(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式（１）；
Y-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-X3 （１）
（式中、Yは、０〜３個のアミノ酸残基を示し、及びX3は０〜２個のアミノ酸残基を示す）で表されることを特徴とするペプチド、又はその医薬上許容しうる塩。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む医薬用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドをコードするDNA断片を含み、形質転換後に前記ペプチドを発現するベクターであって、宿主細胞内で請求項１に記載のペプチドを発現するのに適したベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
細菌細胞であることを特徴とする請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
活性成分として請求項１に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む抗癌剤。
【請求項８】
活性成分として請求項１に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む抗ウィルス剤。
【請求項９】
活性成分として請求項１に記載のペプチド又は該ペプチドの医薬上活性のある塩を含む、インターフェロン誘導活性を示す免疫調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は天然物を起源とする免疫調節物質に関する。具体的には、本発明は免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療において有用な無脊椎動物起源のペプチド及びそのようなペプチドを含む医薬用製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術として免疫系の効力を刺激することができる昆虫を含む動物及び植物組織の物質を含有する天然物起源の様々な医薬用製剤が知られている。
ＣＤ４−陽性Ｔ細胞又は骨髄細胞から抗−ＨＩＶ活性を有する細胞タンパクを得る方法が米国特許第５，４８０，７８２号に開示されている。
抗菌活性と抗ウイルス活性を示す銀杏葉抽出物を含む処方がドイツ特許公開第４３  ３４  ６００  Ａ１号に開示されている。
活性成分として動物の組織、血清又は細胞から抽出された主要組織適合遺伝子複合系抗原を含む、生体の免疫反応を刺激するための医薬用組成物がＷＯ  ９６／０４００５号に開示されている。組織、細胞又は血清はヤギ、子牛又はブタの肝臓及び牛の赤血球から選択される。
抗癌化学療法の副作用を防ぎつつ癌を治療し、かつヒトの免疫機能を増進させるためのニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）植物の抽出物を含む医薬用組成物が米国特許第５，４８２，７１１号に開示されている。
【０００３】
イガイの一種であるミチルス・エデュリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ    ｅｄｕｌｉｓ）から単離され、様々なウイルス、細菌及び原生動物に対して有効な抗生物質組成として使用されるポリペプチド分画がＷＯ  ８１／０３１２４号に開示されている。
蜜蜂由来の抗菌ペプチド並びにその単離、製造及び適用の方法が欧州特許公開第０  ２９９  ８２８  Ａ１号に開示されている。
甲虫の一種であるテネブリオ・モリトール（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）及びレプチノタルサ・デセムリニアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）から単離された抗菌ペプチドがＷＯ  ９０／１４０９８号に開示されている。
鱗翅目昆虫の一種であるヒアロフォラ・グロベリ（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｌｏｖｅｒｉ）から単離された抗菌タンパクが欧州特許公開０  ８５６  ５１９  Ａ２号に開示されている。
レンチウイルス経膜タンパクのアルギニン含有性断片と構造的に類似な抗微生物ペプチドが米国特許第５，７１４，５７７号に開示されている。
【０００４】
ブタの白血球から単離された抗ウイルス及び抗微生物ペプチドが米国特許第５，８０４，５５８号に開示されている。
主要組織適合遺伝子複合系クラスＩＩ抗原に特異的に結合し、それにより自己免疫疾患の発生可能性を減少させる免疫調節ペプチドが米国特許第５，８２７，５１６号に開示されている。
特定抗体の生産及び抗体依存性Ｔ−リンパ球の抗腫瘍活性の刺激剤としての、多様な軟体動物及び、昆虫の一種であるカリフォラ・エリスロセファラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ）を含む節足動物から単離されたヘモシアニン及びアリルフォリンの用途が欧州特許公開第０  ３２０  ５２８  Ａ１号に開示されている。
【０００５】
免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に適した薬の最近の体制は上述した製剤及びこれに類似の天然医薬用製剤により強化されている。しかしながら、現在までに利用可能な薬剤は現存の免疫調節医学における要求の全体に対応しているわけではない。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】
従って、免疫調節活性を有し、特に免疫不全状態、感染症及び腫瘍性疾患の治療に有用な医薬用製剤を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今回驚くべきことに、望ましい免疫調節活性を示す特定のペプチドが発見された。
従って、本発明は最大３０個のアミノ酸残基から成り免疫調節活性を示すペプチドであって、下記の一般構造式（１）；
Ｘ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ３    （１）
