(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロストリス(Caerostris)属のクモの毒腺を含水有機溶媒で抽出した上清を、逆相クロマトグラフィーで精製して得ることができ、次の一般式（１）：
H-A1-A2-NH-(CH2)5-NH-X .......（１）
〔式中、Ａ1 はＰｈｅ残基，Ｔｒｐ残基，Ｔｙｒ残基，Ｉｌｅ残基，Ｌｅｕ残基またはＶａｌ残基を示し、Ａ2 はＡｓｎ残基またはＧｌｕ残基を示し，Ｘは次の一般式（２）：
H-A3-NH-(CH2)m-NH-(CH2)p-CH(NH-Y)-CO- .......（２）
｛式中、Ａ3 はＡｒｇ残基，Ｌｙｓ残基またはＯｒｎ残基を示し、ｍおよびｐは独立して２から５までの整数を示し、Ｙは水素原子またはヒドロキシメチル基を示す。｝で示される基または次の一般式（３）：
H-A3-NH-CH｛(CH2)q-Z｝-CO- .......（３）
｛式中、Ａ3 は前記と同じものを示し、ｑは２から５までの整数を示し、Ｚはアミノ基、グアニジノ基または次の一般式（４）：
-NH-(CH2)r-NH2  ....... （４）
（式中、ｒは２から５までの整数を示す。）で示される基を示す。｝で示される基を示す。〕で表される、カダベリンとその両側に結合した２個ずつのアミノ酸残基からなる分子構造を有する、グルタミン酸レセプター遮断作用を有する化合物またはその塩。
【請求項２】
次の式（５）：
【化１】
0003579438.tif 000005
で表される、請求項１の式（１）において、Ａ1 がＰｈｅ残基、Ａ2 がＡｓｎ残基であり、Ｘは一般式（２）で表され、Ａ3 はＡｒｇ残基、ｍ＝３、ｐ＝４、Ｙはヒドロキシメチル基である化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なグルタミン酸拮抗物質に関し、さらに詳細にはマダガスカル産クモの毒腺より分泌される、グルタミン酸拮抗物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、昆虫等の節足動物の神経をマヒさせるクモ類の毒素に関する研究から、種々の化合物が単離され、ある程度その構造が解明されるとともに、その神経マヒ作用がグルタミン酸レセプター阻害作用に基づくものであることが確認されている。
【０００３】
グルタミン酸は、哺乳類の脳、脊髄等の中枢神経系および昆虫類、甲殻類の神経接合部において、そのレセプターを介して興奮性神経伝達物質として機能していると考えられている。一方、グルタミン酸が過剰に存在すると、神経細胞の過剰興奮をもたらし、神経細胞が死滅することも知られている。この現象は、海馬において、心停止、脳血栓等による脳虚血時に認められ、神経細胞の死滅は、記憶、空間的認知に係わる海馬に著しく大きな影響を及ぼす。従って、グルタミン酸に起因する脳神経疾患に対してグルタミン酸レセプターを一時的に遮断することは治療上有益であると考えられている。
【０００４】
このような観点から、クモ類の毒素は、そのグルタミン酸レセプター阻害作用に注目して研究されており、本発明者等も種々の化合物を報告している（特開平１−２９４７３４号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらのクモ類の毒素とグルタミン酸レセプター阻害作用との関連性を解明し、医薬等に応用するためには、さらに多くのクモ類の毒素を精製・単離する必要があり、実用化のためにはそれらが合成可能な化合物であることが望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、これらの点に鑑み、マダガスカルで採取したセロストリス（Ｃａｅｒｏｓｔｒｉｓ）属の毒グモの毒腺抽出物から、イセエビ歩脚の神経シナプスを用いる神経伝達遮断活性を指標に、セロストリストキシン類と命名した数種の毒素を単離し、その構造が、一般式（１）
