(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を電気泳動分離する複数のキャピラリーと、
前記複数のキャピラリーの泳動終端側の末端近傍に、複数の細孔を有する平板とを有し、
前記複数の細孔は、前記複数のキャピラリーの泳動終端側の末端と対向する位置に設けられていることことを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
前記泳動終端側の末端と、前記平板との間の隙間部には、前記試料を前記細孔に導くシース液が流れるように構成されていることを特徴とする請求項1記載の電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、蛋白、糖等を分離分析する電気泳動装置に関し、特にＤＮＡ（核酸）等の検出、ＤＮＡの塩基配列の解析等に好適な電気泳動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光標識された試料を電気泳動により分子量分離し解析する電気泳動装置としては、例えば蛍光体を標識物にしたＤＮＡの塩基配列決定装置がある。塩基配列決定方法は、周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法による。分子量分離は、ポリアクリルアミドゲル等を使った電気泳動で行う。通常は２枚のガラス板の間に作成した平板上のポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動を行うが、近年、キャピラリー内にゲル（キャピラリーゲル）を作成して電気泳動を行うキャピラリーゲル電気泳動法が開発されている。キャピラリーゲル電気泳動法では、一般にキャピラリーの径が小さいためにゲルの体積当たりの表面積が大きく、ジュール熱の放散が容易であるため、高電圧を印加することができ、高速に分離することができ、有用な方法である。キャピラリーゲル電気泳動法の第１の従来例として、「ニュークレイック  アシッド  リサーチ」誌、第１８巻、第１４１５〜１４１９頁（１９９０年）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８、１４１５〜１４１９（１９９０））に記載の方法がある。図１９に示すように、内径７５μｍのキャピラリーを使用し、９ｋＶの高電圧を印加し、ＤＮＡ断片等の高速及び高分離検出を図っている。この方法の検出部では、キャピラリーの軸とレーザ光の照射軸とを、垂直方向から２５度程度傾斜させ、レーザ光をキャピラリーの中心部に直径約２０μｍに集光して照射し、生じる蛍光をバンドパス干渉フィルタ等で分光して検出している。なお、図１９は上記従来例記載の装置図を基にわかりやすく書き直してある。さらに、第２の従来例として、「ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー」誌、第５１６巻、第６１〜６７頁（１９９０年）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５１６、６１〜６７（１９９０））に、キャピラリーゲル電気泳動法によってＤＮＡの塩基配列を決定する方法が記載されている。この方法では、内径が５０μｍのキャピラリーを使用してＤＮＡ断片を分子量分離している。本例での測定装置は基本的には「サイエンス」誌、第２４２巻、第５６２〜５６４頁（１９８８年）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、５６２〜５６４（１９８８））に記載されているものである。「サイエンス」誌記載の装置図に、判り易くするため、記載内容に基づいて、レーザ光源やシースフロー用のポンプ等を加えた装置構成を図２０に示した。ＤＮＡ断片の検出は、分子量分離された分離液を石英製フローチャンバー（内形２５０μｍ×２５０μｍ）に導き、ＥＤＴＡを含むトリス−ほう酸緩衝液をシース液として液体クロマトグラフィー用ポンプによりフローさせてシースフロー状態にし、フローチャンバーのほぼ中心部を流れる分離液に対して、レーザ光を直径１０μｍ程度に集光して照射し、分光フィルタ等を通してＤＮＡ断片からの蛍光を検出している。なお、第３の従来例である、１つの泳動路で塩基配列を決定する方法として、例えば「ネイチャー」誌、第３２１巻、第６７４〜６７９頁（１９８６年）（Ｎａｔｕｒｅ、３２１、６７４〜６７９（１９８６））等に記載されているように、ＤＮＡ断片の末端塩基の種類毎に、４種の異なる最大蛍光波長を有する蛍光体（フルオレセイン、４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（モレキュラプローブ社製品））で標識し、分子量順に泳動されてくる断片をレーザ光で励起して、４種のバンドパス干渉フィルタによって各々の蛍光を分離して蛍光検出し、塩基配列を決定する方法がある。このように、キャピラリーゲル電気泳動では、通常１本のキャピラリーのみを使用し計測をおこなっている。
【非特許文献１】「ニュークレイック  アシッド  リサーチ」誌、第１８巻、第１４１５〜１４１９頁（１９９０年）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８、１４１５〜１４１９（１９９０））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
キャピラリー電気泳動装置では、試料の微量化等に伴い、検出の高感度化が望まれている。さらに、処理能力の向上、例えば同時処理できる試料数の増大が望まれている。
【０００４】
一般に電気泳動状態での蛍光測定では、目的とする蛍光体自体からの蛍光の他に、背景光として、ゲルによる励起光の散乱光（レーリー散乱など）及び蛍光、ゲルの支持体つまりキャピラリーの内壁及び外壁での散乱光、あるいはキャピラリー自体からの蛍光が生じる。そのため、バックグラウンドレベルが高くなり、検出感度の低下を招くことになる。つまり、高感度な蛍光検出を達成するには、このような背景光をいかに除去するかが重要な課題となる。
【０００５】
また、処理能力を向上させるには、泳動速度をより速くすること、また泳動路であるキャピラリーを複数本同時に泳動し、計測することが必要であり、これらをいかに達成するかが重要な課題となる。
【０００６】
第１の従来例では、バンドパス干渉フィルタ等により励起光（散乱光）を除去し、蛍光成分を分離して検出する第１の対策と、キャピラリーの軸をレーザ光の照射軸と蛍光集光軸とを含む平面に対して垂直から２５度程度傾斜させる第２の対策の２つの対策により、より高感度な蛍光検出を図っている。しかし第１の対策では、干渉フィルタの特性上散乱光を完全に除去することは困難である。加えて、ゲル及びガラス製チューブ自体からも微弱ながらも蛍光が生じることがあり、バンドパス干渉フィルタ等では十分に背景光を除去することは困難である。第２の対策では、キャピラリーを傾けることで、蛍光集光用レンズに入射する散乱光そのものを低減させることができ有効な方法であるが、キャピラリーは断面が円形でありその径が小さいために散乱光強度が大きいこと、さらに散乱光はすくなからず全方向に放射されること、加えてゲル及びガラス製チューブ自体からの蛍光を低減することはキャピラリーを傾けることではできないこと等から、背景光を十分に除去することは困難である。以上の観点から、背景光の除去が十分とはいえず蛍光を高感度に検出することは難しい。なお、本従来例はキャピラリーが１本であり、複数の試料の同時処理の方法については記載も示唆もされてもいない。単純に図１９の装置を複数使用することが考えられるが、レーザ光源や検出器、光学部品等も複数個必要であり、装置が大きく高価になり現実的ではない。さらに、キャピラリーを複数本並べて単一のレーザ光で全てのキャピラリーを照射することも考えられうるが、レーザ光等の光をキャピラリーに照射すると、キャピラリーの断面が円形であるためその界面で光の屈折・散乱が生じ、キャピラリーを通過する光は広く拡散するため、この構成を達成することは現実的にできない。つまり、キャピラリーが１本の場合は問題ないが、複数本のキャピラリーを連続的に照射する場合、キャピラリーを通過する度に次のキャピラリーに照射される光強度が極端に弱くなり、蛍光測定が困難になる。以上のことから、本従来例を複数の試料の同時処理に適用し、処理能力の向上させることは困難である。
【０００７】
第２の従来例は、キャピラリーゲル電気泳動でキャピラリー及びゲルによる散乱光を効果的に除去できる方法である。つまり、キャピラリーゲル端をシースフローチャンバーのサンプル注入口とすることで、キャピラリーゲル外に試料液を導出させ、シースフロー下で蛍光測定を行うため、キャピラリーの界面での散乱光並びにゲルからの散乱光及び蛍光の発生がなくなる。また、シースフローチャンバーでは、試料液はそのほぼ中心を層流状態で流れ、シースフローチャンバーの内壁と接触しないため、シースフローチャンバーからの散乱光と試料からの蛍光とを空間的に分離することができ、蛍光強度を高感度に検出することができる。しかし、シースフローを形成するために、トリス−ほう酸緩衝液をシース液として液体クロマトグラフィー用ポンプ等でシースフローチャンバー内に一定流量で常時フローさせる必要がある。そのため、装置的に高価で、複雑になる等の問題がある。また、シースフローチャンバーは、シース液注入部が太く、シースフロー部である蛍光測定部が細いという複雑な形状であり、シースフローチャンバーの製作が難しく、高価である。さらに第１の従来例と同様に、本従来例では複数の試料の同時処理については記載も示唆もされていない。単純に図２０の装置を複数使用することは装置が大きく高価になり現実的ではない。また、複数のシースフローチャンバーを使用し、各シースフローチャンバーにキャピラリーを配置し、単一のレーザ光を照射することも考えられうる。この場合、レーザ光はキャピラリーを照射しないため、キャピラリーによる光の屈折・散乱がない。しかし、各キャピラリー毎にシースフローチャンバーがあるため、キャピラリーとキャピラリーとの間隔を空間的に狭めることは困難であり、その結果シースフローチャンバー部が大きくなってしまい、複数のシースフローチャンバーを使用すると、装置が大型化し、高価になるという問題がある。さらに複数のシースフローチャンバー内を流れる試料液束の全てを同一の条件で照射するには、レーザ光を細く絞ることができない。なぜなら、レーザ光の焦点深度は照射スポットサイズと関連し、照射スポットサイズが小さくなるとその焦点深度は浅くなるのに対し、複数のシースフローチャンバー内を流れる試料液束間の間隔が広いためである。以上のことから、本従来例を複数の試料の同時処理に適用し、処理能力の向上させることは困難である。
【０００８】
