(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体（抗−hTg自己抗体）の、患者の生物学的流体のサンプル中のチログロブリンに対する自己抗体（抗−hTg自己抗体）の臨床検出用免疫学的アッセイにおける、特異的結合試薬としての使用。
【請求項２】
ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体を、患者の血清中の抗−hTg自己抗体の発生に関連する甲状腺自己免疫疾患に罹っている個々の患者または数人の患者からの血清調製物の形態で、またはそれからアフィニティ精製により得られた抗−hTg−IgG画分の形態で、使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の使用。
【請求項３】
免疫学的アッセイが競合アッセイであり、該アッセイでは、サンプル中に存在する被測定抗−hTg自己抗体および特異的結合試薬として使用されるポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、アッセイの別の試薬として使用されるヒトチログロブリン（hTg）の結合部位に関して競合的であり、各場合とも上記の試薬の一方が標識化され、他方が固体相に結合されており、測定しようとするサンプル中に存在する抗−hTg自己抗体の存在が、固体相に対する標識化試薬の結合の減少に基づいて検出されることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の使用。
【請求項４】
ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、固体担体相と結合されているアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態で使用されること、並びに試験する患者のサンプル中の抗−hTg自己抗体の存在が、それ自体、加えられた標識化ヒトチログロブリンの、固体担体相への結合の減少として現れることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
試験管の壁が固体担体相として使用され、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物が、試験管の壁に、ヒトIgGに対する非特異的結合剤によって結合されることを特徴とする請求の範囲第４項記載の使用。
【請求項６】
ヒトチログロブリンでコーティングされた固体担体相が、さらなる試薬として使用されるようなアッセイにおいて、ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、標識の付着でマークされているアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態で使用されることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、測定しようとする自己抗体の発生が典型的である甲状腺自己免疫疾患に罹っている異なるドナー患者の血清を組み合わせることにより、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG画分の形態で得られ、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物は、hTg親和マトリックスに結合し、その後に適切な緩衝液でそこから溶離することで得られることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
希釈液および／または緩衝溶液、抗−Tg標準液および抗−Tgがゼロの標準液、並びに任意に対照血清を含む一般的成分の他に、さらに２つの成分として、ヒトチログロブリンおよびアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物を含有するキットであって、ヒトチログロブリンまたは抗−hTg−IgG調製物のいずれかが標識化された形態で存在しており、上記２つの成分の他方の成分が、各場合とも試験管の内表面上のコーティングとして存在していることを特徴とする、患者の血清中での抗−hTg自己抗体の免疫学的測定のための臨床診断用の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、診断薬の製造業者により工業規模で製造され、そして販売されている試薬キットによって実施される免疫アッセイによる、生物学的流体中の抗体の検出に関する。特に、本発明は自己抗体、特に甲状腺の自己抗原に対する自己抗体の検出に関し、そしてそこではヒトの血清または血漿中のチログロブリン（hTg）に対するヒトの自己抗体の測定が、本発明においては主として重要である。
チログロブリンは甲状腺自己抗原の１種であり、そして各々約330kDの分子量を有する２種の同じグリコシル化されたサブユニットからなる高分子量蛋白質である（例えば、J.Furmaniak and B.Rees Smith in:Autoimmunity,1990,Vol.7,63−80頁参照）。チログロブリンは、甲状腺コロイドの主要成分であり、そして甲状腺ホルモン類であるトリヨードチロニン（T3）およびチロキシン（T4）の前駆体である。上記の甲状腺ホルモン類の合成の予備段階として、未結合の循環しているヨウ素およびヨウ化物がチロイドペルオキシダーゼ酵素（TPO）の触媒作用の下で、Tgのチロシル基またはヨードチロシン基の中に導入される。次に、甲状腺ホルモン類T3およびT4が、ヨウ素化されたチログロブリンから遊離され、これは血液中のT3またはT4の含有量に応答するホルモン調節機構により影響を受ける。