（式中、Ｘ１は存在しないか又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示し、
Ｘ２はペプチド結合又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示し、
Ｘ３は存在しないか又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示す）
で表されるペプチド又はその医薬上許容しうる塩若しくはエーテルに関する。
【０００８】
本発明は昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシナ  Ｒ．−Ｄ．  （Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ  Ｒ．−Ｄ．；  Ｄｉｐｔｅｒａ，  Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）の細菌感染させた幼虫の血液から単離されたペプチドの代表的な要素であり、ここで”アロフェロン”と命名された新しい種類の免疫調節ペプチドを提供するものである。
【０００９】
本発明のアロフェロンは動物（マウス）及びヒトのナチュラルキラー細胞の細胞傷害性抗癌活性を刺激することが見出されている。アロフェロンの免疫調節活性に関する実験データから、前記アロフェロンがかなり低い濃度でヒト及びマウスのリンパ球の細胞傷害性抗癌活性を刺激することができるということが示されている。最少有効濃度は約０．０００５  ｎｇ／ｍｌと測定されている。最適濃度は０．０５−０．５ｎｇ／ｍｌであることが見出された。先天免疫の奏効体メカニズムとしての天然細胞傷害性の重要な役割（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９８９，  ｖｏｌ．  ４７，１８７−３７５；  Ｂｒｉｔｔｅｎｄｅｎ  Ｊ．，  Ｈｅｙｓ  Ｓ．Ｄ．，  Ｒｏｓｓ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｅｒｅｍｉｎ  Ｏ．，  １９９６，  ｖｏｌ．  ７７，  １１２６−１２４３）を考えると、アロフェロンは免疫調節方式で作用する抗ウイルス、抗微生物及び抗癌薬剤として有用と考えられる。
【００１０】
さらに、細胞傷害性リンパ球の抗癌活性刺激に関して、アロフェロンは実験動物において強くて持続的なインターフェロン合成を誘導することが見出された。インターフェロンはウイルス感染及び何らかの他の外部刺激に反応して生体内で生成される重要な抗ウイルス性（アルファ及びベータ・インターフェロン）及び免疫調節性（ガンマ・インターフェロン）サイトカインの一群である。血中インターフェロン濃度の上昇は広い範囲のウイルス性、腫瘍性及び自己免疫性障害を治療又は緩和させるのに役立つ。組換え又は天然インターフェロンの注射はＣ型肝炎（Ｂｅｋｋｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  １９９８，  ２８，  ６，  ｐ．９６０−９６４），  ヘルペス（Ｃａｒｄａｍａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １９９８，  ４６，  １，  ｐ．５４−５７），  多発性骨髄腫（Ｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １９９８，  １６，  ８，  ｐ．２８３４−２８３９），  ホジキン病（Ａｖｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，  １９９８，  ３０，  ５−６，  ｐ．６５１−６５６），  骨髄性白血病（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｈ．Ｓ．，  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９８，  ８３，  ６，  ｐ．１２０５−１３），  多発性硬化症（Ｄｕｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ，  １９９５，  １，  ｓｕｐｐｌ．１，  ｐ．３２−３７），  アトピー性皮膚炎（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９８，  ８０，  ３，  ｐ．２６３−２６８），  真菌感染症（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １９９７，  １６，  ｐ．５１−５５）などの免疫療法に使用されて好結果が得られている。さらに、外生インターフェロン、すなわちフェニルピリミヂノンアナログであるブロピリミンのような内生インターフェロン合成誘導物質を使用しても同様の治療結果が得られると考えられている（Ａｋａｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｕｒｏｌ．，  １９９８，  ３４，  ｐ．１０７−１１０）。
【００１１】
実験データから、アロフェロンはインターフェロン合成を効果的に誘導して、インターフェロンと類似な様式で、ある種の免疫反応（ナチュラルキラー活性）を刺激することが示されている。そのため、アロフェロンはインターフェロン及びインターフェロン誘導物質と比べてインターフェロン感受性のウイルス疾患及び癌疾患の治療を含む同様の治療的用途を有するがこれらに限定されないと考えられる。このような仮説はウイルスに感染させたマウスの実験から直接確認できる。ヒトインフルエンザウイルスＡ及びＢの致死量を肺に感染させたマウスではアロフェロン投与が生存率を顕著に増大させることが示されている。
【００１２】
