(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化１】
0003588656.tif 000009
（式中、Ｒはベンジル基又はイソブチル基を表す。）
で示される環状ペプチド。
【請求項２】
次式ＩＩ：
【化２】
0003588656.tif 000010
で示される環状ペプチドを有効成分として含む豆類の害虫生育阻害剤。
【請求項３】
害虫がアズキゾウムシである請求項２記載の豆類の害虫生育阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な環状ペプチド及び該環状ペプチドを有効成分として含む豆類の害虫生育阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アズキゾウムシは、アズキ、ササゲ、緑豆（リョクトウ）などの豆類の種子を食害する貯蔵害虫として知られている。アズキゾウムシは、登熟した莢や完熟種子表面に産みつけられた卵から孵化して幼虫となり、次いでこれらの種子に侵入し、食害する。種子中から羽化した成虫は、交尾後直ちに産卵することができるため、温度条件が適していれば貯蔵中のアズキ中で増殖を繰り返し、アズキに大きな被害を与える。
【０００３】
リョクトウ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）は、アズキゾウムシに食害される豆類の一種であることから、かかる害虫に抵抗性を有する物質の開発が望まれている。
これまで、リョクトウの直接の祖先種の一系統であるＴＣ１９６６はアズキゾウムシに抵抗性であることが知られており、リョクトウとの交雑後代を遺伝解析した結果、当該抵抗性が単一の優性遺伝子（Ｒ）に支配されることが知られている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．，３８：４５９−４６４  （１９８８））  。ＴＣ１９６６に由来する抵抗性遺伝子をホモ（Ｒ／Ｒ）にもつ系統ではヨツモン及びブラジルマメゾウムシが生育できない（Ｆｕｊｉｉ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．，２４：１２６−１３２（１９８９））  こと、また、大豆の重要害虫であるホソヘリカメムシに対しても強い生育阻害を示すことから、ＴＣ１９６６には、特異性が広く育種的にも利用価値の高い物質が含まれていると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な環状ペプチド及び該ペプチドを有効成分として含む豆類の害虫生育阻害剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、リョクトウ野性種であるＴＣ１９６６の抵抗性を取り込んだ系統の種子から害虫の生育阻害作用を有する環状ペプチドを単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次式Ｉ：
【０００６】
【化３】
0003588656.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｒはベンジル基又はイソブチル基を表す。）
で示される環状ペプチドである。
さらに、本発明は、次式ＩＩ：
【０００８】
【化４】
0003588656.tif 000003
【０００９】
で示される環状ペプチドを有効成分として含む豆類の害虫生育阻害剤である。害虫としては、例えばアズキゾウムシが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
１．環状ペプチド
本発明の環状ペプチドは、以下の手法により製造することができる。
まず、感受性品種である大阪リョクトウを反復親としてＴＣ１９６６の抵抗性を取り込んだ抵抗性（Ｒ／Ｒ）系統、例えばＢＣ２０Ｆ４  の種子粉を得る。ここで、ＢＣ２０Ｆ４  とは、ＴＣ１９６６を一回親、大阪リョクトウを反復親として戻し交配と抵抗性の選抜を繰り返して２０回行った後、自殖を３回行って作出した系統である。
【００１１】
なお、本発明において「感受性」とは、アズキゾウムシ等の害虫から食害を受ける又は受けやすい性質をいい、「抵抗性」とは、食害を受けない又は受けにくい性質をいう。
【００１２】
