(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に充填剤層が形成された塔の複数を無端に連結した系内で液を一方向に循環流として流す操作と、この系に原料液，溶離液をそれぞれ供給し、かつ分離した所定成分を含む液をそれぞれ上記系外に抜出す操作と、前記の各液を供給する入口の位置及び所定成分を含む液を該系から抜出す出口の位置を弁の切換えにより上記一方向に間欠的に移動させて、上記入口及び出口に対して充填剤を液の流れとは見かけ上反対方向に移動させる操作とにより、上記塔内の充填剤に対して親和力の弱い物質を上記液の流れ方向に移動させ、かつ親和力の強い物質を上記間欠的な弁の切換えにより液の流れとは見かけ上反対方向に移動させて、親和力の異なる物質を連続的に分離して抜出す擬似移動層式クロマト分離操作を用いる方法であって、
上記親和力の弱い物質および／または親和力の強い物質を酵素反応によって生ずる原料を含む液を上記系に供給すると共に、該酵素反応を生ずる酵素を含む酵素液を、上記系内の原料が存在する位置に供給することを特徴とする擬似移動層式クロマト分離操作を用いる有用物質の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、酵素液の系への供給を、原料液の供給口に該原料液と共に供給することを特徴とする擬似移動層式クロマト分離操作を用いる有用物質の製造方法。
【請求項３】
請求項１において、酵素液の系への供給位置を、親和力の強い物質を系外に抜出す出口と、原料液の供給口との間としたことを特徴とする擬似移動層式クロマト分離操作を用いる有用物質の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、アルカリ金属形の強酸性カチオン交換樹脂により充填剤層を形成したことを特徴とする擬似移動層式クロマト分離操作を用いる有用物質の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、系外に抜出した液の一部又は全部について、この液に含まれる酵素を膜ろ過して濃縮側液に回収し、回収した酵素を、系に供給する酵素液の調製に用いることを特徴とする擬似移動層式クロマト分離操作を用いる有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、広義には酵素反応を用いて有用物質を製造する方法に関し、詳細には、クロマト分離操作と酵素反応操作とを同時に行わせて有用物質を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来、酵素反応を利用して有用な物質を製造する方法は種々知られており、代表的には以下のような方法が挙げられる。
【０００３】
第１は、撹拌槽に酵素反応の原料と酵素液を入れて所定時間反応させ、その後、未反応物質と生成物を分離する方法である。
【０００４】
第２は、攪拌槽に原料と酵素液を連続的に供給しながら生産物を連続的に抜出す連続攪拌槽で反応させた後、未反応物質と生成物を分離する方法である。
【０００５】
第３は、 "An Experimental and Computational Study of a Biochemical Polymerisation Reaction in a Chromatographic Reactor Separator"（Chemical Engineering Science Vol.43,No.9,p2369-2375(1988) ）に記載された分離材を充填した単一のクロマトカラムに原料と酵素を含む溶離液を交互に流して酵素反応と生成物の分離を同時に行う方法である。
【０００６】
第４は、特公昭６２−１８２０２号公報に記載の固定化酵素を充填した反応器と分離剤を充填した分離塔を組み合わせて擬似移動層を構成して分離する方法である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記第１及び第２の方法は、反応が平衡（可逆）反応である場合には、平衡反応率以上に反応を進めることができないという問題がある。
【０００８】
