(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えグラム陰性腸内バクテリアホスト細胞であって、その染色体が
（ａ）第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子中に組み込まれる異種DNA断片であって、該DNA断片は第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある第二のコーディング配列を含んでなり、また前記ホスト遺伝子および前記第一のプロモータは前記ホスト細胞にとって内因性であり、且つ前記DNA断片の前記第一のコーディング配列が該内因性プロモータの転写制御下にあり、前記第一のコーディング配列が所望のポリペプチドをコードする異種DNA断片と、
（ｂ）前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異とを具備している組換えホスト細胞。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第一のコーディング配列が複数のポリペプチドをコードする細胞。
【請求項３】
請求の範囲第２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第二のコーディング配列が選別マーカータンパク質をコードする細胞。
【請求項４】
請求の範囲第３項に記載の組換えホスト細胞であって、前記選別マーカータンパク質の発現が前記細胞に対して抗生物質耐性を与える細胞。
【請求項５】
請求の範囲第４項に記載の組換えホスト細胞であって、前記選別マーカータンパク質の発現が前記細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与える細胞。
【請求項６】
請求の範囲第５項に記載の組換えホスト細胞であって、前記腸内バクテリアホスト細胞が、Erwinia chrysanthemi、Escherichia coli及びKlebsiella pneumoniaeからなる群から選択される細胞。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載の組換えホスト細胞であって、前記腸内バクテリアホスト細胞がEscherichia coli細胞である細胞。
【請求項８】
請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種DNA断片は、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の、内因性プロモータの転写制御下にある細胞。
【請求項９】
請求の範囲第８項に記載の組換えホスト細胞であって、前記内因性プロモータがピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータである細胞。
【請求項１０】
請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種DNA断片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞。
【請求項１１】
請求の範囲第10項に記載の組換えホスト細胞であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼがZymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる細胞。
【請求項１２】
請求の範囲第11項に記載の組換えホスト細胞であって、前記細胞はEscherichia coli細胞であり、前記内因性プロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも100％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞。
【請求項１３】
請求の範囲第12項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更に、スクシネート産生を阻害する突然変異を有している細胞。
【請求項１４】
請求の範囲第13項に記載の組換えホスト細胞であって、スクシネート産生を阻害する前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（frd）遺伝子における突然変異を含んでいる細胞。
【請求項１５】
請求の範囲第７項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更に、前記ホスト細胞内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞。
【請求項１６】
請求の範囲第15項に記載の組換えホスト細胞であって、組換えを阻害する前記突然変異がrecA遺伝子における突然変異を含んでいる細胞。
【請求項１７】
所定の方法の産物である組換えグラム陰性腸内バクテリアホスト細胞株であって、該所定の方法が、
（ａ）ホスト細胞にとって内因性である第一のプロモータと該第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト腸内バクテリア細胞を含む培養物を与える工程と、
（ｂ）前記培養物中のホスト細胞をDNA分子で形質転換する工程であって、
該DNA分子は、所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列を含んだ異種DNA断片であり、
かつ前記第一のコーディング配列が前記内因性のプロモータの転写制御下にあるように、相同性組換えによって、前記異種DNA断片の前記ホスト遺伝子内への組込みを生じる形質転換工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で製造された、前記第二のコーディング配列によってコードされる選別マーカータンパク質を第一レベルで発現するホスト細胞を選別する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られたホスト細胞をスクリーニングし、前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞を、前記染色体中に突然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
（ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞を、前記所望のポリペプチド又は前記選別マーカーポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験することにより、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大が、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備した細胞株。
【請求項１８】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記株がEsherichia coliの株であり、また前記方法が更に、
（ｉ）工程（ｂ）において、前記DNA分子はプラスミドであり、該プラスミドは複製が温度感受性であるレプリコンを含むことと、
（ii）工程（ｂ）において、前記ホスト細胞の形質転換には更に、前記プラスミドをホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選別マーカータンパク質を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で、且つ前記プラスミドが複製されない温度で増殖させることとが含まれ、これにより前記プラスミドが相同性組換えによって前記染色体のホスト遺伝子内に組込まれることと、
（iii）工程（ｃ）において、前記ホスト細胞の選別には更に、
（１）前記選別マーカータンパク質を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マーカータンパク質を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させることが具備され、ここで前記ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での非選別条件下で増殖されて、前記プラスミド及び前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列の前記ホスト遺伝子からの切除がもたらされ、更にここで、
（２）前記ホスト細胞は、前記プラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下において増殖され、前記第二のコーディング配列遺伝子および前記プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列を保持したホスト細胞がもたらされること
とを具備した細胞株。
【請求項１９】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、
（ｉ）工程（ｂ）において、前記DNA分子が複製能力のない閉環状DNAを具備することと、
（ii）工程（ｆ）において、前記ホスト細胞の試験が、工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞について、前記選別マーカータンパク質を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを選別し、次いで前記選別マーカータンパク質を前記第二レベルで発現する前記ホスト細胞を、所望のポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞についてスクリーニングすることとを具備した細胞株。
【請求項２０】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質が、前記ホスト株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
【請求項２１】
請求の範囲第20項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が、少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
【請求項２２】
請求の範囲第20項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与え、前記選別マーカータンパク質の前記第二レベルの発現が少なくとも100μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
【請求項２３】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列が、前記所望のポリペプチドをコードする前記第一のコーディング配列の下流にある前記異種DNA断片内に位置した第二のプロモータの転写制御下にある細胞株。
【請求項２４】
請求の範囲第23項に記載の細胞株であって、前記異種DNA断片が転写ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列と前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列との間に位置している細胞株。
【請求項２５】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記腸内バクテリアホスト細胞がErwinia chrysanthemi、Escherichia coliまたはKlebsiella pneumoniae細胞である細胞株。
【請求項２６】
請求の範囲第25項に記載の細胞株であって、前記腸内バクテリアホスト細胞がEscherichia coli細胞である細胞株。
【請求項２７】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記第一のプロモータは、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の内因性プロモータである細胞株。
【請求項２８】
請求の範囲第27項に記載の細胞株であって、前記第一のプロモータがピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータである細胞株。
【請求項２９】
請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記異種DNA断片が、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞株。
【請求項３０】
請求の範囲第29項に記載の細胞株であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがZymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる細胞株。
【請求項３１】
