(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロスポリン関連化合物に対して特異的な免疫原性応答をもたらすために有用である免疫原であって、該免疫原がシクロスポリン関連化合物、タンパク質キャリア、およびジビニルスルホンリンカーを含み、ここで該リンカーが、該キャリアを該化合物のアミノ酸残基１に結合し、そして該化合物が、シクロスポリンおよびシクロスポリン代謝産物からなる群から選択される、免疫原。
【請求項２】
シクロスポリン関連化合物に対して特異的な免疫原性応答をもたらすために有用である免疫原であって、該免疫原がシクロスポリン関連化合物、タンパク質キャリア、およびジビニルスルホンリンカーを含み、ここで該リンカーが、該キャリアを該化合物のアミノ酸残基９に結合し、そして該化合物が、シクロスポリンおよびシクロスポリン代謝産物からなる群から選択される、免疫原。
【請求項３】
前記タンパク質キャリアが、キーホールリンペットヘモシアニンおよびヒト血清アルブミンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の免疫原。
【請求項４】
シクロスポリン関連化合物の特定領域を認識し得る抗体を生産するための方法であって、以下：ａ）該シクロスポリン関連化合物に対して特異的な免疫原性応答をもたらすために、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫原を非ヒト動物に投与する工程；ｂ）該非ヒト動物から、該シクロスポリン関連化合物に対する抗体を回収する工程；およびｃ）少なくとも一つのシクロスポリン関連化合物に対する該抗体の反応性を測定することにより、抗体結合領域を同定する工程、を包含し、該化合物が、シクロスポリンおよびシクロスポリン代謝産物からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
前記同定する工程が、シクロスポリンＡの少なくとも１つの代謝産物に対する抗体の反応性を、シクロスポリンＡに対する抗体の反応性と比較することにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体を回収する前記工程が、前記非ヒト動物から少なくとも一つの抗体生産細胞を回収する工程、該抗体生産細胞を不死化する工程、および、必要に応じて、該不死化された抗体生産細胞からモノクローナル抗体を単離する工程、を包含する、請求項４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記動物が、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、モルモット、ロバ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、イヌ、ネコまたはサルである、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、シクロスポリンおよび／またはシクロスポリン代謝産物、誘導体およびアナログの特定部位に対する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産に関する。これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の反応性により、これらの抗体は、治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）のためのイムノアッセイに特に有用となる。これらのイムノアッセイあるいはＴＤＭキットは、シクロスポリン（ＣＳＡ）、ならびに／またはシクロスポリンの代謝産物、誘導体およびアナログの特定部位に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を含み得る。また、これらのキットは、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体のパネルの様々な組み合わせを含み得る。
【０００２】
（発明の背景）
シクロスポリンは、真菌起源（真菌Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍから単離された）の１１アミノ酸の環状ペプチドであり、２つの一般的でないアミノ酸（（４Ｒ）−４−（（Ｅ）−２ブテニル）−４，Ｎ−ジメチル−１−トレオニン（Ｂｍｔ）およびＩ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ））ならびに数個のペプチド結合したＮ−メチル化残基（残基１，３，４，６，９，１０及び１１）を含む。シクロスポリンの構造を、図１に示す。
【０００３】
現在、移植患者の器官拒絶を抑制するため、もっとも頻繁に投与されている２つの免疫抑制剤は、シクロスポリン（ＣＳＡ）およびタクロリムス（ＦＫ−５０６またはＦＫ）である。ラパマイシン（Ｒａｐａ）は、別の公知の免疫抑制剤である。シクロスポリンの主要なターゲットはヘルパーＴリンパ球であるようである。シクロスポリンは、Ｔ細胞活性化の過程において早期に作用し、そのＴ細胞により生成される因子によって通常活性化される他の細胞型に対して二次的な効果を有する。シクロスポリンは、ヘルパーＴ細胞によるインターロイキン２（ＩＬ−２）の生成を阻害し、それによって、Ｔ細胞の活性化および増殖（免疫応答の増幅）を阻止する。これは、進行中の急性拒絶の予防および処置の両方において効果的である。ＣＳＡの作用機構に関する現在のモデルは、Ｔ細胞の細胞質において、ＣＳＡが、イムノフィリンと呼ばれる特定の結合タンパク質に結合することを示唆する。ＣＳＡ−イムノフィリン複合体は、次に、カルシニューリンと呼ばれるホスファターゼと結合し、そしてこれをブロックする。後者には、サイトゾルから核への活性化因子（ＮＦ−ＡＴｃ）のトランスロケーションが必要であり、核において、この因子は通常、特定の遺伝子のエンハンサー／プロモーターに結合し、そしてこれを活性化する。ＣＳＡの存在下では、サイトゾル活性化因子は核にたどり着くことが出来ず、そしてＩＬ−２の転写（および他の早期の活性化因子）は、強く阻害される。この阻害の結果として、Ｔ細胞は増殖せず、γ−インターフェロンの分泌が阻害され、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は誘発されず、そしてさらにマクロファージの活性化が起きない。
【０００４】
腎毒性、高血圧症、高カリウム血症、低マグネシウム血症及び高尿酸血症を含む、様々な副作用が、シクロスポリン療法と関連する。神経毒性または腎毒性は、特定のシクロスポリン代謝産物と関連付けられている。シクロスポリン薬物モニタリングアッセイの必要要件は、免疫抑制活性および毒性活性を有する親シクロスポリン薬物ならびに代謝産物のレベルを測定することである。ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝産物および誘導体のレベルをモニタリングする方法を改善する必要がある。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、シクロスポリン関連化合物についての特異性を有する抗体を惹起する免疫原性結合対の調製のための方法に用いられる。本発明の実施のために、シクロスポリン関連化合物という用語は、シクロスポリン分子自体および／または種々のシクロスポリン代謝産物および誘導体のいずれのまたは全てを含むことが意図される。シクロスポリンおよびシクロスポリン代謝産物結合体免疫原が調製され、そしてこのシクロスポリンまたは代謝産物分子の特定領域に対する抗体を生産するために、宿主動物の免疫に用いられる。特定の抗体の特異的結合領域を決定することによって、親分子、活性代謝産物、不活性代謝産物、とその他シクロスポリン誘導体／アナログとの間を区別し得るイムノアッセイ法が開発される。シクロスポリン／代謝産物タンパク質結合免疫原形成のためのリンカーアーム分子として、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）の使用が記載されている。
【０００６】
第一の局面において、本発明は、シクロスポリン関連化合物と結合可能な抗体を提供する。上述のシクロスポリン関連化合物あるいはＣＳＡ代謝産物であるＡＭ１あるいはＡＭ９の特定領域を認識するこのような抗体が、好ましい。モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が最も好ましい。また、シクロスポリン関連化合物の特定領域を認識可能な抗体の生産方法が、提供される。この方法は、以下、ａ）シクロスポリン関連化合物に特異的な免疫原性応答を生じさせるために、シクロスポリン関連化合物、リンカーアーム分子及びタンパク質キャリアを含む免疫原を動物に投与する工程；ｂ）この動物から該シクロスポリン関連化合物に対する抗体を回収する工程；そしてｃ）第一のシクロスポリン関連化合物に対する抗体の反応性と第二のシクロスポリン関連化合物に対する抗体の反応性を比較することにより、抗体の結合領域を同定する工程、を含む。このリンカーアーム分子がジビニルスルホンであり、そしてこのシクロスポリン関連化合物が、アミノ酸残基１または９でキャリアと結合されているこのような方法が、好ましい。好ましくは、タンパク質キャリアは、キーホールリンペットヘモシアニンまたはヒト血清アルブミンであり得る。上記方法の達成のための、ハイブリドーマ細胞の使用についても、提供される。
【０００７】
別の局面において、本発明は、哺乳類におけるシクロスポリン関連化合物のレベルを測定するためのイムノアッセイ法を提供する。この方法は、以下、ａ）この哺乳類由来の生物学的試料を、シクロスポリン関連化合物に結合し得る抗体と共にインキュベートする工程；そして、ｂ）この抗体へのシクロスポリン関連化合物の結合を測定する工程、を包含する。これらのアッセイにおいて、このシクロスポリン関連化合物またはＣＳＡ代謝産物であるＡＭ１またはＡＭ９の特定領域を認識する抗体の使用が、好ましい。モノクローナル抗体の使用が最も好ましい。また、生物学的試料中のシクロスポリン関連化合物のレベルを測定するためのイムノアッセイキットであって、上記の抗体を含む該キットも、提供される。また、試料中の特定のシクロスポリン関連化合物の量を決定するアッセイ方法についても提供する。この方法は、以下、ａ）この試料を請求項１に記載の第１の抗体と接触させる工程；２）この試料を請求項１に記載の第２の抗体と接触させる工程；そして、ｃ）この第２の抗体に結合した上記の特定のシクロスポリン関連化合物の量を決定する工程、を包含する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を実施する上でのベストモードを記載する。この実施例は、ＣＳＡ代謝産物の単離、ハプテンの調製、抗体応答を惹起するための動物の免疫、抗体反応性の特徴付け、ＣＳＡおよびＣＳＡ代謝産物または誘導体に対するポリクローナル抗体及びモノクロール抗体の生成および選択、ならびに本発明により提供される抗体を用いたアッセイを記載する。
【０００９】
いかなる様式においても、以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するようには意図されない。
【００１０】
（実施例１−シクロスポリン代謝産物の単離および特徴付け）
シクロスポリンは、肝臓、小腸および腎臓において、代謝される。文献において、種々のフェーズＩおよびＩＩの代謝産物の構造が、ＨＰＬＣおよび質量分析法によって同定されている。ＣＳＡの主要な代謝産物を、図２に示す。代謝反応は、アミノ酸＃１での酸化および環化、ならびに種々のアミノ酸部位での水酸化および脱メチル化を、包含する。
【００１１】
低速度で１０分間。内容物を分液漏斗に注ぐ：下方の水性層を捨て、上部のエーテル層を蒸発させ、乾燥させる。
【００１２】
（２．代謝産物の単離）
１．０ｍＬのＨＰＬＣグレードのメタノールを、乾燥抽出物に添加し、３０秒間ボルテックスし、そして、２分間２８００ｒｐｍで遠心分離する。その上清をオートサンプラーバイアルに移し、そして、以下に示すクロマトグラフィーの条件を用いて、尿を注入する。
【００１３】
0003595506.tif 000002
【００１４】
Ｗ６００グラジエント表：
【００１５】
【化１】
0003595506.tif 000003
以下に示す代表的な保持時間に基づいて、個々の代謝産物を収集する。
【００１６】
【化２】
0003595506.tif 000004
以下は、２０Ｌの尿のロットから回収された種々の代謝産物の量の例である。
【００１７】
【化３】
0003595506.tif 000005
（３．代謝産物の定量的分析）
１ｍＬのメタノールにおいて単離された代謝産物を再構成する。この混合物のうちの２５μＬを取り、そして２５μＬのＣＳＧ（２０，０００ｎｇ／ｍＬ）および３００μＬの移動相を添加し、ボルテックスしそして以下の条件下でＨＰＬＣに１００μＬ注入する。
【００１８】
0003595506.tif 000006
【００１９】
（４．代謝産物濃度）
（代謝産物のピーク面積÷内部標準のピーク面積）×０．５μｇ×（１／０．０２５）×希釈係数＝代謝産物のμｇ。
【００２０】
純度％：
（代謝産物のピークの濃度μｇ／ｍＬ÷全ピーク濃度μｇ／ｍＬ）×１００。
【００２１】
（５．ＣＳＡ代謝産物の最終精製）
一回目のＨＰＬＣ精製において単離された代謝産物は、通常は、９７％より高い純度ではない。それ故、異なるＨＰＬＣカラムおよび移動相を用いて、二度目のＨＰＬＣ精製が必要である。
【００２２】
以下の条件を用いるＨＰＬＣ上に、再構成した代謝産物を注入する。
【００２３】
0003595506.tif 000007
【００２４】
水およびメタノールから構成される二つの溶媒勾配は、この代謝産物を精製するために使用される。分離の鍵は、メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）をその移動相のメタノール部分に添加することである（５００ｍＬのメタノールに対し７０ｍＬのＭＴＢＥを用いる）。使用する正確な勾配は、精製される代謝産物に依存して変動する。
【００２５】
（実施例２−ＣＳＡ−ジビニルスルホンの合成およびタンパク質キャリアへの結合）
（１．ＣＳＡ−ＤＶＳハプテンの調製）
