(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント１；前記ＤＮＡセグメント１の上流に位置し、転写されたＲＮＡの５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント２；および／または、前記ＤＮＡセグメント１の下流に位置し、転写されたＲＮＡの３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント３を含むＤＮＡ構成単位を少なくとも１個含み、ここで、各ＤＮＡ構成単位におけるＤＮＡセグメント１が、ｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入され、かつ、ポリＡテイルが各ＤＮＡ構成単位におけるＤＮＡセグメント１の３’末端近傍であって、少なくともＤＮＡセグメント３の上流に付加されていることを特徴とするベクター。
【請求項２】
ＤＮＡ構成単位を１個または複数個含むものである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
１個または複数個の連続したＤＮＡ構成単位の上流にプロモーターが付加されている、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
１個または複数個の連続したＤＮＡ構成単位の下流にターミネーターが付加されている、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載のベクターを鋳型としてＲＮＡを転写することによって、転写されたＲＮＡの５’末端および／または３’末端がセルフプロセッシングにより切断されて所望のＲＮＡが得られることを特徴とする、ＲＮＡの製造法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載のベクターにより形質転換された動物細胞、植物細胞、または微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規ベクター、それを用いたＲＮＡの製造法、およびそれにより形質転換された動物細胞、植物細胞、または微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、すべての酵素はタンパク質から構成されていると確信されていたが、１９８１年に酵素活性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見され、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。
この画期的発見はコロラド大学のチェック（Ｔ．Ｃｅｃｈ）らによってもたらされた。すなわち、原生動物のテトラヒメナのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体においては、機能上不必要なイントロン（ＩＶＳ）がタンパク質酵素の力を借りずに、セルフスプライシングにより取り除かれることが証明された（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．３１，ｐ．１４７−１５７（１９８２）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３０８，  ｐ．８２０−８２５  （１９８４））。
【０００３】
その後、例えばホスホジエステル結合をセルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と発見された。また、他のＲＮＡ分子を切断するＲＮＡ分子（リボザイム）も見出されている。
最近このような中で、ハセロフ（Ｊ．Ｈａｓｅｌｏｆｆ）とジャーラック（Ｗ．Ｌ．  Ｇｅｒｌａｃｈ）は、数種の植物病原性ウイルスのサテライトウイルスのリボザイムの間で共通に保持されている塩基配列に着目し、わずか２４塩基で構成された短鎖リボザイムを遺伝子操作技術を用いて構築し、人工リボザイムの作出に成功した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３３４，  ｐ．５８５−５９１  （１９８８）；特願平３−５０２６３８号）  。大塚らは非自己のＲＮＡ分子の切断を触媒する短鎖リボザイムを化学合成で調製した（特願平２−１９５８８３号）。
【０００４】
図１はこの短鎖リボザイムの構造と作用部位を示すもので、当該人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合部位Ｃと、２４個の特定の塩基配列を有するＢ（触媒活性部位を含む）から構成されており、基質として示された標的ＲＮＡはＡ（ＧＵＣ）部分に隣接する位置で切断を受ける（図中、矢印で示す）。
【０００５】
なお、このＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣのみに限定されるものではなく、他の配列に変更することも可能である。
そして、このハセロフ（Ｊ．Ｈａｓｅｌｏｆｆ）らの人工リボザイムの構築において用いられた手法は、上記のリボザイムの設計に基づいてリボザイムＲＮＡと相補塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成してプラスミドに挿入し、さらにこの組み換えプラスミドを形質転換して得られたクローンを適当な制限酵素で切断して、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得、これを鋳型としてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で転写することにより人工リボザイムを得るものであった。かかる手法の実施においては標的ＲＮＡの結合部位の塩基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、この３種のリボザイムがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置で切断することを明らかにしている。
【０００６】
リボザイムは基質特異性が高く、標的部位の数塩基の違いも認識することができる。ベネット（Ｍ．Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔ）らは、リボザイムを用いて４つのアイソザイム遺伝子より構成されるマメのグルタミンシンセテースｍＲＮＡの切断実験を行い、４つのうち１つの遺伝子由来のｍＲＮＡを標的とするよう設計したリボザイムが、塩基配列がよく似た他のアイソザイム遺伝子由来のｍＲＮＡは切断しないことを報告している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３１−８３７（１９９２））。
【０００７】
リボザイムのこれらの性質を利用して、リボザイムを薬剤、特に、抗ＲＮＡウイルス剤として応用しようという試みがなされている。ロッシー（Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ）らは、リボザイムを用いてヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）を切断をすることに成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２４７，  ｐ．１２２２−１２２４（１９９０））  。彼らはＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子中のＧＵＣの３’側を切断するリボザイムを設計し、これをコードするＤＮＡをヒトβ−アクチンプロモーターの下流に連結し、ＣＤ４を有するヒーラ細胞に形質転換した。この形質転換体にＨＩＶ−１を感染させ、ポリメラーゼ伸長反応により正常なｇａｇＲＮＡが顕著に減少していることを確認した。
【０００８】
ところが、リボザイムの基質特異性が高いということは、逆の見方をすると、リボザイムの認識部位に塩基置換や欠損等の変異が生じると、もはや当該リボザイムはこれを基質とすることができずに、切断できないことになってしまう。そのため、塩基配列が頻繁に変化するウィルス由来のＲＮＡ、例えば、前述の塩基配列の変化速度が早いことが知られているＨＩＶ−１では、永続的に作用するリボザイムを設計することは困難である。
【０００９】
これを解決する方法の一つとして、標的ＲＮＡの多数の作用部位に多種類のリボザイムを同時に作用させることが考えられ得る。
一ヵ所の標的部位が変異を起こしたとしても、他の標的部位が同時に変異を起こす確率はかなり低いであろうし、標的部位として、そのＲＮＡが機能するのに重要な部位を選択しておけば、変異を起こした場合そのＲＮＡは、もはや機能することができなくなってしまう。
【００１０】
一方、リボザイムと同様のものにアンチセンスＲＮＡがある。これは、標的ＲＮＡを相補する塩基配列を有するＲＮＡで、標的ＲＮＡあるいは標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖と２本鎖を形成することで標的ＲＮＡの転写あるいは、標的ＲＮＡが機能することを阻止するものである。その作用機構は、非常に複雑で、標的ＲＮＡの転写阻害、スプライシング阻害、翻訳阻害、あるいは標的ＲＮＡと２本鎖を形成することにより、ＲＮａｓｅ  による分解を誘導する等が報告されている（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｅｄｓ．  Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｈｏｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１））。
【００１１】
