(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
【化１】
0003568552.tif 000005
[以下、配列番号１という]
で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸化合物、または、配列番号１における生物学的、生化学的、化学的、物理学的および構造的品質と実質的に同一な品質を示す化合物を与える配列番号１のアミノ酸の保存的変化を含み、かつアミロイド前駆体タンパク質のＭｅｔ５９６−Ａｓｐ５９７結合を切断するプロテアーゼとしての機能を有する機能的なその等価物。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸化合物を暗号化している下記の配列：
【化２】
0003568552.tif 000006
[以下、配列番号２という]
を含んでいる核酸。
【請求項３】
選択的ハイブリダイゼーションに好適な条件下に請求項２の化合物のＤＮＡ断片とハイブリッド形成する、ヒト染色体１９ライブラリー由来の４.０キロベースのＨｉｎｄIII断片を含んでいる、配列番号１のアミノ酸化合物を暗号化しているゲノムクローン。
【請求項４】
（ａ）患者から取り出したＤＮＡを制限酵素で消化し、
（ｂ）消化したＤＮＡを配列番号２の化合物に対応する標識したヌクレオチド配列、またはその一部とハイブリッド形成させ、
（ｃ）アルツハイマー病の症状を現わし、またはかって症状を現わしたことがあるドナー家族構成員の、同様に消化しハイブリッド形成させたバンドの形態とハイブリダイゼーションパターンを比較する
ことからなる患者のアルツハイマー病またはアルツハイマー病の発病傾向を決定するためのデータを収集する方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号１のタンパク質を試験物質と接触させ、
（ｂ）物理的に検出可能な手段によってタンパク質活性をモニターし、
（ｃ）試験物質を投与されていない対照と比較して、タンパク質活性と相互作用する物質、またはタンパク質活性に影響を与える物質を同定する
方法からなる、試験物質が配列番号１のタンパク質の機能的なリガンドであるかどうかを測定する検定。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
β−アミロイドペプチド（β／Ａ４）として知られている４２〜４３残基のペプチドがアルツハイマー病およびダウン症候群に関与している。研究者らは、この４キロダルトン（ｋｄ）のタンパク質の脳内異常蓄積がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる一層大きい前駆体タンパク質の切断に起因していると仮定した。正常なＡＰＰの切断はＡ４領域内で起こるので、これと異なった切断事件は正常な完全鎖長が生じたときに起こることが判る。β／Ａ４のアミノ末端残基はアスパラギン酸（ＡＳＰ）であることが最も多く、従ってこれらの事実は、ＡＰＰの５９６位のメチオニン（Ｍｅｔ）［Ｍｅｔ５９６、Ｊ．カン（Ｋａｎｇ）らのアミノ酸番号表示方法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２５巻、７３３頁（１９８７年））を用いる］とＡｓｐ５９７の間で切断するプロテアーゼがアミロイドを生成することを示している。従ってＡＰＰを切断してβ／Ａ４を生成するプロテアーゼはアルツハイマー病およびダウン症候群の特徴を明らかにする重要な手段である。
【０００２】
従来、研究者らは古典的なタンパク質精製技術を利用することによって、異常な切断事件の特徴を明らかにしようと企ててきた。これらの研究の結果、合成ペプチドのＭｅｔ−Ａｓｐ結合を切断する部分的に精製された６８キロダルトンのプロテアーゼが報告された［Ｃ．アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら、ニューロバイオロジー・オブ・エージング（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ）、１１Ａ巻、３０３頁（１９９０年）］。１９９１年にアブラハムおよびその共同研究者らは６８ｋｄプロテアーゼの切断パターンを既知のセリンプロテアーゼ類と比較した［Ｃ．アブラハムら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コンミュニムケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、１７４巻、７９０頁（１９９１年）］。その後、以前の研究で観察した活性が、実際は２つの独立したプロテアーゼの作用であることが同じ研究者らによって報告された。その１つはカルシウム依存性セリンプロテアーゼであり、もう１つはシステイン・メタロプロテアーゼであることが確認された［Ｃ．アブラハムら、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１５巻、１１５頁（１９９１年）、Ｃ．アブラハムら、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、５７巻、５１０９頁（１９９１年）］。これらのプロテアーゼの構造または特性については報告されなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以前に報告された酵素類とは構造的に異なり、ＡＰＰの切断によって、Ｍｅｔ５９６−Ａｓｐ５９７切断が期待される大きさのアミロイド原性断片を生じる新規酵素を提供する。従って新規酵素はアルツハイマー病およびダウン症候群の特徴をさらに明らかにするのに極めて有用である。そのうえ本発明を利用することによって、これらの疾患およびその他の関連疾患の処置をもたらし得る。
