(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子を含むＤＮＡ  断片；ｂ）ポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片；およびｃ）細胞内でＡＴＰ供給に関与する酵素の構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片からなる群から選択される遺伝子の一つ以上を含有し（但し、ｂ）のＤＮＡ  断片を単独で含有する場合を除く）、さらに自己増殖能を有するＤＮＡ  断片も含有するベクターを用いて形質転換した、リンの吸収および蓄積能力が強化された微生物によって、排水中の有機物およびリンを除去することよりなる排水処理方法。
【請求項２】
細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子を含むＤＮＡ  断片が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８８の寄託番号を有する大腸菌またはＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８９の寄託番号を有する大腸菌中に存在する大腸菌の  ｐｓｔオペロン遺伝子を含むＤＮＡ  断片に由来するものである、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８７の寄託番号を有する大腸菌中に存在する、クレブシェラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片に由来するものである、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リンの吸収および蓄積能力を強化した新規微生物を用いて、リンを含む有機性排水から有機物とリンを同時に除去する生物学的リン除去技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
湖沼や内湾などの閉鎖水域において富栄養化が進行し、深刻な社会問題になって久しい。なかでもリンは藻類増殖の制限因子と言われており、富栄養化を防止するためにはこのような閉鎖水域に流入する排水中のリンの量をできる限り削減することが最も効果的であると考えられてきた。そのため、従来より排水中のリンを除去する技術の開発が盛んに行なわれてきた。
【０００３】
リンと有機物を同時に含む有機性排水からのリン除去技術の一つに、生物反応を利用してリンを除去する生物学的リン除去法がある。生物学的リン除去法は、特殊な装置や薬剤添加なしに排水中の有機物とリンの同時除去が達成できる方法として１９８０年代初めから注目を集め、盛んに研究開発が行なわれてきた。
【０００４】
生物学的リン除去法、特に嫌気好気法に代表されるリン含有率が高い余剰汚泥を系外に排出することにより排水からリンを除去する方法では、活性汚泥中にポリリン酸蓄積性細菌を優占化させ、安定的に高リン含有率の活性汚泥を生産することが最も重要である。生物学的リン除去法では曝気槽流入端に嫌気槽を設けるが、ポリリン酸蓄積能のある微生物は嫌気条件下で、菌体内に蓄積したポリリン酸を分解して、リン酸を菌体外に放出しつつ、排水中の有機物を吸収して菌体内蓄積物質として貯蔵し、曝気槽ではこの菌体内貯蔵有機物を代謝しつつ排水中のリンを吸収し、ポリリン酸として菌体内に蓄積する。このため、ポリリン酸蓄積性細菌は他の微生物よりも有利に有機物を吸収でき、この系内に優占的に生育することができる。
【０００５】
この系においては、リン除去率は活性汚泥のリン含有率と有機物の汚泥転換率によって決定される。さらに、活性汚泥のリン含有率はポリリン酸蓄積能を持つ微生物の割合と、該微生物のポリリン酸蓄積能が充分に機能しているかによって決定される。通常の活性汚泥法から生物学的リン除去法に移行した場合、通常ポリリン酸蓄積性細菌の優占化に時間を要し、系のリン除去機能がなかなか発現しないことが多い。また、良好なリン除去性能がみられた後でも、特に有機物濃度及びリン濃度が高い排水においては、維持管理上の小さなミスによりリン除去機能が損なわれ、処理水中にリンが残存することがしばしばあり、一旦処理状況が悪化すると、これを回復するのに多大な時間がかかることが多い。
【０００６】
以上述べたように、生物学的リン除去法は二次処理工程の中で有機物とリンを同時に除去できる優れた排水処理方法であるが、十分なリン除去性能が発揮されるまでに時間がかかる、維持管理に十二分の注意を要する等の問題点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前述の問題点を解決するためには、活性汚泥中にポリリン酸蓄積性微生物を常に優占化させ、かつ該微生物に環境条件にかかわらず常にポリリン酸蓄積能を発現させる必要がある。
【０００８】
