(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光学系の瞳位置に輪帯状の開口を配置し、前記照明光学系と結像光学系とを含む光学系の全部もしくは一部に関して、前記輪帯状の開口と標本面を介して共役な位置関係にある前記結像光学系の瞳位置に位相板を配置して、前記標本面に配置される標本を位相差法により観察するようにした位相差顕微鏡において、
前記位相板は、前記結像光学系の光軸を略中心とする第１の半径と該第１の半径より大きな第２の半径との間の第１の領域と、前記第２の半径と該第２の半径より大きな第３の半径との間の第２の領域とを有し、前記第１の領域および前記第２の領域の一方は位相および振幅を変調する領域とし、他方は吸収領域または遮光領域としたことを特徴とする位相差顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、例えば細胞やバクテリア等の透明な標本を観察するのに用いられる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡においては、一般に、照明光学系の瞳位置に輪帯状の開口を配置し、この輪帯開口、照明光学系および結像光学系を含めた光学系の全部または一部に関して共役な位置関係にある対物レンズの瞳位置に輪帯状の位相膜を配置して、標本面で回折した光のうちの０次光の位相および振幅に変化を与えて他の回折光と干渉させることにより、標本の位相量を像のコントラストに変えて観察し得るようにしている。
【０００３】
また、位相差顕微鏡による位相差像のコントラストについては、例えば、「”Ｓｏｍｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ”  Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．Ｔａｉｒａ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，１２９（１９８３），ｐ．４９−６２」に、その改善方法が記載されている。従来の位相差顕微鏡においては、一般に、輪帯状の位相膜の径を、対物レンズの瞳径の半分程度にすることにより、像コントラストを改善するようにしている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、位相差顕微鏡では、例えば、「  ”位相差顕微鏡の像コントラストに関する考察”  大木裕史，光学，ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９（１９９１），ｐ．５９０−５９４  」に記載されているように、位相リングの径と瞳径との比によってカットオフ周波数が決定されるため、通常の明視野顕微鏡と比較して、解像力が劣るという問題がある。
【０００５】
また、生体標本のように、波長と比較して厚い標本の場合には、「”光学顕微鏡の基礎と応用（４）”小松啓、応用物理、Ｖｏｌ．６０，  Ｎｏ．１１（１９９１），ｐ．１１３６−１２５４  」に記載されているように、ハロー現象が顕著に現れて、位相標本の構造の境界の細部が覆い隠されてしまうという問題があると共に、「  ”顕微鏡における逆問題について”  高橋，根本，電気通信学会技術研究報告ＭＢＥ８８−５８，Ｐ．３５−４２，１９８８  」において指摘されているように、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響が現れ、正確な位相差像が再現されなくなるという問題もある。
【０００６】
この発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、観察すべき標本が比較的厚い場合に、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響を低減し、正確な位相差像を再現できるよう適切に構成した位相差顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明は、照明光学系の瞳位置に輪帯状の開口を配置し、前記照明光学系と結像光学系とを含む光学系の全部もしくは一部に関して、前記輪帯状の開口と標本面を介して共役な位置関係にある前記結像光学系の瞳位置に位相板を配置して、前記標本面に配置される標本を位相差法により観察するようにした位相差顕微鏡において、
前記位相板は、前記結像光学系の光軸を略中心とする第１の半径と該第１の半径より大きな第２の半径との間の第１の領域と、前記第２の半径と該第２の半径より大きな第３の半径との間の第２の領域とを有し、前記第１の領域および前記第２の領域の一方は位相および振幅を変調する領域とし、他方は吸収領域または遮光領域としたことを特徴とするものである。
【００１３】
【作用】
