(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外基質を含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の結合および検出用イムノアッセイ試薬。
【請求項２】
細胞外基質が内皮細胞由来のものである請求項１記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項３】
細胞外基質が上皮細胞由来のものである請求項１記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項４】
ラミニンを含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の結合及び検出用イムノアッセイ試薬。
【請求項５】
ラミニンが約２００ｋＤａの分子量を有するものである請求項４記載のイムノアッセイ試薬。
【請求項６】
表面の少なくとも一部に細胞外基質または狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体を一またはそれ以上含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体のイムノアッセイ検出用試験キット。
【請求項７】
内部表面に細胞外基質または狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる容器を一またはそれ以上含む、請求項６記載の狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体のイムノアッセイ検出用試験キット。
【請求項８】
表面の少なくとも一部にラミニンが固定化されてなる固相担体を一またはそれ以上含む、請求項６記載の狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体のイムノアッセイ検出用試験キット。
【請求項９】
ラミニンが約２００ｋＤａの分子量を有するものである、請求項８記載の試験キット。
【請求項１０】
次の工程を含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の存在を測定するためのバインディングアッセイ法。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面の少なくとも一部に細胞外基質または狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合した接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、そして
（ｅ）生じる色の濃さを測定する。
【請求項１１】
尿を、表面の少なくとも一部にラミニンが固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートする、請求項１０記載のバインディングアッセイ法。
【請求項１２】
ラミニンが約２００ｋＤａの分子量を有するものである、請求項１１記載のバインディングアッセイ法。
【請求項１３】
次の工程を含む、患者の狼瘡疾患の進行度を測定するためのバインディングアッセイ法。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面の少なくとも一部に細胞外基質または狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合した接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、
（ｅ）生じる色の濃さを測定し、そして
（ｆ）所定の日数の後、該患者から得た新たな尿サンプルを用いて、（ａ）から（ｅ）の工程を繰り返す。
【請求項１４】
尿を、表面の少なくとも一部にラミニンが固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートする、請求項１３記載のバインディングアッセイ法。
【請求項１５】
ラミニンが約２００ｋＤａの分子量を有するものである、請求項１１記載のバインディングアッセイ法。
【請求項１６】
次の工程を含む、狼瘡疾患に罹りやすい傾向のある患者の狼瘡病の活動期を予測するためのバインディングアッセイ法。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面の少なくとも一部に細胞外基質または狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合した接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、そして
（ｅ）生じる色の濃さを測定する。
【請求項１７】
尿を、表面の少なくとも一部にラミニンが固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートする、請求項１６記載のバインディングアッセイ法。
【請求項１８】
ラミニンが約２００ｋＤａの分子量を有するものである、請求項１７記載のバインディングアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はイムノアッセイ試薬、キットおよび方法に関する。より詳細には、本発明は狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の結合及び検出に用いられる新規試薬、それを含むキットおよび方法に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】
全身性紅斑性狼瘡（全身性エリテマトーデス：以下、ＳＬＥともいう）は、病原性の自己抗体および免疫複合体の沈着によって組織や細胞が損傷を受けることに起因する、病因不明の疾患である。患者の９０％は、一般に妊娠可能な年齢の女性であるが、子供、男性および高齢者が罹る場合もある。米国では、都市地域でのＳＬＥの羅患率は１００，０００あたり１５から５０であり、白人に比べて黒人に多く、より重症である。また、イスパニア系およびアジア系の人々はＳＬＥに罹り易い。
【０００３】
病原性抗体および免疫複合体の産生が、それらの抑制の失敗と相まって、ＳＬＥの根底にある基本的な異常となる。
ＳＬＥと関連する公知の抗体を下記に挙げる。