請求の範囲第30項に記載の細胞株であって、前記株はEscherichia coli株であり、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記株はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも100％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞株。
【請求項３２】
請求の範囲第26項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、スクシネート産生を阻害する突然変異を有している細胞株。
【請求項３３】
請求の範囲第32項に記載の細胞株であって、スクシネート産生を阻害する前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（frd）遺伝子における突然変異を含んでいる細胞株。
【請求項３４】
請求の範囲第26項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、前記ホスト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞株。
【請求項３５】
請求の範囲第34項に記載の細胞株であって、組換えを阻害する前記突然変異がrecA遺伝子における突然変異を含んでいる細胞株。
【請求項３６】
高レベルの所望のポリペプチドを産生する組換えグラム陰性腸内バクテリアホスト細胞株を製造する方法であって、
（ａ）ホスト細胞にとって内因性である第一のプロモータと該第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト腸内バクテリア細胞を含む培養物を与える工程と、
（ｂ）前記培養物中のホスト細胞をDNA分子で形質転換する工程であって、
該DNA分子は、所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列を含んだ異種DNA断片であり、
かつ前記第一のコーディング配列が前記内因性の第一のプロモータの転写制御下にあるように、相同性組換えによって、前記異種DNA断片の前記ホスト遺伝子内への組込みを生じる形質転換工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で製造された、前記第二のコーディング配列によってコードされる選別マーカータンパク質を第一レベルで発現するホスト細胞を選別する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られたホスト細胞をスクリーニングし、前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞を、前記染色体中に突然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
（ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞を、前記所望のポリペプチド又はマーカーポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験することにより、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のないホスト細胞による前記DNA断片にコードされた全てのポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備した方法。
【請求項３７】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記株がEsherichia coliの株であり、また前記方法が更に、
（ｉ）工程（ｂ）において、前記DNA分子はプラスミドであり、該プラスミドは複製が温度感受性であるレプリコンを含むことと、
（ii）工程（ｂ）において、前記ホスト細胞の形質転換には更に、前記プラスミドをホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選別マーカータンパク質を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で、且つ前記プラスミドが複製されない温度で増殖させることとが具備され、これにより前記プラスミドが相同性組換えによって前記染色体の前記ホスト遺伝子内に組込まれることと、
（iii）工程（ｃ）において、前記ホスト細胞の選別には更に、
（１）前記選別マーカータンパク質を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マーカータンパク質を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させることが含まれ、ここで、前記ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での非選別条件下で増殖されて、前記プラスミド及び前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列の前記ホスト遺伝子からの切除がもたらされ、更にここで、
（２）前記ホスト細胞は、前記プラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列および前記プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子を保持したホスト細胞がもたらされること
とを具備した方法。
【請求項３８】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記方法が更に、
（ｉ）工程（ｂ）において、前記DNA分子が複製能力のない閉環状DNAを具備することと、
（ii）工程（ｆ）において、前記ホスト細胞の試験が、工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞について、前記選別マーカータンパク質を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを選別し、次いで前記選別マーカータンパク質を前記第二レベルで発現する前記ホスト細胞を、所望のタンパク質を前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞についてスクリーニングすることとを具備した方法。
【請求項３９】
請求の範囲第36項に記載のホスト細胞株であって、前記選別マーカータンパク質が、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
【請求項４０】
請求の範囲第39項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が、少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
【請求項４１】
請求の範囲第39項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与え、前記選別マーカータンパク質の前記第二レベルの発現が少なくとも100μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
【請求項４２】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列が、前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列の下流にある前記異種DNA断片内に位置した前記第二のプロモータの転写制御下にある方法。
【請求項４３】
請求の範囲第42項に記載の方法であって、前記異種DNA断片が転写ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが、前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列と前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列との間に位置している方法。
【請求項４４】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記腸内バクテリア細胞がErwinia chrysanthemi、Escherichia coliまたはKlebsiella pneumoniae細胞である方法。
【請求項４５】
請求の範囲第44項に記載の方法であって、前記ホスト細胞がEscherichia coli細胞である方法。
【請求項４６】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記第一のプロモータが、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の内因性プロモータである方法。
【請求項４７】
請求の範囲第46項に記載の方法であって、前記第一のプロモータがピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）プロモータである方法。
【請求項４８】
請求の範囲第36項に記載の方法であって、前記異種DNA断片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする方法。
【請求項４９】
請求の範囲第48項に記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがZymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる方法。
【請求項５０】
請求の範囲第49項に記載の方法であって、前記株はEscherichia coli株であり、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記株はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも100％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる方法。
【請求項５１】
請求の範囲第45項に記載の方法であって、前記染色体が更に、スクシネート産生を阻害する突然変異を有している方法。
【請求項５２】
請求の範囲第51項に記載の方法であって、スクシネート産生を阻害する前記突然変異がフマレートレダクターゼ（frd）遺伝子における突然変異を含んでいる方法。
【請求項５３】
請求の範囲第45項に記載の方法であって、前記染色体が更に、前記ホスト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している方法。
【請求項５４】
請求の範囲第53項に記載の方法であって、組換えを阻害する前記突然変異がrecA遺伝子における突然変異を含んでいる方法。
【請求項５５】
ATCC 68484の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、Escherichia coliの組換えホスト株（pLOI510）。
【請求項５６】
ATCC 68485の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、Escherichia coliの組換えホスト株（pLOI543）。
【請求項５７】
ATCC 55123の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第17項に記載のEscherichia coli KO4の組換えホスト株。
【請求項５８】
ATCC 55124の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第17項に記載のEscherichia coli KO11の組換えホスト株。
【請求項５９】
ATCC 55125の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第17項に記載のEscherichia coli KO12の組換えホスト株。
【請求項６０】
ATCC 55126の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第17項に記載のEscherichia coli KO20の組換えホスト株。
【請求項６１】
請求の範囲第11項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞。
【請求項６２】
請求の範囲第30項に記載の株であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる株。
【請求項６３】
請求の範囲第48項に記載の方法であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、同時係属出願第07/352,062号（1989年５月15日出願）の一部継続出願である。この親出願は、もはや放棄された出願番号第07/239,099号（1988年８月31日出願）の一部継続出願である。
この発明に関する仕事は、一部はアメリカ合衆国エネルギー省基礎エネルギー科学局の補助金FG05−86ER3574号によって援助され、また一部はアメリカ合衆国農務省アルコール燃料計画の補助金88−37233−3987号によって援助された。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
〔発明の背景〕
