(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＭＬＫ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項１の単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
ストリンジェントな条件下で配列番号１で表される配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド分子であって、ここで、当該ポリヌクレオチドはＭＬＫ４遺伝子産物のキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、前記単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項１〜３のポリヌクレオチド分子のいずれかを含む、組換えベクター。
【請求項５】
請求項４の組換えベクターを含む、形質転換宿主細胞。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子にコードされる、精製または単離されているポリペプチドを調製する方法であって、請求項５の宿主細胞を、ポリペプチドの発現を導くことが可能な条件下で培養すること、および該細胞培養から精製または単離されている形態のポリペプチドを回収することを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子にコードされる、精製または単離されているポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子にコードされるポリペプチドに特異的な単離抗体。
【請求項９】
以下の工程を含む、ＭＬＫ４遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法：
ａ）細胞試験試料に試験化合物を適用する工程；
ｂ）該試験試料におけるＭＬＫ４遺伝子産物の細胞レベルを測定する工程であって、このとき該遺伝子産物が配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡであるか、または配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記工程；および、
ｃ）該試験試料における該遺伝子産物のレベルを、参照試料におけるものと比較する工程；
であって、ここで試験試料および参照試料は、培養細胞、組織および器官、ならびにヒトを除く生存動物、からなる群から選択され、そして、このとき参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化が、該化合物がＭＬＫ４遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す、前記方法。
【請求項１０】
遺伝子産物がｍＲＮＡである、請求項９の方法。
【請求項１１】
さらに、該試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項９または１０の方法。
【請求項１２】
ストレス事象が紫外線照射に対する曝露である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ストレス事象が炎症性サイトカインに対する曝露である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
試験試料および参照試料が培養細胞である、請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試験試料および参照試料が培養皮膚組織である、請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試験試料および参照試料がヒトを除く動物である、請求項９ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む、ＭＬＫ４の活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法：
ａ）試験試料に試験化合物を適用する工程；および
ｂ）試験試料及び参照試料におけるＭＬＫ４活性を測定する工程であって、このときＭＬＫ４が配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記工程；
であって、ここで試験試料および参照試料は培養細胞、組織および器官、ならびにヒトを除く生存動物、からなる群から選択され、そして、このとき参照試料と比較した該試験試料におけるＭＬＫ４活性を改変する試験化合物が、ＭＬＫ４の活性に影響を及ぼす化合物と同定される、前記方法。
【請求項１８】
ＭＬＫ４の活性を測定する工程が、ＭＬＫ４のキナーゼ活性を測定することを含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
さらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項１７または１８の方法。
【請求項２０】
ストレス事象が紫外線照射である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ストレス事象が炎症性サイトカインである、請求項１９の方法。
【請求項２２】
試験試料および参照試料が培養細胞である、請求項１７ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
試験試料および参照試料が培養皮膚組織である、請求項１７ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、ＭＬＫ４遺伝子産物をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法：
ａ）試験試料に試験化合物を適用する工程；
ｂ）該試験試料の細胞における少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、このとき該遺伝子が配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＬＫ４遺伝子産物をコードする、前記工程；および、
ｃ）該試験試料における該遺伝子の発現レベルを、参照試料におけるものと比較する工程；
であって、ここで試験試料および参照試料は培養細胞、組織および器官、ならびにヒトを除く生存動物、からなる群から選択され、そして、このとき参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子の発現の特異的な変化が、試験化合物が該遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す、前記方法。
【請求項２５】
さらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の遺伝子発現反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
ゲノムＤＮＡを含む試料中の、ＭＬＫ４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する方法であって、該試料と請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチドとを、該試料中の前記ポリヌクレオチドと前記単離ポリヌクレオチドが複合体を形成するのに充分な時間接触させること、および該複合体を検出することを含み、かくして、複合体が検出された場合、ＭＬＫ４ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドが同定される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
＜１．発明の属する技術分野＞
本発明は、皮膚細胞、特に角化細胞で発現される、新規ポリヌクレオチド、およびそのコード遺伝子産物、並びに該ポリヌクレオチドおよび該遺伝子産物を用いる方法を提供する。特に、本発明は、ｃ−Ｊｕｎ    Ｎ−末端キナーゼキナーゼキナーゼ（ＪＮＫＫＫ類）である新規プロテインキナーゼに関する。さらに、本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびそのコード産物を、薬剤発見、特に皮膚の紫外線光誘導損傷、炎症および乾癬を減じることが可能な薬剤、および外傷治癒を亢進させることが可能な薬剤のスクリーニングに用いる方法を提供する。
【０００２】
＜２．発明の背景＞
多くの細胞外シグナル、例えば光、増殖因子、サイトカインおよび化学薬品または物理的ストレスは、細胞の細胞質における多階層キナーゼカスケードを活性化する。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子は、細胞表面上のその同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体に結合し、それにより該細胞表面受容体の細胞質部分と関連している細胞内タンパク質ｒａｓを活性化するであろう。Ｒａｓはリン酸化し、そしてそれにより分裂促進剤活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）であるｒａｆ１を活性化する。Ｒａｆ１はその後、（やはりリン酸化により）分裂促進剤活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ類）の活性化を誘導し、ＭＥＫは続いて細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ類）をリン酸化する。リン酸化されると、ＥＲＫは核に移動しリン酸化し、そしてこうして転写因子、例えばストレス活性化プロテインキナーゼ１（ＳＡＰ１）および三重複合体因子Ｅｌｋ１を活性化する。例えば、Ｆａｎｇｅｒら，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ７：６７−７４を参照されたい。
【０００３】
ストレス（例えば熱および紫外線（ＵＶ）光）およびサイトカイン（例えばＴＮＦ−およびＩＬ−１）は、ＪＮＫＫＫと称される、特有の一連のキナーゼキナーゼキナーゼを活性化する。これらは、続いて、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８を活性化する特定のＪＮＫＫに作用する。最後の２つのキナーゼは、核に入り、ここでリン酸化し、そして転写因子を活性化する。例えば、Ｄｉｅｎｅら，  １９９７，  ＰＮＡＳ  ９４：９６８７−９２を参照されたい。
【０００４】
異なるストレスに対する細胞反応における最初の事象の大部分は、これまでに解明されてきていない。しかし、異なる細胞外シグナルはＪＮＫＫＫファミリーの異なるメンバーを活性化することが明らかである。したがって、いくつかのＪＮＫＫＫはＴＮＦ−αに特異的に反応性であり、他のものは浸透ショック、さらに他のものはＵＶ照明に特異的に反応性である。Ｄｉｅｎｅら、１９９７、上記；Ｒａｉｎｇｅａｕｄら，１９９５，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７４２０−６。
【０００５】
角化細胞などの皮膚細胞は、紫外線照射損傷に特にさらされやすい。しかし、角化細胞がどのように紫外線照射ストレスに反応するかに関しては、ほとんど知られていない。環境ストレスに対する角化細胞反応の操作により、多様な皮膚障害のための療法と共に美容的（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）使用が生じる可能性がある。
【０００６】
したがって、当業には、薬剤スクリーニングのための標的として用いることが可能な、角化細胞情報伝達に関与する構成要素を解明する、大きな必要性がある。したがって、本発明は、角化細胞により発現され、そして紫外線照射に対する細胞反応に関与する、いくつかの新規ＪＮＫＫＫ、およびそれらの使用を提供する。
【０００７】
＜３．発明の概要＞
本発明は、ＭＬＫ４キナーゼ、ＰＡＫ４キナーゼ、ＰＡＫ５キナーゼ、およびＹＳＫ２キナーゼを含むいくつかの新規ＪＮＫＫＫ遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子と共に、これらのポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、ＰＡＫ５キナーゼをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に関する。
【０００８】
１つの側面において、本発明は、ヒトＭＬＫ４遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＭＬＫ４遺伝子産物の部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の、前述のＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの実質的な部分（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ    ｐｏｒｔｉｏｎ）であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＭＬＫ４遺伝子産物またはＭＬＫ４関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、ヒトＰＡＫ４遺伝子の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ４遺伝子産物の部分は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の、前述のＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＰＡＫ４遺伝子産物またはＰＡＫ４関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、ヒトＰＡＫ５遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ５遺伝子産物の部分は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号６のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする部分である、ヒトＰＡＫ５遺伝子のヌクレオチド配列の部分を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。限定しない態様において、配列番号８のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する全長ヒトＰＡＫ５遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、該ポリヌクレオチド分子は、ｃＤＮＡのＯＲＦに相当する、配列番号９のｎｔ１９９〜ｎｔ２２４４のヌクレオチド配列を含む。別の限定しない態様において、全長ヒトＰＡＫ５遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１１のｎｔ６１２５〜ｎｔ１７，４３３のＯＲＦのヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号９または配列番号１１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、本発明の、前述のＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＰＡＫ５遺伝子産物またはＰＡＫ５関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ヒトＹＳＫ２遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＹＳＫ２遺伝子産物の部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、配列番号１３のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の、前述のＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＹＳＫ２遺伝子産物またはＹＳＫ２関連相同ポリペプチドのペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の、しかし限定しない態様において、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列の下位配列からなるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものをクローニングし、そして発現させるための組成物および方法を提供し、これには、本発明のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものを含むクローニングベクターおよび発現ベクターと共に、本発明のポリヌクレオチド分子、クローニングベクターまたは発現ベクターのいかなるものでもよいものを含む、形質転換宿主細胞および新規株（ｓｔｒａｉｎ）またはそこから由来する細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）が含まれる。限定しない態様において、本発明は、ポリヌクレオチド分子の発現のための１つまたはそれ以上の制御要素と機能可能であるように関連している、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。
【００２３】
