(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
約2:2:1のＤ−グルコース:D−マンノース:D−グルクロン酸比を有する繰り返しペンタマー単位を含み、２つのＤ−グルコース部分はβ−［1,4］配置で結合し、内部Ｄ−マンノース部分はいずれかのグルコース部分にα−［1,3］配置で結合し、Ｄ−グルクロン酸部分は前記内部マンノース部分にβ−［1,2］配置で結合し、外部マンノース部分は前記グルクロン酸部分にβ−［1,4］配置で結合しており、前記内部マンノース部分はアセチル化されておらずかつ前記外部マンノース部分の一部はアセチル化されている、多糖ポリマー。
【請求項２】
前記外部マンノース部分の一部がピルビル化されている、請求項１記載の多糖ポリマー。
【請求項３】
前記外部マンノース部分がピルビル化されていない、請求項１記載の多糖ポリマー。
【請求項４】
約2:2:1のＤ−グルコース:D−マンノース:D−グルクロン酸比を有する繰り返しペンタマー単位を含み、２つのＤ−グルコース部分はβ−［1,4］配置で結合し、内部Ｄ−マンノース部分はいずれかのグルコース部分にα−［1,3］配置で結合し、Ｄ−グルクロン酸部分は前記内部マンノース部分にβ−［1,2］配置で結合し、外部マンノース部分は前記グルクロン酸部分にβ−［1,4］配置で結合しており、前記内部マンノース部分はアセチル化されておらずかつ前記外部マンノース部分の一部はアセチル化されている、多糖ポリマーの製造方法であって、
（ａ）キサンタンガム遺伝子クラスターの機能的遺伝子Ｆたんぱく質を発現することのできないキサントモナス（Xanthomonas）を得ること、
（ｂ）前記多糖ポリマーを形成するに十分な条件において前記キサントモナスを培養すること、
を含む方法。
【請求項５】
前記外部マンノース部分の一部がピルビル化されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記外部マンノース部分がピルビル化されていない、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記キサントモナスがキサントモナスカンペストリス（Xanthomonas campestris）である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記キサントモナスがキサントモナスのアセチラーゼＩ欠損ミュータントである、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記キサントモナスがキサントモナスのアセチラーゼＩ及びケタラーゼ欠損ミュータントである、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
キサントモナスのアセチラーゼＩ欠損ミュータントである、請求項１記載の多糖ポリマーの製造可能なミュータントキサントモナス。
【請求項１１】
キサントモナスのアセチラーゼＩ及びケタラーゼ欠損ミュータントである、請求項１記載の多糖ポリマーの製造可能なミュータントキサントモナス。
【発明の詳細な説明】
本発明は多糖ポリマーに関する。特に、本発明は、キサンタンガムと構造的に等しく、キサンタン生合成経路の成分により形成されるポリマーと規定されるキサンタンベース多糖ポリマーに関し、外部マンノースが特にアセチル化されているがピルビル化されていない、ピルビル化されているがアセチル化されていないよう改良されているか、又は改良されていないが内部マンノースが独立にアセチル化されているかもしくは改良されていないキサンタンベースポリマーを含む。
キサンタンガムはキサントモナス（Xanthomonas）属の細菌、特にX.カンペストリス（X.campestris）種の微生物により製造される。キサンタンガムは、その特有の物理特性、すなわち高比粘度及び疑凝塑性のため広く用いられている製品である。それは通常増粘剤として食品に並びに流動性調節及び特性改良剤として二次もしくは三次油回収に、さらに石油掘削液に用いられる。
化学的に、キサンタンガムはアニオンヘテロ多糖である。ポリマーの繰り返し単位は５個の糖部分、特に２個のグルコース、１個のグルクロン酸及び２個のマンノース部分からなる五量体である。これらの糖残基はグルコース部分がポリマー鎖の主鎖を形成し、マンノース−グルクロン酸−マンノース残基の側鎖がグルコース部分より交互に伸びているよう配列される。通常、この基本構造は、例えばJanson,P.E.,Kenne,L.、及びLindberg,B.らのCarbohydrate Research,45:275〜282（1975）並びにMelton,L.D.,Minot,L.,Rees,D.A.、及びSanderson,G.R.らのCarbohydrate Research,46:245〜257（1976）に記載されているようにアセチル化及びピルビル化される。アセチル化及びピルビル化の程度は様々であることが公知である。キサンタンガムの構造を下式Ｉに示す。
