(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生来のサブゲノムプロモーターを有する、トバモウイルス由来の組換え植物ウイルス核酸であって、
植物ウイルスコートタンパク質をコードする第１の核酸配列に作用可能に連結されている第１のウイルス  サブゲノム  プロモーター、ここで前記第１の核酸配列の転写が前記第１のウイルス  サブゲノム  プロモーターにより調節される；及び
前記トバモウイルスと天然に関係しない第２の核酸配列に作用可能に連結された第２の植物ウイルス由来サブゲノム  プロモーターを含んで成り；
ここで前記第１のウイルス  サブゲノム  プロモーターが前記第２のウイルス由来サブゲノム  プロモーターとは異種であり、それにより、前記組換え植物ウイルス核酸がニコチアナ（Nicitiana）宿主植物における前記第２核酸の組織的転写を可能にすることを特徴とする組換え植物ウイルス核酸。
【請求項２】
前記生来のサブゲノム  プロモーターが前記第１のウイルスサブゲノム  プロモーターである請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項３】
植物ウイルス  コートタンパク質をコードする前記核酸配列が、前記トバモウイルスと天然において関連する請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項４】
前記第２の植物ウイルス由来サブゲノム  プロモーターが、前記トバモウイルスと天然において関連しない請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項５】
前記第１のウイルス  サブゲノム  プロモーターが、植物ウイルス由来であり、且つ前記トバモウイルスと天然において関連しない請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項６】
植物ウイルスコートタンパク質をコードする前記核酸配列が、前記トバモウイルスと天然において関連する請求の範囲第５項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項７】
前記第２の植物ウイルス由来サブゲノム  プロモーターが、前記トバモウイルスと天然において関連する請求の範囲第５項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項８】
第３のウイルス  サブゲノム  プロモーター及び第３の核酸配列をさらに含んで成り、ここで前記第３のウイルス  サブゲノム  プロモーターが前記第１のウイルス  サブゲノム  プロモーター及び第２の植物ウイルス由来サブゲノム  プロモーターのそれぞれとは異種であり、それにより、前記組換え植物ウイルス核酸の宿主植物における前記第３の核酸の組織的転写を可能にする請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれか記載の組換え植物ウイルス核酸のいずれかにより感染されたニコチアナ宿主植物。
【請求項１０】
ニコチアナ宿主において核酸配列を組織的に転写するための方法であって：
(a) 請求の範囲第１〜８のいずれか１項記載の組換え植物ウイルス核酸によりニコチアナ宿主植物を感染せしめ；
(b) 前記感染された植物を増殖し、ここで前記第２核酸配列が組織的に転写されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記転写された第２核酸配列を単離することをさらに含んで成る請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の核酸配列によりコードされるタンパク質を組織的に発現する追加の段階を含んで成る請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１３】
前記発現されたタンパク質を単離することをさらに含んで成る請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項１４】
前記植物内で二次代謝物の生成を調節するタンパク質を組織的に発現する段階をさらに含んで成る請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１５】
前記二次代謝物を単離することをさらに含んで成る請求の範囲第14項記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子生成物が第２核酸配列の組織的な転写から生成され、前記遺伝子生成物がIL−１，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−８，IL−９，IL−10，IL−11，IL−12，EPO, G−CSF,GM−CSF, hPG−CSF, M−CSF,第VIII因子，第IX因子，TPA, hGH, レセプター，レセプターアンタゴニスト，抗体，神経ポリペプチド，メラニン，インスリン及びワクチンから成る群から選択される請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子生成物が前記第２核酸配列の組織的な転写から生成され、前記生成物がアンチ−センス RNA発現に起因する生物学的に不活性なポリペプチド又はタンパク質である請求の範囲第10項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（ａ）自己複製性であり；（ｂ）宿主の中で組織的感染(systemic ifection) を行うことができ；（ｃ）天然ウイルスに対して外来であり、宿主植物の中で転写または発現される核酸配列を含有するか、あるいは含有することができ；そして（ｄ）ことに外来核酸配列の転写および発現について、安定である植物ウイルスのベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスは感染性因子の独特なクラスであり、それらの顕著な特徴は簡単な体制および複製のメカニズムである。事実、完全なウイルス粒子、またはヴィリオンは、タンパク質の外殻によりおよび時には、例えば、アルファウイルスの場合におけるように、追加の膜のエンベロープにより取り囲まれた、自律的複製を行うことができる遺伝学的物質(DNAまたはRNA)のブロックとして主として見なすことができる。外殻タンパク質はウイルスを環境から保護し、そして１つの宿主細胞から他のへの伝達のためのベヒクルとして働く。
【０００３】
細胞と異なり、ウイルスは大きさが成長せず、次いで分割しない。なぜなら、ウイルスはそれらの外殻内に生合成の酵素およびそれらの複製に要求される機構をほとんど（あるいは全く）含有しないからである。むしろ、ウイルスは細胞の中でそれらの別の成分の合成により、次いでアセンブリーにより増殖する。こうして、ウイルスの核酸は、その外殻を脱いだ後、適当な細胞の機構と接触するようになり、ここでこの機構はウイルスの複製に要求されるタンパク質の合成を特定する。次いでウイルスの核酸は、ウイルスおよび細胞の両者の酵素の使用により、それ自体複製する。ウイルスの外殻の成分は形成され、そして核酸および外殻の成分は最後に組み立てられる。あるウイルスでは、複製はヴィリオンの中に存在する酵素により開始される。
【０００４】
所定の植物ウイルスは、一本鎖または二本鎖であることができる DNAまたはRNA を含有することができる。ヴィリオンの中の核酸の比率は約１％〜約50％の間で変化する。遺伝情報／ヴィリオンの量は約３kb〜300kb ／鎖の間で変化する。したがって、ウイルス特異的タンパク質の多様性は変化する。二本鎖 DNAを含有する植物ウイルスの１つの例は次のものを包含するが、これらに限定されない：カウリモウイルス(caulimoviruses)、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)。
【０００５】
一本鎖 DNAを含有する代表的な植物ウイルスは、カッサバ潜在ウイルス、マメゴールデン(golden)モザイクウイルス、およびクロリス・ストリエイト(Chlorisstriate) モザイクウイルスである。イネの矮化ウイルスおよび創傷の腫瘍ウイルスは二本鎖 RNAの植物ウイルスの例である。一本鎖 RNAの植物ウイルスは、タバコモザイクウイルス(TMV) 、カブ黄斑モザイクウイルス(TYMV)、イネ壊死ウイルス(RNV) およびスズメノチャヒキモザイクウイルス(BMV) を包含する。一本鎖RNAのウイルスの中の RNAは、プラス（＋）またはマイナス（−）鎖であることができる。植物ウイルスに関する遺伝情報については、次の文献を参照のこと；Grierson,D. ら（１）；Gluzman,Y.ら（２）。
【０００６】
植物ウイルスを分類する１つの手段は、ゲノムの体制(organizat- ion)に基づく。多数の植物ウイルスは RNAゲノムを有するが、遺伝情報の体制はグループの間で異なる。大部分の１成分から成る植物 RNAウイルスのゲノムは、（＋）−センスの一本鎖分子である。この型のゲノムをもつウイルスの少なくとも１１の主要なグループが存在する。この型のウイルスの例は TMVである。植物 RNAウイルスの少なくとも６つの主要なグループは２成分から成るゲノムを有する。
【０００７】
これらにおいて、ゲノムは通常別々の粒子の中に包膜された２つの明確な（＋）−センスの一本鎖 RNA分子から成る。両者のRNA は感染力のために要求される。ササゲモザイクウイルス(CPMW)は、２成分から成る植物ウイルスの１つの例である。第３の主要なグループは、少なくとも６つの主要な型の植物ウイルスを含有し、３成分から成り、３つの（＋）−センスの一本鎖 RNA分子をもつ。各鎖は別々に包膜されており、そしてすべての３つは感染力のために要求される。３成分から成る植物ウイルスの例はアルファルファモザイクウイルス(AMV) である。
【０００８】
多数の植物ウイルスは、また、特定の遺伝子産生物を増幅するために合成される、より小さいサブゲノムのmRNAを有する。一本鎖 DNAゲノムを有する植物ウイルスの１つのグループは、ジェミニウイルス、例えば、カッサバ潜在ウイルス(CLV) およびトウモロコシ茎ウイルス(MSV) である。いくつかの植物ウイルスは、植物の形質転換ベクターとしてのそれらの使用を予測して、それらの核酸を研究するためにクローニングされてきている。クローニングされたウイルスの例は、次のものを包含する；BMV, Ahlguist, P. およびJanda, M.(３）；TMV, Dawson W.O.ら（４）；CaMV, Debeurier, G. ら（５）；およびBGMV, Moringen, T.ら（６）。
【０００９】
生物の多数の種を形質転換するために利用される技術が開発されてきている。これらの技術により形質転換することができる宿主は、細菌、酵母菌、真菌、かび、動物細胞および植物の細胞または組織を包含する。形質転換は、自己複製性でありかつ所望の宿主と適合性であるベクターを使用することによって達成される。ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスに基づく。外来 DNAをベクターの中に挿入し、次いでこれを使用して適当な宿主を形質転換する。次いで、形質転換された宿主を選択またはスクリーニングにより固定する。これらの宿主の形質転換に関するそれ以上の情報については、次の文献を参照のこと：Moleeular Cloning(７) DNA Cloning （８):Grierson, D.ら（１）、およびMethods in Enzymology 、（９）。
【００１０】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されたウイルスは、CaV, TMVおよびBVを包含する。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第 4,855,237号(BGV) 、欧州特許出願公開（EP−Ａ）第67,553号(TMV) 、日本国特許出願公開第63-14693号(TMA) 、欧州特許出願公開(EPA) 第 194,809号（BV）、欧州特許出願公開(EPA) 第 278,667号（BV）、Brisson, N. ら（10)(CaV)、およびGuzmanら（２）に記載されている。植物を包含する多数の宿主の中の外来 DNAの発現のために使用する偽ウイルスは、WO  87／06261 に記載されている。
【００１１】
ウイルスが DNAウイルスであるとき、ウイルスそれ自体に構成をなすことができる。あるいは、外来 DNAを使用する所望のウイルスのベクターの構成を容易とするために、ウイルスをまず細菌のプラスミドの中にクローニングすることができる。次いで、ウイルスをプラスミドから切取る。ウイルスが DNAウイルスである場合、複製の細菌起源をウイルスの DNAに取り付け、次いでこれを細菌により複製する。
【００１２】
この DNAの転写および翻訳は外殻タンパク質を生産し、この外殻タンパク質はウイルスの DNAを包膜するであろう。ウイルスが RNAウイルスである場合、このウイルスを一般にcDNAとしてクローニングし、そしてプラスミドの中に挿入する。次いで、このプラスミドを使用して構成体のすべてを作る。次いで、プラスミドのウイルスの配列を転写し、そしてウイルスの遺伝子を翻訳してウイルスの RNAを包膜する１種または２種以上の外殻タンパク質を生産することによって、 RNAウイルスを生産する。
【００１３】
植物の中の非ウイルスの外来遺伝子の導入および発現のための植物 RNAウイルスの構成は、前述の文献ならびにDawson,W.O. ら（11);Takamatsu, N. ら（12）；French, R.ら（13）；およびTakamatsu, N. ら（14）により証明される。しかしながら、これらのウイルスのベクターのいずれも、植物における組織的広がりおよび全植物における植物細胞の大部分の中の非ウイルスの外来遺伝子の発現を行うことができなかった。先行技術のウイルスのベクターの多数の他の欠点は、非ウイルスの外来遺伝子の維持のために安定ではないことである。例えば、Dawson, W.O.ら（11）を参照のこと。こうして、植物ウイルスのベクターおよびウイルスを開発するこの活動にかかわらず、宿主植物の中の組織的感染および外来 DNAの安定な発現を行うことができる安定な組み換え植物ウイルスがなお要求されている。
【００１４】
〔発明の要約〕
本発明は、非天然の（外来）核酸配列の維持および転写または発現について安定でありかつ宿主植物の中でこのような外来配列を組織的に転写または発現することができる、組み換え植物ウイルスの核酸および組み換えウイルスに関する。さらに詳しくは、本発明による組み換え植物ウイルスの核酸は、天然植物ウイルスのサブゲノムプロモーター、少なくとも１つの非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーター、植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディング配列、および必要に応じて、少なくとも１つの非天然の核酸配列からなる。
【００１５】
１つの態様において、天然外殻タンパク質がウイルスの核酸から欠失されており、植物宿主の中で発現し、組み換え植物ウイルスの核酸をパッケージし、そして組み換え植物ウイルスの核酸による宿主の組織的感染を保証することができる、非天然植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディング配列および非天然プロモーター、好ましくは非天然外殻タンパク質のコーディング配列のサブゲノムのプロモーターが挿入されている、植物ウイルスの核酸が提供される。
組み換え植物ウイルスの核酸は、１または２以上の追加の非天然サブゲノムのプロモーターを含有することができる。各非天然サブゲノムのプロモーターは、植物宿主の中で隣接する遺伝子または核酸配列を転写または発現することができ、そして互いとおよび天然サブゲノムのプロモーターと組み換えを行うことができない。
【００１６】
１より多い核酸配列が含まれている場合、非天然（外来）核酸配列を天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターまたは天然および非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターに隣接して挿入することができる。非天然核酸配列を宿主植物の中でサブゲノムのプロモーターのコントロール下に転写または発現して、所望の生産物を生産する。
第２の態様において、組み換え植物ウイルスの核酸を第１の態様におけるように提供するが、ただし天然外殻タンパク質のコーディング配列を非天然外殻タンパク質のコーディング配列の代わりに非天然外殻タンパク質のサブゲノムのプロモーターの１つに隣接して配置する。
【００１７】
第３の態様において、天然外殻タンパク質の遺伝子がそのサブゲノムのプロモーターに隣接して存在しかつ１または２以上の非天然サブゲノムのプロモーターがウイルスの核酸の中に挿入されている組み換え植物ウイルスの核酸が提供される。挿入された非天然サブゲノムのプロモーターは植物宿主の中で隣接する遺伝子を転写または発現することができ、そして互いとおよび天然サブゲノムのプロモーターと組み換えることができない。非天然の核酸配列を非天然サブゲノムの植物ウイルスのプロモーターに隣接して挿入することができ、こうして前記配列は宿主植物の中でサブゲノムのプロモーターのコントロール下に転写または発現されて所望の生産物を生産する。
【００１８】
第４の態様において、組み換え植物ウイルスの核酸は第３の態様におけるように提供されるが、ただし天然外殻タンパク質のコーディング配列は非天然外殻タンパク質のコーディング配列と置換される。
ウイルスのベクターは組み換え植物ウイルスの核酸によりエンコードされた包膜されて、組み換え植物ウイルスを生産する。組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物ウイルスを使用して宿主植物を感染させる。組み換え植物ウイルスの核酸は宿主の中で複製し、宿主の中で組織的広がりをし、そして宿主の中で１または２以上の外来遺伝子を転写または発現して所望の生産物を生産することができる。このような生産物は治療用または他の有用なポリペプチドまたはタンパク質、例えば、酵素、複雑な生物分子、リボザイム、あるいはアンチセンス RNA発現から生ずるポリペプチドまたはタンパク質生産物を包含するが、これらに限定されない。
【００１９】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、非天然（外来）核酸配列の維持および転写または発現について安定でありかつ宿主植物の中でこのような外来配列を組織的に転写または発現することができる。組み換え植物ウイルスの核酸および組み換えウイルスに関する。さらに詳しくは、本発明による組み換え植物ウイルスの核酸は、天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーター、少なくとも１つの非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーター、植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディング配列、および必要に応じて、少なくとも１つの非天然の核酸配列からなる。
【００２０】
１つの態様において、天然外殻タンパク質がウイルスの核酸から欠失されており、植物宿主の中で発現し、組み換え植物ウイルスの核酸をパッケージし、そして組み換え植物ウイルスの核酸による宿主の組織的感染を保証することができる、非天然植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディング配列および非天然プロモーター、好ましくは非天然外殻タンパク質のコーディング配列のサブゲノムのプロモーターが挿入されている、植物ウイルスの核酸が提供される。あるいは、外殻タンパク質の遺伝子は、融合タンパク質が生産されるように、その中に非天然の核酸配列を挿入することによって不活性化することができる。組み換え植物ウイルスの核酸は、１または２以上の追加の非天然サブゲノムのプロモーターを含有することができる。
【００２１】
各非天然サブゲノムのプロモーターは、植物宿主の中で隣接する遺伝子または核酸配列を転写または発現することができ、そして互いとおよび天然サブゲノムのプロモーターと組み換えを行うことができない。１より多い核酸配列が含まれている場合、非天然（外来）核酸配列を天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターまたは天然および非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターに隣接して挿入することができる。非天然核酸配列を宿主植物の中でサブゲノムのプロモーターのコントロール下に転写または発現して、所望の生産物を生産する。
