(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
ａ）式Ｉで表されるモノマーを用いて、ヒドロキシル基を含有するベース担体の表面にモノマー単位が線状に連結するオキシラン含有ポリマーをグラフトしてオキシラン含有活性化担体を調製する工程
0003583429.tif 000006
［但し、上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の間の整数である。］
ｂ）工程ａ）からの前記オキシラン含有活性化担体と式IIIで表されるアルコールもしくはフェノールまたは式IVで表されるアミンを反応させる工程
R5−OH                                         III
R5−NH2                                         IV
［但し、上記２式中、
R5はC1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接CH2基がNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基がＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキルであるか、又は
R5は−［（CH2）ｍ−Ｏ−］ｏ−R6であり、但し本式中、ｍは２又は３であり、ｏは１〜200の間の整数であり、
R6はＨ又はC1−C5−アルキルである。］
を有する製造方法によって得られる、疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤。
【請求項２】
請求項１に記載の分離剤を使用する、クロマトグラフィーカラム。
【請求項３】
疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤の製造方法であって、
ａ）式Ｉで表されるモノマーを用いて、ヒドロキシル基を含有するベース担体の表面にモノマー単位が線状に連結するオキシラン含有ポリマーをグラフトしてオキシラン含有活性化担体を調製する工程、および
0003583429.tif 000007
［但し、上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の間の整数である。］
ｂ）工程ａ）からの前記オキシラン含有活性化担体と、下記式IIIのアルコールもしくはフェノール又は下記式IVのアミンとを反応させる工程、
R5−OH                                         III
R5−NH2                                         IV
［但し、上記２式中、
R5はC1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接CH2基がNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基がＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキルであるか、又は
R5は−［（CH2）ｍ−Ｏ−］
ｏ−R6であり、但し本式中、ｍは２又は３であり、ｏは１〜200の間の整数であり、
R6はＨ又はC1−C5−アルキルである。］
を有することを特徴とする、疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の分離剤を使用する、２以上の物質からなる混合物のクロマトグラフィー分離方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は疎水クロマトグラフィー用分離剤に関する。
疎水相互作用に基ずく液体クロマトグラフィー用に、２種類のグループの分離剤が慣用されている：
ａ）高い配位子密度を有する、逆相クロマトグラフィー（RP−クロマトグラフィー）用の分離剤は、非水性溶離液中において低分子量物質を分離するのに主として使われる
ｂ）低い配位子密度を有し、かつ、一般的には低疎水性の配位子（例えばRP−クロマトグラフィーにおけるC8−アルキル又はC18−アルキルの代りに、C4−アルキル又はC7−アリール）を有する、疎水相互作用クロマトグラフィー（HIC）用の分離剤は、水溶性溶離液を用いて蛋白質を分離するのに主として用いられる。カオトロピック塩（chaotropic  salt）、例えば2M硫酸アンモニウム、が出発溶離液に添加され、この塩濃度は勾配溶離の進行中に低下される。
疎水相互作用クロマトグラフィー用の分離剤は当業界では知られている。ポリサッカリド、架橋したポリサッカリド及び架橋したポリアクリル酸メチルもベースの担体として慣用される。どの場合でも、このベースの担体はより低級のアルキル又はアリールラジカル、例えばブチル、フェニル又はベンジルによって置換される。これらの物質を製造する既知の方法は、三弗化硼素エーテル錯化合物の存在下で、オキシラン基を含むベースの担体をアルコールと反応させることに基ずいている。
