(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の理化学的性質を有する、例えば、グリフォラ フロンドサ(Grifola frondosa)由来のトレハロースホスホリラーゼ：
（１）トレハロースと無機リン酸またはその塩に作用してα−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースを生成し；
至適ｐＨ：ｐＨ６．０から６．５（３０℃）
ｐＨ安定性：４℃で２４時間処理したときｐＨ５．５から９．５の範囲で安定
至適温度：３０から３５℃（ｐＨ６．０）
温度安定性：ｐＨ７．０、３０分間処理したとき３５℃以下で安定
（２）α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成し；
至適ｐＨ：ｐＨ約７（３５℃）
ｐＨ安定性：４℃で２４時間処理したときｐＨ５．０から１０．０の範囲で安定
至適温度：３５から３７．５℃（ｐＨ７．０）
温度安定性：ｐＨ７．０、３０分間処理したとき３５℃以下で安定
（３）分子量：ゲル濾過法により約１２０，０００ダルトン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約６０，０００ダルトン。
【請求項２】
炭素源、および窒素源並びに無機塩を含有する栄養培地でグリフォラ フロンドサ(Grifola frondosa)を培養し、トレハロースホスホリラーゼを産生せしめ、次いで培養物からトレハロースホスホリラーゼを回収することを特徴とする請求項１に記載のトレハロースホスホリラーゼの調製方法。
【請求項３】
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースに請求項１に記載のトレハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロースと無機リン酸を生成させこれを採取することからなるトレハロースの製造法。
【請求項４】
無機リン酸またはその塩の存在下にトレハロースに請求項１に記載のトレハロースホスホリラーゼを作用させてα−Ｄ−グルコース １−リン酸を生成させこれを採取することからなるα−Ｄ−グルコース １−リン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、トレハロースの製造に有用なトレハロースホスホリラーゼ、特に温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２  （Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ）に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグレナグラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のＥＣ  ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告されている。また、フラムリナ  ベルチペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）より得られる酵素がα−グルコース  １−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるトレハロースホスホリラーゼとして報告されている（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ５５，  １４７−１５０  （１９８８）  ）。
しかし、上記文献に記載されているフラムリナ    ベルチペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来のトレハロースホスホリラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。この酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安定性が低いためと考えられる。従って、その酵素としての性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいいがたい。また、α−グルコース  １−リン酸とグルコースからのトレハロースの生産性も良いと言えない。
エンザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）  に記載されているＥＣ  ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成するトレハロースホスホリラーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述のような現状に鑑み、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供することを課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラーゼの調整方法、さらにこれを用いたトレハロースの製造方法を提供することを課題とする。本発明はα−Ｄ−グルコース  １  −リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生産する酵素を見いだしたことによりなされたものであり、β−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースとからトレハロースを生産する上記公知の酵素とは明らかに基質特異性が異なりまったく別種の酵素である。以下、本発明において述べるトレハロースホスホリラーゼとは、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成することができる酵素である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースから温度安定性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリラーゼを求め鋭意研究した結果、グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）  属、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）  属、リオフィルム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、レンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）  属、パヌス（Ｐａｎｕｓ）  属、クレピドツス（Ｃｒｅｐｉｄｏｔｕｓ）属、ラエチポルス（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ）属、ポリポレルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ）属、ファボルス（Ｆａｖｏｌｕｓ）  属、トリキャプツム（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ）属、オウデマンシエラ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ）  属、ナエマトロマ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ）  属、ロドフィルス（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｌｌｕｓ）属、グロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ホメス（Ｆｏｍｅｓ）  属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）  属、エルフビンギア（Ｅｌｆｖｉｎｇｉａ）  属、フォミトプシス（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）  属、ランプテロミセス（Ｌａｍｐｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）  属、フォリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属、トリコロマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属の菌株がトレハロースホスホリラーゼを生産することを見いだした。また、これら微生物の培養物から得られるトレハロースホスホリラーゼは、温度安定性に優れていることを見いだし本発明を完成するに至った。
