(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）被検体から採られた血液標本から血漿サンプルを調製する工程であって、該血漿サンプルは実質的に血小板を有さず、該血液標本に存在する血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する手順によって調製される、工程；および
（ｂ）該血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程、
を包含する、被検体中の卵巣ガンの存在を検出する方法。
【請求項２】
以下の工程：
（ａ）被検体から採られた血液標本から血漿サンプルを調製する工程であって、該血漿サンプルは該血液標本から：
以下の工程：
（ｉ）血球および血小板の第１のぺレットならびに第１の上清を得るために、
前記血液標本を400×ｇから1000×ｇの間の第１の速度で遠心分離する工程；
および
（ｉｉ）第２のぺレットならびに第２の上清を得るために、工程（ａ）の該第１
の上清を6500×ｇから10000×ｇの間の第２の速度で遠心分離する工程；
（ｉｉｉ）該血漿サンプルを提供するために、工程（ｂ）から該第２の上清を収  集する工程
を包含するプロセスによって調製される、工程；
（ｂ）該血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程、
を包含する、被検体中の卵巣ガンの存在を検出する方法。
【請求項３】
以下の工程：
（ａ）前記血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；
（ｂ）該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって該血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
（ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）該リン脂質画分中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を
検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）該リン脂質画分中のパルミトイル-LPA、もしくはステアロイル-LPA、も
しくはオレオイル-LPA、またはそれらの組み合わせの存在を検出する工程
を包含するプロセスによって前記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）該被検体から採られた、実質的に血小板を含まない血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程であって、該血漿サンプルは実質的に血小板を有さず、該被検体に存在する血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する手順によって調製される、工程；および
（ｂ）該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程、
を包含する、被検体中の卵巣ガンを検出する方法。
【請求項７】
卵巣ガンの存在を検出する方法であって、該方法は、
被検体由来の血液サンプルにおけるＬＰＡの存在を検出する工程であって、該血液サンプルは、抗凝固剤を含み、該血液サンプルに存在する血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する様式で試験される、工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
以下の工程：
（ａ）前記血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；
（ｂ）該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって該血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
（ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）該リン脂質画分中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって該脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を
