(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザPB2タンパク質をコードするRNA配列が、187〜192位置（ALA4）のアミノ酸の荷電クラスターにおいて、１又は複数の荷電アミノ酸をコードするヌクレオチドを、１又は複数の中性アミノ酸をコードするヌクレオチドで置換することにより改変されていることを特徴とする組み換えインフルエンザウイルス。
【請求項２】
前記インフルエンザPB2タンパク質をコードするRNA配列が少くとも１の追加の改変を含むことを特徴とする請求項１記載のウイルス。
【請求項３】
前記インフルエンザPB2タンパク質をコードするRNA配列が、２〜６位置（ALA1）、120〜124位置（ALA2）、140〜144位置（ALA3）、187〜192位置（ALA4）、339〜343位置（ALA5）、677〜681位置（ALA6）、699〜703位置（ALA7）及び736〜740位置（ALA8）からなる群から選択される位置における改変を含む配列を含むことを特徴とする請求項２記載のウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスが再組み換え体ウイルスであることを特徴とする請求項１記載のウイルス。
【請求項５】
インフルエンザPB2タンパク質をコードする改変RNA配列であって、該インフルエンザPB2タンパク質をコードする配列が、187〜192位置（ALA4）における突然変異を含むことを特徴とする配列。
【請求項６】
187〜192位置（ALA4）における突然変異を含みインフルエンザPB2タンパク質。
【請求項７】
請求項５記載のRNA配列に対応するcDNA配列。
【請求項８】
医薬として許容される担体中に、請求項１又は請求項３に記載のウイルスの免疫原として誘導するのに有効な量を含む免疫原組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はインフルエンザウイルスの免疫原組成物ならびに該組成物の製造方法に関する。より詳細には、本発明はインフルエンザのPB2ポリメラーゼRNA配列内に慎重に特異的に行われた突然変異を有するインフルエンザウイルス免疫原組成物に関する。
背  景
インフルエンザは、激しい呼吸器系疾患を世界中で引き起こすエンベロープを有する１本鎖のマイナス鎖RNAウイルスである。該ウイルスは唯一のオルトミクソウイルス科のウイルスであり、さらにA,B、およびＣの３つの型に分類される。
インフルエンザウイルスは内部に１本鎖のRNAゲノムを含むリボヌクレオ蛋白から成るコアと外側に内側をマトリックス（以後“M1"という）蛋白で裏打ちされたリポプロテインエンベロープを有している。インフルエンザＡ型のゲノムは８つの分節に別れる直鎖のマイナスの極性を有した１本鎖RNAであり、合計10の蛋白をコードしている。分節１は2341ヌクレオチドの長さを有し、RNA依存型RNAポリメラーゼ複合体を構成する３つの蛋白質の１つである759アミノ酸ポリペプチドであるPB2をコードしている。該ポリメラーゼを形成する残りの２つの蛋白質は757アミノ酸からなるPB1と716アミノ酸からなるPAであり、それぞれ2341ヌクレオチドの配列と2233ヌクレオチドの配列（分節２、および３）にコードされている。ゲノムの分節４は、リポプロテインエンベロープから突出した表面糖蛋白であり、細胞に吸着し内部への進入に関係する566アミノ酸のヘマグルチニン（HA）をコードしている1778ヌクレオチドの配列である。分節５は1565ヌクレオチドの長さを有し、ヌクレオカプシドを形成する498アミノ酸長のヌクレオプロテイン（NP）をコードしている。分節６は全長1413ヌクレオチド長であり、454アミノ酸長のノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖蛋白をコードしている。分節７は全長が1027ヌクレオチド長であり、252アミノ酸長のM1蛋白と、Ｍ RNAのスプライシングされたバリアントから翻訳される96アミノ酸長のM2蛋白の２つの蛋白をコードしている。分節８は全長が890ヌクレオチド長であり、それぞれ230アミノ酸長と121アミノ酸長の機能不明な２つの非構造蛋白、NS1とNS2をコードしている。NS2はNS RNAのスプライシングされたバリアントから翻訳される。
インフルエンザＢ型の分節化されたゲノムは直鎖のマイナスの極性を有した１本鎖RNAであり、合計11のポリペプチドをコードしている。分節２は2396ヌクレオチド長を有し、RNA依存型RNAポリメラーゼ複合体を構成する３つの蛋白質の１つである770アミノ酸ポリペプチドであるPB2をコードしている。インフルエンザＢ型ポリメラーゼの残りの２つの蛋白質は752アミノ酸長のPB1と725アミノ酸長のるPAであり、それぞれ2386ヌクレオチド配列と2304ヌクレオチド配列（分節１、および３）にコードされている。ゲノムの分節４は、リポプロテインエンベロープから突出した表面糖蛋白であり、細胞への吸着と融合に関係する584アミノ酸長のHAをコードしている1882ヌクレオチド長の配列である。分節５は1839から1841ヌクレオチドの長さを有し、ヌクレオカプシドを形成する560アミノ酸長のNPをコードしている。分節６は全長が1454ヌクレオチド長であり、466アミノ酸長のNAエンベロープ糖蛋白と100アミノ酸長の機能不明な非構造蛋白であるNB蛋白をコードしている。分節７は全長が1191ヌクレオチド長であり、248アミノ酸長のM1蛋白と、別の読みとり枠から翻訳される195アミノ酸長のBM2蛋白をコードしている。分節８は全長が1096ヌクレオチド長であり、それぞれ81アミノ酸長と122アミノ酸長の機能不明な２つの非構造蛋白、NS1とNS2をコードしている。NS2はNS RNAのスプライシングされたバリアントから翻訳される。
インフルエンザＣ型のゲノムは７つに分節される直鎖のマイナスの極性を有した１本鎖RNAであり、合計８個のポリペプチドをコードしている。分節１は2365ヌクレオチドの長さを有し、RNA依存型RNAポリメラーゼ複合体を構成する３つの蛋白質の１つである774アミノ酸ポリペプチドであるPB2をコードしている。該ポリメラーゼを形成する残りの２つの蛋白質は754アミト酸からなるPB1と709アミノ酸からなるPAであり、それぞれ2363ヌクレオチド配列と2183ヌクレオチド配列（分節２、および３）から成っている。ゲノムの分節４は、リポプロテインエンベロープから突出した表面糖蛋白であり、細胞に吸着、融合しレセプターの破壊活動に関係する655アミノ酸のヘマグルチニン−エステラーゼ表面糖蛋白をコードしている2074ヌクレオチド長の配列である。分節５は1809ヌクレオチドの長さを有し、ヌクレオカプシドを形成する565アミノ酸長のNPをコードしている。分節６は全長が1180ヌクレオチド長であり、374アミノ酸長のマトリックス（Ｍ）蛋白質をコードしている。分節７は全長が934ヌクレオチド長であり、286アミノ酸長のNS1蛋白と、NS RNAのスプライシングを受けたバリアントから翻訳される112アミノ酸長のNS2蛋白の２つの蛋白をコードしている。
細胞に感染するときにはインフルエンザHA蛋白が細胞膜糖蛋白と糖脂質内にあるシアリルオリゴサッカライド分子に吸着する。ビリオンのエンドサイト−シスに続いて、細胞エンドゾーム内でHA分子がその立体構造を変えて膜融合を促進し脱膜を開始する。感染の最初の必須段階としてヌクレオカプシドがウイルスのmRNAが転写される場所である核に移動する。インフルエンザRNAの転写と翻訳が感染細胞の核内で行われ、それから産物が原形質膜の外に出芽あるいは通過し集合してビリオンを形成する。ウイルスは混合感染している間に遺伝子の再選択をする。
