(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の蛋白質：
（ａ）アミノ酸配列が
0003594595.tif 000006
である蛋白質；
（ｂ）アミノ酸配列が
0003594595.tif 000007
である蛋白質；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ抗微生物活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質を少なくとも１つ含む、オリゴマーである蛋白質であって、かつ抗微生物活性を有する蛋白質。
【請求項３】
純粋な蛋白質Ca−AMP1である、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
純粋な蛋白質Bm−AMP1である、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項５】
植物の種子から単離しうる、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項６】
トウガラシ属（Capsicum）の種子及びコバンソウ属（Briza）の種子よりなる群から選ばれる種子から単離しうる、請求項５に記載の蛋白質。
【請求項７】
合成によるものである、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項８】
適切な生物系内における組換えDNAの発現により製造される、請求項１に記載の蛋白質であって、前記生物系が培養された昆虫細胞、培養された哺乳動物細胞、あるいは植物である、前記蛋白質。
【請求項９】
請求項１−８のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する組成物。
【請求項１０】
請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする、組換えDNA。
【請求項１１】
cDNAである、請求項10に記載のDNA。
【請求項１２】
ゲノムDNAである、請求項10に記載のDNA。
【請求項１３】
植物ゲノムから単離された、請求項10に記載のDNA。
【請求項１４】
構成性または誘導性プロモーターの制御下に置かれる、請求項13に記載のDNA。
【請求項１５】
請求項10に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１６】
コードされる蛋白質が発現する状態で請求項10に記載の組換えDNAを含む、培養された昆虫細胞、培養された哺乳動物細胞、あるいは植物である生物系。
【請求項１７】
請求項10に記載の組換えDNAにより形質転換された植物。
【請求項１８】
組換えDNAがCa−AMP1をコードする、請求項17に記載の植物。
【請求項１９】
組換えDNAがBm−APM1をコードする、請求項17に記載の植物。
【請求項２０】
請求項17−19のいずれか１項に記載の植物の種子および子孫。
【請求項２１】
真菌または細菌と対抗する方法であって、該真核または細菌を請求項１−８のいずれか１項に記載の蛋白質に暴露することを含む、前記方法。
【請求項２２】
真菌または細菌を請求項９に記載の組成物に暴露することを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する有機材料から該蛋白質を得るための抽出方法であって、該有機材料をマセレーションおよび溶剤抽出することを含み、有機材料が以下を含む方法：
ｉ）トウガラシ属（Capsicum）の種子及びコバンソウ属（Briza）の種子よりなる群から選ばれる種子；
ii）培養された昆虫細胞、培養された哺乳動物細胞、あるいは植物である生物系。
【請求項２４】
蛋白質が次いで遠心分離、クロマトグラフィーおよび透析により精製される、請求項23に記載の抽出方法。
【請求項２５】
請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、蛋白質の化学合成を含む方法。
【請求項２６】
請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、該蛋白質をコードする組換えDNA配列の適切な生物系内における発現を含む方法であって、前記生物系が培養された昆虫細胞、培養された哺乳動物細胞、あるいは植物である前記方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、殺生物性（biocidal）蛋白質、それらの製造および使用のための方法、ならびにそれらをコードするDNA配列に関するものである。特に本発明は、トウガラシ属（Capsicum）の種子から単離しうる蛋白質、およびコバンソウ属（Briza）の種子から単離しうる蛋白質を含む、抗微生物性蛋白質類に関するものである。
これに関して、抗微生物性蛋白質とは下記のうち少なくとも１つの活性をもつ蛋白質として定義される：抗真菌活性（抗酵母活性を含む）；抗菌活性。活性には、たとえば部分的阻害または死滅などの一定範囲の拮抗作用が含まれる。それらの蛋白質はオリゴマーペプチドサブユニットであってもよく、または単一ペプチドサブユニットであってもよい。
トウガラシ属は50の種を含み、世界中で栽培されている多数の重要な野菜の種を含む（たとえばグリーンおよびレッドペッパー、チリ、パプリカならびにカエンネ（cayenne）ペッパー）。これらの広く栽培されている例のほかに、トウガラシ属には食用ではないが色彩豊かなそれらの果実のために栽培されている多数の種も含まれる。
コバンソウ属は多数の観賞用の草を含み、イネ科に属する。この属は、高温牧草地で見られる草の種、たとえばライグラス（rye  grass）に近縁である。
植物は潜在的な侵入体と戦うために広範な一連の抗真菌活性化合物を産生するが、抗真菌活性をもつ蛋白質がこれらの防御の重要な部分を構成することがこの10年間で明らかになった。幾つかの類の蛋白質が報告されており、それにはチオニン類、β−1,3−グルカナーゼ類、リボソーム不活性化蛋白質およびキチナーゼ類が含まれる。この最後の群の酵素は、以下においてキチン結合性植物蛋白質と呼ばれる、より広い類に属する。基本的なキチナーゼはマメ類から（ボラー（Boller）ら,1983,Planta,157:22−31）、コムギから（モラノ（Molano）ら、1979、Ｊ  Biol  Chem,254:4901−4907）、タバコから（シンシ（Shinshi）ら,1987,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,84:89−93）および他の植物から単離されている。他のキチン結合性植物蛋白質は特定の触媒活性をもたず、従って単にそれらのレクチン活性について記載されているにすぎない。これらには、コムギから（ライスおよびエツラー（Rice,Etzler）,1974,Biochem  Biophys  Res  Comm,59:414−419）、オオムギから（ポーマン（Peuman）ら,1982,Biochem  J,203:239−143）、イネから（ツダ（Tsuda）,1979,J  Biochem,86:1451−1461）、およびイラクサ類（stinging  nettle）から（ポーマン（Peuman）ら,1983,FEBS  Lett,177:99−103）のキチン結合性レクチン類、ならびにゴムノキのラテックスからのヘベイン（hevein）と呼ばれる小型の蛋白質（ファン・パリス（Van  Parijs）ら,1991,Planta,183:258−264）が含まれる。
