(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
0003578762.tif 000021
で示されるゲンタマイシンC1aを単独成分（monocomponent）として生産する、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Micromonospora echinospora）CGMCC0197株。
【請求項２】
（ａ）ミクロモノスポラ・エチノスポラ変異体CGMCC0197を醗酵させることにより、単独成分のゲンタマイシンC1aを生産し、醗酵培地からゲンタマイシンC1aを回収し；そして
（ｂ）ゲンタマイシンC1aの１−アミノ基を選択的にエチル化し、得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを回収すること
を含む半合成１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aの製造方法。
【請求項３】
ゲンタマイシンC1aを醗酵培地から陽イオン交換樹脂及び吸着樹脂のいずれか一方若しくは両方を用いて抽出し、精製することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
醗酵培地から回収されたゲンタマイシンC1aの、１−アミノ基以外の、第１級アミノ基を、前記Ｎ−エチル化の前に非プロトン性極性溶媒中で選択的に保護し、次いで、該保護されたゲンタマイシンC1aを陽イオン交換樹脂を用いて抽出することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単離された保護されたゲンタマイシンC1aを、アセトアルデヒドによる反応及び中間体シッフ塩基の水素化によってＮ−エチル化し、得られた保護された１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを脱保護して、該１−Ｎ−ゲンタマイシンC1aを生産することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを、吸着樹脂を用いて、反応混合物から抽出することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
醗酵培地から回収したゲンタマイシンC1aの、１−アミノ基以外の第１級アミノ基を、前記Ｎ−エチル化の前に、非プロトン性極性溶媒中で選択的に保護し、次いで、保護されたゲンタマイシンC1aを、陽イオン交換樹脂を用いて単離することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記単離された保護されたゲンタマイシンC1aを、アセトアルデヒドによる反応及び中間体シッフ塩基の水素化によってＮ−エチル化し、得られた保護された１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを脱保護して、前記１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを生産することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを、吸着樹脂を用いて、反応混合物から抽出することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）ミクロモノスポラ・エチノスポラCGMCC0197株を醗酵させることによって単独成分のゲンタマイシンC1aを生産し、醗酵培地からゲンタマイシンC1aを回収し；
（ｂ）該ゲンタマイシンC1aの１−アミノ基を選択的にエチル化し、得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを回収し；そして
（ｃ）医薬的に有効量の該１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1a又はその塩を、医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせて、抗菌性組成物を製造すること
を含む半合成１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1a又はその医薬的に許容可能な酸付加塩を含む抗菌性組成物の製造方法。
【請求項１１】
ゲンタマイシンC1aを、陽イオン交換樹脂及び吸着樹脂のいずれか一方若しくは両方を用いて、醗酵培地から抽出し、精製することを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
醗酵培地から回収されたゲンタマイシンC1aの、１−アミノ基以外の、第１級アミノ基を、前記Ｎ−エチル化の前に、非プロトン性極性溶媒中で選択的に保護し、次いで、該保護されたゲンタマイシンC1aを、陽イオン交換樹脂を用いて抽出することを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離された保護されたゲンタマイシンC1aを、アセトアルデヒドによる反応及び中間体シッフ塩基の水素化によってＮ−エチル化し、得られた保護された１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを脱保護して、該１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを生産することを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを、吸着樹脂を用いて反応混合物から抽出することを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
醗酵培地から回収されたゲンタマイシンC1aの、１−アミノ基以外の、第１級アミノ基を、前記Ｎ−エチル化の前に、非プロトン性極性溶媒中で選択的に保護し、次いで、保護されたゲンタマイシンC1aを、陽イオン交換樹脂を用いて単離することを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離された保護されたゲンタマイシンC1aを、アセトアルデヒドとの反応及び中間体シッフ塩基の水素化によってＮ−エチル化し、得られた保護された１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを脱保護して、該１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを生産することを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記得られた１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aを、吸着樹脂を用いて反応混合物から抽出することを特徴とする請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は微生物と抗生物質の分野に関する。具体的に言えば，それは１種の新しい変異菌株及び其の誘導変異育種方法に関するものであり、かつまた、該新菌株を利用して、単一成分のゲンタマイシンC1aを生産し、それを半合成の１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体の有用な中間体（母材）とする，さらに該半合成の１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体を活性成分として、医薬上受け入れ可能の添加剤と共に組成物を構成させる製造方法に関するものである。
