(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の塩素イオンを、α−アミラーゼを用いて定量する方法において、α−アミラーゼの基質として一般式（Ｉ）：
【化１】
0003594331.tif 000007
（式中、Ｘ１  及びＸ２  は異なってガラクトシル基又は水素原子であり、Ｒはフルクトシル基又は置換もしくは非置換のフェニル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）で示される化合物を用いることを特徴とする塩素イオンの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床診断に有用な塩素イオンの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−アミラーゼはキレート剤の存在下でアポ酵素になり活性を消失するが、該アポ酵素が存在する塩素イオン濃度に比例して活性を回復してホロ酵素になる現象を利用したα−アミラーゼによる塩素イオンの定量方法が知られている（特開平４−９４６９８号公報、特開昭６３−１２６４９７号公報）。該定量方法は、α−アミラーゼの基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル  α−マルトヘプタオシド（Ｇ７  −ＣＮＰ）又はｐ−ニトロフェニル  α−マルトヘプタオシド（Ｇ７  −ＰＮＰ）等を用いて行われており、α−アミラーゼ以外にα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼを添加することにより、発色基である２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）やパラニトロフェノール（ＰＮＰ）を遊離させて測定している。
【０００３】
安定でかつ製造しやすいマルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼの基質として用いることが知られている（特開平３−２６４５９６号公報）が、塩素イオンの定量方法については知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
Ｇ７  −ＣＮＰ、Ｇ７  −ＰＮＰ等を基質として用いたα−アミラーゼを用いた塩素イオンの定量方法においては、該基質のα−アミラーゼによる分解物に対してのα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼのミカエリス定数が高いため、これらの酵素を大量に使用しなければならないが、α−グルコシダーゼ等は多糖分解活性を持つため大量に使用すると基質が分解され、盲検値が高くなり定量の精度が低下することが問題になる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の塩素イオンの定量方法は、試料中の塩素イオンを、α−アミラーゼを用いて定量する方法において、α−アミラーゼの基質として一般式（Ｉ）：
【０００６】
【化２】
0003594331.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｘ１  及びＸ２  は異なってガラクトシル基又は水素原子であり、Ｒはフルクトシル基又は置換もしくは非置換のフェニル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）で示される化合物を用いることを特徴とするものである。
前記式（Ｉ）においてＲで表される置換フェニル基としては、好ましくは一般式（ＩＩ）：
【０００８】
【化３】
0003594331.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ１  及びＲ２  は異なって、一方が水素原子、ニトロ基、ハロゲン原子又はカルボキシル基を表し、他方がニトロ基を表す。）で示される基があげられる。
以下、前記式（Ｉ）で示される化合物を化合物（Ｉ）という。
以下に、化合物（Ｉ）に属する代表的な基質を例示する。
【００１０】
Ｒが置換もしくは非置換のフェニル基であるＲａ  で表される化合物（Ｉ）としては、例えばｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド（Ｇａｌ−Ｇ２  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド（Ｇａｌ−Ｇ２  −ＯＮＰ）、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド（Ｇａｌ−Ｇ３  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド（Ｇａｌ−Ｇ３  −ＯＮＰ）、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４  −ＯＮＰ）、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５  −ＯＮＰ）、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド（Ｇａｌ−Ｇ６  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド（Ｇａｌ−Ｇ６  −ＯＮＰ）、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド（Ｇａｌ−Ｇ７  −ＰＮＰ）、ｏ−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド（Ｇａｌ−Ｇ７  −ＯＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド（Ｇａｌ−Ｇ２  −ＣＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド（Ｇａｌ−Ｇ３  −ＣＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４  −ＣＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５  −ＣＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド（Ｇａｌ−Ｇ６  −ＣＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド（Ｇａｌ−Ｇ７  −ＣＮＰ）があげられる。また、これらの各基質のα−マルトシドがβ−マルトシドに、α−マルトトリオシドがβ−マルトトリオシドに、α−マルトテトラオシドがβ−マルトテトラオシドに、α−マルトペンタオシドがβ−マルトペンタオシドに、α−マルトヘキサオシドがβ−マルトヘキサオシドに、α−マルトヘプタオシドがβ−マルトヘプタオシドに置換された化合物も化合物（Ｉ）に含まれる。
