(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上の可溶性の放出性試薬を用いるアッセイのアッセイ精度を向上させる方法であって、前記試薬の放出が架橋PVAからなる遅延放出剤により遅延されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アッセイはイムノアッセイである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイは全血試料に対して行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
架橋PVAからなる遅延放出剤で被膜するか或いはそれと混合した１種類以上の可溶性の放出性試薬を表面に保持する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で使用されるセンサー装置。
【請求項５】
試料封じ込め装置である、請求項４に記載のセンサー装置。
【請求項６】
毛管充填装置である、請求項５に記載のセンサー装置。
【請求項７】
蛍光毛管充填装置である、請求項６に記載のセンサー装置。
【請求項８】
前記遅延放出剤は架橋PVAからなり、
（ａ）前記可溶性の放出性試薬を、PVAを含有する緩衝溶液に溶解し、
（ｂ）前記可溶性の放出性試薬をセンサー装置の適切な表面に微量添加し、
（ｃ）前記PVAを架橋するために架橋剤を前記可溶性の放出性試薬上に導入する各工程からなる、請求項４〜７のいずれか１項に記載のセンサー装置の作成方法。
【請求項９】
前記遅延放出剤は架橋PVAからなり、
（ａ）前記可溶性の放出性試薬を、PVAを含有する緩衝溶液に溶解し、
（ｂ）前記可溶性の放出性試薬をセンサー装置の適切な表面に微量添加し、
（ｃ）こうして微量添加された前記可溶性の放出性試薬をPVAの層で被覆し、
（ｄ）前記PVAを架橋するために架橋剤を前記可溶性の放出性試薬上に導入する各工程からなる、請求項４〜７のいずれか１項に記載のセンサー装置の作成方法。
【請求項１０】
前記遅延放出剤は架橋PVAからなり、
（ａ）前記可溶性の放出性試薬を緩衝溶液に溶解し、
（ｂ）前記可溶性の放出性試薬をセンサー装置の適切な表面に微量添加し、
（ｃ）こうして微量添加された前記可溶性の放出性試薬をPVAの層で被覆し、
（ｄ）前記PVAを架橋するために架橋剤を前記可溶性の放出性試薬上に導入する各工程からなる、請求項４〜７のいずれか１項に記載のセンサー装置の作成方法。
【請求項１１】
更に、
（ｅ）保湿剤である可溶性キャリャー材料を導入する工程を含む、請求項８〜10のいずれか１項に記載のセンサー装置の作成方法。
【請求項１２】
四ホウ酸塩溶液を用いて架橋が行なわれる、請求項８〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記四ホウ酸塩溶液は１％溶液である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
架橋PVAからなる遅延放出剤で被覆するか或いはそれと混合した１種類以上の可溶性の放出性試薬を用いるアッセイにおける遅延放出剤の使用。
【請求項１５】
前記遅延放出剤が、更に可溶性キャリヤー材料を含む、請求項14に記載のアッセイにおける遅延放出剤の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は改良アッセイ方法およびその方法に用いられる装置に関する。特に、本発明は、可溶性の放出性試薬が用いられるアッセイ方法、特にイムノアッセイに関する。
本発明による方法と装置は、ある実施例において、特異的結合アッセイ法、特にイムノアッセイ法での使用が意図されている。可溶性の放出性試薬が用いられることのあるそうした方法の具体例はEP−Ａ−0171148、WO92/09892、WO93/25892およびWO93/025908に挙げられている。
