(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベロ毒素がもたらす腸管上皮細胞の脱落を抑制する腸粘膜障害用薬剤であり、クレオソートを有効成分とすることを特徴とする腸粘膜障害用薬剤。
【請求項２】
ベロ毒素がもたらす小腸の腸管上皮細胞の脱落を抑制する腸粘膜障害用薬剤であり、クレオソートを有効成分とすることを特徴とする腸粘膜障害用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はベロ毒素起因疾患治療薬に関し、詳しくは、病原性大腸菌が産生するベロ毒素によって誘起される疾患を治療するための医薬品に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
病原性大腸菌は、これが産生する毒素の種類によって幾つかの型に分類されており、その分類中において「腸管出血性大腸菌」と呼ばれるものがある。その中でも、特にＯ１５７：Ｈ７（単にＯ１５７と俗称されることもあるので、本明細書でも以下「Ｏ１５７」という）と呼ばれる病原性大腸菌は、ベロ毒素と呼ばれる非常に強力な細胞毒を産生する。ベロ毒素は、当該病原性大腸菌が感染した動物の腸管における上皮細胞へ入り、細胞内の２８ＳリボゾームＲＮＡの特定のアデニン残基とリボース残基の間のＮ−グリコシド結合を加水分解することによりその機能を破壊し、延いてはその細胞の蛋白合成機能を止めて当該細胞を死に至らしめる。この結果、腸管上皮細胞が脱落し、下痢や出血が生じる。また、場合によっては、ベロ毒素が血管内に入って血管内皮細胞を攻撃し、これにより腎障害を引き起こして出血性尿毒症症候群などの重篤な疾患が生じる。
【０００３】
病原性大腸菌による疾患は、これが細菌感染症でありながら、抗生物質や抗菌剤の効果がはっきりせず、一方では、抗生物質の投与によって更なる症状の悪化を惹き起こすことも報告されており、その使用の是非は今日疑問視されている。はっきりしていることは、現在ベロ毒素による疾患の治療薬が存在していないことであり、このような治療薬の開発が切望されていることである。
【０００４】
［発明の目的］
本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、病原性大腸菌が産生するベロ毒素によって誘起される疾患を治療するための医薬品を提供するところにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ベロ毒素が障害を及ぼすであろう腸管粘膜に対し、保護作用をもつ物質を探すべく鋭意検討を重ねた結果、クレオソートがその作用を保有していることを見い出し、そして本発明に至った。すなわち、動物の腸管の内部に、ベロ毒素を投与すると同時に種々の薬物を投与し、当該ベロ毒素により引き起こされる腸管粘膜障害が、同時に投与した薬物によって抑制されるか否かを調べた結果、なかんずくクレオソートがベロ毒素による腸管粘膜障害を見事に抑制することを発見し、そして本発明に至った。
【０００６】
請求項１記載の腸粘膜障害用薬剤は、ベロ毒素がもたらす腸管上皮細胞の脱落を抑制する腸粘膜障害用薬剤であり、クレオソートを有効成分とすることを特徴とする。
【０００７】
請求項２記載の腸粘膜障害用薬剤は、ベロ毒素がもたらす小腸の腸管上皮細胞の脱落を抑制する腸粘膜障害用薬剤であり、クレオソートを有効成分とすることを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
なお、クレオソートは、周知のように、防腐剤として広く使用されている。これは、クレオソートが「肉の保存」なる意味を持つギリシャ語であることからも分かるように、自身が持つ殺菌作用・抗菌作用に基づくものである。そのため、例えば、綿球に浸し、う歯に挿入する適応方法も提案され、重宝されている。
【０００９】
本発明の細菌毒素起因疾患用薬剤は、その主体が上記クレオソートと同じであるが、対象が「細菌」ではなく細菌が産生した「毒素」であることから、当該薬剤の作用機序を上記したような殺菌作用を以て説明することは一切できない。したがって、本発明の薬剤は、従来認識されていた作用機序からは到底予測のつかない薬理作用に基づいて効能効果を発揮するものといわざるを得ないが、詳細な作用機序については現在のところ不明である。
【００１０】
クレオソート（ｗｏｏｄ  ｃｒｅｏｓｏｔｅ，  ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ  ｃｒｅｏｓｏｔｅ）  とは主として木タールの分留により得られるもので、透明かつ室温において液体である（ザ・メルク・インデックス，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，  Ｓ．  Ｂｕｄａｖａｒｉ著，Ｍｅｒｃｋ  社出版，１９８９）。これは特異な臭いを持ち、主としてグアヤコールやクレオゾール等の芳香族化学物からなる混合物である（オガタら，Ｎ．  Ｏｇａｔａ，  Ｔ．  Ｂａｂａ，  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６６，  ４１１−４２３，  １９８９）。その他の成分としてクレゾール、フェノール及びキシレノール等を含む。この「クレオソート」は同名のためしばしば混合されるが、コールタールから得られる「コールタール・クレオソート」とは全く別のものである。