背景技術
周知の如く，現在の菌株発酵生産によるゲンタマイシン（GMと略称する）は三つの主要成分がある。すなわち：ゲンタマイシンC1（GMC1）、ゲンタマイシンC2（GMC2）とゲンタマイシンC1a（GMC1a）である。ゲンタマイシンの品質と治療効果は上記３種類の成分の含有量の多寡と密切な関係がある。中国科学院の楊蘊劉諸氏が曾て1982年「抗生物質」７（１）の12〜15においての報導によればGMC1,GMC2,GMC1aの単独成分が74株の臨床分離して得た緑膿菌の最小抑制濃度（MIC）及び各成分のLD50の値について調べると、GMC1aの成分が割リに良いと認められる。但し，多成分のゲンタマイシンの中から分離純粋化して単独成分となるゲンタマイシン（GMC1、CMC2とGMC1a）には，復雑なプロセスと設備が必要なので，製品の生産コストアップとなるようになり、これがため,1種のゲンタマイシン単独成分の菌株を生産して以て上記の欠点を克服する必要がある。他の面では，アミノ基グリコシド類の抗生物質とするゲンタマイシンは1963年から米国シリングコーポレーション（Schering corporation）のウェステン（Ｍ・Ｊ・Weisten）諸氏が最初に発見して,1966年市場に出回る以来，すでに20年の暦史があるが，今なお人たちに広範に使用されている。しかしながら，それに伴ってきた，ゲンタマイシンの耳、腎臓に対する毒副作用があるため，医療における使用は一定の制限を受けた，近頃,1種類の耳、腎臓に対し毒副作用が低く、抗菌効力が高い、特に耐ゲンタマイシン菌株に対処して有効な新型ゲンタマイシンの開発が広く重要視を受けている。
これがために，この文献中について，米国特許4,2 30847号で掲示されたアミノ基グリコシド抗生物質は，其の中の或るいくらかのアミノ基は選択性の保護を受けたゲンタマイシン誘導体である。米国特許の4,063,015と4,044,123で掲示したように1,3,2′−トリ−Ｎ−アセチルゲンタマイシンは１種の抗生物質と６′−Ｎ−アルキル基アミノ基グリコシドの有用な中間体である，また，カナダ特許1034573号で掲示された１種の１−Ｎ−で取って代わった4,6−ジ−アミノ基グリコシル基−1,3−ジ−アミノ基シクリトール類の製造方法もあるが，参考としてここで述べておく。
既知の技術の中で，目下まだゲンタマイシン誘導体の単独成分を生産する菌株及び此の種の菌株の発酵によって生産したゲンタマイシン誘導体を中間体（母材）として半合成１−Ｎ−エチル基で取って代わつたゲンタマイシン誘導体と其の組合物の報導はない。［１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aはエテミシン（Etimicim）と名付ける。］
本発明の内容。
本発明の目的は次のものを提供するに在る。即ち１種のゲンタマイシンC1a単独成分を生産する菌株である。該菌株はすでに1993年４月23日において中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（略称CGMCC）に保存された，登録記帳番号CGMCC0197のMicromonospora echinosporaである。
上記CGMCCへの該菌株の原寄託は、1995年11月７日付で、ブタペスト条約に基づく国際寄託に変更されている。
１種のゲンタマイシンC1a単独成分の菌株の突然変異育種方法で以てMicromonospora echinospora JIM−401を紫外線で３分間の照射を経て0.5％（重量）のLiClで30分間処理した後の単胞子の懸濁液をミクロノマイシン（MCR）粗製品を含む（2000μg/ml）の平板の上に塗敷して,37℃の下に14日培養してから単独集落を選び，選びを経てMicromonospora echinospora,CGMCC0197を得た。
本発明のもう１つの目的は次のものを提供するに在り。
すなわち,1種の次の如き構造成による半合成抗生物質１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシン誘導体または其の塩の製造方法である。
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以下の段取りを含む。すなわち，母材とするゲンタマイシンC1、ゲンタマイシンC2、ゲンタマイシンC1aまたはゲンタマイシンC2bを非陽子極性の溶剤中に溶解させ，二元過渡金属酢酸塩の存在の下に，母材の１−Ｎ−位上のアミノ基を除く外のアミノ基を，アシル基供給体がアシル化保護を経て、さらに還原剤とアセトアルデヒド存在の下で。母材の１−Ｎ−位上のアミノ基を反応させて，エチル・アミノ基となりさせる，続けて，加水分解によって，アシル基保護基を取り除き，或いは一歩進んで酸と反応して塩となる。
其の特徴として，上記の母核がゲンタマイシンC1aとなり,CGM−CC0197によって，発酵を経てゲンタマイシンC1aの発酵液が得られるイオン交換抽出した後に，成分が90％以上のゲンタマイシンが得られる。また，
其の特徴が上記母材のゲンタマイシンC1aの製造方法であり，次の段取りが含まれている。
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本発明のさらに一歩進んでの目的は次のものを提供するものである。
１種の次の如き構造式の半合成の抗生物質１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体或は其の塩である。
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其の特徴としては,R5がエチル基で,R1とR2は同じもの或は異るものでもよい，それぞれ水素原子またはメチル基である。
また，その特徴はR5＝C2H5及びR1＝R2＝H,またはR1＝H,R2＝CH3。また，その特徴はR1＝R2＝H,R5＝C2H5である。
本発明のまた１つの目的は次のものを提供するに在る。
１種の半合成の抗生物質１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体或はその塩の組合物で，その特徴は0.01〜99.99％重量の次の構造式の活性成分を含んでいる。
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と99.99％〜0.01％重量の医薬上受け入れられるキゃリアである。
其の特徴は上記活性に成分構造式中でR5＝C2H5及びR1＝R2＝H,またはR1＝H,R2＝CH3である。
其の特徴は，また，上記活性成分構造式中では,R5＝C2H5及びR1＝R2＝Ｈである。
以下，付図とより良い実施例を挙げてさらに詳しく説明する。
付図略述
図１は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aの赤外吸収光スペクトル図。
