(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光トラップ用レーザー光で微小試料をトラップし、近赤外の分光分析用レーザー光を走査させて該微小試料からのラマン散乱光の３次元イメージを得る３次元イメージ取得方法であって、
前記分光分析用レーザー光と同一焦点で前記微小試料に可視光を照射し、前記微小試料からの反射光または散乱光から前記光トラップ用レーザー光および前記分光分析用レーザー光の波長の光をそれぞれ除去した後、可視光とラマン散乱光とに分離し、分離した可視光によって前記微小試料の観察を行い、分離したラマン散乱光によって３次元イメージの取得を行う
ことを特徴とする３次元イメージ取得方法。
【請求項２】
近赤外の分光分析用レーザー光の焦点部で、光トラップ用レーザー光を走査させることにより該光トラップ用レーザー光にトラップされた微小試料を走査させて該微小試料からのラマン散乱光の３次元イメージを得る３次元イメージ取得方法であって、
前記分光分析用レーザー光と同一焦点で前記微小試料に可視光を照射し、前記微小試料からの反射光または散乱光から前記光トラップ用レーザー光および前記分光分析用レーザー光の波長の光をそれぞれ除去した後、可視光とラマン散乱光とに分離し、分離した可視光によって前記微小試料の観察を行い、分離したラマン散乱光によって３次元イメージの取得を行う
ことを特徴とする３次元イメージ取得方法。
【請求項３】
前記分光分析用レーザー光がパルスレーザー光であることを特徴とする請求項１または２記載の３次元イメージ取得方法。
【請求項４】
光トラップ用レーザー光を発生する光トラップ用光源と、
近赤外の分光分析用レーザー光を発生する分光分析用光源と、
試料観察用可視光を発生する可視光源と、
光透過性を有する素材の容器と該容器内の光透過性を有する溶液とからなり該溶液中に微小試料を保持する試料保持手段と、
光トラップ用レーザー光もしくは分光分析用レーザー光の焦点位置を３次元的に走査・移動する走査手段と、
分光分析用レーザー光と試料観察用可視光とを同一焦点で前記微小試料に照射する照射手段と、
前記微小試料からの反射光または散乱光から光トラップ用レーザー光および分光分析用レーザー光の波長の光をそれぞれ除去するフィルタと、
前記フィルタを通過した光を可視光とラマン散乱光とに分離するビームスプリッタと、 分離した可視光によって試料を観察する観察手段と、
分離したラマン散乱光を受光してラマン散乱光による３次元イメージを得る分析手段とを備えた
ことを特徴とする３次元イメージ取得装置。
【請求項５】
前記分光分析用レーザー光がパルスレーザー光であることを特徴とする請求項４記載の３次元イメージ取得装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子、ガラス、液滴、細胞等の微小試料を光学的にマニュピレートして３次元イメージを得る方法及びその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
共焦点レーザー顕微鏡（共焦点走査型レーザー顕微鏡ともいう。）あるいは顕微ラマン分光装置は、高分子、ガラス、細胞等の微小（微粒子）試料の内部における蛍光やラマン散乱光の３次元イメージを得るために用いられている（例えば、蛍光の３次元イメージについては「新しい光学顕微鏡（第二巻）共焦点レーザー顕微鏡の医学・生物学への応用」、ラマン散乱光の３次元イメージについては「アナリティカルケミストリー」誌、第６９巻、１９９７年、４５頁〜５０頁、または「モレキュラークリスタル・アンド・リキィドクリスタル」誌、第３１４巻、１９９８年、１９１頁〜１９６頁参照）。
【０００３】
これらの装置では、光学系に共焦点配置を用いている。共焦点配置とは、点光源（例えば、レーザー光源）と点検出器（例えば、ピンホールを装着した光検出器）とが共に試料内の一点に対して結像関係にある。このため、焦点面以外からの画像の寄与がなく、３次元試料中の特定の面だけの像、いわゆる断層像が得られる。
【０００４】
