(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性菌であるサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生するラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株を種菌とし、この種菌を用いて食材を発酵させて得られる、前記物質および前記ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１を含有することを特徴とする発酵食品。
【請求項２】
発酵乳または乳酸菌飲料であることを特徴とする請求項第１項記載の発酵食品。
【請求項３】
請求項１あるいは請求項２記載の発酵食品を殺菌、濃縮あるいは乾燥粉末化する加工処理を施した処理物を、他の食品および／または食品原料に混合し、そして加工して得られることを特徴とする発酵食品を原料として製造される食品。
【請求項４】
他の食品が牛乳、果物ジュース、野菜ジュース、糖液であり、他の食品原料が氷菓の原料ミックス、デザート類の原料ミックス、菓子類の原料ミックスであることを特徴とする請求項第３項記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵食品および発酵食品を原料として製造される食品に関するものであり、更に詳細には食中毒原因微生物に対する抗微生物活性物質（以下、抗菌物質と称することがある）を産生する乳酸菌を含有する発酵食品及びこの発酵食品を原料として製造される各種の食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は古くから人類の生活と密接に関係し、乳製品をはじめ数多くの食品に利用されてきた。乳酸菌の効用については、腸内フローラの改善、抗ガン作用、血圧降下などさまざまな知見が今までに報告されているが、食中毒の発生が大きな社会問題となっている昨今、乳酸発酵による感染防御あるいは抗菌作用といった機能に大きな関心が寄せられている。
【０００３】
一般に乳酸菌による抗菌効果は、乳酸発酵による食品のｐＨ低下や、乳酸自身の殺菌作用によるものと考えられている。また、ある種の乳酸菌では有機酸以外の抗菌物質、すなわちバクテリオシンを産生していることが知られている。そしてこれらの例として、抗菌物質ナイシンを産生するラクトコッカス・ラクチス・亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp.lactis ）［Berridge,N.J.,et al.：Biochem.J.,52,529(1952) ］抗菌物質ガセリシンを産生するラクトバチラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri ）［Toba,T,et  al.:Lett.Appl.Microbiol.,12, 228 (1991)］、抗菌物質ヘルベチシンを産生するラクトバチラス・ヘルベチカス（Lactobacillus helvexicus）［Joerger,M.C.,et al. ：J.Bacteriol.,167,439(1986)］を挙げることができる。
【０００４】
しかし、ヨーグルトに代表される発酵乳製品を食品として摂取した場合、ほぼ中性（ｐＨ）を保っている消化管内において有機酸が有効に殺菌効果を持続しつづけるのかどうかについては不明な点が多い。さらに、乳酸菌が産生する抗菌物質についても、今のところ、さまざまな食中毒原因微生物に対して幅広く有効に作用するものは見いだされていない。
以上のことから、現在幅広い抗菌スペクトルを有し、さまざまな食中毒原因微生物に対して有効に抗菌作用が発揮される物質を産生する乳酸菌の探索とそれを応用した発酵乳製品の開発が望まれている。
【０００５】
こうした状況のもと、本発明者は、食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生する乳酸菌［（受託番号）ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６２３］を見出し、先に特許出願した（特願平１０−３６０４１号明細書）。ＩＭＣ−１と命名された本菌株の菌学的特徴についてはその明細書に詳しく述べられているが、あらためて列挙すると以下の通りである。
【０００６】
（ａ）形態的性質
胞子を形成せず、非運動性で、グラム陽性の桿菌
【０００７】
0003542102.tif 000002
【０００８】
（ｃ）糖類の資化性
ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、アミドンを資化し、酸を生成する。
Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、マンニトール、ソルビトール、メリビオース、メレジトース、Ｄ−ラフィノ−ス、グリコーゲン、キシリトール、β−ゲンチオビオース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸、Ｄ−リキオース、Ｄ−ツラノースを資化しない。
【０００９】
以上の形態的性質、生理的性質、および糖類の資化性より、ＩＭＣ−１株はラクトバチラス・アシドフィラスグループの中でもラクトバチラス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）に属することが確認されている。
【００１０】
さらにＩＭＣ−１株はＭＲＳ培地或いは乳培地で培養した際、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属、エルシニア属といった食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生し、培地中に分泌することが明らかとなっている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、日常的に摂取することにより、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属ならびにエルシニア属などの微生物の汚染が原因とされる食中毒に対して有効な予防効果が期待できる発酵乳、乳酸菌飲料などの発酵食品を提供することであり、本発明の第２の目的は、この発酵食品を原料として製造される食品であって、日常的に摂取することにより、前記微生物の汚染が原因とされる食中毒に対して有効な予防効果が期待できる各種の食品を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
このような課題に鑑みて本発明者は更に鋭意研究を重ねた結果、ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株を種菌とし、これを用いて食材を発酵させることによって、目的とする本菌株およびその代謝産物である抗菌物質を含有した発酵食品が得られること、および、この発酵食品を原料として殺菌、濃縮あるいは乾燥粉末化などの加工処理を施し、これを牛乳、果物ジュース、野菜ジュース、糖液などの他の食品や、アイスクリームなどの氷菓の原料ミックスなどの食品原料に混合して加工すれば目的とする食品が得られることを見いだし、本発明を成すに到った。
【００１３】
本発明の請求項１の発明は、グラム陰性菌であるサルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属およびエルシニア属に属する食中毒原因微生物に対して抗微生物活性を有する物質を産生するラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株を種菌とし、この種菌を用いて食材を発酵させて得られる、前記物質および前記ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１を含有することを特徴とする発酵食品である。
【００１４】
本発明の請求項２の発明は、請求項第１項記載の発酵食品において、発酵乳または乳酸菌飲料であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項３の発明は、請求項１あるいは請求項２記載の発酵食品を殺菌、濃縮あるいは乾燥粉末化する加工処理を施した処理物を、他の食品および／または食品原料に混合し、そして加工して得られることを特徴とする発酵食品を原料として製造される食品である。
本発明の請求項４の発明は、請求項３記載の食品において、前記他の食品が牛乳、果物ジュース、野菜ジュース、糖液であり、前記食品原料が氷菓の原料ミックス、デザート類の原料ミックス、菓子類の原料ミックスであることを特徴とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の発酵食品に使用される乳酸菌（ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株）は、自然界あるいはさまざまな発酵食品の中から、分離・選択することができるほか、化学物質やＵＶ照射などによって誘発されるＩＭＣ−１由来の突然変異株も含まれる。具体的には、突然変異誘発によって、抗菌物質の産生能の高められた株が挙げられる。
