(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなるグループから選択されるポリペプチドを含む、ポリエチレングリコールが結合したポリペプチド。
【請求項２】
ｐ７５  ＴＮＦＲを修飾する方法であって、
配列番号８のアミノ酸１０８及びアミノ酸１２０のリジンをアルギニンに変換し；
ポリエチレングリコールをリジン残基と反応させることによってポリエチレングリコールをｐ７５  ＴＮＦＲに結合させるのに十分な条件下で、変換したリジン残基を有するｐ７５  ＴＮＦＲをポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
請求項２の方法によって作製された、ｐ７５  ＴＮＦＲを含むポリエチレングリコールが結合したｐ７５  ＴＮＦＲ。
【請求項４】
配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ｐ７５  ＴＮＦＲを修飾する方法であって、
配列番号８のアミノ酸１０８のリジンをアルギニンに変換し；
ポリエチレングリコールをｐ７５  ＴＮＦＲに結合させるのに十分な条件下で、変換したリジン残基を有するｐ７５  ＴＮＦＲをポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む、前記方法。
【請求項７】
請求項６の方法によって作製された、ポリペプチドを含むポリエチレングリコールが結合したｐ７５  ＴＮＦＲ。
【請求項８】
ｐ７５  ＴＮＦＲを修飾する方法であって、
配列番号８のアミノ酸１２０のリジンをアルギニンに変換し；
ポリエチレングリコールをｐ７５  ＴＮＦＲに結合させるのに十分な条件下で、変換したリジン残基を有するｐ７５  ＴＮＦＲをポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
請求項８の方法によって作製された、ポリペプチドを含むポリエチレングリコールが結合したｐ７５  ＴＮＦＲ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、タンパク質を修飾する方法に関する。より詳しくは、本発明は、タンパク質の望まれる生物学的活性を維持しつつポリエチレングリコール結合タンパク質に関する利点を提供するような仕方でポリエチレングリコールをタンパク質に結合させるための方法を含む。
【０００２】
関連技術の記載
タンパク質を化学的に修飾する方法と試薬は数十年間広範囲にわたって使用されてきた。慣用的には、タンパク質の化学的修飾はタンパク質の機能的特性及び構造的特徴を研究するために遂行された。遺伝子組換えＤＮＡ技術の出現とタンパク質治療学への関心に伴って、研究者たちは臨床的性能を進歩させるために化学的にタンパク質を修飾してきた。特に、タンパク質をポリエチレングリコールと結合させるための方法は、ポリエチレングリコール結合タンパク質に関する多数の改良された薬理学的及び生物学的特性の結果として、薬学及び生化学界において広く使用されてきた。例えば、ポリエチレングリコール結合タンパク質は血漿の半減期を有意に延ばし、そしてこのために臨床的有用性を実質的に高めたことが知られている。さらに、ポリエチレングリコール結合タンパク質は一般に抗原性及び免疫原性を減少させてきたため、生命を脅かすアナフィラキシーを惹き起こす傾向が少ない。
【０００３】
ポリエチレングリコール結合タンパク質に関するもう一つの利点は、ポリエチレングリコールの高い水溶性の結果として増加している水溶性の利点である。増加した水溶性により、生理的ｐＨにおけるタンパク質の処方上の特徴を改良でき、水溶性の低いタンパク質の集合に伴う問題を減少させられる。
【０００４】
さらに、ポリエチレングリコール結合タンパク質は、反応環境が酵素活性にとって最適ではない酵素反応のような生命産業的応用に役立ってきた。例えば、いくつかのポリエチレングリコール結合酵素はより広い最適ｐＨ活性を示し、最適活性温度を下げている。さらには、多くの有機溶剤の中で活性が下がっていた酵素が有機溶剤の中で反応を触媒するのに有用にさせる程度にまでポリエチレングリコールとうまく結合させられた。例えば、ポリエチレングリコールに西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させると、クロロホルム及びトルエンに可溶となり活性化した（Ｕｒｒｏｔｉｇｏｉｔｙら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，２：１４５−１４９，１９８９）。
【０００５】
ポリエチレングリコール結合タンパク質は血漿循環半減期を増し、免疫原性を減じ、水溶性を増し、酵素活性を改善する程度において多様性をもつ。このような多様性の原因となる要因は多数あり、タンパク質がポリエチレングリコールと置換される程度、ポリエチレングリコールをタンパク質に付着させるために使用される化学物質、及びタンパク質上のポリエチレングリコール部位の位置を含む。
【０００６】
ポリエチレングリコールをタンパク質に付着させる最も一般的な方法は、タンパク質上のアミノ基の窒素によって求核攻撃を受けやすい官能基をもつ、ポリエチレングリコール上の水酸基の少なくとも一つを活性化することを含む。これらの方法は一般に、ポリエチレングリコールの非特異的な付着によって生物学的活性が損なわれる結果となる。
【０００７】
タンパク質をポリエチレングリコールと結合させる別の方法は、結合部位がＮ−末端に限定されるように結合反応物及び条件を制御すること（Ｋｉｎｓｔｌｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：９９６，１９９６）、ポリエチレングリコールをタンパク質カルボハイドレート基に付着させる（Ｕｒｒｕｔｉｇｏｉｔｙら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ２：１４５，１９８９）、タンパク質のシステイン残基にポリエチレングリコールを付着させること（Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３，１９９０）、ポリエチレングリコールを固相及び液相のペプチド合成の間付着させること（Ｆｅｌｉｘ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ６８０  ｃｈ１６，１９９７）、そして、タンパク質のアルギニン残基をポリエチレングリコール付着部位を提供するリジン残基と変換することを含む（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７１８５，１９９１）。これらは反応部位のある程度の制御を提供するが、ポリエチレングリコール結合タンパク質を提供する改良法が引き続き必要とされている。とりわけ、ポリエチレングリコールとタンパク質を結合させ、結果として修飾タンパク質に特徴的な、免疫原性の十分な減少、可溶性の増加、及び半減期の延長を含む、ポリエチレングリコールの利点を維持しつつ生物学的活性を増すあるいは生物学的活性における損失を少なくする修飾タンパク質を得るための方法を提供することが望まれるであろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、タンパク質に関する活性をほとんどあるいは全く減少させない修飾タンパク質を得るタンパク質修飾法を提供する。より具体的には、本明細書中に記載された発明は最初にタンパク質上のポリエチレングリコール結合に適した一つまたはそれ以上のアミノ酸部位を欠失し、次に前記タンパク質をタンパク質にポリエチレングリコールを結合させるのに十分な条件下でポリエチレングリコールと接触させることによってタンパク質を修飾する方法を含む。好ましくは、欠失したアミノ酸残基は、ポリエチレングリコールと反応しないアミノ酸残基と変換される。