(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真球度が式（１）を満足する表面スリ加工ガラスビーズの少なくとも３０個からなり、平均ビーズ直径（Ａｍ）が０．１〜２０ｍｍであり、平均ビーズ直径（Ａｍ）の分散度（Ｓ2）が０．０２以下であるガラスビーズ群からなることを特徴とする免疫測定用担体。
【数１】
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  ２                    （１）
式中、Ａｉは最大ビーズ直径、Ａｊは最小ビーズ直径を示し、Ａｍは平均ビーズ直径を示す。
【請求項２】
請求項１記載の担体を用いてなる免疫測定キット。
【請求項３】
請求項１記載の担体を用いるヘテロジニアス免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫測定用担体に関する。さらに詳しくは、測定対象物質を再現精度良く測定することができる免疫測定用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫測定において、不溶性担体に特異的結合物質を結合させる固定化方法、例えば、担体に特異的結合物質を物理吸着によって固定化する方法（物理吸着法）や、担体表面と特異的結合物質とに官能基を導入して、これらを化学反応させて、担体表面と特異的結合物質とを結合させる方法（化学結合法）が知られており、不溶性担体としては、合成樹脂、無機物、多糖類等からなるシート、フィルム、粒状物等が知られている（例えば、石川栄治ら著「酵素免疫測定法」、医学書院（株）１９８７年発行）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来の不溶性担体を用いる物理吸着法では、特異的結合物質の固定化量にばらつきが生じることが多く、免疫測定の精度に大きく影響を与える。
また、従来の不溶性担体を用いる化学結合法では、官能基の導入によって非特異反応が増大したり、特異的結合物質の固定化量にばらつきが生じやすくなり、免疫測定の精度に大きく影響を与える。
すなわち、従来の担体では、物理吸着法、化学結合法のいずれの方法でも特異的結合物質の固定化量にばらつきが生じやすく、高い精度を発現できないという問題点がある。また、免疫測定試薬の精度や再現性は、製造ロットにより微妙に異なり、品質管理の上で大きな問題となっている。
すなわち、本発明は、測定再現精度の高い免疫測定用担体を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意検討した結果、特定の担体が免疫測定精度及び再現精度に優れていることを見いだし、本発明に到達した。すなわち、本発明の免疫測定用担体の特徴は、真球度が式（１）を満足する表面スリ加工ガラスビーズの少なくとも３０個からなり、平均ビーズ直径（Ａｍ）が０．１〜２０ｍｍであり、平均ビーズ直径（Ａｍ）の分散度（Ｓ2）が０．０２以下であるガラスビーズ群からなる点である。
【数２】
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  ２                    （１）
式中、Ａｉは最大ビーズ直径、Ａｊは最小ビーズ直径を示し、Ａｍは平均ビーズ直径を示す。
【０００５】
本願発明のガラスビーズは、式（２）を満足するものが好ましく、さらに好ましくは式（３）、特に好ましくは式（４）、さらに特に好ましくは式（５）、最も好ましくは式（６）を満足するものである。
【数３】
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  １．７                （２）
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  １．５                （３）
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  １．３                （４）
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  ０．９                （５）
１００×（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｍ  ≦  ０．７５              （６）
【０００６】
Ａｉ、Ａｊ及びＡｍは、１個のビーズについて、少なくとも９ケ所のビーズ直径を測定し、そのうち最大値を最大ビーズ直径（Ａｉ）とし、最小値を最小ビーズ直径（Ａｊ）とする。また、少なくとも９カ所のビーズ直径の和を測定個所で除した値を平均ビーズ直径（Ａｍ）とする。
ビーズ直径の測定個所は、少なくとも９カ所であればよいが、異なる箇所を少なくとも９カ所測定するのが好ましい、さらに好ましくは異なる箇所を９〜１８カ所測定することであり、特に好ましくは以下に例示した異なるカ所を９カ所測定することである。異なる箇所としては、例えば、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所等が挙げられる。すなわち、１個のビーズの中心を通るＸ軸と、Ｘ軸とビーズの中心で直交するＹ軸とを含む平面ＸＹにおいて、Ｘ軸についてのビーズ直径ａ、Ｙ軸についてのビーズ直径ｂ、Ｘ軸及びＹ軸と４５度でビーズの中心で交わる２つの軸についてのビーズ直径ｃ及びｄについて測定する。
【０００７】
