(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を０〜１０℃で固定化ヘパリンを用いる精製工程に付し、アンチトロンビン−IIIを含む溶液を０〜１０℃で強陰イオン交換体による吸脱着工程に付し、乾燥工程に付した後、得られた乾燥状態のアンチトロンビン−IIIをウイルスが不活化されるまで加熱する工程を含む活性ウイルスおよび開裂したアンチトロンビン−IIIを実質的に含有しない精製アンチトロンビン−IIIの製法。
【請求項２】
ウイルスの不活化を、５０〜８０℃、２４〜１２０時間で行う請求項１記載の精製アンチトロンビン−IIIの製法。
【請求項３】
請求項１または２によって得られる活性ウイルスおよび開裂したアンチトロンビン−IIIを実質的に含有しない精製アンチトロンビン−III。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス感染の虞れがなく、且つ副作用が懸念される開裂したアンチトロンビン−ＩＩＩを実質的に含有しない精製されたアンチトロンビン−ＩＩＩ及びその製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンチトロンビン−ＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）は血漿中に存在するα２グロブリンに属する分子量６５，０００〜６８，０００の糖蛋白質の一種で、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビンの凝固活性を強く阻害する。また、トロンビン以外の凝固因子、例えば活性化Ｘ因子、活性化ＩＸ因子などに対しても阻害作用を有している。その他プラスミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告されている。これらの阻害作用は一般にヘパリンの存在下で、より速やかに進行することが知られている。このような作用を有するＡＴ−ＩＩＩは、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や血中のＡＴ−ＩＩＩレベルが低下することによる各種疾患の治療用に用いられている。
ＡＴ−ＩＩＩは血漿中に存在する蛋白質であることから、それを治療用薬剤として用いる場合には混入の虞れのあるウイルスを不活性化する工程を組み込むことが必須である。従来ＡＴ−ＩＩＩ製剤の製造で用いられているＡＴ−ＩＩＩ含有水溶液の加熱によるウイルス不活性化処理は蛋白質に対しても負の影響を与え、それにより変性又は不活性ＡＴ−ＩＩＩが生成する。そこでウイルスの不活化工程後に固定化ヘパリンを用いる精製工程を含めた精製方法（特開昭６３−２３８９６号）、疎水性クロマト処理により不純物を除去する方法（特開平１−２７５６００号）、ＡＴ−ＩＩＩ水溶液の加熱処理時に選択された安定化剤を加え、ＡＴ−ＩＩＩ単量体の割合を一定水準以上に保持する方法（特開平１０−１４７５３８号）及び金属キレート樹脂で処理する方法（特開平１１−４９７９９号）などが提案されてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ウイルス不活化のためにＡＴ−ＩＩＩ含有水溶液を加熱処理した後、前述の固定化ヘパリンを用いる精製法や他の精製法を実施してもなお製剤中には無視し得ない量の変性または不活性ＡＴ−ＩＩＩが含まれている。
近年の研究により、この変性または不活性ＡＴ−ＩＩＩの殆どはヘパリン親和性の低下したものであることが明らかにされてきた。
本発明者らはこの低ヘパリン親和性の変性または不活性ＡＴ−ＩＩＩの中に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上でメインピークであるＡＴ−ＩＩＩよりも小さい移動度を示すものを見付け、これを取り出してＮ末端部分アミノ酸配列分析を行った結果、少なくともＡｒｇ３９３−Ｓｅｒ３９４及びその周辺で開裂したＡＴ−ＩＩＩであることを突き止めた。そしてこの開裂ＡＴ−ＩＩＩは従来、好中球の遊走の誘導や細胞系においてサイトカインの放出との関連性が懸念されていた物質である可能性が大である。
低ヘパリン親和性の変性または不活性ＡＴ−ＩＩＩの除去は、固定化ヘパリンによる精製では困難であり、またこれらは未変性のＡＴ−ＩＩＩと化学構造や物性が極めて似ているため、それらの除去を厳密に行おうとすれば収率の低下を免れない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、一旦低ヘパリン親和性の変性または不活性ＡＴ−IIIが生成してしまえば、それを未変性ＡＴ−IIIから、分離・除去することは極めて難しいという事実に鑑み、低ヘパリン親和性の変性または不活性ＡＴ−III、特に開裂したＡＴ−IIIの生成を抑え、ウイルスを不活化する方法について種々研究を重ねた。その結果、１３℃以下の低温で固定化ヘパリン等により精製したＡＴ−IIIをなるべく低い温度で乾燥し、この乾燥状態のＡＴ−IIIをウイルスの不活化がなされるまで加熱することによって得られた精製ＡＴ−IIIが活性ウイルスおよび前述の開裂したＡＴ−IIIを実質的に含んでいないことを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。