(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各シチジンヌクレオチドのシチジンが５−メチルシチジンで置き換えられており、かつ全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
全てのヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドを製剤的に許容される担体中に含んでなる組成物。
【請求項４】
インターフェロンをさらに含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスの活性を阻害する方法であって、該ウイルス又は該ウイルスに感染された細胞を請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドの有効量と in vitro で接触させることを含んでなる方法。
【請求項６】
ＨＣＶ関連疾患を予防又は治療するために使用される請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項７】
ＨＣＶ関連疾患が、急性ＨＣＶ感染、劇症肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬変又は肝細胞癌である、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【序文】
本出願は、１９９６年５月１７日に出願された米国特許出願第０８／６５０，０９３号の一部継続出願であり、その出願は１９９５年５月３０日に出願された米国特許出願第０８／４５２，８４１号の一部継続出願であって、さらにその出願は１９９５年３月９日に出願された米国特許出願第０８／３９７，２２０号の一部継続出願であって、さらにその出願は１９９２年９月１０日に出願された米国特許出願第０７／９４５，２８９号の一部継続出願である。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの活性をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害し、Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患を予防するか又は治療するために投与され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成に関する。これらの化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連した疾患の重篤性を減らすために予防又は治療のいずれかの目的で使用され得る。これらの化合物はまたＣ型肝炎ウイルスの検出及びＣ型肝炎ウイルス関連疾患の診断にも使用され得る。Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡターゲットと特異的にハイブリダイズしてこれらＲＮＡターゲットの機能を阻害し得るオリゴヌクレオチドが開示される。これらの化合物の使用法も開示される。
【０００３】
【発明の背景】
輸血から今日生じる肝炎の支配的な形態は、以前に特徴付けられたＡ型肝炎ウイルス又はＢ型肝炎ウイルスとは関係なく、そのために非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）と言及されてきた。現在ＮＡＮＢＨは輸血後肝炎の症例のうち９０％以上を占める。輸血レシピエントにおけるＮＡＮＢＨの頻度の推計では、ボランティアの血液を受けた人が５％〜１３％、市販品由来の血液を受けた人が２５％〜５４％に及ぶ。
急性のＮＡＮＢＨは、Ａ型肝炎又はＢ型肝炎ウイルスによって引き起こされる急性疾患ほど重篤でないことが多いが、重症又は劇症の肝炎へ至る場合もある。より懸念されているのは、慢性肝炎への進行が、Ａ型肝炎又はＢ型肝炎ウイルスのいずれかの感染後より、ＮＡＮＢＨ感染後のほうがずっと一般的なことである。被感染者の１０％〜７０％で慢性ＮＡＮＢＨが報告されている。この肝炎の形態は無症候性の患者によっても伝播され、肝硬変及び肝細胞癌のような悪性の疾患へしばしば進行する。肝硬変を伴うか伴わない慢性の活動性肝炎は、輸血後肝炎症例の４４％〜９０％において認められる。肝硬変を発症した患者のうち約１／４が肝不全で死亡した。
【０００４】
慢性の活動性ＮＡＮＢＨは、血液製品に頼るしかない血友病患者にとって重大な問題である。血友病患者の５％〜１１％が慢性の末期肝疾患により死亡するからである。血液又は血液製品に跡付けられる症例以外のＮＡＮＢＨの症例は、しばしば院内曝露、偶然の針刺し又は刺青が原因である。ヒトとの接触を介した伝播も起こるが、これはＮＡＮＢＨではＢ型肝炎ほど一般的ではない。
【０００５】
大部分のＮＡＮＢＨの起因性病原体が同定され、今日ではＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と言及されている（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ公開３１８，２１６号；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９ ，２４４ ，３５９−３６２ ）。組換えＤＮＡにより産生した抗原を用いる血清学的な研究に基づけば、輸血後ＮＡＮＢＨのほとんどの症例でＨＣＶが起因性病原体であることは今や明らかである。ＥＰ公開３１８，２１６号（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ）は、ＨＣＶ−１の部分ゲノム配列を開示し、ＨＣＶ配列及びＨＣＶポリペプチドをクローニングして発現させる組換えＤＮＡの方法、ＨＣＶ免疫診断薬の技術、ＨＣＶプローブ診断薬の技術、抗ＨＣＶ抗体及び新しいＨＣＶ配列を単離する方法を教示する。Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ． はまた、追加のＨＣＶ配列を開示し、免疫診断薬、プローブ診断薬、抗ＨＣＶ抗体産生、ＰＣＲ技術及び組換えＤＮＡ技術における上記配列及びポリペプチドの応用を教示する。アンチセンスポリヌクレオチドをウイルス複製の阻害剤として使用するコンセプトが開示されているが、特定のターゲットは教示されていない。開示された配列に基づいたオリゴマープローブ及びプライマーも提供されている。ＥＰ公開４１９，１８２号（Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）は、新しいＨＣＶ単離体であるＪ１及びＪ７、及びＨＣＶ−１配列とは異なる配列のスクリーニング及び診断薬への使用を開示する。
【０００６】
慢性ＮＡＮＢＨに治療に有効であることが示されている唯一の治療法は、α−インターフェロンである。ほとんどのＮＡＮＢＨ患者がインターフェロン療法の間に臨床症状の改善を示すが、治療が中断されると、少なくとも半分の患者で再発が観察される。長期の緩解が達成されるのは６ヶ月間の治療後でも約２０％の患者でしかない。従って、抗ウイルス療法における著名な進歩が大いに所望されている。急性及び慢性のＨＣＶ感染に対する臨床的に有効な抗ウイルス療法への明らかなニーズが存在するのである。そのような抗ウイルス剤はまた、例えば感染性ＨＣＶを含有する血液製品に偶然さらされた個人に対して、ＨＣＶ関連疾患の発症を予防するためにも有用であろう。ＨＣＶ由来の肝炎を他の病原体によって引き起こされた肝炎から差別化し得て、それ故に適切な治療法を設計することに有用である研究試薬及び診断薬に対するニーズもある。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは通常研究試薬及び診断薬として使用される。例えば、本来、鋭敏な特異性で遺伝子発現を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明する、例えばどのウイルス遺伝子が複製に必須であるかを決定したり、ある生物学的経路の様々な成員の機能を区別したりするために、しばしば当業者によって使用される。従って、この特異的な阻害効果は、研究用に利用されてきた。この特異性及び感度はまた、診断薬への使用のために当技術分野の研究者によって強化される。似通った肝臓の症状を引き起こし得るウイルスが患者のサンプルにおいて容易かつ迅速に区別され、適切な治療を実施することが可能になる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害は、治療処置の適切なクールを決定する手段として有用である。例えば、ＨＣＶ感染を有している疑いのある患者を本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させる前に、患者由来の細胞、組織又は体液をオリゴヌクレオチドと接触させ、ウイルスＲＮＡの機能阻害をアッセイすることができる。ＨＣＶ  ＲＮＡ機能の有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害は、ＲＮＡ複製を測定するノーザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ、又はタンパク質を測定するウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡのような方法によって定常的にアッセイされ得るが、この感染がオリゴヌクレオチド治療に対して反応する可能性があることを示す。
【０００８】
オリゴヌクレオチドはまた、動物及び人間の病的状態の治療における治療成分としても利用されてきた。例えば、本分野の研究者たちは、ウイルス、真菌及び代謝性の疾患との関連が示唆される遺伝子の発現をモジュレートし得る、アンチセンス、三重鎖及び他のオリゴヌクレオチド組成物を同定した。例として、１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，１９５号は、ＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。１９９１年４月２日に発行された米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘルペス・ウイルスであるＶｍｗ６５のｍＲＮＡにハイブリダイズして複製を阻害し得るオリゴマーを提供する。１９９３年３月１６日に発行された米国特許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザ・ウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。１９８９年２月２１日に発行された米国特許第４，８０６，４６３号は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを使用してＨＴＬＶ−ＩＩＩの複製を阻害する方法を提供する。米国特許第５，２７６，０１９号及び米国特許第５，２６４，４２３号（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ ．）は、細胞における異種核酸の複製を阻害するために使用されるホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド類似体に向けられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに対して安全かつ有効に投与され、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床試験が現在進行している。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ２９２２は、ＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス網膜炎に奏効することが示されている（ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａｙ，Ａｐｒｉｌ ２９，１９９４，ｐ ．３ ）。従って、細胞及び動物の被験者、特にヒトの治療にとってオリゴヌクレオチドが有用な薬剤であり得ることが立証されている。
【０００９】
Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ． は、ＨＣＶゲノムの特定領域に相補的なアンチセンス化合物を開示した（カナダ特許出願第２，１０４，６４９号）。
Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． は、ＨＣＶの５’ 非翻訳領域に相補的でＨＣＶタンパク質の翻訳を制御するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそれらの使用法を開示した（ＷＯ９４／０８００２号）。
Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． は、ウイルスポリメラーゼの末端タンパク質領域をコードする肝炎ウイルスゲノムの一部分に相補的なＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそのようなオリゴヌクレオチドを使用して肝炎ウイルスの複製を阻害する方法を開示した（ＷＯ９４／２４８６４号）。