シクロスポリン（３０ｍｇ、２５μｍｏｌ、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｃａｔ  ＃１５８５０ー４  ＵＳＰ参照標準物）、ビニルスルホン（１４７ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）およびベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（１１．４ｍｇ，５０μｍｏｌ）を、６ｍＬのジクロロメタン中で攪拌し、そして、次に４０％の水酸化カリウム水溶液を添加した。その混合物を、１．５時間、急速に攪拌し、そして２Ｍ塩酸で酸性にし、そしてジクロロメタンで希釈した。有機相を分離し、水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして溶媒を蒸発させた。
【００２６】
（２．ＣＳＡ−ＤＶＳハプテンの分析）
ＣＳＡ−ＤＶＳに対応する質量を有する一つ（１つ）の生成物を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ／ＭＳ）により、同定した。その生成物を、ＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム；８０％メタノール（イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ））；４ｍＬ／分；５０℃；２１４ｎｍ）により、精製した。この結果は、純粋なＣＳＡ−ＤＶＳ３．３ｍｇであり、その６００ＭＨｚのプロトンｎｍｒスペクトルを得た。
【００２７】
（３．ＣＳＡ−ＤＶＳ−タンパク質結合体の調製）
ＣＳＡ−ＤＶＳ（１．０ｍｇ）を３５０μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、そして急速に攪拌した、１．２ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（１．６ｍｇ）溶液に、ゆっくりとスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。この混合物を、室温で２４時間、攪拌した。次に、この物質をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して、終夜、透析した。タンパク質の濃度を、ローリータンパク質アッセイにより定量し、このタンパク質へのＣＳＡの結合を、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット分析により確認した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、同じ様式でＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体を調製した。当該技術分野で公知の他のタンパク質キャリアもまた、これらの方法を用いてＣＳＡ−ＤＶＳ結合体を調製するために用い得る。
【００２８】
（実施例３−ＡＭ１−ジビニルスルホンの合成およびタンパク質キャリアへの結合）
（１．ＡＭ１−ＤＶＳハプテンの調製）
ＡＭ１（４．０ｍｇ，３．３μｍｏｌ）、炭酸カリウム（７０ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）および少しの１８−クラウン−６の結晶を、４ｍＬの無水アセトン中に溶解し、室温で４５分間、この溶液を攪拌した。次に、ビニルスルホン（３１．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加し、そして室温で終夜攪拌し反応を行った。次に、その混合物をエチルアセトンで希釈し、そして水、希塩酸溶液および塩水（ｂｒｉｎｅ）（塩化アンモニウムで飽和させた）で連続して洗浄した。次いで、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして溶媒を蒸発させた。メタノールを前記残留物に添加し、そしてそのメタノール可溶性部分を精製のために保持した。精製および結合のために十分量の生成物を取得するまで、この反応を数回繰り返した。
【００２９】
（２．ＡＭ１−ＤＶＳハプテンの分析）
ＡＭ１−ＤＶＳに対応する質量を有する二つ（２つ）の主な生成物を、ＬＣ／ＭＳにより、同定した。その生成物を、ＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム；８０％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；５０℃；２１４ｎｍ）により、精製した。ＡＭ１−ＤＶＳ（種類１）およびＡＭ１−ＤＶＳ（種類２）の両方に対する、６００ＭＨｚプロトンｎｍｒスペクトルを取得した。
【００３０】
（３．ＡＭ１−ＤＶＳ−タンパク質結合体の調製）
ＡＭ１−ＤＶＳ（種類１、０．２ｍｇ）を３００μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、そして急速に攪拌した、１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中のＫＬＨ（１．０ｎｇ）溶液に、ゆっくりとスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。この混合物を、室温で２４時間、攪拌し、そして次に、終夜、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質の濃度を、ローリータンパク質アッセイにより決定した。同じ様式で、ＡＭ１−ＤＶＳ（種類２）をＫＬＨへ結合させた。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または当該技術分野において公知である他のタンパク質キャリアもまた、ＡＭ１−ＤＶＳ結合体を調製するために、キャリアとして用い得る。
【００３１】
（実施例４−ＡＭ１９−ジビニルスルホンの合成およびタンパク質キャリアへの結合体化）
（１．ＡＭ１９−ＤＶＳハプテンの調製：）
ＡＭ１９（４．５ｍｇ，３．６μｍｏｌ）、炭酸カリウム（６０ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）および少量の１８−クラウン−６の結晶を、５ｍＬの無水アセトンに一緒に混合し、そして室温で４５分間、この溶液を攪拌した。次に、ビニルスルホン（４３．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応液を、室温で一晩攪拌した。窒素ガス流を反応フラスコに通すことにより、溶媒をエバポレートさせた。１Ｎ塩酸溶液およびエチルアセトンの混合液で、直ちに、残留物をクエンチした。次に、有機相をエチルアセトンで希釈し、そして水および塩水（ｂｒｉｎｅ）で連続的に洗浄し、そして、次に硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして溶媒をエバポレートさせた。メタノールをこの残留物に添加し、そしてそのメタノール溶解部分をＬＣ／ＭＳ精製に供した。精製および結合体化のために十分量の生成物が得られるまで、反応を数回繰り返した。
【００３２】
（２．ＡＭ１９−ＤＶＳハプテンの分析：）
ＡＭ１９−ＤＶＳ（１３７５−Ｎａ付加物ｍ／ｚ）と一致する質量を持つ三つ（３）の生成物を、ＬＣ／ＭＳにより同定した。同定のために、これらの生成物を、ＡＭ１９−ＤＶＳ（１）、ＡＭ１９−ＤＶＳ（２）およびＡＭ１９−ＤＶＳ（３）と割り当てた。
【００３３】
（ｉ）ＡＭ１９−ＤＶＳ（１）ハプテンの同定、精製および特徴付け）
以下のようにして、ＡＭ１９−ＤＶＳ（１）をＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム）により精製した。：粗収集物からロータリーエバポレートしたＡＭ１９−ＤＶＳ（１）を７７％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして以下の条件：７７％メタノール（イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ））；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。純粋になるまで、収集した物質を再度クロマトグラフィーにかけた。ＡＭ１９−ＤＶＳ（１）の純度を、質量スペクトルおよびＨＰＬＣから評価した。精製されたＡＭ１９−ＤＶＳ（１）のエレクトロスプレーフラグメンテーション（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）プロフィールは、アミノ酸１の第二ヒドロキシルを介するＤＶＳ改変と一致する。本出願の目的のため、このハプテンをＡＭ１９−ＤＶＳ（１）という。
【００３４】
（ｉｉ）ＡＭ１９−ＤＶＳ（２）ハプテンの同定、精製および特徴付け）
２つの工程で、ＡＭ１９−ＤＶＳ（２）をＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム）により精製した。工程１：粗収集物からロータリーエバポレートしたＡＭ１９−ＤＶＳ（２）を８０％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして以下の条件：８０％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。工程２：工程１から収集した物質を凍結乾燥し、６４％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして次の条件：６４％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。ＡＭ１９−ＤＶＳ（２）ハプテンの純度を質量スペクトルおよびＨＰＬＣから評価した。この精製されたＡＭ１９−ＤＶＳ（２）のエレクトロスプレーフラグメンテーションプロフィールは、アミノ酸１の第一水酸基を介するＤＶＳ改変と一致する。本出願の目的のため、このハプテンをＡＭ１９−ＤＶＳ（２）という。
【００３５】
（ｉｉｉ）ＡＭ１９−ＤＶＳ（３）ハプテンの同定、精製および特徴付け：）
２つの工程で、ＡＭ１９−ＤＶＳ（３）をＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム）により精製した。工程１：粗収集物からロータリーエバポレートしたＡＭ１９−ＤＶＳ（３）を６０％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして以下の条件：７６％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。ＡＭ１９−ＤＶＳ（３）ハプテンの純度を、質量スペクトルおよびＨＰＬＣから評価した。精製されたＡＭ１９−ＤＶＳ（３）のエレクトロスプレーフラグメンテーションプロフィールは、アミノ酸９の水酸基を介するＤＶＳ改変と一致する。本出願の目的のため、このハプテンをＡＭ１９−９−ＤＶＳという。
【００３６】
（３．ＡＭ１９−１−ＤＶＳ−タンパク質結合体の調製：）
ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）０．４ｍｇを２５０μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、そして１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中の迅速に攪拌したＫＬＨ（１．０ｍｇ）溶液に、ゆっくりとスパイクした。この混合液を、室温で２４時間、攪拌し、そして次に、ＰＢＳに対して一晩透析した。タンパク質の濃度はＬｏｗｒｙタンパク質アッセイにより決定した。同じ様式で、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２），０．８ｍｇ／ＫＬＨ，６．０ｍｇ；ＡＭ１９−９−ＤＶＳ，０．３ｍｇ／ＫＬＨ，１．０ｍｇの結合体、およびその対応するＨＳＡ結合体を調製した。当該技術分野において公知の他のタンパク質キャリアもまた、ＡＭ１９−ＤＶＳ結合体を調製するために、キャリアとして用いられ得る。
【００３７】
（実施例５−ＡＭ９−ジビニルスルフォンの合成およびタンパク質キャリアへの結合体化）
（１．ＡＭ９−ＤＶＳハプテンの調製：）
ＡＭ９（１１．１ｍｇ、９．１μｍｏｌ）、炭酸カリウム（８０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）および少量の１８−クラウン−６の結晶を、５ｍＬの無水アセトンに一緒に混合し、そして室温で４５分間、この溶液を攪拌した。次に、ビニルスルホン（１０７．５ｍｇ、０．９１１ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応物を室温で一晩攪拌した。窒素ガス流を反応フラスコに通すことにより、溶媒をエバポレートさせた。１Ｎ塩酸溶液およびエチルアセトンの混合液で、直ちに、残留物をクエンチした。次に、有機相をエチルアセトンで希釈し、そして水およびブラインで連続的に洗浄し、そして、次に硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして溶媒をエバポレートした。メタノールを残留物に添加し、そしてそのメタノール溶解部分をＬＣ／ＭＳ精製に供した。精製および結合体化のために十分量の生成物が得られるまで、反応を数回繰り返した。
【００３８】
（２．ＡＭ９−ＤＶＳハプテンの分析：）
ＡＭ９−ＤＶＳ（１３５９−Ｎａ付加物ｍ／ｚ）に対応する質量を持つ二つ（２）の生成物を、ＬＣ／ＭＳにより同定した。これらの生成物を、ＡＭ９−ＤＶＳ（１）およびＡＭ９−ＤＶＳ（２）と割り当てた。
【００３９】
（ｉ）ＡＭ９−ＤＶＳ（１）ハプテンの同定、精製および特徴付け：）
以下に従って、ＡＭ１９−ＤＶＳ（１）をＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム）により精製した。：粗収集物からロータリーエバポレートしたＡＭ９−ＤＶＳ（１）を７０％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして以下の条件：７０％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。ＡＭ９−ＤＶＳ（１）の純度を、質量スペクトルおよびＨＰＬＣから評価した。精製されたＡＭ９−ＤＶＳ（１）のエレクトロスプレーフラグメンテーションプロフィールは、アミノ酸９の水酸基を介するＤＶＳ改変と一致する。本出願の目的のため、このハプテンをＡＭ９−９−ＤＶＳという。
【００４０】
