(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと作動可能に連結された、腫瘍拒絶抗原前駆体MAGE−３をコード化する単離核酸分子、および、HLA−A1をコード化する単離核酸分子とを有する発現ベクター。
【請求項２】
請求項１記載の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、既に放棄された1991年５月23日出願の一部継続出願第705,702号の、1991年７月９日出願の一部継続出願第728,838号の、1991年９月23日出願の一部継続出願第764,364号の、1991年12月12日出願の一部継続出願第807,043号である米国を指定国とする1992年５月22日出願のPCT出願PCT/US92/04354号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して腫瘍学の研究に適用された免疫遺伝学の分野に関する。より具体的には、本発明は、いわゆる腫瘍拒絶抗原の提示や、後にここで「腫瘍拒絶抗原前駆体」又は、「TRAP」と称するものの発現等を通じて、腫瘍が生体組織の免疫システムによって認識されるメカニズムの研究及び分析に関する。最も具体的には、本発明は、HLA−A2分子によって提示される腫瘍拒絶抗原、即ち"TRA"にプロセシングされるそのようなTRAPの一つ、即ち、MAGE−３、をコード化する核酸分子に関する。
【０００３】
背景と従来技術
宿主細胞による癌細胞の認識又は認識の欠如の研究は、数多くの方向で行われてきた。この分野の理解には、基礎免疫学と腫瘍学との両方についてのいくらか理解していることが前提となる。
【０００４】
マウス腫瘍に関する初期の研究によって、これらの腫瘍が同系の動物に移植された時に腫瘍細胞の拒絶に導く分子を示すことが判った。これらの分子は、受容側の動物のＴ細胞によって「認識」され、移植された細胞の溶解を伴う細胞溶解Ｔ細胞応答を誘発する。その最初の証拠は、メチルコラントレン等の化学的発癌物質によって誘発された腫瘍によって得られた。腫瘍によって発現されＴ細胞応答を導出する抗原は、腫瘍によって異なることが判った。化学的発癌物質による腫瘍の誘発と細胞表面抗原の相違に関する一般的教示内容に関してはプレーン（Prehn）他,J.Natl.Canc.Inst.18:769〜778（1957）；クライン（Klein）他,Cancer Res.20:1561〜1572（1960）；グロス（Gross）,Cancer Res.3:326〜333（1943），ベイソンブリオ（Basombrio）,Cancer Res.30:2458〜2462（1970）を参照。この種の抗原は、「腫瘍特異性移植抗原」即ち"TSTAs"として知られるようになった。化学的発癌物質によって誘発された時におけるそのような抗原の発現が観察された後、腫瘍が生体外で紫外線照射によって誘発された場合にも類似の結果が得られた。クリプケ（Kripke）,J.Natl.Canc.Inst.53:333〜1336（1974）参照。
【０００５】
上述のタイプの腫瘍に関してはＴ細胞を介した免疫応答が観察されたが、一方、自然発生性腫瘍は一般的に非−免疫原性であると教示された。従って、これらは、腫瘍を有する対象体の腫瘍に対する反応を誘発する抗原を提示するものではないと考えられた。ヒューイット（Hewitt）他,Brit.J.Cancer33:241−259（1976）参照。
【０００６】
ここに参考文献としてその開示内容を添付するブーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184〜1193（1980）に記載されているように、tum-抗原提示細胞系のファミリは、マウス腫瘍細胞又は細胞系の突然変異によって得られる免疫原性変異体である。詳述すると、tum-抗原は、同系のマウス中において免疫応答を起こさず腫瘍を形成する腫瘍細胞（即ち、"tum+細胞”）を突然変異させることによって得られる。これらのtum+細胞が突然変異された時、これらは同系マウスによって拒絶され、腫瘍を形成することが出来ない（従って、"tum-"）。ここにその開示内容を参考文献として添付するブーン（Boon）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:272（1977）参照。これまで多くのタイプの腫瘍がこの現象を示すことが証明されている。例えば、フロスト（Frost）他,Cancer  Res.43:125（1983）参照。
【０００７】
tum-変異体は、免疫拒絶システムを導出させるので進行性腫瘍を形成することが出来ないと考えらる。この仮説を支持する証拠として、ファン・ペル（Van  Pel）他,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 76:5282〜5285（1979）による、通常は腫瘍を形成することがない"tum-"変異体が、致死下の照射によってその免疫システムを抑制した場合に、マウス内において腫瘍を形成することが出来るという観察、および肥満細胞腫P815の腹腔内注入tum-細胞が12〜15日間指数関数的に増殖し、その後、リンパ球とマクロファージの導入によって僅か数日中に除去されるという観察（ウイッテンホーヴ（Uyttenhove）他,J.Exp.Med.152:1175〜1183（1980））等がある。更に別の証拠として、マウスが、後に免疫抑制的な照射を受けて細胞が攻撃されても、その後の同じtum-変異体に対する攻撃に耐えることが出来る免疫記憶を得るという観察がある（ブーン（Boon）他,Proc.Natl,Acad.Sci.USA74:272〜275（1977）；前述のファン・ペル（Van Pel）他,;前述のウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他）。その後の研究によって、自然発生腫瘍が突然変異を受けた時に、免疫原性変異体を産生し、これが反応を起こすことが判った。事実、これらの変異体は、元の腫瘍に対する免疫防御反応を導出することが出来た。ファン・ペル（Van  Pel）他,J.Exp.Med.157:1992〜2001（1983）参照。従って、同系拒絶反応の標的である腫瘍において、いわゆる「腫瘍拒絶抗原」の提示を導出することが可能であることが示された。異質の遺伝子が自然発生性腫瘍にトランスフェクションされた場合にも類似の結果が得られた。この点に関しては、フィアソン（Fearson）他,Cancer  Res.48:2975〜1980（1988）を参照。
【０００８】
腫瘍細胞の表面に提示され、細胞障害Ｔ細胞に認識され溶解を起こす一つのクラスの抗原が認識された。この類の抗原を、以下、「腫瘍拒絶抗原」即ち"TRA（ｓ）”という。TRAには、抗原反応を導出するものもあるし導出しないものもある。これらの抗原は、これまで、生体外での細胞溶解Ｔ細胞特性研究、即ち、特定の細胞溶解Ｔ細胞（以下、CTL）サブセットによる抗原の同定の研究、を通じて行われてきた。このサブセットは、提示された腫瘍拒絶抗原の認識後に増殖し、そしてその抗原を発現している細胞が溶解される。特性研究によって、前記抗原を発現する細胞を特異的に溶解するCTLクローンが同定された。この研究の具体例としては、レヴィ（Levy）他,Adv.Cancer Res.24:1〜59（1977）；ブーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184〜1193（1980）；ブルナー（Brunner）他,J.Immunol.124:1627〜1634（1980）；マリャンスキー（Maryanski）他,Eur.J.Immunol.124:1627〜1634（1980）：マリャンスキー（Maryanski）他,Eur.J.Immunol.12:406〜412（1982）；パラディーノ（Palladino）他,Canc.Res.47:5074〜5079（1987）が挙げられる。このタイプの分析は、マイナー組織適合性抗原、雄性特異的Ｈ−Ｙ抗原、"tum-"抗原と称さるここに記載のクラスの抗原等の、CTLによって認識される他のタイプの抗原に必要である。
【０００９】
上述の課題の一例である腫瘍は、P815として知られている。ここにその開示内容を参考文献として添付するデプレーン（DePlaen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2274〜2278（1988）；スジコーラ（Szikora）他,EMBO  Ｊ  9:1041〜1050（1990）及びシビル（Sibille）他,J.Exp.Med.172:35〜45（1990）参照。このP815腫瘍は、メチルコラントレンによってDBA/2マウス内で誘発され、生体外腫瘍と細胞系の両方として培養される肥満細胞腫である。P815系は、突然変異後において、P91A（前記デプレーン（DePlaen））、35B（前記スジコーラ（Szikora））及びP198（前記シビル（Sibille））と呼ばれる変異体等、これまで数多くのtum-変異体を産生してきた。腫瘍拒絶抗原とは異なり、そしてこれが重要な相違点であるが、tum-抗原は、腫瘍細胞が突然変異した後でしか存在しない。腫瘍拒絶抗原は、突然変異が無くても、特定の腫瘍の細胞上に存在する。従って、上記参考文献によれば、ある細胞系が、"P1"と呼ばれる系等のtum-であり、これを刺激してtum-変異体を産生することが出来る。tum-表現体はその親細胞系の表現体と異なっているので、tum-細胞系とそのtum+の親の系のDNAの相違が予想でき、そしてその相違はtum-細胞中に於ける目的の遺伝子の位置を特定することに利用できる。その結果、P91A,35B及びP198等のtum-変異体の遺伝子が、遺伝子の遺伝コード化領域に於ける点突然変異によってその正常な対立遺伝子と異なっていることが発見された。前述のスジコーラ（Szikora）及びシビル（Sibille）及びラークウィン（Lurquin）他,Cell  58:293〜303（1989）参照。しかし、これは本発明のTRAには当てはまらないことが判った。これらの参考文献は、更に、前記tum-抗原から誘導されたペプチドが、CTLによって認識されるLd分子によって提示されるものであることを示した。P91Aは、Ldによって提示され、P35はDdによって、そしてP198はKdによって、それぞれ提示される。
【００１０】
ここに参考文献として全部添付される先行特許出願PCT/US92/04354,米国特許出願第807,043;764,364;728,838;及び707,702は、腫瘍拒絶抗原又は"TRA"にプロセシングされる様々なTRAPをコード化する遺伝子及び他の核酸分子に関係する発明が記載されている。
【００１１】
前記遺伝子は、分離、精製された腫瘍拒絶抗原のソース又はTRA自身として有用であり、後述するように、これらはいずれも、前記抗原がその「マーカー」となる癌を治療する薬剤として、あるいは、腫瘍学に於ける様々な診断及び調査方法に利用できる。例えば、tum-細胞を使用して、様々なtum+抗原やtum-細胞を提示する細胞を溶解するCTLを発生させることができることが知られている。例えば、ここに参考文献として添付する、マリャンスキー（Maryanski）他,Eur.J.Immunol  12:401（1982）；及びファン・デン・エインデ（Van  den  Eynde）他,Modern  Trends  in  Luekemia  IX（1990年６月）を参照。前記腫瘍拒絶抗原前駆体を、前記遺伝子によってトランスフェクションされた細胞中で発現させ、目的の腫瘍に対する免疫応答を発生させることができる。
【００１２】
ヒト新生生物（腫瘍）のパラレルな例において、自己由来混合リンパ球−腫瘍細胞培養（以下"MLTC"）が、しばしば、自己由来腫瘍細胞を溶解し、かつ、ナチュラルキラー標的、自己由来EBV−形質転換Ｂ細胞や自己由来線維芽細胞は溶解しない応答（responder）リンパ球を生産することが観察されている（アニキーニ（Anichini）他,Immunol.Today  8:385〜389（1987）参照）。この応答は、メラノーマに関して特によく研究されており、MLTCは、抹消血細胞又は腫瘍浸潤リンパ球のいずれかによって行われてきた。この分野に関する文献としては、クナス（Knuth）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2804〜2802（1984）；ムカールジ（Mukherji）他,J.Exp.Med.158:240（1983）；ヘリン（Herin）他,Int.J.Canc.39:390〜396（1987）；トパリアン（Topalian）他,J.Clin.Oncol  6:839〜853（1988）等がある。安定な細胞障害Ｔ細胞クローン（以後、CTL）がMLTC応答細胞から誘導され、これらのクローンは、腫瘍細胞に対する特異性を有する。前記ムカールジ（Mukherji）他、前記ヘリン（Herin），前記クナス（Knuth）他，参照。腫瘍細胞上においてこれらの自己由来CTLによって認識される抗原は、アーチファクトを表すものではないと考えられる。というのは、これらは新生の腫瘍細胞に観察されるからである。前記トパリアン（Topalian）他，デジョヴアンニ（Degiovanni）他,Eur.J.Immunol.20:1865〜1868（1990）。これらの観察と、本出願において特定のハツカネズミ腫瘍拒絶抗原前駆体の遺伝子の分離に使用された技術との組合せによって、ヒトの腫瘍において提示されたTRAの腫瘍拒絶抗原前駆体をコード化する核酸配列が単離された。従って、いま、以下に記載のその派生効果ともに、特定の腫瘍に最も特徴的なものを非限定的に含む、腫瘍拒絶抗原前駆体をコード化する前記核酸配列の単離が可能となった。
【００１３】