0003560968.tif 000002
自然発生キサンタンガムの広範な有効性にもかかわらず、その物理特性が制限される状況がある。特に、二次もしくは三次油回収において、油溜中の温度及び溜中の塩濃度がキサンタン溶液の最適より高い場合一般的ではない。この状況が生じた場合、キサンタンは沈殿し、凝集し及び／又はその粘度を失う。従って、油回収の間遭遇する種々の条件、例えば高温及び高塩濃度においてうまく作用する新規増粘物質が望ましい。
本発明は、自然発生キサンタンガムとくらべ改良された特性を有するキサンタンベース多糖ポリマー族を開示する。キサンタンガムの改良はすでに記載された。例えば、Bradshawらは（Carbohydrate Polymers,3:23〜38（1983））、脱アセチル化又は脱ピルビル化した化学的に改良したキサンタンガムの製造方法を記載している。Xanthomonas campestrisにより製造されたキサンタンガムを化学的に脱アセチル化する方法も米国特許第3,000,790号及び3,054,689号に記載されている。現在まで、この脱アセチル化法に用いられている主な方法はアセチル化されたキサンタンガムからのアセテート部分の化学的除去であった。キサンタンガムの化学的脱アセチル化法により多くの望ましくない副作用がおこり、グリコシド主鎖の加水分解をおこし、分子の配座に不可逆的変化をおこし、分子量を低下させる。
キサンタンガムは、Holzwarth及びOgletreeらのCarbo.Res.,76:277〜280（1979）に記載のようにして化学的に脱ピルビル化される。この化学的脱ピルビル化法もキサンタンポリマーユニットを変え及び／又はグリコシド主鎖を加水分解する。X.campestrisの株は米国特許第4,296,203号に記載されており、非ピルビル化キサンタンガムを製造するが、この非ピルビル化ガムは化学的手段を用いて完全にアセチル化又は脱アセチル化された。
本発明の目的は、内部マンノースがアセチル化されているかもしくは未改良であり、一方外部マンノースがアセチル化もしくはピルビル化されているか又は未改良である多糖キサンタンポリマーの族を提供することである。
また、この生成物を試験管内で得る方法及び生体内で多糖ポリマーの族を形成する能力を有する微生物を与えることも本発明の目的である。本発明の他の目的は、種々の多糖ポリマーを形成する能力を有する微生物を好気性発酵することによる多糖類の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的及び利点を以下の記載に一部示し、一部はその記載より明らかであろう。
この目的を達成するため及び本発明により、約2:2:1の比のＤ−グルコース:D−マンノース:D−グルクロン酸を有する多糖ポリマーを含む組成物が提供され、ここでＤ−グルコース部分はベーター〔1,4〕形状で結合し、内部Ｄ−マンノース部分は通常交互のグルコース部分にアルファー〔1,3〕形状で結合し、Ｄ−グルクロネート部分は内部マンノース部分にベーター〔1,2〕形状で結合し、外部マンノース部分はベーター〔1,4〕形状でＤ−グルクロネート部分に結合している。
本発明の目的を達成するため、内部マンノース部分が６−０位でアセチル化されているキサンタンガムを含む組成物が提供される。他の構造は内部及び外部マンノース部分の両方がアセチル化されている。他の構造は、外部マンノース部分の一部が４−６−位においてピルビル化され、一部がアセチル化されている。他の構造は外部マンノース部分が４−６位でピルビル化され、内部マンノース部分が６−０位でアセチル化されている。２つの追加構造が提供され、１つは４−６位でピルビル化された外部マンノース部分を有し、他はアセチル化された外部マンノース部分を有する。
また、本発明は上記多糖ポリマーの製造方法でもある。本発明の多糖ポリマーは、多糖を製造する微生物の生合成経路の遺伝子操作により製造される。特に、キサンタンガムを製造するための微生物経路は他のポリマー単位を製造するための生体内又は試験管内システムを作るため操作される。従って、システムは、特に異なる程度までアセチル化もしくはピルビル化された多糖を作り出すため突然変異したアセチラーゼＩ、アセチラーゼII及びケタラーゼ遺伝子の使用により形成される。
以下の実施例と共に本発明の好ましい実施態様を参考にし、本発明の原理を説明する。
本発明の多糖ポリマーは上記に詳細に記載されている。この多糖ポリマーは無細胞酵素系で試験管内で製造され又は適当な突然変異株の細胞を培養することにより生体内で製造される。多糖ポリマーを製造する他の方法も以下に記載する。
試験管内多糖合成
非変異キサンタンガムを製造するための無細胞系の使用に関する基本的方法は、Ielpi,L.,Couso,R.O.、及びDankert,M.A.らのFEBS Letters 130:253〜256（1981）に記載されている。本発明の変異多糖を製造するため、この方法の改良法を用いてよいことがわかった。
