(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノマータイプの、直鎖形態またはシステイン間ジスルフィド架橋によって環化された形態の合成ペプチドであって、一般式（Ｉ）：
Δ−Ｚ−Trp Gly Cys−Θ−Cys Tyr Thr Ser−Ω（Ｉ）
［式中：
−Δはビオチンラジカル、ビオシチンラジカル、水素原子、アセチル（CH3CO−）ラジカル、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖からなる群より選択され、
−Ｚは以下の式の配列からなる群より選択されるペプチド配列を表し：
0003560987.tif 000071
−Θは以下のペプチド配列の群より選択され：
0003560987.tif 000072
セリンの−CO−基に結合している−Ωは以下からなる群より選択される：
−  ヒドロキシル基；
−  ペプチド配列Val−Ψ；および
以下の式の配列の１つ：
0003560987.tif 000073
（式中、ValまたはThrの−CO−残基に結合しているΨは、OH基、NH2基および炭素原子１〜６個を含むアルコキシラジカルからなる群より選択される）］
で表される合成ペプチド。
【請求項２】
Δが脂肪族鎖を表し、該脂肪族鎖が炭素原子１〜６個のアルキル鎖、炭素原子２〜６個のアルケニル鎖および炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖からなる群より選択される、請求項１記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド。
【請求項３】
以下の配列の１つを含む請求項１または２記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチド：
0003560987.tif 000074
0003560987.tif 000075
0003560987.tif 000076
0003560987.tif 000077
0003560987.tif 000078
0003560987.tif 000079
0003560987.tif 000080
0003560987.tif 000081
0003560987.tif 000082
0003560987.tif 000083
0003560987.tif 000084
0003560987.tif 000085
0003560987.tif 000086
【請求項４】
１つ以上の、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを含有するグループＯ  HIV−１感染を検出するための組成物。
【請求項５】
配列番号３（−Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn Glu Thr−）の配列を含むペプチドを、１つ以上の式（Ｉ）で表される合成ペプチドとして含有する請求項４記載のグループＯ  HIV−１感染を検出するための組成物。
【請求項６】
１つ以上の、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドおよび１つ以上のグループＯ  HIV−１組換えペプチドを含有するグループＯ  HIV−１感染を検出するための組成物。
【請求項７】
１つ以上の、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドならびに１つ以上の、HIV−１および／またはHIV−２組換えまたは合成ペプチドを含有するグループＯ  HIV−１感染を検出するための組成物。
【請求項８】
グループＯ  HIV−１感染を検出するためのイムノアッセイ法であって、以下の工程：
ａ）検出可能に標識した１つ以上の、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、抗グループＯ  HIV−１抗体を含む可能性のある患者から得た試料と接触させる工程；
ｂ）該ペプチドと該抗体との複合体の存在または非存在を検出する工程；および
ｃ）所望により該試料中の抗体の量をアッセイする工程、を包含し、ここで該ペプチドと該抗体との複合体の存在がグループＯ  HIV−１感染の指標となる、イムノアッセイ法。
【請求項９】
グループＯ  HIV−１感染を検出するためのイムノアッセイ法であって、以下の工程：
ａ）検出可能に標識した１つ以上の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを含有する請求項４〜７のいずれか１項記載の組成物を、抗グループＯ  HIV−１抗体を含む可能性のある患者から得た試料と接触させる工程；
ｂ）該ペプチドと該抗体との複合体の存在または非存在を検出する工程；および
ｃ）所望により該試料中の抗体の量をアッセイする工程、を包含し、ここで該ペプチドと該抗体との複合体の存在がグループＯ  HIV−１感染の指標となる、イムノアッセイ法。
【請求項１０】
グループＯ  HIV−１特異的抗体検出用診断キットであって、少なくとも１つの、請求項１〜３のいずれか１項記載の式（Ｉ）で表される合成ペプチドおよび該抗体と該ペプチドとの複合体の検出に適切な手段を含む診断キット。
【請求項１１】
