(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸又は無機酸を平衡吸着させた多糖を湿熱処理し、該多糖分子中に１，６結合を高い割合で生成させることを特徴とする分岐多糖の製造方法。
【請求項２】
有機酸又は無機酸を平衡吸着させた多糖に、単糖及び／又はオリゴ糖を添加して湿熱処理し、該多糖分子中に１，６結合を高い割合で生成させることを特徴とする分岐多糖の製造方法。
【請求項３】
多糖分子中に１，６結合を高い割合で生成させることが、湿熱処理後の多糖分子中の１，６結合の割合を、湿熱処理前の多糖分子中の１，６結合の割合よりも、５％以上増加させるものである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
有機酸の平衡吸着量が、使用する多糖の１〜１０％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項５】
無機酸の平衡吸着量が、使用する多糖の０．０３〜０．１％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項６】
湿熱処理時の多糖の水分含有量が１〜１０％（ｗ／ｗ）であり、かつ湿熱処理温度が１２５〜１４０℃であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項７】
使用する多糖が、β−１，３グルカンであることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項８】
得られる分岐多糖が、難消化性、水溶性、免疫賦活性、低コレステロール活性及び植物耐病性からなる群から選ばれた少なくとも１つの性質を有することを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、１，６結合を高い割合で含有する多糖を製造する方法に関し、さらに詳しくは、着色や刺激臭の発生を抑制して、１，６結合を高い割合で含有する多糖を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖類の中でも、分枝度が高いもの、即ち１，６結合を多く含有するものは、粘着性が高く、また老化しにくく安定であることが知られている。糖類において、このような１，６結合を増加させる処理としては、１９５０年代ごろ、澱粉を焙焼することにより澱粉の構造を変化させる方法が報告されている。この構造の変化は、焙焼の際に存在する水分により加水分解が起こり、さらに高温になるにつれて再重合が起こり、１，６結合が多くなるためであると考えられている（二国二郎監修、澱粉科学ハンドブック、朝倉書店ｐ４９８−５００、発行日：１９８４年８月１日）。
【０００３】
このような焙焼デキストリンには、酸を添加しないで１３５〜１５０℃程度まで加熱して得られるブリティシュ・ガム、鉱酸とともに１２０℃前後で加熱して得られる白色デキストリン、及び１５０〜２００℃で加熱して得られる黄色デキストリンがある。
この焙焼という方法において、得られる１，６結合の割合を処理前の１，６結合の割合よりも５％以上高くするには、さらに高温にしたり、反応時間を長くしたりする必要があるが、このように加熱条件を変更すると、着色物質が増加したり、刺激臭が発生したりし、焙焼によって１，６結合を増加させるには、限界があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、着色及び加熱臭の発生を抑えるとともに、オリゴ糖をほとんど含まないようにして、従来より主に食品に使用されている多糖中の１，６結合の割合を増加させる方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酸を平衡吸着させた多糖を、比較的低い温度で、水分含量が低く且つ一定に保持されるように湿熱処理し、連続的に加水分解及び再重合を行わせることにより、着色が少なく、単糖の生成も少なく、短時間で効率的に１，６結合の割合を増加させることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、有機酸又は無機酸を平衡吸着させた多糖を湿熱処理し、該多糖分子中に１，６結合を高い割合で生成させることを特徴とする分岐多糖の製造方法である。