このように（本明細書に定める）キチン結合性植物蛋白質は、キチナーゼ、キチン結合性レクチン類およびヘベインからなる蛋白質群である。これらの蛋白質はすべて、システイン／グリシンに富む保存ドメインを含む（総説についてはレイケルおよびブレケルト（Raikhel,Broekaert）,1991,Control  of  plant  gene  expression,ベルマ（Verma  DP）（編者），テルフォード・プレスを参照されたい）。この共通領域がキチン結合活性をもたらすと思われる。このドメインは40−43アミノ酸の長さであり、２回（イラクサレクチン）もしくは４回（コムギ、オオムギおよびイネレクチン）反復されるか、または無関係なドメインに融合している（基本的キチナーゼおよびプロヘベイン）。ヘベイン自体は43アミノ酸の長さであり、本質的にこの保存ドメインそのものからなる（ブレケルト（Broekaert）ら,1990,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,87:7633−7637）。ヘベインをコードするcDNAクローン（HEV1）が単離された（レイケルおよびブレケルト（Raikhel,Broekaert），米国特許第5187262号明細書、1993年２月16日発行）。図５には下記のキチン結合性植物蛋白質中に見られるシステイン／グリシンに富む共通ドメインを示す：タバコキチナーゼ、マメキチナーゼ、ヘベイン、コムギレクチン、イラクサレクチン。配列の一致および保存変化を囲んだ（保存変化はアミノ酸相同群FWY、MILV、RKH、ED、NQ、STおよびPAG内での置換であると考えられる；一致を最大にした場合に生じるギャップをダッシュで示す）。９アミノ酸残基を含む中央領域は、そのドメインの特に良好に保存された部分であり、下記の配列をもつ：
0003594595.tif 000002
このコア領域の周りにおいてもシステイン／グリシンに富むドメインの中央システインモチーフは絶対的に保存されており、下記の配列をもつ：
システイン−（４アミノ酸）−システイン−システイン−（５アミノ酸）−
システイン−（６アミノ酸）−システイン
キチン結合性植物蛋白質は、キチンを含む特定の生物（菌類または昆虫）の生育に影響を及ぼすことが見出された。しかしそれらの蛋白質の特異性には相異がある。たとえばコムギ／オオムギ／イネ−型のレクチンはゾウムシに対しては毒性であるが、インビトロで菌類に対しては不活性である（マードック（Murdock）ら,1990,Phytochem,29:85−89）。これに対しヘベインおよびキチナーゼ類はインビトロで特定の病原性菌類の増殖に対して阻害性であることが認められた（ファン・パリス（Van  Parijs）ら,1991,Planta,183:258−264;ブレケルト（Broekaert）ら,1988,Physiol  Mol  Plant  Path,33:319−331）。HEV1蛋白質は菌類の増殖を阻害するために使用しうる（レイケルおよびブレケルト，米国特許第5187262号明細書、1993年２月16日発行）。イラクサレクチンはインビトロでヘベインより２−５倍高い水準の抗真菌活性を生じることも示された（ブレケルト（Broekaert）ら,1989,Science,245:1100−1102）。これらの蛋白質が植物において抵抗性を作り出すために有用であるという可能性が述べられている（たとえばパイオニア・ハイブレッドの欧州特許出願第502718号明細書）。
本発明者らは、先に、ヒユ（ハゲイトウ）属（Amaranthus）から単離された広域スペクトル抗真菌活性をもつ２種類の蛋白質（Ac−AMP類）を報告した（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,,Biochemistry,31:4308−4314;国際特許出願公開WO92/21699号明細書）。これは本質的に、キチン結合性レクチン類において同定されたシステイン／グリシンドメインからなる。
本発明によれば、キチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを含むアミノ酸配列を有し、かつ下記のうち１または２以上の特性を備えた抗微生物性蛋白質が提供される：
キチン結合性植物蛋白質より実質的に良好な、植物病原性真菌に対抗する活性；
キチン結合性植物蛋白質より高い、酸性アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の比率；
植物病原性真菌に対する分節菌体分枝（hyphal  branching）を生じる活性。
特にトウガラシ属の種の種子から単離しうる蛋白質、およびコバンソウ属の種の種子から単離しうる蛋白質が提供される。それらの抗微生物性蛋白質は、近縁種および非近縁種（カタポジウム属（Catapodium）、バプティシア属（Baptisia）、ミクロセンシス属（Microsensis）、ヒエンソウ属（Delphinium）を含む）の種子からも単離することができ、またはいずれか適切な方法で合成することができる。
本発明者らは、トウガラシ（Capsicum annuum）の種子から新規な抗微生物性蛋白質（以下、Ca−AMP1（Capsicum annuum  anti−microbial  protein  １）と呼ぶ）を精製した。この蛋白質はキチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを共有するが、ヘベインまたはイラクサレクチンより少なくとも１桁高い、極めて有効かつ広域スペクトルの抗真菌活性を保有するので新規である。このように、これらの蛋白質配列の保存性（たとえばCa−AMP1に関するアミノ酸配列はヘベインと65％等しい）にもかかわらず、このトウガラシ蛋白質はその抗真菌活性の効力およびスペクトルにおいて著しく改良されている。実際に、Ca−AMP1とヘベインはサイズおよびアミノ酸配列において極めて類似するが、それらの活性の水準およびスペクトルにおいて著しく異なることは注目すべきである。
また本発明者らは、コバンソウ（Briza maxima）の種子から新規な抗微生物性蛋白質（以下、Bm−AMP1（Briza maxima  anti−microbial  protein  １）と呼ぶ）を精製した。この蛋白質はキチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを共有するが、極めて有効かつ広域スペクトルの抗真菌活性を保有するので新規である。このように、これらの蛋白質配列の保存性にもかかわらず、このコバンソウ蛋白質はその抗真菌活性の効力およびスペクトルにおいて著しく向上している。Bm−AMP1に関するアミノ酸配列はCa−AMP1と45％等しいが、ヘベインとはわずか35％等しい。
Ca−AMP1およびBm−AMP1の抗真菌活性は、前記のヒユ蛋白質（Ac−AMP）（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,Biochemistry,31:4308−4314;国際特許出願公開WO92/21699号明細書）のものに類似する：これらの蛋白質はすべて実質的にヘベインまたはイラクサレクチンより塩基性が高く、これが活性の相異に関与している可能性がある。
