(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマＳＣＦ２３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２９５）を使用することを特徴とする、サブクラスがＩｇＧであって、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）と特異的に結合し、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒとヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止することができるモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法で製造されたもので、サブクラスがＩｇＧであって、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）と特異的に結合し、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒとヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止することができる、ハイブリドーマＳＣＦ２３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２９５）由来のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマＳＣＦ２３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２９５）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ステムセルファクター、以下、ＳＣＦということもある）に対して特異性を有するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、及びそれを用いる該モノクローナル抗体の製造方法に関する。
【０００２】
ＳＣＦは、造血などにおいて重要な役割を果たしている分子であり、その血中濃度を測定することは血液疾患をはじめとする諸疾患における診断において重要な意義があり、本発明はそれに大きく寄与することができるものである。また、本発明におけるＳＣＦとヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止することができるモノクローナル抗体は、診断薬としてだけでなく治療薬としての用途も有する。
【０００３】
【従来の技術】
ヒトＳＣＦは、造血幹細胞の表面に発現しているｃ−ｋｉｔレセプターのリガンドであって、その前駆体は２７３アミノ酸からなり、Ｎ末端２５アミノ酸のシグナル配列がとれて最終的には２４８アミノ酸で構成され、糖鎖を含む分子量約３０ｋＤａ程度の膜結合型の造血因子である。
【０００４】
このように、ＳＣＦは、１９９０年に遺伝子クローニングされて以来、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその作用に関する研究が進められてきた。その結果、ＳＣＦは、構成的な造血における役割をはじめとし、生殖細胞の成熟期における役割など多くの生理現象に関与していることが明らかになってきた。そして、造血においてＳＣＦはＩＬ−３やＩＬ−６などのサイトカインやｂ−ＦＧＦなどの成長因子と相乗効果を示し、さまざまな段階の造血細胞の増殖、分化を促すことがわかった。したがってＳＣＦは、造血幹細胞の増殖因子としてのみならず、赤血球、血小板、顆粒球、リンパ球の増殖因子として重要なものであり、臨床応用も大いに期待される。
【０００５】
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞や血管内皮細胞で細胞膜結合型として発現される。
そしてその一部は、プロテアーゼによる分解反応により可溶型として産生されるものと推測されている。つまり、ＳＣＦには、膜結合型ＳＣＦと可溶型ＳＣＦ（分泌型ＳＣＦ）とがあり、可溶型ＳＣＦは生理活性を有している。
実際、健常人の血清中には平均３．３±１．１ｎｇ／ｍｌの可溶型ＳＣＦが存在するという報告もある。（Ｌａｎｇｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ  ８１，  ６５６，  １９９３）しかし、このようにして従来法によって可溶型ＳＣＦとして測定された可溶型ＳＣＦが生体内で、その活性を示すことができるか否かについては、以下に述べるような問題点が示されている。換言すれば、従来法で測定された可溶型ＳＣＦが生理活性を有する真の可溶型ＳＣＦであるとの保障がないのである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
既述のように、ＳＣＦのレセプターは、造血幹細胞や造血前駆細胞あるいは血管内皮細胞などの細胞膜表面に発現されるｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物（以下、Ｃ−ＫＩＴということもある）であることが分かっている。そして、このＣ−ＫＩＴも、可溶型の分子として血中に放出されており、その濃度は血中の可溶型ＳＣＦの１０倍以上になると推測されている。
したがって、血中での可溶型ＳＣＦの一部は可溶型のＣ−ＫＩＴと結合し活性を示せない状態にある可能性がある。
【０００７】
しかるに、従来の血中の可溶型ＳＣＦの測定法においては、可溶型Ｃ−ＫＩＴとの結合の有無を区別して検出することはできない。
その両者、すなわち可溶型Ｃ−ＫＩＴと結合した可溶型ＳＣＦと結合していない可溶型ＳＣＦを区別して真に生体内で有効なＳＣＦのみを測定できる新たな技術が必要とされている。
【０００８】
本発明は、このような当業界のニーズに応えるためになされたものであって、各方面から検討の結果、ヒトＳＣＦと特異的に結合し、ヒトＳＣＦとヒトＣ−ＫＩＴの結合を阻止することのできる特異性の高い抗体が創製されれば、それを用いて測定系を組むことができ、その結果、上記目的が達成されることにはじめて着目し、この目的に合致した特異性の高い抗体、特にモノクローナル抗体の創製がその基礎となるとの観点にたち、新規モノクローナル抗体産生システムの確立を本発明の目的として新たに設定した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、鋭意研究の結果、真に活性を持つ血中の可溶型ＳＣＦを測定することのできる抗ＳＣＦ抗体、特にモノクローナル抗体及びその産生トータルシステムを完成するに至り、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１０】
目的とするモノクローナル抗体を産生するための融合細胞（以下、ハイブリドーマということもある）を創製するため、本発明においては、免疫原としてヒトＨｅＬａ細胞に着目しただけでなく、更に効率化を図るためにドナーのｃＤＮＡから目的とする遺伝子のｃＤＮＡを単離し、これをレシピエントに形質導入してなる形質導入細胞（以下、トランスフェクタントということもある）を使用することとした。すなわち、本発明者らは、まず、ＳＣＦを高発現するＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離したＳＣＦのｃＤＮＡをマウス繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入した形質導入細胞株（トランスフェクタント）を作製した。
【００１１】
次に、このトランスフェクタントを免疫原として例えばマウスに免疫し、その脾細胞、リンパ節細胞あるいはＢリンパ球を抗体産生細胞として得る。
この抗体産生細胞とマウス、ヒトあるいはラットの骨髄腫細胞とをいわゆる細胞融合法を用いて融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、上記トランスフェクタントに特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