そして、平面ＸＹとビーズの中心で直交する平面ＸＺにおいて、Ｚ軸についてのビーズ直径ｅ、Ｘ軸及びＺ軸と４５度でビーズの中心で交わる２つの軸についてのビーズ直径ｆ及びｇについて測定する。
そして、平面ＸＹ及び平面ＸＺとビーズの中心で直交する平面ＹＺにおいて、Ｚ軸及びＹ軸と４５度でビーズの中心で交わる２つの軸についてのビーズ直径ｈ及びｉについて測定する。
なお、ビーズ直径は、少なくともビーズ直径の１／１００の精度で測定する。
また、ビーズ直径の測定は、マイクロメーター（テクロック社製及びミツトヨ社等）やデジタルパッサメーター（ユニオンツール社製等）を用いて行うことができる。またこの他、画像処理等で計測してもよい。
【０００８】
ガラスビーズ群における平均ビーズ直径（Ａｍ）の分散度（Ｓ２）は、通常０．０２以下であり、好ましくは０．０１７以下、さらに好ましくは０．０１５以下、特に好ましくは０．０１０以下、最も好ましくは０．００９以下である。分散度（Ｓ２）は、ビーズを統計学に基づいて無作為抽出し、測定した結果（平均ビーズ直径（Ａｍ））を母集団（ガラスビーズ群）の結果とみなして、以下の式で求めるものである。
【数４】
Ｓ２＝Σ（Ａｍ−Ａｎ）２／ｎ              （７）
式中、ｎはガラスビーズ群から無作為に抽出したビーズ数、Ａｍは抽出した各ビーズそれぞれの平均ビーズ直径、Ａｎは平均ビーズ直径（Ａｍ）の無作為に抽出したガラスビーズ群における平均値を示す。
ただし、抽出に必要なビーズ数は、母集団に関係無く、標本が近似的に正規分布をとる個数であればよく、通常少なくとも３０個であり、好ましくは３０〜１０６個、さらに好ましくは４０〜１０００個、特に好ましくは５０〜１００個である。
【０００９】
本発明のガラスビーズは、表面スリ加工されたものであり、通常市場から入手しうるガラスビーズは表面が滑面であるので表面スリ加工（表面の艶消し加工）を実施した後、本発明に使用する。
スリ加工は、ガラスビーズの表面積を大きくし、ビーズ表面の物性を均一にするために行われるものである。
従って、ビーズ直径はスリ加工によって減少するので、入手するガラスビーズ（滑表面）は、スリ加工による減少分を考慮する必要がある。
また、スリ加工により、真球度又は平均ビーズ直径（Ａｍ）の分散度（Ｓ２）は低下する傾向にあるので、入手するガラスビーズ（滑表面）の真球度及び平均ビーズ直径の分散度は、本発明の担体と同じか、これよりもさらに好ましい範囲であることが好ましい。
【００１０】
スリ加工は従来公知の方法等が適用でき、例えば、化学大辞典（共立出版株式会社、１９８９年刊行）第５巻９９９頁記載の物理的方法及び化学的方法等が挙げられる。これらのうち、物理的方法が好ましく、さらに好ましくは加圧空気による砂吹き付け（サンドブラスト）法及び砂掛け磨き（ブラシを水で湿して磨く）法、特に好ましくはサンドブラスト法である。
【００１１】
本発明のガラスビーズの形状は、球状であり、その平均ビーズ直径（Ａｍ）は、０．１〜２０ｍｍが好ましく、さら好ましくは１〜１０ｍｍ、特に好ましくは２〜７ｍｍである。
本発明のガラスビーズの材質としては、ガラスであれば特に制限なく使用できるが、例えば、酸化物ガラス（ケイ酸塩ガラス、リン酸塩ガラス及びホウ酸塩ガラス等）等が挙げられる。
これらのうち、酸化物ガラスが好ましく、さらに好ましくはケイ酸塩ガラスであり、特に好ましくはケイ酸ガラス（主要成分：ＳｉＯ２）、ケイ酸アルカリガラス（主要成分：Ｎａ２Ｏ−ＳｉＯ２）、ソーダ石灰ガラス（主要成分：Ｎａ２Ｏ−ＣａＯ−ＳｉＯ２）、カリ石灰ガラス（主要成分：Ｋ２Ｏ−ＣａＯ−ＳｉＯ２）、鉛（アルカリ）ガラス（主要成分：Ｋ２Ｏ−ＰｂＯ−ＳｉＯ２）、バリウムガラス（主要成分：ＢａＯ−ＳｉＯ２−Ｂ２Ｏ３）及びホウケイ酸ガラス（主要成分：Ｎａ２Ｏ−Ｂ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、最も好ましくはソーダ石灰ガラス及びホウケイ酸ガラスである。
ガラスビーズ（滑表面）は、例えば、株式会社岡部製作所及びウィンステッド  プレシジョン  ボール  カンパニー（ＷＩＮＳＴＥＤ  ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＢＡＬＬ  ＣＯＭＰＡＮＹ）等から入手できる。
【００１２】
本発明の担体は、免疫測定用の担体としてヘテロジニアス免疫測定に好適である。
ヘテロジニアス免疫測定において、免疫測定用担体には、通常、測定対象物（ｂ）に特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質（ａ）という。）が結合されている。
特異的結合物質（ａ）は、測定対象物（ｂ）に特異的に結合する物質であり、ヘテロジニアスな免疫測定で用いられるものであれば、いずれも使用でき、例えば、測定対象物（ｂ）が抗原の場合、該抗原に対する抗体であり、（ｂ）が抗体の場合該抗体が認識する抗原、（ｂ）が糖鎖の場合レクチン、（ｂ）がビオチンの場合アビジン、（ｂ）が遺伝子の場合相補的な遺伝子である。
特異的結合物質（ａ）は、抗原及び抗体の場合と同様に、測定対象物（ｂ）及び（ｂ）に特異的に結合する物質のうち、その一方を特異的結合物質（ａ）として使用できる。また、（ｂ）に特異的に結合する物質（ａ１）と、該物質（ａ１）に特異的に結合する物質（ａ２）とを組み合わせて特異的結合物質（ａ）として用いることもできる。
【００１３】
抗体としては、例えば、次の抗原に対する抗体等が挙げられる。
