(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子のエクソン９において、ＴＣＡＣＣＣＧＴＧの９塩基の繰返し配列によるインサーションの存在を検出することを特徴とするヒトチトクロームＰ４５０２Ｄ６遺伝子多型の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は薬物代謝関連酵素の遺伝子診断法、殊にチトクロームＰ４５０２Ｄ６（以下、ＣＹＰ２Ｄ６と略す）の遺伝子多型の新規な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトチトクロームＰ４５０（Ｐ４５０）は、薬物や生体外異物の解毒化及び代謝的活性化、ステロイドホルモンや胆汁酸の生合成等の重要な働きを担う酵素である。ＣＹＰ２Ｄ６は、該Ｐ４５０の１分子種であり、殊に臨床治療上重要な多くの薬物の代謝に関与しており、現在までに、抗高血圧薬であるブデリソキンやプロパフェノン、β−遮断薬であるプロプラノロール、三環系抗うつ薬であるイミプラミン等の２６種類もの薬物が、該ＣＹＰ２Ｄ６の特異的基質となることが報告されている〔Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ａ．Ｓ．，  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，  ４６，  ３７７−３９４  （１９９０）〕。
【０００３】
一方、上記ＣＹＰ２Ｄ６には多型性が存在することが明らかにされており、常用量の服用でも代謝能の低いひと（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ：  以下ＰＭと略す）では、高い血中濃度を維持することにより、薬の効き過ぎ（副作用）が生じることが報告されている。上記ＣＹＰ２Ｄ６における多型性には人種差が存在し、ＰＭの頻度は欧米人では５〜１０％である〔Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，  Ｕｍｅｎｏ，Ｍ．，  Ｓｋｏｄａ，Ｒ．Ｃ．，  Ｍｅｙｅｒ，Ｕ．Ａ．  ａｎｄ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，  ４５，  ８８９−９０４  （１９８９）〕のに対して、日本人では０〜２％と非常に少ない〔Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．，  Ｔａｍｕｒａ，Ｓ．，  Ｆｕｒｕｙａ，Ｈ．，  Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，  Ｋａｎａｚａｗａ，Ｉ．，  Ｋｏｎｄｏ，Ｉ．  ａｎｄ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ３，  ２５６−２６３  （１９９３）  〕。従って、許可前の新薬がＣＹＰ２Ｄ６の特異的基質であった場合は、臨床試験においてはその低いＰＭ頻度のために副作用の発現を確認できずに、上市後に重篤な副作用の生じる可能性が充分に考えられ、この点より日本人において特に注意を払う必要がある〔鎌滝哲也，ＴＤＭ研究．，１０，２−７  （１９９３）  〕。
【０００４】
最近、上記ＣＹＰ２Ｄ６における多型の原因はその遺伝子における変異にあることが欧米人のＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子解析により明らかにされた〔Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｕ．Ａ．，  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，  ５０，２３３−２３８  （１９９１）  ；  Ｈｅｉｍ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｕ．Ａ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３６，  ５２９−５３２  （１９９０）  ；  Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．Ｄ．，  Ｇｏｕｇｈ，Ａ．Ｃ．，  Ｌｅｉｇｈ，Ｐ．Ｎ．，  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂ．Ａ．，  Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａ．Ｅ．，  Ｍａｒａｎｇａｎｏｒｅ，Ｄ．Ｍ．，  Ｓｔｕｒｍａｎ，Ｓ．Ｇ．，  Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．Ｖ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｃ．，  Ｓｐｕｒｒ，Ｎ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，Ｃ．Ｒ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３９，  １３７３−１３７７  （１９９２）  〕。即ち、ＣＹＰ２Ｄ６は９つのエクソンから構成されるが、ゲノムＤＮＡで２６３７番目のエクソン５における１塩基置換であるＡ型変異、同１９３４番目のエクソン４におけるエクソン−イントロン接合部位の１塩基置換であるＢ型変異及び全欠損であるＤ型変異が報告され、これらの変異・欠損により代謝能が著しく損なわれることが明らかにされている。
【０００５】
上記Ａ型変異及びＢ型変異はＣＹＰ２Ｄ６の変異で非常に高い割合を占めていると考えられ、欧米人のＰＭの９５％はこの両者の変異によって説明できるとの報告〔Ｄａｌｙ，Ａ．Ｋ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｍ．，  Ｍｏｎｋｍａｎ，Ｓ．Ｃ．，  Ｉｄｌｅ，Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｉｄｌｅ，Ｊ．Ｋ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １，  ３３−４１  （１９９１）  〕や、欧米人のＰＭの７５％はＢ型変異に、５〜１１％はＡ型変異に属するとの報告〔上記Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．  等〕がある。
【０００６】
しかしながら、日本人においてはこれらの変異の頻度が低いために殆ど研究は進められていない現状にある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の新規な変異を明らかにするものであり、かかるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型を検出する新しい方法を提供することを目的とする。特に本発明は、少量のＤＮＡ試料を利用して、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の新しい多型を検出できる簡便、容易でしかも感度及び精度の高い上記検出方法を開発することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記目的より、日本人のＰＭのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の解析及び家系解析を行なった結果、上記目的に合致する新しい遺伝子多型を見出すと共に、その検出技術を開発するに成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン９において、ＴＣＡＣＣＣＧＴＧの９塩基の繰返し配列によるインサーションの存在を検出することを特徴とするＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型の検出方法に係わる。