本発明は、染色体中に安定に一組込まれ且つ内因性プロモータの制御下にあるポリヌクレオチド断片であって、ポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチド断片を具備した組換えホスト細胞に関する。例えば、組込まれた断片がチモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のような充分なエタノール産生体からのエタノール産生遺伝子を具備するとき、本発明の範囲内に包含される組換えEscherichia coli及び他の腸内細菌は、バイオマス由来の広範囲の糖を効率的にエタノールに変換することができる。この発明はまた、染色体に組込まれた異種の遺伝子（内因性プロモータの制御下に発現されるもの）によりコードされるタンパクの産生を増大する変異体と、このような変異体を同定する方法に関する。
グリコリシスの間に、細胞はグルコースのような単糖類をピルビン酸に変換し、ATPおよびNADHを産生する。酸化的リン酸化のための機能的な電子伝達系の不存在下においては、少なくとも95％のピルビン酸が、NAD＋を再生し且つグリコリシスの継続およびATP産生に対する不可避的要求を再生する短絡経路において消費される。これらNAD＋再生系の排出物は、通常、醗酵生成物と称される。
微生物は、夫々の属に特異的な一連の醗酵生成物において特に多様である。例えば、Krieg,N.R.,and J.G.Holt,eds.［1984］BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY（Williams ＆ Wilkins Co.,Baltimore）を参照のこと。これらの生成物には、ラクテート、アセテート、スクシネート及びブチレートのような有機酸、並びにエタノール、ブタノール、アセトン及びブタンジオールのような中性生成物が含まれる。実際に、バクテリアによる醗酵生成物は、その多様性によって、分類学における主要な決定因子として用いられる。上記Krieg and Holt［1984］を参照のこと。
醗酵の最終生成物は、幾つかの基本的な特徴を共有している。これら生成物は、それらが最初に産生される条件下では比較的無毒であるが、蓄積されると毒性を有するようになる。これらは、その直接の前駆体がグリコリシスにおいて最終的な電子受容体として働くため、ピルベートよりも低減される。これら醗酵生成物の微生物的産生は、バイオテクノロジーにおける我々の伝統的かつ経済的に最も成功した応用の基礎をなし、これら産物には酪農品、肉、飲料および燃料が含まれる。
殆どの燃料エタノールは、現在のところ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはチモモナス・モビリス（Z.mobilis）の何れかを利用して、コーン澱粉または甘蔗シロップ中のヘキソースから製造される。しかし、これらは比較的高価なバイオマス糖源であり、食品としての価値と競争している。加えて、醗酵の間に多量のヘキソースが、エタノールに変換されるよりも、むしろ微生物細胞を含むバイオマスに逆変換される。従来のエタノール産生微生物について、このバイオマスは、最良でも例えば栄養補足材のような限られた商業的価値しかもたず、従って高価な糖基質の非効率的な利用を与えるに過ぎない。
澱粉およびヘキソース糖は、植物における全炭水化物の単なる一部分にしか過ぎない。幹、葉、果皮、殻、コーンの穂軸等における植物炭水化物の主要な形態は、構造的壁を構成するポリマー、セルロース及びヘミセルロースである。これらポリマーの加水分解によって、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース及びアラビノースを含む中性糖混合物が放出される。天然に存在する微生物で、これら全ての糖（特にペントース）を迅速かつ効率的にエタノールまたは他の何れかの価値ある単一生成物に代謝するものは知られていない。
Escherichia coli（E.coli）および関連腸内細菌、嫌気的条件下での醗酵によって、バイオマス由来の全範囲の糖を代謝できる商業的に有用な微生物のうちの主要な微生物である。しかし、これら微生物は嫌気的発酵条件下において、少量のエタノールを含んだ可溶性生成物の経済的には分離できない混合物に糖を変換する。Ingram,L.O.,T.Conway,D.P.Clark,G.W.Sewell,and J.F.Preston［1987］Appl.Environ.Microbiol.53:2420−2425を参照されたい。然して、このような腸内細菌はバイオマス由来の全範囲の糖を効率的に利用するが、商業的に価値のある充分な収率および均一性で生成物を製造することはできない。
従って、E.coliのような或る種の腸内細菌が示すバイオマス由来の全範囲の糖の効率的な代謝と、エタノールのような商業的に価値ある単一の優勢な可溶性醗酵生成物を高レベルで産生する能力とを併有した微生物が必要とされている。更に、商業的に価値のあるタンパクのような付加的生成物を含む微生物バイオマスを、充分な収率および経済的な回収品質で製造できる微生物が必要とされている。
醗酵経路は、ピルビン酸を酸性生成物および中性生成物の混合物に変える。E.coliのような腸内細菌においては、二つの経路が有力である。ラクテートデヒドロゲナーゼは、NADHを直接NAD＋に酸化しながら、ピルベートの乳酸への還元を触媒する。ピルベート・ホルメート−リアーゼを含む第二経路はもっと複雑である。ピルベート・ホルメート−リアーゼ（ホルメート＋アセチル補酵素Ａへのピルベートの開裂を触媒する）は、E.coliの嫌気的代謝の中心的酵素である。何故なら、酵素は嫌気生活下での大部分のピルベートの代謝を担っているからである。ピルベート・ホルメート−リアーゼをコードするE.coli遺伝子（pf1遺伝子）がクローン化され、配列が決定されている。Christiansen,L.,and S.Pedersen［1981］Mol.Gen.Genet.181:548−551;Rodel,W.,W.Plaga,R.Frank,and J.Knappe［1988］Eur.J.Biochem.177:153−158を参照のこと。pf1遺伝子の前には多重プロモータが存在し、該遺伝子は嫌気生活によって高レベルの発現が誘導される。Sawers,G.,and A.Bock［1988］J.Bacteriol.170:5330−5336を参照のこと。
本発明の組換えホストにエタノール産生遺伝子を与えるために用いられるDNAは、例えば、Z.mobilisから単離される。これは、植物樹液および蜂蜜中に普通に見出だされる異常な代謝的特徴をもった微生物である。野生型Z.mobilisは長い間、リュウゼツラン樹液の醗酵でプルケ（メキシコのアルコール飲料）を製造するための天然の接種菌として、またパームワインのための接種菌として役立ってきた。上記のように、この微生物は燃料エタノール製造にも用いられ、そのエタノール産生速度は酵母のそれよりも実質的に高いことが報告されている。
Z.mobilisは栄養要求性が単純であり、且つアミノ酸類、ヌクレオチド類およびビタンミン類を合成することができるが、この微生物によって代謝される糖の範囲は著しく限定されており、通常はグルコース、フククトースおよび蔗糖からなる。これら糖の醗酵からの基質レベルでのリン酸化は、生合成およびホメオスタシオのための唯一のエネルギー源である。Z.mobilisは、たとえ栄養ブロスのような富裕培地中であっても、発酵可能な糖なしでは増殖できない。
Z.mobilisにおいては、ピルベートをエタノールに変換し且つNAD＋を再生するために二つの酵素、即ちピルベートデカルボキシラーゼ（DPC）およびアルコールデヒドロゲナーゼ、就中II型（ADH II）が必要とされる。Z.mobilisの細胞質内には個々のタンパクが、夫々の可溶性タンパクの２％〜５％に亘る高レベルで存在する。このような高レベルは、エネルギー生成のために要求される高速のNADH酸化およびグリコリシス流（glycolytic flux）にとって不可欠であると思われる。Z.mobilisのPDCおよびADH IIをコードする、pdc遺伝子およびadhB遺伝子のクローン化および配列決定が既に報告されている。Conway,T.,Y.A.Osman,J.I.Konnan,E.M.Hoffman,and L.O.Ingram［1987］J.Bacteriol.169:949−954;Conway,T.,G.W.Sewell,Y.A.Osman,and L.O.Ingram［1987］J.Bacteriol.169:2591−2597;Brau,B.,and H.Sahm［1986］Arch.Microbiol.146:105−110;Brau,B.,and H.Sahm［1986］Arch.Microbiol.144:296−301;Neale,A.D.,R.K.Scopes,R.E.Wettenhall,and N.J.Hoogenraad［1987］Nucleic Acid.Res.15:1753−1761;Ingram,L.O.,and T.Conway［1988］Appl.Environ.Microbiol.54:397−404;Ingram,L.O.,T.Conway,D.P.Clark,G.W.Sewell,and J.F.Preston［1987］Appl.Environ.Microbiol.53:2420−2425を参照のこと。
分子遺伝学は、E.coliのようなペントースを利用する腸内細菌の嫌気的代謝経路と、Z.mobilisのようなエタノール産生菌の効率的なエタノール産生経路とを、単一の微生物内で組み合わせることについての可能性を提供する。従って、E.coli、Erwinia chrysanthemiおよびKlebsiella planticolaのような腸内細菌におけるZ.mobilis pdc遺伝子の発現は、低レベルの本来のADH活性を用いることによって、ピルベートの流れを醗酵生成物としてのエタノールに部分的に転換する。PDCおよびADH IIをコードする多重コピープラスミド上のZ.mobilis遺伝子を有する組換えE.coliによって、より効率的なエタノール産生および高濃度のエタノールが得られている。上記Ingram et al.［1987］;Neal,A.D.,R.K.Scopes,and J.M.Kelly［1988］Appl.Microbiol.Biotechnol.29:162−167を参照のこと。E.coli B（pLOI297）株およびE.coli ATCC 15224（pLOI297）株は、エタノール産生および環境的耐性の点で優れた菌である。Alterthum,F.,and L.O.Ingram［1989］Appl.Environ.Microbiol.55:1943−1948を参照のこと。これら組換えE.coliは、グルコース、ラクトース及びキシロースを効率的にエタノールに醗酵させる。
上記組換えE.coliは、プラスミドに保持されたZ.mobilis由来のエタノール産生遺伝子を用いて、有用なレベルのエタノール産生を達成する。更に、多重コピープラスミドに外来遺伝子を配置することによって、プロトタイプ株におけるエタノール産生の初期試験が容易になる。しかし、プラスミドをホスト細胞内に確実に保持する選択圧（selective pressure）の不存在下において該プラスミドは本来的に不安定であるため、外来遺伝子は完全には安定ではない。更に、プラスミドの不適合性に起因して、エタノール産生遺伝子のための典型的なE.coli発現プラスミドを使用すると、有用なタンパクのような他の選ばれた生成物を産生する追加の外来遺伝子を、基本的な商業的エタノール産生株中に導入するための最も便利な手段が排除される。
〔発明の概要〕
本発明は有用なポリペプチドをコードする染色体に組込まれた異種遺伝子を、高レベルで発現する組換えホスト細胞に関する。本発明の一つの側面に従えば、このような組換え細胞は、まず所望のポリペプチド（類）をコードする異種DNA断片を、内因性プロモータ（好ましくは強力なプロモータ）の制御下でホスト細胞染色体中に挿入することによって得られる。次いで、形質転換された細胞は、任意に突然変異誘発物質で処理される。最後に、挿入されたDNA断片の発現が増大され、挿入されたDNA断片にコードされる夫々のポリペプチド産生の増大がもたらされる突然変異形質転換体を見付けるために、形質転換体は異種遺伝子の発現について、遺伝子選別または遺伝子スクリーニングにより試験される。
染色体に組込まれた異種遺伝子、並びに発現を増大させる突然変異は、増大した遺伝子発現の保持を選別する条件の不存在下においてさえ著しく安定である。また、この遺伝子工学的に加工されたホストは、移動性の遺伝子要素を有していないので、従来のプラスミドを基礎とした組換え産生系よりも環境的に安全である。
以下では、Zymomonas mobilisのような効率的なエタノール産生体からのエタノール産生外来遺伝子を用いて、全範囲のバイオマス由来の糖をエタノールに変換できる組換え腸内細菌のEsherichia coliについて詳細に例示される。これらエタノール遺伝子は、E.coliピルベート・ホルメート−リアゼ（pf1）遺伝子のための内因性プロモータの制御下で、組換えホストの染色体中に安定に組込まれる。このホストの染色体は更に、本発明に従うエタノール産生タンパクの製造を増大させる突然変異を含んでいる。これらの組換えホストは、エタノールと共に、商業的に価値あるタンパクのような他の望ましい生成物を効率的に同時産生するために、通常のE.coli発現プラスミドを収容することができる。従って、エタノール産生のための本発明のバクテリアによる大量醗酵から得られる残渣バイオマスは、任意に、一以上の追加の高価値生成物を多量に提供し得る。
