｅｓｔ；（株）ニッポンジーン社製）を使用した。
本実施例においては、モロと今津ポンカンの組合せで１５個体の水平上下接ぎを行い、活着後、接合部付近の今津ポンカンの胚軸組織をわずかに残して切断し、切断面の上部から発生した１７不定芽を育成した。ＲＡＰＤ検定の結果、１不定芽がキメラ不定芽として選抜され、系統番号５５がキメラ個体として得られた。
本発明においては、不定芽をキメラ候補として育成し、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により選抜するが、この場合、ＤＮＡ分析は、上記ＲＡＰＤ分析方法によるＤＮＡ分析に限らず、適宜のＤＮＡ分析／検定方法により実施することができる。
また、遺伝子産物分析としては、遺伝子の発現産物を分析する適宜の方法を利用することが可能であり、例えば、タンパク質分析、アイソザイム分析、各種の成分分析などが例示される。
【００１７】
（２）キメラ個体の葉部分析による茎頂起源層構成の確定及び新植物の作出
１）茎頂起源層構成の確定
次に、成葉が十分に展葉したキメラ個体について、葉部組織の分析により茎頂起源層構成の確定を行い、得られたキメラ個体が茎頂起源層第１層と茎頂起源層第２、３層の周縁キメラかどうかの確認を行った。葉部分析による茎頂起源層構成の確定方法は、特開平１１−１０３７０６号公報の実施例１に記載した「キメラ個体の葉部分析による茎頂起源層構成の確定および新植物の作出」と同様の手順で確定を行った。
【００１８】
以下に、茎頂起源層第１層と茎頂起源層第２、３層の周縁キメラの層構成の確定方法を詳細に説明する。
１）葉部の採取及び葉部組織の前処理
キメラ個体の葉部試料として、展開直後の黄緑色の柔らかい新葉を採取し、葉部全体を丁寧に洗浄した後、背軸面を削った。残った葉部組織は、乾燥しないように、直ちに、浸透圧を調整した下記組成の酵素希釈用緩衝液に浸漬した。
酵素希釈用緩衝液（組成）
・  １０ｍＭＣａＣｌ2
・  ０．６Ｍマンニトール
・  １．０ｍＭ  ＭＥＳ−カリウム塩
【００１９】
２）葉部酵素処理
酵素溶液は、ヤクルト薬品工業（株）社製のマセロチームＲ−１０とセルラーゼオノズカＲ−１０を使用し、酵素希釈用緩衝液を用いてこれらの酵素をそれぞれ３％及び５％を含む混合酵素液を調製し、ｐＨは５．７に調整した。
まず、ファルコン社製６０ｍｍφディッシュに酵素液１０ｍｌを分注し、これに葉部組織を入れ、４０℃、５０回／分のシーソー振とう下で６０分間酵素反応を行った。この酵素処理を２回繰り返した。
【００２０】
３）表皮細胞の精製
合計１２０分間の酵素反応の後、０．２４ＭＣａＣｌ2 溶液で２回、ＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で２回洗浄の後、更にＴＥ溶液を交換したディッシュ中に表皮細胞を移し、５℃で１晩浸漬することによって葉肉細胞の混入のない表皮細胞を単離、回収した。
【００２１】
４）葉肉細胞の回収
表皮細胞の回収が終了した酵素溶液中には葉肉細胞が浮遊している。この酵素溶液を５０μｍのナイロンメッシュで濾過した。メッシュ上の残渣を０．２４ＭＣａＣｌ2 溶液で回収液量が約４０ｍｌとなるように洗浄・回収を行った。
【００２２】
５）葉肉細胞の精製
洗浄・回収を行った葉肉細胞懸濁酵素液を１０ｍｌ容の遠沈管４本に移し、１５０×ｇで遠心した。上澄み液を捨て、残渣を０．２４ＭＣａＣｌ2 溶液に懸濁させ前述の遠心操作で２回洗浄を行った後、０．２４ＭＣａＣｌ2 溶液中で全ＤＮＡ抽出の直前まで５℃で保存した。
【００２３】
６）ＲＡＰＤ検出用テンペレートＤＮＡの抽出