ＷａｋｉｔａとＷａｎｄｓ は、ＨＣＶのライフサイクルにおける５’ 末端非翻訳領域の役割を決定するためにセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した。５’ 非翻訳領域の３領域及びコアタンパク質コード領域の１領域をターゲットにしたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を有効に妨害し、これらのドメインがＨＣＶ翻訳に必須である可能性を示唆した（Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９ ，１４２０５−１４２１０ ）。
【００１０】
【発明の要旨】
本発明によれば、ＨＣＶ感染の効果をモジュレートする組成物及び方法が提供される。ＨＣＶ  ＲＮＡの選択された配列に相補的で特異的にハイブリダイズし得て、ＨＣＶ  ＲＮＡの機能を阻害し得るオリゴヌクレオチドが提供される。ＨＣＶポリタンパク質の翻訳開始コドン領域が好ましいターゲットである。この開始コドン領域のヌクレオチド３３０−３４９をターゲットにするオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）が特に好ましく、各シチジン残基に５−メチルシチジンを含んでなるこの配列がさらにより好ましい。ＨＣＶ関連疾患を有している疑いのある動物へ、オリゴヌクレオチドを単独でか又は製剤的に許容される担体と組み合わせて投与することによって病態を診断するか又は治療するための方法も提供される。
【００１１】
【発明の説明】
ＨＣＶゲノムのいくつかの領域が本発明のアンチセンスターゲットとして同定された。ＨＣＶゲノムのサイズは約９４００ヌクレオチドであり、いくつかの構造及び非構造タンパク質へプロセシングされるポリタンパク質をコードする、単一の翻訳リーディングフレームを有する。配列の利用可能度及びヌクレオチドの記数法が系統ごとに異なることを銘記すべきである。ＨＣＶの５’ 非翻訳領域（５’ ＵＴＲ）又は５’ 非コード領域（５’ ＮＣＲ）は、ポリタンパク質翻訳開始コドンの上流にある約３４１個のヌクレオチドからなる。「５’ 末端ヘアピンループ」として本明細書で同定されたゲノム（ＨＣＶ−１）の５’ 末端にあるヌクレオチド１−２２に存在しているヘアピンループは、ウイルスのレプリカーゼ又はヌクレオキャプシドタンパク質の認識シグナルとして役立つと考えられている（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， １７１１−１７１５）。この５’ 非翻訳領域は、ループＡ〜Ｆと命名された６個のステムループ構造を包含する二次構造を有すると考えられている。ループＡはヌクレオチド１３−５０付近に存在し、ループＢはヌクレオチド５１−８８付近に、ループＣはヌクレオチド１００−１２０付近に、ループＤはヌクレオチド１４７−１６２付近に、ループＥはヌクレオチド１６３−２１７付近に、そしてループＦはヌクレオチド２１８−３０７付近に存在している（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９２， ６６， １４７６−１４８３）。これらの構造は２つの主要なＨＣＶ群でよく保存されている。
【００１２】
ＨＣＶ  ＲＮＡの５’ 非翻訳領域には、３つの小さな（それぞれ１２〜１６個のアミノ酸）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在している。これらＯＲＦは翻訳の制御に関わっている可能性がある。本明細書で明示されるようなＯＲＦ３翻訳開始コドンは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， １７１１−１７１５の記数法によればＨＣＶ−１のヌクレオチド３１５−３１７に、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， ２４５１−２４５５ の記数法によればヌクレオチド−１２７〜−１２５に見出される。
【００１３】
本明細書で明示されるようなポリタンパク質翻訳開始コドンは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， １７１１−１７１５の記数法によればＨＣＶ−１のヌクレオチド３４２−３４４に、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， ２４５１−２４５５ のＨＣＶ−１記数法によればヌクレオチド１−３に位置しているＡＵＧ配列である。このポリタンパク質のＡＵＧから下流に（３’ 末端へ向かって）コアタンパク質コード領域が広がっている。
【００１４】
本明細書で明示されるような３’ 非翻訳領域は、ポリタンパク質翻訳終止部位（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．によればｎｔ９０３７、Ｈａｎ とＩｎｃｈａｕｓｐｅ の記数法によればｎｔ９３７７で終わる）の下流にあるヌクレオチドからなる。３’ 非翻訳領域内にあるゲノムの３’ 末端に位置するヌクレオチド９６９７−９７１６（ＨＣＶ−ＨについてのＩｎｃｈａｕｓｐｅ の記数法）は、本明細書で３’ ヘアピンループと同定される安定なヘアピンループ構造へ組織化され得る。この３’ ヘアピンのすぐ上流（ＨＣＶ−Ｈのｎｔ９６９１−９６９６）にある短いヌクレオチドストレッチ（Ｒ２）は、本明細書で「Ｒ２配列」と命名されるが、恐らくはｎｔ２３−２８及び３８−４３の同一配列である５’ 末端６塩基対リピート（本明細書で「５’ 末端６塩基対リピート」として同定される）のセットとともに、ウイルスＲＮＡの環化においてある役割を担っていると考えられている（Ｉｎｃｈａｕｓｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９１， ８８， １０２９２−１０２９６）。ゲノムの３’ 末端近くに存在しているパリンドローム配列（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９１， ６５， １１０５−１１１３の記数法によるとヌクレオチド９３１２−９３４２）は、安定な二次構造を形成することができる。これは本明細書では３’ 末端パリンドローム領域として言及される。
【００１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得てＨＣＶ  ＲＮＡの機能を阻害することができる５〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを利用する。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’ 末端ヘアピンループ、５’ 末端６塩基対リピート、５’ 末端非翻訳領域、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域、ＯＲＦ３翻訳開始コドン、３’ 非翻訳領域、３’ 末端パリンドローム領域、Ｒ２配列及び３’ 末端ヘアピンループ領域をターゲットにする。オリゴヌクレオチドとそのターゲットとなる核酸配列との関係は、一般に「アンチセンス」として言及される。オリゴヌクレオチドをある選択された核酸ターゲットに「ターゲットする」ことは、本発明の文脈では、多工程の方法である。この方法は、通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列を同定することから始まる。これは、例えば、その発現が特定の病態に関連づけられる細胞の遺伝子（又はその遺伝子から作られるｍＲＮＡ）、又は感染病原体由来の異種核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）であり得る。本発明では、ターゲットは、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’ 末端ヘアピンループ、５’ 末端６塩基対リピート、ＯＲＦ３翻訳開始コドン（これらはすべて５’ ＵＴＲの内部に含有されている）、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域（これらはいずれもコード領域内に含有されている）、３’ 末端パリンドローム領域、Ｒ２配列又は３’ 末端ヘアピンループ（これらはすべて３’ ＵＴＲの内部に含有されている）である。ターゲットする方法には、所望の効果、即ちＨＣＶ  ＲＮＡ機能の阻害が起こるようにオリゴヌクレオチドが相互作用するための核酸配列内の部位を決定することも含まれる。このターゲット部位が同定されたなら、ターゲットに十分相補的である、即ち所望されるモジュレーションをもたらすのに十分強く、十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択される。
【００１６】
本発明の文脈では、「モジュレーション」は阻害又は刺激のいずれかを意味する。ＨＣＶ  ＲＮＡ機能の阻害が本発明におけるモジュレーションの好ましい態様である。オリゴヌクレオチドは、ウイルスＲＮＡの複製、ｍＲＮＡへの転写、タンパク質への翻訳、ウイルス粒子へのパッケージング又はその全生物学的機能に必要な他の活性へ干渉することによって、ウイルスＲＮＡの機能を阻害することができる。このＲＮＡがその機能の全部又は一部を果たせなければ、ウイルスの正常なライフサイクルの全部又は一部が破綻してしまう。本出願の実施例で教示されるように、この阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（動物）系のいずれかに由来するサンプルにおいて、当技術分野で定常的である方法、例えばＨＣＶ  ＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロットアッセイ、又はタンパク質発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡアッセイによって測定され得る。本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック型の塩基対合としても知られている、通常は反対の核酸鎖か又はある核酸鎖の２領域上にある相補的な塩基間の水素結合を意味する。グアニンとシトシンはその間に３つの水素結合を形成することが知られている相補的な塩基の例である。アデニンとチミンは、その間に２つの水素結合を形成する相補的な塩基の例である。「特異的にハイブリダイズする」及び「相補的」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとオリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特定の結合が起こるほど十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズし得るのに、そのターゲット核酸配列に対して１００％相補的である必要はないと理解されている。オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズし得るのは、オリゴヌクレオチドのターゲットへの結合がターゲット分子の正常機能に干渉して有用性の欠失を引き起こすとき、及び特異的な結合が所望される条件（即ちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又は治療処置の場合又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合の生理学的条件及びそのようなアッセイが実施される条件）の下で、非ターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的な結合が回避されるに十分な程度の相補性があるときである。
【００１７】
本発明の文脈では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーに言及する。「オリゴヌクレオチド」という用語には、同様に機能する天然に存在しないモノマー又はその部分を含んでなるオリゴマー又はポリマーも含まれる。そのような修飾されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドがネーティブな形態よりしばしば好ましいのは、例えば、強められた細胞取込み、ヌクレアーゼ存在下での高められた安定性又は強められたターゲット親和性のような特性のためである。数多くのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾により、それらを取り込んだオリゴヌクレオチドが、ネーティブなオリゴデオキシヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより抵抗性になることが示されている。ヌクレアーゼ抵抗性は、細胞の抽出物又は単離したヌクレアーゼ溶液とともにオリゴヌクレオチドをインキュベートし、経時的に残存している生のオリゴヌクレオチドの程度を、通常はゲル電気泳動によって測定することによって定常的に測定される。ヌクレアーゼ抵抗性を強めるように修飾されたオリゴヌクレオチドは非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い間そのままで存在する。数多くの修飾がオリゴヌクレオチドのそのターゲットへの結合（親和性）を高めることも示されてきた。オリゴヌクレオチドのそのターゲットへの親和性は、オリゴヌクレオチドとターゲットが解離する温度であるオリゴヌクレオチド／ターゲット対のＴｍを測定することによって定常的に決定されている。解離は分光光度計により検出される。Ｔｍが高いほどオリゴヌクレオチドのターゲットに対する親和性が大きい。ターゲットへの結合親和性を強めるオリゴヌクレオチド修飾によりヌクレアーゼ抵抗性が独立的に強められる場合もある。