特に、本発明の一つの側面は、組換えホスト細胞であって、その染色体が（ａ）該ホスト細胞にとって内因性であるプロモータの転写制御下にあり、且つ所望のポリペプチドをコードする異種DNA断片と、（ｂ）前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異で、該突然変異のない前記組換え細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記組換えホストによる前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらす突然変異とを具備した組換えホスト細胞に関する。前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される。一つの好ましい態様において、前記組換えホスト細胞の染色体は、複数の遺伝子をコードする異種DNA断片を具備する。この複数の遺伝子のうちの一つは、選別マーカー遺伝子であるのが有利である。
本発明はまた、下記の方法で得られる細胞株に関し、この方法は、
（ａ）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写制御下にある異種遺伝子を組込むためのホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培養物を与える工程と、
（ｂ）この培養物中のホスト細胞を異種DNA断片で形質転換する工程であって、該異種DNA断片が
（ｉ）選別マーカー遺伝子および所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、
（ii）相同的組換えによって、前記異種DNA断片によりコードされる複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内への組込みを可能にするために、前記ホスト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前記異種DNA断片中に正しく位置した配列
とを具備する形質転換工程と、
（ｃ）上記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（a first level）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別するする工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、ホスト細胞染色体中に突然変異が造り出される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
（ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験し、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異菌を得る工程とを具備する。
この発現増大は、前記突然変異のないホスト細胞による所望のポリペプチドの産生に比較して、ホスト細胞による所望のポリペプチドの産生増大をもたらす。更に、この組込まれた異種DNAの発現増大は、このような増大した発現を有する細胞を選別する条件の不存在下においても保持される。
本発明の好ましい態様において、上記の方法は、次のようにして更に改善される。
（ｉ）工程（ｂ）において、前記異種DNA断片には更に、複製が温度感受性であるレプリコンを含むプラスミドが具備される。
（ii）工程（ｂ）において、ホスト細胞を形質転換する前記方法にはまた、前記異種DNA断片をホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選別マーカー遺伝子を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で増殖させることとが具備される。この細胞は前記プラスミドが複製されない温度で増殖され、前記DNA断片は、相同性組換えの発生によって前記染色体の前記ホスト遺伝子内に組込まれることになる。
（iii）工程（ｃ）において、ホスト細胞を選別する方法には更に、前記選別マーカー遺伝子を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マーカー遺伝子を発現する細胞が選別されない条件下において増殖させることが具備される。特に、これらホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での非選別条件下で増殖され、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子は、第二の相同性組換えの発生によって前記ホスト遺伝子から自然に切除される。次いで、ホスト細胞は前記プラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別マーカー遺伝子および前記プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子を保持したホスト細胞が得られる。
本発明のこの側面に従って、非選別条件およびプラスミドの複製が得られない温度を用いるのは、前記プラスミドレプリコンの染色体中への組込みによって増殖速度が若干阻害されることに基づいている。従って、切除されたプラスミドを有する株は、組込まれたプラスミドを保持した株よりも若干速く増殖し、こうしてプラスミドレプリコンおよび選別マーカー遺伝子が同時に削除されたクローンを富化するための基礎が提供される。
本発明のこの側面に関する他の好ましい態様において、上記の方法は、（ｉ）工程（ｂ）において、前記異DNA断片が複製能力のない閉環状DNAを具備することと、（ii）工程（ｆ）において、ホスト細胞を試験する方法に、工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前記選別マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを選別することと、次いで所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞を得るために、前記選別マーカー遺伝子を前記第二レベルで発現するこれらホスト細胞をスクリーニングすることとを具備させるように更に改良される。前記選別マーカー遺伝子がクロラムフェニコール耐性を与えるときは、例えば上記方法の工程（ｄ）または（ｅ）で製造されたホスト細胞は、少なくとも約20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与えるような第一レベルで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を発現し得る。第二の高いレベルでクロラムフェニコール耐性遺伝子の発現を生じる突然変異細胞を更に選別することが前記方法に含まれる態様においては、前記第二レベルの発現は、少なくとも約100μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与え得る。クロラムフェニコール耐性の高レベル発現を有する突然変異体の選別を、約600μg/mlのクロラムフェニコールを用いて行なうのが有利である。
本発明の組換えホスト細胞は、腸内細菌のような微生物細胞であり得る。この点において適切な腸内細菌の例は、Erwinia chrysanthemi株、Escherichia coli株およびKlebsiella pneumoniae株である。
或る態様において、前記異種DNA断片は、高レベルのエタノールを産生する微生物に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする。このような酵素は、Zymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされるアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼによって例示される。本発明の好ましい態様において、前記組換えホスト細胞は、例えばグルコースまたはキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも約90％または100％の変換率に夫々対応する収率でエタノールを産生することができる。幾つかの場合には、エタノールの観察された収率は、添加された糖の量に基づいて可能な収率を越えるように思える。この結果は、複合栄養のピルベートへの、従ってエタノールへの同時異化を反映している。
本発明の追加の側面に従えば、更なる突然変異、特にスクシネート産生を減少させて酸の生成（これはエタノールの産生を阻害し得る）を低減するような、フマレートレダクターゼ（frd）遺伝子における突然変異をもった染色体を含む上記組換えホスト細胞が提供される。
本発明の範囲内に包含される組換えホスト細胞は、その移動性遺伝子要素と相互作用する能力を低減することによって該細胞を環境的に安全にするために、細胞内での組換えを阻害する更なる突然変異を具備し得る。一つの態様において、組換えを阻害するこの突然変異はrecA遺伝子における突然変異を含み得る。
本発明の組換えホスト細胞は、ここで特に例示した方法以外にも、種々の方法によって製造され得る。このような方法の典型例は、異種DNA断片をホスト細胞染色体上の所定の位置に挿入するための、並びに発現を増大させる突然変異を発生させ且つ同定するための遺伝子工学的方法である。特に、本発明の組換え微生物株の標準的な遺伝子解析によって、組換えホスト細胞（これも同様に本発明の範囲内にある）を作製する他の方法を採用することが可能となる。例えば、本発明に従って生じた特定の突然変異に伴うDNA配列変化の知識は、所望のタンパクをコードする遺伝子のみならず、該遺伝子の高レベルの発現を生じるプロモータおよび突然変異をも含んだ異種DNA断片の設計、合成およびホスト染色体中への導入を可能にする。従って、所望の遺伝子に関する適切な突然変異およびプロモータを含む異種DNA断片を具備したこのような遺伝子の構築は、本発明の範囲内にある他の態様である。
【図面の簡単な説明】
図１は、エタノール産生遺伝子（Z.mobilisのpdc遺伝子およびadhB遺伝子）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子をE.coli染色体のpf1遺伝子中に組込むための、温度調節レプリコン（pSC101;Hamilton,C.M.,M.Aldea,B.K.Washburn,P.Babitzke,and S.R.Kushner［1989］J.Bacteriol.171:4617−22）を含んだ組込みベクター（pLOI543）の構築を示す模式図である。略号:Klenowは、E.coli DNAポリメラーゼＩを用いてオーバーハング領域を塩基で埋めることにより、平滑末端とすることを意味する。
図２は、ベクターなしの環化されたDNAフラグメントを用いて、Z.mobilisのpdc遺伝子およびadhB遺伝子をE.coli染色体のpf1遺伝子中に組込むためのプラスミド（pLOI510）の構築を示す模式図である。略号:Klenowは、E.coli DNAポリメラーゼＩを用いてオーバーハング領域を塩基で埋めることにより、平滑末端とすることを意味する;Cir.Frag.は、アガロースゲルから溶出されライゲートされて閉環に形成された、pLOI510由来の環化されたSal Iフラグメントを意味する。
図３は、バッチ醗酵の間のエタノール生成（A,C,E,G）および増殖（B,D,F）を示す。ＡおよびＢは10％グルコースの醗酵である。記号：●はプラスミドに基づくエタノール産生株ATCC11303（pLOI297）；○は発現増大突然変異を欠く染色体組込みエタノール産生株KO2。ＣおよびＤは、10％グルコースの醗酵である。記号：○は自然な発現増大突然変異を欠く染色体組込み株KO3;●は自然な発現増大突然変異を含む染色体組込み株KO4;▲は22mMの酢酸ナトリウムを補充したKO4。ＥおよびＦは、８％キシロースの醗酵である。記号：●はKO4;▲はKO4の更なる突然変異体KO11で、フマレートダクターゼ活性（frd）を欠くもの；□はKO11の更なる突然変異体KO12で、recA突然変異を有するもの。Ｇは誘発突然変異をもった染色体組込み株のKO20による醗酵である。記号：■は10％グルコース；●は８％キシロース。
図４はpH制御なしの、KO11（frd）による10％グルコースの醗酵を示す。Ａは増殖（●）およびエタノール生成（○）である。ＢはブロスのpHである。
〔好ましい態様の詳細な説明〕
本発明は、組換えホスト細胞であって、その染色体が（ａ）該ホスト細胞にとって内因性であるプロモータの転写制御下にあり、且つ所望のポリペプチドをコードする異種DNA断片と、（ｂ）前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異で、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらす突然変異とを具備した組換えホスト細胞に関する。前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される。
＜定義＞：