甲状腺自己免疫疾患の場合、特に甲状腺機能低下症をもたらす破壊的な橋本甲状腺炎の場合には、チロイドペルオキシダーゼに対する自己抗体の他に、かなりの量のチログロブリンに対する自己抗体も、患者の血液中で検出される（そのような抗体を以下では常に「抗−hTg自己抗体」と称する）。従って、そのような抗−hTg自己抗体の検出および定量的測定は、甲状腺疾患の臨床診断においてかなり重要である。
患者の血清中の抗−hTg抗体の測定は、免疫学的アッセイを含む種々の技術により可能である。このタイプの商業的に利用できるアッセイ（ヘニング試験（HENNINGtest（登録商標））抗−Tg）では、予め希釈した血清サンプルを、試験管の中で標識Tg（トレーサーとして）およびプロテインＡ懸濁液と共に、同時にインキュベートする。抗−hTg自己抗体がサンプル中に存在する場合には、それらはトレーサーとして加えられた抗原hTgと反応する。同時に、懸濁した固体相の粒子の形態で存在するプロテインＡは、抗体のFcサブユニットと非特異的に結合し、そしてサンドイッチ複合体が生成する。それに対して結合された全ての分子を含む固体相懸濁液の粒子は、遠心分離により沈澱とされ、そして未結合のトレーサーを含有する上清は除去される。サンプル中の自己抗体の量が多くなればなるほど、結合されるトレーサーの量は多くなる。それ故、抗−hTg自己抗体の濃度は沈澱中で検出可能なトレーサーの量、例えば放射標識の場合には沈澱中で測定可能な放射活性に正比例する。
全種類のIgG抗体を、区別なく結合しうる非特異的結合相手であるプロテインＡを使用することにより、そしてトレーサーとして標識化チログロブリンを同時に使用することにより、全ての抗−hTg自己抗体が上記のアッセイにおいて検出される。患者の血清は、臨床的に顕在化する甲状腺自己免疫疾患に直接的に関連しない抗−hTg自己抗体を含有しているかもしれないことが知られているため、直接的に結合され、且つ橋本甲状腺炎など臨床的に顕在化する甲状腺疾患の原因であるような抗−hTg自己抗体に選択的に応答するアッセイも、それ自体興味の対象であろう。さらに、上記の既知の方法が、遠心分離工程を必要とすることは、該方向のある種の欠点であるとみなされるであろう。しかしながら、競合アッセイおよびコーティングチューブ方法として作用する他の方法は、遠心分離工程なしで操作され（DYNOtest（登録商標）抗−TPO、この方法の原理に関してはDE 41 20 412 C1を参照のこと）、抗−hTg自己抗体の測定と平行して非常に頻繁に行われている抗−TPO自己抗体の測定用に利用可能である。しかしながら、異なる取り扱い段階を含む２種のアッセイの同時実施は、臨床研究のための実施においては、欠点となることが証明されている。従って、コーティングチューブ技術に従い操作され且つ競合アッセイであり、そして試験血清サンプル中で測定しようとする抗体の存在が、標識試薬（トレーサー）の試験管壁への結合の減少として現れるようなアッセイにより、抗−hTg自己抗体の測定を行えることも、それ自体望ましいであろう。
抗原hTPOのエピトープは、本質的には抗−TPO自己抗体の測定の場合には既知であり、そして競合測定用に適する１組のモノクローナル抗体を見いだすことが可能であるが（Jean Ruf,Marie−Elisabeth Toubert,Barbara Czarnocka,Josee−Martine Durand−Gorde,Mireille Ferrand and Pierre Carayon,in:Endocrinology,Vol.125,No.3,pages 1211−1218,1989参照）、現在では抗原が非常に大きくおよび／または免疫反応に含まれるそれらのエピトープに関する同定が不十分であるか或いは該エピトープが未知である場合には、匹敵する競合アッセイの開発は基本的問題に直面するはずである。そのような症例は、非常に多数あり、そしてグルタメートデカルボキシラーゼ（Ｉ型糖尿病）、アセチルコリン受容体（重症筋無力症）、いわゆる「ミエリン塩基性蛋白質」（多発性硬化症）、TSH受容体および特にチログロブリン（hTg）がそのような抗原の例として挙げられる。
抗−hTG自己抗体を測定するために、抗−TPO自己抗体の測定に関して上記方法に対応する競合アッセイを開発する試みがなされる場合には、チログロブリンに対して製造される抗原または抗体集団として作用するチログロブリンの特殊性に関する難点に遭遇する。最初に述べたように、ヒトチログロブリン（hTg）は、非常に多数の潜在的抗原決定因子（エピトープ）を有する非常に大きい蛋白質抗原であり、動物の直接免疫化により異種抗体を製造するためにヒトチログロブリンを使用すると、ヒトチログロブリンの多数の異なるエピトープに対して指向されることが見いだされているポリクローナル抗体の集団が得られる。しかしながら、最近数年間の研究は、自己免疫疾患中に生成する抗−hTg自己抗体は、明らかにチログロブリン表面上の限られた数のエピトープに対してのみ製造されることを示している（J.Furmaniak and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1990,Vol.7,pages 63−80;J.Ruf,Mireille Henry,Catherine De Micco,P.Carayon,in:Thyroglobulin and Thyroglobulin Autibodies in the Follow−up of Thyroid Cancer and Endemic Goiter（Hufner,M.,and Reiners,C.,Editors）,pages 21−31,1987,G.T.Verlag Stuttgart,New York;C.T.J.Chan,P.G.H.Byfield,R.L.Himsworth and P.Shepherd,in:Clin.exp.Immunol.