インフルエンザウイルスRNAの複製は４つのウイルス遺伝子産物:PB1,PB2,PAならびにNPに依存している。３つのポリメラーゼ蛋白、PB1,PB2ならびにPAは感染した細胞核内で３分子複合体を形成する。各蛋白質はそれぞれ核内局在シグナルを有している。Akkina,j.Virol 61:2217−24（1987）、Mukaigawa,J.Virol 65:245−253（1991）ならびにNieto,J.Gen Virol 75:29−36（1997）参照。特定の機能のいくつかは個々のポリペプチドに負うものである。基本的にPB1は酵素による重合反応：即ち伸長反応に関わる。他のRNA依存型RNAポリメラーゼ蛋白とアミノ酸配列上で相同性を有している。PAの精確な機能は不明である。PB2蛋白は宿主細胞mRNAに存在する5'−末端のキャップ構造に結合する；するとmRNAは切断され、キャップ構造を有する９から15merのオリゴヌクレオチドが生じ、これがインフルエンザウイルスの転写プライマーとなる。PB2アミノ酸配列には細胞由来のキャップ結合蛋白、eIF−4Eと一定の相同性を有する領域がある。Luna,Virus Res 13:143−56（1989）参照。PB2はウイルスRNAの複製に絶対に必要なものではないが、PB1,PA、ならびにNPだけを発現している細胞内のウイルスの鋳型から転写されmRNAはキャップ構造を有しておらず、従って翻訳されない。Nkagawa,J Virol 69:728−33（1995）。転写は鋳型の端から15−22塩基のところの、オリゴ（Ｕ）配列が鋳型非依存的なポリ（Ａ）配列の付加のためのシグナルとして作用する箇所で停止する。感染後期では転写によるmRNA産生の代わりに、ポリメラーゼ蛋白PB1,PB2ならびにPAを用いて新しいウイルスRNAゲノムを作るようになる。ポリメラーゼ複合体は最初cRNAを転写し、これがより多くのvRNA産生のためのテンプレートとして機能する。プラス鎖cRNAコピーはプラス鎖mRNA転写体とは、キャップ構造を有していない点と5'端がメチル化されている点が異なる。また、これらコピーは3'末端は切断あるいはポリアデニル化されていない。従って、cRNAは対応するマイナス鎖の鋳型と共に終止し、全ての遺伝情報をそれぞれの分節に相補配列の形で有していることになる。
マイナス鎖ゲノム（vRNAs）とアンチゲノム（cRNAs）は常にウイルスカプシド蛋白によりカプシド化される；カプシド化されていないRNAはウイルスRNAだけである。ヌクレオカプシドは核内で組み立てられると思われる。ウイルスは細胞質側あるいは出芽エンベロープの内面にM1蛋白を取り込んだ細胞の尖端表面からの出芽により成熟する。HA及びNAグリコプロテインは脂質エンベロープに組込まれる。非寛容細胞ではHAは翻訳後に分解されるが、その結果生じる２本の鎖はジスルフィド結合により結合したままである。
インフルエンザに対して免疫性の物質である宿主細胞内で複製できない不活性化ワクチンを作り出す努力が２つの方向、即ち化学的にウイルス全体を不活性化する方法とウイルスのサブユニット蛋白を利用する方法で検討されてきた。インフルエンザの場合には不活性化ウイルスワクチンあるいは部分的ウイルスワクチンのいずれも可能である。これらワクチンにはHAとNA表面蛋白が、投与により宿主に免疫反応を生じさせる抗原として含まれている。理由は完全には解明されていないが、サブユニットワクチンはインフルエンザの60％から80％にしか有効でない。不活性化全ウイルスワクチンは筋肉内に投与され、基本的には全身性に免疫反応を引き起こすのに対して、生ワクチンの場合には局所性に粘膜免疫も同時に刺激する。後者の免疫は最初にウイルスが攻撃する上呼吸器道に関係するためより有効である。また、不活性化ワクチンは細胞傷害性Ｔ細胞の反応を低下させ、時に遅延型過敏反応を誘導することがある。Guiiain−Barre症候群は不活性化インフルエンザＡ型“swine flu"ワクチンと関連している。Schonberger,Ann Neurol 9（supp）;31−38（1981）参照。
生きた弱毒化したウイルスを使用した免疫成分を作ることができ、宿主に必要な防御反応を誘導することができた。インフルエンザ生ワクチンは宿主内での複製が限定されているため、防御免疫反応は誘導するが病気が引き起こすことはない。以前、有胚鶏卵の様な非天然宿主を何度も通過させたり、非天然宿主を低温温度を増加させたなら通過させたり、化学処理によって無作為に突然変異を誘導し条件変異体を選択して変異体が作成されたことがある。この様な方法から病原性が無いが免疫原性はある変異体が得られた。しかし、上記の方法により作成された遺伝的変異体の特性についての経験は無く、変異体が、“マスタードナー”ウイルスであったのかも不明である。このような変異体が１あるいは２ヌクレオチドの変化の結果であれば、ウイルス成分が最終的に“復帰”したり、あるいは宿主内で戻り変異が生じ、もとの病原性の表現形を再獲得する可能性もある。しかし、これらの方法の一つである低温側温度を上げながら連続継代する方法（A/AmArbor/6/60から誘導した“低温適応”株）では、遺伝的に安定な複数の突然変異ウイルスが得られている。Murphy,Inf Dis In Clin Practice 2参照:174−181（1993）。この様にしてワクチンを作成する間に、弱毒化したマスタードナーウイルスのHAやNAのRNA配列が循環しているインフルエンザのHAやNAのRNA配列に置き換えられていく。この様なウイルスを再選択ウイルスと呼ぶ。
化学的変異誘導により作成したか、自然の変異体をスクリーニングして発見されたインフルエンザの温度感受性（ts）突然変異体については報告がある。この様な突然変異体は感染動物の下部呼吸気道では増殖できず、しばしば上部呼吸器道で増殖するが、野生株に比べるとそのレベルは低い。この様な突然変異体の一つts1A2はインフルエンザ生ワクチンに望まれる特性の多くを有していることが示されている。MurphyとChanock.Genetic Variation Among Influenza Viruses,pps 601−615,Nayak.D.ed.Acadmic Press.NY（1981）およびMurphy,Pjil Trans R Soc Lon B 288;401−15（1980）参照。ts1A2株はPB1とPB2の両方に温度感受性の障害を持っており、所望の弱毒化レベルを有しているが遺伝的には不安定であり、血清陰性の若年ワクチンでは増殖後に再び有毒化する。Murphy.Ann NY Acad Sci 354:172−82（1980）とTolpin,Infection and Immunity 36:645−50（1982）参照。
ts傷害がPB2遺伝子内に同定されているA/Udorn/307/72の温度感受性突然変異パネルについて報告されている。配列分析よりアミノ酸のPB2の65,100,112,171,298,310,386,391と556の位置に変異が発見された。同様にts1A2ウイルスのPB2遺伝子アミノ酸658位置に変異があることが判明している。Lawson,Virology 191:506−10（1992）参照。A/AA/6/60の低温適合株もまた温度感受性であり配列分析からts表現形に部分的に関係している変異の一つは、PB2の265位置のアスパラギンからセリンに変わったことであることが示唆されている。Cox,Virology 167:554−67（1988）,Herlocher,Proc Natl Acad Sci 90:6032−36（1993）およびSnyder,J Virol 62:488−95（1988）参照。さらにA/WSN/33ならびにA/FPV/Rostock/34のPB2  ts突然変異も知られている。ts表現形に関係していると思われるPB2遺伝子配列内の変異はA/WSN/33では417番目のアミノ酸に、A/FPV/Rostock/34では512番目のアミノ酸位置に局在している。McCauley,Virus Res 17:191−98（1990）ならびにYamanaka,Arch Virol 114:65−73（1990）参照。まとめると、これらの研究よりPB2がtsウイルスを得るために変異を誘導するのに適した位置であることを示唆されている。
生きている弱毒化したウイルスを作成する別の方法は、“逆遺伝”技術を応用する方法である。Enami.Proc Natl Acad Sci 87:3802−05（1990）,EnamiとPalese,J.Virol 65:2711−13（1991）およびLuyties,Cell 59:1107−13（1989）参照。この方法では、改変したvRNA様転写体を精製NP,PB1,PB2ならびにPA蛋白質存在下に試験管内でcDNAから転写する。得られた合成RNPを、前もってインフルエンザウイルス、通常は宿主域制限あるいは温度感受性の様な、その後移入されたウイルスを選別できる条件成長欠損を有するヘルパーウイルスを感染させておいた細胞内に移入する。例えば、宿主域制限ヘルパーウイルスは合成NAとPB2遺伝子の救済に利用されている。Enami前出、ならびにSubbarao,J Virol 67:7223−7228（1993）参照。抗体選択もHAおよびNA遺伝子の移入体選別に利用できる。抗体選別技術を用いて、表面HA糖蛋白遺伝子をインフルエンザＡ型ウイルスに移入し救済することができる。HorimotoとKawaoka,J Virol 68:3120−3128（1994）およびLi,J Virol 66:339−404（1992）参照。HA遺伝子はまたインフルエンザＢ型ウイルスに移入し救済することができる。BarelayとPalese,J Virol 69:1275−1279（1995）参照。Ｍ遺伝子（Yasuda,J Virol 68:8141−8146（1994）参照）ならびにNP遺伝子（Li,Virus Res、印刷中、参照）もまた逆遺伝技術により救済される。
