(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の物理化学的性質を有するリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物。
(1)性状：黄色〜褐色のペースト状
(2)リーベルマン反応：陽性
(3)サポニン定性試験：陰性
(4)アントロン反応：陽性
(5)カテキン定性反応：陰性
(6)ニンヒドリン反応：陰性
(7)フラボノイド定性反応：陰性
(8)可視部・紫外部吸収スペクトル：２２０〜２３０ｎｍに極大吸収
【請求項２】
カラムクロマトグラフィーにより分画処理して得られた有機溶媒溶出画分が活性炭により吸着処理されてなるリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物。
【請求項３】
カラムクロマトグラフィーにより分画処理して得られた有機溶媒溶出画分が活性炭により吸着処理されてなり、次の物理化学的性質を有するリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物。
(1)性状：黄色〜褐色のペースト状
(2)リーベルマン反応：陽性
(3)サポニン定性試験：陰性
(4)アントロン反応：陽性
(5)カテキン定性反応：陰性
(6)ニンヒドリン反応：陰性
(7)フラボノイド定性反応：陰性
(8)可視部・紫外部吸収スペクトル：２２０〜２３０ｎｍに極大吸収
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有する育毛剤組成物に係り、その目的は、優れた育毛効果を有し、しかも医薬品、医薬部外品及び化粧品に配合できる安全性の高い育毛剤組成物を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
近年、脱毛症の症状を訴える人が男性の中高齢者層だけでなく、女性や若年層の人の間にも広がっている。脱毛の主な原因としては、血液の循環不全，皮脂の分泌異常，ホルモンバランスの崩れ，栄養不良等の内的要因のほか、頭皮における細菌の感染等の外的要因を挙げることができる。
これらの様々な脱毛の原因に対して頭髪の健全な成長を促進して脱毛症の症状を改善する育毛剤が多数創出されている。育毛剤の有効成分としては、角質溶解剤、殺菌剤、消炎剤、血行促進剤、代謝賦活剤等の成分が用いられ、これらを複数配合することにより頭皮、頭髪の正常な働きを促して脱毛症の症状の改善が試みられている。
【０００３】
一方、リナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）は、特に、タイ国において広く薬用植物として普及しており、タイ国の伝統薬の文献中には種々の薬効を有していることが記載されている。具体的には、癜風、白癬、皮膚疾患や癌などの治療薬、解熱、抗蛇毒薬として有効であるとされており、茎は健康増進にも用いられ、また、葉は膿瘍による痛みの治療薬として、更には、長寿のためにも用いられるとされている。
近年ではリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）に含まれる有効成分に関する研究もなされており、例えば特開平４−１９３８７４号公報には、細菌や糸状菌に対する抗菌作用を示す物質が含まれていることが開示されている。また、特開平６−２３４６９４号公報には、殺菌作用を示す物質が含まれていることが開示されている。更には、ジャーナル  オブ  ナチュラル  プロダクツ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ）第５６巻、第２号、第２９２頁には、抗真菌性のナフトキノン誘導体が含まれることが報告されている。
また、リナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の抽出物の新たな効果として、特開平９−１４３０２５号公報及び特開平９−１４３０９１号公報には、活性酸素消去能を有することが開示されている。
【０００４】
本願出願人は、上記のリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の抽出物が、安全性に優れるとともに、優れた育毛効果を有することを、特願平１１−６６７６３号において既に報告している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特願平１１−６６７６３号において開示した発明には以下の問題が存在した。
特願平１１−６６７６３号において開示した発明は、単にリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）から抽出した抽出物（以下、「粗抽出物」という。）が用いられていたために、植物中の葉緑素を始めとする様々な色素成分が含まれていた。このために、粗抽出物を育毛剤に配合すると製品は濃い色を呈し、しかも使用時に衣服や皮膚などに対して着色する危険性もあり、粗抽出物をそのまま使用することはできなかった。
