(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核ホルモン受容体機能のリガンドとしての試薬を検定するためのインビトロ検定方法において、
精製された第１の核ホルモン受容体、センサー及び候補試薬を含むが、当該受容体の天然活性化補助因子タンパク質は含まないインビトロ混合物を作成し、前記センサーが、直接的に検出可能な蛍光標識に共有結合した配列Ｌ１Ｘ１Ｘ２Ｌ２Ｌ３（配列番号：１８）を含むペプチドからなり、ここでＬ１〜Ｌ３は独立に疎水性アミノ酸から選択され、Ｘ１〜Ｘ２は独立に任意のアミノ酸から選択され、当該ペプチドは受容体に対してインビトロでリガンド依存的な結合を提供し、かつ２４以下のアミノ酸長であり、センサーは約１００ｎＭ未満の濃度であり；
試薬の存在下での受容体へのセンサーの結合の指標としてセンサーの検定蛍光分極を測定し；
当該検定蛍光分極を対応する対照蛍光分極と比較する段階を含んでなり、当該対照蛍光分極が試薬の不存在下での受容体へのセンサーの結合の指標であり、前記検定蛍光分極が対照蛍光分極より大きいことが、当該試薬が受容体のリガンドであることを示す方法。
【請求項２】
核ホルモン受容体機能のリガンドとしての試薬を検定するためのインビトロ検定方法において、
第１の精製された核ホルモン受容体、センサー及び候補試薬を含むが、当該第１の受容体の天然活性化補助因子タンパク質は含まないインビトロ混合物を作成し、前記センサーが、直接的に検出可能な蛍光標識に共有結合した配列Ｌ１Ｘ１Ｘ２Ｌ２Ｌ３（配列番号：１８）を含むペプチドからなり、ここでＬ１〜Ｌ３は独立に疎水性アミノ酸から選択され、Ｘ１〜Ｘ２は独立に任意のアミノ酸から選択され、当該ペプチドは第１の受容体に対してインビトロでリガンド依存的な結合を提供し、かつ２４以下のアミノ酸長であり、センサーのペプチドが第１の受容体と結合して第１の受容体−センサー複合体を形成し、当該複合体が固相上に固定化される条件下であり；
センサーの第１の受容体に対する検定結合を、固定化された第１の受容体−センサー複合体を選択的に検出することにより測定し；
当該検定結合を、対応する対照結合と比較する段階を含んでなり、当該対照結合が試薬の不存在下での第１の受容体へのセンサー結合の指標であり、前記検定結合が対照結合より大きいことが、当該試薬が第１の受容体のリガンドであることを示す方法。
【請求項３】
測定段階が、固定化された第１の受容体−センサー複合体の第１の受容体を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが標識を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが標識に特異的な第２の受容体により標識を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが標識に特異的な第２の受容体により標識を介して固定化され、測定段階が固定化された第１の受容体を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが標識に特異的な第２の受容体により標識を介して固定化され、測定段階が固定化された第１の受容体を第１の受容体に特異的な第３の受容体で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
センサーがエピトープ標識を含み、測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが、固定化されたエピトープ標識に特異的な抗体部分を含む標識特異的な第２の受容体により標識を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
センサーがビオチン標識を含み、測定段階で、第１の受容体がセンサーを介して固定化され、センサーが、固定化されたアビジン部分を含む標識特異的な第２の受容体により標識を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
測定段階で、センサーが第１の受容体を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
測定段階で、センサーが第１の受容体を介して固定化され、第１の受容体が第１の受容体に特異的な第２の受容体を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
測定段階で、センサーが第１の受容体を介して固定化され、第１の受容体が第１の受容体に特異的な第２の受容体を介して固定化され、測定段階が固定化されたセンサーを検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
測定段階で、センサーが第１の受容体を介して固定化され、第１の受容体が第１の受容体に特異的な第２の受容体により標識を介して固定化され、測定段階が固定化されたセンサーを標識に特異的な第３の受容体で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
