(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CPG酵素に対する基質でありプロドラッグである化合物であって、次の式（Ｉ）；
0003541037.tif 000050
｛式中、R1及びR2はそれぞれ独立して塩素原子、臭素原子、沃素原子、基−OSO2Me（但し、Meはメチル基を表わす）又は基−OSO2フェニル（但し、フェニル部分はＣ１〜４アルキル基、ハロゲン原子、−CN基及び−NO2基から独立して選択される置換基の１個、２個、３個、４個又は５個で置換されていてもよい）を表わし；
R1a及びR2aはそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４ハロアルキル基を表わし；
R3及びR4はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４ハロアルキル基を表わし；
R5a、R5b、R5c及びR5dはそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基であって二重結合又は三重結合を１個有していてもよいＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、−NH2基、基−CONR7R8（但し、R7及びR8は下記に記載の意義を有する）、基−NH（Ｃ１〜４アルキル）、基−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、又はＣ２〜５アルカノイル基を表わすか；あるいはR5a及びR5bは一緒になって下記のａ）、ｂ）又はｃ）に記載の基：すなわち
ａ）二重結合を１個有していてもよいC4アルキレン基；
ｂ）C3アルキレン基；又は
ｃ）基−CH＝CH−CH＝CH−、−CH＝CH−CH2−もしくは−CH2−CH＝CH−〔但し、これらの基のそれぞれは独立してＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、Ｃ２〜５アルカノイル基及び基−CONR7R8（基中のR7及びR8は下記に記載の意義を有する）からなる群から選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよい〕を表わし；
ＸはＯ原子、基−NH−又は基−CH2−を表わし；
ＹはＯ原子を表わし；且つ
Ｚは基−Ｖ−Ｗを表わし、該基においてＶは基−CH2−Ｔ−であり、基中のＴは基−CH2−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（SO）−又は−（SO2）−であり（但し、Ｖがその第２の原子として硫黄原子又は酸素原子を有する場合には、Ｗが基−COOH以外の基を表わすことを条件とする）、またＶはさらに炭素原子上に１個又は２個の置換基Q1及び／又はQ2を有していてもよく；ここでQ1及びQ2はそれぞれ独立してＣ１〜４アルキル基又はハロゲン原子を表わすか；あるいはQ1及びQ2は隣り合った炭素原子に結合している場合には、一緒になってＣ１〜４アルキル基及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよいC3〜C4アルキレン基を表わし得；且つ
Ｗは下記の定義（１）〜（９）に記載の基を表わす、すなわちＷは
（１）COOH基；
（２）基−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−R6〔但し、R6はＣ１〜６アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基又は（下記の定義（３）に記載の意義を有する）アリール基を表わす〕；
（３）基−（Ｃ＝Ｏ）−NR7R8〔但し、R7及びR8はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基（該基は基−（Ｃ＝Ｏ）−NR7R8のＮ原子に炭素原子を介して連結される）、又はＣ７〜９アラルキル基を表わし、
ここで、前記アリール基はフェニル基であり；前記ヘテロアリール基は窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される異種原子を１〜３個含有する５員環；又は６員環であり；前記アリール部分それ自体、ヘテロアリール部分及び前記アラルキル基のアリール部分はその炭素原子が基−COOH、−OH、−NH2、−CH2−NH2、−（CH2）１〜４−COOH、テトラゾール−５−イル及び−SO3Hからなる群から選択される置換体の１〜４個で置換されていてもよく且つアルキル基部分はメチル基を有していてもよい〕；
（４）基−SO2NHR9（但し、R9はR7について定義した意義を有するが、さらに−CF3基、−CH2−CF3基又は前記アリール基を表わし得る）；
（５）基−SO3R10（但し、R10はＨ原子、Ｃ１〜６アルキル基又はＣ３〜６シクロアルキル基を表わす）；
（６）基−PO3R10R10（但し、２つの基R10はそれぞれ同一であってもよいし又は異なっていてもよく前記の意義を有する）；
（７）テトラゾール−５−イル基；
（８）基−CONH−SO2R11〔但し、R11は下記の（ａ）〜（ｃ）に記載の基：すなわち、
（ａ）Ｃ３〜７シクロアルキル基；
（ｂ）Ｃ１〜６アルキル基であって、下記に定義するアリール基、Ｃ１〜４アルキル基、−CF3基及びハロゲン原子からなる群から選択される複数の置換基で置換されていてもよいＣ１〜６アルキル基；及び
（ｃ）ペルフルオロ−Ｃ１〜６アルキル基
を表わし；
ここで上記アリール基はフェニル基であるか又は１〜５個の置換基を有するフェニル基であり、該置換基はハロゲン原子、−NO2基、−CF3基、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−NH2基、NHCOCH3基、−CONH2基、基−OCH2COOH、基−NH（Ｃ１〜４アルキル）、基−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２及び基−NHCOO（Ｃ１〜４アルキル）、−OH基、−COOH基、−CN基及び基−COO（Ｃ１〜４アルキル）からなる群から選択されるものである〕；又は
（９）基−Ｍ−Het（但し、ＭはＳ原子、基SO又は基SO2を表わし、且つHetは５員又は６員複素環式芳香環であって該芳香環の炭素原子を介して基Ｍに連結され、Ｏ原子、Ｎ原子及びＳ原子からなる群から選択される異種原子を１個、２個、３個又は４個含有し且つ環の炭素原子が−OH基、−SH基、−CN基、−CF3基、−NH2基及びハロゲン原子からなる群から選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよい５員又は６員複素環式芳香環を表わす）を表わす｝で示される化合物又はその塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸；（２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フエニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フエニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕。
【請求項２】
R1及びR2がそれぞれ独立してＩ原子、Br原子、Cl原子、基−OSO2Me（但し、Meはメチル基を表わす）又は基−OSO2フェニル（但し、フェニル部分はその２位及び／又は４位が請求項１に記載の置換基の１個又は２個で置換されているものである）を表わすものである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1a及びR2aがそれぞれ独立して−CH3基又は水素原子を表わすものである請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
R3及びR4がそれぞれ独立して水素原子、メチル基及び−CF3基を表わすものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
R5a、R5b、R5c及びR5dがそれぞれ独立して水素原子、弗素原子、塩素原子、メチル基、−CONH2基又は−CN基を表わすものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
R5a、R5b、R5c及びR5dがそれぞれ独立して水素原子を表わすものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ＸがＯ原子又は基NHである請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｖが基−CH2−CH2−及び（Ｗがテトラゾール−５−イル基である場合には）−CH2−Ｓ−からなる群から選択されるものである請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｗが請求項１に記載の定義（１）、（２）、（３）、（７）又は（９）に記載の基を表わすものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｗが−COOH基、テトラゾール−５−イル基又は基−CONH（アリール）〔但し、アリール基は請求項１に記載の定義（３）に記載の意義を有する〕を表わすものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
下記の化合物（ａ）〜（ｃ）：すなわち
（ａ）（Ｓ）−２−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニルアミノ｝−４−（1H−1,2,3,4−テトラゾール−５−イル）酪酸及びその塩；
（ｂ）Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩；並びに
（ｃ）Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩；
の中から選択される化合物。
【請求項１２】
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノフェキシカルボニル］−Ｌ−グルタミン酸又はその塩。
【請求項１３】
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸又はその塩。
【請求項１４】
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸γ−（3,5−ジカルボキシ）アニリド又はその塩。
【請求項１５】
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジtert−ブチルエステル。
【請求項１６】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の製造方法であって、
（ａ）次の式：
0003541037.tif 000051
｛式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5c、R5d、Ｘ及びＹは請求項１に記載の意義を有し、Z1は請求項１に記載の意義Ｚを表わし〔但し、Ｗがカルボキシル基を表わす場合には、カルボキシル基は保護された形（Pr2と表示される）で存在することを条件とする〕、且つPr1は保護された形（Pr2と同一であってもよいし又は異なっていてもよい）のカルボキシル基を表わす｝で示される化合物を脱保護し且つ所望ならばこのようにして得られた前記の式（Ｉ）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル］−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロニチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕の製造方法。
【請求項１７】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の製造方法であって、
（ｂ）次の式：
0003541037.tif 000052
〔式中、Z1111は請求項１記載の基Ｚを表わすが、Ｗが請求項１に記載の定義（４）に記載の基（すなわち、基−SO2NHR9）、定義（５）に記載の基（すなわち、基−SO3R10）及び定義（６）に記載の基（すなわち、基PO3R10R10）を表わすことを条件とする〕で示される化合物を、下記の式（II）
0003541037.tif 000053
（式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5c及びR5dは請求項１に記載の意義を有し、Ｘ及びＹはＯ原子を表わし且つＬは脱離性の原子又は基を表わす）示される化合物又は下記の式（Ｖ）
0003541037.tif 000054
（式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5c及びR5dは請求項１に記載の意義を有する）で示される化合物と標準条件下で反応させて、前記の式（Ｉ）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の定義（４）、（５）及び（６）に記載の基を表わす〕を生成させ且つ所望ならば得られた前記の式（Ｉ）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フエニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕の製造方法。
【請求項１８】
請求項１記載の式（１）で示される化合物又はその塩の製造方法であって、
（ｃ）次の式：
0003541037.tif 000055
（式中、Z1111は前記の基Ｚを表わすが、但し、Ｗがテトラゾール−５−イル基を表わすことを条件とする）で示される化合物と、前記の式（II）で示される化合物とを標準条件下で反応させ、それによって前記の式（Ｉ）で示される化合物であって式中のＷがテトラゾール−５−イル基を表わす化合物を生成させ且つ所望ならば得られた式（Ｉ）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩〔但し２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕の製造方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗体指向化酵素プロドラッグを用いる療法（antibody directed enzyme prodrug therapy）（ADEPT）に使用する化合物及びその製造方法に関する。本発明の化合物は、カルボキシペプチダーゼＧ酵素、特にカルボキシペプチダーゼG2（CPG2）と組合わせて使用されるプロドラッグとして特に興味あるものである。
癌化学療法において使用可能性のある多数の細胞毒性化合物（cytotoxic compound）が発見されている。ナイトロジェンマスタード類はかかる細胞毒性化合物のうちの一つの重要な群を形成する。一般的に細胞毒性化合物、特にナイトロジェンマスタード類の臨床使用は、腫瘍細胞と正常細胞との間の細胞毒性効果における選択性が乏しいという理由から制限されている。
この問題を克服するための一つの試みは、いわゆるプロドラッグの開発に関連している。プロドラッグは細胞毒性薬物（drug）の誘導体であり、比較的単純な誘導体である場合が多く、その細胞毒性は親薬物（parent drug）の細胞毒性に比べてかなり軽減されている。かかるプロドラッグを治療中の患者に投与し、それによって目的作用部位の領域においてプロドラッグをただ単に細胞毒性薬物に転化させるという提案がなされている。
一つの試みは、細胞毒性をもつ親化合物であるナイトロジェンマスタードをアミノ酸に連結させてプロドラッグを形成することに関連する。該プロドラッグは酵素の影響下で目的作用部位において親化合物であるナイトロジェンマスタードに転化し得る。この試みは抗体／酵素の複合体をプロドラッグと組合わせて使用することによって実施できる。抗体／酵素の複合体は、腫瘍に選択性をもつ抗体と、プロドラッグを細胞毒性薬物に転化させる酵素とから形成される。臨床実施においては、抗体／酵素の複合体を先ず患者に投与し、腫瘍に結合させる。適当な時間をおいて体のその他の部分から抗体／酵素の複合体が排泄（clearance）された後に、プロドラッグを患者に投与する。プロドラッグの細胞毒性薬物への転化は、局在された酵素の影響下において主として腫瘍の領域で行われる。かかる方式（system）は、国際公開第WO88/07378号として公開された国際特許出願第PCT/GB88/00181号明細書及び米国特許第4,975,278号明細書に記載されている。
CPGによって切断される公知のADEPT用プロドラッグは、その活性薬物として安息香酸マスタードを生成する。しかしながら、腫瘍細胞に対する治療効力を高めるためには、CPGによる切断によってさらに一層活性な薬物が生成されるべき必要がある。CPGを用いるADEPT療法の選択性を高めたい、すなわち健常細胞と比べて癌細胞に対する毒性の比率を高めたいという別の要求が生じる。
本発明はADEPT療法において使用される新規なプロドラッグであって、CPGによって切断されるがしかもCPG触媒反応の公知生成物よりもさらに著しく活性の大きな細胞毒性薬物を産生する新規なプロドラッグを発見したことに基づくものである。CPGは本来、葉酸誘導体からグルタミン酸とアスパラギン酸とを特異的に加水分解により生成する葉酸分解酵素として機能する〔Sherwood R.F.らの論文、Eur.J.Biochem.,148,447−453（1985）〕。カルボキシペプチダーゼＧ酵素は典型的でない葉酸構造類似体（analouge）を認識しない〔Kalghatgi K.K.らの論文、Cancer Research,39,3441−3445（1979）〕、従って、カルボキシペプチダーゼＧ酵素は基質特異性において保守的であるとみなされる。本発明のプロドラッグがCPG酵素例えばCPG1酵素、特にCPG2酵素についての基質であることは驚くべきことである。CPG2はＬ−グルタミン酸誘導体（gulutamate）に対して特異性をもつエキソペプチダーゼである。CPG2酵素は葉酸及びその構造類似体並びにグルタミル−ｐ−アミノ安息香酸から、その部分構造体の−芳香環−CO−NH−Gluの−CO−NH−の所での切断によってグルタミン酸部分を生ずるよう加水分解することが知られている。本発明においては、切断が起こると比較される部分構造体は−芳香環−Ｘ−CO−NH−Glu（式中、Ｘは−NH−、−Ｏ−又は−CH2−である）であり、従って切断点と芳香環との間の距離が変わり、しかも特にＸが−NH−又は−Ｏ−である時には−CO−NH−結合の内部の電子分布が変わっている。CPG2が前記の構造空間的な変差と電子的な変差とを許容（accomodate）したことは予測され得なかったことである。前記のＸが−CH2−である複数の化合物が、Chemical Abstracts,75（５），（1971年８月２日発行）、抄録番号36603m及びKarpaviciusらの論文、Ivd.Acad.Nauk.SSSR,Ser Khim.,no.9,1970年，第2150−2153頁に記載されている（第１表の化合物VI、VIII、IX及びXI参照）。
本発明の一つの要旨によれば、CPG酵素に対する基質でありプロドラッグである化合物であって、次の式（Ｉ）：
0003541037.tif 000002
｛式中、R1及びR2はそれぞれ独立して塩素原子、臭素原子、沃素原子、基−OSO2Me（但し、Meはメチル基を表わす）又は基−OSO2フェニル（但し、フェニル部分はＣ１〜４アルキル基、ハロゲン原子、−CN基及び−NO2基から独立して選択される置換基の１個、２個、３個、４個又は５個で置換されていてもよい）を表わし；
R1a及びR2aはそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４ハロアルキル基を表わし；
R3及びR4はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４ハロアルキル基を表わし；