また、粗抽出物は、アルコール溶液として皮膚に塗布しても皮膚刺激性はないものの、皮膚感作性等の好ましくない作用を発現する場合があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記した課題に鑑みてなされたものであって、請求項１に係る発明は、次の物理化学的性質を有するリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物。
(1)性状：黄色〜褐色のペースト状
(2)リーベルマン反応：陽性
(3)サポニン定性試験：陰性
(4)アントロン反応：陽性
(5)カテキン定性反応：陰性
(6)ニンヒドリン反応：陰性
(7)フラボノイド定性反応：陰性
(8)可視部・紫外部吸収スペクトル：２２０〜２３０ｎｍに極大吸収
請求項２に係る発明は、カラムクロマトグラフィーにより分画処理して得られた有機溶媒溶出画分が活性炭により吸着処理されてなるリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物に関する。
請求項３に係る発明は、カラムクロマトグラフィーにより分画処理して得られた有機溶媒溶出画分が活性炭により吸着処理されてなり、次の物理化学的性質を有するリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を含有することを特徴とする育毛剤組成物に関する。
(1)性状：黄色〜褐色のペースト状
(2)リーベルマン反応：陽性
(3)サポニン定性試験：陰性
(4)アントロン反応：陽性
(5)カテキン定性反応：陰性
(6)ニンヒドリン反応：陰性
(7)フラボノイド定性反応：陰性
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は、リナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の粗抽出物を精製処理することにより得ることができる。
用いられるリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ  ）リナカンツス属（Ｒｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  Ｎｅｅｓ）に属する薬用植物の一種で、高さ５０〜１５０ｃｍの草本植物であり、熱帯アフリカ、インド、タイ、マレーシアなどで栽培或いは野生状態で見ることができる。花は茎頂の円錐状の花序に白色のものをつける。
観賞用に垣根などにされることもあるが、インド、タイ、マレーシア、中国南部などで民間薬として広く利用されている。
【０００８】
本発明においては、リナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の地上部及び地下部の全部位が使用可能で、葉部、茎部、花部、根部等の各部位を単独で、或いは適宜混合して用いてもよく、また全草を使用することもできる。特に、本発明においては、葉部、茎部の各部位、好ましくはこれらの乾燥粉砕物を用いるとよい。
【０００９】
本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物を得るには、まず、リナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）（以下、「原料植物」という。）を有機溶媒により浸漬抽出することにより、若しくは原料植物を有機溶媒により還流抽出することにより、濃褐色の粗抽出液を得る。得られた粗抽出液に原料植物の残渣等が含まれる場合は、残渣等を濾別した濾液を粗抽出液とする。
尚、必要に応じて、得られた粗抽出液を濃縮後、抽出に使用した有機溶媒等の適当な有機溶媒に溶解させ、不溶物を濾別した濾液を粗抽出液としてもよい。
【００１０】
用いられる有機溶媒は特に限定されないが、無水、或いは含水有機溶媒、特に一価アルコール、多価アルコール又はその誘導体、ケトン、エステル、エーテル、石油エーテル、脂肪族炭化水素又はハロゲン化物、芳香族炭化水素より選択された１種以上が含まれる無水、或いは含水有機溶媒を用いるとよい。具体的には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクタノール等の炭素数１〜８の一価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル等の炭素数２〜６の多価アルコール或いはその誘導体、アセトン、メチルアセトン、エチルメチルケトン、イソブチルメチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトン等の炭素数３〜６のケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等の炭素数４〜５のエステル、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等の炭素数４〜８のエーテルや石油エーテル、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン等の炭素数４〜８の脂肪族炭化水素、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等の炭素数１〜２の脂肪族炭化水素のハロゲン化物、ベンゼン、トルエン等の炭素数６〜７の脂肪族炭化水素のうち１種或いは２種以上が含まれてなる無水或いは含水有機溶媒を好ましい例として挙げることができ、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールを用いることがより好ましい。
