(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点の輝度を測定する蛍光輝度測定方法であって、
前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射して蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得る第１の撮像工程と、
前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射することにより前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得る第２の撮像工程と、
該第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る抽出工程と、
該２値化画像をマスクとして前記第１の画像のうち、異物領域と重なった部分の画像を無効とする異物除去工程と、
を含むことを特徴とする蛍光輝度測定方法。
【請求項２】
前記２値化画像の異物領域を一定量だけ膨脹させる膨張工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項３】
測定された微小点の輝度を微小点の基準面積を用いて正規化する正規化工程をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項４】
前記異物除去工程後に各微小点の面積を求め、該面積と微小点の基準面積の比率によって、測定値の信頼性を判定する信頼性判定工程をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項５】
前記第２の画像をレファレンス画像により補正する補正工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項６】
前記抽出工程は、前記第２の画像から得られる微分画像を用いて前記２値化画像を得ることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項７】
前記抽出工程は、前記２値化画像の２値化レベルを各画素に対応する微分信号の度数分布により定めることを特徴とする請求項６に記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項８】
前記微分信号に対応する微小領域での強度で前記微分信号を規格化することを特徴とする請求項６又は７に記載の蛍光輝度測定方法。
【請求項９】
略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点に励起光を照射して得られる蛍光像の輝度を測定する蛍光輝度測定装置であって、
光源と、
励起光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記蛍光物質の像を形成する為の結像手段と、
発生した蛍光の波長のみを選択する第２の波長選択手段と、
蛍光像を走査して画像を得る光電変換手段と、
該画像を記憶する記憶手段と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記記憶手段に記憶された前記第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る処理と、
前記２値化画像をマスクとして前記記憶手段に記憶された前記第１の画像のうち、前記異物領域と重なった部分の画像を無効とする処理と、
を行う画像処理手段と、
を具備することを特徴とする蛍光輝度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、平面上に配列されている複数の微小な点を対象として微小点の輝度を測定する装置に係り、特に、蛍光物質で標識されたＤＮＡや蛋白質などの物質が高密度で微小点として平面上に配列されているバイオチップを対象として、蛍光分析を行うシステムに好適な蛍光輝度測定方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、特開２０００−１２１５５９号公報には、この微小点の蛍光輝度を測定する装置が開示されている。
【０００３】
図１２は、上記特開２０００−１２１５５９号公報に開示されている蛍光輝度測定装置の概略構成図である。この公報に開示の蛍光輝度測定装置は、蛍光標識を行った試料を基板表面に微小点として形成したバイオチップ５２０を図中Ｙ方向に走査するチップ駆動部５０３と、励起光源としてのレーザ５０６と、該レーザ５０６からのレーザ光を反射し、被測定物からの蛍光を透過するダイクロイックミラー５０８と、集光レンズ５０９と、該集光レンズ５０９と上記ダイクロイックミラー５０８とを含む読取ヘッド５０７を図中Ｘ方向に走査するヘッド駆動部５０２と、前記微小点からの蛍光を波長毎に分離するダイクロイックミラー５１１と、レーザ光と蛍光を分離するフィルタ５１５，５１９と、絞りレンズ５１４，５１８と、ピンホール板５１３，５１７と、フォトマル５１２，５１６とから構成されている。
【０００４】
このような構成の蛍光輝度測定装置の作用は、次の通りである。即ち、レーザ５０６で発生したレーザ光は、ダイクロイックミラー５０８により反射されて集光レンズ５０９に向けられ、バイオチップ５２０上に集光されてレーザ光点を形成する。この時、このレーザ光点により照明された部分に蛍光物質が存在した場合には、レーザ光により蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光は、集光レンズ５０９により集光されたのち、ダイクロイックミラー５０８を透過し、色分離ダイクロイックミラー５１１によって波長毎に分離され、各々の波長毎に絞りレンズ５１４、５１８により集光されてピンホール板５１３，５１７を通過し、フォトマル５１２，５１６に入射する。フォトマル５１２，５１６は、光子を検出してＴＴＬレベルのパルスに変換するセンサであるので、フォトマル５１２，５１６に入射した光がパルス信号となり、このパルス数を測定することで微小点の蛍光輝度を測定することができる。さらに、チップ駆動部５０３とヘッド駆動部５０２によりレーザ光点を機械的に走査しながら以上の動作を実施することによって、バイオチップ５２０全体にわたる微小点の蛍光輝度を測定するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、バイオチップ５２０の表面に励起光を反射したり、蛍光を発するような異物が存在すると、バイオチップ５２０上のスポット５２１からの蛍光以外に異物からのノイズとなる光を検出してしまう為、測定した輝度に誤差が生じるという点について対応することができない。
【０００６】
また、従来の蛍光輝度測定装置では、異物の有無を判断することができない為、微小点の輝度値の信頼性について定量的な判断ができない。
【０００７】
本発明は、上記した事情に鑑みなされたもので、バイオチップ上の表面近傍に異物が存在した場合でも、測定誤差を少なくすることが可能であり、異物の存在を認識して輝度測定値の信頼性を定量的に判断することができる蛍光輝度測定方法及び装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明による蛍光輝度測定方法は、略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点の輝度を測定する蛍光輝度測定方法であって、
前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射して蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得る第１の撮像工程と、