【０００４】
現在までのところ痴呆そのものが完全に証明されるまで、ヒトでアルツハイマー病を診断する満足すべき手段はなかった。アルツハイマー病によって痴呆が起こったと確認するには、患者の脳の死後剖検が必要である。本発明では、患者がまだ生存している間に、アルツハイマー病の患者またはアルツハイマー病の発病傾向をもつ患者を決定する手段を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本明細書の記載内容を明白にし、本発明の理解を助ける目的のため、下記の事項について定義する。
【０００６】
「２９３細胞」とは、グラハムらが報告した広く入手可能な形質転換したヒト初代胎児性腎細胞系［Ｆ．Ｌ．グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３６巻、５９〜７２頁（１９７７年）］をいう。この細胞系は、例えばジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、マリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、１０８５２−１７７６（ＡＴＣＣ）から、受入番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３のもとに入手し得る。
【０００７】
「ＡＶ１２細胞」とは、受入番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９５９５のもとにＡＴＣＣから入手し得る別の広く入手可能な細胞系をいう。
【０００８】
「アミロイド原性断片」とは、β／Ａ４ペプチドを含有しているＡＰＰ断片をいう。
【０００９】
「配列番号１の機能的な化合物」とは、ＡＰＰを切断できる配列番号１を含んでいる化合物をいう。
【００１０】
「クニッツ様ドメイン」とは、大豆トリプシンインヒビターと類似のプロテアーゼインヒビター、または大豆トリプシンインヒビターと類似のプロテアーゼインヒビターを暗号化している核酸配列をいう。例えばＰ．ポンテ（Ｐｏｎｔｅ）ら［ネーチャー、３３１巻、５２５頁（１９８８年）］、またはＲ．Ｅ．タンジ（Ｔａｎｚｉ）ら［ネーチャー、３３１巻、５２８頁（１９８８年）］、またはＮ．キタグチら［ネーチャー、３３１巻、５３０頁（１９８８年）］が報告したＡＰＰのクニッツ・プロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）領域はクニッツ様ドメインである。
【００１１】
「ｐＲｃ／ザイム（Ｚｙｍｅ）」とは、修飾したｐＲｃ／ＣＭＶ真核性発現ベクターをいい、ｐＲｃ／ＣＭＶベクターは商業的に入手可能である［インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、３９８５、ソレント（Ｓｏｒｒｅｎｔ）、バレイ（Ｖａｌｌｅｙ）Ｂｌｖｄ．、シュート（Ｓｕｉｔｅ）Ｂ、サンジエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、９２１２１］。プラスミドｐＲｃ／ザイムはヒト・シトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー、ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナル、ネオマイシン耐性遺伝子、エシェリキア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）におけるアンピシリン耐性マーカーとして有用なβ−ラクタマーゼ遺伝子、およびその他の多数の特徴（１９９１年、インビトロジェン社カタログ、２９頁）および全ザイムのコード領域を含んだ１４５１塩基対のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ挿入体を含んでいる。
【００１２】
「ｐＳザイム（ｐＳＺｙｍｅ）」とは、修飾したエシェリキア・コリ・クローニングベクターｐＳＰＯＲＴ−１（商標）［Ｅ．Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、ＤＮＡ、４巻、１６５頁（１９８５年）］をいい、プラスミドｐＳＰＯＲＴ−１（商標）は商業的に入手可能である［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ社、８４００、ヘルガーマン・コート（Ｈｅｒｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｕｒｔ）、ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、マリーランド、２０８７７］。このプラスミドはｐＵＣベクターからの複製開始点を含んでいる。このプラスミドはＣ．ヤニッシュ・ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら［ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３巻、１０３〜１１９頁（１９８５年）］に報告されており、アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、ザイムの全コード領域を含んだ１４５１塩基対のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ挿入体、およびその他の特徴を含んでいる。
【００１３】
「配列番号１の一部」とは、配列番号１の少なくとも６個の連続したアミノ酸残基をいう。
【００１４】
