(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性膝関節炎またはリウマチ性膝関節炎のヒト患者の膝関節液に存在しており、これらの膝関節液から分離され、かつ下記理化学的性質を有するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとが結合した複合体。
（Ａ）分子量：  該複合体をヒアルロニダーゼ処理することにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で非還元状態において約85キロダルトン（Ｘバンド）と約83キロダルトン（Ｙバンド）の二本の主バンドを形成する、
（Ｂ）部分タンパク質一次構造：
1)  ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr Ile Thr Ser Arg
Met Ala Thr Thr Met Ile Gln Ser Lys Val Val Asn Asn Ser Pro Gln Pro
2)  ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Ile Val Ile Lys Val Lys Pro Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Ile Asp Val
Asp Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile Ser Lys Leu Asp Ala Xaa Ala Ser Pro
（式中、Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）
（Ｃ）等電点: 約 6.0〜7.0 （ＤＥＡＥ−セルロファインＡ800 に対する結合のpH依存性からの推定値）
【請求項２】
ヒト関節炎患者の関節液を採取し、タンパク質変性剤を加えてタンパク質非解離条件下で超遠心を行ってヒアルロナン濃度の高いフラクションを採取し、該フラクションにタンパク質変性剤を加えてタンパク質解離条件下で超遠心を行い、得られ得る請求項１に記載のヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとが結合した複合体。
【請求項３】
請求項１に記載の複合体、その複合体を構成するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、又はそれらのペプチドフラグメントをヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとが結合した複合体と交差反応を示す抗体。
【請求項４】
請求項１の複合体、その複合体を構成するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分、Ｙバンド成分、又はそれらのペプチドフラグメントをヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該ヒアルロナン結合性タンパク質と交差反応を示す抗体を用いることを特徴とするヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとが結合した複合体の測定法。
【請求項５】
請求項４に記載されている抗体を用いてヒト関節から採取された関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとが結合した複合体の含量を測定することを特徴とする関節炎の検出方法。
【請求項６】
固相に結合されたプロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質と、請求項４に記載されている抗体と、標識物質を結合した、または結合し得る抗イムノグロブリン抗体とから本質的に構成される関節炎の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、該タンパク質とヒアルロナンとの複合体、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の測定法、関節炎の診断方法および関節炎の診断用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
関節液は、身体各所の関節の関節包内にあって関節軟骨と関節軟骨との間を満たしており、関節の円滑な運動性を保ち、運動時に加わる衝撃を緩和する機能を有している。そしてこれらの機能は、実際には関節液内に豊富に含まれているヒアルロナン（ヒアルロン酸）の働きに負うところが大である。正常人の関節液中のヒアルロナンはほぼ単独で存在しているが、変形性関節炎やリウマチ性関節炎などの炎症性疾患患部関節液中のヒアルロナンには、数種類のタンパク質が結合していることが知られている。関節液の組成は、ヒアルロナンの豊富なことを除けば基本的には血漿成分と同じであり、ヒアルロナンは滑膜細胞により関節液中に放出される。関節に炎症が生じると患部血管の浸透性が変化して、ハプトグロビンやα１−プロテアーゼインヒビターなどのいわゆる急性期の炎症性タンパク質が関節液内に浸透する。これらのタンパク質がヒアルロナンと結合するという報告においては、抗体との反応性において、ハプトグロビン、α２−プロテアーゼインヒビター、インターαトリプシンインヒビター、の３種類が検出された。これらのタンパク質のヒアルロナンとの結合が特異的なものであるかどうかは明らかにされていない。関節液中のヒアルロナンが、その還元末端のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基との間でシッフ塩基を形成して結合し、アマドリ転移によって安定な結合を形成する、という、非特異的な結合様式で、アルブミンやトランスフェリンと複合体を形成するという報告もある。
一方、米田らはウシ血清中からヒアルロナン結合性タンパク質を単離し、これが従来知られていない性質を有することを見いだし、血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（Ｓｅｒｕｍ  Ｄｒｉｖｅｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＨＡＰ）と命名した（Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６５，（９），５２４７−５２５７）。