第３の方法では、分離が回分式クロマトであるため分離が不十分で収率も悪く、これを改善するために長いカラムを使用すると溶離液が多量に必要となり、得られる生成物の濃度が低くなってしまうという問題がある。
【０００９】
第４の方法では、酵素を固定化できない場合には実施できないという問題がある他、酵素を固定化できる場合であっても、固定化により酵素の活性の一部が失われる場合が多いためこれに対する対策が必要になり、また固定化酵素充填剤塔を必要とするため装置が複雑かつ大型化するという問題もある。
【００１０】
本発明者は、以上のような従来技術の種々の問題を検討して本発明をなすに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明の目的は、酵素反応とクロマト分離とを同時に行わせることによって全体操作を簡略化した有用物質の製造方法を提供するところにある。
【００１２】
また本発明の別の目的は、回分式のように純度をよくするために長いカラムを用いて溶離液を多量に用いる必要がなく、純度が高く収率にも優れていて、後段の濃縮工程の負担も小さくでき、有用物質を効率よく高い生産性をもって低コストに製造できる方法を提供するところにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、酵素反応が平衡（可逆）反応である場合に、総括的な反応率を平衡反応率よりも高くすることができて、有用物質を高い収率で製造することができる方法を提供するところにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記した目的は、本願の特許請求の範囲の各請求項に記載した発明により達成される。
【００１５】
本願請求項１の有用物質の製造方法の発明は、内部に充填剤層が形成された塔の複数を無端に連結した系内で液を一方向に循環流として流す操作と、この系に原料液，溶離液をそれぞれ供給し、かつ分離した所定成分を含む液をそれぞれ上記系外に抜出す操作と、前記の各液を供給する入口の位置及び所定成分を含む液を該系から抜出す出口の位置を弁の切換えにより上記一方向に間欠的に移動させて、上記入口及び出口に対して充填剤を液の流れとは見かけ上反対方向に移動させる操作とにより、上記塔内の充填剤に対して親和力の弱い物質を上記液の流れ方向に移動させ、かつ親和力の強い物質を上記間欠的な弁の切換えにより液の流れとは見かけ上反対方向に移動させて、親和力の異なる物質を連続的に分離して抜出す擬似移動層式クロマト分離操作を用いる方法であって、上記親和力の弱い物質および／または親和力の強い物質を酵素反応によって生ずる原料を含む液を上記系に供給すると共に、該酵素反応を生ずる酵素を含む酵素液を、上記系内の原料が存在する位置に供給することを特徴とする。
【００１６】
上記において、擬似移動層式クロマト分離操作を行うための装置としては、例えば、内部に充填剤層を形成し複数の塔を配管で無端に連結した系と、この系の所定位置に原料，溶離液，酵素液を供給しかつその供給位置を間欠的に循環流の下流側に切換え移動することができる液供給系と、分離した成分の富化帯域の液を循環系外に抜出しかつ液供給系と同期して間欠的に循環流の下流側に切換え移動することができる液抜出系と、これら液供給系及び液抜出系の切換え移動を行わせる制御手段の組合せによって構成されたものを用いることができる。
【００１７】
本発明方法は、原料と、酵素反応により生成される物質（成分）とがクロマト分離される関係のものであることが必要であり、酵素反応や充填剤の種類はこれらの関係を満足するものが用いられる。酵素反応は、転移反応，加水分解反応，合成反応などいずれの反応であってもよく、また可逆（平衡）反応，不可逆反応のいずれでもよいが、特に可逆（平衡）反応の場合には、後述する実施例で分かるように平衡反応率よりも高い収率で酵素反応を行わせることができるので好ましい。擬似移動層の内部は、必要に応じて酵素反応及びクロマト分離に適した条件（ｐＨ，温度等）に設定されることは当然である。
【００１８】
反応に用いられる原料は一つの物質であってもよいし、二以上の物質の組合せを原料としてもよい。また酵素反応で生成される物質も一つであっても複数であってもよく、有用物質と共に副生成される物質が生ずる場合であってもよく、有用物質は充填剤に対して親和力の強い物質，親和力の弱い物質のいずれであってもよい。
