(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液をセル内に導入して電極反応させ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法において、測定液に供給する電流の電流値を制御することを特徴とする電気化学発光検出方法。
【請求項２】
電気化学発光物質は、次式（１）または（２）で示されるRu（bpy）32+、次式（３）で示されるRe錯体（ここで、（３）式中、ｎは整数であって好ましくは２または３、ｍは１、２または３であって好ましくは１、ＷはCHO、COOH、NH2またはBr、Ｒは陰イオンである）、および次式（４）で示されるオスミウム（Os）錯体の何れかもしくはそれらの任意の組合わせである請求項１に記載の電気化学発光検出方法。
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【請求項３】
電気化学発光補助物質は、TPA（Tripropylamine）および／またはTEA（Triethyl amine）である請求項１または２に記載の電気化学発光検出方法。
【請求項４】
電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液が導入されるセル内に電極が設けられ、該セル内における電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出するための光検出器を備えるものであって、測定液に供給する電流の電流値を制御するための制御手段を備えていることを特徴とする電気化学発光検出装置。
【請求項５】
電気化学発光物質は、次式（１）または（２）で示されるRu（bpy）32+、次式（３）で示されるRe錯体（ここで、（３）式中、ｎは整数であって好ましくは２または３、ｍは１、２または３であって好ましくは１、ＷはCHO、COOH、NH2またはBr、Ｒは陰イオンである）、および次式（４）で示されるオスミウム（Os）錯体の何れかもしくはそれらの任意の組合わせである請求項４に記載の電気化学発光検出装置。
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【請求項６】
電気化学発光補助物質は、TPA（Tripropylamine）および／またはTEA（Triethyl amine）である請求項４または５に記載の電気化学発光検出装置。
【請求項７】
光検出器は、光電子倍増管および／またはホトダイオードである請求項４〜６の何れかに記載の電気化学発光検出装置。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
この発明は、電気化学発光に際して行われる電極反応を制御する方法と装置に関する。
［背景技術］
電気化学発光（electrochemiluminescence:ECL）とは、金属キレートなどの電気化学発光物質が電極反応によって励起されて発光する現象をいう。例えば特表平２−501749号、特表昭62−500663号、特表昭64−500146号、特表平４−502208号、特表平４−502209号、特公平７−6913号、および特公平７−37464号において、電気化学発光物質を含んだ電解質からなる測定液、もしくはそれに更に電気化学発光補助物質を含んだ電解質からなる測定液をセル内に導入して、該セル内において電極反応させ、その電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法が公知である。
また、電気化学発光を利用して抗原や抗体などの微量物質を検出、定量する方法に関して、例えば次の文献１〜３が知られている。
「文献１」“電気化学発光（ECL）法による高感度免疫学的測定法の検討”、“電気化学発光（ECL）法によるAFP測定の検討”「臨床病理」，第39巻，補冊,1991年
「文献２」“Electrogenerated Chemiluminescence:An Oxidative−Reduction Type ECL Reaction Sequence Using Tripropyl Amine"、「J.Electrochem.Soc.」,Page 3127−3131,Vol.137,No.10,October 1990
「文献３」“Electrochemiluminescence Detection for Development of Immunoassays and DNA Probe Assays for Clibnical Diagnostics"、「CLINICALCHEMISTRY」,Page 1534−1539,Vol.37,No.9,1991