【００１７】
ＩＭＣ−１株の種菌を調製するにあたっては従来どおりの方法を用いることができ、たとえば本菌株を脱脂乳培地で培養することによって得られる。さらに必要に応じて乳酸菌の生育促進物質である大豆ペプチド、酵母エキスまたは乳蛋白質の加水分解物などを同培地に適量加えることによって、より活性の高い種菌を調製することが可能となる。培養温度については通常の乳業用乳酸菌と何ら変わることはなく、３５〜４０℃で培養するのが望ましい。一例として、１％大豆ペプチド添加１０％還元脱脂乳培地を用いて、本菌株を３７℃にて２０時間培養することにより、生菌数が１〜２億／ｍｌの種菌を得ることができる。
【００１８】
本発明の発酵食品は、例えば、上記のようにして得られるＩＭＣ−１株の種菌を牛乳などの獣乳からなる食材に接種し、発酵せしめることで製造されるが、この場合の食品形態としては、ハードタイプヨーグルトのほか、発酵乳のカードを崩した、いわゆるソフトタイプヨーグルトや液状タイプヨーグルト、あるいは冷凍タイプヨーグルト（フローズンヨーグルト）が挙げられる。
【００１９】
また、本菌株は通常のナチュラルチーズを製造する際の種菌としても利用できる。
【００２０】
これらの発酵に供される食材は獣乳そのものに限定されることはなく、たとえば還元脱脂乳や乳成分のひとつである乳清はもちろんのこと、乳以外の食材では豆乳なども発酵原料として使用できる。
【００２１】
ＩＭＣ−１株を種菌として、これを用いて食材を発酵させて製造される本発明の発酵食品、たとえばヨーグルトなどの発酵乳はそのまま食品として提供できるのはもちろんであるが、本発明の発酵食品の種類に応じて、添加物、たとえば、乳、乳製品、砂糖などの糖類、果汁、果肉、野菜汁、ゲル化剤、香料などを任意に加えることができる。
【００２２】
このようにして製造される本発明の発酵食品の具体例としては、例えば、プレーンヨーグルト、加糖ヨーグルト、飲むヨーグルト、フルーツヨーグルト、乳酸菌飲料などが挙げられる。
【００２３】
一方、ＩＭＣ−１株を種菌として上記食材を発酵せしめて得られる本発明の発酵食品（培養物）は、次いで殺菌、濃縮あるいは乾燥粉末化するなどの加工処理を施し、この処理物を食品原料として、牛乳、果物ジュース、野菜ジュース、糖液などの他の食品に混合して加工することにより、また、アイスクリームなどの氷菓の原料ミックス、プリンやゼリーなどのデザート類の原料ミックス、チョコレートやキャンディなどの菓子類の原料ミックスなどの食品原料に混合して加工することにより、食中毒予防を目的とした保健食品に有効に用いることのできる本発明の食品を製造することができる。
【００２４】
本発明の食品の具体例としては、例えば、前記処理物を牛乳、果物ジュース、野菜ジュース、糖液などと混合して製造される乳飲料、清涼飲料水などのほかに、アイスクリームなどの氷菓やプリン、ゼリーといったデザート類の原料ミックス、さらにチョコレートやキャンディといった菓子類の原料ミックスに混合し、そして加工して得られる氷菓、デザート類、チョコレートやキャンディなどの菓子類などの食品を挙げることができる。
【００２５】
ＩＭＣ−１株の種菌は、その他の乳酸菌、たとえば、ラクトバチラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus l actis ）、ラクトバチラス・カゼイ（Lactobacillus casei ）、ラクトバチラス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）さらにカンジダ・ケフィア（Candida kefir ）のような酵母菌やペニシリウム・カンジダム（Penicillium candidum）のようなカビとともに２種または２種以上と併用することができる。
【００２６】
【実施例】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
種菌の調製：１０％還元脱脂乳に最終濃度が１％となるよう大豆ペプチドを加え、１１０℃で２０分間高圧滅菌する。あらかじめＭＲＳ液体培地で増殖させたラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株の培養液を上記脱脂乳培地（300 ｍｌ）に１％量接種し、３７℃にて２０時間発酵させ種菌を得る。
本発明の発酵食品（ヨーグルト）の製造：