具体的には、試料に光束（集光されたレーザー光）を照射しながら、試料または光束を走査させ、共焦点配置により焦点部からのみの反射光または散乱光について連続的に分光測定を行う。光束を固定して試料そのものを走査する方式をステージ走査型と呼び、試料は固定して光束の方を走査する方式を光束走査式と呼ぶ。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述したステージ走査型の場合はステージの移動範囲によって視野が決まるため、視野を広くすることが可能であり、また、光束が固定されているため、ピンホール位置に分光器の入射スリットを合わせることによって蛍光やラマン散乱光のスペクトルを得ることができる。しかし、生体試料等の溶液中にある試料等はステージ走査時に容易に動いてしまうため、試料を機械的（ガラス基板の間に挟む等）に、または接着剤（ポリリジン等）等で試料台に固定する必要があり、この場合、直径数１０ミクロン以下の小さな試料に対してはその固定が困難である上、固定することによる試料の損傷が問題となっていた。
【０００６】
一方、光束走査型の場合は走査が速いのが特徴であるが、光束を走査するために共焦点配置のためのピンホール位置で光の揺らぎが生じ、このため、ピンホール径が１ｍｍ程度（分光器の入射スリットは１０分の１以下）と非常に大きくなり、スペクトル分解能が悪くなって一度に同定できる分子の種類の数が限定されてしまうという問題があった。また、ステージ走査型の場合程ではないにしろ、ある程度の試料固定が必要となるため、固定時における試料の損傷が問題となっていた。
【０００７】
本発明の目的は、直径数１０ミクロン以下の微小試料や細胞等の生体試料を容易にかつ損傷させることなく固定でき、これらの内部の正確な３次元イメージを取得できる方法及びその装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明では、微粒子試料の固定に光トラップ（光ピンセットとも呼ぶ。）を利用する。この光トラップはレーザー光の光圧力によって微粒子を非接触・非破壊で捕獲する方法である。
【０００９】
レーザー光を用いた光圧力による微粒子捕獲の基本原理は、１９７０年にアシュキンによって示され（「フィジカル・レビュー・レター」誌、第２４巻、１９７０年、１５６〜１５９頁参照）、後に、アシュキンを含むグループによって高開口数の対物レンズを用いた簡便な方法が報告された（「オプティクス・レター」誌、第１１巻、２８８〜２９０頁参照）。これによって、対物レンズにより集光されたレーザーの焦点位置近傍に直径約２０μｍから２０ｎｍの微粒子を安定にトラップすることが可能になった。
【００１０】
また、この報告の中では可視域のレーザー光が使われていたが、代わりに近赤外域のレーザー光を用いることによって、細胞等の生体微粒子に対して利用できることも示されている（例えば、特公平２−９１５４５号公報、または「ネイチャー」誌、３３０巻、１９８７年、７６９〜７７１頁等参照）。
【００１１】
本発明では、蛍光やラマン散乱光の３次元イメージを得るために、分光分析用のレーザー光とともに光トラップ用のレーザー光を用いる。これらのレーザー光としては、試料への損傷が少ない近赤外波長（６００ｎｍから１８００ｎｍ）の波長域を持つＨｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザー、Ｎｄ−ＹＡＧレーザー、Ｎｄ−ＹＶＯ４レーザー、Ｎｄ−ＧＬＡＳＳレーザー、Ｎｄ−ＹＬＦレーザー、クリプトンレーザー、ルビーレーザー、金蒸気レーザー、アレキサンドライトレーザー、色素レーザー、チタンサファイアレーザー等を用いるが、分析スペクトルへの光トラップ用レーザー光による影響を避けるため、波長差が１０ｎｍ以上（実用的には２００ｎｍ以上）の２つのレーザー光を用いる。
【００１２】