「ｍＲＮＡ」とは、イン・ビトロまたはイン・ビボの何れかで転写されたリボ核酸（ＲＮＡ）をいい、例えばＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ暗号配列の転写によってイン・ビトロで調製されたＲＮＡ転写物を含む。
【００１５】
「配列番号１または機能的なその等価物」とは、配列番号１、または配列番号１のアミノ酸配列の保存的な変化物をいい、ここでその保存的変化とは、配列番号１と実質的に同一な生物学的、生化学的、化学的、物理学的、および構造的品質を示す化合物を生じる。
【００１６】
「配列番号３」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化３】
ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  Ｇ
【００１７】
「配列番号４」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化４】
ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧ
【００１８】
「配列番号５」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化５】
ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＡ
【００１９】
「配列番号６」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化６】
ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＴＡＧ
【００２０】
「配列番号７」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化７】
ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＧＡ
【００２１】
「配列番号８」とは、以下に示すＤＮＡ配列をいう。
【化８】
ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  Ｔ
【００２２】
「トランスフェクション」とは、宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みを伴ない、または伴なわない宿主細胞への核酸の任意の伝達をいう。
【００２３】
「ザイム」とは、配列番号１のアミノ酸配列、またはその機能的な等価物をいう。
【００２４】
「ザイム関連バンドの立体配置」とは、本明細書に記載した制限断片多型の２種のバンド立体配置から選ばれた２種のバンド配置のうちの１つをいう。一方のパターンは２４００塩基対バンドを示すが、２５００塩基対バンドを示さない。他方のパターンは２５００塩基対バンドを示すが、２４００塩基対バンドを示さない。
【００２５】
本発明は、下記の配列：
【化９】
0003568552.tif 000002
［以下、配列番号１という］
で示されるアミノ酸配列、または機能的なその等価物を含むアミノ酸化合物を提供する。特に配列番号１であるアミノ酸化合物は好ましい。
【００２６】
当業者であれば、配列番号１の若干の変更がアミノ酸化合物の働きを変え得ないことを認めるであろう。例えばある疎水性アミノ酸は他の疎水性アミノ酸と交換し得、類似の側鎖をもつアミノ酸は互いに交換し得、塩基性アミノ酸は他の塩基性アミノ酸と交換し得、酸性アミノ酸は他の酸性アミノ酸と交換し得、小型アミノ酸は他の小型アミノ酸と交換し得、そのほか種々の保存的な入れ替えを実施し得る。例示したアミノ酸化合物と実質的に同一の態様で、実質的に同一の働きを付与するこれらの変化したアミノ酸化合物も、本発明の範囲に包含される。
【００２７】
当業者であれば、このタンパク質が多数の異なった方法によって合成できることは理解し得よう。本発明のすべてのアミノ酸化合物は、固相ペプチド合成法または組換え法等を含む当業界で既知の化学的な方法によって製造できる。上記の方法はともに米国特許第４６１７１４９号に記載されている。高収量を望むのなら、組換え法が好ましい。任意の所望のＤＮＡ配列を組み立てる一般的な方法はブラウンら［ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８巻、１０９頁（１９７９年）］によって報告されている。
【００２８】
他の生産経路も周知である。真核細胞での発現は配列番号２を経由して達成できる（後記）。例えば配列番号１を暗号化しているＤＮＡを含んでおり、シミアンウイルス４０、シトメガロウイルス、またはマウス乳がんウイルスで誘導された発現ベクターを使用して、真核細胞でアミノ酸化合物を生産することができる。また当業界で周知のように、ある種のウイルスも好適なベクターである。例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびラウス肉腫ウイルスは有用である。そのような方法は米国特許第４７７５６２４号に報告されている。発現に関する数種の別法が、サンブルックら［Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第１６および１７章（１９８９年）］によって報告されている。
【００２９】
本発明の別の実施態様では、配列番号１を暗号化している核酸配列を含んだ核酸化合物を包含する。当業者であれば理解し得るように、本発明のアミノ酸化合物は大部分のアミノ酸が１組以上の核酸トリプレットによって暗号化されている遺伝コードの同義性のため、多数の異なった核酸配列によって暗号化できる。それらの入れ替わった核酸配列は同一のアミノ酸配列を暗号化しているから、本発明はさらにこれらの入れ替わった核酸配列を包含する。好ましくは核酸化合物は、ＤＮＡ、センスまたはアンチセンスｍＲＮＡである。ザイムを暗号化しているＤＮＡ化合物の最も好ましい具体例は、下記の配列：