やはり本発明に提供されるのは、本発明のポリヌクレオチド分子がコードする、実質的に精製または単離されているポリペプチドである。特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＭＬＫ４遺伝子産物の部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＫ４遺伝子産物の部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号６または配列番号８いずれかのアミノ酸配列を含む、ヒトＰＡＫ５遺伝子産物の部分、あるいは配列番号１０のアミノ酸配列を含む全長ヒトＰＡＫ５遺伝子産物である。別の特定の、しかし限定しない態様において、該ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、ＹＳＫ２遺伝子産物の部分である。
【００２４】
本発明はまた、本発明のヒトＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２遺伝子産物の部分に相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドも提供する。本発明はまた、本発明の全長ヒトＰＡＫ５遺伝子産物に相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドも含む。本発明はさらに、本発明のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、およびＰＡＫ５遺伝子産物の、実質的に精製または単離されているペプチド断片、並びに配列番号１３の最初の６つのアミノ酸を有する、本発明のＹＳＫ２遺伝子産物の、実質的に精製または単離されているペプチド断片を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の、ヒトＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の、実質的に精製または単離されている部分、あるいは実質的に精製または単離されているヒトＰＡＫ５遺伝子産物、あるいは相同ペプチド、あるいはペプチド断片を調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチド分子またはベクターで形質転換されている宿主細胞を、本発明のポリペプチドまたはペプチド断片の発現を導くことが可能な（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）条件下で培養し、そして細胞培養からポリペプチドまたはペプチド断片を、実質的に精製または単離されている型で回収することを含む、前記方法も提供する。
【００２６】
やはり提供されるのは、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片に特異的な抗体、および試料において、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片を検出する方法である。本発明のさらに別の側面は、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物、相同ペプチド、またはペプチド断片に結合する化合物を同定する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、試料において、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連ポリヌクレオチドを検出する方法であって、特定のポリヌクレオチドに結合し、そして該ポリヌクレオチドと複合体を形成する化合物と該試料を、複合体を形成するのに充分な時間、接触させ、そして該複合体を検出する、したがって、複合体が検出された場合、それぞれ、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連ポリヌクレオチドが検出されることを含む、前記方法も提供する。限定しない態様において、該方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料を、こうしたハイブリダイゼーション条件下で特定のポリヌクレオチドにアニールする核酸プライマーと接触させ、そしてアニールしたポリヌクレオチドを増幅する、したがって、特定のポリヌクレオチドが増幅された場合、それぞれ、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連ポリヌクレオチドが検出されることを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ＪＮＫＫＫ遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；（ｂ）該試験試料における、少なくとも１つの遺伝子産物の細胞レベルを測定し、ここで該遺伝子産物は配列番号１、３、５、７、９、１１および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子由来である；そして（ｃ）該試験試料における該遺伝子産物のレベルを、参照試料におけるものと比較する；ここで参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化は、該試験化合物がＪＮＫＫＫ遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００２９】
本発明はさらに、ＪＮＫＫＫ遺伝子産物をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；（ｂ）該試験試料の細胞における、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定し、ここで該遺伝子は配列番号１、３、５、７、９、１１および１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む；そして（ｃ）該試験試料における該遺伝子の発現レベルを、参照試料におけるものと比較する；ここで参照試料と比較した該試験試料における該遺伝子の発現の特異的な変化は、該試験化合物が該遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の遺伝子発現反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００３０】
本発明のさらに別の側面は、ＪＮＫＫＫ遺伝子産物の活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法であって：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；そして（ｂ）参照試料に対する該試験試料におけるＪＮＫＫＫ遺伝子産物の活性を測定する、ここでＪＮＫＫＫ遺伝子産物は配列番号２、４、６、８、１０および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む；ここで参照試料と比較した該試験試料におけるＪＮＫＫＫ遺伝子産物活性を改変する試験化合物は、ＪＮＫＫＫ遺伝子産物の活性に影響を及ぼす化合物と同定される、ことを含む、前記方法を提供する。好ましい態様において、該方法はさらに、試験試料にストレス事象を適用し、そして該ストレス事象に対する該試験試料の反応に対する試験化合物の影響を測定する工程を含む。
【００３１】
＜５．発明の詳細な説明＞
本発明は、皮膚角化細胞で発現される、ＪＮＫＫＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の同定および性質決定に関する。ＪＮＫＫＫのキナーゼドメインは、配列が保存されているため、細胞または細胞種により発現される、実質的にすべてのＪＮＫＫＫの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）検出のため、プライマーを設計することが可能である。１つの態様において、プライマー対、５’−ＡＴＧＣＡ（ＣＡ）ＣＡＮＧＡ（ＣＴ）ＡＴ（ＡＣＴ）ＡＡ（ＡＧ）−３’（配列番号１４）（順方向）および５’−ＧＣＮＡＣ（ＣＴ）ＴＣＮＧＧＮＧＣＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）（逆方向）を用い、新規ＪＮＫＫＫを検出することが可能である。該プライマー対を用いた産物は、共通の１５０    ｂｐ部分である。以下の実施例の項で論じられるように、プライマー対を用い、ヒト表皮角化細胞ｍＲＮＡをスクリーニングし、そしていくつかの新規ＪＮＫＫＫをコードするポリヌクレオチドを発見した。さらに、本発明は、これらのポリヌクレオチドがコードするＪＮＫＫＫが、紫外線（ＵＶ）光などのストレスに対する細胞反応に関与しているという発見に関する。例として、本発明は、ＭＬＫ４読み枠（ＯＲＦ）の部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号１）；ＰＡＫ４  ＯＲＦの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号３）；ＰＡＫ５  ＯＲＦの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号５）；ＰＡＫ５遺伝子の部分のヌクレオチド配列を含む、別の単離ポリヌクレオチド分子（配列番号７）；ＰＡＫ５遺伝子産物をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号９、ｎｔ１９９〜２２４４のＯＲＦ）；ＰＡＫ５遺伝子のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号１１、ｎｔ６１２５〜１７４３３のＯＲＦ）；およびＹＳＫ２  ＯＲＦの部分のヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子（配列番号１２）に関し、以下の項に記載される。
【００３２】
＜５．１．ポリヌクレオチド分子＞
本明細書において、「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド配列」、「コード配列」、「読み枠（ＯＲＦ）」、およびそれらに匹敵する用語は、一本鎖でもまたは二本鎖でもどちらでもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子両方を指すことが意図される。コード配列またはＯＲＦは、限定されるわけではないが、原核配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、並びに化学的に合成されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む可能性がある。「遺伝子産物」は、遺伝子がコードする産物を指すことが意図され、転写されたＲＮＡメッセージ（エクソンおよびイントロンを含む）、スプライシングされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびそれぞれのｍＲＮＡがコードする翻訳されたタンパク質産物が含まれる。
【００３３】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分子の産生および操作は、当業の範囲内であり、そしてとりわけ、すべて本明細書に援用される、Ｍａｎｉａｔｉｓら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ    Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９８９，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ    Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ    Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｉｎｎｉｓら（監修），  １９９５，  ＰＣＲ    Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ；およびＥｒｌｉｃｈ（監修），  １９９２，  ＰＣＲ    Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークに記載される組換え技術にしたがい、行うことが可能である。
【００３４】
＜５．１．１．ＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明は、ヒトＭＬＫ４関連遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＭＬＫ４遺伝子産物の部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（ａ）配列番号１がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、１つまたはそれ以上の沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）変異を含む（すなわち縮重変異体（ｖａｒｉａｎｔ））；または（ｂ）ＢＬＡＳＴＮ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号１のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．２    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら（監修），  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１，  Ｇｒｅｅｎ    Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ    Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ    ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，ニューヨーク，  ｐ．２．１０．３）で、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．１    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００３６】
本明細書において、ＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子は：（ｉ）真核細胞由来のＭＬＫ４遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ｉｉ）試験試料におけるＭＬＫ４転写物の存在を検出することが可能であり；または（ｉｉｉ）内因性ＭＬＫ４遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは１つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（ｉｖ）ＰＣＲなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、ＭＬＫ４  ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用（ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ    ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生ＭＬＫ４遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異ＭＬＫ４対立遺伝子を含んでもよい。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト由来のＭＬＫ４遺伝子産物の部分のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を含むが、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、生じたアミノ酸配列が、配列番号２に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列同一性がＢＬＡＳＴＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定され、生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。保存的アミノ酸置換は当業に周知である。こうした置換を作成するための規準には、とりわけ、Ｄａｙｈｏｆ，  Ｍ．Ｄ．，  １９７８，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，ワシントンＤ．Ｃ．，  Ｖｏｌ．  ５，  Ｓｕｐ．  ３に記載されるものが含まれる。より明確には、保存的アミノ酸置換は、一般的に、酸性度、またはその側鎖の極性において関連しているアミノ酸のファミリー内で行われるものである。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般的に４つの群に分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはまた、芳香族アミノ酸として共に分類される。いかなる特定の群内での１つまたはそれ以上の置換、例えばロイシンとイソロイシンまたはバリン、あるいはアスパラギン酸とグルタミン酸、あるいはスレオニンとセリン、あるいはいかなる他のアミノ酸残基と構造的に関連したアミノ酸残基、例えば同様の酸性度、または極性、またはそれらを組み合わせた類似性を有するアミノ酸残基も、一般的に、ポリペプチドの機能に重要でない影響を有するであろう。
【００３８】
