(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた軟骨組織をインビトロで調製する方法であって、三次元枠組み上に接種した軟骨を生産する間質細胞を、有効量の成長因子を含む培地で培養し、その結果として、間質細胞および該間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質が、間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体に形成された生物適合性の非生体物質から構成された該枠組みに付着しかつそれを実質的におおうことにより、三次元構築物を形成することからなり、培養が周期的な加圧および対流の動的状態に保たれることを特徴とする方法。
【請求項２】
間質細胞が軟骨細胞または軟骨前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間質細胞が繊維芽細胞または繊維芽細胞様の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
間質細胞が臍帯細胞または臍帯血由来の骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
間質細胞が軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞様細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、白血球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、臍帯細胞、胎盤、または臍帯血由来の骨髄細胞の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
三次元枠組みが生物分解性の物質から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生物分解性の物質がポリグリコール酸、綿、ガット（腸線）縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポリヒドロキシアルカノエートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
枠組みをエチレンオキシドで処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
枠組みを電子ビームで処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
三次元枠組みが非生物分解性の物質から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非生物分解性の物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンまたはニトロセルロース化合物である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
枠組みがメッシュである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
培地が有効量のアスコルベートをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
三次元枠組みに接種した軟骨前駆細胞および該軟骨前駆細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を含んでなり、該三次元枠組みに生細胞が住みついて、軟骨前駆細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体を形成している、請求項１の方法により調製された生きた軟骨組織。
【請求項１５】
軟骨前駆細胞が臍帯細胞または臍帯血由来の骨髄細胞である、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【請求項１６】
枠組みをエチレンオキシドで処理する、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【請求項１７】
枠組みを電子ビームで処理する、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【請求項１８】
三次元枠組みが生物分解性の物質から構成される、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【請求項１９】
生物分解性の物質がポリグリコール酸、綿、ガット（腸線）縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポリヒドロキシアルカノエートである、請求項18に記載の生きた軟骨組織。
【請求項２０】
枠組みが非生物分解性の物質から構成される、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【請求項２１】
非生物分解性の物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、またはニトロセルロース化合物である、請求項20に記載の生きた軟骨組織。
【請求項２２】
枠組みがメッシュまたはスポンジである、請求項14に記載の生きた軟骨組織。
【発明の詳細な説明】
1.序
本発明は、培養物中で軟骨の形成を促進する条件下にin vitroで三次元的な骨組みあるいは枠組み上で間質細胞、例えば軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞及び／または繊維芽細胞様細胞を増殖させることに関する。滅菌剤及び／または滅菌方法により処理された種々の生物分解性及び非生物分解性マトリックスを本発明の骨組みとして使用できる。圧力のような物理的条件及び／または成長因子の添加等の種々の培養条件を調整できる。さらに培養された細胞は、増殖、移植及び／または疾患症状の緩和に有用な遺伝子産物を発現するように遺伝子操作できる。
得られる三次元培養物及び／または生物学的置換軟骨組織構築物は、in vivoにおける移植あるいは内植からin vitroにおける細胞毒性化合物及び医薬物質の有効性のスクリーニングまで種々の用途を有する。軟骨細胞の三次元培養物を記載する実施例により本発明を説明する。
2.発明の背景
関節軟骨は可動関節にスムースな滑動動作能力を与える役割を有している。関節軟骨は下部骨格に強固に付着し、関節により、また関節内の部位によりかなり変化するが、ヒトの関節においては厚さは5mm未満である。関節軟骨は無神経、無血管、無リンパ管である。成人においては、関節軟骨は滑液膜と軟骨の緻密なマトリックスを通して軟骨細胞に到達する二重拡散系により栄養を獲得している。
関節軟骨の生化学的組成は（軟骨により）65〜80％までの水を含み、コラーゲンを最も優勢な有機成分として有する。関節軟骨は、II型コラーゲン、プロテオグリカン及び水から主としてなる緻密な細胞外マトリックスに囲まれた高度に特殊化した軟骨細胞からなる。コラーゲン（主としてII型）は、乾燥重量でその殆どを占める表層領域を除いて、湿潤重量で約15〜25％、乾燥重量で約半分を占める。その濃度は通常、関節表面からの深さが大きくなるに従って徐々に減少する。プロテオグリカン含量は、湿潤重量で10％までであり、乾燥重量の約４分の１である。プロテオグリカンはタンパク質のコアとそれに結合した殆どはコンドロイチン硫酸とケラチン硫酸の形態の直鎖硫酸化多糖からなる。II型コラーゲンに加え、関節コラーゲンは特有の構造を有するいくつかのその他の型のコラーゲンを含む（IV、Ｖ、IX及びＸ）。これらの個々の巨大分子間には種々の相互作用が存在し、プロテオグリカンとコラーゲンとの間の非共有結合的会合、及び異なるコラーゲン種間の共有結合の両方がある。細胞外マトリックスの水流に対する抵抗性は軟骨に高い関節負荷を緩和する能力を与えている。これはショックを吸収し軟骨下骨の応力を最小にするものである（Mowら,1984,J.Biomech.,17:377−394）。成人の軟骨及び骨格の修復能力は限界を有している。
リウマチ及び／または変形性関節炎のような疾患あるいは外傷により引き起された軟骨の損傷は、重大な身体的変形や衰弱を招き得る。ヒト関節軟骨が老化するとその張力特性が変化する。膝関節軟骨の表面部分は30代まで引張強度の増加を示すが、その後関節表面においてII型コラーゲンに対する検出可能な損傷がおこり、引張強度は年齢とともに顕著に減少する。軟骨の深部でも、コラーゲン含量の低下は示さないものの、年齢とともに引張強度が徐々に低下する。これらの観察は、老化とともに物理的な変化が発生し、従って軟骨の構造的組織の変化が発生し、それが十分に進行すると軟骨が外傷的損傷を受けやすくなることを示している。変形性関節炎軟骨においてはII型コラーゲンが過度に損傷し、コラーゲンフィブリルのけん縮が起こる。リウマチ関節炎においては多形性白血球から放出されたプロテアーゼとフリーラジカルの両者の作用により関節表面に見られる損傷の多くが発生する（Tikuら,1990,J.Immunol.145:690−696）。軟骨細胞による軟骨マトリックス分解とプロテアーゼの誘導はおそらく主としてインターロイキン−１（IL−１）あるいは腫瘍壊死因子−α（TNF−α）によるものである（Tyler,1985,Biochem.J.225:493−507）。
軟骨の減少に対する現在の治療は補綴物質による置換であり、例えば、美容的修復のためのシリコーンや、関節裏打ち交換のための金属合金等である。補綴器具を入れると通常は下部組織及び骨格の損失を伴い、元の軟骨により得られた完全な機能は回復しない。入れたままの外来部品の存在に関連する長期の重大な症状としては、感染、糜爛、不安定等がある。
骨細胞を付着させた滅菌骨あるいは骨紛あるいは手術用スチールを最終的に移植して使用しても、細胞支持体の非分解的性質のために殆どの場合成功しない。ある方法においては、in vitro及び／またはin vivoで軟骨形成反応を刺激することができる可溶性骨タンパク質に、少なくとも３日間、in vitroで繊維芽細胞を接触させる。活性化された繊維芽細胞を、次いで生物分解性マトリックスと合わせることにより、あるいは関節内注射あるいは同種移植片及び補綴材料への接着により、in vivo状態に移す。この方法の欠点は、軟骨形成は短期間の培養では発生せず、移植部位での接触させた繊維芽細胞による軟骨合成に対して過度に依存することになることである（Caplan,A,米国特許第4,609,551号、1986年９月２日発行）。
J.P.Vacantiらに付与された1991年８月20日発行の米国特許第5,041,138号は、その後にin vivoに移植するための生物分解性マトリックス上に軟骨細胞を接種する軟骨構造の増殖物を記載している。この系はより大きな表面積と栄養物に対する露出という利点を与えているものの、軟骨細胞を培養するのに使用される条件は日常的なものであり、軟骨細胞のための条件を最適化してコラーゲンやその他の軟骨タイプの巨大分子を生成するための工夫は特にされていない。
