(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ型コラーゲン溶液に、塩酸グアニジンおよび還元剤を加えるＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、ＩＶ型コラーゲン溶液が、牛レンズカプセルを酸で抽出して得られたＩＶ型コラーゲンを含む溶液であるＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法で得られたＩＶ型コラーゲンゲルを透析処理するＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、ＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法に関し、詳しくは、動物の組織の違いなどにより多数の種類が存在しているコラーゲンのうち、ＩＶ型コラーゲンによるゲルを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンは、生体の細胞外マトリックスを構成する主成分であり、生体との適合性に優れていることなどの特長を有し、動物のいろいろな組織から各種のコラーゲンが抽出製造され、医療、医薬品、生化学、美容、食品などの各分野で広く利用されている。コラーゲンを利用する場合、コラーゲンの溶液あるいは必要な形状の乾燥成形体などとして利用することもあるが、コラーゲン溶液をゲル化させたコラーゲンゲルの形で利用することも多い。例えば、細胞培養の担体となるコラーゲンゲルがある。
【０００３】
コラーゲンには、遺伝的に異なり、その特性や機能にも違いのある、多くの種類が存在していることが判っている。種類の異なるコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型などと呼ばれて区別される。コラーゲンを抽出する原料により、得られるコラーゲンのタイプが異なってくる。例えば、皮膚、骨、腱などからはＩ型コラーゲンが得られ、軟骨などからはＩＩ型コラーゲン、血管壁などからはＩＩＩ  型コーラゲン、基底膜からはＩＶ型コラーゲンが得られる。但し、原料によっては、複数タイプのコラーゲンが混在して抽出される場合もある。
【０００４】
従来、一般的に利用されていたコラーゲンは、畜獣の骨や皮を原料にしていたため、実質的にＩ型コラーゲンのみであったり、Ｉ型コラーゲンを主成分にして、他のタイプのコラーゲンが混在している状態のものであったりした。
医薬分野などでは、生体の各組織に対する適合性が非常に重要になる場合があり、使用するコラーゲンのタイプによって、性能に大きな違いが生じることがある。例えば、細胞培養を行うゲル担体の場合、培養する細胞によっては、特定タイプのコラーゲンゲルを用いると、他のタイプのコラーゲンや複数のタイプが混在するコラーゲンを用いたゲルよりも、優れた培養性能を発揮できることがある。
【０００５】
そこで、各タイプのコラーゲンのみを含むコラーゲン溶液を用いて、コラーゲンゲルを製造することが考えられた。すなわち、コラーゲンの使用目的に合わせて、Ｉ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンのみからなるゲルを製造するのである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来採用されていた通常のコラーゲン溶液に対するゲル化手段では、ＩＶ型コラーゲンのゲルを製造することができないという問題があった。
すなわち、コラーゲンのタイプが異なると、ゲル化能にも大きな違いが出てしまう。Ｉ型コラーゲンは比較的ゲル化が容易であり、既知のゲル化手段、たとえば、Ｉ型コラーゲン溶液を生理的条件下に置くことでゲルが形成される。しかし、ＩＶ型コラーゲンは、従来、通常のコラーゲンに対するゲル化手段として知られていた方法では、ゲルが全く形成されない。
