(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織再生のためのデバイスを製造する方法であって、
マトリックス中に生体適合性材料の層を連続的に形成するために無固体形態製作方法を用いる工程を包含し、該マトリックスが、
（ａ）該マトリックス中に伸びる相互連結される孔であって、細胞を接種するための相互連結される孔、および
（ｂ）患者組織内の導管に連結するための開口部を有する該マトリックスを通じる流体流れのための相互連結された管腔
を有する、方法。
【請求項２】
血管に連結され得る前記マトリックス内の相互連結された管腔を形成する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンパ管、外分泌機能管、排出管、および神経内部生長用管からなる群から選択される導管に連結され得る、前記マトリックス内の相互連結された管腔を形成する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記無固体形態製作方法が、
ａ）生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末の第１の分散物をベッド上に拡散する工程、
ｂ）溶媒中の生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末の第２の分散物を含む層をプリントする工程であって、該溶媒は、該第１の生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末を、該第２の生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末に、壁を有することが所望される位置で結合させる、工程、および
ｃ）所望のマトリックスが作成されるまで工程ｂ）を繰り返す工程、
を包含する三次元プリント法である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記無固体形態製作方法が、弾道粒子製造法または融合沈着モデル法であり、そしてポリマー材料が層中のプラットホームに塗布されてポリマーデバイスを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記無固体形態製作方法が、ポリマー粒子をプラットホームに塗布する工程、および該ポリマー粒子の選択された領域をレーザーで融合する工程を包含する、選択的レーザー焼結である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記無固体形態方法が、光重合可能なプレポリマーまたはモノマーの浴の選択された領域を光重合する工程を包含する立体リソグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックスが、生分解性ポリマーから形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マトリックス形成材料より長い分解速度を有する構造要素、または生分解性でない構造要素が前記マトリックス中に取り込まれた、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
テクスチャーが改変され、または前記デバイス壁に表面活性薬剤が塗布されて、該デバイスへのおよび該デバイス内への細胞接着を制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マトリックスが、バインダーの粉末ベッドへの三次元プリント法により作成され、表面活性薬剤を含む溶液が、該バインダーがプリントされる場所の間に該粉末ベッドの領域またはライン中にプリントされる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリックスの外表面が、細胞の接着を防ぐ表面活性薬剤で改変される、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記デバイスに解離された細胞を接種する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記管腔に解離された内皮細胞を接種する工程、および前記デバイスを該細胞が該管腔の壁上に集密層を形成するまで培養する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリックスの他の領域に組織形成細胞を接種する工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
無固体形態製作方法を用いて形成される、組織再生のための医療用デバイスあって、生体適合性材料の連続的な層のマトリックスを備え、該層が、
（ａ）該マトリックス中に伸びる相互連結される孔または管腔であって、細胞を接種するための相互連結される孔または管腔、および
（ｂ）患者組織内の導管に連結するための開口部を有する該マトリックスを通じる流体流れのための相互連結された管腔、
を生成する、デバイス。
【請求項１７】
血管に連結され得る前記マトリックス内の相互連結された管腔を備える、請求項16に記載のデバイス。
【請求項１８】
リンパ管、外分泌機能管、排出管、および神経内部生長用管からなる群から選択される導管に連結され得る、前記マトリックス内の相互連結された管腔を備える、請求項16に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記無固体形態製作方法が、
ａ）生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末の第１の分散物をベッド上に拡散する工程、
ｂ）溶媒中の生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末の第２の分散物を含む層をプリントする工程であって、該溶媒が、該第１の生体適合性ポリマーまたはコンポジット紛末を、該第２生体適合性ポリマーまたはコンポジット粉末に、壁を有することが所望される位置で結合させる、工程、および
ｃ）所望のマトリックスが製造されるまで工程ｂ）を繰り返す工程、
を包含する三次元プリント法である、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記無固体形態製作方法が、弾道粒子製造法または融合沈着モデル法であり、そしてポリマー材料が層中のプラットホームに塗布されてポリマーデバイスを形成する、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記無固体形態製作方法が、ポリマー粒子をプラットホームに塗布する工程、および該ポリマー粒子の選択された領域をレーザーで融合する工程を包含する、選択的レーザー焼結である、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記無固体形態方法が、光重合可能なプレポリマーまたはモノマーの浴の選択された領域を光重合する工程を包含する立体リソグラフィーである、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記マトリックスが、生分解性ポリマーから形成される、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記マトリックス形成材料より長い分解速度を有する構造要素、または生分解性でない構造要素が取り込まれている、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２５】
テクスチャーが改変され、または前記デバイス壁に表面活性薬剤が塗布されて、該デバイスへのおよび該デバイス内への細胞接着を制御する、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記マトリックスが、バインダーの粉末ベッドへの三次元プリント法により製造され、表面活性薬剤を含む溶液が、該バインダーがプリントされる場所の間に該粉末ベッドの領域またはライン中にプリントされる、請求項25に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記マトリックスの外表面が、細胞の接着を防ぐ表面活性薬剤で改変される、請求項25に記載のデバイス。
【請求項２８】
生体活性薬剤をさらに含む、請求項16に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記デバイスが、一連の二次元層として複合的な三次元デバイスを構築する方法により形成される、請求項16に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記層が厚さが２ミクロンと1mmとの間である、請求項29に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記孔または管腔が、150と300ミクロンの間の直径を有する、請求項16に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記デバイスに解離した細胞を接種することをさらに包含する、請求項16に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記孔または管腔の壁上に接種された解離した内皮細胞をさらに含む、請求項17に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記マトリックスの他の領域上に接種された組織形成細胞をさらに含む、請求項33に記載のデバイス。