【００１８】
本発明に想定されている好ましい修飾オリゴヌクレオチドの特定の例は、１つ又はそれ以上の位置で、ネーティブなホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）骨格の代わりにホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環式糖間（「 骨格」 ）結合を含有し得る。最も好ましいのはホスホロチオエート、及びＣＨ２ −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２ 、ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｏ−ＣＨ２ ［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、ＣＨ２ −Ｏ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ 、ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ 及びＯ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −ＣＨ２ 骨格を有するものである（ここでホスホジエステルは、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２ である）。また好ましいのは、モルホリノ骨格の構造を有するオリゴヌクレオチドである（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ，Ｊ ．Ｅ ．とＷｅｌｌｅｒ，Ｄ ．Ｄ ．，米国特許第５，０３４，５０６号）。他の好ましい態様では、タンパク質−核酸又はペプチド−核酸（ＰＮＡ）骨格のように、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置換されていて、塩基はポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している（Ｐ ．Ｅ ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ，Ｍ ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ ．Ｈ ．Ｂｅｒｇ，Ｏ ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４ ，１４９７）。より好ましいのは、１つ又はそれ以上のＰＮＡ、ＭＭＩ又はＰ＝Ｓ骨格結合を含有するオリゴヌクレオチドである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’ 位に以下の１つを含んでなる１種又はそれ以上の置換された糖成分を含有し得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３ 、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ２ ＯＣＨ３ 、ＯＣＨ２ Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＣＨ３ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＮＨ２ 又はＯ（ＣＨ２ ）ｎ ＣＨ３ （ここでｎは１〜約１０である）；Ｃ１ 〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３ ；ＯＣＦ３ ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３ ；ＳＯ２ ＣＨ３ ；ＯＮＯ２ ；ＮＯ；Ｎ３ ；ＮＨ２ ；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ開裂基；コレステリル基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基；又はオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換体。好ましい修飾には、２’ −メトキシエトキシ（２’ −Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３ ）、２’ −メトキシ−（２’ −Ｏ−ＣＨ３ ）、２’ −プロポキシ（２’ −ＯＣＨ２ ＣＨ２ ＣＨ３ ）及び２’ −フルオロ−（２’ −Ｆ）が含まれる。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’ 末端ヌクレオチド上の糖の３’ 位及び５’ 末端ヌクレオチドの５’ 位でも同様の修飾がなされる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模擬体を有する場合がある。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオ塩基修飾又は置換を追加的又は代替的に包含し得る。本明細書で使用されるように、「非修飾の」又は「天然の」ヌクレオ塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。当技術分野で知られている修飾ヌクレオ塩基には、天然の核酸にごく稀に又は一時的に見出されるヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン（これに対応するヌクレオチドであるイノシンは、「普遍塩基」として言及される場合もある）、６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲンチオビオシルＨＭＣ、並びに人工のヌクレオ塩基、例えば、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６ （６−アミノヘキシル）アデニン及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。シトシン塩基が５−メチルシトシンによって置換されているオリゴヌクレオチドは、本発明の好ましい態様である。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドに関するもう１つの好ましい追加又は代替の修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強する１種又はそれ以上の親油性成分をオリゴヌクレオチドへ化学的に連結させることを含む。そのような親油性成分は、オリゴヌクレオチド上のいくつかの異なる位置でオリゴヌクレオチドに連結され得る。好ましい位置には、３’ 末端ヌクレオチドの糖の３’ 位、５’ 末端ヌクレオチドの糖の５’ 位及び任意のヌクレオチドの糖の２’ 位が含まれる。プリンヌクレオ塩基のＮ６ 位も本発明のオリゴヌクレオチドへ親油性成分を連結するために利用され得る。当技術分野で知られているそのような親油性成分には、限定しないが、コレステリル成分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族の鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル成分、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分が含まれる。親油性成分を含んでなるオリゴヌクレオチド及びそのようなオリゴヌクレオチドを製造する方法は、米国特許第５，１３８，０４５号、第５，２１８，１０５号及び第５，４５９，２５５号に開示されているが、その内容は参照により本明細書に組込まれている。
【００２１】
本発明はのある好ましいオリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」は、本発明の文脈において、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドからなる、２種又はそれ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。典型的には、これらオリゴヌクレオチドは、１つ又はそれ以上の有益な特性（例えば、増加したヌクレアーゼ抵抗性、増加した細胞取込み、ＲＮＡターゲットに対する増加した結合親和性）を与える少なくとも１つの修飾ヌクレオチド領域、及びＲＮアーゼＨ開裂の基質となる領域を含有する。ある好ましい態様では、キメラオリゴヌクレオチドは、ターゲット結合親和性を高めるように修飾された少なくとも１つの領域、及び通常は、ＲＮアーゼＨの基質として作用する領域を含む。オリゴヌクレオチドのそのターゲット（この場合、ＨＣＶ  ＲＮＡをコードしている核酸）に対する親和性は、オリゴヌクレオチドとターゲットが解離する温度であるオリゴヌクレオチド／ターゲット対のＴｍを測定することによって定常的に決定されるが、解離は分光光度計により検出される。Ｔｍが高いほどオリゴヌクレオチドのターゲットに対する親和性が大きい。より好ましい態様では、ＨＣＶ  ＲＮＡの結合親和性を高めるように修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’ 位で修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２’ −Ｏ−アルキル又は２’ −フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。そのような修飾はオリゴヌクレオチドへ定常的に取込まれ、これらオリゴヌクレオチドは、ある一定のターゲットに対して２’ −デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（即ち、より高いターゲット結合親和性）を有することが示されてきた。そのような高められた親和性の効果は、ＨＣＶ  ＲＮＡ機能のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を大いに強める。ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼであり、従ってこの酵素の活性化はＲＮＡターゲットの開裂をもたらし、それによりアンチセンス阻害の効率を大いに高め得る。ＲＮＡターゲットの開裂はゲル電気泳動によって定常的に示し得る。もう１つの好ましい態様では、キメラオリゴヌクレオチドはまたヌクレアーゼ抵抗性を強めるように修飾される。細胞には、核酸を分解し得る多種多様なエクソ−及びエンド−ヌクレアーゼが含まれる。数多くのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾により、それらを取り込んだオリゴヌクレオチドが、ネーティブなオリゴデオキシヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより抵抗性になることが知られている。ヌクレアーゼ抵抗性は、細胞の抽出物又は単離したヌクレアーゼ溶液とともにオリゴヌクレオチドをインキュベートし、経時的に残存している生のオリゴヌクレオチドの程度を、通常はゲル電気泳動によって測定することによって定常的に測定される。ヌクレアーゼ抵抗性を強めるように修飾されたオリゴヌクレオチドは非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い間そのままで存在する。多種多様なオリゴヌクレオチド修飾がヌクレアーゼ抵抗性を強めるか又はもたらすことが示されてきた。ターゲットへの結合親和性を強めるオリゴヌクレオチド修飾によりヌクレアーゼ抵抗性も独��的に強められる場合もある。より好ましいのは、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の化合物は、製剤的に許容される塩及びプロドラッグを含め、生物学的に同等な化合物を包含する。
本発明の化合物は、ヒトを包含する動物への投与時に、生物学的に活性なその代謝物又は残基を（直接的又は間接的に）提供し得る、製剤的に許容される塩、エステル又はそのようなエステルの塩、又は他の任意の化合物を網羅する。従って、例えば、本発明の開示は本発明の核酸の製剤的に許容される塩及びそのような核酸のプロドラッグへも引用される。
製剤的に許容される塩とは、本発明の核酸の生理学的及び製剤的に許容される塩、即ち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、所望されない毒性効果をそれへ分与しない塩である。
【００２３】
