(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0003579209.tif 000010
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はそれぞれ水素原子または水酸基の保護基、Ｒ4 はエチル基を示す）
で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化２】
0003579209.tif 000011
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はそれぞれ水素原子または水酸基の保護基、Ｒ4 はエチル基を示す）
で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を有効成分として含有してなるカルシウム代謝改善剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体およびそれを有効成分とするカルシウム代謝改善剤に関する。さらに詳しくは、慢性腎不全、副甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、骨粗鬆症などのカルシウム代謝の欠陥症、乾癬などの皮膚疾患および骨髄性白血病、乳ガンに代表される悪性腫瘍などの細胞分化機能に異常をきたした疾患の治療薬として有用である２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体および該２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を有効成分として含有するカルシウム代謝改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ビタミンＤの研究の進展に伴い、各種の１α−ヒドロキシビタミンＤ誘導体が医薬品として開発されてきており、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ３  や、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  がすでに臨床的に骨粗鬆症治療薬として用いられている。
しかしながら、これらの化合物は、血中カルシウムの上昇作用などの副作用を呈することから、かかる副作用の少ないビタミンＤ誘導体の研究が近年、活発に行なわれてきている。前記ビタミンＤ誘導体として、例えば、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  、２４−エピビタミンＤ２  などが骨粗鬆症治療薬として検討されており、また、２２−オキサ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  などが副甲状腺機能亢進症治療薬として検討されている。
本発明者らは、前記カルシウム代謝改善剤に有用な化合物として、２０−エピ−２２−メチルビタミンＤ誘導体をすでに開発している（特開平６−２５１５５号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記２０−エピ−２２−メチルビタミンＤ誘導体は、ビタミンＤ受容体結合活性が極めて高いという優れた性質を有するが、その反面、血中カルシウム上昇作用は高い。したがって、疾患を治療する立場から、高いビタミンＤ受容体結合活性を有し、安全性に優れたビタミンＤ誘導体の開発が望まれているのが実状である。
しかして、本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ビタミンＤ受容体結合活性が高く、血中カルシウム上昇作用がさほど高くなく、安全性により優れたビタミンＤ誘導体およびそれを含有するカルシウム代謝改善剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
式（Ｉ）：
【０００５】
【化３】
0003579209.tif 000002
【０００６】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はそれぞれ水素原子または水酸基の保護基、Ｒ4 はエチル基を示す）
で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体、ならびに該２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を有効成分として含有してなるカルシウム代謝改善剤
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、２０−エピビタミンＤ誘導体の置換基の影響について詳細に検討を行なったところ、２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ３  が極めて高い活性を有するとともに、副作用が小さいことが見出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
本発明の２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体は、前記したように、式（Ｉ）：
【０００９】
【化４】
0003579209.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はそれぞれ水素原子または水酸基の保護基、Ｒ4 はエチル基を示す）
で表わされる化合物である。
【００１１】
式（Ｉ）において、Ｒ１  、Ｒ２  およびＲ３  が表わす水酸基の保護基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ベンゾイル基などのアシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル基；トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基などの有機シリル基；メトキシメチル基、１−エトキシエチル基、メトキシエトキシメチル基などのアルコキシメチル基；２−テトラヒドロフラニル基、２−テトラヒドロピラニル基などのオキサシクロアルキル基などを挙げることができる。
【００１２】
また、式（Ｉ）において、Ｒ4 は、エチル基を示す。
【００１３】
式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体は、新規化合物であり、公知化合物である式（ＩＶ）：
【００１４】
【化５】
0003579209.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ１  、Ｒ２  およびＲ３  は前記と同じ）
で表わされるコレスタ−５，７，２２−トリエン−２４−オン誘導体またはそのジエン付加物を出発原料とし、式：
【００１６】
【化６】
0003579209.tif 000005
【００１７】
（式中、Ｒ１  、Ｒ２  、Ｒ３  およびＲ４  は前記と同じ）
で表わされるスキームにしたがって合成することができる。
【００１８】
前記スキームにしたがって得られる中間体である式（ＩＩＩ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルプロビタミンＤ誘導体および式（ＩＩ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルプレビタミンＤ誘導体は、いずれも新規化合物であり、また、これらのジエン付加物も新規化合物である。