この新規改良法に対し、好適な緩衝剤、好ましくはEDTAの存在下遺伝子Xanthomonas、好ましくはXanthomonas campestrisの微生物の細胞を溶解させ、その後外因性付加構造を作製できる適当な生合成酵素を得ることにより試験管内無細胞系が形成される。Vandersliceらの米国特許第4,717,449号に記載されているこの試験管内システムの一般的方法は特に本発明に組み込まれる。他の溶解方法も用いてよく、音波処理、フレンチ圧力セル、界面活性剤処理、酵素処理及びこれらの組み合せを含む。
通常、本発明の変異多糖を製造するため、所望の多糖を構成するに必要な酵素を有する微生物の溶解産物が適当な基質とインキュベートされ、この基質は所望のガムにより異なり、UDP−グルコース、GDP−マンノース、UDP−グルクロン酸、アセチル−CoA及びホスホエノールピルビン酸を含む。基質の選択は所望の多糖により異なる。例えば、非アセチル化多糖は基質としてアセチル−CoAを除去することにより得られる。内在基質を除去するための細胞溶解産物の化学的及び／又は酵素処理は当業者に明らかであろう。
さらに、無細胞系は、キサンタン生合成経路の酵素を１種以上欠く突然変異生物体より形成される。そのような突然変異由来細胞溶解産物は、その変異のみのため又は基質と組み合せた変異のため上記変異ガムを形成する。
一実施態様において、生合成プロセスはポリマー単位への放射ラベルした物質の導入により監視される。当業者に公知である生合成中間体を同定するため他の方法を用いてよい。特に、オリゴ糖中間体を分離及び同定するためクロマトグラフ法が開発された。これは薄層クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む。
キサンタンの無細胞生合成は、特定のヌクレオチド３種すべての添加により異なる時間依存性逐次プロセスであることがわかった。ラベルした物質の非特異的導入のバックグランドは最小であり、ガム画分でのキサンタン特異的ポリマーの検出を妨害しない。
多糖生合成経路の多くには脂質キャリヤー、特にイソプレノイドピロホスフェートの発生が示された。さらに、キサンタン生合成におけるピロホスホリルに結合した脂質キャリヤーの発生が示された。従って、キサンタン生合成中間体はこれらのキャリヤー脂質により有機可溶性画分中に回収可能であることがわかった。回収されたオリゴ糖はその後穏やかな酸加水分解、例えばpH2、90℃で20分間によりキャリヤー脂質を除去され、分析用にアルカリホスファターゼにより脱燐酸化される。
中間体生成物を回収するためこの方法を用いることにより、試験管内条件において、X.campestris突然変異体のある溶解産物が非変異ガム合成に必要な基質すべての存在下でさえ非アセチル化又は非ピルビル化キサンタンガムを形成することがわかった。この方法は他の多糖を形成する細胞溶解産物を同定することができる。
生体内多糖合成
上記多糖の無細胞合成法の開発は、種々のXanthomonas  campestris細胞がアセチル化もしくはピルビル化された、又は非改良のマンノース残基を有するキサンタンベースポリマーの合成に必要な酵素をすべて有していることを示した。
さらに、非アセチル化キサンタンガムを合成するすべての細胞は、キサンタンガム合成の間内部又は外部マンノースのいずれかのアセチル化を止める手段が必要である。さらに、非アセチル化、非ピルビル化キサンタンガムを合成するすべての細胞は、アセチル化及びピルビル化工程の両方においてキサンタンガム合成を止める手段が必要である。本発明の一実施態様において、この種々の反応に応答する遺伝子のあるものを変えるため突然変異誘発が用いられる。
限定するものではないが、Tn10,TnK12（Tn10  del 16 de 17KanR）、及びTn903を含むトランスポゾンがXanthomonas  campestrisを突然変異させるため用いてよい。このトランスポゾンは、一実施態様において、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を与える。トランスポゾンは遺伝子に入る能力を有し、コード配列を中断することにより突然変異をおこす。トランスポゾンは、いわゆる自殺ベクター、例えばpRK2013を含む種々のベクター上でXanthamonas  campestrisに導入される。Ditta,G.,Corbin,D.及びHelinsk,D.R.らのProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:7347〜7351（1980）に記載されているように、ベクターpRK2013はそれ自身を非腸内細菌、例えばXanthomonas  campestrisに移す能力を有するが、その宿主内で複製できない。従って、自殺ベクターがXanthomonas  campestris細胞の集団に導入され、この集団がその後テトラサイクリンもしくはカナマイシンの攻撃をうけた場合、生存している各々はトランスポゾンの１つがXanthonomas  campestrisのゲノムに入ったものである。そのような攻撃の生存者をキサンタンガム製造能を失ったものについてスクリーンする。そのような突然変異体は糸状菌タイプXanthonomas  campestrisよりムコイドが少ないと考えられる。
