(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:2において−７〜224または１〜224のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号:2において−７〜224または１〜224のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつSCCE活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号:1において112〜783の配列からなる請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号:1において91〜783の配列からなる請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に定義されたポリヌクレオチドを有し、そのポリヌクレオチドの発現を調節できる複製可能な発現ベクター。
【請求項５】
DSM 8282として寄託された請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
配列番号:1に示す配列を有するポリヌクレオチドを含有し、DSM 8281として寄託されたプラスミド。
【請求項７】
請求項４記載の発現ベクターを有する形質転換体。
【請求項８】
配列番号:2において−７〜224または１〜224のアミノ酸配列を有する遺伝子工学的に生産された実質的に純粋なポリペプチドまたは配列番号:2において−７〜224または１〜224のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつSCCE活性を有する遺伝子工学的に生産された実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドを製造する方法において、以下の工程：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを発現ベクター中に挿入する工程、
（ｂ）工程（ａ）で製造されたベクターで適当な宿主生物体をトランスフォームする工程、
（ｃ）工程（ｂ）において製造した適当な宿主生物体を該ポリペプチドの発現に適当な条件下に培養する工程、および
（ｄ）ポリペプチドを収穫する工程
からなる方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、製造されたポリペプチドをそのポリペプチドと反応性の抗体を用いて単離する方法。
【請求項１１】
請求項８に記載のポリペプチドを含有する、角質層の細胞間接着構造を分解するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリペプチドを含有する角質層の細胞間接着構造を分解するための化粧料またはスキンケア組成物。
【請求項１３】
クリーム、軟膏、ローション、リニメント、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト、スティック、スプレー、シャンプー、石鹸、ヘアコンディショナーおよびパウダーよりなる群から選ばれた局所投与に適した形態である請求項11または12のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項８に記載のポリペプチドを使用することを特徴とする配列番号:2において１〜224のアミノ酸配列を有するネイティブSCCEの酵素活性に対して影響を与える化合物の同定方法。
【請求項１５】
配列番号:2において１〜224のアミノ酸配列を有するネイティブSCCEの酵素活性に対して阻害作用を有する化合物の同定のための請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号:2において１〜224のアミノ酸配列を有するネイティブSCCEの酵素活性を増強できる化合物の同定のための請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
請求項８に記載のポリペプチドの使用することを特徴とする、配列番号:2において−７〜224のアミノ酸配列を有するSCCEのプロ酵素型を配列番号:2において１〜224のアミノ酸配列を有する活性なSCCEに変換できる化合物の同定方法。
【請求項１８】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体。
【請求項１９】
蛋白質または固体支持体にカップリングされた請求項18に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的な抗体またはその機能を有する誘導体である診断薬。
【請求項２１】
請求項18に記載の抗体またはその機能を有する誘導体、および製薬的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換えポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのポリペプチドを発現できる発現系、ならびにそのポリペプチドからなる医薬および化粧料組成物、および多様な化粧用および治療用目的におけるそのポリペプチドの使用に関する。
発明の簡単な説明
臓器としての皮膚は、生物学的、医学的および美容学観点から、興味をそそるものである。皮膚疾患には、臓器特異的な疾患たとえば乾癬および湿疹、あるいは全身疾患の表出たとえば全身性アレルギー反応のような多くの疾患がある。皮膚特異的な疾患が存在するという事実は、皮膚に独特な分子機構の存在の証明と考えることができる。同様に、皮膚特異的な分子過程に関する研究は、皮膚疾患の理解および処置に重要である。これらの過程のいくつかが何らかの様式で皮膚の最も専門化された機能、すなわち体外と体内の間の物理化学的障壁の形成に関係していると考えるのは合理的であると思われる。物理化学的な皮膚障壁は皮膚の最外層すなわち角質層に局在する。
角質層は皮膚も最も専門化された構造である。それは表皮の分化過程の最終生成物、すなわち皮膚の最外層部分を占める重層扁平上皮である。表皮の細胞の大部分は分化の様々な段階にある角化細胞から構成される。最下層の角化細胞、基底細胞は、真皮と接触する基底膜すなわち皮膚の結合組織上に存在し、分裂能をもつ唯一の角化細胞である。基底細胞のある分画は連続的に基底膜から離脱してある分化過程を経過し、これによりこれらの細胞は最終的に角質層のビルディングブロックとなる。この過程において、角化細胞は多数の適応変化を経過する。表皮特異的なサイトケラチンから構成される細胞骨格の含量が増加する。隣接する細胞の中間フィラメントはデスモソーム数の増加によって一つの機能単位に合体する。最も劇的な変化は、最上の生存細胞層、顆粒層から非生存角質層への遷移時に起こり、この過程は通常、角化と呼ばれる。共有結合で架橋された蛋白質が形質膜の内側に接近して付着し、極めて強固な細胞被膜を形成する。さらに、角化細胞特異的な細胞オルガネラに由来する脂質に富んだ物質が細胞外空間に分泌され、角質層の細胞を取り囲む脂質の層状構造を形成することにより、親水性物質の透過に対する障壁が構築される。最後には、濃厚に充満したサイトケラチンフィラメントを除いてすべての細胞内構造が消失する。
角質層の細胞、すなわち角質細胞は、したがって、生存していない。これは、角質層における様々な過程の調整は角化細胞がまだ生存している段階での「プログラミング」の結果でなければならないことを意味する。表皮のターンオーバーは正常時には約４週で進行し、その間約２週間、細胞は角質層の一部であり、落屑の過程での皮膚表面からの細胞剥離によって終結する。この過程は、角質層の「プログラミング」の例である。角質層の物理化学的障壁としての機能の必要条件は、その個々の細胞が、機械的に強固な構造、すなわちデスモソームによって互いに保持されることである。落屑の必要条件であるデスモソームの崩壊は、その組織の障壁機能に障害を与えることなく、角質層の新規な産生とバランスをとって、皮膚表面からの細胞の剥離を起こすように調整されなければならない。
角化の障害
様々な重篤度の皮膚の多数の病的状態の中に、角化過程の障害がある。乾癬では、典型的な慢性炎症に加えて、この疾患の典型的な落屑を生じる未成熟角質層の過剰産生がある。「鱗屑」の形成を招く肥厚化した角質層によって特徴づけられる一群の遺伝性皮膚疾患、いわゆる魚鱗癬がある。数種の魚鱗癬では落屑速度の低下が認められる。魚鱗癬ほど重篤ではないが、「ドライスキン」（乾皮症）もまた、角質細胞が正常の場合のように単一の細胞または細胞の小凝集塊としてではなく、大きな肉眼的にも見える落屑として剥離する角質層によって特徴づけられる。この障害は、高齢者およびアトピー患者、すなわち、皮膚刺激に対する抵抗性の低下および特徴的な形態の内因性湿疹を発症する素因を有する個体の間では極めて一般的である。座瘡疾患においては、脂腺の管内に角化障害があり、それが面皰およびプラグの形成を招く。面皰の形成が先行し、それが炎症性の座瘡病変を誘発するものと考えられている。
角化には蛋白分解酵素が関与する
角化過程および角質層のターンオーバー時には、蛋白分解酵素が重要な役割を果たしていると思われるいくつかの段階がある。確かに、生存細胞と角化表皮層の間の遷移時に起こるサイトケラチンフィラメントを除くすべての細胞内構造の消失には蛋白分解が関与しているに違いない。角化時のサイトケラチンフィラメントの特殊な型での凝集に際して機能すると考えられる蛋白質であるフィラグリンへのプロフィラグリンの変換は、特異的なプロテイナーゼによって触媒される可能性がある。角質層においては、フィラグリンはさらに低分子量の成分に分解され、これは多分「天然の保水剤」として重要であると思われる。角化の過程にはさらにサイトケラミンポリペプチドの蛋白分解的修飾がある。最後に、蛋白分解現象は、最終的に落屑を招来する過程における角質層内の細胞間接着構造の崩壊に重要な役割を果たすものと思われる。
角質層細胞の接着と落屑。デスモソームの役割
角質層ならびに表皮の生存部分における細胞間接着は、その重要な部分がデスモソームによって仲介されている。デスモソームは、それぞれが２つの隣接する細胞によって形成される２個の対称的な半成分から構成されている。デスモソームの各半成分がサイトケラチンフィラメントに連結する一つの細胞内部分と、細胞内に繋留され膜貫通部および細胞外部分を有する糖蛋白質によって形成される一つの部分とをもっている。これらの蛋白質の細胞外部分、デスモグラインは、接着分子であり、細胞外空間におけるそれら互いの相互作用によって接着構造が形成される。デスモソームの崩壊は、手掌および足裏の角質層では、非手掌足裏角質層に比べて多少異なる経路をたどるように思われる。後者の組織では、細胞の完全な角化後直ちにほぼ85％のデスモソームが消失する。極端に平坦化した細胞の絨毛端に優先的に局在するデスモソームの残部は、落屑が起こるレベルまでは見掛け上無傷のままである。手掌足裏角質層においては、角質細胞の平坦化の程度ははるかに低く、この組織の深層ではデスモソームの広範な崩壊はない。いずれの組織においても落屑はデスモソームの崩壊に関連している。魚鱗癬の皮膚においては、また「ドライスキン」においても同様に、角質層の表層部におけるデスモソーム数に増加が認められている。
角質層細胞間脂質
手掌足裏角質層および非手足裏角質層の間のデスモソーム崩壊の差はこの２つの型の組織における細胞外脂質量の差に関係するのかもしれない。脂質の含量は非手掌足裏角質層の方が著しく高い。水および他の親水性物質の透過に対する障壁としてのこの組織の効率は手掌および足裏の角質層よりも優れていると推論される。デスモソームは有意な容量を占めることから、また無傷のデスモソームは細胞外空間の拡大を防止することから、デスモソームの崩壊が、より広い細胞外空間の脂質による利用を可能にする機構であると思われる。角質層の細胞外脂質はまた、いくつかの他の様式で落屑にも関係する。それらは、細胞外空間の主要な構成成分であるから、それらが、この位置で機能する酵素、たとえば、デスモソームの崩壊に関与する酵素の活性に対して重要な影響をもつことが予想される。実際に、脂質代謝における様々な障害が数種の魚鱗癬の有力な原因であることが示されてきた。脂質自体が角質層細胞の接着にある程度は寄与している可能性も考えられる。しかも、脂質の角質層細胞外空間への分泌は、同じく多数の酵素の分泌とも関連するように思われる。脂質の前駆体は上層の生存角化細胞内の特異的なオルガネラに貯蔵されている。これらのいわゆる層板体は多くの加水分解酵素を含有することが明らかにされている。したがって、角質層においてデスモソームの崩壊に関与する酵素は多分、不活性なプロ−型として角化細胞により合成され、層板体に保存され、角化時に角質層細胞外空間に分泌され、そこで活性化され、その活性はさらに、他の因子の中でもとくに細胞外脂質の成分によって調節されるものと推測される。
生存表皮における細胞接着の障害
角化していない生存表皮層中の角化細胞間の接着に損傷のある多くの皮膚疾患がある。これらの疾患は棘融解と呼ばれる状態、すなわち他の点では外見上正常な角化細胞間のデスモソーム接触の破綻によって特徴づけられる。この過程は、プロテイナーゼによって仲介されると思われるが、それらは現在のところ完全には確認されるには至っていない。広範囲に疱疹形成を招来した場合の棘融解は、自己免疫性疾患の尋常性天疱瘡および落葉性天疱瘡、遺伝性の良性家族性天疱瘡（ヘイリーヘイリー病）および遺伝性毛包性角化異常（ダリエー病）がある。
表皮は免疫および炎症反応において能動的役割を果たす
体内と体外の間の物理化学的障壁を形成する機能に加えて、表皮はまた能動的な免疫学的障壁としても機能する。角化細胞は多数のサイトカインおよび他の炎症性メディエーターの産生能ならびにそれらに対する応答能を有し、それを介して角化細胞は免疫および炎症系の細胞と連携し相互作用する。これは微生物感染に対する宿主の防御および創傷治癒において極めて重要である。最近の研究では、角化細胞が多くの炎症性皮膚疾患たとえば乾癬および湿疹において能動的役割を果しているらしいことも示されている。
表皮のプロテイナーゼは炎症に重要な可能性がある
角化細胞で産生されるサイトカインの一つにインターロイキン１（IL−１）がある。IL−１は２つの形態、IL−１αおよびIL−１βとして存在し、いずれも表皮内にある。IL−１αは合成されたままで完全な活性を示すが、IL−１βは不活性な31kDのプロ−型として合成される。プロ−IL−１βは、たとえば単球に存在する特異的なプロテイナーゼによって活性な17kD型に変換されるが、この酵素は現在までのところ正常な表皮には検出されていない。しかしながら、キモトリプシン様の基質特異性を有する多数のセリンプロテイナーゼ（膵臓キモトリプシンおよび好中顆粒球のカテプシンＧ）もまた、プロ−IL−１βのアクティベーターとして働く。
Norris（1990）によって示唆されているように角質層の細胞内空間に存在する蛋白分解酵素は、ある種の条件下には、サイトカインの不活性型を活性型に変換できるものと考えられる。この関係でとくに興味があるのは、生物学的に不活性なプロインターロイキン−１βであり、これは角化細胞によって産生されることが明らかにされている（Mizutaniら、1991）。現在までのところ、プロインターロイキン−１βの活性なインターロイキン−１βへの変換能を有する表皮酵素は見出されていない。しかしながら、キモトリプシンおよびカテプシンＧ（キモトリプシン様酵素）は不活性な31kD組換えプロインターロイキン−１βの完全に活性な17kD型への変換の触媒能を有することから、表皮のキモトリプシン様酵素もこの変換を触媒できる可能性がある。
発明の詳細な説明
本発明は、角質層においてデスモソームの崩壊に関与すると考えられる、角質層キモトリプシン酵素（SCCE）と命名されている酵素に関する。皮膚の角化表層の表面からの細胞の剥離には、デスモソーム蛋白質の崩壊が関係し、それに関与する酵素が亜鉛イオンによって阻害可能なキモトリプシン様セリンプロテイナーゼであると考えられる証拠を例１に示す。
例２には、角質層キモトリプシン酵素（SCCE）、すなわち角質層における細胞内接着構造のインビトロまた多分インビボでの崩壊に関与する条件を満たすプロテイナーゼを記述する。例３には、色素原性基質を用いて、角質層キモトリプシン酵素（SCCE）活性の一部の特徴を記述する。
結果は、SCCEが他のキモトリプシンプロテイナーゼとは酵素学的に異なることを示している。阻害剤プロフィルおよびキモトリプシン様酵素の２つの異なる基質の分解能は、SCCEの場合、ウシキモトリプシンおよびヒトカテプシンＧと比較して有意に相違する。SCCEはまた、ヒトマスト細胞キマーゼとも異なるように思われる。後者の酵素は、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNAの分解を効率的に触媒し（Schwartzら、1987およびSchechterら、1989参照）−SCCEは触媒しない−、アプロチニンまたはSBTIによって阻害されない（Schechterら、1983およびWintroubら、1986）−SCCEは阻害される。
例４には、角質細胞のKCl抽出物から、不溶化大豆トリプシンインヒビター（SBTI）上アフィニティークロマトグラフィーによるSCCEの部分精製、およびSCCEのＮ−末端アミノ酸配列の決定について記載する。非還元サンプルについては、収率は工程１〜６では良好であったが、工程７および９では０に低下し、以後の工程の収率は著しく低下した。還元サンプルでも、工程７および９ではアミノ酸誘導体は検出できなかったが、誘導体が検出できた以後の工程では収率の急峻な低下はなかった。これらの結果は位置７および９にはシステインがあることを示唆するものである。しかしながら、還元およびヨード酢酸（100mM）処置後の工程７および９においてカルボキシメチル化システインを検出することはできなかった。得られた配列（図13、配列番号:3）は還元および非還元サンプルで同一であった。
例５にはSCCE特異的モノクローナル抗体ならびにポリクローナルSCCE特異的トリおよびウサギ抗体、さらにモノクローナル抗体による免疫組織学的研究を記述する。
例６には、ヒトSCCEをコードするcDNAのクローニングおよび配列決定を記述する。最初に、表皮起源のヒト成人角化細胞から誘導されたmRNAよりcDNAライブラリーを調製し、抗−SCCEウサギポリクローナル抗体でスクリーニングした。抗体の一つは高いバックグランドシグナルを与え、初期段階で広範なスクリーニング試験から除外された。他のポリクローナル抗体（Ｄ−５）を用い、真の陽性プラークと予想される多数の免疫反応性プラークを濃縮した。しかしながら、いずれのプラークについても、モノクローナル抗体moAb4およびmoAb9との反応性は認められなかった。単離された11個のプラークについての広範な制限酵素による特徴づけならびにPCRでの特性特徴により、各種プラーク間に類似性は検出できないことがわかった。確かなSCCE cDNA配列の「指紋」決定のこの失敗に基づき戦略を変更せざるを得なかった。
上基底角化細胞におけるSCCE免疫反応性物質の優先的な検出にもかかわらず、培養ヒト角化細胞から調製したcDNAライブラリーをSCCE cDNAのスクリーニングに用いた。このようなライブラリーには基底角化細胞のみからのcDNAを含むことが期待できる。この試みは、基底角化細胞のSCCEモノクローナル抗体も使用して、弱いが多分重要な免疫染色が観察されたことに基づくものであった。
