(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５４ｋＤの分子量を有しており、チオールにより活性化され得、コレステロールにより阻害され得、天然形態にあるときに溶血活性を有するストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）のポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがＮ末端アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕを有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを含むことを特徴とするストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）感染からブタを防御することが可能なワクチン。
【請求項４】
別のストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）免疫原を更に含むことを特徴とする請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
ポリペプチドが担体に結合していることを特徴とする請求項３又は４に記載のワクチン。
【請求項６】
担体が莢膜多糖であることを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項３から６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
ブタ病原性ウイルス又は微生物に由来する付加的免疫原を含むことを特徴とする請求項３から７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項９】
免疫原がアクチノバチラス  プレウロプネウモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、偽狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパーボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、エリシプロトリックス  リューシオパシアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、パスツレラ  マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）及びボルデテラ  ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から構成される群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のポリペプチドに対して単一特異的に反応性の抗体。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と混合することからなる、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）による感染から哺乳類を防御することが可能なワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓのポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓに起因する疾患からブタを防御するためのワクチン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓポリペプチドに対して反応性の抗体及びこのようなワクチンの製造方法に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓは関節炎、敗血症、髄膜炎、心外膜炎、心内膜炎、多漿膜炎及び／又は肺炎により特徴付けられるブタの感染性疾患の主要な原因物質として同定された（Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，Ｆ．Ａ．；Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９：１−５（１９８３），  Ｖｅｃｈｔら；Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ７：  ３１５−３２１  （１９８５），  Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．；  Ｖｅｔ  ｒｅｃ．１０１：  ３７８−３７９  （１９７７），  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ら；  Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５４：  １７０−１７３  （１９９０），  Ｄｅｖｒｉｅｓｅら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１２７：  ６８（１９９０））。
【０００３】
罹患率が特に高いのは３〜１２週齢の子ブタである（Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｒ．Ｓ．及びＥｌｌｉｏｔ，Ｓ．Ｄ．；  Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．，  ７５：  ６９−７８  （１９７５），  Ｇｕｉｓｅら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１１７：  ４３−４４（１９８５），  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ；  Ｌ．Ｍ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ  ２８ｔｈ  Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．２０１−２１０  （１９８５））。全年齢のブタがこの細菌物質に対して感受性であるが、１４週齢以上のブタの致死率は低い（Ｇｕｉｓｅら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１１７：  ４３−４４  （１９８５），  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｊ．及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ；  Ｌ．Ｍ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ  ２８ｔｈ  Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．：  ２０１−２１０  （１９８５））。
【０００４】