本発明においてはじめて、温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼが単一酵素まで精製され、また、その理化学的性質の解明がなされた。
【０００５】
すなわち、本発明は、温度安定性に優れ、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成することができるトレハロースホスホリラーゼであり、また他の発明は、グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）  属、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）  属、リオフィルム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、レンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）  属、パヌス（Ｐａｎｕｓ）  属、クレピドツス（Ｃｒｅｐｉｄｏｔｕｓ）属、ラエチポルス（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ）属、ポリポレルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ）属、ファボルス（Ｆａｖｏｌｕｓ）  属、トリキャプツム（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ）属、オウデマンシエラ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ）  属、ナエマトロマ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ）  属、ロドフィルス（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｌｌｕｓ）属、グロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ホメス（Ｆｏｍｅｓ）  属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）  属、エルフビンギア（Ｅｌｆｖｉｎｇｉａ）  属、フォミトプシス（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）  属、ランプテロミセス（Ｌａｍｐｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）  属、フォリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属またはトリコロマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属に属しトレハロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物を培養してトリハロースホスホリラーゼを産生せしめ、培養物からトレハロースホスホリラーゼを採取することからなるトレハロースホスホリラーゼの製造法である。
【０００６】
また本発明は上記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼを用い、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを製造するトレハロースの製造法に関するものである。また、本出願発明は上記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼを用いトレハロースからα−Ｄ−グルコース  １−リン酸を製造するα−Ｄ−グルコース
１−リン酸の製造法に関するものである。
【０００７】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明により得られたトレハロースホスホリラーゼは、次の理化学的性質を有する。
１．作用：α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロース合成反応」と呼称する）。無機リン酸の存在下トレハロースに作用してα−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースを生成する（以下「加リン酸分解反応」と呼称する）。
２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としてはトレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与体としてα−Ｄ−グルコース    １−リン酸に、糖受容体としてＤ−グルコースに作用する。
３．至適作用ｐＨ：
トレハロース合成反応    （３５℃）
最大活性を示すｐＨ      約７．０
最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲            ６．５から７．５
加リン酸分解反応    （３０℃）
最大活性を示すｐＨ      ６．０から６．５
最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲          ５．５から７．５
４．ｐＨ安定性：
トレハロース合成反応                ５．０から１０．０    （４℃、２４時間）
加リン酸分解反応                      ５．５から９．５      （４℃、２４時間）
５．至適反応温度：
トレハロース合成反応（ｐＨ７．０）
最大活性を示す温度        ３５から３７．５℃
最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲    ３０から４０℃
加リン酸分解反応（ｐＨ６．０）
最大活性を示す温度        ３０から３５℃
最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲    ２５から３７．５℃
６．温度安定性：
トレハロース合成反応        ３５℃、３０分にて安定    （ｐＨ７．０）
加リン酸分解反応                ３５℃、３０分にて安定    （ｐＨ６．０）
７．金属による阻害：
亜鉛、銅により阻害
８．金属の要求性：
なし
９．分子量：
約１２０，０００ダルトン（ＧＰＣによる）
約６０，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
【０００８】
α−Ｄ−グルコース    １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを生成することができる上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従来報告がなく本発明において、初めて報告される。フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）由来のトレハロースホスホリラーゼ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ５５，  １４７−１５０  （１９８８）  ）は、トレハロース合成反応の至適ｐＨは６．３、トレハロースの加リン酸分解反応の至適ｐＨは７．０と報告されている。また、本発明者らの研究によればフラムリナ  ベルチペス  （Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来のトレハロースホスホリラーゼは、３０℃、３０分の温度処理により酵素活性が失われた。従って本発明によるトレハロースホスホリラーゼは温度安定性、至適ｐＨにおいてフラムリナ由来のトレハロースホスホリラーゼと明らかに異なる新規なトレハロースホスホリラーゼである。