（ｉｉ）ＡＭ９−ＤＶＳ（２）ハプテンの同定、精製および特徴付け：）
以下のように、ＡＭ９−ＤＶＳ（２）をＨＰＬＣ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｃ−８  セミ−プレップカラム）により精製した。工程１：粗収集物からロータリーエバポレートしたＡＭ９−ＤＶＳ（２）を７０％メタノールに溶解し、ＨＰＬＣに注入し、そして以下の条件：７０％メタノール（イソクラティック）；４ｍＬ／分；３５℃；２１４ｎｍ、を用いて実行した。ＡＭ９−ＤＶＳ（２）の純度を質量スペクトルおよびＨＰＬＣから評価した。精製されたＡＭ９−ＤＶＳ（２）のエレクトロスプレーフラグメンテーションプロフィールは、アミノ酸１の第二水酸基を介するＤＶＳ改変と一致する。本出願の目的のため、このハプテンをＡＭ９−１−ＤＶＳという。
【００４１】
（３．ＡＭ９−ＤＶＳ−タンパク質結合体の調製：）
ＡＭ９−９−ＤＶＳ（０．４ｍｇ）を３００μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、そして迅速に攪拌した１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中のＫＬＨ（１．０ｍｇ）溶液に、ゆっくりとスパイクした。この混合液を、室温で２４時間、攪拌し、そして次に、ＰＢＳに対して一晩透析した。タンパク質の濃度はＬｏｗｒｙタンパク質アッセイにより測定した。同様の様式で、ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨおよびこれに対応するＨＳＡ結合体を調製した。当該分野において公知の他のタンパク質キャリアもまた、ＡＭ９−ＤＶＳ結合体を調製するために、キャリアとして用いられ得る。
【００４２】
（実施例６−ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝物／誘導体に特異的な抗体応答を引き出すための免疫化）
基本的な免疫化プロトコルを以下に示す。：代表的に、０日目（１°−一次免疫）、７日目（２°−二次免疫）、および２８日目（３°−三次免疫）に、タンパク質含有量に基づいて５、１０、１５または２０μｇの用量のＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物結合体免疫原で、皮下または腹腔内注入によりマウスを免疫化した。２°および３°免疫化の７−１０日後に、抗体応答アッセイのための血清を収集するため、マウスから採血した。種々の他の免疫化スケジュールは、有効であり、これには、以下、０日目（１°）、７日目（２°）、および１４、２１、または３０日目（３°）；０日目（１°）、１４日目（２°）、および２８または４４日目（３°）；および０日目（１°）、３０日目（２°）ならびに６０日目（３°）が挙げられる。三次免疫化後の３０日に、追加免疫を注入し得る。引き続き毎月、追加免疫を投与し得る。
【００４３】
融合手順前３−５日に、免疫化されたマウスに、最終追加免疫として、ＰＢＳ中の免疫原を、腹腔内または静脈内注射した。これは、脾臓（またはリンパ節組織）における免疫特異的Ｂリンパ球の感作および数を増加させる。循環中の抗体のレベルを低下させるために、先の注入の２〜３週間後、この最終追加免疫を投与する。
【００４４】
このような免疫化スケジュールは、特定のポリクローナル抗血清を誘発するため、および特定モノクローナル抗体の調製のためにＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物免疫原結合体でマウスを免疫化するのに有用である。また、ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝物あるいは誘導体に対する特定の抗体を誘発し得る任意の動物を免疫化するためにも、この免疫原組成物は有用である。免疫化する動物には、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコおよびトリならびにサルの種が挙げられる。家庭内動物および野生動物の両方が、免疫化され得る。投与の経路は、任意の簡便な経路であり得、そして免疫化される動物および当該分野の当業者に公知の他の要因に依存して変化し得る。皮下、筋内、腹腔内または静脈内投与のような非経口投与が、好ましい。また、腸溶性の経口投薬形態を包含する経口あるいは経鼻投与もまた用いられ得る。
【００４５】
この組成物の正確な処方は、免疫化される種およびその投与の経路に依存する。０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、ＰＢＳまたは組織培養培地のような溶液中あるいは種々のアジュバント処方物中で、本発明の免疫原は注射され得る。このようなアジュバンドには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ａｄｊｕｖａｘ（Ａｌｐｈａ−Ｂｅｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）、Ｔｉｔｅｒｍａｘ（ＣｙｔＲｘ）、トキシン、トキソイド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、細菌細胞壁、サブユニット（細菌またはウイルス）、糖質部分（モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、オリゴ−、およびポリサッカライド）、硫酸デキストラン、種々のリポソーム処方物またはサポニンが挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。医薬品組成物を調製するために、種々のアジュバントの組合わせが、本発明の免疫原結合体と共に用いられ得る。
【００４６】
本発明の結合体は、免疫原として用いられ、ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝物／誘導体に特異的なポリクローナル抗体を誘発し得、そして、特異的モノクローナル抗体産生のためにＢ細胞を刺激し得る。また、これらは、開発および／または研究ツールとして；イムノアッセイキットの開発における診断試薬として；例えば、細胞レセプターをブロックする予防薬として；および、免疫調節剤および薬物送達組成物としての医療用様式として利用され得る。
【００４７】
（実施例７−ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝物免疫原に対する抗体の反応性を決定するためのアッセイ）
本実施例において用いた、ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物に対する抗体の反応性を決定するための基本的な直接ＥＬＩＳＡプロトコル（ＡｇパネルＥＬＩＳＡ）は以下のとおりである。
【００４８】
（直接ＥＬＩＳＡ手順：）
１．Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｏ結合イムノプレートを用いる。
２．炭酸−炭酸水素緩衝液中にコーＴｗｅｅｎグ抗原（Ａｇ）を１．０μｇ／ｍＬに希釈する。ガラスチューブを用いる。
３．各々のプレートのウェルに１００μＬ添加する。一晩４℃で保存する。
４．ウェルを振り落とし、２００μＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で各ウェルを、三回洗浄する。
５．ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ））を各ウェルに２００μＬ添加する。３７℃で６０分間インキュベートする。
６．工程４と同様に、３回洗浄する。
７．ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）中に適切に希釈した試験抗体を、各ウェルに１００μＬ添加する。３７℃で６０分間インキュベートする。
８．工程４と同様に、３回洗浄する。
９．アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｐｅｒｃｅ  ｃａｔ  ＃３１３２２）を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で１：２０００の濃度に希釈する。各ウェルに１００μＬ添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートする。
１０．工程４と同様に、３回洗浄する。
１１．Ｓｉｇｍａ＃１０４アルカリホスファターゼ基質タブレットを用いて、酵素基質を調製する（１０％ジエタノールアミン（ｖ／ｖ）基質緩衝液中１ｍｇ／ｍＬとする）。各ウェルに１００μＬ添加し、そして室温、暗所で、インキュベートする。およそ１５分間隔で、４０５ｎｍの吸光度を読み取り得る。
【００４９】
ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物免疫原に大して誘発される抗体のアイソタイプレベル（ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプ）を測定するために、以下の基本的手順を用いた。
【００５０】
アイソタイプ決定（Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）ＥＬＩＳＡ手順：
１．Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｏ結合イムノプレートを用いる。
２．炭酸−炭酸水素緩衝液中にコーティング抗原を１．０μｇ／ｍＬに希釈する。各ウェルに１００μＬ添加し、そして一晩４℃で保存する。
３．ウェルを振り落とし、２００μＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で各ウェルを、三回洗浄する。
４．ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ））を各ウェルに２００μＬ添加する。室温で６０分間インキュベートする。
５． 工程３と同様に、３回洗浄する。
６． 希釈していない組織培養上清またはＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で１／１００に希釈したマウスの抗血清を、各ウェルに１００μＬ添加する。室温で６０分間インキュベートする。
７． 工程３と同様に、３回洗浄する。
８． 希釈緩衝液（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ））で、ＥＩＡグレードマウス型（ウサギ抗−マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１：２希釈液を調製する。適切なウェルに、各ウェルあたり１００μＬ添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートする。
９．工程３と同様に、３回洗浄する。
１０．アルカリホスファターゼ結合体化抗ウサギＩｇＧ（Ｔａｇｏ  ＃４６２０）を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で１：２０００の濃度に希釈する。各ウェルあたり１００μＬ添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートする。
１１．工程３と同様に、３回洗浄する。
１２．Ｓｉｇｍａ＃１０４アルカリホスファターゼ基質タブレットを用いて、酵素基質を調製する（１０％ジエタノールアミン（ｖ／ｖ）基質緩衝液中１ｍｇ／ｍＬとする）。各ウェルあたり１００μＬ添加し、そして暗所で室温で、インキュベートする。およそ１５分間隔で、４０５ｎｍの吸光度を読み取り得る。
１３．種々の濃度のマウスクラスおよびマウスサブクラス特異的免疫グロブリン（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ．  Ｉｎｃ．）に対するウサギ抗−マウスアイソタイプ抗体のＥＬＩＳＡ応答から生成される用量応答曲線を用いて、吸光度の読み取り値を抗体μｇ／血清ｍｌに変換した。
【００５１】
以下に示す方法を用いて、ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物／誘導体の特異的部位に対する抗体の結合を決定し、そしてＦＫ−５０６、ラパマイシンおよびＫＬＨまたはＨＳＡタンパク質に対する抗体の交差反応性を定量した。
【００５２】
（阻害ＥＬＩＳＡ手順：）
１．Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｏ結合イムノプレートを用いる。
２．炭酸−炭酸水素緩衝液中にコーティング抗原を１．０μｇ／ｍＬに希釈する。各ウェルに１００μＬ添加し、そして一晩４℃で保存する。
３．同日に阻害抗原チューブを調製する。抗体をガラスチューブにアリコートする。エタノールで適当な抗原濃度に調製し、そして１０μＬエタノール溶液／２５０μＬ抗体でアリコートした抗体に添加する。
４． ウェルを振り落とし、２００μＬのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で各ウェルを、三回洗浄する。
５．ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ））を各ウェルあたり２００μＬ添加する。室温で６０分間インキュベートする。
６． 工程４と同様に、洗浄する。
７．阻害チューブの内容物を、抗原コートプレートに各ウェル１００μＬ移す。３７℃で６０分間インキュベートする。
８．工程４と同様に、洗浄する。
９．アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ＃  ３１３２２）を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で１：５０００の濃度に希釈する。各ウェルに１００μＬ添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートする。
１０．工程４と同様に、洗浄する。
１１．Ｓｉｇｍａ＃１０４アルカリホスファターゼ基質タブレットを用いて、酵素基質を調製する（１０％ジエタノールアミン（ｖ／ｖ）基質緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）。各ウェルあたり１００μＬ添加し、そして暗所で室温でインキュベートする。およそ１５分間隔で４０５ｎｍの吸光度を読み取り得る。