2.1.成長因子及びホルモン
成長因子は、細胞代謝に対するパラクリンあるいはオートクリン作用を有し、軟骨細胞の分裂、マトリックス合成、及び分解を遅延させ、あるいは促進することができる。
2.1.1.形質転換成長因子−β
TGF−βは、多くの細胞型の増殖と分化を制御する関連ダイマータンパク質の成長ファミリーを指す（Barnardら,1990,Biochem.Biophys.Acta.1032:79−87;Massague,1990,Annu.Rev.Cell.Biol.6:597−619;Roberts and Sporn,1990,pp.419−472 M.B.Sporn and A.B.and Roberts（eds.）,Peptide Growth Factors and Their Receptors I,Springer−Verlag,Berlin）。このファミリーのメンバーとしては、TGFβ−１（Derynckら,1985,Nature316:701−705;Mosesら,1981,Cancer Res.41:2842−2848;Robertsら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78,5339−5343;Sharplesら,1987,DNA6:239−244）、TGF−β２（DeMartinら,1987,EMBO J.6:3676−3677;Hanksら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,79−82;Ikedaら,1987,Biochemistry26,2406−2410;Madisenら,1988,DNA7,1−8;Marquardtら,1987,Biol.Chem.262:12127−12131,Seyedinら,1987,J.Biol.Chem.262:1946−1949）、TGF−β３（Derynckら,1988,EMBO J.7:3737−3743;Jakowlewら,1988,Endocrinnol.2,747−755,TGF−β４（Jakowlewら,1988,Mol.Endocrinnol.2:1064−1069）、TGF−β５（Kondaiahら,1990,J.Biol.Chem.265:1089−1093）、より遠縁のMullerian阻害物質（Cateら,1986,Cell.45:685−698）、インヒビン（Masonら,1985,Nature318:659−663）、骨形態形成タンパク質（Wozneyら,1988,Science242:1528−1534）及びOP−１（Oezkaynakら,1990,EMBO J.9:2085−2093）が含まれる。新たに発見されたメンバーとしては、OP−２（Oezkaynakら,1992,J.Biol.Chem.267:25220−25227）、GDF−１（Lee,1990,Mol.Endocrinnol.4:1034−1040）;GDF−３及びGDF−９（McPherron and Lee,1993,J.Biol.Chem.268:3444−3449）及びNodal（Zhouら,1993,Nature361:543−546）がある。
TGF−βは、最初にその細胞増殖に対する効果について特性付けされた。これはラット腎臓繊維芽細胞の足場独立増殖を刺激し（Robertsら,1981）、またサル腎臓細胞の増殖を阻害した（Tuckerら,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6757−6761）。その後、種々の生物学的活性を有することが示されており、これは骨形成を促進し（Noda and Camilliere,1989,Endocrinnol.124:2991−2995;Joyceら,1990,J.Cell.Biol.110:2195−2207;Marcelliら,1990,J.Bone Mineral Res.5:1087−1096;Beckら,1991,J.Bone Mineral Res.6:961;Mackie and Trechsel,1990,J.Cell.Biol.110,2195−2207）、ラット筋肉細胞の軟骨特異的巨大分子の生成を誘発し（Seyedinら,1984,J.Biol.Chem.261:5693−5695;Seyedinら,1986,J.Biol.Chem.261:5693−5695;及びSeyedinら,1987,J.Biol.Chem.262:1946−1949）、初期造血前駆細胞（Goeyら,1989,J.Immunol.143;877−880）、Ｔ細胞（Kehrlら,1986,J.Exp.Med.163:1037−1050）、Ｂ細胞（Kasidら,1988,J.Immunol.141.690−698）、マウス表皮細胞（Pietenpolら,1990,Cell 61:777−785;Coffeyら,1988,Cancer Res.48:1596−1602）及びいくつかのヒト癌細胞系（Robertsら,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:119−123;Ranchalisら,1987,Biophys.Res.Commun.148:783−789）の増殖を阻害する。またコラーゲンとフィブロネクチンの合成と分泌を増加させ（Ignotz and Massague,J.Biol.Chem.261:4337−4345;Centrellaら,1987,J.Biol.Chem.262:2869−2874;Malemudら,1991,J.Cell Physio.149:152−159;Galeraら,1992,J.Cell Physio.153:596−606;Phillipsら,1994,Soc.Inv.Derm.103−2:228−232）、切開傷の回復を促進し（Mustoeら,1987,Science237:1333−1335）、マウス乳房移植物中でカゼイン合成を抑制し（Robinsonら,1993,J.Cell.Biol.120:245−251）、ラット肝臓上皮細胞においてDNA合成とpRbのリン酸化を阻害し（Whitson and Itakura,1992,J.Cell.Biochem.48:305−315）、BFGF結合プロテオグリカンの産生を刺激し（Nugent and Edelman,1992,J.Biol.Chem.267:21256−21264）、EGFレセプターのリン酸化と偏平上皮癌細胞の増殖を制御し（Goldkorn and Mendelsohn,1992,Cell Growth and Differentiation）、子宮上皮細胞（Rotelloら,1991,Proc.Natl,Acad.Sci.USA88:3412−3415）、培養肝細胞及び退化肝臓（Oberhammerら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5408−5412）においてアポプトーシスを起こし得る。また好中球の内皮への固着を阻害することにより（Leferら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1018−1022）再灌流障害に対して心臓保護をもたらし（Leferら,1990,Science249,61−64）、マウスにおける実験的な自己免疫疾患に対して保護を与える（Kuruvillaら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2918−2921）。
TGF−βの筋肉細胞及び軟骨細胞中における軟骨特異的巨大分子の産生を誘発する能力についての前記の報告とは対照的に、TGF−βが繊維芽細胞増殖因子と相乗的に作用して、ニワトリ胸骨軟骨細胞によるコラーゲンII型の合成を阻害すること（Hortonら,1989,J.Cell Physio.141:8−15）及びTGF−βがラット軟骨細胞でII型コラーゲンの産生を阻害すること（Rosenら,1988,J.Cell Physio.134:337−346）が見出されている。実際にTGF−βは、培養物中並びにin vivoにおいて殆どの正常細胞型の増殖の標準的阻害物質として現れ、非常に多様な生物学的活性を示す（Alexandrow,M.G.,and Moses,H.L.,1995,Cancer Res.55:1452−1457）。
TGF−β１はヒト及びブタ血液血小板から（Assoianら,1983）、あるいはヒト胎盤から（Frolickら,1983）精製されており、組換え体TGF−β１も現在では入手可能である（Gentryら,1988,Mol.Cell.Biol.7:3418−3427）。
2.1.2.インスリン様成長因子Ｉ及びII（IGF−Ｉ及びIGF−II）
インスリン単独では、コラーゲンマトリックス合成を刺激することにおいてIFG−Ｉよりもずっと活性が低い。しかしインスリンは、低濃度の血清（１％）の存在下においてプロテオグリカン合成を補強する。以前にはソマトメジンｃと呼ばれていたIGF−Ｉはin vitroにおいてコラーゲン及びプロテオグリカン合成の強力な誘発剤である（Lindahlら,1987,J.Endocrinnol.115:263−271;Markowerら,1989,Cell.Biol.Int.Rep.13:259−270）。
IGF−IIは、DNA及びRNA合成を刺激し、胎児細胞中でクローン増殖を刺激することにおいてIGF−Ｉよりも強力であり、一方IGF−Ｉは成人軟骨細胞に対してはより効果が高い。IGF−IIは、プロテオグリカン合成を刺激するが、インスリンと同様にIGF−Ｉよりもずっと効果が低い（McQuillanら,1986,Biochem.J.240:423−420）。
2.1.3.成長ホルモン（GH）
GHを非経口投与することにより、in vivoにおいて局所的な成長プレートの形成が刺激され得る。下垂体切除により成長プレート軟骨細胞におけるIGF−Ｉが消失し、合成が停止することを示している。一方、GHにより全身的あるいは局所的に処置すると、IGF−Ｉが出現する。GHのin vitroにおける細胞成長に対する直接の刺激効果についての報告（Maroら,1989,Endocrinnology125:1239−1445）はそれが効果を有していなかったとする報告（Burchら,1985,J.Clin.Endocrinnol.Motab.60:747−750）と矛盾している。
2.1.4.その他の成長因子
表皮成長因子（EGF）のみでは軟骨細胞増殖に対して効果を示さない。インスリンと共存すると、EGFは相乗的にプロテオグリカン合成を刺激し、軟骨細胞の増殖を誘発する（Osbornら,1989,J.Orthop.Res.7:35−42）。塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）は、胎児関節軟骨においてプロテオグリカン合成を阻害するが（Hamermanら,1986,J.Cell.Physiol.127:317−322）、成人関節軟骨においてはIGF−Ｉと付加的に機能し、プロテオグリカン合成を刺激するようである（Osborn,K.D.,ら,1989,J.Orthop.Res.7:35−42）。血小板由来増殖因子（PDGF）もプロテオグリカン合成を刺激する（Prinsら,1982,Arthritis Rheum.25:1228−1238）。