ヨーグルトミックスは、あらかじめ牛乳に脱脂粉乳と生クリームを適量加え、無脂乳固形分９．５％、乳脂肪分３．５％に調整した後、均質化（１５０Ｋｇ／ｃｍ2 ）、殺菌（９５℃，４８秒）処理し、３７℃まで冷却する。上記ミックスにラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株の種菌を５％量接種し、３７℃で４８時間発酵させ、本発明の発酵食品（ヨーグルト）を得た。
【００２８】
抗菌物質の抽出：本発明の発酵食品（ヨーグルト）１００ｇを遠心分離にかけ（4000×Ｇ，２０分間）、沈殿画分を除去する。得られた乳清画分１部に対して冷エチルアルコール９部を加え、４℃にて２時間攪拌後、再度遠心分離をかけ（7000×Ｇ，２０分間）、沈殿画分を除去する。次に上清画分を減圧乾固し、抗菌物質を含む油状試料を得る。試料５ｇを少量の滅菌水に溶解し、４０％水酸化ナトリウムでｐＨ６．５〜７．０に調整後、再度少量の水を加え、最終濃度が５００ｍｇ／ｍｌとなるよう抗菌物質溶液を作製する。さらにこの抗菌物質溶液を希釈し、２５０ｍｇ／ｍｌおよび１２５ｍｇ／ｍｌ溶液を作製する。
【００２９】
抗菌活性の測定：被検微生物、すなわちサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi），サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium），サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis），シゲラ・ディセンテリエ（Shigella dysenteriae），シゲラ・ゾンネイ（Shigella  sonnei），シゲラ・フレキシネリ（Shigella  flexneri），毒素原性エシェリシア・コリＯ−１５７（Escherichia coli O-157），腸管侵襲性エシェリシア・コリ（Escherichia coli），エルトール型ビブリオ・コレラ（Vibrio  cholerae），ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio  parahaemolyticus）およびエルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica ）をミューラー・ヒントン・ブロスに接種し、３７℃にて一晩培養する。各培養液０．０５ｍｌをあらかじめ滅菌、溶解した感性ディスク用培地−Ｎ（５ｍｌ）と混和し、ただちにシャーレに分注して固化させる。
【００３０】
滅菌した抗生物質検定用ペーパーディスク（φ１３．０ｍｍ）に１２５ｍｇ／ｍｌ，２５０ｍｇ／ｍｌ，５００ｍｇ／ｍｌ濃度の抗菌物質溶液を０．１ｍｌづつしみ込ませ、上記の寒天培地上に置き、３７℃で２４時間培養する。その後、ペーパーディスク周辺に形成される透明な阻止円の直径を測定し、抗菌活性の有無を判定する。
こうして得られた結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
0003542102.tif 000003
【００３２】
表１は、抗菌物質産生乳酸菌ラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株を種菌として製造した本発明の発酵食品（ヨーグルト）の食中毒原因微生物に対する抗微生物活性を阻止円の直径で示したものであり、表１から本発明の発酵食品（ヨーグルト）は優れた抗菌活性を有することが判る。
【００３３】
（実施例２）
本発明の発酵食品（ヨーグルト）の製造：
下記組成のヨーグルトミックスをあらかじめ均質化（１５０ｋｇ／ｃｍ2 ）、殺菌（９５℃，４８秒）したのち、３７℃まで冷却する。このヨーグルトミックスに、実施例１に記載したラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株の種菌を５％接種し、３７℃にて４８時間培養する。発酵停止後は、冷却しながらヨーグルトのカードを細かく砕き、カップに充填した。
【００３４】
0003542102.tif 000004
【００３５】
（実施例３）
本発明の発酵食品（乳酸菌飲料）の製造：
０．５％大豆ペプチドを添加した１０％脱脂乳培地に実施例１に記載したラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１株の種菌を２％接種し、３７℃にて２０時間培養する。この発酵乳を均質化し、下記の組成でミックスを混合し、本発明の発酵食品（乳酸菌飲料）を製造した。
0003542102.tif 000005
【００３６】