【００１１】
また、有機溶媒の使用量は特に限定されないが、浸漬抽出の場合は原料植物に対して１〜１５重量倍、好ましくは３〜１０重量倍の有機溶媒を、また還流抽出の場合は原料植物に対して１〜１０重量倍、好ましくは３〜７重量倍の有機溶媒を、使用することが好ましい。
抽出する際の温度や抽出時間も特に限定はされないが、浸漬抽出の場合は室温下で１〜数日間浸漬すればよく、また還流抽出の場合は用いる有機溶媒の還流温度にて１〜５時間程度還流すればよい。
【００１２】
次に、得られた粗抽出液をそのまま、若しくは濃縮後、常法に従い吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィーにより分画処理を行うことにより、主に葉緑素等の色素成分の吸着除去を行い、濃緑色を呈する画分が溶出される以前の画分を回収する。
具体的には、溶出溶媒として上記の有機溶媒（段落番号（００１０）参照。）のうちの一種又は上記の有機溶媒及び水のうちから選択された二種以上の混合溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の一価アルコール、アセトン、酢酸エチルのうちから選択された一種又は二種以上の混合溶媒を用いて、有機溶媒溶出画分を分取する。
尚、溶出溶媒を留去して得られる有機溶媒溶出画分の回収率は特に限定されないが、分画に供した粗抽出液中の粗抽出物に対して、６０〜９５％、好ましくは７０〜８５％、より好ましくは７５〜８０％となるように調整するとよい。
また、有機溶媒の使用量は特に限定されないが、例えば、口径５ｃｍのカラムクロマトグラフ管を用いた場合、分画に供した粗抽出液中の粗抽出物に対して、１００〜５００容量、好ましくは２００〜４００容量とされる。
【００１３】
用いられる吸着剤としては、シリカゲル、アルミナの他、合成吸着剤であるセパビーズＳＰ２０７、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（以上商品名、三菱化学社製）、Ｓｅｐａｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（商品名、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  社製）などを例示することができ、セパビーズＳＰ２０７を用いることが好ましい。
吸着剤の使用量は特に限定されないが、分画に供した粗抽出液中の粗抽出物に対して、１０〜５０容量、好ましくは２０〜４０容量とされる。
【００１４】
最後に、溶出溶媒を留去して得られた有機溶媒溶出画分を活性炭により吸着処理する。具体的には、得られた有機溶媒溶出画分を上記の有機溶媒（段落番号（００１０）参照）のうちの一種又は上記の有機溶媒及び水のうちから選択された二種以上の混合溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の一価アルコール、アセトン、酢酸エチルのうちから選択された一種又は二種以上の混合溶媒に溶解した後に活性炭を加えて攪拌する。所定時間攪拌した後に、不溶物及び活性炭を濾別して得られた濾液を濃縮することにより本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物（以下、「精製抽出物」という。）を得ることができる。
尚、精製抽出物の回収率は特に限定されないが、吸着処理に供した有機溶媒溶出画分に対して６０〜９５％、好ましくは７０〜９０％、より好ましくは７０〜８０％となるように調整するとよい。
【００１５】
有機溶媒の使用量は特に限定されないが、吸着処理に供した有機溶媒溶出画分に対して５〜１００容量、好ましくは、３０〜５０容量とされる。
また、活性炭の使用量は特に限定されないが、吸着処理に供した有機溶媒溶出画分に対して０．１〜５重量倍、好ましくは０．５〜１．５重量倍とされる。
活性炭を加えて攪拌する時間は特に限定されないが、０．１〜２時間、好ましくは、０．１〜１時間攪拌すればよい。
尚、前記のように溶出溶媒を留去して活性炭による吸着処理に供することもできるが、溶出溶媒を留去又は濃縮することなく、そのまま活性炭による吸着処理に供することもできる。
【００１６】
このようにして得られた精製抽出物は、以下の物理化学的性質を有する。
▲１▼性状：黄色〜褐色のペースト状を示す。
▲２▼リーベルマン反応：陽性（精製抽出物０．２ｇに無水酢酸２．０ｍｌを加えて水浴上で２分間加熱した後に濾過して得られた濾液１．０ｍｌに、硫酸０．５ｍｌを穏やかに加えることにより、濾液と硫酸の境界面は赤紫色を呈する。）
▲３▼サポニン定性試験：陰性（精製抽出物０．２７ｇに水５．０ｍｌを加え、激しく振り混ぜたとしても、持続性の微細な泡は生じない。）
▲４▼アントロン反応：陽性（精製抽出物１ｇを水３０００ｍｌに溶解して調製した水溶液１．０ｍｌに、アントロン３５ｍｇを硫酸１００ｍｌに溶解して調製した液を２．０ｍｌ加えることにより、緑〜青緑色を呈する。）