例４に記載の実験的に決定されたネイティブSCCE酵素のアミノ末端配列の最も信頼できる部分のアミノ酸配列Ile−Ile−Asp−Gly−Ala−Pro（配列番号:10,aa1〜aa6）に基づいて設計された合成17−マーオリゴヌクレオチドプローブを使用して、プラークをスクリーニングした。実験的に決定されたアミノ配列内の不確かさにより、このヘキサペプチドが最も信頼できる部分の一つであると判断した。さらに、このヘキサペプチドをコードする可能性があるコドンにはDNAプローブの可能な縮重が最も少なかった。実験的に決定されたさらに長い配列、Gln−Val−Ala−Leu−Leu−Ser−Gly−Asn−Gln−Leu（配列番号:3、aa15〜aa24）は、このペプチド配列をコードする配列の高度な縮重により除外された。14の陽性プラークが、一次スクリーニングで同定された。これらの陽性プラークを上に記載したのと同じプローブ、同じ方法を用いて再スクリーニングした。再スクリーニング操作後に２つの陽性プラークが同定された。この２つの選ばれたプラークをさらに一度精製し、挿入体のサイズを、プライマーとして２つのファージアームと相補性のSYM 1600およびSYM 1601を、鋳型として単離されたファージを用いてPCRによって測定した。このクローン化されたフラグメントを部分配列分析に付した。
得られたDNA配列の翻訳により実験的に決定された蛋白質配列と相同なアミノ酸配列が得られた。しかしながら、この配列は翻訳開始コドンを欠いていた。完全長cDNAを単離するために、得られたDNAフラグメントをアガロースゲル上で分離して、緊縮条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするプローブとして使用した。完全長cDNAを得るためには、このプローブによりcDNAライブラリーを、緊縮条件下65℃でハイブリダイゼーションを行ったほかは上述の場合と同じ方法を用いて２回再スクリーニングした。これらの実験により45個のそれぞれ陽性のプラークが同定され単離された。これらを最初に、PCRプライマーとしてSYM 1600またはSYM 1601をSY 3208と組み合わせて使用し、PCR分析によってスクリーニングして、全５′オープンリーディングフレームを含むプラークを同定した。
さらにスクリーニングおよび配列分析を行ったのち、これらのファージに由来する得られたPCR増幅フラグメントを例６に詳述したようにクローン化したところ、結果は、ファージの一つ、205.2.1が完全長の挿入体を含有することを示すものであった。cDNAフラグメントの完全ヌクレオチドが決定された。このヌクレオチド（配列番号:1）は、シグナルペプチドおよびプレポリペプチドを含む253個のアミノ酸から構成されるSCCE前駆体蛋白質の全アミノ酸配列（配列番号:2）をコードするのに十分なオープンリーディングフレームを含有した。
例７には、SCCE cDNA配列に基づいて調製されたcDNAプローブとハイブリダイズ可能であった２つのSCCE mRNA種のヒト表皮における検出を記述する。
例８には、組換えSCCEの大腸菌内での発現を記述する。結果は、細菌内において組換えSCCEの製造が可能であることを示している。
例９には、組換えヒトSCCEの哺乳動物細胞内での発現を記述する。すべての利用可能なポリクローナルウサギおよびトリSCCE抗体、ならびに寄託されモノクローナル抗体と反応性を示す３つの蛋白質が製造される。ネイティブなSCCEに対して作成された抗体と反応性の組換え蛋白質は、精製されたネイティブなヒトSCCEよりも約1kDa大きな見掛けの分子量を示す。この組換え蛋白質は蛋白分解活性を示さない。
組換えSCCEの精製、活性化および更なる特徴を例10に記述する。組換えSCCEの不活性なプロ−型はトリプシンもしくはエンドペプチダーゼLys−Ｃでの蛋白分解切断によって活性化できる。塩基性アミノ酸の後でペプチドを切断する他の多数のプロテアーゼ、たとえばエンドプロテイナーゼLys−Ｃ、パパインおよびプラスミンは、プロ−SCCEを活性なSCCEに活性化できるものと予想される。シグナルペプチドは、22個のアミノ酸から構成されネイティブな活性SCCEのＮ−末端アミノ酸配列に基づき、プロペプチドは７個のアミノ酸から構成されることが見出されている。さらに、製造された組換えSCCEは２つのＮ−グリコシル化型および１個の非グリコシル化型で存在し、これは活性なネイティブSCCEで得られた結果と同様である。
「角質層キモトリプシン酵素（SCCE）」または「SCCE活性を有するポリペプチド」の語はその最も広い局面において、セリンプロテアーゼもしくはそのプロ型たとえばプロ酵素（プロ−SCCE）または蛋白分解切断によって活性化可能な融合蛋白質を意味し、活性型におけるその酵素は、中性のpHまたは中性付近のpH、生理学的温度においてインキュベートされた皮膚の角化層のサンプルによってモデル系に誘導できる自然発生細胞解離の場合と同じインヒビターにより類似の様式で阻害される。
さらに特定すれば、「SCCE活性を有するポリペプチド」の語は、したがってキモトリプシンおよびカテプシンＧとは異なり、その活性型が基質、MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA（Ｓ−2586）を分解できるポリペプチドと定義され、このポリペプチドによる分解は基本的に例３および13に記載され図９および表５に例示されたように、アプロチニン、キモスタチンおよび硫酸亜鉛によって阻害される。
なおさらに特定すれば、「SCCE活性を有するポリペプチド」の語は、足裏角質層のインビトロでのインキュベーション時にデスモソーム蛋白質、デスモグラインＩの蛋白分解性崩壊を起こすことができるポリペプチドを含む。
このようなポリペプチドは、一般的に、解離した足裏角質層細胞の抽出物から精製されたネイティブSCCEに対して作成された抗体とも反応する。このような抗体の例には、例5.2の記載のようにして製造されたポリクローナル抗体、ならびに例5.1に記載のようにして製造されたモノクローナル抗体TE4bおよびTE9bがある。これらのモノクローナル抗体はブダペスト条約の規定によりEuropean Collection of Animal Cell Cultures,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 0JG、United Kingdomに、それぞれ受託番号ECACC 93061817および受託番号ECACC 93061816として寄託されたハイブリドーマTE4bおよびTE9bによって産生される。
ヒトSCCEをコードするcDNAのクローニングおよび配列決定は、例６に記述される。シグナルペプチドおよびプレポリペプチドを包含する253アミノ酸から構成されるSCCE前駆体蛋白質の全アミノ酸配列をコードするのに十分なオープンリーディングフレームを含むクレオチド配列が見出された。このヌクレオチド配列は配列番号:1に、「角質層キモトリプシン酵素（SCCE）」の推定アミノ酸配列は配列番号:2に示す。
「プロ−SCCEまたはその類縁体もしくは変異体」の語は、本発明のヌクレオチド配列を適当な発現系で発現させた場合に産生し、蛋白分解により活性化すると、中性のpHまたは中性付近のpH、生理学的温度、すなわち約37℃においてインキュベートされた皮膚の角化層のサンプルによってモデル系に誘導できる自然発生細胞解離の場合と同一のインヒビターにより阻害できるセリンプロテイナーゼを与える、アミノ酸配列、配列番号:2を有するポリペプチドまたはその配列の類縁体もしくは変異体を意味する。一般的にこの蛋白質は精製されたネイティブまたは組換えのSCCEに対して作成された抗体と反応する。
「SCCEまたはその類縁体もしくは変異体」の語は、本発明のヌクレオチド配列を適当な発現系で発現させた場合に産生して、中性のpHまたは中性付近のpH、生理学的温度すなわち約37℃においてインキュベートされた皮膚の角化層のサンプルによってモデル系に誘導できる自然発生細胞解離の場合と同じインヒビターによって阻害できるセリンプロテイナーゼである、アミノ酸配列、配列番号:2を有するポリペプチド、またはその配列の類縁体もしくは変異体を意味する。一般的にこの蛋白質は、精製されたネイティブまたは組換えのSCCEに対して作成された抗体と反応する。
「その類縁体もしくは変異体」の語はしたがって、配列番号:2に示すアミノ酸配列を正確にはもたないが、上に定義した「SCCE活性」をなお有するポリペプチドを意味する。一般的に、このようなポリペプチドは、実施例に記載されたSCCE蛋白質と比べて、たとえばある程度、アミノ酸組成、または翻訳後修飾たとえばグリコシル化もしくはリン酸化において変化したポリペプチドということになる。
したがってここでは「類縁体」または「変異体」の語は例６に記載のSCCE蛋白質に由来する特徴的アミノ酸配列、配列番号:2と類似のアミノ酸組成または配列を有し、SCCE蛋白質類縁体の発生のために、アミノ酸配列を変える微小な変化たとえば欠失、部位特異的突然変異誘発、余分のアミノ酸の挿入、またはその組合せが行われた蛋白質またはポリペプチドを表わすために用いられる。これらの修飾は類縁体に、興味ある、有用な新規の性質を与えることができる。類縁体ポリペプチドまたは蛋白質は、動物もしくはヒトから誘導することが可能であり、また部分的にもしくは完全に合成起源のもであってもよい。類縁体はまた、組換えDNA技術を用いて誘導することもできる。
本発明の重要な実施態様はしたがって、配列番号:2に示すアミノ酸配列または以下に定義するそのアミノ酸配列のサブ配列とは異なるが本質的には上に定義されたようなSCCE活性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを生じるように、少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換および／または少なくとも１個のアミノ酸が欠失もしくは付加されたポリペプチドに関する。
本発明の興味ある実施態様は、50〜250個のアミノ酸、たとえば少なくとも70個のアミノ酸、少なくとも100個のアミノ酸、少なくとも150個のアミノ酸または少なくとも200個のアミノ酸からなる本発明のポリペプチドの類縁体またはサブ配列であるポリペプチドに関する。
本発明のとくに重要な実施態様は、配列番号:2におけるアミノ酸配列−７〜224を有するポリペプチド（プロ−SCCE）および配列番号:2におけるアミノ酸配列１〜224を有するポリペプチド（SCCE）である。
「酵素的に活性なサブ配列」の語は配列番号:2に示したポリペプチド配列の一部のみからなり、酵素活性を有するポリペプチド配列を意味する。ここで説明された修飾により類縁体化されたポリペプチドサブ配列も包含される。酵素活性部位からなる特異的ポリペプチド（単数または複数）はとくに興味の対照となる。
推定されたアミノ酸配列、配列番号:2を、ヒトキモトリプシン（Toultaら、1989）、ヒトカテプシンＧ（Salvesenら、1987）およびヒトマスト細胞キマーゼ（Caugheyら、1991）酵素のアミノ酸配列と比較した。推定されたアミノ酸配列はセリンプロテアーゼの保存的活性領域を含有するが、ホモロジーの程度は極めて低く、約33〜38％である。この点では、SCCEは既知のセリンプロテイナーゼとは通常の類似性しかもたないように思われる。他方、SCCEは、活性部位のヒスチジン、アスパラギン酸およびセリン残基ならびにこれらの部位に近接する保存された領域に関しては典型的なセリンプロテイナーゼである。これはまた大部分のシステイン残基およびセリンプロテイナーゼの他の高度に保存された領域についても事実である。一次特異性ポケットの底部（キモトリプシンにおける残基189）には、ヒトキモトリプシン、マスト細胞キマーゼ、および前立腺特異的抗原ではセリン残基が、ヒトカテプシンＧではアラニン残基がある。これに対してSCCEでは、この位置はアスパラギン残基によって占められている。これが、SCCEは疑いなくキモトリプシン活性を有するが、各種色素原性ペプチド基質に対するその相対活性はキモトリプシンおよびカテプシンＧとは異なり、また、キモトリプシン様酵素の低分子質量インヒビターであるキモスタチンの阻害効率も異なる所見を説明するものと考えられる。
ヒトキモトリプシン、ヒトカテプシンＧおよびヒトマスト細胞キマーゼの配列とSCCEの配列との間の比較を、配列の以下のアラインメントによって示す。
0003542804.tif 000002
アラインメントは手作業で実施した。
HUMCTRP＝ヒトキモトリプシン（Touitaら、BBRC 158:569−575、1989）
HUMCHTG＝ヒトカテプシンＧ（Salvesenら、Biochemistry 26:2283−2293,1989）
HUMCHYM＝ヒトマスト細胞キマーゼ（Caugheyら、J.Biol.Chem.226:12956−12963,1991）
ホモロジー：
HUMCTRP/SCCE:85/224＝38％
HUMCHTG/SCCE:74/224＝33％
HUMCHYM/SCCE:74/224＝33％
HUMCHTG/HUMCHYM:109/226＝48％
位置番号はキモトリプシノーゲンによる。
下線：
活性部位付近（キモトリプシンでは、Ile 15,His 57,Asp 102,Ser 195）およびキモトリプシンの一次特異性ポケット（キモトリプシンでは、Ser 189,Ser 213〜Try 215,Gly 226）の保存された領域。
星印:SCCEにおいて可能性のあるＮ−グリコシル化部位
本発明の重要な実施態様はしたがって、アミノ酸配列からの20個のアミノ酸の連続鎖が配列番号:2に示すアミノ酸配列から選択される同じ長さのアミノ酸鎖と少なくとも80％程度の相同性を示すアミノ酸配列のポリペプチドに関する。
配列番号:2に示すポリペプチドと少なくとも80％、たとえば少なくとも85％たとえば90％の相同性を有する本発明のポリペプチド配列は重要な実施態様を構成する。配列番号:2に示す配列は全く独特と思われえるので、本発明の範囲は配列番号:2に示すアミノ酸配列から選択された20個のアミノ酸の類似の連続鎖に対する相同性の程度が55％以下、好ましくは70％以下であってもよいポリペプチドを包含する。このような配列は他の種、たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタまたはウシのような他の哺乳動物からの類似の蛋白質から誘導することができる。配列の微小部分は他のセリンプロテアーゼとかなりの類似性を示すことから、本発明の範囲はまた、配列番号:2に示すアミノ酸配列から選択される20個のアミノ酸の類似の連続鎖と少なくとも95％程度、とくに好ましくは少なくとも99％の相同性を有するペプチドを包含する。
「配列相同性」の語は、ポリペプチドのアミノ酸の同一性および位置に関する合致において、２またはそれ以上のアミノ酸のセグメントで、アミノ酸の配列が同一であることを意味する。
すなわち、「相同な」の語はここでは、一定のポリペプチドと配列番号:2に示すアミノ酸配列の間の同一性の程度を示すために用いられる。配列番号:2に示すアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列は、たとえば以下に定義されるハイブリダイゼーションによって得られるDNAもしくはRNA配列のようなヌクレオチド配列から推測することもできるし、また慣用のアミノ酸配列決定法によって得ることもできる。相同性の程度は、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関して、すなわちリーダー配列を考慮に入れないで決定されるのが好ましい。一般的に、ヌクレオチド配列の内部相同性を決定するためにそれらの配列を比較する場合には、コード領域のみが用いられる。
本発明との関連において「寄託された抗体の少なくとも一つによって認識されるポリペプチド」の語は、寄託された抗体の少なくとも一つによって認識され、配列番号:2に示すポリペプチドの任意のサブ配列の線状のまたは空間的なコンフォーメーションに関して実質的に連続した一連の配列を構成するアミノ酸からなるアミノ酸配列を包含するものである。本技術分野ではよく知られているように、二次または三次のコンフォーメーションも興味ある有用な性質を与え、エピトープを構成するものと考えられる。寄託された抗体TE4bおよびTE9bはSCCEのエピトープのコンフォーメーションを認識するものと思われる。
例5.5.2.の記載のようにして調製されたポリクローナルウサギ抗体は、免疫蛍光顕微鏡において、表皮顆粒層の顆粒状染色および下部角質層のむしろ拡散性の染色を生じた。
精製されたネイティブまたは組換えSCCEに対して作成された抗体は一般的に角化（角質化）されたヒト扁平上皮内の上基底細胞に結合するが、非角質化扁平上皮内の上皮細胞には結合しない。これらの抗体はまた、ヒト皮膚の角質層の細胞間空間にも結合する。
本発明のポリペプチドと反応性の抗体は、以下に掲げるように多くの目的に適している。
蛋白質の精製：抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降技術を用いて、生物学的サンプルからポリペプチドまたはその類縁体を精製するために使用できる。
診断および治療：ポリペプチドまたはその類縁体に対するモノクローナル抗体は、動物およびヒトにおける疾患状態の診断および治療に用いることができる。診断薬は、本発明のポリペプチドに対して特異性を有する抗体とすることができる。抗体は他の蛋白質もしくは固体支持体へのカップリングおよび／または凝集試験もしくは発色試験に使用することができる。このような抗体はまた、標準的な組織化学または免疫化学技術を用いて生物学的サンプル中のSCCEポリペプチドまたはその類縁体の定量にも使用できる。
本発明は、その一態様において、上に定義した本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。とくに本発明は、実質的に配列番号:1に示した配列からなるヌクレオチド配列に関する。他の重要な実施態様は、配列番号:2のアミノ酸配列−７〜224からなるポリペプチドまたは配列番号:2のアミノ酸配列１〜224からなるポリペプチドをコードするヌクレオチドのような配列番号:2のアミノ酸配列のサブ配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、配列番号:1に示すヌクレオチド配列と、例７および９に記載したような高緊縮条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列に関する。
本発明は、他の態様においては、配列番号:1に示したヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列またはその類縁体もしくはサブ配列であって、
１）  配列番号:1に示す配列と少なくとも90％の相同性を有し、および／または
２）  アミノ酸配列が配列番号:2に示すアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するポリペプチドをコードし、および／または
３）  1993年６月18日にECACCに寄託され、仮受入番号ECACC 93061817が与えられたハイブリドーマ細胞系TE4bによって産生されるモノクローナル抗体または1993年６月18日にECACCに寄託され、仮受入番号ECACC 93061816が与えられたハイブリドーマ細胞系TE9bによって産生されるモノクローナル抗体によって結合されるポリペプチドをコードし、および／または
４）  解離した足裏角質層細胞の抽出物から精製されたネイティブSCCEに対して作成されたポリクローナル抗血清により結合されるポリペプチドをコードする配列に関する。
本発明の範囲内にはまた、上に定義されたヌクレオチド配列と、SCCE活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が得られるように少なくとも１個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは修飾されるかまたは少なくともさらに１個の付加的ヌクレオチドが挿入された点で異なる修飾されたヌクレオチド配列も包含される。
本明細書および請求の範囲において「サブ配列」の語は、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも18ヌクレオチド、とくに好ましくは少なくとも21ヌクレオチドのサイズを有する配列を意味する。本発明の多くの実施態様においては、本発明のヌクレオチド配列のサブ配列または類縁体は少なくとも48ヌクレオチド、たとえば少なくとも75ヌクレオチドまたは少なくとも99ヌクレオチドからなる。「サブ配列」は上述の基準１）〜４）の少なくとも一つに合致するか、または配列番号:1に示すヌクレオチド配列とハイブリダイズしなければならない。