アロフェロンの化学的構造は、医学的に重要な他の物質だけでなくインターフェロン、他の公知のサイトカイン及びインターフェロン誘導物質に対しても類似性を持たない。アロフェロンの化学的構造及び生物学的活性の様式は、欧州特許公開第０  ３２０  ５２８  Ａ１号に開示されているカリフォラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ）から単離されて免疫活性及び抗腫瘍活性が示されたアリルフォリン（ａｒｙｌｐｈｏｒｉｎ）とも全く異なっている。アロフェロンは、好ましくは１２００  Ｄａに近い分子量を有し、これまでに記述されていない独特なペプチド群に属するものである。カリフォラからのアリルフォリンは約５００，０００  Ｄａの分子量を有し（Ｎａｕｍａｎｎ  Ｕ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  Ｋ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９１，  １７７，  ｐ．９６３−９７１）、欧州特許公開第０  ３２０  ５２８  Ａ１号に開示されているように抗体依存性Ｔ−リンパ球の抗腫瘍活性の特異的ワクチン化及び特異的刺激の過程におけるアジュバントとしての使用が提唱されている。これまでのところナチュラルキラー細胞活性及びインターフェロン合成に対するアリルフォリンの効果の可能性に関するデータは得られていない。
【００１３】
アロフェロンは以下のような一般式により表される独特なアミノ酸配列を有する線形ペプチドである：
Ｘ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ３
（式中、Ｘ１は存在しないか又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示し、
Ｘ２はペプチド結合又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示し、
Ｘ３は存在しないか又は少なくとも１個のアミノ酸残基を示す）。
本発明のアロフェロンは最大３０個、好ましくは最大２０個、最も好ましくは５〜１３個のアミノ酸残基を有する。
本発明のアロフェロンの例を表１に要約する。
【００１４】
【表１】
0003564065.tif 000002
アロフェロン１及び２は哺乳動物ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を刺激することができるサイトカイン様物質を目的を持ってスクリーニングする過程で、昆虫、すなわちカリフォラ・ビシナ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ）の細菌に感染させた血液から単離された天然ペプチドである。アロフェロン３及び４は、天然の原型分子に可能な生物学的に活性な修飾を決定するために化学的に合成されたアロフェロン１のトランケイト形態である。
【００１５】
リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン１〜４の効果の比較研究で、全てのアロフェロンが生物活性を有する分子であることが証明された。実施例５を参照のこと。これによりアロフェロン構造における（機能的に重要な）保存的部分と変更可能な部分の区別が可能となる。アロフェロン５〜２０はアロフェロンの基本構造の可変断片の好ましい変更を示すために表した例である。
【００１６】
データーベースの探索からはアロフェロン構造と密接な類似性を持つ天然物起源のペプチド又は生物活性を有する合成ペプチドは明らかにされなかった。従って、アロフェロンは新しい生物活性ペプチド群に属すると考えられる。それにもかかわらず、アロフェロンはある程度まではある種の機能的に重要なタンパク断片と構造的な類似性を有する。例えば、アロフェロン１はインフルエンザウイルスＢヘマグルチニン前駆体の３７７−３８７断片と６３％の同一性を有する。ヘマグルチニンは宿主の細胞膜との統合をつかさどるウイルス外被の重要な膜親和性タンパクとして知られている。
【００１７】
アロフェロン１は本発明の開発過程において原型分子として使用された。アロフェロン１は１３個のアミノ酸から成る１２６５  Ｄａの分子量を有する線形ペプチドである。表１を参照のこと。アロフェロン２〜４と比較すると、ＮＫ細胞の細胞傷害性の刺激体としての有効性及び他の活性において必要なアロフェロン構造の機能的に重要な要素を決定することができ、このペプチドの生物学的活性を変化させない構造的変更が予測できる。
【００１８】
アロフェロン１をアロフェロン２〜４の構造と比較すると、全てのペプチドがＮＫ細胞の細胞傷害試験で同様の活性を示したことから、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ断片が存在すれば生物学的活性を維持するのに充分であることが示されている。従って、この断片又は断片の一部がアロフェロン配列において核となる保存的構造を表している。アロフェロン１の分子の１〜３位は除去するか、又は１個以上の他のアミノ酸に代替することができる。
【００１９】
さらに、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの類似断片と比較してみると、アロフェロン１配列においてセリン（Ｓｅｒ）とグリシン（Ｇｌｙ）のアミノ酸が占めている４位及び５位は好ましくは脂肪族、芳香族又は複素環式アミノ酸の群から選択される他のアミノ酸に置き換えることができることが分かる。例えば、セリンはスレオニン（Ｔｈｒ）で置き換えることができ、グリシンはセリンで置き換えることができる。
【００２０】
このように、得られているデータからアロフェロン１配列の初めの５個のアミノ酸は存在しないか又は少なくとも１個のアミノ酸を含んでいてもよい可変断片であることが分かる。従って、この断片をアロフェロンの構造式（１）においてＸ１と記す。望ましくは、Ｘ１は存在しないか、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−、Ｔｈｒ−、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−、Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−、Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−及びＴｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から成る群から選択される。
【００２１】