（1987）70,pages 516−523;S.M.McLachlan,U.Feldt−Rasmussen,E.T.Young,S.L.Middleton,M.Blichert−Toft,K.Siersboek−Nielsen,J.Date,D.Carr,F.Clark and B.Rees Smith,in:Clinical Endocrinology（1987）,26,pages 335−346;Q.Dong,M.Ludgate and G.Vassart,in;Journal of Endocrinology（1989）122,pages 169−176;M.E.Devey,K.M.Bleasdale−Barr,S.M.McLachlan,J.Bradbury,F.Clark and E.T.Young,in:Clin.exp.Immunol.（1989）,77,pages 191−195;N.Fukuma,S.M.McLachlan,V.B.Petersen,P.Kau,J.Bradbury,M.Devey,K.Bleasdale,P.Grabowski and B.Rees Smith,in:immunology 1989,67,pages 129−131;N.Fukuma,S.M.McLachlan,V.B.Petersen,K.Beever and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1990,Vol.6,pages 37−45;Shannon L.Gleason,Patricia Gearhardt,Noel R.Rose and Rudolf C.Kuppers,in:The Journal of Immunology,Vol,145,No.6,pages 1768−1775,1990;Herbert S.Bresler,C.Lynne Burek and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vo.54,pages 64−75,（1990）:Herbert S.Bresler,C.Lynne Burek,William H.Hoffman and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol,54,pages 76−86,（1990）;Mireille Henry,Yves Malthiery,Eric Zanelli and Bernadette Charvet,in:The Journal of Immunology,Vol.145,No.11,pages 3692−3698,1990;Shigeki Sakata,Toru Ogawa,Yasuyoshi Kimata,Hiroshi Takuno,Hiroshi Maekawa,Masafumi Matsuda,Osamu Tarutani and Kenji Okuda,in:Molecular and Cellular Endocrinology,79,（1991）,pages 93−98;Gilles Dietrich,Martine Pierchaczyk,Bernard Pau and Michel D.Kagatchkine,in:Eur.J.Immunol.1991,21,pages 811−814;Yves Malthiery,Mireille Henry and Eric Zanelli,in:FEBS Letters,Vol.279,No.2,pages 190−192（1991）;E.Schulz,G.Benker,H.Bethauser,L.Stempka and M.Hufner,in:J.Endocrinol.Invest 15,pages 25−30,1992;Asmae Alami Harchali,Paul Montagne,Marie L.Cuilliere,Majida Bouanani,Bernard Pau and Jean Duheille,in:Clin.Chem.Vol.38,No.9,pages 1859−1864（1992）;B.Mallet,P.J.Lejeune,J.Ruf,M.Piechaczyk,C.Marriq and P.Carayon,in:Molecular and Cellular Endocrinology,88,（1992）,pages 89−95;J.M.Hexham,J.Furmaniak,C.Pegg,D.R.Burton and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1992,Vol.12,pages 135−141;Rudolf C.Kuppers,Ingrid M.Outschoorn,Robert G.Hamilton,C.Lynne Burek and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol.67,No.1,pages 68−77,1993;Peter J.Delves,Sandra M.McLachlan,Elizabeth Drewe,Nao Fukuma,Vaughan B.Petersen and Bernard Rees Smith,in;Journal of Autoimmunity（1993）,1,pages77−91;Patrizio Caturegli,Stefano Mariotti,Rudolf C.Kuppers,C.Lynne Burek,Aldo Pinchera and Noel R.Rose,in:Autoimmunity,1994,Vol.18,pages 41−49）。