ここで、電気化学発光を利用して抗原や抗体などの微量物質を検出し、定量する方法を具体的に説明すると、次のようになっている。先ず、図13はウイルス抗原、癌抗原、異常代謝物などの抗原１を検出する方法であり、この場合は抗原１に対する抗体結合磁気ビーズ２と標識抗体３を用いる。抗体結合磁気ビーズ２は、フェライトを含有せしめたラテックスなどからなる磁気ビーズ５にモノクローナル抗体などからなる抗体６を固相化させた構成である。標識抗体３は、次式（１）または（２）で示されるRu（bpy）32+、次式（３）で示されるRe錯体（ここで、（３）式中、ｎは整数であって好ましくは２または３、ｍは１、２または３であって好ましくは１、ＷはCHO、COOH、NH2またはBr、Ｒは陰イオンである）、次式（４）で示されるオスミウム（Os）錯体などの電気化学発光物質７にモノクローナル抗体などからなる抗体８を固相化させた構成である。
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そして、これら抗体結合磁気ビーズ２と標識抗体３を抗原１に結合させることにより、抗原１を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドイッチ形成させた状態）にして、検出及び定量が行われる。
一方、抗体10を検出する方法の場合は、図14に示すように、抗原結合磁気ビーズ11と標識抗体12を用いる。抗原結合磁気ビーズ11は磁気ビーズ13と抗原14との結合体で構成される。標識抗体12は電気化学発光物質15に抗体16を固相化させた構成である。そして、これら抗原結合磁気ビーズ11と標識抗体12を抗体10に結合させることにより、抗体10を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドイッチ形成させた状態）にして、検出および定量が行われる。
図15は、抗体結合磁気ビーズ２と標識抗体３を用いて抗原１をサンドイッチ形成させ、電極反応によって生じた電気化学発光を検出する方法を、時経列的に示したものである。即ち、該検出方法は
（１）容器に反応溶液21を供給する工程
（２）抗原１を含む検査検体22を供給する工程
（３）抗原１に対する抗体結合磁気ビーズ２を供給する工程
（４）所定温度（例えば37℃）で所要時間（例えば５〜10分間程度）攪拌して抗原１と抗体結合磁気ビーズ２を十分に反応させることにより抗原１を磁石によって捕集できるようにした後、磁石23を容器の周囲に配置させて抗原１を容器内に保持する。そして、この状態で液部分を排除し、バッファを供給して洗浄することにより、容器内の未反応の検査検体22と抗体結合磁気ビーズ２をバッファと共に除去する工程
（５）抗原１に対する標識抗体３を供給する工程
（６）再び攪拌して抗原１と標識抗体３を反応させることにより抗原１を磁石によって捕集でき、かつ、標識化された状態（サンドイッチ形成させた状態）にした後、磁石25を容器の周囲に配置させて抗原１を容器内に保持する。そして、この状態で洗浄することにより、容器内の未反応の標識抗体３をバッファと共に除去する工程
（７）リン酸二水素カリウム（KH2PO4）などの電解液にTPA（Tripropylamine）などの電気化学発光補助物質を含ませてなる電気化学発光（ECL）電解液を供給して測定液を作る工程
（８）測定液に電流を通じて電極反応を生じさせ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質15からの発光を検出する工程を含んでいる。
ここで、上記工程（８）において行われる電気化学発光の発生原理を図16について説明すると、次のようになっている。即ち、抗原１に結合した標識抗体３に保持されている電気化学発光物質７である例えばRu（bpy）32+は、陽電極30上で酸化されてRu（bpy）33+となる。また、電気化学発光補助物質31として電解液中に含まれている例えばTPAは、陽電極30上で酸化されて陽イオンラジカルTPA＋＊となり、更にプロトン（−H+）を失って、還元状態のラジカルTPA＊となる。そして、このラジカルTPA＊から電子が与えられることにより、前記Ru（bpy）33+は、２価の励起状態であるRu（bpy）３２＋＊になって、概略620nmの波長のホトン（光子）32を放出し、再び基底状態のRu（bpy）32+に戻ることとなる。そして、ホトン32の放出と共にTPAは消費されるが、TPAはRu（bpy）32+に比べて過剰に存在するので速やかに補給され、基底状態のRu（bpy）32+は、図16に示すような反応循環を行い、こうして電気化学発光物質７であるRu（bpy）32+は、繰り返し励起されてホトン32を次々に放出するのである。