図２は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aの紫外吸収の光スペクトル図。
図３は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aの1H核磁気共鳴図。
図４は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aの13C核磁気共鳴図。
図５は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aのマス・スペクトル図。
図６はCGMCC0197菌株発酵の産物の硅酸ゲルＧ薄層での階層分析図。
図７はCGMCC0197菌株発酵の産物の紫外吸収光スペクトル図。
図８はCGMCC0197菌株発酵の産物の赤外吸収光スペクトル図。
図９はCGMCC0197菌株発酵の産物の核磁気共鳴スペクトル図。
図10はCGMCC0197菌株発酵の産物のマス・スペクトル図。
本発明の最もよい実施方法
一、１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aの製造：
1.菌株の誘導変異によってCGMCC0197が生まれる。
Micromonospora echinospora JIM−401が菌株発生するため，紫外線光で３分間照射を行い0.5％のLiClで30分間処理してから懸濁液でミクロノマイシン粗製品（2000μg/ml）の平板の上塗敷して,37℃の下で14日培養の後，単独の菌落を選び出して，
0003578762.tif 000006
選びを経て,CGMCC0197が得られる，然る後斜面培養してから，砂土管を作って（または冷凍管にて）保存する。
2.母核ゲンタマイシンC1a（GMC1a）の製造。
ゲンタマイシンC1aの単独成分菌種CGMCC0197（発酵効価800μg/ml程度,GMC1a成分85％以上）三級発酵を経て,GMC1a発酵液が得られ，イオン交換抽出の後，含有量が90〜95％GMC1aが得られて，半合成用供じられる。
0003578762.tif 000007
ミクロノマイシン生産する時，その分離工程においてミクロノマイシンを分離する時，一定純度のGMC1aが得られ。純度より高いGMC1aも直接半合成用に供せられる。
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実施例1:誘導変異育種によるCGMCC0197の生産方法。
Micromonospora echinospora JIM−401斜面１本を取り,10ml滅菌水を加えて胞子をけずり取ってガラス棒の付いた三角瓶に入れ置き,15分間振蕩してから，無菌フィルター紙で濾過して単胞子懸濁液が得られる，適当に希釈した後,0.3％のLiClを加えて,30℃の下で30分間の誘導変異処理を行ってから,30Wの紫外光の下で３分間照射した後，処理液は滅菌水で希釈してから,2000μg/mlのミクロノマイシン粗製品を含有する平ら皿の上に塗敷する，この平ら皿を35℃の下で14日培養を行い，単菌落を斜面に伝え，単菌落斜面を37℃下で８日培養する，取り出してから発酵振り瓶に移植する,35℃の下で回転式振床培養を６日行い，発酵フィルター液を取り，薄層の階層分析鑑別を経て,CGMCC0197が選び得られたわけである。該変種は親株と培養特徴、生理生物化学、炭素源利用等等に発酵産物などの比較においては，いずれも，著しい差別がある。該親株は元来，ミクロノマイシンの生産菌で，其の発酵産物は主としてミクロノマイシンが60〜70％を占め,GMC1aが20％あたりを占めているが,CGMCC0197変種の発酵産物は単成分で，薄層クロマト、紫外光スペクトル赤外光スペクトルと核磁気共鳴及びマス・スペクトルの鑑定によって，ゲンタマイシンC1a（GMC1a）であることが確認された。
上記２つの菌株の培養特徴、生理生物化学特徴と炭素源利用の比較についてはそれぞれ表１−３をご参照して下さい。
CGMCC0197菌株について全細胞加水分解物のアミノ基酸分析では其れにグリココルとメソ形−ジ−アミノ基ビメリック酸が含まれることを明かに表示しといる。
薄層クロマト：
CGMCC0197菌株発酵産物は硅酸ゲルＧ薄層クロマト上において主として１つの斑点と呈しており。そのRf値はGMC1aと同じ（図６）である。
図７から解けるように抗生物質に紫外線吸収は末端吸収であることはアミノ基グリコシド類抗生物質の性と合致している，図８の赤外吸収光スペクトル中では，該抗生物質が典型的なアミノ基グリコシド類抗生物質の特性が明かに示している。
該抗生物質のNMR各プロトン信号は図９に表示されており，それは文献のGMC1aと全く一致している。図10から見られた該抗生物質MSの各分子イオンの断片ピークと文献の値は一致している。その（Ｍ＋１）ピークは450（即ち分子量が449で）ゲンタマイシンC1aの分子量が同じで，これがため,UV、IR、NMR、MSなどの４つ大類のスペクトル解析から解けるように該抗生物質とゲンタマイシンC1aとは同質である。
実施例2,ゲンタマイシンC1aの製造：
CGMCC0197菌種胞子の懸濁液を100L種子培養液の中に接種する,35℃±0.5℃の中で通気（1.2V・V-1・min-1），攪拌（230rpm）の下で40時間培養してから,6500Lの発酵培養液の中へ入れる，通気0.5V・V-1・min-1開始して,6時間の後，通気1.0V・V-1・min-1,34℃±0.5℃の下で攪拌（180rpm）140時間培養する。その間に,24時間と60時間の時に原料1500L補足し,84時間の時に1000Lの水を補足する。最後にGMC1aを含有する発酵液9000L（生長測定力価880μg/ml）が得られた。発酵液を濃塩酸でpH2.5に調節し,70℃まで加熱する,10分間保持して6mol・L-1の水酸化ナトリウムで,pH6.8に戻し調節して、樹脂732（NH4+）120Lを加え入れる，攪拌吸着５時間。樹脂を
0003578762.tif 000009
出し，すすいでから柱状容器に入れる，
0003578762.tif 000010
してから,2mol・L-1解析を行い，溶出液はC290（OH-）柱を経て脱色の後，減圧して80Lまで濃縮され,450L YPR−II樹脂柱（40×400cm）に吸着する，
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の後,20％のアルコール水溶液で解析を行い,GMC1a成分の溶出液を50Lまで減圧濃縮して，冷凍干燥の後，純度90％〜95％のGMC1a粉末6050gが得られた。
＊732（NH4+）とC290（OH-）樹脂は中国上海樹脂工場の製品である。
＊YPR−II樹脂は中国揚州製薬工場の生産した吸着型大穴樹脂である。
実施例３、硫酸ゲンタマイシンC1aの製造：
