(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−プロGRF類似体であって：
A1−A2−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−A8−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−A15−Gln−Leu−A18−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−A24−Asp−Ile−A27−A28−Arg−A30−R0
式中で、A1はTyrまたはHisであり
A2はValまたはAlaであり
A8はAsnまたはSerであり
A15はAlaまたはGlyであり
A18はSerまたはThrであり
A24はGlnまたはHisであり
A27はMet、IleまたはNleであり
A28はSerまたはAspであり
A30は１から15残基のいずれかのアミノ酸配列かまたは欠損しており、
R0はNH2あるいはNH−（CH2）ｎ−CONH2であり、ｎ＝１から12であり、そして
式中でA1は下記の一般式Ｉの疎水性末端がＮ−またはＯ−で結合しており：
0003576170.tif 000013
式中で、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であり、
Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（NH）であり、
（Ｗ＝Ｙ）はシスまたはトランスの（CH＝CR5）を表し、
（W'＝Y'）はシスまたはトランスの（CH＝CR6）を表し、
Ｚは酸素原子またはイオウ原子であり、
R1、R2およびR3は独立して、ヒドロキシル基、水素原子、そして直鎖または分岐のC1−C6アルキル基から選択され、
R4はヒドロキシル基、水素原子または直鎖または分岐のC5−C9アルキル基であり、
R5およびR6は独立して、水素原子、または直鎖または分岐のC1−C4アルキル基であり、
ａは０または１であり、
ｂは０または１であり、
ｃは０から８であり、
ｄ＋ｆの和は１であり、
ｅは０から８であり、
ｇは０から８であり、
ｈは０から１であり、
その中でａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から７原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する、キメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項２】
式中、A1は、式Ｉの疎水性末端によりアンカーされたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ＋ｆの和が１以上であり、ｈは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、R1、R2、R3、R4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項３】
式中、A1は、式Ｉの疎水性末端によりアンカーされたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｄ＋ｆの和が１以上であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項４】
式中ｄ＋ｆの和が１である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項５】
式中、A1は、式Ｉの疎水性末端によりアンカーされたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である、請求項４に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項６】
ｃが０である、請求項５に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項７】
A30が、欠損しているかまたはSer−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leuである、請求項６に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項８】
A30が欠損し、そしてR0がNH2である、請求項７に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項９】
式cisCH3−（CH2）２−CH＝CH−CO−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−NH2または、transCH3−（CH2）２−CH＝CH−CO−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−NH2で表される、請求項８に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項１０】
R0がNH2である、請求項７に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項１１】
式cisCH3−CH2−CH＝CH−CH2−CO−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu−NH2または、transCH3−CH2−CH＝CH−CH2−CO−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly−Glu−Ser−Asn−Gln−Glu−Arg−Gly−Ala−Arg−Ala−Arg−Leu−NH2で表される、請求項10に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項１２】
式中、A1は、式Ｉの疎水性末端によりアンカーされたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項１３】
式中、A1は、式Ｉの疎水性末端によりアンカーされたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｄ＋ｆは１以上であり、ｈは０であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である、請求項１に記載のキメラ脂肪体−プロGRF類似体。
【請求項１４】
活性成分として請求項１に記載のGRF類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤あるいは希釈剤と組み合わせて含む、成長ホルモンの放出を誘導する薬学的処方剤。
【請求項１５】
請求項１に記載のGRF類似体を含む、患者において成長ホルモン欠損症を診断するための、診断薬。
【請求項１６】
患者において成長ホルモンの濃度を増加させるための、請求項１に記載のGRF類似体。
【請求項１７】
患者において下垂体萎縮症あるいは成長遅滞を治療するための、請求項１に記載のGRF類似体。
【請求項１８】
患者において傷害あるいは骨の癒合について治療するための、請求項１に記載のGRF類似体。
【請求項１９】
患者において骨粗鬆症を治療するための、請求項１に記載のGRF類似体。
【請求項２０】
ヒトあるいは動物においてタンパク質の同化作用を増進するための、請求項１に記載のGRF類似体。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（ａ）発明の属する技術分野
本発明は、生物学的活性が増加しそして活性が延長したキメラ脂肪体プロGRF類似体、それらの同化作用性（anabolic）薬剤としての応用、そして成長ホルモン欠損症の治療に関する。
（ｂ）従来の技術の記述
脳下垂体から分泌される成長ホルモン（GH）あるいはソマトトロピンは、生物学的活性が若齢の生物の直線的成長に重要であるが、成熟した状態においても本来の姿（integriy）を維持するために重要である、ホルモンのファミリーを構成する。GHは末梢器官に対して成長因子（インスリン様成長因子−１あるいはIGF−１）、あるいはその受容体（上皮増殖因子あるいはEGF）の合成を刺激することにより、直接的にあるいは間接的に作用する。GHの直接的な作用は、抗インスリン性と呼ばれるタイプのものであり、その作用は脂肪組織のレベルでの脂肪融解に有利である。IGF−１（ソマトメジンｃ）の合成および分泌に対するその作用を介して、GHは軟骨および骨の成長（構造的成長）を刺激し、筋肉および皮膚を含む複数の末梢器官においてタンパク質合成および細胞増殖を刺激する。その生物学的活性を介して、GHは成人においてタンパク質同化作用状態を維持する際に関与し、そして傷害の後の組織再生現象において主要な働きをする。