すなわち、本発明は、（１）ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を０〜１０℃で固定化ヘパリンを用いる精製工程に付し、アンチトロンビン−IIIを含む溶液を０〜１０℃で強陰イオン交換体による吸脱着工程に付し、乾燥工程に付した後、得られた乾燥状態のアンチトロンビン−IIIをウイルスが不活化されるまで加熱する工程を含む活性ウイルスおよび開裂したアンチトロンビン−IIIを実質的に含有しない精製アンチトロンビン−IIIの製法、（２）ウイルスの不活化を、５０〜８０℃、２４〜１２０時間で行う請求項１記載の精製アンチトロンビン−IIIの製法及び（３）請求項１または２によって得られる活性ウイルスおよび開裂したアンチトロンビン−IIIを実質的に含有しない精製アンチトロンビン−IIIである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の原料として用いられるものはヒトＡＴ−IIIを含有するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分であり、それらとしては、たとえばヒト血漿コーン低温エタノール分画法で得られる上清Ｉ，上清II＋III，画分IV−１、クエン酸含有血漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣画分等ヒト血漿から誘導された画分が挙げられる。これらの中で上清Ｉは特に好適な原料である。本発明においてはまず、この原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を、０〜１０℃で、固定化ヘパリンを用いる精製法、つまりヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーに付す。この工程自体は公知であり、本発明において好適に用いられる吸着支持体は、たとえばヘパリンがセルロース、アガロース等の不溶性担体に共有結合したものである。この工程により大部分の夾雑物を除去することができる。得られたＡＴ−IIIを含む溶液は、必要により自体公知の限外濾過に付し、さらに強陰イオン交換体による吸脱着処理工程に付される。これらの工程も０〜１０℃で行われる。使用される強陰イオン交換体としては、その解離度（ｐＫａ）が通常１０．３以上、好ましくは１０．５以上のものである。その構造的特徴として、４級アミノ基を有するもの、特にトリアルキルアミノアルキル基を有するものが好適に使用される。強陰イオン交換体の具体例としては、たとえばトリメチルアミノメチル基、ジエチルヒドロキシプロピルアミノエチル基などのトリアルキルアミノアルキル基を有するものが挙げられる。これらの中でもトリメチルアミノメチル基を有するものが特に好ましい。
【０００６】
これらの官能基を有する不溶性担体としては、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリビニル共重合体、ポリスチレン共重合体などが挙げられる。
ＡＴ−ＩＩＩ含有液と強陰イオン交換体との接触条件はｐＨ６〜８程度、塩濃度０〜０．５Ｍ程度が好ましく、このような条件を具有する溶媒としては、たとえば０．０５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）等が挙げられる。また、溶出条件はｐＨ６〜８程度、塩濃度０．１〜０．５Ｍ程度のものがよく、具体例としては、溶媒として０．１７Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）などが挙げられる。
接触方法はカラム法、バッチ法のいずれでもよい。バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製したＡＴ−ＩＩＩ含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該強陰イオン交換体に接触させる。その条件としては、該交換体１ｍｌに対して該水溶液１〜１００ｍｌを用い、３０分〜２時間程度混和した後に遠心分離して、該交換体を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶媒を添加する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心分離して上澄を回収する。
一方、カラム法にて行う場合、上記の接触条件に調製したＡＴ−ＩＩＩ含有水溶液を、同じ条件で平衡化し、且つカラムに充填された当該強陰イオン交換体に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラムを洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。
【０００７】
この工程により、ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーによっても除去しきれなかった、ヘパリンと親和性を有する夾雑物および混在する可能性のある各種ウイルスが実質的に除去される。この後、必要により再度前述の固定化ヘパリンを用いる精製工程に付してもよい。