EP−Ａ−0171148に開示されたアッセイ法においてある補助試薬が用いられ、これらは放出性試薬の被膜、例えば放出性の抗原または抗体、またはそれらの誘導体の被膜の形であってもよい。アッセイ方法の内部参照を目的とする１つ以上の検量領域を有する装置が記載されているWO92/09892では、試料を装置に添加した後に可溶性試薬の溶解を数秒間遅らせるために、ポリビニルアルコール（PVA）のキャップ層の利用が開示されている。この遅延放出は、正確なアッセイを妨げる試薬の一つの領域から別の領域への流出を防止するためのものである。しかし、そのようなキャップ層の利用によって限られた有効性は得られているものの、不十分な再現性と低い感度の問題に尚も直面している。
WO92/09892に開示されたアッセイ法において、アッセイ方法の成功は試料溶液中に放出された多様な可溶性試薬の空間的な分離（すなわち非混合）に依存する。しかし、可溶性試薬を１種類だけ使用する他のアッセイ技術においては、放出された試薬の最大量がある限定された領域に確実に留まるようにして、高いアッセイの精度と感度を確保することが有利である。
さらに、WO−Ａ−93/025908（ARS  Holdings  NV）は被膜パッチの遅延放出性に一般的に言及しており、PVAをそのようなパッチの適切な材料として示唆している。しかし、架橋PVAを遅延放出剤として用いてもよいということは示唆されていない。
本発明によれば、アッセイで可溶性試薬の放出を遅らせるための代用剤を用いることによって、使用されている既存方法と比較してアッセイの精度と感度を予想以上に向上させることができる。
したがって、本発明の第一の特徴によれば、１種類以上の可溶性の放出性試薬を利用するアッセイにおいて、これらの可溶性の放出性試薬の遅延放出を達成するために架橋PVＡが使用される。
本発明のさらに別の特徴によれば、１種類以上の可溶性の放出性試薬を利用するアッセイでアッセイ精度を向上させる方法において、前記試薬の放出を架橋PVＡを用いて遅延する方法が提供される。
本技術は多様な化学的または生化学的試験法に用いることができるが、特に臨床的試験法、とりわけイムノアッセイ関連に用いられる場合が特に有用である。
さらに、本発明の別の特徴によれば、架橋PVＡで被覆されたか、またはこれに混合された１種類以上の可溶性の放出性試薬を表面に保持した上記アッセイ用のセンサー装置が提供される。
本発明の方法は多様な装置、例えば、ディップスティックまたは試験片センサー、「試料フロースルー」遠心を用いる装置または試料封じ込めを用いた装置等に適用することができる。試料封じ込め装置は本発明の方法を実施するために好ましく、さらに好ましい装置は毛管充填装置、特に蛍光毛管装置、例えばEP−Ａ−171148またはWO−90/14590に記載の種類の装置である。そのような毛管充填装置は単一で用いてもよいし、またはWO−90/1１830に記載のような適切なホルダーと組み合わせて用いてもよい。
EP−Ａ−171148に記載されているように、毛管充填装置（以下CFDとする）は典型的には狭い間隙またはキャビティにより分けられた２枚のプレート状の透明な材料、例えばガラスからなる。一方のプレートは光学的導波管として働き、装置中で行われる試験に適切な固定化試薬を保持する。WO−90/14590に記載されているように、他方の透明プレートは前記キャビティから離れたその表面上に光吸収性材料か不透明な材料の層を保持することができる。競合アッセイで用いる場合には、この固定化試薬は例えば検出しようとするリガンドに対する特異的結合パートナーであってもよく、上記プレートのうちの一方は蛍光性染料（補助試薬）で標識されたリガンド類似体からなる可溶性試薬を保持してもよい。試料が該CFDの一端に接すると、毛細管作用により上記間隙中に引き入れられ補助剤を溶解する。抗原の競合アッセイにおいては、蛍光標識した抗原類似体は導波管上に固定化した限られた数の抗体結合部位に対して抗原試料と競合する。毛細空間は狭いため（典型的には約100ミクロン）、反応は、試料マトリックス、アッセイの種類（例えばサンドイッチまたは競合イムノアッセイ）および抗体親和性によって異なるが、一般的には短時間、おそらくは５分以内で完了する。