(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能であり、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上であることを特徴とする海水養殖のための水産飼料用高クロロフィル含有耐塩性クロレラ 。
【請求項２】
クロレラが、クロレラ属に属する変異株Ｍ−２０７Ａ７であることを特徴とする請求項１記載の海水養殖のための水産飼料用高クロロフィル含有耐塩性クロレラ 。
【請求項３】
請求項１又は２記載のクロレラを、従属栄養的培養方法により培養し、耐塩性及び／又は高クロロフィル含量のクロレラ藻体を採取することを特徴とする海水養殖のための水産飼料用クロレラ藻体の製造法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の高クロロフィル含有耐塩性クロレラを有効成分とすることを特徴とする海水養殖のための水産飼料。
【請求項５】
クロレラに、紫外線照射による変異処理及びメタンスルホン酸エステル若しくはアクリフラビンによる変異処理を施すことを特徴とする、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能でありかつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上の高クロロフィルを含有する海水養殖のための水産飼料用高クロロフィル含有耐塩性クロレラ変異株の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品の着色素材であり、かつ抗胃潰瘍作用、抗アレルギー作用、抗脳血管性障害作用、消臭作用、抗変異原作用、ダイオキシン類排泄促進作用等の機能を有するクロロフィルを高濃度に含有し、健康食品、機能性食品、医薬原材料として優れ、かつ海水中での生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩性クロレラ等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロレラは、クロロコックム目に属する単細胞緑藻であり、生育速度が比較的速く、タンパク質含量が高く、必須アミノ酸であるリジン等を多く含むため、健康食品源あるいは養魚用ワムシの餌として従来から大量に培養されている。また、クロレラに含まれるクロロフィルには、従来報告されている抗胃潰瘍作用、抗肝障害作用、抗アレルギー作用、抗脳血管性障害作用、消臭作用の他に、抗変異原作用やダイオキシン類排泄促進作用もあることが最近報告されている（「食品と開発」VOL.33,NO.8,1998,p18-20）。この報告によると、環境汚染物質として最も問題になっているダイオキシン類をヒトが体内に取り込むのは、９０％以上が食物からの摂取であり、殊に海水から食物連鎖で濃縮された魚介類からの摂取はその６０％にもなっており、またダイオキシン類は一般に小腸からの吸収率が高く代謝されにくいので脂肪組織や肝臓に蓄積されていくとされている。
【０００３】
他方、従来クロレラ中のクロロフィル含量を高める技術としては、培養液中の溶存酸素濃度を０．５から６ｐｐｍの範囲で調節し、培養液をｐＨ５．５から７．５の範囲に調節し、蛋白質の加水分解物或いはアミノ酸を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／培地Ｌの範囲で添加し、且つ連続培養液のグルコースの量を１０〜４０ｍｇ／培地Ｌに調整して、クロレラを光照射なしにタンク内で培養する培養方法による技術（特公昭５８−４０４６２号公報）や、クロレラを紫外線照射処理することによって、全クロロフィル含有量が乾燥重量にて３％以上である高クロロフィル含有クロレラを作出する変異処理による技術（特許第２６２００４５号公報）が知られている。しかし、この全クロロフィル含有量が３％以上の高クロロフィル含有性クロレラ属変異株は塩化ナトリウム含有培地で生育できないものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
最近の環境ホルモンへの関心の高まりから、ダイオキシン類等の環境汚染物質で汚染されていない安全な食品や食品素材が求められている。ワムシ等を餌とし海水で養殖されている魚類もその例外でなく、海水から食物連鎖で濃縮されたダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が少ない魚類への期待が大きくなっている。かかる養殖魚類を供給するためには、その餌であるワムシ等の餌となるクロレラとして、抗変異原作用やダイオキシン類排泄促進作用を有するクロロフィル含量の高いクロレラを用いることが有効である。
【０００５】