【００１０】
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃至当該分野における通称又は慣用に従うものとし、塩基番号はＣＹＰ２Ｄ６ゲノムＤＮＡ〔上記Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．  等の文献の表記〕に従って表記する。
【００１１】
本発明によって明らかにされた新しい型の変異は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン９である４２１３番目において、ＴＣＡＣＣＣＧＴＧの９塩基の繰返し配列によるインサーションの存在として特徴付けられる。
【００１２】
本発明方法は、かかる特定の変異を検出する限りにおいてその手法等に何等の限定もなく、例えば常法である各種の方法を広く採用することができる。本発明によって検出すべき遺伝子変異が明らかにされこれが特定されている以上、その検出のための手法の適宜採用は、本出願開示に従えば当業者に容易であろう。例えば本発明方法は、上記特定された位置の塩基配列の解析を行なうことによっても可能であり勿論これを包含する。サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼーション法〔何れもＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９８，  ５０３−５１７  （１９７５）〕も採用し得る選択であろう。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ法（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｏｈｉｓｍ：  制限酵素断片長多型分析法）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法〔Ｏｒｉｔａ，Ｍ．，  Ｉｗａｈａｎａ，Ｈ．，  Ｋａｎａｚａｗａ，Ｈ．，  Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｅｋｉｙａ，Ｔ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ２７６６−２７７０  （１９８９）〕、ＰＣＲ−ＳＳＯ法〔Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ：ＡＳＯ；  Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，  Ｂｕｇａｗａｎ，Ｔ．Ｌ．，  Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，  Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４，  １６３−１６６  （１９８６）  〕等に従うことができる。
【００１３】
特に本発明においては、上記ＲＦＬＰ法の採用を好ましく例示することができ、殊にＰＣＲ法を利用するＤＮＡの増幅手法との組合わせによれば、少量のＤＮＡ試料を利用して簡便且つ容易にしかも感度及び精度の高い検出が可能である。以下、かかる検出法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）を例にとり本発明を詳述する。
【００１４】
尚、本発明の検出法において採用され得る各種の操作、例えば一部ＤＮＡの化学合成、ＤＮＡの切断、削除、付加乃至結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選択等はいすれも常法に従うことができる〔分子遺伝学実験法、共立出版株式会社、１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー、宝酒造株式会社、１９９０年発行等〕。例えば、ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲル電気泳動法等に従い得、ＤＮＡ配列の決定は、例えばジデオキシ法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，  Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，  ５４６３−５４６７  （１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，  ４９９−５６０  （１９８０）〕等に従い得る。上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行ない得る。ＤＮＡの特定領域の増幅のためのＰＣＲ法もまた常法〔例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，  Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．，  Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．Ａ．，  Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，  Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０，１３５０−１３５４  （１９８５）  〕に従うことができる。これら各種の基本的操作は、例えば本出願に引用の各種文献においても採用されており、後述の実施例とともに参照される。
【００１５】
本発明の検出法において、測定対象であるゲノムＤＮＡは、ヒト由来のサンプルでありこれを含むものであれば特に限定なく採用でき、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液等の体液、肝臓等の組織細胞、毛髪等の体毛等を例示できる。ゲノムＤＮＡはこれらのサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製することができる。該ゲノムＤＮＡより、本発明にかかる変異部位を含むＤＮＡ領域を増幅し、多量にかつ濃縮された被検体を得ることができる。これは、例えばＰＣＲ法に従い実施でき、上記エクソン９のインサーション部分を含み、かつＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のみを特異的に増幅するように適宜設定したプライマーを採用することにより行なわれる。かかるプライマーの設定は、常法に従えばよく、増幅する領域の塩基長等にも制限はなく通常１００ｂｐから５００ｂｐ程度とすることができる。尚、増幅されるＤＮＡ領域は、引続くＲＦＬＰ法において好適に使用し得る任意の制限酵素サイトを含むように設定され、これは該ＤＮＡ領域を該酵素により処理して得られる切断断片に、変異遺伝子と通常（ｗｉｌｄ：  野生型）遺伝子の場合で検出を可能とする長さの違いをもたらす限りにおいてどのようにも設定することができる。かかるプライマー設定の好適な１例は、後述の実施例に示す、センスプライマー（９−Ｓ）及びアンチセンスプライマー（９−ＡＳ）であり、かかる設定によれば、ＣＹＰ２Ｄ６について塩基配列の相同性が非常に高い２つのシュードジーン、即ちＣＹＰ２Ｄ７及びＣＹＰ２Ｄ８、と区別してＣＹＰ２Ｄ６の上記所望領域のみを特異的に増幅することが可能である。かかるつプライマーの設定によれば、所望の制限酵素サイト（ＳｔｙＩサイト）を１ケ所含み、この酵素処理により７７ｂｐ（野生型）又は８６ｂｐ（変異型）と２５７ｂｐ（共通）の切断断片を与える、３３４ｂｐ（野生型）及び３４３ｂｐ（変異型）の所望ＤＮＡ領域が増幅される。
