(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル全長抗ＩＡＰ抗体。
【請求項２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１００が産生するモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１またはＦＥＲＭ  ＢＰ−６１０１が産生するモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起し、かつヒトＩＡＰを認識するモノクローナル抗ＩＡＰ抗体断片。
【請求項４】
抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−６１００が産生するモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−１またはＦＥＲＭ  ＢＰ−６１０１が産生するモノクローナル抗体ＭＡＢＬ−２である請求項３記載の抗体断片。
【請求項５】
Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である請求項３または４記載の抗体断片。
【請求項６】
請求項１記載の抗体を産生する細胞。
【請求項７】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１００またはＦＥＲＭ  ＢＰ−６１０１である請求項６記載の細胞。
【請求項８】
請求項１または２記載の抗体、または請求項３〜５のいずれかに記載の抗体断片を含む白血病治療剤。
【請求項９】
有核血液細胞に発現しているヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）にモノクローナル全長抗体またはモノクローナル抗体断片を結合させることにより、該有核血液細胞にアポトーシスを誘起する方法。
【請求項１０】
以下の工程を含むヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する抗体のスクリーニング方法：
（ａ）ヒトＩＡＰを有する有核血液細胞に被検抗体を接触させる工程、
（ｂ）該細胞にアポトーシスを誘起する抗体を選択する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含むヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する抗体のスクリーニング方法：
（ａ）ヒトＩＡＰを有する有核血液細胞に被検抗体を接触させる工程、
（ｂ）該細胞の増殖を抑制する抗体を選択する工程。
【請求項１２】
フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを誘起する抗体を選択することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
被検抗体がヒトＩＡＰに結合するか否かを測定する工程をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性を有する新規モノクローナル抗体、ならびにその断片、ペプチドおよび低分子化合物、および当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。当該新規抗体は、骨髄性白血病およびリンパ性白血病の治療薬等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、顆粒球コロニー刺激因子、例えば、遺伝子組換え型顆粒球コロニー刺激因子（ｒＧ−ＣＳＦ）は、主に顆粒球系細胞の分化、増殖を促進させる液性因子として知られている。また、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏの実験に基づき、当該ｒＧ−ＣＳＦを投与することにより、骨髄の造血亢進のみならず、脾臓でも著しい髄外造血が起こり造血幹細胞を始めとしてすべての造血前駆細胞が脾臓で増殖することが報告されている。係る脾臓での髄外造血のメカニズムとして、ｒＧ−ＣＳＦの刺激により脾臓の造血微小環境が変化し、造血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであると考えられた。
【０００３】
そこで、本発明者は、当該脾臓での造血機能を解明するため、ｒＧ−ＣＳＦ連投後の脾臓の間質細胞に着目し、間質細胞を介したｒＧ−ＣＳＦによる造血機能亢進の解析を試みるべく、ｒＧ−ＣＳＦを連投したマウス脾臓より造血間質細胞株（ＣＦ−１細胞）を樹立し、係る造血間質細胞を用いてその造血支持能を検討したところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー刺激活性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの造血幹細胞支持能を認めた〔Ｂｌｏｏｄ，８０，１９１４（１９９２）〕。
【０００４】
しかし、当該脾臓間質細胞については、その一部が細胞株（ＣＦ−１細胞）として樹立され、その細胞学的特性の検討等はなされているが、当該細胞表面抗原を認識する特定の抗体を作製することは全く行われておらず、ましてやその特性等については未だ全く知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、脾臓間質細胞株を感作抗原とする、モノクローナル抗体であって、骨髄系細胞にアポトーシスを誘因する特性を有するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、脾臓間質細胞に関する前記知見と、従来の研究結果を踏まえ、脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として鋭意研究し、当該脾臓間質細胞株を感作抗原とするモノクローナル抗体の作製を試み、新規モノクローナル抗体を取得することに成功した。
【０００７】
さらに、前記取得されたモノクローナル抗体の特性について検討し、当該モノクローナル抗体は、骨髄系細胞にアポトーシスを誘起する特性を有するものであることを見い出した。以下、当該モノクローナル抗体をＢＭＡＰ−１抗体と命名し、使用する。
【０００８】
さらに、前記ＢＭＡＰ−１抗体が認識する抗原について検討し、直接発現クローニング（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）により、マウスＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（マウスＩＡＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＺ２５５２４）であることを見出した。
【０００９】
