(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すＤＮＡ配列を含むＤＮＡ、またはストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡにハイブリダイズしかつビオチン生合成酵素をコードする枯草菌由来のＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡがbioA、bioB、bioD、bioF、bioW、bioIおよびORF2からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列のうち少なくとも２つを含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
バシラス属菌種のビオチンオペロンの調節部位を含み、該調節部位は野生型ＤＮＡに対して変異させてあり、該調節部位がオペレーター、プロモーター、転写終結部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソーム結合部位および異化代謝産物抑制部位よりなる群から選択され、該変異が挿入、置換または欠失のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターまたは１コピーもしくは複数コピーの請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む細胞。
【請求項７】
前記細胞が、前記ＤＮＡの存在に加えて、アゼライン酸耐性を付与する変異またはbirA遺伝子の変異のようなビオチンまたはビオチン前駆体の生産を調節解除する変異により特徴づけられる、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記ＤＮＡを欠く野生型細胞と比較して、増加した量のビオチンを産生する、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・プミルス(Bacillus pumilus)、バシラス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、バシラス・チュリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)および大腸菌(Escherichia coli)から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされる組換えタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１のヌクレオチド1208-2554 (bioA)、配列番号１のヌクレオチド4408-5415 (bioB)、配列番号１のヌクレオチド3710-4405 (bioD)、配列番号１のヌクレオチド2544-3713 (bioF)、配列番号１のヌクレオチド439-1218 (bioW)、配列番号１のヌクレオチド5484-6671 (bioI)、および配列番号１のヌクレオチド6748-7509 (orf2)からなる群より選択されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。
【請求項１２】
(a) bioA (配列番号１のヌクレオチド1208-2554)、bioB (配列番号１のヌクレオチド4408-5415)、bioD (配列番号１のヌクレオチド3710-4405)、bioF (配列番号１のヌクレオチド2544-3713)、bioW (配列番号１のヌクレオチド439-1218)、bioI (配列番号１のヌクレオチド5484-6671)、およびorf2 (配列番号１のヌクレオチド6748-7509) からなる群より選択される遺伝子、または、
(b) ストリンジェントな条件下で(a)に記載の遺伝子もしくは(a)に記載の遺伝子の相補体とハイブリダイズしかつビオチン生合成酵素をコードする枯草菌由来のポリヌクレオチド、
によりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
(a) 請求項６〜９のいずれか１項に記載の細胞を用意すること；
(b) ビオチンまたはその前駆体の合成を可能にする時間および条件のもとで該細胞を培養すること；そして
(c) ビオチンまたはその前駆体を単離すること；
を含むビオチンまたはその前駆体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子工学的に操作された生物を使ってビオチンを生産することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビオチン（ビタミンＢ８  またはビタミンＨ）はカルボキシル化反応と脱炭酸反応の補酵素であって、生細胞にとっては不可欠な代謝産物である。高等な生物は外因生のビオチンを必要とするが、多くのバクテリアは自己のビオチンを合成する。
【０００３】
ピメリル−ＣｏＡ（ＰｍＣｏＡ）からビオチンへのビオチン合成経路に関与する酵素的段階は大腸菌  （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  とバシラス・スファエリカス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）において解明されている〔図１；Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｏ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，  Ｈｏｃｈ，  ａｎｄ  Ｌｏｓｉｃｋ編集，  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ３２５−３２９  （１９９３）を参照〕。これらの段階は、１）７−ＫＡＰシンセターゼ（ｂｉｏＦ）によるピメリル−ＣｏＡの７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（７−ＫＡＰまたはＫＡＰＡ）への転化；２）ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）による７−ＫＡＰの７，８−ジアミノ−ペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）への転化；３）ＤＴＢシンセターゼ（ｂｉｏＤ）によるＤＡＰＡのデスチオビオチン（ＤＴＢ）への転化；および４）ビオチンシンセターゼ（ｂｉｏＢ）によるＤＴＢのビオチンへの転化を含んでいる。報告によれば、ＰｍＣｏＡの合成は微生物ごとに異なる酵素的段階を必要とする。ピメリル−ＣｏＡの合成に先行する段階に関与する大腸菌遺伝子としては、ｂｉｏＣ〔Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３，  １９５７７−１９５８５  （１９８８）  〕とｂｉｏＨ〔Ｏ’Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７，  ８００４  （１９８９）〕がある。Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  では、２つの異なる遺伝子ｂｉｏＸとｂｉｏＷがＰｍＣｏＡの合成に関与していると考えられる。ｂｉｏＸはピメレートの生合成に関与していると考えられ〔Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ８７，  ６３−７０  （１９９０）  〕、そしてｂｉｏＷはピメリン酸（ＰｍＡ）をＰｍＣｏＡに転化するピメリル−ＣｏＡシンセターゼをコードすることが明らかにされた〔Ｐｌｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２８７，  ６８５−６９０  （１９９２）  〕。Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  の遺伝子ｂｉｏＸとｂｉｏＷはどちらもヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで大腸菌のｂｉｏＣおよびｂｉｏＨ遺伝子との有意な配列類似性を示さない〔Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  前掲〕。
【０００４】
大腸菌では、ビオチン生合成遺伝子が染色体中に３つまたはそれ以上のオペロンとして存在している。ｂｉｏＡ遺伝子は１つのオペロンにあり、ｂｉｏＢＦＣＤ  遺伝子群は第２の接近した連鎖オペロンにある。ｂｉｏＨ遺伝子は他のｂｉｏ  遺伝子に連鎖していない（図２；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  １，  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏ．  Ｗａｓｈ．  Ｄ．Ｃ．  中の  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｍ．Ａ．  １９８７  参照）。
【０００５】
Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  では、ｂｉｏ  遺伝子の構成が大腸菌のそれとは明らかに相違している。Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ら〔（１９９０）前掲〕は  Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓからｂｉｏ  遺伝子をコードする２つの非連鎖ＤＮＡ断片を単離し、それらの特性を決定した。一方の断片はｂｉｏＤ，  ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＹおよびｂｉｏＢ遺伝子をコードするオペロンを含み、他方の断片はｂｉｏＸ，  ｂｉｏＷおよびｂｉｏＦ遺伝子をコードするオペロンを含んでいる（図２）。ｂｉｏ  遺伝子の順序およびクラスター化が大腸菌とＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  とでは相違している（図２）。
【０００６】
Ｆｉｓｈｅｒ（米国特許第５，１１０，７３１  号）は、大腸菌のビオチンオペロンの遺伝子群を大腸菌の保持欠損株に形質転換し、それを発現させるビオチン産生系をもたらした。
Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ら（米国特許第５，０９６，８２３  号）は、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  においてビオチンの生合成に関与する遺伝子：ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＣおよびｂｉｏＨを記載している。ｂｉｏＡとｂｉｏＤのＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  遺伝子を大腸菌と  Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）の両方にクローニングした。ｂｉｏＡおよびｂｉｏＤ遺伝子をＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  のＢｉｏ−  栄養要求株に安定した状態で組み込んで、原栄養株を選別した。
【０００７】
英国特許第２，２１６，５３０  号は、他の大腸菌遺伝物質（例えば調節配列）から単離した大腸菌のｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＤおよびｂｉｏＦの１以上の遺伝子を含むプラスミドをもたらした。このプラスミドは大腸菌以外の株（好ましくは酵母）内で複製する能力を有し、発現が可能である。
Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  の３つのビオチン合成欠損変異株（ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、および大腸菌のｂｉｏＦに類似しているらしいｂｉｏ１１２と呼ばれる遺伝子）が報告されている〔Ｐａｉ，  Ｊｏｕｒ．  Ｂａｃｔ．  １２１，  １−８  （１９７５）およびＧｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  前掲〕。
【０００８】
日本ゼオン社（米国特許第４，５６３，４２６  号）は、約２４時間培養した後でピメリン酸を添加することを含むビオチン発酵を開示している。Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ＳＡおよび日本ゼオン社（ヨーロッパ特許出願公開第３７９，４２８  号）はビオチン発酵媒体にピメリン酸を添加することを開示している。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトや動物用の食品添加物として有用なビオチンの高レベル生産に用いるための枯草菌およびその密接に関連した種のビオチン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含むベクター、該ＤＮＡ配列またはベクターを含有する細胞、並びに該細胞によるビオチンの生産方法を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般に、ビオチンの高レベル生産に用いるための枯草菌およびその密接に関連した種のビオチン合成オペロンの遺伝子群を提供する。本発明の特定の態様を以下に詳細に説明する。本発明者らは、シトクロムＰ−４５０に類似した酵素をコードする、これまでに知られていない遺伝子（ｂｉｏＩ）を同定し、クローニングし、そして遺伝子工学により操作した。また、本発明者らは、２つのｂｉｏ  オペロン断片を別々にクローニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらを結合させ、そして得られた連結構築物で宿主生物を形質転換することにより、全枯草菌  ｂｉｏオペロン（強力なプロモーターを用いて遺伝子操作すると、意外にも大腸菌には毒性を示す）を過剰発現させるための戦略を開発した。２つの断片のクローニングは、大腸菌内での毒性のために、該オペロンの５’末端を得るのに苦労したことにより容易ならざるものであった。本発明は、特に、上記戦略により得られる全長オペロンを特徴としている。本発明のこれらの特徴および他の特徴を以下に詳細に説明することにする。
【００１１】
かくして、本発明は、１つの面において、（ａ）  枯草菌または枯草菌に密接に関連した種のビオチン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列；（ｂ）  （ａ）  の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列；および（ｃ）  （ａ）  または（ｂ）  に実質的に相同なＤＮＡ配列；よりなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡに特徴がある。ここで用いる枯草菌に「密接に関連した」種とは、枯草菌により代表されるバシラス種のクラスターの仲間である。該クラスターは例えば枯草菌  （Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．  ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）  、Ｂ．セレウス（Ｂ．  ｃｅｒｅｕｓ）  およびＢ．チュリンジエンシス（Ｂ．  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含む。枯草菌クラスターの仲間はＢ．スファエリカス（Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）  およびＢ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  により代表されるクラスターの遠縁バシラス種から遺伝的にそして代謝的に分岐したものである〔図３；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  前掲，  ｐｐ．  ３−１６中のＰｒｉｅｓｔ；  Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏ．  １３３，  ２５２３−２５２９  （１９８７）〕。
【００１２】
上で述べたように、本発明者らは、枯草菌またはその密接に関連した種に存在して、調節解除されたビオチン産生に特に重要である新規な遺伝子（ｂｉｏＩ）を見いだした。該遺伝子は本発明の第１の面の好ましい態様のＤＮＡ中に含まれる。また、好ましくは、少なくともｂｉｏＡとｂｉｏＢが第１の面のＤＮＡ中に含まれる。ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＷおよびＯＲＦ２（β−ケトレダクターゼ様酵素をコードする）も本発明のＤＮＡ中に含めるのが有利である。上記遺伝子の少なくとも２つが該ＤＮＡ中に含まれていてよい。該ＤＮＡ配列は転写プロモーター、例えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモーターのような構成プロモーターに機能しうる状態で連結させてもよい。枯草菌またはその密接に関連した種の全ビオチンオペロンを単一の転写プロモーターに連結させることもできる。さらに、本発明者らは第２のプロモーターを含めることが特に有用であることに気づいた。すなわち、１以上のＤＮＡ配列を第１の転写プロモーターに機能しうる状態で連結させ、そして該遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ配列を第２の転写プロモーターに機能しうる状態で連結させる。第１のプロモーターは枯草菌またはその密接に関連した種のｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦおよびｂｉｏＷの１以上に機能しうる状態で連結させることができる。他のプロモーターはｂｉｏＩ，  ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢの１以上に、あるいはこれらの組合せに機能しうる状態で連結させることができる。特に好ましい態様では、第１のプロモーターが全オペロンの転写を制御し、そしてｂｉｏＩ（ｂｉｏＡおよび／またはｂｉｏＢを含んでいてもよい）の転写が第２のプロモーターによっても制御される。該ＤＮＡは枯草菌またはその密接に関連した種のビオチンオペロンの変異させた調節部位、例えばオペレーター、プロモーター、転写終結部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソーム結合部位または異化産物抑制部位を含んでいてもよい。変異とは、野生型の調節部位での挿入、置換または欠失を意味する。
【００１３】
本発明の第２の面は、本発明者らが枯草菌  ｂｉｏＩ  を発見したことに関係している。この面は該遺伝子または枯草菌  ｂｉｏＩ  に特異的にハイブリダイズする遺伝子を特徴としている。また、それはこのような遺伝子によりコードされるビオチン生合成酵素を特徴としている。
本発明は、また、上記のようなＤＮＡを含むベクター、並びに該ベクターまたは該ＤＮＡを含む細胞をも特徴としている。好ましくは、該ＤＮＡはかかる細胞内で高コピー数へと増幅される。さらに好ましくは、該ＤＮＡは細胞の染色体に安定した状態で組み込まれる。該ＤＮＡは染色体の複数の部位（そのうちの少なくとも１つが  ｂｉｏ遺伝子座である）に、各部位において高コピー数で組み込まれてもよい。また好ましくは、該細胞は、該ＤＮＡの存在に加えて、ビオチンまたはビオチン前駆体の生産を調節解除する変異により特徴づけられる。かかる変異細胞は該ＤＮＡを欠く野生型細胞と比較して増加した量のビオチンを産生する。このような変異はアゼライン酸耐性を付与する変異であっても、そして／またそれはｂｉｒＡの変異であってもよい。
【００１４】
上記の細胞は、ビオチンまたはその前駆体の合成を可能にする時間および条件のもとで該細胞を培養し、その後ビオチンまたはその前駆体を、好ましくは該細胞の細胞外培地から、単離することを含むビオチンまたはその前駆体の生産方法において使用される。
本発明のさらに別の面は、上記のＤＮＡによりコードされる組換えタンパク質、あるいは枯草菌またはその密接に関連した種のビオチン生合成酵素のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列からなる組換えビオチン生合成酵素を特徴としている。
【００１５】
本発明の最後の面は、（ａ）  枯草菌細胞の個体群を用意し；（ｂ）  アゼライン酸の存在下で該個体群を生育させ；（ｃ）  アゼライン酸に対して耐性である細胞を選別し；そして（ｄ）  該細胞またはビオチン生産を調節解除するようにさらに変異させた娘細胞をビオチンの過剰生産能についてスクリーニングすることからなる、ビオチン生産の調節解除により特徴づけられる変異枯草菌細胞の選別方法を特徴としている。
【００１６】
本発明の上述の記載は以下の定義および解説を参照することによりさらに理解されるであろう。ベクターＤＮＡは枯草菌またはその密接に関連した種のビオチン生合成酵素をコードする遺伝子（または該遺伝子の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列）に実質的に相同なＤＮＡ配列を含むことができる。該ＤＮＡ配列は、それを細胞内で発現させるときにビオチンの合成を増強する変異（例えば欠失、挿入または点突然変異）を導入することによって野生型配列から誘導される。ビオチンオペロン遺伝子群のうちの少なくとも２、３、４、５または６個、好ましくは全部を転写プロモーターに機能しうる状態で連結させるとメッセンジャーＲＮＡが得られる。ここで用いる「オペロン」とは同一のプロモーターから同時に転写される１またはそれ以上の遺伝子を指す。「ビオチンオペロン」は遺伝子産物がビオチン生合成の一面に関与する遺伝子群を指す。「プロモーター」とは、該プロモーターの３’方向に位置する遺伝子の転写を開始してメッセンジャーＲＮＡをもたらすＲＮＡポリメラーゼ酵素により認識される核酸配列を意味する。「転写プロモーターに機能しうる状態で連結させた」とは、該プロモーターで開始されたＲＮＡ転写物が該遺伝子に相補的なメッセンジャーＲＮＡを含むように、該遺伝子が該プロモーターに十分接近していることを意味する。転写プロモーターは構成プロモーター（例えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモーター）または誘導プロモーターのいずれであってもよい。