従って、陽電極30上で励起されたRu（bpy）３２＋＊から放出されたホトン32を光電子増倍管などの光検出器を用いて検出することによって、その光量から測定液中に含まれる抗原１を検出し、定量することができる。かかる電気化学発光を利用した検出方法は、化学発光法（CL法）等による測定方法に比べて測定液の調製が容易であるだけでなく、より高度な検出が可能な方法であり、微量物質の検出法として臨床医学面などの分野において大きな期待を寄せている。
以上のような電気化学発光を利用して検出を行うための装置は、国際公開番号US90/01370において明らかにされている。図17に、従来の一般的な電気化学発光検出装置40の構成の概略を示す。該装置40において、本体41の内部にセル42が設けられる。このセル42に送液管43と排液管45が接続され、図示しない送液手段によって測定液がセル42内に導入される。セル42内に導入される測定液は、上記工程（７）において作られた測定液、即ち、抗体結合磁気ビーズ２と標識抗体３を用いてサンドイッチ形成させられた抗原１を含む電解質からなる測定液である。
セル42の底面44に電気化学発光を発生させる際に陽電極となる作用電極46が設けられ、セル42の上面48に電気化学発光を発生させる際に負電極となる対抗電極47が設けられる。これら作用電極46と対抗電極47の間に所定の電位差の電圧を印加することによってセル42内において電極反応が行われる。そして、この電極反応において、陽電極となった作用電極46の面上で電気化学発光が発生する。
セル42の上面48は、例えばアクリルやガラスなどの光を透過させる部材で構成される。そして、この上面48の上方には、測定液が電極反応することによって作用電極46の面上に生ずる電気化学発光を検出して電気信号に変換する光検出器としての光電子倍増管（PMT）50が近接して配置される。
排液管45の途中には、作用電極46と測定液との電位差を検出するための第三の電極である参照電極51が設けられる。ここで、参照電極51として最も一般的に用いられている銀−塩化銀電極についてその構造を説明すると、参照電極51の内部には塩化銀電極52があり、この塩化銀電極52と排液管45中の測定液が、液絡部（多孔質隔壁）53、塩橋（KCl溶液）55、液絡部（細孔）56、及び電解液（KCl溶液）57を介して連絡している。
以上のように構成された電気化学発光検出装置40において、セル42に送液管43を介して測定液が導入された状態で、セル42の底面44に設けられた作用電極46と対抗電極47の間に所定の電位差の電圧が印加され、セル42内において電極反応が行われる。そして、この電極反応により、陽電極である作用電極46の面上で電気化学発光が発生する。こうして発生した光はセル42の上面48を通過し、光電子倍増管50で検出されて電気信号に変換され、処理される。かくして、電気化学発光によって発生する光の量が測定液中の抗原１の量に比例することから、測定液を電極反応させて光らせてその光を検出すれば、測定液に含まれた抗原１を検出、定量することが可能となる。
［技術的課題］
ところで、以上のような電気化学発光を利用した定量を実施するにあたっては、電気化学発光の発生条件を所定のものとして、各測定毎に得られた検出値同士を比較できるようにしなければならない。そのためには測定液中で行われる電極反応を制御し、作用電極46と対抗電極47の間で再現性ある電解が行われるようにしなければならない。
以上のような電極反応は目的とする反応が行われる電極と溶液との界面で行われる。そこで、先に挙げた特表平２−501749号や特公平７−6913号等の先行技術においては、これら電極と溶液との界面の電位を制御するために、図18に示すように、参照電極51を用いて測定液と作用電極46との電位差を検出し、制御しており、それによって一応の成果を達成している。
ところが、この参照電極を用いて電位差を制御する方法は、従来の一般的な電気化学的分析とは大きく手法を異にしている。即ち、従来の一般的な電気化学分析法では、電極反応によって変化する化学種の質や量を、電極電位や電極に流れる電流、もしくはそれらの時間的変化などに基づいて分析している。（なお、K.Yamasita、他らによるJ.AnaI  Chem、Vol  63、No.9、872−876、1991には、分析物を電気化学的作用により直接変化させて発光を見ようとするECLが開示されている。また、Egashira  N.他らによるAnal  Sci.Vol  ６  No.6、903−904、1990には、ラベルしないフリーのRu錯体を用いて電解液中のペルオキソ硫酸塩や蓚酸を定量するためのECLが開示されている。）