本発明の内容において「異種」DNA断片とは、該DNA断片が、この異種断片を挿入される細胞の染色体における内因性プロモータよりも下流の、対応する位置での配列とは異なった配列を含むことを意味する。従って、本発明の異種DNA断片には、ホスト染色体の一つの位置から採取されて他の位置（該断片に関する本来のプロモータ以外の内因性プロモータの制御下にある）に挿入されるDNA断片、並びに他の微生物からのDNA断片が含まれる。該異種DNA断片のヌクレオチド配列は一以上の構造遺伝子をコードし、また、例えば原核細胞、真核細胞もしくはウイルのゲノム、または遺伝子工学によって創製された人工的コード配列を含む何れかの遺伝子源から誘導される。
上記の異種断片は、内因性プロモータ（５′）側の下流でホスト細胞染色体中に組込まれることによって、該内因性プロモータの転写制御下にある。先に述べたように、この内因性プロモータは好ましくは、E.coliのラクトースオペロン（lac）プロモータのような典型的な微生物プロモータを基準にして高レベルの遺伝子発現を与えるという意味において、「強力な」プロモータである。この強力なプロモータのなかには、プロモータ活性のための、即ちRNAポリメラーゼを結合して該酵素を正しい転写開始位置に向けるための単一の部位を含むもの、および複数のこのような部位を含むものが存在する。前者のカテゴリー（単一部位）に属する強力なプロモータの例は、周知のトリプトファン（trp）プロモータである。後者のカテゴリー（複数部位）は、ピルベート・ホルメート−リアーゼ（pf1）遺伝子のためのプロモータによって例示され、その相同性変種はE.coliおよび他の腸内細菌中に見られる。ピルベート・ホルメート−リアーゼは、特に強制的通気のない醗酵に関する嫌気的条件の下で、正常には高レベルで発現される。例えばpf1・mRNAの配列分析およびRNAポリメラーゼがどこに結合するかを示す「フットプリンティング」データにおいて、またはmRNAの５′末端を示す「プライマー伸長」分析において考えられるように、現実のpf1プロモータにはプロモータ活性のための七つの部位が含まれる。
ここでの記述において、「突然変異」とは遺伝物質における相対的に永続性の変化をいい、典型的には遺伝子を構成するコドンの生化学的変化を含むが、染色体構造の物理的変化をも含み得る。本発明に従って適切に用いられる突然変異は、前記の異種DNA断片の発現を増大し、該突然変異のないホスト細胞による当該ポリペプチドの産生に比較して、ホスト細胞による前記断片によりコードされる夫々のポリペプチドの産生増大をもたらす。こうして達成された発現の増大は、このような発現増大を有する細胞を選別する条件の不存在下においても維持される。例えば、本発明に従って、染色体中に組込まれた抗生物質耐性遺伝子およびエタノール産生酵素遺伝子の両者の発現を増大させる突然変異をもった細菌株においては、抗生物質での選別なしでポピュレーションを68倍増（68 population・boublings）した後にも、組込まれた遺伝子の高レベル発現の喪失は検出されない。
本発明に従う突然変異をもった形質転換ホスト細胞は、標準的な遺伝子的方法論に従って、挿入されたDNA断片によりコードされる一以上のポリペプチドの増大した発現によって都合良く検出され得る。一つのポリペプチドの増大した発現は、該ポリペプチドを直接検出することによって決定され、或いは当該ポリペプチドによる活性から推論される。挿入されたDNA断片によってコードされる遺伝子の一つは選別マーカー遺伝子、例えば、当該ホストに抗生物質耐性を与える遺伝子であるのが有利である。この場合、抗生物質耐性遺伝子の発現が増大した突然変異細胞は、当該異種DNA断片の発現を増大する突然変異のないホスト細胞を阻害する第一レベルよりも高い抗生物質濃度を用いて、好都合に選別され得る。
特に、本発明での使用に適した突然変異は、自然の突然変異として、或いは従来の突然変異誘発に続いて、高レベルで発現している組込まれた遺伝子の所望の発現型を有する細胞を選別またはスクリーニングすることによって確実に得ることができる。こうして、このような突然変異の不存在下で耐え得る濃度の30倍も高い抗生物質濃度で細胞増殖が行なわれるような、組込まれたクロラムフェニコール耐性遺伝子の増大した発現を有する細胞の選別に際して、所定のバクテリアにおける適切な突然変異が10-4〜10-5オーダーの頻度で自然に起きることが見出される。同様に、突然変異誘発物質で所定のバクテリア細胞を処理した後にも、このような突然変異誘発処理を行なわない場合よりも約10倍高いレベルでのエタノール関連酵素の発現を有する細胞をスクリーニングすることによって、約0.5−１×10-4の頻度の突然変異生存において適切な突然変異を得ることができる。
本発明での使用に適した突然変異は、実際に、本発明に従って染色体に組込まれた遺伝子の単一コピーからのポリペプチド産生が、多重コピープラスミド上に担持された同じ遺伝子の多重コピーで達成される産生に匹敵する程度にまで、挿入された遺伝子の過剰発現を生じる。例えば、このような適切な突然変異を有するバクテリア細胞は、クロラムフェニコール耐性およびエタノール産生のための組込まれた遺伝子を、多重コピープラスミド上の同じ遺伝子の30−300コピーを含む細胞と機能的に等価なレベルで発現することができる。
本発明に従って使用するための、ここで説明したようにして確認された突然変異についての分子的基礎は決定されていない。しかし、一回のスクリーニング又は選別工程で得られる遺伝子発現の増大の大きさ（例えば約10倍のオーダー）は、遺伝子複製を含む突然変異機構について期待されるよりも実質的に大きい。選別遺伝子の発現において、遺伝子複製によって匹敵する増大を達成するためには、典型的には、選別剤のレベルを逐次的に高くして、反復した選別工程を必要とする。更に、この突然変異の反転の低い頻度（実際には検出不能）もまた、これら突然変異の基礎としての遺伝子複製に対して影響を及ぼす。現実に、双頭遺伝子反復（tandem gene repetition）によって増大した遺伝子発現を生じる突然変異は、本発明の突然変異とは対照的に典型的には不安定であり、このような増大した遺伝子発現を有する細胞を選別する条件の不存在下では維持され得ないことが知られている。反対に、本発明に従って自然に起きる適切な突然変異の観察される頻度は、点突然変異を含む原因機構に匹敵する。
組込まれた遺伝子の発現を増大する突然変異の選別マーカー遺伝子を用いた選別は、当該技術において、突然変異処理の生存当り少なくとも約10-4オーダーの頻度で誘導され得る突然変異をもったクローンを選別するための実際の遺伝子的方法が知られているような、何れのタイプのホスト細胞においても本発明に従って行なわれ得る。同様に、本発明に従う突然変異ホスト細胞のスクリーニングは充分な数のクローンを調製するための実際的な方法を必要とし、この夫々のクローンは、特定の所望遺伝子に適した方法によって、組込まれた所望の遺伝子の高レベルの発現を検出するための充分な細胞を含んでいる。
適切な突然変異のためのこのような選別またはスクリーニングは、前核細胞（バクテリア）および酵母細胞の場合のように、容易に大量培養されるホストで最も容易に行なわれる。説明のために、このようなホストを「微生物細胞」いい、それが構成する株を「微生物株」という。微生物細胞の範疇において、Erwinia chrysanthemi,Esherichia coliならびにKlebsiella planticolaは、これらがペントース及び乳糖を含む広範囲の種々の糖を利用することができるので、特に魅力的なホストである。微生物細胞は好ましいホストであるが、本発明は真菌細胞および真核細胞（動物、昆虫及び植物）を含む、異種DNA断片を内因性プロモータの制御下に挿入できる他のタイプの細胞性ホストの使用をも考慮している。従って、上記のように、ホスト細胞は組込まれた異種DNAの増大した発現を有する細胞の選別またはスクリーニングのレジメに服し、これによって発現の増大した適切な突然変異体を得ることのみを必要とする。
＜エタノール生成E.coliに関する態様＞：
本発明の例示的適用には、E.coli染色体のpf1領域にエタノール産生のためのZ.mobilis遺伝子を組込むことが含まれる。このpf1遺伝子は正常な醗酵代謝の中心をなし、ホルメート＋アセチルCoAへのピルベートの変換を触媒し、生合成のための実質的なアセチル単位源を提供する。この遺伝子の挿入不活性化は、ピルベートを微生物によるエタノールの産生から逸らす競争分岐点の阻害を表わす。また、スクシネート産生を除き、且つRECA遺伝子を不活性化する追加の遺伝子的改良も記述される。
これらの組換微生物は、バイオマス糖類をのエタノール醗酵する際の、同時生成物としての組換ポリペプチドの製造に有用である。染色体中への組込みの結果として、エタノール産生形質の安定性は、エタノール製造用のための工業的規模の醗酵に用いるプラスミドを基礎とする系に比較して顕著に改善される:68世代後のエタノール遺伝子の保持は100％であり、比較対象のプラスミドを基礎とする構築物では98％に過ぎない。また、エタノール産生遺伝子を担持したプラスミドが省略されることによって、エタノール産生能力の妨害を受けることなく、同時生成物を産生するためのプラスミドの挿入が可能となる。
＜生物学的寄託＞
次の培養物は、アメリカ合衆国メリーランド州2058 ロックウイル 12301パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されている。表１には、寄託機関によって該培養物に与えられた受付け番号が列記されている。
0003593125.tif 000002
主題の培養物は、この特許出願が係属している間は、37CFR§1.14および35USC§122に従って特許商標庁長官によって資格を与えられた者の該培養物へのアクセスが保証される条件の下で寄託されている。この寄託物は、主題の出願の対応出願またはその関連出願が出願された外国の特許法による要求に応じて入手可能である。しかしながら、該寄託物の入手可能性は、政府の処分によって付与された特許権を減損して、本発明を実施することの許諾を意味するものではない。
更に、主題の培養寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従って保存され、且つ公衆が入手可能とされる。即ち、これらは該寄託物のサンプルの分譲を求める最も新しい請求の後の少なくとも３年の間、および全ての場合において寄託の日から30年の間、または該培養物を開示して発行された何れかの特許の存続期間の間、これを汚染せずにその生存を維持するために必要な全ての注意をもって保存されるであろう。寄託者は、寄託物の分譲が請求されたときに、寄託物の状態に起因してそのサンプルの分譲ができなくなったならば、寄託物を置き換える義務を負うことを承認する。主題の培養寄託物の公衆の入手可能性に関する全ての制限は、これを開示する特許の付与の際に、回復不能なものとして除去される。
＜E.coliB染色体中への、Z.mobilisのpdc遺伝子およびadhB遺伝子の組込み＞：
以下に記載する二つの例に具体化された二つのアプローチは、外来遺伝子（ここではエタノール産生のためのZ.mobilisE遺伝子）が染色体遺伝子（pf1遺伝子によって例示されるもの）中に組込まれるE.coli（ATCC 11303）のようなバクテリア株を構築するために、本発明に従って採用され得る異なった戦略を表わしている。第一のアプローチにおいては、Hamilton et al.によって開発された温度条件付き組込みベクトーの誘導体を使用することが伴われる。Hamilton,C.M.,M.Aldea,B.K.Washburn,P.Babitzke,and S.R.Kushner［1989］J.Bacteriol.171:4617−22;および後述の例３を参照のこと。
従って例に示すように、ATCC 11303は温度依存性複製プラスミドのpLOI543で形質転換され、続いて温度に基づく選別が行なわれ、二つの相同的組換えが起こった。コロニーの64.5％はクロラムフェニコール（Cm）に感受性であり、プラスミドの喪失を示した。これらCm感受性クローンのうち5.9％は、アルデヒド試験プレート上にピンクのコロニーを形成し、Z.mobilis ADH IIの存在を示した。組込まれたエタノール産生遺伝子は保持しているがCm耐性遺伝子およびプラスミドは喪失しているこれらコロニーのうちの二つは、更なる研究のために選別され、KO1およびKO2と命名された。
例４において考慮されるが、第二のアプローチによって、プラスミドpLOI510からの環化されたSal Iフラグメントを用いてCm耐性の形質転換体が得られ、KO3と命名された。このアプローチにおいては、置換プラスミドは細胞中に導入されない；エタノール産生遺伝子および関連のCm耐性遺伝子のみが染色体中に組込まれる。このKO3クローンもまた、アルデヒド指示プレート上でKO1およびKO2と同じピンクのコロニーを形成した。対象のATCC 11303は白色のコロニーを形成する一方、ATCC 11303（pLOI1297）は強い赤色のコロニーを形成してZ.mobilis遺伝子の高レベルの発現を示した。
続いて、アルカリ性SDS溶解法によって、これら三つの組換体からのベクターの単離が試みられた。臭化エチジウムで染色されたこれら三つのプレパレーションのアガロースゲル中には、肉眼で視認できるベクターは存在しなかった。これらプレパレーションはまた、ホストとしてのTC4に関して、Cm耐性の選別を伴う形質転換実験で試験された。形質転換体は全く回収されず、ベクターの不存在が更に確認された。
＜KO1、KO2およびKO3株による醗酵＞：