【００１７】
オペロンの遺伝子はどれも、該ＤＮＡ配列を細胞内で発現させるときにビオチンの合成を増強する変異を含むことができる。関連した態様において、ビオチンオペロン中の、またはビオチンオペロンの遺伝子中の調節部位も、細胞内で生産されるビオチンレベルを高めるように、例えば変異によって変えることができる。変更し得る調節部位としては、例えば転写終結部位、オペレーター部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソーム結合部位または異化産物抑制部位がある。
【００１８】
本発明のベクターはどれも宿主細胞内に導入することができる。好ましい宿主細胞は下記の理由のために枯草菌細胞である。しかし、本発明のベクターは他のタイプの宿主細胞（例えば大腸菌細胞）やベクターを維持しかつ／またベクターに含まれるビオチンオペロンの遺伝子を発現させるのに必要な装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）  を含む宿主細胞に挿入することもできる。宿主細胞を発現のために使用する場合は、該宿主細胞は、枯草菌がそうであるように、ビオチンを細胞外培地に分泌できるもので、ビオチン産物の回収を容易にするものが望ましい。使用できるいくつかの宿主細胞として、グラム陽性菌、例えば枯草菌１６８、Ｗ２３または納豆株のような枯草菌細胞、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．  ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）  またはＢ．セレウス（Ｂ．  ｃｅｒｅｕｓ）  のような他のバシラス株〔バシラス株については“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ”、オハイオ州立大学生化学部、オハイオ州コロンブス、Ｄ．Ｈ．  Ｄｅａｎ  編集  （１９８６）  第３版を参照〕、またはラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）  、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）  、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）  のような他のグラム陽性細胞；グラム陰性菌、例えば大腸菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）またはクレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の菌株；あるいは真菌細胞、例えば酵母を挙げることができるが、これらに限らない。菌株およびグラム陽性細胞に有用なベクターについては“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”〔Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，  Ｈｏｃｈ，  ａｎｄ  Ｌｏｓｉｃｋ編集，  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９３）  〕を参照されたい。グラム陽性微生物由来のビオチン遺伝子はグラム陰性菌内で発現させることができ（Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．前掲）、サッカロミセス・セレビシエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  由来の真菌遺伝子さえも大腸菌内で発現させることができた〔Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０９，  ２９−３５  （１９９４）  〕。
【００１９】
ベクターが染色体外要素である場合は、それを細胞内で高コピー数へと増幅させることが可能である。これとは別に、ベクターが染色体外要素でない場合は、該ベクターを細胞の染色体に安定した状態で組み込むことができる。組み込まれたベクターも細胞内で高コピー数へと増幅させることが可能であり、すなわち組込みが複数の部位で起こるか、または各部位において高コピー数で起こる。組込みは染色体のランダムな部位で起こってもよいが、染色体の好ましい遺伝子座（例えば  ｂｉｏ遺伝子座）で起こるようにすることが好ましい。完全なベクターを染色体に組み込んでも、ビオチン生合成配列だけを非ビオチン生合成配列（例えばレプリコン配列）の少なくとも一部を欠く染色体に組み込んでもよい。該ベクターまたはビオチンオペロン配列を含む細胞はさらにビオチン生産について調節解除され得る。
【００２０】
「ビオチン生産について調節解除される」とは、ビオチン生合成のレベルを制御する負の制限が細胞から少なくとも部分的に除かれることを意味する。負の制限には調節タンパク質（例えばリプレッサー）、調節タンパク質の作用部位（例えばオペレーター）、抑制因子、または低レベルの律速酵素が含まれるが、これらに限らない。該細胞は大腸菌のｂｉｒＡ遺伝子座に対して相補性を示す遺伝子座に変異を含むことができる。ビオチン分泌の増加を引き起こす変異を含む枯草菌株としてＨＢ３、ＨＢ９、ＨＢ１５、ＨＢ４３、α−ＤＢ９、α−ＤＢ１２、α−ＤＢ６およびα−ＤＢ１７株、または表８、表９、表１０に挙げた変異株もしくは遺伝子操作された菌株があるが、これらに限らない。ビオチンは少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、１ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ、１００ｍｇ／ｌ、３００ｍｇ／ｌ、５００ｍｇ／ｌ、７５０ｍｇ／ｌ、または１．０ｇ／ｌの濃度となるように細胞外培地に分泌されることが好ましい。宿主細胞は枯草菌であることが望ましいが、それは上で挙げた宿主菌株のいずれであってもよい。「ビタマー」または「ビオチンビタマー」とは、酵母への供給に使用し得るビオチン生合成経路でビオチンに先行する化合物のことであり、例えば図１に示した次の化合物：７−ＫＡＰ、ＤＡＰＡまたはデスチオビオチンを指す。用語「ビオチン前駆体」は上記のビオチンビタマーのそれぞれとＰｍＡおよびＰｍＣｏＡを含む。「実質的に相同」とは、枯草菌を含むクラスター内のバシラス種のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にする条件であるが、ストリンジェントであるために枯草菌に密接に関連した種のクラスター外の生物のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを不可能にする条件下で、特異的ハイブリダイゼーションをもたらすのに十分な相同性を有することを意味する。この目的にかなうプローブは以下に提示する。適当なハイブリダイゼーションは比較的ストリンジェントな条件を用いる。例えば、変性ＤＮＡを含むニトロセルロースフィルターを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０７５Ｍクエン酸Ｎａ，  ｐＨ  ７．０）、１０−５０％ホルムアミド、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（０．０２％  ウシ血清アルブミン、０．０２％  フィコール、０．０２％  ピロリドン）および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡの存在下に３７〜４２℃で放射性標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと共にインキュベートする。当業者は、適当な特異性が得られる（つまり、非特異的結合が減少または排除される）まで、例えばホルムアミドの濃度や温度を上げることによってストリンジェンシーを次第に高めることができることを理解するであろう。
【００２１】
「ビオチン合成酵素」とは、図１に示したまたはここで論じたビオチン生合成経路を形成する酵素のいずれか、並びにここで新たに開示した遺伝子（例えばｂｉｏＩまたはＯＲＦ２）によりコードされる酵素を意味する。用語「ビオチン生合成酵素」は枯草菌のビオチン生合成酵素の生化学的作用を示す天然ビオチン生合成酵素の一部または断片をも含むものである。このようなビオチン生合成酵素の一部または断片の大きさは、それが天然酵素の生化学的活性を保持するという機能的要件により決定される。関連遺伝子の加水分解切断または末端切断によりポリペプチド鎖を短くした後に１以上の活性を保持する酵素の例は文献に数多く載っている〔例えば、Ｄａｕｔｒｙ−Ｖａｒｓａｔ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ７６８５−７６８９  （１９７７）  を参照〕。
【００２２】
ここで用いる「断片」または「一部」という用語はポリペプチドに適用され、鎖長が通常は少なくとも約１０個の連続アミノ酸、一般には少なくとも約２０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約３０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０個の連続アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約６０〜８０個の連続アミノ酸である。同様に、核酸と関連させた用語「断片」は上で定義したポリペプチド断片をコードするＤＮＡ配列を指す。対応する天然酵素の生物学的活性を示す候補断片の能力は、次のプロトコールを含むがこれらに限らない当業者に知られた方法により評価することができる。ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ（ｂｉｏＷ）、７−ＫＡＰシンセターゼ（ｂｉｏＦ）、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（ｂｉｏＡ）およびＤＴＢシンセターゼ（ｂｉｏＤ）のアッセイはＩｚｕｍｉ  ら〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙ．  ６２，  ３２６−３３８  （１９７９）  〕により記載されている。ビオチンシンセターゼ（ｂｉｏＢ）の無細胞アッセイはＩｆｕｋｕ  ら〔Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５６，  １７８０−１７８５  （１９９２）〕により記載されている。ｂｉｏＩの産物はＯｍｕｒａ  ら〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３９，  ２３１０−２３７８  （１９６４）〕により記載される分光測定によってシトクロムＰ−４５０と同定しうる。
【００２３】
「組換え」とは、該酵素をコードする遺伝子が枯草菌染色体中の自然界で存在するその部位から取り出されて、当業者に知られた遺伝子工学技術によりベクター中に永続的または一時的に挿入されることを意味する。好ましくは、ベクターは挿入した遺伝子の発現を可能にする配列を含む。
ここで用いる「ベクター」とは、例えばトランスフェクション、形質転換または形質導入により細胞内に導入することができる核酸分子のことである。ベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミドおよびトランスポゾンが含まれるが、これらに限らない。ここで用いるベクターの例としてｐＢＲ３２２、ｐＣＬ１９２０、ｐＣＬ１９２１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９またはｐＳＣ１０１を挙げることができるが、これらに限らない。これらのベクターは大腸菌や他のバクテリア内で複製するが、枯草菌内では複製せず、かくして適当な選択マーカーの付加後には枯草菌への組込み型ベクターとして有用である。枯草菌用の常用される他のベクターとしては、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４および枯草菌内で複製するそれらの誘導体、または“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”（前掲、ｐｐ．  ５８５−６５０）の第４０−４４章に記載される組込み型ベクター、プラスミド、テンペレートファージベクターまたはトランスポゾンが含まれる。多くの微生物用のベクターはさらに“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”〔Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  （１９８５）、１９８６年と１９８８年に追加の改訂版あり〕にも記載されている。組換え型の遺伝子操作した枯草菌ＤＮＡは、複製プラスミドベクターを使わずに枯草菌の染色体に（相同組換えにより）挿入して、そこで増幅させることもできる。
【００２４】
ここで用いる「実質的に純粋な核酸」とは、そのフランキング配列から天然に存在する状態で精製または分離された核酸配列、セグメントまたは断片であって、例えば通常該断片をはさむ配列（例えば、ゲノム中で該断片に隣接する配列）から分離されたＤＮＡ断片を意味する。また、この用語はもともと細胞内で核酸を伴っている他の成分から実質的に精製された核酸にも適用される。好ましくは、「枯草菌のビオチン生合成酵素をコードする配列」は精製された全核酸配列の主要成分であり、例えば全核酸配列の少なくとも１％または１０％を占める。
【００２５】
ここで用いる「相同」は２つのポリマー分子、例えば２つの核酸分子（例えば、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子）または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方においてサブユニット位置が同一のモノマーサブユニットで占められるとき、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいてある位置がアデニンで占められるとき、それらは該位置で相同となる。「ベスト−フィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」相同は配列の整合  （ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を調整することにより達成しうる。２つの配列間の相同性は合致する位置または相同な位置の数の関数であり、例えば２つの化合物配列の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーにおいて５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同となり、２つの配列の位置の９０％（例えば、１０のうちの９）が合致し相同である場合は、その２つの配列は９０％の相同性を共有することになる。相同配列中には非相同配列のギャップが存在してもよい。「実質的に相同」な配列とは保存的置換によってのみ一方が他方と相違する配列のことである。例えば、核酸配列に置換が存在する場合、該置換はその位置でのアミノ酸を変化させないか、あるいは保存的アミノ酸置換をもたらすものである。「保存的アミノ酸置換」は、例えば１つのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による置換（例えば、疎水性、電荷、ｐＫａまたは他の立体配座特性や化学的性質の特徴を共有するアミノ酸同士の置換、例えばバリンのロイシンによる、アルギニンのリシンによる置換）、あるいは（上記のような）ポリペプチドの生物学的活性を破壊しないアミノ酸配列の１以上の位置に存在する非保存的アミノ酸の置換、欠失または挿入である。アミノ酸配列が多重ドメイン酵素の１つのドメインの生物学的活性を低下または変更させるが、該酵素の第２ドメインの第２の生物学的活性を保存する修飾によって相違する場合、それは本発明の範囲内に含まれる。一般に、ポリペプチドは、それが枯草菌のビオチン生合成酵素の天然に存在するアミノ酸配列に対して７５％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみなされる。核酸配列は、それが枯草菌のビオチン生合成酵素をコードする天然に存在する核酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみなされる。
【００２６】
ここで提供される枯草菌の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むバクテリア株は高レベルのビオチンまたはビオチン前駆体を産生させるのに有用であり、これらの化合物はヒトや動物用の食品添加物として有用である。例えば、ビオチンは動物用流通飼料への添加物としてウシ、ニワトリ、ブタなどの家畜に供給することができる。さらに、ビオチンはヒト用のビタミン補給剤に加えることができる。また、ビオチンは検査および診断方法の試薬としても有用である。例えば、ビオチンはタンパク質や核酸の非放射性標識として使用される。ビオチン標識タンパク質はアビジン（卵白に存在するタンパク質）またはストレプトアビジン（ストレプトマイシートにより産生されるビオチン結合タンパク質）へのビオチン固有の結合能によって検出可能である。
【００２７】
商業的プロセスで経済的に使用しうる高力価ビオチンの効率的な生産系を開発することが非常に望まれている。本発明者らは、改良されたビオチン生産系が枯草菌を使うことにより開発可能であることに気づいた。
枯草菌は他の種を用いることに比べていくつかの利点を有する。Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  と違って、枯草菌は遺伝子工学のために非常に詳しく特性決定がなされており、ａ）ビオチンの生産にとって最適な変異株を開発し、ｂ）ビオチン生合成酵素をコードする遺伝子を担うベクターを遺伝子操作して構築するのが容易である。最も重要な点は、本発明者らがここに開示するように、ビオチン生合成酵素をコードする遺伝子の大部分または全部が単一のオペロン上に存在することである。このことにより、オペロンの発現を全体的に調節し、そして発現される各酵素の量を同時に調節することが比較的簡単になる。さらに、枯草菌はビタマー生産に関与する特異なシトクロムＰ−４５０様酵素を含んでおり、ビタマー生産を有意に高めるように操作することができる。この酵素をコードする遺伝子（ｂｉｏＩ）や他の生物からのその同族体がビオチンまたはビオチンビタマーの合成においてある役割を果たしているということは、これまでに報告されていない。
【００２８】
枯草菌のビオチンオペロンの遺伝子を得ることは簡単な作業ではなかった。Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  への配列類似性に基づいて該遺伝子を同定しようとしたが、失敗した。その理由は、バシラス属としてのそれらの共通した分類学上のグループ分けにもかかわらず、枯草菌とＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  とがかなり分岐した種であることにあった  （Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．前掲）  。その結果、関係のあるＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  遺伝子と対応する枯草菌遺伝子との配列相同性があまりにも低すぎて、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  遺伝子をプローブとして用いて枯草菌遺伝子をクローニングすることができなかった。
【００２９】
それ故、本発明者らはビオチン生合成に必要な遺伝子（ｂｉｏ  遺伝子）をクローニングするために別のもっと有利な戦略を採用した。このアプローチはｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦおよびｂｉｏＨの大腸菌変異株を用いる相補性検定と、ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢおよびｂｉｏＦの既知の枯草菌ビオチン変異株を用いるマーカー救済および相補性検定による更なる特性決定を含んでいた  （Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．前掲）  。これらの検定から、枯草菌では６種類すべてのビオチン生合成遺伝子が約８ｋｂの単一のＤＮＡ断片上に含まれることがわかった。この断片の詳細な制限地図が得られ、重複クローン、欠失変異株、サブクローンおよびそれらの個々のヌクレオチド配列の解析により該遺伝子を該ＤＮＡ断片上に次の順序で位置づけることができた：右から左へ、ｂｉｏＷ，  ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２。これら７つの遺伝子はすべて同一方向に転写され、それらが単一オペロンの一部であることと一致する。
【００３０】
その後、ビオチンを生産させるために、枯草菌の単離したビオチンオペロンを微生物宿主に挿入した。該オペロンと微生物宿主はそれぞれに、または別々に、最高レベルのビオチン生産を得るようにビオチン生産を調節解除することができる。
【００３１】
【実施例】
実施例Ｉ．  ビオチン生合成のための枯草菌遺伝子のクローニング
ビオチン生合成に必要な枯草菌遺伝子（ｂｉｏ  遺伝子）をクローニングし、特性決定を行った。これまでに枯草菌のｂｉｏ  遺伝子に関して知られていたことは、ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢおよびｂｉｏＦの変異が存在し、これらが染色体上に連鎖している  （Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．前掲）  ということだけだったので、これらの遺伝子をクローニングするために初めに２つの異なるアプローチをとった。第１のアプローチは、保存配列に従って設計した短い（約４５〜６０ｂｐ）プローブと、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏ  遺伝子からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製した大きいプローブ（約１ｋｂ）を用いる試験を含んでいた。しかし、これらのプローブは枯草菌ＤＮＡの染色体消化物と特異的にハイブリダイズすることができなかった。第２のアプローチは、大腸菌の  ｂｉｏ遺伝子を相補する組換えクローンについて枯草菌ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることを含んでいた。