逆遺伝技術を用いると特異的な突然変異をインフルエンザ遺伝子内に作成できる可能性があり、従って復帰の可能性が少なく、所望の遺伝的安定性が有す温度感受性突然変異体を作ることができる可能性がある。この様な変異体の作成は、野生株のアミノ酸をコードしているコード内に１ヌクレオチド以上のヌクレオチドを加えて変異を起した新しいコドンを導入する方法や、遺伝子外に抑制される可能性が少ない配列に変異を起こしたり、あるいは複数の遺伝子に複数の独立に作用する変異を導入することで達成できる。野生株のアミノ酸をコードしているコドンを変えるために、必要な１塩基以上の変化を作成するための方法が上記の４種類方法だけであることから、ts突然変異を誘導するための付加位置が特定できることが強く望まれている。
“クラスターチャージアラニン（Clustered charged to alanine）突然変異誘発”は、荷電したアミノ酸に変異を起こして荷電していないアミノ酸であるアラニンに変え、生物活性を変化させながら全体構造を維持し、もしくは蛋白の安定性を維持する方法である。この技術はヒト成長ホルモン受容体蛋白（Bass,Proc.Natl.Acad.Sci 88:4498−4502（1991）参照）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）アクチン蛋白（Wertman,Genetics 132:337−50（1995）参照）、ポリオウイルス3Dポリメラーゼ蛋白（DiamlondとKirkegaard,J.Virol 68:863−76（1994）参照）、ワクシニアウイルスG2R蛋白（HassettとCondit,Proc.Natl.Acad.Sci 91:4454−4459（1994）参照）、ならびにヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（WIskerchen,J Virol 69:597−601（1995）参照）の突然変異体を作成するのに利用された。前記例のそれぞれにおいて“荷電されたクラスター”とは、連続する５つのアミノ酸配列のなかの少なくとも２つのアミノ酸が荷電されている配列を意味している。
発明の要約
我々はインフルエンザのネイティブ蛋白配列中のクラスター化荷電アミノ酸基を改変するとインフルエンザウイルスに一定の予想された温度感受性を誘導できることを見いだした。本書における“クラスター化荷電アミノ酸残基”とはインフルエンザウイルスに関するものであり、インフルエンザウイルスの元来の蛋白質中にある少なくとも連続する５つのアミノ酸にあって、４ないしは５つのアミノ酸が正あるいは負に荷電しているものを意味している。荷電したアミノ酸（正もしくは負）にはアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びヒスチジンがある。本発明はインフルエンザPB2蛋白を用いて例示する。
従って、本発明の観点の１つは新規のPB2変異ポリペプチド配列と、インフルエンザウイルスのマスタードナーウイルスに組み込むことで、組み込まれたウイルスが温度感受性表現形質を有するようになる該PB2変異ポリペプチドをコードするRNA配列より構成されている。
PB2変異RNA配列はインフルエンザゲノム内に保護され、特定の温度感受性を有し、逆遺伝技術により所望の変異を誘導するインフルエンザマスタードナーウイルスを作ることができる。従って、本発明の別の観点は前記新規のPB2変異RNAとポリペプチド配列を有する組換えインフルエンザウイルスである。これら組換えインフルエンザウイルスは、培養細胞中及び／又は生きている宿主内での増殖は遅くなり、インフルエンザウイルスの再組換体の調製に使用するマスタードナーとして有用であり、インフルエンザ感染に対するヒトの予防処置のための免疫製剤としても有用である。この様な組換えインフルエンザウイルスを作成するためには、感染可能宿主細胞にヘルパー細胞を感染させ、合成RNP複合体を移入する。合成RNP複合体は試験内で突然変異RNA配列をコードするDNAより転写され、リボヌクレオプロテイン（RNP）にパッケージされてから移入される。移入の結果できた子孫ウイルスのなかには変異し、移入されたRNA配列をウイルス粒子内に取り込んでいるウイルスがある。それから、変異し移入配列を取り込んだ細胞の中の移入変異体を、移入体やヘルパーウイルスが混合している状態のなかから、両ウイルスの表現形質の違いを利用して選別、分離してくる。こうして選別された移入変異体に本発明の組換えインフルエンザウイルスが含まれている。好ましい実施態様では、変異配列はインフルエンザPB2配列ならびに／あるいはインフルエンザＭ配列、ならびに／あるいはインフルエンザNP配列である。この様な実施態様では、変異したPB2および／あるいはＭ配列および／あるいはNP配列は表現形質を弱化させる温度感受性変異を有しているだろう。
本発明の別の観点は、荷電されたクラスター変異を有するPB2変異蛋白をコードしている組換えマイナス鎖RNA鋳型をヘルパーウイルスに感染しているインフルエンザウイルスRNA分節を産生できる細胞に導入することから成るインフルエンザゲノムの改変方法である。使用できるヘルパーウイルスは鳥細胞内では増殖できるが、哺乳動物細胞内では増殖できないものである。より詳細には、例えばMadin−Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞は鳥ウイルスのPB2遺伝子を含むインフルエンザの宿主制限変異体を感染させることができる。Clements,J.Clin Microbiol 30:655−662（1992）。それから合成PB2 RNPを試験管内で変異したvRNA−センス、PB RNAコードする鋳型cDNAを精製RNP蛋白存在下に転写し調製する。cDNAは、ヘルパーウイルス内に救済される場合には哺乳動物内にプラークを形成させるpB2蛋白をコードしていなければならない。得られたRNPは感染したMDBK細胞に導入され、細胞を培養後、培地を集めMDCK細胞を感染させるために使用した。
本発明の別の観点は、インフルエンザ野生型流行性株から得たHAおよびNA糖蛋白質をコードするRNA配列と移入ウイルスから得た残りのRNA配列を含む再組換体ウイルスである。野生型流行性ウイルスは免疫が望まれるインフルエンザウイルスの循環株である。移入ウイルスは弱毒化されたマスタードナー、即ち内部蛋白をコードするRNA分節の１つ以上に弱化された変異を有している組換体インフルエンザウイルスであり、好ましくは本明細書に開示したPB2配列のクラスター化荷電改変を受けた、また／もしくは本書記載の方法に従い作成し弱毒化を試験することができるＭ配列のクラスター化荷電改変を受けた該インフルエンザウイルスである。好適な弱毒化したワクチンウイルスを得る最も生産的な方法は、マスタードナーの６つの内部蛋白RNA分節（PB1,PB2,PA,NP,MおよびNS）を全て保持することである。しかしワクチンウイルスではマスタードナー分節の数はもっと少なくともよく、それでも弱毒化のレベルを維持し遺伝的安定性を保つことができる。
本発明の別の観点は、免疫原として誘導するのに有効な量のインフルエンザウイルス変異に医薬として許容される担体あるいは液体を混ぜた免疫原性医薬組成物である。
本発明の別の観点は、本発明の免疫原性医薬組成物を免疫原として誘導するのに有効な量患者に投与することから成る患者の予防処置法である。本書における“免疫原として誘導”とは哺乳動物にインフルエンザに対する中和抗体産生を促進させるのに十分な量を意味している。この様な量は局所的および／あるいは全身性に抗体産生を刺激し、それによって感染もしくは感染による病気の発症を防止する。患者はヒトであることが好ましい。
発明の詳細な説明
本開示では、通常のアミノ酸は通常用いられるアルファベットを用いて記載した。
インフルエンザのクラスター化荷電アミノ酸残基を改変することにより、該ウイルスに一定の予想通りの温度感受性を持たせることができる。本書において“荷電クラスター”“クラスター化荷電”あるいは“クラスター化荷電アミノ酸残基”という用語はインフルエンザの天然の蛋白質の中の連続する少なくとも５つのアミノ酸であって、４あるいは５個のアミノ酸が正もしくは負に荷電しているものを意味している。荷電したアミノ酸としては以下のものがある：アルギニン、リジン、アスパラギン酸、ゲルタミン酸、ならびにヒスチジンである。
インフルエンザＡ型ウイルスA/LA/2/87PB2蛋白中のアミノ酸残基には８つの荷電クラスターが同定されている。これらの電荷を持ったクラスターは、Ｎ末端のMET残基を１として読み始める通常の読み方を採用して表示するとアミノ酸位置の２から６（実験では“ALA1"とした）、120から124（“ALA2"）、140から144（“ALA3"）、187から192（“ALA4"）、339から343（“ALA5"）、667から681（“ALA6"）、699から673（“ALA7"）、736から740（“ALA8"）である。これらの天然のアミノ酸の特性を以下の表２に示す。
