(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタカスパーゼ−１とＩＬ−１８とを共発現することを特徴とする昆虫細胞又は昆虫であって、ブタカスパーゼ−１が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である、上記昆虫細胞又は昆虫。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載の昆虫細胞又は昆虫を用いることを特徴とする、活性型ＩＬ−１８の生産方法。
【請求項３】
活性型ＩＬ−１８が活性型ブタＩＬ−１８である、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カスパーゼ活性を有するタンパク質（特にブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３）、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡに相補的なＲＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された形質転換体、並びに該タンパク質に反応する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カスパーゼ−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）βの単球でのプロセシングに必要なシステインプロテアーゼとして見いだされ（Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５６，  ７６８−７７４）、インターロイキン−１β変換酵素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｂｅｔａ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＩＣＥ））と呼ばれていた。その後、線虫のアポトーシスの実行遺伝子であるｃｅｄ−３とＩＣＥ遺伝子の塩基配列が相同性を示すことが報告され、類似の構造を持つシステインプロテアーゼが次々に見いだされた。そこで、これらのシステインプロテアーゼの総称として「カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）」という名が提唱された（Ｅ．Ｓ．Ａｌｎｅｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ８７，  １７１）。
【０００３】
カスパーゼ−３（ｃａｓｐａｓｅ−３）もｃｅｄ−３とＩＣＥ遺伝子の塩基配列に相同性を示すシステインプロテアーゼをコードする遺伝子としてヒトで見いだされ（Ｔ．Ａｌｎｅｍｒｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  ３０７６１−３０７６４）、カスパーゼカスケードの比較的下流に位置する重要な分子として知られている。
【０００４】
現在、種々の感染症、癌細胞あるいは化学物質によるプログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）において、カスパーゼカスケードはアポトーシスを起こすシグナル伝達の最も重要な経路と考えられている（Ｄ．Ｗ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２２，２９９−３０６）。そのため、これらアポトーシス異常の関与する疾患の治療薬としてカスパーゼファミリーのプロテアーゼとそのインヒビターは大きなターゲットと考えられている（Ｄ．Ｗ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，２９７−３０１）。
【０００５】
カスパーゼファミリーのタンパク質は、約４０ｋＤａの不活性型前駆体として合成され、プロセシングを受けて、分子量約１０−ｋＤａの短鎖と分子量約２０−ｋＤａの長鎖のサブユニットの重合したヘテロ４量体タンパク質として活性型となる。最近の研究により、カスパーゼ−１はＩＬ−βばかりでなく、主にマクロファージで産生されるＩＬ−１８を活性のない前駆体から活性型に変換する酵素であること（Ｔ．Ｇｈａｙｕｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８６，  ６１９−６２３，  Ｙ．Ｇｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７５，  ２０６−２０９）、及びカスパーゼ−３はＩＬ−１８を活性型から活性のない変性産物へと変換する役割も果たすことが明らかとなった（Ｋ．Ａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，  ２６５９５−２６６０３）。そのため、ＩＬ−１βの関与する様々な炎症反応、及びＩＬ−１８の関与するＴｈ１細胞の活性化を制御する因子としても、そのインヒビターとともに研究が進められている。
【０００６】
これまでに、ヒト（Ｄ．Ｐ．Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５６，  ９７−１００）、マウス（Ｍ．Ａ．Ｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４９，３２５４−３２５９）、ラット（Ｋ．Ｍ．Ｋｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ７，  １０５−１１０）、イヌ（Ｆ．Ｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１９，  ２７−３２）及びニワトリ（Ａ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２１９，  ５５−６２）のカスパーゼ−１遺伝子、並びにヒト（Ｔ．Ａｌｎｅｍｒｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  ３０７６１−３０７６４）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ公開データＵ１９５２２）、ラット（Ｇｅｎｂａｎｋ公開データＵ８４４１０）及びニワトリ（Ｇｅｎｂａｎｋ公開データＡＦ０８３０２９）のカスパーゼ−３遺伝子の全塩基配列が明らかとなっているが、ブタをはじめとする家畜のカスパーゼファミリーに属する遺伝子の報告はなされておらず、ブタをはじめとする家畜におけるウィルス感染症・細菌感染症をはじめとするアポトーシスを呈する病態の解析・予防・治療方法の開発の妨げとなっている。
【０００７】
また、本発明者らは、これまでにブタＩＬ−１８のｃＤＮＡをクローニングし、その前駆体蛋白質および活性型蛋白質をバキュロウィルス・昆虫細胞を用いた発現系により作製したことを報告している（Ｙ．Ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １２，  ５６６−５７２，  ２０００）。しかしながら、ＩＬ−１８が分泌シグナルを持たないこと、昆虫細胞がＩＬ−１８の前駆体から活性型への成熟に必要とされるカスパーゼ−１を持たないこと、昆虫細胞がＩＬ−１８を活性型から変性産物へと分解する内在性のカスパーゼ−３様活性を持っていること等から、バキュロウィルス・昆虫細胞を用いた発現系により前駆体型ブタＩＬ−１８は効率よく培養上清中に分泌発現されるものの、活性型ＩＬ−１８を効率よく分泌発現することはできなかった。
このような状況の下、ブタのカスパーゼファミリーに属する遺伝子の単離・同定が切望されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、ブタのカスパーゼファミリーに属する遺伝子を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、カスパーゼファミリーの遺伝子発現が１連のカスケードとして免疫学的な刺激後の短時間のうちに生じること（水野憲一、伊東  広、カスパーゼファミリーとアポトーシス、医学のあゆみ、１８７，  ３１８−３２３）、及びカスパーゼファミリーのアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端とがヒトやマウスなどの種間で高く保存されていることに着目し、ブタ肺胞マクロファージをリポポリサッカライドで短時間（例えば４時間）刺激して得られたＴｏｔａｌ−ＲＮＡから合成したｃＤＮＡと、ヒト及びマウスのカスパーゼ−１とカスパーゼ−３のＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列に基づいて合成した混合プライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、ブタカスパーゼ−１遺伝子及びブタカスパーゼ−３遺伝子を単離・同定することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡ。
（３）前記（２）記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ。
（４）前記（２）記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（５）前記（４）記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
【００１１】
（６）前記（１）記載のタンパク質に反応する抗体。