【０００７】
ＩＶ型コラーゲンは、前記したように、その存在が主に生体の基底膜にあり、この基底膜とは、生体の各種臓器において上皮組織と結合組織との境界部分に存在するものであるから、上皮細胞などの細胞培養基として優れていることが予測され、組織培養などのゲル担体に、良好な特性が発揮できるものと考えられる。したがって、このような技術分野では、ＩＶ型コラーゲンからなるゲルを製造することが強く要望されている。
【０００８】
なお、ＩＶ型コラーゲンに他のＩ型などのコラーゲンが混在している状態では、ゲルを形成することも可能であるが、この場合は、得られたコラーゲンゲルは、Ｉ型コラーゲンなどの特性を示し、ＩＶ型コラーゲンゲルとしては、十分な性能が発揮できない。
そこで、この発明の課題は、従来、ゲルを製造することができなかったＩＶ型コラーゲンからなり、他のタイプのコラーゲンゲルが使用できなかったり良好な性能が発揮できなかったような各種の用途にも利用可能なＩＶ型コラーゲンゲルを製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する、この発明にかかるＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法は、ＩＶ型コラーゲン溶液に、塩酸グアニジンおよび還元剤を加える。
ＩＶ型コラーゲンとしては、既知の各種製造方法で得られたものが使用できる。具体的には、生体の基底膜がＩＶ型コラーゲンで構成されているので、基底膜あるいはこれを含む組織から抽出することができる。具体的には、腎糸球体やレンズカプセル、胎盤などが使用できる。特に、レンズカプセルが基底膜成分のみで構成されており、抽出も容易であるので、好ましい抽出原料となる。さらに、牛レンズカプセルが、実用的に利用し易く好ましい材料である。これらのＩＶ型コラーゲンを含む原料からの抽出方法としては、塩酸などの無機酸、酢酸などの有機酸を用いて抽出する方法、あるいは、ペプシン等の酵素などを用いて消化する方法が用いられるが、この発明では、酢酸を用いて抽出する方法が好ましい。抽出段階では、ＩＶ型コラーゲンと他のタイプのコラーゲンなどの混入物が含まれていても、これを分離精製して、実質的にＩＶ型コラーゲンのみを含む溶液を得るようにしてもよい。また、この発明の作用効果を損なわない程度であれば、ＩＶ型コラーゲン以外のコラーゲンその他の混入物が含まれていてもよい。
【００１０】
このようにして得られたＩＶ型コラーゲンの溶液に、塩酸グアニジンおよび還元剤を加える。このとき、ＩＶ型コラーゲン溶液のｐＨは、中性付近以上、具体的にはｐＨ６以上であればよいが、コラーゲンの分解を防ぐため、中性ないし弱アルカリ性の範囲、具体的にはｐＨ７〜９が好ましい。ＩＶ型コラーゲンの濃度は、ゲルを形成するには、最低０．２ｍｇ／ｍｌ  程度が必要であり、濃度が高いほど、溶液の粘性増加速度が高い。塩酸グアニジンの添加量は、１．５〜２．５モルが好ましく、２．０付近で最大のゲル化効果を示す。ＩＶ型コラーゲン溶液に塩酸グアニジンを添加した後で、還元剤を加えるのが好ましい。還元剤としては、ジチオスレトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノールなどが使用され、還元剤の添加量は、特に限定はないが、５〜１５ミリモル程度が好ましい。塩酸グアニジンおよび還元剤を加えたＩＶ型コラーゲン溶液を、一定時間、通常は数時間程度の間、静置しておくことで、溶液が流動性を失ってゲル化する。この場合、温度は、ＩＶ型コラーゲンの変性の危険を避けるために低温（例えば、４℃程度）で行うのが好ましい。また、ゲル化に要する時間は、溶液のコラーゲン濃度に依存し、濃度が高いほど、短時間でゲル化する。したがって、ＩＶ型コラーゲンゲルの利用目的によって、ＩＶ型コラーゲン溶液の濃度やＩＶ型コラーゲン溶液をゲル化させる際の形状、前記塩酸グアニジンと還元剤以外に加える添加剤などの条件を設定すればよい。