様々な別のインフルエンザＡ株から得たPB2蛋白のアミノ酸配列を解析し、これらの株の対応する８つの荷電クラスターを同定した。調べたインフルエンザＡ株は、A/Memphis/8/88,A/Chile/1/83,A/Kiev/59/79,A/Udorn/307/72,A/NT/60/68,A/Korea/426/68,A/Great  Lakes/0389/65,A/AnnArbor/6/60,A/Leningrad/13/57,A/Singapore/1/57,A/PR/8/34とA/WSN/33である。これらの株の配列はジーンバンク（GenBank）より入手可能であり、保存ウイルスもAmerican Type Culture Collection,Rockbille,Marylandあるいはその他の公的施設より入手できる。ALA1,ALA3,ALA4,ALA5ならびにALA6の荷電クラスターを含むヌクレオチド配列はそれぞれのインフルエンザ株で完全に保存されている。
ALA2荷電クラスターでは、120位置のアミノ酸残基が上記のChile,NT,Korea,Gerat Lakes,AnnArbor,Leningrad,Singapore,PRおよびWSN株ではＤ残基かその他の荷電された残基の場合はＥである。ALA7荷電クラスターでは、700位置のアミノ酸残基がKiev株ではＧ残基であり、その他の株ではＥ残基である。ALA8荷電クラスターでは、740位置のアミノ酸残基がAnn ArborとWSN株ではＮ残基であり、その他の株では完全にA/LA/2/87に一致した。上記より、A/LA/2/87株を代表に用いるが、前記の株も同様に使用できる。さらに、荷電されたインフルエンザＢと／あるいはインフルエンザＣのアミノ酸の荷電クラスターについての解析を本発明に示す方法で実施し、PB2変異蛋白を作成し、インフルエンザＡについて示した方法と同じに組換体インフルエンザＢとインフルエンザＣウイルスを作成した。例えば、インフルエンザＡ内の荷電クラスターALA4とALA8に対応する荷電クラスターが２つのインフルエンザＢ株、B/AA/1/66とB/NY/1/93に見られる。本書内に開示した方法を使用すれば当業者はその他のインフルエンザ型および株の荷電クラスター残基を特定することができるだろう。
さらに、インフルエンザウイルスのその他の蛋白の荷電クラスターもこれらの技術を利用して特定し改変できるだろう。インフルエンザA,BあるいはＣを改変して免疫原として有意に弱毒化された変異型M1蛋白を産生させることができ、これによって既知の逆遺伝法（reverse genetics techniques）を用いてヒトに投与し予防できる生弱毒化免疫成分を産生することができる。様々なインフルエンザ型と株のＭ蛋白のヌクレオチド配列とアミノ酸配列が知られている。例えばBaylor,Virol.163:618−21（1988）;Narkusin,Virus Res.10:263（1988）;Cox,Virology 167:554−67（1988）およびBuckler−White,J Virol.57:670−700（1986）を参照せよ。当業者は本書記載の技術を用いてインフルエンザＭ蛋白中の荷電クラスターを同定し改変し、該改変Ｍ蛋白を含む組換体インフルエンザウイルスを作成することができる。インフルエンザＡのいくつかの株のNP蛋白のヌクレオチド配列とアミノ酸配列は既知である。例えば、Shu,J Virol 67:223−29（1993）を参照。当業者は本書開示の技術を実施しインフルエンザNP蛋白中の荷電クラスターを同定し改変することができ、該NP蛋白を含む組換体インフルエンザウイルスを作成することができる。
本書に特定される荷電クラスターは本書に記載する方法により改変して温度感受性組換体インフルエンザウイルスを作成することができる。この様な温度感受性組み換えインフルエンザウイルスには温度感受性の獲得に関係するPB2変異アミノ酸配列ならびにRNA配列をゴードする配列を有する変異体を含んでいる。
上記の如く本発明はPB2変異蛋白をコードする新規のRNA配列とcDNA配列を開示し記載する。本発明の蛋白は野生型インフルエンザPB2配列の１から８までの荷電クラスターが中性アミノ酸の置換により改変された変異あるいは改変PB2配列を含む。変異、改変されたならびに変異体もしくは変異したという言葉は相互に同義に使用される。本書では中性アミノ酸は、中性pHにおいて電荷を有せず、全体的な二次構造あるいは三次構造を破壊しないアミノ酸として定義される。中性アミノ酸の例としてはアラニン、バリン、セリンがある。公的な中性アミノ酸はアラニンである。
この様な蛋白がインフルエンザウイルスに取り込まれてインフルエンザのマスタードナー株ができると、免疫成分の調製ならびにインフルエンザの予防処置に有用な温度感受性突然変異体ができる。
本発明のPB2変異蛋白（即ち改変PB2蛋白）は、公知の遺伝子組換体技術あるいは逆遺伝法を用いることでインフルエンザウイルス内に取り込むことができる。逆遺伝法では、元来のPB2配列はPB2蛋白内に１つ以上の荷電クラスター改変をコードするcDNAから試験管内で合成された合成遺伝子で置き換えられる。ヘルパーウイルス感染細胞に荷電クラスター改変をコードしている合成PB2配列を移入する。この合成配列を持った生ウイルスは、野生型のHA及び／又は流行性（すなわち現在流行している病原体）インフルエンザ株のNA遺伝子と組み合わさると、ヒトのインフルエンザの予防治療に免疫構成体として利用できる再組み換えインフルエンザウイルス（“6:2再組換体”）を産生するようになる。同様の方法で、変異Ｍ配列と／あるいは変異NP配列をインフルエンザウイルスに取り込ませることができる。6:2再組換体ウイルスは合成配列と現在流行しているインフルエンザ株から得たHAならびにNA遺伝子を含むマスタードナー株の６つの遺伝子から構成される。6:2インフルエンザ再組換体ウイルスを調製する方法では、まず細胞に弱毒化したマスタードナー株と現在流行している病原性インフルエンザＡウイルスを感染させ、流行株のHAとNA遺伝子のエピトープと反応する抗体と培養した子孫を反応させて再組換体ウイルスを選別する。あるいは、逆遺伝子法を用いても流行株のHAとNA遺伝子を細胞に移入できる。それから細胞にマスタードナー株を感染させ、6:2再組換体を抗体を利用した上記選別法で選び出す。
例えば、ニワトリ腎臓（PCK）あるいはMDBKの単層細胞に１−10倍の感染多重度（moi）で１時間ヘルパーウイルスを感染させる。本発明の１又は複数の変異PB2又はM1もしくはNP蛋白をコードするRNAを感染細胞内に、必要に応じて以下の実施例４で改変されるLuytjes（前掲）、Enami及びPalese（前掲）、及びEncmi（前掲）の方法を利用して移入する。転写反応には直線状のプラスミド、各種のデオキシリボヌクレオチド、T3 RNAポリメラーゼおよび前述のParibinとEnamiの方法により有胚鶏卵の尿嚢内で増殖させたウイルスより調製したリボヌクレオ蛋白を含んでいる。その混合液を37℃,45分間反応させるとRNA転写産物が得られ、続いてRNP複合体にパッケージングされる。DNaseを添加することでプラスミドを除き、その後混合液をヘルパーウイルスを感染させてDEAEデキストラン処理したPCKあるいはMDBK細胞内に導入する。あるいは、混合液を電気ポレーション法で感染細胞内に導入する。培養体は適当温度に維持し（例えば34℃）てから16〜22時間後に集めた。細胞破壊片を沈殿させ、ウイルスを含む上清を適当な哺乳動物細胞、例えばMDCK細胞に撒いた。撒かれたウイルスの子孫をさらにプラークパッセージさせて、それから有胚鶏卵の尿嚢内で増幅した。
より詳細には、インフルエンザウイルスA/LA/2/87の宿主域変異体について記載する。本ヘルパーウイルスは鳥ウイルスA/Mallard/New Yorik/6750/78より得たPB2遺伝子を含んでおり、PCK細胞の様な鳥細胞内で増殖できるが、MDCKの様な哺乳動物細胞内ではプラーク形成できない。Clements,J Clin.Microbiol 30:655−62（1992）参照。A/LA/8/87のMallard PB2遺伝子を、移入した哺乳動物のPB2配列で置き換えるウイルスがMDCK細胞内にプラークを形成することができるようになる。Subbarao,J.Virol 67:7223−28（1993）参照。この様にすると、部位限定の変異を有する合成RNAを哺乳動物PB2配列を移入することでPB2遺伝子のヌクレオチド配列内に特異的変化を導入することができ、試験管内の転写に利用することができる。こうして作られた組換変異インフルエンザウイルスは温度感受性であるため、ヒトを対象とした予防的投与に適した生の弱毒化免疫構成体の作成の為のマスタードナー株として利用することができる。