【０００９】
また、本発明者らはグリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）  属、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）  属、リオフィルム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、レンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）  属、パヌス（Ｐａｎｕｓ）  属、クレピドツス（Ｃｒｅｐｉｄｏｔｕｓ）属、ラエチポルス（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ）属、ポリポレルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ）属、ファボルス（Ｆａｖｏｌｕｓ）  属、トリキャプツム（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ）属、オウデマンシエラ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ）  属、ナエマトロマ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ）  属、ロドフィルス（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｌｌｕｓ）属、グロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ホメス（Ｆｏｍｅｓ）  属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）  属、エルフビンギア（Ｅｌｆｖｉｎｇｉａ）  属、フォミトプシス（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）  属、ランプテロミセス（Ｌａｍｐｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）  属、フォリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属及びトリコロマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属の微生物がトレハロースホスホリラーゼを生産することを見いだした。本菌属中にこのような酵素が存在することは従来知られていない。
【００１０】
また、上記生産菌により生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または上記理化学的性質を持ち温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼによるトレハロースあるいはα−Ｄ−グルコース    １−リン酸の製造法については、従来知られていない。
【００１１】
本発明におけるトレハロースホスホリラーゼの製造法について説明する。本発明において使用する微生物は、グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）  属、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）  属、リオフィルム（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、レンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）  属、パヌス（Ｐａｎｕｓ）  属、クレピドツス（Ｃｒｅｐｉｄｏｔｕｓ）属、ラエチポルス（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ）属、ポリポレルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ）属、ファボルス（Ｆａｖｏｌｕｓ）  属、トリキャプツム（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ）属、オウデマンシエラ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ）  属、ナエマトロマ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ）  属、ロドフィルス（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｌｌｕｓ）属、グロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ホメス（Ｆｏｍｅｓ）  属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）  属、エルフビンギア（Ｅｌｆｖｉｎｇｉａ）  属、フォミトプシス（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ）属、アルミラリエラ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａ）  属、ランプテロミセス（Ｌａｍｐｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）  属、フォリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属またはトリコロマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属に属し、トレハロースホスホリラーゼの生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよい。また、本発明においては上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼを生産することができる任意の微生物を使用することもできる。
【００１２】
本発明のトレハロースホスホリラーゼは生産菌の変異株取得は以下のように行われる。一般的に使用される各種変異誘起剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、紫外線等を用いて、上記トレハロースホスホリラーゼ生産菌を処理することにより変異株を得ることができる。
本発明のトレハロースホスホリラーゼはまた、上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼ、またはその修飾されたトレハロースホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿主に挿入し、そしてその宿主を培養することにより製造することができる。