【００１１】
得られたＩＶ型コラーゲンゲルには、その利用目的に合わせて、任意の後処理を加えることができる。
例えば、前記方法で得られたＩＶ型コラーゲンゲルに、透析処理を行えば、前記ゲル形成に用いた塩酸グアニジンと還元剤の残留成分などを除去して、純度の高いＩＶ型コラーゲンゲルを得ることができる。透析処理の具体的条件については、形成されたＩＶ型コラーゲンゲルの特性が損なわなければ自由に設定でき、通常のコラーゲンゲルに対する透析処理と同様の条件が採用できる。
【００１２】
【作用】
ＩＶ型コラーゲン溶液に、従来のコラーゲンゲルに対する通常のゲル化手段、例えば、コラーゲン溶液を生理的条件に調整するなどの手段を適用しても、ゲルを形成させることが全くできないのに対し、この発明のように、中性付近以上のｐＨ領域で塩酸グアニジンおよび還元剤を加えると、ＩＶ型コラーゲン溶液はゲル化を起こし、十分なゲル特性を示すＩＶ型コラーゲンゲルを得ることができる。その理由は、詳細には不明であるが、ＩＶ型コラーゲンを構成する成分と塩酸グアニジンおよび還元剤との特異的な反応が生じているものと考えられる。具体的には、得られたゲルの骨格はＩＶ型コラーゲン分子で構成され、このゲル化には、ＩＶ型コラーゲン分子中のジスルフィド結合が関与しているものと考えられる。
【００１３】
この方法で得られるＩＶ型コラーゲンゲルは、ＩＶ型コラーゲンに特有の組織構造や特性を備えているため、従来のＩ型コラーゲンゲルでは十分に発揮できないような性能や機能を発揮できることになる。
さらに、前記方法で用いるＩＶ型コラーゲン溶液として、牛レンズカプセルを酢酸などの酸で抽出して得られた溶液を用いれば、ＩＶ型コラーゲン以外の混入物が少なくなり、また、これをさらに精製することによって、特性の優れたＩＶ型コラーゲンからなるコラーゲン溶液が効率的に得られ、その結果として、得られるコラーゲンゲルも、ＩＶ型コラーゲンとしての特性や機能が良好に発揮できることになる。
【００１４】
前記方法で得られたＩＶ型コラーゲンゲルに透析処理を施せば、ＩＶ型コラーゲン以外の不要な成分を除去して、純度の高いＩＶ型コラーゲンゲルを得ることができ、ＩＶ型コラーゲンゲルの有する優れた特性や機能を良好に発揮することが可能になる。
【００１５】
【実施例】
−実施例１−
〔ＩＶ型コラーゲンの製造〕
屠殺直後の牛から得られた眼球から牛レンズカプセルを採取し、氷冷下で、通常の方法を用い、洗浄および脱脂、脱灰処理を行って、精製牛レンズカプセルを得た。
【００１６】
精製牛レンズカプセル１５個に対し、０．５Ｍ酢酸を５〜１０ｍｌの割合で加え、氷冷下で、ポリトロン（スイス、キネマチカ社製）を用いて分散し、引き続き２〜３日をかけて抽出処理を行った。
抽出処理後、遠心分離して不溶物を除き、酢酸粗抽出液を得た。得られた粗抽出液からの凍結乾燥物の重量は、乾燥牛レンズカプセル重量に対し、約１５％であった。
〔ＩＶ型コラーゲンの確認〕
前工程で得られた酢酸粗抽出物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析したところ、ＩＶ型コラーゲンのα鎖と考えられる１８０Ｋ、１７５Ｋ、１６０Ｋ、の位置およびβ鎖と考えられる３２０Ｋの位置に、主たるバンドが認められ、上記以外のバンドは少量であり、ＩＶ型コラーゲンを主体とするものであることが確認された。
〔ＩＶ型コラーゲンゲルの製造〕
前記酢酸粗抽出液を、２Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）に対し、冷却下で２日間透析した。ここで得られた塩酸グアニジンを含む溶液に、ジチオスレトール（ＤＴＴ）を加え、よく攪拌混合し、４℃で保存した。この最終溶液におけるコラーゲン濃度は、１．０ｍｇ／ｍｌ  、ＤＴＴ濃度は１０ｍＭであった。
【００１７】