（７）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質
（８）前記（７）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡ。
（９）前記（８）記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ。
（１０）前記（８）記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【００１２】
（１１）前記（１０）記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
（１２）前記（７）記載のタンパク質に反応する抗体。
（１３）前記（５）記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ブタ活性型ＩＬ−１８の生産方法。
（１４）前記（１１）記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ブタ活性型ＩＬ−１８の抑制方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一（以下、「第一発明」という）は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である：
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
本発明の第二（以下、「第二発明」という）は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である：
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
ここで、第一発明及び第二発明において、「１又は複数個のアミノ酸」とは、欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が、カスパーゼ活性を有する限り、その個数は特に限定されないが、通常は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，  ６４８７‐６５００，  １９８２）によって生じさせることができる個数、好ましくは１又は数個を意味し、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸を意味する。
【００１６】
また、第一発明及び第二発明において、「カスパーゼ活性を有するタンパク質」とは、システインプロテアーゼ活性を有し、かつＰ１（基質側の切断部位のアミノ酸残基）にアスパラギン酸を要求する基質特異性を有するタンパク質を意味する。
第一発明及び第二発明のタンパク質は、以下で詳述するように、それぞれのタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを適当な宿主に導入して発現させることにより得ることができる。
【００１７】
本発明の第三（以下、「第三発明」という）は、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡである。
第三発明のＤＮＡは、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡである限り、その塩基配列は限定されない。
第三発明のＤＮＡの具体例としては、以下の（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡを例示できる：
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
本発明の第四（以下、「第四発明」という）は、上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡである。
第四発明のＤＮＡは、上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡである限り、その塩基配列は限定されない。
第四発明のＤＮＡの具体例としては、以下の（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡを例示できる：
（ｇ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
ここで、「配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ」とは、配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等により得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で（又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で）ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄して得られるＤＮＡを意味する。このようなＤＮＡの具体例としては、配列番号１又は３記載の塩基配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを例示できる。
【００２０】
第三発明及び第四発明のＤＮＡの取得方法は特に限定されない。
第三発明及び第四発明のＤＮＡは、例えば、カスパーゼファミリーの遺伝子発現が１連のカスケードとして免疫学的な刺激後の短時間のうちに生じることを利用して取得することができる。すなわち、ブタの肺から採取した肺胞マクロファージをマイトジェンであるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激した後、該肺胞マクロファージから得られるｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより、第三発明及び第四発明のＤＮＡを得ることができる。
【００２１】
具体的な手法は以下の通りである。
ブタの肺を採取し、公知の方法（例えば、Ｄ．Ｌ．Ｆｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｍｕｒｔａｕｇｈ，  Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  ５７，  １２１−１３４）に記載の方法により肺胞マクロファージを分離する。この肺胞マクロファージをマイトジェンであるＬＰＳで刺激して２〜２４時間培養後、公知の方法（例えば、Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓａｃｃｉ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２，  １５６−１５９（１９８７））によりＴｏｔａｌ−ＲＮＡを得る。この際、使用するブタの性別、品種等は特に限定されない。得られたＴｏｔａｌ−ＲＮＡを市販の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、公知の方法（例えば、Ｊ．ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．８．１１−８．１７）により逆転写反応させ、ｃＤＮＡを合成する。
【００２２】
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ブタカスパーゼ−１遺伝子の両末端にハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより第三発明のＤＮＡを増幅でき、ブタカスパーゼ−３遺伝子の両末端にハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより第四発明のＤＮＡを増幅できる。第三発明のＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ用プライマーは、配列番号１記載の塩基配列に基づいて設計でき、第四発明のＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ用プライマーは、配列番号３記載の塩基配列に基づいて設計できる。第三発明のＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ用プライマーの具体例としては、配列番号５及び６記載の塩基配列からなるプライマーセットを例示でき、第四発明のＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ用プライマーの具体例としては、配列番号７及び８記載の塩基配列からなるプライマーセットを例示できる。設計したプライマーは、その塩基配列に従って化学合成できる。ＰＣＲは常法に従って行なうことができる。
【００２３】
得られたＰＣＲ産物は、例えば、市販のＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  ＣｌｏｎｉｎｇＲ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてプラスミドｐＣＲＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中へサブクローニングし、このプラスミドを公知の方法（例えば、Ｊ．ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．１．２１−１．５２）に従って単離精製する。そして、サンガー法やマクサム・ギルバート法等の公知の方法を用いてＰＣＲ産物の塩基配列を決定できる。