表皮細胞は、ＴＥ溶液からピンセットで採取し、液切りした後、０．６ｍｌ容のマイクロチューブに移し、これに抽出用緩衝液を０．２ｍｌ加え、ＳＤＳ抽出法を１／５にスケールダウンした方法により抽出を行った。
葉肉細胞は、上記保存細胞を、抽出直前に、遠心し、抽出用緩衝液に懸濁し、表皮細胞と同様の抽出法により抽出を行った。
【００２４】
７）ＲＡＰＤ検出
葉部の組織別に抽出を行ったＤＮＡテンペレートを用いてＲＡＰＤ分析を行った結果、酵素処理により得られたキメラ個体の表皮組織では、１３００ｂｐ付近にポンカン由来の増幅ＤＮＡバンド（図３）が検出された。すなわち、系統番号５５は茎頂起源層第１層が今津ポンカンで構成されていることが確定された。
一方、酵素処理により得られたキメラ個体の葉肉細胞では、１０５０ｂｐ付近にオレンジ由来の増幅ＤＮＡバンド（図３）が検出された。すなわち、系統番号５５は、茎頂起源層第２、３層がモロで構成されていることが確定された。
その結果、系統番号５５は、茎頂起源層第１層が今津ポンカン、茎頂起源層第２、３層がモロで構成される周縁キメラ新植物であることが判った。系統番号５５から得られる果実は、果皮がモロ、果肉が今津ポンカンのそれぞれの性質を受け継ぐ、まったく新しい果実が結実することが予想される。
茎頂起源層構成の確定が終了した系統番号５５から穂木を採取し、鉢植えのカラタチ台木及び試験圃場の温州成木に高接ぎし、約１年間にわたりキメラ性の安定性試験を行った。すなわち、高接ぎを行った高接ぎ個体について発生した第１次側枝及び第２次側枝について採取可能な限り調査した結果、すべての葉がキメラ性を維持しており、上記系統は、周縁キメラであることを確認した。
【００２５】
【表１】
0003542555.tif 000002
【００２６】
次に、他の実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。
実施例２
（１）新梢組織と珠心胚実生の胚軸組織の水平上下接ぎによるモロ（新梢組織）と太田ポンカン（珠心胚実生の胚軸組織）のキメラ個体の作出及び選抜
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
本実施例においては、モロと太田ポンカンの組合せで３０個体の上下接ぎを行い、活着後接合部付近の太田ポンカンの胚軸組織をわずかに残して切断し、切断面の上部から発生した８不定芽を育成した。ＲＡＰＤ検定の結果、１不定芽がキメラ不定芽として選抜され、系統番号６５がキメラ個体として得られた。
【００２７】
（２）茎頂起源層構成の確定
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
葉部組織別に抽出を行ったＤＮＡテンペレートを用いてＲＡＰＤ分析を行った結果、酵素処理により得られたキメラの表皮組織では、１０５０ｂｐ付近にオレンジ由来の増幅ＤＮＡバンド（図５）が検出された。すなわち、系統番号６５は茎頂起源層第１層がモロで構成されていることが確定された。
一方、酵素処理により得られたキメラ個体の葉肉組織では、１３００ｂｐ付近にポンカン由来の増幅バンド（図５）が検出された。すなわち、系統番号６５は茎頂起源層２、３層が太田ポンカンで構成されていることが確定された。
その結果、系統番号６５は、茎頂起源層第１層がモロ、茎頂起源層第２、３層がポンカンで構成される周縁キメラ新植物であることが判った。系統番号６５から得られる果実は、果皮がポンカン、果肉がモロのそれぞれの性質を受け継ぐ、まったく新しい果実が結実することが予想される。