小フラグメントが、本明細書に記載されているようなPCR技術に有用なことはよく知られている。このようなフラグメントおよびサブ配列は、例７に記載の本発明のヌクレオチド配列のmRNAフラグメントの同定におけるプローブとしての使用にとくに有用である。
本発明のDNAフラグメントに関して「類縁体」の語は、本発明のDNAフラグメントによってコードされるポリペプチドと同一または実質的に同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指示するものとする。同じアミノ酸が多様なコドンによってコードできることはよく知られている。コドンの利用はとくにそのヌクレオチド配列を発現させる問題の生物体の選択に関係する。したがって、本発明のDNAフラグメントの１個または２個以上のヌクレオチドまたはコドンは、それを発現させた場合、問題のDNAフラグメントによってコードされるポリペプチドと同一または実質的に同一なポリペプチドを生じる他のヌクレオチドまたはコドンにより交換することができる。
また、「類縁体」の語はこの関係では、例３に記載のネイティブSCCE蛋白質の活性に比較して類縁体の酵素活性に有意な悪影響を与えない微小な改変を有することを許容して、SCCEポリペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする、配列番号:1の特徴的なDNA配列と類似のヌクレオチド組成または配列のDNAフラグメントまたはDNA配列を指示するものとして用いられる。「有意な悪影響」の語は、類縁体の酵素活性が、たとえば例３に記載のようにして測定した場合、ネイティブSCCEの酵素活性の少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、なおさらに好ましくは少なくとも70％たとえば少なくとも75％であることを意味する。類縁のDNAフラグメントまたはDNA配列は動物もしくはヒトのような生物体から誘導することもできるし、また部分的もしくは完全に合成起源のものであってもよい。類縁体は組換えDNA技術を用いて誘導することもできる。
さらに、「類縁体」および「サブ配列」の語は、配列中にたとえば１個または２個以上のヌクレオチドの置換、挿入（イントロンを含む）、付加および再配列のような変化で、そのDNAフラグメントまたはそのサブ配列によってコードされるポリペプチドに実質的に悪影響を与えない変化を許容するものとする。
「置換」の語は全ヌクレオチド配列中の１個または２個以上のヌクレオチドの１個または２個以上の異なるヌクレオチドでの置き換えを意味するものであり、「付加」は全ヌクレオチド配列のいずれかの末端における１個または２個以上のヌクレオチドの付加を意味するものと理解され、「挿入」は全ヌクレオチド配列内部への１個または２個以上のヌクレオチドの導入を意味するものであり、「欠失」は全配列のいずれかの末端からまたは内部の任意の適当な位置からの１個または２個以上のヌクレオチドの除去を指示するものであり、「再配列」は２個またはそれ以上のヌクレオチド残基がそのDNAまたはポリペプチド配列の内部でそれぞれ交換されたことを意味するものである。しかしながら、DNAフラグメントはまた、生物体に挿入する前または後に突然変異誘発によって修飾することもできる。
本発明のフラグメント、配列、サブ配列および類縁体に関して本明細書または請求の範囲において用いられる「フラグメント」、「配列」、「サブ配列」および「類縁体」の語はもちろん、それらの天然の環境におけるこれらの現象を包含するのではなくて、たとえば、単離、精製、インビトロまたは組換え型における現象として理解すべきである。
本発明の一実施態様においてはSCCEポリペプチドmRNAの検出および／または定量が、細胞または組織からのRNAの抽出およびそのcDNAへの変換ついでポリメラーゼチェーン反応（PCR）における使用によって達成される。PCRプライマーは本発明のDNAフラグメントたとえば配列番号:1に示すDNAフラグメントに基づいて合成できる。この検出および／または定量方法は、SCCE mRNAの発現が正常より多いかまたは少ない疾患状態の診断のための診断方法として使用することができる。
また、本発明の範囲内には、本発明のヌクレオチド配列を検出できるヌクレオチドプローブからなる診断薬、ならびに正常より多量のSCCEが存在するかまたはSCCEの突然変異型が存在する疾患を有する疑いのある患者からのサンプルを、上述の診断薬と接触させてヌクレオチド配列を増幅させサンプル中における同一または相同のヌクレオチド配列の存在を決定できるPCR分析に付すことからなる、SCCE発現の調節が失われた疾患および／またはSCCE遺伝子が突然変異している疾患の診断方法が包含される。
本発明のポリペプチドは、組換えDNA技術を用いて製造することができる。本発明の重要な実施態様は本発明のヌクレオチド配列からなる発現系に関する。
本発明のポリペプチドの製造に用いられる生物体は高等生物体たとえば動物でもまた下等生物体たとえば大腸菌のような微生物であってもよい。使用される生物体の種類には無関係に、本発明のDNAフラグメントは直接または適当なベクターにより生物体内に導入される。別法として、ポリペプチドは本発明のDNAフラグメントまたはその類縁体もしくはサブ配列を直接または発現ベクターにより導入することにより哺乳動物細胞系内で産生させることもできる。
DNAフラグメントまたはその類縁体もしくはサブ配列はまた、適当な安定な発現ベクターにクローニングし、ついで適当な細胞系内に入れることができる。所望のポリペプチドを産生する細胞をついで、用いたベクターおよび細胞系に適当な条件下における生産性のレベルに基づいて選択される。選択された細胞はさらに増殖させて、所望のポリペプチドの極めて重要かつ連続的な供給源を形成させる。
本発明のDNA配列の特異的類縁体の例には、配列番号:1に示すDNA配列またはその部分からなり、大腸菌内での発現にとくに適合させたDNA配列である。このDNA配列は、大腸菌内に適当な調節配列とともに挿入された場合、配列番号:2に示すアミノ酸配列またはその部分を実質的に有するポリペプチドの発現を生じる配列である。すなわち、このDNA配列は大腸菌によって認識される特異的なコドンからなる。この実施態様の例は例８に記述する。
この関係では、「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の産生に関与し、コード領域の前後（５′上流および３′下流配列）の領域、ならびに個々のコードセグメント、エクソンの間にまたは５′上流もしくは３′下流領域に位置する介在配列、イントロンを包含するDNA配列を指示するものとして使用される。５′上流領域は、遺伝子の発現を制御する調節配列、通常はプロモーターからなる。３′下流領域は遺伝子の転写の終結に関与する配列、ならびに任意に、転写体のポリアデニル化に関係する配列および３′非翻訳領域からなる。
上記に関連して、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列からなり、上記ヌクレオチド配列の発現を誘発できる５′隣接配列を包含する発現系に関する。
とくに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を有しその発現を誘導できる複製可能な発現ベクターに関する。本発明の特定の実施態様は、1993年５月11日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）のコレクションに、ブダペスト条約の規定により受託番号DSM 8282として寄託された名称pS507の複製可能な発現ベクターおよび寄託された上記発現ベクターのヌクレオチド配列とは異なるが同じポリペプチドまたはSCCE活性を有するその類縁体もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を発現する発現ベクターに関する。
換言すれば、本発明の範囲にはまた上述の複製可能な発現ベクターにおいて、発現されるヌクレオチド配列が、SCCE活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が生じるように少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換もしくは修飾または少なくとも１個の付加的ヌクレオチドの挿入が行われた点で寄託されたベクターのヌクレオチド配列と異なる発現ベクターが包含される。
さらに本発明は、1993年５月11日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM）のコレクションに、ブダペスト条約の規定により受託番号DSM 8281として寄託された名称pS500のプラスミド、および配列番号:1に示すヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号:2に示すポリペプチドまたはSCCE活性を有するその類縁体もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列あるいは配列番号:1に示すヌクレオチド配列もしくはその部分と緊縮ハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するプラスミドに関する。
本発明の範囲内にはまた、本発明の発現系をもつ非ヒト生物体が包含される。本発明のこの態様において使用できる生物体には、バシルス、エシェリヒアもしくはサルモネラ属の細菌のような微生物、サッカロミセスもしくはピヒアのような酵母、原生動物、またはカビのような多細胞生物から誘導される細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞もしくは細胞系が包含される。生物体が細菌である場合は、細菌はエシェリヒア属の細菌たとえば大腸菌であることが好ましい。
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドまたは本明細書において定義される融合ポリペプチドをコードするDNA配列を含有するプラスミドベクターに関する。一つの特定な重要な実施態様においては、本発明のDNAフラグメントまたはその類縁体もしくはサブ配列、または本明細書において定義される本発明の融合DNAフラグメントは、宿主生物体または細胞系内で複製できる複製可能発現ベクターに搭載される。
ベクターはとくに、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体またはウイルスとすることができる。本発明の興味ある実施態様においては、ベクターは宿主細胞中に導入した場合、宿主細胞のゲノムにインテグレートされるベクターとすることができる。
高等生物体を使用する場合には、ポリペプチドの製造にトランスジェニック技術を採用することができる。適当な動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ブタ等がある。本発明のポリペプチドをコードするDNAフラグメントは、所望の組織中で組織特異的な調節要素による制御下に発現される。得られた蛋白質はついで、本発明のポリペプチドが得られるように翻訳後修飾に付される。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、選ばれた動物の胚標的細胞内に「トランス遺伝子」を導入することによって発生させる。本発明の一態様においては、トランス遺伝子は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞のゲノム内に含まれた場合に所望の表現型を産生できるDNA配列である。特定の実施態様では、トランス遺伝子は本発明のポリペプチドをコードするDNA配列からなり、このトランス遺伝子は発現してポリペプチドを生成できる遺伝子である。
哺乳動物の生殖細胞系への発現系の導入は、たとえば、Hoganら、1986またはWO 93/04172に記載されたような任意の適当な技術を用いて実施できる。
本発明の特定の一態様においては、本発明のヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドと異なるかまたは同一のポリペプチドをコードする他のヌクレオチド配列を、配列番号:1に示す配列またはSCCEポリペプチドをコードするその類縁体のヌクレオチド配列に、本発明のさらに他の興味ある態様（たとえば例８参照）を構成するポリペプチドである融合ポリペプチドを製造する目的で、インフレームに融合させてなる配列とすることもできる。組換えDNA技術を用いる場合には融合DNA配列は適当なベクターまたはゲノムに挿入することができる。別法として、一方のヌクレオチド配列を、既に他方のヌクレオチドを含有するベクターまたはゲノム中に挿入する。融合ポリペプチドはまた、２つのヌクレオチド配列を別個に挿入して発現を起こさせることによって作成することもできる。真核生物または原核生物いずれかの起源の宿主生物体を、融合配列の発現が保証される条件下に増殖させる。ついで融合ポリペプチドを精製し、適当な方法を用いて本発明のポリペプチドをその融合パートナーから分離する。
本発明の一態様はしたがって、本発明のポリペプチドを製造するにあたり、以下の工程：
（ａ）本発明のヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入する工程、
（ｂ）工程（ａ）で製造されたベクターで適当な宿主生物体を形質転換する工程、
（ｃ）工程（ｂ）において製造された宿主生物体をポリペプチドの発現に適当な条件下に培養する工程、
（ｄ）ポリペプチドを収穫する工程、および
（ｅ）所望により、そのポリペプチドを翻訳後修飾に付す工程
からなる方法に関する。
本発明の範囲内にはまた、上述の方法において、製造されたポリペプチドをたとえば、固定化ネイティブもしくは組換えSCCEポリペプチドまたはそのポリペプチドと反応性の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または他のクロマトグラフィーならびに電気泳動操作のような１または２以上の工程からなる方法によって単離する方法が包含される。
上述のようにして製造されたポリペプチドは、熱処理、化学処理（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等）または酵素処理（ペプチダーゼ、プロテイナーゼおよび蛋白修飾酵素）の結果としての翻訳後修飾に付すことができる。ポリペプチドがその天然の産生環境に匹敵する生物体内で製造された場合には、他の方法で処理することができる、一例として、ポリペプチドが高等生物体たとえば酵母または好ましくは哺乳動物細胞によって発現された場合には、グリコシル化は達成されている場合が多い。グリコシル化は正常には、アミノ酸残基Asn、Ser、Thrまたはヒドロキシリジンに関して見出される。問題の宿主生物体によって引き起こされる処理特性を排除または変更させることが有利な場合も有利ではない場合もある。
生物体または細胞系内でのポリペプチドの本発明による発現に続いて、ポリペプチドはそのまま使用できる場合もまた最初に生物体もしくは細胞系から精製することができる場合もある。ポリペプチドが分泌生成物として発現された場合には、それは直接精製できる。ポリペプチドが会合生成物として発現された場合には、精製前に宿主の部分的または完全な分解が必要になる。ポリペプチドの精製に用いられる操作の例には、（ｉ）抗体による免疫沈降もしくはアフィニティークロマトグラフィー、（ii）適当なリガンドとのアフィニティークロマトグラフィー、（iii）他のクロマトグラフィー操作たとえばゲルろ過、イオン交換もしくは高速液体クロマトグラフィーまたは上述のいずれかの方法の誘導法、（iv）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、および等電点電気泳動のような電気泳動操作、（ｖ）他の任意の特異的な可溶化および／または精製技術、がある。
本発明はまた、実質的に純粋なSCCEポリペプチドに関する。この関連において「実質的に純粋な」の語は、問題のポリペプチドが他の成分、たとえばポリペプチドの製造および／もしくは回収から生じるか、またはほかにそのポリペプチドと一緒に見出される他のポリペプチドまたは炭水化物を実質的に含まないことを意味するものと理解される。蛋白質の純度は、例３の記載のようにして行われるSDSゲル電気泳動によって評価できる。
ポリペプチドは例４の記載のように、SBTIアフィニティークロマトグラフィーまたは固定化された抗体たとえば抗体TE4b上アフィニティークロマトグラフィーにより本技術分野の熟練者には既知の操作に従って精製することができる。高純度の本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが医薬または化粧料組成物中に用いられる場合に有利である。また、その高純度により、大部分の用途において、実質的に純粋なポリペプチドは慣用の低純度のポリペプチドの場合に比較して少量を使用すればよい。
本発明の一態様においては、純粋なポリペプチドは、例９に記載のように本発明のポリペプチドを発現する適当な細胞系から得ることができる。また、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチド配列の個々のアミノ酸の連続カップリングを用いるよく知られた液相または固相ペプチド合成法によって製造することもできる。別法として、個々のアミノ酸のカップリングにより、ホリペプチド配列のフラグメントを形成させ、所望のポリペプチドが生じるようにこれを後にカップリングさせることによって合成することもできる。したがってこれらの方法は本発明の他の興味ある態様を構成する。
本発明の極めて重要な態様は、SCCE活性を有するポリペプチドと、医薬用としておよび／または化粧料用として許容される賦形剤からなる医薬組成物、化粧料組成物またはスキンケア組成物に関する。組成物は、本発明の精製されたネイティブ蛋白質もしくは組換えポリペプチド、または蛋白分解切断によって活性化できる本発明のポリペプチドのプロ酵素もしくは融合蛋白質型から構成することもできる。本発明のポリペプチドのプロ酵素型は「プロドラッグ」すなわち適当な蛋白分解切断によって活性型に変換される化合物と考えることができる。
とくに本発明は、それらに限定されるものではないが、局所適用たとえば皮膚への適用に適した組成物に関する。
局所投与に適した本発明の医薬組成物は、クリーム、軟膏、ローション、リニメント、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト、スティック、スプレー、シャンプー、石鹸、ヘアコンディショナーまたはパウダーとすることができる。
局所投与は、問題の病的変化が生じている生体部分上またはその付近、たとえば皮膚表面のような生体の外部への投与である。適用は、組成物の単純な塗布でよく、また組成物と病的損傷部位の間の接触の確実性を増大させるための適当なデバイス、たとえば、本発明の組成物とともに提供される密封包帯たとえば密封プラスターを使用してもよい。組成物はパッド、プラスター、ストリップ、ガーゼ、スポンジ材料、綿毛片等に浸漬しても、また塗布してもよい。所望により病変部位またはその付近への組成物の注射の形態で使用することもできる。
本発明による局所用組成物は、その製剤の総重量に基づいて１〜80重量％の活性化合物、たとえば活性化合物0.001〜25w/w％、たとえば0.1〜10％、0.5〜５％、２〜５％から構成させることができる。２種以上の活性化合物を組成物中に導入することもできる。すなわち、SCCE、プロ−SCCEまたはSCCEインヒビターを他の医薬用および／または化粧料用化合物と配合してなる組成物も本発明の範囲に包含される。組成物は病変の種類、重篤度および位置に応じて１日に１〜10回適用するのが便利である。