上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を得るための一つの方法として下記の方法がある。該トレハロースホスホリラーゼのＮ末端アミノ酸から約２０番目までのアミノ酸の配列より推定されるＤＮＡ塩基配列を合成し、この部分ＤＮＡ塩基配列をプローブとする。上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼ生産菌のゲノミックＤＮＡをＥＭＢＬ３等のλファージにイン  ビトロ  パッケージングを行うことによりゲノミックライブラリーを作製する。このゲノミックライブラリーのＤＮＡと前述のプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより該トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローニングすることができる。さらに、この遺伝子を例えばサッカロマイセス属またはアスペルギルス属中で発現できるベクターに挿入し、このベクターによってサッカロマイセス属またはアスペルギルス属を形質転換することにより該トレハロースホスホリラーゼを発現する株を選択する。このような方法により該トレハロースホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を保有する宿主を得ることができる。
【００１３】
また、本発明においては、上記理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼと免疫化学的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用することもできる。本発明における免疫化学的性質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリラーゼとは、公知のオクテロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ  ）二重免疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８６、東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるいは部分融合するような沈降線を与えるトレハロースホスホリラーゼである。
具体的なトレハロースホスホリラーゼ生産菌株の例としては、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている表１に示すような菌株を使用することができる。
【００１４】
また、プレウロツス    コルヌコピアエ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）ＩＦＯ    ３０５２８、ラエチポルス  スルフレウス  （Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）  ＩＦＯ    ８４０６、ラエチポルス  ベルシスポルス  （Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ ｖｅｒｓｉｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ    ９０４３、ポリポレルス  ピシペス  （Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ ｐｉｃｉｐｅｓ）ＩＦＯ    ３０３５５、オウデマンシエラ    カナリ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ ｃａｎａｒｉｉ）ＩＦＯ    ３１２１６、ガノデルマ  アプラナツム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）  ＩＦＯ    ６４９８、フォリオタアディポサ  （Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ）ＩＦＯ    ９７７９、トラメテス  ヒルスタ  （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）ＡＴＣＣ  ２０５６１、トラメテス  ベルシコロル  （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）  ＡＴＣＣ  ２０５４７、コリオルス  コンソルス  （Ｃｏｒｉｏｌｕｓｃｏｎｓｏｒｓ）ＡＴＣＣ  ２０５６５、コリオルス    パルガメヌス  （Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｐａｒｇａｍｅｎｕｓ）  ＡＴＣＣ  ２０５６２のような菌株を使用することもできる。
【００１５】
0003563104.tif 000002
0003563104.tif 000003
【００１６】
これら寄託菌の菌株の同定、命名は今関六也氏、本郷次男氏共著による「原色日本菌類図鑑」（正（昭和４９年）、続（昭和５０年）保育社）、「原色日本新菌類図鑑」（Ｉ巻（昭和６２年）、ＩＩ巻（平成元年）保育社）および伊藤誠哉氏著「日本菌類誌」（ＩＩ巻１部（昭和１１年）、２部（昭和１４年）、３部（昭和２５年）、４部（昭和３０年）、５部（昭和３４年）養賢堂）に準拠するものである。
【００１７】
本発明の方法に使用し、また通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した菌種は、該菌種が着生している腐朽植物体の一部、その植物体上に発生している子実体の組織、または胞子を適当な寒天培地に移植し、適温で数週間培養するという培養操作を３回ないし４回繰り返し行なって純粋分離した。
【００１８】
次に、本発明において用いる微生物を培養する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、グリセロール、スターチ、廃糖密などの一般的に使用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロースを適宜用いてもよい。
【００１９】
窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さらに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属塩を使用することができる。また、上記微生物の培養は、担子菌の子実体の培養に使用される培養基材、例えば鋸屑、米糠、厩肥等を用いて行なうこともできる。他に種々の界面活性剤を消泡剤として使用することもできる。
【００２０】
培養は、培養温度約２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃、培地の初発ｐＨは４．５から８．０、好ましくは５．０から７．０として、液体振とう培養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等により好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培養等により行なわれる。
【００２１】
酵素源からのトレハロースホスホリラーゼの調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にあるので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレハロースホスホリラーゼの分離精製は、培養終了後の培養菌体を遠心分離し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当量の緩衝液に懸濁し、菌体破砕をする。菌体破砕は、従来から行なわれている超音波による菌体破砕、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミック社、ＵＳＡ）による菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕などにより行なうことができる。破砕した後不溶物を分離除去して得られる液を粗酵素液とする。粗酵素液はそのままトレハロースまたはα−Ｄ−グルコース  １−リン酸の製造に用いることもできるが、さらに分離、精製して用いることもできる。
【００２２】
