(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８２）をポリ塩化ビフェニルとともに培養する工程を含む、ポリ塩化ビフェニルの分解処理方法。 
【請求項２】
培養する工程がｐＨ９〜１１で行なわれる、請求項１記載の方法。 
【請求項３】
芳香族塩素化合物を分解する能力を有するバチルス  ｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８２）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いた芳香族塩素化合物の分解処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）等に代表される芳香族塩素化合物は、人間や動物に毒性を示すものが多い。皮膚や消化器等から体内に取り込まれると、皮膚傷害や肝臓傷害を引き起こす。さらに、生体中や環境中では分解され難いため、蓄積し、食物連鎖を通して濃縮されていく性質がある。これまでにＰＣＢｓ分解処理技術として、熱処理技術、化学的処理技術、微生物処理技術等が開発されてきた。熱処理技術は、ＰＣＢｓを完全に無機化するための温度管理が難しい。炉の運転温度が低くなると、有害な物質であるダイオキシンの発生が指摘されている。化学的処理技術は、処理条件が高温、高圧の場合が多く、時には金属ナトリウム等の激しい反応性を示す試薬を使用している。従って、装置が大掛かりになり、条件によっては安全上問題がある。微生物を用いた処理方法は、特開平４−３７００９７号公報、特開２０００−２７９５５１号公報等の微生物を用いた例が報告されているが、これらの微生物ではＰＣＢｓの置換塩素数が増えると微生物の分解能が低下するために何らかの脱塩素処理が必要となる等の問題を有するものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルカリ溶液中で、芳香族塩素化合物の脱塩素反応を促進するとともに、至適生育域がアルカリ域にあり、しかも芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いた芳香族塩素化合物の分解処理方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的はかかる微生物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、
（１）バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８２）をポリ塩化ビフェニルとともに培養する工程を含む、ポリ塩化ビフェニルの分解処理方法、並びに
（２）芳香族塩素化合物を分解する能力を有するバチルス ｓｐ．Ｍ−７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４８２）、
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の分解処理方法に用いる芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物について説明する。
【０００６】
本発明において「芳香族塩素化合物」とは、その分子中に１以上の塩素を有する芳香族化合物またはその混合物をいう。
【０００７】
本発明において「芳香族塩素化合物を分解する能力を有する」とは、芳香族塩素化合物が培地成分の炭素源として与えられたとき、資化、分解することをいう。芳香族塩素化合物を分解する能力は、下記の実施例２に記載されるようにガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣと呼ぶ）、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと呼ぶ）、質量分析器（以下、ＭＳと呼ぶ）等を用いて測定することができ、分解菌を入れていないものに比して分解対象の芳香族塩素化合物の減少が認められるものを「芳香族塩素化合物を分解する能力を有する」ものと判定する。
【０００８】
本発明において「好塩基性微生物」とは、塩基性環境下、好ましくはｐＨ  ８〜１１．５で生育可能な微生物である。
【０００９】
芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物としては、バチルス属に属する微生物等が挙げられ、特に限定されない。一例として、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株が挙げられる。該株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８２として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年８月２４日に寄託されている。
【００１０】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株の至適生育ｐＨは、１０．４であり、生育可能なｐＨ範囲は９〜１１．３である。至適生育温度は３０℃であり、生育可能な温度範囲は２０〜４０℃である。