R5a、R5b、R5c及びR5dはそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜４アルキル基であって二重結合又は三重結合を１個有していてもよいＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、−NH2基、基−CONR7R8（但し、R7及びR8は下記に記載の意義を有する）、基−NH（Ｃ１〜４アルキル）、基−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２又はＣ２〜５アルカノイル基を表わすか；あるいはR5a及びR5bは一緒になって下記のａ）、ｂ）又はｃ）に記載の基：すなわち
ａ）二重結合を１個有していてもよいC4アルキレン基；
ｂ）C3アルキレン基；又は
ｃ）基−CH＝CH−CH＝CH−、−CH＝CH−CH2−もしくは−CH2−CH＝CH−〔但し、これらの基のそれぞれは独立してＣ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、Ｃ２〜５アルカノイル基及び基−CONR7R8（基中のR7及びR8は下記に記載の意義を有する）からなる群から選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよい〕を表わし；
ＸはＯ原子、基−NH−又は基−CH2−を表わし；
ＹはＯ原子を表わし；且つ
Ｚは基−Ｖ−Ｗを表わし、該基においてＶは基−CH2−Ｔ−であり、基中のＴは基−CH2−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（SO）−又は−（SO2）−であり（但し、Ｖがその第２の原子として硫黄原子又は酸素原子を有する場合には、Ｗが基−COOH以外の基を表わすことを条件とする）、またＶはさらに炭素原子上に１個又は２個の置換基Q1及び／又はQ2を有していてもよく；ここでQ1及びQ2はそれぞれ独立してＣ１〜４アルキル基又はハロゲン原子を表わすか；あるいはQ1及びQ2は隣り合った炭素原子に結合している場合には、一緒になってＣ１〜４アルキル基及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよいC3〜C4アルキレン基を表わし得；且つ
Ｗは下記の定義（１）〜（９）に記載の基を表わす、すなわちＷは
（１）COOH基；
（２）基−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−R6〔但し、R6はＣ１〜６アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基又は（下記の定義（３）に記載の意義を有する）アリール基を表わす〕；
（３）基−（Ｃ＝Ｏ）−NR7R8〔但し、R7及びR8はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ３〜６シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基（該基は基−（Ｃ＝Ｏ）−NR7R8のＮ原子に炭素原子を介して連結される）、又はＣ７〜９アラルキル基を表わし、
ここで、前記アリール基はフェニル基であり；前記ヘテロアリール基は窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される異種原子を１〜３個含有する５員環又は６員環であり；前記アリール部分それ自体、ヘテロアリール部分及び前記アラルキル基のアリール部分はその炭素原子が基−COOH、−OH、−NH2、−CH2−NH2、−（CH2）１〜４−COOH、テトラゾール−５−イル及び−SO3Hからなる群から選択される置換基の１〜４個で置換されていてもよく且つアルキル部分はメチル基を有していてもよい〕；
（４）基−SO2NHR9（但し、R9はR7について定義した意義を有するが、さらに−CF3基、−CH2−CF3基又は前記アリール基を表わし得る）；
（５）基−SO3R10（但し、R10はＨ原子、Ｃ１〜６アルキル基又はＣ３〜６シクロアルキル基を表わす）；
（６）基−PO3R10R10（但し、２つの基R10はそれぞれ同一であってもよいし又は異なっていてもよく前記の意義を有する）；
（７）テトラゾール−５−イル基；
（８）基−CONH−SO2R11〔但し、R11は下記の（ａ）〜（ｃ）に記載の基：すなわち、
（ａ）Ｃ３〜７シクロアルキル基；
（ｂ）Ｃ１〜６アルキル基であって、下記に定義するアリール基、Ｃ１〜４アルキル基、−CF3基及びハロゲン原子からなる群から選択される複数の置換基で置換されていてもよいＣ１〜６アルキル基；及び
（ｃ）ペルフルオロ−Ｃ１〜６アルキル基
を表わし；
ここで上記アリール基はフェニル基であるか又は１〜５個の置換基を有するフェニル基であり、該置換基はハロゲン原子、−NO2基、−CF3基、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、−NH2基、−NHCOOH3基、−CONH2基、基−OCH2COOH、基−NH（Ｃ１〜４アルキル）、基−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２及び基−NHCOO（Ｃ１〜４アルキル）、−OH基、−COOH基、−CN基及び基−COO（Ｃ１〜４アルキル）からなる群から選択されるものである〕；又は
（９）基−Ｍ−Het（但し、ＭはＳ原子、基SO又は基SO2を表わし、且つHetは５員又は６員複素環式芳香環であって該芳香環の炭素原子を介して基Ｍに連結され、Ｏ原子、Ｎ原子及びＳ原子からなる群から選択される異種原子を１個、２個、３個又は４個含有し且つ環の炭素原子が−OH基、−SH基、−CN基、−CF3基、−NH2基及びハロゲン原子からなる群から選択される置換基の１個、２個、３個又は４個で置換されていてもよい５員又は６員複素環式芳香環を表わす）
を表わす｝で示される化合物又はその塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕が提供される。
前記の式（Ｉ）の化合物は非対称炭素原子を少なくとも１個有する。該非対称炭素原子は、式Ｉにおいて置換基−COOHを有する炭素原子である。さらに、R1、R2、R3、R4、Q1及びQ2の意義に応じて、式（Ｉ）の化合物はさらに追加の非対称炭素原子を有していてもよい。本発明が式（Ｉ）の化合物のかかる形の全て、例えば本明細書に記載の本発明の組成物の有用な生理学的性質をもつラセミ体並びにその個々の光学異性体を包含することが理解されるであろう。かかる異性体をどのようにして分離し得るか及びそれらの生理学的性質をどのようにして決定し得るかは当業者にはありふれた一般的知識である。本発明の化合物は、式（Ｉ）中の置換基−COOHを有する炭素原子においてＬ配置をもつものであるのが好ましい。
本発明は前記の式（Ｉ）で示される化合物の塩を包含する。しかしながら、医薬用途については、前記に挙げた塩は製薬学的に許容し得るものであるが、別の塩が例えば式（Ｉ）の化合物及びそれらの製薬学的に許容し得る塩の製造に用途を見出だし得ることが認められるであろう。本発明の化合物の多形体（polymorfic form）を調製し得るし、しかもこれらの多形体もまた本発明に包含される。
本明細書に挙げた置換基がアルキル基を表わすか又は含んでいる場合には、かかる基は直鎖であってもよいし又は分岐鎖であってもよい。本明細書中に挙げた置換基がＣ１〜６アルキル基を表わすか又は含んでいる場合には、かかる基は炭素原子を１〜４個有するのが都合がよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基、好ましくはメチル基及びエチル基、特にメチル基であるのが都合がよい。本明細書に挙げた置換基がＣ１〜４アルキル基を表わすか又は含んでいる場合には、かかる基は例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基、好ましくはメチル基及びエチル基、特にメチル基であり得る。
R1及びR2として好ましい置換基（value）はＩ原子、Br原子、Cl原子、基−OSO2Me及び基−OSO2フェニル〔但し、フェニル部分は２位及び／又は４位が（本明細書で定義した）置換基の１個又は２個（特に１個）で置換されている〕である。R1及びR2について特に好ましい置換基はＩ原子、Br原子、Cl原子及び基−OSO2Meである。R1a及びR2aとして好ましい置換基は−CH3基又は水素原子であるが、特に水素原子である。
R3及びR4として好ましい置換基は水素原子、メチル基及びCF3基であるが、特に水素原子である。
R5a、R5b、R5C及びR5dとして好ましい置換基は水素原子、弗素原子、塩素原子、メチル基、−CONH2基及びCN基である。R5a、R5b、R5C及びR5dのうちの少なくとも１つが水素原子以外のものであるようにフェニル環上に置換基が存在する場合には、R5a、R5b、R5C及びR5dのうちの１つ又は２つのみが水素原子以外の置換基であることが好ましい。かかる状況においては、R5b及びR5dが水素原子であり且つR5a及び／又はR5Cは水素原子以外のものであることがさらに好ましい。しかしながら、R5a、R5b、R5C及びR5dは水素原子であるのが特に好ましい。
Ｘとして好ましい置換基はＯ原子又はＮ原子、特にＯ原子である。本発明の別の態様においては、Ｘとして特に好ましい置換基はＮ原子である。
Ｖとして好ましい置換基は−CH2−CH2−である。本発明の別の態様においては、Ｖとして好ましい置換基は、Ｗがテトラゾール−５−イル基である場合には−CH2−Ｓ−である。
Ｗが前記の定義（３）に記載の基を表わす場合には、アリール基は置換フェニル基であるのが好ましく、ヘテロアリール基は異種原子を１個又は２個含有している５員環又は６員環であるのが都合がよく、かかる異種原子はピリジル基又はピリミジル基のように窒素原子であるのが好ましい。アリール部分それ自体、ヘテロアリール部分、又はアラルキル基のアリール部分上の好ましい置換基は−COOH基、−CH2−COOH基又はテトラゾール−５−イル基である。
Ｗが前記の定義（８）（ｂ）に記載の基であってＷがアリール基で置換されていてもよいＣ１〜６アルキル基を表わす場合には、この置換されていてもよいアリール基は−CONH2基、−OCH2−COOH基及び／又は−COOH基で置換されたフェニル基であるのが好ましいが、特に非置換フェニル基であるのが好ましい。
Ｗが前記の定義（９）に記載の基を表わす場合には、Hetは窒素原子を１個、２個、３個又は４個含んでいる５員又は６員複素環式芳香環を表わすのが都合がよい。窒素原子は前記の環中に存在する唯一の異種原子であるのが好ましい。従って、具体的な基としてはピリジル基、ピロリル基、1,2,3−トリアジニル基及び1,2,4−トリアジニル基が挙げられる。
Ｗとしての具体的な置換基が前記の定義（１）、（２）、（３）、（５）、（６）、（７）及び（９）に記載の基である場合には、好ましい置換基は前記に詳述した定義（１）、（２）、（３）、（７）及び（９）に記載の基である。
Ｗとしての具体的な置換基は、−COOH基、−CONH2基、基−CONHR8（基中のR8は前記に定義したものであり、特にR8はフェニル基である）、テトラゾール−５−イル基、基−CONH−SO2R11〔基中のR11は前記に詳述した定義（ｂ）又は（ｃ）に記載の基を表わす〕及び基−Ｍ−Het（基中のＭは異種原子を３個又は４個有する５員複素環式芳香環であり、該複素環が異種原子を３個有する場合には炭素原子上でハロゲン原子又はシアノ基で置換されていてもよい）である。
Ｗが基−CONH−SO2R11を表わし、基中のR11がペルフルオロ−Ｃ１〜６アルキル基を表わす場合には、該ペルフルオロアルキル基は炭素原子を１〜４個、特に炭素原子を１個又は２個有するものであるのが好ましい。
Ｗとしてのさらに具体的な置換基は−COOH基、テトラゾール−５−イル基又は基−CONH（アリール）〔基中のアリール基は前記の定義（３）に記載の意義を有する〕である。このような状況においては、アリール基は置換フェニル基であるのが好ましく、好ましい置換基は−COOH基、−CH2−COOH基又はテトラゾール−５−イル基である。
ADEPTにおける実用性により、本発明の好ましい特定の化合物としては、（Ｓ）−２−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニルアミノ｝−４−（1H−1,2,3,4−テトラゾール−５−イル）酪酸及びその塩;N−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩;N−｛４−N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩が挙げられるが、本発明の特に好ましい化合物はＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩である。
別の好ましい化合物であって試験において良好な活性を示した化合物は、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸及びその塩である。
興味ある本発明の化合物の具体的な小群（sub−group）は、R1〜R4、R5a〜R5d、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Q1又はQ2として前記の特定的又は一般的な定義のいずれか一つを単独でとるか、あるいはR1〜R4、R5a〜R5d、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Q1又はQ2の別の特定的又は一般的な定義と組み合わせてとることによって得られ得る。
また、効果的なADEPT用の本発明の供試化合物のCPG切断によって生成される薬物は、生理学的条件下ではCPG2触媒反応の公知の薬物生成物よりも不安定である。腫瘍部位で生成された活性薬物の一部が全身循環（general circulation）の中に漏れ出る（leak）場合には、この低減された安定性は、薬物がADEPT用のCPG触媒反応の公知生成物と同様の安定性をもつ場合よりも健全細胞に対して低い毒性を生じる。従って、本発明者らが行った試験は、薬物（活性薬物であり、プロドラッグではない）の静脈内投与後であっても、すなわち15分後であっても薬物は血漿中で検出されなかったことを証明する。
本発明の化合物は種々の無機及び有機性の酸及び塩基と塩を形成し、かかる塩類は本発明の範囲内にある。かかる塩類としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩例えばナトリウム塩及びカリウム塩、アルカリ土類金属塩例えばカルシウム塩及びマグネシウム塩、有機塩基との塩例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、アミノ酸例えばアルギニン、リシンとの塩などが挙げられる。また、有機酸及び無機酸、例えばHCl、HBr、H2SO4、H3PO4、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸及びカンファースルホン酸との塩類を調製し得る。前記の酸はpKa値が２に相当するかそれよりも小さいpKa値、特にpKa値が１に相当するかそれよりも小さいpKa値をもつ強酸である。生理学的に許容し得る塩類が好ましいが、別の塩類が例えば生成物の単離及び精製において有用であり得る。
前記塩類は慣用の方法で、例えば遊離酸又は遊離塩基の形態の生成物と、１当量又はそれ以上の適当な塩基又は酸とを、前記塩類が溶解しない溶媒又は媒体中で、あるいは後に減圧下で除去される溶媒、例えば水中で反応させることにより形成し得るし、あるいは凍結乾燥することにより形成し得るし又は適当なイオン交換樹脂上で別のカチオン用の存在するカチオン類を交換することにより形成し得る。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（Ｉ）で示される化合物及びその塩の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000003
〔式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5C、R5d、Ｘ及びＹは前記の意義を有し、Z1は前記の意義Ｚを表わすが、Ｗがカルボキシル基である場合にはＷが保護された形（Pr2と表示される）で存在することを条件とし、Pr1もまた保護された形（Pr2と同一であってもよいし又は異なっていてもよい）のカルボキシル基を表わす〕で示される化合物を脱保護し且つ所望ならばこのようにして得られた式（Ｉ）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（Ｉ）で示される化合物及びその塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸並びにこれらの塩を除く〕の製造方法が提供される。
従って、Pr1及びPr2は、例えばベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、２−（トリメチルシリル）エチルエステル、ジメチル−tert−ブチルシリルエステル、ジフェニルメチルエステル、テトラヒドロピランエステル、テトラヒドロフランエステル、メトキシエトキシメチルエステル又はベンジルオキシメチルエステルであってもよいし、あるいは水添分解又は酸触媒反応による脱保護用の一般的に知られているカルボキシ保護基、例えばエステル形成性の保護基であってもよい〔Greene T.W.及びWuts P.G.Mの著作、Protective Groups in Organic Synthesis,2nd Edition,Wiley−Interscience発行,1990年〕。
Pr1及び／又はPr2がベンジルオキシカルボニル基を表わす場合には、脱保護は水素添加によって行うのが好ましい。かかる水素添加は慣用の方法、例えば白金又はラネーニッケルの存在下における方法により行い得るが、炭素の存在下で白金を使用することにより行うのが好ましい。水素添加は、不活性溶媒好ましくは非プロトン性溶媒、特に酢酸エチル、テトラヒドロフランの存在下で、あるいは極性非プロトン性溶媒例えばジメチルホルムアミドの存在下で、好ましくは０〜100℃の温度、さらに好ましくは15〜50℃の温度、特に周囲温度で、好ましくは１〜24時間行うのが都合がよい。
Pr1及び／又はPr2がｔ−ブチルオキシカルボニル基を表わす場合には、脱保護反応は、酸、都合よくは強酸例えばトリフルオロ酢酸、HCl、HBr、HI又はギ酸の存在下で都合よく行い得る。溶媒を使用することが望まれる場合には、不活性は非プロトン性溶媒例えばジクロロメタン又はジエチルエーテルが好ましい。反応は０〜100℃の温度、さらに都合よくは０〜30℃の温度、特には周囲温度で行うのが都合がよい。
（前記に定義した）式（I a）の化合物及びその塩は新規であり、従って本発明の別の要旨を構成する。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（I a）で示される化合物（但し、ＸがＯ原子であり且つＹがＯ原子である）及びその塩の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000004
（式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5C及びR5dは前記の意義を有し、ＸはＯ原子であり、ＹはＯ原子であり且つＬは脱離性の原子又は基である）で示される化合物を次の式：
0003541037.tif 000005
（式中、Pr1及びZ1は前記の意義を有する）で示される化合物と反応させて、それによって前記の式（I a）の化合物を生成させ、且つ所望ならば得られた式（I a）の化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（I a）で示される化合物（但し、ＸがＯ原子であり且つＹがＯ原子である）及びその塩の製造方法が提供される。前記のＬはCl原子、Br原子、Ｉ原子、４−ニトロフェノキシ基又はペンタフルオロフェノキシ基である。上記反応は溶媒の存在下で−10℃〜100℃、好ましくは20〜50℃の温度で行うのが都合がよい。
