(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）その３'末端が下記ｂ）にオペラブルに連結された、ピチア・パストリスＡＯＸ１の５'側調節領域およびピチア・パストリスＤＡＳ１の５'側調節領域からなる群から選択される、５'末端および３'末端を有するピチア・パストリス５'側調節領域；
ｂ）下記ｃ）にオペラブルに連結された、５'末端および３'末端を含む、ＨＳＡシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードするＨＳＡ構造遺伝子であって、上記５'側調節領域の３’末端の下流の０、８または１１のデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するＨＳＡ構造遺伝子；および
ｃ）適切な３'側ターミネーション配列；
を含む、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＨＳＡ生産のための発現カセット。
【請求項２】
５'側調節領域がピチア・パストリス由来のＡＯＸ１の５'側調節領域である、請求項１記載の発現カセット。
【請求項３】
５'側調節領域がピチア・パストリス由来のＤＡＳ１の５'側調節領域である、請求項１記載の発現カセット。
【請求項４】
３'側ターミネーション配列が、ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択されるピチア・パストリス遺伝子から単離された配列である、請求項１、２または３記載の発現カセット。
【請求項５】
発現カセットが、環状プラスミドおよび直鎖状プラスミドからなる群から選択されるベクターに挿入されている、請求項１乃至４の何れか１項記載の発現カセット。
【請求項６】
ベクターがインテグラティブな部位特異性ベクターである、請求項５記載の発現カセット。
【請求項７】
ＨＳＡ構造遺伝子の５’側調節領域の３’末端とＡＴＧ開始コドンの間のヌクレオチドのアデニンおよびチミン含量が５５−６４％である、請求項１乃至６の何れか１項記載の発現カセット。
【請求項８】
以下の連続配置：
ａ）第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント；
ｂ）少なくとも一つのマーカー遺伝子；および
ｃ）第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント
を含むベクターであって、但し、少なくとも一つの発現カセットが成分ｂ）のマーカー遺伝子の前または後ろの何れかに取り込まれており、そして上記第１および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントがピチア・パストリスのゲノムの別々の部分に相同であり、そして上記挿入可能なフラグメントがピチア・パストリスのゲノムに存在するのと同じ方向にて存在する上記ベクターに取り込まれる、請求項１乃至７の何れか１項記載の発現カセット。
【請求項９】
第１の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントが、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択される、ピチア・パストリスから単離された遺伝子のＤＮＡ配列から得られる、前記ベクター中に含まれる請求項８記載の発現カセット。
【請求項１０】
マーカー遺伝子が、ピチア・パストリスＨＩＳ４遺伝子、ピチア・パストリスＡＲＧ４遺伝子、ビール酵母（Saccharomyces cerevisiae）ＳＵＣ２遺伝子、細菌性トランスポゾンＴｎ６０１のＧ４１８R遺伝子、および細菌性トランスポゾンＴｎ９０３のＧ４１８R遺伝子からなる群から選択される、前記ベクター中に含まれる請求項８または９記載の発現カセット。
【請求項１１】
ベクターが、下記
ａ）下記ｂ）にオペラブルに連結された、ピチア・パストリスから単離された長さ約１キロベースのＡＯＸ１遺伝子からのオペラブルな５'側調節領域である第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント；
ｂ）下記ｃ）にオペラブルに連結された、５'末端および３'末端を含む、ＨＳＡシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードするＨＳＡ構造遺伝子であって、上記５'側調節領域の３’末端の下流から８つのデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するＨＳＡ構造遺伝子；
ｃ）下記ｄ）にオペラブルに連結された、ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１遺伝子の３'側ターミネーション配列；
ｄ）下記ｅ）にオペラブルに連結された、ピチア・パストリスから単離されたＨＩＳ４遺伝子であるマーカー遺伝子；および
ｅ）約０．６５キロベースのＡＯＸ１の３'側ターミネーション配列である第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント
よりなる、請求項８、９または１０の何れか１項記載の発現カセット。
【請求項１２】
ＨＳＡ構造遺伝子がＡＴＧ開始コドンの５'側にデオキシリボヌクレオチドＡＧＧＡＡＴＴＣを含むＡＴＧ開始コドンを有する、請求項１１記載の発現カセット。
【請求項１３】
５’側調節領域の３’とＡＴＧ開始コドンの間にデオキシリボヌクレオチドがない、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の発現カセットにより形質転換された、ピチア・パストリス細胞。
【請求項１５】
形質転換されるピチア・パストリス細胞が、ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）、ピチア・パストリスＧＳ１９０（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１４）、ピチア・パストリスＰＰＦ１（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１７）、ピチア・パストリス（ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０）およびピチア・パストリス（ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３１）からなる群から選択される、請求項１４記載のピチア・パストリス細胞。
【請求項１６】
形質転換されるピチア・パストリス細胞がピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）である、請求項１５記載のピチア・パストリス細胞。
【請求項１７】
ピチア・パストリス細胞を請求項１乃至１３の何れか１項記載の発現カセット少なくとも一つを含むベクター少なくとも１種類により形質転換することにより形質転換したピチア・パストリス細胞からＨＳＡを分泌させる方法。
【請求項１８】
ａ）その３'末端が下記ｂ）にオペラブルに連結された、ピチア・パストリス由来のＡＯＸ１の５'側調節領域、ピチア・パストリス由来のＡＯＸ２の５'側調節領域、およびピチア・パストリス由来のＤＡＳ１の５'側調節領域からなる群から選択される、メタノール応答性プロモーターのピチア・パストリス５'側調節領域；
ｂ）下記ｃ）にオペラブルに連結された、５'末端および３'末端を含む、ＨＳＡシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードするＨＳＡ構造遺伝子であって、上記５'側調節領域の３’末端の下流の０、８または１１のデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するＨＳＡ構造遺伝子；および
ｃ）適切な３'側ターミネーション配列；
を含む、ピチア・パストリスにおけるＨＳＡ生産のための発現カセット。
【請求項１９】
３'側ターミネーション配列が、ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択されるピチア・パストリス遺伝子から単離された配列である、請求項１８記載の発現カセット。
【請求項２０】
５’側調節領域の３’とＡＴＧ開始コドンの間にデオキシリボヌクレオチドがないかまたは８つのデオキシリボヌクレオチドがある、請求項１８記載の発現カセット。
【請求項２１】
発現カセットがベクターに挿入されており、そして該ベクターが環状プラスミドまたは直鎖状プラスミドである、請求項１８乃至２０の何れか１項記載の発現カセット。
【請求項２２】
ベクターがインテグラティブな部位特異性ベクターである、請求項２１記載の発現カセット。
【請求項２３】
以下の連続配置：
ａ）第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント；
ｂ）少なくとも一つのマーカー遺伝子；および
ｃ）第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント
を含むベクターであって、少なくとも一つの発現カセットが成分ｂ）のマーカー遺伝子の前または後ろの何れかに取り込まれており、そして上記第１および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントがピチア・パストリスのゲノムの別々の部分に相同であり、そして上記挿入可能なフラグメントがピチア・パストリスのゲノムに存在するのと同じ方向にて存在する上記ベクターに取り込まれる、請求項２２記載の発現カセット。
【請求項２４】
第１の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントが、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択される、ピチア・パストリスから単離された遺伝子のＤＮＡ配列から得られる、請求項２３記載の発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関するものである。１観点においては本発明はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の発現法に関するものである。
【０００２】
背景
ヒト血清アルブミンは成人の最も豊富な血漿蛋白質である。アルブミンの濃度は４０ｍｇ／ｍｌ、すなわち７０Ｋｇの成人男子につき人体を循環するアルブミンは１６０ｇである。この蛋白質は浸透圧を維持し、銅、ニッケル、カルシウム（弱く、結合部位２−３個）、ビリルビンおよびプロトポルフィリン、長鎖脂肪酸、プロスタグランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと弱く結合して、膜を通るそれらの伝達を促進する）、チロキシン、トリヨードチロニン、クリスチンおよびグルタチオンの結合および輸送において機能する。ピーターおよびリード（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｇ．），Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（ピーターおよびショルム（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｊ．）編）１９７７，ｐ．１１−２０によれば、米国内だけで年間１０，０００ｋｇ以上の精製アルブミンが循環不全またはアルブミン欠乏を伴う患者に投与されている。
【０００３】
現在唯一の商業的ＨＳＡ源は分画血液からのものである。血液由来の汚染物質および病原体の危険性がありうることを考慮すると、ＨＳＡ調製のための別法を開発することは商業的ＨＳＡ製造に著しく寄与すると思われる。組換えＤＮＡ法の出現により現在ではＨＳＡを別法により製造することができる。
【０００４】