本発明の組換えインフルエンザウイルスを継代するための方法は通常の方法が利用できる。保存ウイルスは初代培養あるいは樹立細胞培養、例えば初代のウシあるいはニワトリ腎臓細胞あるいはMDCK細胞内の精製プラークである。精製プラークウイルスは更にこれらの細胞株のなかで継代することができる。細胞はプラスチック皿上で培養され、ウイルスは通常0.001から0.1のmolで接種され、２〜３日間培養される。あるいは保管ウイルスは10〜12日間の有胚鶏卵の尿嚢中に接種され、２〜３日間33〜37℃で培養される。
本発明の組換えインフルエンザウイルスの弱毒化の試験はよく確立した試験管内および生体内試験法を用いて実施できる。生体内アッセージでは、下記実施例６に示すように組換えウイルスを温度感受性表現形の有無について調べた。生体内での組換体インフルエンザウイルスの反応原性を下記実施例７記載の如く決定した。
この様な組み換えにより改変した変異インフルエンザウイルスはその他のウイルスのts変異地図を作成する遺伝子相補性分析や、ウイルスの生活環におけるPB2の役割を調べる機能解析、そしてウイルスRNAやPB1あるいはPAの様なその他のウイルス蛋白との相互作用へ関与するPB2領域を決定することにも利用できる。
本発明の改変PB2蛋白は当領域公知の適当な発現調節システムを利用して様々な細胞で組み換え発現し、蛋白の機能を調べることができる。本発明の核酸配列を含む好適なベクターの構築方法も、この様な配列に実施されるハイブリダイセーションアッセー法の様に当該分野では公知である。例えば、Itakuraの米国特許第4,356,270号、Riggsの米国特許第4,431,739号ならびにRutterの米国特許第4,440,859号を参照。その他の宿主細胞、プロモーター、選択マーカー、ならびに技術についてはMatherに交付された米国特許第5,122,469号やAxelに交付された米国特許第4,399,216号及び第4,634,665号、そしてLevinsonに交付された米国特許第4,713,339号、RIngoldに交付された米国特許第4,656,134号、Kellemsに交付された米国特許第4,822,736号、並びにFiersに交付された米国特許第4,874,702号が例示となる。
本発明の核酸配列を有する好適なベクターは当該領域公知の配列連結方法と制限酵素技術を用いて構築することができる。部位特異的切断は好適な制限酵素を通常の条件下、特に制限酵素製造元が特定する条件下に作用させることで実施できる。ポリアクリルアミドゲルあるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動は標準的な技術により実施でき、切断断片を分子量に従い分離することができる。オリゴヌクレオチドは例えば、当分野公知のジエチホスホアミジト法を利用して合成することができる。配列の連結は通常の条件および温度下にT4 DNAライゲースを用いて実施でき、連結の成否は連結混合体で大腸菌を形質転換させることで確認することができる。形質転換がうまくいったものをアンピシリン、テトラサイクリン、あるいはその他の構成物質に対する耐性反応もしくは当分野公知の他のマーカーを利用して選択する。
この様な組み換え技術は全て文献内に紹介されている。例えば、Sambrook,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2d ed.（1989）;DNA CLONING,Vol.IおよびII,D.N.Glover,ed.,1985;OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS,M,J.Gait,ed.,1984;NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION,B.D.Hames,ed.,1984;TRANSCRIPTION AND TRANSLATION,B.D.Hames,ed.,1984;ANIMAL CELL CULTURE,R.I.Freshney,ed.,1986;B.Perbal,A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING（1984）;GENE TRANSFER VECTOR FOR MAMMALIAN CELLS,J.H.Miller,ed.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory;Scopes,PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,2d ed,Springer−Verlag,New York,1986ならびにHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,Vols I−IV,D.M.Weired,ed.,1986を参照のこと。ここに記したこれら出版物は全て開示された内容について引用により組み込まれる。
本発明の生きている組換えインフルエンザウイルス変異体はインフルエンザウイルスによる感染またはその発症を防止するための免疫原組成物として用いることができる。そのような免疫原組成物を作成するために、該生きている組インフルエンザ変異体（すなわち、マスタードナー）及び流行性野生株を培養細胞に同時に感染させる。再組換えウイルスを回収し、感温性誘導突然変異の有無について試験を行った。ドナーウイルスの野生型HA及び／またはNA蛋白によってコードされる表面抗原決定基に対する抗血清さらすことにより野生型HA及び／またはNA蛋白を含有する再組換え体を選別することができる。本発明の変異配列並びにインフルエンザ野生型流行性株からのHA及び／またはNA配列を含む得られたウイルス子孫を、免疫原性組成物を作成するために用いた。該免疫原性組成物は本発明による組換えインフルエンザウイルス変異体を免疫原として生誘導するのに効果的な量だけ医薬として許容される担体もしくは液体に混入されたものからなる。医薬として許容される担体の一例として生理食塩水があげられる。該組成物は全身に投与される。好ましくは皮下または筋内投与用の許容される液体形態で皮下または筋内に投与される。さらに好ましくは、ドロップ、大粒子エアゾール（10ミクロン超）またはスプレイのいずれかを鼻孔から気管上部に投与する。pH、等張性、安定性及びその他の条件に注意を払った上での該液体の調整方法は同業者には明らかである。例えば年令、体調、体重、性別、食事、投与時間及び他の臨床因子のような薬の作用を変えうる様々な因子を鑑みて、医者は投与プログラムを決定する。典型的な投与量はウイルス約１〜約1000HID50（ヒト感染投与量）の範囲である。
本発明の予防処置を実施するには、本発明の免疫原性組成物の免疫原性誘導に効果的な量を予防処置を必要としているヒト患者に投与する。本発明の免疫原性組成物の免疫原性誘導に効果的な量として、一投与あたり約１〜1000HID50（ヒト感染投与量）、すなわち、105−108pfu（プレーク形成単位）の範囲で投与される。投与の回数は先に述べた因子によって変えてよい。投与は患者の鼻孔から気管上部の経路が好ましい。
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。しかしそれは発明の範囲を限定するものではない。
実施例１）A/LA/2/87遺伝子のcDNAクローニング
Madin−Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞とMadin−Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC,Rockville,MD）より入手し、10％ウシ胎児血清（JRH）、2mM  Ｌ−グルタミン（JRH）、100units/mlペニシリン及び0.1g/mlストレプトマイシン（Sigma,St.Louis,MO）を添加したEagle's Modified Essential培地（EMEM;JRH Biosciences,Lenexa,KS）で５％の二酸化炭素存在下37℃で培養した。インフルエンザウイルスA/LA/2/87（H3N2）をDr.L.Potsh（DynCorp/PRI,Rockville,MD）より入手し、一度MDCK細胞中で37℃で継代接種し、Barrett,Growth,Purification and titration of Influenza Viruses,p.119−150,B.W.J.Mahy,ed.IRL Press,Oxford,England（1985）に記載の方法にしたがって、生後10日から12日で標準品質の特殊な病原体を持っていない有胚鶏卵（SPAFAS,Norwich,CT）の尿嚢で35℃で増幅させた。