【００２４】
第三発明及び第四発明のＤＮＡは常法に従って化学合成することにより取得することもできる。
第三発明及び第四発明のＤＮＡはカスパーゼ活性を有するタンパク質の大量生産に利用できる。特に、第三発明のＤＮＡはブタカスパーゼ−１の大量生産に利用でき、第四発明のＤＮＡはブタカスパーゼ−３の大量生産に利用できる。
【００２５】
第三発明及び第四発明のＤＮＡを利用したカスパーゼ活性を有するタンパク質の生産は、第三発明又は第四発明のＤＮＡを含む発現ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物からカスパーゼ活性を有するタンパク質を精製することにより行うことができる。
【００２６】
第三発明又は第四発明のＤＮＡを含む発現ベクターは、第三発明又は第四発明のＤＮＡの上流に適当なプロモーターを含み、その下流に適当なターミネーターを含む。発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＶＬ１３９２、ｐＱＥ３０等を利用できる。発現ベクターを導入した形質転換体の検出を容易にするために、プロモーターの下流に適当なマーカー遺伝子やレポーター遺伝子を挿入しておいてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を使用でき、レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）等をコードする遺伝子を使用できる。
【００２７】
宿主細胞としては、第三発明又は第四発明のＤＮＡを含む発現ベクターと適合し、形質転換され得るものである限り特に限定されず、一般的に使用される天然細胞、人工的に樹立された組換え細胞などの種々の細胞を使用できる。このような宿主細胞としては、例えば、動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞）、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母等を使用できる。特に好ましい宿主細胞は、昆虫細胞である。あるいは、昆虫細胞に代えて、昆虫（例えば、カイコガ幼虫）を用いてもよい。
【００２８】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、プロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、又はこれらの変法を使用できる。
形質転換体の培養及び培養物からのカスパーゼ活性を有するタンパク質の精製は、常法に従って行なうことができる。形質転換体の培養は、例えば、ＲＰＭＩ培地、ＬＢ培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＩＶＥ培地等の培地を用いて室温〜３７℃で２４〜１２０時間行なえばよい。
【００２９】
培養物からカスパーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法としては、▲１▼天然型カスパーゼ及び種々の発現系を利用して発現させた組換えカスパーゼを含む細胞抽出液、あるいは培養上清から、例えば硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロフォービッククロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の方法を組み合わせることにより精製する方法、▲２▼組換え型カスパーゼを発現させる際に、種々の精製用タグ（例えば、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｔ７、チオレドキシン等）を付加して発現させ、それぞれのアフィニティーカラムを利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法、▲３▼カスパーゼに特異的なモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いて作製したイムノアフィニティーカラムを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法を例示できる。
【００３０】
タンパク質のカスパーゼ活性の測定は、例えば、次の方法（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６１：  ４１２２−４１２８（１９９８））により行なうことができる。形質転換体を含む培養物を４００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、氷冷したＰＢＳで洗浄する。細胞溶解用バッファー（例えば、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ  ７．４）に再浮遊させた後、凍結・融解操作を３回繰り返して細胞を溶解する。細胞溶解液を１２０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を回収し、氷上に保つ。タンパク質濃度を測定した後、タンパク質２００μｇを含む緩衝液に４００μＭのカスパーゼ基質（例えば、ＭＢＬ社製Ｃａｓｐａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を加え、反応用バッファー（例えば、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０％グリセロール、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．４）で１５０μｌとする。３７℃で１時間反応させ、４０５ｎｍの吸光度を測定する。これによって、タンパク質のカスパーゼ活性を測定することができる。この際、市販のキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を利用してタンパク質のカスパーゼ活性を測定することもできる。また、カスパーゼ基質としては、蛍光標識されたものも市販されているので、蛍光標識されたカスパーゼ基質を利用し、蛍光の発生を蛍光プレートリーダーで検出することにより、タンパク質のカスパーゼ活性を測定することもできる。
【００３１】
第三発明及び第四発明のＤＮＡを利用してタンパク質を生産する際には、市販のＴｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＥＳＰ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡社製）、ｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｙｔｅｍ（東洋紡社製）等を利用すると便利である。
【００３２】
第三発明のＤＮＡは、カスパーゼ活性を有するタンパク質（特にブタカスパーゼ−１）の生産に利用できる他、ブタカスパーゼ−１遺伝子の検出用プローブとして利用できる。さらに、第三発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて、ブタカスパーゼ−１遺伝子の検出用プローブや、ブタカスパーゼ−１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
【００３３】
第四発明のＤＮＡは、カスパーゼ活性を有するタンパク質（特にブタカスパーゼ−３）の生産に利用できる他、ブタカスパーゼ−３遺伝子の検出用プローブとして利用できる。さらに、第四発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて、ブタカスパーゼ−３遺伝子の検出用プローブや、ブタカスパーゼ−３遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
【００３４】
ブタカスパーゼ−１遺伝子及びブタカスパーゼ−３遺伝子の検出用プローブとしては、第三発明及び第四発明のＤＮＡに相補的なＲＮＡを利用することもできる。第三発明及び第四発明のＤＮＡに相補的なＲＮＡは、例えば、Ｔ７又はＴ３ファージのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＣＲＲ２．１）に第三発明及び第四発明のＤＮＡを組み込み、ＲＮＡポリメラーゼ作用させることにより得ることができる。得られたＲＮＡは酵素的シグナル、蛍光シグナル、ラジオアイソトープ等でラベルすることにより、ブタカスパーゼ−１遺伝子及びブタカスパーゼ−３遺伝子の検出用プローブとして利用できる。
【００３５】
第一発明及び第二発明のタンパク質、並びに第三発明及び第四発明のＤＮＡは、ブタマクロファージ系の細胞におけるＩＬ−１βとＩＬ−１８の活性化制御機構の研究、組換えブタＩＬ−１β及びＩＬ−１８の効率的生産、及びブタにおける種々の病原体の感染防御抗原等によるワクチン開発の際のアジュバントとして利用できる他、ブタカスパーゼ−１及びカスパーゼ−３のインヒビターの研究や、ブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３に対する抗体を作製するための免疫源として利用できる。
【００３６】
本発明の第五（以下、「第五発明」という）は、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質に反応する抗体である。
本発明の第六（以下、「第六発明」という）は、上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質に反応する抗体である。