製剤的に許容される塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属又はアミンとともに形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。好適なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’ −ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ． １９７７， ６６： １ を参照のこと）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来法で塩を産生するために、十分量の所望される塩基にフリーの酸型を接触させることによって製造される。フリーの酸型は、従来法でこの塩型を酸に接触させ、フリーの酸を単離することによって再生され得る。フリーの酸型は、極性溶媒における溶解度のようなある物理的性質においてそれぞれの塩型とやや異なるが、他の点では、本発明の目的にとって、塩はそれぞれのフリー酸と同等である。本明細書で使用されるように、「医薬付加塩」は、本発明の組成物を構成する成分のある酸型の製剤的に許容される塩を包含する。これには上記アミンの有機又は無機塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の好適な製剤的に許容される塩は当業者によく知られていて、例えば塩酸、臭酸、硫酸又はリン酸のような無機酸；例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルコン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸といった天然のタンパク質合成に関わる２０種のα−アミノ酸のようなアミノ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−又は３−ホスホグリセリン酸塩、グルコース−６−リン酸塩、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成とともに）といった有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ又はホスホ酸又はＮ−置換スルファミン酸；又はアスコルビン酸のような他の酸有機化合物といった、様々な無機及び有機酸の塩基性塩を包含する。
化合物の製剤的に許容される塩はまた製剤的に許容されるカチオンとともに形成され得る。製剤的に許容される好適なカチオンは当業者によく知られていて、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び４級アンモニウムカチオンを包含する。炭酸塩又は炭酸水素塩も可能である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドにとって、製剤的に許容される塩の例は、限定しないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジンのようなポリアミン等のようなカチオンとともに形成される塩；（ｂ）例えば塩酸、臭酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸とともに形成される酸付加塩；（ｃ）酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸とともに形成される塩；及び（ｄ）塩素、臭素及びヨウ素のようなアニオン元素から形成される塩を包含する。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プロドラッグ形態でデリバリーされるために追加的又は代替的に製造され得る。「プロドラッグ」という用語は、生体又はその細胞の内部で、内因性の酵素又は他の化学品及び／又は条件の作用によって活性形（つまり、薬物）へ変換される不活性形で製造されている治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．へのＷＯ９３／２４５１０号（１９９３年１２月９日公開）に開示された方法によって、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導体として製造される。
【００２６】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは約５〜約５０ヌクレオチドの長さである。本発明の文脈では、これは５〜５０個のモノマーを有する、すでに記載されたような天然に存在しないオリゴマーを網羅する。
本発明に準拠して使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の既知技術を介して簡便かつ定常的に製造され得る。そのような合成のための装置は、アプライド・バイオシステムズを含むいくつかのベンダーによって販売されている。そのような合成に代わる他の手段も利用し得るが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は技術者の力量にかかっている。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造する同様の技術を使用することも知られている。コレステロール修飾オリゴヌクレオチドのような修飾オリゴヌクレオチドを合成するには、同様の技術、及びＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、ＶＡ）から入手し得るような市販の修飾されたアミダイト及び制御孔ガラス（ＣＰＧ）製品を使用することも知られている。
【００２７】
ＨＣＶウイルス、又はこのウイルスを含有している疑いのある細胞、組織又は体液を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させる、ＨＣＶウイルスの活性をモジュレートする方法が提供される。本発明の文脈では、「接触させること」は、このウイルスの調製物へオリゴヌクレオチドを加えることか又はその逆のこと、又は細胞、組織又は体液の調製物又は単離物へオリゴヌクレオチドを加えることか又はその逆のこと、又はウイルス、細胞、組織又は体液そのものへ、つまり動物、特にヒトの中にオリゴヌクレオチドを加えることを意味する。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬、治療薬、及び研究試薬及びキットとして使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドはＨＣＶ由来のＲＮＡにハイブリダイズするので、このことを活用してサンドイッチ及び他のアッセイが容易に構築され得る。ＨＣＶ又はＨＣＶを含む疑いのあるサンプルに存在するそれとオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する手段の提供が定常的に達成され得る。そのような提供には、酵素結合、放射標識化又は他の好適な検出系が含まれ得る。ＨＣＶの存在又は不在を検出するキットも製造され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのＨＣＶ  ＲＮＡ機能を阻害する特定の能力もまたＨＣＶ、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の検出及び診断に利用され得る。本出願の実施例で説明されるように、ＨＣＶ  ＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害の結果として起こる、ＨＣＶ  ＲＮＡ又はタンパク質レベルの低下は、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡによって定常的に検出され得る。
【００２９】
予防薬及び治療薬について、ＨＣＶ関連疾患を予防する方法及びＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患を治療する方法が提供される。治療組成物の製剤化及びそれに後続する投与は当技術分野の技量範囲内にあると考えられる。オリゴヌクレオチドは医薬組成物において製剤化され得るが、それにはオリゴヌクレオチドに加えて担体、濃化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、リポソーム又は脂質製剤等が含まれ得る。医薬組成物には、インターフェロン、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬等のような１種又はそれ以上の活性成分が含まれ得る。非経口投与用の製剤には、緩衝剤、リポソーム、希釈剤及び他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液が含まれ得る。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、局所又は全身投与のどちらが所望されるのか、及び処置される部位により、数多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、表皮、経皮を含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内又は筋肉内注射、例えば吸入又は通気による肺への投与、頭蓋内（例えば鞘内）又は脳室内投与が含まれる。経口投与については、少なくとも１つの２’ 置換リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドがその吸収と分布特性のために特に有用であることが見出されている（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．へ発行された米国特許第５，５９１，７２１号）。少なくとも１つの２’ −Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用であると考えられている。
【００３１】
局所投与用の製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤及び粉末が含まれ得る。従来の製剤用担体、水性、粉末又は油状の基剤、濃化剤等が必要であるか又は所望され得る。被覆されたコンドーム、グラブなどもまた有用であり得る。
経口投与用の組成物には、粉末又は顆粒剤、水又は非水性媒体に溶けた懸濁液又は溶液、カプセル剤、小袋（ｓａｃｈｅｔ）又は錠剤が含まれる。濃化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤も所望され得る。
【００３２】
非経口投与用の組成物には、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含有し得る滅菌水溶液が含まれ得る。
投与は治療される病態の重症度及び反応性に依存し、治療期間は数日から数ヶ月、又はウイルス力価（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ又はＲＮＡ（ノーザン）ブロットによって定常的に測定される）の減少に奏効するか又は病態の減衰が達成されるまで続く。最適な投与スケジュールは、患者体内の薬物蓄積量の測定から容易に算出される。当業者は、最適投与量、投与方法及び反復率を容易に決定し得る。治療的に又は予防的に有効な量（投与量）は個々の組成物の相対効力によって変化し得るが、一般には、分子量及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又は動物試験のＥＣ５０に基づいて定常的に算出され得る。例えば、（オリゴヌクレオチド配列及び化学構造から派生した）医薬化合物の分子量、及び例えばＩＣ５０のような実験的に導かれた有効用量に基づいて、ｍｇ／ｋｇ単位の用量が定常的に算出される。
一般に、投与量は０．００１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週、１月又は１年、さらには２〜２０年につき１回又はそれ以上投与され得る。
【００３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬力学
ＨＣＶ感染に起因する主要な病理は被感染者の肝臓において起こるので、潜在的な抗ＨＣＶ化合物は、肝臓において有意に濃縮され得ることが有利である。数多くのオリゴヌクレオチド、主にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの薬力学的プロフィールが決定されてきた。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、その配列に拘らず、ごく類似した薬力学及び組織分布を有することが示された。このことは、迅速な分布相（約３０分）及び延長された消失相（約４０時間）によって血漿において特徴付けられている。ホスホロチオエートは末梢組織（即ち、例えば脳室内薬物投与によって直接到達可能であり、さらに多くの神経系病態において不全化した血液脳関門を介して到達することも可能である、脳も例外ではない）まで広く分布し、最大濃度は肝臓、腎皮質及び骨髄において見出される。ほとんどの組織、特に肝臓、腎臓及び骨髄では、ごく延長した組織内化合物半減期をもって、そのままの化合物が十分蓄積している。オリゴヌクレオチドが静脈内か又は皮下で投与されても、同様の分布プロフィールが見出される。さらに、薬力学及び組織分布プロフィールは、げっ歯類、サル及びヒトを包含する動物種内でよく一致している。
【００３４】
【本発明の好ましい態様】
ウイルスをターゲットにするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドはウイルス感染を減らすことに有効であり得ることが見出されている。
