(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の試薬：
（１）タンパク質分解酵素
（２）還元剤、界面活性剤、キレート剤、タンパク質変性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む水溶液であって、ｐＨが７から１０である検体希釈液、
（３）塩および共沈剤
（４）タンパク質変性溶解剤、
を組み合わせてなる血液成分からのウイルス核酸抽出試薬キット。
【請求項２】
タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫ、プロナーゼおよびズブチリシンから選択される請求項１に記載の試薬キット。
【請求項３】
還元剤が２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールである請求項１に記載の試薬キット。
【請求項４】
界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＮＰ−４０）およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）から選択される請求項１に記載の試薬キット。
【請求項５】
キレート剤が二価の金属イオンをキレートしうる能力を有するものである請求項１に記載の試薬キット。
【請求項６】
塩が塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび酢酸ナトリウムから選択される請求項１に記載の試薬キット。
【請求項７】
共沈剤がデキストランまたはグリコーゲンである請求項１に記載の試薬キット。
【請求項８】
タンパク質変性溶解剤がグアニジン塩酸、グアニジンチオシアン酸およびグアニジン硫酸から選択される請求項１に記載の試薬キット。
【請求項９】
以下の操作：
ａ）血液成分にタンパク質分解酵素および検体希釈液を含む試薬を加えてインキュベートすることにより血液成分中のタンパク質、ウイルス由来タンパク質、その他の構成成分および混在物を分解、変性する；
ｂ）さらにタンパク質変性溶解剤を加えて血液成分中のタンパク質、ウイルス由来タンパク質、その他の構成成分および混在物を可溶化する；そして
ｃ）有機溶媒による核酸抽出を行わずに、そのままエタノールまたはイソプロパノールを加えてアルコール沈殿を行う
からなる血液成分からの核酸の抽出方法であって、但し、操作ａ）又はｃ）の何れかにおいて、塩および共沈剤の両者を加える、抽出方法。
【請求項１０】
上記操作ａ）からｃ）までを１本のチューブ内で実施する請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウイルスの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を材料として使用する遺伝子工学、生化学、臨床検査などのバイオテクノロジーの分野に有用な血液成分からのウイルス核酸の抽出試薬キットおよび該試薬キットを用いるウイルス核酸抽出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液成分（血清、血漿）からウイルス粒子中の核酸（ウイルスゲノム）を抽出するには、グアニジンチオシアン酸塩を用いたＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２：１５６−１５９，  １９８７）もしくはその変法などが最も普及しており、従来法はおおよそ次の３段階から構成されている。
１．血液成分（血清、血漿）などのタンパク質およびウイルス構成タンパク質などの分解変性ならびに可溶化処理
タンパク質分解変性ならびに可溶化の処理は、非特異的タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ズブチリシンなどによる加水分解による方法、グアニジン塩酸、グアニジンチオシアン塩酸などのカオトロープ剤での変性による方法、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムなどのイオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＮＰ−４０）およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）などの中性界面活性剤によるタンパク質可溶化方法、アルカリ変性による方法、煮沸による方法などがある。
【０００３】
これらの方法は単独使用でもよいが、２種以上併用することによりさらに分解変性、可溶化の効率を高めることもできる。また上記処理段階において、尿素もしくはチオール系還元剤である２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを添加することによりタンパク質の分解変性処理の効率を高めることもできる。
２．有機溶媒による抽出処理
タンパク質分解処理後はフェノール、クロロホルム、フェノール−クロロホルムなどにより除タンパクの意味での有機溶媒抽出を行う。この処理は、試料由来のタンパク質および精製過程で添加したタンパク質分解酵素などを変性、分解除去でき、上層の水相を別の容器に分取することにより核酸成分が抽出できる。また、水相と有機相の界面を明確にする目的で１／１０〜１／３０程度のイソアミルアルコールを含む有機溶媒に添加して抽出することもできる。