本発明は、上記の従来技術の問題点を解決するためになされたもので、リン除去方法に最も重要な役割を果たす微生物のポリリン酸蓄積能をさらに向上させた微生物を用いた排水処理方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明では、ａ）細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子を含むＤＮＡ  断片、ｂ）ポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片、およびｃ）細胞内でＡＴＰ  供給に関与する酵素の構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片からなる群から選択されるＤＮＡ  断片の少なくとも一つを含有する自己増殖性ベクター、もしくは上記ａ）、ｂ）およびｃ）のＤＮＡ  断片の二つ以上を一緒にもしくは別々に含有する自己増殖性ベクターを用いて形質転換した、リンの吸収および蓄積能力が強化された微生物を共存させた活性汚泥によって、排水中の有機物及びリンを除去する。但し、ｂ）のＤＮＡ  断片のみを含有する自己複製ベクターの使用は除外する。形質転換した微生物は、処理する排水に直接作用させてもよく、または形質転換微生物と活性汚泥との混合物で排水を処理してもよい。
【００１０】
したがって、本発明は次の工程からなる排水処理方法を提供する。
【００１１】
・細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子を含むＤＮＡ  断片（ＤＮＡ  断片（ａ））、ポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片（ＤＮＡ  断片（ｂ））および細胞内でＡＴＰ  供給に関与する酵素の構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片（ＤＮＡ  断片（ｃ））からなる群から選択されるＤＮＡ  断片の少なくとも一つを用意し、
・自己増殖能を有するＤＮＡ  断片を含有する一種以上のベクターを用意し、しかして
・ＤＮＡ  断片（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から任意の組み合わせで選択される（但し、ＤＮＡ  断片（ｂ）単独の選択を除く）ＤＮＡ  断片の少なくとも一つを、該ＤＮＡ  断片中の遺伝子が発現可能な状態に上記一種以上のベクターに結合し、
・上記のようにＤＮＡ  断片（ａ）〜（ｃ）の任意の組合わせと結合された一種以上のベクターを導入して微生物宿主を形質転換して、該微生物のリン吸収および蓄積能力を強化し、
・上記微生物を排水に作用させて排水中の有機物質およびリンを除去する。
【００１２】
本発明の一態様においては、ＤＮＡ  断片（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも一つが一種のベクターに結合されて、微生物宿主中に導入される。
【００１３】
本発明の他の態様においては、ＤＮＡ  断片（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも一つが少なくとも二種のベクターに結合されて、微生物宿主中に導入される。
【００１４】
本発明の排水処理方法の好ましい態様においては、下記のＤＮＡ  断片の組み合わせを有するプラスミドベクターを用いて形質転換した、リン吸収及び蓄積能力が強化された微生物を用いて排水中の有機物およびリンを安定的に高効率で除去する排水処理方法を行う：
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、およびＤＮＡ  断片（ａ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、およびＤＮＡ  断片（ｂ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、ＤＮＡ  断片（ａ）およびＤＮＡ  断片（ｂ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、ＤＮＡ  断片（ｂ）およびＤＮＡ  断片（ｃ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、ＤＮＡ  断片（ａ）、ＤＮＡ  断片（ｂ）およびＤＮＡ  断片（ｃ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、およびＤＮＡ  断片（ｃ）；
・ＤＮＡ  断片（ｚ）、ＤＮＡ  断片（ａ）およびＤＮＡ  断片（ｃ）；
但し、ＤＮＡ  断片（ｚ）は自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片を意味する。本明細書において、「自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片」とは、ＤＮＡ  断片（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも一つを結合すべき特定のベクターが、複製可能なＤＮＡ  断片を含むことを意味する。例えば、ベクターとしてｐＢＲ３２２を用いる場合は、ベクターｐＢＲ３２２の複製起点または他の適当な複製起点を有する必要がある。