アンチセンスＲＮＡもリボザイム同様、抗ＲＮＡウイルス剤等の薬剤としての応用が試みられている。ハン（Ｌ．Ｈａｎ）らは、マウス白血病ウイルスのパッケージングに必須なウイルス遺伝子の配列に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作成し、これが白血病ウイルスに曝されても全く発病しないことを示した（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  Ｖｏｌ．８８  ，ｐ．４３１３−４３１７（１９９２））。
【００１２】
アンチセンスＲＮＡの場合も、リボザイム同様基質特異性が高い。そのため、前述のリボザイムと同様に、標的ＲＮＡにかかわる問題をはらんでいることが当該分野で知られている。リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する方法として、化学的方法；酵素法；また、あるいは遺伝子組み換え法で合成したものを生体外部から入れる方法；遺伝子組み換え法、すなわちリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだものを、適当なベクターに挿入し、これを生体内に導入することにより、生体内でリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生する方法が知られている。前者の化学的方法は、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの効果を持続させるためには、頻繁にリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に注入し、十分な濃度を維持する必要がある。
【００１３】
これに対して、後者の遺伝子組み換え法は生体内で絶えずリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを産生し続けることができるため、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを注入し続ける等の問題点を解決することができる。
ところで、多種類のリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体内に供給する場合、それぞれのリボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡを生体外で前述のように合成し、生体外から供給することは可能であるが、組み換え遺伝子法によりこれを行うことは、多種の遺伝子を生体内に導入するのと同じことであり、この技術は非常に困難であることが当該分野で知られている。
【００１４】
リボザイムに関しては、唯一、チェン（Ｃｈｅｎ）  らは多種のリボザイムを一度に作用させるものとして、一つのプロモーターの下流に多種のリボザイムを幾つも連結し、一分子中に多種のリボザイム活性部位をもつものとして考案した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２０，ｐ４５８１−４５８９（１９９２））  。しかし、このような構築物は一分子中に相補的な配列を多く含み、それらの干渉作用により必ずしもリボザイム活性が高いとはいえない。このことは、連結するリボザイム活性部位が多くなるほど顕著であると考えられる（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９０，  ｐｐ．１１３０２−１１３０６  （１９９３））。
【００１５】
さらに、リボザイムあるいはアンチセンスＲＮＡの様な特定のＲＮＡ転写物をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）  で得ようとする場合、従来法においては、所望のＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写する際に、当該ＤＮＡにより組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断してから転写するという余分の手間を要するものであった（ラン・オフ法と呼ばれている）。
【００１６】
この理由は、当該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡを転写する場合に必然的に生ずる、５’末端側と３’末端側における余分な塩基配列を可能な限り転写させないようにするためである。すなわち、５’末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡを連結させることによって処理されていたが、３’末端側の処理は、ＲＮＡの転写において未だユニバーサルなターミネータが見い出されておらず、当該３’末端側の処理に際して制限酵素を使用するいわゆるランオフ法を採らざるを得なかった（図２）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の制限酵素を使用する従来の方法は、制限酵素を使用するという余分の手間に加えて、転写において切断された線状のＤＮＡを使用する必要があるため、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）では、ＲＮＡを合成することが可能であるが、生体内において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む組み換えベクターを保持、増殖せしめつつＲＮＡ転写物を産生させることができないという欠点を有していた。さらに、５’末端側の処理においてプロモーターのすぐ下流に所望のＲＮＡに対応するＤＮＡを連結したとしても、転写開始点から所望のＲＮＡに対応するＤＮＡまでの間の余分な塩基配列が付加してしまうということを避けることができなかった（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１９，  ｐｐ．５１５２−５１３０  （１９９１））  。
【００１８】
従って、本発明は、環状のまま用いても、５’末端および３’末端に余分な塩基配列が付加されていない所望のＲＮＡを製造することができ、従って、試験管内のみならず、生体内においても、保持、増殖しつつ、所望のＲＮＡを産生することができるベクターを提供することを目的とする。また、本発明は、上記のようなベクターを用いて所望のＲＮＡを製造する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、上記のようなベクターにより形質転換された動物細胞、植物、または微生物を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、所望のＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントの上流および下流に、それぞれ、転写されたＲＮＡの５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントおよび転写されたＲＮＡの３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを配置したベクターを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は次の（１）から（３）を要旨とするものである。
（１）    所望のＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント１；前記ＤＮＡセグメント１の上流に位置し、転写されたＲＮＡの５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント２；および／または、前記ＤＮＡセグメント１の下流に位置し、転写されたＲＮＡの３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント３を含むＤＮＡ構成単位を少なくとも１個含むことを特徴とする動物細胞用ベクター。
（２）    上記のベクターを鋳型としてＲＮＡを転写することによって、転写されたＲＮＡの５’末端および３’末端がセルフプロセッシングにより切断されて所望のＲＮＡが得られることを特徴とする、ＲＮＡの製造法。
（３）    上記のベクターにより形質転換された動物細胞、植物細胞、または微生物。