グループＯ  HIV−１特異的抗体検出用診断キットであって、請求項４〜７のいずれか１項記載の組成物および該抗体と該組成物由来のペプチドとの複合体の検出に適切な手段を含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、グループＯ  HIV−１ウイルスによる感染を検出するための生物学的試験に使用され得る合成ペプチド、その製造方法、このペプチドを含有する組成物およびキット、ならびにこのペプチドを使用する生物学的試験に関する。
グループＯ  HIV−１レトロウイルスは先行技術において公知である。特許EP  0,345,375および特許出願EP  0,657,532は、カメルーン人患者から単離されたANT  70およびANT  70  NA単離物を記載している。より詳細には、これらの文献は、これらの単離物の溶解物またはタンパク質を含有する抗原および抗原性組成物、ゲノムRNAに対応する核酸、これらの核酸を使用するハイブリダイゼーション法、上記単離物の製造方法、ならびにこれらのレトロウイルスのp12、p16、p25、gp41およびgp120タンパク質の製造方法を記載している。
EP  0,591,914は、MVP  5180/91単離物を記載している。ウエスタンブロッティングによって特徴付けられたこの単離物は、上記単離物と同様に、長く知られていたHIV−１レトロウイルス単離物との差異を示す。詳細には、EP  0,591,914は、MVP  5180/91単離物のDNA配列を記載し、gag、polおよびenv遺伝子の位置を示している。EP  0,591,914はさらに、V3ループおよび免疫優性領域（gp41）の合成ペプチドを記載している。これらは、生物学的試験、特に、グループＯ  HIV−１抗体のインビトロ検出に有用である。
EP  0,673,948は、15〜50アミン酸（AA）からなり、配列−VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR−［式中、Ｘはシステイン残基またはセリン残基のいずれかを表す］を含む合成または組換えペプチドを記載している。このペプチドは、特定のグループＯ  HIV−１レトロウイルス単離物による感染を検出するための診断分野において有用である。
これもまたグループＯ  HIV−１ファミリーに属するレトロウイルスの部分を形成するMVP  2901/94単離物を記載しているEP  0,727,483も公知である。この出願は、十分に決定されたペプチド配列を有する特定の抗原を記載している。このペプチド配列は、MVP  2901/94単離物のgp120の配列の部分およびgp41（免疫優性領域）の部分に対応する。
WO  96/12809は、グループＯ  HIV−１ファミリーに属する２つの新たな単離物を記載している。これらは、VAUおよびDUR単離物である。この出願は、上記２つのウイルス由来の特定のペプチド配列を記載しており、それらはHIV−１  VAUまたはDURペプチド配列を認識する抗体の検出に有用である。
WO  96/32293は、ANT  70単離物の配列由来の２つの抗原を記載している。これらはgp41の免疫優性領域の、MDL061と称する抗原および抗原MDL56である。この発明によれば、グループＯ  HIV−１ウイルスに感染した患者由来の血清の限定された収集物の試料の100％を検出するために、これら２つのペプチドを含有する組成物を使用する必要がある。なぜなら、各々の単離ペプチド単独では、満足な結果が得られないからである。
実際、グループＯウイルスの単離物によって示される遺伝子可変性の観点から、同一かつ単一の単離物由来の抗原を使用することによって、感染個体の血清学的スクリーニングを保証することは事実上不可能である。このことは、100％の感度を保証する試薬を得ることは不可能であることを意味する。従って、Ｏグループは、初めて、大きな問題を提起する；それは、特定の血清学的試薬が、特定の分岐をしたグループまたはサブタイプに感染した個体を認識できないことである。これは正にグループＯ  HIV−１ウイルスの事情である。
WO  96/40763も、グループＯの大きな分岐を強調している。この出願は、天然HIV−１タイプＢ配列中にいくつかの微細な改変（１個または２個のアミノ酸の置換）を組込んだペプチドを記載している。この出願によれば、このハイブリッドペプチドは、抗グループＯ抗体と反応することができる。
WO  96/27013は、BCF  01、BCF  02、BCF  03、BCF  06、BCF  07、BCF  08、BCF  09、BCF  11、BCF  12、BCF  13およびBCF  14と称する一連の新たなグループＯ  HIV−１ウイルスならびにESS/BCF02、FAN/BCF01、LOB/BCF06、MAN/BCF07、NKO/BCF08、POC/BCF03、NAN/BCF11、BCF09、BCF12、BCF13およびBCF14と称する対応するgp41優性領域の一連のペプチドを記載している。多数のこれらのペプチドは、その低い可溶性のために（特に、ペプチドBCF13）、診断において取り扱いが困難である。
予期せぬことに、特定の合成ペプチドは優れた質の診断試薬であり、それらによってグループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した患者を満足にスクリーニングできることがここで見出された。このペプチドは、グループＯ  HIV−１レトロウイルスの単離物中に存在する高度に保存された短い配列の周囲に接合された可変配列から構成されている。本発明のペプチドによって、特定のグループＯ  HIV−１単離物のgp41（env）の免疫優性エピトープを有する合成ペプチドを用いて得られる結果より非常に優れた結果を得ることができる。
以下、アミノ酸を名付けるために、３文字表記を使用する。