同様に、アロフェロン１の１４〜１５位は除去するか、又は１個以上のアミノ酸による配列で置き換えることができる。従って、この断片はアロフェロン構造式（１）においてＸ３と記す。望ましくは、Ｘ３は存在しないか、−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ、−Ｈｉｓ、  −Ｔｙｒ−Ａｓｐ、−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、−Ｐｒｏ、−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ、−Ｌｅｕ−Ａｌａ、−Ａｓｐ、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、−Ｍｅｔ  及び−Ｐｈｅ−Ｉｌｅから成る群から選択される。
【００２２】
さらに、アロフェロン及びそれと類似なヘマグルチニン断片を比較すると、アロフェロン分子中ではグルタミンである９位も変更可能であり、グルタミンを例えばアラニンのような他のアミノ酸に置き換えることができることがわかる。そこで、アロフェロン構造式（１）の９位はＸ２と記されるが、これはＧｌｙとＨｉｓを連結するペプチド結合であるか又は少なくとも１個以上のアミノ酸、好ましくは０〜３個のアミノ酸、さらに好ましくは０〜２個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸、特に−Ｇｌｎ−でもよい。
【００２３】
望ましくは、Ｘ２はペプチド結合であるか、−Ｇｌｎ−、−Ｐｈｅ−、−Ａｓｐ−、−Ｓｅｒ−、−Ａｓｎ−、  −Ａｌａ−、−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−、−Ａｌａ−Ｖａｌ−  及び−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙから成る群から選択される。
【００２４】
アロフェロンの生物学的活性を有意に変化させることなく、キャリアタンパクのようなより大きい分子中にアロフェロン配列を挿入することも可能である。そこで、本発明はまた、上記一般式（１）を有するアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパクのような化合物に関するものであるが、このペプチド又はタンパクは自然界に存在するものではなく、特にインフルエンザウイルスＢの前駆体ではない。
【００２５】
下記実施例に要約される免疫学的、薬学的及び毒性学的複合試験から、アロフェロンの有用な性質の範囲が示されている。得られたデータからアロフェロンが新規のサイトカイン様ペプチドであることが示されている。アロフェロンの作用様式にはインターフェロン合成の誘導の他に、細胞傷害性リンパ球による細胞の非自己又は非正常自己認識及び溶解を刺激することが含まれる。従って、アロフェロンはインターフェロン生成不全及びナチュラルキラー細胞の活性不全を矯正し、当該不全によるウイルス性、腫瘍性及びその他の疾患を治療するための免疫調節医薬品として有用である。アロフェロンは事実上毒性がなく、先進的前臨床研究から示されているように、催奇形性、胎児毒性又は突然変異原性を有していない。
アロフェロン１の実験的に立証された性質を表２に要約する。
【００２６】
【表２】
0003564065.tif 000003
【００２７】
一般に、薬学的活性スペクトルはナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性及び抗ウイルス剤耐性に対する影響に関するインターフェロン−アルファの公知の性質と一致する。このような観点から、アロフェロンはインターフェロン−アルファの機能的アナログとして特徴づけることができる。アロフェロンの作用様式は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する刺激に関しては、非常に低い濃度、すなわち約１ピコグラム／ｍｌ（１０−９  ｇ／ｍｌ）で観察される。このような観点から、アロフェロンはインターフェロンやインターロイキンなどの内生サイトカイン類と同等又はより優れた活性を有している。
【００２８】
さらに、アロフェロンは単独で又はインターロイキン１２と協同でインターフェロン−ガンマを含む内性インターフェロンの合成を誘導することができる。従って、アロフェロンはインターフェロン誘導物質群に属すると言える。
アロフェロンのｉｎ  ｖｉｖｏ活性の前臨床研究から、アロフェロンはヒトインフルエンザウイルスに感染したマウスモデルを用いた試験で強力な抗ウイルス活性を有することが示された。このモデルでは、ヒトインフルエンザウイルス懸濁液を野生型のオスに鼻腔内投与して感染させ、アロフェロン１を感染一日前及び感染後１、２、４、６及び８日目に腹腔内投与した。アロフェロンはマウスの肺損傷及び死亡を効果的に防止した。これにより、アロフェロンはウイルス感染を治療又は予防するための医薬用製剤の製造に有用であると言える。
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究過程でアロフェロン１の急性及び慢性毒性はどちらも見られなかった。
【００２９】
本発明の医薬用製剤が賦形剤又は担体のような通常の添加物も含んでいてよいことは言うまでもない。本製剤は鼻腔内；経口又は直腸内のような腸内；及び腹腔内、筋肉内、静脈内又は経皮のような非経口の経路により患者に投与することができる。本製剤は鼻腔内滴下溶液、スプレー剤、リポソーム剤、カプセル剤、錠剤及び座薬のような投与形態で投与できる。非経口用としては、医薬上の活性を有する成分を好ましくは注射可能な溶液の形態にする。
【００３０】
このように、アロフェロンはインターフェロン系及びナチュラル細胞が媒介する細胞傷害を含む先天免疫の改善が治療上の重要性を持ちうる多様な感染性又は腫瘍性疾患の治療又は予防に有用である。アロフェロン適用が有望な状態の例としては、インフルエンザウイルス及び他の呼吸器系ウイルスによる感染症、ウイルス性肝炎、ＡＩＤＳ並びにＡＩＤＳ関連の２次感染症及び腫瘍状態、急性及び慢性の白血病並びにインターフェロン治療の有効性が証明されているその他の癌、インターフェロン治療に感受性を有する全身性真菌感染症などが挙げられる。
【００３１】
