(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞の持つN-アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制または阻害することを含む、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換えタンパク質を昆虫または昆虫細胞で発現する方法。
【請求項２】
昆虫がカイコである請求項１記載の方法。
【請求項３】
昆虫細胞の持つN-アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制または阻害し、哺乳動物由来のタンパク質遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養し該タンパク質を発現させることを含む、請求項１記載のシアル酸が付加された糖鎖を有する組換えタンパク質を製造する方法。
【請求項４】
N-アセチルグルコサミニダーゼ活性の抑制または阻害が、N-アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤の添加により行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物由来のタンパク質遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させる前の昆虫細胞をN-アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤で前処理することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
N-アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤が、2-アセトアミド-1、2-ジデオキシノジリマイシンである請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
タンパク質がインターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキンからなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
タンパク質がインターフェロン-τである請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物への投与に有利なシアル酸が付加された組換えタンパク質を昆虫細胞で発現させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパク質のＮ結合型糖鎖は、タンパク質の生物学的活性や生体内での安定性において重要な役割を果たしている。シアル酸は糖鎖の構成成分の一つであり、Ｎ結合型糖鎖の末端に結合し、特に重要である。
【０００３】
従来のバキュロウイルスと昆虫細胞を用いた遺伝子組換えタンパク質の発現方法では、発現タンパク質に付加されるＮ結合型糖鎖は昆虫細胞に特徴的な構造となり、哺乳類で多く見られているシアル酸の付加による修飾であるシアル化はおこらない。すなわち、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現させたタンパク質ではＮ結合型糖鎖のほとんどはシアル酸の付加がないトリマンノシルコア型である。昆虫細胞ではゴルジ体に局在するＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）が昆虫細胞で発現される糖タンパク質に付加されるＮ結合型糖鎖を昆虫細胞に特徴的な構造に構築する活性を有する。すなわち、合成経路のＮ結合型糖鎖末端のアセチルグルコサミン残基を加水分解することによりシアル酸の結合し得る糖鎖の伸長が起こらないと考えられる（図６）。昆虫細胞型の糖鎖を持つ組換えタンパク質を動物に投与した場合には、昆虫型糖鎖は異物として認識され、あるいは生体内に長くとどまらないなどの問題が生じていた。このため、昆虫細胞で哺乳類由来のタンパク質を発現させても、動物生体内での安定性が低く、動物への投与には適さなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体内での安定性に優れ、哺乳類本来の持つタンパク質に近い、動物への投与に適した形の、シアル酸が付加された組換えタンパク質を昆虫細胞で発現させる方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、昆虫または昆虫細胞を用いた組換えタンパク質の発現の際、昆虫細胞が持つＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去することにより、動物への投与に有利なシアル酸が付加された組換えタンパク質を得られることを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【０００６】
（１）昆虫細胞の持つＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去することを含む、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換えタンパク質を昆虫または昆虫細胞で発現する方法。
（２）  昆虫がカイコである（１）の方法。
（３）  昆虫細胞の持つＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去し、哺乳動物由来のタンパク質遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養し該タンパク質を発現させることを含む、（１）のシアル酸が付加された糖鎖を有する組換えタンパク質を製造する方法。