【００３２】
ＩＡ：  Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  配列とのＤＮＡハイブリダイゼーションにより ｂｉｏ  遺伝子をクローニングする試み
ｂｉｏ  遺伝子を含む枯草菌の制限断片を同定するために、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢおよびｂｉｏＦ遺伝子の内部領域に対する短い（約４５〜６１ｂｐ）プローブを作製した。プローブの配列は大腸菌とＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏ  ＤＮＡヌクレオチド配列から推定された保存アミノ酸に基づいて選ばれた。
【００３３】
これらのプローブの特徴は次のとおりであった：ｂｉｏＡ，  ６０−ｍｅｒおよびｂｉｏＢ，  ４８−ｍｅｒ（それぞれＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  配列由来のヌクレオチド＃１９５０−２００９および＃３３３３−３３８０、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託＃２９２９２）；ｂｉｏＦ，  ４５−ｍｅｒ（Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  配列由来のヌクレオチド＃２８７７−２９２１、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託＃２９２９１）。これらプローブのうち２つは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを低くした（５×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ、３７℃）場合にも、枯草菌ＤＮＡの種々の染色体消化物にハイブリダイズしなかった（ｂｉｏＢプローブ）か、弱くハイブリダイズしたにすぎなかった（ｂｉｏＦプローブ）。ｂｉｏＡプローブだけがハイブリダイズし得た。しかし、ｂｉｏＡハイブリダイゼーションにより同定された精製ＤＮＡ断片は枯草菌のｂｉｏＡ変異株をマーカー救済することができず、この断片はｂｉｏＡ遺伝子を含んでいないことが明らかになった。さらに、このＤＮＡハイブリッドは不安定であった。すなわち、中程度のストリンジェンシー条件（０．２５〜０．１×ＳＳＣ、３７℃）のもとではフィルターからプローブを洗い流すことができた。同様に、３つのｂｉｏ  遺伝子のより大きいＤＮＡプローブ（約１ｋｂ）をＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅により作製したが、これらも枯草菌の染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることができなかった。その結果、枯草菌のｂｉｏ  遺伝子を含む組換えクローンについて遺伝子バンクをスクリーニングする際にこれらのプローブを使うわけにはいかなかった。
【００３４】
ＩＢ：  大腸菌変異株の相補性によるｂｉｏ  遺伝子のクローニング
ランダムな枯草菌断片（約１０ｋｂ）のライブラリーを、陽性選択ベクターｐＴＲ２６４〔Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １７３，  ５０４７−５０５３  （１９９１）〕を使って大腸菌ベクター中に構築した。ｐＴＲ２６４はアンピシリン耐性遺伝子とλリプレッサー遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子をλリプレッサーにより調節を受ける調節配列の制御下に含んでいるｐＢＲ３２２由来のベクターである。ｐＴＲ２６４はｐＴＲ２６２のアンピシリン耐性遺伝子をＰｓｔＩ部位からの該遺伝子の５’末端を付加して再構築することにより作製した。唯一のＢｃｌＩ部位がλリプレッサー遺伝子内に存在する。この部位にＤＮＡ断片を挿入すると、リプレッサー機能が破壊され、その結果ｔｅｔ遺伝子の抑制が解除される。挿入部を有するクローンは、形質転換体をテトラサイクリンプレートにまくことにより選択できる。
【００３５】
ｄａｍ−  大腸菌株から単離してＢｃｌＩで消化したｐＴＲ２６４は、Ｓａｕ３Ａで部分消化してショ糖勾配で分画化しておいた枯草菌染色体ＤＮＡ（８〜１２ｋｂ断片）と連結させた。このライブラリー（ＢＳＢＩと記す）は既知のすべての大腸菌  ｂｉｏ点突然変異を相補するＴｅｔｒ  プラスミドを含んでいた。大腸菌ビオチン変異株Ｒ８７９（ｂｉｏＡ２４）、Ｒ８７５（ｂｉｏＢ１７）、Ｒ８７８（ｂｉｏＣ２３）、Ｒ８７７（ｂｉｏＤ１９）、Ｒ８７２（ｂｉｏＦ３）およびＢＭ７０８６（ΔｍａｌＡ−ｂｉｏＨ）〔Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １１２，  ８３０−８３９  （１９７２）；  Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  ９８，  ５５９−５６７  （１９６９）  〕をＢＳＢＩライブラリーで形質転換した。それぞれのＢｉｏ＋  形質転換体からプラスミドを単離した。プラスミドｐＢＩＯ  １００およびｐＢＩＯ  １０１がＲ８７９（ｂｉｏＡ）の相補性により単離された。プラスミドｐＢＩＯ  １０２およびｐＢＩＯ  １０３がＲ８７７（ｂｉｏＤ）の相補性により、プラスミドｐＢＩＯ  １０４がＲ８７２（ｂｉｏＦ）の相補性により、プラスミドｐＢＩＯ  １０９およびｐＢＩＯ  １１０がＢＭ７０８６（ｂｉｏＨ）の相補性により、そしてプラスミドｐＢＩＯ  １１１およびｐＢＩＯ  １１２がＲ８７８（ｂｉｏＣ）の相補性により単離された（図７）。最後に、ＢＳＢＩライブラリーからのＤＮＡを大腸菌  ＢＭ４０６２〔ｂｉｒＡ（ｔｓ）〕〔Ｂａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  １４６，  ４６９−４９２  （１９８１）〕に形質転換した。４２℃で成育させたコロニーからプラスミドｐＢＩＯ  １１３およびｐＢＩＯ  １１４が単離された。
【００３６】
単離したプラスミドの初期の制限分析はクローン化ＤＮＡ断片の著しい重複を示し、このことは５つの遺伝子ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦおよびｂｉｏＨが枯草菌で単一のオペロンとして集まっていることを示唆する。しかしながら、ｂｉｒＡを相補するプラスミドｐＢＩＯ  １１３およびｐＢＩＯ  １１４は他の５つの断片と重複していなかった。
【００３７】
ＩＣ：  ｂｉｏ  プラスミドの制限地図作成
唯一のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩ部位までのｂｉｏ  遺伝子座の制限地図を図７に示す。ｐＢＲ３２２の誘導体にクローン化したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＩＯ  ２０１と呼ばれた。ｐＢＩＯ  ２０１中の９．９ｋｂ断片の詳細な制限地図は標準的な一重および二重の酵素消化分析により得られた。
【００３８】
大腸菌の相補性により単離されたｂｉｏ  遺伝子の最初のクローンであるｐＢＩＯ  １００は、一端がＢａｍＨＩ部位を越えてさらに３００ｂｐだけ延びていた。大腸菌のｂｉｏＨ変異株の相補性により単離されたｐＢＩＯ  １１０は、他端がＥｃｏＲＩ部位を越えて約１１００塩基対だけ延びていた。サザンハイブリダイゼーション実験から、ｐＢＩＯ  １００の挿入ＤＮＡは枯草菌の染色体の単一連続セグメントから誘導されたものであることがわかった。
【００３９】
ＩＤ：  ｐＢＩＯプラスミドを用いる枯草菌および大腸菌  ｂｉｏ変異株の相補性／マーカー救済
ｐＢＩＯ  １００のクローン化ＤＮＡが枯草菌のｂｉｏ  遺伝子を含むことを検証するために、枯草菌のｂｉｏ  変異株をマーカー救済するｐＢＩＯ  １００の能力について試験した。該プラスミドはｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢおよびｂｉｏＦ変異株を高頻度でビオチン原栄養株へと復帰させた。このことから該クローン化ＤＮＡは枯草菌  ｂｉｏ遺伝子のそれぞれを全部または一部含むことがわかった。
【００４０】
また、ｐＢＩＯプラスミドは大腸菌  ｂｉｏ変異株ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＣおよびｂｉｏＨを相補するそれらの能力についても調べた。ほとんどのプラスミドは２以上の大腸菌ビオチン変異に対して相補性を示した。単離物ｐＢＩＯ  １１２はｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦおよびｂｉｏＨの大腸菌変異に対して相補性を示した（図７）。ｐＢＩＯ  １１２は大腸菌  ｂｉｒＡ（ｔｓ）  やΔ（ｇａｌ−ｕｖｒＢ）変異に対しては相補性を示さなかった。これらのデータは、既知のビオチン遺伝子の大部分が枯草菌内で単一のクラスターとして存在していることを実証した。
【００４１】
ｐＢＩＯ  ２０１のいくつかの欠失体を、２つの制限部位で切断し、必要ならば突出部を修復して連結することにより作製した。欠失プラスミドの構造を確かめた後、それぞれを種々の大腸菌  ｂｉｏ変異株に形質転換し、相補性を評価した。結果を図８に要約して示す。欠失誘導体ｐＢＩＯ  ２０３は既知の大腸菌ビオチン遺伝子のうち６つ  （ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＤ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＨ）  を相補することがわかり、これら６つの遺伝子すべてはＢａｍＨＩからＸｈｏＩまでの８ｋｂのＤＮＡ断片中に存在することがはっきりした。この断片の左から３．８ｋｂを除去すると（ｐＢＩＯ  ２０４）、ｂｉｏＣとｂｉｏＨ変異株を相補する能力が失われた。ｐＢＩＯ  ２０６はビオチンクラスターの右側の２．５ｋｂだけを含んでいたが、これはｂｉｏＡとｂｉｏＦ変異株のみに対して相補性を示した。これらの観察およびハイブリダイゼーションデータに基づいた順序は次のとおりであった：ｂｉｏＣ，  ｂｉｏＨ，  （ｂｉｏＢ，  ｂｉｏＤ），  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＡ。
【００４２】
ＩＥ：  完全なｂｉｏＷを含む枯草菌断片のクローニング
ＤＮＡの配列決定により（下記参照）、ｂｉｏ  オペロンのプロモーターは最初にクローン化されたＤＮＡ断片のいずれにも存在しないことが判明した。しかし、このプロモーター領域は染色体歩行  （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｗａｌｋｉｎｇ）により回収された。大腸菌変異株の相補性により最初に単離されたクローンはどれもｐＢＩＯ  １００よりもさらに右方向へ延びてはいなかった。これは、ｂｉｏＡがこれらクローンの最右端にあり、かつ８〜１０ｋｂの範囲の断片がクローニングのために選ばれていたから、驚くべきことであった。しかし、ｐＢＩＯ  １００のクローン化挿入部の最右端のＤＮＡ配列は、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏＷにやや類似している約３００  ｂｐのオープン・リーディング・フレームを示した。ｂｉｏＡと隣接上流領域を含む断片を、プラスミドのコピー数を減らすためにｐｃｎＢ変異を有する大腸菌  ｂｉｏＡ  細胞にクローニングした〔Ｌｏｐｉｌａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０５，  ２８５−２９０  （１９８６）  〕。かかる条件下で、ｂｉｏＡの上流の別の２．７ｋｂのＤＮＡを含むＰｓｔＩ断片をクローニングし、ｂｉｏ  オペロンの開始位置をＤＮＡ配列決定により調べた。
【００４３】
大腸菌でのｐｃｎＢ変異はｐＢＲ３２２およびｐＵＣ誘導体を含むＣｏｌＥ１誘導プラスミドの低コピー数維持をもたらす（Ｌｏｐｉｌａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，前掲）。ｂｉｏＡおよびｐｃｎＢの両方の変異を有する大腸菌  ＢＩ２５９株を構築した。制限酵素、欠失およびサザン分析から、５．５ｋｂのＰｓｔＩ断片は完全なｂｉｏＡ遺伝子を含むことがわかった。枯草菌  ＧＰ２７５の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で大きさにより分画化した。４．４〜６．６ｋｂ断片のプールをｐＢＲ３２２誘導プラスミドに連結し、大腸菌  ＢＩ２５９株を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性とビオチン原栄養株について選択した。５．５ｋｂの挿入部を含むプラスミドｐＢＩＯ  １１６を回収した。このプラスミドはＢＩ２５９  株を高頻度でビオチン原栄養株へ形質転換することができたが、Ｒ８７９株（ｂｉｏＡ，  ｐｃｎＢ＋）をビオチン原栄養株へもアンピシリン耐性株へも形質転換することができなかった。Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏＷにやや類似している３００  ｂｐを含むプローブ（ｐＢＩＯ  １００の６００  ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ  断片）を用いたサザンハイブリダイゼーションにより、このクローン化ＤＮＡがｂｉｏＷ相同体を含むことを確かめた。
【００４４】
ｐＢＩＯ  １１６はｐｃｎＢバックグラウンドから非常に限られた量でしか得ることができなかった。このクローニング実験に用いたｐｃｎＢ８０対立遺伝子は、ｐＢＲ３２２レプリコンのコピー数を野生型のレベルの約６％に低下させると報じられている（Ｌｏｐｉｌａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，前掲）。プラスミドの安定性を損なうことなくプラスミド収量を向上させるために、このＤＮＡを低コピー数プラスミドにクローニングした。ｂｉｏＷの３’末端内部の唯一のＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＢＩＯ  １１６由来の３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＬ１９２１にクローニングした。ｐＣＬ１９２１はｐＵＣ１９のｌａｃＺ’／ポリリンカークローニング領域と選択可能なスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子を含む低コピー数プラスミドｐＳＣ１０１の誘導体である  （Ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １８：４６３１，  １９９０）。ｐＣＬ１９２１は細胞あたりのコピー数が約５〜１０コピーである。ｐＢＩＯ  １１６由来の精製した３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断したｐＣＬ１９２１のＤＮＡに連結し、この連結ＤＮＡをｐｃｎＢ＋  大腸菌  ＭＭ２９４株に形質転換し、スペクチノマイシン耐性（１００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を含むプラスミドｐＢＩＯ  ３５０を回収した。この菌株から回収されたｐＢＩＯ  ３５０の量はｐｃｎＢ８０株から単離されたｐＢＩＯ  １１６と比べて著しく高く、プラスミドの安定性も損なわれていなかった。
【００４５】
実施例ＩＩ．    枯草菌  ｂｉｏ遺伝子クラスターのＤＮＡ配列決定
ｂｉｏ  生合成遺伝子をさらに同定し、その発現を制御する調節装置を確認し、そして遺伝子操作に適する部位を定めるために、クローンｐＢＩＯ  １００およびｐＢＩＯ  ３５０に含まれる枯草菌  ｂｉｏ遺伝子の配列を、サンガーのジデオキシ配列決定法によりＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭキット、バージョン２．０（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国オハイオ州クリーブランド）を用いてメーカーの指示どおりに決定した。
【００４６】
ＩＩＡ：  ＤＮＡ配列決定の戦略
枯草菌  ｂｉｏ遺伝子を含む８〜１０ｋｂ領域のＤＮＡ配列を得るために採用した戦略は、ほぼ等しい大きさの４つのプラスミドサブクローンに該領域を分割し、その後各サブクローンを通して前進する一組の繰り込まれた欠失体  （ｎｅｓｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）  をつくるというものであった。繰り込まれた欠失体をつくるために、「エキソヌクレアーゼＩＩＩ−エンドヌクレアーゼＳ１」法を採用し、試薬類をキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  社、米国ウイスコンシン州マジソン）として購入した。繰り込まれた欠失体は３つのサブクローンについては両末端から、４つ目のサブクローンについては一端から作製された。３つのサブクローンの両組の繰り込まれた欠失体の配列決定は各サブクローンの両鎖の配列を与えたが、これは完全に正確な配列を得るために必要であった。ｐＢＩＯ  ３５０については、一方の鎖を同様に決定し、相対する鎖は約１５０ｂｐの間隔で配列決定用プライマーを合成することにより決定した。非重複サブクローン間の接合部は、鋳型としてｐＢＩＯ  ２０１またはｐＢＩＯ  １００（またはそのサブクローン）を用いて合成プライマーから配列決定することにより確かめた。配列を整合させ、ＤＮＡＳＴＡＲ  コンピュータプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  社、米国ウイスコンシン州マジソン）と対比させた。
【００４７】
ＩＩＢ：  ｂｉｏ  特異的コード領域および転写調節シグナルの同定および機構
ｐＢＩＯ  １００およびｐＢＩＯ  ３５０からの約８５００ｂｐのＤＮＡ配列の分析は７つのコード領域を含む単一のｂｉｏ  オペロンを示した（図５、図１６および配列番号：１）。ｐＢＩＯ  ３５０中のｂｉｏ  オペロンの５’末端から開始して、ｐＢＩＯ  １００に続けて見ると、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ｂｉｏ  オペロンの「オペレーター」部位への強い配列相同性により規定される転写調節部位の隣に枯草菌ＲＮＡポリメラーゼの増殖期形態（σＡ  ）により認識される推定上のプロモーター配列（Ｐｂｉｏと呼ぶ）を含む約１００ｂｐ領域がまず見つかる。
【００４８】
この推定上のプロモーター領域のヌクレオチド配列を図４に示す。図４の記号は次のとおりである：破線：２回対称の領域；太い下線：Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ｂｉｏＤＡＹＢ  調節部位への類似性；σＡ  ：枯草菌ＲＮＡポリメラーゼの増殖期形態により認識されるプロモーター領域；ＲＢＳ：リボソーム結合部位；＊：ｄａｍ  メチル化によりブロックされる制限部位。推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。Ｐｂｉｏの配列はＴＴＧＡＣＡ−−１７ｂｐ−−ＴＡＴＡＴＴ（配列番号：２）であり、枯草菌のσＡ  コンセンサス配列ＴＴＧＡＣＡ−−１７／１８ｂｐ−−ＴＡＴＡＡＴ  （配列番号：３）とよく一致する。この領域のすぐ後にｂｉｏＷ（２５９アミノ酸）への相同性を有する  ＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）が続き、その後にｂｉｏＡ（４４８アミノ酸）、ｂｉｏＦ（３８９アミノ酸）、ｂｉｏＤ（２３１アミノ酸）およびｂｉｏＢ（３３５アミノ酸）への相同性を有する  ＯＲＦが続く。次の２つのオープン・リーディング・フレームＯＲＦ１（ｂｉｏＩ；  ３９５アミノ酸）およびＯＲＦ２（２５３アミノ酸）は既知のｂｉｏ  遺伝子のどれにも配列類似性を示さなかった（図５）。プロモーター、遺伝子および推定上の転写終結部位の位置を表１に示す。
【００４９】
【表１】
0003593146.tif 000002
【００５０】
プロモーター、転写終結部位およびリボソーム結合部位の位置および方向はｂｉｏ  遺伝子を含む単一オペロンを示している。各遺伝子は強力なバシラスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）によって先行され、計算したΔＧは−１１．６〜−２０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。全遺伝子は同一の転写方向に（右から左へ）向いている。さらに、ｂｉｏＡ，  ｂｉｏＦ，  ｂｉｏＤおよびｂｉｏＢの５’末端はそれぞれの前の遺伝子の３’末端と重複しており、このことはこれら遺伝子の発現が部分的に転写カップリングにより調節されていることを示唆する。ｂｉｏＩとＯＲＦ２はそれぞれ６８および６７塩基対のシストロン間領域によって前の遺伝子から分離されており、このことはそれらが転写的に関連していないことを示す。ｂｉｏＷ遺伝子は上で論じた潜在的なＲＮＡポリメラーゼ（σＡ  ）プロモーター部位および推定上のオペレーター部位により先行されているので該オペロンの最初の遺伝子であるようだ。このプロモーター領域はｂｉｏ  オペロンの始まりを表す。なんとなれば、ｒｈｏ  非依存性転写終結部位に似ているステム−ループ構造  （ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）がそれから約５０ｂｐ上流に存在するからである。この推定上の終結部位は、ｂｉｏ  オペロンと同じ方向を向いているＯＲＦ４−５と呼ばれる強力なバシラスリボソーム結合部位（ＲＢＳ；ΔＧ＝−１４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するコード領域（２９９アミノ酸）により先行されるので、別の転写単位の終結を表している（図９）。最後に、ＯＲＦ４−５のさらに上流に、反対の方向を向いて、強力なバシラスＲＢＳ（ΔＧ＝−１７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が存在し、その後に別のオープン・リーディング・フレームＯＲＦ６の最初の２６６アミノ酸が続く。ＯＲＦ６の残部はＰｓｔＩ部位を越えて続いている。ＯＲＦ６の推定アミノ酸配列はｌａｃＩリプレッサーに関係した多くの調節タンパク質、すなわち大腸菌  ｅｂｇＲ  （機能が不明な潜在オペロンのリプレッサー）；大腸菌  ｐｕｒＲ  （プリンヌクレオチド生合成オペロンのリプレッサー）；および大腸菌  ｃｙｔＲ  （異化酵素をコードするｄｅｏＣＡＢＤ，  ｕｄｐおよびｃｄｄ  、並びに輸送および孔形成タンパク質をコードするｎｕｐＣ，  ｎｕｐＧおよびｔｓｘ  の多面的転写リプレッサー）に有意な類似性を示した。ＯＲＦ４−５とＯＲＦ６の転写は協調しているのかもしれない。なぜならば、ＯＲＦ４−５とＯＲＦ６の５’末端間の１７５ｂｐ内には２つの重複するσＡ  プロモーター配列（ＴＴＧＴＡＡ−−１８ｂｐ−−ＴＡＡＴＡＴ（配列番号：４）→ＯＲＦ６；  ＴＴＧＡＴＡ−−１７ｂｐ−−ＡＡＡＡＧＴ（配列番号：５）→ＯＲＦ４−５）および一連の逆反復配列が見いだされたからである。
