(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記塩基配列：
0003595335.tif 000006
0003595335.tif 000007
を有するアラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の11.6kDaのタペータムのタンパク質または該塩基配列若しくはこの断片と厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有するアブラナ科（family Brassicaceae）由来のタンパク質をエンコードする遺伝子の発現を自然に誘導し、コーディング領域（coding region）の5'方向に上記塩基配列の１〜1460番目の配列を有するプロモーターを有する組換えまたは単離DNA。
【請求項２】
下記塩基配列：
0003595335.tif 000008
0003595335.tif 000009
を有するアラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の12.9kDaのタペータムのタンパク質または該塩基配列若しくはこの断片と厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有するアブラナ科（family Brassicaceae）由来のタンパク質をエンコードする遺伝子の発現を自然に誘導し、コーディング領域（coding region）の5'方向に上記塩基配列の１〜769番目の配列を有するプロモーターを有する組換えまたは単離DNA。
【請求項３】
アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）の11.6kDaのタペータムのタンパク質と等価である、下記塩基配列：
0003595335.tif 000010
を有するブラッシカ  ナプス（Brassica napus）の10.3kDaのタペータムのタンパク質の発現を誘導するプロモーターを有する請求の範囲１に記載のDNA。
【請求項４】
該プロモーターを、発現すると、植物において雄性不稔が生じるDNAに操作して連結した、請求の範囲１から３のいずれかに記載のDNA。
【請求項５】
該雄性不稔DNAが分解酵素をエンコードする、請求の範囲４に記載のDNA。
【請求項６】
該分解酵素によって核酸、タンパク質、炭水化物または脂質が分解する、請求の範囲５に記載のDNA。
【請求項７】
該分解酵素がリボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼである、請求の範囲６に記載のDNA。
【請求項８】
該分解酵素によって炭水化物が分解する、請求の範囲５に記載のDNA。
【請求項９】
該分解酵素がグルカナーゼである請求の範囲８に記載のDNA。
【請求項１０】
グルカナーゼのコード配列との転写融合物（transcriptional fusion）においてシグナル配列を有する請求の範囲９に記載のDNA。
【請求項１１】
該分解酵素によってタンパク質が分解する、請求の範囲５に記載のDNA。
【請求項１２】
該タンパク質分解酵素がアクチニジンまたはパパインである、請求の範囲11に記載のDNA。
【請求項１３】
該雄性不稔DNAが、植物のタペータム細胞において一般的に発見されるRNAに対してアンチセンスであるRNAをコードする、請求の範囲４に記載のDNA。
【請求項１４】
該雄性不稔DNAが、下記塩基配列：
0003595335.tif 000011
0003595335.tif 000012
を有するアラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の11.6kDaのタペータムのタンパク質をエンコードするRNAに対してアンチセンスであるRNAをコードする、請求の範囲13に記載のDNA。
【請求項１５】
該雄性不稔DNAが、下記塩基配列：
0003595335.tif 000013
0003595335.tif 000014
を有するアラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の12.9kDaのタペータムのタンパク質をエンコードするRNAに対してアンチセンスであるRNAをコードする、請求の範囲13に記載のDNA。
【請求項１６】
3'転写調節配列を有する請求の範囲１から15のいずれかに記載のDNA。
【請求項１７】
該3'転写調節シグナルがカリフラワー  モザイク  ウィルス（Cauliflower Mosaic Virus）35S遺伝子由来である、請求の範囲16に記載のDNA。
【請求項１８】
組換体であり、ベクターの形態を有する、請求の範囲１から17のいずれかに記載のDNA。
【請求項１９】
該ベクターがクローニングベクターであり、１つまたはそれ以上の選択マーカーを有する、請求の範囲18に記載のDNA。
【請求項２０】
請求の範囲18または19に記載のベクターを感染または形質転換した微生物の宿主細胞。
【請求項２１】
DNAを形質転換された植物が形質転換されない植物と区別できるマーカー配列を有する、請求の範囲１から19のいずれかに記載のDNA。
【請求項２２】
該マーカー配列によって抗生物質若しくは除草剤耐性が得られるまたは該マーカー配列がグルクロニダーゼをコードする、請求の範囲21に記載のDNA。
【請求項２３】
該マーカー配列がタペータムに特異的でない第二のプロモーターの制御下にある、請求の範囲22に記載のDNA。
【請求項２４】
該第二のプロモーターがカリフラワー  モザイク  ウィルス（Cauliflower Mosaic Virus）（CaMV）35S遺伝子由来である、請求の範囲23に記載のDNA。
【請求項２５】
請求の範囲１から19および21から24のいずれかに記載のDNAを有する植物細胞。
【請求項２６】
少なくとも幾つかの細胞が請求の範囲25に記載されるものである双子葉植物または双子葉植物の一部。
【請求項２７】
請求の範囲26に記載の双子葉植物からの増殖材料。
【発明の詳細な説明】
本発明は、特に雄性不稔を得ることを目的とする、植物への組換DNA技術の適用に関するものである。
遺伝的な背景の異なる親株の有性雑種形成によるハイブリッドの生産は現代農業において重要な営みである。ヘテロシス（heterosis）若しくは雑種強勢（hybrid vigour）の存在によって、子孫は収率や病気に対する耐性等の鍵となる耕種学的な特性において親株に優る。さらに、親株が非常に同型接合である際には、このようにして得られた子孫は遺伝的に非常に均質であり、したがって、作物は、穀物の管理の効率を非常に向上する、発芽時期、生育する高さ、病気のなり易さ、開花時期、種の成熟する時期等の重要な特性において等しく均質な仕方で挙動する。これらの理由によって、ハイブリッド形成した種は農家にとって魅力的であり、したがって、非常に高価で売られる。
自然界では、多くの植物種の生殖体は、自家受精およびその結果ハイブリッドを形成しない子孫の生産が非常にしやすいように並べられている。したがって、自家受粉した種の混入しないハイブリッド形成した種を生産するために、自家受粉を防ぐ様々な物理的、化学的および遺伝的な方法を用いて、異花受精が行われている。
ハイブリッド形成した種を生産するための重要な物理的な方法がイネ科インドトウモロコシ（Zea mays）で用いられている。この種では、雄性および雌性の生殖体が同じ植物体の異なる部位に位置しており、このため雄穂の除去（detasseling）、葯の除去（removal）等の既知の方法による不稔化が容易である。しかしながら、ほとんどの他の多くの穀物の生殖体は、上記ほどはうまく並んでいないので不稔化にかなりの労力、および繁雑な作業がいる；その結果、この方法によって生産されたハイブリッド形成した種は非常に高価なものである。
化学的な方法は、生育できる花粉の生産を殺すまたは遮断する、エーテル類等の殺配偶子剤を用いるものである。しかしながら、このような化学物質は一般的に高価でさらに、漠然とした開化の習性を有する穀物に対しては特に投与するのが難しい。
自家受粉を防止する２つの一般的に用いられる遺伝的な方法は、自家不和合性（self−incompatibility）および雄性不稔である。自家不和合性（self−incompatibility）システムにおいては、生育できる花粉を生産するが、生化学的な遮断が花粉の発芽または花粉管の生育を邪魔し、これによって自家受粉はできない。しかしながら、このようなシステムは、自家不和合性（self−incompatibile）の雌性植物の系統の不足、繁殖の難しさおよび頻繁な自家不和合性（self−incompatibility）の不安定性によって複雑である。場合によっては、繁殖の問題は、自家不和合性（self−incompatibility）の化学的な抑制によってまたは自家受粉に対する生化学的遮断を行う前の未成熟な芽の手による受粉（「芽の受粉（bud poliination）」）によって容易にすることができる。しかしながら、抑制できる自家不和合性（self−incompatibility）は、しばしば、システムの効果を減ずる気候によるストレスを受けやすい。重要な穀物であるアブラナ属（genus Brassica）は、ハイブリッド形成した種の生産に関する自家不和合性（self−incompatibility）システムに関連した難しさを示すよい例である。自家不和合性（self−incompatibility）がアブラナ亜種（Brassica spp.）では普及してるが、このシステムは複雑であり、雌性植物の系統は繁殖するのが非常に難しく、さらに、自家不和合性（self−incompatibility）は気候によるストレスのある条件下では破壊されやすい。
農業においては、自家受粉を防止するために用いられる最も重要な自然のメカニズムはいわゆる雄性不稔である。雄性不稔は、通常、裂開（花粉の放出）の前に葯または花粉の変質を起こすような核若しくはオルガネラ（葉緑体およびミトコンドリア）のゲノムにおけるある種の突然変異が起こることによって生じる。したがって、雄性不稔を発現する植物は雌性植物のみであり、さらに、このような植物によって生産された種は、繁殖能力のある雄性植物からの異花受粉の生成物でなければならない。一般的に、ハイブリッド形成した種の広い利用能に対する最も大きい障害は、効果的な雄性不稔がないことである。