この生物は他の動物種及びヒトにおける疾患に関連する場合もある（Ｄｅｖｒｉｅｓｅら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１２７：  ６８（１９９０），  Ｈｏｍｍｅｚら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１２３：  ６２６−６２７  （１９８８），  Ａｒｅｎｄｓら；  Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １０：  １３１−１３７  （１９８８），  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら；  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：  ２６３３−２６３６  （１９８９），  Ａｒｅｎｄｓ，Ｊ．Ｐ．及びＺａｎｅｎ．Ｈ．Ｃ．；  Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １０：  １３１−１３７  （１９８８））。これらの症例の感染は通常は皮膚外傷を介して生じる。
【０００５】
Ｓ．ｓｕｉｓ疾患はＤｅＭｏｏｒ（ＤｅＭｏｏｒ，Ｃ．Ｅ．；  Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ２９：  ２７２−２８０  （１９６３））によりオランダ国から最初に報告された。それ以来、他のヨーロッパ諸国や、カナダ、米国及びオーストラリアから他の研究者が相次いで報告している（Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｅ．及びＴｉｌｋｅｒ，Ｍ．Ｅ．；  Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２３：  ５−９７  （１９８２），  Ｐｅｒｃｈら；  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：  ９９３−９９６  （１９８３），  Ｌａｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．及びＫｏｔｔ，Ｂ．；  Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｖｅｔ．Ｌａｂ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ  ２８ｔｈ  Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．：  １２１−１３０  （１９８５），  Ｇｕｉｓｅら；  Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１１７：  ４３−４４（１９８５），  Ｃｌｉｆｔｏｎ−Ｈａｄｌｅｙ，Ｆ．Ａ．；  Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎ．１３９：  １−５  （１９８３））。
【０００６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ株は多数の異なる血清型に亜分類された。
【０００７】
血清型決定は莢膜多糖抗原に基づく（Ｋｏｅｈｎｅら；  Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４０：  １６４０−１６４１  （１９７９），  Ｐｅｒｃｈら；  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：  ９９３−９９６  （１９８３））。
【０００８】
これまでに全世界で２９種の異なる血清型が検出されている。
【０００９】
しかしながら、数種の血清型は特定の国に片寄って発生している。スカンジナビア諸国では血清型７が最も多発し、オーストリアでは血清型９が最も多い。全世界中で見いだされる最も一般的な血清型は血清型２である（Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉら；  Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．６７：  ２０２−２０４  （１９８７），  Ｂｏｅｔｎｅｒら；  Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｂ  ９５：  ２３３−２３９（１９８７））。
【００１０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの病因、ビルレンス因子又は防御抗原についてはほとんど不明である。
【００１１】
従って、病原体に対する有効なワクチン接種に必要な因子も解明されていない。
【００１２】
細菌疾患に対するワクチンを製造するために一般に使用されている手段の１つは全細胞ワクチン調製物の製造及び試験である。
【００１３】
これはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓについても実施されており、全細胞ワクチンはブタにおいて同種抗原投与に対して顕著な防御を生じることが判明した（Ｈｏｌｔら；  Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．４８：  ２３−２７  （１９９０））。
【００１４】
しかしながら、全細胞調製物により得られる防御は血清型特異的であると思われる（Ｋｅｂｅｄｅら；  Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：  ２４９−２５７  （１９９０））。全細胞ワクチンの他の一般的な周知の欠点は、ａ）注入部位及びその周囲に望ましくない反応が生じ、ｂ）実際に防御の誘発に関与する物質の量に比較して大量の非特異的タンパク質を投与しなければならないという点である。
【００１５】
多糖莢膜に基づき現時点で既に２９種の異なるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型が公知であるという事実に鑑みると、全細胞をベースとするワクチンは広い防御を得るために多数の血清型を含むべきである。
【００１６】
肺炎レンサ球菌に起因する肺炎からヒトを防御するために実際にこのようなワクチンが製造されている（Ｂｏｕｌｎｏｉｓ，Ｇ．Ｊ．；  Ｊｏｕｒｎ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３８：  ２４９−２５９  （１９９２））。
【００１７】
このワクチンは最高頻度の血清型からの２３種の多糖を含む。このワクチンは複雑であること以外に、莢膜多糖の低免疫原性による重大な欠点がある。
【００１８】
従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの病因に関与すると思われる特定の因子を決定するために多数の試みがなされている。
【００１９】
潜在的ビルレンス因子として赤血球凝集素及びフィブリエが報告されているが、病因におけるそれらの厳密な役割又は機能は未知であり、夫々の分子又はタンパク質は同定されていない（Ｊａｃｑｕｅｓら；  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：  ２８３３−２８３８  （１９９０），  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら；  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８：  ２１５６−２１５８  （１９９０））。
【００２０】
これまでに次の４種のタンパク質が潜在的ビルレンス因子として提案されている。
【００２１】
ａ）４４ｋＤタンパク質（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら；  Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．
３０：  ５９−７１  （１９９２））、
