(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量１ｋDa〜３０ｋDaのタンパク質及び分子量８０ｋDa〜２００ｋDaのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする消化性潰瘍抑制組成物。
【請求項２】
前記消化性潰瘍抑制組成物を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌に由来する消化性潰瘍等を抑制する組成物及びそれを含有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）や慢性胃炎の発病や再発に深く関与している病原菌として、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌、特にヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、以下ピロリ菌という）が知られている。
【０００３】
しかし、ピロリ菌は高い確率で多くの人の胃の中に存在しているものの、ピロリ菌が存在する人でも健常人がいることから、近年、ピロリ菌の存在が必ずしも消化性潰瘍等につながるものではなく、ピロリ菌により胃潰瘍を発症するのはある特定の菌株が有する細胞障害因子が原因ではないかと考えられている。
【０００４】
現在、ピロリ菌による炎症、潰瘍等の細胞障害と直接的な関わりが考えられているのは、空砲化毒素（分子量８７ｋＤａ、以下Ｖａｃ  Ａという）と毒素随伴タンパク（分子量１０５ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、以下Ｃａｇ  Ａという）である。そして、これらのＶａｃ  Ａ及びＣａｇ  Ａはピロリ菌の分離菌株であっても存在する株と存在しない株があることも実証されている（ＳｈａｒｍａＳＡ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３；  １６８１−１６８７，  １９９５）。実際に、ピロリ菌保有患者の血清抗体として、サイトトキシン（１２８ｋＤａ）とＶａｃ  Ａに対する血清抗体は、全ての患者から検出されるのではなく、消化性潰瘍などの特殊な病態で高率に陽性になることが報告されており、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験でも上記毒素により細胞が空砲化する現象が確認されている（Ｌｅｕｎｋ  ＲＤｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：  ９３−９９，  １９８８）。
【０００５】
更に、Ｃａｇ  Ａに対する血清抗体陽性率は、胃炎患者で６０〜６３％、胃潰瘍患者では８０〜１００％となっており、Ｃａｇ  Ａも胃潰瘍と深い関連のある毒素ではないかと考えられている。
【０００６】
又ピロリ菌の超音波破砕上清中には低分子タンパクである熱ショックタンパク（ＨＳＰ、分子量２５ｋＤａ〜３０ｋＤａ）があることが知られているが、本タンパクがもつ生物学的意義については未だ解明が進んでいない。
一方、ピロリ菌による消化性潰瘍等の予防及び治療方法として、例えば以下のような方法が提案されている。
【０００７】
▲１▼特開平４−２７５２３２号公報には、ピロリ菌の全菌体を抗原とした卵黄由来の抗体を含有する食品を用いることにより、ピロリ菌感染の予防方法が開示されている。
【０００８】
▲２▼特開平１０−２８７５８５号公報及び特開平１１−８０１９７号公報には、ピロリ菌に特異的なウレアーゼ（分子量３２ｋＤａ、６０ｋＤａ）や鞭毛（分子量５３ｋＤａ、５４ｋＤａ）を抗原とした卵黄由来の抗体を含有する食品を用いることにより、ピロリ菌の胃での付着を阻止する物質が開示されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ヒトの場合、通常、ピロリ菌は胃粘膜細胞の奥深くまで入り込んで定着するため、完全除菌は抗生物質等の薬剤でも難しいと言われている。したがって、実際の消化性潰瘍患者を考えた場合、上記の公報に開示された、単にピロリ菌の付着阻害による予防・治療法では、効果的にピロリ菌の除菌や、炎症を抑制できるとは決して言い難い。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ピロリ菌による消化性潰瘍をより効果的に抑制する組成物及びそれを含有する飲食品を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の消化性潰瘍抑制組成物は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の飲食品は、前記消化性潰瘍抑制組成物を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明によれば、経口摂取することによりピロリ菌による消化性潰瘍を効果的に抑制できる組成物及び飲食品を提供できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の消化性潰瘍組成物は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵の抽出物を有効成分として含有する。
【００１５】
上記ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌としては、特に限定するものではないが、好ましくはサイトトキシンを生産する株であるヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター  シネジ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター  フェネリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ）、ヘリコバクター   ハイルマニー（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｉｌｍａｎｉｉ）、ヘリコバクター  ラッピニ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｒａｐｐｉｎｉ）、ヘリコバクター  フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｅｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１６】