茎頂起源層構成が確定した系統番号６５から穂木を採取し、鉢植えのカラタチ台木及び試験圃場の温州成木に高接ぎし、約１年間にわたりキメラ性の安定性試験を行った。すなわち、高接ぎを行った高接ぎ個体について発生した第１次側枝及び第２次側枝について採取可能な限り調査した結果、すべての葉がキメラ性を維持しており、上記系統は、周縁キメラであることを確認した。
【００２８】
実施例３
（１）新梢組織と珠心胚実生の胚軸組織の水平上下接ぎによるモロ（新梢組織）と青島ウンシュウ（珠心胚実生の胚軸組織）のキメラ個体の作出及び選抜
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
本実施例においては、モロと青島ウンシュウの組合せで３０個体の上下接ぎを行い、活着後接合部付近の青島ウンシュウの胚軸組織をわずかに残して切断し、切断面の上部から発生した９不定芽を育成した。ＲＡＰＤ検定の結果、１不定芽がキメラ不定芽として選抜され、系統番号６６がキメラ個体として得られた。
【００２９】
（２）茎頂起源層構成の確定
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
葉部組織別に抽出を行ったＤＮＡテンペレートを用いてＲＡＰＤ分析を行った結果、酵素処理により得られたキメラの表皮組織では、１３００ｂｐ付近にウンシュウ由来の増幅ＤＮＡバンド（図７）が検出された。すなわち、系統番号６６は茎頂起源層第１層が青島ウンシュウで構成されていることが確定された。
一方、酵素処理により得られたキメラ個体の葉肉組織では、１０５０ｂｐ付近にオレンジ由来の増幅バンド（図７）が検出された。すなわち、系統番号６６は茎頂起源層２、３層がモロで構成されていることが確定された。
その結果、系統番号６６は、茎頂起源層第１層がウンシュウ、茎頂起源層第２、３層がモロで構成される周縁キメラ新植物であることが判った。系統番号６６から得られる果実は、果皮がモロ、果肉がウンシュウのそれぞれの性質を受け継ぐ、まったく新しい果実が結実することが予想される。
茎頂起源層構成が確定した系統番号６６から穂木を採取し、鉢植えのカラタチ台木及び試験圃場の温州成木に高接ぎし、約１年間にわたりキメラ性の安定性試験を行った。すなわち、高接ぎを行った高接ぎ個体について発生した第１次側枝及び第２次側枝について採取可能な限り調査した結果、すべての葉がキメラ性を維持しており、上記系統は、周縁キメラであることを確認した。
【００３０】
実施例４
（１）シークワシャー及びハムリンオレンジの胚軸組織の水平上下接ぎによるキメラ個体の作出及び選抜
１）水平上下接ぎ・カット・不定芽育成
台木とする実生の胚軸部を子葉から上約１．５〜２．０ｃｍを水平に切断し、その下部を台木とし、穂木とする実生の胚軸部を子葉から上約１．５〜２．０ｃｍを水平に切断し、その上部を穂木として、台木胚軸組織の切断面に穂木胚軸組織の切断面を密着させ、接合部を固定した後、接ぎ木苗を透明プラスチック容器で覆った。この接ぎ木苗を恒温恒湿室（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）で２週間育成し、接ぎ木部の活着を完了した。活着後穂木の胚軸組織がわずかに残るように接合部の上部を水平にカットし、通常の恒温恒湿室（２６℃、湿度７０％、蛍光灯１４時間日長）で育成した。水平上下接ぎ苗の水平切断面の上部全面から発生するすべての不定芽はキメラ候補として育成した。キメラ個体の選抜は実施例１と同様に行った。
本実施例においては、シークワシャー（台木）及びハムリンオレンジ（穂木）の組合せで３０個体の上下接ぎを行い、切断面の上部から発生した４３不定芽を育成した。ＲＡＰＤ検定の結果、１不定芽がキメラ不定芽として選抜され、系統番号７１がキメラ個体として得られた。
【００３１】