ｂ）９４ｋＤタンパク質（Ｈｏｌｔら；  Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．  １００３：  ８５−９４  （１９９０））、
ｃ）１１０ｋＤタンパク質（ＥＦ：細胞外因子）（Ｖｅｃｈｔら；  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ５９：  ３１５６−３１６２  （１９９１），  Ｖｅｃｈｔら；  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６０：  ５５０−５５６  （１９９２），
Ｓｍｉｔｈ及びＶｅｃｈｔ；  ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１６６３０）、
ｄ）１３６ｋＤタンパク質（ＭＲＰ：ムラミニダーゼ放出タンパク質）（Ｖｅｃｈｔら；  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：  ３１５６−３１６２  （１９９１），  Ｖｅｃｈｔら；  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：  ５５０−５５６（１９９２），  Ｓｍｉｔｈ及びＶｅｃｈｔ；  ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１６６３０）。
【００２２】
４４ｋＤタンパク質はＳ．ｓｕｉｓ血清型２の病原株から検出され、非病原性突然変異株には存在しないように思われた。４４ｋＤタンパク質を欠失する突然変異株に対する抗血清は、親株に対する十分な防御を得るためには不十分であった。従って、このタンパク質はビルレンスに関与すると仮定される。
【００２３】
Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２の９４ｋＤタンパクに対するウサギ抗血清は、マウスにおいて同種抗原投与に対する防御を誘発することが判明した。
【００２４】
１１０ｋＤ及び１３６ｋＤタンパク質は病原性の高い株には存在するが、非病原性株には存在しないようであり、１１０ｋＤタンパク質は病原性の低い株には存在しないようである。
【００２５】
従って、１１０ｋＤ及び１３６ｋＤタンパク質は病因に関与すると予想される。他方、これらのタンパク質の単離物に基づく防御実験は未だに公表されていない。
【００２６】
要約すると、これまでに同定された全潜在的ビルレンス因子のうちで血清型２に対する防御に関与することが示されているのは４４ｋＤ及び９４ｋＤタンパク質のみである。この防御はマウスの同種抗原投与でしか実証されていない。
【００２７】
更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ血清型２株ではこれまでに上記４種のタンパク質の存在しか示されていない。
【００２８】
上述のように、多数の異なる血清型が存在するので、血清型から独立し且つ血清学的に交差反応性の防御抗原がワクチンの主成分として明らかに好適である。このような抗原はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓでは報告されていない。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの株には、チオールにより活性化され得、コレステロールにより阻害され得且つ溶血活性を示す分子量約５４ｋＤのポリペプチドを分泌するものがあることが意外にも知見された。
【００３０】
全ての溶血毒素は膜完全性及び／又は機能を破壊することにより哺乳動物細胞を損傷させる現象を生じさせる。この破壊は細胞膜に一旦取り込まれた毒素のオリゴマー形態による孔構造形成によると予想される。
【００３１】
本発明の溶血ポリペプチドはチオール活性化毒素であることが判明した。チオール活性化毒素は還元状態のみで活性であり、酸化後に可逆的に活性を失う（Ｓｍｙｔｈ，Ｃ．Ｊ．及びＤｕｎｃａｎ，Ｊ．Ｌ．；  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｊｅｌｊａｓｚｅｗｉｃｚ，  Ｊ．及びＷａｄｓｔｒｏｍ，Ｔ（編）  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ａｃｅｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ：  １２９−１８３  （１９７８））。
【００３２】
チオール基の役割は解明されていないが、膜を傷つけるために必須の配列モチーフの重要な部分であると推定される。
【００３３】
ある種の溶血素の細胞溶解作用の背後の機序から判断すると、溶血ポリペプチドは哺乳動物細胞膜内でコレステロールに結合すると仮定される。タンパク質は細胞に一旦結合すると、脂質二重膜に侵入する。こうしてオリゴマー溶血素複合体が形成され、トランスメンブラン孔を形成すると仮定される。
【００３４】
本発明のポリペプチドの溶血活性はコレステロールにより阻害され得る溶血素群に属することが立証された。コレステロールは溶血素がそれに感受性の細胞と結合する際に重要な役割を果たすと思われる。コレステロールが細胞との結合における毒素の主要結合部位であるような数種のモデルが提案されている。遊離コレステロールは細胞溶解活性の強力な阻害剤であり、このことは毒素上のステロール結合部位が（遊離）コレステロールにより占められるならばもはや（膜結合）コレステロールに結合し得ないという事実により説明することができる（Ｂｏｕｌｎｏｉｓら；  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：  ２６１１−２６１６  （１９９１））。
【００３５】
本発明の溶血ポリペプチドは約５４ｋＤの推定分子量を有する。この分子量は実施例２に記載するようなポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する標準化方法に従って決定した。図１のレーンＣはマーカー分子（レーンＡ及びＤ）の間で精製ポリペプチドを示す。
【００３６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの株の１種であるＰ１／７株の溶血ポリペプチドは更に、そのＮ末端アミノ酸配列の決定により特徴付けられた。配列番号１はポリペプチドのＮ末端配列を示す。溶血ポリペプチドは数種のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ株から単離することができるが、全株から単離できるわけではない。夫々の溶血ペプチドを産生するＳ．ｓｕｉｓ株における溶血ポリペプチドをコードする遺伝子の核酸配列には僅かな改変が存在してもよい。これらの改変により形成される新しいトリプレットが同一アミノ酸をコードするのであればポリペプチドのアミノ酸配列に何ら影響し得ない。例えばロイシンをコードするトリプレットＣＴＧ中のＧが同様にロイシンをコードするＣにより置換された場合がこれに相当する。一方、ＴがＣにより置換されるならば、新たに形成されるトリプレットはロイシンでなくプロリンをコードする。この結果、溶血ポリペプチドのアミノ酸配列に変異が生じる。
【００３７】