A/LA/2/87ウイルスに感染した鶏卵から尿膜腔液を採取し、SW28ローターを用いて４℃に維持しながら90分間15,000rpmで遠心分離を行い、それを濃縮した。次に４回の12％ステップのスクロース非連続勾配（燐酸緩衝生理食塩水中スクロース12〜60％含む）でSW28ローターを用い４℃に維持しながら75分間15,000rpmで遠心分離を行い精製した。バンドされたウイルス粒子は１％NP−40を用いて破壊した。次にウイルスRNA（vRNA）を押出し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメチルハイドロクロライド（Tris）、pH7.5,100mM塩化ナトリウム及び1mMエチレンジアミンテトラアセテート（EDTA）の存在下でまず0.5mg/mlのプロテインキナーゼＫ（PK;Ameresco,Solon,OH）で37℃で１時間処理した。次にフェノール／クロロホルムの等量を用いて連続的に処理し、エタノール2.5容量で沈殿させた。−20℃で１時間冷却した後、RNAを含有した沈殿物をEppendorfmicrocentrifugeで20分間14,000rpmで遠心分離しペレット化させ、80％エタノールで洗浄し、乾燥し、ジエチルピロカルボネート（DEPC）で処理した水で再びケンダクさせ、最終濃度を0.5mg/mlに調整した。A/Memphis/8.88  PB2遺伝子（Gorman,J Virol 64:4893−4902（1990）参照のこと）の配列に基づいてBamH I及びBamH I制限酵素切断部をもつvRNA約１μｍをPB2遺伝子の24  3'末端に相補的なオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドPB2003とハイブリダイズさせた。PB2003の配列は下記の表に示す。
製造者から提供され、0.5mMの各々のデオキシヌクレオチドシリン酸（dNTPs;Promega,Madison,WI）及びRNAsin  2units/ulを含有する反応緩衝液中で第一のcDNA鎖をSuperscript II逆転写酵素（Gibco/BRL,Bethesda,MD）を用いて42℃で２時間かけて合成した。該cDNAをフェノール／クロロホルム抽出で精製し、Ｓ−300HRマイクロカラム（Pharmacia,Piscataway,NJ）を用いて各成分を分離した。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いてcDNAを1229の位置に特徴的なNco I部分を持つ２つのセグメントに分けて増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーPB2003及びPB2005（1257−1276の位置でvRNA感受性、PB2005配列については表１を参照のこと）を用いてＣ末端クローンを作成した。プライマーPB2002（Xha I制限酵素切断部、T3プロモーター配列及びPB vRNAの５‘末端から28番目のntsを含有するvRNAセンス）及びPB2004（1126−1146の位置、mRNAセンス）を用いてＮ末端クローンを作成した。PB2003及びPB2005の配列は表１に示す。
Perkin Elmer（Norwalk,CT）thermal cyclerを用いて、2mM塩化マグネシウム、0.2mM dNTPS,0.2uMの各プライマー及びTaq polymerase 2.5単位含有した1XPCR緩衝液II（perkin Elmer）中で94℃で１分間50サイクルの変性を行い、40℃で20分間アニーリングし、72℃で３分間伸張して、PCRを行い、72℃で30分間インキュベートした。PCRによって作成されたフラグメントをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、１％低融点アガロースゲル（FMC Rockland,ME）で100ボルトで１時間1X TAE緩衝液（40mM Tric−acetate,1mM EDTA,pH8.0）中で電気泳動を行った。予期したサイズのDNAフラグメント（1.29kb  Ｎ末端フラグメント及び1.24kb  Ｃ末端フラグメント）をゲルから切除し、ゲルスライスを溶かし、Langridge,Anal Biochem 103:264−71（1980）に記載の“QN"法でDNAを抽出した。T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）を用いて、pCR II  TAクローニングベクター（In Vitrogen,San Diego,CA）との連結反応に、精製したDNA各々の一部を用いた。連結混合物の一部を用いてコンピテントE.Coli DH5α細胞（Gibco/BRL Bethesda,MD）を形質転換させた。
Sequenase（USB,Cleveland,OH）を用いて２本鎖プラスミドDNAのジデオキシ鎖ターミネーション配列決定によってA/Memphis/8/88  PB2遺伝子の配列に基づいたプライマーを用いてPB2遺伝子の挿入物の配列決定を行った。
それぞれのフラグメントをもった２種の異なったクローンの配列を決定し、Ｎ末端クローンのうちひとつにおける一つのヌクレオチド欠損を除いて同一と判明した。PB2をコードするオープンリーディングフレームにおけるフレームシフト突然変異を誘発すると予測されたのでＮ末端クローンは使用しなかった。予想通り、11ヌクレオチド及び３アミノ酸が異なっていることを除いては該配列はA/Memphis/8/88  PB2の配列とかなり相同していた。A/Memphis/8/88  PB2の配列はGorman,J Virol 64;4893−4902（1990）に示される。（GenBankにより報告されているように）A/Memphis/8/88およびA/LA/2/87  PB2遺伝子間の配列の違いは（cRNA（＋）センス鎖の第一番目のヌクレオチドから数えて）以下のヌクレオチド位置にする。
80番目（A/Memphis/8/88:G,A/LA/2/87:A）、81番目（A/Memphis/8/88:A,A/LA/2/87:G）、306番目（A/Memphis/8/88:T,A/LA/2/87:C）、338番目（A/Memphis/8/88:A,A/LA/2/87:C）、504番目（A/Memphis/8/88:C,A/LA/2/87:A）、505番目（A/Memphis/8/88:A,A/LA/2/87:C）、543番目（A/Memphis/8/88:T,A/LA/2/87:G）、886番目（A/Memphis/8/88:C,A/LA/2/87:A）、887番目（A/Memphis/8/88:A,A/LA/2/87:C）、990番目（A/Memphis/8/88:G,A/LA/2/87:A）、1164番目（A/Memphis/8/88:A,A/LA/2/87:G）、1929番目（A/Memphis/8/88:T,A/LA/2/87:C）。
80番目及び81番目（the GenBank sequence）の位置に２ヵ所のエラーが判明したA/Memphis/8/88  cDNAを少量再配列決定した。その結果２ヵ所の配列はA/LA/2/87の配列と同じであった。３ヵ所のヌクレオチドの違いはA/LA/2/87のアミノ酸位置第104番目、第160番目及び287番目におけるアミノ酸に反映された。
Ｃ末端クローンをBamH I及びNco Iで、及びＮ末端クローンをXba I及びNco Iで消化して、PB2  cDNA全鎖を再構築した。QN法を用いて消化されたDNAフラグメントは精製され、BamH I/Xba I−digested pUC19 standard cloning vectorにリゲートした。
0003545418.tif 000002
実施例2:PB2  cDNAの突然変異誘発
５個の連続したアミノ酸配列中の４個もしくは５個の正もしくは負に帯電したアミノ酸を帯電クラスターとして定義し、インフルエンザA/LA/2/87  PB2蛋白のアミノ酸配列中に８個の荷電クラスターを確認した。実施例１でクローニングしたcDNAを用いて、特異的な部位特異的改変を含む８個のPB2変異cDNAを以下の通り構築した。
実施例１で得たPB2  cDNAクローンのクラスターおよびアミノ酸改変の位置、および導入した制限酵素部位の要約を表２に示す。一例を除く全てのケースで、クラスター中の正に帯電したアミノ酸（ＲまたはＫ）のみが、中性のアミノ酸残基であるアラニンをコードする核酸で置換することで改変されている。中性のアラニンに対応するいかなるコドン（GCA,GCC,GCG、またはGCU）も、１個の核酸の変化により負荷電のアスパラギン（GACまたはGAU）あるいはグルタミン（GAAまたはGAG）アミノ酸残基へと変異して戻ることから、これによって自発的な復帰の可能性を最小にする。クラスターが負荷電アミノ酸のみからなるALA6では、２個のＤ残基および２番目のＥ残基をアラニンをコードする核酸の置換によって改変した。導入したALA8突然変異は、核の局在化シグナルと考えられている配列の一部と一致しており、インフルエンザＡのA/WSN/33株のPB2蛋白における同じ位置をグルタミンに変える突然変異によって、組換え蛋白を発現しているBHK細胞の核と細胞質に同等に分布するPB2蛋白の生産が起きることが示された。MukaigawaおよびNayak,J Virol 65:245−253（1991）参照。全てのケースで、様々な対立遺伝子を追跡するための制限酵素（RE）の変化を導入するために、翻訳で反映されないようないくつかの突然変異を別に起こした。