本明細書において、ＭＬＫ４関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のＭＬＫ４遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてＭＬＫ４活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００３９】
本発明はさらに、本発明の、前述のＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子のいずれかの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ    ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、配列番号１のヌクレオチド配列の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約２０％、そしてより好ましくは少なくとも約３０％を含み、そして有用性がＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、ＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＭＬＫ４遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。ＭＬＫ４関連ポリペプチドの「ペプチド断片（ｐｅｐｔｉｄｅ    ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、配列番号２の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がＭＬＫ４関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本明細書において、「ペプチド断片」は、好ましくは、長さが少なくとも約１５アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基である。
【００４０】
本明細書に開示されるＭＬＫ４関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトＭＬＫ４遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるＭＬＫ４遺伝子産物の発現を検出し、ＭＬＫ４遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばＡｂｏら、以下を参照されたい）、例えばＡＴＰ結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブＭＬＫ４を生成しそして発現させ、そして既知の技術を用い、ヒト以外の真核種、そして特に他の哺乳動物種におけるＭＬＫ４ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、ＭＬＫ４ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「ＭＬＫ４ホモログ遺伝子産物（ＭＬＫ４  ｈｏｍｏｌｏｇ    ｇｅｎｅ    ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、ＭＬＫ４ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、ＭＬＫ４ホモログ遺伝子は、ヒト以外の異なる真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約７０％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトＭＬＫ４遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。
【００４１】
ＭＬＫ４ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、当業に知られる。例えば、ヒトＭＬＫ４  ＯＲＦの部分を含むポリヌクレオチド分子を検出可能であるように標識し、そして目的の生物由来のＤＮＡから構築したゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、目的の生物に対する参照生物の関係に基づき、選択することが可能である。異なるストリンジェンシー条件のための必要条件は当業者に周知であり、そしてこうした条件は、ライブラリーおよび標識配列が由来する特定の生物に応じ、予測可能であるように、異なるであろう。とりわけ、バクテリオファージライブラリーに関し、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ，  １９７７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    １９６：１８０に、そしてプラスミドライブラリーに関し、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ，  １９７５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７２：３９６１−３９６５に示される技術を用い、ゲノムＤＮＡライブラリーをＭＬＫホモログ遺伝子コード配列に関しスクリーニングしてもよい。前記刊行物は本明細書に援用される。配列番号１に示されるような、ＭＬＫ４  ＯＲＦの部分を含むことが知られるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、またはその部分に相当するオリゴヌクレオチド分子を、これらのスクリーニング実験におけるプローブとして用いてもよい。あるいは、精製ＭＬＫ４遺伝子産物のアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成してもよい。
【００４２】
ＭＬＫ４ホモログ遺伝子コード配列を含むと同定されるクローンは、適切な生物学的機能に関し、試験してもよい。例えば、適切な読み枠と共に、開始および終止シグナルを同定するため、該クローンを配列解析に供してもよい。クローンされたＤＮＡ配列をその後、適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターをその後、相補性に関する試験に対しＭＬＫ４をヌルに（ｎｕｌｌ）している細胞（例えばヒト細胞）に形質転換する。形質転換宿主細胞をその後、ＭＬＫ４情報伝達に関し解析する。
【００４３】
＜５．１．２．ＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド＞
本発明はさらに、ヒトＰＡＫ４遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ４遺伝子産物の部分は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（ａ）配列番号３がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、１つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（ｂ）ＢＬＡＳＴＮ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号３のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．２    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．１    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００４５】
本明細書において、ＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子は：（ｉ）真核細胞由来のＰＡＫ４遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ｉｉ）試験試料におけるＰＡＫ４転写物の存在を検出することが可能であり；または（ｉｉｉ）内因性ＰＡＫ４遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは１つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（ｉｖ）ＰＣＲなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、ＰＡＫ４  ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生ＰＡＫ４遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異ＰＡＫ４対立遺伝子を含んでもよい。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のＰＡＫ４遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号４のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がＢＬＡＳＴＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号４に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有し、生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００４７】
本明細書において、ＰＡＫ４関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のＰＡＫ４遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてＰＡＫ４活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００４８】
本発明はさらに、本発明の、前述のＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号３の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約２０％、そしてより好ましくは少なくとも約３０％を含み、そして有用性がＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、ＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＰＡＫ４遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。ＰＡＫ４関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号４の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がＰＡＫ４関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約１５アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基である。
【００４９】
本明細書に開示されるＰＡＫ４関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトＰＡＫ４遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるＰＡＫ４遺伝子産物の発現を検出し、ＰＡＫ４遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばＡｂｏら、以下を参照されたい）、例えばＡＴＰ結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブＰＡＫ４を生成しそして発現させ、そして既知の技術を用い、ヒト以外の真核種、そして特に他の哺乳動物種におけるＰＡＫ４ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、ＰＡＫ４ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「ＰＡＫ４ホモログ遺伝子産物」は、ＰＡＫ４ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、ＰＡＫ４ホモログ遺伝子は、ヒト以外の異なる真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約７０％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトＰＡＫ４遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。ＰＡＫ４ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００５０】
＜５．１．３．ＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、ヒトＰＡＫ５遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＡＫ５遺伝子産物の部分は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号６のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、ＰＡＫ５遺伝子産物の部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、配列番号８のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。本発明のさらに別の限定しない態様は、ＰＡＫ５ゲノムＤＮＡ（配列番号７を参照されたい）のいかなる１つでもよいエクソンの配列である。本発明のさらに限定しない態様は、ＰＡＫ５ゲノムＤＮＡのいかなる１つでもよいイントロンの配列である。
【００５１】
本発明はさらに、全長ヒトＰＡＫ５遺伝子産物をコードする配列番号９のｃＤＮＡヌクレオチド配列（ＯＲＦのｎｔ１９９−２２４４）を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、ヒトＰＡＫ５遺伝子に相当する、配列番号１１のヌクレオチド配列（ＯＲＦのｎｔ６１２５−１７４３３）を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、本発明のＰＡＫ５遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（ａ）配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、１つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（ｂ）ＢＬＡＳＴＮ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列に対し、あるいは配列番号９または配列番号１１のＯＲＦに対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．２    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．１    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列、あるいは配列番号９または配列番号１１のＯＲＦのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００５３】
本明細書において、ＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子は：（ｉ）真核細胞由来のＰＡＫ５遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ｉｉ）試験試料におけるＰＡＫ５転写物の存在を検出することが可能であり；または（ｉｉｉ）内因性ＰＡＫ５遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは１つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（ｉｖ）ＰＣＲなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、ＰＡＫ５  ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生ＰＡＫ５遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異ＰＡＫ５対立遺伝子を含んでもよい。
【００５４】
本発明はさらに、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のＰＡＫ５遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号６、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がＢＬＡＳＴＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有し、そして生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００５５】