しかし、特表平２−501749号や特公平７−6913号等のECLでは、微量の分析物を検出するために、Ru標識した分析物に対して著しく大量の電気化学発光補助物質（TPA）を用いる。このTPAの濃度は、例えば10-1M程度である。これに対して、その存在量を検知しようとするラベルされたRu化合物の存在濃度範囲は高々10-8〜10-12Mにすぎない。従って、電極反応の殆どはTPAの酸化に費やされ、Ru化合物を二価から三価へ酸化させる電極反応は、（その反応自体は重要ではあるものの）電極反応の中心ではない。このように、分析対象物であるRu化合物を電解する電気量は、その量の１千万倍以上の圧倒的量のTPAを酸化させる電気量に隠れてしまうことになる。先に挙げた特表平２−501749号や特公平７−6913号等の先行技術においては、再現性を得るためには、電解液中に多量に含まれているTPAを、測定の都度均一に、しかも効率良く酸化させるといった、従来の電気化学分析的方法では行なわれていない制御を行う必要があるが、電位を制御する方法では、電流量はその時の電極セル内の状態に左右されるため、厳密な再現性を得難い。また、多量の電気量を必要とするECLでは流れる電流量も多く、溶液の持つ抵抗成分によって電圧ドロップが起き溶液内で電位勾配が発生する。そして、電流が流れていないか、あるいは流れていても電位勾配の発生が無視できるような場合は別として、電位差を制御する方法では、対抗電極47や作用電極46の配置や、電極の構造の違い、運転状態や電極の局部状態による電位分布の変化に起因して、再現性を得るためには電極の運転サイクル全体にわたる電位の設定に高度な調整と熟練が必要となってしまう。
また、先に挙げた特表平２−501749号や特公平７−6913号等のような電位を制御する方法は、参照電極51、特に参照電極51内の電解液57の損耗といった解決課題も有している。即ち、図17において説明したように、参照電極51内の電解質57とセル42内の測定液とは塩橋55を介して繋がっており、このため、参照電極51内の電解液57が少しづつではあるが漏失してしまう。この問題を防ぐために、塩橋55に寒天を加えるなどといった改良策もあるが、漏失を完全には防ぐことはできない。
その他、参照電極51は電位を検出するものであって、参照電極51には電流が流れないとされているものの、様々な要因により塩化銀電極52に微弱電流が流れることを完全には防止できない。従って、長い間検出を行っていると塩化銀電極52表面の塩化銀皮膜が消失し、基準電位を検出できなくなる。このため、安定した検出を長期間に渡って保証するためには、電解液55の補充、消失した塩化銀の塩化銀電極52表面への再付着、または参照電極51自体の交換といったメンテナンスが必要になるといった課題もある。
本発明の目的は、従来必須とされていた参照電極を用いずに、再現性の高い電気化学発光検出方法と装置を提供することにある。
［発明の開示］
かかる課題を解決するために、本発明においては、電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液をセル内に導入して電極反応させ、該電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出する方法において、測定液に供給する電流の電流値を制御することを特徴とする電気化学発光検出方法が提供される。
また、この方法を実施するための好適な手段として、電気化学発光物質と電気化学発光補助物質とを含む電解質からなる測定液が導入されるセル内に電極が設けられ、該セル内における電極反応で生じたイオンの消滅反応により励起された電気化学発光物質からの発光を検出するための光検出器を備えるものであって、測定液に供給する電流の電流値を制御するための制御手段を備えていることを特徴とする電気化学発光検出装置が提供される。
なお、電気化学発光物質は、次式（１）または（２）で示されるRu（bpy）32+、次式（３）で示されるRe錯体（ここで、（３）式中、ｎは整数であって好ましくは２または３、ｍは１、２または３であって好ましくは１、ＷはCHO、COOH、NH2またはBr、Ｒは陰イオンである）、次式（４）で示されるオスミウム（Os）錯体などが好適に用いられる。
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また、電気化学発光補助物質は、TPA（Tripropylamine）やTEA（Trietyl amine）などが好適に用いられる。
また、光検出器は、光電子倍増管やホトダイオードなどが好適に用いられる。