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のベクターの構築において用いられる、ＤＮＡセグメント１は、所望のＲＮＡをコードするものであればよく、これには、トランス作用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、ＲＮＡウィルスのＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、種々のｍＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、アプタマーをコードするＤＮＡセグメント、タンパク結合性ＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント等が含まれるが、これらに限定されることはない。上記のトランス作用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントは、リボザイムＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分と、その両端の該リボザイムＲＮＡの基質ＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とを含む。かかるトランス作用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントとしては、酵母の凝集性に関するＳＦＬ１遺伝子由来のｍＲＮＡを切断し得るリボザイムＲＮＡ（以下、「ＳＦＬ１用リボザイムＲＮＡ」という。）をコードするＤＮＡセグメント、ＨＩＶ−１  の遺伝子に由来するｍＲＮＡの５’末端側Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ配列を切断し得るリボザイムＲＮＡ（以下、「ＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡ」という。）をコードするＤＮＡセグメント、ＨＩＶ−１  のｔａｔ  遺伝子由来のｍＲＮＡ切断し得るリボザイムＲＮＡ（以下、「ｔａｔ  用リボザイムＲＮＡ」という。）をコードするＤＮＡセグメント、ＨＩＶ−１  のｔａｔ３遺伝子由来のｍＲＮＡ切断し得るリボザイムＲＮＡ（以下、「ｔａｔ３用リボザイムＲＮＡ」という。）をコードするＤＮＡセグメント、ＨＩＶ−１  のｇａｇ  遺伝子由来のｍＲＮＡを切断し得るリボザイムＲＮＡ（以下、「ｇａｇ  用リボザイムＲＮＡ」という。）をコードするＤＮＡセグメントを挙げることができる。また、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントとしては、ＲＮＡ  ファージＳＰのＡ２ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント等を、ＲＮＡウィルスのＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントとしては、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）  のゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント等を、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素のｍＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント等を、アプタマーをコードするＤＮＡセグメントとしては、ＨＩＶ  由来のプロテアーゼに結合するアプタマーをコードするＤＮＡセグメント等を、タンパク結合性ＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントとしては、ＨＩＶ  由来のＴａｔ  やＲｅｖ  が結合するＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントなどを挙げることができる。
【００２２】
ＤＮＡセグメント２は、本発明のベクターを鋳型として転写されたＲＮＡの５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分と、その両端の基質ＲＮＡ（すなわち、本発明のベクターを鋳型として転写されたＲＮＡ）の５’末端の切断部位を認識する結合部位をコードする部分を含む。このＤＮＡセグメント２は、ＤＮＡセグメント１の５’上流側に連結される。ＤＮＡセグメント２の具体例としては、図３に５’端処理用リボザイムとして示したものを挙げることができる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  Ｖｏｌ．１８６，  ｐｐ．１２７１−１２７９  （１９９２）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９０，  ｐｐ．１１３０２−１１３０６  （１９９３））。但し、このＤＮＡセグメント２の配列は、セルフプロセッシングできるリボザイムである限り、他のどのような配列でもよい（ＢＩＯ  ｍｅｄｉｃａ，  Ｖｏｌ．７，  ｐｐ．８９−９４  （１９９２））  。リボザイム自身もハンマーヘッド型リボザイムに限定するものではなく、セルフプロセッシングを行う他のリボザイム（例えば、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、テトラヒメナ由来のリボザイムなど）でもよい（Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．１２２，  ｐｐ．８５−９０  （１９９２））  。
【００２３】
ＤＮＡセグメント３は、本発明のベクターを鋳型として転写されたＲＮＡの３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分と、その両端の基質ＲＮＡ（すなわち、本発明のベクターを鋳型として転写されたＲＮＡ）の３’末端側の切断部位を認識する結合部位をコードする部分を含む。このＤＮＡセグメント３は、ＤＮＡセグメント１の３’下流側に連結される。ＤＮＡセグメント３の具体例としては、図３に３’端処理用リボザイムとして示したものを挙げることができる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  Ｖｏｌ．１８６，  ｐｐ．１２７１−１２７９  （１９９２）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９０，  ｐｐ．１１３０２−１１３０６  （１９９３））。但し、このＤＮＡセグメント３の配列は、セルフプロセッシングできるリボザイムである限り、他のどのような配列でもよい（ＢＩＯ  ｍｅｄｉｃａ，  Ｖｏｌ．７，  ｐｐ．８９−９４  （１９９２））  。リボザイム自身もハンマーヘッド型リボザイムに限定するものではなく、セルフプロセッシングを行う他のリボザイム（例えば、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、テトラヒメナ由来のリボザイムなど）でもよい（Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．１２２，  ｐｐ．８５−９０  （１９９２））  。
【００２４】
本発明のベクターは、ＤＮＡセグメント１の上流にＤＮＡセグメント２を、下流にＤＮＡセグメント３を連結したＤＮＡ構成単位を動物細胞用ベクターに挿入することによって、構築することができる。このように構築されたベクターを鋳型としてＲＮＡを転写させると、ＤＮＡセグメント２がコードするリボザイムＲＮＡ（５’末端を切断する）およびＤＮＡセグメント３がコードするリボザイムＲＮＡ（３’末端を切断する）が発現して、転写されたＲＮＡの５’末端および３’末端がセルフプロセッシングにより切断され、余分の塩基配列を有しない所望のＲＮＡが得られる。動物細胞用ベクターとしては、例えば、ｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，  Ｎｏ．２９，  ｐｐ．１２１−１２２  （１９９３）；  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２０，  ｐｐ．２７−３２  （国際医学出版社），  （１９９０））、ｐＳＶＫ３  （Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．７０，  ｐ．３１３  （１９８８））、植物細胞用ベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１  （ＥＭＢＯ  Ｊ．，  Ｖｏｌ．６，  ｐ．３９０１  （１９８７））、微生物用ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９  （Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．１，  ｐ．１０３  （１９８５））  などを挙げることができる。
【００２５】
上記のＤＮＡ構成単位において、生体内での安定化を図るために、ＤＮＡセグメント１をｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入したり、ポリＡテイルまたはポリＡ付加シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）をＤＮＡセグメント１の３’末端近傍であって、少なくともＤＮＡセグメント３の上流に付加したり、制限酵素切断部位を所望の位置に挿入したり、ＤＮＡセグメント１を安定なｍＲＮＡの内部に挿入したり、リボザイム反応を利用してサーキュラーな転写物が得られるようなＤＮＡ配列の内部にＤＮＡセグメント１を挿入したりしてもよい。
【００２６】
所望により、上記のようなＤＮＡ構成単位を複数個連結した動物細胞用ベクターを構築してもよい。このようなベクターは、例えば、所望のＤＮＡ構成単位をリガーゼを用いて動物細胞用ベクターに連結する操作を繰り返すことにより得られる。連結するＤＮＡ構成単位は、同じものでも、異なるものであってもよい。ＤＮＡ構成単位は１００個程度連結することができるが、１乃至１０個程度連結することが好ましい。ＤＮＡセグメント１が同一のＲＮＡをコードしているＤＮＡ構成単位を複数個連結したベクターを鋳型としてＲＮＡの転写を行えば、高い生産効率で同一の所望のＲＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡセグメント１が異なるＲＮＡをコードしているＤＮＡ構成単位を１個または複数個連結したベクターを鋳型としてＲＮＡの転写を行えば、目的とする異なるＲＮＡを一度に得ることができる。例えば、ＤＮＡセグメント１として、種々のリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡや種々のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを選択して、１個または複数個の連続したＤＮＡ構成単位からなるベクターを鋳型としてＲＮＡの転写を行えば、種々のリボザイムＲＮＡや種々のアンチセンスＲＮＡを一度に得ることができるので、このようなベクターは、ＲＮＡの塩基配列が変化しやすいウィルスや癌細胞を標的とする薬剤として有効に使用することができる。