【００５１】
ＯＲＦ２はこのコード領域のすぐ終わりにｒｈｏ  非依存性転写終結部位に似ている安定したステム−ループ構造が存在することからｂｉｏ  オペロン中の最後の遺伝子である。ターミネーター様特徴を有する第２のステム−ループ構造がｂｉｏＢとｂｉｏＩとのシストロン間領域に同定された。ｍＲＮＡのいくつかの二次構造が可能であり、最も有利な構造は−１１ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有し、そして最も有利でない構造は−５．６ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有する。
【００５２】
ビオチンオペロンの最後から下流には強力なＲＢＳ（ΔＧ＝−２０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と２６０アミノ酸の別のコード領域ＯＲＦ３が存在する。ＯＲＦ３の残部は配列決定された領域の最後を示すＢｓｔＸＩ部位を越えて続いている。ＯＲＦ３の推定アミノ酸配列は大腸菌の多くの膜結合輸送タンパク質、すなわちグリセロール−３−ホスフェートパーミアーゼ（ｕｇｐＥおよびｕｇｐＡ）；マルトースパーミアーゼ（ｍａｌＧおよびｍａｌＦ）；およびモリブデンパーミアーゼ（ｃｈ１）に対して有意な類似性を示した。特に、部分ＯＲＦ３ペプチドはすべての膜結合輸送タンパク質に共通して見られる２０アミノ酸配列をＣＯＯＨ末端領域に含んでいる。ＯＲＦ３はその９５ｂｐ上流の推定上のσＡ  プロモーター配列  ＴＡＧＡＣＡ−Ｎ１８−ＴＡＣＡＴＴ（配列番号：１；図１６、＃７６００−７６２９）を用いてｂｉｏ  オペロンとは別個に転写される。
【００５３】
遺伝子と酵素の関係、酵素の大きさ、および他の生物からの同一酵素に対する相同パーセントを表２にまとめてある。
ｌａｃ  プロモーターの転写制御下にｂｉｏＩまたはＯＲＦ２のみを含むプラスミドサブクローンを用いた相補性検定は、大腸菌のｂｉｏＣまたはｂｉｏＨ変異を相補するにはｂｉｏＩだけで十分であることを示した。ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２のコピーをＰＣＲで生成させた。それぞれの遺伝子の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ  部位を導入し、ｂｉｏＩの３’末端にＢａｍＨＩ部位を、そしてＯＲＦ２の３’末端にＡｓｐ７１８１部位を導入した。ＰＣＲで作製した断片はそれぞれ異なるコピー数をもつ３つのプラスミドにクローニングした：低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２１、中間コピー数プラスミドｐＪＧＰ４４（ｐＢＲ３２２から誘導されたもの）および高コピー数プラスミドｐＵＣ１９。これら組換えプラスミドの２つでは、ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２の発現がｌａｃ  プロモーターの制御下にある（ｐＣＬ１９２１およびｐＵＣ１９）。
【００５４】
ｂｉｏＩを含むプラスミドは大腸菌  ＢＭ７０８６  （  ΔｂｉｏＨ）  と大腸菌  Ｒ８７８  （ｂｉｏＣ）の両方に対して相補性を示した。ＯＲＦ２を含むプラスミドは大腸菌  ＢＭ７０８６  またはＲ８７８のいずれにも正常な相補性を付与しなかった。これらの検定から、枯草菌のｂｉｏＩの産物は大腸菌のｂｉｏＣまたはｂｉｏＨ変異株には存在しない活性を代償し、あるいは打ち消すビオチン合成に必要な活性を供給し得ることが明らかである。
【００５５】
ｐＣＬ１９２１（ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  １９９０，前掲）にクローン化した枯草菌  ｂｉｏＷ  遺伝子とそのプロモーターのみを含むプラスミド（ｐＢＩＯ  ４０３）は、培地にピメリン酸を約３０ｍｇ／ｌの濃度で加えたとき、または加えたときだけ、大腸菌ΔｂｉｏＨおよびｂｉｏＣ変異株の両方に対して相補性を示した。この検定から、ｂｉｏＷが大腸菌においてｂｉｏＨやｂｉｏＣを迂回し得るピメリル−ＣｏＡシンセターゼをコードしていることが確かめられた。
【００５６】
【表２】
0003593146.tif 000003
【００５７】
枯草菌ｂｉｏＩまたはＯＲＦ２の推定アミノ酸配列と、大腸菌  ｂｉｏＣ  またはｂｉｏＨ遺伝子もしくは他のｂｉｏ  遺伝子のタンパク質配列と、の間には有意な類似性が見いだせなかった。しかし、その後ＧｅｎＢａｎｋＴＭのタンパク質データベースに対比させたところ、Ｂ．メガテリウム  （Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，  ＢＭ−１）、Ｓ．エリスラエア  （Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ，  ｅｒｙＦおよびｅｒｙＫ）  、Ｓ．グリセオラス  （Ｓ．  ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ，  ｓｕａＣおよびｓｕｂＣ）  、Ｓ．種のＳＡ−ＣＯＯ菌株  （ｃｈｏＰ）  および他の生物由来の多くのシトクロムＰ−４５０酵素に対して有意な類似性を示した。シトクロムＰ−４５０は多くの異なる種類の基質（脂肪酸を含む）のヒドロキシル化を触媒することが知られているモノオキシゲナーゼ類を含む酵素のクラスである。ビオチン前駆体のピメリン酸の合成は未同定脂肪酸のヒドロキシル化および／または更なる酸化を必要とするので、ｂｉｏＩはビオチン合成の初期段階に係わっているのかもしれない。ｂｉｏＣおよび／またはｂｉｏＨ遺伝子は、ｂｉｏＣおよび／またはｂｉｏＨ変異を相補するｂｉｏＩの能力からすると、ｂｉｏＩと機能的に等しいものである。同様の比較実験は、エリスロマイシン生成の初期酵素段階に関与するポリケチドシンターゼＩＩ  （ｅｒｙ  ＡＩＩ）のβ−ケトレダクターゼドメインに対するＯＲＦ２の弱い類似性を示した。
【００５８】
実施例ＩＩＩ． ｂｉｏ  オペロンおよびフランキングコード領域のｃａｔ  挿入変異誘発
ヌクレオチド配列から予測されたｂｉｏ  オペロンの境界を確認し、これまでに同定されていないｂｉｏ  遺伝子の役割を確かめるために、ｃａｔ  カセットを用いてｂｉｏＷ，  ｂｉｏＩ，  ＯＲＦ２，  ｂｉｏ  プロモーター領域，  ＯＲＦ３，  ＯＲＦ４−５およびＯＲＦ６（ｂｉｏ  オペロンの予測された境界の外側にある）の挿入体または欠失体を構築した。ｃａｔ  カセットはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。上記の構築物を作製するために、まず初めに、これらの変異を含むプラスミド誘導体を大腸菌内に構築した。その後、標準方法によるＤＮＡ形質転換を用いて枯草菌のｂｉｏ  染色体遺伝子座にｃａｔ  挿入体を移入した。該挿入体または欠失体がビオチン合成を不活性化したかどうかを調べるために、ビオチンの存在下または非存在下でビオチン不含培地寒天プレート上でこれらの変異を有するコロニーの増殖について評価した（Ｂｉｏ  表現型）。
【００５９】
図１０および図１１の上部に示すように、ｃａｔ  カセットは連結によって、ＢａｍＨＩ部位を使ってｂｉｏＷのコード領域に；ＸｍｎＩ部位を使ってＯＲＦ３に；ＥｃｏＲＶ部位を使ってＯＲＦ６に；ＯＲＦ２の３’末端を欠く２つのＳｓｔＩ部位の間に；またはＯＲＦ４−５を欠く２つのＢｓｔＢＩ部位の間に挿入した。また、ｃａｔ  カセットをＥｃｏ４７ＩＩＩ  部位に連結することによりｂｉｏ  プロモーターを破壊するために、あるいはそれをＨｐａＩ部位間に連結することによりこのプロモーター領域を完全に置換するために、ｃａｔ  カセットを使用した。ＯＲＦ２／ＳｓｔＩ、ＯＲＦ４−５／ＢｓｔＢＩおよび／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ  構築物では、ｃａｔ  遺伝子が破壊されたコード領域またはプロモーター領域と同じ方向でのみ挿入された。他のすべての構築物では、ｃａｔ  カセットが両方の可能な方向に挿入された２つの異なるプラスミド誘導体が作製された。次いで、ｃａｔ  含有プラスミドをｂｉｏ  ＤＮＡの外側での制限酵素切断により線状化し、この切断ＤＮＡをコンピテント枯草菌原栄養株ＰＹ７９に形質転換し、そしてクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）について選択することにより、これら変異の各々をｂｉｏ  遺伝子座に組み込んだ。各変異株のＢｉｏ  表現型を図１０および図１１の下部に要約してある。予測されたｂｉｏ  オペロンの外側に位置するコード領域、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４−５およびＯＲＦ６内への挿入はＣｍｒ  原栄養株コロニーをもたらし、これら変異がビオチン生産および栄養要求性に関して表現型をもたないことを示している。ｂｉｏ  オペロン内部への挿入はヌクレオチド配列データを大体において支持する複雑な結果をもたらした。ビオチンオペロンに対して反対方向に配置したｃａｔ  遺伝子でｂｉｏ  プロモーター領域を中断させたり、ｂｉｏ  オペロンに対してそれぞれの方向に配置したｃａｔ  遺伝子でｂｉｏＷを中断させたりすると、明らかなＢｉｏ−  表現型が得られ、ｂｉｏ  オペロン／プロモーター領域の５’末端でこれら配列の位置を確認した。しかし、ビオチンオペロンと同じ転写方向で挿入したｃａｔ  遺伝子でＰｂｉｏ  プロモーター領域を置換すると、低頻度（０．１％）でＢｉｏ＋  バクテリアが得られた。バイオアッセイ実験から、バクテリアのビオチンビタマー生産は低濃度のクロラムフェニコールの存在下で増加することがわかり、このことはビオチンオペロンの転写が  ｃａｔプロモーターの制御下にあることを示唆している。該オペロンの３’末端はこの遺伝子手法では最終的に同定することができなかった。ｂｉｏＩ内部への挿入は、ビオチン生産が部分的に欠損しているＣｍｒ  コロニーをもたらした。つまり、ビオチン不含培地ではあまり増殖しないが、ビオチン（３３μｇ／ｍｌ）の存在下では野生型レベルにまで増殖する。一方、ＯＲＦ２：：ｃａｔ  変異はＢｉｏ＋  コロニーをもたらした。これらの結果から、ｂｉｏＩはビオチン生産にとって絶対に必要というわけではなく、またＯＲＦ２遺伝子産物は外因性ビオチンの非存在下での野生型の増殖には無くてもよいらしいことが示唆される。ＯＲＦ２：：ｃａｔ１１  変異を有するｂｉｒＡ株（例えばＢＩ４２１；実施例ＸＢを参照）ではビオチン生産への有意な作用がなにも見いだせなかった。それでもなお、ＯＲＦ２はビオチンの過剰生産には必要であるかもしれない。
【００６０】
Ｂｉｏ＋／−  と称されるｂｉｏＩ：：ｃａｔ  変異により生じる部分的ビオチン欠損表現型は極性効果というよりもむしろｂｉｏＩの不活性化によって引き起こされるようだ。なぜならば、下流遺伝子ＯＲＦ２またはＯＲＦ３の内部の変異がＢｉｏ＋  であるからである。Ｂｉｏ＋／−  表現型が真正なものであるか否かを確かめるために、そしてｂｉｏＩ遺伝子産物がピメリン酸の形成に関与することを証明するために、ピメリン酸を供給することによってｂｉｏＩ：：ｃａｔ  変異を迂回させた。図１０にその要約を示すように、ｃａｔ  遺伝子のそれぞれの方向にこの変異を有するＰＹ７９株は、ピメリン酸（３３μｇ／ｍｌ）を含有するビオチン不含培地で野生型レベルにまで増殖した。これらの結果から、ｂｉｏＩ遺伝子産物は初期のビオチン生成に関与し、この産物の不活性化は部分的にしかビオチン生産を破壊しないことが確かめられた。
【００６１】
実施例ＩＶ：  ビオチンオペロンの調節機構の分析
分かれて存在している大腸菌のｂｉｏオペロン、ｂｉｏＡＢＦＣＤの転写は、ｂｉｒＡ遺伝子座によってコードされたリプレッサーが関与する古典的なリプレッサー／オペレーター機構によって調節されている［  Ｃｒｏｎａｎ，  Ｃｅｌｌ  ５８，  ４２７−４２９  （１９８９）］。このリプレッサーは、ＣＯＯＨ末端にホロ酵素シンセターゼ活性を有する二機能性の分子で、この活性によって、ビオチンのアポカルボキシラーゼ酵素への転移に先立って、ビオチンがそのアデニル化形態であるビオチノイル−ＡＭＰに転化される。ビオチノイル−ＡＭＰは、コリプレッサーとしても機能し、リプレッサー／ビオチノイル−ＡＭＰ複合体が、２つの分かれて存在するプロモーターの−１０領域と重なりあったオペレーター部位に結合することによって、転写が阻止される。
【００６２】
野生型のｂｉｏオペロンの５’プロモーター／調節領域を、数種の強力で構成的な枯草菌のプロモーターの１種で置き換える（実施例ＶＩＩ参照）ために、野生型のｂｉｏオペロンのこの領域の特性決定を行った。枯草菌のｂｉｏオペロンの転写開始部位である可能性が最も高いのは、オペロンの１つ目の遺伝子であるｂｉｏＷの約８４ｂｐ上流に位置するσＡ  プロモーター、Ｐｂｉｏ  である（図４）。実際のｍＲＮＡの開始部位は、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスの終わりから３−４ｂｐ下流に位置する２つのアデノシンヌクレオチドの一方、あるいは、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスから７ｂｐ下流に位置するグアノシンである。ＲＮＡのリーダー配列は、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏオペロンの「オペレーター」部位と高い相同性を有する３３ｂｐのセグメントを含んでいる。この領域のヌクレオチド配列と、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏＤＡＹＢオペロンの５’非コード領域の比較を図１２に示す。［図１２の記号は以下のとおり。上側の配列（Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のｂｉｏＤＡＹＢ調節領域）──１５ｂｐの調節領域：二重の太線、二回対称の領域：破線、プライマー伸長法を用いたマッピングによって決定した転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：ＲＢＳ。なお、「Ｇ」および「Ｔ」のヌクレオチドは、上下の配列を合わせるために、配列から外して表示してある。下側の配列（枯草菌のｂｉｏプロモーター領域）──上側の配列に示すＢ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  の調節領域との類似性に基づく１３ｂｐの推定上の調節領域：一重の太線、推定上の転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：ＲＢＳ。なお、「Ｃ」のヌクレオチドは、上下の配列を合わせるために、配列から外して表示してある。］
保存されているヌクレオチドの大半は、互いに９ｂｐのセグメントによって隔てられた（１３ｂｐと１１ｂｐの）２つの部位にかたまっている。この知見から、枯草菌のｂｉｏ遺伝子の転写がリプレッサー／オペレーター機構によって調節され、この機構には、ｔｒｐオペロンの近くに位置するｂｉｒＡに類似した遺伝子が関与している可能性があることが示唆される（実施例ＩＸ参照）。ｂｉｏＷの上流に位置するプロモーターの活性および調節については、ｌａｃＺとｂｉｏＷ（Ｐｂｉｏ  および推定上の調節領域を含む）との翻訳融合物が、ビオチンによって調節されたβ−ガラクトシダーゼの発現を示すことによって確認した（実施例Ｖ参照）。
【００６３】
５’ＲＮＡリーダーは、オペレータ領域と重なりあった、大型で安定した潜在的なステム−ループ構造（ΔＧ＝−１４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を含んでいる。
ｂｉｏＷの上流にＰｂｉｏ  および調節部位が特定されたことからして、枯草菌のｂｉｏ遺伝子は、約７２００ｂｐの単一のポリシストロン性のメッセージとして転写される。また、ｂｉｏオペロンの内側の領域には、二次プロモーターである可能性のある部位も存在している。たとえば、ｂｉｏＩには、コンセンサスσＡ  プロモーター配列と多少類似した、ＴＴＧＡＡＡ−−１７ｂｐ−−ＴＣＴＴＡＴの配列（配列番号６および図１６、番号６２５８−６２８６）が存在している（ｂｉｏＩの開始コドンの約７７５ｂｐ下流）。こうした配列が内部プロモーターとして機能しているのか否かは、ｂｉｏオペロンの内側の部分から得た制限断片を使用して、ｌａｃＺとの翻訳融合物を構築することによって決定することができる（実施例Ｖ参照）。ビオチンの生産は、一次あるいは二次プロモーターの１つ以上を修飾することによって最適化することができる。
【００６４】
ＩＶＡ．  ｂｉｏ−ｌａｃＺ翻訳融合物の構築と分析
ｌａｃＺとの翻訳融合物を構築して、推定上のプロモーター／調節領域の活性ならびに調節を確認し、枯草菌のビオチンオペロンの各種条件での相対的な発現レベルを評価した。この作業は、プロモーターを含まないｌａｃＺコード領域を含む３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢＩＯ３５０のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＢＩＯ３９７およびｐＢＩＯ３９８を得ることによって行った。これらの同一であることが推定される２つのプラスミドは、ｂｉｏＷとｌａｃＺのイン・フレームの「翻訳」融合物を、低コピー数のプラスミド上に含んでいる。ｐＢＩＯ３９７とｐＢＩＯ３９８は、Ｘ−ｇａｌ指示平板上でｌａｃＺ−  大腸菌を淡青色とし、大腸菌ではこの融合が比較的低レベルで発現することが示唆された。
【００６５】
ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物の、枯草菌中でのビオチン調節性の発現を調べるために、Ｂｉｏ＋  部分二倍体を構築した。ｌａｃＺ遺伝子の下流に位置するポリリンカー領域内に位置する単一のＳｍａＩ部位を使用して、ｐＢＩＯ３９７にｃａｔカセットをクローニングした。ｃａｔ遺伝子が翻訳融合物と同一方向を向いている組換えプラスミドの一つ、ｐＢＩＯ３９７ｃａｔを使用して、Ｂｉｏ＋  部分二倍体を作製した。このｐＢＩＯ３９７ｃａｔで、原栄養株の枯草菌ＰＹ７９株のコンピテントな細胞を形質転換し、Ｃｍｒ  について選択した。形質転換体が生じるのは、染色体への組換えが生じた場合のみのはずである。この方法をとると、ｂｉｏオペロンの無傷のコピーが残り、ビオチンを加えなくてもｌａｃ融合物の活性を評価することが可能となる。
【００６６】
ｐＢＩＯ３５０にクローニングしたＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片のプロモーターは、ビオチンによって調節される。ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＣｍｒ  Ｂｉｏ＋  部分二倍体の２菌株のβ−ガラクトシダーゼ活性を、ビオチンを含まない培地中で、ビオチン（１００μｇ／リットル）の存在下ならびに不在下で調べた。液状ＯＮＰＧ検定では、両菌株ともビオチンによって特異的に調節された。β−ガラクトシダーゼのレベルは、ビオチンが存在すると抑制され、ビオチンが存在しないと２４−８５倍の高い比活性が誘導された（表３）。ｂｉｏオペロンにｂｉｏＷ：：ｌａｃＺ融合物を組込んだこの菌株は、新規なビオチン類似物耐性変異株（後述）をＸ−ｇａｌ指示平板上で単離する際にも使用した。
【００６７】
【表３】
0003593146.tif 000004
【００６８】
ＩＶＢ．  ＳＰβ担持ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ翻訳融合物の構築と分析
実施例ＩＶＡのｌａｃＺ融合株に加えて、他の菌株を構築して、ビオチンの調節機構を解明することもできる。一例を挙げると、本発明者らは、ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物をプラスミドに担持させて染色体に挿入すると、組込まれたプラスミドのコピー数が増幅するので技術的な問題を生じることに気づいた。そこで、ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を修飾ＳＰβ特殊形質導入用ファージに導入することによって、単一コピー数の該融合物をｂｉｏオペロンとは異なった部位で発現させることを試みた［たとえば、Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９，  ２２２３−２２３０  （１９８７）  参照］。
【００６９】
ＰＹ７９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）ならびにＢＩ４２１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の２つの単離物を、上述のようにしてβ−ガラクトシダーゼ活性について検定した。結果を表３に示す。