結果として得られたポリエチレングリコール結合タンパク質は、先行技術の方法によって修飾されたタンパク質よりも改良された特徴を有する。活性の有利な保持は、一つまたはそれ以上のタンパク質結合部位がタンパク質修飾過程において変化を受けず、そのため修飾過程後に結合相手と自由に相互作用可能であることに帰される。本発明の範囲内に、ポリエチレングリコール結合に有用なタンパク質及び本明細書に記載された方法によって作製されたポリエチレングリコール結合タンパク質を含む。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、望まれる活性がほとんどあるいは全く減少しないポリエチレングリコール結合タンパク質を生じる仕方でタンパク質やポリペプチドをポリエチレングリコールに結合させる方法及び試薬を提供する。より具体的には、本発明は、タンパク質上の一つあるいはそれ以上の選択された部位においてポリエチレングリコール結合を妨げる条件下でタンパク質とポリエチレングリコールを結合させる方法を提供する。タンパク質結合ドメインにおいて一つあるいはそれ以上の選択部位が活性化されている場合に、本発明に従ってその部位でポリエチレングリコール結合を妨げることは、ポリエチレングリコール結合に関する利点を提供しながら望まれる生物学的活性を維持することに貢献する。
【００１０】
本発明の方法は、ポリエチレングリコール部位と反応可能な一つあるいはそれ以上の選択されたアミノ酸残基を欠失し、タンパク質をポリエチレングリコールと結合させることによって、結果として生じるポリエチレングリコール修飾タンパク質が所望の活性の有意な減少を示さないという発見に基づいている。一つの態様において、選択されたアミノ酸残基はリジン残基である。リジン残基は仮にポリエチレングリコールと反応すると、結果として生じる結合タンパク質がその結合パートナー、基質又は受容体と結合する能力を妨げる。選択されるアミノ酸残基は結合部位に関与していて、修飾されると、結合タンパク質の立体配座と機能を決定する構造的要素を妨げると信じられている。選択されたアミノ酸残基を欠失することによって、ポリエチレングリコールは引き続くポリエチレングリコール修飾反応の間、選択されたアミノ酸残基の部位でタンパク質を修飾することはない。好ましくは、アミノ酸残基の数を保存し最適なタンパク質立体配座を維持するために、欠失したアミノ酸残基はその反応条件のもとでポリエチレングリコールと反応しないアミノ酸残基に変換される。例えば、リジンは欠失され、アルギニン残基に変換されてもよい。アルギニンは、リジンの有するポリエチレングリコール反応性のε−ＮＨ２官能基をもたないということ以外はリジンと同じ構造をもつ。
【００１１】
本発明のポリエチレングリコール修飾にはいかなるタンパク質も適しており、タンパク質リガンド、受容体、抗原、抗体、酵素、タンパク質断片、ペプチド及びポリペプチドを含むがこれに限定されない。本明細書に記載されたようなポリエチレングリコール修飾に特に好ましいタンパク質は、先行技術の方法による修飾に引き続いて所望の活性の低下を示すタンパク質である。本発明の修飾に適している他のタンパク質は複数の結合部位をもつタンパク質である。この態様においては、複数の結合部位の一つまたはそれ以上に関与する活性は低下するが、一つまたはそれ以上の他の結合部位に関与する活性は維持するように、タンパク質をポリエチレングリコールと結合させることが可能である。これは、活性が維持されるための、かつポリエチレングリコールと反応可能な結合部位に関与する一つあるいはそれ以上の選択されたアミノ酸残基を欠失し、引き続くポリエチレングリコール結合のために活性が低下する結合部位に関与するアミノ酸残基を残すことによって遂行される。好ましくは、欠失されたアミノ酸残基あるいは残基群は反応条件下でポリエチレングリコールと反応しないアミノ酸残基と変換される。さらに、欠失されたアミノ酸残基あるいは残基群は天然のタンパク質の活性を有意に減らすことのないアミノ酸残基に変換される。結果として生じるポリエチレングリコール結合タンパク質は、選択された結合部位に関する活性は保ち、かつ、結合過程に含まれる付加部位の程度によって、そのような付加部位に関する活性は減少しているかあるいは全く活性がないであろう。この方法は、一つまたはそれ以上のタンパク質結合部位への対応する結合あるいは基質の結合が、臨床的、診断的あるいは産業的な応用において望ましく制限されている場合に有用である。
【００１２】
本発明によって修飾されるタンパク質は、臨床的及び診断的応用に有用性をもつタンパク質、及びバイオリアクターにおける酵素のようなバイオテクノロジー産業に使用されるタンパク質を含む。本明細書中で記載されたように修飾される可能性のある受容体は、サイトカイン受容体、例えば、ＴＮＦＲ，ＩＬ−４Ｒ，ＩＬ−１Ｒ，ＩＬ−１７Ｒ，ＩＬ−１５Ｒ，ｐ５５ＴＮＦＲ：Ｆｃ及びｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃを含む。結合する候補に挙がる抗体は、ＯＫＴ３（抗−Ｔ細胞），ＡＶＡＫＩＮＥＴＭ（抗−ＴＮＦ）及び抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕを含むがこれに限定されない。結合のための所期の酵素は、ＣＤ３９，ｔＰＡ，及びＤＮＡｓｅを含む。多くのタンパク質は多量体の結合部位をもち、活性に一つより多くの会合を要する。このようなタンパク質は、一つの結合部位の喪失がタンパク質全体を失活させるので、特に修飾に望ましい。多量体タンパク質のメンバーにはＴＮＦ，ｈＧＨ，ＣＤ４０Ｌ，及びＦａｓＬが含まれる。他の候補となるタンパク質リガンドは、多受容体サブユニットに結合することが知られており、ＩＬ−２，ＩＬ−１５，ＧＭ−ＣＳＦ，及びＧ−ＣＳＦを含む。
【００１３】
本発明において、選択されたアミノ酸残基はタンパク質上のそのタンパク質の特異的な機能に貢献する部位に関与しているアミノ酸残基であり、タンパク質修飾反応条件下でポリエチレングリコールと反応するアミノ酸残基である。選択されたアミノ酸残基はタンパク質結合パートナーとの会合に直接関与することもあり得る。あるいは、アミノ酸はタンパク質の空間的立体配置に対し十分に中央に位置してもよく、タンパク質をポリエチレングリコールで修飾することは、たとえアミノ酸残基が結合部位内になくても、あるいは直接又は生理的に結合パートナーとのタンパク質の相互作用に関係していなくても、望ましい特性の有意な損失を生じうる。部位は、タンパク質の活性に関与する対応部位あるいは基質結合部位を含むが、これに限定されない。
【００１４】
当該技術分野において知られている条件下で、ポリエチレングリコールと反応するアミノ酸残基は、ポリエチレングリコールあるいは活性化ポリエチレングリコールとの反応に利用可能な求核部分をもつ残基を有するアミノ酸残基を含む。例えば、リジンはそのε−ＮＨ２を通してポリエチレングリコールと反応性があり、アスパラギン酸とグルタミン酸はそれらのＣＯＯＨ基（カルボキシル基）を通してポリエチレングリコールと反応性があり、セリン及びスレオニンもそのＯＨ基（水酸基）を通して潜在的に活性であり、そして、利用可能なＳＨ（スルフヒドリル基）をもつシステインもまたポリエチレングリコールと反応し得る。ポリエチレングリコールあるいは活性化ポリエチレングリコールとタンパク質の特異的アミノ酸残基との反応に適した条件は既知であり、当業者はこのような反応の知識で満たされている。リジン残基は好ましい反応条件下で活性化ポリエチレングリコールと反応し、副反応は最小限であることが技術分野において知られている。このように、本発明においてリジン残基は典型的に標的残基であり、反応条件はポリエチレングリコールとリジンの反応を最大限にするように調節されている。
【００１５】