【００１９】
ジエン付加物を形成するジエノフィルとしては、ビタミンＤ類の合成分野で用いられているものであれば特に限定がないが、本発明においては、Ｎ−フェニルトリアゾリンジオン、フタラジン−１，４−ジオンなどが好ましい。
【００２０】
前記スキームの各工程について以下に詳細に説明する。
【００２１】
式（ＩＶ）で表わされるコレスタ−５，７，２２−トリエン−２４−オン誘導体またはそのジエン付加物は、例えば、特開平６−２５１５５号公報などに記載されている方法にしたがって合成することができる。
【００２２】
前記コレスタ−５，７，２２−トリエン−２４−オン誘導体またはそのジエン付加物に、例えば、トリメチルシリルクロリドの存在下、低級アルキル銅試薬を作用させてシリルエノールエーテルとし、次いでシリル基を除去し、必要に応じ、水酸基を保護することにより、２２位に低級アルキル基が導入された式（Ｖ）で表わされるコレスタ−５，７−ジエン−２４−オン誘導体が得られる。
【００２３】
前記反応は、立体特異的に進行する。即ち、式（ＩＶ）において、２２位の二重結合がＺの立体配置である不飽和ケトン誘導体を出発原料として用いる場合には、２２位の立体配置がＲであるコレスタ−５，７−ジエン−２４−オン誘導体を得ることができる。
【００２４】
式（Ｖ）で表わされるコレスタ−５，７−ジエン−２４−オン誘導体の２４位のカルボニル基を、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化トリイソブチルホウ素リチウムなどの還元剤を用いて還元させ、必要に応じて水酸基を保護することにより、式（ＶＩ）で表わされるコレスタ−５，７−ジエン−２４−オール誘導体が得られる。
【００２５】
式（ＶＩ）で表わされるコレスタ−５，７−ジエン−２４−オール誘導体の水酸基を、還元的に除去する常法により、例えば、式（ＶＩＩ）で表わされるジチオ炭酸エステルまたはチオ炭酸エステル誘導体に変換し、次いで該誘導体を水素化トリブチルスズなどでラジカル的に還元することにより、式（ＩＩＩ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルプロビタミンＤ誘導体が得られる。
【００２６】
式（ＩＩＩ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルプロビタミンＤ誘導体を光異性化させることにより、式（ＩＩ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルプレビタミンＤ誘導体を得ることができ、これを熱異性化させたのち、必要に応じて脱保護することにより、式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を得ることができる。
【００２７】
このようにして得られた式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体の反応混合物からの単離・精製は、一般に有機化合物を反応混合物から単離・精製する際に用いられている方法と同様の方法によって行なうことができる。例えば、反応混合物を濃縮することにより粗生成物を得、得られた粗生成物を必要に応じて再結晶、クロマトグラフィーなどに付すことによって行なう。
【００２８】
本発明の式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体に対して極めて高い結合活性を示し、しかもビタミンＤ結合タンパクとの親和性が低く、高い分化誘導能を有することから、乾癬などの皮膚疾患、骨髄性白血病、乳ガンに代表される悪性腫瘍などの細胞分化機能に異常をきたした疾患の治療薬として有用である。また、低カルシウム、低ビタミンＤ食ラットに対する投与においても血中カルシウムの上昇作用が弱く、急性毒性試験においても低毒性であったことから、副作用の少ない、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、慢性腎不全、骨軟化症などのカルシウム代謝の欠陥症の治療薬、即ち、カルシウム代謝改善剤としても有用である。
【００２９】
式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を有効成分とする本発明のカルシウム代謝改善剤は、適当な剤型の医薬組成物として経口または非経口的に投与することができる。投与量は、年齢、症状、投与ルートなどによって異なるが、例えば、成人のカルシウム代謝の欠陥症の予防、治療のために投与する場合、通常、成人１日あたり０．０１〜５μｇ、好ましくは０．０５〜１μｇを１〜３回に分けて投与することが好都合であるが、医者の診断に応じて前記範囲を超えて投与することも勿論可能である。
【００３０】
本発明のカルシウム代謝改善剤は、有効成分である式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体の有効量と、薬理学的に許容される担体または賦形剤とを含有する組成物であってもよい。このような組成物は、経口または非経口投与に適する剤型として提供される。
【００３１】
即ち、経口投与のための組成物の剤型としては、例えば、固体または液体の剤型、具体的には錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。このような組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられている担体または賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
【００３２】
非経口投与のための組成物を、例えば、注射剤として用いる場合、公知の方法に従い、通常、注射剤に用いられている無菌の水性ないしは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって該注射剤を調製することができる。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖などや、その他の補助液を含む等張液などがあげられ、これらは、適当な溶解補助剤などと併用してもよい。
【００３３】
かくして得られる本発明のカルシウム代謝改善剤には、式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体を配合することによって好ましくない相互作用を生じないかぎり、他の活性成分が含有されていてもよい。
【００３４】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
アルゴンガス雰囲気下、臭化第一銅・ジメチルスルフィド錯体１１４ｍｇ（０．５５６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦという）１ｍｌ懸濁液に、１．２１Ｍのエチルリチウム／ＴＨＦ溶液０．９２ｍｌ（１．１１ｍｍｏｌ）を−４０℃で滴下し、同温度にて０．５時間撹拌した。反応液を−７８℃に冷却し、トリメチルシリルクロリド８８．２μｌ（０．６９５ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド１２１μｌ（０．６９５ｍｍｏｌ）、（２２Ｚ）−（２０Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２５−メトキシメトキシコレスタ−５，７，２２−トリエン−２４−オン４０ｍｇ（０．０６９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ０．５ｍｌ溶液をこの順にそれぞれ滴下し、−７８℃で４０分間撹拌した。これにトリエチルアミン１．５ｍｌ、酢酸エチル１０ｍｌおよび水を添加し、室温に戻した後、有機層を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。