本発明によれば、当技術分野の技術者は、メッセンジャーＲＮＡが３文字の遺伝暗号を用いてタンパク質をコードする配列情報だけでなく、５’ 非翻訳領域、３’ 非翻訳領域及び５’ キャップ領域としてそのような人々に知られている領域を形成する関連したリボヌクレオチド、並びに様々な２次構造を形成するリボヌクレオチドを包含することを理解するだろう。従って、本発明によれば、コードしているリボヌクレオチドだけでなく、これら関連したリボヌクレオチドをも全体的又は部分的にターゲットとするオリゴヌクレオチドが製剤化され得る。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ＨＣＶの５’ 末端ヘアピンループ、５’ 末端６塩基対リピート、ＯＲＦ３翻訳開始コドン（これらはすべて５’ ＵＴＲの内部に含有されている）、ポリタンパク質翻訳開始コドン、コアタンパク質コード領域（これらはいずれもコード領域内に含有されている）、Ｒ２配列、３’ ヘアピンループ又は３’ 末端パリンドローム領域（これらはすべて３’ ＵＴＲの内部に含有されている）と特異的にハイブリダイズし得る。様々な系統及び同一系統内の様々な型に由来するＨＣＶのＲＮＡには種々の相違点が存在すると予測される。様々なＨＣＶ系統の領域はそれぞれの系統については本質的に同じ機能を担っていて、相同又は類似のＲＮＡ領域に干渉すると様々な系統でも同様の結果がもたらされると考えられる。たとえ種々の系統内でヌクレオチド配列内の違いが存在するとしても、このことは同じであると考えられている。
【００３５】
従って、本明細書で示されるヌクレオチド配列は、説明される特定の系統を代表するものと理解されるだろう。様々な系統のＨＣＶについて相同又は類似の配列も、本発明の範囲内にあるものとして特別に考慮される。本発明の好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’ 非翻訳領域、コアタンパク質翻訳開始コドン領域、コアタンパク質コード領域、ＯＲＦ３翻訳開始コドン及び３’ 非翻訳領域をターゲットにする。
好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部分、又はコアタンパク質コード領域の少なくとも一部分とハイブリダイズする。ヌクレオチド１−６８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）の配列は、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’ 非翻訳領域全体（ヌクレオチド１−３４１）及び１４５以降のヌクレオチドコア領域配列を含む。ポリタンパク質翻訳開始コドンの少なくとも一部分とハイブリダイズし得るきわめて好ましいオリゴヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。
【００３６】
ＨＣＶアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＨＣＶ複製の細胞培養系はまだ確立していない。そのために、抗ＨＣＶ活性についてアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価するにはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイが使用される。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、ウサギ網状赤血球アッセイにおけるＨＣＶのＵＴＲ−コア−ｅｎｖ転写物の合成を阻害する能力についてオリゴヌクレオチド化合物が評価された。
オリゴヌクレオチドの抗ＨＣＶ活性を評価するには細胞をベースとするアッセイも使用される。そのようなアッセイの１つでは、ＨＣＶ  ＲＮＡ機能に対するオリゴヌクレオチドの効果が、ＨＣＶゲノムの５’ 末端を発現する形質転換された肝細胞におけるＲＮＡ及び／又はＨＣＶコアタンパク質レベルを測定することによって評価される。本出願の実施例に記載されるように、組換えＨＣＶ／ワクシニアウイルスアッセイも使用され得る。例えば、本出願の実施例に記載されるような、ルシフェラーゼ配列に融合したＨＣＶ配列を含有する組換えワクシニアウイルスを用いるルシフェラーゼアッセイも使用され得る。蛍光計（ルミノメーター）を用いたルシフェラーゼの定量は、ＨＣＶコアタンパク質の発現及びアンチセンス化合物によるその阻害を測定する簡便な方法である。これは、培養肝細胞又は処置された動物からの肝臓生検のような組織サンプルにおいて実施され得る。
【００３７】
ＨＣＶの動物モデル
慢性ＨＣＶ感染の動物モデルはほとんどない。マウスにおいて化合物を試験するために組換えワクシニア／ＨＣＶ／ルシフェラーゼウイルス発現アッセイが開発された。マウスに組換えワクシニアウイルス（ＨＣＶ／ルシフェラーゼか対照としてルシフェラーゼだけのいずれかを発現している）を接種する。１日〜数日後に臓器（特に肝臓）を採取して、組織内のルシフェラーゼ活性をルミノメトリーによってアッセイする。
以下の特定の実施例は例示目的のためだけに提供され、本発明を制限するためのものではない。
【００３８】
【実施例】
実施例１：オリゴヌクレオチド合成
未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヨウ素酸化を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を使用する自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ、モデル３８０Ｂ）で合成された。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトはアプライドバイオシステムズ（フォスターシティ、ＣＡ）より購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのためには、亜リン酸結合の段階的チオエート化に用いる３ Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に標準酸化ボトルを置き換えた。チオエート化サイクルの待ち工程を６８秒まで高め、それにキャッピング工程を続けた。
【００３９】
２’ −メトキシオリゴヌクレオチドは、２’ −メトキシ−β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト（ケムジーンズ、ニーダム、ＭＡ）及び未修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを用いて合成したが、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待ち工程は３６０秒に高めた。他の２’ −アルコキシオリゴヌクレオチドは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、スターリング、ＶＡから入手できるような適切な２’ 修飾アミダイトを使用して、上記の方法を変更して合成した。
【００４０】
２’ −フルオロ−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ３６， ８３１ の記載のように合成した。簡略に言うと、市販の９−８−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発材料として利用し、２’ −８−Ｏ−トリフィル基のＳＮ ２置換によって２’ −” −フルオロ原子を導入して文献の方法を変更することによって、保護化したヌクレオシド、Ｎ６ −ベンゾイル−２’ −デオキシ−２’ −フルオロアデノシンを合成した。従って、Ｎ６ −ベンゾイル−９−８−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは、３’ ，５’ −ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中等度の収量で選択的に保護化された。ＴＨＰ及びＮ６ −ベンゾイル基の脱保護は標準的な方法を用いて実行し、標準法を用いて５’ −ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び５’ −ＤＭＴ−３’ −ホスホロアミダイト中間体を得た。
【００４１】
２’ −デオキシ−２’ −フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護化９−８−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発材料として使用して実施し、中間体のジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへ変換した。ＴＰＤＳ基を脱保護化した後、ＴＨＰでヒドロキシル基を保護化して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護化アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフリル化に次いで粗生成物をフッ化物で処置し、次いでＴＨＰ基を脱保護化した。標準法を用いて５’ −ＤＭＴ−及び５’ −ＤＭＴ−３’ −ホスホロアミダイトを得た。
【００４２】
２’ −デオキシ−２’ −フルオロウリジンの合成は、２，２’ −アンヒドロ−１−８−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素／ピリジンで処理する文献の方法を変更して達成した。標準法を用いて５’ −ＤＭＴ及び５’ −ＤＭＴ−３’ ホスホロアミダイトを得た。
２’ −デオキシ−２’ −フルオロウリジンのアミノ化を介して２’ −デオキシ−２’ −フルオロシチジンを合成した後、選択的な保護化によってＮ４ −ベンゾイル−２’ −デオキシ−２’ −フルオロシチジンを得た。標準法を用いて５’ −ＤＭＴ及び５’ −ＤＭＴ−３’ ホスホロアミダイトを得た。
【００４３】
メチレン（メチルイミノ）骨格を有するオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，３７８，８２５号によって合成されるが、これは本発明の譲渡人へ同時譲渡され、そのまま参照により本明細書に組込まれている。他の窒素含有骨格はＷＯ９２／２０８２３号によって合成されるが、これも本発明の譲渡人へ同時譲渡され、そのまま参照により本明細書に組込まれている。
アミド骨格を有するオリゴヌクレオチドは、Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ ．Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． １９９５， ２８， ３６６により合成される。アミド成分は簡便で有名な合成法によって容易に得られ、オリゴヌクレオチドの固相合成に必要とされる条件に適合している。
【００４４】
モルホリノ骨格を有するオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ とＷｅｌｌｅｒ）によって合成される。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーは、Ｐ． Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１， ２５４， １４９７ によって合成される。
制御孔ガラスカラム（アプライドバイオシステムズ）から分離し、５５℃で１８時間、濃水酸化アンモニウムにて脱保護化した後、０．５Ｍ  ＮａＣｌと２．５倍量のエタノールからの２度の沈殿によってオリゴヌクレオチドを精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは非変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、少なくとも８５％は完全な長さの物質であると判定された。合成で得られたホスホロチオエート及びホスホジエステルの相対量を３１Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的に検査し、試験によっては、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １８１６２によって記載されるように、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣで精製された物質について得られた結果は、ＨＰＬＣで精製しなかった物質について得られたものと同様であった。
２’ −Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３ 修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、Ｍａｒｔｉｎ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５ ，７８，４８６−５０４ の方法によって合成した。２’ −Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３ −シトシンは、いずれも以下のように合成される５−メチルシトシンであった：
【００４５】
モノマー類：