本明細書において、ＰＡＫ５関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のＰＡＫ５遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞においてＰＡＫ５活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の、前述のＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号５、配列番号７、配列番号９（ｎｔ１９９〜２２４４）または配列番号１１（ｎｔ６１２５〜１７４３３）の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約２０％、そしてより好ましくは少なくとも約３０％を含み、そして有用性がＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、ＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のヒトＰＡＫ５遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。ＰＡＫ５関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の下位配列からなるポリペプチドを指し、ここで下位配列は、有用性がＰＡＫ５関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約１５アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基である。
【００５７】
本明細書に開示されるＰＡＫ５関連ポリヌクレオチド分子を用い、ＰＡＫ５遺伝子産物の部分を発現させ、細胞または組織におけるＰＡＫ５遺伝子の発現を検出し、ＰＡＫ５遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばＡｂｏら、以下を参照されたい）、ＡＴＰ結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブＰＡＫ５を生成しそして発現させ、そして標準的な技術を用い、他の真核種または細胞種におけるＰＡＫ５ホモログ遺伝子を同定してもよい。したがって、本発明はさらに、ＰＡＫ５ホモログ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「ＰＡＫ５ホモログ遺伝子産物」は、ＰＡＫ５ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、ＰＡＫ５ホモログ遺伝子は、ヒト以外の真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約８０％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトＰＡＫ５遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。ＰＡＫ５ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００５８】
＜５．１．４．ＹＳＫ関連ポリヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、ヒト細胞由来のＹＳＫ２遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様において、ＹＳＫ２遺伝子産物は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。限定しない態様において、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
本発明はさらに、本発明のＹＳＫ２遺伝子産物の部分をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に相同な、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。この点で用いられる場合、「相同」という用語は：（ａ）配列番号１２がコードするのと同じポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のためヌクレオチド配列に、１つまたはそれ以上の沈黙変異を含む；または（ｂ）ＢＬＡＳＴＮ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なヌクレオチド配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、配列番号１２のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列同一性を有し、そして中程度にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．２    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号１３の少なくとも最初の６アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下、すなわち０．５    Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１    ｍＭ    ＥＤＴＡ中で６５℃でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション、および０．１    Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記）で、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号１３の少なくとも最初の６アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である。より好ましい態様において、相同ポリヌクレオチド分子は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の相補体にハイブリダイズし、そして配列番号１３の少なくとも最初の６アミノ酸残基をコードし、そして本発明を実施するのに有用である。
【００６０】
本明細書において、ＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子は：（ｉ）真核細胞由来のＹＳＫ２遺伝子産物を、免疫特異的に認識する抗体を生成するのに用いることが可能なペプチドをコードし；または（ｉｉ）試験試料におけるＹＳＫ２転写物の存在を検出することが可能であり；または（ｉｉｉ）内因性ＹＳＫ２遺伝子の制御または発現を改変するための方法を可能にすることができ（例えば遺伝子活性化または不活性化技術、例えばイントロンへの転写活性化因子配列の挿入、あるいは１つまたはそれ以上のエクソンの欠失により）；または（ｉｖ）ＰＣＲなどの標準的な増幅技術を用い、真核細胞において、ＹＳＫ２  ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を増幅するのに用いることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。こうした相同ポリヌクレオチド分子には、ヒト以外の真核種（および特に哺乳動物種、例えばマウス、ウシ、ヒツジ、モルモットおよびラットなど）、または他のヒト単離体に存在する天然発生ＹＳＫ２遺伝子と共に、天然発生、化学合成、または遺伝子操作いずれでもよい、突然変異ＹＳＫ２対立遺伝子を含んでもよい。
【００６１】
本発明はさらに、配列番号１３のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ヒト細胞由来のＹＳＫ２遺伝子産物のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す際、「相同」という用語は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むが、保存的アミノ酸置換が上に定義されるように、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で保存的に置換されており、アミノ酸配列同一性がＢＬＡＳＴＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ）などのいかなる標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムでもよいもので決定されるように、生じたアミノ酸配列が、配列番号１３に対し、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有し、そして生じたポリペプチドが本発明を実施するのに有用である、ことを意味する。
【００６２】
本明細書において、ＹＳＫ２関連ポリペプチドは、該ポリペプチドを用い、真核、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒト細胞または組織由来のＹＳＫ２遺伝子産物に対し抗体を作成し、あるいはこうした細胞または組織においてＹＳＫ２活性または産生を調節する化合物に関しスクリーニングすることが可能である場合、「本発明を実施するのに有用」である。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の、前述のＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの実質的な部分であるヌクレオチド配列からなる、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」は、配列番号１２の全長より短いものからなるポリヌクレオチド分子またはそれと相同なポリヌクレオチド分子であるが、前記ヌクレオチド配列の長さの少なくとも約２０％、そしてより好ましくは少なくとも約３０％を含み、そして配列番号１３の少なくとも最初の６アミノ酸残基をコードし、そして有用性がＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子に関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である、前記ポリヌクレオチド分子を意味する。限定しない態様において、ＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、本発明のＹＳＫ２遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列からなる。ＹＳＫ２関連ポリペプチドの「ペプチド断片」は、配列番号１３のアミノ酸配列下位配列からなり、なお配列番号１３の残基１〜６の配列を含むポリペプチドを指し、そして該下位配列は、有用性がＹＳＫ２関連ポリペプチドに関し上に定義されるように、本発明を実施するのに有用である。本発明のペプチド断片は、好ましくは、長さが少なくとも約１５アミノ酸残基であり、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸残基である。
【００６４】
本明細書に開示されるＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド分子を用い、ヒトＹＳＫ２遺伝子産物の部分を発現させ、細胞種または組織におけるＹＳＫ２遺伝子産物の発現を検出し、ＹＳＫ２遺伝子が突然変異している（例えば相同的組換えにより改変されまたは除去されている）新規細胞株を調製し、周知の技術を用い（例えばＡｂｏら、以下を参照されたい）、ＡＴＰ結合部位を突然変異させることにより、優性ネガティブＹＳＫ２を生成しそして発現させ、そして他の真核種または細胞種におけるＹＳＫ２ホモログ遺伝子を同定してもよい。本明細書において、「ＹＳＫ２ホモログ遺伝子産物」は、ＹＳＫ２ホモログ遺伝子がコードする遺伝子産物として定義され、ＹＳＫ２ホモログ遺伝子は、ヒト以外の真核種由来の遺伝子で、そして当業者により、約８０％より大きいアミノ酸レベルでの配列同一性の度合いに基づき、ヒトＹＳＫ２遺伝子の相同体と認められるものとして定義される。ＹＳＫ２ホモログ遺伝子を含むポリヌクレオチドクローンを同定するための方法は、上述のように、当業に知られる。
【００６５】
＜５．２．オリゴヌクレオチド分子＞
本発明はさらに、本発明の、前述のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものにハイブリダイズする、または本発明の、前述のポリヌクレオチド分子のいかなるものでもよいものの相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子を提供する。こうしたオリゴヌクレオチド分子は、好ましくは、少なくとも長さ約１０ヌクレオチドであり、そしてより好ましくは、少なくとも長さ約２０ヌクレオチドであり、そして中程度にまたは非常にストリンジェントな条件下で、前述のポリヌクレオチド分子の１つまたはそれ以上にハイブリダイズすることが可能である。より短いオリゴヌクレオチド分子に関しては、非常にストリンジェントな条件の例には、〜１４塩基オリゴに関しては約３７℃での、〜１７塩基オリゴに関しては約４８℃での、〜２０塩基オリゴに関しては約５５℃での、そして〜２３塩基オリゴに関しては約６０℃での、６    Ｘ  ＳＳＣ／０．５％リン酸ナトリウム中の洗浄が含まれる。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち約１００    ｎｔより大きいもの）に関しては、中程度におよび非常にストリンジェントな条件は、相同ポリヌクレオチド分子に関し、上の１．１節に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、利用される特定のオリゴヌクレオチド分子に応じ、当業に知られるように、適切に調整することが可能である。
【００６６】
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対し、あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１または１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対し、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物コードポリヌクレオチド分子を増幅する際のプライマーとして、またはＪＮＫＫＫ遺伝子および遺伝子産物の発現を制御する際に有用なアンチセンス分子としてを含め、多様な目的に有用である。増幅は、適切に設計されたオリゴヌクレオチド分子を、標準的技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて用い、行うことが可能であるが、当業に知られる他の増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応もまた、用いてもよい。例えば、ＰＣＲに関しては、適切に設計されたプライマー、増幅しようとするヌクレオチド配列を含むテンプレート、並びに適切なＰＣＲ酵素および緩衝液を含む混合物を調製し、そして標準的プロトコルにしたがいプロセシングし、テンプレートの特定のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５、またはＹＳＫ２関連ポリヌクレオチド配列を増幅する。
【００６８】
＜５．３．組換え発現系＞
＜５．３．１．発現ベクター＞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換えクローニングベクターおよび組換え発現ベクターであって、本発明のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２  ＯＲＦの部分、あるいは全長ＰＡＫ５  ＯＲＦを含むポリヌクレオチド分子を含む、前記ポリヌクレオチド分子をクローニングしまたは発現するのに有用である、前記ベクターを提供する。
【００６９】
以下の説明は、他に示されない限り、上に定義されるような、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２  ＯＲＦの部分、全長ＰＡＫ５  ＯＲＦを含むポリヌクレオチド分子、およびそれらの遺伝子産物、およびすべての相同ポリヌクレオチド分子、相同ポリペプチド、こうしたポリヌクレオチド分子の実質的な部分、並びにこうした産物およびポリペプチドのペプチド断片を含む、本発明の、前述のポリヌクレオチド分子およびポリペプチドのすべてに適用されることが意図される。
【００７０】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のコード配列が、ポリペプチドを産生するため、コード配列の転写および翻訳に必要な、１つまたはそれ以上の制御要素と、機能可能であるように関連しているように構築される。本明細書において、「制御要素」という用語には、限定されるわけではないが、ポリヌクレオチドコード配列の発現をドライブするおよび／または制御するのに利用できる、当業に知られる、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび他の要素のヌクレオチド配列が含まれる。また、本明細書において、コード配列は、１つまたはそれ以上の制御要素と「機能可能であるように関連」しており、ここで該制御要素は、コード配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳、あるいは両方を効果的に制御し、そして可能にする。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチド分子を含むよう設計することが可能な、典型的なプラスミドベクターには、とりわけ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。さらに、真核細胞、例えば哺乳動物細胞における発現のため、特に設計されているベクターが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＰｒｏｍｅｇａから商業的に入手可能である。
【００７２】