ＨＳＡはエッチェベリー（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ）ら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６年８月，ｐ．７２６およびアージャム・シン（Ａｒｊｕｍ  Ｓｉｎｇｈ）の欧州特許出願公開第１２３，５４４号明細書に示されるように、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においても発現される。エッチェベリーは濃度約６ｍｇ／ｌの細胞内ＨＳＡ発現、および細胞会合状態のＨＳＡの存在につき示している。ハヤスケらもビール酵母菌においてＧＡＬ  １プロモーターおよびシグナル配列と合わせたＨＳＡ発現につき示している。ハヤスケらは分泌産生水準１６０ｍｇ／ｌを達成し得たと思われる。欧州特許出願公開第３４４，４５９号明細書に示されるように、ＨＳＡはピチア・パストリスにおいて細胞内または細胞会合蛋白質としても発現している。酵母細胞、たとえばビール酵母菌およびピチア・パストリスにおけるＨＳＡの発現はＨＳＡの安全な代替供給源を提供するための重要な工程であるが、細胞内または細胞会合蛋白質としてのＨＳＡ発現は望ましくない。細胞内または細胞会合ＨＳＡを採取および精製するためには、経費および時間のかかる手段が必要である。さらに、収率を改善し、製造原価を低下させるためには、高水準のＨＳＡ分泌を達成することが有利であろう。
【０００５】
従って高水準のＨＳＡを分泌する酵母菌株を提供することは、当技術分野に著しく寄与すると思われる。
【０００６】
採取および精製の容易な様式でＨＳＡを産生する方法を開発することも、当技術分野に著しく寄与すると思われる。
【０００７】
従って本発明の目的は、高水準のＨＳＡを産生する菌株を提供することである。
【０００８】
さらに本発明の目的は、採取および精製の容易な様式でＨＳＡを産生する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的および利点は、本明細書の記載から当業者に明らかになるであろう。
【００１０】
発明の要約
本発明によれば、ピチア・パストリスにおいてＨＳＡを産生させるための下記よりなる改良された発現カセットが見出された：
（ａ）ピチア・パストリスＡＯＸ１調節領域およびピチア・パストリスＤＡＳ１調節領域よりなる群から選ばれる、５′末端および３′末端を有するピチア・パストリス５′側調節領域；該調節領域の３′末端が下記にオペラブル結合：
（ｂ）シグナル配列および成熟蛋白質をコードし、５′末端および３′末端を有するＨＳＡ構造遺伝子であって、ＨＳＡ構造遺伝子が該ＨＳＡ構造遺伝子の５′末端の約１１個を越えないデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するもの；下記にオペラブル結合：
（ｃ）３′側ターミネーション配列。
【００１１】
本発明によれば、ピチア・パストリスにおいてＨＳＡを産生させるための下記よりなる改良された発現カセットで形質転換されたピチア・パストリス株も見出された：
（ａ）ピチア・パストリスＡＯＸ１調節領域およびピチア・パストリスＤＡＳ１調節領域よりなる群から選ばれる、５′末端および３′末端を有するピチア・パストリス５′側調節領域；該調節領域の３′末端が下記にオペラブル結合：
（ｂ）シグナル配列および成熟蛋白質をコードし、５′末端および３′末端を有するＨＳＡ構造遺伝子であって、ＨＳＡ構造遺伝子が該ＨＳＡ構造遺伝子の５′末端の約１１個を越えないデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するもの；下記にオペラブル結合：
（ｃ）３′側ターミネーション配列。
【００１２】
本発明の他の形態においては、形質転換されたピチア・パストリス細胞からＨＳＡを分泌するための下記よりなる方法も見出された：
（ａ）下記よりなる発現カセット少なくとも１個を含むベクター少なくとも１種類によりピチア・パストリスを形質転換し：
ｉ）ピチア・パストリスＡＯＸ１調節領域およびピチア・パストリスＤＡＳ１調節領域よりなる群から選ばれる、５′末端および３′末端を有するピチア・パストリス５′側調節領域；該調節領域の３′末端が下記にオペラブル結合：ｉｉ）シグナル配列および成熟蛋白質をコードし、５′末端および３′末端を有するＨＳＡ構造遺伝子であって、ＨＳＡ構造遺伝子が該ＨＳＡ構造遺伝子の５′末端の約１１個を越えないデオキシリボヌクレオチドを介してＡＴＧ開始コドンを有するもの；下記にオペラブル結合：
ｉｉｉ）３′側ターミネーション配列；
次いで
ｂ）得られた形質転換したピチア・パストリスをＨＳＡの分泌に適した条件下で培養する。
【００１３】
詳細な説明
本発明は、ＨＳＡを産生させるための改良された発現カセット、改良されたベクター、ならびにこれらの改良された発現カセットおよびベクターにより形質転換されたピチア・パストリス株を提供する。
【００１４】
本発明によれば、発酵ブロスのリットル当たり真正ＨＳＡ約１−３．４ｇのＨＳＡ分泌水準が得られ、さらにＨＳＡ１５−８８μｇ／蛋白質ｍｇが細胞分泌経路内に存在していた。従って本発明は高水準のＨＳＡ分泌手段を提供する。１−３．４ｇ／ｌの水準では高純度のＨＳＡを高収率で採取することができるので、このＨＳＡ産生水準が達成されたことは先行技術による産生水準より著しい前進である。
【００１５】
ＨＳＡ構造遺伝子を発現するためには遺伝子は５′側調節領域および３′側ターミネーション配列にオペラブル結合していなければならず、これが宿主（通常は微生物）内へベクター（たとえば環状のプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラティブベクター）により挿入される発現カセットを形成する。ここで用いるオペラブル結合とは、５′側調節領域、構造遺伝子、および３′側ターミネーション配列がそれらの正常な機能を果たしうる状態で結合および構成された並置状態を意味する。ここで用いる５′側調節領域またはプロモーターとは、種々の刺激に反応して、高い割合のｍＲＮＡ転写をもたらすＤＮＡ配列を意味する。３′側ターミネーション配列は構造遺伝子の終止コドンに対して３′側の配列であり、これはこの配列がオペラブル結合している遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化する機能をもつ（たとえばポリアデニル化の引き金となる配列）。本発明を実施するためには、構造遺伝子のＡＴＧが可能な限り少ない介在デオキシリボヌクレオチドにより、好ましくは約１１個以下のデオキシリボヌクレオチド、極めて好ましくは約８個以下のデオキシリボヌクレオチドにより、５′側調節領域の３′末端に結合することが好ましい。介在デオキシリボヌクレオチドのアデニンおよびチミン含量が約５５−約６４％であることも好ましい。さらに、ある特定の位置についてはヌクレオチド優位性があると思われる。構造遺伝子のＡＴＧコドンから左へ数えて左側の最初の位置を−１位とすると、アデニンまたはシトシンが極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドであり、−２位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチミンであり、−３位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチミンであり、−４位において極めて好ましいヌクレオチドはアデニン、チミンまたはシトシンである。現在では図３および４の制限地図をもつＡＯＸ１もしくはＤＡＳ１  ５′側調節領域、またはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ；１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ；２がそれらの配列の３′末端においてＨＳＡ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンに結合していることが好ましい。ＡＯＸ１  ５′側調節領域の適切な結合の１例を下記に示す：
0003583791.tif 000002
0003583791.tif 000003
数種類の５′側調節領域が解明され、これらをピチア・パストリスにおいてＨＳＡの発現に関連して用いることができる。５′側調節領域の例は、ピチア・パストリス由来の第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）およびｐ４０調節領域などである。本発明の実施に際して用いられる現在好ましい５′側調節領域は、それらがメタノール含有培地に反応しうることを特色とするもの、たとえばＡＯＸ１およびＤＡＳ１よりなる群から選ばれる調節領域である。これらはＤ．Ｗ．ストローマンらにより米国特許第４，８５５，２３１号明細書に記載されており、これをここに参考として引用する。本発明の実施に際して用いられる極めて好ましい５′側調節領域はＡＯＸ１  ５′側調節領域である。
【００１６】
前記の発現カセット中に３′側ターミネーション配列を使用すべきである。３′側ターミネーション配列は遺伝子にオペラブル結合している場合、構造遺伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡを終結させ、ポリアデニル化し、および／または安定化する機能をもつが、特定の３′側ターミネーション配列が本発明の実施に際して重要であるとは思われない。本発明の実施に際して用いられる３′側ターミネーション配列の具体的供給源の数例にはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピチア・パストリスの３′側ターミネーション配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましいものはピチア・パストリス由来のもの、たとえばＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子の３′側ターミネーション配列よりなる群から選ばれるものである。特に好ましいものはＡＯＸ１遺伝子の３′側ターミネーション配列である。
【００１７】
ピチア・パストリスは種々のＨＳＡ構造遺伝子により形質転換することができる（ここで述べる本発明による形質転換体において、ＨＳＡ構造遺伝子はシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質の双方をコードする）。ＨＳＡ構造遺伝子はローン（Ｌａｗｎ）ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：６１０５（１９８１）およびドゥガイチク（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７１（１９８２）により配列決定された。これらの遺伝子はローンらおよびドゥガイチクらの方法による遺伝子の再単離によっても得られ、またはインビトロで一般の遺伝子製造業者、たとえばブリティッシュ・バイオテクノロジー社により合成される。ＨＳＡ遺伝子を得るための可能な１方法は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングするか、またはヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを抗−ＨＳＡ抗血清によりスクリーニングして、ＨＳＡを発現するヒト肝臓ｃＤＮＡを同定することである。適切なＨＳＡ構造遺伝子の一例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に提示される。ＨＳＡに対する構造遺伝子が採取されると、その遺伝子をさらに調整する必要がある。ＨＳＡ構造遺伝子を単離したのち、その遺伝子を適切なピチア・パストリスベクター、たとえばプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラティブベクターに挿入する。
【００１８】
プラスミド型ベクターは長年、組換えＤＮＡ法に用いられる基本的要素の１つであった。プラスミドは微生物に見られる環状の染色体外２本鎖ＤＮＡである。プラスミドは細胞当たり単一または多重コピーで生じることが認められている。プラスミドＤＮＡに含まれるものはプラスミド再生に必要な情報、すなわち自動複製配列、たとえばジェームス・Ｍ．クレグにより米国特許４，８３７，１４８第号明細書（１９８９年６月６日発行）に示されたものであり、これをここに参考として引用する。クレグにより示された自動複製配列は、ピチア・パストリスにおいてプラスミドを維持するのに適した手段である。さらに、形質転換した細胞においてプラスミドの遺伝表現型を選択するための１または２以上の手段もプラスミドにおいてコードされる情報に含まれる。
【００１９】
本発明の実施に際して用いられる適切なインテグラティブベクターは、ジェームス・Ｍ．クレグにより米国特許４，８８２，２７９第号明細書（１９８９年１１月２１日発行）に示された線状の部位特異性インテグラティブベクターであり、これをここに参考として引用する。これらのベクターは少なくとも１）第１挿入性ＤＮＡフラグメント；２）選択性マーカー遺伝子；および３）第２挿入性ＤＮＡフラグメントの順次整列した配列からなる。異種構造遺伝子を含む発現カセットが、このベクターの第１挿入性ＤＮＡフラグメントと第２挿入性ＤＮＡフラグメントの間に、マーカー遺伝子の前または後において挿入される。あるいは構造遺伝子がオペラブル結合しうる挿入性フラグメントの１つに調節領域すなわちプロモーターが含まれる場合、発現カセットをインサイチューで形成することができる。