アミノ酸配列中の変異は１種以上のアミノ酸が機能的等価物により置換された結果であり得、あるいはより低頻度であるが終止コドンの導入の結果であったり、核酸配列中の欠失／挿入の場合には１種以上のアミノ酸の挿入又は欠失の結果であったりする。多くの場合は機能的等価物による置換である。Ｎｅｕｒａｔｈら（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  ＹＯｒｋ  （１９７９），  １４頁、図６）により記載されている例は、アミノ酸アラニンからセリンへの置換Ａｌａ／Ｓｅｒ、又はＶａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ等である。上記機能的に等価なアミノ酸による置換をもたらす変異以外に、１種のアミノ酸を機能的等価物ではない別のアミノ酸により置換した変異もあり得る。この種の変異は、その空間的折り畳みに僅かな改変を有するタンパク質を生成し得るという点のみが、機能的等価物による置換とする。
【００３８】
言うまでもなく、ポリペプチドの免疫原活性が維持されるように溶血ポリペプチドのアミノ酸配列に変異をもたらすように溶血ポリペプチドをコードする核酸配列が変異している場合も本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
本発明は更に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染からブタを防御することが可能であり、上記溶血ポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペプチドに対して免疫応答を誘発することが可能なその一部を含むワクチンに係る。このようなワクチンは例えば本発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペプチドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一部に似せた合成ポリペプチドを使用することにより製造することができる。
【００４０】
このようなワクチンの別の製造方法は細菌培養物からの溶血ポリペプチドの生化学的精製である。この方法は、例えば細菌の遠心分離と、溶血ポリペプチドを他の成分から分離するためのゲル濾過カラムの使用により実施することができる。例えば選択的硫安沈殿により精製した後、遠心分離し、ペレットを適切な緩衝液に溶解させてもよい。
【００４１】
このようなワクチンは例えば分子クローニング法により製造することもできる。この方法では、本発明のポリペプチド又はＳ．ｓｕｉｓの溶血ポリペプチドに対する免疫応答を誘発することが可能なその一部をコードする核酸配列を発現ベクターにクローニングし、その後、適切な発現系で発現させる。その後、発現産物をワクチン中で使用することができる。使用可能な発現系としては、細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞発現系を挙げることができる。
【００４２】
ポリペプチドの別の製造方法は、ポリペプチドの遺伝情報を適切なウイルスベクターにクローニングし、ウイルスの宿主細胞を使用してタンパク質を発現させる方法である。このような系は例えばワクチニアウイルスベクターと感受性哺乳動物細胞の組み合わせ、又はバキュロウイルスベクターとＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の組み合わせである。その後、発現されたポリペプチドを含む細胞溶解物をそのまま又は精製してワクチンベースとして使用することができる。
【００４３】
更に別のアプローチは、ブタを宿主動物とするウイルスを所謂組換えキャリヤー生ウイルス（ＬＲＣ：Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒ）として使用する方法である。このＬＲＣは付加的遺伝情報をクローニングしたウイルスである。この組換えウイルスに感染した動物はベクターウイルスの免疫原に対してのみならず、その遺伝コードが組換えウイルスに付加的にクローニングされるポリペプチドの免疫原部分に対しても免疫原応答を生じる。
【００４４】
外来ブタ病原性生物からの遺伝情報を運搬するための組換えキャリヤー生ウイルスとして特に有用なウイルスは偽狂犬病ウイルスである。このウイルスは例えば偽狂犬病／豚コレラウイルス混合ワクチン接種のためのＬＲＣとして既に使用され、成功している。
【００４５】
好適形態によると、本発明のワクチンは更に他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓ免疫原を含む。
【００４６】
Ｓ．ｓｕｉｓ血清型２溶血ポリペプチドに対する抗血清はその血清型に関係なく他の全溶血産生Ｓ．ｓｕｉｓ株の溶血素に対して反応性であることが判明した。
【００４７】
これは上記４４ｋＤ、９４ｋＤ、１１０及び１３６ｋＤＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓポリペプチドでは立証されていない。
【００４８】
しかしながら、これらのうちの１種又は他の任意のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ免疫原を付加的に含有する本発明のワクチンは、更に優れた効果を有する。この高い効果は例えば相乗効果の結果であると思われる。従って、抗原負荷が更に低く、より有効なワクチンを製造することができる。
【００４９】
より好適な形態によると、本発明のワクチンは更に本発明のポリペプチドに結合した担体を含む。担体としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミンのような他の分子のみならず、複合糖分子も使用できる。
【００５０】
更に好適な形態によると、本発明のワクチンは本発明のポリペプチドに結合した莢膜多糖を含む。
【００５１】
ポリペプチドと炭水化物との共有結合方法は例えばＤｉｃｋ，Ｗ．Ｅ．及びＢｅｕｒｔ，Ｍ．；  Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：  ４８−１１４  （１９８９）により記載されている。
【００５２】
当然のことながら、他の種類の担体又はポリペプチドと炭水化物の他の結合方法も本発明の範囲に含まれる。
【００５３】
別の態様によると、本発明のワクチンは更に他のブタ病原生物及びウイルスからの抗原を含む。このような生物及びウイルスは例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、偽狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパーボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａである。
【００５４】
本発明のワクチンは好適形態によると更にアジュバントを含有し得る。アジュバントは一般に宿主の免疫応答を非特異的に追加免疫する物質からなる。種々多数のアジュバントが当業者に公知である。アジュバントの例はフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（登録商標）、鉱物油（例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｋｏｌ（登録商標））、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。
【００５５】
ワクチンは更に所謂「ベヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）」を含有し得る。ベヒクルはポリペプチドが共有結合せずに付着する化合物である。しばしば使用されるベヒクル化合物は例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン及びベントナイトである。
【００５６】