本発明者らは、全体的に塩基性のプロフィルを保有することが抗真菌性蛋白質の有効性に寄与することを見出した。たとえばオシロイバナ属（Mirabilis）およびダイコン属（Raphanus）から単離された異なる類の抗真菌性蛋白質の場合、より活性の高いものは常に、より塩基性の相同体である（テラス（Terras）ら、1992,J  Biol  Chem,267:15301−15309;カミュ（Cammue）ら、1992,J  Biol  Chem,267:2228−2233）。トウガラシ（Ca−AMP1）蛋白質の配列はヘベインのものに極めて類似するが、塩基性アミノ酸：酸性アミノ酸の比率はCa−AMP1については4:1であり、ヘベインについては4:5である（すなわちはるかに低い）。塩基性アミノ酸：酸性アミノ酸の比率はBm−AMP1については3:1である。Ca−AMP1およびBm−AMP1の塩基性が効力の向上に関与している可能性がある。従って部位特異的突然変異を利用して特定のキチン結合性植物蛋白質（たとえばヘベイン）の塩基性を高めると、特にその置換がトウガラシ（Ca−AMP1）蛋白質において塩基性アミノ酸がある位置でなされた場合（たとえばヘベインの位置28のアスパラギン酸の交換）、またはコバンソウ（Bm−AMP1）蛋白質において塩基性アミノ酸がある位置でなされた場合、抗真菌活性が高まると思われる。従って特定のキチン結合性植物蛋白質の構造を調整することによって、新規な、より有効な本発明の抗微生物性蛋白質を作り出すことが可能である。
多数の異なる植物種をスクリーニングした際に、本発明の蛋白質類が植物の種子にかなり共通であることが明らかになった。蛋白質の抗真菌活性をそれらが生じる予想外の形態学的作用、すなわち部分的に阻害された発芽中の真菌胞子において著しい分節菌体分枝が起こることに基づいて識別することが可能である。これはフザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）を用いた場合に特に顕著である。本発明者らは、ヒユ蛋白質（Ac−AMP1）が真菌分節菌体に対して同様な作用を生じることを今回見出した。この阻害の性質は、それがアッセイに用いるカチオンの濃度に対して極めて感受性であるという事実をも特色とする。
トウガラシ蛋白質（Ca−AMP1）とヒユ蛋白質（Ac−AMP類）の類似性にもかかわらず、それらの一次構造および三次構造には顕著な相異がある。図５は、Ca−AMP1の配列が少なくとも42のアミノ酸残基を含むことを示す。しかしAc−AMP2はこれより短い蛋白質である：すなわち全Ac−AMP2配列はわずか30のアミノ酸残基を含むにすぎない。さらにCa−AMP1の残りの配列は、Ac−AMP2蛋白質に見られない２個の付加的なシステイン残基を含む。システインは蛋白質内の内部結合に関与するので、Ca−AMP1とAc−AMP2の三次構造が異なることはあり得る。
Bm−AMP1は、そのアミノ酸の総数およびそのシステイン残基の数においてCa−AMP1に類似する。Bm−AMP1とCa−AMP1が二次および三次の双方の水準でかなりの相同性を共有することはあり得る。Ca−AMP1と同様にBm−AMP1が、一部はBm−AMP1中に見られる２個の付加的なシステイン残基のためその三次構造においてAc−AMP2と異なることもあり得る。
本発明はさらに、本発明の蛋白質をコードする組換えDNA配列、および該配列を含むベクターを提供する。該DNAを生物系にクローニングまたは形質転換して、コードされた該蛋白質を発現させることができる。
さらに、本発明による抗微生物性蛋白質をコードする組換えDNAで形質転換された植物が提供される。
さらに、真菌または細菌を本発明による蛋白質に暴露することにより、真菌または細菌と対抗する方法も提供される。
Ca−AMP1およびBm−AMP1は広範な抗真菌活性を示し、かつグラム陽性細菌に対しても有効である。それぞれの蛋白質は殺真菌薬または抗生物質として、農業用または薬剤用に有用である。抗微生物性蛋白質への植物病原体の暴露は、植物に、または植物が生育する土壌に付与された前記の蛋白質を微生物内で発現させることにより達成しうる。またそれらの蛋白質は、標準的な農業技術（たとえば噴霧）により該蛋白質を植物の部分に付与することによって、真菌性または細菌性病害と対抗するために使用しうる。またそれらの蛋白質は、植物の生育中に、または収穫後の作物の保護のために、植物体内で発現させることにより真菌性または細菌性病害と対抗するために使用しうる。またそれらの蛋白質は、哺乳動物感染症を治療するための殺真菌薬として使用しうる。
本発明の抗微生物性蛋白質は、適宜な種子から単離精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に合成するか、または組換えDNAの発現により適切な微生物内で産生させることができる。それらの蛋白質をトランスジェニック植物内で発現させることもできる。
Ca−AMP1およびBm−AMP1のアミノ酸配列は、それらがキチン結合性植物蛋白質と同類であることを示す。特にCa−AMP1とヘベインはアミノ酸配列およびサイズが極めて類似する。Ca−AMP1およびBm−AMP1は本質的にそれぞれ共通のシステイン／グリシンドメインからなる。
一次構造の知見から、前記の抗微生物性蛋白質またはその一部を標準的なペプチド合成装置による化学合成により調製することができる。それにより、抗微生物性蛋白質をコードするDNA構造体を調製することもできる。DNA配列は既知のアミノ酸配列から推定するか、または植物由来のDNAライブラリーからその配列を単離することができる。
オリゴヌクレオチドプローブを既知のアミノ酸配列から誘導し、それらを用いて、前記蛋白質の一部または全部をコードするcDNAクローンにつきcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。これらの同じオリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAクローンを用いてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、実際の抗微生物性蛋白質遺伝子（１または２以上）を単離することができる。それらのゲノムクローンには、植物ゲノム内で作動する制御配列が含まれる。こうして抗微生物性（または他の）蛋白質の発現を駆動するために使用しうるプロモーター配列を単離することもできる。これらのプロモーターは、特に環境条件（たとえば真菌性病原体の存在）に応答するものであってもよく、それらを用いていずれかの標的遺伝子の発現を駆動させることもできる。
次いで本発明の抗微生物性蛋白質をコードするDNA（それはcDNAクローン、ゲノムDNAクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて調製されたDNAのいずれであってもよい）を、蛋白質または蛋白質の一部を発現しうる生物系内へクローニングすることができる。DNAを構成性または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性の系の例には、病原体による誘導発現および化学物質による誘導が含まれる。こうして本発明蛋白質を適切な微生物または培養細胞内で産生させ、使用のために抽出および単離することができる。適切な微生物には、大腸菌（Escherichia  coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）および酵母が含まれる。適切な細胞には、培養された昆虫細胞および培養された哺乳動物細胞が含まれる。遺伝子材料をウイルスまたはバクテリオファージ内へクローニングすることもできる。前記DNAを既知の方法でいずれかの植物種内へ形質転換し、これにより抗微生物性蛋白質をその植物内で発現させることもできる。
本発明によれば植物細胞を、本発明による構造体を用いて多様な既知の方法で形質転換することができる（アグロバクテリウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル銃（microprojectile  gun）など）。形質転換された細胞は、適切な場合には次いで新規な核物質がゲノム内に安定に取り込まれた全植物を再生しうる。この方法で、形質転換された単子葉植物および双子葉植物の両方を得ることができが、通常は後者の方が再生しやすい。