【００５３】
直接ＥＬＩＳＡ、アイソタイプ決定ＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ手順で用いる緩衝液は、以下である：
0003595506.tif 000008
0003595506.tif 000009
マウスの抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を検出するために、直接ＥＬＩＳＡ、アイソタイピングＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ手順を記載した。しかし、これらの手順は、他の種（ウサギ、モルモット、ヒツジまたはヤギの抗体を含むがこれらに限定されない）について改変され得る。
【００５４】
（実施例８−ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原に対するポリクローナル抗体応答）
実施例２で記載したＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原および実施例６で記載した免疫レジメ（ｒｅｇｉｍｅｓ）を用いて、マウスでポリクローナル抗血清を調製した。２次および３次免疫から１０日後に回収した個々のマウス血清を、直接ＥＬＩＳＡによって抗体力価に関してアッセイし（実施例７で記載したように）、そしてＣＳＡ、ＣＳＡ結合体またはＫＬＨインヒビターを用いた阻害ＥＬＩＳＡによってさらにスクリーニングした。良好な抗ＣＳＡ反応性を有するマウスポリクローナル血清の例を表１に示す。ＣＳＡおよびＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡは、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ  ＥＬＩＳＡでコートされたプレートへの抗体の結合を用量依存的に阻害した。ＫＬＨまたはＦＫ−ＤＶＳ−ＫＬＨ結合体は、抗体の結合を阻害しなかった。
【００５５】
これらのマウス血清を、抗原パネルＥＬＩＳＡアッセイによってさらに特徴付け、結果を表２に示す。これらの結果は、免疫マウス血清はＣＳＡ−ＤＶＳ、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）、およびＡＭ９−１−ＤＶＳ  ＨＳＡ結合体に対して良好な反応性を有していたことを示す。これらの血清は、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対して低い反応性を有していた。これは、抗血清はＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物分子のエピトープを認識していたこと、および９アミノ酸残基を介したＤＶＳの結合は抗体の反応性を有意に抑制したことを示す（すなわち、９アミノ酸残基を介したＤＶＳ結合は、エピトープ認識部位を阻害する）。これらの血清は、ＣＳＡ抗原に対して特異性を有し、そしてＦＫ、ラパマイシン、またはＨＳＡ抗原と反応しなかった。ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ結合体のＫＬＨ担体分子に対する有意な応答が、ＫＬＨでコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて見られた。
【００５６】
このポリクローナル抗体応答をさらに特徴付けるために、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対する阻害ＥＬＩＳＡを行った。結果を表３に示す。ポリクローナル血清は、ＣＳＡおよび全てのＣＳＡ代謝物によって阻害された（ＣＳＡ代謝物に対する結合においていくらか変動が観察された）。これらの血清は、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ分子のエピトープに結合しなかった。これらの結果は、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原はＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物に対するポリクローナル抗血清を誘発することを示す。
【００５７】
（表１：マウスポリクローナル血清のＣＳＡ特異性を示す阻害ＥＬＩＳＡ（ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００５８】
【表１】
0003595506.tif 000010
（結果は阻害パーセントとして示されている）。
【００５９】
（表２：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨまたはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体の反応性（ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００６０】
【表２】
0003595506.tif 000011
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１００。
【００６１】
（表３：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡ抗原を用いたマウス血清（ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００６２】
【表３】
0003595506.tif 000012
（実施例９−ＡＭ１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原に対するポリクローナル抗体応答）
実施例２で記載したＡＭ１免疫原および実施例６で記載した免疫レジメ（ｒｅｇｉｍｅｓ）を用いて、マウスでポリクローナル抗血清を調製した。２次および３次免疫から１０日後に回収した個々のマウス血清を、直接ＥＬＩＳＡによって抗体力価に関してアッセイした。高い抗ＣＳＡ力価を有するマウスを、抗原パネル反応性によって特異性に関してアッセイした。結果を表４に示す。
【００６３】
これらの結果は、ＫＬＨ担体に結合体化したＡＭ１−ＤＶＳ抗原で免疫したマウスが、ＣＳＡ抗原に対する良好な抗体反応性、およびＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）、およびＡＭ９−１−ＤＶＳ抗原との交差反応性を示したことを示す。これらの血清は、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ抗原に対してより低い反応性を有していた。以前の実施例と同様に、これは、ＤＶＳのカップリングが１アミノ酸残基を介していた場合、抗血清はＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物結合体のエピトープを認識したこと、しかし９アミノ酸残基を介したＤＶＳの結合は抗体反応性を有意に抑制したこと（すなわち、抗体エピトープ認識部位をマスクしている）を示している。これらの血清は、ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物エピトープ特異的であり、そしてＦＫ、ラパマイシン、またはＨＳＡ抗原と反応しなかった。これらのマウスは免疫原結合体のＫＬＨ担体に対して有意な応答を展開した。
【００６４】
これらのポリクローナル抗体応答をさらに特徴付けるために、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対する阻害ＥＬＩＳＡを、実施例７に記載したように行った。結果を表５に示す。これらのポリクローナル血清は、ＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物によって阻害された。しかし、阻害は阻害分子によって３９〜１００％まで変化した。ポリクローナル抗血清は、ＦＫ、ラパマイシン、ＨＳＡ、またはＫＬＨ抗原に対する阻害は観察されず、ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物に対して特異的であった。
【００６５】
（表４：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体反応性（ＡＭ１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００６６】
【表４】
0003595506.tif 000013
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１００。
【００６７】
（表５：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡ抗原を用いたマウスポリクローナル血清（ＡＭ１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００６８】
【表５】
0003595506.tif 000014
（実施例１０−ＡＭ１９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原に対するポリクローナル抗体応答）
ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）またはＡＭ１９−９−ＤＶＳ  ＫＬＨ結合体（実施例４で記載したように）を用いた２次および３次免疫（実施例６で記載したように）から１０日後に血清試料を回収した。これらの血清試料を直接ＥＬＩＳＡによって、特定のハプテンに対する抗体力価に関してアッセイした。ＡＭ１９に対して高い抗体反応性を示す血清を、抗原パネルＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた（表６）。
【００６９】
マウス１および２（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）ハプテン）由来の血清は、ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物エピトープに対して良好な反応性を有し、そしてラパマイシン、ＦＫ、またはＨＳＡエピトープに対して交差反応しなかった。マウス３および４（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）ハプテン）由来の血清もＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物エピトープと反応した。アミノ酸＃９の改変（アミノ酸９にカップリングしたＤＶＳ）は、抗体の結合を減少させた。これらの血清はラパマイシン、ＦＫ、またはＨＳＡ分子のエピトープと交差反応しなかった。すべてのマウスはＫＬＨ担体タンパク質に対して有意な抗体力価を示した。
【００７０】
阻害ＥＬＩＳＡの結果（表７）は、ＣＳＡ代謝物に対する多様なポリクローナル抗体反応性、およびＣＳＡ親分子による阻害が少ししかないまたは全くないことを示している。
【００７１】
（表６：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体反応性（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００７２】
【表６】
0003595506.tif 000015
＊ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）−ＫＬＨ免疫原
＊＊ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）−ＫＬＨ免疫原
＊＊＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）または（２）のＯＤ×１００。
【００７３】
（表７：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物を用いたマウスポリクローナル血清（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００７４】
【表７】
0003595506.tif 000016
＊ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）ＨＳＡでコートしたプレート
＊＊ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）ＨＳＡでコートしたプレート。
【００７５】
ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）結合体を、ウサギを免疫するためにも使用した。ポリクローナル血清の反応性を、表８の阻害ＥＬＩＳＡの結果に示す（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）ＨＳＡでコートしたプレート）。マウス血清で見られたように、このウサギ血清はＣＳＡ分子を認識せず、そしてＣＳＡ代謝物に対する多様な反応性を示し、そしてＡＭ１ｃ、ＡＭ１ｃ９、ＡＭ１９、およびＡＭ９代謝物に強く結合した。ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対する交差反応性はなかった。
【００７６】
（表８：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物を用いたウサギポリクローナル血清（ＡＭ１９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨ（１）免疫原）の阻害パーセント）
【００７７】
【表８】
0003595506.tif 000017
ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテンに対して高い反応性を示す、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ免疫原で免疫したマウス由来の血清を、抗原パネルＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた（表９）。ＫＬＨ担体に対する有意な抗体力価が観察された。
【００７８】