よって、競合アッセイでは、複合体形成によって導波管に間接的に結合する蛍光標識抗原の量は試料中の抗原の濃度に反比例するものとなる。サンドイッチアッセイでは、導波管は検出しようとするリガンドに対する特異的結合パートナーを保持し、上記プレートのうちの一方は蛍光性染料（補助試薬）で標識されたさらに特異的な結合パートナーからなる可溶性試薬を保持する。抗原に関するサンドイッチイムノアッセイでは、試料抗原は蛍光標識された抗体および導波管に固定化された抗体とサンドイッチ複合体を形成する。よって、サンドイッチイムノアッセイについては、複合体形成によって導波管に間接的に結合する蛍光標識抗体の量は試料中の抗原の濃度に直接に比例するものとなる。
上記のアッセイ技術において、可溶性の放出性蛍光標識試薬が瞬時には溶解せず、上記CFDの充填の間に捕捉抗体の領域から離れた装置の一端まで洗い流されることは重大である。これが起こると、非常に不正確で不十分なアッセイシグナルが得られ、意味のない結果が出てしまう。本発明の方法によれば可溶性試薬の洗い流しが確実に最小限に抑制される。
よって、本発明のさらに別の特徴によれば、単一のキャビティまたはそれぞれ試料液体を毛細管作用によりキャビティ中に引き入れることを可能とするのに十分に小さい複数のキャビティを有する特異的に反応する試薬採取試験装置が提供され、ここでキャビティの表面は、装置中で実施されるアッセイに適切な固定化試薬を保持し、上記表面は、使用の際に光透過性導波管として働きかつキャビティの壁を形成する透明な固体プレートの表面であり、キャビティ表面は放出可能な形で前記所望のアッセイのために適切な補助試薬からなる１つ以上の領域を有し、前記の補助試薬は架橋PVＡで被膜されたものか、またはこれに混合されたものである。
架橋PVAを用いて可溶性試薬の適切な遅延放出を行うには、二つの方法がある。最初の方法では、可溶性試薬が装置に微量添加される。上記試薬をPVAを含有する緩衝溶液に溶解する。次に、PVAの別の層を、プリントされた複合体上に好ましくは噴霧被覆により被覆し、その後このPVA層を好ましくは架橋剤の噴霧被覆により架橋する。第二の方法において、可溶性試薬を装置に微量添加する。試薬はPVAを含有する緩衝溶液に溶解する。次に架橋剤を好ましくは噴霧被覆により塗布して、最初の溶液中に存在するPVAを架橋する。
両方法の結果として、（可溶性試薬を被膜したか、またはそれを取り込んだ）装置の表面にPVAの架橋フィルムが形成される。アッセイ技術における利用で、必要に応じてさらに保湿剤の層を例えばスクロース／ラクトース溶液を噴霧被膜することにより塗布することができる。これは試料による装置の湿潤を助け、試料含有タイプの装置の充填を容易にし、保存の際の試薬の安定性を向上させる。
PVAを架橋するための好ましい試薬は四ホウ酸塩溶液、例えば四ホウ酸ナトリウムであるが、他の架橋剤も用いることができる。約0.5〜２％の四ホウ酸塩溶液を用いれば良好な結果が得られ、約１％の溶液を用いることにより最も良い結果が得られることがわかった。
ポリマー試薬は望ましくはpH依存性でないものが必要である。もしくは、特に血液または血清に基づくアッセイについては、ポリマー試薬はpH7と８の間で膨潤することが望ましい。尿の試料には、試料のpHにしばしばいろいろな多様性がある。pH依存性のポリマー、すなわち多様なpHレベルで膨潤するポリマーを利用すると、アッセイでpHカットオフ、すなわち所望のpH範囲を有する試料のみを選択することができる。
本発明の方法は特に抗原または抗体のアッセイ（すなわちイムノアッセイ）に適用でき、本発明の好適な実施例ではアッセイ下のリガンドは抗原であり、特異的結合パートナーは上記抗原に対する抗体からなる。しかし、本発明は抗体または抗原のアッセイに限定されるものとして理解されるべきではない。本発明の改良されたアッセイ法により検定することのできるリガンドの具体例を、それぞれの場合の適切な特異的結合パートナーとともに表１に示す。