【００１６】
かくしてＰＣＲ法に従い増幅された所望ＤＮＡ領域は、ＲＦＬＰの検出に従うサザンブロット法或いはゲル電気泳動法等の採用により、容易に、その領域に含まれる変異を検出確認することができる。該所望ＤＮＡ領域は、上記において適宜に選択された制限酵素による処理（消化）に供され、生成した切断断片は常法に従い特定バンドとして確認される。
【００１７】
上記のようにして得られたバンドのパターンより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型（本発明にかかる変異の存在）を検出することができる。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子の新規な変異が明らかにされ、かかる変異を有するＣＹＰ２Ｄ６の新規遺伝子多型の検出方法が提供される。
【００１９】
該ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型の検出によれば、ＰＭの遺伝子診断が可能であり、殊に既知のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型に起因しないＰＭの診断が可能となることで、各種薬物による副作用発見の診断、予知、原因究明等を行なう上で極めて有用である。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されない。
【００２１】
尚、各例に用いた試薬等に関する略号は、それぞれ次のものを示す。これらの組成は１リットル当りの濃度又は量であり、必要のあるものはオートクレーブ（１２１℃、２０分）等の滅菌処理を行なった。
【００２２】
・ＴＥ溶液…１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）
・２０×ＳＳＣ…３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム
・５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液…フィコール１０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｇ
・２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ８．０）…０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ドデシルサルフェートナトリウム（ＳＤＳ）
・ＳＥ溶液…１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン２ナトリウム
・ホルムアミド色素…ホルムアミド１００ｍｌ、キシレンシアノールＦＦ０．１ｇ、ブロモフェノールブルー０．１ｇ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ４ｍｌ
・ＳＴＥ…１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
・ＬＢ培地…グルコース１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス５ｇ、バクトトリプトン１０ｇ
・ＬＢＡｍｐ＋培地…グルコース１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酵母エキス５ｇ、バクトトリプトン１０ｇ、アンピシリン（オートクレーブ後、終濃度２５μｇ／ｍｌとなるように添加）
・ＬＢＡｍｐ＋プレート…上記ＬＢＡｍｐ＋培地に寒天末１１ｇを添加
・２×ＴＹ培地…バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
・２×ＴＹプレート…上記２×ＴＹ培地に寒天末１１ｇを添加
・１０×ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８．３）…１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、塩化マグネシウム（単位をｍＭとし、濃度はその度に示した）
・Ｈ寒天培地…バクトトリプトン２０ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、寒天末１２ｇ
・Ｈ上層寒天…バクトトリプトン２０ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、寒天末８ｇ
・１０×Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ｐＨ８．８）…６６７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６７ｍＭ塩化マグネシウム、１１６ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、６７μＭ  ＥＤＴＡ、０．１６７％ＢＳＡ
・１０×デナチュレーション（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）緩衝液（ｐＨ９．５）…２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・１０×ブラントエンド（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ  ）緩衝液…０．５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ塩化マグネシウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール
・ラベリングミックス（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｉｘ）…７．５μＭデオキシグアノシン５′−トリフォスフェート（ｄＧＴＰ）、７．５μＭデオキシシチジン５′−トリフォスフェート（ｄＣＴＰ）、７．５μＭデオキシチミジン５′−トリフォスフェート（ｄＴＴＰ）
・４０％アクリルアミド保存液…アクリルアミド３８ｇ、ビスアクリルアミド２ｇ、精製水で計１００ｍｌとする
・１０×ＴＢＥ（ｐＨ８．３）…トリス１０８ｇ、ホウ酸５５ｇ、ＥＤＴＡ９．３ｇ
・ゲルＡ…尿素７６．８ｇ、４０％アクリルアミド保存液２４ｍｌ、１０×ＴＢＥ８ｍｌ、精製水で計１６０ｍｌとする
・ゲルＢ…尿素１４．４ｇ、４０％アクリルアミド保存液４．５ｍｌ、１０×ＴＢＥ７．５ｍｌ、ショ糖３．０ｇ、ブロモフェノールブルー色素溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、精製水で計３０ｍｌとする
・１０×Ｈ溶液…５００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００ｍＭ塩化ナトリウム・１０×Ｍ溶液…１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ塩化ナトリウム
【００２３】
【参考例１】
（１）ヒト末梢血ゲノムＤＮＡの調製