図１は、この発明の原理を説明するための位相差顕微鏡の構成を示すものである。この位相差顕微鏡は、コンデンサレンズ１ａを有する照明光学系１の瞳位置に輪帯開口２を配置し、この輪帯開口２と標本面を介して共役な位置関係にある対物レンズ３ａを有する結像光学系３の瞳位置に位相板４を配置して、標本面に配置される標本５を照明光学系１により照明して、その位相差像を結像光学系３の像面６において観察するものである。
【００１４】
以下、図１に示す位相差顕微鏡の結像について、１次元のモデルを用いて説明する。
いま、結像光学系３の瞳関数をＰ（ξ）  、照明光学系１の瞳関数をＱ（ξ）  、標本５の位相分布をφ（ｘ）  として弱位相近似（ボルン近似）、
ｅｘｐ  ｉ  φ（ｘ）  ＝１  ＋  ｉφ（ｘ）
を行うと、標本５の像強度分布Ｉ（ｘ）は、
【数１】
0003583480.tif 000002
で与えられる。ただし、Φ（ｆ）  はφ（ｘ）  のフーリエ変換を表し、ｆは空間周波数を示す。また、結像光学系３の瞳関数Ｐ（ξ）  は、下記の（２）式で示す関数の線形結合で表すことができるものとする。
【数２】
0003583480.tif 000003
【００１５】
ここで、照明光学系１の瞳関数Ｑ（ξ）  が、Ｑ（ξ）  ＝  Ｐｂ（ξ）  で表せるものとすると、上記（１）式は、
【数３】
0003583480.tif 000004
但し、ＤＣ＝∫  Ｐｂ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫  Ｐｂ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
になる。したがって、位相差顕微鏡における像コントラストは、近似的に（４）式で表される。
【００１６】
上記（４）式をさらに近似展開すると、
【数４】
0003583480.tif 000005
但し、ＤＣ＝∫  Ｐｂ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫  Ｐｂ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｇ（ｆ）＝∫  Ｐｂ（ξ）Ｐｂ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｒ（ｆ，ｆ’）  ＝∫Ｑ（ξ）  Ｐ（ξ＋ｆ）  Ｐ（ξ＋ｆ’）  ｄξ  （但し、ｆ  ≠０  、ｆ’≠０）
となる。
【００１７】
以上の式展開では、輪帯開口２と位相板４とが一致するものとしているが、輪帯開口２の形状が、
【数５】
0003583480.tif 000006
を満足していれば、Ｆ（ｆ）、Ｇ（ｆ）は、
ＤＣ＝∫Ｑ（ξ）ｄξ
Ｆ（ｆ）＝∫Ｑ（ξ）Ｐａ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
Ｇ（ｆ）＝∫Ｑ（ξ）Ｐｂ（ξ＋ｆ）ｄξ／ＤＣ
で与えることができる。
【００１８】
位相差顕微鏡における像コントラストは、（５）式の像コントラストの特性から、それぞれの成分に分解して表すことができる。すなわち、（５）式の各成分を物理的に解釈すると、第１項は位相差像の背景の明るさを表すバックグラウンド成分、第２項は標本の位相量に比例した位相差像のコントラスト成分、第３項は位相板で位相変調を受けない明視野像のコントラスト成分、第４項は０次の非線形成分（ハロー成分）、第５項は２次の非線形成分、第６項は高次の非線形成分をそれぞれ表している。したがって、位相差像のコントラストを改善するためには、（５）式において相対的に第２項を強調すれば良いことになる。
【００１９】
すなわち、標本５が比較的薄い場合には、｜Φ（ｆ）  ｜２  等の位相の２乗成分が非常に小さくなり、第４項以降の項の影響を無視することができるので、位相板４の透過率Ｃを小さくすることで、第２項を強調することができ、これにより像コントラストを改善することができる。
【００２０】
これに対し、標本５が厚い場合には、｜Φ（ｆ）  ｜２  等の位相の２乗成分の影響が無視できなくなって、（５）式の第４項以降の影響が現れるため、位相板４の透過率Ｃを小さくするだけでは、位相差像のコントラストを改善することができなくなる。しかも、標本５が厚いと、その特性によって（５）式の各項の強調のされ方が変わってくる。
【００２１】
例えば、標本５に非対称で一定の位相勾配が存在すると、位相勾配付近で標本５で回折される光に偏りが生じて、特定の方向の回折光だけが強調されるため、特定のｆに対して、｜Φ（ｆ）  ｜２  の値が大きくなり、（５）式の第４項の影響が大きくなる。また、標本５に周期的な位相変化があると、標本５で回折される光が対称となって、Φ（ｆ）  ＝Φ（−ｆ）となり、位相変化の周期および変化量によって特定のｆに対するΦ（ｆ）  およびΦ（−ｆ）の値が大きくなり、（５）式の第５項の影響が大きくなる。
【００２２】