【請求項３５】
その中に接種された組織形成細胞をさらに含む、請求項18に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記ポリマー材料が生体活性薬剤を含む、請求項16に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、組織再生のためのデバイスを処方する方法の技術分野に関する。この方法は、コンピューター支援設計（CAD）を、無固体形態（solid free−form）の製作技術と組み合わせて用い、移植され、細胞が接種され、そして新たな組織を形成し得る血管化ポリマー構造を形成する。
組織を再生する戦略は、臨床上の必要性の範囲に応じて進展しており、肝臓、膵臓および下垂体組織などの組織から損傷または遺伝的に存在しない代謝機能の補充、ならびに骨、軟骨および皮膚などの損傷または奇形連結組織の修復または再構築を含む。細胞の血管内注入により再生され得る血液または骨髄組織とは異なり、大部分の組織の再生には鋳型が必要である。
組織再生についての新たな治療は、細胞が患者中にデバイスとともに移植されるアプローチ、およびデバイスが正常組織の隣に移植され、そしてその組織の新しい領域への生長をガイドするアプローチを含む。後者の例は、骨折部位中に配置される骨再生デバイスであり、これは、骨折部位中への骨組織の成長をガイドする。種々の材料を用いて、骨再生のための無機または無機／ポリマーマトリックスを製作する。これは、サンゴ質レプラニ型（coralline replaniform）ヒドロキシアパタイト（これは、本質的に、Martin,R.Bら、「移植１年後のサンゴ質ヒドロキシアパタイトの骨内部生長および機械的特性」Biomaterials,14:341−348（1993）に記載されたような適合されたサンゴである）、およびArnold Caplanによる、米国特許第4,620,327号、第4,609,551号、第5,226,914号および第5,197,985号に記載されるような細胞成分を取り込むデバイスを含む。コンポジット材料もまた記載されている；しかし、それらは、主に、固定デバイス用に用いられており、骨内部生長用ではない。例えば、Boeree,N.Rら、「整形外科使用のための分解性コンポジットの開発：ヒドロキシアパタイト−ポリヒドロキシブチレートコンポジット材料の機械的評価」Biomaterials,14:793−796（1993）を参照のこと。
組織工学が、再構築手術および移植の目的のために、解剖学的組織および器官を生成することにより、ヒト治療法において補助する可能性を有する科学的分野として現れ出た。これは、材料科学の科学的分野、細胞および分子生物学、および医学を結びつけ、身体内の組織および構造の補充、修復および再構築のための新たなデバイスを生じる。多くのアプローチが、過去10年間にわたって唱道されてきた。１つのアプローチは、組織特異的組織を、開口多孔性ポリマーの足場（scaffold）と組み合わせることである。これは次いで移植され得る。多数の細胞が、細胞培養中のポリマーデバイスに添加され得、そして拡散により維持され得る。移植後、血管内部生長が生じ、細胞が作り替えられ、そして加水分解によりポリマーが分解するにつれ、新たな安定な組織が形成される。インビボにおける栄養源の拡散距離は約0.2mmに過ぎない。従って、0.5mmより厚い構造を計画する挑戦は、酸素を含む血液が担う栄養源の適切な供給を確実にすることである（Cimaら、J.Biomechan.Eng.113,143−151（1991））。
細胞のインビトロまたはインビボいずれかの生長のための組織再生デバイスを製作するために、多くのアプローチが記載されている。ポリマーデバイスが、器官機能を補充するため、または構造的支持を提供するために記載されている。このような方法は、Vacantiら、Arch.Surg.123,545−549（1988）、Yannasらによる米国特許第4,060,081号、Bellらによる米国特許第4,485,097号、およびSchmidtらによる米国特許第4,520,821号により報告されている。しかし、一般に、Vacantiら、およびSchmidtらにより用いられる方法は、細胞を用いた移植および接種のために、現存するポリマー繊維組成物を選択および適合することにより実施され得、その一方、YannasおよびBellの方法は、非常に特異的な改変コラーゲンスポンジ様構造を生成する。
組織再生デバイスは、相互連絡された孔を有して多孔性でなければならず、細胞および組織浸透を可能にする。孔サイズ、形状および曲折のような因子は、すべて組織内部生長に影響し得るが、標準的な加工技術を用いて制御することは困難である。Linda G.CimaおよびMichael J.Cimaによる1994年２月23日に提出された米国特許出願第08/200,636号「無固体形態製作技術による組織再生マトリックス」は、無固体形態製作技術、特にポリマー粉末の三次元プリント法の使用を記載し、解離した細胞を接種し、そして移植されて新たな構造を形成し得るマトリックスを形成する。生体適合性の合成または天然ポリマー、無機材料、または無機材料のポリマーとのコンポジットから特異的構造を構築する無固体形態法の利点は、ここで、得られる構造が、規定された孔サイズ、形状および配向、特に同じデバイス内で異なる孔サイズおよび配向を、デバイス内の異なる特異的部位で１つ以上の表面化学構造またはテクスチャーを備えていることは容易に明らかである。しかし、デバイスは、なお主要な制限を有している：移植細胞を持続する血管を形成するための新たな組織の内部生長は、移植細胞を持続するためにマトリックス内の増加する細胞密度に対して正しい時間に生じなければならず、そして他の組織は、マトリックスを被包または浸潤して移植細胞を塞ぎあるいは破壊してはならない。
従って、本発明の目的は、組織再生における使用のための、複合的、時間的および空間的パターンを備えたポリマーマトリックスの調製のための方法および組成物を提供することであり、この組織再生は、予備設計された血管系を有し、マトリックスを移植させ、現存する血液供給に連結し、そして即座に新たな組織または器官として機能する。
本発明の別の目的は、細胞を接種したマトリックスを培養する方法を提供し、管腔またはその他の脈管を形成する。
本発明のなお別の目的は、外分泌、排出、およびインビボにおける正常組織が伴うその他の機能のために、マトリックス内に、予め存在する管腔および導管を有する組織再生のためのマトリックスを提供することにある。
発明の要旨
無固体形態製作法（SFF）を用いて、組織再生を可能にする、および細胞を接種しかつ移植し付加的に生体活性薬剤の制御放出を提供し得る器官および構造成分を形成するデバイスを製造する。ここで、マトリックスは、移植細胞によって形成される、組織の天然に存在する血管系に機能的に等価な管腔のネットワークにより特徴付けられ、そしてこれは、内皮細胞により裏打ちされ、そして移植の時に、血管またはその他の導管と連結され、マトリックス中に、血管または導管ネットワークを形成し得る。本明細書で規定されるように、SFFは、一連の二次元層として複合三次元目的物を構築する任意の製造技術をいう。このSFF法は、種々のポリマー、無機およびコンポジット材料との使用に適合され、コンピューター支援設計（CAD）を用いて、規定された組成、強度および密度を有する構造を作成する。
SFF法の例は、立体リソグラフィー（SLA）、選択的レーザー焼結（SLS）、弾道粒子製造法（BPM）、融合沈着モデル法（FDM）、および三次元プリント法（3DP）を含む。好ましい実施態様では、3DPを用いて、マトリックス内にチャンネルおよび孔を正確に作成し、肝細胞のような、規定された機能を有する１つまたはそれ以上の細胞型のマトリックス中の引き続く細胞生長および増殖を制御し、そして細胞に行き渡って散在する、内皮細胞で裏打ちされた脈管ネットワークを提供する。リンパ管、胆管またはその他の外分泌管、尿管およびその他の排出管としての使用のために、その他の構造もまた形成され得る。
マクロ構造および多孔性パラメーターは、プリントパラメーター、ポリマーのタイプ、および粒子サイズ、ならびに溶媒および／またはバインダーを制御することにより操作され得る。マトリックス壁の孔隙率、およびマトリックスそれ自身は、SFF法、特に3DPを用いて操作され得る。腐食の間のデバイスの一体性を維持する構造的要素もまた取り込まれ得る。例えば、支持を提供するために、デバイスの壁は、再生する組織のミネラル供給源をさらに提供し得る再吸収可能な無機材料で充填され得る。最も重要なことは、これらの特徴は、個々の患者についてコンピューター支援設計（CAD）を用いて設計されかつ仕立てられ、デバイスの適合性に独自の特徴をもたせ得ることである。
【図面の簡単な説明】
図1aは、組織中の血管ネットワーク構造の略図である。図1bは、組織中の血管ネットワークに融着されたポリマーデバイスの略図である。
図２は、細胞接着を増大するために一般細胞接着分子でプリントしたポリマー（PLLA）チャンネルの領域Ａを有し、その一方、領域Ｂは、細胞接着を防ぐために界面活性剤でプリントされているデバイス構造の略図である。