粗酵素液の分離、精製法としては、硫安沈澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイドロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このようにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いてもよいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルアミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生体触媒として用いることもできる。
【００２３】
酵素の活性は、以下により求めた。すなわちトレハロース１０．８  ｇ    、グルタチオン８６０  ｍｇ  、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．２  ｍｇ  を５７  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し全量を１００  ｍｌ  とした溶液１４００μｌ、２０ｍＭ    ＮＡＤＰ＋水溶液１００μｌ、２６    ｍＭ塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．３４  ｍＭ  グルコース  １，６−二リン酸水溶液１００μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ｍｌ    水溶液    １００μｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ｍｌ水溶液１００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合し、３０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０  ｎｍ  の吸光度によって経時的に測定する。この条件下で１分間に１μｍｏｌ  のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を１単位とする。
【００２４】
本発明によるトレハロースホスホリラーゼの完全に純化された酵素の比活性値は、約３．６単位／  ｍｇ  蛋白質を示す。また、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単一の蛋白バンドが観察される。
【００２５】
本発明のトレハロースホスホリラーゼを利用して、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースからトレハロースを製造するためには、α−Ｄ−グルコース  １−リン酸５  ｍＭ  から４  Ｍ、好ましくは５０    ｍＭ    から３  Ｍ、Ｄ−グルコース５  ｍＭ  から４  Ｍ、好ましくは５０  ｍＭ  から３  Ｍ    を本出願発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、ｐＨ２から１０、好ましくはｐＨ４から９、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から５０℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質Ｄ−グルコース１ｇ  に対して０．０１単位以上、好ましくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２６】
また、本発明のトレハロースホスホリラーゼ酵素を利用して、トレハロースからα−Ｄ−グルコース  １−リン酸を製造するためには、トレハロースを５ｍＭから３  Ｍ、好ましくは５０ｍＭ    から２  Ｍ、無機リン酸およびその塩５ｍＭ    から３  Ｍ、好ましくは５０ｍＭ    から２  Ｍを本出願発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下に、ｐＨ２から１０、好ましくはｐＨ４から９、反応温度を１０から８０℃、好ましくは１５から５０℃で反応させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質トレハロース１ｇ  に対して０．０１単位以上、好ましくは１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定される。
【００２７】
本発明の方法において使用する無機リン酸および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸及びその塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液の形態で用いる。
【００２８】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
【実施例１】
酵母エキス０．７５％、麦芽エキス０．２％、リン酸１カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０５％、グルコース４％（ｐＨ５．５）の組成の培地１００ｍｌを３００ｍｌ三角フラスコに分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した。滅菌した培地（１００ｍｌ培地／３００ｍｌ三角フラスコ、３本）にコリオルス  ヒルスツス  （Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）  微工研菌寄第２７１１号を接種し、２６℃、５日間振とう培養した。培養後遠心分離により菌糸体を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液を加え、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素液２３０ｍｌを得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性は０．０７５単位／ｍｌ、１７単位であった。
【００３０】
【実施例２】
表２の菌株群から選ばれた各菌株を実施例１のようにして調製した培地（各菌株あたり１００ｍｌ培地／３００ｍｌ三角フラスコ、２本）に接種し、２６℃、５日から２０日間振とう培養した。培養後実施例１と同様に処理しこの培養物から粗酵素液を得た。それぞれの菌株由来の粗酵素液の液量およびそのトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ表２に示す値であった。
【００３１】
0003563104.tif 000004
0003563104.tif 000005
0003563104.tif 000006
【００３２】
【実施例３】
酵母エキス０．７５％、グルコース５．０％（ｐＨ５．５）の組成の培地１００ｍｌを３００ｍｌ三角フラスコに分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した。表３の菌株群から選ばれた各菌株を滅菌した培地（各菌株あたり１００ｍｌ培地／３００ｍｌ三角フラスコ、１本）に接種し、２６℃、３日間振とう培養した。培養後遠心分離により菌糸体を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液約２００ｍｌを加え、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素液を得た。この粗酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥトヨパールＴＭ６５０Ｃ（トーソー社製）２０ｍｌを充填したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄後、塩化カリウム濃度０から０．５Ｍ  の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量４００ｍｌ）  を行ない約７ｍｌづつ分画した。活性画分を合わせ酵素液とした。このときのそれぞれの菌株由来の酵素液の液量およびそのトレハロースホスホリラーゼの活性、総活性、比活性を表３に示す。