【００１５】
なお、ＤＮＡ  断片（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）は、これら断片中の遺伝子が、一種以上のベクターと共に適当な微生物宿主に形質転換されたとき、発現される状態で、該ベクターに結合しなければならないが、そのための技術はよく知られている。
【００１６】
（ａ）のＤＮＡ  断片の供給源は、好ましくは原核生物の細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子であるが、具体例としては大腸菌のリン酸輸送系ｐｓｔ  オペロン遺伝子（  Ｂ．Ｐ．Ｓｕｒｉｎ，  Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ａｎｄ  Ｇ．Ｂ．Ｃｏｘ：  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１６１，  ｐｐ．１８９−１９８，１９８５  ）が挙げられる。なかでも好適な具体例としては生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８８号およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８９号の微生物が有するｐｓｔ  オペロン遺伝子ＤＮＡ  断片がある。
【００１７】
（ｚ）の自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片を得ることができるベクターの非限定的例示として、大腸菌の場合は好適例として市販のプラスミドベクターｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２その他が挙げられ、またクレブシエラ属の場合は好適例として市販のプラスミドベクターｐＭＭＢ６６ＥＨ等が挙げられる。
【００１８】
（ｂ）のＤＮＡ  断片の供給源は、好ましくは原核生物のポリリン酸キナーゼ遺伝子であり、具体例として大腸菌のポリリン酸キナーゼ遺伝子（Ｍ．Ａｋｉｙａｍａ，  Ｅ．Ｃｒｏｏｋｅ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２６７，  Ｎｏ．３１，  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎｏｖ．５，  ｐｐ．２２５５６−２２５６１，１９９２）を挙げることができる。
【００１９】
さらに、（ｂ）のＤＮＡ  断片の供給源となる微生物としては、原核生物に属し、ポリリン酸キナーゼ生成能を有する菌株のものが好ましいが、より好ましくはＡＴＰ  のリン酸基をリン酸ポリマーであるポリリン酸に転移してより長鎖長のポリリン酸を生成する反応を触媒する活性、及びその逆方向のポリリン酸のリン酸基をＡＤＰ  に転移してＡＴＰ  を生成する両方向の反応を触媒する活性のうちのいずれかあるいはその両方が高い菌株が良く、またはその変異株でもよい。これらの性質を有する具体例として、例えばクレブシエラ属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エアロバクター属、アルカリゲネス属、マイクロコッカス属などが挙げられるが、特に好ましい例としてクレブシエラ属を挙げることができる。
【００２０】
ポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片は、上記した微生物の染色体を適当な制限酵素、例えばＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ  、ＣｌａＩを用いて切断して得られたＤＮＡ  断片のうち、これらのＤＮＡ  断片と自己増殖能を持つベクタープラスミドとを結合して得られたプラスミドによって形質転換された微生物のポリリン酸キナーゼ活性を調べることによってポリリン酸キナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片を選択、調製することができる。また、より迅速な調製方法としては、すでに得られているポリリン酸キナーゼ遺伝子をプローブとして、サザンハイブリダイゼーション等の方法によりこれとハイブリダイズするＤＮＡ  断片を選択、調製することができる。前記プローブとして用いることができるポリリン酸キナーゼ遺伝子の具体例として、例えば前記Ｍ．Ａｋｉｙａｍａ，  Ｅ．Ｃｒｏｏｋｅ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  の大腸菌のポリリン酸キナーゼ遺伝子を挙げることができる。本発明者らは、この方法によりクレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片を新たに単離した。該断片は、生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８７号の微生物中に含まれている。
