(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003595345.tif 000058
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000059
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000060
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000061
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
を有するモノマー単位を含んでなるオリゴマー化合物。
【請求項２】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000062
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000063
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000064
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000065
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000066
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ｇ及びｈがそれぞれ０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ａが０である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ａが０であり、ｇが０であり、ＶがNHであり、そしてｈが１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ｂが２又は３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｃα又はＣβの少なくとも１つがＳ配位である、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｔが式−CH2−CH2−NH−を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｔが式−CH2−を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｔが式−CH2−CH2−を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
式：
0003595345.tif 000067
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000068
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000069
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式−Ｏ−CH2−CH2を有する。］
を有するモノマー単位を含んでなるオリゴマー化合物。
【請求項１６】
式：
0003595345.tif 000070
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000071
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000072
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式−Ｏ−CH2−CH2−CH2−を有する。］
を有するモノマー単位を含んでなるオリゴマー化合物。
【請求項１７】
Ｗが−（CH2）ｍ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
ｍが２である、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｗが、式：
0003595345.tif 000073
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
ｂが２である、請求項19に記載の化合物。
【請求項２１】
ｂが３である、請求項19に記載の化合物。
【請求項２２】
連結基によって連結された複数のペプチド核酸オリゴマーからなる化合物であって、前記ペプチド核酸オリゴマーの少なくとも１つが、式：
0003595345.tif 000074
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000075
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000076
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000077
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
を有する部分を含んでなる化合物。
【請求項２３】
２つのペプチド核酸オリゴマーが結合基によって結合している、請求項22に記載の化合物。
【請求項２４】
連結基が１つ又はそれ以上の８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸基を含む、請求項22に記載の化合物。
【請求項２５】
式：
0003595345.tif 000078
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000079
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000080
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000081
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有し；そして
R13及びR14は、それぞれ独立して、Ｈ、又は窒素若しくは酸素の保護基である。］
を有する化合物。
【請求項２６】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000082
を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000083
を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000084
を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000085
を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｌが、式：
0003595345.tif 000086
を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項３１】
ｇ及びｈがそれぞれ０である、請求項25に記載の化合物。
【請求項３２】
ａが０である、請求項31に記載の化合物。
【請求項３３】
ａが０であり、ｇが０であり、ＸがNHであり、そしてｈが１である、請求項25に記載の化合物。
【請求項３４】
ｂが２又は３である、請求項25に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｃα又はＣβの少なくとも１つがＳ配位である、請求項34に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｔが式−CH2−CH2−NH−を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｔが式−CH2−を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｔが式−CH2−CH2−を有する、請求項25に記載の化合物。
【請求項３９】
式：
0003595345.tif 000087
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000088
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000089
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式−Ｏ−CH2−CH2−を有し；そして
R13及びR14は、それぞれ独立して、Ｈ、又は窒素若しくは酸素の保護基である。］
を有する化合物。
【請求項４０】
式：
0003595345.tif 000090
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000091
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000092
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式−Ｏ−CH2−CH2−CH2−を有し；そして
R13及びR14は、それぞれ独立して、Ｈ、又は窒素若しくは酸素の保護基である。］
を有する化合物。
【請求項４１】
式：
0003595345.tif 000093
［Ｌは、式：
0003595345.tif 000094
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又は、R11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；
Ａは、単結合、メチレン基又は式：
0003595345.tif 000095
（式中：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり；
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、０又は１〜５の整数であり；
R1及びR2は、水素；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換されてもよい（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ；アミノ及びハロゲンから成る群からそれぞれ独立して選択され；
R3及びR4は、水素；（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換された（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ及びアミノから成る群からそれぞれ独立して選択される。）の基であり；
R15は、OH、保護されたヒドロキシル基又は保護基であり；そして
R16は、Ｈ又はアミノ保護基である。］
の化合物。
【請求項４２】
病的な状態との関連が疑われる配列をコードし、かつ１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖DNA;
該一本鎖核酸のある領域に相補的な領域を含む第一ペプチド核酸オリゴマー；及び
該一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含む第二ペプチド核酸オリゴマーであって、該一本鎖核酸の該チミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に、式：
0003595345.tif 000096
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000097
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000098
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000099
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
の残基を有する第二ペプチド核酸オリゴマー
を含む組成物。
【請求項４３】
一本鎖DNA、第一ペプチド核酸、及び第二ペプチド核酸が三重鎖を形成する、請求項42に記載の組成物。
【請求項４４】
三重らせん化合物を形成する方法であって：
（ａ）１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖核酸を選択する工程；
（ｂ）前記一本鎖核酸のある領域に相補的である領域を含む第一オリゴマーを提供する工程；及び
（ｃ）前記一本鎖核酸及び前記第一オリゴマーを、前記三重らせん化合物を形成するのに有効な時間及び条件下で、第二オリゴマーと接触させる工程であって、前記第二オリゴマーが、前記一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含み、かつ前記一本鎖核酸の前記チミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に、式：
0003595345.tif 000100
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000101
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000102
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000103
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
の残基を有する工程
を含んでなる方法。
【請求項４５】
第一オリゴマーがPNAである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
第一オリゴマーがDNAである、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
第一オリゴマーが一本鎖核酸に対して逆平行に配向し、第二オリゴマーが三重らせん構造の前記一本鎖核酸に対して平行に配向している、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】
三重らせん化合物が式PNA−DNA−PNAを有する、請求項44に記載の方法。
【請求項４９】
一本鎖核酸がDNAである、請求項44に記載の方法。
【請求項５０】
一本鎖核酸がRNAである、請求項44に記載の方法。
【請求項５１】
第一オリゴマーがペプチド核酸であり、前記第一オリゴマーが連結部分によって第二オリゴマーに連結している、請求項44に記載の方法。
【請求項５２】
第一及び第二オリゴマーがそれぞれ４〜20ヌクレオベースの長さである、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
既知のヌクレオベース配列を含有する化学的又は微生物学的実体を検出するため方法であって：
ａ）１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する化学的又は微生物学的実体からヌクレオベース配列を選択すること；
ｂ）前記選択されたヌクレオベース配列に相補的な領域を含有するPNAオリゴマーを提供すること；
ｃ）前記化学的又は微生物学的実体の前記選択されたヌクレオベース配列及び前記相補的なPNAオリゴマーを、前記選択されたヌクレオベース配列に相補的である配列を含有するさらに別のPNAオリゴマーと接触させて、三重らせん化合物を形成すること、この際、前記さらに別のPNAオリゴマーは、前記選択されたヌクレオベース配列の前記チミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に、式：
0003595345.tif 000104
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000105
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000106
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000107
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
の残基を有する；及び
ｄ）前記三重らせん化合物を検出すること
を含んでなる方法。
【請求項５４】
二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項１の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項５５】
二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識方法であって、前記ポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドと結合して三重鎖構造を形成するオリゴマー化合物と接触させることを含み、前記オリゴマー化合物が、式：
0003595345.tif 000108
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜６であるか、又は
0003595345.tif 000109
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000110
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000111
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
を有するモノマー単位を含む方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願への相互参照
本出願は、1997年５月23日に出願された米国特許出願第08/862,629号の一部継続出願であり、この出願の開示はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
発明の分野
本発明は、オリゴマー化合物とその構成モノマー、特にペプチド核酸（PNA）のオリゴマー及びモノマーに向けられている。ペプチド核酸オリゴマーは、高められた結合特異性で核酸を有する三重らせん（三重鎖）構造を形成をするのに有用である。本発明の１つの側面では、新規なPNAオリゴマーが三重鎖構造においてチミジン及びデオキシウリジンに対する特異性を高めた。
発明の背景
ペプチド核酸は、DNAとRNAの両方に結合する点で、オリゴヌクレオチドの有用な代用物である（Egholmら、Nature  1993,365,566−568及びその引用文献を参照のこと）。
PNAは、DNAとRNAの両方に結合し、PNA/DNA又はPNA/RNAの二重鎖を形成する。得られたPNA/DNA又はPNA/RNAの二重鎖は、そのより高い融解温度（Tm）によって証明されるように、対応するDNA/DNA又はDNA/RNAの二重鎖より強い親和性で結合している。このより高い熱安定性は、DNA又はRNAの二重鎖に存在している電荷反発に遭わないPNA骨格の中性が原因とされている。PNAの中性的な骨格は、PNA/DNA（RNA）二重鎖のTmを塩濃度から独立させもする。従って、PNA/DNA二重鎖は、イオン強度に強く依存しているDNA/DNA二重鎖の相互作用を上回る更なる利点を提供する。ホモピリミジンPNAは、相補的なDNA又はRNAと結合し、熱安定性が高い（PNA）2/DNA（RNA）三重鎖を形成することが示されている（例えば、Nielsenら、Science  1991,254,1497;Egholmら、J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1895;Egholmら、J.Am.Chem.Soc.,1992,114,9677を参照のこと）。
親和性が高まるだけでなく、PNAは高められた特異性でDNAと結合することも示されている。PNA/DNA二重鎖のミスマッチが融解するときは、DNA/DNA二重鎖に比較してTmの８〜20℃の低下が見られる。これほど大きいTmの低下は、１つのミスマッチが存在する対応するDNA/DNA二重鎖では見られない。Egholm,M.ら、Nature 1993,365,p.566を参照のこと。
DNA又はRNA鎖へのPNA鎖の結合は、２つの方向の１つで起こり得る。5'から3'への方向のDNA又はRNA鎖が、PNAのカルボキシル末端がそのDNA又はRNAの5'末端の方に向けられ、PNAのアミノ末端がそのDNA又はRNAの3'末端の方に向けられるようにして相補的なPNA鎖と結合するとき、その方向は逆平行であると言われる。平行な方向では、PNAのカルボキシル末端及びアミノ末端は、DNA又はRNAの5'−3'方向に関して逆の配向になる。
その特質のために、PNAはいくつかの異なる応用分野で有用であることが知られている。特に、PNAは相補的なRNA又はDNAと二重鎖及び三重鎖を形成するために使用されている（例えば、Knudsenら、Nucleic  Acids  Res.,1996,24,494−500;及びNielsenら、J.Am.Chem.Soc.,1996,118,2287−2288を参照のこと）。さらに、いくつかの論説がこの分野で最近公表されている。例えば、Hyrupら、Bioorganic  ＆  Med.Chem.,1996,4,5−23;Nielsen、“ペプチド核酸（PNA）；遺伝子治療薬のリード"Trainor（編）、Perspectives Drug Disc.Des.,1996,4,76−84を参照のこと。
PNAはオリゴヌクレオチドよりも強い結合性及び高い特異性を有しているので、クローニング、ブロット法及び蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）のような応用分野のプローブとして大変有用である。ホモピリミジンPNAは、ホモプリンの標的における鎖置換のために使用されている。局所的な三重鎖は遺伝子の転写を阻害する。さらに、Ｄループに重複するか又は隣接する制限部位は制限酵素によって開裂されない。DNAフラグメント内の特定の制限部位にPNAが結合すると、その部位での開裂を阻害し得る。そのような阻害はクローニング及びサブクローニング法において有用である。標識化されたPNAは、蛍光又は他のタイプの検出可能なラベルを有するPNA分子を、二重鎖DNA中の相補配列と鎖侵入（strand invasion）を用いてハイブリダイズさせることによって、DNA分子を直接マップするために使用されもする。
PNAは、PCRベースアッセイ法（PCRクランピング）において点突然変異を検出するためにも使用されている。PCRクランピングでは、PCRベースアッセイにおける点突然変異の検出、例えば研究下のDNAセグメントにおける通常の野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子との相違点を検出するために、PNAが使用される。典型的には、野生型の配列に相補的なPNAオリゴマーを合成し、その１つが突然変異体の配列に相補的である２種のDNAプライマーを有するPCR反応混合物に含ませる。野生型PNAオリゴマーとDNAプライマーは標的に対するハイブリダイゼーションを競合する。DNAプライマーのハイブリダイゼーションとそれに続く増幅が起こるのは、この標的が突然変異対立遺伝子である場合だけである。この方法を用いれば、突然変異体の存在及び正確なアイデンティーティーを決定し得る。
相補的なDNA及びRNA鎖に結合するオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を診断薬、研究用試薬及び潜在的な治療薬として応用することにかなりの研究が向けられている。多くの使用のために、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、活性を発現するためには細胞膜を越えて輸送され、細胞に取込まれなければならない。
PCT/EP/01219は、対応するDNAよりも強く相補的なDNA及びRNAと結合する新規なペプチド核酸（PNA）化合物を記載している。その活性又はその膜又は細胞の輸送をモジュレートするか又は別のやり方で影響を及ぼす基を、これら化合物に追加することが望まれている。そのような輸送を高めるための１つの方法は、ペンダント親油性基を結合することによる。
前もって形成されたモノマーを経るペプチド核酸の合成が、国際特許出願WO92/20702号及びWO92/20703号に記載されている。なお、いずれの内容もそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。また、PNAの合成、構造、生物学的性質及び使用に関する最近の進歩が報告されている。例えば、WO93/12129号及びCook等への米国特許第5,539,083号、Egholmら、Nature  1993,365,566−568,Nielsenら、Science,1991,254,1497−1500;及びEgholmら、J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1895−1897を参照のこと。ペプチド核酸が二本鎖DNAの鎖置換に効果があることも示されている（Patel,D.J.、Nature,1993,365,490−492を参照のこと）。上記の特許及び公表物はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
