(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸、ステロールまたはそれらの混合物が共有結合したヘパリンを含む複合物質。
【請求項２】
当該ヘパリンが、200ないし100,000の分子量を有する請求項１に記載の複合物質。
【請求項３】
当該胆汁酸が、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸およびそれらの混合物からなる群より選ばれる胆汁酸である請求項１に記載の複合物質。
【請求項４】
当該ステロールが、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびそれらの混合物からなる群より選ばれるステロールである請求項１に記載の複合物質。
【請求項５】
当該ヘパリンと胆汁酸またはステロールが1:1ないし1:1,000のモル比で存在する請求項１に記載の複合物質。
【請求項６】
（a）胆汁酸、ステロールからなる群より選ばれるものが共有結合したヘパリンを含む製薬学上有効量の複合物質、（b）製薬学上許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
当該製薬学上許容され得る担体が、経口用薬物担体である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
当該製薬学上許容され得る担体が、持続放出担体である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
当該持続放出担体が、ポリマーマトリックスまたはポリマーコーティングフィルムである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
当該持続放出担体が、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（ε−カプロラクトン）コポリマー、ポリウレタンポリマー、シリコーンポリマー、エチレンビニルアセテートポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、ゼラチンおよびそれらの混合物からなる群より選ばれるポリマーマトリックスあるいはポリマーコーティングフィルムである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医療用デバイス用コーティング材料としての請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
医療用デバイスが、カテーテル、心肺迂回サーキット、心肺酸素供給装置、腎透析機器、あるいは再狭窄防止用ステントもしくはバルーンである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、改変されていないポリサッカリドに比べて疎水性が増したポリサッカリド誘導体に関する。より詳細には、本発明は、ポリサッカリドの生物活性が保存された、両親媒性ヘパリン誘導体等の両親媒性ポリサッカリド誘導体に関する。さらに、本発明は、このような両親媒性ポリサッカリド誘導体を製造し、使用する方法に関する。
【０００２】
ヘパリンは硫酸化Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸残基からなるポリサッカリドである。その数多いイオン化可能な硫酸基により、ヘパリンは強力な電気陰電荷（ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）を有する。ヘパリンはまた、水に可溶性の塩（例えばヘパリンナトリウム）を容易に形成する比較的強い酸である。ヘパリンは肥満細胞にみられ、多くの身体器官、特に豊富に肥満細胞を有する器官から抽出することができる。肝および肺にはヘパリンが特に豊富である。循環血液は肥満細胞の深刻な破壊後を除いてはヘパリンを含んでいない。ヘパリンは血液抗凝固、平滑筋細胞増殖の抑制等の多くの生理学的機能を有している。特に、ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩと強力に相互作用し、フィブリン凝固の形成を防ぐ強力な抗凝固剤である。しかし、インビボでのヘパリンの適用は極めて限られている。ヘパリンは、その親水性と高い陰電荷のため、胃腸管、鼻あるいは口内の粘膜層等から効率的に吸収されない。したがって、臨床的に使用される唯一の投与経路は静脈内および皮下注射である。さらに、ヘパリンは比較的少数の溶媒にしか溶解しないので、医療用デバイスの表面のコーティングあるいは送達システムに使用し難い。
【０００３】