生物学的活性のある種の類似性（ＮＫ細胞の細胞傷害活性の刺激、間接的抗ウイルス活性）にもかかわらず、アロフェロンは構造及び作用様式の点ではインターフェロンとは非常に異なっている。すなわち、インターフェロンは１７０００〜８００００ダルトンの範囲の分子量を有する糖タンパクである。その組織及び種の特異性だけでなくアミノ酸鎖のグリコシル化はインターフェロンの機能的活性に必須の条件である。アロフェロンは好ましくは１２６５  Ｄａの分子量を有する好ましくはグリコシル化されていないオリゴペプチドであり、その分子量はインターフェロンの分子量の１３分の１ないし６０分の１と小さい。アロフェロンのアミノ酸配列はインターフェロンの配列のいずれの断片とも類似性がない。また、機能的側面においてもアロフェロンとインターフェロンの間には本質的な違いがある。すなわち、  アロフェロンは内生的インターフェロンの生成を誘導してインターフェロンにより媒介される防御反応連鎖を促進する。外生インターフェロンの使用は、マイナスのフィードバックメカニズムにより内生インターフェロンの合成をむしろ抑制すると考えられる。
【００３２】
本発明のペプチドは天然原料から単離するか又は公知の方法により合成することができる。本発明のペプチドはまた組換えＤＮＡ技術により製造することもできる。このように本発明は、例えば本発明のいずれかのペプチドを含むペプチド配列をコードするｃＤＮＡのようなＤＮＡ配列を含む適当なベクターで予め形質転換した宿主細胞を培養すること−但し、この場合、当該ＤＮＡ配列はプロモーター調節下に置かれ、当該ペプチド配列のＤＮＡ配列が正しく発現されるように宿主細胞の機構により認識される終止信号が当該ＤＮＡ配列の後ろに続く−及び細胞培養物中の発現産物から探索されたペプチドを回収することを含む。望ましい宿主細胞は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、大腸菌、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に属する。或いは、本ペプチドは周知の化学的合成法により容易に製造することもできる。
【００３３】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【００３４】
【実施例】
実施例１
昆虫の血液からのアロフェロンの単離、構造決定及び化学的合成
アロフェロンは最初、免疫化された（細菌に感染させた）昆虫、すなわちハエの一種であるカリフォラ・ビシナ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ）の血液中に発見された。先に記述されている実験室条件下で維持されたカリフォラ・ビシナの幼虫に摂食後（Ｃｈｅｒｎｙｓｈ  Ｓ．Ｉ．，  Ｓｉｍｏｎｅｎｋｏ  Ｎ．Ｐ．，  Ｎｕｍａｔａ  Ｈ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  Ｚｏｏｌ．，  １９９５，  Ｖｏｌ．３０，  Ｎｏ．３，  ｐ．４９８−４９９）、加熱殺生した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びマイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）細胞の懸濁液に浸した針で小皮を刺すことによって細菌に感染させた。傷付いた敗血症状態の幼虫の血リンパを採取し、遠心分離してＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏ．）にのせた。このカラムを０．０５％トリフルオロ酢酸で洗浄した。その後、標的となる物質を０．０５％トリフルオロ酢酸で酸性化させた５０％アセトニトリルで溶出させた。溶出した組成物を凍結乾燥して、活性素因の段階的クロマトグラフィー精製に使用した。精製工程中に、細胞傷害性細胞としてマウス脾臓リンパ球を用い、標的としてＨ３ウリジンでラベルしたＫ５６２癌細胞を用いて、各分画の生物学的活性をモニターした。
【００３５】
精製工程の結果、強力な免疫調節活性を示しアロフェロン１及び２と命名された２個の近種のオリゴペプチドが最初の組成物から単離され化学的な特性分析がなされた。これらのペプチドのアミノ酸配列はモデル４７３Ａシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で自動エドマン分解法を用いて決定された。アロフェロン１及び２の構造は下記のように決定された：
0003564065.tif 000004
【００３６】
上記ペプチドをさらにブルカー（Ｂｒｅｍｅｎ）ＢＩＦＬＥＸマトリックス補助レーザー脱着タイムオブフライト質量分析計により分析し、分子量が１２６５  Ｄａ（アロフェロン１）及び１１２６  Ｄａ（アロフェロン２）と実験的に決定された。アミノ酸配列データから推定されたアロフェロン１及び２の分子量と質量分析計により決定された分子量は良好に一致しており、このことはアロフェロン１及び２が翻訳後修飾を経ていない線形ペプチドであることを立証している。
【００３７】
アロフェロン１を生物学的研究及び前臨床研究のための原形分子として選択した。後の実験に十分な量のアロフェロン１を得るために、固相ペプチド合成技術によりに化学的にアロフェロン１を合成した（Ｎｅｉｍａｒｋ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｊ．−Ｐ．  Ｂｒｉａｎ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９３，  ｖｏｌ．６，  ｐ．２１９）。ペプチド精製プロトコールは二つの主要な工程を含む。第一の工程はＣ１８吸着剤（Ｗａｔｅｒｓ）を付着させたＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃカラムを用い、０．０５％トリフルオロ酢酸で酸性化させた４０％アセトニトリルでカラム溶出して行った。最終的に、Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＯＤＳ  Ｐｒｅｐ  １０  Ｃ１８  （１００  ｘ  １０  ｍｍ，  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）が装着されたＢｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｓｙｓｔｅｍクロマトグラフを使用して、０．０５％トリフルオロ酢酸及び酸性化させたアセトニトリルの線形濃度勾配（２．５  ｍｌ／ｍｉｎの流速、４０分間で０−２０％  アセトニトリル；検出波長は２２５  ｎｍ）により均質性が得られるまでペプチドを精製した。ペプチドの純度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計により確認した。アミノ酸配列の正確さはマイクロシーケンンシングによって確認した。