【００１１】
前記の例示した化合物（Ｉ）の中で本発明に用いるのに好適なものとしては、Ｇａｌ−Ｇ２  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ２  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ３  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ３  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ４  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ４  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ５  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ６  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ６  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ７  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ７  −ＯＮＰがあげられ、とりわけ好適なものとしては、Ｇａｌ−Ｇ２  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ３  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ４  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ６  −ＰＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ７  −ＰＮＰ等があげられる。
【００１２】
Ｒがフルクトシル基である化合物（Ｉ）としては、例えばフルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトシド（Ｇａｌ−Ｇ２  −Ｆ）、フルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド（Ｇａｌ−Ｇ３  −Ｆ）、フルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４  −Ｆ）、フルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５  −Ｆ）、フルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド（Ｇａｌ−Ｇ６  −Ｆ）、フルクトシル  β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシド（Ｇａｌ−Ｇ７  −Ｆ）があげられる。
【００１３】
本発明において、試料中の塩素イオンをα−アミラーゼを用いて定量する方法とは、水性媒体中カルシウムイオンの存在下、必要によりキレート剤により失活させた、α−アミラーゼが試料中に存在する塩素イオンにより活性化される現象を利用して、α−アミラーゼの基質を添加してα−アミラーゼと反応させ、生成する生成物の量を測定することにより塩素イオン量を定量する方法をいう。
【００１４】
本発明において、試料としては、塩素イオンを含有する試料であればどのようなものでもよく、例えば血液、尿、唾液等の生体試料があげられる。
α−アミラーゼとしては、酵素番号〔３．２．１．１〕に属する酵素であればどのようなものでもよく、例えば動物、植物、微生物由来の天然の酵素及びこれらの酵素を遺伝子工学等により改変したものがあげられる。
【００１５】
水性媒体としては、塩素イオンを含有していない緩衝液であればどのようなものでもよく、例えばグッドの緩衝液（例えばＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ））、クエン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、酢酸緩衝液等があげられる。
キレート剤としては、カルシウムイオンと結合するキレート剤であればどのようなものでもよく、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｃｙＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等があげられる。
【００１６】
カルシウムイオンの供給源としては、例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウムのようなカルシウム塩を水性媒体に添加してもよいし、前記のキレート剤に１対１の比でカルシウムイオンが結合したカルシウムキレートを用いてもよい。
α−アミラーゼの基質を該酵素と反応させ生成する生成物の量の測定は、化合物（Ｉ）においてＲが置換もしくは非置換のフェニル基であるＲａ  で表される場合は、α−アミラーゼ反応により基質から遊離する式、〔グルコース〕ｎａ−Ｒａ  （式中、ｎａは１〜６の整数を表す。）をα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼ、好ましくはα−グルコシダーゼ等の酵素と反応させ、生じたＰＮＰ、オルトニトロフェノール（ＯＮＰ）又はＣＮＰ等の発色を分光光度法により測定するか、又は生じたフェノールをフェノールの定量法により定量することにより行うことができる。
【００１７】