このようなヘパリンの特性を改善するため、リンハートら（Ｒ． Ｊ． Ｌｉｎｈａｒｄｔ， ｅｔ ａｌ．， ８３， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １０３４−１０３９， １９９４）はラウリル（Ｃ１２）およびステアリル（Ｃ１８）基を単一ヘパリン鎖にカップリングし、疎水性は増加しているが抗凝固活性は低い、誘導体化されたヘパリンを製造した。当該結果は、小さい線形脂肪族鎖をヘパリンにカップリングすることは、活性を保存しながらヘパリンの疎水性を増強させるには効果的ではないということを示している。つまり、公知のヘパリン誘導体は、抗凝固活性の保存という点では有効ではなかった。
【０００４】
リベラら（Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ−［８−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｌｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｐｒｙｌａｔｅ ； Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ， １４ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ｐ１８３０−１８３４， １９９７）はＮ−［８−（２−ヒドロキシベンゾリル）アミノ］カプリレートと混合したヘパリンを使用し、ヘパリンの経口送達の可能性を開示した。ドリズスキーら（Ｄｒｙｊｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｌａｓｍａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｅｐａｒｉｎ ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｎｄ Ｏｒａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ， ２８ Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａ． １８８−１９２， １９８９）は増強剤を使用した低分子量ヘパリンの経口吸収の可能性について記述した。
【０００５】
ヘパリン−放出システムの剤型化の為に二つの基本的な方法が開発された。一つの方法はイオン結合によってヘパリンを陽イオン性ポリマーマトリックスに結合させるというものである。ヘパリンの放出はイオン交換メカニズムによってコントロールされる。もう一つの方法は分散ヘパリンを含むものであり、ヘパリンをまずポリマーと物理的に混合し、続いてヘパリンの放出を拡散によってコントロールする。そのようなヘパリンデバイスの製造の為に最も簡単で且つ効率的な方法はソルベントキャスティング（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃａｓｔｉｎｇ）法である。しかし、ヘパリンはポリマーを溶解するのに使用する有機溶媒中では溶解しないため、ソルベントキャスティング法はヘパリンデバイスを製造するのに使用することができない。生物活性を維持しながら、疎水性が増したヘパリン誘導体が製造できれば、このヘパリン誘導体はソルベントキャスティング法によってポリマーマトリックスに簡単に固定化することができる。
【０００６】
以上に鑑み、高い生物活性を有する疎水性ヘパリン誘導体あるいは両親媒性ヘパリン誘導体の開発は当技術分野で重大な進歩であることがわかるであろう。このような疎水性ヘパリン誘導体を、経口投与用あるいは生物学的適合性を改善するための医療用デバイスの表面を改変するための放出制御システムに使用することができる。このようなヘパリン誘導体によってヘパリンの医療的応用範囲がさらに拡張されるであろう。
【０００７】
本発明の要約
本発明の目的は高いヘパリン生物活性を有する両親媒性ヘパリン誘導体を合成することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は水と同様に、アセトン／水といった溶媒中でも溶解する疎水性ヘパリン誘導体を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は表面での血液凝固を防止するための放出制御システムに使用できるヘパリン誘導体を提供することである。
【００１０】
