(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の一本鎖ヌクレオチド配列であって、その3'末端に予め選択された標的配列と十分に相補的な配列を含み、該標的配列を含む核酸鎖と相補的なヌクレオチド配列の核酸ポリメラーゼによる合成をプライミングすることができる第一のヌクレオチド配列、
（ｂ）第一のヌクレオチド配列の5'末端に位置する第二の一本鎖ヌクレオチド配列、
（ｃ）第二のヌクレオチド配列の5'末端に位置する第三の一本鎖ヌクレオチド配列、および
（ｄ）第三のヌクレオチド配列の5'末端に位置する第四の一本鎖ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
第一のヌクレオチド配列がオリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチドを含み、かつ第四のヌクレオチド配列がオリゴヌクレオチドの5'末端のヌクレオチドを含み、
第一のヌクレオチド配列の多数のヌクレオチドはオリゴヌクレオチドによって形成され得るヘアピンの一部を形成することができず、
該オリゴヌクレオチドは、１つ以上の特定の波長のエネルギーを放出することが可能なエネルギー供与体部分と、放出されたエネルギーを１つ以上の特定の波長で吸収することが可能なエネルギー受容体部分とを有する分子エネルギー輸送対をさらに含み、
該供与体部分が第二のヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合し、かつ該受容体部分が第四のヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合するか、または、該受容体部分が第二のヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合し、かつ該供与体部分が第四のヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合し、
該第四のヌクレオチド配列が、該第二のヌクレオチド配列と該第四のヌクレオチド配列との間に二本鎖を形成できるように該第二のヌクレオチド配列と逆方向に十分に相補的であり、
ヘアピンが形成された場合には、供与体部分が励起されてエネルギーを放出すると受容体部分が供与体部分によって放出されたエネルギーを吸収するように該受容体部分と供与体部分とが十分に近位に存在するよう、ヘアピンが第二および第四のヌクレオチド配列のヌクレオチドを含み、且つ
ヘアピンが形成されない場合には、該供与体部分と受容体部分とが該供与体部分と該受容体部分との間の分子エネルギー輸送を妨害する距離離れており、オリゴヌクレオチドが検出可能なシグナルを放出する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
第一のヌクレオチド配列が第四のヌクレオチドと相補的でない、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチドと相補的でない、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
第一のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチドと相補的でない、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ヘアピンが形成されない場合にオリゴヌクレオチドにより放出される検出可能なシグナルが、ヘアピンが形成される場合にオリゴヌクレオチドにより放出されるシグナルよりも強い、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ヘアピンが形成されない場合にのみ検出可能なシグナルを放出する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
検出可能なシグナルが実質的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
標的ヌクレオチド配列が、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、化学的に合成されたDNA、感染性疾患因子の配列、野生型ヒトゲノム配列、ヒト疾患または障害の存在に関与する変異、または増幅産物である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
供与体部分がフルオロフォアであり、かつ受容体部分がフルオロフォアによって放出された光の消光剤である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
供与体部分が、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、５−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、５−（2'−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、アントラニルアミド、クマリン、ランタニドキレート化合物、テルビウムキレート誘導体、またはリアクティブレッド４（Reactive Red 4）である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
受容体部分が、DABCYL、ローダミン、酪酸ピレン、エオジンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、マラカイトグリーン、またはテキサスレッドである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
供与体部分がフルオレセインであり、受容体部分がDABCYLである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
供与体部分がフルオレセイン誘導体であり、受容体部分がDABCYLである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ただ１つのヘアピンを形成することのできる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ヘアピンが形成される場合には、その後供与体部分が結合したヌクレオチドおよび受容体部分が結合したヌクレオチドの相捕物が５ヌクレオチド離れている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
供与体部分に結合したヌクレオチドおよび受容体部分に結合したヌクレオチドが15〜25ヌクレオチド離れている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
第一のヌクレオチド配列が制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
シグナルが光である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号:1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:1のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:1のヌクレオチドの22位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号:1のヌクレオチド配列からなる、請求項20記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号:13のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:13のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:13のヌクレオチドの20位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号:13のヌクレオチド配列からなる、請求項22記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号:14のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:14のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:14のヌクレオチドの24位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号:14のヌクレオチド配列からなる、請求項24記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号:15のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:15のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:15のヌクレオチドの24位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号:15のヌクレオチド配列からなる、請求項26記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号:16のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:16のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:16のヌクレオチドの22位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号:16のヌクレオチド配列からなる、請求項28記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号:17のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:17のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:17のヌクレオチドの22位に結合している、オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号:17のヌクレオチド配列からなる、請求項30記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号:18のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体が配列番号:18のヌクレオチドの１位に結合し、かつDABCYLが配列番号:18のヌクレオチドの20位に結合しているオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号:18のヌクレオチド配列からなる、請求項32記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
（ａ）ポリメラーゼ、および
（ｂ）請求項１のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項３５】
第一のヌクレオチド配列が第四のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項34記載のキット。
【請求項３７】
第一のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項34記載のキット。
【請求項３８】
ヘアピンが形成されない場合にオリゴヌクレオチドによって放出される検出可能なシグナルが、ヘアピンが形成される場合にオリゴヌクレオチドによって放出されるシグナルよりも強い、請求項34記載のキット。
【請求項３９】
ヘアピンが形成されない場合にのみ、オリゴヌクレオチドが検出可能なシグナルを放出する、請求項34記載のキット。
【請求項４０】
検出可能なシグナルが実質的である、請求項39記載のキット。
【請求項４１】
ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項34記載のキット。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項34記載のキット。
【請求項４３】
ポリメラーゼまたはオリゴヌクレオチドを含まない容器中にリガーゼをさらに含む、請求項34記載のキット。
【請求項４４】
第一および第二のオリゴヌクレオチドを含むキットであって、該第一のオリゴヌクレオチドが請求項１のオリゴヌクレオチドであり、第二のオリゴヌクレオチドが、
（ｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な第五のヌクレオチド配列と、
（ii）第五のヌクレオチド配列の5'末端の第六のヌクレオチドとを含むキット。
【請求項４５】
第一のヌクレオチド配列が第四のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項44記載のキット。
【請求項４６】
第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
第一のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項45記載のキット。
【請求項４８】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項44記載のキット。
【請求項４９】
ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項48記載のキット。
【請求項５０】
第一のオリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項44記載のキット。
【請求項５１】
第二のオリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項44記載のキット。
【請求項５２】
以下の段階を含む、試料中に標的ヌクレオチド配列が存在するか否かを判定する方法：
（ａ）請求項１のオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階、
（ｂ）オリゴヌクレオチドを二本鎖核酸に組み込む段階、ならびに
（ｃ）シグナルが検出される場合は試料中に標的ヌクレオチド配列が存在すると決定され、または、シグナルが検出されない場合は試料中に標的ヌクレオチド配列が存在しないと決定される段階。
【請求項５３】
段階（ｂ）と（ｃ）との間に、増幅反応を行い、これによって試料中に標的ヌクレオチド配列が存在する場合に増幅産物へとオリゴヌクレオチドが組み込まれる段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼを用いて二本鎖核酸に組み込まれる、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
第一のヌクレオチド配列が第四のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチドと相補的でない、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
第一のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチドと相補的でない、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
ヘアピンが形成されない場合にオリゴヌクレオチドによって放出された検出可能なシグナルが、ヘアピンが形成される場合にオリゴヌクレオチドによって放出されたシグナルよりも強い、請求項52記載の方法。
【請求項５９】
オリゴヌクレオチドが、ヘアピンが形成されない場合にのみ検出可能なシグナルを放出する、請求項52記載の方法。
【請求項６０】
検出可能なシグナルが実質的である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
標的ヌクレオチド配列が、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、化学的に合成されたDNA、感染性疾患因子の配列、野生型ヒトゲノム配列、ヒト疾患もしくは障害の存在下で示される変異、または増幅産物である、請求項52記載の方法。
【請求項６２】
供与体部分がフルオロフォアであり、受容体部分がフルオロフォアによって放出された光の消光剤である、請求項52記載の方法。
【請求項６３】
供与体部分が、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、５−カルボキシフルオレセイン、ローダミン、５−（2'−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、アントラニルアミド、クマリン、ランタニドキレート化合物、テルビウムキレート誘導体、またはリアクティブレッド４である、請求項52記載の方法。
【請求項６４】
受容体部分が、DABCYL、ローダミン、酪酸ピレン、エオジンニトロチロシン、エチジウム、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、マラカイトグリーン、またはテキサスレッドである、請求項52記載の方法。
【請求項６５】
供与体部分がフルオレセインであり、受容体部分がDABCYLである、請求項52記載の方法。
【請求項６６】
供与体部分がフルオレセイン誘導体であり、受容体部分がDABCYLである、請求項52記載の方法。
【請求項６７】
ヘアピンが形成される場合は、その後供与体部分が結合するヌクレオチドおよび受容体部分が結合するヌクレオチドの相補物が、５ヌクレオチド離れている、請求項52記載の方法。
【請求項６８】
供与体部分が結合するヌクレオチドおよび受容体部分が結合するヌクレオチドが15〜25ヌクレオチド離れている、請求項52記載の方法。
【請求項６９】
増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、トリアンプリフィケーション、核酸配列を基にした増幅、鎖置換増幅、テロメアリピート増幅、もしくはカスケードローリングサークル型増幅であり；増幅不応性変異システムを用いて行われるか；または、インサイチューで行われる、請求項53記載の方法。
【請求項７０】
段階（ｂ）の前に、試料を亜硫酸水素塩と接触させ、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に転換する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
【請求項７１】
オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項52記載の方法。
【請求項７２】
第一のヌクレオチド配列が制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項52記載の方法。
【請求項７３】
シグナルが光である、請求項52記載の方法。
【請求項７４】
以下の段階を含む、標的ヌクレオチド配列を検出する方法：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列にアニーリングする段階であって、第一のオリゴヌクレオチドが請求項１のオリゴヌクレオチドである段階、
（ｂ）鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いて、第一のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し、伸張された第一鎖を生成させる段階であって、標的ヌクレオチド配列は伸張された第一鎖にアニーリングされている段階、
（ｃ）伸張された第一鎖から標的ヌクレオチド配列を分離する段階、
（ｄ）第二のオリゴヌクレオチドを伸張された第一鎖にアニーリングする段階、
（ｅ）鋳型として伸張された第一鎖を用いて、第二のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し、伸張された第二鎖を生成させる段階であって、伸張された第一鎖は伸張された第二鎖にアニーリングされている段階、ならびに
（ｆ）シグナルを検出し、標的ヌクレオチド配列を検出する段階。
【請求項７５】
段階（ｅ）と（ｆ）との間に、伸張された第一および第二鎖を増幅する段階を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
第一のヌクレオチド配列が第四のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項74記載の方法。
【請求項７８】
第一のヌクレオチド配列が第三のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項74記載の方法。
【請求項７９】
ヘアピンが形成されない場合に第一のオリゴヌクレオチドによって放出される検出可能なシグナルが、ヘアピンが形成される場合に第一のオリゴヌクレオチドによって放出されるシグナルよりも強い、請求項74記載の方法。
【請求項８０】
第一のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンが形成されない場合にのみ検出可能なシグナルを放出する、請求項74記載の方法。
【請求項８１】
検出可能なシグナルが実質的である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
伸張された第一および第二鎖の増幅が、
（ｉ）伸張された第二鎖から伸張された第一鎖を分離する段階、
（ii）第一のオリゴヌクレオチドを伸張された第二鎖にアニーリングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドを伸張された第一鎖にアニーリングする段階、
（iii）鋳型として伸張された第二鎖を用いて第一のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張して別の伸張された第一鎖を生成させ、伸張された第二鎖が別の伸張された第一鎖にアニーリングされ；かつ鋳型として伸張された第一鎖を用いて第二のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張して別の伸張された第二鎖を生成させ、伸張された第一鎖が別の伸張された第二鎖にアニーリングされる段階、ならびに
（iv）段階（ｉ）、（ii）および（iii）を有限回繰り返す段階を含む、請求項75記載の方法であって、
段階（ｉ）において、伸張された第一および第二鎖は、それぞれ、段階（iii）の伸張された第一および別の伸張された第二鎖であるか、または、それぞれ、段階（iii）の別の伸張された第一鎖および伸張された第二鎖である方法。
【請求項８３】
以下の段階を含む、標的ヌクレオチド配列を検出する方法：
（ａ）第一のオリゴヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列にアニーリングする段階であって、第一のオリゴヌクレオチドが、
（ｉ）標的ヌクレオチド配列と相補的な第一のヌクレオチド配列と、
（ii）第一のヌクレオチド配列の5'末端の第二のヌクレオチド配列とを含む段階、
（ｂ）鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いて、第一のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し伸張された第一鎖を生成させる段階であって、標的ヌクレオチド配列は伸張された第一鎖にアニーリングされる段階、
（ｃ）伸張された第一鎖から標的ヌクレオチド配列を分離する段階、
（ｄ）第二のオリゴヌクレオチドを伸張された第一鎖にアニーリングする段階、
（ｅ）鋳型として伸張された第一鎖を用いて、第二のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し、伸張された第二鎖を生成させる段階であって、伸張された第一鎖は伸張された第二鎖にアニーリングされる段階、
（ｆ）伸張された第二鎖から伸張された第一鎖を分離する段階、
（ｇ）伸張された第二鎖に第三のオリゴヌクレオチドをアニーリングする段階であって、第三のオリゴヌクレオチドが請求項１のオリゴヌクレオチドである段階、
（ｈ）鋳型として伸張された第二鎖を用いて、第三のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し、二回伸張された第一鎖を生成させる段階であって、二回伸張された第一鎖は伸張された第二鎖にアニーリングされる段階、
（ｉ）伸張された第二鎖から二回伸張された第一鎖を分離する段階、
（ｊ）第二のオリゴヌクレオチドを二回伸張された第一鎖にアニーリングする段階、
（ｋ）鋳型として二回伸張された第一鎖を用いて、第二のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張し、二回伸張された第二鎖を生成させる段階であって、二回伸張された第一鎖は二回伸張された第二鎖にアニーリングされる段階、および
（ｌ）シグナルを検出し、標的ヌクレオチド配列を検出する段階。
【請求項８４】
段階（ｋ）と（ｌ）との間に、二回伸張された第一および第二鎖を増幅する段階を含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
第三のオリゴヌクレオチドの第一のヌクレオチド配列が第三のオリゴヌクレオチドの第四のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
第三のオリゴヌクレオチドの第一のヌクレオチド配列が第三のオリゴヌクレオチドの第二のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
第三のオリゴヌクレオチドの第一のヌクレオチド配列が第三のオリゴヌクレオチドの第三のヌクレオチド配列と相補的でない、請求項83記載の方法。
【請求項８８】
ヘアピンが形成されない場合に第三のオリゴヌクレオチドによって放出される検出可能なシグナルが、ヘアピンが形成される場合に第三のオリゴヌクレオチドによって放出されるシグナルよりも強い、請求項83記載の方法。
【請求項８９】
第三のオリゴヌクレオチドが、ヘアピンが形成されない場合にのみ検出可能なシグナルを放出する、請求項83記載の方法。
【請求項９０】
検出可能なシグナルが実質的である、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
二回伸張された第一および第二鎖の増幅が、
（ｉ）二回伸張された第二鎖から二回伸張された第一鎖を分離する段階、
（ii）第二のオリゴヌクレオチドを二回伸張された第一鎖にアニーリングし、かつ第三のオリゴヌクレオチドを二回伸張された第二鎖にアニーリングする段階、
（iii）鋳型として二回伸張された第一鎖を用いて第二のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張して別の二回伸張された第二鎖を生成させ、二回伸張された第一鎖が別の二回伸張された第二鎖にアニーリングされ；かつ鋳型として二回伸張された第二鎖を用いて第三のオリゴヌクレオチドの3'末端を伸張して別の二回伸張された第一鎖を生成させ、二回伸張された第二鎖が別の二回伸張された第一鎖にアニーリングされる段階、ならびに
（iv）段階（ｉ）、（ii）および（iii）を有限回繰り返す段階を含む、請求項83記載の方法であって、
段階（ｉ）において、二回伸張された第一および第二鎖は、それぞれ、段階（iii）の二回伸張された第一鎖および別の二回伸張された第二鎖であるか、または、それぞれ、段階（iii）の別の二回伸張された第一鎖および二回伸張された第二鎖である方法。
【発明の詳細な説明】
1.緒言
本発明は、分子エネルギー輸送（MET）標識で検出可能に標識された核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅産物の検出法にも関する。さらに本発明は、増幅産物の採取による汚染の可能性を大きく低下させ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、トリアンプリフィケーション、および他の増幅系を含む、多くの核酸配列増幅法に適応可能な、迅速で、感受性が高く、信頼できる増幅産物検出法に関する。
2.発明の背景
2.1.  蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）
分子エネルギー輸送（MET）は、供与体分子と受容体分子との間をエネルギーが非放射的に通過するプロセスである。蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）は、ある種のMETである。FRETは特定の化学化合物の特性から生まれ；それらを特定の光の波長に暴露することによって励起させると、異なる波長の光を放出する（すなわち蛍光を発する）。そのような化合物はフルオロフォアと呼ばれている。FRETでは、エネルギーは、フルオロフォアである供与体分子と受容体分子との間の長距離（10〜100Å）にわたって非放射的に通過する。供与体は、光子を吸収し、このエネルギーを非放射的に受容体に輸送する（フェルスター
0003597869.tif 000002
1949、Z.Naturforsch.A4:321〜327;クレッグ（Clegg）、1992、Methods  Enzymol.211:353〜388）。
励起および放出スペクトルが重なる２つのフルオロフォアが非常に近位に存在する場合、１つのフルオロフォアを励起すると、それによって吸収される波長での光の放出が起こり、第二のフルオロフォアを刺激してそれに蛍光を発生させる。言い換えれば、第一の（供与体）フルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴誘発双極子−双極子相互作用によって、隣接する第二の（受容体）フルオロフォアに輸送される。その結果、供与体分子の寿命は減少してその蛍光は消光するが、受容体分子の蛍光強度は増強され、脱分極する。供与体の励起状態エネルギーを非フルオロフォア受容体に輸送すると、供与体の蛍光は消光して、その後受容体による蛍光の放出も認めない。このように、受容体は消光剤として機能する。
蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）に関与しうる一対の分子はFRET対と呼ばれる。エネルギー輸送を起こすために、供与体および受容体は典型的に、非常に近位に存在しなければならない（70〜100Åまで）（クレッグ（Clegg）、1992、Methods Enzymol.211:353〜388;セルビン（Selvin）、1995、Methods  Enzymol.246:300〜334）。エネルギー輸送の効率は、受容体と供与体分子の距離によって急激に低下する。フェルスター
0003597869.tif 000003
1949、Z.Naturforsch.A4:321〜327）によれば、エネルギー輸送の効率はＤ×10-6に比例し、ここで、Ｄは供与体と受容体との距離である。実際に、これは、約70Åの距離までであればFRETが最も効率よく起こりうることを意味している。
FRETにおいて一般的に用いられる分子には、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（FAM）、2'7'−ジメトキシ−4'5'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（R6G）、N,N,N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX）、４−（4'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）、および５−（2'−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（EDANS）が含まれる。フルオロフォアが供与体であるか受容体であるかはその励起および放出スペクトルによって決まり、それを有するフルオロフォアを組み合わせる。例えば、FAMは波長488nmの光で最も効率的に励起され、500〜650nmのスペクトルの光で消光し、最大放出は525nmである。FAMはJOE、TAMRA、およびROX（その全てが514nmで最大励起を有する）と共に用いるのに適した供与体フルオロフォアである。