さらに、前記ＢＭＡＰ−１抗体の作用を、マウスＩＡＰを遺伝子導入した組み換え体細胞を用いて検討した。すなわち、マウスＩＡＰを発現していないＪｕｒｋａｔ細胞に、常法によりマウスＩＡＰ遺伝子を導入し、マウスＩＡＰを発現する細胞株（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｃｅｌｌ）  を作製し、Ｂ  ＭＡＰ−１抗体の当該マウスＩＡＰ発現細胞に対する作用をＭＴＳ法およびフローサイトメトリーによるＤＮＡ断片化の検索により検討した（特願平９―６７４９９）。
【００１０】
以上の知見に基づき、ヒトのＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ヒトＩＡＰとする；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２３，４８５−４９６，１９９３にアミノ酸配列および塩基配列は記載；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０８、３４１９ー３４２５、１９９５）を抗原とするモノクローナル抗体は、当該抗原を発現する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを誘起する効果があるとの予想に基づき、本発明者は、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを抗原としてモノクローナル抗体の作製を試み、当該抗原を有するヒト有核血液細胞にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体を得ることに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明は、  ヒトのＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ヒトＩＡＰ）を有する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを誘起させる特性を有する新規モノクローナル抗体およびその断片、更には、当該モノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを提供することを目的とするものである。
【００１２】
係る新規モノクローナル抗体は、骨髄性白血病およびリンパ性白血病の治療薬等として有用である。
【００１３】
さらに、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  の機能  としては、インテグリンのαＶβ３のβ鎖に結合しαＶβ３とそのリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）であるビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）との結合を支持する作用（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３，４８５−４９６（１９９３））、好中球と血管内皮との接着に際し血管内皮にＣａ２＋の流入を誘導する作用（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１９９３１−１９９３４（１９９３））、あるいは好中球が血管内皮を通過することを支持する作用が報告されているが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３９７８−３９８２（１９９５））、有核血液細胞についてのアポトーシスに関する機能は報告されていない。
【００１４】
すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識する抗体である。従って、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎの識別、及び同定する機能を有するものである。
【００１５】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを有する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）のアポトーシスを誘起する特性を示す抗体である。ここで、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、核クロマチンＤＮＡがヌクレオソーム単位で切断（いわゆるラダー・フォーメーション）され、その結果、細胞を死に至らしめる現象で、細胞自滅とも云われる現象である。
【００１６】
従来、有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを誘起する特性を有するモノクローナル抗体として知られているものに、抗Ｆａｓ抗体（Ｃｅｌｌ，６６，２３３−２４３，１９９１）、抗ＣＤ４３抗体（Ｂｌｏｏｄ，８６，５０２−５１１，１９９５）、抗ＨＬＡ  ＣｌａｓｓＩα１  Ｄｏｍａｉｎ（Ｂｌｏｏｄ，９０，７２６−７３５，１９９７）抗体等があるが、本発明に係る、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを認識する抗体が有核血液細胞にアポトーシスを誘起する特性については全く知られていない。従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識可能な抗体であり、また、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを有する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを誘起する特性を有するすべてのモノクローナル抗体を包括するものとして定義される。
【００１７】
さらに  本発明に係る抗体は、すべての有核血液細胞にアポトーシスを誘起するもののみには限定されない。少なくとも一種の有核血液細胞にアポトーシスを誘起するものも含まれる。具体的には、骨髄性白血病ならば少なくとも骨髄系細胞にアポトーシスを誘起すればよい。
【００１８】
より詳しくは、本発明は、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起するモノクローナル抗体を提供するものである。
【００１９】
さらに、本発明は、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を有する有核血液細胞にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起するモノクローナル抗体断片、ペプチド、および低分子化合物を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
【００２１】
さらに、本発明は、ＩＡＰに結合してＩＡＰの作用を亢進させ、有核血液細胞にアポトーシスを誘起する物質を含有する抗白血病治療剤を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、上記の物質がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗白血病治療剤を提供するものである。