オリゴヌクレオチドによる三重らせんの形成は、二本鎖デオキシリボ核酸（DNA）の配列特異的な開裂がMoserら、Science,1987,238,645−650によって証明されて以来、熱心な研究分野になっている。三重鎖形成オリゴヌクレオチドが遺伝子治療、診断用プローブ及び他の生物医学的な応用において潜在的な用途があると考えられている。例えば、Uhlmannら、Chemical Reviews,1990,90,543−584を参照のこと。
ピリミジンオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNAにおけるホモプリンの標的への結合を介して三重らせん構造を形成することが分かっている。これらの構造では、その新しいピリミジン鎖は、DNAの主溝においてプリンのワトソン−クリック型の鎖に対して平行に配向し、配列特異的なHoogsteen型の水素結合を介して結合する。この配列特異性は、アデニンを認識するチミン（T:A−Ｔ）及びグアニンを認識するプロトン化シトシン（C+:G−Ｃ）に由来する（Bestら、J.Am.Chem.Soc.,1995,117,1187−1193を参照のこと）。あまりよく研究されていない三重鎖モチーフでは、プリンリッチなオリゴヌクレオチドが二本鎖DNAのプリン標的に結合する。このモチーフの第三の鎖の方向は、プリンのワトソン−クリック型の鎖に対して逆平行であり、その特異性は、グアニンを認識するグアニン（G:G−Ｃ）及びアデニンを認識するチミン又はアデニン（A:A−Ｔ又はT:A−Ｔ）に由来する。Greenbergら、J.Am.Chem.Soc.,1995,117,5016−5022を参照のこと。
ホモピリミジンPNAは、相補的なオリゴヌクレオチドと非常に安定なPNA:DNA−PNA複合体を形成する。２つのPNA鎖及び１つのヌクレオチド鎖を含む三重らせん構造の形成は、1993年７月２日に出願されたDouble−Stranded Peptide Nucleic Acidsと題する米国特許出願第08/088,661号に報告されている。なお、この内容はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。DNAのプリン標的鎖に対してHoogsteen型の鎖が平行である三重鎖の形成は、逆平行の複合体の形成より好ましい。このことから、Hoogsteen型の鎖においてシトシンの代わりにシュードイソシトシンを使用してpH依存的な熱安定性が高められた三重らせん構造を得るためにビス−PNAを使用することが考慮される。Egholmら、J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1895−1897を参照のこと。また、公開PCT出願WO96/02558号も参照のこと。これらはいずれも参照によりそっくりそのまま本明細書中に組み込まれるものとする。
ペプチド核酸は、DNA又はRNAがDNA又はRNAのいずれかに対するよりもDNAとRNAのいずれに対しても（その融解温度によって定量されるように）より高い結合親和性を有することが示されている。この結合親和性の増加によって、これらペプチド核酸オリゴマーは、核酸分子種に対する分子プローブ及び診断薬として特に有用になる。
オリゴヌクレオチドに取込まれたカルバゾール様の2'−デオキシシチジン類似体が２重鎖モチーフの相補的なRNAにおいてグアニンと特異的に対合することがすでに示されている（“Pyrimidine Derivatives for Labeled Binding Partner"と題する、1996年５月26日発行の米国特許第5,502,177号;Matteucci,M.D.,von  Krosigk,U.,Tetrahedron  Letters,1996,37,557−5060;Kuei−Ying,L.ら、J.Am.Chem.,1995,117,3873−3874）。
三重鎖構造の形成において現時点でいくつか制限があること（ホモプリン標的に限られていることなど）は、DNAの特定部位をペプチド核酸によって配列特異的に認識することに対する主要な難点の１つである。Nielsen、J.Am.Chem.Soc.,1996,118,2287−2288を参照のこと。従って、ワトソン−クリック型の塩基対と結合し得るヌクレオベース部分を好ましくはピリミジン三重らせんモチーフの内部に含有する新しいPNAオリゴマーに対する要望がある。
発明の要旨
本発明により提供されるのは、オリゴマー化合物、特に式I:
0003595345.tif 000002
［式中：
Ｌは、アデノシン−チミジンヌクレオベース対の認識部分であり；
Ａは、単結合、メチレン基又は以下の式：
0003595345.tif 000003
（式中：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり；
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であり；
R1及びR2は、水素；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換されてもよい（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ；アミノ及びハロゲンから成る群からそれぞれ独立して選択され；そして
R3及びR4は、水素；（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換された（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ及びアミノから成る群からそれぞれ独立して選択される。）の基であり；
Ｂは、Ｎ又はR3−N+であって、R3は上記の定義通りであり；
Ｅは、CR6R7、CHR6CHR7又はCR6R7CH2であって、R6は水素でありR7は天然に存在するαアミノ酸の側鎖から成る群から選択されるか又はR6及びR7は、水素、（C2−C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1−C8）アルコキシ、（C1−C8）アルキルチオ、NR3R4及びSR5から成る群から独立して選択され、R3及びR4は上記の定義通りであって、R5は、水素；（C1−C6）アルキル；ヒドロキシ、アルコキシ又はアルキルチオ置換（C1−C6）アルキルであるか、又はR6及びR7は、一緒に脂環系又はヘテロ環系をとり；
Ｄは、CR6R7、CH2CR6R7又はCHR6CHR7であって、R6及びR7は上記の定義通りであり；そして
Ｇは、いずれの方向でもよい、−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−又は−NR3SO2−であって、R3は上記の定義通りである。］
を有する部分を含むペプチド核酸である。
好ましい態様では、このモノマー単位は式II:
0003595345.tif 000004
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜約６であるか、又は
0003595345.tif 000005
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜約５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000006
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000007
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜約５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
を有する。
また、本発明により提供されるのは、式III:
0003595345.tif 000008
（式中：
Ｌ、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは、上記の意味を有し、Ｆは、それぞれ独立して、NHR3又はNPgR3であって、R3は上記の定義通りであり、Pgはアミノ保護基である。）を有するモノマー化合物である。
好ましい態様では、本発明のモノマー化合物は、以下の式IV:
0003595345.tif 000009
（式中：
R8、R9、Ｔ、Ｌ、Ｗ、ｋ及びｎは上記の意味を有し、R13及びR14は、それぞれ独立してＨ又は保護基である。）を有する。
本発明の化合物の幾つかの好ましい態様では、ｇ及びｈはそれぞれ０である。より好ましい態様では、ｇ及びｈはそれぞれ０であり、ａは０である。さらに好ましい態様では、ａは０であり、ｇは０であり、ＸはNHであり、そしてｈは１である。
幾つかの好ましい態様では、Ｌは、式：
0003595345.tif 000010
0003595345.tif 000011
のうちの１つである。
幾つかの好ましい態様では、R4及びR5はそれぞれＨである。さらに好ましい態様では、R4及びR5は、それらが結合している原子と一緒にフェニル環を形成する。
幾つかの好ましい態様では、ＱはＮであり、他の好ましい態様では、ＱはCHである。
好ましくは、Ｔは低級アルキルか又はアルキルアミノである。特に好ましい態様では、Ｔは−CH2−CH2−NH−、−CH2−、−CH2−CH2−、−Ｏ−CH2−CH2−、−Ｏ−CH2−CH2−CH2−、−（CH2）ｍ−である。
他の好ましい態様では、Ｗは、式：
0003595345.tif 000012
（式中、ｂは好ましくは０〜４の整数であり、２及び３が特に好ましい。）を有する。さらに好ましい態様では、Ｃα又はＣβの少なくとも１つがＳ配位である。
幾つかの好ましい態様では、本発明の化合物はペプチド核酸である。他の好ましい態様では、本発明の化合物は、連結基によって連結している複数のペプチド核酸オリゴマー、好ましくは２つのオリゴマーを含み、そのペプチド核酸オリゴマーの少なくとも１つは式IIを有する部分を含む。特に好ましい態様では、２つのペプチド核酸オリゴマーが連結部分によって連結されていて、それは好ましくは１つ又はそれ以上の８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸基であり、より好ましくは、３つの８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸基である。
本発明の化合物の幾つかの特に好ましい態様は、式：
0003595345.tif 000013
［R15は、OH、保護されたヒドロキシル基又は保護基であり；
R16は、Ｈ又はアミノ保護基であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000014
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又は、R11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；
Ａは、単結合、メチレン基又は式：
0003595345.tif 000015
（式中：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり；
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、０又は１〜５の整数であり；
R1及びR2は、水素；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換されてもよい（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ；アミノ及びハロゲンから成る群からそれぞれ独立して選択され；そして
R3及びR4は、水素；（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換された（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ及びアミノから成る群からそれぞれ独立して選択される。）の基である。］
を有する
また、本発明により提供されるのは、病的な状態との関連が疑われる配列をコードしかつ１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖DNA;該一本鎖核酸のある領域に相補的な領域を含む第一ペプチド核酸オリゴマー；及び該一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含む第二ペプチド核酸であって、該一本鎖核酸のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に非プリンヌクレオベースを有する残基、好ましくは式IIの残基を有する第二ペプチド核酸、を含む組成物、好ましくは三重鎖の化合物である。
また、本発明は、三重鎖の化合物を形成する方法であって：
（ａ）１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖の核酸を選択する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸のある領域に相補的である領域を含む第一オリゴマーを提供する工程；及び
（ｃ）該一本鎖核酸及び第一オリゴマーを、該三重らせん化合物を形成するのに有効な時間及び条件下で、第二オリゴマーと接触させる工程であって、該第二オリゴマーが、該一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含むペプチド核酸オリゴマーでありかつ該一本鎖核酸のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に式IIの残基を有する工程
を含んでなる方法を提供する。好ましくは、第一オリゴマーはPNA又はDNAである。
本発明の方法の幾つかの好ましい態様では、第一オリゴマーは、一本鎖核酸に対して逆平行に配向していて、第二オリゴマーは三重鎖化合物内の一本鎖核酸に対して平行に配向している。特に好ましい態様では、三重鎖の化合物はPNA−DNA−PNAの式を有する。
好ましくは、一本鎖の核酸はDNA又はRNAである。
さらに好ましい態様では、第一オリゴマーはペプチド核酸であり、この第一オリゴマーは、連結部分によって第二オリゴマーと連結している。
本発明の方法の幾つかの好ましい態様では、第一及び第二オリゴマーは、それぞれ４〜約40ヌクレオベースの長さである。
また、本発明は、既知のヌクレオベース配列を含有する化学的又は微生物学的実体を検出するため方法であって：
１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する化学的又は微生物学的実体からヌクレオベース配列を選択すること；
該選択されたヌクレオベース配列に相補的な領域を含有するPNAオリゴマーを提供すること；
該化学的又は微生物学的実体の該選択されたヌクレオベース配列及び該相補的なPNAオリゴマーを、該選択されたヌクレオベース配列に相補的である配列を含有するさらに別のペプチド核酸オリゴマーと接触させて、三重らせん化合物を形成すること、この際、該さらに別のペプチド核酸オリゴマーは、該選択されたヌクレオベース配列のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に式IIの残基を有する；及び
該三重らせん化合物を検出すること
を含んでなる方法を提供する。
二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識方法であって、該ポリヌクレオチドを式IIの残基を有する化合物と接触させることを含んでなる方法も提供される。
二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識方法であって、該ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドと結合して三重鎖構造を形成するオリゴマー化合物と接触させることを含み、該オリゴマー化合物が、式Ｉ、より好ましくは式IIを有するモノマー単位を含む方法も提供される。
好ましい態様の説明
１つの側面では、本発明は新規なオリゴマー化合物、特に研究用試薬として及び相補的な核酸に対する特定のプローブとして有用であるペプチド核酸を提供する。本発明は、そのオリゴマー化合物の製造に有用であるモノマーのシントンも提供する。
好ましい態様では、本発明の化合物は、式I:
0003595345.tif 000016
［式中：
Ｌは、アデノシン−チミジンヌクレオベース対の認識部分であり；
Ａは、単結合、メチレン基又は式：
0003595345.tif 000017
（式中：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり；
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、０又は１〜５の整数であり；
R1及びR2は、水素；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換されてもよい（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ；アミノ及びハロゲンから成る群からそれぞれ独立して選択され；そして
R3及びR4は、水素；（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換された（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ及びアミノから成る群からそれぞれ独立して選択される。）の基であり；
Ｂは、Ｎ又はR3−N+であって、R3は上記の定義通りであり；
Ｅは、CR6R7、CHR6CHR7又はCR6R7CH2であって、R6は水素でありR7は天然に存在するαアミノ酸の側鎖から成る群から選択されるか、又はR6及びR7は、水素、（C2−C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1−C6）アルコキシ、（C1−C6）アルキルチオ、NR3R4及びSR5から成る群から独立して選択され、R3及びR4は上記の定義通りであり、R5は、水素；（C1−C6）アルキル；ヒドロキシ、アルコキシ又はアルキルチオ置換（C1−C6）アルキルであるか、又はR6及びR7は一緒に脂環系又はヘテロ環系をとり；
Ｄは、CR6R7、CH2CR6R7又はCHR6CHR7であって、R6及びR7は上記の定義通りであり；そして
Ｇは、いずれの方向でもよい、−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−又は−NR3SO2−であって、R3は上記の定義通りである。］
の部分を含有する。
より好ましい態様では、本発明の化合物は式II:
0003595345.tif 000018
［式中：
R8は、Ｈ、COCH3又はアミノ保護基であり；
R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖であり；
R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基であり；
Ｗは−（CH2）ｍ−であって、ｍは０〜約６であるか、又は
0003595345.tif 000019
（式中、ｂは０〜４の整数である。）であり；
ｋは、０〜約５であり；
ｎは、０又は１であり；
Ｌは、式：
0003595345.tif 000020
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又はR11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；そして
Ｔは、式：
0003595345.tif 000021
（ｊ及びｚは、それぞれ独立して０〜約５であって、ｊとｚの和は１〜７であり；
Ｍは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり；
Ｖは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして
ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して０又は１である。）を有する。］
の部分を含有する。
本発明の化合物の好ましい態様には、式IIの部分を１つ又はそれ以上含有するオリゴマー化合物が含まれる。このオリゴマーには、式IIの部分が１つほどであっても、そのオリゴマーのモノマー単位の大部分が式IIの部分であってもよい。
本発明の化合物のさらに好ましい態様には、１つ又はそれ以上の連結部分によって連結している２つのPNAオリゴマーであって、そのPNAオリゴマーの片方又は両方が式IIの部分を少なくとも１つ含有するオリゴマー（ビスPNAオリゴマー）を包含する。本発明は、また、複数のPNAオリゴマーが連結部分によって連結しているより高次に連結したPNAオリゴマーであって、１つ又はそれ以上の連結したPNAオリゴマーが式IIの部分を少なくとも１つ含むオリゴマーを包含する。
本明細書で使用する“ペプチド核酸”（PNA）という用語は、ある点ではオリゴヌクレオチドに類似しているが、構造において異なる化合物を意味する。ペプチド核酸では、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格がペプチド連結を有する骨格に置換されている。各サブユニットは、天然に存在するか又は天然には存在しない塩基を付けている。１つのそのような骨格は、アミド結合を介して連結したＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位から構築される。
本発明は、また、例えば本発明のPNAオリゴマーの製造において有用であるPNAモノマーを提供する。幾つかの好ましい態様では、本発明のPNAモノマーはアキラルな骨格を有する。アキラルなPNA骨格の１つの好ましい例は、２−アミノエチルグリシン骨格である。例えば、国際特許出願WO92/20702号及びWO92/20703号を参照のこと。これらの内容はいずれも参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
他の好ましい態様では、本発明はキラルな骨格を含有するPNAモノマーを提供する。幾つかの好ましい態様では、脂環式構造の取込みを介してキラリティーがPNA骨格に導入される。１つの特に好ましい態様では、この脂環式構造には、アミノエチルグリシン骨格の２−アミノエチル部分のα及びβ炭素が含まれ、式：
0003595345.tif 000022
（式中、ｂは、０〜４の整数であり；αはグリシルアミノ基に隣接する炭素を示し；そしてβは、α炭素に隣接する１つの炭素を示す。）を有する。この脂環式構造は、４、５、６又は７員環であり得る。好ましい態様ではこの脂環式構造は５又は６員環であり、特に好ましいのは６員環である。
光学的に活性な試薬を使用することで、純粋なSS、RR、SR及びRS異性体の合成が可能になる。本発明の幾つかの態様で好ましいのは、SS異性体である。
典型的には、キラル骨格を有するモノマーは、シス又はトランス異性体として入手可能な（1,2）−ジアミノシクロヘキサンを使用して製造される。このシス−（1,2）−ジアミノシクロヘキサンはメソ化合物である。このようなメソ化合物の使用は、ラセミ混合物の分割を必要とする。トランス−（1,2）−ジアミノシクロヘキサンは、鏡像異性体に純粋な形態として市販されているので、その骨格の２−アミノエチル部分のＣα及びＣβのいずれについてもキラリティーが予め決定されたモノマーによく適している。
このジアミンは、典型的にはアミノ基の１つをジ−ｔ−ブチルピロカーボネート（Boc2O）で保護されてからブロモ酢酸メチルでＮ−アルキル化され、キラルな骨格となる。DOC/DhbtOHを使用してリガンド（必要に応じて適切に保護される）をこのキラル骨格とカップリングさせてから塩基性加水分解をすれば、キラルな骨格を含有する所望のモノマーが得られる。このやり方で、SS及びRRモノマーが合成され得る。RS及びSR異性体は、シス−（1,2）−ジアミノシクロヘキサンを使用し、得られるラセミ混合物を分割すれば合成できる。分割は、例えば、液体クロマトグラフィーによって達成され得る。
得られるモノマーは、配座上の制限が増えるので、そのモノマーの親油性を高めると考えられる。キラル骨格を含むPNAモノマーは、1994年12月28日に出願された同時出願中の米国特許出願第08/366,231号に開示されており、その内容はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
本発明の少なくとも１つのキラルモノマーを含むPNAオリゴマーは、当業者に知られている方法によって製造される。アミノ酸をペプチドへ段階的又は断片的に固相アセンブリーするための確立された方法は、普通、弱く架橋結合したスチレン−ジビニルベンゼン共重合体のビーズ化マトリックスを利用し、その架橋結合した共重合体は、ジビニルベンゼンの混合物が付加したスチレンモノマーの粒状重合によって形成されたものである。１〜２％レベルの架橋結合が通常利用される。そのようなマトリックスは、また、本発明による固相PNA合成でも使用することができる。
