(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＤＡＦ抗体を便の上清液と反応させ、上清液中のＤＡＦ分子との抗原抗体反応によりＤＡＦ分子に結合した抗体の量を測定することからなる便中ＤＡＦ分子の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は便中ＤＡＦ分子の検査方法に関する。さらに詳しくは、便中ＤＡＦ分子の濃度を検査することにより、大腸癌存在有無の検出に有用な便中ＤＡＦ分子の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来一般検診においては、大腸癌の有無を調べるために、便潜血検査が実施されてきた。便に潜血が認められる場合には、さらに注腸造影検査、大腸ファイバー検査を実施することにより、大腸癌の発生有無が調べられてきた。しかし大腸癌患者の全てに便潜血が認められるものではなく、またたまたま便に潜血が無い場合もあった。このため、便潜血検査のみによる場合は、大腸癌が存在するに拘わらず、見逃される場合があった。
最近、ＤＡＦ分子の発現が大腸癌組織で亢進していることが免疫組織学的に明らかとなった。ＤＡＦ分子すなわち崩壊促進因子とは、Ｃ３およびＣ５コンバターゼ（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）分解を促進することにより、自己の補体の活性化を促進する糖蛋白質である。ＤＡＦ分子は、正常な大腸粘膜上皮細胞では殆ど発現しないが、大腸癌細胞の特に癌腺管内腔側面に強く発現していることが明らかとなった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、大腸癌患者では、ＤＡＦ分子は便中で増加しているものと推定した。そこで、本発明は便中ＤＡＦ分子の濃度を検査する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗ＤＡＦ抗体を便の上清液と反応させ、上清液中のＤＡＦ分子との抗原抗体反応によりＤＡＦ分子に結合した抗体の量を測定することからなる便中ＤＡＦ分子の検査方法である。本発明方法を用いることによって、大腸癌の有無を容易に検出することが可能となる。
【０００５】
以下本発明の検査方法について詳細に説明する。
便上清液の調製
一定量の便を緩衝液と混合し、撹拌後上清液を遠沈分離する。
抗ＤＡＦ抗体の作成
ヒトＤＡＦ分子を赤血球膜から精製し、抗ＤＡＦモノクロナール抗体および抗ＤＡＦポリクロナール抗体を作成する。
便中ＤＡＦ分子の測定
１）  抗ＤＡＦモノクロナール抗体または抗ＤＡＦポリクロナール抗体をマイクロタイタープレートまたはビーヅなどに固相化し、便上清液と反応させる。
２）  洗浄後、酵素または放射性物質標識抗ＤＡＦモノクロナール抗体または抗ＤＡＦポリクロナール抗体を上記反応物と反応させ、結合した酵素量または放射性物質の量を測定する。
あるいは、
２’）  上記１）の操作に引き続いて、洗浄後、抗ＤＡＦモノクロナール抗体または抗ＤＡＦポリクロナール抗体を反応させる。洗浄後、酵素または放射性物質標識抗モノクロナール免疫グロブリン抗体または抗ポリクロナール免疫グロブリン抗体と反応させ、結合した酵素量または放射性物質の量を測定する。
検量線の作成
既知量の精製ＤＡＦを用いて検量線を作成し、これにより試料中のＤＡＦ量を算出し、便１ｇ中の量として表示した。
本発明の方法によれば、便１ｇ中０．４ｎｇ以上の量を正確に測定することができる。
【０００６】
本発明の方法により検出された大腸癌患者の便中ＤＡＦは、大腸癌細胞そのものに由来するか、あるいは癌から出血した中の赤血球に由来するものと推定される。しかし、便潜血陰性の大腸癌患者の便中でもＤＡＦが検出されているので、癌細胞に由来している便中ＤＡＦを含むものと推定される。大腸疾患を有しない群（以下対照群という）では便中ＤＡＦは検出感度以下であり、正常大腸粘膜はＤＡＦを分泌していないものと推定される。
便潜血による大腸癌スクリーニングにおいては、感度が鈍いこと、あるいは大腸癌には検出できる程の出血を伴わない場合があるという問題点がある。本発明の方法は、出血を伴わない大腸癌を便中ＤＡＦの検査により検出できる場合があるという利点を有している。
【０００７】
以下本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。各例において％は特に断りの無い限り重量％を意味する。
実施例、比較例
便上清液の調製