【００２２】
第２の態様において、組み換え植物ウイルスの核酸を第１の態様におけるように提供するが、ただし天然外殻タンパク質のコーディング配列を非天然外殻タンパク質のコーディング配列の代わりに非天然外殻タンパク質のサブゲノムのプロモーターの１つに隣接して配置する。
【００２３】
第３の態様において、天然外殻タンパク質の遺伝子がそのサブゲノムのプロモーターに隣接して存在しかつ１または２以上の非天然サブゲノムのプロモーターがウイルスの核酸の中に挿入されている組み換え植物ウイルスの核酸が提供される。挿入された非天然サブゲノムのプロモーターは植物宿主の中で隣接する遺伝子を転写または発現することができ、そして互いとおよび天然サブゲノムのプロモーターと組み換えることができない。非天然の核酸配列を非天然サブゲノムの植物ウイルスのプロモーターに隣接して挿入することができ、こうして前記配列は宿主植物の中でサブゲノムのプロモーターのコントロール下に転写または発現されて所望の生産物を生産する。
【００２４】
第４の態様において、組み換え植物ウイルスの核酸は第３の態様におけるように提供されるが、ただし天然外殻タンパク質のコーディング配列は非天然外殻タンパク質のコーディング配列と置換される。
ウイルスのベクターは組み換え植物ウイルスの核酸によりエンコードされた包膜されて、組み換え植物ウイルスを生産する。組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物ウイルスを使用して宿主植物を感染させる。組み換え植物ウイルスの核酸は宿主の中で複製し、宿主の中で組織的広がりをし、そして宿主の中で１または２以上の外来遺伝子を転写または発現して所望の生産物を生産することができる。
【００２５】
明細書および請求の範囲（ここにおいてこのような用語に与えた範囲を包含する）の明瞭なかつ首尾一貫した理解を提供するために、次の定義を提供する：
隣接する：規定した配列に対して直ぐに５′または３′のヌクレオチド配列の中の位置。
アンチセンスの機構：翻訳されているmRNAの少なくとも一部分に対して相補的である RNA分子が細胞の中に存在するために、タンパク質へのmRNAの翻訳速度をコントロールすることに基づく遺伝子の調節の１つのタイプ。
【００２６】
細胞培養物：未分化のまたは分化した状態であることができる細胞の増殖する塊。
キメラの配列または遺伝子：少なくとも２つの異種部分から誘導化されたヌクレオチド配列。配列は DNAまたは RNAからなることができる。
コーディング配列：転写および翻訳されたとき、細胞のポリペプチドの形成を生ずるデオキシリボヌクレオチド配列、あるいは翻訳されたとき、細胞のポリペプチドの形成を生ずるリボヌクレオチド配列。
【００２７】
適合性：ある系の他の成分を使用して作用する能力。ある宿主と適合性であるベクターまたは植物ウイルスの核酸は、その宿主の中で複製することができるものである。ウイルスのヌクレオチド配列と適合性である外殻タンパク質は、そのウイルスの配列を包膜することができるものである。
遺伝子：明確な細胞生産物の原因となる明確な核酸配列。
宿主：ベクターまたは植物ウイルスの核酸を複製することができかつウイルスのベクターまたは植物ウイルスの核酸を含有するウイルスにより感染されるすることができる細胞、組織または生物。この用語は、適当ならば、原核生物および真核生物の細胞、器官、組織または生物を包含することを意図する。
【００２８】
感染：ウイルスがその核酸を宿主の中に転移するか、あるいは宿主の中に核酸を導入する能力、その宿主の中でウイルスの核酸を複製され、ウイルスのタンパク質は合成され、そして新しいウイルス粒子が組み立てられる。これに関して、用語「伝達可能」および「感染力」をここにおいて互換的に使用する。
非天然：サブゲノムのmRNAの生産を促進する非天然 RNA配列であって、これは次のものを包含するが、これらに限定されない：１）植物ウイルスのプロモーター、例えば、ORSVおよびブローム(vrome) モザイクウイルス、２）他の生物からのウイルスのプロモーター、例えば、ヒトシンドビスウイルスのプロモーター、および３）合成プロモーター、
【００２９】
表現型の特性：遺伝子の発現から生ずる観察可能な性質。
植物細胞：原形質体および細胞壁から成る、植物の構造的および生理学的単位。
植物の器官：植物の明確なかつ可視の分化した部分、例えば、根、茎、葉または胚。
植物の組織：植物界または培養物の中の植物の組織。この用語は全植物、植物細胞、原形質体、細胞培養物、または構造的または機能的単位に有機化された植物細胞のグループを包含することを意図する。
【００３０】
生産細胞：ベクターまたはウイルスのベクターを複製することができるが、必ずしもウイルスに対する宿主であることは必要ではない、細胞、組織または器官。この用語は原核生物および真核生物の細胞、器官、組織または生物、例えば、細菌、酵母菌および植物の組織を包含することを意図する。
プロモーター：コーディング配列の転写の開始に関係するコーディング配列に隣接する５′−フランキング非コーディング配列。
原形質体：細胞壁をもたず、細胞培養物または全植物に再生する潜在的能力を有する、分離された植物細胞。
【００３１】
組み換え植物ウイルスの核酸：非天然核酸配列を含有するように修飾された植物ウイルスの核酸。
組み換え植物ウイルス：組み換え植物ウイルスの核酸を含有する植物ウイルス。
サブゲノムのプロモーター：ウイルスの核酸のサブゲノムのmRNAのプロモーター。
実質的な配列の相同性：互いに実質的に機能的に同等であるヌクレオチド配列を意味する。実質的な配列の相同性を有するこのような配列の間のヌクレオチドの差は、遺伝子産生物またはこのような配列によりコードされる RNAの機能に影響を与える小さすぎるであろう。
【００３２】
転写： DNA配列の相補的コピーとしての RNAポリメラーゼによる RNA分子の生産。
ベクター：細胞の間で DNAセグメントを転移する自己複製性 DNA分子。
ウイルス：タンパク質の中に包膜された核酸から構成された感染性因子。ウイルスは、前述したように１成分から成るウイルス、２成分から成るウイルス、３成分から成るウイルスまたは多成分から成るウイルスであることができる。
【００３３】
本発明は、組み換え植物ウイルスの核酸を含有する組み換え植物ウイルスによるか、あるいは植物宿主の感染した組織の中で転写または発現される１または２以上の非天然の核酸配列を含有する組み換え植物ウイルスの核酸による、植物宿主の感染を提供する。コーディング配列の生産物は植物から回収されることができるか、あるいは植物において表現型の特性、例えば、雄性不捻性を引き起こすことができる。
【００３４】
本発明は、ある数の利点を有し、それらの１つは標的生物の形質転換および再生が不必要であることである。他の利点は、標的生物のゲノムの中に所望のコーディング配列組み込むベクターを開発することが不必要であることである。存在する生物は、胚細胞を通る必要なしに、新しいコーディング配列で変更することができる。本発明は、また、所望の生物、組織、器官または細胞にコーディング配列を適用するというオプションを提供する。組み換え植物ウイルスの核酸は、また、外来コーディング配列に対して安定であり、そして組み換え植物ウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸は植物宿主の中で組織的感染を行うことができる。
【００３５】
本発明によるキメラの遺伝子およびベクターおよび組み換え植物ウイルスの核酸は、この分野においてよく知られている技術を使用して構成される。適当な技術は、Molecular Cloning （７）;Methodsin Enzymol.(９）; およびDNA Cloning （８）に記載された。媒質の組成はMiller,J.H.(15) 、ならびに前述の参考文献に記載された。 DNAの操作および酵素の処理は、製造業者が推奨する手順により実施される。
【００３６】
本発明の重要な特徴は、適合性植物宿主の中で複製および組織的広がりを行うことができ、そして植物宿主の中で隣接する核酸配列の転写または発現をすることができる、組み換え植物ウイルスの核酸(RPVNA) の調製である。 RPVNAをさらに修飾して天然外殻タンパク質のコーディング配列のすべてまたは一部分を欠失し、そして天然サブゲノムのプロモーターまたは１つの非天然サブゲノムのプロモーターコントロール下に非天然外殻タンパク質のコーディング配列を含有するようにするか、あるいは天然外殻タンパク質のコーディング配列を非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターのコントロール下に置くことができる。適当なウイルスの部分的リストは前述した。ヌクレオチド配列はRNA,DNA,cDNAまたは化学的に合成した RNAまたは DNAであることができる。
【００３７】
本発明の特徴のいずれかを達成する第１工程は、植物ウイルスの核酸の生物学的機能を破壊しないで、１または２以上の非天然サブゲノムのプロモーターが植物ウイルスの核酸の中に挿入されるように、既知の普通の技術により植物ウイルスの核酸のヌクレオチド配列を修飾することである。サブゲノムのプロモーターは、組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物ウイルスにより感染した植物宿主の中で隣接する核酸配列を転写または発現することができる。天然外殻タンパク質のコーディング配列を２つの態様において欠失し、第２の態様において非天然サブゲノムのプロモーターのコントロール下に配置するか、あるいは他の態様において保持することができる。
【００３８】
それを欠失するか、あるいはそうでなければ不活性化する場合、非天然外殻タンパク質の遺伝子を１つの非天然サブゲノムのプロモーターのコントロール下に挿入するか、あるいは必要に応じて天然外殻タンパク質の遺伝子のサブゲノムのプロモーターのコントロール下に挿入する。この非天然外殻タンパク質は組み換え植物ウイルスの核酸を包膜して、組み換え植物ウイルスを生産することができる。こうして、組み換え植物ウイルスの核酸は、天然または非天然の外殻タンパク質のコーディング配列であることができる。外殻タンパク質のコーディング配列を１つの天然または非天然のサブゲノムのプロモーターのコントロール下に含有する。外殻タンパク質は、植物宿主の組織的感染に関係する。
【００３９】
この要件を満足し、したがって適当であるウイルスのいくつかは、タバコモザイクウイルスのグループからのウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス(TMV) 、ササゲモザイクウイルス(CMV) 、アルファルファモザイクウイルス(AMV) 、キュウリ緑斑点モザイクウイルスのスイカ株(CGMMV−W)およびカラスムギモザイクウイルス(OMV) およびスズメノチャヒキモザイクウイルスのグループからのウイルス、例えば、スズメノチャヒキモザイクウイルス(MBV) 、ソラマメ斑点ウイルスおよびササゲ白化斑点ウイルスを包含する。追加の適当なウイルスは、イネ壊死ウイルス(RNV) 、およびジェミニウイルス、例えば、トマトゴールデン(golden)モザイクウイルス(TGMV)、カッサバ潜在ウイルス(CLV) およびトウモロコシ茎ウイルス(MSV) を包含する。適当なウイルスのこれらのグループの各々は下で特徴づける。
【００４０】
タバコモザイクウイルスのグループ
タバコモザイクウイルス(TMV) はトバモウイルス(Tobamoviruses) の１構成員である。 TMVヴィリオンは管状フィラメントであり、そして単一の右巻きヘリックスで配置された外殻タンパク質のサブユニットからなり、一本鎖 RNAがヘリックスの旋回部分の間にはさまれている。 TMVはタバコならびに他の植物を感染する。 TMVは機械的に伝達され、そして土または乾燥した葉組織の中に１年またはそれ以上の間感染性に止まることができる。
TMVヴィリオンは３より小さいか、あるいは８より大きいpHの環境に暴露するか、あるいはホルムアルデヒドまたはヨウ素により不活性化することができる。TMVの調製物は、植物の組織から(NH4)2SO4 沈澱および引き続く分別遠心により得ることができる。
【００４１】
TMV一本鎖 RNAゲノムは約6400ヌクレオチドの長さであり、そして５′末端においてキャップされているが、ポリアデニル化されていない。ゲノム RNAは、約130,000 (130Ｋ) の分子量のタンパク質および分子量約180,000 (180Ｋ）のリードスルーにより生産された他のタンパク質のmRNAとして働く。しかしながら、それは外殻タンパク質の合成のためのメッセンジャーとして機能することができない。他の遺伝子は感染の間にモノシストロン性３′−コタ−ミナルサブゲノムmRNAの形成により発現され、このmRNAは17.5Ｋの外殻タンパク質をエンコードするもの(LMC) および30Ｋのタンパク質をエンコードするもの（Ｉ2 ）を包含する。30Ｋのタンパク質は感染した原形質体において検出され（16）、そしてそれは感染した植物の中のウイルスの細胞対細胞の輸送に関係する（17）。２つの大きいタンパク質の機能は未知である。
【００４２】
ゲノムのＩ2 および LMCの RNAに相当する二本鎖 RNAを包含する、いくつかの二本鎖 RNA分子は、 TMVで感染した植物の組織の中で検出された。これらの RNA分子は、多分、異なるメカニズムにより起こるように思われるゲノムの複製および／またはmRNA合成のプロセスにおける中間体である。
TMVのアセンブリーは植物細胞の細胞膜の中で明らかに起こるが、 TMVのアセンブリーは、 ctDNAの転写体が精製した TMVヴィリオンの中で検出されたので、葉緑体の中で起こるうることが示唆された。 TMVのアセンブリーは、外殻タンパク質のリング形集合体（「ディスク」)(各ディスクは17サブユニットの２層から成る）および RNAの中の独特の内部の核化部位との間の相互作用により起こる；TMVの共通の株の中の３′末端からの約 900ヌクレオチドのヘアビン領域。
【００４３】
この部位を含有するサブゲノムの RNAを含む RNAはヴィリオンの中にパッケージされることができる。ディスクは RNAとの相互作用のとき明らかにらせんの形態を取り、次いでアセンブリー（伸長）は両者の方向に進行する（しかし核化部位から３′→５′方向において非常にいっそう急速に）。
トバモウイルス(Tobamoviruses) の他の構成員であるキュウリ緑斑点モザイクウイルスのスイカ株(CGMMV−W)は、キュウリのウイルスに関係づけられる。Noru,Y. ら（18）。 CGMMV−W の外殻タンパク質は、 TMVおよび CGMMVの両者の RNAと相互作用して、in vitroでウイルス粒子をアセンブリングする。Kurisuら（19）。
【００４４】
トバモウイルスのグループのいくつかの株は、起源のアセンブリーの位置に基づいて、２つのサブグループに分割される。Fukuda,M. ら（20）。サブグループＩは、ブルガレ(vulgare) 、OM、およびトマトの株を包含し、 RNAゲノムの３′末端からの約800 〜1000ヌクレオチドのアセンブリーの起源を外殻タンパク質のシストロンの外側に有する。Lebeurier, G. ら（21）：およびFukuda, M.ら（22）。サブグループIIは、CGMMV W およびコーンピア(cornpea) 株(Cc)を包含し、RNAゲノムの３′末端からの約 300〜500 ヌクレオチドのアセンブリーの起源を外殻タンパク質のシストロンの内側に有する。Fukuda, M.ら（22）。 CGMMV−W の外殻タンパク質のシストロンは、３′末端からヌクレオチド 176−661 に位置する。３′非コーディング配列は 175ヌクレオチドの長さである。アセンブリー起源は、外殻タンパク質のシストロン内に位置する。Moshi, T. ら（23）。
【００４５】
スズメノチャヒキモザイクウイルスのグループ
スズメノチャヒキモザイクウイルス（BV）は、プロモウイルスと普通に呼ばれる、３成分から成る一本鎖 RNAを含有する植物ウイルスのグループの１構成員である。ブロモウイルスの各構成員は、狭い範囲の植物を感染する。ブロモウイルスの機械的伝達は容易に起こりそしていくつかの構成員は甲虫により伝達される。BVに加えて、他のプロモウイルスは、ソラマメ斑点ウイルスおよびササゲ白化斑点を包含する。
【００４６】
典型的には、ブロモウイルスのヴィリオンは二十面体であり、約26mmの直径をもち、単一種の外殻タンパク質を含有する。ブロモウイルスのゲノムは、線状の正のセンスの一本鎖 RNAの３つの分子を有し、そして外殻タンパク質のmRNAはまた包膜されている。 RNAの各々はキャップド５′末端および３′末端にtRNA様構造（チロシンを受容する）。ウイルスのアセンブリーは細胞質の中で起こる。BMV の完全なヌクレオチド配列は、Alquist ら（24）により同定され、そして特徴づけられた。
【００４７】
イネ壊死ウイルス
イネ壊死ウイルスは、ポティウイルス(Potyviruses) のジャガイモウイルスＹグループの１構成員である。イネ壊死ウイルスのヴィリオンは、１タイプの外殻タンパク質（分子量約32,000〜約36,000) および１分子の線状正センスの一本鎖RNAからなる屈曲性のフィラメントである。イネ壊死ウイルスはポルブムブクサ・アラミニス(Polyvmxa araminis)(植物、藻類および真菌、かびの中に見いだされる真核生物の寄生体により伝達される。
【００４８】
ジェミニウイルス
ジェミニウイルスは、ヴィリオンが独特の形態をもつ、小さい一本鎖 DNA含有植物ウイルスのグループである。各ヴィリオンは、単一のタイプnoタンパク質（約 2.7〜3.4 ×104 の分子量をもつ）から構成された、１対の同じ大きさの粒子（不完全な二十面体）から成る。各ジェミニウイルスは、１分子の円形の正のセンスの一本鎖 DNAを含有する。いくつかのジェミニウイルス（すなわち、カッサバ潜在ウイルスおよびマメのゴールデンモザイクウイルス）において、ゲノムは２つの一本鎖 DNA分子を含有する２成分から成るように思われる。
【００４９】
任意の適当な植物ウイルスの核酸を利用して、本発明の組み換え植物ウイルスの核酸を調製することができる。植物ウイルスのヌクレオチド配列は、普通の技術を利用して、１または２以上のサブゲノムのプロモーターを植物ウイルスの核酸の中に挿入することによって修飾される。サブゲノムのプロモーターは、特定の宿主植物の中で機能することができる。例えば、宿主がタバコである場合、TMV が利用されるであろう。挿入されたサブゲノムのプロモーターはTMV 核酸と適合性でなくてはならず、そしてタバコの中で隣接する核酸配列の転写または発現を指令することができる。
天然外殻タンパク質の遺伝子は、また、保持されることができ、そして非天然の核酸配列は後述するように融合タンパク質をつくるためにその中に挿入することができる。この例において、非天然外殻タンパク質の遺伝子も利用される。
【００５０】
天然または非天然の外殻タンパク質の遺伝子は、組み換え植物ウイルスの核酸の中で利用される。どの遺伝子が利用されても、その天然サブゲノムのプロモーターに隣接するか、あるいは他の利用可能なサブゲノムのプロモーターに隣接して位置することができる。非天然外殻タンパク質は、天然外殻タンパク質についての場合におけるように、組み換え植物ウイルスの核酸を包膜し、そして宿主植物の中で組み換え植物ウイルスの核酸の組織的広がりを提供することができる。外殻タンパク質は、問題の植物宿主の中で組織的感染を提供するように選択される。例えば、 TMV−O 外殻タンパク質はＮ．ベンタミアナ(benthamiana) の中で組織的感染を提供するが、TMV U1外殻タンパク質はニコチアナ・タバクム(N.tabacum) の中で組織的感染を提供する。
【００５１】
組み換え植物ウイルスの核酸は、ウイルスの核酸を適当な生産細胞の中でクローニングすることによって調製される。ウイルスの核酸が DNAである場合、それは普通の技術を使用して適当なベクターの中に直接クローニングすることができる。１つの技術は、複製起源を生産細胞と適合性のウイルス DNAに取り付けることである。ウイルスの核酸が RNAである場合、ウイルスのゲノムの全長の DNAコピーをまずよく知られている手順により調製する。例えば、ウイルス RNAを逆転写酵素を使用して DNAの中に転写してサブゲノムの DNA片を生産し、そして二本鎖 DNAを DNAポリメラーゼを使用して作る。
【００５２】