好ましい反応条件は、有機溶媒（特に、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ジメチルホルムアミド及びジクロロメタン）の存在下で、好ましくは５〜50℃で、好ましくは１〜24時間反応を行うことを包含する。前記の式（II）で示される化合物は本発明の別の要旨を構成し、該化合物は例えばアニリノマスタード基を含有する対応するフェノールを、クロルギ酸アリールエステル例えばクロルギ酸ニトロフェニルエステル（特に、クロルギ酸４−ニトロフェニルエステル）か又はホスゲンのいずれかと反応させて式（II）で示される化合物を生成させることによって製造し得る。
好ましい反応条件は、有機溶媒（特に、酢酸エチル又はクロロホルム）の存在下で、好ましくは15〜50℃で（特に周囲温度で）、好ましくは１〜10時間反応を行うことを包含する。
前記の式（III）の化合物であって式中のＷが前記の定義（３）に記載の基を表わす場合の化合物は、式（III）の化合物であって式中のＷが前記の定義（２）に記載の基を表わす化合物から標準条件を使用して製造し得る。好ましい標準条件は、窒素親核試薬（特に、アンモニア、第１級アミン又は第２級アミン）を用いる反応であって好ましくは25〜50℃で、好ましくは約24時間の反応を包含する。
前記の式（III）の化合物であって式中のＷがテトラゾール−５−イル基を表わす場合の化合物は、対応するニトリルから、公知の方法例えばFinnegan W Gらの論文、JACS,80,3909（1978）に記載の方法によりアミンを生成させ、次いで得られたアミン（Pr3）を脱保護し、それによって式（III）の化合物であって式中のＷがテトラゾール−５−イル基である化合物を製造し得る。
前記の式（III）の化合物であって式中のＷが前記の定義（９）に記載の基を表わす場合の化合物は、本明細書に記載の式（XV）の化合物を標準的条件（特に、ジボランを使用するか、又は混成無水物反応、次いで水素化硼素ナトリウム還元を使用する）を使用して対応する第１級アルコールに還元することによって製造し得る。対応する第１級アルコールは、標準方法により例えばメタンスルホニルクロリドとトリメチルアミンとを使用することによりジクロロメタンの存在下に０℃で脱離性基例えばBr、Ｉ又はメシレートに転化される。該脱離性基は次の式：
HS−Het                                  （XVI）
〔式中、Hetは前記のＷの定義（９）に記載の意義を有する〕で示される基で交換され、それによって酸化条件下で処理された後に次の式：
0003541037.tif 000006
〔式中、Z111はＷが−Ｓ−Het、−（Ｓ＝Ｏ）−Het又は−SO2−Hetを表わすことを条件として前記のＺを表わし、Pr1及びPr3は前記の保護されたカルボキシル基又は−NH2基それぞれである〕で示される化合物を生成する。適当な酸化条件としては酸化剤（特に、３−クロロ過安息香酸）を用いる処理が挙げられる。前記の標準条件下における式（XVII）の化合物の−NH2基の脱保護は、前記の式（III）の化合物であって式中のＷが前記の定義（９）に記載の基を表わす場合の化合物を生成させるのに効果的である。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（I a）で示される化合物（但し、ＸがＮ原子であり且つＹがＯ原子である）及びその塩の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000007
（式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5C及びR5dは前記の意義を有する）で示される化合物又はその塩を、前記の式（III）の化合物と反応させそれによって式（I a）の化合物を生成させ、且つ所望ならば得られた式（I a）の化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（I a）で示される化合物（但し、ＸがＮ原子であり且つＹがＯ原子である）及びその塩の製造方法が提供される。上記の反応は例えば有機溶媒（好ましくは極性非プロトン性溶媒、特にジクロロメタン又は酢酸エチル）の存在下に好ましくは室温で、好ましくは１〜５時間行い得る。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（IV）で示される化合物及びその塩の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000008
（式中、R1、R2、R1a、R2a、R3、R4、R5a、R5b、R5C及びR5dは前記の意義を有する）で示される化合物を、式L1−（Ｃ＝Ｏ）−L2（式中、L1及びL2は脱離性基を表わす）で示される化合物と反応させてそれによって式（IV）で示される化合物を生成させることからなる、前記の式（IV）で示される化合物及びその塩の製造方法が提供される。L1及びL2としての置換基としては、Cl原子、基CCl3、イミダゾリルン基及びアリールオキシ基（特にフェノキシ基）が挙げられる。好ましい反応条件としては有機溶媒（好ましくは極性非プロトン性溶媒、特に酢酸エチル）の存在下に５〜25℃で約15分間反応を行うことが挙げられる。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（I a）で示される化合物（但し、Ｘが基−CH2−であり且つＹがＯ原子である）及びその塩の製造方法であって、前記の式（II）の化合物又はその塩〔但し、Ｘが基−CH2−であり、ＹがＯ原子であり且つＬが都合よくはペンタフルオロフェノキシ基、Cl原子、基−Ｏ−（CO）−Ｃ１〜６アルキル、好ましくは分岐アルキル、特にＣ１〜４アルキル、及び対応するフェニル酢酸の生成物であってカルボジイミド（特に、ジシクロヘキシルカルボジイミド）と反応させたアニリノマスタード基を含有するフェニル酢酸の生成物であることを条件とする〕と、前記の式（III）の化合物とを、標準的反応条件（例えば、極性非プロトン性溶媒例えばジメチルホルムアミド、酢酸エチル又はテトラヒドロフランの存在下に20〜50℃で１〜24時間反応を行う）を使用して反応させ、それによって式（I a）の化合物を生成させ且つ所望ならば得られた式（I a）の化合物をその塩に転化させることからなる、式（I a）で示される化合物（但し、Ｘが基−CH2−であり且つＹがＯ原子である）化合物及びその塩の製造方法が提供される。式（II）の化合物は、アニリノマスタード基を含有する対応するフェニル酢酸から標準的方法を使用して製造し得る。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（I a）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の定義（８）に記載の基（すなわち基−CONH−SO2R11）を表わす〕又はその塩の製造方法であって、前記の式（III）の化合物〔但し、Ｗは前記の定義（８）に記載の基を表わすことを条件とする〕と、前記の式（II）の化合物とをそれ自体公知の反応条件を使用して反応させ、それによって前記の式（I a）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の定義（８）に記載の基を表わす〕を生成させ、且つ所望ならば得られた式（I a）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（I a）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の定義（８）に記載の基を表わす〕及びその塩の製造方法が提供される。好ましい反応条件としては、有機溶媒（好ましくは極性非プロトン性溶媒、特に酢酸エチル又はジクロロメタン）の存在下に５〜50℃（特に周囲温度）で１〜５時間の反応を行うことが挙げられる。
前記の式（III）で示される化合物は本発明の別の要旨を構成し、かかる化合物は次の式：
0003541037.tif 000009
〔式中、Pr1は前記の保護された形のカルボキシル基を表わし、Pr3は保護された形の−NH2基、特にベンジルオキシカルボニル誘導体又はフタルイミド誘導体を表わし且つZ1はＷが前記の定義（８）に記載の基を表わすことを条件として前記のＺを表わす〕で示される化合物のアミノ基を、それ自体公知の反応条件下で脱保護し、それによって前記の式（III）の化合物〔但し、Ｗは前記の定義（８）に記載の基を表わす〕を生成させ、且つ所望ならば得られた式（III）の化合物をその塩に転化させることによって製造し得る。好ましい反応条件としては、炭素上のパラジウムの存在下で、有機溶媒（好ましくは極性非プロトン性溶媒、特に酢酸エチル又はテトラヒドロフラン）中で好ましくは周囲温度で、好ましくは１〜24時間の水素添加が挙げられる。別の好ましい反応条件としては、酢酸中でHBrの存在下に好ましくは周囲温度で、好ましくは１〜24時間脱保護を行うことが挙げられる。
前記の式（XI）で示される化合物は、次の式：
0003541037.tif 000010
（式中、Pr1及びPr3は前記の意義を有し、Z11はＷが−COOHを表わすことを条件として前記のＺを表わす）で示される化合物と、式R11SO2NH2〔式中、R11は前記のＷの定義（８）に記載の意義を有する〕で示される化合物とを、標準的反応条件下で反応させることによって製造し得る。標準的反応条件としては、カルボジイミド（特に、ジシクロヘキシルカルボジイミド）及び塩基〔特に、４−（N,N−ジメチルアミノ）ピペリジン〕の存在下に不活性溶媒（特に、ジクロロメタン）中で反応を行うことが挙げられる。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（Ｉ）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の基（４）（すなわち基−SO2NHR9）、基（５）（すなわち基−SO3R10）及び基（６）（すなわち基PO3R10R10）を表わす〕の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000011
〔式中、Z111は前記の基Ｚを表わすが、Ｗが前記の基（４）（すなわち、基−SO2NHR9）、基（５）（すなわち、基−SO3R10）及び基（６）（すなわち、基PO3R10R10）を表わすことを条件とする〕で示される化合物を、前記の式（II）で示される化合物と標準条件下で反応させるか、あるいは前記の式（Ｖ）で示される化合物と標準条件下で反応させて、それによって式（Ｉ）で示される化合物であって式中のＷが前記の定義（４）、（５）及び（６）に記載の基を表わす化合物を生成させ、且つ所望ならば得られた式（Ｉ）で示される化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（Ｉ）で示される化合物〔但し、Ｗは前記の基（４）（すなわち基−SO2NHR9）、基（５）（すなわち基SO3R10）及び基（６）（すなわち基PO3R10R10）を表わす〕の製造方法が提供される。標準的条件としては、有機溶媒（例えば、非プロトン性極性溶媒、特にジクロロメタン）中で、好ましくは周囲温度での塩基との反応を行うことが挙げられる。前記の式（XVIII）の化合物は公知である（Sigma Chemical Co.社から入手し得る）し、又は公知化合物から標準的方法によって製造し得る。
本発明の別の要旨によれば、前記の式（I a）で示される化合物〔但し、式中のＸはＮ原子又はＯ原子であり、ＹはＯ原子であり、R1及びR2はCl原子、Br原子、Ｉ原子又は基−OSO2Me（特にCl原子）であり、R1aはＨ原子であり、R2aはＨ原子であり、R3はＨ原子であり且つR4はＨ原子である〕及びその塩の製造方法であって、次の式：
0003541037.tif 000012
（式中、R5a、R5b、R5C、R5d、Pr1及びZ1は前記の意義を有し、ＸはＯ原子又は基NHである）で示される化合物を、燐ハロゲン化剤（特に五塩化燐）又は塩化チオニルと有機溶媒（好ましくは非極性非プロトン性溶媒、特にジクロロメタン）の存在下に好ましくは還流温度で１〜２時間（特に90分間）加熱して反応させるか；あるいはメチルスルホニルクロリドと有機溶媒（好ましくは極性非プロトン性溶媒、特にピリジン）の存在下で反応させ、それによって前記の式（I a）で示される化合物〔但し、式中のＸはＯ原子又は基NHであり、ＹはＯ原子であり、R1及びR2はCl原子、Br原子、Ｉ原子又は基−OSO2Meであり、R1aはＨ原子であり、R2aはＨ原子であり、R3はＨ原子であり且つR4はＨ原子である〕を生成させ、且つ所望ならば得られた式（I a）の化合物をその塩に転化させることからなる、前記の式（I a）で示される化合物〔但し、式中のＸはＮ原子又はＯ原子であり、ＹはＯ原子であり、R1及びR2はCl原子、Br原子、Ｉ原子又は基−OSO2Me（特にCl原子）であり、R1aはＨ原子であり、R2aはＨ原子であり、R3はＨ原子であり且つR4はＨ原子である〕及びその塩の製造方法が提供される。メチルスルホニルクロリドを使用する場合には、式（XIX）の化合物中の水酸基は反応に使用する温度に応じてCl原子及び／又は基−OSO2Meに転化させ得る。ジクロロ化合物（すなわち、R1＝R2＝Cl）は反応を70℃で15分間行うことにより都合よく取得し得るし、しかもR1＝Cl且つR2＝−OSO2Meである対応する化合物は反応を50℃で10分間行うことにより都合よく取得し得る。
R1及びR2がBr原子である場合及びR1及びR2がＩ原子である場合には、メタンスルホニル無水物は、これが反応において競争ハロゲンの問題を除くという理由から、メタンスルホニルクロリドに取って代わるのが好ましい。式（XIX）の化合物（0.002M）をCHCl3（30ml）に溶解した。トリエチルアミン（1.12ml）とメタンスルホニル無水物（0.008M）を周囲温度で添加し、混合物を２時間撹拌し、次いで水洗する。このようにして得られた生成物をMgSO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させて油状物を得た。得られた油状物を乾燥DMFに溶解し、沃化リチウム（又は臭化リチウム;0.005M）を添加し、80℃で２時間撹拌し、冷却し、水に注加し次いでエーテルで抽出した。このようにして得られた生成物をMgSO4上で乾燥し、濾過し、蒸発乾固し次いでフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
前記の式（XIX）の化合物は、次の式：
0003541037.tif 000013
〔式中、R5a、R5b、R5C、R5d、Pr1及びZ1は前記の意義を有し、Ｒ＊は基−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は基−Ｏ−CO−Ｌ（但し、Ｌは前記の脱離性基を表わす）〕で示される化合物を前記の式（III）の化合物と反応させて、次の式：
0003541037.tif 000014
（式中、R5a、R5b、R5C、R5d、Pr1及びZ1は前記の意義を有し、ＸはＯ原子又は基NHである）で示される化合物を得ることによって製造し得る。このようにして得られた化合物を（好ましくは炭素上のパラジウムの存在下で）水素添加して式（XXI）に対応するが基−NO2の代わりに−NH2を有する化合物を得る。このようにして得られた化合物をエチレンオキシドと、水性酸条件（好ましくは、酢酸／水1:1）下で、好ましくは周囲温度で１〜２日間反応させ、それによって式（XIX）の化合物を生成させる。
前記の式（Ｉ）で示される化合物であって式中のＷがテトラゾール−５−イル基を表わす化合物の製造方法は、次の式：
0003541037.tif 000015
（式中、Z111は前記の基Ｚを表わすが、Ｗはテトラゾール−５−イル基を表わすことを条件とする）で示される化合物と、前記の式（II）で示される化合物とを標準的条件下で反応させ、それによって前記の式（Ｉ）で示される化合物であって式中のＷがテトラゾール−５−イル基を表わす化合物を生成させ、且つ所望ならば得られた式（Ｉ）の化合物をその塩に転化させることからなる。標準的条件としては、極性非プロトン性溶媒（特に、DMF）中で塩基（好ましくは、ジメチルアミノピリジン、特にトリエチルアミン）の存在下における20〜50℃（特に25℃）で少なくとも２時間（好ましくは20時間）の反応が挙げられる。
プロドラッグ及び薬物の生体外細胞毒性効果
Skehanらによって報告された細胞毒性検定法〔J.Natl.Cancer Int.,82,1107−1112（1990）〕と同様の細胞毒性検定法で、プロドラッグ、プロドラッグと酵素、及び薬物の生体外細胞毒性効果を測定した。96ウェル（well）のマイクロタイター（microtitre）プレート中に移植したDMEM培地（FCS 10％と、グルタミン１％と、ゲンタマイシン0.2％とを含有する）中に、LoVo細胞（ECACC No.87060101）を細胞2,500個／ウェルの濃度で希釈し、５％CO2中で37℃で１夜培養した。種々の濃度の、プロドラッグ、対照としての対応する薬物、又はプロドラッグと酵素（1U CPG2活性／ウェル−１単位の酵素は37℃でメトトレキセート１μモル／分/mlを加水分解するのに必要とされる量である）を前記細胞に加え、培養時間１時間又は24時間のいずれかの後に、細胞を洗浄し、新鮮な培地を加え、次いで該細胞を５％CO2中で37℃で培養した。化合物の添加後３日目に、前記ウェルにTCAを加え（最終濃度16％）、次いでSRB色素（Skehanらの論文）を添加することにより、プレートに付着する細胞タンパク質の量を検定した。540nmで光学密度を測定し、化合物を入れていない対照ウェル中のOD540のパーセントとして測定した。効果は細胞の生育を50％阻止するのに必要とされる濃度（IC50）として表わした。プロドラッグ単独は一般的に試験においてCPG2の存在下のプロドラッグに比べて低い活性を有するであろう（すなわち、CPG2酵素はプロドラッグを薬物に活性化するのに必要である）。化学的に合成した薬物（CPG2活性化を必要としない）の直接添加は検定において対照として働く。
前記の方法を使用して、本発明の代表的な供試化合物を評価し、且つ１時間後のCPG2の不存在下の活性と比べてCPG2の存在下における活性が少なくとも10倍大きい活性比を示すことが認められ、それによって本発明の化合物の実用性を効果的であると証明し且つ確認した。本発明の別の要旨によれば、プロドラッグ成分として前記の式（Ｉ）で示される化合物の少なくとも１種又は該化合物の生理学的に許容し得る塩を、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と一緒に含有してなる医薬組成物が提供される。該組成物は、すでに腫瘍に配置されている（locallized）CPG（好ましくはCPG2）−腫瘍選択性抗体の複合体と共に使用すべき有効量のプロドラッグを含有してなるのが都合がよい。
本発明の別の要旨によれば、プロドラッグ成分として前記の式（Ｉ）で示される化合物の少なくとも１種又はその生理学的に許容し得る塩〔但し、２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロプロピル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−メチルエステル;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸;2−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−ペンタン二酸５−エチルエステル；及び２−（２−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−アセチルアミノ）−４−カルバモイル−酪酸を除く〕を、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と一緒に含有してなる注射用の無菌医薬組成物が提供される。該組成物は有効量のプロドラッグを含有してなるのが都合がよい。
本発明の別の要旨によれば、各々の成分を他方の成分と一緒に使用する２成分系医薬であって、
