(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イカの皮からドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするリン脂質を溶剤を用いて抽出するにあたり、イカの皮を予めアセトンで洗浄・脱水することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
アセトンのイカ皮に対する重量比が１〜５部である請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はイカの皮からドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡと称す）を構成脂肪酸とするリン脂質を、安価にしかも容易に製造する方法に関し、詳しくは、イカの皮からＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質を溶剤を用いて抽出するにあたり、イカの皮を予めアセトンで洗浄・脱水してなる製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本のイカの総生産高は年間１００万トンに達すると言われ、単一の魚種でこれほどの取扱量に達するものは他に例を見ない。これらの内水産加工用に使用されるものからは、皮、内蔵、骨等が産業廃棄物として発生しており、何等利用されることなくしかも経費をかけて廃棄処理を行っているのが現状である。
【０００３】
イカ皮は水産加工業で温湯剥離されて出てくる産業廃棄物で、少なくとも年間２０００トン以上発生していると見積もられている。これを原料として用いることは、産業廃棄物の有効利用という意味で環境汚染防止の面からも大きな効果をもたらすと同時に、現在多大な経費をかけて廃棄しているものの原料化ということから、非常に安価に入手できる期待がもてる。
【０００４】
一方ＤＨＡはその多彩な生理活性により近年とみに注目を集めている物質である。油化学  ＶＯＬ．４３  Ｎｏ．９（１９９４）  Ｐ６８７  〜６９７  に総説されている通り細胞分化作用（制癌効果）、抗炎症作用、抗アレルギー作用、コレステロール低下作用、などが明らかとなってきており、また以前から知られていた記憶学習能向上作用、網膜反射能向上作用、血圧低下作用などともあいまって、食品分野、医薬品分野、化粧品分野等で活発に研究開発が続けられている一分野を形成している。
【０００５】
ＤＨＡはリン脂質に組み込まれて生理活性を発現することから、フリータイプやアシルエステルタイプの物のみならず、ホスファチジルコリン（以下ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（以下ＰＥ）の、主としてｓｎ−２位に組み込まれたリン脂質タイプの物の調製も望まれている。
ＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質の製造法には大きく分けて３つの方法が考えられる。それは合成法、酵素変換法、天然物からの抽出法である。
【０００６】
合成法としては、例えばグリセロール骨格のｓｎ−１位、ｓｎ−２位の両方にＤＨＡが結合しているＰＣを得るには、グリセロホスファチジルコリンの塩化カドミウム錯体にＤＨＡの酸無水物やハロゲン化物等を反応させ精製して得る方法がある（特開昭６２−１６４３９号公報参照）。
又、グリセロール骨格のｓｎ−２位にＤＨＡを有し、ｓｎ−１位にＤＨＡ以外の脂肪酸を有するＰＣ又は、ＰＥを得るには、次の方法が知られている。
【０００７】
例えばグリセロホスファチジルコリンの塩化カドミウム錯体にパルミチン酸やオレイン酸の酸無水物又はハロゲン化物等を反応させてｓｎ−１，２−パルミチン酸ＰＣやｓｎ−１，２−オレイン酸ＰＣが得られる。得られたこれらの化合物を酵素分解（ホスフォリパーゼＡ２  処理）すると１−アシル型リゾリン脂質が得られる。
【０００８】
得られた１−アシル型リゾリン脂質とＤＨＡの酸無水物やハロゲン化物等と反応させてｓｎ−２位にＤＨＡを有するそれぞれの目的化合物を得ることができる。しかし、これらの方法は複雑すぎて工業的製法には全く適さない。
酵素変換法には、戸谷らの大豆リン脂質と魚油間でのリパーゼによるエステル交換（平成２年第４４回日本栄養．食糧学会総会講演要旨）、八木らのリン脂質と脂肪酸間のリパーゼによるアシル基交換（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＶＯＬ．６９，ＰＰ２３−２５，１９９０  ）などの報告がある。
【０００９】