測定段階で、センサーが第１の受容体を介して固定化され、第１の受容体が、第１の受容体に特異的な抗体を含む第１の受容体に特異的な第２の受容体を介して固定化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
第１の受容体が、ＰＰＡＲγ、Ｃｙｐ７ＰＢＰ（ＬＲＨ−１）、ＮＵＲＲ１、ＲＺＲβ、ＰＯＲα、ＮＯＲ−１、Ｒｅｖ−ＥｒｂＡβ、Ｔｌｘ、ＮＧＦＩ−Ｂβ、ＨＺＦ−２α、ＣＯＵＰ−ＴＦα、β、γ、Ｎｕｒ７７、ＬＸＲα、ＣＯＲ、Ｒｅｖ−ＥｒｂＡα、ＨＮＦ４α、ＴＯＲ、ＭＢ６７α、ＳＨＰ、ＦＸＲ、ＳＦ−１、ＬＸＲβ、ＧＣＮＦ、ＴＲ２−１１α、β、ＴＲ４、ＥＲＲα、β及びＤＡＸ−１のリガンド結合ドメインを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドが、ＫＬＶＱＬＬＴＴＴ（配列番号：１）、ＩＬＨＲＬＬＱＥ（配列番号：２）、ＬＬＲＹＬＬＤＫ（配列番号：３）、ＬＬＲＹＬＬＤ（配列番号：４）、ＬＲＹＬＬＤ（配列番号：５）、ＬＬＲＹＬＬ（配列番号：６）、ＬＲＹＬＬ（配列番号：７）、ＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：８）、ＱＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：９）、ＨＱＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：１０）、ＰＱＡＱＱＫＳＬＬＱＱＬＬＴ（配列番号：１１）、ＬＬＱＱＬＬＴＥ（配列番号：１２）、ＶＴＬＬＱＬＬＬＧ（配列番号：１３）、ＩＬＲＫＬＬＱＥ（配列番号：１４）、ＩＬＫＲＬＬＱＥ（配列番号：１５）、ＩＬＲＲＬＬＱＥ（配列番号：１６）及びＩＬＫＫＬＬＱＥ（配列番号：１７）から選択される配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、ＫＬＶＱＬＬＴＴＴ（配列番号：１）、ＩＬＨＲＬＬＱＥ（配列番号：２）、ＬＬＲＹＬＬＤＫ（配列番号：３）、ＬＬＲＹＬＬＤ（配列番号：４）、ＬＲＹＬＬＤ（配列番号：５）、ＬＬＲＹＬＬ（配列番号：６）、ＬＲＹＬＬ（配列番号：７）、ＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：８）、ＱＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：９）、ＨＱＬＬＲＹＬＬＤＫＤ（配列番号：１０）、ＰＱＡＱＱＫＳＬＬＱＱＬＬＴ（配列番号：１１）、ＬＬＱＱＬＬＴＥ（配列番号：１２）、ＶＴＬＬＱＬＬＬＧ（配列番号：１３）、ＩＬＲＫＬＬＱＥ（配列番号：１４）、ＩＬＫＲＬＬＱＥ（配列番号：１５）、ＩＬＲＲＬＬＱＥ（配列番号：１６）及びＩＬＫＫＬＬＱＥ（配列番号：１７）から選択される配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが１２以下のアミノ鎖酸長である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
標識がペプチドのＮ−末端に結合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
センサーが約１０ｎＭ未満の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
センサーが受容体濃度より低い濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
センサーが受容体濃度より低い濃度であり、センサーが１〜５ｎＭの濃度であって受容体が１００〜２００ｎＭの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
標識がセンサーの間接的検出を提供する、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
標識がセンサーの間接的検出を提供し、標識がエピトープタグである、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
標識がセンサーの直接的検出を提供する、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
標識がセンサーの直接的検出を提供し、標識が発光標識である、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
標識がセンサーの直接的検出を提供し、標識が発光標識であり、発光標識が蛍光標識である、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
標識がセンサーの直接的検出を提供し、標識が発光標識であり、発光標識が蛍光標識であり、蛍光標識がペプチドのＮ−末端に結合する、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核ホルモン（ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎ）受容体機能をもたらす薬剤のスクリーニング法を提供する。