1970年代に、FRET標識は特異的抗原を検出するために用いられる免疫蛍光アッセイに組み込まれた（ウルマンら（Ullman）、米国特許第2,998,943号；第3,996,345号；第4,160,016号；第4,174,384号；第4,199,599号）。後に、1980年代初期に、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションへのエネルギー輸送の応用に関するいくつかの特許がヘラー＆共同研究者によって受領された（米国特許第4,996,143号、第5,532,129号および第5,565,322号）。ヨーロッパ特許出願第82303699.1号（公開番号欧州特許第0 070 685 A2号、1983年１月26日付）「非放射活性エネルギー輸送による相同核酸ハイブリダイゼーション診断」において、発明者らは２つのオリゴヌクレオチド、すなわち１つは供与体フルオロフォア、もう一つは受容体を含むオリゴヌクレオチドによって独特の１本鎖ポリヌクレオチド配列を検出することができると主張した。いずれのオリゴヌクレオチドも一定の距離にある解析DNAの隣接する断片とハイブリダイズするため、エネルギー輸送を検出することができる。
「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのための蛍光ストロークシフトプローブ」と題するヨーロッパ特許出願第86116652.8号（公開番号欧州特許第0 229 943 A2号、1987年７月29日付；「EP'943」）において、ヘラー（Heller）らは同じ概要を提唱したが、最大FRETを起こす供与体と受容体の間の特定の距離においてであった。彼らはまた、供与体と受容体の標識が同じプローブ上に存在することができることを開示している（例えば、EP'943:請求項２および図１参照）。
エネルギー輸送に関する同様の出願は、核酸ハイブリダイゼーションの検出方法においてカルデュロら（Cardullo、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790〜8794）によって開示された。フルオレセイン（供与体）およびローダミン（受容体）を相補的オリゴデオキシヌクレオチドの5'末端に接着させる。ハイブリダイゼーション時に、FRETを検出してもよい。言い換えれば、FRETは２つのフルオロフォア標識オリゴヌクレオチドがより長い非標識DNAとハイブリダイゼーションした後に起こった。このシステムは米国特許出願第661,071号およびPCT出願PCT/US92/1591、1992年９月３日付の公開番号WO 92/14845（「蛍光共鳴エネルギー輸送を用いた嚢胞性繊維症および他の遺伝子疾患の診断」と題する「PCT'845」）の主題である。PCT'845はハイブリダイゼーションによる嚢胞性繊維症に関連したヒト染色体DNAにおける異常の検出法を開示している。この方法において用いられるFRETシグナルは、ヘラーら（Heller）が開示した方法と類似の方法で産生されている（PCT'845図１参照）。その他の特許は、DNAの特定の部位間の距離の推定法（オザキ＆マクローリン（Ozaki and McLaughlin）、1992、Nucl.Acids Res.20:5205〜5214）、４方向DNA接合構造の解析法（クレッグら（Clegg）、1992、Biochem.31:4846〜4856）、およびDNAのらせん幾何学の観察法（クレッグら（Clegg）、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2994〜2998）におけるエネルギー輸送の利用を開示している。
2.2.  他のタイプの分子エネルギー輸送（MET）
第2.1章で述べたように、蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）は１つのタイプの分子エネルギー輸送（MET）である。FRETでは、エネルギー供与体は蛍光性であるがエネルギー受容体は蛍光性または非蛍光性であってもよい。蛍光性エネルギー受容体の場合、エネルギー輸送の結果供与体の放出の減少または受容体の放出の増加が起こる（クレッグ（Clegg）、1992、Methods Enzymol.211:353〜388;セルビン（Selvin）、1995、Methods  Enzymol.246:300〜334;ストライヤー（Stryer）、1978、Ann.Rev.Biochem.47:819〜846）。非蛍光性の受容体、例えば発色団または消光剤の場合、エネルギー輸送の結果、供与体の放出の増加が起こる（マタヨシら（Matayoshi）、1990、Science 247:945〜958;チアギ＆クレイマー（Tyagi and Kramer）、1996、Nature  Biotech.14:303〜309;スタインバーグ（Steinberg）、1991、Ann.Rev.Biochem.40:83〜114）。
もう一つの型のMETにおいて、エネルギー供与体は非蛍光性、例えば発色団で、エネルギー受容体は蛍光性である。この場合、エネルギー輸送により、受容体の放出の増加が起こる（ヘラー（Heller）、米国特許第5,532,129号および第5,565,322号；スタインバーグ（Steinberg）、1991、Ann.Rev.Biochem.40:83〜114）。
さらにもう一つ型のMETにおいて、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光、化学発光、電気化学発光で、受容体は蛍光性である。この場合、エネルギー輸送により、受容体の放出の増加が起こる（セルビン（Selvin）、1995、Methods Enzymol.246:300〜334、ヘラーヨーロッパ特許公開番号0070685A2、1993年１月26日付；シュッツバンク＆スミス（Schutzbank and Smith）、1995、J.Clin.Microbiol.33:2036〜2041）。そのようなエネルギー輸送システムの例は、セルビン（前記）によって記述されており、蛍光ランタニドキレート、例えば、テルビウムキレートまたはランタニドキレートが供与体で、フルオレセイン、ローダミンまたはCY−５のような有機色素が受容体である。この戦略を用いて特に効率のよいMETシステムには、供与体としてのテルビウムおよび受容体としてのフルオレセインまたはローダミン、および供与体としてのユーロピウムおよび受容体としてのCY−５が含まれる。逆の状況、すなわち供与体が蛍光性で、受容体が発光性の場合を「感作発光」と呼び、エネルギー輸送により受容体の放出の増加が起こる（デクスター（Dexter）、1953、J.Chem.Physics 21:836〜850）。
理論的に可能な型のMETにおいて、エネルギー供与体は発光性であってもよく、エネルギー受容体は非蛍光性であってもよい。この場合は、エネルギー輸送により供与体の放出の減少が起こる。
2.3.  核酸増幅のモニター法
本発明の前まで、遺伝子増幅産物を直接検出するためにエネルギー輸送を応用することは試みられていない。先行技術の、エネルギー輸送を用いる増幅反応のモニター法では、標識は増幅産物に組み込まれていない。その結果、これらの方法は増幅反応の間接的な測定に依存していた。
一般に用いられる核酸増幅産物の検出法は、非反応プライマーからの増幅産物の分離を必要とする。これは、大きさの差に基づいてプライマーから増幅産物を分離するゲル電気泳動を用いることによって、または遊離のプライマーを洗い流すことによって産物を固定化することによって行われる。しかし、プライマーを先に分離せずに増幅プロセスをモニターする３つの方法が記述されている。それらの全てはFRETに基づいており、それらのいずれも増幅産物を直接検出しない。その代わりに３つの方法は全て増幅に関連した何らかのイベントを検出する。その理由から、それらは、バックグラウンドが高いという問題を伴い、下記に考察するように定量的でない。
ワン（Wang）が記述した１つの方法（米国特許第5,348,853号；ワンら（Wang）、1995、Anal.Chem.67:1197〜1203）は、エネルギー輸送がプローブ上の２つのフルオロフォアの間に起こるエネルギー輸送システムを用いている。この方法では、増幅された分子の検出は、分離段階を必要とすることなく増幅反応管の中で起こる。この方法により、モノ標識プライマーに依存する方法より高い感受性が得られる。
ワンら（Wang）の方法では、リバースプライマーと相補的な「エネルギーシンク」オリゴヌクレオチドを用いる。「エネルギーシンク」およびリバースプライマーオリゴヌクレオチドは供与体および受容体標識をそれぞれ有する。増幅の前に、標識したオリゴヌクレオチドは、エネルギー輸送が自由に起こるプライマー二本鎖を形成する。次に標的鎖の１つを有意に過剰産生する前に、非対象PCRをその遅い対数期に実施する。
過剰産生された標的鎖と相補的なプライマー二本鎖を加えて、過剰なプライマーと共に半ネスト状反応を開始させる。半ネスト状増幅が進行するにつれて、プライマー二本鎖は、標的配列が複製されるにつれて解離し始める。その結果、エネルギー輸送のために形成されたフルオロフォアは互いに分離し、プライマー二本鎖の全てにおいて既に確立されたエネルギー輸送プロセスが、増幅プロセスに関係するプライマーに関して破壊される。測定した蛍光強度は各増幅サイクルの最後に残ったプライマー二本鎖の量に比例する。蛍光強度の減少は、最初の標的容量および増幅の程度に正比例する。
しかし、この方法は増幅産物を検出しないが、その代わりに、「エネルギーシンク」オリゴヌクレオチドからプライマーの解離を検出する。このように、この方法は、放出の減少の検出に依存する；反応前後のシグナルの信頼できる鎖を得るためには、標識されたプライマーの有意な部分を利用しなければならない。この問題はワンら（Wang）によって明らかに言及されており、彼は初回標的濃度を増加させ、その結果標識プライマーの使用を増加させると思われる予備的な増幅段階（非対称PCR）を加えることによって代償しようと試みたが、これもプロセスを複雑にする。
プライマーおよび産物を先に分離することなく増幅産物を検出する第二の方法は、5'ヌクレアーゼPCRアッセイである（登録商標タグマンアッセイとも呼ばれる）（ホランドら（Holland）、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276〜7280;リーら（Lee）、1993、Nucleic Acids.Res.21:3761〜3766）。このアッセイは、増幅反応の際の、二重標識蛍光発生プローブ（「タグマン」プローブ）のハイブリダイゼーションおよび開裂によって、特異的なPCR産物の蓄積を検出する。蛍光発生プローブは蛍光リポーター色素および消光色素の双方で標識したオリゴヌクレオチドを含む。PCRの際に、このプローブが増幅されるべき部分とハイブリダイズするならば、およびハイブリダイズする場合に限り、このプローブはDNAポリメラーゼの5'−エキソヌクレアーゼ活性によって開裂される。プローブの開裂によりリポーター色素の蛍光強度は増加する。
タグマンアッセイにおいて、供与体および消光剤は、フルオロフォアと消光剤の間で行われる5'−3'加水分解の必要条件は、これらの２つの部分が互いに近すぎない場合に限って満たされるため、プローブの3'−および5'−末端に存在することが好ましい（リアミチェフら（Lyamichev）、1993、Science 260:778〜783）。しかし、エネルギー輸送の効率はリポーターと消光剤との間の距離の10のマイナス６乗で減少するため、この必要条件はアッセイの重大な欠点である。言い換えれば、タグマンアッセイでは、最も効率のよい消光を得るために消光剤がリポーターに十分近づくことができない。結果として、非ハイブリダイズプローブからのバックグランド放出はかなり高くなりうる。
さらに、タグマンアッセイは、増幅プライマーを標識していないため、増幅産物を直接測定しない。このアッセイは増幅に関連したイベント、すなわちプライマー配列の間にある標的DNAとハイブリダイズするプローブの加水分解を測定する。その結果としてこのアッセイ法は重要な問題を伴う。
第一に、ハイブリダイゼーションは、標識したオリゴヌクレオチドが大量に存在するのでなければ定量的とはならない。しかし、そうすればバックグラウンドが高くなる（消光が定量的でないため）。さらに、標的DNAの中心部とハイブダイズするオリゴヌクレオチドが大量であれば、PCR効率は低下するであろう。さらに、DNAにハイブリダイズした必ずしも全てのオリゴヌクレオチドが5'−3'エキソヌクレアーゼ加水分解を受けるわけではない：いくつかは加水分解を受けずに置換され、その結果シグナルを喪失する。
エネルギー輸送の使用に依存する増幅産物のもう一つの検出法は、チアギ＆クレイマー（Tyagi and Kramer、1996、Nature Biotech.14:303〜309）が記述した「ビーコンプローブ」法で、これもまた、リザルディら（Lizardi）の米国特許第5,119,801号および第5,312,728号の主題である。この方法は、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーションプローブの一端（5'または3'末端のいずれか）に、供与体フルオロフォアが存在し、もう一端に受容体部分が存在する。チアギ＆クレイマー（Tyagi and Kramer）法の場合には、この受容体部分は消光剤で、すなわち受容体は供与体によって放出されたエネルギーを吸収するが、それ自身は発光を発しない。このように、ビーコンがオープン立体構造である場合、供与体フルオロフォアの蛍光は検出可能であるが、ビーコンがヘアピン（閉鎖）立体構造であれば、供与体フルオロフォアの蛍光は消光する。PCRにおいて用いると、PCR産物の鎖の１つとハイブリダイズする分子ビーコンプローブは「オープン立体構造」であり、蛍光が検出されるが、ハイブリダイズされないまま残っているプローブは蛍光を発しないであろう（チアギ＆クレイマー（Tyagi and Kramer）、1996、Nature  Biotech.14:303〜306）。その結果、蛍光の量はPCR産物の量が増加すると増加し、このようにPCRの進行の手段として用いてもよい。
しかし、この方法はプライマー配列の間にある鋳型とプローブとのハイブリダイゼーションに基づいているため、これに関連する多くの問題があり、そのいくつかはタグマン法に関連して先に記述した問題と同様である。第一に、特に増幅産物がビーコンプローブよりはるかに長い場合、ビーコンプローブが二本鎖PCR産物の１つの鎖に定量的にハイブリダイズする可能性は低い。ハイブリダイズされたこれらのプローブも短時間で第二のDNA鎖に置換されることがある；その結果、この方法は定量的となり得ない。
ビーコンプローブの濃度を増加させることによってハイブリダイゼーション効率を増加させようとしても、反応の際に、ハイブリダイズしたビーコンを置換するためにDNAポリメラーゼが必要となり、これが重合速度を減少させるため、増幅効率は減少するであろう。過剰なプローブもまた、バックグラウンドを増加させるであろう。さらに、増幅産物とビーコンプローブとの間の比は増幅が進行するにつれて変化し、ハイブリダイゼーションの効率も変化するであろう。このように、増幅した産物の検出は定量的でない可能性がある。
したがって、先行技術の増幅産物の検出法における欠点を考慮すると、当技術分野において、増幅産物を迅速、感度よく、信頼性よく、および定量的に検出する改善された方法が必要であることは明らかである。本発明は、エネルギー輸送標識で検出可能に標識した核酸増幅プライマーを提供することによってこの問題を解決する。同様に、核酸配列の増幅のための多くの方法に適応可能で、および増幅産物採取の際に汚染する可能性を大きく低下させる、増幅産物の検出法を提供することによって、この問題を解決する。
本明細書における参考文献の引用は、それらの参考文献が本発明に先行する技術であるとの認可であると見なすべきではない。
3.発明の概要
本発明は、分子エネルギー輸送（MET）標識で検出可能に標識された核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドに関連する。MET対の供与体および／または受容体部分を含む本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを、増幅産物がMET対の供与体および受容体部分の双方を含むように、増幅反応の増幅産物の中に組み入れる。増幅産物が二本鎖であれば、増幅産物に組み入れられるMET対は同じ鎖上にあってもよく、増幅がトリアンプリフィケーションであれば、反対の鎖上にあってもよい。増幅に用いられるポリメラーゼが5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を有する特定の例では、MET対部分の１つはこのエキソヌクレアーゼ活性による増幅産物の集団の少なくとも一部から開裂してもよい。そのようなエキソヌクレアーゼ活性は発明の増幅法に有害ではない。
本発明はまた、本発明のこれらの標識オリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅産物を検出する方法に関する。本発明はさらに、増幅産物採取の際の汚染の可能性を大きく少させ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、トリアンプリフィケーション、およびその他の増幅システムを含む核酸配列の多くの増幅法に適応可能な、迅速、高感度、かつ信頼性のある増幅産物検出法に関する。
本発明の核酸増幅オリゴヌクレオチドは、供与体部分と受容体部分との間の分子エネルギー輸送（MET）の原理を利用している。好ましい態様において、METは、その中でオリゴヌクレオチドが供与体および受容体部分で標識され、供与体部分から放出された蛍光エネルギーが受容体部分によって吸収されるように供与体部分はフルオロフォアであり、受容体部分はフルオロフォアであってもよい、蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）である。本発明の一つの態様において、受容体部分は供与体から異なる波長で吸収されたエネルギーを放出するフルオロフォアである；次に、増幅反応の進行を評価するために受容体の放出を測定してもよい。もう一つの態様において、受容体部分は消光剤である。
好ましい態様において、増幅プライマーは供与体および受容体部分を共に含むヘアピンプライマーで、受容体部分が供与体の蛍光を消光するように形成される。プライマーを増幅産物に組み入れてその立体配置が変化し、消光が消失する場青、供与体部分の蛍光を検出してもよい。
一つの態様において、本発明は、その中でプライマーが増幅産物に組み入れられない場合にMETが起こる、ヘアピン構造を形成する核酸増幅プライマーを提供する。好ましい態様において、プライマーを増幅産物に組み入れない場合、プライマーは、その中で供与体フルオロフォアのエネルギーが非蛍光性フルオロフォアによって消光されるヘアピン構造を形成する。
もう一つの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを増幅産物に組み入れた場合にMETが起こるように、直鎖状であるオリゴヌクレオチド（非二本鎖）ならびに供与体部分および受容体部分で別々に標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドよびブロッキングオリゴヌクレオチドに相補的なリバースプライマーは、トリアンプリフィケーション反応においてそのように標識することができる。
さらにもう一つの態様において、供与体部分および受容体部分は、増幅反応において用いられる１本鎖の直鎖状オリゴヌクレオチド上に存在する。
本発明はまた、増幅産物を直接検出する方法も提供する。この改善された技法は２つの主要な必要条件を満たす。第一に、それは組み入れられないオリゴヌクレオチドを先に分離することなく増幅産物の検出を可能にする。第二に、標識オリゴヌクレオチドを産物に組み入れることによって、増幅産物の直接検出が可能となる。
本発明は、組み入れられないオリゴヌクレオチドを増幅産物から分離する代わりに、先行技術のアプローチのように、残りの遊離のオリゴヌクレオチドからのシグナルが、以下の方法の１つ（以上）において消失する、標識オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド）の組み込みを通じて増幅産物を直接検出する方法を提供する：
ａ）3'−5'エキソヌクレアーゼによる処置；
ｂ）プライマーオリゴヌクレオチド二本鎖が解離し、その結果としていかなるシグナルも産生しない温度まで増幅産物を加熱すること；または
ｃ）供与体および受容体部分の双方によって標識され、およびプライマーが増幅産物に組み込まれない場合に限り、供与体から受容体へのエネルギー輸送が起こるヘアピン構造を形成することができるプライマーの使用。
さらなる態様において、本発明は反応管を開けることなく検出を行うことのできる増幅産物の直接検出法を提供する。この態様の「閉鎖試験管」形式により、多くの応用においてPCRの受容を遅らせる増幅産物採取の際の汚染の可能性が大きく減少する。閉鎖試験管法はまた、試料の処理量が高く、完全に自動化してもよい。本発明はまた、核酸増幅産物の検出または測定のためのキットに関する。該キットは、増幅されるべき核酸の存在が疾患または障害の有無と相関する診断キットであってもよい。
3.1.  定義
本明細書で用いられるように、以下の用語は略語で示す。
ARMS、増幅不応性変異システム
ASP、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応
bp、塩基対
CRCA、カスケードローリングサークル増幅
DABまたはDABCYL、４−（4'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸
EDANS、５−（2'−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸
FAMまたはFlu、５−カルボキシフルオレセイン
FRET、蛍光共鳴エネルギー輸送
JOE、2'7'−ジメトキシ−4'5'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン
HPLC、高速液体クロマトグラフィー
MET、分子エネルギー輸送
NASBA、核酸配列に基づく増幅
PSA、前立腺特異的抗原
Rhod、ローダミン
ROX、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
R6G、６−カルボキシローダミン
SDA、鎖置換増幅
TAMRA、N,N,N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン
TRAP、テロメアリピート増幅プロトコル。
4.図面の説明
本発明は、以下の発明の詳細な説明、発明の特異的な態様の実施例、および、以下に説明する添付図面を参照することによって、より完全に理解することができよう。
図1A〜Ｂは、本発明のヘアピンプライマーの構造の概要を、（Ａ）閉じた状態（消光）、および（Ｂ）開いた状態（発光シグナル）で図示したものである。○、供与体フルオロフォア、●、消光物質フルオロフォア。
図２は、使用されるDNAポリメラーゼが5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているPCRからの増幅産物を直接測定するためのヘアピンプライマーの使用の概要を図示している。（ａ）および（ｂ）、増幅すべき標的配列の相補鎖；○、供与体フルオロフォア、●、消光物質フルオロフォア;F、フォワードプライマー;R、リバースプライマー。
図３（段階Ａ〜Ｄ）は、使用されるDNAポリメラーゼが5'−3'エキソヌクレアーゼ活性をもつPCRからの増幅産物を図示している。（ａ）および（ｂ）、増幅すべき標的配列の相補鎖；○、供与体フルオロフォア、●、消光物質フルオロフォア;F、フォワードプライマー;R、リバースプライマー。
図４は、ユニバーサルヘアピン（配列番号:2）に連結した、選択された標的配列（配列番号:1）の図解例を提示している。（ｄ）は、８〜40ヌクレオチドの、好ましくは、増幅すべき標的核酸配列に相補的な〜15ヌクレオチドの選ばれたプライマー配列である。（d'）は、選択されたプライマー配列の5'付着末端である。付着末端は、１〜10ヌクレオチド、好ましくは、３〜４ヌクレオチドであり、ユニバーサルヘアピンの付着末端（a'）に相補的である。（ｂ）は、ヘアピンが「開いた」形状にあるとき、供与体（Ｆ、FAM）と消光物質（Ｄ、DABCYL）との間が15〜25ヌクレオチド、好ましくは、20ヌクレオチドの距離になるのに十分な長さのユニバーサルプライマー上のループである。（ａ）と（ｃ）は、ユニバーサルプライマーのステムの二本鎖である。選択されたプライマー配列をユニバーサルプライマーに連結させると、消光物質（DABCYL）は、3'末端の内側にあるヌクレオチド上に位置することになる。供与体（FAM）は、5'末端（図示されている）のヌクレオチド、または5'末端側の内側にあるヌクレオチド上に位置していよう。ただ一つ必要なのは、ヘアピンが「閉じた」（「サイレントな」）コンフォメーションをとるときに、供与体と消光物質とが十分に近接していて、消光することが可能になっていることである。
図５は、PCRにおけるFRET供与体−受容体で標識したヘアピンプライマーの使用の概要を図示している。サイクル１〜４の詳細な説明については、5.2.1節を参照のこと。
図６は、トリアンプリフィケーションにおけるFRET供与体−受容体で標識したヘアピンプライマーの使用の概要を図示している。トリアンプリフィケーションのこの態様は、PCRとは異なり、第三のオリゴヌクレオチド（「ブロッカー」）をヘアピンプライマーを伸長させた先に連結させる。PCRで生じるものではあるが、蛍光シグナルは、複製の結果として発生する。
図７は、それぞれFRET部分で標識された２種類の直鎖状のプライマーを用いた概要図を示している。BL、ブロッカー;R、リバースプライマー;F、フォワードプライマー；■、DNAポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長、または、3'−5'エキソヌクレアーゼによるブロッカーの3'末端の加水分解を防止することができる市販の3'修飾基;D、供与体フルオロフォア;A○、受容体フルオロフォア。
図8A〜Ｂは、トリアンプリフィケーションの過程における、（Ａ）3'−5'エキソヌクレアーゼの効果、および（Ｂ）取り込まれなかったFRET標識プライマーに対する、温度上昇の効果を示している。BL、ブロッカー;R、リバースプライマー;F、フォワードプライマー；■、DNAポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長、または、3'−5'エキソヌクレアーゼによるブロッカーの3'末端の加水分解を防止することができる市販の3'修飾基;D、供与体フルオロフォア;A○、受容体フルオロフォア。
図９は、塩基配列に基づく増幅（NASBA）におけるヘアピンプライマーの使用の概要を図示している。NASBAは、同じ温度での逆転写とRNA転写反応との連続的なサイクルに依存している。段階１〜９の詳細な説明については、5.2.3節を参照のこと。
図10は、二本鎖DNA標的のストランド置換増幅（SDA）におけるヘアピンプライマーの使用の概要を図示している。プライマー１と２は、それぞれ別のフォワードプライマーとリバースプライマーである。SDAは、同じ温度でのニッキングと重合／置換の段階を連続して繰り返すことによる。段階１〜４の詳細な説明については、5.2.4節を参照のこと。pol、ポリメラーゼ；リストリクターゼ、制限酵素。
図11A〜Ｂは、「密封チューブ」方式における、２室増幅チューブを図示している。このチュープは、増幅を行った後に、チューブを開くことなく、望ましいときにだけ逆転させ（図11B）て、3'−5'エキソヌクレアーゼを増幅産物と混合するのに用いることができる（12節、実施例６を参照のこと）。
図12は、12節で提供されている配列をもつヘアピンプライマーを用いた実施例以外の、すべての実施例で説明されている、ヒト前立腺特異的な抗原（PSA）DNAの増幅で用いられた鋳型二本鎖の部位（上の鎖：配列番号:3と配列番号:4;下の鎖：配列番号:8と配列番号:9）、およびPSA−Ｉ（配列番号:5）、PSA−Ｐ（配列番号:6）、ならびにPSA−Ｂ（配列番号:7）のオリゴヌクレオチドを図示している。
図13A〜Ｃ。図13Aは、７節（実施例１）で説明されている実験において用いられたPCR増幅法の概要を図示している。図13Aの左側は、７節で説明されている実験で用いられたPCR増幅の方法の概略を示したものである。図13Aの右側は、修飾されていないリバースプライマーを用いたPCR増幅の方法を示したものである。結果は、添付した変性６％ポリアクリルアミドゲル（図13B）とアガロースゲル（図13C）に示されている。図13Bは、非修飾のリバースプライマー（レーン１）、またはローダミンで修飾されたリバースプライマー（レーン２）を用いたとき、［32P］標識されたフォワードプライマーによって増幅されたDNA鎖のサイズを比較している。図13は、非修飾のリバースプライマー（レーン１）、またはローダミンで修飾されたリバースプライマー（レーン２）によって得られた二本鎖PCR産物の量を比較したものである。
図14A〜Ｂ。図14Aは、８節（実施例２）で用いられた実験方法の概要を図示している。結果は、添付した変性６％ポリアクリルアミドゲル（図14B）に示されている。ゲルのレーン１は、取り込まれた［32P］標識されたリバースプライマーと、ローダミン標識されたリバースプライマーとによって増幅されたDNAの鎖を表しており、一方、レーン２は、取り込まれた［32P］標識されたフォワードプライマー（Ｆ）によって増幅されたDNAの鎖を表している。
図15A〜Ｂ。図15Aは、９節（実施例３）で用いられた実験方法の概要を図示している。結果は、添付した変性15％ポリアクリルアミドゲル（図15B）に示されている。ゲルのレーン１は、［32P］およびローダミンで標識したリバースプライマーを示しており、レーン２〜４は、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性をもつT4DNAポリメラーゼと、２分間（レーン２）、５分間（レーン３）、および15分間（レーン４）インキュベートした後の［32P］およびローダミンで標識したリバースプライマーを示している。
図16は、ヌクレアーゼ処理後のFRETによる、増幅産物の検出を示している（10節、実施例４）。発光スペクトラム１は、鋳型DNAとエキソヌクレアーゼ処理によるトリアンプリフィケーションの後に得られた。ペクトラム２は、鋳型DNAとエキソヌクレアーゼ処理のない（DNA対照のない）トリアンプリフィケーションの後に得られた。
図17A〜Ｂは、鋳型DNAを入れない（Ａ）、または鋳型DNAを入れた（Ｂ）トリアンプリフィケーションの後のFRETに対する、温度上昇（75℃）の効果を示している（11節、実施例５）。
図18A〜Ｂ。図18Aは、ヘアピンプライマー（配列番号:10）の上流にあるPSA cDNAの構造を描いたものである。標的DNAに相補的な配列部分を太字で示してある。図18Bは、DABCYL部分の不在下（１）および存在下（２）で、フルオロセインで標識したヘアピンプライマーの発光スペクトラムを示している。40nMのオリゴヌクレオチド試料0.5mlから得られたスペクトラムを、488nmの励起波長を用いて、6.4節で述べたようにして測定した。