従来技術の既知の分離剤を使用するときは、不充分な分離効果がしじゅうみられる。これらの分離剤にしばしばみられる別の不利な点は、生物学的活性の減少及び／又は分析物の非特異的非可逆結合による損失である。
本発明の目的は、特に疎水相互作用クロマトグラフィーのための改善された性質を有する分離剤を提供することである。
ドイツ特許出願DE  43  10  964は、式Ｉのモノマーがヒドロキシル基含有のベース担体にグラフトしている、オキシラン含有活性化担体物質を開示している。
0003583429.tif 000002
但し上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の整数である。
これらの活性化担体物質は、それ自体知られている方法で、疎水相互作用クロマトグラフィー用分離剤に転換できることがわかった。得られたこの分離剤は改善された性質をみせる。
本発明は、次の工程：
ａ）式Ｉで表されるモノマーを用いて、ヒドロキシル基を含有するベース担体の表面にモノマー単位が線状に連結するオキシラン含有ポリマーをグラフトしてオキシラン含有活性化担体を調製する工程
0003583429.tif 000003
［但し、上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の間の整数である。］
ｂ）工程ａ）からの前記オキシラン含有活性化担体と式IIIで表されるアルコールもしくはフェノールまたは式IVで表されるアミンを反応させる工程
R5−OH                                         III
R5−NH2                                         IV
［但し、上記２式中、
R5はC1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接CH2基がNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基がＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキルであるか、又は
R5は−［（CH2）ｍ−Ｏ−］ｏ−R6であり、但し本式中、ｍは２又は３であり、ｏは１〜200の間の整数であり、
R6はＨ又はC1−C5−アルキルである。］
を有する製造方法によって得られる、疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤である。
本発明の分離剤は、表面上にポリマーが共有結合している、ヒドロキシル基含有のベース担体に基ずく、疎水クロマトグラフィーのための分離剤であり、次に示す特徴を有している。
ａ）このベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含む。
ｂ）共有結合したポリマーは、末端モノマー単位によってベースの担体に結合している。
ｃ）このポリマーは式IIのモノマー単位を含む。
ｄ）そのモノマー単位は線状に連結する。
0003583429.tif 000004
但し上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の整数であり、
１方のＸラジカルはOHであって他方のＸラジカルはＺ−R5であり、
ＺはＯ又はNHであり、そして
R5はC1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接CH2基はNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基はＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキルであるか、又は
R5は−［（CH2）ｍ−Ｏ−］ｏ−R6であり、
但しこの式中ｍは２又は３であり、ｏは１〜200の整数であり、R6はＨ又はC1−C5−アルキルである。
本発明はまた、２以上の物質の混合物の分離、特に蛋白質の分離に関連した、本発明の分離剤を使用する、クロマトグラフィーカラムに関する。
本発明はさらに、疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤の製造方法であって、
ａ）式Ｉで表されるモノマーを用いて、ヒドロキシル基を含有するベース担体の表面にモノマー単位が線状に連結するオキシラン含有ポリマーをグラフトしてオキシラン含有活性化担体を調製する工程、および
0003583429.tif 000005
［但し、上式中、
R1、R2及びR3は互いに独立にＨ又はCH3であり、
R4はＨ、C1−C5−アルキル又はC6−C12−アリールであり、