まず、対物レンズ（または対物カセグレン鏡）により収束された光トラップ用のレーザー光を微粒子試料に照射することにより光圧力を発生させ、この光圧力によって試料を固定する。光圧力はレーザー光の強度や対物レンズの開口数等によって決まるが、走査のためには、試料を固定するのに必要な光圧力より大きな光圧力でなければならない。これは光束の焦点位置を走査（連続的に移動）させた場合、光トラップされた微粒子試料に対し溶液抵抗がかかるため、これを相殺するための光圧力が必要となるからである。さらに、分析用レーザー光による光トラップの影響も考慮する必要がある（これについては後で詳しく述べる。）。
【００１３】
光束の焦点位置を走査（移動）させる手段は水平方向と垂直方向の２つの機構からなる。まず、水平方向を走査させるためには、対物レンズに入射する平行なレーザ光をガルバノミラー（光軸を平行移動させるための光学部品）で２次元的に移動させるか、または対物レンズとレーザー光の双方を光軸に対し垂直な面で２次元的に移動させることによって実現できる。そして、垂直方向に走査させるためには、収束のための対物レンズを光軸方向に連続的に移動させることによって実現できる。但し、水平方向、垂直方向のいずれの場合においても、移動速度は試料への光圧力の大きさによって制限を受ける。
【００１４】
一方、異なる波長の分析用のレーザー光は、光トラップを防ぐためにパルスレーザー光を用いたり、光トラップ用のレーザー光より出力の小さなレーザー光を用いる、もしくは開口数の小さい対物レンズで集光する等を行う。試料からの反射光または散乱光に含まれる蛍光やラマン散乱光を再び対物レンズ（または対物カセグレン鏡）を用いてピンホールに集光される。そして、これらの光を分光器でスペクトルにし、検出器でその光強度を測定することにより、分子の種類を識別することができる。
【００１５】
本発明によれば、微粒子試料の固定に光トラップを利用することによって、直径数１０ミクロン以下の微粒子試料の固定が容易となるとともに、溶液中等にある細胞等の生体試料を損傷を与えることなく固定でき、分子の種類毎の３次元イメージの取得に非常に有効である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の内容について、発明の実施の形態に従って具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施の形態の例のみに限定されるものではない。
【００１７】
【実施の形態１】
図１は本発明の第１の実施の形態を示すもので、図中、１は光トラップ用光源、２はビームエクスパンダ、３はレーザーラインフィルタ、４は反射ミラー、５はガルバノミラー、６は対物レンズ、７は調整可能マウント、８はセル、９は溶液、１０は微粒子試料、１１は分析用光源、１２はレーザーラインフィルタ、１３はビームエクスパンダ、１４，１５はビームスプリッタ、１６は対物レンズ、１７は可視光源、１８は集光レンズ、１９は可視透過フィルタ、２０，２１はホログラフィックノッチフィルタ、２２はビームスプリッタ、２３はテレビカメラ、２４は反射ミラー、２５は収束レンズ、２６はピンホール、２７は集光レンズ、２８は反射ミラー、２９は調整可能マウント、３０は回折格子、３１は反射ミラー、３２は収束レンズ、３３はマルチチャネル検出器である。
【００１８】
光トラップ用光源１には、波長１０６４ｎｍ、最大出力２．５ＷのＮｄ−ＹＶＯ４レーザーを用いた。レーザー光はビームエクスパンダ２を用いて適当な直径に調節し、レーザーラインフィルタ３を通すことにより他の波長成分を除いた後、反射ミラー４によりガルバノミラー５へ導入し、収束用の対物レンズ６（開口数０．８）を用いて集光した。
【００１９】
ガルバノミラー５を用いることにより、対物レンズ６の焦点位置を光軸に対し垂直な面内で自由に移動できる。さらに、対物レンズ６を固定する調整可能マウント７を光軸方向に移動することによって焦点位置を光軸方向へも自由に移動することができるため、結果的に焦点位置を３次元的に自由に設定することが可能である。
【００２０】