【００２０】
第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはそれぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであり、形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分と相同なヌクレオチド配列をもつ。インテグラティブベクターの種々の成分は、発現カセットおよび選択性マーカー遺伝子が第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２挿入性ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に配置された状態で、順次整列して線状のＤＮＡフラグメントを形成する。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントは順次整列した線状フラグメント中において、それらが母体ゲノム中で配向しているものに従って互いに配向する。
【００２１】
第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こるべき天然ゲノム部位の別個の部分と相同のヌクレオチド配列である。たとえばゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ遺伝子の座で起こるべきである場合、用いられる第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダーゼ遺伝子の座の別個の部分と相同である。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして使用しうるヌクレオチド配列の例は、ピチア・パストリスアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書に記載されており、両者をここに参考として引用する。ＤＡＳ１という表示は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書において最初に用いられたＤＡＳという表示と等しい。
【００２２】
第１挿入性ＤＮＡフラグメントは発現カセットに用いられる調節領域からなるオペラブル調節領域を含むことができる。第１挿入性ＤＮＡフラグメントを発現カセットの調節領域として用いることは、本発明の好ましい形態である。図１は第１挿入性ＤＮＡフラグメントをカセットの調節領域として用いたベクターの図を提示する。図１に示すように、所望により挿入部位１または２以上、および３′側ターミネーション配列を第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′側に直接に配置することができる。この線状の部位特異性インテグラティブベクターの配置は、適合性３′側ターミネーション配列を別個に付加する必要なしに構造遺伝子を挿入するために用意された部位を提供するという付加的な利点をもつ。
【００２３】
第１挿入性ＤＮＡフラグメントが調節領域を含まない場合、オペラブル発現カセットを提供するためには適切な調節領域を構造遺伝子に結合した状態で挿入する必要がある。また挿入部位に発現カセットを完成する３′側ターミネーション配列が供給されていない場合、３′側ターミネーション配列を構造遺伝子の３′末端にオペラブル結合させることができる。
【００２４】
宿主株を形質転換するために用いられるＤＮＡ中に少なくとも１個の選択性マーカー遺伝子が含まれることも極めて望ましい。これにより、形質転換用ＤＮＡを取り込んだ微生物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は形質転換生物に宿主がもたなかった表現型上の特徴を与える。たとえば形質転換されていない宿主株が特定のアミノ酸生合成経路を欠如している場合、その特定のアミノ酸を産生する能力を回復させ、または抗生物質などに対する耐性を与える。選択性マーカー遺伝子の例は、ピチア・パストリスおよびビール酵母からのＨＩＳ４遺伝子（米国特許第４，８８５，２４２号明細書に記載）およびＡＲＧ４遺伝子（米国特許第４，８１８，７００号明細書に記載されており、ここに参考として引用する）、ビール酵母からのインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）（米国特許第４，８５７，４６７号明細書に記載されており、ここに参考として引用する）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスポジション可能な要素Ｔｎ６０１もしくはＴｎ９０３からのＧ４１８Ｒ／カナマイシン耐性遺伝子よりなる群から選ばれる。
【００２５】
本発明の実施に際して用いられるベクターに付加的なＤＮＡ配列、たとえば細菌性プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなどをも取り込ませうることは当業者に自明である。これらの配列は細菌性宿主においてこれらのベクターを増幅および維持しうるものである。
【００２６】
適切なベクター中へのＨＳＡ構造遺伝子の挿入は、選ばれたベクターを適切な１または２以上の部位で開裂し、そしてＨＳＡ構造遺伝子を含む少なくとも１個のオペラブル発現カセットをベクター中に存在させる適切な方法により行うことができる。ＨＳＡ構造遺伝子のリゲーションはいずれか適切なリゲーション法により、たとえばＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。
【００２７】
ＨＳＡ構造遺伝子およびベクターのリゲーション混合物の初期選択、増殖、および所望により増幅は、好ましくは混合物を細菌性宿主、たとえば大腸菌中へ形質転換することにより行われる（リゲーション混合物を宿主酵母中へ直接に形質転換することもできるが、形質転換率が極めて低い）。大腸菌に関する適切な形質転換法は当技術分野で周知である。さらに、選択マーカー、および細菌性宿主におけるベクターの維持に必要な細菌性複製開始点も当技術分野で周知である。発現系内にＨＳＡ構造遺伝子を含む目的のプラスミドの単離および／または精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離するためのいずれか適切な手段により行うことができる。同様に、リゲーションにより形成されたベクターを、好ましくは増殖後に試験して、ＨＳＡ遺伝子の存在、ならびに調節領域および  ３′側ターミネーション配列へのそれのオペラブル結合を立証することができる。これはエンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動またはサザーンハイブリダイゼーションを含めた種々の方法により行うことができるが、これらに限定されない。
【００２８】
宿主酵母中へのプラスミドまたは線状ベクターの形質転換は下記により教示されるものを含めた適切な形質転換法により行うことができるが、これらに限定されない：クレグおよびバリンガー，米国特許第４，９２９，５５５号明細書；ヒネン（Ｈｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５（１９７８）１９２９；イトー（Ｉｔｏ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３；クレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（１９８５），ｐ．３３７６；Ｄ．Ｗ．ストローマンら，米国特許第４，８７９，２３１号明細書（１９８９年１１月７日発行）；またはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ，５９（１９８７），ｐ．１１５。本発明を実施するために好ましいものはクレグら（１９８５）の方法である。本発明を実施するためには、線状ベクターを用い、サザーンハイブリダイゼーションにより挿入配列を選択することが望ましい。
【００２９】
形質転換に用いる宿主酵母はいずれか適切なメチロトロフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母であってもよい。適切なメチロトロフィック酵母にはハンセヌラ属およびピチア属よりなる群から選ばれる、メタノール上で増殖しうる酵母が含まれるが、これらに限定されない。この群の酵母の例である特定の種のリストはアンソニー（Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ），Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見られる。現在好ましいものは下記のピチア属メチロトロフィック酵母である：たとえば栄養要求性ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）；ピチア・パストリスＧＳ１９０（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１４）、米国特許第４，８１８，７００号明細書に記載；ピチア・パストリスＰＰＦ１（ＮＲＲＬ  Ｙ−１８０１７）、米国特許第４，８１２，４０５号明細書に記載。栄養要求性ピチア・パストリス株はそれらの選択の容易さにおいても本発明の実施に有利である。野生型ピチア・パストリス株（たとえばＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０およびＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３１）も、適切な形質転換マーカー遺伝子を選ぶならば、たとえばＳＵＣ２を用いてピチア・パストリスを蔗糖上で増殖しうる株に形質転換するか、または抗生物質耐性マーカー、たとえばＧ４１８に対する耐性マーカーを用いる場合、同様に有効に採用しうる。
【００３０】
形質転換したピチア・パストリス細胞はそれ以前は栄養要求性であった細胞を形質転換後に、要求される（細胞の栄養要求性のため）生化学的物質の不在下で培養し、新たな表現型（″メタノールスロー″）を選択および検出する方法、または形質転換体に含まれる耐性遺伝子の不在下では酵母にとって有毒である抗生物質の存在下で培養する方法を含めた適宜な方法により選択することができるが、これらに限定されない。
【００３１】
単離した形質転換ピチア・パストリス細胞は適宜な発酵法、たとえば振盪フラスコ発酵法、高密度発酵法、またはクレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，メチロトロフィック酵母、ピチア・パストリスにおける肝炎Ｂ表面抗原の高水準発現および効果的アセンブリー  ５  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４７９（１９８７）に示される方法により培養される。単離体はＨＳＡ産生をアッセイして、最大ＨＳＡ産生水準をもつ単離体を同定することによりスクリーニングすることができる。
【００３２】
目的とする表現型および遺伝子型をもつ形質転換した菌株を発酵槽中で増殖させる。メチロトロフィック酵母における組換えＤＮＡ系産生物の大規模製造のためには、普通は３段階の高細胞密度バッチ発酵システムが、用いられる好ましい発酵プロトコールである。第１、すなわち増殖段階においては、過剰の非誘導性炭素源（たとえばグリセリン）を含む特定の最少培地中で発現宿主を培養する。これらの炭素源上で増殖させた場合、異種遺伝子の発現は完全に抑制され、これにより異種蛋白質の発現なしに細胞マスを生成しうる。現在ではこの増殖期間中、培地のｐＨを約５に維持することが好ましい。次いで短期間の非誘導性炭素源限界増殖により細胞マスをさらに増加させ、メタノール応答性プロモーターを抑制する。この限界増殖期間中の培地のｐＨは産生期間中に維持すべきｐＨ値に調整され、一般にｐＨ約５−約６、好ましくはｐＨ約５．０またはｐＨ約５．８で実施される。限界条件下での増殖期間ののち、メタノール単独（ここでは以下″限界メタノール供給バッチ方式″と呼ぶ）、または限界量の非誘導性炭素源およびメタノール（ここでは以下″混合供給材料供給バッチ方式″と呼ぶ）を発酵槽に添加し、メタノール応答性プロモーターにより駆動された異種遺伝子の発現を誘導する。この第３段階はいわゆる産生段階である。
【００３３】