0003578407.tif 000002
本発明の方法は非常に広い適用性を有しているが、特に、ペプチドホルモン等（例えば甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、インシュリンおよびプロラクチン）または非ペプチドホルモン（例えば、コルチゾール、エストラジオール、プロゲステロンおよびテストステロン等のステロイドホルモン、またはチロキシン（T4）およびトリヨードチロニン等の甲状腺ホルモン）を含むホルモン、タンパク質（例えば、癌胎児性抗原（CEA）および抗体、アルファフェトプロテイン（AFP）および前立腺特異抗原（PSA））、医薬（例えばジゴキシン、薬物乱用）、糖、毒素、ビタミン、ウイルス、例えばインフルエンザ、パラインフルエンザ、アデノウイルス、肝炎ウイルス、呼吸器ウイルスおよびAIDSウイルス、ウイルス様粒子または微生物をアッセイに用いることができる。
理解されるように、ここで使用される「抗体」との用語はその範囲の中に以下のものを含む。
（ａ）使用される慣用の動物、例えばヒツジ、ウサギ、ヤギまたはマウスのいずれかに由来する多様なクラスまたはサブクラスの免疫グロブリン、例えばIgG、IgA、IgM、またはIgEのいずれかのもの。
（ｂ）モノクローナル抗体。
（ｃ）未変性分子、または抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の「断片」、抗体の結合部位、即ちFc部分を欠く断片（例えばFab、Fab'、Ｆ（ab'）２）や、合成法により得られた未変性抗体または断片中の重鎖成分を結合したジスルヒド結合の還元的切断により得られた所謂「半分子」を含む断片。
（ｄ）「ヒト化抗体」等の組換えDNA技術により作られたか、又は変更された抗体。
抗体の断片の調製方法は当分野でよく知られており、ここでは説明しない。
ここで用いられる用語「抗原」は、永久に抗原性のある種（例えば、タンパク質、ペプチド、細菌、細菌断片、細胞、細胞断片およびウイルス）、および適切な条件下で抗原性となるハプテンを包含するものと理解される。
本発明の方法は通常の範囲のタイプの試料、例えば尿、血清に基づく試料および全血試料に適用できる。しかし、先行技術に対して顕著な改良が見られるのは全血試料に対してアッセイを行なう場合である。
本発明をさらによく理解するために、添付の図面を参照されたい。
図１は、本発明の一実施例による蛍光毛管装置（以下FCFDとする）の概略断面図を示す。
図２は、本発明の方法を示すために用いられるFCFDの概略断面図を示す。
図３は、本発明の一実施例による検量領域を有するFCFDの領域の例を概略的に示す。
図４は、ディップ／スティックタイプ装置の概略断面図であり、さらに本発明の一実施例による検量領域を有するそれら装置の領域の例を概略的に示す。
図３および図４において示された記号は以下のことを示す：
0003578407.tif 000003
図において、そこに示された装置は、その外部面に不透明な被膜８を有する（例えばプラスチック材料、石英、シリカまたはガラスの）透明材料で作られた上部プレート２、および透明材料から作られた下部プレート４からなり、両プレートは約1mmの厚さを有し、スペーサー手段（図示せず）を有する適切な接着剤の結合トラックによって1mm以内で離れながら、ほぼ平行な関係で互いに固定されている。図示される実施例において、このように形成されたセルキャビティ６は両末端で外界に開放されているので、液体試料が毛細管減少によってキャビティの一つの開口に引き入れられるときに、空気は他方の開口を通って流出することができる。図示される実施例において、２枚のプレートが互いに偏位している。
実施される試験に適切な試薬12のパッチが上部プレート２の内部表面上に保持される。試薬は可溶性の放出可能な形で装置内に含まれるが、その放出は本発明の方法により遅延される。