検出する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程：
（ａ）リン脂質画分に前記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）該リン脂質画分中のパルミトイル-LPA、もしくはステアロイル-LPA、も
しくはオレオイル-LPA、またはそれらの組み合わせの存在を検出する工程
を包含するプロセスによって前記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（例えば、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、および腹膜ガン）を診断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発明の背景
婦人科ガン（例えば、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、および腹膜ガン）は、米国および欧州の女性の間での最も頻度の高いガンによる死亡原因のひとつである。卵巣ガンのみでも、米国の1996年において、14,800人の死亡原因であると見積もられている。この暗い結果は、少なくとも一部には、腫瘍発達の早期の段階で卵巣ガンを検出することが不可能であることによる。卵巣ガンが早期の段階で診断される場合、治癒の割合は90％に達する。対照的に、進行した病気を有する女性の５年間の見通しは、依然として15％より低い生存率というほど低いままである。従って、早期の診断は、卵巣ガンの予後を改善するのに最も効果的な手段のひとつである。
【０００３】
経膣超音波検査は、卵巣腫瘍を検出するのに用いられる現在利用可能な技術のなかでも最も感度のよいものである。しかし、経膣超音波検査は非特異的である。すなわち、経膣超音波検査は悪性腫瘍と同様に良性のものも検出する。従って、経膣超音波検査による卵巣腫瘍の検出は、悪性腫瘍と良性腫瘍とを区別することが可能な第２の診断手順に付随されなくてはならない。さらに、経膣超音波検査は非常に高価であり、それゆえ多数の患者を検診する手順として有用ではない。
【０００４】
代表的に、良性卵巣腫瘍は外科的手順（例えば、塊の生検、または塊の吸引術、および外科的に患者から採取した細胞の細胞診）によって悪性卵巣腫瘍と区別される。しかし、これらの技術は非常に侵襲的および高価で、吸引術の場合には腹膜にガン性細胞を放つことにつながり得る。
【０００５】
抗原決定基CA 125は、高分子量ムチン様糖タンパク質であり、卵巣ガンについてスクリーニングするための現在最上の血清バイオマーカーである。しかし、CA125検査は、２つの主な限界を受ける。まず、CA 125検査は、それほど感度がよくない。例えば、上昇した血清CA 125のレベルは、すなわち35U/mlという合格点を越えるレベルは、現在ステージIの卵巣ガンを持つ患者の50％未満にしか存在しない（Taylor,K.J.W.およびSchwartz, P.E., 「Screening for Early OvarianCancer,」 Radiology, 192:1〜10,1994）。さらにCA 125検査は、それほど特異的でない。例えば、良性婦人科疾患を有する患者の約25％もまた、CA 125の上昇した血清レベルを有する。さらに、肝硬変のような肝疾患は、腹水なしの場合でさえ、35U/mlを越えるCA125血清レベルを上昇させる（Taylor, K.J.W.およびSchwartz, P.E., 「Screening for Early OvarianCancer,」 Radiology, 192:1〜10, 1994）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、婦人科ガン、特に卵巣ガンを検出する、新規で、簡単で、非侵襲的またはわずかに侵襲的な方法を持つことが望ましく、それは被検体を卵巣ガン早期の段階で同定するほど十分に感度がよく、婦人科ガンを良性と悪性に区別するほど十分に特異的であるものが望まれる。
【０００７】
【課題を解決する手段】
発明の要旨
本発明は、患者の婦人科ガンの存在を検出するための、新しく、簡単で、わずかに侵襲的な方法を提供する。本方法は、患者の血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程を包含する。
【０００８】