本発明の合成ペプチドは、一般式（Ｉ）：
Δ−Ｚ−Trp Gly Cys−Θ−Cys Tyr Thr Ser−Ω（Ｉ）
［式中：
−Δはビオチンラジカル、ビオシチンラジカル、水素原子、アセチル（CH3CO−）ラジカル、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖もしくは炭素原子２〜６個のアルケニル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、
−Ｚは式（II）〜（Ｘ）：
−Ξ１−Ser−Ξ２−                       （II）
−Ser−Ξ２−                            （III）
−Ξ１−Ser−                             （IV）
−Ξ１−Gln−Ξ２−                       （Ｖ）
−Gln−Ξ２−                             （VI）
−Ξ１−Gln−                            （VII）
−Ξ１−Asn−Ξ２−                     （VIII）
−Asn−Ξ２−                             （IX）
−Ξ１−Asn−                             （Ｘ）
｛式中：
−Ξ１は０〜９アミノ酸のペプチド配列を表し、
−Ξ２は０〜５アミノ酸のペプチド配列を表す｝
の１つで表されるペプチド配列を表し、
−Θは式（XI）：
−（AA1）−（AA2）−（AA3）−（AA4）−（AA5）（XI）
｛式中：
・（AA1）はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、
・（AA2）はグリシン残基またはアスパラギン残基のいずれかを表し、
・（AA3）はリジン残基、アルギニン残基またはオルニチン残基のいずれかを表し、
・（AA4）はロイシン残基、アラニン残基、イソロイシン残基またはグルタミン残基のいずれかを表し、
・（AA5）はイソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、トレオニン残基、ノルロイシン残基またはノルバリン残基のいずれかを表すが、
（AA1）、（AA2）、（AA3）、（AA4）および（AA5）は一緒にペプチド配列−Lys Gly Lys Leu Ile−および−Lys Gly Lys Leu Val−を形成しない｝
で表されるペプチド配列を表し、
セリンの−CO−基に結合している−Ωは：
−  ヒドロキシル（−OH）ラジカルまたはアミノ（−NH2）ラジカル、
−  １〜６個の炭素原子を含むアルコキシラジカル、
−  式（XII）：
−Val−Σ−Ψ                            （XII）
｛式中、Σは式（XIII）または式（XIV）：
−（AA6）−Trp Asn−（AA7）−（AA8）    （XIII）
−（AA6）−Trp His−（AA7）−（AA8）     （XIV）
（式中：
・（AA6）はリジンとは異なるアミノ酸を表し
・（AA7）はアミノ酸を表し
・（AA8）はセリンまたはトレオニン残基を表し、
遊離AA8アミノ酸の−CO−残基に結合しているΨは、OHもしくはNH2基または炭素原子１〜６個を含むアルコキシラジカルを表す）
で表される配列を表す｝
で表されるペプチド配列、
−  式（XV）：
−Val−Ψ                                 （XV）
｛式中、バリンの−CO−残基に結合しているΨは、式（XII）について定義したとおりである｝
で表されるペプチド配列、または
−  式（XVI）〜（XVIII）：
0003560987.tif 000002
｛式中、ＺおよびΘは式（Ｉ）について定義したとおりであり、Σは式（XII）について定義したとおりであり、セリンの−CO−残基、AA8アミノ酸の−CO−残基またはバリンの−CO−残基に結合しているΨは式（XII）について定義したとおりである｝
の１つで表されるペプチド配列を表す］
に対応する。
Ωが式（XVI）〜（XVIII）の１つで表されるペプチド配列を表す場合、式（Ｉ）で表されるペプチドはその大きさが26〜66アミノ酸で変動し得るダイマーになる。Ωが式（XVI）〜（XVIII）の１つで表されるペプチド配列を表さない場合、式（Ｉ）で表されるペプチドはモノマータイプでありその大きさは13〜33アミノ酸で変動し得る。
本発明によるペプチドは、直鎖形態またはシステイン間ジスルフィド架橋によって環化された形態のいずれであってもよい。
（AA5）がバリン残基、ロイシン残基またはトレオニン残基のいずれかを表す式（Ｉ）で表される化合物が好ましく、Ωが式（XII）で表されるペプチド配列に対応する場合、（AA6）はグルタミン残基またはアルギニンン残基のいずれかを表す。
−Δがビオチンラジカル、水素原子、１個もしくは２個のチオール、アルデヒドもしくはアミン官能基を含んでもよい脂肪族鎖（該脂肪族鎖は、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル鎖である）または炭素原子２〜６個のアミノアルキルカルボニル鎖を表し、
−Ｚが式（II）または（Ｖ）［式中、Ξ１は２アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ２はアミノ酸を表す］で表されるペプチド配列、式（IV）［式中、Ξ１は３アミノ酸を表す］で表される配列、または式（VIII）［式中、Ξ１は９、８もしくは３アミノ酸のペプチド配列を表し、Ξ２は５アミノ酸のペプチド配列を表す］で表されるペプチド配列を表し、