自然発生した雄性不稔化システムは、様々な穀物：トウモロコシ、テンサイ、セイヨウアブラナの脂肪種子（oilseed rape）及びヒマワリにおいて有用である。多くは、不稔性の破壊及び気候によるストレスのある条件下での花粉の生産等の欠点を有する。遺伝的に制御された雄性不稔は、従来、ほとんど育種集団内から雄性不稔性植物を偶然発見することによっていた。効果的な雄性不稔化システムを発達させることによって、予期できないような事項に依存せず、さらに、栽培動物をより制御できる。本発明はこのような発達に関するものである。
プロモーターは、例えば、発現の時期または位置を特定することによって、発現を調節する遺伝子領域である。プロモーターは、遺伝子のコーディング領域（coding region）と離れてもよく、さらに、異なるコーディング領域（coding region）を誘導するために用いられ、このため、異なる生成物を発現できる。プロモーターは、雄性の配偶子の生産に含まれる細胞／組織に特異的である際には、原則的に雄性不稔を得るために用いることができる。タペータムは、小胞子の発育のための栄養分の供給において重要な役割を果たす葯内の分化した細胞層である。タペータムの機能不全は多くのタイプの自然発生した雄性不稔の原因である。
EP−Ａ−0329308号（パラディン  ハイブリッズ  インク（Paladin Hybrids Inc.））によると、自然発生したものを基礎とした雄性不稔化および有性の自家不和合性（self−incompatibility）システムに関する多くの困難は、報告された「人工の」雄性不稔化システムによって解決できる。EP−Ａ−0329308号は、システムの様々な可能は変異型を記載している。１つのタイプとしては、中心となる要素（central element）は、小胞子に特異的なプロモーターおよび雄性不稔DNAからなるキメラ遺伝子である。小胞子は未成熟な花粉粒である。雄性不稔DNAの重要な性質は、その発現が小胞子の発育に独特であるあるいは必須であるプロセスを妨害することによって、小胞子の発育を終わらせるように設計されていることである。このプロモーターは小胞子に特異的であるため、雄性不稔DNAは小胞子内でのみRNAに転写される。上記出願は、様々なタイプの雄性不稔DNAについて記載している：詳しくは、小胞子に特異的な遺伝子に対するおよび通常、しかし必須の、細胞機能（例えば、アクチニジン及びチューブリン）を有するタンパク質；および細胞毒性のあるタンパク質であるリシンＡ及びジフテリアトキシンに対するアンチセンスRNA。
しかしながら、上記システムは、EP−Ａ−0329308号は必ずしも雄性不稔性植物である植物を生産しない点において、重大な欠点があると考えられる。上記発明において記載されている小胞子に特異的なプロモーターの作用が減数分裂後に起こるため、因子に対して異型接合である植物の小胞子母細胞においては雄性不稔DNAが分離することによって、花粉粒の半分にしかこの因子を受容しない。
分離の問題を回避できる方法は、不稔性因子に対して同型接合である植物を生産することである。しかしながら、このような植物の繁殖は、受粉によって子孫は異種接合性に再度戻ってしまうため、無性のプロセスを経て行われなければならない。これによって、上記発明の適用は繁殖が商業的に生育しうる植物種に限られてしまう。したがって、雄性不稔DNAが母組織において発現でき、これによってすべての花粉粒に作用できることが望ましい。
EP−Ａ−0344029号（プラント  ジェネティック  システムズ（Plant Genetic Systems）（PGS））もまた、ハイブリッド形成した種を生産するのに使用する人工の雄性不稔化システムについて記載している。これは、ニコチアナ  タバカム（Nicotiana tobacum）から単離した葯に特異的なプロモーター（TA29に設計した遺伝子からのもの）および雄性不稔DNAからなるキメラ遺伝子を基礎をしている。この場合、プロモーターは、パラディン（Paladin）のシステムにおけるような小胞子に特異的な遺伝子由来ではなく、タペータム内で非常に発現する遺伝子由来である。このため、このキメラ遺伝子は、小胞子の発育を阻害し、タペータムを分裂または破壊することによって雄性不稔が生じるように設計されている。
上記方法とEP−Ａ−0329308号のものとの最も重要な違いは、減数分裂を受けない細胞のタイプで活性のあるプロモーターの選択によって遺伝的な分離に関する問題が回避される点である。タペータムの破壊によって、遺伝的に組み立てているにもかかわらずすべての小胞子の成熟を阻害する。
植物遺伝学者が商業上重要な穀物及び他の植物において雄性不稔を誘導するのに有用である方法を改善する弛みない努力の一環として、さらに有用な遺伝子及びそれに関連したプロモーターの同定が盛んに行われている。それらのうち、今日世界中で商業上最も重要な穀物としては、アブラナ科（family Brassicaceae）のもの、特にセイヨウアブラナの脂肪種子（oilseed rape）として一般的に知られているブラッシカ  ナプス（Brassica napus）が挙げられる。アブラナ科（family Brassicaceae）のもののタペータムに特異的な遺伝子及びプロモーターが明らかになれば、植物を栽培する人々は、雄性不稔のブラッシカ  ナプス（B.napus）及びアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものの発育について強力な道具として任意に使用できる。予想できない効果を減少させるまたは最小限にすることができため、科若しくはさらに細かい分類学上の分類における異種のDNAを保存することが可能であることは魅力である。さらに、同じ科の他のものの異種DNAを導入したアブラナ科（family Brassicaceae）の形質転換したものは、調節の観点からより遠い源からのDNAを導入したアブラナ科（family Brassicaceae）のものより良好に用いられる。
本発明は、アブラナ科（family Brassicaceae）由来の新規でかつ有用な遺伝子およびプロモーターの発見に基づくものであり、さらに上記発見を利用した方法、遺伝子構築物および形質転換植物に関するものである。
本発明の第一の概念によると、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の11.6若しくは12.9kDaのタペータムのタンパク質またはアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものの同様のタンパク質をエンコードする遺伝子の発現を自然に誘導するプロモーターからなる組換えまたは単離DNA分子を提供するものである。
本明細書において、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）の12.9kDaのタンパク質をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものにおける同様の遺伝子はA3遺伝子と称する；アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）の11.6kDaのタンパク質をエンコードする遺伝子およびアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものにおける同様の遺伝子はA9遺伝子と称する。A9及びA3は、EP−Ａ−0344029号に記載されているタペータムに特異的なプロモーターとは配列および発現のパターンが異なる。EP−Ａ−0329308号の一実施態様で記載されているような、熱ショック若しくは除草剤の適用等の外来因子による誘導は、本発明では機能させる必要はないため、例えば、不明確な開花の習性に付随した問題を抱える必要がない。
A3の時間的な発現（temporal expression）は、小胞子母細胞が減数分裂をする時から初期の小胞子の間期にかけての葯の発育期間中に起こる。A9遺伝子は、タペータム細胞において発現する。A9の発現は、減数分裂をする細胞を有する葯内で開始し、初期の第一間期における小胞子を有する葯にまで続く。
上記で引用された分子量は推定されたものであり、DNA配列から引き出した、存在すると考えられるアミノ酸の数から算定している。アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子によってエンコードされる12.9kDaのタンパク質は118アミノ酸を有する；アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子によってエンコードされる11.6kDaのタンパク質は107アミノ酸を有する。したがって、この分子量は配糖化されていないタンパク質に関するものであることが考えられる。さらに、部分的なタンパク質分解等の他の翻訳後プロセッシングに関する効果は割引いて考えられる。
上記で示された図式はアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のタンパク質に関するもののみであるが、当業者はアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものの同様なタンパク質を容易に同定することができる。例えば、ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）の同様のA9遺伝子は、10.3kDaの算定された分子量を有する96アミノ酸長の推定タンパク質をエンコードする。このような同様な遺伝子は、ハイブリッド形成に関する研究、制限断片長多型（restriction fragment length polymorphism）（RFLP）及び他の既知の方法によって同定される。ほとんど等価のタンパク質をエンコードする遺伝子は、例えば、厳しい条件下（約0.9モルの濃度の食塩水中で約35℃から65℃等）でアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3及びA9遺伝子、またはこれらの断片、例えば10、20、50若しくは100ヌクレオチドに対してハイブリッドを形成する。15〜20ヌクレオチドのプローブが多くの環境下で好ましい。
