(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナスプチダに属する有機溶媒耐性菌株であって、このシュードモナスプチダに属する菌株がシュードモナスプチダCE2010（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２４８）であり、有機溶媒存在下でビフェニルまたはビフェニル化合物を単一炭素源として生育可能であることを特徴とする微生物。
【請求項２】
ビフェニル化合物が、ポリ塩化ビフェニルである請求項１の微生物。
【請求項３】
有機溶媒を０．３％以上含有し、炭素源として少なくともビフェニルまたはビフェニル化合物を含有する培地中で培養することを特徴とする請求項１または２の微生物の培養方法。
【請求項４】
ビフェニル化合物が、ポリ塩化ビフェニルである請求項３の微生物の培養方法。
【請求項５】
有機溶媒が、脂肪属炭化水素類、脂環式炭化水素類、芳香属炭化水素類、アルコール類、エーテル類、ケトン類、またはこれらの誘導体、若しくはそれらの任意の混合物である請求項３または４の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、微生物と、その培養方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、分解が困難で環境汚染の原因の一つとなっているポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等のビフェニル化合物を分解資化することができ、これらの物質を基質として有機溶媒存在下で発酵を行うことのできる新しい微生物と、この微生物の培養方法に関するものである。この発明の微生物は、上記の特性により、例えばバイオリアクターやプロテインエンジリアリングの分野で幅広く利用可能であり、また、汚染土壌や廃水の処理等に活用できる。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
従来より、有機溶媒である炭化水素またはその誘導体を含む培地で生育可能な微生物として、例えば、トルエンまたはサイクロヘキン含有培地で生育するシュードモナスプチダ（Ａ．Ｉｎｏｕｅ；  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８，  ２６４，  １９８９）等が知られている。しかしながら、これらの微生物は、培地中の炭化水素類またはその誘導体に耐性は示すものの、それらの物質をを資化することはできず、従って炭化水素類やそれらに含まれる他の炭化水素類を基質として発酵を行うことは不可能であった。
【０００３】
一方、ＰＣＢなどのビフェニル化合物やビフェニルは、その難分解性によって環境への影響が問題視されている。このため、ビフェニルやビフェニル化合物を分解する微生物の探索が試みられており、これまでにも、例えばクロロビフェニル分解菌であるシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｕｅｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ）  ＫＦ  ７０７  （Ｋ．Ｆｕｒｕｋａｗａ；  Ｊ．  Ｂａｃ．，  １６６，  ３９２，  １９８６）等が自然界から単離されている。しかしながら、これら従来のビフェニルまたはビフェニル化合物分解菌の場合には、ＰＣＢに対する分解能は極めて乏しく、低濃度のＰＣＢは分解するものの、高濃度のＰＣＢを資化することは不可能であった。
【０００４】
このように、これまでに単離されている有機溶媒耐性菌やビフェニル（化合物）分解菌は、炭素水素類および／またはＰＣＢを基質とする発酵に用いる場合には、それらの基質を低濃度に制御するための面倒な操作を必要とし、しかも低濃度基質による反応性の低下から生産性が低いという欠点があった。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、炭化水素類等の有機溶媒に耐性を示すと共に、ビフェニルおよびＰＣＢに対する高い分解能を有する新規な微生物と、この微生物の培養方法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、シュードモナスプチダに属する有機溶媒耐性菌株であって、このシュードモナスプチダに属する菌株がシュードモナスプチダCE2010（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２４８）であり、有機溶媒存在下でビフェニルまたはビフェニル化合物を単一炭素源として生育可能であることを特徴とする微生物を提供する。また、この発明は、有機溶媒を０．３％以上含有し、炭素源として少なくともビフェニルまたはビフェニル化合物を含有する培地中で培養することを特徴とする上記微生物の培養方法をも提供する。
【０００６】