したがって、標本５が厚い場合には、（５）式の第２項が強調されるように、その観察する標本５の特性に応じてＦ（ｆ）および  Ｇ（ｆ）  を適切に選択して、標本５の位相量に比例した位相差像のコントラスト成分を強調すれば良い。このためには、結像光学系３の瞳位置に挿入する位相板４を、位相差像を形成するための位相変調を与える領域と、ハロー成分や非線形成分を減衰するための吸収領域との異なる変調領域をもって構成すれば良い。
【００２３】
ここで、（２）式で示した  Ｐａ（ξ）  を、
【数６】
0003583480.tif 000007
の２つの関数に分解し、新たにこの関数の線形結合として、
Ｐａ（ξ）  ＝  ＰＦ（ξ）  ＋ＴＰｆ（ξ）      （  ０≦  Ｔ（透過率）＜  １）    （７）
で表すと、（５）式は、以下のように表すことができる。
【数７】
0003583480.tif 000008
【００２４】
上記（８）式においては、第４項の影響を小さくすることによって、ハロー成分を低減することができる。ここで、ハロー成分は、観察する標本５に一定の位相勾配が存在する場合に、標本５をフーリエ変換すると、特定の周波数成分が強調されて発生する。したがって、この特定の周波数成分を選択的に減衰するようなフィルタを、結像光学系の瞳面に挿入すれば、ハロー成分を低減することが可能となる。すなわち、（８）式において、Ｈ’（ｆ）  をハロー成分を強調するような特性を持った伝達関数とし、Ｆ’（ｆ）  をハロー成分を減衰するような特性を持った伝達関数とし、さらにＴを小さい値に設定すれば、第４項全体の値を小さくすることができ、その影響を低減することができる。
【００２５】
一方、標本５が対称で周期性がある場合には、標本５での回折光は特定の周波数でΦ（ｆ）  ≒Φ（−ｆ）となり、また、標本５が厚くなると、Φ（ｆ）  およびΦ（−ｆ）の値が大きくなって、Φ（ｆ）  ・Φ＊  （−ｆ）の値が無視できなくなり、（５）式および（８）式の第５項の影響が現れる。この第５項の影響を小さくするためには、ハロー成分の低減と同様に、位相板４に、位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域と、吸収または遮光する領域との異なる変調領域を形成すれば良い。
【００２６】
このようにすれば、標本５の周波数に対応したＲ（ｆ，−ｆ）  の値を小さくでき、したがって（５）式および（８）式の第５項の影響を小さくすることができ、非線形成分の影響を小さくすることができる。すなわち、Ｒ（ｆ，−ｆ）  の値は、従来の位相差顕微鏡の理想光学系を仮定すると、ほぼ図２の斜線部の面積に相当することになるが、上記のように、位相板４に、位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域の他に、吸収または遮光する領域を形成すれば、図３に示すように、Ｒ（ｆ，−ｆ）  の値に相当する部分の面積が小さくなる。
【００２７】
以上のようなハロー成分や非線形成分の低減方法は、位相板４を照明光学系１の瞳と共役な関係が保たれる瞳位置であれば、何処の瞳位置に配置しても同様の効果が得られる。また、ハロー成分や非線形成分を低減するための吸収または遮光領域を有する変調素子は、上記のように位相差像を形成するための位相膜を有する位相板と一体に形成して同一の瞳面内に配置する他、位相板とは別体に形成して、位相板と変調素子とを同一または別々の瞳位置に配置することもでき、これにより同等の効果を得ることができる。
【００２８】
なお、上記のハロー成分や非線形成分は、観察する標本によって発生の仕方が異なるので、ハロー成分や非線形成分を低減する変調素子は、標本毎に最適化するのが望ましい。このためには、位相板と変調素子とを別体に形成し、これらを同一または別々の瞳位置に配置するのが、観察すべき標本に応じて変調素子のみを交換して、ハロー成分や非線形成分の低減の最適化を行うことができるので、標本に容易に対処することが可能となる。また、変調素子を、例えば、液晶シャッタ等の電気的作用により選択できるように、複数の輪帯状の吸収または遮光領域をもって構成すれば、光学系に変化を生じさせることなく、吸収または遮光領域の選択によって、ハロー成分や非線形成分の低減の最適化を行うことができるので、観察すべき標本に容易かつ迅速に対応することが可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下、この発明の実施例について説明する。
この発明の第１実施例においては、図１に示す構成の位相差顕微鏡において、位相板４として、図４に示すように、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａと、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂとの２つの領域を形成したものを用いる。
【００３０】
この実施例において、θ＝π／２になるようにすると、上記（８）式は、