ｉ）所定の抗原を結合し得る抗体又はその断片であって、しかも前記の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容し得る塩を細胞毒性薬物に転化し得るCPG（好ましくはカルボキシペプチダーゼG2）酵素に複合されてある該抗体又はその断片である第１の成分と、
ii）前記CPG（好ましくはカルボキシペプチダーゼG2）酵素の影響下で細胞毒性薬物に転化し得る前記の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容し得る塩である第２の成分
とからなる２成分系医薬が提供される。
前記の抗体又はその断片は腫瘍に関連した抗原と結合し得るものであるのが好ましい。
腫瘍に関連した抗原と結合し得る具体的な抗体は、マウスのモノクローナル抗体A5B7である。抗体A5B7はヒト癌胎児性抗原（CEA）に結合し、しかも結腸癌腫を標的とするのに特に適している。A5B7は16 Manor Courtyard,Hughenden Avenue,High Wycombe,Bucks HP 13 5RE,England,United Kingdom所在のDAKO Ltd.社から入手し得る。抗体断片は完全（whole）なIgG抗体から慣用の方法、例えばMariani M.らの論文、Molecular Immunology,28,69−77（1991）に記載のＦ（ab′）２断片により調製し得る。一般的に、抗体（又は抗体断片）−酵素の複合体は少なくとも２価であるべきである、すなち少なくとも２個の腫瘍関連抗原（これらは同一であってもよいし、異なっていてもよい）に結合し得るものであるべきである。抗体分子は公知の方法により、例えば欧州特許第239400号明細書に記載の“CDR移植（grafting）”によって又は米国特許第4816567号明細書に記載の人間の定常部上の完全な可変部を移植することによって人間化（humanize）し得る。人間化された抗体は抗体（又は抗体断片）の免疫原性を下げるのに有効であり得る。抗体A5B7の人間化された変形（version）は国際特許出願国際公開第WO92/01059号明細書に記載されている。
モノクローナル抗体A5B7を産生するハイブリドーマはPorton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,United Kingdom所在のEuropean Collection of Animal Cell Cultures,Division of Biologics,PHLS Center for Applied Microbiology and Researchに寄託してある。寄託日は1993年７月14日であり、寄託番号はNo.93071411である。抗体A5B7は、寄託したハイブリドーマから当該技術において知られている標準的な技法例えばFenge C,Fraune E ＆ Schuegerl Kの著作“Production of Biologicals from Animal Cells in Culture"（Spire RE,Griffiths JR ＆ Meignier B編）、Butterworth−Heinemann発行、1991年、第262−265頁及びAnderson BL ＆ Gruenberg MLの著作、“Commercial Production of Monoclonal Antibodies"（Seaver S編）、Marcel Dekker発行、1987年、第175−195頁に記載された方法を使用して取得し得る。細胞は抗体産生の良好な水準を維持するために、限定された期間で時々再クローニングする必要があり得る。
ADEPTに有用な別の抗体は下記の文献に記載されている。抗体BW431/26がHaisma H.J.らの論文、Cancer Immunol.Immunother.,34,343−348（1992）に載されている。抗体L6、96.5及び1F5が欧州特許第302,473号明細書に記載されている。抗体16.88が国際特許出願第WO90/07929号明細書に記載されている。抗体B72.3が欧州特許第392,745号明細書に記載されている。抗体CEM231が欧州特許第382,411号明細書に記載されている。抗体HMFG−１と抗体HMFG−11〔Unipath Ltd.社（英国ハンプシャー州Basingstoke所在）製〕は乳脂球状膜上でムチン様糖タンパク質と反応し、しかも乳癌及び卵巣癌を標的とするのに使用し得る。抗体SM3〔Chemicon International Ltd.社（英国ロンドン所在）製〕はムチンのコアタンパク質と反応し、しかも乳癌及び卵巣癌を標的とするのに使用し得る。抗体85A12〔Unipath Ltd.社（英国ハンプシャー州Basingstoke所在）製〕及び抗体ZCEA1〔Pierce Chemical Company社（英国Chesters所在）製〕は腫瘍抗原CEAと反応する。抗体PR4D1〔Serotec社（英国オックスフォード所在）製〕は結腸腫瘍関連抗原と反応する。抗体E29〔DAKO Ltd.社（英国High Wycombe所在）〕は上皮膜抗原と反応する。抗体C242はCANAG Diagnostics社（スウェーデン国Gothenberg所在）から入手し得る。
一般的に、ADEPTにおいて有用な抗体は、それらが認識する腫瘍細胞によってほとんど取り込まれない。このことは標的指向化された（targeted）プロドラッグ活性化性の酵素が細胞表面に存在することを可能にし、従って循環するプロドラッグから腫瘍部位において活性薬物を生成させる。抗体のインターナリゼーション（internalization）は公知の方法、例えばJafrezouらの論文、Cancer Research,52,1352（1992）及びPressらの論文、Cancer Research,48,2249（1988）に記載の方法によって検定し得る。
シュードモナス（Pseudomonas）RS−16からのCPG2の大規模精製はSherwoodらの論文、Eur.J.Biochem.,148,447−453（1985）に記載されている。CPG酵素に連結されるＦ（ab′）２抗体及びIgG抗体の調製は公知の方法によって行い得、しかも例えば国際特許国際公開第WO89/10140号明細書に記載されている。CPGはPorton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,United Kingdom所在のCenter for Applied Microbiology and Researchから取得し得る。またCPGは組換え技術によっても取得し得る。CPG2に関するヌクレオチコード化配列は、Minton N.P.らの論文、Gene,31,31−38（1984）により公表されている。該コード化配列の発現は大腸菌（E.coli）において報告されており〔Chambers S.P.らの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.,29,572−578（1988）〕、またサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において報告されている〔Clarke L.E.らの論文、J.Gen Microbiol.,131,897−904（1985）〕。遺伝子全合成はM.Edwardsの論文、Am.Biotech.Lab.,５,38−44（1987）に記載されている。大腸菌（E.coli）中での異種（heterologous）タンパク質の発現は、F.A.O.MarstonによってDNA Cloning Vo.III,Practical Approach Series,IRL Press発行（D M Glover編）、1987年、第59〜88頁に概説されている。酵母中でのタンパク質の発現は、C.GuthrieとG R Finkによって編集されたMethods in Enzymology Volume 194,Academic Press発行、1991年に概説されている。
CPG酵素はSigma Chemical Company社（Fancy Road,Poole,Dorset,U.K.所在）から入手し得る。CPG酵素は、Goldman PとLevy C.C.の論文、PNAS USA,58,1299−1306（1967）及びLevy C.C.とGoldman Pの論文、J.Biol.Chem.,242,2933−2938（1967）に記載されている。カルボキシペプチダーゼG3酵素はYasuda Nらの論文、Biosci.Biotech.Biochem.,56,1536−1540（1992）に記載されている。カルボキシペプチダーゼG2酵素は、欧州特許第121,352号明細書に記載されている。
本発明の医薬は、第１の成分〔該第１の成分は、所定の抗原を結合し得る抗体又はその断片であってしかも前記の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容し得る塩を細胞毒性薬物に転化し得るCPG酵素に複合されてある抗体又はその断片からなるものである〕を宿主に投与し、次いで第２の成分〔該第２の成分は、CPG酵素の影響下で細胞毒性化合物に転化し得る前記の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容し得る塩からなるものである〕を宿主に投与することにより、ある所定の部位に細胞毒性薬物を送達する。
細胞毒性薬物を送達する（deliver）べき部位は、腫瘍細胞であって一般的に腫瘍を有する哺乳類宿主例えば人に存在する腫瘍細胞であるのが好ましい。
前記第１の成分が腫瘍を有する宿主に投与されると、前記複合体の抗体又は抗体断片部分は該複合体を腫瘍の部位に指向させ（direct）、該複合体を腫瘍細胞に結合させる。
結合されない複合体が治療されるべき宿主から、例えば適当な時間の経過後に宿主からの排泄によるか又は例えばBr.J.Cancer,61,659−662（1990）に記載のようにして加速排泄（accelerated clearance）後に実質的に除去されると、前記第２の成分が宿主に投与され得る。第２の成分を投与する前に、結合されていない複合体を宿主から実質的に除去することが極めて望ましい。その理由は、さもなければ細胞毒性薬物が腫瘍の部位以外の部位で生成され得、従って部位特異的毒性よりもむしろ宿主に対して一般毒性をもたらすからである。
本発明の化合物は、組成物例えば経口投与用の錠剤、カプセル又はエリキシル、直腸投与用の座薬、非経口投与又は筋肉内投与用の無菌溶液又は懸濁液などで使用し得る。
本発明の化合物は、かかる治療を必要とする患者（動物又は人間）に対して最適な薬効を提供するような投与量で投与できる。投与量は、病気の性質や苛酷度（severity）、患者の体重、患者に伴う特殊な食事療法（diets）、同時に行われる薬物治療（medicataion）、当業者によって認められる他の因子に応じて患者、患者に合わせて変化させ得るが、投与量範囲は一般的に１日当たり患者の体重kg当たりにつき約1mg〜150mgであり、一回投与又は頻回投与で投与できる。投与量範囲は１日当たり患者の体重kg当たりにつき約10mg〜75mgであるのが好ましく、１日当たり患者の体重kg当たりにつき約10mg〜40mgであるのがさらに好ましい。
もちろん、これらの投与量範囲は分割された１日当たり投与量を可能にすることが必要な単位基準で調整でき、しかも前記のように病気の性質や重大度、患者の体重、特漉な食事療法（diets）及び他の因子に応じて変化させ得る。
典型的には、これらの投与量は以下に記載の医薬組成物に製剤化できる。
前記の式（Ｉ）の化合物又はその混合物あるいはその生理学的に許容し得る塩の約50〜500mgを、生理学的に許容し得るビヒクル、担体、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、風味剤などと共に、許容された製薬学的実施にふさわしいような単位投与体に調合される。これらの組成物又は製剤中の活性物質の量は、前記に示された範囲内の適当な投与量が得られるような量である。
錠剤、カプセルなどに配合できる補助剤の例は以下のもの：すなわち、結合剤例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、又はゼラチン；賦形剤例えば微晶質セルロース；崩壊剤例えばコーンスターチ、予備ゼラチン化スターチ、アルギン酸など；潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤例えばショ糖、ラクトース又はサッカリン；風味剤例えばペパーミント、冬緑油又はチェリー油（oil of cherry）である。投与単位形がカプセルである場合には、前記の種類の物質のほかに液状担体例えば脂肪油を含有し得る。別の種々の物質を被覆剤として存在させ得るし、又は投与単位の物理的形態を別の状態に変えるために存在させ得る。例えば、錠剤はシェラック（shellac）、砂糖あるいは両方で被覆し得る。シロップ又はエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのショ糖、防腐剤としてのｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル及びプロピルエステル、色素あるいは風味剤例えばチェリーフレーバー又はオレンジフレーバーを含有し得る。
前記のように、式（Ｉ）の化合物及びその生理学的に許容し得る塩、並びに前記に挙げた複合体は慣用の投与方法、例えば以下の方法に限定されないが静脈内投与法、腹腔内投与法、経口投与法、リンパ管内投与法又は腫瘍中への直接投与法を使用して投与し得る。静脈内投与例えば静脈内注入が好ましい。
注射又は注入用の無菌組成物は、慣用の製薬方法に従って、ビヒクル例えば注射用の水、天然産の植物油例えば胡麻油、ヤシ油、落花生油、綿実油など、あるいは合成樹脂性ビヒクル例えばオレイン酸エチルなどに活性化合物を溶解するか又は懸濁させることによって製剤化し得る。緩衝液、防腐剤、酸化防止剤などを必要に応じて配合できる。慣用の製薬方法に従って製剤化した好ましい注射又は注入用無菌組成物は、ビヒクル例えば場合によっては塩、砂糖（特にデキストラン）、緩衝剤及び／又は共溶剤〔特にポリエチエレングリコール、プロピレングリコール又はジメチルイソソルビド（isosorbide）〕を含有していてもよい水にプロドラッグを溶解することを包含する。
本発明の一つの態様によれば、前記の式（Ｉ）で示される化合物は遊離酸の形態で提供され、該遊離酸はその場合に患者に投与する直前に非経口投与用の形態に製剤化され得る。従って、例えば、遊離酸の形態の前記の式（Ｉ）の化合物は緩衝剤と混合され得、それによって投与する直前に生理学的に許容し得る塩に転化される。
本発明の化合物の好ましい単位投与形態は、アンプル中の注射／注入可能な溶液中に再構成用の無菌凍結乾燥体の式（Ｉ）の化合物又はその生理学的に許容し得る塩を含有してなる。アンプルは前記化合物を500mg〜2g（特に、1g）を含有する。
以下の実施例は前記の式（Ｉ）で示される化合物の製造及び該化合物の医薬組成物中への配合を例証するものであるが、それ自体は本発明を限定するものではない。実施例においては、特に明記しない限りは標準操作は下記の通りであった。
ｉ）  蒸発操作は全てロタリーエバポレターにより減圧下で（in vaccuo）行い、仕上げ（work up）操作は残留固形物を濾過することによって除去した後に行った。
ii）各操作は室温、すなわち18〜25℃の範囲内で、且つ不活性ガス例えばアルゴンの雰囲気下で行った。
iii）カラムクロマトグラフィー（フラッシュ操作による）はE.Merk社（西ドイツ国Darmstadt所在）から入手したMerk Kieselgel silica（Art.9385）を用いて行った。
iv）収量、収率は単に例示のために示したものであり、必ずしも得られる最大収量、収率を示したものではない。
ｖ）  前記の式（Ｉ）で示される最終生成物は十分に微量分析して、その構造はNMRスペクトル法及び質量スペクトル法によって確認した。
vi）中間体は一般的に十分に特定しなかったが、その純度は薄層クロマトグラフィー分析、赤外線（IR）分析又はNMR分析により測定した。
vii）融点は補正しておらず且つ油浴装置を使用して測定した。前記の式（Ｉ）で示される最終生成物の融点は、慣用の有機溶媒例えばエタノール、メタノール、アセトン、エーテル又はヘキサン単独又はこれらの混合物から再結晶した後に測定した。
実施例１
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル〔反応工程図１の化合物（２）参照〕（6g）を酢酸エチル（100ml）に溶解した溶液を、30％パラジウム担持炭素（0.6g）上で２時間水素添加した。理論量の水素が吸収されてしまった際に、触媒を濾過し、濾液を蒸発乾固した。得られた残留物を熱エーテル（25ml）に溶解し、濁るまでヘキサンを加えた。これを冷却して、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸〔反応工程図１の化合物（３）参照〕を白色結晶質固体（3.4g）として得た。収率79％、融点87〜89℃。NMR:7.0（ｄ）2H;6.6（ｄ）2H;6.2（ｄ）1H;4.4（ｍ）1H;3.5−3.7（ｍ）8H;2.0−2.6（ｍ）4H元素分析値−予測値  Ｃ＝47.2,H＝4.95,H＝6.88
実測値  Ｃ＝47.5,H＝5.1,N＝6.7
また、標記化合物はエーテルに溶解しない異なる多形体であって融点128〜130℃をもつ多形体としても製造した。
出発原料であるＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルは以下に記載のようにして製造した。
クロルギ酸４−ニトロフェニルエステル（1.43g）をクロロホルム（15ml）に溶解した溶液を、４−［N,N−ビス（２−クロロエチニル）アミノ］フェノール塩酸塩〔Biochem.Pharmacol.,17,893（1968）〕（1.93g）、トリエチルアミン（2ml）及びクロロホルム（20ml）の混合物に加えた。周囲温度で２時間経過した後に、得られた混合物を蒸発乾固し、残留物をMerk社製のシリカゲルArt.9385を用いてクロマトグラフィーにより分離した。ヘキサン／酢酸エチルで溶出し、次いでベンゼン：石油エーテル（3:1）から再結晶すると、生成物としてＯ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネート〔反応工程図１の化合物（１）参照〕を融点66〜67℃の黄色固体（1.4g）（収率50％）として得た。
このようにして得られた生成物5.5gをクロロホルム（40ml）に溶解した溶液に、トリエチルアミン（3.8ml）を加え、次いでＬ−グルタミン酸ジベンジルエステルトシレート（13.75g）を加えた。混合物を撹拌し、60℃で４時間加熱し次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲル（Merk Art 9385）を用い、３％酢酸エチル／クロロホルムで溶出してクロマトグラフィー分離して、必要とする出発原料Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル〔反応工程図１の化合物（２）参照〕6.2g（収率77％）を融点85〜87℃の白色固体として得た。
実施例２
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルの代わりにＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルを使用して実施例１に記載の方法を反復して、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸を融点160〜162℃の白色固体として得た。
NMR:7.3（ｄ）2H;6.7（ｄ）2H;6.0（ｄ）1H;4.2（ｍ）1H;3.7（ｍ）8H;2.3−2.0（ｍ）4H
元素分析値−予測値  Ｃ＝47.3;H＝5.2;H＝10.3;Cl＝17.5
実測値  Ｃ＝46.8;H＝5.2;N＝10.3;Cl＝18.1