本発明の目的は、上記した従来技術の問題点を解決し、電気泳動により分離される試料の蛍光測定または光吸収測定を高感度で簡便に行うことのできる電気泳動装置、及び、複数の試料の同時処理を簡便に行うことのできる電気泳動装置を提供することにある。また、本発明の目的は、ＤＮＡ塩基配列計測に好適で、操作性・安全性がよく、高感度で高スループットの電気泳動装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、電源によって電圧を印加された陰極電極槽と陽極電極槽の間に設けた試料分離部がキャピラリーから成る泳動路である電気泳動装置において、（１）それぞれの一端がそれぞれ陰極電極槽または陽極電極槽に接続された１対または複数対のキャピラリーのそれぞれの他端を光学セル中にその軸をほぼ一致させ一定の間隙を保持して対向させて配置して光学セルを貫通する泳動路を形成し、外部から光学セル内にシース液を注入して流し、試料分離部である上流側の泳動路のキャピラリー端から泳動される試料をシースフロー状態にして対向するキャピラリーに導き、この間隙部を光学検出部とし、光学検出部に光源から光照射して試料を検出するように、あるいは、（２）一端が電極槽に浸されている複数のキャピラリーを光学セル中に終端させ、外部から光学セル内にシース液を注入して流すことにより、各キャピラリーを泳動する試料をシースフロー状態で光学セル中をフローさせ、シースフロー部を光学検出部とし、光学検出部に光源から光照射して試料を検出するように電気泳動装置を構成する。また、（３）一端が電極槽に浸されている複数本のキャピラリーの他端を光学セル内に適当な間隔をもって一直線上に並ぶように保持し固定し、光学セル内に水溶液から成るシース液を流し込み、各キャピラリーの末端の近傍及びその下部にシースフローを形成させて、各キャピラリーを泳動する試料をシースフロー状態で光学セル中をフローさせ、注入したシース液を光学セルから排出し、励起光源部の光を、光学セル内の一直線上に並んだ複数本のキャピラリーの末端の直下部に、上記の直線にほぼ並行に照射し、各々のキャピラリーから泳動流出する試料から蛍光を生じさせ、生じる複数の蛍光の像を各々分割し、分割された像が各々異なる波長域の光成分を有するように、分割手段の前部または後部に分光フィルタを各々配置し、分割した像を結像させ、結像した像を検知する電気泳動装置を構成する。
【００１０】
なお、（１）の構成において、複数のキャピラリー対によって形成される複数の光学検出部を光学セル中に配置する。さらに、複数本のキャピラリー対による複数の光学検出部が一直線上に位置するように複数のキャピラリー対を光学セル中に整列して配置し、全ての光学検出部を同時に照射するように励起光をこの直線に沿って照射し、上記複数の光学検出部で同時に蛍光測定を行ない、（２）の構成において、複数のキャピラリーによって形成される複数の光学検出部を一直線上に位置するように前記複数のキャピラリーを光学セル中に整列して配置し、全ての光学検出部を同時に照射するように励起光を上記直線に沿って照射して各キャピラリーを泳動する試料から発せられる蛍光を同時に検出する。
【００１１】
また（３）の構成では、（１）と同様に、泳動分離用のキャピラリーと同数または同数以上で、泳動分離用のキャピラリーと同じの間隔をもってその端を一直線上に保持し、泳動分離用のキャピラリー末端とレーザ光照射軸とを含む平面内の近傍に配置した中空キャピラリーを介して光学セルから水溶液を排出する構造としてもよい。各々のキャピラリーを泳動する複数の試料からの像を、多面体のプリズムを用いて分割する構造とする。像を４つに分割してそれぞれを同時に検出する構造としてもよい。複数本のキャピラリーを各々泳動する試料からの蛍光像または各々分割された蛍光像は、同時に検出器に結像させ、その強度を同時に計測する。試料から発光する蛍光等は、レンズで集光した後、分割し、結像させる構成とし、また、円筒レンズで一方向を集光した後、分割し、結像させて検出してもよい。
【００１２】
また、（１）および（２）および（３）の構成において、以下のように各部を構成してもよい。試料分離部はキャピラリーゲルで構成し、シース液はキャピラリー内部の緩衝液と同等の成分とし、また、試料の変性剤を含ませることもできる。また、複数本のキャピラリーを保持する手段と、光学セルとが脱着可能であるようにし、光学セル内部に、キャピラリー保持具を指定した位置に保持するための挿入ガイドを設けることもできる。光学セル内部への水溶液の注入は、水溶液を含むシース液容器を光学セルの外部に設け、その液面を光学セルより排した液の面より高い位置に配置し、落差により行うこと、または、上部が開放している光学セルを使用し、光学セル内部に水溶液を流し込む手段が、水溶液を含むシース液容器を光学セルの外部に設け、その液面を光学セル内の排水口より高い位置に配置し、落差により行ってもよい。光学セル内の液面がほぼ一定に成るように制御する機構を設けることもできる。これは、光学セルの上部が開放しており、光学セル内の液面を検知する機構と、液面の低下時にシース液容器内の水溶液をバルブを介して補給する機構によって構成できる。光学検出部では試料の蛍光または光吸収を測定する。また、励起光源部をレーザ装置とし、また少なくとも２種類のレーザ装置とし、これらのレーザ光を同軸にして１本にしてもよい。生じる蛍光などの像は、二次元検出器によって検出できる。また、複数本のキャピラリーの各々への試料の注入は同時に行う。泳動下流側の電極はシース液の排出される容器内だけでなく、光学セル内部、またはシース液容器内部とすることもできる。この泳動下流側の電極はその電位が０Ｖ（接地）、またはその絶対値が他方の泳動上流側の電位の絶対値に比べて小さい値とする。また、試料が泳動される下流側の電極槽内に溜る水溶液の液面がほぼ一定になるようにし、槽に過剰の水溶液を排する機構を設けてもよい。さらに、多数本のキャピラリーを泳動する試料から発する蛍光の両端の長さの二次元検出器の受光サイズに対する比が３以下、つまり全体としての像倍率が１／３倍以上とする。また隣合うキャピラリーとの間隔がキャピラリーサイズの１０倍以下とするのが望ましい。電気泳動では、試料が泳動される下流側の電極の数が１個で、試料の注入側の電極の数が泳動分離用キャピラリーの本数に一致する構造とするのが望ましい。さらに、泳動分離用のキャピラリー内部を流れる電流値をキャピラリー毎に測定し、表示する機構を設ける。その電流値はそれぞれ２値化して表示してもよい。また、泳動分離用キャピラリーには、少なくとも光学セル内部に保持される側の端近傍の内面をシラン化処理し、ゲルを充填することで、少なくとも光学セル内部に保持される側の端近傍のゲルをキャピラリー内壁と化学的に結合させてもよい。
【００１３】
電気泳動装置の構成（１）または（３）では、それぞれの一端がそれぞれ陰極電極槽または陽極電極槽に接続された１対または複数対のキャピラリーのそれぞれの他端を光学セル中にその軸をほぼ一致させ一定の間隙を保持して対向させて配置するので、光学セルの一部を貫通する泳動路を形成できる。外部から光学セル内にシース液を注入して流すので、試料分離部である上流側の泳動路のキャピラリー端から泳動される試料をシースフロー状態にして対向するキャピラリーに導くことができ、上流側のキャピラリーと下流側のキャピラリーとを連続的に試料が電気泳動することができ、しかも上流側のキャピラリーと下流側のキャピラリーとの軸上の間隙部のみに試料を確実に電気泳動させることができる。この間隙部を光学検出部とし、光源から光学検出部への光照射をキャピラリーの無い液中で行なうことができ、試料の蛍光または光吸収等の光学計測を行うことができる。これにより、キャピラリーまたはキャピラリーゲルによる散乱光及び蛍光の発生を回避することができ、高感度な蛍光または光吸収計測が可能となる。このように、複数のキャピラリーを光学セル中に軸をほぼ一致させ一定の間隙を保持して対向させることにより、試料分離部である上流側のキャピラリーと、光学検出部である間隙部とを簡便に構成することができる。しかも下流側に対となるキャピラリーを配置することで、試料の泳動路を正確に規定することができ、光源から光照射を容易にかつ確実にすることができ、また蛍光等の受光をも容易にかつ確実にすることができる。また、シース液及び試料液は下流側のキャピラリー内部のみを通って光学セル外部に流出するが、キャピラリーはその径が小さいため、光学セルに注入するシース液の流量を少なくすることができ、シース液量の低減が可能となる。シース液の流量は光学セルの寸法によらず、キャピラリーの内径によって規定されるため、通常のシースフローチャンバーのようにシース液の注入部の内部の断面積を太くし、シースフロー部の断面積を細くするような形状に光学セルを調整する必要がなく、角形の光学セルを使用できるので、光学セルを容易に、しかも安価に作製することができる。このように、複数のキャピラリー対によって形成される複数の光学検出部を光学セル中に近接して配置することができ、装置の小型化が達成できる。光学セルも１個、シースフローを形成させる配管も１個で済むため安価に、しかも容易に装置を構成できる。また各キャピラリーから泳動される試料は、光学検出部を通過する際に、各キャピラリー毎にシースフロー状態となり、シース液の流れはすべて同じ条件となるため、そのフロー速度等のシースフロー状態は各キャピラリー毎に均一になり、光学検出の精度を向上させることができる。光学セルの内部は、複数のキャピラリー対を保持するため、その断面積が大きくなるが、シース液等は下流側の各キャピラリーを通って流れ出るため、シース液が流れる実効的な断面積はキャピラリーの内径面積の総和となり、光学セル自体の断面積に比べて微小になる。そのため、シース液の流量は少なくて済み、シース液量の低減が可能となり、装置の小型化を図ることができる。
【００１４】
１個の光学セル中に、複数の光学検出部を一直線上に位置するように複数のキャピラリー対を整列して配置し、励起光をこの直線に沿って照射するので、全ての光学検出部を同時に照射することができ、複数の光学検出部での蛍光測定を同時に行うことができる。また、複数の光学検出部が互いに液体を介して連結するため、励起光がキャピラリー等による光散乱を受けずに各光学検出部を照射することができ、励起光を効率良く各光学検出部に導くことができ、高精度に蛍光を検出することができる。なお、光の検出器として２次元のＴＶカメラ等を使用すれば、複数の光学検出部の蛍光像を同時に受光することができる。１個の光学セル中に、複数の光学検出部を一直線上に位置するように複数のキャピラリー対を整列して配置し、複数のキャピラリー対の間隔を近接させることができ、装置を小型に、安価に構成することができるだけではなく、上記の直線上の両端の光学検出部間の長さを短くすることができる。両端の光学検出部間の長さが短くなれば、励起光をレンズ等で細く絞っても、すべての光学検出部をほぼ同等の光ビーム径で照射することができる。例えば、レーザ光を焦点位置で１００μｍ径程度に絞ったとき、その前後約１０ｍｍ程度に渡ってレーザ光径が１００μｍ程度になる。外径２００μｍで内径１００μｍのキャピラリーを４００μｍ毎に並べると、焦点の前後約１０ｍｍ程度の内側に５０本程度配置することができ、これらを同等の光ビーム径・光ビーム強度で照射することができる。これより、励起光を細く絞った状態で各光学検出部を光照射でき、蛍光強度を増大させることができ、高感度に試料を検出することができる。