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例に関する一般情報：
菌株
ピチア・パストリスＧＳ１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１
大腸菌ＪＭ１０３デルタ（ｌａｃ  ｐｒｏ）ｔｈｉ  ｒｐｓｌ（ｓｔｒＡ）ｓｕｐＥ  ｅｎｄＡ  ｓｂｃＢ  ｈｓｄＲ
大腸菌Ｋ１２  ＭＣ１０６１  ＮＲＲ１−１８０１６（Ｆ−，ａｒａＤ１３９デルタ（ｌａｃ  １ＰＯＺＹ）ｘ７４ｇａｌｋ  ｇａｌｕ  ｈｓｒ  ｈｓｍ（＋）ｒｐｓＬデルタ（ａｒａＡＢＯＩＣ  ｌｅｕ）７６９７
大腸菌ＤＧ７５′（ｈｓｄ１、ｌｅｕ６、ｌａｃＹ、ｔｈｒ−１、ｓｕｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１、ｌａｍｂｄａ−）
緩衝液、溶液および培地
以下の実施例で用いた緩衝液、溶液および培地は下記の組成をもつ：
0003583791.tif 000004
【００３５】
0003583791.tif 000005
0003583791.tif 000006
0003583791.tif 000007
0003583791.tif 000008
0003583791.tif 000009
0003583791.tif 000010
0003583791.tif 000011
0003583791.tif 000012
方法
組換えＤＮＡ実験室作業に適した方法は多様な文献中に見られ、それらには以下のものが含まれるがこれらに限定されない：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス社），特にＶｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，バーガーおよびキンメル（Ｂｅｇｅｒ，Ｋｉｍｍｅｌ），（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス社，１９８７），ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社，１９８９）；これらすべてをここに参考として引用する。
【００３６】
例１
ｍＨＳＡ１３の構成
ＨＳＡ構造遺伝子挿入配列の突然変異
欧州特許出願第０  ３４４  ４５９号明細書（ここに参考として引用する）に示されるｐＨＳＡ１３からＥｃｏＲＩ消化により、ＨＳＡをコードするＤＮＡを得た。１％アガロースゲル上での電気泳動により２０６９ｂｐのフラグメントを採取した。このＤＮＡを下記の方法で突然変異させ、下記のとおり変化させた：１）ＥｃｏＲＩ制限部位をＨＳＡシグナル配列のＡＴＧの直前に付加し、２）ＥｃｏＲＩ制限部位をＨＳＡ  ｃＤＮＡ中のＴＡＡ終止コドンに隣接して付加した。
【００３７】
突然変異生成に用いたオリゴヌクレオチドは下記のものであった：
１）ＥｃｏＲＩ部位を付加する５′側突然変異；突然変異生成ヌクレオチド配列：
0003583791.tif 000013
２）ＥｃｏＲＩ部位を付加する３′側突然変異；突然変異生成ヌクレオチド配列：
0003583791.tif 000014
これらはアプライド・バイオシステムズＤＮＡ合成装置、モデル３８０Ａを用いてシアノエチルホスホルアミダイト化学により合成された。
【００３８】
１．２μｇの２本鎖ｍ１３ｍｐ１０をＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、ＨＳＡ構造遺伝子を含む予め単離された２０６９ｂｐフラグメント４５０ｎｇとリゲートした。
【００３９】
リゲーション混合物をコンピーテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＪＭ１０３細胞中へ形質転換した（コンピーテントＪＭ１０３は例２にＭＣ１０６１細胞につき記載したものに従って調製された）。次いでＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有する培地で混合物を平板培養し、透明なプラークにつき平板をスクリーニングした。形質転換体からＤＮＡを採取し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。７３６９および１９５０ｂｐのバンドを示す適正なファージをｍＨＳＡ１３と呼ぶ。
【００４０】
Ａ．２ｍｌのＬ培地中で約７時間インキュベートした陽性プラークにつき大規模ミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を行った。２５ｍｌのＬＢ培地に増殖したばかりのＪＭ１０３細胞２５０μｌを接種した。培養物を１時間増殖させ、７時間齢のプラーク培養物１００μｌを接種した。次いで培養物を一夜増殖させた。培養物をソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−５ＢローターＳＳ３４により１０，０００ｒｐｍで１０分間、２回遠心分離して上澄液を透明にした。３．５ｍｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを培養物に添加し、これを４℃で５時間インキュベートした。次いで培養物を上記に従って再度１０分間遠心分離した。上澄液を廃棄し、ペレットを２ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。次いでペレットをフェノールで抽出し、ＴＥで平衡化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨＣｌ３で２回、エーテルで１回抽出した。８Ｍ  ＬｉＣｌを添加して最終濃度０．８Ｍとなした。３容量のエタノールを添加し、溶液を−２０℃で一夜放置して、存在するＤＮＡを沈殿させた。次いで溶液を上記に従って１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、７０％エタノールですすいだ。沈殿を１５０μｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【００４１】
Ｂ．１ｐｍｏｌのＭ１３組換え鋳型を２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド１（ＥｃｏＲＩ部位を形成する５′側突然変異につき）と混合し、１μｌの溶液ＡおよびｄＨ２Ｏを添加して最終容量１０μｌとなした。この試料を６５℃で５分間インキュベートし、次いで温度を３７℃に３０分間低下させた。
【００４２】
Ｃ．次いで試料に下記のものを添加し：
0003583791.tif 000015
１５℃で少なくとも４−６時間インキュベートした。
【００４３】
Ｄ．次いで試料をｄＨ２Ｏにより１：４０に希釈した。５μｌを用いてコンピーテントＪＭ１０３細胞の試験管６本（各２００μｌ）を形質転換した。形質転換したＪＭ１０３細胞をソフト寒天オーバーレイ中の富化培地上で平板培養した。
【００４４】
Ｅ．次いでフィルターハイブリダイゼーションにより陽性プラークをスクリーニングした。
【００４５】
全容量２５μｌ中の相補的オリゴヌクレオチド１５ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションプローブを６５℃で１０分間加熱した。３μｌの１０×キナーゼ緩衝液（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、１μｌのγ−ＡＴＰおよび１μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（１００ｕ／μｌ）を試料に添加した。試料を３７℃で１時間インキュベートし、Ｇ−５０ファインセファデックスに導通した。カラムから流出する最初のピークを採取した。
【００４６】
ニトロセルロースフィルターを形質転換平板上に５−１０分間乗せることにより、上記プローブを用いてフィルターをハイブリダイゼーション用に調製した。次いでフィルターを平板からはずし、変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ＮＮａＯＨ）上に３分間、裏面を溶液に乗せた状態で浮遊させた。次いでフィルターを変性溶液に５分間浸漬した。ニトロセルロースフィルターを中和溶液（１Ｍトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８；１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に５分間移した。次いで中和したフィルターを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウムである）に５分間移した。次いでフィルターを風乾し、８０℃で１時間、真空下にベークした。５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液、フィルター、１０×デンハルツ（１×デンハルツは０．０２％ファイコル、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミンである）、０．５％ＳＤＳおよび５×ＳＳＰＥを入れた密閉プラスチックバッグ内において、フィルターを６５℃で１時間、予備ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液を５ｍｌ／フィルターの新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に交換した。用いたスクリーニング用オリゴヌクレオチドは下記のものであった：
１）５′側突然変異；スクリーニング用オリゴヌクレオチド：
0003583791.tif 000016
２）３′側突然変異；スクリーニング用オリゴヌクレオチド：
0003583791.tif 000017
予め調製されたスクリーニング用オリゴヌクレオチドをまず６５℃で５分間インキュベートし、次いでフィルターを入れた新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に１×１０６ｃｐｍ／ｍｌとなすのに十分なプローブを添加した。プローブの計算融解温度より５℃低い温度で４時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００４７】
次いでフィルターを６×ＳＳＣにより室温で各１０分間３回洗浄した。最後にフィルターを６×ＳＳＣによりハイブリダイゼーション温度で１回洗浄した。フィルターを３ＭＭワットマン濾紙に乗せて乾燥させ、次いでフィルム（方向指示のためにマークを付けた）に一夜露光した。
【００４８】
陽性プラークをそれぞれ採取し、２ｍｌのＬＢブロス中において３７℃で５分間、別個に増殖させた。
【００４９】
Ｆ．これら陽性プラークにつきミニ鋳型プレプを行った。
【００５０】
１ｍｌのプラーク培養物をエッペンドルフ試験管に移し、エッペンドルフ・モデル５４１４遠心機により５分間遠心分離した。８００μｌの上澄液を採取し、２．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０％ＰＥＧ  ２００μｌをこれに添加した。上澄液を室温で１０分間インキュベートした。上澄液を上記で用いたエッペンドルフ遠心機により１０分間遠心分離した。上澄液をアスピレーションにより除去し、遠心分離により形成されたペレットを２００μｌのＴＥ（１ｍＭトリス，ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。次いで再溶解したペレットをフェノール／クロロホルム抽出し、０．８Ｍ濃度になるまでＬｉＣｌ溶液を添加することにより、上部水相中の鋳型ＤＮＡを沈殿させた。この溶液に２  １／２−３容量のエタノールを添加し、ドライアイス上で５分間沈殿させた。沈殿を上記エッペンドルフ遠心機により１０分間遠心分離した。ＴＥにより最終容量を１５０μｌとなした。
【００５１】
Ｇ．採取したＤＮＡにより２００μｌのコンピーテントＪＭ１０３細胞を形質転換した。単離したｐｈａｓｅＤＮＡの１μｌおよび１／１０希釈液１μｌを形質転換に用いた。
【００５２】
Ｈ．形質転換混合物を先に工程Ｅに記載したように平板培養し、オリゴヌクレオチドによりプラークをスクリーニングした。
【００５３】