又、特許でも、リン脂質もしくはリゾリン脂質と任意の脂肪酸または脂肪酸エステルとから酵素によるエステル交換やアシル化により目的化合物を得る方法が提示されている（特開昭６３−１０５６８６号公報、特開昭６３−１８５３９１号公報、特開平２−３５０９３号公報、特開平５−２３６９７４号公報）。しかし前記の報告例あるいは特許はいずれも導入される脂肪酸がｓｎ−１位もしくはｓｎ−２位にランダムに入ったり、酵素反応率が低すぎる等の問題点が多く、工業的実用化には大きな困難を抱えている。
【００１０】
それにひきかえ天然物からの抽出法は、原料の選択を適切に行い、抽出法に工夫をこらすことで、目的化合物を安価かつ容易に製造するには最も適した方法であるといえる。
ＤＨＡを高濃度に含有する原料が探索され、マグロをはじめとするカツオ、アジ、サバ、イワシ等青背の魚の頭部、腹部、内蔵各部あるいは全体から調製する方法が提示されている（特開昭６３−１６４８５２号公報、特開昭６４−５０８９０号公報）。
【００１１】
又、ＤＨＡを培地に添加して培養した微生物菌体から抽出する方法も提示さ    れている（特開平５−１２３１７６号公報）。
更にイカのリン脂質がＤＨＡを高濃度に含有することに着目し、その内蔵から調製する方法（特開平２−８２９８号公報）やイカ皮からの調製法（特開平６−３２１９７０号公報、特開平７−６８１５７号公報）も報告されている。
【００１２】
しかし上記の従来技術の全てには、原料の抽出前の処理法として、凍結乾燥工程が共通の工程として記載されているのが特徴的である。
ＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質の製造原料としての生体試料（青背の魚、イカ、菌体等）は、元来７０％以上の大量の水を有している。それにひきかえ目的物であるリン脂質の含有率は１％未満であることが多い。しかし溶剤による抽出をより効率的に行うためには含水率を可能な限り低下させることが望ましい。またＤＨＡが非常に酸化されやすいという化学的性質を有することから、取り扱いは低温で、酸素を遮断した状態が好ましい。この２つの要求を満足させる方法として、凍結乾燥法は必然的帰結であるかのように思われる。
【００１３】
生体試料の有する水分を除去する方法としては、圧搾・風乾・加熱乾燥・真空乾燥・凍結乾燥等が考えられる。水分をあるがままの姿のまま減少させようとすれば、圧搾のみでは水分除去率が不十分であり、風乾・加熱乾燥・真空乾燥では処理温度と処理時間の面から問題が残る。以上のことから凍結乾燥法は、不満ではあるが現状では採用せざるをえない工程といえる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はイカの皮からのＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質を凍結乾燥手段を用いることなく安定かつ効率的に回収する製造方法を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決する手段】
即ち、温湯剥離により発生したイカ皮はおよそ９０％の水分を有する。それにひきかえ溶剤で抽出される油分は約３％しかなく更にリン脂質に限るとその含有率は１％程しかない。この水を除去するに必要な凍結乾燥機の運転コストは莫大である。又、乾燥効率を高める為に、試料の表面積を可能な限り広くする必要があるが、凍結乾燥機への仕込み作業にかかる労力も膨大となる。又、凍結乾燥機の宿命であるが、運転時間はどうしても長くならざるをえない。製品の生産能力上、凍結乾燥機にかかる設備投資はどうしても過重になる。それらの理由により凍結乾燥工程を工業的製法に採用することは、多大な不利益を招かざるを得ない。製品の品質を損なうことなく、凍結乾燥に変わりうる、容易で安価な脱水方法が希求される所以であるが、本発明に示すアセトン洗浄法により、その目的が達成されることを見いだした。
【００１６】
又、イカの皮表面は多糖類からなるヌメリ物質に覆われている。この物質は溶剤によるリン脂質抽出工程を進めてゆくとき、往々にして濾過工程の濾過速度を大幅に低下させる原因となることがある。本発明に示すアセトン洗浄法は、このヌメリ物質の除去にも極めて有効であることを見いだした。
更に、リン脂質の定義のひとつにアセトン不溶物とあることから理解できるように、アセトン洗浄という前処理法は原料に含まれるリン脂質を溶出により損なうことのない非常に優れた方法であることを見いだした。
【００１７】