好ましい方法は、以下を包含する：患者から血液標本を提供する工程；血液標本から実質的に血小板を含まない血漿サンプルを得る工程；上記の血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；および、上記の脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程。本方法は、卵巣ガン早期の段階で被検体中の卵巣ガンを検出するのに十分なほど感度がよく、悪性婦人科ガンと良性婦人科ガンとを区別するほど十分に特異的であり、そしてわずかに侵襲的である方法であるので、本方法は患者を卵巣ガンについてスクリーニングするのに特に有用である。
【０００９】
本方法はまた、被検体中の子宮内膜ガン、腹膜ガン、および子宮頸ガンの存在も検出する。従って、本方法は、一種より多くの婦人科ガンについてスクリーニングするのに有用である。
【００１０】
生物学的流体からリゾホスファチジン酸を抽出する新規な方法もまた、提供する。生物学的流体を酸性化する工程および酸性化したサンプルからリゾホスファチジン酸を有機溶媒で抽出する工程を包含する方法は、生物学的流体中のリゾホスファチジン酸の80％より多くを抽出するのに有用である。
【００１１】
本発明はさらに、以下を提供する。
１．以下の工程：
（ａ）被検体から血液標本を提供する工程；
（ｂ）上記血液標本から血漿サンプルを調製する工程；および
（ｃ）上記血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含する、被検体中の婦人科ガンの存在を検出する方法。
【００１２】
２．上記婦人科ガンが、卵巣ガン、腹膜ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
【００１３】
３．以下の工程：
（ａ）血球および血小板の第１のぺレットならびに第１の上清を得るために、上記血液標本を400×ｇから1000×ｇの間の最初の速度で遠心分離する工程；および
（ｂ）第２のぺレットならびに第２の上清を得るために、工程（ａ）の上記第１  の上清を6500×ｇから10000×ｇの間の第２の速度で遠心分離する工程；
（ｃ）上記血漿サンプルを提供するために、工程（ｂ）から上記第２の上清を収  集する工程
を包含するプロセスによって上記血液標本から上記血漿サンプルを調製する、項目１に記載の方法。
【００１４】
４．以下の工程：
（ａ）上記血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；
（ｂ）上記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって上記血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、項目１に記載の方法。
【００１５】
５．以下の工程：
（ａ）リン脂質画分中に上記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）上記リン脂質画分中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含するプロセスによって上記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、項目４に記載の方法。
【００１６】
６．以下の工程：
（ａ）リン脂質画分中の上記脂質抽出物を分離する工程；および
（ｂ）上記リン脂質画分中のパルミトイル-LPA、もしくはステアロイル-LPA、も  しくはオレオイル-LPA、またはそれらの組み合わせの存在を検出する工程
を包含するプロセスによって上記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する、項目４に記載の方法。
【００１７】
７．上記婦人科ガンが卵巣ガンである、項目１に記載の方法。
【００１８】
８．上記婦人科ガンが卵巣ガンである、項目３に記載の方法。
【００１９】
９．上記婦人科ガンが卵巣ガンである、項目４に記載の方法。
【００２０】
１０．上記婦人科ガンが卵巣ガンである、項目５に記載の方法。
【００２１】
１１．以下の工程：
（ａ）酸性化されたサンプルを生成するのに十分な量の酸で生物学的流体サンプルを酸性化する工程であって、上記サンプル中の酸の最終濃度が約0.2Nから2.  0Nである、工程；
（ｂ）水相および有機相を提供するために、酸性化された上記サンプルと有機溶  媒を混合する工程；
（ｃ）上記生物学的流体サンプル中のLPAの80％より多くを含む有機相抽出物を  提供するために、上記有機相から上記水相を分離する工程
を包含する、生物学的流体サンプルからLPAを抽出する方法。
【００２２】
１２．上記生物学的流体サンプルが実質的に血小板を含まない血漿サンプルである、項目１１に記載の方法。
【００２３】