【００２３】
さらに、本発明は、上記の物質がモノクローナル抗体断片、ペプチド、低分子化合物であることを特徴とする抗白血病治療剤を提供するものである。
【００２４】
【発明の実施の形態】
モノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体は、一般的には次のようにして作製することができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを感作抗原とし、当該抗原を通常公知の免疫法を応用して免疫し、通常公知の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常公知のクローン化法を応用してクローン化することにより可能である。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体の作製方法には、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎをマウス白血病細胞株Ｌ１２１０細胞に発現させた組み換え体細胞を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前記細胞株を認識する本発明の抗体を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。
【００２６】
なお、本発明においては、上記方法はあくまで一例に過ぎず、例えば、この場合、前記感作抗原としては、前記Ｌ１２１０組み換え体細胞に限らず、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）そのもの、あるいは可溶化型のヒトＩＡＰを使用することも適宜可能であり、前記Ｌ１２１０組み換え体細胞の場合と同様にして、目的とする有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを誘起するモノクローナル抗体を作製することが可能である。
【００２７】
また、当該抗体のｃＤＮＡライブラリーからファージ・ディスプレイ法を用いて目的とするモノクローナル抗体を作製することも可能である。
【００２８】
このようなモノクローナル抗体の作製方法において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター等が好適なものとして使用される。
【００２９】
また、免疫は、一般的方法により、例えば、前記ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを発現するＬ１２１０組み換え体細胞等を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することに好ましく実施可能である。より具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを、動物に１０日毎に数回投与することが好ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。
【００３０】
次に、前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７８）〕、Ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
【００３１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）の方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができる。
【００３２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に、所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００３３】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００３４】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常、数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実施される。
【００３５】
このようにして作製される本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００３６】
当該ハイブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した方法である。
【００３７】
更に、前記した方法により得られる抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製することができる。
【００３８】
モノクローナル抗体断片
本発明に係るモノクローナル抗体は、上記説明した抗体の全部でもまた、その一部であってもよい。すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体の一部であって、さらには、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識するものであり、また、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを有する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを惹起するものであればよい。係る断片は例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’が挙げられる。さらに、係る断片の作製はパパイン、ペプシ  ン、フィシン等の酵素消化により可能である。得られた断片の特性は上記説明した同様の方法で確認可能である。
【００３９】
モノクローナル抗体と同様の作用を有するペプチドおよび低分子化合物
上記モノクローナル抗体は、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを認識し、有核血液細胞にアポトーシスを誘起するが、同様にＩＡＰを認識し、有核血液細胞にアポトーシスを誘起するペプチドおよび低分子化合物も包含するものである。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体の特性
本発明のモノクローナル抗体は、後記する実施例において具体的に示されるように、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識するものである。
【００４１】
さらに、本発明のモノクローナル抗体はヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを有する有核血液細胞（骨髄系細胞およびリンパ球）にアポトーシスを惹起するものである。
【００４２】