【０００２】
（背景）
核ホルモン受容体は、特異的シス−作用配列に結合することによって標的遺伝子の発現を改変するリガンド活性化転写因子の大きく良好に定義されたファミリーを含む（Ｌａｕｄｅｔ等， １９９２， ＥＭＢＯ Ｊ， Ｖｏｌ， １００３−１０１３； Ｌｏｐｅｓ ｄａ Ｓｉｌｖａ等， １９９５， ＴＩＮＳ １８， ５４２−５４８； Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ等， １９９５， Ｃｅｌｌ ８３， ８３５−８３９； Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ等， １９９５， Ｃｅｌｌ ８３， ８４１−８５０）。ファミリーのメンバーは、オーファン受容体と、ステロイド、ビタミンＤ、チロイドホルモン、レチノイン酸等を含む様々な臨床的意義のあるリガンドに対する受容体との両方を含む。リガンド結合は受容体における立体構造的変化を引き起こし、それらが、大きな核タンパク質の多種多様なグループであり（Ｇｌａｓｓ等， １９９７、Ｃｕｒｒ Ｏｐｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９， ２２２−２３２）、シグネーチャー配列モチーフを占め得る（Ｈｅｅｒｙ等， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ７３３−７３６）転写活性化補助因子と結合するのを促進すると考えられている。得られた複合体は、次いで染色質の高親和性部位に結合して遺伝子転写を調節する。
【０００３】
核ホルモン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストを同定する古典的な方法はリガンド置換検定法であり、放射性標識されたリガンドの候補試薬による置換が検出される。それに換わる方法は、核ホルモン受容体活性化のレポーターの発現についての細胞ベースの転写検定法である（例えば、Ｅｖａｎｓ等， （１９９１） 米国特許第５，０７１，７７３号）。より最近では、ゲルベースの活性化補助因子依存的受容体リガンド検定法（Ｋｒｅｙ等， １９９７， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １１， ７７９−７９１）が、抗高脂血症剤を含む種々の化合物によって活性化された核ホルモン受容体であるペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体（ＰＰＡＲ）のリガンドを同定するのに用いられた。残念なことに、これら種々の検定法は、各々、周知のリガンド及び時間、労働及び資源集約的な細胞ベース及びゲルベースの方法の必要性を含む多くの制約を受ける。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、細胞又はゲルベースの段階を用いることの無い、核ホルモン受容体機能のモジュレーターの有効なスクリーニングのための方法及び組成物を提供する。この方法は、生物活性化合物の化学的ライブラリの、自動化されたコスト効率が良くスループットの高いスクリーニングに適用される。
【０００５】
一実施態様では、本発明はインビトロの方法を提供し、当該方法は、（ａ）核ホルモン受容体、ペプチドセンサー及び候補試薬を含むが、核ホルモン受容体の天然活性化補助因子は含まない混合物を作成し、前記センサーが、受容体に対して、検定条件下で直接的なインビトロの結合を提供し；（ｂ）センサーの受容体への試薬に偏向した結合を測定し；そして（ｃ）当該試薬偏向結合を、センサーの受容体への対応する非偏向結合と比較する段階を含んでなり、偏向結合と非偏向結合との間の差が、当該試薬が受容体機能を調節することを示す。特別な実施態様では、センサーは、核ホルモン転写活性化補助因子モチーフ配列を含む両親媒性アルファへリックス核ホルモン相互作用ドメインを含む。特異性を確実にし結合を最適にするために、センサーは一般にサブマイクロモルの濃度で存在せしめ、結合反応は溶液中で起こす。好ましい実施態様では、センサーは蛍光標識を含み、測定段階は標識の蛍光分極の検出を含む。
【０００６】
また本発明は、標識されたセンサーペプチド等の試薬、及び核ホルモン受容体、ペプチド及び候補試薬を含む反応混合物も提供し、前記ペプチドは、受容体への直接的、インビトロリガンド依存的結合を与え、特に結合は試薬の存在によって促進される。
【０００７】
（本発明の詳細な説明）