本明細書において記載されている好ましいA3及びA9プロモーターは、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）からのものであり、例えば、（ａ）ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）の植物の雄ずいから単離されたmRNAからcDNAを合成し、（ｂ）このcDNAを単離し、（ｃ）このcDNAをプローブとして用いて雄ずいに特異的なmRNAをエンコードするアラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の植物のゲノム領域を同定し、さらに、（ｄ）このDNAのプロモーターを含む（５′）上流の調節領域を同定することによる等、既知の方法によって単離できる。また、この方法は、植物の一種の雄ずいに特異的なDNAのコーディング領域（coding region）を基礎とする、またはこれ由来のプローブを用いて他の種の雄ずいに特異的なmRNAをエンコードするDNA配列を単離できることをも示している。アブラナ科（family Brassicaceae）の他のもの、例えばブラッシカ  ナプス（B.napus）自身のA3及びA9プロモーターもまた、本発明の概念に含まれ、同様に天然の配列の非必須の変形（variation）をも含まれる。
特に好ましいプロモーターは、以下の実施例において記載されているように、図４（アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）A3遺伝子に関する）および図７（アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）A9遺伝子に関する）に示される配列のコーディング領域（coding region）の上流部分にある。当業者は、コーディング領域（coding region）を誘導するプロモーターを十分正確に同定し、さらにこれらを含むDNAを単離するおよび／または組換えることが可能である。
本発明によるプロモーターを含むDNAを用いて、植物、特にアブラナ科（family Brassicaceae）に属するものに以下に示す様々な方法で雄性不稔化することができる。したがって、本発明の重要な実施態様では、上記プロモーターを発現すると雄性不稔になるDNAに操作して連結する。
効果的な不稔化システムが完成したため、種親の繁殖は、無性の方法によってまたは雄性稔性の同質遺伝子系統による雄性不稔の受粉を経て、さらに、子孫のうちから雄性不稔性植物を同定若しくは選択することによって行われなければならない。栄養成長による繁殖が行われれば、本発明はハイブリッドを生産するのに完璧なシステムを形成する。種子穀物を生産するために稔性の回復が必要である際には、本発明は新たな雄性不稔化システムの基礎を形成する。異花受粉レベルが高い種子穀物によっては、種子を混合することによって回復を回避できる。雄性不稔は、稔性の回復が必要でない作物、例えば、アブラナ亜種（Brassica spp.）の野菜等、及びレタス、ほうれんそうやたまねぎ等の他の食用の植物等において特に有用である。
本発明によるA3および／またはA9プロモーターを導入したDNAは、雄性不稔DNAを誘導できるので、ハイブリッド生産において使用できる雄性不稔性植物を生産できる。このプロモーターは、非常にタペータムに特異的であるため、不稔DNAはタペータム内でのみ発現する。発現の制御は非常に強力であり、このDNAは植物の他の細胞では発現しない。このシステムは生育できる花粉粒の生産を阻害する。すべての形質転換植物およびそれらの子孫は雄性不稔性である；減数分裂による分離に関する問題は生じない。
雄性不稔DNAに操作して連結されたプロモーターからなる構築物を、よく知られている方法によって植物（特にアブラナ属（genus Brassica）、さらにはニコチアナ（Nicotiana）及びホルデウム（Hordeum）等の他の属のもの）に形質転換できる。この形質転換によって、植物、プロモーター及び雄性不稔DNAからなる外来のキメラDNAを有する細胞が生産できる。雄性不稔DNAは、植物の雄ずい細胞で生産または過剰生産されると、雄ずい細胞の正常な発育を阻害する、RNA、タンパク質若しくはポリペプチドをエンコードする。
タペータムに特異的なプロモーターは、生育できる雄性配偶子を生産するメカニズムの欠損を引き起こすRNA、タンパク質若しくはポリペプチドをコードする様々な雄性不稔DNA配列を誘導するのに用いる。本発明は、誘導される配列に限られないが、雄性不稔プロモーターを誘導できる配列の多くのクラス、特にこれらの実施例が好ましい。
例えば、誘導できる雄性不稔DNAは分解酵素をエンコードする。この分解酵素は、核酸、タンパク質（若しくは糖タンパク質）、炭水化物および場合によっては脂質等の高分子等の、１つまたはそれ以上生物学的に重要な分子の分解を引き起こす。
リボヌクレアーゼ（RNアーゼ  T1等）およびバーナーゼ（barnase）は、RNAの分解を引き起こす酵素の例である。DNAを分解する酵素の例としては、EcoR I等の部位特異的若しくは部位非特異的である、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが挙げられる。グルカナーゼは、炭水化物の分解を引き起こす酵素の一例である。この酵素、グルカナーゼは、葯内で自然に生産され、減数分裂前に作製されたポリグルカンの保護膜から若い小胞子を放出する機能を有する。この酵素活性化は、小胞子の発育の正しい段階に一致するように発育段階上で調節される。強力な不稔DNAとしてのグルカナーゼの重要な魅力の一つとしては、グルカナーゼの発現の時機を逸し、小胞子の破壊を引き起こす突然変異による雄性不稔性である植物が自然界で知られていることである。グルカナーゼの活性化が成熟前または遅いかによって、２タイプが認識されている。葯内で発現するもの等の、多くの遺伝子の発現によって様々なパターンの時間的な調節（temporal regulation）がされている。したがって、グルカナーゼを不稔DNAとして用いるために、遺伝子の発現を誘導するように選択されたプロモーターによって、好ましくは自然の雄性不稔に関して見付かった発現のパターンを擬態することによって、グルカナーゼ活性を発育段階で好ましく調節できる。雄性不稔を得る一つの方法は、雄性不稔性の突然変異植物内でグルカナーゼ活性を発見したのと同様の発現パターンを有するタペータムに特異的な遺伝子からプロモーターを単離することである。グルカナーゼの発現が遅いと機能的な葯のグルカナーゼ遺伝子を有する植物において不稔性が生じにくいので、不稔性因子は、正常なグルカナーゼの活性化の前に転写を誘導できるプロモーターを有することが必要である。ペチュニア（Petunia）のRM  cms  突然変異体（イチュハー，エス（Izhar,S.）およびフランケル  アール（Frankel,R.）、セオル  アプル  ジェネット（Theor.Appl.Genet.）、41巻、ページ104〜108（1971年））において、葯内のグルカナーゼの発現はまず減数分裂前期の終りに起こり、さらに、減数分裂の完了によって最高まで増加する。この発現パターンは正常なペチュニア（Petunia）の植物のものとは対照的であり、葯内のグルカナーゼは四分子の破壊および若い小胞子の放出に付随して活性化される。このcms変異体において見つかったグルカナーゼ活性の異常なパターンは、小胞子の破壊および雄性不稔に応答すると考えられる。したがって、グルカナーゼ酵素をエンコードする不稔DNAを用いてこの変異を擬態することには、減数分裂前期と小胞子の四分子の出現との間の葯の発育期間中に、葯内、好ましくはタペータム内の雄性不稔DNAの転写を誘導できるプロモーターが必要である；したがって、上記のA3およびA9プロモーターはこの遺伝子を誘導するのに非常に適している。β（1,3）−グルカンが必須な機能をしていると考えられる植物内のどこか、例えば篩部の篩要素において見付かっているので、タペータムに特異的な（または少なくとも葯に特異的な）プロモーターもまた好ましい。
また、この酵素の空間的な調節（spatial regulation）によって標的細胞に接近できる。室部分への分泌は、好ましい実施態様においては、グルカナーゼのコード配列との翻訳融合物（tranlational fusion）における適当なシグナル配列を提供することによって得られる。
グルカナーゼをエンコードするDNAは、標的細胞の外が細胞毒性である生成物を有さないので、雄性不稔DNAとして好ましい。雄性不稔DNAとしてのグルカナーゼは自然のシステムを擬態し、例えばリボヌクレアーゼに比べて本質的に破壊的でないので、プロモーターが他の細胞のタイプの条件によってはわずかな活性しか有さない等の問題が存在しない。
アクチニジンは、プロテアーゼの一例であり、これをコードするDNAは適当な雄性不稔DNAとなりうる。他の例としては、パパインのチモーゲンおよびパパインの活性タンパク質が挙げられる。
相当する核酸が雄性不稔DNAとして有用であるリパーゼとしては、ホスホリパーゼ  A2が挙げられる。
雄性不稔DNAが分解酵素をエンコードする必要はない。雄性不稔DNAの他の例では、サイトカイニンの合成に含まれる、イソペンチルトランスフェラーゼ（isopentyl transferase）等の、植物ホルモンの合成を触媒する酵素、およびオーキシンの合成に含まれる１つまたはそれ以上の酵素をエンコードするものがある。リポキシゲナーゼまたは有害な効果を有する他の酵素をコードするDNAもまた用いられる。
他の雄性不稔DNAとしてはアンチセンス配列が挙げられる。自然界で発生されたものとは反対の配向の遺伝子のコーディング領域（coding region）を誘導することによって、遺伝子のダウンレギュレーションが生じ、これによって、遺伝子生成物がより少量しか生産されないまたは全く生産されない。アンチセンスDNAから転写されたRNAは、細胞において一般的に発見される配列のセンスRNAバージョン（sense RNA version）に結合でき、さらに上記の機能を破壊でき、これによって機能を欠損させることができる。このようなアンチセンスDNAの例としては、A3及びA9プロモーターの制御下で葯中で生産されるA3及びA9遺伝子のアンチセンスDNAがある。このような遺伝子は一般的にタペータム内で発現するため、上記遺伝子に対するアンチセンスはタペータムの機能を破壊し、これによって雄性不稔が起こると考えられる。
アンチセンスDNAのみが自然のセンス転写生成物（natural sense transcription product）が生産されている時に転写されることが決定的な要因ではない。アンチセンスRNAは、通常、そのセンス相補鎖（sense complementary strand）である時に結合するのみであるため、センスRNAが転写される際にのみ毒性効果を有する。したがって、A3若しくはA9遺伝子生成物をエンコードする幾つかのもしくはすべてのDNAに相当するアンチセンスDNAは、A3及びA9遺伝子が発現している間のみ生産されるわけではない。このようなアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの制御下で構成的に発現する。