マウス５および６（ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテン）由来の血清は、ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテンのエピトープを認識した。アミノ酸＃１の改変（ＣＳＡ−ＤＶＳ、ＡＭ９−１−ＤＶＳまたはＡＭ１９−１（２））は、抗体の結合を阻害した。抗体認識部位は、分子のアミノ酸１の表面、またはその付近であると想定される。
【００７９】
ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡでコートしたプレートを用いた阻害ＥＬＩＳＡによって試験した場合、ポリクローナル抗血清は異なる結果を示した。マウス５由来の血清はＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物エピトープの認識を示す。これはポリクローナル血清であるので、免疫原は親ＣＳＡ分子のエピトープおよび代謝物の修飾エピトープに対する抗体を誘発し得る。マウス６に関しては、免疫原は代謝物の修飾エピトープに対する抗体のみを誘発したようであり、ＣＳＡエピトープに対する抗体は産生されなかった。両方の血清に関して、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対する交差反応性はなかった。結果を表１０に示す。
【００８０】
（表９：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体反応性（ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）
【００８１】
【表９】
0003595506.tif 000018
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１００
（表１０：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物を用いたマウスポリクローナル血清（ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００８２】
【表１０】
0003595506.tif 000019
（実施例１１−ＡＭ９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原に対するポリクローナル抗体応答）
実施例５で記載したＡＭ９−１−ＤＶＳまたはＡＭ９−９−ＤＶＳ結合体および実施例６で記載した免疫レジメ（ｒｅｇｉｍｅｓ）を用いて、マウスでポリクローナル抗血清を調製した。個々の血清試料を２次および３次免疫から１０日後に回収し、そして直接ＥＬＩＳＡによって対応するハプテンに対する抗体力価に関してアッセイした。ＫＬＨ担体分子に対する力価も直接ＥＬＩＳＡによって定量した。
【００８３】
特定のハプテンに対して高い抗体（Ａｂ）反応性を示す、ＡＭ９−１−ＤＶＳ結合体で免疫したマウス由来の血清を、次いで抗原パネルＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた（表１１）。これらのマウス由来の血清は、ＣＳＡハプテン、ＡＭ９−１、ＡＭ１９−１（１）、および（２）ハプテン結合体を認識した（すなわち、ＡＭ９−１−ＤＶＳハプテンは、免疫認識のために分子の改変された（水酸化された）ａ．ａ．＃９表面を提示する）。ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡエピトープに対する反応性は観察されなかった。ＡＭ１９−９ハプテンに対する抗体結合の減少は、エピトープ認識部位のマスキングのためと推定される（すなわち、ＤＶＳリンカーアームによる改変ａ．ａ．＃９残基のブロックが、それによってＡｂ／Ａｇ相互作用をブロックする）。阻害ＥＬＩＳＡの結果（表１２、ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＨＳＡでコートしたプレート）は、ポリクローナル抗血清がＣＳＡ親分子のエピトープを強く認識せず、そしてＣＳＡ代謝物に関して多様な反応性を示すことを示す。ＡＭ９−１−ＤＶＳ免疫原は、種々のＣＳＡ代謝物に対するＭｏＡｂを調製および単離するために使用され得る。特異的な抗ＡＭ−９ＭｏＡｂのスクリーニングもまた達成され得る。
【００８４】
（表１１：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体反応性（ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００８５】
【表１１】
0003595506.tif 000020
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１００。
【００８６】
（表１２：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物を用いたマウスポリクローナル血清（ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００８７】
【表１２】
0003595506.tif 000021
ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテンに対して強く反応する、ＡＭ９−９−ＤＶＳ免疫原で免疫したマウス由来の血清を、抗原パネルＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた（表１３）。これらのマウス由来の血清は、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡ分子のエピトープを認識する。しかし、アミノ酸＃１を介したＤＶＳのカップリングは、ＣＳＡ、ＡＭ９−１、ＡＭ１９−１（１）およびＡＭ１９−１（２）−ＨＳＡ結合体で見られたように、抗体の結合を排除または有意に減少するようである。ａ．ａ．＃１残基を介してカップリングしたパネル抗原に対する抗体結合の減少は、Ａｂエピトープ認識部位のマスキングのためと推定される。ＡＭ９−９−ＤＶＳ免疫原は、免疫認識のために分子のａ．ａ．＃１の表面を提示するので、ＤＶＳリンカーアームによるａ．ａ．＃１残基のブロックは、それによってＡｂ／Ａｇ相互作用をブロックする。マウス血清は、ラパマイシン、ＦＫ、またはＨＳＡ抗原と交差反応せず、ＫＬＨ担体タンパク質に対する有意な抗体力価が観察された。
【００８８】
阻害ＥＬＩＳＡの結果（表１４、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡでコートしたプレート）は、これらのポリクローナル血清がＣＳＡ親分子およびＣＳＡ代謝物のエピトープ部位を認識することを示している。ＡＭ９−９−ＤＶＳハプテンは、ＣＳＡ親分子および種々のＣＳＡ代謝物に対するＭｏＡｂを調製および単離するのに使用され得る。
【００８９】
（表１３：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスポリクローナル抗体反応性（ＡＭ９−９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【００９０】
【表１３】
0003595506.tif 000022
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＡＭ１９−９−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１００
（表１４：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物を用いたマウスポリクローナル血清（ＡＭ９−９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）の阻害パーセント）
【００９１】
【表１４】
0003595506.tif 000023
（実施例１２−モノクローナル抗体産生の方法（ＭｏＡｂ）：
モノクローナル抗体産生の工程を下記に要約する：
親薬物または代謝物結合体でマウスを免疫する（１、２、３および追加）
↓
マウス脾臓からＡｂ分泌Ｂ細胞を回収する
＋
骨髄腫細胞株（ＮＳ−１、ＳＰ−２、およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）
↓
ハイブリダイゼーション（ＰＥＧを用いて）
↓
増殖
↓
スクリーニング（イムノブロット、ＥＬＩＳＡ、自動化アッセイ）
↓
クローニング（３×）
↓
スクリーニング
↓
増殖
↓
特徴付け（代謝物交差反応性）
↓
組織培養ＭｏＡｂ産生
↓
腹水ＭｏＡｂ産生。
【００９２】
多くの適当な試薬供給業者が存在するが、融合産物の高い収率を得るために、安定なクローンを単離するために、そしてモノクローナル抗体の産生のために、我々は以下のものが最も好ましいことを見出した。
【００９３】
ダルベッコ改変イーグル培地：（ＤＭＥＭ）は、ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから、Ｃａｔ＃５６４９９−１０Ｌ＋３．７ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３
ＨＡＴサプリメント：（１００×−１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム、４０ｍＭのアミノプテリン、１．６ｍＭのチミジン）は、ＣＡＮＡＤＩＡＮ  ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから、Ｃａｔ＃３１０６２−０３７
ＨＴストック：（１００×−１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム、１．０ｍＭのチミジン）は、ＣＡＮＡＤＩＡＮ  ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから、Ｃａｔ＃１１０６７−０３０
ＦＣＳ：ＳＩＧＭＡのＣＰＳＲ−３  Ｈｙｂｒｉｄ−ＭＡＸ、Ｃａｔ＃Ｃ−９１５５
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：ＰＥＧ４０００、ＳＥＲＶＡ＃３３１３６を使用する。ＰＥＧをオートクレーブし、少し冷却し、そして血清を含まないＤＭＥＭで５０％ｗ／ｖまで希釈する。融合の前日に新しいＰＥＧを作成し、そして３７℃のインキュベーターに置く。
【００９４】
（融合手順）
骨髄腫細胞は、融合の１週間前に解凍および展開し、そして融合の前日に分割する。骨髄腫細胞系統を連続培養に保たない。これは細胞がマイコプラズマに感染すること、およびあらゆる変化も阻害する。それは反復された継代から起こり得る。
【００９５】
例えば：
ＳＰ２／０を１×１０４細胞／ｍＬに分割（ｓｐｌｉｔ  ｂａｃｋ）し得、少なくとも５×１０６細胞／バイアルで凍結する
ＮＳ−１を１×１０４細胞／ｍＬに分割（ｓｐｌｉｔ  ｂａｃｋ）し得、少なくとも５×１０６細胞／バイアルで凍結する
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を１×１０４細胞／ｍｌに分割（ｓｐｌｉｔ  ｂａｃｋ）し得、少なくとも５×１０６細胞／バイアルで凍結する
融合の日に少なくとも０．５×１０７細胞（対数増殖期（ｉｎ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ  ｇｒｏｗｔｈ）を得るように骨髄腫細胞系統を培養する。融合の３から５日前に、免疫マウスを追加免疫する。マウスは、骨髄腫細胞系統と遺伝子型が適合していなければならない。骨髄腫細胞の薬剤感受性を確認する。
【００９６】
血清を、親骨髄腫細胞系統の増殖を支持する能力に関して試験する。血清のバッチを試験するために、親骨髄腫細胞を１０％、５％、２．５％、および１％ＦＣＳ中でクローニングする（クローニングの項で概略を述べるように）。支持細胞層は必要でない。５日間毎日増殖および細胞の生存能力をチェックする。
【００９７】
（融合の日）
１．融合に使用する新しい培地、ＦＣＳを水浴に置く。
２．骨髄腫細胞を回収し、そして血清を含まない培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩまたは他の市販の組織培養培地を使用し得る）で３回洗浄する。
３．免疫マウスから脾臓を摘出する（リンパ節細胞も使用し得る）；それぞれの工程、すなわち皮膚の切断、腹部筋肉の切断、脾臓の摘出の間に、器具を再滅菌するかまたは新しい滅菌器具を使用する。
４．滅菌培地を含むプラスチックペトリ皿へ移動させることによって、脾臓の外側を３回すすぐ；それぞれの工程の間で滅菌鉗子を使用する。
５．血清を含まない培地が入ったプラスチックペトリ皿に脾臓を置き、４つに切断し、そして滅菌ガラスプランジャーでふるいを通して静かに押し、単一細胞の懸濁液を得る。
６．５０ｍＬの円錐形遠心チューブで、３００×ｇ（消音装置中で１２００ｒｐｍ）で１０分間、脾臓細胞を遠心する。
７．１０ｍｌの培地に再懸濁する。アリコートを１００倍に希釈し、細胞を数える。
８．残りの脾臓細胞を遠心し、再懸濁および再遠心する。骨髄腫細胞を同時に洗浄し得る。ＮＳ−１、ＳＰ２／０、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫細胞系統が最も望ましいが、当該分野で公知の他の骨髄腫細胞系統を利用し得る。これらは、マウス細胞系統：Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＦＯ、ＮＳＯ／１、ＦＯＸ−ＮＹ；ラット細胞系統：Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＹＢ２／０およびＩＲ９８３Ｆおよび種々のウサギおよびヒト細胞系統を含むがこれに限らない。
９．脾臓細胞が過剰の５：１または１０：１の比で、骨髄腫および脾臓細胞を一緒に加える。
１０．再遠心：脾臓細胞および骨髄腫を３回洗浄した。
１１．ペレットを静かに払い落とし、そしてインキュベーターに１５分間置いて３７℃にする。
【００９８】
融合プロトコール：
１．チューブを３７℃の水浴（温水の入ったビーカー）中に保ちながら、１分間攪拌しながら１ｍＬの５０％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）溶液を加える（０．２５ｍＬ／１５秒加える）。ＰＥＧは骨髄腫の膜を抗体分泌（Ｂ）細胞と融合させる。