図3aおよび3bは、血管構造をその中に含んで有する組織生成のためのポリマーデバイスの構築計画の略図である。
図4a、4b、4cおよび4dは、ラット肝細胞およびウシ内皮細胞を接種したポリマーマトリックスの顕微鏡写真である。図4aは、ウシ内皮細胞を接種したチャンネルのチャンネルを見おろす４×倍率のマトリックスであり、ここで細胞はチャンネルを裏打ちし、そして不規則矩形チャンネルが仕上がり始めている。図4bは、10×倍率の２つのポリマーチャンネルであり、チャンネル内で丸い同軸の層を形成する細胞を示す。図4cは、20×倍率の、内皮で裏打ちされた三次元ポリマーのチャンネルである。図4dは、各側面上で血管で裏打ちされた肝細胞の「ブリッジ」形成を示す。
発明の詳細な説明
無固体形態製作法は、組織工学用の医療用デバイスを構築するためにいくつかの利点を提供する。組織再生のためのデバイスは、個々の患者、個々の細胞型または器官構造に適合するように、および血管系の「骨格」をポリマー足場中に含んで構築され得る。欠陥内皮細胞および血管ベッドのその他の成分は、インビトロでポリマー鋳型に添加され、デバイスの移植に先立って無傷かつ機能的である血管ネットワークを形成し得る。デバイスの残りは、新たな組織が形成されるために必要なその他の細胞型の導入を可能にするに十分多孔性である。その他の細胞が、移植に先立って、移植時に、または移植後に、移植され得る。デバイスは、個々の患者の要求に仕立てられ得る。
SFF法を用いて、プリントされる材料の組成を変化させることにより、構造平面内で組成を選択的に制御し得る。複雑な多孔性ネットワークまたは特別の組成勾配を備えたような特別の微細構造は、CAD端末で設計され、3DPのようなSFFプロセスにより構築され得る。複合的な再吸収可能なまたは腐食可能な医療用デバイスは、構造要素を取り込み、腐食の間のデバイスの構造的一体性を確実にして構築され得る。
設計され、そして連続的な、無傷の、機能的ネットワークを形成した内皮細胞が接種されると、マトリックスは移植され、そしてデバイスを通じる流体流れが、適切な血管、組織または導管への「新血管」の融着により確立される。例えば、図1bに示されるように、正常組織における血流と等価である細胞への血流（図1a）が達成され、それによって、マトリックスのサイズおよび移植された細胞の数に関わらず、細胞の物質移動要求を満たす。
I.無固体形態プロセス：
三次元プリント法（3DP）．
3DPは、その教示が本明細書に参考として援用される、Sachsら、「CADキャスティング：三次元プリント法によるセラミックシェルおよびコアの直接製作」Manufactureing Review 5（２）,117−126（1992）およびSachsらによる米国特許第5,204,055号に記載されている。適切なデバイスは、連続ジェット流れプリントヘッドおよびドロップオンデマント流れプリントヘッドを備えたデバイスの両方を含む。連続型の高速プリンターは、例えば、Dyton、OhioのDiconix,Inc.により製造および販売されているDijitプリンターであり、連続様式で１秒あたり6000万液滴まで送達し得、そして１分あたり900フィートまでのスピードでプリントし得る約1,500ジェットを備えたラインプリントバーを有している。ラスターおよびベクター装置の両方が用いられ得る。ラスター装置は、ジェットのオンおよびオフとともにベッドを横切ってプリンターヘッドが前後に動く。これは、セッティングに際し、材料がジェットを詰まらせ易いとき問題を有する。ベクター装置は、ｘ−ｙプリンターに似ている。潜在的により遅いが、ベクタープリンターは、より均一な仕上がりを生じ得る。
3DPを用いて、バインダーを、粉末の連続的に沈着した層の選択された領域にインクジェットプリントすることにより固体の目的物を作成する。各層は、粉末の薄層を、粉末ベッドの表面上に広げることにより作成される。粉末ベッドは、各層の粉末拡散およびプリントに際し下がるピストンにより支持される（または、逆に、インクジェットまたは拡散器は各層のプリント後持ち上がり、そしてベッドは静止したままである）。各層に対する指示は、成分のコンピューター支援設計（CAD）表示から直接得る。プリントされる面積は、所望の平面と目的物のCAD表示との間の中間セクションの面積を計算することにより得られる。個々のスライスされたセグメントまたは層は、結合されて三次元構造を形成する。結合しない粉末は、一時的に成分の非連結部分を支持するが、構造が構築されるとき、プリント終了後除去される。
米国特許第5,204,055号に示されるように、3DP装置は、粉末ベッドの長さに沿ってシャトルの動きで相互に駆動される粉末分散ヘッドを備える。直線状のステッピングモーターアセンブリを用いて、粉末分散ヘッドおよびバインダー沈着ヘッドを動かす。分散ヘッドが鋳型の長さに沿って離散したステップで動くとき、粉末材料が決められた領域に分散され、例えば、約100〜200ミクロンの代表的な厚さを有する相対的に緩い層を形成する。複数の分配器を有するインクジェットプリントヘッドもまた、同じ往復様式でステッピングモーターアセンブリにより駆動され、粉末ヘッドの動きに従い、そして各腔の壁を示す選択された領域で液体バインダー材料のジェットを選択的に生成し、それによってそのような領域で粉末材料が結合されるようにする。バインダージェットは、分散ヘッドと実質的に同じ様式で動くプリンターヘッドのラインに沿って分散される。代表的なバインダー液滴サイズは、直径が約15〜50ミクロンの間である。粉末／バインダー層形成プロセスは、デバイスを１層１層構築するように繰り返される。
各層が横たわるとき、層が硬くなるまたは少なくとも部分的に硬くなる間に、一度所望の最終部分の形態が得られ、そして層形成プロセスが終了すると、いくつかの適用では、この形態およびその内容物は、適切に選択された温度で加熱または硬化されて粉末粒子の結合をさらに促進することが望ましくあり得る。さらなる硬化が必要であるかどうかに関わらずいずれの場合でも、緩い、非結合粉末粒子は、超音波洗浄のような適切な技法を用いて除去され、最終的なデバイスを得る。
3DP成分の構築は、個々のバインダー液滴を粉末ベッド中にプリントすることから得られる構造要素を一緒に編み上げるとみなされ得る。これらの要素は、微細構造原始（primitive）と呼ばれる。原始の寸法（dimension）は、その上を微細構造が変化し得る長さスケールを決定する。従って、生体活性薬剤の濃度が変化され得る最小領域は、個々の液滴原始の寸法に近い寸法を得る。液滴原始は、粉末ベッド中の単一ラインに沿った液滴の連続プリントにより形成されるライン原始の幅に非常に類似している寸法を有している。ライン原始の寸法は、単位ライン長さあたりプリントされる粉末およびバインダーの量に依存する。500μｍ幅のライン原始は、メチレンクロライドのような溶媒の1.1cc/分インクジェットプリントが、約45〜75μｍ間の粒子サイズを有するポリカプロラクトン（「PLC」）粉末ベッドのような粉末ポリマー上を８インチ／秒でたどる場合に作成される。より速いプリントヘッド速度およびより小さい粒子サイズは、より細いラインを生成する。原始の寸法は、液体バインダーまたは溶媒が原始を形成する粉末中の領域の孔を充填する必要があるという仮定に基づいて計算された寸法で表されるように見える。
より細い特徴サイズはまた、純粋溶媒よりもむしろポリマー溶媒をプリントすることにより得られる。例えば、クロロホルム中の10wt％PLC溶液は、上記と同じ条件下で200μｍラインを生成する。より高い溶液粘度が、原始の中央から溶媒が離れる移動を防ぎ遅延させる。
溶媒乾燥速度は、3DPによるポリマー部分の生産で重要な変数である。非常に急速な溶媒の乾燥は、プリントされた成分をゆがめさせる傾向がある。すべてではないにしても大部分のゆがみは、低蒸気圧の溶媒を選択することによりなくし得る。従って、クロロホルムをプリントすることにより調製されたPCL部分は、ゆがみがほとんど検出されない一方、メチレンクロライドを用いて作成された大部分は、顕著なゆがみを示す。粒子間の最小のゆがみおよび適切な結合を達成するために溶媒を組み合わせることがしばしば便利であることが見いだされた。従って、攻撃的な溶媒は、小割合で、より低い蒸気圧の溶媒と混合され得る。
立体リソグラフィー（SLA）および選択的レーザー焼結（SLS）
SFF法は、これらの医療用デバイスの構築のための小スケールの組成および微細構造を制御するそれらの能力が特に有用である。3DPに加えて、本明細書に記載されるようにある程度まで利用され得るSFF法は、立体リソグラフィー（SLA）、選択的レーザー焼結（SLS）、弾道粒子製造法（BPM）、および融合沈着モデル法（FDM）である。
立体リソグラフィーは、光重合可能な液体ポリマー材料の浴の上面に向かって走査される集められた紫外線（UV）レーザーの使用に基づく。UVレーザーは、浴を重合させ、そこでレーザー光線が、浴の表面に衝撃を与え、表面および表面直下で第１の固体プラスチック層を生じる。次いで、固体層は、浴中に低下し、そしてレーザーで生じる重合プロセスが、次の層の生成のために繰り返され、以下同様に、所望のデバイスを形成する複数の重ねられた層が得られるまで繰り返される。各場合において、最も新しく生成された層は、次の層の生成のために、液体浴の表面のわずか下の位置に低下する。立体リソグラフィー用のシステムは、Valencia,CAの3D Systems,Inc.により製造され販売されており、これは、生体適合性ポリマー材料を用いる使用に容易に適合可能である。