また、係る特性を利用することにより、骨髄性白血病およびリンパ性白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得るものである。
【００４３】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体を利用して有核血液細胞にアポトーシスを引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、これらを識別、同定するための、あるいは、当該モノクローナル抗体の固有の特性を利用して骨髄性白血病およびリンパ性白血病治療薬剤等として使用するための具体的システムの構築、その改変および応用等は、当業者にとって自明の通常の方法を応用して実施されるものである限り、いずれも本発明の範囲に含まれるものであることは云うまでもない。
【００４４】
抗白血病治療剤
本発明に係る抗白血病治療剤は、ＩＡＰの作用が本発明に係る抗体等の結合により亢進することに基づくものである。また、本発明に係る抗体の投与量については特に制限はないが、５μｇ−５００ｍｇ／ｋｇの範囲であることが好ましい。
【００４５】
実施例
次に、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１（モノクローナル抗体の作製）
（１）  感作抗原と免疫法
感作抗原として、ＤＢＡマウス由来の白血病細胞株Ｌ１２１０細胞（ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２１９，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１０：１７９−１９２，１９４９）にヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を高発現した細胞株を用いて抗原感作を行った。
【００４７】
ヒトＩＡＰの遺伝子は、ＨＬ−６０細胞株のｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より作製したｃＤＮＡを鋳型としてヒトＩＡＰ特異的な塩基配列を持つプライマー（センス・プライマーとしては、ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＡＧＣＧを、アンチセンス・プライマーとしては、ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧを使用した。）を用いたＰＣＲによりヒトＩＡＰを増幅した（図１）。
【００４８】
このＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）に組み込み大腸菌ＪＭ１０９（タカラ社製）にトランスフォーメーションし、ＩｎｓｅｒｔＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，ＡＢＩ社製）にて確認後、発現ベクターｐＣＯＳ１に組み換えた。
【００４９】
発現ベクターｐＣＯＳ１は、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１８，５３２２，１９９０）のデリバティブであり、ヒトエロンゲーション・ファクター−１αをプロモーター／エンハンサーとして使用しネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだベクターである。このヒトＩＡＰを組み込んだ発現ベクターをＬ１２１０細胞株にＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入しＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）により選択し、さらに、遺伝子が導入されたＬ１２１０細胞は限界希釈法により細胞をクローニングした。
【００５０】
得られたクローンについて、ヒトＩＡＰを認識する抗ＣＤ４７抗体（ファーミンジェン社製）で抗原の発現を検討し、発現量の高いクローンを抗原感作の細胞として選択した（図２，３）。この組み換え体Ｌ１２１０細胞の培養条件は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を培地として使用し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃の温度条件下で継代培養を行った。
【００５１】
免疫動物としては、Ｌ１２１０細胞と同系マウスであるＤＢＡ／２マウス（日本チャールズリバー繁殖）を使用した。抗原感作に使用したヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を遺伝子導入したＬ１２１０細胞は、マイトマイシン−Ｃ（協和発酵社製）２００μｇ／ｍｌの濃度で約３０分インキュベーションし細胞の増殖を止めた後、マイトマイシン−Ｃを完全に洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。
【００５２】
この細胞を約５×１０６個の細胞数で約１０日前後の間隔で３回上記のマウス腹腔内に注射し免疫した。３回免疫後に眼窩より血液を採取しその血清を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０倍希釈し、この血清希釈液と抗原感作に用いた組み換え体Ｌ１２１０細胞との結合性をＦＡＣＳｃａｎ（べクトン・ディッキンソン社製）により確認し（図４）、活性の最も高い個体について、４回目の免疫のさらに５日後に約１×１０７個細胞を腹腔内に投与し追加免疫を行った。最終免疫４日後にマウスを屠殺して脾臓を摘出した。
【００５３】
（２）細胞融合
上記のマウスから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細胞を遠沈した後、ＩＭＤＭ培地中に懸濁し、浮遊させ、充分に洗浄を行った。一方、マウス・ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｕ１〔  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−ｂ  ｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）  〕  を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含有するＩＭＤＭ培地にて培養し、同様に前記ＩＭＤＭ培地で洗浄後、その１×１０７個と、前記脾細胞５×１０７個とを遠心管に入れ混合し、ポリエチレングリコール４０００（半井化学社製）によって常法〔Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従い細胞融合させた。
【００５４】