（２）キメラ個体の葉部分析による茎頂起源層構成の確定及び新植物の作出
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
葉部組織別に抽出を行ったＤＮＡテンペレートを用いてＲＡＰＤ分析を行った結果、酵素処理により得られたキメラの表皮組織では、１３００ｂｐ付近にシークワシャー由来の増幅ＤＮＡバンド（図９）が検出された。すなわち、系統番号７１は茎頂起源層第１層がシークワシャーで構成されていることが確定された。
一方、酵素処理により得られたキメラ個体の葉肉組織では、１０５０ｂｐ付近にオレンジ由来の増幅バンド（図９）が検出された。すなわち、系統番号７１は茎頂起源層２、３層がハムリンオレンジで構成されていることが確定された。
その結果、系統番号７１は、茎頂起源層第１層がシークワシャー、茎頂起源層第２、３層がオレンジで構成される周縁キメラ新植物であることが判った。系統番号７１から得られる果実は、果皮がオレンジ、果肉がシークワシャーのそれぞれの性質を受け継ぐ、まったく新しい果実が結実することが予想される。
茎頂起源層構成が確定した系統番号７１から穂木を採取し、鉢植えのカラタチ台木及び試験圃場の温州成木に高接ぎし、約１年間にわたりキメラ性の安定性試験を行った。すなわち、高接ぎを行った高接ぎ個体について発生した第１次側枝及び第２次側枝について採取可能な限り調査した結果、すべての葉がキメラ性を維持しており、上記系統は、周縁キメラであることを確認した。
【００３２】
実施例５
（１）寧波キンカン及びハムリンオレンジの胚軸組織の水平上下接ぎによるキメラ個体の作出及び選抜
１）水平上下接ぎ・カット・不定芽育成
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
本実施例においては、寧波キンカン（穂木）及びハムリンオレンジ（台木）の組合せで３０個体の上下接ぎを行い、活着後接合部付近の寧波キンカンの胚軸組織をわずかに残して切断し、切断面の上部から発生した３９不定芽を育成した。ＲＡＰＤ検定の結果、１不定芽がキメラ不定芽として選抜され、系統番号８３がキメラ個体として得られた。
【００３３】
２）キメラ個体の葉部分析による茎頂起源層構成の確定及び新植物の作出
方法・手順は、実施例１と同様に行った。
葉部組織別に抽出を行ったＤＮＡテンペレートを用いてＲＡＰＤ分析を行った結果、酵素処理により得られたキメラの表皮組織では、１３００ｂｐ付近にキンカン由来の増幅ＤＮＡバンド（図１１）が検出された。すなわち、系統番号８３は茎頂起源層第１層が寧波キンカンで構成されていることが確定された。
一方、酵素処理により得られたキメラ個体の葉肉組織では、１０５０ｂｐ付近にオレンジ由来の増幅バンド（図１１）が検出された。すなわち、系統番号８３は茎頂起源層２、３層がハムリンオレンジで構成されていることが確定された。
その結果、系統番号８３は、茎頂起源層第１層がキンカン、茎頂起源層第２、３層がオレンジで構成される周縁キメラ新植物であることが判った。系統番号８３から得られる果実は、果皮がオレンジ、果肉がキンカンのそれぞれの性質を受け継ぐ、まったく新しい果実が結実することが予想される。
茎頂起源層構成が確定した系統番号８３から穂木を採取し、鉢植えのカラタチ台木及び試験圃場の温州成木に高接ぎし、約１年間にわたりキメラ性の安定性試験を行った。すなわち、高接ぎを行った高接ぎ個体について発生した第１次側枝及び第２次側枝について採取可能な限り調査した結果、すべての葉がキメラ性を維持しており、上記系統は、周縁キメラであることを確認した。
【００３４】