【００２１】
（ｃ）のＤＮＡ  断片の供給源としては、原核生物の細胞内でＡＴＰ  供給に関与する酵素が好ましい。具体例としてはアセテートキナーゼ（Ａ．Ｍａｔｓｕｙａｍａ，  Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ａｎｄ  Ｅ．Ｎａｋａｎｏ：  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ａｃｋＡ  ｇｅｎｅ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１７１，  Ｎｏ．１，  ｐｐ．  ５７７−  ５８０，１９８９  ）、ピルビン酸キナーゼ（Ｏ．Ｏｈａｒａ，  Ｒ．Ｌ．Ｄｏｒｉｔ，  ａｎｄ  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ：  Ｄｉｒｅｃｔ  ｇｅｎｏｍｉａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ：  Ｔｈｅ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．８６，  Ｎｏ．１８，  ｐｐ．  ６８８３  −  ６８８７，  １９８９  ）、カルバメートキナーゼ（Ｍ．Ｋｌｌｅｙ−Ｒａｙｍａｎｎ，  Ｄ．Ｈａａｓ，  Ｃ．Ｖ．  Ｗａｕｖｅｎ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｉｒａｒｄ：  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｍｕｔａｎｔｓｎａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｏｕｒ−ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅｐａｔｈｗａｙ，  ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１６０，  Ｎｏ．３，  ｐｐ．  ９２８−  ９３４，１９８４）等の活性をコードするＤＮＡ  断片がある。
【００２２】
本発明により提供される微生物のリン吸収及び蓄積能力の強化に用いられるプラスミドの具体例としては、細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子として、大腸菌のリン酸取り込みチャンネルＰｓｔ  系を含むＤＮＡ  断片、及び自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片として、ｐＫＴＹ３２１  由来のＤＮＡ  断片からなるプラスミドで、生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８８号の微生物が有する、本発明者らが「ｐＥＰ０２．２  」と命名したプラスミド；又は細胞膜のリン酸輸送に関与する遺伝子として、大腸菌のリン酸取り込みＰｓｔ  系を含むＤＮＡ  断片、及び自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片としてｐＳＴＶ２８由来のＤＮＡ  断片からなるプラスミドで、生命研寄託ＥＥＲＭ  ＢＰ−４３８９号の微生物が有する、本発明者らが「ｐＰ０５」と命名したプラスミド；あるいはポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片と細胞内でＡＴＰ  供給に関与する酵素として大腸菌のアセテートキナーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片、及び自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片として、ｐＵＣ１１８由来のＤＮＡ  断片からなるプラスミドで、本発明者らが「ｐＫＰ０３  」と命名したプラスミド；あるいはポリリン酸キナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ  断片、及び自己増殖能を持つベクターＤＮＡ  断片として、ｐＵＣ１１９由来のＤＮＡ  断片からなるプラスミドで、生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８７号の微生物が有する、本発明者らが「ｐＫＰ０２  」と命名したプラスミドを挙げることができる。
【００２３】