本方法は一般的に３つの成分：核ホルモン受容体、ペプチドセンサー及び候補試薬を、標的化された相互作用を測定するのに有効な量で含有する混合物を用いる。多くの天然核ホルモン受容体は、リガンド結合ドメインを含む分散した機能性ドメインを持つモジュラータンパク質である；上掲のＬａｕｄｅｔ等， Ｌｏｐｅｓ ｄａ Ｓｉｌｖａ等， Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ等参照。主題の受容体は、そのような全長受容体、並びに、対応する受容体リガンド、アゴニスト及び／又はアンタゴニストの存在及び不存在において異なるセンサー結合性を与えるのに十分な受容体の一部を含む。そのような一部は一般的に少なくとも受容体のリガンド結合ドメインを含んでいる。主題の組成物の生合成、分子発現及び精製のために、広範な分子及び生化学的方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ，等， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）を参照、あるいはこの分野で他に知られているものが利用できる。核ホルモン受容体及び対応する標的治療用途の例を表１に列挙する。
【０００８】
【表１】
0003584211.tif 000002
【０００９】
この混合物は、検定条件下で、受容体に対して、直接的な、インビトロの、検定で有意に検出可能な結合を提供するペプチドセンサーも含有する。従って、センサーは、混合物中に受容体の天然の活性化補助因子タンパク質を含有せしめる必要をなくす。センサーは、受容体結合配列、一般的にはＬ１Ｘ１Ｘ２Ｌ２Ｌ３を含み、ここで、Ｌ１−Ｌ３は独立に疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン又はイソロイシイン、より好ましくはロイシンから選択され；Ｘ１−Ｘ２は独立に任意のアミノ酸、好ましくは任意の天然アミノ酸から選択される。この配列を含むセンサー領域は、一般的に両親媒性のアルファへリックスを形成する。このような配列は、天然活性化補助因子タンパク質モチーフ配列でもよく、例えば段階的突然変異分析によりそれらの活性化補助因子モチーフ配列又は共通配列から、及び／又は、全体又は部分的に合成した配列のスクリーニング、例えば残基の無作為化及び受容体結合についての選択から誘導されてもよい。センサーは、必要な受容体特異的結合をもたらすのに十分な長さ及び配列であり、一般的には５０以下、好ましくは２４以下、より好ましくは１２残基以下の長さである。従って、予定された又は無作為化された候補センサーのパネルは、受容体結合について容易にスクリーニングされる。例えば、高スループットの蛍光分極検定法（下記）では、特異的結合を示す候補センサーは、最適化した結合検定条件下で、一般的には少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０ミリ分極単位の向上した蛍光分極により簡便に同定される。
【００１０】
特別の実施態様では、センサーはリガンド、アゴニスト及び／又はリガンド依存的結合を示し、即ちセンサーは、そのようなリガンド／アゴニスト／アンタゴニストの存在及び不存在で区別をつけて、各々一般的には少なくとも１０／１０％、好ましくは少なくとも１００／５０％、より好ましくは少なくとも１，０００／９０％の差動的結合で受容体に結合する。従って、予定された又は無作為化された候補センサーのパネルは、図２及び３において２つの例示的な受容体／リガンド対について例示したように、差動的結合について容易にスクリーニングされる。同様に、標的受容体の周知のアゴニスト又はアンタゴニストを用いて差動的結合が簡便に示される。オーファン受容体については、リガンド結合ドメインに選択的に結合する仮性リガンド又は代替物についての既知のリガンドを予めスクリーニングするのが好都合であることが多い。あるいは、アゴニスト及び／又はアンタゴニストは、予定された又は無作為化された標識候補ペプチドを、検定で検出可能な受容体結合を示すセンサーについてスクリーニングし、次いで、同定されたセンサーの受容体に対する結合を増加／減少させる試薬、即ち各々アゴニスト／アンタゴニストについてのスクリーニングによって同定してもよい。
例示的なセンサー及び結合データを表２に示す。
【００１１】
0003584211.tif 000003
0003584211.tif 000004
0003584211.tif 000005
【００１２】
また、センサーは検出可能な標識も含む。広範な種々の標識を用いることができ、放射活性、発光、光学又は電子密度等の直接的な検出、又はエピトープタグ等の間接的な検出を与える標識が含まれる。標識を検出するために、標識の性質及び他の検定構成要素、例えば光学又は電子密度、放射性放出、非放射性エネルギー移動等を介すること、又は抗体複合体で間接的に検出されること等に応じて種々の方法を用いることができる。特別な実施態様では、標識は受容体結合に従って差動的に検出可能であり、あらゆる結合対非結合の分離段階を不要にする。より特定の実施態様では、標識は、受容体結合に依存する差動的蛍光分極を与える蛍光標識である。このような標識の例はローダミン及びフルオレセインを含み、これらは直接的に又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して間接的に結合させてもよい。（例えば、固相ペプチド合成の間の）ペプチド抱合／取り込みのための好適な標識及び方法はこの分野で良く知られている。センサーは、一般的に約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満、そして最も好ましくは約１ｎＭ未満の濃度で存在する。