これまでのキメラ個体の作出は、寄せ接ぎあるいは貼り接ぎといった材料が珠心胚実生の胚軸組織に限定された接ぎ木方法を利用しており、元の種の形質をほぼ同様にキメラ個体に発現させるためには、珠心胚実生の得られる種を材料に用いなければならず、珠心胚実生の得られない単胚性の種や種子の得にくい種については、キメラ個体の構成種として用いることに制限があった。
しかし、本発明の新しい水平上下接ぎ木方法によれば、不定芽の発生の認められる組織であれば供試することが可能であり、キメラ個体作出にすべてのミカン科植物を用いることが可能となり、キメラ個体をあらかじめ計画的に設計／作出する場合に、いろいろな優良形質を持ち合せた種の中から珠心胚実生が得られる種に限定されることなく選択し、供試することが可能となった。
【００３５】
また、本発明においては、水平上下接ぎの水平切断面の上部全面から発生する不定芽はすべてキメラ候補として育成するため、これまでの接ぎ木方法のように接合部分から発生する不定芽を実体顕微鏡下で観察しながら選抜し、これ以外の部位から発生した不定芽は切除するといった作業を行う必要がないので、従来の作出方法と比較すると、観察による不定芽の選抜作業にかかる多大な時間と労力を別の作出作業にかけることが可能となり、その結果、合成キメラ作出における作業効率は飛躍的に向上した。
【００３６】
本発明の好適な一例であるミカン科の合成周縁キメラ新植物は、果皮と果肉が異なる種から構成されているため、得られたキメラ植物体の果実は、果皮と果肉において、香り、色、香味の構成が既存種にないキメラ果実を結実する植物体である。また、本発明により、既存種の優れた特性がほぼ直接的に形質発現されたキメラ植物体であって、これらの特性を組合せて作出されたミカン科の合成周縁キメラの新植物が提供される。
【００３７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、合成キメラ植物を効率的に作出／育成する方法であって、合成キメラを構成する２種の植物組織を上部と下部になるよう配置し、接合面は水平に接ぎ木を行い、接合部から上部組織をわずかに残し、水平に切断を行い、切断面の上部全面から発生するすべての不定芽を育成し、ＤＮＡあるいは遺伝子産物分析により合成キメラを効率的に作出／育成することを特徴とする合成キメラ植物の生産方法に係るものであり、本発明の水平上下接ぎ方法を利用することにより、１）合成キメラ作出に用いる２種の元の種を計画的に選択する際、珠心胚実生が得られない種、あるいは得ることが困難な種についても、新梢組織を用いることで供試可能となり、珠心胚実生を用いる場合と比べ、果実の特性において、より元の種に近い形質発現が可能となる、２）また、本発明に用いることのできる材料は、従来の材料の珠心胚実生の胚軸組織の他に新梢組織あるいは不定芽の発生する組織であれば供試可能であり、前述の合成キメラ構成種の選択の範囲を大幅に拡げただけでなく、供試できる材料の選択の範囲も拡げることが可能となる、３）更に、従来の寄せ接ぎの方法では、接合部から発生した不定芽以外は、実体顕微鏡下で切除しなければならない検鏡による選抜作業があり、これに多大な時間と労力を要していたが、本発明の接ぎ木によるキメラ作出方法では、この作業が必要ないため、作業効率の飛躍的な向上が図られる、４）このため、従来の方法による合成キメラ作出に供試する元の種及び材料に制限されることがなく、また、実体顕微鏡による選抜作業も必要としないことから、キメラ果実の設計において、形質の計画的な組合せの選択肢が拡がり、作業効率においても飛躍的に向上するため、より効率的で合理的な合成キメラの作出／育成が可能となる、等の格別の効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】水平上下接ぎ方法の説明図を示す。