ヒトの末梢血よりゲノムＤＮＡを以下の方法に従って調製した。即ち、抗凝固剤ヘパリンを使用して採血したヒト末梢血１０ｍｌを３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、バッフィーコートを得た。得られたバッフィコートに等量の冷ＰＢＳを加え、同様に遠心分離操作を２〜３回繰返した。得られたバッフィコートを５倍量の０．２％塩化ナトリウム−５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿のヘモグロビン色が消えるまで上記洗浄操作を繰返し、得られた沈殿にＴＥ溶液０．５ｍｌを加えて完全に懸濁させた後、リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ、１０ｍｇ／ｍｌ）及びアクチナーゼＥ（２０ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ２μｌ及び１００μｌずつ加えた。これを再度懸濁させた後、ＳＥ溶液１．５ｍｌを加え、３７℃で２時間インキュベート後、ＴＥ溶液１ｍｌで希釈した。
【００２４】
次にフェノール−クロロホルム溶液による抽出操作を蛋白層が消失するまで繰返し、最後にクロロホルム抽出を行ない、抽出物を１／２０量の５Ｍ塩化ナトリウム、３倍量の冷エタノールで沈殿させ、得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、得られたゲノムＤＮＡをＴＥ溶液に溶解し２６０ｎｍにおける吸光度を測定（分光光度計：島津ＵＶ−１６０使用）して定量した。
【００２５】
（２）ＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡを用いたサザンブロット分析
上記（１）で調製したゲノムＤＮＡ８μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＸｂａＩで消化し、０．８％アガロースゲルでパルスフィールド（東洋社製エレポスＰＳ−１５１０使用、１００Ｖ、フォワード２秒、バック０．６秒）を用いて電気泳動後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液−１Ｍ塩化ナトリウム溶液、１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１Ｍ塩化ナトリウム溶液で変性し、中和を３０分間ずつ行ない、２０×ＳＳＣで３０分間浸した後、キャピラリー法でナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｈｕｅｌｌ  ）にＤＮＡを８〜１２時間かけてトランスファーさせた。３×ＳＳＣで膜を洗浄した後、８０℃で２時間ベイクすることによりＤＮＡをナイロン膜に固着させた。
【００２６】
１００μｇ／ｍｇの熱変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ８．０）（１×ハイブリダイゼーション緩衝液と１×デンハルト溶液を含む）中で、６５℃で２時間インキュベートしてナイロン膜をブロッキングした後、１００μｇ／ｍｇの熱変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ８．０）に〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシャム社）を用いてラベル後、熱変性したプローブ（全長１．５ｋｂのＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡ）５０ｎｇを加え、６５℃で８〜１２時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで室温１５分間１回、０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで５０℃１５分間１回それぞれ洗浄し、風乾後、−８０℃で１２〜１６時間オートラジオグラフィーを行なった。
【００２７】
（３）解析結果と考察
抗高血圧薬であるデブリソキンを用いたヒトにおける代謝試験によりＬｏｇ１０代謝率〔Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｉｏ  （ＭＲ）＝未変化体／水酸化体代謝物：Ｌｏｇ１０ＭＲ＞１．１をＰＭと定義する〕が１．５０を示したＰＭとその両親及びＥＭ（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ：以下ＥＭと略す）から、それぞれ末梢血を採取し、上記（１）に従いゲノムＤＮＡを調製した。
【００２８】
調製された各ゲノムＤＮＡにつき、上記（２）に従って制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＸｂａＩで処理し、サザンブロット分析を行なった。
【００２９】
その結果、ＣＹＰ２Ｄ６についてＥｃｏＲＩ処理したＰＭとその両親の試料の分析では、１６．０、９．４及び８．６ｋｂに共通してバンドが確認された。
【００３０】
しかして、ＣＹＰ２Ｄ６について塩基配列の相同性が非常に高い２つのシュードジーンＣＹＰ２Ｄ７及びＣＹＰ２Ｄ８が報告されており、ＣＹＰ２Ｄ６及びこれらのそれぞれのＥｃｏＲＩ処理後のサザンブロット分析によれば、それぞれ９．４、１６．０及び８．６ｋｂにバンドを与えることが知られている〔前記Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．  等参照〕。
【００３１】
また、ＸｂａＩ処理後の上記各試料分析でも、３人に共通して２９．０、４．８ｋｂにそれぞれバンドが認められ、ＰＭとその父親の試料では更に１１．５ｋｂにバンドが認められた。
【００３２】
上記ＸｂａＩ処理後のサザンブロット分析については、従来より多数の検討がなされており、４４．０、２９．０、１１．５、１６．０＋９．０ｋｂのバンドにおいて遺伝子多型が示されている。これらの報告によれば、３つのＣＹＰ２Ｄ遺伝子が５′側よりＣＹＰ２Ｄ８、ＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ６と位置すると２９．０ｋｂに、同３つの遺伝子に更にもう１つのＣＹＰ２Ｄ７が加わり５′側よりＣＹＰ２Ｄ８、ＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ６と位置すると４４．０ｋｂにそれぞれバンドが検出される。また、１１．５ｋｂのバンドはＣＹＰ２Ｄ６の完全欠損（Ｄ型変異）であることを示し〔Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｉ．，  Ｙｕｅ，Ｑ．Ｙ．，  Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｌ．，  Ｈｅｉｍ，Ｍ．，  Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎ，Ｌ．，  Ｍｅｙｅｒ，Ｕ．Ａ．，  Ｓｊｏｑｖｉｓｔ，Ｆ．，  ａｎｄ  Ｉｎｇｅｌｍａｎ−Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ４０，  ５５３−５５６  （１９９１）〕、１６．０、９．０ｋｂのバンドが同時に認められるとＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ６の間のゲノムＤＮＡの変異であることが報告されている。
【００３３】
これらのことから、ＰＭは対立遺伝子の一方がＣＹＰ２Ｄ６の完全欠損であるＤ型変異であり、それは父親から遺伝したものと考えられた。
【００３４】
【参考例２】
ＰＣＲ分析によるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変異の検索
（１）プライマーの設定