CGMCC0197菌種胞子懸濁液を中に100ml種子培養液を含有する500ml種子瓶の内に接種する,35℃±0.5℃の下で40時間振床培養（220rpm）して、５つの種子瓶の種子液を10L発酵培養液内に接種する，通気（1V・V-1・min-1），攪拌して,35℃±0.5℃の下で120時間培養する，その間に水を補充して以て発揮された水分を補う。GMC1aを含有する発酵液9.5L（生長測定力価820μg/ml）をしゅう酸でpH3まで調節すると共に70℃まで加熱し,10分間保持してから,6mol・L-1のNaOHでpH6.8まで戻し調節してから濾過する，濾過液は120ml732（NH4+）樹脂柱で吸着する。水洗の後,2mol・L-1アンモニア水で解析する，溶出液は先ず120molの711（OH-）樹脂柱で脱色の後，減圧濃縮して60mlとなり,3mol・L-1のH2SO4でpH5を調節する,5gの活性炭を加え,60℃の下で30分間保持しとから，濾過する，濾過液を冷凍干燥して,GMC1a硫酸塩9gが得られ、その純度は90％〜95％であった。
実施例4,1−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aの製造。
（１）GMC1a（10g,22mmol）をジメチルスルホキシド400mlに溶解する，温度を25℃に保持し，攪拌しながら，テトラ水和酢酸コバルト（11g,44mmol）を加えて,20分間反応させる。混合液中に新鮮に調製した1mol・L-1の無水酢酸（テトラヒドロフランで調製する）溶液56mlを加入して,1時間攪拌する，反応液には500mlの水を加えて，混合して,2mol・L-1HClでpH4まで調節する,732（NH4+）樹脂に通し入れて吸着させ，水洗によって有機溶剤を除去してから,2mol・L-1のNH3・H2Oで解析する。溶出液が減圧濃縮されて100mlとなり,H2Sガスを通し入れる，濾過する（硅藻土で濾過に助ける）濾液が50mlまで真空濃縮されて，冷凍干燥して3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC1a（収率80％，純度85％）12.2gを得た。
（２）１−Ｎ−エチル−3,2',6'−トリ−Ｎ−アセチルGMC1aの製造。
3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC1a10gを取り,200mlの水の中に溶解する,1mol・L-1HClでpH2.5まで調節する，氷水浴で温度３℃に保持して,10mlの40％のアセトアルデヒド−テトラヒドロフラン（1:1）溶液を加え，攪拌しながら,2.5％のナトリウム・ボロハイドライド水溶液を滴下してpH4までにする,1時間反応させる。上記の操作を繰り返えして3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC1aが完全に転化するまでに進む（TLC検出，層析展開システム：クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝2:1:1）。反応液を減圧濃縮して，アセトアルデヒドを除去してから,YPR−II樹脂柱（40×500mm）にて，層析分離を行い,5％,10％,20％のアルコール水溶液（0.5mol・L-1のアンモニア水を含む）で溶出する,1−Ｎ−エチル−3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC1aの溶出液を収め集めて，合せて濃縮して，冷凍干燥の後,5.6g（収率は62％）を得た。
（３）１−Ｎ−エチルGMC1aの製造。
１−Ｎ−エチル−3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC1a5gを取り,1mol・L-1NaOH100mlの溶液で溶解し,100℃の下で還流加水分解48時間行う。室温まで冷却かつ1000mlまで希釈し。732（H+）樹脂にてpH9まで調節する。樹脂を濾出して，柱に入れる，水洗してから,2mol・L-1アンモニア水で解析する，溶出液を減圧濃縮の後,YPR−II樹脂柱（25×300mm）で層析分離を行い,5％,7.5％,15％のアルコール水溶液（0.5mol・L-1のアンモニア水を含む）で溶出する。成分が90％以上の含有量の１−Ｎ−エチルGMC1aの溶出液を収集し，減圧濃縮の後，冷凍干燥して2.7g（収率70％）を得た。
（４）１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩の製造。
１−Ｎ−エチル基GMC1a2gを取り，水15mlの中に溶解し,H2SO4を3mol・L-1,3.5ml加えてpH5.8まで調節する。活性炭1gを加えし,60℃の下で30分間脱色を行う，濾過してから，濾過液を冷凍干燥して,1−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩（収率91％）3.2gを得た。
実施例４の製品について計器で分解測定して次の通りである。
一、赤外吸収光スペクトル（付図１参照）
計器:399−Ｂ（V,S,PECO）。
条件:KBr圧片テスト。
IRが解析によって，該分子の中に−NH,−NH2,−OH,不対称−CH2−，−３−CH3とＣ−Ｏ−Ｃなどの官能基があることを明かに表わしている，それは典型的なアミノ基グリコシド抗生物質の赤外光スペクトルである。
二、紫外吸収光スペクトル（付図２参照）
計器：島津UV−240紫外分光光度計
溶剤:H2O
200nm−400nmに吸収ピークがない。
解析説明：
アミノ基グリコシド抗生物質特性が備われている。
三、Ｈ核磁気共鳴スペクトル（付図３参照）
計器:AM500核磁気共鳴計（BRUKER公司）
溶剤:D2O,TMSを内標とする，共鳴周波数は500.13である。
1H−NMRから分子の中に１−Ｎ−CH2CH3があることが解かる。
四、13CNMR核磁気共鳴スペクトル（付図４参照）
計器:AM−500核磁気共鳴計
溶剤:D2O,TMSを内標とする（13C共鳴周波数は125.76である）
図の中には21個のピークがあり，分子中の21個の炭素に対応しているので，対称性のないことを物語っている。
δ47.02は１−Ｎ−CH2CH3中のメチレン上のＣ。
δ16.43は１−Ｎ−CH2CH3中のメチル上のＣである。
故に13C−NMRスペクトルかろら解かるように化学構造はゲンタマイシンC1aの２−デオキシストレプタミン１−Ｎ位上の水素プロトンがエチル基によって取って代わられたことが解かる。
五、マス・スペクトル（付図５参照）
計器:ZAB−2F型マス・スペクトル計
条件:EI源
マス・スペクトルは分子イオンピーク＋１（Ｍ＋１）＋は478であることを測定する，すなわちその分子量は477で,C21H43N5O7の分子量とふさわしく，せの他の各m/eも均しく文献値と一致している。
綜合解析：
１、マス・スペクトルにおいて，其の分子イオンピークm/eは477で,C12H43N5O7に符合している。
２、マス・スペクトルで測定したm/e317とm/e258は１−Ｎ−エチル・ゲンタマイシンC1aから分解されてさた断片ピークであるが,3−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aから分解されてきた断片ピーク（m/e289t m/e286）は無い。
３、核磁気共鳴図スペクトルの中で,1H,13C,H−1H,H−13C−NMRは均しくジデオキシストレプタミン１−Ｎ位上の水素プロトンがエチルに取って代わられたことが確認された。
４、赤外光スペクトルと紫外光スペクトルは皆アミノ基グリコシド類抗生物質の基本特性を持つことが確認されている。