SLSもまた、集められたレーザー光線を用いるが、緩く圧縮されたプラスチック粉末の領域を焼結し、粉末は１層１層付与される。この方法では、粉末の薄い層が、ローラー機構により平坦な表面上に均一に広げられる。次いで粉末は、高出力レーザー光線を用いてラスター走査（raster−scan）される。レーザー光線があたった粉末物質は融合し、その一方、粉末のその他の領域は離れたままである。粉末の連続的な層が沈着され、そして全体部分が完成するまで１つが別の上面でラスター走査される。各層は、それが先行する層に結合するに十分深く焼結される。医療用デバイスを製造する使用に適合可能な適切なシステムは、DTM Corporation of Austin,TXから入手可能である。
SLAおよびSLSは、このように、両方の技術においては、物質が積層され三次元形状を製造するという点において類似している。これら方法の組成を制御する使用は一次元制御に制限される。何故なら、各層の組成を変え得るだけであるからである。それにも関わらず、これらの方法は、一次元の組成制御が所望のすべてである場合、または孔隙率の変化のみが所望される場合、薬剤送達および組織マトリックスデバイスの構築に有用であり得る。制御された孔隙隙が、SLAおよびSLSを用いて、層表面上のレーザー経路を、デバイス中に残るべき領域のみを含むように単に規定することにより構築され得る。
しかし、SLAおよびSLSは、組織マトリックス前形態の構築に顕著な材料の束縛を課する。SLAは、生体接着剤に用いられるUVまたは可視光で硬化可能なアクリルシステム、または光架橋末端基で終結するポリエチレンオキサイド（PEO）前駆体のような光硬化可能材料のような、生体適合性固体を生じる光重合可能な前駆体との使用に限られる。このプロセスは、感受性の生体分子の存在で実施され得る。従って、薬物を取り込む構造が構築され得る。第２に、レーザー強度または横断速度の変化を用いて、層内の架橋密度を変化させ得、材料の性質を、ある位置からある位置まで特定部分で変化させ得る。SLSは、感受性の生体分子の取り込みが困難であるという欠点を有する。何故なら、粉末層を焼結するためそれを局所的に加熱する必要があるからである。それにも関わらず、高度に多孔性の構造が、PEO粉末のような低融点ポリマーを用いて構築され得る。レーザー強度または横断速度の変化により、局所的密度化の程度を制御する。従って、レーザー強度が高いまたは横断速度が低い領域はより高い密度を有する。
弾道粒子製造法（BPM）および融合沈着モデル法（FDM）
BPMは、インクジェットプリント装置を用い、ここで液体ポリマーまたはポリマーコンポジット材料のインクジェット流れを用いて、インクジェットプリンターが二次元グラフィックプリントを生成する方法に似た、コンピューター制御下で三次元目的物を作成する。デバイスは、連続的な断面を、１層毎、標的に、粒子と連続層との間に結合を生じる冷溶接または急速固化技術を用いてプリントすることにより形成される。金属または金属コンポジットに適用されるようなこのアプローチは、Troy,NYのAutomated Dynamic Corporationにより提案されている。
FDMは、熱または溶媒の存在により流体となるポリマー材料から形成される押し出し成形可能なフィラメントを位置させるＺ方向動きをするｘ−ｙプロッターを使用する。適切なシステムは、Minneapolis,MNのStratasys,Incorporatedから入手可能である。
BPM、FDMおよび3DPは、３つのアプローチのすべてが小面積に物質を沈着するという意味で関連している。従って、これらは、局所組成が任意の所望の三次元プロフィールについて規定および構築され得るという利点を提供する。組成制御は、構築に用いられる特定の装置の分解能により制限されるだけである。FDMは、小ノズルを通じて可塑的に変形可能な材料の細いフィラメントを押し出し成形することにより構造を構築する。このノズルは、所望の三次元構造を生じるような適切なx,yおよびＺ動作により構築表面の上に向けられる。同様に、BPMは、インクジェットプリントヘッドの動作制御を含み、小液滴の形態で物質を沈着する。液滴がプリントされる場所の適切な制御が、所望の三次元形状の構築を可能にする。3DPは２つの物質供給源を用いる：多孔性層を構築する材料とプリントされる材料である。
FDMとBPMを用いる局所組成制御は、複数プリント法または押し出し成形ツールの適用を必要とする。同様のアプローチが、複数プリントヘッドを用いることにより3DPを用いて追従可能である。あるいは、3DPを用いるとき複数液滴を同じ位置プリントし得、プリントされる溶液中に含まれる種の局所組成を増加し得る。
BPMおよびFDMを用いる孔隙率制御は、以下に記載のような、3DPを用いて実施され得る手法と類似の手法を用いて達成され得る。
II.マトリックス材料
ポリマーの選択
処理方法に依存して、マトリックスを形成する材料は、SLAの場合のように、溶液中に、またはSLS、BPM、FDM、および3DPの場合のように、粒子形態であり得る。好ましい実施態様では、物質はポリマーである。最初の方法では、ポリマーは、光重合可能でなければならない。後者の方法では、材料は、好ましくは、粒子形態であり、そして熱、溶媒、またはバインダー（接着剤）の付与により固化される。SLSおよびFDMの場合では、取り込まれる生体活性薬剤を高温に曝すことを避けるために比較的低い融点を有するポリマーを選択することが好ましい。
3DPの場合には、生体適合性材料を、好ましくは粒子形態で、または多孔性シートとして、固化および／または生体活性薬剤の取り込みのために可動ピストン上の固体プラットホームに付与する。ローラーがプラットホーム上で粒子を均一に広げる。次いで、溶媒／またはバインダーをポリマー粒子上に選択的にプリントする。各層が「プリント」された後、ピストンがポリマー材料を下げ、次の層を形成するためにこのプロセスが繰り返される。
粒子は、より球状の粒子が代表的にはより円滑に流動するが、繊維状またはロッド形状を含む任意の形状であり得る。粒子は、好ましくは、直径が10ミクロンまたはそれより大きい範囲が好適であるが、プリントの間で液体媒体中に拡散させ、そして乾燥させる場合より小さな粒子が用いられ得る。
多くの材料がマトリックスを形成するために一般に用いられる。特に指定しなければ、用語「ポリマー」は、マトリックスを形成するために用いられる任意の材料を含むために用いられ、これには、ポリマー、および重合または接着され得、一体ユニットを形成するモノマー、ならびに以下に論議される無機および有機材料が含まれる。好ましい実施態様では、粒子は、有機溶媒中に溶解し、そして溶媒の除去により固化し得る、合成の熱可塑性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ（アンハイドライド）、ポリオルトエステル、乳酸とグリコール酸のポリマーおよびその他のαヒドロキシ酸、およびポリホスファゼン、タンパク質ポリマー、例えば、アルブミンまたはコラーゲン、またはポリサッカライドのようなポリマーから形成される。ポリマーは、非生分解性、または代表的には、加水分解または酵素切断を経由する生分解性であり得る。マトリックスを形成するために用いられ得る非ポリマー材料の例は、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、緩衝化薬剤、および乳糖、ならびに溶媒よりもむしろ接着剤またはバインダーの付与による固化される薬物中で用いられる一般の賦形剤のような有機および無機材料を含む。細胞接着および生長用のデバイスの製造に使用するポリマーの場合、ポリマーは、細胞から適切な薬物学的応答、例えば、付着、移動、増殖および遺伝子発現を惹起するポリマーの能力を基に選択される。
光重合可能な、生体適合性の水溶性ポリマーは、トリエタノールアミン、Ｎ−ビニルピロリドン、およびエオシンＹのような開始剤を用いて生物学的に受容可能な条件下でアルゴンレーザーを用いて光重合され得るポリエチレングリコールテトラアクリレート（分子量18,500）を含む。オリゴ（d,l−乳酸）またはオリゴ（グリコール酸）のような加水分解可能なオリゴマーを用いて伸長されるポリ（エチレングリコール）中央ブロックを有し、そしてアクリレート基で終結する類似の光重合可能なマクロマーもまた使用され得る。
低融点を有する生体適合性ポリマーの例は、４〜８℃で溶融するポリエチレングリコール400（PEG）、20〜25℃で溶融するPEG600、および44〜48℃で溶融するPEG1500を含む。別の低融点材料は、70℃で溶融するステアリン酸である。
他の適切なポリマーは、その教示が本明細書に参考として援用されるThe Polymer Handbook、第３版（Wiley,N.Y.,1989）を参照して得られ得る。
好適な材料は、ポリラクチド／ポリグリコリドファミリー中のポリエステルである。これらのポリマーは、薬物送達および組織再生領域において多くの理由により多いに注目されている。これらは、20年以上にわたり外科縫合に用いられており、食品薬品局（FDA）で認可され、そして長期間かつ好ましい記録を有している。広範な物理的特性および分解時間が、ラクチド／グリコリドコポリマー中のモノマー比を変えることにより達成され得る：ポリ−Ｌ−乳酸（PLLA）およびポリ−グリコール酸（PGA）は、高い程度の結晶度を示し、そして比較的ゆっくりと分解する。その一方、PLLAとPGAのコポリマー、PLGAは、無定型でありそして急速に分解する。真の表面腐食ポリマー、例えば、ポリアンハイドライドを開発する試みがなされているが、ポリマー組成とデバイス特性の相関関係は、標準的な製作技術によって実際に制御することは非常に困難である。これらの課題は、本明細書に記載される処理技術を用いて回避される。