図19は、ヘアピンプライマーによる増幅効率を示している。増幅産物を、商標登録MDEゲルで分離した（FMCバイオプロダクツ社（FMC Bioproducts）、メリーランド州ロックランド）。エチジウムブロマイド染色ゲルが示されている。レーン１〜３は、非標識の対照用直鎖プライマー（レーン１）、FAM−ヘアピンプライマー（レーン２）、およびFAM/DABCYL−ヘアピンプライマー（レーン３）による10-9M PSA cDNAの増幅産物を示している。レーン４〜６は、対照用プライマー（レーン４）、FAM−ヘアピンプライマー（レーン５）、およびFAM/DABCYL−ヘアピンプライマー（レーン６）による10-11M PSA cDNAの増幅産物を示している。レーンＭには、100bpのマーカー（ギブコBRL社（Gibco BRL））を含んでいる。
図20A〜Ｂは、それぞれ、ヘアピンプライマー存在下でのPCR増幅の概略と、その結果とを示している。２つのプライマー、FAMとDABCYLによって標識した上流のヘアピンプライマー、および、5'末端上に32Pで標識した下流プライマーによって、PSA cDNAのPCR増幅を行った（図20A）。ヘアピン構造をもたない上流プライマーを対照として用いた。ヘアピンプライマーの構造は、図18Aで示されており、通常のプライマー配列が、12.3節に示されている。図20Bは、合成されたPCR産物のサイズを示すオートラジオグラムである。［32P］で標識したPCR産物の鎖を、非標識の対照用直鎖プライマー（レーン１）、またはFAM/DABCYL標識したヘアピンプライマー（レーン２）の存在下で合成し、変性６％ポリアクリルアミドゲルで解析した。
図21A〜Ｂ。図21Aは、FAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーで行った増幅反応の蛍光スペクトラムを示している。FAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーの構造が図18Aに示されており、通常の下流プライマーの配列が12.3節に示されている。スペクトラム１〜６は、０サイクル（１）、20サイクル（２）、25サイクル（３）、30サイクル（４）、35サイクル（５）、または40サイクル（６）後の増幅されたPSA cDNAの蛍光強度を示している。図21Bは、サイクル数に対してプロットされた、増幅反応混合液の蛍光強度と、PCR産物に取り込まれた［32P］標識プライマーの画分を示す。PCR産物への［32P］標識プライマーの取り込みが、６％変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって判定し、ホスフォルイメージャー（Phosphor Imager）を用いて定量した。
図22は、ヘアピンプライマーによるPCRの感度を示したものである。スペクトラム１〜６は、各反応において、０個（１）、10個（２）、102個（３）、103個（（４）、104個（５）、105個（６）または106個（７）の分子のクローニングされたPSA cDNAを、鋳型DNAとして、40サイクルのPCRに用いたときの増幅結果を示している。FAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーの構造が図18Aに示されており、通常の下流プライマーの配列が12.3節に示されている。
図23は、ヘアピンプライマーで合成されたPCR産物の可視蛍光を示している。106個（チューブ１）、104個（チューブ２）、103個（チューブ３）、および０個（チューブ４）の分子のクローニングされたPSA cDNA鋳型を、FAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーによる、40サイクルのPCRのための鋳型として用いた。UVトランスイルミネーター画像解析システムを用い、0.2mlの薄壁PCRチューブの中で、DNA蛍光を可視化した。
図24A〜Ｇは、異なったFAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーによって増幅されたPSA cDNAの蛍光強度を示している（図24A〜Ｇは、それぞれ、配列番号:13〜18、および25に対応している）。すべてのプライマーには、3'のステム配列とループの一部である、3'の一本鎖プライミング配列からなる、標的に相補的な、少なくとも18ヌクレオチドの配列があった。標的DNAに相補的な配列が、影をつけた太字のイタリック体で示されている。ｆ、FAM;d、DABCYL;nucl、ヌクレオチド数;rel.（％）、プライマーＡによって増幅したDNAに対する蛍光強度の割合。
図25は、PCRからの増幅産物を直接測定するための直鎖状プライマーの使用の概要を示している。二本鎖PCR産物にプライマーが取り込まれると、エネルギー転移シグナルが発生する。増幅後、3'−5'エキソヌクレアーゼ加水分解によって、取り込まれなかったプライマーからシグナルを取り除く。Ｄ、供与体部分;A、受容体部分;F、フォワードプライマー;R、リバースプライマー。
図26は、13節の実施例７の実験で用いられた３組のPCRプライマーを示している。Uup（配列番号:19）とUd（配列番号:20）は、それぞれ、二亜硫酸処理した非メチル化DNAの配列に対する上流プライマーと下流プライマーである。Mup（配列番号:21）とMd（配列番号:22）は、それぞれ、二亜硫酸処理したメチル化DNAの配列に対する上流プライマーと下流プライマーである。Wup（配列番号:23）とWd（配列番号:24）は、それぞれ、二亜硫酸で処理していないDNAに対する上流プライマーと下流プライマーである。各組の２つのプライマーの一方は、5'末端に、図示された位置で、FAM/DAB（DABCYL）FRETに対で標識されたヘアピン構造をもっている。
図27は、17節の実施例11で説明されている、ウイルスのgag配列のインサイチューPCRで用いることができる、ヘアピンプライマーのBSK38（配列番号:26）の構造の例を示す。
図28A〜Ｂは、14節の実施例８で説明されている、ユニバーサルプライマーによって合成されたPCR産物の可視蛍光を示している。クローニングされたPSA cDNA（A;上の行）とクラミジアのゲノムDNA（B;下の行）を標的として用いた。カラム（１）、完全な反応混合液。カラム（２）、対照１、テールなしの反応混合液。カラム（３）、対照２、鋳型DNAなしの反応混合液。
図29A〜Ｂは、PCRを利用して、テロメラーゼ活性について、目的の細胞または組織を測定するTRAP（テロメア反復配列増幅プロトコール）アッセイ法を示している。図29A（段階１）においては、テロメラーゼは、多数のテロメア反復配列（GGTTAG）（下の行に示されている最も長い反復配列（配列番号:27）を、基質オリゴヌクレオチドの3'末端（配列番号:28）（TS、テロメラーゼ基質）に付加する。
図29B（段階２）では、TSとリバースプライマー（RP）を用いて、PCRによって、伸長産物を増幅して、50ヌクレオチドから、50、56、62、68などと６塩基ずつ増加する梯子状の産物を生成させた。
図30Aは、15節の実施例９で説明されているTRAPアッセイ法で用いられたヘアピンプライマーの配列（配列番号:37）を示している。
図30Bは、TSプライマーと、図30Aに示された配列のヘアピンRPプライマーを用いて行ったTRAPアッセイの結果を示している。10,000細胞、100細胞、または10細胞に相当する細胞抽出物に対してアッセイを行った。３種類の陰性対照もアッセイされた。Taqなし、反応液にTaqポリメラーゼを加えなかった（陰性対照１）。CHAPS、反応液中の細胞抽出物の代わりに、CHAPS溶解緩衝液が用いられた（陰性対照２）、＋Ｈ、アッセイ前に、10,000細胞からの細胞抽出物を熱処理した（陰性対照３）。10、10細胞からの細胞抽出物によるTRAPアッセイ。100、100細胞からの細胞抽出物によるTRAPアッセイ。1,000、1,000細胞からの細胞抽出物によるTRAPアッセイ。10,000、10,000細胞からの細胞抽出物によるTRAPアッセイ。
図31は、5.2.6節で説明されているカスケード・ローリングサークル・アンプリフィケーション（CRCA）を概略的に描いたものである。Ｑ、消光物質;F、フルオロフォア。
図32は、19節の実施例13で説明されている、ローリングサークル（フォワード）ヘアピンプライマー１と２（それぞれ、配列番号:46と47）、リバースヘアピンプライマー１と２（それぞれ、配列番号:48と49）、非ヘアピンフォワード（ローリングサークル）プライマー（配列番号:50）、非ヘアピンリバースプライマー（配列番号:51）を示している。プローブ、またはローリングサークル産物に相補的なヘアピンプライマー配列に下線を施した。非ヘアピン（すなわち、直鎖状）のフォワードプライマー（配列番号:50）は、フォワード（ローリングサークル）ヘアピンプライマー配列１と２の下線部に相当する配列をもっていた。非ヘアピンのリバースプライマー（配列番号:51）は、リバースヘアピンプライマー配列１と２の下線部に相当する配列をもっていた。スペーサー配列を太字で示した。MET対の２つの部分が結合するヌクレオチドにアスタリスク（＊）で印を付けた。
図32には、pUC19の標的特異的配列（5'−TGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT−3'）（配列番号:52）と、19節の実施例13で説明されているライゲーション結合部分を含むスペーサー（一般的）配列を含むCRCAに対する環状プローブの概略が描かれている。rasに対する標的特異的配列（5'−GTTGGAGCTGGTGGCGTAG−3'）（配列番号:53）も示されている。19節の実施例13で説明されている補足実験における標的配列として、ras特異的な配列を用いた。nucl、ヌクレオチド番号。bp、塩基対。Ｔ＊、DABCY部分が結合しているＴヌクレオチド。Ａ＊、FAM部分が結合しているＡヌクレオチド。
図33は、19節の実施例13で説明されている、ヘアピンプライマーによる、一連のカスケード・ローリングサークル・アンプリフィケーション（CRCAs）の結果を示している。各反応において用いられた鋳型サークル、すなわち、標的としてpUC19を用いて作製された環状プローブの数が、Ｘ軸上に示されている。対照反応（リガーゼなし）におけるバックグランドレベルに対する、CRCAs（リガーゼを加える）におけるシグナルのレベルを蛍光測定解析することによって、蛍光単位で測定されたMETシグナル（Ｙ軸）を検出した。−□−、リガーゼなし；−△−、リガーゼあり。
図34は、18節の実施例12で説明されているように、本発明の直鎖状プライマーと、FRET−標識したヘアピンプライマーを用いて、インサイチューPCRを行った後の、HIV−１に初期感染した患者からのリンパ節組織の中のgag陽性細胞を示している。
図35は、図34におけると同じ組織試料を、より高い倍率で見た図を示している。gag陽性細胞は、強いシグナルを示しており、調製物中のバックグランドは低い。
図36は、18節の実施例12で説明されている増幅用混合液からTaqポリメラーゼを除いた陰性対照として用いられた組織試料を示している。
図37は、18節の実施例12で説明されているように、直鎖状プライマーと、FRET−標識したヘアピンプライマーを用いて、インサイチューPCRを行った後の、HIV−１に感染した患者からのリンパ節組織を示している。しかし、シグナル対バックグランドの比率は、図34と35におけるよりも低く、いくつかの細胞ではシグナルが見られるが、PCR後の洗浄が不適切であったために、細胞質バックグランドが他の細胞に見られる。
図38は、18節の実施例12で説明されているように、直鎖状プライマーと、FRET−標識したヘアピンプライマーを用いて、インサイチューPCRを行った後の、エイズ（AIDS）性痴呆で死亡した患者の大脳におけるHIV−Ｉ陽性ニューロンを示している。
5.発明の詳細な説明
本発明は、分子エネルギー輸送（MET）標識で検出可能に標識された核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドに関する。MET対の供与体および／または受容体部分を含む本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドは、増幅産物がMET対の供与体部分と受容体部分との双方を含むように、増幅反応の増幅産物の中に組み入れられる。増幅産物が二本鎖であれば、増幅産物に組み入れられたMET対は同じ鎖上にあってもよく、増幅がトリアンプリフィケーションの場合は反対の鎖上にあってもよい。増幅において用いられるポリメラーゼが5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を有する特定の場合、MET対部分の１つは、このエキソヌクレアーゼ活性によって増幅産物の集団の少なくとも一部から開裂してもよい。そのようなエキソヌクレアーゼ活性は発明の増幅法に有害ではない。
本発明はまた、本発明のこれらの標識オリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅産物を検出する方法に関する。本発明はさらに、増幅産物の採取による汚染の可能性を大きく低下させ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、トリアンプリフィケーション、および他の増幅系を含む核酸配列の増幅のための多くの方法に適応可能な、迅速、高感度、かつ信頼性のある増幅産物検出法に関する。
本発明の核酸増幅オリゴヌクレオチドは、供与体部分と受容体部分との間のMETの原理を利用している。好ましい態様において、METは、オリゴヌクレオチドが供与体および受容体部分で標識され、供与体部分によって放出された蛍光エネルギーが受容体部分によって吸収されるように、供与体部分がフルオロフォアで、受容体部分がフルオロフォアであってもよい、蛍光共鳴エネルギー輸送（FRET）である。本発明の一つの態様において、受容体部分は、供与体から吸収されるエネルギーを異なる波長で放出するフルオロフォアで；次に、増幅反応の進行を評価するために、受容体の放出を測定してもよい。
好ましい態様において、増幅プライマーは供与体部分および受容体部分を共に含み、受容体部分が供与体の蛍光を消光するように形成されるヘアピンプライマーである。増幅産物にプライマーを組み入れて、立体配座が変化し、消光が消失する場合には、供与体部分の蛍光を検出してもよい。
一つの態様において、本発明はプライマーが増幅産物に組み入れられない場合にMETが起こる、ヘアピン構造が形成する核酸増幅プライマーを提供する。好ましい態様において、プライマーが増幅産物の中に組み入れられない場合、プライマーは、供与体フルオロフォアのエネルギーが非蛍光性のフルオロフォアによって消光するヘアピン構造を形成する。
もう一つの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドが増幅産物に組み入れられる場合にMETが起こるように、直鎖状（非二本鎖）である、ならびに供与体部分および受容体部分で個別に標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドおよびブロッキングオリゴヌクレオチドと相補的なプライマーは、トリアンプリフィケーション反応においてそのように標識することができる。
さらにもう一つの態様において、直鎖状プライマー対を用いて、供与体部分および受容体部分は増幅反応において用いられる１つの直鎖状プライマー上に存在する。増幅反応がトリアンプリフィケーションである場合には、供与体および受容体部分の双方で標識されたオリゴヌクレオチドはブロッキングオリゴヌクレオチドではない。
本発明は、（ａ）核酸を含む試料を少なくとも２つのオリゴヌクレオチドに接触させる段階であって、第一のオリゴヌクレオチドが該試料において存在する可能性がある予め選択された標的配列と相補的な配列を含み、該第一および第二のオリゴヌクレオチドが、該標的配列が試料中に存在する場合、該プライマーが該増幅反応の増幅製品に組み入れられるように、該増幅反応において用いられるように適合されるプライマー対であり；該プライマーの少なくとも１つは、分子エネルギー輸送対の供与体部分および受容体部分からなる群より選択される第一の部分で標識され；および同じまたは異なるオリゴヌクレオチドが、該第二の部分が該第一の部分ではない該群のメンバーである該供与体部分および該受容体部分からなる群より選択される第二の部分で標識され、該第一の部分で標識される該プライマーおよび該第二の部分で標識される該オリゴヌクレオチドが該増幅産物に組み入れられるように形成され、供与体部分は励起されると一つ以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容体部分が供与体部分によって放出された一つ以上の特定の波長でエネルギーを吸収する段階；（ｂ）増幅反応を行う段階；（ｃ）該供与体部分からの光放出を刺激する段階；および（ｄ）該供与体部分または受容体部分によって放出されたエネルギーを検出または測定する段階を含む、核酸増幅反応の産物を検出または刺激する方法を提供する。
試料中の核酸は精製してもよく、または精製しなくてもよい。
特殊な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、新鮮なまたは保存された組織または細胞試料について実施される、インサイチューハイブリダイゼーション反応において用いられる。インサイチュー反応では、増幅段階後に標的を正確かつ高感度で直接的に検出できる方法を用いることが有利である。対照的に、パラフィン抱埋組織における従来のインサイチューPCRは、DNA修復メカニズムが例えばCNS、リンパ節、および脾臓からの組織試料に必ず存在するため、ハイブリダイゼーション段階による検出を必要とし、PCR段階の際のリポーターヌクレオチドの直接取り込みによる検出を行わない。典型的に、インサイチューPCRでは、ビオチンまたはジゴキシゲニン部分で標識された従来の直鎖状プライマーが用いられる。しかも、そのような部分で標識されたヌクレオチドの取り込みを増強するように増幅反応条件を修飾する場合には、許容されない程高いバックグラウンドと擬陽性結果が得られる。これは、標識されたヌクレオチドを試料中の切れ目を入れたDNAの中に組み入れる内因性DNA修復酵素の活性に帰因することができる。他の研究者は、他のタイプの単標識PCRプライマーを用いることを試みた（ヌオボ（Nuovo）、1997、「PCRインサイチューハイブリダイゼーション：プロトコルと応用」第３版、リッピンコット・レイブンプレス、ニューヨーク）が、擬陰性結果につながりうる適当な感度を得ることはできなかった。ハイブリダイゼーション段階後に洗浄段階を必要とするために、従来のインサイチューPCRプロトコルでは、さらなる時間および費用を要する。したがって、増幅段階後の直接的な標的の正確かつ感度のよい検出を可能にする方法を用いることが有利である。そのような方法は本発明によって提供される。
特殊な態様において、本発明の増幅反応を実施した後に検出および測定される、供与体部分（例えば、消光剤が受容体部分である場合）または受容体部分（例えば、フルオロフォアまたは発色団が受容体部分である場合）によって放出されたエネルギーは、試料中に最初から存在する予め選択された標的配列の量と相関するため、それによってもとの試料中に存在する予め選択された標的配列の量を測定することが可能になる。このように、本発明の方法を用いて、予め選択された標的配列を含む染色体の数、DNAまたはRNAの量を定量的に測定することができる。
PCRまたは鎖置換増幅において用いられるフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む一対のプライマーは、核酸ポリメラーゼによって他のプライマーの方向において１つのプライマーの伸長産物を生じる場合に、伸長産物がもう一方のプライマーの伸長産物合成の鋳型として作用することができるように、二つの相補的核酸鎖の異なる鎖とそれぞれ相補的であるプライマーを含む。トリアンプリフィケーションにおいて用いられる、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む一対のプライマーは、核酸ポリメラーゼよび核酸リガーゼによってもう一つのプライマーの方向における１つのプライマーの伸長ライゲーション産物を産生する場合、拡張ライゲーション産物がもう一つのプライマーの伸長ライゲーション産物合成の鋳型として作用することができるように、それぞれが２つの相補的核酸鎖の異なる鎖と相補的であるプライマーを含む。これらの例における増幅産物はプライマー配列の間またはプライマー配列を含む試料中の核酸含量である。
本明細書で示すように、「相補的」である核酸は、相補性に由来する望ましい特性、例えばハイブリダイズ能が失われない限り、完全または不完全に相補的であることができる。
特殊な態様において、本発明は、（ａ）少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーに核酸を含む試料を接触させる段階であって、予め選択された標的配列が試料中に存在する場合、増幅反応の増幅産物の中にプライマーが組み入れられるように、オリゴヌクレオチドプライマーを該増幅反応に用いられるように適合させた；少なくとも１つの該オリゴヌクレオチドプライマーが、供与体部分および受容体部分で標識した発明のヘアピンプライマーである段階；（ｂ）増幅反応を行う段階；（ｃ）該供与体部分からエネルギー放出を刺激する段階；および（ｄ）該供与体部分によって放出されたエネルギーを検出または測定する段階を含む、核酸増幅反応の産物を検出または測定する方法を提供する。
本発明はまた、増幅産物を直接的に検出する方法を提供する。この改良された技法は二つの主な必要条件を満たす。第一に、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを分離する前に増幅産物を検出することが可能になる。第二に、標識されたオリゴヌクレオチドを産物に組み入れることによって、増幅産物を直接的に検出することが可能になる。
本発明は、未反応オリゴヌクレオチドを増幅産物から分離する代わりに、先行技術のアプローチのように、残りの遊離のオリゴヌクレオチドからのシグナルを以下の１つ（以上）の方法において消失させる、標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド）の組み込みを通じて増幅産物を直接検出する方法を提供する：
ａ）3'−5'エキソヌクレアーゼでの処置；
ｂ）プライマーオリゴヌクレオチド二本鎖が解離してその結果いかなるシグナルも生じないような温度に増幅産物を加熱すること；または
ｃ）プライマーが増幅産物に組み込まれない場合に限り、供与体から受容体へのエネルギー輸送が起こる、供与体および受容体部分の双方で標識され、ヘアピン構造を形成することができるプライマーを用いること。
さらなる態様において、本発明は反応試験管を開けることなく検出を行うことのできる増幅産物の直接的検出法を提供する。この態様、すなわち「閉鎖試験管」形式は、PCRの多くの適用での利用が遅れる一因である、増幅産物採取の際の汚染の可能性を大きく減少させる。閉鎖試験管法はまた試料の処理量が高く、完全に自動化することができる。本発明はまた、核酸増幅産物の検出または測定のためのキットに関する。そのようなキットは、増幅された核酸の存在が疾患または障害の有無と相関する診断的キットであってもよい。
開示を明らかにするために、制限する目的ではなく、発明の詳細な説明を以下の章に分割する。
5.1.オリゴヌクレオチド
本発明は、増幅された産物に取り込まれ、分子エネルギー転移（MET）と、好ましくは、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）とを利用する、核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドを、供与体部分および／または受容体部分、すなわち「MET対」で標識する。受容体部分は、単に、供与体部分の発光を消光するか、または供与体部分からの発光により励起されると、エネルギーを放出することができる。好ましい態様において、供与体部分から放出される蛍光エネルギーが、受容体部分によって吸収されるように、供与体部分はフルオロフォアであり、受容体部分は、フルオロフォアであってもそうでなくてもよい。標識されたオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーおよび／もしくはリバースプライマーであり、ならびに／またはトリアンプリフィケーションの場合には、ブロッキングオリゴヌクレオチドである。少なくとも一組のMET対が、増幅産物の中に取り込まれるよう（ただし、5'−3'エキソヌクレアーゼ活性があると、引き続き、それによって、増幅産物集団の少なくともいくつかから一部が除去されるかもしれない）、増幅反応で用いるオリゴヌクレオチドを標識する。
本発明の一つの態様において、受容体部分は、異なる波長で供与体から吸収したエネルギーを放出するフルオロフォアであり、次に、増幅反応の進行を評価するために、供与体および受容体部分が、METが生じるのに十分な近位で増幅産物の中に取り込まれるか否かに依存して、供与体および／または受容体の発光の利用を測定することができる。別の態様において、受容体部分は、供与体および受容体部分が、METが生じるのに十分な近位で増幅産物の中に取り込まれたときに、供与体の蛍光を消光する消光物質である。
さらに特異的な態様において（以下の5.1.1節を参照のこと）、プライマーが増幅産物に取り込まれないときは、FRETが起こるヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。好ましい態様において、供与体−消光物質FRET対によって、ヘアピンプライマーを標識する。ヘアピンプライマーが増幅産物に取り込まれると、その構造が変化し（すなわち、直鎖化し）、消光がなくなるため、供与体の蛍光が検出されるようになる。
さらに別の態様において（以下の5.1.2節を参照のこと）、標識されたオリゴヌクレオチドでプライマーとなりうるもの、またはトリアンプリフィケーションの場合にはブロッキングオリゴヌクレオチドとなりうるものは、ヘアピンの形態を形成しない直鎖状分子である。一つの態様において、供与体−受容体のFRET対は、同一の一本鎖のオリゴヌクレオチドプライマーの上に位置している。別の態様において、供与体部分は、第一ヌクレオチドに位置しており、受容体は、第二のオリゴヌクレオチド上に位置している。特異的な態様において、２種類のFRET−標識したオリゴヌクレオチドの一方は、トリアンプリフィケーションに対するプライマーであり、もう一つのFRET−標識したオリゴヌクレオチドは、トリアンプリフィケーションに対するブロッカーである（5.4.2節）。
本発明の増幅反応で用いるためのオリゴヌクレオチドは、適当なサイズであればよく、好ましくは、10〜100ヌクレオチドの範囲、または10〜80ヌクレオチドの範囲にあり、より好ましくは、20〜40ヌクレオチドである。
このオリゴヌクレオチドは、それが、望ましい増幅反応をプライミングできる限り、または、ブロッキングオリゴヌクレオチドの場合にはブロッキングオリゴヌクレオチドとして機能することができる限り、DNAもしくはRNA、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾したものでもよい。オリゴヌクレオチドは、MET部分で標識するほか、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができ、また、それが、望ましい増幅反応をプライミングできる限り、または場合によっては、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして機能することができる限り、その他の付加基や標識を含むことができる。
例えば、オリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウルジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、N6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、5'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイオシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）ｗ、および2,6−ジアミノプリンからなる群より選択されるが、これらに制限されない、少なくとも一つの修飾塩基部分を含むことができる。
別の態様において、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースからなる群より選択されるが、これらに限定されない、少なくとも一つの修飾された糖部分を含んでいる。
さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、ホスホラミドチオ酸、ホスホラミド酸、ホスホロジアミド酸、メチルホスホン酸、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似化合物からなる群より選択される、少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格部分を含んでいる。
当技術分野において既知の標準的な方法によって、例えば、自動DNA合成機（バイオサーチ社（Biosearch）、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）などから購入可能なもの）を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することができる。実施例としては、Steinらの方法（1988、Nucl.Acids Res.16:3209）によって、ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを合成することができ、制御された多孔質ガラス（controlled pore glass）ポリマー担体を使用して（Sarinら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7448−7451）、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドを合成することができるなどである。
当技術分野において既知の標準的な方法によって、例えば、自動DNA合成機（バイオサーチ社（Biosearch）、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、および標準的なホスホルアミダイト化学法を用いた、ポリヌクレオチドのデノボ化学合成によって、または、非特異的な核酸切断する化学薬品もしくは酸素、または部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて、大きな核酸の断片を切断して、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
当技術分野において既知の方法により、自動DNA合成機を用いて、オリゴヌクレオチドを合成するための好ましい方法を行う。例えば、ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（1988、Nucl.Acids Res.16:3209−3221）によって合成することができ、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、制御された多孔質ガラス（controlled pore glass）ポリマー担体を使用して（Sarinら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7448−7451）調製することができるなどである。所望のオリゴヌクレオチドが合成されたら、存在する全ての保護基を除去するための、当技術分野において既知の方法によって、それが合成され、処理された固形担体から、オリゴヌクレオチドを切断する。そして、抽出およびゲル精製を含む、当技術分野において既知の方法によって、オリゴヌクレオチドを精製することができる。アクリルアミドゲルで分離されたオリゴヌクレオチドを調べるか、または分光光度計で260nmにおける光学密度を測定することによって、オリゴヌクレオチドの濃度および純度を決定することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドを、化学合成の過程で、供与体部分および受容体部分によって標識するか、または合成後に当技術分野において既知の方法によって標識を付着させることができる。特異的な態様において、次の供与体と受容体とのMET対が用いられる。すなわち、例えば、テルビウムキレート化合物、またはランタニドキレート化合物などの発光ランタニドキレート化合物を供与体として用い、フルオロセイン、ローダミン、またはCY−５などの有機染料を受容体として用いる。好ましくは、テルビウムを供与体として用い、フルオロセインもしくはローダミンを受容体として用いるか、またはユウロピウムを供与体として用い、CY−５を受容体として用いる。別の特異的な態様においては、供与体は、例えば、フルオロセイン、ローダミン、またはCY−５などの蛍光物質で、受容体は、例えば、ランタニドキレート化合物などの発光物質である。さらに別の態様において、エネルギー供与体は、例えば、ランタニドキレート化合物などの発光物質で、エネルギー受容体は非蛍光物質である。エネルギー転移により、供与体の発光の減少がもたらされる。