3.発明の概要
本発明は、in vitroにおける軟骨の増殖及び調製に関わり、これらはin vivoにおいて種々の目的に使用できる。本発明によれば、軟骨特異的巨大分子と細胞外マトリックスタンパク質を生成する間質細胞を、三次元枠組みあるいは生物分解性の骨組み上に接種し、増殖させる。骨組み上に接種された間質細胞は、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞様細胞、及び／または軟骨組織内で典型的に生産されるコラーゲンII型及びその他のコラーゲン型及びプロテオグリカンを生産できる細胞を含むものとすることができる（下記表Ｉ参照）。間質細胞及び間質細胞により分泌された結合組織タンパク質は、三次元的構造に形成された生物適合性の非生存物質からなる三次元的骨組みあるいは構築物に付着して実質的にそれを包み、前記構造の間隙は前記間質細胞により橋かけされる。そのようにして形成された生存間質細胞により、in vivoで移植された培養物及び／または複数の培養物中での間質細胞の長期間の活性な増殖を維持するのに必要な支持体、成長因子、及び調節因子が与えられる。この三次元系で増殖させると、増殖細胞は成熟し適当に分離してin vivoにおける対応物に類似した成人組織の成分を形成する。
本発明の別の態様においては、間欠的な圧力変化を可能とするように操作できる任意の容器、あるいは増殖の間にチャンバーを加圧し、対流により栄養物を間質細胞に適当に供給できる、軟骨細胞構築物のin vitro製造のために特別に設計されたバイオリアクター系中に置いた三次元枠組み上に間質細胞を接種し増殖させる。
本発明のまた別の態様においては、アスコルベートの存在下または不在下で培養物に外来物として添加された成長因子、例えばTGF−βを使用して間質細胞を刺激して軟骨を生成させる。あるいは、移植後に上首尾な及び／または改善された軟骨生成量を得るために間質細胞を遺伝子操作して特定のタイプのTGF−β（例えばTGF−β１）の遺伝子を発現させることができる。
本発明のさらに別の態様においては、間質細胞を遺伝子操作して、上首尾な及び／または改善された移植を得るのに好適な遺伝子産物を発現させることができる。例えば、間質細胞を遺伝子操作して抗炎症性遺伝子産物を発現させ、炎症性反応により軟骨の破壊を生じるリウマチ関節炎のような変性疾患の危険性を低下させることができる。例えば間質細胞を操作して、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン−２（IL−２）、あるいはその他の炎症性サイトカイン及びメディエーターの中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドあるいはポリペプチドを発現させることができる。好ましくは、前記細胞を操作してそのような遺伝子産物を手術後の回復期の間に一時的に発現させ、及び／または誘導可能な制御下に発現させ、あるいは間質細胞に固定されたキメラ融合タンパク質、例えば細胞外ドメインとしての遺伝子産物に融合した、受容体または受容体様分子の細胞内及び／または膜貫通ドメインからなるキメラ分子として発現させる。
また別の代替的態様においては、間質細胞を遺伝子操作して、拒絶反応、あるいは老化、リウマチ疾患あるいは炎症による関節軟骨における変性変化を促進する因子の発現を「ノックアウト」するようにすることができる。例えば、GM−CSF、TNF、IL−１、IL−２及びサイトカインのような前炎症メディエーターの間質細胞中での発現をノックアウトして炎症の危険性を低減することができる。同様に、MHCクラスII分子の発現をノックアウトして軟骨移植物の拒絶反応の危険を低減することができる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明の三次元培養系により、in vivoで遺伝子あるいは遺伝子産物を導入して移植の結果及び／または遺伝子治療における使用を助け、あるいは改善するためのベヒクルが得られる。例えば、リウマチ疾患あるいは炎症反応及び骨再吸収のような軟骨における変性変化の症状を防止し、あるいは軽減する遺伝子は、疾患条件下で、及び／または老化により過少発現され得、あるいは過剰発現され得る。従って、患者中の遺伝子活性のレベルを、遺伝子操作された間質細胞中の活性遺伝子産物のレベルを調整することによる遺伝子置換療法により、増加または減少させることができる。
下記第６〜８節において実施例により例示する本発明の特定の態様においては、ニュージーランドウサギあるいは雌ウシの関節軟骨からの軟骨細胞を、単層での培養、あるいはポリグリコール酸、ポリ乳酸あるいはその他のポリマーのようなポリマーの殺菌したものから形成された三次元的な生物分解性の生体適合性繊維枠組みまたは骨組み上での培養で増殖させた。枠組みは、組織植え付け部位に植え付けられるまで、細胞に適当な栄養とガス交換が与えられるように設計した。化学的方法あるいは照射により滅菌された生物分解性ポリマー中で、軟骨の増殖を阻害することなく、培養物を無菌条件下に維持することが特に有利であった。外来TGF−β１を三次元的培養物に添加し、軟骨細胞の大幅に増加した増殖と分化を得た。培養された軟骨は、グリコサミノグリカン、コラーゲンＩ及びIIについて軟骨構築物を組織学及び免疫組織化学、生化学的定量、ノーザンブロット分析及び免疫ブロット法により分析することにより特性化した。
【図面の簡単な説明】
図１は、TGF−β１の存在下あるいは非存在下にin vitroで増殖させたウサギ軟骨組織の写真である。
図２は、TGF−β１の非存在下にin vitroで増殖させ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した軟骨組織の写真である。
図３は、TGF−β１の存在下にin vitroで増殖させ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した軟骨組織の写真である。
図４は、TGF−β１の非存在下にin vitroで増殖させ、トリクロームで染色した軟骨組織の写真であり、コラーゲンの存在を示すものである。
図５は、TGF−β１の存在下にin vitroで増殖させ、トリクロームで染色した軟骨組織の写真であり、コラーゲンの存在を示すものである。
図６は、TGF−β１の非存在下にin vitroで増殖させ、アルカンブルーで染色した軟骨組織の写真であり、グリコサミノグリカンの存在を示すものである。
図７は、TGF−β１の存在下にin vitroで増殖させ、アルカンブルーで染色した軟骨組織の写真であり、GAGの存在を示すものである。
図８は、TGF−β１の存在下あるいは非存在下にin vitroで８週間増殖させた後の軟骨の写真である。
図９は、対照、FGF−処置及びTGF−β１−処置した軟骨の培養物における、照射滅菌したメッシュ上で増殖された軟骨の写真である。
図10:TGF−β及びアスコルベートはウシ関節軟骨細胞の増殖を増加させる。
図11:ウシ関節軟骨細胞溶解物中のコラーゲンII型及びGAGの検出。
A.  ウシ関節軟骨細胞を、添加物を含まない（レーン１及び５）、アスコルベートを含む（50μg/ml、レーン２及び６）、TGF−βを含む（20ng/ml、レーン３及び７）、あるいはTGF−β＋アスコルベートを含む（レーン４及び８）、完全培地中で増殖させた。細胞溶解物を調製し、SDS−PAGEにより分画化し、抗コンドロイチン硫酸抗体（抗−CS、レーン１〜４）あるいは正常ウサギ血清（NRS、レーン５〜８）を使用した免疫ブロット法により分析した。
B.  ウシ関節軟骨細胞溶解物をパネルＡと同様に分画化し、コラーゲンII型に対する抗体（レーン１〜４）あるいは正常ウサギ血清（レーン５〜８）で免疫ブロットした。レーン１及び５は添加物なし、レーン２及び６はアスコルベート添加、レーン３及び７はTGF−β添加、レーン４及び８はTGF−β及びアスコルベート添加である。
C.  未処理（レーン１）、アスコルベートで処理（50μg/ml、レーン２）、TGF−βで処理（20ng/ml、レーン３）あるいはTGF−β及びアスコルベートで処理（レーン４）した軟骨細胞からRNAを調製し、材料と方法において記載したように抗コラーゲンII型プローブを使用したノーザンブロットにより分析した。
図12:軟骨構築物の免疫組織化学的染色。試料を、正常ウサギ血清（パネルＡ及びＢ）、抗コラーゲンＩ型（パネルＣ及びＤ）、あるいは抗コラーゲンII型（パネルＥ及びＦ）で染色した。パネルＡ、Ｃ及びＥに示した試料はTGF−βなしに増殖させ、パネルＢ、Ｄ及びＦに示した試料はTGF−βとともに増殖させた。
図13:PGA骨組み上で増殖させたウシ軟骨細胞により生成された軟骨様組織。ウシ軟骨細胞をPGA骨組み上に接種し、材料と方法において記載したようにTGF−βとともに（20ng/ml、パネルＡ）あるいはなしに（パネルＢ）３週間増殖させた。
図14:in vitro軟骨組織のヘマトキシリン及びエオシン染色。試料を切片にし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。パネルＡ及びＢに示した試料はTGF−βなしに増殖させ、パネルＣ及びＤに示した試料はTGF−βとともに増殖させた。
図15は静止条件下で増殖させた軟骨構築物Ａ、及びバイオリアクター中で増殖させた構築物Ｂの写真である。
図16はバイオリアクター中で生成し、ヘマトキシリン／エオシン（Ａ及びＢ）、トリクローム染色（Ｃ及びＤ）、アルカンブルー（Ｅ及びＦ）及びサフラニンＯ（Ｇ及びＨ）で染色した軟骨を示す。パネルＩ及びＪは静止条件下で増殖させた軟骨試料についてのヘマトキシリン／エオシン及びトリクローム染色を示す。
図17:ウシ関節軟骨細胞溶解物の免疫ブロット法。ウシ軟骨細胞からの細胞溶解物を、抗Ｉ型コラーゲン（レーン１）、抗II型コラーゲン（レーン２）、正常ヤギ血清（レーン３）、抗バーシカン（レーン４）、正常ウサギ血清（レーン５）、抗コンドロイチン硫酸（レーン６）、正常マウス血清（レーン７）を使用したウェスタンブロット法により調べた。
図18:軟骨構築物の免疫組織化学的染色。バイオリアクター中で製造した軟骨構築物を免疫組織化学的分析用に処理し、抗II型コラーゲン（Ａ）、抗コンドロイチン（Ｂ）、抗Ｉ型コラーゲン（Ｃ）、及び正常ウサギ血清（Ｄ）により染色した。
5.  発明の詳細な説明：細胞増殖及び適当な細胞成熟化の刺激