欠失に、好ましくはさらに変換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：置換）にも選択されるのに適したアミノ酸残基を決定することは、多くの様々な技術を使用して遂行され得る。３次元構造及びエピトープあるいはタンパク質の機能を決定する構造的要素が未知の場合には、一つの方法は、タンパク質の特異的機能に貢献するタンパク質上の部位に関与するアミノ酸残基を実験的に決定するために、部位特異的突然変異誘発技術を使用することを含む。さらに詳しくはタンパク質上の一つあるいはそれ以上のあらかじめ決定されたポリエチレングリコール反応アミノ酸残基が欠失され、さらに、好ましくは突然変異誘発と組換えＤＮＡ方法論を用いて非反応性アミノ酸残基に変換され得る。このように修飾されたタンパク質をポリエチレングリコールと結合させ、その後、得られたポリエチレングリコール結合タンパク質の活性とその他の関連した特性をテストすることにより、欠失及び変換についてあらかじめ定められたアミノ酸残基（単数又は複数）の適合性に関する価値ある情報を提供する。様々の異なるポリエチレングリコール反応アミノ酸残基に対して上記方法を連続的に繰り返すことにより、タンパク質の機能と活性を決定するのに欠失されるアミノ酸残基の役割に関するより完全な情報が提供されるであろう。例えば、もしタンパク質が８リジン残基を有するならば、タンパク質をコードしているＤＮＡは、一つまたはそれ以上のリジン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンと変換されている多数の様々な突然変異型を産生する部位特異的な方法で突然変異が誘発され得る。突然変異を受けた特異的リジンをコードするコドンは一つの選択されたコドンを含み得るが、リジンをコードするコドンはすべて、リジンをコードするコドンの互いに隣接したＤＮＡコードリジン残基の同時に起こる突然変異誘発を含むいかなる置換も受ける。
【００１６】
突然変異を受けたＤＮＡによってコードされた工学的（ｅｎｇｉｎｅｒｒｅｄ）タンパク質を発現させ、回収し、精製した後、発現タンパク質をポリエチレングリコールと反応させて、結合タンパク質を形成させてもよい。その後、結合タンパク質は機能活性、並びに免疫原性、生理学的クリアランス及び可溶性のようなその他の特徴をテストされ得る。所望の活性、並びに最も好ましいクリアランス、可溶性及び免疫原性の特性をもつポリエチレングリコール結合タンパク質はまた、望まれる選択されたリジン残基、すなわちポリエチレングリコールとタンパク質を反応させるのに先立って欠失され変換された残基を含む。
【００１７】
多くのタンパク質にとって、ポリエチレングリコール反応性アミノ酸残基の場所とそれらの立体配座のタンパク質の構造と機能への貢献が知られている。これらのタンパク質の中には、タンパク質の結晶構造が既知であるタンパク質、及び、いくつかの場合には、タンパク質結合パートナー複合体の結晶構造が知られているタンパク質もある。これらのタンパク質にとって、選択されるアミノ酸残基を決定することは、典型的にはタンパク質結合ドメイン内あるいはタンパク質結合領域に空間的に極めて近接している部位にある残基を同定し、企図されたポリエチレングリコール反応条件下でポリエチレングリコールと反応する残基を同定することのみを必要とする。
【００１８】
本発明に従って、タンパク質上の選択されたアミノ酸残基を欠失することは、修飾タンパク質を提供する様々な適切な手法で遂行され得る。本発明の関係においては、このような手法は部位特異的突然変異誘発技術、並びに技術分野において知られている標準的なタンパク質合成法を使用して一つあるいはそれ以上の選択されたアミノ酸残基を欠いたタンパク質が合成されるタンパク質直接合成法を含むが、これに限定されない。上記のように、好ましくは、選択されたアミノ酸残基を欠失する方法はさらに、選択されたアミノ酸残基をポリエチレングリコールと反応しないアミノ酸残基と変換することを含む。
【００１９】
タンパク質は多くの慣用的技術のいずれによっても作製され得る。望まれるＤＮＡ配列はそれ自体知られている技術を使用して化学的に合成され得る。ＤＮＡ断片もまた全長のクローニングされたＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生され、アガロースゲル上の電気泳動によって単離され得る。制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカーが所望のＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入するのに使用されるか、あるいは、当該断片は天然に内在する切断部位で消化され得る。
【００２０】
アミノ酸配列の変換は、選択されたアミノ酸残基を欠失し、そして欠失した残基を別の残基と変換することも含めて、多数の慣用法のいずれによっても遂行され得る。突然変異は天然の配列の断片にライゲーション可能にする制限部位に近接する変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の部位に誘導され得る。ライゲーションに続いて、得られた再構築された配列は望まれるアミノ酸の挿入、置換、あるいは欠失を有する類似体をコードする。
【００２１】
或いは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発法が、あらかじめ決められたコドンが置換、欠失あるいは挿入によって変換され得る変換遺伝子を提供するのに使用され得る。上記の変換を作成する例示的な方法がＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）；  Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；及び米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号によって開示され、これらはすべて参考文献に援用される。
【００２２】
同様に、本発明はタンパク質の多量体会合を防ぐ方法論を提供する。例えば、ポリエチレングリコールは本明細書に記載されたように選択的に多量体会合部の中あるいは周囲の部位に結合され得るが、「部位保護的」ポリエチレングリコール結合を通してその本来の対応部位へのタンパク質の結合を保護し、こうして受容体の多量体化を防いでいる。
【００２３】
欠失され、さらに、好ましくは選ばれた反応条件下でポリエチレングリコールと反応しないアミノ酸残基に変換された、少なくとも一つの選択されたアミノ酸残基を有する変換タンパク質を作製した後、そのタンパク質はポリエチレングリコールと結合される。ポリエチレングリコール結合物を作製する試薬と方法はそれ自体技術分野において知られており、本発明の実施に一般的に応用可能である。典型的には、これらの方法はまずポリエチレングリコール上の一方または両方の水酸基が活性化されている活性化ポリエチレングリコールを提供し、かつ、ポリエチレングリコール結合のために選ばれたタンパク質上の活性部位に活性化ポリエチレングリコールを反応させることを含む。上記のように、タンパク質をポリエチレングリコールと結合させるのに最も広く使用される方法はタンパク質アミノ部位（リジンのε−アミン窒素あるいはα−アミノ末端アミン）とポリエチレングリコールの活性化水酸基との間の求核反応に基づく。スルフヒドリル基も求核基（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ）なので、ジスルフィド結合の一部ではないシステインスルフヒドリルもタンパク質上の潜在的反応部位である。ポリエチレングリコールのタンパク質との結合の一般的原理、及び一般的な活性化試薬は、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，９（３，４）：２４９−３０４（１９９２）の、ポリエチレン結合タンパク質の使用と特性という論文にＤａｌｇａｄｏらによって記載され、また、Ｈａｒｒｉｓらによる、  ＡＣＳ  シンポジウム  シリーズ  ６８０版、ポリ（エチレン  グリコール）化学と生物学的応用１９９７にも記載されており、いずれも参考文献として本明細書に援用される。