更に、ヒト白血球抗原即ち”HLA”として知られている分子のクラスによるTRAの提示に関して集中的に研究が行われた。この研究によって、該分野に関していくつかの意外な発見が成された。特に、ここにその開示を参考文献として添付の米国特許出願第938,334号において、前記HLA−A1分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のHLA分子にたいして特定のペプチドが特異性を有することが既知であれば、ある特定のペプチドが一つのHLA分子に結合し、他とは結合しないということが予測される、ということを教示している。これは重要である。というのは、ヒトそれぞれによって保有するHLA表現型は異なるからである。その結果、ある特定のペプチドがある特定のHLA分子に対するパートナーであることが同定されることによってそれから診断的及び治療的な派生効果が得られるとしても、これらはその特定のHLA表現型を有する個人だけにしか関係しない。細胞異常は一つの特定HLA表現型に限られないのでこの分野において更に研究する必要があり、標的治療には、対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。
【００１４】
ここに参考文献として添付する1993年１月22日出願の米国特許出願第008,446号には、前記MAGE−１発現産生物が第2TRAにプロセシングされるという事実が開示されている。この第2TRAは、HLA−C10−分子によって提示されるものである。この開示には、あるTRAPが複数のTRAを産生することができることが示されている。
【００１５】
ここに参考文献として添付する1992年12月22日出願の米国特許出願第994,928号には、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原前駆体として記載されている。この参考文献は、いくつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって生産される分子が腫瘍細胞中でプロセシングされてHLA−A2分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を産生する、と記載されている。
【００１６】
前述したように、ヒトそれぞれによってHLAのタイプは異なる。又、特定のMAGE遺伝子の発現が、必ずしも、特定の障害、あるいは特定のHLAタイプの個体に関連するものではないことも判っている。従って、例えば、すべてのメラノーマ患者がMAGE−１  TRAPを発現すると言うことは出来ないし、又、MAGE−１発現がHLA−A1タイプのメラノーマ患者に限られている、と断言することもできない。更に、一つのタイプのTRAPのみが、ある特定のHLAタイプの個体において発現するということも出来ない。どれがこれらのどの因子に相関しているかに関する規則やガイドラインを指摘することはできない。
【００１７】
従って、第2TRAPが、HLA−A1分子によって提示されるTRAPにプロセシングされるとは期待されない。いま、MAGE−１の他に、MAGE−3TRAPから誘導される（プロセシングされて得られる）TRAがHLA−A1分子によって提示されることが判った。これは、この発見の派生効果の記載とともに、後述の例37〜40に示されている。
【００１８】
本発明のこれら、及びその他の態様を、以下の記載において詳述する。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１は、抗原P815Aを発現するトランスフェクション体（transfectant）の検出を示す。
図２は、クロム放出アッセイによって測定された、種々のCTLによる溶解に対するクローンP1.HTR,PO.HTR,ゲノムトランスフェクタントP1A.T2及びコスミドトランスフェクタントP1A.TC3.1の感度を示す。
図３は、コスミドC1A.3.1の制限地図である。
図４は、遺伝子P1Aの発現のノーザン・ブロッティング分析を示す。
図５は、遺伝子P1Aの構造をその制限サイトとともに示す。
図６は、P815又は正常細胞のいずれかから単離された細胞をP1Aからの遺伝子でトランスフェクションし、その後、CTL溶解によってテストした結果を示す。
図７は、肥満細胞系L138を使用した溶解研究を示す。
図８は、抗原も発現する2.4kbの抗原Ｅフラグメント配列のサブフラグメントの地図である。
図９は、遺伝子mage  1,2及び３からのエクソン３部分のホモロジーを示す。
図10は、種々の組織上のMAGE遺伝子のノーザン・ブロッティングの結果を示す。
図11は、図13のデータを表にして表す。
図12は、本出願において使用された種々のヒトメラノーマ細胞系を使用したサザン・ブロッティング実験を示す。
図13は、腫瘍及び正常組織によるMAGE  1,2及び３の発現の一般化した略図。
図14は、種々の細胞系上でCTLクローン20/38を使用したクロム放出アッセイの結果を示す。
図15は、CTLクローン20/38の抗原特異性を調べるために行ったアッセイの結果を示す。
図16は、様々なトランスフェクションされた細胞にTNF放出アッセイを行った時に得られた結果を示す。
【００２０】
配列の簡単な説明
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:1は、遺伝子P1Aの一部のcDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:2は、遺伝子P1AのcDNAのコード化領域を表す。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:3は、配列認識番号（SEQ  ID  NO）:3の前記コード化領域であるP1A  cDNAの非コード化DNAを示す。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:4は、P1AのcDNAの全配列である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:5は、P1AのゲノムDNA配列である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:6は、P1A  TRAの抗原性ペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列は、A+とB+、即ち、Ａ抗原とＢ抗原の両方を発現する細胞に対するものである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:7は、抗原Ｅをコード化する核酸配列である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:8は、MAGE−１をコード化する核酸配列である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:9は、MAGE−２の遺伝子である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:10は、MAGE−21の遺伝子である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:11は、MAGE−３のcDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:12は、MAGE−31の遺伝子である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:13は、MAGE−４の遺伝子である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:14は、MAGE−41の遺伝子である。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:15は、MAGE−４のcDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:16は、MAGE−５のcDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:17は、MAGE−51のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:18は、MAGE−６のcDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:19は、MAGE−７のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:20は、MAGE−８のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:21は、MAGE−９のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:22は、MAGE−10のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:23は、MAGE−11のゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:24は、smage−ＩのゲノムDNAである。
配列認識番号（SEQ  ID  NO）:25は、smage−IIのゲノムDNAである。
【００２１】
好適実施例の詳細説明
本出願の最後に添付した配列から理解されるように、多種の"MAGE"遺伝子が同定された。これらの遺伝子及びcDNA配列の分離には以下の例に記載のプロトコルを使用した。
【００２２】
ここで"MAGE"とは、ヒト細胞から単離された核酸配列をいう。頭文字"smage"は、マウス由来の配列を記載するのに使用される。
"TRAP"又は”TRA”がある腫瘍タイプに特異性を有するものと記載される時、これは、そこで考慮されている分子が、そのタイプの腫瘍に関連していることを意味するが、必ずしも他のタイプの腫瘍を除外するものではない。
【００２３】
例１
抗原P815Aをコード化する前記遺伝子を同定し分離するために、遺伝子トランスフェクションを使用した。この方法は、該遺伝子のソースと、受容細胞系との両方を必要とする。トランスフェクション可能性の高い細胞系P1.HTRが受容体の開始物質であったが、これは４つの認識されるP815腫瘍抗原の一つである「抗原Ａ」を提示することから、使用するには更に処理が必要であった。ファン・ペル（Van  Pel）他,Molecular  Genetics  11:467〜475（1985）参照。従って、前記抗原を発現せず、しかも、所望量のP1.HTRを有する細胞系を分離するためにスクリーニング実験を行った。
【００２４】
これを行うために、P1.HTRを、腫瘍抗原A,B,C及びＤのそれぞれに対する特異性を有するCTLによってスクリーニングした。このようなCTLは、ウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他,J.Exp.Med.157:1040〜1052（1983）に記載されている。
【００２５】
前記選択を行うために、P1.HTRの106個の細胞を、前記CTLクローンの２〜４×106個の細胞と、2mlの培地中で丸底試験管内で混合し、150xgで３分間遠心分離した。37℃で４時間後、マリャンスキー（Maryanski）他,Eur.J.Immunol.12:406〜412（1982）に従い、前記細胞を洗浄し、10mlの培地中で再懸濁させた。CTLアッセイとスクリーニングプロトコル一般に関する更なる情報は、ここにその開示内容を参考文献として添付する、ブーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184〜1193（1980）、及びマリャンスキー（Maryansk1）他,Eur.J.Immunol.12:406〜412（1982）に見られる。
【００２６】
これらの選択を行った時、抗原Ａと抗原Ｂのいずれも発現しない細胞系変異体が発見された。さらに、抗原Ｃに対して特異的なCTLにより選択を行うと、抗原Ｃの欠如した変異体が得られた。これらのスクリーニングの結果の要約については図２を参照されたい。前記変異体PO.HTRは抗原A,B及びＣに対して陰性であり、従って、前記トランスフェクション実験用に選ばれた。
【００２７】
前記細胞系PO.HTRは、ブタペスト条約に従ってフランス国  75724  パリ  リュ・ド・ドクトエール・ル  28  のインスティテュート・パスツール・コレクション・ナショナル・デ・キュルテュール（Institute  Pasteur  Collection  Nationale  De  Cultures）に寄託され、受託番号Ｉ−1117を有している。
【００２８】
この方法は、前記四種類の認識されるP815腫瘍抗原、即ち、抗原A,B,C及びＤの内の少なくとも一つを正常に提示する細胞タイプの変異体である他の細胞系を得るのに利用できる。但し、前記変異体は前記抗原A,B及びＣのいずれも提示しない。P1.HTRは、肥満細胞系であって、したがって、前記プロトコルがP815抗原A,B,C及びＤのいずれをも発現しないが、きわめてトランスフェクション可能性の高い生物学的に純粋な肥満細胞系の分離を可能にすることが理解されるであろう。他の腫瘍タイプも、この方法でスクリーニングして、所望の生物学的に純粋な細胞系を得るのに使用可能である。その結果得られる細胞系は、P1.HTRと同じ程度に、異種DNAに対するトランスフェクション性があり、特定の抗原を発現しないために選択されるであろう。
【００２９】
例２
ここに参考文献としてその開示内容を添付するデプレーン（DePlaen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:2274〜2278（1988）の過去の研究によって、tum-抗原をコード化する遺伝子の回収にコスミドライブラリのトランスフェクションの使用が有効であることが示された。
【００３０】