本発明により、間質細胞を三次元枠組みネットワークあるいは骨組み上に接種し、培養物中で増殖させて生存軟骨材料を形成する。間質細胞は、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞あるいは繊維芽細胞様細胞を含んでもよく、本明細書中により詳細に記載した別の細胞及び／または成分を含んでもよく含まなくてもよい。間質を含む軟骨細胞、繊維芽細胞様細胞及びその他の細胞及び／または成分は胎児あるいは成人に由来するものでよく、軟骨、皮膚等のような入手しやすいソースから得たものでもよい。このような組織及び／または器官は適当な生検によりあるいは剖検の際に得ることができ、死体器官を使用して間質細胞及び成分の豊富な供給を与えることができる。あるいは臍帯及び胎盤組織あるいは臍帯血を、本発明の三次元系において使用するための胎児型の間質細胞、例えば軟骨前駆細胞及び／または繊維芽細胞様細胞の有利な供給源とすることができる。
胎児繊維芽細胞及び／または軟骨細胞を枠組み上に接種して、種々の細胞及び組織の任意のものを培養するための、「属の（generic）」生存間質組織を形成することができる。しかしいくつかの場合においては、「属の」間質系ではなく「種の「specific）」間質系を使用することが好ましい場合もあり、このような場合は間質細胞及び成分は特定の組織、器官あるいは個体から得ることができる。例えば、三次元培養物をin vivoでの移植や内植の目的に使用する場合には、間質細胞及び成分を移植物あるいは内植物を受容する個体から得ることが好ましい場合があり得る。この方法は、移植物及び／またはグラフト対宿主疾患の免疫学的拒絶反応が起こりそうな場合に特に有利であり得る。
三次元マトリックスあるいは枠組み上に接種すると、間質細胞はその枠組み上で増殖し、in vivoで使用できる生存間質組織を形成する。この三次元生存間質組織は、培養物の活性な増殖を長期間維持する。メッシュの開口が培養物中の間質細胞の出口となるので、集密状態の間質培養物は接触阻害を示すことがなく、間質細胞は増殖、分裂を続け、機能的に活性を維持する。
三次元培養物中での軟骨の製造は、間欠的な加圧と対流による間質細胞への栄養物の適当な供給により改善することができる。
成長因子は間質支持体マトリックスにより生成されるので必要ない。しかし、限定するものではないが、TGF−β及びアスコルベートのような成長調節因子を培養物に添加することができる。本発明によれば、軟骨にin vivoで見られる細胞微細環境を培養物中で再現することが重要なので、in vivoの移植あるいはin vitroでの使用の前に間質細胞を増殖させる程度は変化し得る。さらに、この系で増殖した間質細胞を遺伝子操作して、移植物に有利な遺伝子産物、例えば抗炎症因子、例えば抗GM−CSF、抗TNF、抗IL−１、抗IL−２等を産生させることができる。あるいは、間質細胞を遺伝子操作することにより、炎症を促進する天然の遺伝子産物、例えばGM−CSF、TNF、IL−１、IL−２の発現を「ノックアウト」し、あるいはNHCの発現を「ノックアウト」して拒絶反応の危険性を低減することができる。さらに、間質細胞を遺伝子治療に使用するために遺伝子操作して、患者中の遺伝子活性のレベルを調整し、軟骨移植の結果を改善するのに役立てることができる。
三次元培養物は、医薬物質の有効性や細胞毒性を試験することや化合物のスクリーニングにin vitroで使用することもできる。
また別の用途においては、前記三次元培養系を「バイオリアクター」中で使用して、天然の軟骨組織が典型的に経験するような環境的条件下に組織を培養することにより、天然のヒト軟骨組織の重要な生化学的、物理的、及び構造的特性を備えた軟骨組織構築物を生成することができる。前記三次元培養系を間欠的及び周期的な加圧状態に維持し、軟骨細胞に対流により栄養物を適当に供給する。圧力により微多孔質三次元軟骨構築物を通る液体流が促進され、これにより栄養物の供給と構築物に埋め込まれた細胞からの排泄物の除去が促進される。
出願人は発明が機能するメカニズムを説明する義務を課せられるものではないが、前記三次元培養系の効果に貢献するその内在的な要因としては以下のようないくつかの点が挙げられる。
（ａ）前記三次元マトリックスによりタンパク質が結合するためのより大きい表面積が得られ、従って間質細胞が付着するためのより大きい表面積が得られる。
（ｂ）増殖が集密状態に達すると接触阻害を起こし増殖と分裂が停止する単層培養における細胞とは異なり、マトリックスの三次元性により間質細胞は活発に増殖を続ける。間質細胞が複製することにより成長及び調節因子が生成されることは、培養物中の細胞の増殖を刺激し、分化を制御する一つの要因である。
（ｃ）前記三次元マトリックスにより、in vivoの対応する組織に見られるものにより類似した細胞成分の空間分布が得られる。
（ｄ）前記三次元系においては細胞増殖のための可能な容量が増加することにより、細胞成熟化に導く局所的な微細環境が得られる。
（ｅ）前記三次元マトリックスは、付着層中におけるマクロファージ、単球及び可能性のあるものとしてリンパ球等のような移動性細胞の動きをより可能なものとすることにより、細胞−細胞相互作用を最大限に引き出す。
（ｆ）分化した細胞表現型を維持するには、成長／分化因子だけではなく、適当な細胞相互作用も必要であることが認められている。本発明によれは組織微細環境が効果的に再現される。
前記三次元間質支持体、培養系そのもの、及びその維持、並びに前記三次元培養物の種々の使用を以下の下位文節により詳細に記載する。
三次元軟骨細胞培養物には、培養物をプラスチックバッグに入れ、単に出口バルブをつまむかはさんで収容して、より高くした圧縮力を形成することにより、間欠的な加圧をかけることができる。軟骨細胞は細胞分裂のレベルにおいて周囲圧力に反応する。DNA合成の増加を伴うプロテオグリカンのレベルの増加が見られる。
本発明の三次元軟骨培養物は、間欠的で周期的な加圧を形成するための特別な装置であるバイオリアクター中に維持され、軟骨細胞には対流により適当に栄養物が供給される。構築物の見かけ密度が増加する間に、約２〜5mmの厚さの置換軟骨組織構築物全体にわたって軟骨細胞への栄養物の適当な供給を維持することが非常に重要である。バイオリアクターは、限定するものではないが、「ピストン型」、硬質プラスチックバイオリアクター、ベロー、「加圧プレート」を有する軟質プラスチックバッグ、「ローラーピン」を有する軟質プラスチックバッグ等の様々な設計とすることができる。
5.1.  三次元間質組織の製造
三次元枠組みは、（ａ）細胞がそれに付着可能であり（または細胞がそれに付着可能となるように修飾できる）、（ｂ）１より多い層で細胞を増殖させ得る、任意の材料及び／または形態のものとすることができる。多数の種々の材料をマトリックスを形成するのに使用でき、限定するものではないが、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えばポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（PVC）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE、テフロン）、サーマノックス（TPX）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（PGA）、コラーゲン（スポンジ、組紐、編んだ糸等の形態）、ガット縫合糸、セルロース、ゼラチン、その他の生物分解性天然物質あるいは合成物質、例えば種々のポリヒドロキシアルカノエート等が挙げられる。これらの材料はいずれも例えばメッシュ状に編んで三次元枠組みあるいは骨組みを形成することができる。ナイロン、ポリスチレン等のある種の材料は細胞付着性に乏しい基材である。このような材料を三次元枠組みに使用する場合には、間質細胞を接種する前にマトリックスを予備処理して間質細胞のマトリックスに対する付着力を強化しておくことが望ましい。例えば、間質細胞を接種する前に、ナイロンマトリックスを0.1M酢酸で処理し、ポリリシン、PBS及び／またはコラーゲン中でインキュベートしてナイロンを被覆することができる。ポリスチレンも硫酸を使用して同様に処理できる。培養物を長期間維持する場合や低温保存する場合には、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿等の非分解性材料が好ましい。本発明に使用できる好適なナイロンメッシュは、210μｍの平均孔径と90μｍの平均ナイロン繊維径を有するナイロン濾過メッシュであるNitex（＃３−210/36 Tetko,Inc.,N.Y.）である。
三次元培養物そのものを体内に移植する場合には、例えばポリグリコール酸、ガット縫合糸材料、コラーゲン、あるいはゼラチン等のような生物分解性マトリックスを使用することが好ましい。ポリグリコール酸は通常は、エチレンオキサイドあるいは電子ビームの照射により製造の間にin vitroで長時間滅菌される。残念ながらこのような方法はいずれも三次元培養マトリックス上で増殖する細胞に有害な影響を与える。例えばエチレンオキサイドは培養物中の細胞にとって毒性であり、従って電子ビーム処理が好ましい。しかし、電子ビームでの処理により細胞が適当な細胞外マトリックスに付着する前に枠組みから脱落してしまう。培養細胞にTGF−βを添加することによりこの問題は克服される。
軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞あるいは繊維芽細胞様細胞を、下記のその他の間質細胞及び成分とともにあるいはなしに含む間質細胞を枠組み上に接種する。TGF−βのような成長因子を、間質細胞の接種の前、その間、あるいはその後に培養物に添加することができる。培養物中に維持されるTGF−βの濃度をモニターし調整して、増殖を最適なものにすることができる。あるいはTGF−βを発現し生産するように遺伝子操作された宿主細胞を接種物中に含有させることができ、このような細胞は遺伝子操作された間質細胞を含むものとし得る。このような細胞は培養物中のTGF−βあるいはその他のタンパク質因子の供給源となる。好ましくは、TGF−βの遺伝子あるいはコード配列を制御されたプロモーターの制御下に置き、培養物中のTGF−βの生産を制御できるようにすることが好ましい。遺伝子操作された細胞をスクリーニングして、１）リウマチ疾患あるいは炎症反応の症状をin vivoで軽減する細胞型、２）免疫学的監視をくぐり抜け拒絶反応を受けない細胞型を選択することができる。
軟骨細胞のような間質細胞は、生検（適切な場合）により得られるかまたは剖検の際に得られる関節軟骨、肋軟骨などから誘導し得る。繊維芽細胞は包皮あるいは適当な死体の器官からむしろ都合よく多量に得ることができる。繊維芽細胞様の細胞、軟骨前駆細胞を含む胎児細胞は、臍帯もしくは胎盤組織または臍帯血から得られる。このような胎児間質細胞を用いて「属の（generic）」間質または軟骨組織を調製できる。しかしながら、「種の（specific）」間質組織は、本発明の三次元系にしたがって培養増殖させた細胞および／または組織を受け取るには比較的遅い特定個体からの繊維芽細胞を三次元マトリックスに接種することにより調製し得る。
