(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性生物の成分、癌マーカー、アレルゲン、薬物、放射性核種、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、サイトカイン及び核酸からなる群より選ばれる薬剤であるが，抗体は包含されない薬剤に連結されたシアニンスクシンイミジルエステルとフィコビリソームタンパク質とのコンジュゲートを含んでなる患者のFcγR I（CD64）発現細胞に上記薬剤をターゲッティングするための組成物。
【請求項２】
シアニンスクシンイミジルエステルがCy5である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
シアニンスクシンイミジルエステルがフィコエリトリンに連結している請求項１記載の組成物。
【請求項４】
患者からの血液サンプル中のFcγR I（CD64）の検出方法であって、
ａ）  サンプルを標識されたシアニンスクシンイミジルエステルと接触させ；
ｂ）  未結合シアニンスクシンイミジルエステルを取り出し；そして
ｃ）  標識を検出する
工程を含んでなる方法。
【請求項５】
標識が蛍光標識である請求項４記載の方法。
【請求項６】
標識について適当な励起波長の光でサンプルを照射する工程を、さらに含む請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
血液サンプル中のFcγR I保有細胞を示すものとして蛍光を放つ細胞を検出する工程を、さらに含む請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプルをある化合物であって、抗体は包含されない化合物に連結されたシアニンスクシンイミジルエステルと接触させることを含んでなるサンプル中のFcγR I（CD64）発現細胞に該化合物をターゲッティングするための方法。
【請求項９】
シアニンスクシンイミジルエステルがCy5である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
シアニンスクシンイミジルエステルがフィコエリトリンに連結されている請求項８記載の方法。
【請求項１１】
適当な励起波長の光でサンプルを照射し、未結合シアニンスクシンイミジルエステルを除去し、そして蛍光を検出する工程をさらに含んでなる請求項８記載の方法。
【請求項１２】
シアニンスクシンイミジルエステルおよび使用説明書を含んでなるが、抗体は含まれないことを特徴とする、細胞のFcγR Iを検出するためのキット。
【請求項１３】
標識および緩衝剤をさらに含む請求項12記載のキット。
【請求項１４】
シアニンスクシンイミジルエステルおよび使用説明書を含んでなるが、抗体は含まれないことを特徴とする、FcγR Iに対する化合物の吸着をブロックするためのキット。
【請求項１５】
標識および緩衝剤をさらに含む請求項14記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
免疫グロブリンＧ（IgG）受容体（FcγＲ）
IgG抗体分子はその特定のコグネイト抗原に対する２個の結合決定基（Fabとして知られている）及びその細胞受容体（FcγR;Ravetch、J.V.及びＪ−P.Kinet、1991、Ann.Rev.Imm．９:457中に概説される）に対する１個の結合決定基（Fc）を有する。FcγR I、FcγR II及びFcγR IIIと呼ばれる３種類のFcγＲがある。FcγR IはIgG Fcに対する最も高い親和性を有し、単球及びマクロファージ上に、そしてγ−インターフェロン（IFN−γ）により誘導された場合にヒト好中球上に存在し、IFN−γは単球及びマクロファージ上のFcγR I発現も高める（Guyre、P.M.等、1983、J.Clin.Investig．72:393）。インターロイキン−10（IL−10）も単球上のFcγR I発現の強力なアップレギュレーターである（Capsoni、F.等、1995、J.Leukoc.Biol．58:351）。FcγR Iの好中球発現は顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−CSF;Repp、R.等、1991、Blood 78:885）によりほぼ４倍に、そして連鎖球菌咽頭炎中に約３倍に（Guyre、P.M.等、1990、J.Clin.Investig．86:1892）増加される。Ｇ−CSF刺激は腫瘍細胞の高められた好中球による細胞毒性と関係する（Gosselin、E.等、1992、J.Immunol．149:3477）。
低親和性受容体FcγR IIの細胞分布はより広範であり、単球及びマクロファージに加えて好中球、血小板、Ｂ細胞、Ｔ細胞並びにおそらくマスト細胞及び好塩基球に広がる。ヒトFcγR III受容体はマクロファージ及びマクロファージ細胞系、ナチュラルキラー（NK）細胞、骨髄前駆細胞並びに好中球細胞系に限定される（Ravetch及びKinet、上記）。
FcγＲを介した細胞と抗体−抗原複合体の相互作用は、抗体依存性細胞障害、脱顆粒、食作用、並びにリンパ球増殖及び抗体分泌を調節する免疫賦活シグナルを初めとする一続きの反応を引き起こす。例えば、FcγR Iは抗原提示を高めることに有効であり（Valerius、T.等、1993、Blood 82:931）、そしてFcγR Iの相補的名称CD64はヒト前駆細胞混合物（CD34+/CD38+;欧州特許出願EP O 708 336 A2）内の顆粒単球前駆細胞集団を識別するために用いられている。
さらに、FcγR Iに結合するモノクローナル抗体（mAb）はこの受容体の発現のダウンレギュレーションを引き起こすことが示されており、そして慢性免疫性血小板減少性紫斑病患者へのこのmAbの投与は臨床的改善をもたらした（Ericson、S.G.、1996、Brit.J.Haematol．92:718）。１家族の４人の健康メンバーがFcγR Iを欠いているという発見は、FcγR I受容体のインビボ機能の分析を複雑にする（Ceuppens、J.L.1988、J.Clin.Invest．82:571）。
PE−Cy5での細胞染色
タンデム色素PE−Cy5は２つの蛍光色素、Ｒ−フィコエリトリン（PE）及びCy5.18.OSu（Cy5;Mujumdar、R.B.等、1993、Bioconj.Chem．４:105）の組み合わせを含んでなる。PE−Cy5は、例えば、抗−CD34 mAbに結合したPE−Cy5でのフローサイトメトリー実験のカバー写真が付いた、CD34の構造及び生物学を概説するBloodの1996年１月１日号に記述されたように（Krause  DS、等、1996、Blood 87:1）、一般的にモノクローナル抗体（mAb）に結合して用いられる。
PE−Cy5タンデム色素はしばしば３色フローサイトメトリー分析のために他の色素−mAbコンジュゲートと共に用いられるので「トリカラー」として知られている（Waggoner  AS、等、Clinical  Flow  Cytometry中、p185（編集）A.Landay等、The  New  York  Academy  of  Sciences、New  York、New  York、1993）。
インビボでFcγR Iに特異的に結合する無毒の分子は様々な診断及び治療用途に有効である。
発明の要約
一般的に、本発明は白血球（white  blood  cells）（白血球（leukocytes））上のFcγR I種のIgG受容体に特異的に結合する薬剤に関する。これらの化合物の機能的結合のために、本明細書ではこれらの組成物の種類をIgG受容体Ｉリガンド（IgＧ ｒeceptor  Ｉ ｌigand）を表す「GRIL」と称する。これらの薬剤はシアニン、イダエイン、ケラシアニン及びアステリンを例とする天然に存在する植物色素のシアニジンファミリーのメンバーである。
一つの態様として、本発明は蛍光色素Cy5.18.OSu（Cy5と称する）並びにコンジュゲート及び誘導体を例とするシアニン組成物の種類を特徴とする。これらの組成物の一般的な特徴はまず機能的であり、それはそれらが単球及びマクロファージ上に見いだされるFcγR I IgG受容体に高い親和性及び特異性で結合することであり、そして好中球上に現れるように誘導することができる。第二の特徴は化学構造であり、少なくとも２つの部分で構成することができ、その一方はシアニンスクシンイミジルエステル組成物種である。一つの態様として、もう一方はフィコビリソームタンパク質のいずれかから得られ、PEを例とするが限定するメンバーではない。
別の態様として、本発明はGRIL、例えばCy5試薬を例とするシアニン化合物及び治療薬を含んでなる治療組成物を特徴とし、好ましい態様としてその治療薬は少なくとも１個のエピトープを含んでなる。一つの態様として、GRILはFcγR Iへの有用なエピトープの送達を導き、従って、ワクチン及び送達系の両方である組成物を構成する。エピトープを病原性生物、癌マーカー及びアレルギー性物質よりなる広範な群から選択することができる。従って、患者にバクテリア、原生動物、ウイルスまたは真菌のような病原性生物の予防接種をするためにこれらの化合物を用いることができる。好ましい態様として、ワクチンのエピトープはグラム陽性病原体由来、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphyloccoccus  aureus）またはクロストリジウム・テタニ（Clostridium  tetani）の細胞または分泌エピトープ由来である。また、本発明はGRIL及び癌マーカーからのエピトープを含んでなる１つまたはそれより多い型の癌のワクチンも特徴とし、好ましい態様として癌マーカーはヒトEGF受容体ファミリー、ムチンTAG72ファミリー及び胎児性癌ファミリーよりなる群から選択される。
別の態様として、本発明はGRIL及び化学療法細胞障害性抗がん剤、例えば、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、タキソール、ノチルイミン（notirimine）を含んでなる治療組成物、またはCy5試薬及び放射性核種を含んでなる治療組成物を特徴とする。従って、治療薬はシアニン、例えばCy5または類似試薬の存在のためにFcγR Iに向けられ、そして例えば、骨髄性白血病、前骨髄性白血病または白血球粘着不全症の処置のために有用である。