局所適用のためには、製剤は慣用の製薬実務に従い、局所適用に慣用的に用いられる医薬用賦形剤とともに処方される。特定の組成物の製造に用いられるビヒクルの性質は、その組成物の意図された投与方法に依存する。組成物中に使用できる水以外のビヒクルには、皮膚軟化剤、溶媒、湿潤剤、増粘剤および粉末のような固体または液体が包含される。単独でまたは１種もしくは２種以上のビヒクルの混合物として使用できるこれらの種類のビヒクルのそれぞれの例は以下の通りである。
皮膚軟化剤としてはたとえばステアリルアルコール、グリセリルモノリシノール酸エステル、グリセリルモノステアレート、プロパン−1,2−ジオール、ブタン−1,3−ジオール、セチルアルコール、イソプロピルイソステアレート、ステアリン酸、イソブチルパルミテート、イソセチルステアレート、オレイルアルコール、イソプロピルラウレート、ヘキシルラウレート、デシルオレエート、オクタデカン−２−オール、イソセチルアルコール、セチルパルミテート、ジメチルポリシロキサン、セバチン酸ジ−ｎ−ブチルエステル、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、イソプロピルステアレート、ブチルステアレート、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ラノリン、ヒマシ油、アセチル化ラノリンアルコール、石油、鉱油、ブチルミリステート、イソステアリン酸、パルミチン酸、イソプロピルリノレエート、ラウリルラクテート、ミリスチルラクテート、デシルオレエート、ミリスチルミリステート；
溶媒はたとえば水、メチレンクロリド、イソプロパノール、ヒマシ油、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、植物油および動物油、グリセロール、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール、および他のグリコールおよびアルコール、不揮発性油；
湿潤剤または保水剤たとえば、グリセリン、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボン酸ナトリウム、可溶性コラーゲン、ジブチルフタレート、ゼラチン；
粉末としてはたとえば、チョーク、タルク、カオリン、デンプンおよびその誘導体、ゴム、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、化学的に修飾されたマグネシウムアルミニウムシリケート、水和アルミニウムシリケート、カルボキシビニルポリマー、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチレングリコールモノステアレート；
ゲル化剤または膨潤剤、たとえば、ペクチン、ゼラチンおよびその誘導体、セルロース誘導体たとえばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは酸化セルロース、セルロースゴム、グアールゴム、アラビアゴム、カラヤゴム、トラガントゴム、ベントナイト、寒天、アルギネート、カルボマー、ゼラチン、ブラダーラック、セラトニア、デキストランおよびその誘導体、ゴーティゴム、ヘクトライト、イスパギューラ外皮、キサンタンゴム；
ポリマーたとえば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸ポリマーまたはそのコポリマー、パラフィン、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン；
界面活性剤、たとえば、非イオン界面活性剤たとえばグリコールおよびグリセロールエステル、マクロゴールエーテルおよびエステル、糖エーテルおよびエステルたとえばソルビタンエステル、イオン性界面活性剤、たとえばアミン石鹸、金属石鹸、硫酸化脂肪アルコール、アルキルエーテルサルフェート、硫酸化油脂ならびに両性界面活性剤およびレシチン；
緩衝剤、たとえばナトリウム、カリウム、アルミニウム、マグネシウムまたはカルシウム塩（たとえば塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、グルセプチン酸塩または酒石酸塩）。
局所適用の場合、組成物のpHは原理的には極めて広い範囲内たとえば３〜９とすることができる。本発明の好ましい実施態様においてはポリペプチドの適当な蛋白分解活性が得られるpH、たとえば約４〜８のpHが好ましい。上述のような慣用の緩衝剤が所望のpHを得るために使用できる。
本発明の製剤にはまた、他の添加物たとえば安定化剤、防腐剤、可溶化剤、着色剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、pH調整剤、抗酸化剤、香料および皮膚保護剤等を含有させることができる。組成物がシャンプーまたは石鹸の形態の場合には、組成物にはさらに、起泡剤、パール剤および／またはコンディショナーを包含させることができる。
代表的な防腐剤としてはパラベン、ホルムアルデヒド、Kathon CG,Bronidox,Bronopol,p−クロロ−ｍ−クレゾール、クロロヘキシジン、塩化ベンズアルコニウム等がある。
本発明の組成物がシャンプーまたは石鹸の形態の場合には、慣用成分が使用できる。代表的な石鹸およびシャンプー基剤には、ベタイン、ラウリル硫酸ナトリウム、ノニルフェノール、イミダゾール、スルホスクシネート、再脂肪化剤、湿潤剤およびコンディショナーが包含される。
さらに、活性化合物をポリマーマトリックス、もしくはナノ粒子、もしくはリポソームもしくはミセルに導入させるか、またはイオン交換樹脂に吸着させるかまたはポリマーに負荷させて、放出性が改良された製剤として供給することも有利である。
組成物は、慣用の製薬実務に従って、
半固体製剤：ゲル、ペースト、混合物；
液体製剤：溶液、懸濁液、水薬、乳化液
とすることができる。
上述のように、本発明の医薬組成物は本発明のポリペプチド自体もしくはその機能性誘導体、またはそのような化合物の配合物からなる。適当な機能性誘導体の例には、医薬的に許容される塩、とくに皮膚環境に使用して適当な塩が包含される。例としては、アミノ官能基の医薬的に許容される塩、たとえば医薬的にとくに皮膚環境において許容される酸形成陰イオンによる塩がある。たとえば、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ヨウ化物、臭化物、塩化物、ホウ酸塩ならびにたとえば酢酸塩、安息香酸塩、ステアリン酸塩等のカルボン酸から誘導される陰イオンが包含される。
アミノ官能基の他の誘導体には、アミド、イミド、尿素、カルバメート等が包含される。
他の適当な誘導体には、本発明のポリペプチドのカルボキシル基の誘導体、たとえば塩、エステルおよびアミドが包含される。例としては、医薬的に許容される陽イオンとの塩、たとえばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、第二鉄、第一鉄、アンモニウム、および低級（Ｃ１〜６）−アルキルアンモニウム塩が包含される。エステルには低級アルキルエステルが包含される。
例11の組成物の例は、本発明の医薬、化粧料およびスキンケア製剤を例示するものであつて、いかなる意味においても本発明の組成物の範囲を限定するものではない。
ネイティブまたは組換えSCCEからなる化粧料組成物またはスキンケア組成物は、座瘡、乾皮症または他の角質増殖状態たとえば胼胝および毛孔性角化症に対して活性であると考えられる。尋常性座瘡には異なる段階がある。脂腺の管内に角化障害があり、それが面皰およびプラグの形成を招く段階では、SCCEの投与は有用と考えられるが、一方、炎症性の座瘡病変が支配的な特徴である段階ではSCCEを阻害する物質の投与が有利と思われる。
本発明の一態様は、したがって、座瘡、乾皮症または他の角質増殖状態、たとえば胼胝および毛孔性角化症の処置または予防のためのポリペプチドの使用に関する。
上述の科学的所見に基づき、ネイティブまたは組換えSCCEからなる医薬組成物は各種の魚鱗癬、座瘡、乾癬または他の炎症性皮膚疾患たとえば角化症を伴う湿疹、微生物感染および創傷の処置または予防に、とくに局在的に適用した場合に有用である。
本発明の他の態様は、各種の魚鱗癬、座瘡、乾癬、または角化症を伴う他の炎症性皮膚疾患たとえば湿疹の処置または予防のための医薬組成物の製造におけるSCCE活性を有するポリペプチドの使用に関する。
本発明のさらに他の態様は、各種の魚鱗癬、座瘡、乾癬、または角化症を伴う他の炎症性皮膚疾患たとえば湿疹の処置および／または予防方法においてSCCE活性を有するポリペプチドの治療および／または予防有効量をそれを必要とする患者に投与することからなる方法に関する。この処置は予防的なものでも、緩解的なものでも、または治療的なものでありうる。
皮膚環境においてもプラスミノーゲン活性化系に類似の蛋白分解酵素の「カスケード系」の存在することが考えられる。SCCEはこの系の最終生成物の一つと推測される。SCCEの活性は「SCCEインヒビター」によって阻害できることが意図されている。
多くの皮膚疾患たとえば、自己免疫性天疱瘡または棘融解疾患たとえば家族性天疱瘡およびダリエー病においては、角化していない生存表皮層中の角化細胞間の接着に損傷がある（生存表皮における細胞接着の障害の項参照）。この過程は蛋白分解酵素によって仲介され、したがってネイティブSCCEの酵素活性を阻害できる化合物の投与によって処置できるものと考えられる。また炎症性の要素が支配的な特徴である状態では乾癬および他の炎症性皮膚疾患の処置にSCCEインヒビターを投与することも有利であろうと思われる。
したがって、本発明は他の態様において、自己免疫性天疱瘡または棘融解疾患たとえば家族性天疱瘡およびダリエー病の処置または予防用の医薬組成物の製造におけるネイティブSCCEの酵素活性に対して阻害活性を有するSCCEインヒビターの使用に関する。
この関連において、「SCCEインヒビター」の語は、酵素的に活性な本発明のポリペプチド配列またはそのサブ配列もしくは類縁体と、SCCE活性を低下させるように相互作用できる現存のまたは新規な化合物を意味する。低下はたとえば、SCCEインヒビターの候補物質をインヒビターとして用いて、例3.2.に略述した実験を実施することによって測定することができる。上記化合物は、有機分子、小ペプチドもしくは大ポリペプチドまたは上述の化合物いずれかの誘導体とすることができる。このようなアプローチはSCCEインヒビターの同定のための薬剤スクリーニングプログラムにも使用することができる。
本発明のさらに他の実施態様は、したがって、本発明の組換えポリペプチドの使用からなる、ネイティブSCCEの酵素活性に対して影響を有する化合物の同定方法に関する。
とくに、本発明は、ネイティブSCCEの酵素活性に対して阻害活性を有する化合物の同定方法に関する。
他の態様においては、本発明は、ネイティブまたは組換えSCCEの酵素活性を増強できる化合物の同定方法に関する。
本発明の組換えポリペプチドの重要な用途は薬剤のスクリーニングアッセイにおける使用である。本発明のポリペプチドは薬剤のスクリーニング系に使用することができる。したがって本発明はまた、本発明のポリペプチドの使用からなるSCCEプロ酵素型を活性SCCEに変換できる化合物の同定方法に関する。
本発明の概念の範囲にはまた、SCCEポリペプチドに結合できる物質の設計に使用するための、とくにこの酵素の活性部位に結合する薬物の設計に使用するためのSCCEポリペプチドの三次元構造の推定における上に定義したアミノ酸配列の使用が包含される。
最後に、本発明の重要な態様は、SCCEポリペプチドによって発揮される活性の様々な調節方法である。この活性は上述の様々な疾患状態に重要な関わりをもつものと考えられる。
本発明のポリペプチドまたはその類縁体に相当するmRNAの少なくとも部分に相補性のDNAまたはRNAフラグメントはヒト細胞内のSCCE mRNAの翻訳を停止させるのに有効であり、したがってそのポリペプチドの合成を阻害できる可能性がある。SCCEの正常より高い発現が見出される疾患状態たとえば自己免疫性天痘瘡または棘融解疾患たとえば家族性天疱瘡およびダリエー病に関連して興味がもたれるこのアプローチはアンチセンスオリゴ療法として一般的に知られているものであり、したがって本発明はこのアプローチを包含する。
図面の説明
図1.  インビトロで足裏角質層から剥離された単極細胞。インビボで外側を向いている組織表面が図では上方になる。インキュベーション時この表面には進行的な細胞解離が認められるが、他の表面では細胞の解離はないことに注意。
図2.  アプロチニンの不存在下（丸）および存在下（三角）にインキュベートした足裏角質層からの細胞の剥離における時間経過とアプロチニンの影響。４つの組織片についての累積平均と範囲を示す。
図3.  接着足裏角質層および解離細胞における抗−デスモグライン（抗−DGＩ）反応成分。A.クーマッシーブルー染色SDS−PAGE。B.イムノブロット。１−3:接着組織、非希釈（１）、希釈1/3（２）、希釈1/9（３）、４−5:解離細胞、非希釈（４）、希釈1/3（５）。接着組織内には、Mr 160kDの見掛け上無傷のDGＩのみ、解離細胞内にはMr95および80kDのDGＩ分解生成物のみが認められることに注意。
図4.  インビトロで細胞剥離時の足裏角質挿層でのデスモグラインＩ（DGＩ）の分解の時間経過およびアプロチニンの影響。アプロチニン（15μＭ）の不存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）にインキュベートされた足裏角質層の抽出物のイムノブロットのデンシモメトリックスキャニング。160kDにおけるピークは無傷のDGＩに相当する。95および80kDにおけるピークはこの蛋白質の分解生成物に相当する（図３参照）。DGＩの分解に対するアプロチニンによる効率的な阻害に注意。
図5.  インビトロで細胞剥離時の足裏角質層におけるデスモグラインＩ（DGＩ）の分解に対する亜鉛イオン（Ａ）、キモスタチンとロイペプチン（Ｂ）の影響。亜鉛イオンおよびキモスタチンによる抗−DGＩ陽性成分の160kDから95および80kDへの変換の阻害がみられるが、ロイペプチンには阻害は認められない。
図6.  足裏角質層細胞に伴うペプチド加水分解活性。２種の基質の加水分解を405nmにおける吸収の変化の測定により追跡した。３回のインキュベーション実験の平均。四角＝Ｓ−2586、丸＝Ｓ−2288。
図7.  角質細胞関連Ｓ−2586加水分解活性のpH依存性。３回のインキュベーション実験の平均。四角＝酢酸ナトリウム、丸＝リン酸ナトリウム、三角＝トリス塩酸塩。
図8.  解離した足裏角質層細胞の抽出物におけるカゼイン分解活性を示すザイモグラフィー。実験の詳細は例2.2の記載参照。
A:還元剤（sc/s）およびKCl（sc/k）を含まない、0.125ngウシキモトリプシン（ｃ）および0.5ngウシトリプシン（ｔ）含有Laemmliのサンプル緩衝液で抽出した足裏角質細胞からの酵素の比較。電気泳動前に、KCl抽出液は5mMトリス塩酸塩、pH6.8に対して透析し、SDSおよびグリセロールを加えて最終濃度をサンプル緩衝液中の場合と同じにし、全レーンに10μlを添加した。分子量マーカーは左側にある。
B:インキュベーション緩衝液のpHに対する依存性。酵素源＝解離足裏角質細胞のSDS抽出物。トリトンＸ−100による前処置およびインキュベーションのための緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0およびpH5.5）および0.1Mトリス塩酸塩（pH7.0およびpH8.0）。他の条件はＡと同じ。
C:インヒビターの影響。sc＝足裏角質細胞のSDS抽出物;c＝ウシキモトリプシン;t＝ウシトリプシン。インヒビターはトリトンＸ−100による前処置およびその後のインキュベーション時に存在させた。最終濃度は、ロイペプチン160μＭ。アプロチニン15μＭ、キモスタチン40μＭ、亜鉛イオン（硫酸塩として）100μＭとした。ロイペプチンおよびキモスタチンはジメチルスルホキシド（DMSO）中溶液として添加した。前処理およびインキュベーションのための緩衝液＝0.1Mトリス塩酸塩、pH8、DMSO最終濃度１％（v/v）。他の条件はＡと同じ。
図9.  SCCE、ウシキモトリプシンおよびヒトカテプシンＧのインヒビター（A:アプロチニン、B:キモスタチン、C:硫酸亜鉛）、ならびに基質特異性（Ｄ）に関する比較。Ａ〜Ｃではインヒビター不存在下の酵素活性を100％として標準化した。Ｄは、MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNAでの酵素活性を１任意単位として標準化した。
図10.  共有結合大豆トリプシンインヒビター（SBTI）上アフィニティークロマトグラフィー。点線:280nmにおける吸収、溶出液の蛋白質濃度を反映する。白四角の実線:S−2586を基質とした場合のペプチド加水分解活性、405nmにおける吸収の変化を示す。白丸の実線:S−2288を基質とした場合のペプチド加水分解活性、405nmにおける吸収の変化を10倍して示す。
図11.  図10に示すクロマトグラムからの分画２、６および10のSDS−PAGEおよびクーマッシーブルー染色（Ａ）ならびに共重合カゼインとのSDS−PAGE後のザイモグラフィー。分子量マーカーは左側に示す。Ｂ中、ｌはロイペプチン（160μＭ）によって阻害できたカゼイン分解成分群、ｃはキモスタチン（40μＭ）によって阻害できたカゼイン分解成分群。
図12.  SBTI−Affigel 15（12.5％ゲル）上アフィニティークロマトグラフィーによって精製したSCCEのSDS−PAGE。1:非還元サンプル、2:還元サンプル。分子量マーカーは左側に示す。
図13.  SCCEのＮ−末端アミノ酸配列。星印は位置７および９における推定されたシスチンの不確実性を示す。疑問符はアミノ酸誘導体は検出できなかったが、その後の工程の収率の低下はなかった位置を意味する。
図14.  モノクローナル抗体TE4bおよびTE9bの免疫沈降およびイムノブロッティングによる特性表示。
a:クーマッシー染色12.5％SDS−PAGE、非還元条件。
レーン1:分子量マーカー
レーン2:例3.1の記載により調製した解離足底角質細胞のKCl抽出物
レーン3:例4.1の記載のように、不溶化大豆トリプシンインヒビダー上アフィニティークロマトグラフィーによって精製したSCCE
b:0.1％共重合熱変性カゼインを含む12.5％SDS−PAGE、クーマッシー染色ゲルにおける免疫沈降のザイモグラフィー。
レーン1:分子量マーカー
レーン2:aのように透析したKCl抽出物
レーン３−6:左から右へ、moabTE4b（20μｇ）、moabTE9b（10μｇ）、moabPZ（10μｇ）、およびリン酸緩衝食塩溶液による可溶化免疫沈降。moabPZは妊娠性蛋白質に対するIgG1−κ型のマウスモノクローナル抗体であり、無関係の陰性対照として使用した
c:12.5％SDS−PAGE（非還元条件）からのイムノブロット。
レーン1:アルカリホスファターゼ接合アビジン（BioRad）で検出されたビオチン化分子量マーカー。レーン２、４および６における電気泳動サンプルはａのレーン２と同一であり、レーン３、５および７における電気泳動サンプルはａのレーン３と同一である。
レーン２および3:第一の抗体＝moabTE4b、0.2μg/ml
レーン４および5:第一の抗体＝moabTE9b、0.1μg/ml
レーン６および7:第一の抗体＝moabPZ、0.1μg/ml
ａ〜ｃにおける矢印は、それぞれ相対分子量（上から下へ）93、66、45、31、22、および14kDを示す。
図15.  図15はプラスミドpS500を示す。このプラスミドは、pUC19中にクローニングされた全長ヒトSCCE cDNAを含有する。詳細は例６参照。
図16.  ヒト表皮から調製されたmRNAによるノーザンブロット。総RNA約100gに相当するポリＴ精製RNAを各レーンに適用した。1:SCCE−cDNAの1070bp Hinc 2/Hinc 2フラグメントから調製したプローブで実施したハイブリダイゼーション。2:SCCE−cDNAの655bp Hinc 2/Bgl 2フラグメントから調製したプローブで実施したハイブリダイゼーション。
図17.