抗原が部分的にベヒクルに埋包されるこのようなベヒクルの特殊形態は所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２，  ＥＰ１８０．５６４，  ＥＰ２４２．３８０）である。
【００５７】
更に、ワクチンは１種以上の適切な表面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを含有し得る。
【００５８】
多くの場合、ワクチンを安定剤と混合し、例えば分解し易いポリペプチドが分解しないようにしたり、ワクチンの寿命を強化したり、凍結乾燥効率を改善する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：  ５０９  （１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストラン又はグルコース）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）又はその分解産物、及び緩衝剤（例えばアルカリ金属リン酸塩）である。更に、ワクチンを生理学的に許容可能な希釈剤に懸濁してもよい。
【００５９】
言うまでもなく、アジュバントを添加し、ベヒクル化合物又は希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳化又は安定化する他の方法も本発明に含まれる。
【００６０】
別の態様によると、本発明のポリペプチド又はその抗原部分に対して単一特異的に反応性の抗体を使用し、受動的免疫を付与する。
【００６１】
単一特異的抗体は、本発明の５４ｋＤポリペプチド又はその一部と反応することが特異的に可能であり、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ抗原に対しては特異的に反応しない抗体である。
【００６２】
病原体に対する抗体を受動的免疫感作で首尾よく使用することができる。この種の療法の利点は、感染時投与に抗体を利用できるという点にある。従って、宿主の免疫系が活性化され、十分に高い防御レベルを生じるまで待つ必要がなく、時間の損失がない。特に感染が既に発生している場合や疾患が進行中の場合に抗体を投与すると、病原体及び病原体により生成される毒素から動物を即座に回復させることができる。従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ感染後にＳ．ｓｕｉｓ溶血ポリペプチドに対する抗体を利用してブタを疾患から防御することが可能なワクチンも本発明の範囲に含まれる。
【００６３】
本発明は更に、本発明のポリペプチドを医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と混合することからなる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓによる感染に対して哺乳動物を防御することが可能なワクチンの製造方法も提供する。
【００６４】
【実施例】
実施例１
細菌株
Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２株Ｐ１／７及び６８８／９は英国、ケンブリッジ大学のＴ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ博士により提供された。タイプ２株４００５、Ｄ２８２、３９２１、３９７７、３８８９及びＴ１５はオランダ国、Ｌｅｙｓｔａｄ，ＣＤＩ−ＤＬＯのＵ．Ｖｅｃｈｔ博士から入手した。タイプ７株１０６８１、１０７２７及び１４３９１はデンマーク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＩｎｔｅｒｖｅｔＳｃａｎｄｉｎａｖｉａのＢ．Ｎｉｅｌｓｅｎ博士により提供された。参照株１〜２２はデンマーク、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪ．Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ博士から入手した。
【００６５】
株Ｂ１０、血清型１はオランダ国、Ｄｅｖｅｎｔｅｒの“Ｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｔ  ｖｏｏｒ  ｄｉｅｒｅｎ，  Ｏｏｓｔ−Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ”から入手した最新のフィールド単離株である。
【００６６】
株ＮＶ９２１０９血清型８、２２０８９ＫＭ血清型９及び２２０８９１ＧＶ血清型１４は疾患ブタからの最新フィールド単離株である。
【００６７】
細菌培養物
細菌株をヒツジ血液寒天上で画線し、２４時間３７℃で培養した。バッチ培養物中の溶血素産生を定量するために、数個のコロニーを１００ｍｌ  トッド−ヒューイットブロス（Ｄｉｆｃｏ）に接種し、指数増殖期の終わりまで（通常５〜６時間）３７℃で培養した。次に１０，０００×ｇで１０分間遠心分離により細胞を除去し、上清を使用時まで−２０℃で保存した。
【００６８】
溶血素阻害試験
血清の溶血素阻害力価を決定するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４）を希釈剤として使用し、深いウェルを有するタイタープレート中で試験血清の連鎖２倍希釈液（２μｌ）を調製した。次に、２５溶血単位を含有する溶血素溶液７５μｌを各ウェルに加えた。２０℃で１０分間インキュベーション後、２％（洗浄）ウマ赤血球懸濁液１５０μｌを各ウェルに加え、溶血活性の滴定に関して上述したように試験を行った。溶血の５０％阻害を最小限度で生じる最高希釈度として力価を決定した。１：１２８に予備希釈した７５μｌの血清Ｐ３９９及び種々の株の未希釈培養物上清７５μｌを使用して、（Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２から誘導される）精製溶血素に対する特異的ブタ血清Ｐ３９９が種々の（血清型）株により生じる溶血活性を阻害する能力を単一ウェル中で試験した。その後、上記のように試験を完了した。同様に１：１２８に予備希釈した予備免疫血清を対照（最大溶血）として使用した。血清Ｐ３９９が予備免疫血清に比較して溶血を＞５０％阻害した場合には交差中和が明白であった。最大溶血（予備免疫血清）がバックグラウンド（血清Ｐ３９９）の２倍に達しないので、溶血素力価＜２４のサンプルはこの試験では結果を与えない。
【００６９】
実施例２
溶血素の精製
株Ｐ１／７の一晩培養物２５０ｍｌを３７℃のトッド−ヒューイットブロス１２リットル中で嫌気性条件下で６時間成長させた後、細胞を連続フロー遠心分離により除去した。培養物上清を４℃に冷却し、０．８μｍフィルターに通した後、ＰＴＣＧ１０，０００ＮＭＷＬフィルターで１５０ｍｌに濃縮した。０．２μｍフィルターを通した後、１．０ｍｌずつをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル濾過カラム（ＦＰＬＣ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加え、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する４０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）で溶離した。０．５ｍｌフラクションを集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング及び溶血素試験で分析した。溶血ピーク活性はフラクション３５〜４５で溶出した（図２）。