（４）  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の抑制、阻害または除去が、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤の添加により行われる、（１）〜（３）のいずれかの方法。
【０００７】
（５）  哺乳動物由来のタンパク質遺伝子を導入したバキュロウイルスを感染させる前の昆虫細胞をＮ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤で前処理することを含む（４）の方法。
（６）  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤が、２−アセトアミド−１、２−ジデオキシノジリマイシンである（４）または（５）の方法。
（７）  タンパク質がインターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキンからなる群から選択される（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）  タンパク質がインターフェロン−τである（７）の方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まず哺乳動物由来のタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞または昆虫を得ることが必要である。
【０００９】
哺乳動物由来のタンパク質は限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコまたはイヌ由来のサイトカイン、増殖因子等の生理活性物質、たとえばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、顆粒球・コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、繊毛上皮細胞刺激ホルモン（ｈＣＧ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ）、血液凝固因子（ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ）、等が挙げられる。該タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスは、例えば、分子生物学実験プロトコールＩＩＩ、１９９７年、丸善株式会社、ｐ６６５〜ｐ６８７記載の方法等の公知の方法により得ることができる。すなわち、本発明において製造しようとするタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入し、昆虫細胞内においてこの組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡの間で２重相同組み換えを生じさせることによって作製することができる。バキュロウイルスとしては、例えば、核多角体ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。
【００１０】
昆虫細胞としては、本発明の組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを導入することが可能であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＴＮ５細胞等が挙げられる。
さらに、このようにして得た組換えバキュロウイルスを昆虫に感染して、哺乳動物のタンパク質遺伝子を発現可能に含む昆虫を得ることもできる。例えば、組換えバキュロウイルスをカイコに感染することにより哺乳動物のタンパク質を発現し得るカイコが得られる。
【００１１】
該昆虫細胞または昆虫を、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去する条件下で培養または飼育することにより、シアル酸が付加された組換えタンパク質が産生される。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去する条件として例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤の添加が挙げられる。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤としては、例えば２−アセトアミド−１、２−ジデオキシノジリマイシン（２−ＡＤＮ）  （ｐ−ニトロフェニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド）が挙げられる。培養昆虫細胞で組換えタンパク質を発現させる場合、培地に添加する阻害剤の濃度に限定はないが、数ｍＭ〜十数ｍＭが望ましく、２ｍＭ〜５ｍＭが特に望ましい。昆虫細胞の培養は、例えば、  ＥＸ−ｃｅｌｌ  ４００培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、  １０％牛胎児血清を含むＴＣ１００培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＳ社製）等の適当な培地を用い、適温で行うことができる。
【００１２】
また、哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含む昆虫に経口、注射等により該阻害剤を投与してもシアル酸が付加された組換えタンパク質を得ることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性阻害剤を含む培地での培養は、予め哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含ませた昆虫細胞を該阻害剤含有培地で培養してもよいが、組換えタンパク質へのシアル酸の付加量を考慮すると、組換えバキュロウイルスを昆虫に感染する前に昆虫細胞を該阻害剤含有培地で前処理して培養しておくのが好ましい。