このようにして得られた精製ＡＴ−ＩＩＩを含む水溶液は水分含量が５％以下、望ましくは３％以下となるよう乾燥される。この乾燥工程においても、処理温度はなるべく低い方が好ましく、通常の凍結乾燥によりこの条件は満たされる。
乾燥された組成物の形状は、粉末状、ケーキ状または他のいずれの形態でもよい。
得られた乾燥状のＡＴ−ＩＩＩは、ウイルスが不活化されるまで加熱される。加熱温度は５０〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６０〜７０℃であり、加熱時間は２４〜１２０時間、好ましくは７２〜１０８時間、さらに好ましくは８４〜１００時間程度である。
加熱時の雰囲気としては通常大気圧の空気が用いられるが必要により減圧空気、窒素その他の不活性ガス中で行っても差し支えない。
また加熱時のＡＴ−ＩＩＩの熱変性を極力防止する目的で糖、糖アルコール、各種アミノ酸、有機酸塩類、及び無機酸塩類等を溶液中に添加しておき、それを乾燥して加熱処理に付してもよい。加熱はどのような手段でもよいが、オーブン、赤外線照射、砂浴または水浴などの手段が適宜使用される。
【０００８】
この加熱工程の操作によりウイルスは不活性化され、しかも液状加熱の場合と違って開裂したＡＴ−ＩＩＩが実質的に含まれていない精製ＡＴ−ＩＩＩが得られる。ここに活性ウイルスを実質的に含有しないＡＴ−ＩＩＩとは、ウイルスの不活化処理によりウイルスが培養不可能なレベルにまで減少したＡＴ−ＩＩＩを意味し、この状態に至ったＡＴ−ＩＩＩはヒトに投与してもウイルス感染の恐れはない。
また開裂したＡＴ−ＩＩＩを実質的に含まないＡＴ−ＩＩＩとは、後述の試験例２のＮ末端部分アミノ酸配列分析の結果、開裂したＡＴ−ＩＩＩの認められないことを意味する。
なお、こうした精製工程中にウイルス除去膜処理等を施すことで、より安全な製剤を提供することができる。
製剤としては、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、等張化剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段により行うことができる。また、該製剤は静脈注射等の注射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留水等の溶解液に溶解して用いられる。
本発明により得られる高度に精製されたＡＴ−ＩＩＩは、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）をはじめ、手術後、肝炎、肝硬変、膵炎、新生児呼吸窮迫症候群等により血液中のＡＴ−ＩＩＩレベルが低下した患者に投与して血栓の発生を防止することができる。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例をあげてさらに本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
実施例１
コーン低温エタノール分画の上清Ｉ約１７．５リットルをＤＥＡＥ陰イオン交換体で処理した後、未吸着画分をプールとして集めた。
０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で予め平衡化したヘパリン−セファロース６ＦＦゲル約３７０ｍｌを充填したカラムに前述のプール画分を５℃で負荷した。引き続き、５〜１０℃でそれぞれ０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出したＡＴ−ＩＩＩ画分を限外濾過装置（フィルトロン社製  ポアサイズ１０Ｋ）を用い、５〜１０℃で０．１Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍｌになるまで濃縮した。
前記画分を０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で約１．０リットルに希釈した。予め０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦゲル（ファルマシア社製、トリメチルアミノメチル／架橋アガロース）約３４０ｍｌに前述の希釈液を５〜１０℃で負荷した。次いで、同温度条件下で０．０１Ｍリン酸緩衝液、０．１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を６．０リットル送液して洗浄した後、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．１７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を３．０リットル送液しＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