【００３７】
第五発明及び第六発明の抗体は、それぞれ上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質及び上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質に反応し得る限り、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質を免疫原として用いて常法に従って調製できる。例えば、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質で免疫した動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等）の血清免疫グロブリンから抗原アフィニティカラムを用いて調製できる。
【００３９】
モノクローナル抗体は、例えば、以下の工程により作製することができる。
（１）抗原の調製
（２）免疫及び抗体産生細胞の採取
（３）細胞融合
（４）ハイブリドーマの選択及びクローニング
（５）モノクローナル抗体の採取
【００４０】
以下、各工程について説明する。
（１）抗原の調製
抗原としては、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質を用いる。上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを利用して調製でき、抗原とする上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質は、例えば、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを利用して調製できる。
【００４１】
（２）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られたタンパク質を免疫原として、アジュバンドとともに哺乳類、鳥類等に投与する。
ここで、アジュバンドとしては、市販のフロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバンド、ＢＣＧ、ハンターズ、タイターマック、キーホールリンペットヘモシアニン含有オイル等が挙げられ、これらを単独で使用してもよいし、これらの２種以上を混合して使用してもよい。
【００４２】
哺乳類としては、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等を使用でき、鳥類としては、ハト、ニワトリ等を使用できるが、特にマウス、ラット等を使用するのが好ましい。
投与の方法としては、公知の何れの方法を使用してもよく、例えば、静脈内投与、皮下投与、又は腹腔内投与を使用できる。
【００４３】
抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、通常１０〜１０００μｇ、好ましくは２０〜１００μｇである。免疫の間隔は、通常１〜３週、好ましくは２週であり、免疫の回数は、通常１〜３回、好ましくは２回である。
最終免疫日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採集する。
採取する抗体産生細胞としては、リンパ節細胞、脾臓細胞等が挙げられるが、好ましくは脾臓細胞である。
【００４４】
（３）細胞融合
抗体産生細胞と細胞融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等の種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能である株化細胞を使用できる。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば  ＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ選択培地で生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、８‐アザグアニン耐性株を使用できる。この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し（ＨＧＰＲＴ−）、ＨＡＴ培地で生育できない。
【００４５】
このようなミエローマ細胞としては、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２等のマウスミエローマ細胞株、２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３等のラットミエローマ細胞株、ＳＫＯ−００７等のヒトミエローマ細胞株等を使用できる。
【００４６】
細胞融合は、例えば、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを混合比１：５〜１：１０の割合で、ＲＰＭＩ１６４０培地等の培地中で融合促進剤存在下、室温で１〜７分間細胞同士を接触させることによって行うことができる。この際、融合促進剤としては、平均分子量１０００〜５０００のポリエチレングリコール、ポリビニールアルコール等を使用できる。また、センダイウイルス等の融合ウイルスを使用してもよい。
【００４７】
（４）ハイブリドーマの選択、スクリーニング及びクローニング
細胞融合後、ハイブリドーマを選択する。
ハイブリドーマの選択方法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマを選択培地（例えばＨＡＴ培地）で培養することにより行なうことができる。この際の培養は、常法に従えばよく、特に限定されない。通常は３７℃で７〜１４日間培養すればよい。
【００４８】
目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、次の方法によって行なうことができる。マイクロプレートの各ウェルに上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質を吸着させた後、ブロックエース（大日本製薬）等でブロックする。該マイクロプレートの各ウェルにハイブリドーマの培養上清を加え、２５〜３７℃で１〜２時間放置する。これを生理的食塩水で洗浄した後、適当に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗イムノグロブリンを加える。生理的食塩水で洗浄した後、ＡＬＰローゼ（シノテスト社）を用いてアルカリフォスファターゼの活性を測定し、アルカリフォスファターゼの呈色を有するウェルを、上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質に特異的な抗体を産生する細胞を含むウェルとする。これによって目的のハイブリドーマをスクリーニングすることができる。
【００４９】
このウェルから目的とするハイブリドーマをクローニングする方法は、通常の方法に従えば良く、特に限定されない。ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行なうことができる。
【００５０】
（５）モノクローナル抗体の採取
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。
細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマを仔ウシ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、Ｅ−ＲＤＦ培地又は無血清培地等の動物細胞培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％Ｃ０２  濃度）で３〜７日間培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を取得できる。
【００５１】
腹水形成法においては、例えば、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン（２，６，１０，１４‐テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を投与し、その後、ハイブリドーマ１×１０６〜１×１０７個、好ましくは２×１０６個を腹腔内に投与する。投与した哺乳動物を１〜２週間、好ましくは１０日間、飼育した後、腹水又は血清を採取することにより目的とするモノクローナル抗体を取得できる。
【００５２】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸塩分析法、ＤＥＡＥ−セルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択し、これらを単独で又は組み合わせて使用することにより精製を行うことができる。
【００５３】
採取したモノクローナル抗体が目的とするモノクローナル抗体であることの確認は、例えば上記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質或いは上記（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質を用いたウェスタンブロット法により行なうことができる。
【００５４】
第五発明の抗体は、例えば、ブタカスパーゼ−１を含む試料からのブタカスパーゼ−１の分離及び精製、試料中に含まれるブタカスパーゼ−１の検出及び定量等に使用できる。
第六発明の抗体は、例えば、ブタカスパーゼ−３を含む試料からのブタカスパーゼ−３の分離及び精製、試料中に含まれるブタカスパーゼ−３の検出及び定量等に使用できる。