出発原料として使用したＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルは、４−［N,N−［ビス（２−クロロエチエル）アミノ］フェノールの代わりに４−［N,N−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチル−フェノールを使用して実施例例１に記載の方法と同様の方法で製造した。
上記の４−［N,N−［ビス（２−クロロエチエル）アミノ］−３−メチルフェノールは次のようにして得た（反応工程図２参照）。
（ａ）  ４−アミノ−ｍ−クレゾール（12.3g）を酢酸／水（1:1）（500ml）に溶解した溶液に、エチレンオキシド（40g）を吹き込んだ。混合物を室温で48時間保持し、次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いて酢酸エチルで溶出してクロマトグラフィー分離して、４−［N,N−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−３−メチル−フェノールを油状物（6.2g）として得た。
NMR:第２表参照。
（ｂ）  このようにして得られた生成物（6g）、水酸化カリウム（1.6g）及びエタノール（40ml）の混合物に臭化ベンジル（4.24g）を加えた。得られた混合物を撹拌し、還流温度で２時間加熱し、冷却し次いで蒸発させることにより濃縮した。得られた残留物を水（100ml）に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出し、乾燥し次いで蒸発させて2,2'−（４−ベンジルオキシ−２−トルイジノ）ジエタノールを融点70〜72℃の固体（7.2g）として得た。
NMR:第３表参照。
（ｃ）  このようにして得られた生成物（7g）にクロロホルム（50ml）中で10〜20℃で五塩化リン（11.4g）を少しずつ加えた。次いで、混合物を還流温度で90分間加熱し、冷却し次いで水に注加した。有機層を分離し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、水洗し次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いてクロマトグラフィー分離した。ヘキサン／酢酸エチル（2:1）で溶出した後に、４−ベンジルオキシ−３−メチル−N,N−ビス（２−クロロエチル）アニリン（2.2g）を油状物として得た。
NMR:第４表参照。
上記の反応の代わりに使用される別の反応は次の通りである。前記の工程（ｂ）で得た生成物（2.6g）をピリジン（8ml）に溶解した溶液に０〜５℃でメタンスルホニルクロリド（2.5ml）を加えた。次いで、混合物を70℃で15分間加熱し、冷却し次いで希クエン酸溶液（100ml）に注加した。得られた混合物を酢酸エチルで２回抽出し、乾燥し次いで蒸発させて４−ベンジルオキシ−３−メチル−N,N−ビス（２−クロロエチル）アニリン2.6g（収率84％）を油状物として得た。
NMR:第４表参照。
（ｄ）  このようにして得られた生成物（2g）にエタノール（25ml）中でエーテル性HCl（飽和）を完全な溶液が認められるまで加えた。30％パラジウム担持炭素触媒300mgを加え、水素雰囲気下で水素の適量が吸収されるまで混合物を撹拌した。触媒を濾過することにより除去し、次いで濾液を蒸発させて４−［N,N−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェノール塩酸塩を融点164〜167℃の固体（950mg）として得た。
実施例３
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸塩酸塩
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（4.4g）を酢酸エチル（20ml）に溶解した溶液に、エーテル（120ml）に溶解した塩化水素の飽和溶液を加えた。周囲温度で１時間後に、得られた混合物を蒸発させて固体を得た。この固体をエーテルと共に磨砕して（triturate）Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸塩酸塩（3.5g）を融点148〜150℃の灰色固体として得た〔反応工程図３参照〕。
NMR:7.2（ｄ）2H;6.7（ｄ）2H;4.2（ｍ）1H;3.7（ｍ）8H;2.4−1.8（ｍ）4H
元素分析値：
実測値  Ｃ＝46.7;H＝6.8;N＝7.0
予測値  Ｃ＝47.1;H＝6.55;N＝7.5
出発原料であるＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルは次のようにして得た。
ｐ−フルオロニトロベンゼン（14.1g）とジエタノールアミン（30ml）の混合物を撹拌し、130℃で２時間加熱した。上記混合物を約60℃まで冷却し、48％水酸化ナトリウム溶液10mlを含有する水１リットルに注加した。15℃まで冷却した後に、沈殿を濾取し、次いで乾燥して2,2'−（４−ニトロアニリノ）ジエタノール（20.7g）（収率92％）を得た。融点102〜104℃。
このようにして得た生成物（20g）と、ジクロロメタン（200ml）と、ピリジン（7ml）との混合物に、冷却しながら塩化チオニル（39ml）を加えた。塩化チオニルの添加後に、混合物を還流温度で１時間加熱した。冷却後に、混合物をそれと等容量のジクロロメタンで希釈して、注意しながら２回水洗し、乾燥し次いで蒸発させてN,N−ビス（２−クロロエチル）−４−ニトロアニリンを融点81〜83℃の固体21gとして得た。
再蒸留したテトラヒドロフラン（20ml）にこのようにして得た生成物（0.53g）を溶解した溶液に、30％パラジウム担持炭素触媒（100mg）を加えた。混合物を水素の雰囲気下で２時間撹拌し、次いで触媒を濾過することにより除去した。濾液を蒸発乾固し、得られた残留物をエーテル（20ml）に再溶解し、次いで塩化水素をエーテルに溶解した溶液を若干過剰になるまで加えた。生成した４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］アニリニウムクロリドを固体として得、乾燥した。収量0.5g、融点238〜240℃（分解）。
トリホスゲン（Aldrich社製）200mgをクロロホルム（10ml）に溶解した溶液に０〜５℃で、上記のようにして得た生成物（539mg）、次いでトリエチルアミン（0.83ml）を加えた。室温で15分経過した後に、Ｌ−グルタミン酸ジtert−ブチルエステル（0.31g）をクロロホルム（5ml）に溶解した溶液を加えた。得られた混合物を周囲温度で18時間放置し、水洗し、乾燥し次いで蒸発乾固した。得られた残留物をMerk社製のシリカゲルを用いて、ヘキサン−酢酸エチル（3:1）で溶出してクロマトグラフィー分離し、所望の出発原料Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジtert−ブチルエステル0.44gを油状物として得た〔反応工程図３参照〕。
NMR:δ7.2d及びδ6.65（dd）4H芳香族性
δ4.1（ｍ）1H
δ3.66（ｓ）8H
δ1.7−2.2（ｍ）4H
δ1.38（ｓ）9H及びδ1.42（ｓ）9H。
実施例４
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸の製造に関して実施例３に記載の方法と別の方法を以下に記載する。
出発原料であるＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルを実施例３の対応する工程と同様の方法で製造した。
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（1.138g）をDMF（15ml）に溶解した溶液を、10％Pd/C上で16時間水素添加した。濾過し、減圧下で蒸発させた後に、得られた残留物をクロロホルム（20ml）に溶解した。18時間後に、結晶質沈殿を濾取し、減圧下で乾燥してＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸を得た。収量730mg（収率93％）。アセトン／クロロホルムから再結晶した後に、微細棒状物を形成した。融点116〜118℃。
NMR（CD3COCD3）：δ8.0（ｓ）1H;7.2（ｄ）2H;6.6（ｄ）2H NH;4.4（ｍ）1H;3.6（ｍ）8H;2.5−1.9（ｍ）4H。
実施例５
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（0.4g）を酢酸エチル（10ml）に溶解した溶液に30％パラジウム担持炭素（50％湿潤物）（160mg）を加え、混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過した後に、濾液を蒸発乾固した。得られた油状残留物を酢酸エチル／ヘキサンと共に磨砕した後に、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸を白色粉末として得た（210mg、融点111〜114℃）。
出発原料であるＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルは次のようにして得た。
無水酢酸エチル（200ml）及び炭酸カリウム（5.5g）にＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロアニリニウムオキサレート（oxalate）（3.5g）を懸濁させた懸濁液をアルゴン雰囲気下で５℃に冷却した。この混合物に、ホスゲンのトルエン溶液（1.9M;5.5ml）を加えた。添加後に、混合物を室温で10分間撹拌し、濾過し次いで濾液を硫酸マグネシウム上で乾燥した。得られた乾燥濾液を、グルタミン酸ジベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩（5g）と、炭酸カリウム（2g）と、酢酸エチル（100ml）との混合物に一度に加えた。トリエチルアミン（2ml）を加え、混合物を周囲温度で20分間撹拌した。得られた混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いて、酢酸エチル／ヘキサン（1:2）で溶出してクロマトグラフィー分離し、所望の前記出発原料を油状物として得た。これは結晶化した。収量5.5g、融点81〜84℃。
出発原料としてｐ−フルオロニトロベンゼンの代わりに3,4−ジフルオロニトロベンゼンを使用して４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−３−フルオロニトロベンゼン融点99〜101℃を得た以外は、実施例３に記載のようにして４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロアニリニウムオキサレートを製造した。
このようにして得た生成物を実施例３に記載のようにして塩化チオニルで処理して、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロニトロベンゼンを得た。融点66〜68℃。
このようにして得た生成物を、溶媒として酢酸エチルを使用して実施例３に記載のようにして水素添加した。得られた混合物を濾過し、濾液を蒸発させて小容量とし、次いでエーテルに再溶解した。エーテルに溶解したシュウ酸の飽和溶液を過剰になるまで加え、所望の生成物４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−フルオロアニリニウムオキサレートを採取した。融点146〜148℃。
実施例６
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
30％パラジウム担持炭素70mg（50％湿潤物）を含有する酢酸エチル（30ml）にＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（350mg）を溶解した溶液を、水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を濾過した後に、濾液を蒸発乾固し、得られた残留物を酢酸エチル／ヘキサンと共に磨砕して、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸を油状物として得た。
NMR:8.7（ｓ）1H;7.6（ｓ）1H;7.1−7.4（ｍ）2H;6.5（ｄ）1H;4.2（ｍ）1H;3.3−3.6（ｍ）8H;1.7−2.4（ｍ）4H。
出発原料であるＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルは、出発原料として４−フルオロニトロベンゼンの代わりに４−フルオロ−３−クロロニトロベンゼンを使用して４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−３−クロロニトロベンゼンを橙色油状物として得た以外は実施例３と同様の方法によって得た。NMR:8.0−8.2（ｍ）2H;7.3（１）1H;4.7（ｔ）2H;3.5（ｍ）8H。
このようにして得た上記生成物を、実施例３に記載のようにして塩化チオニルで処理して、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロニトロベンゼンを油状物として得た。NMR（CHCl3）:8.3（ｄ）1H;8.1（ｑ）1H;7.25（ｄ）1H;3.8（ｔ）4H;3.6t）4H。
このようにして得た生成物を、溶媒として酢酸エチルを使用して実施例３に記載のようにして水素添加した。触媒を濾過することにより除去し、濾液を蒸発させて小容量にし、エーテルに再溶解し次いで飽和エーテル性シュウ酸を過剰になるまで加えた。濾過することによってシュウ酸塩を得た。融点118〜121℃。
このようにして得た上記生成物を実施例５に記載のようにして、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−クロロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸に転化させた。油状物が得られた。NMR:7.1−7.4（ｍ）13H;5.1（ｓ）2H;5.0（ｓ）2H;4.6（ｍ）1H;3.5（ｓ）8H;2.0−2.6（ｍ）4H
実施例７
本発明の化合物を含有する典型的な医薬組成物
A:カプセル当たりプロドラッグ100mgを含有する乾燥充填カプセル
0003541037.tif 000016
化合物をNo.60粉末に粉砕し、次いで該粉末上にラクトースとステアリン酸マグネシウムとをNo.60ブロッティングクロス（blotingcloth）の中を通した。次いで、一緒にした成分を約10分間混合物し、No.1乾燥ゼラチンカプセルに充填した。
B:錠剤
典型的な錠剤は化合物（100mg）、予備ゼラチン化デンプンUSP（82mg）、微晶質セルロース（82mg）及びステアリン酸マグネシウム（1mg）を含有する。
C:座薬
直腸投与用の典型的な座薬製剤は化合物（50mg）と、ジナトリウムカルシウムエデテート（edetate）（0.25〜0.5mg）と、ポリエチレングリコール（775〜1600mg）とを含有する。別の座薬製剤は、例えばジナトリウムカルシウムエデテートをブチル化ヒドロキシトルエン（0.04〜0.08mg）に置き換え且つポリエチレングリコールを水素添加した植物油（675〜1400mg）例えばSuppocire L、Wecobee FS、Wecobee M、Witepsolsなどに置き換えることによって調製した。
D:注射剤
典型的な注射剤は化合物（500mg）と、ベンジルアルコール（0.05ml）と、注射剤用の0.15M炭酸水素ナトリウム水溶液（5.0ml）とを含有する。
実施例８（反応工程図４参照）
Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（２−メシルオキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（２−メシルオキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図４の化合物６、式中のR1＝Cl及びR2＝OSO2Me）（110mg）をトリフルオロ酢酸（TFA）（2.2ml）に懸濁させ、周囲温度で40分間撹拌した。TFAを減圧下で除去し、残った油状物を酢酸エチル（1ml）で希釈し、次いで蒸発させてＮ−｛４−［Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（２−メシルオキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸−1.02TFA−0.16EtOAc（反応工程図４の化合物９、式中のR1＝Cl及びR2＝OSO2Me）90mg（収率95％）を得た。
NMR:−CH2−CH2−OSO2Me/−CH2−CH2−Cl
2.15（ｓ）3H;3.70（ｍ）6H;
その他4.30（ｔ）1H;4.49（ｔ）1H;
芳香族6.75（ｄ）2H;6.92（ｄ）2H;
1.8−2.3（ｍ）4H;4.02（ｍ）1H;7.90（ｄ）1H
出発原料であるＮ−｛４−［Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（２−メシルオキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステルは以下に記載のようにして製造した。
乾燥クロロホルム（30ml）にＬ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル塩酸塩（4.26g）とトリエチルアミン（4ml）とを溶解した溶液を、ギ酸４−ニトロフェニルエステル（2.92g、Aldrich社から入手し得る）の冷却溶液と共に５分間撹拌した。周囲温度で５時間後に、溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（70ml）に溶解し、濾過し次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いて、クロロホルムで溶出してクロマトグラフィー分離して、４−ニトロフェニルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図４の化合物２）を油状物として得た。収量5.02g（収率82％）。
NMR:7.33（ｄ）2H;8.24（ｄ）2H;1.46（ｓ）9H;1.50（ｓ）9H;2.0−2.4（ｍ）4H;4.32（ｍ）1H;5.90（ｄ）1H。
このようにして得られた生成物（反応工程図４の化合物２）（5.01g）を酢酸エチル（30ml）に溶解した溶液を、10％パラジウム担持炭素上で３日間水素添加した。触媒を濾過した後に、得られた溶液を冷却し、エチレンオキシド（5ml）を加え、次いで周囲温度で22時間放置した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を分離し、水洗し、乾燥し（硫酸マグネシウムで）次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いて、酢酸エチル／クロロホルム（2:1）で溶出してクロマトグラフィー分離して４−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］フェニルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図４の化合物４）3.93g（収率69％）を得た。融点91〜93℃。
このようにして得た生成物（反応工程図４の化合物）（0.86g）をピリジン（3ml）に溶解した溶液を、メタンスルホニルクロリド（0.6ml）と共に２℃で20分間、次いで50℃で10分間撹拌した。得られた反応混合物を酢酸エチルと水の間で分配した。有機層を分離し、水洗し、乾燥し（硫酸マグネシウムで）次いで蒸発乾固した。得られた残留物をシリカゲルを用いて、酢酸エチル／ジクロロメタン（1:9）で溶出してクロマトグラフィー分離して４−［（２−クロロエチル）（２−メシルオキシエチル）］アミノフェニルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図の化合物６）0.44g（収率43％）を油状物として得た。