【００７０】
種々のカラムフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングで分析した結果、溶血活性は約５４ｋＤの単一抗原と同時に移動することが判明した（図３）。溶血フラクション３５〜４５をプールし、５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４で４℃で３時間選択的に沈殿させることにより微量の汚染物質を除去した。遠心分離後、ペレットを４０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに再懸濁した。この最終調製物はクーマシーブリリアントブルーで染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で約５４ｋＤの単一ポリペプチド種として出現し（図１）、β−メルカプトエタノールで還元後に約０．７×１０６溶血単位／ｍｇの比活性を有していた。
【００７１】
タンパク質定量
ウシ血清アルブミンを標準として使用してＬｏｗｒｙら（Ｌｏｗｒｙら；  ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５  （１９５１））の方法によりタンパク質濃度を測定した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング
Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．；  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：  ６８０−６８５  （１９７０））に記載の方法に概ね従って９％スラブゲル及びサンプル調製物中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ポリペプチドをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色するか又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。ブロットをポリクローナルウサギ血清Ｒ２０８９又はポリクローナルマウス血清Ｍ１８９でプローブした（抗血清の項参照）。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス結合体及び基質としてジアミノベンジジンを使用して結合抗体を可視化した。
【００７３】
種々の処理後の溶血活性
全処理とも力価２７を有する４０ｍＭリン酸緩衝塩水溶液（ｐＨ７．２）中の精製溶血素０．５ｍｌずつを使用した。
【００７４】
−２０℃、４℃、２０℃、３７℃及び１００℃の各温度で溶血素をインキュベーション後に溶血アッセイで温度差の効果を測定した。プロテイナーゼ−Ｋ効果処理を試験するために、濃縮酵素溶液（２ｍｇ／ｍｌ）５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１０分間２０℃でインキュベートした。その後、溶血素アッセイで残留溶血活性を測定した。
【００７５】
β−メルカプトエタノールによる還元効果を試験するために、１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加え、１０分間２０℃でインキュベートした後、溶血素アッセイで活性を試験した。
【００７６】
Ｈ２Ｏ２による酸化効果を試験するために、１０％Ｈ２Ｏ２溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃で１０分間インキュベートした。その後、溶血素アッセイで残留活性を測定した。
【００７７】
１０％（ｗ／ｖ）ＴＬＣＫ溶液５μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃で１０分間インキュベートすることにより、ＴＬＣＫ（Ｎ−Ａ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、Ｓｉｇｍａ）によるチオール基のアルキル化効果を決定した。その後、溶血素アッセイで残留活性を測定した。
【００７８】
（１０％エタノール中）５％コレステロール１０μｌを溶血素溶液０．５ｍｌに加えた後、２０℃で１０分間インキュベートし、その後、溶血素アッセイで残留活性を測定することによりコレステロールの効果を試験した。
【００７９】
過剰のβ−メルカプトエタノール（２％最終濃度）を反応混合物の一部に加えた後、２０℃で１０分間インキュベートし、溶血活性を滴定することにより、所定の処理の還元による可逆性を試験した。
【００８０】
種々の処理が溶血活性に及ぼす効果を表１に示す。結果から明らかなように、溶血素は熱不安定性であり、プロテイナーゼ−Ｋ消化、Ｈ２Ｏ２による酸化及びＴＬＣＫによるアルキル化に対して感受性である。更に、溶血活性はコレステロールにより阻害される。β−メルカプトエタノールと共にインキュベーション後、活性の増加が検出され、Ｈ２Ｏ２で酸化した調製物に過剰のβ−メルカプトエタノールを加えると、溶血活性は回復した。ＴＬＣＫで処理した調製物に過剰のβ−メルカプトエタノールを加えると、溶血活性は部分的に回復した。この部分的な回復はＴＬＣＫと反応しなかった酸化チオール基の存在により説明することができる。温度及びコレステロールの効果はβ−メルカプトエタノールの添加により逆転しなかった。
【００８１】
夫々の試薬又は溶血素を省略した二重の試験サンプルは夫々の方法が溶血活性に及ぼす効果又は試薬が赤血球に及ぼす効果を夫々示さなかった。
【００８２】
溶血素に対する種々の赤血球種の感受性
力価２８を有する精製溶血素の還元（０．１％β−メルカプトエタノール）調製物を使用して種々の赤血球種（即ちヒト、ウシ、シチメンチョウ、ハト、マウス、ニワトリ、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ及びブタ）の感受性を試験した。「溶血活性の滴定」とほぼ同様に試験を行った。全赤血球は溶血素に対してほぼ同等に感受性であるように思われた。力価は２７（マウス、ネコ及びシチメンチョウ）〜２１０（ヒト）であった。
【００８３】
Ｎ末端アミノ酸配列
株Ｐ１／７から得た精製溶血素の最初の１６アミノ酸残基を自動エドマン分解により配列番号１に示すように決定した。
【００８４】
種々のＳ．ｓｕｉｓ株中の溶血素分子の分布
血清型株１〜２２を含む入手可能な全株をトッド−ヒューイットブロス中で指数増殖期の終わりまで（５〜６時間）培養し、その後、細胞を遠心分離により除去した。培養物上清中の溶血素分子の存在を溶血素アッセイ及びイムノブロッティングで決定した。全部ではないが多くの株は培養物上清中で種々の量の溶血活性を生じるように思われた（表２）。
【００８５】
低活性のサンプルを含む全溶血サンプルはコレステロール及びＨ２Ｏ２により阻害されるように思われた。更に、Ｈ２Ｏ２で酸化した調製物に過剰のβ−メルカプトエタノールを加えると、溶血活性は完全に回復した。
【００８６】
要約すると、大部分の株は免疫学的及び生化学的に溶血素に関連する培養物上清中で溶血活性を生じるように思われ、他の非関連溶血素では何の徴候も検出されなかった。
【００８７】
実施例３
ワクチン
精製溶血素、濃縮培養物上清又はプールしたＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１をベースとする４種のワクチン及びプラシーボワクチンを株Ｐ１／７から調製した。
【００８８】
比較のために、精製ＥＦをベースとするワクチンを調製した。
【００８９】
株Ｂ１０から濃縮培養物上清をベースとするワクチンを調製した。