セル８は、光透過性を有する素材（例えば、ガラス、プラスチック）からなる中空の容器であり、その内部は光透過性を有しかつ試料に応じてこれに影響を及ぼすことのない溶液（例えば、水）９が満たされ、この溶液９中に微粒子試料１０がある。微粒子試料１０は対物レンズ６により収束されたレーザー光によって光トラップされる。光トラップされた微粒子試料１０はレーザー光の焦点近傍に安定に固定され、レーザー光の焦点位置を変化させることによって３次元的に移動させることができる。なお、微粒子試料１０を観察するための可視光学系については後述する。
【００２１】
一方、分析用光源１１には、波長７３０ｎｍ、最大出力１Ｗのチタンサファイアレーザーを用いた。レーザー光はビームエクスパンダ１２を用い、適当な直径に調節し、レーザーラインフィルタ１３を通すことにより他の波長成分を除いた後、ビームスプリッタ１４で反射させ、ビームスプリッタ１５を透過させた後、対物レンズ１６（開口数０．５５）で収束して試料１０に照射した。
【００２２】
試料観察のための可視光源１７には５０Ｗのハロゲンランプを用いた。光源１７からの光は集光レンズ１８を通してから可視透過フィルタ１９を通した後、ビームスプリッタ１５で反射させ、対物レンズ１６を用いて試料１０に照射した。試料１０からの反射光及び散乱光より、光トラップ用光源１の波長の光をホログラフィックノッチフィルタ２０で除去し、さらに分析用光源１１の波長の光をホログラフィックノッチフィルタ２１で除去した後、ビームスプリッタ２２によりテレビカメラ２３に導入することによって試料を観察することができる。
【００２３】
また、試料の分析に用いるラマン散乱光はビームスプリッタ２２を透過し、反射ミラー２４で収束レンズ２５に導入される。収束レンズ２５の焦点にはピンホール２６があり、試料の焦点外から発生したラマン散乱光が排除される。そして、このラマン散乱光は集光レンズ２７を通り、反射ミラー２８で調整マウント２９に固定された回折格子３０に照射される。
【００２４】
回折格子３０でスペクトルとなった光は反射ミラー３１で収束レンズ３２へ導入され、マルチチャネル検出器３３に結像される。そして、マルチチャネル検出器３３で光強度を測定することにより、分子の種類を同定したり、分子の状態を知ることができる。さらに、光トラップされている微粒子試料１０を前記方法により２次元または３次元に連続的に走査することによって、２次元または３次元のラマン散乱光のイメージを得ることができる。
【００２５】
測定に用いた微粒子試料１０には、メリフィールド法によってポリ−Ｌ−チロシンを修飾した直径約１０μｍのポリスチレンビーズを用いた。以下にその作製法の詳細を述べる。
【００２６】
ポリスチレンのビーズ５０ｇをクロロメチルエーテル５０ｍｌに入れ、塩化スズ１．８ｍｌを滴下する。２５℃で１時間、さらに０℃で３０分撹拌する。反応液を除去し、ジオキサンと水の３：１の混合溶液で洗浄後、ジオキサンと３Ｍ塩酸の３：１の混合溶液で洗浄し、水がなくなるまでジオキサンで洗い、さらにジオキサンがなくなるまでメタノールで洗った後、減圧下で乾燥させてクロロメチル化ポリスチレン樹脂を得た。
【００２７】
次に、７．２ｍｍｏｌのｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンと当量のトリエチルアミンをアルコール２０ｍｌに溶解し、これに１０ｇのクロロメチル化樹脂を加えて８０℃で１昼夜加熱環流する。樹脂をろ過してエタノール、水、メタノールの順で十分洗浄して乾燥し、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アルギニンが表面に結合した樹脂を得た。
【００２８】
次に、当該樹脂に１Ｍ塩酸の氷酢酸溶液３０ｍｌを加え、室温で３０分間ふりまぜる。溶液を除き、氷酢酸、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の順で十分に洗浄する。さらに、トリエチルアミン３ｍｌをＤＭＦ３０ｍｌに溶解した液で２０分間洗浄し、これを除去してさらにＤＭＦで十分に洗浄する。これにより、アルギニンの先端に結合した保護基であるｔ−ＢＯＣ基を外した。ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロシン１．７６ｇを精製したＤＭＦに溶解し、これに保護基を外した当該樹脂を入れ、１０分間ふりまぜた後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．３２ｇをＤＭＦ３ｍｌに溶解して加え、２時間ふりまぜた。