加齢とともに起こるGH分泌の減少は、ヒト、および動物で示されており、生物の加齢を開始するあるいは加齢に関与する同化作用から異化作用へのシフトを引き起こしやすい。筋肉量の減少、脂肪組織の蓄積、骨の脱イオン化、加齢とともに見られる傷害後の組織再生能力の減少がGHの分泌の減少と相関している。
このようにGHは子供の直線的な成長のために絶対的に必要な、そして成人においてタンパク質の代謝を調節するための生理学的同化作用性薬剤である。
脳下垂体からのGHの分泌は、２種の視床下部性のペプチドであるソマトスタチンおよび成長ホルモン放出ホルモン（GRF）が主に調節している。ソマトスタチンはGHの分泌を阻害し、一方でGRFは促進する。
ヒトGHは、遺伝子工学により約10年間製造されてきた。最近までGHの使用法のほとんどは、子供の成長遅延に関するものであったが、現在では成人に対するGHの使用について研究されている。GHおよびGRFの薬理学的使用は以下の３種の主要なカテゴリーに分類することができる。
子供の成長
組換えヒト成長ホルモンでの治療は、下垂体性小人症、腎臓機能不全症、ターナー症候群そしてこびと症の子供において成長を刺激することが示された。組換えヒトGHは現在ではヨーロッパおよびアメリカ合衆国で、GH欠損症により引き起こされる子供の成長遅延のために、そして子供の腎臓機能不全症のために、“みなしご薬物”として販売されている。その他の使用に関しては、臨床的な試験研究が行われている。
成人および初老の患者に対する長期的治療
GHの分泌の減少により、加齢の際の体構造における変化が起こる。組換えヒトGHで１年間治療する予備的研究で、筋肉量の増加そして皮膚の厚さの増加、高齢の患者集団における骨密度の若干の増加を伴う脂肪量の減少が報告された。骨粗鬆症に関しては、最近の研究は組換えヒトGHが骨のイオン化を増加しないことを示唆し、閉経後の女性において骨の脱イオン化を阻害しうることを示唆する。さらにこの理論を示すための研究が現在進行中である。
成人および初老の患者に対する短期的治療
前臨床的研究および臨床的研究において、成長ホルモンは、タンパク質の同化作用や火傷の治癒、エイズや癌の治癒、けがの癒合および骨の癒合を刺激することが知られてきた。
GHおよびGRFについては、獣医薬理学的な使用についても企図している。GHおよびGRFの両方とも、脂肪組織の代わりに筋肉組織が蓄積しやすいことにより肥育期の間にブタの成長を刺激し、ウシにおいては乳の産生を増加し、そして動物の健康を危険にさらし得るような望ましくない副作用はいかなるものもなく、そして産生する肉あるいは乳にいかなる残存も見られない。ウシソマトトロピン（BST）は現在ではアメリカ合衆国において販売されている。
現在行われている臨床的研究のほとんどは、組換えGHで行っている。GRFは、ほとんどの事例において近い将来GHの使用に変わる運命にある第二世代の産物であると考えられている。これにより、GHそれ自体の使用を越えるの多数の利点がGRFの使用には存在する。
生理学的利点
成長ホルモン（GH）は、脳下垂体からパルス状に分泌され、この分泌のリズムは最適の生物学的作用のために不可欠なものである。分泌の本来の形式に対応したGHの投与を成功させることは困難である。GRFを遅速放出調製物として、あるいは点滴として持続的様式により投与した場合、GHの分泌が増加しその間そのパルス性は保たれる。
現在販売されている組換えGHは、22kDaの形であるが、一方でGRFは脳下垂体からより幅広い生物学的作用に関わるあらゆる化学的異性体の合成および分泌を誘導する。
GHによる治療により、結果として脳下垂体の内在性成長ホルモンの分泌の能力は減少し、そしてGRFに対するGHの反応は、このような治療の後微弱になる。一方、GRFによる治療ではこの欠点は存在せず、脳下垂体に対するその亢進作用は、通常の動物においてそして成長ホルモン細胞機能不全を伴う患者において脳下垂体の分泌能力を増加する。
経済的利点
遺伝子工学によるGHの産生は、臨床的に使用するためには非常に高価なものである。特に、使用した細菌株からの物質によるこれら商業的調製物のコンタミネーションについての危険性がある。これら細菌性のコンタミネーション物質は、患者において発熱性物質となり、そして結果として免疫誘起反応を起こしうる。組換え産物の精製は、以下に示す多数の連続的なクロマトグラフィー工程をにより効果的なものとなる。徹底的な純度の基準を設ければ、複数回の品質管理工程を行うことになる。
GRFの合成は、化学的な性格によるものである。その合成は固層中で効果的であり、そしてその精製は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して一回工程で行う。同様に結果として同一の生物学的作用を得るために投与するべきGRFの量はGHの量と比較してずっと少ない。
これらすべての利点にも関わらず、化学的に不安定であることを主要な理由として、GRFは未だに療法薬剤としては現在までのところ商業的になっていない。ヒトGRFは、以下の配列である44アミノ酸のペプチドである。
0003576170.tif 000002
最小活性コア部分は、hGRF（１−29）NH2である。
0003576170.tif 000003
多くのペプチドに関して、hGRF（１−29）NH2は血清中で急速に分解し、そしてその代謝物には残存する生物学的活性はない。酵素の作用、すなわちジペプチジルアミノペプチダーゼIV型の作用は、血液中で結果としてGRFのAla2−Asp3のペプチド結合を加水分解することがよく知られている。この加水分解は、文献で報告されている多くの研究の主題であった多数のネガティブな結果を引き起こしている。本質的にはこの加水分解により、生物学的活性が1/1000以下に減少する、特異的な活性を持つ切断したペプチドを形成することを誘導する。
子供および成人での臨床的研究から、天然のhGRF（１−44）NH2あるいは活性のあるhGRF（１−29）NH2断片は、組換えGHの活性に相当する効果を引き起こすほど活性はない。
多くのGRF類似体が記述されたが、しかしそれらはすべて異なるアミノ酸配列を有する化あるいは合成アミノ酸（Ｄ体）を含む改変GRFであるという欠点が存在する。これらGRF類似体は、潜在的には免疫原性を有し、そしてそれらをヒトに投与することにより免疫傷害性の問題や潜在的な副作用を引き起こす可能性がある。
ペプチド配列のＣ末端に疎水性の基、たとえば−NEt2でアンカーをすることにより、結果として特異的な活性の顕著な増加を引き起こすことができる。疎水性という用語では、これらの結果はたとえばMuranichi（S.Muranichi  et  al.,1991,Pharm.Res.,8:649−652）の研究など、疎水基として小ペプチド類似体を合成する際に使用するラウロイル基の無効性を力説する、最近の研究により否定される。このように、先行技術の否定的な研究は、疎水性残基を使用することではより強力なGRF類似体を見いだすという問題を処理することができなかった。
Gaudreauら（P.Gaudreau  et  al.,1992,J.Med.Chem.,35（10）,:1864−1869）は、ラット脳下垂体受容体に対するアセチル−GRF（１−29）NH2、６−アミノヘキサノイル−GRF（１−29）NH2、そして８−アミノオクタノイル−GRF（１−29）NH2の親和性を記述している。この報告において、試験した脂肪酸−GRF組成物のどれも、hGRF（１−29）NH2それ自体よりも高い親和性を示さず、そして筆者らは“・・・hGRF（１−29）NH2のＮ末端の疎水性特性を増加するための改変は、受容体親和性を増加するためには適切なアプローチを構成しない。”と結論づけた。
Coyら（D.H.Coy  et  al.,1987、J.Med.Chem.,30:219−22;1989年５月10日に公開された欧州特許出願第314,866号）は、ラットモデルにおける、より特定的にはペントバルビタールナトリウムにより麻酔をしたラットにおける生物学的活性の増加を伴うアセチル−GRFペプチドについて記述している。培養ラット脳下垂体細胞によるin  vitroでのGHの反応を同様に解析した。しかしながら、これらの著者は、GRFのＮ末端領域に追加した２よりも長い炭素鎖（アセチル）を持つ脂肪酸−GRF類似体を合成しそして試験することはなかった。