幾つかの好ましい態様では、本発明のPNAオリゴマーは、１つ又はそれ以上のキラルなモノマーサブユニットを含有する。本発明のPNAオリゴマーは、１つのキラルサブユニット又は複数のキラルサブユニットを含有しても、キラルサブユニットから主に又は完全に構成されてもよい。
好ましくは、PNAオリゴマーは、標的分子に相補的である、即ち、PNAオリゴマーの少なくとも一部分が、ワトソン−クリック型の塩基対吸引力により標的分子に、又はHoogsteen型の水素結合により、三重鎖構造にハイブリダイズする能力を有するように製造される。
好ましい態様では、PNA骨格のアミノアルキル窒素は、式II及びIVにおいてR8と表示される置換基を有し得る。好ましくは、R8は、水素、COCH3又はアミノ保護基である。
本発明の化合物上に存在する官能基は，保護基を含有し得る。保護基そのものは、アミノ基やカルボキシル基のような官能基へ選択的に付け外しできる化学的官能基として知られている。これらの基は、ある化合物中に存在して、その化合物がさらされる化学反応条件に対してそのような官能基を不活性にする。あらゆる多種多様な保護基が本発明で利用され得る。アミノ基に対する１つの好ましい保護基はBoc基である。本発明による他の好ましい保護基は、Greene,T.W.及びWuts,P.G.M.,“Protective Groups in Organic Synthesis"2d.Ed.,Wiley ＆ Sons,1991に見出し得る。
置換基R9は、水素又は天然に存在するアミノ酸の側鎖である。本明細書で使用する“アミノ酸”という用語は、アミノ基及びカルボキシル基を両方含む分子を意味し、CH（COOH）（NH2）−（側鎖）という一般式を有する。天然に存在するアミノ酸は、自然界で見出されるアミノ酸、即ち、生物体によって産生されるものである。１つの代表的なアミノ酸側鎖は、リジンの側鎖、つまり−（CH2）４−NH2である。他の代表的な天然に存在するアミノ酸は、例えば、Lehninger,Biochemistry,Second Edition,Worth Publications,Inc.,1975,pages 73−77に見出され得る。
好ましい態様では、R10は、Ｏ、NH、Ｏ−アルキレン又はリジン残基である。本明細書で使用する“アルキル”という用語には、例えば、エチル、イソプロピル及びシクロプロピル基のような直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素基が含まれる。好ましいアルキル基は、１〜約10の炭素原子を有する。“アルキレン”という用語は、二価のアルキル基、即ち、メチレン（−CH2−）、エチレン（−CH2CH2−）、プロピレン（−CH2CH2CH2−）等を意味する。
“アルコキシ”という用語は、−Ｏ−アルキル基としてのその慣例的な意味を有する。“アルキルチオ”基は、−Ｓ−アルキルという式の基を意味する。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
アリールという用語は、例えば、フェニル、ナフチル、キシリル、ピロール及びフリル基を含む単環式及び多環式芳香族の基を表すためのものである。アリール基（例、イミダゾール基）は、３つ程度に少ない炭素原子を含み得るが、好ましいアリール基は６〜約14の炭素原子を、より好ましくは６〜約10の炭素原子を含有することができる。本発明によるアラルキル及びアルカリール基は、それぞれ、アルキルとアリール部分とを含む。アラルキル基は、そのアルキル部分を介して結合し、アルカリール基はそのアリール基を介して結合する。ベンジル基は、アラルキル基の１つの例を提供し、ｐ−トルイルは、アルカリール基の１例を提供する。本明細書で使用する“ヘテロ環”という用語は、窒素、イオウ又は酸素のようなヘテロ原子を少なくとも１つ含む環系を意味する。“ヘテロアリール”という用語は、アリールへテロ環基を特に意味する。
本発明の文脈では、“ポリヌクレオチド”という用語は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーを意味する。
本発明のPNAモノマーでは、アデノシン−チミジンヌクレオベース対の認識部分が、式Ｉの置換基Ａとして表されるつなぎ部分（tether）によってPNA骨格に結合している。幾つかの好ましい態様では、このつなぎ部分は、好ましくはPNA骨格の窒素原子と結合するカルボニル基が末端になる。より好ましい態様では、このつなぎ部分は、２−アミノエチルグリシン骨格のグリシル窒素に結合しているカルボニル基が末端になる。さらに好ましい態様では、このつなぎ部分は、２−アミノエチルグリシン骨格のキラルな誘導体のグリシル窒素に結合しているカルボニル基が末端になり、そのアミノエチルグリシン骨格の２−アミノエチル部分のα及びβ炭素は、上記のように、脂環式環の一部になる。
幾つかの好ましい態様では、PNA結合カルボニル基に結合したつなぎ部分は、式：
0003595345.tif 000023
（式中、ｊ及びｚは、それぞれ独立して、０〜約５であるが、ｊとｚの和は１〜７であり;Gは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、フェニル又はＰ（Ｏ）２であり;Xは、NH、Ｓ又はCH2であり；そして、ａ、ｈ及びｇは、それぞれ独立して、０又は１である。）を有する。幾つかの好ましい態様では、つなぎ部分は、アルキル又はアルキルアミノであり、好ましくは、約６より少ない炭素、特に好ましくは２つの炭素を有する。特に好ましいつなぎ部分には、−CH2−CH2−NH−、−CH2−、−CH2CH2−、−Ｏ−CH2−CH2−及び−Ｏ−CH2−CH2−CH2−基が含まれる。三重鎖構造の相補的な位置に存在しているリガンドとAT（特にチミン）との間の相互作用を最大化すべき適切な配置及び方向をリガンドが有するように、つなぎ部分を選択することが望ましい。好ましくは、つなぎ部分は、直鎖状で、直鎖のなかに３〜６の原子、より好ましくは４〜５の原子、特に好ましくは４つの原子を含む。
幾つかの好ましい態様では、そのエチル部分にキラル中心を有する少なくとも１つのPNAモノマーが、ミスマッチ（即ち、標的分子の変異性）の起こることが予測されるか又は知られている部分でPNAオリゴマーへ取り込まれる。
本発明のPNAオリゴマーは、それへ結合する多様な置換基を有し得る。例えば、幾つかの好ましい態様では、本発明のオリゴマーはPNAのより容易な検出又は輸送をもたらす結合基（conjugate group）を有する。この結合基は、レポーター酵素、レポーター分子、ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、タンパク質、芳香族親油性分子、非芳香族親油性分子、リン脂質、インターカレーター、細胞受容体結合性分子、架橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、RNA開裂性複合体、金属キレート剤、ポルフィリン、アルキル化剤、及び、ポリマーアミン、ポリマーグリコール及びポリエーテルのようなポリマー化合物であり得る。本発明のPNAには、直接的に又は所望により連結部分を介して結合している１つ又はそれ以上の結合体（conjugate）が含まれ得る。そのように誘導体化されるとき、PNAは、例えば、診断薬又は治療薬として、ある試験構造体の相補的な核酸又は三重鎖へ他の特質を与えるのに、又は細胞膜を越えて治療薬又は診断薬を輸送するのに有用である。
上記の結合基は、PNA骨格上の任意のところで、つまり、式IIのモノマー単位上かPNAの他のところのいずれかで、本発明のPNAオリゴマーに結合させることができる。この結合基は、モノマーに結合して、PNAオリゴマーの中へ取込まれ得る。別のやり方では、この結合基は、構成モノマーからのアセンブリーの後にPNAオリゴマーと結合させてもよい。結合基を付けるための方法は、1994年10月６日に出願された同時出願中の米国出願第08/319,411号に開示されている。なお、その内容はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
幾つかの特に好ましい態様では、本発明のオリゴマー化合物は、発色団又は発蛍光団、例えば、フルオレセイン又はローダミンのようなレポーター分子を有する。例えば、少なくとも１つのキラルモノマーを有するものを含め、本発明のPNAオリゴマーは、アミノヘキサンのリンカー基を使用して、フルオレセイン又はローダミンを含むように容易に誘導体化される。これら誘導体化されたPNAオリゴマーは、興味の対象のDNAのある断片に対するプローブとしての使用によく適している。当業者は、本発明が多種の他のタイプの標識試薬又はリンカーに適用できることを理解するであろう。
式Ｉ〜IVの置換基Ｌによって表される、本発明の化合物のアデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、三重らせん鎖のチミジンに相補的な（つまり、アデノシン−チミジン塩基対に相補的な）位置に通常見出されるヌクレオベースの代用物である。本発明のアデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、アンチセンスの応用では、二重鎖と三重鎖モチーフのいずれによっても、チミンの代用物として使用され得る。
ワトソン−クリック型のアデノシン−チミジン塩基対に相補的な位置にアデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分を含有するモノマー単位を有する（即ち、ワトソン−クリック型のアデノシン−チミジン塩基対に相補的な位置に式Ｉ又はIIのモノマー単位を有する）本発明のオリゴマーを取込んだ三重鎖構造は、ワトソン−クリック型のアデノシン−チミジン塩基対に相補的な部位に天然のヌクレオベースを有する点を除けば同一である三重鎖構造と比較して、増加した結合性を示す（つまり、より高い融解温度を有する）。それ故、本発明の化合物は、この増加した結合性によって、三重らせん構造の中のチミン残基を“認識する”ことができる。従って、本明細書で定義される“アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分”という用語は、三重らせん構造においてワトソン−クリック型の塩基対と結合し得る天然のヌクレオベースに代わって用いられるとき、そのアデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分を有さない同一の三重鎖と比較して、より増加した結合性を有する三重鎖構造を形成する、非天然のヘテロ環部分である。
本発明の幾つかの好ましい態様では、アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、Ｃ−ピリミジン（例えば、つなぎ部分で又はつなぎ部分なしで骨格にピリミジンを連結させている結合が窒素原子ではなく炭素を介してなされているピリミジン）又はイソピリミジンである。
式Ｉ〜IVの−Ｔ−Ｌによって表される、本発明の化合物のアデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分及びつなぎ部分は、三重鎖構造、例えばPNA:DNA−PNA三重鎖構造のDNA部分の相補的なチミジン残基に対して最大の親和性をもたらすように選択される。特定の理論に拘束されることを望むわけではないが、ワトソン−クリック型の二重らせん構造の主溝におけるＴ−Ａ塩基対のチミンを認識するためには、リガンドは、チミンの５−メチル基を回避するに十分な自由度をもたらすつなぎ部分のあるPNA骨格に結合されることが望ましいと考えられる。さらに、選択されたリガンドは、好ましくはチミンの４−オキソ基に結合し得る水素供与体を有する。さらに有用な特徴は、リガンド上に位置しているか又は結合していて、アデニンのＮ−６水素原子と水素結合を形成する水素受容体として機能し得る、第二の官能基の存在である。ワトソン−クリック型の二重らせん構造でチミンを認識する本発明の化合物は、これら属性を有すると考えられる。
アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、当業者に知られている方法によって選択され得る。例えば、アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、Biosym,San Diego,Carforniaから入手可能なInsight II及びDiscoverプログラムのような適切なコンピュータモデルプログラムによって選択され得る。
幾つかの好ましい態様では、アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、式：
0003595345.tif 000024
を有する。
他の好ましい態様では、アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分は、式：
0003595345.tif 000025
（式中、
Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又は、R11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）
を有する。
別の好ましい態様では、アデノシン−チミジンヌクレオベース対認識部分に結合しているつなぎ部分、つまり式ＩのＡ又は式IIのＴは、−CH2−CH2−NH−、−CH2−、−CH2−CH2−、−Ｏ−CH2−CH2−、又は−Ｏ−CH2−CH2−CH2−基である。
特に好ましい態様では、本発明のモノマーは、式：
0003595345.tif 000026
［Ｌは、式：
0003595345.tif 000027
（Ｑは、CH又はＮであり；
R17は、Ｈ又はC1−C8アルキルであり；
R11及びR12は、それぞれ独立して、Ｈ、C1−C8アルキル又はハロゲンであるか；
又は、R11及びR12は、それらが結合している炭素原子と一緒にフェニル基を形成する。）を有し；
Ａは、単結合、メチレン基又は、式；
0003595345.tif 000028
（式中：
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり；
ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、０又は１〜５の整数であり；
R1及びR2は、水素；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換され得る（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ；アミノ及びハロゲンから成る群からそれぞれ独立して選択され；
R3及びR4は、水素；（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ又はアルコキシ又はアルキルチオ基で置換された（C1−C4）アルキル；ヒドロキシ；アルコキシ；アルキルチオ及びアミノから成る群からそれぞれ独立して選択さる。）の基であり；
R15は、OH、保護されたヒドロキシル基、又は保護基であり；そして
R16は、Ｈ又は保護基である。］
を有する
本発明のPNAオリゴマー及び連結したPNAオリゴマーは、PNA2/DNA三重らせん構造を形成するのに有用である。本発明の化合物の好ましい態様には、PNA鎖の少なくとも１つが、式Ｉ、好ましくは式IIによるモノマー部分を少なくとも１つ含有する三重らせん（即ち、三重鎖）PNA・DNA−PNA構造が含まれる。より好ましい態様では、PNA・DNA−PNA内の２つのPNAオリゴマーがビス−PNAの構成メンバーになる；即ち、２つのPNAオリゴマーが１つ又はそれ以上の連結部分（“連結基”）によってともに連結される。
本発明の化合物においてPNAオリゴマーを連結する連結部分は、そのPNAオリゴマーが三重鎖構造を形成するに十分な自由度を有するように選択される。多種の基が連結部分として使用され得、例えば、アミノ酸基によって連結される“egl基”（エチレングリコール）及び“Aha基”（６−アミノヘキサン酸）がある。さらなる連結セグメントには、α−アミノ酸、特にグリシン又はリジンとの空間を占める上記のAha基が含まれる。１つの特に好ましい連結部分は、カップリングしたときに“多重エチレングリコール単位”（“egl"）を効果的にもたらす１つ又はそれ以上の８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸残基である。
広範囲の他の化合物も連結セグメントに有用であり、従って、本発明の範囲内に含まれる。一般に、連結セグメントは、１つ又はそれ以上の官能基からなる空間スパン（Space spanning）基で分離された一級アミノ基とカルボキシル基を有する化合物である。幾つかの代表的な空間スパン基は、C1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C20アルキニル、少なくとも１つのＯ又はＳ原子を有するC1〜C20アルカノイル、C7〜C34アラルキル、C6〜C14アリール及びアミノ酸である。好ましいアルカノイル基は、Ｏ又はＳのような１〜10個のヘテロ原子を有し得る。好ましいアルカノイル基には、メチル、エチル及びプロピルアルカノキシ、特にポリエトキシ、即ち、エチレングリコールが含まれる。α−アミノ酸のＤ、Ｌ及びDL異性体を含むアミノ酸、並びに長鎖のアミノ酸も、一緒に連結して連結セグメントを形成することができる。特に好ましいアミノ酸は、６−アミノヘキサン酸である。空間スパン基として使用されるアラルキル基は、芳香環上に位置するか又は１つ若しくはそれ以上のCH2基で隔てられているアミノ基又はカルボキシ基を有し得、この場合、CH2基の総数は20以下である。アラルキルが連結したPNAの置換位置は様々であり得るが、現時点ではオルト及びメタが好ましい。というのは、これらの位置での置換、特にオルトでの置換は、ビス−PNAが曲がって、この２つの結合したペプチド核酸鎖がお互いに平行な空間配置をとることが促進されるからである。誘発された湾曲部を含む他の群のビスPNAは、シス−アルケニルリンカー又はプロリンリンカーを取込むものである。
連結セグメントを選択するときに１つ考慮すべきことは、PNA化学との適合性、及びPNAの一末端上の官能基を第二のPNAの一末端上の官能基に連結する能力である。また、連結セグメントは、２つの連結したPNAがssDNA、ssRNA又はdsDNAと、２つの独立したPNA一本鎖が相互作用するのと同じように相互作用し得るほど柔軟であるように選択され得る。有効であることが分かった幾つかの好ましい連結セグメントは、23及び24原子の長さを有する。
本明細書で使用する“相補的”という用語は、核酸（RNA又はDNA）二重鎖;PNA−核酸二重鎖；核酸、PNA又はそれらの混合物を含む三重鎖構造の内部にワトソン−クリック型又はHoogsteen型の結合を形成する能力としてのその慣例的な意味を有する。
本発明のPNA2/DNA化合物では、PNAオリゴマーは典型的にはワトソン−クリック型の逆平行鎖として製造され、追加的なPNAオリゴマーは平行（例えば、Hoogsteen型の）鎖として製造される。１つの好ましい態様では、本発明のPNAモノマーは、Hoogsteen型の鎖において、標的核酸のチミン又はウラシルに相補的な位置で使用されて、このHoogsteen型の鎖の結合性が増加し、その結果、形成される三重らせんの融解温度（Tm）が増加する。
本明細書で使用する“結合親和性”という用語は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性の相互作用等を介して標的分子に結合する２重鎖の能力を意味する。標的分子には、一本鎖DNA又はRNA、並びにDNA、RNA及びPNAのようなそれらの類似体間の二重鎖が含まれる。
本明細書で使用する“ヌクレオベース”という用語は、核酸の二重鎖又は三重鎖構造中のワトソン−クリック型又はHoogsteen型の結合に参画し得るヘテロ環塩基というその慣例的な意味を有する。これらには、天然のヌクレオベースであるアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル、並びにDNA又はRNA類似体において天然のヌクレオベースの機能を模倣することが知られている非天然のヌクレオベース（つまり、ヌクレオベースの類似体）が含まれる。代表的なヌクレオベース類似体は、例えば、S.T.CrookとB.Lebleu編，“Antisense Research and Application,Chapter 15,CRC Press,1993及びMeriganらへの米国特許第3,687,808号に見出される。なお、これらの内容はそのまま参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
幾つかの好ましい態様では、本発明のPNAオリゴマーは、核酸標的とともに三重らせん構造を形成し、ここでPNAオリゴマーはこれまでに報告されているPNAオリゴマーに比較して増加した結合親和性を有する。核酸標的中のチミン又はウラシルに相補的な位置に式Ｉ〜IVのPNAモノマー部分を有するPNAオリゴマー及び連結したPNAオリゴマーは、チミン又はウラシルに相補的である位置にアデニンを有する連結したPNAオリゴマーで形成される同一の三重鎖構造に比較して、向上した結合特異性を示す（以下の実施例５を参照のこと）。
従って、本発明のPNAオリゴマー及び連結したPNAオリゴマーには、チミジン残基を含有するオリゴヌクレオチド配列を検出又は同定することが望まれる用途がある。従って、本発明のPNAオリゴマーは、研究試薬及び診断ツールとして有用である。１つの好ましい態様では、本発明のオリゴマー及び連結したオリゴマーは、１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する、病的な状態との関連が疑われる核酸配列の検出に有用である。従って、本発明には、病的な状態との関連が疑われる核酸配列、及び少なくとも１つの本発明のPNAオリゴマーを含有する三重鎖構造が含まれる。
幾つかの好ましい態様では、病的な状態との関連が疑われる配列をコードしかつ１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖DNA;該一本鎖核酸のある領域に相補的な領域を含む第一ペプチド核酸；及び該一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含む第二ペプチド核酸であって、該一本鎖核酸のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に式Ｉの残基、好ましくは式IIの残基を有する第二ペプチド核酸、を含む本発明の組成物が提供される。
本発明は、また、三重鎖の化合物を形成する方法であって、（ａ）１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する一本鎖の核酸を選択すること；（ｂ）該一本鎖核酸のある領域に相補的である領域を含む第一オリゴマーを提供すること；及び（ｃ）該一本鎖核酸及び第一オリゴマーを、該三重らせん化合物を形成するのに有効な時間及び条件下で、第二オリゴマーと接触させることを含んでなり、その際、該第二オリゴマーが、該一本鎖核酸のある領域に相補的な配列を含み、かつ該一本鎖核酸のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に式Ｉ又はIIの残基を有する方法を提供する。
幾つかの好ましい態様では、一本鎖の核酸は、病原性のような生物学的活性について選択される。次いで、第一オリゴマーは、この一本鎖核酸のある領域、好ましくは１つ以上のチミン残基を有する領域に相補的である領域を含むように合成される。これら一本鎖核酸及び第一オリゴマーの第二オリゴマーとの接触は、当技術分野で知られている三重鎖形成を促進する様々な方法によって実現され得る。例えば、サンプル中の核酸をインビトロで定量するための米国特許出願第08/088,661号を参照のこと。これは、前記第一及び第二オリゴマーとそのサンプルに対する有効な三重鎖形成に必要なすべての試薬を所望により含有する１つ又はそれ以上の溶液をピペッティングすることによってなし得る。
好ましい態様では、既知のヌクレオベース配列を含有する化学的又は微生物学的実体を検出するため方法であって、ａ）１つ又はそれ以上のチミン残基を含有する化学的又は微生物学的実体からヌクレオベース配列を選択すること;b）該選択されたヌクレオベース配列に相補的な領域を含有するPNAオリゴマーを提供すること;c）該化学的又は微生物学的実体の該選択されたヌクレオベース配列及び該相補的なPNAオリゴマーを、該選択されたヌクレオベース配列に相補的である配列を含有するさらに別のPNAオリゴマーと接触させて、三重らせん化合物を形成すること、この際、該さらに別のPNAオリゴマーは、該選択されたヌクレオベース配列のチミン残基に相補的な１つ又はそれ以上の位置に式Ｉ又はIIの残基を有する；及びｄ）該三重らせん化合物を検出することを含んでなる方法が提供される。
三重らせん化合物の検出は、上記のように本発明の化合物に共有的又は非共有的に結合している発色団又は発蛍光団のようなレポーター分子の検出によって達成され得る。有用な結合体は、WO95/14708、WO95/16202及びWO92/20703に記載されている。別のやり方では、検出は、Tm試験、質量測定および架橋試験を含む、いくつかの手段のうち任意のもので成し得る。