【００３６】
得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２３Ｚ）−（２０Ｓ，２２Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−トリメチルシリルオキシコレスタ−５，７，２３−トリエン１９．５ｍｇを得た（収率４１％）。
【００３７】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．１７（９Ｈ，ｓ，Ｓｉ（ＣＨ３  ）３  ）、０．６１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．３５および１．３６（各３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．３５（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、３．７７および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．５８−４．９５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３）、５．３８および５．６７（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００３８】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
２９５０、２８６０、１７４０、１４４０、１２４５、１１４０、１０３０
【００３９】
ＭＳ  ｍ／ｚ
６２８（１）、５５２（３）、４７６（２）、４６５（１）、４０１（６）、３２５（５２）、２４９（３４）、１９７（６２）、１５５（２３）、１２５（５６）、７３（１００）
【００４０】
実施例２
アルゴンガス雰囲気下、（２３Ｚ）−（２０Ｓ，２２Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−トリメチルシリルオキシコレスタ−５，７，２３−トリエン１７５ｍｇ（０．２５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ２．５ｍｌ溶液に、−３５℃で１Ｍ−テトラブチルアンモニウムフルオリドＴＨＦ溶液３０４μｌ（０．３０４ｍｍｏｌ）を加え、同温度で１５分間撹拌した後、酢酸エチルで希釈して有機層を１０％−塩化アンモニウム水溶液、水および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００４１】
減圧下に濃縮して得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−オキソコレスタ−５，７−ジエン１５０ｍｇを得た（収率９６％）。
【００４２】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．７０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−２１）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．３４および１．３７（各３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．４０（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．７８−５．０２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３）、５．３７および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００４３】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
２９５０、２８７０、１７４０、１７７０、１４４０、１３８０、１２６０、１１４５、１０３０
【００４４】
ＭＳ  ｍ／ｚ
５８６（０．７）、５４２（２）、５１０（３）、４９７（２）、４６６（６）、３３６（１１）、３２６（９）、２４９（１８）、２２４（１１）、２１０（２２）、１５５（２７）、１４１（１７）、１０３（１００）
【００４５】
実施例３
（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−オキソコレスタ−５，７−ジエン１４６ｍｇ（２３６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン１ｍｌのＴＨＦ０．８ｍｌ溶液に、水素化ホウ素ナトリウム２３．２ｍｇ（０．６１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液を塩化メチレンで希釈後、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００４６】
減圧下に濃縮して得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２４−ヒドロキシ−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１３３ｍｇを得た（収率９１％）。
【００４７】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．７６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３７および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００４８】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
３５５０、２９５０、２８６０、１７５０、１４４０、１３８０、１３４０、１２６０、１１４０、１０３５
【００４９】
ＭＳ  ｍ／ｚ
５８６（０．７）、５４４（５）、５１２（８）、４６８（８）、４３６（４０）、４０７（３２）、３６５（３９）、２７８（２３）、２４９（４０）、２２４（２３）、２０９（５６）、１５５（５３）、１４１（４５）、１０３（１００）
【００５０】
実施例４
アルゴンガス雰囲気下、（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２４−ヒドロキシ−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン９．７ｍｇ（０．０１５６ｍｍｏｌ）およびイミダゾール０．５ｍｇ（０．００７８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ０．８ｍｌ溶液に、水素化ナトリウム９．４ｍｇ（油性、６０重量％品、０．２３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した後、二硫化炭素１８．８μｌ（０．３１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。この溶液にヨウ化メチル１２．１μｌ（０．１９５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈して水および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００５１】