今までに、記述されたGRF類似体のほとんどは、（Gaudreauらの類似体やCoyらの類似体を含め）ラットのモデルでin  vitroかin  vivoのどちらかで試験されてきた。ヒトおよびラットのGRF（１−29）NH2ははっきりと異なっているため、GRFの構造−活性関係は両方の種において異なる。そのため、ラットで得られた結果をヒトに対して外挿することはできない。
1989年６月６日に公開された欧州特許出願第320,785号は、（C1−C8）−アルキル、（C1−C8）−アルキルカルボニルおよびカルボキシ−（C1−C8）−アルキルから選択される鎖を含むGRF類似体を開示する。
1992年10月28日に公開された欧州特許出願第511,003号は、天然のGRFあるいは以前に記載されたGRF類似体に対して、活性および有効性が高いアミノ末端改変GRF類似体を開示する。
それゆえ、合成代謝活性を増進したGRF類似体を設計すること、そして活性が延長するようなGRF類似体を設計することが必要である。この活性の増加は、血清分解に対する抵抗性からおよび／または高アゴニストの特徴から結果として得られる。
ヒトおよび動物に持続的に注射する場合に免疫反応を阻害するために、合成代謝活性を増加し、一方で生物分解性を残し、そして天然のGRFと構造的に近似するGRF類似体を提供することが非常に望ましい。
発明の概要
本発明の一つの目的は、生物分解性を有し、そして非免疫原性の新規のプロGRF類似体であって、生物学的活性が増加し活性が延長したものを提供することである。
本発明の別の目的は、ヒトおよび動物に持続的に投与したときにたとえばインスリン様成長因子−Ｉ（IGF−１）の濃度を実質的には上昇することができる、合成活性活性が増加しおよび活性が延長した、プロGRF類似体を提供する。
本発明の別の目的は、さらなる生物学的な活性と、延長された活性をいずれかのプロGRF類似体に付与する方法を提供する。
本発明の別の目的は、合成代謝の活性が増加しそして活性が延長した活性化プロGRF類似体を生成する方法を提供することである。
本発明は、キメラ脂肪体−GRF類似体を調製することに関する。これらのキメラ類似体は、疎水性部分（末端）を含み、１またはいくつかの疎水性末端をGRFにアンカーすることにより、調製することができる。本発明によるプロGRF類似体は、以下において特徴づけられる：
ａ）これらの類似体は亢進した生物学的活性を有している；特にそれらはヒトに緊密に関係する動物モデルにおいて投与した場合に、GHおよびIGF−１の血中濃度を顕著に増加することができる。この特徴は、結果として患者に投与すべき活性亢進組成物の濃度を減少させることができ、その結果治療効率を増進することができ、そして治療コストを減少することができるという点で特に有利である。
ｂ）天然のアミノ酸および疎水性の代謝可能基質（たとえば脂肪酸など）の両方を、プロGRF類似体の化学合成のために使用する。完全に代謝可能な天然の基質のこのような使用は、潜在的な第二の効果、すなわち複数回の投与をする場合における効果を提供することを意図している。
ｃ）それらの類似体は、限られた少ない濃度で高い生物学的活性を示す。
ｄ）それらの類似体は、延長された長期間にわたって、高い生物学的活性を伴う活性を持ち続ける。
本発明による脂肪体の使用により、結果として先行技術の欠点すべてを克服するプロRF類似体となる。本発明のプロGRF類似体は、生物分解性であり、非免疫原性であり、そして用量を減少しても合成代謝活性が増加した状態を示し、そして活性が延長した状態である。さらに本発明は、GRFおよびその任意の類似体、すなわち短縮された類似体や置換された類似体に関する。
予期しなかったことであるが、成長期ブタにおいて持続性に投与した場合に、Ｎ−ブチリルGRF（１−29）NH2あるいはＮ−オクタノイルGRF（１−29）NH2ではなくＮ−ヘキサノイルGRF（１−29）NH2が統計的に見てIGF−１の濃度を上昇させることを本発明の結果は示した。GRFのＮ末端領域にC4あるいはC8鎖を付加することによりＮ−ヘキサノイル−GRF（C8−GRF）と比較したときに生物学的活性の低い化合物が得られたことを、本発明は示している。そのため、GRFの生物学的活性を増加するためにGRFに対してアンカーするための炭素鎖の最適な長さは、C5からC7であることを、本発明は示す。GRFのＮ−アセチル化（C2鎖の付加）によりラットにおいて生物学的活性が増加することを示しそしてC2より長い炭素鎖を持つ化合物の活性を記載していないCoyらによる研究報告に基づいては、この結果は予期しなかった。
本発明の方法によれば、GRFあるいはその類似体のＮ末端あるいはＣ末端に１またはいくつかの疎水性末端をアンカーすることにより、これらの類似体を作成することができる。切断および精製の後、結果として得られた改変ペプチドは、非常に低い濃度で投与した場合に、高い生物学的な活性を有することが示される。
本発明によれば、生物学的活性が増加し、以下の一般式：
A1−A2−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−A8−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−A15−Gln−Leu−A18−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−A24−Asp−Ile−A27−A28−Arg−A30
を有する生物学的活性が増加したキメラ脂肪体−GRF類似体を提供し、
式中で、A2はValまたはAlaであり
A15はAlaまたはGlyであり
A24はGlnまたはHisであり
A27はMet、IleまたはNleであり
A28はSerまたはAspであり
A30はいずれかのアミノアルキルカルボキシアミド−NH−（CH2）ｎ−CONH−であって、ｎ＝１から12までか、あるいは１から15残基のいずれかのアミノ酸配列であり、
A1はTyrまたはHisであり、A8はAsnまたはSerであり、そしてA18はSerまたはThrであり、その中でA1は以下の一般式Ｉの疎水性末端によるＮ−またはＯ−で結合されており：
0003576170.tif 000004
式中で、Ｇはカルボニル、フォスフォニル、スルフリルあるいはスルフィニル基であってａ＝０または１であり、
Ｘは、酸素原子、イオウ原子、あるいはアミノ基（−NH−）であって、ｂ＝０または１であり、
R1、R2およびR3基は、同一あるいは別個のものであり、そしてヒドロキシル基、水素原子、そして低級直鎖アルキル基あるいは分岐アルキル基から選択され、
−（Ｗ＝Ｙ）−および−（W'＝Y'）−は、R5およびR6がＨまたはC1−C4アルキルであるシスまたはトランスの二重結合−（CH＝CR5）−および−（CH＝CR6）−であって、ｄおよびｆ＝０または１であり、
R4はヒドロキシル基、水素原子またはC5−C6アルキルであり、そして
Ｚは酸素原子またはイオウ原子であって、ｈ＝０または１であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈは、同一または別個のものであり、そしてR4が水素であるときそれらはすべてが０ということはなく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｈの和は、式Ｉの疎水性末端が５から８原子の（Ｃ、Ｏおよび／またはＳ）直鎖状の主鎖を有する様になる。
本発明の好ましいキメラ脂肪体プロGRF類似体は、以下の群から選択される：
ａ）式中でA1は、式Ｉの疎水性末端により結合されたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａおよびｂの両方が１であり、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、Ｘは酸素原子であり、R1、R2、R3、R4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が３、４、５または６である。
ｂ）式中でA1は、式Ｉの疎水性末端により結合されたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂ、ｄ、ｆおよびｈのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4はヒドロキシル基であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