【００５５】
本発明の第七（以下、「第七発明」という）は、上記（５）記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ブタ活性型ＩＬ−１８の生産方法である。
本発明の第八（以下、「第八発明」という）は、上記（１１）記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ブタ活性型ＩＬ−１８の抑制方法である。
【００５６】
上述のように、カスパーゼ−１はＩＬ−１８を活性型に変換する活性を有する。従って、ブタＩＬ−１８の発現系においてブタカスパーゼ−１を発現させる（すなわち、ブタＩＬ−１８とブタカスパーゼ−１を共発現させる）ことにより、ブタ活性型ＩＬ−１８を効率よく生産することができる。また、カスパーゼ−３はＩＬ−１８を変性させる活性を有する。従って、ブタＩＬ−１８の発現系においてブタカスパーゼ−３を発現させる（すなわち、ブタＩＬ−１８とブタカスパーゼ−３を共発現させる）ことにより、ブタＩＬ−１８の活性を抑制することができる。
【００５７】
第七発明又は第八発明において用いるブタＩＬ−１８の発現系は、当業者に公知のものであってよく、例えば、Ｙ．Ｍｕｎｅｔａら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １２，  ５６６−５７２，  ２０００；ブタＩＬ−１８の配列：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１０００３）に記載のものを用いることができる。
【００５８】
上記共発現は、第三発明のＤＮＡ（ブタカスパーゼ−１）又は第四発明のＤＮＡ（ブタカスパーゼ−３）を用いて、当業者に公知の方法により行うことができる。形質転換用宿主として昆虫細胞又は昆虫を用いる場合には、例えば、前記ＤＮＡを昆虫細胞発現用ベクターにクローニングし、ブタカスパーゼ−１又はカスパーゼ−３を昆虫細胞中で発現する組換えバキュロウィルスを作製することができる。該組換えバキュロウイルスを、ブタ前駆体ＩＬ−１８を分泌発現する組換えバキュロウィルス（Ｙ．Ｍｕｎｅｔａら，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １２，  ５６６−５７２，  ２０００）とともに昆虫細胞又は昆虫に感染させ、該昆虫細胞又は該昆虫を培養又は飼育することにより、上記共発現を行うことができる。ここで、ブタカスパーゼ−１を用いてブタ活性型ＩＬ−１８を生産する場合には、ブタカスパーゼ−３のインヒビターを利用してもよい。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により、本発明について具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕ブタカスパーゼ−１遺伝子の単離・同定
（１）ｃＤＮＡの合成
ブタのカスパーゼファミリー遺伝子が発現している細胞からｍＲＮＡを得るため、正常なブタから肺胞マクロファージ（ＡＭφ）を採取し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）により刺激した。すなわち、正常なブタの肺を無菌的に取り出し、肺内をＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製）で洗浄することにより得られる肺胞洗浄液５００ｍｌを採取した後、この肺胞洗浄液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ブタＡＭφを回収した。回収したＡＭφを１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５０μＭ  β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）に細胞濃度１×１０６／ｍｌとなるように再浮遊させ、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳを加えて、４時間、３７℃、５％炭酸ガス下で４時間培養した後、公知の方法（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓａｃｃｉ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２，１５６−１５９，１９８７）によりＴｏｔａｌ−ＲＮＡを精製した。このＴｏｔａｌ−ＲＮＡの１μｇを鋳型として、宝酒造社製の市販されているキット（Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１）により、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。
【００６０】
（２）ＰＣＲによるブタカスパーゼ−１遺伝子の増幅
Ｐｅｒｋｉｎｅｒｍｅｒ社製のＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅに、１０×ＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌ、５Ｕ／μｌのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、上記（１）で合成したｃＤＮＡ  １μｌ、並びにヒト及びマウスのカスパーゼ−１のアミノ酸配列に基づいて化学合成したプライマー（センスプライマー：５’−ｇｃｃａｔｇｇｃｎｇａｙａａｒｇｔｎｙｔ−３’（配列番号５）及びアンチセンスプライマー：５’−ｙｔａａｔｇｔｃｃｔｇｇｇａａｓａｇｒｔａｒａａ−３’（配列番号６））各２μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。なお、各プライマーの塩基配列中、「ｎ」で表される塩基は、「ａ」、「ｃ」、「ｇ」、「ｔ」又は「ｕ」を意味し、「ｒ」で表される塩基は「ｇ」又は「ａ」を意味し、「ｙ」で表される塩基は「ｔ」、「ｕ」又は「ｃ」を意味し、「ｓ」で表される塩基は「ｇ」又は「ｃ」を意味する。
【００６１】
ここで、センスプライマー（配列番号５）は、ヒトカスパーゼ−１遺伝子の塩基配列の−３〜−１に存在する「ｇｃｃ」と、ヒトカスパーゼ−１のアミノ酸配列の１〜６に存在するアミノ酸に対応する全てのコドンを考慮して設計した混合プライマーである。また、アンチセンスプライマー（配列番号６）は、ヒトカスパーゼ−１のアミノ酸配列の３９８〜４０５（４０５は終止コドンに対応）に存在するアミノ酸に基づいて設計した混合プライマーである。
この混合物について９４℃で４５秒間、４８℃で４５秒間、７２℃で２分間のサイクルを３５回繰り返してＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を得た。
【００６２】
（３）ＰＣＲ産物のクローニング
上記（２）で得られたＰＣＲ産物を、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にて、ｐＣＲＲ２．１ベクターへ組み込んだ後、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、形質転換体ｐｃａｓｐａｓｅ−１ＴＡを得た。
【００６３】
（４）塩基配列の決定
ＰＣＲ産物が組み込まれていたクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で１００ｍｌ培養し、プラスミドＤＮＡをＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で精製し、組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により決定した。
なお、ブタカスパーゼ−１遺伝子（配列番号１）を組み込んだプラスミドｐＣＲＲ２．１を導入した大腸菌ＩＮＶαＦ’株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７４９９として寄託されている（寄託日：平成１１年８月５日）。
【００６４】
（５）カスパーゼ−１のアミノ酸配列の比較
以上の方法で決定されたブタカスパーゼ−１のｃＤＮＡの全塩基配列及び推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
ブタカスパーゼ−１のアミノ酸配列を公知のヒト、マウス、ラット、イヌ及びニワトリのカスパーゼ−１のアミノ酸配列と比較した結果、それぞれ、７２．５％、６２．６％、６４．１％、５３．９％及び２５．７％の相同性を示した。
【００６５】
〔実施例２〕ブタカスパーゼ−３遺伝子の単離・同定
（１）ＰＣＲによるブタカスパーゼ−３遺伝子の増幅
Ｐｅｒｋｉｎｅｒｍｅｒ社製のＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅに、１０×ＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌ、５Ｕ／μｌのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、実施例１（１）で合成したｃＤＮＡ  １μｌ、並びにヒト及びマウスのカスパーゼ−３のアミノ酸配列に基づいて化学合成したプライマー（５’−ａｔｇｇａｓａａｃａｎｙｒａａａｍｃｔｃｍｇｔｇｇａ−３’（配列番号７）及び５’−ｙｔａｇｔｇａｔａａａａｒｔａｓａｇｔｔｃ−３’（配列番号８））各２μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。なお、各プライマーの塩基配列中、「ｎ」で表される塩基は、「ａ」、「ｃ」、「ｇ」、「ｔ」又は「ｕ」を意味し、「ｍ」で表される塩基は「ａ」又は「ｃ」を意味し、「ｒ」で表される塩基は「ｇ」又は「ａ」を意味し、「ｙ」で表される塩基は「ｔ」、「ｕ」又は「ｃ」を意味し、「ｓ」で表される塩基は「ｇ」又は「ｃ」を意味する。