減圧下に濃縮して得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２４−［（メチルチオ）チオカルボニルオキシ］−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン７．０ｍｇを得た（収率６３％）。
【００５２】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．５６および０．６０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、１．２８（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、２．５４および２．５５（３Ｈ，ｓ，ＳＣＨ３  ）、３．３７（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、  ３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．６３−５．００（４Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３，ＯＣＨ２  Ｏ）、５．３７および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）、５．８４および５．９５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２４）
【００５３】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
２９５０、２８７５、１７４０、１４４０、１３８０、１３４０、１２６０、１１４０、１０５０
【００５４】
ＭＳ  ｍ／ｚ
６７８（１）、５９０（３）、５４０（２）、５２８（３）、４９７（３）、４０６（２７）、３２５（５７）、２４９（４０）、２０９（４７）、１５５（５４）、９１（５６）、６９（１００）
【００５５】
実施例５
アルゴンガス雰囲気下、（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２４−［（メチルチオ）チオカルボニルオキシ］−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン２３．５ｍｇ（０．０３３０ｍｍｏｌ）、水素化トリブチル錫５３．０μｌ（０．１９８ｍｍｏｌ）およびアゾビスイソブチロニトリル２．７ｍｇ（０．０１６５ｍｍｏｌ）のトルエン１ｍｌ溶液を０．５時間加熱還流後、室温に戻し、減圧下溶媒を除去した。
【００５６】
得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１５．２ｍｇを得た（収率７６％）。
【００５７】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ−２１）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．２２（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．３７（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．７１（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ２  Ｏ）、４．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．９０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３８および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００５８】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
２９５０、２８６０、１７４５、１４４０、１３８０、１３４０、１２７０、１１４０、１０４０
【００５９】
ＭＳ  ｍ／ｚ
５４２（７）、４６６（２９）、３９０（１００）、２７７（５８）、２４９（３２）、２０９（５８）、１５５（３８）、１４１（３６）、１０３（５６）、６９（８２）、５５（９１）
【００６０】
実施例６
（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−エチル−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１２．１ｍｇ（０．０２００ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水塩１９．０ｍｇ（０．１００ｍｍｏｌ）のエタノール２ｍｌ溶液を０．５時間加熱還流した後、５％水酸化カリウムメタノール溶液２ｍｌを加え、１時間加熱還流した。室温に戻した後、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液にあけ、酢酸エチルで２回抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。
【００６１】
減圧下に溶媒を除去し、得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシコレスタ−５，７−ジエン８．１９ｍｇを得た（収率９２％）。
【００６２】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．２３（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．７７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３８および５．７２（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００６３】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
３３８０、２９５０、２９３０、２８６０、１４６０、１３８０、１１５０、１０５５
【００６４】
ＭＳ  ｍ／ｚ
４４４（１３）、４２６（２１）、４０８（１５）、３９３（１０）、２９５（１５）、２５１（１３）、２２７（２６）、１７１（２７）、１５７（３１）、６９（８８）、５９（９７）、５５（９１）
【００６５】
ＵＶ（エタノール）λｍａｘ  ：２７１、２８２、２９４ｎｍ
【００６６】
実施例７
（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシコレスタ−５，７−ジエン２８．７ｍｇ（０．０６４５ｍｍｏｌ）のエタノール（９９．５％）２００ｍｌ溶液を攪拌下でアルゴンガスをバブリングしながら、０℃で４００Ｗ高圧水銀灯を用い、バイコール透過光にて３分間光照射を行なった後、１．５時間加熱還流した。反応液を濃縮後、得られた残渣を分取用薄層クロマトグラフィで精製し、原料の（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシコレスタ−５，７−ジエンと生成物の（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエンの混合物１３．８ｍｇを得た。