しかし、従来ヒトの関節炎患者の関節液からヒアルロナンに結合性を有するタンパク質が精製単離されたことは報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、関節炎患者の関節液に存在するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質およびこれに対する抗体を提供することである。
また、本発明の目的は、ヒト関節液に存在するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質を、この抗体を使用して測定して関節炎を検出する方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、この関節炎の診断に用いる診断用キットを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトの関節炎患者の関節液中にヒアルロナン結合性タンパク質が豊富に存在することを見出し、この物質を精製単離し、その物性を明らかにした。また、関節炎の罹患部位におけるヒアルロナン−タンパク質相互作用の重要性を探る上で、本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は、新たなプローブとなる可能性を持ち、関節液中のこの物質を測定することが、上記の関節炎、すなわち変形性膝関節炎とリウマチ性膝関節炎とを鑑別する上で有用な手段となり得ることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、変形性膝関節炎またはリウマチ性膝関節炎のヒト患者の膝関節液中においてヒアルロナンと結合して存在しており、これらの膝関節液から分離され、かつ下記理化学的性質を有するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質：
（Ａ）分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で非還元状態において約８５キロダルトン（Ｘバンド）と約８３キロダルトン（Ｙバンド）の二本の主バンドを形成する、
（Ｂ）部分タンパク質一次構造：
▲１▼  ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ
▲２▼  ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントは次のとおり；
Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｘａａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ
（式中、Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）である。
（Ｃ）等電点：  約  ６．０〜７．０  （ＤＥＡＥ−セルロファインＡ８００  に対する結合のｐＨ依存性からの推定値）。
また、本発明は上記ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体である。
【０００６】
さらに、本発明は前記のヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分、Ｙバンド成分、それらのペプチドフラグメント、または該ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンの複合体をヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分およびＹバンド成分の１または２以上と交差反応を示す抗体である。
また、本発明は上記の抗体を用いることを特徴とするヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質を測定する方法である。
さらに、本発明は上記抗体を用いてヒト関節から採取された関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質含量を測定して関節炎を検出する方法である。
さらにまた、本発明は固相に結合されたプロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質（プロテオグリカンのヒアルロナン結合部位；ＨＡＢＲ）と、上記の抗体と、標識物質を結合した、または結合し得る抗イムノグロブリン抗体とから本質的に構成される関節炎の診断用キットである。
以下本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸などに関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リジン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｙ：スレニオン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
【０００８】
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は、ヒトの変形性膝関節炎またはリウマチ性膝関節炎患者の膝関節液中において多量に発見されたものである。この物質の精製は以下の方法で行うことができる。
すなわち、上記関節炎患者のヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を含有する関節液を採取し、これに低濃度のタンパク質変性剤（例えば、０．４  Ｍ程度のグアニジン塩酸塩）を加えてタンパク質とヒアルロナンとが会合した状態（非解離条件下）で超遠心（アソシエイティブ超遠心）を行う。次に、このヒアルロナンを多く含むフラクションに、より高濃度のタンパク質変性剤（例えば、４Ｍ程度のグアニジン塩酸塩）を加えてタンパク質解離条件下で超遠心（ディソシエイティブ超遠心）し、ヒアルロナンを多く含むフラクションを採取する。このタンパク質変性剤としてはグアニジン塩酸塩、尿素等が用いられる。