例えば、特発性血小板減少性紫斑病のような自己免疫疾患の患者を処置する目的のために、化学療法または放射線療法GRILでFcγR I受容体を標的とする方法は本発明の別の態様である。本発明の薬剤は白血球上に位置するIgG受容体を標的とするので、本発明の方法はそのような処置のために患者から取り出された血液サンプルまたは骨髄サンプルから得られた細胞へのエクスビボでのこれらの組成物の送達を含み、続いてその血液もしくは骨髄細胞サンプルまたはその細胞子孫をその患者に戻す。さらに、インターフェロン、インターロイキンまたはコロニー刺激因子を患者またはエクスビボの血液もしくは骨髄サンプルまたはそのようなサンプルから得られる細胞に投与してもよい。好ましい態様として、患者はIFN−γ、IL−10またはＧ−CSFを投与される。
本発明の別の態様は患者からの血液サンプルまたは骨髄サンプル中のFcγR I（CD64）を検出及び定量するための組成物及び診断方法を特徴とし、それはサンプルをGRILステインと接触させ、非特異的に結合した試薬を取り除き、適当な励起波長の光をサンプルに照射し、そして血液サンプル中のFcγR I保有細胞を示すものとして蛍光を放つ細胞を検出する工程を含んでなる。好ましくは、少なくとも１つのさらなる色素試薬、例えば、フルオレセイン試薬またはフィコエリトリン試薬をGRILと共に用いる。好ましい態様として、GRILで染色された細胞をフローサイトメトリーにより分析及び単離する。別の態様として、GRILで染色された細胞を蛍光顕微鏡法により分析する。これらの態様では、照射の励起波長は好ましくは約475ないし505nmの範囲にある。最も好ましくは、血液中のFcγR Iの数は診断の指標であり、それは検出方法が診断的に用いられる場合に適切な条件下で測定される。好ましい態様として、この方法は白血球接着不全症または骨髄性もしくは前骨髄性白血病；感染及び／または炎症の存在の診断として；あるいは治療薬の投与中及び後の治療をモニターするために用いられる。治療薬を好ましくはインターフェロン、インターロイキンまたはコロニー刺激因子、特にIFN−γ、IL−10またはＧ−CSFである。
さらに別の態様として、本発明は化合物をスクリーニングし、そしてそれらの中でFcγR Iに結合する候補治療薬を同定する方法を特徴とする。この方法は細胞の第一サンプルを候補薬剤と接触させ、そして細胞の第二サンプルをコントロールバッファーと接触させ、次に細胞の第一及び第二の両方のサンプルをGRILステインで染色することを含んでなる。特異的に結合した色素で細胞の蛍光を引き起こすために適切な波長でサンプルを照射し、第二サンプルに比較して第一サンプルの染色を統計的に有意な程度まで減らす薬剤が可能性のある治療候補であるように、染色された細胞の指標として蛍光を用いる。この方法は好ましくはこの方法により可能性のある治療活性を有すると同定された化合物の各々の製薬学的製剤を調合するさらなる工程も含んでなる。この方法により使用者はIgG受容体と相互作用する低分子量薬剤候補を同定することができる。そのような薬剤候補はFcγR I発現の調節またはFcγR IへのFc結合の阻害に有用である可能性がある。
また、本発明はGRILステイン、バッファー、容器及び使用説明書を含んでなる、細胞上のFcγR Iをアッセイするためのキットも特徴とする。このキットは診断目的のために有用である。本発明により包含される別のキットはFcγR Iへのシアニジン及びCy5試薬の吸着を阻止するために有用であり、抗−FcγR I抗体、GRILステイン試薬、バッファー、容器及び使用説明書を含んでなる。このキットはFcγR IへのGRIL試薬の結合を阻止し、それ故、そのような試薬を他の細胞表面分子を染色するために用いることができるはずである。
本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び請求からより明白になる。
【図面の簡単な説明】
図１は任意の単位の平均蛍光強度として表される、各々PE−Cy5が結合されたモノクローナル抗体で染色された、単離された血液細胞、U937細胞及びFcRでトランスフェクトされたII A1.6細胞のフローサイトメトリー分析の図式表示であり；非染色細胞は断続線（interrunpted  lines）により表され;CD4、CD8、CD13及びCD19に特異的なモノクローナル抗体、マウスIgG1アイソタイプコンジュゲートで少なくとも５回各実験を実施し；図1aはコントロールの提供者から単離された好中球（PMN）を示し；図1bはＧ−CSFで４日間処置した患者から単離されたPMNを示し；図1cは示したようにRPMI 1640培地/10％FCS中で培養されるかまたは300U/mlのIFN−γを含むRPMI培地中で一晩培養時のU937単球細胞を示し；図1dは単離時に染色された単球を示し、図1eはFITCで標識されたCD14モノクローナル抗体に基づくフローサイトメトリーにより単核細胞画分から選び出された、赤血球の溶解後の全血中の単球を示し；図1fはヒトFcγR II a、ヒトFcγR II b、ヒトFcαＲ（＊で示す）またはヒトFcγR IでのネズミB II A1.6細胞トランスフェクタントを示す。
発明の詳細な説明
I.一般に
本発明は特定のタンデム色素試薬がある種類の抗体受容体への特異的高親和性結合というさらなる特性も有するという発見に関する。抗体は白血球（leukocytes）（白血球（white  blood  cells））により産生され、そして特定の種類の白血球により主として結合される。本明細書に用いられる「血液」という用語は具体的に未分画の血液だけでなく、いくつかの細胞を得ることができる血液の画分、例えば、保存されているかもしくはヘパリンのような抗凝固剤で処理されている血液サンプル、または血液もしくは骨髄細胞を濃縮するための遠心分離により得られた濃縮された細胞もしくは骨髄画分もさす。骨髄及びその細胞成分は成熟血液細胞に分化する血液細胞前駆体及び幹細胞を含有する。
血液の多数の疾患、例えば白血球粘着不全症（LAD）と呼ばれる先天性免疫不全症及び急性骨髄性白血病（AML）として知られている血液癌が特性化されている。LADの先天性遺伝子はリガンド受容体のβサブユニットに影響を与え、それは欠陥のある食細胞接着をもたらし、頻発するバクテリア及び真菌感染を引き起こす。LADの症状は著しい白血球増加である（1mm3当たり30,000−150,000の範囲までの白血球数の上昇、R.H.Buckley、Primary  Immunodeficiency  Diseases、p.1353、1993.Fundamental  Immunology中、第三版、Raven  Press、NY;Majima、T.等、1990、J.Immunol．145:1694）。インビトロで培養された急性前骨髄性白血病細胞AML−M3は正常細胞または他の白血病の細胞よりかなり顕著にPE−Cy5ステインに結合する（Ansari、M.Q.等、1995、Cytometry 26:83）。同様に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）に結合された抗−EcγR Iモノクローナル抗体（mAb）を用いて、急性炎症の患者においてEcγR Iレベルの上昇が観察されている（Davis  BH、等、1995、Lab  Hematol １:3）。GRILは白血球上のFcγR Iに特異的に結合し、そしてモノクローナル抗体より経済的で且つ製造及び使用することが可能であるので、本発明の方法はこれらの疾患の診断のために有用である。
さらに、ある種の薬剤での患者の処置、具体的にはＧ−CSFで処置される（Repp  Ｒ、等、1991、Blood 78:885）かまたはIFN−γで処置された（Guyre  PM、等、1983、J.Clin  Invest 72:393）患者からの細胞は、白血球生産に対する刺激作用及び増加したFcγR Iレベルを生じる。FcγR Iを刺激するこれら及び他の薬剤での診断及び成功した治療の、具体的には長い期間にわたって与えられる治療プロトコルのモニタリングは本発明の用途として考えられる。この診断用途は迅速さ、経済性及び患者サンプルの入手しやすさという利点を与える。必要とされるサンプルは指の刺し傷からの１または数滴の血液であり、そして必要な装置はある波長でのスライドの照射並びに別の波長での視覚化及び／または写真撮影のためのフィルターを装備した蛍光顕微鏡である。診療室または外来診察中を染色、対比染色及びすすぎに当てることができ、短期間内に結果を得ることができる。
本発明は特に骨髄細胞に物質を送達するためにFcγR Iに対するGRILの親和性を用いることを意図する。可能性のある抗がん剤である細胞障害性物質を本発明のGRILとの会合によるかまたはコンジュゲートとして骨髄細胞に送達することができ；これらの物質はノチルイミン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン及タクソールを例とするがそれらに限定されない。放射性核種はイメージング及び治療用途のために医学的に有用であり、そして放射のエネルギースペクトル及び放射性核種の半減期に基づいて選択される。GRILとの会合による骨髄細胞への送達のために好ましい放射性核種はテクネチウム−93m、テクネチウム−95m、テクネチウム−99m、レニウム186、レニウム188及びレニウム189、並びにヨウ素−125及びＩ−131を含むがそれらに限定されない。「結合された」という用語はイオン的または共有結合的に（すなわち、架橋剤を介して）結合されることを意味する。
「治療薬」は受容者に対して生物学的作用を有することができる薬剤を意味する。好ましい治療薬はワクチンの活性を保有するか、または受容体の発現を調節することができる。薬剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬）、毒素（例えば、リシン）、放射性核種（例えば、Ｉ−131、Re−186、Re−188、Ｙ−90、Bi−212、At−211、Sr−89、Ho−166、Sm−153、Cu−67及びCu−64）、ホルモンアンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、mRNA配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、化学療法ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タンパク質、ホウ素含有化合物（例えば、カルボラン）、光動的薬剤（photodynamic  agents）（例えば、ローダミン123）、エネジエン（enediynes）（例えば、カリチェアミシン（calicheamicins）、エスペラミシン（esperamicins）、ダイネミシン（dynemicin）、ネオカルジノスタチン（neocarzinostatin）発色団及びケダルシジン（kedarcidin）発色団）並びに転写に基づく製薬を初めとする付加的活性を与える成分に治療薬を結合することができる。