【００６７】
得られた混合物をアセチル化（無水酢酸８．２μｌ、ピリジン１１．７μｌ、塩化メチレン１ｍｌ、室温、１．５時間、分取用薄層クロマトグラフィで精製）、脱アセチル化（１Ｎ−ナトリウムメトキシド０．０５ｍｌ、メタノール０．５ｍｌ、ＴＨＦ０．５ｍｌ、０℃、２時間、分取用薄層クロマトグラフィで精製）を経て精製し、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン、即ち（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ａ）２．０２ｍｇを得た。
【００６８】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．５４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−２１）、１．２２（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、４．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．００および５．３３（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９）、６．０２および６．３８（各１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｈ−７，Ｈ−６）
【００６９】
ＩＲ（ｎｅａｔ）ｃｍ−１
３４００、２９５０、２８６０、１４６０、１３８０、１２１０、１１６０、１０５５
【００７０】
ＭＳ  ｍ／ｚ
４４４（３）、４２６（６）、４０８（５）、３９３（３）、３１３（３）、３０２（１）、１５２（２６）、１３４（１００）、１０５（２９）
【００７１】
ＵＶ（エタノール）λｍａｘ  ：２６４ｎｍ、λｍｉｎ  ：２２７ｎｍ
【００７２】
実施例８
アルゴンガス雰囲気下、臭化第一銅・ジメチルスルフィド錯体１．３９９ｇ（１３．６０５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１０ｍｌ懸濁液に、１．６０Ｍのブチルリチウム／ヘキサン溶液８．５０ｍｌ（１３．６０５ｍｍｏｌ）を−３５〜−３０℃で滴下し、同温度にて０．５時間撹拌した。反応液を−７８℃に冷却し、トリメチルシリルクロリド１．０７９ｍｌ（８．５０３ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド１．４７９ｍｌ（８．５０３ｍｍｏｌ）および（２２Ｚ）−（２０Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２５−メトキシメトキシコレスタ−５，７，２２−トリエン−２４−オン５００ｍｇ（０．８５０３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ５ｍｌ溶液をこの順にそれぞれ滴下し、−７８℃で４０分間撹拌した。これにトリエチルアミン１５ｍｌ、酢酸エチル１００ｍｌおよび水１５０ｍｌを加え、室温に戻した後、セライト濾過し、水層を酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出し、合わせた有機層を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。
【００７３】
得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２３Ｚ）−（２０Ｓ，２２Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−トリメチルシリルオキシコレスタ−５，７，２３−トリエン４９６．８ｍｇを得た（収率７３％）。
【００７４】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．１９（９Ｈ，ｓ，Ｓｉ（ＣＨ３  ）３  ）、０．６０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．８０（ｄ，３Ｈ，Ｈ−２１）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．３５および１．３６（各３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．２６（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、３．７８および３．８１（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．６５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３）、５．３８および５．６７（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００７５】
実施例９
アルゴンガス雰囲気下、（２３Ｚ）−（２０Ｓ，２２Ｓ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−トリメチルシリルオキシコレスタ−５，７，２３−トリエン４３６ｍｇ（０．６０６４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ５．４５ｍｌ溶液に、−４３〜−４０℃で１Ｍ−テトラブチルアンモニウムフルオリドＴＨＦ溶液０．７０９ｍｌ（０．７０９ｍｍｏｌ）を加え、同温度で１５分間撹拌した後、酢酸エチルで希釈して有機層を５％−塩化アンモニウム水溶液、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００７６】
減圧下に濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−オキソコレスタ−５，７−ジエン２７０．３ｍｇを得た（収率６８．９％）。
【００７７】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ブチル基ＣＨ３  ）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．３４および１．３７（各３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．４０（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  Ｏ）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  Ｏ）、４．７８−４．９７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３）、５．３７および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００７８】
実施例１０