Ｂｉｏ＋  の菌株であるＰＹ７９では、ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺの発現は極めて低レベルであったが、ビオチン特異的な調節を示した。β−ガラクトシダーゼはビオチンの存在下では抑制され、ビオチンの不在下では約９−１５倍誘導された。２コピー以上のプラスミド上に担持されたｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＰＹ７９について行った上述の検定と比べると、単一コピーの融合物によって生産されるβ−ガラクトシダーゼは、抑制成育条件では３倍少なく、抑制解除成育条件では約２０倍少ないことが示された。枯草菌のｂｉｒＡ株（ＢＩ４２１、実施例ＸＢ参照）では、該融合物の構成的な発現が低レベルであるのが観察された。ｂｉｒＡ株でのβ−ガラクトシダーゼのレベルは、抑制解除成育条件で成育させたＰＹ７９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）で観察されるレベルよりわずかに高い程度であった。ＢＩ４２１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の単離物の一つでは、ビオチンがβ−ガラクトシダーゼの発現をわずかに抑制し、このｂｉｒＡ変異がビオチンによる該融合物の調節を完全に解除するものでない可能性が示唆された。こうした結果から、ｂｉｏＷの発現がビオチンによって調節されていることが確認された。
【００７０】
ビオチンによる調節を、互いに独立に単離した２種のビオチン類似物耐性変異株についても調べた。ＨＢ３は自発性のｂｉｒＡ変異を含んでおり、α−ＤＢ９は、ｂｉｏともｂｉｒＡともリンクしていないα−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる。これらの菌株の形質導入、成育、検定を、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の検定を中間指数増殖期に行った以外は上述の通りにして行った。表３に示すように、該融合物を含むＨＢ３株は、低レベルの構成的なｌａｃＺの発現を示した。しかし、ｂｉｒＡ変異株の場合とは異なり、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）は、ビオチン調節性のｌａｃＺの発現を示した。
【００７１】
実施例Ｖ：  枯草菌のｂｉｏ遺伝子を含む大腸菌株からのビオチンならびにビオチンビタマーの分泌
本発明者らは、相補性検定の間に、ｐＢＩＯ２０１を含む大腸菌のｂｉｏＡ変異株が、対照プラスミドであるｐＢＲ３２２を含む同一菌株を栄養共生させうることを観察した。このことは、ｐＢＩＯ２０１を含む菌株によって合成されたビオチンが培地中に分泌され、Ｂｉｏ−  株によって代謝されたことを実証するものである。そこで本発明者らは、新たに構築した各種のプラスミドについて、ビオチンならびにビオチンビタマーを培地中に分泌する能力を調べた。
【００７２】
大腸菌のＭＭ２９４株およびＪＭ１０９ｌａｃＩＱ  株（両菌株ともｂｉｏ遺伝子については野生型）を、ｐＢＲ３２２、ｐＢＩＯ２０１、ｐＵＣ１９、およびｐＢＩＯ２８９（下記の実施例ＶＩに記載）で形質転換した。ｐＢＲ３２２およびｐＢＩＯ２０１による形質転換体は、２％のグルコースを含む最少培地で成育させた。ｐＵＣ１９およびｐＢＩＯ２８９による形質転換体は、液体最少培地では十分に成育しなかったので、２％のグリセロールを含む富栄養培地で成長させた。４８時間後に、遠心分離によって細胞を除去し、残りの生きた細胞はクロロホルムで死滅させた。上清を、０．５％のグルコースおよび５ｍｇ／ｌのチアミンを加えたディフコ（Ｄｉｆｃｏ）  社製ビオチン検定用培地（Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｄｉｕｍ）の１０倍希釈物を用いて順次希釈し、後述する大腸菌Δ（ｍａｌ−ｂｉｏＨ）および大腸菌Δ（ｂｉｏＡ−Ｄ）を成長させうるか否かについて調べた。ビオチンならびにデスチオビオチンの連続希釈液から、標準曲線を作成した。この検定は１μｇ／リットルに対して感受性であった。
【００７３】
これらの検定の結果を表４に示す。枯草菌のｂｉｏ遺伝子をコードするプラスミドを含む菌株がビオチンを分泌するのに対し、対照プラスミドを含む菌株はビオチンを分泌しなかった。このことから、枯草菌のビオチンオペロン（ｐＢＩＯ２８９）を含む大腸菌の菌株が、高レベルのビオチンおよびビオチン前駆体を分泌しうることが実証された。
【００７４】
【表４】
0003593146.tif 000005
【００７５】
この検定は、他の菌株、たとえば枯草菌の菌株、あるいは他のプラスミドによって生産されるビオチンやビオチン前駆体のレベルを調べる際にも使用することができる。候補の菌株は、機能的なビオチンオペロンを有しているプラスミドを用いて形質転換してから調べる。また、候補のプラスミドは、ビオチンを分泌することがわかっている菌株で調べる。
【００７６】
実施例ＶＩ：  「最小」ｂｉｏサブクローンの構築
最小サブクローンは、もともとの一次クローン（たとえば、ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１）が有していた関連機能のすべてをコードしている。「最小」サブクローンを構築したのは、欠失地図の作成ならびにＤＮＡの配列情報から導出したｂｉｏ遺伝子の位置を確認し、転写ターミネーターの下流側からＥｃｏＲＶ部位の右側までのオープン・リーディング・フレーム（図５参照）がビオチンの生合成に際して不要であることを確認するためである。
【００７７】
ｐＢＩＯ２０１（ｂｉｏＷ遺伝子以外のｂｉｏ遺伝子であると考えられるオープン・リーディング・フレームをすべて含む）のＥｃｏＲＶ（部分）からＢａｍＨＩまでの断片を、ｐＵＣ９［Ｖｉｅｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｇｅｎｅ  １９，  ２５９−２６８  （１９８２）］のＳｍａＩからＢａｍＨＩまでの骨格に挿入して、ｐＢＩＯ２８９を構築した。ｐＢＩＯ２８９のｂｉｏ遺伝子は、いずれもｐＵＣ９のｌａｃプロモーターより下流に位置しており、ｐＵＣ９はｐＢＲ３２２（ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１の親）より高コピー数に保持されているので、ｐＢＩＯ２８９は、大腸菌宿主中では、ｐＢＩＯ２０１およびｐＢＩＯ１００より高レベルでｂｉｏ遺伝子を発現すると予測される。一連の同遺伝子型の大腸菌のｂｉｏ変異株をｐＢＩＯ１００、２０１、および２８９ならびにｐＢＲ３２２（対照）で形質転換した。各形質転換体について、ビオチン欠乏培地での相補性を検定した。結果を表５に示す。ｐＢＩＯ２８９は、単一のｂｉｏ遺伝子が欠損したすべての変異株に対して相補性を示し、全ての関連遺伝子が推定上のターミネーターの上流に位置していることが確かめられた。ターミネーターより下流のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ３）は、個々の大腸菌のｂｉｏ変異株を相補する上で不必要である。
【００７８】
【表５】
0003593146.tif 000006
【００７９】
実施例ＶＩＩ．  全長の野生型ならびに遺伝子操作型枯草菌ビオチンオペロンの構築
枯草菌の染色体中に組込んで増幅させるための遺伝子操作型の全長のｂｉｏオペロンを構築する実験について以下に説明する。
【００８０】
ＶＩＩＡ：  全長の野生型ｂｉｏオペロンの再構築
大腸菌中で作動するためには、枯草菌のビオチンオペロンの５’末端を低コピー数でクローニングする必要があることがわかったので、枯草菌の染色体中に組込むための完全な遺伝子操作型ビオチンオペロンを構築するにあたっても、低コピー数のプラスミドを使用した。さきに説明したように、枯草菌のビオチンオペロンの５’末端を、１細胞当たり約５−１０コピーで存在する低コピー数のプラスミドであるｐＣＬ１９２１（Ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  １９９０，    前掲）  中に、３ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングして、ｐＢＩＯ３５０を得た。
【００８１】
次に、ｐＢＩＯ２０１から得たｂｉｏオペロンの３’部分をｐＢＩＯ３５０に付加することによって、全長のビオチンオペロンを再構築した。ビオチンオペロンの大半ならびに約３ｋｂの下流側のＤＮＡを含む、ｐＢＩＯ２０１から得た１０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩならびにＥｃｏＲＩで開裂させておいたｐＢＩＯ３５０に連結した。得られた、正しい予測通りの構造を有していた２種のプラスミドを、ｐＢＩＯ４００ならびにｐＢＩＯ４０１と称した。ｐＢＩＯ４０１は、ΔｂｉｏＡ−Ｄ変異株をはじめとするすべての公知の大腸菌のｂｉｏ変異株に対して相補性を示す。ｐＢＩＯ４０１をΔｂｉｏＡ−Ｄ株での相補性によって選択し、富栄養培地で生育させたところ、このプラスミドは十分に安定で、使用可能量のプラスミドＤＮＡを得ることができた。ｐＢＩＯ４０１が有しているスペクチノマイシン耐性遺伝子が枯草菌では発現されないので、ｐＢＩＯ４０１のＥｃｏＲＩ部位にｃａｔカセットを加えて、当業者に公知の方法で枯草菌の野生型あるいは調節解除型の菌株での選択、組込み、増幅を行うことができるようにし、プラスミドｐＢＩＯ４０１ｃａｔｓ  を得た。
【００８２】
ｂｉｏコピー数の増大がビオチンの生産に及ぼす影響を調べるために、単一コピーのｃａｔカセット（５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐性）と全ｂｉｏオペロンとを含むｐＢＩＯ４０１ｃａｔｓ  を、枯草菌の野生型株ならびにビオチン調節解除型株の染色体に組込んだ。プラスミドのコピー数は、６０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上で選択を行うことによって増幅させ、それによってビオチンの生産量を増大させた。
【００８３】
ＶＩＩＢ：  遺伝子操作型ｂｉｏオペロンの構築
枯草菌の染色体に組込むための遺伝子操作型の調節解除ビオチンオペロンを構築するにあたっては、唯一の制限部位を、転写シグナル、調節部位、ならびにコード領域の間に挿入して、種々の要素や対立遺伝子を交互にたやすく導入できるようにしておくのが有利であった。また、唯一の制限部位は、こうした構築物内で遺伝子操作したビオチンオペロンを挟むためにも使用され、これにより染色体への組込みに先立って、大腸菌由来のベクター配列を取り除くことができる。
【００８４】
本発明者らは、強力で構成的なプロモーターを有する遺伝子操作による枯草菌のｂｉｏオペロンを構築する作業が容易ならざる作業であることを見いだした。オペロンを強力で構成的なプロモーター、たとえばＳＰ０１−１５あるいはＳＰ０１−２６プロモーターによって転写する場合、枯草菌のビオチンオペロンの全体を大腸菌の単一のプラスミド上に維持しておくことは、たとえ低コピー数のプラスミドの場合であっても不可能であった。もっと別の新規な戦略を開発して、遺伝子操作によるｂｉｏオペロンの全体を含む増幅可能なＤＮＡ断片を枯草菌の染色体に導入する必要があった。そこでまず、クローニングと遺伝子操作の目的で、オペロンを２つの別々の断片である５’カセットならびに３’カセットとして操作した。次に、ＤＮＡの操作が終了した時点で、適当な５’カセットならびに３’カセット由来の関連ＤＮＡ断片を連結し、この連結したカセットで枯草菌を直接形質転換した。連結は、得られた環状あるいはコンカテマー状の分子が染色体中の相同な配列と組換わって、ベクター配列を伴う場合でも伴わない場合でも、操作したＤＮＡが増幅可能なかたちで挿入されるように行った。
【００８５】
プラスミドは、遺伝子操作型のｂｉｏオペロンを含む構築物を開発する際の骨格ベクターとして使用するべく構築した。これらのプラスミドは、低コピー数のプラスミドであるｐＣＬ１９２０（Ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  １９９０，    前掲）  に基づくものであった。ｐＣＬ１９２０中のポリリンカーを、ＮｏｔＩ部位で挟んだポリリンカーで置き換えた。ｐＣＬ１９２０中に存在するｌａｃプロモーターも、単純化の目的で除去した。ｌａｃプロモーターとポリリンカーを含む断片は、ＥｃｏＲＩを用いて取り除いた。ｐＳＣ１０１の複製起点と、スペクチノマイシンに対する耐性をコードしているオメガ断片を含む骨格を、ＮｏｔＩリンカーの存在下で再度環状として、ｐＢＩＯ１２１を得た。プラスミドｐＪＧＰ４０は、ＮｏｔＩ部位によって挟まれたポリリンカーにクローニングされたカナマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２の誘導体である。このｐＪＧＰ４０から得たカナマイシン耐性をコードするＮｏｔＩ断片を、ｐＢＩＯ１２１のＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＢＩＯ１２４を得た。２つの向きを「ａ」および「ｂ」で示す（図１３）。双方のｐＢＩＯ１２４誘導体をＡｓｐ７１８Ｉで消化し、再度連結したところ、カナマイシン耐性要素が取り除かれて完全なポリリンカーが残り、プラスミドｐＢＩＯ１２６ａならびにｐＢＩＯ１２６ｂが得られた。
【００８６】
ＶＩＩＢｉ：  ５’カセットの遺伝子操作
ｂｉｏオペロンの５’末端のどの機能的要素を唯一の制限部位によって分離するべきであるのかを考慮するにあたって、最も重要な要素は、１）推定上のビオチンプロモーターの上流に位置する推定上のステム−ループ終結部位、２）推定上のプロモーター−オペレーター−リーダー領域、ならびに３）ｂｉｏＷのリボソーム結合部位、開始コドン、および５’コード領域であった。図１３に示すように、我々の戦略では、ＰＣＲによってビオチンプロモーターの上流のターミネーターから７０ｂｐ上流に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位を導入した。ターミネーターをプロモーター−オペレーター領域から分離するために、この領域のＣｌａＩ部位をＸｈｏＩ部位にかえた。ｂｉｏＷのリボソーム結合部位の上流に位置するＥｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂａＩ部位にかえて、プロモーター−オペレーター−リーダー領域が、リボソーム結合部位−開始コドン断片から分離するようにした。図１４に、使用したすべてのＰＣＲプライマーとその向きが記載してある。表６には、ＰＣＲによって作製した断片が列挙してある。１）５’のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位を導入し、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂａＩ部位にかえるＰＣＲ断片Ｅ、２）Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂａＩ部位にかえ、ｂｉｏＷのＢａｍＨＩ部位まで伸長するＰＣＲ断片Ｂ、および３）ｐＢＩＯ１２６ＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化物、との３つの連結反応を行ったところ、プラスミドｐＢＩＯ１３９が得られた。ＰＣＲ断片Ｃ、ＰＣＲ断片Ｄ、ならびにＳａｌＩとＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１３９、との第二の３つの連結反応によって、ＣｌａＩ部位がＸｈｏＩ部位となり、初期構築を完了し、プラスミドｐＢＩＯ１４４を得た。ｐＢＩＯ１４４は、ｂｉｏオペロンの修飾した野生型５’末端を含んでおり、プロモーター／オペレーター領域の上流のＣｌａＩ部位が唯一のＸｈｏＩ部位に、そしてこの領域のすぐ下流のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位が唯一のＸｂａＩ部位に置換されている（図１４）。ＳａｌＩ部位からＢａｍＨＩ部位までのｐＢＩＯ１４４の予測されるＤＮＡ配列を確認した。
【００８７】
ＶＩＩＢｉｉ：  遺伝子操作型３’ｂｉｏカセット
ＮｏｔＩで挟まれたポリリンカーを有する低コピー数プラスミドであるｐＢＩＯ１２６Ａで、３’カセットを構築した。ｐＢＩＯ１２６Ａを、組込みならびに増幅用のベクターとして使用可能とするために、ｐＨＷ９［Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．    １５０，  ８１５−８２５  （１９８２）  ］から得たｃａｔ遺伝子のＰＣＲ断片をＢｓｔＢＩ部位に導入して、プラスミドｐＢＩＯ１４６Ａを得た。このｐＢＩＯ１４６Ａのポリリンカーに、ｐＢＩＯ２０１（実施例ＩＣ）およびｐＢＩＯ２８９（実施例ＶＩ）から得たＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をクローニングして、プラスミドｐＢＩＯ１５１およびｐＢＩＯ１５２をそれぞれ得た。この２種のプラスミドは、ｂｉｏオペロンに付随する３’フランキング配列の量が異なっている。
【００８８】
ＶＩＩＣ：  構成的なプロモーターによる遺伝子操作型ｂｉｏオペロンの調節
各種の構成的なプロモーター、たとえばＳＰ０１バクテリオファージから得たプロモーター、具体的にはＳＰ０１−２６あるいはＳＰ０１−１５［Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｏ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５２，  ２４７−２６５  （１９８１）  ］を、ＸｈｏＩ部位とＸｂａＩ部位の間のｂｉｏプロモーター／オペレーター領域のかわりに加えることができる。この場合、枯草菌の染色体への組込みおよび増幅が行われると、ビオチンオペロン全体の発現を構成的プロモーターから誘導しうるベクターが得られることとなる。その結果、ビオチンの生産が実質的に向上する。
【００８９】
【表６】
0003593146.tif 000007
【００９０】
ＶＩＩＣｉ：  ＳＰ０１−２６プロモーターを有する５’カセットの構築
遺伝子操作による「野生型」プロモーターから得たＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片を、ＳＰ０１−２６プロモーターを含むＰＣＲ断片で置換することによって、ＳＰ０１−２６プロモーターがビオチンオペロンに読み取られる５’カセットを構築した。このＳＰ０１−２６プロモーターを含むＰＣＲ断片は、クローニングしたＳＰ０１−２６プロモーターのｐＵＣ８サブクローンであるｐＮＨ２０１［Ｌｅｅ，  Ｇ．，  Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｐｅｒｏ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １８０，  ５７−６５  （１９８０）］から作製したものである。使用したプライマー（ＸＨＯ２６ＡおよびＸＢＡ２６Ｂ、表６Ａ）によって、プロモーターの上流側にＸｈｏＩ部位が導入され、プロモーターの下流側にＸｂａＩ部位が導入された。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したＰＣＲ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１４４と連結し、この連結したＤＮＡで、大腸菌ＹＭＣ９を形質転換した。Ｓｐｅｃｒ  形質転換体から得たプラスミドのミニプレップを、ＳＰ０１−２６プロモーター領域内に位置するＥｃｏＲＶ部位が獲得されているか否かについてスクリーニングした。次に、予測されるＥｃｏＲＶ部位を示すプラスミドを、プライマーＸＨＯ２６ＡおよびＢＩＯＷ１を使用してＰＣＲによってスクリーニングして、ＳＰ０１−２６プロモーターと５’ｂｉｏＷ断片が並んでいることを確認した。正しい構造を有していた２つのプラスミドｐＢＩＯ１５８およびｐＢＩＯ１５９は、いずれも予測される配列を有していた。
【００９１】
ＶＩＩＣｉｉ：  ＳＰ０１−１５プロモーターを有する５’カセットの構築
ｐＢＩＯ１４４にクローニングするのに適した末端を有する、ＳＰ０１−１５プロモーター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）を含むＤＮＡ断片も、ＰＣＲによって作製した。プライマー（ＸＨＯ１５ＢおよびＸＢＡ１５Ｃ、表６Ａ）を選択して、ＳＰ０１−１５プロモーターがＸｈｏＩ（上流）とＸｂａＩ（下流）で挟まれた断片を作製した。ＳＰ０１−１５からの転写物のはじめの方にも、潜在的なステム−ループ構造が存在している。下流のプライマーも、ｂｉｏｍＲＮＡの新たな５’末端に位置する潜在的なステム−ループ構造が伸長して、ＳＰ０１−１５プロモーターによって開始される転写物の＋１塩基を包含するよう設計した。ＳＰ０１−１５を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１４４に連結した。この連結ＤＮＡで大腸菌を形質転換して、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１６９を作製した。ｐＢＩＯ１６８とｐＢＩＯ１６９は同一の単離物で、ともにＳＰ０１−１５プロモーターを有する５’ｂｉｏカセットを含んでいる。
【００９２】
0003593146.tif 000008
【００９３】
ＶＩＩＣｉｉｉ：  全長遺伝子操作型「野生型」ｂｉｏオペロンの構築と組込み
上述の各種の遺伝子操作型５’ｂｉｏカセットから得たＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｂｉｏオペロンの３’末端と選択可能なｃａｔ遺伝子とを含むｐＢＩＯ１５１およびｐＢＩＯ１５２（実施例ＶＩＩＩ（ｂ）（ｉｉｉ）、上述）のＳａｌＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に導入することによって、全長遺伝子操作型ビオチンオペロンを構築した。大腸菌株ＲＹ６０７（Δｂｉｏ）をＢｉｏ＋  とする相補性によって、適当な形質転換体を選択した。たとえば、ｐＢＩＯ１４４の「野生型」の遺伝子操作型５’ビオチンオペロンから得たＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＩＯ１５１に導入すると、全長野生型ｂｉｏオペロンを３’フランキング領域とともに含み、ビオチンオペロンと同一方向を向いたｃａｔ遺伝子を含むｐＢＩＯ１５５が得られた。ｐＢＩＯ１４４から得た同じ５’断片をｐＢＩＯ１５２に連結したところ、ｐＢＩＯ１５５と同じ特徴を有するものの、ｂｉｏオペロンの下流の３’フランキング領域を欠くｐＢＩＯ１５６が得られた。
【００９４】
プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５６を、プラスミド全体のまま、あるいは大腸菌のベクター配列を欠失させて、枯草菌に組込んだ（表７）。枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、およびＨＢ３株（ＢＩ４２１とＨＢ３はｂｉｒＡ突然変異体、実施例Ｘ参照）を、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５６で形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを選択した。組込んたプラスミドの増幅は、クロラムフェニコールのレベルを段階的に上昇させた複数の平板上に各菌株を線状に接種していくことによって行った（表７、菌株ＢＩ２２８、２３０、２３５、２３７、２４３、および２４５）。