前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射することにより前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得る第２の撮像工程と、
該第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る抽出工程と、
該２値化画像をマスクとして前記第１の画像のうち、異物領域と重なった部分の画像を無効とする異物除去工程と、
を含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明による蛍光輝度測定装置は、略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点に励起光を照射して得られる蛍光像の輝度を測定する蛍光輝度測定装置であって、
光源と、
励起光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記蛍光物質の像を形成する為の結像手段と、
発生した蛍光の波長のみを選択する第２の波長選択手段と、
蛍光像を走査して画像を得る光電変換手段と、
該画像を記憶する記憶手段と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記記憶手段に記憶された前記第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る処理と、
前記２値化画像をマスクとして前記記憶手段に記憶された前記第１の画像のうち、前記異物領域と重なった部分の画像を無効とする処理と、
を行う画像処理手段と、
を具備することを特徴とする。
【００１０】
即ち、本発明の蛍光輝度測定方法及び装置によれば、標識蛍光物質を励起する波長の光を照射して第１の画像を得て、前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射して得た前記被測定物に付着した異物の画像から抽出した異物領域画像によってマスクを作成し、該マスクと前記第１の画像との論理積をとることにより、前記第１の画像から異物領域を除去するので、バイオチップに付着した異物からのノイズ光を除去することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１２】
［第１の実施の形態］
まず、本発明の第１の実施の形態に係る蛍光輝度測定方法及び装置を、図１乃至図９の（Ｂ）を用いて説明する。
【００１３】
なおここで、図１は、本第１の実施の形態において微小点の輝度を測定する際のデータ処理方法の概要図である。また、図２の（Ａ）は、本実施の形態に係る蛍光輝度測定装置の概要を示す構成図であり、図２の（Ｂ）は、バイオチップのフォーマットを示す概要図である。図３の（Ａ）は、バイオチップに用いる蛍光物質の吸収波長と、蛍光波長の相対強度の分光特性の一例を示したものであり、図３の（Ｂ）は、蛍光測定用フィルタユニットの分光透過率特性、図３の（Ｃ）は、異物画像撮影用フィルタユニットの分光透過率特性を示したものである。図４の（Ａ）は、１つの微小点に対する分割画像を示す図であり、図４の（Ｂ）は、図４の（Ａ）に表示されている線分ＡＢ上のＣＣＤからの出力信号を示す図である。図５の（Ａ）は、異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する輝度信号Ｓを表す図であり、図５の（Ｂ）は、最大輝度Ｓｍａｘの１／２を閾値としたときの２値化結果を示す図である。図６の（Ａ）は、レファレンス画像の輝度分布特性を示す図である。また、図６の（Ｂ）は、２種類の異物が混在する場合の適切なる閾値の設定方法を説明するためのもので、横軸を均等分割した微分信号Ｓ”の代表値、縦軸をこの微分信号Ｓ”に該当する画素の総数とする度数分布図である。図７の（Ａ）は、図５の（Ａ）の輝度信号にレファレンス輝度信号ＳＲに対する最大輝度信号ＳＲｍａｘの比ＳＲｍａｘ／ＳＲを乗じた値を輝度信号Ｓ’とした場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する輝度信号Ｓ’を表す図であり、図７の（Ｂ）は、最大値Ｓｍａｘ’の１／２を閾値としたときの２値化結果を示す図である。また、図８の（Ａ）は、一次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図であり、図８の（Ｂ）は、二次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図である。そして、図９の（Ａ）は、微分信号を別な手法により求めたときの一次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図であり、図９の（Ｂ）は、同様に微分信号を別な手法により求めたときの二次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図である。
【００１４】
即ち、図２の（Ａ）に示すように、本実施の形態に係る蛍光輝度測定装置においては、照明ユニット１は、水銀ランプ等の光源２を有し、この光源２から投射された光束は、コレクタレンズ３で集光され、開口絞り４及び視野絞り５で絞られた後、レンズ６を介してフィルタセット７に入射されるように構成されている。
【００１５】
また、本実施の形態においては、図３の（Ａ）に示すような特性を有する蛍光物質を標識物質として使用する。即ち、同図中、参照番号２６で示すような吸収スペクトルと、該吸収スペクトル２６よりも長波長の発光スペクトル２７を有するものである。
【００１６】
蛍光測定用フィルタセット７は、図３の（Ｂ）に示したように、標識物質として用いた図３の（Ａ）に示した特性を有する蛍光物質が励起される光の波長を選択的に透過する分光透過率特性２８を有する波長選択フィルタ８（以下、励起フィルタと表記する）と、該励起フィルタ８で透過した波長の光を反射し且つバイオチップ上の微小点の標識蛍光物質から発生した蛍光の波長だけを一定の波長帯域で透過する分光特性２９を有するダイクロイックミラー９と、バイオチップ上の微小点の標識蛍光物質から発生した蛍光の波長のみを選択的に透過し且つ不要波長成分を吸収する分光透過率特性３０を有する波長選択フィルタ１０（以下、吸収フィルタと表記する）と、で構成されている。
【００１７】
また、異物画像撮影用フィルタセット１１は、図３の（Ｃ）に示したような、標識物質として用いた蛍光物質が励起されず、バイオチップ上の異物で反射もしくは異物が蛍光を発する波長の光を選択的に透過する分光透過率特性３１を有する波長選択フィルタ１２と、該波長選択フィルタ１２で透過した光を反射し、バイオチップ上の異物で発生した蛍光又は異物で反射した光を透過する分光特性３２を有するダイクロイックミラー１３と、発生した異物からの蛍光または異物で反射した光の波長のみを選択的に透過する分光特性３３を有するフィルタ１４と、から構成されている。
【００１８】
これらのフィルタセット７，１１は、フィルタセット取付部材１５に取り付けられ、一方のフィルタセットが照明光軸と観察光軸の交点とダイクロイックミラー９，１３が一致するように配置され、後述するようなフィルタセット制御手段２０からの切換え信号に基づき、フィルタセット切替機構１６により、切替えられるように構成されている。
【００１９】