別の特異的な態様において、供与体部分は、フルオロフォアである。別の特異的な態様においては、供与体部分も受容体部分もフルオロフォアである。FRET対における供与体または受容体として選択されうる適当な部分が表１に示されている。
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当業者は、当技術分野において既知の分光測定技術を用いて、どのフルオロフォアが、適当な供与体−受容体のFRET対を作るかを、容易に判定することができる。例えば、FAM（525nmの発光最大値をもつ）は、FRET対において、TAMRA、ROX、およびR6G（これらはすべて、514nmの励起最大値をもつ）に対する適当な供与体である。アミノ−モディファイアー（Amino−Modifier）C6 dT（グレンリサーチ社）を用いて、指定された位置に修飾されたＴ−塩基が導入されるように、好ましくは、プライマーを合成過程で修飾し、ジュ（Ju）ら（1995、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4347−4351）によって説明されているところにしたがって、一次的なアミノ基を修飾されたＴ−塩基に取り込む。これらの修飾は、この後、オリゴヌクレオチドの指定された位置に、蛍光色素を取り込むために用いることができる。
供与体部分と受容体部分との間の最適な距離は、供与体部分の発光が、受容体部分によって吸収される距離である。この最適距離は、用いられる特異的な部分によってさまざまであり、当業者は、当技術分野において既知の技術を用いて、容易に決定することができる。受容体部分が、検出されるべきエネルギーを放出するフルオロフォアであることが望ましいエネルギー転移では、供与体フルオロフォアと受容体フルオロフォアは、好ましくは、30ヌクレオチドまでの距離で、より好ましくは３〜20ヌクレオチドまでの距離で、また、より好ましくは６〜12ヌクレオチドまでの距離で隔てられている。受容体部分が供与体の発光を消光することが望ましいエネルギー転移では、供与体部分と受容体部分は、好ましくは、１ヌクレオチド以下の距離（例えば、二本鎖構造の反対鎖上の相補的ヌクレオチド）で隔てられているが、５ヌクレオチドの距離（らせん一回転分）も、用いる利点がある。
さらに別の態様において、ヌクレオチドは、さらに、32P、35S、3Hなどを含む、当技術分野において既知の検出可能なマーカーによって、または、アルカリホスファターゼ、またはホースラディッシュパーオキシダーゼなど、特定の化学反応が行われると、検出可能なシグナルを産生する酵素的マーカーによって標識することができる。このような酵素マーカーは、増幅処理の変性段階を生き延びるために、好ましくは熱に安定的である。
また、オリゴヌクレオチドは、ハプテンまたは標識されたアビジンが結合することができるビオチンもしくは標識された抗−ジゴキシゲニン抗体が結合することのできるジゴキシゲニンなどの分子に共有的に結合されたヌクレオチドを取り込むことによって、間接的に標識される。オリゴヌクレオチドは、化学合成の過程で補助的に標識することができ、または合成後に、当技術分野において既知の方法によって、補助的な標識を付着させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸の増幅反応において、プライマーとして、またはトリアンプリフィケーションの場合には、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして、核酸の増幅産物を検出または測定するために用いられ、それによって、3'側プライマー配列に相補的な、試料中の標的核酸が検出、測定される。したがって、3'プライマー配列が、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、および菌類を含むが、これらに限定はされないヒトの病気の感染性病原体の（例えばゲノムの）配列に相補的であり、それによって、患者の核酸試料中に感染体が存在することを診断するという診断方法において、本発明のオリゴヌクレオチドを使用することができる。標的核酸は、ゲノムでも、cDNAでも、mRNAでも、合成されたものでもよく、ヒトもしくは動物、または微生物などのものでもよい。病気や障害の診断または予測で用いられる別の態様において、標的配列は、野生型のヒトのゲノム、またはRNA、またはcDNAの配列で、ヒトに病気や障害がある場合には、突然変異が示唆されるが、または、その代わりに変異配列でもよい。このような態様においては、選択的に、それぞれ、野生型配列か変異配列を増幅する異なるプライマーセットによって、同じ試料に対して増幅反応を繰り返すことができる。例示すれば、変異には、１個以上のヌクレオチドの挿入、置換、および／もしくは欠失、または転座がありうる。
5.1.1  ヘアピンプライマー
本発明は、プライマーが増幅産物に取り込まれないと、METが起こるヘアピン構造をとるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
したがって、特異的な態様において、本発明は、以下の連続的な配列を5'から3'の順に含むオリゴヌクレオチドであるか、またはそれらを含むオリゴヌクレオチドであるヘアピンプライマーを提供する。すなわち、（ａ）６〜30ヌクレオチドの第一の塩基配列であって、該第一塩基配列の中のヌクレオチドが、エネルギー転移分子対の供与体部分および受容体部分からなる群より選択される第一の部分によって標識されており、励起されると、供与体部分が、一つ以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容体部分が、供与体部分によって放出された、一つ以上の特定の波長のエネルギーを吸収する第一の塩基配列、（ｂ）３〜20ヌクレオチドの第二の一本鎖塩基配列、（ｃ）６〜30ヌクレオチドの第三の塩基配列であって、該第三塩基配列の中のヌクレオチドが、該供与体部分および該受容体部分からなる群より選択される第二の部分によって標識されていて、該第二の部分が、第一の塩基配列を標識していない該基の一つであり、該第三の塩基配列と該第一塩基配列は、該第一塩基配列と該第三塩基配列との間で二本鎖を形成するのに十分逆方向に相補的であり、それによって、供与体部分が励起されて、エネルギーを放出したときに、受容体部分が、供与体部分の放出したエネルギーを吸収するよう、該第一部分と第二部分とが十分近位にある第三の塩基配列、および（ｄ）核酸のポリメラーゼによって、該標的配列を含む核酸鎖に相補的な塩基配列の合成をプライミングすることができるようにするために、その3'末端に、予め選択された標的配列に十分相補的な配列を含む、該オリゴヌクレオチドの3'末端の第四の、８〜40ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列で、該二本鎖が形成されないと、該第一の部分と該第二の部分とは、該第一の部分と該第二の部分との間で分子エネルギーの転移ができない距離に隔てられる第四の塩基配列。
供与体部分および受容体部分がFRET対である、特異的な態様において、第二の部分が第一の部分の蛍光を消光できない（第二の部分が消光物質のとき）ために、または第二の部分が第一の部分の蛍光を吸収できない（第二の部分がフルオロフォアのとき）ために、それ自体は蛍光発光できないために、第一の部分と第二の部分が、FRETを起こせない距離に隔てられていることが観察される。
特異的な態様において、第二の塩基配列（ループ構造）および／または第一の塩基配列（二本鎖の）および／または第三の塩基配列（二本鎖の）は、標的配列に相補的な配列を含まない。または、第二の塩基配列および／または第一の塩基配列および／または第三の塩基配列、または以上の配列の一部は、標的配列に相補的な配列を含んでいてもよい。
好ましい態様において、プライマーは、プライマーが増幅産物の中に取り込まれないと、非蛍光の受容体部分によって、供与体のフルオロフォアのエネルギーが消光されるというヘアピン構造を形成する。当業者は、所与のFRET対の既知の構造と疎水性から、この対が、METにとって最も近い位置になるような立体的配置を容易に決定することができよう。
特異的な態様において、ヘアピンプライマーは、４つの部分を含む（図１）：（ｄ）の部分は、3'末端配列で、標的配列に相補的な配列を含み、DNAポリメラーゼのプライマーである。（ｃ）の部分は、プライマー配列の5'末端配列にある第一ステム配列である。（ｂ）の部分は、ヌクレオチドの一本鎖ループを形成する。（ａ）の部分は、第二ステム配列で、第一ステム配列に相補的である。（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の部分、またはその一部は、増幅すべき標的DNAに相補的であってもなくてもよい。（ｄ）の部分は、好ましくは８〜30ヌクレオチドの長さであり、（ｃ）の部分は、好ましくは６〜30ヌクレオチドの長さであり、（ｂ）の部分は、好ましくは３〜20ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは、４〜６ヌクレオチドの長さである。
第一ステム配列である（ｃ）の部分は、供与体フルオロフォアを含み、第二ステム配列である（ａ）の部分は、受容体（例えば、消光物質）を含むか、または、その逆でもよい。取り込まれなかったヘアピンプライマーにおいては、２つのステム配列が二本鎖になると、供与体および受容体の２つの部分が互いに近接するために、供与体の発光は受容体に転移される。
供与体部分および受容体部分は、ヘアピンステム（二本鎖領域）の末端のヌクレオチドのどちらに位置していても、または内側に位置していてもよい。このように、本発明の一つの態様において、供与体部分と受容体部分（または消光物質）は、それぞれ、標的に相補的なヘアピンプライマーの5'末端に位置し、ヘアピンステム上の相補的なヌクレオチド残基の上に位置している（図１）、または、この逆でもよい。または、各部分は、相補的なステム配列の内部にあるヌクレオチド上に位置していてもよい。または、一つの部分が、内側のヌクレオチド上にあり、もう一つの部分が5'末端のヌクレオチド上にあってもよい。または、一つの部分もしくは両方の部分が、二本鎖領域の反対の末端に位置していてもよい。
好ましくは、供与体部分と受容体部分は、一つの部分が5'末端上に、もう一つの部分が相補鎖上に5bp離れたところの、ステムに相補的な配列に付着している。例えば、この２つの部分は、ステムの２つの相補鎖によって形成される二重らせんの5bpの回転（180度）によって並置され、そのため、立体的に近接するようになり、供与体からの発光が、受容体に転移される（例えば、消光される）。
または、この２つの部分は、ヘアピンが閉じた形状になったとき、１ヌクレオチド（3.4Å）以下の距離で隔てられている、ステムの相補鎖上に位置することができる。最も好ましくは、２つの部分は、ステム上の相補的ヌクレオチド上にあり、ヘアピンが閉じた形状になったとき、互いに直接反対側になる。
ヘアピンプライマーが直鎖状になると、供与体部分は、実質的にMETができなくなるのに十分な長さの介在配列によって、受容体部分（例えば、消光物質）と隔離されなければならない。供与体フルオロフォアと受容体フルオロフォアとからなるFRET対が用いられるとき、２つのFRET部分は、（ａ）第一ステム配列の少なくとも一部、（ｂ）ループ、および（ｃ）第二ステム配列の少なくとも一部を含む介在配列によって隔離される。また、この介在配列は、好ましくは15〜25ヌクレオチドの長さ、また、より好ましくは20ヌクレオチドの長さである。
一つの態様において、受容体部分は、異なった波長で供与体から供与されるエネルギーを再放出するフルオロフォアである。すなわち、プライマーが閉じた状態になると、供与体からではなく、受容体からの発光が検出されるということである。好ましい態様において、受容体部分は消光物質であり、蛍光を発することなく、供与体からの発光を吸収する。どちらの場合も、プライマーが直鎖化されているときにだけ、すなわち、開いた状態のものが、二本鎖増幅産物の中に取り込まれたときにだけ、供与体の蛍光が検出されると考えられる。この状態でのエネルギー転移は最低であるため、供与体からの強い発光シグナルが検出される。
本発明の重要な局面は、閉鎖状態から開放状態への変化が、増幅中にのみ起こるという点である。図２および３は、本発明のヘアピンプライマーのPCRでの使用の概要を示している。図２では、PCRで用いられるDNAポリメラーゼには、5'−3'エキソヌクレアーゼ活性がないが、図３では、5'−3'エキソヌクレアーゼ活性がある。PCRでは、PCRプライマーの一方または両方が、ヘアピンプライマーであればよい。
図２および３において、（ａ）および（ｂ）は、増幅すべき標的配列の２つの相補鎖であり、「Ｒ」と「Ｆ」は、それぞれ、PCR増幅のためのフォワードプライマーとリバースプライマーである。制限ではなく、例示すれば、リバースヘアピンプライマーは、そこに取り込まれた供与体フルオロフォアと消光物質が存在するように設計されている。PCR産物に取り込まれなかったリバースヘアピンプライマーは、近接したところに、フルオロフォアと消光物質をもっており、そのため、遊離したリバースプライマーからの蛍光は消光される。PCRにおけるヘアピンプライマーの使用法については、下記の5.2.1節を参照のこと。
5.1.1.1.  ユニバーサルヘアピンおよびヘアピンプライマー
一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、選択されたプライマー配列に、化学的（例えば、臭化シアンを用いて）、または酵素的（例えば、リガーゼを用いて）に結合させることができ、プライマー配列の相補配列を含む標的核酸配列を増幅することができる「ユニバーサル」ヘアピンである。本発明は、オリゴヌクレオチドであり、その塩基配列が、5'から3'の順に、以下の連続配列からなる「ユニバーサル」ヘアピンを提供する。すなわち、（ａ）１から10ヌクレオチドの一本鎖の第一の塩基配列、（ｂ）２〜30ヌクレオチドの第二の塩基配列で、該第一の塩基配列または該第二の塩基配列の中のヌクレオチドが、分子エネルギー転移対の供与体部分および受容体部分からなる群から選択される第一の部分によって標識され、ここで、該供与体部分は、励起されると一つ以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容体部分は、供与体部分が放出した一つ以上の特定の波長のエネルギーを吸収するという第二の塩基配列、（ｃ）３〜20ヌクレオチドの第三の一本鎖塩基配列、（ｄ）２〜30ヌクレオチドの第四の塩基配列で、該第四の塩基配列の中のヌクレオチドが、該供与体部分と該受容体部分からなる群より選択される第二の部分によって標識され、該第二の部分が、該第一または第二のいずれも標識していない該基の一つであり、供与体部分が励起されて、エネルギーを放出したときに、受容体部分が、供与体部分の放出したエネルギーを吸収できるように、該第一部分と第二部分とが十分近くなるよう、第四の塩基配列が該第二の塩基配列に対して、該第二の塩基配列と該第四の塩基配列との間で二本鎖を形成するのに、逆方向に十分相補的な第四の塩基配列。
ユニバーサルヘアピンの例が、図４に示されている。本発明のユニバーサルヘアピンは、3'末端状の第一ステム配列（２〜30ヌクレオチド長、好ましくは、４〜６ヌクレオチド長）、ループ（３〜20ヌクレオチド長、好ましくは、４〜６ヌクレオチド長）、第一ステム配列に本質的に相補的な第二ステム配列（２〜30ヌクレオチド長、好ましくは、４〜６ヌクレオチド長）、および、5'側一本鎖の付着（「粘着性」）末端配列（例えば、１〜10ヌクレオチド長、好ましくは、３〜４ヌクレオチド長）を含む。
標的DNA配列に相補的で、ユニバーサルヘアピンに連結させるのに適した、選択されたプライマー配列は、例えば、自動DNA合成機および標準的なホスホラミダイト化学法を用いた、ポリヌクレオチドのデノボ化学合成によって、または、非特異的な核酸切断する化学薬品もしくは酵素、または、部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて、大きな核酸の断片の切断によるなど、当技術分野において既知の標準的方法によって作製することができる。
選択されたプライマー配列をユニバーサルヘアピンに結合させるためには、選択されたプライマー配列は、5'末端に、ユニバーサルヘアピンの付着配列（図４）に本質的に相補的な付着配列を含んでいなければならない。一つの態様において、選択されたプライマー配列上の5'付着末端は、ユニバーサルヘアピンの上の5'付着末端を相補するように、化学的に合成される。別の態様において、選択されたプライマー配列上の5'付着末端は、制限的エンドヌクレアーゼの付着的な切断によって作出される。
ユニバーサルヘアピン上の標識部分を、後に、その3'末端が、選択されたプライマー配列に連結されるのを妨害するような位置に置いてはならない。したがって、好ましくは、標識部分は、ユニバーサルヘアピン（図４）の3'末端のヌクレオチド上は置かれていない。ヘアピンの5'末端では、標識部分は、5'末端にある末端ヌクレオチド上に置かれていてもよいし、また、5'末端から内側にあるヌクレオチド上に置かれていてもよい。
図４に示されているようなユニバーサルプライマーの供与体部分（蛍光物質）と受容体部分（消光物質）は、供与体部分の発光が、受容体部分によって消光されるような距離で隔てられていなければならない。好ましくは、供与体部分と受容体部分は、ヘアピンが閉じた形状になったとき、１ヌクレオチド（3.4Å）以下の距離で隔てられている。
一つの態様において、２つのFRET対は、第一ステム配列の一部、ループ、および第二ステム配列の一部を含み、好ましくは、長さ15〜25ヌクレオチドの介在配列によって隔離されている。より好ましくは、ユニバーサルヘアピン上のループは、ヘアピンが「開放」形態になったときに、供与体（例えば、FAM）と消光物質（例えば、DABCYL）との間に20ヌクレオチドの間隔を設けるのに十分な長さをもっている。
図４は、選択された標的配列（８〜40ヌクレオチド、好ましくは、〜15ヌクレオチド）とユニバーサルヘアピンが、互いに連結される前の概略例を示している。
別の態様において、本発明のユニバーサルヘアピンプライマーは、増幅すべく予め選択された標的核酸配列に相補的ではなく、増幅反応で用いられる別のプライマーの一本鎖配列に一致する3'配列を含むものが使用される。もう一方のプライマーの3'側配列は、標的核酸配列に相補的であるが、その5'側同一配列は、標的核酸配列に相補的でない（実施例によって参照のこと、図５と5.2.1節）。
5.1.2  直鎖状オリゴヌクレオチド
別の態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、どちらも、ヘアピン構造を採ることができない直鎖状の分子である。供与体−受容体のFRET対は、どちらも、互いの距離がFRETが起き得るような範囲内にある、同一の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー上に位置するフルオロフォアである。この態様において、FRET対による二重標識は、標識の励起と発光振動数の分離を大きくする。この分離が大きくなると、発光シグナルの正確な定量を妨害しうるバックグランドとなる蛍光を減少させる。
例えば、特異的な態様において、フルオロセインを供与体部分として、ローダミンを受容体部分として用いることができる。フルオロセインは、488nmで励起のピークを示すが、励起スペクトラムが大きいため、その発光振動数である520nmで、いくらかの励起を示す。このため、フルオロセインを単一の標識として用いると、520nmでのアーティファクトによる発光が起き、定量的な分光光度測定の精度と感度を低下させることになる。しかし、フルオロセイン部分を供与体として用い、ローダミン部分を受容体として用いれば（ローダミンは、520nmで励起のピークを示し、605nmで発光のピークを示す）、励起は488nmで起き、発光は605nmで起きるので、バックグランドとなるアーティファクトを多いに減少させることになる。
別の特異的な態様において、供与体部分が、第一のオリゴヌクレオチドプライマー上にあり、受容体が、第二の、相補的なオリゴヌクレオチド上にある。この態様の好ましい局面において、２つのFRET標識されたプライマーのうちの一つは、トリアンプリフィケーションのためのプライマーであり、もう一つのFRET標識されたプライマーは、トリアンプリフィケーションのための、ブロッキング用オリゴヌクレオチド（ブロッカー）である。
5.2.  ヘアピンプライマーを用いて、増幅産物を検出するための方法
本発明のヘアピンプライマーの特異的な態様において、受容体部分は、供与体部分によって伝達されたエネルギーを吸収する、フルオロフォアまたは消光物質である。好ましい態様において、受容体部分は消光物質であり、プライマーは、遊離のプライマー上の受容体部分が、供与体からの蛍光を消光させるような構造をとる。プライマーが、増幅産物の中に取り込まれると、その構造が変化し、消光が減少し、供与体部分の蛍光が検出されるようになる。
本発明の検出方法は、オリゴヌクレオチドが増幅産物の中に取り込まれるような増幅システム、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システム（米国特許第4,683,195号、および第4,683,202号）、トリアンプリフィケーションシステム（商標登録TriAmp、オンカー社（Oncor Inc.）；全部が、参照として本明細書に組み入れられる、1995年６月５日に提出された米国特許出願第08/461,823号;1994年８月４日付け、PCT国際公開公報第9417206 A1号;1994年８月４日付け、PCT国際公開公報第9417210 A1号）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）システム（米国特許第5,409,818号；コンプトン（Compton）、1991、Nature 350:91〜92）、およびストランド置換増幅（SDA）システム（ウォーカー（Wlaker）ら、1992、Nucl.Acids Res.20:1691〜1696）に応用することができる。増幅の結果、ヘアピンプライマーは、二本鎖ポリヌクレオチド増幅産物の中に取り込まれる。
特異的な態様において、ヘアピンプライマーを用いて、保存された細胞もしくは組織、または新鮮な細胞もしくは組織の試料に対するインサイチューの増幅をプライミングする（例えば、ヌオボ（Nuovo）、1997、PCRインサイチューハイブリダイゼーション：プロトコールと応用、第３版（PCR In Situ Hybridization:Protocols and Applications,Third Edition、リッピンコット−ラーフェンプレス（Lippincott−Raven Press）ニューヨーク）を参照のこと）。
FRET対を含む、さまざまな特異的態様が、供与体フルオロフォア部分と消光物質受容体部分からなる、好ましいFRET対を含むものとして、本明細書の下記に説明されているが、このような態様は、受容体部分が消光物質ではなくフルオロフォアに置き換えても、説明することができたであろうと理解されるべきである。
5.2.1.  ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるヘアピンプライマーの使用法
一つの態様において、本発明のヘアピンプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をプライミングするために用いられ、それによって、増幅産物の中に取り込まれるようになる（実施例は、図２と3A〜Ｄに図示されている）。
PCRプライマーは、5'末端上に、ヘアピンステム上の近接した位置（30ヌクレオチド以下）にある、FRET供与体部分と受容体部分とともにヘアピン構造を含んでいる。プライマーは、プライマーが増幅産物の中に取り込まれたときにだけ、供与体部分からの蛍光シグナルが発生するように設計されている。修飾されたヘアピンプライマーは、DNAポリメラーゼの活性を妨害せず、好ましい局面において、熱安定的なPfuポリメラーゼ、またはTaqポリメラーゼを用いることができる。フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーは、ヘアピンプライマーでもよい。
図３に示されている実施例において、ヘアピンプライマーが、その5'末端ヌクレオチド上に消光物質を持っており、その二本鎖反対側鎖に供与体フルオロフォアを含んでいるが、このフルオロフォアと消光物質はFRET対である。PCRの第一サイクル（図3B）において、両プライマーとも、それぞれの標的鎖にハイブリダイズし、DNAポリメラーゼによって伸長される。第二サイクルにおいて（図3C）、リバースプライマーから伸長した産物が、フォワードプライマーの鋳型となり、フォワードプライマーから伸長した産物が、リバースプライマーの鋳型となる。フォワードプライマーが、ヘアピン構造の5'末端の方に伸長されると、用いられたポリメラーゼによって、以下の２つのうちのどちらかが起こりうる。すなわち、DNAポリメラーゼの5'−3'エキソヌクレアーゼ活性によって、消光物質をもつ5'側ヌクレオチドが加水分解されるか、および／または、DNAポリメラーゼが、ヘアピンの5'末端を除去して、鋳型をコピーするかのどちらかが起こりうる。どちらの場合にも、消光物質とフルオロフォアは、互いに離れた位置にあり、シグナルが発生する（図3D）。
例えば、PCR、トリアンプリフィケーション、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、およびストランド置換増幅（SDA）（前記参照）など、ヘアピンプライマーが、反応混合液に用いられる他のどのようなオリゴヌクレオチドにも相補的でなく、また、ヘアピンプライマーが二本鎖DNA増幅産物の中に取り込まれる方法において、ヘアピンプライマーを用いることができる。したがって、例えば、ヘアピンプライマーを使用するトリアンプリフィケーションにおいて、もう一つの非ヘアピンプライマーは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに相補的である。
別の態様（図５）においては、２つの選択されたプライマー、プライマー１とプライマー２とともに、PCRをプライミングするために、ユニバーサルヘアピンプライマーが用いられている。この場合、ユニバーサルヘアピンプライマーは、増幅産物の中に取り込まれ、２つの直鎖プライマーのいずれかに連結されてはいない。この態様において、ユニバーサルヘアピンプライマーの3'配列は、増幅に用いられる直鎖上のフォワードプライマーとリバースプライマーの組のいずれかの5'側配列に一致しており、この5'側配列（図５のプライマー２の配列「Ａ」）は、標的配列に相補的であってはならない。
PCRの第一サイクルの過程で、標的DNA（＋）鎖に相補的なプライマー１が伸長する。プライマー２は、標的の（−）鎖に相補的な配列がある3'部位と、図５で「Ａ」と名付けられた、標的に相補的でない配列をもつ5'部位とをもつ。配列Ａは、好ましくは、10〜25ヌクレオチドであり、より好ましくは、12〜15ヌクレオチドの長さである。
第二サイクルの過程で、プライマー２の伸長産物（矢印で示されている）は、プライマー１の鋳型となる。プライマー１は、伸長されるが、このとき、増幅産物は、配列Ａに相補的な「A'」と名付けられた配列を含んでいる。
第三サイクルの過程で、ヘアピンプライマーのＡ配列は、前回のサイクルによってできた増幅産物のA'配列にアニールする。
第四サイクルの過程で、伸長したヘアピンプライマーが、プライマー１の鋳型となる。プライマー１を伸長している過程で、消光物質とフルオロフォアが分離し、蛍光シグナルが、増幅産物から発光される。同様に、この方法は、トリアンプリフィケーションにも応用することができる。この場合には、ヘアピンプライマーは、ブロッカーに相補的でないプライマーである。
5.2.1.1.  対立遺伝子特異的なPCR（ASP）でのヘアピンプライマーの使用法
別の態様において、本発明のプライマーは、対立遺伝子特異的なPCR（ASP）をプライミングするために用いられる。この態様において、増幅プライマーの一方または両方が、ヘアピンプライマーである。ASPにおいては、標的DNAがPCR増幅用プライマーの3'に完全に相補的であれば、それが選択的に増幅される。ヘアピンプライマーの3'末端は、遺伝子（標的DNA）の既知の突然変異部位の１塩基か２塩基のところか、その内側で、相補的な配列になっているところまでで終結する。適当な反応条件の下では、プライマーの3'末端に、１塩基のミスマッチ（例えば、突然変異によって起こるヌクレオチド置換）があったり、小さな欠失や挿入があると、標的DNAは増幅されない（岡山ら、1989、J.Lab.Clin.Med.114:105〜113;ソマー（Sommer）ら、1992、BioTechniques 12:82〜87）。したがって、ASPを用いて、予め選択された標的配列に相補的なヘアピン配列と、試料中の核酸との間に、少なくとも一つのミスマッチがあるかないかを検出することができ、増幅があれば、そのようなミスマッチはないことが示される。
5.2.2.  トリアンプリフィケーションにおけるヘアピンプライマーの使用法
5.2.2.1.  トリアンプリフィケーション反応における一般的な段階
トリアンプリフィケーションにおいて、ヘアピンプライマーと直鎖プライマー（5.2節と5.4節を参照のこと）の両方を用いることができる。
トリアンプリケーション反応は、３種類のオリゴヌクレオチド、２つのプライマーオリゴヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカー）に基づいている。実施例は、図６に示されている。２つのプライマー、フォワードプライマーとリバース「伸長」プライマーは、選択された標的（鋳型）DNAの２つの鎖に相補的である。第三のオリゴヌクレオチドであるブロッカーは、２つの伸長プライマーの一方に部分的に相補的である。トリアンプリフィケーションは、２つの熱安定的酵素、DNAポリメラーゼとDNAリガーゼを利用する。重合とライゲーションの段階を反復する過程で、伸長されたプライマーの一つが、ブロッカーに連結される。
トリアンプリフィケーションの一つの方法（「gap」法）では、フォワードオリゴヌクレオチドは、増幅すべき標的配列の第一の末端の第一の分節に実質的に相補的なプライマーである。リバースオリゴヌクレオチドは、標的配列の鎖上の配列である、標的配列の第二の末端の第二の分節に実質的に相補的なプライマーである。第三のオリゴヌクレオチド（「ブロッカー」または「ブロッキングオリゴヌクレオチド」）は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの少なくとも一部に実質的に相補的である。
増幅産物の伸長と連結を反復することからなるgapトリアンプリフィケーションの概略図が、図７に示されている。ブロッカーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーと同じ濃度、またはより高い濃度で用いることができる。好ましくは、ブロッカーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度よりも、1.2から２倍高い濃度で用いられる。ブロッカーに相補的なプライマーは、増幅過程でストランド置換が起こるのを避けるために修飾されている。すなわち、好ましい態様においては、このプライマーは、ストランド置換が起こるのを防ぐために、ブロッカーの5'末端に相補的な位置に2'−ｏ−メチルを含む。