Ｉ．２ｍｌのＬ培地中で約７時間インキュベートした陽性プラークにつき大規模ミニプレプを行った。２５ｍｌのＬＢ培地に増殖したばかりのＪＭ１０３細胞２５０μｌを接種した。培養物を１時間増殖させ、７時間齢のプラーク培養物１００μｌを接種した。次いで培養物を一夜増殖させた。次いで培養物をソルバルＲＣ−５ＢローターＳＳ３４により１０，０００ｒｐｍで１０分間、２回遠心分離して上澄液を透明にした。３．５ｍｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを培養物に添加し、これを４℃で５時間インキュベートした。次いで培養物を上記に従って再度１０分間遠心分離した。上澄液を廃棄し、ペレットを２ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。次いでペレットをフェノールで抽出し、ＴＥで平衡化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＣＨＣｌ３で２回、エーテルで１回抽出した。８Ｍ  ＬｉＣｌを添加して最終濃度０．８Ｍ  ＬｉＣｌとなした。３容量のエタノールを添加し、溶液を−２０℃で一夜放置して、存在するＤＮＡを沈殿させた。次いで溶液を上記に従って１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、７０％エタノールですすいだ。沈殿を１５０μｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【００５４】
Ｊ．次いで陽性プラークをジデオキシ配列決定法により配列決定して、適正な突然変異を含むＭ１３構成体を見出した。
【００５５】
Ｋ．適正な５′側突然変異を含むＭ１３構成体を鋳型とし、第２オリゴヌクレオチドを３′側突然変異のプライマーとして用いて工程Ｂ−Ｊを反復した。適正な突然変異をｍＨＳＡ１４０と表示した。
【００５６】
Ｌ．マニアチスのアルカリ溶解法により、ｍＨＳＡ１４０のＲＦ  ＤＮＡを採取した。
【００５７】
例２
ｐＨＳＡ１４０発現ベクターの構成
ｐＡＯ８０４は宿主大腸菌中において米国農務省ノーザーン・リージョナル・リサーチ・センター（イリノイ州ペオリア）から受理番号Ｂ−１８１１４で入手される。ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動して〜７．５ｋｂフラグメントを採取することにより採取され、これはユニークＥｃｏＲＩ部位で切断された線状ｐＡＯ８０４であった。
【００５８】
ｐＡＯ８０４はピチア・パストリスＡＯＸ１遺伝子座を部位特異性分断しうるベクターである。これは下記の要素を含む：ユニークＥｃｏＲＩクローニング部位により分離されたＡＯＸ１プロモーターおよび転写ターミネーター；野生型ピチアＨＩＳ４遺伝子；転写ターミネーターの下流にある、ＡＯＸ１遺伝子座の３′末端からのＤＮＡゲノムセグメント；ならびに細菌性宿主における選択および複製に必要な配列。これらの成分はプラスミドのＢｇ１ＩＩ制限消化により発現カセットおよび選択性マーカー（その末端がゲノムの連続部分と相同である）、ＡＯＸ１遺伝子座を放出し、形質転換に際して染色体に安定に挿入しうる様式で整列する。さらにアンピシリン耐性遺伝子およびプラスミドｐＢＲ３２２からのｏｒｉもｐＡＯ８０４プラスミドに含まれる。
【００５９】
ｐＡＯ８０４およびｍＨＳＡ１４０から、ＨＳＡの産生をコードする遺伝子を含むベクターを構成した。ｐＡＯ８０４をＥｃｏＲＩで消化し、末端をアルカリホスファターゼ（１Ｕの酵素、３７℃、１時間、５０ｍＭトリス・Ｃｌ、ｐＨ９．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭスペルミジン中）で処理することにより脱リン酸化した。ｍＨＳＡ１４０もＥｃｏＲＩで消化し、ＨＳＡをコードする１８２９ｂｐフラグメントを放出させた。このフラグメントを０．８％調製用アガロースゲル電気泳動により精製した。６０ｎｇのこのフラグメントと２４０ｎｇのｐＡＯ８０４を２３℃で１時間、６６ｍＭトリス・Ｃｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰを用いて、１ワイス単位（Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔ）のＴ４リガーゼにより１０μｌの反応容量でリゲートした。リゲーション反応物を用いて、コンピーテントＭＣ１０６１細胞をアンピシリン耐性に形質転換した。
【００６０】
ＭＣ１０６１は下記の方法で形質転換のためにコンピーテントとなされた。大腸菌ＭＣ１０６１の対数中期培養物（５０ｍｌ）をＩＥＣ  ＤＰＲ６００臨床用遠心機により３，０００ｒｐｍで５分間、４℃において遠心分離することにより採取し、１０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。培養物を２５ｍｌの５０ｍＭ  ＣａＣｌ２に０℃で３０分間、再懸濁した。細胞を上記に従って遠心分離し、２ｍｌの５０ｍＭ  ＣａＣｌ２に再懸濁した。
【００６１】
形質転換のために、リゲーション反応物を２００μｌのコンピーテント細胞懸濁液に添加し、０℃で氷上において１５分間インキュベートし、３７℃で５分間、熱ショックを与え、２３℃で５分間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天平板に細胞を直接接種した。平板を３７℃で１０−１６時間インキュベートした。得られたコロニーはＡｍｐＲであった。耐性コロニーを採取し、制限消化により解明した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス５ｍｌ中において３７℃で５時間、細胞を増殖させ、バーンボイムおよびドーリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｄｏｌｙ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：１５１３（１９７９）］の方法によりＤＮＡを調製した。ＰｖｕＩＩ消化に際して４７５０、３０００および１９００ｂｐフラグメントを示すミニプレプを選択し、ｐＨＳＡ１４０と表示した。
【００６２】
例３
ピチア・パストリスの形質転換
例２に記載したベクターを含むピチア・パストリス株を下記の方法で調製した。メタノール利用欠如株（Ｍｕｔ−またはメタノールスロー）および野生型メタノール利用株（Ｍｕｔ＋またはメタノールノーマル）が形成された。
【００６３】
ピチア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４；ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）をクレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：４７９−４８５（１９７８）に記載のスフェロプラスト形質転換法により形質転換した。米国特許第４，８７９，２３１号明細書も参照されたい。
【００６４】
Ａ．Ｍｕｔ＋株
ベクターの挿入をＡＯＸ１遺伝子座へ方向づけるために、２および１０μｇのＳａｃ１消化ｐＨＳＡ１４０を別個に、ＯＤ６００が５である（すなわち２５×１０７細胞）ＧＳ１１５中へ形質転換した。形質転換体を最少培地においてリジェネレートさせ、Ｈｉｓ＋表現型につきスクリーニングした。その際、挿入部位およびベクターコピー数に関するサザーン分析により数種類のＨｉｓ＋形質転換体がスクリーニングされた（例５）。
【００６５】
Ｂ．Ｍｕｔ−株
ＨＳＡ発現カセットがＡＯＸ１構造遺伝子中へ挿入されてこれを分断したＭｕｔ−株を形成させるために、ベクターｐＨＳＡ１４０をＰｖｕＩで消化し、次いでＢｇ１ＩＩで部分消化した。次いで消化物を０．８％アガロースゲル上でサイズ分画し、６．０−９．０ｋｂのサイズのＤＮＡを単離した（発現カセットは〜７．４ｋｂであると予想された）。このＤＮＡを５μｇ用いてＯＤ６００が５である（２５×１０７細胞）ＧＳ１１５をスフェロプラスト法により形質転換した。Ｈｉｓ＋細胞を同定し、次いで下記によりＭｕｔ−表現型につきスクリーニングした。
【００６６】
平板表面を無菌蒸留水の存在下で掻き取り、低出力で１５秒間音波処理することにより形質転換体をプールした。次いでそれらをＡ６００＝０．１に希釈し、１０−３および１０−４の希釈度で、グリセリンを炭素源として含有する最少平板培地に二重試験法により接種し、３０℃で２−３日間インキュベートした。次いでそれらを、蒸気相で１００μｌのメタノールを添加した最少平板培地上へレプリカ接種した。３０℃で２４時間インキュベートしたのち、４％の形質転換体はメタノール上で残りの形質転換体より緩慢に増殖することが明らかであった。Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ−単離体のうち５種類をサザーン分析により調べた（例５）。
【００６７】
例４
酵母ＤＮＡミニプレプ
１０４個／ｍｌの細胞を５ｍｌのＹＰＤに３０℃で一夜接種し、次いでダモン（Ｄａｍｏｎ）ＩＥＣ  ＤＰＲ６００臨床用遠心機により３，０００ｒｐｍで５分間ペレット化した。このペレットを０．５ｍｌの１Ｍソルビトール、０．１ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁し、試料を１．５ｍｌミクロ遠心管に移した。０．０２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）１００，０００（マイルズ・ラボラトリーズ）を添加し、試料を３７℃で６０分間インキュベートした。細胞をミクロ遠心機により高速で１分間ペレット化し、０．５ｍｌの５０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。０．０５ｍｌの１０％ＳＤＳを添加し、試料を混合し、６５℃で３０分間インキュベートした。０．２ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．２）を添加し、試料を氷上で６０分間インキュベートした。試料を再度、ミクロ遠心機により高速で５分間遠心分離した。
【００６８】
上澄液を新たな１．５ｍｌミクロ遠心管に移し、室温のイソプロパノール１容量を添加した。試料を混合し、室温に５分間静置し、次いでミクロ遠心機により高速でごく短期間（１０秒）遠心分離した。上澄液を注ぎ出し、ペレットを風乾した。ペレットを０．３ｍｌの１０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁したのち、膵臓ＲＮアーゼの１ｍｇ／ｍｌ溶液１５μｌを添加し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。０．０３ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、試料を混合し、０．２ｍｌのイソプロパノールを添加した。試料をミクロ遠心機により高速で遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。次いで上澄液を注ぎ出し、ペレットを乾燥させ、０．１−０．３ｍｌの１０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した（注意：ＤＮＡを制限消化に用いる前に、溶液をミクロ遠心機により高速で１５分間遠心分離して、消化を妨害する可能性のある不溶性物質を除去する必要がある）。
【００６９】
例５
株の解明
形質転換したピチア細胞（例３）および形質転換していない宿主ピチア細胞から例４の記載に従ってＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化した。試料を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、サザーンブロットを実施した（マニアチスら、１９８２）。フィルターをＡＯＸ１特異性プローブまたはＨＩＳ４特異性プローブとハイブリダイズし、挿入が起こった位置を決定した。挿入部位はその形質転換体と野生型菌株のハイブリダイゼーションスペクトルを比較することにより決定された。野生型バンドの大きさの変化はその遺伝子座で挿入が起こったことの証明である。以後の分析のために選ばれた菌株に関するサザーンハイブリダイゼーションおよび菌株の解明を下記にまとめる。
【００７０】
【表１】
0003583791.tif 000018
ＨＳＡ発現ピチア株の発酵槽増殖
選択培養平板から接種物を調製し、２％グリセリンを含有する緩衝化ＹＮＢ中で３０℃において、ＯＤ６００が０．５−１０．０となるまで一夜増殖させた。一夜の培養物５−５０ｍｌアリコートを２Ｌ容発酵槽に添加し、５ｍｌ／ＬのＰＴＭ１塩類を含有する５×基礎塩類中で３０℃において抑制増殖期を継続した。４０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウムの添加によりｐＨを５．０に維持し、５％（ｖ／ｖ）消泡剤ストラクトル（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ）の添加により発泡を抑制した。必要に応じて通気および撹拌を強化することにより、溶存酸素を２０％以上に維持した。温度は約３０℃に維持された。グリセリンが消費されるまで、このバッチ増殖期を２０−３０時間継続した。次いでＭｕｔ＋株についてはメタノール限界供給バッチ式で、またはＭｕｔ−株についてはメタノール過剰供給バッチ式で、発酵を継続した。