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＡ型変異とＢ型変異の検出のために、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のこれら変異部位のみを特異的に増幅するようにプライマーを設計し、またＡ型変異の判定用として３′末端を変異部位に設定し、１塩基の差異で選択性を持たせた２種類のプライマー（Ａ′−ＳＷ及びＡ′−ＳＭ）を設定した。
【００３５】
これら各プライマーの塩基配列とその存在位置を図１に示す。
【００３６】
（２）プライマーの精製
上記（１）で設計又は設定された各プライマーの調製、精製を次の通り行なった。即ち、２９％アンモニア水３ｍｌで脱トリチル化して合成したオリゴヌクレオチドを、２９％アンモニア水３ｍｌでレンジから切り離した後、６０℃で４時間インキュベートした。アンモニア水を蒸発させた後、得られたペレットを２０μｌのホルムアミド色素に溶解させ、この溶液を１００℃で５分間加熱後、２０％変性アクリルアミドゲルで電気泳動を行なった。尚、電気泳動用緩衝液には１×ＴＢＥを使用した。
【００３７】
上記泳動後、オリゴヌクレオチドを含むゲル部分の位置をＵＶランプ照射により確認後切り出し、１ｍｌのシリンジを用いて押出し粉砕した。ここにＳＴＥ５ｍｌを加え、ローテーターでゆっくりと回転させ１０〜１２時間抽出した。抽出液を１００℃で１０分間加熱した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を、予めＴＥ溶液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０カラムに通し、オリゴヌクレオチドを吸着させ、１．５Ｍ塩化ナトリウム−１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５０μｌ、０．１Ｎ水酸化ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡ２００μｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０μｌを順にカラムに通して溶出させた。尚、オリゴヌクレオチド回収のためのチューブには予め１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を５０μｌ入れておき、溶出液をすばやく中和した。この溶液をエタノール沈殿させ、得られたオリゴヌクレオチドを適量の精製水に溶解させ、２６０ｎｍの吸光度を計ることにより定量した。
【００３８】
（３）ＰＣＲ法によりＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＡ型変異検出のためのゲノムＤＮＡの増幅
ＰＣＲ法を用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＡ型変異（ゲノムＤＮＡで２６３７番目のエクソン５における１塩基欠損）の部分を含むゲノムＤＮＡの増幅を、パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）を用いて以下の通り行なった（図１参照）。
【００３９】
即ち、参考例１の（１）で調製したゲノムＤＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ）１μｌに、精製水１７．５μｌ、５ｍＭデオキシリボヌクレオチド５′−トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）溶液１μｌ、１０×ＰＣＲ溶液（１０ｍＭ）２．５μｌ、１０μＭセンスプライマー（Ａ−Ｓ）１μｌ、１０μＭアンチセンスプライマー（Ａ−ＡＳ）１μｌを加えて５分間煮沸後、３分間氷冷した。これにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）１μｌを加えて全量を２５μｌとし、更にミネラルオイルを当量重層し、９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分を１サイクルとして、２５サイクルの反応を行なった。
【００４０】
反応終了後、ミネラルオイルを除き、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順次行ない、得られたＤＮＡ断片をＴＥ３０μｌに溶解させた。
【００４１】
増幅したＤＮＡ断片がＣＹＰ２Ｄ６であることの確認は、そのバンド長（７５７ｂｐ）と、これを制限酵素（ＡｖａＩ、ＰｖｕＩＩ）処理して、ＡｖａＩ処理では３５０、２０４、２０３ｂｐのバンドが、ＰｖｕＩＩ処理では４６４、２９５ｂｐのバンドをそれぞれ観察することにより行なった。
【００４２】
尚、上記において、ＣＹＰ２Ｄ７が増幅すれば、ＡｖａＩ処理で４００、３５０ｂｐのバンドが、ＣＹＰ２Ｄ８が増幅すれば、ＰｖｕＩＩ処理で４３１、１４６、９０、７０、２７ｂｐのバンドが観察されるため、これらと上記ＣＹＰ２Ｄ６とは明確に区別できる。
【００４３】
（４）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＡ型変異の判定
３′末端の１塩基のみが異なるセンスプライマー２種類（Ａ′−ＳＷ、Ａ′−ＳＭ）と、上記（３）で用いたアンチセンスプライマー（Ａ−ＡＳ）とを組み合わせ用い、また上記（３）で調製した試料溶液を用いて、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子Ａ型変異の判定を以下の通り行なった。
【００４４】
即ち、（３）で調製した試料溶液１μｌに、精製水１７．５μｌ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液１μｌ、１０×ＰＣＲ溶液（７．５ｍＭ）２．５μｌ、判定用の１０Ｍセンスプライマー（Ａ′−ＳＷ又はＡ′−ＳＭ）１μｌ、１０Ｍアンチセンスプライマー（Ａ−ＡＳ）１μｌを加えて５分間煮沸後、３分間氷冷した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）１μｌを加えて全量を２５μｌとし、更にミネラルオイルを当量重層し、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとして２５サイクルの反応を行なった。反応終了後、ミネラルオイルを除き、０．０２％エチデュームブロミド（ＥｔＢｒ）を含む１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、判定を行なった。
【００４５】
３′末端の１塩基のみが異なるセンスプライマーの内、Ａ′−ＳＷは野生株のみを、Ａ′−ＳＭはＡ型変異のみをそれぞれ特異的に増幅させるものであるため、Ａ′−ＳＷ側にのみ４５１ｂｐのバンドが観察されると野生型、Ａ′−ＳＷ、Ａ′−ＳＭ側の両方に４５１ｂｐのバンドが観察されるとヘテロのＡ型変異、Ａ′ＳＭ側のみ４５１ｂｐのバンドが観察されるとホモのＡ型変異と、それぞれ判定できる。
【００４６】
この結果、ＰＭとその両親ともに野生型を示すＡ′−ＳＷ側のみに４５１ｂｐのバンドが認められ、Ａ型変異ではないことが確認された。
【００４７】
（５）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＢ型変異検出のためのゲノムＤＮＡの増幅
センスプライマーとして（Ｂ−Ｓ）を、アンチセンスプライマーとして（Ｂ−ＡＳ）をそれぞれ用いて、上記（３）に準じてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＢ型変異（ゲノムＤＮＡで１９３４番目のエクソン４におけるエクソン−イントロン接合部位の１塩基置換）の部分を含むゲノムＤＮＡの増幅を行なった。
【００４８】