【００１１】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株の菌学的性質を表１〜３に示す。
【００１２】
【表１】
0003588451.tif 000002
【００１３】
【表２】
0003588451.tif 000003
【００１４】
【表３】
0003588451.tif 000004
【００１５】
該微生物は、好気的生育を示す有芽胞桿菌であることからバチルス属  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）であると考えられる。生理性状試験からは、ブドウ糖、マンノース、メリビオースから酸を産生し、ゼラチン加水分解陽性、硝酸塩還元能を呈する好塩基性バチルスであることからバチルス・アルカロフィルス（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）が示唆されるものの、ソルビトール、キシロースからの酸産生が認められないため該微生物は、バチルス属に属するものであるが、バチルス属のいずれかの種に分類することは適当ではないと考えられ、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株と命名されている。バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列と近縁にあると考えられる細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の相違性を表４に示し、それに基づく近隣結合法による系統樹を図１に示す。
【００１６】
【表４】
0003588451.tif 000005
【００１７】
さらに、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列に関するＢＬＡＳＴサーチの結果を、相同性の高いものから１０番目の菌株まで表５に示す。表５中のスコアはＢＬＡＳＴサーチによる相同性の評点を示す。
【００１８】
【表５】
0003588451.tif 000006
【００１９】
本発明の芳香族塩素化合物の分解処理方法は、前記した芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物を用いることに特徴を有しており、該微生物を芳香族塩素化合物とともに培養する工程を含む。芳香族塩素化合物を分解する能力を有する好塩基性微生物として、好ましくはバチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を用いる。以下に分解処理方法の例として、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を用いた場合について説明するが、これに限定されるものではない。本明細書において「分解処理」とは、分解対象成分が対照に対して著しく減少することをいう。
【００２０】
芳香族塩素化合物の具体例としては、クロロベンゼン、ポリ塩化ナフタレン、塩素化ダイオキシン、ビレン、フルオランテン、ポリ塩化ビフェニル、ｐ−クロロ−安息香酸、ｏ−クロロ安息香酸等およびそれらの混合物が挙げられる。
【００２１】
本発明において分解処理の対象となるＰＣＢｓは、置換塩素数が少なくとも１つの塩素を有する化合物である。
【００２２】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株は、至適生育ｐＨが塩基性にある好塩基性微生物である。芳香族塩素化合物の分解処理方法に好塩基性微生物を用いることは、好気的条件下で分解が進行し、かつ分解条件の一つが２８〜３０℃とマイルドな温度範囲で行える等の観点から好適である。
【００２３】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を芳香族塩素化合物とともに培養する工程は、適当な培地、例えば炭酸ナトリウムによって培地をアルカリ側に調整した培地を用い、少量のビフェニルを生育基質とし、振盪や攪拌のできる環境において行われる。使用する培地は、特に限定されるものではないが、リン酸、マグネシウム及びその他の鉄、亜鉛等の微量成分を含み、窒素源として塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウム又はペプトンなどの有機物分解を用い、ｐＨをアルカリ側に調整したものである。
【００２４】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を芳香族塩素化合物とともに培養するとは、芳香族塩素化合物を培地に添加して培養することをいう。
【００２５】
培養に添加する菌体数は、分解効率の観点から、一般には、培養液に対して１×１０５  ／ｍｌ〜１×１０６  ／ｍｌである。
【００２６】
培養温度は、本発明の菌株の生育及びＰＣＢ分解速度の観点から、２０〜４０℃の範囲内が好ましく、２５〜３５℃の範囲内がさらに好ましく、２７〜３２℃の範囲内が特に好ましい。