また、上記の分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａ及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質は、例えば以下のような方法で菌体から調製できる。
【００１７】
サイトトキシンを生産するピロリ菌株を常法にしたがって培養し、菌体の不活性化処理を行う。この菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波破砕機等により破砕した後、菌体を可溶化する。好ましくは、緩衝液にグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４）を用いて菌体を可溶化する。この溶液を遠心して可溶化抽出溶液を回収し、ゲル濾過等により、目的の分子量の画分を分取し、必要に応じて凍結乾燥する。
【００１８】
なお、上記の分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質は、その分子量から判断するとＶａｃ Ａ及びＣａｇ Ａを含むと考えられ、又上記の分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質についてはＨＳＰを含むと考えられる。
【００１９】
上記のようにして調製したタンパク質を鶏に免疫する方法としては、例えばＭａｋｏｔｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.，５６（２）:２７０−２７４， １９９２に記載された方法等を採用できる。なお、本発明においては、上記タンパク質を免疫原として用いる際には、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質と、分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質とをタンパク質当たり１対１で混ぜて用いることが好ましく、より好ましくは、分子量２０ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質と、分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質とを１対１で混ぜて用いることが好ましい。
【００２０】
また、抗原を免疫された鶏が生産した卵から抗体を調製する方法としては、卵から卵黄液を分離し、得られた卵黄液を粉末化した後、その粉末をエタノールによって脱脂した粉末中から緩衝液を用いて抽出することにより調製できる。なお、上記免疫卵をそのまま消化性潰瘍抑制組成物として用いることもできる。
【００２１】
本発明の消化性潰瘍抑制組成物の１日当たりの有効摂取量は、上記抗体換算で好ましくは１〜１０，０００ｍｇであり、より好ましくは１〜１００ｍｇである。該摂取量が抗体換算で１ｍｇ未満であると消化性潰瘍抑制効果が期待できず、１０，０００ｍｇ超であるとハンドリングの面等で問題を生じる。
【００２２】
また、本発明の消化性潰瘍抑制組成物の形態としては、特に制限はなく、例えば錠剤、カプセル剤、溶液、粉末、顆粒等が挙げられる。
【００２３】
本発明の飲食品は、上記消化性潰瘍抑制組成物を０．０１〜１０ｇ（抗体換算で１〜１０００ｍｇ）含むことが好ましく、０．０１〜０．１ｇ（抗体換算で１〜１００ｍｇ）含むことがより好ましい。
【００２４】
上記飲食品としては、特に制限はなく、例えば清涼飲料、ヨーグルト、錠菓、チョコレート、ガム、錠剤等が挙げられる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
▲１▼抗原の調製
胃潰瘍患者からヘリコバクター・ピロリ株を分離し、サイトトキシンを生産する株であることを確認した後、７％（ｖ／ｖ）馬脱繊維血液を含むＳｋｉｒｒｏｗの寒天培地で３７℃、４日間培養した（１０％ＣＯ２、１０％空気、加湿）。
【００２７】
次いで、コロニーをかきとり、生理食塩水に懸濁し、この懸濁液に０．５％（ｖ／ｖ）となるようにホルマリンを加え、室温１８時間放置して菌体の不活化処理を行った。
【００２８】
次いで、菌体を３，０００×ｇ、１０分間の遠心分離で集め、生理食塩水で３回洗浄した。菌体を１×１０８ＣＦＵ／ｍｌになるよう生理食塩水に分散させ、抗原液Ａとした。
【００２９】
特開平１０−２８７５８５号公報に記載された方法によりウレアーゼを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてウレアーゼＡ（３２ｋＤａ）とウレアーゼＢ（６０ｋＤａ）を確認した後、タンパク含量として１．０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶液を調製し、抗原液Ｂとした。
【００３０】
更に、抗原液Ａをグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４）に懸濁して超音波破砕機により破砕した後、菌体を可溶化（３７℃×２時間）した。この可溶化抽出溶液と不溶部分を遠心（８，０００ｒｐｍ×２０分）した後、ゲル濾過（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００，５００×８．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，  ＹＭＣ）により、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク液を分取し、凍結乾燥してそれぞれ粉末を得た。