２．３７℃の水浴中に保ちながら１分間攪拌する。溶液は塊だらけになる。
３．１分間攪拌しながら３７℃で１ｍＬの培地を加える。
４．１分間攪拌しながらあと１ｍＬの培地を加える。
５．２分間攪拌しながら８ｍＬの培地を加える。
６．３００×ｇ（消音装置中で１２００ｒｐｍ）で１０分間遠心し、そして上清をピペットで取り除く。
７．チューブ中の細胞に１０ｍＬの培地＋２０％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）を加え、そしてプラスチックのペトリ皿に注ぐ。
８．３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーターに１−３時間置く。これは融合産物の安定性を増す。
９．培地中で（１００μＬ／ウェル）ウェルあたり２×１０５細胞の濃度で細胞をプレーティングする。
１０．次の日、細胞に培地中１００μＬの２×ＨＡＴを与える。
【００９９】
−この時支持細胞層は必要でない。
【０１００】
−３日目に、融合産物に１００μＬの培地＋ＨＡＴ選択添加物を与える。ハイブリドーマ細胞（骨髄腫：脾臓細胞ハイブリッド）は、核酸のデノボ合成経路を阻害する薬剤アミノプテリンの添加によって選択される。骨髄腫：脾臓ハイブリッド細胞は、サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）経路を使用することによって生存し得る。融合しなかった骨髄腫細胞および骨髄腫：骨髄腫融合産物は、サルベージ経路に欠損を有しており、そして死滅する。免疫マウス由来の融合しなかった脾臓細胞は、組織培養では増殖しない。骨髄腫：脾臓細胞ハイブリッドを選択するために、メトトレキサートまたはアザセリンのような当該分野で公知の他の薬剤を使用し得る。
【０１０１】
−必要なら５日目に、融合産物に１００μＬの培地＋ＨＡＴ＋脾臓／胸腺支持細胞層を与える（１×１０５細胞／ウェル）。線維芽細胞、ＲＢＣ、または他の細胞型も支持細胞層として使用し得る。
【０１０２】
−１週間細胞に培地＋ＨＡＴを与え続け、融合後から７日目までに培地＋ＨＴに変える。融合から１０−１４日後にクローンが現れる。
【０１０３】
注記：
１．脾臓細胞、骨髄腫細胞の洗浄および融合プロトコールの工程１−６は、血清を含まない培地で行う。
２．胸腺細胞は約３日、融合しなかった脾臓細胞は約６日で死滅する。
３．ハイブリッドはかなり大きく、そしてほとんどいつも球形で虹色である。
４．Ｔ細胞および顆粒球コロニーも増殖し得る。それらはより小さい細胞である。
【０１０４】
ハイブリッド細胞のクローニング：
１．滅菌エッペンドルフピペットチップを用いて、ウェル中で２００μＬを再懸濁し、そして小さい５ｍＬの滅菌チューブへ移す。
２．もとのウェルに２００μＬの培地（２０％のＦＣＳ  ｖ／ｖ）を加える。これはクローニング手順の安全予防措置である。親細胞も予防措置として２４穴プレートに移し得る。
３．工程１のハイブリッド細胞懸濁液の２０μＬを取り、そして２０μＬのエオジンまたはトリパンブルー溶液を加える。４０倍の倍率では、ハイブリッド細胞は骨髄腫細胞系統とほとんど同じ大きさおよび形態に見える。
４．生存能力のある細胞を、以下のものを用いた限界希釈によってクローニングする：
融合に使用された２０％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）
培地
１×ＨＴ
１ｍｌあたり１×１０６の胸腺細胞
クローニングプロトコールあたりクローン１４００細胞
希釈クローニング手順：
２０％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）を有するＤＭＥＭ中で１０ｍＬの胸腺細胞クローニング懸濁液を作成する。１４００ハイブリッド細胞を取り、そして２．８ｍＬに希釈する。
列１：８ウェルにまく（２００μＬ／ウェル）→１００細胞／ウェル。
【０１０５】
残りの１．２ｍＬに１．２ｍＬの培地を加える。
列２：８ウェルにまく（２００μＬ／ウェル）→５０細胞／ウェル。
【０１０６】
残りに２．０ｍＬの培地を加える。
列３：８ウェルにまく（２００μＬ／ウェル）→１０細胞／ウェル。
【０１０７】
残りに１．２ｍＬの培地を加える。
列４：８ウェルにまく（２００μＬ／ウェル）→５細胞／ウェル。
【０１０８】
残りに２．８ｍＬの培地を加える。
列５および６：１６ウェルにまく（２００μＬ／ウェル）→１細胞／ウェル。
【０１０９】
クローニングおよび陽性ウェルのスクリーニングの後、早く増殖する、より強く反応するクローンを再びクローニングする。ハイブリドーマが安定および単一細胞のクローンであることを保証するために、試験した全てのウェルが陽性になるまでこのクローニングを３回繰り返す。次いで細胞を増殖させ得、そして組織培養上清をモノクローナル抗体のために回収する。当該分野で公知の他の限界希釈クローニング手順、単一の細胞を選ぶ単一細胞クローニング手順、および軟寒天での増殖による単一細胞クローニングも採用し得る。
【０１１０】
モノクローナル抗体の産生：
モノクローナル抗体を、組織培養上清から容易に回収し得る。ハイブリッド細胞は、ＦＣＳ補充物を含む組織培養培地、または当該分野で公知の血清を含まない培地中で増殖し得る。大規模な量のモノクローナル抗体を、中空繊維またはバイオリアクター技術を用いて産生し得る。腹水液として産生した場合、特異的なモノクローナル抗体の濃度、親和性、およびアビディティーを増加させ得る。
【０１１１】
腹水液産生：
１．ハイブリッド細胞を注射する少なくとも５日前に、０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を注射（Ｉ．Ｐ．）することによってマウスを調整する。マウスは注射される細胞と遺伝子型が適合しているべきである。すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＮＳ−１またはＳＰ２／０融合産物と共に使用する。細胞を注射する前に照射する場合、適合しない遺伝子型を有するマウスを使用し得る。しかし、Ｂａｌｂ／ｃプリスタン処理マウスが使用するのに最も良い。
２．ＰＢＳ中１０６（またはそれ以上）のハイブリッド細胞を注射する（Ｉ．Ｐ．）。ＦＣＳを除去するために、注射の前に細胞を３回洗浄する。
３．約７−１４日でマウスは穿刺する準備ができる。腹水細胞および液を収集するために１８−１／２Ｇの針を使用する。
４．これらのマウス由来の少なくとも１０６腹水細胞を、よりプリスタン処理したマウスに移す。
５．腹水細胞を１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）、２０％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）、ＤＭＥＭ培地中で凍結し得る。バイアルあたり約５×１０６細胞を凍結する。
【０１１２】
組織培養または腹水液によって調製したモノクローナル抗体を、当該分野で公知の方法を用いて精製し得る。
【０１１３】
（実施例１３−ＣＳＡおよび／またはＣＳＡ代謝物／誘導体の特定の部位に対するモノクローナル抗体の単離および特徴付け）
ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物の特定の部位に対する反応性を有するモノクローナル抗体を単離および特徴付けする工程を、下記に概略を述べる：
ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物の特定の部位に対するＭｏＡｂを同定する工程
免疫レジメ（ｒｅｇｉｍｅ）（ポリクローナル血清を収集する）
↓
直接ＥＬＩＳＡ（ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物に対するＡｂ）
↓
抗原パネルＥＬＩＳＡ
↓
阻害ＥＬＩＳＡ
（ＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物／誘導体エピトープに対する特異性、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ阻害剤に対する交差反応性）
↓
直接ＥＬＩＳＡ（ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、またはＨＳＡ交差反応性）
↓
融合手順
↓
親融合産物のスクリーニング
イムノドット（Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ）
直接ＥＬＩＳＡ
阻害ＥＬＩＳＡ
Ａｂアイソタイピング
↓
クローニングおよびスクリーニング（３×）
↓
組織培養上清中のＡｂの特徴付け
直接ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧアイソタイプのみ）
ＡｇパネルＥＬＩＳＡ（ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、またはＨＳＡの交差反応性）
阻害ＥＬＩＳＡ（ラパマイシン、ＦＫ、ＣＳＡ、およびＣＳＡの代謝物阻害剤）
↓
腹水産生
直接ＥＬＩＳＡ（Ａｂ力価およびアイソタイプ）
阻害ＥＬＩＳＡ（ラパマイシン、ＦＫ、ＣＳＡ、およびＣＳＡの代謝物阻害剤）
↓
Ａｂ精製
抗体反応性を特徴付ける
（イムノドット（Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ）アッセイ）
１．５−１０μＬの抗体を、参照のためにグリッドを据えたニトロセルロース紙に点在させる。
２．風乾し、そしてニトロセルロースをＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）／５％のミルク（ｗ／ｖ）に浸して、非特異的結合部位をブロックする。振とうしながら室温で６０分間インキュベートする。
３．ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）で２回すすぎ、そして１０分間振とうしながら洗浄する。
４．アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｔａｇｏ  ｃａｔ＃ＡＭＩ４４０５）をＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）中で１：２０００に希釈する。パラフィルムまたはサランラップ上にニトロセルロースを置き、そしてニトロセルロースが覆われるまで希釈した結合抗体を加える。覆いをして３７℃で６０分間インキュベートする。工程の間でニトロセルロースを乾かさない。
５．工程３のように洗浄する。
６．ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃１８２８０−０１６；２０ｍＬの基質緩衝液中８８μＬのＮＢＴおよび６６μＬのＢＣＩＰ、１００ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ）を用いて酵素基質を調製する。基質溶液中にニトロセルロースを置き、そして色の展開を見ながら室温で１０−３０分振とうする。
７．水でニトロセルロースをすすぎ、反応を止める。
【０１１４】
一旦抗体分泌親融合産物を同定すれば、組織培養上清をＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物反応性に関して、実施例７で記載したように直接、アイソタイピングおよび阻害ＥＬＩＳＡアッセイによってさらに特徴付けた。ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物陽性親融合産物のクローン（３×）由来の組織培養上清を、次いでＩｇＧ産生クローンを単離するためにアイソタイピングＥＬＩＳＡによって、抗体力価を決定するために直接ＥＬＩＳＡによって、ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物反応性を決定するためおよびＦＫおよびＨＳＡ交差反応性を決定するためにＡｇパネルＥＬＩＳＡによって、ならびにさらに特異性を証明し、そしてＣＳＡ部位反応性を決定するためにラパマイシン、ＣＳＡ、ＦＫおよびＣＳＡ代謝物を用いた阻害ＥＬＩＳＡによって特徴付けた。
【０１１５】
イムノドット（Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ）および直接ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＣＳＡおよび代謝物抗原に対して強い反応性を有する多くの親融合産物を同定した。本発明者らは現在、直接、Ａｇパネル、阻害およびアイソタイピングＥＬＩＳＡアッセイによって、ＣＳＡおよび代謝物抗原に対して反応性を有する、多くのＩｇＭおよびＩｇＧ分泌クローンを単離した。
【０１１６】
（実施例１４−ＣＳＡ−ＤＶＳ免疫原に対して誘発されるモノクローナル抗体）
ＣＳＡ−ＤＶＳ結合体で免疫したマウス由来の脾臓細胞を、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマクローンを調製するために使用した。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗ＣＳＡ分泌クローンを単離した。表１５は、これらの抗ＣＳＡ  ＭｏＡｂの２つ（ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９）由来の組織培養上清（ＴＣＳ）の反応性を例証する。
【０１１７】
これらの２つのＭｏＡｂは、ＣＳＡ−ＤＶＳ、ＡＭ９−１−ＤＶＳ、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）およびＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）パネル抗原（すなわち、＃１アミノ酸残基を介して結合したハプテン）に対して良好な反応性（高いＯＤ）を示す。ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテンに対するＭｏＡｂ結合の減少は、＃９アミノ酸残基を介したＤＶＳ結合が、Ａｂ／エピトープ結合を減少することを示す（すなわち、ＣＳＡ分子のこの領域は重要であるか、またはエピトープ認識部位の一部である）。ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９は、ＣＳＡエピトープに特異的であり、そしてＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ分子のエピトープに交差反応しなかった。