【００１５】
なお、試料分離部をキャピラリーゲルで構成して容易に分子量分離ができる。
また、下流側のキャピラリーを中空のキャピラリーとし、シース液等を効率良く流すことができる。下流側にはキャピラリーそのものではなくても同等の動作を行いうるもの、例えば平板に上部キャピラリー数に相当する孔や溝を形成させたものを使用できる。シース液を、キャピラリー内部の緩衝液と同等の成分とすることで、間隙部つまり光学検出部での電気の流れを確保することができ、試料の電気泳動を可能にする。さらに、キャピラリー内部と外部の緩衝液の組成が同等であるため、キャピラリー内部の緩衝液が光学セル内部に流れでて組成が変動することを防ぐことができ、電気泳動での試料の分離能を損なわない。また、試料が一本鎖のＤＮＡ等の場合には、シース液に変性剤を含ませることもできる。この場合、試料ＤＮＡが間隙部つまり光学検出部を泳動する際に再結合することを防ぐことができ、測定精度が向上する。キャピラリー内部に閉じ込めたの変性剤が光学セル内へ漏れでる可能性が少なくなり、電気泳動での試料の分離能を損なわない。
【００１６】
また、シース液の光学セルへの注入は、シース液容器内のシース液の液面を下流側電極槽内の液面よりも高い位置に配置することで、落差により簡便にシース液をフローさせることができ、シース液を機械的にフローさせる必要が無く、簡便で安価な装置構成となる。さらに、ポンプ等を使用する場合に発生する脈流が無くなるため、安定したシースフローが可能になり測定精度が高まる。なお、シース液の流量は、シース液容器内のシース液の液面と下流側電極槽内の液面の落差を変えることで容易に調整することができる。光学セルは、キャピラリーを取り付けた際に密封される形状の他、上部が開放している形状のセルを使用するとキャピラリー保持具の取付けが簡便にできる。このとき、シース液容器の液面を光学セル内の排水口より高い位置に配置することで、前述と同様の効果が得られる。また、光学セル内の液面を検知する機構と、液面の低下時にシース液容器内の水溶液をバルブを介して補給する機構を設け、光学セル内の液面がほぼ一定になるように制御し、脈流の少ない安定したシースフローが達成でき、簡便で安価に装置を構成できる。
【００１７】
光学検出部では、試料の蛍光または光吸収のどちらでも測定することができる。なお、間隙部の間隙距離は特に規定されないが、０．１ｍｍから３ｍｍ程度とするのが好ましい。一般に、間隙部の間隙距離を短くすればするほど試料が間隙空間を泳動しやすくなるため、基本的に間隙長は短い方が好ましい。しかしながら、装置を組立てる上で、間隙長が短すぎるとその調整が難しくなるため、通常現実的には０．１ｍｍ以上が好ましい。ただし、０．１ｍｍ以下に設定することも可能であって、その限界は、間隙部でのレーザ光等の励起光束の幅により決定される。また逆に、間隙部の間隙距離を長くすると、試料が拡散しやすくなる。
間隙長が３ｍｍ程度であれば、試料が正常に泳動することを確認した。つまり、間隙長を０．１ｍｍから３ｍｍ程度とすることで、試料を簡便に効率よく電気泳動させることができる。また、キャピラリー対を光学セル内部に保持し電気泳動させることにより、試料はキャピラリーとキャピラリーとを結ぶ線上を泳動し、光学セル内面と接触しないため、試料のセル内面への吸着、及びセル内面からの散乱光の影響を除去することができ、検出感度の向上を図ることができる。
【００１８】
また各々のキャピラリーを泳動する複数の試料からの像を、多面体のプリズム等を用いて分割し、それぞれが異なる波長域の光成分を通すように分光フィルタを用い、１試料から複数の情報を容易に得ることができる。特に、像をＤＮＡの塩基種の数である４つに分割すれば、それぞれの塩基種に対し別々の蛍光体で標識しＤＮＡ塩基配列を効率よく決定できる。
【００１９】
複数本のキャピラリーを各々泳動する試料からの蛍光像または各々分割された蛍光像は、同時に二次元検出器に結像させその強度を同時に計測することで、キャピラリーの本数に選らずに高速に計測することが可能になる。
【００２０】
また、光学セル内部に、キャピラリー保持具を指定した位置に保持するための挿入ガイドを設け、複数本のキャピラリーと光学セルとが脱着可能とすることでキャピラリーの取付け、取扱等の操作性が向上する。
【００２１】
また、励起光源部をレーザ装置とし、また少なくとも２種類のレーザ装置とし、これらのレーザ光を同軸にして１本にして照射することで、ＤＮＡ断片への励起を効率良く行うことができる。
【００２２】
泳動分離用の複数本のキャピラリーの本数に等しい電極を設け、複数の試料液に各々キャピラリーと電極を浸し、同時に電圧を印加して複数本のキャピラリーの各々への試料の注入を同時に行うことにより、試料の注入が容易に、かつ一度の操作でできることになり、従来のように１本単位で行う場合に比較して、時間の短縮、操作性の向上が図れ、さらに、泳動分離用のキャピラリー内部を流れる電流値をキャピラリー毎に測定することが可能になる。キャピラリー内部を流れる電流値は、キャピラリーの状態を知るのに有効であり、例えば、ゲルの破損等による分離の不良をあらかじめ予測できる。電流値の表示は、２値化のレベルを任意に設定し、電流値を２値化して通常の泳動電流以下のときにランプが点灯するように表示するので、キャピラリーゲルの破損等がモニタでき、ゲルキャピラリーの交換、再計測を行う必要性を効率よく判断でき使い勝手の向上が図れる。
【００２３】
さらに、光学セル内部に保持する隣合うキャピラリーとの間隔がキャピラリーサイズの１０倍以下とし、検出する蛍光像の全体としての像倍率を１／３倍以上とすることで、平板ゲル方式と比べ受光立体角を増大させることかでき、同じ量の蛍光体に対する検出感度の向上が図れる。
【００２４】
電気泳動装置の構成（２）または（３）の一部の構成では、一端が電極槽に浸されている複数のキャピラリーを光学セル中に終端させ、外部から光学セル内にシース液を注入して流すことにより、各キャピラリーを泳動する試料が各々シースフロー状態で光学セル中をフローすることになり、シースフロー部を光学検出部とし、電気泳動装置の構成（１）と同様にして、各々のキャピラリーを泳動する試料を別々に測定することができ、電気泳動装置の構成（１）と同様の作用を得る。電気泳動装置の構成（１）に関して説明した関連するその他作用は、電気泳動装置の構成（２）についても同様である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、光学測定をキャピラリーゲル等の試料分離部の外で行うことにより、背景光等の影響の少ない高感度な蛍光または光吸収計測が可能な電気泳動装置が実現できる。また、複数の試料を同時に泳動し、同時に計測することのできる簡便な電気泳動装置が実現できる。また、操作性・安全性が高く高スループットでＤＮＡの塩基配列決定が可能な装置が実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００２７】
〔実施例１〕
本実施例では、蛍光標識したＤＮＡ断片を電気泳動により分子量分離し、蛍光によって検出を行う。標識用の蛍光体として、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用する場合について説明する。試料である蛍光標識したＤＮＡ断片としては、ＤＮＡ断片の一部に蛍光体で標識したもの等が使用できる。
例えば、周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法により、蛍光標識したプライマーを使い、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行うことで調製する。つまり、プライマーとして、ＦＩＴＣが結合したプライマー（標識プライマー）を使用し鋳型の一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを加えてアニールし、一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを結合させる。次にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄｄＡＴＰを加え、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる。以上の操作で、末端がＡの種々の長さの蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。これを試料とする。
【００２８】
まず、装置構成について説明する。図１に、本実施例の電気泳動装置の電気泳動部及びレーザ光照射系の構成図を示す。図２に、電気泳動装置の蛍光検出系の構成図を示す。電気泳動装置は試料分離部となるキャピラリーを２０本並べて、複数の試料を同時に計測する構成とする。試料分離部として、２０本のシリカ製のキャピラリー１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ……、１ｔを使用する。これらは各々内径１００μｍ、外径３７５μｍ、長さ４０ｃｍのシリカ製の同じキャピラリーとする。さらにそれらと同じ内外径を有する長さ１０ｃｍの２０本のシリカ製のキャピラリー２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、……、２ｔを使用する。キャピラリー１ａ〜１ｔには、変性剤の尿素を含むポリアクリルアミドゲルを充填したキャピラリーゲルを作成する。まず、キャピラリー内部を洗浄し、シランカップリング処理する。次いで、脱気した３．８４％のアクリルアミド、０．１６％のビスアクリルアミド、７Ｍの尿素、２ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス、ほう酸緩衝液にテトラメチルエチレンジアミン、過硫酸アンモニュウム溶液を加えキャピラリーに注入して重合させ、アクリルアミドゲルを作成する。キャピラリーはシランカップリング処理されているため、アクリルアミドゲルとキャピラリーとは化学的に結合しており、泳動時にキャピラリーからゲルがはみでることがない。
【００２９】