【００１１】
クレオソート、またはその構成成分あるいはそれを含有する混合物は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。
【００１２】
ベロ毒素による腸管粘膜障害を治療する目的において、クレオソートまたはその構成成分の投与量については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して１〜５００ｍｇであり、好ましくは２〜１００ｍｇである。また、注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．２〜３００ｍｇであり、好ましくは０．２〜５０ｍｇである。これらの１日量を２〜４回に分けて投与することもできる。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明に関する具体的な実施例を示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。また、剤型、投与方法、動物等についてもこの実施例に限定されない。
【００１４】
なお、以下の実施例においては、ウサギの腸管内にベロ毒素を投与し、その結果として生じる腸粘膜障害を顕微鏡検査により確認した。またこれと平行して、他のウサギにおいて、腸管内にベロ毒素と試験物質とを同時に投与し、その試験物質が腸粘膜障害を抑制するかどうかを調べた。以下詳述する。
【００１５】
参考実験（塩類溶液に対するウサギ小腸の吸収）
まず、始めに、塩類溶液に対するウサギ小腸の吸収の程度を調べた。
【００１６】
８週齢雄のＮＺＷ系統の兎（北山ラベス社より入手、体重約２ｋｇ）を２４時間絶食とした。ただし、水は自由に与えた。兎は保定器に入れ、耳静脈にペントバルビタールナトリウム（アボット社製）を体重１ｋｇ当たり２５〜３０ｍｇをゆっくり静脈注射することにより麻酔をかけた。麻酔後は呼吸等のバイタルサインに充分注意し、麻酔のかけすぎによる全身状態の悪化に充分注意をした。次に、手術台の上に背臥位とし、素早く電気バリカンにより腹部を剃毛、イソジン液（明治製菓社製）にて消毒し、上腹部正中切開にて開腹した。途中の出血に対しては適宜小型の止血鉗子（例えばモスキート鉗子）にて止血し大量出血を防いだ。なお、手術は可能な限り無菌的とした。開腹後、空腸の起始部を見つけ、そこから１０ｃｍの位置に絹糸をかけ、空腸の結さつを行なった。必要に応じ、開創器または鈎にて開腹の状態を保つこととした。結さつは、３号絹糸を通した縫合用のわん針を持針器にて持ち、腸間膜の腸管への付着部へ通して行なった。このとき、弱すぎると腸内容物が結さつ部を越える可能性があり、強すぎると組織を損傷する可能性があるので、結さつの程度には注意をはらった。また、腸間膜およびその血管はできるだけ傷つかないように注意した。また、全ての組織は愛護的に取扱うことによりその損傷を避けた。次に、さらに肛門側５ｃｍの位置に同様の結さつを行い５ｃｍの「小腸区分」を作った。同様の結さつを順次、肛門側へ５ｃｍずつ行い、全部で３個の「小腸区分」を作った。手術中は兎の体温が下がる傾向があるため、例えば手術台の底を少し加温するとか、使い捨てカイロにて体のまわりを加温する等、何らかの方法にて保温することが必要であった。ただし加温のしすぎに充分注意した（やや温かい程度がよい）。
【００１７】
第１〜第３の「小腸区分」の内腔に対し、［表１］に示す成分を注入し、３時間後、及び１８時間後の腸液量を測定した。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
［表１］から明らかなように、ブドウ糖存在下において、腸液の吸収は促進されるが（０．９２ｍｌに対し０．６１ｍｌは有意差あり）、クレオソートは、このような実験系において、腸液の吸収に対し何ら影響を及ぼさない（腸液の吸収を妨げない）ことが分かった（０．６１ｍｌに対し０．６０ｍｌは有意差なし）。ちなみに、前述したような３時間後測定においてブドウ糖存在下において塩類溶液の吸収が促進されるのは、腸上皮に存在するナトリウム・ブドウ糖共輸送蛋白（ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を介するナトリウムイオンとブドウ糖の吸収促進効果によるものであり、このことはＷＨＯが推奨する経口補液剤（一般にＯＲＳと称される）の原理となっている。なお、前述の実験においては、各成分の濃度は合計して等張となるようにしている。そうしないと、浸透圧の違いにより吸収速度が変化するからである。
【００２０】
本実験（ベロ毒素による腸管粘膜障害及びクレオソートによる障害抑制）
１．検体
ベロ毒素（ＶＴ）の検体（５０ｎｇ／ｍｌ、２ｍｌ／１ｖｉａｌ、Ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ４３８９０の培養上清）は入手時から冷凍保管した（−２０℃以下で保管）。なお、使用直前に解凍し、解凍後は充分に撹拌した。