【００３３】
0003563104.tif 000007
【００３４】
【実施例４】
シゾフィルム  コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）微工研条寄第４９４１号を酵母エキス０．７５％、麦芽エキス０．２％、グルコース５％（ｐＨ６．２）の組成の培地１００リットルを用いて２００リットルのジャーファーメンターで培養を行なった。培養は、温度２５℃、撹拌２９０ｒｐｍ  、通気０．５ＶＶＭ  、７０時間行なった。培養後、培養液４００ｍｌから、遠心分離により菌糸体を集めた。
【００３５】
菌糸体に２０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）約２００ｍｌを加え、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素液約２４０ｍｌを得た。この粗酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥトヨパールＴＭ６５０Ｃ（トーソー社製）２０ｍｌを充填したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄後、  塩化カリウム濃度０から０．５Ｍ  の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量４００ｍｌ）を行ない約７．５ｍｌづつ分画し、活性画分８０ｍｌをえた。この画分のトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性、比活性はそれぞれ０．１３単位／ｍｌ、１０．３単位、０．１５単位／ｍｇ蛋白であった。
【００３６】
【実施例５】
マッシュルーム（アガリクス  ビスポルス  （Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）  ）、まいたけ（グリフォラ  フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ））、まつたけ（トリコロマ  マツタケ  （Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ））、ひらたけ（プレウロツス  オストレアツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ））、ぶなしめじ（リオフィルム  ウルマリウム  （Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｕｌｍａｒｉｕｍ））、しいたけ（レンチヌス  エドデス  （Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ））から選ばれた各菌株の新鮮な子実体それぞれ１００ｇ  に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む。以下同じ）約１５０ｍｌを加え、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し上清液を得、これを粗酵素液とした。
【００３７】
粗酵素液を、２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＱＡＥトヨパールＴＭ（トーソー社製）２０ｍｌを充填したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄後、塩化カリウム濃度０から０．５Ｍ  の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量４００ｍｌ）を行なった。トレハロースホスホリラーゼ活性画分をホローファイバー限外濾過装置を使用して濃縮し各酵素液を得た。それぞれの菌株由来の酵素液の液量、およびそのトレハロースホスホリラーゼ活性、総活性、比活性を表４に示す。
【００３８】
0003563104.tif 000008
【００３９】
【実施例６】
新鮮なグリフォラ  フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）  子実体３００ｇ  に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトールを含む。以下同じ）６００ｍｌを加え、ワーリングブレンダーＴＭ（ダイナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、上清液７５８ｍｌを得、これを粗酵素液とした。この粗酵素液の総活性は１８５単位、比活性０．０３８単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００４０】
この粗酵素液に、硫酸アンモニウムを４０％飽和になるように加え、遠心分離により不溶物を除去し、この上清にさらに６０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離により６０％飽和硫酸アンモニウム沈澱画分を得た。沈澱物を小量の２０％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液に溶かした後、同じリン酸緩衝液で平衡化したブチルトヨパールＴＭ６５０Ｍ（トーソー社製）カラム（２２ｍｍφ×２５０ｍｍ）に通し、同じ緩衝液で洗浄後、硫酸アンンモニウム濃度２０％から０％の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量８００ｍｌ）を行ない、１０ｇ  ずつ分画したところ活性は画分６４から７８にあった。
【００４１】
この活性画分を濃縮後、２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したトヨパールＴＭＨＷ−５５Ｓ（トーソー社製）カラム（２５ｍｍφ×７００ｍｍ）に通し、１０ｍｌずつ分画し活性画分１６から２０を得た。活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥトヨパールＴＭ６５０Ｃ（トーソー社製）カラム（２２ｍｍφ×２５０ｍｍ）に通し、塩化カリウム濃度０から０．３Ｍ  の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量８００ｍｌ）を行ない、１０  ｍｌ  ずつ分画し活性画分２３から３４を得た。この活性画分の酵素活性は０．９３単位／ｍｌ、総活性１１１単位、比活性２．６４単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００４２】
この活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した後、２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＡＦ−ブルートヨパールＴＭ６５０ＭＬ（トーソー社製）カラム（１０ｍｍ×１５０ｍｍ）に通し、塩化カリウム濃度０から０．５Ｍ  の直線濃度勾配溶出（２０ｍＭリン酸緩衝液、総容量４００  ｍｌ）を行ない、１０ｍｌずつ分画し活性画分１３から４０を得た。活性画分を２０  ｍＭ  リン酸緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌＴＭＧ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×３００  ｍｍ  、流速０．５ｍｌ／分、トーソー社製）カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより精製を行なった。
【００４３】