他方、水産飼料として実際にクロレラを利用する場合、海面に撒かれたクロレラはシオミズツボワムシ等の生き餌となるが、耐塩性をもたないクロレラを海面に撒くと海水中で生育することができないことから次第に死滅し、養魚用ワムシ等の餌として当初の期待以下となるばかりか、死滅したクロレラが残餌となるため、水質を悪化させる可能性が高く、このため、従来のクロレラは多少クロロフィル含量が高いものであっても、水産飼料としての有用性の面で満足できるものではなかった。そして、クロレラに耐塩性をもたせ、海水に適応させることは従来知られていなかった。
【０００６】
本発明の課題は、クロロフィル含量が高く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中での生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩性クロレラを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためには、高クロロフィル含量と耐塩性という２つの性質を併せもつクロレラを作出すればよいとの知見に辿り着いた本発明者は、クロレラに紫外線処理及びアクリフラビン処理を施すことにより、海水で生育可能で、かつクロロフィルを高濃度で含有するクロレラを再現性よく作出することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロフィル含有量が高いことを特徴とする高クロロフィル含有耐塩性クロレラ（請求項１）や、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上であることを特徴とする高クロロフィル含有耐塩性クロレラ（請求項２）や、クロレラが、クロレラ属に属する変異株Ｍ−２０７Ａ７であることを特徴とする上記高クロロフィル含有耐塩性クロレラ（請求項３）や、変異処理を施すことによって得られることを特徴とする塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能な耐塩性クロレラ（請求項４）や、全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上であることを特徴とする高クロロフィル含有クロレラ（請求項５）に関する。
【０００９】
また本発明は、上記のクロレラを従属栄養的培養方法により培養し、耐塩性及び／又は高クロロフィル含量のクロレラ藻体を採取することを特徴とするクロレラ藻体の製造法（請求項６）や、上記高クロロフィル含有耐塩性クロレラや耐塩性クロレラを有効成分とすることを特徴とする水産飼料（請求項７）や、クロレラに、紫外線照射による変異処理及びメタンスルホン酸エステルもしくはアクリフラビンによる変異処理を施すことを特徴とする変異株の作出方法（請求項８）や、変異株が、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上の高クロロフィル含有耐塩性クロレラ属変異株であることを特徴とする上記変異株の作出方法（請求項９）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の高クロロフィル含有耐塩性クロレラ、耐塩性クロレラ又は高クロロフィル含有クロレラは親クロレラ株に変異処理を施すことによって作出することができる。かかる変異処理としては、紫外線照射及び／又は変異薬剤による変異処理を挙げることができる。
【００１１】
本発明においてクロレラとは、クロロコックム目のクロレラ（Chlorella）属に属する単細胞緑藻をいい、変異処理に付される親クロレラ株としては、例えば湖沼から採取した水ならびに砂泥から分離されるクロレラ野生株や、保存株であってもよく、これらクロレラ属に属するクロレラとして、クロレラ・ソロキニアナ（C.sorokiniana）、クロレラ・ブルガリス（C.vulgaris）、クロレラ・エリプソイディア（C.ellipsoidea）、クロレラ・ルテオビリディス（C.luteoviridis）、クロレラ・プロトセコイディス（C.protothecoides）、クロレラ・ゾフィンギエンシス（C.zopfingiensis）、クロレラ・バイエガータ（C.vaiegata）、クロレラ・キサンセーラ（C.xanthella）、クロレラ・サッカロフィリア（C.saccharophilia）、クロレラ・ミニアータ（C.miniata）等を例示することができる。
【００１２】
また、親株と変異株共に、有機物を炭素源とする従属栄養増殖で培養可能なクロレラ株が好ましい。かかるクロレラ株の培養用培地ならびに変異株の選択培養用培地としては、クロレラ株が増殖しうるものであればどのような培地でもよく、ＹＭブロス液又は第１表に組成を示すＹＭ寒天培地（いずれもDifco社製）や第２表に組成を示すクロレラ培養用培地を例示することができる。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
【表２】
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【００１５】