全ての抗体または免疫複合体が病原性であるというわけではなく、抗体のあるものはその抗原特異性ゆえに疾患を引き起こす。このような抗体の例としては、赤血球表面抗原または凝固因子に対する抗体が挙げられる。またその他の抗体は、それらの免疫グロブリン（Ｉｇ）のアイソタイプ、補体（Ｃ’）結合能力、結合活性および／または電荷ゆえに疾患を引き起こす。例えば、補体を結合する陽イオン性抗体は、糸球体の基底膜中のポリアニオンに結合し、抗原を結合し、損傷を引き起こす。
【０００４】
ＳＬＥの病因には、遺伝学的、環境上および性ホルモンの因子が含まれる。これらは異常な体液性，細胞性免疫反応、抗体および免疫性複合体の不適当な除去を引き起こす。
【０００５】
従来公知のＳＬＥ患者中の自己抗体としては、抗核抗体（ＡＮＡ）；抗ＤＮＡ；抗Ｓｍ；抗ＲＮＰ；抗ＲＯ（ＳＳＡ）；抗Ｌａ（ＳＳＢ）；抗ヒストン；抗カルジオリピン；抗赤血球；抗血小板；抗白血球；抗神経細胞が挙げられる。
【０００６】
抗体バインデイングアッセイ法はＳＬＥの存在を検出するために用いられている。公知のように、イムノアッセイ法とも呼ばれる特異的抗体バインディングアッセイ法は、急速に浮上しつつある分析技術であり、その高い特異性および感度ゆえに、診断および研究に最も広く使用されている。この技術の初期のものは、放射性同位体標識を用いたものであるが、近年酵素標識を用いるエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）技術に段々とって代わられつつある。このＥＩＡ技術は放射性同位体標識を用いたものに比べて、同等の感度を有しながら、より安全性・簡便性に優れ、かつ安価である。
【０００７】
ＥＩＡ技術のうち、固相担体（例えば、試験管、ポリスチレンビーズまたは窪んだ穴を備したプレート等）の感作された表面に付着させた酵素標識された抗体もしくは抗原を用いる、いわゆる“異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）”アッセイ法がよく用いられている。そのような技術は、略称ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）と一般的に呼ばれている。ある変法では、この技術は、二番目の抗体、即ちある特定の第一抗体に対する抗血清、の使用という公知技術と共に用いられる。当該二番目の抗体は、フリーな状態、または特異的抗原と結合している場合は抗原−抗体複合体の状態で、任意の第一抗体を検出するための非特異的検出器として働く。
【０００８】
上記方法の一変法では、それは公知のコート試験管技術（ｃｏａｔｅｄ  ｔｕｂｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）にもまた反応性を示すものであるが、抗原を試験管の内部壁表面に付着させ、その中で結合反応を行うものである。その結果、被験サンプル中に存在する、試験管の内部壁表面に付着している抗原に特異的なフリーの抗体は、試験管内表面上に固定化された該抗原を介して、試験管内表面に結合する。それから、反応混合液を該試験管から除去して、試験管を洗浄し、該試験管に酵素標識された第二抗体を含む第二の溶液を入れる。この標識された第二抗体はまた、抗原を介して試験管内表面に結合している抗体にそれ自身が結合することによって固定化される。試験管を再び空にして洗浄し、そして第二抗体の酵素標識と反応しうる適当な基質で満たして、酵素活性を測定する。この活性は、被験サンプル中の抗体の濃度と直接的に比例する。
【０００９】
上述したように、全身性紅斑性狼瘡は各種の自己抗体の出現で特徴づけられる。これらの抗体の多くは、インビトロでは細胞内の抗原（例えば、核抗原等）と結合する。しかしながら、インビボにおけるそれらのリガンドは明らかとなっていない。
【００１０】
ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナル・メディシン、１２版、第１４３５頁、（１９９１）〔Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐ．１４３５，（１９９１）〕には、下記のように報告されている。
【００１１】
「特徴的な抗体が存在すれば、ＳＬＥの診断が正しいという確認になる。抗核抗体（ＡＮＡ）は最もよいスクリーニング試験である。もし、該試験の基質が、例えばＷＩＬ−２またはＨＥＰ−２細胞の場合のように人体の核であるならば、狼瘡疾患患者の９５％以上の者は陽性を示すであろう。囓歯類の肝臓または腎臓の基質は、ＡＮＡまたは抗細胞質抗体のような広い範囲での検出はできず、ＳＬＥ血清の約８５％がこれらの基質に対して陽性を示す。ＡＮＡ陽性はＳＬＥに特有ではなく、ＡＮＡは健常人にも生じる場合があり（通常は低い力価である）、その頻度は年齢とともに増加する。さらに、他の自己免疫性疾患、急性ウイルス感染、慢性炎症過程およびいくつかの薬剤によってＡＮＡ陽性が引き起こされるようである。それゆえに、ＡＮＡ陽性はＳＬＥの診断を裏付けるものの特異的ではなく、ＡＮＡが陰性であればＳＬＥの可能性は少ないが、全く否定するものではない。ｄｓＤＮＡおよびＳｍに対する抗体は比較的ＳＬＥに特異的なものであるが、上で挙げた他の自己抗体はそうではない。ＡＮＡおよび抗ＤＮＡの高い血清レベル及び補体の低レベルは、通常、疾患の活動性を反映し、特に腎炎患者においてそうである。クリオグロブリンまたは他の免疫複合体の血清レベルは、時々疾患の活動性と関連する。総機能的メオライティック補体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）レベル（ＣＨ５０）は、補体活性化を示す最も感度のいい測定法であるが、また非常に実験誤差を受け易いものである。Ｃ３およびＣ４の量的なレベルは広く入手可能である。Ｃ３が正常なレベルでＣＨ５０のレベルが非常に低い場合は、ある補体成分の先天的欠陥を示唆する。」
【００１２】
このように、ＳＬＥのある特徴的な抗体が確認され、また該抗体が診断の目的で使用されているものの、これらの抗体のインビボでのリガンドは同定されておらず、またＡＮＡを用いる最もよいスクリーニング試験ですら特異的なものとは考えられていない。
【００１３】
さらにまた、特に重要なことであるが、これまで該抗体の存在および／または力価は、腎臓での疾患活動性を反映していない。
【００１４】
本発明によると、今回、狼瘡腎炎で役割を果たしていると思われる新規な自己抗体群が見出された。これらの抗体は下記の特徴を有する。
ａ）それらは細胞外基質（以下、ＥＣＭという）成分と結合する。
ｂ）それらはＳＬＥ患者の尿中に特異的に発生する。