【００７１】
ａ．Ｍｕｔ＋発酵；メタノール限界供給バッチ式
実験５４４；Ｇ＋ＨＳＡ１４０Ｓ１（コピー数１）
実験５５７；Ｇ＋ＨＳＡ１４０Ｓ４（コピー数２）
実験５４５；Ｇ＋ＨＳＡ１４０Ｓ３（コピー数＞２）
細胞密度の増大を継続させ、かつ発酵槽内における過剰のエタノール蓄積を防止するために、メタノールの添加により誘導前に少量のアルコールオキシダーゼが発現すべく、ＡＯＸ１プロモーターを解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓ）した。この解除はグリセリン限界条件下に約ｐＨ５．０での増殖により達成された。初期増殖期でグリセリンが消費されたのち、５０％（ｗ／ｖ）グリセリン供給（１２ｍｌ／ＬのＰＴＭ１微量塩類を含有）を８−１６ｍｌ／時の量で開始し、約１２０−１４０ｍｌが添加されるまで継続した。次いでメタノール供給（１００％メタノール＋１２ｍｌ／ＬのＰＴＭ１微量塩類）を１ｍｌ／時で開始することによりＡＯＸ１プロモーターの完全発現を誘導した。培養物がメタノール限界に反応するまで数時間、メタノール供給を継続した。この反応はメタノール供給を短時間停止した際の溶存酸素の突然の増加として現れる。次いで５．５ｍｌ／時の量に達するまで８−１２時間にわたってメタノール供給を増加させた。これらの条件下にメタノール上で８２、９６または９８時間発酵を継続したのち、培養物を採取した。
【００７２】
ｂ．Ｍｕｔ−発酵；メタノール過剰供給バッチ式
Ｍｕｔ−発酵をＭｕｔ＋発酵に関する記載に従って実施し、ただしメタノール供給を１ｍｌ／時の供給４時間ののち、３−４ｍｌ／時に増加し、残留メタノール濃度０．５％以下となした。
【００７３】
増殖培地中へ分泌されたＨＳＡの定量
ａ．ＥＬＩＳＡ
ヒト血清アルブミンに関するＥＬＩＳＡ法には下記の試薬が必要である：ヒトアルブミン（カッペル、オルガノン・テクニカから入手）、ヤギ抗ＨＳＡ抗体（アトランティック・アンティボディーズから入手）、ヤギ抗ＨＳＡ抗体、ペルオキシダーゼにコンジュゲート（カッペル、オルガノン・テクニカから入手）およびＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジクロリド塩（シグマから入手、１０ｍｇ／錠）。ＨＳＡは業者による下記の指示に従って再構成された。この場合（ロット＃２６７０６）、３．０ｍｌの蒸留水をバイアル内容物に添加した（最終濃度は１８．８ｍｇ／ｍｌであった）。各１００μｌの２９アリコートにラベルを付け、急速凍結した。
【００７４】
１８．８ｍｇ／ｍｌの１００μｌを１．７８０ｍｌのＰＢＳで希釈することにより１６アリコートを調製した（最終１．０ｍｇ／ｍｌ）。１００μｌのこれら１６アリコートにラベルを付け、急速凍結した。
【００７５】
１ｍｇ／ｍｌの１００μｌを９．９ｍｌのＰＢＳで希釈することにより、さらに１００アリコートを調製した（最終１０μｌ）。次いで各１００μｌのこれら１００アリコートにラベルを付け、急速凍結した。この希釈液を用いて標準希釈曲線を開始した。ヤギ抗ＨＳＡは溶液状で供給された。ヤギ抗ＨＳＡ試薬を５０μｌアリコートに分割し、ラベルを付け、急速凍結した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ＨＳＡは２．０ｍｌの蒸留水を添加することにより再構成された（最終濃度２３ｍｇ／ｍｌ）。次いで５０μｌアリコートのヤギ抗ＨＳＡコンジュゲートにラベルを付け、急速凍結した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ法：
注意：室温の緩衝液のみを使用すること。
【００７７】
１．コーティング用緩衝液を使用直前に調製する。ヤギ抗ＨＳＡ抗体を１：５００に希釈する。この溶液２００μｌを各ウェルに添加する。パラフィルムを密着し、３７℃で１時間インキュベートする。
【００７８】
２．プレート内容物をシャープにシンク内へ落とす。ＴＢＳＴで３回洗浄する。蒸留水で２回洗浄する。
【００７９】
３．２００μｌのブロット緩衝液をすべてのウェルに添加する。パラフィルムを密着する。３７℃で一夜インキュベートする。
【００８０】
４．翌朝、ウェル内容物をシンク内へ落とす。ＴＢＳＴで３回洗浄する。蒸留水で２回洗浄する。
【００８１】
５．１００μｌのＴＢＳＴをすべてのウェルに添加する。
【００８２】
６．１０μｇ／ｍｌのストックＨＳＡ標準液をＴＢＳＴで希釈する。
【００８３】
Ｓ＝フリーザーからのストック＝１０μｇ／ｍｌ
ＳＳ＝サブストック＝Ｓの１：１００＝１０，０００ｐｇ／１００μｌ
Ｓ−１＝ＳＳの１：１０＝１，０００ｐｇ／１００μｌ
希ＳＳ，１：１＝５，０００ｐｇ／１００μｌ
希ＳＳ，１：３．３＝３，０００ｐｇ／１００μｌ
希ＳＳ，１：５＝２，０００ｐｇ／１００μｌ
希Ｓ−１，１：１＝５００ｐｇ／１００μｌ
希Ｓ−１，１：５＝２００ｐｇ／１００μｌ
希３，０００ｐｇ／１００μｌ  １：１＝１，５００ｐｇ／１００μｌ
８．１００μｌの試料希釈液および標準曲線希釈液を各ウェルに添加する。
【００８４】
９．パラフィルムを密着し、３７℃で２時間インキュベートする。
【００８５】
１０．ＴＢＳＴで５回洗浄する。蒸留水で２回洗浄する。
【００８６】
１１．ヤギ抗ＨＳＡコンジュゲートをブロット緩衝液で１：２０００に希釈する。室温で暗所において２時間インキュベートする。
【００８７】
１２．ＴＢＳＴで３回洗浄する。蒸留水で２回洗浄する。
【００８８】
１３．使用直前に：ＯＰＤの１ペレットを遮光容器内の蒸留水３ｍｌに添加する。水２１ｍｌをピペットで５０ｍｌのファルコン試験管に装入する。３ｍｌのＯＰＤ溶液をファルコン試験管に添加し、１０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を添加し、混合する。
【００８９】
この溶液２００μｌを各ウェルに添加する。パラフィルムを密着し、暗所で１０分間インキュベートする。５０μｌの４．５Ｍ硫酸の添加により反応を停止する。
【００９０】
１４．ＥＬＩＳＡ読み取り機により、フィルター４を用いて４９２ｎｍで読み取る。
【００９１】
ｂ．データ
各株から分泌されたＨＳＡの水準、および発酵に関する他の情報を表２に示す：
【表２】
0003583791.tif 000019
組換え生成物の解明
ａ．ゲル分析
発酵実験５３７、５４４および５４５の発酵ブロスの試料を誘導期の種々の時点で取り出し、ＳＤＳゲルおよびクマシーブルー染色により分析した。発酵槽ブロスの１０倍希釈液５μｌ（０．５μｌに相当）をゲルに付与した。ｒＨＳＡ（組換えＨＳＡ）とＨＳＡ標準品の染色バンドの相対強度により、ＥＬＩＳＡにより測定されたｒＨＳＡ水準（ｇ／ｌ）が高いことが確認された。さらに３種類すべての発酵および分析したすべての時点からのｒＨＳＡが、ＨＳＡ標準品と等しい泳動性を示した（６９Ｋｄ）。ｒＨＳＡがすべてのＨＳＡ発現菌株により分泌された主要な蛋白種であるという事実は、高い初期純度（＞９０％）のｒＨＳＡが増殖培地中へ分泌されたことを示唆する。約４５Ｋｄに泳動する他の蛋白種も発酵時間に伴って増大する強度で検出された。この蛋白種は分泌に際して二次的プロセスにおいて、もしくは発酵ブロス中へ分泌されるプロテアーゼによる分泌後の蛋白質分解産物として産生されるか、またはそれら両者である。それはウェスターンブロットに際してＨＳＡ特異性ポリクローナル抗血清により検出されたので、ｒＨＳＡに関連するものである。
【００９２】
ｂ．Ｎ−末端配列
分泌されたｒＨＳＡのＮ−末端領域の蛋白質配列を発酵槽ブロスの透析試料について求めた。配列はアプライド・バイオシステムズ・モデル４７０Ａ蛋白質合成装置により決定された。アミノ酸のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体はアプライド・バイオシステムズ・モデル１２０Ａ分析装置を用いた高性能液体クロマトグラフイーにより同定された。その結果、ｒＨＳＡのＮ−末端がアスパラギン酸であり、ＨＳＡのＮ−末端アミノ酸と一致することが示された。他の前駆物質型ｒＨＳＡは無いと思われる。決定された残りの配列はＨＳＡに関する既知の配列と等しかった。
【００９３】
例６
ＨＳＡ発現ベクターｐＨＳＡ３１３の構成
天然ＡＯＸ１  ５′側調節領域（プロモーター）の３′末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザクト結合（ｅｘａｃｔ  ｌｉｎｋａｇｅ）を含むベクターを備えたｐＨＳＡ３１３ベクターを構成した。
【００９４】
Ａ．ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成
約２００ｎｇのｐＨＳＡ１１３（欧州特許出願第０  ３４４  ４５９号明細書に記載され、図７に示される）を、ＲＥａｃｔ１緩衝液２０μｌ中のＣ１ａＩ  １単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物を水で１００μｌとなし、等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１  Ｖ／Ｖ）で１回抽出し、次いで水層を等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに調整し、３容量の冷エタノールを添加することにより、水相中のＤＮＡを沈殿させた。混合物を氷上（４℃）に１０分間放置し、ミクロ遠心機により４℃において１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによりＤＮＡ沈殿を採取した。ＤＮＡペレットを７０％冷エタノール水溶液で２回洗浄した。洗浄したペレットを真空乾燥し、１０μｌの水に溶解し、これに２μｌの１０×リゲーション緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、６μｌの水、および１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。混合物を４℃で一夜インキュベートし、１０μｌアリコートを用いて大腸菌ＤＧ７５′（マニアチスら）を形質転換し、ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。これはＨＩＳ４および３′側ＡＯＸ１、ならびにこれらの配列を結合するのに用いた小範囲のｐＢＲ３２２配列の欠失を示す。ＨＩＳ４、３′側ＡＯＸ１およびｐＢＲ３２２配列の欠失により、ｐＨＳＡ１１３ベクター中に存在するＣｓｐ４５Ｉ部位２カ所のうち１カ所が排除される。残りのＣｓｐ４５Ｉ部位はＡＯＸ１  ５′側調節領域（プロモーター）中にある。
【００９５】
Ｂ．ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成
５μｇのｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＢｓｔＥＩＩ  １０単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノールで抽出し、工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿をＣｓｐ４５Ｉ緩衝液１００μｌに溶解し、１０単位のＣｓｐ４５Ｉの存在下に３７℃で２時間消化した。次いで消化したＤＮＡをフェノール抽出し、工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、１０μｌアリコートを０．９％アガロースゲルの隣接ウェル２個に装填した。電気泳動ののち、レーンの１つに対応するゲル部分を染色し、これを用いて未染色レーン中のｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａのＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントの位置を決定した。ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含むゲル部分をゲルから切り出した。大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含むゲル部分を、５００μｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中へ電気泳動により溶出した（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。このＤＮＡ溶液を工程Ａの詳述に従ってフェノール抽出し、ＤＮＡ沈殿を１００μｌの水に溶解した。次いで大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを下記のＢｓｔＥＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉオリゴヌクレオチドリンカーとリゲートした。アリコート（１０μｌ）のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを４℃で一夜、２０ｎｇのアニールしたリンカーオリゴヌクレオチド５′−ＣＧＡＡＡＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）および５′−ＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液２０μｌ中においてリゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａベクターは上記リンカーにより、外来ＤＮＡ配列を含まない天然ＡＯＸ１  ５′側調節領域（プロモーター）の３′末端とＨＳＡのＡＴＧ開始コドンとの間のイグザクト結合を有する。