３．アルコール沈殿
アルコール沈殿は溶液中の核酸の濃縮、塩の除去およびフェノールなどの有機溶媒の混在物の除去のために行われる。通常、２００〜５００ｍＭ程度の塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加後、エタノールを２〜３倍量またはイソプロパノールを等量加えて高速遠心することにより核酸を沈殿として回収することができる。
【０００４】
このアルコール沈殿の際、検体試料中の核酸量は極めて微量であることが多く、通常のアルコール沈殿では回収できない場合が生じてくるため共沈剤を添加することが好ましい。グリコーゲン、トランスファーＲＮＡなどを適当量添加して共沈させることにより微量の核酸の回収効率を高めることができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の方法では、有機溶媒による抽出もしくはそれらに代わる何らかの方法による核酸成分の分離（容器の移し変え）が必要となる。このため最低チューブが２本以上必要となり、チューブの蓋の開け閉めの回数も多くなり、抽出操作が煩雑となり、抽出される核酸の定量性が失われてしまう可能性が高まる。そのうえ、この分離操作の際に、汚染（コンタミネーション）の危険性も生じてくる。またこれらの有機溶媒の使用は危険で人体に有害であるばかりでなく、その廃棄にも考慮が必要であるという欠点を有している。
【０００６】
そこで、本発明は▲１▼９０分程度の短時間の簡単な操作で従来の方法と同等以上の高収率、高純度のウイルス由来の核酸を抽出できる、▲２▼操作過程でチューブ間の移し変え作業がなく、１本のチューブで実施できるので、臨床分野で利用する際の汚染（コンタミネーション）を防ぐことができる、▲３▼抽出過程で用いたチューブのまま逆転写反応など実験の次に段階へ進むことができる、▲４▼使用チューブ数が少なく、使用試薬も比較的安価なので経済的である、▲５▼フェノール、クロロホルムまたはその混合物など危険で人体に有害な有機溶媒を使用しない、などの利点を有する新規な血液成分からのウイルス核酸抽出試薬キットおよび該試薬キットを用いるウイルス核酸抽出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血清、血漿などの血液成分に含まれるウイルス中から核酸を、本発明の試薬キットの各試薬の用量および濃度を工夫することにより、簡易にしかも１本のチューブで、再現性よく定量的に抽出しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、以下の試薬：
（１）タンパク質分解酵素
（２）還元剤、界面活性剤、キレート剤、タンパク質変性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アルカリ性である検体希釈液、
（３）塩および共沈剤
（４）タンパク質変性溶解剤、
を組み合わせてなる血液成分からのウイルス核酸抽出試薬キットを提供する。本発明の試薬キットは上記（１）〜（４）の試薬を含むが、このうち（２）の検体希釈液と（３）の塩および共沈剤とを一緒にして供することも可能である。
【０００９】
本発明はまた、以下の操作：
ａ）血液成分にタンパク質分解酵素、検体希釈液、ならびに場合により塩および共沈剤を含む試薬を加えてインキュベートすることにより血液成分中のタンパク質、ウイルス由来タンパク質、その他の構成成分および混在物を分解、変性する；
ｂ）さらにタンパク質変性溶解剤を加えて血液成分中のタンパク質、ウイルス由来タンパク質、その他の構成成分および混在物を可溶化する；そして
ｃ）有機溶媒による核酸抽出を行わずに、操作ａ）で塩および共沈剤を加えていない場合にはこの段階で両者を加え、そのまま低級アルコールを加えてアルコール沈殿を行う、
からなる血液成分からの核酸の抽出方法を提供する。
【００１０】
本発明の試薬キットを用いるウイルス核酸抽出は以下の手順で行う。
（ａ）タンパク質分解酵素によるタンパク質成分の分解、変性
（ａ−１）血液成分にタンパク質分解酵素および検体希釈液を加える。
【００１１】
本発明における血液成分としては、血清、血漿を用いることができる。
【００１２】
タンパク質分解酵素としては、非特異的タンパク質分解酵素が好ましく、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、ズブチリシンなどが特に好ましい。酵素濃度としては、２００ｎｇ／μｌ（血液成分）以上が好ましい。
【００１３】
本発明の検体希釈液は、還元剤、界面活性剤、キレート剤、タンパク質変性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む水溶液であって、ｐＨが弱酸性から弱アルカリ性の溶液である。還元剤としては、チオール系還元剤が好ましく、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどが特に好ましい。界面活性剤としては、上記検体希釈液中で沈殿を起こすおそれのないもの、またはは何らかの手段により再溶解可能なものである。ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＮＰ−４０）およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）などが特に好ましい。キレート剤としては、二価の金属イオンをキレートしうる能力を有するものが好ましく、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）などが特に好ましい。また、タンパク質変性剤としては尿素が特に好ましい。これらのうちどれを使用するかは検体の種類および得られる核酸の性質などに依存する。本発明の検体希釈液は弱酸性から弱アルカリ性で使用するが、ｐＨが７〜１０が好ましい。
