(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障の治療に有用な薬剤の製造のための、
式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ          （Ｉ）
（式中、Ｘは、Ａｒｇのα−アミノ基に結合していて、水素、炭素原子数１ないし４のアシル基から選択され；
Ｙは、Ａｓｐの１の位置のカルボニル基に結合していて、ヒドロキシ基、炭素原子数１ないし４のアルコキシ基、ペプチド結合により前記カルボニル基に結合しているアミノ酸セリンの残基から選択される）
の化合物およびその薬学的に受容できる塩の使用法。
【請求項２】
Ｘが水素であり、Ｙがヒドロキシ基である式（Ｉ）の化合物の請求項１に記載の使用法。
【請求項３】
Ｘがアセチル基であり、Ｙがアミノ酸セリンの残基である式（Ｉ）の化合物の請求項１に記載の使用法。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物の塩が酢酸塩、トリフルオロ−酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩から選択される、請求項１〜３に記載の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、緑内障の治療に有用な薬剤の製造のための、
式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ          （Ｉ）
（式中、Ｘは、Ａｒｇのα−アミノ基に結合していて、水素、炭素原子数１ないし４の（Ｃ１  〜Ｃ４  ）アシル基から選択され；
Ｙは、Ａｓｐの位置１のカルボニル基に結合していて、ヒドロキシ基、炭素原子数１ないし４の（Ｃ１  〜Ｃ４  ）アルコキシ基、ペプチド結合により前記カルボニル基に結合したアミノ酸セリンの残基から選択される）
の化合物の使用法に関する。
【０００２】
本発明の使用法における式（Ｉ）の化合物は活性成分として薬学的に受容できる塩にも使用できる。
【０００３】
本発明の使用法における式（Ｉ）の化合物は活性成分として眼科用薬剤組成物にも使用できる。
【０００４】
【従来の技術】
トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐは、腫瘍細胞と細胞外基質との間の相互作用を阻害することについて文献で周知である［ルオシュラティ（Ｒｕｏｓｈｌａｔｉ）およびピエルシュバッチャー（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）４４：５１７，１９８６］。
【０００５】
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの免疫刺激活性は、イタリア国特許第１，２２２，４３７に記載されている。
【０００６】
【問題を解決するための手段】
今、驚くべきことに、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、および前記一般式（Ｉ）に包含されるその誘導体が、抗緑内障特性を有することが見出された。
【０００７】
Ｘがアセチル基であり、Ｙがアミノ酸セリンの残基である式（Ｉ）の化合物が好ましい。トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（本明細書では今後ＲＧＤと命名する）が特に好ましい。さらに、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸または硫酸との式（Ｉ）の化合物の付加塩が好ましい。
【０００８】
原発性解放角緑内障（ＰＯＡＧ）は、前眼房のドレナージ流出系を通る房水経路の閉塞のために起こると考えられる。
【０００９】
比較的年長の患者の緑内障の眼の線維柱網内への本発明の眼科用薬剤組成物の局所投与は、安定した低血圧効果を与える。上記の治療効果は、主として、水分泌の有意の遮断を起こすことなく、水の流出能係数（ａｑｕｅｏｕｓ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）が有意に増大するためである。抗緑内障効果はまた、本発明の化合物の非経口投与後にも見られた。
【００１０】
本発明の化合物の局所適用では、刺激、炎症または眼高血圧のような局所的な副作用が全く起こらない。
【００１１】
本発明の化合物の使用は、上部（ｅｐｉ）−または内部（ｉｎｔｒａ）眼腫瘍の場合にはすすめられない。
【００１２】
兎の眼のドレナージ流出系の形態学的な閉塞は、リポソーム−ヒトフィブロネクチン複合体（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の単一房内投与によって作られた。
【００１３】