【００１３】
また、検定混合物は候補試薬も含有する。好適な候補試薬は多数の化学的部類を包含するが、典型的には有機化合物；好ましくは小さな有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られる。特別な実施態様では、検定混合物は受容体の既知のリガンドも含む。この実施態様は、受容体のアンタゴニストのスクリーニングに特に適している。また、種々の他の試薬も混合物中に含まれ得る。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤等を含み、使用され得る。
【００１４】
混合物は、候補試薬が存在しない場合、センサーが受容体に基準となる結合親和性で結合する条件下でインキュベートする。特別な実施態様では、受容体、ペプチド及び試薬を含む混合物の全ての成分は溶液中にある。混合物成分は、必要な結合を提供するために任意の順序で添加でき、インキュベーションは最適な結合を促進する任意の温度で実施してよい。インキュベーション時間は、同様に最適な結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを促進するために最短化される。インキュベーションの後、受容体と試薬との間の試薬偏向結合が、上記のような標識の性質に従って検出される。試薬有無での結合における相違が、その試薬が受容体結合機能を調節することを示している。ここで用いる相違とは、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の違いを表す。
【００１５】
センサーと受容体との間の結合を測定するために、センサー及び核ホルモン受容体の性質、検定が溶液中で行われるか又は部分的あるいは全体的に固相で行われるか、発光、放射活性又は蛍光放出が用いられるか否か、固定化された受容体−センサー複合体のセンサー又は受容体が検出されるか否か等に応じて広範な種々の方法が用いられる。中でも固相での実施態様では、測定段階は、受容体のセンサーを介した、又はセンサーの受容体を介した固定化を含み得る。例えば、センサーは標識を含むと考えられ、タグ又はセンサー自身のアミノ酸がエピトープ標識を提供しうる。従って、受容体はセンサーを介して固定化され、センサーは標識を介して固定化されうる。標識は固相に従来の共有及び／又は非共有結合で直接結合してもよく、標識に特異的な１又は複数の第２の受容体、例えばセンサーエピトープ特異的抗体、アビジン（この場合標識はビオチン）等を介して間接的に結合してもよい。センサーがこのように固定化されると、測定段階は一般に、従来のＥＬＩＳＡ形式におけるような受容体特異的抗体等で固定化された核ホルモン受容体の検出を含む。好ましいＥＬＩＳＡ形式検定法は、特に高スループット使用において、簡便な読み出しのための化学発光又は時間分解蛍光基質を用いる。
【００１６】
それに換わる固相実施態様では、センサー及び受容体が逆になる、即ち、センサーが核ホルモン受容体を介して固定化される。同様に、受容体は直接固定化されるか、あるいは１又は複数の受容体特異的受容体を介して結合し、次いで固定化されたセンサーが、例えばＥＬＩＳＡ型の形式において直接的又は間接的に検出される。
【００１７】
固相検定法は、パネル又は混合物中で複数の異なる配列センサーを同時又は並行してスクリーニングする場合に特に有用である。例えば、オーファン受容体では、ファージディスプレー検定法において弱く結合したペプチドが同定される。弱く結合したペプチドは、ペプチド結合を調節する化合物のライブラリのスクリーニングに用いられ、次いで陽性の混合物が分離され個々のペプチドによって検定される。このような活性ペプチドは、次いで、例えば蛍光部分で直接的に標識され、例えば以下に記載するような蛍光分極検定法などの非常に高いスループットの溶液相検定法において用いられる。また、このようなペプチドのパネルは、既知の受容体の候補モジュレーターをスクリーニングするのにも用いられ、与えられたモジュレーターの活性／特異性の仮想の指紋（ｖｉｒｔｕａｌ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）を構成する一連の結合効果を与える。さらに、このようなペプチドは、直接検出可能なセンサーペプチドを必要とする溶液相検定法のための好ましい対照物の同定に用いてもよい。
【００１８】
また本発明は、主題の方法で用いるための試薬も提供する。例えば、本発明は、検出可能な標識に共有結合した配列Ｌ１Ｘ１Ｘ２Ｌ２Ｌ３を含むペプチドからなるか、又は実質的になるセンサーを提供し、ここでＬ１−Ｌ３は独立に疎水性アミノ酸から選択され、Ｘ１−Ｘ２は独立に任意のアミノ酸から選択され、前記ペプチドは核ホルモン受容体に対して直接的なインビトロのリガンド依存的結合を提供する。特別な実施態様では、標識はペプチドのＮ−末端に結合した蛍光標識であり、ペプチドは２４、好ましくは１８、より好ましくは１２、最も好ましくは８残基以下の長さである。また本発明は、例えば、核ホルモン受容体、ペプチド及び候補試薬を含む混合物などの試薬混合物も提供し、前記ペプチドは受容体に対して直接的なインビトロのリガンド依存的結合を提供し、好ましくは、その結合は試薬の存在下で促進される。