次いでこの DNAを適当なベクターの中にクローニングし、そして生産細胞の中にクローニングする。 DNA片をマッピングし、そして適切な配列の中で組み合わせて、必要に応じて、ウイルス RNAゲノムの全長の DNAコピーを生産する。次いで、外殻タンパク質の遺伝子をもつか、あるいはもたないサブゲノムのプロモーターのための DNA配列を、利用する本発明の特定の態様従い、核酸の中の非必須部位の中に挿入する。非必須部位は、植物ウイルスの核酸の生物学的性質に影響を与えない部位である。 RNAゲノムは感染性因子であるので、生産細胞の中で RNAが生産されるようにcDNAは適当なプロモーターに隣接して位置する。キャップド RNAが感染性因子である場合、 RNAは普通の技術を使用してキャップされる。
【００５３】
本発明の第２の特徴は、植物宿主の中で転写されることができる１または２以上の非天然の核酸配列をさらに含む組み換え植物ウイルスの核酸である。非天然の核酸配列は、使用する特定の態様に依存して、非天然ウイルスのサブゲノムのプロモーターおよび／または天然外殻タンパク質の遺伝子に隣接して配置される。非天然の核酸配列は普通の技術により挿入されるか、あるいは融合タンパク質が生産されるように、非天然の核酸配列は天然外殻タンパク質のコーディング配列の中にあるいはそれに隣接して挿入することができる。転写される非天然の核酸配列は、アンチセンスメカニズムにより表現型の特性の発現を調節することができる RNAとして転写されることができる。
【００５４】
あるいは、組み換え植物ウイルスの核酸の中の非天然の核酸配列は、植物宿主の中で転写および翻訳して、表現型の特性を生成することができる。１または２以上の非天然の核酸配列は、また、１より多い表現型の特性の発現をコードすることができる。どのウイルスのサブゲノムのプロモーターを使用しても、１または２以上の非天然の核酸配列が適切な向きにあるように、普通の技術を使用して、非天然の核酸配列を含有する組み換え植物ウイルスの核酸は構成される。
【００５５】
植物細胞の中の有用な表現型の特性は、次のものを包含するが、これらに限定されない：除草剤に対する改良された許容度、熱または冷たさ、乾燥、塩分または浸透圧のストレスに対する改良された許容度；病害虫（昆虫、線虫またはダニ）または病気（真菌、かび、細菌またはウイルス）に対する改良された耐性；酵素または二次的代謝物の生産；雄性または雌性の不捻性；矮化；早い成熟；改良された収量、成長力、雑種強勢、栄養の量、芳香または加工の性質など。他の例は、商業的使用のために重要なタンパク質または生産物、例えば、リパーゼ、メラニン、色素、抗体、ホルモン、製剤、抗生物質などを包含する。他の有用な表現型の特性は、分解または阻止酵素、例えば、モルトになるオオミギの根の発育を防止または阻止するために利用されるようなものの生産である。表現型の特性は、また、その生産がバイオリアクターにおいて望まれるような二次代謝物であることができる。
【００５６】
組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物ウイルスの核酸の相補的コピーの二本鎖 DNAを、生産細胞の中にクローニングする。ウイルスの核酸が RNA分子である場合、生産細胞と適合性であるプロモーターに核酸（cDNA）をまず取り付ける。次いで、生産細胞と適合性である適当なベクターの中に、 RPVNAをクローニングすることができる。この方法において、キメラのヌクレオチド配列の RNAコピーのみが生産細胞の中で生産される。例えば、生産細胞が大腸菌(E.coli)である場合、 Iacプロモーターを使用することができる。
【００５７】
生産細胞が植物細胞である場合、CaMVプロモーターを使用することができる。ウイルス RNAが生物学的活性のためにキャップしなくてはならない場合、生産細胞は真核生物、例えば、酵母菌、植物または動物の細胞であることができる。あるいは、生産細胞と適合性であるプロモーター隣接するベクターの中に RPVNAを挿入する。ウイルスの核酸が DNA分子である場合、生産細胞と適合性である複製起源にそれを取り付けることによって、それを生産細胞の中に直接クローニングすることができる。この方法において、キメラのヌクレオチド配列の DNAコピーが生産細胞の中で生産される。
【００５８】
プロモーターは、 DNAに結合しかつ RNA合成を開始するように RNAポリメラーゼを指令する DNA配列である。強いプロモーターおよび弱いプロモーターが存在する。強いプロモーターの中には、lacuv5, trp, tac, trp −lacuv5, λp1, ompF、および blaがある。大腸菌(E.coli)の中で外来遺伝子を発現するために有用なプロモーターは、強くかつ調節されるプロモーターである。バクテリオファージλのλp1プロモーターは、強く、よく調節されたプロモーターである。Hedgpeth,J.M. ら（25）;Bernard,H.M. ら（26）;Remaut,E.P.ら（27）。
【００５９】
温度感受性λリプレッサーをエンコードする遺伝子、例えば、λclts 857をクローニングベクターの中に含めることができる。Bernard ら（26）。低い温度（31℃）において、ｐ1 プロモーターはcI−遺伝子産生物により抑制された状態に維持される。温度を上昇させると、リプレッサーの活性は破壊される。次いで、ｐ1 プロモーターは大量のmRNAの合成を指令する。このようにして、大腸菌(E.coli)生産細胞は、ベクター内でエンコードされた生産物の生産前に、所望の濃度に成長することができる。同様に、温度感受性プロモーターは所望の時間に培養温度を調節することによって活性化される。
【００６０】
非常に高いコピー数を条件的に獲得することができるプラスミドを組み立てることは有利であることがある。例えば、lac またはtac を含有するpAS2プラスミドは42℃において非常に高いコピー数を達成するであろう。次いで、pAS2プラスミドの中に存在する lacリプレッサーをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより不活性化して、mRNAを合成させる。
RPVNAをつくるときの他の別法は、１より多い核酸を調製すること（すなわち、多成分から成るウイルスのベクター構成体に必要な核酸を調製すること）である。この場合において、各核酸はそれ自身のアセンブリー起源を必要とするであろう。各核酸はサブゲノムのプロモーターおよび非天然の核酸配列を含有するように調製することができる。
【００６１】
あるいは、１成分から成るウイルスの核酸の中に非天然の核酸配列を挿入すると、２つの核酸（すなわち、２成分から成るウイルスのベクターの発生に必要な核酸）を生成することができる。天然核酸のコーディング配列のあるものの複製および翻訳から離れた非天然の核酸配列の複製および転写または発現を保持しようとするとき、これは有利であろう。各核酸はそれ自身のアセンブリー起源をもたなくてはならないであろう。
本発明の第３の特徴は、ウイルスまたはウイルス粒子である。このウイルスは、包膜された前述のRPVNA からなる。次いで、生ずる生産物は適当な植物宿主を感染することができる。 RPVNA配列を植物宿主内で転写および／または翻訳して、所望の生産物を生産する。
【００６２】
本発明の１つの態様において、組み換え植物ウイルスの核酸は異種キャプシドにより包膜される。最も普通には、この態様は棒状キャプシドを使用する。なぜなら、それはより幾何学的に構成された二十面体のキャプシドまたは球形のキャプシドより長い RPVNAを包膜する能力を有するからである。棒状キャプシドの使用は、より大きい非天然の核酸配列の組み込みを可能として RPVNAを形成する。このような棒状キャプシドは、 RPVNAの中に１より多い非天然の核酸配列が存在するとき、最も有利である。
【００６３】
本発明の他の特徴は、前述の RPVNAを含有するベクターである。RPVNA は、生産細胞のプロモーターまたは生産細胞と適合性の複製起源から成る群より選択されるヌクレオチド配列に隣接して存在する。このベクターを利用して生産細胞を形質転換し、次いでこの生産細胞はある量で RPVNAを生産するであろう。生産細胞はこのベクターと適合性の任意の細胞であることができ、そして原核生物または真核生物の細胞であることができる。しかしながら、ウイルスRNA(RPVNA)をキャップして活性としなくてはならない場合、生産細胞、例えば、真核生物の生産細胞はウイルス RNAをキャッピングすることができなくてはならない。
【００６４】
本発明の他の特徴は、組み換え植物ウイルスまたはウイルスの核酸が感染した宿主である。宿主の中に導入後、宿主は自己複製性、包膜および組織的広がりをすることができる RPVNAを含有する。宿主は普通の技術により組み換え植物ウイルスで感染することができる。適当な技術は、次のものを包含するが、これらに限定されない：葉の剥離、溶液の中の剥離、高い速度の水の噴霧および宿主の他の損傷ならびに組み換え植物ウイルスを含有する水を宿主の種子に吸収させる。さらに詳しくは、適当な技術は次のものを包含する：
【００６５】
（ａ）手による接種  包膜されたベクターの手による接種は、中性のpHの低いモル濃度のリン酸塩緩衝液を使用して、セリットまたはカーボランダム（通常約１％）を添加して実施する。１〜４滴の調製物を葉の上表面に置き、そしておだやかにこする。
（ｂ）植物ベッドの機械化した接種  植物ベッドの接種は、葉を切断しながらトラクター駆動草刈機の中にベクター溶液を噴霧（CO2 噴射）することによって実施する。あるいは、植物ベッドを草刈りし、そして切断した葉の上にベクター溶液を直ちに噴霧する。
（ｃ）単一の葉の高圧噴霧  単一の植物の接種は、また、ほぼ１％のカーボランダムを緩衝化ベクター溶液の中に含有する狭い方向づけられた噴霧（50psi 、葉から６〜12インチ）で噴霧することによって実施する。
【００６６】
RPVNAを植物宿主の中に導入する別の方法は、Grimsley, N.ら（28）に記載されているアグロ感染(agroinfeetion) または癌腫菌(Agrobacterium) 仲介形質転換（時にはアグロー感染と呼ばれる）として知られている技術である。この技術は、宿主細胞の中に癌腫菌(Agrobacterium) の DNAの一部分を転移することによって植物をコロニー化する癌腫菌(Agrobacterium) の普通の特徴を使用し、ここでそれは核の DNAの中に組み込まれるようになる。 T−DNA は25塩基対の長さである境界配列により定められ、そしてこれらの境界配列の間の DNAは植物細胞の中に同様によく転移される。 T−DNA の境界配列の間の RPVNAの挿入は RPVNAを植物細胞の中に転移させ、ここで RPVNAは複製され、次いで植物を通して組織的に広がる。
【００６７】
アグロー感染はジャガイモ紡錘体塊茎ウイロイド(PSTV)(Gardner,R.C. ら（29)); CaV(Grimsley, N.ら (30))：MSV(Grimsley, N.ら（28）前掲）およびLazarowitz,S.C.(31))、メヒシバ茎ウイルス(Donson,J.ら（32))、コムギ矮化ウイルス(Hayes, R.J.ら(33)) およびトマトゴールデンモザイクウイルス(TGMV)(Elmer, J.S.ら（34))およびGardner, W.E. ら(35)) を使用して達成された。したがって、感受性植物のアグロー感染は、上のウイルスの任意のもののヌクレオチド配列に基づく RPVNA培養室ヴィリオンを使用して達成することができるであろう。
【００６８】
本発明のなお他の特徴は、特定したポリペプチドまたはタンパク質の生産物を生産する方法であり、このような生産物は、例えば、酵素、複雑な生物分子、リボザイム、またはアンチセンス RNAから生ずるポリペプチドまたはタンパク質の生産物であるが、これらに限定されない。このような生産物は次のものを包含するが、これらに限定されない：IL−1,IL−2,IL−3,…IL−12など；EPO: G−CSF,GM−CSF, hPG−CSF, M−CSF などを包含する CSF；因子VIII；因子IX；tPA ； hGH；受容体および受容体のアンタゴニスト；抗体；ニューローポリペプチド；メラニン；インスリン；ワクチンなど。
【００６９】
RPVNAの非天然の核酸配列は、所望の生産物の生産に導く転写可能な配列からなる。この方法は、組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸、例えば、前述のもので適当な植物宿主を感染させ、感染した宿主を成長させて所望の生産物を生産し、そして必要に応じて、所望の生産物を単離することを包含する。感染した宿主の成長は、生ずる生産の単離と同様に、普通の技術に従う。
【００７０】
例えば、タンパク質、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII) 、α−トリコサンシン、イネα−アミラーゼ、ヒトα−ヘモグロビンまたはヒトβ−ヘモグロビンのためのコーディング配列を、欠失されている TMV外殻タンパク質のコーディング配列のプロモーターに隣接して挿入する。他の例において、チロシナーゼのコーディング配列、例えば、ストレプトミマイセス・アンティバイオディカス(Streptomyces antibioticus) から単離されたものを、 TMV、カラスムギモザイクウイルス(OMV) またはイネ壊死ウイルス(RNV) の同一のプロモーターに隣接して挿入する。
【００７１】
組み換えウイルスは、前述したように、生ずる組み換え植物ウイルスの核酸を使用して調製することができる。タバコまたは発芽するオオミギを組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸で感染させる。ウイルスの核酸は植物の組織の中で自己複製して、酵素のアミラーゼまたはチロシナーゼを生産する。このチロシナーゼの活性はメラニンの生産に導く。例えば、Huber, M. ら（36）を参照のこと。
【００７２】
他の例において、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのコーディング配列、例えば、バチルス(Bacillus)種No.17 −１から単離されたもの（米国特許第 4,135,977号参照) を、OMV,RNV,PVY またはPVX から誘導化されたヌクレオチド配列のウイルスの外殻タンパク質のプロモーターに隣接して挿入し、ここで外殻タンパク質のコーディング配列は除去されており、次いで非天然プロモーターおよび外殻タンパク質の遺伝子を含有する。トウモロコシまたはジャガイモを適当な組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸で感染させて、酵素のシクロデキストリングルコトランスフェラーゼを生産する。この酵素の活性は、香味剤としてあるいは薬物放出に有用であるシクロデキストリンの生産に導く。
【００７３】
ある植物において、生産物としてアンチセンス RNAの生産は、ある種の表現型の特性の発現を防止するために有用である。とくに、薬物として乱用される物質を生産する（例えば、コカインはコカ植物から誘導化され、そしてテトラヒドロカンナビノール(THC）は大麻またはマリファナ植物から誘導化された乱用の活性物質である）。乱用可能な物質の生産に必要な植物 RNAに対して相補的なアンチセンス RNAは、この物質の生産を防止するであろう。これは法で禁じられた薬物の供給を減少する有効な道具であることが証明することができるであろう。
【００７４】
本発明のなお他の特徴は、有機化合物の立体特異的触媒作用に適当な酵素を生産する方法である。非天然の核酸配列は、所望の生産物の生産に導く転写可能な配列からなる。この方法は組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸、例えば、前述のもので適当な宿主を感染させ、感染した宿主を成長させて所望の生産物を生産させ、そして所望の生産物を単離することを包含する。感染した宿主の成長は、生ずる生産物の単離と同様に、普通の技術従う。次いで、立体特異的酵素を利用して所望の反応を触媒する。立体特異的酵素の１つの使用はラセミ体混合物の分割である。
【００７５】
１つの例において、適当なエステラーゼまたはリパーゼのコーディング配列、例えば、適当な微生物から単離されたものを TMV、カラスムギモザイクウイルス(OMV) またはイネ壊死ウイルス(RNV) から誘導化されたヌクレオチド配列のウイルスの外殻タンパク質のプロモーターに隣接して挿入し、ここで外殻タンパク質のコーディング配列は除去されており、次いで非天然プロモーターおよび外殻タンパク質の遺伝子を含有する。タバコまたは発芽するオオミギを組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸で感染させて、エステラーゼまたはリパーゼの酵素を生産する。この酵素を単離しそして、欧州特許出願公開（EP−A)第 0233656号または欧州特許出願公開（EP−A)第 0227078号に記載されているように、ナプロキセンのような化合物の立体特異的調製において使用する。
【００７６】
エステラーゼのコーディング配列を適当な微生物、例えば、次のものから単離する：枯草菌(Bacillus subtilis) 、バシラス・リヘニフォルミス(Bacillus licheniformis)（この種の試料はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type CultureCollection) 米国マリイランド州ロックビレ)(ATCC) に受け入れ番号11945 で受託された) 、シュードモナス・フルオレセンス(Pseud- omonas fluoreseens) 、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas put- ida)（この種の試料は発酵研究所(IFO) 、大阪、に受け入れ番号12996 で受託された) 、シュードモナス・リボフラビナ(Pseudomonasriboflabina)（この種の試料はIFO に受け入れ番号13584 で受託された) 、シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)（この種の試料は応用微生物学研究所(SAM) 、東京大学、に受け入れ番号1049で受託された) 、シュードモナス・アエルアニノサ(Pseudomonasaeruaninosa)(IFO 13130) 、ムコル・アングリマクロオルス(Mucorangulimacrosporus)(SAM6149)、アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)(ATCC 21218)、菌株は III−25(CBS 666.86)、菌株LK  ３−４(CBS 667.86)、菌株Sp4(CBS 668.86) 、菌株 Thai III 18−1(CBS 669.86) 、および菌株Thai VI 12(CBS
670.86)である。
【００７７】
有利には、種枯草菌(Bacillus subtilis) の培養物は、種バシラス(Bacillus)種 Thai １−８(CBS 679.85)、種バシラス(Bacillus)種 In IV−８(CBS 680.85)、種バシラス(Bacillus)種 Nap 10 −N(CBS 805.85) 、種バシラス(Bacillus)種Sp 111 4 (CBS 806.85)、種枯草菌(Bacillus subtilis）１−85(Yuki,S.ら、Japan J.Gen.42：251(1967))、枯草菌(Bacillus subtilis) １−85／ pNAPT−７(CBS 673.86)、枯草菌(Bacillus subtilis) 1A−40／ pNAPT−８(CBS 674.86)、および枯草菌(Bacillus subtilis) 1A−40／ pNAPT−７(CBS 675.86)の培養物を包含する。有利には、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoreseens) の培養物は、シュードモナス(Pseudomonas) 種Kpr １−６(CBS 807.85)およびシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoreseens) 種(IFO 3081)の培養物を包含する。
【００７８】
リパーゼのコーディング配列は、適当な微生物、例えば、カンジダ属(Candida) 、リゾプス属(Rhizopus)、ムコル属(Mucor) 、アスペルギルス属(Aspergilus)、ペニシリウム属(Penicillium) 、シュードモナス属(Pseudomonas) 、クロモバクテリウム属(Chromobacte- rium) 、およびゲトリキウム属(Getriehium)から単離される。カンジダ・シリンドラセア(Candida cylindracea) のリパーゼはとくに好ましい（Qu−Mingら、Tetrahedron Letts,27、7(1986))。
【００７９】