ヒアルロナンを多く含むフラクションを、脱塩し、７５％エタノール飽和とすることによって沈澱物を得る。この沈澱物は、ヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体である。この複合体は、タンパク質解離条件下でも解離しない。
【０００９】
次に、この複合体をヒアルロナンを基質として分解することができるムコ多糖類分解酵素で分解し、必要に応じて透析処理、分子ふるい処理（ゲル濾過、限外濾過等）  、電気泳動処理などを行ってヒアルロナン結合性タンパク質を精製単離する。ヒアルロナンを基質として分解することができるムコ多糖類分解酵素としては、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼなどが用いられる。
【００１０】
本発明の抗体を作成するには、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのサブユニットと考えられるＸバンド成分もしくはＹバンド成分、これらを酵素的もしくは化学的に分解して得られるペプチドフラグメント、またはヒアルロナンと上記タンパク質との複合体を抗原（免疫原）として用い、これをヒト以外の動物（好ましくは哺乳動物）に投与することによって該動物を免疫し、該動物の体内に産生された抗体をその体液（血液等）から得ることができる（例えば、抗血清として）。また、免疫された動物の抗体産生細胞（脾細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞など）を採取し、これを使用してモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００１１】
具体的には、上記抗原をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の適当な溶媒に溶解し、通常これにアジュバント（フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバントなど）を混合し、ヒト以外の動物（好ましくは哺乳動物）、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、アヒル等（好ましくは、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ）のリンパ節、皮下、皮内、静脈内または腹腔内等に投与する。初回投与後、１〜５週間に一度、１〜５回程度同様に追加免疫を行うと上記抗原（免疫原）に対する抗体が免疫感作された動物の体内に産生される。抗原をコートしたマイクロプレートを用いる免疫測定（ＥＬＩＳＡ等）によって血液等の抗体価を調べ、抗体価が上昇した後に血液等を採取する。血液から抗血清を分離するには、採血した血液を放置後、遠心分離する方法によることができる。このような抗血清をさらに精製する必要があるときは、溶解度差を利用した選択的分別法（硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱など）、電荷の差を利用した分別法（等電点沈澱、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィーなど）、抗体、イムノグロブリンとの特異的親和性の差を利用する分別方法（プロテインＡ等によるアフィニティークロマトグラフィーなど）、担体への吸着係数の差を利用する方法（ハイドロキシアパタイト吸着体等による吸着クロマトグラフィーなど）、分子量の差を利用する分別法（ゲル濾過法、超遠心法など）など、抗血清の精製法として通常用いられる方法を適宜組み合わせて分離精製を行うことができる。
【００１２】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は前記抗体産生細胞を公知の方法（ハイブリドーマ法；Ｇ．  Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６，  ５１１−５１９（１９７６）；Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７（１９７５）；Ｍ．Ｓｈｕｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７６，  ２６９−２７０（１９７８）；「単クローン抗体−ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ−」，（株）講談社，１９８３年２月２０日発行など参照）によって長期間増殖可能にし、該細胞を培養することによって培地中に産生、蓄積させることができる。また、ハイブリドーマを、主要組織適合性が一致する動物、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスなどに、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を予め投与した後、その腹腔内に投与し、腹水腫瘍を形成させて腹水中に抗体を蓄積させることもできる。このように産生されたモノクローナル抗体は上記抗血清と同様の方法により精製することができる。
【００１３】
以上のごとく調製された本発明の抗体は、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分およびＹバンド成分の１または２以上と交差反応を示すものであり、ヒトの関節炎が変形性関節炎かリウマチ性関節炎であるかの鑑別診断、あるいは関節炎治療の予後の診断等に使用することができる。なお、本発明の抗体は、以上の抗原特異性を有するものである限り、免疫動物、製法等は限定されず、ポリクローナル抗体（抗血清など）およびモノクローナル抗体を包含する。また、このような抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼで限定分解して得られたフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２  、Ｆａｂ’、Ｆａｂなど）であって本発明の抗体の特徴を保持するものは本発明の抗体に包含される。
【００１４】