【００９６】
Ｃ．ｐＨＳＡ３１３の形成
１μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存した。
【００９７】
１μｇのｐＡＯ８０７Ｎ（図８、その構成は欧州特許出願第０  ３４４  ４５９号明細書に記載）をＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＰｓｔＩにより３７℃で４時間消化した。消化したＤＮＡをアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において５５℃で１５分間処理した。１５分間の終了時にさらに１０単位のホスファターゼを添加し、１５分間インキュベートした。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させた。１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩ  ５単位によりＤＮＡを３７℃で４時間消化し、工程Ａの記載に従ってフェノール抽出し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を約２０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解した。このＣ１ａＩフラグメントはＨＩＳ４遺伝子および３′側ＡＯＸ１第２挿入性配列を含む。
【００９８】
約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂−ホスファターゼ処理ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約８０ｎｇのＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（４μｌ）、４μｌの５×リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼをを用いて４℃で一夜リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ３１３を得た。このリゲーションによるｐＨＳＡ３１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡＯＸ１  ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図７にｐＨＳＡ１１３プラスミドにつき示したものと同じである。
【００９９】
例７
５′側および３′側イグザクトＨＳＡ発現プラスミドｐＨＳＡ４１３の形成
ＡＯＸ１  ５′側調節領域の３′末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザクト結合、およびＡＯＸ１  ３′側ターミネーション配列の５′末端とＨＳＡ構造遺伝子の３′末端との間のイグザクト結合を有するベクターを提供するｐＨＳＡ４１３ベクターを構成した。
【０１００】
Ａ．ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成
１μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ３緩衝液１００μｌ中のＥｃｏＲＩ  １０単位により３７℃で４時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例６の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、Ｂｓｕ３６Ｉ緩衝液１００μｌ中のＢｓｕ３６Ｉ  ２０単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例６の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させ、１００μｌの水に溶解した。約１００ｎｇのＥｃｏＲＩおよびＢｓｕ３６Ｉ開裂ＤＮＡを、１０ｎｇのアニールしたオリゴヌクレオチド５′−ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）および５′−ＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と混合し、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中において４℃で一夜リゲート（ｌｉｇａｔｅ）した。リゲーション混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を用いて大腸菌を形質転換し、ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。このプラスミドにおいては、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ中に存在するＢｓｕ３６ＩとＥｃｏＲＩの間の下記配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）：
0003583791.tif 000020
が下記の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）により置換されている：
0003583791.tif 000021
Ｂ．ｐＨＳＡ４１３の形成
１μｇのｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存した。
【０１０１】
約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂−ホスファターゼ処理ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約８０ｎｇ（４μｌ）のＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（例６の工程３、第２節を参照されたい）、４μｌの５×リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて４℃で一夜リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ４１３を得た。このリゲーションによるｐＨＳＡ４１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡＯＸ１  ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図７にプラスミドｐＨＳＡ１１３につき示したものと同じである。
【０１０２】
例８
ｐＨＳＡ３１３およびｐＨＳＡ４１３によるピチア・パストリスの形質転換
Ａ．ベクターの調製
それぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＡＯ８０７Ｎ（陰性対照）をＨＳ緩衝液２００μｌ中において、５０単位のＮｏｔＩにより３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェノール抽出し、例６の記載に従って沈殿させ、２０μｌのＣａＳに溶解し、次いでピチア・パストリスＧＳ１１５の形質転換に用いた。同様にそれぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＡＯ８０７Ｎを、２０単位のＳｓｔＩにより、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＲＥａｃｔ２緩衝液２００μｌ中において３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェノールで抽出し、例６の記載に従って沈殿させ、２０μｌのＣａＳに溶解した。
【０１０３】
Ｂ．細胞の増殖
ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５８５１）を約１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１２−２０時間振盪培養した。１００ｍｌのＹＰＤ培地に種培養物を接種して、約０．００１のＯＤ６００を得た。この培地を振盪フラスコ中において３０℃で約１２−２０時間培養した。ＯＤ６００が約０．２−０．３となった時点で、ソルバルＲＢ５Ｃを用いて１５５５ｇで５分間遠心分離することにより培養物を採取した。
【０１０４】
Ｃ．スフェロプラストの調製
細胞を１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、次いで１５００ｇで５分間遠心分離した。（遠心分離は特に指示しない限り、各細胞洗浄ののち、ソルバルＲＴ６０００Ｂを用いて１５００ｇで５分間行う。）細胞を１０ｍｌの新たに調製したＳＥＤ中で１回、１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中で１回洗浄し、最後に１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に再懸濁した。７．５μｌの３ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）（１００，０００単位／ｇ、マイルズ・ラボラトリーズより入手）を細胞懸濁液に添加した。細胞を３０℃で約１０分間インキュベートした。（５％ＳＤＳ中におけるＯＤ６００の６０％低下を正確な時間マーカーとして利用しうる。）スフェロプラストを１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中において７００ｇで５−１０分間遠心分離することにより洗浄した。１０ｍｌの無菌ＣａＳを細胞の最終洗浄液として用い、細胞を再度７００ｇで５−１０分間遠心分離し、次いで０．６ｍｌのＣａＳに再懸濁した。
【０１０５】
Ｄ．形質転換
ピチア・パストリスＧＳ１１５細胞を１０μｇの線状ＤＮＡ（工程Ａ参照）により、スリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ５９，１１５−１２５（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法によって形質転換した。ＤＮＡ試料を１２×７５ｍｍの無菌ポリプロピレン試験管に添加した（２０μｌの容量となるまで）。（ＤＮＡは適切な緩衝液、たとえばＴＥ緩衝液、またはＣａＳ中に含有すべきである。）１００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡ試料に添加し、室温で約２０分間インキュベートした。１ｍｌのＰＥＧ溶液を各試料に添加し、室温で約１５分間インキュベートし、７００ｇで５−１０分間遠心分離した。ＳＯＳ（１５０μｌ）をペレットに添加し、室温で約３０分間インキュベートした。最後に８５０μｌの１Ｍソルビトールを添加した。
【０１０６】
Ｅ．スフェロプラストのリジェネレーション