【００２４】
ポリエチレングリコール及びモノメトキシポリエチレングリコールの活性化型は市販されており、本発明の方法に使用され得る。最も注目すべきは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬが多数のポリエチレングリコールポリマーとポリエチレングリコール誘導体を提供している。Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃカタログ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７−１９９８は参考文献として本明細書に援用される）は、広範囲の反応条件下でタンパク質を結合するのに適した活性化ポリエチレングリコールを記載し、利用可能にしている。さらにこのカタログは、誘導されるポリエチレングリコール試薬にとって好ましい反応条件を提供する。タンパク質をポリエチレングリコールと結合するのに適した多数の試薬を認識してきた当業者は、選択されるタンパク質の性質、タンパク質上の反応性アミノ基やスルフヒドリル基の性質及び結合タンパク質の最終的な使用の観点で様々な試薬の選択枝を識別するであろう。例えば、可溶性、活性の特徴、及び誘導性が改良されているが必ずしも臨床的クリアランス時間が増す必要はない結合タンパク質を提供するためにはサクシニルコハク酸活性化ポリエチレングリコール（ＳＳ−ＰＥＧ）が結合反応に使用され得る。タンパク質へのエステル結合はあまり安定していないのでｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解されて、ポリエチレングリコールをタンパク質から離すであろう。活性化ポリエチレングリコールが利用可能であり、これはスルフヒドリル基に対立するものとしてのアミノ基とより好ましく反応するし、逆もまた同様であろう。一般に選択される活性化ポリエチレングリコールはスクシニミジルカルボン酸活性化ポリエチレングリコール、スクシニミジルコハク酸活性化ポリエチレングリコール及びスクシニミジルプロピオン酸ポリエチレングリコールを含む。
【００２５】
市販の活性化ポリエチレングリコールを選択するもう一つ別の方法としては、所期のポリエチレングリコールを、所期のタンパク質上の部位と反応する部位を形成するように水酸基と反応する試薬を使用して活性化してもよい。典型的には、タンパク質反応部位はアミノ基だが、スルフヒドリル基や水酸基でも可能であり、活性化ポリエチレングリコールは典型的には活性化エステルあるいはイミジゾルである（同書２７４−２８５ページ参照）。好ましくは、ポリエチレングリコールのただ一つの水酸基が活性化されるが、これは活性化反応においてモノメトキシポリエチレングリコールを使用することによって遂行され得る。しかしながら、２つの水酸基が活性化される方法も本発明の範囲内に含まれる。活性化する基及び求核攻撃の性質に応じて活性化部分は求核反応後のタンパク質に取り込まれても、取り込まれなくてもよい。
【００２６】
ポリエチレングリコールはいかなる分子量でもよいが、好ましくは、約５００から約１０００００の範囲にあること、そしてさらに好ましくは２０００から２００００の範囲にあることが好ましい。特定のポリエチレングリコール分子量を選択する基準は、修飾に選択されるタンパク質の分子量、タンパク質上の荷電、タンパク質のタイプ及び結合のために可能な部位の数と場所を含むが、これに限定されない。様々な分子量のポリエチレングリコールと結合したタンパク質の免疫学的特徴及び血漿半減期の特徴はＤｅｌｇａｄｏらのＣｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，９：２４９，１９９２及びＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０  の  ＨａｒｒｉｓらのＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９７で論じられている。当該技術分野において知られているように、一般的に、タンパク質に結合するポリエチレングリコールの量が大きいほど、血漿半減期は長く、タンパク質水溶性は大きい。糸球体濾過の分子量のカットオフ値は約７０ｋＤａなので、約７０ｋＤａ未満の分子量をもつタンパク質は、血漿半減期の延長を経験するであろう。７０ｋＤａ以上のタンパク質では、ポリエチレングリコールとその分子量の影響はそのクリアランス機構によって様々であろう。
【００２７】
一般的に、本発明の方法において高分子量のポリエチレングリコールの使用は、より低分子量のポリエチレングリコールの使用よりも、タンパク質の一分子あたりより多くのポリエチレングリコールを有する結合タンパク質を結果として生じる。それゆえ、タンパク質分子あたり大量のポリエチレングリコールが望ましい場合には、ポリエチレングリコールの分子量は２００００までが好ましい。しかしながら、より低分子量のポリエチレングリコールは、より大きな溶液移動性（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）のために、高分子量タンパク質よりもタンパク質上のより多くの部位に結合し得る。それゆえ、タンパク質が多数の望ましい結合部位を有する場合には、最多数の部位が結合されることを保証するために、より低い分子量を有するポリエチレングリコールを使用することが好ましい可能性がある。これはタンパク質上の結合可能部位あるいは反応可能部位が互いに非常に近接している場合に特に望ましい方法である可能性がある。ポリエチレングリコール分子量を選択するのにもう一つ考慮することは、たとえ本発明に従って処理されたタンパク質が保護された部位を持っていても、分子量のより大きなポリエチレングリコールは大きすぎて、ひとたび結合すると、それらの分子の大きさがそれらの空間的あるいは立体的影響を拡大させ、結合部位あるいは受容体部位が近づきやすさを減少させることである。あらゆる選択されたタンパク質に最適なポリエチレングリコール分子量を決定し、ポリエチレングリコール結合から望まれる利益を決定することは当業者の知識に含まれている。
【００２８】
上記ポリエチレングリコール結合法は結果として共有結合を通してタンパク質をポリエチレングリコールに結合する方法であるが、他の会合を通して結合する方法も本発明の範囲内に含まれる。本発明の関連においては、タンパク質は様々に異なる連結あるいは結合機構を使用してポリエチレングリコールに結合することによって修飾してもよい。例えば、結合のために選択されたタンパク質はアミノ基あるいは他の適切に反応性のある官能基にポリＡオリゴヌクレオチドと共に誘導され、ポリＴオリゴヌクレオチドと共に誘導されたポリエチレングリコールと結合され得る。他の方法は、既知の特異的な結合パートナーを持つ官能基と共にタンパク質を誘導し、前記タンパク質を官能基への結合パートナーで誘導されたポリエチレングリコールと結合させることを含む。例えば、タンパク質がビオチンと共に誘導され、ポリエチレングリコールはストレプトアビジンあるいはアビジンと共に誘導され得る（逆もまた同様である）。これは結果としてビオチンをもつタンパク質部位にポリエチレングリコールを特異的に結合させることとなる。ある官能基を導入する目的でタンパク質を修飾する多くの試薬が市販されている。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログはタンパク質修飾に関する様々な試薬の利用法を明らかにし提供している。これらのなかには、Ｎ−末端アミンとリジンアミノ基に活性基を導入するＴｒａｕｔ試薬及びＳＡＴＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ、１巻、Ｅ−１４ページ）を含む。これらの活性基はより特異的にポリエチレングリコールと反応する官能基をさらに導入する部位を提供する。当業者はポリエチレングリコールと所期のタンパク質の間のイオン相互反応も可能であることを認識するであろう。例えば、タンパク質上のイオン部分とポリエチレングリコール上のそのカウンターイオンの会合は、その会合が生理的条件下でも会合を維持するのに十分なほど強ければ使用され得る。