この診断に用いる検出法は、関節炎患者の関節から関節液を採取し、そのなかに含有されるヒアルロナン結合性タンパク質複合体を定量し、その量によって多い場合にはリウマチ性関節炎（ＲＡ）、少ない場合には変形性関節炎（ＯＡ）と鑑別することができる検出法である。この定量方法としては公知の免疫測定法、ドットブロット法（ウエスタンブロット法）等が用いられる。
【００１５】
本発明に使用される公知の免疫測定（イムノアッセイ）としては、上記の本発明の抗体を使用してヒト関節液由来ヒアルロナン結合性を定量的または定性的に測定できる方法であれば限定されない。
すなわち、沈降反応や凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法（ＴｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ゲルを支持体として用いて抗原と抗体を拡散させ、沈降線または沈降輪を形成させる免疫拡散法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、担体上に抗原を吸着させ、これと抗体を反応させ、さらにこの抗体を抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡなどを用いて二次的に検出するウエスタンブロット法（ドットブロット法）、または分別検出の容易な物質で標識した抗原または抗体を用いる標識化免疫測定法（Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の何れの測定系も本発明の測定法に適用できる。より具体的には、免疫比濁法としては、本発明の抗体を結合したポリスチレン微粒子（ラテックス）、赤血球などを担体粒子として使用する凝集反応法などが例示され；免疫拡散法としては、本発明の抗体の担体として寒天ゲル、アガロースゲル、セルロースアセテート膜、デキストランゲルなどを使用するオクタロニー拡散法、ウーダン拡散法などが例示され；ウエスタンブロット法（ドットブロット法）としては、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンフルオライド膜に抗原を吸着させ、本発明の抗体を抗原と反応させ、次いで酵素標識抗イムノグロブリン抗体（例、パーオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体）または放射性同位元素標識プロテインＡで本発明の抗体を検出する方法が例示され；標識化免疫測定法としては、酵素を標識物質として使用するエンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法，ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ））；放射性同位元素を標識物質として使用するラジオイムノアッセイ（放射線免疫測定法，ＲＩＡ）、蛍光物質を標識物質として使用する蛍光イムノアッセイ（蛍光免疫測定法）などが例示される。
【００１６】
これらの測定法は、公知の方法［入江  實編、「続ラジオイムノアッセイ」、（株）講談社、１９７９年５月１日発行；石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」、第２版、（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．９２，  （１９８３），  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｅ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，アカデミックプレス社発行  参照］に準じて実施される。
【００１７】
なお、標識化免疫測定法による場合、本発明の抗体または抗イムノグロブリン抗体を、酵素（パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、放射性同位元素（１２５  Ｉ、１３１  Ｉ、３  Ｈなど）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）などの標識物質で直接標識するか、または他の物質（ビオチン−アビジン（もしくはストレプトアビジン）系、抗免疫グロブリン抗体など）を介して間接的にこれらの標識物質で標識して測定に供する。
抗原抗体反応後、検体中の抗原と結合した抗体（サンドイッチ結合物を含む）と、未結合の遊離の状態の抗体との分離（ＢＦ分離）が必要な場合、液相法（二次抗体、ポリエチレングリコール、デキストラン炭末などを使用する）または固相法（固相化した測定対照物質に結合性を有するタンパク質、抗体を使用する）のいずれの方法によってもよいが、固相法が好適である。
【００１８】
本発明の免疫測定法としては、特に以下の方法が簡便であり、好ましい。すなわち、プロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＲ）を固相に固定化し、このＨＡＢＲと、測定試料中に存在するヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体とを反応させて、該複合体をそのヒアルロナン部分を介して固相上に捕捉し、捕捉された該複合体と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合させ、固相上に捕捉された該複合体に特異的に結合した抗体を公知の方法で検出、測定する方法である。抗体を検出、測定する方法としては、抗体として前記のような標識物質を予め結合させた本発明の抗体を用いて標識物質を測定する方法；未標識の抗体を上記免疫反応に使用し、複合体と結合した抗体を、標識物質を結合した抗イムノグロブリン抗体と反応させて標識物質を測定する方法；あるいは未標識の抗体を上記免疫反応に使用し、複合体と結合した抗体を、ビオチン等の物質を結合した抗イムノグロブリン抗体とを反応させ、さらにビオチン等の物質と特異的に反応するアビジン（またはストレプトアビジン）と標識物質との結合物を反応させて標識物質を測定する方法などが挙げられる。
なお、上記固相としては試験管、ビーズ、マイクロプレート、濾紙、ラテックスなどが使用され、固相にＨＡＢＲ、抗体などを固定化する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法［「固定化酵素」、１９７５年３月２０日、（株）講談社発行、第９〜７５頁参照］を応用して行うことができる。特に物理的吸着法は簡便な点で好ましい。なお、ＨＡＢＲ、抗体等が結合していない部分を血清アルブミン、ゼラチンなどによってブロッキングすることが好ましい。