融合タンパク質は、非天然の核酸配列をウイルスの核酸の構造遺伝子、例えば、外殻タンパク質の遺伝子の中に組み込むことによって形成することができる。ウイルスの構造遺伝子上の調節部位は機能的に止まっている。こうして、タンパク質合成は通常の方法で、外来遺伝子上のメチオニンのための開始コドンから停止コドンに起こって、融合タンパク質を生産することができる。融合タンパク質はアミノ末端にウイルスの構造タンパク質の一部分またはすべてを含有し、そしてカルボキシ末端に所望の材料、例えば、立体特異的酵素を含有する。
【００８０】
その引き続く使用のために、立体特異的酵素をまずこの融合タンパク質からの特異的切断により処理し、次いでさらに精製することができる。臭化シアンとの反応はペプチド配列をメチオニン残基のカルボキシ末端において切断させる（5.0 、Needle- man,"Protein Sequence Determination", Springer、1970、N.Y.) 。したがって、この目的に、第２配列はメチオニンのための追加のコドンを含有し、これによりメチオニン残基は融合タンパク質のＮ−末端の天然タンパク質配列とＣ−末端の外来タンパク質との間に配置されることが必要である。しかしながら、他のメチオニン残基が所望のタンパク質の中に存在する場合、この方法は失敗する。さらに、臭化シアンを使用する切断は種々の他のアミノ酸において二次反応を引き起こすという欠点を有する。
【００８１】
あるいは、「リンカー」と呼ぶオリゴヌクレオチドのセグメントを第２配列とウイルスの配列との間に配置することができる。このリンカーはタンパク質分解酵素の伸長した特定の切断部位ならびに特定の切断部位のアミノ酸配列をコードする（例えば、米国特許第 4,769,326号および米国特許第 4,543,329号を参照のこと) 。非天然タンパク質のアミノ末端における融合タンパク質の中のリンカーの使用は、臭化シアンの切断において固有の選択的酵素の加水分解による二次反応を回避する。
【００８２】
このようなリンカーの１例は、一般式 Pro−Xaa  Gly−Pro(配列番号：１)(非天然タンパク質のアミノ末端）のテトラペプチドであり、ここで Xaaは任意の所望のアミノ酸である。全体の切断は、まずXaa Gly 結合をコラゲナーゼ(E.C. 3,4,24.3.,クロストリジオペプチダーゼ）で選択的に切断し、次いでアミノアシル−プロリンアミノペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ−P,E.C.3.4.11.9.)でグリシン残基を除去し、そしてプロリンアミノペプチダーゼ(E.C.3.4.11.5.) でプロリン残基を除去することによって実施する。別法において、アミノペプチダーゼ酵素をポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼで置換することができる。他のリンカーおよび適当な酵素は米国特許第 4,769,326号に記載されている。
【００８３】
本発明のなお他の特徴は、植物における雄性不捻性を誘発する方法である。雄性不捻性はいくつかのメカニズムにより誘発することができ、これらのメカニズムは次のものを包含するが、これらに限定されない：アンチセンス RNAのメカニズム、リボザイムのメカニズム、あるいは雄性不捻性または自己不適合性を誘発するか、あるいは正常の配偶体の発育を妨害することができるタンパク質のメカニズム。キメラのヌクレオチド配列の第２のヌクレオチド配列は、雄性不捻性の誘発に導く転写可能な配列からなる。この方法は適当な植物をウイルス、例えば、前述のもので感染させ、そして感染した植物を成長させて所望の雄性不捻性を生成することを包含する。感染した植物の成長は、普通の技術に従う。
【００８４】
雄性不捻性は植物の中に多数のメカニズムにより誘発することができ、これらのメカニズム次のものを包含するが、これらに限定されない：（ａ）花粉の形成の不存在、（ｂ）不育のおよび／または非機能的花粉の形成、（ｃ）自己不適合性、（ｄ）自己適合性の阻害、（ｅ）１または２以上のミトコンドリアの機能の混乱、（ｆ）正常の配偶体の発育を妨害するホルモンまたは他の生物分子の生産の変更、または（ｇ）正常雄性配偶体組織に必要な発育遺伝子の阻害。
【００８５】
これらのメカニズムは、アンチセンス RNA、リボザイム、遺伝子またはタンパク質生産物を使用することによって達成することができる。本発明の組み換え植物ウイルスの核酸は、植物の中の雄性不捻性を誘発するように機能する１または２以上のヌクレオチド配列を含有する。この機能を達成するために、組み換え植物ウイルスの核酸はヌクレオチド配列、単一の遺伝子または１系列の遺伝子を含有することができる。
【００８６】
雄性不捻性の特性は、核エンコードされた雄性不捻性の遺伝子を単離することによって形成することができるであろう。これらの遺伝子の多くは単一の遺伝子であることが知られている。例えば、Tanksleyら（37）は、緊密に連鎖した酵素コーディング遺伝子 Prx−２の稀な対立遺伝子をもつCIS の中にms−10を配置した。 Prx−２対立遺伝子は相互優性であり、戻し交雑の集団の中の劣性ms−10対立遺伝子を有するヘテロ接合性植物についての選択を可能とし、そしてハイブリッドの生産のために親の中に遺伝子を転移する間の子孫の試験の必要性を排除する。
【００８７】
雄性不捻性アントシアニン不含植物（ms−10aa／ms−10aa）をヘテロ接合性の繁殖能力のある植物に交雑させ、ここで稀なペルオキシダーゼの対立遺伝子は劣性雄性不捻性対立遺伝子とシスの関係にあった（ms−10 Prx−２′／＋Prx −２＋）。雄性不捻性植物を子孫から選択した（ms−10 Prx−２′／ms−10aa）。いったん雄性不捻性遺伝子が将来の親の系統の中に転移されると、不捻性植物を戻し交雑またはＦ2 種子のロットから実生の段階で選択することができる。
【００８８】
パールミレットにおいて、劣性雄性不捻性遺伝子はvg 272およびIP 482の中に見いだされた。パールミレットの系統Vg 272およびIP 482における雄性不捻性は、単一の劣性遺伝子により本質的にコントロールされる。Vg 272における雄性不捻性は劣性遺伝子、ms、のためであり、この劣性遺伝子は花粉母細胞の中で減数分裂に対する作用をもたず、四分子から微小球の分離後であるが最初の有系分裂の分割の開始前に作用する。
【００８９】
Dewey ら（39）は、TURF 243と表示する。雄性不捻性(cms−T)トウモロコシのミトコンドリアから3574bpの断片を単離しそして特徴づけた。TURF 243は、12,961Mrおよび24,675Mrのポリペプチドをエンコードすることができる２つの長いオープンリーディングフレームを含有する。TURF 243転写体は、核のレストーラー遺伝子Rf1 およびRf2 により捻性に回復した cms−T 植物の中で独特に変更されるように思われる。Ｔ細胞質からのトウモロコシ mtDNAの断片を、ヌクレオチド配列の分析により特徴づけた。核酸の単離を得るために、ミトコンドリアのRNA(mtRNA)、および mtDNAを、普通の技術によりゼア・マイス(Zca Mays)の６〜７日間暗所で成長させた実生から調製した。
【００９０】
雄性不捻性の特性を形成することができる他の手段は、ウイルスから雄性不捻性遺伝子を単離することによる。植物の中で雄性不捻性を誘発するいくつかのウイルスまたはウイルス様粒子が存在する。最近の研究が示唆するように、雄性不捻性ビートの中にウイロイド様因子が存在することができる。（40）。細胞質の雄性不捻性は個々別々の粒子、例えば、プラスミドまたは封人体により条件づけられることができる。ウイルスは細胞不捻性組織的の調和をもって種子伝達されない。グラフトユニオン(graft union) を横切るある種類の因子の転移は、ペチュニア、ビート、ヒマワリ、およびアルファルファにおいて証明された。
【００９１】
接穂の捻性の直接の効果は存在しないが、接木した接穂上の維持による自殖または交雑は次の世代において雄性不捻性植物を生産した。36℃６週、次いで25℃で成長させた cmsビートは、多分「細胞質の球形の物体」の排除のために、新しい苗条から捻性植物を生産したが、これらの植物からの子孫は正常の成長条件において３世代後に不捻性に復帰した。ソラマメ植物(Vicia fabal) における細胞質の雄性不捻性は、ウイルスまたはウイルス様粒子により引き起こされることが発見された。多分 cms系に類似する場合がガーリックにおいて起こる。芽胞体のcms植物に典型的な花粉の退化は葯の中にリケッチア様封入体を示し、これは抗生物質で排除することができ、花粉は捻性にさせることができるであろう（41）。
【００９２】
雄性不捻性の特性は、変更したタンパク質を導入する第３の方法により、トランシットペプチド配列を使用して形成することができるので、それはミトコンドリアの中に輸送され、そしてミトコンドリアの機能を混乱させるであろう。このタンパク質は正常のミトコンドリアの機能を圧倒するか、あるいはきわめて重大な経路において要求される代謝を減少する。ミトコンドリアの中のわずかの混乱は雄性不捻性に導くことが広く信じられている。Remyら（42）は、正常のおよび細胞質の雄性不捻性Ｂ．ナプス(napus) 系統から葉緑体タンパク質の２次元の分析を実施した。
【００９３】
Ｂ．ナプス(napus) のＮおよび cms系統の葉緑体およびミトコンドリアの DNAを、制限酵素分析により特徴づけそして比較した。同一の制限パターンは、 cmsＢ．ナプス(napus) 系統および cms特性をＢ．ナプス(napus) の中に転移するために使用した日本ハツカダイコンの cms系統からの葉緑体について見いだされた。Remyの研究において、Ｂ．ナプス(napus) のＮおよび cms系統のストロマおよびチラコイドからの葉緑体タンパク質を、２−Ｄポリアクリルアミドゲルの分離により特徴づけそして比較した。（１）２つの系統のストロマの隔室は非常に類似し、そして（２）系統は ATPアーゼ複合体からの、カップリング因子CPのβサブユニットに相当するスポットにより区別することができることが示された。
【００９４】
植物の中で雄性不捻性を誘発する第４の方法は、正常の配偶体の発育を変更するホルモンを誘発または阻害する、例えば、花成段階の前またはそのときにジベレリン酸の生産を阻止して花粉の形成を混乱させるか、あるいは花成段階の前またはそのときにエチレンの生産を変更して花の形成および／または性の発現を変更することによる。
【００９５】
植物の中で雄性不捻性を誘発する第５の方法は、正常の配偶体の組織のために要求される発育遺伝子を、例えば、発育のシグナルRNA またはmRNAに対して相補的であるアンチセンス RNAを使用して、阻害することによる。Padmaja ら（43）は、ペチュニアの近交系から単離した自発的雄性不捻性突然変異体についての細胞遺伝学の研究を論じている。雄性不捻性は芽胞嚢の非定型の挙動に関連することが発見され、延長した核の分割、および究極的に腺の型から周辺質の型への変換の結果として退化により特徴づけられた。
【００９６】
植物の中で雄性不捻性を誘発する第６の方法は、自己不適合性遺伝子を単離し、そして本発明のベクターの中でその遺伝子を使用することである。異系交配を促進する自己不適合性（Ｓ）遺伝子系は、被子植物の族の50％より多くの中に存在する。いくつかの系において、豊富な花柱の糖タンパク質（Ｓ糖タンパク質）が同定された。これらの糖タンパク質は多形性であり、そして同定されたＳ対立遺伝子と相関関係をもつことができる。Ｎ．アラバ(alaba) およびＢ．オレラセアエ(oleraceae) の花柱の糖タンパク質に相当するＳ遺伝子は、クローニングされ、そして配列決定された。アミノ酸の置換および欠失／挿入は、配列を通して存在するが、対立遺伝子の特異性をエンコードするように思われる超変動性の領域に集まる傾向がある。
【００９７】
植物の中で雄性不捻性を誘発する第７の方法は、自己不適合性をブロックし、適合性部位に結合しかつそれを不活性化するタンパク質を操作するか、あるいは自己適合性をターンオフし、mRNAと結合するアンチセンス RNAを自己適合性タンパク質に操作することによる。
雄性不捻性を生ずる特定の効果は、ちょうど胞子発生細胞の形成の早い段階から生活可能な花粉を含有する葯が裂開しない状態までの範囲であることができる。この範囲内の発育段階のいくつかまたはすべては影響を受けることがある。より明らかな特定の効果のいくつかは、次の例を包含する：
【００９８】
１）減数分裂は崩壊し、花粉の母細胞または早い小胞子の退化に導き、この場合において花粉は発育中断しそして葯の発育は早い段階で阻止される。
２）外膜の形成は崩壊し、そして小胞子は壁が薄くなり、多分形状がゆがみ、そして生活不可能である。葯は一般に外膜より発育するが、まだ正常ではない。３）小胞子の液胞は以上であり、でん粉の蓄積が減少し、そして芽胞嚢の持続性が明らかである。花粉は生活不可能であり、そして葯はまだ正常ではない。
【００９９】
４）花粉は存在し、そして生活可能であり、そして葯は正常に見えるが、裂開しないか、あるいは非常に遅延した裂開を示す。
５）自己不適合性のメカニズムは花粉粒による花柱の酵素的消化を崩壊または妨害する。
植物の中の雄性不捻性は、上に列挙したメカニズムにより花粉の落下の前の任意の段階において誘発することができる。選択した雄性不捻性のメカニズムは畑の中の（または温室の中の）植物に実生発生後および植物の落下前の任意の時に適用することができる。適用の正確な時は、使用する雄性不捻性のメカニズムおよび雄性不捻性植物を生産する最適な有効性に依存するであろう。
【０１００】
【実施例】
以下の例では、相反する指示の無いかぎりメーカーの推奨する手順に従って酵素反応が行なわれた。相反する規定の無いかぎり、「分子クローニング」（７）、「Meth in Enzymol.」（９）及び「 DNAクローニング」（８）で記述されたもののような標準的な技術が使用された。
比較例
以下の比較例は、宿主植物の全身性感染の間の従来技術に基づく組換え型ウイルス核酸の不安定性又は、植物を全身性感染させ挿入された非天然遺伝子の産物を効果的に産生することの不能、のいずれかを立証している。
【０１０１】
比較例１．
TVRの30Ｋ及び外皮タンパク質の遺伝子の間に TMVサブゲノミック RNAプロモータの後ろで融合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT) を挿入することによって、組換え型植物ウイルス核酸を調製した。pTWV−CAT −CPをDawson, W.O et al, (11) に記述されているとおりに調製した。簡単に言うと、pTWV−CAT −CPは、Nco Ｉ(nt.5460) で TMV菌株Ｕ１（４）の完全ゲノムcDNAクローンである pTMV204を切断し、 DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化し、Pst Ｉリンカー（Boehrin-get-Mannheim Biochemicals からのCCTGCACG）を付加し、Pst Ｉ及びNsi Ｉ(nt.6207) で切除し、外皮タンパク質 ORF (45) にCATORFが置換した変更 TMVであるpTWV−S3−CAT −28のNsi Ｉ部位(nt.6207) の中にこの 747−bpフラグメントを連結させることによって構築された。 TMVヌクレオチドの番号付けは、Goelet et(46) のものである。各々の構成体の正しい連結及び配向を、制限地図作成及び配列決定によって検査した。
【０１０２】
接種  プラスミド DNA構成体のインビトロ転写及び接種の手順は、以前に記述された通り（３）であった。ウイルスは、Xanthitobacco (Nicotiana tabacum
L. ）及びNicothiana svlvestris 内で全身的に繁殖した。局所的病巣宿主としてXanthi−nc tobaccoを用いた。接種に先立ち植物を温室内で生育させ、次にひきつづき約2000lxの16時間の光同期で植物発育チャンバ内で25°に維持した。
CAT検定   CAT活性の量を、基本的に記述された手順（47）で検定し、検定緩衝液内で 200mgの葉組織を解離させ、その後 0.5mMのアセチル CoA及び 0.1μCiの〔14Ｃ〕−クロラムフェニコールを付加し、37°で45分間インキュベートし、抽出してから薄層クロマトグラフィで分離し、最後にオートラジオグラフィに付した。
【０１０３】
RNA分析  接種から４日後に、感染した葉からの全 RNAを、記述のとおり（47ａ）抽出させた。ブロットハイブリダイゼーション分析のために、 RNAを 1.2％のアガロースゲル内で電気泳動させ、ニトロセルロースへトランスファし、CATORFを含むpUC119又はpCM1(Pharmacia) 内で TMVのニックトランスレーションされたcDNA（nts.5080−6395）でハイブリッド形成させた。感染した葉からの合計 RNAは同様に、基本的にAusubet et al. (48) 内で記述されている通りに野生型配列についてRNアーゼ保護検定によって分析された。
【０１０４】
pTMV204の３′半部分（Bam H Ｉ：nt.3332 −Pst Ｉ：nt.6401)をpT７／T3−19(BRLから) にクローニングした。Eco R Ｉ消化(nt.4254) の後、３′ウイルス配列に相補的な32Ｐで標識づけされた転写物を、T7 RNAポリメラーゼを用いて産生させた。余剰量のプローブを RNA試料にハイブリッド形成し、40μｇ／mlのRNアーゼＡ(Sigma) 及び 300ＵのRNアーゼT1(BRL) で処理し、抽出しDMSO及びグリオキサールで変性させ、 1.2％のアガロースゲル内で電気泳動に付し、後にそれを乾燥させてコダックのＸ線フィルムに露光させた。
【０１０５】
ProgenYウイルスのcDNAクローンの構築
RNAを、精製されたビリオンから抽出し、cDNAを以前に記述された通り（４）に調製した。２本鎖cDNAをBam H Ｉ(nt.3332) 及びSac Ｉ(nt.6142) で消化し、Bam H Ｉ−及びSac Ｉ消化を受けた pUC19へとクローニングさせた。 DNAのヌクレオチド配列決定は、ジデオキシヌクレオチド鎖終端手順（49）によるものであった。
【０１０６】
結果  外皮タンパク質遺伝子の上流に挿入された CATカートリッジを有するpTMC−CAT −CPのインビトロ転写物は、長さ7452ヌクレオチドで遺伝子順序が 126Ｋ， 183Ｋ，30Ｋ， CAT及び外被タンパク質であるハイブリッドウイルス CAT−CPを結果としてもたらした。N. tabacum L. 品種Xanthi及びXanthi−nc及びN. sylvestris の葉を接種するのに、インビトロ転写物を使用した。効果的に複製されTMV204と同様に接種された葉の中で細胞から細胞へ移動する外被タンパク質（45） CAT−CPに対する置換物として CATを発現する遊離RNA ウイルス、S30CAT−28又は野生型ウイルス、TMV204での感染を受けた植物からの結果と、これらの結果を比較した。
【０１０７】
壊死性炎の病巣は、TMV204及びS3−CAT −2Bによってひき起こされるものとほぼ同時にXanthi−nc tobacco上で発達し、これと同じサイズのものであった。 CAT−CPは、全身性宿主Xanthi tobacco及びN. sylvestris の接種された葉の中にいかなる症状も誘発しなかったが、TMV204により産生されたものに類似するモザイク症状を、発達しつつある葉の中に生み出した。ビリオン精製後に得られる収量及び接種された葉の薄い切片の透過型電子顕微鏡検査により見積られた、 CAT−CPでの感染を受けた細胞内のビリオンの濃度は、TMV204感染からのものにほぼ等しいと思われた。
【０１０８】
CAT−CPは、TMV204の6395ヌクレオチドに比べて7452のヌクレオチドという長さをもち、その結果、野生型 TMVの 300nmのビリオンに比べ長さ 350nmの CAT−CPビリオンがもたらされることになる。ウイルスは、 CAT−CPの感染を受けた植物の接種された葉から精製され、透過型電子顕微鏡によって分析された。 CAT−CP感染からのビリオンの大部分が、長さ 350nmのものであった。電子顕微鏡で見た TMVUIのビリオンの長さを評価する上での１つの問題点は、調製物が通常、個々のゲノム長ビリオンに加えて、断片化され末端−末端縮合されたビリオンを含んでいるということにある。全く異なる 350〜300nm のビリオンの割合を決定するため、各々のサイズの個々のビリオンを計数した。
【０１０９】
CAT−CPを接種された葉の中の 350／300nm のウイルスの比率は、野生型感染からの12：253 に比べて、 191：21であった。野生型の TMV感染における 350nmビリオンは、 TMVUIが末端−末端縮合する傾向をもち全ての長さのビリオンが発見可能であることから、恐らくは断片化されたビリオンの末端−末端縮合の結果として得られたと思われる。これらのデータは、 CAT−CPの追加遺伝子がこれらの接種された葉の中に維持され包膜されていたことを示唆している。