Woelfel（ヴォルフェル）他,Immunogenetics  26:178〜187（1987）に従い、P1.HTRの選択的プラスミド及びゲノムDNAを調製した。トランスフェクションは、コルサロ（Corsaro）他,Somatic  Cell  Molec.Genet  7:603〜616（1981）に従い、これをいくらか変更して行った。簡単に述べると、バーナード（Bernard）他,Exp.Cell.Biol.158:237〜243（1985）に記載されているように、60μｇの細胞DNAと３μｇのプラスミドpHMR272のDNAとを混合した。このプラスミドは、受容細胞に、ヒグロマイシン（hygromycin）耐性を与え、従って、トランスフェクション体をスクリーニングするための便利な方法を提供するものである。前記混合DNAを、940μｌの1mM  Tris−HCl（pH7.5）、0.1mM  EDTA及び310μｌの1M  CaCl2と混合した。前記溶液を、常時撹はんしながら、NaOHによってpH7.1に調整した1.25mlの50mM  Hepes、280mMのNaCl、1.5mMのNa2HPO4にゆっくりと添加した。リン酸カルシウム−DNA沈澱を室温で30〜45分間で形成させた。この後、それぞれがPO.HTR細胞（５×106）から成る15のグループを400gで10分間遠心分離にかけた。上清を除去し、ペレットを、前記DNA沈澱を含む培地中に直接的に再懸濁した。この混合物を37℃で20分間培養し、その後、これを10％の胎児ウシ血清を補った22.5ml  DMEMを含む80cm3の組織培養フラスコに添加した。24時間後、培地を取り替えた。トランスフェクションの48時間後、細胞を収集して計数した。トランスフェクションされた細胞は、ヒグロマイシンＢ（350ug/ml）を添加した培地を使用して大量培養して選択した。この処理によってヒグロマイシン耐性の細胞が選択された。
【００３１】
各グループに対して、それぞれが40mlの培地中に８×106の細胞を有する二つのフラスコを準備した。トランスフェクタントの数を推定するために、各グループからの１×106の細胞を、10％の胎児ウシ血清（FCS）、0.4％のバクトアガー（bactoagar）、及び300μg/mlのヒグロマイシンＢを有する5mlのDMEM中で培養した。次に12日間後にコロニーを計数した。二つの別々の測定を行い、その平均をとった。この平均値を５倍し、対応グループ中のトランスフェクタントの数を推定した。これまで約0.3であるとされてきたP815のクローニング効率を修正する必要があった。
【００３２】
例３
前記例２に記載したトランスフェクションの８日間後、Ficoll−Paqueによる密度遠心分離を使用して、死滅細胞から抗生物質耐性トランスフェクタントを分離した。これらの細胞を非選択的培地中にて１ないし２日間保持した。これらの細胞を、200μｌの培地中で30細胞／マイクロウェルの割合にて96のウェルマイクロプレート（丸底）中に塗布した。調製したトランスフェクタントの数に依り、100〜400の範囲のマイクロウェルを準備した。寒天コロニーテストによって500〜3000の数が推定された。５日間後、前記ウェルは約６×104の細胞を含んでおり、前記ウェルの1/10をマイクロプレートに移し、次に30℃で培養することによって、複製プレートを調製した。１日後、マスタプレートを遠心分離にかけ、培地を除去し、各ウェルに、Ｐ−815抗原Ａ（CTL−P1:5）に対する750CTLを、40U/ml組換えヒトIL−２を含むCTL培地中の106個の照射済み同系フィーダー脾臓細胞と、刺激細胞を殺すためのHAT培地とともに添加した。６日間後、プレートを視覚によって調べて、CTLが増殖したウェルを同定した。プレートが増殖するマイクロカルチャーを示した所で、100μｌの前記ウェルのアリコットを51Cr標識化P1.HTR標的細胞（１ウェル当り  ２×103〜4x103）を含む別のプレートに移し、４時間後にクロム放出を測定した。高CTL活性を示したマイクロカルチャーに対応する複製マイクロカルチャーを拡張し、10％のFCSを含むDMEM中での限界希釈によってクローニングした。５日間後、約200のクローンを収集し、前述したようにして、視覚的溶解アッセイで前記CRL.P1:5細胞系によってスクリーニングした。これらの結果については図1A参照。
【００３３】
これらの実験において、15のグループのトランスフェクション体の内、３つが少数の陽性マイクロカルチャーを産生した。前述した方法により、これらのマイクロカルチャーのP1.HTRに対する細胞溶解活性をテストした。増殖が観察されたマイクロカルチャーの大半が細胞溶解活性を示した。この活性は、図1Bに示されるように、背景を十分に越えるものであった。この図は、二つの細胞グループ（グループ"5"及び"14"）、400及び300マイクロウェルが、30のヒグロマイシン耐性トランスフェクション細胞によって接種されたデータの要旨を示している。その後、抗−Ａ  CTL  P1:5の添加によってこれらのマイクロカルチャーの増幅と複製化とを行った。６日間後、P.HTRに対する細胞溶解活性をテストした。図において、各点は、一つのマイクロカルチャーの細胞溶解活性を表している。
【００３４】
複数の陽性ウェルに対応する複製マイクロカルチャーをサブクローニングしたところ、これらのサブクローンの１％以上が、抗−Ａ  CTLによって溶解されていることが判った。従って、33,000のヒグロマイシン耐性トランスフェクション体から、三つの独立したP815a発現トランスフェクション体が得られた。以後P1A.T2と称するこれらの系の一つを更にテストした。
【００３５】
P1A.T2の関連抗原プロフィールが図２に示されている。これは、前述したタイプの抗−CTLアッセイによって得られたものである。
【００３６】
例４
P1A.T2について行ったCTLアッセイは、それが抗原Ａ（"815A"）を提示するものであること、従って、P1.HTRからこの遺伝子を受けたことを示した。この目的のために、この細胞系を、以下の実験において、前記抗原前駆体の遺伝子ソースとして使用した。
【００３７】
これまでの研究によって、tum-抗原をコード化する遺伝子は、コスミドライブラリによって得られたトランスフェクション体から直接的に回収出来ることが判っている。デプレーン（DePlaen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:2274〜2278（1988）参照。この手法に従って、P815遺伝子の回収を行った。
【００３８】
グロスヴェルド（Grosveld）他,Gene10:6715〜6732（1982）に従い、P1A.T2の全ゲノムDNAを部分的に制限エンドヌクレアーゼSau  3A1で消化し、塩化ナトリウム密度勾配超遠心にかけて、35〜50kbのDNA断片について濃縮した。ここにその開示内容を参考文献として添付するベイツ（Bates）他,Gene26:137〜146（1983）に記載されているように、これらの断片を、C2RBのコスミドアームにライゲートした。これらのコスミドアームは、Sma Iによる切断、子ウシ腸ホスファターゼによる処理、その後のBamH Iでの消化によって得たものであった。結合DNAをラムダファージ成分にパッケージ化し、前記グロスヴェルド（Grosveld）他，に従って、E.coli  ED  8767上で滴定した。１マイクログラムのDNA挿入体当り、約９×105のアンピシリン耐性コロニーが得られた。
【００３９】
30,000の独立したコスミドを10mMのMgCl2中で、2mlのED8767と混合し、37℃で20分間培養し、20mlのLuria  Bertani（"LB"）培地で希釈し、その後、１時間培養することによって、前記コスミドグループを増幅した。この懸濁液は滴定され、アンピシリン（50μg/ml）の存在下で１リットルのLB培地の接種に使用された。２×108細胞/mlのバクテリア濃度（OD600＝0.8）にて、10mlのアリコットを凍結し、培養に200μg/mlのクロラムフェニコールを添加して一晩培養した。全コスミドDNAをアルカリ溶解法によって分離し、CsCl勾配で精製した。
【００４０】
これらの実験において、650,000コスミドのライブラリが調製された。前記増幅プロトコルにおいて、約30,000のコスミドの21のグループが使用された。
【００４１】
例５
前述の21のグループのコスミド（60μｇ）と前述の４μｇのpHMR272とを使用して、５×106PO.HTR細胞をトランスフェクション体宿主として使用した。トランスフェクションは、前の例において記載したのと同様の方法で行った。前述のCTLアッセイを再び使用して、各グループ当り平均3000のトランスフェクション体の抗原提示をテストした。一つのコスミドグループは、薬剤耐性トランスフェクション体の約1/5,000の頻度で繰り返し陽性トランスフェクション体を産出した。P1A.T2についてと同様、これらのトランスフェクション体も、抗原ＡとＢとの両方の発現を示した。トランスフェクション体P1A.TC3.1の発現のパターンを図２に示す。
【００４２】
例６
前述の例５に示したようにして、P815A抗原を提示する三つの独立したコスミドトランスフェクション細胞を分離した。デプレーン（DePlaen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2274〜2278（1988）に従って、これらのトランスフェクション体のDNAを分離し、ラムダファージ抽出物と直接にパッケージ化した。その結果得られた生成物を、例５と同様にして、アンピシリン選択によりE.coli  ED8767上で滴定した。同様に、例５に従い、再びPO.HTRを使用してコスミドの増幅とトランスフェクションとを行った。
【００４３】
下記の表１に示すように、高頻度でトランスフェクションが観察された。
【００４４】
【表１】
0003594307.tif 000002
【００４５】
前記コスミドを制限酵素で分析したところ、直接パッケージ化トランスフェクション体P1A.TC3.1が32のコスミドを有し、これらの内の７つが異なっていることが判った。これらの７つのコスミドのそれぞれを、前述した方法で、ここでも再び上述のプロトコルに従って、PO.HTRにトランスフェクションし、これらのトランスフェクション体のP815A提示を調べた。これらのコスミドトランスフェクション体の内の４つが、P815A提示を示し、更に、前述したすべての実験と同様に、P815Bも発現された。
【００４６】
前記二つの抗原の提示を示す前述の４つのコスミドの内、コスミドC1A.3.1は、僅かに16.7キロ塩基長であり、これを選択して下記のように更に分析した。
前記コスミドC1A.3.1を制限エンドヌクレアーゼ分析し、図３に示す地図を得た。
【００４７】
上述のプロトコルを再び使用して、すべてのEcoR I断片をトランスフェクションしたところ、7.4キロ塩基長の断片のみが抗Ａ  CTLが溶解できるトランスフェクション体を産生した。Pst I断片にも類似の実験を行ったが、7.4kb  EcoR I断片中に完全に含まれている4.1kb断片のみが、溶解可能なトランスフェクション体を産生した。
【００４８】
この断片（即ち、前記4.1kb  Pst I断片）を、Sma Iで消化し、トランスフェクションすると、抗原Ａ及びＢを提示する宿主細胞を産生する2.3kbの断片を得た。最後に、Sma I/Xba Iで得た900塩基長の断片も、これら二つの抗原の前駆体の発現を転移した。即ち、このトランスフェクションされた宿主細胞は、抗原ＡとＢの両方を提示した。
【００４９】
例７
上述の900塩基長の断片を、親細胞系中でのP815A遺伝子の発現を検出するプローブとして使用した。これを達成するために、デーヴィス（Davis）他，Basic  Methods  In  Molecular  Biology（Eleseview  Science  Publishing  Co.New  York）（1986）のグアニジン−イソチオシアネート法を使用して、先ず、トータル細胞RNAを分離した。オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィーを使用してポリA+mRNAを分離精製する方法もこの同じ参考文献に依った。
【００５０】
次に、サンプルをノーザン・ブロッティング分析した。RNAサンプルを、0.66Mのホルムアルデヒドを有する１％のアガロースゲル上でフラクション化した。これらのゲルを、ニトロセルロース膜上での一晩のブロッティングの前に、10xSSC（SSC:0.15M  NaCl:0.015M  クエン酸塩ナトリウム、pH7.0）で30分間処理した。これらを、80℃で２時間ベーキングし、その後、前記膜を、10％の硫酸デキストラン、１％のSDS及び1MのNaClを含む溶液中において60℃で15分間、プレハイブリダイゼーションした。次に、100μg/mlの鮭精子DNAと共に、変性プローブ（前記900塩基長断片）を使用してハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】
P1.HTRpoly−A+RNAを使用して、このプロトコルを実行した場合は、図４、レーン１（RNAの６μｇ）に示すように、１つの1.2kbのバンドと２つのややぼんやりしたバンドが同定された。
【００５２】
同じプローブを使用して、前記細胞系由来のpoly−A+RNAから調製されたcDNAライブラリのスクリーニングを行った。これによって、1kbの挿入部を有し、5'末端が欠失していることを示唆するクローンが得られた。このcDNAのノーザン・ブロットは図示されていない。
【００５３】
それぞれのケースに於いてハイブリダイゼーション実験を、60℃で一晩行った。これらのブロットを、室温にて2xSSによって二度洗浄し、更に、60℃にて１％のSDSを添加した2xSSCによって二度洗浄した。
【００５４】
以上の実験により、周知のサンガー（Sanger）ジデオキシチェーンターミネーション法を使用した配列決定を可能にするのに十分に、P815A抗原前駆体を発現するDNAが図形化された。これは、様々な制限エンドヌクレアーゼを使用し、合成オリゴヌクレオチドプライマによる特異的開始によって発生したクローン上で行われた。該遺伝子のエクソンに関する結果は、認識配列番号（SEQUENCE  ID  NO）:4に示されている。
【００５５】
例８
上述のノーザン分析によって、前記cDNAの5'末端が欠失していることが示唆された。この配列を得るために、位置320〜303に対応するプライマを使用してP1.HTR  RNAからcDNAを調製した。次に、位置286〜266に対応する3'プライマと、フローマン（Frohman）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:8998〜9002（1988）に記載の5'プライマとを使用したポリメラーゼ連鎖反応により、該配列を増幅した。予想された大きさ（270塩基）のバンドが見つかり、これをサザン・ブロットにおいて、前述の900bp  Sma I/Xba I断片にハイブリダイゼーションした。m13tg  130λ  tg131へのクローニング後、小さな270bpの断片が配列決定された。この配列は配列認識番号（SEQUENCE  ID  NO）:1に図示されている。