図3Aおよび図3Bは、10％グルコースでのKO2およびATCC 11303（pLOI297）による醗酵の比較を示している。KO1株による醗酵はKO2による醗酵と同一であり、提示されていない。これらの新規な構築物は、低い容量生産性（volumetric productivity）およびエタノール収率（表２）に示されるように、極めて非効率的なエタノール産生体である。増殖はATCC 11303（pLOI297）の半分未満に制限され、また72時間後でも4g/リットルのエタノールしか産生されなかった。KO3株はKO1およびKO2よりも若干良好ではあるが、依然として極めて貧弱なエタノール産生体である（図3C−D;表２）。
0003593125.tif 000003
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0003593125.tif 000005
これら三つの新規株による醗酵の間、pHを維持するために大容量の塩基が消費され、酸性醗酵生成物の過剰生成が示された。
＜組込まれたpdc遺伝子およびadhB遺伝子の突然変異による発現の増大＞
アルデヒド指示プレート上で観察されたピンクの発現型は、エタノール産生のためのZ.mobilis遺伝子の発現が不十分であることを示していると思われる。当該技術において周知の標準的条件下でのエチルメタンスルホネートを用いた突然変異誘発の後に、アルデヒド指示プレート上での暗赤色の発現型をスクリーニングスルことによって、KO2に組込まれた遺伝子の発現増大を生じる突然変異が得られた。一つのプレートに200−400のコロニーを有する約200のプレートを分析した。四つの暗赤色コロニーが単離され、色が濃くなったことによってADH IIの発現増大が示された。
高レベルの抗生物質耐性を発現する突然変異体が挿入された他の遺伝子をも高レベルで発現するか否かを決定するために、高レベルのCm耐性の選別を用いて、KO3の自然突然変異体が富化された。一晩培養したものの稀釈列を、２％グルコースおよび600μg/mlのCmを含むルリア観点プレート上に撒いた。一晩インキュベーションした後に、撒かれた細胞100,000個当たり略一つの頻度で、Z.mobilisのpdcおよびadhBita遺伝子の高レベル発現を示す大きなコロニーの発生が観察された。これら全てのコロニーはATCC 11303（pLOI297）、即ち優れたエタノール産生株であるプラスミドに基づく構築物と同じく、アルデヒド指示プレート上で暗赤色の発現型を示した。二つの突然変異体、即ちKO4株およびKO5株が更なる研究のために保存された。Cm耐性の選別に際してKO4株およびKO5株からのDNAプレパレーションがTC4を形質転換できないこと、および臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル中にベクターDNAが存在しないことによって、これら株におけるベクターの欠失が再度確認された。
＜KO4、KO5およびKO20による醗酵＞：
図3Cおよび図3Dは、KO4およびKO5による10％グルコースの醗酵を示している。この二つの株は、高レベルの抗生物質に対する耐性を選別することによって、組込まれたエタノール産生遺伝子の発現を増大させる突然変異が同時に選別されたものである。二つの株は同一であり、KO4による醗酵のみがプロットされている。これら改良された構築物による増殖、細胞収率およびエタノール収率は、プラスミドに基づく構築物であるATCC 11303（pLOI297）のそれに殆ど等価であった。表２を参照のこと。初期段階の容量生産性によって、また30時間後に達成されるエタノールレベルによって示されるエタノール生成速度はATCC 11303（pLOI297）よりもやや遅かったが、KO4およびKO5での理論収率は高く、添加されたグルコースに基づく100％を越えていた。この遅い醗酵の際の高収率は、複合栄養物がピルベート（従ってエタノール）に同時異化されることを反映している。これらの複合栄養物は、生合成のための主要な窒素源として役立つ。糖が消費され尽くした後の継続する脱窒素によって、KO4、KO5およびATCC 11303（pLOI297）でのpHの上昇を生じた。このようなpH上昇は、糖の消費をモニターするための便利な方法を提供する。
また、KO4およびATCC 11303（pLOI297）による８％キシロースの醗酵が比較された（図3Eおよび図3F）。KO4は、30時間後のエタノールレベルから明らかなようにエタノール生成速度は若干遅かったが、エタノール収率ではプラスミドに基づく構築物と等価であった（表２）。
図3Gは、組込まれたエタノール産生遺伝子の発現を増大させる誘発突然変異をもったKO20株による、10％グルコースおよび８％キシロースの醗酵を示している。誘発された突然変異をもったこの株による二つの糖の醗酵は、高レベルの抗生物質で選別された自然突然変異を有するKO4株およびKO5株による醗酵と本質的に同じであった。
＜添加された酢酸の影響＞：
嫌気的増殖の際の、pf1遺伝子生成物は酢酸産生の主要ルートであり、また生合成のための主要なアセチルCoA源であることが示されている。Z.mobilisエタノール経路遺伝子による挿入不活性化は、ATCC 11303の誘導体における脂質合成のためのアセテート欠乏を導き得る。酢酸ナトリウムを補充することによってエタノール産生速度が改善され、収率が僅かに増大されることが見出された（図3CおよびD;表２）。
＜組換えE.coliにおけるZ.mobilis酵素の発現＞：
選別された組換え株のフレンチプレス抽出物において、Z.mobilis PDCの比活性が測定された。PDCは比較的熱に安定な酵素であり、活性は、このような測定を複雑にする天然のE.coli活性を熱で不活性化した後の抽出物において測定された。対照株のATCC 11303には活性が検出されなかった。KO2およびKO3の両者は、0.2U/mgの低レベルの活性を生じた。高Cm耐性の突然変異体であるKO4の抽出物には、10倍も高い活性（2.1U/mgタンパク）が存在した。KO4におけるPDCのレベルは、プラスミドに基づく構築物のATCC 11303（pLOI297）中で産生されるレベルと殆ど等価であり、天然のZ.mobilis中に見られレベル（Ingram,L.L.,and T.Conway［1988］Appl.Environ.Microbiol.54:397−404）と同様であった。
これらの株からのタンパク抽出物は、SDS−PAGEによっても試験された。ATCC 11303と組換え誘導体との間には、Z.mobilis遺伝子に帰すべき変化に加えて、タンパクにおける数多くの変化が観察された。KO4およびATCC 11303（pLOI297）は、KO2およびKO3に存在するよりも高レベルで、PDCのサイズに対応する60,000MW領域のタンパクバンドを含んでいた。このバンドはATCC 11303対照株には存在しなかった。Z.mobilisのADH IIが見出される38,000MW領域には多くの内因性タンパクが見出だされたため、発現の相違は不明瞭であった。
＜E.coli ATCC11303によって産生される有機酸＞：
醗酵の間に、E.coliのエタノール産生株によって著しい量の塩基が消費され（表２）、同時生成物としての酸の生成が示された。表３に示すように、高レベルのこれら酸は、ATCC 11303親株およびKO3株によって産生される。
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ATCC 11303（pLOI297）およびKO4は低レベルの酢酸および乳酸を産生するが、KO4によるコハク酸産生は高いままである。コハク酸産生をなくすために、Tn10のテトラサイクリン耐性マーカーの選別を含む標準的な遺伝子的方法を用いてTn10ベクターを挿入し、続いてフザリン酸選別を用いてTn10を除去して、Tn10の不正確な切除に起因するfrd削除をもたらすことによって、frd突然変異が導入された。得られた株（KO11）はフマレートレダクターゼ活性を欠失していた。
このfrd突然変異は、グルコース醗酵の際のコハク酸産生のレベルを、親のKO4における産生の３％にまで減少させた（表３）。しかしながら、醗酵の間に酸の滴定をしないならば、この低レベルの酸の産生でさえ、滴定をしない醗酵中のpHを低減し、従ってグルコースからのエタノールの生産性を減少させるには充分である。
しかし、酸の滴定を伴うならば、フマレートダクターゼの除去によって、キシロースからのエタノール産生速度、細胞収率およびエタノール収率は改善される（表２）。また、滴定を伴うならば、エタノール収率は本質的に同じままであるが、グルコースからの容量生産性は増大する（表２）。
＜染色体に組込まれた遺伝子およびプラスミドに基づく遺伝子のE.coli中における安定性の比較＞：
ATCC 11303（pLOI297）、KO4およびKO5が、抗生物質選別を伴わずに、10％（w/v）を含むルリアブロス中において30℃で68世代まで増殖された。48時間後および120時間後に、培養物は選別プレート、非選別プレートおよびアルデヒド指示プレート上に撒かれ、全CFUに対するCm耐性CFUの比ならびにエタノール産生コロニーの比率が測定された。表４は、KO4およびKO5の挿入された遺伝子が、染色体挿入物として安定に保持されたことを示している。
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エタノール産生のための遺伝子が染色体中に組込まれているKO4株およびKO5株は、プラスミドpLOI297での従来の構築物よりも優れている。組換形質であるエタノール産生の保持については、Alterthun,F.,and L.O.Ingram［1989］Appl.Environ.Microbiol.55:1943−1948を参照のこと。たとえ、pLOI297を有するE.coli株のようにプラスミド喪失の比率が低いときでも、少ない培養物を数百万ガロンの醗酵ブロスにまでスケールアップすることが含まれる商業的なエタノール製造の目的において、本発明に従って組込まれた外来遺伝子を有する株は、比較され得るプラスミドに基づく株を凌駕した著しい利点を与える。
＜recA突然変異の効果＞：
recA突然変異はKO4およびKO11にも導入され、これら株は組換えプラスミドのホストとして使用された。得られた株は、夫々KO10およびKO12と命名された。このrecA突然変異は酢酸、乳酸またはコハク酸の産生には影響しなかったが、recA、frd突然変異体（KO12）における増殖および遅い醗酵を減少させた（表２）。この影響の基礎は知られておらず、構築の間に創製された二次的突然変異を表わしているかもしれない。
＜本発明に従って染色体に挿入され得る遺伝子＞：
本発明は、ここに特別に例示したadhおよびpdc遺伝子以外の遺伝子を用いて実施することができる。グリコリシスの酵素は、主要な配列に関してかなりの保存性を示すことが確立されている。例えば、Conway,Swell,and Ingram［1987］J.Bacteriol.169:5653−5662を参照のこと。この高レベルの保存性は、当業者が、酵素ファミリーの一以上のメンバーからの主要な情報を用いて、機能的に等価で且つ遺伝子的に関連した酵素を他の微生物から単離することを可能にする。実際に、Z.mobilis pdc及びS.cerevisiaeのpdcに関する本件発明者の情報をDNAプローブの設計に用いて、とうもろこし由来のピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子をクローン化するために、丁度このようなアプローチが成功裡に用いられている。Kelly,P.M.［1989］Plant Molecular Biology 13:213−222を参照のこと。また、全体の遺伝子をプローブとして用いる他の戦略も使用され得る。従って、本発明の目的にとっては、ピルベートデカルボキシラーゼ活性が、本発明で例示したようにZ.mobilisからの遺伝子によって与えられるか、或いは同一の酵素活性を指示するコーン由来の遺伝子（既にクローン化され、配列決定されている）、酵母または他の微生物由来の遺伝子によって提供されるかということは問題ではない。また、本発明を実施するために、アルコールデヒドロゲナーゼ活性がウマ、酵母、ヒトもしくは昆虫由来の遺伝子によって与えられるか、或いは他のバクテリア遺伝子から与えられるかも問題ではない。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現はアルデヒド指示プレート上で直接観察され得るから、配列情報は必ずしも、この酵素活性を示す蛋白をコードする追加の遺伝子を単離するための最良のアプローチではないであろう。しかしながら、このような単離のために配列が用いられるか否かは、現実的には重要ではない。実際に、多くのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が既に入手されており、多くの論文で良く説明されている。