【００２９】
先の修飾タンパク質を使用可能な本発明のさらなる態様は、結合に選択されたタンパク質がポリエチレングリコール結合可能部位を保護アミノ酸領域外にほとんど持たないかあるいは全く持たない方法を含む。タンパク質上にアミノ部位及びスルフヒドリル部位を導入するように、選択されたタンパク質を修飾することによって、十分なポリエチレングリコールが選択されたタンパク質に結合され望ましい利益を提供し得る。選択されたタンパク質を修飾することは遺伝子工学方法論あるいは化学修飾を用いて遂行され得る。上記のように、非常に様々な望ましい結果に到達するためにタンパク質を修飾する方法と試薬は、当該技術分野において知られている。詳しくは、ＷｏｎｇのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３  に結合試薬と方法条件に関する情報が提供され、本明細書に参考文献として援用される。
【００３０】
ポリエチレングリコールは好ましいタンパク質結合反応物質であるが、様々な付加ポリマー修飾物質がタンパク質を修飾するのに使用されている。これらは修飾ポリエチレングリコール、分枝ポリエチレングリコール、架橋したポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、アルブミン及びゼラチンを含む。当業者は本発明をひとたび理解すれば、本明細書中に記載された原理及び方法がこれらの付加試薬のいずれかを用いてタンパク質を修飾する方法に応用され得ることを認識するであろう。
【００３１】
本明細書中に記載された方法によって修飾されたタンパク質は、活性に予測される有意な損失なくポリエチレングリコール結合に関する利益を有する。結合後の活性を確立するために既知の検査法を単に適用することによって、本発明に従って結合されたタンパク質に利益が示され得る。活性試験はタンパク質に特異的であり、所期のタンパク質に応じて選ばれなければならない。多くのタンパク質は一つまたはそれ以上の活性に関与する一つ以上の部位をもつ。このようなタンパク質の測定活性の選択は、所期の活性と、アミノ酸残基欠失及びそれに続く結合反応に特異的に選択される部位とに依存する。ポリエチレングリコール結合タンパク質の活性を評価するのに加えて、ポリエチレングリコール置換の程度、分子量、結合部位が解析され得る。これらの解析法を施行する技術はよく知られており、ポリエチレングリコール結合タンパク質に関して  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，９（３：４）：２８５−２９１，１９９２にいくらかの記載がある。実施例４から６は、ポリエチレングリコール結合タンパク質を特徴づける模範的な方法を記載している。
【００３２】
生物学的活性の特徴を改善させる化合物を提供することに加えて、本発明の方法はより均質で産出高のより高いポリエチレングリコール結合分子産物を提供する。結合は分子の生物学的活性に重要なアミノ酸残基には起こらないので、反応産物は多数の不必要な産物フラクションを省くことによって精製される必要がない。ポリエチレングリコール反応は完了され得るし、かつ、あらゆる利用可能なポリエチレングリコール部位が十分に反応され得るので、最終産物は、特異的部位に好ましい条件下で作製される従来技術の産物よりも均質である。
【００３３】
以下の実施例は本発明の特異的な態様のより詳細な記載を提供するために示されるのであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
実施例１
タンパク質修飾部位の選択
以下に記載するのは本発明によって欠失され置換されるｐ７５  ＴＮＦ受容体のアミノ酸残基を同定する方法である。予期されるポリエチレングリコール修飾反応条件はリジン残基のε−アミノ基とＮ−末端アミンの修飾に好ましいものであるべきなので、同定されたアミノ酸は、ＴＮＦ受容体―リガンド複合体においてＴＮＦ受容体とリガンドの間の接触をさせるリジン残基であった。
【００３４】
ｐ７５ＴＮＦ受容体は、ｐ５５ＴＮＦ受容体を含む構造的に相同な受容体のファミリーに属する。ＴＮＦαとＴＮＦβ（ＴＮＦリガンド）はｐ５５及びｐ７５ＴＮＦ受容体への結合において競合する。ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン及びＴＮＦβによって形成された複合体のＸ−線結晶構造が決定された（Ｂａｎｎｅｒら，Ｃｅｌｌ  ７３：４３１，１９９３  は本明細書に参考文献として援用される）。この結晶学の研究が、ｐ５５ＴＮＦ受容体とＴＮＦβの複合体は、３つのｐ５５ＴＮＦ受容体分子がＴＮＦβ三量体に対称に結合していることを確認した。これらの研究はさらに受容体が２つの近接するＴＮＦβサブユニット間の溝に結合することを示した。有利なことに、複合体の結晶構造はＴＮＦ受容体の構造と活性に一つのモデルを提供し、そして、複合体として接触する、リガンド内及び受容体内のアミノ酸ドメインを同定するために使用され得る。
【００３５】
ｐ５５ＴＮＦ受容体アミノ酸配列及びｐ７５ＴＮＦ受容体アミノ酸配列の配列整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、ｐ７５ＴＮＦ受容体残基Ｋ３４，Ｋ４２，Ｋ４７，Ｋ１０８，Ｋ１２０及びＫ１４０が、ｐ５５ＴＮＦ受容体残基Ｋ３２，Ｙ４０，Ｇ４５，Ｓ１０８，Ｌ１１９及びＴ１３８と近接して配列していることを明らかにしている（ＢａｎｎｅｒらのＣｅｌｌ  ７３：４３１，１９９３  参照）。この整列情報とｐ７５ＴＮＦ受容体上のリジン残基の空間的位置を説明する分子モデルとに基づいて、ｐ７５受容体上の２つのリジン残基がｐ７５受容体とリガンドを接触させることが示される。これらのリジン残基はＫ１０８及びＫ１２０である（１０８番目のリジンと１２０番目のリジン）。図１はｐ７５ＴＮＦ受容体の（シグナル配列を除いて）細胞外ドメインのアミノ酸配列を提供し、ポリエチレングリコール結合部位であるリジン残基とＴＮＦαと接触するリジン残基を示す。こうして、１０８番目と１２０番目のリジン残基が本発明によって欠失及び置換に選択された。
【００３６】
実施例２
野生型ｐ７５ＴＮＦ受容体と突然変異型ｐ７５ＴＮＦ受容体の作製
以下に記載するのは、野生型可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体分子（ｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞外ドメイン）と３つの突然変異型可溶性ＴＮＦ受容体分子を作製する方法である。野生型可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体は配列番号７及び配列番号８で記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を有する。以下の実験に使用された野生型及び突然変異型ＴＮＦ受容体分子はシグナルペプチドを除く細胞外ドメインであった。
【００３７】
ＩｇＧ１Ｆｃ部分と融合したヒトｐ７５ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）の２つの細胞外リガンド結合部位が、共有結合的に２量体化して融合した構築物の型の可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体（Ｍｏｈｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４８−１５６１，１９９３）は、ジヒドロ葉酸リダクターゼ選択可能増幅可能マーカーを使用してタンパク質をＣＨＯ細胞中で発現させることによって作製された。浮遊細胞は遠心され、調節されたバイオリアクター中で血清除去媒体に再浮遊された。産物は７日後に回収され、ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及び引き続いてイオン交換クロマトグラフィー法を用いて精製された。