１３．上記酸性化されたサンプル中の酸の最終的な濃度が約1.3Nから約2.0Nである、項目１１に記載の方法。
【００２４】
１４．以下の工程：
（ａ）被検体から実質的に血小板を含まない血漿サンプルを提供する工程；
（ｂ）上記血漿サンプルから脂質抽出物を調製する工程；および
（ｃ）上記脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程
を包含する、被検体中の婦人科ガンを検出する方法。
【００２５】
１５．上記婦人科ガンが卵巣ガンである、項目１４に記載の方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】
発明の詳細な説明
本発明は、患者の婦人科ガン、特に卵巣ガンの存在を検出するための、新規で簡単な方法を提供する。本方法は、患者からの血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程を包含する。好ましくは、血漿サンプルは、実質的に血小板を含まない。本明細書中で記載のように、血漿サンプルは、それが患者から得た元々の血液標本中に存在する血小板の95％未満を含む場合に、実質的に血小板を含まない。好ましい実施態様では、方法は、患者から全血標本を得る工程、全血標本から実質的に血小板を含まない血漿サンプルを得る工程、血漿サンプルから脂質を抽出する工程、および脂質抽出物中のリゾホスファチジン酸の存在を検出する工程を包含する。
【００２７】
好ましくは、血漿サンプルは、全血標本中に存在する血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化する条件下で得られる。そのような条件は、例えば、血液凝固阻止薬を含む管中に被検体から全血標本を採集する工程を包含する。適切な血液凝固阻止薬は、例えば、ヘパリンおよびキレート化剤を含む。全血標本は、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、またはクエン酸ナトリウム、より好ましくはEDTA）の存在下で採集するのが好ましい。なぜなら、キレート化剤はサンプル中のホスホリパーゼ活性を低下させ、かつ全血標本の凝固を妨げるからである。
【００２８】
血漿は、代表的には全血標本を遠心分離して、全血標本中の血球をペレット化すること、および上清を採集することによって得られる。この上清は、全血標本中の血漿の大部分を占める。
【００２９】
好ましくは、血漿は、その手順は血球および血小板のペレットおよび第１の上清を提供するための第１の遠心分離工程、ならびに血小板の第２のペレットおよび血漿上清を提供するための、第１の上清を遠心分離する第２の遠心分離工程を含む手順によって血液標本から得られる。第１の遠心分離工程の速度は、好ましくは400〜1000×ｇの間、より好ましくは約500〜650×ｇ、最も好ましくは約550〜約600×ｇである。次いで、上清を管から取り出し、そして第２の遠心分離を、6500〜10000×ｇの間、より好ましくは約7000〜8500×ｇの速度で行う。２段階の遠心分離手順は、血小板からのリゾホスファチジン酸の放出を最小化し、従ってサンプル中のリゾホスファチジン酸のより正確な決定を可能にする。
【００３０】
次いで、血漿サンプル中の実質的にすべての脂質（特に、リン脂質）が、好ましくは、血漿サンプルから少なくとも80％のリゾホスファチジン酸を回収する脂質抽出手順によって抽出される。より好ましくは、脂質抽出手順は血漿サンプル中の少なくとも85％のLPAを回収する。好ましい脂質抽出手順の例は、以下の工程を包含する：血漿サンプルを酸性化する工程；酸性化した血漿サンプルを有機溶媒と混合して、水相および有機相を提供する工程（ここで、リン脂質は優先的に有機相に分配する）；および、有機相を回収し、血漿サンプル中のリゾホスファチジン酸の80％より多くを含む脂質抽出物を提供する工程。好ましくは、血漿サンプルを酸性化するために、塩酸を用いる。好ましくは、酸性化された血漿サンプルの最終的な酸濃度は、約0.2N〜約2.0N、より好ましくは約1.3Nから約2.0Nである。
【００３１】
酸性化された血漿サンプルからリゾホスファチジン酸を抽出するために適切な有機溶媒は、例えばブタノール、イソプロパノール、ならびに極性有機溶媒（例えば、メタノール）および非極性有機溶媒（例えば、クロロホルム）を含む混合有機溶媒を含む。好ましくは、有機溶媒はメタノールおよびクロロホルム（2:1の比)の混合物である。
【００３２】