ｃ）式中でA1は、式Ｉの疎水性末端により結合されたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が１であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が２、３、４または５である。
ｄ）式中でA1は、式Ｉの疎水性末端により結合されたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂおよびｈのそれぞれは０であり、ｄ＋ｆの和が２であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が０、１、２または３である。そして
ｅ）式中でA1は、式Ｉの疎水性末端により結合されたTyrまたはＮ−α位で結合されたHisであり、その中でａが１であり、ｂ、ｈ、ｄおよびｆのそれぞれは０であり、Ｇはカルボニルであり、R1、R2、R3およびR4は水素原子であり、そしてｃ＋ｅ＋ｇの和が４、５、６または７である。
本発明の目的において、“疎水性末端”あるいは“Ht"という用語は、脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール、コレステロール誘導体などのいずれかの機能化された脂肪体を意味することを意図している。“シュードミセル残基”あるいは“Pr"という用語は、残基がスウィッターイオニック型（switterionic  form）のミセル構造を形成しまたは取り入れうる様に設計された、側鎖を有するいずれかのαアミノ酸を意味することを意図している。
本発明により、活性成分として本発明のGRF類似体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて、成長ホルモンの放出を誘導するための薬学的処方を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のGRF類似体を投与することを含む、前記患者における成長ホルモン濃度を増加する方法を提供する。
本発明により、患者に対して本発明のGRF類似体を投与し成長ホルモンの反応を測定することを含む、前記患者における成長ホルモン欠損症の診断のための方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のGRF類似体を投与することを含む、前記患者における脳下垂体萎縮症または成長遅延の治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のGRF類似体を投与することを含む、前記患者における傷害の癒合または骨の癒合についての治療方法を提供する。
本発明により、患者に対して効果的な量の本発明のGRF類似体を投与することを含む、前記患者における骨粗鬆症の治療方法を提供する。
本発明により、ヒトまたは動物に対して効果的な量の本発明のGRF類似体を投与することを含む、前記ヒトまたは動物におけるタンパク質同化作用（タンパク質節約効果を含む）を増進する方法を提供する。
本発明において、アミノ酸を、生化学命名法においてIUPAC−IUB委員会により推奨されている様にペプチド技術分野において一般的に受け入れられている慣習的な３文字省略表記により以下に示すように同定する。
アラニン                                     Ala
アルギニン                                   Arg
アスパラギン                                 Asn
アスパラギン酸                               Asp
システイン                                   Cys
グルタミン酸                                 Glu
グリシン                                     Gly
ヒスチジン                                   His
ロイシン                                     Leu
リジン                                       Lys
メチオニン                                   Met
オルニチン                                   Orn
フェニルアラニン                             Phe
プロリン                                     Pro
セリン                                       Ser
スレオニン                                   Thr
トリプトファン                               Trp
チロシ                                       Tyr
Ｄ−チロシン                                 tyr
バリン                                       Val
“天然アミノ酸”という用語は、天然において生じ、または天然に生じるペプチドにおいてアミノ酸残基として取り込まれるアミノ酸を意味する。さらに省略形Nleは、ノルロイシンを意味することを意図している。
使用するその他の省略形は、
TFA   トリフルオロ酢酸
HOBt  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIC   ジイソプロピルカルボジイミド
DMF   ジメチルフォルムアミド
Pip   ピペリジン
DMAP  ４−ジメチルアミノピリジン
Boc   ｔ−ブチルオキシカルボニル
Fmoc  フルオレニルメチルオキシカルボニル
BOP   ベンゾトリアゾ−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート
Me    メチル
HF    フッ化水素酸
NEt3トリエチルアミン、そして
TEAP  トリエチルアンモニウムリン酸（緩衝剤）
本明細書中で記述するすべてのペプチド配列は、一般的に受け入れられている慣習に従って記載し、その際Ｎ末端アミノ酸は左に、Ｃ末端アミノ酸は右に記載する。
【図面の簡単な説明】
図１は、皮下に注射したhGRF（１−29）NH2類似体のブタ血清IGF−１に対する効果についてのグラフである。
図２は、静脈注射をした４μg/kgのhGRF（１−29）NH2および４μg/kgの（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2（TT−01024）＋類似体のブタ血清GHに対する効果の曲線である。
図３は、様々な濃度のhGRF（１−29）NH2対［ヘキセノイルトランス−３］0hGRF（１−29）NH2（TT−01024）の、I.V.投与後300分を通じてのGHの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−60分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜0.01および＊＊＊Ｐ＜0.001）
図４は、５μg/kgのhGRF（１−29）NH2および５μg/kgの（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2類似体のブタ血清GHに対する効果の曲線である。
図５は、様々な濃度のhGRF（１−29）NH2対［ヘキセノイルトランス−３］0hGRF（１−29）NH2（TT−01024）の、S.C.投与後420分を通じてのGHの曲線下領域に対する効果を示すグラフである。（基礎的期間である−60分から０分までとの比較をした場合、＊＊Ｐ＜0.01および＊＊＊Ｐ＜0.001）
発明の詳細な説明
本発明は、高活性であるが生物分解性であり非免疫原性であるキメラ脂肪体プロGRF類似体の新規なファミリーを生成するための、脂肪体、すなわちシュードミセル残基および／または疎水性末端を使用することに関する。
本発明により、脂肪体プロGRF類似体を：
GRFまたはその類似体の一つのＣ末端および／またはＮ末端部分において、１またはいくつかの疎水性末端で結合することにより、または
GRFまたはその類似体の一つを化学的に合成する際に、１またはいくつかのシュードミセルαアミノ酸誘導体（“シュードミセル残基”）を取り込むことにより、
化学的に合成することができる。