実施される試験に適切な試薬10のパッチは低部プレート４の内部表面上に保持され、前記パッチ10はプレート２のパッチ12の真下に位置する。イムノアッセイの場合、パッチ10は例えばある量の関連する固定化抗体または抗原またはハプテンを保持する。
図１に示された装置の実施例の使用操作をここで説明する。以下の記載は、標識抗原形式の競合タイプのイムノアッセイの装置の使用に関するものであるが、本発明の装置は標識抗体形式のイムノアッセイ（競合タイプとサンドイッチタイプの両方）における使用および他の種類のアッセイ（サンドイッチタイプまたは競合タイプ）または他のタイプの化学的または生化学的試験における使用にも適する。
試料液体は図１に示された矢印の方向で装置内に入る。キャビティ６が試料液体で充填された直後に、材料のパッチ12が溶解し、そこに含まれる試薬を液体中に放出する。
前述のように、パッチ12は上部プレート２上に適切な可溶性材料を用いて保持される。適切な可溶性材料は、保湿被膜、例えばスクロース系またはソルビトール系のものである。パッチ12中の試薬は、架橋PVＡで被覆されているか、またはこれに混合され、パッチ内の試薬を遅延放出する。本発明による適切な被膜は典型的には試料液体との最初の接触後２〜10秒で溶解する。
抗原に対する競合タイプのイムノアッセイのために準備された図１に示された種類の装置の一実施例において、パッチ12は蛍光標識抗原類似体を含有してもよい。パッチ10は、アッセイ下の抗原に対する特異抗体である、ある量の固定化された特異結合パートナーからなる。よって、試料液体の導入後、パッチ12は溶解して抗原類似体を試料溶液中に放出する。試料溶液中に導入された抗原は、パッチ10に含まれる抗原に対する特異抗体のエピトープ結合部位について抗原類似体と競合する。したがって、パッチ10中に固定化された特異抗体に結合する蛍光材料の量は試料液体中の抗原の濃度の関数となる。慣用の競合タイプの光学的イムノアッセイがこの種の競合的平衡を伴う。
パッチ12の試薬の遅延放出によって、装置が充填した後にパッチ10と12により結合された領域に最大量の蛍光材料が確実に留まり、上記試薬の流出をこのように最小化することによってアッセイ精度と感度を増加できる。
図２において、図示される装置はアッセイ法に用いられるものではないが、本発明の有効性を実証することを目的としている。この装置は、パッチ12がパッチ10に対して偏位配置されたこと以外は図１に示されたものと基本的に同じである。よって、アッセイ法に使用するには、装置に試料を充填してアッセイを行なう際に、パッチ10中で結合する蛍光標識試薬の量がパッチ12からの試薬流出の測定値となる。公知の遅延技術を利用するような既存のアッセイを本発明によるものと比較することにより、本発明による改良点を示すことができる。
図３に示される装置は、図１の装置のように上部プレート２と下部プレート４とからなる。パッチ12がプレート２の内部表面に保持され、パッチ10がプレート４の内部表面に保持されており、これらのパッチおよびそれらに含まれる試薬は図１を参照して既に記載した通りである。図示されるようにプレート２と４に保持されたパッチ９と13は検量領域からなる。使用されるときパッチ12と13中の試薬の放出が本発明の方法により遅延される。使用には、一対のパッチ９と13により規定された領域で、パッチ13からの複合体がパッチ９の固定化試薬へ結合するために最初の高いシグナルが領域９から起こる。このシグナルは、リガンドがパッチ９中の複合体の標識リガンド類似体と競合するにしたがって時間とともに減少する。パッチ12と13からの試薬の遅延放出によって、最大量の各試薬が一対のパッチ10と12および一対のパッチ９と13により規定された領域中に確実に放出される。パッチ13から隣接領域への試薬の最小量の流出が起こる。これらの要因によってアッセイの精度と感度は最大化する。