調製しうる遺伝子修飾された植物の例には、家畜用穀物（field  crop）、穀類（cereal）、果実および野菜、たとえば下記のものが含まれる：カノラ（canola）、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、バレイショ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ。
本発明は図面を参照することによってさらに理解しうる：
図１は、Ca−AMP1の精製に関するカチオン交換クロマトグラム、およびこれと共に抗真菌活性のグラフを示す。
図２は、精製されたCa−AMP1のHPLCプロフィルを示す。
図３は、Ca−AMP1のSDS−PAGE分析を示す。
図４は、Ca−AMP1のアミノ酸配列を示す。
図５は、Bm−AMP1、Ca−AMP1、Ac−AMP2、および多数のキチン結合性レクチンのアミノ酸配列の一致を示す。
図６は、蛋白質Ca−AMP1に関して可能性のある推定DNA配列の１つを示す。
図７は、Ca−AMP1、およびヒユ蛋白質Ac−AMP1と共にインキュベートされた、部分的に阻害されたフザリウム・カルモラム胞子を示す。
図８は、キチンを用いたCa−AMP1のアフィニティークロマトグラフィー処理の種々の画分のSDS−PAGE分析を示す。
図９は、Bm−AMP1の精製に関するカチオン交換クロマトグラム、およびこれと共に抗真菌活性のグラフを示す。
図10は、精製されたBm−AMP1のHPLCプロフィルを示す。
図11は、Bm−AMP1のアミノ酸配列を示す。
図12は、Bm−AMP1に関して可能性のある推定DNA配列の１つを示す。
以下の実施例は本発明を説明するものである。
実施例１
抗真菌活性および抗菌活性のアッセイ
抗真菌活性は先に報告された顕微分光分析により測定された（ブレケルト（Broekaert）,1990,FEMS  Microbiol  Lett,69:55−60）。試験はルーティンに20μｌの（フィルター滅菌した）被験溶液および80μｌの真菌胞子（２×104胞子/ml）を用いて、半濃度バレイショデキストロースブロス（培地Ａ）、またはそれぞれ最終濃度1mMおよび50mMとなるように添加されたCaCl2およびKClを含有する半濃度バレイショデキストロースブロス（培地Ｂ）中で実施された。
特に指示しない限り試験生物はフザリウム・カルモラム（菌株IMI  180420）であり、インキュベーションは25℃で48時間行われた。増殖阻止率％は、595nmにおける対照微生物培養物の補正済み吸光度に対する、対照微生物培養物の補正済み吸光度から試験微生物培養物の補正済み吸光度を差し引いたものの比率の、100倍と定義される。補正済み吸光度値は、48時間後に測定された595nmにおける吸光度から30分後に測定された595nmにおける吸光度を差し引いたものに等しい。
抗菌活性は下記に従って顕微分光分析により測定された。細菌懸濁液はソフト栄養寒天（トリプトン、10g/l;シープラーク（Seaplaque）（FMC）,5g/l）に接種することにより調製された。細菌懸濁液（105コロニー形成単位/ml）のアリコート（80μｌ）を、平底96ウェルミクロプレート内のフィルター滅菌試料（20μｌ）に添加した。595nmにおける培養物の吸光度を、28℃でのインキュベーションの30分後および24時間後に、ミクロプレート読み取り装置により測定した。増殖阻止率％は抗真菌活性アッセイにつき前記に述べたように計算された。
実施例２
トウガラシまたはコバンソウの種子からの塩基性蛋白質の抽出
1kgのトウガラシまたはコバンソウの種子（チルターン・シーズから、英国カンブリア）をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を４℃で２時間、10mM  NaH2PO4、15mM  Na2HPO4、100mM  KCl、2mM  EDTAおよび1mMベンズアミジンを含有する氷冷された抽出用緩衝液２リットルで抽出した。得られたホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（7,000×ｇで30分間）により澄明化した。固体硫酸アンモニアを上清に添加して、75％相対飽和度となし、４℃で一夜放置することにより沈殿を生成させた。7,000×ｇで30分間の遠心分離後に、沈殿を最小容量の蒸留水に再溶解し、ベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を用いて蒸留水に対して徹底的に透析した。透析後に、10倍濃度の緩衝液を添加することにより溶液を50mM  NH4Ac（pH9）に調整し、50mM  NH4Ac（pH9）中で平衡化したＱ−セファロース高速流（Ｑ−Sepharose  Fast  Flow）（ファルマシア、スウェーデン国ウプサラ）カラム（12×5cm）に導通した。カラムを通過した蛋白質画分を酢酸でpH6に調整した。
この物質は前記種子の塩基性（pI＞９）蛋白質画分である。これらの画分をさらに実施例３の記載に従って精製した。
実施例３
トウガラシまたはコバンソウの種子からの抗微生物性蛋白質の精製
トウガラシまたはコバンソウの抗微生物性蛋白質の単離に用いた出発原料は、実施例２に従って成熟種子から抽出された塩基性蛋白質画分であった。これらの蛋白質をこの抽出物のカチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。
約500mlの塩基性蛋白質画分を50mM  NH4Ac（pH9）に調整し、50mM  NH4Ac（pH9）中で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｑ−Sepharose  High  Performance）（ファルマシア）カラム（10×1.6cm）に付与した。カラムを3.0ml/分で、50−750mM  NH4Ac（pH6.0）の直線濃度勾配を用いて325分間にわたって溶離した。溶出液を280nmにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき監視し（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図１および９の下側パネルに示す）、10mlの画分で採集した。それぞれ画分からの試料を実施例１の記載に従って抗真菌活性につきアッセイした（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図１および９の上側パネルに示す）。
クロマトグラフィー処理後に、トウガラシ抽出物は220mM  NH4Ac付近で溶出する幅広い活性ピークを与えた。コバンソウ抽出物は250mM  NH4Ac付近で溶出する幅広い活性ピークを与えた。抗真菌活性を示すこれらの画分をプールし、逆相HPLCによりさらに精製した。そのピークの約3mg量を、0.1％TFA（トリフルオロ酢酸）で平衡化したPEP−Ｓ（多孔質シリカC2/C18、ファルマシア）カラム（25×0.4cm）に装填した。カラムを1ml/分で、0.1％TFAから100％アセトニトリル/0.1％TFAまでの直線濃度勾配を用いて100分間にわたって溶離した。溶出液を280nmにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき監視した（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図２および10の下側パネルに示す）。1mlの画分を採集し、真空乾燥し、1mlの蒸留水に再溶解し、そのうち10μｌを抗真菌アッセイに用いた（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図２および10の上側パネルに示す）。十分に分離した単一の活性ピークを、それぞれCa−AMP1およびBm−AMP1と呼んだ。