PCRにより増幅した断片を用いたカセット突然変異誘発法によってALA1およびALA5改変を含むPB2  cDNAを作った。所望の置換をもつ配列に加え、近傍にある唯一の制限酵素切断部位の配列を含むプライマー（ALA1またはALA5、これらの配列については表１を参照）を、別の特有の制限酵素切断部位から遠い逆センスのプライマーと共に用いた。ALA2,ALA3,ALA4,ALA6,ALA7、およびALA8を含むPB2  cDNAは、Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）を用いて作成した。
0003545418.tif 000003
実施例3:ウイルスRNPの調製
ウイルスのリボヌクレオプロテイン（RNP）はSPF卵で増殖させたA/PR/8/34ウイルスから、Parvin,J Virol 63:5142−5152（1980）に記載されたプロトコールに改変を加えて用い、以下に開示する通りの精製した。
600から700個のSPF卵に約104pfuのインフルエンザA/PR/8/34ウイルスを注射して、35℃で２日間インキュベートした。一晩かけて４℃に冷却した後、尿嚢液を回収し、Amicon Hollow Fiber Cartridge（Type H1P100−20）とAmicon LP−１ポンプを用いて、約10倍に濃縮した。ウイルスを、SW28ローターを用いた25,000rpm,90分間、４℃の遠心分離により沈殿させ、100mM NaCl,10mM Tris−HC1,pH7.5,10mM EDTA（NTE緩衝液）で再懸濁し、30％スクロースクッションを通して、２回再沈殿（SW28ローターで、25,000rpm,2.5時間の後、SW50.1ローターで36,000rpm,90分間）した。
得られたウイルスの沈殿物を、0.1M Tris,pH8.1,0.1M KCl,5mM MgCl2,5％グリセロール、1.5％Triton−N 101,10mg/mlリソレシチン（使用時に添加）、および1.5Mmジチオトレイトール（DTT）に、最終蛋白濃度が3mg/mlとなるように再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。破壊したウイルスを、Amicon Centriprep−10濃縮器を用い、Beckman J−6B遠心機で、１〜３時間、3000rpmの条件で濃縮した。ウイルスのコアを、３層のグリセロール非連続勾配（33％,50％、および70％グリセロール）で、SW50.1ローターを用い45,000rpm,4℃で４時間遠心して精製した。0.3mlの画分を勾配から回収し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分析した。
NP蛋白中で濃縮した画分をプールして、CsCl/グリセロース非連続勾配（３層:15M  CsCl/30％グリセロール、2.0M  CsCl/35％グリセロール、および2.5M  CsCl,40％グリセロール）で、SW50.1ローターを用い、45,000rpm,24時間、４℃で遠心した。再度、画分をNP蛋白で濃縮してプールし、50,000ダルトンの分子量カットオフの透析チューブを用い、50％グリセロール、50mM Tris pH7.5,100mM NaCl,10mM MgCl2、および1mM DTTの最終緩衝液組成で透析した。各RNP調製物の蛋白濃度は１から2mg/mlであった。RNPは−80℃で保存した。RNPの活性は、0.1μg/μｌのRNPを用い、得られたウイルスをトリプシンの非存在下でMDBK細胞にプラーク形成させた点を除いて、Enami,Proc Natl Acad Sci USA 87:3802−3805（1990）の方法及び下記に要約したプロトコールに従った、WSN−HKヘルパーウイルスを用いるNA救済によって測定した。通常、トランスフェクションの収率は５−10x104pfuであつた。
実施例4:PB2変異cDNAのトランスフェクションおよび組換えPB2ウイルスの救済
野生型インフルエンザA/LA  PB2  cDNAおよび実施例２で構築した８個のインフルエンザA/LA  PB2  cDNA変異体を、Paleseとその共同研究者が初めに記載した逆遺伝法のプロトコール（例えば、EnamiおよびPalese,J Virol 65:2711−13（1991）参照）に変更を加えた方法に従い、Clements,Murphyとその同僚、J Clin Microbiol 30:655−662（1992）およびSubbarao,J Virol 67:7223−８（1993）が記載した通り、宿主域変異PB2ヘルパーウイルスを用いて、インフルエンザウイルス中に救済した。PB2宿主域ヘルパーウイルスは、A/Mallard/NY/6750/78由来のPB2遺伝子とA/LA/2/87由来の残りの７個の遺伝子を含む、単一遺伝子の再組換え体ウイルスであり、Dr.L.Potash（DynCorp/PRI,Rockville MD）から提供を受け、SPF卵で増殖させた。
このPB2ヘルパーウイルスは、PCK細胞中で効率よく増殖できるが、哺乳類細胞ではプラークを形成しない宿主域変異体である（Clements,J Clin Microbiol 30:655−662（1992）を参照）ことから、以前に初代培養鶏腎臓（PCK）細胞のトランスフェクションによる救済に用いられたことがある（Subbarao,J Viol 67:7223−８（1993）を参照）。驚くべきことに、我々は、哺乳類細胞株であるMDBKにこのウイルスを感染させることができ、また、その発現がインフルエンザの発現のためのポリメラーゼ機能（IVACAT）に依存するトランスフェクトされた指示遺伝子（クロラムフェニコール  アセチル  トランスフェラーゼ、CAT）を発現させることができることを見いだした。Luytijes,Cell 59:1107−1113（1989）を参照。従って、我々は、PCK細胞の代わりにMDBK細胞をPB2救済実験に用いた。
さらに我々は、MDBK細胞のエレクトロポレーション法を用い、以前に記載されたDEAE−デキストラン  トランスフェクション法（Li,Virus Res投稿中、及びU.S.出願番号08/316,049,1994年９月30日出願、ここに引用文献として含める、を参照）と比較して、ヘルパーウイルスの複製を10倍低減し、同等かそれ以上のトランスフェクタント  ウイルスを産生する、改善されたトランスフェクション法を採用した。エレクトロポレーション技術によって、もう一つのバックグラウンドの要因、つまりRNP調製物中に少量存在するA/PR/8/34由来のPB2をコードするRNA、も除かれたようである。
MDBK細胞はmATCC,Rocksille,Md.から提供を受けた。準集密的単層のMDBK細胞（トランスフェクション当たり60mmディッシュ１枚）に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS;JRH BioSciences,Lenexa,KS）で希釈したヘルパーウイルスを、感染多重度（moi）が５となるように、１時間、室温で感染させた。感染細胞は、事前に暖めておいた（37℃）0.5％トリプシンをかけて室温で２分間おき、ディッシュからはがした。Mg-2及びCa-2を含むPBS（JRH）中のダイズ  トリプシン  インヒビター（Sigma）2mgを添加して、トリプシンは不活性化した。感染細胞を、Beckman卓上臨床遠心機を用い室温で５分間、2000rpmで遠心して沈殿させ、これを0.3mlのPBSに再懸濁した。細胞を、エレクトロポレーション用のキュベット（0.4cmギャップ、Bio−Rad,Hercules,CA）に移した。vRNA−センスRNPは、Bsm Iで直線状にしたPB2  cDNA（トランスフェクション当たり２μｇ）を、ヌクレオチド３リン酸（Promega,Madison,WI）各々0.5mM,1unit/μ１  RNAsin（Promega）、および0.2〜0.4μg/μｌの精製RNP蛋白の存在下で、T3ポリメラーゼ（2units/μl,Stratagene,LA Jolla,CA）により転写して得た。転写物は37℃で45分間インキュベートした後、37℃で５分間、RQ1  Dnase（Promega）処理した。RNP混合物をキュベット中の感染細胞に添加し、Bio−Rad（Hercules,CA）Gene Pulserにより、直ちに250mV,500μＦの１パルスを加えてエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を、１％牛血清アルブミン（BSA;Gibco/BRL,Grand island,NY）および1.25μg/ml  Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトン（TPCK）処理トリプシン（Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ）を含む2mlのMEM（JRH）中で再度播種し、34℃で一晩インキュベートした。