Ｈ−Ａ１−Ａ２−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−Ｘ  ．．．．．．．（１）
〔式中、Ａ１  はＰｈｅ残基，Ｔｒｐ残基，Ｔｙｒ残基，Ｉｌｅ残基，Ｌｅｕ残基またはＶａｌ残基を示し、Ａ２  はＡｓｎ残基またはＧｌｕ残基を示し，Ｘは次の一般式（２）：
0003579438.tif 000002
｛式中、Ａ３  はＡｒｇ残基，Ｌｙｓ残基またはＯｒｎ残基を示し、ｍおよびｐは独立して２から５までの整数を示し、Ｙは水素原子またはヒドロキシメチル基を示す。｝で示される基または次の一般式（３）：
Ｈ−Ａ３−ＮＨ−ＣＨ｛（ＣＨ２）ｑ−Ｚ｝−ＣＯ−  ．．．．．．．（３）
｛式中、Ａ３  は前記と同じものを示し、ｑは２から５までの整数を示し、Ｚはアミノ基、グアニジノ基または次の一般式（４）：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２    ．．．．．．．（４）
（式中、ｒは２から５までの整数を示す。）で示される基を示す。｝で示される基を示す。〕で示される新規化合物であり、これらの化合物がグルタミン酸拮抗作用を示すことを見い出して、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は前記一般式（１）で表される、セロストリストキシン類と命名した新規化合物またはその塩を、グルタミン酸拮抗物質として提供する。
【０００８】
本発明のセロストリストキシン類を得るには、該物質を含むと思われる原料、例えばセロストリス属クモの毒腺から、以下の方法により単離・精製することができる。例えばＣａｅｒｏｓｔｒｉｓ  ｅｘｔｒｕｓａ，  Ｃ．  ｍｉｔｒａｒｉｓ，  Ｃ．  ｓｅｘｃｕｓｐｉｄａｔａ等のセロストリス属クモの毒腺を含水有機溶媒中でホモジナイズし、得られたホモジネートを遠心分離して得られる上清を逆相クロマトグラフィーに付し、必要なら最終的に２１５ｎｍの紫外吸収モニターで単一のピークを示すまで、このクロマトグラフィーを繰り返しもくしは他の適当な精製手段を用いて精製することにより、目的とする化合物を単離・精製すれば良い。
【０００９】
この精製工程中、ホモジナイズに用いる含水有機溶媒とは、水と混ざり合う有機溶媒と水との混合物を意味し、本発明の化合物を抽出し得るものであれば特に限定されないが、例えば含水アセトン、含水アセトニトリル等が例示できる。また、得られた上清を直接逆相クロマトグラフィーに付す場合には、これらの含水有機溶媒に０．０１〜１％程度のトリフロロ酢酸（以下ＴＦＡと略す）を添加することが望ましい。ＴＦＡの存在は、酸性下での抽出を可能とし、また、抽出液をそのまま逆相クロマトグラフィーにかけることを可能とする。
【００１０】
また、本発明のセロストリストキシン類は、カダベリン（１，５−ジアミノペンタン）の両端のアミノ基に、α−アミノ酸残基がＣ末端から２個づつぺプチド結合した構造を有するため、５−アミノペンタンニトリルの５−アミノ基に、常法により該当するアミノ酸残基を導入し、次いでシアノ基の還元により得られる１−アミノ基に、同様にして該当するアミノ酸残基を導入する方法で合成することもできる。
【００１１】
本発明のセロストリストキシン類は、慣用技術により適当な酸付加塩に変換することができる。好ましい酸付加塩は、医薬として適当な酸との反応により得られ、例えば乳酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、桂皮酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等、あるいはリン酸塩、リン酸水素塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩および硫酸水素塩等が挙げられる。
【００１２】
本発明のグルタミン酸拮抗物質の生物活性は、特開平４−１９８１６１号公報の記載にしたがい、イセエビ歩脚の神経筋標本に対して、興奮性後シナプス電位（ＥＰＳＰ）を発生させ、神経繊維に投与した化合物がＥＰＳＰに与える影響を測定することにより検定することができる。