リポソームは、逆相蒸発（ＲＥＶ）技術に従う改良されたブリフ−ダイヤー法（Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）［ブリフ、イー・ジー（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．）およびダイヤー、ダブリュー・ジェイ（Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．）（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１−９１７）を用いて、卵黄から製造した。フィブロネクチンは、新鮮なまま凍結したクエン酸塩化ヒト血漿から、アキヤマ、エス・ケイ（Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ．）およびヤマダ、ケイ・エム（Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．）（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６０，４４９２−４５００、の方法に従って精製した。
【００１４】
下記の製造例で、実験モデルをさらに詳しく説明する。
製造例
リン脂質１００ｍｇを丸底フラスコ内のペンタン１５ｍｌに溶解させ、ヒトフィブロネクチン（Ｆｎ）（２５μｇ）を含有する、２価カチオンＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないｐＨ７．２〜７．４のダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の標準リン酸塩−緩衝塩類溶液（ＮａＣｌ  １４０ミリモル／ｌ、ＫＣｌ  ３ミリモル／ｌ、Ｎａ２  ＨＯＰ４  ・２Ｈ２  Ｏ  ６．５ミリモル／ｌ、ＫＨ２  ＰＯ４    １．５ミリモル／ｌ）［米国、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）Ｌａｂ．］５ｍｌを加えた。このフラスコを３０℃に温めた水浴中に浸漬した。完全に混合した後、アルゴンを、ガラス細管によって試料内に通した。ペンタンを、通常は０．５−１．０ｍｌ／分の速度で除去した。混合物の粘性の増加がペースト状の状態まで観察された。その後、ゲルは比較的迅速に崩壊し、混濁した非粘性の間リポソーム懸濁液が形成された。さらにアルゴンを散布した後、個々のゲル小滴が消失した。小胞の平均流体力学的径は、多分散性２７％で３５０ｎｍであった。
【００１５】
フィブロネクチン分子は、リポソーム小胞のスペース内に組み入れられることができ、またはリポソーム表面に結合することができる。製造中、酸化を妨げるための予防措置がとられた。リポソーム−フィブロネクチン複合体の組成物を得た。
【００１６】
【作用】
リポソーム−フィブロネクチン複合体の眼内投与前に、５％トリメカイン（Ｔｒｉｍｅｃａｉｎ）溶液の点眼（１．５−２．０分間隔で３回）による局所麻酔を行なった。続いて２％ノボカイン（Ｎｏｖｏｃａｉｎｅ）溶液０．２ｍｌを結膜下に注射し、そして眼瞼の麻酔および２つの垂直な直筋の麻酔をひき起こすために眼外組織中に注射した。麻酔効果が達成された後、眼瞼をひろげて眼瞼ホルダーで固定し、そして眼球を下方（ｉｎｆｅｒｉｏｒ）直筋の領域に鉗子によって固定した。穿刺切開を、側頭上部四分円において縁から１．５−２．０ｍｍ、角膜内に行なった。リポソーム８ｍｇ／ｍｌおよび、ヒト血漿フィブロネクチン１０μｇ／ｍｌを含む組成物（組成物Ａ）０．０７５ｍｌを、切開穴を通じた房水の漏れを妨げるための針が角膜層を斜めに貫通することができるようになっているインスリンシリンジに接続した２５ゲージ針で、兎の眼（ＯＤ）の前房内に導入した。０．０７５ｍｌの量の偽薬［ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の標準リン酸塩−緩衝塩類溶媒）を、同様に片方の眼（ＯＳ）内に投与した。眼内圧（ＩＯＰ）値を、圧平眼圧計によって測定した。流体力学値は、出発ＩＯＰ水準に従って５．５または１０ｇのプランジャー荷重をかけた電子サハロフ（Ｓａｃｈａｒｏｖ）張力記録計を用いてグラント（Ｇｒａｎｔ）張力記録法により監視した。張力記録法曲線は、前記組成物の投与後３−５時間内およびその介入以来２４時間後に得た。評価の２４時間後に、ＯＤはＩＯＰの有意の増大を示し、これは房水流出うっ滞（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）のためＯＤにおいて２５．５６ｍｍＨｇに達した（Ｃ＝０．１５ｍｍＨｇ）。対照（ＯＳ）眼における適当なＩＯＰ値は、Ｃ値０．２４で９．３６ｍｍＨｇであった。
【００１７】