【００２７】
さらに、１個または複数個の連続したＤＮＡ構成単位の上流にプロモーターを、下流にターミネーターを付加することが望ましい。これにより、ＲＮＡの転写効率が高まり、また、ＲＮＡ転写物のサイジングを確実に行うことが可能となる。プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６  プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ  プロモーター等を挙げることができる。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ＳＶ４０ターミネーター、ＮＯＳ  ターミネーター等を挙げることができるが、用いるプロモーターに対応するものが好ましい。
【００２８】
本発明のベクターの構築において、ＤＮＡセグメント１としてトランス作用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントやアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを選択すれば、本発明のベクターを鋳型として、トランス作用リボザイムＲＮＡやアンチセンスＲＮＡが効率良く転写される。従って、このようなベクターを当該する細胞用のプロモーターおよびターミネーターに連結すると、抗ＲＮＡウィルス剤あるいは抗癌剤として、医薬、動物薬、農薬に利用することができる。また、本発明のベクターを、イン・ビトロで利用することにより、５’端と３’端がきちんとそろったＲＮＡ転写物を得ることが可能であり、純度の高い試薬（例えば、Ｃ型肝炎ウィルス等の感染を検出するための診断薬としてのＲＮＡプローブ）として利用することもできる。
【００２９】
本発明のベクターを用いてＲＮＡの転写を各種細胞内で行う場合には、当該する細胞用のプロモーターとターミネーターに該ベクターを連結し、当該する細胞を形質転換し、薬剤耐性マーカー等により形質転換体を選抜し、それらを培養することにより所望のＲＮＡを製造させることができる。本発明の動物系に改変したベクターにより形質転換できる動物細胞としては、ＳＷ４８０  細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｍｏｌｔ４  細胞、ＣＯＳ  細胞、３Ｙ１  細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等を挙げることができ、植物系に改変したベクターにより形質転換できる植物細胞としては、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）  細胞、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｕｃｕｌｅｎｔｕｍ）細胞、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）細胞等を挙げることができ、微生物系に改変したベクターにより形質転換できる微生物としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、カビ等が挙げられる。
【００３０】
動物系に改変したベクターによる動物細胞の形質転換は、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．５２，  ｐ．４５６  （１９７３））、エレクトロポーレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１３１１  （１９８７））  、リポフェクチン法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｎｕｔｒ．，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．１７５  （１９８９））、ウィルスを介した方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，  ｐ．３４，  Ｍａｒｃｈ  （１９９４））  などにより行うことができ、植物系に改変したベクターによる植物細胞の形質転換は、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３１９，  ｐ．７９１  （１９８６））  、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．２７１７  （１９８４））  、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．８５，  ｐ．８５０２  （１９８８））  、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１２，  ｐ．８７１１  （１９８４））等により行うことができ、微生物系に改変したベクターによる微生物細胞の形質転換は、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、ファージを介した方法（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）  等により行うことができる。
【００３１】
以上の点を図面を用いて更に具体的に説明する。但し、図３、４、５、９、１０、１１および１２に示されている塩基配列は、組換えプラスミドのセンス鎖のものであることに留意されたい。
図３はＳＦＬ１用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを含む組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３の構造を表すものである。ｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３はｐＧＥＮＥ  ８４５９（多比良ら、特願平１−３２９８３１及び、Ｋ．Ｔａｉｒａ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，  ７３３−７３７（１９９０））  のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片を取り除き、この代わりに、常法により化学合成した新たなＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片（図３のｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３のＥｃｏＲＩサイトからＳａｃＩサイトに相当する）を挿入したものである。
【００３２】
当該プラスミドは、５’→３’の方向に、  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される５’端切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント；ＳＦＬ１ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分からなるＳＦＬ１用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント；および転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される３’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを有している。
【００３３】
そして、上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位をコードするＤＮＡ配列は、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する（図３中、★で示してある。）。
図４は、ＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを含む組み換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  の構造を表すものである。ｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  は、図３に示すｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を取り除き、この代わりに、図６のＡ〜Ｄに示した合成ＤＮＡリンカーを挿入したものである。
【００３４】
図９は、ＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡを産生する本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  の構造を表すものである。このプラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  は、ヒト細胞用発現ベクターｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢ  （Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ２０，  ｐｐ．２７−３２  （国際医学出版社），  （１９９０））のＥｃｏＲＩ（３３００）／ＮｏｔＩ断片を取り除き、この代わりに、図４に示すｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を挿入したものである。