こうして得られたモノクローナル抗体を、あらかじめ例えばビオチン標識したＳＣＦと結合させておきこのビオチン標識ＳＣＦのＣ−ＫＩＴ陽性細胞株への結合能を、例えばＡＶＩＤＩＮ−ＦＩＴＣをさらに反応させることによりフローサイトメトリーで検出し、その結合を阻止することのできるモノクローナル抗体を選択的に得ることができる。
【００１２】
このようにしてＳＣＦとＣ−ＫＩＴの結合を阻止することのできる抗ＳＣＦ抗体を安定的に産生できるハイブリドーマを得た。このようにして得たハイブリドーマは、ＳＣＦ２３５と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２９５）。
【００１３】
これらのクローンをそれぞれ常法にしたがって培養し、モノクローナル抗体を分離採取する。得られたモノクローナル抗体は、免疫沈降法、ウエスタン−ブロッティング法等により目的とする抗ＳＣＦ抗体であることが確認された。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、もちろんこれらの実施例のみに限られるものではない。
【００１５】
【実施例１：抗体の作製】
【００１６】
（１）免疫原の作製
ＳＣＦを高発現するＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離したＳＣＦのｃＤＮＡを動物細胞発現用ベクター  ｐＢＣＭＧＳ−ｎｅｏに組み込んだ後、これをマウス繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入し、得られたトランスフェクタントを免疫原とした。
【００１７】
（２）ハイブリドーマの作製
【００１８】
（ａ）免疫
８週令のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）に上記トランスフェクタントを２週間間隔で腹腔内投与した。免疫の効果は、マウスの尾静脈から採取した末梢血の血清と免疫原との反応性により評価した。効果を確認した後、最終免疫、細胞融合を行った。
【００１９】
（ｂ）細胞融合
最終免疫から４日後、免疫されたマウスの脾細胞とマウス骨髄腫由来細胞株ＳＰ−２を常法に従って細胞融合させた。
【００２０】
（ｃ）抗ＳＣＦ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
抗ＳＣＦ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング法として、トランスフェクタント及びその親株細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ３）を抗原とした間接抗体法を用いた。
トランスフェクタントに結合し、親株細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ３）には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングした。その結果、クローン（ＳＣＦ２３５）を得た。（図１）
【００２１】
（ｄ）抗体の精製
ＳＣＦ２３５の培養上清を限外ろ過濃縮した後、結合用緩衝液（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ）と等量混合した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）を結合用緩衝液で平衡化し、上記混合液をカラムに流して抗体を結合させた後、結合用緩衝液でカラムを洗浄した。０．２Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０）をカラムに流して溶出を行い抗体画分を得た。
【００２２】
【実施例２：結合実験】
ｂｉｏｔｉｎ標識ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とＳＣＦ２３５抗体を室温で１５分間反応させた後、Ｃ−ＫＩＴ陽性細胞株（ＨＣＫ／３Ｔ３：ｃ−ｋｉｔ遺伝子をＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入して得られたＣ−ＫＩＴトランスフェクタント）と４℃で６０分間反応させた。
その後、アビジン−ＦＩＴＣ（ＡＶＩＤＩＮ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ）を加え、さらに、４℃で３０分間、暗所で反応させた。
【００２３】
この細胞を常法に従い、フローサイトメトリーの検体として供し、ｂｉｏｔｉｎ標識ＳＣＦのＣ−ＫＩＴへの結合を測定した。その結果、予めＳＣＦ２３５抗体と反応させなかったときに比べ、その結合は完全に阻止された。（図２）
すなわち、ＳＣＦ２３５抗体はＳＣＦのＣ−ＫＩＴへの結合を阻止することの可能なモノクローナル抗体であることが確認された。
【００２４】
【実施例３：抗体の性質】
ＳＣＦ２３５抗体のサブクラスをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検定したところ、ＩｇＧ１であった。
【００２５】
また、得られたＳＣＦ２３５抗体５μｇを還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に、ゲルをクマシー染色したところ、マウスＩｇＧに特有の５０ｋＤａと２５ｋＤａの２本のバンドを検出した。（図３）ゲルとしては、ポリアクリルアミド濃度４〜２０％のグラジエントゲルを用いた。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によってはじめて、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒと特異的に結合するモノクローナル抗体が作製された。このモノクローナル抗体は、ヒトＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒとヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止し得るものである。
【００２７】
この特性を利用して、該抗体を用いる測定法を使用することにより、血中のＣ−ＫＩＴと結合していない遊離の可溶型ＳＣＦのみを選択的に測定することが可能である。
【００２８】
例えば、ＳＣＦ抗体を固相化しておけば、遊離のＳＣＦ（分泌型ＳＣＦ）のみが選択的に該抗体に結合し、血液中に共存する遊離のＣ−ＫＩＴと結合しているＳＣＦは該抗体には結合しない。したがって、固定化されたＳＣＦ抗体に捕捉されたＳＣＦを、標識した二次抗体を用いる等の方法にしたがって測定すれば、遊離のＳＣＦのバイオアッセイが可能となるのである。
【００２９】
このようにして、該抗体による測定法を用いることにより患者自身の血中の遊離した可溶性ＳＣＦを測定することができるだけでなく、人為的に投与された可溶型ＳＣＦの代謝をモニターすることができる。
このことは血液疾患をはじめとする疾患における診断薬や治療薬の開発にも多大な貢献をすることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスフェクタントをＳＣＦ２３５抗体で染色した後フローサイトメトリーを用いて解析した図面である。
【図２】Ｃ−ＫＩＴのトランスフェクタントとｂｉｏｔｉｎ標識ＳＣＦを、ＳＣＦ２３５との反応後に反応させた後、フローサイトメトリーを用いて解析した図面である。
【図３】ＳＣＦ２３５抗体を還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にクマシー染色した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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