キャピラリー２ａ〜２ｔは、それらの内面が正の電荷を有するように処理する。まず、キャピラリーに３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン溶液を注入して反応させ、１１０℃で熱処理して、キャピラリー内面をアミノシラン化して正の電荷を有するようにする。このようにすることでキャピラリー２ａ〜２ｔの各々の内部の電気浸透流の向きが負極から正極の向きになり、アクリルアミドゲルを充填したキャピラリー１ａ〜１ｔでの試料の泳動方向（負極→正極）と、キャピラリー２での試料の移動方向（負極→正極）が一致し、試料の泳動を確実にすることができる。以上のキャピラリー１ａ〜１ｔ及び２ａ〜２ｔのそれぞれの一端を、光学セル内部に対向させて、一定の間隙を保持するように固定し、試料を光学的に検出する。ここでは蛍光により試料を検出するため、光学セルとして蛍光セルを使用する。つまり、上記キャピラリー１ａ〜１ｔ及び２ａ〜２ｔのそれぞれの一端を角形の石英製蛍光セル４（外形：幅３６ｍｍ×奥行４．５ｍｍ×長さ３ｍｍ、内形：幅３０ｍｍ×奥行２ｍｍ×長さ３ｍｍ、：幅は図の横方向（キャピラリー１ａ→１ｔの並び方向）、奥行は図の紙面に対して垂直方向、長さは図の縦方向（各キャピラリーの１→２の試料泳動方向））内部に配置する。配置方法は、キャピラリー１ａとキャピラリー２ａとが同軸になるように、しかも、１ｍｍの長さの間隙部３ａを形成して対向させる。キャピラリー１ｂと２ｂ、１ｃと２ｃ、１ｄと２ｄ……、１ｔと２ｔも同様に、各々同様の間隙部３ｂ、３ｃ、３ｄ……、３ｔとを形成するように配置する。キャピラリーの光学セル内への固定は、ふっ素樹脂、例えば四ふっ化エチレン樹脂製の平板状のブロックに０．６ｍｍ間隔で２０箇所の垂直孔を設けたマルチキャピラリー保持具５ａ及び５ｂを使用する。つまり、マルチキャピラリー保持具５ａの２０箇所の垂直孔に１本ずつキャピラリー１ａ〜１ｔを差し込み、またマルチキャピラリー保持具５ｂの２０箇所の垂直孔に１本ずつキャピラリー２ａ〜２ｔを差し込み、キャピラリー１ａと２ａ、１ｂと２ｂ、１ｃと２ｃ、１ｄと２ｄ……、１ｔと２ｔとがそれぞれ同軸になるようにマルチキャピラリー保持具５ａと５ｂを蛍光セル４の上部と下部に密着させて固定する。さらに間隙部３ａ〜３ｔを光学検出部、ここでは蛍光検出部とするため、各々の間隙部３ａ〜３ｔが１直線上に整列するように、石英製蛍光セル４内でのキャピラリー１ａ〜１ｔ及び２ａ〜２ｔの長さ等を調整する。なお、キャピラリー１ａ〜１ｔ及びキャピラリー２ａ〜２ｔのそれぞれの他端は、緩衝液（トリス、ほう酸、ＥＤＴＡ、尿素を含む緩衝液）を入れた陰極側電極槽６及び陽極側電極槽７に浸す。蛍光セル４には、その内部をシース液で満たすためのシース液注入口８が設けられており、四ふっ化エチレン樹脂製のチューブ９を介してシース液容器１０内のシース液１１が注入できる構造としている。シース液には、トリス、ほう酸、ＥＤＴＡ、尿素を含む緩衝液を使用し、キャピラリー１ａ〜１ｔのキャピラリーゲル内の緩衝液と同じ成分とし、キャピラリーゲルの構成成分の蛍光セル４内への漏れ出しを防止するようにする。
【００３０】
また、キャピラリー１ａ〜１ｔ及びキャピラリー２ａ〜２ｔを内部に配置した状態の蛍光セル４内を、シース液で満たし、シース液容器１０内のシース液１１の液面を陽極側電極槽７内の緩衝液の液面より高く配置することで、シース液はキャピラリー２ａ〜２ｔを通って陽極側電極槽７内に流れる。この状態では、蛍光セル４内及びキャピラリー２ａ〜２ｔの内部がシース液つまり緩衝液で満たされ、またキャピラリー１ａ〜１ｔもキャピラリーゲルで満ちており、陰極側電極槽６と陽極側電極槽７の間に直流高電圧電源１２により直流電圧を印加することで、例えばキャピラリー１ａと間隙部３ａとキャピラリー２ａを貫くように電流が流れ、試料を電気泳動させることができる。また、シース液容器１０内のシース液１１の液面を陽極側電極槽７内の緩衝液の液面より高く配置することで、キャピラリー２ａ〜２ｔの内部をシース液が流れでることになり、各々のキャピラリー２ａ〜２ｔの上部、即ち間隙部３ａ〜３ｔの各々を中心とした流れが生じる。そこでキャピラリー１ａ〜１ｔから泳動されてくる試料は、キャピラリー２ａ〜２ｔの上部の流れに沿って、各々間隙部３ａ〜３ｔをシースフロー状態で通過し、各々のキャピラリーに導かれ、陽極側電極槽７側に泳動される。キャピラリー２ａ〜２ｔはその内部が正の電荷を有するように処理しており、キャピラリー２ａ〜２ｔ内の電気浸透流はキャピラリー１ａ〜１ｔから陽極側電極槽７の方向になり、間隙部への液の逆流が無く、シース液を安定に陽極側電極槽７方向に流すことができ、特にシース液の流量が少ない場合でも安定にシース液を陽極側電極槽７方向に流すことができる。
【００３１】
電気泳動は、陰極側電極槽６と陽極側電極槽７の間に直流高電圧電源１２により直流電圧を印加することで行う。電圧印加により、キャピラリー１ａとキャピラリー２ａを流れる電流は主に間隙部３ａを中心に流れ、同様にキャピラリー１ｂと２ｂ、１ｃと２ｃ、１ｄと２ｄ……、１ｔと２ｔを流れる電流は主に各々間隙部３ｂ、３ｃ、３ｄ……、３ｔを中心に流れる。さらに上述のように、キャピラリー１ａ〜１ｔから泳動されてくる試料は、キャピラリー２ａ〜２ｔの上部の流れに沿って、各々間隙部３ａ〜３ｔをシースフロー状態で通過し、各々のキャピラリーに導かれる。つまり、各々のキャピラリー及び間隙部を泳動する試料は、隣の間隙部を泳動する試料と接触せずに泳動し、各々の間隙部を泳動する試料を分離して蛍光計測することができる。また、試料は蛍光セル４の内面にも接触しないため、蛍光セルへの試料の吸着の影響が無く、また蛍光セル面での散乱光をスリット等で空間的に除去することができ、高感度な蛍光測定が可能になる。
試料である蛍光標識ＤＮＡ断片の導入は、陰極側のキャピラリー１ａの端を一時的に試料液に浸し、試料液と陽極側電極槽７の間に６ｋＶの電圧を２０秒間程度印加することで行う。その後キャピラリーの端を元の陰極側電極槽６に戻す。この操作をキャピラリー１ｂ〜１ｔの各々について行い、キャピラリー１ａ〜１ｔのキャピラリーゲル内に試料を注入する。なお、試料の注入は、上記のように１本ずつ順番に行っても良いし、またキャピラリー１ａ〜１ｔをそれぞれ試料液に浸し、同時に電圧を印加することで行っても良い。試料の電気泳動による分子量分離は、陰極側電極槽６と陽極側電極槽７の間に６ｋＶの直流電圧を印加して行う。キャピラリー１ａ〜１ｔの各々に注入された試料は、各々キャピラリー１ａ〜１ｔのキャピラリーゲル内を陰極側から陽極側に向かって分子量分離されつつ泳動され、各々間隙部３ａ〜３ｔを通過する。間隙部３ａ〜３ｔを通過する試料の検出は、標識用の蛍光体であるＦＩＴＣを励起するために波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ光を使用し、レーザ光が、１直線上に整列させた間隙部３ａ〜３ｔを同時に、またほぼ同じ条件で照射するようにレーザ光軸を調整して照射し、発する蛍光を計測することで行う。つまり、アルゴンレーザ光源２０の波長４８８ｎｍのレーザ光２１をレンズ２２により絞って照射し、間隙部３ａ〜３ｔを通過する蛍光標識ＤＮＡ断片を励起する。ビーム径が約０．７ｍｍのレーザ光を使用し、焦点距離が１００ｍｍのレンズ２２を使用し、間隙部３ａ〜３ｔの中間に焦点を合わせる。この場合、焦点でのレーザ光のスポットサイズは１５０μｍ程度で、その焦点深度は約２０ｍｍである。間隙部３ａから間隙部３ｔまでの距離は、キャピラリー１ａからキャピラリー１ｔまでの距離に等しく、本例の場合０．６ｍｍ×１９つまり約１２ｍｍである。つまり、レーザ光は間隙部３ａ〜３ｔの２０箇所をほぼ同一のスポットサイズで照射しており、またそのスポットサイズがキャピラリーゲルの太さ（１００μｍ）とほぼ同等となる。以上のように、レーザ光のスポットサイズをキャピラリーゲルの太さとほぼ同等の大きさにでき、また全ての間隙部をほぼ同一のスポットサイズで照射するように、光源とレンズ系を選定することにより、間隙部３ａ〜３ｔを泳動する蛍光標識ＤＮＡ断片を均一にしかも効率良く励起することができる。
【００３２】
間隙部３ａ〜３ｔを泳動する蛍光標識ＤＮＡ断片からの蛍光はレーザ光照射方向と垂直方向から検出する。その構成図を図２に示した。ＤＮＡ断片から発せられた蛍光３０は、干渉フィルタ３２で散乱光などの背景光等を除去し、レンズ３３で、ＣＣＤカメラ等の二次元検出器３４に結像する。二次元検出器３４はコントローラ３５により制御されて間隙部３ａ〜３ｔの蛍光像を検出し、コンピュータ等のデータ処理装置３６で各間隙部３ａ〜３ｔ毎の蛍光強度の時間変化を連続的に、しかも全ての間隙部を同時に計測し、それらの結果をモニタ３７に表示し、プリンタ３８に出力し、またメモリ３９に保存する。これにより、１ａ〜１ｔの各キャピラリー毎に分子量分離された泳動パターンを同時にかつ連続的に測定することができる。なお、本例の場合、間隙部の蛍光像は一次元上に並ぶため、ＣＣＤカメラのようなや二次元検出器のかわりに、ホトダイオードアレイ等の一次元検出器をも使用することができる。また干渉フィルタ３２には、ＦＩＴＣからの蛍光を効果的に検出するために、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの波長域を通過するバンドパス干渉フィルタを使用する。また、間隙部３ａ〜３ｔの像が二次元検出器の受光面に全て結像するように、レンズ３３の像倍率を設定する。本実施例では間隙部は基本的に緩衝液であるため、レーザ光は、キャピラリー等の散乱を受けずに間隙部を伝播する。そのため、複数のキャピラリーを泳動する試料を同時に、均質に、効率的に光照射することができる。また、キャピラリーやキャピラリーゲルによる散乱光や蛍光などの背景光を大幅に低減することができ、高感度に蛍光を検出することが可能になる。背景光の低減効果としては、例えば間隙部を形成させることなく、被覆を除去したキャピラリーそのものにレーザ光を照射して蛍光検出する場合と比べて、本実施例のように間隙部で蛍光計測を行うと、検出される背景光強度が１／１０程度以下になり、より低濃度の試料を検出できるようになる。また、複数の間隙部を１直線上に整列させることで、すべての間隙部を同時にしかも簡単にレーザ光で照射することができ、簡便な装置構成とすることができる。また、複数のキャピラリー対を１個の光学セルに保持できることにより、光学セルが１個で済み、シース液の注入に要する配管も１系統で済む。またシースフローは間隙部近傍でのみ生じるため、各間隙部での流速はすべての間隙部でほぼ同等となり、間隙部間での再現性が高い。そのため、泳動路間のバラツキが少なく、また、光学セルも本実施例のように単純な構造の光学セルで十分であり、通常のシースフローチャンバのように複雑な形状の光学セルを使用する必要が無く、全体的に、簡便な装置構成となる。本実施例では、隣合うキャピラリー間の間隔は０．６ｍｍに設定した。このようにキャピラリー対を一定の間隙を保持して対向させることにより、試料の泳動する位置を規定することができ、複数のキャピラリー（及び間隙部）を近接して配置することができ、光学セルを小型化することが可能である。また、このことにより、レーザ光をより細く絞って間隙部を照射することも可能になる。また逆に、同じ光学セル内により多くのキャピラリー対を保持することができるようになる。本実施例によれば、分子量分離部が従来と同様のキャピラリーゲルであるため、分子量分離特性を損なうことなく、高感度に試料を検出することができる。
【００３３】
また、本実施例によれば、液体クロマトグラフィ用ポンプ等の機械的手段を使用せずに緩衝液をフローさせることができるため、装置構成が簡便になり、安価になる。また、ポンプ等を使用する場合に生じる脈流が無いため、シース液の流れが安定になり、流速の変動が少なくなり、間隙部を流れる試料の蛍光強度の変動が抑えられ、測定精度を高めることができる。なお、シース液の流量はシース液容器内のシース液の液面と泳動下流側の陽極側電極槽内の緩衝液の液面との落差を変えることで容易に調整することができる。また、泳動下流側のキャピラリーの内径を変えることでも調整することができる。なお、液体クロマトグラフィ用ポンプ等の機械的手段によりシース液をフローさせることも基本的に可能である。この場合、流量が直接設定できるという利点がある。しかし、ポンプの脈流により蛍光強度が変動しやすくなるため、データ処理において平滑化等の処理を十分に行う必要がある。