【０００６】
また、本発明は、有機酸又は無機酸を平衡吸着させた多糖に、単糖及び／又はオリゴ糖を添加して湿熱処理し、該多糖分子中に１，６結合を高い割合で生成させることを特徴とする分岐多糖の製造方法である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用することのできる多糖は、天然多糖、合成多糖、その誘導体であればいかなるものでもよいが、例えば澱粉、α−１，４グルカン（アミロース）、β−１，３グルカン（カードラン）、α−１，３グルカン、β−１，４グルカン（セルロース）、ヘミセルロース、カラギーナン、グルコマンナン、寒天（アガロース）、グルコマンナン、ペクチン、グァーガム、ローカストビーンガム、サイリウム、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、アルギン酸等が挙げられる。
【０００８】
本発明では、上記多糖に酸処理を施し、酸を平衡吸着させる。酸は、有機酸又は無機酸のいずれを用いてもよい。有機酸としては、酢酸、クエン酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、アジピン酸、安息香酸、フマル酸、シュウ酸、フィチン酸、ソルビン酸、リンゴ酸等の食品添加物の適用を受けているものが好ましく、さらにはｐＫａ（酸解離定数の逆数の常用対数）の小さいものが好ましい。また、無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ルイス酸等を用いることができる。
【０００９】
有機酸を用いる場合は、多糖に対する有機酸の平衡吸着量が１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように酸処理を行うのが好ましく、無機酸を用いる場合は、多糖に対する無機酸の平衡吸着量が０．０３〜０．１％（ｗ／ｗ）となるように酸処理を行うのが好ましい。有機酸が１０％、又は無機酸が０．１％を超えると、カラメル反応等で着色が激しくなる場合があり、また有機酸が１％、又は無機酸が０．０３％未満では、１，６結合の割合の増加率が悪くなる。添加量が少量で済むという点より、無機酸を用いるのが好ましく、取扱いの点から塩酸を用いるのが特に好ましい。
【００１０】
また、当該酸処理によって、多糖の水分含有量を０．５〜１５％（ｗ／ｗ）とするのが好ましく、特に１〜１０％（ｗ／ｗ）とするのが好ましい。なお、本発明でいう水分含有量とは、酸吸着多糖を１０５℃のオーブンに入れ、１時間おきにその重量を測定し、ほぼ一定（重量変化率０．５  ％以内）になるまで測定した結果の、重量軽減分をいう。
【００１１】
このような酸処理は、例えば無機酸であれば、０．０５〜０．１％の酸水溶液に、有機酸であれば、１〜１０％の酸水溶液に多糖を浸漬し、室温で平衡吸着させることにより行うことができる。あるいは、酸水溶液を多糖に噴霧させることにより、必要量吸着させてもよい。
【００１２】
得られた酸吸着多糖は、濾別後、風乾、減圧乾燥等により乾燥させて、水分含有量を１〜１０％（ｗ／ｗ）とするのが好ましい。このように水分含有率を低く抑えるのは、原料に用いられる多糖に含まれる水分の存在が、加熱による多糖分解に伴うグルコースあるいは還元糖の生成を促進するとともに、１，６結合の生成を阻害してしまうからである。従って、酸吸着多糖を低水分含有率とすることにより、単糖及びオリゴ等の生成量を少なく抑え、かつ高分子の変性多糖（１，６結合含有多糖）を収率よく生成することができる。
【００１３】
本発明では、このように含水量を調整した酸吸着多糖に対して、湿熱処理を施す。具体的には、酸吸着多糖を耐熱性容器に詰めて密閉し、オーブン中で好ましくは１２５〜１４０℃、特に好ましくは約１３０〜１３５℃で湿熱処理を行う。処理時間は、３０分〜１時間が好ましい。このような湿熱処理を施すことによって、反応が均一に行われ、また生成物の褐変や異臭の発生を防止することができる。
【００１４】
また、この湿熱処理の際に、単糖及び／又はオリゴ糖を添加することにより、重合の頻度を向上させて、１，６結合を増加させることができる。それらの添加量としては、多糖に対して１〜１０％（ｗ／ｗ）程度であるのが好ましい。添加量が多くなると、重合による水分含量が増加し、加水分解が促進されたり、着色がひどくなったりする。