本発明の他の実施態様において、それが製造するガムをアセチル化及び／又はピルビル化しない突然変異体を発生するため他の突然変異誘発を用いてよい。そのような方法は当業者に明らかであり、限定するものではないが、輻射、組換えDNA法（特に、Capageらの米国特許出願番号第333,868号、「Recombinant−DNA Mediated Production of Xanthan Gum」、1989年４月３日出願、及び下記例１）及び化学突然変異誘発物質処理を含む。そのような突然変異誘発法の例はMiller,J.H.のExperiments in Molecular Genetics（1972）;Davis,R.W.,Bostein,D.及びRoth,J.R.らのAdvanced Bacterial Genetics（1980）；及びManiatis,T.,Fritsch,E.F.及びSambrook,J.らのMolecular Cloning（1982）に記載された。
この他に、適当な突然変異体は所望の多糖、例えばアセチル化されているがピルビル化されていない、ピルビル化されているがアセチル化されていない、ピルビル化及びアセチル化されている、又は内部マンノースはアセチル化されているかもしくは未改良であるが未改良である外部マンノースを有するキサンタンガムの存在に対し各突然変異体の培養ブロスをアッセイすることにより検出される。従って、突然変異体はキサンタンガム経路の種々の位置でブロックされることがわかった。内部マンノースでアセチル化され及び外部マンノースでアセチル化された（X1397）、内部マンノースでアセチル化され及び外部マンノースでピルビル化された（X1398）、内部マンノースでアセチル化され及び外部マンノースで未改良の（X1399）、内部マンノースで未改良であり及び外部マンノース成分の一部がピルビル化されさらに一部がアセチル化されている（X1400）、内部マンノースで未改良であり及び外部マンノースでアセチル化されている（X1401）、内部マンノースで未改良であり及び外部マンノースでピルビル化されている（X1402）、並びに内部マンノースで未改良であり及び外部マンノースで未改良である（X1403）キサンタンガムを製造するXanthomonas  campestrisの突然変異体はそれぞれNo.68033,68034,68035,68036,68037,68038及び68039としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）,Rockville,Marylandに寄託されている。
同じ生成物を得るためアセチラーゼＩ、アセチラーゼII及びケタラーゼの酵素阻害剤を用いることは、本発明の範囲内ではない。この多糖族を製造する他の方法、例えば天然キサンタンガムの酵素及び化学分解も考えられている。
突然変異体は、野生タイプXanthomonas  campestrisの増殖について当該分野において公知の条件で増殖する。例えば、好適な同化性炭素源、例えばグルコース、スクロース、マルトース、スターチ、複炭水化物、例えば糖蜜又はコーンシロップ、種々の有機酸等上で増殖する。炭素源の混合物も用いてよい。供給される炭素源の濃度は10〜60g/lである。通常約0.1〜10.0g/lの有機もしくは無機窒素の同化性源並びにミネラルも増殖に必要であり、その選択は当業者において容易である。好適な窒素源の例は、アンモニア塩、硝酸塩、尿素、イースト抽出物、ペプトン、もしくは他の加水分解した蛋白様物質又はこれらの混合物である。好適なミネラルの例は、燐、硫黄、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを含み、これらしばしばキレート化剤、例えばEDTAもしくはクエン酸と共に加えられる。
Xanthomonas  campestrisの増殖に最適の温度は18〜35℃、好ましくは約27゜〜30℃である。
Xanthomonas  campestris細胞は、適切なレベルの溶解した酸素、例えば飽和の約10％以上を保つよう空気もしくは酸素を供給することにより好気的に増殖される。好ましくは、このレベルは約20％以上に保たれる。pHはしばしば約6.0〜8.0、好ましくは約6.5〜7.5に保たれる。