ｎは１〜５の間の整数である。］
ｂ）工程ａ）からの前記オキシラン含有活性化担体と、下記式IIIのアルコールもしくはフェノール又は下記式IVのアミンとを反応させる工程、
R5−OH                                         III
R5−NH2                                         IV
［但し、上記２式中、
R5はC1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接CH2基がNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基がＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキルであるか、又は
R5は−［（CH2）ｍ−Ｏ−］ｏ−R6であり、但し本式中、ｍは２又は３であり、ｏは１〜200の間の整数であり、
R6はＨ又はC1−C5−アルキルである。］
を有することを特徴とする、疎水相互作用クロマトグラフィーのための分離剤の製造方法に関する。アルコールとの反応は三弗化硼素エーテル錯化合物の存在下に行うのが好ましい。
本発明はまた、本発明の新規分離剤を使用する、疎水相互作用クロマトグラフィー手段による、本発明の分離剤を使用する、２以上の物質からなる混合物のクロマトグラフィー分離方法、特に蛋白質の分離のための方法に関する。
図1aは、新規な分離剤上での蛋白質類、すなわちシトクロムＣ、ミオグロビン、リゾチーム及びキモトリプシノーゲンの分離を示す。比較のため、図1bは、従来技術の既知の分離剤での同じ混合物の分離状況を示す。
疎水性のアルキルラジカルか又はアリールラジカルであるR5は、ヒドロキシル基を含有するベースの担体上にグラフトするポリ（メタ）アクリレートの置換基として存在する。これに関連して、このR5ラジカルは、疎水クロマトグラフィー（すなわちRPクロマトグラフィー及び、特に疎水相互作用クロマトグラフィー）を目的とする、当業者に知られている疎水性置換基であり、C1−C20−アルキル、C6−C25−アリール、C7−C25−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はC1−C5−アルコキシにより誘導することもでき、この際、１個以上の非隣接CH2基はNH又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のCH基はＮによって置き換えることができるC7−C25−アリールアルキル、あるいはポリエトキシ誘導体又はポリプロポキシ誘導体を含む。
疎水相互作用クロマトグラフィーのためには、エチレン、プロピル、ｎ−ブチル又はｎ−ペンチルなどのC2−C5−アルキルラジカル、でなければｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−アミル又はネオ−ペンチルなどの分岐鎖ラジカル、及びフェニル、ナフチル、アントラシル又はフェナントリルなどのC6−C14−アリール、さもなければベンジルなどのC7−C10−アルキルアリール又はC7−C10−アリールアルキルが好ましい。
これらのラジカルは、ポリマー類似反応において相当するR5−OHアルコールを三弗化硼素エーテル錯化合物の存在下にオキシランと反応させることにより導入される。このポリマー類似反応においては、オキシラン成分としてオキシラン含有ポリマーが使用され、このものはヒドロキシル基を含有するベース担体上にグラフトしている。R5−OHフェノール及びR5−NH2アミンは、苛性ソーダ水溶液の存在下にオキシラン成分と反応させられる。これらの反応体は互いに交換することもできる：この場合、ヒドロキシル基含有担体は、三弗化硼素エーテル錯化合物存在下に2,3−エポキシプロピルフェニルエーテルなどのオキシラン誘導体と反応する。
疎水性の度合いはR5置換基の選定及び置換度によって影響を受ける。余剰のオキシラン基は、既知の方法、稀硫酸処理で除くことができる。
殊更説明するまでもなく、当業者は以上の説明を最大限に利用することができるものと考えられる。この理由により、好ましい実施態様は専ら開示を説明するものであり、決して限定するものではないものと解釈すべきである。
以上及び以下に記載の出願、特許及び刊行物などの全開示、及び該当ドイツ特許出願DE  43  23  913（1993年７月16日出願）の開示を、参考文献として本出願中に取り入れる。
実施例
実施例１：オキシラン−活性化担体の製造、フラクトゲル（Fractogeol,登録商標）−TSK  HW  65（Ｓ）からの方法
2gの硝酸セリウムアンモニウム（25mlの2MHNO3中に溶解）を、50mlの沈澱フラクトゲル（登録商標）TSK  HW  65（Ｓ）と25mlの水からなる懸濁液中に、室温で激しく撹拌しながら混合した。１分後、30mlのジオキサン中3gの（2,3−エポキシプロピル）メタクリレートを含む溶液を添加した。この混合物をさらに３時間撹拌した。次いで反応懸濁物を先ず蒸留水で洗浄し、さらに0.05M  EDTA溶液で洗浄した。