【００１５】
湿熱処理を終えた多糖は水に溶解し、ｐＨを調整する。ｐＨの調整には一般のアルカリがいずれも使用可能であるが、好ましくは炭酸ナトリウムを用いる。アルカリ水溶液でｐＨを５〜５．５、好ましくはｐＨ５．２に調整したのち、常法により脱塩し、（ａ）  スプレードライ法により乾燥させるか、（ｂ）  遠心分離した上澄み液をエチルアルコール中に攪拌しながら注入し、再度の遠心分離により上澄液を除去し、得られたエチルアルコール不溶性画分からエチルアルコールを除去し、乾燥させる。このようなエチルアルコール処理を行うことにより、着色性物質及び低分子糖の一部を除去することができる。
【００１６】
以上の方法によれば、多糖分子中の１，６結合の割合を、湿熱処理する前の多糖分子中の１，６結合の割合よりも、５％以上増加させることができる。また、このように１，６結合を多い割合で含有する分岐多糖は、６０％程度の高収率で得られる。
このようにして得られる分岐多糖は、難消化性、水溶性、免疫賦活性、低コレステロール活性、植物耐病性等の性質を有することが期待され、また食物繊維としても有望である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び実験例により具体的に説明するが、これらにより本発明の範囲が限定されるものではない。
尚、実施例及び実験例において用いた各測定方法を、以下に参考例として説明する。
【００１８】
〔参考例〕
（１）    平均分子量の測定方法
試料を水に溶解し、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）濃度に調製した試料液を用い、下記の条件下で高速液体クロマトグラフィーを行い測定する。
0003597566.tif 000002
【００１９】
（２）    グリコシド結合様式の検討方法
グリコシド結合様式は、下記のメチル化法  ［Ｒ．  Ｇｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｍ．  Ｂｕｌｌ．，  ３８（１０），  ２７７１−２７７４  （１９９０）］  でメチル化し、加水分解後にガスクロマトグラフィーにより各グリコシド結合の定量を行うことにより調べる。
【００２０】
▲１▼  メチル化
脱水した試料（１０ｍｇ）をネジ付試験管に入れ、１ｍｌの脱水ＤＭＳＯを加えて溶解する。これにＮａＯＨを１００ｍｇ加え、直ちに０．５ｍｌのヨウ化メチルを加える。窒素ガスによる置換を行った後、スターラーで攪拌しながら１〜２時間反応させ、水５ｍｌを加える。これに５ｍｌのクロロホルムを加えて十分に振とうし、クロロホルム層を三角フラスコにとる。同様の操作を５回繰り返し、三角フラスコにとったクロロホルム層に蒸留水２５ｍｌを加え、振とう後、クロロホルム層を回収する操作を３回繰り返す。次にエバポレーターで減圧乾燥する。
【００２１】
▲２▼  完全メチル化の確認
クロロホルム１〜２ｍｌで試料を溶解した後、クロロホルムを対照としてＩＲを測定し、水酸基がないことを確認する。
【００２２】
▲３▼  分離
セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）で糖画分を分離する。溶媒は、クロロホルム：メタノール＝２：１を用い、試料を溶媒１ｍｌに溶かして分離する。糖画分をフェノール硫酸法で確認後、回収し、減圧乾燥する。
【００２３】
▲４▼  加水分解
メチル化物に１〜２ｍｌの９０％（ｗ／ｖ）ギ酸を加えて窒素ガス置換を行い、１００℃で３〜８時間反応させ、減圧乾燥する。
１〜２Ｍのトルフルオロ酢酸１〜２ｍｌを添加し、窒素ガス置換して密封する。１００℃で３〜１０時間反応させ、トリフルオロ酢酸が完全に除去されるまで乾燥する。
【００２４】
▲５▼  還元
加水分解物を１〜２ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）以下のエタノール水溶液で溶解し、試料の５〜１０倍量のホウ酸水素化ナトリウムを加えて室温で２〜４時間放置する。
アンバーライトＣＧ−１２０〔Ｈ＋  〕（オルガノ社製）を蒸留水に懸濁させて、試料に少量ずつ滴下する。十分量を添加し、１０分以上静置する。濾過後、残渣を５０％エタノール水溶液で洗浄し、さらに９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液で洗浄した後、減圧乾燥する。減圧乾燥後、析出したホウ酸結晶を５〜１０ｍｌのメタノールに溶解し、減圧乾燥する。この操作を２回繰り返す。