▲５▼カテキン定性反応：陰性（精製抽出物０．１３ｇを５０％エタノール２０ｍｌに加えて２分間振り混ぜた後、濾過して得られた濾液１．０ｍｌを５０％エタノール９．０ｍｌに溶解して調製したエタノール溶液１．０ｍｌに、バニリン１０ｍｇをエタノール１．０ｍｌに溶解した液に水１．０ｍｌ及び塩酸６．０ｍｌを加えて調製した液を１．０ｍｌ加えたとしても、変化は観察されない。）
▲６▼ニンヒドリン反応：陰性（精製抽出物１ｇを水１００ｍｌに溶解して調製した水溶液５．０ｍｌに、ニンヒドリン０．１ｇを水に溶かし５．０ｍｌとしたニンヒドリン水溶液１．０ｍｌを加えて、３分間加熱したとしても、変化は観察されない。）
▲７▼フラボノイド定性反応：陰性（精製抽出物０．２５ｇに５０％エタノール５．０ｍｌを加え、溶解後、マグネシウムリボン０．１ｇ及び塩酸１．０ｍｌを加えて放置したとしても、変化は観察されない。）
▲８▼可視部・紫外部吸収スペクトル：２２０〜２３０ｎｍ付近に吸収極大を示す。尚、可視部に吸収極大を示さない。
【００１７】
本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は、後述する試験例において示すように優れた育毛効果を有するとともに、極めて安全性が高いものである。
上記のリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物を用いて本発明に係る育毛剤組成物とする場合、その配合量は特に限定されないが、少なすぎると有効成分配合による効果が充分発揮されないため、全組成物中０．０１〜１００重量％、好ましくは、０．１〜１０．０重量％、更に好ましくは、０．５〜５．０重量％である。
【００１８】
本発明に係る育毛剤組成物には、上記の有効成分以外に、育毛・養毛成分として、例えば、ビタミンＥ及びその誘導体、センブリエキス、ニンニクエキス、セファランチン、塩化カルプロニウム、アセチルコリン等の血行促進剤、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、ノニル酸バニルアミド等の局所刺激剤、サリチル酸、レゾルシン、乳酸などの角質溶解剤、プラセンタエキス、ペンタデカン酸グリセリド、パントテニルエチルエーテル、ビオチン、ヒノキチオール、アラントイン等の代謝賦活剤、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸等の消炎剤、イソプロピルメチルフェノール、トリクロサン、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等の殺菌剤、メントール、カンフル等の清涼剤、その他女性ホルモン等を適宜配合することも可能である。
【００１９】
更に、本発明の効果を損なわない範囲で、アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、界面活性剤、精製水、香料、防腐剤、抗菌剤、油剤、高級脂肪酸、脂肪酸エステル、保湿剤、清涼剤、色素等の通常の化粧品成分、或いはホルモン類、ビタミン類、アミノ酸類、収斂剤及び胎盤抽出物、エラスチン、コラーゲン、ムコ多糖、アロエ抽出物、ヘチマ水、ローヤルゼリー、バーチ、ニンジンエキス、カモミラエキス、甘草エキス、サルビアエキス、アルテアエキス、セイヨウノコギリソウエキス等の生薬成分をはじめとする動植物抽出成分等の特殊配合成分を目的に応じて適宜任意に配合してもよい。
【００２０】
尚、前記育毛剤組成物は化粧品、医薬部外品或いは医薬品として用いることができ、例えば、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアトリートメントとして用いることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
〔試料の調製〕
（比較例１）
タイ国より入手したリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の葉及び茎の乾燥粉砕物１．５ｋｇに、７．５Ｌのメタノールを加え、還流温度にて２時間還流抽出した。不溶な植物残査を濾別し、濾液を減圧留去することにより得られた濃褐色ペースト状の抽出物６０ｇ（収率４．０％）を比較例１の試料とした。
【００２２】
（比較例２）
上記調製した比較例１の試料１０ｇを、合成吸着剤セパビーズＳＰ２０７（三菱化学社製）３００ｃｃを充填した口径５．０ｃｍのクロマトグラフ管（ガラスフィルター付）に添着し、メタノール３０００ｍｌで溶出後、減圧留去して得られた褐色〜茶褐色のペースト状の画分８．０ｇ（収率８０．０％）を比較例２の試料とした。
【００２３】
（実施例１）
比較例２の試料６．０ｇをメタノール２００ｍｌに溶解し、比較例２の試料と略等量の粉末活性炭（和光純薬工業社製）を加え、室温下で１５分間撹拌した。活性炭を濾別後、濾液を減圧留去して得られた黄褐色の精製抽出物４．８ｇ（収率８０．０％）を実施例１の試料とした。
【００２４】
〔物理化学的性質の確認〕
上記調製した実施例１の試料の物理化学的性質について試験した。以下、その試験項目と試験結果及び試験方法について記載する。
▲１▼性状：黄褐色のペースト状
▲２▼リーベルマン反応：陽性（実施例１の試料０．２ｇに無水酢酸２．０ｍｌを加え、水浴上で２分間加熱した後濾過して得られた濾液１．０ｍｌに硫酸０．５ｍｌを穏やかに加えたところ、濾液と硫酸の境界面は赤紫色を呈した。）