（１）タンパク質関連物質：ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、ＣＡ５０、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＳＣＣ，ＫＭＯ１、ＮＳＥ、ＩｇＥ、特異ＩｇＥ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＩＡＰ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、ＣＲＰ、α２−ＭＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ミオグロビン、ミオシン、トランスフェリン、アポリポタンパク、糖タンパク、アルブミン、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＲＦ、リンパ球サブセット、ＬＥ細胞、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体及びＡＳＯ等。
【００１４】
（２）ホルモン関連物質：インスリン、ＨＧＣ、β−ＨＣＧ、成長ホルモン、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、Ｔ３、Ｔ４、ＦＴ３、ＦＴ４、ＴＢＧ、Ｃ−ペプチド、Ｔ−Ｕｐｔａｋｅ、エストロゲン、ＨＰＬ、Ｅ２、コルチゾール、プロゲステロン、テストステロン及びソマトスタチン等。
（３）薬物関連物質：ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール及びテオフィリン等。
【００１５】
（４）感染症関連物質：真菌、連鎖球菌、大腸菌、結核菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、カンシダ、マイコプラズマ、トキソプラズマ、梅毒、マラリア原虫及び赤痢アメーバー等そのもの自体、並びにこれらに対する抗体及びこれらの代謝物等。
（５）環境・食品関連物質：環境ホルモン（エストラジオール等の性ホルモン、ペンタクロロフェノール、アトラジン、アラクロール、シマジン、メソミル、ドリン、アルディアルブ、ベミノル、ＰＣＢ、ダイオキシン及びＤＤＴ等）、農薬（スミチオン、α−ベンゾピエン、フェンバレレート及びメトリブジン等）、貝毒・藍藻毒（サキシトキシン、マイクロシスチン及びゴニオトキシン等）、及びカビ毒（アフラトキシン、オクラトキシン及びゼラレノン等）等。
これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’又はＦａｂであってもよい。
【００１６】
レクチンとしては、例えば、コンカナバリンＡ（Ｃ−３，Ｃ−４，Ｃ−６位の水酸基が未置換のα−Ｄ−Ｍａｎを２残基以上含む糖鎖に特異的に結合する。）、ドリコスマメレクチン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃに特異的に結合する。）、ダツラレクチン（キチンオリゴ糖及びＮ−アセチルラクトサミンに特異的に結合する。）、デイゴマメレクチン（Ｎ−アセチルラクトサミン構造を持つアスパラギン複合型糖鎖に特異的に結合する。）、フコースバインディングプロテイン（Ｇａｌ等の２位に結合したα−Ｌ−Ｆｕｃに特異的に結合する。）等が挙げられる。
【００１７】
アビジンとしては、卵白由来のアビジン、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉ）由来のストレプトアビジン等が挙げられる。
相補的な遺伝子としては、特開平６−１８６２３２号公報に記載の相補的な遺伝子等、例えば、ポリデオキシアデニル酸とポリチミジル酸の組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
本発明の担体と特異的結合物質（ａ）とを結合する方法としては、ヘテロジニアス免疫測定に用いられる方法であれば制限ないが、例えば、担体表面に導入されたアミノ基及びスルフヒドリル基等の官能基と、特異的結合物質（ａ）のアミノ基及びスルフヒドリル基等の官能基とを結合剤（グルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル及びｏ−フェニレンビスマレイミド等）で架橋する方法（米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書等）等が挙げられる。
【００１９】
特異的結合物質（ａ）が結合された担体は、例えば、以下の工程１〜４により、測定対象物質のヘテロジニアス免疫測定に供することができる。なお、これらの工程に限定はされない。
工程１．測定対象物（ｂ）と特異的結合物質（ａ）が結合した担体とを反応させる。
工程２．工程１で生じた担体との反応物から未反応物を除く。
工程３．工程２で得られた精製反応物に、標識体を反応させる。
工程４．工程３で得られた担体に結合した標識体量を測定する。
【００２０】
ヘテロジニアス免疫測定法に使用される標識体は、標識物質と特異的結合物質（ｃ）とからなる結合体である。
標識体に用いられる特異的結合物質（ｃ）としては、（１）サンドイッチ法の場合、測定対象物（ｂ）を特異的に認識する結合物質、（２）競合法の場合、測定対象物（ｂ）と同じ免疫反応性を有する物質等が使用できる。
（１）の場合、標識体に用いられる特異的結合物質（ｃ）としては、免疫測定用担体に用いられる特異的結合物質（ａ）と同じものも使用できるが、測定対象物（ｂ）の認識部位（結合部位）が（ａ）とは異なるものが好ましく、さらに好ましくは（ｂ）の認識部位が（ａ）とは異なり、かつ由来する動物種が（ａ）とは異なるものである。