実施例４
精製した抗微生物性蛋白質Ca−AMP1の分子構造
精製した抗微生物性蛋白質の分子構造をさらに分析した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を市販のプレキャストゲル（高密度ファストゲル（PhastGel  High  Density）、ファルマシアから）上で、ファストシステム（PhastSystem、ファルマシア）電気泳動装置を用いて実施した。試料用緩衝液は200mMトリス−HCl（pH8.3）、１％（w/v）SDS、mM  EDTA、0.005％ブロモフェノールブルー、および特に指示しない限り１％（w/v）ジチオトレイトール（DTE）を含有していた。電気泳動後に蛋白質を12.5％グルタルアルデヒド中で固定し、ホイケスホーベンおよびデルニック（Heukeshoven,Dernick）（1985,Electrophoresis,6,103−112）に従って銀染色した。比較のために分子量マーカー（ファルマシア）を走行させた（図３、列Ｍ）:17kDa、14.5kDa、8kDa、6kDa、2.5kDa。
Ca−AMP1をSDS−PAGEにより分析した。Ca−AMP1はβ−メルカプトエタノールで還元したのち、見掛け分子量４−5kDaの単一バンドとして走行する（図３、列２および４）。未還元Ca−AMP1は14kDaの単一バンドとして走行する（図３、列１および３）。これらの結果は、天然Ca−AMP1はオリゴマー（恐らく二量体）蛋白質であることを示す。
実施例５
Ca−AMP1およびBm−AMP1のアミノ酸配列
フルマー（Fullmer）（1984,Anal  Biochem,142,336−341）の方法を用いるＳ−ピリジルエチル化によりシステイン残基を修飾した。Pep−Ｓ（多孔質シリカC2/C18）（ファルマシア）カラム（25×0.4cm）上でのHPLCにより試薬を除去した。カラムを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）から0.1％TFA含有アセトニトリルまでの直線濃度勾配を用いて溶離することにより、Ｓ−ピリジルエチル化蛋白質を採集した。得られた蛋白質画分を、120Aアナライザー（アプライド・バイオシステムズ）によるフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体のオンライン検出を伴う477A蛋白質シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）により、アミノ酸配列分析した。
Ca−AMP1の配列を決定する最初の試みにより、この蛋白質はＮ−末端ブロックされていることが示された。次いでＳ−ピリジルエチル化蛋白質を供給業者（ベーリンガー・マンハイム、FRG）の指示に従ってピログルタメートアミノペプチダーゼで脱ブロックした。この反応は部分的に成功して、最初の16アミノ酸に関する配列が求められたにすぎない。
Ｃ−末端に関する配列を求めるために、Ca−AMP1をトリプシンで消化し、得られた３つのフラグメントを配列決定した。１つはブロックされていることが認められ、これはＮ−末端である。他の２つのペプチドの配列決定により、それらをＮ−末端に関する配列と整列させることができ（図４）、かつその完全配列はキチン結合性植物蛋白質中に見られたシステイン／グリシンに富むドメインと相同性であることが示された（図５）。Ca−AMP1に関するこの配列が不完全であって、Ｃ−末端にさらにアミノ酸があるという可能性はある。このペプチドがＮ−末端ブロックされており、これをアミノペプチダーゼで除去しうるという所見は、Ｎ−末端アミノ酸がグルタミンであることを示唆する。
Bm−AMP1のアミノ酸配列を図11に示す。配列中の２つの位置において２アミノ酸の選択の可能性がある。位置９においてアミノ酸はアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）であり、位置23においてアミノ酸はセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）である。精製された蛋白質画分Bm−AMP1は、これら２位置において前記アミノ酸のいずれかの組み合わせをもつ異なる配列のペプチドの混合物である可能性がある。
図５は、タバコキチナーゼ（シンシ（Shinshi）ら,1987,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,84:89−93）、マメキチナーゼ（ブログリー（Broglie）ら,1986,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,83:6820−6824）、ヘベイン（ブレケルト（Broekaert）ら,1990,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,87:7633−7637）、コムギレクチン（レイケルおよびニルキンス（Raikhel,Nilkins）,1987,Pro  Nat  Aca  Sci  USA,84:6745−6749）、イラクサレクチン（チャポー（Chapot）ら,1986,FEBS  Lett,195:231−234）、Ac−AMP2（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,Biochemistry,31:4308−4314;国際特許出願公開WO92/21699号明細書）からのＮ−末端アミノ酸配列、ならびにCa−AMP1およびBm−AMP1に関する配列の一致を示す。配列の一致および保存変化を囲んだ。保存変化はアミノ酸相同群FWY、MILV、RKH、ED、NQ、STおよびPAG内での置換であると考えられる。一致を最大にした場合に生じるギャップをダッシュで示す。
Ca−AMP1およびBm−AMP1に関するアミノ酸配列は、キチン結合性植物蛋白質中のシステイン／グリシンに富むドメインに対して著しい類似性を示す。特にCa−AMP1はヘベインに65％等しい。Bm−AMP1はヘベインに35％、Ca−AMP1に45％等しい。ヒユ蛋白質類と同様に、Ca−AMP1およびBm−AMP1はヘベインより実質的に塩基性が高い。
Ca−AMP1およびヘベインは両方とも４個の塩基性アミノ酸を含むが、Ca−AMP1はヘベインの５個に対し１個の酸性アミノ酸を含むにすぎない。それらの活性にとってこれらの蛋白質の全体としての塩基性が重要であれば、ヘベインの位置28のアスパラギン酸を、Ca−AMP1のこの位置に見られるアルギニンに交換すると、ヘベインの比活性が高まると期待される。事実、Ca−AMP1とヘベインはサイズおよびアミノ酸配列において極めて類似するが、それらの活性の水準およびスペクトルは著しく異なるというのは、極めて注目に値すると思われる。
Bm−AMP1は、６個の塩基性アミノ酸およびわずか２個の酸性アミノ酸を含み、これに対しヘベインは４個の塩基性アミノ酸を含むが、５個の酸性アミノ酸を含む。従ってBm−AMP1の全体として塩基性のプロフィルが、ヘベインおよび他のキチン結合性植物蛋白質と比較してこの蛋白質の抗真菌活性が向上していることに関係すると思われる。
図６および12は、それぞれCa−AMP1およびBm−AMP1をコードする遺伝子の可能なDNA配列の１つを示す。この遺伝子配列は、分かったアミノ酸配列から、双子葉植物に一般的に生じるコドンを用いて推定された。トウガラシおよびコバンソウの実際の遺伝子配列は、遺伝子コドンの縮重のため、異なる可能性がある。