したがって、本発明のさらなる概念によると、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の11.6若しくは12.9kDaのタペタームタンパク質またはアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものの同様のタンパク質をエンコードする遺伝子において自然に転写されるDNA鎖の少なくとの一部に相補的である転写可能なDNA鎖を有するアンチセンス核酸を提供するものである。
本発明の上記概念によるアンチセンスDNAは、以下の間に限られないが、タペータムの発育の間に転写できる適当なプロモーターの制御下にある。したがって、上述したように、このプロモーターは構成性であるが、本発明の第一の概念に関する上記のA3及びA9等のタペータムに特異的なプロモーターを使用してもよく、これらはより大きな制御に対しては好ましい。このようなアンチセンスDNAは、通常、アブラナ科（family Brassicaceae）のものの雄性不稔を得るのに有用である。
雄性不稔DNAのさらなる例としては、得られた標的配列に対して非常に特異的に切断できるRNA酵素（リボザイムとして知られている）をエンコードするものがある（ハセロフ（Hseloff）およびガーラック（Gerlach）、ネイチャー（Nature）、334巻、ページ585〜591（1988年））。アンチセンスDNAと同様、リボザイムDNA（例えば、A3若しくはA9遺伝子によってエンコードされるRNAに対して標的にされたリボザイムをコードする）は、A3及びA9遺伝子の発現の時にのみ発現するとは限らない。また、構成性発現（constitutive expression）に使用されるもの等、リボザイムをエンコードするDNAを誘導するのに好ましいプロモーターを使用することも可能である。
したがって、本発明のさらなる概念によると、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）の11.6若しくは12.9kDaのタペタームタンパク質またはアブラナ科（family Brassicaceae）の他のものの同様のタンパク質をエンコードする遺伝子によってエンコードされたRNAを特異的に切断できるリボザイムをエンコードするDNAを提供するものである。このようなリボザイムをエンコードするDNAは、通常、アブラナ科（family Brassicaceae）のものを雄性不稔化するのに有用である。
本発明のDNA配列の好ましい実施態様においては、A3/A9プロモーターおよび雄性不稔DNA構築物、ポリアデニレーションシグナル（polyadenylation signal）等の３′転写調節シグナルからなるもの等がある。３′転写調節シグナルは、好ましくは、カリフラワー  モザイク  ウィルス（Cauliflower Mosaic Virus）35S遺伝子由来である。他の３′転写調節シグナルも使用できることを認識しなければならない。
上記のアンチセンス核酸およびリボザイムをエンコードする核酸は、さらに一般的な原則の例である：したがって、本発明のさらなる概念によると、A3およびA9遺伝子の適当な発現を選択的に破壊する（例えば発現に関して）DNAを提供するものである。
本発明による組換DNAは、ベクターの形態を有する。このベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージである。ベクターは、しばしば、これらの感染した（または形質転換した：これらの言葉は本明細書において交互に用いられる）細胞を選択でき、好ましくは、異種のDNAを導入したベクターを有する細胞を選択できるような１つまたはそれ以上の選択マーカーを有する。適当な出発シグナル（start signal）および停止シグナル（stop signal）が通常存在する。さらに、ベクターが発現しようとすると、発現を誘導するのに十分は調節配列（regulatory sequence）が存在する；しかしながら、本発明によるDNAは通常植物細胞において発現するため、微生物を宿主とする発現は、本発明の初期の目的の中に含まれないが、使用してもよい。調節配列（regulatory sequence）を含まないベクターはクローニングベクターとして用いられる。
クローニングベクターを大腸菌（E.coli）または操作が容易である他の適当な宿主に導入できる。したがって、本発明のさらなる概念によると、上記したDNAを感染または形質転換した宿主細胞を提供するものである。
本発明によるDNAは、in  vitroのプロセス等、さらに続くヌクレオチドを一緒に連結する（coupling）、および／またはオリゴ−および／またはポリ−ヌクレオチドを連結する（ligating）等の従来の方法によって調製できるが、組換DNA技術も選択できる。
最後に、本発明によるDNA（（ｉ）A3および／またはA9プロモーターに雄性不稔遺伝子を加えたもの、（ii）A3および／またはA9のRNAに標的にされたA3および／またはA9遺伝子若しくはリボザイムDNAに対するアンチセンスDNAのどちらであっても）は、適当な方法によって植物細胞に導入できる。本発明のさらなる概念によると、上記した本発明によるDNAを含む植物細胞を提供するものである。
好ましくは、不活化された（disarmed）Ti−プラスミドベクターを用いてさらに、例えば、EP−Ａ−0116718号およびEP−Ａ−0270822号に記載されているもの等、既知の方法によってアグロバクテリウム（Agrobacterium）によって運ぶことによって、DNAを植物細胞中に形質転換する。または、電気排出装置（electrical discharge apparatus）を用いて外来DNAを直接植物細胞に導入してもよい。上記方法は、例えば、受容植物が単子葉植物である等、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が効果的でない時に好ましい。いずれかの種の植物細胞の核DNA内でのDNAを安定して導入できる他の方法も好ましい。上記植物としては、遺伝的形質転換が一般的に可能でない植物種が挙げられる。
また、本発明によるDNAは、好ましくは、外来のDNAを有する形質転換植物が外来のDNAを含まない他の植物と容易に区別できる第二のキメラ遺伝子（「マーカー」遺伝子）を有している。このようなマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性（ヘレラ−エストレラ（Herrera−Estrella）ら、1983年）、除草剤耐性（EP−Ａ−0242246号）およびグルクロニダーゼ（GUS）の発現（EP−Ａ−0344029号）等が挙げられる。マーカー遺伝子の発現は、好ましくは、タペータム以外の細胞において発現できる第二のプロモーターによって制御され、これによって植物の再生のいずれかの段階でマーカーを有する細胞若しくは組織を選択できる。好ましい第二のプロモーターは、カリフラワー  モザイク  ウィルス（Cauliflower Mosaic Virus）（CaMV）の35Sサブユニットのコートタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。しかしながら、他の適当な第二のプロモーターも使用してもよい。
植物全体は、１つの形質転換植物細胞から再生でき、したがって、本発明は、上記した本発明によるDNAを有する形質転換植物（または増殖材料等の、これらの部分）を提供するものである。再生は既知の方法によって行える。形質転換された植物の花の場合では、生育できる花粉を生産できないことによる雄性不稔であると考えられる。花粉が生産できる際には、受容植物の種子を得ることができないことによって生育できないと考えられる。
ここで、本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。以下の制限酵素および他の略称を用いる：
A,AccI;B,BamH I;Bg,Bgl II;
C,Cla I;H,Hinc II;
Hd,Hind III;K,Kpn I;M,Mlu I;
N,Not I;Nc,Nco I;Nr,Nru I;
P,Pst I;R,Rsa I;R I,EcoR I;
R V,EcoR V;S,Sst I;Sa,Sal I;
Sp,Sph I;Sm,Sma I;Ss,Ssp I;
S II,Sac II;X,Xho I;Xb,Xba I。
ORF＝読み取り枠（open reading frame）
実施例は添付した図を参照にしており、図を以下に説明する：
図１は、A3内に含まれるORFの推定のタンパク質の配列と共にブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNA  A3のDNA配列を示すものである；
図2aは、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子とのブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNAであるE3およびE5のDNA配列の比較を示すものである。下線部のトリヌクレオチドは、それぞれの配列によってエンコードされたORFの末端を示している；
図2bは、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子によってエンコードされた推定のポリペプチドとのブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNAであるE3およびE5によってエンコードされた推定のポリペプチドの比較を示すものである；
図３は、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のゲノムクローン  G3.6の制限酵素地図を示すものである。関連した部位のみを示し、これらはG3.6にのみ有るものではない。A3のコーディング領域（coding region）の部分を黒塗りの箱として示す。また、プラスミドpRS5および15の中にクローニングされた挿入部分の範囲をも示す；
図４は、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子のDNA配列および推定の一次構造を示す。下線部分の配列はTATAボックスのモチーフ（TATA box motif）に適合している；