【化１０】
0003568552.tif 000003
［以下、配列番号２という］
を有するものである。ただしセンスおよびアンチセンスｍＲＮＡである核酸化合物も好ましい。
【００３０】
本発明はまた、配列番号１または機能的なその等価物を暗号化した核酸を含んでいる核酸ベクターを提供する。好ましい核酸ベクターはＤＮＡである核酸ベクターである。最も好ましいものは、配列番号２であるＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡベクターである。特に好ましいＤＮＡベクターはプラスミドｐＳザイムである。
【００３１】
エシェリキア・コリ／ｐＳザイムは配列番号２を含んだクローニングベクターを含んでいるが、この株をザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＲＲＬ）、アグリカル  チュラル・リサーチ・サービス（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）、Ｕ．Ｓ．デパートメント・オブ・アグリカルチャー（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイズ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、６１６０４に寄託し（１９９２年４月２９日）、ＮＲＲＬ  Ｂ−１８９７１の受入番号のもとにその保存培養株の一つとして貯蔵された。配列番号２は、例えば１４５１塩基対のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限断片としてプラスミドから単離できる。その他の断片も配列番号２を得るのに有用である。
【００３２】
またＤＮＡ配列は、ＡＢＳ［アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、８５０、リンカーン・センタードライブ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、ＣＡ、９４４０４］３８０Ｂ  ＤＮＡシンセサイザーのような商業的に入手可能な自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して合成することができる。またＤＮＡ配列は、米国特許第４８８９８１８号に報告されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産することができる。
【００３３】
またこれらのベクターの制限断片も提供される。好ましい断片は、ｐＳザイムの１４５１塩基対のＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限断片、８０３塩基対のＢｓｒＢＩ／Ｅｓｐ３Ｉ制限断片、および８１５塩基対のＥｃｏＮＩ／ＢｆａＩ制限断片である。
【００３４】
さらに本発明のＤＮＡベクターは好ましくは配列番号２、または機能的なその対応物の発現を推進させる位置にプロモーターを含む。プロモーターがヒト胎児性腎細胞（２９３細胞）、ＡＶ１２細胞、酵母細胞、またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞で機能するようなベクターが好ましい。最も好ましいＤＮＡ発現ベクターはプラスミドｐＲｃ／ザイムである。
【００３５】
標準的な手技を用いてエシェリキア・コリから単離できるプラスミドｐＳザイムを容易に修飾して、例えばエシェリキア・コリ、サッカロマイセテス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）科に属する酵母、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属のフォール・アーミーウオーム（ｆａｌｌ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）の卵巣に由来するＳｆ９細胞（バキュロウイルス発現系の宿主として普通に使用される）等を含むさまざまな生物で、ザイムを生産する発現ベクターを組み立てる［これらの手技については、例えばサンブルックら（前掲）参照］。
【００３６】
現在の文献はＡＶ１２発現ベクターを組み立て、ＡＶ１２宿主細胞をトランスフェクトする技術を含んでいる（例えば米国特許第４９９２３７３号参照）。また現在の文献は２９３発現ベクターを組み立て、２９３宿主細胞をトランスフェクトする多数の技術を含んでいる。
【００３７】
必要であれば周知の技術を用い、単に好適な調節要素を置き換えることによって、２９３細胞を利用する組立てのプロトコールをその他の細胞系の類似のベクター組立てに応用することができる。使用し得るプロモーターは、例えばチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオニンプロモーター、熱ショックプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、またはマウス乳がんウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、ＢＫウイルスプロモーターのような種々のウイルスプロモーター等が挙げられる。さらに「共通」配列から誘導し、または他のプロモーターのハイブリッドとして作り出して人工的に組み立てたプロモーターも本発明を実施する過程で使用し得る。
【００３８】
また本発明のＤＮＡ化合物はプライマーおよびプローブを含む。配列番号１、またはその一部を暗号化している少なくとも１８個連続した塩基対からなる核酸化合物は本発明に包含される。ＤＮＡであるプローブまたはプライマーは好ましい。最も好ましいプローブまたはプライマーは配列番号３および配列番号４である。当業者にとって、プローブおよびプライマーに関連する技術が周知であることは明白であろう。