本明細書中で「LPA」とも言及されるリゾホスファチジン酸は、次いで、従来技術（例えば、薄層クロマトグラフィーによる分離）を用いて有機相中の他のリン脂質から分離される。リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ならびにリゾホスファチジン酸、パルミトイル-LPA、オレオイル-LPA、およびステアロイル-LPAを含む標準物質を１次元TLCによって分離した予備研究は、LPAのRf値がパルミトイル-LPAおよびステアロイル-LPAについては0.14、そしてオレオイル-LPAについては0.13であることを示した。予備研究は、各LPA種が、リゾホスファチジルコリンの速度よりも遅い速度で、およびリゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルエタノールアミンと異なる速度で移動することもまた示した。リン脂質標準物質を２次元TLCに供した予備研究もまた、この様式で（すなわち、１次元TLCによって）調製したLPAが任意の他のリン脂質を含まないことを示した。
【００３３】
LPA画分中のリゾホスファチジン酸の量は、次いで、従来技術を用いることで数量化される。用いられる数量化の技術は、被検体によって提供される血液標本の量に依存する。例えば、血液標本の大きさが２ml以下である場合、LPAをピコモル量で検出可能な数量化の技術を用いることが好ましい。LPAをピコモル量で検出するのに適切な技術は、例えば、単離されたLPA画分を加水分解し、次いで加水分解物中の各脂肪酸の量をガスクロマトグラフィーによって数量化することを含む。血液標本の大きさが20ml以上である場合、LPAをナノモル量で検出可能な技術（例えば、LPA画分中の全亜リン酸定量）が適切である。
【００３４】
本明細書中で開示される方法は、婦人科ガン（例えば、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、腹膜ガン、および卵巣ガン、すなわち、上皮卵巣ガン）を検出するのに有用である。上皮卵巣ガンは、漿腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜(endometroid)腫瘍、明細胞腫瘍、未分化ガン、混合上皮腫瘍、および未分類上皮腫瘍を含む。
【００３５】
本明細書中で開示される方法は、患者内の卵巣塊の悪性度を評価するために、および患者内の外科的に後期の発達段階（すなわち、Surgical Stage IIIおよびSurgical Stage IV）にあるものと同様に、早期の発達段階（すなわち、SurgicalStage IおよびSurgical Stage II）にある卵巣ガンを検出するために特に有用である。外科的な段階は、病気の重篤度を示しており、Stage Iは最も低く重篤であり、そしてStageIVは最も高く重篤である。International Federation of Gynecology and Obstetricsによって確立された基準によれば、卵巣ガンは卵巣に限定されており、StageIの卵巣ガンでは腹水を含むことも含まないこともあり得る。Stage IIにおいては、ガンの骨盤への転移が存在し、そして子宮または卵管への転移もあり得る。StageIIIの卵巣ガンは、腹部への転移によって特徴づけられる。Stage IVにおいては、腹腔の外側へのガンの遠隔転移がある。
【００３６】
本明細書中で開示される方法は、簡単で、わずかに侵襲的で、そして被検体からの血液標本のみを必要とする。従って、そのような方法は、以前にガンを保有していると診断されたことのない患者、特に婦人科ガン、とりわけ卵巣ガンの危険がある患者のスクリーニングにもまた有用である。そのような患者は、この病気の家族歴によって高い危険にある女性、無排卵周期で閉経前の女性、および閉経後の女性を含む。
【００３７】
本発明は、下記の実施例によってさらに記載される。しかし、その実施例は、いかなる方法でも、本発明の精神または展望のいずれをも限定するものとみなされ得ない。
【００３８】
【実施例】
血漿サンプルを、84人の女性の被検体から提供される血液標本から得た。約２mlの全血標本を、7.2mgのEDTAを含む５ml真空容器管(vacutainertube)中に各被検体から収集した。
【００３９】
全血標本からの血漿サンプルの取得
全血標本を５分間580×ｇで遠心分離し、血球および血小板のペレットならびに上清を提供した。上清をシリコン処理した微量遠心分離管に移し、そして５分間8000×ｇで遠心分離し、第２のペレットおよび血漿上清を提供した。血漿上清を、すぐに処理するか、または-70℃で貯蔵するかのいずれかをした。
【００４０】
血漿サンプルからのLPAの抽出