２，２’ −アンヒドロ［１−β−Ｄ −アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本の市販品）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。この混合液を撹拌しながら還流加熱し、発生する二酸化炭素ガスを制御されたやり方で放出させた。１時間後、やや黒ずんだ溶液を減圧濃縮した。得られたシロップを、撹拌しながら、ジエチルエーテル（２．５Ｌ）へ注いだ。生成物はゴムを形成した。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶かした。この溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと、堅いゴムを生じた。エーテルをデカントし、このゴムを真空オーブンにて乾燥させ（６０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）、得られた固形物を粉砕して明褐色の粉末にした（５７ｇ，粗収率８５％） 。この物質を以後の反応に使用した。
【００４６】
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’ −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧力容器へ加え、前もって１６０℃に加熱した油浴に置いた。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、この容器を開き、この溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）を加えて磨砕した。残渣を温アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ３ ＣＮ（６００ｍＬ）に溶かし、蒸発させた。０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含有するＣＨ２ Ｃｌ２ ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）でシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填した。残渣をＣＨ２ Ｃｌ２ （２５０ｍＬ）に溶かし、シリカ（１５０ｇ）に吸着させてからカラムにロードした。充填溶媒で生成物を溶出させ、生成物１６０ｇ（６３％）を得た。
【００４７】
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共沸させ、残渣を乾燥させてからピリジン（１．３Ｌ）に溶かした。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この反応物をさらに１時間撹拌した。次いでメタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を止めた。ＨＰＬＣにより約７０％の生成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、ＣＨ３ ＣＮ（２００ｍＬ）を加えて磨砕した。残渣をＣＨＣｌ３ （１．５Ｌ）に溶かし、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３ 及び２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ ＳＯ４ で乾燥し、濾過して、蒸発させた。２７５ｇの残渣を得た。この残渣を、０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填して溶出させる３．５ｋｇシリカゲルカラムで精製した。純粋な分画を蒸発させて生成物１６４ｇを得た。純度の低い分画からさらに約２０ｇを得て、全体収量１８３ｇ（５７％）を得た。
【００４８】
３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（ＤＭＦ５６２ｍＬ及びピリジン１８８ｍＬから調製された３：１の混合液７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を合わせて室温で２４時間撹拌した。最初にｔｌｃサンプルをＭｅＯＨ添加で急冷し、ｔｌｃにより反応をモニターした。ｔｌｃで判断して、反応終了後、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合液を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３ （８００ｍＬ）に溶かし、２ｘ２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層をＣＨＣｌ３ ２００ｍＬで再抽出した。一緒にした有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残渣１２２ｇを得た（約９０％の生成物）。この残渣を３．５ｋｇシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出さた。純粋な生成物の分画を蒸発させて９６ｇ（８４％）を得た。
【００４９】
３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ３ ＣＮ（７００ｍＬ）に溶かして第一の溶液を調製し、取って置いた。トリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ３ ＣＮ（１Ｌ）溶液へトリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）を加え、−５℃に冷却し、オーバーヘッド撹拌子を使用して０．５時間撹拌した。この溶液を撹拌しながら、０−１０℃に保ちながら、ＰＯＣｌ３ を１滴ずつ３０分かけて加え、得られた混合液をさらに２時間撹拌した。この後の溶液へ、第一の溶液を１滴ずつ４５分間かけて加えた。得られた反応混合物を一晩冷室に保管した。反応混合液から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶かし、不溶性の固形物を濾過で除去した。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ３ 及び２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃで磨砕し、表題化合物を得た。
【００５０】
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）／ＮＨ４ ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間撹拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）で共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶かし、２リットルのステンレス鋼圧力容器へ移した。ＮＨ３ ガスが飽和したメタノール（４００ｍＬ）を加え、容器を２時間１００℃へ加熱した（ｔｌｃにより完全な変換が示された）。容器の内容物を蒸発乾固させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、表題化合物８５ｇ（９５％）を得た。
【００５１】
Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶かし、無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、ｔｌｃは反応が約９５％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸させた。残渣をＣＨＣｌ３ （７００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３ （２ｘ３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４ で乾燥し、蒸発させ、残渣（９６ｇ）を得た。この残渣を、０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理した。生成物の純粋な分画を蒸発させて表題化合物９０ｇ（９０％）を得た。
【００５２】
Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’ −アミダイト
Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ２ Ｃｌ２ （１Ｌ）に溶かした。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を撹拌しながら窒素環境下で加えた。得られた混合液を室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは反応が約９５％完了したことを示した）。反応混合液を飽和ＮａＨＣＯ３ （１ｘ３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性の洗浄液をＣＨ２ Ｃｌ２ （３００ｍＬ）で再抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４ で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理した。純粋な分画を合わせて表題化合物９０．６ｇ（８７％）を得た。
５−メチルシチジンＤＭＴβ−シアノエチルホスホロアミダイトは、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フラミンガム、ＭＡ）から市販されている。
【００５３】
実施例２：ポリタンパク質翻訳開始コドン領域及び隣接したコアタンパク質コード領域をターゲットにするアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性の評価
（１）ＨＣＶ−ＲＮＡの翻訳開始コドン（ヌクレオチド番号３４２−３４４）を包含する領域及び隣接したコアタンパク質コード領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を評価するために、ヌクレオチド３２０〜ヌクレオチド３７９の領域に相補的である２０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチド系列を製造した。これらは、ＨＣＶ  ＲＮＡ上のそのターゲット配列によって命名される。つまり、オリゴヌクレオチドの名称（例、３３０）は、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：３７に示される対応するＨＣＶ  ＲＮＡターゲット配列の５’ 末端ヌクレオチドの番号である。従って、オリゴヌクレオチド３３０はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示されるＨＣＶ  ＲＮＡのヌクレオチド３３０−３４９をターゲットにする。これらオリゴヌクレオチドのうち、オリゴヌクレオチド３２４−３４４は、ＡＵＧ開始コドンそのものに相補的であるＣＡＴ配列の全部又は一部を含有する。これらアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を表１に示す。
【００５４】
【表１】
0003589979.tif 000002
【００５５】
上記２１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイで評価した。表１に示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド３２８、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８及び３６０は、７０％以上の阻害活性を示したので、好ましい。このなかで、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０及び３５２は、９５％以上のきわめて高い阻害活性を示したので、最も好ましい。
上記９種の最も活性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なＨＣＶターゲット配列は、ポリタンパク質翻訳開始コドン付近のコアタンパク質コード領域にある３５２〜３５５番目の４つのヌクレオチドを共有する。従って、翻訳を阻害するにはこれら４つのヌクレオチドをターゲットにすることが好ましい。それ故、配列ＧＧＡＴを含んでなるオリゴヌクレオチドは本発明の好ましい態様である。
【００５６】
（２）系統間で変異することが知られているヌクレオチドがイノシンに置換されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価：
翻訳開始コドン付近のコアタンパク質コード領域内のヌクレオチド配列では、系統間で塩基の変異がヌクレオチド３５０、３５１、３５２、３５６及び３６２で時々起こることが知られている。この知見に基づいて、「普遍塩基」であるイノシンでこれらの塩基を置換すると様々なウイルスの阻害に有効になるかどうかを試験した。
【００５７】