これらのベクターの制御要素は、その強度および特異性において多様である可能性がある。利用される宿主／ベクター系に応じ、いくつかの適切な転写および翻訳要素のいずれを用いてもよい。細菌のための転写制御領域またはプロモーターの、限定しない例には、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ラムダ左および右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、並びにｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターが含まれる。真核細胞のための転写制御領域またはプロモーターの、限定しない例には、いくつかのみを挙げると、ウイルス制御領域、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域、内因性真核遺伝子由来の組織特異的または誘導性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター、ミオシン軽鎖−２プロモーター、インスリンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および真菌プロモーター、例えばｇａｌ    ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、および接合因子プロモーターが含まれる。
【００７３】
適切な制御要素と機能可能であるように関連している特定のコード配列を含む組換えベクターを構築するための方法は、当業に周知であり、そしてこれらのいずれを用い、本発明を実施してもよい。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記；Ｉｎｎｉｓら、１９９５、上記；およびＥｒｌｉｃｈ、１９９２、上記に記載される技術を参照されたい。
【００７４】
融合タンパク質発現ベクターを用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物融合タンパク質を発現させてもよい。精製融合タンパク質を用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物に対する抗血清を作成し、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の生化学的特性を研究し、異なる生化学的活性を持つＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２融合タンパク質を設計し、または組換え発現系において、発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の同定または精製を援助してもよい。使用可能な融合タンパク質発現ベクターには、限定されるわけではないが、β−ガラクトシダーゼおよびｔｒｐＥ融合体、マルトース結合タンパク質融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体およびポリヒスチジン融合体（キャリアー領域）をコードする配列を組み込んだベクターが含まれる。
【００７５】
ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２融合タンパク質が精製に有用な領域を含むよう設計してもよい。例えば、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２−マルトース結合タンパク質融合体はアミロース樹脂を用い精製することが可能であり；ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質はグルタチオン・アガロースビーズを用い精製することが可能であり；そしてＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２−ポリヒスチジン融合体は二価ニッケル樹脂を用い精製することが可能である。あるいは、キャリアータンパク質またはペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のため、用いてもよい。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を、制御要素と機能可能であるように関連するよう、発現ベクター内に設計し、そして配置し、発現されたエピトープがＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに融合するようにしてもよい。例えば、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧＴＭエピトープタグ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をコードするヌクレオチド配列を、標準的な技術により、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に対応する点で、発現ベクター内に挿入してもよい。発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチド−ＦＬＡＧＴＭエピトープ融合産物をその後、商業的に入手可能な抗ＦＬＡＧＴＭ抗体を用い、検出し、そしてアフィニティー精製してもよい。
【００７６】
ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２融合タンパク質をコードする発現ベクターはまた、特異的なプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含むように設計し、特異的なプロテアーゼでの処理により、発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドが、キャリアー領域または融合パートナーから放出されるようにしてもよい。例えば、融合タンパク質ベクターには、とりわけ、トロンビン、または因子Ｘａ切断部位をコードするＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００７７】
既知の方法により、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２  ＯＲＦの上流でそして読み枠内で、シグナル配列を発現ベクター内に設計し、発現された遺伝子産物の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）および分泌を指示してもよい。シグナル配列の限定しない例には、とりわけ、α因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼ、およびＴ細胞受容体由来のものが含まれる。
【００７８】
本発明のクローニングまたは発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞の選択を援助するため、ベクターは、さらにリポーター遺伝子産物または他の選択可能マーカーのコード配列を含むよう、設計してもよい。こうしたコード配列は、好ましくは、上述のように、制御要素コード配列と機能可能であるように関連している。本発明に有用である可能性があるリポーター遺伝子は当業に周知であり、そしてとりわけ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥ、およびチロシナーゼをコードするものが含まれる。選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列は当業に周知であり、そして抗生物質または代謝拮抗物質に対する耐性を与える、または栄養要求性必要条件を供給する遺伝子産物をコードするものが含まれる。こうした配列の例には、とりわけ、メトトレキセート、Ｇ４１８またはミコフェノール酸に対する耐性をコードするものが含まれる。
【００７９】
＜５．３．２．宿主細胞＞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、およびそこから由来する新規株または細胞株を提供する。本発明の実施に有用な宿主細胞は、好ましくはヒト細胞であるが、他の真核細胞または原核細胞もまた、用いてもよい。こうした他の形質転換宿主細胞には、典型的には、限定されるわけではないが、微生物、例えば、とりわけ、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡベクターで形質転換されている細菌、あるいは組換えベクターで形質転換されている酵母が含まれる。
【００８０】
望ましい特定の方式で遺伝子産物を修飾しそしてプロセシングする、適切な宿主細胞を選択してもよい。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、糖鎖付加、リン酸化）のための特徴的な機構を有する。例えば、細菌系における発現を用い、非糖鎖付加タンパク質産物を産生してもよい。酵母における発現および分泌は、糖鎖付加タンパク質産物を産生することが可能である。哺乳動物細胞における発現を用い、タンパク質産物の「天然」プロセシングを確実にしてもよい。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる度合いでプロセシング反応に影響を及ぼす可能性がある。
【００８１】
例えばクローニングまたは発現目的のため、宿主細胞として好ましい細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の株である。典型的には、培養で増殖するよう、そしてクローニング技術のために適応させた大腸菌株、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、米国メリーランド州ロックビル（寄託番号第３１３４３号）または商業的供給源（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）いずれからも入手可能なＤＨ５α株を、用いることが可能である。好ましい真核宿主細胞には、ヒト細胞、および特に角化細胞が含まれるが、他の哺乳動物細胞および酵母細胞または昆虫細胞もまた、効果的に利用することが可能である。
【００８２】
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、実質的に均質な細胞培養の１つまたはそれ以上の宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションされる。発現ベクターは、一般的に、既知の技術にしたがい、例えばプロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈澱、塩化カルシウム処理、微量注入、エレクトロポレーション、組換えウイルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、形質導入、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、または微粒子銃により、宿主細胞に導入される。形質転換体の選択は、標準法により、上述のように、例えば組換えベクターと関連している選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を発現している細胞を選択することにより、行ってもよい。
【００８３】
宿主細胞に発現ベクターが導入されたら、宿主細胞染色体またはエピソームいずれかにおける、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連コード配列の組込みおよび維持を、標準的技術により、例えばサザンハイブリダイゼーション解析、制限酵素解析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むＰＣＲ解析により、または免疫学的アッセイにより、期待される遺伝子産物が検出されることを確認してもよい。組換えＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連コード配列を含むおよび／または発現している宿主細胞は、当業に周知の少なくとも４つの一般的なアプローチのいずれにより同定してもよく、該アプローチには：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、またはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｉｉ）「マーカー」遺伝子機能の存在の検出；（ｉｉｉ）宿主細胞におけるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２特異的ｍＲＮＡ転写物の発現により測定されるような転写レベルの評価および（ｉｖ）例えばイムノアッセイにより測定されるような成熟ポリペプチド産物の存在の検出が含まれる。
【００８４】
＜５．３．３．ＪＮＫＫＫポリペプチドの発現および性質決定＞
ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連コード配列が適切な宿主細胞に安定して導入されたら、形質転換宿主細胞をクローン的に増殖させ、そして生じた細胞をＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物の最大産生を導くことが可能な条件下で増殖させる。こうした条件には、典型的には、高密度に細胞を増殖させることが含まれる。発現ベクターが誘導性プロモーターを含む場合、適切な誘導条件、例えば温度シフト、栄養素の枯渇、無償性の（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ）誘導因子の添加（例えば炭水化物類似体、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））、過剰な代謝副産物の集積、またはそれらに匹敵するものが、発現を誘導するのに必要とされるように使用される。
【００８５】
発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を採取しそして溶解し、そして、タンパク質分解を最小限にするため、当業に知られる抽出条件下、例えば４℃でまたはプロテアーゼ阻害剤の存在下で、あるいは両方の条件下で、産物を溶解物から単離し、そして精製する。発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物が宿主細胞から分泌される場合、枯渇した栄養素培地を、単純に収集し、そしてそこから産物を単離する。
【００８６】
発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物は、適切なように、限定されるわけではないが、以下の方法：硫酸アンモニウム沈澱、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、およびアフィニティークロマトグラフィーのいかなる組み合わせをも含む、標準的な方法を用い、細胞溶解物または培地から単離しまたは実質的に精製してもよい。発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物が生物学的活性を示す場合、適切なアッセイの使用により、精製法の各工程で、調製の純度の増加をモニターしてもよい。発現されたＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連遺伝子産物が生物学的活性を示しても示さなくても、各々、例えば大きさ、またはそうでなければＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２に特異的な抗体との反応性に基づき、あるいは融合タグの存在により、検出することが可能である。
【００８７】
本発明はこうして、本発明のポリヌクレオチド分子がコードする実質的に精製または単離されているポリペプチドを提供する。特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ヒトＭＬＫ４遺伝子産物、またはその部分である。別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ヒトＰＡＫ４遺伝子産物、またはその部分である。さらに別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号６、８または１０のアミノ酸配列を含む、ヒトＰＡＫ５遺伝子産物、またはその部分である。さらに別の特定の、しかし限定しない態様において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、ヒトＹＳＫ２遺伝子産物、またはその部分である。本発明はさらに、本発明のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２のいかなるものでもよいものに相同な、実質的に精製または単離されているポリペプチドを提供し、相同ポリペプチドは上に定義される通りである。本発明はさらに、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物のペプチド断片または相同ポリペプチドを提供し、ペプチド断片は上に定義される通りである。本発明の、実質的に精製または単離されているポリペプチドは、多様な目的、例えばＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２タンパク質と相互作用する、そしてしたがってＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２活性（情報伝達に関与する事象を含む）に影響を及ぼす化合物の候補である化合物に関するスクリーニング、およびＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物に対して向けられる抗体の作成などに有用である。こうした化合物および抗体を、治療法で用い、皮膚に対するＵＶ損傷を治療しまたは予防してもよい。
【００８８】