NMR:3.15（ｓ）3H;3.70（ｍ）6H;4.29（ｔ）2H;6.75（ｄ）2H;6.92（ｄ）2H;1.41（ｓ）9H;1.42（ｓ）9H;1.8−2.3（ｍ）2H;3.97（ｍ）1H;7.92（ｄ）1H
実施例９〜15
実施例２に従って以下の第２表〜第８表に記載の出発原料及び中間体を使用して第１表に記載の下記の化合物を製造した。
0003541037.tif 000017
すなわち、実施例２に記載の方法と同様の方法で実施例９〜15の化合物を製造した。すなわち、実施例10の化合物は、工程（ａ）で使用した４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノ−３−イソプロピルフェノール〔Gliman Hらの論文、J.Org.Chem.,19,1067−1078（1954）〕に置き換えることにより製造した。実施例11の化合物は４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノ−２−メチルフェノール（Aldrich社から入手し得る）に置き換えることにより製造し、実施例12の化合物は４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノ−３−フルオロフェノール〔Journal of the Chemical Society（1964）,p473に従って製造した〕に置き換えることにより製造した。実施例13の化合物は４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノナフタ−１−オール（Aldrich Chemical Co.,Ltd.社から入手し得る）に置き換えることにより製造し、且つ実施例14の化合物は４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノ−２−クロロフェノール〔Journal of the American Chemical Society,45,2192（1923）に従って製造した〕に置き換えることにより製造した。実施例15の化合物は４−アミノ−ｍ−クレゾールを４−アミノ−３−クロロフェノール〔Berichte:p.2065（1938）；及びOrganic Synthesis;Collected Vol.4,p.148に従って製造した〕に置き換えることにより製造した。
実施例９〜15で用いた出発原料及び中間体並びにそれらの性質を以下の第２表〜第８表に記載する。
0003541037.tif 000018
0003541037.tif 000019
0003541037.tif 000020
0003541037.tif 000021
0003541037.tif 000022
0003541037.tif 000023
0003541037.tif 000024
実施例16
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリド
α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリド（2.0g）を酢酸エチル（50ml）に懸濁した懸濁液を、10％パラジウム担持炭素（0.15g）上で４時間水素添加した。触媒を濾過することにより除去し、濾液を35℃で減圧下で蒸発乾固した。生成物すなわち４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリド（反応工程図６の化合物１）1.4g（収率83％）を白色結晶質固体として得た。融点110℃。
元素分析値−予測値％  Ｃ＝54.8,H＝5.22,N＝8.71
実測値％  Ｃ＝54.5,H＝5.62,N＝8.31
出発原料である前記のα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドは下記のようにして製造した。
ジクロロメタン（30ml）中のα−ベンジル−ｐ−トシル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリド（2.8g）とＯ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネート（2.0g）の混合物に、トリエチルアミン（2ml）を加えた。混合物を室温で16時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をシリカゲル（Merk Art 9385）を用いて10％酢酸エチル／クロロホルムで溶出してクロマトグラフィー分離して、α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドを白色固体として得た。収量1.9g（収率64％）。
出発原料である上記Ｏ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートは下記のようにして製造した。
ジクロロメタン（100ml）中でギ酸４−ニトロフェニルエステル（7.25g）と４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノール塩酸塩（10g）との混合物に、トリエチルアミン（10ml）をジクロロメタン（10ml）に溶解した溶液を２時間にわたって加えた。室温で16時間撹拌した後に、溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をシリカゲル（Merk Art 9385）を用いてクロマトグラフィー分離した。ジクロロメタンで溶出し、得られた溶出液を蒸発させて生成物を赤色油状物として得た。ヘキサンで磨砕して黄色固体を得、これをベンゼン／ヘキサンから再結晶してＯ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートを橙色結晶として得た。収量10.4g（収率71％）、融点68℃。
出発原料である上記のｐ−トシル−α−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドは下記のようにして製造した。
Ｎ−ｔ−BOC−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（10g）とジシクロヘキシルカルボジイミド（6.1g）とをジクロロメタン（120ml）に溶解し、室温で10分間撹拌した。アニリン（2.8ml）を加え、混合物を室温で16時間撹拌した。得られた混合物を濾過し、得られた沈殿をジクロロメタン（２×15ml）で洗浄した。得られた濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×100ml）及び水（100ml）で連続的に洗浄し、次いで蒸発させた。生成した固体を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶して無色板状結晶8.2g（収率67％）を得た。得られたγ−アニリド（12.0g）とｐ−トルエンスルホン酸（5.4g）とをベンゼン（300ml）中で40分間還流し、次いで１夜放置して冷却した。生成した沈殿を濾過し、ポンプ吸引で乾燥し、次いで酢酸エチル／メタノールから再結晶してｐ−トシル−α−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドの無色板状晶を得た。8.2g（収率58％）。
実施例17
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルアミド
α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドに代えてα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルアミド使用して実施例16に記載の方法を反復して、Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルアミド（反応工程図６の化合物２）を得、これを酢酸エチル／ヘキサンから再結晶して無色結晶を得た。融点129℃。
元素分析値−予測値％  Ｃ＝51.9,H＝6.32,N＝9.09
実測値％  Ｃ＝52.1,H＝6.33,N＝8.96
前記α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルアミドは、γ−アニリド誘導体に関する実施例16に記載の方法と同様の方法で得た。
実施例18
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（0.6g）をジクロロメタン（6ml）に溶解した溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（15ml）を加えた。次いで、この溶液を０℃で３日間放置しておいた。次いで、この溶液を蒸発乾固して４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸を油状物として得た。収量0.49g。
NMR:8.46（ｓ）1H;7.15（ｍ）3H;4.18（ｍ）1H;3.55（ｍ）4H;3.35（ｍ）4H;2.3（ｍ）2H;2.23（ｓ）3H;2.0（ｍ）2H。
出発原料である前記４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルは下記のようにして製造した。
３−メチル−４−ニトロアニリン〔Journal of Organic Chemistry,33,3498（1968）〕（7.6g）を酢酸エチル（150ml）に溶解した溶液に、炭酸カリウム（27.5g）を加え、次いでトルエンに溶解したホスゲンの1.9M溶液（27.5ml）を30℃以下の温度に維持しながら滴下した。次いで、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。この混合物にＬ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（13g）を加え次いで周囲温度で１夜撹拌した。次いで、得られた溶液を濾過し、水洗し、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発して油状物を得た。次いで、これをシリカを用いてヘキサン：酢酸エチルが3:1の混合溶液で溶出してクロマトグラフィー分離し、３−メチル−４−ニトロフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルを油状物として得た。収量11.19g（収率51％）。NMR:9.16（ｓ）1H;8.0（ｄ）1H;7.43（ｍ）2H;6.70（ｄ）1H;4.1（ｍ）1H;2.51（ｓ）3H;2.25（ｍ）2H;1.8（ｍ）2H;1.41（ｄ）8H。
３−メチル−４−ニトロフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（4.7g）を酢酸エチル（125ml）に溶解した溶液を30％Pd/C（0.5g）上で水素添加した。次いで、得られた混合物をセライト（Celite）（特にFluka Chemical Ltd社から入手し得る、粒度20〜45μｍの精製し且つ焼成したケイソウ土）を通して濾過し、次いで蒸発させて暗黒色固体を得た。この固体を、シリカ上を酢酸エチル：ヘキサン（1:1）を使用して溶出してクロマトグラフィー分離し、３−メチル−４−アミノフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルを油状物として得た。収量3.71g（収率83％）。
NMR:7.98（ｓ）1H;6.9（ｍ）2H;6.52（ｄ）1H;6.15（ｄ）1H;4.53（ｓ）2H;4.15（ｍ）1H;2.25（ｍ）2H;2.04（ｓ）3H;1.8（ｍ）2H;1.45（ｄ）18H。
３−メチル−４−アミノフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（5g）を氷酢酸（25ml）と水（25ml）とに溶解した溶液にエチレンオキシド（4.8g）を吹き込んだ。次いで、得られた溶液を周囲温度で24時間撹拌した。蒸発乾固した後に、残留物を酢酸エチルに再溶解し、水洗し、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させて４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルを得、これをさらに精製することなしに使用した。NMR:8.35（ｓ）1H;7.1（ｍ）3H;6.35（ｄ）1H;4.15（ｍ）1H;3.35（ｍ）4H;3.05（ｍ）4H;2.25（ｍ）2H;2.20（ｓ）3H;1.8（ｍ）2H;1.45（ｄ）18H。
４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（4g）をピリジン（60ml）に溶解した溶液に、アルゴン雰囲気下で30℃以下に温度を維持しながらメタンスルホニルクロリド（3.8ml）を滴下した。添加後に、上記溶液を80℃で２時間撹拌した。得られた溶液を冷却し、10％クエン酸（500ml）に注加し、酢酸エチルで抽出し、水洗し、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させて褐色油状物を得た。この油状物を、シリカゲル上をヘキサン：酢酸エチル（5:1）を使用して溶出してクロマトグラフィー分離し、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−３−メチルフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルを油状物として得た。収量7.23g、収率28％。NMR:8.42（ｓ）1H;7.1（ｍ）3H;6.36（ｄ）1H;4.13（ｍ）1H;3.50（ｍ）4H;3.31（ｍ）4H;2.3（ｍ）2H;2.23（ｓ）3H;1.9（ｍ）2H;1.4（ｓ）9H;1.35（ｓ）9H。
本実施例に関する反応工程を反応工程図７に示す。
実施例19
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンジルカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（0.5g）をジクロロメタン（1.5ml）に溶解し、トリフルオロ酢酸（1.5ml）を加えた。得られた溶液を周囲温度で２時間撹拌した。次いで、上記溶液を蒸発させて標記化合物を油状物（0.8g）として得た。NMR:8.22（ｄ）1H;7.10（ｄ）2H;6.66（ｄ）2H;4.19（ｍ）1H;3.69（ｓ）8H;2.24（ｍ）2H;1.9（ｍ）2H;2.32（ｓ）2H。
出発原料である前記４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルは以下に記載のようにして製造した。
４−ニトロフェニル酢酸（5.4g）をジメチルホルムアミド（75ml）に溶解した溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（4.05g）を加えた。得られた混合物にＬ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（7.77g）、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（6.2g）を加えた。次いで、この混合物を周囲温度で18時間撹拌した。得られた混合物を濾過し、濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水及び0.5M塩酸で洗浄し、次いで乾燥し、蒸発乾固した。得られた残留物を、シリカゲルを用いてヘキサン／酢酸エチル（2:1）で溶出することによりクロマトグラフィー分離して、４−ニトロベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル9.7g（収率77％）を油状物として得た。
NMR:8.2（ｄ）2H;7.45（ｄ）2H;6.45（ｄ）1H;4.45（ｍ）1H;3.15（ｄ）2H;2.1（ｍ）4H;1.4（ｄ）9H;1.35（ｓ）9H。
４−ニトロベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（9.7g）を酢酸エチル（200ml）に溶解した溶液を30％Pd/C（900mg）上で水素添加した。次いで、得られた混合物をセライトを通して濾過して黄色油状物（４−アミノベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル）を得、これを精製することなしに使用した。収量8.2g、収率90％。NMR:8.23（ｄ）1H;6.92（ｄ）2H;6.50（ｄ）2H;4.86（ｓ）2H;4.15（ｍ）1H;3.24（ｓ）2H;2.22（ｍ）2H;1.8（ｍ）2H;1.45（ｄ）18H。
４−アミノベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（8.2g）を氷酢酸（40ml）と水（40ml）とに溶解した溶液にエチレンオキシド（7.1g）を加えた。次いで、得られた混合物を周囲温度で24時間撹拌した。得られた溶液を蒸発乾固し、エーテルに再溶解し、水洗し、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させて油状物〔４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル〕（6.3g）を得、これをさらに精製することなしに使用した。NMR:8.16（ｄ）1H;7.02（ｄ）2H;6.58（ｄ）1H;4.1（ｍ）1H;3.4（ｍ）8H;3.25（ｓ）2H;2.25（ｍ）2H;1.8（ｍ）2H;1.4（ｓ）18H。
４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（2.88g）をピリジン（45ml）に溶解した溶液に、アルゴン雰囲気下で25℃以下に温度を維持しながらメタンスルホニルクロリド（2.91ml）を滴下した。添加後に、上記溶液を80℃で１時間撹拌した。次いで、得られた溶液を冷却し、10％クエン酸（500ml）に注加し、エーテルで抽出し、水洗し、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させて褐色油状物を得た。この油状物を、シリカゲルを用いてヘキサン：酢酸エチル（2:1）で溶出してクロマトグラフィー分離して、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンジルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステルを油状物として得た（1.3、収率42％）。
NMR:8.19（ｄ）1H;7.10（ｄ）2H;6.66（ｄ）2H;4.10（ｍ）1H;3.69（ｓ）8H;3.32（ｓ）2H;2.21（ｍ）2H;1.9（ｍ）2H;1.37（ｄ）18H。収量1.32、収率42％。
本実施例に関する反応工程を反応工程図８に示す。
実施例20
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジｔ−ブチルエステル（実施例３に記載のようにして製造したもの）（500mg）を98％ギ酸（10ml）に溶解した溶液を周囲温度で24時間放置しておいた。得られた溶液を蒸発乾固し、残留物をMerk社製シリカゲルArt 9385を用いてジクロロメタン／酢酸エチル／ギ酸（7:2:1）でクロマトグラフィー分離して標記化合物を油状物として得た。該油状物を結晶化した。融点117〜119℃。
実施例21
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］−３−フルオロフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（0.5g）を酢酸エチル（10ml）に溶解した溶液に30％Pd/C（100mg）を加え、水素雰囲気下で６時間撹拌した。触媒を濾過し、濾液を蒸発させて油状物として標記化合物を得た。NMR:8.6（ｓ）1H;7.35（dd）1H;7.1−6.8（ｍ）2H;6.5（ｄ）1H;4.2（ｍ）1H;3.7−3.2（ｍ）8H;2.4−1.6（ｍ）4H。
