(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニバクテリウム・グラニュローサム (Propionibacteriumgranulosum) ＡＤ３０００１  生工研菌寄（番号 FERM P-15018）に属する菌体を培養して得られる培養物、又は該培養物を除菌して得られる培養上清物の一方又は両方を含む化粧料。
【請求項２】
アトピー性皮膚炎用化粧水として用いられる請求項１に記載の化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は抗菌性組成物及びその用途に関し、更には皮膚有害菌に対して特異的又は選択的に抗菌作用を示す抗菌性組成物、これを含有する化粧料、アトピー性皮膚炎及び該抗菌性成分を産生する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アトピー性皮膚炎の原因については十分に解明されていないが、アトピー性皮膚病変部の常在菌分析からスタフィロコッカス・アウレウス菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が高頻度に検出されることが知られており、皮膚病変の憎悪因子の一つと考えられている。故に治療剤としては抗菌剤（テトラサイクリン、セファロスポリン系、ニューキノロン系），ステロイド剤（プレドニン、コルチコステロン）などが用いられている。他方、健康な肌の人の皮膚の常在細菌叢（マイクロフローラ）をみると、スタフィロコッカス・エピデルミディス菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が好気性マイクロフローラのほとんどを占めているのに対し、肌荒れしている人の肌荒れ部位では前者に比べてスタフィロコッカス・エピデルミディス菌の数は著しく減少しており、皮脂量の多い肌荒れタイプの肌にはマイクロコッカス菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属やスタフィロコッカス・アウレウス等のマイクロフローラが大半を占め、これらは、皮膚へ悪い物質を分泌しているとして有害菌と言われている。従来から肌荒れ防止及び改善には天然抽出物（プラセンタエキス、へチマエキスなど）、皮膚賦活剤（アミノ酸類、ビタミン類など）あるいは保湿剤（グリセリン、尿素、など）が用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、抗菌剤は抗菌スペクトルが広すぎる為に、皮膚有害菌以外の有用常在菌まで殺し正常なマイクロフローラの形成を妨げてしまう。また、服用によるアレルギー、胃腸障害などの副作用がある。従って、確実な治療効果を発揮しかつ副作用の少ない抗菌剤、例えばスタフィロコッカス・アウレウス菌やマイクロコッカス属菌に対して抗菌作用を示す皮膚に優しい低刺激性の抗菌性組成物が望まれた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は、正常な状態の皮膚に存在する細菌を培養し、その培養液よりマイクロコッカス属及びスタフィロコッカス・アウレウスに対して抗菌作用を示す物質の検索を目的として鋭意研究を重ねた結果、プロピオニバクテリウム・グラニユローサムに属する菌の培養液中に皮膚有害菌に対して特異的に抗菌活性を示す成分があること、さらにこれを含有する化粧料がアトピー性皮膚炎の治療に有用であることを見いだし、本発明を完成した。即ち、本発明はプロピオニバクテリウム・グラニュローサムに属し、皮膚有害菌に対して特異的に抗菌作用を示す成分を産生する菌を培養して得られる培養液、または該培養液を除菌して得られる培養上清を含有することを特徴とする、皮膚有害菌に対して特異的に抗菌作用を示す抗菌性組成物並びにこれを含有する化粧料及びアトピー性皮膚炎、並びに当該抗菌作用を示す成分を産出する微生物を提供するものである。
【０００５】
本発明において、皮膚有害菌に対して特異的に抗菌作用を示す成分を産生する菌としては、例えばＡＤ３０００１株（以下本菌株という）が挙げられる。本菌株の菌学的性質は以下の通りである。
0003579134.tif 000002
以上の性質をもとに、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４年）の記載から、本菌株をプロピオニバクテリウム・グラニュローサム  ＡＤ３０００１と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。（平成７年６月３０日寄託）（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５０１８）。
【０００６】
本発明に用いる皮膚有害菌に対して特異的に抗菌作用を示す成分は、上記菌株を栄養源含有培地に接種し嫌気的に培養すれば、培養液中に生産される。かかる菌株としては、上記ＡＤ３０００１株はもとより、その人工変異株あるいは自然変異株であっても上記成分を産生する能力を有するものであれば、全て本発明に使用することができる。
【０００７】
【実施例】
以下、実施例を例示して本発明の効果をより一層具体的明瞭に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
実施例  １
本菌株プロピオニバクテリウム・グラニュローサムＡＤ３０００１をＧＡＭ液体培地    ３００ｍｌ（０．５ｖ／ｖ％）に接種し、３７℃、５日間嫌気的に静置培養して生菌数１０９個  ／ｍｌの培養液を作り、得られた培養液を１２，０００  ｒｐｍの連続遠心分離に付し、菌体上清を０．２２マイクロンのフィルターを用いて無菌濾過し培養上清液を得た。
ＧＡＭ液体培地の組成（１ｌ当たり）
ペプトン                                １０．０  ｇ
大豆ペプトン                          ３．０  ｇ
プロテオーゼペプトン                １０．０  ｇ
消化血清末                        １３．５  ｇ