バイオチップ２４は、図２の（Ｂ）に示すように、例えば、１０ｍｍ×２０ｍｍの方形のガラス板で作られており、その表面には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）やローダミン等の蛍光物質により標識したＤＮＡや蛋白質などの被検体が、例えば直径が５０μｍの微小な略円形の微小点２５として、例えば１００μｍの間隔で格子状に配列してあるものである。さらに、微小点を形成してある領域を認識する目的で、標識に用いた蛍光物質を位置検出用微小点３５として、隅部に４つ形成してある。また、このバイオチップ２４は、図示しない２軸（ＸＹ）ステージ上に設置され、水平面内で移動することができるようになっており、対物レンズ３４の視野内に位置決めできるようになっている。
【００２０】
対物レンズ３４は、バイオチップ２４の上方に、その作動距離だけ離れて設置してあり、バイオチップ２４を励起照明して発生した蛍光が、この対物レンズ３４を通して集光され、結像レンズ１７を通して光電変換素子としてのＣＣＤ素子１８上に前記バイオチップ２４の像を形成するように、観察光路を形成している。このような装置の一例として、一般の落射蛍光顕微鏡を用いることができる。なお、本実施の形態では、照明方法として同軸落射照明を採用しているが、観察光路を外れて偏斜照明とすることもでき、また、照明光を輪帯として、暗視野落射照明とすることもできる。
【００２１】
ＣＣＤ素子１８は、バイオチップ２４の蛍光像を電気的に走査してアナログ画像信号を出力するものである。制御手段２３は、このアナログ信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器１９と、画像メモリ２１とを有し、さらに、画像の２値化機能、複数の画像間の論理積を行う機能、任意領域の面積を測定する機能、任意領域内の輝度値を積算する機能、を有する画像処理手段２２と、四則演算を行う演算手段４２と、フィルタセット制御手段２０と、から構成されている。
【００２２】
次に、図２の（Ａ）及び図４の（Ｂ）を用いて、本実施の形態の作用を説明する。
【００２３】
まず、バイオチップ２４上の４つの位置決め用微小点３５で規定されている測定範囲が観察光学系の像倍率とＣＣＤ素子１８の受光面サイズにより決定される視野範囲と一致するように、図示しない２軸ステージによりバイオチップ２４を位置決めする。次いで、フィルタセット切替機構１６により、バイオチップ２４上の微小点２５の蛍光画像を撮影するように、蛍光測定用フィルタセット７が撮影位置に位置決めされる。
【００２４】
一方、光源２から発した光束は、コレクタレンズ３によって集光され、開口絞り４及び視野絞り５で絞られた後、レンズ６を介して蛍光測定用フィルタセット７に導かれる。この蛍光測定用フィルタセット７に導かれた光は、標識蛍光物質の吸収波長域２６に一致する分光透過特性２８を有する励起フィルタ８によって特定の半値巾を持つ波長の光束となる（以下、励起光と称する）。ダイクロイックミラー９が分光特性２９を有しているので、この光束は、ダイクロイックミラー９によって反射され、対物レンズ３４を通してバイオチップ２４上に照射される。この時、バイオチップ２４上の微小点２５として配列された蛍光物質は、その物性及び環境により決定する励起光よりも長い波長を有する蛍光を発する。各々の微小点２５を発した蛍光は、対物レンズ３４によって集光され、ここで発生した蛍光は、ダイクロイックミラー９の透過波長域であるので蛍光測定用フィルタセット７のダイクロイックミラー９を透過し、さらに吸収フィルタ１０を透過して、ＣＣＤ素子１８上に微小点２５の像を形成する。
【００２５】
この後、ＣＣＤ素子１８上の微小点２５の像をＣＣＤ素子１８により電気的に走査して、アナログ電気信号に変換する。このアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器１９によりデジタル信号に変換され、図１に示す微小点の蛍光画像１０１として画像メモリ２１に記憶される。
【００２６】
次に、フィルタセット切替機構１６により、蛍光測定用フィルタセット７から異物画像撮影用フィルタセット１１に切替えて、蛍光物質が励起されない光の波長の照明光をバイオチップ２４に与え、上記ステップと同様の操作にて図１に示す異物画像１０２を画像メモリ２１に記憶させる。このとき、微小点２５の標識蛍光物質は励起されないので、異物画像１０２には微小点２５の像は含まれない。
【００２７】
次に、異物画像１０２から異物領域を抽出するため、画像処理手段２２により、この異物画像１０２に対して２値化処理を行う。このとき、一般に、均一輝度の物体を無収差レンズでγ値が「１」の受光素子上に結像した場合、得られた画像の最大輝度の１／２を閾値として２値化した時の境界が、主光線と最適像面との交点と考えられ、得られた２値化領域を異物の外形として採用できる。
【００２８】
ただし、バイオチップ２４上に照射される励起光に空間的なむらが存在する場合、異物が発する蛍光の輝度にも空間的なむらが生じてしまう。そして、一律に最大輝度の１／２を閾値とすれば、同一の異物が複数存在すると仮定しても、励起光の空間的なむらに起因して一部の異物が異物として認識されないということが生じ得る。
【００２９】
この現象について、図５の（Ａ）及び（Ｂ）を用いて詳細に説明する。図５の（Ａ）は、異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する輝度信号Ｓを表す図である。図に示すように、励起光に空間的なむらが存在する場合、同一特性の異物が複数個（図ではＡ、Ｂ及びＣの３個とした）存在する時に、同一の輝度信号が得られない。今、異物Ａが最も大きな輝度信号とし、これをＳｍａｘとし、異物Ｂ及び異物Ｃの輝度信号をそれぞれＳ１及びＳ２とし、Ｓｍａｘ／２＜Ｓ１＜Ｓｍａｘ、Ｓ２＜Ｓｍａｘ／２の場合には、一律に最大輝度の１／２を閾値とすれば、図５の（Ｂ）に示すように、異物Ａのみが、２値化した時の境界が主光線と最適像面との交点に一致することになり、正確な領域を示すが、異物Ｂにおいては、正確な領域よりも小さくなってしまう。さらに、異物Ｃにおいては、全く認識されないことになる。
【００３０】
次に、この欠点を除去する方法について説明する。
その第一の方法は、励起光のむらを測定し、これにより補正する方法である。このために、均一な反射率又は発光率を有する平面板の画像（レファレンス画像）を、例えば図６の（Ａ）に示すような輝度分布特性として撮り込む（実際には二次元の輝度分布であるが、ここでは便宜上一次元で表示してある）。なお、図６の（Ａ）において、縦軸はレファレンス輝度信号ＳＲとし、その最大値を最大輝度信号ＳＲｍａｘとする。次に、図５の（Ａ）に示す如く得られた輝度信号ＳにＳＲｍａｘ／ＳＲを乗じた値を輝度信号Ｓ’とすれば、図７の（Ａ）に示す如く３個の異物の輝度信号Ｓ’は等しくなる。従って、輝度信号Ｓを用いる代りに、この輝度信号Ｓ’の最大値Ｓｍａｘ’の１／２を閾値とすれば、図７の（Ｂ）に示す如く３個とも同様に、２値化した時の境界が、主光線と最適像面との交点に一致することになり、正確な領域を示す。以上は、異物以外の輝度を０として説明したが、迷光や受光素子の暗電流などによりノイズが混入することが有るので、さらに望ましくは、閾値を（Ｓｍｉｎ’＋Ｓｍａｘ’）／２とする方が良い。ここでＳｍｉｎ’は輝度信号Ｓ’の最小値である。
【００３１】
次に、同じくこの欠点を除去する第二の方法について説明する。この方法は、上述の第一の方法と異なり、レファレンス画像を不要とする方法である。
【００３２】
即ち、今、輝度信号Ｓをｆ（ｉ，ｊ）で表し、式
【数１】
0003576523.tif 000002
を用いて微分信号Ｓ”を求めるものとする。ここで（ｉ，ｊ）を中心とするｉ方向及びｊ方向の近傍（隣接画素に限定しない）は、それぞれ［−ｍ１，ｍ２］及び［−ｎ１，ｎ２］で表される。また、Ｃ０，ｍ，ｎは平均オペレータであり、通常は
【数２】