【００３４】
光学セル内部のシース液は、下流側のキャピラリー２ａ〜２ｔを通りセル外に流れ出る。キャピラリーは一般にその内径が細いため、そこを流れる流量は一般に少なくなる。そのため、シース液の液量が低減でき操作性が向上する。また、本実施例では、キャピラリー２ａ〜２ｔの内部が正の電荷を有するように処理して、キャピラリー２ａ〜２ｔ内の電気浸透流の向きをキャピラリー１ａ〜１ｔから陽極側電極槽７の方向になるようにして、間隙部へのキャピラリー２ａ〜２ｔからの液の逆流が無いようにした。このことより、特にシース液の流量が少ない場合でも安定にシース液を陽極側電極槽７方向に流すことができる。なお、キャピラリー２ａ〜２ｔの内径が大きい場合等のようにシース液の間隙部での流速が大きい場合には、電気浸透流の効果が小さくなるため、必ずしもキャピラリー２ａ〜２ｔの内面の処理を施す必要はない。本実施例では、シース液及び陽極側電極槽、陰極側電極槽内の緩衝液には、トリス、ほう酸、ＥＤＴＡ、尿素を含む緩衝液を使用し、キャピラリーゲルの緩衝液と同じ成分とした。このことにより、キャピラリーゲルの構成成分が蛍光セル４内または電極槽へ漏れ出ることかなくなり、キャピラリーゲルの再使用を含めより安定で分離能の良い電気泳動を続けることができる。なお、ＤＮＡの変性剤である尿素を含まない状態の緩衝液を使用することもできる。この場合は、キャピラリーゲル内の尿素が時間とともにキャピラリーゲルから電極槽や蛍光セル内に漏れ出る可能性が有り、繰返しの使用回数が多少減少するが、尿素を含む緩衝液の場合と同様の泳動が可能である。
【００３５】
なお、使用するレーザ装置及び蛍光体は、アルゴンレーザ及びＦＩＴＣに限られるものではなく、任意の蛍光体及び適当なレーザ装置が使用できる。本実施例では、ＤＮＡ断片の測定を例にして説明したが、蛋白、糖等の分析にも当然のことながら使用できる。また、本実施例では２本とも同じ内径のキャピラリーを使用したが、異なる内径のキャピラリーの組合せも可能である。例えば、上流側のキャピラリーの内径より下流側のキャピラリーの内径を細くすれば、上流側のキャピラリー端から泳動される試料が下流側のキャピラリーに導入される時に絞られるため、試料液の濃度が高くなり、より高感度に検出することができるようにもできる。また上流側のキャピラリーの内径より下流側のキャピラリーの内径を太くすれば、上流側のキャピラリー端から泳動される試料をより容易にかつ確実に下流側のキャピラリーに導びくこともできる。さらに、本実施例によれば、励起光をキャピラリー部を透過させることなく試料からの蛍光を測定できることから、キャピラリーが透明である必要はない。つまりキャピラリーの被覆を除去する必要がないため、取り扱いが容易になる。さらに四ふっ化エチレン樹脂や三ふっ化塩化エチレン樹脂などの不透明なふっ素樹脂製のキャピラリー等種々の材質のキャピラリーを使用することも可能となる。ふっ素樹脂製のキャピラリーは試料の吸着が少ないため、表面処理等の処理操作が不必要であり、また破損がないため、操作性が向上する。また耐薬品性に優れるので、幅広いｐＨ範囲の溶媒を使用することが可能になる。なお、本実施例では、複数のキャピラリー対の場合について説明したが、１つのキャピラリー対だけの場合も同様に、泳動し、蛍光検出し、試料の分離パターンを測定することが可能である。この場合は、光検出器として光電子増倍管等が使用できる。
【００３６】
〔実施例２〕
次に、実施例１の装置を使用し、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法について説明する。周知のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法により、蛍光標識したプライマーを使い、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行って蛍光標識ＤＮＡ断片を調製する。プライマーとして、ＦＩＴＣが結合したプライマー（標識プライマー）を使用する。まず、一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを加え、アニール（２本鎖形成）して、一本鎖ＤＮＡに標識プライマーを結合させる。この反応液を４分割し、それぞれにＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対応したＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる。つまり、標識プライマーの結合した一本鎖ＤＮＡに４種のデオキシヌクレオチド三りん酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）とターミネータとなるｄｄＡＴＰを加えポリメラーゼ反応を行わせる。この反応により、末端がＡの種々の長さの蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。同様の反応をＣ、Ｇ、Ｔについても行う。上述のようにして得られる４つのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの反応液を、キャピラリー１ａ〜１ｔのうちの４本例えばキャピラリー１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄのそれぞれに注入する。注入法は実施例１と同様で、Ａ反応液を１ａに、Ｃ反応液を１ｂに、Ｇ反応液を１ｃに、Ｔ反応液を１ｄに注入する。注入後約６ｋＶの電圧を印加することで電気泳動させる。波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ光を励起光として、各ギャップ３ａ〜３ｄでの蛍光強度の時間変化を測定する。ＤＮＡ断片は分子量の小さい順に泳動されることから、蛍光ピークの生じたギャップ位置を時間順に解析することで塩基配列が解析できる。
【００３７】
実施例１の装置は、試料を注入できるキャピラリーを２０本有している。上記のＤＮＡ塩基配列決定方法によれば、同時に５種類のＤＮＡ試料の塩基配列を決定することができる。光学セル内に保持するキャピラリー対の数を増やせばより多くのＤＮＡ試料の塩基配列を決定することもできる。なお、本実施例では、蛍光体としてＦＩＴＣの１種を使用している。しかし、同時に２種以上の蛍光体からの蛍光を検出することも可能である。その場合には、例えば周知のように図２において干渉フィルタ３２、レンズ３３、検出器３４からなる光検出装置の組を蛍光体の数に一致する数だけ設け、それぞれが別々の波長域の蛍光を検出するようにしてもよいし、または、レンズ３３の後に分散プリズムを配置して分光し、それをカメラ等の二次元検出器に結像させて受光し、泳動路毎及び波長毎に蛍光強度を測定し、泳動路毎及び蛍光体毎の蛍光強度を算定するようにしてもよい。
【００３８】
上記のように、複数の蛍光体を同時に測定できる装置構成とした場合も、ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。つまり、末端塩基の種類毎に、異なる蛍光体で標識したプライマーを使用し、それぞれＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせた後、反応液を混合し、電気泳動させる。そして、間隙部空間を通過するＤＮＡ断片の蛍光を検出し、そのときの蛍光体の種類を識別することで塩基種が同定でき、塩基配列が決定できる。なお、蛍光体の種類の識別は、４種の蛍光体の蛍光極大波長での蛍光強度を比較する等により決定することができる。この場合は、１対のキャピラリーと間隙部で構成される泳動路で、ＤＮＡ試料の塩基配列を決定することができる。つまり図１のように複数の泳動路を有する場合、複数のＤＮＡ試料の塩基配列を同時に決定することが可能になる。
【００３９】
〔実施例３〕
上記第１の実施例及び第２に実施例では、蛍光測定により試料を検出する装置について説明したが、吸光度の測定、透過光強度の測定などの光吸収測定の場合も同様に装置を構成することができる。図３に、光吸収測定の場合の電気泳動装置の光照射系・検出系の部分の構成図を示す。電気泳動部分は、実施例１の図１と同様の構成とする。試料、例えばＤＮＡの制限酵素切断断片の導入は実施例１と同様に行い、分子量分離するための泳動も実施例１と同様に行う。間隙部３ａ〜３ｔを通過するＤＮＡ断片に対して、キセノンランプやＤ2ランプ等の光源５０の光をモノクロメータ５１を通し、レンズ５２で集光し、間隙部３ａ〜３ｔを照射する。照射する光波長は試料の吸収波長に設定するのが通常であり、例えばＤＮＡ断片に対しては、２６０ｎｍ程度が適当である。ＤＮＡ断片により光吸収を受け透過した光は、再びレンズ５３で集光されてホトダイオードアレイ等の一次元センサ５４で検出する。一次元センサ５４は一次元センサ用のコントローラ５５により動作が制御され、コンピュータ等のデータ処理装置５６で各間隙部毎の泳動パターン等が測定され、それらの結果はモニタ５７に表示、プリンタ５８に出力され、またメモリ５９に保存される。本実施例では、間隙部をキャピラリー間に設け、キャピラリー部を分子量分離部、間隙部空間を吸光度を測定する光学検出部と分けることで、照射光は光散乱の極めて少ないシース液中を透過するため、キャピラリーやゲル等で散乱されることなく試料を効率よく照射することができ、高精度な吸光度測定が可能になる。具体的には、本実施例のように間隙部に光を入射させた時の透過光強度（試料が通過しない場合で受光用のレンズの開口数が０．１９の場合）を１とすると、従来のようにキャピラリーを透過させる場合はその透過光強度が０．６程度に低下する。これはキャピラリー自体及び電気泳動で分子量分離させるための媒体であるポリアクリルアミドゲル等のゲルが光の散乱体であるため、その部分で入射光が散乱され、その結果透過光が減少するためである。透過光強度が低下することはその分だけ光検出器等のＳ／Ｎが低下することを意味し、測定精度が低下する。また、従来の場合はキャピラリーの表面等で散乱や反射した光もその一部が検出されてしまうが、これらの光は試料を照射することなく（試料による吸収を受けずに）直接検出器に入射する。このような試料の存在にかかわらずに検出される光成分があると、微小な光強度変化が測定しにくくなり、つまり精度の高い吸光度測定が困難になる。なお、本実施例では、モノクロメータ５１を通した光を、レンズにより間隙部部に集光して照射しているが、集光せずにほぼ平行光として照射し、間隙部を通過した光のみを空間的に分離してその光強度を測定することでも同様に測定が可能である。
【００４０】
〔実施例４〕