【００３９】
例えば配列番号３または配列番号４の全部または一部を、暗号配列へハイブリッド形成するのに使用し得る。ついで周知の技術を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いて、完全鎖長の配列を生産できる。ついで完全鎖長の配列を任意の最も適したベクターへサブクローンすることができる。
【００４０】
別法として、通常の手段によってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため、配列番号３または配列番号４を５’末端で放射能で標識し得る。また結合したｍＲＮＡ転写物を逆転写するため、フィルターへ結合したザイム暗号化ＤＮＡの任意の一片を全ｍＲＮＡ転写物で飽和し得る。
【００４１】
プライマーおよびプローブは当業界周知の手段によって入手し得る。例えばｐＳザイムを単離したら、制限酵素およびそれに続くゲル分離を用いて、最も適した断片を単離し得る。
【００４２】
本発明のもう１つの態様は、ザイムのゲノムクローンである。好ましいゲノムクローンは、配列番号１を暗号化しているＤＮＡ断片とハイブリッド形成するヒト染色体１９ライブラリーからの４．０キロベースのＨｉｎｄＩＩＩ断片である。これは、配列番号２またはその一部とのハイブリダイゼーションによって得ることができる。例えば配列番号３および配列番号４を放射能標識し、ついで対応するゲノムＤＮＡを同定し、単離するために、染色体１９ライブラリーをプローブするのに使用し得る。
【００４３】
本発明はまた、ドナーのヒトＤＮＡを
（１）制限酵素ＴａｑＩで消化し、
（２）標識したザイムＤＮＡとハイブリッド形成して、ザイム関連バンドの形態（立体配置）を明らかにし、
（３）アルツハイマー病の症状を示し、またはかって症状を示したことがあるドナー家族の構成員の、同様に消化しハイブリッド形成したバンドの形態と比較する
ことからなるアルツハイマー病の診断検定を提供する。好ましくはアルツハイマー病の診断検定では、ドナーのヒトＤＮＡ供給源として血液試料を利用する。
【００４４】
ゲノムＤＮＡが本発明で提供され、ザイム関連制限断片鎖長の多型が本発明の開示によって確認されるから、この操作の残りの部分は当業界既知の方法によって達成し得る。例えば米国特許第４６６６８２８号には、これらの操作が記載されている［例えばＢ．リューイン（Ｌｅｗｉｎ）、ジーンズ（Ｇｅｎｅｓ）、７８頁（１９８７年）、レビュー・レストリクション・フラグメント・レングス・ポリモルフィズム・テクニクス・アンド・セオリー（ｒｅｖｉｅｗ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ）のような多数の参考文献がある］。
【００４５】
本発明によって提供された核酸を内蔵している宿主細胞は、本発明の範囲に包含される。好ましい宿主細胞は卵母細胞である。好ましい卵母細胞は、本発明のセンスｍＲＮＡまたはＤＮＡ化合物を注入したものである。一層好ましい卵母細胞は、本発明のセンスｍＲＮＡまたはＤＮＡ化合物を、ＡＰＰを暗号化しているＤＮＡまたはｍＲＮＡとともに注入したものである。最も好ましい本発明の卵母細胞はセンスｍＲＮＡを注入したものである。
【００４６】
それ以外の好ましい宿主細胞は、配列番号２を含んだベクターでトランスフェクトしたものである。配列番号２をトランスフェクトした好ましい宿主細胞としては、２９３細胞、ＡＶ１２細胞、酵母細胞、およびエシェリキア・コリ細胞等が挙げられる。最も好ましい２９３およびエシェリキア・コリの宿主細胞は、２９３／ｐＲｃ／ザイム、エシェリキア・コリ／ｐＳザイムである。
【００４７】
同様に好ましい宿主細胞は、配列番号２を含んでいるＤＮＡベクターとＡＰＰの暗号配列を含んでいるＤＮＡで同時トランスフェクトしたものである。２９３細胞、ＡＶ１２細胞、酵母細胞、およびエシェリキア・コリ細胞は特に有用な同時トランスフェクトの宿主細胞である。
【００４８】
卵母宿主細胞はリューベルトらが報告した方法に従って組み立てることができる［リューベルト（Ｌｕｅｂｂｅｒｔ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ＵＳＡ）（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ    ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＵＳＡ））、８４巻、４３３２頁（１９８７年）］。ＡＰＰを暗号化しているＤＮＡまたはＲＮＡ（ともに６９５および７５１アミノ酸の形）はセルコエらの報告に従って入手し得る［セルコエ（Ｓｅｌｋｏｅ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（ＵＳＡ）、８５巻、７３４１頁（１９８８年）］。その他の宿主細胞のトランスフェクションは当業界周知のものである。細胞の同時トランスフェクションは標準的な手技を用いて達成し得る［例えばゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２巻、１０４４頁（１９８２年）参照］。
【００４９】
従って本発明はまた、配列番号１を発現できる宿主細胞を組み立てる方法を提供する。その方法は、配列番号１を暗号化したＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることからなる。好ましい方法では２９３細胞を宿主細胞として使用する。この２９３細胞は受入番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３のもとにＡＴＣＣから入手し得る。別の好ましい方法としては、ＡＶ１２細胞を宿主細胞として使用する。ＡＶ１２細胞は受入番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ９５９５のもとにＡＴＣＣから入手し得る。別の好ましい方法では、サッカロマイセテス科に属する酵母細胞、または細菌エシェリキア・コリを宿主細胞として使用する。