【００１９】
また、前記ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体の定量には、本発明の関節炎診断用キットを用いることができる。このような関節炎診断用キットとしては、例えば、固相に結合されたプロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質、前記した抗体、及び標識物質を結合した、または結合し得る抗イムノグロブリン抗体（好ましくは、抗ＩｇＧ抗体）とから本質的に構成される関節炎診断用キットが用いられる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の具体的実施例を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
実施例１
ヒアルロナン結合性タンパク質の調製
１）関節液からのヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の精製
リウマチ性膝関節炎患者の関節液を採取し、軽く遠心分離して不溶物を取り除き、ハンクス液によって５〜６倍に希釈した。これに１／１０体積の４Ｍグアニジン塩酸塩溶液を加え、アジ化ナトリウムを微量加えた後、塩化セシウムを加えて５０％（ｗ／ｖ）とした。超遠心チューブに入れて４℃に静置後、４℃、１２３，０００  ×ｇ  の超遠心を４８時間行った（タンパク質非解離条件での超遠心；アソシエイティブ超遠心）。超遠心後、チューブの底から１０等分に分割したフラクションをとり、その各々の比重とヒアルロナンおよびタンパク質濃度とを測定し、図１にその結果を示した。
【００２１】
図１において実線はローリー（Ｌｏｗｒｙ）  法によって定量した各フラクションのタンパク質濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）を表し、破線は放線菌ヒアルロニダーゼを用いる方法により定量したヒアルロナン濃度（単位：μｇ／ｍｌ）を表している。比重の小さい画分（比重  １．３０  前後）  に集まっているヒアルロナンは、関節の炎症に伴い、低分子化したヒアルロナン断片と考えられる。比重  １．４３  以上のフラクションに全体比３０％以上のヒアルロナンが存在し、９３％以上のタンパク質成分はそれ以下の比重の画分に分布していた。
【００２２】
ヒアルロナンを多く含む比重  １．４３  以上の画分を集め、更にグアニジン塩酸塩を加えて、最終のグアニジン塩酸塩濃度を４Ｍとした。これを再度超遠心にかけ（タンパク質解離条件下での超遠心；ディソシエイティブ超遠心）、１０等分のフラクションに分割して、比重とヒアルロナンおよびタンパク質濃度とを測った結果を図２に示した。
図２において、実線、破線はそれぞれタンパク質濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロナン濃度（単位：μｇ／ｍｌ）  を表している。
【００２３】
ヒアルロナンは比重１．４５〜１．４６を中心として分布し、比重約  １．４〜１．５  の範囲に全体比６０％以上のヒアルロナンが集中していたので、この範囲のフラクションを集めた。このフラクションを脱塩し、７５％エタノール沈澱によって沈澱物を得た。この沈澱物はヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体（ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体）であり、ここに含まれるタンパク質量は元々の関節液に含まれていた量の約０．０３％であった。この画分を放線菌由来のヒアルロニダーゼで処理したところ、下記（３）に示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ；１１％）電気泳動において分子量約８５，０００ダルトンと約８３，０００ダルトンの２本のバンド（それぞれＸバンドおよびＹバンド）を示した（図３参照）。
【００２４】
図のマーカーは、ファルマシア社製、標準分子量キットの電気泳動図である。分子量の９４，０００ダルトンはホスホリラーゼｂ、６７，０００ダルトンはウシ血清アルブミン、４３，０００ダルトンは卵白アルブミン、３０，０００ダルトンはカーボニックアンヒドラーゼ、２０，１００ダルトンは大豆トリプシンインヒビター、１４，４００ダルトンはα−ラクトアルブミンをそれぞれ示す。
レーン３は、精製されたＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体にヒアルロニダーゼを加えて加温し、その後加熱処理を含む調製法によって電気泳動サンプルとしたものである。レーン２は、複合体に酵素を加えずに、その他はレーン３のサンプルと同様の処理を行って調製した電気泳動サンプルである。レーン１は複合体に酵素を加えず、一切の加温、加熱もせずに調製した電気泳動サンプルである。
レーン１でもレーン２でも、染色バンドは出現せず、レーン３にのみ２本のバンドが出現した。従ってレーン３で現れたバンドは、酵素処理時の加温や電気泳動サンプル調製時の加熱によって生成された物質ではなく、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体のヒアルロナンがヒアルロニダーゼによって消化されることにより遊離したタンパク質を表していることがわかった。
【００２５】
２）ヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体からのヒアルロナン結合性タンパク質の分離法
ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を適当な緩衝液中に溶解し、コンドロイチナーゼＡＢＣをホルミル−セルロファイン（商品名，チッソ（株）製，生化学工業株式会社販売）に固定化した担体を充填したカラムにアプライしてヒアルロナンを消化した後、消化物を透析してヒアルロナン分解物を除き、ヒアルロナン結合性タンパク質単独溶液を得た。
【００２６】