この溶出画分をさらに精製するため、再度ヘパリン−セファロースゲル処理を行った。すなわち０．０２Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．３で予め平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３７０ｍｌを充填したカラムに、前述のＱ−セファロースＦＦゲルの溶出液を５〜１０℃で負荷した。引き続き、同温度条件下でそれぞれ０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルで洗浄した後、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．３）３．０リットルでＡＴ−ＩＩＩを溶出した。
【００１０】
次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出した溶液を前述のものと同一の限外濾過装置を用い、１０℃以下で濃縮・緩衝液交換を行った。交換緩衝液として、０．０２Ｍクエン酸緩衝液、０．０７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を用い、２８０ｎｍの吸光度にて１０になるよう希釈・調整した。その後前記のＡＴ−ＩＩＩ溶液の凍結乾燥を行った。得られた乾燥品を品温６６±１℃で９６時間加熱処理を行った。
本粉末を注射用水で溶解後、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ウイルス除去膜（旭化成製、プラノバ３５Ｎ）処理を実施し、凍結乾燥して、本発明の精製ＡＴ−ＩＩＩ製剤Ａを得た。
【００１１】
試験例１
１）本発明製剤Ａと市販製剤Ｂ〜Ｅとの比較試験
本発明のＡＴ−ＩＩＩ製剤Ａと市販ＡＴ−ＩＩＩ製剤Ｂ〜Ｅとの比較試験を行った。市販ＡＴ−ＩＩＩ製剤はすべてＡＴ−ＩＩＩ含有水溶液の加熱によるウイルス不活化を行って得られたものである。比較した試験項目はＡＴ−ＩＩＩ活性および蛋白質量である。以下試験材料及び試験方法、試験結果の順に説明する。
２）試験材料及び試験方法
試料液
製剤Ａ〜Ｅはバイアルに充填、凍結乾燥したものをそれぞれの溶解液にて溶解し試料液Ａ〜Ｅとした。
ＡＴ−ＩＩＩ活性の測定
生物学的製剤基準記載のＡＴ−ＩＩＩ力価測定法に則り測定した。
蛋白質量の定量
ウシ血清アルブミン（バイオラッド社製）を標準蛋白質として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いて行った。
【００１２】
３）試験結果
ＡＴ−ＩＩＩ活性、蛋白質量及び比活性
ＡＴ−ＩＩＩ活性、蛋白質量の測定結果及び比活性を〔表１〕に示す。
【表１】
0003595466.tif 000002
〔表１〕から明らかなように、本発明の製剤Ａの比活性は５．６  ＩＵ／ｍｇと高値を示したのに対し、市販の製剤Ｂ〜Ｅは４．５〜５．３  ＩＵ／ｍｇであった。
【００１３】
試験例２
１）ヘパリンセファロースカラムを用いた本発明製剤Ａ及び市販製剤Ｂ〜Ｅの分析試験
ヘパリンセファロースカラムを用いて、本発明製剤Ａ及び市販製剤Ｂ〜Ｅの分析を行った。まず、製剤Ａ〜Ｅから調製した試料液Ａ〜Ｅをヘパリンセファロース（アマシャムファルマシア社製）カラムに負荷し、ＡＴ−ＩＩＩの溶出パターンを比較した。
また更に本発明製剤Ａおよび市販製剤Ｂ〜Ｅについてヘパリンセファロースカラムから溶出した各蛋白質のピーク画分を分取し、その分取画分についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロットによる分析およびＮ末端部分アミノ酸配列分析を行った。以下、試験材料、試験方法、試験結果の順に説明する。
【００１４】
２）試験材料及び試験方法
試料液
製剤Ａ〜Ｅはバイアルに充填、凍結乾燥したものをそれぞれの溶解液にて溶解し試料液Ａ〜Ｅとした。すべての試料液を、生物学的製剤基準記載のＡＴ−ＩＩＩ力価測定法を用いてＡＴ−ＩＩＩ活性の測定を行い、その値を基に１８．７  ＩＵ／ｍｌの濃度に調整して、ヘパリンセファロースカラムに負荷した。
ＡＴ−ＩＩＩ活性の測定
ヘパリンセファロースカラムから溶出したＡＴ−ＩＩＩ画分の活性の測定は、テストチームＡＴ−ＩＩＩ２キット（第一化学社製）を用いて行った。
ヘパリンセファロースクロマトグラフィー
０．０２Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したヘパリンセファロース６ＦＦ（アマシャムファルマシア社製）カラムにＡＴ−ＩＩＩ活性濃度を調整した試料液１６．７ｍｌを負荷し、０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液、０〜２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）の直線濃度勾配を用いてＡＴ−ＩＩＩを溶出させた。ピークの検出は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより行った。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
ゲル濃度を７．５％に調整し、Ｌａｅｍｍｌｉ  の方法［Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７巻，  ６８０（１９７０）］に従って行った。
ウエスタンブロット