【００５０】
好ましい方法では２９３細胞で配列番号２を含んでいる発現ベクターを利用する。この目的のため特に好ましいものはｐＲｃ／ザイムである。
【００５１】
別の好ましい方法は、（ａ）配列番号２を含んでいるＤＮＡベクター、および（ｂ）ＡＰＰ暗号配列を暗号化しているＤＮＡ発現ベクターからなる。最も好ましい方法では、ＤＮＡベクターｐＲｃ／ザイムを利用する。トランスフェクトした宿主細胞を、配列番号１が発現されるような当業者周知の条件下で培養し、このようにしてトランスフェクトした宿主細胞内でザイムを生産し得る。
【００５２】
また本発明は、本発明のプローブと相同なＤＮＡを同定する方法を提供する。この方法は、ハイブリッド形成条件下で試験核酸をプローブと組み合わせ、ハイブリッド形成する試験核酸を同定することからなる。この方法で使用する好ましいプローブは、配列番号３および配列番号４である。ハイブリダイゼーション技術は当業界周知のものである［例えばサンブルックら（前掲）参照］。
【００５３】
また本発明によって提供された化合物を利用する検定も本発明の範囲に包含される。提供された検定は、物質がザイムのリガンドであるかどうかを決定するものであって、その方法は、ザイムを物質と接触させ、物理的に検出可能な手段によってザイム活性をモニターし、ザイムと相互作用し、またはザイムに影響を与える物質を同定する方法からなる。
【００５４】
本発明の好ましい検定は、細胞培養検定、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検定、または合成競合検定である。
【００５５】
好ましい細胞培養検定は、ザイムおよびＡＰＰを暗号化している核酸を同時発現する卵母細胞、ＡＶ１２細胞、エシェリキア・コリ細胞、酵母細胞、または２９３細胞を使用する。好ましい同時発現細胞培養検定は２９３／ｐＲｃ／ザイムを利用するものである。好ましい検定は酵母細胞とＡＰＰのアミノ酸５８７〜６０６を暗号化しているＤＮＡ化合物を利用する。ザイム暗号化ＤＮＡおよびＭｅｔ５９６／Ａｓｐ５９７切断部位コドンを含んだＡＰＰ暗号化ＤＮＡを使用した酵母検定を実施する１方法が報告されている［スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびコホーン（Ｋｏｈｏｒｎ）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、ＵＳＡ、８８巻、５１５９頁（１９９１年）］。
【００５６】
最も好ましい卵母細胞検定はｍＲＮＡを同時発現する。最も好ましい細胞培養検定はウエスタンブロット分析、または物理学的に検定可能な手段として放射能標識したＡＰＰを使用する。好ましいＨＰＬＣ検定では、基質として完全鎖長の真核細胞で誘導したＡＰＰを利用する。
【００５７】
最も好ましい合成競合検定は、物質がクニッツ様ドメイン遺伝子生産物とザイムへの結合を競合するものである。最も好ましいザイム／クニッツドメイン競合検定は、ＡＰＰを放射性同位元素で標識したものである。
【００５８】
細胞培養検定はアウスベルらによって詳細に報告された方法に従って達成され得る［Ｆ．アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８９年、９．１〜９．５頁］。ＨＰＬＣ検定は主としてヒルズおよびチマシェフが報告した方法により実施し得る［ヒルズ（Ｈｉｒｓ）およびチマシェフ（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ）編、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、９１巻、第ＶおよびＶＩ節（１９８３年）］。ザイム／クニッツ様ドメイン結合または競合検定は、ベンネットおよびヤマムラの報告に従って実施し得る［Ｊ．ベンネット（Ｂｅｎｎｅｔ）およびＨ．ヤマムラ（Ｙａｍａｍｕｒａ）、ニューロトランスミッター・レセプター・バインディング（Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）、１９８５年、第３章］。
【００５９】
本発明はまた、ザイムを同定し、または精製する方法を提供する。この方法は試験タンパク質を抗ザイム抗体で飽和し、結合できなかった抗ザイム抗体を除去し、結合したまま残っている抗ザイム抗体を検出することからなる。抗体イメージング技術は当業界既知の方法である。
【００６０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例は単に発明を説明するためのものであって、これによって本発明の範囲を限定する目的をもつものではない。
【００６１】
実施例１：２９３細胞内におけるザイムの生産
エシェリキア・コリ・ｐＳザイムの凍結乾燥品のアリコートをザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリーズ、ペオリア、イリノイズ、ＵＳＡ、６１６０４から受入番号ＮＲＲＬ  Ｂ−１８９７１のもとに入手し、下記の方法で、培養として直接使用できた。この培養はＮＲＲＬに寄託された。
【００６２】