実施例６
本発明蛋白質の抗真菌活性の安定性
抗真菌活性に関する試験は、実施例１に挙げたアッセイ法に従って、フザリウム・カルモラム胞子を含有する増殖培地で５倍希釈された20μｌの試料を用いて行われた。未処理対照試料は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7）中の被験蛋白質500μg/mlからなっていた。熱安定性試験は、アリコートの被験蛋白質を100℃までの種々の温度で10分間加熱することにより行われた。ジスルフィド橋の還元は、30mMのジチオトレイトールおよび300mMのトリス−HCl（pH8.6）を添加することにより行われた。逆相クロマトグラフィーにより試薬を除去した。消化のために種々のプロテアーゼを200μg/mlで添加し、37℃で３時間インキュベートした。試薬のみを含有する対照処理は、逆相クロマトグラフィー段階後に抗真菌活性につき陰性であることが証明された。
精製されたCa−AMP1蛋白質およびBm−AMP1蛋白質の抗真菌活性は、最高80℃で10分間の熱処理に対して抵抗性であった。しかしジチオトレイトールによるジスルフィド結合の還元は、抗真菌活性を完全に失わせた。これらのジスルフィド結合は生物学的活性にとって必須なのである。
プロテイナーゼＫまたはプロナーゼＥによるCa−AMP1の処理は抗真菌活性を少なくとも10倍低下させたのに対し、トリプシンはこの活性をわずか２倍低下させ、キモトリプシンは活性に対して影響を及ぼさなかった。
実施例７
本発明蛋白質の抗真菌効力
（Ａ）Ca−AMP1
精製された蛋白質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法を用いて種々の植物病原性真菌につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収集、ならびに菌糸体フラグメントの調製は、先に報告されたものに従って行われた（ブレケルト（Broekaert）ら,1990,FEMS  Microbiol  Lett,69:55−60）。下記の真菌株を用いた：アルテルナリア・ブラシオコラ（Alrernaria brassicola）MUCL  20297、アスコシタ・ピシ（Ascochyta pisi）MUCL  30164、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）MUCL  30158、セルコスポラ・ベチコラ（Cercospora beticola）K897、コレトリカム・リンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthianum）MUCL  9577、フザリウム・カルモラムIMI  180420、フザリウム・オキシスポラムf.sp.ピシ（Fusarium oxysporum  f.sp.pisi）IMI  236441、フザリウム・オキシスポラムf.sp.リコペルシシ（Fusarium oxysporum  f.sp.lycopersici）MUCL  909、ネクトリア・ヘマトコッカ（Nectria haematococca）コレクション・ファン・エッテン160−２−２、ペニシリウム・ジギテイタム（Penicillium degitatum）（K0879）、フォマ・ベタ（Phoma betae）MUCL  9916、ピレノフォラ・トリティシ−レペンチス（Pyrenophora tritici−repentis）MUCL  30217、ピリキュラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）MUCL  30166、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）CBS  207−84、セプトリア・トリティシ（Septoria tritici）（K1097D）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）（K1127）、ベルティシリウム・アルボ−アトラム（Verticillium albo−atrum）（K0937）、ベルティシリウム・ダーリア（Verticillium dahliae）MUCL  19210。
リゾクトニア・ソラニについては菌糸体フラグメントを接種物として用い、これに対し他のすべての真菌は胞子として接種された。
増殖培地Ａまたは培地Ｂを用いて、抗真菌性蛋白質の系列希釈液を真菌に付与した。増殖阻止率％を顕微分光分析法により測定した。48時間のインキュベーション後に50％の増殖阻止に要する濃度（IC50値）を用量−反応曲線から計算した。
結果を表１にまとめる。
0003594595.tif 000003
一連の真菌につき培地Ａにおいてアッセイしたところ、IC50値は１μg/mlから500μg/ml以上にまで変動した。しかし18株中12株の病原性真菌についてはIC50値は50μg/ml未満であり、10株の真菌についてはIC50値は10μg/ml未満であった。これらの結果は、Ca−AMP1が有効かつ広域スペクトルの真菌増殖阻害物質であることを示す。
しかしCa−AMP1の活性はアッセイに採用されるイオン条件に対して著しく感受性であり、その活性は高い塩類（培地Ｂ）においては本質的に失われる。
Ca−AMP1を用いて得られた抗真菌活性の水準は、先にヒユの種子から単離された２種類のペプチド（Ac−AMP類）（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,Biochemistry,31:4308−4314）のものに匹敵する。キチン結合性植物蛋白質、たとえばヘベインまたはイラクサレクチンと比較して、Ca−AMP1ははるかに高い比活性をもつ。先に本発明者らは、イラクサレクチンが100μg/ml未満の濃度で試験した７株中３株の真菌のみを阻害し、20μg/ml未満では阻害しないことを示した（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,Biochemistry,31:4308−4314）。またヘベインはイラクサレクチンよりはるかに活性が低いとすら報告されている（ファン・パリス（Van  Parijs）ら,1991,Planta,183:258−264）。従ってアミノ酸配列の類似性にもかかわらず、Ca−AMP1はヒユ蛋白質と同様に、キチン結合性植物蛋白質とは別個に分類しうる。
Ca−AMP1およびヒユ蛋白質は、部分的に阻害された真菌胞子において同じ形態学的変化をもたらす。これは、アッセイにフザリウム・カルモラム胞子をIC50値より２−４倍低い蛋白質濃度において使用した場合、容易に見ることができる。光学顕微鏡下で観察すると、これらの蛋白質は発芽中の分節菌体を著しく分枝させる（図７）。図7Aは24℃で８時間発芽させた対照胞子を示す；図7Bおよび7Cは、それぞれCa−AMP1およびAc−AMP1により部分的に阻害された胞子を示す。ヘベインは濃厚な分節菌体および芽を発現させることが報告されている（ファン・パリス（Van  Parijs）ら,1991,Planta,183:258−264）。
（Ｂ）Bm−AMP1
精製された蛋白質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法を用いて種々の植物病原性真菌につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収集、ならびに菌糸体フラグメントの調製は、先に報告されたものに従って行われた（ブレケルト（Broekaert）ら,1990,FEMS  Microbiol  Lett,69:55−60）。下記の真菌株を用いた：アルテルナリア・ロンギペス（Alrernaria  longipes）株CBS  620.83、ボツリチス・シネレアMUCL  30158、クラドスポリウム・スフェロスペルマム（Cladosporium  sphaerospermum）株KO791、フザリウム・カルモラムIMI  180420、ペニシリウム・ジギテイタム株K0879、セプトリア・トリティシ（K1097D）、トリコデルマ・ビリデ（K1127）、ベルティシリウム・ダーリアMUCL  19210。