アルゴンガス雰囲気下、（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）−２４−オキソコレスタ−５，７−ジエン２６８．２ｍｇ（０．４１４６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン１．３４ｍｌ溶液に、メタノール１．３４ｍｌおよび水素化ホウ素ナトリウム４１．１ｍｇ（１．８０６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌した。これに水素化ホウ素ナトリウム８．２２ｍｇを加え、室温でさらに２時間攪拌した。反応液を塩化メチレンで希釈後、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００７９】
減圧下に濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２４−ヒドロキシ−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン２３３．７ｍｇを得た（収率８６．８％）。
【００８０】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．６９および０．７８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ブチル基ＣＨ３  ）、１．００および１．０１（３Ｈ，ｓ、Ｈ−１９）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．６８−４．９８（４Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３，ＯＣＨ２  Ｏ）、５．３８および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００８１】
実施例１１
アルゴンガス雰囲気下、（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２４−ヒドロキシ−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１７１．７ｍｇ（０．２６４６ｍｍｏｌ）およびイミダゾール３．６０ｍｇ（０．０５２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１．４ｍｌ溶液に水素化ナトリウム６３．５ｍｇ（油性、６０重量％品、１．５８８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０分間攪拌した後、二硫化炭素１２８μｌ（２．１１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で０．５時間攪拌した。この溶液にヨウ化メチル８３μｌ（１．３２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈して水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００８２】
減圧下に濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２４−［（メチルチオ）チオカルボニルオキシ］−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン２９．６ｍｇを得た（収率１５．１％）。
【００８３】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．５５および０．６０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ブチル基のＣＨ３  ）、１．００および１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．２７（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、２．５４および２．５５（３Ｈ，ｓ，ＳＣＨ３  ）、３．３７（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基ＣＨ３  ）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基ＣＨ３  ）、４．６９−４．９４（４Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−３，ＯＣＨ２  Ｏ）、５．３６および５．６８（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）、５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９５Ｈｚ，Ｈ−２４）
【００８４】
実施例１２
アルゴンガス雰囲気下、（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２４−［（メチルチオ）チオカルボニルオキシ］−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン３４．７ｍｇ（０．０４６９５ｍｍｏｌ）、水素化トリブチル錫７６．９μｌ（０．２９３４ｍｍｏｌ）およびアゾビスイソブチロニトリル４．０ｍｇ（０．０２４５ｍｍｏｌ）のトルエン０．６２ｍｌ溶液を２５分間加熱還流後、室温に戻し、減圧下溶媒を除去した。
【００８５】
得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１３．０ｍｇを得た（収率４３．７％）。
【００８６】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ブチル基ＣＨ３  ）、１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．２２（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．３７（３Ｈ，ｓ，メトキシメチル基のＯＣＨ３  ）、３．７８および３．８０（各３Ｈ，ｓ，メトキシカルボニル基のＣＨ３  ）、４．７１（２Ｈ，ｓ，メトキシメチル基のＯＣＨ２  Ｏ）、４．８３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．９０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３８および５．６９（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００８７】
実施例１３
（２０Ｓ，２２Ｒ）−１α，３β−ビス（メトキシカルボニルオキシ）−２２−ブチル−２５−（メトキシメトキシ）コレスタ−５，７−ジエン１３．０ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）をクロロホルム１．３９ｍｌに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸一水塩１３．０ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）のエタノール１．３９ｍｌ溶液を加え、１時間加熱還流した。室温まで冷却した後、５％水酸化カリウム／エタノール溶液１．３９ｍｌを加え、１時間加熱還流した。室温に戻した後、反応液を酢酸エチルにて希釈し、５％塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌ、水２０ｍｌにて順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
