(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤芽球に分化し得る継代培養可能なヒト株化細胞であって、ヒトパルボウイルスＢ１９をヒト細胞の培養条件下で前記ヒト細胞株に接種した後、培養することによりヒトパルボウイルスＢ１９の感染を許し、ヒトパルボウイウルスＢ１９の増殖が可能な細胞を１０％以上含むことを特徴とするヒト細胞株ＫＵ８１２Ｅｐ６（寄託番号FERM P-16310）。
【請求項２】
請求項１記載のヒト細胞株ＫＵ８１２Ｅｐ６（寄託番号FERM P-16310）に検体を接種した後、培養することを特徴とする検体のヒトパルボウイルスＢ１９の感染価測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトパルボウイルスに感受性を示すヒト細胞株及び該細胞株を用いたヒトパルボウイルスの感染価測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パルボウイルスは、直径約２０ｎｍほどの最小のＤＮＡウイルスで、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ミンク、ヒト等多くの動物に感染することが知られている。この中で、ヒトに病原性を持つヒトパルボウイルスＢ１９（Ｌａｎｃｅｔ，  ｖｏｌ  １，  ｐ１６０−１６１，  １９８４  ）（以下本明細書中においては、Ｂ１９と記載する）はＣｏｓｓａｒｔ  らにより発見され、小児の伝染性紅斑、胎児水腫、溶血性貧血患者では一過性の赤血球造血障害による無形成発作、免疫不全状態の患者では慢性骨髄不全等の原因となることが知られている。また、Ｂ１９はエンベロープを持たないため、変性剤や有機溶媒に対して耐性を示し、輸血や血液製剤を経由して感染する可能性が示唆されている（Ｌａｎｃｅｔ，  Ｖｏｌ  ３４３，  ｐ２１１−２１２，  １９９４  ）。
【０００３】
輸血や血液製剤からの感染を防ぐためには、ＰＣＲ法やレセプター凝集法等を用いたＢ１９の検出が行われているが、感染予防のためには、ウイルスの存在如何よりも、そのウイルスの感染性の測定が重要となる。Ｂ１９に感受性を示す細胞としては、ＪＫ−１（Ａｒｃｈ．ｖｉｒｏｌ．，  Ｖｏｌ  １３１，  ｐ２０１−２０８，  １９９３）、ＭＢ−０２（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  Ｖｏｌ  ６７，  ｐ５６２−５６６，  １９９３  ）、ＵＴ−７（Ｂｌｏｏｄ，  Ｖｏｌ  ７９，  ｐ１８−２４，１９９２  ）等が知られているが、これらの細胞は感受性がそれほど高くないため、Ｂ１９の感染価を測定には用いることができない。Ｂ１９の感染価測定には主にＣＦＵ−ｅ障害試験が応用されているが、ＣＦＵ−ｅ細胞は株化されていないため、試験の度に培養を必要し、操作性の面で問題があった。このような状況において、より簡便なインビトロでの感染価測定法の確立が待ち望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、Ｂ１９に感受性を示す細胞株を提供し、簡便な感染価測定方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の課題を解決すべく、ヒト細胞にＢ１９を感染させる研究を重ねた結果、ヒト慢性前骨髄性白血病より樹立されたＫＵ８１２細胞にＢ１９を感染させることに成功し、該感染細胞を用いたＢ１９の感染価測定を可能にし、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、赤芽球に分化し得る継代培養可能なヒト株化細胞ＫＵ８１２Ｅｐ６であって、ヒトパルボウイルスＢ１９をヒト細胞の培養条件下で前記ヒト細胞株に接種した後、培養することによりヒトパルボウイルスＢ１９の感染を許し、ヒトパルボウイウルスＢ１９の増殖が可能な細胞を１０％以上含むことを特徴とするヒト細胞株を提供する。更に、本発明は、前記ヒト細胞株に検体を接種した後、培養することを含む検体のヒトパルボウイルスＢ１９の感染価測定方法を提供する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本願発明のＢ１９に感受性を示す細胞を樹立するには、ヒトの細胞であればいずれの細胞でも用いることができるが、Ｂ１９が幹細胞から赤血球へ分化する過程の赤芽球段階で感染することから、赤芽球に分化し得る細胞であることが好ましく、具体的にはＫＵ８１２が好ましい。ヒト細胞株ＫＵ８１２は、ヒト慢性前骨髄性白血病より樹立された細胞で、多機能分化性の幼若好塩基球である（Ｍａｓａｋｉ  Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ７３（７），  ｐ２００３−２０１３，  １９８９）。ＫＵ８１２細胞を用いる場合には、分化を促す因子としてエリスロポイエチンを含む培地を用いて限界希釈法にてクローニングすると、Ｂ１９に感受性を示す細胞を効率よく得ることができる。
【０００９】