エシェリキア・コリ／ｐＳザイムの培養から塩化セシウム精製によってプラスミドｐＳザイムを単離した。ついでプラスミドｐＳザイムをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化した。生じた断片は直線状であった。ＤＮＡリガーゼを使用して、あらかじめ直線化したｐＲｃプラスミド（商標）（インビトロジェン、カタログ＃Ｖ７５０−２０）へこのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片およびＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカーをライゲーションした。
【００６３】
ついで新たに作成した配列番号２を含んでいるｐＲｃ／ザイム・ベクターでコンピテント・エシェリキア・コリ細胞をトランスフェクトし、これをアンピシリン含有培地で増殖することにより、アンピシリン耐性遺伝子を含んでいる細胞を選び出した。
【００６４】
エシェリキア・コリへｐＲｃ／ザイム・ベクターをトランスフェクトしたのち、ｐＲｃ／ザイムベクターを単離するため、引き続きプラスミド調製品を作成した。２９３細胞をｐＲｃ／ザイム・ベクターでトランスフェクトするため、チェンおよびオカヤマが開発した方法を用いた［Ｃ．チェン（Ｃｈｅｎ）およびＨ．オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、７巻、２７４５頁（１９８７年）］。これらの細胞を実施例２で報告する細胞培養検定に使用した。
【００６５】
２９３細胞内で安定な形質転換体を生産するため、抗生物質Ｇ４１８（ゲネチシン）による選択をこの段階に加えた。ついでＧ４１８の存在で生育したコロニーをザイムの供給源として使用した。
【００６６】
実施例２：細胞培養検定
ヒト胎児性腎細胞（２９３細胞）をｐＲｃザイムとＡＰＰ暗号化ベクターで同時トランスフェクトした。一方の場合は、６９５アミノ酸のＡＰＰを暗号化しているベクター（クニッツ様ドメインを欠いている）をｐＲｃザイムとともに同時トランスフェクトした。また他方の場合は、７５１アミノ酸のＡＰＰを暗号化しているベクター（クニッツ様ドメインを含む）をｐＲｃザイムともに同時トランスフェクトした。
【００６７】
トランスフェクションは標準的なリン酸カルシウム・トランスフェクションを用いて達成した。サンブルックら（前掲）が報告したようなそれ以外のトランスフェクション・プロトコールでも有効であった。６９５アミノ酸（ＫＰＩを含まず）のＡＰＰ暗号配列を使用すると、サンブルックら（前掲）が報告したようなＡＰＰタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に対する抗血清を使用するウエスタン・ブロット分析により、アミロイド原性断片が検出された。この方法では、オルタースドルフら［Ｔ．オルタースドルフ（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６５巻、４４９２〜４４９７頁（１９９１年）］が報告した抗ＢＸ６を使用した。７５１アミノ酸（ＫＰＩを含む）のＡＰＰを使用すると、アミロイド原性断片は検出されなかった。
【００６８】
実施例３：ＨＰＬＣ検定
ＡＰＰを暗号化しているバキュロウイルスで感染させた細胞で、完全鎖長のＡＰＰを生産する。この方法は、クノップスらの方法［Ｊ．クノップス（Ｋｎｏｐｓ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６６巻、７２８５頁（１９９１年）］によって達成される。ついで活性ザイムおよび試験化合物の存在でＡＰＰをインキュベートする。そのあとＡＰＰ断片を高速液体クロマトグラフィーによって分離する。それぞれプールした断片をヒルズおよびチマシェフの方法［ヒルズおよびチマシェフ編、メソッズ・イン・エンジモロジー、９１巻、第ＶおよびＶＩ節（１９８３年）］のような標準的な方法を用いて微量配列決定する。生成したアミロイド原性断片（Ｍｅｔ５９６またはＡｓｐ５９７の何れかで終わる）の量を、試験化合物が存在しない場合に生じる量と比較して、試験化合物のザイムに与える影響の強さを決定する。
【００６９】
実施例４：ザイム／クニッツ様ドメインの競合検定
ＡＰＰのＫＰＩドメインのペプチドを合成し、これを同位元素ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）で標識する。ついでＪ．Ｐ．ベンネットおよびＨ．ヤマムラの方法［ニュウーロトランスミッター・レセプター・バインディング、６１巻、（１９８５年）］に従って、競合結合検定を実施する。ついで従来のＥＬＩＳＡ検定の場合と同様に、ザイムをプラスチック微量滴定板ウエルへ結合させる。この段階の代表的なプロトコールの１つはＦ．アウスベルが報告している［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、２巻、１１．１〜１１．３（１９８９年）］。引き続き、放射能標識したＫＰＩドメインおよび未標識競合化合物を９６穴の微量滴定板ウエルへ添加する。ついでウエルを洗浄する。ザイムに対する未標識競合化合物の比親和性を計算するため、残留する同位元素を記録する。
【００７０】
実施例５：ゲノムクローンの単離
カロン２１Ａバクテリオファージ内のヒト染色体１９ゲノムライブラリーに特異的なゲノムライブラリーをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１、パークローン・ドライブ、ロックビル、マリーランド、ＵＳＡ２０８５２（ＡＴＣＣ）（カタログ番号５７７１１）から購入した。これらのファージをエシェリキア・コリＫ８０２  ｒｅｃＡ−宿主株（カタログ番号４７０２６）へトランスフェクトした。ファージの力価は、１マイクロリットル当たり６．５〜７．０×１０４プラーク形成単位であった。ザイムを暗号化している遺伝子のゲノムクローンを、ファージライブラリーの通常のスクリーニング［例えばサンブルックら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、２．６〜２．１１４（１９８９年）参照］によって単離した。
