(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを保持するかまたはベクターによって感染されたｒｅｃＡ変異及びｒｅｃＪ変異を導入した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を培養することを含む、ベクターＤＮＡを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主を用いてベクターを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法に関し、特にｒｅｃＡ変異及びｒｅｃＪ変異を導入した大腸菌を用いてベクターを大腸菌宿主内で安定に保持または増殖させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ベクターＤＮＡを大腸菌宿主内で保持または増殖させる際、ベクターＤＮＡ、特に外来性のＤＮＡが組換えを起こしＤＮＡの構造が変化するために、ベクターが宿主内で安定に保持、増殖されなかったり、発現産物の収率が悪化するという問題があった。そのため、ベクターＤＮＡをクローニングするための宿主または外来ＤＮＡを発現させるための宿主として、相同的組換えの遺伝子であるｒｅｃＡ変異株が用いられることがあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ｒｅｃＡ変異株宿主中では、相同的組換えは抑制されるが、非相同的組換えは一般にｒｅｃＡタンパク質に依存していないので、ｒｅｃＡ変異株宿主中のベクターＤＮＡの非相同的組換えを効果的に抑制することはできなかった。本願発明は、宿主中の相同的組換え及び非相同的組換えの両者を押さえることによって、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、ベクターＤＮＡを安定に増殖させることを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、ベクターＤＮＡを安定に増殖させるための大腸菌宿主を用いてベクターＤＮＡを宿主大腸菌内で安定に保持または増殖させる方法に関する。
【０００５】
大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子及びｒｅｃＪ遺伝子は、相同的組換えに関与する遺伝子として知られている（ｒｅｃＡ：▲１▼Ｃｌａｒｋ  Ａ．Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，７，ｐ６７−８６（１９７３），▲２▼Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，Ｒａｊｕ  Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６（１９８８））（ｒｅｃＪ：  ▲１▼Ｈｏｒｉｉ  Ｚ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０，ｐ３２７−３４４（１９７３），  ▲２▼Ｌｏｖｅｔｔ  Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７，ｐ１９０−１９６（１９８４），▲３▼Ｌｏｖｅｔｔ  Ｓ．Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，ｐ２６２７−２６３１（１９８９））
本願発明は、ベクターＤＮＡの宿主大腸菌として、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株を用いることを特徴とする。該変異株は、相同的組換え遺伝子であるｒｅｃＡ遺伝子が変異しているので、相同的組換えが顕著に抑制される。更に、本願発明者らは、意外にも、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株においては、非相同的組換えが顕著に抑制されることを見出した。このことから、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株においては、相同的組換えと非相同的組換えを合わせた組換え頻度全体が、極度に減少することが明らかになった。更に、本願発明者らは、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株は、二重変異株であるにも関わらず、培地中で良好に増殖することを見出した。このことから、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株は、ベクターを宿主大腸菌内で安定に保持または増殖させ、必要に応じて遺伝子の発現産物を取得するための宿主として、十分に実用に耐え得るものであることが判明した。
【０００６】
本願発明の宿主は、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異を有する大腸菌であれば、原則的にはいずれの株でも使用可能であるが、例えばＲ５９４株（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７，ｐ．３２９（１９６５）  ）、Ｃ６００株（ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，ｐ．４４０（１９５４）  ）、ＮＭ５３８株（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７０，ｐ．８２７（１９８３）  ）にｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異を導入したものなどが用いられる。各菌株にｒｅｃＡ変異及びｒｅｃＪ変異を導入するにはＰ１トランスダクション法（別冊  蛋白質核酸酵素  細菌・ファージ遺伝実験法，ｐ．７１−７２，共立出版株式会社（１９７２））等の公知の方法が用いられる。ｒｅｃＡ変異株では形質導入の効果が低下するので、ｒｅｃＪ変異を導入後、ｒｅｃＡ変異を導入するのが望ましい。
【０００７】
ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクターいずれでもよく、例えばプラスミドベクターとしてはｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ系プラスミド、ファージベクターとしては、ＥＭＢＬ系ファージ、λｇｔ系ファージなどが挙げられる。なお、本願発明の宿主−ベクター系は、Ｐ１ベクター、コスミドなどの長大な外来性ＤＮＡを有するベクターの増殖に特に有効である。ベクターは、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。発現ベクターの場合、プロモーターの下流に構造遺伝子を接続すれば、宿主内で該構造遺伝子を発現させ、発現産物を取得することができる。
【０００８】
ベクターによって形質転換された宿主は、常法に従い培養することができる。培地としては、大腸菌が増殖すればいずれのものでもよいが、例えばＬ培地、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＳＯＢ培地などが挙げられる。培養は振盪条件下、温度２５℃〜４０℃、ｐＨ５〜９で行うのが望ましい。
【０００９】
培養した形質転換宿主からのベクターの回収は、常法に従って行うことができる。例えば、プラスミドベクターの場合は、アルカリ法、ボイリング法等によって行うことができ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），１．２１−１．５２）、ファージベクターの場合は、ファージライセートからファージを回収することによって行うことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），２．６０−２．８０）。
【００１０】