ｃ）それらのレベルは腎疾患の活動性と相関している。
【００１５】
さらに、今回、活動的な状態にある疾患を有する狼瘡患者の尿が、内皮細胞により産生されるＥＣＭおよび上皮細胞により産生されるＥＣＭ〔マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、登録商標）〕と結合する抗体を含有していることが見出された。この抗体は、ラミニンの２００ｋＤａ鎖、及びマトリゲル（登録商標）中のそれぞれ分子量約９７ｋＤａおよび約１１６ｋＤａを有する二つの未知の蛋白質と結合する。
【００１６】
これらの発見に基づいて、本発明は、細胞外基質を含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の結合および検出に用いられるイムノアッセイ試薬を提供するものである。
本発明で用いられる細胞外基質は内皮細胞または上皮細胞に由来するものである。
【００１７】
本発明はまた、ラミニンを含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の結合および検出に用いられるイムノアッセイ試薬を提供する。特に本発明で好適に用いられるのは約２００ｋＤａの分子量を有するラミニンである。
【００１８】
他の局面において、本発明は、内部表面に細胞外基質またはその狼瘡抗体結合性ラミニン成分が結合している容器を一またはそれ以上含む、狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体を検出するイムノアッセイ用試験キットを提供する。
【００１９】
本発明はさらに、次の工程を含む狼瘡疾患患者の尿中に見つかった抗体の存在を測定するためのバインディングアッセイ法を提供する。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面の少なくとも一部に細胞外基質またはその狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合した接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、そして
（ｅ）生じた色の漏さを測定する。
【００２０】
本発明の方法が狼瘡疾患の進行度を追跡するために、また狼瘡疾患に罹りやすい傾向がある患者において狼瘡の活動期（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ）を予測するために用いることができることが理解されるだろう。
従って、本発明によれば、また、次の工程を含む患者の狼瘡疾患の進行度を測定するためのバインデイングアッセイ法も提供される。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面の少なくとも一部に細胞外基質またはその狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合した接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、
（ｅ）生じた色の濃さを測定し、そして
（ｆ）所定の日数の後、該患者から得た新たな尿サンプルを用いて（ａ）から（ｅ）の工程を繰り返す。
【００２１】
ここで所定の日数とは、医師の推奨に従って日、週、または月単位のいずれで測られるものでもよい。
本発明はまた、次の工程を含む狼瘡疾患に罹りやすい傾向のある患者において狼瘡疾患の活動期を予測するためのバインディングアッセイ法を提供する。
（ａ）疑いのある尿サンプルを、表面上の少なくとも一部に細胞外基質またはその狼瘡抗体結合性ラミニン成分が固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートし、
（ｂ）該固相担体を洗浄して、剰余サンプルを除去し、
（ｃ）該固相担体を抗ヒト／マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ接合体とインキュベートし、
（ｄ）該固相担体を、結合接合体の存在下で色が変化する適当な酵素基質と接触させてインキュベートし、そして
（ｅ）生じた色の濃さを測定する。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施態様では、前記の尿を、表面上の少なくとも一部にラミニンが固定化されてなる固相担体と接触させてインキュベートする。好ましくはラミニンは約２００ｋＤａの分子量を有するものである。
【００２３】
本発明で用いるＥＣＭは自体既知の方法、例えば、ナパルステクらによって記載された方法〔Ｎａｐａｒｓｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１０，ｐ．２４１（１９８４）〕により調製することができる。あるいは市販品を用いてもよい。例えば、商品名マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、登録商標）として販売されているマウス膜ＥＣＭは、バイオロジカル・インダストリーズ・リミテッド社（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，イスラエル）から入手でき、本発明で用いることができる。
ＥＣＭの成分は、機能上幾つかの役割を果たす。それらは細胞同士を結合するＥＣＭ接着成分を含む。それらは無細胞基底膜のシートを構成し、このシートはマトリックスまたは足場様（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｌｉｋｅ）の様式により、特定の組織の特徴的な三次元の細胞構成を決定する。ＥＣＭのその他の役割は驚くほど動的である。ラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンのようなＥＣＭ成分は、足場依存性細胞の基質結合および細胞質拡散を仲介する付着因子である。幾つかの付着因子（例えばラミニン）はまた固有のマイトジェン（分裂促進）活性を有し、成長因子としても機能する。
【００２４】
付着因子および成長因子としての性質に加えて、特定の組織に特徴的な、ＥＣＭ成分の特定の組合せは、類上皮細胞が形態学的、生化学的機能上十分な状態にまで分化または成熟するために必要である。
【００２５】