さらに別のPNAオリゴマーは、別のやり方では、固体支持体上での固定化を可能にするポリスチレンのような部分に結合し得る。そのような部分の１つの例は、ストレプタビジンのコーティングを介してポリスチレンに結合し得るビオチンである。次いで、三重らせん構造の形成は、他のPNAオリゴマー又は化学的な実体のヌクレオベース配列のいずれかに結合したラベルによって達成され得る。
化学的な実体とは、化学合成されたオリゴマー及び化学的又は酵素的に（例、PCR）増幅されたヌクレオベース配列を含有する化合物を含むと解釈される。本発明に関連した微生物学的な実体とは、例えば、動物、脊椎動物、細菌又は植物由来の細胞、又はHIV又はHBVのようなウイルス、プラスミド又はゲノムを含むと解釈される。
これら分析方法において、さらに別のPNAオリゴマーが取込まれた三重鎖構造の形成は、分析されるサンプル、例えば、上記の化学的又は微生物学的な実体を含有するサンプル中のその実体の存在を示すものとして解釈される。
本発明は、また、前記ポリヌクレオチドを式Ｉ又はIIの化合物と接触させることを含む、二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識のための方法を提供する。
本発明は、さらに、二本鎖ポリヌクレオチドの配列特異的認識方法であって、該ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドと結合して三重鎖構造を形成するオリゴマー化合物と接触させることを含み、該オリゴマー化合物が、式Ｉ又はIIを有するモノマー単位を含む方法を提供する。
本発明の追加的な利点及び新規な特徴は、以下に提示されるその実施例を検討すれば、当業者に明らかになるだろう。ただし、それらは添付の特許請求を限定すると解されてはならない。
実施例
化合物IIないしＶの合成を下記スキーム１にまとめる。
0003595345.tif 000029
実施例１
Ｎ−（３−クロロピリダジン−６−イル）−３−アミノプロピオン酸（化合物II）
無水エタノール（20mL）中の3,6−ジクロロピリダジン（50.0ミリモル、7.45g）及び３−アミノプロピオン酸（60.0ミリモル、5.34g）の溶液に炭酸カリウム（30.0ミリモル、4.15g）を添加し、その懸濁液を加熱して３時間還流させた。この混合物を室温に冷却し、その明褐色固体残滓を酢酸エチル（300mL）と水（300mL）とに分配した。水相のpHを2M塩酸水溶液で3.5に調整し、黄色固体を濾過し、無水エタノール（10mL）及びジエチルエーテル（２×20mL）で洗浄して5.04g（50％）を得た。TLCでのRfが0.31（ジクロロメタン／メタノール／酢酸、85:10:5）であることから、この生成物は純粋であった。
Mp217−218℃（分解）;1H NMR（DMSO−d6）：δ12.24（bs、1H、COOH）、7.34（ｄ、Ｊ＝9.0Hz、1H、芳香族）、7.22（ｍ、1H、NH）、6.92（ｄ、Ｊ＝9.0Hz、1H、芳香族）、3.51（ｑ、Ｊ＝6.6Hz、2H、（CH2）Ｎ）、2.63（ｔ、Ｊ＝6.6Hz、2H、（CH2）Ｃ（Ｏ））。13C NMR（DMSO−d6）：δ173.08、158.18、145.31、128.59、118.58、36.99、33.34。
実施例２
Ｎ−（３−ベンジルオキシピリダジン−６−イル）−３−アミノプロピオン酸（化合物III）
水素化ナトリウム（22.0ミリモル、0.88g）をベンジルアルコール（10mL）に溶解した。得られた溶液にＮ−（３−クロロピリダジン−６−イル）−３−アミノプロピオン酸（10.0ミリモル、2.01g）を添加し、その混合物を約165℃（油浴180℃）に３時間加熱した。室温に冷却した後、水（120mL）を添加し、水相をジクロロメタン（３×50mL）で抽出した。2M塩酸水溶液でpHを4.0に調整した。その明褐色沈殿を濾過し、水（２×1mL）で洗浄して五酸化リンで乾燥させた。得られた固体を乾燥させて表題の化合物1.36g（47％）を得た。TLCでのRfが0.16（ジクロロメタン／メタノール／酢酸、85:10:5）であることから、この生成物は純粋であった。
Mp258−259℃（分解）;1H NMR（DMSO−d6）：δ12.21（bs、1H、COOH）、7.5−7.3（ｍ、5H、芳香族）、6.93（ｄ、Ｊ＝9.3Hz、1H、芳香族）、6.89（ｄ、Ｊ＝9.3Hz、1H、芳香族）、6.54（ｍ、1H、NH）、5.32（ｓ、2H、CH2−Ph）、3.47（ｔ、Ｊ＝6.6Hz、2H、（CH2）Ｎ）、2.63（ｔ、Ｊ＝6.6Hz、2H、（CH2）Ｃ（Ｏ））;13C NMR（DMSO−d6）：δ173.39、158.60、156.07、137.41、128.39、128.04、127.80、120.71、119、34、67.40、37.25、33.64;FAB＋:274.1（Ｍ＋１）。
実施例３
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−［N'−｛（３−ベンジルオキシ）ピリダジン−６−イル｝−３−アミノプロピオニル］グリシンエチル（化合物IV）
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンエチル（1.80ミリモル、444mg）をジメチルホルムアミド（12mL）に溶解し、Ｎ−（３−ベンジルオキシピリダジン−６−イル）−３−アミノプロピオン酸（1.98ミリモル、542mg）及び３−ヒドロキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−４（3H）−オン（2.0ミリモル、326mg）を添加した。この混合物を氷浴において冷却し、N,N'−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（2.2ミリモル、454mg）を添加した。１時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空下で蒸発させ、ジクロロメタン（40mL）に再溶解して５パーセント重炭酸ナトリウム水溶液（２×20mL）で洗浄した。アセトニトリル（10mL）を添加し、有機相を真空下で蒸発させた。その粗製生成物を、シリカカラムを用いてジシクロメタン／メタノール（97:3）で溶出して精製した。生成物を含む画分をプールし、真空下で蒸発させて表題の化合物0.704g（78％）を得た。TLCでのRfが0.41（ジクロロメタン／メタノール、90:10）であることから、この生成物は純粋であった。
1H NMR（CDCl3）：δ7.5−7.3（ｍ、5H、芳香族）、6.79（ｄ、Ｊ＝9.3Hz、1H、芳香族）、6.71（ｄ、Ｊ＝9.3Hz、1H、芳香族）、5.72（ｍ、1H、NH）、5.40（ｓ、2H、CH2−Ph）、5.31（ｍ、1H、NH）、4.19（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、4.01及び4.06（ｓ、2H、Ｏ（CH2）−Ph）、3.78（ｍ、2H、CH2）、3.50（ｍ、2H、CH2）、3.26（ｍ、2H、CH2）、2.76及び2.60（ｍ、2H、CH2）、1.41及び1.39（ｓ、9H、Boc）;13C NMR（CDCl3）：δ173.30（mi.）及び173.07（ma.）、170.01、169.50、159.34、155.99（mi）及び155.70（ma.）、137.05、128.40、128.18、127.89、120.70、119.94、79.42、68.37（ma.）及び68.27（mi.）、61.76（mi.）及び61.36（ma.）、50.49（mi.）及び49.24（ma.）、48.75（ma.）及び47.60（mi.）、38.96（ma.）及び38.77（mi.）、37.80（mi.）及び37.50（ma.）、32.05（mi.）及び31.93（ma.）、28.36、14.11;FAB＋:502.3（Ｍ＋１）。
実施例４
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−［N'−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６イル）−３−アミノプロピオニル］グリシン（化合物Ｖ）
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−［N'−（（３−ベンジルオキシ）ピリダジン−６−イル）−３−アミノプロピオニル］グリシンエチル（0.88ミリモル、440mg）をテトラヒドロフラン（4.25mL）に懸濁させた。この懸濁液を冷却し、1M水酸化リチウム水溶液（2.5mL）を添加した。30分後、ジクロロメタン（6mL）を添加し、有機相を水（6mL）で抽出した。2M塩酸水溶液を滴下により添加することで水相のpHを4.0に調整し、その水相をジクロロメタン（6mL）で抽出した。有機相を真空下で蒸発させ、無水エタノール（30mL）に溶解してパラジウム／炭素触媒（240mg）を添加した。この混合物を２時間水素化し、触媒を濾別した。得られた溶液を減圧下で濃縮した後、高真空下で乾燥させて表題の化合物333mg（80％）を得た。TLCでのRfが0.07（ジクロロメタン／メタノール、80:20）であることから、この生成物は純粋であった。
1H NMR（アセトン−d6）：δ7.09（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.75（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.22及び6.06（ｍ、1H、NH）、5.75（ｍ、1H、NH）、4.23及び4.10（ｍ、2H、CH2）、3.46（ｍ、2H、CH2）、3.28及び3.23（ｍ、2H、CH2）、2.78及び2.58（ｍ、2H、CH2）、1.39及び1.38（ｓ、9H、Boc）;FAB＋:384.1（Ｍ＋１）。
実施例５
核酸標的中のチミジン（Ｔ−Ａ塩基対）に対する３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジンの特異性の評価
ビス−PNAを含むPNAオリゴマーの合成をEgholmら,J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1895−1897及び9677−9678に説明される通りに行った。Linked Peptide Nucleic Acidsと題する公開PCT出願WO96/02558号も参照のこと。
３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン基を有するPNAオリゴマーによるオリゴデオキシヌクレオチド中のチミジンに対する特異性を決定するため、10量体標的配列を含む16量体オリゴデオキシヌクレオチドを調製し、Hoogsteen鎖の２つの位置で基が変化する３種類のビス−PNAで処理した。これらのビス−PNAは、２つの10量体PNAを３つを連続する８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸基を介して結合させて調製した。これら２つの10量体は以下に示されるように逆平行に結合させた。Hoogsteen鎖における（標的配列によって決定されるような）通常はプロトン化シトシンが存在する位置は、シュードイソシトシン（Ｊ）が占めている。
0003595345.tif 000030
これらの３種類のビス−PNAは、上記の図において変数Ｘで指定される基に関してのみ異なっていた。各ビス−PNAの結合をPNA及びDNAが約３μＭの溶液で、100m MNaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM EDTA中のpH7.0で測定した。260nmでの吸収を５〜90℃まで0.5℃間隔で記録した。
0003595345.tif 000031
0003595345.tif 000032
Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン基は、主鎖に結合する塩基を持たないヌル位置である。Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン基は積み重なることも、チミンと水素結合を形成することもできない。グアニンは、DNA三重らせんにおいてグアニンがチミン（Ｔ）と相互作用してかなり安定なG:T−Ａトリプレットを形成することが報告されている（Bestら,J.Am.Chem.Soc.,1995,117,1187−1193を参照）ため、比較として用いた。
Tmの増加は、３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジンによるチミジンに対する特異性の増加のためであると信じられる。この増加はグアニンよりもかなり大きい。
実施例６
核酸標的中のシチジン（Ｃ−Ｇ塩基対）に対する３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジンの特異性の評価
ビス−PNAを含むPNAオリゴマーの合成をEgholmら,J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1895−1897及び9677−9678に説明される通りに行った。Linked Peptide Nucleic Acidsと題する公開PCT出願WO96/02558号も参照のこと。
３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン基を有するPNAオリゴマーによるオリゴデオキシヌクレオチド中のチミジンに対する特異性を決定するため、10量体標的配列を含む16量体オリゴデオキシヌクレオチドを調製し、Hoogsteen鎖の２つの位置で基が変化する３種類のビス−PNAで処理した。これらのビス−PNAは、２つの10量体PNAを３つの連続する８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して結合させて調整した。これら２つの10量体は以下に示されるように逆平行に結合させた。Hoogsteen鎖における（標的配列によって決定されるような）通常はプロトン化シトシンが存在する位置は、シュードイソシトシン（“J"で表示）が占めている。
0003595345.tif 000033
これらの３種類のビス−PNAは、上に示される構造において変数Ｘで指定される基に関してのみ異なっていた。各ビス−PNAの結合をPNA及びDNAが約３μＭの溶液で、100m MNaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM EDTA中のpH7.0で測定した。260nmでの吸収を５〜90℃まで0.5℃間隔で記録した。
0003595345.tif 000034
0003595345.tif 000035
Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン基は、主鎖に結合する塩基を持たないヌル位置である。Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン基は積み重なることも、シチジンと水素結合を形成することもできない。
３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジンをＣ−Ｇ対の次に組み込み、ヌル基及びシチジン基と比較して、チミジンで見られる特異性の増加（ヌル塩基について57℃対47℃、実施例５）がシチジンについて見られるかどうかを見た。Tmの大きな低下としてシチジンで見られる効果は三重構造の不安定化であった。ヌル塩基（Ｘ＝Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン）及びグアニジン基はほぼ同じ効果を示す；他に対して大きく安定化されているとも不安定化されているとも考えられない。
実施例７
核酸標的への配列番号２の結合の評価
８つの異なるオリゴデオキシヌクレオチド標的配列へのビスPNA（配列番号２、実施例５）の結合を実施例５に説明される手順に従って測定した。特異性に対する不一致の効果を見るため、２つの３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン（以下、“ODHP"）基に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチド標的配列上の位置を変更する。標的配列及び形成される三重らせん構造で得られるTmを以下に示す。
0003595345.tif 000036
ODHP・Ｔ−Ａトリプレットの形成は、ODHPをアデニン、グアニン又はシトシンと向かい合わせて配置した場合の熱的安定性の劇的な減少によって示されるように、非常に特異的であることが立証された。チミン（Ｔ）対照に対する不一致当たりの溶融温度（不一致当たりのδTm）の差は、Ａについて12℃;Gについて16.5℃；及びＣについて12.0℃であった。配列番号13（両可変位置にウラシルを有する）でのTmの増加は、チミンに存在するメチル基による妨害を反映するものと信じられる。
実施例８
核酸標的への配列番号６の結合の評価
４つの異なるオリゴデオキシヌクレオチド標的配列への配列番号６の結合を実施例５に記載される手順に従って測定した。特異性に対する不一致の効果を見るため、２つの３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン基に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチド標的配列上の位置を変更する。標的配列及び形成される三重らせん構造で得られるTmを以下に示す。
0003595345.tif 000037
３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン基がＣ−Ｇ塩基対と相互作用する場合、Tmから分かるように、強い不安定化効果が存在する。この効果は、このＣ−Ｇ塩基対と相補的な位置のヌル塩基、又はシチジン基では見られない。
式VI−VIIを有するモノマーシトシンの合成（実施例９〜15）を以下に示す。
0003595345.tif 000038
実施例９
［1,8］ナプチリジン（Napthyridin）−２（1H）−オン３−酢酸
−78℃に冷却したTHF（30mL）及びLDA（24.4ミリモル）の溶液に、THF（4.0mL）中のコハク酸ジ−ｔ−ブチル（5.60g）の溶液を徐々に添加した。15分後、THF（7mL）に溶解した３−カルバルデヒド−２−ピバロイルアミノピリジン（2.37g）を添加した。この透明黄色溶液を−78℃で15分間攪拌した後、室温に暖めた。その後、この溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液（200mL）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（２×100mL）で抽出した。有機相を乾燥させ（Na2SO4）、真空中で蒸発させた。3M HCl水溶液:THFの3:1混合物液中のこのジアステレオマーアルコールの溶液を加熱して24時間還流させた。室温に冷却した後、pHを４に調整し、生じた固体をを濾過し、真空下で乾燥させて表題の化合物1.52g（65％）を黄褐色の物質として得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ12.19（bs、1H、NH）、8.48（dd、ｊ＝4.8、1.8、1H）、8.09（dd、ｊ＝7.7、1.8、1H）、7.86（ｓ、1H）、7.24（dd、7.7、4.7、1H）、3.48（ｓ、2H）。
実施例10
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）グリシンメチル
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル（4.50ミリモル）をDMF（20mL）に溶解し、［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン３−酢酸（1.02g、5.00ミリモル）、HOAt（0.68mL、5.00ミリモル）及びDIEA（0.871mL、5.0ミリモル）を添加した。０度に冷却した後、DCC（1.13g、5.5ミリモル）を添加した。一時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、酢酸エチル（150mL）に再溶解して、飽和NaHCO3水溶液（２×50mL）、次いで水（50mL）で洗浄した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させた。粗製生成物をシリカカラムで、ジクロロメタン／メタノール（9:1、v/v）で溶離して精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて表題の化合物1.09g（58％）を黄褐色固体として得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ12.18（bs、1H、NH）、8.49−8.47（ｍ、1H、芳香族）、7.79−7.76（ｓ、1H、芳香族）、7.25−7.22（ｍ、1H、芳香族）、6.91−6.75（ｔ、1H、NH）、4.37−4.06（ｓ、2H、CH2）、3.67−3.48（ｓ、2H、CH2）、3.64（ｓ、3H、CH3O）、3.49−3.46（ｍ、2H、CH2）、3.20−3.15（Ｍ、2H、CH2）、1.36−1.35（ｓ、9H、CH3、（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.32（170.54）、170.10、162.61、155.83、149.86、149.31、136.52（136.83）、135.87（135.99）、129.94（129.64）、118.46、114.44、78.05（77.81）、51.83（52.21）、48.19、47.64（46.69）、38.46（38.00）、33.49（33.82）、28.28.FAB+MS:419.22（Ｍ＋H+C20H26N4O6＋H+についての算出値419.19）。
実施例11
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）グリシン（化合物VI）
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）グリシンメチルの溶液に2M LiOH水溶液（6.0mL、12.0ミリモル）を添加した。20分後、室温で水（15mL）をさらに添加し、THFを真空中で除去した。2M HClを添加することにより水相のpHを3.0に調整した。沈殿を濾別し、水（２×10mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて表題の化合物852mg（88％）を無色の粉末として得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ12.67（bs、1H、COOH）、12.20（BS、1H、NH）、8.49−8.46（ｍ、1H、芳香族）、7.82−7.76（ｓ、1H、芳香族）、7.26−7.22（ｍ、1H、芳香族）、6.91−6.74（ｔ、1H、NH）、4.25−3.98（ｓ、2H、CH2）、3.61−3.47（ｓ、2H、CH2）、3.47−3.40（ｍ、2H、CH2）、3.22−3.02（ｍ、2H、CH2）、1.36−1.35（ｓ、9H、CH3、（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ172.58（172.38）、170.50（170.14）、162.70、156.71、155.75、155.02、153.29、149.89、136.08、128.54、128.20、128.00、9391、77.95、66.49,52.18（51.70）、49.65（49.32）、47.59（47.37）、33.42、31.80（31.42）、28.24（28.06）、25.40（24.53）、21.66。FAB+MS:405.18（Ｍ＋H+C19H24N4O6＋H+についての算出値405.18）。
実施例12
３−ホルミル−２−ピバロイルアミノキノリン
−78℃のTHF（75mL）中の２−ピバロイルアミノキノリン（5.00g、21.92ミリモル）の溶液に、BuLi（5.48mL、ヘキサン中10M、54.80ミリモル）を添加した。２時間後、−78℃で、Ｎ−ホルミルモルホリン（3.79g、37.88ミリモル）を添加することによりジアニオンの反応を停止させた。この反応混合物を室温に暖め、2M HCl水溶液（20mL）に注ぎ入れた。2M HClを添加することにより水相のpHを7.0に調整し、水相を水（100mL）で希釈してジエチルエーテル（２×100mL）で抽出した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させて乾燥させた。この粗製生成物を石油エーテル／酢酸エチルから再結晶し、表題の化合物2.92g（52％）を得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ10.70（bs、1H、NH）、9.82（ｓ、1H、CHO）、8.85（ｓ、1H、芳香族）、8.19−8.17（ｍ、1H、芳香族）、7.97−7.95（ｍ、1H、芳香族）、7.91−7.87（ｍ、1H、芳香族）、7.76−7.62（ｍ、1H、芳香族）、1.30（ｓ、9H、CH3）。13C NMR（DMSO−D6）：δ189.62、189.55、178.37、149.66、148.15、140.33、132.77、129.82、127.51、126.59、125.48、123.64、26.97。FAB+MS:257.05（Ｍ＋１、C15H16N2O2＋H+についての算出値257.13）及び279.04（Ｍ＋Na+、C15H16N2O2＋Na+についての算出値279.11）。
