(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子修飾した多分化能中枢神経系（CNS）神経幹細胞を製造する方法であって、
（ａ）多分化能CNS神経幹細胞を、該多分化脳CNS神経幹細胞の増殖を誘導するのに有効な成長因子を含む無血清培地中で増殖させる工程であって、
該多分化能CNS神経幹細胞は、成長因子の存在によって引き起こされる無限増殖的分裂を行うことができ、かつ、ニューロン、神経膠星状細胞及び乏突起神経膠細胞へ分化することができる子孫を生成することができるものである工程、
（ｂ）増殖した細胞へ外来性ポリヌクレオチドを導入することにより、該増殖した細胞を遺伝子修飾する工程、及び、
（ｃ）遺伝子修飾した多分化能CNS神経幹細胞を更に増殖させる工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）における培地中の多分化能CNS神経幹細胞の増殖を誘導するのに有効な成長因子が、酸性繊維芽細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンフィレグリン、形質転換成長因子アルファ及びこれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞が胎児から得られたものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞が成人から得られたものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記神経幹細胞がヒトから得られたものである、請求項１、２又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖した細胞が、成長因子生成物を生成するように遺伝子修飾される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記成長因子生成物が、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、毛様体神経栄養因子、アンフィグリン、塩基性繊維芽細胞成長因子、酸性繊維芽細胞成長因子、表皮細胞成長因子、形質転換成長因子アルファ、形質転換成長因子ベータ、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子及びインターロイキンからなる群から選ばれる請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記増殖した細胞が、成長因子受容体を製造するように遺伝子修飾される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記成長因子受容体が、p75低親和性神経成長因子受容体、毛様体神経栄養因子受容体、ニューロトロフィン受容体、表皮細胞成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容体及びアンフィレグリン受容体からなる群から選ばれる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記増殖した細胞が、神経伝達物質を生成するように遺伝子修飾される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記神経伝達物質が、セロトニン、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、タキキニン、エンドルフィン、ヒスタミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパーテート、グリシン、グルタメート、γ−アミノ酪酸及びアセチルコリンからなる群から選ばれる請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖した細胞が、神経伝達物質合成遺伝子を含むように遺伝子修飾される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記神経伝達物質合成遺伝子が、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖した細胞が、神経ペプチドを生成するように遺伝子修飾される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記神経ペプチドが、Ｐ物質、神経ペプチド−Ｙ、エンケファリン、バソブレシン、血管作用性小腸ペプチド、グルカゴン、ボンペシン、コレシストキニン、ソマトスタチン及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドからなる群から選ばれる請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖した細胞が、クロム親和性顆粒アミン伝達物質を生成するように遺伝子修飾される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
さらに、（ｄ）前記遺伝子修飾細胞を分化させる工程を含む請求項１〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子修飾した多分化能CNS神経幹細胞を含む培養物であって、
該神経幹細胞が、
（ａ）ネスチンを陽性に染色し、
（ｂ）乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、及びニューロンへの分化が可能である子孫を生成することができ、かつ、
（ｃ）成長因子によって引き起こされる無限増殖的分裂を行うことができるものであり、
該細胞培養物が請求項１の方法により得られるものであることを特徴とする培養物。
【請求項１９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項18記載の培養物。
【請求項２０】
前記細胞が、成長因子生成物、成長因子受容体、神経伝達物質、神経伝達物質受容体及び神経ペプチドからなる群より選ばれる生物学的に活性な物質を発現するように遺伝子修飾されている、請求項18又は19に記載の培養物。
【請求項２１】