バイオロジカル・インダストリーズ・リミテッド社は、マトリゲル（登録商標）製品に関する見込みの中で、インビボＥＣＭは集合的にいえば、細胞により分泌され、三次元組織構成および機能のための支持体および枠組みとして役立つすべてのＥＣＭ分子および分子集合体であると説明する。特に、本発明の実施例で用いたマトリゲル（登録商標）は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）〔ナイドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）〕を含有する天然の可溶化組織基底膜の多成分調製品として記載されている。
【００２６】
ＥＣＭは多くの成分からなり、ビメンチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エンタクチン、コラーゲンおよびフィブロネクチンを含む〔Ｒ．Ｔｉｍｐｌ，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，”Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．２９３−２９８（１９８６）〕。初めの３成分は内皮および上皮由来ＥＣＭ中の両方に見出される。ＥＣＭと反応するＣ７２モノクローナル抗体がＥＣＭのラミニン成分と結合することが見出された。このＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１狼瘡マウス由来の抗体を試験した。なぜなら、この抗体は数種のマウス抗ＤＮＡ狼瘡抗体に共通するＶＨ遺伝子配列を利用しているように、狼瘡抗体の主要なグループを代表するからである。このＶＨ遺伝子を用いる抗体の一つであるＡ５２は、腎臓と結合することおよび単離された灌流ラット腎モデルにおいて腎機能障害を誘発することが以前に示されている〔Ｅ．Ｒａｚ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉ−ＤＮＡ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｂｉｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｔｏ  Ｒｅｎａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅＩｓｏｌａｔｅｄ  Ｐｒｅｆｕｓｅｄ  Ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４２，ｐｐ．３０７６−３０８２（１９８９）〕。最近、同じＶＨ遺伝子がＭＲＬ／１ｐｒ／１ｐｒモデルの腎炎原性抗ラミニン抗体をコードすることが示された〔Ｍ．Ｈ．Ｆｏｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｎｅｐｈｒｏｔｒｏｐｉｃ  Ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ＭＲＬ／１ｐｒ／１ｐｒ  Ｍｏｕｓｅ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１５１．ｐｐ．８１４−８２４（１９９３）〕。ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１系の狼瘡マウスからの同様の抗体もまたＥＣＭ中のラミニンと結合するという所見は、ラミニンが実際にこれらのいわゆる抗ＤＮＡマウス狼瘡抗体に対する真の生体内における腎臓標的抗原であるかもしれないことを示す。ポリクローナルマウスおよびヒト尿性自己抗体のＥＣＭとの結合がラミニンによっても抑制されるという本知見は、ラミニンが腎炎原性ヒト狼瘡抗体の主要な標的抗原でもあることを示す。
【００２７】
【実験例・実施例】
本発明をより十分に理解しうるように、以下の実例となる図面に言及して好ましい態様および実施例に関して本発明を説明する。
ここではその図面について詳細に特定して言及するが、示した詳細は例示であり、本発明の好適な態様を実例を挙げて論じる目的のためだけのもので、最も有用で発明の本質および概念的側面がよく理解できる記載であると考えられるものを提供するために示されていることを強調する。この点について、発明の構造的な詳細を発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に示すことは行わず、記載は図面と共に、発明の幾つかの形式を実際にどのようにして具体化するかを当業者に明らかにする。
【００２８】
実施例１：角膜内皮ＥＣＭでコートされたウエルの調製
以前Ｖｌｏｄａｓｋｉらによって示された、細胞外基質：構造と機能（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）〔“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｌａｍｉｎａ  ｂｙ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｏｒｎｅ  Ｃｅｌｌｓ”Ａ．Ｒ．Ｒｅｄｄｉ編、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．２８３−３０８（１９８５）〕の記載と同様にして、ウシ角膜内皮細胞をペトリ皿中で増殖させた。細胞がコンフルエントに達した時、それらをトリプシンによって除去、洗浄し、カウントして、そしてマイクロウエル中で１０４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で培養した。
コンフルエントに達した５日後（播種後約１０日）、細胞層を０．５％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水にさらすことによって（１０分、２２℃）溶解し、完全な状態でマイクロウエルにしっかりと付着、内在するＥＣＭを残した。
【００２９】
実施例２：
マトリゲル（登録商標）を１：１００に希釈し、３０分間マイクロウエル中に置き、実施例１と同様に安定化した。
【００３０】
実施例３
ＥＣＭをマイクロウエルに結合させ、実施例１および２と同様に安定化した。