図５は、ブラッシカ  ナプス（B.napus）cDNAのA9のDNA配列およびこのcDNAに含まれたORFの推定の一次構造を示す；
図６は、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のゲノムクローン  G9.1の制限酵素地図を示すものである。A9のコーディング領域（coding region）の部分を黒塗りの箱として示し、また、プラスミドpWP39、55および64中の挿入部分の範囲を示す；
図７は、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子のDNA配列および推定の一次構造を示す。下線部分の配列はTATAボックスのモチーフ（TATA box motif）に適合している；
図8aは、ブラッシカ  ナプス（B.napus）のA9  cDNAおよびアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子の間のDNA配列の相同性を示す。下線部分のヌクレオチドは、これらの配列の中に含まれるORFの停止コドン（stop codon）の部分を示す；
図8bは、ブラッシカ  ナプス（B.napus）のA9  cDNAおよびアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子によってエンコードされた推定の生成物間の相同性を示す；
図９は、A3プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（E.coli）遺伝子の転写融合物（transcriptional fusion）を有するキメラ遺伝子の構築を示す；
図10は、A9プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（E.coli）遺伝子の転写融合物（transcriptional fusion）を有するキメラ遺伝子の構築を示す；
図11は、A9−GUSを形質転換したタバコ植物の葯におけるβ−グルクロニダーゼ活性を示す；
図12は、形質転換植物においてA3及びA9プロモーターからセンス及びアンチセンスRNAを発現するキメラ遺伝子の製造において使用される中間のクローニングベクターの構築を示す；
図13aおよび13bは、A3及びA9プロモーターおよびRNAアーゼであるバーナーゼ（barnase）のキメラ遺伝子の構築を示す；および
図14aおよび14bは、A3及びA9プロモーターおよびＣ末端の拡張（extension）が欠損しているニコチアナ  タバカム（Nicotiana tobacum）のβ−1,3グルカナーゼ遺伝子のキメラ遺伝子の構築を示す。図14aは、転写融合構築物（transcriptional fusion construct）の調製を説明し、図14bは、翻訳融合構築物（translational fusion construct）の調製を説明する。
実施例において、特に記載のない限り、組換DNAの作製および操作方法はすべて、マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー  クローニング（Molecular Cloning）：ア  ラボラトリー  マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982年に記載されている標準的な方法を用いて行われた。
実施例
実施例１  アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）からの葯に特異的な遺伝子であるA9およびA3の単離
以下に記載したようにして、切開した葯から抽出されたRNAから構築されたブラッシカ  ナプス（Brassica napus）のcDNAライブラリーを分画スクリーニング（differential screening）することによって、葯に特異的なcDNAを単離した。cDNAクローンであるA3およびA9を1.4〜1.8mmの長さである葯から構築したライブラリーから単離した。このライブラリーを、ベクター  ラムダ  ザップ（Lambda Zap）（ストラタジーン（Stratagene）製）中に構築した。A3およびA9のcDNAをプローブとして用いて、ベクター  ラムダ  ダッシュ（Lambda Dash）（ストラタジーン（Stratagene）製）中に構築さらたアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のゲノムライブラリーから相同性のある遺伝子を単離した。
材料および方法
植物材料：核酸を単離するためのすべての播種材料は、24℃で18時間の光周期で環境が制御された生育キャビネットの中で生育した２〜３週令の植物から得た。分画スクリーニング（differential screening）およびノーザンブロット（Northern blot）分析のための苗木のRNAは、ブラッシカ  ナプス  オレイフェラ  変種「トパーズ」（B.napus oleifera var.″Topaz″）より得た。雄製稔性の芽は、ブラッシカ  ナプス  オレイフェラ  変種「リクター」（B.napus oleifera var.″Lictor″）（ニッカーソンズ  シーズ（Nickersons Seeds）製、ケンブリッジ（Cambridge）、英国）の野外で生育させた（field grown）植物から収集した。雄性不稔性の芽は、野外で生育させた（field grown）ブラッシカ  ナプス  オレイフェラ  変種  シーエムエス「オグラ」（B.napus oleifera var.CMS″Ogura″）（ニッカーソンズ  シーズ（Nickersons Seeds）製、ケンブリッジ（Cambridge）、英国）の植物から得た。
葯の切開:cDNAライブラリーの構築のために、花序を素早く集め、最大５時間、必要になるまで４℃で保存した。鋭いピンセットを用いて適当な大きさの芽から葯を切開し、直ぐに液体窒素中で凍結した。
花粉の単離：チョウング（Choung）およびビーバースドルフ（Beaversdorf）（プラント  サイ（Plant Sci.）、39巻、ページ219〜226（1985年））の方法を用いて適当な長さの新鮮な芽から小胞子を単離し、RNAを単離する前に−80℃で凍結した。（凍結された芽から単離された花粉では非常に分解したDNAしか得られない）。
芽の収集：最初の花が開く直前の段階の、芽の完全な輪生体の多くのサンプルを液体窒素中で凍結し、−80℃で貯蔵した。
葯および芽の細胞学的段階（cytological staging）：アセトルオルセイン（aceto−orcein）若しくはアクリジンオレンジの存在下でつぶした全葯から押し出された胞子形成細胞（sporogenous cell）、小胞子若しくは花粉粒を光学顕微鏡で調べることによって、予め決められた長さの芽の発育段階を評価した。目盛のついた接眼レンズの格子を備えた低電力の光学顕微鏡を用いて、芽の長さを正確に測定した。芽の長さは、小花梗の底から最も高いがく片の先までを測定した。
RNAの単離および分析：低分解（low resolution）ノーザンドットブロット（Northern dot blot）分析またはmRNAの単離のために使用する材料を、液体窒素で冷却した乳ばちの中で微粉末になるまでひいた。従来記載されている（ドレイパー（Draper）ら、「プラント  ジェネティック  トランスフォーメーション  アンド  ジーン  エックスプレッション：ア  ラボラトリー  マニュアル（Plant Genetic Transformation and Gene Expression:A Laboratory Manual）」、ブラックウェル  サイエンティフィック  パブリッシャーズ（Brackwell Scientific Publishers）、オックスフォード（Oxford）（1988年））ようなフェノールを基礎とした方法を用いて、粉末から全RNAを単離した。ポリ（Ａ）+RNAを、本質的にはマニアティス（Maniatis）らのマニュアルにおいて記載されているようにしてオリゴ（dT）−セルロース  クロマトグラフィーを２回行うことによって精製した。高分解（high resolution）ドットブロット（dot blot）用のRNAを、ヴァーウォード（Verwoerd）ら、ヌク  アッシズ  レス（Nuc.Acids Res.）、17巻、ページ2362（1989年）の方法にしたがって単離した。
cDNAライブラリーの構築およびスクリーニング：製造会社の指示にしたがって、（アマシャム（Amersham）若しくはファルマシア（Pharmacia）製の）cDNA合成キットを用いてポリ（Ａ）+RNAから、cDNAを合成した。cDNAを、EcoR Iで切断した脱リン酸化されたラムダ  ザップ  Ｉ（Lambda Zap I）（ストラタジーン（Stratagene）製）（「胞子形成」ライブラリー（″sporogenesis″library））またはラムダ  ザップ  II（Lambda Zap II）（ストラタジーン（Stratagene）製）（「小胞子−発育」ライブラリー（″microspore−development″library））に連結し、アマシャム（Amersham）製のin  vitroのパッケージングエクストラクツ（packaging extracts）を用いてパッケージングした。サージェント（Sargent）、メソッズ  イン  エンザイモロジー（Methods in Enzymol.）、152巻、ページ423〜432（1987年）にしたがって適当な葯のポリ（Ａ）+RNAまたは苗木のポリ（Ａ）+RNAのいずかより調製した［32P］で標識された１本鎖のcDNAプローブを含んだ２枚のハイボンド−エヌ（HYBOND−Ｎ）フィルター（アマシャム（Amersham）製）上で、クローンを分画してスクリーニングした。（ハイボンド−エヌ（HYBOND−Ｎ）という表現は商標である。）
RNAドットおよびゲルブロット：ドット−ブロット（dot−blot）用の全RNAを、製造会社の指示にしたがって、ハイボンド−エヌ（HYBOND−Ｎ）（アマシャム（Amersham）製）上にスポットした。ノーザンゲル（Northern gel）をランニングさせ、フォーニイ（Fourney）（ビーアールエル  フォーカス（BRL Focus）、10巻、ページ５〜７（1988年））にしたがって、RNAをハイボンド−エヌ（HYBOND−Ｎ）上に移した。ハイブリッド形成およびハイボンド−エヌ（HYBOND−Ｎ）フィルターの洗浄は製造会社の指示にしたがって行った。
