(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面でポリマーが共有結合的に結合している水酸基含有保持基材をベースとするゲル浸透クロマトグラフィー用の保持材で、
ａ）保持基材が脂肪属水酸基を含んでおり、
ｂ）共有結合的に結合したポリマーが末端モノマー単位を経由して保持基材と結合しており、
ｃ）線状のポリマーが式IIのモノマー単位からできており、
ｄ）ポリマーがエーテル橋で架橋されている
ことを特徴とする保持材。
0003583782.tif 000006
式中
R1,R2およびR3は互に独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨまたはC1−C5アルキルであり、
ｎは１ないし５の整数である。
【請求項２】
表面でポリマーがグラフト重合により共有結合的に結合している水酸基含有保持基材をベースとする保持材を製造する方法で、水酸基含有保持基材粒子をセリウム（IV）イオン存在下で式Ｉのモノマーを含む溶液中に懸濁して重合させ、
0003583782.tif 000007
式中
R1,R2およびR3は互に独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨまたはC1−C5アルキルであり、
ｎは１ないし５の整数であり、
つづいてエーテル橋をつくり、最後に残存エポキシド基を水酸基に変換させることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の保持材を使用するゲル浸透クロマトグラフィーカラム。
【請求項４】
請求項１に記載の保持材を用いるゲル浸透クロマトグラフィーによって混合物中の少くとも二つの物質を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明はゲル浸透クロマトグラフィーの改良法とこの方法で用いる保持材に関する。
巨大分子のサイズ分離用のゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）は生体高分子、特に蛋白質を分離するための標準の方法となった。この方法は親水性の表面をもち且つ不明確な吸着挙動のできるだけ少い保持材を必要とする。更に、用いられる保持体は高い流量を達成するために圧力に対し安定でなければならない。広空隙の保持体の場合この條件を満すことは特に難しい。
出願DE4310964は式Ｉのモノマーが水酸基含有の保持基材にグラフトされているオキシラン含有の活性化保持材を開示している：
0003583782.tif 000002
式中
R1,R2およびR3は互に独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨまたはC1−C5アルキルであり、
ｎは１ないし５の整数である。
これらの活性化保持材は反応して本発明の架橋グラフトポリマーをつくることができることがわかった。この反応において、架橋は、例えば三弗化硼素エーテル錯体と反応することによって、線状のポリマー鎖をもつ既知のグラフトポリマーに対して起る：
必要ならば残りのエポキシド基を続いて加水分解する。
もし脂肪属水酸基を含有する（ｇ当り１ミリ当量のOH）多孔質のビニルベースのコポリマーである、フラクトゲル▲Ｒ▼（Fractogel▲Ｒ▼）TSK  HW  65（Ｓ）をメタクリル酸グリシジルとグラフト重合にかけつづいて架橋すれば、この基材の分離性は大幅に変化することが判った。これらの方法は分離性の改善されたゲル浸透保持体を入手する手段を提供する。
本発明は表面でポリマーが共有結合的に結合している水酸基含有保持基材をベースとするゲル浸透クロマトグラフィー用の保持材に関し、この保持材は
ａ）保持基材が脂肪属水酸基を含んでおり、
ｂ）共有結合的に結合したポリマーが末端モノマー単位を経由して保持基材と結合しており、
ｃ）線状のポリマーが式IIのモノマー単位からできており、
ｄ）ポリマーがエーテル橋で架橋されている、
ことを特徴としている：
0003583782.tif 000003
式中
R1,R2およびR3は互に独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨまたはC1−C5アルキルであり、
ｎは１ないし５の整数である。
本発明は表面でポリマーがグラフト重合により共有結合的に結合している水酸基含有保持基材をベースとする保持材を製造する方法に関し、この方法は水酸基含有保持基材粒子をセリウム（IV）イオン存在下で式Ｉのモノマーを含む溶液中に懸濁して重合させ、
0003583782.tif 000004
式中
R1,R2およびR3は互に独立にＨまたはCH3であり、
R4はＨまたはC1−C5アルキルであり、
ｎは１ないし５の整数であり、
つづいてエーテル橋をつくり、最後に残存エポキシド基を水酸基に変換させることを特徴としている。
本発明は本発明の保持材を使用するゲル浸透クロマトグラフィーカラムおよび本発明の保持材を用いるゲル浸透クロマトグラフィーによって混合物の少くとも二つの物質を分離する方法に関する。