【００８８】
減圧下に溶媒を除去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィで精製することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシコレスタ−５，７−ジエン７．２ｍｇを得た（収率７４％）。
【００８９】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−２１）、０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ブチル基ＣＨ３  ）、０．９５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９）、１．２２（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、３．７８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．０７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、５．３９および５．７５（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−６，Ｈ−７）
【００９０】
実施例１４
（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシコレスタ−５，７−ジエン１１．５ｍｇをエタノール（９９．５％）２４ｍｌに溶解した後、ベンゼン１８０ｍｌを加え、０℃で１５分間窒素を吹き込んだ。溶液をバブリングしながら０℃で４００Ｗ高圧水銀灯を用い、パイレックス透過光にて１５分間光照射を行なった後、１時間加熱還流した。
【００９１】
反応液を濃縮後、得られた残渣をＨＰＬＣ（（株）ワイエムシイ製、商品名：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、メタノール／水（容量比）＝８０／２０）で精製し、下記の物性を有する（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン、即ち（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ｂ）１．１７ｍｇを得た。
【００９２】
１  Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ）δ
０．５７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）、０．７３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−２１）、１．１７（６Ｈ，ｓ，Ｈ−２６，Ｈ−２７）、４．１２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１）、４．３５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、４．９０および５．２９（各１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９）、６．０８および６．３２（各１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｈ−７，Ｈ−６）
ＵＶ（エタノール）λｍａｘ：２６４ｎｍ、λｍｉｎ：２２７ｎｍ
【００９３】
試験例１〔ウシ胸腺１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体との結合性試験〕
（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ａ）および（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−メチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （比較化合物）のウシ胸腺１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体との結合能を測定した。
【００９４】
即ち、化合物Ｉ−Ａおよび比較化合物の段階的希釈溶液（１、２、４、８、１６、３２、６３、１２５、２５０、５００、５０００ｐｇ／５０μｌエタノール溶液）の各々に、ウシ胸腺１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体（（株）ヤマサ製）溶液（５００μｌリン酸緩衝液）を添加し、撹拌したのち、室温で１時間プレインキュベイションした。各々にトリチウムラベルした１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （４．８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）１２５７０ｄｐｍ／５０μｌエタノール溶液を加え、撹拌し、４℃で一夜放置した後、ＤＣＣ（デキストランコーテッドチャコール）懸濁液（（株）ヤマサ製）を加え、攪拌し、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体と結合していない試料（遊離型）を吸着させた。
【００９５】
反応混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ）することにより、ＤＣＣを分離し、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体と結合している試料（結合型）を遊離型から分離（ＢＦ分離）した。上清５００μｌを採り、シンチレーションカウンターにて放射活性を測定し、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体に結合しているトリチウムラベルした１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  の割合を求めて、トリチウムラベルした１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  の５０％が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体と結合する時の被験化合物の濃度（ＥＤ５０値）を求めた。
【００９６】
対照化合物として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  を用いて同様の試験を行ない、該化合物のＥＤ５０値を求め、これを１とした時の被験化合物の結合活性の相対活性を求めた。その結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
0003579209.tif 000006
【００９８】
なお、表１〜４中、対照化合物、比較化合物、化合物Ｉ−Ａおよび化合物Ｉ−Ｂは、以下の化合物を示す。
対照化合物：１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  