本発明により、GRFおよびその類似体を合成する際に架橋として使用するシュードミセル残基（Pr）の構造は、以下のように表すことができる：
0003576170.tif 000005
式中、Ｗは−CO2Q3、−PO3Q3および−SO3Q3からなる群から選択される基であり、
Q3は、水素原子、アンモニウムイオン、メンデレーエフの周期表の1A群の要素を含む群から選択される要素、あるいは以下の脂肪体、すなわちペンテン酸、ヘキセン酸、ヘプテン酸、またはそれらの飽和型から由来する機能的な基であり、
Q1は、アルケニル、アラルキル、アリールおよびアルキル（Cn1H2n1+1）（ここでn1は１から８までの数である）からなる群から選択される基である。Q1は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下のリストから選択することができる：
0003576170.tif 000006
式中、P1からP9は水素原子；メチル基；主要な脂肪族鎖、脂環式鎖または芳香族鎖を伴う機能的な疎水性末端を表し、以下のリスト、すなわち一般式（CmH2mO2）で表される飽和脂肪酸であって、ｍが４から12までの数である直鎖あるいは分岐鎖；あるいはGross  ＆  Meienhofer（1981,The  Peptides,vol.3,Academic  Press:1−341）により記述されている、側鎖保護基、たとえばP1がベンジル基、ブロモ−２ベンジル、ジクロロ−2,6−ベンジルまたはｔ−ブチルであり、P2がベンジル基またはｔ−ブチルであり、P3がベンジル基、ｔ−ブチル、トリチル、アセトアミドメチルあるいはベンズアミドメチルであり、P4がトリフルオロアセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）あるいはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）であり、P5はニトロ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、メシチレンスルホニルあるいはペンタメチルクロマン（pentamethylcromane）であり、P6が水素という条件付きでP5およびP6がアダマンチルオキシカルボニルであり、P7がフェナシル基、ベンジルオキシメチルあるいはｔ−ブトキシメチルであり、P8がベンズヒドリル基、ジメトキシベンズヒドリル、トリチルあるいはキサンテニルでありうる、
ｎは０から６までの整数であり、
Ｙは以下の一般式で表され：
Ｙ＝−Ａ−Pz
式中、Ａは二価のヘテロ原子であり、好ましくは酸素、イオウ、−NH−基あるいは−Ｎ（Me）−基であり、
Pzは、ｚが１から４までの整数である、前に定義したP1からP4までと同一であり、そして
Q2が水素原子である。Q1がＨまたは低級アルキルである場合、Q2はアルキル、、アルコキシ、アルケニル、アラルキルあるいはアリール基のいずれでもよい。これらの条件において、Q1として上記に定義したものと化学的同一性を有する。
（Q1）および（Q2）が結合している炭素原子は、Ｌ体またはＤ体である。それらは不斉であるが、しかし（Q1）＝（Q2）あるいは（Ｗ）＝（Ｙ）である場合には不斉ではない。
結合が１またはそれ以上の疎水性末端（Ht）非シュードミセルで構成されている場合においては、前記末端の構造全体は以下の様に表すことができる：
（Ht）:R−XOfQ5
式中、Ｒは分岐鎖または直鎖のアルキル基、アルケニル基、アリール基あるいはアラルキル基であり、そして一般式CmH2mO2で表される飽和脂肪酸を含む代謝可能な脂肪体の群から由来することができ、好ましくはｍが４から６までの整数であり、１不飽和あるいは多不飽和の脂肪酸、脂肪アミンおよびアルコールであり、
Ｘはリン原子、炭素原子あるいはイオウ原子であり、
ｆは１から３までの整数であり、
Q5は水素原子、アンモニウムイオンあるいはアルカリ金属イオンを表し、ｆが１から２の整数である場合にはQ5は以下の機能、すなわちＸおよびｆは上記で定義した通りであるアミノ（−NH−）、アルコール（−OH）、チオ（−SH）、あるいは酸（−XOfH）のうち少なくとも１つを有するという条件下で上記Ｒと同様に定義することができる。
化学的結合反応をよりよく行うために、酸型のもとで機能化された疎水性末端あるいはシュードミセル残基を使用することが好ましい。これらの条件下においては、結合反応は好ましくは固層中で（Merrifield  R.B.,1963,J.Am.Chem.Soc.,85:2149;1964,J.Am.Chem.Soc.,86:304）、たとえば先行技術において既知の、ベンゾトリアゾ−ル−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（B.Castro  et  al.,1975,Tetrahedron  letters,Vol.14:1219）などの完全に活性な試薬を使用することにより行われる。
結合するべきシュードミセル残基は一般的にはマロン酸塩（malonic  salt）、好ましくはジエチルアセトアミドメチルマロン酸のナトリウム塩と、アルキルハロゲン化物、アルケニルハロゲン化物、アリールハロゲン化物あるいはアラルキルハロゲン化物とを、たとえばジメチルフォルムアミドなどの極性溶媒中で、直接作用することにより調製する。この反応は通常は、続いて酸またはアルカリ加水分解を行い、そして結果として得られたラセミ混合物を分解（好ましくは酵素的に）する。
特定の条件においては、シュードミセル残基の調製物は、以下より構成される：
ａ）第一の工程；すなわち、リジン、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸などの機能化された側鎖を有するアミノ酸を直交する様式で保護すること、そしてサスリン型（sasrin  type）の固体支持体上に接着すること（M.Mergler  et  al.,1988,Peptides,Chemistry  and  Biology,Proceedings  of  the  American  peptide  symposium,St.Louis,p.259,G.R.Marshall,Ed.,Escom,leiden）、
ｂ）第二の工程；すなわち、側鎖を特異的に脱保護すること、そして上述したように代謝可能な疎水性末端（Ht）を自由部位に結合すること。シュードミセル残基（Pr）は支持体−残基結合の切断（TFA/CH2Cl2）の後、精製工程を行うことにより得られる。
三機能性の遊離アミノ酸のαにおいて機能する酸とアミンを選択的に配合することにより、たとえば酢酸銅などの鉱物性起源を持つ薬剤を配合することにより、シュードミセル残基を調整することができる。これらの条件において、形成された複合体および前記末端をそのアシルハロゲン化物中であるいはその酸型またはアミン型中で直接作用することにより、凝縮薬剤の存在下で、代謝可能な疎水性末端の結合を行う。
結合をすべき疎水性末端が脂肪酸を含む場合には、結合をするという観点での活性化がin  situで起こりうる。使用した合成ストラテジーにより、伝統的な脱保護条件下において、結合する直前にペプチド結合部位を遊離する（Gross  ＆  Meienhofer,1981,The  Peptides,vol.3,Academic  Press:1−341）。ついで疎水性末端（Ht）あるいはシュードミセル残基（Pr）は、有機溶媒、たとえばエーテル（テトラヒドロフラン）、脂肪族ハロゲン化溶媒（ジクロロメタン）、ニトリル（アセトニトリル）あるいはアミド（ジメチルフォルムアミド）中で、結合試薬で濃縮する。
結合の動力学の観点では、好ましい反応温度は20から60℃である。使用した疎水性末端の疎水性が高ければ高いほど、結合反応時間は温度とは反比例して変化するがしかし0.1から24時間までの間でのみ変化する。
例示することができる実施例として、以下に記述するトリアシルリジン合成について疎水性脂肪酸末端の結合原理の全体を、概略的に説明する。
0003576170.tif 000007