血漿サンプルからの脂質、特にLPAの抽出を、０〜４℃で実施した。血漿の各１mLのサンプルを、0.2mLの12N HClを加えることにより酸性化し、約2.0 Nの最終HCl濃度の血漿サンプルを提供した。混合後、酸性化した血漿に2:1の比率のメタノール/クロロホルムを含む混合有機溶媒４mLを加え、そして混合物を１分間ボルテックスし、そして氷上で10分間インキュベートした。１mLのクロロホルムおよび1.25mLのH2Oを、混合物に加えた。十分に混合した後、混合物を４℃で10分間1000×ｇで遠心分離した。下の有機層を新たなガラス管に移し、そして窒素下40℃で乾燥させ、リン脂質抽出物を提供した。
【００４１】
この抽出手順の全回収率および再現性を、内因性のオレオイル-LPAを欠く３点平行の血漿サンプルに10nmolの合成オレオイル-LPAを加えることによって試験した。サンプルを本手順により抽出し、そして各サンプル中のオレオイル-LPAの量を定量した。この分析は、本抽出手順によるLPAの平均回収が92.7％（±5.6％の標準誤差）であることを示した。
【００４２】
脂質抽出物中のLPAの単離
各脂質抽出物を50μlの2:1メタノール/クロロホルム混合物中に溶解し、そしてEMScience, Darmstadt, Germanyから得た事前コートしたシリカゲル60 TLCプレート（20×20cm、層の厚さ250mm)の単一レーンにロードした。AvantiPolar-Lipids, Inc.から得たオレオイル-LPA 10〜50μlを含有する2:1メタノール/クロロホルム混合物の50μlアリコートをプレートの１つの外側のレーンにロードし、そしてSigmaChemical Companyから得たリゾホスファチジルコリン10〜50μgを含有するクロロホルムの50μlアリコートをプレートの反対の外側のレーンにロードした。オレオイル-LPAおよびリゾホスファチジルコリンを、プレート上のLPA画分の位置を決定するための移動度の参照として使用した。脂質を、室温で、約３時間、クロロホルム-メタノール-水酸化アンモニウム(65:35:5.5)の混合物を用いて展開した。次いで、オレオイル-LPAおよびリゾホスファチジルコリンの標準品を含む外側のレーンに0.1％8-アニリノ-1-ナフタレン-スルホン酸を噴霧し、そしてこれを紫外線下で可視化した。
【００４３】
血漿サンプルからの脂質抽出物をロードしたレーン中の各々の単離されたLPA画分を、プレートからKimble,Vineland, New Jerseyからの別々の15mlディスポーザブルガラス遠心分離管中にかきとった。LPA画分は、オレオイル-LPA標準品のRfに対応するプレートの距離まで移動した、そしてリゾホスファチジルコリン標準品のRfまで伸長するがより短いすべての脂質を含んだ。
【００４４】
各サンプルから単離したLPA量の測定
２mLの１MエタノールKOHを、単離されたLPA画分を含む各管に加えた。次いで、その管を60℃で１時間インキュベートし、管中に存在するLPAを加水分解した。冷却後、メチルベヘネート（クロロホルム中1.5mg/mL）を含む内部標準溶液５μl、１mLの６NHCl、５mLのH2O、および５mLのエチルエーテルを加水分解物に加えた。混合物を30秒間ボルテックスし、そして1000×ｇで10分間遠心分離した。次いで、上層を新たなガラス管に移し、そして窒素下40℃で乾燥した。残留物（これは、LPAから遊離した脂肪酸を含んでいた）を、0.6mLの石油エーテル中に溶解し、そして溶解した脂肪酸を、各管に１mLのBCl3-メタノール試薬を加え、そして100℃で10分間インキュベートすることにより、メチル基転移した。BCl3-メタノールを、SupelcoInc., Bellefonte, PAから得た。脂肪酸メチルエステルを、１mLの石油エーテルで抽出した。混合物を10秒間ボルテックスし、そして
1000×ｇで５分間遠心分離した。最上層を、ねじぶた式のSupelcoサンプルバイアル3.7mLに移し、そして窒素下40℃で乾燥した。次いで、残余物を25μlのクロロホルム中に溶解し、そして５〜15μlのクロロホルム溶液をガスクロマトグラフィーによる分析用に使用した。
【００４５】
加水分解によってLPAから遊離された脂肪酸のGC分析