得られた種子粉をアセトン脱脂した後、８０％エタノールで抽出する。次いで、該８０％エタノール抽出物を水−ブタノール２液分配で分画し、ブタノール層及び水層を得、生育阻害活性測定法に従って阻害活性を測定する。阻害活性を認めたブタノール層の画分を減圧乾固後、少量の８０％エタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析する。ＨＰＬＣは、例えば以下の条件により行うことができる。すなわち、４５％アセトニトリル溶液で平衡化した東ソーＯＤＳ８０ＴＭ  カラム（７．８  ×３００  ｍｍ）  に上記試料２５０  μｌを注入し、４５％アセトニトリルで連続溶出し、２２５ｎｍ  の紫外光で溶出ピークを検出する。そして、アズキゾウムシに感受性の大阪リョクトウを対照として同様に調製し、目的の抽出物とクロマトグラムのパターンを比較する。
【００１３】
次に、感受性の大阪リョクトウには認められない特徴的なピークに溶出する物質を量的に多く濃縮するために、該８０％エタノール抽出物を３０％エタノールで平衡化したＣ１８逆相オープンカラム（３０×２５０  ｍｍ）により分画し、非吸着（３０％エタノール溶出）画分と６０％エタノール溶出画分を調製する。阻害活性が認められた６０％溶出画分を濃縮乾固後、少量の８０％エタノールに溶解し、ＨＰＬＣで抵抗性系統に特徴的に認められるピークの溶出液を回収して溶出物質を量的に多く（２５〜３０ｍｇ）純化することにより、本発明の環状ペプチドを調製することができる。
【００１４】
精製された環状ペプチドは、さらに数回に分けて回収したピークに溶出する物質を再びＨＰＬＣで分画することにより高度に純化させることができる。また、精製されたペプチドの化学構造等については、質量分析、ＮＭＲ等の通常使用されている方法により決定することができる。
【００１５】
２．豆類の害虫生育阻害剤
以上のようにして得られた本発明の環状ペプチドを害虫生育阻害剤として使用する場合は、使用する豆類の種類を特に限定しない。例えば、リョクトウ、アズキ、ササゲ、ダイズ等における害虫の生育を阻害することを特異目的として使用することができる。
【００１６】
生育を阻害する対象となる害虫としては、例えばアズキゾウムシ、ヨツモンマメゾウムシ、ホソヘリカメムシ、ハスモンヨトウ等が挙げられる。
生育阻害活性の測定は、人工豆を用いた生物検定法により行う。すなわち、各画分の凍結乾燥粉を大阪リョクトウ粉に０．１  〜２０％加えて良く混合し、少量の水を加えて人工豆を作り、デシケーター内で一晩乾燥する。乾燥人工豆にアズキゾウムシを放虫し、２〜３日産卵させた後、飽和食塩水で湿度７０％にした３０℃の恒温器内に置く。最低１５日経過後、実体顕微鏡下で幼虫の生長を調査し、大阪リョクトウ粉の人工豆（コントロール）での生育との比較により各画分の生育阻害活性を調べる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００１８】
〔実施例１〕  環状ペプチドの調製
大阪リョクトウ（岩手大学から入手）を反復親としてＴＣ１９６６のアズキゾウムシ抵抗性を戻し交配法によって育成することにより、抵抗性系統（Ｒ／Ｒ；  ＢＣ２０Ｆ４  系統）  を作製した。アセトン脱脂した該抵抗性系統の種子粉２００ｇを８０％エタノール５０００ｍｌで抽出し、これをロータリーエバポレーターで減圧濃縮乾固し、少量の水に分散した後、凍結乾燥した。該凍結乾燥物を大阪リョクトウ粉に１０％混合し、少量の水を加えて軽く練った後、小指先の大きさに丸め、デシケーター中に一晩放置して人工豆を得た。
【００１９】
次に、得られた混合物について、以下の方法によりアズキゾウムシ幼虫の生育試験を行った。すなわち、乾燥人工豆にアズキゾウムシを放虫し、２〜３日産卵させた後、飽和食塩水で湿度７０％にした３０℃の恒温器内に置いた。１５日経過後、実体顕微鏡下で幼虫の生長を調査し、大阪リョクトウ粉の人工豆での生育との比較により生育阻害活性を調べた。
【００２０】
なお、対照として、大阪リョクトウの抽出物を１０％混合した混合物を用いて上記と同様に試験を行った。
その結果、前記エタノール抽出物と人工豆との混合物を用いた場合は、アズキゾウムシ幼虫の生育が著しく阻害された（表１，Ｎｏ．４、７等）。一方、大阪リョクトウの抽出物を１０％混合した混合物を用いた場合は生育阻害は認められなかった（表１，Ｎｏ．１）。
【００２１】
そこで、Ｒ／Ｒ系統の８０％エタノール抽出物の濃縮乾固物を３０％エタノール２５０ｍｌに分散し、遠心して少量の沈殿物を除去後、３０％エタノール溶液で平衡化したＣ１８  逆相（Ｂｏｎｄａｐａｋ（登録商標）  ＨＣ１８  ＨＡ  １２５Å、ミリポア社製）オープンカラムにより分画した。
分画条件は、室温で、流速３０〜５０ｍｌ／ｈｒ  で行った。