【００１３】
哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含む昆虫を飼育し、または哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含む昆虫細胞を培養し、飼育または培養された昆虫または昆虫細胞からシアル酸が付加された、すなわち動物細胞で産生される動物型の糖鎖を有する組換えタンパク質を得ることができる。例えば培養昆虫細胞を用いる場合、昆虫細胞の培養液、細胞溶解液又は細胞破砕液を取得することによってシアル酸が付加された、組換えタンパク質を得ることができる。昆虫細胞を破砕する方法としては、例えば、遠心分離で昆虫細胞を集め、これを緩衝液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝撃を与える方法が挙げられる。このとき緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液やリン酸緩衝液、ＰＢＳ等を使用すればよい。上記懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、上記懸濁液に超音波を照射する方法等が挙げられる。
【００１４】
また、培養した昆虫細胞を溶解する方法としては、例えば、上記懸濁液にＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を１％程度含むＰＢＳを加えて撹拌する方法が挙げられる。昆虫細胞を破砕又は溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得し、上清から組換えタンパク質を単離・精製することができる。
得られたタンパク質がシアル酸を付加しているかどうかは、例えば、タンパク質を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ＰＶＤＦ膜やニトロセルロース膜に転写し、レクチンを用いたブロット法により解析することができる。レクチンを用いた解析方法は、例えば、グライコバイオロジー実験プロトコール、細胞工学別冊、１９９６年、谷口直之他監修、に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕  ウシインターフェロン−τ（ｂｏＩＦＮ−τ）遺伝子を導入した組換えバキュロウイルスの作製
ウシインターフェロン−τ（ｂｏＩＦＮ−τ）の鋳型ｍＲＮＡは、ウシトロホブラスト細胞から、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｃｌｏｎｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｔｉｏｎ，  １４６−１５０記載の方法により得た。ｂｏＩＦＮ−τのＯＲＦをコードするｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅しプラスミドベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ｂｏＩＦＮ−τのｃＤＮＡ組換えバキュロウイルストランスファーベクターおよび組換えバキュロウイルスはＩｎｕｍａｒｕ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７６，  １９５−２０１に記載の方法により構築した。
【００１６】
〔実施例２〕  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤を添加してのｂｏＩＦＮ−τ遺伝子を含む昆虫細胞の培養
（１）Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害剤を添加した培地を用いてのバキュロウイルスの昆虫細胞への感染
ＴＮ５細胞を０〜５ｍＭの２−アセトアミド−１、２−ジデオキシノジリマイシン（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−１，２−ｄｉｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（２−ＡＤＮ）、Ｔｒｏｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を含むＥＸ−ＣＥＬＬ４０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  社製）を用いて２８℃で３日間培養した。次いで、上述のように作製した組換えバキュロウイルスをＴＮ５（ＴＮ５Ｂ１−４）細胞にｍｏｉ＝１．０で感染し、さらにＥＸ−ＣＥＬＬ４０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  社製）を用いて２８℃で３日間培養した。その後、組換えｂｏＩＦＮ−τ（ｒｂｏＩＦＮ−τ）を含む培養上清を回収した。
また、組換えタンパク質の糖鎖の付加、すなわちＮ−グリコシル化の阻害は、組換えバキュロウイルス感染ＴＮ５細胞を１μｇ／ｍｌのツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む培地で３日間培養することにより行った。
【００１７】
（２）昆虫細胞の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