0003576523.tif 000003
が与えられる。さらにｇ（ｉ，ｊ）は微分画像を表し、
【数３】
0003576523.tif 000004
又は、
【数４】
0003576523.tif 000005
で表される。ここで、Ｃ１，ｍ，ｎ及びＣ２，ｍ，ｎは微分オペレータであり、例えば一次微分オペレータとしては、
【数５】
0003576523.tif 000006
又は、
【数６】
0003576523.tif 000007
が多く用いられ、二次微分オペレータとしては、ラプラシアンフィルタとして知られる、
【数７】
0003576523.tif 000008
が多く用いられる。
【００３３】
このようにして求められた微分信号Ｓ”は、一次微分オペレータを用いる場合は図８の（Ａ）に示す如く３個とも同一の微分信号となり、異物の輪郭線は最大微分信号Ｓｍａｘ”で一定幅の線となる。この幅の中心を結ぶ線が実際の異物輪郭線となる。また、二次微分オペレータを用いる場合は図８の（Ｂ）に示す如く、３個とも同一の微分信号となり、微分信号Ｓ”の正負が反転する点で結ばれる線が異物輪郭線となる。
【００３４】
なお、これまでは何れの場合も便宜上、輝度信号Ｓの境界付近の傾きが一定として説明したが、実際にはこの傾きは一定ではなく、そのため図８の（Ａ）及び図８の（Ｂ）の微分信号Ｓ”のパターンは矩形分布でなく、正規分布に近いパターンとなるので、閾値を用いて処理された信号を用いて異物領域を決定するか、又は微分信号Ｓ”のピーク点を用いて異物領域を決定することが望ましい。ただし、前者の場合は、原理上必ずしも閾値を最大微分信号Ｓｍａｘ”の１／２とする必要はない。また、後者の場合は、微分信号Ｓ”を求める式を前述の式ではなく、単に式
Ｓ”＝ｇ（ｉ，ｊ）
としても十分である。即ち、図９の（Ａ）及び（Ｂ）に示す如くである。図９の（Ａ）においては、Ｓ”の極大値に対応する点で形成される領域を異物領域とし、図９の（Ｂ）においては、Ｓ”の極大値に対応する点と極小値に対応する点との中央点で形成される領域を異物領域とするものである。
【００３５】
次に、前者の場合のさらに適切なる閾値の設定方法について説明する。
即ち、これまでは、１種類の同一の異物について説明してきたが、実際には複数種類の異物が存在する。今、異物１及び異物２が混在する場合の適切なる閾値の設定方法について説明する。図６の（Ｂ）は、横軸を均等分割した微分信号Ｓ”の代表値、縦軸をこの微分信号Ｓ”に該当する画素の総数（以後、度数と称する）とする度数分布図である。同図に示すように、微分信号Ｓ”の小さいゾーンにノイズが集中的に現れ、異物１及び異物２はそれらの特性に応じて固有のゾーンに散発的に現れる。従って、この度数分布図を用いて閾値を設定することができる。即ち、図示の閾値１を採用すれば異物１及び異物２の輪郭線を得ることができ、図示の閾値２を採用すれば異物２のみの輪郭線を得ることができる。さらに、閾値１及び閾値２を採用すれば異物１のみの輪郭線を得ることができる。
【００３６】
最後に、画像処理手段２２により異物の輪郭線とその内部を例えば０または−１、他の部分を１としたものを異物領域画像１０３として画像メモリ２１に記憶する。
【００３７】
さらに、微小点２５の蛍光画像１０１に対して、この異物領域画像１０３をマスクとして、画像処理手段２２により２つの画像間の積をとり、異物領域を除去した微小点２５の蛍光画像１０４を得る。即ち、０又は−１の値の領域が異物領域として認識できる蛍光画像１０４を得ることができる。
【００３８】
また、ここでは２値化処理により得られた領域を直接、異物領域として採用して、微小点２５の蛍光画像１０１から除去するようにしているが、２値化して得られた異物領域に対して、回折像の中心から二次の回折ピークと三次の回折ピークとの間の谷までの距離（回折によるボケ量、以下の（１）式の右辺第１項）と、フォーカシング誤差を考慮した時の最大ボケ量（（１）式の右辺第２項）との和として、光学的なボケの量を以下の（１）式で与え、この量だけ異物領域を膨脹させ、微小点の蛍光画像から除去するようにしても良い。但し、βは光学系の像倍率、λは異物の像を形成する光の波長、αは対物レンズ３４のバイオチップ側の開口数、Δはデフォーカス量である。
【００３９】
【数８】
0003576523.tif 000009
【００４０】
次に、バイオチップ２４上に形成した位置検出用微小点３５を検出して、４つの位置検出用微小点３５の重心位置、又は位置検出用微小点３５の２値化画像の図心位置を求め、この座標とバイオチップ２４の配列情報から、前記微小点の蛍光画像１０４を、参照番号１０５で示したように、各々の微小点単位に分割する。
【００４１】
そして、次の手順で、各微小点２５に対する測定領域を設定する。
【００４２】
即ち、異物領域を除去した微小点毎の分割画像１０６、１０７に対して、分割画像内の最大輝度の１／２又は最大輝度と最小輝度の平均値を閾値として２値化処理を行い、２値化領域の最大Ｘ座標、最小Ｘ座標、最大Ｙ座標、及び最小Ｙ座標を求め、それぞれｘｍａｘ、ｘｍｉｎ、ｙｍａｘ、ｙｍｉｎとする。これらの座標を元に、測定領域及びノイズサンプリング領域を決定する為の矩形領域を与える２つの座標を図４の（Ａ）に示すように（ｘｍｉｎ’，ｙｍｉｎ’）及び（ｘｍａｘ’，ｙｍａｘ’）として、以下の式で与える。
【００４３】
ｘｍｉｎ’＝ｘｍｉｎ−δ                                  …（２）
ｙｍｉｎ’＝ｙｍｉｎ−δ                                  …（３）
ｘｍａｘ’＝ｘｍａｘ＋δ                                  …（４）
ｙｍａｘ’＝ｙｍａｘ＋δ                                  …（５）
なお、ここでは、測定領域として矩形領域を考えたが、前記２値化領域に対して上記（１）式で決まる量だけ、領域の形状を保ったまま膨脹させた領域を採用しても良い。
【００４４】
次に、前記２値化領域に相当する物体としての微小点の実面積を、画素数と光学系の倍率から計算し、これをＤとする。ここで、バイオチップ２４を作成する際に設定した、微小点の標準面積Ｄ０と測定した微小点の面積Ｄとから、以下の（６）式を計算する。
【００４５】
σ＝Ｄ０／Ｄ                                          …（６）
このとき、分割画像１０６に示したように微小点２５が異物で覆われていない場合は、
【数９】
0003576523.tif 000010
となるが、分割画像１０７に示したように微小点が異物で覆われている場合には、σ＞＞１となる。このσを用いて、例えばσ＜１０の場合にだけ輝度測定を実施し、これに合致しない場合には、異物や、微小点そのものの欠陥として、その微小点に関するデータは信頼性がないものと判定する。
【００４６】
次に分割画像１０６に対して以下の処理を行う。
【００４７】
即ち、ＣＣＤ素子１８から得られる画像信号には、通常、ノイズが含まれる。このノイズ成分は、装置構成や測定環境に依存するが、一般的には、励起光の基板（バイオチップ２４）での反射光、励起光による基板の自家発光に基づく励起光ノイズ（励起光に起因するノイズ）が支配的であり、時には迷光ノイズ（励起光以外の光源に起因するノイズ）も無視できない。なお、図４の（Ａ）及び（Ｂ）は、説明し易いようにモデル化して表現してあるが、実際には検出されるべき信号及びノイズ信号は平坦ではなく、位置によりむらがある。特に、前述の励起光ノイズは照明むらを反映するので、ノイズ成分のむらの最大原因となる。
【００４８】
そこで、本実施の形態においては、分割画像領域内であり且つ測定領域外の領域をノイズサンプリング領域として、ノイズサンプリング領域内の信号の総和をノイズサンプリング領域の面積で除することで求められるの平均ノイズ信号を、測定領域内の画素に対する信号から減算する。