アッセイを行うために、まず初めに、非特異的結合を減少させるため、ウエルをウシ胎児血清およびウシ血清アルブミンを含むブロッキング溶液でインキュベートした。該ウエルを洗浄してその中に希釈した尿または血清サンプルを置きインキュベートする。もし、抗ＥＣＭ抗体がサンプル中に存在すれば、それらはマイクロウエル中で抗原と結合するであろう。マイクロウエルを洗浄して剰余サンプルを除去した後、アルカリホスフォターゼまたはペルオキシダーゼに接合した抗ヒト／マウスＩｇＧを用いて二番目のインキュベートを行った。非結合の接合体を次の洗浄段階で除去する。それから酵素基質（ｐ−ニトロ−フェニルホスフェートまたはｏ−フェニレンジアミン）を加える。もし、結合した接合体が存在していたら、無色基質はその色が変化するであろう。それから反応を停止し、色を固定化する。色の濃さを４０５ｎｍ（過酸化物）で光学的に測定する。該色の濃さは試料中に存在する抗ＥＣＭ抗体の濃度に比例する。
狼瘡患者、健常人および狼瘡マウスの尿および血清を試験したところ、抗ＥＣＭ抗体は、活動的な状態にある腎疾患を持つ狼瘡患者の尿中に特に見られ、そのレベルは腎疾患の活動性と相関して減少することがわかった。
これらの試験の結果を表１〜表３にまとめる。
【００３１】
【表１】
0003541236.tif 000002
【００３２】
ＳＬＥ患者および健常人コントロールの尿の各種希釈物の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。狼瘡尿は、１：１０，０００に希釈した場合でもＥＣＭに結合した。
【００３３】
【表２】
0003541236.tif 000003
【００３４】
ＳＬＥ患者、健常人コントロールおよびＭＲＬ／１ｐｒマウスの尿をそれぞれ１：４に希釈し、またＳＬＥ患者の血清を１：１００に希釈して、ＥＣＭとのそれらの反応をＥＬＩＳＡによって試験した。狼瘡患者および狼瘡マウスの尿はＥＣＭと反応することが観察された。
【００３５】
【表３】
0003541236.tif 000004
【００３６】
三人のＳＬＥ患者の尿中の抗ＥＣＭ反応について、疾患の活動期および治療反応後、試験した。抗ＥＣＭ抗体のレベルは疾患の活動性に相関する所見が得られた。
【００３７】
実施例４
尿および血清サンプルは、１２人の健康なボランティアおよび２２人のＳＬＥ患者から、彼らが健康診断のために病院を訪れた際に得たものである。実施した試験の結果を表４に示す。尿および血清は小分けして、使用するまで−２０℃で凍結した。
【００３８】
【表４】
0003541236.tif 000005
【００３９】
全てのＳＬＥ患者は、ＳＬＥの分類のための１９８２年ＡＲＡ基準〔Ｅ．Ｍ．Ｔａｎら“Ｔｈｅ  １９８２  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，”Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１２７１−１２７７（９８２）〕で分類した。
２２人の患者のうち１１人が調査時に活動的な状態にある腎炎を持っていた。それらの患者のうち２人の腎炎を診断したところ、尿検査によって蛋白尿およびＲＢＣ円柱が観察された。その他の９人の患者については、また腎臓生検も行われ、５患者にびまん性増殖性糸球体腎炎；２患者に膜性腎炎；および各々１患者に膜性増殖性糸球体腎炎および間質性腎炎が見られた。５人の患者が臨床的に活性な狼瘡を有しており、彼らのうち２患者にびまん性皮膚発疹；および各々１患者に多発性関節炎、多発性筋炎および中枢神経系関与疾患の症状が主として現れていた。さらに、３人の患者は疾患が活動的な状態にあるために発熱していた。治療担当の医師によれば、コルチコステロイドの投与を開始するか、または該投与量を増加させることが必要になったときに、疾患は活動的な状態にあるとして定義される。残りの６人の患者は、６か月以上の間、臨床的に緩解の状態にあった。さらに、臨床的活性インデックスは、Ｌｏｃｋｓｈｉｎらのものを同様に用いた〔“Ｌｕｐｕｓ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ：Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ  Ａｂｓｅｎｃｅｏｆ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｒ  ａｆｔｅｒ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，”Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７７，ｐｐ．８９３−８９８（１９８４）〕。
【００４０】
ＭＲＬ／１ｐｒ、ＭＲＬ＋／＋Ｃ５７Ｂ１６、ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｃ５７Ｂ１６×ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１およびＣＢＡ／Ｎマウスはジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｍａｉｎｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。尿は下腹部に弱い圧力を加えて、５００μｌのエッペンドルフチューブ中に集めた。
モノクローナル抗ＤＮＡ抗体Ｃ７２由来のＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１はＤ．Ｅｉｌａｔ教授（Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）から寄贈されたものである。この抗ＤＮＡ  ＩｇＧ抗体の結合特異性については、〔Ｄ．ＥｉｌａｔおよびＲ．Ｆｉｓｃｈｅｌ，“Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎ  Ｖ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｍｉｃｅ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．３６１−３６８（１９９１）〕に記載されている。
【００４１】
Ｉ．Ｖｌｏｄａｖｓｋｉ教授（Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）より寄贈されたウシ角膜内皮細胞を、前記実施例１と同様にしてペトリ皿中で増殖させた。細胞がコンフルエントに達した時、それらをトリプシンＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ：バイオロジカル・インダストリーズ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）によって除去し、洗浄し、カウントして、そして９６穴マイクロウエルプレート（ヌンク，Ｋｍａｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中、１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルの濃度で培養した。播種してから１０日後、細胞層を１０分間、２２℃、０．５％トリトンＸ−１００（シグマ・ケミカル・カンパニー：Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にさらすことによって溶解した。これらの条件のもとで、ＥＣＭはウエルにしっかりと接着したまま残された。