前記神経幹細胞を懸濁培養中で増殖させる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は、U.S.S.N.08/010,829号（出願日1993年１月29日）、U.S.S.N.07/726,812号（出願日1991年７月８日）、U.S.S.N.07/961,813号（出願日1992年10月16日）、及びU.S.S.N.07/967,622号（出願日1992年10月28日）の特許出願の一部継続出願である。上記の出願の内容は、参考文献として特に本明細書中に組み込まれる。
発明の背景
本発明は、中枢神経系（CNS）疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞（genetically modified cell）の製造方法に関する。特に、本発明は、成長因子反応性（growth factor responsive）神経幹細胞の遺伝子修飾、並びに、成長因子反応性神経幹細胞から誘導される分化神経細胞及び神経膠細胞の遺伝子修飾、並びに、神経退化性疾患（neurodegenerative disorder）を処置するためのこれらの細胞の使用に関する。
CNS疾患は、神経退化性疾患（例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病）、急性脳創傷（acute brain injury）（例えば、卒中、頭部創傷、及び脳性麻痺）、及びCNS機能障害（例えば、うつ病、てんかん、及び精神分裂病）のような非常な苦痛を含む。近年、神経退化性疾患は、その疾患のために非常に危険な状態にある初老の人々が増大していることから、重大な関心事となっている。アルツハイマー病、多発硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びパーキンソン病を含む、この病気は、CNSの特定の位置の神経細胞の退化と関係があり、それらの細胞又は脳領域が意図する機能を実行できないようになる。神経退化性疾患に加えて、急性脳創傷は、しばしば神経細胞を欠失し、影響を受けた脳領域が不適当に機能し、かつ、それに続く行動異常をもたらす。多分、CNS機能障害の大部分（影響を受けた人々の数に関して）は、神経細胞の欠失によって特徴づけられるのではなく、むしろ存在する神経細胞の異常な機能による。これは、ニューロンを不適当に刺激すること、又は神経伝達物質の異常な合成、遊離、及び調製によるものであろう。これらの機能障害は、うつ病及びてんかんのような疾患を十分に研究し、特徴づけた結果であり、ノイローゼ及び精神病のような疾患をよく理解していない結果であろう。
現在までのところ、CNS疾患の処置は、主に医薬化合物を投与することによりなされている。不幸なことに、このタイプの処置は、薬物を血液脳関門を横切って運ぶ限定された能力、及びそれらの薬物を長期間投与する患者に必要な薬物耐性を含む、多くの複雑化の要因を伴っている。例えば、パーキンソン病患者のドーパミン作用性の活性の部分的回復が、レボドパ（levodopa）によって達成されるが、このレボドパは、血液脳関門を横切ることができるドーパミン前駆体である。しかし、患者は、レボドパの効果に耐性ができる。ゆえに、その効果を維持するために即座に投与量の増加が必要となる。さらに、動きが増加し、かつ制御できないような、レボドパに関連する、多くの副作用がある。
最近、神経学的組織移植の概念が、パーキンソン病のような神経退化性疾患の処置に適用されている。神経移植により、薬物の常時投与の必要性をなくすだけでなく、血液脳関門により生じる複雑な薬物送達システム（drug delivery system）の必要性をもなくすこととなる。
神経伝達物質を通常製造する欠失した細胞を置き換えるために、遺伝子修飾細胞を、神経学的組織移植に用いている。例えば、繊維芽細胞（fibroblast）を、チロシンヒドロキシラーゼ（繊維芽細胞にドーパミンを製造させる）のためのcDNAを含むレトロウィルスベクターで遺伝子修飾し、パーキンソン病の動物モデルに移植した（ガーゲ（Gage）ら、米国特許第5,082,670号）。
遺伝子修飾繊維芽細胞をCNS疾患の処置に用いることにより、パーキンソン病の動物モデルのある行動欠損（behavioral deficit）が改善する見込みがあり、CNSへの必要な伝達物質を供給する新規なアプローチを表すが、パーキンソン病の処置として、及び、一般に神経退化性疾患及び脳創傷を処置する治療上のアプローチとして、いくつかの重大な欠点がある。第１に、CNSは主に３つの細胞タイプ、即ち、ニューロン、神経膠星状細胞、及び乏突起神経膠細胞から成る。繊維芽細胞は存在しない。CNS内に外来性細胞（foreign cell）を移植すること、並びに宿主細胞の機能におけるその直接及び間接の効果をいまなお研究しなければならない。しかし、膜結合因子の発現、並びに、成長因子及びプロテアーゼのような溶解性分子の遊離によって、その周囲の組織の通常の挙動を変化させるようである。これは、ニューロンへの直接の作用により、又は神経膠細胞の通常の機能の変化により、神経刺激パターンの崩壊が生じるのであろう。
繊維芽細胞がCNSに移植されるときに生じる他の関心事は、繊維芽細胞分裂の内因性阻害をほとんど制御できないので、移植細胞が腫瘍を形成するかもしれないという可能性である。一方、外因性シグナルは、細胞が企てる分裂の回数を制御するのに大きな役割を有する。移植繊維芽細胞の分裂におけるCNS環境の効果、及び繊維芽細胞腫瘍形成の高い可能性は、長期間研究されていない。
繊維芽細胞をCNSに移植する際の第３の関心事は、神経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞、又はニューロンが組込まれるように、繊維芽細胞がCNS細胞と組込むことができないことである。繊維芽細胞は、内因的には、神経細胞様方法を拡張し、宿主組織を有するシナプスを形成する能力に限られている。しかし、遺伝子修飾及びCNSへの繊維芽細胞の移植は、ある分子をCNSへ伝達するための現在の技術における改善であるが、繊維芽細胞が組込めず、CNS組織として機能しないこと、CNS細胞におけるそれらの潜在的な負の効果、及び増殖についてのそれらの限定された内因性制御により、急性又は慢性CNS損傷又は疾患の処置のための移植にそれらを実務上用いることを制限する。