【００４９】
次に、差し引かれて得られた検出信号の測定領域内での総和を微小点の信号強度Ｐ０とする。さらに、微小点の信号強度Ｐ０を微小点の実面積で補正して（正規化処理）、微小点の輝度測定値Ｐとし、次の（７）式によりこのＰを求める。なおここで、Ｄ０は微小点の標準面積、Ｄは先に計算された各微小点の２値化画像から求めた実面積である。
【００５０】
Ｐ＝（Ｄ０／Ｄ）Ｐ０                                  …（７）
この補正即ち正規化処理により、微小点形成誤差によるノイズ、また、異物により微小点２５の一部が隠れた場合の誤差を除去することができる。
【００５１】
なお、本実施の形態のようなＣＣＤ素子１８等を用いた電気的な走査によってバイオチップ２４の像を一括して撮像し、画像メモリに記憶するようにしているが、これに限らず、従来のように機械的な走査を行ってバイオチップ２４の像を分割して撮像し、画像メモリ上でバイオチップ２４の全体像を得るようにしても良いことは勿論である。さらに、両者を組み合わせることで、ＣＣＤ素子１８では一度に全体を撮像できないような大きなバイオチップを使用することも可能となる。
【００５２】
また、この実施の形態には、本発明の効果のほかに、次のような特有の効果がある。
【００５３】
即ち、ＣＣＤ素子１８を用いている為、バイオチップ２４の像を一括して処理することができ、測定時間の短縮を図ることができる。また、一方で、露出時間を長く取ることも可能である為、輝度の測定感度の点でも有利である。なお、本実施の形態における各構成は、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、画像処理装置はパーソナルコンピュータとすることができ、ＣＣＤ素子１８にはペルチェ素子等で冷却されているタイプの冷却ＣＣＤを用いることができる。
【００５４】
また、異物領域を膨脹させて微小点の蛍光画像から除去すれば、光学系の焦点合わせに関わる誤差を吸収することができ、微小点の蛍光画像から異物のノイズ光の影響をさらに低下させることができる。
【００５５】
さらに、本実施形態においては、検出されるべき信号のむらにより２値化領域が図示のような円形でない場合、又は１つの分割画像に複数の２値化領域が存在する場合でも、（ｘｍｉｎ’，ｙｍｉｎ’）及び（ｘｍａｘ’，ｙｍａｘ’）で定まる矩形領域を測定領域とすることで、この測定領域内に検出されるべき全ての信号が含まれることが保証される。
【００５６】
また、微小点近傍でノイズサンプリング領域を設定して、微小点からの信号強度を補正しているので、検出されるべき信号の検出精度が向上する。しかも、前述の如くデフォーカスを考慮して測定領域を設定してあるので、デフォーカスノイズが発生しないことも明らかである。
【００５７】
［第２の実施の形態］
次に、本発明の第２の実施の形態に係る蛍光輝度測定方法及び装置を、図１０の（Ａ）乃至図１１を用いて説明する。
【００５８】
なおここで、図１０の（Ａ）は、本第２の実施の形態に係る蛍光輝度測定装置の概要を示す構成図であり、図１０の（Ｂ）は、レファレンスチップの概要図である。また、図１１は、本実施の形態による測定方法を示すフローチャートである。
【００５９】
本実施の形態においては、図１０の（Ａ）に示すように、ＣＣＤ素子１８に入射する光量を調整する目的で、結像レンズ１７とＣＣＤ素子１８の間の光路上に、それぞれ既知の透過率を有する複数のＮＤフィルタ３９を選択的に挿入する構成としている。即ち、ＮＤフィルタ３９は、フィルタ保持手段４０に複数取り付けられており、ＮＤフィルタ制御手段３８からの司令に基づき、ＮＤフィルタ切替手段４１により、光路に挿入される透過率の異なるＮＤフィルタが切替えられるようになっている。
【００６０】
また、本実施の形態においては、図２の（Ｂ）に示すバイオチップ２４に加えて、図１０の（Ｂ）に示すレファレンスチップ３６も用いるものである。ここで、レファレンスチップ３６は、平面ガラス等の基板に蛍光標識として使用する蛍光物質を、上記バイオチップ２４の微小点２５と同一の位置に既知の蛍光分子数を有する参照微小点３７と、バイオチップ２４と同様に微小点群の４隅に標識と同一の蛍光分子をそれぞれ位置検出用微小点３５として転着してある。
【００６１】
なお、転着の方法は、使用する蛍光分子の重量とその分子量から使用する蛍光分子数を特定し、この蛍光分子数の蛍光分子の溶液を既定量となるように作り、この溶液を一定量だけインクジェット方式により基板上に吐出するものである。また、ピンに溶液を付着させて基板に接触させるような方法によっても良い。なお、参照微小点１つ当たりの蛍光分子数はこれらの諸量（溶液量及び溶液中の蛍光分子数）と溶液の吐出量から計算して求められる。また、蛍光分子の保持方法として固相化試薬を用いると確実な保持が可能であるが、必ずしも必要としない。
【００６２】
このレファレンスチップ３６は、図１０の（Ａ）に示したように図示しない２軸ステージ上に上記バイオチップ２４と同一の平面内に設置されており、２軸ステージにより、光学系の視野内に位置決めできるようになっている。
【００６３】
その他の構成は、前述の第１の実施の形態と同一であるので、説明を省略する。
【００６４】
次に、かかる構成の蛍光輝度測定装置を用いた測定方法を、図１１のフローチャートを用いて説明する。
【００６５】
まず、レファレンスチップ３６を対物レンズ３４の視野と一致するように位置決めする（ステップＳ１）。
【００６６】
即ち、レファレンスチップ３６上の４つの位置決め用微小点３５で規定されている測定範囲が観察光学系の像倍率とＣＣＤ素子１８の受光面サイズとにより決定される視野範囲内に包含されるように、図示しない２軸ステージによりレファレンスチップ３６を位置決めする。
【００６７】
次に、蛍光測定用フィルタセット７を撮影位置に位置決めする（ステップＳ２）。
【００６８】
即ち、フィルタセット切替機構１６により、レファレンスチップ３６上の参照微小点３７の蛍光画像を撮影するように、蛍光測定用フィルタセット７を撮影位置に位置決めする。
【００６９】
次に、ＮＤフィルタ３９を切替えながらレファレンスチップ３６の蛍光画像をＣＣＤ素子１８で撮影する（ステップＳ３）。
【００７０】
即ち、レファレンスチップ３６を励起照明して参照微小点３７内の蛍光分子が発生する蛍光の画像を複数枚のＮＤフィルタ３９を切替えながら撮り込む。なお、本実施の形態において、受光素子としてＣＣＤ素子１８を用いているが、ＣＣＤ素子に特定するものではなく、他のエリアセンサでも構わない。従って、以下に記述される「ＣＣＤ素子」はエリアセンサでも通用するものである。
【００７１】
次に、ＮＤフィルタ３９を切替えながらレファレンスチップ３６のバックグラウンド画像をＣＣＤ素子１８で撮影する（ステップＳ４）。
【００７２】
即ち、レファレンスチップ３６の蛍光画像を撮り込んだ直後に励起照明を遮断して、バックグラウンド画像を撮り込む。このバックグラウンド画像は、検出強度に不要な暗電流及び迷光により構成される。
【００７３】
次に、レファレンスチップ３６を視野から外し、バイオチップ２４を視野内に位置決めする（ステップＳ５）。
【００７４】
即ち、バイオチップ２４上の４つの位置決め用微小点３５がレファレンスチップ３６の位置決め用微小点３５の位置と略一致するように、図示しない２軸ステージによりバイオチップ２４を位置決めする。
【００７５】
次に、ＮＤフィルタ３９を切替えながら、バイオチップ２４の蛍光画像をＣＣＤ素子１８で撮影する（ステップＳ６）。
【００７６】