a:クーマッシー染色SDS−PAGE 12.5％ゲル。
１および2:それぞれpS510およびpS511でトランスフォームしIPTGで誘導したTG2細胞を超音波処理したPBS−トリトンＸ−100不溶性ペレット。3:ヒト足裏角質層から精製したSCCE。
b:トリプレ免疫血清（１−３）およびトリ抗−SCCE（４−６）によるイムノブロット。１および4:pS510でトランスフォームしIPTGで誘導したTG2細胞。２および5:pS511でトランスフォームし、IPTGで誘導したTG2細胞。３および6:ヒト足裏角質層から精製したSCCE。
サンプルはメルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液中で煮沸して調製。
図18.  図18は、例９の記載に従って構築された発現ベクターpS507の環状地図を示す。ベクターpS507は哺乳動物細胞で組換えヒトSCCEの発現を誘導する。
図19.  図19は哺乳動物細胞でのpS507の組換えヒトSCCE遺伝子の発現の分析を示す。
レーン1:C127細胞からのRNA
レーン2:pS507でトランスフェクトしたC127細胞の単離クローン1:24からのRNA
レーン3:pS507でトランスフェクトしたC127クローンの集団混合物からのRNA。
レーン４および5:SCCE cDNA配列を欠く以外はpS507と同一の発現ベクターpS147でトランスフェクトしたC127細胞からのRNA。サイズマーカーは左側に示す。
図20.  C127細胞中で発現したSCCEのSDS−PAGEついでイムノブロッティング。
レーン１および6:予め染色した分子量マーカー（BioRad、106、80、49.5、32.5、27.5および18.5kDa）
レーン2:pS507/C127、ミックス、Ｔ−フラスコ
レーン3:pS507/C127、ミックス、ローラーＡ
レーン4:pS507/C127、ミックス、ローラーＢ
レーン5:陰性対照pS522/C127
レーン7:角質層から調製されたネイティブSCCE
レーン8:pS507/C127、クローン24、Ｔ−フラスコ
レーン9:pS507/C127、クローン24、ローラーＡ
レーン10:pS507/C127、クローン24、ローラーＢ
図21.  プラスミドpS507を有するC127細胞の培養培地から精製した組換えSCCEのSDS−PAGE（Ａ）およびイムノブロッティング（Ｂ）。
レーン１および5:予め染色した分子量マーカー（BioRad、106、80、49.5、32.5、27.5および18.5kDa）
レーン2:精製前の細胞培地
レーン3:クロマトグラフィーから収集された非結合物質
レーン4:低pH緩衝液で溶出された結合物質
図22.  カゼインポリアクリルアミドゲル上において活性を検定したネイティブSCCEおよび活性化組換えSCCE。
レーン１および10:分子量マーカー（Pharmacia 14〜94kDa）
レーン2:ネイティブSCCE
レーン3:ネイティブSCCE
レーン４〜6:それぞれ１時間、３時間および一夜切断した組換えSCCE（460ng/ウエル）
レーン7:レーン４〜６のサンプルと同量のトリプシン、ただしAPMSFの不存在下
レーン8:レーン４〜６のサンプルと同量のトリプシン、それらのサンプル中と同量のAPMSFの存在下
レーン9:レーン３と同じ
図23.  Ｎ−グリコシダーゼＦ（登録商標）処理されたネイティブおよび組換えSCCEのイムノブロット。サンプルを８〜18％SDS−PAGE上で分離し、上述のようにイムノブロットを行った。
レーン1:分子量マーカー。分子量は上から106、80、49.5、32.5、27.5および18.5kDa
レーン２および3:組換えSCCE、それぞれ0.3および３μｇ
レーン４および5:ネイティブSCCE、それぞれ1.5および1.8μｇ
レーン３および５のサンプルはＮ−グリコシダーゼＦ（登録商標）で処理。
実施例
例  １
皮膚の角質化した表層の表面から剥離する細胞にデスモソーム蛋白質の分解が関与すること、および関係する酵素は亜鉛イオンによって阻害できるキモトリプシン様セリンプロテイナーゼと思われることの証拠
1.1.  角質層における落屑
この研究の目的は、皮膚の角化した層、角質層における細胞の接着および表面細胞の解離（落屑）に関与する機構の本質を解明することである。角質層の薄片0.3〜0.6mm厚を、正常皮膚をもつ被験者の踵下から皮膚表面に平行に切断した。組織片を、0.1％ナトリウムアジド含有リン酸緩衝食塩溶液中、室温で３時間濯ぎ、インビボにおいて外側に向いていた表面から、緩く付着していた細胞を掻き落とした。組織表面に垂直に1mmの厚さのスライスを切り取り、ついでこれを0.1Mトリス塩酸塩pH8.5mM EDTA、0.1％ナトリウムアジド、ならびに0.45％アガロースを含有する培地中に入れると、アガロースの存在により培地は直ちにゲル化した。37℃で０、５および15時間インキュベートしたのち、組織を含むゲル片をドライアイス上で凍結した。20μｍのクリオスタット切片を皮膚表面に垂直にクリオスタットで切断し、位相差顕微鏡にマウントして検査した。足裏角質層の切片からの連続した単極剥離細胞をインビトロでインキュベートして観察した（図１）。細胞はインビボにおいて外側を向いていた組織表面のみから剥離した。したがって、観察された過程は落屑を再現したものである。
1.2.  温度、pH、および酵素インヒビターの影響
次に、各種パラメーターたとえば温度、pH、および酵素インヒビターの影響についての検討を可能にする、細胞剥離の定量化方法を開発した。足裏角質層の直径3mmのシリンダーを、1.1.に上述したように緩く付着した表面細胞から採取し遊離させた組織の薄片よりバイオプシーパンチで調製した。このシリンダー（インビボにおいて外側を向いていた表面が所定の表面積を有する）を、0.1Mトリス塩酸塩pH8、5mM EDTA、0.1％ナトリウムアジドを含む培地0.5ml中、アプロチニン（Boehringer Mannheim,Germany）４×10-6mol/lの存在下または不存在下に、1.5mlのエッペンドルフ管内において37℃で５、10および20時間インキュベートし、ついでVortexミキサー上で10秒間攪拌して解離表面細胞を放出させた。残った組織を除去し、新鮮な培地を加えてインキュベーションを続けた。遊離した細胞を含む管を5000gで２分間遠心分離して細胞を集めた。細胞ペレットを0.5mlのリン酸緩衝食塩溶液で１回洗浄し、ついで60℃で1M水酸化ナトリウム0.6mlにより1.5時間処理した。アルカリ可溶性蛋白質をLowryら、1951に従って定量して、放出された細胞の量の標識とした。結果は図２に示す。
同様にして、各種インヒビター候補、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタチン（Boehringer Mannheim、Germany）およびヨードアセトアミド（Sigma,St.Louis,MO）の影響について検討した。単一の2mm組織シリンダーを調製し、以下の表１に示す濃度の各種インヒビター候補を含むまたは含まない培地中37℃で16時間インキュベートし、放出した細胞を上述のように定量化した。至適細胞放出率が得られるようにEDTA（メタロプロテイナーゼの阻害剤である）をインキュベーション培地に含有させたことに注意。
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セリンプロテイナーゼインヒビターのアプロチニンおよび大豆トリプシンインヒビターは細胞剥離を効率的に阻害した（図２および上記表１）。これら２種の物質は阻害的であったが、メタロプロテイナーゼのインヒビター（EDTA）、チオールプロテイナーゼのインヒビター（ヨードアセトアミド）、アスパラギン酸プロテアーゼのインヒビター（ペプスタチン）は阻害しなかったことから、観察された過程にはセリンプロテアーゼが関与していると結論された。また、角質層における細胞の接着は蛋白質構造に依存し、インビトロ
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Egelrud、1988）にも働いているに違いないと結論された。
足裏角質層からのインビトロ細胞剥離の更なる研究において、過程は２つの別個の工程に分離できることがわかった。第一の工程は、インキュベーション培地中にEDTAが存在してもしなくても無関係に起こる。第二の工程はEDTAの存在下のみで起こる。第一の工程はアプロチニンのほか、キモスタチンおよび亜鉛イオンで阻害できた。第二の工程はアプロチニンとキモスタチンで阻害できた
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様基質特異性を有するプロテイナーゼの低分子量インヒビターである。さらにトリプシン様基質特異性を有するプロテイナーゼの低分子量インヒビターであるロイペプチンはインビトロ細胞剥離に影響
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角質層における細胞接着に関係があるととくに思われ、したがって、上述の落屑様の細胞剥離に際して分解される可能性のある蛋白質構造は、デスモソームである。デスモソームは、隣接する細胞中に位置する２個の対称的な半成分から構成される。この２つの半成分は細胞外空間で、デスモグラインと呼ばれる膜貫通蛋白質によって連結されている。
1.3.  インビトロでの細胞剥離時のデスモグラインＩ（DGＩ）の消滅
足裏角質層からのインビトロにおける細胞剥離時の、デスモグラインＩ（DGＩ）の消滅を検討した。足裏角質層を1.1.に上述したようにインキュベートして、なお接着している組織を解離細胞から分離した。細胞および組織を、0.1Mトリス塩酸塩pH9、9M尿素、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１％メルカプトエタノール、を含有する緩衝液の組織20mgあたり1ml中37℃で15時間抽出した。抽出物をLaemmliに従い（Laemmli,1970）、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下に7.5％ゲル中ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）に付し、ついで電気泳動的にニトロセルロース膜（Bio−Rad,Richmond,CA）に移し（Towbinら、1979）、これを、ウシの鼻面から精製したDGＩに対して作成したウサギポリクローナル抗血清（Gorbskyら、1985）でプローブした。結合した抗体は、アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗−ウサギ免疫グロブリン（Bio−Rad,Richmond,CA）で検出した（Blakeら、1984）。
結果は図３に示す。イムノブロットに添加されるサンプルの量は、接着組織および解離細胞についてほぼ等しい蛋白質濃度（クーマッシーブルー染色SDS−PAGEゲルの肉眼的検査によって評価する）を与えるように調整した。抽出物の数種の希釈液を流して接着角質層および解離細胞における様々な抗体DGＩ反応性成分の量の半定量的比較ができるようにした。
まだ接着している組織および解離細胞を別個に抽出した場合、なお接着している組織は見掛け上無傷のDGＩのみを含有していたのに対し、解離した表面細胞はこの蛋白質の分解によると推定される生成物のみを含有した（図３）。
図４および５には足裏角質層からのインビトロ細胞剥離時におけるDGＩの分解に対するアプロチニン、亜鉛イオン、キモスタチン（Boehringer Mannheim,Germany）およびロイペプチン（Boehringer Mannheim,Germany）の影響を示している。
最初に、インビトロにおいて細胞剥離の過程にある足裏角質層でのデスモグラインＩ（DGＩ）の分解における時間経過およびアプロチニンの影響を検討した。足裏角質層の抽出物を例1.2.に記載のように（ただし、抽出前に解離細胞から接着組織の分離は行わない）アプロチニン（15μＭ）の存在下または不存在下にインキュベートし、０、６、12および24時間後に抽出した。上述のようにSDS−PAGEおよびイムノブロッティングを実施した。イムノブロットのデンシトメトリースキャニングはジグザグ様式561nmの反射光によりShimadzu CS−9000移動スポットスキャナー（Shimadzu,Kyoto,Japan）で行った。結果は図４に示す。DGＩの分解に対するアプロチニンによる効率的な阻害に注意。
ついで、インビトロにおける細胞の剥離時の足裏角質層でのデスモグラインＩ（DGＩ）の分解に対する亜鉛イオン、キモスタチンおよびロイペプチンの影響を検討した。実験法は上に略述した通りとした。インキュベーションは、硫酸亜鉛の場合には濃度０、１もしくは5mMで、キモスタチンまたはロイペプチンの場合には濃度330μＭで24時間行った。結果は、亜鉛イオンおよびキモスタチンによる抗−DGＩ陽性成分の16kDから95および80kDへの変換の阻害を示したが、ロイペプチンでは阻害は認められなかった。
これらの結果から、アプロチニン、亜鉛イオンおよびキモスタチンは阻害剤であったが、ロイペプチンは阻害しなかったことが明らかである。すなわち、DGＩの分解に対する阻害剤プロフィルは、イ
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Egelrud,1990b）と同様であった。
手掌足裏角質層からの細胞剥離に関与する機構と類似する機構が、手掌および足裏以外の生体部位からの皮膚の角質層にも存在することの証明は重要と考えられた。Takahashiら（Takahashiら、1987）は、界面活性剤N,N−ジメチルドデシルアミンオキシド（SIgma,St.Louis,MO）とドデシル硫酸ナトリウム（Bio−Rad,Richmond,CA）のモル比8:2の混合物が、全表皮のトリプシン処理によって調製された非手掌足裏角質層に細胞の解離を引き起こすことを報告している。外因性のトリプシンの夾雑を避けるために、臀部からの正常なヒト皮膚の生検パンチを上述の界面活性剤混合物およびEDTAとと
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これらの条件下に、角化層は単一細胞に解離することが見出された。インキュベーション培地にアプロチニンを添加するとこの細胞の解離が防止された。非手掌足裏角質層においても細胞の接着は蛋白構造に依存すること、この組織における落屑は蛋白分解に依存すること、およびこの組織はこの蛋白分解を触媒できるプロテイナーゼを含有することが結論づけられた。細胞の解離には角質層のみが関与し、さらに深い角化していない表皮層は関与していないことから、関係するプロテイナーゼは深層部では不活性化または阻害された状態で存在するものと結論された。
例  ２
角質層キモトリプシン酵素（SCCE）の発見：インビトロにおいてまた多分インビボにおいても、角質層での細胞内接着構造の崩壊に関与するための基準を満たすプロテイナーゼ
例１に示した実験から、足裏角質層での落屑のインビトロモデルにおける単極表面細胞の解離に関与するプロテイナーゼは以下の性質をもたねばならないと結論された。
1.角質層に存在しなければならない。
2.セリンプロテイナーゼでなければならない。
3.キモトリプシン様の基質特異性およびインビトロ細胞剥離およびデスモグラインＩの関連した分解について観察されるのと類似の阻害剤プロフィルをもたねばならない。
4.角質層において細胞外局在を示さなければならない。
5.生理的条件下に活性を発揮できるpH依存性をもたねばならない。角質層のpHは約4.5〜６である。
6.インビトロでの足裏角質層からの細胞の剥離は、インキュベーション培地の容量がインキュベートされる組織片の容量に比較して極めて大きくても、またインキュベーション培地がインキュベーションの間繰り返し交換されても、長いインキュベーションの間に連続して進行するので、関係する酵素はインキュベーション時にインキュベーション培地中に抽出されないような方式で組織に結合していると考えるのが合理的である。
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Egelrud,1990）。
2.1.  解離した足裏角質細胞に会合した酵素活性
解離した足裏角化細胞（角質細胞）は例１の記載のように足裏角質層のインキュベーションによって調製した。細胞をメッシュサイズ100μｍのナイロンネットでろ過し、ついで10容の0.1Mトリス塩酸塩pH8、5mM EDTA中で３回、0.1Mトリス塩酸塩pH8中で３回洗浄した。ついで細胞を２種類の色原性のプロテイナーゼ基質Ｓ−2288またはＳ−2586（Kabi Diagnostica,Stockholm,Sweden）とインキュベートした。Ile−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−2288）はアルギニン特異性を有する広範囲のセリンプロテイナーゼ（たとえばトリプシン）によって分裂される。Arg−Pro−Try−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−2586）はキモトリプシン様プロテイナーゼの基質である。
総容量120μｌ中、各反応混合物には、0.07Mトリス塩酸塩pH8、0.1％ナトリウムアジド、洗浄した足裏角質細胞の25％懸濁液１、2.5、５もしくは10μｌならびに1.04mM（Ｓ−2586）または1.25mM（Ｓ−2288）の基質を含有させた。マイクロタイタープレート中で５時間37℃でインキュベートしたのち、120μｌの10％酢酸を添加して反応を停止させた。細胞を沈降させたのち、各上清液200μｌを新たなウエルに移した。細胞をBehring Elisaプロセッサー（Behringwerke,Marburg,Germany）で除去したのち、２種の基質の加水分解を405nmにおける吸収の変化によって追跡した。
図６に示すように、解離した足裏角質細胞に会合し、Ｓ−2586の加水分解を触媒する酵素活性が認められた。これに比しＳ−2288に対する活性は低かった。
Ｓ−2586加水分解活性のpH依存性をついで検討した。実験法は上に略述したように、洗浄した足裏角質細胞の25％懸濁液10μｌと様々なpHの緩衝液（酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはトリス塩酸塩）を使用した。最終緩衝剤濃度は0.07Mとした。結果は図７に示す。これから活性はpH7〜８で至適であるが、pH5.5でも有意であることが明らかである。
さらに別の実験では、懸濁した足裏角質層細胞に会合したプロテイナーゼによるpH8におけるＳ−2586の加水分解に対するEDTA、金属イオンおよびプロテイナーゼインヒビターの影響を検討した。実験法は上にまた表２に概述した通りとした。
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上記表２に示すように、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF:セリンプロテイナーゼの一般的インヒビター）、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、キモスタチン（キモトリプシンインヒビター）、ならびに亜鉛イオンはＳ−2586の加水分解活性を阻害したが、ロイペプチン（トリプシンインヒビター）は阻害しなかった。したがって、阻害剤プロフィルは、インビトロ細胞剥離および関連するデスモグラインＩの分解について認められたプロフィルに極めて類似する。
2.2.  解離足裏角質層のザイモグラフィー
2.1.で発見されたＳ−2586の加水分解活性に関与する酵素は角質細胞を0.1Mトリス塩酸塩pH8中1M KClで抽出した場合、可溶化できることが見出された。したがって、ザイモグラフィーの実験を実施した。この理由から、角質細胞のKCl抽出液をLaemmli（Laemmliら、1970）に従って電気泳動のために調製した。ただし、サンプル緩衝液中には還元剤を添加せず、サンプルの加熱は行わなかった。サンプルはまた還元剤を含まないLaemmliのサンプル緩衝液による室温での解離足裏角質細胞の抽出によっても調製した。ザイモグラフィーには、Horieらの操作（Horieら、1984）の方法の改良法を採用した。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）はLaemmliに従い、１％共重合熱変性カゼインを含む12.5％ゲル中で実施した。電気泳動後、ゲルを２％トリトンＸ−100を含む緩衝液中、室温で１時間濯いでSDSを除去し、ついで37℃で15時間インキュベートした。次にゲルをクーマッシーブルーで染色した。分離されたカゼイン分解酵素は青色のバックグランドに対する明瞭なバンドとして示された。実験の詳細については図８の説明を参照されたい。
結果は図８に示す。足裏角質細胞の抽出物は見掛けの分子量約25kDの一つの主要なカゼイン分解酵素を含有した。また、分子量約30kDの微量のカゼイン分解酵素も含まれていた（これらの微量成分は図では明瞭には認められない。その後、これらはロイペプチンで阻害されるが、キモスタチンでは阻害されないことが分かった）。25kDの酵素はpH5.5〜８で有意な活性を示した。この活性は、アプロチニン、亜鉛イオン、およびキモスタチンで阻害されたが、ロイペプチンによっては阻害されなかった。すなわち、上述のＳ−2586の加水分解活性物の場合と同じ阻害剤プロフィルを示した。ゲル排除クロマトグラフィーによる実験（示していない）では、25kDのカゼイン分解酵素はＳ−2586の加水分解活性物と共溶出することがわかった。
2.2.に上述したのと同じ技術を用いた別の実験（示していない）では、非手掌足裏角質層には、足裏角質細胞に会合している25kDプロテイナーゼと見掛け上同一の性質を有する酵素は含まれていないことが見出された。以後、この酵素を、角質層キモトリプシン酵素
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SCCEは、角質層の細胞外空間で活性を示すことが可能なような様式で足裏角質細胞に会合している証拠も得られた。これはまず、解離した角質細胞が西洋ワサビペルオキシダーゼ（Mr 44kD）を透過させないことの証明によってなされた。ついで、ヒトフィブリノーゲン（Mr 340kD）は角質細胞の懸濁液によって分解できること、さらにこの分解がSCCEの場合と同じインヒビターによって阻害できることが明らかにされた。フィブリノーゲンの分解が可溶化された酵素によることは除外できている（Egelrud,1990）。
例  ３
角質層キモトリプシン酵素（SCCE）の部分精製および色素原性基質によるプロテイナーゼアッセイ
3.1.  足裏角質細胞のKCl抽出物の調製
例１に記載した解離足裏角質細胞の調製をスケールアップして、例２に記載のSCCEを含有する洗浄された足裏角質細胞のKCl抽出物を調製した。足裏角質細胞のKCl抽出物の調製の概略を以下の表３に模式的に示す。肥厚したヒト足裏角質層は、Society for Swedish Pedicyristsの協力によって収集した。クリップまたはカットによって得られた材料のみを用いた。落屑異常のある足からは材料の収集は行わなかった。郵送前に、角質層は風乾し、プラスチックの袋に収めた。実験室では使用時まで−20℃で保存した。