なお、この発明は、上記の微生物として、シュードモナスアルギノーザ、シュードモナスフルオレセンス、シュードモナスエスビー、またはシュードモナスプチダに属する菌株を、さらに詳しくは、シュードモナスプチダに属するシュードモナスプチダＣＥ２０１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２４８）を例示する。
さらにこの発明の培養方法においては、有機溶媒が、脂肪属炭化水素類、脂環式炭化水素類、芳香属炭化水素類、アルコール類、エーテル類、ケトン類、またはこれらの誘導体、若しくはそれらの任意の混合物であることを好ましい態様としてもいる。
【０００７】
この発明の微生物は、特に毒性が強い芳香属炭化水素類を始めとして、脂肪属炭化水素類、脂環式炭化水素類、アルコール類、エーテル類、ケトン類またはこれらの誘導体等の有機溶媒を２０％以上の高濃度で含む培地において、ビフェニルまたはＰＣＢ等のビフェニル化合物を資化分解することができる。このたため、この微生物は、その培養時に大量の基質の供給が可能となり、生産性が向上するると共に、基質濃度の制御が容易となり、雑菌汚染の防止も可能となる。また、溶媒耐性能を有することにより、高濃度のビフェニルやＰＣＢ等をも分解資化することができ、しかもこれらの水難溶性物質を各種炭化水素類に溶解するため、基質の濃度制御が可能となり、生産性も向上する。
【０００８】
以下、この発明の微生物とその培養法について、さらに詳しく説明する。
この発明の微生物は、この発明の発明者等が全国各地から集めた土壌を検索し、ビフェニル０．１ｇ、酵母エキス０．０１％  、塩化ナトリウム０．２％、硫酸アンモニウム０．５％、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸一水素カリウム０．２％および有機溶媒（脂肪属炭化水素類、脂環式炭化水素類、芳香属炭化水素類、アルコール類、エーテル類、ケトン類、またはこれらの誘導体、若しくはそれらの任意の混合物）２０％  を含む培地で培養し、形成されたコロニーを分離して取得したものである。
【０００９】
この菌株は、次の菌学的性質を有する。
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以上の菌学的性質を基準として、取得菌株を文献（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ    Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８４）で検索したところ、この菌株の性質がシュードモナスプチダと一致することが判明した。そこで、シュードモナスプチダの標準菌株ＩＦＯ−３７３８と溶媒耐性菌ＩＨ２０００、および上記取得菌株について、各溶媒に対する耐性能を調べた。結果は表１に示した通りであり、この菌株はＩＨ２０００と同様の溶媒耐性菌であることが判明した。さらにこれら３菌株について、ビフェニルを唯一炭素源とした場合の各溶媒に対する耐性能を調べた。結果は表２に示した通りであり、この取得菌株は、溶媒耐性能と同時にビフェニル資化能をも有することが確認された。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
【表２】
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【００１２】
以上のことから、この発明の発明者等が新たに分離した菌株は、シュードモナスプチダと形態学的性質や生理学的性質等は一致するものの、溶媒に対する挙動を異にし、また溶媒存在下でビフェニルを資化することから、シュードモナスプチダに属する新菌株と認め、シュードモナスプチダＣＥ２０１０と命名し、平成６年３月２８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２４８）。
【００１３】
このシュードモナスプチダＣＥ２０１０は、窒素源、無機イオン等の他、有機溶媒を０．３％以上含有し、炭素源として少なくともビフェニルまたはビフェニル化合物を含有する培地で培養することができる。
窒素源としては、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキス、コーンスティーブリカー、カザミノ酸、塩化アンモニウム、炭素、硝酸ナトリウム等を用いることができ、無機イオンとしては、燐酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、銅イオン、マンガンイオン等を用いることができる。
【００１４】
炭素源は、ビフェニルやＰＣＢ等のビフェニル化合物の他、グルコース、フラクトース、キシロース、澱粉加水分解物等の糖類を用いることができる。