【００１９】
この発明によれば、系外で酵素反応を行わせる必要がなく、擬似移動層装置内で酵素反応とクロマト分離とを同時に行わせることによって全体操作、設備を簡略化して有用物質を製造することができる。
【００２０】
請求項２の発明は、上記発明において、酵素液の系への供給を、原料液の供給口に該原料液と共に供給することを特徴とし、請求項３の発明は、酵素液の系への供給位置を、親和力の強い物質を系外に抜出す出口と、原料液の供給口との間としたことを特徴とする。
【００２１】
この発明によれば、酵素と原料を効率よく接触させることができ、特に請求項３の発明によれば、酵素が他の物質に比べて移動流速の速い場合に、原料の供給位置よりも循環流の上流側から酵素が流れるので、より効率的に酵素と原料が接触することができる。
【００２２】
請求項４の発明は、上記の各発明において、アルカリ金属形の強酸性カチオン交換樹脂により充填剤層を形成したことを特徴とする。
【００２３】
本発明方法において用いられる充填剤は、例えばイオン交換樹脂、ゲルろ過用充填剤などを挙げることができるが、アルカリ金属形の強酸性カチオン交換樹脂を用いるこの発明によれば、低分子量の糖類やペプチド類の分子量による分離ができ、これらの製造に有効である。
【００２４】
請求項５の発明は、上記の各発明において、系外に抜出した液の一部又は全部について、この液に含まれる酵素を膜ろ過して濃縮側液に回収し、回収した酵素を、系に供給する酵素液の調製に用いることを特徴とする。
【００２５】
この発明によれば、比較的高価な酵素を再利用して繰り返し使用でき、資源の有効利用と製造コストの低減に有効である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
実施形態１
図１は本発明方法を実施するのに用いられるロータリーバルブ型擬似移動層装置の一例の概要を示したものであり、実際の装置は、充填剤充填塔である１２本のカラム１〜１２を同一円周上に等角度をなすように離隔配置し、配管１５によって無端状に連結されているが、この図１では、説明の便宜上カラムを直線状に展開配置した状態で示した。
【００２７】
そしてこの装置では、この１２本のカラムからなる系に対して原料液、酵素液，溶離水の各供給液をポンプ２１，２２，２３により所定のカラムに供給し、Ａ区分液及びＣ区分液を所定のカラムからポンプ２４，２５で抜出すように連結されると共に、図示しない開閉弁の切換えにより一定時間毎に循環流（図中に流れ方向を矢印で示した）の下流側に一カラムづつ、カラムとの連結が切換え移動されるようになっている。
【００２８】
すなわち、図１の状態では、原料液及び酵素液はポンプ２１，２２によってカラム５の塔頂に液を供給するように連結されていると共に、溶離液はポンプ２３によってカラム１の塔頂に供給するように連結され、かつＡ区分液はポンプ２４によってカラム１０の塔末から液を抜出し、Ｃ区分液はポンプ２５によってカラム２の塔末から液を抜出すようにそれぞれ連結されている。そしてこの連結が間欠的に液の循環する下流側に移動されることによって、間欠的に移動された次の時点では、原料液及び酵素液はカラム６の塔頂へ、また溶離水はカラム２の塔頂へそれぞれ供給され、Ａ区分液はカラム１１の塔末から、Ｃ区分液はカラム３の塔末からそれぞれ液を抜出すように連結が切換えられる。以下同様にして各液の供給位置，抜出位置が一定時間毎にカラム一つづつ循環流の下流側に移動するように切換えられる。
【００２９】
上記装置において、以上の操作を行うことで、無端接続されたカラムの系に原料液と酵素液の混合液として供給された原料と酵素は、酵素反応により反応生成物を生成し、生成されたうちの充填剤に対する親和力の弱い成分（Ａ区分液の成分）は循環流によって原料よりも下流方向にその富化帯域が進み、Ａ区分液の抜出し口から系外に抜出される。一方、生成物のうちの充填剤に対する親和力の強い成分（Ｂ区分液の成分）は、上述した供給口及び抜出口の一定時間毎の切換えにより充填剤が見掛け上循環流の流れとは反対方向に移動することにより、その富化帯域は原料の供給位置よりも上流側に移動し、供給される溶離水に押されてＣ区分液の抜出し口から系外に抜出される。