比較化合物：（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−メチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  
化合物Ｉ−Ａ：（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  
化合物Ｉ−Ｂ：（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  
【００９９】
試験例２〔ヒト骨髄性白血病細胞の分化誘導試験〕
イーグルの修飾培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養したヒト骨髄性白血病細胞を培養皿に培養皿あたり２×１０５  個加えた。次に２つの被験化合物（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ａ）および（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ｂ）をエタノール（５０μｌ）に溶解させて得られた段階的希釈溶液を加えた。
【０１００】
被験化合物のインキュベーション濃度は、いずれも１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０  Ｍおよび１０−１１  Ｍの５段階である。
【０１０１】
４日間インキュベーションした後、スーパーオキシド産生をニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元によって測定した。すなわち、ブルーホルマザンが細胞内に沈着して青染された細胞をそれぞれの濃度で２回、２００個以上の細胞をカウントして測定した。青染した細胞の全細胞数に対する割合から分化誘導の割合を求め、５０％の細胞が分化する時の被験化合物の濃度（ＥＤ５０値）を求めた。
【０１０２】
対照化合物として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  を用いて同様の試験を行ない、該化合物のＥＤ５０値を求め、これを１とした時の被験化合物の分化誘導活性の相対活性を求めた。その結果を表２に示す。
【０１０３】
【表２】
0003579209.tif 000007
【０１０４】
試験例３〔マウスにおける血中カルシウム上昇作用〕
８週齢雄性ｄｄＹマウス（ＳＬＣ）に、（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ｂ）、（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−メチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （比較化合物）または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （対照化合物）を静脈内投与し、投与２４時間後に眼窩採血（５０μｌ）を行ない、血中イオン化カルシウム値をイオン化カルシウム測定装置により測定した。得られた被験化合物投与群の各投与量毎の血中カルシウムイオン濃度を基に、それぞれの非投与群の血中カルシウムイオン濃度からの上昇率を求めた。その結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
0003579209.tif 000008
【０１０６】
試験例４〔ラットにおける血中カルシウム上昇作用〕
ビタミンＤ欠乏症ラットを、カルシウム０．４７重量％およびリン０．３重量％を含有したビタミンＤ欠乏食で１週間、次いでカルシウム量を０．０２重量％に減少させたビタミンＤ欠乏食で２週間飼育することによってつくった。
【０１０７】
本法によって得られたビタミンＤ欠乏症ラットの血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３  と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  は、検出限界以下である。
【０１０８】
次に、これらのラットに表４に示す量の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （対照化合物）、（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−メチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （比較化合物）または（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ａ）のプロピレングリコール：エタノール（９５：５）０．１ｍｌ溶液を７日間腹腔内注射により投与した。最終投与から２４時間後に血清を取り出し、血清カルシウム濃度をＣａｌｃｅｔｔｅ自動カルシウム滴定装置を用いて測定した。ブランク実験も同様に行なった。非投与群の血中カルシウム濃度からの投与群の血中カルシウム濃度の上昇率を求めた。その結果を表４に示す。
【０１０９】
【表４】
0003579209.tif 000009
【０１１０】
表１〜４に示された結果から、以下のことがわかる。
【０１１１】
（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−エチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ａ）は、表１に示された結果からウシ胸腺１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  受容体と高い結合活性を有することがわかり、また、表２に示された結果からヒト骨髄性白血病細胞の分化誘導能が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （対照化合物）の３８倍程度と極めて強いことがわかる。さらに、表４に示された結果から、化合物Ｉ−Ａは、ビタミンＤ誘導体の副作用の指標の１つとなる血中カルシウム濃度上昇作用が対照化合物および比較化合物よりも弱いことがわかる。
【０１１２】
（２０Ｓ，２２Ｒ）−２２−ブチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （化合物Ｉ−Ｂ）についても、表３に示された結果から１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３  （対照化合物）および比較化合物と比較して、血中カルシウム上昇作用が弱いことがわかる。また、表２に示されるように、化合物Ｉ−Ｂの分化誘導能は対照化合物の２倍程度と強い。
【０１１３】
以上の結果から、本発明の２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体（Ｉ）は、副作用の少ない治療薬として有用であることがわかる。
【０１１４】
【発明の効果】
本発明の式（Ｉ）で表わされる２０−エピ−２２（Ｒ）−低級アルキルビタミンＤ誘導体は、高いビタミンＤ受容体結合活性を有し、安全性に優れたものであるので、副甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、骨軟化症、骨粗鬆症などのカルシウム代謝の欠陥症、乾癬などの皮膚疾患および骨髄性白血病、乳ガンに代表される悪性腫瘍などの細胞分化機能に異常をきたした疾患の治療に有用なカルシウム代謝改善剤として好適に使用しうるものである。