−Θが式：
0003560987.tif 000003
で表されるペプチド配列を表し、
−Ωがヒドロキシル基、ペプチド配列（XV）または式（XII）で表されるペプチド配列に対応する以下の配列：
0003560987.tif 000004
の１つを表す式（Ｉ）で表されるペプチドが好ましい。
好ましくは、Ｚは式：
0003560987.tif 000005
で表されるペプチド配列を表す。
20〜50アミノ酸を含み、式（I a）：
Δ−Za−Trp Gly Cys−Θ−Cys Tyr Thr Ser−Ωａ（I a）
［式中、
Zaは式II a〜X a:
Ξ1a−Ser−Ξ2a                         （II a）
−Ser−Ξ2a                            （III a）
−Ξ1a−Ser                             （IV a）
Ξ1a−Gln−Ξ2a                          （V a）
−Gln−Ξ2a                             （VI a）
Ξ1a−Gln−                            （VII a）
Ξ1a−Asn−Ξ2a                       （VIII a）
−Asn−Ξ2a                             （IX a）
−Ξ1a−Asn                              （X a）
｛式中：
−Ξ1aは１〜５アミノ酸のペプチド配列を表し、
−Ξ2aはアミノ酸を表す｝
で表されるラジカルを表し、
−Ωａは式（Ｉ）について定義される式（XII）で表されるペプチド配列または式（XVII a）：
0003560987.tif 000006
｛式中、Zaは式（I a）について定義したとおりである｝
で表されるペプチド配列を表し、
Δ、Θ、ΣおよびΨは式（Ｉ）について定義したとおりである］
に対応する合成ペプチドも、本発明の一部を形成する。
以下の配列の１つを含む式（Ｉ）または（I a）で表されるペプチド（これらのペプチドは、上記で定義したように、ダイマータイプであってもよく、モノマータイプであってもよい）が好ましい。配列を１文字表記および３文字表記で示す：
0003560987.tif 000007
0003560987.tif 000008
0003560987.tif 000009
0003560987.tif 000010
0003560987.tif 000011
0003560987.tif 000012
0003560987.tif 000013
0003560987.tif 000014
0003560987.tif 000015
0003560987.tif 000016
0003560987.tif 000017
0003560987.tif 000018
0003560987.tif 000019
0003560987.tif 000020
0003560987.tif 000021
0003560987.tif 000022
以下の合成ペプチドは特に好ましいペプチドである：
0003560987.tif 000023
0003560987.tif 000024
0003560987.tif 000025
0003560987.tif 000026
0003560987.tif 000027
0003560987.tif 000028
0003560987.tif 000029
0003560987.tif 000030
0003560987.tif 000031
0003560987.tif 000032
0003560987.tif 000033
0003560987.tif 000034
0003560987.tif 000035
0003560987.tif 000036
0003560987.tif 000037
0003560987.tif 000038
本発明の主題である式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、常法に従って固相合成によって得ることができる:R.B.Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.（1963），85,pp.2149−2154;R.C.Sheppard,「Peptides  1971」,Nesvadba  H.（編）North  Holland,Amsterdam,pp.111;E.AthertonおよびR.L.Sheppard,「Solid  phase  peptide  synthesis,a  practical  apprach」,IRL  PRESS,（1989）,Oxford  University  Press,pp.25−34。自動合成機としては、Milliporeの合成機「9050  Plus  Pep  Synthesizer」または等価な合成機を使用することが可能である。
合成に使用する固体支持体は、使用する技術および化学反応に適合性であるべきである。例えば、合成機「9050  Plus  pep.Synthesizer」での合成用には、いわゆる「連続フロー」技術に適切な樹脂を使用することが推奨される;PEG  PS樹脂はこの基準に合致する。この支持体は、ポリスチレンビーズの官能機と第１のアミノ酸の結合点との間に位置する、ポリエチレングリコール（PEG）に基づくアーム（「スペーサー」）からなる。この結合点の性質は、選択したＣ末端官能機に従って変動し得る。本発明の場合、種々のPEG−PS樹脂を使用した。