形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に、平板当たり２０ｍｌのリジェネレーション用寒天ＳＤＲの底部アガロース層を注入した。さらに、形質転換試料がＳＯＳ中にある期間中に、４５℃の水浴中の１５ｍｌコニカルボトム型コーニング試験管に８ｍｌアリコートのリジェネレーション用寒天を分配した。形質転換した試料５０または２５０μｌアリコートを４５℃に保持された溶融リジェネレーション用寒天８ｍｌアリコートに添加し、２０ｍｌ固形底部寒天層を含む平板上に注入した。これらの平板を３０℃で３−５日間インキュベートした。
【０１０７】
Ｆ．形質転換体の選択
ヒスチジンを欠如する培地ＳＤＲ上で培養することにより形質転換体を選択した。ＮｏｔＩ線状ベクターを用いて得た形質転換体の場合は、ヒスチジンの不在下で増殖したコロニーを″メタノール−スロー″表現型（ＮｏｔＩ  ＤＮＡフラグメントによるＡＯＸ１構造遺伝子の置換を示す）についてもスクリーニングした。次いで″メタノール−ノーマル″（ＳｓｔＩ線状ＤＮＡを用いて得たもの）およびメタノール−スローを示す数種類の形質転換ＧＳ１１５細胞を培養し、ＨＳＡの産生につきアッセイした。
【０１０８】
例９
ＧＳ１１５／ｐＨＳＡ３１３、およびＧＳ１１５／ｐＨＳＡ４１３インテグラティブ形質転換体におけるメタノール誘導ＨＳＡ分泌
ｐＨＳＡ３１３およびｐＨＳＡ４１３を用いて形質転換したピチア・パストリスＧＳ１１５株を振盪試験管培養においてＨＳＡ分泌につき分析した。メタノール−スローおよびメタノール−ノーマル双方の株を用いた。それぞれの場合、３６の独立コロニーを試験した。ｐＡＯ８０７Ｎを用いて得た形質転換体を陰性対照とした。培地中へのＨＳＡの効果的な分泌および安定な蓄積を保証するためのプロトコールを開発した。
【０１０９】
細胞を５０ｍｌの試験管に入れた１０ｍｌのＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達するまで増殖させた（２−３日間）。細胞は１０−２０Ａ６００単位である。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、次いでペレットを２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁した。試験管にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズクロス）で蓋をした。次いで試験管を３０℃の振盪機に戻した。２−３日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物につきアッセイした。ペレットを新鮮な培地で再懸濁し、新たな分泌のために振盪機へ戻すことができる。ピチア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシー染色による分析のために、１０μｌの培地上澄液で十分であった。これらの条件下でＨＳＡに対応する６７ｋＤの単一バンドが認められた。形質転換体ＧＳ１１５／ｐＨＳＡ３１３とＧＳ１１５／ｐＨＳＡ４１３の発現水準に有為差はなく、これはｐＨＳＡ３１３中に存在するＨＳＡ遺伝子からの３′側非翻訳配列の欠失は発現水準に有為に影響を与えないことを示す。振盪フラスコ培養において、メタノール−スローとメタノール−ノーマルの形質転換体間にＨＳＡ発現水準の有為差は認められなかった。これはＡＯＸ１の分断が効果的ＨＳＡ発現にとって本質的でないことを示す。予想どおりＧＳ１１５／ｐＡＯ８０７Ｎ形質転換体（陰性対照）の培地および細胞抽出液のいずれにもＨＳＡは存在しなかった。
【０１１０】
例１０
ＨＳＡ産生のためのＭｕｔ−ピチア・パストリスのバッチ供給式発酵
ピチア・パストリスＧＳ１１５：ｐＨＳＡ  ４１３−６を作業容量８．５リットルの２０リットル容バイオラフィッテ（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ）発酵槽に接種した。接種物は下記の方法で調製された：培養物をＹＭ平板上で増殖させ、次いで振盪フラスコ中のＹＭブロス１００ｍｌに移し、約２４時間増殖させた。この培養物５０ｍｌを振盪フラスコ中のＹＭブロス１リットルに移し、同様に約２４時間増殖させた。次いでこの１リットルをバイオラフィッテ発酵槽中の発酵培地８．５リットルに移した。発酵培地は最少塩類＋ビオチン＋５％グリセリンからなっていた。バッチ増殖条件には下記のものが含まれる：ｐＨ＝５．８（ＮＨ３で調整）、温度＝３０℃、および空気飽和２０％以上の溶存酸素。
【０１１１】
約２４時間後にグリセリン消費が完了し、この時点で１０−１５ｍｌ／時の量で緩徐なメタノール供給を開始した。発酵槽中のメタノール濃度を監視し、ブロス中のメタノール濃度０．５−０．９％を維持すべく供給量を調整した。
【０１１２】
クマシーブルー染色したＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の濃度測定により、培地中に分泌されたＨＳＡを定量した。領域は同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で実験した一連の既知重量の真正ＨＳＡを参考にした。これらのゲルから得たデータを表３に示す。
【０１１３】
【表３】
0003583791.tif 000022
【０１１４】
【配列表】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：９４０ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003583791.tif 000023
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：６００ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003583791.tif 000024
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１８３０ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003583791.tif 000025
0003583791.tif 000026
0003583791.tif 000027
0003583791.tif 000028
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３６ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003583791.tif 000029
（５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：３９ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003583791.tif 000030
（６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１８ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：スクリーニング用オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003583791.tif 000031
（７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１８ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：スクリーニング用オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003583791.tif 000032
（８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１６ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
0003583791.tif 000033
（９）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１９ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003583791.tif 000034
（１０）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１３ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003583791.tif 000035
（１１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：１４ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003583791.tif 000036
（１２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２３１ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：リンカーオリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0003583791.tif 000037
（１３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に関する情報：
（ｉ）配列特性：
（Ａ）長さ：２０ｂｐ
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖形成状態：１本
（Ｄ）位相幾何学的状態：線状
（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド
（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0003583791.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｇ１ＩＩからＢｇ１ＩＩへ時計回りにフラグメント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含むプラスミドｐＡＯ８０４を示す図である。構造遺伝子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することができる。このプラスミドはＮＲＲＬ  Ｂ−１８１１４のプラスミドＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ消化およびゲル電気泳動を行い、図１に対応する線状の〜７．４ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントを採取することにより得られる。
【図２】環状のｐＨＳＡ１３を示す図である。
【図３】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１  ５′側調節領域を示す制限地図である。
【図４】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１  ５′側調節領域を示す制限地図である。
【図５】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１  ３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
【図６】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１  ３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
【図７】線状ｐＨＳＡ１１３を示す図である。
【図８】ＮｏｔＩからＮｏｔＩへ時計回りにフラグメント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含むプラスミドｐＡＯ８０７Ｎを示す図である。構造遺伝子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することができる。
【図１】
0003583791.tif 000039
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0003583791.tif 000043
【図６】
0003583791.tif 000044
【図７】
0003583791.tif 000045
【図８】
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