骨に仕立てられる微細構造には、最終デバイス中の無機粉末が、デバイスの強度を増加し、そして再生組織のためのミネラル供給源を提供する。肝臓のような軟組織の強度要求は、骨に対するより実質的に少なく、最終デバイス中のより大きな空隙画分が許容され得る。
これらのデバイスは任意のSFF技術により作成され得るが、好ましい方法は3DPである。１つのアプローチでは、無機粉末がベッド中に拡散される。この粉末は、一般に、ある形態のリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトであり、そして天然の供給源から得られ得（例えは、動物の骨から単離される）、または合成により作成された粉末である。粉末が骨から単離される場合（例えば、Glenn Mills Milling manchine中で骨を粉砕することにより）、それは厳密には無機ではなく、天然タンパク質およびその他の生物学的マクロ分子を含み得る。粉末は、好ましくは、再吸収可能または生分解性である。粉末サイズは、壁厚および層厚さの分解能を制御する。直径が40ミクロン以下の粉末は、100ミクロン以下の分解能を得るために好適である。分解能は、一般に、粉末サイズの寸法の少なくとも２倍である。代表的には直径が１ミクロン以下の非常に微細な粉末が、溶液としてベッド中に拡散され得、次いで、それは乾燥され、またはこのような粉末は、3DP機械の外側の別の工程で、非特異的な相互作用により、薄い、一般に100〜200ミクロンの間の厚の、粘着性の、多孔性シートに成形され得、そして得られるシートは、通常のローリングおよび拡散操作の代わりに、各層が構築されるとき、ベット中に横たえられ得る。層は、好ましくは、厚さが少なくとも２〜５ミクロンの間、より好ましくは、10〜20ミクロンの間、そしてより代表的には、100ミクロン〜1mmの間である。骨由来のアパタイトは、このように処理され得る無機粉末の例である。骨由来のアパタイトは、平均寸法が0.003×0.009×0.04ミクロンの粒子を有する。
バインダーの選択
好ましい方法3DP、ならびにSLAおよびBMPで溶媒および／またはバインダーが用いられる。
バインダーは、ポリマーおよび／または生体活性薬剤用の溶媒、またはポリマー粒子を結合する接着剤であり得る。熱可塑性ポリマーの大部分に対する溶媒は公知であり、例えば、メチレンクロライドまたはその他の有機溶媒である。タンパク質およびポリサッカライドポリマーに対する有機および水性溶媒もまた公知であり、タンパク質の変性を避けるべき場合には、例えば、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドのような架橋剤を含む水性溶液が好適である。しかし、いくつかの場合では、タンパク質の変性により結合が最良に達成され得る。
バインダーは、従来の粉末処理方法で用いられるのと同じ材料であり得、またはプリント後粉末ベッドで起こる化学的または物理的変化により、例えば、加熱、光重合、または触媒の結果として、同一のバインダーを最終的に生じるように設計され得る。
生体活性薬剤用の溶媒の選択は、所望の放出様式に依存する。腐食し得るデバイスの場合では、溶媒は、マトリックスを溶解するか、または第２のポリマーおよび／または沈着される薬物を含むように選択されるかのいずれかで選択される。第１の場合には、プリントされた液滴は、局所的にポリマー粉末を溶解し、そして蒸発し始める。薬物は、蒸発後、効果的にポリマー粉末中に沈着される。何故なら、溶解されたポリマーが薬物と一緒に沈着されるからである。薬物とポリマーの両方がプリントされた溶液中に溶解される場合は、粉末層が溶媒中で可溶性でない場合有用である。この場合、結合は、ポリマー粒子間の首部における薬物ポリマーコンポジットの沈着により達成される。
攻撃的な溶媒は、粒子をほぼ完全に溶解する傾向にあり、そして乾燥に際し、密なポリマーを再沈澱させる。乾燥のための時間は、主に、溶媒の蒸気圧により決定される。より低い溶解度と比較して、１つの極端、例えば、１つの層をプリントするために必要な時間の間に、ポリマーを非常に急速に溶解させる。30重量％溶解性であるような、ポリマーが非常に可溶性である範囲が存在する。粒子が攻撃される程度は、粒子サイズおよび溶媒中のポリマーの溶解性に依存する。微細な粉末は、より大きな粒子サイズを有する粉末より完全に溶解する。
バインダーおよびポリマー濃度
バインダーは、クロロホルム、またはクロロホルムとゆがみを最小にするエチルアセテートのようなより揮発性の少ない溶媒の混合物中の、分子量が50,000〜200,000のポリ乳酸またはポリカプロラクトンのような再吸収可能なポリマーであり得る。
バインダー溶液中のマトリックス材料濃度は、一般に、ノズルによって適応され得る限度である、送達される物質の量を最大にし、そして液滴の弾道衝突点から離れる溶媒の移動を最小にする両方であり、それによってライン幅の分解能を最大にする。ポリマー濃度の上限は、分子量100,000のポリ−Ｌ−乳酸について15％である。このポリマー濃度は、ある場合には、１パスのプリントでは、不十分であり得る；より大きな粉末で作成されたデバイスは、この量のポリマーでは粘着性であり得る。プリントされる物質の量は、プリント溶液に少量のラテックスまたはその他の粒子を含めることにより増加され得る。例えば、ポリグリコール酸（PGA）は、クロロホルムまたはエチルアセテートに可溶性ではない。PGAのナノ粒子を、プリント溶液中に含め得（直径が７ミクロンまでの粒子はノズルを通じて収容し得る）、プリントされるポリマー内容物を増加する。30重量％ポリマーを含むラテックス（EudragitTMは市販されているアクリルラテックスである）は、現存する機械で困難なくプリントされた。
ベッド中にプリントされる物質の量はまた、ポリマー溶液中に無機小粒子、例えば、骨由来のアパタイトを含めることにより増加し得る。
ベッド中にプリントされるポリマーの量を増加する別のアプローチは、第１の層が少なくとも部分的に乾燥した後、次の層に移動する前に、第２のまたはより多いパスをプリントすることである。
デバイス特徴のテクスチャーを改変する手段
例えば、1cm×1cmで100ミクロン厚さの特徴の「壁」は、それが、ベッドの深さに沿って層の後、層の後に単一のライン層をプリントすることにより構築されるとき、１つの層内で連続ラインのシートをプリントする場合に比べて異なるテクスチャーを示す。層の後に、ライン層をプリントすることにより構築された壁は、両側面にテクスチャーを有し（粉末のある部分が接着する）、そしてそのテクスチャーは、各側面で同一である。対照的に、同一層内で、連続ラインを用いてプリントされたシートは、多くの場合、各側面で異なるテクスチャーを有する。「底」は、ポリマー壁の塊中への粉末の不完全な吸収により影響されるテクスチャーを有する。「上面」は、より多くのバインダーが、粒子を覆うプリントされたラインの上面で本質的に捕獲されるので、滑らかであり得る。しかし、プリントされたバインダー中の低ポリマー濃度では、「シート」の上面はまた、顕著なテクスチャーを示し得る。何故なら、バインダーは、粘度がより低く、そして粉末中により容易に浸透し得るからである。
シート中のテクスチャーは、粉末中のバインダー濃度により、および連続ライン間の間隔によりの両方に影響される。例えば、４〜12cm/秒のプリント速度を用いて75〜100ミクロンの粉末サイズを有するPCL粉末中にプリントされたクロロホルム中の15％PCL溶液は、25ミクロンの間隔でプリントされた場合滑らかな層を生成するが、75ミクロンの間隔でプリントされた場合、高度なテクスチャー表面を形成する。
テクスチャーのこれらの影響は、最適組織再生速度を得るデバイスを設計することにおいて有益であり得る。矩形断面の単一チャンネルは、１つの側面または２つの側面上に滑らかな表面を、そして他の側面上にテクスチャー表面を有し得る。滑らかな表面は、急速な細胞移動を可能にし得、その一方テクスチャー表面は、細胞が分化する部位を提供し得る。
コンポジットデバイスの形成
コンポジットデバイスは、無機および有機成分を組み合わせることにより作成され得る。特に、デバイス中のマトリックス材料の量を、無機粉末ベッド中にマトリックス材料の溶液を１パスのプリントにより、例えば、ポリマーラテックスをプリント溶液中に添加することにより得られ得る量を超えて増加させることが所望され得る。別の方法は、ポリマー粉末を無機粉末と混合することである。なお別の方法は、ベッド中にポリマー粉末のみを拡散し、そしてポリマー粉末を一緒に結合する溶媒中の無機粒子の分散液（30容量％まで）をプリントすることである。この例は、クロロホルム中のアパタイト粒子の溶液を、PLA粉末ベッド上にプリントすることである。あるいは、ポリマーバインダーを無機分散液とともに、例えば、30容量％粒子を、クロロホルム中のPLAの５重量％溶液に添加することにより、含ませ得る。極端で例では、ベッドには、材料を全く含まず；無機および有機材料の両方がノズルを通じてプリントされ得る。
取り込まれ得る生体活性薬剤