（２）の場合、標識体に用いられる特異的結合物質（ｃ）としては、測定対象物（ｂ）及びその断片等が挙げられる。
標識物質としては、従来公知のものが使用でき、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質及び酵素等が用いられる。
【００２１】
標識物質と標識体に用いられる特異的結合物質（ｃ）との結合には、従来公知の方法等が適用でき、例えば、「続生化学実験講座５  免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行）１０２〜１１２頁に記載の方法等が用いられる。
具体的には、例えば、（１）標識物質がアイソトープの場合、クロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を（ｃ）のチロシン残基に導入する方法、（２）標識物質が蛍光物質の場合、フルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で（ｃ）に反応させ、（ｃ）のリシン残基に結合させる方法、（３）標識物質が発光物質の場合、アクリジニウム誘導体−Ｉ（同人化学研究所社製）を緩衝液中で（ｃ）に反応させ、（ｃ）のアミノ基に結合させる方法、（４）標識物質が酵素の場合、酵素の持つアミノ基と（ｃ）の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル６−マレイドヘキサノエート等のニ架橋性試薬で結合する方法等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
なお、本実施例は、本発明による免疫測定用担体によって、再現精度が良くなることを示すものである。
【００２３】
実施例１
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約３．２ｍｍの１０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス）に、アスコンサンドブラスト装置Ｂ−２型（厚地鉄鋼株式会社製）を用いて８０メッシュ以下のエメリー（商品名：モランダムＡ−４０、昭和電工株式会社製）を１０分間、４ｋｇ／ｃｍ２の加圧空気で吹き付け、ガラスビーズ群をサンドブラストした。なお、サンドブラストに際しては、ガラスビーズ群をエメリーの通過する５００メッシュの網状の容器内に入れ、容器を９０ｒｐｍで攪拌しながら、上部からエメリーを吹き付けた。その際、ビーズ群は容器内の一定範囲内を回転しながら移動するので、移動範囲の全てにエメリーがあたるように吹き付けノズルの位置調整を行い、サンドブラストした。サンドブラスト後、ガラスビーズ群に付着したエメリーとガラス粉を次の通り洗浄して除去した。
【００２４】
＜エメリーとガラス粉の洗浄方法＞
脱イオン水４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶にサンドブラスト後のガラスビーズ１０００個を加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、エメリーとガラス粉と共に脱イオン水をアスピレーターで吸引除去した。再び脱イオン水４０ｍＬを加え、同様に洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。
【００２５】
ビーズ直径の計測：
１０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて１．４８以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．００９であった。
【００２６】
抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズ群の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶にガラスビーズ１０００個を加え、１時間、２５℃で反応させ、反応液をアスピレーターで吸引除去した。
次いで脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のガラスビーズ１０００個を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、１時間、２５℃で反応させた。そして、脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
さらにこの洗浄後のガラスビーズ１０００個を抗ＰＳＡモノクローナル抗体（メディクスバイオケミカ社製）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、１時間、２５℃で反応させた。なお、ＰＳＡは前立腺特異抗原の略号である。
反応後、抗ＰＳＡ抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズ群を作製した。これを０．１％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに浸漬し２〜１０℃で保存した。
【００２７】
ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡ抗体の作製：
抗ＰＳＡモノクローナル抗体（メディクスバイオケミカ社より購入、ガラスビーズに結合した抗体とは認識部位が異なるもの）、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製、以下ＰＯＤと略記する）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