実施例13
ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン３酢酸
−78℃に冷却したTHF（15mL）及びLDA（THF中2M、15.9ミリモル、7.95mL）の溶液に、THF（3.0mL）中のコハク酸ジ−ｔ−ブチル（15.9ミリモル、3.28g）の溶液を徐々に添加した。15分後、−78℃で、THF（10mL）に溶解した３−ホルミル−２−ピバロイルアミノキノリン（1.92g、7.50ミリモル）を添加した。この透明黄色溶液を−78℃で15分間攪拌した後、室温に暖めた。この溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液（200mL）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（２×100mL）で抽出した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させた。このジアステレオマーアルコールの粗製生成物をTHF（5mL）及びHCl（3M、水溶液）の混合液中で加熱して24時間還流させ、次いで水（100mL）に注ぎ入れてK2CO3で中和した。黄褐色の沈殿を水（２×25mL）で洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。その粗製生成物（1.60g）をアセトニトリル（50mL）中で加熱し、熱いまま濾過した。生成物をエーテル（２×25mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて、HPLC（260nm）によって純度61％と判定された物質1.50g（79％）を得た。
実施例14
Ｎ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン３−イル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル（0.812g、3.5ミリモル）をDMF（10mL）に溶解し、ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン３酢酸（883mg、3.5ミリモル）を添加した。この混合物を氷浴において冷却し、HBTU（1.52g、4.0ミリモル）を添加した。１時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、ジクロロメタン（100mL）に再溶解して飽和NaHCO3水溶液（２×50mL）で洗浄した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させた。粗製生成物をシリカカラムで、ジクロロメタン／メタノール（97:3、v/v）で溶出して精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて標題の化合物345mg（21％）を黄色褐色固体として得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ12.13（bs、1H、NH）、8.70−8.65（ｍ、1H、芳香族）、7.91（ｓ、1H、芳香族）、7.88（ｓ、1H、芳香族）、7.79−7.75（ｍ、1H、芳香族）、7.55−7.49（ｍ、1H、芳香族）、6.90−6.72（bs、1H、NH）、4.36−4.05（ｓ、2H、CH2）、4.11（ｑ、Ｊ＝、2H、CH2）、3.67−3.33（ｓ、2H、CH2）、3.48−3.53（ｍ、2H、CH2）、3.27−3.04（ｍ、2H、CH2）、1.35（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.17（170.32）、170.01（170.39）、163.08（163.17）、155.75（155.63）、148.67、147.02、136.20（136.46）、136.07（136.13）、131.17、130.16（129.88）、128.67、126.90、124.85（124.67）、115.67（115.63）、78.00（77.76）、51.81（52.20）、48.18（48.38）、47.63、38.43（38.29）、33.56（33.87）、28.26。FAB+MS:469.10（Ｍ＋H+C24H28N4O6＋H+についての算出値469.21）。
実施例15
Ｎ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシン（化合物VIII）
THF（4.0mL）中のＮ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン３−イル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル（0.426ミリモル、200mg）の溶液に2M水溶液（1.07mL、2.14ミリモル）を添加した。15分後、室温で水（7.0mL）をさらに添加し、THFを真空中で除去した。水相をジクロロメタン（２×2mL）で抽出し、2M HCl水溶液を添加することによりpHを3.0に調整した。形成された沈殿を濾別し、水（２×5mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて表題の化合物176mg（91％）を黄褐色粉末として得た。
FAB-MS:453.42（Ｍ−H+,C34H26O6−H+についての算出値453.18）。
実施例16
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（キノリン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）グリシンメチル
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンエチル（443mg、1.8ミリモル）をDMF（10mL）に溶解し、キノリン−２（1H）−オン−３−酢酸（Shanmugam,P.,Naturforsch,1973,196,551−553の手順によって調製）（406mg、2.0ミリモル）及びHOAt（272mg、2.0ミリモル）を添加した。この混合物を氷浴で冷却し、DCC（413g、2.0ミリモル）を添加した。１時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、酢酸エチル（100mL）に再溶解して飽和NaHCO3（２×30mL）、次いで水（30mL）で洗浄した。有機相を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させた。粗製生成物をシリカカラムで、ジクロロメタン／メタノール（9:1、v/v）で溶出して精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて表題の化合物476mg（60％）を黄褐色固体として得た。
実施例17
Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（キノリン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−グリシン（化合物VII）
THF（10mL）中のＮ−（２−Boc−アミノエチル）−Ｎ−（キノリン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）グリシンメチル（427mg、0.99ミリモル）に2M LiOH水溶液（2.5mL、５ミリモル）を添加した。20分後、室温で、水（10mL）をさらに添加した。THFを真空中で蒸発させ、2M HCl水溶液（2.5mL）を激しく攪拌しながら添加した。沈殿を濾別し、水（２×10mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて表題の化合物280mg（74％）を無色の粉末として得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ11.77（bs、1H、NH）、781（7.74）（ｓ、1H、芳香族）、7.64−7.13（ｍ、4H、芳香族）、6.95−6.65（ｍ、1H、NH）、3.98（4.25）（ｓ、2H、CH2）、3.59（3.45）3.30−3.00（ｍ、4H、2xCH2）、1.37（1.35）（ｓ、9H、CH3（Boc））。
実施例18
Ｎ−［（２−ヒドロキシ−10−Ｈ−ピリミド［5,4−ｂ］［1,4］ベンゾチアジン−１−イル）アセチル］−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンエチル
２−ヒドロキシ−10−Ｈ−ピリミド［5,4−ｂ］［1,4］ベンゾチアジン（653mg、3.0ミリモル）をDMF（30mL）に懸濁させ、NaH（鉱物油中60％、132mg、3.3ミリモル）を一度に添加した。15分後、Ｎ−ブロモアセチル−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）−グリシンエチル（1.10g、3.3ミリモル）を添加した。この混合物を室温で２時間攪拌し、真空中で蒸発させ、ジクロロメタン（200mL）に再溶解し、飽和NaHCO3水溶液（100mL）及び飽和NaCl水溶液で１回洗浄した。その混合物を乾燥させ（MgSO4）、真空中で蒸発させて乾燥させた。その粗製物質を、メタノール／ジクロロメタン（1:9、v/v）を溶離液として用いてシリカゲルカラムで精製し、表題の化合物853mg（57％）を得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ10.37（bs、1H、NH）、7.51（ｓ、1H、Ｈ−６）、7.09−7.05（ｍ、2H、芳香族）、6.94−6.75（ｍ、3H、芳香族＋NH）、4.66−4.48（ｓ、2H、CH2）、4.30−4.04（ｓ、2H、CH2）、4.18−4.08（ｑ、2H、CH2）、3.41（ｍ、2H、CH2）、3.20−3.03（ｍ、2H、CH2）、1.38−1.37（ｓ、9H、CH3（Boc））、1.24−1.18（ｔ、3H、CH3）。13C NMR（DMSO−D6）：δ169.44＋169.09、167.87＋167.58、160.15、155.82、154.58、141.23、136.50、127.49、126.09、124.01、116.97、115.83＋115.76、93.39、78.13＋77.85、61.22＋60.61、49.26＋49.02、48.01、47.09、38.33、28.25、14.109。FAB+MS:503.18（Ｍ＋H+C23H29N5O6S＋H+についての算出値504.19）。
実施例19
Ｎ−［（２−ヒドロキシ−10−Ｈ−ピリミド［5,4−ｂ］［1,4］ベンゾチアジン−１−イル）アセチル］−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシン
Ｎ−［（２−ヒドロキシ−10−Ｈ−ピリミド［5,4−ｂ］［1,4］−ベンゾチアジン−１−イル）アセチル］−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンエチル（201mg、0.4ミリモル）をTHF（10mL）に溶解し、LiOH（2M、水溶液、1.0mL）を添加した。15分後、室温で水（10mL）を添加してTHFを真空中で蒸発させ、HCl（2M、水溶液、1.0mL）を激しく攪拌しながら添加した。固形黄色物質を濾別し、真空中で乾燥させて表題の化合物173mg（91％）を得た。
1H NMR（DMSO−d6）：δ10.37（bs、1H、NH）、7.51（ｓ、1H、Ｈ−６）、7.09−7.05（ｍ、2H、芳香族）、6.94−6.75（ｍ、3H、芳香族＋NH）、4.66−4.48（ｓ、2H、CH2）、4.30−4.04（ｓ、2H、CH2）、3.41（ｍ、2H、CH2）、3.20−3.03（ｍ、2H、CH2）、1.38−1.37（ｓ、9H、CH3（Boc））。FAB+MS:476.23（Ｍ＋H+、C21H25N5O6S＋H+476.16）。
実施例20
Ｎ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンモノマーを選択された位置に有するPNA10量体のPNA及びDNA標的配列へのハイブリダイゼーション
０、１、又は３つの三環系Ｎ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンモノマー（実施例15）が選択された位置に組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションを、PNA（配列番号21）及びDNA（配列番号22）標的配列の両者に対して測定した。PNA配列は前出のEgholmに説明される通りに調製した。
これら３つのPNAは、下記表において変数bTで指定される基に関してのみ異なっていた。各PNAの結合をPNA及びDNA又はPNA及びPNAが約３μＭの溶液中で、100mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM EDTA中のpH7.0で測定した。260nmでの吸収を５〜90℃まで0.5℃間隔で記録した。
0003595345.tif 000039
0003595345.tif 000040
各変数（E1）は組み込まれたＮ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンモノマーである。PNA−PNA二重鎖におけるＮ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンモノマーの効果は無効であり、例えば、不安定化しない。PNAオリゴマーにおけるこれら３つの三環系モノマーの効果はDNA標的との相互作用に対して大きな効果を有し、Tmの８℃の増加を生じる。
実施例21〜39
３−ホルミル−６−メチル−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン及び３−ホルミル−５−メチル−２−（ピバロイルアミノ）ピリジンはTurner,J.A.J.Org.Chem.1990,55,4744−4750に従って調製した。Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチルはDueholmら,Org.Prep.and Proc.Int.,1993,25,457−461に従って調製した。以下の化学薬品は受け取ったまま用いた：ブチルリチウム（ヘキサン中2.5M、Aldrich 23,071−５）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（Aldrich D、000−２）、ジイソプロピルアミン（Aldrich 11,001−９）及び３−ヒドロキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−４（3H）−オン（DhbtOH）（Aldrich 32,796−４）。
コハク酸ジ−tert−ブチルは、コハク酸塩化物（61g、0.40モル）をジメチルアニリン（0.84モル、101g）、tert−ブチルアルコール（57g、0.75モル）及びジエチルエーテル（200mL）の還流混合液に滴下により添加することで調製した。生じた溶液を還流下で２時間攪拌し、水（200mL）を添加することにより反応を停止させた。有機相を分離し、10％H2SO4（25mL）及びNaHCO3（100mL）で２回抽出し、乾燥（MgSO4）させて真空中で油状になるまで蒸発させた。クーゲルローア（Kugelrohr）蒸留（116℃、16mmHg）により、所望の生成物（11g、22％）を白色の低融点固体として得た。1H NMR（CDCl3）:2.48（ｓ、4H、CH2）、1.45（ｓ、18H、CH3）。13C NMR（CDCl3）:171.59、80.50、30.61、28.08。
核酸合成用のホスホロアミダイトはCruaChemから入手した。TLCはシリカ60（Merck 5554アルミニウムシート）で、カラムクロマトグラフィーはシリカ60（230−400メッシュASTM）（Merck 9385）で行った。1H及び13Cnmrスペクトルは5mm管において250MHz（Bruker AMX250）又は400MHz（Varian Unity 400）のいずれかで得た；化学シフトは低磁場方向が正である。FAB質量スペクトルはJeol Hx110/110質量分析計で記録した。全てのPNAオリゴマーは、3,5−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして用いて、陽イオンモード稼働のKratos Compact MALDIIIで記録するMALDI−TOF質量分光法によって特徴付けた。Tm値はGilford Response分光計で得、PNA及びDNAが約３μＭの溶液で、100mM NaCl、10mM Na2HPO4、0.1mME DTA中のpH7.0で測定した:260nmでの吸収を５〜90℃まで0.5℃間隔で記録した。PNAのオリゴマー化は前出のDueholmに従来記載される通りに行った。DNAのオリゴマー化は、標準プロトコルに従い、MilliGen/Biosearch8700DNA合成機で行った。PNA配列は前出のEgholmに説明される通りに調製した。
式IXを有するモノマーシントンの調製を以下に示す（実施例21〜39）。
0003595345.tif 000041
ここで：
0003595345.tif 000042
アンチセンス及び抗原によって遺伝子の発現を阻害するアプローチは、生理学的条件下での一本鎖及び二本鎖核酸の効率的な特異的標的指向性を頼みとする。オリゴヌクレオチドによるdsDNAの効率的な三重鎖標的指向性はシトシンN3のプロトン化に依存し、したがって、このpH依存性を排除するために多数の核酸塩基が合成され、評価されている。このクラスの核酸塩基のうちで最も成功している構成要素は、５−メチルシトシン、１シュードイソシトシン２及び８−オキソアデニンである。５−メチルシトシンはＣ−５置換基の結果としてN3の塩基性が増加しているシトシン模倣体のクラスを代表するが、シュードイソシトシン及び８−オキソアデニンはシトシンの“恒久的にプロトン化された”類似体であり、したがって、実質的にpHとは無関係に三重構造を形成することが可能である。
幾つかの好ましい態様において、本発明は、1,8−ナフチリジン−2,7−（I,8H）−ジオン核酸塩基を含むPNAを提供し、この核酸塩基は、プロトン化されたシトシンの機能を模倣する能力に加えて、拡大した芳香族表面積を有する。
以下の例においては、モノマーE1〜E6をPNAの10量体オリゴマーに、離れた部位に加えて隣接する部位に組み込むことにより、1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン複素環系の二重鎖認識特性を評価した。これらのPNAとDNA、PNA及びRNA標的との二重鎖は、ワトソン・クリックの相補的PNA−DNA、PNA−PNA、又はPNA−RNAオリゴマー認識系とは異なるようにアデニンが1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン単位と向かい合うように設計した。異なるように置換された1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン単位を含む複合体の熱的安定性を、対応する非置換1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン及びチミン含有対照と比較した。
化合物E1〜６の調製を下記スキーム２に一般的に示す。
0003595345.tif 000043
（ａ）LDA及びコハク酸ジ−tert−ブチルを用いてジエチルエーテル中−78℃で予め形成されたコハク酸ジ−tert−ブチルのエノレートをTHF中の出発化合物の予備冷却溶液（−78℃）に添加し、最初に−78℃で、次いで室温で攪拌した；この反応からの粗製生成物を3M HCl水溶液を用いて還流温度で処理した；（ｂ）Ｎ−（2Boc−アミノエチル）グリシンメチル、DhbtOH及びDCC;又はDMF中のHBTU、室温で一晩；（ｃ）THF中の2M LiOH、室温。
実施例21
６−アミノ−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン
ジオキサン（250mL）中の2,6−ジアミノピリジン（50.0g、0.46モル）の溶液に、ジオキサン（50mL）に溶解した塩化ピバロイル（27.9g、0.23モル）を徐々に（１時間）添加した。得られた混合物を２時間攪拌し、白色沈殿（2,6−ジアミノピリジン塩酸塩）を濾別した。有機相を真空中で蒸発させて乾燥させ、その粗製生成物をｎ−ヘキサン／酢酸エチルから再結晶して所望の生成物（32.83g、74％）を無色の結晶（mp140−141℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ8.93（ｓ、1H）、7.34（ｔ、7.9Hz、1H）、7.19（ｄ、7.6Hz、1H）、6.18（ｄ、7.6Hz、1H）、5.75（br.s、2H）、1.19（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ176.5、158.5、150.4、138.4、103.6、101.5、39.4、27.1。FAB+MS（m/z）:193.88 M＋H+、C10H15N3O＋H+についての算出値194.1293。
実施例22
６−クロロ−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン
濃HCl水溶液（150mL）中の６−アミノ−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン（28.00g、0.145モル）の予め冷却した（−10℃）懸濁液に、水（8mL）に溶解した亜硫酸カリウム（14.81g、0.174モル）を1.5時間にわたって添加した。得られた反応混合物を−10℃、窒素の下で５時間攪拌した後、濃NaOH水溶液を添加することによりpHを９に調製した。この水溶液を酢酸エチル（３×100mL）で抽出し、有機画分を2M NaOH（３×40mL）で洗浄した。有機相を乾燥（MgSO4）させて真空中で蒸発させ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチルから再結晶して所望の生成物（17.70g、58％）を白色粉末（m.p.86−87℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ10.08（s br、1H）、8.04（ｄ、8.1Hz、1H）、7.81（ｔ、8.1Hz、1H）、7.17（ｄ、8.1Hz、1H）、1.22（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ177.4、152.5、147.8、141.4、119.0、112.8、39.4、26.8。FAB+MS（m/z）:213.06 M＋H+、C10H13ClN2O＋H+についての算出値213.0795。
実施例23
（７−クロロ−1,8−ナフトフィリジン（naphtphyridin）−２（1H）−オキソ−３−イル）酢酸