デバイス中に取り込まれ得る生体活性薬剤に本質的に制限はない。これらの物質は、スプレー乾燥、噴霧、粉砕、またはその他の標準的方法を用いて粒子に処理され得るか、またはこれらの物質は、エマルジョン化、マイクロパーティクル、リポソーム、またはその他の小粒子に形成され得、そしてそれは好ましくは、化学的に安定に残存し、ポリマーマトリックス中で生物学的活性を保持する。
生体活性薬剤はまた、原則的には構造的役割を有する化合物、例えば、骨再生用マトリックス中のヒドロキシアパタイト結晶を含む。粒子は、マトリックスを作成するために用いたポリマー粒子の粒子サイズより大きいまたはより小さいサイズを有し得る。
例として、一般に、特にそうでないことが示されない限り、本明細書で「生体活性薬剤」として呼ばれるのは、タンパク質およびペプチド、核酸、ポリサッカライド、核酸、脂質、および非タンパク質有機化合物および無機化合物を含む。これらの物質は、生物学的効果を有し、限定されないが、抗炎症剤、抗微生物剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、ホルモン、抗酸化剤、チャンネルブロッカー、およびワクチンを含む。生物学的効果を発揮しない、空気、バリウムのような放射線不透過性材料、またはその他の造影剤などを取り込むことも可能である。
組織再生マトリックス用の好ましい実施態様では、細胞増殖、分化、および／または移動モジュレーターが、孔およびチャンネルと同じレベルの分解能で、デバイスの特異的領域中に取り込まれる。これらの物質は、Sigma Chemical Companyのような供給者から市販されており、そして文献に詳細に記載されている。
生体活性薬剤の取り込みのパターン
生体活性薬剤を取り込む２つの原則的な方法がある：ポリマーマトリックス内の分散、および離散ポリマーマトリックス内の離散ユニットである。最初の場合では、生体活性薬剤は、好ましくは、ポリマー粒子バインダー中に付与される；第２の場合には、生体活性薬剤は、ポリマー粒子に対して非溶媒中で付与される。
SLAの場合、取り込まれるべき生体活性物質は、液体マトリックス材料中に分散される；他のすべての場合では、取り込まれるべき生体活性材料は、SLSおよび3DPの場合物質の有意な廃棄をもたらすが、粒子と混合され得る；これらの場合には、生体活性物質を溶媒またはバインダー中に取り込むことが好ましい。
例えば、デバイスは、PLA、PGA、およびそれらのコポリマー（PLGA）のような、分解可能なポリマーのマトリックス中に分散または包埋された生体活性薬剤の粒子からなり得る。デバイスの移植後、ポリマーマトリックスは、ゆっくりと加水分解および腐食する。生体活性物質の放出速度は、正味の拡散よりもむしろポリマーの腐食速度により決定される。従って、薬物放出速度は、マトリックス中の薬物の分布により、またはポリマー微細構造の変動により制御され得、腐食速度は、デバイス中の位置で変動する。デバイス表面から離れた位置で周期的である薬物濃度プロフィールは、例えば、ポリマーが腐食するにつれて、周期的な時間の薬物放出速度を生じる。ポリマー組成または孔隙度の周期的変動によっても同じ効果が達成され得る。
別の実施態様では、生体活性薬剤は、以下の方法で、製作の間にポリマー構造の表面上に吸着により取り込まれ得る：バインダーのラインを印刷する（例えば、ポリ（Ｌ−乳酸）（PLLA）に対してクロロホルム）、次いで、このラインに隣接して、繊細芽細胞生長因子（FGF）−ヘパリン血管形成因子混合物をその中に含む水性溶液のラインを印刷する。FGF−ヘパリンは、溶液からポリマー表面上に吸着し、局所的に血管形成因子を提供する。
構造要素の取り込み
腐食するデバイスの実際の適用は、腐食の経過の間のデバイスの機械的一体性により制限される。真の腐食可能なデバイスは、単に表面に限定される反応により分解しない。むしろ、表面および塊の微細構造は、腐食の経過の間に発達し、そして薬物が送達される速度を改変する。例えば、経口腐食可能デバイスは、孔をあけ、そして破壊されて離れ、流体に曝される表面領域を変え、そして薬物が放出される速度を変える。再吸収可能なポリマーデバイスは、加水分解の前に膨潤し、それもまた薬物の非直線状放出をもたらす。
同じまたは異なるポリマー粒子を用いて作成された構造要素が、デバイス内で設計され得、分解の間に、腐食可能なデバイスに伴う多くの課題を避けるように、物理的構造支持を提供する。3DPを用いて、ポリマー粒子の固化により形成されたデバイス内に、例えば、異なるポリマー材料の面積または領域の沈着により、分解ポリマーの領域内の非分解ポリマーの領域のような、構造要素を生成し得る。
デバイス中の孔隙度の制御
3Dプリントデバイス中の孔隙度は、特徴サイズのレベルで（10〜20ミクロンの間またはそれ以上）、または特徴サイズ以下のレベルのいずれかで生成され得る。特徴サイズのレベルは、孔隙度は、特徴が配置される場所により制御され、そしてそれ故孔サイズおよび形状は、三次元で変化し得る。
特徴サイズ以下のレベルの孔隙度は、種々の方法で生成され得る。
（１）ポリマー中に溶解しない、そして次いでポリマーに対して非溶媒で浸出され得る粒子のベッド上にポリマー溶液をプリントする。この場合、デバイスを形成するポリマーは、塩、糖またはポリエチレンオキシドのような粒子のベッド上にプリントされる。プリントプロセスが終了した後、デバイスを粉末ベッドから取り出し、そしてポリマーに対して粒子を溶解する非溶媒中に置く。例えば、クロロホルム中のポリ乳酸を、糖粒子のベッド上にプリントし得、そして次いで糖は、水で浸出され得る。
（２）プリントされた溶媒中に部分的に可溶性である粒子のベッド上にポリマー溶液をプリントする。例は、ポリ乳酸溶液をポリエチレンオキサイド粒子のベッド上にプリントすることである。この手順は、PLAの表面中へのPEOの内部浸透を可能にし得、そして最終デバイスの表面特性を改善し得る。プリント後、PEOは水で浸出され得る。
（３）ポリマー溶液を、ポリマーの加熱ベッド上にプリントする。例は、クロロホルム中のポリ乳酸を、100℃まで加熱したPLA粒子のベッド上にプリントすることである。クロロホルムの沸点は60℃であり、そしてそれ故、それは粒子ベッドにぶつかると沸騰し、泡を形成させる。
（４）ポリマー溶液を発泡剤を含むベッド上にプリントする。
（５）粉末に対して小溶解度のみを有する溶媒とともにプリントする。このようにして、小量のポリマーのみが、粒子間の首部で沈着され、粉末ベッド中でもとの孔隙度の大部分を残す。例えば、PCLは、アセトン中にわずかに溶けるのみであり、そしてアセトンは、比較的高い蒸気圧を有する。従って、非常に少量のポリマーが溶媒が乾燥する前に溶解される。従って、粒子間に形成される首部は小さくそして得られる成分の孔隙度は、大部分もとの粉末ベッドのそれと同じである。
改変表面特性を有するデバイス
デバイスの選択された領域における表面特性を改変することもまた、重要であり、そして表面活性薬剤を含む溶液を、バインダーがプリントされる場所の間における領域またはライン中にプリントすることにより達成され得る。本明細書で用いられるように、「表面活性薬剤」は、RGDペプチドのような、細胞接着を促進し得る薬剤、または、界面活性剤のような（例えば、ポリエチレングリコールまたはPluronicTM（ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドブロックコポリマー））、細胞接着を阻害する物質であり得る。表面活性薬剤は、一般に、バインダーをプリントするために用いる溶媒と不混和性の溶媒中に含まれるべきである。
例えば、RGD接着ペプチドのような接着ペプチドを、特定のチャンネル（例えば、血管内部生長のためのチャンネル）中に取り込むことが所望され得る。PeptideTMのようなTelios（LaHoya,California）により市販されている疎水性テイルを有するペプチドのような接着ペプチドは、水中に溶解し、そして第２のセットのプリントノズルを用いて「空隙」中にプリントし得る。比較的非揮発性の溶媒である水を添加することは、バインダーをプリントした領域から溶媒除去の動力学を改変し得る。例えば、水を添加することは、蒸発のための表面領域を閉塞することにより溶媒除去を遅延し得、そしてゆがみ減少を補助し得る。ポリマー表面との接触に際し、ペプチドは、溶液からポリマー表面上へ吸着する。
表面はまた、改変されて細胞接着を防ぐ。これは、周辺組織からデバイス中に過剰の軟連結組織内部生長を防ぐために所望され得、そして、例えば、空隙中に、PluronicTM（BASF）またはpoloxamerTMの水性溶液をプリントすることにより達成され得る。このようなコポリマーの疎水性ブロックは、チャンネルの表面に吸着し、この疎水性ブロックは水相中に伸びる。吸着されたPluronicTMを表する表面は、タンパク質およびその他の生物学的マクロ分子の吸着に抵抗する。他の吸着を防ぐ物質は、その教示が本明細書に参考として援用される、Lee,J.H.,J.Kopecekら、「PEOを含むブロックコポリマー界面活性剤により調製されたタンパク質抵抗性表面」J.Biomed.Mat.Res,23:351−368（1989）に記載されている。
デバイスの「壁」が（クロロホルムのような）有機溶媒でなお「湿って」いる間表面活性薬剤でデバイスをプリントすることは、接着を防ぐ物質の壁への吸着を増加し、そして疎水性ブロックが表面中にブレンドされるようになることさえ可能にし、得られる表面改変の安定性を増加する。
細胞は、選択的表面化学品を局所的に用いてマトリックス中の特定部位に位置され得る。図２についていえば、細胞は、任意のいつかの方法でマトリックス内の特定部位を標的にし得る。