また、発現ベクターを保持する形質転換された大腸菌による構造遺伝子の発現と発現産物の回収は、常法に従って行うことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版．Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ’ｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）第１７章「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」）。
【００１１】
以下、本願発明に関する実施例を示すが、本願発明の技術的範囲は当該実施例に限定されない。なお、以下の実施例は、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異を有する大腸菌宿主において、非相同的組換え頻度が低下していることを示すためのものであり、該大腸菌宿主において、相同的組換え頻度が低下していることはいうまでもない。
【００１２】
【実施例】
［実施例１］  非相同的組換えを検出するシステム
溶原化したλファージが誘発される際、通常はプロファージ両端に位置するａｔｔ  部位同志の部位特異的組換えによってファージＤＮＡの切り出しが起こる。しかし低頻度で、ａｔｔ  部位以外の部位での非相同的組換えによるλファージＤＮＡの切り出しも起こる。その結果、プロファージ座近傍の大腸菌のｇａｌ  遺伝子又はｂｉｏ  遺伝子をゲノム内に取り込んだ、形質導入ファージλｇａｌ  又はλｂｉｏ  が形成される。
【００１３】
λファージはＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できない。この性質は「  Ｓｐｉ−  」（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｐ２  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略）といわれる。しかし例外的にλ  ｒｅｄ−  γ−  はＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できる（λ  Ｓｐｉ−  ）。
【００１４】
本願発明者らは、λファージが溶原化した野生株を様々な条件で誘導して得た、λ  Ｓｐｉ−  のゲノム構造をＰＣＲ法によって調べたところ、８４株中８２株がｂｉｏ  遺伝子をゲノム内に取り込んでいることを見出だした。
【００１５】
そこで、λｂｉｏ  の形成頻度を調べる代わりに、λ  Ｓｐｉ−  の形成頻度を調べ、非相同的組換え頻度の指標とした。
【００１６】
このλ  Ｓｐｉ−  の検出による非相同的組換え頻度の測定方法は、ノイズが極めて少ない、信頼性の高い方法である。
【００１７】
［実施例２］  ＵＶ照射による誘発
溶原菌をλＰＹ培地（１リットル中バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、イ−スト・エキストラクト１ｇ、寒天１０ｇを滅菌し、１ＭＭｇＳＯ４  １．５ｍｌとＭ９Ａ液１０ｍｌを加える）中で一晩培養した。培養液１／１００容をλＰＹ培地中３０℃で菌数が約１．５×１０８  ／ｍｌになるまで成育させ、この培養液２ｍｌをプレート（直径８．５ｃｍ）中に分注して、攪拌しながら紫外線を０．５５ｍＷ／ｃｍ２  の強度で１０秒照射した。培養液を回収し、４２℃で１５分間振盪し、その後３７℃で２時間振盪培養し溶菌させた。溶菌液に数滴のＣＨＣｌ３  を加え、さらに５分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を得た。このファージ液をＭ９培地で希釈し、指示菌（Ｙｍｅｌ）一晩培養物０．１ｍｌ、λトップ培地（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、寒天４ｇ）２．５ｍｌとともにλプレート（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、寒天４ｇ）にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、全ファージ数を測定した。
【００１８】
［実施例３］  λ  Ｓｐｉ−  ファージ数の測定
２×１０７  個のファージを、指示菌（ＷＬ９５（Ｐ２）：  ｍｅｔＢ  ｓｕｐＥ  ｓｕｐＦ  ｈｓｄＲｋ  ｔｏｎＡ  ｔｒｐＲ  （Ｐ２））一晩培養物０．１ｍｌ、λトップ培地２．５ｍｌとともにλトリプティケ−スプレート（１ｌ中ＢＢＬ  トリプティケ−スペプトン  （ＢＢＬ  Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  社）  １０ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、寒天１０ｇ）にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、λ  Ｓｐｉ−  ファージ数を測定した。
【００１９】
［実施例４］  λ  Ｓｐｉ−  ファージ形成頻度の測定
培養物０．１ｍｌ中の全ファージ数（実施例２で測定した値）に対する、培養物０．１ｍｌ中のλ  Ｓｐｉ−  ファージ数（実施例３で測定した値）を計測し、λ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度とした。
【００２０】
［実施例５］  野生株または変異株におけるλ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度の測定野生株、ｒｅｃＡ変異株、ｒｅｃＪ変異株またはｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株のλ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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表１に示すように、野生株に比べて、ｒｅｃＪ変異株においては、λ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度が約１／７に減少した。このことから、野生株に比べて、ｒｅｃＪ変異株においては、非相同的組換え頻度が減少することが判明した。
【００２２】
また、表１に示すように、ｒｅｃＪ変異株に比べて、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株においては、λ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度が更に約１／４に減少した。即ち、野生株に比べて、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株においては、λ  Ｓｐｉ−  ファージの形成頻度が約１／２５に減少した。このことから、野生株に比べて、ｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株においては、非相同的組換え頻度が顕著に減少したことが判明した。
【００２３】
［実施例６］  野生株または変異株における大腸菌の増殖速度の測定
λＰＹ培地中で、Ｒ５９４株（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７，ｐ．３２９（１９６５）  ）の野生株、Ｒ５９４株のｒｅｃＡ変異株、Ｒ５９４株のｒｅｃＪ変異株またはＲ５９４株のｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株を、３７℃で培養した。対数増殖期において菌数が２倍になるのに必要な時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ）を測定した。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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表２に示すように、野生株、ｒｅｃＡ変異株、ｒｅｃＪ変異株またはｒｅｃＡ／ｒｅｃＪ二重変異株の間で、増殖速度に顕著な差異は見られなかった。
【００２５】
【発明の効果】
本願発明によって、宿主中のベクターの組換え頻度を顕著に抑制し、宿主大腸菌内でベクターＤＮＡを安定に保持または増殖させることが可能になった。