アロフェロン１について記載したものと同等の方法により、アロフェロン１のトランケイテッド形態であるアロフェロン３及び４が合成、精製及び検査された。
【００３８】
実施例２
マウス脾臓リンパ球の細胞傷害に対するアロフェロン１の効果
マウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロンの効果を分析するために、標準的な細胞傷害アッセイを用いた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｕｄｏ  Ｅ．，  Ｇａｎｎ，  １９７１，  ｖｏｌ．６２，  １３９−１４５；  Ｆｉｌａｔｏｖａ  Ｎ．Ａ．，  Ｍａｌｙｇｉｎ  Ａ．Ｍ．，  Ｇｏｒｙｕｎｏｖａ  Ｌ．Ｂ．，  Ｆｅｌ  Ｖ．Ｙａ．  ａｎｄ  Ｋｈａｖｉｎｓｏｎ  Ｖ．Ｋ．，  Ｔｓｉｔｏｌｏｇｉａ，  １９９０，  ｖｏｌ．３２，  Ｎｏ．６，  ６５２−６５８）。Ｈ３−ウリジンでラベルしたＫ５６２ヒト白血病細胞を細胞傷害性リンパ球による攻撃の標的として用いた。新鮮な脾臓リンパ球と標的細胞を合わせて上記調製物の存在又は非存在下で１８時間間インキュベートした。その後、死亡した及び正常な標的細胞の比率並びにそれに対応する細胞傷害指数を対照群及び実験群において測定した。
【００３９】
合成アロフェロン１の刺激活性についての典型的な結果を表３に示す。
培地にアロフェロンを投与すると広い濃度範囲（０．０５−５０  ｎｇ／ｍｌ）で、標的である腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の統計的に有意な増幅が誘導された。５００  ｎｇ／ｍｌの濃度では刺激効果を示さなかった。しかしながら、この場合でも細胞傷害が対照レベル以下には抑制されることはなかった。従って、最小有効濃度の１０００倍過剰でもＮＫ細胞の細胞傷害活性に対して有害ではなかった。
このようにアロフェロンは、ＮＫ細胞の活性化をつかさどるインターロイキン２又はインターフェロン−アルファのような特異的サイトカインに特徴的な非常に低い濃度でマウス脾臓リンパ球の細胞傷害活性を刺激する。同時に、アロフェロンは有効濃度の１００００倍過剰でも免疫抑制作用を示さなかった。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
実施例３
ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン１の効果
細胞傷害指数の測定を実施例２に記述したように行った。ヒト末梢血液リンパ球をドナーの新鮮な血液から分離し、ヒストパック１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いた遠心分離により赤血球を除去した。遠心分離後、リンパ球をリン酸緩衝液に再懸濁し、遠心分離後、ＲＮａｓｅを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。このリンパ球を２×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈し、直ちに細胞傷害の分析に使用した。ＮＫ細胞の細胞傷害の天然刺激剤であるインターフェロン−アルファ２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ，  Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を陽性対照として用いた。
【００４２】
上記調製物を培地に加えた場合０．０００５  ｎｇ／ｍｌの濃度からＫ５６２癌細胞に対するＰＢＬの細胞傷害が有意に増加したが、刺激活性は約０．０５  ｎｇ／ｍｌの濃度でプラトーに達した（表４）。５  ｎｇ／ｍｌの濃度で投与されたインターフェロン−アルファ２ｂは０．０５−０．５  ｎｇ／ｍｌの最適濃度範囲で投与されたアロフェロンと比較すると効果が低かった。
これらの実験データは腫瘍細胞を溶解に導く末梢血液リンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性に対するアロフェロンの強力な刺激効果を証明している。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
実施例４
健康なドナー集団におけるリンパ球の細胞傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン１及びインターフェロン−アルファ２ｂの有効性の変動の比較研究
アロフェロン及びインターフェロン−アルファ２ｂの刺激に対するリンパ球の反応の多様性及び相互関係を評価するために、１７人の健康なドナーから無作為にサンプリングしてＰＢＬの細胞傷害活性をモニターした。細胞傷害活性は実施例２及び３に記述したように評価した。この研究では二種類の標的細胞：すなわち、赤骨髄性白血病細胞に由来するＫ５６２細胞株及び固形結腸直腸腫瘍に由来するＡ４３１細胞株を同時に使用した。この試験でリンパ球と標的細胞の比率（Ｅ／Ｔ比）は２０：１であった。
【００４５】
得られたデータを表５に要約する。表中の各数値は６回の細胞傷害測定の結果を含むものである。このデータは対照群においてリンパ球の細胞傷害活性の大きなばらつきを示し、特に異なる起源の標的細胞を認識して排除する能力における違いを示している。上記調製物の投与に対する反応も異なる。それにも関わらず、アロフェロンとインターフェロン投与に対する反応では明確な相互関係が大部分のドナーで見られた：ほとんどのケースでインターフェロンに陽性に反応するドナーはアロフェロンにも陽性に反応し、逆も同様である。
【００４６】
表５のデータに基づいて計算された２種の調製物の有効性を総合化した数値を表６に示す。ほとんどのドナーがインターフェロン（１７人のドナー中１０人）及びアロフェロン（同じく１０人）に反応し、Ｋ５６２又はＡ４３１標的に対する細胞傷害活性が統計的に立証される増加を示した。アロフェロン及びインターフェロン投与に対する反応性は良好な相互関係にあった：すなわち、９人のドナーが両方の調製物に同程度に反応し、各１人のドナーがそれぞれインターフェロン又はアロフェロンに選択的に反応した。