本発明の文脉における保持基材はポリマーがグラフトされている粒子である。表面に第一級または第二級脂肪属水酸基をもつかまたは公知の方法で脂肪属水酸基を導入できるという條件で、用いうる保持基材は一般に慣用の多孔質または非多孔質保持体粒子である。特に適した保持基材はポリビニルアルコールベースのポリマー、または（メタ）アクリレート誘導体と脂肪属水酸基を含有するモノマーのコポリマー、あるいは脂肪属水酸基を含有するジオール変性のシリカゲルまたはポリビニルベースのコポリマーである。このような保持基材は市販されている；一つの例に脂肪属水酸基を含有する（ｇ当り１ミリ当量のOH）多孔質のビニルベースのコポリマーであるフラクトゲル▲Ｒ▼（Fractogel▲Ｒ▼）TKS  HW  65（Ｓ）（E.メルク製）がある。
驚くことにオキシラン基含有の（メタ）アクリル酸エステルを脂肪属水酸基よりなる保持基材にその表面でグラフトさせることができることがわかった。この関係において、重合はセリウム（IV）イオンを用いる本発明に従って開始する:G.MinoとS.Kaizerman（1958）,J.Polymer  Science  31  242−243;G.Minoら（1959）,J.Polymer  Science  38,393−401.この発明によれば、この方法によって得られる活性化保持材は更に反応してゲル浸透クロマトグラフィー用の架橋分離材を生じることができる。
MinoとKaizmanのグラフト重合は硝酸で酸性化された純粋に水性の溶液中で既知の方法に従って行われる。従って、この反応は容易に水に溶けるモノマーを用いてのみ行うことができる。しかし、驚くことに使用溶剤が水と水酸基を含有しない有機溶媒の混合物である場合にもセリウム（IV）塩を用いた反応が可能であることがわかった。この関係で特に好ましい溶媒はジオキサンとテトラヒドロフランである。反応混合物中の有機溶媒の割合は10−80容量％が好ましく、20−50容量％が特に好ましい。
既知の架橋デキストランまたはアガロースゲルをベースとするマクロ細孔材料とは対照的に、本発明のゲルは圧力に安定であり高い流量を許容する。
これ以上何も述べなくても、当業者は上記の説明を最大限に利用することができると考えられる。従って、好ましい実施態様は単に説明のためのものと理解すべきであって、決して何らかの意味で限定的である開示と解釈してはならない。
上記および下記の全部の出願、特許および刊行物の完全な開示と、1993年10月８日提出の対応出願DE4334353は参考のため本出願に組込まれている。
次の実施例は発明を更に詳細に説明することを意図するもので、発明に何ら制限を課するものではない。
実施例
下記の調製例において、室温（RT）は15−30℃である。重合は撹拌機、滴下漏斗および温度計を備えた適当な大きさの三つ口フラスコ中で行われる。洗滌は吸引濾過器上で吸引を伴う濾過によって行われる。
実施例１：フラクトゲル▲Ｒ▼（Fractogel▲Ｒ▼）−TSK  HW  65（Ｓ）を原料としてオキシラン活性化保持体の調製
4gの硝酸セリウム（IV）アンモニウム（50mlの2M  HNO3に溶解）を100mlの沈降フラクトゲル▲Ｒ▼−TSK  HW  65（Ｓ）および50mlの水の懸濁液と室温ではげしく撹拌しながら混合する。１分後、60mlのジオキサン中6gの2,3−エポキシプロピルメタクリレートの溶液を加える。撹拌を３時間続ける。つづいて反応懸濁液を始めに蒸留水で次に0.05M  EDTA溶液で洗滌する。
実施例２：ポリ−2,3−エポキシプロピルメタクリレート鎖の架橋
実施例１で得られた変性ゲルを各々200mlの25,50および75容量％のジオキサン水溶液で洗滌して脱水し、最後に200mlの純ジオキサンで洗滌する。次の反応のために、ゲルを100mlの乾燥ジオキサン中に懸濁し、懸濁液を三つ口フラスコに移す。25mlの三弗化硼素エーテル錯体を、空気を遮断して、撹拌しながら加え、撹拌を室温で１時間つづけた。次にゲルを濾過し各々200mlのジオキサン、アセトンおよび水で洗滌した。
最後に、未反応のオキシラン基を200mlの0.5M硫酸で処理して加水分解する（２時間、45℃）。次にこの材料をリン酸塩緩衝液（0.1M;pH7）で中性まで洗滌し、最後に水で洗滌する。
次の性能例は本発明によって変性された分離材の作用を示す。
実施例３：変性分離材と非変性出発物質の比較
二つのガラスクロマトグラフィー管（長さ30cm,内径10mm;スーパーフォーマンス▲Ｒ▼（SuperFormance▲Ｒ▼），メルク製）の一つに非変性のフラクトゲル▲Ｒ▼TSK  HW  65（Ｓ）分離材を充填し、他の一つに実施例２によって変性した分離材を充填する。種々の検量用蛋白質やデキストランブルーを20mMリン酸塩緩衝液（pH7）中の0.15M  NaCl溶液に溶解し、1ml/分の流量で両カラム上で溶離させる。次の溶離データーが得られる。
0003583782.tif 000005
高分子量をもつアナライト（デキストランブルーとサイレオグロビン）の溶離特性は著しく変化するが、中位または低分子量の蛋白質（ウシ血清アルブミンとミオグロビン）の場合はそうではないことがわかる。