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それぞれの続くアフィニティークロマトグラフィーのためには、各50gの足裏角質層よりの２回のプレパレーションからの抽出物１および抽出物２をプールした。
3.2.  色素原性基質によるプロテイナーゼのアッセイ
阻害剤、アプロチニン、キモスタチン、硫酸亜鉛の効果、ならびに基質特異性に関して、SCCE、ウシキモトリプシン、およびヒトカテプシンＧの比較を行った。
蒸留水中にMeo−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA（Ｓ−2586）、１−メチル−２−ピロリドン中にSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNA（Boehringer,Mannheim,Germany）（インキュベーション混合物中の溶媒の最終濃度４％）、およびジメチルスルホキシド中にキモトリプシン（インキュベーション混合物中の溶媒の最終濃度１％）の保存溶液を調製した。化膿性ヒト唾液からのカテプシンＧはE.Lotti,Geneva,Switzerlandから入手した。SCCEの原料は、上述のようにして調製した解離足裏角質細胞のKCl抽出物とした。インヒビター、アプロチニン、キモスタチンおよび硫酸亜鉛の入手先は上述した通りであった。
インキュベーションはマイクロタイタープレート中37℃で実施した。総インキュベーション容量は135μｌとした。各インキュベーション混合物には、トリス塩酸塩pH8.0（最終濃度0.08M）、KCl（最終濃度0.2M）、基質溶液100μｌ、25μｌの酵素源（0.1Mトリス塩酸塩pH8.0、1.0M KCl中に適宜希釈）および10μｌのインヒビター溶液を含有させた。
図９、Ａ〜Ｃでは、MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA（Ｓ−2586、初期濃度1.2M）を基質として使用した。Ｄでは両基質の初期濃度は1.2Mとした。
インキュベーションの終了時（1.5時間）に、各ウエルに125μｌの10％酢酸を加え、ブランクとして酵素を添加しなかったインキュベーション混合物とともに405nmで吸収を読み取った。添加した酵素の量はインキュベーションの終了時において405nmの吸収に0.3〜0.7の変化を与えるように調整した。
結果は図９、Ａ〜Ｄにまとめた。インヒビターの影響の検討には、基質としてＳ−2586を用いた。SCCEおよびキモトリプシンのインヒビターとしてのアプロチニンの効率は高く、この２種の酵素でほぼ同じであった。他方、カテプシンＧの効果ははるかに低かった（図9A）。キモスタチンは３種の酵素すべての阻害を生じたが、50％阻害を生じるインヒビターの濃度は、キモトリプシンおよびカテプシンＧの場合よりもSCCEでは３桁大きかった（図9B）。硫酸亜鉛はSCCEの効率的インヒビターであったが、キモトリプシンおよびカテプシンＧでは効果的なインヒビターではなかった（図9C）。基質MeO−Suc−Arg−Pro−Tyr−pNA（Ｓ−2586）およびSuc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNAに対する３種の酵素の活性を図9Dに比較する。目的は調べた酵素の間の類似性および相違を見出すことであったので、これらの実験は、各基質について１つの初期濃度でしか実施しなかった。Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNAは、Ｓ−2586よりもキモトリプシンおよびカテプシンＧについては有意に良好な基質であることが明らかにされたが、SCCEでは逆の結果が見出された。
例  ４
角質層キモトリプシン酵素の精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定
4.1.  角質層のKCl抽出物からのSCCEの不溶化大豆トリプシンインヒビター（SBTI）上アフィニティークロマトグラフィーによる精製
図10にはSBTI上アフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。アフィニティーゲルは、50mgのSBTI（Boehringer,Mannheim,Germany）を12mlの沈降Affigel 15（BioRad,Richmond,CA）に、製造業者の説明書に従って連結して調整した。ゲル上の残った活性基はエタノールアミンでブロックした。100g（乾燥重量）の足裏角質層（総容量700ml）のからのKCl抽出物を合わせて、ガラスカラム中に充填されたSBTI−Affigel 15の床0.8×2cmを通し、42ml/hの流速で流し、溶出液の280nmにおける吸収を連続的に記録した。0.1Mトリス塩酸塩pH8、1M KClでカラムを、溶出液の吸収が0.01以下になるまで洗浄し、ついで10mlの0.1Mトリス塩酸塩pH8で洗浄した。１、10および100mMの塩酸で、結合した物質の段階的溶出を実施した。溶出液の吸収が0.01以下に低下したとき溶出液を変えた。3mlの分画を、溶出液のpHを７以上に調整するのに十分な量として計算された総容量0.4mlのトリス塩酸塩pHを含む試験管に集めた。各分画のpHを直ちにチェックし、必要ならば小容量の1Mトリス塩酸塩pH8で約７に調整した。Ｓ−2586（SCCEの基質）およびＳ−2288（トリプシン様酵素の基質）によるペプチド加水分解活性の分析は例2.1.の記載と同様に実施した。アッセイ混合物中の両基質の初期濃度は1.1mMとした。Ｓ−2586加水分解活性物の約90％がゲルに結合した。洗浄したゲルを10〜100mMの塩酸で段階的に溶出すると、適用したKCl抽出物の総Ｓ−2586加水分解活性物の約60％が回収された。総Ｓ−2288加水分解活性物のうち約20％がアフィニティーゲルに結合し、約10％が溶出液中に回収された。
図11には、SDSの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）およびザイモグラフィーによるSBTI−アフィニティークロマトグラフィーからの溶出液の分析を示す。非還元サンプルを
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1991および例２の2.2.も参照されたい。電気泳動の準備の前にサンプルはＡではUltrafree−MC−Filter（カットオフ10kD;Millipore,Bedford,MA）での遠心ろ過により20倍に濃縮し、Ｂでは10倍に希釈した。
図12には、SBTIアフィニティークロマトグラフィーからの非還元および還元サンプルのSDS−PAGEによる比較を示す。図10および11に示すように、SBTIアフィニティークロマトグラフィーでは、見掛けの分子量約25kDの非還元型および約28kDの還元型の蛋白質が90％以上の純度で生成した（クーマッシーブルー染色SDS−PAGEゲルから判定）。さらに、主成分より見掛けの分子量が約1kD大きい微量のクーマッシーブルー陽性成分が存在した。ザイモグラフィーゲル上では、非還元サンプルでのクーマッシーブルー染色ゲルにおける２つのバンドと同じ電気泳動移動度をもつ１つの主要バンドと１つの微小バンドが検出された。これらのカゼイン分解性成分はいずれもキモスタチンによって阻害された。さらに、ザイモグラフィーでは見掛けの分子量約30kDの微小成分が認められ、これはロイペプチンで阻害された。精製された主要蛋白質がSCCEであると結論された。
4.2.  SCCEのＮ末端アミノ酸配列のアッセイ
SBTI−Affigel 15よるクロマトグラムからのA280nm 0.2の一分画200μｌを還元または非還元SDS−PAGE用に調製し、12.5％ポリアクリルアミドゲル（厚さ1mm、スロット幅73mm）上に流した。電気泳動ののち、蛋白質を電気泳動的にImmobilonろ紙（Millipore）移し、Matsuidaira、1987に従いクーマッシーブルーで染色した。主要な蛋白質バンドを切り取り、Applied Biosystems 477Aパルス液相アミノ酸配列アナライザーおよびオンラインPTH 120Aアナライザー（Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA,USA）で処理した。配列決定は通常のサイクルプログラムおよび製造業者からの試薬を用いて実施した。標準蛋白質から計算した初期および反復収率は25％および97％であった。
アミノ酸誘導体の収率はただ１つのペプチドが配列決定されるように適合させた。非還元サンプルでは、１〜６工程の収率は良好であったが、工程７および９では収率は０に低下した。以後の工程の収率は著しく低かった。還元サンプルでも工程７および９ではアミノ酸誘導体は検出されなかったが、誘導体が検出できた以後の工程では急峻な収率の低下はなかった。結果は位置７および９におけるシステインの存在を示唆する。しかしながら、ヨード酢酸（100mM）での還元および処置後の工程７および９においてもカルボキシメチル化システインは検出できなかった。得られた配列（図13、配列番号:3）は還元および非還元サンプルで同一であった。
例  ５
5.1.  SCCE特異的モノクローナル抗体の調製
BALB/cマウス（Bomholtgaard,Denmark）に、例4.1.に記載のようにして精製されたネイティブSCCE約30μｇをフロインド完全アジュバント（Difco Laboratories,Detroit,MI）中に取り皮下注射として投与した。１月後、同量のSCCEのフロインド不完全アジュバント（Difco Laboratories,Detroit,MI）中注射を反復した。最初の注射から４月後に、１匹のマウスに連続して３日間、１回あたり30μｇの抗原を静脈内ブースター注射によって投与した。ハイブリドーマは、Carlssonら、1985に記載された方法により、SP2/0ミエローマ細胞系の細胞（ATCC CRL 1581）で生成させた。精製SCCEプレパレーションと反応する抗体の同定はELISA法によって行った。陽性クローンからの培養上清をSDS−PAGE後イムノブロッティングによりさらに分析した。この試験でSCCEと反応する抗体を産生するクローンをマウス腹水中で増殖させ、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、Carlssonら、1985に記載された方法で分類した。２つの有用な抗体、moabTE4bおよびmoabTE9bが得られ、いずれもIgG1−κに分類された。
免疫沈降およびイムノブロッティングによるmoabTE4bおよびTE9bの特性は図14に示す。
図14a（レーン２）は例3.1.に記載のようにして調製した解離足裏角質細胞の濃縮KCl抽出物でのクーマッシーブルー染色SDS−PAGEゲルを示す。サンプルは0.1M酢酸ナトリウムpH4に対して４時間透析し、限外ろ過によって約10倍に濃縮したのち電気泳動用に調製した。図14a（レーン３）は例4.1.に記載のようにして精製したSCCEプレパレーションを示す。
図14bは、抗体を角質細胞のKCl抽出物とインキュベートし、ついで不溶化プロテインＡで回収した場合のイムノブロッティングの結果を示す。再可溶化して解離させた抗原−抗体複合体は例２の記載のようにしてザイモグラフィーで分析した。
限外ろ過によって約５倍に濃縮した解離足裏角質細胞のKCl抽出物250μｌをリン酸緩衝食塩溶液に対して透析し、これに最終濃度10mg/mlになるようにウシ血清アルブミン（Sigma,St.Louis,MO）を添加し、10μｌの抗体溶液またはリン酸緩衝食塩溶液と混合して４℃で15時間インキュベートした。次に試験管に25μｌの沈降プロテインA Sepharose（Pharmacia,Uppsala,Sweden）を加え、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベーションを続けた。ゲルを遠心分離によって回収し、0.05Mトリス塩酸塩pH7.5、0.5M NaCl中、0.05％Tween 20（Sigma,St.Louis,MO）1mlで５回洗浄した。最終洗浄後に、ゲルを、還元剤を含まないLaemmliのサンプル緩衝液100μｌにより室温で１時間抽出した。抽出液を遠心分離によって澄明とし、ゲルに適用した。
MoabTE4bおよびTE9bの両者は、精製SCCEおよびKCl抽出物中の相当する主要カゼイン分解酵素と同じMrをもつカゼイン分解酵素を沈殿させた。これらの抗体は抽出物中のMr約30kDaの微小カゼイン分解酵素は沈殿させなかったが、これらはトリプシン様セリンプロテイナーゼのインヒビターであるロイペプチンによって阻害されることが明らかにされている。25kDaのカゼイン分解酵素に加えて、これらの抗体はMr約80kDaの微小蛋白分解成分に結合するようであった。この成分は、製造前に乾燥させた組織から精製された足裏角質細胞のKCl抽出物中に通常存在し、新鮮な組織からのプレパレーションには認められない（T.Egelrud,未発表所見）。アフィニティークロマトグラフィーにより精製したSCCEプレパレーション中には存在せず、凝集生成物であろうと思われる。抗体と反応性の相当する成分はイムノブロットでは検出できなかった。
非還元条件下に行ったSDS−PAGEのイムノブロット上で（図14c）においてmoabTE4bおよびTE9bは、足裏角質細胞のKCl抽出物中（図14cレーン２および４）および精製SCCEプレパレーション中（図14cレーン３および５）に存在する成分と反応し、それらはいずれもザイモグラム上の主要精製蛋白質および主要カゼイン分解成分と同一のMrを示した。これらの抗体は、SDSの存在下に還元されたサンプルとは反応せず、これらはコンフォーメーション依存性エピトープに向けられていることが示唆された。
非還元型でMr約25kDの主要蛋白質に加えて、精製されたSCCEプレパレーションはMr約25kDのクーマッシー陽性成分を含有する（非還元型、例３参照）。ザイモグラム上には相当するカゼイン分解成分が存在し、主要な25kDのカゼイン分解成分と同様な方式でキモスタチンによって阻害できる（例３参照）。moabTE4bおよびTE9bのさらに高い濃度でも（結果は示していない）この微小成分はイムノブロット上抗体と反応することが観察できた。同様な結果が（示していない）、プレパラティブ電気泳動によって精製された主要クーマッシー陽性成分に対して作成されたポリクローナルウサギ抗体でも得られた。SCCE様活性をもつこの２つの蛋白質と見掛けの免疫学的交差反応の正確な関係はわかっていない。
5.2  ポリクローナルSCCE特異的抗体
5.2.1.  ニワトリ抗−SCCE
例4.1.に記載のようにSBTI−アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたSCCE 45μｇを0.2mlの0.1Mトリス塩酸塩中において、60℃で60分間熱変性させたのち、等容量のフロインド完全アジュバント（Difco Laboratories）中にホモジナイズした。得られたエマルジョンを約20週齢のDercoニワトリに皮下注射し、免疫前血清の調製のために血液サンプルを採取した。ニワトリには、３、５および７週後にフロインド不完全アジュバントと30μｇの精製、熱変性SCCEを用いるほかは同様に調製したエマルジョン（各エマルジョン250μｌ）をさらに皮下注射によって投与した。最後の注射から２週後にニワトリから採血した。血液は直ちに２容のAlsever溶液（100mlあたり、1.87gグルコース、0.8gクエン酸ナトリウム、0.62g食塩、クエン酸でpH6.1とする）と混合し、遠心分離した。さらに検討するために選択されたトリ抗−SCCEはイムノブロッティングの実験では1/2000に希釈して使用した。抗血清の特異性の例示は図17および例８を参照されたい。
5.2.2.  ウサギ抗−SCCE
SBTI−アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたSCCEを厚さ15mmのゲル上、Laemmli、1970に従い例4.1.に記載のようにして非還元SDS−PAGEに付した。SCCEであることが前に明らかにされた主要蛋白質をLeeら、1987の塩化銅染色法によっ可視化し切り取った。Leeらに従い、EDTAで塩化銅を除去したのち、ゲルスライスをリン酸緩衝食塩溶液中にホモジナイズした。ホモジナイズしたゲルスライスのサンプルを等容のフロインドのアジュバントに懸濁した。この方法で完全アジュバント中に調製された純粋なSCCE、約30μｇをウサギに皮下投与した。３、５および７週後に、同量のSCCEの注射を、この場合には不完全アジュバントとともに、反復して実施した。最後の注射から２週後に、ウサギから採血した。得られたウサギ抗−SCCE（Ｄ−５）を500〜1000倍に希釈して、アルカリホスファターゼ接合抗−ウサギ免疫グロブリンを第二の抗体として用いるイムノブロット実験に使用した。
すべてのイムノブロット実験で、結合した第二の抗体が、Blakeら、1984に従い検出された（例５、８および９参照）。
ウサギ抗−SCCE Bo−１は、SDS−PAGEの前に還元したSCCEを抗原として用いたほかは同様にして調製した。
5.3.  モノクローナル抗体による免疫組織化学的検討
SCCE特異的モノクローナル抗体による免疫組織化学的検討で、SCCEはヒト角化扁平上皮（表皮、毛嚢の内部毛根鞘、硬板層）の高い上基底細胞に検出できたが、非角化扁平上皮（毛嚢の内部毛根鞘、口唇および頬粘膜）には検出できなかった。すなわち、SCCEは角化扁平上皮に特異的に発現するものと考えられる。さらに、SCCEはインビトロで構築されたヒト表皮の高い上基底細胞で発現され、空気−水の界面に増殖することが見出された。角化細胞の増殖を刺激したが角質層の形成は阻害しなかった濃度のレチノイン酸を培地に添加するとSCCEはもはや発現しなかった。これは、SCCEの発現が表皮分化プログラムの一部であることを示唆するものである。
SCCE特異的モノクローナル抗体の免疫電子顕微鏡による実験の結果は、デスモソームの分解におけるSCCEの役割、すなわち落屑における役割と合致するものであった。抗体は最上層顆粒細胞と最下層の角質層細胞の間への分泌を受けている積層板を特異的に標識するが、角質層では抗体は細胞空間でデスモソームと密接に会合しているエピトープを認識した。
例  ６
ヒトSCCEをコードするcDNAのクローニングおよび配列決定
制限酵素はPromega,Madison,MIから、TAQ−ポリメラーゼはPerkin−Elmer−Cetus,Norwalk,CTから入手した。表皮起源のヒト成人角化細胞から誘導されたmRNAより調製したλgt11ヒト角化細胞cDNAライブラリーはClontech Laboratories,Palo Alto,CA（カタログ＃EL1045b）から得た。最初にライブラリーを抗−SCCEウサギポリクローナル血清Ｄ−５とBo−１（例5.2.2.参照）でスクリーニングした。Bo−１ポリクローナル抗−SCCE血清は高いバックグランドシグナルを与えたので、広範なスクリーニング研究から初期の段階で除外した。Ｄ−５抗血清を用いて、真の陽性プラークと予想される多数の免疫反応性プラークを濃縮した。いずれのプラークにもモノクローナル抗体moAb4およびmoAb9との反応性は認められなかった。単離された11個のプラークについての広範な制限酵素による特徴づけおよびRCRでの特性表示により、各種のプラーク間に類似性は検出できないことがわかった。このような部分類似性の存在は、プラークが同じcDNA配列からの相同なDNA挿入体を含むことを指示するものである。確かなSCCE cDNA配列の「指紋」の特定のこの失敗に基づいて、戦略を変更した。
プローブとして縮重合成オリゴヌクレオチドを用いて、プラークハイブリダイゼーションにより、プラークを大腸菌Y1090（Clontech）内でスクリーニングした。オリゴヌクレオチドプローブは、例4.2.に記載のネイティブSCCE酵素の実験的に決定されたアミノ末端配列に基づいて設計した。そのアミノ酸配列の最も信頼できる部分、Ile−Ile−Asp−Gly−Ala−Pro（配列番号:3、aa1〜aa6）を合成17−マーオリゴヌクレオチドプローブ、５′−ATHATHGAYGGNGCNCC−３′（Ｈ＝Ａ、ＣまたはT;Y＝ＣまたはT;N＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）の構築に選択した（SYM3067と命名した。配列番号:4）。オリゴヌクレオチドプローブはBeckman 200A DNAシンセサイザーを用い、販売業者の指示書に従いホスホラミダイト法で合成した。
大腸菌Y1090細菌は、0.2％マルトースおよび10mM MgSO4を含有するLB培地（Sambrookら、1989）中で一夜増殖させた。ついで、0.4mlの培養液を希釈ライブラリーファージ株と混合し、37℃で20分間吸着させた。感染培養液を6mlの軟アガール（LBおよび10mM MgSO4中0.75％アガロース）と混合した。軟アガール混合物を10個の150mm LAプレート上に注いだ。プレートを37℃で５時間インキュベートし、４℃に一夜放置した。プレートは総計約４×105のプラークを含有した。
プラークの固定化には、各プレートを、NEN DuPont Colony/Plaque Screen膜（DuPont,Wilmington,DE）で２分間覆った。膜を0.5M NaOH中で２分間ずつ２回、トリス塩酸塩pH7.5中で２分間ずつ２回濯ぎ、風乾した。これらの膜はついで以下に記載するハイブリダイゼーション実験に使用した。膜は100mg/mlのニシン精子DNA（Sigma,St.Louis,MO）を含有する10％デキストラン硫酸、1M NaCl、１％SDS溶液中、65℃で５時間プレハイブリッドした。プローブ、SYM 3067をT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega,Madison、WI）を用いて［γ−32P］dATP標識し、プレハイブリダイゼーション混合物に加えた。ハイブリダイゼーションは42℃で12〜18時間行った。
ハイブリダイゼーション後に、膜を２×SSC中室温で５分間ずつ４回、２×SSC、１％SDS中42℃で30分間ずつ２回、最後に0.1SSC中室温で30分間洗浄した。膜はＸ線フィルム（Hyperfilm−MP,Amersham,UK）上オートラジオグラフィーに付した。14個の陽性プラークが一次スクリーニングで同定された。これらの陽性プラークを、上述の場合と同じプローブおよび同じ方法を用いて再スクリーニングした。再スクリーニング操作後、２つの陽性プラークが同定された。この２つの選ばれたプラークをさらに一度精製し、挿入体のサイズを、プライマーとしてSYM 1600およびSYM 1601を、鋳型として単離されたファージを用いてPCRによって測定した。これらの２つのプライマーはそれぞれ、λgt11ファージの左および右アームと相補性である。ファージA 6.2.2から生成した約0.9kbの増幅DNAフラグメントを次にEcoR Iで消化し、EcoR Iで消化したpUC19（Pharmacia,Uppsala,Sweden）、pS496中にクローニングした。このクローニングされたフラグメントはpUC19に相補性の配列プライマーを用い部分配列分析に付した。ヌクレオチド配列はT7配列決定キット（Pharmacia,Uppsala,SwedenまたはUSB,Cleveland,Ohio）を用いて決定した。