切片上ハイブリッド形成法（in situ hybridisation）：包理および薄断片の作製のために、ブラッシカ  ナプス（B.napus）の芽をシーアールワイオー−エム−ベッド（CRYO−Ｍ−BED）（ティエーエービー  ラボラトリーズ  イクィップメント  エルティディ（TAAB Laboratories Equipment Ltd.）製）中に凍結した。（シーアールワイオー−エム−ベッド（CRYO−Ｍ−BED）という表現は商標である。）薄断片を公称10μｍの厚さに切断し、サブベッドスライド（subbed slide）上にのせ（ファン  プロオイジェン−ネット（Van Prooijen−Knegt）ら、ヒストケミカル  ジェー（Histochemical J.）、14巻、ページ333〜334（1983年））、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水した。［35S］rUTP（＞1000Ci/ミリモル、アマシャム（Amersham）製、SJ.1303）で標識されたセンスおよびアンチセンスRNAプローブを、cDNAがクローニングされている、ブルースクリプトエクシケーナイナス（BLUESCRIPT  SK-）（ストラタジーン（Stratagene）製）のT3およびT7プロモーターから転写した。（ブルースクリプト  エクケー−（BLUESCRIPT  SK-）という表現は商標である。）転写後、プローブをアルカリによる加水分解によって切断し、約150bp長のプローブ断片を得た。ハイブリッド形成用溶液（hybridisation solution）は、50％ホルムアルデヒド、300mM塩化ナトリウム、10mM  Na2HPO4  pH6.8、10mMトリス−塩酸  pH7.5、5mM  EDTA、0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％フィコール、0.02％ポリビニルピロリドン、10mMジチオトレイトール、10％硫酸デキストラン、0.7mg/ml  大腸菌（E.coli）のtRNA、50〜100ng/mlのプローブストック（6.7×105cpm/ngプローブ）であった。薄断片を30μｌのハイブリッド形成用溶液（hybridisation solution）において50℃で16時間ハイブリッド形成した。スライドを50％ホルムアルデヒド、300mM塩化ナトリウム、10mM  Na2HPO4  pH6.8、10mMトリス−塩酸  pH7.5で50℃で１時間ずつ計３回洗浄し、さらに、RNアーゼ  Ａバッファーですすぎ、ホルムアルデヒドを除去した。RNアーゼ  Ａ処理、（500mM塩化ナトリウム、10mMトリス塩酸  pH7.5にRNアーゼ  Ａを150μg/mlで溶解したもの）を37℃で１時間行った。さらに、スライドを２×SSC（0.3M塩化ナトリウム、0.03Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）において65℃で30分間を２回洗浄し、濃度勾配のついたアルコール（graded alcohol）を通すことによって脱水し、乾燥した。オートラジオグラフィーを目的として、スライドを、アイエルエフオーアールディ  ケー５（ILFORD  K5）の核酸の飛跡用エマルジョン（nuclear track emulsion）（1:59の割合のグリセロール：水の混合物において1g/ml）中に45℃で漬けた。（アイエルエフオーアールディ  ケー５（ILFORD  K5）という表現は商標である。）被爆時間は２から14日であった。現像は、コダック  ディ19（KODAK  D19）において行った。（コダック  ディ19（KODAK  D19）という表現は商標である。）さらに、現像された薄断片をメチレンブルーで染色し、永久プレパラートを作製した。
ａ）アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）A3遺伝子の単離および特性の評価
ブラッシカ  ナプス（B.napus）の葯、花粉、雄ずい葉および苗木から抽出されたRNAを用いたノーザンハイブリダイゼーション（Northern hybridization）分析によって、A3は長さが1.6〜2.3mmの葯においてしか発現せず、1.8〜2.3mmで発現が最高になることが示された。このようにして、A3の時間的な発現（temporal expression）は、小胞子母細胞が減数分裂する時から初期の小胞子の間期までの葯の発育期間中にわたる。切片上ハイブリッド形成法（in situ hybridisation）によって、ブラッシカ  ナプス（B.napus）においては、A3は葯のタペータムにおいてのみ発現することが指摘された。A3のcDNAは、347bpの長さで、１〜329bpから拡張する読み取り枠（open−reading frame）（ORF）を有する（図１）ことからこのクローンは全長でないことが分かる。ノーザンゲルブロット（Northern gel blot）からブラッシカ  ナプス（B.napus）のA3のmRNAの推定の大きさは約500bpであり、これによってもこのクローンが全長でないことが指摘される。このA3のcDNAを用いて、同じブラッシカ  ナプス（B.napus）のライブラリーから相同性のあるcDNAクローン（E3およびE5）を単離した。E5のcDNAは422bp長であり、１〜333bpのORFを有する（図2a）。このcDNAは、重なっている領域ではA3のcDNAと一致し、A3の出発の５′側の5bpおよびA3の終結の３′側の69bpのA3配列が拡張している。E3のcDNAは、１〜314bpの位置が拡張するORFを有する398bp長である（図2a）。E3のcDNAは、ヌクレオチドレベルでE5のcDNAと95％一致し、推定のORF生成物は91％一致している。A3と相同性はあるが一致はしないE5のクローニングによって、葯に特異的な遺伝子であるA3の配列を基礎としたプローブによって相同性のある葯に特異的な遺伝子のクローニングが可能であることが明らかである。
A3のcDNAとハイブリット形成する15kbのアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のゲノムクローン（G3.6）を単離した（図３）。A3プローブと強くハイブリッド形成する2300bpのHind III−Hinc II領域をG3.6からサブクローニングし、一部を配列分析する（図４）ことによって、ブラッシカ  ナプス（B.napus）のE5のcDNAと非常に相同性のあるORF（770〜1126の位置）が明らかにされた（ヌクレオチドレベルで82％およびタンパク質レベルで76％）（図2a、ｂ）。アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子は明らかにイントロンを含まない。A3によってエンコードされた推定のタンパク質は、12.9kDaの分子量を有する118アミノ酸から構成される。エヌビーアールエフ（NBRF）タンパク質のデータベースの研究（放出34）によっては、推定のA3タンパク質に相同性のあるタンパク質は見つからなかった。A3のコーディング領域（coding region）の推定の出発点から69bp上流の、699〜707bpの間にTATAボックスの共通配列（ジョシ（Joshi）、1987年）がある。
ｂ）A9遺伝子の単離および特性の評価
ノーザン（Northern）分析および切片上ハイブリッド形成法（in situ hybridisation）によって、ブラッシカ  ナプス（B.napus）のA9遺伝子は葯の長さが1.5〜2.3mmのタペータム細胞において発現し、2.0〜2.3mmで発現が最高になることが示される。A9の発現は、減数分裂をしている細胞を有する葯内で開始し、初期の第一間期における小胞子を有する葯にまで続く。A9のcDNAは、１〜296bpの位置のORFを含む490bpの長さである（図５）。ノーザンゲルブロット（Northern gel blot）より、ブラッシカ  ナプス（B.napus）におけるA9のmRNAの測定された大きさは約550〜600bpである。A9のmRNAの存在量は、葯のポリＡ＋mRNAの全量の0.1〜0.2％の間であった。
A9のcDNAとハイブリッド形成する13Kbのアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のゲノムクローン（G9.1）を単離し（図６）、3145bpのXba I断片をクローニングし、一部を配列分析した（図７）。この断片は、ヌクレオチドレベルでA9のcDNAのORFと76％一致し（図8a）、さらにこれらのORFの推定生成物と73％一致する（図8b）1461〜1781bpの位置のORFを有している。cDNAおよびゲノム配列の比較によって、cDNAにおけるORFは9bpの位置で開始し（図５）、A9遺伝子はイントロンを含まないことが指摘される。A9遺伝子の推定の出発点から70bp上流部分（1382〜1389の位置）に、ジョシ（Joshi）（1987年）の共通配列に適合するTATAボックスがある。ブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNAによってエンコードされた推定のORFは、10.3kDaの算定分子量を有する96アミノ酸であり、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のものは、11.6kDaの分子量を有する107アミノ酸である。エヌビーアールエフ（NBRF）タンパク質のデータベースの研究によって推定のA9タンパク質に対して全体的な相同性は見つからなかったが、A9タンパク質は、数種の2S植物の貯蔵タンパク質においておよびある種の植物のプロテアーゼ阻害剤中に存在するシステインモチーフを（cysteine motif）有する。
実施例２  アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）およびニコチアナ  タバカム（Nicotiana tobacum）の葯におけるβ−グルクロニダーゼの発現を誘導するためのA9およびA3プロモーターの使用
A3およびA9の推定のプロモーター領域がアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）およびニコチアナ  タバカム（N.tobacum）において外来遺伝子の発現を誘導することができることを示すために、プロモーターの転写融合物（transcriptional fusion）をβ−グルクロニダーゼ（GUS）をエンコードする大腸菌（Escherichia coli）遺伝子について行った。