【０１１８】
ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９  ＭｏＡｂの特異性をさらに特徴付けるために、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対する阻害ＥＬＩＳＡアッセイを行った。表１６は、ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９由来のＴＣＳが、親ＣＳＡ分子（ＣＳＡ−２Ｇ９がより強く阻害された）ならびにＡＭ１およびＡＭ１ｃ代謝物によって阻害されることを示す。ＡＭ４ｎ代謝物、ＡＭ１ｃ９代謝物、ＡＭ１９の代謝物、およびＡＭ９代謝物による阻害は有意である。ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳは、ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物エピトープに特異的であり、そしてラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡと交差反応しない。ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９は、ＣＳＡ親分子およびＣＳＡ代謝物レベルを測定するＴＤＭアッセイで使用され得る。
【０１１９】
（表１５：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ＣＳＡ−１Ｈ６、ＣＳＡ−２Ｇ９）反応性）
【０１２０】
【表１５】
0003595506.tif 000024
（ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９はどちらもＩｇＧ１抗体アイソタイプである）
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１０  ０
（表１６：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡの抗原によるＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳの阻害パーセント）
【０１２１】
【表１６】
0003595506.tif 000025
（実施例１５−ＡＭ１−ＤＶＳ免疫原に対して誘発されるモノクローナル抗体）
ＡＭ１−ＤＶＳ結合体で免疫したマウス由来の脾臓細胞を、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞を調製するために使用した。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗ＣＳＡ  ＭｏＡｂを、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対する直接ＥＬＩＳＡによって単離した。表１７は、これらのモノクローナル抗体クローンのうち２つ（ＡＭ１−２Ｅ１０およびＡＭ１−７Ｆ５）由来の、ＴＣＳの反応性を例証する。
【０１２２】
ＣＳＡ−ＤＶＳハプテンによって誘発されるモノクローナル抗体と同様に、ＡＭ１−ＤＶＳハプテンに対して誘発されるＭｏＡｂは、ＣＳＡ−ＤＶＳ、ＡＭ９−１−ＤＶＳ、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）、およびＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）パネル抗原（すなわち、＃１アミノ酸残基を介してＤＶＳリンカーと結合したハプテン）に対して良好な親和性を有する。同様に、ＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテンに対するＭｏＡｂ結合の減少は、＃９アミノ酸残基を介したＤＶＳの結合は、Ａｂ／エピトープ結合を減少させることを実証する。これらの結果は、ＡＭ１−２Ｅ１０およびＡＭ１−７Ｆ５が、ＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物エピトープに特異的であり、ＦＫ分子、ラパマイシン分子、ＫＬＨ分子、またはＨＳＡ分子のエピトープを認識しないことを示す。
【０１２３】
ＡＭ１−２Ｅ１０およびＡＭ１−７Ｆ５  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳの特異性を、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡ結合体に対する阻害ＥＬＩＳＡによってさらに特徴付けた。表１８は、ＡＭ１−２Ｅ１０が親ＣＳＡ分子および全てのＣＳＡ代謝物によって阻害されることを実証する。このＭｏＡｂは、ラパマイシン分子、ＦＫ分子、ＫＬＨ分子、またはＨＳＡ分子のどのエピトープとも交差反応しない。ＡＭ１−２Ｅ１０は、ＣＳＡ親分子および全てのＣＳＡ代謝物レベルを測定するＴＤＭアッセイで利用し得る。
【０１２４】
ＡＭ１−７Ｆ５に関しては、ＡＭ１代謝物およびＡＭ１ｃ代謝物が、ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡでコートしたプレートに対するＭｏＡｂ結合を強く阻害する。より少ないが有意な阻害がＣＳＡ親分子およびＡＭ４ｎ代謝物、ＡＭ１ｃ９代謝物、ＡＭ１９代謝物およびＡＭ９代謝物によって見られた。ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡは、有意な阻害を示さなかった。この結果は、ＡＭ１−７Ｆ５が、ＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物レベルを測定するＴＤＭアッセイで使用し得ることを実証する。特定のＴＤＭアッセイ条件下では（すなわちＭｏＡｂ希釈）、ＡＭ１−７Ｆ５はまた、ＡＭ１代謝物およびＡＭ１ｃ代謝物のレベルを選択的に測定するのに使用し得る。
【０１２５】
（表１７：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡの抗原に対するマウスモノクローナル抗体反応性（ＡＭ１−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原））
【０１２６】
【表１７】
0003595506.tif 000026
（ＡＭ１−２Ｅ１０はＩｇＧ２ｂであり、およびＡＭ１−７Ｆ５はＩｇＧ１抗体アイソタイプである）
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＣＳＡ−ＤＶＳ−ＨＳＡのＯＤ×１０  ０
（表１８：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡの抗原によるＡＭ１−２Ｅ１０  ＭｏＡｂクローンおよびＡＭ１−７Ｆ５  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳの阻害パーセント）
【０１２７】
【表１８】
0003595506.tif 000027
（実施例１６−ＡＭ１９−ＤＶＳ免疫原に対して誘発されるモノクローナル抗体）
ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）結合物で免疫したマウス由来の脾臓細胞を、ＭｏＡｂ分泌ハイブリドーマ細胞を調製するために使用した。抗ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）ＥＬＩＳＡ反応性ＩｇＭおよびＩｇＧ  ＭｏＡｂアイソタイプを単離した。表１９は、これら抗ＡＭ１９−１−ＤＶＳ  ＭｏＡｂの２つ（ＡＭ１９−１−７Ｅ１２−１およびＡＭ１９−１−７Ｅ１２−２）由来の、ＴＣＳの反応性を示す。
【０１２８】
これら２つのＭｏＡｂ  ＴＣＳは、ＣＳＡ−ＤＶＳ、ＡＭ９−１−ＤＶＳ、ＡＭ１９−９−ＤＶＳ、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）およびＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）パネル抗原に対して高い反応性を有する。これらのモノクローナルは、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対して交差反応しなかった。ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）でコートしたＥＬＩＳＡプレートによる、より特異的な阻害ＥＬＩＳＡを用いると、ＣＳＡ親分子は抗体結合を阻害せず、ＡＭ１ｃ代謝物質はこれらＭｏＡｂの結合を強く阻害し、ＡＭ１およびＡＭ１ｃ９はＭｏＡｂ結合を有意に阻害し、ＡＭ４ｎ、ＡＭ１９およびＡＭ９は結合を中程度に阻害し、そしてラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡはＭｏＡｂ結合の阻害を示さなかった（表２０）。
【０１２９】
特定のＴＤＭアッセイ条件下では（すなわちＭｏＡｂ希釈）、ＡＭ１ｃ代謝物質のレベルを定量し得る；ＣＳＡ親分子に反応しないが、全てのＣＳＡ代謝物質レベルを選択的に同定するために、アッセイのパラメーターも修飾し得る。
【０１３０】
表１９：ＣＳＡ、ＣＳＡ代謝物質、ＦＫ、ラパマイシン、ＫＬＨ、またはＨＳＡ抗原に対するマウスモノクローナル抗体反応性（ＡＭ１９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原）
【０１３１】
【表１９】
0003595506.tif 000028
（ＡＭ１９−１−７Ｅ１２−１およびＡＭ１９−１−７Ｅ１２−２はどちらもＩｇＧ１抗体アイソタイプである）
＊反応性パーセント＝テスト抗原のＯＤ／ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（１）−ＨＳＡのＯＤ×１００。
【０１３２】
表２０：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物質、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、およびＨＳＡ抗原によるＡＭ１９−１−７Ｅ１２−１およびＡＭ１９−１−７Ｅ１２−２  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳの阻害パーセント
【０１３３】
【表２０】
0003595506.tif 000029
同様に、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）およびＡＭ１９−９−ＤＶＳハプテン−タンパク質結合物免疫原を用いて、ＭｏＡｂを調製した。例えば、ＡＭ１９−１−ＤＶＳ（２）およびＡＭ１９−９−ＤＶＳ結合物を、ＡＭ１またはＡＭ９代謝物質に対して特異的なＭｏＡｂを開発するのに使用した。ＡＭ１９−１およびＡＭ１９−９免疫原の能力は、ＡＭ１またはＡＭ９代謝物質残渣のＭｏＡｂ開発に限定されない；それらはまた、他のＣＳＡ代謝物質残渣および親ＣＳＡ分子のエピトープに対するＭｏＡｂを調製するために使用し得る。ＡＭ１９−９ハプテンに対して誘発されるＭｏＡｂの反応性の例を表２１に示す。
【０１３４】
表２１：ＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物質によるＡＭ１９−９−１Ｅ１１、ＡＭ１９−９−５Ａ６およびＡＭ１９−９−２Ｇ９  ＭｏＡｂクローン由来のＴＣＳの阻害
【０１３５】
【表２１】
0003595506.tif 000030
＊これらのＴＣＳは、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡに対して交差反応性を有していなかった。
【０１３６】
（実施例１７−ＡＭ９−ＤＶＳ免疫原に対して誘発されるモノクローナル抗体）
本出願で開示される方法を用いて、ＡＭ９−ＤＶＳ−ＫＬＨ結合物で免疫したマウス由来の脾臓細胞を、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞を調製するために使用し得る。ＡＭ９−１−ＤＶＳ−ＫＬＨおよびＡＭ９−９−ＤＶＳ−ＫＬＨ免疫原を、ＡＭ１、ＡＭ１ｃおよびＡＭ９代謝物質部分に対する特異性を有するＭｏＡｂを誘発するために使用し得る。他のＣＳＡ／ＣＳＡ代謝物質抗原に対するＭｏＡｂも、これらの免疫原を使用して調製し得る（表２２）。
【０１３７】
表２２：ＡＭ９−１−９Ｈ５、ＡＭ９−１−２Ａ１１、ＡＭ９−９−４Ｆ５およびＡＭ９−９−６Ｃ３由来のＴＣＳの阻害パーセント
【０１３８】
【表２２】
0003595506.tif 000031
＊これらのＴＣＳは、ラパマイシン、ＦＫ、ＫＬＨ、またはＨＳＡに対して交差反応性を有していなかった。
【０１３９】
（実施例１８−精製モノクローナル抗体の選択性）
本発明のＭｏＡｂの反応性および選択性を確認するために、精製ＭｏＡｂを組織培養上清から調製した。ＭｏＡｂを精製するために、以下の手順を使用した：
抗体精製プロトコール：
モノクローナル細胞の凍結バイアルを解凍し、そしてＤＭＥＭ＋補充物（１０％のＣＰＳＲ−３、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム）２００ｍｌ中で、コンフルエントになるまで増殖させる。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
１．１２００ＲＰＭ、１０分間、４℃で遠心分離することによって、濃縮上清を回収する。
濃縮上清のｐＨをｐＨ７に保つ。
２．指示に従ってプロテインＧカラムを調製する（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、コード番号１７−０８８６−０２、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
３．室温で濃縮上清をプロテインＧカラムにかける。
４．２５ｍｌの結合緩衝液（０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄する。
５．１５−２０ｍｌの溶出緩衝液（０．５Ｍの酢酸、ｐＨ３．０）でカラムを溶出する。
６．フラクションコレクター（ＩＳＣＯ、ＦＯＸＹ  Ｊｒ．）を用いて画分を回収する。
７．０．５ｍｌの中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）で溶出画分を中和する。