本発明で、上記各ＤＮＡ  断片を含有するプラスミドベクターで形質転換して、リンの吸収および蓄積能力を強化させる微生物（宿主菌）の例としては、大腸菌、シュードモナス属、アルカリジェネス属、クレブシエラ属等が挙げられる。好ましい微生物としては大腸菌ＭＶ１１８４株が挙げられる。本明細書において、「リンの吸収および蓄積能力が強化された微生物」とは、リンの吸収および蓄積能力を殆ど示さなかったものが形質転換によりそのような能力を持つにいたった微生物、並びに、リンの吸収および蓄積能力が形質転換前に比べて有意に強化された微生物の両者を含むものである。
【００２４】
プラスミドベクターの導入による宿主菌の形質転換は、常法により行うことができる。
【００２５】
以上に説明したプラスミドを用いて形質転換された微生物を、活性汚泥に共存させることによって排水中の有機物及びリンを安定的に高効率で除去することができる。例えば、形質転換された微生物を培養し、被処理水の水質に一定時間馴致させたものを、標準活性汚泥処理法において、曝気槽の流入端から、被処理水の有機物及びリンの濃度に応じた量を定期的に活性汚泥中に共存させることによって、排水中の有機物及びリンを高効率で除去することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
プラスミドｐＥＰ０２．２  の作製
大腸菌ＭＶ１１８４株から染色体ＤＮＡ  を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断して得られたＤＮＡ  断片から７−ｋｂのＤＮＡ  断片を選抜した。このＤＮＡ  断片と、制限酵素ＥｃｏＲＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したプラスミドｐＢＲ３２２を混合し、Ｓｃｈｌｅｉｆ  らの著書（Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆ  ａｎｄ  Ｐ．Ｃ．Ｗｅｗｎｓｉｎｋ：  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｔｏｒｋ  Ｉｎｃ．，  １９８１  ）に記載の方法に従い反応させ、結合した。
【００２８】
上記で得たプラスミド混合液を用い、ｐｓｔ  オペロンの一部であるｐｓｔＳを欠損した大腸菌ＡＮＣＣ７５株をＳａｍｂｒｏｏｋらの著書に記載（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）の方法に従い形質転換し、組換え体のコロニー１５６  個の中からリン酸吸収力が増加した１  個を選抜した。この株が保有するプラスミドを制限酵素ＤｒａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断して得られた６−ｋｂのＤＮＡ  断片、及び制限酵素ＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３を混合し、結合した。
【００２９】
上記で得たプラスミド混合液を用い、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、組換え体のコロニー６５個の中からｔａｃ  プロモーターの下流に上記の６−ｋｂのＤＮＡ  断片が挿入されているプラスミドを保有するコロニー１  個を選抜した。この株が保有するプラスミドをさらに制限酵素ＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断して得られた６．２−ｋｂのＤＮＡ  断片、及びプラスミドｐＫＴＹ３２１  を制限酵素ＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断したものを混合し、上記の方法で反応させ、結合した。上記で得たプラスミド混合液を用い、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、組換え体の白いコロニー４３個のうち、リン酸吸収活性の最も高いコロニー１  個を選抜した。この株の有するプラスミドをｐＥＰ０２．２  と命名した。本プラスミドを有する大腸菌ＭＶ１１８４株は、平成５年８月１９日付けで生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８８号の番号で寄託された。本プラスミドの構成を図１に示す。図１において、ｐｓｔＳはリン酸結合タンパクをコードする領域であり、ｐｓｔＣ、ｐｓｔＡおよびｐｓｔＢは各々リン酸輸送体サブユニットをコードする領域であり、そしてｐｈｏＵは未知のコンポーネントであり、これらのコンポーネントは全体としてｐｓｔ  オペロンを構成している。図１中の他の記号の意味は次の通りである。Ｐｔａｃ：ｔａｃ  プロモーター、Ｂ  ：制限酵素ＢａｍＨＩ  の作用サイト、Ｈ  ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  の作用サイト、（Ｓ／Ｄ）  ：制限酵素ＳｍａＩ及びＤｒａＩの作用サイト。
【００３０】