また本発明の別の目的は、胃腸管から吸収され得、それによって血液凝固を防止するための経口送達が容易となる、ヘパリン誘導体を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに異なる目的はデオキシコール酸やグリココール酸等の胆汁酸、またはコレステロール等の疎水性作用剤（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｇｅｎｔ）あるいはアルカン酸とカップリングさせたヘパリンを含むヘパリン誘導体を提供することである。
【００１２】
これらのおよびその他の目的は疎水性作用剤が共有結合したポリサッカリドを含む複合物質（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）を提供することによって取り組むことができる。ポリサッカリドとして好ましいものはヘパリン、ヘパリンナトリウム、スルホン化ポリサッカリド、セルロース、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選ばれるものである。特に好ましいポリサッカリドはヘパリンである。このようなヘパリンは約２００ないし１００，０００の分子量を有するものが好ましい。本発明の好ましい実施態様において、疎水性作用剤としては胆汁酸、ステロールおよびアルカン酸からなる群より選ばれるものである。好ましい胆汁酸としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸（ｌａｇｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸およびそれらの混合物が挙げられる。好ましいステロールとしては、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびそれらの混合物が挙げられる。好ましいアルカン酸としては炭素数約４ないし２０個のアルカン酸、例えば酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、ポリサッカリドおよび疎水性作用剤は約１：１ないし１：１０００のモル比で存在する。
【００１３】
本発明のさらに他の一面は、製薬学上有効量の（ａ）疎水性作用剤が共有結合したポリサッカリドを含む複合物質、および（ｂ）製薬学上許容され得る担体、を含む医薬組成物を含む。製薬学上許容され得る担体は経口用薬物担体、持続放出担体、非経口投与用担体等であってもよい。好ましい持続放出担体としては、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（ε−カプロラクトン）コポリマー、ポリウレタンポリマー、シリコーンポリマー、エチレンビニルアセテートポリマー、ヒドロゲル、コラーゲン、ゼラチンおよびこれらの混合物等からなる群より選ばれるものを含む当技術分野によく知られているポリマーマトリックスが挙げられる。
【００１４】
本発明のさらに異なる一面は、疎水性作用剤が共有結合したヘパリンを含む複合物質と十分に混合したポリマーマトリックスを含む医薬組成物で医療用デバイスをコーティングすることを含む、血液と接触する医療用デバイスにおける血液凝固を抑制するための方法を含む。典型的には、医療用デバイスは当技術分野でよく知られているようなフィルムキャスティング技術を使用してコーティングされる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の両親媒性ポリサッカリド組成物、およびその製造および使用方法を開示し、記載する前に、本発明はその構成、工程段階および材料がある程度変形が可能であるため、本発明はここに開示されている特定の構成、工程段階および材料に限定されないものと理解すべきである。さらに本発明の範囲は添付の請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるべきものであるため、本明細書で使用した用語は特定の実施態様を説明する目的でのみ使用されるものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではないことを理解すべきである。
【００１６】
本発明の明細書および添付の請求の範囲で使用されるにあたり、他に明確なことわりがない限り、単数形である”ａ”、”ａｎ”や”ｔｈｅ”は複数の対象物を含むものであることに留意すべきである。すなわち、例えば“胆汁酸”への言及は２以上の胆汁酸類の混合物を包含し、“アルカン酸”への言及は１以上のアルカン酸類への言及を包含し、“ステロール”への言及は２以上のステロール類の混合物への言及を包含する。
【００１７】
本発明の明細書および請求の範囲で次の用語は下記で説明する定義に従って使用する。
【００１８】