【０１１０】
インビトロ RNA転写物又はその後の第１又は第２継代の局所的病巣を用いて、CAT−CPの接種を受けた葉の中で CAT活性を検出した。検定した 100以上の試料の中から異なる陽性試料の中で１つの変動範囲が見い出された。外皮タンパク質の無い突然変異体S3−CAT −2Bの感染を受けたものと類似の CATレベルが、 CAT−CP感染を受けた葉の中に発見された。TMV204の感染を受けた又は健康な葉では、表面に出ない量しか検出されなかった。
【０１１１】
TMVの複製を支持するものとして知られている一連の宿主を接種し CAT活性についてスクリーニングすることにより野生型 TMVの宿主範囲に対し CAT−CPの宿主範囲を比較した。 CAT活性は、Solanaceaeに加えて３つの植物族を代表するZinnia eleaans Jacq., Lunaria annua  L., Beta vulaaris L., Calendula officinalisL., 及びSpiracia oleracea  L.,の接種された葉の中に検出された。このことは、 TMVゲノムのこの変化が宿主範囲を変えるとは思えないことを表わしていた。
【０１１２】
挿入された配列の結果として付加的なサブゲノミック RNAを CAT−CPが産生したか否かを見極めるために、感染した葉からの全 RNAを抽出し、 TMV又はCATDNAプローブを用いてブロットハイブリダイゼーションにより野生型 TMVのものと比較した。Xanthi−nc tabacco内で予め２度継代された CAT−CPの感染を受けたXanthi tobaccoの葉が、野生型 TMVに比較されるべき欠失を伴う CAT−CP及び後代ウイルスの個体群を含んでいたということを理由として選択された。
【０１１３】
２つの全く異なるゲノミック RNAが検出された。最大のものは TMVとCAT の両プローブに対しハイブリッド形成したが、一方小さい方のゲノミック RNAは、 TMVプローブに対してのみハイブリッド形成し、野生型Tvゲノミック RNAと同時移動した。TMV204感染を受けた葉からは２つであったのに対し、 CAT−CP感染を受けた葉からの RNA内には３つの全く異なる小さい RNAが発見された。野生型 TMVの外皮及び30Ｋタンパク質のためのサブゲノミックメッセージと共に同時移動した小さい方のRNA は、Tv特異プローブに対してのみハイブリッド形成した。
【０１１４】
CAT−CP感染を受けた葉からの大きい方のサブゲノミックRNA が、 CAT及び TMVの両プローブに対しハイブリッド形成した。野生型 TMVのサブゲノミックmRNAに関してはこの大きい方のサブゲノミック RNAがゲノミック RNA（50）と３′同末端であると仮定すると、これらの結果は、 CATの発現のために予測された余分の CAT−CPmRNAと一貫性がある。30Ｋ, CAT 及び外皮タンパク質の ORFを含む30Ｋタンパク質についての推定上の CAT−CPサブゲノミック RNAは観察されなかったが、これは恐らく 2.4kbと 4.4kbの間の領域内のバンドが、電気泳動中に宿主rRNAに対し付着するウイルス RNAによって不明確にされ、分解が困難であった（50, 51）からであると考えられる。
【０１１５】
上部の全身的に感染を受けた葉における CAT活性の量は可変的であり、接種された葉におけるよりもはるかに低く、数多くの場合においていずれも検出されなかった。Tv及び CATプローブでのハイブリダイゼーションは、ウイルスを保持する CATの配列の割合が急速に検出不可能なレベルにまで減少することを実証した。 CAT−CPから、挿入されたCATORFが欠失したウイルスの個体群への遷移は、植物の全身性浸入の間そして時として接種された葉の中で起こった。これとは対照的に、 CAT配列及び CAT活性は往々にして、３〜４回単一の病巣を通して継代されたウイルスの接種を受けた葉の中で検出された。
【０１１６】
接種から約30日後の全身的に感染を受けたXanthi tobaccoの葉からの CAT−CPビリオンを検査した。 CAT−CPの感染を受けた植物の最も上の葉からのビリオンの数量化は、78：716 という 350−／ 300−nmのビリオンの比率を生成した。これを、接種された葉内の 191：21の比率と比較すると、個体群の主要な構成要素が全身性感染の間に 300−nmビリオンへと移行したことがわかった。 CAT−CPの連続的な複製後に回収した欠失した後代ウイルスは、宿主範囲及び症候学の面で野生型 TMVと同一であった。
【０１１７】
CAT挿入を包含していた領域（nts.3332−6142）のcDNAを、ウイルス個体群の試料採取を目的として全身性感染を受けたXanthiの葉からの後代 CAT−CPビリオン RNAからクローニングした。サイズ及び制限地図作成による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野生型 TMVと同一であることを示した。
１つのcDNAクローンは、 CAT−CP構成体について予測されたサイズであると思われたが、制限地図は、 CAT−CPについて予測されたものから変動していた。野生型としてサイズ及び制限分析により評価された５つのクローンを、 CAT挿入の領域を通してと同様に外皮タンパク質遺伝子の一部分を通しても配列決定し、これが親の野生型ウイルスと同一であることがわかった。このことは挿入された配列を切除して、野生型 TMVを生み出すことができるということを示唆していた。
【０１１８】
考えられるこの切除を確証するために、ブロットハイブリダイゼーション分析において用いられた全葉 RNAの試料を、接種を受けた葉の中で相補的なＴ７産生の負鎖 RNAを用いたRNアーゼ保護検定によって分析した。これとは対照的に、CAT 配列及び CAT活性は往々にして、単一の病巣を通して３〜４回継代されたウイルスの接種を受けた葉の中に検出された。
【０１１９】
接種から約30日後に、全身性感染を受けたXanthi tobaccoの葉からの CAT−CPビリオンを検査した。 CAT−CPの感染を受けた植物の最も上部の葉からのビリオンの数量化は、78：716 という 350−／ 300−nmのビリオンの比率を生み出した。これを接種された葉における 191：21という比率に比較すると、それは個体群の主要な構成要素が全身性感染中に 300−nmビリオンへと移行したことを表わしていた。 CAT−CPの連続した複製の後に回収された欠失した後代ウイルスは、宿主範囲及び症候学の面で野生型 TMVと同一であった。
【０１２０】
CAT挿入を包含していた領域（nts.3332−6142）のcDNAを、ウイルス個体群の試料採取を目的として全身性感染を受けたXanthiの葉からの後代 CAT−CPビリオン RNAからクローニングした。サイズ及び制限地図作成による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野生型 TMVと同一であることを示した。
【０１２１】
１つのcDNAクローンは、 CAT−CP構成体について予測されたサイズであると思われたが、制限地図は、 CAT−CPについて予測されたものから変動していた。野生型としてサイズ及び制限分析により評価された５つのクローンを、 CAT挿入の領域を通してと同様に外皮タンパク質遺伝子の一部分を通しても配列決定し、これが親の野生型ウイルスと同一であることがわかった。このことは、挿入された配列を切除して、野生型 TMVを生み出すことができるということを示唆していた。
【０１２２】
考えられるこの切除を確証するために、ブロットハイブリダイゼーション分析において用いられた全葉 RNAの試料を、野生型 TMVのヌクレオチド4254−6395に相補的なＴ７産生の負鎖 RNAを用いたRNアーゼ保護検定によって分析した。この領域内に野生型の配列が存在することにより、2140ヌクレオチドの保護された RNAという結果がもたらされることになる。 CAT−CR RNAからのこのサイズのバンドは、プローブを保護するため野生型 RNAを用いて生成された類似のバンドと同時移動した。
【０１２３】
これらのデータは、 CAT−CPの挿入された配列が精確に欠失され得ることを確認した。反復内での位置の一範囲にわたって CAT−CPと野生型 TMVプローブ RNAの間のハイブリッド内のバルジループが発生できるようにする CAT−CP RNA内の反復配列の存在を考慮に入れると、 CAT−CP RNAによる野生型プローブのRNアーゼ保護は、２つのヌクレオチドサイズ範囲すなわち 683−935 及び1202−1458の中に入るバンドのセットを生み出すはずである。目に見えるその他の２つの主要バンドはこれらのサイズのものであり、これらの試料内の CAT−CP RNAの存在を確証している。
【０１２４】
CAT−CPの挿入された配列の喪失は、２つの続発するプロセスによるものであると思われた。第１のプロセスは、後代ウイルスのcDNAクローンの配列分析により示されているような個々の分子内の挿入された配列の喪失であった。欠失は反復配列の間で起こったため、これがその他のプラスセンスRNA ウイルスについて記述されているように相同な組換えによって発生した可能性もある（52−54）。第２のプロセスはウイルス個体群の中の選択された移動という結果をもたらした。
【０１２５】
ウイルス個体群が試料採取されたRNアーゼ保護検定は、 CAT−CP及び野生型ウイルスの両方が、接種された葉の中の個体群の構成要素でありうるということを立証した。全身性感染を受けた葉の中の CAT−CPの欠如は、恐らくウイルス個体群の移動によるものであった。これは、もとのハイブリッドが複製及び全身性の動きに関して欠失した後代野生型ウイルスと効果的に競合し得ないためであると考えられる。
【０１２６】
比較例２．
組換え型植物ウイルス核酸を、 TMVの未翻訳の３′領域と外皮タンパク質の遺伝子の間に TMVサブゲノミック RNAプロモータの後ろで融合された CAT遺伝子を挿入することにより調製した。pTMV−CP−CAT は、Dawson et al.(II) によって記述されている通りに調製した。簡単に言うと、pTMV−CP−CAT は、Hin d III(nt.5081)でpTMV−S3−CAT −28を切断し、 DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化し、Pst Ｉ及びNsi Ｉ(nt.6207) を付加し、 pTMV204の NsiＩ部位(nt.6207) 内でこの1434−bpフラグメントを連結することによって構築された。各々の構成体の正しい連結及び配向は制限地図作成及び配列決定によって検査した。
【０１２７】
比較例Ｉに記されているように、植物の接種、 CAT検定、 RNA分析及び後代のcDNAクローンの構築を行なった。大きい方のハイブリッドウイルス構成体であるpTMV−CP−CAT は、外皮タンパク質サブゲノミックプロモータ及び組立ての起点を含む30Ｋ遺伝子の一部分の 628ヌクレオチドの反復を含んでいた。この構成体は、長さ7822ntで 126Ｋ， 183Ｋ，30Ｋ、外皮タンパク質そして CATという遺伝子順序をもつウイルスCP−CAT を産生するはずである。CP−CAT の複製レベルは低いものであった。これは、野生型ウイルスの病巣の直径の約２分の１という小さい壊死性炎の病巣をXanthi−nc内に生成し、その出現は２日遅れた。これらの病巣からのCP−CAT の伝染性は、 CAT−CP又は野生型 TMVのものの約 100分の１のレベルであった。
【０１２８】
Xanthi又は N. sylvestris植物の中でいかなる全身性症状も現われず、ウイルス感染は、接種された葉からのみトランスファー可能であった。CP−CAT の感染を受けた葉の中では、低いが再生可能なレベルの CAT活性が見られた。このキメラウイルスの複製は、このように損なわれたことから、特徴づけはそれ以上進行しなかった。 CAT−CPとは対照的に、全身性宿主内でさらに長い期間CP−CAT が複製できるようにされた場合、植物の上部葉の中にはいかなる野生型様ウイルスの症状も全く見られず、これらの葉からウイルスが回収されたことは全く無く、このことはすなわち、このハイブリッドウイルスが野生型ウイルスを生み出す形で挿入された配列を欠失させなかったということを示唆している。
【０１２９】
比較例３．
TMVゲノムの全長 DNAコピーを調製し、Dawson, W.O. et al.(t)によって記述されているとおり、pBR322のPST Ｉ部位の中に挿入する。ウイルス外皮タンパク質遺伝子は30Ｋのタンパク質遺伝子に隣接する TMVゲノムの位置5711にある。TMV ゲノムの DNAコピーを含むベクターは、適切な制限酵素及びエキソヌクレアーゼで消化され、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。例えば、外皮タンパク質コーディング配列は、cla Ｉ及びNsi Ｉでの部分的消化とそれに続くウイルスの teh３′−テイルを再度付着させるための再連結によって、除去される。
【０１３０】
あるいは、ベクターは、ウイルス核酸の３′末端で切断される。ウイルス DNAは外皮タンパク質コーディング配列の開始コドンを通して上方へBal 31又はエキソヌクレアーゼIII での消化によって除去される。次にウイルス３′−テイルの配列を含む合成 DNA配列を、残りの５′末端に連結させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、 TMV RNAを分離しそれをタバコ植物の感染に用いることによって確認される。分離された TMV RNAは、自然の条件下では非感染性であることがわかっている。
【０１３１】
pNEOからの 314−bp  Sau 3Aフラグメント(Tn5 NPTII遺伝子の NH2末端）は、クレノウポリメラーゼの充てんを受け、Sal Ｉ（pd〔GGTCGACC〕）リンカーに連結された。これを次に SalＩ及び PstＩで消化させ、Pst Ｉ／Sal Ｉ消化されたpUC128 (55) の中に挿入して、 pNU10を得た。pNEOプラスミドをAsu IIで消化し、これにクレノウポリメラーゼを充てんし、Xho Ｉリンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連結させてpNX1を得た。pNX1をXho Ｉで消化し、クレノウポリメラーゼをこれに充てんし、Pst Ｉでこれを消化し、Pst Ｉ／Sma Ｉ消化された pNU10内に連結させて、pNU116を得た。
【０１３２】
pNU116(NPTII配列）からのXho Ｉ／Sal Ｉフラグメントを、外皮タンパク質プロモータに隣接して連結させる。 NPTII遺伝子インサートを含む、結果として得られた RFVNAを、 TMV耐性のためのＮ遺伝子を含むよう戻し交雑された栽培品種である12のNicotiana tabacum(cv. Xanthi−NC）及びＮ遺伝子を含まない栽培品種である12のN. tabacum（cv. Xanthi）に適用した。両方のタバコ栽培品種において、接種を受けたいずれの植物の中にも全身性の拡散は全く観察されなかった。N. tabacum(cv. Xanthi NC) は、ウイルスに対する耐性を表す接種葉上の特徴的な斑点を示した。N. tabacum(cv.Xanthi) は、いかなる斑点も全身性症状も示さなかった。
【０１３３】
比較例４．
比較例１及び３に記述されている通りに、 NFTIIコーディング配列を含む組換え型植物ウイルス核酸を調製した。 NFTII及び外皮タンパク質コーディング配列は、各々「０」外皮タンパク質プロモータに隣接していた。外皮タンパク質遺伝子の存在は、ベクターを全身的に拡散し得るものにするはずである。
NPTII挿入された遺伝子を含む、結果として得られたRFVNA を12のN. tabacum(cv. Xanthi NC) 上に接種し、12のN.tabacum (cv. Xanthi NC) は、比較例１の場合の通り、12の植物の各々において斑点を示した。N. tabacum（cv. Xanthi) は、全ての12の植物の中でベクターの全身的拡散を示した。
【０１３４】
N. tabacum (cv. Xanthi) の葉からの葉盤を、カナマイシンを含む培地上で培養した。組織は培養内で全く生残せず、これは NFTII遺伝子の喪失又は機能不良を表わしている。処理されたN. tabacum（cv. Xanthi) 植物の葉から回収されたNFTII遺伝子を含む当該ベクターのその後の電子顕微鏡写真方法は、このベクターが NPTII遺伝子に相応するベクターの１切片を喪失したことを示し、これは、ベクターの破断及び組換えを表わしていた。
【０１３５】
好ましい実施例
以下の例は、本発明をさらに明確に表わしている。これらの例は、本発明を例示するものにすぎず、制限的意味のあるものとしてみなされるべきものではない。
例１．
細菌プラスミドの構築．カッコ内の数字は、 TMV−U1配列を表わす（46）。 DNA操作は、基本的に（48）に記述されているとおりに行なわれた。 pTBN62 (DH5α；Gibco BRL ；及びH8101)を除いて、全てのプラスミドは E. coli菌株 JM109内で繁殖させられた。
【０１３６】
pTKU1(図１）． 7.3kbのpTMV204(４） PstＩフラグメント（pPMI（３）からのλファージプロモータ及び TMV−U1ゲノム）を pUC19へとサブクローニングしpTP5を得た。pTMV204 Apa Ｉフラグメント（5455−6389）をオリゴヌクレオチドpd〔CAGGTACCC 〕及び d〔 GGGTACCTGGGCC〕に連結させ（SEQ  ID No：２）、Kpn Ｉ（ヌクレオチド配列内で下線が付されているもの）及びNco Ｉ（5459）で消化し、Nco Ｉ／Kpn Ｉ消化されたpTP5へと連結させてpTPK10を生成した。pTPK10からPst Ｉ／Kpn Ｉ−消化されたpUC118へと 7.3kbのPst Ｉ／Kpn Ｉをサブクローニングすることによって pTKU1を構築した。 pTKU1はpPM1のλファージプロモータの下流に完全な TMV−UIゲノムの DNAコピーを含んでいた。
【０１３７】
pTKUIのKpn Ｉ消化及びインビトロ転写は、感染性 TMV RNAを与えた。オドントグロッサムリングスポットウイルス（ORSV、時として TMV−O と呼ばれる）外皮タンパク質、DHFR及び NFTII ORFのPst II部位は、ハイブリッド構成体のプラスミド DNAを消化し感染性インビトロ転写物を産生するためのこの制限酵素（pTMV204, 4を線形化するのに利用されるもの）を使用を禁じていたことを理由として、 pTKUIが構築された。
【０１３８】
pTB2（図１）．pTMVS3−28（45）は、外皮タンパク質開始コドンが ACGに突然変異させられXho Ｉ部位が全外皮タンパク質コーディング配列に置換している pTMV204の誘導体であった。pTMVS3−28からの 1.9kbのNco Ｉ／Sal Ｉフラグメント（pBR322内の5459−SaI １部位）を NcoＩ／ SalＩ消化されたpNEO（56）へと連結させpNS283を得た。 pBabsＩは、 TMV−UI(nts4254−6370) に対するヌクレオチド、 ORF及びアミノ酸配列の類似性をもつORSVビリオン RNAからの 2.4kbのEco R Ｉ cDNA であった。
【０１３９】
680bpの pBabs1 HincII／Ear Ｉ（クレノウポリメラーゼ充てん済み）フラグメント（その AUGの下流にORSV外皮タンパク質 ORFと 203の塩基を含む）を、pNS283のNst Ｉ部位（6202：T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化されたもの）に連結させてpB31を産生した。次にpB31からのNco Ｉ／Sal Ｉフラグメントを（pBR322内で対応する野生型フラグメント5459−SaI1部位に置換する）Nco Ｉ／Sal Ｉ消化された pTMV204に連結させ、pTB281を得た。pTB281からのBamHＩ／ SplＩフラグメントをBamHＩ／ SplＩ消化された pTKUI（対応する野生型フラグメント3332−6245に置換するもの）に連結させることによってpTB2を構築した。
【０１４０】
pNC4X(57) ． pNC4Xは、 pUC8XにクローニングされたR67 OHFR遺伝子から成っていた。プラスミドは、DHFR遺伝子のための開始コドンから８つの塩基分上流にXho Ｉ部位を含んでいた。さらに、停止コドン及びカルボキシ末端DHFR配列の５つの塩基を欠失させ、Sal Ｉ部位によって置換した。
【０１４１】