すべての真菌を胞子として接種した。
増殖培地Ａまたは培地Ｂを用いて、抗真菌性蛋白質の系列希釈液を真菌に付与した。増殖阻止率％を顕微分光分析法により測定した。48時間のインキュベーション後に50％の増殖阻止に要する濃度（IC50値）を用量−反応曲線から計算した。
Bm−AMP1についての結果を表２にまとめる。
0003594595.tif 000004
一連の真菌につき培地Ａにおいてアッセイしたところ、IC50値は１μg/mlから150μg/mlにまで変動した。しかし８株中６種の病原性真菌についてはIC50値は10μg/ml未満であった。これらの結果は、Bm−AMP1が有効かつ広域スペクトルの真菌増殖阻害物質であることを示す。
しかしBm−AMP1の活性はアッセイに採用されるイオン条件に対して著しく感受性であり、その活性は高い塩類（培地Ｂ）においては本質的に失われる。
Bm−AMP1を用いて得られた抗真菌活性の水準は、Ca−AMP1のもの、および先にヒユの種子から単離された２種類のペプチドのもの（Ac−AMP類）に匹敵する。キチン結合性植物蛋白質、たとえばヘベインまたはイラクサレクチンと比較して、Bm−AMP1ははるかに高い比活性をもつ。先に本発明者らは、イラクサレクチンが100μg/ml未満の濃度で試験した７株中３株の真菌のみを阻害し、20μg/ml未満では阻害しないことを示した（ブレケルト（Broekaert）ら,1992,Biochemistry,31:4308−4314）。またヘベインはイラクサレクチンよりはるかに活性が低いとすら報告されている（ファン・パリス（Van  Parijs）ら,1991,Planta,183:258−264）。従ってアミノ酸配列の類似性にもかかわらず、Bm−AMP1はCa−AMP1およびヒユ蛋白質と同様に、キチン結合性植物蛋白質とは別個に分類しうる。
実施例８
Ca−AMP1のキチン結合活性
Ca−AMP1とキチン結合性植物レクチンの配列の類似性により、Ca−AMP1もキチンに結合する可能性があることが示唆された。
ミクロ−キチン−カラムにCa−AMP1を装填し、カラムを50mM  NH4Ac（pH7.0）で洗浄した。50μｇのCa−AMP1をカラム（0.5×1cm）に装填し、溶出液をカラムに３回再循環した。最終溶出液を採集した。カラムを1mlの50mM  NH4Ac（pH7.0）で５回洗浄し、この画分を採集した。最後にカラムを1mlの100mM酢酸（pH2.8）で５回洗浄し、この酸洗浄画分を採集した。採集した画分を脱塩し、逆相クロマトグラフィーにより濃縮し、最後にSDS−PAGE分析のための試料用緩衝液50μｌに溶解した。
図８はこの分析の結果を示す。列Ｍは29kDa、20.1kDa、13.2kDaおよび5kDaのサイズの分子量マーカーを示す。列１は、対照としての還元Ca−AMP1の走行である。列２は、反復50mM  NH4Ac（pH7.0）洗浄により溶出した画分である。列３は酸洗浄画分、列４は初期貫流物である。大部分の蛋白質がカラムに結合し、低pHの脱着用緩衝液中に溶出したことが分かる。これは、Ca−AMP1がキチンに対して親和性を示すことを示唆する。
実施例９
Ca−AMP1およびBm−AMP1の抗菌活性および抗酵母活性
精製した蛋白質を下記の細菌：巨大菌（Bacillus megaterium）ATCC  13632、大腸菌株HB101、およびシュードモナス・アエウロゲナーサ（Pseudomonas aeurogenasa）NCIB8295の増殖に対して及ぼす影響につき評価し；またビール酵母（Saccharomyces cerevisiae）JRY188の増殖に及ぼす影響を評価した。バイオアッセイは実施例１の記載に従って実施された。結果を表３にまとめる。Ca−AMP1およびBm−AMP1は、それぞれ巨大菌およびビール酵母の増殖を強く阻害したが、試験した２種類のグラム陰性細菌に対してはほとんど、または全く影響を与えなかった。
0003594595.tif 000005
実施例10
Ca−AMP1およびBm−AMP1  cDNAの分子クローニング
野生の植物から６つの異なる生育段階の種子を採集し、液体窒素中で凍結し、−80℃に保存する。粉砕したのち、６つの異なる生育段階の混合物15gからデブリース（De  Vries）ら（1988,Plant  Molecular  Biology  Manual,B6,1−13）の方法により全RNAを抽出する。ただし組織のｇ当たり、6mlの1:2フェノール:RNA抽出用緩衝液混合物、および2mlのクロロホルムを用いる。シルフロー（Silflow）ら（1979,Biochemistry  18,2725−2731）の記載に従って、オリゴ（dT）−セルロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（Ａ）+mRNAを精製する。ガブラーおよびホフマン（Gubler,Hoffman）（1983,Gene  25,263−269）に従って1.5μｇのポリ（Ａ）+mRNAから二本鎖cDNAを調製し、ファルマシアのcDNA合成キットを用いてEcoR I/Not Iアダプターにリゲートする。
これらのcDNAを製造業者の指示に従ってラムダZAP IIファージベクター（ステラタジーン）内へクローニングする。cDNAライブラリーをスクリーニングするためのDNAプローブはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により下記に従って調製される。Ca−AMP1またはBm−AMP1のアミノ酸の走行に対応する２種類のディジェネレート（degenerate）オリゴヌクレオチドを合成する：一方はセンス配向を有し、他方はアンチセンス配向を有する。両方のプライマーとも、それらの５′末端にAAAGAATTC（すなわちEcoR I認識配列に続くAAA）配列をもつ。PCRは、Taqポリメラーゼを使用し、標準的条件下で（サムブルック（Sambrook）ら,Molecular  Cloning,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、アンプライマー（amplimer）としてのオリゴヌクレオチド、および標的DNAとしての25ngのcDNAを用いて実施される。温度プログラムには、94℃で５分間の初期段階、30サイクル（94℃で１分間;45℃で２分間;72℃で３分間）、および72℃で10分間の初期段階が含まれる。PCR増幅生成物を３％アガロース（ヌシーブ（NuSieve）、FMC）ゲル上で精製する。ディジェネレートオリゴヌクレオチドを用いて、このPCR生成物を部分的に再増幅する。このPCR増幅生成物を再度３％アガロース（ヌシーブ、FMC）ゲル上で精製し、同一条件下でのPCRにより再増幅する。ただし反応混合物は130μＭのdTTPおよび70μＭのジゴキシゲニン−11−dUTPを200μＭのdTTPの代わりに含有する。ジゴキシゲニン標識PCR増幅生成物を再度３％ヌシーブアガロースゲル上で精製する。約10,000プラーク形成単位のラムダZAP II  cDNAライブラリーを、ジゴキシゲニン標識PCR増幅生成物により、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ（Hybond−Ｎ）、アメルシャム）を用いるin  situプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。