ａ）A3−GUS融合物（図９）
G3.6の1030bpのHinc II断片をベクターpTZ18（ファルマシア  エルティディ（Pharmacia Ltd.）製）のHinc II部位にサブクローニングし、pRS5を形成した（図９）。これをSst Iで切断し、この断片をSst Iで切断したpIC19H（マルシュ（Marsh）ら、ジーン（Gene）、32巻、ページ481〜485（1984年））にクローニングし、pWP87を形成した。次に、A3プロモーターをpWP87からHind III−Nru I断片として回収し、Hind III及びSma Iで切断したpB I101.1（ジェファーソン（Jefferson）ら、エンボ  ジャーナル（EMBO J.）、６巻、ページ3901（1987年））にクローニングした。このようにして得られたプラスミド（pWP92）（図９）は、GUSに融合したSst I部位（図４において745bpの位置）の上流の745bpのA3配列を有する。
ｂ）A9−GUS融合物（図10）
329bpのHinc II−Rsa I断片（図７において1105〜1434bpの位置）をHinc IIで切断したpTZ18にクローニングし、pWP70Aを形成した。DNA配列分析によって、Rsa I部位の再形成において生じたRsa I、Hinc II結合部位で「Ｇ」残基が欠損していることが分かった。A9プロモーターを有するpWP70AのHind III、BamH I断片をBamH I、Hind IIIで切断したピーブルースクリプト（pBluescript）（ストラタジーン（Stratagene）製）にクローニングし、pWP71を形成した。より大きなA9の上流領域を有するプラスミドを再構築するために、pWP71のEcoR I、Hind III断片を900bpのpWP64のHind III、EcoR I断片（図６）（Acc I、BamH Iで切断されたpTZ19中にクローニングされた1486bpのAcc IBgl II断片を有する）と置き換え、pWP72を形成した。また、pWP71のEcoR I、Hind III断片を1397bpのpWP55のHind III、EcoR I断片（図６）（Xba Iで切断されたpTZ19中にクローニングされた3146bpのXba I断片を有する）と置き換え、pWP73を形成した。pWP71、pWP72及びpWP73のHind III、Xba I断片をHind III、Xba Iで切断したpBI101.1中にクローニングし、それぞれpWP74、pWP75及びpWP76を形成した。このようにして得られたpWP74は、329bpのA9プロモーター断片（1108〜1437bpの位置）を有し、pWP75は、936bpのA9断片（501〜1437bpの位置）を有し、pWP76は、1437bpのA9断片（１〜1437bpの位置）を有し、すべてがGUSに融合している。
次に、すべてのGUS構築物を、標準的な形質転換技術を用いてニコチアナ  タバカム（N.tobacum）およびアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）中に形質転換した。形質転換された植物を分析することによって、GUS活性が葯の組織、特にタペータム細胞に局在していることが示された。GUS活性の時間的な調節（temporal regulation）は、実施例１に記載されたようにA3及びA9遺伝子で観察された時間的な発現（temporal expression）と一致した。図11は、形質転換タバコ植物の葯におけるA9−GUS融合物の活性を示している。GUS活性を、胞子形成細胞（sporogenous cell）の発育の時期にちょうどある葯内を蛍光光度計で測定した。GUSの発現のパターンは、融合物において用いられた上流領域の長さに関わりなく（量的にも質的にも）同じであった。これらの実験によって、A9プロモーターが、減数分裂をしている細胞の発育段階で始まり、初期の小胞子の間期の間に終わる期間を通してタペータム細胞内で転写を誘導することが明らかに示される。
実施例３  発現カセット（expression cassette）の構築および形質転換植物における葯に特異的なメッセージ（message）に対するセンス及びアンチセンスRNAの製造におけるこれらの使用
葯に特異的プロモーターな若しくは構成プロモーター（constitutive promoter）のどちらかを使用して、形質転換植物における葯に特異的な転写物に相当するセンスまたはアンチセンスRNAの発現を誘導でき、このようにして葯の突然変異および雄性不稔を強力に作製する。同様の葯に特異的なプロモーターを用いて、葯の機能に好ましくないタンパク質または酵素をエンコードする遺伝子の葯に特異的な発現を誘導でき、これによって雄性不稔が作製できる。上記使用に関する、発現カセットの使用、上記実施例において記載された構築を実施例４及び５において記載する。
ａ）A9プロモーターを用いてセンス及びアンチセンスRNAを発現するための中間ベクターの構築
pWP72（図10）をXba Iで消化し、再結合することによって、ポリリンカーのBanH I部位を除去し、pWP78（図12）を形成する。pWP78のKpn I、Sst I（Sst Iの末端はクレノウ（Klenow）によってブラントエンドになっている）のA9プロモーター断片をKpn I、Sma Iで切断したpJIT60中に連結し、pWP80（図12）を形成する。pJIT60は、CaMV  35Sプロモーターが２本鎖のCaMV  35Sプロモーター（グエリノウ（Guerineau）ら、ヌク  アッシズ  レス（Nuc.Acids Res.）、16巻ナンバー23、ページ11380（1988年））に置き代わっている以外はpJIT30（グエリノウ（Guerineau）ら、プラント  モル  バイオル（plant Mol.Biol.）、15巻、ページ127〜136（1990年））と同じものである。pWP80の中間ベクターは、転写物を安定化させる35S  CaMVポリアデニレーションシグナルを有するピーブルースクリプト（pBluescript）由来のポリリンカーに融合した936bpのA9プロモーター断片から構成される。
ｂ）A3プロモーターを用いてセンス及びアンチセンスRNAを発現するための中間ベクターの構築
pJIT60のCaMVのプロモーターを、pWP87の745bpのKpn I,Hind III断片（図９）をKpn I、Hind IIIで切断したpJIT60中にクローニングすることによって、A3プロモーターと置き換え、pWP88（図12）を形成する。したがって、pWP80およびpWP80は、プロモーター領域および周りの制限酵素部位以外は同じである。
ｃ）A9のcDNAのセンスまたはアンチセンスの配向（orientation）に連結したタペータムに特異的なA9プロモーターを有するキメラ遺伝子の構築
葯に特異的なブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNAを、cDNAの末端にEcoR Iリンカー（ファルマシア  エルティディ（Pharmacia Ltd.）製）を添加することによって、EcoR Iで切断したラムダ  ザップ  II（Lambda Zap II）にクローニングした。また、これらのリンカーは、内部にNot I部位を有しており、このため、cDNAが内部にNot I部位を有していなければ、全cDNAをNot I断片として回収できる。したがって、A9に関するブラッシカ  ナプス（B.napus）のcDNAは、Not I断片として回収され、Not Iで切断したpWP80中に両方の配向（orientation）（センスおよびアンチセンス）でクローニングされる。プロモーター、cDNAおよびターミネーター領域を、Hind III、Xho Iで消化したpWP80誘導体から切り出し、Sal I、Hind IIIで切断されたpBin19（ベヴァン（Bevan）ら、ヌク  アシッズ  レス（Nuc.Acids Res.）、22巻、ページ8711〜8721（1984年）中にクローニングする。
pBin19誘導体を、ブラッシカ  ナプス（B.napus）に形質転換する。このようにして得られたアンチセンスA9のRNAを発現する形質転換植物は雄性不稔である。
雄性不稔を生じるように構築できる他のキメラ遺伝子は以下の通りであり：−
ｉ）アンチセンスA9のRNAを発現するような、アラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子のコーディング領域（coding region）に連結されたA9プロモーター；
ii）A9のcDNAからまたはアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA9遺伝子からのいずれかの、アンチセンスA9の発現を誘導するA3プロモーター；
iii）A3のcDNAまたはアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子のいずれかを用いた、A3に対するアンチセンスRNAを発現するA9プロモーター；
iv）A3のcDNAまたはアラビドプシス  タリアナ（A.thaliana）のA3遺伝子のいずれかを用いた、A3に対するアンチセンスRNAを発現するA3プロモーター。
これらのプラスミドもアブラナ科（the Brassicaceae）の他のものに形質転換することによって形質転換植物において雄性不稔が得られる。
実施例４  キメラのA3−バーナーゼ（barnase）およびA9−バーナーゼ（barnase）遺伝子の構築および形質転換植物におけるこれらの発現
A3およびA9プロモーターの利用能を示すために、これらを用いてタペータム細胞におけるRNアーゼである、バーナーゼ（barnase）の発現を誘導する。雄性不稔性植物を作製するためのバーナーゼ（barnase）遺伝子の利用は、EP−Ａ−0344029号（プラント  ジェネティック  システムズ（Plant Genetic Systems））に記載されており、マリアニ（Mariani）ら、ネイチャー（Nature）、347巻、ページ737〜741で公表されている。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを特定部位の遺伝子増幅（polymerase chain reaction）（PCR）において用いて、プラスミドpTG2（ホロビッツ（Horovitz）ら、ジェー  モル  バイオル（J.Mol.Biol.）、216巻、ページ1031〜1044（1990年））からバースター（barstar）および成熟したバーナーゼ（barnase）生成物をエンコードする断片を得る：