ＤＴＴを添加して約４時間を経過すると、溶液は流動性を失って、完全にゲル化した。ゲルの強さも十分にあり、このままで各種の用途に利用可能なものであった。
なお、上記実施例と比較するために、ＤＴＴを添加しない以外は、全く同様にして調製されたコラーゲン溶液は、２４時間経過しても、全くゲル化が認められなかった。
〔ＩＶ型コラーゲンゲルの透析〕
前工程で得られたＩＶ型コラーゲンゲルに対して、０．５Ｍ酢酸または２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、４℃で透析処理を行った。透析後も、ゲル状態は変化がなく、良好なゲルを維持していた。
【００１８】
−実施例２−
前記実施例１で得られた酢酸粗抽出物を用いて、さらに精製されたコラーゲンゲルを製造した。
〔ＩＶ型コラーゲン溶液の精製〕
前記酢酸粗抽出液を、６Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析した。得られた溶液を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア社製）カラムを通過させて、素通り画分を得た。さらに、スペクトラ／ポアセルローズエステル透析チューブ（分画分子量３０００００：スペクトラム社製）を用いて、前記溶媒に対して透析を行って、コラーゲン溶液の精製を行った。
〔精製ＩＶ型コラーゲン溶液の分析〕
前工程で得られた精製コラーゲンについて、実施例１と同様の電気泳動法で分析した。その結果、前記同様に、ＩＶ型コラーゲンのα鎖およびβ鎖を表す、３２０Ｋと１８０Ｋ、１７５Ｋ、１６０Ｋの位置に主たるバンドが認められ、その他にも極めて僅かにバンドが認められたが、いずれもＩＶ型コラーゲンに対するポリクロナール抗体で染色された。このことから、ここで得られた精製コラーゲンは、実質的にＩＶ型コラーゲンのみからなる純度の高いものであることが確認された。
〔精製ＩＶ型コラーゲンゲルの製造〕
前記精製後のＩＶ型コラーゲン溶液を、２Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）に透析した後、コラーゲン濃度を調整して、コラーゲン濃度の異なる４種類の溶液Ａ〜Ｄを得た。
【００１９】
各溶液Ａ〜Ｄに、前記同様のＤＴＴを加え、よく攪拌混合し、４℃で保存した。この最終溶液におけるコラーゲン濃度は、Ａ液＝１．０ｍｇ／ｍｌ  、Ｂ液＝０．５０ｍｇ／ｍｌ  、Ｃ液＝０．２５ｍｇ／ｍｌ  およびＤ液＝０．１０ｍｇ／ｍｌ  であった。
ＤＴＴを添加から、溶液が流動性を失って、完全にゲル化するまでの時間を測定したところ、Ａ液＝約４時間、Ｂ液＝約８時間、Ｃ液＝約２４時間であった。Ｄ液は、２４時間経過後にもゲル化が認められなかった。したがって、この実施例の条件では、コラーゲン溶液の濃度を、０．１０ｍｇ／ｍｌ  を超える濃度に設定しておかなければならないことが判る。また、得られたゲルの強さは、Ａ＞Ｂ＞Ｃとなっており、コラーゲン濃度に依存することが判る。したがって、コラーゲンゲルの利用目的に合わせて、コラーゲン溶液の濃度を設定すればよいことが判った。
【００２０】
さらに、得られたゲルに、実施例１と同様の透析処理を行ったが、良好なゲル状態は維持されたままであった。
【００２１】
【発明の効果】
以上に述べた、この発明にかかるＩＶ型コラーゲンゲルの製造方法によれば、従来ゲルを形成させることが困難であったＩＶ型コラーゲンを用いて、各種の用途に利用可能なゲルを製造することが可能になる。
その結果、従来のＩ型コラーゲンゲルのような他のタイプのコラーゲンゲルでは培養基質として不十分であった動物細胞、例えば、基底膜上に存在する上皮系細胞の培養に対して、極めて有効な基質となったり、他のタイプのコラーゲンゲルに比べて優れた特性を発揮できるようになったりするなど、コラーゲンゲルの新たな用途の開発や性能の向上に大きく貢献できることになる。