【００２７】
培養におけるｐＨは、本使用株の生育及びＰＣＢ分解速度の観点から、ｐＨ９〜ｐＨ１１．３が好ましく、ｐＨ９．５〜ｐＨ１１がさらに好ましく、ｐＨ１０．３〜ｐＨ１０．８が特に好ましい。
【００２８】
培養時間は、生育環境維持の観点から、一般に、４〜７日間である。
【００２９】
本発明の分解処理方法において、芳香族塩素化合物の分解処理をモニターするために、培養液を成分分析に供することができる。成分分析は、通常使用される方法が用いられ、例えば、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーが使用される。
【００３０】
本発明の分解処理方法により処理された芳香族塩素化合物の分解処理物は、最終的には水と二酸化炭素であり、遊離した塩素は培地組織によってＫＣｌ又はＮａＣｌ等の塩として廃棄することができる。
【００３１】
【実施例】
本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
ＰＣＢｓ分解菌の分離は、ＰＣＢｓの炭素骨格であるビフェニルを資化する菌を探すことから開始した。ビフェニル分解菌の分離に使用した分離用液体培地の成分および調製方法を以下に示す。
【００３３】
分離用液体培地成分：
Ａ液（蒸留水、１０００ｍｌ当たり）
Ｋ２  ＨＰＯ４  、１ｇ
ＮＨ４  Ｃｌ、１ｇ
ＣＡＰＳ、１１．１ｇ；および
Ｂ液（蒸留水、１０００ｍｌ当たり）
ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ、２０ｇ
ＭｎＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ、２ｇ
ＦｅＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ、１ｇ
ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ、０．５ｇ
Ｌ−アスコルビン酸、１ｇ。
【００３４】
Ａ液の調製方法：Ｋ２  ＨＰＯ４  ；１ｇ、ＣＡＰＳ；１１．１ｇを蒸留水約９７０ｍｌに溶解後、ｐＨを１０．０に調整し、９８０ｍｌにメスアップする。その後１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。室温に戻してから、ＮＨ４  Ｃｌ  １ｇ／２０ｍｌをろ過滅菌して加えた。
【００３５】
Ｂ液の調製方法：適量の蒸留水に各成分を順次溶解後、１０００ｍｌにメスアップし、１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。その後冷蔵保存する。
【００３６】
分離用液体培地の調製：Ａ液１００容に対してＢ液１容の割合で混合し、使用する。
【００３７】
分離用寒天培地の調製：Ｋ２  ＨＰＯ４  ；１ｇ、ＣＡＰＳ；１１．１ｇを蒸留水約９７０ｍｌに溶解後、ｐＨを１０．０に調整し、９８０ｍｌにメスアップする。寒天２０ｇを加え１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。５０℃付近に保温。ＮＨ４  Ｃｌ  １ｇを含む蒸留水２０ｍｌをろ過滅菌して加え、シャーレに約２０ｍｌ分注する。
【００３８】
ビフェニル分解菌の分離方法：３００ｍｌの三角フラスコに分離用液体培地３０ｍｌ、唯一の炭素源として粉末ビフェニル（約５ｍｇ）、土壌より採集した試料を適量加え、３０℃、１５０ｒｐｍで振盪培養をおこなった。添加したビフェニルの減少を目視で確認できたフラスコの培養上清１ｍｌを新しい分離用液体培地に移し振盪培養を続けた。数日後、培養上清の一部をとり、分離用寒天培地に塗布した。粉末ビフェニル（約５００ｍｇ）を置いたシャーレのフタに、培養上清を塗布した寒天表面を下にして重ね、シャーレの縁にビニールテープを巻き、３０℃で静置培養する。寒天培地上に出現してきたコロニーは、新しい分離用寒天培地に塗布し、上記と同様の操作を繰り返し行い、純化を行った。
【００３９】
純化した株のビフェニル分解能は、次の条件によって分析した。
【００４０】
ビフェニルの抽出：培養上清４ｍｌをとり、１ＮＨＣｌ溶液を用いてｐＨを２〜３に調整する。調整後、上清を分液ロートに移し、酢酸エチル２ｍｌを加え、両者をよく混和した。静置後、酢酸エチル層を分取した。同様の操作を繰り返し行い分取した酢酸エチル層を前回分と併せた。全量を４ｍｌにメスアップ後、酢酸エチル層を適量の硫酸ナトリウムを加え脱水し、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００４１】
ＨＰＬＣ分析条件：使用カラム；コスモシール５Ｃ１８（ナカライテスク）、移動相；７０％アセトニトリル、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度；４０℃、吸収波長；２７０ｎｍ、インジェクション量；２０μｌ。
【００４２】