次いで、得られた融合細胞を、１０％ＦＢＳおよび融合細胞の増殖刺激剤（ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１，ベーリンガー・マンハイム社製）を含むＩＭＤＭ培地にて懸濁し９６個のウエルプレートに分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。翌日にＨＡＴ選択培地および増殖刺激剤を含む１０％ＦＢＳ・ＩＭＤＭ培地に置換して培養を継続し、増殖維持させた。
【００５５】
次に、このようにして得られた融合細胞についてその培養上清の機能を白血病細胞株を用いて検討するため、融合細胞の培地を１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地に代え、培養を継続し増殖維持させた。
【００５６】
（３）スクリーニング
上記の融合細胞の培養上清を用いて以下のスクリーニングを行った。
【００５７】
▲１▼        一次スクリーニング
ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｉｎ（ＩＡＰ）の遺伝子を遺伝子導入したマウス脾臓間質細胞株（ＣＦ−１細胞）（抗原感作に用いたヒトＩＡＰを発現するＬ１２１０細胞を作製する際使用したプラスミドと同一のプラスミドを遺伝子導入し組み換え体細胞とした）を９６ウェルプレートに１ｘ１０４／ウェルで播種し終夜で培養し、その後２％ＰＬＰ  （ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）により固定しＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。このプレートは、洗浄後１％ＢＳＡ溶液にて室温で１時間ブロッキングし、さらに洗浄後各種ハイブリドーマの培養上清を５０μｌ添加し室温で１時間インキュベーションした。  洗浄後、アルカリフォスファターゼでラベルした抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（Ｈ＋Ｌ）（ザイメッド社製）を添加し室温で１時間インキュベーションし、洗浄後ＳＩＧＭＡ  １０４  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（シグマ社製）を最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加し室温でインキュベーションし、比活性をマイクロプレート・リーダー（Ｍｏｄｅｌ  ３５５０，  バイオラッド社製）で測定した。
【００５８】
その結果、ハイブリドーマを２８８０ウェルに播種しその内２０８９ウェルにハイブリドーマの出現を確認し１８７ウェルが一次スクリーニングで陽性であった。なお、陰性対照としては、マウスＩｇＧ１を、陽性対照としては抗ヒトＣＤ４７抗体（ファーミンジェン社製）をそれぞれ、３μｇ／ｍｌ濃度で５０μｌ添加し室温で１時間インキュベーションした。
【００５９】
▲２▼        二次スクリーニング
一次スクリーニングで陽性と判定したクローンについて、発現ベクターｐＣＯＳ１  のみを遺伝子導入したＣＦ−１細胞を対照として、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を発現するＣＦ−１細胞を用いてのＥＬＩＳＡ系を行うことで、ハイブリドーマが産生する抗体がヒトＩＡＰを特異的に認識するか否かをスクリーニングした。
【００６０】
その結果、一次スクリーニングで陽性と認められた１８７ウェルの内２１ウェルについて陽性が認められた。これらのうち、７Ｄ２および１１Ｃ８を代表例として、ヒトＩＡＰとの特異的結合をＥＬＩＳＡの吸高度で表１に示した。
【００６１】
0003568398.tif 000002
▲３▼        三次スクリーニング
二次スクリーニングで陽性と判定したクローンについて、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞リンフォーマ株）およびＡＲＨ７７細胞（ヒトミエローマ細胞株）を用いて増殖抑制実験を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞は５Ｘ１０３／ウェルで、ＡＲＨ７７細胞は１Ｘ１０４／ウェルの細胞数で９６ウェルプレートに１００μｌで播種  し、この細胞の浮遊液に上記のハイブリドーマ・クローンの培養上清を５ないし１０μｌ添加し、約２日間培養後ＭＴＳにより細胞数を測定した。対照としては、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地および一次スクリーニングで陰性であったクローン（８Ｇ２および９Ｃ５）の培養上清をそれぞれ５または１０μｌずつ添加した。
【００６２】
その結果は、１１Ｃ８、７Ｄ２−Ｅ３（７Ｄ２のサブ・クローン）、１３Ｆ１、２Ｆ１２の４クローンを代表例として増殖抑制効果を図５，６に示した。
【００６３】
（４）抗体の特性
▲１▼  １１Ｃ８，７Ｄ２−Ｅ３、１３Ｆ１，２Ｆ１２の培養上清について、イムノグロブリンのタイプをＥＬＩＳＡ系を用いて検討した。
【００６４】
すなわち、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を発現するＣＦ−１細胞を９６ウェルプレートに播種しＥＬＩＳＡプレートを作製し上記の培養上清を５０μｌ添加し、二次抗体としてはアルカリフォスファターゼでラベルした抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメッド社製）および抗マウスＩｇＭ抗体（バイオソース社製）を反応させ、マイクロプレート・リーダーで測定した。その結果、１１Ｃ８，７Ｄ２−Ｅ３はＩｇＧであり、１３Ｆ１，２Ｆ１２はＩｇＭであった。
【００６５】
▲２▼  上記の４クローンの内１１Ｃ８，７Ｄ２−Ｅ３の２クローンについて、ＤＮＡの断片化をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・ディッキンソ  ン社製）でＪｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞を用い解析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いては１１Ｃ８および７Ｄ２−Ｅ３について、ＨＬ―６０細胞を用いては１１Ｃ８について検討した。
【００６６】
１２ウェルのプレートに、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＨＬ−６０細胞をそれぞれ４Ｘ１０４／ウェル／２ｍｌで播種し、７Ｄ２−Ｅ３および１１Ｃ８の培養上清  を２００μｌを添加し２日間培養後、測定に供した。対照としては、８Ｇ２の培養上清を同等量添加した。細胞を培養プレートより回収し２００ｘｇで細胞ペレットを２ｍｌの冷７０％エタノール中に４℃で６０分間固定した。次いで、細胞を遠心し、１ｍｌのＰＢＳ中で洗浄後、０．５ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。この０．５  ｍｌの細胞サンプルに対して０．５ｍｌのＲＮＡｓｅ（ＴｙｐｅＩ−Ａ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，ＵＳＡ，１ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を加え、次いで、１ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ，  １００μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）溶液に混合した。混合した細胞は暗所で３７℃で６０分間インキュベーションした後、４℃の暗所に保持し、フローサイトメトリーによる測定に供した。