本明細書で使用した“胆汁酸”とは、ステロイド、コラン酸の天然および合成の誘導体を意味し、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、イソウルソデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸およびそれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書で使用した“ステロール”とは、ステロイド類に構造的に関連したアルコール類を意味し、コレスタノール、コプロスタノール、コレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびそれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書で使用した“アルカン酸”とは、約４ないし２０個の炭素原子を有する飽和脂肪酸を意味する。アルカン酸の例としては、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびそれらの混合物等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本明細書で使用した“疎水性ヘパリン誘導体”および“両親媒性ヘパリン誘導体”は互換的に使用される。ヘパリンは極めて親水性の物質である。疎水性作用剤をヘパリンに結合させることにより、ヘパリンの疎水性を増加させると、本明細書でいう両親媒性ヘパリン誘導体もしくは疎水性ヘパリン誘導体が生成される。ヘパリン誘導体は天然ヘパリンに比べて疎水性が増加していて、該ヘパリン誘導体は親水性部分と疎水性部分とを有する、すなわち両親媒性であるので、どちらの用語も適当であると考えられる。
【００２２】
ヘパリンを抗血栓剤として使用し、血液凝固を防止することはよく知られている。ヘパリンは高密度の陰電荷がスルホン基およびカルボキシル基によって提供されるため、高度に親水性である。この親水性の為にヘパリンは普通静脈内あるいは皮下注射によって投与される。ここでは若干疎水性の性質あるいは両親媒性の性質を有し、また高い生物活性を有するヘパリン誘導体について記述する。胆汁酸、例えばデオキシコール酸（ＤＯＣＡ）；ステロール、例えばコレステロール；およびアルカン酸、例えばラウリン酸およびパルミチン酸等の疎水性作用剤をヘパリンとカップリングした。デオキシコール酸およびコレステロールは共に、体内で見出される天然由来の化合物であるため非毒性である。ヘパリンのアミン基を疎水性作用剤のカルボキシル基とカップリングした。ＤＯＣＡ、ラウリン酸およびパルミチン酸における末端カルボキシル基はカップリング反応に直接使用したが、一方、コレステロールのヒドロキシ基はカップリングに先立ちクロロ酢酸と反応させて活性化した。そのような疎水性部分をヘパリンのアミン基に結合させることがヘパリンの生物活性にほとんど影響を及ぼさないということがわかった。ヘパリンおよび疎水性作用剤の間のカップリングはＦＴ−ＩＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分析によってアミド結合を探知することによって確認した。
【００２３】
カップリング反応の収率は約７０ないし８０％であり、疎水性作用剤あるいは供給モル比（ｆｅｅｄ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）を変えても有意な変化はなかった。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の場合、供給比が増加するにつれ、結合体中のＤＯＣＡの量もまた増加した。ヘパリン−ＤＯＣＡ中のＤＯＣＡの重量％はヘパリンの供給モル比がＤＯＣＡに対して１：２００のとき、２４％であった。このモル比はＤＯＣＡに対するヘパリン中のアミン基の比率に比べ、極めて高いものであった。したがって、この供給比は過量のＤＯＣＡと推定される。
【００２４】
本発明の疎水性ヘパリン誘導体は多くの医学的用途を有する。例えば、疎水性ヘパリンは経口投与することができる。ヘパリンの経口投与は経口用抗凝固薬としてヘパリンの用途を大きく拡張することができる。このヘパリン誘導体は当技術分野によく知られている製薬学上許容され得る担体とともに製剤化される。さらに例をあげると、疎水性ヘパリン誘導体はカテーテル、心肺迂回サーキット（ｃｉｒｃｕｉｔ）、心肺酸素供給装置（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）、腎透析機器、再狭窄防止用ステントあるいはバルーンコーティング等の医療用デバイスのコーティング材料として使用することができる。疎水性ヘパリン誘導体は典型的には担体と混合し、続いて当技術分野でよく知られているようなフィルムキャスティング技術によって医療用デバイスの表面上にコーティングする。