増幅したＤＮＡ断片がＣＹＰ２Ｄ６であることの確認は、そのバンド長（５３３ｂｐ）と、これを制限酵素（ＡｖａＩ）処理して、３１１、１４６、７６ｂｐのバンドをそれぞれ観察することにより行なった。上記において、ＣＹＰ２Ｄ７、ＣＹＰ２Ｄ８が増幅すれば、ＡｖａＩ処理で４５７、７６ｂｐのバンドが観察されるため、これらと上記ＣＹＰ２Ｄ６とは明確に区別できる。
【００４９】
（６）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＢ型変異の判定
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のＢ型変異は、エクソン４におけるエクソン−イントロン接合部位の１塩基置換の制限酵素ＭｖａＩの認識酵素の消失を利用して判定できる。
【００５０】
即ち、上記（５）で調製した試料溶液１０μｌに、１０×Ｍ溶液２μｌ、ＭｖａＩ（１０Ｕ／μｌ）２μｌ、精製水６μｌを加えて全量を２０μｌとし、３７℃２時間インキュベート後、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。
【００５１】
２７９ｂｐのバンドが観察されると野生型、３８４、２７９ｂｐのバンドが観察されるとヘテロのＢ型変異、３８４ｂｐのバンドが観察されるとホモのＢ型変異と判定できる。
【００５２】
この結果、ＰＭとその両親ともに２７９ｂｐのバンドが認められ、Ｂ型変異ではないことが確認された。
【００５３】
【実施例１】
ＰＭにおけるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列の解析
（１）プライマーの設定及び精製
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のすべてのエクソン、エクソン−イントロン接合部位を４ケ所に別けてそれぞれ特異的に増幅するようにプライマーを設定し、参考例２と同様にして各プライマーを精製し、これらを用いて以下のＰＣＲ法にて各フラグメントを増幅させた。
【００５４】
設定したプライマーの塩基配列、ＣＹＰ２Ｄ６の対応位置及び得られる各フラグメントの概略を図２に示す。尚、上記で利用するエクソン２〜４の部位を増幅させるためのアンチセンスプライマー（Ｂ−ＡＳ）、エクソン５〜６の部位を増幅させるセンスプライマー（Ａ−Ｓ）及びアンチセンスプライマー（Ａ−ＡＳ）は、それぞれ参考例２で作成したものと同一のものを使用した。
【００５５】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン及びエクソン−イントロン接合部位の増幅
ＰＣＲ法を用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン及びエクソン−イントロン接合部位を含むゲノムＤＮＡを次の通り増幅させた。
【００５６】
即ち、参考例１で調製したゲノムＤＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ）１μｌに、精製水１７．５μｌ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液１μｌ、１０×ＰＣＲ溶液（１０ｍＭ）２．５μｌ、１０μＭセンスプライマー１μｌ、１０μＭアンチセンスプライマー１μｌを加えて５分間煮沸後、３分間氷冷した。これにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）１μｌを加えて全量を２５μｌとし、更にミネラルオイルを当量重層し、９４℃１分、Ｆ１では５３℃、Ｆ２では４８℃、Ｆ３では５５℃、Ｆ４では５０℃でそれぞれ２分、７２℃２分を１サイクルとして、２５サイクルの反応を行なった。反応終了後、ミネラルオイルを除き、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順次行ない、得られた各ＤＮＡ断片をＴＥ２０μｌに溶解させた。
【００５７】
増幅した各ＤＮＡ断片がＣＹＰ２Ｄ６由来のものであることは、バンド長と、適当な制限酵素（Ｆ１：ＨｈａＩ、Ｆ２：ＡｖａＩ、Ｆ３：ＡｖａＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｆ４：ＳｔｙＩ）処理によるバンドの観察により確認した。
【００５８】
（３）ブルースクリプトベクターへのサブクローニング
上記（２）で得たＣＹＰ２Ｄ６の各ＤＮＡ断片（Ｆ１〜Ｆ４）の平滑末端化を次の通り実施した。
【００５９】
即ち、それぞれ５００ｎｇ相当をＴＥ２０μｌに溶解し、２ｍＭ  ｄＮＴＰ８μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、１０×Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ｐＨ８．８）４μｌ、精製水７μｌを加え全量４０μｌとし、３７℃、１５分間反応を行なった。精製水を加えて全量を２００μｌにした後、フェノール抽出２回、クロロホルム抽出１回を行ない、得られた上清に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）溶液１５μｌと冷エタノール３７５μｌを加え、−８０℃に冷却後、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、沈殿を７０％エタノールで洗浄後乾燥した。
【００６０】
上記ＰＣＲ産物の５′末端にはリン酸基がつかないため、リン酸化を次の通り実施した。即ち、平滑末端化したＤＮＡ断片にデナチュレーション緩衝液（ｐＨ９．５）７５μｌを加え、２分間煮沸後、氷中に２分間放置した。アデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ、５０ピコモル／μｌ）１μｌ、１０×ブラントエンド緩衝液１０μｌ、精製水１２μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１１Ｕ／μｌ）２μｌを加えて計１００μｌとし、３７℃、１時間反応を行なった。精製水を加えて全量を２００μｌにした後、フェノール抽出２回、クロロホルム抽出１回を行ない、得られた上清に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）溶液１５μｌと冷エタノール３７５μｌを加え、−８０℃に冷却後、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、１０μｌの精製水に溶解させることにより、挿入フラグメントをそれぞれ調製した。
【００６１】
ブルースクリプトベクター２μｇをＨｉｎｃＩＩで処理後、１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）４７μｌ、アルカリホスファターゼ（０．５Ｕ／μｌ）２μｌを加え、全量を５２μｌとした後、６５℃、３０分間反応させた。精製水を加えて全量を２００μｌにした後、フェノール抽出を３回、クロロホルム抽出を１回行なった。この上清に、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）溶液１５μｌと冷エタノール３７５μｌを加え、−８０℃に冷却後、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、沈殿を乾燥させた後、２０μｌのＴＥに溶解し、ベクター側の脱リン酸化を行なった。
【００６２】