【００３１】
得られた菌体抽出タンパク質をタンパク含量として１．０ｍｇ／ｍｌとなるように溶液を調製し、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク液を抗原液Ｃ、８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク液を抗原液Ｄ、両方をタンパク質含量として１対１で含む抗原液Ｅとした。
【００３２】
▲２▼免疫卵黄の調製
産卵鶏（ホワイトレグホン）を５群に分け、上記５種類の抗原液（抗原液Ａ、抗原液Ｂ、抗原液Ｃ、抗原液Ｄ、抗原液Ｅ）を１羽当たり１ｍｌ筋肉注射した。初回免疫後、１週毎に各群から集めた鶏卵から卵黄を分離し、週毎の特異抗体価を測定した。
【００３３】
鶏卵卵黄中の特異抗体価の測定は、週毎に集められた各卵黄液を２，０００倍希釈して酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法という）により行った。週毎の特異抗体価が下がってきた頃合を見計らって、実施例１で得られた５種類の抗原液を用いて追加免疫を行った。
【００３４】
追加免疫後も上記と同様のＥＬＩＳＡ法により特異抗体価を測定し、抗体価が安定した時から鶏卵を採取し、これを免疫卵とした。
【００３５】
各免疫卵１ｋｇをホモミキサーで均質化した後、噴霧乾燥して粉末を調製し、卵黄粉末（抗体含有卵黄粉末）を得た。上記の各抗体含有卵黄粉末４７０ｇに、エタノールを５倍量添加して脱脂を行い、脂質が１％以下になるよう脱脂を繰り返し行った。得られた脱脂卵黄粉末にＰＢＳバッファーを加えて卵黄水溶性タンパク質を抽出し、抽出溶液を凍結乾燥して粉末化し、抗体粉末Ａ（抗原液Ａの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｂ（抗原液Ｂの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｃ（抗原液Ｃの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｄ（抗原液Ｄの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｅ（抗原液Ｅの免疫卵から得られた粉末）を得た。更に、市販の卵を使用し、上記と同様の方法を用いて得られた粉末をコントロール粉末とした。
【００３６】
▲３▼細胞障害因子に対する抗体活性の評価
ＥＬＩＳＡの固相化抗原を、▲１▼ピロリ菌の全菌体、▲２▼ウレアーゼ、▲３▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａの菌体抽出タンパク質、▲４▼８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク質、及び▲５▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａ及び８０ｋＤａ〜２００ｋＤａ（１：１）の菌体抽出タンパク質ミックスとし、コーティングを行った。
【００３７】
上記抗体粉末Ａ〜Ｅ及びコントロール粉末を１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、倍々希釈を１０回行い、ＥＬＩＳＡ法にて分析を行い、同じ発色値での濃度を、コントロール粉末と比較して何倍になるかを求め、その倍数を特異抗体価として評価した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0003597784.tif 000002
【００３９】
表１から、抗体粉末Ｅに含まれる抗体は、全菌体にも若干反応するものの、特に分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク質に対して高い特異抗体価を示すことが分かる。また、抗体粉末Ｃに含まれる抗体は、▲３▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａの菌体抽出タンパク質に対する特異抗体価が比較的低いことから、該菌体抽出タンパク質は抗原性が弱いことが分かる。また、抗体粉末Ｅに含まれる抗体はウレアーゼ抗原とは反応しないことが分かる。
【００４０】
実施例２（細胞空砲化抑制効果試験）
ＨｅＬａ細胞を用いて、ピロリ菌が有する毒素による空砲化試験を以下のようにして行なった。
【００４１】
イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ製）９．４ｇを蒸留水に溶解して全量を１，０００ｍｌとした。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で完全滅菌し、室温まで冷却した後、滅菌済み１０％炭酸水素ナトリウム水溶液を１５ｍｌ加えた。そして、使用前に濾過滅菌したＬ−グルタミン０．２９２ｇ及び牛胎児血清を加えて調製し、ＨｅＬａ細胞の培養液として用いた。
【００４２】
実験は極力継代が少ないもので行い、細胞の状態を確認した後、カウンターにより細胞が１０３個になるように、８穴の滅菌プレートにアプライした。
【００４３】
そして、▲１▼滅菌生理食塩水（ネガティブコントロール）、▲２▼実施例１に記載のピロリ菌培養液を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１０分間）した上清（ポジティブコントロール）を添加した。このポジティブコントロールによる細胞空砲化を確認した後、上記▲２▼に実施例１で得られた抗体粉末Ａ〜Ｅを０．０１、０．１、０．５、１％になるように添加した各溶液を０．１ｍｌずつ添加し、２４時間後の細胞の様子を顕微鏡にて観察した。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0003597784.tif 000003