組換えバキュロウイルス感染後３日間培養したＴＮ５細胞の培養上清２０μｌをサンプルとして還元条件下でＳｃｈａｇｇｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６６，  ３６８−３７９の記載に従い、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、分離されたタンパク質をＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）Ｇ−２５０を用いて染色し、またはＰＤＦＶ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。タンパク質を転写した膜を５％スキムミルク含有ＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロッキングを行い、次に０．２μｇ／ｍｌの抗ｂｏＩＦＮ−τモノクローナル抗体（片倉産業社製）と室温で１時間反応させ、さらに２０００倍希釈したＨＰＲ−ウサギ抗マウスＩｇＧと室温でインキュベーションした。タンパク質と結合した抗体は３，３’−ジアミノベンジジン染色により可視化した。ＣＢＢ染色後およびウエスタンブロット後のバンドの濃さは、デンシトメーターを用いて定量した。
【００１８】
ツニカマイシン処理し、Ｎ−グリコシル化を阻害した組換えｂｏＩＦＮ−τのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果およびウエスタンブロット分析の結果を図１に示した。図１中、レーン１は野生型のウイルスを感染した哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を含まないＴＮ５細胞を用いた分析、レーン２はツニカマイシン不存在下で培養した哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含むＴＮ５細胞を用いた分析、レーン３はツニカマイシン存在下での哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に含むＴＮ５細胞を用いた分析結果を示す。約１９．５ｋＤおよび２２ｋＤａのタンパク質が培養上清中に認められた（図１Ａ、レーン２）。これらの２つの分子は抗ｂｏＩＦＮ−τモノクローナル抗体と反応した（図１Ｂ、レーン２）。ツニカマイシンでＮ−グリコシル化を阻害した場合、ＣＢＢ染色（図１Ａ、レーン３）およびウエスタンブロット分析（図１Ｂ、レーン３）で１９．５ｋＤの分子のみ認められた。これらの結果は、２２ｋＤａの分子はＮ−グリコシル化されており、１９．５ｋＤａの分子はされていないことを示す。
【００１９】
図２にＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤の添加の組換えｂｏＩＦＮ−τのグリコシル化に対する効果を示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の結果であり、図２ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット分析の結果である。各レーンのサンプルは、レーン１が２−ＡＤＮを添加した場合の野生型のウイルスを感染したＴＮ５細胞の培養上清、レーン２は２−ＡＮＤ不存在下の培養で得られた組換えｂｏＩＦＮ−τを含む培養上清、レーン３は２−ＡＤＮ存在下（５ｍＭ）の培養で得られた組換えｂｏＩＦＮ−τを含む培養上清である。ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤を添加して得たｒｂｏＩＦＮ−τの分子量は２３．３ｋＤａであり、阻害剤を添加しない場合の分子量の２２ｋＤａに対して有意に増加した。しかし、図には示されていないが、ツニカマイシンでＮ−グリコシル化を阻害したグリコシル化されていない組換えｂｏＩＦＮ−τの分子量は２−ＡＤＮを添加した場合でも１９．５ｋＤａのままで変化しなかった。この結果は、Ｎ−グリコシル化されたｒｂｏＩＦＮ−τの分子量の増加は、オリゴ糖部分の増加であること、すなわち２−ＡＤＮ処理により糖鎖が修飾されたことを示している。
尚、５ｍＭの濃度の２−ＡＤＮを添加しても細胞の増殖は影響を受けなかった。
【００２０】
（３）レクチンブロット分析
組換えバキュロウイルス感染後３日間培養したＴＮ５細胞の培養上清を用いて、還元条件下でトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（１レーン当たりのタンパク質量は６００ｎｇ）。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロッキングを行った後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有２００ｍＭ  ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＲＰ−ＳＮＡ、ＥＹ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）と室温で１時間反応させた。反応した炭化水素は、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅウエスタンブロットケミルミネッセンスキット（ＮＥＮ社製）を用いて可視化した。
【００２１】
ＧｌｃＮｃａｓｅの活性の阻害が昆虫細胞においてシアル化されている組換え糖タンパク質の産生をもたらすかどうかを調べるために、組換えｂｏＩＦＮ−τのＮ−グリカンの末端構造をα−２、６結合シアル酸を認識し得るレクチンであるＳＮＡを用いたレクチンブロット分析により決定した。
【００２２】
ＴＮ５細胞のＧｌｃＮＡｃａｓｅ抑制アッセイは以下のようにして行った。