３）ヒアルロナン特異的定量法
試料溶液（１００μｌ  〜  ３００μｌ）に、  １．３％の酢酸カリウムを含む９５％エタノールを３倍体積加えて攪拌し、氷温で３０分静置後、１５，０００  ｒ．ｐ．ｍで３０分間遠心し、上澄みを除いた。得られた沈澱に５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて溶かし、放線菌由来ヒアルロニダーゼ  ２．５〜５．０  ＴＲＵ（濁度減少ユニット）を加え、５０℃で３０分消化した。消化後、１００  ℃で３分間加熱して酵素反応を止め、φ０．２２μｍのフィルターで遠心濾過した。濾液をポストカラム反応式糖質検出ＨＰＬＣシステム（東ソー（株））にアプライすることによってヒアルロナン分解物を定量した。定量には、鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウムを同緩衝液に溶解し、試料と同時に酵素処理したものをスタンダードとして用いた。
【００２７】
４）分子量測定法
Ｓｅｇｒｅｓｔ  らの方法〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ，  ２８−Ｂ  巻，  ５４−６３  頁（１９７２）〕に従い、トリス／グリシン／ＳＤＳ（ｐＨ８．３）でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに１０μｌの試料を付与し、電気泳動を行った。試料には、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体をヒアルロニダーゼで処理してヒアルロナンを除いたものを用いた。染色をクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０  で行い、標準分子量キット（ファルマシア社製）の同電気泳動における泳動度に基づき、分子量を観察した。その結果を図３に示す。
前述したように、本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は約８５，０００ダルトン（Ｘバンド）と約８３，０００ダルトン（Ｙバンド）との二本のバンドを示し、それらはいずれもヒアルロニダーゼ処理しなかった試料には見られず、ヒアルロニダーゼとは異なる位置のバンドであった。また、この結果は試料を還元処理しても、しなくても同じであった。
【００２８】
５）等電点の測定
本発明のＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体のヒアルロナンを酵素（ヒアルロニダーゼ）消化してヒアルロナン結合性タンパク質単独とした場合、陰イオン交換体カラム（ＤＥＡＥ−セルロファインＡ８００  ：チッソ（株）製，生化学工業株式会社販売）に対して、ｐＨ７．０  ではすべて結合し、ｐＨ６．０  では結合するものとしないものとがおおよそ同じ割合であった。この現象より、当該タンパク質の等電点は約ｐＨ６．０  から７．０  の間、特に約ｐＨ  ６．０〜６．５  であると判断した。
【００２９】
６）部分的アミノ酸一次構造の決定
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＸバンドとＹバンドとに分け、そのそれぞれを既知の方法に従ってプロテアーゼＶ８で処理し、得られたペプチドフラグメントの内から、Ｘバンドから１種類、Ｙバンドから１種類のペプチドを選んで、アプライド・バイオシステムズ社製のアミノ酸配列決定器を用い、固相法によってアミノ末端からのアミノ酸配列を決定した。それぞれのペプチドのアミノ末端からのアミノ酸配列は下記の通りであった。
【００３０】
▲１▼  ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造。
Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ
▲２▼  ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造。
Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｘａａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ
（Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）
なお、プロテアーゼＶ８  （Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｖ８）は、スタフィロコッカス・アウレウスＶ８（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８）から調製された酵素で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基末端側を切断するエンドプロティナーゼ（至適ｐＨ４．０  と７．８）である〔製造元  ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）。
【００３１】
実施例２
ヒト関節液ヒアルロナン結合性タンパク質に対する抗体の作成
実施例１に従って得られたＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を、５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解して放線菌由来のヒアルロニダーゼで消化後、消化物を実施例１  ４）と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ヒアルロナン結合性タンパク質のＸバンド成分とＹバンド成分を抽出した。これらそれぞれを抗原として含む  ０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同体積のフロイント完全アジュバントと混合し、ウサギ膝嵩リンパ節に注射した。その後２週間おきに２回５０μｌ  の  ＰＢＳを同体積のフロイント不完全アジュバントに混合し、同じ部位に注射した。毎週ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）  によって抗体価を調べ、２回目のブーストの２週間後に採血し、２種類の抗血清を得た。この抗血清を抗体として用いた。得られた抗体はＸ成分とＹ成分どちらを抗原としたものでもＸ成分とＹ成分の双方に同程度に反応した。また、これらの抗体は、ウシ血清やマウス血清においても、その中に含まれる本発明のヒアルロナン結合性タンパク質に相当する成分と反応した。