【００６６】
ここで、センスプライマー（配列番号７）は、ヒトカスパーゼ−３のアミノ酸配列の１〜９に存在するアミノ酸に基づいて設計した混合プライマーである。また、アンチセンスプライマー（配列番号８）は、ヒトカスパーゼ−３のアミノ酸配列の２７２〜２７８（２７８は終止コドンに対応）に存在するアミノ酸に基づいて設計した混合プライマーである。
この混合物について９４℃で４５秒間、４８℃で４５秒間、７２℃で２分間のサイクルを３５回繰り返してＰＣＲ反応を行ない、ＰＣＲ産物を得た。
【００６７】
（２）ＰＣＲ産物のクローニング
上記（１）で得られたＰＣＲ産物を、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にて、ｐＣＲＲ２．１ベクターへ組み込んだ後、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、形質転換体ｐｃａｓｐａｓｅ−３ＴＡを得た。
【００６８】
（３）塩基配列の決定
ＰＣＲ産物が組み込まれていたクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で１００ｍｌ培養し、プラスミドＤＮＡをＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で精製し、組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により決定した。
【００６９】
（４）カスパーゼ−３のアミノ酸配列の比較
以上の方法で決定されたブタカスパーゼ−３のｃＤＮＡの全塩基配列と推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。ブタカスパーゼ−３の推定アミノ酸配列を公知のヒト、マウス、ラット、イヌ及びニワトリのカスパーゼ−３のアミノ酸配列と比較した結果、それぞれ８８．４％、８６．６％、８７．７％及び５５．５％の相同性を示した。
なお、ブタカスパーゼ−３遺伝子（配列番号３）を組み込んだプラスミドｐＣＲＲ２．１を導入した大腸菌ＩＮＶαＦ’株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７５００として寄託されている（寄託日：平成１１年８月５日）。
【００７０】
〔実施例３〕ブタカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３を発現する組換えバキュロウィルスの作製
（１）ブタカスパーゼ−１を発現する組換えバキュロウィルスの作製
ＰｅｒｋｉｎＥｒｍｅｒ社製のＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅに、１０×ＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌ、５ユニット／μｌのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、実施例１（３）で得られたｐｃａｓｐａｓｅ−１ＴＡを１μｌ、配列番号１に基づいて化学合成した、５’−ＧＡＴＣＣＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＴＡＡＧＧＴ−３’（配列番号９）および５’−ＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１０）で表される塩基配列のプライマーを加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法によりこの混合物を９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応させ、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物とＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製プラスミドベクターｐＶＬ１３９２を制限酵素ＥａｇＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、当分野において公知の方法によってライゲーションおよび大腸菌ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行って形質転換体を得た。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で１８時間培養した後、プラスミドＤＮＡ（ｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１）をＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で精製し、組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により決定した。
【００７１】
この組換えプラスミドＤＮＡを１μｇと、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）０．２５μｇを市販の昆虫細胞培養用培地Ｓｆ９００ＩＩ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１００μｌで混和し（溶液Ａ）、別にＳｆ９００ＩＩ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１００μｌとＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１０μｌを混和した（溶液Ｂ）。溶液Ａと溶液Ｂを混和した後、室温で１５分間静置し、あらかじめ１×１０６個のＳｆ２１細胞を培養しておいた２５ｃｍ２フラスコに加えて、２７℃で５時間培養した。上清を捨て、５ｍｌのＳｆ９００ＩＩを加えてさらに４日間２７℃で培養し、上清を回収した。上清に含まれる組換えウィルス（ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１）を、既知の方法（Ｍ．Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｆａｕｌｋｎｅｒ，  Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６，３６１−３６４）によりプラーククローニングを行って精製組換えバキュロウィルスを得た。
【００７２】
（２）ブタカスパーゼ−３を発現する組換えバキュロウィルスの作製
ＰｅｒｋｉｎＥｒｍｅｒ社製のＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅに、１０×ＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌ、５ユニット／μｌのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、実施例２（２）で得られたｐｃａｓｐａｓｅ−３ＴＡ１μｌ、配列番号３に基づいて化学合成した、５’−ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＡ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴ−３’（配列番号１２）で表される塩基配列のプライマーを加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法によりこの混合物を９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応させ、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物とＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製プラスミドベクターｐＶＬ１３９２を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、当分野において公知の方法によってライゲーションおよび大腸菌ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行って形質転換体を得た。
【００７３】
上記（１）と同様に、この形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡ（ｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−３）を精製し、組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。さらに、上記（１）と同様に、組換えウィルス（ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−３）を精製し、精製組換えバキュロウィルスを得た。
【００７４】
（３）ブタ前駆体型ＩＬ−１８を発現する組換えバキュロウィルスの作製