紫外線照射による変異処理は、親株から目的とする変異株が得られるのであればどのような変異処理でもよく、かかる紫外線照射による変異処理としては、例えば波長２５４ｎｍを有する紫外線ランプによる照射を用いる処理方法を例示することができる。紫外線照射による変異は、図１に示すように、例えば４〜１０ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の範囲の紫外線照射量で行うと目的とする変異株が比較的得られやすい。また、複数回照射の方が一回照射より効率よく目的とする変異株を得ることができる場合が多い。
【００１６】
また、変異薬剤による変異処理は、親株から目的とする変異株が得られる変異処理であればどのようなものでもよく、かかる変異薬剤による変異処理としては、例えばメタンスルホン酸エステル、アクリフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン、５−ブロモウラシル、ヒドロキシルアミン等の変異薬剤を用いる処理方法を例示することができるが、これらの中でも、特にメタンスルホン酸エステルやアクリフラビンが目的とするクロレラ変異株を作出する上で好ましい。これら変異薬剤の処理濃度や処理時間は、親株から目的とする変異株が効率よく得られるように、変異薬剤の種類に応じて適宜設定することができるが、通常１〜５００ｐｐｍの濃度で１０〜６０分間の条件で処理される。例えばメタンスルホン酸エステルやアクリフラビンの処理濃度は、それぞれ２０〜２００ｐｐｍ、５〜５０ｐｐｍが好ましい。
【００１７】
さらに、紫外線照射による変異処理と変異薬剤による変異処理を併用することが特に好ましい。例えば本発明の、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能な耐塩性クロレラや塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロフィル含有量が高い高クロロフィル含有耐塩性クロレラ、殊に塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上である高クロロフィル含有耐塩性クロレラは、紫外線照射による変異処理だけでは再現性をもって作出することは殆ど困難であるが、複数回の紫外線処理と、メタンスルホン酸エステルやアクリフラビン等の変異薬剤による変異処理とを併用することにより、再現性よく作出することができる。また、本発明者らによると、これら耐塩性株の選抜率はおよそ１／１０6であることが実験により確かめられている。
【００１８】
そして、２回の紫外線処理とアクリフラビンによる変異処理とを併用することにより、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上である高クロロフィル含有耐塩性クロレラの一例として、クロレラ属に属する変異株であるＭ−２０７Ａ７株を作出した。このＭ−２０７Ａ７株は、群馬県高崎市宮原町３  麒麟麦酒株式会社応用開発センター内に保存され、特許法第２７条の３の規定に準じて分譲されるものである。
【００１９】
本発明において、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能とは、１重量％塩化ナトリウムを添加したＹＭ寒天培地に接種し、３５℃、７日間暗所で培養した場合に生育することをいい、また、全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上とは、上記第２表に組成を示すクロレラ培養用培地に接種し、２００ｒｐｍの振とう培養を３５℃、３日間行った場合に全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上となることをいう。
【００２０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００２１】
実施例１［高クロロフィル含有耐塩性クロレラの取得］
（親株の単離）
１９９７年５月から７月にかけ、群馬県内の湖沼から採取した水ならびに砂泥から、第３表に示すＡ１０培地（東京大学分子生物学研究所編IAM Catalogue ofStrains.ｐ４０４．１９９３）に第４表に組成を示す抗生物質混液Ｎ６（発酵工学会平成３年度大会要旨４７１頁）を１％加えた寒天培地上で、３５℃、７日間、日照周期明暗１２時間１２時間で培養し、クロレラ属の単細胞緑藻類を単離した。次に、これをピペット洗浄法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年１２月１日発行、ｐ７０）により完全に無菌化した。この無菌株をＹＭブロス液に接種し、３５℃、７日間暗所で培養し、増殖した株をＹＭ寒天培地を用いて単離し親株とした。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
【表４】