▲３▼サポニン定性試験：陰性（実施例１の試料０．２７ｇに水５．０ｍｌを加え、激しく振り混ぜたところ、持続性の微細な泡は生じなかった。）
▲４▼アントロン反応：陽性（実施例１の試料１ｇを水３０００ｍｌに溶解して調製した水溶液１．０ｍｌに、アントロン３５ｍｇを硫酸１００ｍｌに溶解して調製した液２，０ｍｌを加えたところ、緑〜青緑色を呈した。）
▲５▼カテキン定性反応：陰性（実施例１の試料０．１３ｇを５０％エタノール２０ｍｌに加えて２分間振り混ぜた後に濾過し、濾液１．０ｍｌを５０％エタノール９．０ｍｌに溶解して得られた溶液１．０ｍｌに、バニリン１０ｍｇをエタノール１．０ｍｌに溶解して更に水１．０ｍｌ及び塩酸６．０ｍｌを加えて調製した溶液を１．０ｍｌ加えたところ、変化は観察されなかった）
▲６▼ニンヒドリン反応：陰性（実施例１の試料１ｇを水１００ｍｌに溶解して調製した水溶液５．０ｍｌに、ニンヒドリン０．１ｇを水に溶解して５．０ｍｌとしたニンヒドリン水溶液を１．０ｍｌ加えて、３分間加熱したところ、変化は観察されなかった。）
▲７▼フラボノイド定性反応：陰性（実施例１の試料０，２５ｇを５０％エタノール５．０ｍｌに溶解した後、マグネシウムリボン０，１ｇ及び塩酸１．０ｍｌを加えて放置ところ、変色は観察されなかった。）
▲８▼可視部・紫外部吸収スペクトル：２２０〜２３０ｎｍ付近に吸収極大を示した。可視部には吸収極大を示さなかった。
【００２５】
〔育毛効果試験〕
（試験例１：マウスの発毛に対する効果）
１．試料溶液の調製
実施例１及び比較例１〜２の各試料を、その濃度が５％（Ｗ／Ｖ）となるようにエタノールに溶解したものを検体溶液とした。また、エタノールをコントロールの検体溶液とした。
２．マウスへの塗布
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ  Ｃｒｊマウス（８週齢、体重２１〜２６ｇ）を一週間以上馴化飼育を行ったあと、異常のなかったものについて、背部被毛を電気バリカンで、２ｃｍ×４ｃｍの広さに毛刈りし、さらに電気シェーバーにて除毛し、検体溶液の投与部位とした。除毛してから３日後、実施例１及び比較例１〜２の各検体溶液を各１０匹のマウスに連続１９日間、１００μＬづつ、１日１回午前中に塗布した。試験期間中、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ  Ｃｒｊマウスは、温度２２±２℃、相対湿度５５±１５％、換気回数２０回／時、照射時間を午前６時から午後６時に設定した飼育室で、プラスティックケージ（１４．５ｃｍ×２６ｃｍ×１２．５ｃｍ）を用いて５匹ずつ飼育した。
検体塗布部位の状態を定期的に観察し、以下の評価基準に従ってスコアをつけ、１０匹の平均点を算出した。結果を表１に示す。
＜評価基準＞
皮膚がピンク色を呈する・・・０点
皮膚が灰色に変化（１００％未満）・・・１点
皮膚が灰色に変化（１００％）・・・２点
発毛が茶色に変化（１００％未満）・・・３点
発毛が茶色に変化（１００％）・・・４点
発毛が黒色に変化・・・５点
【００２６】
【表１】
0003584397.tif 000002
【００２７】
表１の結果から、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は、粗抽出物と同様の優れた育毛効果を有していることがわかる。また、マウスの皮膚投与部位は、試験期間中を通じて影響はなく、粗抽出物並びに本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物による皮膚刺激性は認められなかった。
【００２８】
〔安全性試験〕
（試験例２：皮膚感作性試験）
１．試料の調製
▲１▼感作投与検体
注射用水とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＣＡ）を等量混和し、油中水型（ｗ／ｏ）のエマルジョンを調製した。尚、貼付投与検体は、被験物質（実施例１及び比較例１の各試料）に白色ワセリン（健栄製薬社製）を加えて２５％（Ｗ／Ｗ）となるように調製した。
▲２▼誘発投与検体
被験物質を必要量分取してそのまま用いた。
２．感作方法
３週齢のモルモット（Ｃｒｊ：Ｈａｒｔｌｅｙ，  ＳＰＦ雄）を５日間の検疫後、２日間馴化飼育を行ったあと、異常のなかったものを用い、１群３匹とした。
一次感作は、モルモットの肩甲骨上約４×６ｃｍを剪毛し、その翌日に正中線を挟んだ２×４ｃｍの投与部位の四隅に注射用水とＦＣＡの１：１の油中水型（ｗ／ｏ）乳化液を０．１ｍｌ／ｓｉｔｅ皮内投与した。続いて、皮内投与部位の角質層に滅菌した２３Ｇの注射針を用いて井型の傷を付けた。擦過傷で囲む部位に、被験物質群には被験物質の２５％ワセリン軟膏１００ｍｇを硫酸紙に広げて貼付し、２４時間閉塞した。皮内投与以外の操作を連続３日（１日１回）行った。
二次感作は、初回貼付感作投与から７日後に、１０％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）含有のワセリン軟膏２００ｍｇを一次感作投与部位に開放塗布した。２４時間後にＳＬＳ含有のワセリン軟膏を除去した。除去後、被験物質２５％ワセリン軟膏２００ｍｇを硫酸紙に広げて貼付し、一次感作と同様に４８時間閉塞した。
３．誘発方法