実際には、リポソーム−フィブロネクチン複合体の眼内投与の後３−５時間内には、ＩＯＰの増大が起こった。基準値と比較して９．０−１２．０ｍｍＨｇのＩＯＰの上昇は、通常、本組成物の投与後１時間ですでに検出され、注射から最初の５時間以内は、上述の増大した水準に保たれた。典型的には、本接着性組成物の眼房内導入からの最初の４時間以内の房水産生の増大は、おそらくは本組成物が増大した虹彩一毛様体組織要素の透過性を誘発する能力のために、５．３８ｍｍ３  ／分に達することができた。
【００１８】
表１は、ＩＯＰ測定の結果を示している。
【００１９】
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評価の２４時間後にドレナージ流出系の有意の細胞浸潤が組織学的に観察され、リポソーム−フィブロネクチン複合体に接着した細胞残屑が房水流出うっ滞をひき起こした。
【００２０】
表２は、ＩＯＰ測定の結果を示す。
【００２１】
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別の一連の対照実験は、リポソームの投与は眼内高血圧または房水のうっ滞をひき起こさないだけであることを示した。高血圧効果も房水流出のうっ滞も、純粋なヒト血漿フィブロネクチンの房内導入後には検出されなかった。
【００２２】
【実施例】
下記の実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
７６匹の兎に、２価カチオンＣａ＋２およびＭｇ＋２を含まないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の標準リン酸塩・緩衝塩類溶液（ｐＨ７．２−７．４）中の０．５％のＲＧＤ溶液４０μｌを３０分間右眼に滴下して前処理を行なった。第一の眼の挑戦は、前記の製造例において得た組成物Ａ  ０．０７５ｍｌを用いて実施した。左眼は、同一時間間隔内に同一体積の偽薬［ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｅｃｏ）の標準リン酸塩−緩衝塩類溶液で同様に処理した。眼の挑戦後に、両眼を２４−３０時間以内に、前記製造例に記載したように試験した。組織学的試験はこの挑戦の２４時間後に実施した。摘出した眼を１０％中性緩衝化ホルムアルデヒド溶液中に固定し、グレード（等級）アルコール中で脱水し、パラフィン中に埋め込んだ。ヘマトキシリンおよびリン脂質用のエオシンまたはスダンブラック（リポソーム染色）で染色された全眼の切片を、高血圧および房水流出能うっ滞のモデル化中、眼における構造的変化または炎症反応を評価するために使用した。挑戦された眼の組織の組織学的切片における炎症の程度は、虹彩および周囲の組織の急性炎症細胞による浸潤について、そして前眼房内への浸潤の拡張について採点された。局所的な許容可能性は眼の刺激反応の評価をもとにした。処理眼と対照眼との間にＩＯＰ基準線の上昇は、統計的に異なった（Ｐ＜０．０１）。処理眼はＩＯＰ平均基準線１６．５ｍｍＨｇで出発して、相当するＣ値（流出能）０．３３をもち、１７．３０ｍｍＨｇという評価の２４時間後の平均Ｐｏ値を示し、一方対照眼のＩＯＰ増加は、同じ２４時間間隔で、平均値２２．３８ｍｍＨｇをもつ顕著に増大したＰｏ値および房水流出能（Ｃ＝０．１３）のうっ滞を示した。そのため、０．５％、ＲＧＤＳの眼の局所処理は、房水流出脳のうっ滞において２．５倍の防止を与える。０．５％のＲＧＤＳペプチド溶液の局所適用は、障害、充血、灼熱感のような刺激を誘発しなかった。リポソーム−フィブロネクチン複合体の眼内投与の３０分前に０．５％  ＲＧＤＳペプチド溶液で、単一の眼の前処理を行なうと、前眼房角の流出通路における細胞／リポソーム／フィブロネクチン残屑の沈着が妨げられ、そして眼内炎症の誘発が予防され、一方リポソーム−フィブロネクチン複合体を用いる前眼房挑戦の前に偽薬で処理すると、はっきりした炎症反応が誘発された。
実施例２
０．２５％ＲＧＤペプチド溶液を使用することを除き、実施例１と同じ方法に従って、下記の結果を得た。
【００２３】
０．２５％ＲＧＤの単一用量の圧力低下効果は、２４時間後まで観察され、その最も目立つ活性は、房内投与後少なくとも４時間では続いており、一方偽薬処理した眼は、同じ時間内に基準線から１４０％増大を示した。処理眼と対照眼との間のＩＯＰの差異は有意である（Ｐ＜０．００１）ことがわかった。前眼房のリポソーム−フィブロネクチン複合体を用いた挑戦は、最初の４時間以内には著しい眼の炎症反応をひき起こさなかったが、偽薬で処理した眼においては眼の挑戦後４時間で相当する４０．１８ｍｍＨｇに達するＰｏ値の著しい増大をともなって、有意の房水流出能うっ滞（Ｃ＝０．１２）を誘発した。房水流出経路の閉塞は、組織学的試験によってはっきりと述べることができ、いくつかの関係する急性または慢性炎症細胞は前眼房における閉塞の形態学的基質として注目された。基本的には、房水流出うっ滞という現像は、前眼房挑戦の４時間後にピークとなるようにみえた。もう一方の眼を、０．２５％ＲＧＤ溶液４０μｌで単一前処理すると、かなり流出能が増大し（Ｃ＝０．３７）、同じ間隔で監視したときの眼内高血圧が防止された。リポソーム−細胞沈着物の解離は、水流出経路において検出することができ、粒子状残屑のない領域の保存が組織学的試験によって眼のドレナージ領域に現われた。