本明細書において、ポリペプチドは、該ポリペプチドが特定の調製において、成分重量の大部分（すなわち少なくとも約５０％）を構成する場合、「実質的に精製」されている。また、本明細書において、ポリペプチドは、該ポリペプチドが特定の調製において、成分の少なくとも約９０重量％を構成する場合、「単離」されている。また、本明細書において、ポリヌクレオチド分子は、該分子が特定の調製において、核酸成分の少なくとも約９０重量％を構成する場合、または例えばゲル電気泳動技術により測定されるように、他のすべてのポリヌクレオチド分子から分離されているように見える場合、「単離」されている。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の、実質的に精製または単離されているＭＬＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ５遺伝子産物、ＹＳＫ２遺伝子産物またはペプチド断片を調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチド分子または組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞を、特定の遺伝子産物、ポリペプチド、またはペプチド断片の発現を導くことが可能な条件下で培養し、ここで前記組換えベクターはそれぞれ、本発明のＭＬＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ５遺伝子産物、ＹＳＫ２遺伝子産物またはペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含み、該ヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上の制御要素と機能可能であるように関連している、そして細胞培養から、実質的に精製または単離されている型で、発現された遺伝子産物、ポリペプチド、またはペプチド断片を回収することを含む、前記方法を提供する。
【００９０】
充分な純度のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物が得られたら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列解析、キナーゼ活性などの生物学的活性によるものを含む、標準的方法により、性質決定してもよい。例えば、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物のアミノ酸配列は、標準的なペプチド配列決定技術を用い、決定することが可能である。ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物は、それぞれＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の疎水性および親水性領域を同定するため、親水性解析（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ７８：３８２４を参照されたい）、または類似のソフトウェアアルゴリズムを用い、さらに性質決定してもよい。構造解析を行い、特定の二次構造を取るＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の領域を同定してもよい。生物物理的方法、例えばＸ線結晶解析（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，  １９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  １１：７−１３）、コンピューターモデリング（ＥｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ（監修），  １９８６，  Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ    ｉｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中）、および核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物およびそれらの基質の間の相互作用の部位をマッピングしそして研究してもよい。これらの研究から得た情報を用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物上の特定の部位を、これらの遺伝子産物と相互作用し、そして活性を改変させる薬剤候補の潜在的な標的として選択してもよい。
【００９１】
＜５．４．抗体＞
本発明はさらに、本発明の、ＭＬＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ４遺伝子産物、ＰＡＫ５遺伝子産物、ＹＳＫ２遺伝子産物に対し、あるいは相同ポリペプチドまたはペプチド断片に対し結合する、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体は、天然ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物を精製する、あるいはＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の活性または生物学的機能を解析するアフィニティー試薬として、用いてもよい。
【００９２】
抗体は、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２関連ポリペプチドのいずれに対し作成してもよい。抗ＭＬＫ４、抗ＰＡＫ４、抗ＰＡＫ５または抗ＹＳＫ２特異的抗体を産生するのに知られる方法にしたがい、限定されるわけではないが、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスを含む、多様な宿主動物を用いてもよい。当業に知られる多様なアジュバントを用い、抗体産生を亢進してもよい。
【００９３】
標準的技術を用い、ポリクローナル抗体を免疫化動物から得て、そして抗ＭＬＫ４、抗ＰＡＫ４、抗ＰＡＫ５または抗ＹＳＫ２特異性に関し試験してもよい。あるいは、培養中の連続する細胞株による抗体分子産生を提供するいかなる技術を用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製してもよい。これらには、限定されるわけではないが、元来ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，  １９７５，  ２５６：４９５−４９７）に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ    ４：７２；Ｃｏｔｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８０：２０２６−２０３０）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ    Ｃａｎｃｅｒ    Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）が含まれる。あるいは、一本鎖抗体産生のため記載された技術（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を適応させ、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２特異的一本鎖抗体を産生してもよい。これらの刊行物は、本明細書に援用される。
【００９４】
ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに特異的な結合部位を含む抗体断片もまた、本発明に含まれ、そして既知の技術により生成することが可能である。こうした断片には、限定されるわけではないが、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体分子のペプシン消化により生成することが可能な、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することが可能な、Ｆａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２４６：１２７５−１２８１）、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに対し望ましい特異性を有するＦａｂ断片の迅速な同定を可能にしてもよい。
【００９５】
モノクローナル抗体および抗体断片を産生するための技術は当業に周知であり、そして、とりわけ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ    Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＪ．Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  １９８６，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ    Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドンにさらに記載されている。上に引用されたすべての刊行物は、本明細書に援用される。
【００９６】
＜５．５．アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム＞
やはり本発明の範囲内にあるのは、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２  ｍＲＮＡに結合する、該ｍＲＮＡを分解するおよび／または該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう機能する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列である。
【００９７】
アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう、作用する。例えば、少なくとも約１５塩基でそしてＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の特有の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば慣用的なホスホジエステル技術により、合成することが可能である。
【００９８】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することが可能な酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーションの後、ヌクレオチド鎖切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ    ｃｌｅａｖａｇｅ）を伴う。ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２  ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的にそして効果的に触媒する、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子もまた、本発明の範囲内である。
【００９９】
いかなる潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位も、まず、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含む、リボザイム切断部位に関し標的分子をスキャンすることにより、同定される。同定されたら、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５および２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性がある二次構造などの予測される構造的特徴に関し、評価してもよい。候補標的の適切さはまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を試験することにより、評価してもよい。
【０１００】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは両方とも、既知の方法により調製することが可能である。これらには、例えば固相ホスホアミト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｔｅ）化学合成などの化学合成のための技術が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により、生成してもよい。こうしたＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多様なベクターに組み込んでもよい。
【０１０１】
細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに多様な修飾を導入してもよい。可能性がある修飾には、限定されるわけではないが、分子の５’および／または３’端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内のホスホロチオエートの使用またはホスホジエステル結合の代わりの２’−Ｏ−メチルの使用が含まれる。
【０１０２】
＜５．６．ＪＮＫＫＫ遺伝子産物の検出、並びに診断および治療的使用＞
本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２ポリペプチド分子、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドと共に、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドを認識する本発明の抗体は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の発現における改変から生じる疾患または異常の診断に有用である。発現における改変は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子の転写における増加または減少、あるいはＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の翻訳における増加または減少いずれでもよい。あるいは、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子配列における突然変異、対立遺伝子、または多型の存在は、限定されるわけではないが、紫外線光または他のストレスにより引き起こされる皮膚損傷、あるいは乾癬に対する感受性の増加または減少を含む、疾患または異常と相関させることが可能である。
【０１０３】
核酸に基づく検出法は、当業に周知であり、そしてハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンおよびサザンハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、および連結連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイ、または上記の組み合わせ（例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）が含まれる。こうしたアッセイは、上述のような、相補的配列を含む、本発明の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを利用する。ＲＮＡ遺伝子産物の解析が望ましい場合、当業に知られるように、特定のアッセイは、典型的には、増幅および／またはハイブリダイゼーションの前に逆転写工程を含むであろう。こうした核酸に基づく技術は、一般の当業者により設計し、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子発現のレベル、あるいは特定の突然変異、対立遺伝子または多型の存在または非存在をアッセイしてもよい。
【０１０４】
タンパク質またはポリペプチドに基づく検出法もまた、一般の当業者に周知であり、そして例えば免疫学的アッセイ、例えば標識標的のウェスタンブロット、免疫沈降、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。これらのアッセイは、上述の本発明の抗体を用いる。再び、こうしたアッセイは、細胞または生物により発現されるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドのレベル、あるいはＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドにおける突然変異、対立遺伝子、または多型の存在または非存在を測定してもよい。
【０１０５】
異常な状態が、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の過剰産生または産生不足と関連している場合、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、異常な状態を予防する、改善するまたはそうでなければ治療するのに有用である可能性がある。例えば、遺伝子配列を細胞に導入することにより、遺伝子治療を用い、細胞が不適切なレベルのＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物を発現している、あるいは異常なまたは不活性なＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドを発現している異常を治療してもよい。いくつかの例において、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の過剰発現により特徴付けられる異常な状態は、以下に記載される遺伝子治療技術を用い、予防しまたは治療することが可能である。特に、遺伝子治療ベクターが、上述のような本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムを発現するよう設計し、それによりポリペプチドに効果的に翻訳されるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の量を減少させてもよい。