繊維芽細胞は繊維芽細胞の供給源として利用される適当な器官または組織を解離することにより容易に単離し得る。これは当業者に公知の技術を用いて簡単に行える。例えば、組織や器官を機械的に解離させ、かつ／また、隣接細胞間の結合を弱めて、著しい細胞破壊を起こすことなく組織を個々の細胞の浮遊液中に分散させることを可能にする消化酵素および／またはキレート剤で処理する。酵素的解離を行うには、組織を細かに切り刻み、刻んだ組織を多くの消化酵素のいずれか１種または酵素の組合せで処理する。これらにはトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、DNアーゼ、プロナーゼなどが含まれ、これらに限らない。機械的破壊も多くの方法で行えるが、2,3の名を挙げると、粉砕機、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、加圧セル、またはソニケーター（音波処理装置）があるが、これらに限らない。組織解離技術に関しては、Freshney,Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique,2d ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.9,pp.107−126を参照のこと。
繊維芽細胞様の細胞もヒト臍帯（33〜44週）から単離し得る。新鮮な組織を小片に細かく切り、媒体で洗うかまたは使用に供するまで液体窒素中で急速凍結する。臍帯組織は上記のように解離することができる。
ひとたび組織が個々の細胞の浮遊液に調製されたら、その浮遊液はサブ集団に分画化され、そこから繊維芽細胞および／または他の間質細胞および／または成分が得られる。これはまた、特定の細胞型のクローニングおよび選択、望まない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合集団中の異なる細胞凝集能に基づく分離、凍結−融解法、混合集団中の細胞の異なる付着性、濾過、通常の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心エルトリエーション（向流遠心分離）、ユニット重力分離、向流分配、電気泳動および蛍光活性化セルソーティングを含むがこれらに限らない標準的な細胞分離技術を使っても行える。クローン選択および細胞分離技術に関しては、Freshney,Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Techniques,2nd Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.11 and 12,pp.137−167を参照のこと。
軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞または繊維芽細胞様細胞の単離は例えば次のように行うことができる。新鮮な組織サンプルを十分に洗い、血清を除くためにハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中で細かく切り刻む。刻んだ組織はトリプシンのような解離性酵素の新たに調製した溶液中で１〜12時間インキュベートする。インキュベーション後、解離細胞を懸濁し、遠心によりペレット化し、その後培養皿にまく。全ての繊維芽細胞は他の細胞の前に付着し、したがって、適当な間質細胞を選択的に単離し増殖させることができる。次に、単離した間質細胞を集密的に増殖させ、その集密培養物から取り上げて三次元支持体に摂取する（Naughtonら,1987,J.Med.18（３＆４）:219−250）。三次元マトリックスに高濃度の間質細胞（例えば約106〜５×107個/ml）を接種すると、比較的短時間で三次元間質支持体が樹立されるだろう。
軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞または繊維芽細胞様細胞のほかに、他の細胞を加えて、培養下での長期増殖に必要とされる三次元間質組織を形成することができる。例えば、疎性結合組織中に存在する他の細胞を、軟骨細胞や繊維芽細胞とともに三次元支持体に接種し得る。こうした細胞としては、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞などが挙げられるが、これらに限らない。これらの間質細胞は上述したような当分野で知られた方法を用いて臍帯、胎盤または臍帯血を含む適当な器官から容易に得ることができる。
この場合も、培養細胞を体内移植または植込みに使用することを予定している場合は、その間質細胞を患者自身の組織から得ることが好ましい。三次元支持体上での細胞の増殖は、その枠組みにタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、および／または他の物質を加えるかまたは被覆することにより、さらに高めることができる。
間質細胞の接種後、三次元マトリックスは適当な栄養培地中でインキュベートすべきである。多くの市販培地、例えばRPMI 1640、Fisher's、Iscove's、McCoy'sなどを用いるのが好ましい。三次元間質マトリックスは増殖活性を最高にするためにインキュベーション期間中培地につり下げるか浮かべることが重要である。さらに、使用済み培地を除き、遊離細胞を減らし、そして新鮮な培地を供給するために、培養物を周期的に「フィード（feed）」すべきである。これらの段階の間、TGF−βの濃度を調整し得る。軟骨細胞の培養のためには、非必須アミノ酸のプロリンとアスコルベートも培養物中に加えられる。
これらの方法は、間質細胞を接種した三次元枠組みを収容する密閉系のバイオリアクターを用いて行うとき、非常に促進される。バイオリアクターは汚染の可能性を減らし、間欠的および周期的加圧下に培養物を維持して、軟骨組織構築物のあらゆる軟骨細胞に十分な栄養を対流によって供給する環境条件を作りだす。
インキュベーション期間中、間質細胞は三次元マトリックスに沿って直線的に増殖し、該マトリックスを取り囲んで集落化し、その後マトリックスの開口部へと増殖し始めるだろう。細胞を増殖させるうえで大切なことは、組織特異的細胞を有する間質組織を接種するに先立って、生体組織に存在する間質細胞の量を反映する程度に該細胞を増殖させることである。
枠組みの開口部は、間質細胞が開口部を横切って伸びることができるような適当な大きさとすべきである。枠組みを横切って伸び、活発に増殖している間質細胞を維持することは、間質細胞によって作り出される成長因子の生産を高め、それゆえ、長期培養物を支持するだろう。例えば、開口部が小さすぎると、間質細胞は急速に集密状態に達するが、メッシュから容易に出ることができない。捕捉された細胞は接触阻害を示して、増殖の支持および長期培養の維持に必要な諸因子の生産を中止してしまう。開口部が大きすぎると、間質細胞は開口部を横切って伸びることができない。これも増殖の支持と長期培養の維持に必要な諸因子の間質細胞による生産を低減させるだろう。メッシュ型のマトリックスを使う場合は、ここに示すように、約150μｍから約220μｍの範囲の開口部がうまくいくことが判明した。しかしながら、三次元構造および枠組みの複雑さに応じて、他のサイズも同様にうまくいくかもしれない。実際、間質細胞を伸長させ、長期間の複製および増殖を持続させる形状または構造はどれも本発明にしたがって有効に使用できる。
枠組みに付着された、さまざまな割合の、さまざまな型のコラーゲンは、その後に接種される組織特異的実質細胞の増殖に影響を及ぼし得る。三次元皮膚培養系においては、コラーゲンＩ型およびIII型を初期マトリックスに付着させることが好ましい。付着させるコラーゲン型の割合は、適当なコラーゲン型を作り出す繊維芽細胞を選択することにより手加減したり、増強したりできる。これは補体を活性化し得る適当なイソタイプまたはサブクラスのモノクローナル抗体（特定のコラーゲン型を規定する）を用いて行われる。こうした抗体および補体を用いると、希望のコラーゲン型を発現している繊維芽細胞をネガティブ選択することができる。これとは別に、マトリックスに接種するために用いられる間質は希望のコラーゲン型を合成する細胞の混合物であってもよい。５種類のコラーゲン型の分布および由来を表Ｉに示す。
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したがって、培養すべき組織および希望のコラーゲン型に応じて、適当な間質細胞が三次元マトリックスに接種するために選択される。例えば、軟骨の増殖および調製のためには、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞または繊維芽細胞様細胞を使用すべきである。
三次元間質支持体のインキュベーション中に、増殖性細胞がマトリックスから遊離することがある。これらの遊離細胞は培養容器の壁面に付着し、そこで増殖し続けて集密単層を形成する。これは、例えばフィーディング（feeding）の間に遊離細胞を取り除くか、または三次元間質マトリックスを新しい培養容器に移すことにより、防止または排除すべきである。容器内に集密単層が存在すると、三次元マトリックスおよび／または培養物中の細胞の増殖が「シャットダウン（shut down）」されるだろう。集密単層を取り除いたり、新しい容器内の新鮮培地にマトリックスを移したりすると、三次元培養系の増殖活性が回復する。こうした除去や移転は間質単層の集密度が25％を越えたあらゆる培養容器において行われるべきである。また、遊離細胞が付着するのを防ぐために培養系を攪拌したり、培養物の定期的フィーディングの代わりに、新鮮な培地が対流によって系内を連続的に流れるように培養系を設計することもできよう。三次元培養物内での増殖を最大にすると同時に、マトリックスからの遊離細胞を流出させて除去するために流速を調整することができ、その結果、遊離細胞が容器の壁面にくっついて増殖し、集密状態になることはないだろう。いずれの場合にも、遊離した間質細胞を回収して、今後使用するために凍結保存することができる。
5.2.  三次元培養系の使用
本発明の三次元培養系はさまざまな用途において使用できる。それらには、2,3の例を挙げると、マトリックスから得られた培養細胞または培養マトリックスそのものの体内移植または植込み；化合物、アレルゲン、成長／調節因子、医薬品化合物などの有効性および細胞毒性のin vitroスクリーニング；ある種の疾病のメカニズムの解明；薬剤および／または成長因子が機能する作用機序の研究；がんの診断およびモニター；遺伝子治療；および生物学的活性産物の生産が含まれるが、これらに限らない。
5.2.1.  体内移植
本発明の三次元培養系において作られた生物学的置換軟骨組織構築物は、すでに存在する軟骨組織を置換したり増やすために、新組織または改変組織を導入するために、人工装具を修飾するために、あるいは生体組織または構造を接合するために使用することができる。例えば、制限するものではないが、本発明の特定の実施態様は、ｉ）三次元培養系で増殖させた置換軟骨組織構築物を被覆した人工股関節、ii）軟骨組織構築物による膝の再構成、およびiii）関節軟骨の再構成および／または置換を必要とする他の関節の人工装具を含むものである。