上記第１から第３の実施例では、キャピラリー対により間隙部を形成したが、間隙部はキャピラリー対のみによって形成されるものではない。例えば、分子量分離部を上記実施例と同じくキャピラリーとし、このキャピラリー端と細孔を有した平板とで間隙部を形成することもできる。図４に間隙部の構成図を示す。実施例１と同様に、分子量分離部である２０本のキャピラリー１ａ〜１ｔをマルチキャピラリー保持具５ａに保持し、蛍光セル６０に固定する。蛍光セル６０の反対側には内径２００μｍの細孔６１ａ〜６１ｔを有する平板６２を固定する。キャピラリー１ａ〜１ｔの各々と対向する位置に細孔６１ａ〜６１ｔを設けることで、間隙部が形成され、シース液を流すことで各々のキャピラリーから泳動される試料を対応する細孔に導くことができる。なお、平板６２の下には、液溜め６３を配置し、細孔から流れ入る溶液を一旦溜め、チューブ６４を介して電極槽６５に導く。電気泳動は電極槽６５ともう一方の電極槽（図示せず）に電圧を印加することで、実施例１と同様に行うことができる。レーザ光の照射、蛍光検出等も同様である。
【００４１】
〔実施例５〕
実施例１に対して、下流側のキャピラリーを使用せずに、上流側のキャピラリーのみを使用し、シース液を流して泳動する方式を構築することもできる。図５に電気泳動装置の電気泳動部の構成図を示す。実施例１と同様にキャピラリー１ａ〜１ｔのそれぞれの一端を、光学セル４内部に各々の先端をそろえて保持する。キャピラリーの光学セル内への固定は、ふっ素樹脂、例えば四ふっ化エチレン樹脂製の平板状のブロックに０．６ｍｍ間隔で２０箇所の垂直孔を設けたマルチキャピラリー保持具５ａを使用する。つまり、マルチキャピラリー保持具５ａの２０箇所の垂直孔に１本ずつキャピラリー１ａ〜１ｔを差し込み、マルチキャピラリー保持具５ａを蛍光セル４の上部に密着させて固定する。蛍光セル４の下部はシール板７０と四ふっ化エチレン樹脂製のチューブ７１を接続し、チューブ７１端を陽極側電極槽７内に浸し、シース液が流れるように、また、電気泳動が可能なようにする。蛍光セル４には、その内部をシース液で満たすためのシース液注入口８が設けられており、四ふっ化エチレン樹脂製チューブ９を介してシース液容器１０内のシース液１１が注入できる構造とする。また、シース液容器１０内のシース液１１の液面を陽極側電極槽７内の緩衝液の液面より高く配置することで、キャピラリー１ａ〜１ｔから泳動されてくる試料をシース液に包んで蛍光セル４内を流すことができる。これらの溶液は最終的に陽極側電極槽７側に導かれる。電気泳動は、陰極側電極槽６と陽極側電極槽７の間に直流高電圧電源１２により直流電圧を印加することで行う。各々のキャピラリーを泳動され出る試料は、キャピラリーの直下では、他のキャピラリーを泳動する試料と接触せずに光学セル内を泳動し、最終的に陽極側電極槽７に泳動される。試料の検出は蛍光セル４内のキャピラリー端より５００μｍ下流側の部分をレーザ光照射して蛍光を受光する。受光系は実施例１と同様の構成で行う。本実施例では、基本的にシースフローの形成方法の部分において実施例１と異なる。本実施例では、光学セル内部の全体をシース液が層流状態で流れる。そのため、光学セル内部の位置によってシース液の流速が多少異なり、また、試料の泳動する路が変化しやすいという不安定性がある。しかし、感度、装置構成の簡便性等において実施例１とほぼ同様の効果が得られる。
【００４２】
〔実施例６〕
実施例１記載の装置において、下流側キャピラリーを複数の溝を有する平板として、間隙部を形成することもできる。図６に複数の溝を有する平板の斜視図を示す。図ではキャピラリー４本に対応するように４つの溝を有する場合を図示した。蛍光セルの内部の形状に一致する平板８０の片面に４つの溝８１ａ、８１ｂ、８１ｃ、８１ｄを形成させる。溝の形状は分子量分離用のキャピラリーの大きさに対応させ、例えば、幅３００μｍ、深さ６００μｍとする。また、溝と溝との間隔は１ｍｍとする。なお、これらの間隔、溝の形状は自由に変更しうる。図７に、上記平板を使った電気泳動装置の電気泳動部の蛍光セル部分の断面図の斜視図を示す。蛍光セル８４は、セル内部が幅２０ｍｍ、奥行３ｍｍ、長さ４０ｍｍであり、（石英）ガラスの板厚が２ｍｍの上下端が開いているフローセル型のものを使用する。また図は蛍光セルの手前側のガラス部を除いた状態を示す。この蛍光セル８４内部に平板８０を密着させてはめ込み、溝８１ａ、８１ｂ、８１ｃ、８１ｄと蛍光セルのガラスとで形成される４つの流路を形成させる。また、内径１００μｍ、外形２００のキャピラリー（実施例１と同様にして内部にゲルを作製する）８２ａ、８２ｂ、８２ｃ、８２ｄをマルチキャピラリー保持具８３により蛍光セル８４内部に固定する。キャピラリー同志の間隔は１ｍｍとして溝と溝との間隔に一致させ、また各々の溝の中央部にキャピラリーの軸がくるように調整する。これらはマルチキャピラリー保持具８３に設ける孔等の位置を調整することで対応できる。また、キャピラリー８２ａ、８２ｂ、８２ｃ、８２ｄの蛍光セル内部での端を揃え、各キャピラリー端と平板８０とが１ｍｍ程度離れるように調整して蛍光セル内部に固定する。なお、蛍光セルの下部を陽極電極槽内の緩衝液と接触させるようにすることで電気泳動を可能にする。また、実施例４または実施例５と同様にチューブを介して電極槽と接続させることも可能である。蛍光セル８４には、その内部をシース液で満たすためのシース液注入口８５が設けられており、四ふっ化エチレン樹脂製チューブ８６を介してシース液容器８７内のシース液８８が注入できる構造とする。また、シース液容器８７内のシース液８８の液面を陽極側電極槽内の緩衝液の液面より高く配置することで、キャピラリー８２ａ〜８２ｄから泳動されてくる試料をシース液に包んで蛍光セル８４内を流し、各々溝８１ａ〜８１ｄを通して陽極側電極槽に導くことができる。
電気泳動、レーザ光照射、蛍光検出は、実施例１で説明したのと同様に行うことで、複数のキャピラリーの各々で分離される試料を、同時に効率良く検出することができる。本実施例では、下流側をキャピラリーではなく、溝を形成した平板により構成した。そのため、各々の溝の端面を容易に揃えることができ調整が容易になる。また、平板を石英ガラスなどとすれば、レーザ光が乱反射して平板にあたってもその部分から蛍光が生じることが無く、蛍光測定が容易になる。
【００４３】
〔実施例７〕
ゲル充填キャピラリーアレイを使ったＤＮＡの塩基配列を決定する装置及び方法について説明する。実施例２と同様の方法により、ＤＮＡシーケンシング用の試料（蛍光標識ＤＮＡ断片）を調製する。１本の泳動路（ゲルキャピラリー）で４つの塩基種を識別するために、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ断片毎に異なる蛍光体を標識したプライマーを使用する。Ａ断片には、蛍光極大波長が約５５０ｎｍの蛍光体を標識したプライマー（プライマーＡと略記）を結合させた。同様にＣ、Ｇ、Ｔ断片には、蛍光極大波長が各々約５２０、５７５、６０５ｎｍの蛍光体を標識したプライマー（各々プライマーＣ、プライマーＧ、プライマーＴと略記）を結合させた。これらの断片群は最終的に単一容器にいれて混合し、エタノール沈殿処理の後、脱イオン化ホルムアミド（１／１００量のトリス緩衝液を含む）に溶解させた。ゲルキャピラリーへの注入前には、９０℃で２分間加熱して熱変性させて断片を１本鎖にし、その後すぐに氷冷し、注入操作に使用した。なお、蛍光標識をプライマーにではなく、ターミネータにして試料を調製してもよい。
【００４４】
次に測定装置について説明する。図８はキャピラリーアレイを構成するためのサブアレイの構成図をであり、図９は図８のサブアレイを複数個組み合わせた本実施例のキャピラリーアレイの構成図をしめす。さらに、図１０はキャピラリーアレイを使ったＤＮＡ塩基配列決定装置の構成図、図１１は試料注入部の拡大断面図、図１２はＤＮＡ塩基配列決定装置の泳動電流計測・表示部の構成図、図１３は光学セル部近傍の構成を示すための光学セル断面を含む説明図、図１４は蛍光検出・色分離部の原理構成図、図１５は２次元検出器で得られる蛍光像のイメージ図、図１６は使用した蛍光標識プライマーの蛍光特性と分光フィルタの透過特性図、図１７は１本のゲルキャピラリーを泳動する試料から発する蛍光信号強度の時間波形の１例（生データ）、図１８は解析して得られたＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ断片毎の時間波形である。
【００４５】
内部にゲルを充填したキャピラリーを９６本用い、一端を１直線状に並べた並べたキャピラリーアレイを作製した。９６本を１つの保持具でアレイ状に組立てると、組立が複雑になり、またキャピラリーの交換が難しくなるため、キャピラリー８本単位のサブアレイを形成し、このサブアレイを１２組並べて９６本のキャピラリーアレイを構成した。図８に示すように、長さがわずか異なる８本のキャピラリー９０を同一平面上に並べ、キャピラリーの中心間の間隔が、一端が９ｍｍ間隔、他端が０．５ｍｍ間隔になるようにキャピラリー保持具９１及び９２でそれぞれ固定し、それらの端の位置を揃える。９ｍｍ間隔に固定されたキャピラリー端９０ａは試料注入側端であり、反対側の９０ｂは光学検出側端である。
このサブアレイは図９のように１２組組み合わされ、キャピラリーアレイ１０７が構成される。１２個のキャピラリー保持具９１は同一平面上に１２列に並べるようにエリア・アレイ保持具９３で固定し、他端のキャピラリー保持具９２は１２個が順番に１直線上に並ぶようにリニア・アレイ保持具２１４で固定する。その結果キャピラリー端９０ａは同一平面上に８本１２列の格子状に並び、９０ｂ側は９６本のキャピラリー端が１直線上に並ぶ。図９では１列目のサブアレイについてのみキャピラリー９０をつなげて示した。２〜１２列目のサブアレイについては途中のキャピラリーは省略してある。３〜１１列目についてはサブアレイそのものを省略したが、１列目、２列目、１２列目のサブアレイの間に順番に配置してある。使用したキャピラリーは内径０．１ｍｍ、外径０．２ｍｍ、長さ約３５ｃｍのものを使用し、実施例１と同様にその内部にアクリルアミドゲルを充填して使用した。ゲル濃度は９％Ｔ（（アクリルアミド＋ビスアクリルアミド）の全溶液量に対する比率）、０％Ｃ（ビスアクリルアミドの（アクリルアミド＋ビスアクリルアミド）に対する比率）とした。本実施例のキャピラリーアレイ１０７の使用により、９６試料の同時解析が可能になる。
【００４６】