実施例５、１−Ｎ−エチルGMC2bの製造。
（１）3,2′−ジ−Ｎ−エチルGMC2bの製造
GMC2b（1g,2.16mmol）を40mlのジメチルスルホキシドの中に溶解し，攪拌溶解を完全に行った後，温度を25℃に保持して，この溶解液の中にテトラ水和酢酸コバルト（1.1g,4.42mmol）を加え，充分に攪拌して,20分間の後，混合物中に1mol・L-1の無水酢酸（テトラヒドロフランで調製する）溶液6.5mlを加える。１時間攪拌して，反応終ろ後に強酸性陽イオン交換樹脂（アンモニウム型）柱にかけた,2mol・L-1アンモニア水で溶出する，溶出液を30mlまで濃縮して,H2Sガスを通入して，あらゆるCo2+が沈でんしてCoSとなり，濾過を行い，濾過液を減圧濃縮して，冷凍干燥してから,3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC2b（1.05g,収率は80％）を得た。
（２）１−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC2bの製造。
上記の3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC2b（1.05g,1.73mmol,純度90％）を取り,30mlの水中に溶かす,1mol・L-1HClを加えてpH2.5まで調節する,3℃まで氷浴冷却する。2ml1mol・L-1のアセトアルデヒド−テトラヒドロフラン溶液（2.0mmol）を加え入れる,10分間攪拌する,NaBH4（0.095g,2.50mmol,2mlの水中に溶かす）に滴下して反応混合物を１時間攪拌する，反応過程中においては温度３℃を保持し，さらに1mol・L-1のHClを加えてpHを2.5まで調節する。0.4ml1mol・L-1のアセトアルデヒド−ラトラハイドロフラン溶液（0.40mmol）を加え入れて５分間攪拌する,NaBH4溶液（0.016g,0.42mmol少量の水中に溶かす）を滴下して加える，混合物を１時間攪拌する，さらに1mol・L-1のHClを加えてpH2.5まで調節し,0.2ml1mol・L-1アセトアルデヒド−テトラヒドロフラン溶液（0.2mmol）を加え入れ,5分間攪拌して,NaBH4溶液（0.008g,0.21mmol,極少量の水に溶かす）を滴下加える,2時間攪拌する。反応液を30mlまで減圧濃縮する，大穴吸着型の樹脂柱層分析を経て,3％,6％,15％のアルコール水溶液で各層を溶出する,TLCで溶出物を検出する，必要の成分を合併して減圧濃縮し，冷凍干燥して,1−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC2b（0.59g,純度86％，収率51％）を得た。
（３）１−Ｎ−エチルGMC2bの製造。
上記の１−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC2b（0.59g,0.88mmol）100mlの1mol・L-1NaOH中に溶かす。100℃まで加熱する，還流加水分解48時間,TLCで反応過程をモニタリングする，加水分解完成してから,3mol・L-1のH2SO4を添加してpH6.0まで溶液を調整し，該溶液を吸着型大穴樹脂柱層析を行い,3％,6％,15％のアルコール水溶液で各層づつ溶出する,TLCで溶出物を検出する，必要な成分を合わせて，減圧濃縮冷凍干燥してから１−Ｎ−エチルGMC2b（0.38g,0.70mmol,純度91％，収率82％）を得た。
注:TLCで使用する溶媒システムはクロロホルム：メタノール:28％のアンモニア水＝2:1:1。
図11で示す如く，其の核磁気共鳴データは：
Ｈ−NMR  δ1.22（3H,1−Ｎ−Ｃ−CH3）
δ1.36（3H,4″−CH3）
δ2.77（3H,6'−Ｎ−CH3）
δ2.95（3H,3″−Ｎ−CH3）
δ5.17（H,1″−Ｈ）
δ5.85（H,1−Ｈ）
実施例6,1−Ｎ−エチルGMC2の製造。
（１）3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC2の製造
GMC2を5g取り,200mlのジメチルスルホキシドで溶解する，温度25℃を保持し,5.4gのテトラ水和酢酸コバルトを加えてから，続けて20分間攪拌する。然る後，混合溶液中に28.5mlの新鮮調製した1mol・L-1の無水酢酸溶液（テトラハイドロフランで調製する）を滴下加えて,1時間反応させる，反応液に250mlの水を加えて混合する,30℃を保持して,200mlの110（H+）（30×300mm）の樹脂柱に通入して吸着させる，水洗で有機溶剤を除去する,2mol・L-1のNH3H2Oで解析する，溶出液が減圧濃縮の後,H2Sガスを通し入れて，硅藻土で助濾剤として濾過を行う，濾過液を減圧濃縮し，冷凍干燥してから3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC25.8g（純度85％，収率81％）を得た。
（２）１−Ｎ−エチル−3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC2の製造。
3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC24.5gを取り,100mlの水の中に溶かす,3mol・L-1のH2SO4でpH5に調整する，自然冷却して，氷水浴で３℃を保持する,1mol・L-1のHClでpH3.0に調節し,6mlの40％アセトアルデヒド−テトラヒドロフラン溶液（1:1）を加え，攪拌しながら25％のナトリウムシアノ・ボロハイドライド水溶液を滴下加えてpH4までにする,1時間攪拌してpHを３−４に保持させる，上記の操作を3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC2完全に転化するまで（TLCで検出、溶媒システムはクロロホルム：メタノール：アンモニア水＝2:1:1）繰り返えをする，反応液を減圧濃縮して，アセトアルデヒドを除去してからCAD−40樹脂柱（25×300mm）層析で分離し,3％,8％,15％のアルコール水溶液（0.5mol・L-1のアンモニア水）で溶出する,1−Ｎ−エチル−3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC2を含む溶出液を収集して，合併濃縮してから冷凍干燥の後,3.0g（収率は65％）を得た。
（３）１−Ｎ−エチルGMC2の製造。
１−Ｎ−エチル−3,2′,6′−トリ−Ｎ−アセチルGMC2を2.5g取り,50mlの1mol・L-1のNaOHで溶解し,100℃還流加水分解を48時間行う。冷却かつ希釈して500mlに至らせる,732（H+）樹脂でpH9に調節してから樹脂を取り出して，柱に入れる,2mol・L-1のアンモニア水で解析する，溶出液が減圧濃縮を経た後,CAD−40吸着樹脂柱（25×300mm）で層析で分離して,3％,6％,15％のアルコール水溶液（0.5mol・L-1のアンモニア水を含む）で溶出す，成分含量の90％以上の１−Ｎ−エチルGMC2の溶出液を合併して，減圧濃縮冷凍干燥してから１−Ｎ−エチルGMC2を1.4g（収率70％）得た。
実施例7,1−Ｎ−エチルGMC1の製造。
（１）3,2'−ジ−Ｎ−アセチルGMC1の製造。