膝、股関節、肘、足首および上腕関節を含めた、いくつかの関節における関節軟骨の内部障害の検査は関節鏡検査法により可能となった。関節鏡を用いた外科手術は次第に一般的になりつつあり、成功を収めている。例えば、膝には直径３〜4mmの小型の切断器具が多数用いられる。手術器具が関節鏡の視野に入ってくる三角法（triangulation）は複数の入口を必要とする。また、切断器具は関節鏡自体のチャンネルを通過させることもでき、その場合は関節にただ一つの開口を必要とする（Jackson,R.W.,1983,J.Bone Joint Surg.［AM］65:416）。関節鏡手術による損傷部または変質部の選択的切除と、その後の軟骨移植は成功裏に行うことができる。軟骨組織構築物はいろいろなタイプの関節の再構成手術にも用いることができる。手術法の細部はResnick,D.and Niwayama,G.編,1988,Diagnosis of Bone and Joint Disorders,2d ed.,W.B.Sanders Co.に記載されている。
三次元組織培養移植片は、本発明にしたがって、既存の組織を置換したり増やすために、新組織または改変組織を導入するために、または生体組織もしくは構造を一緒に接合するために使用される。
5.2.2.  化合物の有効性および細胞毒性のin vitroスクリーニング
三次元培養物は薬剤、成長／調節因子、抗炎症剤などの有効性および細胞毒性について多種多様な化合物をスクリーニングするためにin vitroで用いられる。この目的のためには、培養物でin vitroで維持して試験化合物にさらす。細胞毒性化合物の活性は培養細胞を傷つけたり死滅させるその能力により測定できる。これは生体染色法により簡単に検査できる。成長／調節因子の作用は、例えば、全細胞を計数してカウント数の差を調べることによるマトリックスの細胞量の分析により評価できる。これは型特異的細胞抗原を規定する抗体を用いる免疫細胞化学的手法の使用を含めた標準細胞学的および／または組織学的方法を使って行うことができる。三次元系で培養した正常細胞に対する各種薬剤の効果も評価できる。
本発明の三次元培養物は生理学的または病理学的状態を研究するためのモデル系として使用できる。例えば、固定化された関節は多くの点で比較的すみやかに傷害を受ける。プロテオグリカンの減少と水分量の増加がすぐに観察されるので、軟骨細胞の代謝活性が影響を受けるようである。軟骨の自然な白色の、輝くような外観が鈍い青みがかった色に変化し、軟骨の厚みが減少する。しかしながら、このプロセスのいかほどが栄養欠乏によるもので、いかほどがストレス依存性代謝的ホメオスタシスの混乱によるものなのかは、まだはっきりしていない。三次元軟骨細胞培養系は、異なる物理的条件（例えば、間欠的加圧および軟骨構築物への栄養培地のポンプ輸送作用による）の下での軟骨の栄養要求を調べるために使用できる。これは関節軟骨（例えば膝関節）の引張力の加齢に伴う低下または損傷に伴う低下（弱体化した軟骨が外傷を受けやすくなる）の根本原因を究明する上で特に有用である。
本発明によると、三次元軟骨細胞培養物は、リウマチ病において滑液中に放出されるサイトカインや他の前炎症伝達物質（例えば、IL−１、TNFおよびプロスタグランジン）の作用機構を研究するためにも使用できる。患者自身の関節液をin vitroで用いることにより、これらの化合物が軟骨細胞の増殖に及ぼす効果を研究したり、また、特定患者に最も有効な細胞毒剤および／または薬剤、すなわち軟骨の吸収を妨げて関節軟骨の釣り合いのとれた増殖を高めるもの、をスクリーニングすることができる。こうした薬剤はその後患者を治療するために用いられる。
5.2.3.  遺伝子工学的に操作した軟骨
本発明の三次元培養系は、移植を助けたりその結果を向上させるために、かつ／また、遺伝子治療において使用するために、遺伝子と遺伝子産物をin vivoで導入するための運搬体（ベヒクル）を提供する。例えば、抗炎症性遺伝子産物を発現するように間質細胞を遺伝子操作すると、リウマチ様疾患の炎症反応による軟骨の欠損または変性変化の危険度を少なくすることができる。これに関連して、間質細胞は抗炎症性遺伝子産物、例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、TNF、IL−１、IL−２または他の炎症性サイトカインに対する中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチド、を発現するように遺伝子操作される。IL−１はプロテオグリカンやII、IX、XI型コラーゲンの合成を低下させることが示されている（Tylerら,1985,Biochem.J.227:869−878;Tylerら,1988,Coll.Relat.Res.82:393−405;Goldringら,1988,J.Clin.Invest.82:2026−2037;Lefebvreら,1990,Biophys.Acta.1052:366−372）。また、TNFもプロテオグリカンとII型コラーゲンの合成を阻害するが、IL−１ほど強力ではない（Yaron,I.ら,1989,Arthritis Rheum.32:173−180;Ikebe,T.ら,1988,J.Immunol.140:827−831;Saklatvala,J.,1986,Nature 322:547−549）。
好ましくは、細胞は、このような遺伝子産物を手術後の回復期間に一時的におよび／または誘導可能な制御下に発現するように、または間質細胞に固着されたキメラ融合タンパク質、例えば細胞外ドメインとしての遺伝子産物に融合された受容体または受容体様分子の細胞内および／または膜貫通ドメインからなるキメラ分子として発現するように遺伝子操作される。他の実施態様では、間質細胞は患者が欠失している遺伝子または治療効果を発揮すると思われる遺伝子（例えば、軟骨の生産を刺激するTGF−βなど）を発現するように遺伝子操作される。間質細胞に導入される対象の遺伝子はリウマチ様疾患や関節疾患に関係があるものでなければならない。
間質細胞は宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに用いる遺伝子を含む組換えDNA構築物を使って遺伝子操作することができる。宿主細胞はその後クローニングして、三次元培養系でクローン的に増殖される。活性遺伝子産物を発現する三次元培養物はその産物が不足している個体に移植される。例えば、さまざまなタイプのリウマチ様または関節疾患の症状を防いだり軽減したりする遺伝子が病気の状態の下では不十分に発現（underexpress）されるか、またはダウンレギュレート（down regulate）される。特に、リウマチ様または関節疾患における炎症反応の防止に関与する遺伝子の発現がダウンレギュレートされる。また、リウマチ様または関節疾患の上記病理学的状態の一部または全部の症状発現と、その結果としての徴候の発症に結びつく遺伝子産物の活性が弱められる。かくして、遺伝子活性のレベルが存在する遺伝子産物のレベルを増加させるか、または三次元培養系中に存在する活性遺伝子産物のレベルを増加させるかのいずれかにより増大される。その後、活性標的遺伝子産物を発現する三次元培養物は、その産物が不足しているリウマチ様または関節疾患の患者に移植される。ここで用いる「標的遺伝子」とは、標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルのモジュレーションが、軟骨の吸収および軟骨細胞による炎症伝達物質の生産を防止することによりリウマチ様または関節疾患の症状を軽減するように作用する方法でリウマチ様または関節疾患に関与する遺伝子のことである。
さらに、患者は軟骨移植後の回復期間中に遺伝子置換療法で治療することもできる。置換軟骨組織構築物またはシートは個々の患者の要件を満たすように特別に設計され、例えば、１以上の遺伝子を調節するように間質細胞を遺伝子操作したり、遺伝子発現の調節を一過性または長期にしたり、遺伝子活性を非誘導性または誘導性にしたりすることができる。例えば、非誘導性ベクター（アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むがこれらに限らない）、または誘導性プロモーター（メタロチオネインまたは熱ショックタンパク質を含む）、さらにリポソームのようなDNAを細胞に導入する他の粒子、または直接DNA注入または金粒子を用いて、１コピー以上の正常標的遺伝子、または標的遺伝子機能を有する正常標的遺伝子タンパク質産物の生産を支配する遺伝子の一部を、三次元構築物を移植するヒト細胞に挿入し得る。例えば、宿主による移植片の拒絶を防止するヒト補体調節タンパク質をコードする遺伝子をヒト繊維芽細胞に挿入することができる。McCurryら,1995,Nature Medicine 1:423−427。
その後、リウマチ様または関節疾患の症状を軽減させるために、このような遺伝子操作間質細胞、例えば、それぞれが異なる所望の遺伝子産物を発現する間質細胞の混合物、またはいくつかの特定遺伝子を発現するように遺伝子操作された１種類の間質細胞を患者に移植する。遺伝子の発現の非誘導性（すなわち、構成性）または誘導性プロモーターの制御下におくことができる。遺伝子の発現レベルおよび調節される遺伝子のタイプは、個々の患者が受ける治療条件に応じてコントロールされ得る。
遺伝子治療に三次元培養物を用いることは多くの利点を伴う。第一に、この培養物は真核細胞から成るので、遺伝子産物が培養下で適切に発現されプロセシングされて活性産物を生成する。第二に、遺伝子治療法は、臨床的に価値があり、妥当であり、有効であるためには、トランスフェクションした細胞の数を実質的に増やすことができる場合にのみ有用である。本発明の三次元培養物はトランスフェクションした細胞の数の増加と、トランスフェクションした細胞の（細胞分裂による）増幅を可能にする。
間質細胞に導入された遺伝子の構成性または一過性発現を得るためにさまざまな方法を用いることができる。例えば、Seldonら,1987,Science 236:714−718に記載されたトランスカリオティック移植法を使用できる。ここで用いる「トランスカリオティック（transkaryotic）」とは、移植した細胞の核が安定したまたは一過性のトランスフェクションによるDNA配列の付加により改変されていることを意味する。細胞は組込み型ウイルスベクター（例：レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター）、または非組込み型複製ベクター（例：パピローマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクター）、または複製欠損ウイルスベクターを含むがこれらに限らない多様なベクターのいずれかを用いて遺伝子工学的に操作できる。一過性の発現を希望する場合は、非組込み型ベクターまたは複製欠損ベクターが好適である。というのは、対象遺伝子の発現を制御するためにこれらの系中で誘導性または構成性プロモーターを使用できるからである。また、対象遺伝子が誘導性プロモーターにより制御されるという条件で、一過性の発現を得るために組込み型ベクターを使用してもよい。