各々のサンプル中の各脂肪酸量を測定するために、Supelco Inc.からの100/120Chromosorb WAWに３％SP-2310、２％SP-2300でコーティングした融合シリカカラム(25m×0.2mm)を備えた、Hewlett-PackardModel 5710Aガスクロマトグラフを使用した。ガスクロマトグラフの条件は以下の通りであった：オーブンの開始温度は185℃であった；２分後、温度を２℃/分で230℃まで上昇させ、そして４分間保持した；インジェクター温度は200℃であった；検出器温度は、300℃であった；窒素がキャリアガスであり、50PSI下、流速30ml/分であった；空気流速は24PSI下、240ml/分であった；水素流は15Psi下、30ml/分であった。脂肪酸メチルエステルを検出するために、フレームイオン化検出器を用いた。NuCheck Prep Inc.. Elysian, MNから得た、２つの脂肪酸メチルエステル標準混合物を用いて、２つの標準曲線を得た。２つの標準混合物は、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、アラキドン酸メチル、およびベヘン酸(behanete)メチルのエステルの異なる組み合わせを含んだ。保持時間は、パルミチン酸メチルについては3.8分、ステアリン酸メチルについては6.7分、オレイン酸メチルについては7.3分、リノール酸メチルについては8.3分、アラキドン酸メチルについては14.0分、およびベヘン酸メチル（内部標準）については15.3分であった。
【００４６】
各サンプル中の各脂肪酸の濃度を計算し、そして各血漿サンプル中の全LPAの濃度を得るために合算した。各LPA種および各サンプル中の全LPAのμMでの濃度を、表Ｉに示す。
【００４７】
各女性被検体とも、健常であるかまたは活性な疾患を有しているかを決定するために、１つ以上の慣習的診断手順を受けた。その診断手順は、適切であれば、任意の検出される塊の臨床検査、臨床化学、および外科的評価を含んだ。これらの慣習的診断手順に基づいて、患者を表Ｉに列挙される疾患のうちの１つの活性な形態を有すると、または健常であると診断した。
【００４８】
【表１】実施例の被検体の血漿におけるLPAレベル（μM）
0003542349.tif 000002
0003542349.tif 000003
0003542349.tif 000004
0003542349.tif 000005
LPA(P) : パルミトイル-LPA
LPA(S) : ステアロイル-LPA
LPA(O) : オレオイル-LPA
LPA(L) : リノレニル-LPA
LPA(A) : アラキジル-LPA
LPA(D) : ドコサヘキサニル-LPA
B.D. : 検出以下
N.A. : 利用不可。
【００４９】
婦人科ガンを有すると診断された患者の血漿中の各LPA種の平均濃度±SE、および婦人科ガンを有さないと診断された患者の血漿中の各LPA種の平均濃度±SEを表IIに示す。婦人科ガンを有する患者の血漿中の全LPAの平均濃度±SE、および婦人科ガンを有さない患者の血漿中の全LPAの平均濃度±SEを表IIIに示す。PracticalNonparametric中でW.J. Conoverによって記載されているような、Wilcoxon Rank Sum統計検定を用いて、統計学的ベキ計算(statisticalpower calculations)を実施した。LPAレベルが検出以下の場合、0.1μmを計算中で用いた。
【００５０】
【表２】実施例からの被検体の血漿における個々のLPA種の平均濃度
0003542349.tif 000006
0003542349.tif 000007
0003542349.tif 000008
LPA(P) : パルミトイル-LPA
LPA(S) : ステアロイル-LPA
LPA(O) : オレオイル-LPA
LPA(L) : リノレニル-LPA
LPA(A) : アラキジル-LPA
LPA(D) : ドコサヘキサニル-LPA
B.D. : 検出以下
N.A. : 利用不可。
【００５１】
【表３】患者の血漿における全LPAの平均濃度（μM）
0003542349.tif 000009
LPA(P) : パルミトイル-LPA
LPA(S) : ステアロイル-LPA
LPA(O) : オレオイル-LPA
LPA(L) : リノレニル-LPA
LPA(A) : アラキジル-LPA
LPA(D) : ドコサヘキサニル-LPA
B.D. : 検出以下
N.A. : 利用不可。
【００５２】
表Ｉに示すように、Ｉ期、II期、III期、またはIV期の卵巣ガンを有する各患者において、検出可能なレベルの全LPAが見出さた。従って、早期の卵巣ガンまたは後期の卵巣ガンを有すると診断された患者の全員が、患者の血漿中に検出可能なレベルのLPAを有した。卵巣ガンを有するいずれの患者においても、偽陰性は観測されなかった。Ｉ期およびII期の卵巣ガンを有する被検体中の全LPAの濃度は、4.67〜32.32μMの範囲であった。III期およびIV期のガンを有する被検体中の全LPAの濃度は、2.53〜56.17μMの範囲であった。さらに、卵巣ガンを有する患者すべてにおいて検出可能なレベルのステアロイル-LPAが見出され、そして卵巣ガンを有する患者19人中18人において、検出可能なレベルのLPA種のパルミトイル-LPAおよびオレオイル-LPAが見出された。