１〜５ｇの便に同重量の緩衝液を加えて撹拌する。緩衝液としては、ウシの血清アルブミン１％、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％およびフェニルメチルスルフォニルフルオライド１ｍＭを含むリン酸緩衝液を用いた。撹拌後、２０，０００ｇで１５分間遠沈分離した。上清液を採取し、−８０℃で測定するまで凍結保存した。
【０００８】
抗ＤＡＦマウスモノクロナール抗体の作成
１）  ヒトＤＡＦ分子の精製
ヒト血液５０ｍｌから赤血球を分離し、ＥＤＴＡ１ｍＭ、フェニルメチルスルフォニルフルオライド０．１ｍＭを含む５ｍＭリン酸緩衝液４００ｍｌを加えて撹拌し、４８，０００ｇで遠沈し、沈澱となった赤血球基質を集めた。
１ｇの赤血球基質を５ｍＭリン酸緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈し、ブタノール８０ｍｌを加えて撹拌した後、１２，０００ｇで遠心分離し、上層のブタノールと下層の沈澱に挟まれた中央の水層を回収した。ついで、ＤＥＡＥ−セファセルカラムを用い、塩酸ナトリウムを０．０４Ｍ、ノニオデットＰ−４０を０．１％含有する０．０２Ｍトリス緩衝液により、ＤＡＦ分子粗分画を分離した。
さらに、ＤＡＦ粗分画をフェニル−セファロースカラムを用い、塩酸ナトリウムを０．３Ｍ、ノニオデットＰ−４０を０．１％含有する０．０４Ｍリン酸緩衝液および塩酸ナトリウムを０．０５Ｍ、ノニオデットＰ−４０を１％含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液を用いて分離した。さらに、ハイドロキシアパタイトカラムで分離後、得られた分画を塩酸カルシウム０．７ｍＭ、塩酸マグネシウム０．７ｍＭ、塩酸マンガン０．７ｍＭ、塩酸ナトリウム０．２Ｍ含有する１０ｍＭトリス緩衝液で透析した後、レンチルレクチン−セファロースカラムを用いて、精製ＤＡＦ分子を分離した。
【０００９】
２）  抗ＤＡＦマウスモノクロナール抗体の作成
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを結核死菌含有フロユンドアジュバンドに懸濁した５μｇの精製ＤＡＦにて１週毎に２回免疫した。３週間後、マウスより脾細胞を取り出し、ポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１マウスミエローマ細胞と融合した。作成されたハイブリドーマの培養上清を、精製ＤＡＦをブロッティングしたニトロセルロース膜と反応させ、結合したマウスモノクロナール抗体をＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ＡＢＣキットを用いて検出することにより、スクリーニングし、４種類の抗ＤＡＦモノクロナール抗体産生ハイブリドーマを得た。
産生されたモノクロナール抗体はすべてＩｇＧ１カッパーであった。４種類のモノクロナール抗体のうち、本試験にはＤＡＦ分子の活性部分を認識する１Ｃ６モノクロナール抗体を用いた。１Ｃ６モノクロナール抗体産生ハイブリドーマをマウスの腹腔に注射し腹水を作成し採取した。
腹水から、硫酸アンモニウム沈澱法およびＤＥＡＥクロマトグラフィ（トーソー（株）製、“Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ”）を用いて１Ｃ６抗ＤＡＦモノクロナール抗体ＩｇＧを分離精製した。
【００１０】
家兎抗ＤＡＦポリクロナール抗体の作成
精製したＤＡＦを３７℃で１時間インキュベートすることにより、１０ｍｌの家兎赤血球に取り込ませた。この赤血球を洗浄後、溶解し、細胞膜を遠心分離により分離した。これを結核死菌含有フロユンドアジュバンドに懸濁し、この懸濁液を用いて赤血球を分離した家兎に免疫した。免疫した家兎から採血し、血清を分離し、硫酸アンモニウム沈澱法およびＤＥＡＥクロマトグラフィを用いて家兎ＩｇＧを分離精製した。
得られた抗体の特異性は免疫ブロット法により確認した。すなわち、ヒト赤血球基質の粗抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ニトロセルロース膜にブロットした後、家兎ＤＡＦポリクロナール抗体を反応させた。結合した家兎ＩｇＧ抗体を、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャム・ジャパン（株））を用いて検出したところ、ＤＡＦ分子の分子量７０ｋＤに相当する部位に単一のバンドが検出され、家兎抗ポリクロナール抗体の特異性が確認された。
【００１１】
便中ＤＡＦ分子の測定