図１０は、ＤＮＡ塩基配列決定装置の構成図である。キャピラリーアレイ１０７は、格子状に並んだ端を９６穴のウエルを有するマイクロプレート様の上部個別電極槽１０４の緩衝液（または、試料液）に挿入する。なお、図では、キャピラリーアレイ１０７と上部個別電極槽１０４との接続状態は図示していないが、これは図１１において説明する。なお、図では、わかりやすくするために、キャピラリーの本数を９６本から２０本に少なくして表示した。直線状に並べたキャピラリーアレイ１０７の他端は光学セル１０３の内部に固定される。光学セル１０３にはシース液容器１０５からシース液（緩衝液）をチューブ１２２とバルブ１２１を介して注入し、キャピラリーアレイ１０７の下部に配置した中空のキャピラリーアレイ１０８内部を通って下部電極槽１０６に排出される。キャピラリーアレイ１０７と中空のキャピラリーアレイ１０８とは、それぞれの端を対向させ、２ｍｍ離して固定されている。試料を励起するための光源として、２種のレーザ装置を使用した。１つは波長４８８ｎｍのアルゴンレーザ装置１０１であり、もう１つは波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザ装置１０２であり、これらをミラー１０９とダイクロイックミラー１１０によりアルゴンレーザ光１１１とＹＡＧレーザ光１１２を同軸にして、１本のレーザ光１１３となるようにして、光学セル１０３にレンズ（図示せず）で絞って照射した。蛍光標識された試料から生じる蛍光は、集光レンズ１１４、４種の分光フィルタ１１５ａ〜ｄ、像分割プリズム１１６、結像レンズ１１７により、２次元検出器１１８に結像させ、各試料のＤＮＡ断片からの蛍光強度の時間波形をデータ処理ユニット１１９で解析する構成とした。
【００４７】
キャピラリーアレイ１０７への試料の注入について、図１１（試料注入部／上部電極槽の拡大断面図）により説明する。図１１は、１２個の中の１個のキャピラリー保持具９１に保持されるキャピラリーを含む面の断面図を示す。８穴×１２列（合計９６穴）の容器様凹み１０４ａ、１０４ｂ…を有する上部個別電極槽１０４を使用する。例えば、９６穴のＶ底ウエルのマイクロプレートや９６個のサンプリングチューブを８個×１２列の格子状に９ｍｍ間隔に配置したものが使用できる。キャピラリーアレイ１０７の間隔は上部個別電極槽１０４の形状に合致させる必要がある。また容器様凹み１０４ａ、１０４ｂ…を各々上部電極槽とするため、９６本の白金電極１２０ａ、１２０ｂ…を、容器様凹みに対応したキャピラリーアレイ１０７端と同様に、電極保持板１２０により、８本×１２列の格子状に配置して固定した。また、電極保持板１２０には、それぞれの白金電極の近傍にはキャピラリーを通すための孔２５２ａ、２５２ｂ…が設けてある。試料２４０は凹み１０４ａ、１０４ｂ…の内部に入れる。上部個別電極槽１０４の上部に電極保持板１２０をスペーサ２５０をはさんで重ね、さらにエリア・アレイ保持具９３をスペーサ２５１をはさんで重ねる構造とする。個々のキャピラリー１０７ａ、１０７ｂ…は電極保持板１２０の孔２５２ａ、２５２ｂ…を貫いて試料液２４０に浸り、同様に個々のキャピラリー別に白金電極１２０ａ、１２０ｂ…も試料液２４０に浸る。これらの電極と下部電極槽１０６内の電極との間にほぼ同時に電圧を印加して試料２４０中のＤＮＡ断片をキャピラリー内に注入する。電圧は、１００〜２００Ｖ／ｃｍの電界強度となるようにし、数秒〜１０秒程度印加する。例えば５ｋＶで１０秒間印加する。試料注入後は、上部個別電極槽１０４を取外し、代わりに緩衝液の入った別の上部個別電極槽１０４をセットし、１００〜４００Ｖ／ｃｍの電界強度、例えば７ｋＶを印加して泳動を続けることで、分子量分離が行われる。この構成により、９６試料を同時に注入し、次いで９６試料を同時に電気泳動できる。また、試料の注入は、電極保持板１２０とエリア・アレイ保持具９３つまりキャピラリーアレイ１０７を重ねるだけで済み、従来の平板ゲルの場合のようにピペッティングにより１試料ずつ手操作で行う必要が無くなり、操作性を大幅に向上させることができる。
【００４８】
なお、電界印加時には、図１２に示すように個々のキャピラリーを流れる電流値を個別に同時に連続的に計測し、表示する機構を設けた。上部個別電極槽１０４内の電極（１２０ａ、１２０ｂ…）と下部電極槽１０６内の白金電極２０９には泳動電源１３３により電圧が印加される。電極１２０ａと泳動電源１３３の間に１０ｋΩ程度の抵抗１３１と電圧計１３２を図１２のように結線する。電流は電極２０９→バッファー液２４５→キャピラリーアレイ１０８→光学セル部→キャピラリーアレイ１０７の個々のキャピラリー１０７ａ→容器様凹み１０４ａ内のバッファー液２４６→電極１２０ａ→抵抗１３１→端子２６０とながれる。なお、キャピラリー１０７ａとキャピラリーアレイ１０８の間には光学セル部等があるが図１２では省略した。電圧計１３２の値によりキャピラリーを流れる電流値を換算し、その電流値を二値化手段により二値化して電流表示パネル１４０に伝送する。端子２６１、２６２も、図１２では省略したが、同様にそれぞれ電極１２０ｂ、１２０ｃに接続し、キャピラリー１０７ｂ、１０７ｃをながれる電流値を二値化して電流表示パネル１４０に伝送する。以下キャピラリーアレイ１０７の全てのキャピラリーについても同様である。端子２７０は最後の９６本目の端子である。電流表示パネル１４０には８個×１２列の表示ランプ１４０ａ、１４０ｂ…が配置され、それぞれキャピラリー１０７ａ、１０７ｂ…の電流値を表示する。なお、抵抗１３１はキャピラリーゲルの抵抗値に比べて十分小さい抵抗値のものを選ぶ。通常、１００ｋΩ以下であれば問題はない。また二値化のレベルは適当に調整できるようにする。通常泳動電流は、印加電圧、キャピラリー長などにより異なるが、０．０１ｍＡ程度である。ゲルが破損したりすると電流が流れなくなったり、小さくなったりする。そこで、例えば０．００３ｍＡ以下になったときに表示ランプが点灯するようすると、ゲルの破損などの異常をキャピラリー単位で認識することができる。その結果、異常のあるキャピラリーに対す測定結果の解析を中止するなどの処置を施すことができる。また、本例では、８本単位にキャピラリーをサブアレイ化しており、破損したキャピラリーのあるユニットのみを交換することができ、キャピラリーアレイを有効に使用し続けることができる。このように操作性がよく経済的な装置構成となる。
【００４９】
次に、光学セル部近傍の構造を図１３により説明する。光学セル１０３は、箱状の形状であり、筐体２０１、アレイガイド２０２及び２０５、シース液注入口２０３、光学窓２０４及び２０６などから構成される。なお、図１３が記載される紙面の前面及び後面にも筐体や光学窓があるが、図では省略した。また、筐体２０１、光学窓２０４及び２０６の部分は断面を示した。光学セル１０３の上部は開放しており、この部分からリニア・アレイ保持具２１４に固定されているキャピラリーアレイ１０７を、アレイガイド２０２及び２０５に沿って光学セル内に挿入し、固定する。光学セル１０３にはシース液容器１０５からシース液（緩衝液）がチューブ１２２とバルブ１２１を介して注入され、実施例１と同様に、セル内でシースフローを形成し、キャピラリーアレイ１０７の下部に配置した中空のキャピラリーアレイ１０８内部を通って下部電極槽１０６に排出される。光学セル１０３は上部に開放しており、シース液容器のシース液の液面２３０とセル内に流れ込んだシース液の液面２３１は連動しており、この高さと下部電極槽１０６の液面の高さの差等によってシース液がセル内をフローすることになる。
中空のキャピラリーアレイ１０８は、実施例１と同様の内面処理をほどこした内径０．２ｍｍ、外径０．３５ｍｍ、長さ３ｃｍのものを使用し、リニア・アレイ保持具２１５によって、０．５ｍｍ間隔に均等に並べ、光学セル１０３内部のキャピラリーアレイ１０７端と２ｍｍ離し、キャピラリーアレイ１０７と１０８のそれぞれのキャピラリー同士の端が対向するように固定した。中空のキャピラリーアレイ１０８及びリニア・アレイ保持具２１５は光学セル１０３に固定され、水漏れなどの無いようにシールされている。また光学セル１０３と下部電極槽１０６は気密性よく密着させ、その内部に溜る液は排出口２１０からバルブ２１１、チューブ２１２を介して廃液容器２１３に捨てられる。つまり排出口２１０の高さを超える液は排されることになり、下部電極槽１０６内の液面の高さは、ほぼ一定となるため。そのため、シース液が流れ込んできても落差はあまり変化せず、シースフローが安定に形成される。またバルブ２１１を閉じると、下部電極槽１０６内がシース液で満ちるため、シース液の流れがとめることができ、シース液を有効に使用することができるようになる。特に、測定を終了し、次の測定まで時間が空くときに、この機構は必要になる。本例では、液面２３０と２３１がほぼ一致するが、例えば、液面２３１の液面センサを設け、液面の減少に応じてバルブ１２１を開閉する機構をもうけてもよい。この場合、シース液容器１０５を光学セルよりも高い位置に配置することができ、装置構成が容易になる。
【００５０】
下部電極槽１０６には電圧印加用の白金電極２０９、その端子台２０８が設けられておる。ゲルキャピラリーを使う場合、白金電極２０９には（反対側の電極に対して）正の電圧を印加する。例えば白金電極１２０ａに０Ｖ、白金電極２０９に７ｋＶというような印加も可能だが、白金電極１２０ａに−７ｋＶ、白金電極２０９に０Ｖ（接地）という電圧印加が安全性を確保するため望ましい。これは、シース液全体が白金電極２０９の電圧とほぼ同電位になり、電極２０９が高電圧状態になると、シース液容器内、光学セル内、廃液容器内のシース液がすべて高電圧になり、漏水等による感電、漏電、絶縁破壊の危険性が増すからである。電極２０９に０Ｖ（接地）の場合は、試料側が負高電圧になるが、緩衝液のフローなどは無いため、漏水などが無く、感電、漏電を容易に防ぐことができるため、装置構成が容易にできるようになる。また、光学セルの筐体２０１としてステンレスなどの金属を使用することも容易になり、加工性がよくなり、安価に光学セルを作製することかできる。なお、電極２０９は本例のように中空のキャピラリーアレイ１０８の下部に配置したが、光学セル内またはシース液容器内に配置してもよく、同様の効果がある。
【００５１】
レーザ光１１３は光学窓２０４または２０６をとおって光学セル内に入射し、実施例１と同様にシースフロー状態で泳動するＤＮＡ断片を励起し、蛍光を生じさせる。蛍光発光点２２０は、図のようにキャピラリーのほぼ直下に点状に発生する。ことになる。これらの像は紙面の垂直方向から光学窓（図示していない）を通して検出する。なお、レーザ光１１３はレンズにより、絞って照射するが、焦点距離が約１５０ｍｍのレンズを使用することで、キャピラリーアレイの幅（本例の場合約５０ｍｍ）全体に渡って均一に照射することができる。また、レーザ光は同軸にしないで照射することも可能であるが、同軸にした場合、２本のレーザ光が同一個所を照射するので、それぞれのレーザで励起されるＤＮＡ断片の泳動距離が一定にできるので泳動時間のずれがなくなり、解析精度が向上する。
また、両方のレーザ光波長に吸収のある蛍光体の場合、同軸にすると、励起光強度が実質的に増大するので検出感度が向上する。なお、１本のみのレーザでも測定は可能である。
【００５２】