好ましくは、用いる発現制御要素は、その産物が生体内で必要なときだけ合成されるように、調節された遺伝子発現を可能とすべきである。選ばれるプロモーターは、幾分かは、培養する組織および細胞の型に左右されるだろう。タンパク質分泌能を有する細胞と組織（例えば、豊富な粗面小胞体およびゴルジ体により特徴づけられるもの）が好ましいものである。宿主細胞は適当な発現制御要素（例：プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAと選択マーカーを用いて形質転換できる。外来DNAの導入後、遺伝子操作細胞を富化培地で増殖させ、その後選択培地に変える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを安定的に取り込み、増殖してフォーカスを形成することを可能にする。その後、それをクローニングして細胞系へと増殖させる。この方法は遺伝子のタンパク質産物を発現する細胞系を作製するために有利に用いられる。
挿入された遺伝子の発現を進行させるために任意のプロモーターを用いることができる。例えば、ウイルスのプロモーターとしては、CMVプロモーター／エンハンサー、SV40、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、エラスチン遺伝子プロモーターおよびβ−グロビンが挙げられるが、これらに限らない。一過性の発現を希望するのであれば、このような構成性プロモーターを非組込み型および／または複製欠損ベクター中で用いるのが好ましい。また、誘導性プロモーターを用いて、必要なときに挿入遺伝子の発現を引き出すこともできよう。例えば、誘導性プロモーターとして、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質が挙げられるが、これらに限らない。
これまでに記載されて使用された組織特異性を示す転写制御領域の例としては、膵臓の腺房細胞内で活性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Switら,1984,Cell 38:639−646;Ornitzら,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409;MacDonald,1987,Hepatology 7:425−515）；膵臓のβ細胞内で活性のインスリン遺伝子制御領域（Hanahan,1985,Nature 315:115−122）；リンパ球様細胞内で活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら,1984,Cell 3S:647−658;Adamsら,1985,Nature 318:533−538;Alexanderら、1987,Mol.Cell.Biol.7:1436−1444）；脳の乏突起膠細胞内で活性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら,1987,Cell 48:703−712）；骨格筋内で活性のミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Shani,1985,Nature 314:283−286）；および視床下部内で活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら,1986,Science 234:1372−1378）が挙げられるが、これらに限らない。
遺伝子工学的に操作した細胞が個体に移植されると、抗炎症性の遺伝子産物（例えば、GM−CSF、TNF、IL−１、IL−２または他の炎症性サイトカインに対する中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチド）の存在がリウマチ様または関節疾患と関連した炎症反応を改善させる。IL−１は軟骨吸収の、そして軟骨細胞による炎症伝達物質の産生の、刺激剤である（Campbellら,1991,J.Immun.147:1238−1246）。
本発明の三次元培養系で用いる間質細胞は、移植部位の炎症または拒絶を促進する因子の発現を「ノックアウト」するように遺伝子操作してもよい。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させる負の調節法については以下で論ずる。ここで用いる「負の調節（negative modulation）」とは、調節治療を行わないときの標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に対して標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性が低下することを意味する。間質細胞に固有の遺伝子の発現は多くの技術を用いて低下またはノックアウトすることができ、例えば、相同組換え法を使ってその遺伝子を完全に不活性化する（一般には「ノックアウト」と呼ばれる）ことにより発現を阻止し得る。通常、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（またはその領域の5'側のエキソン）が陽性の選択マーカー（例えば、neo）により中断され、標的遺伝子からの正常なmRNAの生産が妨げられ、その結果該遺伝子が不活性化される。また、遺伝子の部分的欠失体を作製したり、全遺伝子を欠失させたりすることによっても遺伝子を不活性化できる。ゲノム内でかなり離れている。標的遺伝子に相同の２つの領域を含む構築物を使うことにより、２つの領域の間にある配列を欠失させることができる。Mombaertsら,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084−3087。
標的遺伝子の活性レベルを低下させるために、標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス及びリボザイム分子も本発明にしたがって使用することができる。例えば、アンチセンスRNA分子は免疫応答に関して最も可変性であることが明らかにされた主要組織適合遺伝子複合体（HLA）の発現を抑制する。さらに、三重らせん分子は標的遺伝子の活性レベルを低下させるために利用できる。こうした技術は、L.G.Davisら編,Basic Methods in Molecular Biology,2nd ed.,Appleton ＆ Lange,Norwalk,Conn.1994に詳細に記載されている。
上記の技術のいずれかを用いると、軟骨細胞におけるIL−１の発現をノックアウトして、軟骨吸収と軟骨細胞による炎症伝達物質の生産の危険性を低減できる。同様に、移植拒絶反応の危険性を少なくするために、MHCクラスII分子の発現をノックアウトすることもできる。
本発明のさらに別の実施態様では、三次元培養系をin vitroで使用して生物学的産物を高収量で生産することもできる。例えば、特定の生物学的産物（例：成長因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体など）を自然界で多量に産生する細胞、または外来遺伝子産物を生産するように遺伝子操作された宿主細胞を、三次元培養系をin vitroで使用してクローン的に増やすことができる。形質転換細胞が遺伝子産物を栄養培地中に分泌するのであれば、標準的な分離技術（例えば、2,3の名を挙げると、HPLC、カラムクロマトグラフィー、電気泳動技術）を使って使用済み培地または馴化培地からその産物を容易に単離し得る。「バイオリアクター」が考案されており、これは三次元培養物をin vitroで供給するために流動法を利用するものである。本質的に、新鮮な培地が三次元培養物中を通過するとき、培養物から放出される細胞とともに遺伝子産物が培養物から流出される。遺伝子産物は使用済み培地または馴化培地の流出物から（例えば、HPLCカラムクロマトグラフィー、電気泳動などにより）単離できる。バイオリアクター系は、軟骨組織の増殖中のチャンバーの加圧を可能にし、かつ対流により栄養分を間質細胞に供給するように特別に設計されている。
6.実施例：三次元軟骨細胞培養系
本発明の三次元培養系は、生理的条件に匹敵する系において、in vitroでの軟骨細胞の複製および集落化をもたらす。重要なことは、培養を開始するために用いた当初の軟骨細胞接種物中にあらゆる細胞型が存在すると仮定すると、この系で複製された軟骨細胞は正常な軟骨組織に存在する細胞の全てを含む点である。軟骨移植片は、主にその移植片の位置とポリマーマトリックスにまいた軟骨細胞の型に応じて、１以上の型の軟骨であり得る。以下の実施例では、（ｉ）エチレンオキシドまたは電子ビームにより滅菌した生物分解性のポリグリコール酸マトリックス上にまいたウサギ軟骨細胞の、TGF−βの存在下または不在下での増殖方法；（ii）アスコルベートを含むまたは含まないTGF−β含有培養物中のポリグリコール酸マトリックス上でのウシ軟骨細胞の増殖方法；および（iii）バイオリアクター内に入れたポリグリコール酸マトリックス上でのウサギ軟骨細胞の増殖方法；について記述する。採用した特定条件を以下に記載する。
6.1.  材料および方法
6.1.1.  成長因子
Gentryら,1987,Mol.Cell.Biol.7:3418−3427にしたがって調製した組換えTGF−β１は20ng/mlの濃度で用いた。組換えヒトβ繊維芽細胞増殖因子（βFGF）（Pepro Tech.,Inc.,Rocky Hill,N.J.）は10mg/mlの濃度で用いた。アスコルビン酸またはアスコルビン酸塩は50μg/mlの濃度で用いた。
6.1.2.  細胞
健康な成熟（２〜３歳）雌ウシまたはニュージーランド白ウサギ（４〜８ヵ月齢）の関節面から軟骨を取り出した。軟骨片を10％ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、非必須アミノ酸、50mg/mlプロリン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび35μg/mlゲンタマイシンを含む完全培地DMEM中で37℃、20時間コラゲナーゼ（0.2％w/v）により消化した。遊離した軟骨細胞を遠心し、完全培地中に再懸濁し、細胞数を数え、Ｔ−150フラスコにつき106個をまいた。細胞は常法にしたがい集密的に継代させた（５〜７日ごと）。
6.1.3.  細胞の播種
ポリグリコール酸メッシュ（45mg/cc;非加熱プレートした；厚さ2mm;直径1cm）をエチレンオキシドまたは電子ビーム（Ｅ−ビーム,3MR）処理により滅菌し、完全培地中に一夜浸漬しておいた。メッシュにつき３〜４×106個の細胞を６ウェルプレートで完全培地中に37℃で２日間まき、用いたプロトコールに応じてインキュベーターまたはバイオリアクターに入れた。アスコルベート含有培地は１週間に２〜３回変えた。次いで試料を一定の増殖期間後にPBSで洗い、組織学のために処理した。
6.1.4.  組織学および免疫組織化学