ＣＹＰ２Ｄ６のエクソン及びエクソン−イントロン接合部位を含んだフラグメント１００ｎｇと、ブルースクリプトベクター１０ｎｇとを混合し、ライゲーションを行なった。連結反応終了後のＤＮＡ溶液にコンピテントセル懸濁液３００μｌを加え、氷中に２０分間放置した。これに４２℃、２分間のヒートショックを与えた後、１ｍｌのＬＢ溶液を加えて１時間インキュベートした。３０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清１ｍｌを除き、再度懸濁させた後、ＬＢ培地に播き、３７℃で一晩培養して、形質転換体を得た。
【００６３】
尚、宿主大腸菌としては、ＴＧ１を用い、上記コンピテントセルは以下の方法により作製した。
【００６４】
大腸菌の一夜培養液２ｍｌを２００ｍｌのＬＢ培地に植え、６５０ｎｍにおける吸光度が０．６付近になるまで３７℃で培養した。これを氷水中で３０分間冷却後、集菌し、１００ｍｌの５０ｍＭ塩化カルシウムに懸濁させた。１５分間ゆっくり転倒攪拌しながら氷中に１時間放置した後、再度集菌し。２０ｍｌの５０ｍＭ塩化カルシウム−２０％グリセロールに懸濁させた。これを、３１０μｌずつ分注し、液体窒素でただちに凍結後、−８０℃で保存した。なお、集菌以降の操作はすべて低温室（４℃）で行なった。
【００６５】
（４）二本鎖ＤＮＡの少量調製
得られた形質転換体のコロニーを回収し、ＬＢＡｍｐ＋培地３ｍｌで培養した。この培養液を遠心分離して菌体を回収し、プラスミドＤＮＡに少量調製を以下の方法に従って行なった。
【００６６】
即ち、先の培養液の１．５ｍｌをチューブにうつし、５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、沈殿の菌体を回収し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２００μｌに懸濁させた後、１％ＳＤＳ−０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液４００μｌを加え、氷中に５分間放置した。５Ｍ酢酸カリウムの２００μｌを加えて５分間氷冷し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を別のチューブに移し、イソプロパノール７００μｌを加えた。これを１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、得られた沈殿を２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１００μｌで懸濁させた後、ＲＮａｓｅＩ（１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加えて６５℃で１５分間インキュベートした。フェノール抽出、クロロホルム抽出を行なった後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）１２μｌと冷エタノール２２４μｌを加え、−８０℃に冷却後、１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。回収したプラスミドをベクターのマルチクローニングサイト及び組込んだＤＮＡ断片の制限酵素地図より選んだ制限酵素で処理後、アガロースゲル電気泳動することにより、それぞれ目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００６７】
（５）Ｍ１３ベクターへのサブクローニング
組込んだＤＮＡ断片のプラスミド内での方向性を、ベクターのマルチクローニングサイト及び及び組込んだＤＮＡ断片の制限酵素地図より選んだ制限酵素で処理を行ない、確認した。
【００６８】
ベクターのマルチクローニング部位にのみに認識部位をもつ２種類の制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）で処理して回収したフラグメントを、これらフラグメントと同様に処理したＭ１３ベクターに挿入し、ライゲーションを行なった。連結反応終了後のＤＮＡ溶液（１００ｎｇ）３０μｌにコンピテントセル懸濁液３００μｌを加え、４０分間氷中に放置した。４２℃、２分間のヒートショック後、Ｈ上層寒天３ｍｌ、大腸菌一夜培養液２００μｌを混合し、Ｈ寒天培地上に播き、３７℃で一晩培養して形質転換体を得た。尚、宿主大腸菌にはＪＭ１０３を用いた。ここでコンピテントセルは、上記（４）に示した方法に従い作製した。
【００６９】
（６）ファージ一本鎖ＤＮＡの調製
ファージ一本鎖ＤＮＡの調製を以下の方法で行なった。即ち、形質転換体のプラークを回収し、２×ＴＹ培地３ｍｌ中で６時間培養した。この培養液１．５ｍｌを１５０００ｒｐｍ、５分間、２回遠心分離して上清を回収した。先の上清１．３ｍｌに２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−２．５Ｍ塩化ナトリウム２００μｌを加え、室温で１５分間放置した後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ファージＤＮＡを沈殿させた。更に、１５０００ｒｐｍ、２分間遠心分離し、上清を完全に取り除き、沈殿をＴＥ２００μｌに溶解させ、フェノール１００μｌを加え攪拌後、室温で１５分間放置した。更にクロロホルム１００μｌを加えて同様の操作を行なった。１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清１５０μｌを取り、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）溶液１５μｌと冷エタノール３７５μｌを加え、−８０℃に冷却後、エタノール沈殿を行なった。１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離を行ない、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。沈殿を乾燥させた後、２０μｌのＴＥに溶解し、一本鎖ＤＮＡを回収した。アガロースゲル電気泳動を行ない、フラグメントの入っていないＭ１３ベクターより調製した一本鎖ＤＮＡを対照として、移動度の小さいバンドが検出されることを利用して、目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００７０】
（７）ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン及びエクソン−イントロン接合部位の塩基配列の解析
上記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを用いて、塩基配列の解析を文献記載の方法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，  Ｍｉｋｌｅｎ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７４，  ５４６３−５４６７  （１９７７）〕に従い、以下の通り実施した。尚、シークエンス反応は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＴＭＶＥＲ．２．０に添付されているマニュアルに従って行なった。
【００７１】