【００２８】
ＰＳＡ免疫測定法（検量線の作製）：
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液中で保存していた抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズ１個を取り出し生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した後、該ビーズ１個と標準ＰＳＡ液（ＰＳＡ濃度が１００ｎｇ／ｍＬの標準液）の０．０１ｍＬと免疫反応用緩衝液［０．１％の牛血清アルブミン、０．８５％の塩化ナトリウム、０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（界面活性剤）含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）］の０．１３ｍＬとを試験管に分注し、試験管中で３７℃、７分間反応させ、ビーズ＋ＰＳＡ複合体を形成した。
反応後、試験管中の液をアスピレーターで除き、ビーズ＋ＰＳＡ複合体を生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した。
【００２９】
次に、試験管中のビーズ＋ＰＳＡ複合体１個にＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体を０．１３μｇ／ｍＬ含有する免疫反応緩衝液の０．１４ｍＬを試験管に分注し、試験管中で３７℃、７分間反応させ、ビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体を形成した。
反応後、試験管中の液をアスピレーターで除き、ビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体を生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した。
最後に、発光試薬Ａ［０．１８ｇ／Ｌのルミノール、０．１ｇ／Ｌの４−（シアノメチルチオ）フェノール含有の０．１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）］の０．０７ｍＬと０．０１％過酸化水素水の０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃、４３秒間発光反応させ、発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量を発光検出器［光電子倍増管を使用、ＢＬＲ−２０１（アロカ社製）］で測定した。
上記と同様にして、標準ＰＳＡ液（ＰＳＡ濃度が０，５，２５，５０ｎｇ／ｍＬの標準液）を用いて、ビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体を作製して、発光量を測定した。標準ＰＳＡ液の各濃度について２回測定を行い、これらのデータをスプライン曲線で回帰して検量線を作製した。
【００３０】
ＰＳＡ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記と同様にして、標準ＰＳＡ液（ＰＳＡ濃度が２５ｎｇ／ｍＬの標準液）を用いて、ビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体５０個（再現精度用検体）を作製して、それぞれ発光量を測定した。そして、上記で作製した検量線を用いて再現精度用検体の発光量をＰＳＡ濃度に読み替えた。
この濃度値（ｎ＝５０）の平均値と標準偏差を算出し、標準偏差／平均値×１００（％）の再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表１に示す。
【００３１】
実施例２
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約４．５ｍｍの１０００個のガラスビーズ［（指定品、株）岡部製作所製］に、実施例１と同様にビーズのスリ加工を行った。
ビーズ直径の計測：
１０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて０．５２以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．００５であった。
【００３２】
抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例１と同様に、抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを作製した。だだし、反応及び洗浄に用いる溶液の液量は実施例１の２倍量とした。
ＰＳＡ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例１と同様に形成したビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体について、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表１に示す。
【００３３】
実施例３
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約６．６ｍｍの３０００個のガラスビーズ［指定品、（株）岡部製作所製］に、実施例１と同様にビーズのスリ加工を行った。
ビーズ直径の計測：