GMC10.477gを取り,200mlのジメチルスルホキシドの中に溶解する，温度は25℃に保持し，テトラ水和酢酸コバルト0.55gを加えいれ,20分間攪拌反応させる，然る後，混合液の中に新鮮に調製された1mol・L-1の無水酢酸2.9mlを加え入れ,1時間反応させる。反応液に水25mlを加え,732（H+）樹脂で吸着する,2mol・L-1のアンモニア水で解析し，溶出液を20mlまで減圧濃縮して,H2Sガスを通し入れる，コバルトイオンを除去する，濾過を行い，濾過液を減圧濃縮後した冷凍干燥してから3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC1を（収率82％）0.55g得た。
（２）１−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC1の製造。
上記の製品を15mlの水中に溶す，その中に1mol・L-1のHClでpHを３まで調節する，氷水浴して冷却の後,3℃に保持する,0.84mlの40％アセトアルデヒド−テトラハイドロフラン溶液を加え入れ,10分間攪拌してから10％のNaBH4の水溶液を滴加する，かつ,1mol・L-1のHClでpH3−４に保持する。１時間攪拌する。上記の操作を重復に行う,3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC1完全に転化するまでにする。反応液を減圧して濃縮し，アセトアルデヒドを除去し,YPR−II樹脂柱で層析を行う。５％,10％,20％のアルコール水溶液で各層溶出し,1−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC1を含む溶出液を収集して合併濃縮し，冷凍干燥の後,0.234g（収率48％）を得た。
（３）１−Ｎ−エチルGMC1の製造。
上記の１−Ｎ−エチル−3,2′−ジ−Ｎ−アセチルGMC1を1mol・L-1のNaOHの水溶液に溶かす100℃に加熱して48時間還流加水分解する,TLCで検出単一斑点が生ずるまでにする，反応終了せば，反応液を冷却かつ水で希釈して100mlに至らしめる,732（H+）樹脂でpH9まで調節し,30分間攪拌吸着してから，樹脂を濾出する,2mol・L-1のアンモニア水で解析する，溶出液を濃縮後,YPR−II吸着樹脂にて層析を行う。３％,6％,15％のアルコール水溶液で溶出する，目的物を含有する溶出液を合併濃縮し，冷凍干燥してから１−Ｎ−エチルGMC10.124g（収率63％）を得た。
実施例8,硫酸塩注射剤の製造。
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩またはその水に溶かした塩は皆注射剤を造って臨床使用に供する調製法は次の通り：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩            50g（力価）
無水亜硫酸ナトリウム                 2g
注射用水を加えて                     1L
pH                                   5.0〜7.0
プロセス：主要と補助材料を秤り取り，配液量80％の注射水中に溶かし,pHを調整する，活性炭を適量に加えて，全量まで水を加えてから，炭素を取り去った後，細孔フィルタ−膜で，きれいになるまで精ちに濾過してから，窒素充填，
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を注封してから得たのである。
上記配合表の中にまた，ピロ亜硫酸ナトリウム（抗酸化剤）と防腐剤として少量のパラオキシ安息香酸メチル（1.3mg/50mg（力価）／本）、ペラオキシ安息香酸プロピル（0.2mg/50mg/本）を加える。
規格:50mg（力価）/1ml;75mg（力価）/1.5ml及び100mg（力価）/2ml
実施例9:1−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩粉注射剤５万ユニット／本。
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩       ５万ユニット／本
NaCl（注射用）                  9mg/本
低分子デキストラン              7mg/本
ピロ亜硫酸ナトリウム（分析純）  3mg/本
注射用水を加えて                0.5ml/本
プロセス：体積の70％を占める新鮮な滅菌注射水を取り，ピロ亜硫酸ナトリウム（分析純），塩化ナトリウム,1−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩などの原料を加え入れて，溶解させてから低分子デキストラン液を入れる，最後に滅菌注射用水で全量まで添加してから薬液のpHを測定し,0.22μｍの細孔濾過膜で２回の無菌濾過さ行う，毎本0.5〜0.54mlをアンプルに入れて，冷凍干燥してから口を封じて，漏えい検出，ランプ検査，色文字入れる。
実施例10:1−Ｎ−エチルGMC1a錠剤（緩釈剤型、腸溶剤を含む）10万ユニット／錠
調製法I:1−Ｎ−エチルGMC1a
硫酸塩                              10kg
蔗糖粉                              12.4kg
CaCO3                               6.8kg
澱粉                                 5kg
クエン酸                            0.3kg
アルコール（70％）                  約8L
ステアリン酸マグネシウム            0.4kg/10万錠
調製法II:1−Ｎ−エチルGMC1a
硫酸塩                                    5kg
デキストリン                              4.7kg
20％の澱粉のり                            適量
すっかり攪拌してから錠を造る（16目），顆粒は65℃の下で
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乾して14目の完整粒となりさせ，圧錠前に１％のステアリン酸マクネシウムを加える。
適応症は，細菌性赤痢、腸炎、下痢。
実施例11:1−Ｎ−エチルGMC1a目薬の製造
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩    5g（力価）
NaCl                         8.0g
ピロ亜硫酸ナトリウム         2g
蒸りゅう水                   適量/1000mlに達する
プロセス：正確に調製法によりNaClとピロ亜硫酸ナトリウムを適量の蒸りゅう水にて溶解してから1000mlまで蒸りゅう水で補足する，濾過する，澄みきるまで濾過してから合格に処理した，点眼瓶中に注入し，腹栓及びアルシ蓋をかぶせて,100℃の下で空気の中で30分間滅菌を行い，澄みきった後，ラベルを刷りつけ，包装して完成品検査合格とする。