「癌マーカー」という用語は特定の型の癌細胞の表面と特異的に関係する抗原をさす。疾病の型と関係し、そして正常組織には見いだされないタンパク質の生産により多数の型の癌を特性化することができる。これらのタンパク質はしばしば胚の発生の特定の段階で用いられ、そして正常な成人の生涯中には見られない。これらのマーカーは癌に対する治療薬の設計において例えば、抗癌ワクチンのエピトープの供給源として特に有用である。本発明はGRILと適切なエピトープの結合によりFcγR Iに癌特異的エピトープを送達することを含んでなる。本発明においてエピトープの供給源として予想される腫瘍マーカーの例は乳癌及び卵巣癌を含み、それらは性ホルモンに依存する癌である。乳癌は異常に発現される受容体、例えば、ヒトEGF様受容体ファミリー（HER）のもの、例えばHER−２、−３及び４を特徴とすることができる。本発明はHER抗原のこれらの態様に限定されない。性ホルモンに依存する癌のさらなる例は前立腺癌を含む（Smith、P.、1995、Cancer  Surveys 第23巻：Preventing  Prostate  Cancer、Imper.Cancer  Reseach  Fund  and  testicular  cancers）。正常な哺乳類の胎児の発生中に神経上皮幹細胞により発現されるネスチンタンパク質は脳腫瘍の大部分の型を初めとする中枢神経系の腫瘍上にも発現される（McKay、D.G.Ronald、米国特許第5,338,839号、8/16/94）。それは皮膚上に見られる黒色腫及び他の組織に転移しているものにも発現され（V.A.Florenes、R.Holm、O.Myklebost、U.Lendahl、O.Fodstad、1994、Cancer  Res．54:354−６）、従って、検出及び処置することが困難である。
本発明の方法の他の腫瘍型はウィルムス腫瘍（A.J.Buckler、K.M.Call、T.M.Glaser、D.A.Haber、D.E.Housman、C.Y.Ito、J.Pelletier、Rose、E.A.Rose、米国特許第5,350,840号）、胃腸癌（R.Fishel等、国際出願WO95/14085、05/26/95）、化学療法中の多剤耐性の発生を特徴とする癌（J.M.Croop等、米国特許第5,198,344号）、並びに分析のために配列を当業者が利用できるRb、ras及びｃ−mycのような当業者によく知られている多数の癌遺伝子のうちの少なくとも１つの存在を特徴とする癌を例とするがそれらに限定されない。TAG72のようなムチン抗原を発現する腫瘍も、胎児性癌抗原（CEA）ファミリーのタンパク質の少なくとも１つを発現する腫瘍と同様に、ワクチンとしての送達のために色素試薬中に混和されるエピトープの適当な供給源である。CEA遺伝子ファミリーは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する17より多い近縁の遺伝子からなる。このファミリーの抗原を認識する抗体はCEAスーパーファミリーの５亜群からのトランスフェクタントとそれらの反応性に基づいて同定される。これらはａ−BGP、ｂ−CGM6、ｃ−NCA、ｄ−CGM1及びｅ−CEA（DAKOカタログ、抗−CD66abce）である。
また、抗原は微生物の表面または分泌産物と関係する。「病原体」という用語は疾患を引き起こす生物を含むことを意味し、そのような疾患は疾病を引き起こす生物であるバクテリア、ウイルス、真菌及び原生動物の１つまたはそれ以上の特定の種により引き起こされる。本発明では、病原体はエシュリキア・コリ（Escherichia  coli）血清型0157:H7、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter  pylori）、ヘリコバクター・ムステラエ（H.mustelae）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus  influenzae）及びヘモフィルス・デュクレイ（H.ducreyi）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas  aeruginosa）、シゲラ・ディセンテリア（Shigella  dysenteria）、サルモネラ・チフィ（Salmonella  typhi）及びサルモネラ・パラチフィ（S.paratyphi）のようなグラム陰性バクテリア種；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium  tuberculosis）、マイコバクテリウム・レプレ（M.Leprae）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium  tetani）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus  aureus）及びストレプロコッカス・ヘモリティカス（Streptococcus  hemolyticus）のようなグラム陽性バクテリア種；リケッチア（Rickettsia）及びクラミジア（Chlamydia）種のような偏性細胞内バクテリア生物;HIV−１及び−２を初めとするがそれらに限定されない、相補的DNAを合成するために逆転写酵素を用いるRNA含有ウイルスであるレトロウイルス;HSV−Ｉ及び−II、非Ａ非Ｂ非Ｃ肝炎ウイルス、ポックスウイルス並びに狂犬病ウイルスのような他の病原性ウイルス；カンジダ（Candida）及びアスペルギルス（Aspergillus）種のような真菌；クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium  parvum）、赤痢アメーバ（Entamoeba  histolytica）及びランブル鞭毛虫（Giardia  lamblia）のような原生動物；並びにニュカッスル病ウイルスのような動物病原体を例とするがそれらに限定されない。タンパク質をスクリーニングすることにより、そしてインビトロでペプチドをアッセイすることによりこれらの生物から独特なエピトープを得ることは当業者に一般に知られており；多数の例が記述されており、そして適切なアミノ酸残基配列をジーンバンク（Genbank）から入手することができる。
「感染」という用語は当該宿主における病原体の持続及び増殖を含むことを意味する。感染の存在を診断するために用いられる症状は熱、炎症、痛み、感染の部位もしくはその近くでの関節及び筋肉の感覚を含むが、これらの症状の１つまたはそれ以上の欠如は当該宿主生物における感染を除外しない。「炎症」という用語は感染に伴う一組の宿主反応を示し、感染がない場合でも例えば、自己免疫反応、変性疾患、組織リモデリング疾患、アレルゲンへの露出及び／または他の疾患の症状として存在することがある。炎症反応はプロテアーゼ、ヒスタミンの放出を伴う好中球、マスト細胞及び好塩基球の脱顆粒のような細胞プロセス、並びに超酸化物生成、並びにインターフェロン及び腫瘍壊死因子のようなサイトカインの生産及びそれらに対する反応を含む。急性炎症は高められたCD64発現のために、FITCで標識された抗−CD64 mAbでの白血球の増加した染色と関係する（Davis、BH等、上記）。
II.蛍光色素
本発明の組成物、方法及びキットは蛍光用途のための色素、色素試薬及びタンデム色素試薬に関し、本発明はある種のこれらの色素及び試薬がFcγR Iとして知られているIgG抗体の受容体の種類に高い親和性及び特異性で結合することを含んでなる。タンデム色素試薬は特定の波長または波長の範囲の光が分子の片方の成分により吸収され、それが分子励起を経て次に異なる波長の光を出すような（蛍光の特性）、２つまたはそれより多い共有結合的に連結された別個の色素成分で構成される。この第一成分により出される光はタンデムのもう一方の成分により実質的に吸収され、それは次に別の波長の光を出す。これらの特性によりタンデム色素が多数の蛍光色素の抗体コンジュゲートを用いて細胞型及び細胞構造の位置の同定のために有用であることが分かっている。
いくつかの一般的に用いられる単一及びタンデム蛍光色素の光スペクトル特性を表１に示す（Immunotech−Coulter  Corp.カタログ、「Cytometry  Monoclonal  Reagent  Guide」、8/95、p.3から修正した形で複製される）。最大光吸光度のピーク、励起及び発光のパラメーターにより単一の実験または分析において２つまたはそれより多い蛍光色素を同時に使用することができる（例えば、Chang、T.W.1993、U.S.P.N.5,256,542を参照）。
タンデム蛍光色素抗体コンジュゲートは細胞分離用途（Loken、M.R.等、1992、U.S.P.N.5,137,809）及び細胞分析のために用いられ、異なる特異性の抗体に結合された単一色素成分で構成されるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）及び／またはフィコエリトリン（Ｒ−PEまたはPE;Kronick、M.、1986、J.Immunol.Methods 92:1;及びU.S.P.N.4,857,474、1989年８月15日）のような１つまたはそれより多い「単純な」蛍光色素と組み合わせて用いられる。従って、各色素種は異なる細胞成分または分子に特異的な抗体に結合される。他のものと組み合わせた色素の有用性は光エネルギー相互作用のスペクトルの２つの特徴：（１）各々FITC及びPEと共に用いることができる以下の表１に挙げたPE−テキサスレッド及びPE−Cy5のような、単一の照射波長または狭い帯域の波長により色素分子が励起される程度；及び（２）独特な色またはピークとして認識できるように他の色素と十分に異なる波長の光を各励起色素分子が出す程度により決定される。第一の特徴により使用者は多重に染色された生物学的サンプルを単一の波長、この例では488nmで照射することができ、そして第二の特徴により使用者は各々特定の細胞型または構造と関係する異なる色の発光を観察及び記録することができる。
0003574665.tif 000002
観察及び分析の好ましい方法は光源並びに励起及び発光波長に適切なフィルターを備えた顕微鏡での直接視覚化、並びに顕微鏡に装着したカメラの使用を含む。この種類の色素試薬で適切に染色された生細胞の細胞分離及び計数のために最も好ましい本発明の方法はFACScanまたはFACStar（Becton  Dickinson、San  Jose、CA）のようなフローサイトメトリー装置を用いた単離である。この装置は混合した細胞集団を例えばアルゴンレーザー光源で488nmで照射し、そしてバッファーのような動いている液体中で検出される各細胞からの発光スペクトルシグナルを用い、発光の収集のための各種帯域フィルターを用いて細胞が検出器を通って流れる時に各細胞を分類する（例えば、Lohmeyer、J.等、1994、J.Immunol.Methods 172:59を参照）。この装置は細胞集団を数えて且つ集めることができ、さらなる分析及び使用のためのデータ及び細胞画分の両方を与える。