【００２５】
▲６▼  アセチル化
試料にピリジン０．３ｍｌを加え、溶解させた後、無水酢酸０．３ｍｌを加える。オイルバス上、９５〜１００℃で９０〜１２０分反応させ、反応後冷却する。トルエン１ｍｌ添加し、４０℃以下で減圧濃縮し、乾固する。
【００２６】
▲７▼  溶解
試料を０．５ｍｌのクロロホルムに溶解してガスクロマトグラフで分析する。
【００２７】
▲８▼  ガスクロマトグラフィーの条件
［ＴＩＣ］
0003597566.tif 000003
【００２８】
〔実施例１〕
市販のカードラン１０ｇを６試験区用意し、それぞれ１００ｍｌの０．０５％（ｖ／ｖ）希薄塩酸水溶液に１０分間浸漬し、濾紙で濾過後、風乾した。その後、水分含有率が１％、２．６％、３％、５％、１０％及び１５％（ｗ／ｗ）となるように、６０℃で減圧乾燥した。これらを試験区▲１▼から▲６▼とした。
得られた酸吸着カードランを、スクリューキャップ付き試験管に移して密閉し、１３０℃で３０分間、オーブン中で湿熱処理した。ここで、水分含量１５％のもの（試験区▲６▼）は、１２０℃あたりから褐変が激しくなったため、１２５℃に達温したところで試験を中止した。また、試験区▲１▼については、さらに３０分間湿熱処理を行った。
【００２９】
湿熱処理後、それぞれ４０％（ｗ／ｗ）水溶液にするとともに、ｐＨを５．６に調整した後、遠心分離により、水不溶性画分を除去した。遠心分離した上澄液をイオン交換樹脂により脱塩し、これをエタノール中に攪拌しながら注入した後、遠心分離により上澄液を除去し、エタノール不溶画分を得た。分別した沈殿物は、８０％エタノール水溶液及び９９．５％エタノール溶液により数回洗浄した後、当該エタノールを除去し、乾燥させた。得られた水溶性多糖の量をそれぞれ表１に示す。
また、得られた水溶性多糖の分子量を測定するために、ＨＰＬＣ装置を用いてＧＰＣ分析を行った。結果（重量平均分子量及び分子量分布）を表１に示す。
【００３０】
〔実験例１〕
実施例１で得られた多糖▲１▼〜▲５▼及び未処理カードランを試料として、参考例に従ってメチル化し、ＧＣ−ＭＳ法により結合様式を分析した。
この結果、未処理のカードランでは１，３結合のみが検出され、１，６結合については検出限界以下であった。これに対し、サンプル▲１▼〜▲５▼では、１，３結合及び１，６結合が検出され、１，２結合及び１，４結合由来のピークはわずかに検出されたのみであった。１，６結合を有するグルコースが全グルコースに占める割合を、ＧＣ分析のピーク面積より算出した結果を表１に示す。
表１から明らかなように、水分含量が増加するにつれて、１，６結合を有するグルコースの割合が増加する傾向があった。
【００３１】
【表１】
0003597566.tif 000004
【００３２】
〔実験例２〕
実施例１で得られた▲１▼から▲５▼までの５種の水溶性多糖の酵素に対する消化性を調べた。酵素としてはザイモリエイス−１００Ｔ（生化学工業社製）を用い、対照試験区としてカードランを用いた。カードラン及び５種の水溶性多糖をそれぞれ３ｍｇずつとり、イオン交換水５ｍｌに溶解した。但し、カードランは水不溶性であるため、分散状態のまま使用した。
これらの水溶液に、ザイモリエイス酵素液（２０ｍｇを２ｍｌのイオン交換水に溶解した液）を１００μｌ加えて、３７℃で２４時間反応させ、ＧＰＣ分析により酵素に対する消化性を調べた。結果を表１に示す。
表１から、ザイモリエイスでは分解されない水溶性多糖が実施例１により得られたことが分かった。また、アミラーゼに対する消化性は全く認められなかった。なお、カードランは水に不溶性であるが、湿熱処理後は水溶性となることが分かった。
【００３３】
〔実施例２〕
市販のカードラン１０ｇを、１００ｍｌの各種濃度の希薄塩酸水溶液に１０分間浸漬し、濾紙で濾過後、風乾した。その後、水分含有率が３％（ｗ／ｗ）となるように、６０℃で減圧乾燥した。このうち１ｇをサンプリングし、１０ｍｌのイオン交換水に分散させ、ＮａＯＨで中和滴定することにより、酸の吸着量を測定した。