以下の実施例は例示のために提供され、いかなる限定もされない。
【００１９】
（実施例）
Ｉ．高スループットのインビトロ蛍光分極検定法
試薬：
センサー：ローダミン標識Ｌ１Ｘ１Ｘ２Ｌ２Ｌ３ペプチド（最終濃度＝１−５ｎＭ）
受容体：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／核ホルモン受容体
リガンド結合ドメイン融合タンパク質（最終濃度＝１００−２００ｎＭ）
バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ 塩化マグネシウム、ｐＨ７．６
【００２０】
プロトコール：
１．９０マイクロリットルのペプチド／ＮＨＲ混合物を、９６−ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。
２．ウェル毎に１０マイクロリットルの試験化合物を添加する。
３．５分間振盪し、５分以内の蛍光分極の量を、Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）を用いて測定する。
【００２１】
ＩＩ．立体配座センサー−ＥＬＩＳＡ形式検定法
バッファー及び溶液調製：
１．１０Ｘ  検定用バッファー：
１００ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ
３００ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ
２０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ
ＭＱ Ｈ２Ｏを添加して１Ｌとする。
２．リガンド／ペプチド／タンパク質の主混合物
タンパク質：最終濃度＝１００ｎＭ
ビオチン−ペプチド（分子量：１３６６．７３８７ｇ／モル）：最終濃度＝１μＭ
検定用バッファー及びＨ２Ｏを添加し最終容量とする：
最終バッファー濃度＝１Ｘ
３．抗体混合物：
抗−ＧＳＴ、ウサギ（最終濃度＝１：１０，０００）
抗−ウサギ−ＨＲＰ（最終濃度＝１：１０，０００）
Ｔ−ＴＢＳを添加して最終容量とする：最終バッファー濃度＝１Ｘ
【００２２】
方法：
１．適当なペプチド／タンパク質の組み合わせで５０ｍＬの主混合物（上記２参照）を作成する（５０ｍＬのポリプロピレン管を使用）。室温で１時間インキュベートする。
２．主混合物９５μＬを９６−ウェルプレート＊＊の各ウェルに添加する。
＊＊リアクチ−結合ストレプトアビジン被覆、白色ポリスチレンプレート
（＃１５１１８Ｂ）、Ｐｉｅｃｅからのスーパーブロッキング試薬により
阻止されている。
３．各試験化合物（ストック＝６０μＭ）の５μＬをプレートの各ウェルに移す。
４．プレートを室温で１時間インキュベートする。
５．インキュベートしながら、ウサギ抗−ＧＳＴ抗体及び抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体混合物を作成する（上記３参照）。氷上で１時間インキュベートする。
６．プレートをＨ２Ｏで３回完全に洗浄する。
７．プレートの各ウェルに１００μＬの抗体混合物を添加する。
８．室温で１時間インキュベートする。
９．Ｈ２Ｏで３回洗浄する。
１０．スーパーシグナル基質（混合したルミノール及び過酸化物）をＨ２０中で１：２に希釈し、１００μＬを各ウェルに添加する。
１１．３−５分間振盪する。化学発光を読む。
【００２３】
この明細書で引用した全ての出版物及び特許出願は、あたかも各々の出版物又は特許出願が特に及び個々に参考として取り入れられると示されているように、ここに出典明示して取り入れるものとする。前記の発明は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例によって幾分詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく、それにある種の変更及び修飾が可能であることは容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＵＫ−１３９１センサーを用いたオキシステロールリガンドでのＬＸＲ活性化用量反応のグラフである。
【図２】蛍光分極検定法において２４−ケトコレステロールリガンド（２μＭ）がＬＸＲの標識されたペプチドセンサーに対する親和性を向上させることを示す用量反応のグラフである。
【図３】蛍光分極検定法において９−シス−レチノイン酸リガンド（１μＭ）がＲＸＲ受容体の標識されたペプチドセンサーに対する親和性を向上させることを示す用量反応のグラフである。
【図４】ＬＸＲ／２４−ケトコレステロールリガンド（２μＭ）、ＰＰＡＲγ／ＢＲＬ４９６５３（１μＭ）及びＲＸＲ／９−シス−レチノイン酸リガンド（１μＭ）についての、ＴＵＫ−１３９１センサーでの蛍光分極ＮＲＨアゴニスト検定法の確証を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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