図４に示す装置は図１に示す装置におけるような下部プレート４のみからなる。実施される試験に適切な試薬のパッチを含有する領域10がプレート４の表面に保持されている。イムノアッセイの場合、前記領域は、例えばアッセイ下のリガンドの第一エピトープに対するある量の未標識の関連固定化抗体と、アッセイ下のリガンドの第二エピトープに対するある量の標識抗体とを有するものとし、標識された抗体は可溶性の放出可能な形で存在するが、使用される試薬の放出は本発明の方法により遅延される。また、実施される試験に適切な試薬のパッチを含有する検量領域９をプレート４の表面に保持する。イムノアッセイの場合、上記領域は、例えば、アッセイ下のリガンドの第一エピトープに対するある量の未標識の関連固定化抗体と、アッセイ下のリガンドの第二エピトープに対するある量の標識抗体と、アッセイ下のある量の抗原とを、アッセイの操作下で上記抗原と上記２抗体間で1:1:1の複合体を形成するように有するものとし、アッセイ下の上記標識抗体と上記抗原は溶解性の放出可能な形で存在するが、使用される試薬の放出は本発明の方法により遅延される。
図４に示す装置の実施例を使用する際の操作をここで説明する。試薬の具体例と以下の記載とは、標識抗体形式のサンドイッチタイプのイムノアッセイにおける装置の使用に関するものであるが、本装置は標識抗原形式のイムノアッセイおよび他の種類のアッセイ（競合タイプ）または他の種類の化学的または生化学的試験においても適することを理解されたい。
本装置は試験液中に浸し、その直後にパッチ９と10中の可溶性試薬が溶解する。本発明によるこれら試薬の遅延放出によって、上記試薬はほぼ示された領域内に確実に留まる。よって、領域10はアッセイ測定を提供し、領域９は初期の高いシグナルを有する検量領域を提供する。可溶性試薬がこれら領域間を限定されて移動することで、アッセイの精度と感度は最大化する。
以下の実施例は本発明の方法の適用性を具体的に説明するためのものであって、本方法を限定するものではない。
比較例１
出発材料の調製：
1.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
抗PSAモノクローナル抗体はスイスのCoinsins所在のSerono  Diagnostics  SAにより供給されたものである。約1mmの厚さを有するPermablocガラス（英国、St.Helens所在のPilkington  Glass社）を超純水中、界面活性剤（例えばTween  20）を用いて超音波撹拌で清浄した。ガラスの表面を、アミノプロピルトリメトキシシランの２％水溶液（pH3〜４）中で２時間75℃でインキュベートすることにより活性化した。水で濯いだ後にこのガラスシートを115℃で４時間以上乾燥した。次に、このガラスを0.05Mリン酸緩衝液（pH7）中の2.5％グルタルアルデヒド溶液中で60分間インキュベートし、次に蒸留水で完全に洗浄した。リン酸緩衝液（pH7）中の１％の抗PSA抗体溶液をガラス上に分離するように加えて、２〜４時間インキュベート（パッチ10を形成）することにより上記ガラス上に上記抗体の模様を付けた後、上記ガラスシートを緩衝溶液で洗浄した。不要な吸着タンパク質を公知の方法により6M尿素溶液に浸すことで除去した。最後に、スクロース／ラクトースの層をスピンコーティングによりガラスシートの表面に形成した。こうして図１に示すFCFD試験装置のプレート４を形成した。
1.2.アロフィコシアニン（APC）に複合させた抗PSA抗体の調製：
上記の1.1に用いられた抗体に対するPSA分子上の異なるエピトープを認識する第二抗PSAモノクローナル抗体はMolecular  Probes社（米国オレゴン州ユージーン）によってアロフィコシアニン（λex＝650nm,λex＝660nm）に複合されそのままの状態で用いた。
1.3.抗PSA抗体の分離領域にわたる特異試薬の微量添加：
不透明な被膜を、PCT/GB90/00764に記載のようにPermablocガラスの清潔なシート上にスクリーン印刷した。装置の測定領域を、３×7mm域でポリビニルアルコールを含有する緩衝液中のアルフィコシアニン／抗PSA抗体複合体の層を上記領域にわたってガラス上に微量添加することにより作成した。上記複合体を風乾した後に、ポリビニルアルコール（緩衝液中４％）の層を複合体にわたって微量添加した（パッチ12の形成）。最後に、ガラスの全シートをスクロース／ラクトースの層に噴霧被覆により塗布した。こうして図１に示すようなFCFD試験装置のプレート２を形成した。