【００２１】
２．実験動物
（１）使用動物
北山ラベス株式会社で生産された雄のウサギ（ｋｂｌ：ＮＺＷ）８匹を購入し、７日間以上の検疫および馴化後に８週齢以上（体重：１．５０〜２．２０ｋｇ）で使用した。
【００２２】
（２）飼育条件
試験実施期間中、温度１９〜２５℃、湿度４０〜７０％、換気回数１６回／時間および照明１２時間（７〜１９時）／日に設定した飼育室で、アルミニウム製ケージ［３５Ｗ×５０Ｄ×３５Ｈ（ｃｍ）］に個別に収容し飼育した。その間、固型飼料（ＬＲＣ４、オリエンタル酵母工業株式会社）および上水道水を自由に摂取させた。
【００２３】
３．実験方法
（１）小腸区分の作製
前記の「予備実験（塩類溶液に対するウサギ小腸の吸収）」の項と同様にして各ウサギの小腸において５ｃｍの「小腸区分」を８個作った。これらの「小腸区分」を起点より順にＮｏ．１〜Ｎｏ．８とした。
【００２４】
各小腸区分の腸管内腔に、各種濃度の検体（下記［表２］参照）を１．５ｍｌずつ投与した（どの検体をどの箇所に投与したかは下記［表３］を参照）。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
【表３】
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【００２７】
投与終了後、３７℃に加温した０．１ｗ／ｖ％のペントシリン生理食塩液（ペントシリン：富山化学、ロット番号：ＡＦ６５０）を用いて腹腔を洗浄し、筋層および皮膚をそれぞれ別々に縫合した。縫合後は水のみを自由に摂取させた。
【００２８】
（２）顕微鏡組織検査用標本の作製
小腸の光学顕微鏡用標本を以下のようにして作製した。すなわち、各小腸区分を１０％中性緩衝ホルマリン水溶液で固定した。さらに、各小腸区分を常法にしたがってパラフィン包埋し、ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製した。
【００２９】
（３）結果
前述したように、ベロ毒素によって惹起される腸粘膜障害に対するクレオソートの抑制作用を検討する目的で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７の培養上清、すなわちベロ毒素を５０ｎｇ／ｍｌ含む液体にクレオソートを０〜１００μｇ／ｍｌ添加した液１．５ｍｌを長さ５ｃｍのウサギの小腸区分に注入した。注入後８時間、各小腸区分の粘膜障害を顕微鏡観察した結果、クレオソートが０μｇ／ｍｌ（不存在）の場合（検体１を使用した場合）においてベロ毒素により高度の腸粘膜障害が見られたが、クレオソートが１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌ含まれる場合には、腸粘膜はさほど障害を受けておらず、腸粘膜障害に対するクレオソートの抑制作用を確認することができた。ここに、検体１（クレオソート０μｇ／ｍｌ）、検体２（クレオソート１μｇ／ｍｌ）、検体３（クレオソート５μｇ／ｍｌ）、検体４（クレオソート１０μｇ／ｍｌ）、検体５（クレオソート３０μｇ／ｍｌ）及び検体６（クレオソート１００μｇ／ｍｌ）を用いた場合の小腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の各々を１点ずつ（任意選択）、図１〜図６に示す。図１〜図６からも分かるように、クレオソートには、ベロ毒素による腸粘膜障害を抑制する効果がある。このことは、クレオソートが病原性大腸菌にする治療薬として用いられ得ることを示す。なお、上記したクレオソートの腸粘膜保護作用は、検体６を使用した場合に最も顕著に現れ、次いで検体５、検体４、検体３、検体２の順となっている。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、病原性大腸菌が産生するベロ毒素によって誘起される疾患を治療するための医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】検体１を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図２】検体２を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図３】検体３を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図４】検体４を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図５】検体５を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図６】検体６を用いた場合の腸粘膜の状態を示す顕微鏡写真の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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