【００３０】
以上のようにして、図１の装置を用いて本発明の方法を実施することにより、原料液に含まれる原料と、酵素液に含まれる酵素とが擬似移動層装置に供給される直前で混合された時点から擬似移動層装置内で酵素反応が進行することになると共に、同時に擬似移動層の作用であるクロマト分離が行われ、この酵素反応と擬似移動層式クロマト分離が同時に行われることによって、効率的な酵素反応と生成物質の分離抜出しを連続的に行うことができる。
【００３１】
そして特に、酵素反応が平衡（可逆）反応である場合には、クロマト分離作用により生成物質が酵素反応の場から分離される（原料と酵素が接触する場から、これに関与しない場に移行する）ために、平衡（可逆）反応における生成物質生成の方向の反応を促進することができる。
【００３２】
実施形態２
図２に示した本例は、上記図１で説明した実施形態１の装置に比べて、酵素液の供給位置を、Ｃ区分液の抜出し位置（図２で言えばカラム２の塔末）よりも下流で、原料液の供給位置（図２で言えばカラム５の塔頂）の上流において、カラムの系に酵素液を供給するようにしたものであり、その他の構成は実施形態１と同じである。なお図２は、カラム２の塔末からカラム３の塔頂への配管１５に逆止弁３０を設けた例として示しているが、この逆止弁３０は必ずしも必須のものではなく、循環流の流量制御によって実質的に循環流が流れないようにするようにしてもよい。なおこの逆止弁も供給口及び抜出口と同様に一定時間毎に循環流の下流側に移動されるものである。
【００３３】
本例の装置によれば、最も流れ方向への進み方が速い酵素液が循環流によって原料が存在する領域に渡って確実に通過するので、実施形態１に比べて酵素反応をより効率よく行わせることができる。
【００３４】
実施例１
単位充填層として内径１．２ｃｍ、長さ２０ｃｍで加熱ジャケット付きのガラスカラムの１２本を用いて図１のロータリーバルブ型擬似移動層装置を構成した。
【００３５】
上記充填剤としては、ロームアンドハース社製のアンバーライトＣＲ１３１０（クロマト分離用ゲル型強酸性カチオン交換樹脂）のナトリウム形を用いた。各ゾーンのカラム数は溶離液供給口から下流方向に２本、２本、６本、２本とした。すなわち、溶離液供給口からＣ区分抜出口までの充填剤に対して親和力の強い成分の回収ゾーンを２本、Ｃ区分抜出口から原料供給口までのゾーンを２本、原料供給口からＡ区分抜出口までのゾーンを６本、Ａ区分抜出口から溶離液供給口までの親和力の弱い成分の回収ゾーンを２本とした。この装置内でβ−フラクトフラノシダーゼによる次のフラクトシル基転移反応を行わせた。
【００３６】
ラクトース＋スクロース＝ガラクトシルスクロース＋グルコース
ここで、ラクトースはガラクトースとグルコースの結合した物質、スクロースはグルコースとフラクトースの結合した物質、ガラクトシルスクロースはラクトースとフラクトースの結合した物質であり、該反応はスクロースを構成するフラクトースをラクトースに転移させる平衡反応である。
【００３７】
ｐＨを７．０に調整したラクトースとスクロースの混合水溶液ならびにβ−フラクトフラノシダーゼ原液の稀釈液を原料供給口より供給し、装置内のｐＨを調整するために１０ｍｇ／Ｌの水酸化ナトリウムを溶解した溶離水を溶離液供給口から供給した。反応温度は５５℃、原料糖濃度はそれぞれ１０ｗｔ％、酵素濃度は１８０Ｕ／ｍｌとした。ただし、１Ｕは常法により１分間に１μｍｏｌのフラクトシル基を転移させる酵素量とした。１サイクルの時間は２時間とした。また、各流速は次のようにした。
【００３８】
原料供給口とＣ区分液抜出口間の単位充填塔における流速：１．４５ｍｌ／ｍｉｎ
原液液供給量：０．０５ｍｌ／ｍｉｎ
酵素液供給量：０．０５ｍｌ／ｍｉｎ
溶離水供給量：０．７５ｍｌ／ｍｉｎ
Ａ区分液抜出し量：０．４０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｃ区分液抜出し量：０．４５ｍｌ／ｍｉｎ
運転の結果、１５時間後に下記表１に示す濃度と組成のＡ区分液とＣ区分液が得られた。