【００２９】
溶液を除き、ＤＭＦ、エタノール、氷酢酸で洗浄した後、前述と同じ方法で保護基のｔ−ＢＯＣ基を外した。さらに同様の方法で、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロシンを反応させて保護基のｔ−ＢＯＣ基を外すことを１００回繰り返し、表面がポリ−Ｌ−チロシンで覆われたポリスチレンビーズを得た。
【００３０】
上記作製法によって得られたポリ−Ｌ−チロシン修飾のポリスチレンビーズをごく少量、水中に分散させ、そのうちのビーズ１個に対し本装置によるラマンイメージ測定を行った。
【００３１】
始めに、ビーズの中心付近を通る断面で２次元イメージ取得測定を行った結果、ポリスチレンに含まれる一置換ベンゼン基のラマンピーク（１０００ｃｍ−１）はビーズ内部に均一に分布しているの対し、ポリ−Ｌ−チロシンに含まれる二置換ベンゼン基のラマンピーク（８２６または８５０ｃｍ−１）はビーズの外周に沿って円形リング状に分布していた。
【００３２】
次に、同じ２つのラマンピークに対して３次元イメージ取得測定を行った結果、一置換ベンゼン基のラマンピークはビーズ内部に均一に分布しているの対して、二置換ベンゼン基のラマンピークはビーズの外周に沿って球状に分布していた。
【００３３】
【実施の形態２】
図２は本発明の第２の実施の形態を示すもので、ここでは第１の実施の形態において分光分析用レーザー光の焦点位置を３次元的に変化させるようになした例を示す。即ち、３４は分析用光源１１のレーザー光（ここでは可視光源からの光も含めて）の位置を光軸に対して垂直な面内で自由に移動するガルバノミラーであり、３５は対物レンズ１６を光軸方向に移動自在に固定する調整可能マウント３５である。
【００３４】
これらを用いて、第１の実施の形態において光トラップ用光源１のレーザー光の焦点位置をガルバノミラー５及び調整可能マウント７により３次元的に変化させるのと同様な手法により、分析用光源１１のレーザー光の焦点位置を３次元的に変化させる。この場合、光トラップされた微粒子試料１０をイメージ測定中に移動させる必要はなく、ガルバノミラー５及び調整可能マウント７はなくても良い。
【００３５】
この装置を用いて、第１の実施の形態の場合と同様の方法で作製したポリ−Ｌ−チロシン修飾のポリスチレンビーズの微粒子試料１０についてラマンイメージ測定を行った。その結果、第１の実施の形態の場合と同様の結果が得られた。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、試料の固定に非破壊・非接触の光トラップを用いることによって、直径数１０ミクロン以下の小さな微粒子試料の固定が容易となるとともに、細胞等の生体試料を損傷を与えることなく固定でき、分子の種類毎の３次元イメージの取得に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態を示す装置構成図
【図２】本発明の第２の実施の形態を示す装置構成図
【符号の説明】
１：光トラップ用光源、２，１２：ビームエクスパンダ、３，１３：レーザーラインフィルタ、４，２４，２８，３１：反射ミラー、５，３４：ガルバノミラー、６，１６：対物レンズ、７，３５：調整可能マウント、８：セル、９：溶液、１０：微粒子試料、１１：分析用光源、１４，１５，２２：ビームスプリッタ、１７：可視光源、１８，２７：集光レンズ、１９：可視透過フィルタ、２０，２１：ホログラフィックノッチフィルタ、２３：テレビカメラ、２５，３２：収束レンズ、２６：ピンホール、２９：調整可能マウント、３０：回折格子、３３：マルチチャネル検出器。
【図１】
0003568846.tif 000002
【図２】
0003568846.tif 000003