遺伝子修飾及び移植のために好適な組織は、CNS細胞、即ちニューロン、神経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞であろう。CNS細胞の１つの供給源は、ヒト胎児性組織からのものである。いくつかの研究により、胎児性CNS組織の移植を受けた後にパーキンソン病の患者に改善が見られた。ヒトの患者の尾状器官及び被殻にドーパミン細胞を含む未発達中脳組織を移植することにより、パーキンソン病が進んだ何人かの患者に長期にわたる臨床上の利益があることが、フリード（Freed）ら（N Engl J Med 327巻:1549−1555（1992年））によってわかった。同様な成功がスペンサー（Spencer）ら（N Engl J Med 327巻:1541−1548頁（1992年））によっても示された。ウィナー（Widner）ら（N Engl J Med 327巻:1556−1563頁（1992年））は、胎児性中脳組織の両側性移植を受けたMPTP誘導パーキンソン症候群の患者に長期間の機能向上があることがわかった。
上記の研究は励みになるが、病気の処置のために流産した胎児の組織を用いることは、倫理的な考慮と政治的な障害が生じる。また他の考慮もある。胎児のCNS組織は、１以上の細胞タイプから成り、よって、組織の明確な供給源とはならない。さらに、胎児組織を十分かつ常時に供給することが、移植に対して入手可能なのか否かという重大な疑問がある。例えば、MPTP誘導パーキンソン症候群（ウィナー、上述）の処置において、１人の患者の脳の移植に、６〜８体の胎児からの組織が用いられた。また、胎児組織を調製する間、雑菌混入の潜在性の問題もある。さらに、組織が既にバクテリア又はウィルスで感染されており、使用する各々の胎児について、費用のかかる診断検査が必要となるかもしれない。しかし、診断検査をしても、感染した組織が全てわかるわけでもない。例えば、HIVフリーの組織の診断は保証できない。その理由は、一般にウィルスに対する抗体が感染後数週間まで現れないからである。
胎児組織の代わりに、無制限量で入手可能であり、移植のための組織の、明確かつ再現性ある供給源を有することがより好ましいであろう。神経組織は最小の分裂をするので、これらの基準に容易には合致しない。神経膠星状細胞は分裂する能力を保持し、多分、外来遺伝子での感染を分析できるが、神経細胞とシナプスを形成する能力は限定され、外来性遺伝子生成物の発現及び遊離の外因性調節も結局限定される。
乏突起神経膠細胞についても、同じような問題のいくつかを受ける。また、成熟乏突起神経膠細胞は分裂せず、乏突起神経膠細胞の始原細胞（即ち、O2A細胞）への感染を制限する。しかし、乏突起神経膠細胞始原細胞の限られた増殖能力のため、これらの細胞の感染及び収穫（harvesting）は、実務上の供給源とはならない。
ニューロンの外来性遺伝子による感染、及びCNSへの移植は、方法を拡張させ、シナプスを作り、環境によって調節される能力を考慮すると、理想的であろう。しかし、分化したニューロンは分裂せず、化学的及び物理的手段による外来性遺伝子でのトランスフェクションは効力がなく、又はそれらは長期間安定ではない。試験管中で（in vitro）第１の神経前駆体をレトロウィルス・ベクターで感染させることは、実用的ではない。その理由は、神経芽細胞が大量のニューロン（ニューロンが組込まれ、外来遺伝子を発現する）の選択をする分裂が限られるように制御されるか、ほとんど不可能だからである。ガン遺伝子のレトロウィルス運搬体により神経前駆体を不死化する可能性、及びそれに続く所望の遺伝子の感染は、移植細胞による腫瘍形成の潜在性のため、好ましくない。
非常にたくさんの分裂ができないニューロンに伴う問題を克服する、ある試みが、神経細胞系を確立したロネット（Ronnett）らによって開示されている（Science 248巻、603−605頁（1990年））。細胞系は悪性ではないが、一側性のメガレンセファリィ（megalencephaly）、ニューロンの低度な増殖、及びニューロンの移動乱れを有する患者から得た大脳皮質組織から誘導される。しかし、この細胞系の特性が与えられているが、一旦細胞が宿主CNSに移植されると、分裂を止めることができるのかということに関して疑問である。
外来性遺伝子をCNSに導入する他のアプローチが、モアシャッド（Morshead）及びファン・デア・コイ（Van Der Koy）（J.of Neurosci、12（１）巻、249−256頁（1992年））によって示唆される。上衣下（subependymal）細胞を、E.coliβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子を有する複製欠乏組替えレトロウィルスで感染させた。3Hチミジン及びBrdU組み込みを用いて、CNSのこの領域に連続有糸分裂があることがわかった。増殖細胞は、細胞が無限増殖的に非対称な幹細胞に分裂するという事実をベースとした幹細胞であることを、モアシャッド（Morshead）及びファン・デア・コイ（Van Der Koy）は示唆する。即ち、分裂細胞はある多能性（multipotential）細胞を生じるが、他の娘細胞の運命は細胞死である。この考えの基礎となるのは、分裂速度が一定であるのに、CNSの領域での細胞数が相対的に増加しないことによる。
内因性幹細胞が無限増殖的に分裂するという事実から、それらをレトロウィルス・インフェクションを経る遺伝子修飾の好適なターゲットとできる。しかし、これらの細胞は、密度が約５細胞/100立方ミクロン未満でしかCNS内に存在せず、分裂速度及び分裂数は、後成的調製下で少なくとも部分的であるようである。よって、上衣下幹細胞を内因性増殖させる上での大きな制限は、その細胞がCNSに固定数で存在し、新しい遺伝子の導入が制御困難であるということにある。第２の大きな制限は、げっ歯類及び霊長類において細胞が空間的に上衣下層に限定されており、幹細胞又はその子孫がCNSの他の領域に移動できないことにある（スマート（Smart）、J.of Comp.Neurology、116巻、325−347頁（1961年）；ルイス（Lewis）、Nature、217巻、974−975頁（1968年））。同じ細胞は、他のCNS領域に記載されておらず、もし存在しても、それらを同定できない。
先行技術において、非CNS組織移植が宿主組織に完全に組込むことができないということ、及び非腫瘍性で、組込み可能なCNS細胞を、移植のために信頼できる供給源から無制限量での利用可能性がないことは、多分、神経移植における最大の制限である。