本発明の多糖は、好適な方法により発酵ブロスより回収される。イソプロパノール、エタノール、又は他の好適なアルコールによる沈殿により本発明の多糖が容易に得られる。通常、アルコールは、好ましくは塩化カリウム、塩化ナトリウム又は他の塩の存在下約50〜75％（体積基準）の濃度に加えられる。この他に、ポリマーは超遠心によりブロスから回収される。
強化油回収に用いるための流動性調節溶液も種々の多糖ポリマーより製造される。約50〜約3000ppmの濃度の多糖ポリマーの溶液がそのような流動性調節溶液に適当である。油回収をさらに高めるためこれらの溶液と共に他の公知の添加剤も用いてよい。そのような添加剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤、又は金属もしくは有機架橋剤を含む。
キサンタンガム様の多糖ポリマーは、食品、化粧品、医薬配合物、糊、掘削液、印刷インク、等の増粘剤として及びゲル化剤として用いてよい。さらに、パイプ内の液体流の摩擦を低下させるために用いてもよい。
実施例
以下の例は、本発明の好ましい実施態様を説明する。
例１
この例は、キサンタンガムのアセチル化を触媒する酵素をコード化する２種のX.campestrisの存在を示す。
Capageらの米国特許出願第333,868号は、キサンタンガム生合成に必要な遺伝子クラスターを含むX.campestris DNAの16kbセグメントのヌクレオチド配列を記載している。突然変異はDNA配列により確認された各遺伝子の不活性化により同定された。この突然変異を担持する突然変異体株の遺伝表現型が決定された。トランスポゾン挿入により生じた遺伝子下での突然変異（第1a図参照）は、検出可能なアセテートを含まないキサンタンガムを形成した。遺伝子Ｇの挿入変異はキサンタンガム生合成に全く欠陥を形成しなかった。遺伝子Ｇ欠損した突然変異体は高レベルのキサンタンガムを形成し、このガムはほぼ通常のモル比でキサンタンの通常の成分をすべて含んでいた。この最初の結果を基準として、遺伝子Ｇがキサンタンの内部マンノースの公知のアセチル化を触媒すると結論付けられたが、一方遺伝子Ｇ蛋白質の活性は未知のままである。
しかし、遺伝子Ｆ及びＧ（gpF及びgpG）の生成物のアミノ酸配列を予想するためDNA配列を用いる場合、この蛋白質が互いに広範な相同を有することがわかった。この発見はgpF及びgpGの機能が同じであることを示した。遺伝子Ｇを欠損した突然変異体の遺伝表現型はその後再調査され、この突然変異体により形成されたキサンタンの組成物は正確に定量された。このデータは野生タイプX.campestrisと比較してG-突然変異体により形成されたガムのアセテート含量がわずか（５％〜10％）であるが十分低下したことを示した。従って、キサンタンのアセチル化にgpGがどんな役割を果たすか調べるため他の実験を行った。
gpGが通常キサンタンガムのアセチル化の10％に関与するという仮説は、表面上は遺伝子Ｆのトランスポゾン挿入変異がアセチル化を排除する結果と矛盾する。明らかに、この突然変異体ガムは10％の通常のアセテート含量を保たなかった。しかし、遺伝子Ｆへの挿入によりいわゆる「極性」効果の結果として遺伝子Ｇの発現を低下させる又は排除することが可能であった。Tn10の挿入は通常、Kleckner,N.らのJ.Mol.Bio.,97:561〜575（1975）に報告されているように、挿入より、転写によって遺伝子の発現を低下させる。さらに、Oppenheim.D.S.及びYanofsky,C.のGenet.95:785〜795（1980）に報告されているように、挿入変異を含む遺伝子に下流遺伝子が「翻訳結合」した場合、この低下は全く厳しい。翻訳結合は１つの遺伝子の翻訳停止シグナルが隣接する下流遺伝子の翻訳開始シグナルと重っている現象である。そのような結合がおこるケースにおいて、下流遺伝子の翻訳の開始は結合部におこる上流遺伝子の翻訳の停止に依存している。従って、結合した遺伝子の上流での挿入は、この挿入が上流遺伝子の翻訳を早期に停止させ及びフレームシフトをおこすため下流遺伝子の発現を劇的に低下させ、又は排除する。
ガム遺伝子クラスターのDNA配列は、遺伝子Ｆの翻訳停止が遺伝子Ｇの翻訳開始と重っていない、すなわちこの２つが「結合」していることを明らかにした（第1b図参照）。さらに、遺伝子Ｇに対する翻訳開始シグナルの配列はそれほど強くなく、これは翻訳結合が遺伝子Ｇの発現に十分な役割を果たすことを示唆している。この仮説をテストするため、遺伝子Ｆのコード化配列内で欠失変異を行った（第２図参照）。この欠失は遺伝子Ｆ内のCla Iサイトの間の660ベースペアーを除去した。こ欠失したDNAは遺伝子Ｆのコード化配列内に存在し、他のDNAは挿入されない。従って、この欠失は遺伝子の大部分（約60％）を除去するが、除去されるベースペアーの多くが３で均等に割ることができるので読取りフレームを変えない。この欠失変異により形成された変異gpF（gpFdel）は合計364個のアミノ酸から220個を失うが、遺伝子Ｆの翻訳開始及び遺伝子Ｆ翻訳停止は未変化のままである。gpFのアミノ酸残基の2/3の除去はすべての蛋白質活性を除去すると考えられる。従って、この突然変異体からの残留アセチラーゼ活性はすべてgpGの活性に起因するであろう。