ＵＶ２８０ｎｍで検出すると１５．９分に１本のピークが見られた。このピークが活性ピークであった。この時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持時間から分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約１２０，０００であった。この精製酵素の活性、総活性、比活性はそれぞれ３．５７単位／ｍｌ、１８単位、５．６３単位／ｍｇ蛋白質であった。こうして得られた酵素の純度はドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べたところ、一本のバンドのみが観察され、純粋なトレハロースホスホリラーゼであることが確認された。その分子量は約６０，０００であった。
【００４４】
【実施例７】
実施例６により得られた精製酵素および実施例６の方法に準じて調製した精製酵素を用いて本酵素の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性を調べた。α−Ｄ−グルコース    １−リン酸、トレハロースの定量は以下の方法により行なった。
【００４５】
α−Ｄ−グルコース  １−リン酸の定量法：
０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、１．０  Ｍ    ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μｌ、１４．８ｍＭＮＡＤＰ＋  水溶液５０μｌ、２６ｍＭ塩化マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４ｍＭα−Ｄ−グルコース  １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ｍｌ水溶液２５μｌ（０．７８単位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ｍｌ水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ｎｍで吸光度測定しα−Ｄ−グルコース  １−リン酸量とした。
【００４６】
トレハロースの定量法：
反応液をポリアミンカラム（ＹＭＣ  ＰａｃｋＴＭ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ    ＩＩ
４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）、溶離液アセトニトリル：水＝７０：３０、流速１ｍｌ／分、カラム温度３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求めた。
このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時間は１５．７分であった。
【００４７】
［基質特異性］
加リン酸分解反応：
本酵素を用いて各種糖類の加リン酸分解反応を行なった。トレハロースからはα−Ｄ−グルコース  １−リン酸とＤ−グルコースが生成した。トレハロース以外のパラチノース、マルトース、イソマルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、ネオトレハロースの二糖は反応しなかった。
【００４８】
二糖合成反応：
本酵素を用いて各種単糖とα−Ｄ−グルコース    １−リン酸による二糖合成反応を行なった。Ｄ−グルコース以外のＬ  −グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フコースは反応しなかった。また、本酵素を用いてＤ−グルコースと各種糖リン酸による合成反応を行なった。α−Ｄ−グルコース    １−リン酸以外のβ−Ｄ−グルコース    １−リン酸、α−Ｄ−マンノース  １−リン酸、α−Ｄ−キシロース  １−リン酸、α−Ｄ−ガラクトース  １−リン酸は反応しなかった。
【００４９】
［至適ｐＨ］
加リン酸分解反応：
緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０から８．２）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から９．７）を用いた。各ｐＨにおいて３０℃、１時間反応を行ない生成したα−Ｄ−グルコース    １−リン酸量を上述の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵素の至適ｐＨ範囲は５．５から７．５であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図１を得た。
【００５０】
トレハロース合成反応：
緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０から８．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から１１．０）を用いた。各ｐＨにおいて３５℃、３時間反応を行ない生成したトレハロース量を上述の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵素の至適ｐＨ範囲はｐＨ６．５から７．５であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図２を得た。
【００５１】
［ｐＨ安定性］
加リン酸分解反応：
緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から１２．０）を用いた。トレハロースホスホリラーゼを各ｐＨに、４℃、２４時間放置した。放置後、３２．５℃、１時間反応させ生成したα−Ｄ−グルコース    １−リン酸を上述の方法により定量することにより各種ｐＨにおける酵素活性を求めた。その結果、本酵素はｐＨ５．５から９．５において安定であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図３を得た。
【００５２】
トレハロース合成反応：
緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から１２．０）を用いた。トレハロースホスホリラーゼを各ｐＨに、４℃、２４時間放置した。放置後、３５℃、３時間反応させ生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し各ｐＨにおける酵素活性を求めた。その結果、本酵素は、ｐＨ５．０から１０．５において安定であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図４を得た。
【００５３】
［至適温度］
加リン酸分解反応：
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、温度０℃から５０℃の所望の温度で１時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したα−Ｄ−グルコース  １−リン酸を上述の方法により定量し各温度おける酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反応温度は２５℃から３７．５℃であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図５を得た。
【００５４】
トレハロース合成反応：
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、温度２０℃から５０℃の所望の温度で３時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反応温度は３０℃から４０℃であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図６を得た。
【００５５】
［温度安定性］
加リン酸分解反応：
トレハロースホスホリラーゼを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、温度０℃から５０℃の所望の温度に３０分間放置した。放置後、３２．５℃、１時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したα−Ｄ−グルコース    １−リン酸を上述の方法により定量し各温度における酵素活性を求めた。その結果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図７を得た。