【００３５】
該プラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  は、５’→３’の方向に、ＳＲαプロモーター；動物細胞中で転写させるためのプロモーター；  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される５’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント２）；ポリＡテイルおよびＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入された状態にある（Ｃｏｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ８，  ３８６１−３８６６  （１９８９））、ＬＴＲ  ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分とからなるＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント１）；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される３’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント３）；およびＳＶ４０のポリＡシグナルをコードするＤＮＡセグメントを有している。
【００３６】
そして、上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位をコードするＤＮＡ配列より転写されたＲＮＡは、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する（図９中、★で示してある。）。
当該プラスミドは、動物細胞においては、転写がＳＲαプロモータの下流から始まり、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡセグメント、５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、ＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、及び３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントが順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した５’末端及び３’末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされる。
【００３７】
従って、この図９の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより、ポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態にある、ＬＴＲ  用リボザイムＲＮＡ（図７のＡに示す。）が得られる。このリボザイムＲＮＡは、メチオニンｔＲＮＡのヘアピン構造およびポリＡテイルで保護されているため、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有する。
【００３８】
図５は、ｔａｔ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを含む組み換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔの構造を表すものである。ｐＶ３ＴＡ−ｔａｔは、図４に示すｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  のＡｐａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を取り除き、この代わりに、図６のＥに示した合成ＤＮＡリンカーを挿入したものである。
【００３９】
図１０は、ｔａｔ  用リボザイムＲＮＡを産生する本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｔａｔ  の構造を表すものである。これは、ヒト細胞用発現ベクターｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢ  （Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２０，  ｐ．２７  （１９９０））  のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（３３００）断片を取り除き、この代わりに、図５に示すｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を挿入したものである。
【００４０】
該プラスミドｐＭＥ−ｔａｔ  は、５’→３’の方向に、ＳＲαプロモーター；動物細胞中で転写させるためのプロモーター；  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される５’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント２）；ポリＡテイルおよびＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入された状態にある、ｔａｔ  ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分とからなるｔａｔ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント１）；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される３’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント３）；およびＳＶ４０のポリＡシグナルをコードするＤＮＡセグメントを有している。
【００４１】
そして、上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位をコードするＤＮＡ配列より転写されたＲＮＡは、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する（図１０中、★で示してある。）。
【００４２】
当該プラスミドは、動物細胞中においては、転写がＳＲαプロモータの下流から始まり、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡセグメント、５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、ｔａｔ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、及び３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントが順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した５’末端及び３’末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされる。
【００４３】
従って、この図１０の組み換えプラスミドを鋳型として転写することにより、ポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態にある、ｔａｔ  用リボザイムＲＮＡ（図７のＢに示す。）が得られる。このリボザイムＲＮＡは、メチオニンｔＲＮＡのヘアピン構造およびポリＡテイルで保護されているため、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有する。
【００４４】
図１１は、ＨＩＶ−１  のｔａｔ３用リボザイムＲＮＡを産生する本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｔａｔ３の構造を表すものである。これは、図５に示すプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  のＡｐａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を図８に示すｔａｔ３リンカーと置換した後、該プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を得、ヒト細胞用発現ベクターｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢ  のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（３３００）断片を取り除き、この代わりに、前記のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を挿入したものである。
【００４５】
該プラスミドｐＭＥ−ｔａｔ３は、５’→３’の方向に、ＳＲαプロモーター；動物細胞中で転写させるためのプロモーター；  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される５’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント２）；ポリＡテイルおよびＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入された状態にある、ｔａｔ３  ｍＲＮＡ  の切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分とからなるｔａｔ３用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント１）；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される３’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント３）；およびＳＶ４０のポリＡシグナルをコードするＤＮＡセグメントを有している。