（１）ポリマー（PLLA）チャンネルの領域Ａは、細胞接着を増加するフィブロネクチン、コラーゲン、またはラミニンのような一般的な細胞接着分子でプリントされ、領域Ｂは、細胞接着を阻害するためにPluronicR68（ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロックコポリマー）のような界面活性剤でプリントされる。表面改変剤をプリントすることは、所望の表面改変剤の水性溶液を、チャンネルを形成するためにプリントされたバインダーラインの次のラインにプリントすることにより達成され得る；タンパク質または界面活性剤は、水性溶液からポリマーの表面に吸着される。あるいは、表面改変剤は、バインダー自身とともに含まれ得る。タンパク質を含む界面活性剤は、バインダー中に非常に低濃度、0.1〜１重量％で含まれるとき、表面特性を改変し得る。これらの濃度では、塊の性質における変化は小さい。最初の時間には、実質細胞が接種され、そして領域Ａに接着するが、領域Ｂには細胞は接着しない。培養の約１〜２週間後、内皮細胞または別の細胞型が実質細胞の上面に接種され得る。領域Ｂは、第２の細胞型が接種される前に、フィブロネクチンのような接着タンパク質の水性溶液で処置することにより改変され得、これは、界面活性剤を置き換え、そしてそれ故、先にはマトリックスのすべての内側表面上に内皮細胞による完全コーテイングを可能にすることが阻害されていた領域中に細胞接着を可能にする。
（２）領域Ａは、１つの細胞型に選択的な分子で、そして領域Ｂは、別の細胞型に選択的な分子でプリントされ得る。このような分子は、一般に、PLLAおよびポリ（乳酸−グリコール酸）（PLGA）の表面に強力に吸着する強力な疎水性成分（Cell−Takにおけるような市販の試薬）に連結された、内皮細胞についてのREDVまたは肝細胞についてのガラクトースのような、高度に特異的な小リガンドを含む。このことは、最初の時間に、１つ以上の細胞型が接種されたとき、空間的分離を可能にする。
III.組織工学のための前形態の構築
無傷の組織構造の再生は、隣接する健康な組織の生長の刺激により生じ得（例えば骨欠陥の治癒）、または患者自身の組織または組織適合ドナーの組織のいずれかを用いて別の部位からの細胞の移植を必要とし得る（例えば、新たな軟骨構造の生長、肝臓の補充）。いずれの場合にも、新たな組織の生長を補助する足場または鋳型として供されるデバイスがほとんどすべての場合に必要である。このデバイスは多くの機能を供し得る。こちらは：（１）移植された細胞に対する固定化部位として、（２）創傷ベッド中への軟組織脱出を防ぎ、そして分化組織を伴う治癒を可能にする保護的空間の形成、（３）デバイスの表面性質を経由して細胞を移動または生長させること、および（４）生長因子、ホルモン、またはサイトカインのような可溶性分子の放出を経由して細胞を移動または生長させること、を含む。
上記の３つの適用、および考案され得る組織再生におけるその他の適用には、3DPは、生分解性ポリマーを処理するための現在の技術に対して少なくとも３つの利点を提供する：（１）仕立てられた巨視的形状、（２）良く規定された微細構造、これは、福峰性の孔サイズ分布および方向が配向された孔およびチャンネルを含み得る、（３）特定部位における因子の制御放出を提供するための製造の間の生長因子の取り込み、および（４）デバイス内の点から点への細胞接着、移動、および機能を制御するための選択された孔およびチャンネル中の表面特性を局所的に制御する能力。
本明細書で用いられる用語「組織」は、実質組織（肝臓、すい臓、腸、および代謝機能を有するその他の組織）、血管、皮膚、ならびに軟骨および骨のような連結組織のような両軟組織を含む。
マトリックス構築は、各組織タイプにより異なるが、構築に用いられる方法は、代表的には同じであり、適切な形状、ならびに孔サイズ、ならびに血管およびその他の脈管（リンパ、神経、外分泌および排出機能のための脈管）用の管腔を生成するために最適化されている。事実上、すべての組織はリンパ排出を必要とする。その他の特異的な管構造は、肝臓中の胆管、胸中の乳管、および腎臓中の細管を含む。これらの管構造は、共通に、組織を貫通する小（２〜50ミクロン）脈管から直径が1mmまたはそれ以上の大きな収集小管への脈管サイズにおける漸次的変化を有し、そして管構造は、代表的には分岐している。分岐構造はまた、神経内部生長のために供し得る。
一般に、相互連結された孔またはチャンネルは、外部から内部中に伸び、代表的には、直径が0.15〜0.5mmの間で、約30〜300ミクロン厚さの壁により分離され、固体または約５〜80ミクロンの平均孔サイズを有する多孔性のいずれかである。マトリックス内の脈管の特定の配置は、灌流されている組織に依存する。肝臓のような、代謝的に高度に活性な組織では、細胞は、血流から１つまたは２つの細胞層を超えて、10〜20ミクロンの距離をおいて離れることはない。別の極端な例では、健康な軟骨では、血管はなく、それは厚さが1mmまたはそれ以上であり得る。骨のような組織は、中間であり、細胞は、空間中でまばらに分布し、そして代謝的には比較的静かである。代謝的に活性な細胞による酸素の容量消費速度Qoxygenは、約３×10-5mmol/cm3細胞塊である（Cima、Ph.D.学位論文、University of California at Barkeley,Chemical Engineering 1988）。ここで細胞塊は、「密にパックされている」と考えられる。皮質骨のような組織組織中では、組織容積中の細胞の画分は約10％に過ぎず、そしてQoxygenは、組織を基礎にして計算されたとき相当して減じられる（即ち、組織消費速度は、約0.3×10-5mmol/cm3細胞塊であり得る）。次いで、組織に適切な酸素（制限栄養源）を供給するために必要な血液または培養培地の流速は、以下の式で表される：
0003583142.tif 000002
ここでＦは容積流速、Qoxygenは酸素の容量消費速度、coxygenは組織に至る動脈中の酸素濃度、そしてVcellular tissueは、血液溶積自身を含まない、組織要素の容量である。酵素の供給は、組織から離れる血管中の酸素濃度が動脈中の酸素濃度の少なくとも50％である場合「適切」であり；これは前因子２を導く。空気で飽和された標準的な組織培養培地については、coxygen＝0.16×10-3mmol/mlである（Cima,Ph.D.学位論文）。血液については、濃度はヘモグロビンの存在に起因してより高く、そして動脈血coxygenは、約0.8×10-3mmol/mlである。従って、肝臓については、組織1cm3あたり23ml/分の培地流速が必要であり、そして対応して必要な血流は組織1cm3あたり約4ml/分である。骨については、これらの流速は、それぞれ約２および0.4ml/分である。
血流の適切な分布のための導管を提供するためのチャンネルの配置は、（１）利用可能な圧低下駆動力、および（２）拡散距離を考慮しなければならない。αである組織の細胞性画分（例えば骨はα＝0.1）が指定されれば、任意の直径チャンネルを通じて流れる血液または培地により支持され得る組織層の厚さは、約50/αである、何故なら、「密にパックされた」組織中の酸素の拡散距離は、約50ミクロンであるからである。ポリエステルのような生分解性ポリマーについて３−DPまたはその他の類似のSFF技術を用いる、直系150ミクロンの配向したチャンネルおよび３〜50ミクロンのオーダーの微小孔は、粉末ベッド中の賦形剤を用いて生成され得る。図1aは、組織の正常血管系の略図である。適切なインビトロ組織建築を生成する１つのアプローチは、図1bに示されるような分岐システムを構築することであり、ここで暗いラインは、マトリックス中に作成されたチャンネルを示す。陰の領域は、周辺マトリックスより急速に再吸収する材料でプリントされた領域を示す。インビトロで組織を生成するために、デバイスに最初実質細胞の層が接種される。この層は、集団が倍化するために約１週間培養中に維持され得る。それは、内部の細胞に適切な酸素供給を確実にするために灌流リアクター内に維持され得る。次いで、デバイスに、内皮細胞の層が接種され、そしてさらに培養される。マトリックスが急速に再吸収される領域で、組織は拡散し得、そして陰の領域の中央にある導管から生長する毛細管で浸透されるようになる。これらの導管は、直径が150〜300ミクロンである。陰の領域の各々は直径が0.5〜2mmである。陰の領域に包埋されない導管については、導管を形成するマトリックスは、比較的ゆっくりと再吸収し、これらの血管が主要血管であることを確実にする。培養にある間、培養培地はまた、導管を通じて循環され得、血管が開放されたままであることを確実にする助けとなる。
理想的には、組織再生のために用いられるデバイスは、患者の特定の必要性に合わせた様式とされ得る特定の巨視的形状を有する。例えば、患者の１つの側の顎骨のなくなった一片の下顎補充では、損傷していない側にある骨に正確に一致するように、デバイスを製作するCADプログラム中に現存する骨のMRIイメージを入力することにより製作される。さらに、デバイスは、理想的には、組織内部生長のために相互連結された孔およびチャンネルの特別に仕立てられた微細構造を有し、ここで孔およびチャンネルは、三次元内で、正確に規定されたサイズ、形状、表面化学および位置にある。例えば、骨内部生長の場合では、骨内部生長のために大きな軸方向のチャンネル、および隣接する骨からの血管、および骨膜組織からの血管の内部生長のためのより小さな横断チャンネルが存在し得る。