【００５６】
例９
例７及び８に記載され配列認識番号（SEQ.ID  NO）:4に図示された前記配列を得た後、コスミドCIA.3.1の5.7kb領域を配列決定した。この断片は、トランスフェクション体中にP815Aを発現する前記900塩基長の断片を含んでいることが知られていた。前記コスミドはゲノム由来であるため、この実験によりイントロンとエクソンとの図形化が可能になった。
【００５７】
前記遺伝子の図形化された構造が図５に示されている。配列認識番号（SEQ  ID  NO）:4と共に、これらのデータは、前記抗原前駆体に対する遺伝子、以後"PIA"という、は約５キロ塩基長であり、３つのエクソンを有していることを示している。224のアミノ酸のタンパク質に対するORFは、エクソン１にて開始し、エクソン２で終止している。抗原Ａ及びＢの前駆体の発現を転写する前記900塩基対断片は、エクソン１のみを有している。前記プロモータ領域は、配列認識番号（SEQ.ID  NO）:1に示されているように、CAATボックスと、エンハンサ配列とを有している。この後者の特徴は、ゲラハティ（Geraghty）他,J.Exp.Med  171:1〜18（1990）；キムラ（Kimura）他,Cell  44:261〜272（1986）によって観察されたように、大半のMHCクラスＩ遺伝子のプロモータに観察されている。
【００５８】
リップマン（Lipman）他Science  227:1435〜1441（1985）に示唆されているように３と６のＫ−トリプルパラメータを有するプログラムFASTAを使用し、又、Genbankデータベースリリース65（1990年10月）を使用して、コンピュータホモロジー検索を行った。ブルボン（Bourbon）他,Mol.Biol.200:627〜638（1988）や、シュミットーザッハマン（Schmidt−Zachmann）他,Chromosoma  96:417〜426（1988）に記載されているように、マウスの核小体タンパク質NO38/B23において酸性領域をコード化する配列に類似した、エクソン１によってコード化される酸性領域（位置524〜618）の一部に対応する95の塩基以外、ホモロジーは見られなかった。95の塩基の内、56が同じであった。これらのホモロジーがクロスハイブリダイジングの理由であるか否かを調べるために、前記900塩基断片でスクリーニングしたマウスの脾臓cDNAライブラリを使用して実験を行った。前記クロスハイブリダイジングバンドの大きさに近似のcDNAクローンが得られた。これらを部分的に配列決定したところ、2.6kbのcDNAがマウス核小体体について報告されているcDNA配列に正確に一致し、他方、1.5kbのcDNAがマウス核小体タンパク質NO38/B23に一致することが判った。
【００５９】
以後"PIA"という、前記遺伝子のヌクレオチド配列の分析結果は、そのコード化された生成物が25kdの分子量を有していることを示唆している。配列認識番号（SEQ  ID  NO）:4の分析結果は、潜在的核標的化シグナルが残基５〜９（ディングウォール（Dingwall）他,Ann  Rev.Cell  Biol.2:367〜390（1986））にあり、大きな酸性ドメインが位置83〜118にあることを示している。上述のように、これはP1Aと２つの核タンパク質の間のホモロジーの領域を含んでいる。推定リン酸化サイトは位置125（セリン）に見いだすことが出来る。更に、前記Ｃ−末端の近くに、第２の酸のドメインが、14のグルタミン酸残基の連続したストレッチとして見られる。類似のＣ末端構造が、ケッセル（Kessel）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  84:5306〜5310（1987）によって、核局在化を有するハツカネズミのホメオドメインタンパク質に見出されている。
【００６０】
遺伝子P1Aの配列の、P91A,35B及びP198の配列との比較研究において、類似性は発見されず、これは、P1Aが別の系の遺伝子と抗原とを示すものであることを示している。
【００６１】
例10
前記P1Aプローブと配列とが入手されたところで、正常な細胞に存在する前記遺伝子が腫瘍によって発現される遺伝子と同じものであるかどうかを調べた。そのために、ラムダzap II  10とDBA2ハツカネズミ腎細胞のゲノムDNAとを使用してファージライブラリを調製した。P1Aをプローブとして使用した。ハイブリダイゼーション条件は、前述したものであり、ハイブリダイゼーションクローンが見つかった。このクローンは、前記P1A遺伝子のエクソン１及び２を有しており、図５の位置0.7〜3.8に対応していた。この配列の局在化の後、PCR増幅を行い図５の3.8〜4.5に対応する配列を得た。
【００６２】
配列分析を行ったが、正常な腎臓から得た前記遺伝子と、P815腫瘍細胞から得たP1A遺伝子との間に相違は見られなかった。
【００６３】
更に行った実験において、前述したような方法で、DBA/2腎細胞に見つかった遺伝子を、PO.HTRにトランスフェクションした。図７に示すこれらの実験は、抗原Ａ及びＢが、正常な腎細胞から単離されたP1A遺伝子によって同じくらい効率的に、正常な腎細胞から単離された腎臓遺伝子によっても発現されることを示した。
【００６４】
これらの実験によって、腫瘍拒絶抗原前駆体をコード化する遺伝子は、突然変異から発生する遺伝子ではなく、むしろ、この遺伝子は、正常な細胞中に存在するがその内部で発現されないものである、という結論が導かれる。以下に記載するように、この発見の派生効果は重要である。
【００６５】
ここに詳述しなかった研究に於いて、前記遺伝子の変異体を入手できることが判った。いくらかの細胞は、正常な"P1A"ではなく、"P1A-B+"であった。これらの間の唯一の相違は、18番目のトリプレットが変異体においてはValではなくAlaをコード化するというエクソン１の点突然変異である。
【００６６】
例11
他の細胞タイプについて更に実験を行った。前述のノーザン・ブロットハイブリダイゼーションについて記載されたプロトコルに従い、正常肝臓及び脾臓細胞のRNAを、前記P1A遺伝子の転写体が見つかるか否かを調べるためにテストした。このノーザン・ブロットデータは図４に示され、ここに見られるように、発現の証拠は無い。
【００６７】
P1Aが単離された前記ハツカネズミP815細胞系は、肥満細胞腫である。従って、肥満細胞系を研究してこれらの細胞が前記遺伝子を発現するか否かを調べた。ネイベル（Nabel）他,Cell  23:19〜28（1981）に記載の肥満細胞系MC/9,と骨髄由来肥満細胞の短期培養とを、前述した方法（ノーザン・ブロッティング）でテストしたが、転写は見つからなかった。これに対して、Balb/C由来IL−３依存細胞系L138.8A（ヒュールトナー（Hueltner）他,J.Immunol.142:3440〜3446（1989））をテストした時には、強いシグナルが見られた。この肥満細胞の作用は図４に示されている。
【００６８】
BALB/CとDBA/2マウスの両方が共通してＨ−2d単模式種（ハイプロタイプ）を有していることが知られているので、前述のCTLを使用して溶解に対する感度をテストすることが出来た。図８は、これらの結果を示し、抗Ａおよび抗Ｂ  CTLが前記細胞を強力に溶解し、これに対して抗Ｃと抗Ｄ種は溶解しなかったことを実質的に証明している。
【００６９】
他のマウス腫瘍細胞系、即ち、奇形癌細胞系PCC4（ブーン（Boon）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  74:272〜275（1977）、と白血病LEC及びWEH1−3B、について更にテストを行った。これらのサンプルのいずれにおいても、発現は検出できなかった。
【００７０】
例12
MHC分子によるP1A抗原の実際の提示は注目される。これをテストするために、コスミドC1A.3.1を、表現型Ｈ−2kを示す線維芽細胞系DAPにトランスフェクションした。これらの細胞系を、Kd,Dd,及びLd抗原のいずれか一つを発現する遺伝子でトランスフェクションした。前記コスミドとMHC遺伝子との両方でのトランスフェクションの後、再び前述した方法で、CTLによる溶解を調べた。表２に要約されたこれらの研究は、P1A抗原Ａ及びＢの提示にはLdが必要であることを示している。
【００７１】
【表２】
0003594307.tif 000003
【００７２】
腫瘍拒絶抗原の提示が、特定のMHC分子と関係があるのではないかという観察は、以下に詳述するヒト細胞とHLA分子とを使用した実験で確認された。
【００７３】
例13
前記P1A遺伝子の配列と、それから誘導可能なアミノ酸配列とを使用して、A+B+である（即ち、抗原Ａ及びＢの両方を発現する細胞の特徴）抗原的ペプチドと、A-B+であるペプチドとが同定された。このペプチドは図10に示されている。このペプチドを、これを提示する細胞に対する特異性を有するCTL細胞系の存在下においてPO.HTR細胞のサンプルに投与した時、このPO.HTR細胞が溶解され、これは、前記遺伝子によって発現される生成物に基づくペプチドをワクチンとして使用可能であるという考えを支持するものである。
【００７４】
例14
以下にMZ2−MELと称するヒトメラノーマ細胞系は、クローン細胞系ではない。これは、抗原"D,E,F及びA"として知られている、自己由来CTLによって認識される４つの安定した抗原を発現する。更に、二つの他の抗原"B"及び"C"が、前記腫瘍のいくつかのサブ系（サブライン）によって発現される。これらの６つの抗原に対して特異的なCTLクローンが、ファン・デン・エインデ（Van  den  Eynde）他,Int.J.Canc.44:634〜640（1989）によって記載されている。MZ2−MELの認識されるサブクローンとして、MEL3.0とMEL3.1とがある（前記ファン・デン・エインデ（Van  den  Eynde）他）。細胞系MEL3.1は、前述したP815変異体について記載したCTL研究によって測定された時、抗原Ｅを発現する。従って、これを、前記抗原前駆体を発現する核酸配列のソースとして選択した。
【００７５】
腫瘍拒絶抗原前駆体に対する関連核酸配列の分離において、前記のこれまでに開発された技術は、受容細胞が次の二つの要件を満たさなければならないことを示す。即ち、（ｉ）その受容細胞は、正常な条件下においては問題のTRAPを発現してはならない、そして、（ii）それは関連クラスＩ  HLA分子を発現しなければならない。更に、受容細胞は、高いトランスフェクション頻度を有さなければならない。即ち、それは「好適な」受容体でなければならない。
【００７６】
そのような細胞系を得るために、前記クローンサブラインME3.1に対して、前述のファン・デン・エインデ（Van  den  Eynde）に従って、抗Ｅ  CTL82/30による選択を繰り返し行った。選択を反復することにより、サブクローンMZ2−MEL−2.2iscE-が単離された。このサブクローンはHPRT-でもあった（即ち、HAT培地:10-4M  ヒポキサンチン、3.8x10-7アミノプテリン,M2−デオキシチミジン、に対して反応する）。前記サブクローンを、以下、"MEL−2.2"と略称する。
【００７７】
例15
ここに参考文献としてその開示内容を添付するヴォルフェル（Woerfel）他,Immonogenetics  26:178〜187（1987）に従って、MEL3.0ゲノムDNAを調製した。ニコラス（Nicolas）他,Cold  Spring  Harb.,Conf.Cell  Prolif.10:469〜485（1983）に記載されているように、前記プラスミドpSVtkneoβ、ジェネチシン（geneticin）耐性を付与するので、これは、この実験で行われたように、コトランスフェクションのマーカとして使用することができる。
【００７８】
コルサオ（Corsao）他,Somatic  Cell  Molec.Genet  7:603〜616（1981）の手順に類似してはいるが同じではない手順によって、全ゲノムDNAと前記プラスミドとをコトランスフェクションした。前記ゲノムDNA（60μｇ）とプラスミドDNA（６μｇ）とを940μｌの1mM  Tris.HCl（pH7.5）;0.1mM  EDTA中で混合し、その後、310μｌの1M  CaCl2を添加した。この溶液を、定常撹はんしながら、1.25mlの2xHBS（50mM  HEPES）280mM  NaCl、1.5mM  Na2HPO4、NaOHによってpH7.1に調節）にゆっくりと添加した。室温で30〜45分間でリン酸カルシウムDNA沈澱物を形成させ、その後、これらを、10％の胎児ウシ血清を添加した22.5mlのメラノーマ培地（Dulbecco's  Modified  Eagle's  Medium）中にあらかじめ24時間３×106MEL2.2細胞を接種しておいた80cm2の組織培養フラスコに添加した。24時間後、前記培地を置換した。トランスフェクションの48時間後、細胞を採取して2mg/mlのジェネチシンを添加したメラノーマ培地中に４×106細胞/80cmフラスコの割合で接種した。前記ジェネチシンは選択マーカとして作用する。
【００７９】
例16
トランスフェクションの13日間後、ジェネチシン耐性コロニーを計数し、２ないし３日間非選択性培地中にて培養した。次に、トランスフェクションされた細胞を、１ウェル当り約30の成長コロニーを得るために、20％の胎児ウシ血清（FCS）を有する200μｌの培養培地中において、200細胞／ウェルの割合で96−ウェルマイクロプレートに塗布した。それぞれ独立したトランスフェクション体が少なくとも４回現れるように、マイクロカルチャーの数を過剰にした。
【００８０】
10日間後、ウェルは約６×104の細胞を有していた。これらの細胞を分離し、各マイクロカルチャーの1/3を複製プレートに移した。６時間後、即ち、再付着後、培地を除去し、35U/mlのIL−２を有する100μｌのCTL培地中で各ウェルに1500の抗−Ｅ  CTL（CTL82/30）を添加した。１日後、下記の例において説明する理由により、上清（50μｌ）を採取し、TNF濃度を調べた。
【００８１】
例17