【００５６】
トレハロース合成反応
トレハロースホスホリラーゼを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、温度０℃から５０℃の所望の温度に３０分間放置した。放置後、３５℃、３時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。その結果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図８を得た。
【００５７】
【実施例８】
実施例４により得たシゾフィルム  コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）微工研条寄第４９４１号のトレハロースホスホリラーゼ酵素液をホローファイバー限外濾過装置で濃縮し酵素液１２  ｍｌ  を得た。この酵素液の活性は０．８７単位／ｍｌであった。この酵素液１０μｌ、０．４  Ｍ  Ｄ−グルコース水溶液１２５μｌ、０．４Ｍ  α−Ｄ−グルコース  １−リン酸水溶液１２５μｌ、０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、および精製水１４０μｌを混合し、３０℃、２４時間エッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を実施例７に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃度は１１ｍＭであった。この時のＤ−グルコースからのトレハロースのモル収率は１１％であった。
【００５８】
【実施例９】
実施例５により得たアガリクス  ビスポルス  （Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）  、グリフォラ  フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）  、プレウロツス  オストレアツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、リオフィルム  ウルマリウム  （Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｕｌｍａｒｉｕｍ）  由来の各トレハロースホスホリラーゼ酵素液を用いて実施例８と同様にトレハロース生成反応を行ない反応液中のトレハロース量を実施例７に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃度はそれぞれ２４ｍＭ、３５ｍＭ、４８ｍＭ、７．４ｍＭであった。この時のＤ−グルコースからのトレハロースのモル収率は、それぞれ２４％、３５％、４８％、７％であった。
【００５９】
【実施例１０】
実施例６により得たグリフォラ  フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）  由来の精製トレハロースホスホリラーゼ３．５７単位／ｍｌ水溶液５６μｌ（０．２単位）、１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、１．０Ｍ  Ｄ−グルコース水溶液１５０μｌ、０．５Ｍ  α−Ｄ−グルコース  １−リン酸水溶液４００μｌ、および精製水２９４μｌを混合し、３５℃、７２時間エッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を実施例７に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃度は８０  ｍＭ  であった。この時のＤ−グルコースからのトレハロースのモル収率は５３％であった。
【００６０】
【実施例１１】
実施例６により得たグリフォラ  フロンドサ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）  由来の精製トレハロースホスホリラーゼ３．５７単位／ｍｌ    水溶液２８μｌ（０．１単位）、０．５Ｍ  トレハロース水溶液２００μｌ、０．４Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２５０μｌ、０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）２００μｌ、および精製水３２２μｌを混合し、３０℃、２４時間エッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のα−Ｄ−グルコース    １−リン酸量を実施例７に記載の方法で測定したところ、α−Ｄ−グルコース    １−リン酸の濃度は３２  ｍＭ  であった。この時のトレハロースからのα−Ｄ−グルコース    １−リン酸のモル収率は３２％であった。また、  反応液中のＤ−グルコースをグルコース測定キッド（イアトクロムＴＭ    Ｇｌｕ−ＬＱ  、ヤトロン社製）により定量したところ、Ｄ−グルコースの濃度は３１  ｍＭ  であった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、温度安定性の優れたトレハロースホスホリラーゼが提供される。また、新たにトレハロースホスホリラーゼを生産することが見いだされたトレハロースホスホリラーゼ生産菌によって生産されるトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼの製造法が提供される。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを利用したα−Ｄ−グルコース    １−リン酸およびトレハロースの製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸分解反応の至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図２】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロース合成反応至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図３】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸分解反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
【図４】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロース合成反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
【図５】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸分解反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
【図６】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロース合成反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
【図７】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸分解反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
【図８】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロース合成反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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