問題の複雑さのために、完全なエピトープのマップ作製は現在までhTgに関しては成功しておらず、その状況は、自己免疫疾患中に生成した自己抗体が明らかにコンフォーマティブ抗体の中にあることが見いだされたという事実によりさらに困難となり、それにより動物由来のモノクローナル抗−hTg抗体を使用するエピトープのマップ作製時の試みをさらに困難にし、そして組み換え逐次抗体を使用する関連エピトープのマップ作製を妨げている（Q.Dong,M.Ludgate and G.Vassart,in:Journal of Endocrinology（1989）122,pages 169−176）。それ故、動物の血清中でhTgを用いた免疫化により得られるポリクローナル異種IgG集団は、自己免疫疾患において生ずる抗−hTg自己抗体集団には対応せず、従って競合免疫学的アッセイにおける使用にはあまり適してはいないか、または不適切であるのは明らかである。
他方では、抗−hTg自己抗体を測定するための競合アッセイにおいてモノクローナ抗−hTg抗体を使用する試みが、希望する結果、すなわち自己免疫疾患の病理学適過程に実際に関連する抗−hTg自己抗体の割合を測定するアッセイの開発をもたらさないことが見いだされている。モノクローナル抗−hTg抗体を使用する場合に不満足な結果となる理由は、抗−hTg自己抗体生成に含まれる個別のエピトープが、非常に大きいhTg分子上で互いに少ない程度で影響するため、患者の血清中に実際に存在するポリクローナル抗−hTg自己抗体の分画だけが、モノクローナル抗−hTg抗体を使用する競合アッセイで検出されるということ、並びにこれらの分画が全体的な病理学的過程を適切には示さないということである。
動物由来のモノクローナル抗−hTg抗体の代わりにモノクローナルまたは組み換えヒト抗−hTg抗体を使用する試み（GB−Ａ−2 265 713）は原則的にこの問題を改善するものではない。
従って、既存の競合アッセイに基づく抗−hTg自己抗体の測定は信頼性がなく、十分な感度で実施することができないということが知られている。
従って本発明の目的は、そのような自己抗体が多数の関連エピトープを有する抗原に対して製造され、そしてポリクローナル抗体の集団として存在する時でもそのような自己抗体を高い精度および信頼性をもって測定できるような方法で、抗体の競合アッセイ、特に抗−hTg自己抗体測定用の競合アッセイを設定することである。
この目的は、請求の範囲第１項に記載された特異的結合試薬としてチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体を使用することにより、特に甲状腺自己免疫疾患に罹っているヒト患者の血清からのチログロブリンに対するアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG自己抗体を使用することにより、患者の血清中の抗−hTg自己抗体の測定において達成される。
ポリクローナル抗−hTg自己抗体の本発明に従う特に有利な使用方法は、従属請求の範囲第２項〜第７項に記載されている。
本発明はさらに請求の範囲第８項記載の患者の血清中の抗−hTg自己抗体の免疫学的測定用試薬キットにも関し、それは本質的にそのような試薬キットの一般的成分の他にアフィニティ精製された抗−hTg自己抗体（アフィニティ精製された抗−hTg IgG調製物）を含有することにより特徴づけられている。
請求の範囲第９項に記載されている非常にさらに一般的な態様に従うと、本発明は、一般的にはそのような抗体の発生により特徴づけられる疾患の臨床診断用のポリクローナルヒト抗体の使用にも関し、その理由としては、さらに以下でより詳細に説明されているように、抗−hTg自己抗体の決定から生ずる原則を他の用途にも適用することができ、そして患者の血清から得られるポリクローナルヒト抗体（hIgG）は免疫学的アッセイを実施するための商業用試薬キット中で特異的結合試薬としてすでに使用されていることを確認することが不可能であるからである。
本出願では、チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が「特異的結合試薬」として使用されると述べられているが、これは、それらが抗原と１つもしくは複数の抗体との間の特異的免疫学的反応を使用する免疫学的アッセイにおいて、反応物として使用されることを意味する。「特異的結合試薬」は「分析物用の結合剤」の意味で使用されるものではなく、その理由は測定しようとする抗体を「分析物」とみなす必要がないであろうし、本発明に従い使用されるチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が、抗原チログロブリンの結合部位のための競合剤として競合するからである。