一般的なGRF類似体の合成工程は9050TMとペプチド合成機（Millipore  Corporation,Milford,MA）上で、FmocストラテジーとMilliporeにより供給された合成回路を使用して、固層方法により行った。Fmocアミノ酸は、Bachem  Californiaおよびその他の商業的供給源から購入した。カップリング方法としてBOP/HOBtを使用する連続的Fmoc化学は、はじめにFmoc−Pal−PEG樹脂（Millipore、カタログ番号:GEN  913383）にＣ末端カルボキシアミドを産生するために適用する。Fmocの脱保護反応は、DMF中20％のピペリジン溶液中で行った。合成が終了した後、樹脂をDMFとエーテルでよく洗浄し、乾燥させる。最終的な側鎖保護基およびペプチド−樹脂結合の切断は、Milliporeが供給している以下の混合物、すなわちTFA、水、フェノール、トリイソプロピルシラン（88:5:5:2）を含む手順を使用して行った。ついでペプチドを沈殿し、エーテルで洗浄し、乾燥する。逆相HPLC精製（バッファーA:TEAP2.5;バッファーB:A中で80％のCH3CN、ウォーターペップ4000、吸光度214nm、検出器モデル486、流速50ml/分、一般的な105分かけてＢを25％から60％にする直線的密度勾配を使用する）に続き、脱塩工程（バッファーC:水中0.1％TFA、バッファーD:CH3CH/H2O（80:20）中で0.1％TFA）を行うことで、HPLC（ミレニウム／光ダイオードの連続検出）により概算すると単一性が97％以上であり、回収率が10−30％であるペプチドを得ることができる。
本発明により、GRF類似体の産生についての前臨床的モデルとして価値のあるため、試験動物種としてブタを選択した。実際ヒトおよびブタのGRF（１−29）NH2は構造的に100％の相同性を有し、そして生理学的なGH分泌のパターンも両種でほとんど同一である。
さらに、GRF類似体の活性は、その急性的なGH放出の活性よりもIGF−１の血中濃度を顕著に増加することができることにより測定した。実際、GHまたはGRFに誘導されたGHの同化作用活性および治癒効果がIGF−１の合成および分泌が増加することにより媒介されていることが知られている。そのため、GRFに誘導されたIGF−１の増加を測定することは、治療効率のもっともよい指標となる。
本発明は、発明の範囲を限定するのではなく発明を説明するために提供する以下の実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。
実施例Ｉ
［ブチリル０］、［オクタノイル０］−、［ヘキサノイル０］−、［ヘキサノイル30］、［ヘキサノイル0,30］、HGRF（１−29）NH2及び［ヘキサノイル０］HGRF（１−44）NH2対HGRF（１−29）NH2の反復投与の、ブタ血清IGF−１濃度に対する効果
これらの実験の目的は、GRF類似体の同化作用性薬剤としての可能性を評価することである。GHの分泌あるいはGRFで誘導されたGHの分泌は、インスリン様成長因子Ｉ（IGF−１）の合成と分泌を増加することを介して、同化作用活性を発揮し、結果として循環血中IGF−１濃度を増加させることが知られている。GRF類似体処置に対する同化作用性反応の強度は、ブタにおいてIGF−１の濃度の上昇と比例していることが、以前に示された（Dubreuil  P.et  al.,1990,J.Anim.Sci.,68:1254−1268）。
それゆえ、脂肪酸プロGRF類似体の同化作用活性を研究するためには、ブタにおいて反復皮下投与により引き起こされるIGF−１濃度を増加させる能力を評価した。
実験１
26頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重40−45kg）を、４実験群にランダムに分けた：
１−hGRF（１−29）NH2（10μg/kg、ｎ＝７）
２−［オクタノイル０］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝６）
３−［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝６）
４−［ブチリル０］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝７）
それぞれの動物は、４日間連続してBIDを皮下に投与した（１日２回）。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、IGF−１の測定に供した。
実験２
40頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重40−45kg）を、５実験群にランダムに分けた：
１−塩類溶液（ｎ＝８）
２−hGRF（１−29）NH2（40μg/kg、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（10μg/kg、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（40μg/kg、ｎ＝８）
それぞれの動物は、５日間連続してBIDを皮下に投与した（１日２回）。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、IGF−１の測定に供した。
実験３
48頭のランドレース種×ヨークシャー種の去勢オスブタ（体重40−45kg）を、６実験群にランダムに分けた：
１−塩類溶液（ｎ＝８）
２−hGRF（１−44）NH2（30μg/kg、ｎ＝８）
３−［ヘキサノイル０］hGRF（１−44）NH2（30μg/kg、ｎ＝８）
４−［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝８）
５−［ヘキサノイル30］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝８）
６−［ヘキサノイル0,30］hGRF（１−29）NH2（20μg/kg、ｎ＝８）
選択した濃度は、hGRF（１−44）NH2類似体については30μg/kg、hGRF（１−29）NH2類似体については20μg/kgであり、それら濃度はモル数を基準とすると同一の濃度を示す。それぞれの動物は、５日間連続してBIDを皮下に投与した（１日２回）。それぞれの日の朝のその日の最初の注射の前に、そしてその日の最後の注射の後に血液サンプルを採取し、IGF−１の測定に供した。
IGF−Ｉ測定
ブタ血清中のIGF−１濃度は、以前に記載されているように（Abribat  T.et  al.,1993,J.Endocrinol.,39:583−589）ギ酸−アセトン抽出をした後、二抗体放射免疫アッセイを行うことで測定した。放射免疫アッセイの前に行う抽出は、内在性IGF−１結合タンパク質を除去するための必要な工程である。
統計的解析
どちらの実験においても、IGF−１のデータは変動の源として日数と処置（GRF類似体）を用いて、分散の二方向反復測定解析（two  way  repeated  measure  analysis）により解析した。複数比較法（multiple  comparison  procedures）を行った（スチューデント−ニューマンケウルス法（Student−Newman  Keuls  method））。Ｐ＜0.05を統計的に有意として判断した。
結果
実験１
日数の顕著な効果（Ｐ＝0.0004）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＝0.011）の両方とも存在し、これよりIGF−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表１）。IGF−１の測定のための血液サンプルは、化合物をその日に最初に注射する前に毎日採取する。データは一群あたり６から７の値の平均±SEMとして示している。
0003576170.tif 000008
複数の比較から、［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2がIGF−１濃度の上昇を誘起していることが示され、それは第４日目（29％、Ｐ＜0.05）および第５日目（38％、Ｐ＜0.05）で顕著であった。ヒトGRF（１−29）NH2は試験した濃度ではIGF−１濃度に対して効果を示さなかった。
実験２
日数の顕著な効果（Ｐ＝0.0001）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＝0.0001）の両方とも存在し、これよりIGF−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表２）。IGF−１の測定のための血液サンプルは、その日の最初の注射の前に毎日採取する。データは一群あたり８の値の平均±SEMとして示している。
0003576170.tif 000009