【図２】ミカン科の合成周縁キメラ新植物系統番号５５の植物体の写真を示す。
【図３】系統番号５５の組織別ＲＡＰＤ分析結果を示す。
【図４】ミカン科の合成周縁キメラ新植物系統番号６５の植物体の写真を示す。
【図５】系統番号６５の組織別ＲＡＰＤ分析結果を示す。
【図６】ミカン科の合成周縁キメラ新植物系統番号６６の植物体の写真を示す。
【図７】系統番号６６の組織別ＲＡＰＤ分析結果を示す。
【図８】ミカン科の合成周縁キメラ新植物系統番号７１の植物体の写真を示す。
【図９】系統番号７１の組織別ＲＡＰＤ分析結果を示す。
【図１０】ミカン科の合成周縁キメラ新植物系統番号８３の植物体の写真を示す。
【図１１】系統番号８３の組織別ＲＡＰＤ分析結果を示す。
【符号の説明】
Ａ  ミカン科植物の組織（Ａ種）
Ｂ  ミカン科植物の組織（Ｂ種）
Ｃ  キメラ候補不定芽
ａ  ユズ実生胚軸部分を切断する工程
ｂ  Ａ種組織をユズ台に切り接ぎする工程
ｃ  活着後、Ａ種の組織を切断する工程
ｄ  直ちにＢ種の組織をＡ種の組織の上部に水平に接ぎ木を行う工程
ｅ  Ａ種とＢ種の活着後、Ｂ種の組織をわずかに残して切断する工程
ｆ  蒸留水等で直ちに切断面を覆い、透明プラスチックカップを被せ暗所で数
日間育成後、通常の育成方法でキメラ候補不定芽（Ｃ）の育成を行う工程
（図３の符号の説明）
Ｍ  Ｍａｒｋｅｒ  ４（φＸ１７４／ＨａｅIII   Ｄｉｇｅｓｔ）
１  ポンカン全葉
２  オレンジ全葉
３  系統番号５５の全葉
４  系統番号５５の表皮組織由来ＤＮＡの増幅ＤＮＡバンド
５  系統番号５５の葉肉細胞由来ＤＮＡの増幅ＤＮＡバンド
（図５の符号の説明）
Ｍ  Ｍａｒｋｅｒ  ４（φ×１７４／ＨａｅIII   Ｄｉｇｅｓｔ）
１  ポンカンの全葉
２  オレンジの全葉
３  系統番号６５の全葉
４  系統番号６５の表皮組織由来のＤＮＡの増幅バンド
５  系統番号６５の葉肉組織由来のＤＮＡの増幅バンド
（図７の符号の説明）
Ｍ  Ｍａｒｋｅｒ  ４（φ×１７４／ＨａｅIII   Ｄｉｇｅｓｔ）
１  ウンシュウの全葉
２  オレンジの全葉
３  系統番号６６の全葉
４  系統番号６６の表皮組織由来のＤＮＡの増幅バンド
５  系統番号６６の葉肉組織由来のＤＮＡの増幅バンド
（図９の符号の説明）
Ｍ  Ｍａｒｋｅｒ  ４（φ×１７４／ＨａｅIII   Ｄｉｇｅｓｔ）
１  シークワシャーの全葉
２  オレンジの全葉
３  系統番号７１の全葉
４  系統番号７１の表皮組織由来のＤＮＡの増幅バンド
５  系統番号７１の葉肉組織由来のＤＮＡの増幅バンド
（図１１の符号の説明）
Ｍ  Ｍａｒｋｅｒ  ４（φ×１７４／ＨａｅIII   Ｄｉｇｅｓｔ）
１  キンカンの全葉
２  オレンジの全葉
３  系統番号８３の全葉
４  系統番号８３の表皮組織由来のＤＮＡの増幅バンド
５  系統番号８３の葉肉組織由来のＤＮＡの増幅バンド
【図１】
0003542555.tif 000003
【図２】
0003542555.tif 000004
【図３】
0003542555.tif 000005
【図４】
0003542555.tif 000006
【図５】
0003542555.tif 000007
【図６】
0003542555.tif 000008
【図７】
0003542555.tif 000009
【図８】
0003542555.tif 000010
【図９】
0003542555.tif 000011
【図１０】
0003542555.tif 000012
【図１１】
0003542555.tif 000013