以上のような本発明によれば、電気化学発光を発生させる際の電極反応を制御するために従来必須とされていた参照電極を取り去ることができ、また、ブランク発光を低減した分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明にかかる電気化学発光検出装置の説明図である。図２は、本体の分解図である。図３は、本体を構成する底面の断面図である。図４は、本体を構成する上面の断面図である。図５は、電流値を制御する場合の測定回路図である。図６は、実験例１において電位差を制御した場合の発光強度の経時的変化を示すグラフ図である。図７は、図６の低レベル域における電解液のブランク発光の状態を拡大して示したグラフ図である。図８は、実験例１において電流値を制御した場合の発光強度の経時的変化を示すグラフ図である。図９は、図８の低レベル域における電解液のブランク発光の状態を拡大して示したグラフ図である。図10は、実験例１において電流値を制御した場合の時間に対する電流値の変化の一例を示すグラフ図である。図11は、実験例１において電位差を制御した場合の時間に対する電位差の変化の一例を示すグラフ図である。図12は、実験例１において電位差を制御した場合における制御電圧と、測定された電流値の関係を示すグラフ図である。図13は、電気化学発光を利用して抗原を検出する方法の基本原理の説明図である。図14は、電気化学発光を利用して抗体を検出する方法の基本原理の説明図である。図15は、電気化学発光を利用した検出方法の工程説明図である。図16は、電気化学発光の発生原理の説明図である。図17は、従来の一般的な電気化学発光検出装置の構成の概略図である。図18は、参照電極を利用した測定回路図である。
［発明を実施するための最良の形態］
図１は、本発明の方法を実施するために好適に利用される電気化学発光検出装置60を例示している。該装置60において、本体61の内部にセル62が設けられる。なお、この本体61の分解図を図２に示す。本体61は、中央に平面視で木の葉形状をした空間部（セル）62を有するスペーサ65と、このスペーサ65の上面に密着してセル62の上方を塞ぐ上面66と、スペーサ65の下面に密着してセル62の下方を塞ぐ底面67とを供える。底面67には、セル62内に測定液を流通させる接続口69a、69bが形成されている。そして、これらスペーサ65、上面66、及び底面67とを重ねることによりセル62が構成される。
セル62には、底面67に形成された接続口69a、69bを介して送液管68と排液管70が接続され、排液管70にはポンプ71が装着される。ポンプ71は例えばチューブポンプで構成され、このポンプ71の稼働によって測定液が送液管68からセル62内に導入された、また、セル62内の測定液が排液管70から排出される。セル62内に導入される測定液は、先に図15で説明した工程（７）において作られた測定液、即ち、抗体結合磁気ビーズ２と標識抗体３を用いてサンドイッチ形成させられた抗原１を含む電解質からなる測定液である。
セル62の底面67には陽電極である円板形状の作用電極72が設けられる。図３に示すように、底面67の上面中央に形成された凹部72aに作用電極72を上から嵌入して、作用電極72を固定している。作用電極72は、金、白金、ニッケル等の金属、炭素などの導電材料からなる。また、この作用電極72の下方において底面67の下面に形成された凹部72bには、図１に示すように、アーム73の先端に取り付けられた磁石75が嵌入自在である。アーム73は軸76を中心に回動し、アーム73が上昇すると磁石75が作用電極72下方の凹部72bに嵌入した状態となり、アーム73が下降すると磁石75が作用電極72下方の凹部72bから退避した状態となる。
セル62の上面66には、作用電極72の上方において左右両側に位置する一対の対抗電極77が設けられる。図４に示すように、対抗電極77は、上面66の下面に形成された凹部79にそれぞれ嵌入固定される。この対抗電極77も、作用電極72と同様に導電材料からなる。この対抗電極77と上記作用電極72の間に給電装置78によって電圧が印加され、セル62内の測定液に所定の電流値の電流が流れることにより、電極反応が行われる。そして、この電極反応が行われる際に陽電極となる作用電極72の面上で電気化学発光が発生する。セル62内の測定液中を流れる電流の電流値は、抵抗Ｒを流れる際に測定され、給電装置78に入力される。また、給電装置78には、セル62内の測定液中に流す電流の電流値を制御するための制御信号が入力される。