（ａ−２）塩および共沈剤の添加
この段階で塩および共沈剤を添加しておくことができる。塩の種類としては塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは酢酸ナトリウムなどが好ましい。共沈剤としては高分子多糖類が好ましく、グリコーゲンまたはデキストランが特に好ましい。デキストランの平均分子量は５００，０００以上のものが特に好ましい。
【００１４】
ここで本発明の検体希釈液、ならびに塩および共沈剤の試薬成分の一例として好ましい濃度範囲を以下に示す（なお、以下の濃度は、デキストランを除いて検体希釈液中の濃度であり、塩および共沈剤も検体希釈液中に溶解した場合の濃度である）。
２−メルカプトエタノール                    ０．１−４％
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム          ０．１−２％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩    １−１００ｍＭ
尿素                                        ４−１０Ｍ
塩化ナトリウム                              ５０−５００ｍＭ
デキストラン（平均分子量  ２，０００，０００）        １０−２００μｇ／１検体
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）            ５０−４００ｍＭ
上記の試薬はｐＨが弱酸性から弱アルカリ性水溶液で使用し、上記濃度の試薬混合物水溶液を血液成分（血清、血漿）１００μｌに対して１００〜１０００μｌ添加することが好ましい。なお、この検体希釈液はタンパク質分解酵素の加水分解性能を高める、もしくは補助する効能を有している。また、上記試薬およびタンパク質分解酵素添加撹拌後、５５℃前後で１０分間以上インキュベートを行うとよりいっそう上記試薬の効能が上がり、検体試料中のタンパク質成分の分解、変性効率が高められる。
【００１５】
また、後述するように、塩および共沈剤はこの段階で添加しても、あるいは後のアルコール沈殿の段階で添加してもよい。
（ｂ）タンパク質変性溶解剤の添加
次いでタンパク質変性溶解剤を添加する。タンパク質変性溶解剤としては、カオトロープ剤が好ましく、グアニジン塩酸、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硫酸塩などが特に好ましい。これらのタンパク質変性溶解剤は最終濃度が１０〜３０００ｍＭになるように添加するのが好ましい。
【００１６】
また、場合によりタンパク質変性溶解剤を添加、撹拌後に５５℃前後で１分間以上インキュベートを行うとタンパク質変性溶解剤の効能が一層高められる。
（ｃ）アルカリ沈殿
この後、上記反応液にイソプロパノール、エタノールなどの低級アルコールを添加して核酸を析出沈殿させる。この操作をアルコール沈殿という。イソプロパノールを用いる場合は、好ましくはイソプロパノール最終濃度４０％以上、エタノールを用いる場合は、エタノール最終濃度が７０％以上になるように添加する。この際低級アルコール添加後に−７０〜４℃にて冷却し、塩析効果を高めることもできる。上記したように、この段階で塩および共沈剤を加えることも可能である。
【００１７】
次いで、好ましくは８，０００×ｇ以上、４℃で冷却遠心を行う。遠心分離時間は５分以上が好ましく、核酸は共沈剤と共に白色沈殿としてチューブ底に得られる。沈殿した核酸は遠心を行った後、上清をデカンテーションまたは吸引により取り除き回収する。
【００１８】
最後にアルコール沈殿して得られた核酸を７０％エタノールで洗浄し、適当な溶液に再溶解して保存することにより使用可能な状態となる。
【００１９】
本発明の方法においては、ここまでのウイルス核酸抽出操作を１本のチューブ内で実施する。
【００２０】
本発明による上記の方法は、例えばフェノール−クロロホルムで抽出した後、アルコール沈殿を行うなど従来の技術と組み合わせても使用可能である。
【００２１】
本発明の方法により抽出されたウイルス核酸が従来技術により抽出されたウイルス核酸と同等以上のものであることの確認は以下の項目により行うことができる。
（１）逆転写反応
ウイルスがＲＮＡウイルスで、抽出ウイルスゲノムがＲＮＡである場合には、本発明の方法で抽出されたウイルス由来のＲＮＡは抽出に用いたチューブのままで、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写酵素により逆転写反応を行うことができる。つまり本発明の方法により抽出されたＲＮＡは逆転写反応を阻害するような物質を含んでいない高純度なものである。
【００２２】
上記逆転写反応で得られたｃＤＮＡは以下に述べる遺伝子増幅法により増幅し確認することができる。
（２）抽出遺伝子の増幅（ＰＣＲ）