３０００個のビーズのうち、８０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ８０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて１．２３以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．００８であった。
【００３４】
抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例１と同様に、抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを作製した。だだし、反応及び洗浄に用いる溶液の液量は実施例１の６倍量とした。
ＰＳＡ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例１と同様に形成したビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体について、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表１に示す。
【００３５】
比較例１
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
３．２ｍｍのビーズ１０００個（指定品，（株）岡部製作所製）について、容器内のビーズ群の移動範囲（上面）の６０％の面積にエメリーがあたるように吹き付けノズルの位置調整を行い、３０分間サンドブラストする以外、実施例１と同様にしてビーズのスリ加工を実施した。
ビーズ直径の計測：
１０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて３．５７以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．０２１であった。
【００３６】
抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例１と同様に、抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを作製した。
ＰＳＡ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例１と同様に形成したビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体について、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表１に示す。
【００３７】
比較例２
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約４．５ｍｍの１０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製）について、容器内のビーズ群の移動範囲（上面）の６０％の面積にエメリーがあたるように吹き付けノズルの位置調整を行い、２５分間サンドブラストする以外、実施例１と同様にしてビーズのスリ加工を実施した。
ビーズ直径の計測：
１０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて２．８１以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．０１５であった。
【００３８】
抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例２と同様に、抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを作製した。
ＰＳＡ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＰＳＡ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例１と同様に形成したビーズ＋ＰＳＡ＋ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体について、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0003545365.tif 000002
【００４０】
表１から明らかなように、式（１）左辺の値が高い比較例１及び２においては、ＣＶが７．８％及び４．９％と高く、再現精度が悪い。これに対し、実施例１、２及び３のように式（１）左辺の値が低いと、ＣＶがそれぞれ２．９％、１．２％及び２．５％と低く、再現精度が高い。分散度（Ｓ２）も数値が小さいほどＣＶは小さくなり、特に０．０１以下で再現精度が高いことが判る。
【００４１】
実施例４
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約３．２ｍｍの２０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製）について、実施例１と同様にビーズのスリ加工を行った。
ビーズ直径の計測：
２０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて０．７２以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．００８であった。
【００４２】
抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズの作製：