【００９５】
野生型ビオチンオペロンの増幅されたコピーを含むものの、大腸菌の配列は含まない菌株を構築するべく、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５６をＮｏｔＩで消化した。それぞれの消化物の大きいほうの断片を環状として、枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、およびＨＢ３株の形質転換に使用した。カセットの増幅は、クロラムフェニコールのレベルを段階的に上昇させた複数の平板上に線状に接種していくことによって行った（表７、菌株ＢＩ２３２、２３４、２３９、２４１、２４７、および２４９）。
【００９６】
ＳＰ０１プロモーターによって誘導されるｂｉｏオペロンの連結反応生成物で、枯草菌を直接形質転換した。５’カセットから単離されたＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（５’フランキング配列、プロモーター領域、および５’ｂｉｏＷ）、ならびに３’カセットから単離されたＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片（３’ｂｉｏＷ、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＩ、ＯＲＦ２、ターミネーター、３’フランキング配列、およびｃａｔ）を標準的な条件で連結して、各種の枯草菌株を形質転換するのに使用した。５’のＮｏｔＩからＢａｍＨＩまでのカセットは、ＳＰ０１−２６プロモーターを含むｐＢＩＯ１５８、あるいはＳＰ０１−１５プロモーターを含むｐＢＩＯ１６８から得たものである。３’カセットは、伸長した３’フランキング配列を含むｐＢＩＯ１５１、あるいは端が切り取られた３’フランキング配列を含むｐＢＩＯ１５２から得たものである（表７、菌株ＢＩ２６７、２６８、２７４、２７６、２７８、および２８２）。
【００９７】
これらの各ＤＮＡ連結反応生成物で、野生型のＰＹ７９株を形質転換し、また場合によっては、ビオチン調節解除型のＢＩ４２１株（ｂｉｒＡ変異株、後述の実施例ＸＢ参照）を形質転換した。各菌株のコンピテントな細胞は標準的な方法によって調製し、上述の各種のｂｉｏ含有ＤＮＡ連結反応混合物で形質転換し、Ｃｍｒ  について選択した。これらのＤＮＡは枯草菌中では複製できないので、Ｃｍｒ  形質転換体が生じるのは、染色体ならびに形質転換用ＤＮＡ上に存在する互いに相同な配列の間での組換えを介して、染色体のｂｉｏ遺伝子座に連結ＤＮＡが組込まれることによるものである。各実験で、１０−５０のＣｍｒ  形質転換体を選択して、性質を調べた。形質転換体は、ＰＣＲによるスクリーニングを行って、ＳＰ０１プロモーターがｂｉｏＷと並んでいることを確認した。
【００９８】
【表７】
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【００９９】
実施例ＶＩＩＩ：  第一世代の枯草菌ビオチン産生株の特性解析
サザンブロット実験を使用して、組込んだカセットの構造を解析し、遺伝子操作型菌株の代表的なサブセットの増幅の程度を調べた。これらの実験から、ＳＰ０１プロモーターの存在が増幅の程度に有意な影響を及ぼしていることが明らかとなった。野生型のｂｉｏプロモーターを含む遺伝子操作型の全長ｂｉｏオペロンは、６０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上で成育させた菌株で、他のオペロンが類似条件で示すレベルと類似したレベルにまで増幅された（概算値、１５コピー／細胞）。しかし、ＳＰ０１−１５プロモーターにより駆動されたｂｉｏオペロンの増幅は、２倍少なく、ＳＰ０１−２６プロモーターにより駆動されたｂｉｏオペロンの増幅は、約４倍少なかった。このように、枯草菌の細胞は、ｂｉｏオペロンによってコードされた産物の少なくとも１種について、限定された耐性を有している。
【０１００】
ＶＩＩＩＡ．  試験管培養におけるビオチンおよびビオチン前駆体の産生の検定
複数コピーの野生型ｂｉｏオペロンあるいはＳＰ０１修飾ｂｉｏオペロンがビオチンの産生に及ぼす影響を調べるために、これらの遺伝子操作型ｂｉｏオペロンが染色体に組込まれ、増幅された野生型ならびにビオチン調節解除型の枯草菌株のビオチンの産生について調べた。結果を表８に示す。
【０１０１】
いずれの菌株も、５ｍｌのＶＹ培地で３７°で一晩成育させ、遠心分離を行い、上清液を５分間オートクレーブにかけて、残りの細胞をすべて死滅させた。（ビオチンとデスチオビオチンは、オートクレーブ処理に対して安定性である。）この上清液をビオチンを含まない培地に希釈し、そして大腸菌株ＲＹ６０４（ΔｂｉｏＨ）およびＲＹ６０７（ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ）を接種した。ＲＹ６０４およびＲＹ６０７は、菌株ＢＭ７０８６およびΔ（ｇａｌ−ｕｖｒＢ２１９）（Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  、前掲、Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  、前掲）の関連領域をそれぞれＭＭ２９４に形質導入することによって構築したものである。前者がビオチン上ならびにビオチンビタマー上で成育するのに対し、後者はビオチン上でのみ成育する。各種の枯草菌変異株によって産生されたビオチンとビオチンビタマーは、ＯＤ６００  での標準曲線から計算した。
【０１０２】
この検定では、野生型の枯草菌株であるＰＹ７９から、代表的には約６−１０μｇ／ｌのビオチンが得られた（表８）。これらの実験で使用したＶＹ培地は、細胞の成育以前に２０−４５μｇ／ｌのビオチンを有していた。したがって、培地から供給されたビオチンの大半が、野生型の細菌によって成育中に消費されたことになる。
【０１０３】
数種のビオチン類似物耐性の変異株が、５０−１００μｇ／ｌという、野生型株で見られたビオチンの５−１０倍のビオチンを産生した。ｂｉｒＡに似た変異を有する２種のビオチン類似物耐性株を使用した。一方の変異株であるＨＢ３は、自然発生的ホモビオチン耐性変異を含んでいる。もう一方の菌株であるＢＩ４２１は、突然変異誘発を行っていないバックグラウンドに交差させた、エチルメチルスルフェートによって生成したα−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる（実施例Ｘ参照）。双方の菌株とも、これらの実験で５０−１００μｇ／ｌのビオチンが得られた（表８および９）。
【０１０４】
ｂｉｏオペロンの「野生型」のコピーを野生型株ＰＹ７９に組込んで増幅させると、ビオチンの産生量が、ＰＹ７９単独の場合に見られる量の１０−５０倍に向上した（表８）。かかる菌株（ＢＩ２３０およびＢＩ２３４）は、ＰＹ７９単独の場合に産生されるのが６−１０μｇ／ｌであるのに対し、１５０−６００μｇ／ｌを産生した。しかし、野生型のｂｉｏオペロンを組込んで増幅させたコピーを含むｂｉｒＡ変異株を検定したところ、さらに劇的な結果が見られた。こうした検定では、ビオチンの産生量がさらに５−１０倍向上し、ビオチンの収量が最高２，０００μｇ／ｌとなるのが観察された（ＢＩ２４１、ＢＩ２３７、ＢＩ２４９、表８参照）。
【０１０５】
ＳＰ０１プロモーターを有する遺伝子操作型のｂｉｏオペロンを含む野生型の枯草菌株を分析したところ、ビオチンの産生量が向上しており、ビオチンの力価は、野生型のｂｉｏプロモーターを含むものが１５０−６００μｇ／ｌであるのに対し、通常１０００−２０００μｇ／ｌとなっていた（ＢＩ２６７、およびＢＩ２７４、表９参照）。構成的なプロモーターを含む野生型株とｂｉｒＡ変異株とでは、ビオチン産生量の劇的な差異は見られなかった（表９）。
【０１０６】
２種目の検定では、ビオチンのインディケータとしてラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ）を用い（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ５６：  ９５−９８，  １９４４  ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をビオチンビタマーのインディケータとして用いた（Ｂａｌｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１７：  ４７９−４８５，  １９９３）。検定は、検定用の培養物に抗生物質を加えて混入による干渉を減らした以外は、記載のとおりにして行った。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  は抗生物質の大半に対して感受性であるので、自然発生のストレプトマイシン耐性変異株であるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｓｔｒ３を選択し、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンの存在下でビオチンの検定に使用した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはもともと大抵の抗菌性化合物に対して耐性であり、この場合も、５０μｇ  ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンの存在下で使用した。ビオチンに対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの成育応答は（約５０倍の希釈範囲については）、大腸菌の成育応答より穏やかに減少する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、大腸菌よりＤＡＰＡおよびＫＡＰＡに対する応答性が高い。
【０１０７】
ラクトバシラスをインディケータとして培養物のビオチン産生量を検定すると、より正確なレベルを測定することができた。こうした条件を使用したところ、遺伝子操作型のＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する枯草菌株は、野生型のｂｉｏオペロンの増幅コピーを有する調節解除型の枯草菌株のほぼ２倍ものビオチンを産生していた（表１０）。
【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
【表１０】
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【０１１１】
ＶＩＩＩＢ：  ビオチンならびにビオチン前駆体の大量生産についての各種菌株の評価
遺伝子操作型のビオチン産生株のビオチンならびにビオチン前駆体の大量生産については、発酵技術を使用することによって評価を行うことができる。発酵槽ならびに培地条件は、一連の各種のものを用いることが可能である。一例をあげると、以下の発酵はいずれも、コンピュータ制御の１４リットルのチェマップ（Ｃｈｅｍａｐ）発酵槽で、ＤＯ（溶存酸素）制御、グルコース制限、流加培養発酵戦略を使用することによって実施した。ビオチンならびにビオチン前駆体の産生量の測定は、オートクレーブ処理した無細胞ブロスの逐次希釈液に、上述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  あるいはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの適当な菌株を接種することによって行った。培地の組成ならびに他の発酵条件を表１１に示す。
【０１１２】
各種の菌株によって産生されたビオチンならびにビオチン前駆体を表１２に示す。いずれの発酵においても、初期バッチと供給溶液の双方に１ｇ／ｌのピメリン酸を加えた。ＢＩ２８２、ＢＩ２７８、およびＢＩ２７６が、ビオチンならびにビオチン前駆体を産生するうえで最適であった。
【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
【表１２】
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【０１１５】
【表１３】
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【０１１６】
ＶＩＩＩＣ：  バイオオートグラフィーによる発酵ブロスの分析
ビオチン産生株によって分泌されたビタマーのスペクトルは、バイオオートグラフィーの技法によって検定することができる。本件では、発酵ブロスを遠心分離によって透明とし、オートクレーブ滅菌した。１μｌの上清培養液をベーカー−フレックス微晶質セルロ−ス薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）板上にスポットし、溶媒としてｎ−ブタノールと１Ｎ塩酸（６：１  ｖ／ｖ）を用いて化合物の分離を行った。乾燥後、クロマトグラフを、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドとカナマイシンを含有し、大腸菌株ＲＹ６０４（ΔｂｉｏＨ）／ｐＯＫ１２（ＫａｎＲ  ）を含浸させたビオチン不含の寒天平板上で、表面を下向きとして１時間インキュベートした。ＫａｎＲ  のプラスミドであるｐＯＫ１２［Ｖｉｅｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｇｅｎｅ  １００，  １８９−１９４  （１９９１）  ］をＲＹ６０４に加えたのは、単に抗生物質耐性を付与して検定の際の混入を減らすためである。次に、ＴＬＣ板を取り除き、寒天平板を３７°Ｃでインキュベートした。２０時間経過後に、ＴＬＣ板上のビオチンとビタマーの位置に対応する成育スポットが現れた。図１７に、ビオチンとビタマーの標品を、代表的な発酵のサンプルとともに示す。このクロマトグラフィー系で観察されたＲｆ  値を表１４に示す。この技法は、セルロースＴＬＣのかわりにペーパークロマトグラフィーを使用した場合にも用いることができる（表１４）。ビオチンとビオチンスルホキシドのみが検出されるＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−Ｄ：：ＫａｎＲ  ，Ｂｉｓ＋  ）を使用したバイオオートグラフィーと比較したところ、発酵ブロス中に実質的な量のデスチオビオチンとビオチンの双方が存在していることが示された。
【０１１７】
発酵培地にピメリン酸塩を加えると、おそらくはＫＡＰＡであるビオチンビタマーのレベルが増大した（図１７、レーンＤ）。このことは、ピメリン酸塩を加えていない同様の発酵（図１７、レーンＢ）と比べて、ＫＡＰＡ／ＢＳＯスポットが増大していることによって示された。ビオチンとビオチンスルホキシドのみを検出するＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−Ｄ：：ＫａｎＲ  ，Ｂｉｓ＋  ）を使用したバイオオートグラフィーでも、この物質が検出されたので、この物質の一部はビオチンスルホキシドであることが立証された。しかし、ＲＹ６３４を用いた際にＫＡＰＡ／ＢＳＯの位置に生成したスポットの強度は、ＲＹ６０４／ｐＯＫ１２を用いた場合に検出されるスポットの強度より有意に低かった。
【０１１８】
デスチオビオチンとＫＡＰＡが蓄積されたことは、ｂｉｏＢとｂｉｏＡによってコードされる生合成の各段階の制限を示唆するものである。こうした制限は、これらの各遺伝子の発現を増大させたり、これらの各段階の基質、補因子、あるいは共同タンパク質のプールを増大させたりすることによって解消することができる。ｂｉｏＢあるいはｂｉｏＡの発現をそれぞれ別々に増大させるには、個々の遺伝子のサブクローンあるいは個々の遺伝子のＰＣＲで得たコピーを、強力なプロモーター（ＳＰ０１、ｖｅｇ等）を有する発現ベクターに挿入し、ＤＮＡをプラスミド、たとえばｐＵＢ１１０、あるいはファージ、たとえばＳＰβを介して細胞に導入するか、あるいは染色体の非必須遺伝子、たとえばｂｐｒに直接組込めばよい。
【０１１９】
【表１４】
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【０１２０】
ＶＩＩＩＤ：  遺伝子操作型の菌株におけるｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの合成の分析
ノーザンブロット実験を選ばれた菌株について行って、ｂｉｏオペロンの転写パターンと、各種の遺伝子操作型の菌株に存在するｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの量を調べた。予測された通り、操作型菌株のすべてで、ｂｉｏオペロン全体をカバーする７ｋｂのＲＮＡ転写物が見られた。野生型ならびにｂｉｒＡ変異型の枯草菌株でも、操作型菌株より量は少ないものの、この転写物が存在していた。また、全ての菌株が、ｂｉｏオペロンの最初の５つの遺伝子をカバーする５ｋｂの転写物を、７ｋｂの転写物より多量（約８倍）に含んでおり、有意量の転写物が、ｂｉｏＢの後の潜在的な終結部位（図５）で終端していることが示唆された。ｂｉｏＷ遺伝子の大半をカバーする０．８ｋｂの小型転写物も有意量観察された。この転写物は、異化産物抑制に関与する部位のコンセンサス配列［  Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ，  Ｇ．  Ｈ．，  “  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ２１３−２１９  （１９９３）  ］と類似性を有する配列の付近で終端していた。この３種の転写物同士の相対的な比は、ビオチンの不在下で成育させた野生型株でも、野生型のｂｉｏプロモーターあるいはＳＰ０１プロモーターにより駆動されたｂｉｒＡ変異株あるいは操作型株でも同一であった。これらの各種菌株の間では、ｂｉｏ特異的なＲＮＡの総量の絶対量のみが劇的に異なっていた。野生型のプロモーターあるいはＳＰ０１−１５プロモーターを有する遺伝子操作型の第一世代の産生株は、抑制解除型の野生型細胞のそれぞれ約３０倍あるいは６０倍のｂｉｏ特異的ＲＮＡを産生した。ｂｉｒＡ変異株のｂｉｏ特異的ＲＮＡのレベルは、抑制解除型の野生型細胞のＲＮＡレベルよりわずかに（２−３倍）高いのみであり、ビオチン上で成育させても影響を受けなかった。
【０１２１】
こうした実験から、ＳＰ０１プロモーターが、オペロン１個当たりについて、野生型のｂｉｏプロモーターの少なくとも４倍のＲＮＡの合成を支配していることが示唆された。しかし、ＳＰ０１−ｂｉｏオペロンのコピー数が少ない場合には、ｂｉｏ特異的なＲＮＡの総量は、十分に増幅された野生型オペロンの場合に観察される量のせいぜい２倍にとどまった。ＲＮＡのレベルはビオチンの産生レベルと相関しており、遺伝子操作型の増幅されたＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する菌株は、増幅された野生型のオペロンを有するｂｉｒＡ変異株の約２倍のビオチンを産生し、１つ以上のｂｉｏ遺伝子の発現を増大させると、ビオチンの力価が増大することが確認された。
【０１２２】
実施例ＩＸ．  枯草菌のｂｉｒＡ様遺伝子の遺伝子マッピング
枯草菌の  ｂｉｏオペロンを含有するＤＮＡクローンに加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  のｂｉｒＡ調節遺伝子の高温感受性変異を相補する、枯草菌の染色体ＤＮＡを含む、２つの組換えプラスミド、ｐＢＩＯ１１３およびｐＢＩＯ１１４が回収された。ｂｉｒＡ遺伝子産物は大腸菌のなかで、アポ酵素にビオチンを付加する酵素として、またビオチン生合成遺伝子の発現に対し負の調節を行う、リプレッサータンパク質として機能している。
【０１２３】
ｂｉｒＡ−相補性遺伝子の枯草菌染色体上の位置を、ＰＢＳ１を用いた普遍的な形質導入によってマッピングした。これを行うために、ｂｉｒＡ遺伝子座近傍に選択可能な抗生物質耐性マーカー、ｃａｔ  をもつ枯草菌株を作製した。次いで、染色体上の  ｃａｔの遺伝子座を決定することによって、ｂｉｒＡ相補性ＤＮＡのマッピングを行った。ｃａｔ  カセット（ｐＭＩ１１０１から得られた［Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  １２，  １−９  （１９８４）］）  を含むｐＢＩＯ１１３の誘導体を構築し、この組込み型ベクターを枯草菌の染色体に導入した。ｐＢＩＯ１１３のクローン化した７．０ｋｂの挿入物は、枯草菌染色体の対応するセグメントと相同なので、Ｃａｍｐｂｅｌｌ組換え［Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ａｄｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １１，  １０１−１４５  （１９６２）］による  ｃａｔ含有ｐＢＩＯ１１３の染色体への組込みによってｂｉｒＡの近傍にｃａｔ  遺伝子が導入された。標準のＰＢＳ１−形質導入マッピングを用いて、  ｂｉｒＡ  −相補性遺伝子は染色体の  ２０２°領域、ｔｒｐ  座に非常に近い位置（＞９０％の連鎖）  にマッピングされた。
【０１２４】
実施例Ｘ．ビオチン生産について調節解除された枯草菌宿主株の構築
ＸＡ．  ビオチン類似体耐性株
ビオチン生産について調節解除された株を選択するために、ビオチン類似体を用いた。探索した変異のなかには、大腸菌ｂｉｒＡ遺伝子と相同性をもつ可能性のある遺伝子に生じた変異があった。しかし、ビオチン類似体に対する耐性による選択はまた、ｂｉｒＡのオペレーター部位に変異をもつ株、または細胞内への類似体の輸送にかかわる機能をコードする遺伝子に変異をもつ株を生ずることが期待される。類似体耐性変異株はまた、これだけに限るものではないが、フィードバック阻害剤を含む阻害剤に耐性の酵素をコードする一つまたは複数の遺伝子を含む。ビオチン類似体  （ホモビオチン、α−デヒドロビオチン、５（２−チエニル）  ペンタン酸）は日本ロッシュ（日本、神奈川）から得た。突然変異を誘発した枯草菌細胞は、各ビオチン類似体の結晶一個を含むＴＢＡＢ  （Ｄｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ，  カタログ番号  ０２３２−０１−９）  プレート上にまいた。
【０１２５】