【００４７】
このように、健康なドナーの反応性の分析からこのモデルではアロフェロン及びインターフェロン−アルファ２ｂは同様の有効性を持つことが示される。さらに、全ての個体においてではないにしても大部分の個体において、２種の調製物は細胞傷害性リンパ球の活性を刺激するものとして互換性があるように見える。
【００４８】
【表５】
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【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
実施例５
癌患者からの無作為サンプリングによるリンパ球の細胞傷害活性に対する刺激に関するアロフェロン１及びインターフェロン−アルファ２ｂの有効性の変動の比較研究
１８人の種々の悪性腫瘍の患者から取った血液サンプルを実施例３の健康なドナーの場合と同様のプロトコールで試験した。結果を表７に示す。アロフェロン処置対する陽性反応が、多様な患者群、特に慢性及び急性白血病患者（９例中５例）で見られた。非ホジキンリンパ腫の患者（６例中２例）及び肺癌患者１例でも陽性反応が検出された。
【００５１】
インターフェロン又はアロフェロンに陽性反応をみせる個体の比率は健康なドナーに比べると癌患者で若干減少したがそれでも有意であった（全体数に対してそれぞれ５６％及び５０％）。インターフェロン及びアロフェロンに対する反応性の相互関係も健康なドナーに比べると弱かったが証明されている。所定の試験によると、アロフェロンは癌患者の一部において注射用インターフェロンを代替するに適当なように見える。しかしながら、アロフェロンの活性がインターフェロンの活性によく似ているだけではなく内生インターフェロンの産生を刺激するということを考えると、天然の細胞傷害の直接的な活性化及び内生インターフェロン合成の誘導を通じて免疫反応を二重に刺激することが予想されるために、アロフェロンは注射用インターフェロンの代替製剤としてよりいっそう期待される。
【００５２】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００５３】
【表１１】
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【００５４】
実施例６
ヒト末梢血液リンパ球の細胞傷害活性に対するアロフェロン１構造アナログの影響
アロフェロン１アナログであるアロフェロン３及び４の活性を実施例２及び３に述べたプロトコールに従って調べた。健康なドナーの血液から単離した単核分画及びＡ４３１細胞株の標的細胞を合わせて、上記調製物、すなわちアロフェロン１、アロフェロン３，アロフェロン４又はインターフェロン−アルファ２ｂ（陽性対照）のうちの１つの存在下でインキュベートした。全ての例において上記調製物の濃度は５  ｎｇ／ｍｌとした。無処置対照群を上回る細胞傷害指数を有効性の基準として使用した。
表９のデータはアロフェロン１及びインターフェロン−アルファ２ｂと比較してアロフェロン３及び４に同様の有効性があることを証明している。
このように、アロフェロン１の構造的アナログであるアロフェロン３及び４の有効性の比較分析から、アロフェロン１のアミノ酸配列の１−４位及び／又は１４−１５位がその特異的薬理活性においては不要であり、従って、活性の損失なしに変更又は置換することができるアロフェロン１構造の可変部分であることが示されている。
【００５５】
【表１２】
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【００５６】
実施例７
ヒトインフルエンザウイルスＡが感染したマウスに及ぼすアロフェロンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルス活性
アロフェロンの抗ウイルス活性をヒトインフルエンザウイルスＡを致死量感染させたマウスモデルを使用して調べた。対マウス病原性ウイルス株Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（セロタイプ  Ｈ３Ｎ２）の懸濁液を２０〜２２  ｇ体重の野生型オスに  ＬＤ５０の１０倍に相当する用量で鼻腔内に投与した。０．５  ｍｌの０．９％  ＮａＣｌに溶解したアロフェロン１をウイルス接種の一日前、並びに接種後１、２、４、６及び８日目に腹腔内注射した。この調製物はマウス一匹当たり２５及び２．５μｇ（０．５及び０．０５μｇ／ｋｇ）の２種類の用量で試験した。対照マウスには同一容量の溶媒を注射した。感染後十日間のマウスの死亡率をモニターした。
表１０のデータは２５μｇのアロフェロンで処置した群で感染後の死亡率が有意に減少したことを示している。２．５μｇの用量では有効でなかった。
【００５７】
【表１３】
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【００５８】
アロフェロンの抗ウイルス活性をレマンタジンと比較した実験で同様の結果が得られた。表１１を参照のこと。レマンタジン（アマンタジン誘導体）はインフルエンザウイルスＡに対して特異的に有効な最も強力な抗ウイルス剤の一つである（Ｅｒｓｈｏｖ  Ｆ．Ｉ．，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｄｉｃｉｎａ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  １９９８，  １８７ｐｐ）。アロフェロンをウイルス接種の１日前、次いで接種の１時間前、さらに感染後１及び２日後に２５μｇの用量で皮下注射した。レマンタジンは１０００μｇの用量でウイルス接種の１日前、次いで接種の１時間前、さらに感染後１、２及び３日後に経口投与した。
【００５９】
アロフェロン及びレマンタジンは両方ともインフルエンザウイルスによって引き起こされる致命的な肺損傷からほとんどの感染動物を有効に保護した。レマンタジンのほうがインフルエンザウイルスＡ感染の場合においてはわずかにより効果的であるように見えるが、アロフェロンに比べるとレマンタジンは著しく多い投与量（約４０倍）で使用しなければならない。さらに、インフルエンザウイルスのＡ株及びＢ株に同等に効果的なアロフェロンとは異なり、レマンタジンはインフルエンザウイルスＢ及び他のウイルス感染の場合には効果がないことが知られている。