二次感作投与の２週間後に誘発投与した。モルモットの剪毛した腹側部に、被験物質群には各被験物質の１〜１０％ワセリン軟膏１０ｍｇを２４時間開放塗布した。尚、無処置群の動物には各被験物質を貼付した。
４．判定方法
開放塗布後約２４、４８、７２時間経過後に、皮膚反応（紅斑と痂皮形成、浮腫）の有無及びその程度を観察し、以下の評価基準に従ってスコアをつけた。
尚、皮膚反応の程度は、各個体の合計評点（紅斑と痂皮形成の評点＋浮腫形成の判定）を基に無処置群と被験物質との間でＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定法により検定した。
＜評価基準＞
紅斑と痂皮形成
紅斑なし・・・０点
ごく軽度の紅斑・・・１点
明らかな紅斑・・・２点
中〜強度の紅斑・・・３点
反応が深く、わずかに痂皮をつけた深紅色紅斑・・・４点
浮腫形成
浮腫なし・・・０点
軽度の浮腫・・・１点
中度の浮腫・・・２点
投与域を出る反応で１ｍｍ以上にもなる強い浮腫・・・３点
【００２９】
結果を表２に示す。
【表２】
0003584397.tif 000003
【００３０】
表２の結果から、比較例１で得られたリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の粗抽出物は皮膚感作性を示すが、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は皮膚感作性を示さないことが分かる。
【００３１】
（試験例３：光毒性試験）
１．試料の調製
被験物質としては、実施例１の試料を日局注射用水（扶桑薬品工業社製）により１０％（Ｗ／Ｖ）となるように調製した液を用いた。陰性対照としては日局注射用水を、陽性対照としては８−メトキシプソラレン（１％オクソラレン（商標名）ローション：大正製薬社製）をそれぞれ用いた。
２．最小紅斑量（ＭＥＤ）の測定
４週齢のモルモット（Ｓｌｃ：Ｈａｒｔｌｅｙ，  ＳＰＦ雄）を９日間馴化飼育を行った。馴化期間中にモルモット３匹を用いて、背部被毛を電気バリカンと電気カミソリで、できるだけ広く除毛した。翌日、除毛部に四箇所穴を開けたアルミホイルで被覆し、粘着テープで固定した後、ＵＶ−Ｂをそれぞれに０．２、０．４、０．６、０．８Ｊ／ｃｍ２  照射した。照射には並列６灯のＦＬ−２０ＳＥランプ（波長２８０〜３７０ｎｍ、極大波長３００ｎｍ、東芝社製）を皮膚照射面から１０ｃｍ離して使用した。照射後、２４、４８時間経過後に照射部の紅斑の有無を観察し、紅斑が照射後２４時間経過後に認められ、４８時間経過後には消失した０．６Ｊ／ｃｍ２  を最小紅斑量（ＭＥＤ）とした。
３．投与部位及び投与方法
９日間の馴化飼育の後、最小紅斑量（ＭＥＤ）測定に使用していない動物のうち、異常のない動物５匹を試験に用いた。
電気バリカンと電気カミソリでモルモットの背部をできるだけ広く除毛した。翌日、背部正中線を挟んで左右対称の位置に陰性対照、陽性対照、被験物質を、１部位当たり０．０５ｍｌを１．５×１．５ｃｍの投与部位にそれぞれ塗布した。塗布は位置による偏りを避けるため、個体ごとに配列順序を変えた。
４．光照射
投与検体塗布後約３０分後に片側はアルミホイルと粘着テープで被覆して並列６灯のＦＬ−２０ＳＥランプ（波長２８０〜３７０ｎｍ、極大波長３００ｎｍ：ＵＶ−Ｂ）で皮膚塗布面から１０ｃｍ離して０．２８〜０．３３Ｊ／ｃｍ２  を照射した。更に、ＦＬ−２０ＢＬＢランプ（波長３００〜４３０ｎｍ、極大波長３６５ｎｍ：ＵＶ−Ａ）で同様に９．６２〜１０．７６Ｊ／ｃｍ２  を照射した。この際、３２０ｎｍ以下の紫外線を遮るためにランプと皮膚の間にガラスフィルターを設置した。
紫外線照射量はデジタル紫外線強度計を用いて測定し、ＦＬ−２０ＳＥの紫外線照射量は最小紅斑量の１／２ＭＥＤとした。
５．皮膚反応の観察
照射後、２４、４８、７２時間経過後に照射部位〔ＵＶ（＋）〕と非照射部位〔ＵＶ（−）〕の皮膚反応の強さを以下の基準で判定した。
＜評価基準＞
紅斑
紅斑なし・・・０点
ごく軽度の紅斑・・・１点
明らかな紅斑・・・２点
中〜強度の紅斑・・・３点
強度の紅斑〜痂皮形成・・・４点
浮腫
浮腫なし・・・０点
軽度の浮腫・・・１点
中度の浮腫・・・２点
強度の浮腫・・・３点
【００３２】
結果を表３に示す。
【表３】
0003584397.tif 000004
【００３３】
表３の結果から、実施例１の試料の塗布部は、紫外線照射及び非照射のいずれの部位にも観察期間を通じて紅斑及び浮腫は認められず、平均評価点及び反応率共に、照射後７２時間まで０であった。従って、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は光毒性を示さないことが分かる。
【００３４】
（試験例４：変異原性試験（細菌））
１．試料の調製及び菌株
実施例１の試料に黄色灯下で注射用水を加えて５０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液を注射用水で順次希釈して、公比２で６濃度（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６ｍｇ／ｍｌ）の被験物質溶液を調製した。
尚、試験には、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８、ＴＡ１５３７、ＴＡ１５３５、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＷＰ２ｕｖｒ  Ａの菌株を用いた。