本発明の直鎖プライマーが用いられる場合（5.4節）には、増幅中に、ブロッカーが、エキソヌクレアーゼによって加水分解され（ヘアピンプライマーではなく、直鎖プライマーを用いた増幅法で用いられる）、また、望ましくない伸長が起こるのを防ぐために、好ましくは、ブロッカーを修飾する。好ましい態様において、増幅中に、ブロッカーがエキソヌクレアーゼによって加水分解され、また、望ましくない伸長が起こるのを防ぐために、ブロッカーは、3'末端にビオチンを持っている。
トリアンプリフィケーションの別の方法である「gapでない方法」は、実質的には、上記のgap法と同じであるが、フォワードプライマーの5'末端が、リバースプライマーの3'末端に隣接している点が異なっている。
5.2.2.2.  トリアンプリフィケーション反応におけるヘアピンプライマーの使用
本発明の一つの態様において、ヘアピンプライマーが、トリアンプリケーション反応をプライミングするのに用いられ、それによって、増幅産物の中に取り込まれる。トリアンプリフィケーションにおいてヘアピンプライマーを用いるとき、ヘアピン構造は、フォワードプライマーかリバースプライマーのいずれのプライマーの一部であってもよく、ブロッカーに相補的ではない（図６）。ブロッカーが、増幅産物に取り込まれないプライマー上でヘアピン構造が形成されるのを妨害するため、この場合には、ブロッカーに相補的なプライマーは用いることができない。
ヘアピンプライマーは、好ましくは、ステム上のFRET供与体−受容体対によって標識されている。トリアンプリフィケーションの第一サイクルの過程で、ヘアピンプライマーを伸長させ、ブロッカーに連結する。第二サイクルの過程で、伸長されたヘアピンプライマーが、第二のプライマーの鋳型となる。第二のプライマーを伸長させる過程で、ヘアピンが開放され、消光物質がフルオロフォアから引き離されて、供与体が蛍光シグナルを放出する。
5.2.2.3.  核酸配列に基づく増幅（NASBA）におけるヘアピンプライマーの使用法
本発明のプライマーを用いて、図９にその実施例を示した、核酸配列に基づく増幅（NASBA）をプライミングすることができる。NASBAは、逆転写とRNA転写反応の連続的な反復を行い、一定の温度で実施される。ここでは、３種類の酵素（逆転写酵素、RNase H、およびT7 RNAポリメラーゼ）が用いられる。一つの態様において、この方法は、２種類のプライマーを用いるが、そのうちの一つは、FRET供与体部分と受容体部分（消光物質）で標識された、本発明のヘアピンプライマーである。代替的な態様において、両方のプライマーが、本発明のヘアピンプライマーである。
好ましくは、プライマー１は、3'末端に、標的RNAに相補的な約20塩基の配列と、T7RNAポリメラーゼによって認識される標的相補的な配列の5'側にあるプロモーター配列をもっている。プライマー２は、RNA（−）に相補的な、本発明のヘアピンプライマーであり、図９の例示によって図示されているようなエネルギー転移部分によって標識されているヘアピン構造を5'末端にもっている。
非反復のNASBAの段階は、以下のようにして進行する（図９）。段階１では、プライマー１が、RNA標的配列にアニールする。逆転写では、プライマー１の3'末端を伸長させるためのdNTPが使用され、RNA/DNAハイブリッドが形成される。段階２では、RNase Hが、このハイブリッドのRNA鎖を加水分解する。段階３では、ヘアピンプライマー２が、ハイブリッドから残った一本鎖DNAにアニールする。逆転写酵素が、第二のDNA鎖を合成し、プロモーター領域を二本鎖化する。段階４では、混合液中の第三の酵素であるT7 RNAポリメラーゼが、プロモーター配列に結合して、各鋳型分子から100分子にのぼるRNAコピーを生成させる。
そして、反復NASBAの段階は、以下のようにして進行する。段階５では、ヘアピンプライマー２が、その3'末端のプライミング配列によって、RNA鋳型に結合し、逆転写酵素が、それを伸長させて、RNA/DNAハイブリッドを作出する。複製の結果、ヘアピンの5'末端が除去されてコピーされる。このとき、消光物質とフルオロフォアは、もうフルオロフォアを消光することができないほど遠くに隔てられているため、その蛍光を検出することができる。段階６では、RNase Hが、RNA鎖を加水分解する。この結果できた一本鎖DNAは、ヘアピン構造が再び形成されるために、まだ「サイレント」（蛍光が消光している）。段階７では、プライマー１が、一本鎖DNAに結合する。逆転写酵素が、プライマーと鋳型DNAの両方の3'末端に結合する。段階８では、一本鎖DNAの3'末端が伸長され、二本鎖の、転写活性のあるプロモーターが回収される。同時に、プライマー１の3'末端が伸長される。複製の結果として、ヘアピンの5'末端が除去されて、コピーされる。このとき、消光物質とフルオロフォアは、フルオロフォアを消光できないほど離れているために、このフルオロフォアを検出することができる。段階９では、T7 RNAポリメラーゼが、各鋳型分子から多様なRNAを生成させる。
このように、この態様においては、段階５と８の増幅産物が、FRET標識したヘアピン構造を取り込み、反復段階の過程で、蛍光シグナルを付与する。
上記の実施例において、コンプトン（Compton）（1991、Nature 350:91〜92）によって説明されているように、NASBAにおいてヘアピンプライマーが用いられる。しかし、逆転写酵素、RNase H、およびT7 RNAポリメラーゼ以外に、ポリメラーゼ特異的な5'−3'エキソヌクレアーゼ活性が存在していると、複製の過程で、ヘアピンプライマーの5'末端が加水分解されてしまう。鋳型DNAに付着している消光物質がなくなるために、蛍光シグナルが、段階５と８ではなく、段階６と７でも発生する。
5.2.2.4.  ストランド置換増幅（SDA）におけるヘアピンプライマーの使用法
本発明のヘアピンプライマーは、二本鎖DNA標的のストランド置換増幅（SDA）において使用することができる。フォワードプライマー、および／またはリバースプライマーは、ヘアピンプライマーでもよい。SDAは、ニッキングと重合／置換の段階を連続的に反復することにより、一定の温度で行われる。
特異的な態様（図10）において、プライマー１とプライマー２はどちらも、本発明のヘアピンプライマーである。各プライマーは、3'末端の一本鎖プライミング配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および5'末端にFRET標識されたヘアピン構造をもつ。
SDAは、以下のようにして進行する。段階１において、標的DNAを変性し、プライマー１とプライマー２をそれらの3'側配列によってアニールする。段階２において、dNTPを用いて、プライマーの3'末端を伸長するが、dNTPの一つは、5'−［−α−チオ］三リン酸である。改変された鎖によって、二本鎖の制限酵素部位が形成される（チオ修飾された鎖は、エンドヌクレアーゼ加水分解に対して抵抗性である）。同時に、複製の結果として、ヘアピンプライマーの5'末端が除去されて、コピーされる。このとき、消光物質とフルオロフォアは、フルオロフォアを消光できないほど離れているために、このフルオロフォアを検出することができる。段階３において、制限酵素によって、二本鎖DNAの修飾されていない鎖にニックを入れる。段階４においては、5'−3'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼ、好ましくは、Bst DNAポリメラーゼのラージフラグメント（「Bst LFポリメラーゼ」）が、ニックの3'末端を伸長し、一本鎖DNA標的を置換し、この同じサイクルを再び繰り返す。
このように、この態様においては、段階２、３および４の増幅産物が、FRET標識されたヘアピンプライマーを取り込み、蛍光シグナルを付与する。
5.2.2.5.  テロメア反復配列増幅プロトコール（TRAPs）におけるヘアピンプライマーの使用法
テロメアは、真核生物の染色体の末端に見られる特異的な構造である。ヒトの染色体においては、テロメアは、６塩基（TTAGGG）の何千という繰り返しからなっている（ブラックバーン（Blackburn）とゾスタック（Szostak）、1984、Ann.Rev.Biochem.53:163;ブラックバーン（Blackburn）、1991、Nature 350:569;ザキタン（Zakitan）、1989、Ann.Rev.Genet.23:579）。テロメアは、染色体の末端を安定化させる。切断されてテロメアを失った染色体は、融合、再編成、および転座を起こす（ブラックバーン（Blackburn）、1991、Nature 350:569）。体細胞では、DNAポリメラーゼ複合体が、ラギング鎖の5'最末端を複製できないために、インビボ、インビトロともに、細胞分裂のたびに、テロメアの長さは次第に短くなって行く（ハーレイ（Harley）ら、Nature 345:458;ヘイスティー（Hastie）ら、1990、Nature 346:866;リンゼイ（Lindsey）ら、1991,Mutat.Res.256:45;カウンター（Counter）ら、EMBO J.11:1921）。安定になる。これらの観察から、テロメアの長さが、細胞の加齢を検知する「有糸分裂時計」として機能し、最終的には、複製の老化とプログラムされた細胞死のシグナルを出すのではないかという仮説が導き出された（シェイ（Shay）とライト（Wright）、1996、Current Opinion in Cancer 8:66〜71;ハーレイ（Harley）ら、1991,Mutat.Res.256:271;グライダー（Greider）、1990,BioEssays 12:363;ピアティチェック（Piatyszek）ら、Method in Cell Science 17:1）。
TRAP（テロメア反復配列増幅プロトコール）アッセイ法は、PCRを利用するインビトロのシステムでは、非常に感度が高く、テロメラーゼ活性を検出するために用いられる。本発明のヘアピンプライマーをTRAPアッセイ法、例えば、商標登録TRAP−eze（オンカー社（Oncor Inc.）、メリーランド州ゲティスバーグ）アッセイ法で用いることによって、テロメラーゼ陽性細胞を検出することができる。
好ましくは、TRAPアッセイ法は、商標登録TRAP−ezeキット（オンカー社（Oncor Inc.）、メリーランド州ゲティスバーグ）によって提供されている指示に従って、実施される。商標登録TRAP−ezeアッセイ法は、PCRを利用する、一バッファー二酵素のシステムである。しかし、下記ではPCRについて説明しているが、明らかに、テロメラーゼのアッセイは、PCR以外の増幅法を用いても実施することができる。商標登録TRAP−eze反応の第一段階において、テロメラーゼは、基質オリゴヌクレオチド（TS、テロメラーゼ基質）の3'末端にテロメア反復配列（GGTTAG）をいくつか付加する（図31）。
オリゴマーの3'末端の、例えば、AGAGTTまたはTTAGGGなどの特異的な配列は、オリゴマーをTSとして用いるためには重要である（モーリン（Morin）、1991、Nature 353:454〜456）。好ましくは、この配列は、５〜６ヌクレオチドの長さであるが、これより短い配列、例えば、４ヌクレオチドの配列を用いることもできる。
第二の段階において、TS−テロメラーゼ伸長産物のテロメア反復配列に相補的な配列を含む、TSおよびリバースプライマー（RP）を用いたPCRによって、伸長された産物を増幅し、50ヌクレオチドから始まり、50、56、62、68などと、６塩基ずつ増加していく梯子状の産物が生成される。このように、活性のあるテロメラーゼの反応産物が、PCR増幅の鋳型として用いられるため、テロメラーゼが試料中に存在するときだけ、これらの梯子状のバンドのPCR増幅を行う。テロメラーゼ活性のレベルは、PCR産物の量を測定して評価する。
好ましい態様において、RPは、本発明のヘアピンプライマーである。一つの特異的な態様において、MET対で標識された17−bp長のヌクレオチド、5'−ACGCAATGTATGCGT＊GG−3'（配列番号:29）を直鎖状のRPプライマーに加え、RPとして用いるために、本発明のヘアピンプライマーを形成させた（実施例15、図30Aを参照のこと）。実施例によれば、供与体部分をオリゴマーの5'末端に付着させることができ、受容体部分をＴ残基に付着させることができる。
反応条件を最適化することによって、非常に低いレベルのテロメラーゼ活性を検出することができ、このアッセイ法の感度は、PR産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用する従来からのアッセイ法の感度に匹敵する（図30B）。
別の態様において、TSプライマーの5'末端に、ステム−ループのヘアピン構造を付着させることができる。そして、このように修飾されたTSオリゴマーは、PCR増幅用プライマーとしてだけでなく、テロメラーゼに対する基質としても用いられる。テロメラーゼの基質特異性は、TSオリゴマーの3'末端にある塩基配列によって決定されると考えられるため、こうなる。
さらに別の態様において、組織切片のインサイチューTRAPを用いて、また、本発明のヘアピンプライマー、例えば、TRAP用のプライマーとして、図30Aに示されているプライマーを用いて、テロメラーゼ陽性細胞を組織切片の中で検出することができる。テロメラーゼ活性をもつ１種類の細胞を検出するために、本明細書において説明されている方法を用いることができる。このような検出感度レベルを得ることは、従来のチューブ内での組織試料のTRAPアッセイでは困難である。
PCRによるTRAPアッセイ法は、細胞／組織抽出物の中の微量のテロメラーゼ活性を検出できるほど感度が高い（すなわち、細胞集団の１％にテロメラーゼ活性があれば検出される）が、異質な細胞集団におけるテロメラーゼ陽性細胞を個別に同定したり、細胞／組織の形態をテロメラーゼ発現と相関させることは不可能である。これに対して、インサイチューTRAPアッセイ法において、従来からの蛍光顕微鏡を用いて、テロメラーゼ陽性細胞の同定によって、テロメラーゼ発現と一つの細胞の病態生理学的状態の両方を研究することができるようになる。
チューブ内TRAPアッセイ法と同様、インサイチューTRAPアッセイ法（15.1節、実施例２参照）には、酵素的活性のあるテロメラーゼが必要である。インサイチューTRAPアッセイ法は、増幅反応、好ましくは、PCRのための鋳型DNAとして用いられる、テロメラーゼによって伸長された産物を増幅するという方法によって、テロメラーゼ活性を検出する。
チューブ内TRAPアッセイにおいてPCR産物を検出するために、いくつかの処理方法が可能である。例えば、一つの態様において、目的とする遺伝子ターゲッティングのために標識されたプローブを、PCR産物にハイブリダイズさせることができ、その後で、結合したプローブを抗体で検出する。または、PCR産物への標識の取り込みを、抗体によって検出することもできる。
これに対して、インサイチューTRAPアッセイ法に、本発明のヘアピンプライマーを利用することによって、上記の検出段階を省くことができる。チューブ内TRAPアッセイ法と同じく、インサイチューTRAPアッセイ法では、TSプライマー、またはRPプライマーとしてヘアピンプライマーを用いることができる。生成されたPCR産物の中に取り込まれたヘアピンプライマーだけが蛍光を発するため、増幅後に、PCR増幅後の検出／洗浄段階なしに、直接、スライドを蛍光顕微鏡下で眺めることができる。目的とする遺伝子標的が増幅されたときにだけ、細胞が蛍光を発する。
インサイチューTRAPアッセイ法で本発明のヘアピンプライマーを利用することは、他の方法よりも大きな利点がある。まず、検出段階がなくなる。インサイチューPCR法の技術的問題の一つは、PCR産物が拡散することであり、これが、増幅産物の本来の部位を同定することを著しく困難にしている。検出段階がなくなると、この問題が少なくなる。さらに、検出段階と洗浄段階ともになくなると、組織の形態を保つことが可能になる。
第二に、内部対照を取り込むことができることである。スライド調製物の不均一性と、PCR増幅の阻害因子が存在する可能性によって、偽陰性の結果がもたらされることがある。PCR増幅のために、内部陽性対照を取り込むことによって、この問題を未然に防ぐことができる。内部対照は、プライマー対と鋳型DNAとからなり、TRAP反応混合液に加えられる。内部対照の２つのプライマーのうちの一つは、ローダミン/DABCYLで標識された、FRETを行うヘアピンプライマーなど、MET対で標識された、本発明のヘアピンプライマーである。非対照用ヘアピンプライマー上の蛍光標識とは別個の発光プロファイルをもつ、この第二の蛍光標識（例えば、ローダミン）を利用することにより、例えば、FAMで標識されたテロメラーゼ産物と、ローダミンで標識された内部対照などのような、２つの異なった増幅産物を同時に固定することが可能になる。FAM、およびローダミンに適した、それぞれ異なるフィルターを通して、蛍光顕微鏡で試料を見ることにより、対照の増幅が起きたか否かを評価することができる。
内部対照の増幅は、試料中のテロメラーゼ活性の有無とは無関係である。PCR阻害が存在することは、同じスライド上で、内部対照の増幅がないか、著しく減少することによって評価することができる。したがって、試料が、テロメラーゼ産物を示さないが、内部対照の増幅を示したときは、その結果は、その試料は、本当にテロメラーゼ陰性であることを示していて、PCR阻害による偽陰性の結果ではないと解釈することができる。こうして、方法論の信頼性が大いに向上する。
最後に、臨床実験場面でTRAPアッセイ法を行うに当たって、最も大きな障害の一つとなるのは、このアッセイ法が、非常に、PCRの持ち越し汚染をもたらしやすいということである。従来のPCRプライマーではなく、本発明のヘアピンプライマーを用いる、上記のTRAPアッセイ法の閉鎖チューブ方式の方が、臨床実験室では大いに有用であろう。
5.2.2.6.  カスケード式ローリングサークル増幅（CRCA）におけるヘアピンプライマーの使用法
本発明のヘアピンプライマーを、カスケード式ローリングサークル増幅（CRCA）において用いることができる（リザルディ（Lizardi）とカプラン（Caplan）、1997年５月29日に公開された国際公開公報第97/19193号）（図31）。PCRと同じように、CRCAは、２つのプライマーによって操作される。CRCAを用いる、本発明の一つの態様において、プライマーの片方、または両方が、MET対で標識されたヘアピンプライマーであり、好ましくは、一つのヘアピンプライマーだけが、MET対によって標識されている。このヘアピンプライマーは、それがカスケード反応産物の中に取り込まれたときにだけ、METシグナルを発生させる。しかし、PCRとは異なり、反応には、熱変性の反復サイクルが必要ではないため、等温で行われる。このプロセスにおいて、第一のフォワードプライマーは、環状化された鋳型プローブにハイブリダイズし、例えば、Bst DNAポリメラーゼのラージフラグメント（「Bst LFポリメラーゼ」）などのDNAポリメラーゼによって、サークルを回って伸長し、最後に、長い5'側テールを形成するために、プライマー末端を置換する。第二のリバースプライマーが、第一のプライマーによる合成から置換したテールの上で、ストランド置換合成を開始する。
前回の合成から置換した鎖上で、両方のプライマーが、継続的に合成開始を繰り返すCRCAが起こる。本発明のヘアピンプライマーを、フォワードプライマーか、リバースプライマーとして使用すると、閉鎖系の中でCRCA産物を直接検出することが可能になる。これを、二価の直鎖プローブを標的部位で環状化させるための最初の特殊なライゲーション反応（下記参照）と組み合わせると、本発明のヘアピンプライマーを用いる反応は、感染因子の検出、アロタイピング、および癌診断におけるような稀な事象の検出をするための、非常に感度が高く、簡単なシステムとして利用することができる。
CRCAを始めるために、標的配列への直鎖プローブ（好ましくは、長さ約90塩基）のライゲーションを行わなければならない。これは、例えば、アンプリガーゼ（Ampligase）（エピセンター・テクノロジーズ社（Epicentre Technlogies）、ウィスコンシン州マディソン）などの好熱的リガーゼによって触媒される。フォワードプライマーを加えて、環状化したプローブにアニールさせる。例えば、Bst DNAポリメラーゼのラージフラグメント（８ユニット）など、強いストランド置換活性をもつポリメラーゼを加えると、CRCAが開始する。この好熱性酵素によって、テールを持った、数キロベースの産物が生成され、標的配列が直列に反復した反復配列が多数、したがって、リバースプライマーの結合部位が多数産生される。
その一方または両方が、MET対で標識されたヘアピンプライマーでありうるが、好ましくは、一方だけがMET対で標識されている、フォワードプライマー、およびリバースプライマーは両方とも、鋳型DNAへの迅速な結合を確かなものにするため、好ましくは、過剰量（１μＭ）存在する。各プライマーが伸長するにつれて、ポリメラーゼが、その先で伸長している鎖を置換して、それによって、別のプライマーの結合部位をもつ、新しい一本鎖テールの組が作出される（図31）。
この処理を何サイクルも続けると、数百コピーの最初のサークルから、取り込まれなかったヘアピンプライマーを含む二本鎖増幅産物が、数マイクログラム生成させることができる。MET発光を測定するために温度を下げると、取り込まれなかったヘアピンプライマーはすべて、ヘアピン構造に復帰する。MET対が供与体−消光物質のFRET対であるとき、このヘアピン構造への復帰によって、蛍光シグナルが消光される。したがって、供与体−消光物質のFRET対で標識されたヘアピンプライマーで用いられれば、ライゲーション、またはカスケード反応が起きなかった試料では、バックグランドを超えるシグナルは生じないはずである。
CRCAは、一般的には約60〜65℃という一定の温度で行われるので、プライマーは、これらの温度で効果的に結合するのに十分な長さ（18マー以上の長さ）にする必要がある。ヘアピンプライマーは、好ましくは、室温で強いヘアピン構造を形成するが、ストランド置換合成を阻害しないように（図32）、60〜65℃では、比較的不安定なものを選択する。ヘアピンは、合成中のヘアピンをさらに不安定化させるように、プライマー結合配列と部分的に重複させることができ、または、スペーサー領域によって、プライマー結合部位から分離することもできる。
本発明のヘアピンプライマーを使用するCRCAの好ましい態様において、この他の反応成分には、200μＭのdNTPs、2mMのMgSO4、20mMのTris−HCl、pH8.8、10mMのKCl、10mMの（NH4）2SO4、および0.1％トライトンＸ−100が含まれる。ライゲーション反応とカスケード反応は、リガーゼを、まず、NAD＋（0.5mM）存在下で添加し、ポリメラーゼを加える前に10分間インキュベートして、同じチューブで、同じ温度で行うことができる。
5.3  3'−5'エキソヌクレアーゼ、および／または温度上昇を用いて、増幅産物の検出法
以下の小分節で説明される本発明の方法は、PCR、トリアンプリフィケーション、NASBA、およびSDAを含む核酸増幅反応の過程で用いるために、5.4分節で説明されている方法（直鎖プライマーを用いる）と組み合わせることもできる。3'−5'エキソヌクレアーゼ、または温度上昇を用いることによって、取り込まれなかったプライマーを分離する必要なし（したがって、「閉鎖チューブ」方式も可能である）に、増幅産物を検出することができるので、直鎖プライマーとともに使用するとき、このような処理法が好ましい。ヘアピンプライマーを使用すると、検出されるシグナルの型に基づいて、増幅産物と取り込まれなかったプライマーとを区別することができるため、本発明のヘアピンプライマーを用いた処理においては、エキソヌクレアーゼ処理や加熱は必要とされない。
5.3.1.  増幅反応における3'−5'エキソヌクレアーゼの使用
PCRおよびトリアンプリフィケーションに関する5.4分節における一定の態様で説明されているように、また、増幅反応が完了した後、NASBAとSDAで用いるために、すべての遊離プライマーを切断するために、反応容器の中に、3'−5'エキソヌクレアーゼを入れることができる。すると、適当な波長の光によって、供与体のレベルが刺激される。受容体部分がフルオロフォアのとき、発光する受容体の標識は、増幅産物の中に取り込まれていて、切断を受けなかったものだけであるため、増幅の程度を示すことができる。さらに増幅を続けるほど、シグナルは強くなってゆく。受容体部分が、蛍光を発せず、転位エネルギーを熱にして使ってしまう（すなわち、消光してしまう）ときには、増幅反応は、供与体の発光の減少で測定することができる。
トリアンプリフィケーションが用いられる（5.4.2分節）一つの態様において、増幅反応が完了した後、反応容器の中に、一本鎖特異的な3'−5'エキソヌクレアーゼを加える。図８に示されているように、3'−5'エキソヌクレアーゼ処理によって、リバースプライマーの対合しない末端が加水分解される。ブロッカーの3'末端は、保護されているため処理を受けない。
増幅産物の中のFRETフルオロフォアの相互作用は、２つの理由で、この処理による影響を受けない。まず、増幅産物の3'末端が塩基対合するため、エキソヌクレアーゼにとってよい基質とならない。次に、増幅産物に取り込まれたプライマーは、3'末端上で伸長し、その標識されたヌクレオチド残基は、保護されていない3'−ヒドロキシ基から比較的離れている。したがって、ヌクレアーゼが修飾塩基に到達するまでには、ずっと長い時間がかかる。その結果、検出可能なFRETシグナルだけが増幅産物から生じ、バックグランドがない。好ましくは、供与体はフォワードプライマー上にあり、受容体はブロッカー上にあるが、この逆も可能である。
直鎖プライマーを用いた核酸の増幅において、3'−5'エキソヌクレアーゼを用いると、反応後に、増幅産物を取り込まれなかったオリゴヌクレオチドから分離する必要がなくなる。好ましい態様において、本発明の方法は、増幅産物を分離させるために容器を開放することなく、反応が進行している容器の中で実施することができる。ポリメラーゼとヌクレアーゼは、増幅の過程、例えば、図11Aに示されているように、２室反応チューブの中で機械的に分離することができる。増幅後、図11Bのように、反応チューブを反転させ、エキソヌクレアーゼが増幅用混合液と混合するようにし、反応しなかった標識プライマーの加水分解を起こさせる。これにより、持ち越し汚染の機会は大幅に減少し、その結果、臨床実験において偽陽性の結果が出ることは、ほとんどなくなる。この「閉鎖チューブ」方式も、容易に自動化になじむ。
別の態様において、熱安定性DNAポリメラーゼが、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素ともたない酵素という２つの酵素と組み合わされて存在している例外つきで、5.4.1節、5.4.2節、および６節で説明されているようにして、トリアンプリフィケーションまたはPCR増幅を行うことができる。エキソヌクレアーゼに対するポリメラーゼの比率は、増幅サイクルの過程で重合が優位を占めるように調整することができる。増幅後、サイクルが終了したときには、プライマーが結合できる一本鎖鋳型は、それ以上生成されない。このようにして、dNTPを取り込むためにDNAポリメラーゼが結合する鋳型／プライマー複合体はなくなる。したがって、DNAポリメラーゼには、その3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を用いて、反応しなかったプライマーに結合し、分解する機会がある。
5.3.2.  増幅反応における温度上昇の利用
トリアンプリフィケーションのような増幅反応のバックグランド蛍光は、エキソヌクレアーゼを使用する代わりに、増幅容器の温度を上げることによって大幅に減少させることができる。検出過程で、使用されなかったブロッカーとリバースプライマーとの間で形成された短い二本鎖を解離させるのに充分高い温度まで、容器の温度を上げて、FRETを防止する。同時に、これらよりもずっと長い増幅産物は、二本鎖のまま残り、FRETシグナルを発生させる（例えば、実施例５を参照のこと）。この態様では、好ましくは、熱安定性キュベット、またはプレート読み取り式蛍光測定器を用いて検出が行われる。本態様は、また、増幅産物を使用されなかったプライマーから分離する必要がないという点でも有利である。このように、エキソヌクレアーゼ処理を用いる前記の態様と同じように、反応容器を開くことなく、直接、増幅産物を検出することができる。
5.4.  直鎖プライマーを用いた増幅産物の検出法
例えば、PCR、NASBA、ストランド置換、およびインビトロまたはインサイチューのトリアンプリフィケーションにおいて、本発明の直鎖プライマーを用いることができる。閉鎖チューブ方式の増幅反応において、直鎖プライマーを用いるときは、好ましくは、3'−5'エキソヌクレアーゼ処理、および／または温度上昇（5.3節）を用いて、プライマーと増幅産物を分ける。
5.4.1  ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における直鎖プライマーの使用
一つの態様において、本発明のプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（実施例は、図25に示されている）をプライミングするのに用いられ、それによって、増幅産物の中に取り込まれる。供与体フルオロフォア部分がプライマーに付着していて、フルオロフォアか消光物質である受容体部分は、同じプライマー上の供与体から少し離れたところ（30ヌクレオチド以下のところ）に付着している。
PCR増幅が完了した後、反応容器の中に3'−5'エキソヌクレアーゼを入れる。エキソヌクレアーゼは、反応容器中のすべての遊離プライマーを切断する。次に、この反応混合液を、供与体部分を励起するのに適当な波長の光に当てる。
受容体部分がフルオロフォアであるとき、光を放出する受容体の標識だけが、増幅産物の中に取り込まれている未切断のプライマーであり、これによって、増幅の程度が示されることになる。増幅がさらに進行するほど、受容体部分からのシグナルは大きくなる。受容体部分が、蛍光を発せず、転位エネルギーを熱にして使ってしまう（すなわち、消光してしまう）ときには、反応の進行は、供与体の発光の減少で測定することができる。
5.4.1.1  対立遺伝子特異的PCR（ASP）における直鎖プライマーの使用
別の態様において、本発明の直鎖プライマーを用いて、上記5.2.1.1節で説明されている、対立遺伝子特異的PCR（ASP）がプライミングされる。本態様において、増幅プライマーの一方または両方を直鎖プライマーにすることができる。
5.4.2  トリアンプリフィケーションにおける直鎖オリゴヌクレオチドの使用法
一つの態様において、本発明の一組の直鎖プライマーが、トリアンプリフィケーションにおいて使用される（5.2.2.1節で説明されている一般的段階）。
トリアンプリフィケーションのgap方式に応用されているように、また、MET対の供与体部分と受容体部分が、それぞれ、別々の直鎖オリゴヌクレオチド上に位置している態様において、前向きに伸長するプライマーか、逆向きに伸長するプライマーのいずれか、および第三の、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標識される。しかし、MET供与体−受容体標識の組合せの一つが、ブロッカー上になければならず、もう一つの標識は、ブロッカーに相補的なプライマーの一本鎖3'末端（例えば、７節および８節を参照のこと）上になければならない。供与体フルオロフォアと受容体フルオロフォアからなるFRET対を用いる、このような特異的な態様においては、プライマーとブロッカーのオリゴヌクレオチドは、両方のオリゴヌクレオチドが近接していて（互いにハイブリダイズしている）、供与体の標識が刺激されると、FRETが起こり、受容体のフルオロフォアの発光波長で蛍光シグナルが産生されるように、それぞれ、供与体と受容体のフルオロフォアによって標識される。（または、受容体部分は、消光物質でもよい）。特異的な態様において、ブロッカーに相補的でないプライマーは、FRET対の供与体部分か受容体部分によって非標識されているか、または、両方の部分によって標識されている（下の段落を参照）。トリアンプリフィケーション後、好ましくは、取り込まれなかったプライマーの分離を必要とすることなしに、増幅産物の検出が可能になるよう、エキソヌクレアーゼ処理、および／または温度上昇を用いる（5.3.1節および5.3.2節を参照）。