発明の要約
神経細胞の培養方法及び移植方法を含む、先行技術に伴う前述の欠点を考慮して、遺伝子修飾され、ニューロン及び神経膠細胞へと分化することができ、ホ乳類のCNSに組込むことができる、神経移植のための、非形質導入細胞が無制限量で、かつ信頼できる供給源として、当業界に必要であることは明らかである。
よって、本発明の目的は、移植のための遺伝子修飾した、及び後成的調節した細胞の信頼できる供給源を提供することにある。また、この細胞は、CNSへの移植において、さらにニューロン及び神経膠細胞に分化し、存在するCNS構造に組込まれる。
本発明の他の目的は、遺伝子修飾のために大量に扱うことができる細胞の豊富な供給源を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、CNS内のほとんどいかなる場所へも即座に移植することができる遺伝子修飾細胞を提供することにある。
本発明のこれらの目的及び他の目的、並びに本発明の特徴は、以下の説明及び請求の範囲から、当業者にとってみれば明らかであろう。
CNS疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ドナー組織から神経幹細胞を単離する工程、（ｂ）該神経幹細胞を前駆細胞を得るための成長因子を１以上含む培地で増殖する工程、及び（ｃ）幹細胞及び前駆細胞を遺伝子修飾して、CNS疾患の処置に有用な細胞を製造する工程を有する。
他の態様として、CNS疾患の処置に有用な遺伝子修飾細胞の製造方法は、（ａ）遺伝子導入ドナーから神経幹細胞を単離する工程、（ｂ）該神経幹細胞を成長因子を１以上含む培地で増殖してCNS疾患の処置に有用な前駆細胞を得る工程を有する。
CNS疾患の処置に有用な生物学的活性物質を製造する遺伝子修飾前駆細胞を、患者のCNSに移植するCNS疾患処置方法も開示する。
前述の参考文献は、特許を請求する本発明を開示するものではなく、先行技術としてのものである。この参考文献は背景情報のために提供する。
【図面の簡単な説明】
図1:β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウィルスを感染させた遺伝子修飾前駆細胞の写真。遺伝子を含む細胞は、特徴的な青色の反応生成物を示す。
図2:含β−ガラクトシダーゼ前駆細胞が移植された、新生マウスの皮質のセクションの移植後２−４週間の写真。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む移植細胞は特徴的な青色の反応生成物を示す。
好適な態様の説明
神経幹細胞（NSC）が報告され、それの潜在的な使用が、レイノルズ（Reynolds）及びワイス（Weiss）、Science 255巻:1707頁（1992年）に記載されている。これは本明細書中に参考文献として組み込まれる。『幹細胞』の語は、無制限の増殖が可能で、多くの始原細胞（始原細胞は、その代わりに、分化した又は分化可能な娘細胞を生じることができる）を発生可能な能力を有する幹細胞を生じることが可能な未分化細胞をいう。『神経幹細胞』（NSC）の語は、本発明の幹細胞をいい、適当な培養条件下での子孫をいい、神経膠細胞及び神経始原細胞を含む。NSCが神経芽細胞を生じること（レイノルズ（Reynolds）及びワイス（Weiss）、Restorative Neurology ＆ Neuroscience 4巻:208頁（1992年）、参考文献として本明細書に組み込まれる）がわかった。NSCは、大部分の大膠細胞タイプ（神経膠星状細胞及び乏突起神経膠細胞）を生じることも知られている。
神経幹細胞は、ヒト又は他の動物の供給源からの成人又は胎児の神経組織を含む、さまざまなドナー組織から生成することができ、レイノルズ（Reynolds）及びワイス（Weiss）（上記）の方法により培養できる。『ドナー』の語は、本発明で用いた神経幹細胞の供給源であるヒト又は他の動物をいう。ある状況では、ドナーは遺伝子導入動物である。『遺伝子導入動物』の語は、DNAのセグメントがすべての細胞のゲノム（生殖細胞を含む）に物理的に組込まれ、そのためDNAを子孫に伝達できる、ヒト以外の動物をいう。
本発明の神経幹細胞は、成長因子反応性である。ある所定の無血清培地、及び表皮細胞成長因子（EGF）などのような成長因子又はミトゲン（mitogen）の存在下で成長させた場合、その細胞は分裂が誘発され、未分化細胞のクラスターを生じる。『神経球（neurosphere）』の語が用いられ、細胞のクラスターをいう。少なくとも細胞のいくつかは、ネスチン（＋）表現型（nestin（＋）phenotype）である。クラスターは、幹細胞及び／又は始原細胞を有し、分化細胞を含んでも、含まなくともよい。『始原細胞』の語は、神経幹細胞から誘導された未分化細胞をいい、適当な条件下での神経膠細胞及び／又は神経始原細胞を含む子孫をいう。
本明細書で用いるとき、『前駆細胞』の語は、成長因子又は成長因子の組合せを含む培地で増殖した神経幹細胞から誘導された、本明細書の生細胞（living cell）をいい、『前駆細胞』の語は始原細胞及び幹細胞の両者を含む。神経球の細胞は後に前駆細胞とよばれる。前駆細胞は代表的には神経球の形態で成長するが、培地の条件によって異なる成長パターンを示すことができる。本明細書で用いるとき『成長因子』の語は、タンパク質、ペプチド、ミトゲン、又は成長、増殖、分化、又は栄養効果（trophic effect）を有する他の分子をいう。また、成長因子の語は、成長因子のいかなる組合せも含む。そのような成長因子には、神経成長因子（NGF）、酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子（aFGF、bFGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）、EGF、EGF様リガンド、アンフィレグリン（amphiregulin）、形質転換成長因子アルファ及びベータ（TGFα、TGFβ）、インシュリン様成長因子（IGF）などが挙げられる。