【００６７】
その結果、図７〜９，１０〜１１に示す様に、７Ｄ２−Ｅ３および１１Ｃ８の培養上清は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に、１１Ｃ８の培養上清はＨＬ−６０細胞に対しアポトーシスを起こしている細胞の比率を上昇させることが認められた。
【００６８】
▲３▼  上記の１１Ｃ８の培養上清について、ヒト骨髄間質細胞株ＫＭ１０２細胞フィーダーレイヤーとしてＨＬ―６０細胞との共培養系で、これらの培養上清がＨＬ―６０細胞にアポトーシスを起こすか否かを検討した。
【００６９】
すなわち、２ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（ナルジェ  ヌンク  インターナショナル社製）にＫＭ１０２細胞を播種しｓｕｂ―ｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態にし、この上に１ｘ１０５個のＨＬ―６０細胞を播種し約  １日培養し、その後接着していないＨＬ―６０細胞を除去し同時に上記の培養上清を最終濃度で１０％となるように添加し２日間培養した。培養後、細胞を１０％ホルマリンで固定し、ＴＵＮＥＬ法（ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｌｕｓ（Ｏｎｃｏｒ社製））によりアポトーシスを起こしているＨＬ―６０細胞を検出した。その結果、図１２，１３に示す様に１１Ｃ８の培養上清では、対照のヒトＩＡＰと反応しないハイブリドーマクローンの培養上清９Ｃ５に比べアポトーシスになっているＨＬ―６０細胞の数は増加していることが観察された。
【００７０】
（５）抗体の精製
ハイブリドーマが産生する抗体の精製については、上記のハイブリドーマ株のうち、ＩｇＧを産生する７Ｄ２−Ｅ３および１１Ｃ８のクローンの細胞株を、常法に従いプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／ｃ／ＡｎＮＣｒｊマウス（♂，日本チャールズリバー社製）に腹腔内注入した。数週間後、産生された腹水を採取し産生される抗体を常法により分離し精製した。すなわち、得られた腹水はポロス  プロテインＡ  プラスチックカラム（パーセプティブ・バイオシステム社製）で精製し、ＰＢＳ（ダルベッコ社製）で透析しＳＤＳ−ＰＡＧＥによりバンドの確認を行った。  図１４に示すごとく、標品のマウスＩｇＧ（カペル社製）を対照として電気泳動を行うと、７Ｄ２−Ｅ３および１１Ｃ８のクローンのＩｇＧは、非還元条件、還元条件ともに、標品のマウスＩｇＧと同一の位置にバンドが認められた。
【００７１】
上記の実施例においては、感作抗原として、前記ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）を発現するＬ１２１０細胞を使用した場合について例示したが、他のヒトＩＡＰを発現する細胞あるいはヒトＩＡＰそのものを使用した場合にも同様にしてモノクローナル抗体を作製すること、さらに、ファージ・ディスプレイ法を用いての抗体ライブラリーからのモノクローナル抗体の作製も可能であり、本発明は前記モノクローナル抗体に限らず、それと同様の特性を有するすべてのモノクローナル抗体、および当該モノクローナル抗体を産生するすべてのハイブリドーマを包含するものである。
【００７２】
さらに、上記のモノクローナル抗体の発明には、ヒト型化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、プライマテイズド抗体、さらに、抗体を各種酵素（パパイン、ペプシン、フィシン等）により消化した抗体の断片を含むものとする。
【００７３】
本発明のモノクローナル抗体の抗ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）抗体を産生するハイブリドーマは、ＤＢＡ系マウス脾細胞とマウス・ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｕ１を親細胞として作製された新規な融合細胞であり、公的微生物寄託機関である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、１９９７年９月１１日、抗ＩＡＰ抗体（マウスハイブリドーマ  １１Ｃ８−Ｆ８（１１Ｃ８のサブクローン），ＭＡＢＬ−１と命名した）、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１００、抗ＩＡＰ抗体（マウスハイブリドーマ  ７Ｄ２−Ｅ３（７Ｄ２のサブクローン）、ＭＡＢＬ−２と命名した）、受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−６１０１として国際寄託されている。
【００７４】
実施例２（ＭＡＢＬ−１、ＭＡＢＬ−２抗体のサブクラス決定）
上で得られたＭＡＢＬ−１、およびＭＡＢＬ−２抗体のサブクラスを決定する目的で、１００ｎｇ／ｍｌに調製したＭＡＢＬ−１、およびＭＡＢＬ−２抗体５００μｌを、ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ  ＫＩＴ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にスポットしたところ、ＭＡＢＬ−１はＩｇＧ１、κであり、ＭＡＢＬ−２はＩｇＧ２ａ、κであることが明らかとなった。
【００７５】
実施例３（ヒトＩＡＰを発現するヒト白血病細胞）
ヒトＩＡＰを認識する抗ＣＤ４７抗体（市販品を使用した）で各種ヒト白血病細胞株におけるＩＡＰの発現をフローサイトメトリーで検索した。ヒトＩＡＰはＣＤ４７と同一と考えられていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，３０４，  ５２５−５３０，１９９４）、上記の抗体を検索に用いた。細胞株としては、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｋ５６２細胞、ＡＲＨ７７細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＣＭＫ細胞を用いた。細胞は、２ｘ１０５／サンプルとし、抗ＣＤ４７抗体は最終濃度で５μｇ／ｍｌで細胞とインキュベートし、二次抗体はＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を使用した。また、コントロールとしてはマウスＩｇＧ１抗体（ザイメット社製）を使用した。フローサイトメトリーの結果は、図１５（ＨＬ−６０）及び図１６（Ｊｕｒｋａｔ）に示され、いずれの細胞株もＩＡＰを発現していることが明らかとなった。