ほ乳類のゲノムの大きさは６×106kbである。各薬剤耐性トランスフェクション体に組み込まれたDNAの平均量は約200kbであると予想されたので、抗原Ｅがトランスフェクションされたかどうかを確かめるためには最低30,000のトランスフェクション体が試驗される必要があるだろう。ハツカネズミ細胞についての以前の研究によって、CTL刺激アッセイが使用された時は、問題の抗原を発現する細胞をわずか３％を含むグループが同定することが出来たことが示された。これはアッセイの数をファクタで30減らすはずである。前述したように、混合E+/E-細胞中の抗−Ｅ  CTLアッセイは有用ではあるが、これは一貫した結果が得られないという点において十分なものではない。
【００８２】
従って、別のテストが考案された。CTLの刺激を、ここで繰り返す必要のない周知の方法を使用して腫瘍壊死因子（TNF）の放出によって調べた。例15に記載したように、トランスフェクション体の各ウェルに対して、1500CTL82/30の細胞を添加した。これらのCTLを刺激の６日間後に収集した。前述したように、各ウェルの1/3の細胞が除去され、残りの2/3（４×104）が再付着された後、CTLとIL−２がそれに添加された。24時間後に50μｌの上清を除去し、２μｇのアクチノマイシンＤを添加した10％のFCSを37％の割合で添加したW13培地（Ｌ−アルギニン（116mg/l）、Ｌ−アスパラギン（36mg/l）、Ｌ−グルタミン（216mg/l）を添加したRPMI−1640）50μｌ中に３×104のW13（WEHI−164  クローン13;エスペヴィック（Espevik）他,J.Immunol.Meth.95:99〜105（1986））細胞を含むマイクロプレート、８％のCO2雰囲気中にて移した。前記細胞系W13は、TNFに対する感応性を有するマウス線維肉腫細胞系である。RPMI  1640中の組換えTNF−βの希釈物を標的細胞コントロールに添加した。
【００８３】
20時間の培養後、W13培養を評価し、ハンセン（Hansen）他,J.Immunol.Meth.119:203〜210（1989）の比色定量アッセイの応用を使用して死滅細胞の百分率を測定した。この測定において、PBSに50mlの（３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−y1）−2,5−ジフェニールテトラゾリウムブロマイド2.5mg/mlにて添加し、その後、37℃で２時間培養した。100μｌの溶解溶液（１容量のN,Nジメチルフォルムアミドを37℃にて1.6％の酢酸及び2.5％の1N  HClによりpH4.7として、30％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウムを含有する２容量の水と混合させたもの）を添加することによって紺青ホルマザン結晶を溶解した。プレートを37℃で一晩培養し、ODsを、650nmをコントロールとして570nmで測定した。死滅細胞の百分率は、エスペヴィック（Espevik）他,J.Immunol.Meth.95:99〜105（1986）に従い、下記の式によって算出した。
【００８４】
【数１】
0003594307.tif 000004
【００８５】
その結果は、E+/E-細胞の率が僅かに1/45である時でもかなりのTNFの産生が観察され、従って活性CTLを示すものであることを示した。これによって、30のグループの薬剤耐性トランスフェクション体をテストすることを決定した。
【００８６】
例18
上述の例17に記載したように、細胞のTNF産生をテストした。トランスフェクション後、全部で100のグループのE-細胞（４×106細胞／グループ）をテストしたところ、各グループにつき平均700の割合で７×104の独立したジェネクチン耐性トランスフェクション体を得た。トランスフェクション細胞の一つのグループのみが、抗Ｅ抗原CTLクローン82/30にTNFを産生させるマイクロカルチャーとなった。テストした300のクローンの内、８が陽性であった。次に、標準式51Cr放出アッセイを使用してこれらのクローンの抗−Ｅ  CTLによる溶解をテストしたところ、これらが元のE+細胞系と同じ程度に効率的に溶解されることがわかった。ここに記載のトランスフェクション体E.T1は、CTLのMEL2.2の抗原B,C,D及びＦに対するのと同じ溶解パターンを有していた。
【００８７】
70,000のジェネチシン耐性トランスフェクション体の内から一つのトランスフェクション体のみが前記抗原を提示したという事実は、一見すると非常に低いように思われるかもしれないが、実際にはそうではない。P815に関して前述した研究は、1/13,000の平均頻度を示した。ヒトDNA受容MEL2.2は、P1.HTRに対して1/5のDNAを組み込むようである。
【００８８】
例19
トランスフェクタントE.T1が見つかったところで、前記細胞集団のE+の汚染がその原因であるか否かという疑問を含むいくつかの疑問に関する分析が必要となった。前述の抗原提示の分析は、E.T1が、丁度受容細胞MEL2.2と同様に、B-及びC-であることを示している。更に、標準選択手法の使用により、これがHPRT-であることもわかった。しかし、ここに記載する研究において使用されたすべてのE+細胞はHRPT+であった。
【００８９】
更に、MEL2.2のE+復帰突然変異体がE.T1の源であることも可能であった。これをテストするために、コトランスフェクション配列は、通常、受容ゲノムの単一の位置で組み込まれるというペルーチョ（Perucho）他,Cell  22:309〜317（1988）の観察を利用した。もしもトランスフェクション体の抗原ＥがpSVtkneoβとのコトランスフェクションから生じるとすれば、配列が結合されるはずであり、該抗原の欠失によって隣接のpSVtkneoβ配列も欠失するかもしれない。前述のヴォルフェル（Woelfel）他は、これが事実であることを示した。もしも正常な
更に、MEL2.2のE+復帰突然変異体がE.T1の源であることも可能であった。これをテストするために、コトランスフェクション配列は、通常、受容ゲノムの単一の位置で組み込まれるというペルーチョ（Perucho）他,Cell  22:309〜317（1988）の観察を利用した。もしもトランスフェクション体の抗原ＥがpSVtkneoβとのコトランスフェクションから生じるとすれば、配列が結合されるはずであり、該抗原の欠失によって隣接のpSVtkneoβ配列も欠失するかもしれない。前述のヴォルフェル（Woelfel）他は、これが事実であることを示した。もしも正常なE-細胞がpSVtkneoβによりトランスフェクションされるのであれば、配列が結合され、抗原の欠失によって隣接のpSVtkneoβ配列も欠失するかもしれない。しかし、もしもpSVtkneoβによって正常にトランスフェクションされたE+細胞がE.T1であるならば、「共欠失」は起こらないはずである。これをテストするために、前記トランスフェクション体E.T1を、前述したように、82/30で免疫選択した。二つの抗原欠失変異体が得られたが、これらは、このCTLによる溶解に対して耐性があった。これらはいずれも、ジェネチシン耐性を失わなかったが、サザン・ブロッティング分析は、これらの変異体においていくつかのneor配列の欠失を示し、これはE.T1におけるＥ遺伝子とneor遺伝子との間の密接な関係を示した。これによって、E.T1がトランスフェクション体であるという結論が導かれた。
【００９０】
例20
前記E+サブクローンMZ2−MEL  4Bを、コスミドライブラリを調製するためのDNAソースとして使用した。この約700,000のコスミドから成るライブラリを、前述のコスミド  トランスフェクション  プロトコルに従って、MZ2−MEL2.2細胞にトランスフェクションした。
【００９１】
前記コスミドトランスフェクタントのDNAをラムダ相成分に直接的にパッケージ化することによって、問題の配列を有するコスミドを取り出すことが可能な場合がある。しかし、この方法はここでは成功しなかった、そこで、我々は、前記トランスフェクションされたDNAをコスミドベクターpTL6の適当な制限断片にライゲートすることによって、前記トランスフェクション配列を奪回（rescue）した。これを二つのトランスフェクション体について行い、そのうちの一つで成功した。B3と称する一つのコスミドがこの実験から回収された、これに、Xma Iによる制限エンドヌクレアーゼ消化、又は、大きな12kbのXma Iトランスフェクション断片のBamH I消化、を行った。前記断片はベクターpTZ  18Rにクローニングされ、次いでMEL2.2にトランスフェクションされた。ここでも再び、TNFの産生を、トランスフェクションの成功の指標とした。これらの実験によって、抗原Ｅを12kb  Xma I断片、次いで、12kbセグメントのBamH I消化による2.4kb断片にトランスフェクション可能な遺伝子配列が決定された。
【００９２】
サザン・ブロット（BamH I/Sma Iで消化したDNA）によって測定されたように、前記2.4kbの断片は、MZ2−MELからの2.4kb断片と患者MZ−２のＴ細胞クローンとハイブリッドする。前記バンドは、図12に示されているように、MZ2−MELのE-抗原欠失変異体には存在しない。
【００９３】
前記Ｅ抗原前駆体遺伝子の配列が決定され、これをここに提示される。
0003594307.tif 000005
0003594307.tif 000006
【００９４】
例21
前記2.4kbのゲノム断片が同定された後、"E+"サブラインがなんらかの相同DNAを発現したかどうかを調べた。細胞系MZ2−MEL3.0をソースとして使用し、cDNAライブラリを、公知の技術を使用して、そのmRNAから調製した。前記2.4kb断片をプローブとして使用し、ノーザン・ブロッティング分析によって、約1.8kbのmRNAが相同であると同定された。cDNAをスクリーニングした時、前記2.4kb断片の部分に対するほとんど完全な同一性を示すクローンが得られた。このようにして、二つのエクソンが同定された。前記2.4kbのBamH I断片の前に位置するコスミドB3の断片の配列決定によって、更にこれらの上流に位置する別のエクソンが見つかった。この遺伝子は、図８に示すように、約4.5kbに及んでいる。前記転写領域の開始点が、前記cDNAの5'末端に対してPCRを使用して確認された。これらの三つのエクソンは、65,73及び1551塩基対より構成される。エクソン３の位置66にはATGが位置し、その後には828塩基対のリーディングフレームがある。
【００９５】
例22
前記2.4kb断片のより小さなセグメントが抗原Ｅの発現を転移することが出来るか否かを調べるために、公知の技術を使用して、前述の比較的大きな遺伝子に対応する小さなピースをつくり、E+細胞に転移した。図８は、その３つの断片の境界を示している。
【００９６】
このような抗原発現の転移によって、前記遺伝子は、前記抗原を活性化させるタンパク質のをコード化するのではなく、むしろ、前記抗原前駆体をコードすることを示している。
【００９７】
例23
前述のcDNAの調査によって、驚くべきことに、二つの互いに異なってはいるが互いに密接に関連したcDNAが明らかになった。テストした時、これらのcDNAは、抗原Ｅの発現を転移しなかったものの、前記第1cDNAセグメントに対する実質的な相同性を示している。前記三つのセグメントは、「メラノーマ抗原」の"MAGE"と称する新たに認識された遺伝子のファミリを示すものと思われる。図９において、"MAGE−1"は、MZ2細胞からの前記抗原の発現を指示する。各遺伝子の第３エクソンの部分が図９に示されている。前記第２及び第３配列は、第１のものよりも、互いに密接に関連している（第１に対してそれぞれ18.1％と18.9％の違い；互いに対して12％の違い）。得られた９のcDNAクローンの内、各タイプにつき三つが得られ、これは発現が同じであることを示唆している。ここで"MAGE"とは、分子のファミリと、これらの分子をコード化する核酸のことをいう。これらの核酸は、共通の程度の相同性を有し、いくつかの種類のヒト腫瘍細胞を含む腫瘍細胞と、ヒトの腫瘍とにおいて発現される。前記ファミリは、その第１のメンバがヒトのメラノーマ細胞において同定されたという理由により、"MAGE"と呼ばれる。しかし、以下の実験が示すように、MAGEのメンバは決してメラノーマ腫瘍に限られたものではなく、むしろ、MAGEは腫瘍拒絶抗原前駆体のファミリとそれらをコード化する核酸配列とを指す。これらから得られる抗原を、ここでは、"MAGE  TRA”即ち「メラノーマ抗原腫瘍拒絶抗原」という。
【００９８】
例24
マウス腫瘍による実験は、Ｔ細胞によって認識される新しい抗原が、新規な抗原ペプチドをコード化する領域において活性遺伝子を修飾する点突然変異から生じる可能性があることを示した。大半の正常細胞においては発現されない遺伝子の活性化からも新たな抗原が発生する可能性がある。抗原MZ2−Ｅに関してこの問題を明らかにするために、メラノーマ細胞中に存在する前記mage−１を、患者MZ2の正常細胞中に存在するものと比較した。前記2.4kbの断片の最初の半分をカバーしている1300bpのストレッチを包囲するプライマを使用したフィトヘマグルチニン活性化血液リンパ球のDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅を行った。予想された通り、PCR産物が得られたが、これに対して、前記E-変異体のDNAではなにも得られなかった。このPCR産物の配列は、前記E+メラノーマ細胞が有する前記遺伝子の対応配列と同じであることが判った。更に、抗原MZ2−Ｅは、クローニングPCR産物によってトランスフェクションされた細胞によって発現されることが判った。この結果は、正常時においては不活性な遺伝子の活性化が、腫瘍拒絶抗原MZ2−Ｅの出現の原因であることを示唆するものである。
【００９９】
例25