オリゴヌクレオチド３４４−ｉ１と命名したアンチセンスＤＮＡは、３５０番目の塩基をイノシンによって置換して製造した。同様に、オリゴヌクレオチド３４４−ｉ３と命名したアンチセンスＤＮＡは、３５０、３５６及び３６２番目にある３つの塩基をイノシンによって置換し、オリゴヌクレオチド３４４−ｉ５と命名したアンチセンスＤＮＡは、３５０、３５１、３５２、３５６及び３６２番目にある５つの塩基をイノシンによって置換して製造した。これらアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイで評価した。結果として、高い阻害活性を示したのはオリゴヌクレオチド３４４−ｉ１及び３４４−ｉ３である。従って、ＨＣＶ  ＲＮＡのヌクレオチド３４４−３６３をターゲットにして３つ又はそれ以下のイノシン置換を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。それらの阻害活性を表１に示す。
【００５８】
実施例３：Ｈ８Ａｄ１７細胞アッセイにおける、オリゴヌクレオチド１２０、３３０及び３４０、及びオリゴヌクレオチド１２０、２６０、３３０及び３４０の先端切れ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）バージョンのＨＣＶ  ＲＮＡレベルに対する効果に関する評価
Ｐ＝Ｓのオリゴヌクレオチド、１２０、３３０及び３４０の抗ＨＣＶ活性を以下のようにＨ８Ａｄ１７細胞において評価した。
ＨＣＶ遺伝子の５’ ＮＣＲ−コア−ｅｎｖ領域をコードする遺伝子（１．３ｋｂ）を含有する発現プラスミドを従来法によって製造し、標準法によりリポフェクチンによって肝細胞株（Ｈ８Ａｄ１７）へトランスフェクトした。ＨＣＶコアタンパク質を発現する、所望される肝細胞の形質転換体が得られた。
【００５９】
ＨＣＶ  ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析によって定量して発現レベルを決定した。コアタンパク質の発現も、固相抗体として抗ＨＣＶコア−マウスモノクローナル抗体を、一次抗体として抗ＨＣＶヒトポリクローナル抗体を、二次抗体としてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）−結合抗ヒトＩｇＧ−マウスモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ法によって検出し得た。
肝細胞の形質転換体（２．５ｘ１０５ 細胞）を６穴プレートに接種した。各プレートへ上記で得られた５種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（それぞれ５μＭの濃度）を加えた。２日後、細胞を採取して計数した。細胞を１回洗浄してから溶かし、ノーザンブロットによって阻害活性を測定した。Ｐ＝Ｓのアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない対照に比較して算出した。
【００６０】
すでに述べたように、オリゴヌクレオチドの番号（例、３３０）は、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：３７に示される対応するＨＣＶ  ＲＮＡターゲット配列の５’ 末端ヌクレオチドの番号である。例えば、オリゴヌクレオチド１２０というのは、ＨＣＶ  ＲＮＡのヌクレオチド１２０−１３９をターゲットにした２０マーである。上記化合物のそれぞれは、０．５μＭ及び０．１７μＭの用量でＨＣＶ  ＲＮＡレベルを減少させた。従って、上記３種の化合物（Ｐ＝Ｓの２０マーである１２０、３３０及び３４０）はきわめて好ましい。１５マーのバージョン（３’ 末端又は５’ 末端のいずれか一方で５ヌクレオチドだけ切れているもの）は、０．５μＭの用量でＨＣＶ  ＲＮＡを減少させた。従って、これらの化合物は好ましい。１０マーはどの用量でも配列特異的な阻害を示さなかった。
オリゴヌクレオチド３３０の短縮化した類似体もホスホロチオエートとして数多く合成し、同じやり方でＨＣＶ  ＲＮＡレベルへの効果について評価した。オリゴヌクレオチド３３０の配列が片端又は両端で切断された。これらのオリゴヌクレオチドを表２に示す。オリゴヌクレオチド濃度は１００ｎＭであった。
【００６１】
【表２】
0003589979.tif 000003
【００６２】
このアッセイでは、オリゴヌクレオチド９０３６、１０４７１、１０４７０、９０３８、１０５４９及び１０５５０がＨＣＶ  ＲＮＡ発現を５０％以上阻害し、従って、好ましい。
【００６３】
実施例４：ＨＣＶ  Ｈ８Ａｄ１７ＲＮＡアッセイにおけるオリゴ２５９、２６０及び３３０の評価
Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチド及び２’ −Ｏ−プロピル／Ｐ＝Ｓギャップオリゴヌクレオチドの抗ＨＣＶ活性を、実施例３に記載されるようにして、Ｈ８Ａｄ１７細胞で評価した。Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドの２５９、２６０及び３３０は、１７０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度で、いずれもこのアッセイにおいてＨＣＶＲＮＡレベルを同様に（約５５％）減少させた。オリゴヌクレオチド２５９の２’ −Ｏ−プロピルギャップバージョンは、（１７０ｎＭのオリゴヌクレオチド用量で）ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの約２５％阻害を示したが、オリゴヌクレオチド２６０及び３３０は、このアッセイでは２’ −Ｏ−プロピルギャップオリゴヌクレオチドほど活性ではなかった。同じタイプの以前のアッセイでは、オリゴヌクレオチド３３０のギャップ２’ −Ｏ−プロピルバージョンは、ＨＣＶ  ＲＮＡを減少させはしたが、Ｐ＝Ｓの３３０オリゴヌクレオチドに観察されるほどではなかった。
【００６４】
実施例５：ＨＣＶ  Ｈ８Ａｄ１７タンパク質アッセイにおけるオリゴ２５９、２６０及び３３０の評価
ＨＣＶコアタンパク質レベルに対するオリゴヌクレオチドの効果を評価するために以前用いたＥＬＩＳＡアッセイに代わるものとして、アフィニティー精製ヒトポリクローナル抗ＨＣＶ血清及び１２５ Ｉ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを利用するウェスタンブロットアッセイを開発した。６穴プレートにＨ８細胞を３．５ｘ１０５ 細胞／穴でまいた。細胞は一晩増殖させた。リポフェクチン５μｇ／ｍｌを含有するＯｐｔｉｍｅｍにおいて細胞をオリゴヌクレオチドで４時間処理した。細胞にＨ８培地２ｍｌを与え、一晩回復させた。細胞を採取するために、細胞をＰＢＳ  ２ｍｌで一度洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液１００μｌで溶解させ、削り取って採取した。電気泳動をするには細胞溶解液を沸騰させ、１０〜１４μｌの細胞溶解液を１６％ポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードした。電気泳動後、タンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦ膜へ移した。２％ヤギ血清及び０．３％ＴＷＥＥＮ−２０を含有するＰＢＳにおいてこの膜を固定し、一次抗体（ヒト抗コア抗体２２４３及びウサギ抗Ｇ３ＰＤＨ抗体）とともに一晩インキュベートした。この膜を５ｘ５分間緩衝液で洗浄し、次いで二次抗体（１２５ Ｉ−結合ヤギ抗ヒト、及び１２５ Ｉ−結合ヤギ抗ウサギ抗体）とともに４〜８時間インキュベートした。この膜を５ｘ５分間緩衝液で洗浄し、プラスチックに封じ、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒカセットに一晩さらした。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（モレキュラーダイナミクス、サニーベール、ＣＡ）上でバンドを定量し、Ｇ３ＰＤＨの発現レベルへ正規化し、対照の無処理細胞に対する比率として結果をプロットした。
【００６５】
Ｐ＝Ｓ及び２’ 修飾３３０オリゴヌクレオチドをこのウェスタンブロットアッセイを用いて評価した。これらのオリゴヌクレオチドを表３に示す。示した配列では、大文字が塩基配列、小文字（ｏ又はｓ）がヌクレオシド間結合を表し、それぞれホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。太字＝２’ −Ｏ−プロピル。＊＝２’ −Ｏ−ブチルイミダゾール。＋＝２’ −Ｏ−プロピルアミン。
【００６６】
【表３】
0003589979.tif 000004
【００６７】
細胞は、２５ｎＭ、１００ｎＭ又は４００ｎＭの用量のオリゴヌクレオチドで処理した。コアタンパク質の最大の減少（高用量で約９０〜９５％）が観察されたのは、Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドである。従って、この化合物はきわめて好ましい。２’ −Ｏ−プロピルギャップＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドではコアタンパク質の発現が約８０％阻害された。従って、この化合物は好ましい。２’ −Ｏ−プロピル／Ｐ＝Ｏ化合物はこのアッセイで活性を示さなかった。
【００６８】
実施例６：細胞アッセイにおける修飾された３３０オリゴの評価
３３０配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を有して様々な修飾［Ｐ＝Ｓデオキシ；２’ −Ｏ−プロピル（均一な２’ −Ｏ−プロピルかギャップのある２’ −Ｏ−プロピル、いずれも一様にＰ＝Ｓ）；又は２’ −フルオロ修飾（ギャップがあるか又は均一である、いずれも一様にＰ＝Ｓ）］を含有するオリゴヌクレオチドを、スクランブルホスホロチオエート対照に比較して、Ｈ８Ａｄ１７コアタンパク質ウェスタンブロットアッセイにおいて評価した。
このアッセイでは、Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドが一貫して最高であり、対照に比較してＨＣＶコアタンパク質翻訳を平均で６２．４％阻害した（ｎ＝７）。２’ −Ｏ−プロピル及び２’ −フルオロのギャップオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの実験で５０％以上阻害した。一様に２’ −フルオロであるか又は一様に２’ −Ｏ−プロピルのオリゴヌクレオチドはこの実験では不活性であった。
【００６９】
このアッセイでは、Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドが一貫して最高であったので、好ましい。そのなかで、Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドの２６０、２７０、２７５、２７７及び３３０がより好ましい。均一な２’ −フルオロＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドの３４５、３４７及び３５５もまたより好ましい。
追加の均一２’ −フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＣＶコアタンパク質発現を阻害する能力について試験した。オリゴヌクレオチド３４４もまたきわめて活性であることが判明したので、好ましい。ヌクレオチド３４４〜ヌクレオチド３４７のＨＣＶ  ＲＮＡターゲット領域は、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害に対してきわめて敏感であることがわかった。従って、このターゲット領域に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。これらのなかでより好ましいのは、２’ −フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【００７０】
実施例７：「単一ウイルス」組換えワクシニア／ＨＣＶコアタンパク質アッセイの評価
Ｔ７ポリメラーゼを発現するヘルパーワクシニアウイルスと同時感染することを必要としない、「単一ウイルス」ワクシニアアッセイ系を開発した。ＨＣＶ配列を発現する組換えワクシニアウイルスで感染する前に、リポフェクチン非存在下で、細胞をオリゴヌクレオチドで前処理した。次いで細胞に、ＨＣＶの５’ ＵＴＲ−コアを発現する組換えワクシニアウイルスを２．０ｐｆｕ／細胞の感染多重度で感染させた。感染後、細胞を濯ぎ、オリゴヌクレオチド含有培地で後処理した。このアッセイで得られた初期の結果は、Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチドの２５９及び２６０が１μＭの濃度でＨＣＶの５’ −ＵＴＲコアの発現を６０％以上阻害することを示す。阻害は用量依存的である。
【００７１】
均一に２’ −フルオロであるＰ＝Ｓオリゴヌクレオチドの２６０、３３０及び３４０の活性を、ＲＹ５細胞を使用する組換えワクシニア「単一ウイルス」アッセイで評価した。オリゴヌクレオチド含有培地は感染後に加えた。２’ −フルオロ修飾オリゴヌクレオチド２６０は、感染前にオリゴヌクレオチドで細胞を前処理せずとも、ＨＣＶコアタンパク質の発現に対して用量依存的な阻害効果（約６５％阻害まで）を引き起こした。前処置をした同一のアッセイにおいて、２’ −フルオロＰ＝Ｓ修飾オリゴヌクレオチド３４０は、０．１μＭ、０．３μＭ及び１．０μＭの用量でＨＣＶコアタンパク質の発現を効果的に阻害し、最大阻害率は約７５％であった。従って、このオリゴヌクレオチドは好ましい。ＨｅｐＧ２細胞を用いる「単一ウイルス」アッセイにおいても、均一２’ −フルオロホスホロチオエートとしてのオリゴヌクレオチド３４０の用量依存的な効果が観察された（約６０％の阻害）。従って、このオリゴヌクレオチドは好ましい。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２６０もＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて約６０％の阻害を示した。