1.4.FCFD試験装置の作成：
EP−Ａ−0171148に記載されるようなFCFD試験装置は、毛管セル装置の長いへりを定めるパターンで、100μｍ直径のガラス微小球（英国のJencons社）を含有する紫外線硬化性接着剤（米国、Norland社のUVS91）の結合トラックを上記1.1の導波管上へスクリーン印刷することによって作成した。上記の1.3で定義されたようなガラスシートを導波管上に配置し、この積層物を真空下においた。真空とした結果、ガラスの上部シートが接着剤上にプレスされ、これらのガラス微小球はガラスシート間で100μｍの間隙を形作った。次に、この積層物を紫外光源にさらして接着剤を硬化した。最後に、この積層シートをEP−Ａ−0171148に記載のようにばらばらにして個々の試験装置とした。
1.5.PSAアッセイの測定に用いられる装置：
WO92/09892に記載のような単純な蛍光測定用装置を用いて、PCT/GB90/00764に記載のように適切なアッセイ測定を行なった。
PSAのアッセイ法：
量の知られているPSAを含有するヘパリン化全血試料をFCFD装置に加え、室温で20分間インキュベートした。６つのFCFDを用いて「減少」標準曲線（すなわち、０、10および100ng/mLのPSA）を、PSAの同濃度で充填した一対の装置で作った。表１に示されたデータは不十分な標準曲線が得られたことを示し、一対のFCFD装置間に低いトップシグナルと不十分な再現性が存在した。これは、全血試料が装置に入り、そして「瞬時に」アロフィコシアニン／抗PSA抗体複合体を溶解し、捕捉抗体が配置されている領域から離れてFCFDの長さを移動することにより引き起こされるものである。
比較例２
遅延放出化学を用いず、微量添加のアッセイ試薬を有さないPSAに関するFCFD全血アッセイ
2.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
例１と同じである。
2.2.アロフィコシアニン（APC）に複合させた抗PSA抗体の調製：
例１と同じである。
2.3.FCFD試験装置の作成：
実施例１と同じである。
2.4.PSAアッセイ測定に用いられる装置：
例１と同じである。
PSAに関するアッセイ法：
等量のアロフィコシアニン／抗PSA抗体を、PSAを含有する全血試料と混合し、FCFDに添加した。アッセイを実施例１と同じ方法で読んだ。データはFCFD全血血液アッセイについて良好な投与量／応答曲線が存在することを示している（表３）。
例３
3.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
例１と同じである。
3.2.アロフィコシアニン（APC）に複合させた抗PSAの調製：
例１と同じである。
3.3.抗PSA抗体の分離領域にわたる特異試薬の微量添加：
抗体を微量添加した後、Eudragit  NE  30D（Rohm  Pharma,ドイツ）を上記複合体の先端に噴霧被覆した以外は例１と同じである。
3.4.FCFD試験装置の作成：
例１と同じである。
3.5.PSAアッセイ測定に用いられる装置：
例１と同じである。
PSAに関するアッセイ法：
Eudragitの存在のために、抗体／フルオロフォア複合体の溶解が試料がFCFDを充填するまで遅延された以外は例１と同じである。この結果、PSAアッセイはリプリケート間でさらに良い精度を示し、さらに高いトップシグナルを示した。
例４
4.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
例１と同じである。
4.2.アロフィコシアニン（APC）に複合させた抗PSAの調製：
例１と同じである。
4.3.抗PSA抗体の分離領域にわたる特異的試薬の微量添加：