なお、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を抗原とした場合も、同様の抗原特異性を有する抗体が得られる。
【００３２】
実施例３
関節炎患者関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質の免疫測定
（１）変形性関節炎患者関節液とリウマチ性関節炎患者関節液とに含まれるヒアルロナン結合性タンパク質量の、ドットブロットによる比較
変形性膝関節炎（以下ＯＡと略す）患者（３例）、およびリウマチ性膝関節炎（以下ＲＡと略す）患者（３例）ついて、以下のドットブロット法によって本発明のヒアルロナン結合性タンパク質を測定した。なお、各患者関節液は名古屋大学医学部整形外科の岩田教授より提供された。
【００３３】
各患者関節液を２０ｍＭリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で希釈し、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に５μｌ  ずつスポッティングした。この膜を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中でに浸し、３７℃で２時間ブロッキングした。その後実施例２で調製した抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体を含むＰＢＳ中にて室温で１時間反応させ、よく洗浄した後、パーオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体で同じく室温で１時間反応させ、膜に結合したパーオキシダーゼを、過酸化水素とジアミノベンチジンとによって発色させた。その結果を図４に示す。図４は発色強度を模式的に示したものであり、図中、●は濃く発色、○は明確に識別できる程度に発色、△は薄く見える程度に発色、∴は殆ど見えない程度に発色したことをそれぞれ示している。
【００３４】
その結果、ＲＡ患者の関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質の濃度はＯＡ患者の関節液中よりも明らかに高く、試料の希釈倍率から判断して、数倍から数十倍の差があった。
【００３５】
（２）変形性関節炎患者関節液とリウマチ性関節炎患者関節液とに含まれるヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体量の、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）による比較
実施例３（１）のドットブロッティングでそのヒアルロナン結合性タンパク質濃度に差がみられたＯＡ関節液とＲＡ関節液各２例について、ＥＬＩＳＡにより、ヒアルロナンと結合しているヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体）の量を比較した。
【００３６】
（Ａ）プロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質の精製
市販のウシ鼻軟骨プロテオグリカンモノマーより、既知の方法（Ｔｅｎｇｌａｄ，  Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ５７８，  Ｐ２８１，１９７９）及び特開昭６４−４６９号公報記載の方法に従ってヒアルロナン結合タンパク質（プロテオグリカンのヒアルロナン結合部位；  以下ＨＡＢＲと略す）を精製した。
すなわち、牛の鼻中隔軟骨  ３００ｇをハサミで小片に切断し、これを予め４℃に保持されたグアニジン塩酸塩４Ｍを含む酢酸ナトリウム  ０．５Ｍ溶液（ｐＨ５．８）に投入して４℃に保持して一夜撹拌抽出した。抽出液を１３，０００Ｘｇで２０分間遠心分離し、上清液を採取した。この上清液を精製水に透析させ、凍結乾燥させ、得られる固形分を粉砕して粗抽出物粉末を得た。
【００３７】
得られた粗抽出物粉末１６００ｍｇと、トリプシン（シグマ社製）０．８ｍｇ  とを、酢酸ナトリウム  ０．１Ｍを含んだ  ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２５ｍｌに加え、３７℃で２時間保存した。次いで大豆由来トリプシン阻害剤１ｍｇ（シグマ社製）及びグアニジン塩酸塩１９．１ｇを加えた後、さらに  ０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて総量を５０ｍｌとした。
このようにして得られたトリプシン処理したＨＡＢＲ含有溶液５０ｍｌにヒアルロン酸結合セファローズ５０ｍｌを加えて混合し、直ちに透析膜の中に入れ、４℃に冷却し９倍量の精製水中で一夜透析させた。透析後、ゲル全量を内径  ３．２  ｃｍ  のカラムに充填し、１Ｍの食塩水溶液で洗浄し、未吸着分を除去した。
【００３８】
さらに１Ｍ〜３Ｍの食塩水溶液で順次洗浄し不要な蛋白を除去し、前記塩酸グアニジン塩酸塩４Ｍを含む０．５  Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）で吸着分を溶出させ回収した。
この回収液をＤＩＡＦＬＯ  ＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮し、全量を４ｍｌとし、セファロース６Ｂカラム（φ  ３．１×４３ｃｍ）を通過させ、第２及び第３ピークを示す成分を回収し、それぞれをＤＩＡＦＬＯ  ＰＭ−１０で分離濃縮してＨＡＢＲの精製標品を得た。
【００３９】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡ
（Ａ）で調製したＨＡＢＲをｐＨ７．２  の２０ｍＭ  ＰＢＳに  ５μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、この溶液を９６穴マイクロプレートに  １００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置してコーティングした。プレートを洗浄後、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液を  ２００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。試料の関節液（ＯＡ患者およびＲＡ患者関節液各２例）はＰＢＳでそれぞれのヒアルロナン濃度を合わせて希釈列を作成し、ブロッキング後のプレートに  １００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートを行った。プレートを洗浄後、実施例２で調製した抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体（Ｘバンド成分を抗原としたもの）（約１μｇ／ｍｌ）を  １００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートし、更にパーオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ジャクソン社製，生化学工業株式会社販売；市販原液を１／５０００に希釈したもの）を  １００μｌ／ウェルずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。プレートをよく洗浄し、マイクロプレートに結合したパーオキシダーゼをオルトフェニレンジアミンと過酸化水素で発色させ、プレートリーダーで４９０ｎｍ  における吸光度を比色した。ＲＡおよびＯＡ患者関節液について結果をそれぞれ図５及び図６に示す。各図中、実線と点線は、各疾患の異なる２患者の関節液を示す。図５はＲＡ関節液の場合であり、図６はＯＡ関節液である。ＯＡ関節液はＲＡ関節液よりもヒアルロナン濃度が１０倍高くなっている。
その結果、ＯＡ関節液中のＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の量は、ＲＡ関節液中よりもはるかに少なく、１／５０以下であった。
【００４０】
【発明の効果】
１）現在、リウマチの診断は、医師の所見や患者の自覚が頼りとされる部分が大きく、客観的、定量的診断法が切に求められている。現在用いられている診断法として最も一般的なものは、アメリカリウマチ協会の１１項目からなる診断基準であり、そのうち何項目を満たすかによってリウマチかそうでないかの診断が行われている。ところが、それに含まれている項目は、上述のように医師や患者の主観に基づくものや、リウマチ因子のように、肝疾患や癌患者など他の疾病でも検出されるもの、あるいは健常人でも検出されるものが含まれている。絶対的な客観的、定量的診断法というものを確立することはたいへん困難と思われるが、何通りかの客観的、定量的な診断手法の組み合わせにより、ＲＡかＯＡかの診断をより確実かつ罹患早期に行うことは、そうした困難を解決するための重要なステップであると考えられる。
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質に対する抗体を用いた免疫測定（イムノアッセイ）によって、ＯＡとＲＡとの区別を明確に行うことができる。この測定系を診断試薬へ応用することにより、従来の診断法に新たな視点からの客観的かつ定量的な診断基準を供与することができる。
２）ヒアルロナン結合性タンパク質の合成を抑制する物質、あるいは体液中のヒアルロナン結合性タンパク質をスカベンジする物質をスクリーニングすることにより、新たな治療薬の開発できることが予測される。
【００４１】
【配列表】
0003555691.tif 000002
【００４２】
0003555691.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によるアソシエイティブ超遠心分離した各フラクションの比重とヒアルロナン及びタンパク質濃度との関係を示す。
【符号の説明】
───  タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
………  ヒアルロナン濃度（μｇ／ｍｌ）
【図２】実施例１のアソシエイティブ超遠心分離した比重１．４３以上の画分をさらにディソシエイティブ超遠心した各フラクションの比重とヒアルロナン及びタンパク質濃度との関係を示す。
【符号の説明】
───  タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
………  ヒアルロナン濃度  （μｇ／ｍｌ）
【図３】実施例１のヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の放線菌由来ヒアルロニダーゼによる処理物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【符号の説明】
レーン１  ヒアルロニダーゼ処理せず、加熱処理もしなかった試料
レーン２  ヒアルロニダーゼ処理せず、加熱処理をした試料
レーン３  ヒアルロニダーゼ処理を行った試料
【図４】実施例３のリウマチ性関節炎（ＲＡ１〜ＲＡ３）と変形性関節炎（ＯＡ１〜ＯＡ３）各３人の患者の関節液の、抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体を用いたドットプロットによるヒアルロナン結合性タンパク質濃度の比較模式図を示す。
【符号の説明】
●、○、△、∴は発色強度を示す。●＞○＞△＞∴である。
【図５】実施例３のリウマチ性膝関節炎の関節液のヒアルロナン濃度とパーオキシダーゼ発色の吸光度（４９０ｍｍ）との関係を示す。
【符号の説明】
───  患者Ａ
………  患者Ｂ
【図６】
実施例３の変形性膝関節炎の関節液のヒアルロナン濃度とパーオキシダーゼ発色の吸光度（４９０ｍｍ）との関係を示す。
【符号の説明】
───  患者Ｃ
………  患者Ｄ
【図１】
0003555691.tif 000004
【図２】
0003555691.tif 000005
【図３】
0003555691.tif 000006
【図４】
0003555691.tif 000007
【図５】
0003555691.tif 000008
【図６】
0003555691.tif 000009