【００４２】
ＥＣＭでコーティングされたウエルは、１０％ウシ胎児血清（バイオロジカル・インダストリーズ）および２％ウシ血清アルブミン（シグマ）を含むブロッキング溶液で６０分間インキュベートした。試験に先立って、尿を１：４に希釈し、血清を尿サンプルと同じＩｇＧレベルに達するまで希釈した。プレート洗浄後、前述のように０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で希釈した血清または尿サンプルを加え、９０分間室温でインキュベートした。それから、該プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンペルオキシダーゼ接合体またはヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭペルオキシダーゼ接合体１：５０００（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ：Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）をウエルに加え、４５分間インキュベートした。それから、該プレートを洗浄することによって非結合の接合体を除去し、基質ＯＰＤ（シグマ）を加えた。１０分後、６Ｎ硫酸を加えて反応を止め、吸光度を４９２ｎｍで光学的に測定した。ＥＭＣでコーティングしないで同様にブロックしたウエルを、非特異的結合のコントロールとして用いた。
【００４３】
各々の患者からの血清および尿ＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定した。ポリスチレン９６穴プレート（コーニング、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、カーボネートコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）で１：１０００に希釈したアフィニィピュア（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ）ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）５０μｌ／ウエル）で、４℃で終夜コーティングした。ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄し、３０分間室温で１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（３００μｌ／ウエル）でブロックした。ブロッキング後、ウエルを３回洗浄し、適宜希釈をした尿または血清を５０μｌ／ウエルの割合で加えた。既知濃度のヒトＩｇＧ（Ｇａｍｍｏｎａｔｉｖ，Ｋａｂｉ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）もまたウエル中に入れ、スタンダードとして用いた。サンプルを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳで１：５０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭペルオキシダーゼ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ）を５０μｌ／ウエルの割合で加え、室温で１時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで９回洗浄し、３０％Ｈ２Ｏ２を６μｌ含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）３０ｍｌに、１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミンを溶解させた溶液を１００μｌ／ウエルの割合で加えて、反応を進めた。２０分後に、呈色反応を、１：９の割合で希釈したＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。
【００４４】
ポリスチレン９６穴プレート（ヌンク）を、１０μｇ／ｍｌラミニン（シグマ）含有カーボネートコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）、１０μｇ／ｍｌＤＮＡ（シグマ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、またはマトリゲル（基底膜マトリゲル：コラボレイティブ・リサーチ・インク．，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＢＢＳ（ホウ酸緩衝生理食塩水，ｐＨ８．８）１：１００希釈液（それぞれ５０μｌ／ウエル）でコーティングした。マトリゲルは、その主たる成分としてラミニンを含む、ＥＨＳ上皮腫瘍によって作られたマトリックスの市販調製品である〔Ｈ．Ｋ．Ｋｌｅｉｎｍａｎら，“Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３１２−３１８（１９８６）〕。ウエルをコーティングし、４℃で終夜保存した。ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄し、３０分間室温で３００μｌ／ウエルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした。ブロッキングの前およびその間、尿またはＣ７２を、異なる濃度の抑制抗原と混合し、３０分間室温で、更に３０分間４℃でインキュベートした。ブロッキング後、ウエルを３回洗浄し、抑制抗原を用い、或いは用いずに、５０μｌ／ウエルの尿またはＣ７２上清を加え、９０分間室温でインキュベートした。ウエルを６回洗浄し、５０μｌ／ウエルの第二抗体〔アルカリホスファターゼ（シグマ）に１：１０００の割合で接合した抗マウスＩｇＧ、または西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ジャクソン）に１：５０００の割合で接合した抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ〕を加え、９０分間室温でインキュベートした。ウエルを９回洗浄し、適当な基質溶液（１００μｌ／ウエル）を加えた。アルカリホスファターゼについては４０５ｎｍ、ＨＲＰについては４９２ｎｍにおける吸光度が測定された。