ブタ前駆体型ＩＬ−１８を発現する組換えバキュロウィルス（ＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８）を、Ｙ  ｍｕｎｅｔａら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  １２，  ５６６−５７２，  ２０００）に従って作製した。すなわち、ＰｅｒｋｉｎＥｒｍｅｒ社製のＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅに、１０×ＰＣＲバッファー１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１０μｌ、５ユニット／μｌのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、ブタ肺胞マクロファージ（ＬＰＳ刺激）から得られたｃＤＮＡ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１０００３）を１μｌ、配列番号１３に基づいて化学合成した、５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）で表される塩基配列のプライマーを加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法によりこの混合物を９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応させ、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物とＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製プラスミドベクターｐＶＬ１３９２を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、当分野において公知の方法によってライゲーションおよび大腸菌ＤＨ５α株へのトランスフォーメーションを行って形質転換体を得た。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で１８時間培養した後、プラスミドＤＮＡ（ｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８）をＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で精製し、組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により決定した。
【００７５】
この組換えプラスミドＤＮＡを１μｇと、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ  Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）０．２５μｇを市販の昆虫細胞培養用培地Ｓｆ９００ＩＩ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１００μｌで混和し（溶液Ａ）、別にＳｆ９００ＩＩ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１００μｌとＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）１０μｌを混和した（溶液Ｂ）。溶液Ａと溶液Ｂを混和した後、室温で１５分間静置し、あらかじめ１×１０６個のＳｆ２１細胞を培養しておいた２５ｃｍ２フラスコに加えて、２７℃で５時間培養した。上清を捨て、５ｍｌのＳｆ９００ＩＩを加えてさらに４日間２７℃で培養し、上清を回収した。上清に含まれる組換えウィルス（ＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ−１８）を、既知の方法（Ｍ．Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｆａｕｌｋｎｅｒ，  Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６，３６１−３６４）によりプラーククローニングを行って精製組換えバキュロウィルスを得た。
【００７６】
〔実施例４〕ブタ前駆体型ＩＬ−１８を発現する組換えバキュロウィルスとブタカスパーゼ−１を発現する組換えバキュロウィルスとの共発現による昆虫細胞でのブタ活性型ＩＬ−１８の効率的生産
実施例３（１）で得たＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１及び実施例３（３）で得たブタ前駆体型ＩＬ−１８を発現する組換えバキュロウィルス（ＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８，  Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）を、あらかじめ市販の昆虫細胞培養用培地Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ社製）中に５×１０６個のＴｎ５細胞を培養しておいた７５ｃｍ２フラスコに細胞１個あたり１０個の組換えウィルスが感染するように加えて、２７℃で４日間培養し、細胞および培養上清中に発現、分泌された組換えブタＩＬ−１８を回収した。
【００７７】
この細胞溶解液および培養上清中に発現、分泌されたブタＩＬ−１８の分子量を、公知の方法（Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）に従い、抗ブタＩＬ−１８モノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより分析した結果を図１に示す。図１において、（Ａ）は培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８のイムノブロット像であり、（Ｂ）は細胞溶解液中に発現されたブタＩＬ−１８のイムノブロット像である。レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は野生型バキュロウイルス感染昆虫細胞、レーン２はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８感染昆虫細胞、レーン３はＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１感染昆虫細胞、レーン４はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８／ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１感染昆虫細胞による結果を示す。白矢印はブタ前駆体型ＩＬ−１８を示し、黒矢印はブタ活性型ＩＬ−１８を示す。
図１によれば、培養上清及び細胞内のいずれにおいても、共発現によりブタ活性型ＩＬ−１８の分子量である約１８ｋＤａにバンドが得られたことがわかる。
【００７８】
また、培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８の分泌量を、公知の方法（Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，  ２０，  ３３１−３３６）に従い、ＥＬＩＳＡで測定したところ、その発現量は４．４５μｇ／ｍｌであった。この発現量は前駆体型ブタＩＬ−１８の発現量とほぼ同等であり、既に報告されているバキュロウィルス由来の分泌シグナルを含む組換えバキュロウィルス（ＡｃＧＰ６７Ｂ−ＩＬ１８，  Ｙ  Ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）の感染により昆虫細胞培養上清中に分泌される活性型ブタＩＬ−１８の分泌量の約１０倍の分泌発現が可能であることが明らかとなった。結果を図２に示す。
【００７９】
さらに、培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８の生物活性を公知の方法（Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）により測定した結果を図３に示す。図３に示すグラフにおいて、縦軸はブタ末梢血単核球により生産されたＩＦＮ−γの濃度を示す。
図３によれば、共発現により得られた活性型ブタＩＬ−１８の生物活性はＡｃＧＰ６７Ｂ−ＩＬ１８感染により得られた活性型ブタＩＬ−１８より有意に高く、その生物活性は５００ｎｇ／ｍｌのヒト活性型ＩＬ−１８（ＭＢＬ社製）に相当することが明らかとなった。
【００８０】
〔実施例５〕ブタカスパーゼ−１とブタ前駆体型ＩＬ−１８の共発現による昆虫細胞でのブタ活性型ＩＬ−１８の発現のブタカスパーゼ−１インヒビターによる抑制
実施例４と同様に、ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１及びＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８をＴｎ５細胞にＭＯＩ１０で感染させ、２７℃で４日間培養し、細胞を回収した。この際、培養液中に１００μＭの市販のカスパーゼ−１インヒビター（宝酒造社製）を加えた。この昆虫細胞内に発現したブタＩＬ−１８の分子量を、公知の方法（Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）に従い、抗ブタＩＬ−１８モノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより分析した結果を図４に示す。図４において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は野生型バキュロウイルス感染昆虫細胞、レーン２はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８感染昆虫細胞、レーン３はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８／ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１感染昆虫細胞、レーン４は１００μＭカスパーゼ−１インヒビター存在下でのＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８／ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１感染昆虫細胞による結果を示す。矢印はブタ活性型ＩＬ−１８を示す。