種々の正常及び腫瘍細胞による遺伝子mage−１の発現を評価するために、ノーザン・ブロットを、前記第３エクソンの大部分をカバーするプローブとハイブリッドした。ヒト腫瘍細胞系MZ2−MEL3.0において観察された結果とは異なり、患者MZ2のCTLクローンから単離されたRNAと同じ患者のフィトヘマグルチニン活性化血液リンパ球とにおいてはバンドは観察されなかった。他の個体のいくつかの正常組織も同様に陰性であった（図10及び図11参照）。他の患者の14のメラノーマ細胞系をテストした。その内の11が陽性で、様々な強度のバンドを有していた。これらの培養細胞系に加えて、メラノーマ腫瘍組織の４つのサンプルを分析した。患者MZ2の転移を含む二つのサンプルは陽性であり、これによって、前記遺伝子の発現が組織培養のアーチファクトを表すものであるという可能性が除外された。肺腫瘍を含む他の２〜３の組織学的タイプの腫瘍をテストした。これらの腫瘍の大部分は陽性であった（図10及び図11）。これらの結果はMAGE遺伝子ファミリが多くのメラノーマおよび他の腫瘍により発現されることを示している。しかし、これらは、遺伝子mage−1,2又は３のどれが、これらの細胞によって発現されたのかについてはっきりと示すものではなかった。というのは、これらの三つの遺伝子に対応するDNAプローブはかなりの程度、クロス・ハイブリッドしたからである。この分析をより具体的にするために、PCR増幅と、特異性の高いオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションを使用した。cDNAが得られ、これらを、ここに記載の三つのMAGE遺伝子に関して同一のエクソン３の配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマを使用したPCRによって増幅された。次に、そのPCR産物が、前記三つの遺伝子の一つに対する完全な特異性を示した三つの他のオリゴヌクレオチドとハイブリッドする能力を有するかどうかについてテストした（図９）。陰性の細胞からのRNA中でメラノーマMZ2−MEL3.0のRNAを希釈するコントロール実験によって、ここに使用した条件下においては、前記シグナルの強度が希釈度に対して比例的に減少することと、1/300の希釈においてもまだ陽性のシグナルが検出可能であることが判った。PCRによってテストした正常細胞（リンパ球）は、前記三つのMAGE遺伝子の発現に関して陰性であることが確認され、従って、これはMZ2メラノーマ細胞種の発現レベルの1/300th以下の発現レベルを示唆するものである（図11）。メラノーマ細胞系のパネルに関して、その結果は、メラノーマにおいてはMAGE遺伝子mage1,2及び３を発現するものと、mage−２とmage−３のみを発現するものとがあることを明示している（図11及び10）。他の腫瘍の内には三つの遺伝子のすべてを発現したものと、mage−２又はmage−３のみ、またはmage−３のみを発現したものとがあった。いくつかの陽性PCRの結果が、前記三つの特徴付けられたMAGE遺伝子の一つを発現を反映するものではなく、前記プライミング及びハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを共有する別の密接に関連した遺伝子の発現を反映するものであるという可能性をはっきりと除外することは不可能である。前記MAGE遺伝子ファミリは、多様な腫瘍によって発現されるものであり、これらの遺伝子はこれまでテストされた正常細胞中においては不活性である、と結論付けることができる。
【０１００】
例26
高い効率でトランスフェクションし、効率的にTRAPを発現する配列が入手されたことによって、関連の主要組織適合性複合体（MHC）クラスＩ分子の探索が可能となった。患者MZ2のクラスＩ特異性は、HLA−A1,A29,B37,B44及びC6である。MZ2と同様にA1を有する患者の他の４つのメラノーマを、前記2.4kb断片とpSVtkneoβとにコトランスフェクションさせた。これらの内の三つが、CD8＋である抗−Ｅ  CTLクローン82/30によるTNF放出を刺激するneorトランスフェクション体を産出した（図10）。MZ2と共にA29,B44又はC6を共有する他の４つのメラノーマではE-トランスフェクション体は得られなかった。これは、抗原MZ2−Ｅの提示分子がHLA−A1であることを示唆している。確認として、HLA−A1患者の腫瘍からの６つのメラノーマ細胞系の内、二つが患者MZ2の抗体−Ｅ  CTLクローン82/30によるTNF放出を刺激することが判った。これらの腫瘍細胞系の内の一つ、MI13443−MELも、これらの抗−Ｅ  CTLによる溶解に対する高い感度を示した。これら二つのメラノーマは、mage−１遺伝子を発現したメラノーマであった（図13）。A1を有さないHLA単模式種（ハロタイプ）を有する患者の８つのメラノーマについて、その溶解に対する感度と、前記CTLによるTNF放出を刺激する能力について調べた。これはいずれも陽性ではなかった。いくつかのヒト抗腫瘍CTLが、元の腫瘍と適当なHLA特異性を共有する同種腫瘍を溶解する能力があることが報告されている（ダロウ（Darrow）他,J.Immunol.142:3329（1989））。特に前に詳述したハツカネズミ腫瘍に関する類似の結果に鑑みて、遺伝子mage2及び３によってコード化される抗原ペプチドも、HLA−A1又は他のクラス１分子によって同系CTLに提示されうるという可能性が高い。
【０１０１】
例27
前述したように、メラノーマMZ2は、抗原Ｅの他に、抗原F,D及びA'を発現した。抗原Ｅをコード化する核酸配列の単離後、抗原Ｆをコード化する核酸配列を単離するために類似の実験を行った。
【０１０２】
これを行うために、細胞種MZ2−MEL2.2の培養を、前述したE-細胞系、抗−Ｅ  CTLクローンに対する処理に関して記載したものと同じ方法で、抗−Ｆ  CTLクローン76/6によって処理した。これによって、Ｆ抗原欠失変異体が分離され、これに対して複数回の選択を行った。その結果得られた細胞系、"MZ2−MEL2.2.5"、は抗−Ｆ  CTLによる溶解に対しては完全な耐性を有するが、抗−Ｄ  CTLによっては溶解されることが判った。
【０１０３】
再び、抗原−Ｅ前駆体DNAの分離に関して述べたプロトコルに従って、前記F-変異体を、F+細胞系FZ2−MEL3.0からのゲノムDNAとトランスフェクションした。これらの実験によって、90,000の薬剤耐性トランスフェクション体が産生された。これらについて、前に詳述したTNF検出アッセイで30の細胞のプールを使用してそのMZ2−Ｆ発現をテストした。一つのプールが抗−Ｆ  CTLによるTNF放出を刺激し、これはクローニングされた。145のクローンの内の５つが、抗−Ｆ  CTLを刺激することが判った。これも前述のプロトコルに従った溶解アッセイによって、（ｉ）抗原Ｆをコード化する遺伝子の発現、及び（ii）抗原Ｆ自身の提示、を確認した。
【０１０４】
例28
F+細胞系の同定後、そこからのDNAを使用して細胞をトランスフェクションした。これを行うために、再び前述のプロトコルを使用して、F+細胞系MZ2−MEL.43のコスミドライブラリを調製した。このライブラリを約50,000のコスミドからなる14のグループに分割し、各グループからのDNAをMZ2−MEL2.2.5にトランスフェクションした。次に、トランスフェクション体の、抗−Ｆ  CTLクローン76/6からのTNF放出を刺激する能力をテストした。14のコスミドグループの内、一つが抗原Ｆを発現する二つの独立したトランスフェクシヨン体を産生し、これは、17,5000のジェネチシン耐性トランスフェクション体から２つの陽性が産生されたことになる。
【０１０５】
例29
サザン・ブロット（図12）上に観察されたパターンから一つの遺伝子ファミリの存在が示唆された。これを行うために、抗原M22−Ｅの発現を転移した前記2.4kbのBamH I断片を32p（32P）でラベルし、E+クローニングサブクローンM22−MEL2.2のBamH I消化DNAのサザン・ブロット上でプローブとして使用した。ハイブリダイゼーション条件は、50μl/cm2の3.5xSSC、lxDenhardt's溶液、25mMのリン酸ナトリウムバッファ（pH7.0）、0.5％SDS,2mM  EDTA、を含み、前記2.4kbプローブは、予め、［α32P］dCTP（２〜3000Ci/mole）で３×106cpm/mlにラベルしておいた。ハイブリダイゼーションは、65℃において18時間行った。この後、膜の洗浄を、65℃にて、2xSSC中と0.1％SDS中でそれぞれ１時間づつと、最後に0.1xSSCと0.1％SDS中でそれぞれ30分間の計４回行った。ハイブリダイゼーションを同定するために、Kodak  Ｘ−ARフィルムとKodak  Ｘ−Omatic微細強化スクリーンとを使用して膜のオートラジオグラフを行った。
【０１０６】
以下の例において、「ハイブリダイゼーション」が言及される時、使用されたストリンジェント条件は、上述したものと類似のものであった。ここで「ストリンジェント条件」とは、前述した条件をいい、これらは当該技術において周知の変更が可能である。
【０１０７】
例30
ヒト肉腫細胞系LB23−SARのサンプルから、mage4をコード化する前記cDNAを同定した。この細胞系は、mage1,2又は３は発現しないことが判ったが、この細胞系のmRNAは、mage1の前記2.4kb配列にハイブリダイゼーションする。これを更に調べるために、全LB23−SAR  mRNAからcDNAライブラリを調製し、次に、これを前記2.4kb断片にハイブリダイゼーションした。このプローブにハイブリダイゼーションする一つのcDNA配列が同定された。以後、これをmage4という。
【０１０８】
例31
前述の"MZ"細胞のソースである患者"MZ2"からのPHA−活性化リンパ球を使用して実験を行った。mage2又は３に対してではなくmage1に対して相同性を示すオリゴヌクレオチドプローブを、前記PHA活性化細胞由来のコスミドライブラリとハイブリッドした。しかし、ハイブリダイゼーションBamH Iコスミド断片の大きさは、4.5kbであり、これは前記物質がmage1ではないことを示した。しかし、mage1〜４に対する相同性に基づき、前記断片は"mage5"と呼ぶことができる。MAGE5の配列は、配列認識番号（SEQ  ID  NO）:16に示されている。
【０１０９】
例32
メラノーマ細胞系LB−33−MELをテストした。該細胞系からのトータルmRNAを使用してcDNAを作成し、次に、これをオリゴCHO9:（ACTCAGCTCCTCCCAGATTT）とCHO10:（GAAGAGGAGGGGCCAAG）とで増幅した。これらのオリゴは、前述したmage1,2及び３と共通のエクソン３の領域に対応するものである。
【０１１０】
これを行うために、１μｇのRNAを、前述した、２μｌの10xPCRバッファと、２μｌの10mM  dNTPと、1.2μｌの25mM  MgCl2と、１μｌの80mMのCHO9の溶液とからなる全部で20μｌと、20単位のRNAsinと、200単位のＭ−MLV逆転写酵素とに希釈した。この後、42℃で40分間培養を行った。その後、８μｌの10xPCRバッファと、4.8μｌの25mM  MgCl2と、１μｌのCHO10と、2.5単位のサーマス・アクアティカス（Thermus  acquaticus）（"Taq"）ポリメラーゼと、全容量100μｌとなる水とを使用して、PCR増幅を行った。次に、増幅を30回行った（94℃で１分間、59℃で２分間、72℃で３分間）。各反応物の10μｌを、アガロースゲル上でサイズフラクション化し、その後、ニトロセルロースでブロッティングを行った。その生成物は、オリゴヌクレオチドプローブCHO18（TCTTGTATCCTGGAGTCC）とハイブリダイゼーションすることが判った。このプローブはmage1を同定したが、mage2や３は同定しなかった。しかしながら、前記生成物はプローブSEQ4（TTGCCAAGATCTCAGGAA）とはハイブリダイゼーションしなかなった。このプローブも、mage1には結合したがmage2と３には結合しなかった。これは、前記PCR産物がmage1,2及び３とは異なった配列を有していることを示すものであった。この断片の配列決定は、更に、mage4及び５との相違も示した。これらの結果は、前に同定されたmage1,2,3,4及び５とは異なる配列を示すものであり、これをmage6と命名した。
【０１１１】
例33
MZ2のPHA−活性化リンパ球からのコスミドライブラリを使用した追加実験において、前記2.4kbのmage1断片を、プローブとして使用し、相同断片を分離した。しかし、このクローンは、mage1,2,3又は４に対する特異性を有するオリゴヌクレオチドには結合しなかった。得られた配列は、mage1のエクソン３に対するいくらかの相同性を示し、これはmage1〜６とは異なっている。更なるスクリーニングによって、mage8〜11が産生された。
【０１１２】
例34
前記TRAP及びこれらから誘導された（プロセシングされて得られた）TRAの有用性は、以下によって例証された。
mage1のエクソン３は、抗原Ｅの発現を転移することが示された。結果として、このエクソン３より誘導される合成ペプチドが抗−Ｅ  CTLに対する感度を与えるのに使用されうるかが決定された。
【０１１３】
これを行うために、標準的プロトコルを使用し、正常には抗−E/CTLには感応しない細胞をエクソン3.1より誘導された合成ペプチドにより培養した。P815Aに関して前述したCTL溶解アッセイと、3mMのペプチド濃度を使用して、前記ペプチドGlu−Ala−Asp−Pro−Thr−Gly−His−Ser−Tyrが最善であることが示された。前記アッセイは、30％の溶解を示し、これは前記抗−Ｅ  CTLに対する感応性の付与を示すものである。
【０１１４】
例35
"smage"と称される核酸配列をハツカネズミ細胞から分離した。前述したプロトコルに従い、コスミドベクターC2RBを使用して、正常DBA/2腎臓細胞のDNAからコスミドライブラリを調製した。プローブとして、MAGE−１の前記2.4kb  BamH I断片を使用した。前記DNAをナイロンフィルタにブロッティングし、これらを65℃において2xSSC中で洗浄して、前記smage物質を同定した。
【０１１５】
例36
更に別の組織サンプルについて、前述したプロトコルを使用して、MAGEの存在をテストした。以下はこれらの結果の内のいくつかである。
【０１１６】
脳又は腎臓腫瘍組織にはMAGE遺伝子の発現はなかった。結腸腫瘍組織は、MAGE1,2,3及び４の発現を示したが、但しテストしたすべての組織がすべてのMAGE遺伝子を発現したわけではなかった。このことは、膵臓腫瘍（MAGE1）、非−小細胞肺（MAGE1,2,3及び４）、前立腺（MAGE1）、肉腫（MAGE1,2,3及び４）、胸（MAGE1,2及び３）、及び喉頭（MAGE1及び４）にも当てはまる。