【０１０６】
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団への組換えＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリヌクレオチドの搬送に用いてもよい。当業者に周知の方法を用い、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを構築してもよい。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ    Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌら，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ    Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ    Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨークに記載される技術を参照されたい。あるいは、いくつかの例のみを挙げると、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリヌクレオチドを含む、組換え非ウイルスベクターを、標的細胞への搬送のため、リポソームに再構成してもよいし、あるいは例えば「ＤＮＡワクチン」におけるように、裸のポリヌクレオチドとして搬送してもよい。
【０１０７】
＜５．７．薬剤スクリーニング適用＞
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドを含む、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２遺伝子産物は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物に特異的に結合し、そしてしたがってそれぞれ、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとしての潜在的な使用を有する化合物を同定する、スクリーニングアッセイに用いてもよい。特定の好ましい使用において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドのキナーゼ活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングするのに有用である。
【０１０８】
本発明はしたがって、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに特異的に結合する分子を検出するアッセイを提供する。例えば、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリヌクレオチドを発現している組換え細胞を用い、それぞれＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドを組換え的に産生してもよいし、そしてそれぞれＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに結合する分子に関しスクリーニングしてもよい。前述を行うのに用いることが可能な方法は、一般的に、当業に知られる。
【０１０９】
多様性ライブラリー、例えば無作為またはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーを、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに特異的に結合する分子に関しスクリーニングしてもよい。用いてもよい多くのライブラリーが当業に知られ、例えば化学合成ライブラリー、組換え（例えばファージディスプレー）ライブラリー、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリーがある。
【０１１０】
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｒｄｏｒら，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍら，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，  １９９４，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら，  １９９４，  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ    Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，  １９９２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ    １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９０：１１７０８−１１７１２；１９９３年１０月１４日付けのＰＣＴ刊行物第ＷＯ  ９３／２０２４２号；並びにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８９：５３８１−５３８３に記載されている。
【０１１１】
ファージディスプレーライブラリーの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ｒ．Ｂ．ら，  １９９２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ，  １９９２，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １５２：１４９−１５７；Ｋａｙら，  １９９３，  Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；並びに１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ刊行物第ＷＯ  ９４／１８３１８号に記載されている。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリーには、限定されるわけではないが、１９９１年４月１８日付けのＰＣＴ刊行物第ＷＯ  ９１／０５０５８号；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが含まれる。
【０１１３】
１つの例において、非ペプチドライブラリー、例えばベンゾジアゼピンライブラリー（例えばＢｕｎｉｎら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）をスクリーニングしてもよい。Ｓｉｍｏｎら，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８９：９３６７−９３７１に記載されるものなど、ペプトイドライブラリーもまた用いてもよい。用いてもよいライブラリーの別の例は、ペプチドにおけるアミド官能性がペルメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）されており、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成しているものであり、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９１：１１１３８−１１１４２）に記載されている。
【０１１４】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られる多様な方法のいずれにより、達成してもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する、以下の参考文献：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，  １９８９，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら，  １９９２，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ    １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら，  １９９４，  Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら，  １９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら，  １９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６３：６７１−６７３；並びにＰＣＴ刊行物第ＷＯ  ９４／１８３１８号を参照されたい。
【０１１５】
特定の態様において、スクリーニングは、固相に固定したＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドとライブラリーメンバーを接触させ、そして該ポリペプチドに結合するライブラリーメンバーを採取することにより、行ってもよい。こうしたスクリーニング法の例は、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」技術と呼ばれ、例としてＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，  １９８８，  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら，  １９９２，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ    １３：４２２−４２７；ＰＣＴ刊行物第ＷＯ９４／１８３１８号；および上に引用された他の参考文献に記載されている。
【０１１６】
別の態様において、酵母において相互作用するタンパク質を選択するためのツーハイブリッド系（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８８：９５７８−９５８２）を用い、細胞内でＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドに特異的に結合する分子を同定してもよい。
【０１１７】
本発明の別の側面において、薬剤のための候補化合物をスクリーニングするための方法が提供される。こうした薬剤を用い、患者において、紫外線光誘導損傷、炎症および乾癬を減少させ、そして外傷治癒を亢進させることが可能である。患者は動物、典型的には哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１１８】
例えば、本発明のＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の発現に影響を及ぼす化合物に関し：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；（ｂ）該試験試料における、少なくとも１つのＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の発現を測定し；そして（ｃ）該試験試料における該遺伝子の発現を、参照試料におけるものと比較することにより、スクリーニングすることが可能である。参照試料と比較した該試験試料における遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化は、該化合物がＪＮＫＫＫ遺伝子由来の遺伝子産物の細胞レベルに影響を及ぼすことを示す。「遺伝子産物の細胞レベルの特異的な変化」という用語により、レベルの変化が細胞における総合的な転写または翻訳レベル（アッセイされる遺伝子産物に依存する）を改変することなく起こることを意味する。例えば、ｍＲＮＡを測定する場合、「特異的な変化」を引き起こす化合物は、一般的な転写リプレッサーである化合物ではない。同様に、例えば、タンパク質レベルをアッセイする際、「特異的な変化」を引き起こす化合物は、一般的な翻訳リプレッサーではない。転写または翻訳に対する全体的な影響が試験化合物の存在下で起こるかどうかは、コントロールのハウスキーピング遺伝子産物（例えば２例のみを挙げると、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子産物またはアクチン遺伝子産物）に関しアッセイすることにより、決定することが可能である。
【０１１９】
また、ストレス事象の存在下またはストレス事象に対する反応における、試験化合物の、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子またはポリペプチドの発現または細胞反応に対する影響をアッセイすることも可能である。細胞に適用するストレス事象は、紫外線照射に対する曝露であってもよい。好ましい紫外線照射は、３２０−４００    ｎｍの範囲内の波長のＵＶ−Ａであってもよいし、または２８０−３２０    ｎｍの範囲内の波長のＵＶ−Ｂであってもよいし、または２００−２８０    ｎｍの範囲内の波長のＵＶ−Ｃであってもよい。スクリーニング目的のため、試料に適用する他の種類のストレス事象は、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１、インターフェロン類、ＦＧＦ類またはＰＤＦＧなどの炎症性サイトカインに対する曝露であってもよい。さらに別の種類のストレス事象は、熱ショック、浸透ショック、ヒ素などの毒性化学薬品に対する曝露、（例えば溶媒での）透過性バリアーの破壊などである。
【０１２０】
１つの好ましい態様において、薬剤スクリーニング法は：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；（ｂ）該試験試料および参照試料をストレス事象に曝露し；（ｃ）該試験試料における、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を測定し、ここで該遺伝子産物の転写物は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１２からなる群より選択される配列を含む；そして（ｄ）該試験試料における該遺伝子産物の発現を、参照試料におけるものと比較することにより、ストレス事象に対する細胞反応を遮断するまたはそうでなければ調節する際の試験化合物の有効性を決定することを含む。試験化合物がストレス事象に反応し、転写物の発現を有意に減少させる場合、該試験化合物は、該ストレス事象に対する細胞反応を遮断するのに潜在的に有効である可能性がある薬剤候補として同定される。ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の発現は、上述のいかなる方法を用い、測定してもよい。本アッセイに用いるのに最も好ましい遺伝子産物は、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２遺伝子産物である。
【０１２１】
別の好ましい態様において、薬剤スクリーニングの方法は：（ａ）試験試料に試験化合物を適用し；（ｂ）該試験試料にストレス事象を適用し；そして（ｃ）該試験試料におけるそして参照試料におけるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの量を測定する、ここでＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドは配列番号２、４、６、８、１０および１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む；ここで参照試料と比較した該試験試料におけるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの量の減少は、試験化合物がストレス反応を潜在的に遮断することが可能な薬剤候補として同定される、ことを伴う。
【０１２２】
本発明のさらに別の側面は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの活性に影響を及ぼす化合物に関しスクリーニングする方法である。試験化合物を試験試料に適用し、そして参照試料に比較した該試験試料におけるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの活性を測定してもよい。参照試料に比較した該試験試料におけるＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチド活性を改変する試験化合物は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの活性に潜在的に影響を及ぼす可能性がある薬剤候補として同定される。全長ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２ポリペプチドは各々キナーゼであり；したがって、これらのポリペプチドの活性にはキナーゼ活性並びにＡＴＰおよびその類似体に対する結合が含まれる。他の活性には、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドキナーゼ活性を活性化する活性化因子と相互作用する能力、下流標的タンパク質との相互作用、およびアミノ末端制御ドメインを介した阻害剤との相互作用が含まれる。
【０１２３】