本発明の方法により抽出されたウイルス核酸は、それがＤＮＡであればそのまま、あるいはそれがＲＮＡであればｃＤＮＡに変換の後、そのウイルスゲノムに特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することができる。通常ＰＣＲ法は厳密な条件を必要とするが、本発明の方法により抽出されたウイルス核酸はこのＰＣＲ法を阻害するような不純物を含まない高純度なものである。
【００２３】
ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡは常法によりポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色により電気泳動像として確認することができる。
【００２４】
このように本発明の試薬キットおよび方法を用いて抽出されるウイルス核酸は、血液中のウイルスの存在確認、または定量など、ウイルスゲノムの研究、臨床分野に適用できる。また本発明の方法はウイルス以外にも組織、細菌、培養細胞、白血球などからの核酸抽出にも応用でき、本発明の抽出方法の応用範囲は極めて大きい。
【００２５】
以下に記載する実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】
実施例１．ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムの抽出
本実施例では１０８コピー／ｍｌのＨＢＶが含まれている血清を陰性血清により段階希釈し、１０８〜１０３コピー／ｍｌの希釈系列を作り、各希釈系列の血清を用いて以下のＨＢＶ−ＤＮＡの抽出を行った。
【００２７】
上記の各コピー数のＨＢＶを含むヒト血清１００μｌを検体試料とし、使用チューブは容積が１．５ｍｌのものを用いた。
【００２８】
タンパク質分解酵素、検体希釈液、塩および共沈剤は以下の試薬、濃度で使用した。
・タンパク質分解酵素：２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液（ベーリンガーマンハイム社製）。
・検体希釈液（本実施例では検体希釈液に塩および共沈剤を添加して１つの溶液として使用した。以後の実施例においても検体希釈液は塩および共沈剤を含むものとする）を以下のように調製した。
【００２９】
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）                ２００ｍＭ
２−メルカプトエタノール                          ２％
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム                １％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩        １０ｍＭ
尿素                                              ８Ｍ
塩化ナトリウム                                ２００ｍＭ
デキストラン  Ｔ−２０００              ０．０２６０％
（ファルマシア社製）
１．５ｍｌ容チューブに検体血清１００μｌを取り、タンパク質分解酵素溶液１５μｌ、検体希釈液３８５μｌを添加した。検体数が多い場合は予め酵素溶液と検体希釈液を１検体当たりが上記の用量となるよう混合し、４００μｌずつ血清に添加することも可能である。撹拌後、５５℃で３０分間インキュベートした。次いでこのチューブにタンパク質変性溶解剤として８Ｍグアニジン塩酸溶液を２５０μｌ添加し、撹拌後５５℃で１５分間インキュベートした。さらにこのチューブにイソプロパノール６００μｌを添加し撹拌後、４℃で１５分間静置した。１２，０００×ｇ、４℃で遠心した後、上清を吸引により除去し、５００μｌの７０％エタノールで２回洗浄し、同様に遠心後、上清を除去し１０分間吸引乾燥した。ここまでの操作は全て１本のチューブ内で行った。
【００３０】
抽出後、得られたＨＢＶゲノムＤＮＡを３０μｌの精製水に再溶解し、そのうちの２．５μｌを試料として用い、ＨＢＶゲノムのプレコア領域に特異的なプライマーを用いて遺伝子増幅を行った。これを１．５％アガロースゲルの電気泳動に付し、エチジウムブロマイド染色により検出した。この結果を図１に示す。
【００３１】
図から明らかなように、本発明の方法は、かなりコピー数の少ない試料からも効率よくＨＢＶのＤＮＡを抽出することができる。また、本発明の方法により抽出したＨＢＶのＤＮＡはＰＣＲに十分使用できる高純度のものである。
【００３２】
実施例２．ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの抽出
本実施例では１０８コピー／ｍｌのＨＣＶが含まれている血清を陰性血清により段階希釈し、１０８〜１０３コピー／ｍｌの希釈系列を作り、各希釈系列の血清を用いて以下のＨＣＶ−ＲＮＡの抽出を行った。
【００３３】
上記の各コピー数のＨＣＶを含むヒト血清１００μｌを検体試料とし、使用チューブは容積が１．５ｍｌのものを用いた。
【００３４】
抽出方法および各試薬の種類、濃度は実施例１と同様に行った。
【００３５】
得られたＨＣＶゲノムＲＮＡに逆転写反応に必要な試薬２０μｌを添加し、同一チューブ内で逆転写反応を行った。
【００３６】