さらに、プラスミドｐＥＰ０２．２  のＰｔａｃプロモーターを、ｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターに置換して、挿入されたＤＮＡ  の産物が構成的に発現されるようにしたプラスミドを作成し、このプラスミドをｐＰ０５と命名した。本プラスミドを有する大腸菌ＭＶ１１８４株は、平成５年８月１９日付けで生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８９号の番号で寄託された。
【００３１】
実施例２
プラスミドｐＫＰ０２  の作製及びクレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ遺伝子の核酸塩基配列の解析
クレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１を常法に従い培養、集菌、洗浄、溶菌、除タンパク処理、ＲＮＡ  分解酵素処理を行い、全ＤＮＡ  を得た。この全ＤＮＡ  を制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ  を用いて分解した後、アガロース電気泳動で分離後、長さ約２．０  〜３．０−ｋｂのＤＮＡ  断片を抽出した。これらのＤＮＡ  断片にプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素Ｓａｌ  Ｉ  で切断したものを混合し、実施例１と同様に反応させ、結合した。
【００３２】
上記で得たプラスミド混合液を大腸菌ＭＶ１１８４株のコンピテントセルと混合し、０．５ｍＭ  イソプロピルチオ−  β−  ガラクトシド、５０ｍｇ／ｌの５−ブロモ−  ４−  クロロ−３−  インドリル−Ｄ−  ガラクトシド及びアンピシリンを含む２ｘＴＹプレートに塗沫し、培養した。組換え体の白いコロニー５８個のうち、Ａｋｉｙａｍａ  らの文献（Ｍ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｅ．Ｃｒｏｏｋｅ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２６７，  Ｎｏ．３１，  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎｏｖ．５，  ｐｐ．２２５５６−２２５６１，１９９２）に記載の大腸菌のポリリン酸キナーゼ遺伝子とハイブリダイズする組換えプラスミドを含むコロニー１  個を選抜した。このプラスミドをｐＫＰ０２  と命名した。本プラスミドを有する大腸菌ＭＶ１１８４株は、平成５年８月１９日付けで生命研寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３８７号の番号で寄託された。本プラスミドの構成を図２に示す。図２中の記号の意味は次のとおりである。ｐｐｋ  ：ポリリン酸キナーゼ遺伝子、Ｐｌａｃ：ｌａｃ  プロモーター、Ｘ  ：制限酵素ＸｈｏＩの作用サイト、（Ｓａ／Ｘ）：制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩの作用サイト。
【００３３】
クレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ遺伝子の核酸塩基配列の解析結果を図３および図４に連続して示す。
【００３４】
実施例３
プラスミド  ｐＥＰ０３およびｐＫＰ０３  の作製
大腸菌Ｋ−１２から染色体ＤＮＡ  を精製し、制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｕｌＩを用いて分解した後、アガロース電気泳動で分離後、長さ約４．０  〜５．０−ｋｂのＤＮＡ  断片を抽出した。これらのＤＮＡ  断片にプラスミドｐＵＣ１８  を制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｍａＩで切断したものを混合し、反応させ、結合した。
【００３５】
上記で得たプラスミド混合液を用いて大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、組換え体の白いコロニー２５６  個のうち、Ｍａｔｓｕｙａｍａ  らの文献（Ａ．Ｍａｔｓｕｙａｍａ，  Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ  Ｅ．Ｎａｋａｎｏ：  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ａｃｋＡ  ｇｅｎｅ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１７１，  Ｎｏ．１，  ｐｐ．  ５７７−  ５８０，１９８９  ）に記載の大腸菌のアセテートキナーゼ遺伝子のＤＮＡ  配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして、これとハイブリダイズする組換えプラスミドを含むコロニー１７個を選抜した。さらに、これらの１７株の中からアセテートキナーゼ活性が最も高いコロニー１  個を選抜した。この株が有するプラスミドをｐＥＰ０３  と命名した。プラスミドｐＥＰ０３  を制限酵素ＭｕｌＩ及びＰｓｔＩで処理して得られたＤＮＡ  断片と、プラスミドｐＫＰ０２  を制限酵素ＸｏｈＩで切断したものを混合し、結合した。