前駆細胞は非形質転換一次細胞であるが、それらは無限増殖性細胞系の特徴を有する。EGFのような成長因子の存在下の未分化状態で、細胞は無限増殖的に分裂し、ゆえに、遺伝子修飾の優れたターゲットとなる。本明細書で用いるとき『遺伝子修飾』の語は、外因性DNAの導入による、安定な又は一過性の前駆細胞の遺伝子型の変形をいう。DNAは合成、又は天然由来のものであるのがよく、遺伝子、遺伝子の部分、又は他の有用なDNA配列を含んでもよい。本明細書で用いるとき『遺伝子修飾』の語は、天然ウィルス作用、天然遺伝子再結合などにより生じるような、天然で生じる変形を含まないことを意味する。外因性DNAは、ウィルスベクター（レトロウィルス、修飾ヘルペスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルスなど）、又は直接DNAトランスフェクション（リポフェクション（lipofection）、リン酸カルシウム・トランスフェクション、DEAEデキストラン、及びエレクトロポレーションなど）によって前駆細胞に導入することができる。本発明の遺伝子修飾細胞は、完全に分化し、多くの分化プロトコールを用いて再現できるようにニューロン又は大膠細胞を製造する能力を有するという、さらに付加した利点を有する。
他の態様として、前駆細胞は、遺伝子導入動物から誘導され、よって、ある意味では、すでに遺伝子修飾されている。遺伝子導入動物を発生させるのに現在いくつかの方法が用いられる。最もしばしば用いられる技術は、DNAを単個細胞の受精卵に直接微量注射する方法である。他の技術には、レトロウィルス仲介転移（retroviral−mediated transfer）、又は胎児性幹細胞内の遺伝子転移（gene transfer in embryonic stem cell）が挙げられる。これら及びその他の技術は、ホーガン（Hogan）ら、Manipulatingu the Mouse Embryo、A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Ed,1986年）に詳しく、これは本明細書に参考文献として組み込まれる。これらの遺伝子導入動物の使用には、健康な神経球とトランスフェクションする必要がないという事実を含む、ある利点を有する。遺伝子導入動物から誘導される前駆細胞は、安定した遺伝子発現を示すであろう。遺伝子導入動物を用いることにより、新しい遺伝子組合せを発生することができる。遺伝子導入動物は、神経細胞により発現された、いかなる有用な遺伝子もそのゲノムに組込むことができる。有用なDNAの例を、遺伝子修飾前駆細胞について以下に議論する点で挙げる。
CNSに細胞移植する際の重要な難題は、宿主内に移植後のドナー細胞の同定である。トリチウム・ラベル、蛍光染料、デキストラン、及びリポーター遺伝子を運ぶウィルスベクターを含むドナー細胞をマークするために多くの計略がなされている。しかし、これらの方法は、毒性、安定性、又は長期間にわたる希釈という固有の問題を受ける。遺伝子導入動物から誘導した神経細胞を用いることにより、移植神経細胞の同定を達成できる改善した手段が提供できる。遺伝子導入マーキングシステムにより、細胞ラベルのための、より安定した、効果的な方法を提供する。このシステムで、例えば膠細胞繊維性酸性タンパク（GFAP）及びミエリン塩基性タンパク（MBP）のプロモーター要素が、遺伝子導入マウスのE.coliβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子の発現を指示することができる。これらのシステムで、レポーター遺伝子の細胞特異性発現が、神経膠星状細胞（GFAP−lacZ）中及び乏突起神経膠細胞（MBP−lacZ）中で、発生調節されたように生じる。
一旦増殖すると、神経球細胞を、単細胞サスペンションへ機械的に分離し、一晩おくことができる培地中のペトリ皿上に置く。前駆細胞をその後遺伝子修飾する。前駆細胞が遺伝子導入細胞から発生する場合、細胞の所望の特性に依存して、その後、それをさらに遺伝子修飾するか、又は修飾しない。細胞のいかなる有用な遺伝子修飾も本発明の範囲内にある。例えば、前駆細胞を修飾し、例えば神経伝達物質又は成長因子などの生物学的活性物質を製造させるか、又はその製造を増加させる。遺伝子修飾は、組替えレトロウィルスでのインフェクション又は先行技術で既知の方法（マニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.（1982年）を参照のこと）を用いたトランスフェクションによって行われる。簡単には、キメラ遺伝子構築物はウィルス、例えばレトロウィルス長末端繰り返し（LTR）、シミアンウィルス（SV40）、サイトメガロウィルス（CMV）；又は、チロシン・ヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（DBH）、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（PNMT）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、膠細胞繊維性酸性タンパク（GFAP）、神経特異性エノラーゼ（NSE）、ニューロフィラメント（NF）タンパク（NF−Ｌ、NF−Ｍ、及びNF−Ｈなど）のような、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子の発現を指示するホ乳類細胞特異性プロモーターを含むであろう。また、ベクターには、実験遺伝子でコインフェクト（coinfect）されたとき、ゲネチシン（geneticin）（G418）、タンパク質合成阻害剤への耐性を授与する、E.coliアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような薬物選択マーカーが含まれるであろう。