２．菌懸濁液の調製
Ｌ字型試験管を用いて１０ｍｌのニュートリエントブロス培養液に自然解凍した菌懸濁液２０μｌを接種し、３７℃で８．５時間振盪培養した。培養後、菌懸濁液の濁度（ＯＤ）を紫外・可視分光光度計で測定し、増殖対数期の終期若しくは静止期の初期であることを確認した。
３．陽性対照及び陰性対照の調製
Ｓ９ｍｉｘ  （ラット肝Ｓ９（オリエンタル酵母工業社製）０．１ｍｌとコファクター（オリエンタル酵母工業社製）０．９ｍｌより調製）を用いない直接法では、ＴＡ９８及びＷＰ２ｕｖｒ  Ａ菌株については、陽性対照として２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）をそれぞれ０．１及び０．０１μｇ／プレートの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して調製した溶液を用いた。また、ＴＡ１５３７菌株については、９−アミノアクリジン（９ＡＡ）を８０．０μｇ／プレートの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して調製した溶液を用いた。ＴＡ１５３５菌株については、ソディウムアジド（ＳＡＺ）を０．５μｇ／プレートの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して調製した溶液を用いた。
また、Ｓ９ｍｉｘ  を用いる代謝活性化法では、ＴＡ９８、ＴＡ１５３７、ＴＡ１５３５、ＷＰ２ｕｖｒ  Ａ菌株については、陽性対照として２−アミノアントラセン（２ＡＡ）をそれぞれ０．５、２．０、２．０、１０．０μｇ／プレートの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解して調製した溶液を用いた。
また、陰性対照としては、注射用水を用いた。
尚、プレートはバイタルメディアＡＭＴ−Ｓ培地（極東製薬工業社製）を用いた。
４．軟寒天溶液（トップアガー）の調製
軟寒天溶液（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加温溶解し、ネズミチフス菌用には０．５ｍｍｏｌ／Ｌビオチン及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン混合溶液、大腸菌用には０．５ｍｍｏｌ／Ｌトリプトファン溶液をそれぞれ１／１０容の割合で添加した。試験には約４０℃に保温して使用した。
５．試験方法
試験は黄色灯下で、プレインキュベート法を採用してＳ９ｍｉｘ  を添加した代謝活性化法と添加しない直接法により行った。
▲１▼直接法
小試験管に注射用水、陽性対照物質或いは被験物質溶液０．１ｍｌを入れた後、０．１ｍｏｌ／ＬＮａリン酸緩衝液０．５ｍｌ及び菌株の懸濁培養液０．１ｍｌを順に加え、攪拌後３７℃で振盪培養した。２０分後に小試験管を取り出し、トップアガー２．０ｍｌを加えて攪拌後、プレート上に均一に撒いた。この操作は小試験管２本ずつを３０秒間隔で進行させた。
トップアガーを重層後、遮光して３７℃の恒温器内で４８時間培養し、出現した復帰変異コロニー数を数え、平均値を求めた。
▲２▼代謝活性化法
直接法の０．１ｍｏｌ／ＬＮａリン酸緩衝液０．５ｍｌの代わりにＳ９ｍｉｘ  ０．５ｍｌを用いて同様に操作した。
尚、評価方法は、被験物質処理群において陰性対照値と比べて２倍以上の復帰変異コロニー数が出現し、かつ、用量依存性が認められる結果を得たときを陽性とした。
【００３５】
結果を表４に示す。
【表４】
0003584397.tif 000005
【００３６】
表４の結果から、実施例１で得られた抽出物群のコロニー数はいずれの用量も陰性対照値の２倍以下であり、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）抽出物は、細菌を用いた変異原性試験において、変異原性を示さないことが分かる。
【００３７】
（試験例５：哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験）
１．試料の調製
被験物質は、実施例１の試料に培地を徐々に加えて均一に混和し、５．０、４．０、３．０ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液とした。
陰性対照としては同培地を用いた。陽性対照としてはジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）を日本薬局方生理食塩水に溶解し、更に培養液１％を添加して調製した。
Ｓ９ｍｉｘ  は、全量１ｍｌの組成が、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）４μｍｏｌ、塩化マグネシウム５μｍｏｌ、塩化カリウム３３μｍｏｌ、グルコース６−リン酸５μｍｏｌ、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）４μｍｏｌ、Ｓ９（オリエンタル酵母工業社製）０．３ｍｌとなるように調製し、培地２．５ｍｌに０．５ｍｌのＳ９ｍｉｘ  を添加して、培地中のＳ９濃度を５％とした。