ジエチルエーテル（150mL）中のジイソプロピルアミン（22.03g、100ミリモル）の予め冷却した（−78℃）溶液にBuLi（ヘキサン中2.5M）（40mL、100ミリモル）を添加し、その溶液をこの温度で15分間攪拌した後、ジエチルエーテル（20mL）に溶解したコハク酸ジ−tert−ブチル（10.83g、50.0ミリモル）を徐々に添加した。−78℃で20分後、乾燥THF（20mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解した６−クロロ−３−ホルミル−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン（Turner,J.A.,J.Org.Chem.,1990,55,4744−4750）（11.32g、50.0ミリモル）を徐々に添加した。その黄色溶液を−78℃で30分間攪拌した後、室温に暖めた。次に、その溶液をNH4Cl（飽和、水溶液）（200mL）に注ぎ入れ、水層を分離してジエチルエーテル（２×100mL）で２回抽出した。合わせた有機層を水（100mL）で１回、食塩水（100mL）で１回洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発させた。そのジアステレオマーアルコールの粗製生成物をジオキサン（150mL）及びHCl（3M、水溶液）（150mL）に溶解し、６時間還流させた。得られた黄色沈殿を濾別し、水で１回、ジエチルエーテルで１回洗浄し、真空中で乾燥させて所望の生成物を黄色固体として得た。（10.91g、89％）。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.43（ｓ、1H、COOH）、8.12（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、7.87（ｓ、1H、芳香族）、7.29（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、3.55（ｓ、2H、CH2）。13C NMR（DMSO−d6）：δ171.7、162.6、149.9、149.1、139.3、136.4、129.6、118.4、113.5、35.6。FAB+MS（m/z）:239.04、Ｍ＋H+、C10H7ClN2O3＋H+についての算出値239.0223。C10H7ClN2O3についての分析算出値:C 50.33、H 2.96、N 11.74。実測値:C 50.49、H 2.98、N 11.96。
実施例24
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミノエチル）−Ｎ−（７−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシンメチル
（７−クロロ−1,8−ナフトフィリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）酢酸（0.50g、2.10ミリモル）及びDhbtOH（0.34g、2.10ミリモル）を乾燥DMF（15mL）に溶解した。この混合物を氷上で冷却し、DCC（0.43g、2.10ミリモル）を添加して40分間攪拌した。DMF（5mL）に溶解したＮ−（２−tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル（0.46g、2.10ミリモル）を添加した。１時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、EtOAc（25mL）に再溶解し、濾過してNaHCO3（５％、水溶液）（３×25mL）及び食塩水（２×25mL）で洗浄した。有機相を乾燥（MgSO4）させ、濾過して真空中で蒸発させた。その粗製生成物をシリカカラムで、ジクロロメタン／メタノール（9:1v/v）で溶出して精製した。生成物を含む画分を真空中で蒸発させ、所望の生成物（0.61g、64％）を僅かに黄色の固体（mp68−69℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.45（br.s、1H、NH）、8.11（8.16）（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、7.79（7.81）（ｓ、1H、芳香族）、7.32（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、6.91（6.81）（ｍ、1H、NH）、4.05（4.36）（ｓ、2H、CH2）、3.68（3.67）（ｓ、2H、CH2）、3.64（ｓ、3H、CH3O）、3.49−3.42（ｍ、2H、CH2）、3.20−3.15（3.05−3.00）（ｍ、2H、CH2）、1.36（1.35）（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.33、170.08、162.39（162.48）、155.77、149.72、149.04、139.06、135.89（136.16）、130.29（130.00）、118.32、113.45、78.01、51.79（52.20）、47.61（48.15）、38.43、33.45（33.78）、28.25。FAB+MS（m/z）:453.1553（Ｍ＋H+、C20H25N4O6Cl＋H+についての算出値453.1540）。
実施例25
Ｎ−２−（（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミノエチル）−Ｎ−（７−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシン
メチルＮ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミノエチル）−Ｎ−（７−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシン（0.607g、1.34ミリモル）をTHF（10mLmL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解し、LiOH（0.428M、水溶液）（6.90mL、2.95ミリモル）を添加した。30分後、室温で水（10mL）をさらに添加し、THFを真空中で除去した。HCl（2M、水溶液）を添加することによりこの水溶液のpHを3.0に調整した。白色沈殿を濾別し、水（２×10mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて生成物（355mg、60％）を僅かに黄色の粉末（mp176−78℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.42（br.s、1H、COOH）、8.07（8.14）（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、7.84（7.78）（ｓ、1H、芳香族）、7.30（ｄ、8.1Hz、1H、芳香族）、6.88（6.71）（ｍ、1H、NH）、3.97（4.23）（ｓ、2H、CH2）、3.61（ｓ、2H、CH2）、3.47−3.43（3.33−3.30）（ｍ、2H、CH2）、3.19−3.16（3.05−3.03）（ｍ、2H、CH2）、1.36（1.34）（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.92（171.21）、169.88（170.22）、162.37（162.46）、155.74、149.67、149.00、138.95（139.13）、135.82（136.06）、130.35（130.00）、118.28、113.45（113.51）、77.99（77.75）、48.10（50.29）、47.57（46.75）、38.41（37.97）、（33.75）33.51、28.27。FAB+MS（m/z）:439.1371（Ｍ＋Ｈ＋、C19H23N4O6Cl＋H+についての算出値439.1384）。
実施例26
（７−メチル−1,8−ナフチリジン−２−オン−３−イル）酢酸
ジエチルエーテル（125mL、モレキュラーシーブで乾燥）中のN,N−ジイソプロピルアミン（4.84g、48.0ミリモル）の予め冷却した（−78℃）の溶液にBuLi（ヘキサン中2.5M）（19.0mL、48.0ミリモル）を添加し、その溶液をこの温度で15分間攪拌した後、ジエチルエーテル（10mL）に溶解したコハク酸ジ−tert−ブチル（5.75g、0.0250モル）を徐々に添加した。−78℃で20分後、乾燥THF（10mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解した３−ホルミル−６−クロロ−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン（5.00g、23.0ミリモル）を徐々に添加した。得られた黄色溶液を−78℃で30分間攪拌した後、室温に暖めた。次に、その溶液をNH4Cl（飽和、水溶液）（100mL）に注ぎ入れた。水層を分離し、ジエチルエテール（３×50mL、モレキュラーシーブで乾燥）で抽出した。合わせた有機層を水（50mL）で１回、食塩水（50mL）で１回洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発させた。そのジアステレオマーアルコールの粗製生成物をHCl（3M、水溶液）（80mL）に溶解し、3.5時間還流させた。水相をジエチルエーテル（３×75mL、モレキュラーシーブで乾燥）、クロロホルム（３×50mL）で洗浄した後、K2CO3を添加することによりpH7に調整した。生じた黄色沈殿を濾別し、水で１回、ジエチルエーテルで１回洗浄し、真空中で乾燥させて所望の生成物（1.25g、27％）を黄色固体として得た。mp.＞250℃。1H NMR（D2O/NaOH;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ7.53（ｄ、8.1Hz、1H）、7.31（ｓ、1H）、6.69（ｄ、8.1Hz、1H）、3.20（ｓ、2H）、2.25（ｓ、3H）。13C NMR（D2O/NaOH）：δ180.4、172.1、159.0、155.7、136.5、135.9、126.6、116.6、114.8、39.6、23.3。FAB+MS（m/z）:218.0768（Ｍ＋Ｈ＋、C11H10N2O3＋H+についての算出値219.0770）。
実施例27
Ｎ−（（７−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル
DMF（25mL）中の（７−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）酢酸（0.995g、4.60ミリモル）及びDhbtOH（0.744g、4.60ミリモル）の予め冷却した（０℃）溶液にDCC（1.04g、5.00ミリモル）を添加し、その混合物を０℃で40分間攪拌した後、Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンエチル（1.10g、5.0ミリモル）を添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させ、酢酸エチル（75mL）に再溶解して５％NaHCO3（３×25mL）及び食塩水（２×25mL）で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過して真空中で蒸発させた。粗製生成物を、ジクロロメタン／メタノール（90:10v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて所望の生成物（790mg、41％）（mp98−100℃）を得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.05（s br、1H）、7.91（7.96）（ｄ、8.0Hz、1H）、7.74（7.71）（ｓ、1H）、7.10（ｄ、8.0Hz、1H）、6.90（6.99）（ｍ、1H）、4.05（4.36）（ｓ、2H）、4.09（ｑ、Ｊ＝5.2Hz、3H）、3.63（ｓ、3H）、3.47（ｍ、2H）、3.17（ｓ、2H）、3.16（ｓ、3H）、1.36（1.35）（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.44（170.66）、170.11、162.65（162.73）、159.22、155.83（155.71）、148.99、136.43（136.77）、136.04（136.17）、128.61（128.29）、118.21、112.00（112.07）、78.04、51.81（52.20）、47.63（48.20）、38.59（38.45）、33.42（33.75）、28.27、24.22。FAB+HRMS:433.2086、C21H29N4O6についての算出値433.2087。
実施例28
Ｎ−（（７−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシン
THF（10mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）中のＮ−（（７−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−tert−ブチルオキシカルボニルアミノエチル）グリシンメチル（0.775g、1.79ミリモル）の溶液にLiOH（2M、水溶液）（2.0mL）を添加した。得られた溶液を室温で30分間攪拌し、水をさらに添加してTHFを真空中で除去した。その水溶液のpHをpH3.0に調整して沈殿を集め、濾過により洗浄（２×10mL）して所望の生成物（424mg、56％）を無色の沈殿（mp94−95℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.05（s br、1H）、7.90（7.96）（ｄ、7.9Hz、1H）、7.78（7.71）（ｓ、1H）、7.11（ｄ、7.9Hz、1H）、6.90（6.73）（ｍ、1H）、3.97（4.23）（ｓ、2H）、3.59（ｓ、2H）、3.44（ｓ、3H）、3.04（3.15）（ｍ、2H）、1.37（1.36）（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.94（171.22）、170.00（170.16）、162.6、159.1、155.7、148.8、136.30（136.57）、135.90（136.09）、128.28（128.62）、118.12、111.96（112.00）、77.9、48.08（48.29）、47.5、38.39（38.05）、33.44（33.66）、28.3、24.2。FAB+HRMS（m/z）:417.1794、C20H25N4O6についての算出値417.1774。
実施例29
６−Ｍエチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−酢酸
ジエチルエーテル（75mL、モレキュラーシーブで乾燥）中のジイソプロピルアミン（35.7ミリモル、3.61g）の予め冷却した（−78℃）溶液にBiLi（ヘキサン中2.5M）（31.5ミリモル、12.6mL）を添加し、得られた溶液を室温で15分間攪拌した後、ジエチルエーテル（50mL、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解したコハク酸ジ−tert−ブチル（18.7ミリモル、3.85g）を徐々に添加した。−78℃で30分後、THF（30mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解した2,2−ジメチル−Ｎ−（３−ホルミル−５−メチル−２−ピリジニル）プロパンアミド（17ミリモル、3.74g）を徐々に添加し、生じた黄色混合物の攪拌を−78℃でさらに30分継続した後、その溶液を室温に暖めてNH4Cl（飽和、水溶液）（100mL）に注ぎ入れた。水相をジエチルエーテル（50mL、モレキュラーシーブで乾燥）で３回抽出し、有機抽出物を食塩水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発させた。粗製生成物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶してジアステレオマー混合物（3.36g、44％）を得、それを真空中で乾燥させた後そのまま用いた。ジオキサン（25mL）中の上記ジアステレオマー混合物（7.0ミリモル、3.15g）にHCl（3M、水溶液）（25mL）を添加し、得られた溶液を還流下で10時間攪拌した。ジオキサンを真空中で蒸発させ、水（25mL）をさらに添加し、pHを8.0に調整した後、ジクロロメタン（50mL）で抽出した。水相を15分間激しく攪拌して残留するジクロロメタンを除去し、HCl（2M、水溶液）を添加することにより水相のpHを4.0に調整した。沈殿を濾別して水（２×5mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて所望の生成物を無色の粉末として得た（878mg、57％）。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.10（s br、1H、NH）、10.46（ｓ、1H、COOH）、8.33（ｓ、1H、芳香族）、7.89（7.97）（ｓ、1H、芳香族）、7.79（7.55）（ｓ、1H、芳香族）、3.34（ｓ、2H、CH2）。FAB+HRMS:219.0773（Ｍ＋H+C11H10N2O3＋H+についての算出値219.0770）。
実施例30
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシンメチル
DMF（20mL）中の６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−酢酸（3.30ミリモル、719mg）の溶液にDIEA（3.30ミリモル、427mg）及びHBTU（3.30ミリモル、1.25g）、次いでＮ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル（3.00ミリモル、696mg）を添加し、この混合物を室温で２時間攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、ジクロロメタン（100mL）に再溶解して５％NaHCO3（２×50mL）で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過して真空中で蒸発させ、その粗製生成物を、ジクロロメタン／メタノール（95:5v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分を真空中で蒸発させ、所望の生成物（551mg、41％）を無色の泡状物質として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.08（s br、1H、NH）、8.34（ｓ、1H、芳香族）、7.84（7.91）（ｓ、1H、芳香族）、7.73（7.70）（ｓ、1H、芳香族）、6.91（6.75）（ｍ、1H、NH）、4.05（4.36）（ｓ、2H、CH2）、3.45−3.66（２つの重複するｓ及びここでの回転異性体、4H、2CH2）、3.64（ｓ、3H、CH3O）、3.20−2.99（ｍ、2H、CH2）、2.34（ｓ、3H、CH3）、1.36（1.37）（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.31（170.54）、170.06、162.45（162.53）、155.77（155.67）、150.29、147.45、136.17（136.47）、135.42（135.57）、129.87（129.55）、127.35（127.30）、113.96（114.02）、78.01（77.66）、51.80（52.18）、48.20（46.63）、47.58（50.12）、40.60、33.53（33.84）、28.60、17.38。FAB+MS:433.2093（Ｍ＋H+、C21H28N4O6＋H+についての算出値433.2087）。
実施例31
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチルグリシン
THF（8mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解したＮ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシンメチル（1.0ミリモル、405mg）の溶液にLiOH（2M、水溶液）を添加し、得られた溶液を室温で15分間攪拌した。水（8mL）をさらに添加してTHFを真空中で蒸発させ、HCl（2M、水溶液）を添加することによりその水溶液のpHを3.0に調整した。無色の粉末を濾別して水（２×5mL）で洗浄し、所望の生成物（228mg、84％）をHPLC（260nm）で純粋な無色の粉末として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.08（s br、1H、NH）、8.33（ｓ、1H、芳香族）、7.81（7.90）（ｓ、1H、芳香族）、7.76（7.70）（ｓ、1H、芳香族）、6.89（6.73）（ｍ、1H、NH）、3.97（4.23）（ｓ、2H、CH2）、3.59（ｓ、2H、CH2）、3.30−3.50（ｍ、水の信号で部分的に覆われている、2H、CH2）、3.18−3.00（ｍ、2H、CH2）、2.34（ｓ、3H、CH3）、1.36（1.34）（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.96（171.22）、170.14（170.47）、162.44（162.51）、155.74、150.22、147.41（147.38）、136.13（136.35）、135.36（135.55）、129.90（129.55）、127.31（127.27）、113.97（114.03）、78.00（77.77）、48.19（46.71）、47.51−（50.29）、38.98（38.40）、33.60（33.81）、28.26、17.40。
実施例32
６−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−酢酸
ジエチルエーテル（100mL、モレキュラーシーブで乾燥）中のジイソプロピルアミン（46.2ミリモル、4.67g）の予め冷却した（−78℃）の溶液にBuLi（ヘキサン中2.5M）（46.2ミリモル、18.5mL）を添加し、生じた溶液を室温で15分間攪拌した後、ジエチルエーテル（20mL、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解したコハク酸ジ−tert−ブチル（24.2ミリモル、4.99g）を徐々に添加した。−78℃で20分後、THF（50mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解した2,2−ジメチル−Ｎ−（５−クロロ−３−ホルミル−２−ピリジニル）プロパンアミン（22.0ミリモル、5.03g）を徐々に添加し、生じた黄色混合物の攪拌を−78℃で60分間継続した後、その溶液を室温に暖めてNH4Cl（飽和、水溶液）（100mL）に注ぎ入れた。水相をジエチルエーテル（50mL、モレキュラーシーブで乾燥）で３回抽出し、有機抽出物を食塩水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発させた。その粗製生成物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶してジアステレオマー混合物を得、真空中で乾燥させた後それをそのまま用いた；この粗製ジアステレオマー混合物をジオキサン（75mL）に溶解し、HCl（3M、水溶液）（75mL）を添加した。得られた溶液を還流下で６時間攪拌し、室温に冷却して濾過した。ジオキサンを真空中で蒸発させ、K2CO3を添加することにより水相のpHを8.0に調整して、その水相をジエチルエーテル（25mL、モレキュラーシーブで乾燥）で抽出した。その後、HCl（4M、水溶液）を添加することにより水相のpHをpH3.0に調整し、僅かに黄褐色の沈殿を濾別して水（２×20mL）で洗浄した。この固体を真空中で乾燥させて所望の化合物（3.21g、58.2％）を白色固体として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.42（s br、1H、NH）、10.79（ｓ、1H、COOH）、8.52（ｄ、Ｊ＝2.6Hz、1H、芳香族）、8.28（8.19）（ｄ、Ｊ＝2.4Hz、1H、芳香族）、7.84（7.74）（ｓ、1H、芳香族）、3.50（ｓ、2H、CH2）。FAB+MS:239.00（Ｍ＋H+、C10H7N2O3Cl＋H+についての算出値239.0223）。
実施例33
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシンメチル
DMF中の６−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−酢酸（313mg、1.25ミリモル）、トリエチルアミン（304mg、3.0ミリモル）、DhbtOH（204mg、1.25ミリモル）及びＮ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンエチル塩酸塩（283mg、1.0ミリモル）の溶液にDCC（258mg、1.25ミリモル）を添加した。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させた。その混合物をジクロロメタン（150mL）に再溶解して濾過し、５％NaHCO3（２×50mL）、次いで食塩水（50mL）で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過して真空中で蒸発させた。その粗製生成物を、酢酸エチル（95:5v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分を真空中で蒸発させ、所望の生成物（294mg、63.0％）を無色の粉末として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.40（s br、1H、NH）、8.51（ｄ、Ｊ＝2.5Hz、1H、芳香族）、8.23（8.29）（ｄ、Ｊ＝2.4Hz、1H、芳香族）、7.77（7.74）（ｓ、1H、芳香族）、6.90（6.73）（t br、1H、NH）、4.07（4.33）（ｓ、2H、CH2）、4.09（4.13）（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、3.64（3.50）（ｓ、2H、CH2）、3.48（3.29）（ｔ、Ｊ＝6.9Hz、2H、CH2）、3.18（3.05）、（ｍ、2H、CH2）、1.37（1.35）、（ｓ、9H、CH3（Boc））、1.18（ｔ、Ｊ＝7.1Hz、3H、CH3）。13C NMR（DMSO−D6）：δ169.99（170.25）、169.47（169.80）、162.40、155.77、147.96（147.82）、135.61、134.64（134.79）、131.41（131.06）、124.07、115.32、78.01（77.78）、60.51（61.05）、48.16（50.26）、47.81（46.66）、38.46（37.99）、33.48（33.89）、28.25、14.11。FAB+MS:467.1712（Ｍ＋H+、C21H27N4O6Cl＋H+についての算出値467.1697）。