本発明は上記の知見に基づいて構成されたもので、イカの皮からＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質を溶剤を用いて抽出するにあたり、イカの皮を予めアセトンで洗浄・脱水することを特徴とする製造方法である。
まず本発明で対象とするイカとしては特に限定されるものではなく、例えばヤリイカ、モンゴウイカ、コウイカやアオリイカなどが挙げられ、また本発明で用いるイカの皮としては、上記イカから温湯剥離により発生したイカ皮そのまま、または適宜冷凍したものを流水中で解凍したものであってもよく、このイカ皮を直接アセトン洗浄することは十分可能であるが、アセトンの使用量をできるだけ少なくするために、アセトン洗浄工程の前にできるだけ水切りを行っておくことは非常に有用である。
【００１８】
水切りの効率を上げるため、イカ皮を粉砕しておくことも有用である。
つまりアセトン洗浄の前処理として、９０％の水分を有するイカ皮をまずミンチにし、それを圧搾機にかけ、絞れるだけ水を絞っておくことが好ましい。但し、この処理によっても水分含量は約８０〜８５％までしか低下させられない。
イカ皮１部に対しアセトンを重量比で１部以上用いて洗浄を行う。アセトンの使用量は多いほど含有する水との置換効果が高いため脱水効果は高くなり乾燥時間を短くできる利点があるが、５部以上だとその得られる効果に見るべき差がでなくなるため、使用量は１〜５部の範囲で十分であるといえる。洗浄は一度に全量で行っても良いが、数次に分けて行っても良い。洗浄・脱水効果を高めるためには数次に分けて行うのがより好ましい。
【００１９】
ここで言うアセトンとしてはアセトン純度が９０％以上のものが好ましく、９５％以上が特に好ましく、また通常の液体状態であれば特に温度にはこだわらないが、原料が熱を嫌う生体試料である点に鑑み、冷アセトンを用いるのが好ましいことと言える。
原料と、洗浄アセトンの分離は遠心分離法や加・減圧濾過法等の、通常の工業的手法のいずれのものも使用できる。分離に引き続き、乾燥気体（窒素、アルゴン、空気等）を用いて強制的に脱液してやることで、極めて短時間の内に試料の水分量は３０％以下に達し、乾燥時間を多少延長することで１０％以下にすることができる。ここで用いる気体も不活性な乾燥気体や、乾燥空気等であれば何でも使用可能だが、試料が酸化を嫌うことや値段等に鑑み、窒素を用いるのが好ましいと言える。
【００２０】
ここで使用されたアセトンは通常の回収工程を経ることで何度でも繰り返し使用することができるため、非常に経済的である。
このように乾燥された原料から、目的とするＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質を抽出する溶剤としては、リン脂質を溶解する通常の溶媒を単独又は混合して用いることができる。
【００２１】
例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチルエーテル、ヘキサン、クロロホルム、クロロホルムーメタノール系、ｎーヘキサンーエタノール系、クロロホルムーｎーヘキサン系、クロロホルムーエーテル系、クロロホルムーエタノール系等が挙げられる。
これらの溶媒から適宜選択する溶媒については、抽出率を重視するか、装置や作業への危険性でみるか、回収操作の容易性でみるか、等さまざまの判断基準が考えられるが、健康食品や医薬品用途を考える場合は、最終製品中への有害物＝残留溶媒の問題に力点を置いて判断する必要がある。そこで生理的な機能を重視したそれら用途には、残留量が最大限許容されるエタノールを選択することが特に好ましい。
【００２２】
抽出後、抽出溶媒を回収し、例えばこの溶媒を留去した後に残留する抽出物を他のＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質可溶性溶媒、例えばヘキサンの３〜３．５倍量に溶解し、次いでＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質不可溶性溶媒、例えばアセトンの１．５〜４倍量を添加して目的とするＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質を不溶物として沈澱、回収することにより、目的とする少なくともＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質であるレシチンを得る。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により更に詳しく本発明の説明を行うが、これら実施例は決して本発明を限定するものではない。
【００２４】
【実施例１】