【００４６】
そして、上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位をコードするＤＮＡ配列より転写されたＲＮＡは、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する（図１１中、★で示してある。）。
【００４７】
当該プラスミドは、動物細胞中においては、転写がＳＲαプロモータの下流から始まり、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡセグメント、５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、ｔａｔ３用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、及び３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントが順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した５’末端及び３’末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされる。
【００４８】
従って、この図１１の組換えプラスミドを鋳型として転写することにより、ポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態にある、ｔａｔ３用リボザイムＲＮＡ（図７のＣに示す。）が得られる。このリボザイムＲＮＡは、メチオニンｔＲＮＡのヘアピン構造およびポリＡテイルで保護されているため、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有する。
【００４９】
図１２は、ＨＩＶ−１  のｇａｇ  用リボザイムＲＮＡを産生する本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｇａｇ  の構造を表すものである。これは、図５に示すプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  のＡｐａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を図８に示すｇａｇ  リンカーと置換した後、該プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を得、図９に示すヒト細胞用発現ベクターｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢ  のＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（３３００）断片を取り除き、この代わりに、前記のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を挿入したものである。
【００５０】
該プラスミドｐＭＥ−ｇａｇ  は、５’→３’の方向に、ＳＲαプロモーター；動物細胞中で転写させるためのプロモーター；  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される５’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント２）；ポリＡテイルおよびＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントにおけるアンチコドンをコードする部位に挿入された状態にある、ｇａｇ  ｍＲＮＡの切断部位を認識する結合部位をコードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部分とからなるｇａｇ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント１）；転写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断される３’端切断部位と、この切断を行うループ状の触媒活性部位、及び上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位からなるリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメント３）；およびＳＶ４０のポリＡシグナルをコードするＤＮＡセグメントを有している。
【００５１】
そして、上記セルフプロセッシングの切断部位を認識する結合部位をコードするＤＮＡ配列より転写されたＲＮＡは、切断部位直前にある一つの塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩基対を形成する（図１２中、★で示してある。）。
【００５２】
当該プラスミドは、動物細胞中においては、転写がＳＲαプロモータの下流から始まり、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡセグメント、５’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、ｇａｇ  用リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメント、及び３’末端をセルフプロセッシングにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントが順次ＲＮＡに転写される。そして、転写されたＲＮＡは前記した５’末端及び３’末端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプロセッシングされる。
【００５３】
従って、この図１２の組換えプラスミドを鋳型として転写することにより、ポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態にある、ｇａｇ  用リボザイムＲＮＡ（図７のＣに示す。）が得られる。このリボザイムＲＮＡは、メチオニンｔＲＮＡのヘアピン構造およびポリＡテイルで保護されているため、生体内におけるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有する。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、これらの実施例により本発明の範囲が限定されるものではない。
【００５５】
〔実施例１〕    組換えベクターｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３の構築
図３に示すｐＧＥＮＥ８４５９ｖ３  の構造のうち、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片に相当するＤＮＡ断片を多比良ら（特願平１−３２９８３１号；Ｔａｉｒａ  Ｋ．，  Ｏｄａ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｎｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｋ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，  ７３３−７３７（１９９０））の方法に従って、調製した。すなわち、上記ＤＮＡ断片を構成する二本鎖ＤＮＡの各鎖を化学合成し、各鎖の５’末端をリン酸化した後、両鎖を混合し、アニールして二本鎖ＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片１００ｐｍｏｌ  を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで前もって切断しておいた組換えプラスミドｐＧＥＮＥ８４５９  （多比良ら、特願平１−３２９８３１号；Ｔａｉｒａ  Ｋ．，  Ｏｄａ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｎｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｋ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，  ７３３−７３７（１９９０））に、林等の方法（１）Ｈａｙａｓｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｚａｗａ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｏｂａｙａｓｈｉ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，３２６１−３２７１（１９８５）および２）Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｚａｗａ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｏｋａ，Ｎ．  ａｎｄ  Ｏｂａｙａｓｈｉ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，７９７９−７９９２（１９８５））  に従って連結した。