実施例34
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチルグリシネート
Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−Ｎ−（６−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オキソ−３−イル）アセチルグリシンメチル（374mg、0.8ミリモル）の溶液にLiOH（2M、水溶液）を添加した。得られた混合物を室温で15分間攪拌した。その後、水（8mL）をさらに添加してTHFを真空中で蒸発させ、HCl（4M、水溶液）を添加することにより水相のpHを3.0に調整し、沈殿を濾別して水（２×5mL）で洗浄した。得られた溶液を室温で15分間攪拌し、水（8mL）をさらに添加してTHFを真空中で蒸発させ、HCl（2M、水溶液）を添加することにより水相のpHを3.0に調整した。白色沈殿を濾別して水（２×5mL）で洗浄し、真空中で乾燥させ、所望の生成物（281mg、80.2％）を、HPLC（260nm）で純粋な無色の粉末として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.70（s vbr、1H、COOH）、12.39（s br、1H、NH）、8.51（ｍ、1H、芳香族）、8.20（8.28）（ｄ、Ｊ＝2.2Hz、1H、芳香族）、7.80（7.74）（ｓ、1H、芳香族）、6.88（6.74）（ｍ、1H、NH）、4.21（3.97）（ｓ、2H、CH2）、3.63（3.48）（ｓ、2H、CH2）、3.45（ｔ、Ｊ＝6.6Hz、2H、CH2）、3.16（3.04）、（ｍ、2H、CH2）、1.37（1.35）、（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.96（171.26）、169.88（170.22）、162.42（162.48）、155.78（155.67）、147.94（147.82）、135.52、134.61（134.79）、131.47、131.17、115.33、78.00（77.78）、47.45（50.27）、48.07（46.71）、38.40（37.97）、33.42（33.56）、28.26。FAB＋MS:439.1380（Ｍ＋H+、C19H23N4O6Cl＋H+についての算出値439.1384）及び445.1（Ｍ＋Li+、C19H23N4O6Cl＋Li+についての算出値445.1466）。
実施例35
３−ホルミル−４−メチル−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン
ジエチルエーテル（100mL、モレキュラーシーブで乾燥）中の４−メチル−２−（ピバロイルアミノ）ピリジン（6.87g、36.0ミリモル）の予め冷却した（−78℃）溶液にtert−BuLi（50.0mL、75.0ミリモル）を徐々に添加した。得られた溶液を−78℃で3.5時間攪拌した後、DMF（5.19g、71.0ミリモル）を添加して−78℃でさらに30分間攪拌し、次いで室温に暖めて2M HCl（水溶液、100mL）に注ぎ入れた。この混合物を15分間攪拌した後、K2CO3を添加することによりpHを7.0に調整した。水相をジエチルエーテル（３×75mL、モレキュラーシーブで乾燥）で洗浄し、合わせた有機画分を食塩水（100mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）させて真空中で蒸発させた。その粗製生成物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶し、所望の生成物（4.66g、59％）を僅かに黄褐色の結晶（mp117−20℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ11.19（s br、1H）、10.41（ｓ、1H）、8.49（ｄ、5.0Hz、1H）、6.92（ｄ、5.0Hz）、2.69（ｓ、3H）、1.37（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ192.02、176.97、154.15、152.82、152.69、121.70、116.09、40.69、27.46、18.77。FAB+MS（m/z）:221.1300（Ｍ＋H+、C12H16N2O2＋H+についての算出値221.1290）。
実施例36
（５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）酢酸
ジエチルエーテル（125mL、モレキュラーシーブで乾燥）中のN,N−ジイソプロピルアミン（6.2mL、0.044モル）の予め冷却した溶液にBuLi（ヘキサン中2.5M）（17.8mL、0.044モル）を添加し、得られた溶液を室温で15分間攪拌した後、ジエチルエーテル（10mL、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解したコハク酸ジ−tert−ブチル（5.35g、23ミリモル）を徐々に添加した。−78℃で30分後、THF（10mL、LAB−SCAN C2520、モレキュラーシーブで乾燥）に溶解した３−ホルミル−４−メチル−２−（ピバロイルアミノ）−ピリジン（4.65g、21.0ミリモル）を徐々に添加し、この温度での攪拌を30分間継続した。この溶液を室温に暖め、NH4Clの溶液（飽和、水溶液、100mL）に注ぎ入れた。水相をジエチルエーテル（３×50mL）で３回抽出し、有機抽出物を水（50mL）及び食塩水（50mL）で洗浄してMgSO4で乾燥させ、真空中で蒸発させた。その粗製生成物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶してジアステレオマー混合物を得、真空中で乾燥させた後それをそのまま用いた。このジアステレオマー混合物をHCl（3M、水溶液、50mL）に溶解し、その溶液を還流下で3.5時間攪拌して室温に冷却し、ジエチルエーテル（２×50mL）で洗浄し、K2CO3で中和してクロロホルム（３×50mL）で再度洗浄した。冷却して沈殿させた後、表題の化合物1.39g（37％）を得た。（mp＞250℃）。1H NMR（D2O/NaOD）：δ8.25（ｄ、4.9Hz、1H）、7.71（ｓ、1H）、6.84（ｄ、4.9Hz、1H）、2.36（ｓ、2H）、1.05（ｓ、3H）。13C NMR（D2O/NaOD）：δ180.30、171.68、155.44、148.84、146.04、132.61、127.08、117.60、116.21、27.22、16.98。FAB+MS（m/z）:219.10（Ｍ＋H+、C11H10N2O3＋H+についての算出値219.0770）。
実施例37
Ｎ−（（５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル
DMF（25mL）中の（５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）酢酸（1.20g、5.50ミリモル）及びDhbtOH（0.987g、6.10ミリモル）の予め冷却した（０℃）溶液にDCC（1.25g、6.10ミリモル）を添加し、得られた混合物を40分間攪拌した後、Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル（1.32g、6.10ミリモル）を添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させ、酢酸エチル（75mL）に再溶解してDCUを濾別した。有機相をNaHCO3（３×25mL）及び食塩水（２×25mL）で洗浄し、乾燥（MgSO4）させて真空中で蒸発させた。粗製生成物を、MeOH/ジクロロメタン（95:5から90:10 v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて所望の生成物（752mg、33％）（mp175−77℃）を得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.10（12.08）（s br、1H）、8.33（8.33）（ｄ、Ｊ＝4.8Hz、1H）、7.96（7.90）（ｓ、1H）、7.09（ｄ、Ｊ＝4.8Hz、1H）、6.92（6.70）（ｍ、1H）、4.07（4.37）（ｓ、2H）、3.67（ｓ、2H）、3.64（ｓ、3H）、3.46（ｍ、2H）、3.17（ｍ、2H）、2.54（2.53）（ｓ、3H）、1.37（1.35）（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−D6）：δ170.30（170.50）、170.04、162.30、155.73、149.47、149.25、145.16、132.92（133.56）、129.12（129.28）、119.87、113.35、77.97、52.13、51.76（50.12）、47.47（48.16）、39.98（38.39）、33.81（33.99）、28.24、17.66。FAB+MS（m/z）:433.2087（Ｍ＋H+、C21H28N4O6＋H+についての算出値433.2086）。
実施例38
Ｎ−（（５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシン
THF（10mL）中のＮ−（（５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）−アミノエチル）グリシンメチル（0.72g、1.70ミリモル）の溶液にLiOH（水溶液、2M）（2.0mL）を添加した。得られた溶液を室温で45分間攪拌した後、さらに水を添加し、THFを真空中で蒸発させ、その水溶液のpHを3.0に調整した。生じた沈殿を水（２×10mL）で洗浄し、遠心によって集め、真空中で乾燥させて所望の生成物（366mg、53％）を白色粉末（mp133−36℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.12（s br、1H）、8.33（ｄ、Ｊ＝4.9Hz、1H）、8.00（ｓ、1H）、7.09（ｄ、Ｊ＝4.9Hz、1H）、6.92（6.70）（ｍ、1H）、3.99（4.26）（ｓ、2H）、3.62（ｓ、2H）、3.45（ｍ、2H＋H2O）、3.17（ｍ、2H）、2.53（2.52）（ｓ、3H）、1.36（1.34）（ｓ、9H）13C NMR（DMSO−D6）：δ171.07（171.31）、170.23（170.54）、162.36、155.80、149.53、149.27、145.30、132.67（133.55）、129.35（129.20）、119.92、113.44、78.01、48.13、47.33、38.60（38.36）、34.07、28.27、17.76.FAB-HRMS（m/z）:417.1798、C20H26N4O6−Ｈについての算出値417.1774。
実施例39
修飾PNAを用いるハイブリダイゼーション研究
各PNAの結合を、PNA及びDNA又はPNA及びPNAが約３μＭの溶液において、100mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM EDTA中のpH7.0で測定した。26nmでの吸収を５〜90℃まで0.5℃間隔で記録した。
置換は以下に示されるように略す：
（E1）  Ｎ−（ベンゾ［ｂ］［1,8］ナプチリジン−２（1H）−オン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Boc−アミノエチル）グリシン；
（E2）  ７−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン；
（E3）  ６−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン；
（E4）  ７−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン
（E5）  ６−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン；及び
（E6）  ５−メチル−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン。
ΔTmは、チミン含有対照の熱的安定性に対して修飾当たりで示す。
A.修飾位置を１つ有するPNA10量体の、相補的PNA及びDNA標的配列に対するハイブリダイゼーション
選択された位置に０又は１つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションをPNA（配列番号21）及びDNA（配列番号22）（実施例20を参照）標的配列の両者に対して測定した。PNA配列は前出のEgholmに説明される通りに調製した。
これらのPNA10量体は、修飾PNAモノマーが占める10量体内の１つの位置に関してのみ異なる（下記表を参照）。
0003595345.tif 000044
B.3つの修飾位置を有するPNA10量体の、相補的PNA及びDNA標的配列に対するハイブリダイゼーション
選択された位置に０又は３つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションをPNA（配列番号21）及びDNA（配列番号22）（実施例20を参照）標的配列の両者に対して測定した。PNA配列は前出のEgholmに説明される通りに調製した。
これらのPNA10量体は、修飾PNAモノマーが占める10量体内の３つの位置に関してのみ異なる（下記表を参照）。
0003595345.tif 000045
0003595345.tif 000046
C.3つの修飾位置を有するPNA10量体の、相補的PNA及びDNA標的配列に対するハイブリダイゼーション
選択された位置に０又は３つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションをPNA（配列番号40）及びDNA（配列番号41）標的配列の両者に対して測定した。PNA配列は前出のEgholmに説明される通りに調製した。
これらのPNA10量体は、修飾PNAモノマーが占める10量体内の３つの位置に関してのみ異なる（下記表を参照）。
0003595345.tif 000047
0003595345.tif 000048
D.3つの修飾位置を有するPNA10量体の、相補的PNA及びDNA標的配列に対するハイブリダイゼーション
選択された位置に０又は１つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションを、相補的であるか、又は修飾PNAにおいて修飾されている位置に１つの不一致を有するかのいずれかのPNA及びDNA鎖に対して測定した。非修飾PNAもこれら８種類の標的と標準としてハイブリダイズさせる。DNA（5'−dAGT GXT CTA C−3'）又はPNA（Ｈ−AGT GXT CTA C−NH2）を調製し、Ｘ位置は、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちの１つを表し、したがって、８つの個別の標的配列が得られた（下記表を参照）。
0003595345.tif 000049
0003595345.tif 000050
E.Hoogsteen鎖に３つの離れた修飾を含むビス−PNA（各々は、３つの連結した８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して結合する逆平行７量体である）の、７量体標的領域を含む13量体DNAへのハイブリダイゼーション
Hoogsteen鎖の選択された位置に０又は３つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションを、７量体標的配列を含む13量体DNAに対して測定した。アデニンを13量体DNA標的内で、hoogsteen鎖における修飾された位置に一致させて配置した。ビス−PNAの合成は前出のEgholmに説明される通りに行った（下記表を参照）。これらのビス−PNAは、２つの10量体PNAを３つの連続する８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して逆平行方向に結合させて調製した。Hoogsteen鎖における（標的配列によって決定されるような）通常はプロトン化シトシンが存在する位置は、シュードイソシトシン（“J"と表す）が占めている。ΔTmは、チミン含有対照の熱的安定性に対して修飾当たりで示す。
0003595345.tif 000051
F.Hoogsteen鎖に３つの隣接する修飾を含むビス−PNA（各々は、３つの連結した８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して結合する逆平行７量体である）の、７量体標的領域を含む13量体DNAへのハイブリダイゼーション
Hoogsteen鎖の選択された位置に０又は３つの修飾が組み込まれているPNA10量体のハイブリダイゼーションを、７量体標的配列を含む13量体DNAに対して測定した。アデニンを13量体DNA標的内で、hoogsteen鎖における修飾された位置に一致させて配置した。ビス−PNAの合成は前出のEgholmに説明される通りに行った（下記表を参照）。これらのビス−PNAは、２つの10量体PNAを３つの連続する８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して逆平行方向に結合させて調製した。Hoogsteen鎖における（標的配列によって決定されるような）通常はプロトン化シトシンが存在する位置は、シュードイソシトシン（“J"と表す）が占めている。ΔTmは、チミン含有対照の熱的安定性に対して修飾当たりで示す。
0003595345.tif 000052
実施例40〜42
式Ｘを有するモノマーシトシンの調製を以下に示す（実施例40〜42）。
0003595345.tif 000053
この新規1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル核酸塩基はＪ塩基の代替物であり、好ましい態様において、これは三重鎖形成モチーフにおけるＧ含有塩基対を認識することが可能である。
実施例40
（1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン−３−イル）酢酸
NaOH（6M、水溶液）（50mL）中の（７−クロロ−1,8−ナフチリジン−２（1H）−オン−３−イル）酢酸（4.00g、17.0ミリモル）の懸濁液を19時間加熱して還流させた後、室温に冷却した。HCl（濃、水溶液）を添加することによりこの水溶液のpHを7.0に調整し、生じた沈殿を濾過により集め、水で繰り返し洗浄して所望の生成物（3.47g、94％）を無色の粉末（mp＞250℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ11.83（br、2H）、7.81（ｄ、Ｊ＝8.8Hz、1H）、7.69（ｓ、1H）、6.37（ｄ、Ｊ＝8.8、1H）、3.40（ｓ、2H、水の信号によって隠されている）。13C NMR（D2O/NaOD）：δ184.03、174.45、173.44、141.12、139.79、122.42、113.63、110.97、41.92。FAB+MS（m/z）:175.92（Ｍ−COOH＋H+、C9H7N2O2についての算出値176.0586）
実施例41
Ｎ−（（1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル（３）
DMF中の（1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン−３−イル）酢酸（1.80g、8.38ミリモル）及びHOAt（1.34g、10.1ミリモル）の予め冷却した溶液にDCC（2.08g、10.1ミリモル）を添加し、その混合物を０℃で40分間攪拌した後、Ｎ−（Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）−グリシンメチル（2.22g、9.00ミリモル）を添加した。その混合物を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させ、ジクロロメタン（100mL）に再溶解してDCUを濾別した。有機相をNaHCO3（飽和、水溶液）（３×75mL）、食塩水（２×100mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発させた。その粗製生成物を、AcOH/MeOH/CH2Cl2（2/9/89 v/v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物含有画分をプールし、真空中で蒸発させて所望の生成物（1.70g、46％）（mp197−198℃）を得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ7.50（7.55）（ｄ、Ｊ＝8.8Hz、1H）、7.45（7.40）（ｓ、1H）、6.93（6.71）（ｍ、1H）、5.99（ｍ、1H）、4.04（4.39）（ｓ、2H）、3.63（ｓ、3H）、3.47（3.50）（ｍ、2H）、3.32（3.31）（ｍ、2H）、3.16（3.03）（ｑ、Ｊ＝6.0Hz、2H）、1.35（1.34）（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ171.54（171.77）、170.17（170.53）、165.89、155.78、148.79、138.64、136.48（136.93）、118.01（117.56）、111.67、101.80、77.90（77.72）、51.75（52.07）、48.21（50.15）、47.59（46.51）、38.10、33.30（33.88）、28.26。FAB+MS（m/z）:435.1871（Ｍ＋H+、C20H27N4O7についての算出値435.1880）。
実施例42
Ｎ−（（1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシン（４）
THF（20mL）中のＮ−（（1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン−３−イル）アセチル）−Ｎ−（２−（tert−ブチルオキシカルボニル）アミノエチル）グリシンメチル（1.70g、3.79ミリモル）の予め冷却した（０℃）溶液にNaOH（2M、水溶液）（20mL）を添加した。この溶液を室温で15分間攪拌し、水をさらに添加して真空中でTHFを蒸発させた。HCl（2M、水溶液）を添加することによりこの水溶液のpHを3.0に調整し、生じた沈殿を水（２×5mL）で洗浄し、遠心により集め、乾燥させて所望の生成物（1.31g、82％）を無色の粉末（mp195−97℃）として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ11.90（s br、2H）、7.76（7.83）（ｄ、Ｊ＝8.8Hz、1H）、7.68（7.61）（ｓ、1H）、6.89（6.72）（ｍ、1H）、6.39（6.38）（ｄ、Ｊ＝8.8Hz、1H）、3.96（4.21）（ｓ、2H）、3.53（3.43）（ｓ、2H）、3.34（ｍ、2H、水の信号によって隠されている）、3.16（3.03）（ｍ、2H）、1.36（1.35）（ｓ、9H）。13C NMR（DMSO−d6）：δ171.13（171.48）、170.82（170.46）、163.37、162.51、147.30、139.14（139.33）、137.25（137.52）、122.17、109.00、105.90、78.01、48.08（50.38）、47.60（46.76）、38.41（38.02）、33.43（33.14）、28.27。FAB+MS（m/z）:421.1723（Ｍ＋H+、C19H25N4O7についての算出値421.1723）、443.1543（Ｍ＋Na+、C19H24N4O7Na+についての算出値443.1543）。