別の好ましい態様において、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの活性、例えばキナーゼ活性、ＡＴＰおよびその類似体への結合、または下流標的タンパク質の活性化を、ストレス事象の適用に対する反応において、試験試料および参照試料においてアッセイし、そして比較し、薬剤候補の有効性を予測してもよい。薬剤候補が、特定のストレス事象、例えば紫外線照射による、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの機能の誘導を妨げる場合、該薬剤候補は、該ストレス反応を遮断するのに有効である可能性がある。
【０１２４】
いくつかの好ましい態様において、試験試料および参照試料は培養細胞、組織または器官である。他の好ましい態様において、試験試料および参照試料は生存動物である。特に好ましい態様において、ヒト皮膚の小さな生検（例えば約５    ｍｍ３）を培養し、そして例えば紫外線照射、１つまたはそれ以上の増殖因子、サイトカイン、薬剤、ホルモンまたはビタミンで処理する。明示された時間後（処理が紫外線照射である場合、典型的には２４−４８時間後）、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２遺伝子産物の発現に関し、またはＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＹＳＫ２ポリペプチドの活性に関し、生検を試験する。
【０１２５】
本発明は記載されてきているが、以下の実施例は、例示の手段として提供され、そして限定ではない。
【０１２６】
【実施例】
＜実施例１：ＹＳＫ２、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５ ｃＤＮＡのクローニング＞
本実施例は、本発明の新規ＪＮＫＫＫのクローニングに用いる方法を例示する。
【０１２７】
（材料および方法）
正常ヒト包皮表皮角化細胞は、ストーニーブルックのニューヨーク州立大学のＭ．  Ｓｉｍｏｎ博士の好意により提供された。３Ｔ３フィーダー層を用い、培養を開始し、そしてその後、使用するまで液体窒素中で凍結した。融解すると、ウシ脳下垂体抽出上皮増殖因子、インスリン、甲状腺ホルモンおよびヒドロコルチゾンを補った、明示された血清不含角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）（角化細胞−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）中で、フィーダー細胞なしに、角化細胞を増殖させた。
【０１２８】
ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ    Ｃｏｒｐ．、ウィスコンシン州マディソン）を用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅のため、角化細胞由来のメッセンジャーＲＮＡを用いた。ＪＮＫＫまたはＪＮＫＫＫのキナーゼドメインの間の相同領域に対応するプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを用い、角化細胞ｍＲＮＡ由来の１５０    ｂｐ    ＰＣＲ産物を増幅した。該プライマーは、キナーゼドメイン領域に対応する以下の配列を含む。
順方向：５’−ＡＴＧＣＡ（ＣＡ）ＣＡＮＧＡ（ＣＴ）ＡＴ（ＡＣＴ）ＡＡ（ＡＧ）−３’（配列番号１４）
逆方向：５’−ＧＣＮＡＣ（ＣＴ）ＴＣＮＧＧＮＧＣＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）
ＲＴ−ＰＣＲに用いた実際のプライマーはまた、クローニング部位も含んだ。これらの配列は以下の通りである：
順方向：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡ（ＣＡ）ＣＡＮＧＡ（ＣＴ）ＡＴ（ＡＣＴ）ＡＡ（ＡＧ）−３’（配列番号１６）
逆方向：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＮＡＣ（ＣＴ）ＴＣＮＧＧＮＧＣＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）
ＰＣＲ産物をサブクローニングし、そして配列決定した。
【０１２９】
（結果）
配列決定した７０の異なるクローンの中で、１０の異なるＪＮＫＫＫが同定され、そのうち４つが新規であるようであった。他のＪＮＫＫＫとの、欧州分子生物学ネットワーク（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）におけるタンパク質データベース（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ    ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇで利用可能）に対するアミノ酸配列比較により、４つの新規ＪＮＫＫＫは、いくつかの異なるファミリーの、多様な既知のＪＮＫＫＫに対し、ある程度の相同性を示すことが明らかになった。１つのＪＮＫＫＫクローンは、１２−１３１位で、ネズミＹＳＫ２遺伝子配列の１３４塩基領域（ｅｍｂ：Ｕ４９９４９の５０３−３８４位に対応、Ｏｓａｄａら，  １９９７，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０４７−２０５７）に９１％同一であり；それゆえ、本クローンは、ヒト角化細胞ＹＳＫ２（配列番号１２）と名付けられた。さらに、２つのヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）はヒト角化細胞ＹＳＫ２に関連していた。特に、ヒトＥＳＴ    ｅｍｂ：ＡＡ５５７５７３（ＮＣＩ−ＣＧＡＰ、“Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ    Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＣＧＡＰ），  Ｔｕｍｏｒ    Ｇｅｎｅ    Ｉｎｄｅｘ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｃｉｃｇａｐ”、未刊行）は、ヒトＹＳＫ遺伝子配列（配列番号１２）と、配列番号１２の６−１４２位およびｅｍｂ：ＡＡ５５７５７３の３２−１６８位に対応する１３７    ｂｐ領域で、９６％同一性を示した。ヒトＥＳＴ    ｅｍｂ：ＡＡ５７８０８８（ＮＣＩ−ＣＧＡＰ、“Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ    Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＣＧＡＰ），  Ｔｕｍｏｒ    Ｇｅｎｅ    Ｉｎｄｅｘ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｃｉｃｇａｐ”、未刊行）もまた、配列番号１２と、配列番号１２の６−１４１位およびｅｍｂ：ＡＡ５７８０８８の３５−１７０位に対応する１３６    ｂｐ領域で、９６％同一性を示した。
【０１３０】
ＭＬＫ４（配列番号１）と称される別のＪＮＫＫＫクローンは、ＪＮＫＫＫのＭＬＫファミリーのメンバーに５０％〜７８％同一であった。最後に、ＰＡＫ４（配列番号３）およびＰＡＫ５（配列番号５）と称される２つのＪＮＫＫＫクローンは、ＪＮＫＫＫのＰＡＫファミリーのメンバーに同様の同一性を示した。しかし、欧州分子生物学ネットワークタンパク質データベースにおいて、ＭＬＫ４またはＰＡＫ５のいずれにも、相同体配列を発見することはできなかった。ＰＡＫ４の最初の配列検索では、ＰＡＫ４がＰＡＫ遺伝子ファミリーの新規メンバーであることが示されたが、本研究の途中で、ヒトＰＡＫ４の全長配列が公表された（Ａｂｏら，  １９９８，  ＥＭＢＯ  Ｊ    ２２：６５２７−６５４０）。
【０１３１】
同定された異なるＪＮＫＫＫの相対存在量は、以下の表１に示される。
【０１３２】
【表１】
0003597124.tif 000002
【０１３３】
＊ＬＩＭＫは、ＪＮＫＫＫファミリーに関係しているがそのメンバーではないプロテインキナーゼである。Ｆｒａｎｇｉｓｋａｋｉｓら，  １９９６，  Ｃｅｌｌ  ８６：５９−６９。ＢＰＡＧ１は基底角化細胞に豊富なタンパク質である。ＢＰＡＧ１のｍＲＮＡは、我々のオリゴヌクレオチドの３’末端の８塩基により認識される２つの部分を含む。
【０１３４】
ＭＬＫ４、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＹＳＫ２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物（配列番号１、３、５、１２）を、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のｍＲＮＡに対するノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。図２は、試験された器官で、ＰＡＫ４遺伝子の発現が遍在性であることを示す。しかし、ＰＡＫ５遺伝子は、角化細胞および脳で強く発現しているが、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓では発現していないか、または弱くしか発現していない。ＭＬＫ４遺伝子は、角化細胞、腎臓および膵臓で発現しているが、脳、胎盤、肺、肝臓、および骨格筋で発現していない。ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＭＬＫ４の転写物の大きさは、それぞれ３．４、４．４、および４．８    ｋｂである。
【０１３５】
＜実施例２：ＰＡＫ５遺伝子のゲノム配列＞
オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１８）および５’−ＧＴＡＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１９）を用い、ＰＡＫ５遺伝子を含む、商業的に入手可能なＰ１ヒトライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）からゲノムクローンを同定した。Ｐ１ゲノムクローンを部分的に配列決定し、そしてさらなるコード配列を推定した。推定したエクソンを示したポリヌクレオチド配列を、配列番号７として示す。配列番号８は、部分的なゲノム配列から推定したアミノ酸配列を示す。ＰＡＫ５遺伝子の部分的な図式的な構造を図１に表す。ＰＬＣ−２遺伝子は、Ｐ１クローンのＰＡＫ５遺伝子と連鎖することが見出された。ＰＬＣ−２遺伝子は、染色体１５にマッピングされてきており；したがってＰＡＫ５遺伝子もまた、染色体１５上に存在するはずである。
【０１３６】
ＰＡＫ５タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号８）は、特にキナーゼドメイン（配列番号８のアミノ酸残基９３〜３１１）において、ＰＡＫ４（配列番号４）のものと非常に似ている。本発明のいかなるＪＮＫＫＫのキナーゼドメインも、基質をリン酸化する、酵素的に活性があるドメインとして有用性がある。ＰＡＫ５キナーゼドメインの配列は、ＡＴＰ結合に必須の保存されるリジン（Ｋ）残基（配列番号８のアミノ酸残基１２０）を含む。ＰＡＫ４から類推すると、ＰＡＫ５においてこのリジン残基をアラニンまたはメチオニン残基に変化させる突然変異は、ＰＡＫ５酵素活性を消失させるであろう一方、リジン残基をグルタミンに変化させる突然変異は、全長ＰＡＫ５タンパク質を恒常的に活性にするであろう。キナーゼドメインの外側では、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５の間にはより低い相同性が観察される。ＰＡＫ５の２１残基カルボキシ末端伸長は、ＰＡＫ４のものより４アミノ酸長い。さらに、ＰＡＫ５タンパク質の入手可能なアミノ末端配列は、ＰＡＫ４以外のいかなる既知のタンパク質にも類似性を持たない。したがって、ＰＡＫ５タンパク質のカルボキシ末端およびアミノ末端領域は共に、ＰＡＫ５を免疫特異的に認識する抗体を生成するのに有用であろう。
【０１３７】
ＰＡＫ５の全長ヒトｃＤＮＡ配列のＯＲＦは、配列番号９のｎｔ１９９〜２４４に示される。ヒトＰＡＫ５遺伝子の全長ＤＮＡ配列は、配列番号１０に示され、ＯＲＦはｎｔ６１２５〜１７４３３である。
＜実施例３：ＹＳＫ２およびＰＡＫ５ ｍＲＮＡの紫外線照射誘導発現＞
本実施例において、新規ＪＮＫＫＫの発現に対する多様な波長の紫外線照射の影響を調べた。ＵＶ−Ｃ光（２２０〜２９０    ｎｍの短波長紫外線照射）およびＵＶ−Ａ光（３２０〜４００    ｎｍの長波長紫外線照射）両方の影響を別個に解析した。
【０１３８】
角化細胞は、上の実施例１．１項に記載されるように増殖させた。細胞は、３−１０  ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ−Ｃ光または１−５    Ｊ／ｃｍ２のＵＶ−Ａ光での照明の前に、２回の１：４継代を通じ増やした。曝露６または２４時間後に細胞を採取した。Ｑｉａｇｅｎのキットを用い、ポリＡ    ｍＲＮＡを細胞から精製した。
【０１３９】
図３Ａは、ＹＳＫ２遺伝子がＵＶ−Ｃ光により誘導されることを示す。角化細胞は、１０  ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ−Ｃ光に曝露した。コントロールおよびＵＶ−Ｃ光処理細胞由来のメッセンジャーＲＮＡを、電気泳動により分離し、そしてノーザンブロットにより膜に移した。その後、３２Ｐ−ｄＮＴＰで標識した１９０    ｂｐのＹＳＫ２  ＲＴ−ＰＣＲ産物をプローブとして用い、膜をハイブリダイズした。図３Ａが示すように、角化細胞におけるＹＳＫ２遺伝子の発現は、ＵＶ−Ｃ光曝露により非常に亢進した。
【０１４０】
図３Ｂは、ＰＡＫ５遺伝子がＵＶ−Ａ光処理により誘導されることを示す。ヒト角化細胞をＵＶ−Ａ光（５    ｍＪ／ｃｍ２）に曝露し、採取し、そして細胞からｍＲＮＡを調製した。処理および未処理細胞におけるＰＡＫ４およびＰＡＫ５  ｍＲＮＡのレベルを、ディファレンシャルディスプレーを用い、比較した。ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，  １９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２５７：９６７−７１。上記のプライマー、配列番号１４および１５、または配列番号１６および１７を用い、増幅を行った。その後、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５  ＤＮＡを明確にするため、生じた増幅ＤＮＡを制限酵素ＴａｑＩで消化した。結果により、ＰＡＫ５が紫外線照射により誘導されることが立証される。
【０１４１】
ディファレンシャルディスプレー実験（図３Ａおよび３Ｂ）は、ＹＳＫ２およびＰＡＫ５遺伝子両方の発現が紫外線照射により誘導されることを示す。しかし、２つの遺伝子の誘導は、紫外線照射の波長に依存する。ＹＳＫ２遺伝子発現は、短波長紫外線照射（２２０〜２９０    ｎｍ）であるＵＶ−Ｃにより誘導される。対照的に、ＰＡＫ５遺伝子発現は、長波長紫外線照射（３２０〜４００    ｎｍ）であるＵＶ−Ａにより誘導される。紫外線照射によるＹＳＫ２およびＰＡＫ５遺伝子発現誘導により、２つの遺伝子の産物が細胞外紫外線照射（または他のストレスシグナル）を伝達する情報伝達カスケードに関与していることが示唆される。ＭＬＫ４およびＰＡＫ４  ｍＲＮＡ遺伝子発現は、これらの実験において、紫外線照射により誘導されなかったが、この事実により、光または他のストレスに応する角化細胞反応における役割を除外することはできない。これらの遺伝子産物は、遺伝子発現におけるいかなる変化よりも前の、ストレスに反応する初期細胞事象に関与している可能性がある。
【０１４２】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに充分である。実際、分子生物学、医学の分野または関連分野の当業者に明白である、本発明を行うための上述の手段の多様な修飾は、請求項の範囲内であることが意図される。
【０１４３】
上に引用されるすべての参考文献は、完全に本明細書に援用される。
【０１４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＡＫ５遺伝子の構造を説明する概略図である。
【図２】図２は、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５遺伝子の組織特異的発現を例示するノーザンブロットである。メッセンジャーＲＮＡは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓から単離し、変性ゲルの示されるレーンに泳動し、そして膜にブロットした。同じブロットを続けて（ハイブリダイゼーションの間に剥がした後）、ＭＬＫ４、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５に特異的な標識１５０塩基対プローブにハイブリダイゼーションした。
【図３】図３は、紫外線照射に反応したＹＳＫ２およびＰＡＫ５遺伝子の誘導を示す。図３Ａは、未処理の（コントロール）またはＵＶ−Ｃ照射で５日間処理した（コントロール）角化細胞由来のｍＲＮＡのノーザンブロットである。ブロットを、ＹＳＫ２遺伝子に特異的な１５０塩基対プローブにハイブリダイズした。図３Ｂは、ＵＶ−Ａ光に反応したＰＡＫ４およびＰＡＫ５遺伝子の発現レベルにおけるいかなる変化をも調べるよう設計した、ディファレンシャル・ディスプレー実験を示す。角化細胞を０、６または２４時間ＵＶ−Ａ光に曝露し、採取し、そしてｍＲＮＡを解析した。ＰＡＫ４およびＰＡＫ５メッセージに対応するバンドを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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