【００５６】
この溶液を用いて大腸菌ＭＶ１１８４株（宝酒造から入手）を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、挿入された断片中のＸｈｏＩサイトを利用してポジティブなクローンを選択して、プラスミドｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３を得た。ｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３の構造を図３に示す。このｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７０Ａ）を用いて確認した。
【００５７】
〔実施例２〕    組換えベクターｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲの構築
図６のＡに示す合成ＤＮＡリンカー（配列番号１および２、図４に示すｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲの構造のうち、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片に相当する）を多比良ら（前記）に記載の方法に従って、調製した。このＤＮＡ断片を、前述の林等の方法に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで前もって切断しておいた図３に示す組換えプラスミドｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３に連結し、これで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換した。コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、前記のＤＮＡ断片が挿入されたことによりｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３のＫｐｎＩサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００５８】
こうして得られたプラスミド０．５μｇを制限酵素ＸｈｏＩとＳａｌＩで処理し、多比良ら（前記）の方法に従って調製して連結した図６のＢ（配列番号３および４）および図６のＣ（配列番号５および６）に示す合成ＤＮＡリンカー２μｇを、前述の林等の方法に従い、連結した。これで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、上記のＤＮＡ断片が挿入されたことにより  ＢａｍＨＩサイトが消失したことと、ＡｐａＩサイト、ＥｃｏＲＶ  サイトが生じたことを利用してポジティブなクローンを選択した。
【００５９】
さらに、こうして得られた組換えプラスミド  ０．５μｇを制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、多比良ら（前記）の方法で調製した図６のＤに示す合成ＤＮＡリンカー（配列番号７および８）を前述の林等の方法で連結した。これで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、断片が挿入されたことによりＳａｌＩサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択して、プラスミドｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  を得た。ｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  の構造を図４に示す。ｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ  の塩基配列をＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７０Ａ）を用いて確認した。
【００６０】
〔実施例３〕    組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔの構築
図６のＥに示す合成ＤＮＡリンカー（配列番号９および１０、図５に示すｐＶ３ＴＡ−ｔａｔの構造のうち、ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＶ断片に相当するＤＮＡ断片）を多比良ら（特願平１−３２９８３１号；Ｔａｉｒａ  Ｋ．，  Ｏｄａ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｎｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｍａｅｄａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｋ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，  ７３３−７３７（１９９０））の方法に従って、調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＡｐａＩとＥｃｏＲＶで処理した図４の組換えベクターｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲに、前述の林らの方法に従って連結した。これで大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、ＤＮＡ断片が挿入されたことをＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製３７０Ａ）を用いて塩基配列を確認することにより、ポジティブなクローンを選択して、プラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  を得た。ｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  の構造を図５に示す。
【００６１】
〔実施例４〕    組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−５’の構築
図５に示したｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  を制限酵素ＸｂａＩおよびＳｐｈＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡ  ポリメラーゼ処理により平滑化した後、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼにより自己閉環させ、これを大腸菌ＭＶ１１８４に形質転換した。
【００６２】
コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、ＸｂａＩ−ＳｐｈＩ  断片欠失によるＫｐｎＩサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択し、ｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−５’を得た。さらに、得られたｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−５’をＨｉｎｄＩＩＩ  で処理したものを鋳型にＴ７ＲＮＡ  ポリメラーゼ反応系に供し、５’末端をセルフプロセッシングするリボザイムのみが機能していること、および、その結果５’端切断部位より下流の領域の転写物が生産されることの確認を行った。
【００６３】
〔実施例５〕    組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−３’の構築
図５に示したｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ  を制限酵素ＳｍａＩおよびＳａｃＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡ  ポリメラーゼ処理により平滑化した後、Ｔ４ＤＮＡ  リガーゼにより自己閉環させ、これを大腸菌ＭＶ１１８４に形質転換した。
【００６４】
コロニーを形成させた後プラスミドを取り出し、ＳｍａＩ−ＳａｃＩ  断片欠失によるＸｈｏＩサイトが消失したことを利用してポジティブなクローンを選択し、ｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−３’を得た。さらに、得られたｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ−３’を鋳型にＴ７ＲＮＡ  ポリメラーゼ反応系に供し、３’末端をセルフプロセッシングするリボザイムのみが機能していること、および、その結果３’端切断部位より上流の領域の転写物が生産されることの確認を行った。
【００６５】
〔実施例６〕組換えプラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  、ｐＭＥ−ｔａｔ  、ｐＭＥ−ｔａｔ３および  ｐＭＥ−ｇａｇの構築