尚、培地は非働化（５６℃、３０分）済みの仔牛血清を約１０％の割合で添加したイーグルＭＥＭ培地を用い、培養は５％ＣＯ２  、３７℃に調整した炭酸ガスインキュベーター内で行った。
２．試験方法
チャイニーズハムスター雌肺由来のＣＨＬ／ＩＵ細胞（継代数１６）を培地５ｍｌを入れた直径６０ｍｍのシャーレに２×１０４  個を播種して３日間培養した後、用量当たり２枚のシャーレを用いて培地を被験物質溶液２．５ｍｌとＳ９ｍｉｘ  ０．５ｍｌの混合液に換え、細胞を６時間処理し、生理食塩水で洗浄し、新鮮な培地５ｍｌを加えて更に１９時間培養した。
標本作成のために、培養終了２時間前にコルセミド（最終濃度０．２μｇ／ｍｌ）をシャーレに添加して分裂期の細胞を蓄積した。培養終了時に、トリプシン処理で細胞を剥離し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により細胞を回収した。次に、７５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム液を加え、３７℃で１５分間保温した後、カルノア固定液（メタノール：酢酸＝３：１）で細胞を固定した。固定した細胞をスライドグラス上に滴下し、空気乾燥させた。観察前に１．５％ギムザ溶液（ｐＨ６．８の１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液で調製）で染色した。
３．観察
それぞれ各用量当たり１００個（１シャーレに付き５０個）の良く拡がった分裂中期細胞を１０００倍で観察し、染色体構造異常（正常な染色体数２３〜２７）及び倍数体を検索した。
構造異常については、染色分体型切断、染色分体型交換、染色体型切断、染色体型交換、その他（断片化、多数の異常）及びギャップ（染色分体幅より狭い非染色性部位）を顕微鏡下で識別し、それらの総異常数及びギャップの出現数を表５に記した。また、数的異常については、倍数体及び総異常細胞数を表５に記した。
尚、陰性及び陽性対照については、それぞれ５０個（１シャーレに付き２５個）の分裂中期細胞を同様に観察した。
評価方法は、染色体異常を持つ細胞又は倍数体の出現頻度に用量依存性が認められ、出現頻度が１０％以上を陽性とした。また、出現頻度が５％以上１０％未満を疑陽性、５％未満を陰性とした。
【００３８】
結果を表５に示す。
【表５】
0003584397.tif 000006
【００３９】
表５の結果から、実施例１で得られた抽出物は、構造異常の頻度は３ｍｇ／ｍｌで２．０％、４ｍｇ／ｍｌで４．０％、５ｍｇ／ｍｌで４．０％と、いずれの場合も５％未満であった。また、数的異常は、倍数体が１（１．０％）又は２個（２．０％）見られたが、これらも５％未満であった。従って、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の抽出物は、哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験において、変異原性を示さないことが分かる。
【００４０】
〔着色性試験〕
（試験例６：白色綿布を用いた着色性試験）
１．試料の調製
比較例１〜２の試料及び実施例１の試料をそれぞれ５％の濃度になるようにエタノールに溶解して、検体溶液とした。また、比較例３〜５の試料としては、市販の育毛剤をそのまま用いた。
２．試験方法
１０ｃｍ×１０ｃｍに切った木綿製の白色布をそれぞれの試料溶液３ｍｌに浸した。風乾後、布を３枚（３ｃｍ×１０ｃｍ）に切り、１片はそのまま染み等の汚れの程度を目視により評価した（方法▲１▼）。残る２片のうち１片は水による手揉み洗いを行い風乾した後に（方法▲２▼）、もう１片は漂白剤に３分間浸した後水洗いし風乾した後に（方法▲３▼）、染み等の汚れの程度を、以下の評価基準に従って目視により評価した。
＜評価基準＞
×：濃い染みが残る
△：染みが残る
○：ほぼ白色に近い
◎：未処理の布と区別がつかない
【００４１】
結果を表６に示す。
【表６】
0003584397.tif 000007
【００４２】
表６の結果から、比較例１及び２のリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の抽出物は、白色木綿布への濃い着色性を示し、特に比較例１の抽出物（粗抽出物）においては、一度着色した色は漂白によっても除けなかった。
これに対して、実施例１で得られた本発明に係る抽出物は比較例２〜４の市販育毛剤と同等以上に白色木綿布への着色性は、殆ど示さないことが分かる。
【００４３】
以下、本発明に係るリナカンツスナスツス（Ｒｈｉｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｎａｓｕｔｕｓ）の抽出物を用いた育毛剤組成物の処方例を示す。
【表７】
0003584397.tif 000008
【００４４】
【表８】
0003584397.tif 000009
【００４５】
【発明の効果】
以上詳述した如く、本発明に係る育毛剤組成物は、有効成分として優れた育毛効果を奏し、医薬品、医薬部外品及び化粧品に配合できる安全性の高い抽出物であるリナカンツスナスツス（Rhinacanthus nasutus）抽出物を配合するものであるから、優れた育毛効果を有するとともに、安全性が高く、しかも衣服等に付着したとしても容易に除去することができる。