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜（アマシャムファルマシア社製）に転写し、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ＡＴ−ＩＩＩポリクロナール抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  社製）を用いて行った。
【００１５】
３）試験結果
各試料液のヘパリンセファロースカラムからのＡＴ−ＩＩＩ溶出パターンの比較製剤Ａ〜Ｅより調製された試料液Ａ〜Ｅのヘパリンセファロースカラムからの溶出パターンを〔図１〕〜〔図５〕に示した。各図に示されるように、全ての試料液において１．２〜１．３Ｍ塩化ナトリウム濃度付近でメインピークの溶出が認められた。各図において、点線で示されたＯＤ２８０ｎｍ溶出パターンから明らかなように、いずれの試料においても塩化ナトリウム濃度１．０Ｍ以下の溶出画分に低ヘパリン親和性蛋白の溶出が認められたが、その量は試料液Ａが最も少なかった。
試料液Ａ〜Ｅのヘパリンセファロースカラムからの溶出ピーク画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
試料液Ａ〜Ｅのヘパリンセファロースカラムからの各溶出ピーク画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、その像を〔図６〕〜〔図１０〕に示した。各図のＮｏ．電気泳動像におけるレーンＮｏ．とフラクションＮｏ．との関係を〔表２〕に示す。
【００１６】
【表２】
0003595466.tif 000003
〔図６〕〜〔図１０〕から明らかなように、試料液Ａ〜Ｅのいずれにおいても低塩化ナトリウム濃度溶出ピーク画分中に、メインピークのバンドと同様の移動度を示すバンドが認められた。
試料液Ａでは、メインピークと同様の移動度を示すバンド以外のバンドは認められなかったが、試料液Ｂ〜Ｅはいずれも０．３〜０．７塩化ナトリウム濃度の溶出ピーク画分中に、メインピークの移動度より小さい移動度を示すバンドが認められた。これらのバンドの成分はいずれもウエスタンブロットにおいて抗ＡＴ−ＩＩＩ抗体と反応した。
【００１７】
試料液ＢおよびＣから得られたバンドの成分をそれぞれＮ末端部分アミノ酸配列分析をした結果、いずれも２種類のＮ末端アミノ酸配列を検出した。すなわち、一つはヒトＡＴ−ＩＩＩのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と同じアミノ酸配列を示す断片（配列番号２および３）と、もう一つはヒトＡＴ−ＩＩＩのＳｅｒ３９４（配列番号４における第４番目のアミノ酸  Ｓｅｒ  が、ヒトＡＴ−ＩＩＩの第３９４番のアミノ酸  Ｓｅｒ  に当たる。）からの配列と同じ配列を示す断片（配列番号５および６）が検出された。この結果から、このバンドの成分はＡＴ−ＩＩＩが少なくとも反応部位（Ａｒｇ３９３−Ｓｅｒ３９４）で開裂したものであると考えられる。
以上の結果から、本発明製剤Ａは低ヘパリン親和性ＡＴ−ＩＩＩを僅かしか含んでおらず、また開裂したＡＴ−ＩＩＩが認められかったことから、本発明製剤は開裂したＡＴ−ＩＩＩを含まない高純度ＡＴ−ＩＩＩ調製物であることが明らかとなった。これに対し市販ＡＴ−ＩＩＩ製剤Ｂ〜Ｅはいずれも低ヘパリン親和性ＡＴ−ＩＩＩを含み、それらの中に開裂したＡＴ−ＩＩＩを確認した。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の精製ＡＴ−ＩＩＩは開裂ＡＴ−ＩＩＩを実質的に含まないので、極めて安全性の高い製剤を提供することができる。すなわち、本発明の製法によれば、従来法で得られているウイルスの不活化効果と少なくとも同程度のウイルス不活化効果を有するにもかかわらず、低ヘパリン親和性の変性又は不活性なＡＴ−ＩＩＩの混入が少なく、特に開裂ＡＴ−ＩＩＩを実質的に含まない精製ＡＴ−ＩＩＩが得られるので、それらを除去するための追加工程が不要である。しかも本方法は大量生産に好適な方法であるので、工業的製法として極めて有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】製剤Ａのヘパリンセファロースカラム溶出パターン。
【図２】製剤Ｂのヘパリンセファロースカラム溶出パターン。
【図３】製剤Ｃのヘパリンセファロースカラム溶出パターン。
【図４】製剤Ｄのヘパリンセファロースカラム溶出パターン。
【図５】製剤Ｅのヘパリンセファロースカラム溶出パターン。
【図６】製剤Ａの溶出ピークのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像。
【図７】製剤Ｂの溶出ピークのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像。
【図８】製剤Ｃの溶出ピークのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像。
【図９】製剤Ｄの溶出ピークのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像。
【図１０】製剤Ｅの溶出ピークのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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