２μｇ／ｍｌ濃度の１Ｃ６抗ＤＡＦマウスモノクロナール抗体をマイクロタイタープレートの１ウエルあたり１００μｌ加え、４℃で１２時間反応後、ウシの血清アルブミン１％を含むリン酸緩衝液を加えて４℃で１晩静置した。洗浄後、便の上清液を１ウエル当たり１００μｌ加え、４℃で１晩インキュベートした。洗浄後、ウエルに濃度４μｇ／ｍｌの家兎抗ＤＡＦポリクロナール抗体ＩｇＧを１００μｌ加え、室温で２時間反応後洗浄した。ついでパーオキシダーゼ標識山羊Ｆ（ａｂ）’２抗家兎ＩｇＧ（ＴＡＧＯ社製、米国）を１００μｌ加え、室温で２時間反応後、洗浄し、２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸を用いて発色させた。オートマチックＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１２】
検量線の作成
１ウエル当たり０．１ｎｇから１０ｎｇの量の精製ＤＡＦを加えて反応させ、検量線を作成し、これにより試料中のＤＡＦ量を算出し、便１ｇ中の量として表示した。
【００１３】
便潜血の検査方法
グアヤック法：塩野義（株）製便潜血スライドを用いて検査した。
免疫法：栄研（株）製ＯＣ−ヘモディア−栄研を用いて検査した。
上記した便中ＤＡＦ検査法および便潜血検査法を用いて、大腸癌患者２９例および明らかに大腸疾患を有しない対照群２０例について、本発明の検査法の有用性を検討した。結果を図１〜図２および表１〜表４に示す。
【００１４】
図１は、２９例の大腸癌患者と２０例の大腸疾患を有しない対照群の便中ＤＡＦ分子の濃度を示す。対照群中１５例では便中ＤＡＦ分子は検出感度以下であり、５例では便１ｇ中１ｎｇ以下であった。これに対し大腸癌患者では、２９例中１５例が便１ｇ中１ｎｇ以上であり、２例では０．４〜１ｎｇの範囲にあり、残り１２例は検出感度以下であった。大腸癌患者と対照群の便中ＤＡＦ分子濃度には、統計学的に有意（ｐ＝０．００６）な差が認められる。また便中ＤＡＦ分子１ｎｇ／ｇを境界とすると大腸癌患者群と対照群との区別が可能であり、１ｎｇ／ｇ以上の便中ＤＡＦ分子濃度を有する例を陽性とすると、大腸癌患者の陽性率は５２％（１５例／２９例）であり、対照群の０％に比して有意の差が認められた（ｐ＝０．０００１）。
【００１５】
図２は、便中ＤＡＦ分子の存在が認められた大腸癌患者５例についての手術前と手術後の便中ＤＡＦ分子の濃度の相違を示す。５例中４例では手術後検出感度以下に減少し、残り１例では８．６ｎｇ／ｇから１．４ｎｇ／ｇに減少していることを示す。
表１は便中ＤＡＦ分子の検出率と大腸癌の大きさとの関連を調べた結果を示す。
【００１６】
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【００１７】
表２は便中ＤＡＦ分子の検出率と大腸癌の部位との関連を調べた結果を示す。
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【００１８】
表３は便中ＤＡＦ分子の検出率とＤｕｋｅｓステージとの関連を調べた結果を示す。
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【００１９】
表４は便中ＤＡＦ分子の検出率と便潜血反応との関連を調べた結果を示す。
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大腸癌患者２９例の便潜血は、グアヤック法で１６例５５％、免疫法で２３例７９％に陽性であった。便中ＤＡＦ分子は、グアヤック法で陰性の１３例中５例、免疫法で陰性の６例中４例で検出された。なお対照群のうち２例は便潜血反応陽性であったが、便中ＤＡＦ分子は陰性であった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の便中ＤＡＦの検査方法によれば、大腸疾患を有しない対照群の便中ＤＡＦに比して大腸癌患者の便中ＤＡＦを有意の差で検出できる検査方法が提供される。さらの本発明の検査方法によれば、便潜血陰性の大腸癌患者からも便中ＤＡＦを検出できる検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸癌患者と大腸疾患を有しない対照群における便中ＤＡＦ濃度を示すグラフである。
【図２】大腸癌手術前後の便中ＤＡＦ濃度の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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