有機溶媒は、脂肪属炭化水素類、脂環式炭化水素類、芳香属炭化水素類、アルコール類、エーテル類、ケトン類、またはこれらの誘導体、若しくはそれらの任意の混合物を用いる。このうち、脂肪属炭化水素類としてはペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、１−ｏｒ２−ヘキセン、１−オクチン、１−ドデセン、１，３−ペンタジエン、１，５−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等を、脂環式炭化水素類としてはシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロペンタン、メチルシクロヘキサン等を、芳香属炭化水素類としてはトリエン、キシレン、スチレン、エチルベンゼン、クロロベンゼン等を、アルコール類としては１−ヘプタノール、１−オクタノール、１−デカノール等を、エーテル類としてはｎ−ヘキシルエーテル、ｎ−ブチルフェニルエーテル、ジベンジルエーテル、メトキシトルエン等を、そしてケトン類としては２−ベンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、シクロヘキサノン等をそれぞれ用いることができる。
【００１５】
培養は、ｐＨ５〜９、温度２０〜４０℃の好気的条件下で行うことができる。以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】
実施例１
シュードモナスプチダＣＥ２０１０を、最小培地（ビフェニル０．１ｇ、酵母エキス０．０１％  、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸一水素カリウム０．２％、塩化ナトリウム０．２％、蒸留水を含有）１０ｍｌに稙菌し、溶媒（オクタン、シクロオクタン、ヘキサン、またはシクロヘキサン）を２．５ｍｌ  添加した。３０℃で２００時間培養し、比色計（ＭＯＤＥＬ  ３３０  ＵＶ−ＶＩＳ−ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ，  Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ．）で培養液の吸光度（波長６６０ｎｍ）を測定し、培地の濁度を指標として菌の生育状態を比較した。また、対照として、溶媒無添加でも同様の条件で培養し、生育状態を測定した。
【００１７】
結果は、図１に示したとおりであり、シュードモナスプチダＣＥ２０１０はいずれの溶媒存在下でも、溶媒非存在下と同様に良好に生育した。
実施例２
シュードモナスプチダＣＥ２０１０とシュードモナスプチダの標準菌株ＩＦＯ−３５３８を、それぞれ最小培地（ビフェニル０．１ｇ、酵母エキス０．０１％  、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸一水素カリウム０．２％、塩化ナトリウム０．２％、硝酸アンモニウムｏ．５％、蒸留水を含有）に稙菌し、培地１０ｍｌに対して溶媒（ヘキサンまたはシクロヘキサン）を２．５ｍｌ  添加した。３０℃で９６時間培養し、実施例１と同様に各菌株の生育状態を比較した。
【００１８】
結果は、表３に示した通りであり、標準菌株ＩＦＯ−３５３８がビフェニルおよび溶媒の存在下で生育しなかったのに対し、この発明の菌株シュードモナスプチダＣＥ２０１０は、良好に生育した。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
実施例３
実施例２と同様の培地に各種ＰＣＢ（ジ・トリ・テトラクロロビフェニル含有）５０ｐｐｍ  を加え、それぞれの培地にシュードモナスプチダＣＥ２０１０を植菌した。３０℃で９６時間培養し、ＰＣＢの分解の程度を比較した。
結果は表４に示した通りであり、この発明の菌株シュードモナスプチダＣＥ２０１０は、難溶解性ＰＣＢに対して優れた資化分解能を示した。
【００２１】
【表４】
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【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、有機溶媒に対して優れた耐性を示すと共に、ビフェニルおよびＰＣＢに対する高い資化分解能を有する新規な微生物と、この微生物の培養方法が提供される。この発明の微生物は、本来強い毒性を持つビフェニルまたはＰＣＢを単一炭素源とする溶媒含有培地で生育し菌体を増殖するため、溶媒中のビフェニルまたはＰＣＢの濃度制御が可能となり、同時に溶解して使用する水難溶性物質も高濃度で使用できる。このため、この発明の微生物は、バイオリアクターやプロテインエンジリニアリング等の分野で幅広く利用できる。また、生産性も著しく向上する。
【００２３】
さらに、この発明の微生物は、ビフェニルやＰＣＢ等の難分解性物質を容易に資化分解するため、ハロゲン化有機廃棄物等による汚染土壌や汚水の処理または汚染物質除去のモニターとしても利用できる。しかも、微生物による汚染処理は、設備の簡略化、低エネルギー、自律的運転および最終的な産生物回収等の可能性を含み、また既存の処理施設にも適用可能なため、システム全体の低コスト化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の微生物の一例であるシュードモナスプチダＣＥ２０１０を、異なる溶媒中で培養した時の培地濁度の経時的変化である。
【図１】
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