複数の比較から、［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2の試験したすべての濃度でIGF−１濃度が上昇することが示された。10μg/kgの時には、IGF−１濃度は第５日目および第６日目（16から21％、Ｐ＜0.05）で顕著に増加した。20μg/kgの時には、IGF−１濃度は第３、４、５、および第６日目（20から22％、Ｐ＜0.05）で顕著に増加した。40μg/kgの時には、IGF−１濃度は第３、４、５、および第６日目（27から48％、Ｐ＜0.05）で顕著に増加した。IGF−１濃度は塩類溶液で処置したブタ、およびhGRF（１−29）NH2で処置したブタにおいて一定のままであった。
最後に、第１日目から第６日目までのIGF−１濃度の増加は、［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2（△IGF−１＝11.9＋（2.77＊濃度）;r＝0.68、Ｐ＜0.0001）の濃度に依存していた。
実験３
日数の顕著な効果（Ｐ＜0.0001）および顕著な処置×日数相互作用（Ｐ＜0.0001）の両方とも存在し、これよりIGF−１濃度の増加は、試験した類似体に依存していることを示している（表３）。複数の比較から、ヘキサノイルの機能を有するGRFのＮ末端領域が分岐している類似体の活性が高いことが示された：
［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2は、第５日目および第６日目に（28％および31％、Ｐ＜0.05）IGF−１濃度が顕著に増加した。
［ヘキサノイル0,30］hGRF（１−29）NH2は、第４、５および第６日目に（32％、35％および43％、Ｐ＜0.05）IGF−１濃度が顕著に増加した。
［ヘキサノイル０］hGRF（１−44）NH2は、第３、４、５および第６日目に（41％、54％、50％および61％、Ｐ＜0.05）IGF−１濃度が顕著に増加した。
先にhGRF（１−29）NH2について示したように（実験１および実験２）、完全長のhGRF（１−44）NH2はIGF−１濃度に対してわずかしかまたは全く効果を示さなかった（第６日目には維持できなかった第５日目の顕著な効果を除く）。最後に、hGRF（１−29）NH2のＣ末端領域にヘキサノイル機能を結合することにより、hGRF（１−29）NH2と比較したときに活性が増加した類似体（第６日目でIGF−１濃度が21％増加した、Ｐ＜0.05）を回収したが、［ヘキサノイル０］hGRF（１−29）NH2よりは活性が低かった。
ヒトGRF（１−29）NH2およびhGRF（１−44）NH2は、等モル濃度にするために、それぞれ20μg/kgおよび30μg/kgを注射した。データは一群あたり８の値の平均±SEMとして示している。
0003576170.tif 000010
結論
hGRF（１−29）NH2およびhGRF（１−44）NH2のどちらも、20から40μg/kgの範囲の濃度では、IGF−１濃度を修飾することができない。しかしながら、脂肪酸の結合により、GRFはより活性が高まり、そしてIGF−１分泌に対する活性が顕著に増加した類似体が得られた。脂肪酸の結合は、hGRF（１−29）NH2およびhGRF（１−44）NH2のどちらともの同化作用の活性を増進する効果があった。上記の結果から、使用する理想的な脂肪酸はヘキサン酸あるいは任意のC6脂肪誘導体であり、そして好ましくは最大限に活性の高い類似体を回収するためにGRFのＮ末端領域に結合すべきことが結論づけられた。
実施例II
プロGRF類似体のブタIGF−１濃度に対する相対的効果
これは、単一の濃度のそれぞれの試験物質対塩類溶液を、５日間、１日２回皮下投与する処置である。この実験は、（アミノヘキサノイル）0hGRF（１−29）NH2、（ヘキシルフォルミエート（Hexylformiate））0hGRF（１−29）NH2、（ヘキセノイルトランス−２）0hGRF（１−29）NH2、（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2および（ムコノイル）0hGRF（１−29）NH2の効率を、（ヘキサノイル）0hGRF（１−29）NH2の効率と比較するために行われた。
試験した化合物すべては、GRF類似体の同一のファミリーに属している：それらは、分子の活性を増進するために設計された、天然のGRFおよび天然の脂肪酸との組み合わせである。
試験類似体の特定
TT−01015:（ヘキサノイル）0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
TT−01021:（アミノヘキサノイル）0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
TT−01022:（ヘキシルフォルミエート（Hexylformiate））0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
TT−01023:（ヘキセノイルトランス−２）0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
TT−01025:（ムコノイル）0hGRF（１−29）NH2、塩類溶液中20μg/kg
試験物質の経路および頻度
投与:1日２回の皮下注射
試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ
動物の記載：購入時に体重が35kgの発育期去勢オスブタ56頭
食餌：商業的濃縮試料（タンパク質含量18％）を、随意に給餌した。
実験計画:56頭のブタを、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝８）にランダムに分けた。それぞれの群は、１日２回以下の処置で皮下注射した（用量:3ml、皮下注射）
群1:塩類溶液                            ２回／日
群2:TT−01015                    20μg/kg2回／日
群3:TT−01021                    20μg/kg2回／日
群4:TT−01022                    20μg/kg2回／日
群5:TT−01023                    20μg/kg2回／日
群6:TT−01024                    20μg/kg2回／日
群7:TT−01025                    20μg/kg2回／日
処置として第１日目から第５日目まで投与した。注射の直前にそれぞれの動物から血液サンプルを回収し、さらに第６日目にもう一度血液サンプルを採取した。
血液サンプルは凝固させ、血清を遠心分離で回収し、そしてIGF−１アッセイに供した。
結果は、第１日目（処置前濃度）から第６日目（５日間のGRFの投与後）までのIGF−１濃度の上昇として定義される、Ｄ−IGF−１として図１に示した。試験した類似体すべての中で、ヘキサノイル−、ヘキシルフォルミエート−、ヘキセノイルトランス−２−、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2だけが６日間の実験期間を通じてIGF−１濃度を顕著に増加させ、一方でアミノヘキサノイル−およびムコノイル−hGRF（１−29）NH2は顕著には増加させなかった。hGRF（１−29）NH2は先のアッセイ（実施例１）と同一濃度、同一条件において、効果がないことを示したため、GRFのＮ末端領域にさらに様々なC6炭素鎖を付加することによりその生物活性を増加することが、これらの結果から示された。
実施例III
（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2対hGRF（１−29）NH2の、ブタにおける血管内GH放出活性。
この実験は、プロGRF類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2による静脈内（I.V.）の急性GH放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてhGRF（１−29）NH2の効果と比較することにより行われた。
（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2は、天然のhGRF（１−29）NH2および天然の脂肪酸と組合わさる。この研究は、複数の濃度で、１回の静脈内（I.V.）注射を行う研究であった。
試験類似体の特定
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、0.25μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、１μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、４μg/kg