結合する抗体を抗ＡＦＰモノクローナル抗体（ロシュダイアグノチクスより購入）にし、反応液及び洗浄液量を２倍にした以外は、実施例１と同様にして抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。
【００４３】
ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体の作製：
抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコジャパン社より購入）を用いて実施例１と同様にＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
【００４４】
ＡＦＰ免疫測定法：
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液中で保存していた抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズ１個を取り出し生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した後、ビーズ１個と標準ＡＦＰ液（ＡＦＰ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬの標準液）の０．０１ｍＬと免疫反応用緩衝液［０．１％の牛血清アルブミン、０．８５％の塩化ナトリウム、０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（界面活性剤）含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）］の０．１３ｍＬとを試験管に分注し、試験管中で３７℃、７分間反応させ、ビーズ＋ＡＦＰ複合体を形成した。
反応後、試験管中の液をアスピレーターで除き、ビーズ＋ＡＦＰ複合体を生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した。
【００４５】
次に、試験管中のビーズ＋ＡＦＰ複合体１個にＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体を０．１３μｇ／ｍＬ含有する免疫反応緩衝液の０．１４ｍＬを試験管に分注し、試験管中で３７℃、７分間反応させ、ビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体を形成した。
反応後、試験管中の液をアスピレーターで除き、ビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体を生理食塩水０．５ｍＬで３回洗浄した。
最後に、発光試薬Ａ［０．１８ｇ／Ｌのルミノール、０．１ｇ／Ｌの４−（シアノメチルチオ）フェノール含有の０．１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）］の０．０７ｍＬと０．０１％過酸化水素水の０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃、４３秒間発光反応させ、発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量を発光検出器［光電子倍増管を使用、ＢＬＲ−２０１（アロカ社製）］で測定した。
上記と同様にして、標準ＡＦＰ液（ＡＦＰ濃度が０，２０，１００，４００ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液）を用いて、ビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体を作製して、発光量を測定した。標準ＡＦＰ液の各濃度について２回測定を行い、これらのデータをスプライン曲線で回帰して検量線を作製した。
【００４６】
ＡＦＰ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記と同様にして、標準ＡＦＰ液（ＡＦＰ濃度が１００ｎｇ／ｍＬの標準ＡＦＰ液）を用いて、ビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識抗ＡＦＰ抗体複合体５０個（再現精度用検体）を作製して、それぞれ発光量を測定した。そして、上記で作製した検量線を用いて再現精度用検体の発光量をＡＦＰ濃度に読み替えた。
この濃度値（ｎ＝５０）の平均値と標準偏差を算出し、標準偏差／平均値×１００（％）の再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表２に示す。
【００４７】
実施例５
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約６．６ｍｍの２０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製）について、実施例１と同様にビーズの前処理を行った。
ビーズ直径の計測：
２０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて１．６８以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．０１７であった。
【００４８】
抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例４と同様に、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。だだし、反応及び洗浄に用いる溶液の液量は実施例１の６倍量とした。