即ち、バイオチップ２４を励起照明して各微小点内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤ素子１８で撮り込む。この際、複数枚のＮＤフィルタ３９を切替えながら蛍光画像を撮り込む。
【００７７】
次に、ＮＤフィルタ３９を切替えながら、バイオチップ２４のバックグラウンド画像をＣＣＤ素子１８で撮影する（ステップＳ７）。
【００７８】
即ち、バイオチップ２４の蛍光画像を撮り込んだ直後に励起照明を遮断して、バックグラウンド画像を撮り込む。このバックグラウンド画像は、レファレンスチップ３６のバックグラウンド画像と同様に、検出強度に不要な暗電流及び迷光により構成される。
【００７９】
次に、異物画像撮影用フィルタセット１１に切替える（ステップＳ８）。
【００８０】
即ち、フィルタセット切替機構１６により、バイオチップ２４上の異物の画像を撮影するように、異物画像撮影用フィルタセット１１を撮影位置に位置決めする。
【００８１】
その後、バイオチップ上の異物の画像を撮影する（ステップＳ９）。
【００８２】
即ち、バイオチップ２４上の異物を標識蛍光物質が励起されない波長の光で照明して、異物が発生する蛍光（自家蛍光）または反射光により、異物の画像をＣＣＤ素子１８で撮り込む。
【００８３】
そして、異物画像を２値化する（ステップＳ１０）。
【００８４】
即ち、撮影した異物画像またはこれの微分画像を特定の閾値で２値化して異物領域を特定し、この画像を２値化異物画像とする。
【００８５】
次に、レファレンスチップ３６とバイオチップ２４の蛍光画像から各々のバックグラウンド画像を差し引き、補正画像とする（ステップＳ１１）。
【００８６】
即ち、一般的に受光素子の出力には暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズが含まれる。この直流ノイズを除去する為にレファレンスチップ３６及びバイオチップ２４について各々蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き、これを補正画像と称し以後の処理の対象とする。これをＮＤフィルタ別に行う。
【００８７】
その後、各補正画像中の位置検出用微小点に対応する画像の重心位置を検出する（ステップＳ１２）。
【００８８】
即ち、レファレンスチップ３６及びバイオチップ２４に形成される微小点２５及び参照微小点３７は、図２の（Ｂ）及び図１０の（Ｂ）に示すように、２次元に配列されており、共に４隅に位置する４個の微小点が位置検出用微小点３５として用いられる。位置検出用微小点３５は位置信号を出す為のものであるから、その要素内の物質は発光物質又は反射物質であれば何でも良いことになるが、標識として使用される蛍光物質の蛍光波長とは異なる蛍光波長の蛍光物質を用いるほうが好ましい。この理由は、位置検出用微小点３５から発生する蛍光がノイズとして作用する可能性を無くすことができるからである。この場合には、位置検出用微小点３５に特有の励起波長で照明して位置検出をすることになる。位置検出には、４個の位置検出用微小点３５それぞれの重心座標を位置座標とする方法や、補正画像を最大強度の１／２のレベルで２値化して４個の図心を位置座表とする方法などを採用する。
【００８９】
そして、各補正画像を回転移動して、ＮＤフィルタ別の回転画像とする（ステップＳ１３）。
【００９０】
即ち、レファレンスチップ３６及びバイオチップ２４について各々得られた４つの位置検出用微小点３５の位置座標で形成される４辺形が最小偏差で矩形となるように位置座標を修正してから、この矩形の各辺が画像の座標軸と平行となるように画像中心を回転中心として補正画像を回転移動する。移動後の画像を回転画像と呼ぶ。この時、２値化異物画像についてもバイオチップ２４と同じ量だけ回転移動させる。
【００９１】
次に、バイオチップ２４の蛍光画像に対して、２値化異物画像をマスクとして異物領域に一致する蛍光画像の輝度情報を無効にする（ステップＳ１４）。
【００９２】
即ち、画像処理手段２２により２値化異物画像として得られた画像とバイオチップ２４の蛍光画像との論理積を行い、２値化異物領域と一致するバイオチップ２４の蛍光画像の画素の輝度データを「０」にする。
【００９３】
その後、各回転画像を参照微小点３７及び微小点２５毎の画像に分割し、各々、ＮＤフィルタ別、及び微小点別の分割画像とする（ステップＳ１５）。
【００９４】
即ち、レファレンスチップ３６及びバイオチップ２４の各回転画像に関する位置決め用微小点４個の位置座標と参照微小点３７及び微小点２５の配列条件とから分割条件を決定して、この分割条件ですべての回転画像を参照微小点３７又は微小点２５毎の画像に分割し分割画像とする。
【００９５】
そして、最適なＮＤフィルタ３９に対応する各分割画像を要素別の測定用画像として抽出する（ステップＳ１６）。
【００９６】
即ち、レファレンスチップ３６上の同一位置の参照微小点３７に対するＮＤフィルタ枚数分のレファレンス分割画像の中から最大信号強度がＣＣＤ素子１８のダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で強度信号が最大であるレファレンス分割画像を１個抽出し、これを測定用レファレンス画像と呼ぶ。同様に、バイオチップ２４上の同一位置の微小点２５に対するＮＤフィルタ枚数分の分割画像の中から最大信号強度がＣＣＤ素子１８のダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大である分割画像を１個抽出し、これを測定用サンプル画像と呼ぶ。測定用レファレンス画像及び測定用サンプル画像は、各々撮影時に使用したＮＤフィルタ３９の透過率Ｔｋが大きなものから順次、補正輝度Ｒｋ（＝分割画像中の最大強度×撮影に使用したＮＤフィルタ３９の透過率）を求める。ここでｋは透過率の大きな順にＮＤフィルタに付与した番号である（ｋ＝１〜ｎ）。このＲｋの変化率（＝（Ｐｋ＋ｌ／Ｔｋ＋ｌ）−（Ｐｋ／Ｔｋ））が負の条件を満たした時にＮＤフィルタ番号ｋに対応する画像を抽出する。
【００９７】
次に、上記抽出した各測定用画像を２値化し、要素別の２値化画像とする（ステップＳ１７）。
【００９８】
即ち、測定用レファレンス画像及び測定用サンプル画像の全てについて、各々の画像における最大信号と最小信号の平均値を閾値として２値化し、これらを各々レファレンス２値化画像及びサンプル２値化画像とする。ここで、サンプル２値化画像については２値化領域の面積Ｄを計算する。
【００９９】
その後、各２値化画像により測定領域及びノイズサンプリング領域を設定する（ステップＳ１８）。
【０１００】
即ち、レファレンス２値化画像のすべてについて、各々の最大Ｘ座標ｘＲｍａｘ、最小Ｘ座標ｘＲｍｉｎ、最大Ｙ座標ｙＲｍａｘ、最小Ｙ座標ｙＲｍｉｎを求める。同様に、サンプル２値化画像の全てについて、各々の最大Ｘ座標ｘＳｍａｘ、最小Ｘ座標ｘＳｍｉｎ、最大Ｙ座標ｙＳｍａｘ、最小Ｙ座標ｙＳｍｉｎを求めてから、ノイズのサンプリング領域を設定するための座標ｘＲｍａｘ’、ｘＲｍｉｎ’、ｙＲｍａｘ’、ｙＲｍｉｎ’、ｘＳｍａｘ’、ｘＳｍｉｎ’、ｙＳｍａｘ’、及びｙＳｍｉｎ’を次式により算出する。
【０１０１】
ｘｍｉｎ’＝ｘｍｉｎ−δ                                  …（８）
ｙｍｉｎ’＝ｙｍｉｎ−δ                                  …（９）
ｘｍａｘ’＝ｘｍａｘ＋δ                                  …（１０）
ｙｍａｘ’＝ｙｍａｘ＋δ                                  …（１１）
但し、δは光学系のボケ量を与える量であり次式で与えられる。
【０１０２】
【数１０】
0003576523.tif 000011