MET対の受容体部分と供与体部分の両方によって二重に標識された直鎖オリゴヌクレオチドを用いることが望ましく、また、取り込まれなかった標識オリゴヌクレオチドを分離する必要を回避するために、トリアンプリフィケーション反応後にエキソヌクレアーゼ処理（温度上昇ではない）が用いられるべき、トリアンプリフィケーションを用いる別の態様において、フォワードプライマー、および／またはリバースプライマーはそれぞれ、FRET対の供与体部分と受容体部分（互いにFRET距離のなかにある）の一つが、3'側一本鎖伸長部分にあれば、それらの部分の両方で標識することができる。
5.5.  マルチプレックスアッセイ法におけるヘアピンまたは直鎖プライマーの使用法
いくつかの特異的なプライマーセットを使用して、同一の反応混合液中で、いくつかの核酸標的の増幅を行うことができる。好ましい態様において、各標的に対するプライマーの一方、または両方が、蛍光部分とFRETを行うことができる消光物質によって標識されたヘアピンプライマーであってもよい。数個の核酸標的の増幅には、各プライマーセットを標識するために、異なった発光波長をもつ別々の蛍光受容体部分を用いる必要がある。
増幅後の検出と解析の過程で、反応に用いられた各プライマーセットに特徴的な特異的な波長で、反応混合液が発光させられ読み取られる。このようにして、混合液の中のどの特異的な標的DNAが増幅され標識されているかを判定することができる。特異的な態様において、各別の標的配列を増幅するために、２組以上のプライマー対が用いられる。
5.6.  本発明の増幅反応を用いて、DNAのメチル化状態を測定すること
グアノシンの5'側にあるシトシンのメチル化が、いくつかの真核生物の遺伝子の発現に大きな効果を与えていることが知られている（バード（Bird）、1992、Cell、70:5〜８）。正常な細胞において、メチル化は、主に、CG−に乏しい領域で起こり、「CpGアイランド」と呼ばれるCGに富んだ領域では、メチル化は起きない。この例外は、インプリンティングされた遺伝子の調節領域の転写不活性化（リ（Li）ら、1993、Nature 366:362〜365）、および女性の不活性化されたＸ染色体上の全遺伝子（プファイファー（Pfeifer）、1989、Science 246:810〜813）に関係したCpGアイランドの広範なメチル化である。
通常はメチル化されていないCpGアイランドの無作為のメチル化は、不死化され形質転換された細胞の中では、比較的よくある現象として記録されており（アンテクエラ（Antequera）ら、1990、Cell 62:503〜514）、また、それは、ヒトの癌における腫瘍抑制遺伝子であることが明らかにされた遺伝子の転写不活性化に関係している（ハーマン（Herman）ら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821〜9826）。感度よくCpGアイランドのメチル化を検出すれば、腫瘍抑制遺伝子の機能を明らかにすることができるかもしれず、早期に腫瘍を検知するための新しい方法を提供することになる。
メチル化特異的PCRは、少量のDNA試料中で、異常な遺伝子メチル化を検出するための感度のよい方法である（ハーマン（Herman）ら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821〜9826）。メチル化特異的PCRは、DNAを修飾するために、初期二亜硝酸反応が用いられる。全くメチル化されていないシトシンが、二亜硫酸反応では主であり、ウラシルに転換する。メチル化されたシトシンは、二亜硫酸反応による影響を受けない。この結果、メチル化されたDNAの配列は、二亜硫酸反応後には、メチル化されていない同一のDNA配列と異なることになる。したがって、これらの各配列を特異的に増幅するために（例えば、メチル化されていない、二亜硫酸処理されたDNAを増幅するためのプライマー対の２種のプライマーのそれぞれが、メチル化されたか、または未処理のDNAに対するプライマー対に比較して、（以前はメチル化されていないシトシンであったヌクレオチドに相補的な）Ａ残基で置き換えられた一つ以上のＧ残基をもち、また、Ｔ残基で置き換えられた一つ以上のＣ残基をもつような）、異なっているプライマーセットを設計することができる。
この他のPCRによる技術におけるように、この方法は、非常に感度が高い。そのPCR以外の原因による持ち越しによる汚染は、偽陽性をもたらす原因となる。本発明のMET標識されたヘアピンプライマーを使用することによって、反応が閉鎖チューブ方式で行われ、モニターされるために持ち越しによる汚染の危険がなくなる。
本発明の方法において二亜硫酸処理を用いることは、PCRを利用する方法に限定されず、それに代わって用いられるその他の増幅方法にも用いることができる。したがって、本発明は、ヘアピンプライマーか直鎖プライマーを用いた本発明の増幅反応を用いて、DNAのメチル化状態を測定する方法を提供する。この方法には、増幅反応を行う前に、精製された核酸を含む試料を、試料中のメチル化されていないシトシンをウラシルに転換させるのに充分な量の二亜硫酸と接触させること、および、増幅反応を、例えば、脆弱Ｘ遺伝子、プレイダー−ウイリー（Prader−Willi）症候群領域、アンゲルマン（Angelman）症候群領域、p15遺伝子、p16遺伝子、Ｅ−カドヘリン遺伝子、フォン・ヒッペル−リンダウ（von Hippel−Lindau）症候群遺伝子などの予め選ばれた標的配列に特異的なプライマー対が存在下で行うことが含まれる。別々の反応容器で用いられるプライマー対は、二亜硫酸処理されメチル化された、二亜硫酸処理されメチル化されていない、および二亜硫酸処理されていない（野生型）核酸に、それぞれ特異的であることが好ましい。試料中の核酸のメチル化状態に関する結論は、どのプライマー対が増幅産物を生じたかによって導き出すことができる。好ましい態様において、増幅反応は、一つ以上のヘアピンプライマーを用いたPCRである。
DNAのメチル化状態を判定するためのキットと方法も提供される。特異的な態様において、そのようなキットは、増幅を行うために、一つ以上の容器の中に、本発明のオリゴヌクレオチドを１種類以上と、（選択的には、ヒドロキノン粉末と一緒に）二亜硫酸ナトリウムを含む。選択的には、さらに、そのようなキットは、別の容器の中に、以下のものを一つ以上含む。すなわち、ミネラルオイル、DNA結合基質、NaI溶液、グリコーゲン、増幅バッファー、対照用非メチル化DNA、および対照用メチル化DNA。
5.7.  選択された標的DNA配列を増幅し検出するためのキット
本発明の付加的な局面は、核酸増幅産物の検出と測定を行うためのキットに関する。特異的な態様において、このキットは、一つ以上の容器の中に、ユニバーサルヘアピンプライマー、および／または直鎖プライマーを含むが、これらに限定はされないヘアピンプライマーなど、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドを一つ以上含む。さらに、このキットは、本発明の増幅反応を行うための付加的成分を含む。増幅されている標的核酸配列が、病気や障害を示すものであるとき、本キットは、診断や予測に用いることができる。特異的な態様において、一つ以上の容器、増幅を行うための本発明のフォワードプライマーとリバースプライマー、および、選択的には、DNAポリメラーゼ、または、２種類のDNAポリメラーゼで、エキソヌクレアーゼ活性をもつものともたないものを含むキットが提供される。トリアンプリフィケーション用のキットは、さらに、一つ以上の容器、ブロッキングオリゴヌクレオチド、および、選択的には、DNAリガーゼを含むことができる。
容器中のオリゴヌクレオチドは、例えば、凍結乾燥されていたり、または溶液（例えば、蒸留水、または緩衝溶液）中にあるなど、どのような形状であってもよい。同一の増幅反応中で用いるために調製されたオリゴヌクレオチドを、一つの容器の中、または別個の容器の中で組み合わせることができる。一つ以上の増幅用（フォワードおよびリバース）プライマーを含み、例えば、各プライマー対の供与体部分が、異なった波長で蛍光を発するなど、各増幅産物から検出されるシグナルが異なった波長をもつものである複合キットも提供される。このような複合キットには、少なくとも２組のプライマー対が含まれる。
特異的な態様において、キットは、一つ以上の容器の中にあり、好ましくは、10〜100、または10〜80ヌクレオチドの範囲にあるプライマー対、および、より好ましくは、20〜40ヌクレオチドの範囲にあるプライマー対で、適当な反応条件下で、選択された標的核酸の少なくとも一部を増幅（例えば、競合的PCRおよび競合的逆転写酵素PCR（クレメンティ（Clementi）ら、1994、Genet.Anal.Tech.Appl.11（１）:1〜6;ジーベルト（Siebert）ら、1992、Nature 359:557〜558）などの、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、イニス（Innis）ら、1990、PCRプロトコール（PCR Protocol）、カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス社（Academic Press））、トリアンプリフィケーション、NASBA、ストランド置換法、または当技術分野において既知の他の方法によって）をプライミングすることができるプライマー対を含む。
別の態様において、選択された標的DNA標的配列を検出するためのキットは、一つ以上の容器の中に、（ａ）一方または両方が、METを行うことができる蛍光部分と消光部分で標識されたヘアピンプライマーであるPCRプライマー、（ｂ）対照用DNA標的配列、（ｃ）増幅用に最適化されたバッファー、（ｄ）例えば、PCR、またはトリアンプリフィケーション、またはSDA用のDNAポリメラーゼ、NASBA用の逆転写酵素など、想定された増幅法に適した酵素、（ｄ）例えば、温度、増幅サイクル数など、最適な条件を説明してある、増幅を行うための説明書のセットを含む。選択的には、本キットは、（ｅ）例えば、解析を行うための蛍光プレート読み取り器、またはサーモサイクラー−プレート読み取り器などの、蛍光発光を刺激し検出するための手段を提供する。
さらに別の態様において、トリアンプリフィケーションのためのキットが提供される。このキットは、フォワードおよびリバースの伸長プライマー、およびブロッキングヌクレオチドを含む。フォワードプライマーかリバースプライマーを、一組のMET部分の一つの部分で標識して、この組合せのMET部分の残りの部分でブロッキングオリゴヌクレオチドを標識する。このようなキットの一つの態様は、一つ以上の容器の中に、（ａ）第一のオリゴヌクレオチド、（ｂ）トリアンプリフィケーション反応で用いるための該第一と第二のオリゴヌクレオチドが直鎖プライマーである、第二のオリゴヌクレオチド、（ｃ）該第一のオリゴヌクレオチドの配列に相補的でハイブリダイズ可能な配列を含むブロッキングオリゴヌクレオチドである、第三のオリゴヌクレオチドで、該第一と第三のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、供与体部分が励起されて、エネルギーを放出すると、受容体部分が、供与体部分によって放出されるエネルギーを吸収するように、該第一と第三のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、供与体部分と受容体部分からなる分子エネルギー転移対の一つである第一の部分と第二の部分で標識されている第三のオリゴヌクレオチド、および（ｄ）別の容器に、核酸のリガーゼを含む。
キットの別の態様は、一つの容器の中に、ユニバーサルヘアピンプライマーを含み、選択的には、臭化シアン、または核酸リガーゼ（例えば、T4DNAリガーゼなどのDNAリガーゼ）を含む第二の容器を含む。
図５に示されているような反応を行うためのキットは、一つ以上の容器の中に、（ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）核酸の配列を増幅するための増幅反応において、第一と第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、DNA合成するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーである第二のオリゴヌクレオチドプライマーで、該第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）該核酸配列中の予め選択された標的配列に相補的ではない5'配列、および（ii）予め選択された標的配列に相補的な3'配列、および（ｃ）5'から3'方向に（ｉ）６〜30ヌクレオチドの第一の塩基配列であって、該第一塩基配列の中のヌクレオチドが、エネルギー転移分子対の供与体部分および受容体部分からなる群より選択される第一の部分によって標識されており、励起されると、供与体部分が一つ以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容体部分が供与体部分によって放出された、一つ以上の特定の波長のエネルギーを吸収する第一の塩基配列、（ii）３〜20ヌクレオチドの第二の一本鎖塩基配列、（iii）６〜30ヌクレオチドの第三の塩基配列であって、該第三塩基配列の中のヌクレオチドが、該供与体部分および該受容体部分からなる群より選択される第二の部分によって標識されていて、該第二の部分が、第一の塩基配列を標識していない該基の一つであり、該第三の塩基配列と該第一塩基配列は、該第一塩基配列と該第三塩基配列との間で二本鎖を形成するのに十分逆方向に相補的であり、それによって、供与体部分が励起されて、エネルギーを放出した際に、受容体部分が、供与体部分の放出したエネルギーを吸収するよう、該第一部分と第二部分とが十分近位にある第三の塩基配列、（iv）その3'末端に、該第二のオリゴヌクレオチドプライマーの該5'側配列に相当する配列を含む、該第三のオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端の、10〜25ヌクレオチドからなる第四の塩基配列を含む。このようなキットが、トリアンプリフィケーションに用いられる場合には、ブロッキングオリゴヌクレオチも提供することができる。
本発明の別のキットは、（ａ）第一のオリゴヌクレオチド、（ｂ）第二のオリゴヌクレオチドを一つ以上の容器に含み、（ｃ）別の容器に核酸リガーゼを含むキットであって、該第一と第二のオリゴヌクレオチドが、互いにハイブリダイズ可能で、該第一のオリゴヌクレオチドが、供与体部分によって標識されており、該第二のオリゴヌクレオチドが、受容体部分によって標識されており、該供与体部分および受容体部分が、分子エネルギー転移対であり、励起されると、供与体部分が、一つ以上の特定の波長のエネルギーを放出し、受容体部分が、供与体部分によって放出された、一つ以上の特定の波長のエネルギーを吸収する第二のオリゴヌクレオチド、および、（ｃ）別の容器に核酸リガーゼを含む。
6.  実施例：一般的実験法
別に特記するものを除き、以下の実施例、第７〜13節に詳細を記載したすべての実験には以下の実験法を用いた。すべての実施例において、実験はトリアンプリフィケーションまたはPCRのいずれかを用いて実施した。
6.1.  オリゴヌクレオチド配列：合成および修飾
ヒト前立腺特異的抗原（PSA）DNAのセグメントに対して相補的な３つのオリゴデオキシヌクレオチドを合成した（図12）。リバースプライマーは、ブロッカーの5'末端に対して相補的な位置に2'−ｏ−メチル部分を含む。この修飾は、増幅過程における鎖置換を防止するために不可欠であった（5.2.2.1節参照）。ブロッカーは、3'−5'エキソヌクレアーゼによる加水分解および増幅過程における望ましくない伸長からの保護のため、3'末端にビオチンを有する。ジュ（Ju）ら（1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4347〜4351）に記載された通り、ブロッカーおよびフォワードプライマーの合成の間に、修飾Ｔ−塩基に一級アミノ基が組み入れられる（アミノ修飾C6 dT）。これらの修飾は、後にオリゴヌクレオチドの指定位置に蛍光色素を組み入れるために用いた。合成されたオリゴヌクレオチドを脱塩処理し、ジュら（1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4347〜4351）によって発表された方法により、リバースプライマーおよびブロッカーの修飾されたチミジン残基にそれぞれFAM（供与体として）およびローダミン（受容体（receptor）として）を結合させた。標識されたオリゴヌクレオチドを、15％変性ポリアクリルアミドゲルにかけて精製した。
プライマーの吸収スペクトルは、ヒューレットパッカード（Hewlett Packard）8452Aダイオードアレイが分光光度計を用いて測定し、蛍光スペクトルは島津（Shimadzu）RF−5000分光蛍光光度計（Columbia,MD）を用いて記録した。
6.2.  前立腺特異的抗原（PSA）標的DNAの増幅
トリアンプリフィケーションは、20mM Tris−HCl（pH8.5）、10mM（NH4）2SO4、0.1mg/ml BSA、2mM NAD、0.1％Triton X100、2mM MgCl2、200μＭの各dNTP、10-11Mの鋳型、250nMのフォワードプライマー、250nMのFAM標識リバースプライマー、500nMのRhod標識ブロッカー、Pfu−exo-DNAポリメラーゼ（3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼ、Stratagene）６単位およびAmpligase（登録商標）DNAリガーゼ（Epicentre Technologies,Madison,WI）30単位を含む120μｌ中にて実施した。ブロッカーおよびリガーゼをPCR反応混合物に加えなかったことを除き、PCR増幅は同一条件を用いて行った。
熱サイクル処理は、94℃５分間の変性に続いて、95℃30秒および60℃２分間を35サイクル行うことによって実施した。最後に60℃で６分間の伸長を行ってPCRを終了した。
第１対照として、DNA鋳型の非存在下にて同様のトリアンプリフィケーション反応を行った。第２対照は、反応混合物をサーマルサイクラーでインキュベートしなかったものとした。
6.3.  3'−5'エキソヌクレアーゼ処理
別に表記した場合を除き、増幅されたDNAまたは対照プローブを含む増幅緩衝液120μｌに、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するT4 DNAポリメラーゼ４単位を添加し、37℃で15分間インキュベートした。
6.4.  エネルギー転移の測定
エネルギー転移の測定は、島津（Shimadzu）RF−5000分光蛍光光度計を用いて行った。励起波長は488nmとし、発光スペクトルは500〜650nmの範囲で記録した。
7.実施例1:DNAポリメラーゼはローダミン修飾を有するDNA鋳型を複製する
本実験（図13A）は、ローダミンによるDNA鋳型の修飾がDNAポリメラーゼの活性に及ぼす影響を明らかにするために実施した。リバースプライマーのローダミン標識がdNTPの組入れを遮断するのであれば、フォワードプライマーの伸長はこの修飾部に対向する塩基のところで停止するはずである。この場合には、増幅された産物の２本の鎖のサイズは異なると思われ、組入れを生じたフォワードプライマーの方が短くなるはずである。
PCR増幅（図13A）は、ブロッカーを用いなかったことを除き、第６節に記載したトリアンプリフィケーションに関する条件を用いて実施した。図13Bに示した通り、修飾型および非修飾型のリバースプライマーの存在下において合成された鎖は同一サイズであり、このことは、ローダミン修飾が増幅に干渉しなかったことを示している。
増幅反応の収量に対するローダミン標識の影響も評価した。PCR増幅を実施し、対照として非修飾型のリバースプライマーを用いた。図13Cのアガロースゲルに示されている通り、ローダミンで修飾されたリバースプライマーまたは非修飾型のリバースプライマーが存在した場合で産物の量は同様であった。
これらの結果から、DNA鋳型における修飾はDNAポリメラーゼによって触媒される伸長反応に悪影響を及ぼさないとの結論が得られる。
8.実施例2:リバースプライマーの修飾はDNAリガーゼによって触媒される反応に悪影響を及ぼさない
トリアンプリフィケーションでは増幅のために耐熱性DNAリガーゼを用いるため、プライマーの修飾が連結効率に影響を及ぼすか否かを明らかにすることは重要であった。トリアンプリフィケーションは、ローダミン標識リバースプライマーを用いて、第６節に記載した通りに実施した。図14Aに示した通り、ブロッカーはその3'末端に、リバースプライマーの配列よりも長く伸長する、ビオチンが付加された４つのヌクレオチドを有する。
伸長したフォワードプライマーをブロッカーと連結させた場合には、結果として得られる鎖は、反対側の鎖よりもほぼ４ヌクレオチド分長いと予想され、それは伸長したリバースプライマーを組み入れていると思われる。連結が全く起こらず、その代わりにブロッカーが置換された場合には、両方の鎖は同じ長さになると予想される。［32P］標識したフォーワードまたはリバースプライマーを平行実験において用いることにより、連結効率を評価した。
図14Bに示した通り、標識されたフォワードプライマーを用いて得られた産物の大部分は、標識されたリバースプライマーによる鎖よりも長く、このことから修飾は連結反応に対して重大な影響を及ぼさないことが示された。
9.実施例3:エキソヌクレアーゼはローダミンで標識されたヌクレオチド残基を除去することができる
ローダミンで標識された［32P］標識リバースプライマーのエキソヌクレアーゼ加水分解を、第６節に記載した方法を用いるPCR増幅における増幅反応混合物中にて実施した（図15A）。3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有するT4 DNAポリメラーゼを用いた。加水分解産物を15％変性アクリルアミドゲルによって分析した。図15Bに提示した結果は、修飾されたオリゴヌクレオチドが５分後にほぼ定量的に加水分解されたことを示している。同様の結果は、ローダミンで標識された［32P］標識リバースプライマーがブロッカーとともに存在した場合にも得られた。
10.実施例4:ヌクレアーゼ処理後のエネルギー転移による増幅産物の検出
FAM標識されたリバースプライマーとローダミン標識されたブロッカーとの間のFRETによるトリアンプリフィケーション産物を検出するために、第６節に記載した通りに、トリアンプリフィケーションおよび引き続いてのエキソヌクレアーゼ処理を行った。対照として、DNA鋳型の非存在下におけるトリアンプリフィケーション反応も行った。
発光スペクトルを図16に提示する。２本鎖増幅産物からは605nmのFRETシグナルが放出されたが（図16、スペクトル１）、DNA鋳型なしで実施した対照反応物からはFRETシグナルは全く放出されなかった（図16、スペクトル２）。
11.実施例5:増幅産物およびブロッカー／リバースプライマー複合体の耐熱性の差に基づく増幅産物の検出
本実験の目標は、遊離型のブロッカーおよびリバースプライマーが２本鎖を形成しなくなって両者の間のエネルギー転移が起こらなくなるような特定の温度を見いだせるか否かを明らかにすることにあった。しかし、この温度では、２本鎖トリアンプリフィケーション産物は依然として２本鎖であると思われ、このため、それに組み入れられたプライマーはFRETシグナルを生じると思われる。
トリアンプリフィケーションは、第６節に記載した通りに実施した。対照反応はDNA鋳型の非存在下にて実施した。増幅後に、反応混合物を75℃に加熱し、発光スペクトルを記録した。その結果、この温度では増幅していないプライマーからは何らシグナルが得られないことが示された（図17A〜Ｂ）。しかし、増幅産物からは605nmでのローダミン発光（すなわちFRETシグナル）を明瞭に検出することができた。
12.実施例6:エネルギー転移に基づくDNAの増幅および検出のためのヘアピンプライマーを用いる閉鎖チューブ方式
12.1.  要旨
閉鎖系においてPCR増幅されたDNAを直接検出するための新たな方法が記載される。本方法は、蛍光共鳴エネルギー転移による標識がなされたプライマーを増幅産物に組み入れることに基づく。PCRプライマーはそれらの5'末端に、供与体および受容体の部分が近接してヘアピンのステム部に位置するようなヘアピン構造を含む。プライマーは、そのプライマーが増幅産物に組み込まれた場合のみに蛍光シグナルを生じるように設計されている。FAMを供与体とし、DABCYLを消光剤として標識されたヘアピンプライマーを用いて得られた信号対バックグランド比は35:1であった。修飾されたヘアピンプライマーはDNAポリメラーゼの活性を妨げず、耐熱性のPfuおよびTaqポリメラーゼの両方を用いることができる。この方法を、前立腺特異的抗原に関するcDNAの検出に適用した。その結果、増幅産物の蛍光強度は組み込まれたプライマーの量と相関しており、最初の鋳型がわずか10分子であっても検出しうることが示された。この技術によって、持ち越し汚染のリスクは除かれ、増幅アッセイは単純化され、極めて広いダイナミックレンジにわたって増幅されたDNAのリアルタイム定量化を行うという新たな可能性が切り開かれる。
12.2.  序
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびその他の核酸増幅法は、微量の開始標的配列を幾何級数的に増幅させるためのツールを提供する（MullisおよびFaloona,1987,Methods in Enzymology 155:335〜350;Landegren,1993,Trends Genet.9:199〜204に総説がある）。DNA/RNA増幅法が極めて高感度であることから、癌および感染菌の早期発見のための診断法の開発が促された。しかし、核酸増幅を臨床利用する上での欠点には、持ち越し汚染のために偽陰性の結果、ならびに反応の不成功および／または標準化されていない反応条件によって生じる偽陰性の結果の可能性があることが含まれる（Orrego,1990,Innisら（編）、PCRプロトコール、方法および応用に関する手引き（PCR Protocols,A guide to methods and applications）、Academic Press,San Diego,CA,pp.447〜454）。
持ち越し汚染の主要な源は、以前の増幅反応物から得られる増幅産物である。PCRは極めて高感度であるため、極めてわずかな汚染があっても偽陽性の結果が生じる恐れがあり、このため、この問題に対処するためのいくつかの手法が考案されている。これらには、ウラシルＮ−グリコシダーゼで続いて処理することによるdTUP組入れ（Longoら、1990,Gene 93:125〜128）、PCRプライマーにリボヌクレオチドを組み入れた後に塩基処理を行うこと（Walderら、1993,Nucleic Acids Res.21:4339〜4343）、または紫外光を照射するとチミジン残基との付加環化反応を生じるイソソラレン誘導体の使用（Ciminoら、1991,Nucleic Acids Res.19:88〜107）がある。しかし、この問題に対するより単純でより確実な解決策は、増幅反応および検出段階が両方とも同一容器の中で起こるために増幅後に反応チューブが開かれることのないような閉鎖系であると思われる。さらに、「閉鎖チューブ」方式は、検出過程を著しく単純化し、ゲル電気泳動またはドットブロット分析などの方法による増幅後分析を行う必要性をなくす。
以下に記載する方法は、標識したオリゴヌクレオチドプライマーの反応産物への組入れによって、増幅されたDNAを直接測定することを意図している。プライマーが起こすコンフォメーション転移は、２種の標識の間のエネルギー転移のためのスイッチとして働く。この方法では、供与体および受容体（消光剤）の部分が両方とも、増幅プライマーの5'末端にあるヘアピン構造に結合される。プライマーは、標識されたオリゴヌクレオチドが２本鎖増幅産物に組み入れられた場合のみに蛍光シグナルを生じるように設計される。この高感度な方法は、定量的または定性的な結果のいずれかを得るために用いることもできる。特定のDNA配列を検出するためのこの系に関する応用には、PCRに加えて、トリアンプリフィケーション、核酸配列に基づく増幅（NASBA）および鎖置換増幅が含まれる。
12.3.  材料および方法
オリゴヌクレオチドプライマー
ヒト前立腺特異的抗原（PSA）cDNAの172bpのセグメントに対して相補的である以下のオリゴデオキシヌクレオチドを化学合成した：上流プライマーとして5'−CCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCAT（配列番号:11）、下流プライマーとして5'−GGTGTACAGGGAAGGCCTTTCGGGAC（配列番号:12）。エネルギー転移性標識を有する上流ヘアピンプライマーの構造を図24A〜Ｇに示す。FAMは、化学合成の最終段階においてFAMホスホルアミダイトを用いてヘアピンプライマーの5'末端に組み入れた。修飾されたＴ−塩基は、Amino−Modifier C6 dT（Glen Research）を用いることによって指定位置に導入し、ジュ（Ju）ら（1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4347〜4351）によって記載された通りに、DABCYLを一級アミノ基に結合させた。標識されたオリゴヌクレオチドをHPLCによって精製した。
PBA cDNAの調製
実験には、ヒトPSA発現性のLNCaP細胞系列（American Type Culture Collection）を用いた。LNCaP細胞を、全血から単離したリンパ球により、LNCaP細胞１個に対してリンパ球102個からLNCaP細胞１個に対してリンパ球106個までの範囲の比率で希釈した。メッセンジャーRNAはDynal精製キットを用いて単離した。cDNAは、推奨された手順に従って、単離されたmRNAから、逆転写酵素（Appligene）およびオリゴdT12−18プライマー（Pharmacia）を用いで合成した。
PCR条件
PSA cDNAの増幅は、20mM Tris−HC1（pH8.5）、50mM KCl、2mM MgCl2、200μＭの各dNTP、それぞれ500nMの上流および下流プライマー、ならびにpfuexo-DNAポリメラーゼ（3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないもの;Stratagene）５単位を含む100μｌ中にて行った。熱サイクル処理は、94℃５分間の変性に引き続いて、95℃30秒、60℃45秒および72℃1.5分を20〜40サイクル行うことによって実施し、最後に72℃で５分間の伸長を行って終了した。
PCR産物は、QIAquick Spin PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製し、pUC19プラスミド中にクローニングした。PCR産物のゲルに基づく検出には、MDE（登録商標）ゲル（FMC BioProducts）を用いた。増幅産物に組み入れられたプライマーの量の評価には、7M尿素を加えた６％ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動、および引き続いてのPhosphorImager−SP（Molecular Dynamics）による定量化を用いた。
蛍光検出