ＴＮ５細胞（２．０×１０７細胞）をＰＢＳで１回洗浄し１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含む１ｍｌの  ＰＢＳですすいだ。１０００×ｇで５分間遠心分離した後に、上清を酵素源として用いた。５０μｌの上清を５０μｌの２−ＡＤＮと最終２−ＡＤＮ濃度が０〜５ｍＭとなるように混合し、２００μｌの基質溶液（０．２Ｍのクエン酸リン酸緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−アセチルグルコサミド）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。反応を１ＭのＮａ２ＣＯ３の添加により停止させ、放出されたｐ−ニトロフェノールの吸収を４２０ｎｍで測定した。図３に結果を示した。図３ＡはＴＮ５細胞のＧｌｃＮＡｃａｓｅ抑制アッセイの結果をＴＮ５細胞におけるパラニトロフェノール形成の程度により示す。図３ＢはｒｂｏＩＦＮ−τにおけるシアル酸の検出の結果を示す。また、図３ＣはＣＢＢ染色による発現した組換えｂｏＩＦＮ−τの検出の結果を示す。図中レーン１〜６は、それぞれ２−ＡＤＮの添加濃度が０、０．０５、０．５、１、２および５ｍＭの場合の結果を示す。
【００２３】
図３Ａに示すように、ＧｌｃＮｃａｓｅ活性は、２−ＡＤＮにより濃度依存的に阻害され、５ｍＭの２−ＡＤＮで約８０％阻害された。
図３Ｂのレクチンブロット分析および図３ＣのＣＢＢ染色の結果が示すように、ＳＮＡ反応性バンドは２−ＡＤＮの添加により濃度依存的に増加したが、タンパク質の総量は変わらなかった。
【００２４】
さらに、組換えｂｏＩＦＮ−τのＮ−グリカンのα−２、６結合シアル化を確認するために以下の２つの実験を行った。まず、転写した膜をシアリダーゼ（Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）で処理し、レクチンブロット分析を行った。次いで、ＳＮＡを１０ｍＭの３’シアリルラクトースまたは０．１ｍＭの６’シアリルラクトースでプレインキュベーションし、レクチンブロット分析を行った。図４に結果を示す。図４中、用いたサンプルは、レーン１が２−ＡＤＮ存在下での野生型ウイルスを感染したＴＮ５細胞の培養上清、レーン２が２−ＡＤＮ存在下（５ｍＭ）の培養で得られた組換えｂｏＩＦＮ−τを含む培養上清、レーン３は２−ＡＤＮ不存在下の培養で得られた組換えｂｏＩＦＮ−τを含む培養上清である。図４Ａはシアリダーゼ処理しない場合、図４Ｂはシアリダーゼ処理した場合の結果を示す。図に示すとおり、シアリダーゼ処理により、２−ＡＤＮ存在下でＴＮ５細胞により発現された組換えｂｏＩＦＮ−τは消失した。図４Ｄは１０ｍＭの３’シアリルラクトースでプレインキュベーションした場合の結果、図４Ｃは０．１ｍＭの６’シアリルラクトースでプレインキュベーションした場合の結果を示す。図が示すように、組換えｂｏＩＦＮ−τは２−ＡＤＮの存在下で６’シアリルラクトースの処理により消失した。一方、ＳＮＡと組換えｂｏＩＦＮ−τの結合は、３’シアリルラクトース処理およびＭａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  レクチン処理で消失しなかった。Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎレクチンはα−２、３結合シアル酸を認識し組換えｂｏＩＦＮ−τとは反応しない。これらの結果は、α−２、３結合シアル酸ではなくα−２、６結合シアル酸がＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害条件下での組換えｂｏＩＦＮ−τのＮ−グリカンの末端に付加されたことを示す。
【００２５】
〔実施例３〕  組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン２（ＩＬ２）での検討
シアル化が他の糖タンパク質でも生じるか調べた。ＩＦＮ−τと同様に、ウシＣＭ−ＧＳＦまたはブタＩＬ２遺伝子を含むＴＮ５細胞を作製して培養し、培養上清についてレクチンブロット分析を行った。図５に結果を示す。図５中、ＡはＣＢＢ染色の結果、Ｂはレクチンブロット分析の結果を示す。各レーンのサンプルは、レーン１および２が組換えＧＭ−ＣＳＦで、それぞれ２−ＡＤＮ存在下で得られたもの、２−ＡＤＮ不存在下で得られたものである。また、レーン３および４は組換えＩＬ２で、それぞれ２−ＡＤＮ存在下で得られたもの、２−ＡＤＮ不存在下で得られたものである。図に示されるように、組換えＧＭ−ＣＳＦおよび組換えＩＬ２の分子量は２−ＡＤＮ存在下で得たものが不存在下で得たものに対して有意に増加していた。また、レクチンブロット分析により組換えＧＭ−ＣＳＦおよび組換えＩＬ２がＳＮＡと反応することがわかった。これらの結果は、組換えＧＭ−ＣＳＦおよび組換えＩＬ２においてもＧｌｃＮＡｃａｓｅ活性を阻害した場合α−２、６結合末端シアル化が生じることを示す。
【００２６】
【発明の効果】
実施例に示されるように、糖タンパク質の遺伝子を含む昆虫細胞を、ＧｌｃＮＡｃａｓｅ活性を抑制、阻害または除去して培養し、組換え糖タンパク質を得た場合、組換えタンパク質の糖鎖にはシアル酸が結合しており、哺乳動物型であった。従って、本発明により安定性に優れ、哺乳類本来の持つタンパク質に近い、動物への投与に適した、シアル酸が付加された組換えタンパク質を昆虫細胞で大量に発現させることができ、動物およびヒト用医薬品の開発に大いに貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果およびウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤の添加の組換えｂｏＩＦＮ−τのグリコシル化に対する効果を示す図である。
【図３】シアル化組換えｂｏＩＦＮ−τの産生に対する２−ＡＤＮの効果を示す図である。
【図４】ＴＮ５細胞により発現された組換えｂｏＩＦＮ−τがα２、６結合シアル化されていることを示す図である。
【図５】昆虫細胞で産生された組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ２がシアル化されていることを示す図である。
【図６】昆虫細胞におけるＮ−グリコシル化の経路を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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