なお、βは光学系の像倍率、λは微小点２５及び参照微小点３７の像を形成する光の波長、αは対物レンズ３４のバイオチップ側の開口数、Δはデフォーカス量である。
【０１０３】
ここで算出した点（ｘＲｍｉｎ’，ｙＲｍｉｎ’）及び点（ｘＲｍａｘ’，ｙＲｍａｘ’）で定まる矩形内を測定用レファレンス画像の測定領域とし、該矩形外を測定用レファレンス画像のノイズサンプリング領域とする。同様に、点（ｘＳｍｉｎ’，ｙＳｍｉｎ’）及び点（ｘＳｍａｘ’，ｙＳｍａｘ’）で定まる矩形内を測定用サンプル画像の測定領域とし、該矩形外を測定用サンプルのノイズサンプリング領域とする。
【０１０４】
次に、測定用画像上で測定領域の信号から平均ノイズ信号を差し引く（ステップＳ１９）。
【０１０５】
即ち、測定用レファレンス画像に設定したノイズサンプリング領域の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用レファレンス画像の測定領域の信号からこの信号を差し引いて測定用レファレンス画像の検出信号とする。同様に、測定用サンプル画像に設定したノイズサンプリング領域の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用サンプル画像の測定領域の信号からこの信号を差し引いて測定用サンプル画像の検出信号とする。
【０１０６】
そして、微小点２５の標準面積当たりの信号強度を算出する（ステップＳ２０）。
【０１０７】
即ち、各参照微小点３６に対応する測定用レファレンス画像の測定領域内における検出信号の総和を計算し、ＰＲとする。さらに、複数の微小点２５に対応する検出信号の総和ＰＲの最大値をＰＲｍａｘとする。また、各微小点２５に対応する測定用サンプル画像の測定領域内での検出信号の総和を算出しＰＤ０とする。次いで、微小点２５の標準面積当たりの信号強度ＰＤを以下の（１３）式を用いて算出する。これらの信号強度は励起光むら、励起光ノイズ及び微小点形成誤差により生じる強度誤差が除去された強度として得られる。
【０１０８】
【数１１】
0003576523.tif 000012
【０１０９】
以上のような本実施の形態によれば、バイオチップ２４の輝度測定に当たりレファレンスチップ３６を用いて励起光量の補正を行っているので、励起光の空間的、時間的な変動をキャンセルすることができる。
【０１１０】
以上実施の形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【０１１１】
ここで、本発明の要旨をまとめると以下のようになる。
【０１１２】
（１）  略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点の輝度を測定する蛍光輝度測定方法であって、
前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射して蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得る第１の撮像工程と、
前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射することにより前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得る第２の撮像工程と、
該第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る抽出工程と、
該２値化画像をマスクとして前記第１の画像のうち、異物領域と重なった部分の画像を無効とする異物除去工程と、
を含むことを特徴とする蛍光輝度測定方法。
【０１１３】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態及び第２の実施の形態が対応する。
【０１１４】
標識蛍光物質を励起する波長の光を照射して得た第１の画像を得て、前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射して得た前記被測定物に付着した異物の画像から抽出した異物領域画像によってマスクを作成し、該マスクと前記第１の画像との論理積をとることにより、前記第１の画像から異物領域を除去するので、バイオチップに付着した異物からのノイズ光を除去することができる。
【０１１５】
輝度測定の誤差を少なくできる。
【０１１６】
（２）  前記２値化画像の異物領域を一定量だけ膨脹させる膨張工程をさらに含むことを特徴とする（１）に記載の蛍光輝度測定方法。
【０１１７】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態及び第２の実施の形態が対応する。
【０１１８】
前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射して得た前記被測定物に付着した異物の画像を二値化処理して得られる異物領域に対して光学的なボケ量を考慮した距離だけ、異物領域を膨脹処理してマスクを作成し、該マスクと標識蛍光物質を励起する波長の励起光を照射して得た第一の画像と論理積をとる。
【０１１９】
異物領域を膨脹させているので、観察光学系の焦点合わせ精度が悪くても、測定誤差が大きくならない。
【０１２０】
（３）  測定された微小点の輝度を微小点の基準面積を用いて正規化する正規化工程をさらに含むことを特徴とする（１）又は（２）に記載の蛍光輝度測定方法。
【０１２１】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１２２】
微小点内の画素の輝度を積算して、微小点の基準面積により輝度測定値を正規化する。
【０１２３】
微小点の面積がばらついても、輝度測定値の誤差が小さくなる。
【０１２４】
（４）  前記異物除去工程後に各微小点の面積を求め、該面積と微小点の基準面積の比率によって、測定値の信頼性を判定する信頼性判定工程をさらに含むことを特徴とする（１）乃至（３）の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【０１２５】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１２６】
微小点の基準面積と実際の微小点の面積とから、基準面積に対する実面積の比率を計算して、予め設定した閾値と比較する。
【０１２７】
測定値の信頼性を定量的に判定できる。
【０１２８】
（５）  前記第２の画像をレファレンス画像により補正する補正工程をさらに有することを特徴とする（１）乃至（４）の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【０１２９】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１３０】
レファレンス画像により励起光のむらを測定し、これにより第２の画像を補正する。
【０１３１】
励起光に空間的なむらが有っても、全ての異物を正しく認識できるようになる。
【０１３２】
（６）  前記抽出工程は、前記第２の画像から得られる微分画像を用いて前記２値化画像を得ることを特徴とする（１）乃至（４）の何れかに記載の蛍光輝度測定方法。
【０１３３】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１３４】
第２の画像から得られる微分画像を用いて、該第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る。
【０１３５】
レファレンス画像を用いること無く、励起光に空間的なむらが有っても、全ての異物を正しく認識できるようになる。
【０１３６】