【００２５】
改変後は、高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ：商品名）でフェニルセファロース（商品名）上のクロマトグラフィー（リン酸緩衝液よりは硫酸アンモニウム緩衝液で溶出する）によって示されるように、ヘパリン−疎水性作用剤は、疎水性媒質と疎水性相互作用を示す傾向があることもわかった。これらのヘパリン誘導体は改変していないヘパリンに比べると、結合親和性が増強していた。改変ヘパリン誘導体とフェニルセファロース（商品名）との相互作用の増加は、その増強された疎水性によるものであり、疎水性官能性基が存在する結果である。このような結果は、疎水性ヘパリンが、胆汁酸、ステロールあるいはアルカン酸をヘパリンに結合させることによって得られることを示唆している。溶解度試験において、極性溶媒あるいは有機溶媒がヘパリン−疎水性作用剤結合体を溶解するのに適切であった。例えばヘパリン−デオキシコール酸結合体は６５％アセトン溶液（３５％水）中に良く溶解した。最終的には、改変ヘパリン誘導体の生物活性は疎水性作用剤との結合によって余り影響を受けないことが確認された。ヘパリンに結合させた疎水性作用剤の役割を、抗凝固およびＸａ因子分析によって測定されるヘパリンの二つの生物活性について調べた。疎水性は、抗凝固活性および抗Ｘａ因子活性の減少をある程度伴うが、そのような生物活性の減少は深刻なものではなかった。これらの結果はヘパリンのアミン基の遮断がその生物活性にほとんど影響を及ぼさないことを示している。しかし、ヘパリン−疎水性作用剤結合体において、疎水性作用剤の量が２０重量％を超過した場合には、ヘパリンの生物活性は漸進的な減少を示した。該結合体中の疎水性作用剤の量が２０重量％より少ない場合、該結合体は、改変されていないヘパリンの生物活性の８０％を超える生物活性を有していた。疎水性ヘパリンにおける８０％という生物活性は、医薬的用途での生物活性を支持するに十分なものと示唆される。
【００２６】
実施例１
ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の合成
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＨＯＳｕ、９２ ｍｇ／５ ｍｌ）５ ｍｌをＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６５ ｍｇ／５ ｍｌ）５ ｍｌと混合した後、ＤＭＦ中のＤＯＣＡ （１９６ ｍｇ／５ ｍｌ）５ ｍｌを添加した。ＤＯＣＡ、ＨＯＳｕおよびＤＣＣのモル比は１：１．６：１．６であった。ＨＯＳｕおよびＤＣＣの濃度はＤＯＣＡのそれよりも若干高めでＤＯＣＡを完全に活性化した。得られた溶液を真空下、室温で５時間反応し、続いて反応中に沈澱した副産物であるジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を除去した。未反応のＤＣＣは蒸留水一滴を加え、濾過することによって除去した。さらに残留ＨＯＳｕは蒸留水１５ｍｌを加えて除去した。活性化されたＤＯＣＡを沈澱させ、続いて凍結乾燥した。続いて活性化されたＤＯＣＡをＤＭＦ中に溶解し、室温で４時間ヘパリンと反応させた。この反応で使用したヘパリンの量は４０ないし４００ｍｇの範囲であった。反応後、二つの形態の生成物、水溶性生成物および水不溶性生成物が存在した。これらの生成物は０．４５μｍメンブランフィルターを通す濾過によって分離し、水不溶性生成物は真空オーブン中で乾燥した。水溶性生成物はメンブラン（ＭＷＣＯ ３，５００）を使用し水に対して１時間透析し、続いてヘパリン−ＤＯＣＡをフリーズドライした。
【００２７】
この手順によって調製されたヘパリン誘導体について当技術分野でよく知られている方法に従いＦＴ−ＩＲおよびＮＭＲによって特徴づけを行い、ヘパリンと疎水性作用剤との間のカップリングがうまくいっていることを確認した。ヘパリン誘導体の証明はヘパリンのアミン基の、疎水性作用剤のカルボキシル基とのカップリングによって生じるアミド結合である。ＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１７４０−１５００ ｃｍ−１の範囲のスペクトルの間に有意な変化が認められた。１５８５ｃｍ−１に強いバンドが観察され、アミド振動（ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）に帰属された。これはヘパリンと疎水性作用剤との間のアミド結合の存在と係わりがある。