本発明は、現在免疫学的アッセイ用の試薬キットの工業的製造分野において一般的な動物由来の抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗−hTg抗体）を使用する代わりに、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患に罹っていることが示されている患者の血清から直接得られるポリクローナルヒト自己抗体を使用する場合、患者の血清中で抗−hTg自己抗体を非常に高い信頼性でもって検出できるという知見に基づいている。本発明では、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患の典型的な症状を有する一人の患者の血清の形態で、そのようなポリクローナルヒト自己抗体を使用することが一般的に可能であるが、使用される出発血清が検出しようとする疾患に関連する人間において生成されるかもしれないできるだけ完全な全ての自己抗体の集団を確実に含有するようにするためには、複数のそのような患者の一緒にした（「プールされた」）血清をポリクローナルヒト自己抗体源として使用することが好ましい。さらに、抗−hTg自己抗体の測定の場合には、ポリクローナルヒト自己抗体は好適にはそのような血清中に存在する全てのhTg自己抗体が使用されるような方法では用いられず、その代わりに、ポリクローナルヒト自己抗体、hTg親和マトリックスを使用するアフィニティ精製後に、特異的結合試薬として使用される免疫グロブリン画分が本質的に抗−hTg自己抗体だけからなるような方法で好適に用いられる。
本出願がアフィニティ精製目的のためのまたは免疫学的アッセイにおける試薬としてのチログロブリンまたはヒトチログロブリンの使用に関する場合には、それが主として意味するものは例えば英国の会社であるサイパックの如き種々の製造業者から商業的に入手できる一般的なヒトチログロブリンである。しかしながら、非常に特異的なチログロブリン画分が甲状腺自己免疫疾患の自己抗体の生成中に平均を越える程度まで含まれるかもしれないことが最近示されている（Ali H.Saboori,Noel R.Rose,Rudolf C.Kuppers,Wayne G.Butscher,Herbert S.Bresler and C.Lynne Burek,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol.72,No.1,pages 121−128,1994;A.Gardas,in:Autoimmunity,1991,pages 331−336）ため、本発明はアフィニティ精製のため、およびアッセイにおける試薬としても、完全チログロブリン調製物ではなく、自己免疫疾患に関して特に重要であるヒトチログロブリン画分だけ、例えば上記の文献中で蛋白質ピーク１として表示されておりそして大きく減少したヨウ素化度を有するチログロブリンに対応する蛋白質画分、または健康な人間と比べて橋本甲状腺炎に罹っている人間において大きな割合で発生することが示されているhTgの他の画分だけを、特に使用する。そのようなチログロブリン画分を完全チログロブリン調製物の代わりに使用することにより、アッセイの選択性および／または感度並びに特異性に関して別の利点を得ることもさらに可能となる。
本発明に従うヒト抗−hTg自己抗体の測定は２つの図面および２つの測定曲線並びに２つの使用例に関して以下でさらに詳細に説明される。
図面において、
図１は、標識された形態で使用されるhTg用の、固定化された特異的結合剤として作用するアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG画分を使用する抗−hTg自己抗体測定の第一の変法における方法の原理を示しており、図２は、固定化された形態で使用されるhTg用の特異的結合剤として標識された形態で使用されるアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG画分を使用する抗−hTg自己抗体測定の第二の変法における方法の原理を示しており、図３は、実施例１に従うアッセイにおける抗−hTg自己抗体の測定に関する測定値の表で共に典型的な測定曲線を示しており、そして図４は、実施例２に従うアッセイにおける抗−hTg自己抗体の測定に関する測定値の表で典型的な測定曲線を示している。
特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−hTgの使用により、特異的結合試薬として加えられるポリクローナルヒト自己抗体が患者のサンプル中で検出しようとする自己抗体と競合するような競合免疫学的アッセイを実現することが可能である。
特に、一つの変法によると特にアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態のポリクローナルヒト抗−hTg抗体が固体担体相、特に試験管の壁と、結合し、そして標識ヒトチログロブリン、例えば放射性ヨウ素処理されたヒトチログロブリンが別の試薬として使用されるような方法でこのアッセイを実施することができる（図１参照）。抗−hTg自己抗体の不存在下では、特に検出しようとする甲状腺疾患の原因であるhTg自己抗体の不存在下では、標識チログロブリンは、完全に、またはブランク対照の百分率特性値まで結合される。検出しようとするタイプの抗−hTg自己抗体が患者のサンプル中に存在する場合には、この方法で特異的結合試薬として使用される抗体と患者の血清中の抗体との間の競合が生じ、後者は固体相に対する標識チログロブリンの結合減少で現れ、それは固体／液体分離後に固体相上で見られる標識の減少をもたらす。
原理的にそれ自体既知である方法の別の原理では（図２）、抗原すなわちヒトチログロブリン（またはその画分、上記参照）を固体相の上で固定化しそして標識ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体画分の形態のトレーサーを使用するような工程を行うこともできる。この場合にも、患者のサンプル中で測定しようとする自己抗体の存在が固体相に対する標識の結合減少をもたらす。