蛍光像の検出について、図１４により説明する。蛍光発光点２２０から発する蛍光は、集光レンズ１１４により集光し、像分割プリズム１１６により４つに分割し、結像レンズ１１７により、それぞれ結像（２２１ａ〜ｂ）させる。この際、４種の分光フィルタ１１５ａ〜ｄを像分割プリズムの前面（または後面）に配置することで、それぞれ分割された光が別々の波長成分となるようにできる。これは１つの蛍光発光点２２０について説明したが、すべての発光点についても同様であり、しかもこれら分割が同時に行われる。つまり、レーザ光走査や検出器の機械的走査をする場合のように時間分割されることはなく、蛍光強度の測定間隔が長くなることはなく高速に計測できる。リアルタイムで連続的に計測することも可能である。また、像分割プリズムの前に集光レンズを配置することで蛍光の集光効率が向上し、検出感度の向上が図れる。また集光レンズの代わりに円筒レンズを使うことも可能である。この場合、１方向のみの光を集光するので通常の凸レンズを使う場合に比べて効率は約半分になるが、使わない場合に比べ大幅に検出感度を向上できる。また像分割プリズムを使う場合、蛍光発光位置がずれると分割される像の強度の比率が大きく変動する。平板ゲルを使う場合は、ゲルの発熱などにより、ゲルに入射したレーザ光が曲がって蛍光発光位置がずれ、測定精度が低下しやすいという問題があるが、本実施例の場合、レーザ光は水溶液中を通るのでレーザ光は曲がることなく一定位置を照射するので従来に比べ測定精度が向上する。
【００５３】
また、光学セル内では、キャピラリーが密に配置されるので、９６泳動レーンという多数の場合でも、その配置の両端の間隔は５ｃｍ程度以下となる。そのため、像分割プリズムの前に集光レンズや円筒レンズなどの集光素子を使用することができ、蛍光をより高感度に検出できる。従来の平板ゲルの場合には、２４泳動レーンでも、その両端の泳動レーンの間隔は３０ｃｍ程度であり、像分割プリズムの前に集光レンズを置く場合、直径３０ｃｍのレンズが必要になるなどの理由で現実的に困難である。
【００５４】
本実施例では、キャピラリーアレイの幅が約５０ｍｍに対して、２次元検出器の受光素子の幅が約２７ｍｍのものを使用した。全体としての像倍率は約１／２であり、平板ゲル方式の場合は１／１０程度になるのに比べて集光効率がよい。
さらに、キャピラリーアレイを２０から３０本程度と少ない場合は、等倍の拡大率になり、集光効率が向上し、より高感度化する。集光効率の低下を防ぐため、キャピラリーアレイでのキャピラリー同士の間隔はキャピラリー径の１０倍程度以下とするのが望ましい。
【００５５】
図１５は実際に得られる２次元検出器上での蛍光像のイメージ図であり、２０本のキャピラリーアレイの場合である。図の横方向は、キャピラリーアレイ（配列）方向であり、縦方向は（色）分割方向である。９６本の場合も同様に、横に９６個、縦に４個の蛍光像が得られる。このようにキャピラリーアレイを泳動するすべての試料を、同時に、各々４（色）分割して計測できる。そこで４種の分光フィルタ１１５ａ〜ｄをプライマーＡ、プライマーＣ、プライマーＧ、プライマーＴの蛍光を透過するように調整することにより、プライマーＡ、プライマーＣ、プライマーＧ、プライマーＴを識別して計測できる。
【００５６】
図１６は蛍光標識プライマーの蛍光特性と分光フィルタの透過特性図であり、このようにそれぞれの蛍光標識プライマーの蛍光極大波長付近に最大透過率を有する分光フィルタ（但し、励起レーザ光の波長を透過しないようにする）を使用し、計測を行う。
【００５７】
図１７はキャピラリーアレイのうちの１本のゲルキャピラリーを泳動する試料から発する蛍光信号強度の時間波形の実測値である。上から分光フィルタ１１５ａ、ｂ、ｃ、ｄを透過した蛍光強度の時間波形である。このように１試料／１キャピラリーから４種の蛍光情報を同時に得ることができる。ただし、図１６からわかるように、蛍光標識プライマーの蛍光はブロードであり、４種の蛍光標識プライマーの蛍光が重なり合っている。そのため、図１７の波形は、単一の蛍光標識プライマーの信号ではなく複数の蛍光標識プライマーの蛍光の和として観測されている。例えば、ＩａはプライマーＴの蛍光に、プライマーＧ、プライマーＡ、プライマーＣの蛍光成分が混ざったものである。Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄについても同様である。蛍光標識プライマーの蛍光特性と分光フィルタの透過特性と検出器の感度特性を基にこれらの影響を補正すると、図１８のように上からプライマーＴ、プライマーＧ、プライマーＡ、プライマーＣ単独の蛍光強度の時間波形が得られる。これはそれぞれＴ、Ｇ、Ａ、Ｃ断片の泳動スペクトルとなり、この波形から通常の方法により、ＤＮＡの塩基配列が決定できる。
【００５８】
本実施例では、塩基配列決定を９６試料同時に行うことができ、高スループット化達成できる。具体的には、泳動速度が２００塩基／時間程度であり、全体としてスループットは、２０ｋ塩基／時間と平板ゲルを使用する従来法に比較して１０倍以上の高スループット化が達成できる。
【００５９】
また本実施例についても実施例１に関し記載した同様の効果がある。また、上記光学セルを実施例１または実施例４〜６に記載の構造の光学セルとしても上記とほぼ同様にＤＮＡの塩基配列決定のための計測をすることができ、また実施例１または実施例４〜６に関し記載した同様の効果がある。
【００６０】
また本実施例では４分割プリズムを使用したが、２分割プリズムを使用し、特開平５−１１８９９１号公報に記載の方法に従って塩基種を識別することにより、ＤＮＡの塩基配列が決定できる。
【００６１】
なお、本実施例では、実施例１と同様にキャピラリーアレイのキャピラリーはその内面をシランカップリング処理し、ゲルをキャピラリー内壁に化学的に結合させた。この処理はキャピラリー内壁全面に行なう必要はなく、一部、つまり光学セル側の端近傍のみでもよい。これによって光学セル内部のシース液へのゲルのはみ出しを同様に防ぐことができ、かつ処理が簡単になり、しかもゲルが安定に調製できる。またゲルには界面活性剤等を添加してもよい。これらのことは、先に説明した実施例１〜６についても同様に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の第１の実施例の電気泳動装置の電気泳動部及びレーザ光照射系の構成図。
【図２】本発明の第１の実施例の電気泳動装置の蛍光検出系の構成図。
【図３】本発明の第３の実施例の電気泳動装置の光照射系・検出系の部分の構成図。
【図４】本発明の第４の実施例の電気泳動装置の間隙部付近の構成図。
【図５】本発明の第５の実施例の電気泳動装置の電気泳動部の構成図。
【図６】本発明の第６の実施例の複数の溝を有する平板の斜視図。
【図７】本発明の第６の実施例の電気泳動装置の電気泳動部の蛍光セル部分を示す図。
【図８】本発明の第７の実施例で使用するキャピラリーのサブアレイの構成図。
【図９】本発明の第７の実施例で使用するキャピラリーアレイの構成図。
【図１０】本発明の第７の実施例の電気泳動装置の構成図。
【図１１】本発明の第７の実施例における試料注入部／上部電極槽の拡大断面図。
【図１２】本発明の第７の実施例の電気泳動装置における泳動電流計測・表示部の構成図。
【図１３】本発明の第７の実施例の電気泳動装置における光学セル部の近傍の構成を示す一部断面を含む説明図。
【図１４】本発明の第７の実施例の電気泳動装置における蛍光検出・色分離部の原理構成図。
【図１５】本発明の第７の実施例の電気泳動装置における２次元検出器で得られる蛍光像のイメージ図。
【図１６】本発明の第７の実施例で使用した蛍光標識プライマーの蛍光特性と分光フィルタの透過特性図。
【図１７】本発明の第７の実施例による１本のゲルキャピラリーを泳動する試料から発する蛍光信号強度の時間波形の測定データの一例を示す図。
【図１８】図１７のデータを解析して得られたＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ断片に対する時間波形。
【図１９】従来例のキャピラリー電気泳動装置の蛍光測定部の構成図。
【図２０】従来例のキャピラリー電気泳動装置のシースフローキュベットを使用した蛍光測定部の構成図。
【符号の説明】
【００６３】
１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ〜、１ｔ…キャピラリー、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ〜、２ｔ…キャピラリー、４…蛍光セル、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ〜、３ｔ…間隙部、５ａ及び５ｂ…マルチキャピラリー保持具、６…陰極側電極槽、７…陽極側電極槽、８…シース液注入口、９…四ふっ化エチレン樹脂製のチューブ、１０…シース液容器、１１…シース液、１２…直流高電圧電源、２０…アルゴンレーザ光源、２１…レーザ光、２２…レンズ、３０…蛍光、３２…干渉フィルタ、３３…レンズ、３４…二次元検出器、３５…コントローラ、３６…データ処理装置、３７…モニタ、３８…プリンタ、３９…メモリ、５０…光源、５１…モノクロメータ、５２…レンズ、５３…レンズ、５４…一次元センサ、５５…一次元センサ用のコントローラ、５６…データ処理装置、５７…モニタ、５８…プリンタ、５９…メモリ、６０…蛍光セル、６１ａ〜６１ｔ…細孔、６２…平板、６３…液溜め、６４…チューブ、６５…電極槽、７０…シール板、７１…チューブ、８０…平板、８１ａ、８１ｂ、８１ｃ、８１ｄ…溝、８４…蛍光セル、８２ａ、８２ｂ、８２ｃ、８２ｄ…キャピラリー、８３…マルチキャピラリー保持具、８５…シース液注入口、８６…チューブ、８７…シース液容器、８８…シース液、９０…キャピラリー、９０ａ、９０ｂ…キャピラリー端、９１、９２…キャピラリー保持具、９３…エリア・アレイ保持具、１０７…キャピラリーアレイ、２１４…リニア・アレイ保持具、１０１…アルゴンレーザ装置、１０２…ＹＡＧレーザ装置、１０３…光学セル、１０４…上部個別電極槽、１０４ａ、１０４ｂ〜…容器様凹み、１０５…シース液容器、１０６…下部電極槽、１０７…キャピラリーアレイ、１０７ａ、１０７ｂ〜…キャピラリー、１０８…中空のキャピラリーアレイ、１０９…ミラー、１１０…ダイクロイックミラー、１１１…アルゴンレーザ光、１１２…ＹＡＧレーザ光、１１３…レーザ光、１１４…集光レンズ、１１５ａ〜ｄ…分光フィルタ、１１６…像分割プリズム、１１７…結像レンズ、１１８…２次元検出器、１１９…データ処理ユニット、１２０…電極保持板、１２０ａ、１２０ｂ…白金電極、１２１…バルブ、１２２…チューブ、１３１…抵抗、１３２…電圧計、１３３…泳動電源、１４０…電流表示パネル、１４０ａ、１４０ｂ〜…表示ランプ、２０１…筐体、２０２、２０５…アレイガイド、２０３…シース液注入口、２０４、２０６…光学窓、２０８…端子台、２０９…白金電極、２１０…排出口、２１１…バルブ、２１２…チューブ、２１３…廃液容器、２１４…リニア・アレイ保持具、２１５…リニア・アレイ保持具、２２０…蛍光発光点、２２１ａ〜２２１ｄ…結像、２３０…シース液容器のシース液の液面、２３１…セル内に流れ込んだシース液の液面、２４０…試料、２４５、２４６…バッファー液、２５０、２５１…スペーサ、２５２、２５３…孔、２６０、２６１、２６２、２７０…端子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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