湿重量１Ｋｇ（水分９１％）のアメリカオオアカイカの皮をひき肉処理し、油圧搾り機で水切りを行ったところ水分は８３％まで減少した。この圧搾後のイカの皮を２５０ｍｌの冷アセトン（和光純薬工業社製、１級、純度９９％）で５回洗浄したあと、室温で送風乾燥を１時間行ったところ、乾物（水分３％）を９２．８ｇ得た。
【００２５】
これを５００ｍｌのエタノールで抽出し、抽出液を分離した。残査を再度１５０ｍｌのエタノールで抽出し、抽出液を分離した。抽出液同士を合わせてエタノールを留去させると、１１．６ｇの脂質分が得られた。この脂質分にヘキサン５５ｍｌを加えて溶解した。次いでこの溶液を冷却下、攪拌しながらアセトン１１０ｍｌを加えると、レシチンがアセトン不溶物として沈殿した。この沈殿を濾過により捕集し、凍結乾燥したところ７．５ｇのレシチンが得られた。このレシチンの構成成分のうちＰＣとＰＥはイアトロスキャン分析によると各々、４５％、１１％であった。また構成脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーにより求めたところ、ＤＨＡが３８％、ＥＰＡが１２％、パルミチン酸が２９％であった。
【００２６】
【実施例２】
湿重量２００ｇ（水分８８％）のムラサキイカの皮をミンチ、圧搾処理して、水分を８１％まで低下させた。このイカの皮を２５０ｍｌの冷アセトンで５回洗浄し、加圧濾過器に入れ、窒素ガスで脱液を行った。液が切れてから更に１０分間通気したところ、乾物（水分５％）を２５．３ｇ得た。
【００２７】
これを１００ｍｌのエタノールで２回抽出し、抽出液を１６５ｍｌ得た。
エタノールを留去して得られる脂質分をヘキサンにより再溶解し、不溶物を濾過除去したヘキサン溶液を冷却攪拌下、アセトンを徐々に添加するとレシチンの沈殿が生成する。この沈殿を濾取し凍結乾燥することにより、水分含量０．５％以下のレシチンを２．０ｇ得た。
【００２８】
【実施例３】
冷凍イカ皮（アメリカオオアカイカ）１５Ｋｇを流水により解凍した。ミンチ、圧搾処理により水分８２％の湿イカ皮８．３Ｋｇを得た。この湿イカ皮を５０Ｌの冷アセトン中に投入し、十分に攪拌した。このスラリーをフィルタープレスで分離し、窒素ガスで脱液を行った。アセトン処理イカ皮を取り出し、完全にアセトン臭が消失するまで２０分風乾したところ水分３．５％の乾物を１．５Ｋｇ得た。これを７．５Ｌのエタノールで抽出し、エタノールを留去すると、脂質分１５０ｇが残った。これを７２０ｍｌのヘキサンに溶解し、不溶物を濾別すると６５０ｍｌのヘキサン溶液が得られた。このヘキサン溶液を冷却・攪拌しながら１７００ｍｌのアセトンを徐々に添加してゆくとレシチンの沈殿が生成した。この沈殿を濾取し、１０Ｔｏｏｒ以下で５時間真空乾燥したところ、水分含量１．０％のレシチンが９７ｇ得られた。
【００２９】
【参考例１】
湿重量１０ｇのムラサキイカの皮を凍結乾燥し、１．６ｇの乾物を得た。これを細かく砕いた後、クロロホルム：メタノール＝２：１の混合溶剤で抽出し、０．２６ｇの脂質成分を得た。この脂質成分にアセトン４０ｍｌを加え、冷却しながら攪拌を行い、中性脂質を分別濾過し、アセトン不溶分０．２２ｇを得た。
【００３０】
これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ＰＥおよびその他のリン脂質混合物に分画した。次いで、その他のリン脂質混合物をセファロースカラムクロマトグラフィーにかけることにより、その他のリン脂質混合物からＰＣを分離した。単離したＰＣとＰＥは各々０．１１ｇと０．０４ｇであった。
【００３１】
【比較例１】
上記参考例１では、湿イカ皮がそのまま凍結乾燥され、クロロホルム：メタノールの混合溶媒で抽出し、この抽出物からアセトン可溶物を洗浄除去したものであるため、イカ皮を覆っている多糖類由来のヌメリ物質の一部が同伴し、採取されたアセトン不溶物中のレシチン純度を著しく低下させた。
【００３２】
また、上記のクロロホルム：メタノールの混合溶媒での抽出物をヘキサンに溶解したところ、その５０％はヘキサン不溶物であった。
これに対し、本発明の如く湿イカ皮を予めアセトンで処理することによりヌメリ物質の除去効果が極めて良好であり、脂質抽出物中のヘキサン不溶物は１０％以下に減少せしめることができた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、ＤＨＡを構成脂肪酸とするリン脂質の安価な製造法を提供する。本発明により含水率が９０％にも及ぶイカ皮からリン脂質を抽出する際の前処理が、凍結乾燥法をはじめとする他の乾燥方法に比べ極めて短時間にかつ、リン脂質の変性を招くことなく、後工程の妨げとなる多糖類由来のヌメリ物質の除去も含めて可能となった。