ＩＭＣ−１株の再分離：実施例３に記載した本発明の発酵食品（乳酸菌飲料）を１ｍｌ分取し、９ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁後、常法に従い滅菌生理食塩水を用いて１０7 まで段階希釈する。各希釈液０．１ｍｌを、ＭＲＳ寒天平板培地の表面に塗抹し、３７℃にて４８時間培養する。その後、出現した集落の中から任意に２０個選び釣菌し、ＭＲＳ寒天平板培地上で分離培養を繰り返すことでＩＭＣ−１の再分離株（ＮＯ．１〜ＮＯ．２０）を得る。
【００３７】
抗菌物質産生能の確認：ＩＭＣ−１の再分離株（ＮＯ．１〜ＮＯ．２０）をそれぞれＭＲＳ液体培地にて３回継代したのち、各培養液を０．５％濃度の酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地（５０ｍｌ）に１％量づつ接種し、３７℃で４８時間培養する。得られた発酵乳をｐＨ４．５に調整後、遠心分離にかけ（7000×Ｇ，２０分間）、沈殿画分を除去し上清画分を分取する。
【００３８】
滅菌した抗生物質検定用ペーパーディスク（φ１３．０ｍｍ）に各上清画分を０．１ｍｌづつしみ込ませ、エシェリシア・コリ  ＲＢ（Esherichia coli RB）を被検微生物として、ペーパーディスク法にて上清画分の抗菌活性を測定する。
【００３９】
【表２】
0003542102.tif 000006
【００４０】
表２は、本発明の発酵食品（乳酸菌飲料）から釣菌したラクトバチラス・アミロボラスＩＭＣ−１の再分離株（ＮＯ．１〜ＮＯ．２０）についてエシェリシア・コリに対する抗微生物活性を示したものであり、表２より、乳酸菌飲料中に生存しているＩＭＣ−１株が抗菌物質産生能を保有していることがわかる。
【００４１】
（実施例４）
発酵乳の殺菌：
あらかじめ牛乳に脱脂乳と生クリームを適量加え、無脂乳固形分１１．５％、乳脂肪分４．０％に調整した原料ミックス５ｋｇを、均質化（１５０ｋｇ／ｃｍ2 ）、殺菌（９５℃、４８秒）処理した後、３７℃まで冷却する。上記ミックスにラクトバチラス・アミロポラスＩＭＣ−１株の種菌を５％量接種し、３７℃で４８時間発酵させ、発酵乳を得た。
【００４２】
次に、この発酵乳２１００ｇに対して、砂糖３００ｇ、２．５％ペクチン溶液６００ｇを加え、よく攪拌したのち、均質化（１５０ｋｇ／ｃｍ2 ）、殺菌（９０℃、３０秒）処理して無脂乳固形分８．０％、乳脂肪分２．８％の殺菌発酵乳を得た。
【００４３】
殺菌発酵乳の抗菌活性の測定：上記殺菌発酵乳を１００ｇ採り、４０％水酸化ナトリウムでｐＨ４．５に調整後、遠心分離にかけ（４０００×Ｇ，２０分間）抗菌物質を含んだ上清液を得た。
一方、原料ミックス２１００ｇに対して、砂糖３００ｇ、２．５％ペクチン溶液６００ｇを加え殺菌（９０℃、３０秒）したものを対照ミックスとし、この対照ミックス１００ｇを４０％乳酸でｐＨ４．５に調整後、遠心分離にかけて（４０００×Ｇ、２０分間）得られた上清液を対照品として用いた。
【００４４】
このようにして調製した各上清液についてペーパーディスク法にて各病原微生物に対する抗菌活性を測定した。
【００４５】
【表３】
0003542102.tif 000007
【００４６】
表３から、殺菌発酵乳が抗菌活性を有していることがわかる。
【００４７】
（実施例５）
本発明の食品（アイスクリーム）の製造：
実施例４で調製した殺菌発酵乳を使って下記組成のアイスクリームミックスを作成し、フリージングすることによってアイスクリームを得た。
【００４８】
0003542102.tif 000008
本発明の食品（アイスクリーム）について、実施例１と同様にして抗菌活性を測定した結果、優れた抗菌活性を有していた。
【００４９】
（実施例６）
本発明の食品（ゼリー）の製造：
実施例４で調製した殺菌発酵乳を使って、下記組成のデザートミックスを作成し、６０℃で攪拌したのち、カップに充填、冷却してゼリーを得た。
【００５０】
0003542102.tif 000009
本発明の食品（ゼリー）について実施例１と同様にして抗菌活性を測定した結果、優れた抗菌活性を有していた。
【００５１】
【発明の効果】
抗菌物質産生能を有する乳酸菌を利用した本発明の発酵食品およびこの発酵食品を原料として製造される本発明の食品は、従来から提供されている発酵乳製品などの食品に比べ、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリシア属、ビブリオ属ならびにエルシニア属などの食中毒原因微生物に対して優れた増殖阻止効果を有している。
したがって、本発明の発酵食品およびこの発酵食品を原料として製造される本発明の食品を日常的に摂取することにより、上記微生物の汚染が原因とされる食中毒に対して有効な予防効果が期待できる。