ビフェニル分解能を示した菌の一つについて、前記する菌学的性質を調べたところ、バチルス属の細菌であることが判明し、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株と命名した。バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００１年８月２４日に寄託した（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４８２）。
【００４３】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株による上記ビフェニル分解実験では、培養から７日目にはほとんど全てのビフェニルが分解されていた。
【００４４】
実施例２
ビフェニル分解能を有するバチルス  ｓｐ．Ｍ−７株を用いてＰＣＢｓ分解実験を行った。本実施例では、ＰＣＢｓとして、ＫＣ−４００（ジーエルサイエンス社製、１分子内に２〜６個の塩素置換を有するＰＣＢｓを下記の比で含む：２塩素置換ＰＣＢｓ；３％、３塩素置換ＰＣＢｓ３３％、４塩素置換ＰＣＢｓ：４４％、５塩素置換ＰＣＢｓ：１６％、６塩素置換ＰＣＢ：５％）を使用した。ＰＣＢｓ分解実験に使用したＰＣＢｓ分解用液体培地の成分および調製方法を以下に示す。
【００４５】
ＰＣＢｓ分解用液体培地の成分：
Ｂ液（実施例１で使用したもの）：および
Ｃ液（蒸留水１０００ｍｌ当たり）
Ｋ２  ＨＰＯ４  、１ｇ
ポリペプトン、０．５ｇ
Ｎａ２  ＣＯ３  、１０ｇ。
【００４６】
Ｃ液の調製：Ｋ２  ＨＰＯ４  ；１ｇ、ポリペプトン；０．５ｇを蒸留水９６０ｍｌに溶解し、１２１℃、１５分オートクレーブ処理する。室温に戻してから、蒸留水４０ｍｌに溶かしたＮａ２  ＣＯ３  ；１０ｇをろ過滅菌して加えた。
【００４７】
ＰＣＢｓ分解用液体培地の調製方法：Ｃ液１００容に対してＢ液１容の割合で混合して調製した。
【００４８】
ＰＣＢｓ標準液（ＫＣ−４００を８．７μｇ／ｍｌの濃度でヘキサンに溶解させたもの）のＨＰＬＣ分析の結果を図２により示す。
【００４９】
ＨＰＬＣ分析条件：使用カラム；コスモシール５−ＰＹＥ（ナカライテスク）、移動相；ヘキサン、流速；０．７ｍｌ／ｍｉｎ、吸収波長；２５４ｎｍ、カラム温度；２５℃、インジェクション量；２０μｌ
【００５０】
図２中の各ピークについては、それぞれ、保持時間４．６７分が３塩素置換ＰＣＢであり、保持時間５．２３分および５．３５分が４塩素置換ＰＣＢｓであり、保持時間６．１２分および６．７１分が５塩素置換ＰＣＢｓであり、保持時間７．６８分および８．５７分が６塩素置換ＰＣＢｓであると考えられる。４〜６塩素置換ＰＣＢｓのピークがそれぞれ２つ存在するのは、ビフェニルにおける塩素の置換位置の差異が保持時間に影響したものと考えられる。
【００５１】
ＰＣＢｓ分解実験：３００ｍｌ容三角フラスコにＰＣＢｓ分解用液体培地３０ｍｌ、ＫＣ−４００  ２３４μｇ（終濃度７．８μｇ／ｍｌ）、播種細胞（バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株）数１．５×１０５  を加え、３０℃、１５０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行い、ＰＣＢｓ分解能を調べた。
【００５２】
ＰＣＢｓ抽出：培養液３０ｍｌを分液ロートに移し、ヘキサン３ｍｌを加え両者をよく混和する。静置後、分離したヘキサン層を分取する。同様の操作をさらに二回繰り返す。分取したヘキサン層をあわせ、ヘキサンで１０ｍｌにメスアップする。ヘキサン層に適量の硫酸ナトリウムを加え脱水し、ＨＰＬＣ分析を行なった。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析条件は、前記ＰＣＢｓ標準液のＨＰＬＣ分析に使用した条件と同一である。
【００５４】
バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株によるＰＣＢｓ分解実験のＨＰＬＣ分析を図３に示す。図２のＰＣＢ標準液のＨＰＬＣ分析との比較から、ＰＣＢｓのほとんどがバチルス  ｓｐ．Ｍ−７株によって分解されていることがわかる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の微生物による芳香族塩素化合物の分解処理方法は、常温常圧において脱塩素が可能であり、特殊な装置を必要とすることなく、低コストでの分解処理が可能であるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７と近縁の細菌との近隣結合法による系統樹を示す図である。
【図２】図２は、ＰＣＢｓ標準液のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図３】図３は、バチルス  ｓｐ．Ｍ−７株によるＰＣＢｓ分解実験のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図１】
0003588451.tif 000007
【図２】
0003588451.tif 000008
【図３】
0003588451.tif 000009