この反応の出発原料は、塩化チオニルの代わりに臭化チオニルを用いた以外は実施例５に記載の方法と同様の方法で製造した。
0003541037.tif 000025
実施例23の化合物のNMRデータは次の通りである：δ8.6（幅広）1H;δ7.6（ｍ）1H;δ7.2（ｍ）2H;δ4.25（ｍ）1H;δ3.6−3.3（ｍ）8H;δ2.4−1.7（ｍ）4H。
実施例21〜24の化合物の製造に使用した出発物質及び中間体並びにそれらの物性を以下の第10表〜第13表に示す。
0003541037.tif 000026
0003541037.tif 000027
0003541037.tif 000028
0003541037.tif 000029
実施例25〜32
以下に記載のようにした以外は実施例１に記載の方法と同様の方法で次の化合物を製造した。
0003541037.tif 000030
0003541037.tif 000031
実施例25〜32の化合物のそれぞれのNMRデータを以下の表に示す。
0003541037.tif 000032
0003541037.tif 000033
実施例25の化合物は、水素添加反応においてα−ベンジル−４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）−アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミンを使用した以外は実施例１に記載のようにして製造した。その製造について以下に記載する。水素添加反応においては、前記α−ベンジル化合物を可溶化するのを促進するために酢酸エチルにテトラヒドロフランを加えた。
実施例26及び27の化合物は、実施例１に記載のようにして中間体α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−メシルグルタミン及びα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−（３−メチルフェニル）グルタミンそれぞれを水素添加することにより製造した。
実施例28の化合物は、実施例１に記載のようにして４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−（５−テトラゾリル）−α−アミノ−Ｌ−酪酸ベンジルエステルを水素添加することにより製造した。また、実施例28の化合物はすぐ後に記載するような第２の方法によっても製造した。Ｏ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）−カーボネートとの反応において、Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルの代わりに（ｓ）−２−アミノ−４−（1H−1,2,3,4−テトラゾール−５−イル）酪酸〔Z.Grzonkaらの論文、Tetrahedron,33,2299−2302（1977）〕を使用した以外は実施例１に記載の方法と同様の方法を実施した。反応は乾燥DMF中で２当量のトリエチルアミンを用いて25℃で20時間行った。蒸発乾固した後に、得られた残留物を酢酸エチルに溶解し、希クエン酸で洗浄し、乾燥し次いで蒸発乾固した。得られた生成物は酢酸エチルから徐々に結晶化した。得られた残留物を酢酸エチルから再結晶して実施例28の化合物（融点173〜175℃）を得た。
実施例29の化合物は、実施例28の第１の製造法について記載の方法と同様の方法によって製造したが４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−（５−テトラゾリル）−α−アミノ−Ｌ−酪酸ベンジルエステルの代わりに１−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニルアミノ｝−１−ベンジルオキシカルボニル−２−（５−チオテトラゾール）エタンを使用した。同様の反応操作によりゴム状物を得、これをカラムクロマトグラフィーによりシリカ上を４％ギ酸／酢酸エチル（容量）で溶出することにより精製した。
また、実施例29の化合物はすぐ後に記載するような第２の方法によっても製造した。
１−アミノ−１−カルボキシ−２−（５−チオテトラゾール）エタン（600mg、2.89mM）を乾燥DMF（48ml）に懸濁し、トリエチルアミン（0.806ml、578mM）を加え、得られた懸濁液を撹拌した。Ｏ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネート（1.10g、2.89mM）を固体として一度に加え、得られた溶液を室温で20時間撹拌した。DMFを減圧下で除去した。得られた残留物を酢酸エチルと希クエン酸に溶解した。酢酸エチル層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し次いで蒸発させた。得られた粗生成物をシリカを用いて４％ギ酸／酢酸エチルで溶出してカラムクロマトグラフィー分離して、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−１−カルボキシ−２−（５−チオテトラゾール）エタンをガラス状固体（0.963g）として得た。NMR（DMSO6）:3.46（dd,1H）;3.69（s,8H）;3.8（dd,1H）;4.38（m,1H）;6.72（d,2H）;6.93（d,2H）;8.12（d,1H）。
実施例30及び31の化合物は、実施例１に記載のようにして、α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−フェニル］−Ｌ−グルタミン及びα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（５−テトラゾリル）−フェニル］−Ｌ−グルタミンそれぞれを水素添加することにより製造した。
実施例32の化合物は実施例１に記載のようにして、α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）フェニル］−Ｌ−グルタミンを水素添加することにより製造した。
実施例25〜32の化合物の製造に使用される中間体
実施例25の化合物の製造に使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）−アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミンは、Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルトシレートをα−ベンジル−Ｌ−グルタミン〔L.Zervasらの論文、J.Am.Chem.Soc.,87（１）,99−104（1965）〕に置き換えた以外は実施例１に記載のようにして、Ｏ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートから製造した。得られた生成物はシリカを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶出は80％EtOAc/20％ヘキサンを用いて行った。エーテルと共に磨砕した後に、生成物を白色固体として得た。
実施例26の化合物の製造に使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−メシル−Ｌ−グルタミンは次のようにして製造した。
乾燥ジクロロメタン50ml中のＮ−Boc−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル〔E.Kliegerらの論文、Ann,673,196−207（1964）〕（10g）を、ジメチルアミノピリジン（DMAP）（3.9g）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（6.73g）で処理した。次いで、この反応フラスコにメタンスルホンアミド（3.04g）を導入し、反応を25℃で20時間続けた。ジクロロメタンを蒸発させ、残留物を酢酸エチルに再溶解した。次いで、酢酸エチル溶液を0.25Mクエン酸で洗浄し、その後に水洗し次いで硫酸マグネシウム（無水）上で乾燥した。酢酸エチルを蒸発させて残留物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して、シリカ上で溶出液として塩化メチレン、次いで５％メタノール／塩化メチレン、次いで10％メタノール／塩化メチレンを使用して精製し、次のBoc−保護したアシルスルホンアミドを得た。
0003541037.tif 000034
NMR:δ1.37（ｓ）9H;1.98（ｍ）2H;2.34（ｔ）2H;5.11（ｄ）2H;7.26（ｄ）1H;7.36（ｓ）5H;11.64（ｓ）1H。
得られたBoc−保護したアシルスルホンアミド3.6gを酢酸エチル50mlに懸濁し、次いで８当量のHClを飽和させた酢酸エチル（3.1M溶液22.4ml）を加えた。上記の出発原料スルホンアミドが溶液になった。反応をアルゴン雰囲気下に25℃で20時間続けた。次の式：
0003541037.tif 000035
で示されるα−ベンジルγ−メシル−Ｌ−グルタミン・塩酸塩が白色固体として生成し、これを濾取し、無水エーテルで洗浄した後にデシケーター中で乾燥した。NMR:δ2.08（ｍ）2H;2.52（ｍ）2H;3.20（ｓ）3H;4.09（ｔ）1H;5.15−5.35（dd）2H;7.39−7.50（ｍ）5H;約９（幅広）3H。
Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルトシレートを上記α−ベンジルγ−メシル−Ｌ−グルタミン酸酸塩に置き換えた以外は実施例１に記載のようにして、Ｏ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートからα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−メシルグルタミンを製造した。得られた反応生成物をカラムクロマトグラフィーによりシリカ上を10％ギ酸の酢酸エチル溶液（容量％）で溶出することにより精製した。
実施例27の化合物の製造に使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）−アミノ］フェノキシカルボニル−γ−（３−メチルフェニル）−Ｌ−グルタミンは、次のようにして製造した。
Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルをＬ−グルタミン酸α−ベンジルエステル〔C.Coutsogeorgopoulsらの論文、J.Am.Chem.Soc.,83,1885（1961）参照〕に置き換えた以外は実施例１に記載のようにしてＯ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートからα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）−アミノ］フェノキシカルボニル−γ−（３−メチルフェニル）−Ｌ−グルタミンを製造した。また、反応は乾燥DMF中で25℃で２時間行った。得られた生成物を酢酸エチル／ヘキサンの混合物をそれぞれ70/30の割合から酢酸エチル100％までの範囲で使用してカラムクロマトグラフィー（シリカ、Merk art 9386）により精製した。得られた生成物のNMRデータを第17表に示す。
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（300mg）を乾燥テトラヒドロフラン（5ml）中で1.1当量のトリエチルエアミンで処理した。乾燥テトラヒドロフラン（10ml）に溶解したギ酸イソブチル（0.08ml、1.1当量）を反応混合物に−25℃で徐々に加えた。15分後に、乾燥テトラヒドロフラン（5ml）に溶解したｍ−トルイジン1.1当量（0.08ml）を加えた。得られた混合物を25℃に加熱し、次いで18時間継続的に撹拌した。次いで、得られた反応混合物を濾過し、濾液を蒸発させて残留物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより酢酸エチル／ヘキサンを溶出液として使用して精製した。適切な画分を蒸発させて、α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−（３−メチルフェニル）−Ｌ−グルタミンを白色結晶質固体として得た。この生成物から得られたNMRデータを第17表に示す。
実施例29の化合物の製造に使用する１−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニルアミノ｝−１−ベンジルオキシカルボニル−２−（５−チオテトラゾール）−エタンは、次のようにして製造した。
β−クロロアラニン（18.50g、115.6ミリモル）（Sigma ChemicalCo.社製）と、５−チオテトラゾール（11.79g、115.6ミリモル、欧州特許公告第33965号明細書に記載のようにして製造したもの）とを2M水酸化ナトリウム溶液230mlに撹拌しながら加えることによって、１−アミノ−１−カルボキシ−２−（５−チオテトラゾール）−エタンを製造した。次いで、反応混合物を室温から90℃まで1.5時間加熱した。次いで、反応混合物を室温まで放置冷却し、さらに氷／メタノール浴で冷却することにより冷却し、反応混合物を濃塩酸でpH4.0まで酸性化し、撹拌を0.5時間続けた。生成した沈殿物を濾取し、冷水で洗浄し、次いでエーテルで洗浄し、濾過し、吸引乾燥して6.9gを得た。母液のpHを再チェックし、約5.5まで上昇していることを認めた。上記の操作を反復し、さらに生成物2.3gを得た。これを高真空下で乾燥した。
NMR:δ3.30−3.50ppm（ｍ）2H;4.16−4.22ppm（ｑ）1H;7.47ppm（幅広）NH2と交換するH2O。
元素分析値−予測値Ｃ＝23.2;H＝4.4;N＝33.8（＋H2O 1モル）
実測値Ｃ＝23.1;H＝4.4;N＝33.7（H2O 9.6％）
Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルをγ−（５−チオテトラゾリル）−α−ベンジルオキシカルボニル−アミノ−Ｌ−酪酸〔Z Gronkaらの論文、Tetrahedron Letters,33,2399−2402（1977）〕に置き換えた以外はＯ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェニル｝−O'−（４−ニトロフェニル）カーボネートから実施例１に記載のようにして、１−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）−アミノ］フェノキシカルボニルアミノ｝−１−ベンジルオキシカルボニル−２−（５−チオテトラゾール）−エタンを製造した。乾燥ジメチルホルムアミドを溶媒として使用し、反応を25℃で行った。反応混合物を２時間後に処理し、得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカ上を酢酸エチル中の２％ギ酸／塩化メチレン（容量比で3:1）から調製した混合物で溶出することにより精製した。この生成物のNMRデータを第16表に示す。
実施例27の化合物の製造に使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（ベンジルオキシカルボニルメチル）フェニル］−Ｌ−グルタミンは、次のようにして製造した。
３−アミノフェニル酢酸（10g）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（13.2g）とを、トルエン（30ml）中のベンジルアルコール（27.2ml）に加えることによって、３−アミノフェニル酢酸ベンジルエステル・ｐ−トルエンスルホン酸塩を製造した。混合物を還流下で加熱し、生成した水をディーン・スターク（Dean−Stark）受器中に集めた。水を全て蒸留した後に、混合物を25℃まで放置冷却し、その後に酢酸エチルで希釈し、氷浴中に１時間置いた。結晶質ｐ−トルエンスルホン酸塩を濾取し、デシケーターン中で乾燥した（23.5g）。NMR:δ2.31（ｓ）3H;3.82（ｓ）2H;5.11（ｓ）2H;7.11（ｄ）2H;7.25−7.45（ｍ）8H;7.52（ｄ）2H。
α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（ベンジルオキシカルボニルメチル）フェニル］−Ｌ−グルタミンは、ｍ−トルイジンを３−アミノフェニル酢酸ベンジルエステルに置き換えた以外は実施例27に記載のようにして製造した。
実施例31で使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（５−テトラゾリル）フェニル］−Ｌ−グルタミンは、ｍ−トルイジンを３−（テトラゾール−５−イル）アニリンに置き換えた以外は実施例27に記載のようにして製造した。出発原料として必要する３−（テトラゾール−５−イル）アニリンは次のようにして製造した。エタノール（2.5リットル）に５−（３−ニトロフェニル）テトラゾール〔Finnegan W.G、Henry R.A.及びLolquist Rの論文、J.A.C.S.,80,3908（1985）〕（52g）を溶解した溶液に10％パラジウム担持炭素（5g）を加え、混合物を水素の雰囲気下で16時間撹拌した。触媒を濾過して除去し、得られた濾液を蒸発させて所望の出発原料（40.5g;融点188〜189℃）を得た。
実施例32で使用するα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−γ−［３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）フェニル］−Ｌ−グルタミンは、ｍ−トルイジンを３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）アニリンに置き換えた以外は実施例27に記載のようにして製造した。
NMR
ClCH2CH2N:3.68（ｍ）8H
芳香族:6.68−7.74（ｍ）1H
ArCH2O:5.12（ｓ）2H;5.14（ｓ）2H
αCH:4.18（ｍ）1H
その他:1.92−2.15（ｍ）2H;2.45（ｍ）2H;8.12（ｄ）1H;9.7（ｓ）1H;9.9（ｓ）1H。
実施例32の製造において中間体として使用する３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）アニリンは次のようにして製造した。ｍ−フェニレンジアミン（10g）を酢酸エチル（200ml）に溶解した溶液の冷却溶液（０℃）に炭酸水素カリウム溶液（水300mlに9g溶解したもの）を撹拌しながら加えた。酢酸エチル（100ml）に溶解したクロルギ酸ベンジル（13.2ml）を10分間にわたって滴下し、０℃で１時間撹拌し、次いでM HCl（水溶液）を加えて酸性（pH2）にした。生成物を酢酸エチル（250ml）中に抽出し、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し次いで減圧留去して油状物を得た。油状物をMerk社製シリカゲルArt 9385上でヘキサン／酢酸エチル（7:3）で溶出してクロマトグラフィー分離し、所望の中間体を低融点をもつ固体として得た（収率35％）。
NMR:9.32（ｓ）1H;7.30（ｍ）5H;6.80（ｔ）1H;6.70（ｍ）1H;6.50（ｍ）1H;6.12（ｍ）1H;5.0（ｓ）2H;4.88（ｓ）2H。
0003541037.tif 000036
0003541037.tif 000037
実施例33