遺伝子修飾が生物学的活性物質の製造のためであるとき、その物質は、一般に、任意のCNS疾患の処置に有用なものであろう。例えば、ある成長因子生成物を分泌するような細胞を遺伝子修飾するのが好ましいであろう。本明細書で用いるとき、『成長因子生成物』の語は、タンパク質、ペプチド、ミトゲン、又は成長、増殖、分化、又は栄養効果を有する他の分子をいう。CNS疾患の処置に有用な成長因子生成物には、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（brainderived neurotrophic factor）（BDNF）、ニューロトロフィン（neurotrophin）（NT−３、NT−4/NT−５）、毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor）（CNTF）、アンフィレグリン、bFGF、aFGF、EGF、TGFα、TGFβ、PDGF、IGF、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞が修飾され、p75低親和性NGFr、CNTFr、ニューロトロフィン受容体のtrkファミリー（trk、trkB、trkC）、EGFr、FGFr、及びアンフィグリン受容体を含むある成長因子受容体（ｒ）を発現することができる。細胞を処理して、セロトニン、Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、タキキニン、Ｐ物質、エンドルフィン、エンケファリン、ヒスタミン、Ｎ−メチルＤ−アスパーテート（NMDA）、グリシン、グルタミン、γ−アミノブチル酸（GABA）、及びアセチルコリンなどのような、さまざまな神経伝達物質又はその受容体を製造することができる。有用な神経伝達物質−合成遺伝子には、TH、ドーパ・デカルボキシラーゼ（DDC）、DBH、PNMT、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ChAT、及びヒスチジンデカルボキシラーゼが挙げられる。さまざまな神経ペプチドをコードする遺伝子（CNS疾患の処置に有用であると証明できる）には、物質Ｐ、神経ペプチド−Ｙ（NP−Ｙ）、エンケファリン、バソプレシン、血管作用性小腸ペプチド（VIP）、グルカゴン、ボンベシン、コレシストキニン（CCK）、ソマトスタチン、及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）などが挙げられる。
成功した、トランスフェクトした／インフェクトした細胞を選択した後、それらを96個のくぼみのあるプレート中で限界希釈を用いてクローンして、所望の生物学的活性物質の存在を分析した。所望の物質を高レベルで発現するクローンを成長させ、それらの数をＴフラスコ中で拡大した。特異的な細胞系をその後凍結保存する（cyropreserve）ことができる。遺伝子修飾前駆細胞系は、細胞／遺伝子治療に用いることができ、よって、遺伝子修飾細胞によって製造した生物学的活性分子の必要な患者のCNSに移植することができる。遺伝子修飾前駆細胞の多くのクローンが得られるであろう。あるものは、神経細胞を優先的に生じるであろうし、他のものは神経膠細胞を生じるであろう。
また、遺伝子修飾前駆細胞は、移植の前に試験管内で（in vitro）さまざまな分化プロトコールを受けることができる。例えば、増殖できる培地から遺伝子修飾前駆細胞を取り除き、その細胞のニューロン又は大膠細胞への分化を誘発する成長因子又は成長因子の組合せを含む培地で処理してもよい。分化プロトコールは、同時係属中の出願U.S.S.N.07/967,622号（出願日1992年10月28日）に述べられている。用いたプロトコールは、所望の遺伝子修飾細胞のタイプに依存するであろう。ポリ−Ｌ−オルニチン又はポリ−Ｌ−リジンをコートしたフラスコなどを含む固定基質（fixed substrate）に前記細胞を置くことによって、分化を誘発することができる。
さまざまなマーカーが、分化細胞を同定するのに用いられる。乏突起神経膠細胞を生じる乏突起神経膠前駆細胞は、表現型A2B5（＋）、O4（＋）/GalC（−）、MBP（−）、及びGFAP（−）を有することができる［この表現型に限定されない］。乏突起神経膠細胞（CNS内で軸索を周囲におくミエリンを形成する神経膠細胞である）は、表現型ガラクトセレブロサイド（＋）、ミエリン塩基性タンパク（＋）、及び膠細胞繊維酸性タンパク（−）［GalC（＋）、MBP（＋）、GFAP（−）］を有する。
ニューロンは、次の表現型マーカーを１以上有することができる。ニューロン特異性エノラーゼ（NSE）、ニューロフィラメント（NF）タンパク、タウ−１、及びMAP−２である。多くの古典的な神経伝達物質酵素のあらゆるものの発現をベースとして、ニューロンを同定することができる。また、形態的基準及び電気生理学的記録のような他の機能的な測定をベースとして、ニューロンを同定することができる。そのような同定は、上記の表現型マーカーの１以上の同定と組合わせて行われる。
タイプＩ神経膠星状細胞は、平坦な原形質／繊維芽細胞様の形態を有する神経膠細胞である。これらの細胞は、表現型GFAP（＋）、A2B5（−）、GalC（−）、及びMBP（−）を有する。タイプII神経膠星状細胞（星状突起軸受形態（stellate process−bearing morphology）を示す神経膠細胞である）は、表現型GFAP（＋）、A2B5（＋）、GalC（−）、及びMBP（−）を有する。
一旦、細胞が分化すると、所望のタンパク質の発現について、それらを再度分析する。所望の表現型を有する細胞を単離することができ、遺伝子修飾細胞により発現したタンパク質又は生物学的活性分子の必要な患者に移植することができる。
前駆細胞をCNSに移植する、いかなる好適な方法も用いることができ、これにより、細胞が適当にCNSに組込まれる。ダンカン（Duncun）ら、J.Neurocytology、17巻、351−361頁（1988年）（本明細書中に参考文献として組込まれる）により用いた方法により、注入法は例示され、ヒトに用いるためにスケールアップされ、修飾されたものが好ましい。ゲイグ（Gage）ら、米国特許第5,082,670号（本明細書中に参考文献として組込まれる）により教示される、CNSへの繊維芽細胞のような細胞サスペンジョンの注入のための方法は、前駆細胞の注入にも用いることができる。さらなるアプローチ及び方法が、Neural Grafting in the Mammalian CNS（ビヨーク（Bjorkund）及びシュテネビ（Stenevi）、eds.、（1985年））（本明細書中に参考文献として組込まれる）に見出すことができる。注入した遺伝子修飾細胞の数は、治療の効果と提供するのに必要な量であり、処置する条件により変化するであろう。一般に、遺伝子修飾神経前駆細胞は、10細胞/100立方ミクロンを越えた濃度で脳の中に存在するであろう。
前駆細胞が患者に注入され、非宿主組織（即ち、同種移植又は異種移植）から誘導されるとき、移植の長寿を保証するために免疫抑制技術が必要となる。局所免疫抑制は、グルーバー（Gruber）、Transplantation 54巻、１−11頁（1992年）に開示されており、これは本明細書中参考文献として組込まれる。ロッシーニ（Rossini）、米国特許第5,026,365号（本明細書中参考文献として組込まれる）は、局所免疫抑制に好適な被包方法を開示する。