【００３６】
上記で得たプラスミド混合液を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記）の方法に従い大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、組換え体の白いコロニー８０個のうち、プラスミドｐＫＰ０２  をプローブとして、これとハイブリダイズする組換えプラスミドを含むコロニー３  個を選抜し、さらにその中からアセテートキナーゼ活性の最も高いコロニー１  個を選抜した。この株の有するプラスミドをｐＫＰ０３  と命名した。本プラスミドの構成を図５に示す。図５中の記号の意味は次のとおりである。ｐｐｋ  ：ポリリン酸キナーゼ遺伝子、ａｃｋＡ：アセテートキナーゼ遺伝子、Ｐｌａｃ：ｌａｃ  プロモーター、Ｐ  ：制限酵素ＰｓｔＩの作用サイト、Ｘ  ：制限酵素ＸｈｏＩの作用サイト、（Ｓ／Ｍ）  ：制限酵素ＳｍａＩ及びＭｌｕＩの作用サイト。
【００３７】
実施例４
プラスミドｐＥＰ０２．２  、プラスミドｐＫＰ０３  、プラスミドｐＥＰ０３  およびプラスミドｐＫＰ０２  を用いた形質転換株のリン除去活性発現
常法に従い、次のプラスミドを大腸菌ＭＶ１１８４株に導入した：プラスミドｐＥＰ０２．２  ；プラスミドｐＥＰ０２．２  とプラスミドｐＫＰ０２  ；プラスミドｐＫＰ０３  ；プラスミドｐＫＰ０２  とプラスミドｐＥＰ０３  ；プラスミドｐＥＰ０２．２  とプラスミドｐＥＰ０３  ；プラスミドｐＫＰ０２  ；プラスミドｐＥＰ０２．２  とプラスミドｐＥＰ０３  ；プラスミドｐＥＰ０３  ；およびプラスミドｐＥＰ０２．２  とプラスミドｐＫＰ０３  。これらの大腸菌をＬ−ブロスで前培養後、表１に示すＴ０．４−  培地に接種して培養し、経時的にサンプリングをして菌体濃度及び培地中のリン濃度を測定した。また対照としてポリリン酸キナーゼ構造遺伝子のＤＮＡ  断片が挿入されていない大腸菌およびポリリン酸キナーゼ構造遺伝子のＤＮＡ  断片が挿入されているプラスミドｐＫＰ０２  について、同様にリン除去活性を測定した。測定の結果を表２に示す。なお、以下において、各プラスミドを有する大腸菌株は、表２で用いた大文字アルファベットで示す。
【００３８】
【表１】
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【表２】
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実施例５
新規プラスミドによって形質転換された微生物の添加による排水中のリン除去実験
プラスミドｐＥＰ０２．２  を導入した大腸菌をＬＢ培地を用いて３７℃で培養し、全量を集菌、洗浄後、表３に示す組成の合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で１  時間培養した（菌体（Ａ）  ）。
【００３９】
プラスミドｐＥＰ０２．２  及びプラスミドｐＫＰ０２  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｂ）  ）。
【００４０】
プラスミドｐＫＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｃ）  ）。
【００４１】
プラスミドｐＥＰ０２．２  及びプラスミドｐＫＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｄ）  ）。
【００４２】
プラスミドｐＥＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｅ）  ）。
【００４３】
プラスミドｐＫＰ０２  及びプラスミドｐＥＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｆ）  ）。
【００４４】
プラスミドｐＥＰ０２．２  及びプラスミドｐＥＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｇ）  ）。
【００４５】
プラスミドｐＫＰ０２  、プラスミドｐＥＰ０２．２  及びプラスミドｐＥＰ０３  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｈ）  ）。
【００４６】
常法に従いｐＫＰ０２  を導入した大腸菌を上記の方法と同様に培養、集菌、洗浄後、合成下水中に５．０ｇ／ｌとなるように懸濁し、２０℃で５  時間培養した（菌体（Ｐ）  ）。
【００４７】