【００４５】
ＤＮＡに結合している抗体を、ミリポア（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のフィルターアッセイを用いることによって測定した〔Ｂ．ＧｉｎｓｂｅｒｇおよびＡ．Ｋｅｉｓｅｒ，“Ａ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＦｉｌｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｎａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｓｅｒａ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＳＬＥ，”Ａｒｔｈｒｉｔｓ．Ｒｈｅｕｍ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１９９−２０７（１９７３）〕。血清および尿を、０．２Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した。１０μｌの３Ｈ−標識ＤＮＡ（６０００カウント／分）を、１００μｌ抗体に加えた。混合物を３７℃で３０分間、さらに６０分間４℃でインキュベートした。混合物を、０．４５μｍニトロセルロースフィルター（ミリポア）を用い、減圧下で濾過した。フィルターを３ｍｌのＢＢＳで二回洗浄し、それぞれを別個のプラスチックバイアル中に入れた。フィルターを室温で少なくとも１６時間乾燥し、β−シンチレーションカウンターでトルエンベースのシンチレーション液を用いて測定した。結果を、二試料を一組として（デュープリケート）、その試料の平均として表した。試料は平均値の８％未満の範囲で推移した。
【００４６】
活動的な状態にある狼瘡の患者から得られた尿を遠心分離し、上清をプロテインＡセファロースカラム（シグマ）に通した。カラムをＰＢＳでよく洗浄し、免疫グロブリンを０．１Ｍクエン酸で溶出した。溶出後直ちに、免疫グロブリンを２Ｍトリス溶液（ｐＨ  １１）を用いて中和し、免疫グロブリン濃度を求めるためにそのＯ．Ｄ．を２８０ｎｍで測定した。定量後、免疫グロブリンをコロジオンバッグ（ザルトリウスＡＧ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に集め、３日間ＰＢＳで透析し、使用まで０．２％アジドを用いて４℃で保存した。ＩｇＧは、ＮＯＲ−Ｐａｒｔｉｇｅｎ  ＩｇＧ−ＭＣプレート（ベーリングベルケＡＧ：Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて放射状免疫拡散法によって定量した。
【００４７】
マトリゲルおよびラミニンを、Ｌａｅｍｍｌｉにより記されたようにして２．５時間、１００ｖで、８％ＳＤＳゲル中で実験した〔Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，“Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｄ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２７，ｐ．６８０（１９７０〕。蛋白質を、０．０１％ＳＤＳを加えたメタノールフリーのトリス−グリシントランスファー緩衝液中、１００ｖで１．５時間、ポリビニリデン二フッ化物（ＰＶＤＦ）膜に移した。該膜を、１０％ヤギ血清含有ＰＢＳを用いて４℃で終夜ブロックし、洗浄し、そして狼瘡患者の尿から得られたＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）または１％ヤギ血清含有ＰＢＳで希釈された等量のポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｇａｍｍｏｎａｔｉｖ，Ｋａｂｉ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と１時間、室温で反応させた。膜を再度洗浄し、１％ヤギ血清含有ＰＢＳで１：５０００に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリンアルカリホスファターゼ（ジャクソン）を用いてさらに１時間インキュベートした。該膜を再び洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を用いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）でインキュベートすることによって反応を進めた。分子量マーカーはクマシー蛋白質染料で染色することによって検出した。
【００４８】
（結果）
２２人の狼瘡患者、１２人の健常人ボランティア、５匹の４月齢ＭＲＬ／１Ｐｒマウス、ＭＲＬ＋／＋マウス、および４系統のコントロール非狼瘡マウスから得られた尿サンプルについて、ＥＬＩＳＡによって抗ＥＣＭ抗体の存在を調べた。前記表４に示されるように、狼瘡患者の殆どの尿、並びに狼瘡マウスの尿には、高レベルの抗ＥＣＭ抗体が含まれ（平均ＯＤ±ＳＥ：それぞれ０．６５±０．１１および１．１５±０．０５）、一方健常人ボランティア（ＯＤ  ０．０１５±０．００７）または５種の非狼瘡マウス（ＯＤ  ０．０３±０．００９，示さず）から得られた尿中には非常に低レベルしか認められなかった。
【００４９】
ＳＬＥ患者の尿からプロテインＡカラムで単離された免疫グロブリンは、マトリゲルの２００ｋＤａ、９７ｋＤａおよび１１６．７ｋＤａ成分、ならびにラミニンの２００ｋＤａ鎖と反応することを示した。２００ｋＤａは、ラミニンのＢ１およびＢ２鎖に相当する。マトリゲルの低分子量バンドの成分は同定されなかったが、それは高分子量成分の分解生成物であるかもしれない。同じ濃度のポリクローナルヒト免疫グロブリンは、マトリゲルまたはラミニンのいずれにも結合しなかった。