酵母エキス                                ５．０  ｇ
肉エキス                                    ２．２  ｇ
肝臓エキス末                            １．２  ｇ
ブドウ糖                                ３．０  ｇ
リン酸二水素カリウム                  ２．５  ｇ
塩化ナトリウム                            ３．０  ｇ
溶性デンプン                          ５．０  ｇ
Ｌ−システイン塩酸塩                    ０．３  ｇ
チオグリコール酸                    ０．３  ｇ
ｐＨ                        ７．３±０，１
【０００８】
上記実施例  １で得られた培養上清  ０．０２  ｍｌを直径６ｍｍのペーパディスクに含ませ、予め純粋培養したマイクロコッカス属の菌株を接種した標準寒天培地に置いて好気的に３７℃、２４時間培養し、そのテ゛ィスクの周囲に透明な発育阻止帯が形成されているか否かを観察し、阻止円の径を測定した結果を表１に示す。なお、菌体を接種しなかったＧＡＭ培地上清には発育阻止帯の形成は認められなかった。
【表１】
0003579134.tif 000003
【０００９】
上記、実施例  １で得られた培養上清を減圧濃縮し凍結乾燥して粗抗菌粉末を得た。得られた抗菌粉末の皮膚有害菌を含む皮膚常在菌に対する抗菌作用は９６穴のマルチトレイを使用するマイクロブロス希釈法常法により測定した。サンプルは滅菌精製水に溶かした連続濃度希釈溶液（０．１ｍｌ）をマルチトレイの穴に加え、更に２倍濃度のＧＡＭ培地に試験菌を加えた懸濁液（１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を０．１ｍｌずつ加えた。マルチトレイを好気中で３７℃，４８時間（嫌気性菌は嫌気中で７２時間）培養した。得られた最小阻止濃度（ＭＩＣ）の試験結果を表  ２に示す。
【表２】
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上記のごとく、培養上清乾燥粉末の水溶液は皮膚有害菌といわれるスタフィロコッカス・アウレウス菌、マイクロコッカス菌属、バチルス菌属、大腸菌属の試験菌に対して顕著な生育阻止効果が認められた。一方、健康な皮膚に常在するプロピオニバクテリウム・アクネス、あるいは、スタフィロコッカス・エピデルミデスは、ほとんど阻害効果が認められなかった。
【００１０】
安全性
上記実施例１で得られた培養上清にジクロロメタン：メタノール（２：１）を加え脂質成分を除去した水溶性画分をボランテイア５人の前腕曲内側皮膚に貼付し、２４時間後の皮膚刺激性についての観察を行い表  ３に示す結果を得た。
【表３】
0003579134.tif 000005
上記のように、安全性についてはなんら問題はなかった。
【００１１】
実施例  ２  （化粧料）
上記実施例１で得られた培養上清液にジクロロメタン：メタノール（２：１）を加え脂質成分を除去した水溶性画分を凍結乾燥して得られた乾燥粉体１０ｇを精製水９０ｇに溶かしたものを用意し、種々のスキンケア化粧品基材と１：１までの比率で使用時手のひらで混合し、皮膚に適用することにより、有用菌の優勢な皮膚常在菌叢を形成維持することができる化粧料が得られた。
【００１２】
実施例  ３  （肌荒れ及びアトピー性皮膚炎用化粧水）
上記実施例１で得られた培養上清液にジクロロメタン：メタノール（２：１）を加え脂質成分を除去した水溶性画分を凍結乾燥して得られた乾燥粉体５ｇを精製水７７ｇにとき、ついでグリセリン５ｇを混合し、さらに予め９５％エチルアルコール１０ｇにオレイルアルコール０．１ｇ、ポリオキシエチレンモノオレエート１．０ｇ、パラオキシ安息香酸メチルエステル０．１ｇ、少量の酸化防止剤、香料及び色素を混合溶解させたものを攪拌添加して化粧水を得た。対象化粧水として培養上清液を含まないものを調製し、肌荒れとアトピー性皮膚炎をもつ男子ボランテア（１４歳）の炎症部に塗布テストしたところ、使用感は良好であり、スタフィロコッカス・アウレウスとマイクロコッカスは本試験では、検出限界以下となり、使用前のレベルから激減しており正常な皮膚常在菌叢を形成する上でプラスに働くことが示された。
【００１３】
実施例  ４  （クリーム）
上記実施例１で得られた培養上清液にジクロロメタン：メタノール（２：１）を加え脂質成分を除去した水溶性画分を凍結乾燥して得られた乾燥粉体５ｇ、グリセリン５ｇ，ポリエチレングリコール４００を２ｇ及び精製水７０ｇを７０℃加熱混合溶解したもの中へ、予めセタノール４ｇ，スクワラン５ｇ，ステアリン酸１ｇ，ミツロウ１ｇ，ワセリン２ｇ，グリセリンモノステアレート２ｇ，パラオキシ安息香酸エチルエステル０．１ｇ、少量の香料を加熱混合溶解させたものを攪拌混合して、ホモジナイザーで乳化し室温まで冷却してクリームを得た。（配合量は重量％）
【００１４】
実施例  ５  （ローシヨン）
上記実施例１で得られた培養上清液にジクロロメタン：メタノール（２：１）を加え脂質成分を除去した水溶性画分を凍結乾燥して得られた乾燥粉体５ｇ、グリセリン８ｇ及び精製水４６ｇを７０℃で加熱混合溶解したものを、予めマイクロクリスタリンワックス１ｇ、ミツロウ２ｇ，ラノリン２ｇ，流動パラフィン３０ｇ、ソルビタンセスキオレイン酸エステル４ｇ，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（２０  Ｅ．Ｏ）１ｇ，ステアリン酸アルミニウム０．２ｇ，パラオキシ安息香酸エチルエステル０．１ｇ，及び少量の香料を加熱混合溶解させたものへ攪拌混合して、ホモジナイザーで乳化し室温まで冷却してクリームを得た。（配合量は重量％）
【００１５】
【発明の効果】
本発明の抗菌性組成物には皮膚有害菌に対して特異的に抗菌活性を有する。  従ってこれを含有する化粧料は、皮膚上に常在する他の有用微生物に影響を与えず、正常な皮膚常在菌叢に戻し、肌荒れ及びアトピー性皮膚炎を有効に治癒させることが期待できる。