個々の試料の蛍光スペクトルの測定には、島津（Simadzu）RF−5000分光蛍光光度計を用いた。室温で反応混合物100μｌを20mM Tris−HCl、pH8.5、50mM NaClおよび2mM MgCl2によって500mlに希釈し、10×３キュベット（NSG Precision Cells,Inc.）に入れた。FAM/DABCYL（４−（4'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）のFRET対については488nmの励起波長を用い、500〜650nmのスペクトルを記録した。UVトランスイルミネーター画像解析システム（Appligene）にチューブを直接かけることによる蛍光性PCR産物の可視化、およびD540/40フィルター（Chroma Technology）を用いた据え付けカメラによる写真撮影も行った。
12.4.  結果
ヘアピンプライマーを用いるPCRの実験デザイン
この方法では、PCRプライマーの一方（または両方）の5'末端にヘアピン構造が存在する（図１）。ヘアピンのステムおよびループの配列は標的DNA配列に対して部分的に相補的であってもよいが、これは必要ではない。ヘアピンのステム配列には２つの部分が結合している:1つはヘアピンの5'末端にある消光剤であり、もう１つはヘアピンの反対側のステムにある発蛍光団である。発蛍光団および消光剤の位置は、これらの部分の市販の前駆物質が入手可能であるかどうかに応じて入れ替えてもよい。DABCYLは、吸収スペクトルがFAMの発光スペクトルと一部重複する非蛍光性の発色団である。ピーク波長488nmの光によって励起されると、FAMはピーク波長516nmの蛍光を放出する。しかし、DABCYLが供与体となる発蛍光団に十分近い位置にある場合には、DABCYLへのエネルギー転移および熱としての散逸が可能である。したがって、修飾されたプライマーが「閉鎖型」の立体配置（ヘアピン）をとっている場合には、FAMおよびDABCYLは近接しており、フルオレセインの発光はDABCYLによって消失させられる。
PCRの最初のサイクルの間に（図２）プライマーは伸長し、２回目のサイクルでは鋳型となる。ヘアピン構造は非常に安定であるため（Varani,1995,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:379〜404）、いかなる標的分子に対するPCRのアニーリング段階においても、このステムが解離する可能性は低い。この場合には、5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を持たないDNAポリメラーゼがヘアピンステムの5'末端に到達すると、ポリメラーゼがそれを置換してその配列を複製すると考えられる。このため、ヘアピンプライマーはPCR過程において２本鎖らせん構造に組み入れられることによって線状化し、供与体および受容体の間隔は約20ヌクレオチド（ほぼ70Å）になり、このため両者の間に明らかなエネルギー転移は起こらなくなって（Selvin,1995,Methods Enzymol.246:300〜334）、FAMによる蛍光が顕著に増強されると考えられる。
ヘアピンプライマーの配列および分光学的特性
前立腺特異的抗原（PSA）に関するcDNAを増幅するためのヘアピンプライマーの構造を図18Aに示す（配列番号:10）。このプライマーは、12ヌクレオチド長の１本鎖プライミング配列、7bpのステムおよび６ヌクレオチドのループからなる。蛍光性部分（FAM）はプライマーの5'末端に位置し、消光剤（DABCYL）はステム配列の対側鎖にあるFAMと交差する。図18Bは、DABCYL組入れ前および後におけるFAM標識ヘアピンプライマーの発光スペクトルを提示している。消光剤が存在しない場合には、波長488nmで励起されたFAMはピーク波長516nmの蛍光を発する。同じオリゴヌクレオチドがDABCYLによっても標識されると、蛍光エネルギーは消光剤に転移し、516nmにはるかに弱いピークが検出される。FAM/DABCYLで標識されたオリゴヌクレオチドに残留蛍光が認められることは、一部には、FAMのみによって標識されたオリゴヌクレオチドが少量存在することが理由である。このため、標識されたオリゴヌクレオチドを綿密にHPCL精製することが、以後の実験でバックグラウンド値を低くする上で非常に重要である。
ローダミンを消光剤として用いた場合にも同様の結果が得られた（データは提示せず）。しかし、DABCYLには、消光剤として、非蛍光性の発色団であるという利点がある。すなわち、これは自らが発光することなくフルオロセインのエネルギーを吸収する。その結果として、受容体の放出による干渉を受けることなく、フルオロセインの発光をより正確に検出できると思われる。
PCRプライマーとしてのヘアピン−オリゴヌクレオチドの使用
耐熱性Pfuexo-DNAポリメラーゼを用いて、PSA cDNAの断片のPCRを実施した。ヒトPSA発現性のLNCaP細胞にリンパ球を混合したものから得た全cDNAを増幅に用いた。臭化エチジウムで染色したゲルをアッセイに用いた予備実験では、リンパ球105個あたり１個のPSA細胞を検出しうることが示された。定量化のために、PCR産物のクローニングを行い、ヘアピンプライマーの存在下における増幅効率を、ヘアピン構造および修飾を持たない対照プライマーを用いた場合と比較するために用いた。図19は、対照プライマー、FAMのみを含むヘアピンプライマー、およびFAM/DABCYLというFRET対によって標識されたヘアピンプライマーとも、増幅された産物の量は同様であったことを示している。
本方法に関する必須の必要条件は、増幅過程の間にヘアピンプライマーが線状化することである。このため、DNAポリメラーゼは、5'末端に至るまでのヘアピンの全体にわたって、ヘアピンプライマーに対して相補的な鎖を合成する能力を有する必要がある。以下の実験は、ヘアピンプライマーの構造の修飾が、以降の完全長PCR産物の合成に影響を及ぼすか否かを明らかにするために実施した。PSA cDNAの増幅は以下の２つのプライマーを用いて実施した:FAM/DABCYLで標識された上流ヘアピンプライマー、および5'末端が32Pによって標識された下流プライマーである（図20A）。ヘアピン構造を持たない上流プライマーを対照として用いた。
ヘアピンプライマーの構造および／または修飾がDNAポリメラーゼの障害となるならば、このプライマーの5'末端までの全体が複製されることはないと思われ、［32P］標識された鎖は、対照プライマーの存在下において合成された対応する鎖よりも短いと考えられる。
個々の鎖の長さを測定するために、変性ゲル電気泳動を用いた。図20Bの結果に示されている通り、ヘアピンプライマーの存在下において合成された［32P］標識鎖は対照プライマーを用いて合成された対応する鎖よりも長く、このことはDNAポリメラーゼがヘアピン構造の全体を読み取って完全長産物を合成しえたことを示している。
この方法のもう１つの重要な局面は、ヘアピンプライマーの耐熱性である。高温にあった結果として、供与体および／または受容体が連結しているオリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合またはリンカーアームが切断されるのであれば、消光剤が発蛍光団から分離してバックグラウンド値が上昇すると考えられる。事実、50ピコモルのヘアピンプライマーを100μｌの反応物中で40サイクルにわたってインキュベートした場合には、バックグラウンド信号は蛍光強度にして3.8単位から12単位に上昇した。しかし、観察されたバックグラウンド値は依然として低く、アッセイに用いた量である、フルオロセインで標識したオリゴヌクレオチド50ピコモル（200単位）から放出された蛍光のわずか６％を占めるのみであった。
ヘアピンプライマーを用いるPCRの観測
反応の観測にPCR産物の蛍光を用いうることを示すために、リンパ球104個当たりヒトPSA発現性のLNCaP細胞１個を含む混合物から得た全cDNAを、FAM/DABCYLで標識したヘアピンプライマーを用いて増幅した。さまざまな数のサイクルを実施した後に、分光蛍光光度計を用いて増幅産物の蛍光強度を測定した（図21A）。その結果、わずか20サイクル後に蛍光強度は増幅していない反応混合物と比べて５倍上昇し、40サイクルの増幅後には35倍の上昇が検出された。産物中に組み入れられた［32P］標識プライマーの割合を測定するために、変性ゲル電気泳動後にPhosphorImagerを用いて定量化を行うことによって同一試料を分析した。図21Bの結果では、反応混合物の蛍光強度は産物中に組み入れられたプライマーの量と相関することが示されている。
もう１つの実験では、本方法の感度を調べた。定量化のために、クローン化したPSA cDNAを鋳型として用いた。１反応物当たりクローン化したPSA cDNAの０、10、102、103、104、105または106分子を用いて40サイクルのPCRを実施した。図22の結果は、本方法は最初のDNA鋳型が10分子であれば分光蛍光光度計を用いて十分に検出できるほどの感度があることを示している。据え付けカメラおよびD540/40フィルターを備えたUVトランスイルミネーターにチューブを直接かけることによる蛍光性PCR産物の可視化も行った。このフィルターを用いると、515〜560nmという狭い波長幅における発光を検出することができる。図23に示されている通り、最初の鋳型として104、105および106分子を用いて実施したPCR反応による蛍光は、チューブの肉眼観察によって容易に検出することができた。
増幅および検出に対する標識ヘアピンプライマーの構造の影響
ステム、ループおよび3'1本鎖配列のサイズが異なるいくつかのヘアピンプライマーを、これらのパラメーターがPCR効率および信号対バックグラウンド比にどの程度影響を及ぼすかを評価するために合成した。構造および相対蛍光強度を図24A〜Ｇに提示した。検討したプライマーはすべて、標的に対して相補的な少なくとも18ヌクレオチドの配列を有し、これには3'1本鎖プライミング配列、3'ステム配列およびループの一部が含まれる（図24A〜Ｇにおいて太字で強調した部分）。
3'1本鎖プライミング配列の長さは、PCR反応におけるヘアピンプライマーの効率に極めて重要であることが判明した。プライミング配列の長さを構造Ａの12ヌクレオチドから構造Ｇの６ヌクレオチドに短縮した場合には（図24）、ほとんど産物が検出されなくなった。この結果に関して考えられる説明は、このオリゴヌクレオチドでは60℃のアニーリング温度でもヘアピンプライマーが好ましいコンフォメーションであり、標的DNAとのハイブリダイゼーションにステムおよびループのヌクレオチドは用いられないということである。この場合には、分子の２次構造に関与しない唯一の部分は3'1本鎖配列である。しかし、構造Ｇの3'末端にある６ヌクレオチドは有効なPCRプライマーとなるには長さが不十分である。
ステムおよびループのサイズを少し変えた場合には、生成された産物の量にわずかな差が認められた。ステムが7bpよりも長くなるとPCRの効率はわずかに低下した。3'末端のAT塩基対をGCに置換することによってステムを安定化することにより、信号対バックグラウンド比は10％高まった。
12.5.  考察
「閉鎖チューブ」方式において増幅産物を検出するための方法は、それが反応の複雑性を軽減するだけでなく、持ち越し汚染の可能性をなくし、その結果として偽陽性の結果が生じる可能性を最小限に抑えることからも、PCRに基づく自動診断システムに向けての重要な段階である。増幅プライマーはそのステムに、蛍光共鳴エネルギー転移を生じうる２つの標識を有する１つのヘアピン構造を含む。１つの標識は発蛍光団である供与体であり、もう１つは発蛍光団によって放出されるエネルギーを吸収しうる消光剤である。オリゴヌクレオチドプライマーがヘアピン型コンフォメーションにある場合には35倍の蛍光消失が認められ、すなわち産物にプライマーが組み入れられなかった場合に検出されたのは最大蛍光の３％未満であった。ヘアピンから線状コンフォメーションへの切り替えは、複製の結果として起こる。すなわち、ステムの5'末端がDNAポリメラーゼによって置換されて相補鎖が合成され、ヘアピンはもはや形成されない。組み入れられたプライマーでは、発蛍光団と消光剤との間の距離は20塩基対前後であって、これは70Åに近く、この距離でのエネルギー転移は無視しうる程度であるため（Selvin,1995,Methods Enzymol.246:330〜334）、発蛍光団の定量的発光を検出することができる。
本方法の主な利点は、蛍光シグナルが、これまでの方法のようにハイブリダイズさせたプローブからではなく（Holland,ら、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276〜7280;Leeら、1993,Nucleic Acids Res.21:3761〜3766;TyagiおよびKramer,1996,Nature Biotechnol.14:303〜309）、産物自体から発生することにある。これはバックグラウンドを低く保ち、極めて広いダイナミックレンジにわたる増幅されたDNAのリアルタイム定量化を可能とする。さらに、検出には、ハイブリダイゼーションに関係する方法に必要となる特定の緩衝液または温度条件は必要でない。長い２本鎖DNA産物と短いヘアピンプライマーとの間の区別は非常に効率的になされるため、信号対バックグラウンド比は、種々の反応条件において広い温度範囲にわたって同一であると思われる。
この方法は、１本鎖オリゴヌクレオチドが２本鎖産物に組み入れられる多くの増幅システムに応用することができ、任意の耐熱性DNAポリメラーゼと適合性がある。本実施例では、5'−3'および3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を持たない酵素であるPfuexo-DNAポリメラーゼを用いた。5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を有するTaqポリメラーゼを用いても同様の結果が得られた（データは提示せず）。5'−3'エキソヌクレアーゼ活性はいくつかのDNAポリメラーゼの除去修復機能の一部であり、それは遊離プライマーを攻撃することはないと思われる。しかし、伸長したヘアピンプライマーが、鋳型DNAとアニーリングした場合にも依然としてヘアピン型コンフォメーションを維持しているならば、DNAポリメラーゼはヘアピンステムの5'末端を加水分解すると思われ、供与体または受容体と連結した5'ヌクレオチドが溶液中に放出されると考えられる。複製または加水分解のいずれの場合にも、供与体の発蛍光団は受容体から離れ、消光作用はなくなり、増幅産物からの蛍光シグナルを検出することができることから、提案された増幅／検出法には任意の耐熱性DNAポリメラーゼを用いることが可能になると思われる。
本実施例で提示された35倍もの信号対バックグラウンド比は、恐らくこれよりさらに高くなると思われる。発表されているデータからは、発蛍光団および消光剤が互いに共有結合で結ばれている場合には、200倍の消光を達成しうることが示唆される（Wangら、1990,Tetrahedron Lett.31:6493〜6496）。このことは、ステム構造に互いに密接してFRET標識を配置することによって消光効率が高まるであろうことを意味する。この目標は、リンカーアームの変化、標識の位置を変更すること、または供与体および受容体が互いにある程度の親和性を有するようなFRET対を用いることなどのいくつかの手法によって達成しうると考えられる。このシステムを改良するためのもう１つのやり方は、標識の溶液中への自然放出によって増幅中にバックグラウンド値が高まることを防ぐために、FRETで標識されるオリゴヌクレオチドの耐熱性を高めることである。
本実施例に記載され、提示された方法は、標的核酸の存在を定性的または定量的に検出しようとする任意の診断手順に応用することができる。これは、感染症の病原体および食物または水の微生物汚染の検出のほか、一部の型の癌の検出に応用しうると思われる。本方法のあらゆる用途を開発する上で重要な段階はプライマーの構造およびサイクリング条件の最適化であり、これはあらゆる副産物がシグナルをもたらす恐れがあるためである。しかし、標識されたヘアピンプライマーによって増幅されたDNAは任意の伝統的な方法によって分析することができるため、産物のサイズおよび純度をゲル電気泳動によって確認しうるという事実は最適化を容易にするものである。
本実施例は、前立腺特異的抗原のcDNAを検出するためのこの方法の有用性を示す。その結果、検出の特異性および感度は他の増幅に基づく方法と同等であることが示された。すなわち、最初の標的がわずか10分子であっても検出は可能である。この方法は、いくつかの標的が同一反応において増幅される「多重」分析にも用いることができる。この目的のために、さまざまな発蛍光団で標識されたヘアピンプライマーを用いることができる。多数の試料を検討する必要のある臨床的応用については、アッセイの結果を判読するために、PCR装置と別々または組み合わせて蛍光プレート読み取り装置を用いることができると思われる。
13.実施例7:ヘアピンプライマーを用いるPCRを用いてのCpG島のメチル化状態に関するアッセイ
13.1.  材料および方法
ゲノムDNAは、OH3（メチル化されていないP16 DNA）およびHN 12（メチル化されたP16 DNA）細胞系列（The Johns Hopkins Medical InstitutionsのS.B.BaylinおよびD.Sidranskyの両博士から入手）から入手し、亜硫酸水素塩によって処理した（Hermanら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:9821〜9826）。
亜硫酸水素処理した非メチル化DNA（UupおよびUd（それぞれ配列番号:19および20））、亜硫酸水素処理したメチル化DNA（MupおよびMd）（それぞれ配列番号:21および22）および亜硫酸水素処理を受けていないDNA（野生型、WT）（WupおよびWd）（配列番号:23および24）のそれぞれを増幅するために３組のPCRプライマー（図26）を化学合成した。それぞれの組における２つのプライマーのうち一方は、5'末端にFAM/DABCYLで標識されたヘアピン構造を有する。
PCRは、10mM Tris−HCl（pH8.3）、50mM KCl、2mM MgCl2、0.25mMの各dNTP、0.5μＭの各プライマー、対応するDNA鋳型100ngおよびAmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elemer）１単位を含む40μｌ中にて実施した。熱サイクル処理は、94℃12分間の変性（これらの条件はAmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼの活性化のためにも必要である）に続いて、95℃45秒、65℃45秒および72℃１分を35サイクル行うことによって実施した。最後に72℃で５分間の伸長を行ってPCRを終えた。
13.2.  結果
反応産物は第６節に記載した通りに分析した。PCR増幅後に反応混合物の蛍光強度を測定した。DNA鋳型の存在下にて増幅された反応混合物の蛍光強度（＋）は、DNA鋳型の非存在下において増幅された反応混合物の蛍光強度（−）と有意差があった（表２）。例えば、Ｕ−プライマーセット（配列Ｕ（亜硫酸水素処理されたメチル化されていない）DNAの増幅用、表２参照）をU DNAとともに用いた場合には、それは増幅され、シグナルの強度は鋳型を加えない反応混合物の強度とは有意差があった。同様に、Ｍ−プライマーセットを用いるとＭ（亜硫酸水素処理したメチル化された）DNAの増幅がもたらされ、Ｗ−プライマーセットを用いるとＷ（野生型で化学修飾を受けていない）DNAの増幅がもたらされた。
0003597869.tif 000008
13.3.  結論
以上の結果は、メチル化された、またはメチル化されていないDNAを確実かつ高感度に検出するために、METで標識されたヘアピンプライマーを増幅反応に用いうることを示している。
14.実施例8:汎用的なヘアピンプライマーを用いてのPCR増幅
14.1.  序
この実施例では、汎用的なヘアピンプライマーを、PCR増幅のプライミングを行うための２種の選択された線状プライマーであるプライマー１および「テーリングされた（tailed）」プライマー２とともに用いた実験を提示する（5.2.1節参照）。このユニバーサルヘアピンプライマーは増幅産物に組み入れられ、２つの線状プライマー配列の一方と連結されなかった。ユニバーサルヘアピンプライマーの3'配列は、増幅に用いた線状のフォーワードおよびリバースプライマーの対の一方の5'配列と同一であり、この5'配列（図５のプライマー２の配列「Ａ」）は標的配列に対して相補的ではなかった。
PCRの最初のサイクルの間に、標的DNA（＋）鎖に対して相補的なプライマー１（図５）が伸長した。プライマー２（図５）は、標的配列（−）鎖に対して相補的な配列を3'部分に有し、標的配列に対して相補的でない配列を有する図５の「Ａ」と表記された5'部分を有する。（プライマー１およびプライマー２に関する配列は以下の14.2節で記載する）。配列Ａは15ヌクレオチド長である。
２回目のサイクルの間には、プライマー２の伸長による産物（図５で矢印で示されている）がプライマー１に関する鋳型となった。プライマー１は伸長し、その増幅産物としては配列Ａに相補的である「A'」と命名された配列が得られた。
３回目のサイクルの間には、ユニバーサルヘアピンプライマーのＡ配列が以前のサイクルによる増幅産物のA'配列とアニーリングした。鋳型の3'末端が伸長し、ユニバーサルヘアピンプライマーはヘアピン状に折り返さず複製され、消光剤および発蛍光団が分離され、蛍光シグナルが増幅産物から放出された。
４回目のサイクルでは、伸長したユニバーサルヘアピンプライマーがプライマー１に対する鋳型となった。プライマー１の伸長の間に、ヘアピンは折り返さず複製され、消光剤および発蛍光団が分離され、蛍光シグナルが増幅産物から放出された。
PCR産物の＞80％に汎用プライマーが組み入れられ、蛍光検出によって検出しうるように、反応条件およびプライマーの濃度を最適化した。
14.2  材料及び方法
PCR条件
一セットの実験（下記の表３参照）において、pUC 19プラスミド、クラミジアゲノムDNA、及び全ヒトゲノムに存在するp16遺伝子にクローニングした前立腺特異性抗原（PSA）cDNAの増幅を、Flu/DABCYL（「ユニバーサルヘアピンプライマーの配列」参照）で標識したユニバーサルヘアピンプライマーを用いるPCR増幅法によって行い、そしてPSA、クラジミア、及びP16にそれぞれ特異的な三つの対の線状プライマー１と線状テールプライマー２、106個分子のPSA及びクラジミア配列、並びに100ngのヒトDNAを反応ごとに用いた。
増幅は20mMトリス−HCl（pH8.8）、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、0.001％のゼラチン、200μＭの各dNTP、0.5μＭのプライマー１、0.1μＭのプライマー２、0.5μＭのFlu/DABCYLで標識したユニバーサルヘアピンプライマー及び１単位のTaq DNAポリメラーゼ（Takara,Shiga,Japan）を含む20μｌ中で行った。しかしながらP16遺伝子の増幅では、Tagの代わりにAmpliTag Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いるHot Start（登録商標）増幅法を行った。最適な増幅条件においてテールプライマー（プライマー２）の濃度は、導入されたユニバーサルヘアピンプライマーを用いて大部分のPCR増幅産物が得られるように、低く維持される。
熱サイクルは、94℃で５分間の変性を行った後、95℃で20秒間、55℃で30秒間及び72℃で１分間のサイクルを20〜40サイクル行い、更に72℃で最後の５分間の延長を行って終了した。必要とされるサイクル数は、最初の標的の濃度に依存する。ユニバーサルヘアピンプライマーを用いたPCR反応は通常、匹敵量の生成物が得られる標準のPCRよりも３〜５サイクル多く必要である。ユニバーサルヘアピンプライマーはサイクル３（図５）では単に導入し始め、増幅過程でテールプライマーと競合も起こる。
コントロール反応はそれぞれのDNA標的ごとに行った。対照１は反応混合物中にテールプライマーを含んでいなかった。この場合ユニバーサルヘアピンプライマーがテイル配列のみに相補的な配列に特異的であると、産物はないと予測され、DNA標的のどれかの他の配列にハイブリダイゼーションすることができなかった。
対照２は反応混合物中にDNA標的を含んでいなかった。
二つ目のセットの実験（表４参照）では一セットのPCR増幅を、濃度を種々に変えたPSA cDNA標的とPSA−特異性プライマー１とテールプライマー２、及びユニバーサルヘアピンプライマーを用いて行った。別のセットの（従来法の）PCR増幅は、PSA−特異性プライマー１とテーリングしていない（untailed）プライマー２を用いて行った。
この第２セットの実験でのPCRは、10mMトリス−HCl（pH8.3）、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.25mMの各dNTP、0.5μＭの各プライマー、100ngの対応するDNA鋳型及び１単位のAmpliTag Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む40μｌ中で行った。熱サイクルは、94℃で12分間の変性をして行った。またこれらの条件は、AmpliTag Gold（登録商標）ポリメラーゼの活性化にとっても利用されるものであり、それに続いて95℃で45秒間、65℃で45秒間及び72℃で１分間のサイクルを35サイクル行った。このPCRは72℃で最後の５分間の延長を行って終了した。
線状の非標識プライマーを用いて増幅した産物は、臭化エチジウム染色したゲル状で可視化した。
蛍光検出
Shimadzu RF−5000分光蛍光光度計を個々の試料の蛍光スペクトルを測定するために用いた。反応混合物の５μｌの分量を、20mMトリス−HCl、pH8.8、50mMのKCl、2mMのMgCl2を用いて600μｌに希釈し、室温にて10×3mmのキュベット（NSG Precision Cells,Inc.,Farmingdale,NY）に入れた。フルオレセイン/4−（4'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）FRET対に対しては488nmの励起波長を用い、スペクトルを500nmと650nmの間で記録した。
蛍光強度はバックグランドを差し引いた後で測定した。バックグランドは、このPCR増幅反応を行う前の反応混合物中に含まれるユニバーサルヘアピンプライマーの蛍光として定義した。
最初の標的の量がそれほど少なくない（1000分子またはそれ以上）と、蛍光PCR増幅産物はUVトランスイルミネーター画像分析システム（Appligene,Strasbourg,France）に直接このチューブを置いても可視化でき、グリーンD540/40フィルター（Chroma Technology,Brattleboro,VT）を利用した据え付けカメラで写真がとれた。
また定量的な結果を得るために、フルオロメトリックプレートリーダーを用いてもよい。この場合反応は、密閉型の96−ウェルPCRプレートにおいて行えばよい。次にその同じプレートをプレートリーダーに移し、プレートの上部から発生する蛍光を測定する。この測定は、好適な量のサイクルの後で行うことができる。シグナルが充分に強くない場合には、その同じプレートをPCR装置に戻して移し変え、短時間（１−２分間）の余熱段階により更にサイクルを行えばよい。最初の標的の正確な量を測定するために、適当な内部対照を含有させておくべきである。異なる色のヘアピンプライマーが内部対照として用いられるはずである。リアル−タイム検出型PCR装置、例えばan Idaho Light−cycler（Idaho Techmology,Inc.,Idaho Falls,ID）を用いれば、最初の標的の定量をより容易に行うことができる。
ユニバーサルヘアピンプライマーの配列
0003597869.tif 000009
この太字の配列は、特異的プライマーのテーリング部分と同じである。
特異的線状プライマーの配列
それぞれの配列において、プライマー２のテーリング配列は太字にされた小文字に表される。
0003597869.tif 000010
14.3.  結果
表３に示されているようにユニバーサルヘアピンプライマーは、三種の異なる標的を特異的に検出するためにPCR増幅反応で用いることができる。三種全てのゲノム配列、すなわちPSA、クラミジアのゲノム配列、及びP16を増幅し、スペクトロ蛍光光度計を用いてその増幅反応の蛍光スペクトルを測定することによってそれらの増幅産物を検出した。
0003597869.tif 000011
さらにPSA及びクラミジアの増幅産物をトランスイルミネーターのチューブに配置し、グリーンフィルターを通してそれらの写真を撮ることによって可視化した。その結果が図28A−Ｂに現されている。対照と比較して蛍光は増幅後に有意に大きくなったが、それはDNA標的が増幅されたことを示している。
プライマー１、テールプライマー２、及びユニバーサルヘアピンプライマーを用いたPCR増幅の感度は、プライマー１及びテーリングしていないプライマー２を用いた従来のPCR増幅の感度と比較した。表４（下記）に明らかにされているように、プライマー１、テールプライマー２及びユニバーサルヘアピンプライマーを用いたPCR反応の感度はプライマー１及びテーリングしていないプライマー２を用いたPCR反応で得られた感度に匹敵する。14.2節において説明したように最適条件とプライマー濃度を用いると、10モルと同じくらい少量のPSA標的を、ユニバーサルヘアピンプライマーまたは従来の線状の（テーリングしていない）配列−特異性のプライマーのいずれかを用いて検出することができた。蛍光強度はこのPCR増幅反応を行う前に存在するバックグランドを差し引いた後で検出した。
0003597869.tif 000012
14.4.  考察
この実施例で見られた結果は、PCR増幅において従来の線状PCRプライマーに比べてユニバーサルヘアピンプライマーの方が数個の顕著な利点があることを証明している。
第一に、ユニバーサルヘアピンプライマーは、先に最適化したどれかのセットのPCRプライマーを用いて増幅反応を行う際に用いることができる。第二にユニバーサルヘアピンプライマーを用いると密閉されたチューブの形態が可能となり、すなわち増幅及び検出を同じチューブで、そのチューブを全く開口することなく行える。これによってアンプリコン（以前の反応から得られる増幅産物）による汚染が持ち越されず、そのため偽陽性の結果が生じないことが確実になる。持ち越される汚染をこのように最小にすることは、非常に多くの臨床試験を分析する場合に特に重要である。従来、非常に多くの臨床試料を分析する場合に汚染を避けることは一般に困難であって、偽陽性の結果が有害となっている。密閉されたチューブでのPCR増幅において本発明のユニバーサルヘアピンプライマーを用いると、このような汚染の可能性を回避できる。PCRに基づいたアッセイでこのような密閉されたチューブの形態と本発明のヘアピンプライマーを用いると、少なくとも三つの異なる標的を一つのアッセイで特異的に検出することができる。
第三に、PCR増幅で本発明のユニバーサルヘアピンプライマーを用いることによって、定量的な結果を得ることができる。例えば、蛍光測定プレートリーダーを用いることによって増幅産物の量を定量することができ、その際適当な内部対照、例えば第２の既知の標的配列の既知の数とその標的に対応するプライマーが用いられることになっている。
第四に、PCR増幅で本発明のユニバーサルヘアピンプライマーを用いることによって、ゲル電気泳動やドット−ブロットのような時間のかかる後処理の増幅を行う必要がない。この段階を省略することでそれぞれのセットの増幅反応において２−３時間は助かる。
最後にここに現れた結果は、ユニバーサルヘアピンプライマーがp16遺伝子を増幅するために利用できることを示している。したがってユニバーサルヘアピンプライマーは、腫瘍のサプレッサーであるP16遺伝子のメチル化状態を検出するキットに包含させると好ましい。
15.実施例9:テロメラーゼ−陽性細胞を検出するテロメアの繰り返し増幅プロトコール（TRAP）アッセイでのヘアピンプライマーの利用
この実施例は、テロメラーゼ−陽性細胞の検出を明らかにしており、そこではTRAPアッセイが本発明のヘアピンプライマーとともに用いられている。
15.1.  方法及び結果
実験1.