実施例２:n−ブチル置換担体物質の合成
実施例１にしたがって製造した乾燥ゲル50gを1,4−ジオキサン250ml中に懸濁させ、50mlの１−ブタノールを加えた。次いで30mlの三弗化硼素エチルエーテル錯化合物を加え、その溶液を室温で１時間撹拌した。その後、反応生成物を吸引濾過してアセトンと水で洗浄した。
実施例３：ベンジル置換担体物質の合成
１−ブタノールの代りにベンジルアルコールを使用する以外は、実施例２の方法にしたがってベンジル−置換の担体物質を製造した。
実施例４：フェニル置換担体物質の合成
0.6M  NaOH及び0.5Mフェノールからなる溶液中に、100mlのフラクトゲル−エポキシテンタクル（expoxytentacle）ゲルを懸濁させた。この溶液を40℃で12時間撹拌した。次いでこのものを吸引濾過し、0.5M硫酸溶液中で40℃にて２時間ゆるやかに撹拌した。その後、中性になるまで0.25Mリン酸塩緩衝液（pH7）で洗浄を行い、さらに水で洗浄した。
実施例５：フェニル置換担体物質合成の変形法
実施例１に従って製造したオキシラン含有ゲル25mlを、0.5M硫酸100mlで40℃にて２時間処理し、ジオール誘導体を生成させた。この誘導体をジオキサンで数回洗浄し、25mlの乾燥ジオキサン中に懸濁させた。この懸濁物を乾燥管を含むエルレンマイヤーフラスコに移し、3mlのBF3−エーテル錯化合物、次いで10mlの2,3−エポキシプロピルフェニルエーテルをピペットで添加して、全体を室温にて45分間振盪した。生成物をジオキサンで３回、次いで水で洗浄した。
実施例６：（アミノブチル）−置換担体物質の合成
0.2Mのｎ−ブチルアミンと0.2Mの炭酸ソーダ緩衝液（pH＝11）からなる水溶液100mlを、実施例１に従って製造されたゲル50ml中に加えた。この溶液を40℃で24時間撹拌した。次いでこのものを吸引濾過し、硫酸の0.5M溶液中で40℃にて２時間ゆっくり撹拌した。その後、中性に達するまで0.25Mリン酸塩緩衝液（pH7）で洗浄を行い、次に水で洗浄した。
実施例７：ポリエチレングリコール−置換担体物質の合成
20gのポリエチレングリコール（PEG6000）及び0.3M炭酸ソーダ緩衝液（pH＝13）からなる水溶液100mlを、実施例１に従って製造したゲル50mlに添加した。この懸濁液を40℃で24時間撹拌した。次いでこのものを吸引濾過し、硫酸の0.5M溶液中で40℃にて２時間ゆっくり撹拌した。その後、0.25Mリン酸塩緩衝液（pH7）で中性になるまで洗浄を行い、次いで水で洗浄した。
応用例Ａ:n−ブチル置換担体物質上での蛋白質の分離
実施例２にしたがって製造された担体物質を、スーパーフォーマンス（Super  Formance:登録商標）ガラスカラム（50×10mm）中に充填し、負荷緩衝液（20mMリン酸ソーダ緩衝液中1.8M（NH4）2SO4,pH7.0）により平衡安定化させた。シトクロム、ミオグロビン、リゾチーム及びキモトリプシノーゲンを含む混合物（各ケース4mg/ml）をカラムに装入した（200μｌ）。次いで後者を、20mMリン酸ソーダ緩衝液（pH7.0）中の（NH4）2SO4の勾配が1.8MからゼロＭ、流速が1ml/分で溶離させた（時間,30分）。溶離曲線を280nmで光度測定法により測定した。
これら４つの蛋白質は完全に分離させた（図1a参照）。
応用例Ｂ：ベンジル置換担体物質での蛋白質の分離
実施例３に従ってつくられた担体物質をスーパーフォーマンス（登録商標）ガラスカラム（50×10mm）に充填した。試料とクロマトグラフィー条件は応用例Ａに記載のものと同じであった。
これら４つの蛋白質は、この物質でも完全に分離された。すなわち、溶離曲線は応用例Ａで得られたものと同様であった。
比較例Ｃ：従来技術のｎ−ブチル置換担体物質上での蛋白質の分離
市場で入手可能な担体物質（ｎ−ブチル置換架橋ポリメタクリレート）をスーパーフォーマンス（登録商標）ガラスカラム（50×10mm）中に充填した。試料とクロマトグラフィー条件は応用例Ａに記載したものと同じであった。
応用例Ａとは異なり、これら４つの蛋白質は全く分離されなかった（図1bを参照）。
応用例Ａと比較例Ｃに使用した分離剤は極めて類似したベースの担体（架橋したポリメタクリレート）を有しているので、この結果は意外であった。
比較例Ｄ：従来技術のベンジル置換担体物質による蛋白質の分離
市場入手可能の担体物質（ベンジル置換架橋アガロース）をスーパーファーマンス（登録商標）ガラスカラム（50×10mm）に充填した。試料及びクロマトグラフィー条件は応用例Ａに記載のものと同じであった。
応用例Ｂとは異なり、これら４つの蛋白質は完全には分離されなかった。
【図１ａ】
0003583429.tif 000008
【図１ｂ】
0003583429.tif 000009