得られたDNA配列の翻訳により実験的に決定された蛋白質配列と相同なアミノ酸配列が得られた。しかしながら、この配列は翻訳開始コドンを欠いていた。完全長cDMAを単離するために、得られたDMAフラグメントをアガロースゲル上で分離して、緊縮条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするプローブとして使用した。このプローブはマルチプライムDMA標識系（Amersham,UK）を用い、以下の操作によって32P標識した。ゲル1gあたり3mlの割合で水を加え、沸騰水浴中に７分間置いてゲルを融解させDMAを変性させた。試験管を37℃の水浴に移し、少なくとも10分間置いた。約25ngのDMAを含有する１容のDMA/アガロース溶液を供給者の説明書に従い標識反応に添加した。
完全長cDMAを得るためには、このプローブによりcDMAライブラリーを緊縮条件下65℃でハイブリダイゼーションを行なったほかは上述の場合と同じ方法を用いて２回再スクリーニングした。これらの実験により45個のそれぞれ陽性のプラークが同定され単離された。これらを最初、PCRプライマーとして、
SYM 1600（５′−GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC−３′；配列番号:5）
または
SYM 1601（５′−ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG−３′；配列番号:6）
をSY 3208と組み合わせて使用し、PCR分析によってスクリーニングして、全５′オープンリーディングフレームを含むプラークを同定した。
SCCE cDMAの５′部分に少なくとも一部が相補性であるSYM 3208,5′−TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA−３′，配列番号:7は、pS496から獲得されたDMA配列情報に基づいて設計された。このスクリーニング後に、４つのファージが更なる分析のために選択された。配列分析には、これらのファージに由来する得られたPCR増幅フラグメントを上述のようにしてpUC19にクローン化した。得られた結果は、ファージの一つ、205.2.1が完全長の挿入体を含有することを指示するものであった。
ファージ単離体205.2.1からのDMAはSambrookら、1989に従って調製し、このDMAプレパレーションをEcoR Iで消化した。消化したDMAをアガロース電気泳動によって分離し、約1kbのフラグメントを単離し、EcoR Iで消化したpUC19中にクローニングした。得られたプラスミドはpS500と命名した（図15）。cDMAフラグメントの完全ヌクレオチド配列は上述のようにして決定した。配列決定反応のプライマーとしては、pUC19もしくはSCCE配列に相補性の特異的オリゴヌクレオチドを使用した。このヌクレオチド配列（配列番号:1）は、シグナルペプチドおよびプレポリペプチド（配列番号:2）を含む253個のアミノ酸から構成されるSCCE前駆体蛋白質の全アミノ酸配列をコードするのに十分なオープンリーディングフレームを含有した。
106.1.2と命名した他のファージは、５′−非翻訳領域と最初の３つのコドンを欠くSCCE cDMA配列を含有することが分かった。この挿入体を954bpのEcoR Iフラグメントとして単離し、EcoR Iで線状化したpUC19中にクローニングし、プラスミドpS498が得られた。このプラスミドは部分的に配列を決定した。
108.1.2と命名した第三のファージも、５′−非翻訳領域と翻訳領域の７つのヌクレオチドを欠くSCCE cDMA配列を含有することが分かった。このcDMA挿入体は３′−非翻訳領域の長い変異体であり、停止コドンの1057bp下流まで延長されていた。この1884bpのEcoR Iフラグメントを単離し、EcoR Iで線状化したpUC19中にクローニングした。得られたプラスミドは完全に配列を決定して、PS501と命名した。
例  ７
ヒト表皮におけるSCCE mRNAの検出
ヒト表皮から総RNAの調製
これは、Chomczynski ＆ Sacchi,1987に従って実施した。形成外科から非疾患ヒト腹部皮膚を入手した。除去直後に氷上で冷却した。15分以内にメスで薄層を削り取って表皮を回収し、溶液Ｄ（Chomczynski ＆ Sacchi,1987）に浸漬してガラスホモジナイザーによってホモジナイズした。以下、Chomczynski ＆ Sacchiに記載されたプロトコールに従った。ペレット化した総RNAは70％エタノール中−20℃に、さらに分析するまで保存した。
メッセンジャーRNAの調製
500μｇの総表皮RNAをPoly A Tract−kit（Promega）により、供給者の説明書に従って処理した。
RNAの電気泳動およびブロッティング
アガロースゲル（1.4％）は１×MOPS緩衝液中0.66Mフォルムアルデヒドおよび0.6g/mlエチジウムブロミド（Sigma,St.Louis,MO）で調製した。100μｇ総RNAに相当するmRNAをRNAサンプル緩衝液（50％ホルムアミド、2.2Mホルムアルデヒド、３％Ficoll,1×MOPS）中に溶解し、適用前に60℃に５分間加熱した。RNAマーカー（BRL,Gaithersburg,MD）は同様に処置された。電気泳動後、ゲルを蒸留水中で５分間、ついで50mM NaOH中で30分間、0.1Mトリス塩酸塩pH7.5中で30分間濯いだ。GeneScreen Plus膜（NEN DuPont,Wilmington,DE）へのブロッティングはVacu−Gene装置（Pharmacia,Uppsala,Sweden）により10×SSC中で１時間行った。膜をついで３×SCC中で洗浄し、一夜乾燥し、80℃に２時間加熱した。RNAはUV光下に膜上に可視化された。
cDMAプローブ
例６に記載したようにして調製されたプラスミドpS501を、Hinc IIおよびBgl IIで消化した。このcDMAは、bp No 1060に１個のHinc II部位およびbp No 1715に１個のBgl II部位を含有する。1070bpフラグメント（pUC19中のHinc II多重クローニング部位〜内因性Hinc II部位）は、５′末端の7bpを除くSCCEコード領域をこれまでに単離されたすべてのSCCE−cDMAに共通のbp 944〜951のポリアデニル化部位を含めて含有する。ポリＡテールを含まない655bp Hinc II〜Bgl IIフラグメントはSCCE−cDMA 108−１−２に独特である。フラグメントをアガロース電気泳動により精製し、マルチプライムDMA標識キット（Amersham,Buckinghamshire,UK）での32P dCTP標識プローブの製造に使用した。
ハイブリダイゼーション
膜は１×TE中１％SDSと30分間煮沸し、１％SDS、1M NaCl、10％デキストラン硫酸、ニシン精子DMA 0.1mg/ml中60℃で３時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは同じ溶液中60℃で一夜行った。洗浄は２×SCC中１％SDS、60℃で２×30分および0.1×SCC中室温で３時間行った。ついで膜をオートラジオグラフィーに付した。
結果：
ヒト表皮中におけるサイズ約1.2kbおよび2.0kbの２つのmRNA種の存在を明らかにすることができた（図16）。これは２種類のcDMAが見出されたクローニング実験で得られた証拠とよく一致した。
例  ８
組換えSCCEの大腸菌内での発現
pGEX−2T/SCCEプラスミドの構築
1.センスPCRプライマー
0003542804.tif 000014
SYM 3667;配列番号:8、下線を付した活性ネイティブSCCEのＮ末端アミノ酸IIDGAPCをコードする３′−部分、BamH I部位とX a因子部位IEGRをコードする付加配列をもつ５′−部分。
0003542804.tif 000015
SYM 3368;配列番号:9、下線を付したアミノ酸配列LETAGEEをコードする完全SCCE−cDMA配列中塩基対76〜96に相当する３′−部分、５′−部分は1aに同じ。
2.アンチセンスPCRプライマー
0003542804.tif 000016
SYM 3371;完全SCCE−cDMA配列、配列番号:1中塩基対285〜304に相補性、bp294にSac I−部位を有する。
pS498の配列（例６）をプライマー1a/2および1b/2によりPCR増幅した。得られた生成物は、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製し、BamH I/Sac Iで消化し、アガロース電気泳動によって精製した。ついで、これらを、BamH I/EcoR Iで消化したpGEX（Pharmacia）中に、pS498のEcoR IおよびSac I消化によって得られたSCCE 106−１−２の３′の673塩基対とともに、TG2細胞内でクローニングした。発現研究に使用した細菌クローンから、プラスミド（X a因子部位の次にネイティブＮ末端をコードするpS510ならびにX a因子部位の次に提案されたプロペプチドをコードするpS511）が単離され、PCR生成物から誘導される挿入体に相当するヌクレオチド配列が、T4シーケンシングキット（Pharmacia,Uppsala,Sweden）を用いたジデオキシチェーンターミネーション法でチェックされた。
発現研究
カルベニシリン（Sigma,St.Louis,MO）50μg/mlを含有するLB培地中、TG2細胞をpS510およびpS511とともに一夜培養した液を新鮮な培地で10倍に希釈し、37℃で３時間増殖させた。IPTG（Sigma,St.Louis,MO）を最終濃度0.1mMになるように添加し、培養体をさらに37℃で３時間増殖させた。細菌ペレットをPBS中トリトンＸ−100（Sigma,St.Louis,MO）中で超音波処理した。10,000×ｇで15分間遠心分離したのちに、上清およびペレットをSDS−PAGEおよびポリクローナルSCCE特異的トリ抗血清によるイムノブロッティングで分析した。
SCCE様免疫反応性を有し、Mr約50kD（pS510）および約52kD（pS510）のITPG誘導可能蛋白質が大量に、PBS−トリトンＸ−100に不溶性のペレット中に見出された（図17参照）。
PBS−トリトンＸ−100中での超音波処理後の上清は、不溶性ペレット中の場合と同サイズのGST/SCCE融合蛋白質を含有していたが、その量は不溶性ペレットに比較して少量であった。
これらの結果は、SCCEがGSTとの融合蛋白質として発現できること、プレプロSCCEアミノ酸配列中の特異的プロテアーゼ切断部位に相当する配列は細菌内で組換えSCCEを製造する意図でこの実験の反復を可能にすることを示している。製造された蛋白質は尿素またはグアニジウム塩酸塩中に溶解することが可能であり、ついでSCCEの高い等電点により陽イオン交換クロマトグラフィーで精製できる。精製された蛋白質は変性剤の濃度が低い緩衝液に対し透析することにより再生し、ついでX a因子で切断してSCCEまたはプロSCCEからGSTポリペプチドを放出させることができる。GST/SCCE融合蛋白質は、SCCE特異的抗体の製造のための免疫原として、また抗体精製におけるイムノソーベントとしても使用することができる。
例  ９
哺乳動物細胞内における組換えヒトSCCEの発現
組換えSCCEの製造のための発現ベクターの生成には、ヒトcDMA配列をプラスミドpS500から897bp EcoR I/Dra Iフラグメントとして単離した。このフラグメントをEcoR IおよびSma Iで消化したpUC19中にサブクローニングして、プラスミドpS502を得た。プラスミドpS502をついでEcoR IおよびSal Iで消化してSCCE cDMA配列を0.9kbフラグメントとして単離し、これを再度Hind III部位を欠くpUC19変異体にサブクローニングして、プラスミドpS503を得た。このpUC19変異体は、pUC19のHind III消化、クレノウ酵素を用いる充填および再ライゲーションによって生成させた。発現ベクター中へのクローニングを容易にするためには、Hind III部位をSCCE cDMAの５′末端に導入した。これはpS503のEcoR I消化およびその部位をHind IIIに変換するリンカー、SYM 3603、５′−AATTGTGGAAGCTTCCAC−３′配列番号:10の挿入によって行った。SCCE cDMAの蛋白質コード部分を繋留し、Hind III部位を５′末端に、Sal I部位を３′末端にそれぞれ有する得られたプラスミドはpS505と命名された。
最終の発現ベクターは３種の異なるDMAフラグメントのライゲーションによって得られた。最初にpS505をHind IIIおよびSal Iで消化して0.9kbフラグメントを単離した。
第二に、マウスメタロチオネイン上流調節要素の遠位部分ウシパピローマウイルス配列、mRNA処理シグナルを提供するウサギβグロビンゲノムフラグメントおよびプラスミド配列pML2dを与えるために、大腸菌内での選択および複製を可能にするために（Waldenstromら、1992）、ベクターpS147をSac IおよびSal Iで消化し、約12kbのフラグメントを単離した。
第三に、マウスメタロチオネインプロモーターの近位部分を単離するために、リーダー配列内に位置するネイティブなBgl IIがHind III部位に変換されているプラスミドpS42をSac IおよびHind IIIで消化し、約220bpフラグメントを単離した。
これらの３つのフラグメントのライゲーションにより、SCCE発現ベクターpS507（図18参照）が生成した。
発現ベクターpS507をHarvey肉腫ウイルス５′長末端リピートにより駆動されるネオマイシン抵抗性遺伝子を含むベクターおよびSV40ポリアデニル化シグナル（Lusky ＆ Botchan,1984）とともにマウスC127細胞（ATCC CRL 1616）にコトランスフェクトした。トランスフェクション実験は、リン酸カルシウム沈降法（Graham ＆ Van der Eb,1973）に従って実施した。細胞は、10％ウシ胎児血清（HyClone,Logan,UT）を補充したハムF12/ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM;Gibco BRL,Gaithersburg,MD）（1:1）中で培養した。ネオマイシン抵抗性細胞クローンを1.5ng/mlのG418（Gibco BRL）で選択し、選択から10〜15日後に、抵抗性細胞クローンを同定し、マスタープレートから単離し、以後の分析のために継代培養した。
組換えSCCE遺伝子の発現を分析するため、単離された細胞系から総RNAを調製した。総RNAはC127細胞から調製し、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、32P標識SCCEプローブにハイブリダイズした。プローブは、pS500のHinc II消化およびアガロース電気泳動によって単離されたSCCE cDMAの1070bp Hinc IIフラグメントとした。実験操作はAusubelら、1992に従った。ノーザンブロット実験、ならびに32P標識SCCE cDNAとのハイブリダイゼーションで、組換えSCCE mRNAはSCCEベクター、pS507を繋留する数種の細胞系において検出可能であることが示された。SCCE cDNAを含まないほかは同一のベクターを含有するC127細胞に由来する対照サンプルではハイブリダイゼーションは認められなかった（図19）。1.4kBのサイズは期待されたサイズに相当する。
条件細胞培養培地のサンプルを収穫し、イムノブロッティングによって分析した。SDS−PAGEはLaemmli（1970）に従って実施し、イムノブロッティングについては、トリ抗−ネイティブSCCEを検出抗体として使用した。アルカリホスファターゼ標識抗−トリIgG（Sigma,St.Louis,MO）を酵素標識に使用した。結果は図20に示す。
組換えSCCEの発現を分析するため、総RNAを、発現ベクターpS507でトランスフェクトしたC127細胞から調製した。対照サンプルとして、総RNAは、非トランスフェクトC127細胞および発現ベクターpS147によりトランスフェクトしたC127細胞の両者から調製した。ベクターpS147は、ヒトSCCE cDNAに代えてヒト胆汁塩刺激リパーゼのcDNA（Nilssonら、1990）を含有するほかは、pS507と類似する。RNAがAusubelらの方法により調整された。ノーザンブロット実験、ならびに32P標識SCCE cDNAとのハイブリダイゼーションによって、約1.4kbの組換えSCCE mRNAが、SCCEベクター、pS507を繋留するC127細胞において検出可能であることが示された（図19）。pS147を含むC127細胞系または非トランスフェクトC127細胞に由来する対照サンプルではハイブリダイゼーションは認められなかった。
条件細胞培養培地のサンプルを収穫し、SDS−PAGEおよびイムノブロッティングによって分析した。ブロットはBlakeら、1984の記載のようにして展開した。得られた結果（図20参照）は、pS507を繋留するC127細胞が、例５に記載したようにして調製されたすべての利用可能なポリクローナルウサギおよびトリSCCE抗体ならびに抗−SCCEモノクローナル抗体と反応する３種の蛋白質を産生することを示している。組換えSCCE反応性蛋白質は精製されたネイティブヒトSCCEよりも約1kDa大きい見掛けの分子量を示す。この組換え蛋白質は蛋白分解活性を示さない。推定されるSCCEアミノ酸配列を、実験的に決定されたネイティブヒトSCCEのNH2末端および他のキモトリプシン様プロテアーゼと比較した結果、C127細胞中で産生された組換えSCCEはそのプロ酵素型であると結論することができた。配列データは、このプロ酵素が配列...AQGDKIIDGAP....,におけるリジンのＣ末端側で蛋白分解的に切断されることによって活性化できることを指示している。下線を付した配列は活性なネイティブヒトSCCEのNH2配列（配列番号:2、aa5〜aa6）である。
例  10
組換えSCCEの精製および特性
精製
1.3mgのネイティブなSCCEに対するモノクローナル抗体TE4bを1.5mlのCNBr活性化Sepharose（Pharmacia−LKB Biotech,Uppsala,Sweden）に製造業者によって記述された方法を用いてカップリングした。SCCEを含有する培地40mlを0.45μｍのフィルターを通してろ過し、ついでカラムに適用した。カラムを10mMリン酸ナトリウム、150mM食塩、pH7.2で数回洗浄し、0.1Mグリシン塩酸塩、pH2.5で溶出した。溶出した蛋白質には、直ちに0.1容の1Mトリス塩酸塩、pH8.0を加えて中和した。
活性化
モノクローナル抗体をカップリングしたゲル（上記参照）を用いて精製した組換えSCCE（200μｌ中4.6μｇ）を4.6μｌの0.1mg/mlトリプシン（重量比10:1）により37℃で消化した。サンプル（50μｌ）を20分、１時間、３時間および20時間に採取し、５μｌの10μＭ（４−アミジノフェニル）メタンスルホニル（APMSF;Boehringer Mannheim,Germany）を添加して反応を停止させた。切断されたSCCEの活性は例2.2.に記載のようにカゼインゲル上非還元SDS−PAGEによりアッセイした。得られた切断型SCCEの同一性は還元SDS−PAGE、ついでイムノブロッティングにより、トリ抗−ネイティブSCCEついでアルカリホスファターゼ標識抗−トリIgGおよびアルカリホスファターゼの基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を用いてアッセイした。
Ｎ末端アッセイ
アフィニティー精製（上述のように）SCCE、約35μｇを、Bio−Dot SFユニット（Bio−Rad,Richmond,CA）を用いImmobilon膜（Millipore,Bedford,MA）上でスロット−ブロットした。ついで、膜を数回蒸留水で洗浄してトリスおよびグリシンをすべて除去した。蛋白質が結合した膜の部分を切断し、Applied Biosystems（Foster City,CA）477Aパルス液相シーケンサーおよびオンラインPTH 120Aアナライザーを用いて配列決定を行った。配列決定は通常のサイクルプログラムおよび製造業者からの試薬によって実施した。最初の６個の位置について得られた配列は、配列番号:2のアミノ酸−７〜−２に相当するglu−glu−ala−gln−gly−aspであった。この結果から結論できるように、シグナルペプチドは22個のアミノ酸から構成され、ネイティブな活性SCCEのＮ末端アミノ酸配列に基づき、プロペプチドは７個のアミノ酸から構成される。
脱グリコシル化
精製された組換えSCCE（５μｇ）、およびネイティブなSCCE（20μｇ）を、20μｌの0.5％SDSおよび0.1Mβ−メルカプトエタノール中３分間煮沸した。サンプルをリン酸ナトリウム、pH8.6およびNonidet P−40で最終濃度それぞれ0.2Mおよび1.25％に希釈した。Ｎ−グリコシダーゼ（登録商標）（Boehringer Mannheim）を加え（組換え蛋白質については0.6単位、ネイティブ蛋白質については1.2単位の酵素）、反応混合物を37℃で一夜インキュベートした。サンプルアッセイ中SDSの最終濃度は0.17％であった。Ｎ−グリコシダーゼ（登録商標）処理SCCEを上述のように８〜18％SDS−PAGE、ついでイムノブロッティングによって分析した。得られた結果は、２つの上方のバンドの見掛けの分子量の低下したが、最も下のバンドの見掛けの分子量は変化しなかった（図23）。これはC127細胞中で産生された組換えSCCEは２つのＮ−グリコシル型と１つの非グリコシル型で存在することを示している。この結果は活性なネイティブSCCEでみられる結果と同じである（図23）。
例  11
SCCEからなる組成物
組成物は、活性化合物と他の成分を完全に混合することを含む慣用の製薬技術によって製造できる。パーセントはすべて重量％である。
２種以上の活性化合物からなる組成物も本発明の範囲内にある。したがって、以下の実施例は２種以上の活性物質を包含するものと解釈することができる。同様に、「SCCE」の語は「プロSCCE」の語で置換できる。すなわちSCCEならびに「プロSCCE」からなる組成物も本発明の範囲内にある。
SCCE＝ネイティブまたは組換え角質層キモトリプシン酵素、他の活性化合物と結合していてもよい
q.s.＝十分量
クリームo/w                                     ％
SCCE                                    0.01−20
ポリソルベート                               0.5
乳化ワックス                                  ５
鉱油                                          ４
ジメチコン                                    １