フローサイトメトリーは血液及び骨髄中の細胞集団中の異なる種類の細胞を分離するために幅広く用いられており；白血病及びリンパ腫のタイピングの手段として、異なる型の白血球を相互に分離するため（Howard、M.等、1994、J.Clin.Path．（London）47:1006;U.S.P.N.5,234,816）並びに研究及び治療用途のために、他の細胞型から単離して除かれた血液幹細胞前駆体画分を得るため（U.S.P.N.5,137,809、1992年８月11日）に特に有用であった。フローサイトメーターは臨床試験所の使用において日常的になってきている。細胞のいくつかのパラメーターを同時に測定することができ：前方散乱光は細胞の大きさを測定するために用いられ；そして二次散乱検出器は細胞細胞質の粒状度に関する情報を与え、白血球の様々な型を区別するために用いられる。
各々、特定のモノクローナル抗体に結合されている蛍光色素（fluorescent  dye）「蛍光色素（fluorochromes）」から出される蛍光はサイトメーターにより集められる。これらのパラメーターは用いられるモノクローナル抗体−色素コンジュゲートの特異性及び組み合わせにより広範な用途を生じる。
FITC、フルオレセインのイソチオシアネート（3',6'−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン−１（3H）,9'−［9H］キサンテン］−３−オン;Merck  Index、第11版、1989、Merck  and  Co.、Rahway、NJ）に結合された抗体を含んでなる多数の試薬が利用できる。FITCは389kDaの分子量及び495nmの吸収極大を有する蛍光色素である。488nmの光によるその励起によりおよそ520nmで最大の蛍光発光を生じる。530＋／−15nmの帯域（BP）フィルターを用いることによりこの蛍光色素の最適な検出が与えられる。FITCは高量子収率（吸収から発光蛍光へのエネルギー移動の効率）を有し、そして吸収された光子の約半分が蛍光として出される。結合相手（例えば、抗体、アジビンまたはストレプトアジビン）当たりのFITC分子の数は通常３ないし５分子の範囲にある。フルオレセインの二ナトリウム塩は角膜損傷、眼内炎症の場合並びに眼の血管造影及びコンタクトレンズ装着のために診断的に用いられる。
多数の抗体コンジュゲート試薬の別の蛍光色素成分、PEは紅藻で見いだされた補助（accessory）光合成色素であり、それは光合成中に光エネルギーをクロロフィルに移すようにインビボで機能する。この240kDAタンパク質は１分子当たり各々線状テトラピロールの34のフィコエリトロビリン蛍光色素を有し、それらは488nmの光により励起されると576nmのピークの光を発する。単一レーザーフローサイトメトリー使用には585＋／−21nm BPフィルターが最適検出のために用いられる。二重レーザー系で複数色分析を実施する場合には、用いられている他のコンジュゲートを補整するために検出のより厳重な窓、例えば575＋／−13nm BPフィルターが必要である。PharMingen（San  Diego、CA）PE製品の結合化学は抗体または他のタンパク質当たり平均１個のPE分子を生じる。
シアニンはヤグルマソウ（センタウレア・シアヌス（Centaurea  cyanus））から単離され、構造的にシアニジンの3,5−ジグルコシドであり、それは２−（3,4−ジヒドロキシフェニル）−3,5,7−トリヒドロキシ−１−ベンゾピリリウムクロリドであり、バナナから単離された（Merck  Index、上記）。別のシアニジン誘導体、スミノミザクラから単離された３−ラムノグリコシドは夜盲症の治療用途を有すると記述されている。コケモモ（ワクシニウム・ミルチルス（Vaccinium  myrtillus））果実のアントシアノシドは栄養と薬効のある栄養剤として販売され、ある製造業者（Amrion,Inc.、Boulder、CO）によると、それは血管拡張を改善し、毛細血管透過性を減少し、血管中のコラーゲンを保護し、酸化防止剤として作用し、そして炎症過程の制御を補助するために経口で飲まれ、一般視力、胃裏層、血液脳関門、並びに脚及び腸の静脈を改善する（Gen.Engin.News 16（11）、p.27、1996）。
Cy5.18.OSuとも呼ばれるシアニジン誘導体色素Cy5は化学構造5,5'−ビス−スルホ−1,1'−（ε−カルボキシフェニル）−3,3,3',3'−テトラメチルインドジカルボシアニン−ジスクシンイミジルエステルを有する（A.S.Waggoner等、Clinical  Flow  Cytometry中、p.185（編集）A.Landay等、The  New  York  Academy  of  Sciences、New  York、New  York、1993）。スルフィドリル基のシアニン色素標識試薬（Ernst、L.A.等、1989、Cytometry 10:3）及びカルボキシメチルインドシアニンスクシンイミジルエステル（Southwick、P.L.等、1990、Cytometry 11:418）は記述されており、そして組成物が特許出願（USPN 4,981,977及び5,268,486）に請求されており、それらの特許及び公開の内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。Cy5の構造、並びにその合成並びに光の吸収及び発光のスペクトルはMujumdar、R.B.、1993、Bioconj．Chem．４:105に示されている。Cy5はスルホインドシアニンスクシンイミジルエステルとして記述され、それらはインドシアニン発蛍光団の芳香族核上に負に荷電したスルホネート基を含有するアミノ反応性シアニン色素である。このファミリーのCy5メンバーは２個の置換された環構造を連結する５−炭素の不飽和ポリメチン架橋を特徴とする。633nm HeNeレーザー線またはDrレーザーの647nm線でCy5を励起することができる。Cy5及びその誘導体は光安定性が顕著であり、それはフルオレセインのものに匹敵するかまたはそれより優れている。250,000の吸光係数（L/mol cm）は非常に高い。類似した構造及び合成の方法を有する関連色素（Mujumdar等、上記）は本明細書では「Cy5」という表現の中に包含され、それ故、この表現は一般にシアニン色素標識試薬のスルホインドシアニンスクシンイミジルエステル、例えば、（Cy3として知られている）Cy3.29.OSu及びCy7.18.OHを包含する。Cy5試薬、Cy5コンジュゲート及びCy5誘導体という語は少なくともCy5成分及び別の分子の存在を含んでなるコンジュゲートを意味する。この基本構造のさらなる新規誘導体、シアニン試薬のスルホベンゾインドシアニンスクシンイミジルエステルが記述されており（Mujumdar、S.R.等、1996、Bioconj.Chem ７:356）、それらはCy5及び他のスルホインドシアニンスクシンイミジルエステルの特性を共有し、そしてFcγR Iに親和性及び特異性を有して結合すると考えられる。
単一の488nmアルゴンイオンレーザー線での励起により３色の蛍光を生じるために、PEとタンデムのCy5で構成されるCy5試薬PE−Cy5を用いることがWaggoner等、1993、上記中に最適化の条件であるとして記述されている。テキサスレッドに基づくタンデム色素の主要な問題は一方の成分の不安定性に起因し、使用中にもう一方の成分のスペクトル中への発光の漏洩をもたらし、そのもう一つの成分の波長またはその近くで光を発するテキサスレッド色素を使用する能力を制限している。しかしながら、Cy5及びその試薬ファミリーの色素はテキサスレッドより長い波長の光を発し、その結果、他の色素と共にCy5を用いることから得られるデータの分析は検出窓の設定及び後の計算において最小の経路補整を必要とする。コンジュゲートの１分子当たりに結合されるCy5分子の数の比率は合成生成物の相対発光波長スペクトルに影響を及ぼすので、Cy5試薬の最適形態使用のために考慮すべき事柄はそれらの成分からのCy5試薬の合成の工程を含む。従ってPE−Cy5では、より多数のCy5分子が各PEに最適範囲まで結合されるにつれてPEからCy5へのエネルギー移動の効率が増加し、それを越えると過剰のCy5成分間の消光相互作用が見られる。最適比率はPE−Cy5タンデム色素中の1PE当たり４ないし８のCy5である（Waggoner等、1993、上記）。タンデム色素は光感受性であり、以下の実施例に示すように、暗条件下で色素を保存及び使用し、実験を実施すると使用中の安定性が改善される。
以前に合成されたタンデム色素のものに比較して、PE−Cy5の蛍光の量及びバックグラウンドの欠如により向上したシグナルの大きさのために、それは抗体−色素コンジュゲートでの細胞分析研究のためのうまくいく分析手段になる。しかしながら、異なる製造業者からの各種PE−Cy5製品の骨髄細胞への「非特異的」結合の少なくとも１つの報告が発表されており（Stewart  SJ、等、上記）、PE−テキサスレッドコンジュゲートはこの特性を示さないのでそれはCy5成分に起因すると考えられる。それに反して、Takizawa等は低親和性マウスIgG受容体FcγR II及びFcγR IIIへのPE及びそのmAbコンジュゲートの結合を報告している（J.Immunol.Methods、1993、162:269）。
本発明は以下の実施例に記述するように、Cy5試薬、例えば、Cy5、PE−Cy5及び抗体コンジュゲート並びに関連試薬の予期せず本質的特異的な結合親和性を特定し、そしてフローサイトメトリー並びに診断、スクリーニング及び治療用途のためのこれらの使用方法を提供する。本明細書に使用される「PE−Cy5」という用語はフィコエリトリン及びCy5.18.OSuで構成される特定のタンデム色素を示し；「PE−Cy5試薬」という用語は例えば抗体へのPE−Cy5コンジュゲート、遺伝子工学による結合タンパク質及びペプチド（U.S.P.N.5,233,409及び5,403,484）、アビジン、ビオチンまたは他の分子の存在を示すがそれらに限定されない。
一般的に、本発明は片方がシアニンスクシンイミジルエステル組成物種の色素である２成分で構成されるFcγR Iの有用な特異的リガンドを作製することを意図する。FcγR Iのこの特異的リガンドをIgＧ受容体Ｉリガンドを表す「GRIL」と称する。本発明のGRILの厳密な光吸収、励起及び発光スペクトルは、診断のような本明細書のいくつかの用途には有用であるが、治療のような他の用途のために必要な高親和性及び特異性に必須の特性ではない。応用のためのGRILの使用分野が蛍光染色を必要とする場合は、GRILは「GRILステイン」または「GRIL色素」と呼ばれ、そしてそのような組成物で染色された細胞は「GRILで染色された細胞」のように表される。さらに、フィコブリソーム成分及びシアニンスクシンイミジルエステル成分で構成されるGRIL新規組成物で、該タンデム色素が例えば抗体、結合タンパク質、アビジンまたは他の置換基でさらに置換されるものは本明細書において「GRIL組成物」または「GRIL試薬」と呼ばれる。