【００３９】
【表１】
0003542892.tif 000002
【００４０】
なお次式（ｉ）で計算した出口基準の総括反応率は５５．８％であり、比較例１の平衡反応率４４．９％に比べて、１０．９％高かった。
【００４１】
【数１】
0003542892.tif 000003
【００４２】
また、反応で生成したガラクトシルスクロースのＡ区分液での回収率は１００％であり、Ａ区分液のガラクトシルスクロースの純度は比較例１の回分反応に比べて１９．５％高くすることができた。
【００４３】
比較例１
実施例１の反応を回分反応で行った。５５℃に保った実施例１と同じ原料液１００ｍｌにβ−フラクトフラノシダーゼを１０１Ｕ添加し、３時間、６時間、９時間、２１時間、２７時間後にそれぞれ２ｍｌづつ反応液をサンプリングし、酵素を１００℃、１０分で加熱失活させた後、高速液体クロマトにより組成を測定した、その結果を下記表２に示した。
【００４４】
【表２】
0003542892.tif 000004
【００４５】
また次式（ii）で計算したラクトースからガラクトシルスクロースへの反応後基準の反応率は、３時間後２５．９％、６時間後３９．８％、９時間後４４．９％、２１時間後４４．２％、２７時間後３９．６％であり、したがって回分法での平衡反応率は上記の反応率が最大となる反応時間（９時間）を採用しても４４．９％が最大であることが分かる。
【００４６】
【数２】
0003542892.tif 000005
【００４７】
実施例２
図１のロータリーバルブ型擬似移動層装置で酵素液の供給場所を変更した図２の装置を用い、他の条件はすべて実施例１と同じにしてガラクトシルスクロースを製造した。
【００４８】
運転の結果、１５時間後に下記表３に示す濃度と組成のＡ区分液とＣ区分液とが得られた。
【００４９】
【表３】
0003542892.tif 000006
【００５０】
なお、実施例１と同様に計算した出口基準の総括反応率は６０．２％であり、実施例１よりも４．４％高くなった。また反応で生成したガラクトシルスクロースのＡ区分液での回収率は１００％であり、Ａ区分液のガラクトシルスクロースの純度は実施例１の５３．１％に比べ、５．２％高くすることができた。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素反応とクロマト分離とを同時に行わせることにより、酵素反応の操作あるいはクロマト分離の操作をそれぞれ単独に行う場合に比べて全体操作が簡略化され、しかも、回分式のように純度をよくするために長いカラムを用いて溶離液を多量に用いる必要がなく、純度が高く収率にも優れていて、後段の濃縮工程の負担も小さくでき、有用物質を効率よく高い生産性をもって低コストで製造できるという効果が奏される。
【００５２】
また、酵素が固定されていないので、固定化によってその活性が損なわれることがなく、酵素の活性を十分に発揮させることができる。
【００５３】
更に、酵素をその基質である原料液が存在する位置に供給するので、基質が存在しない場合に失活の虞が大きい酵素の利用の上でも優れた利点が奏される。
【００５４】
また更に、酵素反応が平衡（可逆）反応である場合には、原料と酵素が存在する反応場からクロマト分離の働きで連続的に生成物が分離される作用がはたらくので、生成物から原料生成方向への逆反応が抑制され、生成物を生成する総括的な反応率が通常の攪拌槽内で行われる平衡反応率よりも高くなり、有用物質を高い収率で製造することができるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１で用いられるロータリーバルブ型擬似移動層式クロマト分離装置の構成概要をフロー図として示した図。
【図２】本発明の実施例２で用いられるロータリーバルブ型擬似移動層式クロマト分離装置の構成概要をフロー図として示した図。
【符号の説明】
１〜１２・・・カラム
２１・・・原料液供給ポンプ
２２・・・酵素液供給ポンプ
２３・・・溶離水供給ポンプ
２４・・・Ａ区分液抜出しポンプ
２５・・・Ｃ区分液抜出しポンプ
【図１】
0003542892.tif 000007
【図２】
0003542892.tif 000008