このCla I欠失変異は、プラスミドのベクター部位内に位置し、WayらのGene,32:369〜379（1984）に記載されたトランスポゾンTn10 del 16 del 17の挿入及び他の野生タイプ遺伝子クラスターを有するプラスミドpRK290−H336.13上で行なわれる（第3a図）。この欠失したプラスミド（p13delClaと呼ぶ）は遺伝子Ｂを失ったX.campestris Gum-欠失株X1231に転化され、得られる株X1231（p13delCla）により形成される多糖を分析した。このガムは低いが十分な量のアセテートを含み、野生タイプキサンタンにみられる量の約10〜15％であった。この結果はgpF及びgpGの両方がアセチラーゼであり、キサンタンのアセチル化体がgpGによりアセチル化されたキサンタンアセチル化の成分を少量含むgpFにより触媒されることを示した。しかし、gpGの活性からではなくgpFdelの残留活性より得られる変異体X1231（p13delCla）にみられるアセチル化は低レベルのままである。これを説明するため、プラスミドpRK290−H336の重複変異誘導体を構成した。第3b図に示すように、この重複変異体は遺伝子Ｇ内で遺伝子F Cla I欠失変異及び挿入変異（KBml）を組み合せた。この重複変異プラスミドpH336KBmldelClaを株X1231に転移し、形成された多糖を分析した。X1231（p13delCla）により形成されるガムに見られる低レベルアセチル化がgpGの活性より得られる場合、重複変異体X1231（pH336KBmldelCla）は遺伝子Ｇ内の挿入変異によりgpG活性を排除すべきであり、アセチル化が見られない。しかし、X1231（p13delCla）中のアセチル化活性源が変異体gpFdelである場合、遺伝子Ｇ挿入はアセチル化に影響を与えず、X1231（p13delCla）にみられる同じ10％レベルは重複変異株により形成されるガム中にみられるべきである。株X1231（pH336KBmldelCla）により形成される多糖はアセテートを含まないことがわかった。このことは、gpGがキサンタンのアセチル化を触媒せず、野生タイプ株において、gpGが総アセチル化の約10％に関与することが証明された。
例２
この例は、gpG（しかしgpFでない）によるアセチル化に対する標的残基がキサンタン繰り返し単位の外部マンノースであり、外部マンノースのピルビル化をブロックした際にこのアセチル化が高められることを示す。
キサンタン生合成遺伝子クラスターの遺伝子Ｌの突然変異（第1a図）は外部マンノースのピルビル化を触媒するカタラーゼ酵素を不活性化するため前記に示された。gpL活性を欠く突然変異体はピルベートを欠くキサンタンガムを形成する。しかし、そのような突然変異体の初期の研究は、この非ピルビル化ポリマーがアセテートを高レベル、通常0.8アセテート／マンノース含むことを明らかにした。従って、外部マンノースはピルビル化が遺伝学的にブロックされた場合に効果的にアセチル化され、他の研究はこのアセチル化がgpFではなくgpGにより触媒されることを示した。
２つのアセチラーゼ遺伝子とケタラーゼ遺伝子との及び互いの相互作用を調べるため、遺伝子Ｆ（アセチラーゼＩ）、遺伝子Ｇ（アセチラーゼII）、及び遺伝子Ｌ（ケタラーゼ）における突然変異のすべての組み合せを含む８種の突然変異体株を構成した。ガム遺伝子クラスターを含むプラスミドpRK290−H336において突然変異の種々の組み合せを構成した。
この構成に用いられる遺伝子Ｆ変異は、この遺伝子内でのフレーム内欠失である。上記のように、この欠失は遺伝子Ｆ内のCla Iサイトの間の660ベースペアーを除去する。欠失されたDNAは遺伝子Ｆのコード化配列内に存在し、他のDNAは挿入されない。従って、この欠失は遺伝子の多く（約66％）を除去するが、欠失されたベースペアーの多くが３で均等に割ることができるので読み取りフレームを変えない。この欠失変異により形成された変異体gpF（gpFdel）は合計364個のアミノ酸より220個を失なうが、Ｆの翻訳開始及びＧの開始に結合したその翻訳停止は未変化のままである。gpFのアミノ酸残基の2/3の除去は上記gpF活性の除去に示されている。
この突然変異体に用いられる遺伝子Ｇ変異は遺伝子Ｇのコード化配列を中断するBamH Iサイトでの遺伝子Ｇ内の挿入（KBml）である。挿入されたDNAはVieira,J.及びMessing,J.らのGene,19:259〜268（1982）に記載されているように、プラスミドpUC4−Ｋの1.3kb Kanr DNAセグメントを含む制限フラグメントであり、これはトランスポゾンTn903のカナマイシン耐性遺伝子由来である。