原材料として使用する出発樹脂およびアミノ酸は、市販されている製品である（PerSeptive−BiosystemまたはNeosystem）。
ペプチド合成用に、以下の側鎖保護基を使用した：
0003560987.tif 000039
使用する、アミノ酸のα位の第１級アミン官能基の一次的保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基である。脱保護は、ジメチルホルムアミド中20％ピペリジン溶液を用いて実施する。
カップリングには、好ましくは、過剰のジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を使用する。
合成後、樹脂を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタン）で洗浄し、真空下で乾燥させ、次いで０℃に冷却し適切な「スカベンジャー」を含有するトリフルオロ酢酸（TFA）に基づく溶液で処理する。例えば、82％のトリフルオロ酢酸、５％のフェノール、５％の水、５％のチオアニソールおよび３％のエタンジチオールを含有するＫ試薬を使用してもよい。
樹脂の濾過後、合成ペプチドを沈殿させ、エーテルでリンスする。
次いで、合成ペプチドを逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、その純度を質量分析によって測定する。固相としては、例えば、Bondapak  Ｃ−18相を使用することができる。ペプチドを２つの緩衝液（本質的に水性の第１の緩衝液（例えば、水−TFA  0.1％）およびむしろ有機性の第２の緩衝液（例えば、60％アセトニトリル、39.92％水および0.08％TFAを含有する混合物））の間の直線勾配を形成させることによって溶出させる。採集した純粋な画分を合し、真空下で濃縮し、凍結乾燥する。
環化のために、精製合成ペプチドを酢酸アンモニウム溶液（10mM）中に溶解する。1M水酸化アンモニウムを添加することによって、pHを8.5に調整する。溶液を激しく撹拌する。環化は18時間後に完了する。次いで、酢酸を添加することによって、pHを６に下げる。環化したペプチドを凍結乾燥し、次いで、上記のように逆相液体クロマトグラフィーによって精製する。
本発明のペプチドの免疫反応性を、グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した主にカメルーン起源の患者由来の血清を用いて評価した。実施した種々の試験は、本発明のペプチド（単独でまたは組み合わせで（ペプチドの組成物））によって、グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した血清を100％検出することができることを示した。
それゆえ、本発明の合成ペプチドは、グループＯ  HIV−１レトロウイルスによる感染のスクリーニングのための免疫学的試験に適用される。式Ｉで表されるいくつかの合成ペプチドの組み合わせを使用することも可能である。式Ｉで表されるペプチドを２つ以上含有し得るこの組み合わせも、本発明の一部を形成する。ペプチド番号１（2B）および番号３（4B）を含有する組み合わせが好ましい。
本発明の式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、常法によって得ることができ、例えば、EP  0,591、914に記載の配列を有するグループＯ  HIV−１組換えペプチド（組換えタンパク質）との組み合わせで使用することもできる。
本発明の合成ペプチドを、特許出願または特許EP  0,387,914、EP  0,239,425、EP  0,220,273またはEP0,267,802に記載のペプチドのような他のHIV−２および／またはHIV−１組換え（組換えタンパク質）または合成ペプチドと組み合わせて使用することもできる。この特許出願または特許のリストは、網羅しているのではなく例示のために挙げている。
１つ以上の、式（Ｉ）で表される合成ペプチドおよび１つ以上の、HIV−１またはHIV−２組換えまたは合成ペプチドを含有する組成物は、種々のHIVレトロウイルスに感染した患者のスクリーニング用の診断に適用される。この組成物も本発明の一部を形成する。
１つ以上の、式（Ｉ）で表される合成ペプチドを、単独でまたはグループＯ  HIV−１組換えペプチドまたはHIV−１および／もしくはHIV−２組換えもしくは合成ペプチドと組み合わせて使用するイムノアッセイ法も本発明の一部を形成する。
本発明は、式（Ｉ）で表されるペプチドまたは少なくとも１つの、式（Ｉ）で表されるペプチドを含有する組成物を含む、イムノアッセイを実施するためのキットにも関する。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例1:
本発明による化合物の製造：ペプチド番号２（3B）
0003560987.tif 000040
このペプチドを固相で合成した。1963年にMerrifield（J.Am.Chem.Soc.（1963）85,pp.2149−2154）によって開発された技術は、第１のアミノ酸をポリマー固体支持体（樹脂）上にその酸官能基によって結合させ、合成されるペプチドが樹脂に結合されたまま、ペプチド配列をこの第１のアミノ酸から伸張させることからなる。