【００３８】
３つの突然変異型可溶性ＴＮＦ受容体分子のそれぞれに、特定のリジン、Ｋが欠失され、アルギニン、Ｒが同じ場所に組み込まれた。より詳しくは、１０８番目のリジン及び／又は１２０番目のリジンは、個々に突然変異を受けて、２つの単一突然変異（Ｋ１０８ＲあるいはＫ１２０Ｒ）及び一つの二重突然変異（Ｋ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ）が作製され、これらは１０８番目のＫ及び／又は１２０番目のＫが同部位でＲに置換された。配列番号１はＫ１０８Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号２は配列番号１にコードされたアミノ酸配列を記載する。配列番号３はＫ１２０Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号４は配列番号３によってコードされるアミノ酸配列を記載する。配列番号５はＫ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号６は配列番号５によってコードされるアミノ酸配列を記載する。
【００３９】
簡単に言えば、突然変異型はｈＴＮＦ受容体とＦｃの融合タンパク質（ｈＴＮＦＲ：Ｆｃ）のＳｆｒ１−Ｎｏｔ１断片のＰＣＲ突然変異誘発を用いてヒトｐ７５ＴＮＦ受容体のＫ１０８及びあるいはＫ１２０の部位特異的突然変異誘発を用いて作製された。突然変異型ＴＮＦ受容体断片は哺乳類発現ベクターｓｆ  Ｈａｖｅｏ４０９の中でヒトＦｃ断片と読み枠が合うように（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）連結された。作製されたクローンのいくつかは望ましい核酸変化が突然変異ヌクレオチド配列に入れられたことを確認するためにシークエンスされた。
【００４０】
より詳しくは、ＰＣＲ突然変異誘発法を用いて突然変異４３０塩基対Ｓａｌ／Ｓｆｒ１断片を産生した。ＰＣＲ突然変異誘発法はＰＣＲ反応の鋳型として使われる野生型ＴＮＦＲｃＤＮＡ（配列番号７）を使用した。３つの突然変異Ｓａｌ１−Ｓｒｆ１ＤＮＡ断片を生じるＰＣＲ反応に使われるオリゴヌクレオチド配列は以下の通りであった。
【００４１】
ＴＮＦ受容体（Ｋ１０８Ｒ）突然変異型では、３‘オリゴヌクレオチドは３８９番めのＡからＧへの置換および３’末端のＳｒｆ１部位を含む。ＴＮＦ受容体（Ｋ１２０Ｒ）突然変異型では、３‘オリゴヌクレオチドは４２５番目のＡからＧへの置換と３’末端のＳｒｆ１部位を含む。ＴＮＦ受容体（Ｋ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ）突然変異型では、オリゴヌクレオチドは３８９番目と４２５番目のＡからＧへの置換と３’末端のＳｒｆ１部位を含む。突然変異型ＰＣＲ  ＤＮＡ断片を産生するのに使用される５’オリゴヌクレオチドはＴＮＦＲコードヌクレオチドにはヌクレオチド変化はなく、５’Ｓａｌ１部位を含んだ。
【００４２】
ＰＣＲ反応にはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  キットと試薬がメーカーの説明書通りに使用された。ＰＣＲサイクルプロトコールは以下の条件を含んだ。９４℃２分、９４℃３０秒、５０℃１５秒、７２℃１分を２５サイクル反応させる。
【００４３】
ＰＣＲ反応で産生されたＤＮＡ断片は１％アガロースゲル上で分離され、４３０塩基対ＴＮＦＲ断片はＢＩＯ１０１製のＧｅｎｅＣｌｅａｎ試薬を用いて単離された。単離された断片はＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中でＮＥＢのＳａｌ１とＳｒｆ１と共に制限酵素で消化された。そのＤＮＡはその後ＢＩＯ１０１のＧｅｎｅｃｌｅａｎ試薬を用いて再精製された。
【００４４】
上記のように産生された（そしてＴＮＦ受容体の５’末端に対応する）突然変異型Ｓａｌ１／Ｓｒｆ１ＤＮＡ４３０断片のそれぞれは、ＴＮＦ受容体３’末端とヒトＦｃ  ｃＤＮＡに対応する１０６５塩基対のＳｒｆ１／Ｎｏｔ１ＤＮＡ断片と、７７３０塩基対のＳａｌ１／Ｎｏｔ１ｐＤＣ４０９発現ベクターに独立に連結された。２０ｎｇのｐＤＣ４０９ベクターがそれぞれの連結反応に使用され、ＴＮＦ受容体断片は３倍のモル濃度で存在した。連結反応は室温３時間５００ユニットの連結酵素を用いてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘの中で行なわれた。
【００４５】
連結反応混合物を透析し、反応混合物の１０分の１を大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞へエレクトロポレーションした。それぞれのコンストラクションから１０コロニーを液体培養中で増殖させ、発現ベクター構築物を制限酵素解析を用いて確認した。３つの突然変異のそれぞれの１つの構築物中のＴＮＦ受容体ｃＤＮＡ導入は、望ましいヌクレオチド突然変異を確認するためにヌクレオチドシークエンスによって解析された。
【００４６】
３つの突然変異融合ｃＤＮＡ構築物をＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は３７℃７日間培養され、これらの細胞から馴化培地を回収し、Ｆｃ  ＥＬＩＺＡアッセイを用いてＴＮＦＲ：Ｆｃ発現をモニターした。馴化培地は、ＴＮＦ活性の阻害を測定するのに基づくＡ３７５細胞増殖バイオアッセイを用いて、ＴＮＦ受容体生物学的活性もモニターされた。３つのＴＮＦＲ：Ｆｃ突然変異型とＴＮＦＲ：Ｆｃ野生型構築物は同様の受容体分子発現レベルを示した。
【００４７】
突然変異型ＴＮＦ受容体タンパク質を収集し精製するために、トランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞から上清がトランスフェクト後７日間集められ、遠心と０．４５μｍフィルターを通す濾過によって浄化された。収集され濾過された野生型と突然変異型のタンパク質の精製は、プロテインＡアフィニテイークロマトグラフィーを用いて遂行された。融合タンパク質のＦｃ部位を捉えるためにプロテインＡセファロースコラムが使用された。ひとたび結合すると、タンパク質は３カラム容量分の２５ｍＭ  ＴＲＩＳ／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗われ、３カラム容量分の５０ｍＭ  酢酸ナトリウム／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で溶出された。溶出された融合タンパク質はそれぞれ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４でｐＨ７．４で透析され、ほぼ１ｍｇ／ｍＬに希釈された。最終的に収集された産物は上記のように精製された可溶性ｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃ突然変異型であった。配列番号１はＫ１０８Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号２は配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を記載する。配列番号３はＫ１２０Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号４は配列番号３でコードされたアミノ酸配列を記載する。配列番号５はＫ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ突然変異型のヌクレオチド配列を提供し、配列番号６は配列番号５によってコードされたアミノ酸配列を記載する。