こうして得られた、酸吸着量が０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．２％のカードランに対して、実施例１と同様の方法で湿熱処理を行った。このとき、酸吸着量が０．２％の糖は着色がひどく、異臭がした。この酸吸着量が０．２％のものを除いて、４サンプルについて実施例１と同様にメチル化分析し、１，６結合の割合を調べた。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
0003597566.tif 000005
【００３５】
表２から明らかなように、酸吸着量が０．０３〜０．１％の状態で湿熱処理した多糖は、１，６結合を５％以上有する。
【００３６】
〔実施例３〕
８ｍｌの１２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸水溶液（有機酸）を、市販のカードラン１０ｇに添加し、水分含有率が７．８％（ｗ／ｗ）となるように減圧乾燥した。
得られた酸吸着カードランを、スクリューキャップ付き試験管に移して密閉し、１３５℃で６０分間、恒温器中で湿熱処理した。湿熱処理後、１０％（ｗ／ｗ）水溶液にするとともに、ｐＨを６．０に調整した後、遠心分離により、水不溶性画分を除去した。遠心分離した上澄液をイオン交換樹脂により脱塩し、これをエタノール中に注入した後、遠心分離により上澄液を除去し、エタノール不溶画分を得た。得られた沈殿物は、８０％エタノール水溶液及び９９．５％エタノール溶液により数回洗浄した後、当該エタノールを除去し、減圧乾燥した。
得られた水溶性多糖は、２．８ｇであった。この多糖をＧＰＣ分析した結果、重量平均分子量は４２００であり、分子量分布は２．１であった。また、実施例１と同様にメチル化分析し、１，６結合の割合を調べた。その結果、１，６結合の割合は５．１％であった。
【００３７】
次に、得られた水溶性多糖のうち３ｍｇをイオン交換水５ｍｌに溶解し、実験例２と同様のザイモリエイス酵素液を１００μｌ加えた後、３７℃で２４時間反応させ、ＧＰＣ分析により酵素に対する消化性を調べた。この結果、重量平均分子量は４０００でほとんど変化せず、ザイモリエイスでは分解されない水溶性多糖が得られたことが分かった。また、アミラーゼに対する消化性は全く認められなかった。
【００３８】
〔実施例４〕
有機酸としてのクエン酸１ｇと、グルコース０ｇ、０．５ｇ、１ｇとをそれぞれ水８ｍｌに溶解し、当該３種のグルコース濃度のクエン酸水溶液を、コーンスターチ１０ｇにそれぞれ添加した。その後、水分含有率が３％（ｗ／ｗ）となるように、６０℃で減圧乾燥した。この酸吸着澱粉を、それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ  とした。
【００３９】
これらの酸吸着澱粉Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ  を、それぞれスクリューキャップ付き試験管に移して密閉し、１３５℃で６０分間、恒温器中で湿熱処理した。湿熱処理後、１０％（ｗ／ｗ）水溶液にするとともに、ｐＨを６．０に調整した後、遠心分離により、水不溶性画分を除去した。遠心分離した上澄液をイオン交換樹脂により脱塩し、これをエタノール中に注入した後、遠心分離により上澄液を除去し、エタノール不溶画分を得た。得られた沈殿物は、８０％エタノール水溶液及び９９．５％エタノール溶液により数回洗浄した後、当該エタノールを除去し、減圧乾燥した。
【００４０】
得られた水溶性多糖の量を表３に示す。また、この多糖をＧＰＣ分析した結果（重量平均分子量及び分子量分布）も合わせて表３に示す。
次に、得られた水溶性多糖のうち２ｇずつをイオン交換水２０ｍｌに溶解し、アミラーゼ（天野製薬社製，アミラーゼＡＤ）６８０ｕｎｉｔｓ  を用いて、３７℃で２４時間酵素処理し、イオン交換樹脂で除蛋白後、エタノール中に沈殿精製した。当該回収率を表３に示す。
【００４１】
【表３】
0003597566.tif 000006
【００４２】
表３より、グルコースの添加量を増やすにつれて、アミラーゼに対して難消化性となっており、１，６結合が多くなっていることが分かる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、着色及び加熱臭の発生を抑えるとともに、オリゴ糖をほとんど含まないようにして、多糖中の１，６結合を増加させることができる。