ペプチド番号２の合成用に、合成機として、合成機「9050  Plus  Pep  Synthesizer」を使用し、樹脂として、樹脂Fmoc  Thr（OtBu）PEG  PSを使用した。
合成の各工程を下記の表Ｉにまとめる：
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合成の最後に、樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥させた。
次に、樹脂をＫ試薬（82％トリフルオロ酢酸;5％フェノール;5％水;5％チオアニソール;3％エタンジチオール）で処理した。次いで、ジエチルエーテルを用いた沈殿によって単離したペプチド番号２（3B）を、同じ溶媒でリンスした。こうして、140mgのペプチド番号２（3B）を得た。
次いで、ペプチド番号２（3B）を、逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。固相として、Bondapak  Ｃ−18相を使用した。ペプチドを、２つの緩衝液（本質的に水性の第１の緩衝液（例えば、水−TFA  0.1％）およびむしろ有機性の第２の緩衝液（例えば、60％アセトニトリル、39.92％水および0.08％TFAを含有する混合物））の間の直線勾配を形成させることによって溶出させた。採集した純粋な画分を合し、真空下で濃縮し、凍結乾燥させた。
環化のために、このようにして得た精製合成ペプチドを酢酸アンモニウム溶液（10mM）中に溶解した。1M水酸化アンモニウムを添加することによって、pHを8.5に調整した。溶液を激しく撹拌した。環化は18時間後に完了した。次いで、酢酸を添加することによって、pHを６に下げた。環化したペプチドを凍結乾燥させ、次いで、上記のように逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。
本発明による化合物の製造：ペプチド番号15（22B）
このペプチドを、樹脂として樹脂FmocPAL  PEG−PSを使用した以外、ペプチド番号２（3B）のように合成した。
合成の各工程を下記の表IIにまとめる：
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合成の最後に、樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥させた。
次に、樹脂をＫ試薬（82％トリフルオロ酢酸;5％フェノール;5％水;5％チオアニソール;3％エタンジチオール）で処理した。次いで、ジエチルエーテルを用いた沈殿によって単離したペプチド番号７（22B）を、同じ溶媒でリンスした。こうして、140mgのペプチド番号15（22B）を得た。
次いで、ペプチド番号15（22B）を、ペプチド番号２（3B）について上記したように、逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、次いで環化させ、凍結乾燥し、精製した。
同様に、適切な樹脂およびアミノ酸を使用して、本発明の他の化合物を合成した。
表IIIは、質量分析によって評価した、非環化形態の、式（Ｉ）で表されるいくつかのペプチドの分子量を示す。
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実施例2:
本発明によるペプチドの免疫反応性の免疫酵素試験による評価：試験番号１
使用した血清ESS、DUR、VAUおよびHADは、グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染したフランス人患者由来の血清である。グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した患者由来の他の血清試料は、
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AIDS（1977），11,pp.445−453に記載の血清学アルゴリズムに従ってグループＯに血清型決定された。
HIV陰性血清（ｎ＝48）を、健常ボランティアから得た。
使用した合成ペプチドを、水中に1mg/mlの濃度で溶解した（ストック溶液）。固相の感受性化工程（コーティング）のために、各ペプチドの２μg/mlの溶液（ストック溶液を0.1M炭酸緩衝液で希釈することによって得た）110μｌを、マイクロタイタープレートMicrotiterTM（NUNC）の各ウェルに添加した。一晩室温でインキュベートした後、マイクロプレートを、まず0.1％のTween▲Ｒ▼  20および0.001％のメルチオレートナトリウムを含有するTris−NaCl緩衝液pH7.4で洗浄し、
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飽和溶液を吸引した後、プレートを10分間50℃で加熱した。
血清試料をスキムミルク溶液（0.01％のフェノールレッド、0.25％のクロロホルムおよび0.25％のKathon▲Ｒ▼を補充したクエン酸緩衝液）で1/5希釈し、プレートのウェルに入れ、30分間40℃でインキュベートした。
0.1％のTween▲Ｒ▼  20および0.001％のメルチオレートナトリウムを含有するTris−NaCl緩衝液pH7.4で洗浄した後、30％グリセロールおよび25％正常ウシ胎児血清を補充したクエン酸緩衝液中の、保存剤として0.01％のメルチオレートナトリウムを含有する、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒト
IgGおよびIgMヤギ抗体からなる結合体の溶液100μｌをプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを30分間40℃でインキュベートした。
0.1％のTween▲Ｒ▼  20および0.001％のメルチオレートナトリウムを含有するTris−NaCl緩衝液pH7.4で洗浄した後、過酸化水素中のＯ−フェニレンジアミン溶液100μｌを各ウェルに添加することによって発色させた。次いで、マイクロプレートを30分間室温で暗所でインキュベートした。次いで、発色反応を100μｌの4N硫酸を添加することによって停止した。490および620nmで吸光度（Ａ）を測定した。
各ウェルで読み取った相対的吸光度（A490−A620）は、各ペプチドの免疫反応性に比例する。これは、各ペプチドが、試験を実施した生物学的試料と反応する能力を示す。カットオフ値を、0.15に等しい吸光度として決定した。これは、陰性値の平均（ｎ＝48）＋12標準偏差に相当する。
本発明のペプチド（ペプチド番号３（4B）、ペプチド番号２（3B）およびペプチド番号１（2B）、全て環化形態）の反応性を、配列としてVAU単離物（グループＯ  HIV−１レトロウイルス）のエンベロープ（env）の天然配列の一部を有し、gp41の免疫優性エピトープを含む２つの合成ペプチドの反応性と比較した。
これら２つのペプチドは、以下の配列を有する：
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この研究用に、これらのペプチドを環化形態で使用した。この研究の結果を表IVに示す。
0003560987.tif 000048
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表IVの結果は、ペプチド番号３（4B）が、他のペプチドについて示された性能に対して最良の性能を示すことを示す。このペプチドは、gp41の免疫優性エピトープに対応するVAU単離物の配列の一部を有する２つのペプチドに比較して、グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した患者の血清間での最良の識別を可能にする。さらに、本発明のペプチド番号２（3B）および番号１（2B）は、同数のアミノ酸を含むVAU  22  AAペプチドよりも免疫反応性が高い。
実施例3:
本発明によるペプチドの免疫反応性の免疫酵素試験による評価：試験番号２
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AIDS（1977），11,pp.445−453に記載の血清学アルゴリズムに従ってグループＯに血清型決定された。遺伝子型決定された試料（Maryland）をアメリカ合衆国から得た。異なる免疫反応性試験のために十分な容量を得るために、これらの試料を、表Ｖに示す希釈率で陰性ヒト血清中で事前に希釈した。
使用した合成ペプチドを、水中に1mg/mlの濃度で溶解した（ストック溶液）。固相の感受性化工程（「コーティング」）のために、実施例２に記載のように手順を実施した。
血清試料をスキムミルク溶液（0.01％のフェノールレッド、0.25％のクロロホルムおよび0.25％のKathon▲Ｒ▼を補充したクエン酸緩衝液）で1/5希釈し、プレートのウェルに入れ、30分間40℃でインキュベートした。
0.1％のTween▲Ｒ▼  20および0.001％のメルチオレートナトリウムを含有するTris−NaCl緩衝液pH7.4で洗浄した後、30％グリセロールおよび25％正常ウシ胎児血清を補充したクエン酸緩衝液中の、保存剤として0.01％のメルチオレートナトリウムを含有する、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgGおよびIgMヤギ抗体からなる結合体の溶液100μｌをプレートの各ウェルに添加し、次いで、プレートを30分間40℃でインキュベートした。
0.1％のTween▲Ｒ▼  20および0.001％のメルチオレートナトリウムを含有するTris−NaCl緩衝液pH7.4で洗浄した後、実施例２に記載のように発色させた。
各ウェルで読み取った相対的吸光度（OD）（A490−A620）は、各ペプチドの免疫反応性に比例する。これは、各ペプチドが、試験を実施した生物学的試料と反応する能力を示す。
本発明のペプチド（ペプチド番号10（14B）、番号11（18B）、番号12（19B）、番号14（21B）、番号15（22B）、番号16（23B）、全て環化形態）の反応性を、配列としてグループＯ  HIV−１レトロウイルスのエンベロープ（env）の天然配列の一部を有する３つの相同合成ペプチドの反応性と比較した。これらのペプチドは、VAU単離物由来の２つのペプチド  −  ペプチドVAU  22  AAおよびペプチドVAU  35  AA  −ならびにペプチドMVP  5180（表Ｖ中「MVP  5180」と記す）である。ペプチドVAU  22  AAおよびVAU  35  AA（その構造は実施例２に示す）ならびにペプチドMVP  5180は、gp41の免疫優性エピトープを含む。
これら全てののペプチドを環化形態で使用した。MVP  5180ペプチドの配列は下記のとおりである：
0003560987.tif 000051
この研究の結果を表Ｖに示す。
0003560987.tif 000052
試験した各ペプチドについて、波長A492−A620で読み取った種々のレベルの相対的吸光度に対応する４つのクラス（ａ、ｂ、ｃおよびｄ）に試料を整理した：