セル62の上面66中央は、例えばアクリルやガラスなどの光を透過させる部材で構成され、作用電極72の面上で発生した電気化学発光は、左右一対の対抗電極77の間からセル62の上面66中央を介して上方に透過される。そして、この上面66の中央上方には、測定液が電極反応することによって作用電極72の面上に生ずる電気化学発光を、対抗電極77からセル62の上面66中央を介して検出し、電気信号に変換する、光検出器としての光電子倍増管（PMT）80が近接して配置される。なお、セル62を構成する他の部材であるスペーサ65及び底面67などは、上面66中央と同様にアクリルやガラスなどで構成しても良いが、スペーサ65及び底面67は光透過性は要求されないので、テフロンなどの汚れ難い材料で構成しても良い。
また、図示はしないが、本体61全体は暗箱などの遮蔽手段によって覆われており、セル62内の電気化学発光で発生した光以外の光は、光電子倍増管80には一切入らないように構成してある。
さて、以上の如く構成された検出装置60においては、先ず測定に先立って、セル62内にクリーニング液（アルカリ液）が導入される。このクリーニング液の導入は、クリーニング液が入った図示しない容器等に送液管68の先端を投入した状態でポンプ71を稼働することにより行われる。これにより、セル62の内面が洗浄されると共に、セル62の底面67に設けられた作用電極72の表面と、セル62の上面66に設けられた対抗電極77の表面が洗浄され、後の電極反応が良好に行われるようになる。
洗浄終了後、先ずセル62内のクリーニング液が電解液と入れ替えられて、アーム73が上昇し、磁石75が作用電極72の下方に嵌入した状態となる。そして、ポンプ71が稼働してセル62内へ一定量の測定液が電解液と共に導入される。
ポンプ71の稼働によって測定液は電解液と共に送液管68からセル62内に導入され、更に排液管70から排出される。こうして、抗原１を含んでいる測定液が電解液と共にセル62内を連続的に流動されると、抗体結合磁気ビーズ２が磁石75の磁力で吸着されることにより、測定液中に含まれている抗原１は作用電極72の表面に捕集される。こうして、所定量の測定液がセル62内を通過したら、ポンプ71の稼働を停止させ、電解液の導入を終了させる。次いで、アーム73が下降して磁石75が作用電極72の下方から退避した状態となる。
こうして、セル62内は測定液である電解質によって満たされ、かつ、所定量の測定液中に含まれていた抗原１が作用電極72の表面に捕集された状態となる。
この状態において、給電装置78によって作用電極72と対抗電極77との間に電圧が印加され、セル62内の測定液に、制御信号に基づく所定の電流値の電流が流されて電極反応が開始する。また、セル62内の測定液中を流れる電流の電流値は、抵抗Ｒを流れる際に測定され、給電装置78に入力される。
ここで、セル62内の測定液中を流れる電流の電流値の制御は図５に示すようにして行われる。即ち、セル62内を流れる電流の電流値を抵抗Ｒにより電圧として検出し、増幅器81を介してその出力を誤作動増幅器82の反転入力側に導き、制御信号と対比することにより、測定液中に流す電流値を制御する。例えば抵抗Ｒの抵抗値が10Ωで、増幅器81の増幅度が10倍の場合に、制御したい電流値が1mAであれば、制御信号として100mVを設定する。また、−100mVの制御信号を与えることにより、測定液中に流す電流値を−1mAとすることもできる。
かくして、測定液中に所定の電流値の電流が流されることにより制御された電極反応が行われ、セル62内において、先に図16で説明した反応が生じて、陽電極である作用電極72の近傍で電気化学発光が発生する。こうして発生した光はセル62の上面66を通過し、光電子倍増管80で検出されて電気信号に変換され、処理される。電気化学発光によって発生する光の量が測定液中の抗原１の量に比例することから、測定液を電極反応させて光らせてその光を検出すれば、測定液に含まれた抗原１を検出、定量することが可能となる。なお、こうして電気化学発光を利用した検出、定量が終了した後、再び、ポンプ71の稼働によってセル62内にクリーニング液（アルカリ液）が導入され、セル62内の洗浄が実施される。
［実施例］
次に、実際に電気化学発光を利用して抗原の検出を行い、本発明に従って測定液中の電流値を制御した場合と、従来例のように参照電極と作用電極の間の電位差を制御した場合を比較した。以下に、その実験結果を示す。
（検出装置の構成）
電極は、先に図２において示したものの他に、作用電極として６×6mmおよび６×8mmの白金板からなる電極をセルの下面に配置した。対向電極は、６×3mmの白金板をセルの天井面に作用電極の両側に位置する様に配置した。セルの天井面は、アクリル樹脂板を用い、スペーサは厚さ0.5mmのテフロン製のものとした。作用電極の表面に抗体を捕集させる磁石はφ５×4mmの単極磁石を用いた。送液管68は、内径1.0mmのテフロン製チューブを用い、吸引液量は、0.01〜５ミリリットルの範囲で可変なものとした。光電子倍増管（PMT）は、「ルミノメーター」（ハマホト製Ｒ−1104型PMTを用いたルミノメーター、ゲインが高く、赤色に敏感な光電子倍増管、PMT電圧は、500〜1,100ボルトで可変）を用いた。なお、従来例の比較実験を行うため、銀／塩化銀からなる参照電極を設けた。また、セル内の電流値および電位差は、マイクロプロセッサーを用いて所定の値に制御して検出を行った。