【００４８】
実施例３
野生型及び突然変異型ｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃ受容体のポリエチレングリコールとの結合
以下に記載するのは、ポリエチレングリコール結合性野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子およびポリエチレングリコール結合性突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の作製法である。それぞれのポリエチレングリコール結合反応には実施例２で作製された野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃあるいは突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃの１００マイクログラム（１００μｇ）の分が４００μＬの５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．５に溶解され、タンパク質に対するポリエチレングリコールの様々なモル比で（ＴＮＦＲ：Ｆｃにおけるリジン残基の数で計算されて）４゜Ｃ一晩でＳＰＡ−ＰＥＧと反応させられた。タンパク質のリジン残基に対するモル比は１：１及び１０：１である。ＳＰＡ−ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから購入された５０００分子量のスクシニミジルカルボン酸活性化モノメトキシポリエチレングリコールである。タンパク質とポリエチレングリコール溶液は２８゜Ｃで一晩反応させられた。
【００４９】
ポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子のそれぞれは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化されたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで精製された。ポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃはこれらの条件下でレジンに結合した。未反応のポリエチレングリコールと反応副産物は５カラム容量分の平衡緩衝液でカラムから洗い流された。ポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃは５カラム容量分の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でカラムから溶出された。溶出された分画は貯留され、約１−５ｍｇ／ｍＬに濃縮された。
【００５０】
以下に示すのは上記方法によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合されたＴＮＦＲ：Ｆｃ分子のそれぞれに与えられる名称である。
１．ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ）；
２．ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１０８Ｒ）；
３．ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１２０Ｒ）；
４．ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ．
実施例４
結合型ＴＮＦＲ：Ｆｃの特性づけ
以下に実施例３で作製されたポリエチレングリコール結合野生型及びポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の特性づけ、並びに実施例２で作製された非結合型野性型及び突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の対照としての特性づけを記載する。この特性づけをする解析にはＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ及び  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  バイオアッセイ試験が含まれた。
【００５１】
４−２０％アクリルアミド濃度勾配ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖａｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）はポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子及びポリエチレングリコール結合野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子それぞれ１μｇを用いて施行された。ゲルはＮｏｖａｘ  ｆａｓｔ  ｓｔａｉｎ  で製造者の指示通りに染色された。この勾配ゲルは、ポリエチレングリコール結合の程度はポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子とポリエチレングリコール結合野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子とのそれぞれで同様であることを示した。
【００５２】
サイズ排除クロマトグラフィーは実施例３に記載されたようにポリエチレングリコールと結合した分子それぞれに施行された。サイズ排除特性づけはＢｉｏＲａｄの３００ｘ８ｍｍＳＥＣ−４００Ｂｉｏｓｉｌカラムを装備したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ  の  Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ  を用いて施行された。試料注入サイズは５０−１００μｇであり、動相は、１ｍＬ／分  リン酸緩衝食塩水であった。この結果、ポリエチレングリコール結合突然変異型及びポリエチレングリコール結合野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃは全体の大きさがかなり増加していることが確認された。より詳しくは、結合反応に使用されるリジンに対するポリエチレングリコールの比率によって、ポリエチレングリコール結合分子は非結合分子の２−３倍の大きさであった。
【００５３】
ポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子、ポリエチレングリコール結合野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子及び非結合型ＴＮＦＲ：Ｆｃが、ＥＬＩＺＡテストを受けた。ＥＬＩＺＡテストには、抗ＩｇＧ１−Ｆｃモノクローナル抗体で９６穴のマイクロタイタープレートをコートし、ポリエチレングリコール修飾タンパク質をマイクロタイタープレートに装填し、そしてそれらを抗ＩｇＧ１−Ｆｃ抗体と結合させることが含まれた。ポリクローナル抗ＴＮＦＲ２次抗体が、プレートに結合したポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の量及びポリエチレングリコール非結合性ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の量を検出するのに使用された。これらの研究の結果は、ポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ及びポリエチレングリコール結合野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃが抗ＩｇＧ１−Ｆｃ抗体及び／又は抗ＴＮＦＲ抗体との結合を減少させる或いは消失させることを示した。この結果はポリエチレングリコール結合が抗体結合に活性のあるエピト−プを遮蔽することを示唆する。