【００７２】
実施例８：ＨＣＶを阻害するオリゴヌクレオチドの診断的使用
ＨＣＶ  ＲＮＡ機能を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用すれば、ＨＣＶ  ＲＮＡレベル又はＨＣＶコアタンパク質レベルの減少が測定され、ＨＣＶ起因性肝炎の明確な診断が容易に達成し得る。当業者に定常的に使用されている標準法により、針を用いた生検によって得られる血液サンプル又は肝臓組織サンプルからＲＮＡを抽出し、電気泳動して、ノーザンブロット用ニトロセルロースへ移す。血液又は組織の同一サンプルをＲＮＡ抽出の前にアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。次いで、この２つのブロットにおける推定ＨＣＶシグナルの強度を比較する。もしＨＣＶが存在して（恐らくは病気の原因になって）いれば、オリゴヌクレオチド処理サンプルでは未処理サンプルに比較してＨＣＶ  ＲＮＡシグナルが減少するだろう。ＨＣＶが病気の原因でなければ、この２つのサンプルは同一のシグナルを有するだろう。ＨＣＶ  ＲＮＡの検出及び定量のためのＲＴ−ＰＣＲ、又はＨＣＶコアタンパク質翻訳のウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡ測定のような他の方法を利用する同様のアッセイを設計し得るが、これらはすべて当業者によって定常的に実施されている。
【００７３】
ＨＣＶ  ＲＮＡ機能を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する診断法は、肝炎患者から単離したあるウイルスがある治療に反応するかどうかを、そのような治療を開始する前に決定することにも有用である。患者の血液又は肝臓組織サンプルからＲＮＡを単離して、上記のようにブロットする。ＲＮＡ抽出及びブロッティングに先だってＨＣＶを阻害するために、同一の血液又は肝臓のサンプルをアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。この２つのブロットにおける推定ＨＣＶシグナルの強度を比較する。もしオリゴヌクレオチドが患者由来ウイルスのＲＮＡ機能を阻害することができれば、オリゴヌクレオチド処理サンプルでは未処理サンプルに比較してＨＣＶシグナルが減少するだろう。このことは、患者のＨＣＶ感染がアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療に反応することを示すので、治療処置クールが開始し得る。２つのサンプルが同一のシグナルを有する場合、オリゴヌクレオチドではウイルスの複製が阻害し得ないのだから、別の治療法が適用される。ＲＮＡの検出及び定量用のＲＴ−ＰＣＲ、又はＨＣＶコアタンパク質発現を定量するためのウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのような他の方法を利用する同様のアッセイを設計し得るが、これらはすべて当業者によって定常的に実施されている。
【００７４】
実施例９：ＶＨＣＶ−ＩＲＥＳワクシニア／ＨＣＶ組換えウイルス感染マウスモデル
ｐＳＣ１１（ＮＩＨからライセンス供与された）は、ワクシニアの初期及び後期プロモーターＰ７．５を使って異種遺伝子を発現し、ワクシニアの後期プロモーターＰ１１を使ってＬａｃＺ遺伝子を発現するワクシニアウイルスの発現ベクターである。ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）配列は、相同的組換えのためにこれら２種のプロモーター発現ＤＮＡ配置に近接した。Ｈ型ＨＣＶの感染に罹った慢性ＨＣＶ患者からのｃＤＮＡクローンであるｐＨＣＶ３から得た、ＨＣＶの５’ 非コード領域、Ｅ１のコア及び部分を包含する、ＨＣＶ  ＲＮＡヌクレオチド１〜１３５７を、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル配列（プロメガ、ｐＧＬ−２プロモーターベクター）を含有するルシフェラーゼ遺伝子の５’ 末端へ融合した。この融合ＤＮＡフラグメントをｐＳＣ１１のワクシニアプロモーターの下に配置した。得られた構築体をｐＶＮＣＥＬＵＡと名付けた。ＨＣＶ  ＲＮＡヌクレオチド７０９〜１３５７の欠失をｐＶＮＣＥＬＵＡ内につくり、再連結して構築体ｐＶＨＣＶ−ＩＲＥＳを産生させた。この構築体は、内部リボソームエントリーで翻訳機序を開始させるＨＣＶイニシエーターを使用する。ｐＶＣ−ＬＵＡはルシフェラーゼ対照ウイルスの構築体であり、そこでは翻訳開始コドン及びポリアデニル化シグナルを包含するルシフェラーゼ遺伝子がｐＳＣ１１のＰ７１．５プロモーターの下に直接配置された。
【００７５】
相同的組換えによって組換えワクシニアウイルスを産生する基本的な実験法は当技術分野で知られている。相同的組換え及びウイルスプラーク用のＣＶ−１細胞及びＴＫ−選択用のＨｕ  ＴＫ−１４３ＢはＡＴＣＣより購入した。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用して行った。組換えウイルスの選択は、ＢｒｄＵ抵抗性でルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性を示すウイルスプラークを選択して行った。このウイルスを３回のプラーク選択を介して精製し、これを用いて１００％純粋なウイルスストックを調製した。このウイルス含有ＢＳＣ−４０細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに採取した後、３回凍結融解してウイルスを分離した。細胞破片を遠心分離で除去し、上澄液をウイルス感染用に使用した。各組換えウイルスの名称に頭文字の「Ｖ」を付け、対応するＤＮＡ構築体（「ｐ」を先頭に名付ける）からそれを区別した。
【００７６】
６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスをチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（ボストン、ＭＡ）から購入した。このマウスを無作為に群分けし、前処理として感染前の２日間は１日１回、後処理として感染後４時間目に１回、オリゴヌクレオチドを皮下投与した。感染は、１ｘ１０８ ｐｆｕのウイルス／生理食塩水０．５ｍｌを腹腔内に注射して実行した。感染から２４時間後に各マウスから肝臓を取り出し、ドライアイス上に保ってから、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて、２０μｌ／ｍｇのルシフェラーゼレポーター溶解緩衝液にて約３０秒間３０，０００ｒｐｍで均質化した。氷上のエッペンドルフ管へサンプルを移し、２０秒間振盪させた後、４℃で３分間遠心分離し、上澄液２０μｌを９６穴マイクロタイタープレートへ移し、ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ）１００μｌを加えた。そのすぐ後で、相対発光ユニットをルミノメーター（ＭＬ１０００／モデル２．４、ダイナテックラボラトリーズ社）を用いて測定した。
【００７７】
実施例１０：ＶＣＨＶ−ＩＲＥＳ感染マウスモデルにおける３３０オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ６５４７の評価：
ＨＣＶ翻訳開始コドンの周囲にあるヌクレオチド３３０−３４９をターゲットにした２０マーのデオキシオリゴヌクレオチド（「３３０オリゴヌクレオチド」、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、先の実施例で、ホスホジエステルとして試験したときに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいてＨＣＶコアタンパク質の合成を特異的に阻害することが示された。同一配列のホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ  ６５４７によって、ＨＣＶの５’ 非コード領域、Ｅ１生成物のコア及び部分（ＨＣＶのヌクレオチド１−１３５７）を発現する形質転換されたヒト肝細胞へ１００ｎＭの用量で投与されるとき、ＨＣＶ  ＲＮＡが少なくとも５０％減少することが示された（Ｈａｎｅｃａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０，５２０３−５２１２ ）。この効果は用量依存的で配列依存的であった。
【００７８】
ＶＨＣＶ−ＩＲＥＳ感染マウスモデルを用いてＩＳＩＳ  ６５４７をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２日間、１日１回、生理食塩水に溶かしたオリゴヌクレオチドで皮下的に前処理し、次いで１ｘ１０８ ｐｆｕのＶＨＣＶ−ＩＲＥＳで腹腔内に感染させた後、感染後４時間目にオリゴヌクレオチドで後処理した。生理食塩水で処理し、同量のＶＨＣＶ−ＩＲＥＳで感染させた群を対照とした。ＨＣＶ遺伝子の発現に対するオリゴヌクレオチドの効果は、感染後２４時間目のルシフェラーゼ活性によって測定した。ＶＨＣＶ−ＩＲＥＳで感染したが生理食塩水で処理した対照に比較して、ＩＳＩＳ  ６５４７は、用量依存的に（２ｍｇ／ｋｇで１０．５％阻害、６ｍｇ／ｋｇで２８．２％阻害及び２０ｍｇ／ｋｇで５１．９％阻害）ルシフェラーゼシグナルを減少させた。対照的に、関連のない対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １０８２（ＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＡＣＧＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）は、２０ｍｇ／ｋｇではルシフェラーゼシグナルの非特異的な阻害が観察されたものの、低用量では阻害効果を示さなかった。オリゴヌクレオチド６５４７の様々な投与経路（皮下、静脈内又は腹腔内）は、同様の阻害レベルを示した（２０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ、７６％、６３％及び５８％）。
【００７９】
実施例１１：ＶＣＨＶ−ＩＲＥＳ感染マウスモデルにおける５−メチル−Ｃ修飾３３０オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ１４８０３の評価
今日利用可能なへテロ環式塩基修飾の１つは、ヌクレオ塩基のシトシンが５位でメチル化されている５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）である。これに対応するヌクレオチドは５−メチルシチジンである。この修飾を含有するオリゴヌクレオチドはこの塩基修飾の無い類似体よりも高いターゲット結合親和性を示し、ＲＮアーゼＨの基質となる（Ｄｅａｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９７， ７， ２２９−２３３）。それらはまた非修飾バージョンより免疫刺激も補体刺激も誘発しない（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９７， １２， ４０９−４１２ ）。
【００８０】
あらゆるシチジンヌクレオチドが５−メチルシチジンで置換された、ＩＳＩＳ６５４７の５−ｍｅ−Ｃバージョンを合成した。このオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ  １４８０３を、その親化合物であるＩＳＩＳ  ６５４７と直接比較して、マウスのＶＨＣＶ−ＩＲＥＳ系で評価した。８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、感染前の１日及び２時間前、及び感染後４時間目に、生理食塩水に溶かしたオリゴヌクレオチドで皮下的に処理した。マウス１匹につき１ｘ１０８ ｐｆｕのＶＨＣＶ−ＩＲＥＳ又はＶＣ−ＬＵＡの腹腔内注射によってマウスを感染させた。感染後２４時間目に肝臓のルシフェラーゼ活性を定量し、生理食塩水で処理して同量のＶＨＣＶ−ＩＲＥＳ又はＶＣ−ＬＵＡで感染させたマウス群の肝臓におけるルシフェラーゼ活性と比較した。ＩＳＩＳ  １４８０３の肝臓ルシフェラーゼ活性阻害は、２ｍｇ／ｋｇで１１．１％、６ｍｇ／ｋｇで３３．５％、及び２０ｍｇ／ｋｇで５９．１％を示した。ＩＳＩＳ  １４８０３は、対照のＶＣ−ＬＵＡウイルスにおいて、低用量ではルシフェラーゼ活性の阻害を示さなかったが、２０ｍｇ／ｋｇの高用量ではルシフェラーゼ活性の非特異的な阻害がやや観察された。この非特異的な阻害は対照のオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ  １０８２でも観察されたので、高用量のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが示す一般的な効果であると考えられた。
【配列表】
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