（検出に用いた試薬素材）
電気化学発光物質：次式（１）で示されるRu（bpy）32+
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電解液:112mM  KH2PO4、88mM  K2HPO4・3H2O、50μＭ  NaCl、6.5mM  NaN3、0.8μＭ  トライトンＸ−100、0.4mM  トウイーン20、および100mM  トリプロピールアミンの水溶液。
クリーニング液（アルカリ液）:0.5MのKOH、1.25％トライトンＸ−100を含む水溶液。
Ru（bpy）32+−NHS:ルテニウム（2,2'−バイピリジル）２（４−［３−（1,3−ジオキソラン−２−イル）プロピル］−４−メチル−2,2−バイピリジン）2+
ダイナール粒子：日本ダイナール社から入手した直径4.5μｍの磁気ビーズ。
（電流値制御によるECL測定）
電流値制御によるECL測定周期は、次の三段階からなる。即ち、（１）測定前条件化、（２）測定、および（３）洗浄である。その測定前条件化段階では、電流を0.0mAから＋8.0mAを経て−5.0mAから＋0.1mAへと電流矩形波を適用する操作を含んでいる。また、その測定段階では、10mA/秒の割合で、＋0.1mAから＋8mAを経て、＋0.2mAへと電流三角波を適用する操作を含んでいる。最後の洗浄段階では、＋0.0mAから＋8.0mAを経て、−5.0mAから0.0mAへと電流矩形波を適用する操作を含んでいる。すべての電流は６×5mm寸法の作用電極に流れる電流値に対するものであり、６×8mmに対する電流値は1.6倍その値を大きくした。
（電位差制御によるECL測定）
電位差制御によるECL測定周期も同様に、次の三段階からなる。即ち、（１）測定前条件化、（２）測定、および（３）洗浄である。その測定前条件化段階では、2.0V/秒の割合で、電圧を0.0Vから＋2.2Vを経て−1.0Vから＋0.6Vへと電圧三角波を適用する操作を含んでいる。また、その測定段階では、1.0V/秒の割合で、＋0.6Vから＋2.8Vを経て、＋2.0Vへと電圧三角波を適用する操作を含んでいる。最後の洗浄段階では、＋0.0Vから＋3.0Vを経て、−0.5Vから0.0Vへと電圧矩形波を適用する操作を含んでいる。すべての電圧は、銀／塩化銀の参照電極に対するものである。
（実験例１）
標識した磁気粒子（感作磁気粒子、即ちサンドイッチ形成された状態の抗原のモデル粒子）を用いて、電流値を制御した場合のECL発光と、電位差を制御した場合のECL発光の比較測定を行った。
感作磁気粒子は、次のようにして作製した。即ち、アンコートのＭ−450ダイナビーズ（日本ダイナール社）の30mg（１ミリリットル）を、150mMの燐酸緩衝液（pH7.5）２ミリリットルを用いて磁気分離法で２回洗浄。その後、0.05％チメロサール含有の燐酸緩衝食塩水（PBS）１ミリリットル中にRu（bpy）32+で標識したMouse  IgG（自社エーザイ製）を150μｇを含む溶液を加え、一昼夜、室温で回転混合しながら反応させた。その後溶液と粒子とを磁気的に分離させて、磁気粒子以外の溶液は除去した。さらに、粒子表面に未反応部分がないようにするため、0.05％のアジドナトリウム含有の３％牛血清アルブミン（Bovine  Serum  Alubmine;BSA）/PBSを１ミリリットル加え、室温で２時間にわたって反応させた。感作粒子は、一回２ミリリットルの洗浄液を用いて、五回洗浄し、最後に、保存するために、同じ緩衝液1,000ミリリットル中に再懸濁させ感作磁気粒子を得た。
ECL発光の測定は、次のように行った。即ち、ポンプの稼働によって感作粒子懸濁液200マイクロリットルをセル中に引き入れるに当って、作用電極の表面に感作粒子を補足するために、作用電極下部の磁石を押し上げ、試料が電解液と共に電極セル部に送り込まれた時点で磁石アームを待避させ、電極に計測ステージの電位を印加し、光電子倍増管を用いて発光強度を計測した。
電流値を制御した場合と電位差を制御した場合のそれぞれについて、感作粒子（サンドイッチ形成された状態の抗原）による発光カウントがほぼ等しくなるように条件を調整し、それぞれの場合において発光のピークが認められた時間を中心としてその前後20区間（前後で合計41区間）の発光強度を積算した値を表１に示す。