【００７６】
実施例４（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシス効果）
（１）ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞を用い、ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２抗体のアポトーシス惹起作用をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ベーリンガーマンハイム社製）により検討した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖによる解析の結果を図１７〜２２にそれぞれ示した。ここで図の左下の領域にあるドットは生細胞を、右下の領域はアポトーシス細胞を、右上の領域は壊死細胞を示す。抗体は対照としてマウスＩｇＧ（ザイメット社製）、ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２を１０μｇ／ｍｌで使用し、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞では、４ｘ１０３個の細胞で７２時間、Ｊｕｒｋａｔ細胞では６ｘ１０４個の細胞で４８時間インキュベートした後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖにより解析した。その結果、図１７〜２２に示す通り、細胞死が認められた。また、ＨＬ−６０細胞では、ＭＡＢＬ−１を１０μｇ／ｍｌで使用し、１ｘ１０５個の細胞でＡｎｎｅｘ−Ｖにより解析し、同様に細胞死が認められた。
【００７７】
（２）Ｆａｂ化したＭＡＢＬ−２抗体について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞に対するアポトーシス惹起作用を検討した。すなわち、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞を４ｘ１０３個で培養し、抗体はＦａｂ化したＭＡＢＬ−２およびその対照としてマウスＩｇＧを１０μｇ／ｍｌ濃度で使用し、７２時間インキュベートした後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖで測定した。その結果は、著しい細胞死が認められた（図２３，図２４）。ＭＡＢＬ−２抗体のＦａｂ化は、抗体をパパイン（ピアス社製）で消化し精製したものを実験に供した。Ｆａｂ化したＭＡＢＬ−２抗体については、そのＳＤＳ電気泳動により確認認した（図２５）。
【００７８】
実施例５（ｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシスの検討）
（１）ＭＡＬＢ−１およびＭＡＬＢ−２（Ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）による薬効
ヒトＩＡＰを発現するＫＰＭＭ２細胞（ヒトミエローマ細胞株）をＳＣＩＤマウスに移植し、移植後１０日目にＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２（Ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）をそれぞれ５μｇ／ｈｅａｄ、５０μｇ／ｈｅａｄ（ｎ＝５）を単回静脈内投与し、ＫＰＭＭ２移植後２８日目に血中ＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡにて測定した結果、消失したことが確認された。さらに生存期間についても検討した。その結果、ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２を処置した群では、血中ヒトＩｇＧ濃度については顕著な抑制が見られ殺腫瘍効果を示した（図３０）。さらに生存期間も顕著に延長したことがわかる（図２６）。
【００７９】
（２）ＭＡＬＢ−１およびＭＡＬＢ−２（Ｆ（ａｂ’）２）による薬効
ＭＡＬＢ−１およびＭＡＬＢ−２抗体をペプシンにより消化しプロテインＡにより精製（ピアス社製）したＦ（ａｂ’）２を用い、Ｆｃ領域を介した細胞障害作用を除外した殺腫瘍効果を検討した。すなわち、ヒトＩＡＰを発現するＫＰＭＭ２細胞（ヒトミエローマ細胞株）をＳＣＩＤマウスに移植し、Ｆ（ａｂ’）２化したＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２の１００μｇ／ｈｅａｄ投与群では、移植後６日目、１０日目に、１０および３０μｇ／ｈｅａｄ投与群では投与後６、８、１０日目に静脈内投与し、血中ＩｇＧ濃度を移植後３０日目にＥＬＩＳＡにて測定した（図２７）。さらに、生存期間についても移植後９０日まで検討した。その結果、ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２を処置した群では、血中ヒトＩｇＧ濃度については顕著な抑制効果が認められ、殺腫瘍効果を示した。さらに生存期間も顕著に延長したことがわかる（図２８）。なお、Ｆ（ａｂ’）２化したＭＡＢＬ−１抗体、及びＭＡＢＬ−２抗体のＳＤＳ電気泳動写真を図２９に示す。以下、図面と共に本発明による  の第１実施形態について詳細に説明する。
【００８０】
【配列表】
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【００８１】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識する抗体であり、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを有する有核血液細胞にアポトーシスを引き起こす抗原である。従って、ヒトＩｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎを特異的に認識する抗体として、これらを識別、同定するのに有用であると共に、有核血液細胞にアポトーシスを引き起こす作用を有することから、当該特性を利用して、骨髄性白血病およびリンパ系白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＬ―６０細胞株のｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡからＰＣＲ法で増幅したヒトＩＡＰのバンドを示す電気泳動写真である。左側より分子量マーカー（Ｍ）、ヒトＩＡＰ（１）、βアクチン（２）を示す。
【図２】図２は、ヒトＩＡＰを発現させたＬ１２１０細胞の抗ＣＤ４７抗体によるヒトＩＡＰの発現量を示す図である。ピークは、対照としてｐＣＯＳ１のみを遺伝子導入したＬ１２１０細胞を示す。