抗体を微量添加した後、0.24％の四ホウ酸塩水溶液を複合体の末端に噴霧被覆して微量添加の溶液中に存在するポリビニルアルコールを架橋したこと以外は例１と同じである。
4.4.FCFD試験装置の作成：
例１と同じである。
4.5.PSAアッセイ測定に用いられる装置：
例１と同じである。
PSAに関するアッセイ法：
架橋ポリビニルアルコールの存在のために、抗体／フルオロフォア複合体の溶解が試料がFCFDを充填するまで遅延された以外は例１と同じである。この結果、PSAアッセイはリプリケート間で更に良い精度を示し、更に高いトップシグナルを示した（表４）。
例５
四ホウ酸塩濃度の最適化：
5.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
例１と同じである。
5.2.アロファコシアニン（APC）に複合させた抗PSA抗体の調製：
例１と同じである。
5.3.抗PSA抗体の分離領域にわたる特異的試薬の微量添加：
抗体を微量添加した後、四ホウ酸塩の異なる濃度の水溶液を複合体の末端に噴霧被覆して微量添加の溶液中に存在するポリビニルアルコールを架橋したこと以外は例１と同じである。
5.4.FCFD試験装置の作成：
例１と同じである。
5.5.PSAアッセイ測定に用いられる装置：
例１と同じである。
PSAに関するアッセイ法：
架橋ポリビニルアルコールの存在のために、抗体／フルオロホア複合体の溶解が試料がFCFDを充填するまで遅延された以外は例１と同じである。最適遅延放出は１％の四ホウ酸塩により得られた（表５）。
表５の数字は、0.5％の四ホウ酸塩を用いるとさらに高いトップシグナル／バックグラウンドシグナルの比率が得られることを示唆するが、アッセイを繰り返すと１％の四ホウ酸塩を用いる場合に見られるような再現性は得られなかった。従って１％の四ホウ酸塩を用いるとより良好なアッセイ精度が得られた。
実施例６
公知の方法と本発明による遅延された放出方法を用いるPSAに関するFCFD全血アッセイ
6.1.抗体被膜の光学的導波管の作成：
捕捉抗体を一定範囲にわたって固定化して図２に示すように装置のパッチ10を形成した以外は例１と同じである。
6.2.アロフィコシアニン（APC）に複合された抗PSA抗体の調製：
例１と同じである。
6.3.抗PSA抗体の分離領域にわたる特異的試薬の微量添加：
特異的試薬をある範囲に微量添加して図２に示すように装置のパッチ12を形成した以外は例１と同じである。試薬の微量添加後に一部の装置は四ホウ酸塩で処理したが、他のものは処理しなかった。
6.４.FCFD試験装置の作成：
例１と同じである。
6.５.PSAアッセイ測定に用いられる装置：
例１と同じである。
PSAに関するアッセイ法：
PSAを含有する全血試料をFCFDに加え、領域1Cからのアッセイシグナルを読んだ。公知のPVAキャップ層のみが存在している場合、事実上FCFD内に遅延放出がなく、可溶性試薬が装置から洗い流されて、PSAアッセイの投与量／応答曲線が得られる（表７）。本発明の遅延放出方法がFCFDに用いられた場合、装置から洗い流される試薬の量は少なくなり、大幅に減少した投与量／応答曲線が得られる（表７）。
表６の50ng/mlのPSA濃度での8.580の数字は、PVAキャップ層を単純に含有する既存の技術の不正確さを示す。同様に、そのような方法におけるアッセイ曲線は斜めとなる（すなわち大きなバックグラウンドシグナルを示す）傾向がある。
上記の例において異なる複合体が多様な例に用いられ、複合体の品質、つまり最大シグナルが異なることに注意されたい。一部の例は低い色の純度を有する複合体を用い、他のものは高い色の純度を有する複合体を用いた。よって、アッセイで得られるトップシグナルの直接の比較は通常はこれらの例の間で行なうべきではない。そうした比較には異なる純度という要素が考慮されないためである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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