【０１１７】
例37
細胞溶解CTLクローン"20/38"を、メラノーマ患者MZ2の末梢血液リンパ球から得た。このクローンは、ここにその開示内容を参考文献として添付するファン・デン・エインデ（Van  den  Eynde）他,Int.J.Cancer  44:634〜640（1989）に記載されている。前記クローンは、ここにその開示内容を参考文献として添付するヘリン（Herin）他,Int.J.Cancer  39:390〜396（1987）に従って、単離された。しかし、ここにこのアッセイを説明しておく。自己由来メラノーマ細胞を、試験管内で成育し、次に、10％のHEPESと30％のFCSとを添加したDMEM中で107細胞/mlで再懸濁し、200μCi/mlのNa（51Cr）O4とともに37℃で45分間培養した。ラベルした細胞を10mMのHEPESを添加したDMEMで３回洗浄した。次に、これらを10mMのHEPESと10％のFCSとを添加したDMEM中で再懸濁し、その後、103の細胞を有する100μｌのアリコットを96のウェルマイクロプレートに分配した。前記CTLのサンプルを100μｌの同じ培地に添加し、アッセイを繰り返した。プレートを100gで４分間遠心分離に掛け、5.5％のCO2雰囲気中で37℃にて４時間培養した。
【０１１８】
プレートを再び遠心分離に掛け、上清の100μｌのアリコットを収集し、計数した。51Cr放出率を以下によって算出した。
【０１１９】
【数２】
0003594307.tif 000007
【０１２０】
ここで、ERは、観察された実験上の51Cr放出値、SRは103ラベル化細胞を200μｌの培地のみで培養することによって測定された自然放出値、そして、MRは、100μｌの0.3％Triton  Ｘ−100を標的細胞に対して添加することによって得られた最大放出値、である。
【０１２１】
高いCTL活性を示した前記単核血液サンプルを拡張し、制限希釈によってクローニングし、同じ方法を使用して再度スクリーニングした。
【０１２２】
同じ方法を使用して、K562細胞をテストした。EBV−Ｂ細胞を使用した時の、唯一の相違点は、DMEM培地を、５％のFCSを添加したHank's培地によって置き換えたことだけであった。
【０１２３】
これらの実験によって、CTLクローン20/38が単離された。
【０１２４】
図１は、これらのアッセイの結果を示す。特に、前記CTLクローンが自己由来メラノーマ細胞系MZ2−MEL.3.0は溶解したが、EBV−Ｂ細胞系、線維芽細胞、K562や非自己由来メラノーマ細胞系SK−MEL−29は溶解しなかったことが判る。
【０１２５】
例38
前記CTLクローンが前記自己由来細胞系に対して特異的であることが認識された後、その抗原特異性をテストした。これを行うために、患者MZ2由来の抗原欠失変異体を、上述したものと同じタイプのクロム放出アッセイにおいてテストした。これらの標的系は、D+,E+,F+,A+であるMZ2−MEL3.0と、D-であるMZ2−MEL.61と、E-であるMZ2−MEL2.2と、F-であるMZ2−MEL.4とであった。CTLクローン20/38の他に、抗−Ａ（CTL28/336）、抗−Ｆ（CTL76/6）及び抗−Ｅ（CTL22/13）であることが知られているクローンもテストした。
【０１２６】
これらの結果は図15に示されている。CTLクローン20/38が前述のすべての細胞系を溶解し、これらよってD-細胞系MZ2−MEL.61を除いてクロム放出を起こさせ、従って、該CTLクローンが抗−Ｄであること示すものであることが理解されるであろう。この結果は、ここには記載しないが、前記CTLクローンによるTNF放出がメラノーマ系提示抗原Ｄの存在下においてのみ観察された実験において確認された。
【０１２７】
例39
抗原Ｄが標的分子として同定された後、これを提示するHLAタイプを検出する研究を行った。例Ａに記載の実験は、抗原ＤがMZ2−MELによって提示されることを示したが、この細胞系のHLA特異性は知られている（即ち、A1,A29,B37,B44,Cw6,C.cl.10）。しかしながら、HLA分子を欠失しているMZ2−MELの変異体A29,B44及びC.cl.10がそれでもまだ抗原Ｄを発現することも知られていたので、これらを考慮対象から除外することができた。B37を発現する系については発見されなかったので研究しなかった。
【０１２８】
全部で13の同種系をテストし、これらはHLA−A1（13中10）か、又はCw6（13中３）のいずれかを発現した。これらの細胞系の、CTLクローン20/38によってTNFの放出を刺激する能力を、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics35:145〜152（1992）の方法を使用してテストした。このアッセイは、WEHI  164−13細胞に対する上清の毒性のテストを通じてTNF放出を測定するものである。
【０１２９】
前記アッセイにおいて、前記同種系からの細胞サンプル（3000、10,000又は30,000細胞）を前記CTLクローン1500細胞と25u/mlのIL−２との存在下で培養した。24時間後。培養より得られた上清はWEHI細胞に対する毒性についてテストされた。その結果は下記の表３に示されている。
８つの細胞系が前記CTLクローン20/38からTNF放出を刺激することが判った。これらの種のすべてがHLA−A1であった。前記Cw6提示系はいずれも刺激しなかった。
【０１３０】
前記細胞系を、更に、MAGE発現を検出するためにアッセイした。TNF放出を刺激した８つの種のすべてがMAGE−３を発現したが、陰性であった二つのHLA−A1種はこれを発現しなかった。
【０１３１】
【表３】
0003594307.tif 000008
【０１３２】
例40
例Ｃに記載した結果に鑑みて、抗原Ｄが実際に、MAGE−３から誘導された（プロセシングされて得られた）腫瘍拒絶抗原であるのか否かを調べるために実験を行った。これを行うために、受容COS7細胞を、100ngのpcDNA  I/AmpにクローニングしたHLA−A1に対する遺伝子、および、（ａ）pcDNA  I/AmpにクローニングしたMAGE−１に対するcDNA、（ｂ）pcDSRαにクローニングしたMAGE−２に対するcDNA、または（ｃ）pcDSRにクローニングしたMAGE−３に対するcDNA、のいずれか一つ100ngとトランスフェクションした。トランスフェクション配列を、製造業者の指示に従ってプラスミドにライゲートした。COS−７細胞のサンプルを、10％の胎児ウシ血清を添加したDulbeco's  modified  Eagles  Medium（"DMEM"）中にて、15,000細胞／ウェルの割合で組織培養平底マイクロウェルに接種した。これらの細胞を37℃で一晩培養し、培地を除去し、これを10％のNu血清、400μg/mlのDEAE−デキストラン、100μＭのクロロキン、そして上述したプラスミドを有する30μl/ウェルのDMEM培地と置換した。37℃での４時間の培養後、前記培地を除去し、これを10％のDMSOを有する50μｌのPBSと置換した。この培地を２分後に除去し、これを10％のFCSを添加した200μlDMEMと置換した。
【０１３３】
この培地の交換後、COS細胞を37℃にて24時間培養した。その後、培地を廃棄し、10％のプールされたヒト血清を含み、25μ/mlのIL−２を添加した100μｌのIscove培地中に、1500の細胞のCTLクローン20/38を添加した。24時間後、上清を除去し、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics35:145〜152（1992）に記載されているように、WEHI細胞上のアッセイにてTNF含有量を測定した。これらの結果を図16に示す。
【０１３４】
前記CTLクローンが、HLA−A1とMAGE−３とによってトランスフェクションされたCOS7細胞によっては強力に刺激されたが、他のmage遺伝子によってトランスフェクションされた細胞には刺激されなかったことが理解されるであろう。これによって、抗原Ｄは、遺伝子MAGE−３によってコード化された腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導された（プロセシングされて得られた）腫瘍拒絶抗原であり、このTRAがHLA−A1分子によって提示されるという結論が導かれる。
【０１３５】
前記例を含む以上の開示は、極端な値となる多くのツールを当業者の手に委ねている。先ず、前記諸例は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコード化する核酸分子及びこれに対して相補的な核酸分子を分離する方法を明らかにし、これを提供するものである。DNAは二重鎖形態で存在し、かつ、二つの鎖のそれぞれが他方に対して相補的であることが知られている。DNAの鎖が与えられれば、当業者はその相補体を分離したり、あるいはこれを合成することが出来るまで核酸ハイブリダイゼーション技術は発達している。
【０１３６】
ここで「核酸分子」とは、前述した特性を有する、すべての種のDNA及びRNAを指す。ゲノムDNA及び相補的DNA、即ち"cDNA"は、共に特定のタンパク質をコード化し、MAGEコード化配列の分離のための例が示すように、本開示は、当業者にこれらの両方をいかに得るかを教示するものである。
【０１３７】
同様に、mRNA等のRNA分子も得ることができる。繰り返すと、当業者に参照することによって、一旦、コード化配列が入手できれば、mRNAを分離又は合成することができる。
【０１３８】
「アンチセンスDNA」又はmRNA等のTRAPをコード化しない相補的配列は、例えば、コード化配列をプローブすること、およびその発現を阻止する手法に有用である。
【０１３９】
前記例は、TRAP分子をコード化するか、又はこれらの分子を発現する核酸配列によってトランスフェクションされた細胞系の生物学的に純粋な培養の製造を示すものであることが明白に理解されるであろう。このような培養は、例えば、腫瘍拒絶抗原のソースとして、あるいは治療に利用可能である。本発明のこの側面について次に記載する。
【０１４０】
前記TRAPコード化配列によってトランスフェクションした細胞を、更に他のコード化配列とトランスフェクションすることも可能である。他のコード化配列の具体例としては、インターロイキン（例えば、IL−２またはIL−４）等のサイトカイン遺伝子、または、主要組織適合性抗原（MHC）やヒト白血球抗原（HLA）分子等がある。
【０１４１】
サイトカイン遺伝子トランスフェクションは、これらの発現が前記細胞の生体内における生物学的純粋培養の治療的効力を高めることが期待されているので有用である。インターロイキントランスフェクション体が癌病状の治療のために患者に投与された治療についてはよく知られている。特に好適な実施例において、細胞は、（ｉ）TRAP分子、（ii）HLA/MHC分子、及び（iii）サイトカイン、のいずれか一つをコード化する配列とトランスフェクションされる。
【０１４２】
HLA/MHCコード化配列とのトランスフェクションが望ましいのは、或る種のTRAは、特定のMHC/MLA分子によってのみ優先的又は特異的に提示されるかも知れないからである。従って、受容細胞が既にTRAの提示に関連するMHC/HLA分子を発現する場合には、該抗原の過剰発現を起こさせるために更に形質転換することも可能ではあるが、追加のトランスフェクションは必要でないかもしれない。他方、受容細胞が正常には関連MHC/HLA分子を発現することがない時には、第２の配列にてトランスフェクションすることが望ましい。又、もう一つの配列とのトランスフェクションということは更にそれ以上の他の配列とのトランスフェクションの可能性を排除するものでないことは言うまでもない。
【０１４３】
ここで記載される細胞系との関連で使用される「生物学的に純粋」とは、単に、これらが実質的に他の細胞を有さない、ということを意味する。厳密には、「細胞系」は、その定義により、「生物学的に純粋」であるが、このような表現を使用することによってこれをより完全に表現するものである。
【０１４４】
細胞のトランスフェクションには、適当なベクターが使用されることが必要である。従って、本発明は、問題とするTRAPのコード化配列がプロモータに作動可能に連結されている発現ベクターを含む。該プロモータは、当該技術において知られているもののような強力なプロモータ、又は、分化（differential）プロモータ、即ち、特定の細胞タイプにおいてのみ作動するプロモータであってよい。前記発現ベクターは、更に、ワクシニアウィルスやBCG等のウィルス又はバクテリアのゲノムの全部又は一部を含むことができる。このようなベクターは、ワクチンの製造において特に有用である。
【０１４５】
前記発現ベクターは、TRAP配列がそこに含まれる限り、複数のコード化配列を含むことが可能である。
【０１４６】
発現ベクターは、TRAP配列がそこに含まれているかぎりは、幾つかのコード化配列を含んでいる。前述したサイトカイン及び／又はMHC/HLA遺伝子は、TRAP配列とともに一つのベクターに含ませてもよい。これが望ましくない場合には、各コード化配列がプロモータに作動可能に連結された２つ又はそれ以上の別々のベクターが使用される発現システムを提供することができる。ここでも、前記プロモータは、強力又は分化プロモータであってよい。コトランスフェクションは周知の技術であり、この分野の当業者はこの技術の利用を期待できる。前記ベクターは、これらが、TRAP分子ではなく直接的にTRAをコード化するように構成できる。これによって、翻訳後の処理が不要となる。
【０１４７】