【００８１】
図４によれば、共発現により出現するブタ活性型ＩＬ−１８のバンドはカスパーゼ−１インヒビターの添加により完全に消失し、このブタ前駆体ＩＬ−１８からブタ活性型ＩＬ−１８への昆虫細胞内でのプロセッシングが、ブタカスパーゼ−１を発現する組換えバキュロウィルスを共感染したことによるカスパーゼ−１の活性に特異的なものであることが明らかとなった。
【００８２】
〔実施例６〕ブタカスパーゼ−３とブタ前駆体型ＩＬ−１８の共発現による昆虫細胞内でのブタＩＬ−１８の変性
実施例３（２）で得たＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−３を、実施例４と同様に、ＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８とともにＴｎ５細胞にＭＯＩ１０で感染させ、２７℃で４日間培養し、細胞を回収した。この昆虫細胞内に発現したブタＩＬ−１８の分子量を、公知の方法（Ｙ  ｍｕｎｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１２，  ５６６−５７２）に従い、抗ブタＩＬ−１８モノクローナル抗体を用いたイムノブロットにより分析した結果を図５に示す。図５において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は野生型バキュロウイルス感染昆虫細胞、レーン２はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８感染昆虫細胞、レーン３はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８／ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１感染昆虫細胞、レーン４はＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８／ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−３感染昆虫細胞による結果を示す。黒矢印はブタ活性型ＩＬ−１８を示し、白矢印はブタＩＬ−１８の変性産物を示す。
【００８３】
図５によれば、ブタカスパーゼ−３を発現する組換えウィルスとの共発現においては、ブタ前駆体ＩＬ−１８から分子量約１６ｋＤａの変性産物が生じることが明らかとなった。昆虫細胞は内在性のカスパーゼ−３様活性を持つことが報告されており（Ｍ  Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  １４２１−１４２４）、本結果から、カスパーゼ−３に特異的なインヒビターを用いることにより、さらに昆虫細胞におけるブタＩＬ−１８の生産量が増加することが期待される。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、カスパーゼ活性を有するタンパク質（特にブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３）、それをコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡに相補的なＲＮＡが提供される。
本発明のＤＮＡを用いれば、遺伝子工学的手法により容易にかつ大量にブタカスパーゼ（特にブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３）を生産することが可能となる。
【００８５】
また、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡはハイブリダイゼーションのプローブとして利用することができ、ブタマクロファージ系の細胞におけるＩＬ−１βとＩＬ−１８の活性化制御機構の研究に利用できる。
さらに、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づいて、各種臓器や培養細胞におけるブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３のｍＲＮＡの発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲのプライマーを構築できる。
【００８６】
さらに、本発明のタンパク質及びＤＮＡは、ブタカスパーゼ−１及びブタカスパーゼ−３並びにそのインヒビターの利用によるブタのアポトーシスの関与する生体反応、例えば、繁殖領域における卵胞の閉鎖や黄体の退行あるいはウィルスや細菌感染症における炎症反応の人為的制御法に利用できる。
【００８７】
さらに、本発明のタンパク質及びＤＮＡは、ブタをはじめとする家畜における活性型のＩＬ−１β及びＩＬ−１８組換えタンパクの効率的生産に利用できる。
さらに、本発明のタンパク質及びＤＮＡは、ブタをはじめとする家畜における種々の病原体の感染防御抗原等によるワクチン開発の際のアジュバントとして利用できる。
【００８８】
【配列表】
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【００８９】
【配列表フリーテキスト】
（１）配列番号５：ＰＣＲ用プライマー
（２）配列番号５：ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔ又はｕである（存在位置：９）
（３）配列番号５：ｙはｔ，ｕ又はｃである（存在位置：１２）
（４）配列番号５：ｒはｇ又はａである（存在位置：１５）
（５）配列番号５：ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔ又はｕである（存在位置：１８）
（６）配列番号５：ｙはｔ，ｕ又はｃである（存在位置：１９）
（７）配列番号６：ＰＣＲ用プライマー
（８）配列番号６：ｙはｔ，ｕ又はｃである（存在位置：１）
（９）配列番号６：ｓはｇ又はｃである（存在位置：１６）
（１０）配列番号６：ｒはｇ又はａである（存在位置：１９）
（１１）配列番号６：ｒはｇ又はａである（存在位置：２２）
（１２）配列番号７：ＰＣＲ用プライマー
（１３）配列番号７：ｓはｇ又はｃである（存在位置：６）
（１４）配列番号７：ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔ又はｕである（存在位置：１１）
（１５）配列番号７：ｙはｔ，ｕ又はｃである（存在位置：１２）
（１６）配列番号７：ｒはｇ又はａである（存在位置：１３）
（１７）配列番号７：ｍはａ又はｃである（存在位置：１７）
（１８）配列番号７：ｍはａ又はｃである（存在位置：２１）
（１９）配列番号８：ＰＣＲ用プライマー
（２０）配列番号８：ｙはｔ，ｕ又はｃである（存在位置：１）
（２１）配列番号８：ｒはｇ又はａである（存在位置：１３）
（２２）配列番号８：ｓはｇ又はｃである（存在位置：１６）
（２３）配列番号９：ＰＣＲ用プライマー
（２４）配列番号１０：ＰＣＲ用プライマー
（２５）配列番号１１：ＰＣＲ用プライマー
（２６）配列番号１２：ＰＣＲ用プライマー
（２７）配列番号１５：ＰＣＲ用プライマー
（２８）配列番号１６：ＰＣＲ用プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】ブタカスパーゼ−１及びブタ前駆体ＩＬ−１８の共発現により、（Ａ）培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８；及び（Ｂ）昆虫細胞内に発現されたブタＩＬ−１８；の分子量を、イムノブロットにより分析した結果を示す電気泳動写真である。
【図２】培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８の分泌量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図３】培養上清中に分泌されたブタＩＬ−１８の生物活性を測定した結果を示す図である。
【図４】ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−１及びＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８のカスパーゼ−１インヒビター存在下での共発現により、昆虫細胞内に発現したブタＩＬ−１８の分子量を、イムノブロットにより分析した結果を示す電気泳動写真である。
【図５】ＡｃｐＶＬ１３９２−ｃａｓｐ−３及びＡｃｐＶＬ１３９２−ＩＬ１８の共発現により、昆虫細胞内に発現したブタＩＬ−１８の分子量を、イムノブロットにより分析した結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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