【００７１】
ポリメラーゼ連鎖反応［例えばショワルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）およびゾンマー（Ｓｏｍｍｅｒ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７７巻、９０〜９４頁（１９８９年）が報告したような］を利用して、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ精製した［バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐ．Ｏ．ボックス７０８、ロックビル・センター（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｃｅｎｔｒｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＵＳＡ、１１５７１、カタログ番号７３２−６０１０）ｐＲｃ−ザイムＤＮＡ断片へ配列番号５および配列番号６のプライマーを特異的にアニーリングすることにより、放射能標識したｃＤＮＡプローブを合成した。
【００７２】
ゼータ・プローブ（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ）（商標）・ブロッティング・メンブランの使用説明書（バイオ・ラド、カタログ番号１６４−０１５３）の記載に従い、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を６５℃で実施した。推定初代ザイム・バクテリオファージをクロロホルム２〜３滴を含有するＳＭ緩衝液中に貯蔵した。ついで単一で均質なプラーク（７１１−４）を３次スクリーンから単離した。ザイムへのイン・シトウ・ハイブリダイゼーションによって陽性であったλ−バクテリオファージＤＮＡの単離を標準的な手技を用いて達成した。
【００７３】
精製したλ−ファージ・ザイムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロース／ＴＢＥ［０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．１Ｍホウ酸、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸］ゲルで電気泳動した。ついで分離したＤＮＡを、ゼータ・プローブ（商標）使用説明書の２．５節に記載された非変性条件［０．５×ＴＢＥ泳動緩衝液、８０ボルト（一定）、１時間］、ついでゼータ・プローブ（商標）使用説明書の２．８節に記載された変性条件［０．４Ｍ  ＮａＯＨ、１０分間］を用いて、ゼータ・プローブ（商標）・ブロッティング・メンブラン上へ移動させた。
【００７４】
ｐＲｃ／ザイムのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片を含んでいる放射能標識したプローブを、ランダム・プライミングしたＤＮＡ標識キット（例えばベーリンガー・マンハイム・コーポレーション（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、９１１５、へーグ・ロード（Ｈａｇｕｅ  Ｒｏａｄ）、Ｐ．Ｏ．  ボックス  ５０４１４、インジアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インジアナ（Ｉｎｄｉａｎａ）、ＵＳＡ、４６２５０−０４１４、カタログ番号１００４７６０により商業的に入手可能である）とともに使用し、本発明のクローン中に３’暗号配列が見つかるかどうかを測定した。上記のゼータ・プローブ（商標）・メンブランへ前述のようにハイブリダイゼーションおよび洗浄を実施し、オートラジオグラフィーによりザイムの３’領域との相同性を明らかにした。
【００７５】
５’ザイムのコード領域を含んでいるファージ７１１−４を確かめるため、配列番号７および配列番号８を使用するポリメラーゼ連鎖反応をもう一度利用してカインツらの方法［カインツ（Ｋａｉｎｚ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー、２０２巻、４６頁（１９９２年）］に従い、３次プラーク精製した染色体１９ザイム・ファージＤＮＡから４７０塩基対のバンドを増幅した。このＤＮＡ断片を精製し、ついでｐＵｃ１９発現プラスミドへ前述のようにサブクローンした。５’ザイムｃＤＮＡコード領域の１〜３３配列、および５’ザイムコード領域の上流の追加的な２７２ヌクレオチドに対応するＤＮＡ配列の同一性を標準的な手技を用いるＤＮＡ配列分析によって確認した。
【００７６】
プラスミドの寄託：
ブダペスト条約［ザ・ブダペスト・トリーティー・オン・ジ・インターナショナル・レコグニション・オブ・ザ・デポジット・オブ・マイクロオーガニズムス・フォア・パーパシズ・オブ・パテント・プロシデュアズ（ｔｈｅ  Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）］の規定に従い、下記の培養を、ザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・センター（ＮＲＲＬ）、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス、Ｕ．Ｓ．デパートメント・オブ・アグリカルチャー、１８１５Ｎ．  ユニバーシティー・ストリート、ペオリア、イリノイズ、６１６０４へその永久保存株として寄託した。
【００７７】
0003568552.tif 000004