III.抗体及び抗体受容体
IgG分子の受容体はFcγR Iとして知られており、好中球及び好酸球上に誘導でき、そのうちFcγR Iは単球及びマクロファージ上に見いだされる高親和性受容体である（Van  de  Winkel  JGI、等、1993、Immunol  Today 14:215）。低親和性IgG受容体は好中球（多形核好中球、PMN）、単球及び血小板上に見いだされるFcγR II並びにマクロファージ、PMN及びナチュラルキラー細胞（NK）上に見いだされるFcγR IIIである。また、低親和性IgG受容体はマスト細胞及びＴ細胞のサブセット上にも見いだされる（Ravetch等、1991、Ann.Rev.Imm．９:457）。これらの受容体へのIgGの結合と関係する生物学的機能は食作用、超酸化物生成、細胞毒性及びメディエーター放出の誘発を含む。FcγR Iはその高親和性のためにインビボでIgGで飽和されているかもしれず、定常状態の状況を示唆するので、その生物学的役割は完全には決定されていない。連鎖球菌の感染中のFcγR Iの発現の誘導（Guyre、P.M.等、1990、J.Clin.Invest．86:1892）、慢性肉芽腫症の患者のIFN−γ処置中の誘導、及び健康な個体におけるごくわずかな量から急性炎症中の多数までの好中球上の誘導（Davis、BH等、上記）を初めとするデータから、感染に対する抵抗性における重要な役割が示唆される（Van  de  Winkel  JGI、等、1993、Immunol  Today 14;215）。
抗体はエピトープとして知られている外来分子の認識の単位に反応して高等動物の免疫細胞により合成されるタンパク質である。高等動物で典型的に循環している抗体分子の集団は、動物がさらされている免疫原の集団に見いだされる多数の異なるエピトープのいずれかに各々が特異的である多数組の抗体を含んでなるので、その集団は「ポリクローナル」として知られており、それらの各抗体はそのコグネイトエピトープに対する特異的親和性を特徴とする。エピトープは最も小さい抗原性決定基であり、それはタンパク質では６ないし８残基の長さのペプチドを含んでなる（Berzofsky、J.及びI.Berkower、（1993）Paul、W.、編集、Fundamental  Immunology中、Raven  Press、N.Y.、p.246）。抗体分子のそのコグネイトエピトープに対する親和性は低いもの、例えば10-6Mから高いもの、例えば10-11Mまでである。
本明細書に用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は単一分子組成の抗体分子の調製物をさす。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。培養における細胞の連続増殖により抗体分子の生産を与える技術を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。これらはKohler及びMilsteinにより最初に記述されたハイブリドーマ技術（Nature、1975、256:495−497;Brown等、1981、J.Immunol  127:539−46;Brown等、1980、Ｊ  Biol  Chem  255:4980−83;Yeh等、1976、PNAS  76:2927−31;及びYeh等、1982、Int.J.Cancer  29:269−75も参照））並びにより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor等、1983、Immunol  Today  4:72）、EBV−ハイブリドーマ技術（Cole等、1985、Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy、Alan  R.Liss,Inc.、pp.77−96）及びトリオーマ（trioma）技術を含むがそれらに限定されない。
「外来」抗原に対する免疫反応は、生物内で発現される「自己」タンパク質及び他の分子がその生物にとって抗原性または免疫原性ではないという認識を含んでなる。実際、同級または同族の決定基と「外来」または異種起源の決定基の間の識別は免疫系の発達中に生物の免疫系の成熟を通して得られる。「自己」に対する結合決定基を有する抗体を保有する免疫細胞に対する選択の系が起こり、その結果、成熟すると免疫系は生物に生来のタンパク質または他の分子を攻撃しない。しかしながら、「自己免疫疾患」として知られているある種の異常疾患では、そのような識別が厳正ではなく、内因性構造が免疫系からの攻撃を受ける可能性がある。症状の自己免疫悪化がある自己免疫疾患及び疾病の例は全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症及び慢性関節リウマチを含む。（米国HHS省、1992年データによると）米国の約150,000人の患者を冒す一つの自己免疫疾患の特発性血小板減少性紫斑病（ITP）は、自己抗原で被覆された血小板を循環から除く脾臓及び肝臓中のマクロファージに起因する。自己抗体は通例IgGアイソタイプを有し（Schwarz、R.S.、Autoimmunity  and  Autoimmune  Diseases、1993、p.1075、Fundamental  Immunology中、第３版、W.E.Paul、編集、Raven  Press、NY）、この疾患は連続的な血小板破壊をもたらす。本発明の組成物の種類はFcγR I受容体上の部位に対する結合決定基を含んでなるために、この受容体上の部位に結合することができる。そのために、発明された組成物は細胞表面上のこれらの受容体の数を調節することもでき、さらにこれらの受容体の機能的部分に結合して抗体結合と競合することができ、従って、自己免疫疾患の処置のための可能性のある薬剤である。さらに、抗体結合決定基のFv領域のアミノ酸残基配列データは、この結合部位を含んでなる残基の組の大きさ、電荷及び形状のようなタンパク質の特徴の３次元モデルを得るための基礎であり、その結果、受容体に結合する薬剤の部分を合成することができ、この結合部位に似た薬剤を設計することができる。
抗原の１つの型はアレルゲンである。「アレルゲン］は敏感な患者においてアレルギー性または喘息性反応を引き起こすことができる物質をさす。ある集団のある割合に感受性反応を引き出すアレルゲンの数は莫大であり、花粉、昆虫毒、動物鱗屑、チリダニタンパク質、真菌胞子及び薬剤（例えば、ペニシリン）を含む。天然の動物及び植物アレルゲンの例は以下の属：フェリス（Felis）（フェリス・ドメスチカス（Felis  domesticus））；カニス（Canis）（カニス・ファミリアリス（Canis  familiaris））；デルマトファゴイデス（Dermatophagoides）（例えば、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Dermatophagoides  farinae））；ペリプラネタ（Periplaneta）（例えば、ペリプラネタ・アメリカナ（Periplaneta  americana））；アンブロシア（Ambrosia）（アンブロシア・アルテミイスフォリア（Ambrosia  artemiisfolia））；ロリウム（Lolium）（例えば、ロリウム・ペレンネ（Lolium  perenne）またはロリウム・マルチフロラム（Lolium  multiflorum））；クリプトメリア（Cryptomeria）（クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria  japonica））；アルテルナリア（Alternaria）（アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria  alternata））；アルナス（Alnus）（アルナス・グルチノサ（Alnus  gultinosa））；ベツラ（Betula）（ベツラ・ベルコサ（Betula  verrucosa））；クエルカス（Quercus）（クエルカス・アルバ（Quercus  alba））；オレア（Olea）（オレア・ユーロッパ（Olea  europa））；アルテミシア（Artemisia）（アルテミシア・ブルガリス（Artemisia  vulgaris））；プランタゴ（Plantago）（例えば、プランタゴ・ランセオラタ（Plantago  lanceolata））；パリエタリア（Parietaria）（例えば、パリエタリア・オフィシナリス（Parietaria  officinalis）またはパリエタリア・ジュダイカ（Parietaria  judaica））；ブラテラ（Blattella）（例えば、ブラテラ・ゲルマニカ（Blattella  germanica））；アピス（Apis）（例えば、アピス・マルチフロラム（Apis  multiflorum））；クプレッサス（Cupressus）（例えば、クプレッサス・センペルビレンス（Cupressus  sempervirens）、クプレッサス・アリゾニカ（Cupressus  arizonica）及びクプレッサス・マクロカルパ（Cupressus  macrocarpa））；ジュニペルス（Juniperus）（例えば、ジュニペルス・サビノイデス（Juniperus  sabinoides）、ジュニペルス・ビルギニアナ（Juniperus  virginiana）、ジュニペルス・コミュニス（Juniperus  communis）及びジュニペルス・アシェイ（Juniperus  ashei））；ツヤ（Thuya）（例えば、ツヤ・オリエンタリス（Thuya  orientalis））；カメシパリス（Chamaecyparis）（例えば、カメシパリス・オブツサ（Chamaecyparis  obtusa））；アグロピロン（Agropyron）（例えば、アグロピロン・レペンス（Agropyron  repens）；セカレ（Secale）（例えば、セカレ・セレアレ）（Secale  cereale））；トリチカム（Triticum）（例えば、トリチカム・アエスチバム（Triticum  aestivum））；ダクチリス（Dactylis）（例えば、ダクチリス・グロメラタ（Dactylis  glomerata））；フェスツカ（Festuca）（例えば、フェスツカ・エラリオル（Festuca  elarior））；ポア（Poa）（例えば、ポア・プラテンシス（Poa  pratensis）またはポア・コンプレッサ（Poa  compressa））；アベナ（Avena）（例えば、アベナ・サチバ（Avena  sativa））；ホルカス（Holcus）（例えば、ホルカス・ラナタス（Holcus  lanatus））；アントキサンタム（Anthoxanthum）（例えば、アントキサンタム・オ��ラタム（Anthoxanthum  odoratum））；アレナテラム（Arrhenatherum）（例えば、アレナテラム・エラリウス（Arrhenatherum  elarius））；アグロスチス（Agrostis）（例えば、アグロスチス・アルバ（Agrostis  alba））；フレウム（Phleum）（例えば、フレウム・プラテンス（Phleum  pratense））；ファラリス（Phalaris）（例えば、ファラリス・アルンジナセア（Phalaris  arundinacea））；パスパルム（Paspalum）（例えば、パスパルム・ノタタム（Paspalum  notatum））；ソルギュム（Sorghum）（例えば、ソルギュム・ハレペンシス（Sorghum  halepensis））及びブロマス（Bromus）（例えば、ブロマス・イネルミス（Bromus  inermis））に特異的なタンパク質を含む。