以上から明らかなように、前記配列は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」（TRAP）をコード化し、これらの腫瘍拒絶抗原前駆体が腫瘍拒絶抗原（”TRA”）にプロセシングされる。それぞれの特異例を含めてこれらのカテゴリーの両方の単離された形態がここに記載されている。恐らく、これらの最も有益な側面は、種々の癌状態を治療するためのワクチンとしてのものである。証拠によれば、TRAが腫瘍細胞上で提示され、その後、免疫応答が展開し、細胞が除去される。前記例は、種々のTRAが細胞に投与された時、CTL応答が起こって提示細胞が除去されることを示している。これはワクチンに特有の作用であり、従って、TRAにプロセシングされるTRAP、およびTRA自身を、単独又は、薬剤的に適当な組成物とともにワクチンとして使用することが可能である。同様に、提示細胞も、同じ様に、単独又は他の成分と組み合わせて使用して薬剤組成物を作るのに使用することができる。ワクチンとして使用可能な更に別の物質としては、その表面にTRA分子を提示する単離細胞や、TRAP断片、特に単離された状態の突然変異ウィルス、そしてトランスフェクションされたバクテリアなどがある。ここでいう「断片」とは、TRAよりは小さいが、前述したようにワクチンとして要求される特性を有するペプチドのことをいう。TRAとHLA分子の複合体を含むか、又は、該複合体から成る他のワクチンもある。ここに記載したタイプのワクチンは、予防的に、即ち、癌状態の発生を予防するのに十分な量を対象体へ投与することによって使用可能である。
【０１４８】
免疫応答の発生は、それがＴ−細胞に関連している場合とＢ−細胞に関連している場合とのいずれの場合においても、提示された腫瘍拒絶抗原に特徴的な効果である。Ｂ−細胞応答については、特に、TRAに対する、即ち、TRAに特異的に結合する抗体の発生に関係している。これに加えて、TRAP分子はそれらを免疫原に変えるのに十分なサイズを有しており、そしてこれらに特異的に結合する抗体は本発明の一部である。これらの抗体はポリクローナル又はモノクローナルのいずれであってもよく、後者はここで繰り返す必要のない周知の方法のいずれかを使用して作成される。例えば、mAbsは、Balb/Cマウス等の動物モデルを使用して、あるいは、例えばEBV形質転換体を使用して試験管内で作ることができる。更に、抗血清は、ある種の細胞がTRAを提示する癌状態を有する対象体から分離することができる。このような抗体は、TRAとHLA/MHC分子との相互反応によって規定されるエピトープに対して発生させることも可能である。
【０１４９】
上記開示内容を概観することによって、「腫瘍拒絶抗原の提示及び認識」と呼ぶことが可能なシステムには多数の側面が存在することが理解されるであろう。これらの現象の認識によりいくつかの診断上の効果が生まれる。例えば、特異的なCTLクローンまたはTRAに対する抗体の存在によって、対象体からのサンプル中に於けるCTL、TRAに対する抗体の結合、又は対象体サンプルとの関連に於ける抗−TRA  CTLの活動をモニタして癌状態（後に説明する）を診断したりモニタすることが可能になる。同様に、TRAPに対する核酸分子の発現を、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）、アンチセンスハイブリダイゼーション、プローブ技術、等によってモニタすることができる。体液（血液、血清、その他の滲出液等）、組織及び腫瘍を含む種々の対象体サンプルをアッセイすることができる。
【０１５０】
診断方法の一具体例は、結核の診断に現在使用されている標準的「ツベルクリンテスト」の応用である。この標準的皮膚テストは、診断補助として、安定状態の「精製タンパク質誘導物」即ち"PPD"を投与するものである。同様に、本発明によりTRAは、診断補助物質としてそのような皮膚テストやモニタ一法にも使用可能である。
【０１５１】
「癌状態」という用語は、ここでは、癌の発生とともに始まる最終的な臨床上の顕在化に到るすべての病理的事象を含むものとして使用されている。腫瘍は「最初から」目に見える腫瘍として発生するのではなく、むしろ、正常な細胞の悪性への形質転換、その後の腫瘍、突然変異等のバイオマスの発育の成長等に関連する様々な事象が存在する。更に、腫瘍が自然に消滅することはめったにないので緩解とは「癌状態」の一部に関するものと理解される。本発明の診断的側面は、一つの細胞の悪性への形質転換から、腫瘍の発達及び突然変異を経る癌発生に関するすべての事象と、緩解とを含むものである。これらのもののすべてがここに含まれている。
【０１５２】
「対象体」が使用される時、この用語は癌状態にある全ての種を包含する。これは、ヒトと家畜動物、飼育用動物等のヒト以外の動物を含む。
【０１５３】
本発明には治療的側面も存在する。ワクチンとしてTRAP及びTRAの有効量を投与することの効力については既に上述した。同様に、生体外で特異的CTLを開発し、これらを対象体に投与することが出来る。問題のTRAを提示する細胞に特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体を投与することができる。これらの抗体は、メトトレキセート放射性ヨウ素化化合物、リシン等の毒素、他の細胞増殖抑制又は細胞溶解薬等を非限定的に含む特定の抗腫瘍剤に結合させることができる。従って、本発明は「標的化」抗体療法を含み、更に、CTLの使用による癌細胞の除去への応用も含まれる。
【０１５４】
例37〜40からのデータは、MAGE−３から誘導される（プロセシングされて得られる）腫瘍拒絶抗原がHLA−A1分子によって提示されることを示している。従って、このTRAPをコード化する前記核酸分子、この核酸分子を組み込んだ、前記配列によってコード化されるTRAP自体、ベクター、細胞系等の他に、本発明は、更に、MAGE−３  TRAPとHLA−A1をコード化する分子の組合せもその範囲に含むものである。従って、コトランスフェクション体、両方のコード化配列を含むベクター、キット等の発現システム、又は分離ベクター等のすべてが本発明に含まれる。同様に、前述したワクチンを、MAGE−３からのTRAPとアジュバントとを組み込むことによって作ることができる。
【０１５５】
尚、或る種のTRAPは一つ以上のTRAを産生することがある。MAGE−３の場合、ここで使用されている意味に於ける抗原Ｄがそこから誘導される（プロセシングされて得られる）ことが示され、本発明の一側面は、この分離腫瘍拒絶抗原に関するものである。更に別の側面は、前記TRAの単離された複合体とその提示分子、即ち、HLA−A1である。
【０１５６】
HLA−A1によって提示されるMAGE−３由来TRAの同定によって、様々な治療的及び診断的方法が示唆される。治療的側面、例えば、MAGE−３発現によって特徴付けられる障害の治療を、多種類の方法で行うことが出来る。尚、ここで「障害」とは、MAGE−３が発現される癌（例えばメラノーマ）等のすべての病理状態を指す。
【０１５７】
本開示に基づく治療方法は、HLA−A1細胞等のTRA提示細胞の溶解に到る、対象体の免疫システムの応答を前提としている。このような方法の一つは、問題の表現型の異常細胞を有する対象体に対して、前記複合体に特異的なCTLを投与するものである。当業者は、このようなCTLを生体外（試験管内）で開発することが可能であろう。具体的には、血液細胞等の細胞のサンプルを、前記複合体を提示し、かつ特定のCTLの増殖を誘発しうる細胞に接触させる。前記標的細胞は、前述したタイプのCOS細胞等のトランスフェクション体であってよい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、問題のCTLと結合された時、その増殖を刺激する。ここに使用されているようなCOS細胞は、容易に入手可能であり、他の適当な宿主細胞も容易に入手可能である。
【０１５８】
養子移入と称される前記治療方法（グリーンバーグ（Greenberg）,J.Immunol.136（５）:1917（1986）；レッデル（Reddel）他,Science257:238（７−10−92）；リンチ（Lynch）他,Eur.J.Immunol.21:1403〜1410（1991）；カスト（Kast）他,Cell 59:603〜614（11−17−89）について詳述すると、前記所望複合体を提示する細胞を、CTLと結合させ、それに対する特異性を有するCTLを増殖させる。次に、増殖されたCTLを、前記特定の複合体を提示する異常細胞によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に投与する。すると、CTLが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。
【０１５９】
上記治療は、対象体の異常細胞の内の少なくともいくつかが前記HLA/TRA複合体を提示するということを前提としている。これは、非常に容易に検出できる。というのは、特定のHLA分子を提示する細胞を同定する方法や、示された配列を含むDNAを発現する細胞を同定する方法はともに当該技術においては周知だからである。このような細胞が一旦分離されると、これらを対象体の異常細胞のサンプルに対して使用し、生体外で溶解を検出することができる。もしも溶解が観察されれば、特異的CTLをこのような治療法に使用することによって、異常細胞に関連する状態を軽減することができる。やや関連性の低い方法としては、標準的アッセイを使用して異常細胞のHLA表現型を調べ、例えばPCRを使用した増幅によって発現を検出するものがある。
【０１６０】
本発明によって可能な治療方法は養子移入に限らない。多数の方法を使用して、CTLを生体内で刺激することも可能である。その一つの方法、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用、については既に上に詳述した。この方法において使用される細胞は、照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な遺伝子の片方又は両方によってトランスフェクションした細胞等の、正常に前記複合体を発現するものであってよい。チェン（Chen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:110〜114（1991年１月）はこの方法を例示しており、これはHPVE7ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の治療方法における利用を示している。様々な細胞タイプを使用できる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を有するベクターを使用できる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいては、問題の遺伝子は、例えばワクシニアウィルス又はバクテリア性BCGによって担持され、これらの物質は実質的に宿主細胞に「感染」する。その結果得られる細胞が目的の複合体を提示し、これらが自己由来CTLによって認識され、次にこれらが増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又はその前駆体自身を、問題の前記HLA分子を提示するHLA−A1提示細胞への組み込みを容易にするためにアジュバントと結合させることによっても類似の効果が達成できる。TRAPがプロセシングされて前記HLA分子のペプチドパートナーを産生し、一方、それ以上のプロセシングを必要とせずにTRAが提示される。従って、MAGE−３由来TRAがHLA−A1分子、又はなんらかのHLA分子によって提示される障害を治療することが出来るのである。
【０１６１】
診断の側面においては、TRAPの発現のアッセイによって、ここで使用している意味においての障害を検出することが出来る。これは直接的（例えば、TRAP配列のPCRアッセイによって）又は、TRAの存在はTRAPが発現されている、又は、発現されたということを意味するので、MAGE−３由来TRAのアッセイを通じて間接的に行うことができる。
【０１６２】
尚、ここには二つの核酸分子、即ち、それぞれがTRAP  MAGE−３コード化するMAGE−３とMAGE−31とが示されていることが理解されるであろう。又、「MAGE−３  TRAPコード化する核酸分子」という表現が使用される場合、発現においてこの分子を産生するすべての分子が含まれるものと理解される。そのコード化領域内部においてコドン縮重を示す等の変異、あるいはそのイントロン内の変異等のすべての変異が本発明に含まれる。
【０１６３】
これまで使用した用語及び表現は記載のための用語であって限定のための用語ではなく、これらの用語及び表現の使用にあたっては図示され記載された特徴構成の均等物を除外する意図は無く、本発明の範囲内においてその他の種々の改変が可能であると理解される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗原P815Aを発現するトランスフェクション体（transfectant）の検出を示す。
【図２】図２は、クロム放出アッセイによって測定された、種々のCTLによる溶解に対するクローンP1.HTR,PO.HTR,ゲノムトランスフェクタントP1A.T2及びコスミドトランスフェクタントP1A.TC3.1の感度を示す。
【図３】図３は、コスミドC1A.3.1の制限地図である。
【図４】図４は、遺伝子P1Aの発現のノーザン・ブロッティング分析を示す。
【図５】図５は、遺伝子P1Aの構造をその制限サイトとともに示す。
【図６】図６は、P815又は正常細胞のいずれかから単離された細胞をP1Aからの遺伝子でトランスフェクションし、その後、CTL溶解によってテストした結果を示す。
【図７】図７は、肥満細胞系L138を使用した溶解研究を示す。
【図８】図８は、抗原も発現する2.4kbの抗原Ｅフラグメント配列のサブフラグメントの地図である。
【図９】図９は、遺伝子mage1,2及び３からのエクソン３部分のホモロジーを示す。
【図１０】図10は、種々の組織上のMAGE遺伝子のノーザン・ブロッティングの結果を示す。
【図１１】図11は、図13のデータを表にして表す。
【図１２】図12は、本出願において使用された種々のヒトメラノーマ細胞系を使用したサザン・ブロッティング実験を示す。
【図１３】図13は、腫瘍及び正常組織によるMAGE1,2及び３の発現の一般化した略図。
【図１４】図14は、種々の細胞系上でCTLクローン20/38を使用したクロム放出アッセイの結果を示す。
【図１５】図15は、CTLクローン20/38の抗原特異性を調べるために行ったアッセイの結果を示す。
【図１６】図16は、様々なトランスフェクションされた細胞にTNF放出アッセイを行った時に得られた結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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