ヘパリン誘導体のヘパリン部分でＮ−Ｈ基のピークは３５００および１６２０ｃｍ−１周囲でそれぞれ示された。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルはδ７．５８（アミン結合での炭素）、５．５（グルコサミン２，６−二硫酸のＨ−１）、δ５．３５（グルコサミン２−硫酸のＨ−１）、δ５．２（イズロン酸２−硫酸のＨ−１）で特徴的な吸収ピークを示した。ヘパリン−ＤＯＣＡおよびヘパリンを比較すると、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは１７８ ｐｐｍ（アミン結合での炭素）で相異するピークを示した。これらの結果はヘパリン−ＤＯＣＡ結合体においてアミド結合の存在を確認するものであり、ヘパリンのアミン基がＤＯＣＡのカルボキシル基へカップリングしていることを立証するものである。
【００２８】
実施例２
ヘパリン−コレステロール結合体の調製
遊離カルボキシル基を生じさせる為に、コレステロールのヒドロキシル基をクロロ酢酸と反応させることによって活性化した。この改変したコレステロールをＤＭＦ １０ｍｌ中でＨＯＳｕおよびＤＣＣと反応させた。コレステロール、ＨＯＳｕおよびＤＣＣのモル比は１：１．６：１．６であった。反応は室温で５時間行った。未反応のＤＣＣおよびＨＯＳｕを除去するため、水を加え、該溶液を０．４５μｍメンブランで濾過した。次に活性化したコレステロールをヘパリン溶液と４時間反応させた。二つの生成物、水溶性生成物および水不溶性生成物を該反応から得た。これらの生成物を上記実施例１で記述した手順に従って処理した。
【００２９】
実施例３
ヘパリン−アルカン酸結合体の合成
ラウリン酸およびパルミチン酸を実施例１の手順に従ってヘパリンにカップリングした。アルカン酸のカルボキシル基をヘパリンのアミン基にカップリングし、アミド結合を形成させた。カップリング剤は同様にＨＯＳｕおよびＤＣＣであった。
【００３０】
ヘパリン−ＤＯＣＡ、ヘパリン−コレステロール、ヘパリン−アルカン酸について、生成収率、分子量およびヘパリンと疎水性作用剤間の結合モル比は反応物のモル比によって種々であった。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の収率は７１ないし７７％の範囲であった。ヘパリンのモル重量は光散乱（ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって１２，３８６ダルトンと測定された。改変ヘパリン誘導体における疎水性作用剤の量はヘパリンの分子量を各ヘパリン誘導体の測定分子量から差し引いて算出した。ヘパリンに対するデオキシコール酸の供給モル比を１：６から１：２００に増加させることにより、ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体中のＤＯＣＡの量は７から２４％に増加した。ヘパリン−コレステロール結合体についてもまた収率は７３ないし７８％の範囲であった。しかし、このような疎水性ヘパリン結合体におけるコレステロールの量は、ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体におけるＤＯＣＡの量よりわずかに少なかった。ヘパリン−ラウリン酸およびヘパリン−パルミチン酸結合体において、同様の量のアルカン酸がヘパリンにカップリングした。
【００３１】
実施例４
ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の溶解度試験
ヘパリンは水やホルムアミド等の割合少数の溶媒にしか溶解することができない。本発明のヘパリン誘導体はわずかに疎水性を有するため、このような誘導体は追加の溶媒にも可溶性であるものと期待された。本実施例では、このことを、溶媒としてのアセトンと水との混合物中で溶解度を評価することによって調べた。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の場合において、ＤＯＣＡの重量％が増加するにつれ、溶媒中の結合体の溶解度が増加した。ＤＯＣＡが１４重量％の場合、ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体は５０：５０アセトン−水に溶解したが、この結合体は７０：３０アセトン−水には溶解しなかった。２４重量％ＤＯＣＡの場合、溶媒中のヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の溶解度は溶媒のアセトン含量が増加するにつれて増加した。溶媒中のヘパリン−ＤＯＣＡ（２４％）結合体の溶解度はアセトンと水の体積比が５０：５０の時に最大となった。