【数８】
0003583480.tif 000009
となる。
【００３１】
図５は、第１実施例において、照明光学系１の瞳位置に配置される輪帯開口２の内径ＮＡｉ  ’  および外径ＮＡＯ  ’、位相板４における輪帯状領域４ａの内径ＮＡｉ  および外径ＮＡＯ  、同じく位相板４における遮光領域４ｂの内径ＮＡｆ  および外径ＮＡＦ  を、結像光学系３の瞳の半径を１に規格化した座標を用いて、それぞれ、ＮＡｉ  ’  ＝０．３、ＮＡＯ  ’＝０．４、ＮＡｉ  ＝０．３、ＮＡＯ  ＝０．４、ＮＡｆ  ＝０．２５、ＮＡＦ  ＝０．３としたとき、上記（９）式によって計算したＦ’（ｆ）  およびＧ’（ｆ）  のそれぞれの伝達関数を示すものである。ここで、λは観察時の波長、ＮＡは対物レンズ３ａの開口数を示す。なお、比較のために、図６に、従来の位相差顕微鏡において、ＮＡｉ  ＝０．３、ＮＡＯ  ＝０．４としたときのＦ（ｆ）およびＧ（ｆ）の伝達関数を示す。
【００３２】
図５および図６に示すＦ’（ｆ）  およびＦ（ｆ）を比較すると、低周波数において、Ｆ’（ｆ）  はＦ（ｆ）よりも小さくなることがわかる。したがって、この周波数帯域での位相差像のコントラストは、（１０）式から明らかなように、従来の位相差顕微鏡におけるよりも低下することになるが、Ｆ’（ｆ）  が小さくなることで、ハローの影響が低減されるので、Ｃの値を小さく設定しても、ハローの影響が小さくなり、相対的にコントラストの高い位相差像を得ることができる。なお、ハローの影響を低減するためには、ＮＡｉ  ＝０．２５、ＮＡＯ  ＝０．４とするだけでも、同様の効果が得られるが、この場合には、Ｇ’（ｆ）  ＜Ｇ（ｆ）となって、上記（１０）式の第３項の明視野成分の影響が大きくなり、相対的に位相差像のコントラストを低下させることになる。
【００３３】
このように、この実施例によれば、位相板４に、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａと、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂとの２つの領域を形成したので、観察すべき標本が比較的厚い場合に、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。
【００３４】
この発明の第２実施例においては、図１に示す構成の位相差顕微鏡において、位相板４として、図７に示す構成のものを用いる。この位相板４は、図４に示す位相板４において、透過率Ｔがほぼ０の輪帯状の遮光領域４ｂを、位相差像を形成するための位相θおよび振幅Ｃを変調させる輪帯状領域４ａの外側に形成したものである。
【００３５】
図８は、第２実施例において、結像光学系３の瞳の半径を１に規格化した座標を用い、位相板４の輪帯状領域４ａの内径ＮＡｉ  および外径ＮＡＯ  を、ＮＡｉ  ＝０．３，ＮＡＯ  ＝０．４、遮光領域４ｂの内径ＮＡｆ  および外径ＮＡＦ  を、ＮＡｆ  ＝０．４，ＮＡＦ  ＝０．４５としたときのＦ’（ｆ）  およびＧ’（ｆ）  のそれぞれの伝達関数を示すものである。なお、図８には、比較のために、図７において遮光領域４ｂを形成しないときのＦ（ｆ）の伝達関数をも示す。
【００３６】
図８から明らかなように、この実施例においても、第１実施例におけると同様に、Ｆ’（ｆ）  の伝達関数を、低周波数において遮光領域４ｂを有しないＦ（ｆ）よりも低くなる。したがって、第１実施例におけると同様に、比較的厚い標本を観察する場合に、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。
【００３７】
図９は、この発明とともに開発した第１参考例を示すものである。この参考例は、図１に示す構成において、対物レンズ３ａの瞳をリレーするリレー光学系７を設け、対物レンズ３ａの瞳位置（１次瞳位置）に位相膜を有する位相板４を配置し、リレー光学系７によってリレーされる瞳位置（２次瞳位置）に遮光膜を有する変調素子８を配置したものである。ここで、照明光学系１の瞳位置に配置された輪帯開口２と、結像光学系３の１次瞳位置に配置された位相板４の位相膜とは、互いに共役関係を有するように、例えば、輪帯開口２および位相膜のそれぞれの内径Naiおよび外径NAoを、NAi＝０．３、NAo＝０．４で一致させる。
【００３８】
図１０は、この参考例において、結像光学系３の２次瞳位置に配置する変調素子８における遮光膜の内径NAf および外径NAF を、NAf ＝０．２，NAF ＝０．２５としたときのF'(f) およびG'(f) のそれぞれの伝達関数を示し、図１１は、NAf ＝０．５，NAF ＝０．５５としたときのF'(f) およびG'(f) のそれぞれの伝達関数を示す。なお、図１０および図１１には、比較のために、図９において変調素子８を有しないときのF(f)の伝達関数をも示してある。