膜を風乾し、DNAを紫外線（0.15J/cm2）下で膜に架橋させる。ハイブリダイゼーションは64℃で16時間、10ng/mlの熱変性ジゴキシゲニン標識プローブを含有する５×SSC、１％ブロッキング試薬（ベーリンガー・マンハイム）、0.1％Ｎ−ラウロイルサルコシン、0.02％ドデシル硫酸ナトリウム中において実施される。非特異的に結合したプローブは、２×SSC/0.1％SDS中25℃において５分間で２回、0.1×SSC/0.1％SDS中60℃において15分間で２回、すすぐことにより除去しうる。プローブの検出は、アルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー・マンハイム）およびその基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ベーリンガー・マンハイム）を用いて、製造業者の指示に従って行われる。陽性プラークを、同一プローブにより同一条件下でさらに２回のスクリーニング過程により精製する。精製プラークから挿入配列を切り取り、インビボでピーブルースクリプトファージミド（pBluescript  phagemid）形中へヘルパーファージR408により挿入する。種々の陽性クローンからの挿入配列をEcoR I消化により切り取り、それらのサイズをアガロースゲル電気泳動により比較する。幾つかのクローンをヌクレオチド配列分析する。最大挿入配列を有するクローンがCa−AMP1またはBm−AMP1に対応するオープンリーデグフレームを有する可能性があり、これは実験用Ｎ−末端アミノ酸配列との比較により判定しうる。全長cDNAクローンはそれらの５′および３′末端非翻訳領域ならびにポリアデ���ル化シグナルにおいて互いに異なる可能性がある。
全長cDNAを得るために、他の方法をとることができる。PCRを標準的条件下で、一方ではM13普遍プライマー、他方ではM13逆プライマーと組み合わせたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて実施する。このオリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドが、全長未満（less−than−full−length）cDNAクローンのポリＡテイルを直接にフランキングする３′側非翻訳領域の一部の逆相補配列を形成する。この配列を５′末端方向へ、前方にヌクレオチド'ATA'を含むGAATTC  EcoR I認識部位によって延長する。鋳型としては２μｇの全cDNAまたは105の組換えファージを用いる。両方の場合とも、３回の別個の反応を設定する。増幅の前に、PCR温度プログラムにおいて99℃で５分間の初期段階によりファージを溶解して、ファージDNAを放出させる。増幅生成物のサイズは３％アガロース（ヌシーブ、FMC）ゲル上での電気泳動により決定される。異なる長さの挿入配列に対応するサイズの生成物が得られ、cDNAライブラリー中に全長cDNAが存在する場合にはこれらにそれが含まれる。
実施例11
発現ベクターの構築
発現ベクターを構築する：これは、その５′末端においてカリフラワーモザイクウイルスの35S  RNAの強力な構成性プロモーター（オデル（Odell）ら,1985,Nature  313,810−812）によりフランキングされ、高い転写活性を得るための重複エンハンサー要素（カイ（Kay）ら,1987,Science  236,1299−1302）を備えた、Ca−AMP1またはBm−AMP1  DNAの全コード領域を含む。Ca−AMP1/Bm−AMP1  DNAの全コード領域は、その３′末端側においてはカリフラワーモザイクウイルスの35S  RNAのポリアデニル化配列（CaMV355）によりフランキングされている。このベクターのプラスミド主鎖は、ファージミドpUC120（ビエイラおよびメッシング（Vieira,Messing）,1987,Methods  Enzymol.153,3−11）である。発現ベクターは下記により構築される。Ca−AMP1/Bm−AMP1  DNAから構成されるcDNAクローンを、pEMBL18＋（ベーリンガー）のBamH I/Sal I部位へクローニングする。このBamH I/Sal Iフラグメントを、予めBamH IおよびSal Iで消化した発現ベクターpFAJ3002内へサブクローニングする。pFAJ3002は発現ベクターpFF19（チンメルマンズ（Timmermanns）ら,1990,J.Biotechnol.14,333−344）の誘導体であって、そのユニークEcoR I部位をHind III部位で交換したものである。
実施例12
植物形質転換ベクターの構築
実施例11で得た発現ベクターをHind IIIで消化し、Ca−AMP1/Bm−AMP1  DNA発現カセットを含むフラグメントをpBin19RiのユニークHind III部位へサブクローニングする。pBin19Riは植物形質転換ベクターpBin19（ベバン（Bevan）,1984,Nucleic  Acids  Research  12,8711−8721）の修飾形であって、ユニークEcoR I部位とHind III部位が交換され、欠陥ntp II発現カセット（イエノフスキー（Yenofsky）ら,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87:3435−3439）が導入されたものである。
実施例13
植物形質転換
攻撃力を失わせた（disarmed）アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Agrobacterium tumefacience）株LBA4404（pAL4404）（ヘケマ（Hoekema）ら,1983,Nature  303,179−180）を、実施例12において調製したベクターによりデ・フラモンド（de  Framond）ら（BioTechnology  1,262−269）の方法で形質転換する。
タバコ（Nicotinia tabacum）サムサン（Samsun）の葉のディスクを用いて、ホーシュ（Horsch）ら（1985,Science  227,1229−1231）の方法、およびpFRG8を含むアグロバクテリウム属菌株との同時培養に基づいて、タバコの形質転換を行う。同時培養は100μg/mlのカナマイシンの選択負荷のもとで実施される。これらのトランスジェニック植物（pFRG8で形質転換）を、100μg/mlのカナマイシンを含有する培地上で再生させる。これらのトランスジェニック植物を新たに導入された遺伝子の発現につき、標準的なウェスタンブロット法により分析することができる。導入された遺伝子の構成性発現が可能な植物を選択し、自家受粉させて種子を得ることができる。トランスジェニック植物のF1実生をさらに分析する。
【図１】
0003594595.tif 000008
【図２】
0003594595.tif 000009
【図３】
0003594595.tif 000010
【図８】
0003594595.tif 000011
【図６】
0003594595.tif 000012
【図４】
0003594595.tif 000013
【図１１】
0003594595.tif 000014
【図１２】
0003594595.tif 000015
【図５】
0003594595.tif 000016
0003594595.tif 000017
【図７】
0003594595.tif 000018
【図９】
0003594595.tif 000019
【図１０】
0003594595.tif 000020