免疫抑制の技術を使用する代わりに、遺伝子置換又は胎児性幹細胞の相同再結合を用いるノックアウト（knockout）法が、スミシーズ（Smithies）ら（Nature、317巻、230−234巻（1985年））により教示され、細胞系の遺伝子置換又はノックアウトに拡張した（H.Zheng 35ら、PNAS、88巻、8067−8071頁（1991年））。双方ともに本明細書中参考文献として組込まれる。この方法は、主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）遺伝子の切除（ablation）のための前駆細胞に適用することができる。MHC発現を欠く前駆細胞は、豊富な神経細胞個体群を、患者を免疫抑制する必要性がなく、同種、及び多分異種の組織適合性障害を越えて移植することができる。ドナー細胞の抗原性を減少させる再結合法の使用のための概論及び引用は、グルーバー（Gruber）（上記）によって開示されている。表面改質による移植の免疫原性の減少への具体的なアプローチが、ファウストマン（Faustman）WO 92/04033（1992年）に開示されており、これは本明細書中参考文献として組込まれる。
神経組織の固体組織フラグメント及び細胞サスペンジョンは、全体として免疫原性であるので、移植内の個々の細胞タイプは、度合が低いがそれら自身免疫原性であることが可能である。例えば、バートレット（Bartlett）ら（Prog.Brain Res.82巻、153−160頁（1990年））（本明細書中参考文献として組込まれる）は、MHC発現の基礎にある免疫床分離を使用することにより、移植のための胎児性神経上皮細胞の特定生物型群（subpopulation）を前もって選択することによって、神経同種移植拒絶を排除している。このように、免疫抑制技術を用いない患者によって、同種及び異種移植拒絶の機会を減少させる、他のアプローチが提供された。
ヒトの移植に関する試験結果から、パーキンソン病の脳に胎児中脳組織同種移植が生存することが比較的低いことがわかった（フリード（Freed）ら及びスペンサー（Spencer）ら、上述）。移植材料の生存が低いのは、同じ病気関連因子によって生じ、元が同じである神経退行による。環境（患者自身のニューロンに毒性がある）が、移植した組織又は細胞と同じように毒性があると予想することができる。これを支持するものとして、MPTP損傷したヒトに胎児中脳組織を移植したことから提供された重要な機能の向上の報告がある（ワイドナー（Widner）ら、上述）。パーキンソン病の脳の状況と異なり、MPTP誘導パーキンソン症候群は、パーキンソン病に伴う突発性プロセスを発生せずに、主に黒質のドーパミン作動性ニューロンの機能欠損にある。パーキンソン病の脳と異なり、MPTP損傷したヒトの脳は、移植の際の神経毒性が全くないようである。
最近、新規なクロム親和性顆粒アミン運搬体（CGAT）cDNAが、リュー（Liu）ら（Cell、70巻、539−551頁（1992年））によって記載されており（これは本明細書中に参考文献として組込まれる）、この物質が、試験管内で（in vitro）CHO細胞中の神経毒MPP＋への耐性を示す。黒質からのドーパミン作動性ニューロンは、MPP＋によって特異的に殺されるので、前駆細胞中のCGAT遺伝子発現により、前駆細胞をパーキンソン病の脳に移植後、細胞の生存度を向上させることができる。
本明細書中に記載する発明をより十分に理解するために、次に実施例を記載する。この実施例は、例示のためだけであり、発明の範囲を限定するために述べるものではない。
実施例
実施例１
前駆細胞の増殖
生後14日（E14）CD1アルビノマウス（チャールズ・リバー）を断頭し、脳及び線条体（striata）を無菌法を用いて除去した。その組織を炎研磨した（fire−polished）パスツールピペットで分離し、ダルベッコ修飾イーグル培地（DMDM）:F−12栄養素混合物（Gibco）が1:1の混合物からなる無血清培地に移した。その細胞を５分間800r.p.m.で遠心し、上澄みを吸引し、細胞をDMEM/F−12培地に測定のため再懸濁した。
この細胞を、グルコース（0.6％）、グルタミン（2mM）、重炭酸ナトリウム（3mM）、HEPES（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（5mM）、並びに、インシュリン（25μg/ml）、トランスフェリン（100μg/ml）、プロゲステロン（20nM）、プトレッシン（60μＭ）、及び塩化セレン（30nM）（グルタミン［Gibco］を除き、すべてシグマ（Sigma）から購入）を含む所定のホルモン混合物及び塩混合物（血清と置換するため）を含むDMEM/F−12（1:1）からなる無血清培地（後に『完全培地』という）に懸濁させた。さらに、培地は、EGF（マウス下あご腺から精製した、Collaborative Research）又はTGFα（ヒト組替え、Gibco）を16−20ng/ml含んでいた。基質の前処理をせずに、細胞を75cm2組織培養フラスコ（コーニング（Corning））中に0.2×106細胞/mlで移し、37℃、湿度100％、95％空気/5％CO2のインキュベーター中に入れた。
細胞を、最初の48時間内で増殖し、３−４日までに試験管内で（days in vitro（DIV））、小さなクラスター（神経球として知られている）を形成し、４−6DIV間で基質から離した。
7DIV後、神経球を除去し、２−５分間400r.p.m.で遠心し、ペレットを炎研磨したパスツールピペットで、個々の細胞に機械的に分離し、完全培地2mlに移した。
１×106細胞を、EGF含有完全培地20mlを有する組織培養フラスコ75cm2に移した。幹細胞の増殖、及び新しい神経球の形成が再初期化された。無制限量の幹細胞を発生させるために、この手順を６−８日毎繰り返した。
実施例２
バクテリアル・β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むレトロウィルスでの前駆細胞の遺伝子修飾