ヨウ素放射性同位体が、本発明の実施例においてトレーサー分子用のマーカーまたは標識として常に使用されるとしても、使用する標識の性質は厳密なものではなく、他の適当な標識をトレーサー調製用に選択および使用できることは当業者には明らかである。
固体相は、それ自体は既知である微量滴定板の壁または他の粗い分散性もしくは微細な分散性の固体相であってもよく、そして適当な固体相は主として特定用途に関する実際の考察を基にして選択することができる。
以下の試験が示すように、驚くべきことに、特異的結合試薬としてポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体を使用する競合アッセイにより、ヒトの血清中の抗−hTg自己抗体の信頼性のある測定が可能になるということが見いだされた。
特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用は、多分、抗−hTg自己抗体の病原性成長に関連する可能性のある、全てのエピトープ用の結合相手が、そのようなポリクローナル特異的結合試薬のhTg分子上に存在するという利点を有するであろう。しかしながら、このことは患者の血清中のそのような抗−hTg自己抗体のいかなる発生も検出可能な効果とすることを保証しており、この効果はもちろん患者の血清中の個別の自己抗体タイプの量および／または数につれて増加する。特異的結合試薬としてモノクローナル抗体を用いると、実際にはモノクローナル抗体と抗原との間の特異的結合は、患者の血清からのある種のタイプの自己抗体により妨害されず、かくしてそのような自己抗体は検出されないという可能性は、本発明の方法では予期されない。ある種の疾患に関する典型的なセットであり、且つ抗体集団として、ある種の病理学的症状と関連するフィンガープリント分布の性質を表す自己抗体を有する患者の血清を使用することにより、そのようなフィンガープリントパターンに関するありうる最適な特異性も得られ、そして非特異的な副作用は、適当な標準化により排除することができる。
ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が使用される時には、これらの抗体または関連抗原の固定化または標識化をしても、hTgの全ての関連エピトープを全ての関連する自己抗体タイプとの結合用に利用するのに十分な可能性があるため、集団の各々の個別の抗体タイプが全体的な測定結果に対して寄与し、その臨床的関連性は増加する。
しかしながら、本発明の前提条件は、また、現在まで使用されてきたような、動物の免疫化により得られた抗体を用いるか、または対応するモノクローナル抗体を用いる代わりに、疾患に罹っているヒトドナーの血清から得られる抗体を用いて操作する際に、重大問題が実際に存在しないという驚くべき発見である。例えば、驚くべきことに、橋本甲状腺炎患者の血清中に存在する抗−hTg自己抗体の量は、相対的に少量のドナー血清でも大量のコーティング試験管の調製のために十分であるような量であることが見いだされた。それ故、約25000回の個別測定用に十分な量である5mgのアフィニティ精製された抗−hTg自己抗体は、例えば1000U/mlの抗−Tg含有量（出願人のヘニング試験（登録商標）抗−Tgで測定された）を有する10mlの患者の血清を使用して得られる。さらに、十分で比較的少数の疾患に罹っている人間のプールされた血清が使用される時には、実質的に同一の結合性質を有する非常に適切なポリクローナルヒト自己抗体が、意図する使用のために得られ、そしてバッチ毎に観察されるかもしれない相対的な変動は一般的な較正工程により容易に考慮することができる。
従って、適切な入手性および／または再現性並びに特異的結合試薬の品質の不変性に関する条件は、ポリクローナルヒト抗体を使用するアッセイでは証明されていない。先入観にも等しいそのような条件は、現在商業用アッセイにおいて特異的結合相手として何故ヒトIgG画分が使用されないかの理由、並びに患者の血清中の抗体測定用の免疫学的アッセイのための商業的試薬キット製造用の特異的結合相手としてのポリクローナルヒトIgGキット画分の使用に関する提案を文献中で見付けられないかの理由を説明できるであろう。
特に、疾患に特異的な抗体集団の「フィンガープリントパターン」を検出可能であるという、上述の検出特異性に関する上記の事項から、本発明が基づく原理が、抗−hTg自己抗体の測定用だけでなく一般的に臨床的診断における抗体測定用、および特に外部抗原に対する抗体の測定用にも適していることは明らかである。このタイプの可能な用途は、例えば、疾患に罹っている一人の患者から得たIgG画分を、患者の血液中を循環する抗体の減少に基づいて、この特異的患者の症状における改良を監視するために使用するアッセイ用の特異的結合相手として使用することである。そのような場合では、医師に、患者から得たIgG画分で、医師自身によってコーティングされる試験管以外の全ての必要な試薬を含有している試薬キットを提供することができる。医師がそのような患者に対して特異的な試験管のある種のストックを準備したら、彼はその後に患者における抗体濃度の変化およびおそらく元の抗体の消失を監視することができる。
同様に、プールされており、そして必要に応じてアフィニティ精製により濃縮されている患者の血清からのある種の抗原に対するヒト抗体を使用して、試験システムを製造することもでき、それにより一般的であるが、臨床的にみて信頼性の高い方法で、この抗原により惹起される疾患に罹っている疑いのある患者の免疫状態を測定することが可能となる。適する抗原は、自己抗原だけでなく細菌もしくはウイルス由来の病原性抗原、またはアレルゲンとして作用する抗原も挙げられる。そのような試験システムは、抗原およびこれらの抗原に対して製造される抗体のタイプに関して、非常にわずかしかわからない時にも準備することができ、その理由は、これが適切な抗体生成での免疫系の反応を反映するならば、この試験システムは、ある程度まで対応する病理学的症状の存在または不存在を直接的に示すからである。