IV.製薬学的組成物
本発明の化合物をインビボでの患者への投与のために適当な製薬学的組成物中に混和することができる。好ましい態様として、製薬学的組成物はGRIL、本発明のGRIL組成物または試薬及び製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。本発明のさらに別の態様として、製薬学的組成物を組み合わせ治療により、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、組み合わせ治療は少なくとも１つの抗がん剤、１つの抗生物質、１つのワクチンまたは他の通常の治療と本発明の組成物を含むことができる。
さらに、組織、例えば血液または骨髄の細胞を患者から取り出し、分画し、必要な場合、細胞数を増やすために培養し、製薬学的に許容しうる担体中GRIL、例えばCy5試薬でエクスビボで処理し、そして治療のために患者に戻すことができる。エクスビボでの培養及び増殖中に、特定の細胞型、例えば、単球もしくは好中球集団またはそのような白血球の幹細胞を選択することができる。さらに、エクスビボでの培養及び増殖中の様々な時点で、エクスビボで培養された細胞をある種の機能的FcγＲ分子を改変するように薬剤で処理することができる。薬剤は成長因子、サイトカイン、IFN−γ、Ｇ−CSF、腫瘍壊死因子（TNF）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（GM−CSF）のようなリンホカイン並びにIL−２、IL−10及びIL−12のようなインターロイキンを含むがそれらに限定されない。本発明の好ましい薬剤はIFN−γ、Ｇ−CSF及びIL−10を含む。
本明細書に使用される場合、「製薬学的に許容しうる担体」は生理的に適合するあらゆる及び全ての溶媒、分散媒質、被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤（isotonic  and  absorption  delaying  agents）等を含む。製薬学的有効物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路により、酸の作用または化合物を不活性化する可能性のある他の自然条件から化合物を保護するための材料中に有効化合物を被覆することができる。
本明細書に用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、通常注射による、腸及び局所的投与以外の投与形態を意味し、限定せずに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄空内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含む。
「製薬学的に許容しうる塩」は親化合物の所望する生物学的活性を保持し、いかなる望まれない毒物学的作用も与えない塩をさす（例えば、Berge、S.M.等、1977、J.Pharm.Sci.66:1−19を参照）。そのような塩の例は酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような無毒の無機酸並びに脂肪族のモノ−及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等のような無毒の有機酸から得られるものを含む。塩基付加塩はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属及びN,N'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような無毒の有機アミンから得られるものを含む。
本発明の組成物を当該技術分野で知られている様々な方法により投与することができる。当業者により認識されるように、投与の経路及び形態は所望する結果により変わる。移植、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を初めとする、制御放出製剤のような、化合物の迅速な放出を防ぐ担体と共に有効化合物を調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解可能な生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多数の方法は特許を得るかまたは当業者に一般的に知られている。例えば、Sustained  and  Controlled  Release  Drug  Delivery  Systems、J.R.Robinson、編集、Marcel  Dekker,Inc.、New  York、1978を参照。
ある投与経路により本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐための物質で化合物を被覆するかまたはそれと共に化合物を同時投与することが必要である可能性がある。例えば、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤中で化合物を患者に投与することができる。製薬学的に許容しうる希釈剤は食塩水及びバッファー水溶液を含む。リポソームは水中油中水滴型CGFエマルジョン及び通常のリポソーム（Strejan等、1984、J.Neuroimmunol．７:27）を含む。あらゆる通常の媒質または薬剤が有効化合物と配合禁忌でない限り、本発明の製薬学的組成物におけるその使用が考えられる。
治療組成物は典型的に無菌でそして製造及び保存の条件下で安定でなければならない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬剤濃度に適した他の整った構造として配合することができる。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコース水等）並びにそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒質であってもよい。例えば、レチチンのような被覆の使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、そして界面活性剤の使用により適切な流動度を保つことができる。多くの場合で、等張剤、例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有することが好ましい。吸収を遅らす薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含有することにより注入可能な組成物の持続的な吸収をもたらすことができる。
必要な場合、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量の有効化合物を混和し、続いて滅菌ミクロ濾過により滅菌した注入可能な溶液を調製することができる。通例、基本的な分散媒質及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌したビヒクル中に有効化合物を混和することにより分散液を調製する。滅菌した注入可能な溶液を調製するための滅菌した粉末の場合には、調製の好ましい方法は、先に滅菌濾過したその溶液から有効成分及びあらゆるさらなる所望する成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥（freeze−drying）（凍結乾燥（lyophilization））である。
投与量投薬計画は最適の所望する反応（例えば、治療反応）を生じるように調整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分けられた投与量を時間にわたって投与してもよく、または治療状況の緊急により示されるように投与量を比例して減少もしくは増加してもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために単位剤形の非経口組成物を配合することが特に好都合である。本明細書に用いられる単位剤形は処置される患者に単位投与量として適した物理的に別個の単位をさし；各単位は必要な製薬学的担体と会合して所望する治療効果を生じるように計算された有効化合物の前以て決定された量を含有する。通例、100パーセントのうち、この量は約0.01パーセントから約99パーセントまでの有効成分、好ましくは約0.1パーセントから約70パーセントまで、最も好ましくは約１パーセントから約30パーセントまでである。本発明の単位剤形の特定は（ａ）有効化合物の独特な特性及び得られる特定の治療効果並びに（ｂ）個体の感受性の処置のためにそのような有効化合物を調合することの当該技術分野に固有の限界により決定され、そしてそれらに直接依存する。
製薬学的に許容しうる酸化防止剤の例は（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤を含む。
経皮パッチは体への本治療発明の化合物の制御された送達を与えるという利点を与える。皮膚を越えた組成物の流入を増すために吸収促進剤（enhancers）を用いることもできる。速度制御膜を与えるかまたはポリマーマトリックスもしくはゲル中に組成物を分散させることによりそのような流入の速度を制御することができる。例えば、米国特許第4,708,716号及び第5,372,579号に記述された装置を初めとする、電離療法または他の電気的に補助された方法により組成物を経皮的に送達する、パッチを初めとする装置も本発明に用いることができる。