（７）  前記抽出工程は、前記２値化画像の２値化レベルを各画素に対応する微分信号の度数分布により定めることを特徴とする（６）に記載の蛍光輝度測定方法。
【０１３７】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１３８】
２値化のための閾値を、各画素に対応する微分信号の度数分布により定める。
【０１３９】
適切なる閾値の設定が行える。
【０１４０】
（８）  前記微分信号に対応する微小領域での強度で前記微分信号を規格化することを特徴とする（６）又は（７）に記載の蛍光輝度測定方法。
【０１４１】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１４２】
微分信号に対応する微小領域での強度で微分信号を規格化し、それに基づいて２値化のための閾値を設定する。
【０１４３】
さらに適切なる閾値の設定が行え、複数種類の異物を正しく認識できるようになる。
【０１４４】
（９）  略平面を有する基板上に配列された蛍光物質を含む微小点に励起光を照射して得られる蛍光像の輝度を測定する蛍光輝度測定装置であって、
光源と、
励起光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記蛍光物質の像を形成する為の結像手段と、
発生した蛍光の波長のみを選択する第２の波長選択手段と、
蛍光像を走査して画像を得る光電変換手段と、
該画像を記憶する記憶手段と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起できる波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、蛍光物質を含む微小点の画像を第１の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記第１の波長選択手段を制御して、前記光源からの光のうち前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射すると共に、前記第２の波長選択手段を制御して、前記光電変換手段により、前記基板上に付着した異物の画像を第２の画像として得て、前記記憶手段に記憶する処理と、
前記記憶手段に記憶された前記第２の画像から異物領域を抽出して２値化画像を得る処理と、
前記２値化画像をマスクとして前記記憶手段に記憶された前記第１の画像のうち、前記異物領域と重なった部分の画像を無効とする処理と、
を行う画像処理手段と、
を具備することを特徴とする蛍光輝度測定装置。
【０１４５】
この発明に関する実施の形態は、第１の実施の形態が対応する。
【０１４６】
標識蛍光物質を励起する波長の光を照射して得た第１の画像を得て、前記蛍光物質を励起しない波長の光を照射して得た前記被測定物に付着した異物の画像から抽出した異物領域画像によってマスクを作成し、該マスクと前記第１の画像との論理積をとることにより、前記第１の画像から異物領域を除去するので、バイオチップに付着した異物からのノイズ光を除去することができる。
【０１４７】
輝度測定の誤差を少なくできる。
【０１４８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、バイオチップ上の表面近傍に異物が存在した場合でも、測定誤差を少なくすることが可能であり、異物の存在を認識して輝度測定値の信頼性を定量的に判断することができる蛍光輝度測定方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態において微小点の輝度を測定する際のデータ処理方法の概要図である。
【図２】（Ａ）は第１の実施の形態に係る蛍光輝度測定装置の概要を示す構成図であり、（Ｂ）はバイオチップのフォーマットを示す概要図である。
【図３】（Ａ）はバイオチップに用いる蛍光物質の吸収波長と蛍光波長の相対強度との分光特性の一例を示した図、（Ｂ）は蛍光測定用フィルタユニットの分光透過率特性を示した図であり、（Ｃ）は異物画像撮影用フィルタユニットの分光透過率特性を示した図である。
【図４】（Ａ）は１つの微小点に対する分割画像を示す図であり、（Ｂ）は（Ａ）に表示されている線分ＡＢ上のＣＣＤからの出力信号を示す図である。
【図５】（Ａ）は異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する輝度信号Ｓを表す図であり、（Ｂ）は最大輝度Ｓｍａｘの１／２を閾値としたときの２値化結果を示す図である。
【図６】（Ａ）はレファレンス画像の輝度分布特性を示す図であり、（Ｂ）は２種類の異物が混在する場合の適切なる閾値の設定方法を説明するためのもので、横軸を均等分割した微分信号Ｓ”の代表値、縦軸をこの微分信号Ｓ”に該当する画素の総数とする度数分布図である。
【図７】（Ａ）は図５の（Ａ）の輝度信号にレファレンス輝度信号ＳＲに対する最大輝度信号ＳＲｍａｘの比ＳＲｍａｘ／ＳＲを乗じた値を輝度信号Ｓ’とした場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する輝度信号Ｓ’を表す図であり、（Ｂ）は最大値Ｓｍａｘ’の１／２を閾値としたときの２値化結果を示す図である。
【図８】（Ａ）は一次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図であり、（Ｂ）は二次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図である。
【図９】（Ａ）は微分信号を別な手法により求めたときの一次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図であり、（Ｂ）は同様に微分信号を別な手法により求めたときの二次微分オペレータを用いた場合の異物が存在するｙ方向の位置におけるｘ方向の画素位置に対する微分信号Ｓ”を表す図である。
【図１０】（Ａ）は本発明の第２の実施の形態に係る蛍光輝度測定装置の概要を示す構成図であり、（Ｂ）はレファレンスチップの概要図である。
【図１１】第２の実施の形態による測定方法を示すフローチャートである。
【図１２】従来の蛍光輝度測定装置の概略構成図である。
【符号の説明】
１      照明ユニット
７      蛍光測定用フィルタセット
８      波長選択フィルタ（励起フィルタ）
９，１３      ダイクロイックミラー
１０      波長選択フィルタ（吸収フィルタ）
１１      異物画像撮影用フィルタセット
１２      波長選択フィルタ
１４      フィルタ
１５      フィルタセット取付部材
１６      フィルタセット切替機構
１７      結像レンズ
１８      ＣＣＤ素子
１９      Ａ／Ｄ変換器
２０      フィルタセット制御手段
２１      画像メモリ
２２      画像処理手段
２３      制御手段
２４      バイオチップ
２５      微小点
３４      対物レンズ
３５      位置検出用微小点
３６      レファレンスチップ
３７      参照微小点
３８      ＮＤフィルタ制御手段
３９      ＮＤフィルタ
４０      フィルタ保持手段
４１      ＮＤフィルタ切替手段
４２      演算手段
１０１、１０４      蛍光画像
１０２      異物画像
１０３      異物領域画像
１０６、１０７      分割画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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