組織を収穫時にPBSで洗い、写真を撮った。それらを10％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）および／またはトリクロームおよび／またはサフラニンＯで染色した。いくつかの試料については、ビオチン−ストレプトアビジン増幅システム（Biogenex Corp.）を使ってパラフィン包埋組織に対して免疫組織化学的染色も行った。その後、それらを３％過酸化水素とともにインキュベートして内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックし、トリス−塩水緩衝液ですすぎ、ビオチンブロック血清（Dako,Inc.）とともにインキュベートして非特異的なバックグラウンドをなくした。ブロッキング血清を流出させ、Ｉ型コラーゲンとII型コラーゲンに対する一次抗体を加えた。次に切片をビオチン化抗IgGとインキュベートし、トリス−塩水緩衝液で洗った。次に、それらを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとともにインキュベートし、トリス−塩水で洗った。その後、切片を3,3−ジアミノベンジジン基質と一緒にインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。
6.1.5.  免疫ブロット法
関節軟骨細胞の集密的単層を１％Tween 20を含むPBS中にかき取った。Lupis緩衝液（Laemmli,U.K.,1970,Nature 227:680−685に記載）を加え、細胞溶解物をSDS−PAGEおよびBurnette,W.N.,1981,Anal.Chem.112:195−203に記載の免疫ブロット法で分画化した。Ｉ型およびII型コラーゲンに対する抗体はSouthern Biochemicals,Inc.（Birmingham,AL）から入手し、抗コンドロイチン硫酸抗体はSigma（St.Louis,MO）から入手した。
6.1.6.  コラーゲンおよびGAGの定量
構築物を凍結乾燥し、分析するまで−70℃で貯蔵した。構築物は5mMシステインおよび5mM EDTAを含む100mMリン酸緩衝液（pH6.5）中のパパイン（1mg/ml）を用いて65℃で一夜消化した。コラーゲンとGAGの定量は記載される方法（Farndaleら,1986,Biochem.Biophys.Acta 883:73−177;Woessner,J.F.,1961,Archiv.Biochem.Biophys.93:440−447）にしたがって行った。
6.1.7.  ノーザンブロット分析
RNAを単離し、アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画化し、記載されるとおりに［32P］−標識II型コラーゲンcDNAを用いて釣り上げた（Chomozynski,P.,and Sacchi,N.,1987,Anal.Biochem.162;Lehrachら,1977,Biochemistry 16:4743−4751;およびMadisenら,1986,DNA 7:1−８）。
6.2.  ウサギ軟骨細胞培養物に及ぼすエチレンオキシドまたは電子ビーム滅菌の効果
ａ）エチレンオキシドまたはｂ）電子ビームにより滅菌したポリグリコール酸メッシュに、６ウェルプレートで、全容量10ml（側面につき50ml）でメッシュあたり３〜４×106個の細胞をまき、組織培養インキュベーター内に入れて37℃で３〜４時間インキュベートした。この時点で1.5mlの培地を加えた。播種メッシュを一夜インキュベートした。翌日5mlの培地を加えた。培地は１週間につき３回変えて、これを４週間行った。その後試料を取り出し、PBSで洗い、組織学のために処理した：ヘマトキシリン／エオシン、トリクローム（コラーゲンのため）およびアルカンブルー（グリコサミングリカンのため）。
6.3.  結果
6.3.1.  ウサギ軟骨細胞培養物に及ぼすエチレンオキシドまたは電子ビーム滅菌の効果
（ａ）エチレンオキシドで処理したポリグリコール酸メッシュ
TGF−βの存在下において三次元マトリックスで増殖させた軟骨細胞は、より平滑で、より輝いている軟骨組織をもたらし、TGF−βを加えない培養物中で増殖させた組織よりも固体のコンシステンシーを有していた（図１）。
ヘマトキシリン−エオシン染色を用いた軟骨組織の組織検査は、TGF−βを含む培養物（図３）と比べた、TGF−βを含まない培養物（図２）における細胞充実性（cellularity）の増加を示した。
コラーゲンの存在の指示薬であるトリクロームによる染色は、TGF−βを含む培養物中で増殖させたもの（図５）と比べた、TGF−βを加えないで増殖させた培養物（図４）におけるコラーゲン付着の増加を示した。
アルカンブルー染色は、TGF−βを加えないもの（図６）と比べて、試料をTGF−βの存在下で増殖させたとき（図７）、軟骨組織全体におけるGAG付着の均一な分布と増加を示した。
８週間後の組織の全体的な外観は、TGF−βの存在下で増殖させた軟骨がTGF−βの不在下で増殖させたものよりも実質的に大きいことを示した（図８）。
TGF−βを含む培養物中で増殖させた軟骨の乾燥重量の２倍の増加、20％多いコラーゲンおよび80％多いGAGが見られた。以下の表IIを参照のこと。
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（ｂ）電子ビームで滅菌したメッシュ上にまいたウシ軟骨細胞は４週間後に貧弱な増殖しか示さなかった。これは照射処理後にPGAが急速に分解されたためであると思われ、細胞外マトリックスに付着できる前に細胞が落下してしまう。
繊維芽細胞増殖因子Ｂ（bFGF）の添加は全く影響を及ぼさなかった。しかしながら、TGF−βを添加すると、軟骨細胞の増殖が起こり、軟骨細胞による細胞外マトリックスの生産が増えることにより軟骨組織の形成が生じる。こうして、TGF−βの添加は電子ビームでメッシュを滅菌することの有害作用を逆転させ、三次元培養マトリックスにおける軟骨の生産を高める（図９）。
7.アスコルベートの存在下または不在下での単離培養物中のおよび三次元枠組み上のウシ軟骨細胞の増殖に及ぼすTGF−βの効果
ａ）ウシ軟骨細胞をＴ−25フラスコにつき2.0×105個の細胞でまいた。24時間後それらをアスコルベート、TGF−βまたはこれらの両方で処理した。
ｂ）ポリグリコール酸メッシュに３×106個のウシ軟骨細胞をまき、６ウェルプレートで50mg/mlアスコルベートを含むまたは含まないTGF−β含有完全培地中37℃で２日間培養した。
7.1.  結果
7.1.1.  アスコルベートの存在下または不在下での単層培養物中のおよび三次元枠組み上のウシ軟骨細胞の増殖に及ぼすTGF−βの効果
（ａ）TGF−βは単層中のウシ軟骨細胞の増殖を高める
図10Aは、TGF−βが単層中のウシ軟骨細胞の増殖を刺激したことを示す。アスコルベートの添加はTGF−βと相加的な刺激作用を示した。図10Bは、アスコルベートの存在下でのTGF−βの増殖作用の時間経過を示す。軟骨細胞の増殖の刺激作用は0.1mg/mlのTGF−βで観察され（図10C）、βFGFはわずかな阻害作用をもっていた。
TGF−β処理はまたGAG合成を実質的に増加させた（図11A）が、II型コラーゲンには検出可能な作用を及ぼさなかった（図11B）。ノーザンブロット分析は、TGF−βがII型コラーゲンのmRNAレベルに影響を与えないことを示した（図11C）。抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いる免疫ブロット法は陰性であった（図12）。
（ｂ）三次元枠組み上の軟骨構築物の増殖
図13は、軟骨構築物がTGF−βの存在下では平滑で、きらきら輝いていて、３倍大きいことを示す（図13および表III）。細胞は外側のへりで最も濃縮されているものの、中心部はそれほど濃密ではなく、比較的分解されていないポリグリコール酸繊維を含んでいた（図14）。構築物はII型コラーゲンについて陽性に染色された（図12EおよびＦ）が、Ｉ型コラーゲンについては陰性だった（図12CおよびＤ）。表IIIは、TGF−βが構築物の乾燥重量を約2.5倍増加させ、同様にコラーゲンとGAGも増加させることを示す。
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これらの結果は、TGF−βが単層中の軟骨細胞の増殖を高めるばかりでなく、三次元枠組み上での軟骨生産をも高めることができることを示している。
8.密閉バイオリアクター系におけるポリグリコール酸枠組み上のウサギ軟骨細胞による軟骨の生産
６ウェルプレートでポリグリコール酸メッシュに４×106個の細胞をまいて２日間おき、次にバイオリアクターに入れ、16チャンネルポンプ（Cole−Parmer:コンピューター化ドライブを備えたMasterflex,モデル番号7550−90）を使って完全培地（５個のバイオリアクターに対して250ml）を50μg/mlの流速、37℃で28日間供給し、この間培地交換を行わなかった。新鮮なアスコルベート（最終濃度50μg/ml）を３日ごとに加えた。別のグループの実験として、細胞をまいたメッシュを６ウェルプレートで5mlの培地を用いて静止系にて培養し、週に２回の培地交換を行った。ポリグリコール酸の枠組み上で細胞を増殖させるために使用した培地は、アスコルベートを加えたことを除いて、単層での細胞増殖のときと正確に同じものであった。
8.1.  結果
8.1.1.  密閉バイオリアクター系におけるポリグリコール酸枠組み上のウサギ軟骨細胞による軟骨の生産
図15Aは、細胞をまいたメッシュを静止系で増殖させたときの全体的な外観を示す。それらはバイオリアクター系で増殖させた構築物（きらきら輝いており、厚さが約2mmであった）よりも薄かった。ヘマトキシリン／エオシンまたはトリクロームによる組織検査は、メッシュ全体にいきわたる細胞増殖と細胞外マトリックスの付着を示した（図16Aおよび16C）。アルカンブルーおよびサフラニンＯによる染色はGAGの付着を示した（図16E−16H）。静止系で増殖させた構築物の染色は、はるかに少ないマトリックスの付着を示した（図16IおよびＪ）。免疫染色はII型コラーゲンとコンドロイチン硫酸に対して陽性の反応性を示したが、Ｉ型コラーゲンに対しては示さなかった（図17）。バイオリアクターにおいて生産された軟骨は抗II型コラーゲンおよび抗コンドロイチン硫酸により陽性に染色された（図18AおよびＢ）が、抗Ｉ型コラーゲンでは染色されなかった（図18C）。生化学的分析はコラーゲンとGAGの値がそれぞれ乾燥重量の15％および25％であることを示した。構築物のこれらの値は、それぞれ乾燥重量の30〜70％および10〜30％であると発表されたウサギ関節軟骨の各値に都合よく匹敵するものである。
本発明は、本発明の個々の側面の単なる例示にすぎない特定の実施態様によりその範囲を制限されるものではなく、機能的に同等の方法および成分は本発明の範囲内であり、ここに示し記載したものに加えて、当業者には前述の記載および添付図面から明らかになるだろう。このような修飾は請求の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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