軟組織に仕立てられる微細構造には、最終デバイスの成分として無機粉末を有することは所望されない。しかし、クロロホルムまたはメチレンクロライド中のPLAのようなポリマーの溶液を、無機粉末ベッド上へまたはポリマー／無機混合ベッド上へプリントすることは、塩化ナトリウムのような水溶性無機粉末が用いられる場合、最終デバイス中で増加した孔隙度を生成するための技術である。有機溶媒は、市販の薬物送達デバイスの製造で日常的になされているように、真空処理により除去され得る。超臨界二酸化炭素もまた、塩素化溶媒の痕迹を除去するために安全溶媒として用いられ得る。溶媒除去は、各層を、プリントプロセスの間に乾燥させることにより促進され得、それによって、デバイスから次の溶媒除去のために真空下で必要な時間の長さを減少する。
粉末の第１の層が拡散された、またはSFFデバイスのベッド中に配置された後、バインダーが、壁を有することが所望される位置でプリントされる。バインダーがプリントされない場所は、プロセスの終わりで粉末が除去されるとき、チャンネルまたは空隙になる。長い骨折の修復デバイスには、好ましい設計は、直径が60〜300ミクロンのまっすぐなチャンネルを有し、約60〜150ミクロンの壁がデバイスの端から端までの長さを走り、隣接する骨がデバイス中に生長することを可能にし、そして直径が約60〜100ミクロンのチャンネルを横切り、それは、血管の骨膜領域からの内部生長を可能にし、または本明細書の他で記載したようである。横切るチャンネルは、中で生長する血管の必要性の予想から、軸方向チャンネルほど数が多い必要はないけれども、デバイスの全体の空隙画分は、80％以上に維持すべきである。100ミクロン程度の薄い横断壁を有することが望ましくあり得る。最も外側の層はまた、接近可能である内部チャンネルの数を制限することにより骨膜領域からの過剰の組織内部生長防ぐように設計され得る。
血管の形成
血管は、天然に存在する血管構造のパラメーターを開始するように設計される。管腔の直径は、次に接種された内皮細胞が増殖して管腔壁を覆うための厚さを補償するために増加される。生分解性ポリマーを用いてマトリックスを形成する好ましい実施態様では、マトリックスは、最終的に、分解されて事実上天然の血管と区別できない血管を形成する接種細胞のみを残す。標準的な方法は、血管相当物を形成するために要求される詳細の必要なレベルを達成し得ない；これは無固体技術では問題ではない。何故なら、分解能のレベルはそのように小さいからである。血管管腔は、マトリックス中で相互連結され、１つまたはそれ以上の入口が移植のときに１つまたはそれ以上の動脈に融着され、そして１つまたはそれ以上の出口が１つまたそれ以上の静脈に融着される。複数の相互連結を有することが好ましく、そして移植のときに手術による連結を必要とするポートはほとんどない（このような手術は、肝臓、肺、心臓、およびその他の組織のような移植組織を移植する移植外科医には完全に日常的であるが）。連結は、より日常的な補綴片が血管、食道またはその他の管状構造中に挿入されるのと同じ方法でなされる。
本明細書で用いられる「動脈」および「静脈」は、その分岐が毛細管ネットワーク中至るにまたはそこから出得るすべてのサイズの血管をいう。
本発明は、3DPを用いる組織再生マトリックスの構築のためのプロセスの以下の非限定的実施例によりさらに例示される。
実施例1:組織再生マトリックスの産生
組織再生デバイスを、45〜75ミクロン範囲にふるいをかけたPLLA粉末の3DPを用いてプリントした。
構築戦略は、図3aと3bに概略的に図示され、以下のようであった：
第１から第６の層:1×3cmのシートをプリントする。
第７から第17の層：図3aに示すように、両方の外側のエッジの長さに沿って750ミクロンラインで外壁を形成し、全体の中央に300ミクロンのラインおよび中央300ミクロンラインと外側750ミクロンラインとの間の中央に走る300ミクロンラインをプリントする。
第18から第19の層：図3bに示されるように、中央にある300ミクロンラインおよび中央の1cm×1cmシートをプリントする。
第20〜第31の層：層７を繰り返す。
第32〜第33の層：層１を繰り返す。
第34〜第45の層：層18および19を繰り返す。
第48〜第59の層：層７を繰り返す。
第60〜第67の層：層１を繰り返す。
得られるデバイスは、300ミクロンの直径を有する壁、および500ミクロン直径のチャンネルにより特徴づけられる。
実施例2:三次元ポリマー足場上の内皮細胞と肝細胞の同時培養
ウシ内皮細胞を、実施例１に記載のように作成されたデバイス上で、ラット肝細胞と同時培養した。
材料および方法
ウシ大動脈内皮細胞を標準的に説明された技術を用いウシ大動脈から回収し、そしてDMEM（ダルベッコの改変イーグル培地）、10％ウシ胎児血清、および１％抗生物質溶液中の培養で増殖させる。次いで細胞をトリプシン処理し、そして計数した。培地に浸漬したマトリックスに細胞を接種し、細胞を１時間付着させ、次いで培地中に置いた。培地を２日後に交換し、次いでその後１〜２日毎に交換した。肝細胞をラット肝臓から標準的な灌流技術により単離した。細胞を計数し、そしてそれらの生存率をチェックした。実施例１に記載のように作成された２つの殺菌ポリマー構築物に、１×106肝細胞および内皮細胞を接種し、そして２つのポリマー構築物に、１×107肝細胞を接種し、そして内皮細胞を２つのポリマー構築物上に接種した。細胞を１時間ポリマーに付着させ、そして次いで培地を添加し、その後、最初の２週間は、毎日交換し、次いでその後は、１〜２日毎に交換した。
同時培養が接種された２週間後、アセチル化Low Density Lipoproteinを用いて内皮細胞を標識した。この構築物は、組織学的切片および電子顕微鏡を用いて評価した。
結果：
ウシ大動脈内皮細胞は、接種後すぐにポリマー足場のチャンネルに沿って付着した。図4aは、培養中２週間後のウシ内皮細胞を接種したポリマーマトリックスの顕微鏡写真である。培養２週間後、内皮細胞は、チャンネルを徐々に裏打ちし始め、粗い表面を滑らかにし、そして三次元ポリマーの矩形チャンネルを丸くした。これは、図4bおよび4cでより高い倍率で示される。最も明瞭に図4cで示されるように、インビトロで２週間後、内皮細胞は、マトリックスに接着する第２の細胞型、肝細胞を有するマトリックスの下に横たわるように見える。傾向顕微鏡で見たとき、LDL標識内皮細胞は、ポリマーの全表面を覆って、かつポリマーのチャンネルを裏打ちしているように見えた。図4dに示されるように、培養１ケ月後、LDL標識内皮細胞は、マトリックスチャンネルを横切ってブリッジを形成しているように見え、第２の丸められた細胞型（肝細胞）はマトリックスに接着し、かつブリッジに隣接し、正常ラット肝臓で見出されるのと組織学的に類似である。
実施例3:その中に培養された肝細胞を有する血管化細胞の構築
目的：この研究は、移植された器官または血管化されたフリーの組織弁（flap）と類似の様式で移植され得る、厚い、複合的な、三次元の予備血管化されたコンポジット構造の作成を示す。
方法：三次元プリント技術を用いて、立体コンピューター支援設計ファイルに従って、ポリラクチド−コ−グリコリド（65L:35G、分子量53,000）のコポリマーに関してフリー形態製作により三次元生分解性足場（ｎ＝90）を生成した。ポリマー構築物は、500ミクロンの内直径および300ミクロンの壁厚を有する複数の血管様チャンネルから構築された。ウシ内皮細胞を、当業者に公知の外植技術を用いて単離し、そして組織培養で増殖した。肝細胞を成熟Lewisラットからコラゲナーゼ消化を用いて単離した。ポリマー構築物（ｎ＝50）に2.5×106内皮細胞を接種し、そして培養中に置いた。ポリマーマトリックスの第２の群（ｎ＝40）に2.5×106内皮細胞および2.7×106肝細胞の同時懸濁液を接種した。すべての細胞は標準的技術を用いて培養した。細胞−ポリマー構築物は、インビトロで18時間〜５週間維持した。標本は、位相コントラスト顕微鏡、蛍光アセチル化低密度リポタンパク質標識、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、トルイジンブルー染色、および走査電子顕微鏡を用いて分析した。
結果：細胞−ポリマー構築物（ｎ＝90）の顕微鏡的検査は、細胞が三次元ポリマーマトリックスに接着し、そして経時的にポリマーを集密な細胞層で覆ったことを示した。蛍光顕微鏡は、４週間で、内皮細胞が、ポリマーマトリックスのチャンネルを、天然の血管ネットワークに似ている内皮が裏打ちされた丸いチャンネルに内在的に再改築したことを示した。走査電子顕微鏡は、内皮細胞が、天然血管の連続的な舗床様の裏打ちとなったことを確認した。内皮細胞−肝細胞同時培養はまた、内皮細胞単層により裏打ちされたポリマーチャンネルの壁に隣接して肝細胞により経時的な再改築を示した。
結論:1）無形態製作されたポリマーは、内皮細胞および肝細胞に対して非毒性である、２）：細胞は、三次元ポリマーマトリックスに接着する、および３）経時的に正常組織形態に似る本質的な認識がある。初期調査は、無固体形態製作プリントで製作された三次元ポリマーマトリックスを用いることが実行可能であれば、組織工学の厚い、複合的な、予備血管化された構造を示した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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