本発明の樹立細胞を用いるＢ１９の感染価測定は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、Ｂ１９培養液またはＢ１９陽性血清と本発明の樹立細胞とを混合して培養し、Ｂ１９特異抗体を用いた蛍光抗体法にて、感染細胞の有無を確認することで、感染価を測定できるが、本発明の感染価測定方法は、これに限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
【００１１】
実施例１  パルボウイルス感染細胞の作製
理化学研究所より購入したＫＵ８１２細胞を、６ＩＵ／ｍｌエリスロポイエチン（以下本明細書中ではＥＰＯと記載する）及び１０％牛胎児血清（以下本明細書中ではＦＣＳと記載する）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下本明細書中では培地Ａと記載する）を用いて希釈し、９６ウエルプレートに細胞１個／ウエルになるように分注した。３７℃で１週間培養後、成育したウエルから細胞を回収した。同様の方法にて培地Ａで希釈、培養を２回繰り返し、最終的に限界希釈法によりクローニングされたクローンとして１００クローンを得た。
【００１２】
この１００クローンそれぞれを、培地Ａを用いて希釈し、２ｘ１０４  細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。その５０μｌを９６ウエルプレートに分注し、更に、組織培養５０％感染価（以下本明細書中では、ＴＣＩＤ５０と記載する）１０３  ／ｍｌになるよう培地Ａで希釈したヒトパルボウイルス液を各ウエルに５０μｌづつ加え、７日間培養した。培養後、ヒトパルボウイルスに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡＢ８２９２、ケミコンインターナショナル社製）を用いた間接蛍光抗体法で、ヒトパルボウイルス感染細胞を確認した。
【００１３】
間接蛍光抗体法は、培養した細胞をスライドグラスにマウントし、メタノールで固定化後、５００倍希釈したモノクローナル抗体ＭＡＢ８２８２と１時間反応さた。スライドグラスを洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と１時間反応させ、蛍光顕微鏡下で陽性率を確認した。この時の感染効率は１０〜６０％で、クローンにより異なっていた。
【００１４】
この中から、感染効率の高いクローンとしてＫＵ８１２Ｅｐ６株を取得した。尚、ＫＵ８１２Ｅｐ６株は工業技術院生命工学工業研究所微生物寄託センターに寄託され、その寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６３１０である。
【００１５】
実施例２  感染価測定
実施例１で作製したヒトパルボウイルス感染細胞ＫＵ８１２Ｅｐ６を培地Ａで継代培養し、２〜５ｘ１０４  細胞／ｍｌになるよう希釈した。この懸濁液１００μｌを、４８ウエルプレートに分注した。次に、ヒトパルボウイルス感染検体Ａ〜Ｇを１０ｎ  連続希釈し、それぞれ１００μｌを添加後、３７℃で１時間インキュベートした。次ぎに、３００μｌの培地Ａを添加し、５％二酸化炭素ガス下、３７℃で培養を開始した。１週間培養後、細胞を回収し、実施例１と同様の間接蛍光抗体法により、蛍光顕微鏡下で感染が確認される検体の最終希釈濃度を確認した。感染価はリード・ミンチの方法に従ってＴＣＩＤ５０で表示した。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
実施例３  感染価測定系のウイルス不活化試験への応用
ヒトパルボウイルス感染価ＴＣＩＤ５０１０８  ／ｍｌのウイルス液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃の水浴中で３０分間インキュベートした後、残存するウイルス感染価を実施例２の感染価測定の方法に従って実施した。培地Ａで２〜５ｘ１０４  細胞／ｍｌになるよう希釈したヒトパルボウイルス感染細胞ＫＵ８１２Ｅｐ６の懸濁液１００μｌを４８ウエルプレートに分注した。次ぎに、各温度でインキュベートしたウイルス液を１０ｎ連続希釈し、それぞれ１００μｌ添加後、３７℃で１時間インキュベートした。次ぎに、３００μｌの培地Ａを添加し、５％二酸化炭素ガス下、３７℃で培養を開始した。１週間培養後、細胞を回収し、実施例１と同様の間接蛍光抗体法により、蛍光顕微鏡下で感染が確認される検体の最終希釈濃度を確認した。感染価はリード・ミンチの方法に従ってＴＣＩＤ５０で表示した。結果を図１に示す。５０℃３０分の熱処理ではパルボウイルスＢ１９は全く不活化されず、６０℃３０分の熱処理でも感染性は残存した。７０℃３０分の熱処理では感染性は全て失われた。
【００１８】
【発明の効果】
本発明により、Ｂ１９に感受性を示す細胞株を提供し、簡単な感染価測定方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】熱処理によるパルボウイルスＢ１９の不活化を示す図である。
【図１】
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