Z.mobilisは、機能的なアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする二つの遺伝子を含んでいる。一つは、ここに例示されたadhBであり、これはClostridium acetobutylicum由来のブタノール（アルコール）デヒドロゲナーゼ、E.coli由来のプロパンジオール（アルコール）オキシドレダクターゼおよびSaccharomyces由来のADH IVアルコールデヒドロゲナーゼと進化論的に関連している。これらは全てクローン化され配列が決定されている。アルコールデヒドロゲナーゼをコードする第二のZ.mobilis遺伝子はadhAであり、これは亜鉛アルコールデヒドロゲナーゼであり、最近になって我々本願発明者がクローン化し、配列を決定した。このadhAは、全て入手可能なヌクレオチド配列から推論された一次構造の比較に基づいて、動物、植物中における記述された典型的なアルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母において優勢な遺伝子と進化論的に関連している。我々は、本発明に従って予想されるように、このadhA遺伝子が非常にうまく元のadhB遺伝子を置換することを見出した。
ピルベートデカルボキシラーゼ活性（ピルベートはアセトアルデヒド＋二酸化炭素に変換される）をもった蛋白の合成は、アルデヒド指示プレート上で直接観察され得る。このアルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現もまた、アルデヒド指示プレート上で直接観察され得る。従って、上記のように我々の仕事による配列情報がコーンpdc遺伝子の単離に最近用いられたが、配列情報は他のadh遺伝子またはpdc遺伝子の配置に対する必ずしも最良のアプローチではない。こうして、機能的等価物を与える多くの他のpdc遺伝子およびadh遺伝子が、他の生命体から単離され得る。これらの他の遺伝子は、使用のために入手可能なZ.mobilisのpdc遺伝子およびadh遺伝子のための適切な置換体であること、また、他のこのような遺伝子は現在の遺伝子をプローブとして用いることによって、或いは、より好ましくは指示プレート上での活性を観察することによって同定され得ることは完全に予期され得る。
より一般的には、エタノール酸性遺伝子以外の多くの遺伝子が、本発明に従って染色体中に組み込まれ、発現され得るであろう。これらに本質的に含まれるのは、組換ホスト内で何れかの望ましいポリペプチドを発現し得る遺伝子、例えばインスルン、成長ホルモン、および商業的に重要な酵素をコードする遺伝子である。
＜例示バクテリアの有用性＞：
ある種のバクテリアおよび他の単純な生命体は、ヘキソース、ペントース及び乳糖を含む広範囲の基質を活発に代謝することができる。この特徴が、E.coliを組換DNA製造法のための魅力的なホストにしている。ここに記載される発明は、種々のバイオマス源、特に木および非食用植物の主要部分をなすヘミセルロース（キシロース、アラビノース及び他の糖を含む）並びにホエー（乳糖）のような未利用バイオマス（under utilized biomas）から、エタノールの経済的に製造するために、組換えバクテリア株を使用することを可能にする。また、複合ポリマーを分解する細胞外酵素の産生のような特殊な能力をもった微生物が、本発明に従ってエタノール産生体に変換され得る。
従って、本発明の一つの側面は、エタノールの製造のための改良された微生物を提供する。E.coli細胞は、adhおよびpdcをコードする遺伝子がホスト染色体中に組み込まれるように形質転換された。従来は、エタノール産生のための上記二つの遺伝子を具備したプラスミドで形質転換することによって、E.coliにエタノール産生能力が与えられてきた。これら従来の形質転換の成功は、遺伝子の多重コピー、典型的には細胞当たり30−300コピーから得られる極めて高レベルのエタノール産生酵素によってもたらされた。
ここに記載する、pdcおよびadh遺伝子の単一コピーがホスト染色体中に組み込まれた初期構築物は、代謝をエタノールに変え、またこれらプラスミド上の遺伝子の多重コピーによって与えられる機能レベルを倍加するには不十分なレベルのPDCおよびADHを与えた。続いて、上記の自然の突然変異および誘発突然変異によって、クロラムフェニコール耐性のための遺伝子（もし存在するならば）並びにADHおよびPDCのための遺伝子を含む、染色体に組み込まれた全ての遺伝子の発現を自然に増大させる細胞が与えられた。これらの突然変異体は高レベルのエタノール産生酵素を生成し、従って多重コピープラスミドを含む従来のバクテリアと機能的に同等であった。Cm耐性マーカー遺伝子並びにエタノール遺伝子を有する株での自然の突然変異の場合に、Cm耐性遺伝子の発現増大がエタノール関連酵素の発現増大をも示すという結果は、特に驚くべきものであった。何故なら、Cm耐性遺伝子はそれ自身のプロモータを含み得るし、またadhB遺伝子の転写ターミネータの下流にさえ存在し得るからである。
本発明の他の側面は、組換タンパクの効率的な製造のために、このエタノール産生組換えバクテリアを使用することに関する。即ち、この組換細胞は、有用なタンパクをコードする遺伝子で更に形質転換され得る。また、これら追加の遺伝子は染色体中に組み込まれ得るし、或いはプラスミドにも担持され得る。実際のところ、本発明に従えば、組み込まれた遺伝子（この例ではエタノール産生遺伝子）の高レベルの発現によってプラスミドにこれらを担持させる必要性がなくなるから、本発明の組換細胞は、プラスミド上に担持された追加の遺伝子を受入れ且つ維持するために特に適している。recA突然変異のような、相同性組換を阻害する追加の突然変異は、組換タンパクの製造におけるこのようなホストの環境的安全性を増大するであろう。
糖代謝からの有機酸の蓄積は、一般的に嫌気的増殖の間の醗酵の結果と考えられる。しかし、一般には好気的条件下での激しい撹拌の間でさえ、多量のアセテートがE.coliによって生成される。細胞密度が高いときは、アセテートの産生は増殖の初期の段階から進行し、後期の段階に限定されない。この好気的条件下でのグルコースからの酸生成は、リン酸緩衝液を補充した培地中での最終細胞密度が増大することによって示されるように、ブロス中および固体培地上での増殖を制限するように働く。
ホスト微生物のエタノール醗酵への転換は、種々の組換生成物の産生を増大させるために用いられ得る。これら生成物における機能の維持は、高密度培養における増殖の際のブロスのpHに関係する。単位細胞タンパク当たりのこの酸性化の範囲は、有機酸よりもエタノールを酸性させることによって最小限に抑制される。酸素移動は、屡々、微生物の高密度培養での増殖の際の主要な制限因子であり、酸生成および増殖培地のpHドリフトをもたらすのはこの制限による。醗酵生成物としてエタノールを産生する組換え体において、エタノール産生酵素は、グリコリシスからのピルベートの一部をアセトアルデヒドに変換し、またNADHを再酸化して、与える損傷の少ない代謝産物のエタノールを産生する。酸化的リン酸化のための機能的呼吸鎖およびエタノール産生酵素の両方を含む株は、NAD＋の再生の間に両者の系が作動し、また酸性廃棄生成物が還元されるため、より高い細胞密度にまで増殖され得る。このような固有の柔軟性によって、組換生成物の収率増大がもたらされるのと同様、プロセス制御についてもさほど厳格な条件は要求されなくなる。
従って、本発明のエタノール産生バクテリア株は、最小限の酸生成を伴う嫌気的条件下で組換タンパクを製造するための優れたホストである。多くの組換えタンパクはシステイン架橋またはジスルヒド架橋を含み、これらの適切な折り畳または反応は活性酵素を形成するための不可欠の特徴である。ジスルヒド結合の形成は酵素によって促進されるから、このようなタンパクを嫌気的条件下で合成することによって、単離および制御された条件下での折り畳みが行なわれる前に誤った折り畳みが起こる機会が減少し、生物学的に活性な生成物を多く回収することが可能となる。
既述したところから、本発明によって与えられる、タンパクまたは全体の代謝経路をコードする遺伝子を染色体に形質転換する能力は極めて有用であることが、当業者には容易に明らかであろう。この点に関して、例えば、異なった遺伝子座からの遺伝子が染色体上に配置される種々の状況に対して、本発明を適用すること考えられる。エタノール産生をコードする遺伝子の配置は、この新規な発明概念の一つの例にしか過ぎない。ここに説明した原理に従えば、種々の生命体由来のアルコールデヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子が、望ましい経路を創製するために、種々の生命体由来のピルベートデカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子と組合わされ得る。他の経路に必要なタンパクをコードする遺伝子もまた、染色体に組み込まれ得るであろう。また、当業者には明らかなように、ここに説明したエタノール経路について、アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびビルベートデカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子が共通の制御下にあることは必要とされない。
次に、以下に示す例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
例１  E.coliピルベート・ホルメート−リアーゼ遺伝子を含む組込みプラスミドの構築
この例を通して、特に言及しない限りは次の材料および方法が用いられた。全ての遺伝子構築物のために、E.coli TC4が用いられた。Conway,T.,Y.A.Osman,J.I.Konnan,E.M.Hoffman,and L.O.Ingram［1987］J.Bacteriol.169:949−954を参照のこと。全ての増殖実験において、選別のための適切な抗生物質および指示濃度のグルコースを含むルリアブロスが用いられた。特に言及した場合を除き、抗生物質は次の最終濃度で用いられた：アンピシリンは50μg/ml;クロラムフェニコール（Cm）は指示に従って20μg/mlまたは600μg/ml;テトラサイクリンは12.5μg/ml。Z.mobilis ADH IIを発現する組換えE.coliによって、エタノールから生成されたアルデヒドを検出するために、シッフ試薬を含むADH指示プレートが用いられた。Conway,T.,G.w.Sewell,Y.A.Osman,and L.O.Ingram［1987］J.Bacteriol.169:2591−2597を参照のこと。
プラスミドの調製、制限酵素での消化、ライゲーション、形質転換およびゲル電気泳動のために、標準的方法が用いられた。続いて行なわれるクローニングのための制限フラグメントの単離は、Microfilterfuge管（Rainin Instrument Co）を用いることによりマイクロフィルターGTGアガロース（FMC BioProducts,ME）からの溶出によって達成された。
E.coliピルベート・ホルメート−リアーゼ遺伝子（pf1）を含む組込みプラスミドを構築するために用いた方法が、図１に示されている。E.coliの不完全なピリベート・ホスメート−リアーゼ（pf1）遺伝子を有するプラスミドpHB4（既出のSawers et al［1988］）がBamH Iで部分的に消化され、その５′−突出末端がDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋められ、該フラグメントはSAl Iリンカー（dCGTCGACG）へのライゲーションによって再結合された。pf1遺伝子の外側のBamH I部位がSAl I部位で置き換えられたこれらのプラスミドは、個々の形質転換体のスクリーニングによって同定された。得られたプラスミドのpLOI513は、該プラスミドのpf1部分をプラスミドの残りの部分から取出すことを可能とする二つのSAl I部位を含んでいる。
クロラムフェニコール耐性マーカー遺伝子は、1.37−kbのHha Iフラグメントとして、プラスミドクローニングベクターのpBR325から切り出された。Prentki,P.,F.Karch、S.Iida,and J.Meyer［1981］Gene 14:289−299を参照のこと。このHha Iフラグメントは、クレノウポリメラーゼで処理されて突出末端を埋められ、pLOI295内のadhB遺伝子の下流にあるクレノウ処理されたBamH I部位に、pdc遺伝子およびadhB遺伝子と同じ向きでライゲートされて、pLOI515が創製された。Ingram,L.O.,T.Conway,D.P.Clark,G.W.Sewell,and J.F.Preton［1987］Appl.Environ.Microbiol.53:2420−2425を参照のこと。プラスミドpLOI515は次いでSAl Iで消化され、またEcoR Iで部分的に消化された。そして、クレノウポリメリゼーションで平滑末端とした後、BamH Iリンカー（dCCGGATCCGG）でライゲートされた。このライゲーション混合物は、GTGアガロースゲル上で分離された。プロモータのないpdcおよびadh遺伝子、並びにCm遺伝子（プロモータ有り）を有するフラグメントが消化され、BamH Iで消化された。元のEcoR I−SAl Iフラグメントの夫々の末端にEcoR IおよびSAl・Ｉ部位が創製されたこのBamH Iフラグメントは、pUC19（Bethesda Research Laboratoriesから入手可能）からSAl I部位を除去することによって生成されたLOI505のポリリンカーのBamH I部位にクローニングされた。SAl Iで消化することによってpLOI506におけるCm遺伝子の上流のSAl I部位が除去され、クレノウポリメラーゼで埋められ、再ライゲーションされてpLOI508が創製された。pLOI508の4.6−kb BamH Iフラグメントが、プラスミドpLOI513に担持された不完全なpf1構造遺伝子におけるBamH I部位に挿入された。こうして得られたプラスミドpLOI510は、以下に説明する相同性組換（例４）を使用することによって、E.coli株Ｂ（ATCC 11303）の染色体中にpdc遺伝子、adhB遺伝子およびCm遺伝子を導入するために用いられた。