【００６０】
【表１４】
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【００６１】
実施例８
ヒトインフルエンザウイルス  Ｂが感染したマウスにおけるアロフェロンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルス活性
アロフェロンの抗ウイルスＢ有効性を実施例６に記述したプロトコールに従って試験した。対マウス病原性  Ｌｅｅ  １／４０ヒトインフルエンザウイルス  Ｂ  株をＬＤ５０の３及び３０倍当量の用量で動物に鼻腔内接種した。多様なインフルエンザウイルス株に有効な抗ウイルス剤であるリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、すなわち１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（Ｌｉａｏ  Ｈ．Ｊ．  ａｎｄ  ＳｔｏｌｌａｒＶ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  １９９３，  ２２，  ２８５；  Ｅｒｓｈｏｖ  Ｆ．Ｉ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｄｉｃｉｎａ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  １９９８，  １８７  ｐｐ）を陽性対照として使用した。
【００６２】
結果を表１２に示す。ウイルス投与量に関わらず、両方の対照群で感染により高い致死率の重篤な肺炎が引き起こされた。リバビリンは低い方のウイルス用量（ＬＤ５０の３倍）  を接種したマウスでは有効に保護したが、高い方の用量（ＬＤ５０の３０倍）に対しては有効でなかった。この時、アロフェロンは両方の場合において同等に有効であった。従って、アロフェロンは公知の抗ウイルス剤であるリバビリンに比較して、より優れた抗ウイルス効果を有することが証明された。さらに、アロフェロンはリバビリンの治療用量の約１／１０程度の用量で有効であった。
【００６３】
【表１５】
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【００６４】
実施例９
マウスにおけるインターフェロン合成に対するアロフェロンのｉｎ  ｖｉｖｏ  効果
アロフェロンの抗ウイルス活性に可能な作用様式を調べるために、マウスにおけるインターフェロン合成に対する上記調製物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を研究した。アロフェロン処理及び対照（無処理）動物の血清中のインターフェロン濃度を単層Ｌ−９２９細胞をモデルに用いて測定した。水疱性口内炎ウイルス（Ｉｎｄｉａｎａ  株）を試験ウイルスとして５０％細胞変性用量の１００倍超過用量で使用した。インターフェロン活性の１ユニットは、試験ウイルスの細胞傷害に対して５０％のＬ−９２９細胞を保護するマウス血清希釈倍数の反比例値で表す。シクロフェロンを陽性対照として用いた。シクロフェロンはアクリダノン化合物群に属するインターフェロン誘導物質である（Ｅｒｓｈｏｖ  Ｆ．Ｉ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｄｉｃｉｎａ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  １９９８，  １８７  ｐｐ）。アロフェロン又はシクロフェロンはそれぞれ２５μｇ及び５００μｇの用量で腹腔内投与された。
２シリーズの実験結果を表１３に要約する。各シリーズで実験群は４匹の動物から成っていた。各動物から血液サンプルを採取して個々の血清を合わせ、インターフェロン測定に使用した。アロフェロンは統計的に有意にインターフェロン濃度増加を刺激し、処置の２４時間後に最大効果に達した。
【００６５】
【表１６】
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【００６６】
マウスにおけるインターフェロン合成に対するアロフェロンのｉｎ  ｖｉｖｏ効果に関する他の例を表１４に示す。アロフェロンを皮下注射したことと個々の血液サンプルを別々に分析したことを除いて、上記実験と同じ方法で行った。アロフェロン及びシクロフェロンは両方とも短期間観察、すなわち処置後６時間目においてインターフェロン生成を刺激した。２４時間の間にアロフェロン及びシクロフェロンの両方の処置動物でインターフェロン力価は対照レベルに戻った。
このように、上記データからアロフェロンが公知のインターフェロン誘導物質であるシクロフェロンと同様のレベルでｉｎ  ｖｉｖｏインターフェロン誘導活性を有することが確認された。刺激効果の長さは、おそらく動物の生理的状態及び投与方法に依存して、６時間から２４時間又はそれ以上の範囲に及びうる。シクロフェロンのような伝統的なインターフェロン誘導性化学物質と比較して、アロフェロンは非常に低い投与量（約１／２０）で有効であるという長所を持つ。
【００６７】
【表１７】
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【００６８】
実施例１０
アロフェロンの毒性評価
アロフェロンの毒性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いて試験した。表１５を参照。動物及び微生物モデルでの急性若しくは慢性毒性、アレルゲン活性、胎児毒性又は生殖機能に対する有害な効果、又はヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでの細胞傷害はこれまでのところ記録されていない。従って、アロフェロンは毒性が非常に低いか又は実質的に毒性がない物質と結論される。
【００６９】
【表１８】
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【表１９】
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