また、基質である化合物（Ｉ）のＲがフルクトシル基の場合は、α−アミラーゼ及びα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼと反応さることにより生じたシュークロース（グルコース−フルクトース）を、シュークロースホスホリラーゼ、α−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、無機リン酸、グルコース−１，６−二リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）等を用いるシュークロースホスホリラーゼを用いるシュークロースの定量方法〔酵素ハンドブック，丸尾文治及び田宮信雄編，朝倉書店１９８２年刊〕により生成物の量を測定することができる。
【００１８】
本発明のうち、Ｒが前記式（ＩＩ）で示される置換フェニル基である化合物（Ｉ）を基質として用いる場合は、次のようにして行うことが好ましい。
即ち、必要により０．０１〜５％の界面活性剤、０．１〜１００ｍＭのカルシウムイオン、５〜５００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨが６〜９の水溶液に０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．２〜２０ｍＭの化合物（Ｉ）を溶解し、これに更に１〜１００単位のα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼ、必要により０．１〜１００ｍＭのキレート剤を添加して試薬液１を調製する。これに試料を加えた後、１５〜４０℃で１〜１０分加温した後、試薬液１と同じ緩衝液又は水溶液に、必要により０．１〜１００ｍＭのカルシウムイオンを加え、更に０．０１〜１００単位／ｍｌのα−アミラーゼを加えて調製した試薬液２を添加して、更に１５〜４０℃で１０秒〜２０分間反応させ生じる発色を分光光度計で測定する。ここで用いる界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。
【００１９】
Ｒがフルクトシル基である化合物（Ｉ）を基質として用いる場合は、前記のシュークロースホスホリラーゼを用いるシュークロースの定量方法〔酵素ハンドブック，丸尾文治及び田宮信雄編，朝倉書店１９８２年刊〕により測定を行う。
なお、前記の測定法において、化合物（Ｉ）の代わりにα−アミラーゼを試薬１に加え、α−アミラーゼの代わりに化合物（Ｉ）  を試薬液２に加える以外は同様の方法で塩素イオンの定量を行ってもよい。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
以下に示す試薬１と試薬２を用いて試料中の塩素イオンを定量した。
【００２１】
0003594331.tif 000004
試薬１（２．２５ｍｌ）に塩素イオンを１２５ｍＭ  含む標準液を５０μｌ  添加し、攪拌後更に試薬２を０．７５ｍｌ加えて、３７℃で試薬２添加後２分から３分までの間の４０５ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計で測定した。検量線を求めるために、同様の操作を塩素イオン濃度１００ｍＭ  、７５ｍＭ、  ５０ｍＭ  、２５ｍＭ、  ０ｍＭについても行い、図１に示す検量線を得た。
【００２２】
予め、イオン選択性電極法（日立製７３６自動分析機）で定量して塩素イオン６２．０ｍＭを含むことが確認された血清試料を、前記と同様の操作により測定したところ６２．３ｍＭであった。
（実施例２）
実施例１で用いたＧａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰまた比較例としてのｐ−ニトロフェニルα−マルトペンタオシド（Ｇ５  −ＰＮＰ）又はｐ−ニトロフェニル  ベンジリデン−α−マルトペンタオシド（Ｂｚ  −Ｇ５  −ＰＮＰ）を用いて実施例１と同様の方法により３０℃、２４時間における試薬盲検の増加度を検査した。
【００２３】
また、実施例１で使用した血清試料を前記の方法で各１０回ずつ測定し、結果の再現性を示す変動係数（ＣＶ）を算出した。結果を表１に示した。
【００２４】
【表１】
0003594331.tif 000005
【００２５】
表１から明らかなように、実施例１で使用したＧａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰを用いた場合のみ、ブランクも小さく、再現性もよかった。
（実施例３）
以下に示す試薬１と試薬２を用いて試料中の塩素イオンを定量した。
0003594331.tif 000006
試薬１（２．２５ｍｌ）に塩素イオンを８０ｍＭ含む標準液を５０μｌ  添加し、攪拌後更に試薬２を０．７５ｍｌ加えて、３７℃で試薬２添加後２分から３分までの間の３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。検量線を求めるために、同じ操作を塩素イオン濃度７０ｍＭ、  ６０ｍＭ  、５０ｍＭ、  ２５ｍＭ  、０ｍＭ  についても行い、図２に示す検量線を得た。
【００２６】
（実施例４）
実施例１のＧａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰの代わりに、Ｇａｌ−Ｇ５  −ＯＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ５  −ＣＮＰ、Ｇａｌ−Ｇ７  −ＰＮＰ又はＧａｌ−Ｇ７  −ＯＮＰを使用する以外は実施例１と同様の操作を行い、塩素イオンの１００ｍＭ  標準液、精製水、血清試料を測定した後、標準液の場合の吸光度変化と血清試料の場合の吸光度変化を比較して試料中の塩素イオン濃度を定量したところ、それぞれの基質を用いて、６１．９ｍＭ、６１．７ｍＭ、６２．２ｍＭ、６２．５ｍＭであった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、試薬盲検値が小さく、定量の精度が高い塩素イオンの定量方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇａｌ−Ｇ５  −ＰＮＰを用いた場合の検量線。
【図２】Ｇａｌ−Ｇ４  −Ｆを用いた場合の検量線。
【図１】
0003594331.tif 000008
【図２】
0003594331.tif 000009