【００９０】
ワクチンは次のように調製した。
【００９１】
均質なマイクロエマルジョンが得られるまで精製溶血素（４０μｇタンパク質／ｍｌ）をＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバントと１：１で混合した。このワクチンをＶＡＣ−ＳＬＹと命名した。
【００９２】
濃縮培養物上清を含有するワクチンは、ＰＴＣＧ濃縮物の一部（１．９ｍｇタンパク質／ｍｌ）を均質懸濁液が得られるまでＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバントと１：１で混合した。このワクチンをＶＡＣ−ＣＣＳと命名した。
【００９３】
第３のワクチンは、プール及び濃縮したＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムフラクション１９〜３１（２ｍｇタンパク質／ｍｌを含有）を均質懸濁液が得られるまでＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバントと混合（１：１）することにより調製した。カラムフラクション１９〜３１はＳ．ｓｕｉｓ株Ｐ１／７の細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含んでいたが、本質的に溶血素を含有していなかった。このワクチンをＶＡＣ−ＳＣＦと命名した。
【００９４】
第４のワクチンは、細胞上清を０．２μｍフィルターで濾過した後、６０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４で０℃で１６時間沈殿させることにより調製した。遠心分離後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、培養物上清の約１００倍の濃度の調製物を得た。
【００９５】
プラシーボワクチンは抗原溶液の代わりに４０ｍＭリン酸緩衝塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用した以外は上記と同様に調製した。
【００９６】
株Ｂ１０を使用し、上述のように６０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４で０℃で１６時間沈殿させることによりワクチンを調製した。
【００９７】
（ＮＨ４）２ＳＯ４の漸減勾配を使用して株Ｐ１／７培養物上清の疎水的相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフローカラム、高置換）後にＥＦワクチンを得た。（透析及び希釈後の）最終精製ＥＦ調製物は約１５０μｇ／ｍｌのＥＦを含有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によると、調製物は純度＞９５％であった。
【００９８】
抗血清
次のように精製溶血素に対する特異的ポリクローナルブタ血清（Ｐ３９９）を得た。４週齢のブタをワクチンＶＡＣ−ＳＬＹ  ２ｍｌで筋肉内経路（頸部）により免疫感作した。感作から２週間後、同一（量）のワクチン及びワクチン接種経路を使用してブタに追加免疫した。追加免疫から２週間後、ブタから採血し、血清を使用時まで−２０℃で保存した。
【００９９】
マウス防御試験
４週齢Ｂａｌｂ−Ｃマウスを４群に分け、ＶＡＣ−ＣＣＳ、ＶＡＣ−ＳＣＦ、ＶＡＣ−ＳＬＹ又はプラシーボワクチン０．５ｍｌを皮下経路によりワクチン接種した。感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路を使用してマウスに追加免疫した。追加免疫から２週間後、４×１０９ＣＦＵ／ｍｌを含有するトッド−ヒューイットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使用してマウスに腹腔内経路で抗原投与（０．５ｍｌ）した。抗原投与後、致死率を７日間記録した。
【０１００】
結果
抗原投与後、プラシーボをワクチン接種したマウスは３日以内に死亡し、ＶＡＣ−ＣＣＳ及びＶＡＣ−ＳＬＹをワクチン接種したマウスは完全に防御されたようであった（表３）。ＶＡＣ−ＳＣＦは部分的な防御しか誘発しなかった。このワクチンは株Ｐ１／７の細胞外で産生された抗原の大部分を含有していたが、本質的に溶血素を含有していなかった。
【０１０１】
結論
以上から結論すると、本発明の精製溶血素を含有するワクチンはマウスにおいて防御性である。従って、溶血素はビルレンス因子であり、Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２感染の有害な効果からマウスを防御するにはこの単一ビルレンス因子を中和すれば十分である。
【０１０２】
マウス異種防御実験
実験動物
Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏから入手したＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢）を使用した。
【０１０３】
実験手順
３０匹（２×１５）１群のマウス群に表６に示すように夫々のワクチン０．４ｍｌを１回皮下経路で接種するか、又はワクチン接種せずにおいた（３０匹１群）。ワクチン接種から４週間後に１群につき半数のマウスには株Ｂ１０（タイプ１）、残りの半数には株Ｐ１／７（タイプ２）の６時間培養物０．５ｍｌを腹腔内経路で免疫投与した。
【０１０４】
致死率を７日間記録した。株Ｂ１０は株Ｐ１／７（致死率１００％）に比較してマウスに対して低病原性であった（致死率約２０％）。そこで、Ｂ１０抗原投与群の疾患マウスの数も記録した。抗原投与直前に血液サンプルを採取し、プールした群血清をイムノブロットで試験した。
【０１０５】
結果
溶血素試験によると、株Ｂ１０（血清型１）の培養物上清は溶血活性が２９・５であり、株Ｐ１／７（血清型２）の培養物上清は活性が２７であった。即ち、株Ｂ１０は株Ｐ１／７の５倍の溶血活性を生じた。
【０１０６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によると、株Ｂ１０及びＰ１／７の両方の濃縮培養物上清は５４ｋＤタンパク質（ＳＬＹ）を含有しており、株Ｂ１０の濃縮培養物上清は活性が高いことから、５４ｋＤタンパク質の含有量が高いと思われた。
【０１０７】
精製ＥＦは５４ｋＤタンパク質を含有していなかった。
【０１０８】
抗原投与後、どちらの培養物上清含有ワクチンもマウスに同種及び異種防御を誘発することが判明した（表６参照）。株Ｐ１／７又はＢ１０の培養物上清を抗原として使用してプール群血清をイムノブロットで試験した処、どちらの培養物上清ワクチンも抗ＳＬＹ抗体を誘発することが判明した（表６）。抗Ｂ１０培養物上清では、抗Ｐ１／７培養物上清に比較して強い反応が検出された。イムノブロットで異種試験（Ｐ１／７培養物上清に対する抗Ｂ１０培養物上清及びＢ１０培養物上清に対する抗Ｐ１／７培養物上清）を行った処、５４ｋＤ抗原は主要又は唯一の反応性抗原であった。
【０１０９】
精製ＥＦをワクチン接種したマウスでは抗体は誘発されたが、高投与量であるにも拘わらず同種又は異種抗原投与から防御されなかった（表６）。
【０１１０】
結論
どちらの培養物上清ワクチンもマウスに同種及び異種防御を誘発した。異種試験時に５４ｋＤ抗原がイムノブロットにおける唯一又は主要な反応性抗原であるという事実は、ＳＬＹがマウスにおける交差防御因子であることを明示している。
【０１１１】
ブタ防御実験
ＶＡＣ−ＳＬＹ、ＶＡＣ−ＳＣＦ及びプラシーボを上述のように調製した。
【０１１２】