実施例３
安定化した原発性開放角緑内障（進行した段階のＰＯＡＧ）によって冒された年長の患者を滴径約３５μｌで滴びんから投与した０．５％ＲＧＤ洗眼薬で治療した。賦形薬は、２価カチオンＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の標準リン酸塩−緩衝塩類溶液（ｐＨ７．２−７．４）であった。滴剤を午前８時および午後８時に投与した。眼内圧を午後３時に圧平眼圧測定法によって測定した。眼の許容可能性は以下の症状チェックリストを使用した後で評価した：障害、充血、灼熱感、光恐怖、涙が起こらなかった。この研究の短期間という性質のため、視野および視野神経乳頭形態学の変化は評価しなかった。データを集めて、バリアンス（Ｖａｒｉａｎｃｅ）、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ試験、および対になったスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ試験の分析を用いて分析した。Ｐ＜０．０５という値は、行なわれたすべての統計学的試験に対して統計学的に有意義であると考えられた。
【００２４】
眼内圧の値は、治療の前および治療の間記録された。表３には、緑内障治療の統計学的分析の結果が示されている。
【００２５】
症状のリストに基づく局所許容可能性は、すべての治療に対して優れていた。前眼房には発赤または細胞（ｃｅｌｌｓ）はみられなかった。
【００２６】
【表３】
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実施例４
実施例３のものと同じ方法を使用して、ＰＯＡＧに冒された年長患者群について、用量−効果相関研究を実施した。各々０．１、０．２５、０．５％Ｗ／Ｖ  ＲＧＤを含む溶液を試験した。
【００２７】
表４は、用量−効果相関研究の結果を示している。
【００２８】
【表４】
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すべての患者は、全評価期間中経験を積んだ眼科医によって継続的に管埋された。ＲＧＤ−ペプチドを用いた治療が治療の最初の何日か以内に無効であった場合には、この処置は中断され（０．１％ＲＧＤ溶液を用いたデータ参照）、そして患者は直ちにチモロールおよびピロカルピンを用いた通常の治療に移された。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物はまた、眼の外傷および硝子体増殖過程（ｖｉｔｒｅｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の場合に網膜剥離の予防のために、眼内水晶体移植、後水晶体色の線維症に関連する炎症（続発性白内障）を予防するために使用することもできるという実験的証拠もある。式（Ｉ）の化合物の別の用途には、角膜上皮修復および外科手術後の傷の治癒を促進するためのそれらのポリマー移植片、シートまたはコンタクトレンズ上での固定がある。
【００３０】
本眼科用薬剤組成物の中で、洗眼薬が特に好ましい。洗眼薬は、塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸、および当技術分野で公知のその他の任意の賦形剤を含むリン酸塩緩衝塩類溶液のような眼科用に適する賦形剤と混合した、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物より成る。この洗眼薬の最終的なｐＨは、７．２ないし７．４となっているであろう。そして溶液はＣａ２＋およびＭｇ２＋のような２価の正イオンを含んでいてはならない。
【００３１】
本発明の眼科用組成物は、米国マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．“レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ・ハンドブック（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）”に記載されたような通常の技術に従って製造することができ、例えば、洗眼薬、液剤、軟膏、薬物を添加した栓子の形であることができる。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は、抗緑内障活性を働かせるのに有用な量で含有される。
【００３３】
用量ならびに薬量学は、病気の重さ、患者の年令および身体の状態に従って専門医によって推定されるであろう。
【００３４】
例として、液剤の形の本薬剤組成物は、活性成分０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ないし５．０ｍｇ／ｍｌ、を含有するであろう。