hGRF（１−29）NH2、0.25μg/kg
hGRF（１−29）NH2、１μg/kg
hGRF（１−29）NH2、４μg/kg
試験物質の経路および頻度
投与：静脈内の短時間注射
試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ
動物の記載：購入時に体重が35kgの発育期去勢オスブタ56頭
食餌：商業的濃縮試料（タンパク質含量18％）を、随意に給餌した。
実験計画:56頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、７実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）にランダムに分けた。
群1:塩類溶液
群2:TT−01024、                       0.25μg/kg
群3:TT−01024、                       1   μg/kg
群4:TT−01024、                       4   μg/kg
群5:hGRF（１−29）NH2、               0.25μg/kg
群6:hGRF（１−29）NH2、               1   μg/kg
群7:hGRF（１−29）NH2、               4   μg/kg
pGHアッセイのための血液サンプルはGRFの注射の１時間から５時間後まで、20分ごとに採取し、さらに追加的に注射の10分後と30分後にも採取した（ｎ＝21サンプル）。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−20℃で保存しそしてpGHのアッセイに供した。
結果を図２および図３に示す。図２に示したように、hGRF（１−29）NH2（４μg/kg）は、注射後およそ60分間継続する急速なGH放出を誘導した。対照的に、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2により同一の濃度でもっと長い時間、およそ260分間にわたってGH濃度が上昇した。さらに、最初の60分間のGH反応は穏やかであり、このことからこの類似体がプロGRFとして機能し、注射後数分間あるいは数時間のうちに血清中で切断されて天然のGRFに変化することが示唆される。様々な濃度のGRFおよびその類似体の、GHの曲線下領域（注射後０−300分）に対する効果を示した図３に示したように、hGRF（１−29）NH2は0.25あるいは１μg/kgの時には顕著な効果を示さなかったが、４μg/kgの時にはGHの分泌に対して顕著な効果を示した。一方、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2は試験した３濃度すべてにおいて顕著な反応を示した。まとめると、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2は、GH分泌に対して効果が増加したGRF類似体であることをこれらの結果は示しており、プロGRFとして機能することができ、血清中で酵素的分解から保護されていることを示唆している。
実施例IV
（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2対hGRF（１−29）NH2の、ブタ皮下におけるGH放出活性。
この実験は、プロGRF類似体である（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2による皮下（S.C.）の急性GH放出活性をテストするために、ヒトに生理学的に近似したモデルにおいて、そしてhGRF（１−29）NH2の効果と比較することにより行われた。
試験類似体の特定
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、0.31μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、1.25μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、５μg/kg
TT−01024:（ヘキセノイルトランス−３）0hGRF（１−29）NH2、20μg/kg
hGRF（１−29）NH2、1.25μg/kg
hGRF（１−29）NH2、５μg/kg
hGRF（１−29）NH2、20μg/kg
試験物質の経路および頻度
投与：皮下の短時間注射
試験系：ランドレース×ヨークシャーのブタ
動物の記載：購入時に体重が35kgの発育期去勢オスブタ64頭
食餌：商業的濃縮試料（タンパク質含量18％）を、随意に給餌した。
実験計画:36頭のブタ（４頭の予備のブタ）を、実験の前１週間以内にカニュレーション（カテーテルを頸静脈中に外科的に移植）した。第１日目と第７日目に、カニュレーションした動物は、８実験群（１実験群あたりブタｎ＝４）にランダムに分けた。
群1:塩類溶液
群2:TT−01024、                       0.31μg/kg
群3:TT−01024、                       1.25μg/kg
群4:TT−01024、                       5   μg/kg
群5:TT−01024、                      20   μg/kg
群6:hGRF（１−29）NH2、               1.25μg/kg
群7:hGRF（１−29）NH2、               5   μg/kg
群8:hGRF（１−29）NH2、              20   μg/kg
pGHアッセイのための血液サンプルはGRFの注射の１時間から７時間後まで、20分ごとに採取した（ｎ＝25サンプル）。血液サンプルは＋４℃で凝固させた。血清は遠心分離により回収し、−20℃で保存しそしてpHGのアッセイに供した。
結果を図４および図５に示す。図４に示したように、hGRF（１−29）NH2（５μg/kg）は、注射後の最初の60分間にGH放出を誘導した。一方、同一の濃度のヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2の注射により240分間持続したGH反応を誘導した。図５では、様々な濃度の試験したGRFの、実験時間を通じてのGHの曲線下領域（注射後０−420分）に対する効果を示した。この期間を通じて、hGRF（１−29）NH2はいずれかの試験した濃度においても顕著なGH反応を示さなかったが、一方、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2では５および20μg/kgの時にGH  AUCの顕著な増加を示した。全体的に見ると、皮下に投与した場合でも、ヘキセノイルトランス−３−hGRF（１−29）NH2は、GH分泌に対して非常に効果的であることをこれらの結果は示唆している。
本発明はその特定の態様と組み合わせて記述されている一方、本発明はさらに改変することができることを理解すべきであり、そしてこの応用は発明の原理に従った発明のいずれかの変化、使用あるいは適用も一般的には含むことを意味し、本発明を含む技術分野において既知のあるいは慣習的な実施において生ずるようなそしてこれまでに述べた、そして添付した請求の範囲に続く本質的な特徴に適用することができるような本発明の開示からの新しい方針などを含むものである。
配列表
（２）SEQ  ID  NO:1の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:44アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）仮定：なし
（vi）配列の記述:SEQ  ID  NO:1
0003576170.tif 000011
（２）SEQ  ID  NO:2の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:29アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）仮定：なし
（vi）配列の記述:SEQ  ID  NO:2
0003576170.tif 000012
【図１】
0003576170.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0003576170.tif 000018