17bp−長ヌクレオチド、5'−ACGCAATGTATGCGT＊GG−3'（配列番号:29）をRPプライマーの5'末端に添加した（図30A）。FAMはオリゴマーの5'末端に結合し、またDABCYLはＴ＊残基に結合した。ヘアピンプライマーの内部−チェインステム−ループが形成したとき、FAMとDABCYL残基は互いに反対側に位置した（図30A）。この立体配置では、FAMとDABCYLとの間にFRETがあるため、5'FAMの蛍光放出は導入されていないオリゴマーは最小であった。
このヘアピンRPプライマーを用いる一連のTRAPアッセイにより、RPの5'修飾がTRAPアッセイの効率を有意に変えないことが明らかになった（図30B）。TRAPアッセイは、TSプライマーと図30Aに示されたRPプライマー配列（配列番号:37）を使用し、10,000個、1000個、100個、または10個の細胞に等価な細胞抽出物を用いて行った。三つの負の対照も進行させた（図30B）。すなわち「Taqなし」では、Taqのないポリメラーゼをその反応に添加し（負の対照１）、「CHAPS」では、CHAPS溶解緩衝液をその反応で細胞抽出物の代わりに用い（負の対照２）、「＋Ｈ」では、10,000個の細胞から得られた細胞抽出物をアッセイを行う前に熱処理した（負の対照３）。４つの反応チューブ（チューブあたり0.05ml）をそれぞれ抽出物または対照に対して調製し、熱サイクラー（サイクル条件:94℃で30秒間及び55℃で30秒間）においてPCR増幅を図30Bに示されたサイクル数で行った。このサイクルを終えたとき、そのチューブを熱サイクラーの加熱ブロックから除去し、蛍光を測定するまで暗所に保存した。蛍光の測定を行うために0.02mlの反応混合液を0.60mlの緩衝液（10mMのトリス−HCl、pH7.6、150mMのNaCl、2mMのMgCl2）とともに混合し、488nm光によって励起された516nmでの放出をShimadzu RF−5000U分光蛍光光度計を用いて測定した。
反応条件を最適化することによって、非常に低いレベルのテロメラーゼ活性を検出した。すなわちこのアッセイの感度は、RP産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた従来のアッセイの感度と匹敵する（図30B）。
実験2.
インサイチューでのTRAPアッセイの第１段階では、目的の選りすぐった組織または細胞のスライドを調製する。固定されていない組織は液体窒素で素早く凍結し、ミクロトーム切断器によって凍結した薄片を調製する。単細胞スプレッドを、例えばCytospin（登録商標）（Shandon Lipshaw Inc.,Pittsburgh,PA）を用いて細胞懸濁液を遠心分離することで調製する。調製したスライドを続いて、RNaseを含まないDNaseを40mMのトリス−HCl pH7.4、6mMのMgCl2及び2mMのCaCl2中に含有する溶液を用い、５−15時間処理する。
Probe−Clips（GraceBio−Labs,Pontiac,MI）のようなスライド密封システムを用いる。Probe−Clipsはスライド上に取り付け、そして試料をDNA溶液で被覆して５時間から15時間インキュベートする。Probe−Clipsは接着剤や他の毒性の溶媒を用いることなく試料の周りに密封容器を形成するものであり、それはまた、TRAP拡張増幅反応でも使用することができる。
TRAPアッセイを、TRAP−ese（登録商標）キットとともに提供された使用説明書にしたがって調製したスライド上の試料に実施する。標準的なチューブ内TRAPアッセイでの実験条件は、わずかな改良を加えて利用することができる。増幅した後でそのスライドは、PCR増幅後の検出／洗浄段階を行うことなく蛍光顕微鏡で直接的に可視化される。目的の遺伝子標的が増幅されると、細胞は蛍光のみとなるであろう。
16.実施例10:増幅不応性突然変異システム（ARMS）アッセイにおけるヘアピンプライマーの使用
16.1.  序文
対立遺伝子−特異的PCRを、ヘアピンプライマーを用いて正常配列とベータ−３−アドレナリン作動性受容体（B3AR）遺伝子のW64R突然変異体とを増幅するために実施した。この遺伝子の正常の産物は内臓の脂肪に顕著に発現するＧ−タンパク質結合受容体である。それは安静時の代謝速度と脂肪分解の調節因子であると考えられており、またW64R突然変異体は肥満と関連している（Clementらの、1995,New Engl.J.Med.333:352−354）。
16.2.  方法
増幅不応性突然変異システム（ARMS）アッセイ（Newtonら、1989,Nucl.Acids Res.17:2503−2516）を、対立遺伝子−特異PCRのために用いた。ARMSアッセイにおいて上流側の対立遺伝子のプライマーはヘアピン構造を有しており、共通の下流側プライマーを用いた。ARMSアッセイは、プライマーが間違った対立遺伝子と対になる場合にはそのプライマーの3'末端でミスマッチが存在するように設計されている。
B3AR遺伝子の配列と対立遺伝子のプライマーが表５（下記）に示されている。太字形はB3AR配列の最重要コドン64に用いられており、またアンダーラインをつけた配列は対立遺伝子特異的プライマーが設計された領域を示している。ヘアピンプライマーは、表５に示されているように、消光剤としてのDABCYLを用いて内部のチミンで、また発蛍光団としてのFAMを用いて5'末端で修飾した。
0003597869.tif 000013
ARMSアッセイは、10mMトリス−HCl、pH8.3、50mMのKCl、2mMのMgCl2、400μＭの各dATP、dCTP、dTTP、及びdGTPを含む緩衝液、並びに10％のジメチルスルホキシド（DMSO）中で実施した。プライマーはそれぞれ１μＭの濃度で用い、また20μＬの反応あたり1.5UでTaqポリメラーゼ（Takara,Shiga,Japan）を用いた。20μＬのPCR反応はPE−2400熱サイクラー（PE Applied Biosystems,Foster City,CA）にて94℃で４分間、実施した後、94℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で30秒間のサイクルを35サイクル行い、更に72℃で10分間の延インキュベートをしてから４℃に維持した。
16.3.  結果
上記に記載した反応条件を用いて、クローニングした正常体（W64）と突然変異体（R64）の鋳型を特異的に増幅し得るためにテストした。標的のない負の対照もそれぞれの反応とともに実施した。PCRを行った後、３μＬのそれぞれのPCR反応をゲル上で実施し、そして臭化エチジウムを用いて染色した。上記に記載したPCRシステムを用いると、正常のプライマーが存在する場合には正常体（W64）標的だけが可視バンドを形成し、また、突然変異標的が存在する場合には突然変異体標的（R64）のみが可視バンドを形成した。負の対照において、またミスマッチした標的を用いて実施したPCR反応においてはバックグランドのPCRアーティファクトは観察されなかった。それぞれのPCR反応も、それぞれの反応液から得られる５μＬを15mMのトリス−HCl、pH8.0、50mMのNaCl、及び2mMのMgCl2の緩衝液、0.6mLに入れて希釈することで蛍光出力についてテストした。各反応の蛍光は、488nmの励起波長と516nmの放出波長を用いてShimadzu RF−5000U分光蛍光光度計で測定した。
それぞれの試料から負の対照のバックグランドの蛍光を差し引いてから、正常の（W64）対立遺伝子プライマーと正常の（W64）標的DNAを用いて行ったPCRは相対蛍光が37であり、一方正常の（W64）対立遺伝子プライマーと突然変異の標的（R64）を用いて行ったPCRから得られる蛍光は負の対照と同じであった。突然変異の（R64）対立遺伝子プライマーと正常の（W64）標的DNAを用いて行ったPCRは、相対蛍光が２であり、また突然変異の（R64）対立遺伝子プライマーと突然変異の標的（R64）を用いて行ったPCRは相対蛍光が19であった。これらの結果は、良好なPCR産物と蛍光がARMSの設計でヘアピンプライマーを用いた対立遺伝子−特異性のPCRからもたらされること、また正常の対立遺伝子と突然変異の対立遺伝子とを区別する能力は蛍光のみに基づいており、ゲル電気泳動を行う必要がなかったことを示している。
17.実施例11:ヘアピンプライマーを用いたインサイチューでのPCRを利用するHIV−１ウイルスゲノムのgag領域に対するアッセイ
17.1.  序文
HIV−１プロウイルスは標準的なインサイチューハイブリダイゼーションで検出することが非常に困難であるが、インサイチューでのPCRの後では、ハイブリダイゼーションと洗浄段階の追加の時間と費用が伴うものの、日常的かつ容易に検出することができる。この実施例は、増幅段階後に直接的に標的を精密かつ高い感度で検出することを可能にした本発明の方法を説明している。
以下の方法は、HIV−1 DNA標的を検出するために用いられ、インサイチューでのPCRでFRET−標識されたヘアピンプライマーを使用する。これらの方法はハイブリダイゼーション段階を回避し、DNA修復により偽陽性の結果を生じさせないであろう。この方法の別の利点は、以前のインサイチューでのPCR法におけるようにハイブリダイズしたプローブによって蛍光信号の発生が起こるというよりはむしろ、産物自体によって蛍光信号が発生することである。ここでのインサイチューPCRの主要な利用はウイルスDNAまたはRNAの検出である。本発明の標識されたプライマーを用いることによってもたらされるような感度の改善は、対立遺伝子特異的なインサイチューでのPCRによる小さな遺伝子の欠失の検出や突然変異の検出といった、広範な応用を可能にする。
17.2.  材料及び方法
中枢神経系、リンパ節、及び脾臓から得られる細胞などの潜在的にHIV−１が感染した広い範囲の細胞を含む組織を、本発明のFRET−標識したプライマー及び技術的に一般に知られている標準的なインサイチューでのPCR法を用いてHIV−1DNAについてアッセイする（例えば、Nuovo及びBloch,米国特許第5,538,871号、Bagasra及びSeshamma,1994,Protocol:In situ amplification and hybridization,Second Ed.,John Wiley and Sons,Somerset,NJ）。
上流側と下流側のPCRプライマーの対（配列番号:43−44、下記参照）を化学的に合成して用いることによって、HIV−１ウイルスゲノムDNAのgag領域から得られる配列の部分を増幅できる。用いられる一つまたは二つのオリゴヌクレオチドPCRプライマーは、例えばFAM/DABCYLのようなMMET対で標識したヘアピン構造を3'末端で持っているとよい。
例えばヘアピンプライマーは、gag標的配列を含む核酸配列に相補的な核酸配列の核酸ポリメラーゼによる合成を刺激できるように、3'末端の一本鎖のヌクレオチド配列が配列番号:43または配列番号:44の配列を含んでいるものを用いるとよい。
このようなヘアピンプライマーの一例であるBSK38（配列番号:26）が図27に示されている。このプライマーは、そのプライマーが増幅産物に組み入れられないときにはMETが生じるようなヘアピン構造を形成している。それが増幅産物に導入される場合にはその立体配置が変化し（すなわち、それは線状になる）、FAM/DABCYL FRET対の場合では消光作用が除去されてドナーの蛍光が検出される。
また、プライマーの対は、ヘアピンの配置を形成していないMET−標識の線状プライマーであってもよい（セクション5.4参照）。
一方または両方のプライマーが線状のプライマーであると、それらはgag配列に相補的な続く配列を有することができる。
0003597869.tif 000014
対照の実験では、従来のインサイチューPCR（例えば、Nuovo,1997,PCR In situ Hybridization:Protocols and Applications,Third Edition,Lippincott−Raven Press,New York）を、例えばSK38（配列番号:43）及びSK39（配列番号:44）のようなgag配列に相補的な二つの線状プライマーを用いて実施する。増幅産物は、プローブとしてSK19配列を用いるインサイチューでのハイブリダイゼーション段階を経て検出する。
0003597869.tif 000015
本発明のFRET−標識したプライマーを用いるインサイチューでのPCRは、次の段階を遂行することによって行う。まず、一試料をガラス製顕微鏡スライドに載せてから標準的な方法によって固定化する。普通に用いられる固定液には、例えばエタノール、メタノール、メタノール：酢酸、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド、または他の当業者に既知の固定液が含まれる。
この試料は、例えばプロティナーゼＫのようなプロテアーゼを用いて必要に応じて前処理することにより増幅試薬の浸透を助けることができる。プロテアーゼの濃度と処理の時間は、それぞれの試料について経験的に決定する。
ヌクレオチド、本発明のヘアピン状（または線状）プライマー、増幅用緩衝液、及び熱安定性DNAポリメラーゼ、すなわち例えばTaqポリメラーゼからなる増幅用混合物を続いて添加する。カバーガラスまたは他の適当な溶液封じ込み装置を取り付けることで、続く熱サイクル段階の間、混合物の濃度を一定に保つことができる。（インサイチューでのPCRの一般的な方法及び緩衝液組成物については、例えばNuovo,1997,PCR In Situ Hybridizatyon:Protocols and Applications,Third Edition,Lippincott−Raven Oress,New York、Nuovoらの、米国特許第5,538,871号参照）
次にインサイチューでの増幅は、溶液PCRによって以前に確立したアニーリングおよび伸長を行うための条件を用いて例えば30−40サイクルを熱サイクラーで行うが、その例では、第１番目の熱サイクルは、94℃で３分間の変性後、55℃で２分間のアニーリング／伸長が行われ、残りの39サイクルは94℃で１分間の変性と２分間の伸長が行われる。
導入されなかったヘアピンプライマーはシグナル後−増幅を生じないため、洗浄段階を減少させるか削除する。これにより、増幅しなかった産物が後−増幅洗浄段階の間になくなるため検出の感度が改善する。
PCR増幅後、この反応混合物のMETシグナル強度を例えば蛍光顕微鏡を用いて測定する。HIV gag鋳型に陽性な細胞は例えば蛍光のようなシグナルを示すはずであり、gagに陰性な細胞はシグナルを示さないはずである。
18.実施例12:ヘアピンプライマーを用いたインサイチューでのPCRを利用するHIA−１ウイルスゲノムのgag領域の特徴付け
18.1.  序文
この実施例では、脾臓、リンパ節、脳、及び頚部から得られる一連のHIV−１感染した組織を、ヘアピンプライマーを用いたインサイチューでのPCRを利用してHIV−１ウイルスゲノムのgag領域についてアッセイした。
18.2.材料及び方法
ヘアピンプライマーと線状プライマーは化学的に合成し、HIV−１ウイルスゲノムDNAのgag領域からの配列の部分を増幅するために用いた。
用いた線状プライマーはSK39（配列番号:44）であった。
用いたヘアピンプライマーはBSK38（配列番号:26）であり、図27に示されている（上述のセクション17も参照）。このヘアピンプライマーの一本鎖の核酸配列は、その3'末端に、SK38（配列番号:43）の配列の3'部分を含んでいた。このプライマーの5'部分はFAM/DABCYL MET対で標識したヘアピンを構成していた。3'一本鎖配列はgag配列に相補的であるため、それはプライマーとして適していた。
このプライマーは、そのプライマーが増幅産物に導入されない場合にMETが生じるようなヘアピン構造を形成する。それが増幅産物に導入される場合はその立体配置は変化し（すなわち、それは線状になる）、FAM/DABCYL FRET対の場合では消光作用が除去されてドナーの蛍光が検出される。
対照の実験では、従来のインサイチューPCR（Nuovo,1997,PCR In situ Hybridization:Protocols and Applications,Third Edition,Lippincott−Raven Press,New York）を、増幅混合物（下記参照）に存在するgag配列に相補的な二つの線状のプライマーであるSK38（配列番号:43）及びSK39（配列番号:44）を用いて実施した。増幅産物は、プローブとしてSK19（配列番号:45）配列を用いるインサイチューでのハイブリダイゼーション段階を経て検出した。
線状のプライマーと本発明のFRET−標識したヘアピンプライマーを用いたインサイチューでのPCRは、数カ所の変更を加えて本質的には17節に記載されているように行った。組織の薄片はシランの被覆を施したガラス製顕微鏡スライドに付着してから、10％の中性緩衝ホルマリンで１週間固定化し、続いて当業者に既知の標準的な方法を用いてパラフィン包埋培地中に包埋した。薄片を脱パラフィンした（５分間キシレンを用いて、続いて５分間100％のエタノールによってインキュベートした）。その試料を2mg/mlのペプシンを用いて30分間、前処理した。それから１試料あたり10−20μｌの増幅混合物をそのスライドに添加し、続いてそれを高圧滅菌したポリプロピレン製カバーガラスで覆ってから予め加熱したミネラルオイルを塗布した。
混合物50μｌあたりの増幅混合物は次の試薬からなる。
５μｌのPCR緩衝液II（Perkin−Elmer）
９μｌのMgCl2（最終濃度は4.5mM）
８μｌのdNTP（最終濃度はそれぞれ200μＭ）
1.5μｌの２％BSA
２μｌの修飾したSK38オリゴヌクレオチド（最終濃度は0.2μＭ）
２μｌのSK39オリゴヌクレオチド（最終濃度は0.2μＭ）
21.5μｌのDEPC−処置した水
１μｌのTaq−ポリメラーゼ（Perkin−Elmer 5U/μｌ）
続いてインサイチューでの増幅を、「ホットスタート（hot start）」のプロトコールを用いて熱サイクラーで35サイクル行った。Taqポリメラーゼは、そのブロックが55℃に到達するまで増幅混合物に使用させず、それからDNA試料を94℃で３分間加熱することによって初めに変性させ、その後、94℃で１分間の変性と、60℃で1.5分間のアニーリング／伸長を行うサイクルを開始した。
PCR増幅を行った後で、非常に厳重に洗浄を行った（PCR後10分間、15mMの塩と２％のBSA中、60℃で）。続いてその試料に含まれる細胞のMETシグナル強度を蛍光顕微鏡を用いて測定した。
18.3.  結果
図34は、早期にHIV−１感染した患者から採取したリンパ節組織に含まれるgag陽性細胞であって、線状プライマーと本発明のFRET−標識したヘアピンプライマーを用いてインサイチューでPCRを行った後のものを示す。
図35は、より増幅度を高めた組織試料についての同じ見方のものを示す。gag陽性細胞は強いシグナルを示し、調製物中のバックグランドは小さかった。
図36は負の対照を示しており、そこではTaqポリメラーゼが増幅混合物に含まれていなかった。gag陽性細胞は観察されなかった。
図37も、線状プライマーとFRET−標識したヘアピンプライマーを用いてインサイチューでPCRを行った後の、HIV−１感染した患者から採取したリンパ節組織を示す。gag陽性細胞が見られる。しかしながらバックグランドに対するシグナルの比は図34及び35に示された比よりも小さい。不十分なPCR後の洗浄が行われたことで他の細胞の細胞質のバックグランド以外のいくつかの細胞にシグナルが存在している。
図38は線状のプライマーとFRET−標識したヘアピンプライマーを用いてインサイチューでPCRを行った後の、AIDS痴呆で死亡した患者の大脳におけるHIV−１陽性ニューロンを示している。バックグランドに対するシグナルの良好な比について注目されたい。
18.4.  考察
HIV−感染した患者から得られ、したがってHIV gag鋳型に対して陽性であることがわかっている細胞は蛍光シグナルを示したが、gagに対して陰性であると予測された細胞はシグナルを示さなかった。
19.実施例13:カスケード回転サークル増幅（CRCA）アッセイにおけるヘアピンプライマーの使用
19.1.  方法及び結果
一つのヘアピン（MET）プライマーと一つの非−ヘアピンプライマーを用いて行ったカスケード回転サークル増幅（CRCA）を用いることによって、モデル標的配列、すなわちPUC19へのハイブリダイゼーションでDNAリガーゼを用いて連結反応を行うことにより環状にされる「パッドロック（padlock）」プローブを増幅することができる（Nilssonら、1994,Science 265:2085−2088）とともに、バックグランドに対するシグナルが高い比になるのを達成でき、かつ10までの鋳型サークルの感度を達成できる。回転サークル（前進）ヘアピンプライマー１もしくは２（配列番号:46−47）または反転ヘアピンプライマー１もしくは２（配列番号48−49）のいずれかが、FAM/DABCYL MET対を用いて標識された（図32参照）場合、８単位のBstDNAポリメラーゼ、すなわち増幅反応において大きな断片を用いてアガロースゲル分析を行ったところ、正常のカスケード産物が観察された。
CRCA反応は以下のプライマーの対（図32参照）を用いて行った。すなわちMET−標識したヘアピンの前進（回転サークル）プライマー１（配列番号:46）と非−ヘアピン反転プライマー（配列番号51）、MET−標識したヘアピン前進プライマー２（配列番号:47）と非−ヘアピン反転プライマー（配列番号:51）、非−ヘアピン前進（回転サークル）プライマー（配列番号:50）とMET−標識したヘアピン反転プライマー１（配列番号:48）、及び非−ヘアピン前進（回転サークル）プライマー２（配列番号:50）とMET−標識したヘアピン反転プライマー２（配列番号:49）である。
数マイクログラムの二本鎖DNA産物が、64℃で１時間かけた25μｌの反応で発生した。強いMETシグナルが、対照反応（リガーゼのないもの）でのバックグランドレベルに比較した蛍光測定分析で検出された。蛍光産物はまた、光透過装置上の反応チューブを直接可視化することによっても観察された。
図33に図示されているように、バックグランドにかぶさったMETシグナルが、10鋳型サークル（＋リガーゼ）と同じくらいの数で明らかに観察された。図33に図示されたCRCAは、標識されていない非−ヘアピン前進（回転サークル）プライマー１（配列番号:46）とMET−標識したヘアピン反転プライマー１（配列番号:48）を用いて実施した。鋳型サークルは標的としてpUC19を用いて作られた環状になったプローブであった。大きな断片である８単位のBstポリメラーゼを用い、CRCA反応を64℃で１時間実施した。リガーゼを含まないところでの全てのプローブ濃度で、シグナルは低いままであり、このことは環状になった鋳型がCRCAに対して必要であること、及びヘアピンプライマーが潜在的に導入される可能性のある非−特異性の反応が抑制されることを証明している。
さらにCRCA産物は、最初のプローブの連結反応の連結部位でのみ切断する制限的なエンドヌクレアーゼであるHae IIIを用いて切断した。この切断によってそのプローブの単位の長さの二本鎖産物が得られ、このことは増幅された産物が真のCRCA産物であることを証明している。
CRCAはまた、反転プライマーがFAM/DABCYL MET対（図32に示されたようなヘアピン反転プライマー１または２のいずれか）で標識したヘアピンプライマーである場合にも実施し、これに対して前進プライマーが修飾されていないヘアピンプライマー（図32に示されているような前進ヘアピンプライマー１または２のいずれかに同じで、MET部分を引いたもの）である場合にも実施した。ヘアピン前進プライマーと非−ヘアピン反転プライマーを用いた上述した結果と同様に、バックグランドにかぶさってMETシグナルが明らかに観察されたし、また正常の低いバックグランドのシグナルが観察された。二つのヘアピンプライマーを使用すると、標的やゲノムのDNAとプライマーとの間の非−特異性の相互作用を抑制することによって、特異性を改善できるとともに、他の標的システムの持つバックグランドを減少させる。
非−ヘアピン前方（回転サークル）プライマー（配列番号:50）、MET−標識されたヘアピン反転プライマー１（配列番号:48）及びラス標的特異性配列（配列番号:53）を用いたCRCAは、ラス突然変異体及び野生型配列を検出するために行った。連結反応を行ったが、そこでは連結部がラス配列（配列番号:53）のコドン12で正しい塩基対または間違った塩基対を含んでいた。METシグナルは、正しく対が形成されたＡ・Ｔ連結反応が、〜104までの投入標的分子に希釈された場合に検出されたが、これに対して間違った対が形成されたＡ・Ｇ反応では108分子が検出のためには必要であり、このことは正しい塩基対と間違った塩基対との間に約10,000倍の識別力があることを示している。
本発明は、この明細書に記載した特殊な態様によって範囲に制限を加えるべきではない。実際に、ここに記載したそれらの他の本発明のさまざまな変形は前述した説明と添付した図面より当業者に明らかであろう。このような変形は付随する請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
種々の刊行物を本明細書に引用したが、その開示内容はその全体が参照文献として組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図２】
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【図１８Ａ】
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【図２８Ａ】
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【図３】
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【図２４Ａ】
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【図４】
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【図１２】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ｂ】
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【図２８Ｂ】
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【図５】
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【図２３】
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【図６】
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【図７】
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【図２４Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図１５Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図２０Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図２４Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１９】
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【図２７】
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【図１６】
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【図２４Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図２４Ｅ】
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【図１７Ｂ】
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【図２４Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２４Ｇ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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