【００２２】
上記カラムから分画された非吸着（３０％エタノール溶出）画分、及び６０％エタノール溶出画分を調製し、それぞれの調製物について前記と同様にアズキゾウムシ生育阻害活性の試験を行った。
その結果、３０％溶出画分を人工豆に２０％混合しても阻害は認められなかったが（表１，Ｎｏ．９）、６０％エタノール溶出画分に強い阻害活性を認めた（表１，  Ｎｏ．１０）。
【００２３】
【表１】
0003588656.tif 000004
【００２４】
表１中、「ＯＲ」は大阪リョクトウ、「Ｒ／Ｒ」はＢＣ２０Ｆ４  代の抵抗性系統、「抽出物」は種子粉の８０％エタノール抽出・乾燥物を意味する。また、生育結果のうち、「○」は幼虫の生育が良好で羽化に至ったもの、「△」は幼虫の生育が不良で羽化できないもの、「×」は幼虫の生育ができず、１〜２齢で死亡したものを意味する。
【００２５】
次に、８０％エタノール抽出物の水−ブタノール２液分配のブタノール層に阻害活性が濃縮された２液分配のブタノール層に阻害活性を認めたので、本画分を減圧乾固後、少量の８０％エタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（東ソーＯＤＳ  ８０Ｍ  （９．２×２５０ｍｍ），検出２２５ｎｍ）で分析、比較した。
【００２６】
その結果、４５％アセトニトリルでの溶出において、抵抗性系統（Ｒ／Ｒ）は感受性の大阪リョクトウには認められない特徴的な２つのピークを与えた（図１，矢印部分；Ａは大阪リョクトウ、ＢはＢＣ２０Ｆ４  系統のＨＰＬＣパターン）。
抵抗性と感受性とでは２つのピークが明瞭に異なるため、これらのピークに溶出する物質が目的物質であると確信した。
【００２７】
そこで、該２つのピークに溶出する物質を量的に多く（人工豆での生育阻害活性が調査できる程度の量であり、最終物質量としては最低５〜１０ｍｇ程度）、かつ高度に濃縮した。
濃縮方法は、オープンカラムで分画した６０％エタノール溶出画分の減圧濃縮乾固物の８０％エタノール溶解物をＨＰＬＣにより分画し、特徴的な２つのピーク物質を、それぞれ単一のピークになるように純化することにより行った。
【００２８】
その結果、主要ピークに溶出する物質の濃縮物（純化物質）を凍結乾燥物として５０ｍｇ得た。
人工豆に、主要ピークに溶出する物質を０．３〜０．４％混入させ、アズキゾウムシ幼虫の生育阻害試験を前記と同様に行った。
【００２９】
その結果、アズキゾウムシの生育は１〜２齢で完全に阻害された。
以上の結果から、上記主要ピークに溶出する物質がＴＣ１９６６に由来する主要な耐虫性物質と判定し、ＧＩＦ−１とした。
【００３０】
一方、もう一つのピークに溶出する物質（ＧＩＦ−２とする）を０．６〜１．０％混入した人工豆では、アズキゾウムシ幼虫は順調に生育し、羽化に至った。
さらに、ＧＩＦ−１及びＧＩＦ−２をＨＰＬＣで分画することにより完全な単一ピークになるように純化し、質量分析およびＮＭＲ等を用いて化学構造を解析した。
ＮＭＲの結果を表２に、質量分析の結果を表３に示す。
【００３１】
【表２】
0003588656.tif 000005
【００３２】
【表３】
0003588656.tif 000006
【００３３】
その結果、ＧＩＦ−１は芳香族アミノ酸を２個含む３個のアミノ酸（ヒドロキシロイシン、フェニルアラニン及びチロシン）と１個のオキシ酸がアミド結合を形成し環化した構造をもつ下記式ＩＩ：
【００３４】
【化５】
0003588656.tif 000007
【００３５】
で示される環状ペプチドであることがわかった。
また、ＧＩＦ−２は芳香族アミノ酸を１個含む３個のアミノ酸（ロイシン、ヒドロキシロイシン及びチロシン）と１個のオキシ酸がアミド結合を形成し環化した構造をもつ下記式ＩＩＩ：
【００３６】
【化６】
0003588656.tif 000008
【００３７】
で示される環状ペプチドであることがわかった。
なお、上記式ＩＩＩ  で示される環状ペプチドＧＩＦ−２（式ＩにおいてＲがイソブチル基のもの）は、上記式ＩＩで示されるＧＩＦ−１（式ＩにおいてＲがベンジル基のもの）を合成する際の中間体として用いることもできる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、新規環状ペプチドが提供される。本発明の環状ペプチドは豆類の害虫の生育を阻害することができる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１】
0003588656.tif 000011