リボザイム発現プラスミド  ｐＶ３ＴＡ  −  ＬＴＲ、  ｐＶ３ＴＡ  −  ｔａｔ、ｐＶ３ＴＡ  −  ｔａｔ  の  ＡｐａＩ  ／  ＥｃｏＲＶ  断片を図８に示すｔａｔ  ３  リンカー（配列番号１１および１２）と置換したｐＶ３ＴＡ  −  ｔａｔ  ３  、ｐＶ３ＴＡ  −  ｔａｔ  の  ＡｐａＩ  ／  ＥｃｏＲＶ  断片を図８に示すｇａｇ  リンカー（配列番号１３および１４）と置換した  ｐＶ３ＴＡ  −  ｇａｇを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した後、Ｋｌｅｎｅｗ  ｆｌａｇｍｅｎｔ  で平滑化した。その後、ＥｃｏＲ  Ｉで処理した後、アガロースゲル電気泳動法によりＥｃｏＲ  Ｉ  ／  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  断片を分離した。
【００６６】
前述したヒト細胞用発現ベクター  ｐＭＥ１８−２２６ＨｙｇＢをＮｏｔ  Ｉ  で切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｌａｇｍｅｎｔ  で平滑化し、その後  ＥｃｏＲ  Ｉで部分切断を行い、ＥｃｏＲ  １  （３３００  ）部位のみが切断されたものをアガローズゲル電気泳動法により分離した。
このＥｃｏＲ  Ｉ  ／  Ｎｏｔ  Ｉ間に先に調製した  ＥｃｏＲ  Ｉ  ／  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片をそれぞれ挿入し、ヒト細胞用リボザイム発現プラスミドｐＭＥ  −  ＬＴＲ  ，  ｐＭＥ  −  ｇａｇ  ，  ｐＭＥ  −  ｔａｔおよびｐＭＥ  −  ｔａｔ  ３  を得た。ｐＭＥ−ＬＴＲ  、ｐＭＥ−ｔａｔ  、  ｐＭＥ−ｔａｔ３  および  ｐＭＥ−ｇａｇの構造を、それぞれ、図９〜１２に示す。
これらを改変リゾチーム．トライトン法（  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ，  Ｖｏｌ．  ７  ，  ｐ．  ２７４５  −  ２７５２  （１９８７））  により大量調製した。
【００６７】
〔実施例７〕ｉｎ    ｖｉｖｏ抗  ＨＩＶ−１アッセイ
抗  ＨＩＶ−１アッセイ方法は、Ｈｏｍａｎｎらの方法  （  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ  ．２１，  ｐ．２８０９  −  ２８１４  ）に従い、以下のようにして行った。
ＳＷ  ４８０細胞  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．３６  ，  ｐ．４５６２  −  ４５６９  （１９７６））を４８穴細胞培養プレート中で、１０％牛胎児血清、２ｍＭ、Ｌ  −  グルタミン、１００Ｕ／μｌペニシリン、１００μｇ／μｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにて、  ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで３７℃、５％ＣＯ２  の状態で培養し、ＨＩＶ  −  １  をコードするプラスミド  ｐＮＬ  ４  −  ３  （  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．  ５９，  ｐ．  ２８４  −  ２９１，  （１９８６））  ４０ｎｇ、および、例６で調製したヒト細胞用リボザイム発現プラスミド１２０  ｎｇを、リン酸カルシュウム法（  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．  ７  ，  ｐ．２７４５  −  ２７５２  （  １９８７  ）  ）によりＳＷ  ４８０細胞内に導入した。
【００６８】
上記ＳＷ  ４８０細胞を３７℃、５％ＣＯ２の状態で２４時間培養し、１ｘ１０５のＨＩＶ−１  感染性細胞  ＭＴ  −  ４  （Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ２２９，  ｐ．５６３  −  ５６６，  （１９８５））  を含み、１０％牛胎児血清、２ｍＭ、Ｌーグルタミン、１００Ｕ／μｌ  ペニシリン、１００μｇ／μｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（１ｍｌ）  で培養培地を置換し、３７℃、５％ＣＯ２  の状態でさらに３日間培養を続け、その後、上澄中のＨＩＶ−１増殖を市販のｐ２４検出キット（オランダ、Ｏｒｇａｎｏｎ  社製）を用いて測定した。
【００６９】
なお、コントロールとしては、ヒト細胞用リボザイム発現プラスミドの代りにＨＩＶ−１の増殖を阻害しないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）より  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で転写した  ＲＮＡ  （Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  １９，  ｐ．１４２１  −  １４２６  ）を用いた。
【００７０】
結果を図１３に示す。図１３のグラフにおいて、縦軸の数値はコントロールに対する各検体のＨＩＶ−１  増殖の割合（％）を示し、横軸のＡはｐＭＥ  −  ＬＴＲ  、ＢはｐＭＥ  −  ｇａｇ  、ＣはｐＭＥ  −  ｔａｔ  、ＤはｐＭＥ  −  ｔａｔ  ３  、Ｅはコントロールであることを示している。グラフ中の数値は、各ヒト細胞用リボザイム発現プラスミドもしくはコントロールＲＮＡを導入した細胞について別々に調製した８個の試料を用意し、それぞれの  ｐ  ２４濃度を測定し、このプロセスを３回繰り返し、その値の平均値から算出したＨＩＶ−１  増殖の割合±標準誤差を表している。つまり、図１３の数値は２４個の実験値の平均値である。
【００７１】
図１３からわかるように、すべてのヒト細胞用リボザイム発現プラスミドにおいてＨＩＶ−１  増殖抑制が観察され、特にｐＭＥ  −  ｔａｔ  では９５％以上の増殖抑制がみられた。
【００７２】
以上の結果から、  ｉｎ  ｖｉｖｏでも上記のヒト細胞用リボザイム発現プラスミドから転写されたリボザイムが  ＨＩＶ−１の  ＲＮＡに作用し、その結果、  ＨＩＶ−１の増殖が抑制されたと推論され、上記のヒト細胞用リボザイム発現プラスミドがｉｎ  ｖｉｖｏ  でも有効に作用することが示された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のベクターは、環状のまま用いても、５’末端および／または３’末端側に余分な塩基配列が付加されていない所望のＲＮＡを製造することができる。従って、本発明のベクターを用いれば、制限酵素を使用する必要がなく、簡便な操作で所望のＲＮＡの製造を行うことができるほか、試験管内のみならず、生体内においても、該ベクターを保持増殖せしめながら、所望のＲＮＡの産生を図ることができる。
【００７４】
本発明のベクターは、抗ウィルス剤や抗腫瘍剤として、医薬、動物薬、農薬等に、また、Ｃ型肝炎ウィルス等の感染を検出するための診断薬としてのＲＮＡプローブの作成などにも有効に使用することができる。
【００７５】
【配列表】
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【００７６】
0003593548.tif 000003
【００７７】
0003593548.tif 000004
【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ハセロフ（Ｊ．Ｈａｓｅｌｏｆｆ）等が示した短鎖人工リボザイムの構造を示す図である。
【図２】従来の転写手段であるラン・オフ法を示す模式図である。
【図３】組換えプラスミドｐＧＥＮＥ  ８４５９ｖ３の構造を示す図である。
【図４】組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲの構造を示す図である。
【図５】組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔの構造を示す図である。
【図６】組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ＬＴＲ、ｐＶ３ＴＡ−ｔａｔの構築に用いた合成ＤＮＡリンカ−の塩基配列を示す図である。
【図７】ポリＡテイルとそれに続くＧＵＣの塩基配列を付加したメチオニンｔＲＮＡのアンチコドン部位に挿入された状態にある、ＬＴＲ用リボザイムＲＮＡ、ｔａｔ用リボザイムＲＮＡ、ｔａｔ３用リボザイムＲＮＡおよびｇａｇ  用リボザイムＲＮＡの塩基配列を示す図である。
【図８】組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｔａｔ３を構築するのに用いた合成オリゴヌクレオチドであるｔａｔ３リンカーの塩基配列、および、組換えプラスミドｐＶ３ＴＡ−ｇａｇを構築するのに用いた合成オリゴヌクレオチドであるｇａｇリンカーの塩基配列を示した図である。
【図９】本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  の構造を示す図である。
【図１０】本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｔａｔ  の構造を示す図である。
【図１１】本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｔａｔ３の構造を示す図である。
【図１２】本発明の組換えプラスミドｐＭＥ−ｇａｇ  の構造を示す図である。
【図１３】ヒト細胞用組換えプラスミドｐＭＥ−ＬＴＲ  、ｐＭＥ−ｔａｔ  、ｐＭＥ−ｔａｔ３および  ｐＭＥ−ｇａｇのＨＩＶ増殖抑制活性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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