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【００２４】
（高クロロフィル変異株の選抜）
上記親株を１０7 〜１０8 個／ｍｌの細胞密度で無菌水に懸濁した液に、５ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の照射量の紫外線処理を２回行い、ＹＭ寒天培地上で３５℃、７日間暗所で培養し、出現したコロニーで親株よりも緑色の濃いコロニー５０株を選択・単離した。この単離した５０株の変異株にさらに２０ｐｐｍのアクリフラビンを用いて３０分間の接触処理を行い、緑色の濃いコロニーの単離を繰り返し、再度５０株を選択・単離した。
【００２５】
（耐塩性株の選抜）
高クロロフィル含有株５０株を１重量％塩化ナトリウムを添加したＹＭ寒天培地に接種し、３５℃、７日間暗所で培養し、出現したコロニー３０株から高クロロフィル含有かつ耐塩性変異株M−２０７Ａ７株を選択・単離した。この変異株の主な性状を第５表に示す。この性状から、変異株M−２０７Ａ７株は塩化ナトリウム１重量％で生育可能であることがわかる。
【００２６】
【表５】
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【００２７】
（クロロフィル含量の測定）
上記で得られたＭ−２０７Ａ７株と比較例としての市販品Ｂ−１株を第２表に組成を示すクロレラ培養用培地で培養した。また対照としてのクロレラ・ブルガリスＣ−２７を第３表に組成を示すＡ１０培地で培養した。培養は５００ｍｌ容三角フラスコに各培地を１００ｍｌ入れ、２００ｒｐｍの振とう培養を３５℃、３日間行い、培養後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理し、藻体を回収した。全クロロフィル含有量は、藻体のメタノール抽出液を６５０ｎｍ及び６６５ｎｍの吸光度を測定する方法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年  １２月１日発行、ｐ４９８に記載されている方法）により測定した。結果を第６表に示す。
【００２８】
【表６】
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【００２９】
（ワムシでの給餌試験）
天然海水：水道水＝３：１のワムシ飼育用溶液３Ｌを入れた５Ｌ容ビーカーに、ワムシの初発濃度が１５０〜２００個体／ｍｌとなるようにワムシを入れ、水温を２７℃に保ちながら、クロレラＰＣＶ（Packed Cell Volume）６０ｖ／ｖ％の懸濁液をワムシ１００個体あたり、朝に０．１ｍｌ、晩に０．２ｍｌとなるように４日間給餌した。この実験を７回繰り返し、本発明のＭ−２０７Ａ７株と比較例としての市販品Ｂ−１株についてワムシの増殖（４日後）の差異を調べた。７回平均の結果を第７表に示す。第７表より、ワムシが海水で生存可能な耐塩性株をよく食べることが検証された。
【００３０】
【表７】
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【００３１】
（Ｍ−２０７Ａ７株の大量培養）
５０Ｌ容ジャーファーメンターに第４表に記載の培地を４０Ｌ入れ、通気量３０Ｌ／分、撹拌３００ｒｐｍ、暗所３５℃で３日間培養後、培養液を回収し、３０００ｒｐｍ１５分間遠心分離処理してクロレラ藻体を得た。上記方法で全クロロフィル含量を求めたところ４．３％（乾燥重量あたり）であった。この結果、高クロロフィル含有耐塩性クロレラを、タンク内における通常の従属栄養的培養方法によって、優れた性状を保持した状態で工業的規模で大量に培養できることがわかった。
【００３２】
実施例２［再現性試験］
親株の採取源である湖沼の場所を異にする他は、実施例１と同様にして、高クロロフィル含有耐塩性クロレラを単離した。実施例１と異なる８カ所の湖沼からも、表８に示すように、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上である高クロロフィル含有耐塩性クロレラを得ることができた。
【００３３】
【表８】
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【００３４】
【発明の効果】
本発明によると、クロロフィル含量が高く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中での生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩性クロレラを、タンク内における通常の従属栄養的培養方法によって、優れた性状を保持した状態で工業的規模で大量に培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】紫外線照射によるクロレラの死滅率を表す図である。
【図１】
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