・  −  a:OD＜0.100、
・  −  b:0.100＜OD＜0.500、
・  −  c:0.500＜OD＜1.000、
・  −  d:OD＞1.000、
このようにして、ペプチドの免疫反応性の程度を評価することが可能になった。最も免疫反応性が高いペプチドは、最大数の試料が最高の吸光度値に対応するクラスに見出されるペプチドである。
結果を表VIに示す。
0003560987.tif 000053
結果は、試験した全ての本発明のペプチドが、天然単離物に由来する先行技術の対称ペプチド（MVP  5180、VAU）よりも良好な免疫反応性の性能を達成することを示す。本発明のペプチド、番号15（22B）、番号14（21B）および番号16（23B）は、最も免疫反応性が高いことが見出されている。
実施例4:
本発明によるペプチドを含有する組成物の免疫反応性の免疫酵素試験による評価
この試験のために、実施例２に記載のプロトコルに従って手順を実施し、同じ血清を使用した。使用したマイクロプレートを、環化したペプチド番号１（2B）もしくは環化したペプチド番号３（4B）またはこれら２つのペプチドを含有する（1:1w/w）組成物のいずれかを用いて感受性化した。各ウェル中に、２μg/mlのペプチド番号１（2B）を含有する溶液100μｌ、２μg/mlのペプチド番号３（4B）を含有する溶液100μｌまたは１μg/mlのペプチド番号１（2B）および１μg/mlのペプチド番号３（4B）を含有する溶液100μｌのいずれかを入れた。
この試験の結果を表VIIに示す。
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表VIIの結果は、診断に使用した場合、本発明のペプチドの組成物によって、グループＯ  HIV−１レトロウイルスに感染した患者由来の全ての血清の検出が可能になることを示す。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称:Pasteur Sanofi Diagnostics
0003560987.tif 000056
（Ｃ）市:Marnes la Conquette
（Ｅ）国:France
（Ｆ）郵便番号:92430
（Ｇ）電話:0153774000
（Ｈ）テレファックス:0153774133
（ii）発明の名称：グループＯ  HIV−１ウイルスによる感染検出用の生物学的アッセイに有用な合成ペプチド
（iii）配列数:16
（iv）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25（EPO）
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号1:
0003560987.tif 000057
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号2:
0003560987.tif 000058
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号3:
0003560987.tif 000059
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号4:
0003560987.tif 000060
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号5:
0003560987.tif 000061
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号6:
0003560987.tif 000062
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号7:
0003560987.tif 000063
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号8:
0003560987.tif 000064
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:16アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号9:
0003560987.tif 000065
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:16アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号10:
0003560987.tif 000066
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号11:
0003560987.tif 000067
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号12:
0003560987.tif 000068
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:32アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号13:
0003560987.tif 000069
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
（Ａ）生物名:syn
（xi）配列：配列番号14:
0003560987.tif 000070