ＶＡＣ−ＳＬＹはＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント中２０μｇ／ｍｌの精製溶血素を含有していた。ＶＡＣ−ＳＣＦ（２ｍｇタンパク質／ｍｌ）はＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント中にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓの細胞外で産生されたタンパク質の大部分を含有していたが、本質的に溶血素を含有していなかった。
【０１１３】
４週齢のブタ９匹を各々３匹からなる３群に分け、ＶＡＣ−ＳＬＹ、ＶＡＣ−ＳＣＦ及びプラシーボ２ｍｌを（筋肉内、頸部）ワクチン接種した。最初の感作から２週間後、同一ワクチン及びワクチン接種経路を使用してブタを追加免疫した。ブースターから２週間後、４×１０９ＣＦＵ／ｍｌ（４）を含有するトッド−ヒューイットブロス中の株Ｐ１／７の６時間培養物を使用して静脈内経路（０．５ｍｌ）抗原投与した。感作の直前に血液サンプルを採取し、血清を使用時まで−２０℃で保存した。
【０１１４】
細菌再単離
剖検時に大脳、肺及び足根から、可能な場合には大部分の患部からスワブを採取した。成長した寸法に基づいて細菌成長を０、１、２、３又は４と採点した。
【０１１５】
結果
抗原投与後、プラシーボでワクチン接種したブタは、数個の関節損傷による跛行、外観の意気消沈及び高体温により特徴付けられる重度の臨床徴候を生じた。プラシーボでワクチン接種した３匹のブタのうち２匹は神経学的徴候を生じ、非常に重症であったため、安楽死させる必要があった。ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種したブタは対照と同一の臨床徴候を示したが、その程度は低かった。この群のうちの１匹は神経学的徴候を生じ、安楽死させる必要があった。ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタは最も軽症であった。この群のブタは軽度の徴候しか示さず、他の２群に比較して短期間に回復した。臨床結果を表４に要約する。解剖すると、プラシーボでワクチン接種したブタは重度の多発性関節炎に罹患しており、ほとんどの関節が冒されていた（表５）。ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種したブタも同様に多発性関節炎に罹患していたが、その程度は低く、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタのほとんどの関節は正常であった（表５）。
【０１１６】
プラシーボでワクチン接種した３匹のブタのうちの２匹及びＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した３匹のブタの全部の種々の組織から種々の量のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓが再単離されたが、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタからは再単離されなかった（「再単離合計得点」の項目の下に示した数は各群における合計動物から再単離された細菌の相対量を示す）（表５）。
【０１１７】
脳サンプルの組織学的試験（表５）の結果、ＶＡＣ−ＳＣＦでワクチン接種した２匹のブタ及びプラシーボでワクチン接種した２匹のブタに髄膜炎が検出された。
【０１１８】
結論
ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタは数日間で臨床徴候を示したが、これらの徴候はＶＡＣ−ＳＣＦ又はプラシーボでワクチン接種したブタに比較すると著しく軽度であり且つ短期間であった。解剖すると、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタはＶＡＣ−ＳＣＦ又はプラシーボでワクチン接種したブタに比較して繊維性関節炎が軽度であり、頻度も低かった。更に、ＳＣＦでワクチン接種した２匹のブタ及びプラシーボでワクチン接種した２匹のブタは髄膜炎に罹患していたが、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタのうちで髄膜炎に罹患しているものは皆無であった。更に、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタの肺、関節及び脳は無菌であったが、他の２群のこれらの器官の大部分からはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓタイプ２が再単離された。イムノブロットでは、ＶＡＣ−ＳＬＹでワクチン接種したブタの血清（抗原投与日に採取）は全培養物上清中の５４ｋＤの単一抗原バンドと反応し、溶血素が免疫原性であること及び溶血素調製物が高純度であることが確認された。
【０１１９】
以上の結果から明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ溶血素は重要な因子であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ感染の有害な作用からブタを高度に防御し、種々の器官／組織から細菌を除去するためにはこの単一因子を中和すれば十分である。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル配列：ＮＯ
フラグメント型：Ｎ末端
起源
生物名：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ
株名：Ｐ１／７
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【図面の簡単な説明】
【図１】低分子量マーカー（レーンＡ）、濃縮培養物上清（レーンＢ）、精製Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ溶血素（レーンＣ）及び高分子量マーカーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。左右の数字はマーカータンパク質の分子量を示す。
【図２】Ｓ．ｓｕｉｓタイプ２株Ｐ１／７の濃縮培養物上清のＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２クロマトグラフィーのエマルジョン曲線。実線：２８０ｎｍの吸光度、破線：溶血素力価。
【図３】マーカータンパク質（レーンＡ）、株Ｐ１／７の濃縮培養物上清（レーンＢ）及びＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムフラクション（レーンＣ〜Ｎ）のウェスタンブロット。レーンＣ：フラクション１５、レーンＤ：フラクション１８、レーンＥ：フラクション２０、レーンＦ：フラクション２３、レーンＧ：フラクション２６、レーンＨ：フラクション２８、レーンＩ：フラクション３０、レーンＪ：フラクション３２、レーンＫ：フラクション３４、レーンＬ：フラクション３６、レーンＭ：フラクション３８、レーンＮ：フラクション４０。
マーカータンパク質（レーンＡ）はクーマシーブリリアントブルーで染色した。Ｓ．ｓｕｉｓ抗原（レーンＢ〜Ｎ）はウサギ血清でプローブした後、ヤギ抗ウサギ結合体及びジアミノベンジジンを基質として使用することにより染色した。マーカータンパク質の分子量を左側に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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