患者に有毒ではなく、特定の患者、組成物及び投与形態に対して所望する治療反応を得るために有効な有効成分の量を得るように本発明の製薬学的組成物中の有効成分の実際の投与量レベルを変えることができる。選択される投与量レベルは用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出の速度、処置の時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物及び／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び前の病歴並びに医療技術分野でよく知られているような因子を初めとする各種薬物動態学因子により決まる。
当該技術分野の通常技術を有する医師または獣医は必要な製薬学的組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師または獣医は製薬学的組成物中に用いられる本発明の組成物の服用量を所望する治療効果を得るために必要なものより低いレベルで開始し、そして所望する効果が得られるまで投与量を徐々に増やすことができるはずである。通例、本発明の組成物の適当な日服用量は治療効果を生じるために有効な最も低い服用量である化合物の量である。そのような有効服用量は通例上記の因子により決まる。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であることが好ましく、好ましくは標的の部位の近くに投与される。必要な場合、治療組成物の有効な日投与量を場合により単位剤形で、一日にわたって適切な間隔で別個に投与される２、３、４、５、６またはそれより多い副投与量として投与することができる。
治療組成物を当該技術分野で知られている医療装置で投与することができる。例えば、好ましい態様として、本発明の治療組成物を米国特許第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号または第4,596,556号に記述された装置のような無針皮下注入装置で投与することができる。本発明に有用なよく知られている移植物及びモジュールの例は：制御された速度で薬剤を調合するための移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する米国特許第4,486,194号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号；連続的な薬剤送達のための可変流量移植可能注入装置を開示する米国特許第4,447,224号；複数室区画を有する浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第4,439,196号；及び浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第4,475,196号を含む。これらの特許は引用することにより本明細書に組み込まれる。多数の他のそのような移植物、送達系及びモジュールが当業者によく知られている。
上記のように、有効化合物が適当に保護される場合、化合物を例えば不活性希釈剤または吸収できる食用担体と共に経口投与することができる。本明細書に用いられる場合「製薬学的に許容しる担体」はあらゆるそして全ての溶媒、分散媒質、リポソーム製剤及び被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延薬剤、並びに他の上に説明したものを含む。経口投与に対して安定である製薬学的有効物質の配合のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。あれゆる通常の媒質または薬剤が有効化合物を配合禁忌でない限り、治療組成物におけるそれらの使用が考えられる。
本発明は以下の実施例によりさらに例示され、それらはさらに制限すると解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開特許の内容は引用することにより本明細書に明白に組み込まれる。
実施例
材料及び方法の節に記述する以下の方法論を以下に記述するこれらの実施例にわたって用いた。
材料及び方法
Immunotech/Coulter  Corporation（Westbrook、ME及びKennesaw、GA）から入手した色素−抗体コンジュゲート、非結合タンデム色素または他の試薬を使用するための免疫血液学プロトコルをここに記述する。ヒト末梢血の細胞懸濁液の免疫蛍光染色には、以下のように細胞を調製し、濃縮した。サンプルが通常または高い白血球数を有する場合には全血を用い、赤血球を溶解により除いた。低い白血球数を有するサンプルでは、以下のようにFicoll  Hypaque（Pharmacia−Upjohn、Piscataway、NJ）法により赤血球を分離した。EDTA抗凝血剤中に集められた血液の細胞懸濁液に等容量のNaCl（0.9％）を添加した。希釈された血液を血液の約半分に等しい容量のFicoll  Hypaqueを含有する円錐遠心管の側面に沿ってピペットで移し、管を室温で700gで15分間遠心分離した。血漿界面の単核細胞をパスツールピペットで取り出し、集められた単核細胞の容量と等しい容量のハンクス（Hank's）または類似溶液で３回洗浄し、各洗浄後に４℃で300gで10分間遠心分離した。上清を吸引し、各洗浄後に廃棄し、そして細胞を約106細胞/mlの濃度に懸濁媒質中に再懸濁し、穏やかに混合し、そしてトリパンブルーまたは臭化エチジウムを用いて細胞生存度を測定した（細胞は約80％生存可能であった）。
直接染色法は蛍光色素に直接結合している一次抗体を用いる。分離された細胞では、細胞懸濁液（100μｌ）を２つの管（その一方を自己蛍光のコントロールとして用いる）の各々にピペットで移した。結合された色素−モノクローナル抗体（20μｌ）を１つの試験管に添加し、それを穏やかに混合した。細胞を暗所で４℃で30分間インキュベートし、PBSまたはハンクス培地で２回洗浄し、そしてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法での分析の前に100ないし500μｌの固定試薬または１％ホルムアルデヒド中に再懸濁した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質（70％グリセロール、30％グリシンバッファーpH8.6）を手で添加した。
高い白血球数（10,000細胞/mlより多い）の場合の全血での免疫染色では、血液を等張溶液に希釈して約5,000白血球/ml（標準値）を得た。全血100μｌを試験管中にピペットで移し、色素に結合されたモノクローナル抗体溶液20μｌを試験管に添加し、中身を穏やかに混合し、暗所で室温で75分間インキュベートした。次に溶解溶液を添加し、暗所で25℃で５分間インキュベーションを続けた。固定試薬を添加し、細胞を700gで５分遠心分離し、100μｌないし500μｌのPBSまたは１％ホルムアルデヒド中に再懸濁し、そしてそれぞれフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法により分析した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質を添加した。
二重標識化には、各々異なる蛍光色素に結合された抗体の混合物で細胞の一次インキュベーションを実施した。本明細書に記述される組み合わせはFITC/フィコエリトリンであり；同じ方法がFITC及びPE−Cy5が結合された抗体の組み合わせでの染色のために適している。分離された細胞の免疫染色では、100μｌの細胞懸濁液を２つの管の各々（それらの一方をコントロールとして用いる）にピペットで移した。モノクローナル抗体溶液20μｌを試験官に、そして20μｌの食塩水をコントロール管に添加し、管を穏やかに混合し、４℃で30分間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）またはハンクス培地で２回洗浄し、0.5％ホルムアルデヒドを含有するPBSまたは食塩水100ないし500μｌ中に再懸濁し、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法で分析した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質を添加した。
全血のサンプルでの免疫蛍光を分析するために、EDTAで処理した100μｌの血液を２つの管（１つのコンントロール管及び１つの試験管）にピペットで移し、20μｌのコンジュゲートモノクローナル抗体溶液を試験官に、そして20μｌのPBSをコントロール管に添加し、次に180μｌのPBSを各管に添加し、中身を穏やかに混合した。管を室温で15分インキュベートし、溶解溶液を添加し、暗所で25℃で５分インキュベーションを続けた。固定試薬を添加し、細胞を400gで３分遠心分離し、PBSで２回洗浄し、それぞれフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法での分析のために100μｌないし500μｌのPBSまたはホルムアルデヒド（１％）中に再懸濁した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質（70％グリセロール、30％グリシンバッファーpH8.8）を添加した。
DAKO  Corp.（Carpinteria、CA及びGlostrup、Denmark）から入手した色素−抗体コンジュゲート、非結合タンデム色素または他の試薬を使用するための免疫血液学プロトコルをここに記述する。抗凝血剤を含有する試験管中に静脈血を集め、単核細胞を分離媒質での遠心分離により単離した。あるいは、抗体−色素インキュベーション処置後に赤血球を溶解した。単核細胞をRPMI1640（Gibco/BRL、Bethesda、MD）またはPBS、pH7.2−7.4で２回洗浄した。100μｌ中に1 x 108細胞までを含有する細胞懸濁液を抗体に結合した色素10μｌまでと混合し、暗所で４℃で30分間インキュベートした。（二重抗体及び三重抗体標識コンジュゲートもこのプロトコルで用いた）。細胞を２％ウシ血清アルブミンを含有するPBSで２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために適切な液体中に再懸濁した。また、二重抗体または三重抗体染色を用いるこれらの同じ方法は末梢血及び骨髄中の未熟骨髄造血を評価するためにも有用である。