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計測された発光パターンを図６〜９に示す。先ず、電位差を制御して測定したECL発光の発光パターンの制御電位差と発光強度の関係を、図６に経時的に示した。図７は、低レベル域における電解液によるブランクの発光の状態を拡大して示したものである。図示のように、電位差制御による場合は、ブランク発光は電位変化に追従する様な発光が認められた。
次に、電流値を制御して測定したECL発光の発光パターンの制御電流値と発光強度の関係を、図８に経時的に示した。図９は、図７と同様に、低レベル域における電解液によるブランクの発光の状態を拡大して示したものである。電流制御の場合においても、電位差制御による場合と同様な強度のECL発光が認められた。しかしながら、図９に示す如く、ブランクの発光は非常に低値で、しかも、電位差制御の場合に見られた単峰性のノイズ発光のピークは、電流値制御の場合には全く認められなかった。
感作粒子の発光カウントの再現性（CV）においては、電位制御1.06％に対して電流制御した場合は0.55％と約２倍の改善がなされ、また、計測液のブランク発光は電流値を制御した場合の方が極端に少なく、正規信号に対するノイズの割合（S/N比）では、電位差を制御した場合は220倍であるのに対して、電流を制御した場合は1302倍と、約６倍もS/N比を向上させる効果が認められた。
図10は、電流値を制御した場合の時間に対する電流値の変化の一例を示すものであり、図11は、電位差を制御した場合の時間に対する電位差の変化の一例を示すものである。また、図12に、電位差を制御した場合における制御電圧と、測定された電流値の関係を示した。なお、これら図10〜12において、区間１は測定前の条件化を行っている状態、区間２は測定を行っている状態、区間３は電極の洗浄を行っている状態を示す。図10に示されるように、電流値を制御した場合は、電流の最高値は高々8mAであった。これに対して、電位差を制御した場合は、図12に示されるように、過渡的に17mAと、電流値を制御した場合の二倍強の大きな電流値が示されていることが分かった。電位差を制御した場合に現れるこうした過渡電流は電極面での電界条件が厳密には制御されていないことが示される。また、運転サイクル毎に幾度も流れるこうした過渡電流は電極のエッジ部分に集中する性質を持っているので、過渡電流は電極の磨耗劣化を引き起こし、電極の耐久性が劣るものと予想される。
（実験例２）
電極間の距離を変えた場合のECL発光の電気化学的特性を、電位差を制御した場合と電流値と制御した場合とで比較した。対向電極の電極間隔を6mm、8mm及び10mmと変化させ、それぞれの場合に発光のピークを与える電位差や電流値がどの様に変わるかを比較検討した。実験例１と同様の感作磁気粒子を用い、電位差を制御した場合は発光のピークを与える電位差を、電流値を制御した場合は発光のピークを与える電流値を求め、比較した。表２にその結果を示す。
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電位差を制御した場合は、対向電極の間隔が変わると電位差も変化したが、電流値を制御した場合は各電流値は変化しなかった。
（実験例３）
作用電極の面積を変えた場合のECL発光の電気化学的特性を、電位差を制御した場合と電流値を制御した場合とで比較した。作用電極の幅6mmのものと幅8mmのものについて、電極間隔10mmの対極電極を用い、実験例１の感作粒子を用いて発光のピークを与える電極ドライブ条件を、電位差を制御した場合と電流値を制御した場合とで比較した。表３に示す如く、何れの場合も作用電極の面積が変化することによって電極のドライブ条件は変化したが、電流値を制御した場合は、電流値が電極面積に比例した値であることが分かった。
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［産業上の利用可能性］
本発明によれば、電気化学発光を発生させる際の電極反応を制御するために従来必須とされていた参照電極を取り去ることができるばかりでなく、ブランク発光の少ない良質なECL発光を実現できるようになる。しかも、電位制御では避けられなかった過渡電流を発生させることがないので、電極の損耗も少ない。加えて、参照電極の交換も不要となり、メンテナンス性に優れた装置を提供できる。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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