８．２８０ｎｍの波長で溶出画分の光学密度を測定する（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒＤＵ６４０ｉ）。
９．Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：６−８０００（ＳＰＥＣＴＲＵＭ、＃１３２６５３）中に画分を一緒にプールする。
１０．１×ＰＢＳに対して４℃、Ｏ／Ｎで透析する。
１１．ＢＳＡを標準（０、２００、４００、６００、８００、１０００ｍｇ／ｍｌ）として使用してプロテインアッセイをする。２８０ｎｍの波長でＯ．Ｄ．を読む。
【０１４０】
当該分野で公知の他の抗体精製方法を使用し得る。競合的阻害ＥＬＩＳＡを用いて、水酸化または脱メチル化ＣＳＡ代謝物質のパネルに対するＭｏＡｂの交差反応性を決定した。本発明の代謝物質ハプテン結合物に対するＭｏＡｂは、その選択性に基づいて少なくとも６つのグループに分け得る。組織培養上清から精製した種々のＭｏＡｂの選択性を表２３に示す。
【０１４１】
表２３：精製ＭｏＡｂの選択性
【０１４２】
【表２３】
0003595506.tif 000032
＊この選択性は、阻害ＥＬＩＳＡ形式で決定した。
【０１４３】
グループＩのＭｏＡｂは、ＡＭ１代謝物質に選択的であり、図３はＡＭ１代謝された残渣に対するＭｏＡｂ  ＡＭ１９−９−５Ａ６の選択性を示す。
【０１４４】
（実施例１９−ＣＳＡ誘導体に対するモノクローナル抗体）
ＣＳＡ−１Ｈ６、ＣＳＡ−２Ｇ９、ＡＭ１−２Ｅ１０、ＡＭ１−７Ｆ５およびＡＭ１９−７Ｅ１２−１  ＭｏＡｂの特異性も、ＣＳＡ、ＣＳＡ誘導体およびＣＳＧインヒビターを用いて分析した（表２４）。
【０１４５】
以前に示したように、これらのＭｏＡｂは親ＣＳＡ分子によって阻害された。ＣＳＡ分子のアミノ酸＃１残基の重水素化は、Ａｂエピトープ部位認識に影響を与えなかった。そのＥＬＩＳＡプレートへの結合は、このＣＳＡ誘導体によって阻害された。ＭｏＡｂ  ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９は、シクロスポリンＧ（ＣＳＧ）分子に良好な親和性を有する。ＡＭ１  ＭｏＡｂはＣＳＧに対して中程度（ＡＭ１−２Ｅ１０＝６１％阻害）から低い（ＡＭ１−７Ｆ５＝２８．８％阻害）親和性を示す。
【０１４６】
このデータは、ＣＳＡ−１Ｈ６、ＣＳＡ−２Ｇ９、ＡＭ１−２Ｅ１０およびＡＭ１−７Ｆ５がＣＳＡ分子およびアミノ酸残基＃１を改変したＣＳＡ誘導体に対して良好な親和性を有することを示す。ＣＳＡ−１Ｈ６およびＣＳＡ−２Ｇ９はまた、ＣＳＧ分子にも良好な親和性を有する。これらのＭｏＡｂはどれもラパマイシンまたはＦＫの誘導体のエピトープと交差反応しない。
【０１４７】
表２４：ＣＳＡ、ＣＳＧ、およびＣＳＡ誘導体によるＣＳＡおよびＡＭ１  ＭｏＡｂの阻害パーセント
【０１４８】
【表２４】
0003595506.tif 000033
この実施例は、本発明のＣＳＡまたはＣＳＡ代謝物質結合物を用いて、ＣＳＡ親分子、ＣＳＧ、または他のＣＳＡ誘導体／アナログのエピトープを認識する抗体を誘発し得ることを示す。
【０１４９】
（実施例２０−インビトロ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによるＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物質の生物学的活性の測定）
生物学的（免疫抑制的）活性を有するＣＳＡ代謝物質を同定し、そしてこの活性を親ＣＳＡ分子の免疫抑制活性と比較して定量するのに、ＭＬＲアッセイは有用である。
【０１５０】
この目的に有用な混合リンパ球増殖アッセイ手順の例を、図９に図表を用いて示し、そして以下のように行う：
２方法（ｔｗｏ−ｗａｙ）混合リンパ球反応アッセイ：
１．２人の個人から血液を採取し（それぞれ２０ｍｌ）、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてリンパ球を単離する。
２．２％の酢酸（ｖ／ｖ）中１：１０の希釈でリンパ球を数える。
３．ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ（ｖ／ｖ）中１×１０６細胞／ｍｌでそれぞれのリンパ球集団（Ａ＋Ｂ）を１０ｍｌ調製する。
４．９６ウェル滅菌組織培養プレート、平底（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ｃａｔ＃８３．１８３５）を設定する。それぞれのウェルに以下のものを加える：
５．ウェルあたりリンパ球集団Ａのアリコート１００μｌ
６．ウェルあたりリンパ球集団Ｂのアリコート１００μｌ
７．補充物を含まないＤＭＥＭ中、三連で、ウェルあたり０、２．５、５、１０、２５、５０および１００μｇ／Ｌの薬物（ＣＳＡおよびＣＳＡ代謝物質）を、アリコート２０μｌ
８．増殖に対する薬物の効果を測定するために、プレートを５日間、３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。
９．６日目に、補充物を含まないＤＭＥＭ中１：５０希釈のメチル−３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃ＴＲＫ１２０）を３．２ｍｌ調製する。ウェルあたり３０μｌを加え、そして１８時間３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。
１０．７日目にＣｅｌｌ−Ｈａｒｖｅｓｔｏｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ、ｃａｔ＃１１０１９）を用いてガラスマイクロファイバーフィルターＧＦ／Ａ（Ｗｈａｔｍａｎ、ｃａｔ＃１８２００２４）で細胞を回収する。１．０ｍｌの滅菌蒸留水で細胞を３回洗浄する。
注：全ての手順は、無菌技術を用いて生物学的フローフード（ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）で行う。
１１．フィルターをシンチレーションバイアルに置き、そして１．５ｍｌのＳｃｉｎｉＳａｆｅ  Ｐｌｕｓ  ５０％  シンチレーション液（Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃ＳＸ−２５−５）を加える。
１２．ベータカウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、ＴＡＵＲＵＳ自動化液体シンチレーションカウンター）を用いて１分間、リンパ球に組み込まれた放射活性の量を測定する。
１３．それぞれの薬剤に関して平均および標準偏差を計算し、そして結果を以下のように表す：
0003595506.tif 000034
％増殖＝１００−％阻害
当該分野で公知の他の混合リンパ球反応アッセイも使用し得る。
【０１５１】
生物学的に活性なＣＳＡ代謝物質および／または親ＣＳＡ分子に結合する、本発明の抗体を選択するためにＭＬＲアッセイを利用し得る。生物学的に不活性な代謝物質部分に対する反応性に関しても抗体を選択し得る。そのような反応性／選択性を示すＭｏＡｂの例を、表２５に示す。
【０１５２】
表２５：抗ＣＳＡ代謝物質ＭｏＡｂの、ＭＬＲのＣＳＡ阻害をブロックする能力
【０１５３】
【表２５】
0003595506.tif 000035
表２５に示したように、１００μｇ／Ｌ濃度のＣＳＡは、ＭＬＲを４９．１％（ＩＣ５０の値）阻害し、培地単独はＭＬＲの阻害を引き起こさなかった。多くのＭｏＡｂがＭＬＲのＣＳＡ阻害をブロックし、ＣＳＡ分子のエピトープへのＭｏＡｂ結合（または交差反応性）を示した。全てのＭｏＡｂはこのＭＬＲアッセイでコントロール試験し（ＣＳＡ薬物無しで）、非特異的抑制効果を決定した。どのＭｏＡｂもＭＬＲの抑制を示さなかった。３つのＭｏＡｂ（ＡＭ９−１−２Ａ１１；ＡＭ１９−９−５Ａ６；ＡＭ１９−９−２Ｇ９）は、ＭＬＲのＣＳＡ阻害をブロックする能力を示さなかった。この結果は、代謝物質部分に対する選択性を示す阻害ＥＬＩＳＡの結果を確認する。ＡＭ９−１−２Ａ１１はＡＭ１およびＡＭ１ｃに選択的である；ＡＭ１９−９−５Ａ６はＡＭ１に選択的である；およびＡＭ１９−９−２Ｇ９はＡＭ１およびＡＭ９に選択的である。これらのＭｏＡｂはＣＳＡ分子のエピトープに結合または交差反応しない。
【０１５４】
（実施例２１−シクロスポリンの特定の部位に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイキット）
本発明のＣＳＡの特定の部位に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、イムノアッセイまたはＴＤＭキットの開発に使用し得る。そのようなアッセイは、直接、阻害、競合的またはサンドイッチイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイシステム）、ＲＩＡ、固相または液相アッセイまたは自動化アッセイシステムを含み得るが、これらに限定されない。
【０１５５】
自動化アッセイ形式で、ＣＳＡ−２Ｇ９  ＭｏＡｂはＣＳＡ−酵素結合物を有意に阻害し得る（２７．６％；このアッセイ形式での最大阻害は３０％）。この阻害は、遊離ＣＳＡによって調節（ブロック）され得る。自動化ＴＤＭアッセイにおけるＣＳＡの定量のために最適化され得る、本発明の結合物を用いて誘発される他のＭｏＡｂは、ＭｏＡｂ  ＣＳＡ−１Ｈ６；ＡＭ１−７Ｆ５；ＡＭ１−３Ｂ１；ＡＭ１−２Ｅ１０；ＡＭ１−３Ｃ１；ＡＭ１９−１−５Ｄ２；ＡＭ１９−１−４Ｅ８；ＡＭ１９−１−５Ｂ２；ＡＭ９−９−１１Ｈ１１およびＡＭ９−９−４Ｆ５を含む（しかしこれらに限定されない）。
【０１５６】
本発明のさらなる局面は、患者試料中の代謝物質を除去またはブロックするために代謝物質選択的ＭｏＡｂを使用すること；それによって抗ＣＳＡ代謝物質交差反応性を低減することである。これは、試料中の親ＣＳＡ分子レベルのより正確な決定を可能にする。この目的のために最も好ましい本発明のＭｏＡｂは、ＭｏＡｂ  ＡＭ１−２Ｅ１０；ＡＭ１９−９−５Ａ６；ＡＭ９−１−６Ｄ４；ＡＭ９−１−７Ｄ２；ＡＭ９−９−１１Ｇ９；ＡＭ９−９−６Ｃ３；ＡＭ１−３Ａ６；ＡＭ１９−１−７Ｅ１２；ＡＭ９−１−２Ａ１１；ＡＭ１９−９−１Ｅ１１；ＡＭ１９−９−１Ｄ８；ＡＭ１９−９−２Ｇ９；およびＡＭ９−１−４Ｄ６を含むがこれらに限定されない。
【０１５７】
本発明の別の局面は、ＣＳＡまたは代謝物質ハプテン結合物を、アミノ酸＃１の領域の外側のＣＳＡエピトープに対する抗体を調製するのに使用し得ることである。アミノ酸＃９の領域の外側のＣＳＡエピトープに対して他の抗体を調製し得る。２つの異なる種由来の抗体を用いて、ＴＤＭのためのサンドイッチアッセイを開発し得る。例えば、ＡＭ９−９−ＤＶＳハプテン結合物を用いて調製したマウスポリクローナルまたはモノクローナル抗体（Ａｂ  Ａ）はＣＳＡに結合する；ＣＳＡ−ＤＶＳまたはＡＭ１−ＤＶＳハプテンを用いて調製したウサギポリクローナルまたはモノクローナル抗体（Ａｂ  Ｂ）は、ＣＳＡ分子の他の面にあるエピトープに結合し、サンドイッチアッセイを提供する。本発明はまた、ＣＳＡ代謝物質の種々のエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。これらのＭｏＡｂを用いて特定の代謝物質をブロック、結合、または除去する方法を、当該分野で公知の方法を用いて開発し得る。
【０１５８】
ＭｏＡｂの組み合せを用いて、ＣＳＡ親分子および特定の生物学的に活性な、および／または毒性の代謝物質レベルを測定するためにも、ＴＤＭアッセイを設計し得る。例えば、ＭｏＡｂ（親ＣＳＡ分子に特異的）と、ＭｏＡｂ（ＡＭ１およびＡＭ１ｃ代謝物質に特異的）およびＭｏＡｂ（ＡＭ９代謝物質に特異的）との組み合せを、ＣＳＡ、ＡＭ１、ＡＭ１ｃ、およびＡＭ９代謝物質レベルを測定するために使用し得る。そのようなＭｏＡｂをまた、ＣＳＡまたは特定のＣＳＡ代謝物質レベルを定量するために単独で使用し得る。
【０１５９】
本出願で開示された実施例は、親ＣＳＡ／ＣＳＡ誘導体レベル；または親ＣＳＡ／ＣＳＡ誘導体および全てのＣＳＡ代謝物質レベル、または親ＣＳＡ／ＣＳＡ誘導体および特定の代謝物質レベル（すなわち、ＡＭ１および／またはＡＭ１ｃおよび／またはＡＭ９）を測定するＴＤＭアッセイ、あるいは特定のＣＳＡ代謝物質レベルを測定するＴＤＭアッセイの開発に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製を示す。それらは本発明の原理の単なる証明として提示しただけなので、本発明は実施例２−５で記載した免疫原を用いたモノクローナル抗体の産生に限定されない。本発明はまた、ＣＳＡ誘導体または任意のＣＳＡ代謝物質を用いた免疫原の調製、および全てのＣＳＡ代謝物質（すなわち、フェーズ（ｐｈａｓｅ）Ｉ、ＩＩ等の代謝物質）に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生を含む。
【０１６０】
本開示を読む際、本発明の改変が当業者に明らかである。これらの改変は本開示、実施例、および本明細書に添付する請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）の構造を示す。
【図２】図２は、ＣＳＡの主な代謝産物及びその代謝経路を示す。
【図３】図３は、ＣＳＡ代謝産物ＡＭ１に対するモノクローナル抗体ＡＭ１９−９−５Ａ６の選択性を示す。
【図４】図４は、ＡＭ９代謝産物に対して選択的なモノクローナル抗体を図示する。
【図５】図５は、ＡＭ１及びＡＭ１ｃ部分に対するモノクローナル抗体ＡＭ１９−１−７−Ｅ１２の選択性を示す。
【図６】図６は、ＡＭ１およびＡＭ９代謝産物に対して選択性を有するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の例を図示する。
【図７】図７は、ＣＳＡ及びＡＭ９に対するＭｏＡｂ  ＡＭ９−９−４Ｆ５の選択性を示す。
【図８】図８は、ＡＭ１、ＡＭ１ｃＡＭ９およびＡＭ１９代謝産物に対して、親であるＣＳＡ分子よりも優れた選択性を有するＭｏＡｂを図示する。
【図９】図９は、ＭＬＲアッセイ手順を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0003595506.tif 000042
【図８】
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【図９】
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