【００３２】
実施例５
４℃でのフェニル−セファロースＣＬ−４Ｂゲル上のヘパリンの分離に対する分析  フェニル−セファロース（商品名）ＣＬ−４Ｂを、ヘパリン−ＤＯＣＡ、ヘパリン−コレステロール、およびヘパリン−アルカン酸から未反応のヘパリンを除去する為に使用した。これはさらに、カップリングされたヘパリン誘導体における疎水性の程度を評価するのに有用であった。牛の肺より調製された市販のヘパリンナトリウム（抗凝固活性、ｍｇ当たり１４０ ＵＳＰ）をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｈｅｐａｒ Ｃｏ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｏｈｉｏ）から入手した。フェニルセファロースＣＬ−４ＢゲルカラムをＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｗｅｄｅｎ）より入手した。カラム（ＨＲ １６／３０ Ｉ．Ｄ．）を１０容量の水で洗浄し、続いて少なくとも４０ ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で２０分間、次いで１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４０ ｍｌ、次いで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）４０ ｍｌで洗浄することにより使用前に平衡化した。同じリン酸緩衝液（５ｍｌ）中のヘパリン（５ｍｇ）および疎水性ヘパリン（５ｍｇ）の溶液をカラムに付し、それぞれ勾配溶媒で溶出した。流速は１ ｍｌ／ｍｉｎ．で、各２−ｍｌ分画を分画回収機によって回収した。カラム上の溶出後、カラムを水１００ ｍｌおよび１．７Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄して残ったヘパリンあるいはヘパリン−ＤＯＣＡ結合体を全て除去し、回収された分画をアズール  Ａ（Ａｚｕｒｅ Ａ、濃度：０．０１ ｍｇ／ｍｌ）と１分間混合した。ヘパリンあるいは疎水性ヘパリンを含む各分画をＶａｒｉａｎ ＣＡＲＹ １Ｅ ＵＶ／ＶＩＳ分光計で５００ ｎｍでの吸光度を分光光度的にモニタリングすることにより定量化した。
【００３３】
ヘパリンおよびＤＯＣＡの間の相異するカップリング比についてＦＰＬＣにおけるヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の溶出曲線の変化を観察した。ヘパリンは溶出剤としてＰＢＳで溶出されたが、極めて親水性であるため硫酸アンモニウムでは溶出されなかった。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体はＰＢＳでは溶出されなかったが硫酸アンモニウム溶液では溶出された。溶出剤中の硫酸アンモニウムの濃度が増加するにつれ、溶出されたヘパリン結合体の疎水性も増加した。ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体はＤＯＣＡの量を増加しても１．３Ｍ硫酸アンモニウム溶液で完全に溶解した。
【００３４】
実施例６
ヘパリン誘導体の生物活性
改変ヘパリン誘導体の抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）とＸａ因子色素原分析（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）法によってそれぞれ測定した。ヘパリン誘導体の抗血栓活性はそれぞれＦＸａ色素原分析およびＡＰＴＴによって測定した（図１）。これらの実験で使用したヘパリンの生物活性はｍｇ当たり１４０ ｕｎｉｔｓの能力を有していた。本研究で製造したすべてのヘパリン誘導体の生物活性は改変していないヘパリンの生物活性に比べ、７０％を超えるものであった。結合体の製造に使用した疎水性作用剤に関しては結合体の生物活性について差はなかった。しかしながらヘパリン誘導体の生物活性は、結合体中の疎水性作用剤の量を増加させるにつれ、若干減少した。７重量％のＤＯＣＡを含有する結合体を試験した場合、ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の相対的生物活性はＡＰＴＴ分析によれば９３％、ＦＸａ分析によれば８０％であった。対照的に、２４重量％ＤＯＣＡを含有する結合体を試験した場合には、そのようなヘパリン−ＤＯＣＡ結合体の相対的生物活性は７１．５％（ＡＰＴＴ）および７０．１％（ＦＸａ分析）にまで減少した。