PharMingen（San  Diego、CA）から入手した色素−抗体コンジュゲート、非結合タンデム色素または他の試薬を使用するための免疫血液学プロトコルをここに記述する。細胞を組織から採取し、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球を溶解または密度勾配により除いた。細胞を冷えた洗浄バッファー（PBS/0.1％NaN3/1.0％ウシ胎仔血清）中で１回洗浄し、350 x gで５分間遠心分離した。細胞ペレットを2 x 107細胞/mlの濃度（すなわち、50μｌ当たり106細胞）に再懸濁した。一次mAb（例えば、蛍光色素が結合されたmAb）を洗浄バッファー中に前以て決定された最適濃度に希釈し、50μｌの容量でＵ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。50μｌのmAb（または陰性コントロールでは50μｌの洗浄バッファー）を含有する各ウェルに細胞（106）を50μｌで添加し、穏やかにボルテックスするかまたは軽くたたくことにより混合した。プレートを暗所で４℃で20−40分間インキュベートし、350gで５分間遠心分離し、200μｌの洗浄バッファーで２回（またはビオチンが結合した一次抗体を用いる場合は３回）洗浄した。各遠心分離後に、ウェルを吸引するかまたはプレートを振って上清を除いた。穏やかにボルテックスするかまたはプレートを軽くたたくことを用いて次の洗浄または希釈された二次試薬の添加の前にペレットをほぐした。第二工程試薬を必要とする場合、細胞ペレットを100μｌの適切な二次試薬（例えば、蛍光色素が結合されたアビジン、ストレプトアビジン、抗−Igアロタイプ、抗−Igアイソタイプ、ポリクローナル抗−Ig）中に再懸濁した。例えば、抗体を洗浄バッファー中100μｌ当たり１μｌに希釈し、ほぐされた細胞ペレットを含有する各ウェルに添加し、プレートを暗所で４℃で20ないし40分間インキュベートした。細胞を200μｌの洗浄バッファーで２回洗浄した。洗浄バッファー（100μｌ）を用いてフローサイトメトリーのために適切な管中の0.4mlアリコートの洗浄バッファーに細胞ペレットを移した（最終濃度0.5ml中約106細胞）。染色後できるだけすぐにフローサイトメーターでのサンプルデータを得た。
実施例1.  ヒトPMN及び好中球へのPE−Cy5モノクローナル抗体コンジュゲートの結合、並びにＧ−CSF処置の影響
フローサイトメトリーで14の異なるPE−Cy5結合モノクローナル抗体の特性を調べることによりFcγR IへのPE−Cy5の特異的結合を観察した。これらのコンジュゲートは３つの異なる会社（DAKO、Gertrup、Denmark及びCarpenteria、CA;Immunotech、Brussels、Belgium及びWestbrook、ME並びにCoulter、Miami、FLの事業部として；並びにPharMingen、San  Diego、CA）により製造され、それらを上に記述した、供給業者により推奨される方法論に従って用いた。
正常な提供者から単離された単球及び好中球（PMN）並びにインビボでＧ−CSFで処置された患者からのPMNの染色を分析した。意外にも、Ｔ及びＢ細胞抗原に対するmAbに結合されたこのタンデム色素で構成されるPE−Cy5試薬を用いて単球（図1d）及びＧ−CSF−PMN（図1b）の両方が発光染色を示した。任意の単位の細胞の蛍光は正常なPMNの蛍光（図1a）に比べてバックグラウンドより１ないし２桁大きいことが見いだされた。PMNは高レベルのFcγR III（CD16）を発現し、一方、単球及びＧ−CSFで処理したPMNはFcγR IIIに加えてFcγR Iを発現する（Van  de  Winkel  JGI、等、1993、Immunol  Today 14:215;Repp  Ｒ、等、1991、Blood 78:885）。従って、他者により以前に見いだされた、異なる細胞型の中で観察される「非特異的」PE−Cy5試薬染色パターンはここではFcγR I発現を示す細胞と相関することが観察された。
実施例2.  PMN及びU937単球細胞へのPE−Cy5モノクローナル抗体コンジュゲートの結合に対するγーインターフェロン（IFN−γ）処置の影響
FcγR I発現レベルを増加することが知られている条件（Guyre  PM、等、1983、J.Clin  Invest 72:393）のIFN−γで一晩培養されたPMN及びU937ヒト単球細胞へのPE−Cy5コンジュゲートの結合を評価した。PMN及びU937細胞の両方でのデータから、IFN−γでの処置によりPE−Cy5抗体コンジュゲートの結合が増大されたことが示される（U937を図1cに示す）。IFN−γはPMN上にFcγR Iを誘導し、そして単球及びマクロファージ上のこの受容体の発現を増加するので、この結果はPE−Cy5結合が骨髄細胞上のFcγR Iの発現の存在及び量と相関することを示す。
実施例3.  FcγR I、FcγR II a、FcγR II bまたはFcαＲをコードする遺伝子でのマウスII A1.6B細胞のトランスフェクション及びPE−Cy5コンジュゲート結合
FcγR IへのPE−Cy5コンジュゲートの結合の特異性を評価するために、各トランスフェクタントが１つのFcR分子型を発現するように作製された一連のFcR−トランスフェクタントを試験した。受容体のII A1.6細胞マウスＢ細胞はIgG受容体を欠いており;A20 B細胞リンパ腫（Morton、HC、等、1995、Ｊ  Biol  Chem 270:29781）から得られたIgGの異なるヒトFc受容体（FcγR I、CF64;Van  Vugt  MJ、等、1996、Blood 87:3593;FcγR II a、CD32;FcγR II b1、CD32、Van  den  Herik−Oudijk  IE、等、1995、Blood 85:2202）及びIgA受容体FcαＲ、CD89（Morton  HC、等、上記）をコードする遺伝子の各々でサンプルをトランスフェクトした。トランスフェクタントを（CD3、CD4またはCD8に対する抗体に共有結合的に連結された）異なるPE−Cy5 mAbコンジュゲートで染色した。他のトランスフェクタント（FcγR II、FcγR IIIまたはFcαＲ）の蛍光強度はFcγR Iを欠いている細胞と同一であったので、FcγR Iでトランスフェクトされた細胞のみがPE−Cy5コンジュゲートの結合を示した（図1f）。
ここではFcγR Iでトランスフェクトされたマウス3T3細胞で同様なデータを得た（Van  Vugt  MJ、等、1996、Blood 87:3593も参照）。FcγR Iを保有する細胞に対する特異的染色はFITCで標識されるかまたはPEで標識されたmAbでは見られず、それはFcγR Iがこれらの色素の中でPE−Cy5タンデム蛍光色素のCy5成分中のある部位のみと相互作用することを示す。マウスFcγR II及びFcγR IIIはPE色素及びPE色素コンジュゲートに結合するがFcγR Iは結合しない（Takizawa、F.等、上記）。ここでは非結合PE色素がヒトIgG受容体に結合しないことが観察された（データは示さない）。さらに、マウスFcγR IはPE−Cy5タンデム色素抗体コンジュゲートに特異的に結合するがFcγR II及びFcγR IIIは結合せず、それはヒト受容体で見られたものと同じパターンである。
実施例4.  FcγR Iの遺伝子でトランスフェクトされたマウスII A1.6B細胞に対する非結合Cy5色素の結合
上記の実施例はPE−Cy5及びこのタンデム色素の抗体コンジュゲートがヒトFcγR Iに特異的に結合することを示すが、しかしながら、FcγR Iの結合は非結合PEでは観察されなかった。非結合Cy5反応性色素（DAKO）の結合特異性を測定するために、この試薬を10mg/mlの濃度でDMSO中に溶解し、0.05 Tris−HCl、0.1M NaCl、15mM NaN3、１％BSA中で1mg/mlのストック濃度に希釈した。さらに、非結合PE−Cy5を同じ一連の実験で用い、PBS中1.5mg/mlのストック濃度に希釈した。
トランスフェクトされていないII A1.6B細胞及びヒトFcγR Iの遺伝子（参考文献、上記を参照）でトランスフェクトされたこれらの細胞、試験当たり20μｌ中2 x 105細胞を10μｌのCy5で４℃で１時間染色した。コントロール細胞ではなくトランスフェクタントのうまくいった染色が100ng/mlから1g/mlまでの範囲の色素の濃度で観察された。トランスフェクタントの平均蛍光強度はコントロール細胞のものより少なくとも１桁大きかった。また、30ng/mlから1.5μg/mlまでの範囲の色素濃度でもコントロール細胞ではなくトランスフェクタントでPE−Cy5での細胞の染色が観察された。上に記述したPE−Cy5のために適切な励起及び発光波長の帯域フィルターゲートを用いて全ての蛍光実験を実施し、それ故、PE及びPE−Cy5と比較して減少したCy5の活性は488nmでのCy5による比較的低い吸収のためである。この次善の励起にもかかわらず、データからCy5及びCy5タンデム色素誘導体のCy5部分がFcγR Iに特異性を有して結合することが示される。
実施例5.  PE−Cy5試薬をコグネイトコンジュゲートリガンドに使用するためのFcγR IへのPE−Cy5抗体コンジュゲート結合の阻止
FcγR Iを発現する細胞を20％のプールしたヒト血清またはFcγR I−リガンド−結合領域を阻止するモノクローナルCD64抗体（mAb 197、Van  de  Winkel  JGJ、等、1993、Immunol  Today 14:215）または集合IgGのいずれかで処理することにより、これらの細胞のPE−Cy5染色を90％より大きい程度まで阻止した。代表的なデータ（図1e）は単球のPE−Cy5コンジュゲート染色が全血染色アッセイにおいて80％より大きく減少したことを示す。
PE−Cy5コンジュゲートmAbを用いてマクロファージの「非特異的」染色が観察されており（Stewart  SJ、等、上記）、そしてAML−FAB M3白血病細胞の「高感度且つ特異的染色」も観察された（Ansari  MO、等、1996、Cytometry 26:813）。それらの結果はマクロファージ上に存在し、そしてAML白血病細胞上に発現されるFcγR IへのPE−Cy5試薬による特異的高親和性結合のためであることが本発明のデータにより示される。
本発明のデータから、IFN−γまたはＧ−CSFでの治療処置の経過をモニターするため、及びより複雑で高価な試薬の代わりに診断法としてCy5試薬を使用できることが示される。
同等物
当業者は本明細書に記述される本発明の特定の態様の多数の同等物を通常の実験のみを用いて認識し、または突き止めることができる。そのような同等物は以下の請求の範囲により包含されると考えられる。
【図１】
0003574665.tif 000003