適応症：細菌性結膜炎，急性出血性結膜炎など。
実施例12:1−Ｎ−エチルGMC1aリニメント剤の製造。
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩                   1.6g
液体パラフィン                              3.3g
適応症：膿か疹，びらんそうしょう，熱傷、火傷及び其の他細菌性皮膚感染。
実施例13:1−Ｎ−エチルGMC1aエーロゾルの製造。
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a                 10mg（力価）
アルコール                          4.5mg
ジフリュオル・ジクロロ・メタン      適量
１本14ml
適応症：細菌性感染気管炎と重症扁桃腺炎及び喉頭炎など。
実施例14:1−Ｎ−エチルGMC1a軟膏剤乳剤型基剤を製造する実例。
１、水が油を包む型（油／水）基剤
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩                   1.6g
乳化ろう                                    30 g
白ワセリン                                  50 g
液体パラフィン                              20 g
２、油で水を包む型基剤
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩                   1.6g
ポリグリセリンステアリン酸IIIエステル     6   ｇ
ワセリン                                   96.8g
３、水溶性基剤
調製法：
１−Ｎ−エチルGMC1a硫酸塩                   1.6g
ゼラチン                                    3  g
グリセリン                                 30  g
水                                          適量
全量100g
上記実例８−14中の活性成分とする１−Ｎ−エチルGMC1aは１−Ｎ−エチルGMC2b、１−Ｎ−エチルGMC2或いは１−Ｎ−エチルGMC1で以って取って代わることができる，それによって相応的な組成物を構成し得るのである。
工業応用性
本発明の長所はあきらかである。本発明によって提供されたCGMCC0197が発酵培養を経てゲンタマイシンC1aの単成分が生まれる（GMC1a力価は800μg/mlに達し得る）。これがために，本発明は遺伝学の径路を変わる方法でGMC1aを生産するプロセスを提供した。本発明で提供したCGMCC0197の生産力は割に強いので直接産業に応用することができる，したがって，本発明にかかわる１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体の製造は有用な中間体を提供したのである。本発明によって提供された１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体またはその塩にそれを活性成分として，医薬上で受け入れ可能の添加剤で構成した組成物は１種のワイド・スペクトルの抗生物質である。それはGM耐薬菌に対応して比較的に良好な作用があって，耳、腎臓に対し毒性が低い，これがために，本品に対し敏感する緑膿菌、変形菌、セラチア属などから引き起された次の感染及びGMカナマイシン（KM）、メチシリン，アミカシン（AMK）など多種類薬物耐性の大腸菌，クレブシェラ氏属，大腸菌属，ブドウ球菌属により引き起された次の感染：敗血症，気管支炎，気管支拡張症，肺炎，腹膜炎，腎盂炎，膀胱炎などの病症に適応し，また，ペニシリンに対し過敏の患者に対しても優良な治療剤となり，特に児童と老齢者に対しては，本品の使用は,GM、KMとAMKより更に安全で信頼できるものである。GM、KM、ミクロノマイシン（MCR）、メチシリン薬物耐性菌株感染に対しては指折りの薬物と言えるもので，かつまた,AMKと交差薬物耐性がなく故,AMK性細菌感染の治療に適用するものである。
本発明に公開された１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aは体外抗菌作用の研究を経て，その結果で表明されたように臨床分離された1108株の普段よく見られた致病菌の抗菌活性，殺菌作用は皆ゲンタマイシンと相似しまたはゲンタマイシンンにすぐれている。ゲンタマイシン，ミクロノマイシンンとセフアゾリンの耐性菌株は半数または半数以上の最低抑菌濃度（MIC）値が依然として安全、有効の血薬濃度範囲内に在り，特に53株が高度な薬物耐性金黄色ブドウ球菌（MRSA）は66％の菌株が≦8mg・L-1の濃度に抑制される。これがため，本発明の１−Ｎ−エチルGMC1aがメチシリン耐性黄色ブドウ球菌治療効果の向上に積極的な作用（表４−７参照）を発揮するものである。
本発明の１−Ｎ−エチルGMC12はマウス体内の薬効力測定によって解かるように，マウス体内の細菌感染に対し，良好な治療効果がある。その体内保護作用はアミカシン（AMK）に相似している，但し，ゲンタマイシンとトブラマイシンにすぐれており,1−Ｎ−エチルシソマイシン（NTL）より低いものである。殊にゲンタマイシン耐薬菌株感染のマウス体内の療効に対しては，アミカシン，ゲンタマイシン，とトブラマイシンより１−４倍強いものである。
本発明の１−Ｎ−エチルGMC1aは，テストを行った各種の菌株感染のマウス体内治療効果の重復性が良好である。かつ，生存，マウスに対し，心臓血の培養を行い，細菌クリアランスが高い，これはその体内の抑菌と殺菌力が非常に強いことを物語っている，かつまた，体外の抑菌活力とほぼ一致している。
本発明の１−Ｎ−エチルゲンタマイシンC1aの毒物研究の結果は次の通りである。
１、１−Ｎ−エチルGMC1aの動物に対する急性毒性の研究
１−Ｎ−エチルGMC1aで，昆明マウスi.v,s.c,i.mに，給薬LD50それぞれ65.47,479.91,172.89mg/Kg。NIHマウスi.v,s.cに給薬LD50,それぞれ79.88mg/Kgと460.42mg/Kgとする,1−Ｎ−エチルGMC1aの急性毒性は明かにNTLより低く,GMに近づいている。１−Ｎ−エチルGMC1aのラットi.v,s.c,i.m,i.pに対し給薬LD50,それぞれ73.75,402.65,565.16と627.98mg/Kg。
２、動物に対する慢性毒性研究。
１−Ｎ−エチルGMC1aを繰り返して薬を用う安全性を評価するために，ラット腹腔に１−Ｎ−エチルGMC1aを90日注射とBeagle犬静脈に１−Ｎ−エチルGMC1aを90日注射の毒性試験を行った。