枯草菌ＰＹ７９  （Ｓ．Ａ．  Ｚａｈｌｅｒ  株  ＣＵ１７６９，（ｍｅｔ  Ｂ５，  ｇｌｎＡ１００，  Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４  前掲）  から誘導した、ＳＰβのキュアリングを行った原栄養株をエチルメタンスルホネート  （ＥＭＳ）で致死率９０％になるように突然変異を誘発した。生存細胞を一夜培養し、培養液の０．１ｍｌをＴＢＡＢプレートにまいた。２つのビオチン類似体の結晶をプレート上に置き、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。α−デヒドロビオチンと５（２−チエニル）ペンタン酸の結晶は枯草菌の増殖を阻止し、結晶周辺に阻止ゾーンを形成した。阻止ゾーンのなかにビオチン類似体耐性株である可能性をもつ、独立のコロニーが出現した。
【０１２６】
α−デヒドロビオチンと５（２−チエニル）ペンタン酸のまわりの阻止ゾーンからとり出したコロニーは、α−デヒドロビオチンのゾーンから選択したものについてはＤＢ−１からＤＢ−４まで、また５（２−チエニル）ペンタン酸から選択したものについてはＴＰ−１からＴＰ−３までというように命名した。単離したコロニーは、各々の類似体のさまざまな量を含む最少カザミノ酸プレートにストリーク  （線状に塗布）  した。これらの株は野生株よりもそれぞれの類似体をもつプレート上でよりよく成育した（  すなわちより大きなコロニーを形成した）。
【０１２７】
さらに類似体ホモビオチン（ＨＢ）およびα−デヒドロビオチン（α−ＤＢ）  に対する耐性についての、同様のプレートスクリーニングによって、２７の変異株を選択した。この後者の選択においては、枯草菌ＰＹ７９培養物のＥＭＳによる突然変異誘発は２つの独立の実験によって行われた。最初の突然変異誘発ＥＭＳ１の細菌に対する致死率は９６％であったのに対し、第２のＥＭＳ２は８２％であった。ＰＹ７９、ＥＭＳ１、ＥＭＳ２の富栄養培地での一夜培養物をＴＢＡＢ  （富栄養）  、ＢＩＯＳ  （ビオチン不含）  またはＭＩＮ  （グルコース最少）  プレートにまき、ホモビオチンまたはα−デヒドロビオチンの結晶をそれぞれのプレート上に置いた。２４時間後、いくつかの耐性コロニーの増殖がみられる、阻止ゾーンの形成が観察された。独立のコロニーをホモビオチンプレートまたはα−デヒドロビオチンプレートからとりだし、α−デヒドロビオチンまたはホモビオチンを含むＢＩＯＳプレート上に再びストリークした。
【０１２８】
リプレッサーまたはオペレーター欠損変異をもつ可能性のある変異株を、測定可能なレベルのビオチンを分泌する能力によってスクリーニングした。各変異株を、ビオチンまたはビオチンビタマー産生能について試験した。各株をＶＹ培地  （５ｍｌ；２０ｇ／ｌの  Ｄｉｆｃｏ子ウシ浸出肉汁および５ｇ／ｌ  Ｄｉｆｃｏ酵母抽出液）  で３７℃、１８−２４時間培養し、上清を滅菌的にろ過した。ろ過して得た上清をビオチン不含培地で連続希釈し、この連続希釈培地に大腸菌株ＲＹ６０４（ΔｂｉｏＨ）  およびＲＹ６０７（ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ）  を植えつけた。前者の株はビオチンとビオチンビタマーの両方で生育したが、後者はビオチンでだけしか生育しなかった。異なる枯草菌の変異株で生産されるビオチンおよびビオチンビタマーはビオチンおよびデスチオビオチンから得られた標準曲線から計算した。コレクションのなかの、ホモビオチン耐性変異株ＨＢ３，  ＨＢ９，ＨＢ１５，およびα−デヒドロビオチン耐性変異株α−ＤＢ９，α−ＤＢ１６，α−ＤＢ１７の６変異株は約  １００μｇ／ｌの分泌されたビオチンを産生した。他の変異株はビオチンをまったく産生しないか、または産生しても１０μｇ／ｌだった。上の方法で選択された他の変異株は、７５μｇ／ｌ、  １５０μｇ／ｌまたはさらに  ２００μｇ／ｌ，  ２５０μｇ／ｌまたは  ３００μｇ／ｌを産生することが期待されうる。
【０１２９】
ＸＢ．ビオチン類似体耐性変異のマッピング
実施例ＩＸは枯草菌ｂｉｒＡ遺伝子がｔｒｐＣ２の下流わずかの位置にマッピングされることを示した。６株のビオチン分泌、類似体耐性の変異株について、この変異がｂｉｒＡ様のリプレッサーに位置するかどうかを決めるために、ファージ形質導入を用いてｔｒｐＣ２との連鎖をしらべた。各候補を枯草菌１６８（ｔｒｐＣ２）とかけ合わせ、Ｔｒｐ＋  の導入体をホモビオチンの存在または非存在下で最少培地にパッチした。その結果、６株の類似体耐性変異株のうちの５株（ＨＢ３，ＨＢ９，ＨＢ１５，α−ＤＢ１６，αＤＢ１７）はｂｉｒＡ座位に密接に連鎖している  （Ｔｒｐ＋  および類似体耐性が９０−９５％の頻度で同時に形質導入された）ことが示された。ＢＩ４２１はα−ＤＢ１６のｂｉｒＡ変異をもつ変異株１６８  の、ホモビオチン耐性（ＨＢｒ）  Ｔｒｐ＋  導入体である。
【０１３０】
α−ＤＢ９に保持されている、類似体耐性の６番目の変異はｔｒｐＣに連鎖しておらず、したがってｂｉｒＡの単一の変異ではない。同様な形質導入マッピングの実験（図１０参照）において、α−ＤＢ９からｂｉｏＷ：：ｃａｔ７株への形質導入によって、α−ＤＢ９の変異はビオチンオペロンに連鎖していないことが示された。したがって、α−ＤＢ９の変異株の表現型は、ｂｉｒＡとも、ｂｉｏＷＡＦＤＢＩ  とも異なる第３の部位の変異によるものか、または、類似体耐性の表現型を発現するのにそのすべてが必要とされるような、二箇所以上の座位に生じた変異によるものである。α−ＤＢ９変異はビオチンパーミアーゼ、ビオチン輸出ポンプ、またはビオチン生合成に関係する酵素に影響を与えうる。異なる座位に位置する、類似体耐性変異（ＨＢ３やα−ＤＢ９などの変異）は、菌株構築の標準的な技術によって単一の菌株に集めることができ、これによってビオチン分泌能の一段と高い株が得られる。これら類似体耐性変異株または上の手順で単離およびスクリーニングされた他の変異株は、ビオチンの過剰生産のための宿主細胞として用いることができるであろう。
【０１３１】
上に述べたように、α−デヒドロビオチンに対する耐性として単離されたαＤＢ１２およびＰＹ７９（ｐＢＩＯ３９７  ｃａｔ）のホモビオチン耐性自然発生突然変異株ＨＢ４３がもつさらに２つのビオチン類似体耐性変異もまたｂｉｒＡ座位にマッピングされた。
【０１３２】
ＸＣ．  枯草菌ｂｉｒＡ変異株のＤＮＡ塩基配列
アミノ酸の変化をひき起す変異は、ＨＢ３のようなホモビオチン耐性株、およびα−ＤＢ１６のようなα−デヒドロビオチン耐性株のｂｉｒＡ遺伝子に見出されうる。そのような変異株を見つけるために、野生型の枯草菌ｂｉｒＡ遺伝子と、ビオチン類似体耐性変異をもつ枯草菌ｂｉｒＡ遺伝子を比較することができる。野生型の枯草菌ｂｉｒＡ遺伝子の塩基配列は、ｐＢＩＯ１１３またはｐＢＩＯ１１４にクローン化したｂｉｒＡ＋  遺伝子の塩基配列解析によって得ることができる。変異型のｂｉｒＡ遺伝子の塩基配列はこの遺伝子のＰＣＲコピーからもっとも容易に得ることができる。各ｂｉｒＡ変異体から得たゲノムＤＮＡ鋳型とｂｉｒＡのコード領域をはさむことがわかっている一組のプライマーを用いて、いくつかの独立のＰＣＲを実施することができる。独立の各ＰＣＲからＤＮＡ断片を単離し、これを大腸菌ｐＵＣ２１にクローン化することができる［Ｖｉｅｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｇｅｎｅ  １００，  １８９−１９４  （１９９１）  ］。２つの独立のＰＣＲのそれぞれからの単離物を、一連の内部プライマーを用いて、両鎖について配列解析を行うことができる。ＰＣＲによって導入されたいかなる人為的な変異も、２つの独立のＰＣＲクローンのいずれか一方だけに出現する筈である一方、“真の”変異は独立の単離物のいずれにも現われる筈である。
【０１３３】
三次元構造がわかっている大腸菌ｂｉｒＡタンパク質［Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ９２５７−９２６１  （１９９２）］との比較によって、変異の特性を決定できる。たとえば、変異はＤＮＡ接触ヘリックスの一つに位置しているかもしれない。この情報を用いて  ｂｉｏオペロンの発現を調節する能力の低下した、枯草菌のより進んだｂｉｒＡ変異株を構築することができる。たとえば、塩基配列の決定された２つの変異を、よく知られた方法である特定部位の突然変異誘発  （ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて、一つの遺伝子上に組合わせることができる。あるいは、ｂｉｒＡのビオチンリガーゼ活性部分ではなく、ＤＮＡ結合部分を除去する小さな欠失を構築することができるであろう。
【０１３４】
実施例ＸＩ．  第二世代の遺伝子操作型枯草菌ビオチン産生株
遺伝子操作による第一世代の枯草菌ビオチン産生株の構築およびその性格の検討を行っている際、本発明者らは、ビオチン生産の調節系にはいくつかの制限段階があり、その改変によってビオチン産生を増強させることができることに気付いた。たとえば、サザンブロットのデータからわかるように、ＳＰ０１プロモーター駆動ビオチンオペロンは、野生型のビオチンオペロンほどの高いコピー数にまでは増幅されない。第一に、過剰生産された場合細胞にとって有害である遺伝子産物を同定し、この遺伝子を増幅されるカセットから除去することによってこの問題を回避することができる。第二に、ビオチンオペロンには、部分的なｍＲＮＡ合成の完了前終結をもたらす２つの部位がある。次の例は野生型のビオチンの調節機構の理解を、ビオチン生産条件を至適化するためにどのように用いることができるかを示す。
【０１３５】
ＸＩＡ．ＳＰ０１プロモーター駆動  ｂｉｏカセットのコピー数を改善する構築物
上に示されように、ＳＰ０１によって駆動されるビオチンオペロンは、野生株オペロンによる制御を受けるビオチンオペロンより、増幅の度合いが低い。本発明者らは、ｂｉｏ  遺伝子群の一つまたはそれ以上の遺伝子産物は高レベルになると細菌に有毒であることを理解した。高レベルの増幅はその特定の  ｂｉｏ遺伝子を欠いたビオチンオペロンを用いることによって可能となるであろう。どの遺伝子が高レベルで受入れがたいものとなるかを決定するために、本発明者らは次のような実験を企画した。
【０１３６】
最初に、すべての  ｂｉｏ遺伝子のあるレベルの構成的な発現を確保するために、染色体のビオチンプロモーターをＳＰ０１−１５プロモーターで置き換えた。このために、上流の相同配列をＳＰ０１−１５プロモーターを含む５’カセット  （ｐＢＩＯ１６８）に付加した。この構築は５’ビオチンカセットのすぐ上流の配列から得られた１．８ｋｂのＰＣＲ断片を、ｐＢＩＯ１６８の  ＳａｌＩから  ＮｒｕＩ部位の隙間へと導入することにより行った。１．８ｋｂ  ＰＣＲ断片は、上流に  ＮｒｕＩ部位、下流末端に  ＳａｌＩ部位を導入するように設計したプライマーを用いて得た。生じたプラスミドｐＢＩＯ１８０は、ｂｉｏ  オペロン上流の１．８ｋｂの相同配列と、プロモーター下流の０．７ｋｂによってはさまれたＳＰ０１−１５プロモーターを持っている。このプラスミドは、ｃａｔ  カセットによって置き換えられたビオチンオペロンのプロモーター領域をもち、ビオチンに対する栄養要求性変異株である、Δ：：ｃａｔ１７（実施例ＩＩＩ参照）  を形質転換するために用いた。続けて生じる二度の組換え過程を通じて、ＳＰ０１−１５プロモーターは  ｃａｔカセットを置き換えることができ、この結果所望の原栄養株ＢＩ２９４ＣｍＳ  が得られた。
【０１３７】
各  ｂｉｏ遺伝子の欠失は標準の方法によって生じさせることができる。以下はｂｉｏＷに非極性の欠失変異を構築した方法の一例である。
ｂｉｏＷの欠失は５’カセットｐＢＩＯ１６８を改変することによって得た。ＳＰ０１−１５プロモーターと、ＢａｍＨＩ部位が後につづく、ｂｉｏＷの最初の３コドンをもつＰＣＲ断片（図１６）  を得た。このＰＣＲ断片は、ｐＢＩＯ１６８の  ＸｈｏＩからＢａｍＨＩまでの断片を置き換えたのちに、生じた５’カセットのｐＢＩＯ１７８が、３’ｂｉｏカセットとの連結によって、イン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のｂｉｏＷ欠失を生じさせるような操作を行った  （図１６参照）  。この連結反応混合物を用いて枯草菌ＢＩ２９４の形質転換  （既述）  を行い、Ｃｍｒ  の組込み体  （ＢＩ２９６）を選択することによって、ｂｉｏＷの増幅を伴わずにビオチンオペロンの増幅が可能となった。ｂｉｏＷの染色体上のコピーは依然としてＳＰ０１−１５プロモーターから転写される。ＢＩ２９４に組込まれた、完全なＳＰ０１−１５駆動ビオチンオペロンをもつ対照株をも構築し、これをＢＩ２９５と名付けた。オペロンのコピー数は、増幅されたＢＩ２４７  （実施例ＶＩＩＣｉｉｉ）にくらべると、いずれの場合も低下した。これら２株の増幅を比較すると、ｂｉｏＷはその産物が過剰生産されたときに毒性を与える遺伝子ではないことが示唆される。
【０１３８】
過剰生産したときに有害となる遺伝子を同定するために、この手順を各  ｂｉｏ遺伝子について順次くり返すことができる。
増幅したｂｉｏＷ遺伝子を欠くＢＩ２９６によるビオチン産生と、増幅したｂｉｏＷ遺伝子をもつ同遺伝子型の株ＢＩ２９５との比較分析によって、ｂｉｏＷの産物はビオチンの生合成にとって律速的な酵素ではないことが示された  （表１５）  。ＢＩ２９６は  ｂｉｏカセットの増幅なしに、親株ＢＩ２９４の１０倍以上のビオチンを産生した。さらに、ＢＩ２９６は完全なＳＰ０１−  ｂｉｏオペロンをもつ同遺伝子型の対照株ＢＩ２９５とほぼ同量のビオチンを生産した。このような実験を各  ｂｉｏ遺伝子の内部の非極性欠失について繰り返すことによって、枯草菌におけるビオチン生合成の律速遺伝子が同定されるであろう。
【０１３９】
【表１５】
0003593146.tif 000017
【０１４０】
ＸＩＢ．可能な転写終結部位の除去
ビオチンオペロンの内部には２か所の転写終結部位がある。約０．８ｋｂのｍＲＮＡ断片がみつかり、これはプロモーターから枯草菌の異化産物抑制配列  （ＣＲＳ）  のコンセンサス配列とホモロジーを共有するｂｉｏＷのある領域までの距離に相当する。ノーザンブロットでみられるおもなビオチン転写物は５．２ｋｂである。これはプロモーターと、ステム−ループ構造のあとに一連のＴ残基がつづくｂｉｏＢ−ｂｉｏＩの連結部との間の距離に相当する。ＣＲＳを除去し、ｂｉｏＢ−ｂｉｏＩの連結部のうしろからオペロンの末端までの転写レベルを増大させるための構築を行った。
【０１４１】
ＸＩＢｉ．    異化産物抑制配列の除去
枯草菌では、胞子形成およびある種の酵素の生合成には異化産物抑制の支配をうける［Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  編の“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．中のＣｈａｍｂｌｉｓｓ，  Ｇ．Ｈ．，  ｐｐ．２１３−２１９  （１９９３）］。
【０１４２】
２か所の異化産物抑制部位  （ＣＲＳ）  の可能性のある部位が、ｂｉｏ  オペロンの内部または周辺に位置している。一つはＯＲＦ３の推定上の５’リーダー領域の内部に位置する。２番目の異化産物抑制様配列はｂｉｏＷの３’末端部に位置する。この配列の位置は、ノーザンブロットで検出される０．８ｋｂ−特異的転写産物の３’末端と一致し、異化産物抑制が一部、ｂｉｏ  オペロンの発現を制御している可能性を示唆している。この異化産物抑制様の配列には、短いＡｂｒＢ調節配列もまた存在している［Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  編の“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．中のＳｈａｕｃｈ，  Ｍ．Ａ．，  ｐｐ．７５７−７６４  （１９９３）  ］。
【０１４３】
ＢａｍＨＩ部位とＣＲＳをコードするｂｉｏＷの一部を図１９に示した。ＣＲＳはＢａｍＨＩ部位の１１ｂｐ下流から出発する。ＣＲＳを含む配列中の４コドンは、アミノ酸の配列を変えることなく３番目の位置を変化させて、別のコドンに変えることができる。３番目の位置の変化はＣＲＳのもっともよく保存された配列（下線部分）４残基のうちの３残基を変化させる（図１９）  。
【０１４４】
図１９に示されるように、ｂｉｏＷのなかのＣＲＳ部位はまた、ＡｂｒＢコンセンサス結合部位とかなりの相同性をもっている。ＣＲＳの配列を変更するときに払うべき配慮は、ＡｂｒＢに対する結合部位の配列が似ているので、ＣＲＳを破壊する際に強いＡｂｒＢ結合部位を生じさせることのないように注意しなければならないということである。しかし、ＣＲＳを破壊させるために導入した変更はまた、ＡｂｒＢ部位に対する相同性をも低下させる。図１９に示した変化を導入するために、ＢａｍＨＩ部位、所望の変異をもつＣＲＳ領域、およびプライミングのための２０残基を含むＰＣＲプライマーを設計した。適切な下流プライマーはＢａｍＨＩおよび  Ｂｓｔ１１０７Ｉによって切断されうる６６０ｂｐ  の断片の生成を可能にする。ＢａｍＨＩおよび  Ｂｓｔ１１０７Ｉの両制限酵素ともに、プラスミドｐＢＩＯ２８９中にそれぞれ唯一の制限部位をもつ。ＢａｍＨＩおよび  Ｂｓｔ１１０７Ｉで切ったＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよび  Ｂｓｔ１１０７Ｉで切ったｐＢＩＯ２８９にクローニングし、プラスミドｐＢＩＯ１７９を得た。ｐＢＩＯ１７９からのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を次いでｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、新しい３’カセットプラスミドｐＢＩＯ１８３を得た。ｂｉｏＷの染色体上のコピーの配列を変えるために、２段階のプロトコルを用いた。最初に  ｃａｔ遺伝子をＢＩ２９４（  実施例ＸＩＡ）  のｂｉｏＷのＢａｍＨＩ部位に導入した  （実施例ＩＩＩ）。これによって栄養要求株ＢＩ２９４：：ｃａｔ７が生じた。この栄養要求株を直線化したｐＢＩＯ１７９によって形質転換を行い、  Ｂｉｏ＋  の選択を行うことによって、異化産物抑制配列を破壊するように変えられたｂｉｏＷの配列をもつ、ＳＰ０１−１５プロモーターによって駆動される、単一のビオチンオペロンの染色体コピーをもつＢＩ２９７株を得た。新しい３’カセットｐＢＩＯ１８３を５’カセットすなわちｐＢＩＯ１６８とともに用いて、ＢＩ２９７に組込み、増幅を行うことによって、改変したｂｉｏＷの増幅を確実にし、そして異化産物抑制による完了前転写終結を解除できるかもしれない。この株はＢＩ３０６である。この手続きで、異化産物抑制に対してより感受性の低い可能性のある第二世代のビオチン産生株が得られる。
【０１４５】
ＸＩＢｉｉ．  ｂｉｏＢ以後の終結部位の除去あるいは迂回路
転写終結の内部部位の下流にあるビオチン遺伝子の発現の増大をはかるために二つの戦略をとった。最初の戦略はターミネーターの除去を含むものである。第二の戦略は、ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２の強い転写をもたらすために、ＢｉｏＩの前にＳＰ０１−１５プロモーターを挿入することである。
【０１４６】
シストロン間領域に位置するターミネーターを除去するために（図２０）  適当なＰＣＲプライマーを設計した。一つのプライマーは唯一のＢｓｐＥＩ部位から上流のｂｉｏＢとハイブリッド形成を行う。第二のプライマーは、  ＰｍｌＩ部位、ｂｉｏＩのリボソーム結合部位、および５１ｂｐとんでｂｉｏＢの停止コドンと３’末端の２３ｂｐと相補的である（図２０）  。ＢｓｐＥＩと  ＰｍｌＩによる消化で２０９ｂｐ  の断片が生じ、これを用いてｐＢＩＯ２８９のＢｓｐＥＩ−ＰｍｌＩ断片を置き換えてｐＢＩＯ１８１が得られた。このプラスミドを新しい３’カセットを得るために用い、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、ｐＢＩＯ１８５が得られた。ｂｉｏＢからｂｉｏＩ間のターミネーターを除去することによる、ＢＩ２９４の染色体ビオチンオペロンの改変は二段階で行った。第一に、実施例ＩＩＩで述べたと同様の方法を用いて、ｂｉｏＢの末端に  ｃａｔ遺伝子を導入した。これによって  Ｂｉｏ−  ，  Ｃｍｒ  株ＢＩ３００が生じた。直線化したプラスミドｐＢＩＯ１８１を用いてＢＩ３００の形質転換を行うと、  Ｂｉｏ＋  単離株は所望のターミネーター欠失をもち、これはＢＩ３０３と名付けられる。ターミネーター欠失を含む、組込まれた増幅ビオチンオペロンは、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１８５に由来するＢａｍＨＩ−  ＮｏｔＩ断片の連結物によってＢＩ３０３を形質転換することを通じて構築し、これをＢＩ３０７と命名した。
【０１４７】
ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２の最大の発現を確実にするために、ＳＰ０１−１５プロモーターをｂｉｏＩの前に導入した。ｐＢＩＯ１６８からのＳＰ０１−１５プロモーターはＰＣＲで増殖し、下流側にリボソーム結合部位およびｂｉｏＩの開始コドン／ＰｍｌＩ部位を、そして上流側にｓｔｕＩ部位を導入した。用いたプライマーは、１）５’−ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＣおよび２）５’−ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＴＴである。ＳｔｕＩおよびＰｍｌＩによるＤＮＡの消化は平滑末端を生むので、ｐＢＩＯ２８９のＰｍｌＩによる消化はＳｔｕＩ／ＰｍｌＩ消化ＰＣＲ断片の導入を可能にする。一方の配向をとるとｂｉｏＩ開始コドンにＰｍｌＩ部位が再生され、ＳＰ０１−１５プロモーターはｂｉｏＩとＯＲＦ２の転写を発動させる。この方向性をもったプラスミドをｐＢＩＯ１８２と名付けた。新しい３’カセット  （ｐＢＩＯ１８４）はｐＢＩＯ１８２のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングすることにより構築した。この構築物は、ｂｉｏＢとｂｉｏＩの間のターミネーターの除去によって生ずるものよりも、ｂｉｏＩおよびＯＲＦ２のより大きな転写を生ずることが期待される。
【０１４８】
ＳＰ０１−１５駆動ｂｉｏＩ構築物のＢＩ２９４の染色体コピーへの導入は、直線化したｐＢＩ０１８２によるＢＩ３００の形質転換  （前述）  に続いて  Ｂｉｏ＋  について選択し、ＢＩ３０４を得ることによって行われた。組込みと増幅によりＢＩ３０８が得られた。
【０１４９】
ＸＩＢｉｉｉ．    単一コピーターミネーター改変株によるビオチン生産