【００１３】
【作用】
本発明のセロストリストキシン類は、後述の実施例に示すように、上記の検定法において著しいＥＰＳＰ抑制効果、即ちグルタミン酸レセプター遮断効果を示す。従って、神経疾患、特にハンチントン病、癲癇、パーキンソン氏病および老人性痴呆の様な神経障害の治療に際してグルタミン酸レセプターを一時的に遮断する作用機能を有する治療薬として有用である。さらに、これら神経疾患の神経科学研究のツールとしても有用である。
【００１４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１．セロストリストキシン類の単離
マダガスカル産のセロストリス属毒グモ（Ｃａｅｒｏｓｔｒｉｓ  ｅｘｔｒｕｓａ，  Ｃ．  ｍｉｔｒａｒｉｓ，  Ｃ．  ｓｅｘｃｕｓｐｉｄａｔａ）  の毒腺混合物（凍結乾燥品）５０個分を、０．１％トリフロロ酢酸（以下ＴＦＡと略す）を含む６０％アセトニトリル１００μｌ中でホモジナイズし、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をＯＤＳ８０−ＴＭ（東ソー製・φ４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いる逆相クロマトグラフィーに付し、４０℃で、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ中、６０分でアセトトリル５％から６０％の直線濃度勾配により溶出した。
【００１６】
溶出液は２１５ｎｍのＵＶ吸収でモニターし、イセエビ歩脚の神経接合部を用いるバイオアッセイを行うと、活性は図１に示すクロマトグラムにおいて、保持時間１２〜２０分に観察される７本のピークに合致して認められた。これらのピークに対応する毒素をそれぞれセロストリストキシン１〜７と命名した。これらのうち、保持時間１６分に相当する６番目のピークを分取し、同一条件で単一ピークを示すまでクロマトを繰り返すことによりセロストリストキシン６を精製した。
【００１７】
実施例２．セロストリストキシン類の構造決定
得られたセロストリストキシン６の構造決定は、アミノ酸分析、アミノ酸配列分析、ＮＭＲおよびＭＳ分析により行った。先ず、セロストリストキシン６を常法に従って、５．７Ｎ塩酸中、１１０℃、２４時間加水分解し、これをアミノ酸自動分析器（東ソー製・８０３Ｃ型）で分析したところ、それぞれ１モルのフェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、カダベリンおよびε−アミノプロピルリジンが得られた。また、自動アミノ酸配列解析器（アプライドバイオシステム製・４７６Ａ型）でアミノ酸配列を分析したところ、１サイクル目にフェニルアラニンとアルギニンが、２サイクル目にアスパラギンとε−アミノプロピルリジンが得られた。さらに、分子量を質量分析計（ＪＥＯＬ製、ＬＤＩ−１７００型  ＭＡＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳ）で測定したところ、〔Ｍ＋Ｈ〕＋  として、ｍ／ｚ＝７３５であった。また、ＪＥＯＬ製・ＪＸ４００型核磁気共鳴測定装置で測定した２Ｄ−ＮＭＲは、図２に示すデータが得られた。
【００１８】
これらのデータから、セロストリストキシン６の構造を、式（５）：
【化２】
0003579438.tif 000003
と同定した。この構造は、一般式（１）において、Ａ１  がＰｈｅ残基、Ａ２  がＡｓｎ残基であり、Ｘは一般式（２）で表され、Ａ３  はＡｒｇ残基、ｍ＝３、ｐ＝４、Ｙはヒドロキシメチル基である場合に相当する。
【００１９】
また、セロストリストキシン１〜５および７も、それらの塩酸加水分解物のアミノ酸分析で、カダベリンおよび等モルの４個のアミノ酸を与えることおよび、それらのスペクトルデータから、一般式（１）：