【００５４】
実施例５
野生型及び突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の薬物動態学
以下に記載するのは野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃとポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃ突然変異型分子Ｋ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ（１０８番目と１２０番目のリジンがアルギニンに置換されている）の薬物動態を比較するために企図された実験である。突然変異分子はポリエチレングリコール：リジンの比が１０：１で結合されていた。
【００５５】
１０−１２週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス２グループが、１０μｇの野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃあるいは結合型突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃを全量１００μＬで静脈注射された。注射後、マウスは殺され、血液試料が心臓に穴をあけることによって５分後、１時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に収集された。血漿試料はＡ３７５バイオアッセイで解析された。ポリエチレン結合突然変異型及び野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃの消失半減期、ｔ１／２が決定された。半減期値はｔ１／２＋／−Ｓ．Ｅ．で表され、Ｓ．Ｅ．はデータポイントに対数直線を当てはめた場合の標準誤差を示す。野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃのｔ１／２は１６．５＋／−１．０時間と決定され、ポリエチレングリコール突然変異型のそれは３６．５＋／−８．５時間と決定された。
【００５６】
上記の実験の結果は、本発明によって作製されたポリエチレングリコール結合ＴＮＦ受容体は、ポリエチレングリコール非結合性のＴＮＦ受容体と比較して、有意に循環半減期が延長されていることを示す。
【００５７】
実施例６
ポリエチレン結合性野生型ＴＮＦＲ：Ｆｃ及びポリエチレン結合性突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃの生物学的活性
実施例３で作製されたポリエチレングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の生物学的活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａ３７５  バイオアッセイで測定された。このアッセイは一般的にＯｎｏｚａｋｉらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３５：３９６２（１９８５）及びＮａｋａｉらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５４：１１８９（１９８８）に記載されている。このバイオアッセイはＡ３７５ヒト悪性黒色腫付着培養株のＴＮＦα阻害反応に基づいている。可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃは用量依存性にＴＮＦαの阻害活性を特異的に中和する。このバイオアッセイを行うために、３７５培養株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８７２）が、フラスコから単層細胞を取り除くのにｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を用いて得られた。得られた細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ修飾Ｅａｇｌｅｓ培地のアッセイミデイウムで牛胎仔血清、非必須アミノ酸及びピルビン酸ナトリウムも加えられて洗われた（すべてＧＩＢＣＯから購入された）。
【００５８】
９６穴プレートが実施例３に記載されたポリエチレングリコール結合突然変異型ＴＮＦＲ：Ｆｃの連続希釈溶液で作製された。その後、上記のアッセイミデイウム中の同量のＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．＃２１０−ＣＡ  ＴＦ）が９６穴プレートのウェルに加えられ、次に同量の４ｘ１０５の細胞浮遊液がそれぞれのウェルに加えられた。
【００５９】
プレートは３７℃の１０％ＣＯ２下の湿箱中に置かれ、細胞は７２時間インキュベートされた。その後プレートを湿箱から出し、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、ブロットし、そしてエチルアルコールで固定した。生きている細胞は０．１％水性クリスタルバイオレット溶液を用いて固定細胞を染色することによって可視化された。プレートを水で洗い、細胞をブロットした後、２％デオキシコール酸ナトリウム溶液がそれぞれのウェルに加えられ、それぞれのプレートのウェルはＤｅｌｔａ  Ｓｏｆｔ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてプレートリーダー上で波長５７０ｎｍの時の吸光度として読まれた。標準的生物学的活性ユニットがそれぞれの試料に割り当てられ、ウェルの中のＴＮＦＲ：Ｆｃの濃度を考慮して調整された。空のウェルは生物学的活性ゼロに割り当てられた。
【００６０】
Ａ３７５バイオアッセイの結果はポリエチレングリコール結合分子の活性の順序を以下のように示した。
ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１０８Ｒ，Ｋ１２０Ｒ，）＞ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１０８Ｒ）＞＞ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（Ｋ１２０Ｒ）＝ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ  （ＰＥＧ＝＞ポリエチレングリコール結合性）
この結果はポリエチングリコール結合ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で決定されたように有意な生物学的活性を維持していることを示している。ＴＮＦＲ：Ｆｃの変異型ＰＥＧ−ＴＮＦＲ：Ｆｃ（１０８Ｒ）は、１０８番目のリジン残基がアルギニンに変異されたものだが、１２０番目のリジンがアルギニンに変異されている変異型よりもずっと大きな活性を維持しているので、Ｋ１０８に結合したポリエチレングリコールがＴＮＦ結合に干渉していることが示唆される。この残基がＲ１０８に変異されている時は、１０８番目のポリエチレン結合が妨げられ、ＴＮＦ結合活性が有意に減少させられることもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポリエチレングリコール結合部位であるｐ７５ＴＮＦ受容体細胞外ドメイン内のリジン残基及びＴＮＦαと接触するリジン残基を例示する。
【配列表】
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【図１】
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