即ちまず、鋳型ＤＮＡ７μｌ（７００ｎｇ）とプライマー（１ピコモル／μｌ）１μｌ、５×アニーリング緩衝液（ｐＨ７．５）２μｌを混合し、６５℃で２分間加熱後、徐々に冷却することによりプライマーを鋳型ＤＮＡにアニールさせた。次に、０．１Ｍ  ＤＴＴ１μｌ、ラベリングミックス２．０μｌ、〔α−３３Ｐ〕デオキシアデノシン５′−トリフォスフェート（ｄＡＴＰ）０．５μｌ、８倍希釈したＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ２μｌを加え、室温で２〜５分間インキュベートした。その間、４種のジデオキシＮＴＰを含む反応停止液を２．５μｌずつ分注し、３７℃でプレインキュベーションした。反応終了後、反応混合液を３．５μｌずつ各停止液の中に加え、更に３７℃で５分間インキュベートした。ホルムアミド色素液４μｌを加え、２分間煮沸した後、ゲルへ添着した。ゲルは６０ｃｍのガラス板を用い、ゲル厚０．４ｍｍのショ糖濃度勾配ゲルを作製した。ゲルＡ溶液４０ｍｌ、ゲルＢ溶液１５ｍｌに対して、２０％Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と１０％アンモニウムパーサルフェート（ＡＰＳ）をそれぞれ３２μｌ及び９μｌ加えた後、ディスポーザブルの５０ｍｌシリンジを使用してゲルＡ溶液、ゲルＢ溶液の順に吸い、気泡を２〜３個吸入することで穏やかに攪拌し、ガラスプレートの中に注入した。残りのスペースには、上層ゲルを満たした。電気泳動は、１×ＴＢＥを用い、２５００〜３０００Ｖの定電圧で２〜７時間行なった。泳動後、ゲルを１０％酢酸−１０％メタノールに１５分間浸漬してＤＮＡを固定し、ゲルドライヤーで吸引しながら乾燥させ、−８０℃で一晩Ｘ線フィルムを露光させた。
【００７２】
（８）解析結果と考察
ＰＭの各エクソン及びエクソン−イントロン接合部位の塩基配列の解析を行なった結果、エクソン９（４２１３ｂｐ）においてＴＣＡＣＣＣＧＴの９塩基（４２１３〜４２２２ｂｐ）の繰返し配列によるインサーションを確認した（図３）。
【００７３】
このインサーションにより３アミノ酸（バリン、プロリン、トレオニン）の挿入が考えられた。またこの位置は、薬物酸化反応において重要な鉄との結合部位でありヘム蛋白であるＰ４５０において重要な働きを担っている、ヘム結合領域（ＨＲ−２領域）の直後であった。ＰＭにおいては、このインサーションによる３アミノ酸の挿入が代謝活性に対してなんらかの影響を与え、代謝能が著しく低下したものと推測された。
【００７４】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の上記変異は、今までに報告のない新しい型の変異であり、この変異がＰＭの原因と考えられた。
【００７５】
【実施例２】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子新規変異の検出（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）
（１）プライマーの設定及び精製
新規な変異の部位であるエクソン９のインサーション部位を含み、且つＣＹＰ２Ｄ６のみ特異的に増幅するように、センスプライマーを設定した。アンチセンスプライマーは実施例１で作成したもの（９−ＡＳ）と同一のものである。設定されたプライマーの塩基配列とその位置を図４に示す。
【００７６】
参考例２と同様にして各プライマーを精製し、これらを用いて以下のＰＣＲ法にてエクソン９のゲノムＤＮＡを増幅させた。
【００７７】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン９の増幅
前記参考例１で調製したゲノムＤＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ）１μｌに、精製水１７．５μｌ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液１μｌ、１０×ＰＣＲ溶液〔この例のみ２００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２５０ｍＭ塩化カリウム、０．５％ツイーン２０、１ｍｇ／ｍｌゼラチン、１０ｍＭ塩化マグネシウムの組成とした〕２．５μｌ、１０μＭセンスプライマー（９−Ｓ）１μｌ、１０μＭアンチセンスプライマー（９−ＡＳ）１μｌを加えて５分間煮沸後、３分間氷冷した。これにＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）１μｌを加えて全量を２５μｌとし、更にミネラルオイルを当量重層し、９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を１サイクルとして、２５サイクルの反応を行なった。
【００７８】
反応終了後、ミネラルオイルを除き、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順次行ない、得られた各ＤＮＡ断片をＴＥ２０μｌに溶解させた。
【００７９】
増幅したＤＮＡ断片がＣＹＰ２Ｄ６由来のものであることは、バンド長（３３４ｂｐ）と、制限酵素（ＳｔｙＩ、Ａｓｐ７１８）処理し、ＳｔｙＩ処理で２５７、７７ｂｐのバンドが、Ａｓｐ７１８処理で１８９、１４５ｂｐのバンドがそれぞれ観察されることにより確認された。この時、ＣＹＰ２Ｄ７が増幅するとＳｔｙＩ処理で３３１ｂｐのバンドが、ＣＹＰ２Ｄ８が増幅するとＡｓｐ７１８処理で３２０ｂｐのバンドが観察され、これらと明確に区別できる。
【００８０】
（３）ＰＣＲ産物の制限酵素処理によるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のエクソン９のインサーションの判定
上記（２）で増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳｔｙＩで処理し、そのバンド長で判定を行なった（図５）。
【００８１】
即ち、（２）で調製した試料溶液１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌ、ＳｔｙＩ（１０Ｕ／μｌ）２μｌ、精製水６μｌを加えて全量を２０μｌとし、３７℃で２時間インキュベートした。反応終了後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を順に行ない、ＤＮＡ断片をＴＥ５μｌに溶かした。１０％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行なって、７７ｂｐのバンドが観察されると野生型と、７７ｂｐ及び８６ｂｐのバンドが観察されるとヘテロの変異型と、また８８６ｂｐのバンドが観察されるとホモの変異型とそれぞれ判定した（図６）。
【００８２】
（４）結果と考察
ＰＭとその両親における、上記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の新規変異の検出の結果を図７に示す。ＰＭとその母親（図中ＭＰ）において８６ｂｐのバンドが認められ、本発明にかかる変異（インサーション）が確認された。ＰＭにおけるこの変異は母親より遺伝したことが明らかとなった。尚、図中ＦＰはＰＭの父親を示し、図にはＥＭの結果も併記されている。
【００８３】
以上の結果より、本発明にかかるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の新規変異の検出はＰＭの遺伝子診断に有用であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例２（１）において設定したプライマーの塩基配列と存在位置を示す。
【図２】実施例１（１）において設定したプライマーの塩基配列と存在位置を示す。
【図３】実施例１に示す方法に従って得られたＰＭ及びＥＭについての電気泳動写真とその結果観察される９塩基インサーションの塩基を示す。
【図４】実施例２（１）において設定したプライマーの塩基配列と存在位置を示す。
【図５】実施例２（３）に示すＣＹＰ２Ｄ６遺伝子エクソン９のインサーションのバンド長による判定を示す。
【図６】図５に示す判定に従う型の区別を示す。
【図７】実施例２に従い得られたＰＭ及びその両親の判定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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