【図３】図３は、ヒトＩＡＰを発現させたＬ１２１０細胞の抗ＣＤ４７抗体によるヒトＩＡＰの発現量を示す図である。ピークは、ヒトＩＡＰ遺伝子を導入したＬ１２１０細胞で明らかにヒトＩＡＰの発現量が増加していることを示す。
【図４】図４は、免疫マウスでの抗体価を示す図である。左側のピークは、Ｉｎｔａｃｔ  Ｌ１２１０細胞。右側のピークはヒトＩＡＰを発現させたＬ１２１０細胞であり、細胞融合に供したマウスの血清は明らかにヒトＩＡＰを認識していることを示す。
【図５】図５は、ハイブリドーマの培養上清を用いての増殖抑制実験（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を示す図である。
【図６】図６は、ハイブリドーマの培養上清を用いての増殖抑制実験（ＡＲＨ７７細胞）を示す図である。
【図７】図７は、培養上清によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘起作用（ＰＩ染色による解析）を示す図であり、対照とした８Ｇ２の培養上清の場合の結果を示す。Ｒ１はアポトーシスの比率（％）を示し、７．４３％である。
【図８】図８は、培養上清によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘起作用（ＰＩ染色による解析）を示す図であり、７Ｄ２−Ｅ３の場合の結果を示す。Ｒ１はアポトーシスの比率（％）を示し、９．８４％である。
【図９】図９は、培養上清によるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘起作用（ＰＩ染色による解析）を示す図であり、１１Ｃ８の場合の結果を示す。Ｒ１はアポトーシスの比率（％）を示し、１５．３２％である。
【図１０】図１０は、培養上清によるＨＬ―６０細胞に対するアポトーシス誘起作用（ＰＩ染色による解析）を示す図であり、対照とした８Ｇ２の培養上清の場合の結果を示す。Ｍ１はアポトーシスの比率（％）を示し、６．９４％である。
【図１１】図１１は、培養上清によるＨＬ―６０細胞に対するアポトーシス誘起作用（ＰＩ染色による解析）を示す図であり、１１Ｃ８の場合の結果を示す。Ｍ１はアポトーシスの比率（％）を示し、１２．１６％である。
【図１２】図１２は、ＫＭ―１０２とＨＬ―６０細胞との共培養系でのアポトーシスの解析（ＴＵＮＥＬ法）であり、対照として９Ｃ５の培養上清を用いた結果を示す顕微鏡写真である。ここで、アポトーシスの細胞は黒又は褐色に染色される。核染色はメチルグリーンで行い、倍率は１００倍である。
【図１３】図１３は、ＫＭ―１０２とＨＬ―６０細胞との共培養系でのアポトーシスの解析（ＴＵＮＥＬ法）であり、１１Ｃ８の培養上清を用いた結果を示す顕微鏡写真である。ＴＵＮＥＬ陽性細胞が図１２より多数認められる。ここでアポトーシスの細胞は黒又は褐色に染色される。核染色はメチルグリーンで行い、倍率は１００倍である。
【図１４】図１４は、ハイブリドーマ株７Ｄ２−Ｅ３および１１Ｃ８より精製されたＩｇＧをＳＤＳ・ＰＡＧＥにより解析した結果を示す電気泳動写真である。分子量マーカー（Ｍ、Ｍ’）、非還元条件でのマウスＩｇＧ（標品）（１）、７Ｄ２−Ｅ３（２）、１１Ｃ８（３）、還元条件でのマウスＩｇＧ（標品）（４）、７Ｄ２−Ｅ３（５）、１１Ｃ８（６）を示す。
【図１５】図１５は、ＨＬ−６０細胞を用い、ＣＤ４７の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
【図１６】図１６は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を用い、ＣＤ４７の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（Ｌ１２１０−ｈＩＡＰ）を用いた（７２時間インキュベーション）アポトーシス惹起作用を示すためのコントロールとして、ｍＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）の結果を示す。
【図１８】図１８は、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞を用いた（７２時間インキュベーション）、ＭＡＢＬ−１（１０μｇ／ｍｌ）のアポトーシス惹起作用を示す。
【図１９】図１９は、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞を用いた（７２時間インキュベーション）、ＭＡＢＬ−２（１０μｇ／ｍｌ）のアポトーシス惹起作用を示す。
【図２０】図２０は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた（４８時間インキュベーション）、アポトーシス惹起作用を示すためのコントロールとして、ｍＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）の結果を示す。
【図２１】図２１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた（４８時間インキュベーション）、ＭＡＢＬ−１（１０μｇ／ｍｌ）のアポトーシス惹起作用を示す。
【図２２】図２２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた（４８時間インキュベーション）、ＭＡＢＬ−２（１０μｇ／ｍｌ）のアポトーシス惹起作用を示す。
【図２３】図２３は、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞（Ｌ１２１０−ｈＩＡＰ）を用いた（７２時間インキュベーション）アポトーシス惹起作用を示すためのコントロールとして、ｍＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）の結果を示す。
【図２４】図２４は、Ｆａｂ化したＭＡＢＬ−２（１０μｇ／ｍｌ）について、ヒトＩＡＰを遺伝子導入したＬ１２１０細胞に対するアポトーシス惹起作用を示す。
【図２５】図２５は、Ｆａｂ化したＭＡＢＬ−２抗体のＳＤＳ電気泳動写真を示す。
【図２６】図２６は、ＭＡＢＬ−２で処置した場合に生存期間が顕著に延長したことを示す。
【図２７】図２７は、実施例５（２）におけるＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２８】図２８は、Ｆ（ａｂ’）２化したＭＡＢＬ−２を処置した場合に生存期間が顕著に延長したことを示す。
【図２９】
図２９は、Ｆ（ａｂ’）２化したＭＡＢＬ−１抗体、及びＭＡＢＬ−２抗体のＳＤＳ電気泳動写真を示す。
【図３０】
図３０は、ＭＡＢＬ−１およびＭＡＢＬ−２を処置した群で見られる、血中ヒトＩｇＧ濃度についての顕著な抑制、殺腫瘍効果を示す（図３０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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