【００５３】
対照的に、健常であると分類された23人の被検体のうち19人は、それらの血漿中に検出可能なレベルのLPAを有さなかった。残りの４人の健常な患者は、それらの血漿中に0.42〜4.93μMの範囲の、低濃度のLPAを有した。これらの値が偽陽性を示すかどうか、またこれらの個体が、患者を診断するために使用される他の慣習的な手順によって検出されない婦人科ガンを有したかどうかは未知である。さらに、卵巣ガンを有すると診断された患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度は、健常患者の血漿中の全LPAおよび各LPA種の平均濃度より、有意に高かった。これらの結果は、その卵巣ガンがなお発達の早期にある患者を含む、婦人科ガンの卵巣ガンを有する患者を同定するために、本発明の方法が非常に感度がよく、それゆえ有用であるということを確証する。この結果はまた、患者の血漿中のパルミトイル-LPAもしくはステアロイル-LPAもしくはオレオイル-LPA、またはそれらの組み合わせの存在を検出する方法もまた、卵巣ガンを検出するために有用であることを示す。
【００５４】
LPAは、子宮頸ガンおよび子宮内膜ガンを有すると診断された被検体の全員の血漿、ならびに腹膜ガンを有すると診断された９人の被検体のうちの８人の血漿中でもまた、検出された。腹膜ガンは、血漿中に検出可能なレベルのLPAを有さなかった１人の患者中で、全体的に脱塊(debulk)されていた。この結果は、そのガンが外科手術によって完全に除去された患者の血漿中に、LPAは存在しないことを示唆する。従って、本発明の方法は、ガンの外科的除去を受けた患者中の、婦人科ガンの再発をモニターするために有用である。子宮頸ガンおよび子宮内膜ガンを有する被検体の血漿中のLPA濃度は、2.00〜63.23μMの範囲であった。
【００５５】
対照的に、婦人科ガン以外のガン、すなわち、乳ガン、白血病、および子宮肉腫を有すると診断された17人の患者のうち15人の患者において、検出可能なレベルのLPAは存在しなかった。さらに、良性婦人科疾患である子宮類線維を有する被検体のいずれにおいても、検出可能なレベルのLPAは存在しなかった。結合組織に由来する婦人科肉腫、および良性子宮類線維を有する４人の患者のうち３人由来の血漿は、それらの血漿中に検出可能なレベルの全LPAを有さなかったので、それぞれの婦人科器官の悪性上皮細胞が、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、および腹膜ガンを有する患者の血漿中のLPAの供給源であり得ると考えられる。
【００５６】
その感度、簡便さ、および低コストのために、本発明の方法は婦人科ガンについて患者をスクリーニングするために有用である。本発明の方法のためおよびCA125試験のための血液標本を、患者から同時に採取し得るので、本発明の方法によって婦人科ガンについて患者をスクリーニングするときに、CA125試験もまた実施され得る。あるいは、本発明の方法は婦人科ガンを検出するために単独で使用され得る。
【００５７】
LPAは良性婦人科ガンを有する患者の血漿中に存在しないので、本発明の方法は、婦人科塊(mass)を有する患者において、良性である婦人科疾患と悪性である婦人科疾患とを区別するためにもまた有用である。悪性卵巣塊と良性卵巣塊とを区別するこの方法の使用は、経膣的超音波検査のようなより高価な技術、または、現在、卵巣組織悪性腫瘍を診断するために用いられている腫瘍バイオプシーまたは腫瘍吸引術のようなより侵襲的な技術を受けることを必要とされる患者の数を減らすはずである。
【００５８】
本発明は、本発明を実施するために本発明者らに現在既知の最良の態様を構成する、多くの好ましい実施態様に関して記載されているが、当業者に明白であるような種々の変形および改変が、本明細書に添付される請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱することなしになされ得ることは、理解されるべきである。
【００５９】
【発明の効果】
婦人科ガン、特に卵巣ガンを検出する、新規で、簡単で、非侵襲的またはわずかに侵襲的な方法を持つことが望ましく、それは被検体を卵巣ガン早期の段階で同定するほど十分に感度がよく、婦人科ガンを良性と悪性に区別するほど十分に特異的である診断方法が提供された。