用いた遺伝子Ｌ変異は２つのタイプである。１つは遺伝子Ｌのコード化部位でのトランスポゾンTnK12の挿入である。第２のタイプは、カナマイシン及びストレプトマイシンに対し遺伝子コード化耐性を有するTnK12の3kb Hind IIIの欠失によるこの挿入より得られる。このTnK12欠失変異において、TnK12 DNAの1kbの挿入は遺伝子Ｌコード化配列内に残っており、これは遺伝子Ｌ生成物を挿入不活性化する。
試験管内組換えDNA法を用いてプラスミドpRK290−H336上でこの突然変異の種々の組み合せを行った。得た８種の変異プラスミドを、染色体からガム遺伝子クラスター全体を除去する欠失変異を含むX.campestris株X1231へE.Coliより移した。８種の得られた株X1396〜X1403（表１）をポリマー製造について分析した。
0003560968.tif 000003
株はすべて300mlのじゃま板付振盪フラスコ内で
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を含む、pH7.0の50ml FXC−RAH−１培地で培養した。温度は30℃に保った。約60時間のインキュベーション後、培養ブロスを２〜４体積の蒸留水で稀釈し、10℃における14,000〜18,000gでの30分の遠心により細胞を除去した。２〜３体積の２−プロパノールの添加により懸濁液よりガムを沈殿させ、前記条件を用いる遠心により集めた。この沈殿を100〜300mlの20mM NaOH内に再び水和させ、沈殿を繰り返した。最後にガムを100mlの蒸留水に再び水和した。各サンプルをその後12,000〜14,000カットオフセルコースチューブ内で４lの蒸留水に対し、毎日水を換え４日間透析した。
各精製したガムの三組のサンプルを真空乾燥により３〜４倍に濃縮し、120℃で2.5時間2Mトリフルオロ酢酸中で加水分解した。1.2M Na2CO3で中和後、この加水分解物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析用に0.45minフィルターを通し濾過した。
分析は、Aminex HPX−87イオン交換カラム（300×7.8mm）を取り付けたベックマンHPLCを用いて行った。214nmでの紫外吸収により有機酸が検出された。中性糖を検出するため屈折率を用いた。移動相として0.01N H2SO4を用い45℃で0.6ml／分の流速でカラムを行った。
各加水分解物中の成分のモル比は、各糖及び有機酸に対するピークに基づく検量曲線を用いて計算した。
マンノースに対するアセテート及びピルベートのモル比を表２に示す。
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表２に示したデータについて以下の観察を行なう。
1.  遺伝子Ｆ内の660bp欠失は遺伝子Ｆ蛋白質（アセチラーゼＩ）を不活性化した。X1402対X1398参照。
2.  遺伝子Ｇ蛋白質（アセチラーゼII）はキサンタンをアセチル化し、カタラーゼが活性である場合野生タイプとくらべ低レベルである。例４に記載のX1400対X1396参照。
3.  ケタラーゼが不活性化された場合、アセチラーゼIIによるアセチル化は劇的に増す（X1400対X1401）
4.  アセチラーゼＩによるアセチル化の程度はケタラーゼの不活性化に対応して増加しない。例４のX1398対X1399参照。
5.  ピルビル化はアセチル化の程度にかかわらずそれほど変わらない。例４のX1396,X1398,X1400、及びX1402参照。
このデータは、遺伝子Ｇ蛋白質（アセチラーゼII）がキサンタンの外部マンノースのアセチル化を触媒することを示している。これはケタラーゼが活性である場合限られた程度におこるがケタラーゼ−変異体では劇的に増すと考えられる。このデータは、ピルビル化がアセチル化をブロックするが、アセチル化のレベルにかかわらずピルビル化が変化しないので逆は真でないことを示している。遺伝子Ｆ蛋白質（アセチラーゼＩ）は内部マンノースのみのアセチル化を触媒し、米国特許第4,713,449号及び米国出願番号第844,335号のキサンタンのポリトリマー及びトリテトラマー変異体に対するデータは、ケタラーゼが外部マンノースのみのピルビル化を触媒することを示している。
例３
この例は、gpG（アセチラーゼII）がキサンタン繰り返し単位の内部マンノースのアセチル化を触媒しないことを示す。