【００４５】
表２から、抗体粉末Ｃは細胞の空砲化現象をほとんど抑制しないが、抗体粉末Ｄは細胞の空砲化現象を抑制することが分かる。特に、両方の抗体を含有する抗体粉末Ｅは劇的に細胞の空砲化現象を抑制することが分かる。
【００４６】
実施例３（マウスによる除菌効果試験）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、８週齢）を使用し、本消化性潰瘍抑制組成物による除菌試験を実施した。
【００４７】
上記マウスに、実施例１で分離されたピロリ菌株（１×１０９個）を経口投与し、１週間後、試験群の一部を屠殺して胃内のピロリ菌数を測定してピロリ菌が定着していることを確認した。その後、試験動物を６群（１群１０匹）に分け、下記の飼料を与えた（自由摂取）。
【００４８】
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗体粉末Ａ（０．０１％、０．１％、１％）
３群：通常飼料＋抗体粉末Ｂ（０．０１％、０．１％、１％）
４群：通常飼料＋抗体粉末Ｃ（０．０１％、０．１％、１％）
５群：通常飼料＋抗体粉末Ｄ（０．０１％、０．１％、１％）
６群：通常飼料＋抗体粉末Ｅ（０．０１％、０．１％、１％）
【００４９】
上記飼料で２ヶ月間飼育した後、開腹し、胃内のピロリ菌の数を測定した。その結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
0003597784.tif 000004
【００５１】
表３から、抗体粉末Ｅを投与した群は、意外にも抗体粉末Ｂを投与した群とほぼ同程度の高い除菌効果が得られることが分かる。
【００５２】
実施例４（スナネズミによる炎症および潰瘍抑制効果試験）
スナネズミはピロリ菌が感染（胃粘膜細胞奥深くまで定着）し、４〜６ヵ月後に非常に高い確率で出血を伴う重度の炎症（胃潰瘍）を発症するモデル動物として認知され、本状態が、実際ヒトでの胃潰瘍患者と状況が似ていると言われている。
【００５３】
本モデル動物を用い、実施例１で分離されたピロリ菌株を１×１０９個投与し４ヵ月後、試験群の一部を屠殺し、胃を開腹して胃内の潰瘍状態を確認した。屠殺した試験動物全てにおいて出血を伴う潰瘍を確認した後、試験動物を６群（１群８匹）に分け、下記の飼料を与えた（自由摂取）。
【００５４】
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗体粉末Ａ（０．０１％、０．１％、１％）
３群：通常飼料＋抗体粉末Ｂ（０．０１％、０．１％、１％）
４群：通常飼料＋抗体粉末Ｃ（０．０１％、０．１％、１％）
５群：通常飼料＋抗体粉末Ｄ（０．０１％、０．１％、１％）
６群：通常飼料＋抗体粉末Ｅ（０．０１％、０．１％、１％）
【００５５】
上記の飼料で２ヶ月間飼育した後、開腹して胃内のピロリ菌の数、及び胃炎・出血を伴う潰瘍の状況を以下の５つの評価基準で点数化して８匹の平均点を求めた。
【００５６】
０：症状なし
１：赤くはれ上がっている（１箇所）
２：赤くはれ上がっている（２箇所）
３：赤くはれ上がっている（３箇所以上）
４：出血が認められる（１箇所）
５：出血が無数認められる（２箇所以上）
その結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
0003597784.tif 000005
【００５８】
表４から、抗体粉末Ｂ及び抗体粉末Ｅを投与した群は、抗体粉末Ａを投与した群に比べて高い除菌効果が得られているものの、どの群も実施例３のような完全除菌に近い状態には至っていないことが分かる。
【００５９】
また、炎症状態は、抗体粉末Ａ及び抗体粉末Ｂを投与した群においてはほとんど回復しておらず、抗体粉末Ｃ及び抗体粉末Ｄを投与した群においてもやや回復傾向が見られるにとどまっている。一方、抗体粉末Ｅを投与した群においては著しい炎症回復効果が認められることが分かる。本結果から、今回初めてＶａｃ  Ａ及びＣａｇ  Ａを含むタンパクの抗体とＨＳＰを含むタンパクの抗体を合わせることで驚くべき抗炎症効果が得られることが分かる。
【００６０】
実施例５
以下、本発明の消化性潰瘍抑制組成物を含有する飲食品の処方例を挙げる。
【００６１】
（１）ヨーグルトの処方例
牛乳                                    ９６％
脱脂粉乳                              ０．５％
本発明の消化性潰瘍抑制組成物              ３％
水                                    ０．５％
【００６２】
（２）顆粒粉末の処方例
牛乳                                    ５０％
卵                                      ４０％
砂糖                                    １０％
本発明の消化性潰瘍抑制組成物              ３％
【００６３】
（３）胃炎、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍予防タブレットの処方例
本発明の消化性潰瘍抑制組成物              ３％
デキストリン                            ７０％
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、有効成分として、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体と分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を合わせたことにより、驚くべき抗炎症効果を得ることができた。故に、本抗体を含有させることで、経口摂取することによりピロリ菌による消化性潰瘍を効果的に抑制できる組成物及び飲食品を提供できる。