pNU116． 315bpの pNEO Sau 3S（クレノウポリメラーゼ充てん済）フラグメント(Tn5 NPNII遺伝子の NH2末端）をSal Ｉ(pd〔GGTCGACC〕）リンカーに連結し、Sal Ｉ／Fst Ｉで消化し、Fst Ｉ／Sal Ｉ消化したpUC128 (55) 内に挿入してpNU10を得た。pNEOをAsu IIで消化し、クレノウポリメラーゼで充てんし、Xho Ｉリンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連結させてpNX1を生成した。pNX1をXho Ｉで消化し、クレノウポリメラーゼで充てんし、Pst Ｉで消化し、結果として得られた632bpフラグメント(Tn5 NPTII遺伝子のCOOH末端）を PstＩ／ SmaＩ消化されたpNU10内へ連結させることによって、pNUII6を構築した。 NFTII遺伝子のこの操作は、開始コドンより16塩基上流で、その存在が形質転換された植物細胞（58）内の NFTII活性を減少させていた付加的な ATGコドンを除去した。
【０１４２】
pTBD4 及びpTBN62（図１）． pNC4X（DHFR配列）及びpNU116(NPTII配列）からのXho Ｉ／Sal Ｉフラグメントをそれぞれ、 TMVコーディング配列と同じ向き（センス）でpTB2のXho Ｉ部位の中に連結した。
インビトロ転写及び植物の接種
（45）の通りに育てた植物に、それぞれKpn Ｉ消化されたpTBD2, pTBD4及びpTBN62からのインビトロ転写物TB２（nt. 6602），T8D4(nt.6840) 及びTBN62 (nt.7434) を接種した。インビトロ転写方法は、前述のとおりであった。
【０１４３】
後代ビリオン RNAの分析．ウイルス精製は、ポリエチレングリコールでの１回の沈降（８％ PEG、 0.1Ｍ NaCl 、０℃、１時間）及び１回の超遠心分離（151000−235000×ｇ；90分）を伴って、基本的に Gooding及びHebert（59）により記述されている通りであった。１時間37℃で10mMのトリス HCl、pH 7.5、１mMのEDTA、 0.1％の SDS内の 0.2μｇのフロティナーゼＫで１mgのウイルスを消化しその後フェノール／クロロホルム抽出を行なうことによって、ビリオン RNAを抽出した。
【０１４４】
RNA試料を、DMSOで変性させ、グリオキサール化し、１％のアガロースゲル内で電気泳動し、ニトロセルロース（気孔径0.45μｍ；Schleicher and Schull ；48）へとトランスファさせた。トランスファは、〔α-35 Ｓ〕−dATP(New England Nuelear）で標識付けされた（50）制限フラグメントでプローブ探査した。RNアーゼ保護検定は、（48）に記されている通りであった。TBD4−38及びpTBN62−38は、BamHＩ／ KpnＩ消化されたpBluescript SKI(Stratagene) 内にクローニングされた、それぞれ pTBD4及びpTBN62からのBam H Ｉ／Kpn Ｉフラグメント（nts.3332−6396）を含んでいた。
【０１４５】
NPTIIの免疫学的検出．標本の調製及びウェスタン分析は、以前に記述された通りであった（45）。葉の試料を液体Ｎ2 と抽出緩衝液（10％のグリセロール、62.5mMのトリス HCl  pH７、５％のメルカプトエタノール、５mMのフェニルメチルスルフォニルフルオリド）の中で摩砕した。ウシ血清アルブミンを標準としてブラッドフォード検定(Stratagem；61）により、当量タンパク質濃度を決定し、絶対濃度を見積った。ウェスタントランスファを NPTIIに対する抗血清（１：500 ；５Prime,  ３Prime, Inc.)で、次にアルカリ性ホスファターゼでコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ IgG（１：1000）でプローブ探査した。
【０１４６】
NFIII活性検定． NPTII活性を、その硫酸ネオマイシンリン酸化反応によって検出した。酵素検定は、抽出緩衝液が上述のとおりであり健康な組織内の精製された NPTII（５Prime,３Prime, Inc.)の一連の希釈物が含まれていた点を除いて、（62）に記述されている通りであった。
硫酸カナマイシンに対する耐性についてスクリーニングするための葉盤検定．NPTIIはアミノグリコシドカナマイシン（56）に対する耐性を付与する。接種後12日目の若い全身性の葉を、表面殺菌し、約0.01％のTween 20（５分）、0.25％の次亜塩素酸ナトリウム（２分）70％のエタノール（30秒）、精製水（４×10秒）の中で洗浄した。葉盤を葉から対を成して切断した；１つは、 Murashige及び Skoog(MS)の培地単独の上に置き、もう１つは、硫酸カナマイシン補充したMS培地上に置いた。プレートを、16時間の光周期で32℃でインキュベートした。７日毎に、葉盤を調製したばかりの培地へトランスファさせた。
【０１４７】
それぞれ DNA構成体 pTB2, pTBD4及びpTBN62から誘導されたインビトロ転写物を N.benthamiana植物に機械的に接種した結果、標準的な TMV形状と収量（1.５〜5.９mgのウイルス／組織１ｇ）のウイルス症候性感染がもたらされた。症状はTMV−UIに感染した植物に比べさほど重症ではなく、全身性葉の穏やかなクロロシス（白化）とゆがみを伴う植物の萎縮から成っていた。それぞれ TB2, TBD4及び TBN62の接種を受けた植物の全身的に感染した組織からのビリオン RNAのサイズは、それぞれのプラスミドからインビトロで転写された RNAの予想された長さと一貫していた。
【０１４８】
これらの RNA種は、 TMV配列に加えてそのそれぞれの細菌遺伝子インサートを含んでいた。それぞれのゲノムの操作された部分に対して相補的なプローブを、後代TBD4及び TBN62のウイルス RNAによるRNアーゼ保護検定において保護した。これは、以前の構成体（11）では問題であった挿入された配列の精確でかつ迅速な欠失がTBD4又は TBN62では起こらなかったということを表わしていた。以前に報告された構成体では、反復したサブゲノミックプロモータ配列（11）間の組換えのために外来性インサートが欠失したという仮説が立てられた。
【０１４９】
TBD4及び TBN62では、非相同のサブゲノミックmRNAプロモータを利用することによってこのような反復配列は低減された。目に見えプローブよりも小さく全長ウイルス RNAよりも小さい付加的なバンドは、TBN62 個体群の一部分の中の変化を表わしている可能性があるが、この場合、全長バンドと付加的なより小さなバンドの相補的割合は、それに続く継代の後変化が無かった。
【０１５０】
TBD4及び TBN62ビリオン RNAの配列安定性は、 N.benthamianaを通しての連続継代において検査された。それぞれ pTBD4及びpTBN62からの２つ及び４つの独立したインビトロ転写物イオン反応を用いて、植物に接種を行ない、全身的に感染を受けた葉組織を11〜12日毎に連続継代させた。48日間の全身性感染の後、ノーザントランスファハイブリダイゼーションによりDHFR配列を含むTBD4の全長ビリオン RNAがなおも検出され、RNアーゼ保護検定においてゲノムの操作された一部分に対して相補的なプローブをなおも保護していた。
【０１５１】
N.tabacum Xanthi-nc上の局所的病巣の分離により 170日間繁殖されたTBD4感染植物からビリオン RNAのクローナル個体群が５つ誘導された（10継代が関与する１シリーズ）。そのうち３つの個体群についてのコンセンサスDHFR配列は、コーディング配列のヌクレオチド72での翻訳的に沈黙した第３の塩基変化（Ｕ−＞Ｃ）を除いて、公表されたDHFR配列と一致していた。DHFRコーディング配列の位置72でのヌクレオチド変化は48日間繁殖されたTBD4感染を受けた植物からの後代RNAにおいては明らかでなかった。 TBN62による感染を連続的に受けた植物からのビリオン RNAは、独立した一連の継代の各々において NPTII配列の異なる部分が欠失している状態で、比較的不安定であった。
【０１５２】
これらの配列の喪失時間は、第１の継代後（12〜24日）と第３の継代後（36〜＞47日）の間で変動した。 TBN62の NPTII配列内で欠失が発生する理由はわかっていない。しかしながら、TBD4内のDHFR配列の安定性に基づくと、挿入された外来性配列のこのような不安定性は、発現ベクター TB2の内発的特長であるとは思われない。これとは対照的に、このような欠失は、挿入された外来性配列自体のヌクレオチド組成によって要求されるものである可能性がある。 DNA植物ウイルスベクターの間での類似の不安定さも見られてきた。
【０１５３】
広範に使用されている選択可能なマーカー NPTII(62)についての抗血清及び感受性酵素検定の市販の供給源によって、 TBN62での感染を受けた組織をさらに分析することが可能となった。ウェスタンブロット分析、酵素活性及び葉盤検定は、 TBN62の全身性感染を受けた植物繊維において機能的 NPTII、酵素が存在しその表現型発現がみられるものの TB2感染を受けた植物又は健康な植物においてはそれがみられないことを立証した。 NPTIIタンパク質及び酵素活性は、36日間繁殖させたいくつかの TBN62感染を受けた植物の中でさえ検出された。
【０１５４】
抽出可能な NPTIIタンパク質のレベルが、最も発現度の高い TMVタンパク質である外皮タンパク質よりも著しく低いものであることは明らかであった。このような低レベルは、植物細胞内のそれぞれのタンパク質の相対的安定性又は分配を反映するものでもありうるし、或いは又リポータ遺伝子の転写後の発現又はサブゲノミックmRNAの合成に影響を及ぼすベクター又は外来性遺伝子配列のもつ単数又は複数の様相によるものであるとも考えられる。ベクター構成体での感染を受けた植物からのウイルスの比較的高い収量は、ウイルス複製の効率の劇的な減少を妨げるように思われる。
【０１５５】
しかしながら、低い発現のための１つの可能性は、ゲノムの３′未端との関係におけるリポータ遺伝子の位置にあるかもしれない。 TMVの異なる突然変異体により産生される 30kDaのタンパク質の量は、ゲノムの３′末端からの 30kDaのタンパク質 ORFの距離に反比例することが示された。この関係は、French及びAhlquist(63)の観察事実すなわち、ブロムモザイクウイルスRNA3からのサブゲノミック RNAのレベルは、プロモータが３′末端に近く挿入されればされるほど漸進的に高くなる、ということと一貫していた。
【０１５６】
例２．
例１の RPMは N.benthanianaの中で全身的に拡散できるものの、 N.tabacum内で全身的に拡散することはできない。この例は、 N.tabacum内での全身的拡散が可能である RPMの合成について記述している。
pTB2内に含まれているＯ−外皮タンパク質コーディング配列は、 Aha IIIでの消化によりpTB2から切断された。UI−外皮タンパク質コーディング配列は、 AhaIIIでの消化により pTMV204から除去され、 Aha III消化されたpTB2内に挿入されてベクターpT8U5(図Ｉ）を産生した。
【０１５７】
それぞれpNC4X(DHFR配列) 及びpNU116(NPTII配列) からの XhoＩ／ SalＩフラグメントを、 TMVコーディング配列と同じ向き（センス）で pTBU4の XhoＩ部位内に連結させる。例１に記載されている通りに N.tabacum植物を接種し分析する。全身性感染を受けた植物内には機能的酵素が見られるが、対照植物内には見られない。
【０１５８】
例３．
この例は、天然の外皮タンパク質遺伝子がその天然サブゲノミックプロモータの制御下にあり、非天然核酸の発現を駆動するため非天然サブゲノミックプロモータが挿入されているRP VNAの合成について記述する。
TMV−O プロモータ及び TMV−UI外皮タンパク質配列を、 XhoＩ及び KpnＩで消化することによってpTB2から除去する。平滑末端化及び PstＩリンカーの付加によって、 XhoＩ末端を PstＩ部位に変換する。この PstＩ／ KphＩフラグメントをBluescriptベクター内へサブクローニングする。このBluescriptベクターの２つのサブクローンを、以下のような部位特異的突然変異誘発により作り出す：
【０１５９】
ATG(外皮タンパク質) の開始部位での突然変異を強制し ATG部位の近くに XhoＩ部位を作り出すことになる部位特異的フラグメントを作り出すため PCT技術を用いてBluescript SubＩを調製する。Bluescript Sub2 は、TAA(外皮タンパク質) 停止部位での突然変異を強制し TAA部位の近くに XhoＩ部位を作り出すことになる部位特異的フラグメントを作り出すべく PCR技術を用いて調製する。Bluescript SubＩの PstＩ／ XhoＩ切断及びBluescript Sub2 の XhoＩ／ KpnＩ切断は、連結されうる２つのフラグメントを与え、 TMV−O プロモータから下流にあるXhoＩクローニングインサート部位を有する PstＩ／ KpnＩフラグメントを提供する。この PstＩ／ KpnＩフラグメントは、 NsiＩ／ KpnＩフラグメントを除去させたpTKUＩベクター内に挿入される。（ PstＩ末端は NsiＩに連結されうる) 。結果として得られるクローンは、３′側に TMV−O プロモータを伴う、 TMV−O プロモータによって駆動されることになる選択された遺伝子を中に挿入できるXhoＩインサート部位を伴うpTKU１−ａである。
【０１６０】
それぞれpNC4X(DHFR配列) 及びpNU116(NPTII配列) からの XhoＩ／ SalＩフラグメントは、 TMVコーディング配列と同じ向きでpTBU１−ａの XhoＩ部位内に連結される。 N.tabacum植物は、例１に記述されている通りに接種及び分析を受ける。全身性感染を受けた植物には、機能的酵素が見られるが、対照植物には見られない。
【０１６１】
例４．
Ｏ−外皮タンパク質（例１）又はＵ１−外皮タンパク質遺伝子（例２）のいずれかをもつ RVPNA内への挿入のための付加的な DNAコーディング配列を調製した。各々のケースにおいて、コーディング配列と同じ向き（センス）でpTB2（例１）又はpTBU5(例２）の XhoＩ部位を含むように、コーディング配列を合成した。
【０１６２】
E.coliへとプラスミドを形質転換し一晩の培養から DNAを分離させるためには、標準的手順を用いた。プラスミド DNAの抽出の後、 DNA依存性 RNAポリメラーゼを用いて（選択された遺伝子を伴って又は伴わない)TB2又はTBU5ベクターの RNAコピーを作製した。以前に公表されたとおり、転写反応中m7GpppG4を付加することにより、反応の間 RNAをキャップ形成させた。この RNAは次にタバコ植物に接種を行なうのに用いられた。多数の植物の接種のため、幅広い濃度の過渡的ベクターを精製するのに標準的なウイルス分離技術を使用することができる。
【０１６３】
XhoＩリンカーを含む中国産キュウリのα−トリコサンチンについてのコーディング配列は、SEQ ID NO:４として対応するタンパク質を伴ってSEQ ID NO:３内に示されている。
XhoＩリンカーを含むイネのα−アミラーゼのためのコーディング配列は、SEQ ID NO:６として対応するタンパク質を伴ってSEQ IDNO:5の中に示されている。この配列は、以下のように調製された：
【０１６４】
Hind IIIで酵母発現ベクターpEno／I0364 を消化し、一本鎖 DNA懸垂を除去するため緑豆エキソヌクレアーゼで処理した。完全なイネα−アミラーゼ cDNA 05103 65 1990;Gen BanK受入れ番号M24286) を含む0.16kbの Hind III （平滑末端）フラグメントを、 ScaＩで消化し、 XhoＩオリゴヌクレオチド(5′CCTCGAGG３′）でリンカー形成させた。変更α−アミラーゼcDNAフラグメントを、低溶融アガロースゲル電気泳動を用いて分離させ、pBluescript KS+(Stratagene, La Jolla. Calif.) 内でアルカリ性ホスファターゼで処理された XhoＩ部位へとサブクローニングさせ、E.coli K−12菌株 C−600 の中で維持した。
【０１６５】
短かい３′−未翻訳領域を含むイネα−アミラーゼコーディング配列は、以下のとおりに調製された：
E.coliベクター pVC18／13(64)を KpnＩ、 XhoＩで消化させ、 Exo III及び緑豆エキソヌクレアーゼで処理した。変更プラスミドを DNA poll, DNAリガーゼで処理し、 C−600 に形質転換した。分離株、クローンpUC 18／3 #8は、 05103の停止コドンに非常に近い３′欠失を有していた。このプラスミドを EcoRIで消化し、緑豆エキソヌクレアーゼで処理し、 XhoＩオリゴヌクレオチド(5′CCTCGAGG３′) でリンカー形成した。
【０１６６】
結果として得られるプラスミド(pUC18／3 #8X)からの1.４kbの Hind III − XhoＩフラグメントを、低溶融アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、pBluescript KS-(Stratagene,La Jolla,Calif.) にサブクローニングし、E.coli K−12菌株 C−600 及び JM109内に維持した。一本鎖鋳型を用いてジデオキシ終端により欠失を配列決定した。欠失は、イネａ−アミラーゼ停止コドンを通過して14bpのところにあることが見極められた。プラスミドpUC 18／3 #8X を Hind III で消化し、緑豆エキソヌクレアーゼで処理し、 XhoＩオリゴヌクレオチド(5′CCTCGAGG３′）でリンカー形成した。トラフ溶出によって1.４kbの XhoＩフラグメントを分離し、pBlues- cript KS+ 内でアルカリ性ホスファターゼ処理された XhoＩ部位へとサブクローニングし、 JM109内に維持した。
【０１６７】
ヒトα−ヘモグロビン又はβ−ヘモグロビンに対するコーディング配列及びペチュニアEFSPシンターゼのトランジットペプチドを含む配列決定は、SEQ ID NO:７又はSEQ ID NO:８内に、又対応するタンパク質配列はそれぞれSEQ ID NO:９及び SEQ ID NO:10 として示されている。
例１に従って調製されたα−トリコサンチンに対する遺伝子を含む組換え型植物ウイルス核酸で処理された N.benthamianaからの精製されたタンパク質抽出物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、ウェスタン分析のための標準的手順を用いてα−トリコサンチンに特異的な抗体でプローブ操査した。図２は、α−トリコサンチンに対する遺伝子を含む組換え型植物ウイルス核酸で処理された植物内での、処理済α−トリコサンチンタンパク質の産生を実証するゲルのオートラジオグラフである。
【０１６８】
例５．
現場試験
屋外現場設計は２つの実験（１及び２）を含んでいた。実験１は、全ての外周畦ならびに内部畦上にタバコの未処理周縁畦（８）を含む典型的なロークロップ形態であった。さらに、４本の畦毎に、処理済み畦（Ｔ）のいずれとも直接接触することなく畑に大型農業機器がアクセスできるようにするため（例えば農薬を噴霧するため）植栽せずに残されたスペーサー畦（Ｓ）があった。各々の接種は、個々の植物の単葉にベクターを手で直接塗布することによって処理された。
【０１６９】
実験２は、典型的な苗床構成であった。トラクタの動力取出し装置にとりつけられた改造芝刈り機を用いて苗床を頻繁に刈り取ることによって、均等な高さで１平方フィートあたり高密度の植物が栽培された。この実験は、ベクターの接種を受けていない苗床の完全な周縁部を含んでいた。
処理された苗床の接種は、改造型芝刈機ブレードアセンブリを通して下方に向けられたスプレーを用いて行なわれ、隣接する苗床に対する過剰噴霧を防ぐように操作された。
【０１７０】
実験１は、ランダム化されたブロック内の主要な小区画としての７つの遺伝子型と４つの複製を伴う畦栽培を用いた分割小区画設計であった。各小区画は長さ13フィートで３本の畦から成り、試験のためには各中心畦のまん中の３〜４本の植物のみが用いられた。畦は中心で４フィートあり、畦の中で植物は20〜22インチの間隔がとられていた。
実験２は、４つの遺伝子型と３つの複製を伴う苗床栽培を用いた、ランダム化された完全ブロック設計であった。各々の小区画は４フィート×12フィートの苗床から成っていた。
【０１７１】
遺伝子型．  実験１：（Nicotiana tabacum ）Ｋ−326, SpG−28，TI−560,  Md−609, Gal pao, Wisc−503B及びNicotiana benthamiana ．
実験２：（Nicotiana tabacum ）Ｋ−326,  TI−560,  Md−609, Gal pao.