ガム遺伝子クラスターの遺伝子ＩはトランスフェラーゼＶをコード化し（第１図）、酵素はキサンタン生合成においてマンノースを脂質結合した四糖中間体に加える。このシステムは米国特許第4,713,449号に記載されている。遺伝子Ｉを不活性化する変異は脂質結合した四糖を合成する。この四糖繰り返し単位は重合されポリテトラマーガムを与え、これはその通常の結合に内部マンノースを含むがキサンタンガムに通常みられる外部マンノースを欠いている（第４図）。遺伝子Ｉ内に挿入変異を及び遺伝子Ｆ内にCla I欠失変異を含む重複変異体プラスミド、pKBm2delClaを構成した（第５図参照）。この重複変異体プラスミドpKBm2delClaをその染色体中にガム遺伝子Ｂ及びＣのみを含むX.campestris欠失株X1106に変えた。pRK290−HA3より得られる変異体プラスミドはＢもしくはＣを有しないが、残りのガム遺伝子、Ｄ〜Ｍをすべて含むので遺伝子Ｂ及びＣは染色体より提供される。得られる株、X1106（pKBm2delCla）又はX1419をポリマー組成について２回分析した。両方の分析ともポリマー中のアセテートを検出できなかった。この結果は、アセチラーゼIIがポリテトラマーの内部マンノースをアセチル化できないことを示している。この変異体株において、遺伝子Ｇが変異されておらず、遺伝子Ｆ変異が遺伝子Ｇの発現に影響を与えないと示された非極性Cla I欠失であるのでアセチラーゼIIは活性である。
例４
この例は、キサンタンガムの五糖繰り返し単位のアセチル化及びピルビル化の遺伝子調節により形成される多糖族を含む繰り返し単位を説明する。この繰り返し単位の構造を第６図に示す。
（ａ）野生タイプ（X1396）；アセチラーゼI-、アセチラーゼII+、ケタラーゼ＋
通常のキサンタンを内部マンノース残基において広くアセチル化し、外部マンノース残基においてピルビル化する。一般的な考えに反し、通常のキサンタンの十分な割合（10〜20％）の外部マンノース残基がアセチル化される。従って、通常のキサンタン繰り返し単位は外部マンノースの改良に関し外生である。
（ｂ）L-（X1397）；アセチラーゼI+、アセチラーゼII+、ケタラーゼ−
このポリマーはピルベートを含まず、結果として外部マンノース残基においてかなりアセチル化されている。内部マンノース残基は野生タイプと同様かなりアセチル化されている。
（ｃ）G-（X1398）；アセチラーゼI+、アセチラーゼII-、ケタラーゼ＋
このポリマーは野生タイプと同様内部マンノースにおいてかなりアセチル化されており、外部マンノースは野生タイプと同様ピルビル化されている。しかし、外部マンノースはアセチル化されていない。
（ｄ）G-,L-（X1399）；アセチラーゼI+、アセチラーゼII-、ケタラーゼ−
このポリマーは内部マンノースの高レベル野生タイプアセチル化を有するが、外部マンノースは未改良である。
（ｅ）F-（X1400）；アセチラーゼI-、アセチラーゼII+、ケタラーゼ＋
このポリマーは内部マンノースは未改良であるが、外部マンノースは野生タイプと同様に改良されている。すなわち、外部マンノースはピルビル化されているが、外部マンノース残基の多くは十分アセチル化されている。
（ｆ）F-,L-（X1401）；アセチラーゼI-、アセチラーゼII+、ケタラーゼ−
このポリマーは未改良内部マンノースを含む。外部マンノースはピルビル化されていないが、かなりアセチル化されている。
（ｇ）F-,G-（X1402）；アセチラーゼI-、アセチラーゼII-、ケタラーゼ＋
このポリマーは内部又は外部マンノース残基のいずれにおいてもアセチル化されていない。外部マンノースのピルビル化は通常野生タイプと同様におこる。
（ｈ）F-,G-,L-（X1403）；アセチラーゼI-、アセチラーゼII-、ケタラーゼ−
このポリマーはアセテート又はピルベートを含まない。内部又は外部マンノース残基のいずれも改良されていない。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、キサンタンの生合成に必要な12個の遺伝子のクラスターを含むX.campestrisの染色体の16kb部位のBamH I制限マップを示し、及びBamH I制限マップに対するこの12個の遺伝子の適当な位置を示す図である。
第1b図は遺伝子Ｆ及びＧ内の制限サイト、並びに遺伝子Ｆ及びＧの接点におけるDNA配列を示す図である。
第２図は、ガム遺伝子クラスターの遺伝子Ｆ内の欠失変異（delCla）の構成を示す図である。
第3a図はプラスミドpRK290−H336由来のプラスミドp13delClaの構造を示す図である。
第3b図はプラスミドpH336KBmldelClaの構造を示す図である。
第４図は、キサンタンガムのポリテトラマー変異体の繰り返し単位の化学構造を示す図である。
第5a図は、pRK290−HA3由来のプラスミドpHA3KBm2delClaの構造を示す図である。
第5b図はX.campestris株X1106に存在する染色体欠失変異の程度を示す図である。
第６図は、野生タイプX.campestris並びに遺伝子F,G、もしくはＬの変異欠失及びこれらすべての可能な組み合せにより形成された多糖の繰り返し単位の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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