例２  E.coliピルベート・ホルメート−リアーゼ遺伝子およびプラスミド複製のための温度感受性を含む組込みプラスミドの構築
プラスミドpLOI295をEcoR IおよびSAl Iで消化し、pdcおよびadhB遺伝子を有する3.2−kbのEcoR I−SAl Iフラグメントを、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を形成した。この平滑末端フラグメントを、転写に関して同じ向きの不完全なpf1遺伝子をもった、pLOI513のクレノウ処理されたしたBamH I部位にライゲートしてpLOI542を得た。次に、pLOI542はSAl Iで消化され、7.2−kbのSAl Iフラグメントは、温度感受性のレプリコンおよびCm遺伝子を含むpMAK705のポリリンカーにおけるSAl I部位にライゲートされた（図２）。Hamilton,C.M.,M.Aldea,B.K.Washburn,P.Babitzke,and S.R.Kushner［1989］J.Bacteriol.171:4617−4622を参照のこと。得られたプラスミドpLOI543は、相同性組換えによってE.coli染色体中に組み込まれた（以下の例３を参照のこと）。
例３  付随する抗生物質耐性遺伝子の喪失を伴った、Z.mobilis pdc及びadhB遺伝子のE.coli Bにおける染色体への組込み
組換えプラスミドpLOI543（これは30℃で複製するが44℃では複製しない）を用いることにより、E.coli BをCm遺伝子で形質転換し、クロラムフェニコール耐性を与えた。形質転換された細胞は、20μg/mlのクロラムフェニコール及び５％（w/v）のグルコースを含む100mlのルリアブロス中において44℃で24時間増殖され、染色体中へのプラスミドの組込みについて選別された。この培養物の一部（0.1ml）を稀釈し、該稀釈された細胞懸濁液が、５％（w/v）グルコースを含み且つクロラムフェニコールを含まない100mlのルリアブロスを接種するために用いられた。この培養物は、切除を行なうために30℃で12時間増殖された。培養物の一部（0.1ml）を稀釈し、これを100mlの新鮮な培地に接種することによって、２回以上の増殖サイクルが実行された。次いで、12時間培養物の稀釈された細胞懸濁液を用いて５％（w/v）グルコースを含むルリアブロスを接種し、プラスミドを除去するために44℃でインキュベートされた。最後に、該培養物の稀釈系列を２％（w/v）グルコースを含むルリア寒天プレート上に撒き、30℃で増殖させることによって、単一のコロニーが単離された。プレート上に現れた単一のコロニーは、アルデヒド指示プレートを用いることによってエタノール産生遺伝子についてスクリーニングされ、またクロラムフェニコールに対する感受性によりプラスミドの喪失についてスクリーニングされた。クロラムフェニコールに対して感受性であるが、エタノール産生遺伝子を含んでいる二つのクローン、即ち、KO1株およびKO2株が選別された。これらのクローンは、アルデヒド指示プレート上でピンクのコロニーを生成した。
例４  付随する抗生物質耐性遺伝子が保持される、Z.mobilis pdc及びadhB遺伝子のE.coli Bにおける染色体への組込み
プラスミドpLOI510がSAl・Ｉで消化され、不完全なpf1遺伝子を含んだ8.6−kbのSAl・Ｉ断片が、低DNA濃度での自己ライゲーションによって環化された。共有結合的に閉館されたDNAフラグメントは、自立的な複製を可能とする配列を欠いていた。E.coli Bは、20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性について選別することによって、このライゲーション混合物で形質転換された。クロラムフェニコール耐性の形質転換体におけるadhB遺伝子の発現は、クロラムフェニコールプレートからのコロニーを、ADH指示プレート上に撒くことによって確認された。単一のクローンが更なる特徴付けのために選別され、KO3と命名された。プラスミドに担持されたadh遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠失していることは、DNAプレパレーションに形質転換体が存在しないこと、およびアガロースゲル上での直接分析によって確認された。このクローンは、アルデヒド指示プレート上でピンクのコロニーを生成した。
例５  選別マーカー遺伝子の不存在下でZ.mobilisのpdcおよびadhB遺伝子の発現を増大させる突然変異の創製および検出
例３においては、ホスト細胞を形質転換させるために用いたDNA断片上のエタノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の喪失をもたらす条件下で、Z.mobilis pdcおよびadhB遺伝子のE.coli Bにおける染色体への組込みが行なわれた。例３の方法によって得られたKO2株が、バクテリア遺伝子学の技術で周知の標準的条件下で、メチルメタンスルホネートを用いて突然変異誘発された。突然変異誘発されて生き残った細胞（約４−８×104）を、１プレート当たり200−400コロニーでアルデヒド指示プレート上に撒いた。ADH IIの増大した発現を示す四つの暗赤色コロニーが単離され、後記の例８で説明するようにしてエタノール産生が試験された。これらの突然偏位体のうち、エタノール産生収率が最も高いものをKO20株と命名した。
例６  付随した抗生物質耐性遺伝子の発現増大について選別することによる、Z.mobilis pdcおよびadhB遺伝子の発現を増大させる突然変異の選別
例４において、Z.mobilis pdc及びadhB遺伝子のE.coli Bにおける染色体への組込みが、ホスト細胞を形質転換するために用いたDNA断片上のエタノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の保持がもたらされる条件下で行なわれた。例４の方法で得られたKO3株の稀釈系列を、２％グルコース及び600μg/mlのクロラムフェニコールを含んだルリア寒天プレート上に撒いた。一晩インキュベートした後に、撒かれた細胞100,000個当たり略一つの頻度で、大きな脂肪コロニーが観察された。これらの大きなコロニーはアルコールを産生し、アルコール指示プレート上での試験において明赤色を呈した。KO4およびKO5の二つの株について更に研究が行なわれた。
例７  recAおよびfrd突然変異の導入
E.coli株JC10240におけるrecA突然変異が、Cm及びテトラサイクリンの両者に対する耐性（Tn10付近の）についての選別によって、KO4株およびKO5株に導入された。recA発現型の同時遺伝（co−inheritance）は、UV感受性の増大によって確認された。
frd突然変異を可動化できるE.coli Hfr株が、Tn10についての選別を伴って、DW12からのfrd欠失突然変異［zid::Tn10,Δ（frdABCD）］をKL282株に変換することによって構築された。Blaut,M.,K.Whittacher,A.Valdovinos,B.A.C.Ackrell,R.P.Gunsalus and G.Cecchini［1989］J.Biol.Chem.264:13599−13604を参照のこと。frd突然変異は、フマレートレダクターゼ活性の喪失によって、テトラサイクリン耐性形質導入体の中から同定された。こうして得られたHfr株のSE1706は、frd欠失をKO4株に接合させるために用いられた。
Tn10は、改良フザリン酸培地上での選別によって構築物から削除された。例えばMaloy,S.R.,and W.D.Nunn［1981］J.Bacteriology 145:1110−1112を参照のこと。この培地は１リットル当たり、15gの寒天、5gのトリプトン、5gの酵母抽出物、20gのグルコース、10gのNaCl、50mgのクロルテトラサイクリン、10gのNaH2PO4、12mgのフザリン酸、および10mMのZnCl2を含んでいる。クロルテトラサイクリン（12.5mg/ml）及びフザリン酸（1mg/ml）のストックが、70％エタノール中で調製された。クロルテトラサイクリン、リン酸ナトリウムおよび塩化亜鉛を含む複合培地成分が別々にオートクレーブ処理され、冷却した後に混合された。70％エタノール中の抗生物質はそのままで滅菌的である。Tn10喪失を選別するために、対数増殖期の培養物の稀釈系列をフザリン酸プレートに広げ、37℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーは、単離のために別のフザリン酸プレート上で画線培養され、テトラサイクリン耐性の喪失について試験された。KO10（recA）、KO11（frd）およびKO12（recA,frd）の三つの株が構築された。
例８  エタノール遺伝子発現の特徴付け
＜醗酵実験＞：
醗酵は、10％（w/v）グルコースまたは８％（w/v）キシロースを補充したルリアブロス中で行なわれた。350mlの培地を収容したフリーカ（500−ml、Fisher Scientific Company,Orlando,FL）に、適切に穿孔されたゴムキャップを介してpH電極、ガス出口およびサンプリング口を設けた。塩基（2N KOH）の添加により6.0のpHを維持するために、pHコントローラ（Jenco model 3671;Whatman Lab Sales,Hillsboro,OR）が用いられた。1.25インチの星型磁石棒（100rpm）で連続的に撹拌しながら、30℃でのバッチ醗酵を繰り返し行なった。
単離されたコロニーからの接種菌は、振蘯しないフラスコ内において30℃で一晩増殖された。醗酵は、略1.0の初期O.D.550nm（乾燥重量330mgの細胞／リッタ）まで接種された。
分光光度計（Bausch and Lomb Spectronic 70）を用いた550nmでの混濁測定によって、細胞増殖をモニターした。エタノールは、例えばDombek,K.M.,and L.O.Ingram［1986］Appl.Environ.Microbiol.51:197−200に記載されているようにして、ガス−液体クロマトグラフィーによって測定された。変換効率の値は、塩基の添加によって生じる醗酵容量変化について補正され、また最初に添加された全ての糖が代謝されたと仮定された。容量生産性および比生産性は、醗酵の初期段階（６−24時間）の間に評価されたもので、最大容量を表わす。表および図に示した全ての醗酵データは、２回以上のバッチ醗酵の平均を表わす。
＜培養における揮発性および非揮発性の酸の分析＞：
72時間の醗酵の後、有機酸分析のためにサンプルが取り出された。揮発性酸および非揮発性酸は、Hewlett−Packard 3390Aインテグレータに接続されたGow−Mac Series 580ガスクロマトグラフ（Gow−Mac Instrument Company,Bridgewater,NJ）を用いて、ガス−液体クロマトグラフィーによって測定された。非揮発性酸は、分析の前にメチルエステルに変換された。
＜ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）＞：
細胞は、醗酵条件の下で24時間増殖され、０℃に冷却され、遠心分離（7,000×Ｇ、10分）によって回収され、10mMの２−メルカプトエタノールを含んだ1/3容量の5mMのリン酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄し、−20℃で凍結保存した。細胞ペレットは等容量の緩衝溶液中に再懸濁され、20,000psiでフレンチプレッシャーセルに２回通すことによって破壊された。膜類は、100,000×Ｇで90分間遠心することによって除去された。上清は、８％アクリルアミド変性ドデシル硫酸ナトリウムゲルを用、Biorad Mini−Protein II電気泳動ユニット（Biorad Laboratories,Richmond,CA）で分離された。タンパクは、ブラッドフォード試薬で測定された。Bradford,M.M.［1979］Mol.Gen.Genet.181:548−551を参照のこと。夫々のレーンには略20μｇのタンパクが負荷された。
＜酵素活性＞：
PDC活性は、例えば、Conway,T.,Y.A.Osman,J.I.Konnan,E.M.Hoffmann and L.O.Ingram［1987］J.Bacteriol.169:949−954に記載されているようにして、熱処理されたフレンチプレス抽出物中で測定された。熱処理は、詰抗する天然の酵素（これは組換E.coliにおけるPDCの測定を複雑にする）を不活性化するために用いられた。
なお、ここに説明された例および態様は例示の目的でのみ記載したものであり、この記載に照らして種々の改良または変更が当業者に示唆されるであろう。従って、これらの改良または変更もまた、この出願の精神および範囲内のものであり、請求の範囲中に含まれるものであることに留意すべきである。
【図３Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ｂ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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