【００３５】
実施例７
ヘパリン経口送達
韓国動物センターの動物飼育施設で飼育した６ラットを投薬前１２時間絶食させた。体重が２５０−３００ｇであるラットの群にヘパリン、高分子量ヘパリン−ＤＯＣＡあるいは低分子量ヘパリン−ＤＯＣＡの単回経口投与量を投与した。血液試料（０．５ｍｌ）を３．８％クエン酸ナトリウムを混合したヘパリン被覆毛細管によって順次採取した。試料をヘパリンあるいはヘパリン誘導体を投与する前および投与後毎時間隔で１０時間後まで採取した。血漿を遠心分離によって集め、−２０℃よりも低い温度で凍結した。各試料で血漿ヘパリン活性をＡＰＴＴ分析によって測定した。ＡＰＴＴバイオアッセイは実施例６の手順に従って行った。血漿ＡＰＴＴ単位はフィブロメータによって測定される凝固時間から決定した。
【００３６】
低分子量ヘパリン−ＤＯＣＡの場合（図２）、最大凝固時間は経口投与して４時間後にみられた。凝固時間は、１０時間後にはベースラインに復帰した。高分子量ヘパリン−ＤＯＣＡの場合（図３）は、最大凝固時間は経口投与して８時間後にみられた。凝固時間は、１０時間後でも２０分よりも長い間維持された。高分子量ヘパリン−ＤＯＣＡは低分子量ヘパリン−ＤＯＣＡに比べてより高い抗凝固活性を有していた。
【００３７】
実施例８
ヘパリン誘導体のインビトロでの放出率
まずポリエチレンディスク（２．２２ｃｍ直径）上で誘導体化されたヘパリンをＰＥＯ／ＰＣＬマルチブロックコポリマーにキャスティングすることにより、インビトロの試験を行った。ＰＥＯ／ＰＣＬはポリ（エチレンオキシド）（分子量約２，０００）とポリ（ε−カプロラクトン）（分子量約２，０００）との交互ブロックで構成されたマルチブロックコポリマーであり、該コポリマー全体の分子量は約３０，０００である。ヘパリン誘導体を該ポリマーと混合してアセトン／水中に溶解し、ポリエチレンディスク上にキャスティングし、続いて溶媒を蒸発させた。続いてディスクの下面を５０−ｍｌバイアルの底部に付けた。それぞれのディスクをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．４、Ｉ＝０．１５）２０ ｍｌ中に浸漬させ、３７℃、８０ ｒｐｍの振盪水槽（Ｈａｎ Ｂａｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｋｏｒｅａ）中に無作為に割当てた位置に置いた。指定時間（放出された培地中のヘパリン誘導体濃度が３７℃でのその飽和溶解度の１０％を超過しないように決定される）に、試料を取り出し、アズール Ａと混合した後、ＵＶ分光学（５３０ｎｍ）によって薬物含量を分析した。それぞれの試料採取時間毎に全放出培地を除去し、新鮮な予め温めておいたＰＢＳ緩衝液に代替した。放出研究に続いて、ＰＥＯ／ＰＣＬマルチブロックコポリマーフィルム中のヘパリン誘導体の初期量を、４０日間に亘って放出された累積量と４０日間でディスクに残っている量とを合計することによって算出した。これを薬物負荷から算出される初期量と比較した。放出されたヘパリン誘導体の累積量を時間に対してプロットし、放出されたパーセンテージを、繰り返し測定の分散分析によって行う統計的比較に使用した。
【００３８】
ヘパリン誘導体は、小さいバースト効果を有する殆ど制御された放出率でポリマーマトリックスから放出された。このバースト効果は１時間以内に表われ、バーストで放出された量は投入量の約１０％であった（図４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡＰＴＴ分析（クローズドシンボル）および色素原分析（オープンシンボル）分析によって測定した疎水性ヘパリンの生物活性を示している：■および□はデオキシコール酸（ＤＯＣＡ）；●および○はコレステロール；▼および▽はパルミチン酸；▲および△はラウリン酸を示す。
【図２】図２は、低分子量ヘパリン−ＤＯＣＡを経口投与した場合の凝固時間を時間の関数で示している。
【図３】図３は、高分子量ヘパリンＤＯＣＡ−を経口投与した場合の凝固時間を時間の関数で示している。
【図４】図４は、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ＰＣＬ）ポリマーマトリックスからの累積ヘパリン−ＤＯＣＡ結合体放出を、時間の関数で示している；ポリマーマトリックスにおける、ヘパリン−ＤＯＣＡの重量％：（▽）、５％ＤＯＣＡ；（○）、１０％ＤＯＣＡ；（△）、２０％ＤＯＣＡ；（□）、３０％ＤＯＣＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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