実施例43
Hoogsteen鎖に修飾を含む修飾ビス−PNA（各々は、３つの連結した８−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸（egl）基を介して結合する逆平行７量体である）のハイブリダイゼーション/pH依存性（pH9.0、7.0及び5.0）
（E7）＝1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン
（E8）＝フェノチアジン
A.hoogsteen鎖にシトシン、シュードイソシトシン又は1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオンを有するビス−PNAのハイブリダイゼーション
1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン（E7）のジケト互変体のハイブリダイゼーションを、合成DNA 5'−dCGCAGAGAAACGC−3'（配列番号74）の相補的標的領域を標的指向するビス−PNA7量体中のシトシン及びシュードイソシトシンと比較する。
0003595345.tif 000054
B.hoogsteen鎖の離れた位置にシトシン、シュードイソシトシン、フェノチアジン又は1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオンを有するビス−PNAのハイブリダイゼーション
1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン（E7）のジケト互変体のハイブリダイゼーションを、合成DNA 5'−dCGCAGAGAGACGC−3'（配列番号78）の相補的標的領域を標的指向するビス−PNA7量体中のシトシン、シュードイソシトシン、及びフェノチアジンと比較する。
0003595345.tif 000055
C.hoogsteen鎖の隣接する位置にシトシン、シュードイソシトシン、フェノチアジン又は1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオンを有するビス−PNAのハイブリダイゼーション
1,8−ナフチリジン−2,7（1,8H）−ジオン（E7）のジケト互変体のハイブリダイゼーションを、合成DNA 5'−dCGCAAGGGAACGC−3'（配列番号83）の相補的標的領域を標的指向するビス−PNA7量体中のシトシン、シュードイソシトシン、及びフェノチアジンと比較する。
0003595345.tif 000056
実施例44〜56
式XI〜XIIIを有するモノマーシトシンの調製を以下に示す（実施例44〜55）。
0003595345.tif 000057
これらの核酸塩基モノマーは、二重鎖及び三重鎖の両者の形成におけるＴ残基認識体として、アンチセンスの適用において有利に用いられる。
実施例44
（３−オキソ−2,3,4,5−テトラヒドロピリダジン−６−イル）プロピオン酸エチル
無水エタノール（50mL）中のヒドラジン一水和物（95ミリモル、4.76g）の溶液に４−オキソピメリン酸ジエチル（100ミリモル、23.03g）を添加した。この混合物を室温で１時間攪拌し、真空中で蒸発乾燥させて所望の生成物（18.96g、定量的）を純粋な（HPCL260nm）白色固体として得た。この物質をHPCL（260nm）で分析したところ、純粋であることが見出された。UVλmax242nm。1H NMR（CDCl3）：δ8.61（s br、1H、NH）、4.11（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、2.60−2.55（ｍ、4H、2CH2）、2.50.2.40（ｍ、4H、2CH2）、1.22（ｔ、Ｊ＝7.1Hz、3H、CH3）。13C NMR（CDCl3）：δ172.41、167.16、153.35、60.36、30.85、29.76、25.17、14.00。FAB+MS:199.1085（Ｍ＋H+、C9H14N2O3＋H+についての算出値199.1083）。
実施例45
（３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル）−プロピオン酸エチル
エタノール（50mL）中の（３−オキソ−2,3,4,5−テトラヒドロピリダジン−６−イル）−プロピオン酸エチル（50.0ミリモル、9.90g）の溶液に臭素（75.0ミリモル、11.99g）を添加した。この混合物を室温で14時間攪拌し、その混合物をNaHCO3（飽和、水溶液）（500mL）に注ぎ入れた。得られた混合物をジエチルエーテル（５×500mL）で徹底的に抽出した。合わせた有機画分をMgSO4で乾燥させ、真空中で蒸発させた。その粗製生成物をトルエンから再結晶し、表題の化合物（3.35g、34.1％）を高純度（HPLC、260nm）の無色針状体として得た。UVλmax228nm及び285nm。1H NMR（CDCl3）：δ11.62（s br、1H、NH）、7.18（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、7.88（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、4.11（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、2.90（ｔ、Ｊ＝7.0Hz、2H、CH2）、2.64（ｔ、Ｊ＝7.0Hz、2H、CH2）、1.25（ｔ、Ｊ＝7.1Hz、3H、CH3）。13C NMR（CDCl3）：δ172.20、161.50、146.73、134.06、129.74、60.45、31.47、25.89、13.97。FAB+MS:197.10（Ｍ＋H+、C9H12N2O3＋H+についての算出値197.0926）。
実施例46
３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル−プロピオン酸
THF中の（３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル）−プロピオン酸エチル（3.00ミリモル、589mg）の溶液にLiOH（2M、水溶液）（7.50mL）を添加した。この溶液を室温で15分間攪拌し、水（25mL）をさらに添加してTHFを真空中で除去した。HCl（2M、水溶液）を添加することにより水相のpHを3.0に調整し、固形物質を濾別して水（２×3mL）で洗浄した。この固体を真空中で乾燥させ、所望の生成物（461mg、91.4％）を無色の粉末として得た。1H NMR（CDCl3）：δ11.62（s br、1H、NH）、7.18（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、7.88（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、4.11（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、2.90（ｔ、Ｊ＝7.0Hz、2H、CH2）、2.64（ｔ、Ｊ＝7.0Hz、2H、CH2）、1.25（ｔ、Ｊ＝7.1Hz、3H、CH3）。FAB+MS:169.0611（Ｍ＋H+、C9H12N2O3＋H+についての算出値169.0613）。
実施例47
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル−プロピオニル］グリシンメチル
DMF中の３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル−プロピオン酸（2.00ミリモル、336mg）の溶液にトリエチルアミン（2.00ミリモル、202mg）、DhbtOH（2.20ミリモル、359mg）、及びＮ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル（2.20ミリモル、464mg）、次いでDCC（2.20ミリモル、454mg）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させた。生じた油をジクロロメタン（100mL）にとり、NaHCO3（飽和、水溶液、50mL）で２回洗浄し、食塩水（50mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させて真空中で蒸発乾燥させた。その粗製生成物を、酢酸エチル／メタノール（95:5）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて表題の化合物（405mg、53％）を無色の泡状物質として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.74（s br、1H、NH）、7.37（7.35）（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、6.79（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、6.85（6.69）（ｔ、1H、NH）、4.00（4.24）（ｓ、2H、CH2）、3.61（ｓ、3H、CH3）、3.39（3.30）（ｔ、2H、CH2）、3.08（2.99）（ｑ、2H、CH2）、2.80−2.50（ｍ、4H、2xCH2）、1.33（1.36）（ｓ、9H、Boc）。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.391（170.66）、168.78（169.12）、159.08、154.45、145.49（145.58）、133.09（133.15）、128.25、76.73（76.51）、50.50（50.98）、46.24（48.48）、46.44（45.26）、37.09（36.72）、28.71（29.12）、28.02（27.87）、26.99（27.05）。
実施例48
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル−プロピオニル］グリシン（式XI）
THF（12.5mL）中のＮ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル−プロピオニル］グリシンメチル（1.00ミリモル、382mg）の溶液にLiOH（2M、水溶液、2.0mL）を添加した。この溶液を室温で15分間攪拌し、水（10mL）をさらに添加してTHFを真空中で除去した。HCl（2M、水溶液）を添加することにより水相のpHを3.0に調整した。ジクロロメタン（DCM）で連続抽出することによって生成物を単離した後、真空中で蒸発させて所望の生成物（215mg、80％）を無色の粉末として得た（UVmax287nm）。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.73（s br及びs vbr、2H、NH及びCOOH）、7.38（7.35）（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、6.78（ｄ、Ｊ＝9.7Hz、1H、芳香族）、6.83（6.70）（ｔ、1H、NH）、3.92（4.11）（ｓ、2H、CH2）、3.39−3.27（ｍ、2H、CH2）、3.08（3.00）（ｑ、2H、CH2）、2.73−2.66（ｍ、2H、CH2）、2.69−2.52（ｍ、2H、CH2）、1.33（1.36）（ｓ、9H、Boc）。13C NMR（DMSO−d6）：δ171.50（171.93）、171.04（171.38）、160.39、155.73、146.88（146.92）、134.41、129.53、77.99（77.76）、47.44（49.98）、47.61（46.64）、38.31（37.97）、30.05（30.40）、29.31（29.12）、28.24。FAB+MS:369.14（Ｍ＋H+、C16H24N4O6＋H+についての算出値369.1774）。
実施例49
Ｏ−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６−イル）−２−オキシ−酢酸
3,6−ジヒドロキシピリダジン（5.00g、44.6ミリモル）を無水エタノール／水（3:1）（40mL）に懸濁させ、KOH（2.10g、37.6ミリモル）を添加した。30分後、ブロモ酢酸エチル（9.20g、54.9ミリモル）を徐々に添加した。この懸濁液を加熱して還流させ、一晩放置した。その混合物を真空中で蒸発させ、水（30mL）をさらに添加した。水相を酢酸エチル（４×50mL）で抽出し、有機画分を真空中で蒸発させた、その粗製生成物を、１％酢酸を含むメタノール／クロロホルム（1:4 v/v）を溶離液として用いてシリカゲルカラムで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて所望の生成物（1.56g、21％）（１％酢酸を含むメタノール／クロロホルム（1:4 v/v）を用いるTLC、Rf0.32により純粋）を得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.10（s br、1H、NH）、7.15（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.83（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、4.29（ｓ、2H、CH2）。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.77、159.77、152.77、132.53、128.23、65.65。FAB+MS:分子量に相当する信号は観察されなかった。
実施例50
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［Ｏ−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６−イル）−２−オキシ−アセチル］グリシンエチル
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）グリシンエチル（395mg、1.60ミリモル）をDMF（10mL）に溶解し、Ｏ−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６−イル）−２−オキシ−酢酸（300mg、1.76ミリモル）、次いで３−ヒドロキシ−1,2,3−ベンゾトリアジン−４（3H）−オン（291mg、1.78ミリモル）を添加した。この混合物を氷上で冷却し、N,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（404mg、1.96ミリモル）を添加した。１時間後、氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩攪拌した。その混合物を真空中で蒸発させ、粗製生成物を、ジクロロメタン／メタノール（93:7 v/v）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて、TLC、Rf0.30（ジクロロメタン／メタノール90:10 v/v）で純粋な表題の化合物（436mg、62％）を得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.14（s br、1H、NH）、7.23（7.19）（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.88（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.71（ｍ、1H、NH）、4.94（4.78）（ｓ、2H、CH2）、4.08（ｑ、Ｊ＝7.1Hz、2H、CH2）、4.01（ｓ、2H、CH2）、3.12（ｍ、2H、CH2）、3.02（ｍ、2H、CH2）、1.36（ｓ、9H、CH3（Boc））、1.17（ｔ、Ｊ＝7.1Hz、3H、CH3）。13C−NMR（DMSO−d6）：δ169.15（169.54）、167.15（167.43）、159.72、155.79、151.85、133.23、127.57、78.15（77.87）、63.04（63.55）、60.62（61.20）、47.59（48.92）、46.82、38.31（37.78）、28.25、14.11。FAB+MS:398.94（Ｍ＋H+、C17H26N4O7＋H+についての算出値399.19）。
実施例51
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［Ｏ−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６−イル）−２−オキシアセチル］グリシン（式XII）
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［Ｏ−（３−オキソ−2,3−ジヒドロピリダジン−６−イル）−２−オキシアセチル］グリシンエチル（402mg、1.01ミリモル）をTHF（10mL）に懸濁させ、LiOH（2M、水溶液）（2.50mL）を添加した。90分後、水（10mL）をさらに添加し、THFを真空中で除去した。HCl（4M、水溶液）を添加することにより水相のpHを4.0に調整した。この混合物を冷所に一晩放置し、生じた沈殿を濾別して氷冷水（３×10mL）で洗浄し、真空中で乾燥させて表題の化合物（124mg、34％）を白色粉末として得た。この生成物はTLC、Rf0.33（ブタノール／酢酸／水 4:1:1 v/v/v）で純粋であった。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.14（s br、1H、NH）、7.23（7.17）（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.88（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.72（ｍ、1H、NH）、4.92（4.77）（ｓ、2H、CH2）、3.94（4.13）（ｓ、2H、CH2）、3.13（ｍ、2H、CH2）、3.02（ｍ、2H、CH2）、1.36（ｓ、9H、CH3（Boc））。13C NMR（DMSO−d6）：δ170.65（171.04）、167.02（167.41）、159.76、155.84（155.72）、151.94、133.24、127.64、78.19（77.91）、63.14（63.53）、47.39（48.93）、46.75、38.28（37.77）、28.28。FAB+MS:369.15（Ｍ＋H+、C15H22N4O7−H+についての算出値369.14）。
実施例52
Ｏ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル］４−ヒドロキシ酪酸エチル
DMF（40mL）中の3,6−ジヒドロキシピリダジン（20.0ミリモル、2.24g）の溶液にNaH（鉱物油中の60％分散液）を一度に添加した。この不均一混合物を室温で30分間攪拌した後、４−ブロモ酪酸エチル（25.0ミリモル、4.88g）を添加し、その不均一混合物を100℃で２時間攪拌した。得られた黄色溶液を真空中で蒸発させて酢酸エチル（500mL）にとり、５％NaHCO3水溶液（２×200mL）、次いで食塩水（200mL）で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過して真空中で蒸発させた。得られた粗製物質を酢酸エチル／石油エーテルから再結晶し、所望の生成物を無色の輝く粉末として得た（2.35g、52％）。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.14（s br、1H、NH）、7.12（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.86（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、4.09−4.03（ｍ、4H、重複CH3）、2.41（ｔ、Ｊ＝7.32Hz、2H、CH2）、1.94（ｍ、2H、CH2）、1.17（ｔ、Ｊ＝7.0Hz、3H、CH3）。13C NMR（DMSO−d6）：δ172.55、159.66、152.66、133.16、127.72、65.59、59.97、30.22、23.82、14.18。FAB+MS:227.1041（Ｍ＋H+、C15H14O4N2＋H+についての算出値227.1041）。
実施例53
Ｏ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル］４−ヒドロキシ酪酸
THF（40mL）中のＯ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル］４−ヒドロキシ酪酸エチル（5.00ミリモル、1.13g）の溶液にLiOH（2M、水溶液）（10.0mL）を添加した。この溶液を室温で15分間攪拌し、水（20mL）をさらに添加してTHFを真空中で除去した。HCl（2M、水溶液）を添加することにより水相のpHを3.0に調整し、固形物質を濾別して水（２×5mL）で洗浄した。真空中で乾燥させた後、表題の化合物（909mg、91.8％）を無色の粉末として得た。1H NMR（DMSO−d6）：δ12.14（s br、1H、NH）、7.13（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.86（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、4.06（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、2H、CH2）、2.34（ｔ、Ｊ＝7.4Hz、2H、CH2）、1.90（ｍ、2H、CH2）。13C NMR（DMSO−d6）：δ174.15、159.71、133.16、127.78、65.72、30.24、23.87。FAB+MS:199.0713（Ｍ＋H+、C15H14O4N2＋H+についての算出値199.0719）。
実施例54
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［Ｏ−（３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル）４−ヒドロキシブチリル］グリシンメチル
DMF中のＯ−［３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル］４−ヒドロキシ酪酸（3.3ミリモル、643mg）の溶液にジイソプロピルエチルアミン（3.3ミリモル、427mg）及びHBTU（3.30ミリモル、1.25g）、次いでＮ−（２−Boc−アミノエチル）グリシンメチル（3.0ミリモル、696mg）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌し、真空中で蒸発させた。得られた油をジクロロメタン（200mL）にとり、NaHCO3（飽和、水溶液）（70mL）で２回、次いで食塩水（70mL）で洗浄し、MgSO4で乾燥させた。この溶液を濾過し、真空中で濃縮して乾燥させた。その粗製物質を、ジクロロメタン／メタノール（95:5）を溶離液として用いてシリカで精製した。生成物を含む画分をプールし、真空中で蒸発させて所望の生成物（0.93g、75％）を無色の泡状物質として得た。1H NMR（DMSO−d6;この化合物は２種類の回転異性体として存在する；少数回転異性体の化学シフトは括弧内に示す）：δ12.12（s br、1H、NH）、7.14（7.11）（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、6.86（ｄ、Ｊ＝9.9Hz、1H、芳香族）、4.05（ｔ、Ｊ＝6.4Hz、2H、CH2）、3.99（4.21）（ｓ、2H、CH2）、3.61（3.67）（ｓ、2H、CH2）、3.06（ｍ、2H、CH2）、1.91（ｍ、2H、CH2）、1.35（ｓ、9H、Boc）。13C NMR（DMSO−d6）：δ172.33（172.16）、170.43（170.11）、159.63、155.74、152.72、133.07、127.75、77.97（77.73）、65.88、51.74（52.20）、47.71、47.43、38.34（37.96）、28.24、24.12。FAB+MS:413.2042（Ｍ＋H+、C18H28N4O7＋H+についての算出値413.2036）。
実施例55
Ｎ−（２−Bocアミノエチル）−Ｎ−［Ｏ−（３−オキソ−2,3,−ジヒドロピリダジン−６−イル）４−ヒドロキシブチリル］−グリシン（式XIII）
表題の化合物を、実施例51に説明される手順により、実施例54において調製される表題の化合物を用いて調製する。
本明細書において言及され、又は参照される特許、出願、及び刊行物の各々は参照することによりその全体がここに組み込まれることが意図されている。
当業者が認めるように、本発明の精神から逸脱することなく、多くの変更及び変形を本発明の好ましい態様に対してなすことができる。そのような変種の全てが本発明の範囲内にあることが意図されている。