化学的施肥．  実験１：移植後800 １bs６−12−８；１回目の収穫後100 １bs33−０−０；２回目の収穫後200 １bs  15−０−14。
実験２：苗床形成時点で2400  １abs   12−６−６；１回目の収穫後300 １abs 33−０−０；２回目の収穫後；670 １bs  15−０−14．
【０１７２】
刈り取り．  実験２は、植物に対し均質性を付与するため、１週間に２回の割合で２週間刈り込まれた。
雑草、昆虫及び疾病の制御．  実験１：畦を形成するに先立ち、Paarlan ６Ｂ（１qt／Ａ），Temik 15Ｇ（20  １ｂ／Ａ）及びRidomil （２ qts／Ａ）を散布し、円板すきで耕すことによって取り込ませた。畦形成中、Telone  Ｃ−17（10.5 gal／Ａ）を適用した。移植の後、芽を食う毛虫やイモムシを制御するためDipel （１／２  １ｂ／Ａ）を適用した。必要に応じてアリマキやイモムシを制御すべくDrthene （２／３  １ｂ／Ａ）を適用した。
【０１７３】
実験２：播種時点で、又播種後60〜70日目から始めて一週間毎に（必要に応じて）Ridomil ２Ｇ（１qt／Ａ；１oz／150 平方ヤード）を適用した。炭疽病及び苗立枯れ病を制御するため初期苗床段階で必要に応じて葉面散布としてカルバメート76wp（３  １ｂ／100galの水）も同様に使用された。正規の移植サイズでは、Dipel （１／２lb／Ａ）が適用された。必要に応じてアリマキやイモムシを制御するためOrthene （２／３lb／Ａ）が適用された。
移植．  実験１は、実験２の苗床から引き抜いた実生を用いて移植された。
【０１７４】
接種．  実験１：NPT II，α−トリコサンチン又はイネα−アミラーゼを含む選択された組換え型植物ウイルス核酸を、各々の非対照植物の単葉に手で接種した。個別の植物各々には単一のベクターを接種した。
実験２：植物が最後に刈り込まれている間に刈り込み用芝刈り機のデッキを通して適用されるスプレーを用いて、実験１で記述されたベクターを植物に接種した。各々の非対照小区画は、単一のベクター構成体を受け入れた。対照植物は、どのベクターの接種も全く受けなかった。
【０１７５】
データ収集．  実験１：接種された植物及び対照植物の両方の葉の試料採取は、植物が約30インチの丈になるまで第１の成長中に予定通り（ほぼ週１回）行なわれた。次に植物を回転ブラシグレードで切断し（収穫１）て、地面より上に露出した柄を６インチ残した。次に植物を、約30インチの高さまで成長し続けさせた（第２の生長)。収穫２の直前に、葉の試料を取った。切断、成長及び試料採取のためのこの手順は、ベクター内に挿入された検出可能な量の問題の遺伝子が見い出された場合、第３の成長及び第４の成長について繰返された。
【０１７６】
実験２：各々の小区画からの10本の植物の試料採取は、接種から収穫１まで及び収穫１から収穫２まで予定通り（ほぼ一週間毎に）行なわれた。収穫２の後、試料採取は収穫３においてのみ行なわれた。
試料サイズ及び分析方法    植物の頂部近くの単葉から 1.6cmの盤を切除した。各々の葉盤を、無水エタノールを含むネジキャップのついた25ml入りのガラス製バイアル内又は密封可能なプラスチック袋の中に入れた。
葉盤は、無水エタノール内に保存するか又は凍結乾燥した。検出すべき特異的遺伝子産物に応じて、葉の試料を、ノーザン又はウエスタンブロット分析又は特異的酵素活性のための標準的技術に従って調製した。
【０１７７】
最初の成長の間、ベクターシステムのあらゆる外部表現型発現を観察するべく、RPVNA で処理されたpIantsの目による監視を行なった。いくつかのケースにおいて、表現型発現は、タバコモザイクウイルス感染に典型的であった（葉内のより明るい及びより暗い「モザイク」パターン）、その他のケースにおいては、見られた唯一の症状は、直径約２mmの白又は褐色の斑及び／又は葉上の中央葉脈の伸長の抑制を含め、接種された葉上にあった。
【０１７８】
例６．
OMV ゲノムの全長DNA コピーを、Dawson, W.O. etal. (4)により記述されているとおりに調製する。OMV ゲノムのDNA コピーを含むベクターを適切な制限酵素又は適切なエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、OMV を分離し、それを用いて発芽しつつある大麦植物を感染させることによって、確認される。分離されたOMV RNA は、自然条件下で病巣を超えて拡散することはできない。OMV 配列を含むベクターは、例１〜３に記述されているとおりに調製される。
【０１７９】
例７．
ゲノムの全長DNA を、Dawson, W.O. etal. (4)によって記述されているとおりに調製する。ENV ゲノムのDNA コピーを含むベクターを、適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼを用いて消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、RNV RNA を分離しそれを用いて発芽しつつある大麦植物を感染させることによって確認される。分離されたウイルスは、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。OMV 配列を含むベクターを、例１〜３に記述されている通りに調製する。
【０１８０】
例８．
PVY 又はPVX ゲノムの全長DNA コピーをDawson, W.O. etal. (4)によって記述されている通りに調製する。PVY 又はPVX ゲノムのDNA コピーを含むベクターを、適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼを用いて消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、PVY 又はPVX ENA を分離しそれを用いてサツマイモ植物を感染させることによって確認される。分離されたPVY 又はPVX RNA は、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。OMV 配列を含むベクターを、例１〜３に記述されている通りに調製する。
【０１８１】
例９．
メイズ（トウモロコシ）条斑ウイルス（MSV)ゲノムの全長DNA コピーをDawson, W.O. etal. (4)によって記述されているとおりに調製する。MSV ゲノムのDNA コピーを含むベクターを適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、MSV を分離しそれを用いてサツマイモ植物を感染させることによって確認される。分離されたMSV は、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。OMV 配列を含むベクターを、例１〜３に記述されているとおりに調製する。
【０１８２】
例10．
TGMVゲノムの全長DNA コピーを、Dawson, W.O. etal. (4)によって記述されているとおりに調製する。TGMVゲノムのDNA コピーを含むベクターを適切な制限酵素又は適切なエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、TGMV RNAを分離しそれを用いてサツマイモ植物を感染させることによって確認される。分離されたTGMV RNAは、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。TGMA配列を含むベクターを、例１〜３に記述されているとおりに調製する。
【０１８３】
例11．
ベーターサイクロデキストリングルコトランスフェラーゼに対するコーディング配列を以下の要領でアルカリ親和性Bacillus sp.菌株No.38 −２から分離する：
菌種No.38 −２（66）の染色体DNA をSau  3AIで部分的に分割させ、フラグメントをBam  HI 消化されたpBR322内で連結させる。産生菌種のゲノムからの 3.2kbのDNA フラグメントを含む、形質転換体を支持するプラスミドpcs115は、CGT 活性を有する。この形質転換体により産生されるCGT は、オクタロニー２重拡散試験によりNo.38 −２CGT に対するものと完全に融合する１本の沈降ラインを与える。フラグメントのヌクレオチド配列は、puc19 を用いたジデオキシ連鎖終端反応（チュインターミネータ法）及びエキソヌクレアーゼ欠失方法（67）によって発見される。
【０１８４】
フラグメントのヌクレオチド配列は、CGT 遺伝子に対応する単一の読取り枠を示す。66kDalの分子質量をもつタンパク質を1758bpのこの読取り枠から翻訳することが可能である。詳しいヌクレオチド配列については、ハナモト、T. ex. al.
(66）を参照のこと。
【０１８５】
細胞外形状のCGT のＮ末端アミノ酸の配列は、ペプチドシークエンサで発見される。NH2-Ala-Pro-Asp-Thr-Ser-Val-Ser-A5n-Lys-Gln-Asn-Phe-Ser-Thr-Asp-Val-Ile(SEQ ID NO : 6)はDNA 配列（残基１〜17）から演繹されたものと同一である。この結果は、27個のアミノ酸残基（残基−27〜−１）が、CGT の分泌中に除去されるシグナルペプチドを表わしていることを示唆している。DNA 配列から計算された成熟CGT の分子量は、63,318である。
【０１８６】
サイクロデキストリングルカ／トランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部分に基づきプローブが調製され、これはこの酵素に対するコーディング配列を分離するために用いられる。代替的には、ベータサイクロデキストリングルコトランスフェラーゼコーディング配列は、逆転写の後に分離される。コーディング配列を含むフラグメントは、例６−10において調製されたベクター内の天然ウイルス外皮タンパク質遺伝子のサブゲノミックプロモータに隣接して分離されクローニングされる。
【０１８７】
例12．
例11のRPVNA を用いて、コーン（トウモロコシ）植物（OMV, RNV又はTGMVに基づくウイルス）又はサツマイモ植物（PVY 又はPVX に基づくウイルス）を感染させる。感染を受けた植物は、正規の成長条件下で成長させられる。植物は、植物組織内のサイクロデキストリンへのでんぷんの変換の触媒として作用するサイクロデキストラン・グルコトランスフェラーゼを産生する。サイクロデキストリンは、従来の技術を用いて分離される。
【０１８８】
例13．
Ａ．エステラーゼに対するコーディング配列を、Bacillus subtilis Thai 1〜8 (CBS 679.85)から以下のとおりに分離する。正の選択ベクターpUN121（68）を使用する。このベクターはアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びＣ1 −抑制遺伝子を支持している。テトラサイクリン遺伝子の転写は、Ｃ1 −抑制遺伝子の遺伝子産物によって妨げられる。外来性DNA がＣ1 −抑制遺伝子のBcl  I部位内に挿入されると、テトラサイクリン遺伝子の活性化という結果がもたらされる。こうして、アンピシリン／テトラサイクリン寒天平板上での組換え体の正の選択が可能となる。
【０１８９】
部分的にSau 3aで消化されたBacillus subtillis Thai 1 −8 DNA は、Bcl I 消化されたpUN121DNA と混合される。ポリヌクレオチドリガーゼの使用による再循環の後、Cacl2 形質転換手順を用いてE. coli DH1 (ATCC  No.33849)の中にDNA 混合物を導入する。アンピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性をもつ1000のE. coliコロニーが得られる。全ての形質転換体をGergan et al. (69)に従って保存し、レプリカ平板法に付す。複製されたコロニーを、エステラーゼ活性の検出のため以前に記述された手順に基づいて軟寒天オーバーレイ技術を用いてスクリーニングする。
【０１９０】
基本的に、形質転換体全体にわたり、 0.5％の低溶融アガロース、 0.5Ｍのリン酸カリウム(pH7.5), 0.5mg／ｌのβ−酢酸ナフチル及び 0.5mg／mlのファストブルーを広げる。数分以内で、エステラーゼ又はリパーゼ活性を伴うコロニーが紫色を発生させる。このようなコロニーを ZX YT（16ｇ／ｌのBactotryptone, 10 ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのNaCl）培地の中で一晩成長させ、次にＳ−ナプロキセンエステルをＳ−ナプロキセンに変換するその能力について検定する（EP-A0233656 の例１の方法）。１つのE. coli 形質転換体は、Ｓ−ナプロキセンエステルを変換することができる。この形質転換体から、 pNAPT−２（CBS67186) と呼ばれるプラスミドを分離する。そのサイズは 9.4kbである。
【０１９１】
pNAPT−２のHind III制限酵素フラグメントを pPNE0／ori 内へ連結させる。これは、以下に記す通りに行なう。pUC19 の 2.7kbの EcoRI／Sma Ｉ制限フラグメントをpUB110の 2.5kbの EcoRI／Sna BI制限フラグメントに連結することにより、 pPNeo／ori を構築する。結果として得られたシャトルプラスミド pPNeo／ori (5.2kb）は、pUC19 起点及びpUB110起点の存在のためE.coliとBacillus種の両方において複製する能力をもつ。さらに、 pPNeo／ori は、アンピシリン耐性をコードする遺伝子及びネオマイシン耐性をコードする遺伝子を支持する。
【０１９２】
サブクローニングのためには、Hind III消化された pNAPT−２をHind III消化された pPNeo／ori と混合し、連結させる。この混合物を、記述されているとおり（Maniatis et al.,前出）E. coliJM101 hsdsへと形質転換する。E. coli JM101 hsdsは、Phabagen収蔵機関から入手する（受入れ番号No. PC2493, Utrecht 、オランダ）。酢酸β−ナフチルを加水分解することのできるコロニーを、EPA0233656の例56に記されている通りに選択する。２つの正のコロニー pNAPT−７及び pNAPT−８から、プラスミドDNA を分離し、いくつかの制限酵素認識位置を決定することにより詳細に特徴づけする。
【０１９３】
Ｂ．E. coliエステラーゼに対するコーディング配列は、以下のように調製される：
プラスミドpIP1100(E. coli BM2195 から分離されたもの）及びpBR322を混合し、Ava Ｉで消化し、連結し、E. coliへと形質転換し、クローンをEm(200／ｇ／ml）上で選択する。Ap及びEmのみならずSmに対する耐性をもつ形質転換体を、粗リゼイトのアガロースゲル電気泳動によって分析する。最小のハイブリッドプラスミドを擁する形質転換体を選択し、そのプラスミドDNA をAva Ｉで消化し、3.5kb のpIP100インサートを精製し部分的にSau 3Aで消化する。得られた制限フラグメントをpBR322のBam HI部位内へクローニングし、Emで選択された形質転換体をSm上でレプリカ平板法に付す。
【０１９４】
Ap及びEmに対してのみ耐性をもつ突然変異体のプラスミド含有量を、アガロースゲル電気泳動により分析する。最小のハイブリッドpAT63 からのDNA を精製し、Sau 3A，Eco RI，Pst Ｉ又はHind III−Bam HIエンドヌクレアーゼ（図示せず）での消化の後にアガロースゲル電気泳動によって分析する。プラスミドpAT63 は、pBR322と1.66kbのpIP1100 DNA インサートから成る。PAT63 の精製された E−Hind III (1750−bp）及びBam HI−Pst Ｉ(970−bp) フラグメントは PUC８内にサブクローニングされ、Em耐性を付与しないことがわかる。
PAT63 の HpaII−BamHI フラグメントはSanger技術によって配列決定される。完全な配列は、Ounissi, H. et al.（71）内に示されている。
Ｃ．アシラーゼからのコーディング配列は、Arthrobacter viscosus 8895GU, ATCC27277 から、以下のように分離される：
pACY184 のEco RI分割部位の中にEco RI分割されたA. viscosus染色体DNA を挿入することによりA. viscosus8895GU の遺伝子ライブラリを構築する。ベクターDNA 及びA. viscosus DNA の両方をEco RIで消化する。ベクターDNA の５′末端を、仔ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼで脱リンする。脱リンされたベクターのDNA 及び消化されたA. viscosus DNA をT4 DNAリガーゼでインキュベートし、E. coli HB101 へと形質転換させる。
【０１９５】
E. coliの形質転換されたコロニーをSerratia marcescensオーバーレイ技術によりスクリーニングした。培地にはペニシリンＧを付加した。S. marcescens は、ペニシリンＧの脱アシル化産物、６−アミノペニシラミン酸（６−APA)に対する感受性をもつ。形質転換されたE. coli のコロニーは、一晩の培養内でS. marcescens阻害の部域を生み出すことになる。形質転換されたE. coliが支持するプラスミドを、pHYM−１と呼ぶ。反対のDNA 配向を有するプラスミドは、pHYM−２（72）と呼ばれる。
【０１９６】
Ｄ．ヒト胃リパーゼmRNAに対するコーディング配列を、凍結組織のイソチオシアン酸グアニジニウムによって調製する。ポリアデニル化RNA を、オリゴ（dt）−セルロースクロマトグラフィによって分離する。当該技術分野において周知の手順によりヒト胃mRNAからcDNAを調製する。cDNAを、Pst Ｉ−切断したdGテイルをもつpBR322にアニールする。ハイブリッドプラスミドをE. coli DH1内に形質転換させる。ニトロセルロースフィルター上でのコロニーハイブリダイゼーションにより形質転換体をスクリーニングする。使用するプローブは、ラット舌側リパーゼ遺伝子から合成され、ニックトランスレーションによって標識付けされる。正のコロニーを成長させ、制限エンドヌクレアーゼ地図作製によりプラスミドを分析する。
【０１９７】
上述のように調製されたエクステラーゼ、アシラーゼ又はロパーゼ遺伝子を適切なベクターから除去し、緑豆ヌクレアーゼ又はDNA ポリメラーゼＩを用いて平滑末端化させ、Xho Ｉリンカーを付加する。Xho Ｉリンカーを伴うこのエステラーゼを、Xho Ｉで分割し、例１−３又は６−10で記述されているベクターの中に挿入する。例２に従って調製したRPVNA による適切な宿主植物の感染は、植物組織内のエステラーゼ、アシラーゼ又はリパーゼの合成という結果をもたらす。酵素は、従来の技術により分離及び精製され、立体特異的化合物を調製するのに用いられる。
【０１９８】
例14．
CMS−Ｔに対するコーディング配列を、Dewey, R.E.et al.(73）により記述されている通りにBam HIメイズ（トウモロコシ）mtDNA ライブラリから分離する。ORF−13コーディング配列を制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く開始コドンに対する５′−エキソヌクレアーゼ消化によって、分離する。代替的には、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発により ORF−13コーディング配列の開始コドンに隣接して制限部位を処理する。適切な制限酵素での消化が、 ORF−13に対するコーディング配列を生み出す。 ORF−13コーディング配列を含むフラグメントを分離し、例６，７及び10で調製されたベクター内で天然ウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングする。
【０１９９】
メイズ（トウモロコシ）植物を、例１に従って調製されたRPVNA で感染させる。感染を受けた植物を正規の成長条件下で成長させる。植物は、感染を受けたメイズ植物内で雄性不稔を誘発する cms−Ｔを産生する。
【０２００】
例15．
Ｓ2 −タンパク質のコーディング配列（自家不和合性に対する）を、EP−A0222526内に記述されている通りにNicotiana alata から分離する。Ｓ2 −タンパク質のコーディング配列を制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く開始コドンに対する５′エキソヌクレアーゼ消化によって分離する。代替的には、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりＳ2 −タンパク質コーディング配列の開始コドンに隣接して制限部位を処理する。適切な制限酵素での消化が、Ｓ2 −タンパク質に対するコーディング配列を生み出す。Ｓ2 −タンパク質コーディング配列を含むフラグメントを分離し、例１〜３において調製されたベクター内でウイルス外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングする。
【０２０１】
花粉形成に先立ち、例１に従って調製されたRPVNA によってタバコ植物を感染させる。感染を受けた植物は、正規の成長条件下で成長させられる。この植物は、自家不和合性メカニズムを介して雄性不稔を誘発するＳ−タンパク質を産生する。
以下の例は、本発明の植物RNA ウイルスベクターを用いて高レベルの治療的タンパク質を発現させ得るということを立証している。
【０２０２】
例16．新しいRNA ウイルスベクターを用いた、トランスフェクションを受けた植物内での生物学的活性をもつα−トリコサンチンの急速かつ高レベルの発現
トリコサンチンは、中国薬草の根に見い出される真核性リボソーム不活性化（失活）タンパク質である。Trichosanthes Kirilowii Maximowiczの中では、α−トリコサンチンは、28SrRNA 内のＮ−グリコシド結合の分割に触媒作用する単量体タンパク質である（75，76）、この反応は、延長因子と相互作用する60Ｓリボソームサブユニットの能力に影響を及ぼすことによってタンパク質合成を阻害する。成熟化合物は、27kDa というおおよその相対分子質量をもち、当初プレタンパク質として産生される（77）、その生合成中に、推定される23アミノ酸分泌シグナルペプチドが除去され、おそらく19アミノ酸ペプチドがカルボキシ末端から切除される。