ラットに対して低、中、高の３種の剤量はそれぞれ30、100、180mg（力価）/Kg/日（MKD）として腹腔を経て給薬する。実験中においては，一般的生理学の観察と血液学検査と病理学検査を行った。その結果，次のことが明かになった。１−Ｎ−エチルGMC1aを90日腹腔注射して，中毒の表現が明かになった剤量は100MKDより大きいものであり，基本的な安全剤量は30MKDでする，ミクロノマイシン（MCR）関系文献に比べて（MCRの基本安全剤量は25MKDで，主要の中毒表現剤量は63MKD以上でする）ラットに対する繰り返え給薬の毒性は１−Ｎ−エチルGMC1aはミクロノマイシンより大きくない。
Beagle犬静脈注射給薬剤量はそれぞれ10、30、60mg（力価）/Kg/日３組となる。ラットに対し，上記３項目の観察と検査を行う外，また，眼底検査を行った。試験結果をMCR文献と比較すると,1−Ｎ−エチルGMC1a10MKDを連続90日の静脈注射の効果は，基本上,MCR10MKDを連続30日の筋肉内注射の効果に相当する，これがため,1−Ｎ−エチルGMC1aの臨床研究中において,MCRの臨床用量は比較的大きな参考価値がある。
３、耳毒性の研究
１−Ｎ−エチル基GMC1aは聴覚毒性と前庭毒性がある。ラットの聴源性反応とマウス水泳実験を採用すり，それは１−Ｎ−エチルGMC1a,GMとKMの３種類のアミノ基グリコシド類の抗生物質の耳に対する毒性研究でする。研究の結果は,1−Ｎ−エチルGMC1aの耳毒性はGMとKMより遥かに低いものである。
１−Ｎ−エチルGMC1aとGM,AMKのモルモット耳毒性についての比較は，実験中では各種の薬品は均しく低、中、高の３つの剤量を設ける，毎日筋肉内注射を行い，連続投薬28日間，実験中においてそれぞれ聴力と前庭機能の測定が行われた。投薬終了後，その翌日モルモットを首切り死なせて，その側頭骨を固定して，内耳の標本を製作して，全蝸牛の切片を敷く，壊死した毛細胞を計算し，走査電子顕微鏡とヒセロイジン切片観察を行い、実験の結果は次の通りである。
（１）蝸牛毒性:1−Ｎ−エチルGMC1aと生理食塩液対照組と比較して，低、中、高の３つの剤量組においていずれも明かな蝸牛毒性が観察されなかった。しかしながら,GM及AMKでは小剤量組を除いて，中剤量でも最小可聴値が高くのぼり，高剤組では，動物の聴力がほとんど全部喪失する状況になる。形態学の観察では１−Ｎ−エチルGMC1a組のモルモット蝸牛切片中の毛細胞は何等変化もない，らせん神經節も正常である。たとえ,100mg/Kg/day大劑量組においても，コルティ器官が全く正常である。本実験の劑量範囲内では，まだ１−Ｎ−エチルGMC1aの蝸牛毒性が観察されなかった。しかしながら,GM、AMKの各組ではいずれも蝸牛毒性が明かに表われている，中、小剤量組でさえ，すでに毛細胞の散在性または巣状壞死が觀察される，高剤量組ではコルティ器官の毛細胞の大量壞死が観察されり，厳しい時は支持細胞と神経節細胞まで波及している。だから,1−Ｎ−エチルGMC1aの蝸牛毒性が極めて小さく，しかし,GM及AMK組蝸牛に対する損傷は比較的に顕著である。
（２）前庭毒性:3種の薬品と対照組と比較して，いずれも一定の差異が現われている。１−Ｎ−エチル基GMC1a組はただ大剤量の時に眼振抑製率が高くなる現象が現われてくる，形態学の観察によると，大剤量の１−Ｎ−エチルGMC1a組には卵形嚢斑と膨大部積の位置覚毛が粘りつながる，但し膠状膜は完全で傷がない。しかしながら,GMとAKMはいずれも動物前庭機能の損傷と形態破壊を引き起すことができる。走査電子顕微鏡での観察にすると，両者の大剤量組の卵形嚢斑中央部の膠状膜と位置覚膜は消失し，残余された少量の位置覚毛の毛嚢は粘りつながっている，耳石が比較的に小さく或い界目がはっきりしない，球形嚢斑の上皮位置覚毛が不完全でありまたは消失している。これがために１−Ｎ−エチルGMC1aとGM、AMKに比べれば,1−Ｎ−エチルGMC1aの方の前庭毒性程度は大変低く，低いレベルに属するものと認められる。AMKは稍や大きく,GMの前庭毒性は最も厳重である。
以上の状況を綜合すると,1−Ｎ−エチルGMC1aの耳毒性が極めて低い，本実験中では，ほとんど蝸牛毒性が観察されなかった。軽度の前庭毒性があると難も,GMとAMKに比べて遥かに低い。
４、１−Ｎ−エチルGMC1aの腎毒性研究。
１−Ｎ−エチルGMC1aはアシノ基グリコシド類抗生物質にして，腎臓は毒性ターゲット器官の１つである。これがために,1−Ｎ−エチルGMC1aの毒性研究の時，また，専門的にラツトの筋肉内注射する１−Ｎ−エチル基のGMC1aの比較とアミカシンとゲンタマイシンの腎毒性比較を行う。テストにおいて，腎毒性に常用の６項目の尿液指標と２項目の血液生化指標を選択して，腎臓の病理形態学観察に結合することによってる３者の腎毒作用を比較するものである。
各試験組の動物は投薬時間の延長と剤量の増加に伴い，異常な指標の出現も亦相応的に多くなる，病理変化もだんだん重くなる。給薬の第７日目から，ゲンタマイシン150MKD,100MKD組では，中毒死亡の動物が逐次増加されるが,1−Ｎ−エチルGMC1aとアミカシン各剤量組は皆死亡が出現しなかった。これがため,3つの薬品の腎毒作用は，比較性より強いのは低剤量であり，すなわち50MKD組でする。
50MKD組に給薬５−15日，ゲンタマイシン組の異常指標は３項目（Ｕ−LDH,u−prとBUN）から６項目（ｕ−GOT,u−LDH,u−pr,u−su,BUN,Ser）に増加する。腎細管上皮細胞も亦，投薬５日目からの単独散在性の壊死より発展して多数動物の腎臓の大片状と広範性の厳重壊死となる。そして,1−Ｎ−エチルGMC1aとアミカシン組動物はこの期間において僅かに個別の指標統計学上の異常或はすこしの上しょう趨勢があり，病理形態学上においても亦僅かに給藥５日目の微かな變性發展から単獨散在性の細胞壞死となる。これがため，機能と形態学上の比較によると,1−Ｎ−エチルGMC1aの腎毒作用は明かにゲンタマイシンより軽く，アミカシンと顕著な差異はない。
５、１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体の変異誘発試験結果は陰性を呈しており，本品の生殖毒性テストの結果，胚子毒性がないことを表明している。
本発明の１−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体にかかわる動物体内の薬物代謝動力学と組成分布の研究の結果で明かになったように，本品は吸収されるのが迅速で，消去半衰期を取りけすのが短く，且血中薬物濃度が剤量の増加に従って高くなる，腎臓からの排泄は主要な代謝径路である。ラツト体内組織分布は腎臓の濃度は一番高く，その次は肺臓、心臓、脾臓となっている。ここで一言いう値のあることは実験中に次のことが発現された，すなわち,1−Ｎ−エチルゲンタマイシン誘導体はGMよりも血液脳関門を透過して脳組織に入りこみ，臨床使用上では実用価値あるべきである。本品は血漿蛋白質結合率は割に低い。
上述の具体実施例は僅かに説明をあきらかにすることを目的とするもので，本発明の保護範囲は権利要求書の中に体現させるつもりである。
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【図２】
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【図１】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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