次に図６に示す装置を用いてリン除去処理実験を行なった。反応槽に通常の活性汚泥法で運転を行なっている下水処理場の曝気槽から採取した活性汚泥１５００ｍｌを投入し、表３の組成の合成下水を用いて、曝気５．０  時間、静置１．０  時間（４  サイクル／日）の回分法で連続実験を行なった。曝気時の最初の５  分間に培地１２５ｍｌ  および菌体（Ａ）４ｍｌを注入し、静置時間の最後の１０分間で上澄水（以下これを処理水と呼ぶ）１２５ｍｌ  を引き抜いた。槽内活性汚泥濃度が５０００ｍｇ／ｌになるように余剰汚泥の引き抜きを１  回／日行なった。リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）添加量は処理水リン濃度が安定して０．１ｍｇ／ｌ  になった時点で漸次増加した。
【００４８】
菌体（Ｂ）  、（Ｃ）  、（Ｄ）  、（Ｅ）  、（Ｆ）  、（Ｇ）  及び（Ｈ）  についても同様に回分法で連続実験を行なった。菌体（Ｐ）  も形質転換の影響に関する対照として同様に実験に含めた。
【００４９】
また対照として、菌体の注入を行なわずに曝気５．０  時間、静置１．０  時間（４  サイクル／日）の回分法で連続実験を行なった系（以下これを対照系（Ｉ  ）とする）及び菌体の注入を行なわずに嫌気撹拌１．５  時間、曝気３．５  時間、静置１．０  時間（４  サイクル／日）の回分式生物学的リン除去法（嫌気好気法）で連続実験を行なった系（以下これを対照系（ＩＩ）とする）を設けた。
【００５０】
リン除去処理実験結果を表４に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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表４から明らかなように、通常の活性汚泥のみで曝気５．０  時間、静置１．０  時間（４  サイクル／日）の回分法で運転を行なった対照系（Ｉ  ）では、原水リン初期濃度２５．０ｍｇ／ｌでは処理水中にリンが残存し続けたので、実験開始後１１日目から原水リン濃度を１５ｍｇ／ｌに減らしたが、リン除去性能は全く発現しなかった。通常の活性汚泥のみで生物学的リン除去運転を行なった対照系（ＩＩ）では、原水リン初期濃度２５．０ｍｇ／ｌでは処理水中にリンが残存し続けたので、実験開始後２１日目から原水リン濃度を１５ｍｇ／ｌに減らしたところ、リン除去性能が発現され処理水リン濃度が０．１ｍｇ／ｌ  になった。しかし、一旦リン除去性能が発現された後、原水リン濃度を増加させていくと、処理水中にリンが残存するようになった。
【００５３】
これに対し、プラスミドｐＫＰ０２  を含有するベクターを用いて形質転換された細菌（Ｐ）  を添加した系では嫌気好気サイクルを含む生物学的リン除去運転を行なわなくても速やかにリン除去性能が発現された。また、生物学的リン除去運転を行なった対照系（ＩＩ）と比較しても速やかにリン除去性能が発現され、その後原水リン濃度を増加させた場合でも安定した処理水水質が得られた。
【００５４】
さらに本発明の方法を用いてリン吸収および蓄積能力を強化した細菌（Ｂ）  を添加した系では細菌（Ｐ）  を添加した系と同様に嫌気好気サイクルを含む生物学的リン除去運転を行なわなくても速やかにリン除去性能が発現された。また、細菌（Ｐ）  を添加した系と比較しても速やかにリン除去性能が発現され、その後原水リン濃度をさらに増加させた場合でも安定した処理水水質が得られ、活性汚泥のリン含有率も細菌（Ｐ）  を添加した系の約１．８  倍になった。また、細菌（Ａ）  、（Ｃ）  、（Ｄ）  、（Ｅ）  、（Ｆ）  、（Ｇ）  あるいは（Ｈ）  を添加した系でも、リン除去性能に違いはあるものの、いずれも生物学的リン除去運転を行なった対照系（ＩＩ）以上のリン除去性能が得られた。
【００５５】
なお、いずれの系においても有機物の除去率は９５％  以上が得られた。
【００５６】
【発明の効果】
本発明の方法は微生物のリン吸収および蓄積能力をさらに強化できるという優れた特性を有している。従って、本発明の方法で形質転換された微生物を活性汚泥に定量的に添加するだけで、排水中のリンおよび有機物の除去を安定的に行なうことができる。
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＥＰ０２．２  の構成図である。
【図２】プラスミドｐＫＰ０２  の構成図である。
【図３】クレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ遺伝子の核酸塩基配列を途中まで示す図である。
【図４】クレブシエラ・エアロジェネスＡＴＣＣ９６２１のポリリン酸キナーゼ遺伝子の核酸塩基配列を図３に続いて最後まで示す図である。
【図５】プラスミドｐＫＰ０３  の構成を示す図である。
【図６】本発明の微生物を用いるリン除去処理実験装置の概略図である。
【符号の説明】
１：反応槽、２：供試菌体、３：培地、４：処理水、５：空気、６：エアポンプ、７：ポンプ、８：除菌フィルター、９：余剰汚泥
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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