【００３９】
図１０および図１１から明らかなように、いずれの場合においても、Ｆ’（ｆ）  の伝達関数は、低周波数において変調素子８を有しないＦ（ｆ）よりも低くなる。したがって、第１実施例におけると同様に、比較的厚い標本を観察する場合には、ハロー成分や非線形成分を低減することができ、位相差像のコントラストを改善することができる。しかも、Ｆ’（ｆ）  は、変調素子８の遮光膜の内径および外径によって、その変化が異なるので、観察する標本に応じて最適な遮光膜を有する変調素子８を配置することにより、ハロー成分や非線形成分をより有効に低減することができる。
【００４０】
この発明とともに開発した第２参考例においては、変調素子８として、図１２ＡおよびＢに示す構成のものを用いる。この変調素子８は、液晶シャッタをもって構成したもので、図１２Ｂに断面図を示すように、共通の透明電極９を形成した硝子基板１０ａと、図１２Ａに平面図を示すように、複数の輪帯状の透明電極１１を形成した硝子基板１０ｂとで液晶１２をサンドイッチすると共に、硝子基板１０ａ，１０ｂの液晶１２とは反対側の面に、それぞれパラニコルの状態となるように偏光板１３ａ，１３ｂを設けたものである。
【００４１】
この参考例によれば、観察すべき標本に応じて、変調素子８の電圧を印加する輪帯状の透明電極１１を選択することにより、吸収または遮光する領域を選択することができるので、第１参考例におけるよりも、観察すべき標本に容易かつ迅速に対処でき、ハロー成分や非線形成分を有効に低減することができる。
【００４３】
なお、第１および第２参考例においては、対物レンズ３ａの１次瞳位置に位相板４を配置し、２次瞳位置に変調素子８を配置するようにしたが、逆に、１次瞳位置に変調素子８を、２次瞳位置に位相板４を配置することもできる。
【００４４】
付記
１．請求項１記載の位相差顕微鏡において、前記位相板は、位相差像を形成するための位相変調を与える領域と、ハロー成分や非線形成分を減衰する吸収領域とを有することを特徴とする位相差顕微鏡。
【００４５】
【発明の効果】
以上のように、この発明によれば、結像光学系の瞳位置に配置される位相板を、結像光学系の光軸を略中心とする第１の半径と該第１の半径より大きな第２の半径との間の第１の領域と、第２の半径と該第２の半径より大きな第３の半径との間の第２の領域とを有し、第１の領域および第２の領域の一方は位相差像を形成するための位相および振幅を変調する領域とし、他方は吸収領域または遮光領域としたので、観察する標本が比較的厚い場合に発生するハロー成分や非線形成分を低減でき、位相差像のコントラストを改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の原理を説明するための位相差顕微鏡の構成を示す図ある。
【図２】従来の位相差顕微鏡によるR(f,-f) の値を説明するための図である。
【図３】この発明の位相差顕微鏡によるR(f,-f) の値を説明するための図である。
【図４】この発明の第１実施例による位相板の構成を示す図である。
【図５】第１実施例における光学系の伝達関数の一例を示す図である。
【図６】従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数を示す図である。
【図７】この発明の第２実施例による位相板の構成を示す図である。
【図８】第２実施例における光学系の一例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図９】この発明とともに開発した第１参考例を示す図である。
【図１０】第１参考例における光学系の一例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図１１】第１参考例における光学系の他の例の伝達関数と、従来の位相差顕微鏡における光学系の伝達関数とを比較して示す図である。
【図１２】この発明とともに開発した第２参考例による変調素子の構成を示す図である。
【符号の説明】
１  照明光学系
１ａ  コンデンサレンズ
２  輪帯開口
３  結像光学系
３ａ  対物レンズ
４  位相板
５  標本
６  像面
【図１】
0003583480.tif 000010
【図２】
0003583480.tif 000011
【図３】
0003583480.tif 000012
【図４】
0003583480.tif 000013
【図５】
0003583480.tif 000014
【図６】
0003583480.tif 000015
【図７】
0003583480.tif 000016
【図８】
0003583480.tif 000017
【図９】
0003583480.tif 000018
【図１０】
0003583480.tif 000019
【図１１】
0003583480.tif 000020
【図１２】
0003583480.tif 000021