Ｈ−Ａ１−Ａ２−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−Ｘ  ．．．．．．．（１）
〔式中、Ａ１  はＰｈｅ残基，Ｔｒｐ残基，Ｔｙｒ残基，Ｉｌｅ残基，Ｌｅｕ残基またはＶａｌ残基を示し、Ａ２  はＡｓｎ残基またはＧｌｕ残基を示し，Ｘは次の一般式（２）：
0003579438.tif 000004
｛式中、Ａ３  はＡｒｇ残基，Ｌｙｓ残基またはＯｒｎ残基を示し、ｍおよびｐは独立して２から５までの整数を示し、Ｙは水素原子またはヒドロキシメチル基を示す。｝で示される基または次の一般式（３）：
Ｈ−Ａ３−ＮＨ−ＣＨ｛（ＣＨ２）ｑ−Ｚ｝−ＣＯ−  ．．．．．．．（３）
｛式中、Ａ３  は前記と同じものを示し、ｑは２から５までの整数を示し、Ｚはアミノ基、グアニジノ基または次の一般式（４）：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２    ．．．．．．．（４）
（式中、ｒは２から５までの整数を示す。）で示される基を示す。｝で示される基を示す。〕で表される化合物であると推定された。
【００２０】
実施例３．セロストリストキシンのグルタミン酸拮抗作用の測定
セロストリストキシンのグルタミン酸拮抗作用の測定は、特開平４−１９８１６１号公報記載の方法で行った。即ち、イセエビ歩脚の殻を外して興奮性神経と抑制性神経を露出させ、これに刺激電極を装着した。次いで神経−筋接合部を露出させ、記録電極を装着した。電極を装着した歩脚は、人工海水を充たした容器に移し、刺激電極部分と記録電極部分との間に仕切りを設けた。グルタミン酸拮抗作用を測定すべき試料をこの記録電極側（即ち、神経−筋接合部を含む側）チャンバーの人工海水に溶解した。
【００２１】
次いで、興奮性神経を電気刺激し、刺激に応じて神経末端から放出されるグルタミン酸により惹起される興奮性後シナプス電位（ＥＰＳＰ）を記録した。
【００２２】
この方法に従って、各セロストリストキシンの１×１０−５Ｍ溶液１０μｌを、記録電極側のチャンバーに添加して、ＥＰＳＰに与える影響を調べたところ、セロストリストキシン１〜７はいずれもこの濃度でＥＰＳＰを抑制することが判明した。単一ピークを示すまで精製したセロストリストキシン６はこの濃度でＥＰＳＰを５３％抑制した。これらの結果は、セロストリストキシンがグルタミン酸レセプター遮断作用を有することを示している。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、新規グルタミン酸拮抗物質であるセロストリストキシン類が提供された。本物質は、節足動物の、神経／筋接合部の後シナプス性グルタミン酸レセプターイオンチャンネルに作用する。従来知られている多種のクモ毒由来のグルタミン酸レセプター阻害物質は、２，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、インドール酢酸、ナフチル酢酸あるいは４−ヒドロキシ酢酸等に、１ないしは２個のアミノ酸と、スペルミン、スペルミジン、プトレアニン等の多価ポリアミンが結合した構造を有する化合物であり、本発明の化合物のように、４個のα−アミノ酸とジアミンとからなる化合物は知られていない。
【００２４】
本発明の化合物は、適当な担体を用いて製剤化することにより、医薬品または農薬として使用することができる。また、本発明の化合物は、神経科学研究のツールとして、特にハンチントン病、癲癇、パーキンソン氏病および老人性痴呆の様な神経障害の治療法や研究手段を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】セロストリストキシン類の単離のための、ＯＤＳ８０−ＴＭ逆相クロマトグラフィーを示すチャート図である。
【図２】セロストリストキシン６の構造決定のための、二次元ＮＭＲの結果を示すチャート図である。
【図１】
0003579438.tif 000006
【図２】
0003579438.tif 000007