本発明を図面に示されている抗−hTg自己抗体に対する２つのアッセイタイプに関する２つの実施例を参照しながら、以下でさらに詳細に説明する。しかしながら、ここで、本発明の原理は、抗−hTPO自己抗体の測定の場合のように、モノクローナル抗体を使用する競合免疫学的アッセイが、大多数の症例において、本質的に正確な結果を与えるような他の症例においてもその価値を有するという点に注意を払うべきである。IgG画分の形態のポリクローナルヒト抗体を使用すると、これまでのように、前もってアフィニティ精製することなしに、匹敵する正確な結果を得ることができ、さらに血清が正確に測定されずに抗体を含まないとされる非常に希な場合でも正確な結果が得られ、その血清が検出しようとする自己抗体を実際には含有していたことを示した。
実施例
物質
全ての実施例において固体相として使用される管は、スターインサートを有する75×12mmのヌンク製のマクシソープ品質の管である。
記載されている緩衝溶液は、
緩衝液A:燐酸塩で緩衝された食塩水溶液（PBS）、0.1％ツィーン20
緩衝液B:10mM TRIS HCl、10mM NaCl、pH7.8
緩衝液C:20mM燐酸ナトリウム、pH7.0
緩衝液D:25mMクエン酸
緩衝液E:0.5M燐酸ナトリウム、pH8.0
緩衝液F:20mM燐酸ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン（BSA、シグマ）、３％の結晶化が抑制されたソルビトールシロップ（カリオンFP、メルク）、pH7.5
血清サンプル：
橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺炎およびグルーヴズ病を示す患者からの血清サンプルをドイツの種々な病院から得た。それらを試薬の調製用または試験血清として使用した。対照サンプルとして使用する血清サンプルは感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の症状のなかった人間からの血清である。
比較方法として使用されたヘニング試験（登録商標）抗−Tgに従うアッセイは商業用アッセイであり、そしてベルリンのブラームス・ダイアグノスチカGmbHからの操作指示付きの試薬キットの形態で入手できる。
ヨウ素125−標識ヒトチログロブリンは、上記の商業用のヘニング試験（登録商標）抗−Tgから採取された。
試薬の調製用の橋本甲状腺炎のある患者の血清からの抗−hTg自己抗体のアフィニティ精製
ａ）親和マトリックスの調製
20mgのヒトチログロブリン（サイパック、英国）を7mlの緩衝液Ｃの中に溶解させ、そして100mlの過ヨウ素酸ナトリウム（フルカ）を加える。15分間にわたるインキュベート後に、溶液をNAP25カラム（ファルマシア）により脱塩しそして次に10mlのカルボリンク物質（ピアース、米国）と混合する。４℃における20時間にわたるインキュベート後に、この物質を10mlガラスカラム（バイオラド）の中に入れそして緩衝液Ｃで洗浄する。
ｂ）橋本患者の血清からのヒト抗−Tg自己抗体のアフィニティ精製
10人の橋本甲状腺炎患者の各々から得られた1mlの血清を混合し（出願人のHENNINGtest（登録商標）抗−Tgを用いる測定に相当する最終的な抗−hTg含有量:5000U/ml）、そして120分間にわたり親和マトリックス上で蠕動ポンプを使用して1ml/分の流速で循環させる。カラム流出流の吸収を280nmにおいて連続的に測定する。カラムを次に50mlの緩衝液Ｃで洗浄する。
カラムを緩衝液Ｄで洗浄することにより、ヒト抗−hTg自己抗体を溶出する。ヒト抗−hTg自己抗体（溶離後の量:4ml）を4mlの緩衝液Ｅと混合し、そしてその後の使用のために必要となるまで４℃において貯蔵する。
実施例1:放射性ヨウ素で処理したチログロブリンをトレーサーとして使用する抗−hTg自己抗体の測定（方法HD−Ｒ）
ａ）橋本甲状腺炎の患者からのヒト抗体を用いる試験管の調製（「HD−Ｒ管」）
ヒト抗体を結合するために、抗−ヒト−IgGでコーティングされた管を最初に調製した。この目的のためには、ヤギ−抗−ヒト−IgG（注文番号3AG474、等級２、スカンチボディーズ、米国）を緩衝液Ｂの中で6.7μg/mlの最終濃度になるまで希釈した。300μｌのこの溶液を、ピペットで試験管（ヌンクからのマキシソープ管）に入れ、そして室温において20時間にわたりインキュベートした。次に管の内容物をデカントし、そして管に緩衝液Ｆを完全に充填した。２時間にわたるインキュベート後に、管の内容物をデカントし、そして管を真空中で乾燥した。調製された管（「AHI管」）を４℃において保存した。
上記の如きアフィニティ精製されたヒト抗−hTg自己抗体を、緩衝液Ａで２μg/mlの蛋白質濃度になるまで希釈し、そして100μｌのこの溶液を抗−ヒト−IgGでコーティングされた管（AHI管）の各々にピペットで入れ、そして２時間にわたり室温において振とうしながら（320回転／分）インキュベートした。次に、緩衝液Ａの中に、1mg/mlのヒトIgGを含有する溶液を、遊離している抗−ヒト−IgG結合部位を飽和させるためにピペットで入れ、そしてインキュベートをさらに２時間にわたり振とうしながら続ける。次に、管を各回毎に2mlのPBSで２回洗浄し、そしてその後の使用のために必要となるまで４℃で貯蔵する。