グリセリルステアレート                        ６
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
グリセリン85％                                ４
プロピレングリコール                          ７
pH調整剤                                0.01−10
水                                        65−76
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤、乳化系（油相および水相の比率ならびに乳化剤および他の関連賦形剤の量）。
クリームo/w
％
SCCE                                    0.01−20
セチルアルコール                             0.5
ラノリン                                      ５
白色ワセリン                                  10
鉱油                                          45
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                          １
pH調整剤                                0.01−10
防腐剤                                      q.s.
水                                        ５−25
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤、乳化系（油相および水相の比率ならびに乳化剤および他の関連賦形剤の量）。
軟膏
％
SCCE                                    0.01−20
ラノリン                                      15
ワセリン                                  ８−68
鉱油                                          15
ジメチコン                                    ２
抗酸化剤                                    q.s.
変動可能な因子の例：抗酸化剤
リニメント
％
SCCE                                    0.01−20
乳化ワックス                                  ４
グリセリルステアレート                        ３
鉱油                                          15
ポリソルベート80                             0.6
グリセリン85％                                ３
プロピレングリコール                          ５
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
水                                        ９−69
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤、乳化系（油相および水相の比率ならびに乳化剤および他の関連賦形剤の量）。
ゲル
％
SCCE                                    0.01−20
トリエタノールアミン                      １−５
エチルアルコール                              10
セチルアルコール                              10
セルロースガム                                ５
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
水                                        59−74
変動可能な因子の例：ゲル形成剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。
溶液、水
％
SCCE                                    0.01−20
pH調整剤                                0.01−10
セチルアルコール                              ４
プロピレングリコール                          ５
防腐剤                                      q.s.
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
水                                        37−89
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。再脂肪化剤、湿潤剤
溶液、エチルアルコール
％
SCCE                                    0.01−20
pH調整剤                                0.01−10
プロピレングリコール                          ５
セチルアルコール                              ３
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
エチルアルコール                          50−95
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、湿潤剤
懸濁剤
％
SCCE                                    0.01−20
カルボマー                                   0.5
セルロースゴム                               0.5
ポリソルベート80                             0.1
プロピレングリコール                          ５
アスコルビン酸                              0.05
セチルアルコール                              ４
ポリソルベート                              q.s.
EDTA                                         0.1
pH調整剤                                0.01−10
水                                        72−80
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤、懸濁剤。
ペースト
％
SCCE                                    0.01−20
ワセリン                                  45−55
酸化亜鉛                                      40
鉱油                                          ５
抗酸化剤                                    q.s.
変動可能な因子の例：抗酸化剤、ペースト剤。
スティック
％
SCCE                                    0.01−20
キュティナLM                              70−80
ミリスチルアルコール                          ５
ヒマシ油                                      ２
蜜蝋、白色                                    10
白色ワセリン                                  ３
抗酸化剤                                    q.s.
変動可能な因子の例：抗酸化剤、スティックベース。
スプレー、手動式
％
SCCE                                    0.01−20
pH調整剤                                0.01−10
エチルアルコール                              30
グリセリン85％                                ５
プロピレングリコール                          ５
セチルアルコール                              ３
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
水                                        22−57
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。再脂肪化剤、湿潤剤
スプレー、エアゾル溶液
％
SCCE                                    0.01−20
pH調整剤                                0.01−10
イソプロピルミリステート                      ３
プロピレングリコール                          ５
エチルアルコール                          48−92
噴射剤                                      q.s.
変動可能な因子の例：再脂肪化剤、湿潤剤
スプレー、泡状エアゾル
％
SCCE                                    0.01−20
ワックス                                      ３
エチルアルコール                          50−55
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
水                                        20−35
噴射剤                                      q.s.
変動可能な因子の例：噴射剤、抗酸化剤、キレート剤
スプレー、エアゾルエマルジョン手動式
％
SCCE                                    0.01−20
セルロース誘導体                          １−３
Tween(R)60                                   1.0
グリセリルステアレート                       2.5
カリウムソルベート                           0.2
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
pH調整剤                                0.01−10
水                                        50−95
噴射剤                                      q.s.
変動可能な因子の例：抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。乳化系（油相および水相の比率ならびに乳化剤および他の関連賦形剤の量）。
シャンプー
％
SCCE                                    0.01−20
ラウリル硫酸ナトリウム                        40
セチルアルコール                              ３
起泡剤またはコンディショナー                  ３
食塩                                          ２
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
水                                        43−53
変動可能な因子の例：シャンプーベース、抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。湿潤剤、コンディショナー
ボディーシャンプー
％
SCCE                                    0.01−20
ラウリル硫酸ナトリウム                        40
セチルアルコール                              ４
起泡剤またはコンディショナー                  ３
パール剤                                      10
防腐剤                                      q.s.
抗酸化剤                                    q.s.
EDTA                                         0.1
水                                        40−50
変動可能な因子の例：シャンプーベース、抗酸化剤、キレート剤、防腐剤。添加剤、コンディショナー
薬用石鹸
％
SCCE                                    0.01−20
１−ヒドロキシエタン−1,1−ジリン酸          0.2
グリセリン                                   0.8
ココナツ油および獣脂のナトリウム石鹸      88−98
添加剤                                       0.7
変動可能な因子の例：湿潤剤、石鹸ベース
パウダー
％
SCCE                                    0.01−20
タルク                                    65−70
カオリン                                      ６
二酸化チタン                                  ２
炭酸カルシウム                                ８
ステアリン酸マグネシウム                      ３
トーモロコシまたはオート麦デンプン        ５−10
変動可能な因子の例：パウダーベース、防腐剤、重量比
ヘアコンディショナー
％
SCCE                                    0.01−20
セチルアルコール                             2.2
アルキルトリメチルアンモニウムクロリド      1.25
オクチルドデカノール                          １
クエン酸                                      １
EDTA                                         0.1
防腐剤                                      q.s.
抗酸化剤                                    q.s.
水                                     100とする
変動可能な因子の例：コンディショナー、防腐剤。キレート剤、抗酸化剤
同様にして、SCCEの活性を阻害または増強できる化合物からなる局所用組成物が製造できる。
例  12
組換えSCCEのデスモソーム消化活性
無傷のデスモソームを含有する角質細胞をテープ剥がしによって皮膚から角質層の深部まで採取し、扁平細胞をヘキサンで脱着しアリコートを乾燥した。角質細胞のアリコート（3mg）を1M食塩により４℃で抽出して固有のプロテアーゼを可溶化し、ついでインキュベーション緩衝液（0.1Mトリス塩酸塩、pH8.0）で徹底的に洗浄してプレパレーションから内因性の蛋白分解活性を除去した。インキュベーションは0.1Mトリス塩酸塩、pH8.0中10μｇの組換えSCCEの存在下もしくは不存在下に、37℃で24時間行った。この酵素によるデスモソームの消化の証拠は、デスモソームのマーカー蛋白質、デスモグラインＩ（DGＩ）のレベルの測定によって明らかにされた。これは扁平細胞から、8M尿素/2％SDS/β−メルカプトエタノール緩衝液中での抽出、ついでコンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィーを用いるDGＩ糖蛋白質の精製によって単離された。コンカナバリンＡ溶出液をSDS−PAGEで分画化し、電気泳動的にPDVF膜に移し、イムノブロッティングを行った。DGＩは特異的抗血清を用いて同定し、増強化学ルミネセンスを用いて検出した。結果は表４に示す。
0003542804.tif 000017
表４に掲げた結果は、組換えSCCEが、インビトロアッセイにおいて、角質層の細胞間接着構造を分解できることを示している。
例  13
組換えSCCEの活性に対するインヒビターの影響
rSCCEのＳ−2586加水分解活性に対するインヒビター、アプロチニン、キモスタチンおよび硫酸亜鉛の影響を検討した。実験デザインは例3.2.に略述した通りである。結果は表５に示す。
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表５に示すように、アプロチニン、キモスタチン、および亜鉛イオンは、組換えSCCEのＳ−2586加水分解活性を、そのネイティブ酵素と同様に阻害した。
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【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:986塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
起源：
生物名：ホモサピエンス
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:25.786
配列の特徴
特徴を表す記号:sig peptide
存在位置:25..90
配列の特徴
特徴を表す記号:mat peptide
存在位置:112.783
配列
0003542804.tif 000021
0003542804.tif 000022
0003542804.tif 000023
配列番号:2
配列の長さ:253アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：蛋白質
配列
0003542804.tif 000024
0003542804.tif 000025
配列番号:3
配列の長さ:24アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル:NO
フラグメント型:N−末端
起源：
生物名：ホモサピエンス
配列
0003542804.tif 000026
配列番号:4
配列の長さ:17塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000027
配列番号:5
配列の長さ:21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000028
配列番号:6
配列の長さ:21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000029
配列番号:7
配列の長さ:21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000030
配列番号:8
配列の長さ:42塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000031
配列番号:9
配列の長さ:42塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
0003542804.tif 000032
配列番号:10
配列の長さ:18塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類:DNA
配列
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【図１】
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【図１６】
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【図１７Ａ】
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【図４Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図４Ｂ】
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【図１１】
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【図５Ａ】
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【図９Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１９】
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【図５Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図８】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【図１８】
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【図２２】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２３】
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