ビオチンおよびビタマーは、ラクトバシラスとサッカロミセスを用い、実施例ＶＩＩＩＡに述べたように、試験管培養によって定量した。ｂｉｏＢとｂｉｏＩの間のターミネーターを欠失したＢＩ３０３、およびｂｉｏＩの前にＳＰ０１−１５プロモーターを導入したＢＩ３０４に対する対照としてＢＩ２９４を用いた。表１６に示したように、ターミネーターの欠失またはｂｉｏＩの前へのＳＰ０１−１５プロモーターの導入は、ビオチンの力価にはほとんど影響を与えないが、ビオチンビタマーの生産を劇的に上昇させる。
【０１５０】
【表１６】
0003593146.tif 000018
【０１５１】
ＸＩＣ．  ｂｉｏ  遺伝子リボソーム結合部位の改変
ｂｉｏ  オペロンの遺伝子の翻訳は、リボソーム結合部位を、配列５’ＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ３’をもつ標準的な枯草菌のリボソーム結合部位に近いものに一致させることによって改善できる。このような変更は、適当な制限部位をコードし、改変したリボソーム結合部位、およびＰＣＲ反応のプライミングを確保するために必要な十分な下流ＤＮＡをコードするＤＮＡプライマーの合成によって導入することができる。適当な第２のプライマーを選ぶことによって、当業者は、改変されたリボソーム結合部位を含むＰＣＲ産物を合成することができる。この改変したリボソーム結合部位をもつＰＣＲ断片は、次に実施例ＸＩＢｉ  で述べた、改変したＣＲＳ配列を導入するのに用いたと同じ方法によって、操作される  ｂｉｏオペロンへと導入することができる。
【０１５２】
実施例ＸＩＩ． 枯草菌のアゼライン酸耐性  （  Ａｚｌｒ  ）  変異株
直鎖Ｃ９  ジカルボン酸であるアゼライン酸は、ピメリン酸の同族体であり、オレイン酸からピメリン酸への転化の中間体であると考えられている  （Ｏｈｓｕｇｉ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ４５，  ２３５５−２３５６  （１９８１）参照）  。１ｇ／ｌのピメリン酸は枯草菌におけるビオチンビタマーの生産を促進し、３０ｍｇ／ｌのピメリン酸は野生株の増殖をＰＹ７９  ｂｉｏＩ：：  ｃａｔ９  栄養緩慢株（ｂｒａｄｙｔｒｏｐｈ）へと回復させる。  （実施例ＩＩＩ参照）  ３０ｍｇ／ｌのアゼライン酸は、ＰＹ７９  ｂｉｏＩ：：  ｃａｔ９  の増殖を支持する上で、ピメリン酸の代わりに使用できない。実際、３０ｍｇ／ｌのアゼライン酸はＰＹ７９  ｂｉｏＩ：：  ｃａｔ９  の増殖を著しく阻害する。より高濃度のアゼライン酸は野生株の枯草菌の増殖を阻害し、この阻害は１μｇ／ｌのビオチンの添加によって打ち消される。これらの結果から、本発明者らは枯草菌においてアゼライン酸はビオチン生合成の特異的な阻害剤であると考えた。
【０１５３】
野生型の大腸菌株ＭＭ２９４は比較的アゼライン酸に耐性である。枯草菌由来のｂｉｏＷ遺伝子のみを含むｐＢＩＯ４０３をもつ、大腸菌ＰＹ６０４  （ΔｂｉｏＨ）  はビオチンに対する栄養要求性をもつが、この要求性は３０ｍｇ／ｌのピメリン酸によって満足される。しかし、過剰のピメリン酸  （８０ｍｇ／ｌ）  の存在下で増殖したＲＹ６０４／ｐＢＩＯ４０３は、アゼライン酸による阻害に感受性をもつ。したがって、本発明者らは、アゼライン酸は、ピメリン酸の拮抗阻害剤として、あるいはビオチン類似体または他の毒性の中間体にとり込まれることによって、ピメリル  ＣｏＡシンセターゼ  （ｂｉｏＷ）  のレベルで作用すると結論した。
【０１５４】
ＸＩＩＡ．  枯草菌のアゼライン酸耐性変異株の単離
最少寒天培地上、２ｇ／ｌ  （約１０−２Ｍ）  のアゼライン酸は、殺菌的に作用したり、増殖を完全に妨げたりはしないが、ＰＹ７９の増殖を著しく阻害する。２ｇ／ｌのアゼライン酸の存在下で、ＰＹ７９のバックグラウンドよりも増殖をみせる７つの自然発生突然変異体を分離した。アゼライン酸に対する耐性は一つの場合  （下記参照）  を除く、すべての場合に安定した形質のようであった。７株の変異株を暫定的にＰＡ１−ＰＡ７（ＰＹ７９アゼライン酸耐性）  と命名した。ＰＡ１からＰＡ７までをＶＹ培地を用いて試験管中で培養し、指示大腸菌を用いてビオチン生産を定量した  （表１５）  。変異株は二つのクラスに類別される。ＰＹ７９よりも大量にビオチンを生産する株（ＰＡ５，ＰＡ６）および生産量がＰＹ７９と同程度の株（ＰＡ１，２，３および７）である。ＰＡ４の性質は不安定または真の変異株ではないように見られたので、その後の検討は行わなかった。本発明者らはまた、変異株が２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培地上のコロニーの大きさに関して２つのクラスに類別されること、およびこの２つのクラスがビオチン生産について類別したクラスと一致していることを認めた（表１１）。培養液上清中にビオチンを最も多量にもつ変異株（ＰＡ５およびＰＡ６）は小さいコロニーを、ビオチン非分泌型のＰＡ１，２，３および７は大きなコロニーを形成する。ＰＡ１およびＰＡ３はＰＹ７９を栄養共生させる（すなわち、ＰＹ７９にたいするアゼライン酸の阻害効果を打ち消す）化合物を、２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少培地上に分泌する。
【０１５５】
２つのクラスのアゼライン酸耐性変異株の代表として、ＰＡ３およびＰＡ６を選び、さらに性質を検討した。アゼライン酸の連続希釈を含む液体最少培地中で、ＰＡ３およびＰＡ６は、親株ＰＹ７９と比較して明らかなアゼライン酸に対する耐性を示す（図２１）。しかし、ＰＡ３およびＰＡ６の用量反応曲線は互いにはっきりと異なっている。ＰＡ３はＰＡ６よりも大きな耐性を示し、低濃度のアゼライン酸の存在下では、ＰＡ６はＰＡ３またはＰＹ７９と同じ細胞濃度までは増殖できない。
【０１５６】
ＸＩＩＢ．  アゼライン酸耐性変異株のマッピング
ＰＡ３およびＰＡ６におけるアゼライン酸耐性変異をマッピングするために、本発明者らはそれぞれの変異がｂｉｒＡまたはビオチンオペロンに位置するかどうかを調べた。最初のケースでは、ＰＡ３およびＰＡ６から得たＰＢＳ１形質導入溶菌液を、ＲＬ１（ｔｒｐＣ２）に対して用い  Ｔｒｐ＋  形質導入体を選択した。ｔｒｐＣ２およびｂｉｒＡ座位は形質導入により約９０％の連鎖をもつ。  Ｔｒｐ＋  形質導入体は次いで２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培地上にパッチを行い、アゼライン酸耐性をスクリーニングした。どの  Ｔｒｐ＋  形質導入体もアゼライン酸耐性ではなく、どちらの変異もｔｒｐＣ２に連鎖しておらず、したがってまたどちらもｂｉｒＡ変異ではないことが示された。ＰＡ３変異は二つの形質導入（一つはＰＹ７９Ｐｂｉｏ  ：：ｃａｔ１７  への、他はＰＹ７９ｂｉｏＷ：：ｃａｔ７への）で  ｂｉｏに対する強い連鎖を示したが、ＰＡ６変異ではそのような連鎖を示さなかった。
【０１５７】
ＸＩＩＣ．  ビオチン生産へのアゼライン酸耐性変異の影響
ビオチン生産の調節を変えるもう一つの方法はアゼライン酸耐性変異のいずれかをｂｉｒＡ変異と結びつけることである。
ＨＢ３またはα−ＤＢ１６からのｂｉｒＡ変異をＰＡ３またはＰＡ６のいずれかへ２段階の形質導入過程を経て導入した。最初にＰＡ３およびＰＡ６を  ｔｒｐＥ  ：：Ｔｎ９１７  ｌａｃ  ［Ｐｅｒｌｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  １４０−１４３  （１９８６）］による形質導入を行いエリスロマイシン耐性で選択することによって  Ｔｒｐ−  とした。ｂｉｒＡ変異はＨＢ３またはα−ＤＢ１６から  Ｔｒｐ＋  を選択することによって導入された。親株および  Ｔｒｐ＋  形質導入体をホモビオチン耐性およびアゼライン酸耐性についてスクリーニングした。ＰＡ６はホモビオチン感受性であり、そのため、２重変異株は  Ｔｒｐ＋  形質導入体のなかから、ホモビオチン耐性のコロニーをスクリーニングすることによって同定できた。  Ｔｒｐ＋  形質導入体のうちの約６０％だけがホモビオチン耐性でもあった  （これは形質導入によると通常９０％連鎖であるｂｉｒＡとｔｒｐＥとの間のマップ距離がＴｎ９１７  によって乱されたためであろう）。ＰＡ３はホモビオチンに耐性であり、このため２重変異株の直接の同定は可能ではなかった。しかし、以下に述べるようにビオチン分泌の増大から判断して、形質導入体の６０％が２重変異株であった。
【０１５８】
親株、ＰＡ３  ｂｉｒＡ２重変異の候補株、および実際のＰＡ６  ｂｉｒＡ  変異株について、ＶＹ試験管培養を用いたビオチンおよびビタマー生産の試験を行った。表１８に示すように、ＰＡ３由来の２重変異株はｂｉｒＡ親株に比較して４から６倍多量のビタマーおよび２倍多量のビオチンを生産した。ＰＡ６に由来する２重変異株はｂｉｒＡ親株に比較して、同程度またはほんのわずかに多いビオチンおよびビタマーを生産した。明らかに、ＰＡ３変異は調節解除された株におけるビオチン生産を助けている。
【０１５９】
ＸＩＩＤ．  他のアゼライン酸耐性変異株
ＰＡ３およびＰＡ６によっで代表されるタイプのアゼライン酸耐性変異株に加えて、少なくとも２つの新たなクラスに類別されるいくつかのアゼライン酸耐性変異株が、ＰＹ７９株のバックグラウンドからの自然発生突然変異体として単離された。
【０１６０】
アゼライン酸耐性変異がｂｉｒＡまたは  ｂｉｏオペロンと連鎖しているかどうかを決定するために、上に述べた形質導入によってさらに１１の変異株を部分的にマッピングした。どれもがｔｒｐＣ２とは連鎖しておらず、従ってどの変異もｂｉｒＡ座位には位置しないことになる。しかし、調べた１１の変異のなかで８つが  ｂｉｏオペロンと連鎖していた。これら８変異のうち２つがＰＡ３がそうであったように  ｂｉｏプロモーターと密接に連鎖していた一方、６つは  ｂｉｏプロモーターとの連鎖が  １００％よりは実質的に小さく、変異は  ｂｉｏプロモーターよりもたしかに下流のｂｉｏ  オペロンにあることを示唆している。このようにこの後者の６変異株のグループは、ＰＡ３とＰＡ６とも異なる、別のクラスのアゼライン酸耐性変異を提示するものである。このグループはＢＩ５１４，ＢＩ５２１，ＢＩ５３２，ＢＩ５３５，ＢＩ５３７およびＢＩ５４５を含む。このグループの変異株は、たとえばｂｉｏＩまたはｂｉｏＷ変異株のように、ピメリン酸の生産または利用能力の増大した変異株を含む可能性がある。
【０１６１】
新しい変異株のうちの３株はｂｉｒＡにも  ｂｉｏオペロンにもマッピングされなかった。このグループはＢＩ５２３，ＢＩ５４４，およびＢＩ５４９を含み、ピメリン酸の前駆体の生産量が増大しているか、またはさまざまなビオチン前駆体をより効率よくビオチンに転化する変異株を含む可能性がある。これらのグループのいずれもＰＡ６とは同じ性質を示さなかった。なぜならばＰＡ６とはちがって、これらはすべてアゼライン酸を欠く最少培地中でＰＹ７９（野生株）と同じ細胞濃度にまで増殖するからである。
【０１６２】
新しい変異株を表１９にまとめた。いずれもそれ自身でビオチン生産の有意な増大をもたらさないが、これらの変異は、ＰＡ３の場合がそうであるように、他のビオチン（生産）調節解除変異と結びついたときにビオチン生産が増大する可能性がある。
本発明者らは１９９４年５月４日、ブダペスト条約の条項と規約のもとで、菌株ＰＡ３，ＨＢ４３，ＨＢ３，ＢＩ５４４，ＢＩ５３５，ＢＩ４２１，ＢＩ３０４，ＢＩ２８２およびＢＩ２７４を米国メリーランド州ロックヴィルの  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に寄託し、それぞれに対し受託番号ＡＴＣＣ  ５５５６７，  ５５５６８，  ５５５６９，  ５５５７０，  ５５５７１，  ５５５７２，  ５５５７３，  ５５５７４  および５５５７５  を受取った。
【０１６３】
【表１７】
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【０１６４】
【表１８】
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【０１６５】
【表１９】
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【０１６６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：８４７８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１６７】
【化１】
0003593146.tif 000022
【０１６８】
0003593146.tif 000023
【０１６９】
0003593146.tif 000024
【０１７０】
0003593146.tif 000025
【０１７１】
0003593146.tif 000026
【０１７２】
配列番号：２
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１７３】
【化２】
0003593146.tif 000027
【０１７４】
配列番号：３
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１７５】
【化３】
0003593146.tif 000028
【０１７６】
配列番号：４
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１７７】
【化４】
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【０１７８】
配列番号：５
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１７９】
【化５】
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【０１８０】
配列番号：６
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１８１】
【化６】
0003593146.tif 000031
【０１８２】
配列番号：７
配列の長さ：３００
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１８３】
【化７】
0003593146.tif 000032
【０１８４】
配列番号：８
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１８５】
【化８】
0003593146.tif 000033
【０１８６】
配列番号：９
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１８７】
【化９】
0003593146.tif 000034
【０１８８】
配列番号：１０
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１８９】
【化１０】
0003593146.tif 000035
【０１９０】
配列番号：１１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１９１】
【化１１】
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【０１９２】
配列番号：１２
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１９３】
【化１２】
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【０１９４】
配列番号：１３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１９５】
【化１３】
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【０１９６】
配列番号：１４
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１９７】
【化１４】
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【０１９８】
配列番号：１５
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
【０１９９】
【化１５】
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【０２００】
配列番号：１６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
【０２０１】
【化１６】
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【０２０２】
配列番号：１７
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
【０２０３】
【化１７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  のビオチン合成経路の説明図である。
【図２】大腸菌、Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  、およびＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  のビオチン遺伝子の構成を示す模式図である。
【図３】バシラス属に関係した系統発生的一貫性のなさを示す図である。
【図４】ＯＲＦ４−５リーディング・フレームの終結のアミノ酸翻訳（配列番号：１６）およびｂｉｏＷリーディング・フレームの開始のアミノ酸翻訳（配列番号：１７）を含むＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｏ  プロモーター領域のヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す図である。
【図５】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ビオチンオペロンの物理的地図である。
【図６】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ビオチンオペロンの転写を示す地図である。
【図７】ｐＢＩＯプラスミドについての制限酵素部位および相補性の結果を示す図である。
【図８】ｐＢＩＯ  ２０１の欠失体およびサブクローンを用いた相補性の結果を示す図である。
【図９】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｏ  プロモーター領域の物理的地図である。
【図１０】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｏＷ、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の内部の  ｃａｔ（クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ）挿入変異の位置およびＢｉｏ  表現型を示す図である。
【図１１】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｏ  プロモーター領域、ＯＲＦ４−５およびＯＲＦ６の内部の  ｃａｔ挿入変異の位置およびＢｉｏ  表現型を示す図である。
【図１２】Ｂ．  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ｂｉｏＤＡＹＢ  調節領域（配列番号：８）とＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｉｏ  プロモーター領域（配列番号：９）のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
【図１３】５’−ビオチンオペロンカセットのために導入された制限部位を示す図である。１．上流の相同領域、ターミネーター；２．プロモーター、オペレーター、リーダー；３．リボソーム結合部位、開始コドン、５’−ｂｉｏＷ  。
【図１４】５’−ｂｉｏ  カセットのための次のＰＣＲプライマーの向きおよび配列を示す図である：ＯＲＦ４．１（配列番号：１０）、ＢＩＯＬ５’（配列番号：１１）、Ｌｅａｄｅｒ１  （配列番号：１２）、ＡＮＥＢ１２２４（配列番号：１３）、ＢＩＯＬ３  （配列番号：１４）、およびＢＩＯＬ４  （配列番号：１５）。
【図１５】ｐＢＩＯ  １４４の構築の説明図である。
【図１６】Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ビオチンオペロンのＤＮＡ配列およびそのフランキング配列（配列番号：１）を示す図である。
【図１７】種々の発酵ブロスのビタマースペクトルを示す電気泳動の写真である。
【図１８】ｂｉｏＷのイン−フレーム  （ｉｎ−ｆｒａｍｅ）  欠失を示す図である。
【図１９】ｂｉｏＷの異化産物抑制配列の要素を示す図である。
【図２０】ｂｉｏＢとｂｉｏＩの間で欠失されたターミネーター領域を示す図である。
【図２１】菌株ＰＡ３およびＰＡ６のアゼライン酸耐性を示すグラフである。
【図２２】菌株ＢＩ５３５  およびＢＩ５４４  のアゼライン酸耐性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0003593146.tif 000047
【図６】
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【図７】
0003593146.tif 000049
【図８】
0003593146.tif 000050
【図９】
0003593146.tif 000051
【図１０】
0003593146.tif 000052
【図１１】
0003593146.tif 000053
【図１２】
0003593146.tif 000054
【図１３】
0003593146.tif 000055
【図１４】
0003593146.tif 000056
【図１５】
0003593146.tif 000057
【図１６Ａ】
0003593146.tif 000058
【図１６Ｂ】
0003593146.tif 000059
【図１６Ｃ】
0003593146.tif 000060
【図１６Ｄ】
0003593146.tif 000061
【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
0003593146.tif 000064
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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