0003595335.tif 000002
第一のプライマーは、ハートレイ  アール  ダブル（Hartley R.W.）のジェー  モル  バイオル（J.Mol.Biol.）、202巻、ページ913〜915（1988年）における図１のヌクレオチド95〜221bpと相同性を有する。第二のプライマーは、pTZ18U（ファルマシア（Pharmacia）製）のHind III部位の直ぐ次ぎの配列と相同性がある。バースター（barstar）は、活性のあるバーナーゼ（barnase）は特殊な阻害剤であるバースター（barstar）が存在しないとクローニングできないので、この断片上に残す（バーナーゼ（barnase）のみが形質転換植物内では発現する）。PCR断片をXba I、Hind IIIで消化し、Xba I、Hind IIIで切断したピーブルースクリプト（pBluescript）中にクローニングし、pWP120（図13a）を形成する。
ａ）バーナーゼ（barnase）へのA9プロモーターの転写融合（transcriptional fusion）
pWP120をXba I、Hinc IIで消化し、バーナーゼ（barnase）／バースター（barstar）断片をXba I−Sma Iで切断したpWP91中にクローニングし、A9プロモーターが成熟したバーナーゼ（barnase）配列に転写融合する（trancriptionally fused）pWP127（図13b）を形成する（pWP91は、Xba IとEcoR Iとの間のポリリンカー領域がSpe I、BamH I、Sma IおよびPst I部位と置き代わっている以外はpWP80と同じである）。Sal Iで切断したpBin19にpWP127のXho I断片を連結することによって、この遺伝子融合物をpBin19に移す。
ｂ）バーナーゼ（barnase）へのA9プロモーターおよび遺伝子の転写融合（transcriptional fusion）
以下のプライマーをPCR反応において用いて、A9遺伝子の５′の転写されない全領域を含み、A9遺伝子の開始メチオニン（initiating methionine）周辺の配列をNco I部位に突然変異させたpWP64（図６）からA9プロモーター断片を得る（第二のプライマーは、pTZ19Uベクター内の配列と相同性がある）：
0003595335.tif 000003
この断片をHind III、Xba Iで切断し、pWP80またはpWP91中にクローニングし、これらの中間ベクター内に存在するA9プロモーター断片を置き換える。この新たな中間ベクターは、それぞれpWP112およびpWP113である。
pWP120をNco I、Hinc IIで切断し、バーナーゼ（barnase）／バースター（barstar）断片をNco I、Sma Iで切断したpWP113中にクローニングし、pWP128（図13b）を形成する。次に、このキメラ遺伝子をpBin19のSal I部位にXho I断片としてクローニングする。
ｃ）バーナーゼ（barnase）へのA3プロモーターの転写融合（transcriptional fusion）
pWP127をSal I、Xba Iで切断し、pWP88のSal I、Xba IのA3プロモーター断片中にクローニングすることによって、pWP127のA9プロモーターをA3プロモーターと置き換え、pWP131（図13b）を形成する。このキメラ遺伝子を、Kpn I、Sal Iで切断したpBin19中にKpn I、Xho I断片として移す。
このpBin19誘導体プラスミドを、形質転換植物内のバーナーゼ（barnase）が発現することによって葯のタペータム細胞が分解し、これによって雄性不稔が完了するニコチアナ  タバカム（N.tobacum）中に形質転換する。この植物は雌性稔性である。このようにして、両方のA3およびA9プロモーターは、タペータムに特異的であり、タペータム細胞内の細胞毒性のある物質の発現を誘導することによって雄性不稔性であるが、他の点では表現型は正常である形質転換植物を生産するのに適している。これらのプラスミドはまた、ブラッシカ  ナプス（B.napus）、イネ科インドトウモロコシ（Zea mays）及びホルデウム  ブァルガレ（Hordeum Vulgare）等の他の穀物種中にも形質転換でき、これによって形質転換植物における雄性不稔が得られる。
実施例５  A3及びA9プロモーターおよびβ−1,3グルカナーゼ遺伝子のキメラ遺伝子融合物の構築および形質転換植物における発現
ノーザーン（Northern）分析によって決定されたA3及びA9遺伝子（実施例１）およびプロモーター−GUS融合物（実施例２）の発現の時間的なパターン（temporal pattern）によって、両方のプロモーターとも、四分子からの小胞子の放出前の葯の発育段階で活性を有することが示される。このようにして、いずれのプロモーターも、前記したようのと同様に、葯においてβ−1,3グルカナーゼの未成熟な発現を誘導することによって雄性不稔を得るのに適している。
ニコチアナ  タバカム（N.tobacum）のβ−1,3グルカナーゼをエンコードするcDNAは、シンシ（Shinshi）ら（ピーナス（PNAS）、85巻、ページ5541〜5545（1988年））およびニール（Neale）ら（プラント  セル（Plant Cell）、２巻、ページ673〜684（1990年））によって報告されている。この酵素は、液胞内に存在し、これによってＣ−末端配列は細胞内の部位に応答することが指摘される（ファン  デン  ブルッケ（Van den Blucke）ら、ピーナス（PNAS）、86巻、ページ2673〜2677（1989年））。ニコチアナ  タバカム（N.tobacum）のグルカナーゼの配列（シンシ（Shinshi）ら、1988年、ニール（Neale）ら、1990年）に相補的な２本のオリゴヌクレオチドを用いて、さらにニコチアナ  タバカム（N.tobacum）のmRNAからグルカナーゼcDNAを単離するために特定部位の遺伝子増幅（polymerase chain reaction）を用いることによって、このグルカナーゼについて操作されるcDNAをクローニングする。第一のオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：
0003595335.tif 000004
このプライマーはグルカナーゼの５′領域（シンシ（Shinshi）ら、1989年における７〜29の位置）と同じ配列の後にXba IおよびNco I部位を有する。第二のオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：
0003595335.tif 000005
このプライマーは、ストップコドン（stop codon）であるトリヌクレオチドの後にSac II部位および成熟したグルカナーゼのＣ−末端をエンコードする領域（シンシ（Shinshi）ら、1988年における1017〜993の位置）に相補的な配列を有する。したがって、このグルカナーゼを、中間ベクターpWP80およびpWP88中に連結するために、両末端の制限酵素部位を用いてクローニングする。また、Ｃ−末端の標的シグナル（targeting signal）を除去できるように、この酵素を操作する。したがって、この酵素は、形質転換植物において発現する際には、液胞に移るのではなく分泌されると考えられる。グルカナーゼ遺伝子を、Xba I、Sac IIで切断したpWP80中にXba I、Sac II断片としてクローニングし、A9プロモーターグルカナーゼとの間の転写融合物（transcriptional fusion）を形成し、pDW80PRを形成する。pDW80PRのSal I、Xba IのA9プロモーター領域をpWP88のSal I、Xba IのA3プロモーター領域で置き換えることによってpDW88PR（図14a）を形成し、A3−グルカナーゼ転写融合物（transcriptional fusion）を構築する。グルカナーゼをNco I、Sac II断片としてNco I、Sac IIで切断したpWP112中にクローニングすることによってpDW112PR（図14b）を形成し、A9プロモーターおよびグルカナーゼに関する遺伝子の転写融合物（transcriptional fusion）を作製する。pDW80PRおよびpDW112PRにおけるキメラ遺伝子をSal I、EcoR V断片としてSal I、Sma Iで切断したpBin19中に移し、さらに、pDW88PRにおけるキメラ遺伝子をSac I、EcoR V断片としてSac I、Sma Iで切断したpBin19中に移す。これらのpBin19誘導体をニコチアナ  タバカム（N.tobacum）に形質転換する。小胞子母細胞周辺のカロースは形質転換植物内で未成熟に消失し、これによって雄性不稔が得られる。これらのプラスミドはまた、ブラッシカ  ナプス（B.napus）、イネ科インドトウモロコシ（Zea mays）及びホルデウム  ブァルガレ（Hordeum Vulgare）等の他の穀物種中にも形質転換することによって形質転換植物における雄性不稔が得られる。
【図１４ａ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0003595335.tif 000029
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【図６】
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【図７】
0003595335.tif 000032
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0003595335.tif 000037
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【図８ａ】
0003595335.tif 000039
0003595335.tif 000040
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ｂ】
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