【０２０３】
精製されたT.kirilowii 誘導のα−トリコサンチンは、急性感染を受けた CD4+ リンパ系細胞内及び慢性感染を受けたマクロファージ（78，79）内でHIV 複製の濃度依存性阻害をひき起こす。この化合物は、現在、HIV 感染に対する治療における考えられる治療的薬剤として臨床研究で評価されつつある。α−トリコサンチンによる抗HIV 感染の正確なメカニズムはわかっていない。HIV 複製の触媒作用及び阻害に関与するアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発を用いて同定できる。
【０２０４】
詳細な構造／機能分析には、組換え型タンパク質の豊富な供給源ならびに突然変異体を生成し分析する急速な方法が必要とされる。E.coliにおけるα−トリコサンチンの発現は以前に報告された（81，97）が、合成される量は少なく（細胞タンパク質全体の約0.01％）、カルボキシ末端延長部分は除去されず、化合物の生物学的活性は見極められなかった。
【０２０５】
約 6.4kbのプラス−センスRNA 鎖１本から成るゲノムをもつトバモウイルス（Tobamoviruses)が非相同タンパク質を産生するのに用いられた。ウイルスcDNAクローンからのRNA 転写物は、RNA 複製、運動及び包膜に関与するタンパク質をコードする感染性鋳型として役立つ。伝令RNA 合成のためのサブゲノミックRNA を、マイナス−センスRNA 鎖（83）上にある内部プロモータによって制御する。タバコ原形質体内のロイ−エンケファリン（84）及び接種を受けたタバコの葉の中の細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（85，86）を発現するために、以前はTMV RNA ウイルスを使用していた。
【０２０６】
外来性遺伝子を発現するためのこれらの以前の試みは、不安定な構成体又は長距離ウイルス運動の喪失といういずれかの結果をもたらした。最近になって、タバコモザイクウイルス菌株Ｕ１(TMV−U1）とオドントグロッサム輪紋病ウイルス（ORSV）からの付加的なRNA サブゲノミックプロモータで構成されたハイブリッドウイルスでのトランスフェクションを受けたNicotiana benthamiana 植物が、全身的かつ安定したネオマイシンホスフォトランスフェラーゼの発現を生み出している（87）。
【０２０７】
pBGC152 の構築
プラスミド pSP６−Tku １は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりSP６プロモータに融合され、 XhoＩ／ KpnＩフラグメントとしてpUC118内に挿入された全 TMV−Ｕ１ゲノムを含んでいる。TMV ゲノムに対しSP６プロモータ配列を付着させるのに用いられる突然変異誘発プライマーの配列は次の通りである：5′ -GGGCTCGAGATTTAGGTGACACTATAGTATTTTTACAACAATTACCA -3′
【０２０８】
なおここでXho Ｉ部位はイタリック体で記され、SP６プロモータは肉太活字で示されTMV 配列には下線が施こされている。プライマーは、pC48と呼ばれるTMV サブクローンに付着された (Raffo et al.,  Virology 184 ： 277−289 (1991)) 。上述のプライマ及びTMV 配列5673〜5692に相補的なプライマーを用いたPCR により、プロモータを付着させた。この増幅は、ca. 614bp のフラグメントを産生し、このフラグメントを次にXho Ｉ及びEco RI（TMV270）で消化してca. 292bp フラグメントを産生し、次にこのca. 292bp フラグメントを同様に切断されたPUC129内にサブクローニングして、結果としてプラスミド pSP６−Ｔ１を得た。
【０２０９】
pSP６−Ｔ１をXho Ｉ及びXma Ｉ（TMV256で切断するSma Ｉアイソシゾマー）で切断し、結果として得られたca. 278bp フラグメントを、ゲノムの５′末端の唯一のPst Ｉ部位で切断しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化しその後Xho Ｉリンカーを付加することによって変更されていたpTku１（Dorson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 ：7204〜7208 (1991))の中に連結させた。こうして感染性クローン pSP６−Tku １及び消化されたX maＩという結果がもたらされた。
【０２１０】
図９に示されているように、Eco RI，DNA ポリメラーゼ（クレノウ）及びKpn Ｉリンカーを用いて、pBR322内のEco RI部位をKpn Ｉ部位に突然変異誘発させた。結果として得られたプラスミドpBSG121 のKpn Ｉ＼Bam HIフラグメントをpTBzのKpn Ｉ＼Bam HIフラグメント（1992年７月24日に寄託された ATCC No.75280) で置換した。結果として得られたプラスミドpBSG122 のSal Ｉ／Kpn Ｉフラグメントを pSP６−Tku Ｉの XhoＩ／Kpn Ｉフラグメントで置換し（Ｔ１としても知られている）、結果としてプラスミドpBGC150 を得た。
【０２１１】
pBGC150 のBam HI／Kpn Ｉフラグメントを、 pTB２／ＱのBam HI／Kpn Ｉフラグメントと置換し、結果としてプラスミドpBGC152 を得た。本書中にその内容が参考として内含されているPiatak, Jr.,et al の米国特許第 5,128,460号の中に記述されているプラスミドpQ21D (ATCC No.67907) から始めて、 pTB２／Ｑを構築した。pQ21D 内のTCS 配列のPCR 増幅された0.88kbのXho Ｉフラグメントを含むプラスミド「クローン５Ｂ」は、５′-CTCGAGGATG ATC - -- ---//--- --- ATT TAG TAA CTCGAG- ３′（Xho Ｉ部位はイタリック体）という配列が得られるようにpQ21D の開始及び停止コドンでXho Ｉクローニング部位を導入するのにオリゴヌクレオチド突然変異誘発を用いて得られた。「クローンＢ」からの0.88kbのXho Ｉフラグメントを、プラスミド pTB２／Ｑを生み出すような向き（センスの方向）でプラスミド pTB２のXho Ｉ部位内にサブクローニングした。
【０２１２】
トランスフェクションを受けた植物のインビトロ転写、接種及び分析
以前に記述されたとおり（89）、N. benthamiana植物に、 KpnＩ消化されたpBGC152 のインビトロ転写物を接種した。BGC152転写物での感染を受けたN. benthamianaの葉からビリオンを分離させ、２％の水性酢酸ウラニルで染色し、Zeiss CEM902計器を用いて透過型電子顕微鏡写真を撮った。
【０２１３】
α−トリコサンチンの精製、免疫学的検出及びインビトロ検定
接種後２週間目に、接種を受けていない上部のN. benthamianaの葉の組織 3.0グラムから合計可溶性タンパク質を分離した。液体窒素中で葉を凍結させ、３mlの５％の２−メルカプトエタノール、10mMのEDTA, 50mMのリン酸カリウムpH6.0 の中で摩砕した。懸濁液を遠心分離し、組換え型α−トリコサンチンを含む上清を、20mMのNaCl, 50mMのリン酸カリウムpH6.0 で平衡化されたSephadex G−50カラムに装てんした。試料を次に、 Sepharose−５ Fast Flowイオン交換カラムに結合させた。アルファ−トリコサンチンをpH6.0 の50mMのリン酸カリウム内で 0.002−１Ｍ NaCl の線形勾配で溶出させた。
【０２１４】
Centricon−20（Amicon）でα−トリコサンチンを含む分画を濃縮させ、ダイアフィルトレーション(Centricon−10, 50mMのリン酸カリウム、pH6.0, 1.7Ｍの硫酸アンモニウム）により緩衝液を交換した。次に試料をHR５／５アルキルSuperose FPLC カラム（Pharmacoa)上に装てんし、線形硫酸アンモニウム勾配で（50mMのリン酸カリウム中 1.7〜０Ｍの硫酸アンモニウム、pH6.0)溶出した。標準としてBSA を用いて、合計可溶性植物タンパク質濃度を決定した（90）。α−トリコサンチンの濃度を、Ｅ280 ＝1.43のモル吸光係数を用いて決定した。精製タンパク質を 0.1％の SDS，12.5％のポリアクリルアミドゲル（91）上で分析し、一時間の電気ブロッティング（吸収転移）によりニトロセルロース膜にトランスファした。
【０２１５】
ブロットを受けた膜を、ヤギ抗−αトリコサンチン抗血清の2000倍希釈液を用いて１時間インキュベートした。増強された化学発光ホースラディッシュ（ワサビダイコン）ペルオキシダーゼ結合されたウサギ抗ヤギIgG (Cappel)を、メーカー（Amersham）の仕様に従って発達させた。１秒未満の時間、オートラジオグラムを露出した。抽出した葉の試料中の全ての組換え型α−トリコサンチンの量を、粗抽出液オートラジオグラムシグナルを既知の量の精製されたGLQ223から得られたシグナルに比較することによって、決定した。ウサギの網状赤血球のリゼイトシステム内でのタンパク質合成の阻害を測定することにより、リボソーム不活性化活性を決定した。
【０２１６】
生物学的活性を有するα−トリコサンチンの高レベル発現の確認
本発明の植物ウイルスベクターは、トランスフェクションを受けた植物におけるα−トリコサンチンの発現を誘導する。ゲノミッククローンpQ21D (88)からのα−トリコサンチンのための読取り枠(ORF）は、タバコモザイクウイルス(TMV) 外皮タンパク質サブゲノミックプロモータの制御下に置かれた。
【０２１７】
SP６DNA 依存性RNA ポリメラーゼを用いたインビトロ転写により、pBGC152 （図４）からの感染性RNA を調製し、機械的にN. benthamianaに接種するのに使用した。透過型電子顕微鏡写真（図５）、局所的病巣感染性検定及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 増幅（20；データは示さず）によって確認されるように、接種を受けていない全ての上部葉にわたり、ハイブリッドウイルスが広がっている。
【０２１８】
上部葉（接種後14日目）の中で合計可溶性タンパク質の少なくとも２％のレベルまで、27kDa のα−トリコサンチンが蓄積し、標準として精製されたT.kirilowii 誘導のα−トリコサンチンであるGLQ223（78）を用いて免疫グロッティングによってこれを分析した（図６）、感染を受けていないN. benthamiana対照植物抽出物の中には、検出可能な交叉反応タンパク質は全く観察されなかった（図６，レーン５）。クーマシー染料を用いて７μｇの葉の粗抽出液の中に、組換え型α−トリコサンチンが容易に検出された（図７，レーン３）。
【０２１９】
従来の研究者は、合計可溶性タンパク質の２％という遺伝子的に操作された植物における外来性タンパク質の最大蓄積量を報告している。抗体及びヒト血清アルブミンといった潜在的に貴重なタンパク質の発現が以前に報告されたものの（94，95）、これらは、アグロバクテリウムが媒介した遺伝子導入植物の中で産生された。この植物のウイルス発現システムと以前の方法の間の主要な相異点は、産生されるタンパク質の量及び、遺伝子的に操作された植物を得るのに必要とされる時間にある。単一の遺伝子導入植物を作り出すのに数カ月かかるのに対してα−トリコサンチンの全身性感染及び発現は２週間未満で発生した。
【０２２０】
トランスフェクションを受けたN. benthamiana（接種後14日目）内の上部葉から産生され精製されたα−トリコサンチンは、天然α−トリコサンチンと構造的に同一であった。27kDa のタンパク質は抗−α−トリコサンチン抗体と交叉反応し、GLQ223標準と同一のFPLC精製プロフィールを有していた。組換え型タンパク質のＣ末端配列は分析されなかったが、GLQ223も精製された組換え型α−トリコサンチンも両方共、同一の電気泳動移動度を有するように思われた（図７）。組換え型α−トリコサンチンの精確なＣ末端アミノ酸は、今後決定していくべきものである。Ｎ末端配列、Asp-Val-Ser-Phe-Arg-Leu-Ser は、自動化されたタンパク質シークエンサー（96）を用いて精製タンパク質から得られた。
【０２２１】
この結果は、調製物の推定上のシグナルペプチドが、図１に示されている部位で正しく処理されていることを示していた。この部位における推定上のシグナルペプチドの除去は、von Heijne (97）の方法による統計学的予測と一貫性あるものであった。α−トリコサンチンシグナルペプチドが、タンパク質を細胞外空間内にターゲッティングすることによってその高レベルの発現に寄与した可能性がある。α−トリコサンチン開始コドンをとり囲むヌクレオチド配列は同様に、翻訳の開始の効率にも影響をもつ可能性がある。
【０２２２】
高度に発現された TMV−U1（５′TTAAATATGTCT３′）及びORSV５′TGAAATATGTCT３′）外皮タンパク質遺伝子の翻訳開始部位に隣接する（フランキング）ヌクレオチドが、 pBGC152／α−トリコサンチン（５′TCGAGGATGATC３′）内の相応する領域が非常にわずかの類似性しか示さない間に保存される、という点に留意すると興味深い。α−トリコサンチンの翻訳開始部位近くのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発がその発現を増大することは可能である。
【０２２３】
組換え型α−トリコサンチンは、細胞無しのウサギ網状赤血球翻訳検定（図８）においてタンパク質合成の濃度依存性阻害をひき起こした。ID50（50％の阻害に必要とされる用量）は約 0.1ng／mlであり、これはT. kirilowii誘導のα−トリコサンチン（GLQ223）に匹敵する値であった。ID50及び用量応答に基づいて、トランスフェクションを受けた植物内で産生された酵素は、天然タンパク質と同じ特異的活性を有していた。この結果は、ウイルスの増幅中の外来性配列内の塩基対の置換及び欠失が組換え型酵素の特異的活性を低下させることから、ウイルスRNA 依存性RNA ポリメラーゼの適合度が比較的高かったということを示唆している。
【０２２４】
開示され請求されている発明が立証しているように、pBGC152 は、トランスフェクションを受けた植物の中での生物学的活性をもつα−トリコサンチンの非相同発現を誘導することができる。組換え型タンパク質の大規模産生は、接種された植物のサイズ及び数を単純に増大させることによりRNA ウイルスベースのシステムを用いて容易に得られる。高濃度のα−トリコサンチンを含む組織は接種後２週間目に収穫できることから、このシステムは、部位特異的突然変異の効果を迅速にスクリーニングするために使用できる。インビボでのHIV 複製の阻害に関与する重要なアミノ酸の同定は、可能性あるエイズ治療用薬剤としてのα−トリコサンチンの効力を改善する一助となるかもしれない。
【０２２５】
以下のプラスミドは、特許手続き及びそれに基づく規制を目的とした微生物の寄託の国際的認知に関するブダペスト条約（ブタペスト条約）の条項の下で米国標準培養収蔵機構（ATCC），Rockuill, MD. USA に寄託され、かくしてブダペスト条約の条項に従って維持され利用可能な状態におかれている。このようなプラスミドの利用可能性は、いかなる政府であれその特許法に従ったその権限の下で許可された権利を侵害して本発明を実施する許可とみなされてはならない。
【０２２６】
寄託された培養には、表示通りのATCC寄託番号が割り当てられた：
プラスミド ATCC番号
pTB2                          75280
本発明は本特許出願において、発明の好ましい実施態様の詳細を参考にしながら開示されてきたが、当業者であれば発明の精神及び添付クレームの範囲内で容易に変更を考えつくと思われることから、この開示は、制限的意味をもたずむしろ例示的意味をもつものであると理解されるべきである。
【０２２７】
参  考  文  献
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【０２４０】
【配列表】
0003545683.tif 000002
0003545683.tif 000003
【化１】
0003545683.tif 000004
【化２】
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【化３】
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【化５】
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【化６】
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【化８】
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【化９】
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【化１５】
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【化１６】
0003545683.tif 000026
0003545683.tif 000027
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に従い調製されたいくつかのベクターおよび制限部位を図解する。Ｕ１は天然植物ウイルスの核酸であり、Ｏは非天然植物ウイルスの核酸であり、そしてハッチングした区域は非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターである。制限部位は次の通りである： X−XhoI,N−NsiI,K−KpnI,S−SplI,B−BamHI,No−NcoI,P−PstI。ハッチングしたボックス（例えば、TB２において）はTMV−O のプロモーター、すなわち、外殻タンパク質の開始コドンの203bp 上流を表し、そして点描ボックスはファージのプロモーターを表す。白抜きボックスはオープンリーディングフレームを表し、そして充実ボックスはクローニングベクターの配列を表す。ベクターは次の通りである：Ａ）およびＢ）pTKU1 、Ｃ）pTMVS3−28、Ｄ）pTB2、Ｅ）pTBN62およびＦ）pTBU5 。
【図２】図２は、本発明に従い感染したＮ．ベンタミアナ(benthamiana) の中のα−トリコサンシン(trichosanthin) の生産のウェスタン分析のオートラジオグラフである。レーンａは分子サイズマーカーであり、レーンｂおよびｃはα−トリコサンシンを生産するように操作した酵母菌からの抽出物であり、そしてレーンｄはＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの抽出物である。
【図３】図３は、α−トリコサンシンの発現ベクターであるpBGC152 を図解する。このプラスミドはTMV U1の 126−、 183−、および30−kDa のオープンリーディングフレーム(ORF) 、ORSVの外殻タンパク質の遺伝子(Ocp) 、SP６プロモーター、α−トリコサンシン遺伝子、およびpBR322プラスミドの一部分を含有する。30ＫのORF の中のTAA 停止コドンには下線が引かれており、そしてバー（｜）は成熟ペプチドからの推定上のシグナルペプチドを分割する。30Ｋのオープンリーディングフレームのマイナス鎖内に位置するTMV U1のサブゲノムのプロモーターは、α−トリコサンシンの発現をコントロールする。サブゲノムの RNAの推定上の転写開始点(tsp) はピリオド（．）で示す。
【図４】図４は、図３に示すプラスミドpBGC152 中のα−トリコサチンをコードするDNA の開始コドン附近の配列を示す。
【図５】図５は、in vivo の pBGC152転写体でトランスフェクションされたＮ．ベンタミアナ(benthamiana) の組織的に感染した葉からのヴィリオンの電子顕微鏡写真を図解する。顕微鏡写真の下部の左隅に位置する黒色のバーの長さは、ほぼ 140nmを表す。
【図６】図６は、接種後２週のトランスフェクションしたＮ．ベンタミアナ(benthamiana) 植物のタンパク質の分析である。ａ、ウェスタンブロット分析。レーン１：200ng のGLQ223；２：50ngのGLQ223；３：pBGC152 転写体で感染したＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの全体の可溶性タンパク質の７μｇ；４：アルキルスパロースFPLCクロマトグラフィーからのピーク画分；５：非感染のＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの全体の可溶性タンパク質の７μｇ；６：非感染のＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの全体の可溶性タンパク質の７μｇおよび 100ngのGLQ223。
【図７】図７は、組み換えα−トリコサンシンの精製のプロフィルである。精製の間の種々の段階からの試料を、12.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分析した。レーン１：アマーシャム(Amersham)の前以て染色した高い範囲の分子量標準；２：精製したGLQ223；３：pBGC152 転写体で感染したＮ．ベンタミアナ(benth- amiana) からの全体の可溶性タンパク質；４：８セファロースのクロマトグラフィーからのピーク画分；５：アルキルスパロースFPLCクロマトグラフィーからのピーク画分。
【図８】図８は、細胞不含ウサギ網状赤血球翻訳アッセイにおけるタンパク質合成の阻止を図解する。50％の阻止のために要求される投与量（ID50）。BGC 152 転写体（黒色の円および三角形、反復１および２）、GLQ223（黒色の正方形) 、およびシクロヘキシイミド（白抜きの円）で感染したＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの精製したα−トリコサンシンを、変化する濃度において、in vitroタンパク質合成を阻止するそれらの能力について分析した。
【図９】図９は、 pBGC152プラスミドの合成を図解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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