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（188mg）（反応工程図９の化合物14参照）をトリフルオロ酢酸（TFA）（4ml）に懸濁し、周囲温度で30分間撹拌した。TFAを減圧下で除去し、残った油状物を酢酸エチル（3ml）で希釈し、次いで蒸発させて４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−1.4TFA−0.8EtOAc（反応工程図９の化合物15）（162mg）を得た。収率82％。
NMR:1.84−2.01（ｍ）1H;2.36（ｍ）2H;3.31（ｔ）4H;3.72（ｔ）4H;4.02（ｍ）1H;6.66（ｄ）2H;6.94（ｄ）2H;7.92（ｄ）1H。
中間体として使用した４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステルは次のようにして製造した。
ａ）生成物ビス（２−メシルオキシエチル）アミノ−フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図９の化合物11参照）（1.0g）をアセトニトリル（50ml）に溶解した溶液を、沃化ナトリウム（1.0g）と共に70℃で20時間撹拌した。得られた反応混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲル上で酢酸エチル／シクロヘキサン（1:5）で溶出してクロマトグラフィー分離して、４−［N,N−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図９の化合物14参照）を油状物（0.75g）として得た。収率68％。NMR:1.41（ｓ）9H;1.43（ｓ）9H;1.81−1.95（ｍ）1H;2.34（ｍ）2H;3.31（ｔ）4H;3.72（ｔ）4H;4.00（ｍ）1H;6.67（ｄ）2H;6.93（ｄ）2H;7.91（ｄ）1H。
ｂ）ビス（２−メシルオキシエチル）アミノフェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル
４−［N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（実施例８に記載のようにして得たもの−反応工程図４もまた参照のこと）（2.53g）をピリジン（9ml）に溶解した溶液を、メタンスルホニルクロリド（1.8ml）と共に２℃で20分間撹拌し、次いで80℃で11分間撹拌した。得られた反応混合物を酢酸エチルとクエン酸／水（10％）との間で分配した。有機層を分離し、水洗し、（硫酸ナトリウムで）乾燥し、次いで蒸発乾固した。得られた残留物を、シリカゲル上で酢酸エチル／ジクロロメタン（1:9）で溶出してクロマトグラフィー分離して４−［N,N−ビス（２−メシルオキシエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル（反応工程図９の化合物11）を油状物（0.75g、収率28％）として得た。NMR:1.41（ｓ）9H;1.43（ｓ）9H;1.81−1.99（ｍ）1H;2.34（ｍ）2H;3.16（ｓ）6H;3.72（ｔ）4H;3.9（ｍ）1H;4.31（ｔ）4H;6.78（ｄ）2H;6.92（ｄ）2H;7.9（ｄ）1H。
実施例34
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］フェノキシカルボニル｝−Ｌ−グルタミン酸
４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル〔反応工程図９の化合物（12）参照〕（133mg）をTFA（4ml）に懸濁し、周囲温度で30分間撹拌した。TFAを減圧下で除去し、残った油状物を酢酸エチル（3ml）で希釈し、次いで蒸発させて４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−1.3TFA−0.9EtOAc〔反応工程図９の化合物（13）参照〕（126mg、収率80％）を得た。NMR:1.83−2.01（ｍ）1H;2.36（ｍ）2H;3.58（ｔ）4H;3.76（ｔ）4H;4.03（ｍ）1H;6.71（ｄ）2H;6.94（ｄ）2H;7.92（ｄ）1H。
中間体として使用した４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステルは次のようにして製造した。
ビス（２−メシルオキシエチル）アミノ−フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル〔反応工程図９の化合物（11）−実施例８に記載のようにして得たもの−反応工程図４も参照のこと〕（0.48g）をアセトニトリル（30ml）に溶解した溶液を、臭化リチウム（0.26g）と共に70℃で22時間撹拌した。得られた反応混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残留物を、シリカゲル上で酢酸エチル／ジクロロメタン（1:5）で溶出してクロマトグラフィー分離して、４−［N,N−ビス（２−ブロモエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ジ−ｔ−ブチルエステル〔反応工程図９の化合物（12参照〕を油状物（0.37g、収率83％）として得た。NMR:1.41（ｓ）9H;1.43（ｓ）9H;1.8−1.98（ｍ）1H;2.34（ｍ）2H;3.58（ｔ）4H;3.76（ｔ）4H;3.97（ｍ）1H;6.72（ｄ）2H;6.93（ｄ）2H;7.93（ｄ）1H。
実施例35
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−２−フルオロフェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
中間体４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−２−フルオロフェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル〔NMR（DMSO）:7.62（ｔ）1H;7.35（ｓ）10H;6.8（ｄ）1H;6.57（ｍ）2H;5.1（ｄ）4H;4.33（ｍ）1H;3.7（ｓ）8H;2.43（ｍ）2H;2.0（ｍ）2H〕から実施例５の対応する工程と類似の方法で、標記化合物〔NMR（DMSO）:8.0（ｓ）1H;7.65（ｔ）1H;6.6（ｍ）3H;4.2（ｍ）3H;3.7（ｓ）8H;2.28（ｍ）2H;1.8（ｍ）2H〕を製造した。
上記中間体は次のようにして製造した。
３−フルオロ−４−ニトロアニリン（1.3g）に氷酢酸（30ml）中でエチレンオキシド（6.6g）を加え、反応混合物を密閉フラスコ中で実験室温度で72時間保った。得られた溶液をその元の容量の半分まで減圧下で蒸発させ、塩化ナトリウム飽和水溶液で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を一緒にし、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、蒸発させ、次いで得られた残留物をシリカゲルを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル50％（容量比）を含有するヘキサンで溶出して未反応の出発原料及びモノ置換生成物を除去した後に、酢酸エチルで溶出して、生成物2',2'−（３−フルオロ−４−ニトロアニリノ）ジエタノール（融点99〜101℃）を得た。
このようにして得られた生成物（280mg）をジクロロメタン（7.5ml）に溶解し、ピリジン（0.1ml）を加え、次いで得られた溶液を氷／水浴中で冷却した。撹拌しながら塩化チオニル（0.25ml）を滴下した。塩化チオニルの添加が完了した際に、反応混合物を還流下で１時間加熱し、次いで実験室温度20時間放置した。得られた反応溶液をジクロロメタン（10ml）で希釈し、３回水洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させ、次いで得られた残留物をメタノールから再結晶して生成物N,N−ビス（２−クロロエチル）−３−フルオロ−４−ニトロアニリン（融点97〜98℃）を得た。
このようにして得られた生成物（200mg）をテトラヒドロフラン（7.5ml）中で、パラジウム／炭素（５重量％のもの20mg）の存在下で水素雰囲気中で16時間撹拌した。触媒を濾過して除去し、溶媒を蒸発させた。得られた残留物を最小限の容量のメタノールに溶解し、塩化水素を飽和させたジエチルエーテルを過剰量加えることにより粗生成物を沈殿させた。メタノール／ジエチルエーテルから再結晶して、生成物４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−２−フルオロアニリニウムクロリド（融点195〜200℃、分解）を得た。
得られた生成物を実施例５の対応する工程と同様の方法で所望の中間体に転化させた。
実施例36〜43
実施例36〜43の化合物の構造分析データ及び元素分析データを第17表に示す。
第17表に挙げた化合物は、実施例16に記載の方法に従って製造した。すなわち、実施例36の化合物は実施例16におけるアニリンを４−アミノ安息香酸ベンジル（Aldrich Chemical Co.,Ltd.社製）に置き換えることにより製造した。同様に、実施例37〜43の化合物は、実施例16におけるアニリンを４−アミノ安息香酸ベンジル、sec−ブチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン又はｐ−ベンジルオキシアニリンに置き換えることにより製造した。
0003541037.tif 000038
実施例44
Ｎ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸
前記中間体４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸ジベンジル（1.138g）をDMF（15ml）に溶解した溶液を10％Pd/C上で16時間水素化した。濾過し、真空中で蒸発させた後に、得られた残留物をクロロホルム（20ml）に溶解した。18時間後に、結晶質沈殿を濾取し、真空中で乾燥して４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル−Ｌ−グルタミン酸を得た。収量730mg（収率93％）。アセトン／クロロホルムから再結晶した後に、極微細棒状物を生成した。融点116〜118℃。
NMR（CD3COCD3）：δ8.0（ｓ）1H;7.2（ｄ）2H;6.6（ｄ）2H;6.2（ｄ）2H NH;4.4（ｍ）1H;3.3（ｍ）8H;2.5−1.9（ｍ）4H。
前記ジベンジル中間体は次のようにして製造した（反応工程図10参照）。
グルタミン酸ジベンジル・ｐ−トルエンスルホン酸塩（Bachem U.K.から入手し得る;0.25g）をアルゴン雰囲気下で乾燥塩化メチレン（10ml）に溶解し、０℃に冷却した。ピリジン（0.162ml）を加え、次いでトルエンに溶解したホスゲン（1.93M、0.311ml）を迅速に加えた。得られた溶液を０℃で２時間撹拌し、ピリジン（0.05ml）を加え、次いで４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］アニリニウムクロリドを１度に加えた。混合物を０℃で10分間撹拌し、次いで室温で18時間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を酢酸エチルと水とで希釈した。次いで、有機層を希クエン酸（２×）、水及び飽和食塩水で順々に洗浄し、乾燥し次いで蒸発させて所望のジベンジル中間体を固体として得た。
前記ジベンジル中間体の別の合成経路は次の通りである：
トリホスゲン（1g）をクロロホルム（80ml）に溶解した溶液に、10℃で４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］アニリニウムクロリド（2.7g）を加えた。温度を10℃に保ちながら、トリエチルアミン（4.15ml）を加え、混合物を撹拌し、周囲温度まで15分間昇温させた。この混合物にグルタミン酸ジベンジル・トシレートとトリエチルアミン（1.7ml）とを一度に加えた。周囲温度で1.5時間経過した後に、得られた混合物をクロロホルム（100ml）で希釈し、２回水洗し、乾燥し次いで蒸発させて乾燥した。得られた残留物をMerk社製のシリカゲルArt 9385上で、酢酸エチル／ヘキサンで溶出してクロマトグラフィー分離してＮ−｛４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル｝−Ｌ−グルタミン酸ジベンジル（2.5g）を得た。融点119〜122℃。
実施例45
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルカルバモイル−γ−［Ｎ（３−カルバモイル）アニリノ］−Ｌ−グルタメート（反応工程図11の化合物７）
標記化合物は次のようにして製造した（反応工程図11参照）。前記中間体（反応工程図11の化合物6;1g）をTHF20mlに溶解した溶液を30％Pd/C（10mg）上で４時間水素化した。次いで、得られた混合物をセライトを通して濾過し、蒸発させて褐色油状物を得、次いでこれを溶出液として１％ギ酸／酢酸エチルの混合物及び３％ギ酸／酢酸エチルの混合物を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、得られた適当な画分を蒸発させ、酢酸エチルを相互作用させて標記化合物300mgを得た。NMR:ClCH2CH2N:3.66（ｓ）8H;芳香族:6.66−7.46（ｍ）8H;αCH:4.22（ｍ）1H;その他:1.66−2.06（ｍ）2H;2.39（ｍ）2H;3.49（ｓ）2H;6.29（ｄ）1H;8.33（ｓ）1H;9.93（ｓ）1H;12.5（b,s）2H。
前記中間体は次のようにして製造した：
（ａ）トルエン（30ml）中のベンジルアルコール（27.2ml）に３−アミノフェニル酢酸（10g）と、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（13.2g）とを加えることによって、３−アミノフェニル酢酸ベンジルエステル・ｐ−トルエンスルホン酸塩を製造した。混合物を還流下に加熱し、生成した水をジーンスターク（Dean−Stark）受器中に集めた。全ての水が留去し終わった際に、混合物を25℃まで自然冷却し、その後にジエチルエーテルで希釈し、氷浴中に１時間置いた。結晶質ｐ−トルエンスルホン酸塩を濾取し、得られた生成物をデシケーター中で乾燥した（収量23.5g）。NMR:δ2.31（ｓ）3H;3.82（ｓ）2H;5.11（ｓ）2H;7.11（ｄ）2H;7.25−7.45（ｍ）8H;7.52（ｄ）2H。
（ｂ）乾燥DMF20ml中でＮ−Boc−α−ベンジル−Ｌ−グルタメート（5g）をヒドロキシベンゾチアゾール（HOBT）（1.1当量;2.45g）と共に５℃で加熱し、得られた反応混合物をこの温度でアルゴン雰囲気下に10分間撹拌した。次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCI）（1.1当量;3.37g）を加え、反応混合物を５℃でさらに10分間撹拌し、その後に25℃まで自然昇温させ、さらに45分間撹拌した。次いで、３−アミノフェニル酢酸ベンジルエステル・ｐ−トルエンスルホン酸塩〔（ａ）で得た生成物〕（1.1当量;6g）を乾燥DMF20ml中の1.1当量のトリエチルアミン（2.23ml）と一緒に加え、得られた反応混合物を25℃でさらに20時間撹拌した。次いで、ジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾取し、DMF濾液を蒸発乾固した。次いで、得られた残留物を酢酸エチルに再溶解した。次いで、得られた酢酸エチル溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液次いで食塩水で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム（無水）上で乾燥した。得られた酢酸エチル抽出液を蒸発させて残留物を得、これを溶出液30％、40％及び50％酢酸エチル／ヘキサン混合物を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。適当な画分を蒸発させて生成物（反応工程図11の化合物４）5gを得た。
NMRデータ:1.39（ｓ）9H;1.81−2.10（ｍ）2H;2.38（ｍ）2H;3.69（ｓ）8H;4.03（ｍ）1H;5.12（ｍ）4H;6.92（ｄ）1H;7.21（ｍ）1H;7.35（ｍ）11H;7.42（ｄ）1H;7.52（ｓ）1H;9.89（ｓ）1H。
（ｃ）（ｂ）で得られた生成物（5g）をエーテル10mlに懸濁し、ジクロロメタン5mlを（溶解性を促進するために）加え、次いで飽和エーテル/HCl8当量を加えた。次いで、得られた反応混合物を25℃で20時間撹拌した。生成物はこの段階では不溶性油状物であった。次いで、エーテルを蒸発させ、得られた残留物をトルエンを用いて２回共沸させ、その後にエーテルを加え、次いで蒸発させて生成物（反応工程図11の化合物５）5gを黄色フォーム状物として得た。
NMRデータ：δ2.35（ｍ）2H;δ2.65（ｍ）2H;δ3.50（ｓ）2H;4.22（bs）1H;δ5.01（ｓ）2H;δ6.8−7.6（ｍ）14H;δ8.65（bs）3H;δ9.35（ｓ）11H。
（ｄ）乾燥THFF20ml中の1,1−カルボニルジイミダゾール1.1当量（0.66g）を５℃で、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］アニリニウムクロリド1gを含有する溶液で処理した。次いで、反応混合物を５℃で15分間撹拌し、その後に（ｃ）で得た生成物１当量（1.84g）を乾燥DMF20ml中の1.1当量のトリエチルアミン（0.56ml）と一緒に加え、25℃でさらに２時間撹拌した。次いで、トリエチルアミン塩酸塩の沈殿を濾過して除去し、THF濾液を蒸発させ、得られた残留物を酢酸エチルに再溶解した。次いで、得られた酢酸エチル溶液を水洗し、その後に0.25Mクエン酸次いで食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム（無水）上で乾燥した。酢酸エチルを蒸発させて残留物を得、これを溶出液として30％、40％及び50％酢酸エチル／ヘキサン混合物を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。適当な画分を蒸発させて所望の中間体（反応工程図11の化合物６）を得た。
NMRデータ:ClCH2CH2N:3.65（ｓ）8H;芳香族:6.63−7.5（ｍ）18H;ArCH2O:5.10（ｓ）2H;5.12（ｓ）2H;αCH:4.32（ｍ）1H;その他1.83−2.13（ｍ）2H;2.41（ｍ）2H;6.42（ｄ）1H;8.25（ｓ）1H;9.91（ｓ）1H。
実施例46
４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−（3,5−ジカルボキシ）アニリド
αベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−アニリドの代わりに、α−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−（3,5−ジカルボキシ）アニリドを使用して実施例16に記載の方法を反復して、４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−（3,5−ジカルボキシ）アニリドを無色結晶（融点167〜170℃）として得た。
元素分析値：−予測値％  Ｃ＝49.6  Ｈ＝4.87  Ｎ＝6.68
実測値％  Ｃ＝49.7  Ｈ＝4.9  Ｎ＝6.7
前記のα−ベンジル４−［N,N−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−（3,5−ジカルボキシ）アニリドは、γ−アニリノ誘導体に関する実施例16に記載の方法と同様の方法で製造した。
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