【００５０】
患者を、臨床的に活動的な状態にある疾患を持つ患者（１６患者、平均活性インデックス１０．２）および非活動的な状態にある疾患を持つ患者（５患者、平均活性インデックス２．２）に分けた時、前述のように、活動性疾患のグループは、非活動性疾患のグループ（ＯＤ  ０．１４±０．０５）より著しく高レベルの抗ＥＣＭ抗体（ＯＤ  ０．８±０．１３）を有していた。活動的な状態にある疾患を持つ患者の中で、臨床的に腎炎を持つ１１患者（２．３ｇ／ｄｌの平均蛋白尿、円柱等）が、最も高レベルの抗ＥＣＭ抗体（ＯＤ  ０．９５±０．１２）を有していた。興味深いことに、腎炎の臨床的な徴候はないが、活動的状態にある狼瘡を持つ５患者も、また尿中のこれら抗体レベルが増加していた（０．４８±０．０８）。腎炎患者の活性インデックスは１０．８であり、一方臨床的な徴候のない腎炎患者は８．６の活性インデックスを有していた。アミロイド症および妊娠中の毒血症のために蛋白尿を有する患者の尿サンプル、ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで０．１−１０ｍｇ／ｍｌに希釈されたヒト免疫グロブリンはＥＣＭと結合しなかった（表示せず）。
【００５１】
血清および尿の間の抗ＥＣＭ抗体レベルの違いを試験するために、尿中の抗体について、似たＩｇＧ濃度に希釈された血清中の抗体のレベルと比較し、その結果を表５に示す。表５に示されるように、抗ＥＣＭ抗体は、狼瘡患者の尿中に主に見られ、一方血清中にははるかに低い濃度でしか認められなかった。ポリクローナルヒト免疫グロブリン（Ｇａｍｍｏｎａｔｉｖｅ，Ｋａｂｉ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた後でさえも、健常人ドナーからの尿中にはＥＣＭ結合の増加は観察されなかった。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
表５に示された結果は、活動的状態にある狼瘡を持つ患者が尿に高レベルの抗ＥＣＭ抗体を有することを示唆する。これら抗体のレベルが疾患活動性と相関関係するかどうかを確認するために、５患者について、活動的状態にある糸球体腎炎の間、およびコルチコステロイド投与を増加した後それらが改善された二，三数週間後についての、抗ＥＣＭ抗体レベルを調べた。その結果を下記表６に示す。表６に見られるように、抗ＥＣＭレベルは非常に低いレベルまで低下し、疾患活性の低下とパラレルであった。１人の患者について、１８か月間抗ＥＣＭレベルを追跡した。表６に見られるように、これら抗体のレベルは疾患活動性と相関関係にあった。さらに、これら抗体のレベルの増加が、ネフローゼ症候群を伴う腎炎の激しい再発より、一週間程前に起こった。蛋白尿の程度、抗ＤＮＡ抗体またはＣ３のレベルが、尿の抗ＥＣＭレベルに比して、この患者の疾患活動性とよりよく相関するという所見は得られなかった（データ示さず）。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
まず図１について説明する。
狼瘡患者から得られた尿サンプル中の抗ＥＣＭ抗体を、疾患の緩解期間および臨床的再発期間にわたって、１８カ月間繰り返し測定した。最終サンプルは、激しい腎炎の臨床的再発前３週間に取ったものである。この結果を図１に示す。
【００５６】
図２および図３について説明する。
試験する抗原でコートしたウエル上でのＥＬＩＳＡによって結合を測定したものである。Ｃ７２上清（図２）またはＳＬＥ患者の尿（図３）を反応させ、抗マウスアルカリホスファターゼ接合体又は抗ヒト西洋わさびペルオキシダーゼによって検出したものである。
マウスのモノクローナル抗ＤＮＡ抗体Ｃ７２は、ＤＮＡへの反応性と同様挙動でマトリゲルおよびラミニンに反応することを示した（図２）。この反応性のパターンは、これら三つの抗原全てと反応した狼瘡患者の尿中に見つかった抗体と似ているが、狼瘡患者の尿中に見つかった抗体はＤＮＡに対してよりマトリゲルおよびラミニンに対してより反応性を示した（図３）。これは、マトリゲル中の主成分であるラミニン〔Ｈ．Ｋ．Ｋｌｅｉｎｍａｎら，“Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３１２−３１８（１９８６）〕が、狼瘡患者に見つかった抗体、ならびにマウスの狼瘡モデルの抗ＤＮＡ抗体の標的抗原であるという可能性を示唆する。
【００５７】
図４および図５について説明する。
結合をＥＬＩＳＡによって測定した。抑制は、異なる濃度の抑制抗原を用いて、Ｃ７２上清（図４）またはＳＬＥ患者の尿（図５）とプレインキュベートすることによって行なった。抑制率は、ＰＢＳのみでプレインキュベートした抗体の吸光度のパーセンテージとして計算した。
これらの図からわかるように、マトリゲルおよびラミニンは、モノクローナルおよびポリクローナルの尿抗体両方の反応性を抑制でき；ＤＮＡも全ての抗原に対する反応性を抑制したが、それは抑制抗原を高濃度で用いた時に生じた（図４、５）。抑制の特異性は、基底膜の別の非常に一般的な成分であるコラーゲンが、狼瘡尿の抗体（図５）またはモノクローナルＣ７２抗体（図４）の反応性を全く抑制できなかったことから証明された。
【００５８】
本発明は、先に述べた実施例の詳細に限定されることなく、本発明の本質的性質を逸脱することなく他の特定の態様で実施できることは当業者に明らかなことである。ゆえに、本実施例が全ての点において、例示として、また限定的でないものとして考慮され、前述の記載よりもむしろ付加されたクレームを参照することが望まれる。また、クレームと均等な意味および範囲内でのあらゆる変更は、クレームに包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、一人の患者における抗ＥＣＭレベルの連続的な測定を示すグラフである。
【図２】図２は、モノクローナル抗ＤＮＡ  Ｃ７２抗体と幾つかの抗原との結合を示すグラフである。
【図３】図３は、ＳＬＥ患者の尿と幾つかの抗原との結合を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｃ７２とマトリゲル（登録商標）との結合の抑制を示すグラフである。
【図５】図５は、ＳＬＥ患者の尿とマトリゲル（登録商標）との結合の抑制を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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