ｂ）測定の実施
工程は下記のインキュベート方式に基づく：
1.  サンプルの調製のために、対照群、並びに患者および標準者のヒト血清を緩衝液Ａで１＋20（１部の血清、20部の緩衝液）の比で希釈する。
2.  100μｌのサンプルを橋本甲状腺炎患者の抗体でコーティングされた管（HD−Ｒ管）にピペットで入れる。
3.  100μｌの放射性ヨウ素処理されたヒトTg（市販のHENNINGtest（登録商標）抗−Tgアッセイの成分）をピペットで入れる。
4.  ２時間にわたり、室温で振とうしながらインキュベートする。
5.  液体相を除去し、そして各回毎に2mlのPBSで２回洗浄する。
6.  管に残っている放射活性を測定する。
ｃ）結果
上記の条件下において、サンプル中の抗−チログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたチログロブリントレーサーは、橋本甲状腺炎患者からのIgGでコーティングされている管に73％の程度まで結合される。サンプル中の抗−Tg自己抗体の量の増加により、標識チログロブリンの結合は減少する。標準者の代表的測定値および代表的な測定曲線が、図３に示されている。
予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカからの比較方法であるヘニング試験（登録商標）抗−Tg中と全く同様に、41個の対照サンプルが上記の方法で陰性であると見いだされている（表１参照）。
橋本甲状腺炎、グルーヴズ病または免疫甲状腺炎の患者からの85個の血清を本発明に従う方法および比較方法であるヘニング試験（登録商標）抗−Tgで測定した。
潜在的に抗−hTg−陽性である測定サンプルの中で、本発明に従う方法で35個のサンプルが、そして比較方法では32個が陽性であると見いだされた。28個のサンプルは、両方の方法で陽性であると見いだされた。測定結果は表２に示されている。これらの結果は、患者の血清中のチログロブリンに対する自己抗体の測定に関してポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用が適することを示している。
実施例2:患者の血清からの標識化されたアフィニティ精製されたヒト抗−hTg自己抗体を使用する抗−hTg自己抗体の測定（方法Tg−Ｒ）
ａ）ヒト抗−hTg自己抗体の放射性ヨウ素処理
上記の通りにしてアフィニティ精製され、そして橋本病に罹っている患者の血清50μｌの量のから得られたヒト抗−hTg自己抗体10μｇを、50μｌのpH7.4の50mM燐酸ナトリウム緩衝液および２μｌの150μCiNa125Iと混合し、そして標識化反応を、古典的なクロルアミンＴ方法により行い、そして５μｌのH2O中の2.5μｇのクロルアミンＴの添加により開始した。60秒間の反応時間後に、サンプルを300μｌのpH7.4の50mM燐酸ナトリウム緩衝液で希釈し、そして上記の一般的な方法でNAP−10−カラム（ファルマシア）により脱塩する。得られた標識抗体を50mM燐酸ナトリウム緩衝液、0.1％ツィーン20、0.2％BSA、pH7.4で400,000cpm/mlの最終希釈度となるまで希釈する。この物質を４℃において貯蔵する。
ｂ）工程
測定に関しては、工程は下記のインキュベートプロトコールに基づいている：
1.  サンプル調製に関しては、対照群、患者および較正からのヒト血清を緩衝液Ａで１＋20に希釈する。
2.  100μｌのサンプルをチログロブリンでコーティングされている試験管にピペットで入れる。
3.  以上の通りにして調製された100μｌの放射性ヨウ素処理されたヒト抗−hTg抗体をピペットで入れる。
4.  ２時間にわたり室温で振とうしながらインキュベートする。
5.  液体相を分離し、そしてこれらの管を各回毎に2mlのPBSで２回洗浄する。
6.  管に残っている放射活性を測定する。
ｃ）結果
上記の条件下において、サンプル中の抗−hTgチログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたヒト抗−hTg抗体は、ヒトチログロブリンでコーティングされている管（Tg−Ｒ）に32％の程度まで結合される。サンプル中の抗−hTg抗体量の増加により、標識ヒト抗−hTg抗体の結合は減少する（代表的な測定曲線は図４に示されている）。
予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカGmbHからの比較方法であるヘニング試験（登録商標）抗−Tg中と同様に、10個の対照サンプルは上記の方法で陰性であると見いだされている（表１参照）。
橋本甲状腺炎、グルーヴズ病または免疫甲状腺炎の85人の患者からの血清の測定においては、16個のサンプルが、本発明の方法により陽性であると測定された。比較方法であるヘニング試験（登録商標）抗−Tgでは、17個のサンプルが陽性であると測定された。この検定変法の14個のサンプルは比較方法であるヘニング試験（登録商標）抗−Tgと一致した（表２参照）。
患者の血清から得られ、そして患者の血清中のチログロブリンに対する、対応する自己抗体の測定のための標識化された形態で存在する、ヒト抗−hTg抗体を使用することも可能であることがこのようにして見いだされた。
0003558645.tif 000002
0003558645.tif 000003
0003558645.tif 000004
【図１】
0003558645.tif 000005
【図２】
0003558645.tif 000006
【図３】
0003558645.tif 000007
【図４】
0003558645.tif 000008