(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子の抗体が結合した１分子の酵素に更に所望の数の酵素を結合させてなる酵素抗体結合物の製造方法であって、
（ａ）１分子の抗体及び１分子の酵素からなる酵素標識抗体を製造し、
（ｂ）前記標識抗体中の酵素に更に酵素を結合させ、ついで
（ｃ）所定数の酵素が結合した酵素抗体結合物を分画法によって精製する
ことからなる製造方法。
【請求項２】
（ａ′）１分子の抗体と複数の第一の官能基が導入された１分子の酵素とを反応させることにより、１分子の抗体及び１分子の酵素からなる酵素標識抗体を製造し、
（ｂ′）前記標識抗体中の酵素に存在する第一の官能基と第二の官能基が導入された酵素とを反応させることにより、標識抗体中の酵素に更に酵素を結合させ、ついで
（ｃ）所定数の酵素が結合した酵素抗体結合物を分画法によって精製する
ことからなる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
抗体が、ＩｇＧのＦａｂ’フラグメントである請求項１ないし２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４】
酵素が、アルカリホスファターゼである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗体が結合した酵素に更に酵素を結合してなる酵素抗体結合物、及びこの酵素抗体結合物を含む酵素免疫測定（以下ＥＩＡという。）用のキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来ＥＩＡでは、抗体が酵素に結合した酵素標識試薬が用いられている。この試薬は抗体１分子に対して酵素１分子が結合した結合物である。
【０００３】
近年、免疫測定の高感度化の要求に対し、前記抗体１分子に対して酵素１分子が結合した結合物を、抗体１分子に対して酵素が２分子以上結合した結合物として測定することが行われている。この抗体に酵素が結合した結合物としては、重合させた酵素に抗体を反応させた結合物、抗体中の複数のチオール基を利用して２分子以上の酵素を反応させた結合物等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、重合させた酵素を用いる方法では、重合した酵素と抗体との反応を制御することができなかった。また、抗体中の複数のチオール基を利用した結合物では、複数のチオール基を有する一部の抗体には適用するともできるが、すべての抗体に適合することができなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は鋭意研究を行った結果、抗体が結合した酵素に更に酵素を結合させてなる酵素抗体結合物を見出し本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、また前記酵素抗体結合物を組み込んだＥＩＡキットを提供する。
【０００７】
本発明の結合物は、抗体が結合した酵素に更に酵素を反応させて製造する。原料である抗体が結合した酵素は、酵素の官能基とＩｇＧクラスの抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 等の抗体フラグメントの官能基とをグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド、ピリジル・ジスルフィド、カルボジイミド等の架橋試薬あるいは縮合試薬の存在下反応させることにより製造することができる。
【０００８】
本発明に用いることができる酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、パーオキシーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【０００９】
酵素抗体結合物を得るには、反応させる酵素に反応性の官能基を導入し、前記と同じ架橋試薬あるいは縮合試薬の存在下反応させる。結合する酵素の数は、前記架橋試薬又は縮合試薬の量を制御することにより行うことができる。また得られた酵素抗体結合物は、ゲルろ過法等の分子量による分画法によって精製され、分子量の分析より結合した酵素数が決定できる。
【００１０】
本発明の酵素抗体結合物は、測定対象物質に対応した抗原又は抗体結合固相、前記酵素に対応した基質等のＥＩＡ試薬と組み合わせてキットを構成し、検体中の抗原又は抗体の測定に用いることができる。ＥＩＡは、周知の１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法等のサンドイッチ法、競合法等のいずれでもよく、免疫反応により固相上に免疫複合体を形成して結合した酵素に発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を反応させ、その結果発生するシグナルを測定することにより行うことができる。シグナルの測定結果より、酵素活性を求め測定対象物を測定することができる。
【００１１】
【実施例】
以下，実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
実施例１  アルカリホスファターゼへのチオール基の導入
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ；オリエンタル社製）３２ｍｇをゲル濾過カラム（ファルマシア製；ＰＤ−１０）を通すことで、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に緩衝液置換した。イミノチオラン（ナカライテスク社製）０．３１ｍｇを加え、１時間室温で放置しチオール基の導入を行った。これをゲル濾過カラム（ファルマシア製；ＰＤ−１０）を通すことで未反応のイミノチオランを除き、チオール基導入ＡＬＰを得た。
【００１３】
実施例２  酵素抗体結合物の作製
マレイミド法で製造したＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（１：１）と実施例１で作製したチオール基導入ＡＬＰとを分子量１：２の割合で混合し、１時間放置した。これによってＡＬＰ上に存在するマレイミド基とＡＬＰのチオール基が反応し、酵素抗体結合物を得た。これをゲル濾過カラム（ファルマシア製；Superose  ２００）で分子量５０万付近のＡＬＰ：Ｆａｂ’＝３：１画分をプールし、酵素抗体結合物（以下ＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（３：１）という）を得た。
【００１４】
実施例３  抗ＨＢｓポリクローナル抗体結合粒子の作製
フェライト粒子（日本ペイント社製）３００ｍｇを０．４％塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、精製水１．５ｍｌに懸濁後、ＥＤＣ（ナカライテスク社製）４０ｍｇ／ｍｌ水溶液を１．５ｍｌ添加し室温で５分間放置する。抗ＨＢｓポリクローナル抗体１５ｍｇ／７．５ｍｌを添加し、２５℃、１時間エンドオーバーエンドで撹拌する。さらにこの粒子を洗浄後、ポストコート緩衝液２０ｍｌを加え一晩３７℃エンドオーバーエンドで撹拌し、洗浄後粒子濃度を１．５％に合わせて抗ＨＢｓポリクローナル抗体結合粒子とした。
【００１５】
実施例４  ＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（１：１）及びＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（３：１）によるＨＢｓ抗原の測定
実施例２の原料であるＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（１：１）０．５μｇ／ｍｌ又は実施例２で作成されたＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（３：１）０．５μｇ／ｍｌを用いてＨＢｓ抗原サブタイプａｄ（濃度：０．０５〜０．４ｎｇ／ｍｌ）の測定を行った。実施例３で作製した抗ＨＢｓポリクローナル抗体結合粒子を用い、化学発光酵素免疫測定装置（ルミパルスｆ；富士レビオ社製）を用いて２ステップサンドイッチ法による測定を行い、５秒間の発光量を測定した。その結果を図１に示す。
【００１６】
同様にＨＢｓ抗原サブタイプａｙ（濃度：０．０５〜０．４ｎｇ／ｍｌ）について測定を行った。その結果を図２に示す。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の酵素抗体結合物は、抗体に所定数の酵素が結合し、酵素の比活性を高めた化合物である。従って、この酵素抗体結合物を用いるＥＩＡでは、微量物質を高感度測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各濃度のＨＢｓ抗原サブタイプａｄをＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（１：１）とＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（３：１）によって測定した時の結果を示す図である。
【図２】各濃度のＨＢｓ抗原サブタイプａｙをＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（１：１）とＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体（３：１）によって測定した時の結果を示す図である。
【図１】
0003541701.tif 000002
【図２】
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