逆転写反応後、反応液５μｌに対して、ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡの５’−ノンコーディング領域に特異的なプライマーを用い増幅反応を行い、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色により検出した。
【００３７】
なお、同じ検体をＡＧＰＣ法（ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｏｒｏｆｏｒｍ  法、実験医学、Ｖｏｌ．９  Ｎｏ．１５：９９−１０２，  １９９１）の変法（共沈剤使用）にて抽出し、同様に検出を行い比較した。この結果を図２に示す。
【００３８】
図から明らかなように、本発明によりＨＣＶのＲＮＡの抽出から逆転写反応までを１本のチューブで行い、これをＰＣＲに付した場合でも、かなりコピー数の少ない試料からも効率よくＨＣＶのＤＮＡを抽出することができる。
【００３９】
実施例３．検出血清の使用量幅の検定
ＨＣＶを含むヒト血清（１０８コピー／ｍｌのＨＣＶ含有）１、１０、５０、１００μｌを検体試料とし、使用チューブは容積が１．５ｍｌのものを用いた。
【００４０】
抽出方法および各試薬の種類、濃度、用量および逆転写反応、ｃＤＮＡ増幅は実施例２と同様に行った。この結果を図３に示す。
【００４１】
図から明らかなように、いずれの検体試料を用いてもＨＣＶ−ＲＮＡの検出を容易に行うことができた。
【００４２】
なお、本発明の方法は血清、血漿などの血液成分からのウイルス核酸の抽出に使用できるのみならず、全血からのゲノムＤＮＡの抽出にも使用できる。これを以下の参考例に示す。
参考例１．ウシ血液からのゲノムＤＮＡの抽出
ウシ全血２ｍｌ（ＥＤＴＡ採血）をチューブに取り、ＲＣＬＢ（Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）（０．３２Ｍシュークロース、１％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２ｍＭトリス塩酸緩衝液）を４ｍｌ加え、氷上でよく混和し、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。次にＲＣＬＢを２ｍｌ加えて混和し、同様に遠心分離、上清除去を行った。この操作をもう一度行った。得られた沈渣に検体希釈液５９０μｌ（実施例１と同じく検体希釈液に塩を溶解した。但し本参考例では共沈剤は添加していない）、タンパク質分解酵素（２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）１０μｌを加え、時折混和しながら５５℃で３０分間インキュベートし、沈渣を完全に溶解させた。さらに、タンパク質変性溶解剤として８Ｍグアニジン溶液を５０μｌ添加し混和した後、５５℃で１５分間インキュベートした。最後にイソプロパノールを６００μｌ加え、ＤＮＡを析出分離した後、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥して精製水３００μｌに再溶解した。抽出したウシゲノムＤＮＡ溶液を吸光度測定し、純度および収量を検討した。
【００４３】
結果を以下の表１に示す。
【００４４】
0003588370.tif 000002
【発明の効果】
本発明によって、フェノール、クロロホルムなど有機溶媒を用いる方法などの従来の方法よりも短時間で、しかも安全に高純度のウイルス核酸を得ることができる。しかも、使用チューブが１本で済み、経済的である上に、ウイルス核酸を研究する上で最も注意を要するコンタミネーションの危険性を低減できる。このような本発明の効果は多数の血液検体中のウイルスを検出する場合には特に有用である。
【００４５】
また、本発明の方法によって抽出、精製されたウイルス核酸は、逆転写反応、遺伝子増幅技術に対応できるなど、各種遺伝子工学、ウイルス学などの材料として十分に使用可能なものであり、その応用分野は極めて広い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により抽出したＨＢＶ−ＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅した結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。図中、Ｍはマーカー（ｐＢＲ３２２  ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ）であり、Ｃは陰性血清１００μｌから抽出したコントロールである。
【図２】本発明の方法により抽出したＨＣＶ−ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により増幅した結果を、ＡＧＰＣ法と比較して示すアガロースゲル電気泳動の写真である。図中、Ｍはマーカー（ｐＢＲ３２２  ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ）である。
【図３】検体血清の使用量幅の検定の結果を示す電気泳動の写真である。図中、Ｍはマーカー（ｐＢＲ３２２  ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ）である。
【図１】
0003588370.tif 000003
【図２】
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【図３】
0003588370.tif 000005