上澄を回収して、希釈せず、10−cmディッシュ（トランスフェクション当たり２枚）のMDCK細胞の集密的単層を感染させるのに用いた。これに、2.5μg/ml  TPCK−トリプシンを含むＬ−15培地（JRH）中の0.8％アガロースを重層し、３日間34℃でインキュベートした。プラークを0.5mlのMEM/1％BSA中にとり、ピペットで分散させて、プラーク分散液0.1mlを24ウエルディッシュのMDCK細胞を感染させるのに用いた。感染MDCK細胞を34℃で２〜３日間インキュベートし、下記の実施例５に記載したように、組換えウイルスのスクリーニングを行った。
実施例5:組換えウイルスのRT/PCRスクリーニング
細胞変性効果（CPE）、即ち、細胞の伸張、球形化、およびこれに続く細胞の剥離と死、を示すウエルの上澄を回収し、痕跡量の添加cDNAの持ち越しを防ぐため、RQ1 Dnaseで37℃10分間処理した。vRNAは、上述の実施例１で記載したように、培地をPK処理した後、フェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿をおこなって調製した。RNAの３分の１はRT/PCRスクリーニングに用いた。プライマーには、n2pb24とPB2006（これらのプライマーの配列については表１を参照）を使った。これらのプライマーは、これらの実験で用いた３つの株（A/LA/2/87,A/PB8/34、またはA/Mallard/NY/6750/78）由来のPB2遺伝子の短い領域を増幅することができる。第一鎖のcDNAは、Superscript II逆転写酵素（Giobco/BRL,Bethesda,MD）を用い、各々のデオキシヌクレオチド３リン酸、0.1mM,n2pb2.4プライマー、１μＭ、およびRNAsin  2units/ml（Promega）を含む、生産者から供給された反応緩衝液中において、42℃,30分間合成した。反応混合物を、1XPCR緩衝液II（Perkin Elmer）,2mM MgCl2,0.2mM dNTPs,0.2μＭ各プライマー、および2.5units Taポリメラーゼに調製した。Perkin Elmer（Norwalk,CT）のサーマルサイクラーでPCRを行った。変性を94℃で１分間、アニーリングを50℃で１分間、伸長を72℃で２分間の条件で、35サイクル行った後、72℃で30分間インキュベーションした。
これらのプライマーを用いて得られたPCR断片を、下記の表３に示すような、３つの株のPB2遺伝子の特徴である異なるサイズの消化物を産生するHinf I（New England Biolabs,Beverly,MA）で消化して同定した。
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変異PB2 RNA配列を含むことが確認されたプラーク由来のPB2変異ウイルスは、MDCK細胞でプラーク精製され、一旦34℃でMDCK細胞に引継いだ後（MEM＋トリプシン中、２〜３日）、RT/PCRおよびHInf I制限酵素分析によって再度スクリーニングされ、33℃でSPF卵（SPAFAS）で増殖させたALA4突然変異導入ウイルスを除いては、35℃でSPF卵（SPAFAS）で増殖させた。RT/PCRによって、８個のPB2変異インフルエンザウイルスのうち６個が、うまくトランスフェクトされ、上述の技術によって保護されることが示された（ALA1,ALA4,ALA5,ALA6,ALA7、およびALA8）。ALA2とALA3は数回試みたが救済されず、従ってMDCK細胞中では生物学的に不活性なPB2蛋白をコードしていると思われる。
実施例6:温度感受性決定
上記実施例５におけるPB2変異ウイルスの群落数は、34℃（許容温度）の二酸化炭素培養器中、または、Lauda定温浸付サーキュレータによって厳密に温度を調整した水浴に沈めることにより、あるいは37,38、もしくは39℃としたNalgeneバイオコンテナ（Nalge,Rochester,NY）中で、MDCK細胞内のプラークアッセイ法によって力価測定された。水浴は、所望される温度を0.1℃の範囲に保った。よく水分を除去した容器を、密閉する前に二酸化炭素５％、酸素21％、窒素74％の気体（バイオブレンド;Altair,San Ramon,CA）で置換した。シャットオフ温度は、100倍あるいはプラーク形成（EOP）をそれ以上に低下させる最低温度で、それは34℃前後と観察された。
あるウイルスについて、プラークの大きさが温度上昇によって再現的に減少する場合、あるいはEOPが39℃において10倍またはそれ以上減少する場合、そのウイルスに温度感受性ありと決定した。EOPとプラークの形態は37から40℃の範囲の温度下で分析された。A/LA/2/87ウイルスの親株あるいは野生種のトランスウェクタント（LA36−8.1より分離）のEOPは、この温度範囲において、２倍以下で変化した。結果を以下の表４に示す。
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実施例7:フェレット（Ferrets）におけるPB2変異ウイルスの反応原性
候補となるインフルエンザワクチンの反応原性のテストのために、動物モデルとしてフェレットを選択した。フェレットは発熱、鼻かぜ症状、くしゃみ、無気力など、人間と動じインフルエンザの症状をいくつか示すからである。予めインフルエンザに対する抗体を持つものをスクリーニングし、７日間ペニシリンによる処置（一日30,000unit）を施した生後10週から12週の去勢したオスのフェレットを、Triple TFarm（Sayre,Pa）より入手した。フェレットにはジエチルエーテルによる麻酔をかけ、約108EID50のウイルスを混合した1mlの接種物（両鼻腔に各0.5mlづつ）で鼻腔内感染させた。感染したフェレットの体温は、３日間、一日２回、直腸内測定した。感染していないフェレットの正常体温は39℃（華氏102.2度）である。39.75℃（華氏103.5度）以上を発熱とする。３日の後、ペントバルビツールナトリウム（フェレット１頭当たり130mg）の心臓注射によってフェレットを安楽死させ、肺と鼻介を分離した。組織懸濁液（10％wt./vol.）の調製にはHankのバランス処理した塩水（HBSS,Gibco/BRL,Bethesda,MD）、すなわち2Xのベーゼン・イーグル・メディア（BME）アミノ酸、2XのBMEビタミン、4mMのＬ−グルタミン、0.05mg/mlのゲンタマイシンサルフェート（化学品は全てGibco/BRLより入手した。）を含有するもので均質化した。ウイルス力価は、Barrett,Growth,Purification and Titration of Influenza Viruses,p.119−150,B.W.J.Mahy,ed.,IRL Press,Oxford,England（1985）に記載されたEID50アッセイにより決定した。
最大級に弱毒化したPB2変異種、ALA1（49−14.1から分離）ならびにALA4（65−31.1から分離）を、それぞれ３頭づつに感染させた。比較例として、３頭のフェレットを野生種のLA  PB2（LA36−8.1より分離したものはALA1の比較例として、LA36−9.1からのものはALA4の比較例として利用した。）の遺伝子を持つトランスフェクタントウイルスに感染させた。結果を表6a及び6bに示した。ALA1は、鼻介中で確認可能な程度に複製を行い、野生種のトランスフェクタントと同様に発熱を誘発するので、顕著に弱毒化されているわけではない。しかしながら、ALA4は３頭のフェレットのいずれにも発熱を起こさせず、鼻介中においてより低い力価の複製を行った。これらの結果は、PB2遺伝子（ALA4）のクラスター荷電アラニン突然変異誘発によって生じたtsウイルスが、弱毒性のワクチン生成可能な機能を有する表現型を持っていることを示す。
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