ＡＦＰ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例４と同様に形成したビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識ＡＦＰ抗体複合体、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表２に示す。
【００４９】
比較例３
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約４．５ｍｍの２０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製）について、容器内のビーズ群の移動範囲（上面）の６０％の面積にエメリーがあたるように吹き付けノズルの位置調整を行い、３０分間サンドブラストする以外、実施例１と同様にしてビーズのスリ加工を実施した。
ビーズ直径の計測：
２０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて５．３５以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．０２８であった。
【００５０】
抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例４と同様に、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。だだし、反応及び洗浄に用いる溶液の液量は実施例１の２倍量とした。
ＡＦＰ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例４と同様に形成したビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識ＡＦＰ抗体複合体、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表２に示す。
【００５１】
比較例４
ビーズのスリ加工（つや消し加工）：
直径約６．６ｍｍの２０００個のガラスビーズ（指定品、（株）岡部製作所製）について、容器内のビーズ群の移動範囲（上面）の６０％の面積にエメリーがあたるように吹き付けノズルの位置調整を行い、２０分間サンドブラストする以外、実施例１と同様にしてビーズのスリ加工を実施した。
ビーズ直径の計測：
２０００個のビーズのうち、６０個のビーズを無作為に抽出し、それぞれのビーズについて、図１〜３に示したようにビーズ直径ａ〜ｉの９ヶ所に相当する箇所をマイクロメーター（ミツトヨ社製ＭＤＣ−２５Ｍ）で計測し、Ａｉ、Ａｊ及びＡｍを導いた。
このビーズ６０個それぞれについてＡｉ、Ａｊ及びＡｍを、式（１）の左辺に代入したところ、すべて２．６６以下であった。
また、このビーズ６０個の分散度（Ｓ２）を式（７）から算出したところ、０．０１７であった。
【００５２】
抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズの作製：
実施例４と同様に、抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを作製した。だだし、反応及び洗浄に用いる溶液の液量は実施例１の６倍量とした。
ＡＦＰ免疫測定法の再現精度（ＣＶ値）の評価：
上記で作製した抗ＡＦＰ抗体結合ガラスビーズを用いて実施例４と同様に形成したビーズ＋ＡＦＰ＋ＰＯＤ標識ＡＦＰ抗体複合体、発光量の測定を行い、再現精度（ＣＶ）を求めた。その結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
0003545365.tif 000003
【００５４】
表２から明らかなように、式（１）左辺の値が高い比較例３及び４においては、ＣＶが９．０％及び５．５％と高く、再現精度が悪い。一方、実施例４及び５のように式（１）左辺の値が低くなると、それぞれＣＶが１．６％及び３．６％と低く、再現精度が高い。分散度（Ｓ２）も数値が小さいほどＣＶは小さくなり、特に０．０１以下で再現精度が高いことが判る。又、が同じ数値の場合、式（１）左辺の値が小さい方が再現精度が高いことが判る。
表１及び２の結果から、式（１）左辺の値とＣＶの値には相関関係があり、ビーズの真球度の度合いによって、再現精度に大きく影響することがわかる。
また、分散度も制御することで、さらに良好な再現精度を得ることができる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の免疫測定用担体を用いることで、極めて高い再現精度で測定データが得られ、臨床的な判断の正確性をより高めることができる。
また、試薬を製造する側にとっても、製造ロットごとのばらつきを低減できるので品質管理が容易となる。
【０００５６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビーズの中心を通るＸＹ平面におけるビーズ直径ａ，ｂ，ｃ及びｄを示すビーズの断面図
【図２】ビーズの中心を通るＸＺ平面におけるビーズ直径ａ，ｅ，ｆ及びｇを示すビーズの断面図
【図３】ビーズの中心を通るＹＺ平面におけるビーズ直径ｂ，ｅ，ｈ及びｉを示すビーズの断面図
【図１】
0003545365.tif 000004
【図２】
0003545365.tif 000005
【図３】
0003545365.tif 000006