前駆細胞を実施例１で記載されるように増殖した。神経球（４−５日経過）の大きなパス−１フラスコを振って、フラスコからその球を取り除いた。そのフラスコを３−５分間400r.p.m.で回転させた。神経球を乱さないように、培地の約半分を除去した。その球及び残りの培地を除去し、ファルコン（Falcon）12ml遠心管に入れ、３−５分間600r.p.m.で回転させた。残りの培地を除去し、数百マイクロリッターを残した。
バクテリアル・β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んだレトロウィルスを、セプコ（C.Cepko）によって製造したCRE  BAG2細胞系により、複製不足な状態で、充填させ、分泌させた。CRE細胞が集密になった１日後、細胞をPBSで洗浄し、レトロウィルスをDMEM/F12/HM/20ng/ml  EGF中で４日間収集した。ウィルス含有培地を0.45μｍシリンジフィルタ（syringe filter）で濾過した。神経球をウィルス含有培地に再懸濁し、大きなフラスコに移し、37℃で一晩インキュベーター中に放置した。翌日、フラスコの内容物を12ml遠心管に移し、800r.p.m.で遠心した。細胞をEGF含有培地/HMに再懸濁し、単細胞に分離させ、数を計測した。細胞を、全体積20ml中、50,000細胞/mlとなるように、大きなフラスコに再度移した。
４日後、形質転換細胞をG418で濃度300μg/mlで選択した。形質転換球を、24個のくぼみがあるプレート中のポリオルニチンでコートしたカバーガラス上に置いた。神経球をそのプレートに付着した後、細胞を４℃で５分間グルタルアルデヒド0.1％で固定した。細胞を固定した後、細胞をPBSで10分間２度洗浄した。その後細胞をPBS中のトリトン（Triton（登録商標））0.1％で10−15分間室温で洗浄した。Ｘ−Gal  1mg/ml溶液を各々のくぼみに加え、37℃で一晩培養した。一晩培養後、細胞をPBSで10分間３度洗浄し、いかなる反応生成物をも観察した。積極的な反応により、伝達遺伝子を含む細胞を示す、青色となった。
実施例３
遺伝子導入マウスからの前駆細胞の調製
遺伝子導入マウスを、MBPのプロモーターがE.coli  β−ガラクトシダーゼ（lacZ）の発現を指示する、MBP−lacZキメラ遺伝子の標準前核注入を用いて製造した。遺伝子導入動物をlacZに特異なオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって同定した。
神経球を、実施例１で述べた方法を用いてE15遺伝子導入マウス及びDNAネガティブ同腹子（negative littermate）から調製した。神経球を、EGF20ng/mlの存在下所定の培地で増殖させ、35週間経過させた。経過後、神経球を取り込み、ゆっくりと800RPMで遠心し、機械的に炎研磨したパスツールピペットで粉砕することによって分離させた。さまざまな経過期間で、培地の条件を変化させることにより、細胞を誘発して、乏突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、及びニューロンに分化させた。フリーフローティング（free−floating）幹細胞クラスターをゆっくりと遠心し、EGFを用いない、１％仔ウシ血清を有する同じベースの所定の培地に再懸濁させ、ポリオルニチン処理したカバーガラス上に置いて、細胞接触を促進させた。クラスターはガラスにしっかりと付着し、細胞はゆっくりと、又は分裂するのをやめて、分化し始めた。
さまざまな細胞タイプの同定を、ニューロン（MAP−２、NF−Ｌ、及びNF−Ｍ）、神経膠星状細胞（GFAP）、及び乏突起神経膠細胞（A2B5、O1、O4、Gal C、及びMBP）に特異的な抗体を用いる免疫蛍光顕微鏡検査法を用いて行った。植え付け後１〜14日後、カバーガラス上の細胞を、通常ヤギ血清５％、及びHEPES緩衝液25mM、pH7.3（MEM−HEPES、NGS）で希釈した、第１の抗体、O1、O4、Gal C、及びA2B5（上澄み）で、室温で30分間固定せずに培養した。第１の抗体に続いて、MEM−HEPES、NGSで希釈した、ローダミン結合した第２の抗体（シグマ（Sigma））中で、カバーガラスをゆっくり５回洗浄した。カバーガラスをその後、MEM−HEPES中で５回洗浄し、−25℃で酸性アルコール（５％氷酢酸/95％エタノール）で固定した。その後、カバーガラスをMEM−HEPESで５回洗浄し、顕微鏡の検鏡板に固定し、蛍光顕微鏡を用いて検査するか、又はGFAP、ネスチン（nestin）、MBP、又はプロテオリピドタンパク（PLP）に対してラビットポリクローナル抗血清で免疫反応させた。第２ラウンドの免疫ラベリング（immunolabeling）にさらされたとき、カバーガラスを、第１に、１時間、0.9％NaClを有するリン酸緩衝液0.1M中の５％通常ヤギ血清（NGS）で培養し、その後、室温で１−２時間NGSで希釈した第１のラビット抗体中で培養した。カバーガラスをPBSで３回洗浄し、その後、NGSで希釈した、適当な第２の抗体結合体で培養し、PBSで再度洗浄し、最後にシティフルオロ・アンチフェーダント装着媒体（Citifluor antifadent mounting medium）を有する顕微鏡のスライドガラス上に載せ、蛍光顕微鏡により検査した。それらを最初にモノクローナル抗体の上澄みで培養しない場合、カバーガラスを20分間PBS中の４％パラホルムアルデヒド（pH7.4）で固定し、PBSで洗浄し、100％エタノールで透過させ、PBSで再度洗浄し、PBS中５％NGSで１時間培養した。第１の抗体及び第２の抗体結合体を上記概説したように適用した。
遺伝子導入動物から誘導した神経幹細胞は、ニューロン、神経膠星状細胞、及び乏突起神経膠細胞への分化の潜在能力が非遺伝子導入幹細胞と区別がつかなかった。MBPプロモーターは、細胞特異的で、かつ発育的に適当なように、β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子の発現を指示した。乏突起神経膠細胞が遅い継代MBP−lacZ神経球（20継代）から誘導され、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現したとき、遺伝子導入発現は、著しく安定である。よって、遺伝子導入でマークした神経球は、神経膠細胞移植のための細胞の優れた供給源であるようである。
実施例４
リン酸カルシウム・トランスフェクションを用いる前駆細胞の遺伝子修飾
前駆細胞を実施例１に記載したように増殖した。細胞をその後リン酸カルシウム・トランスフェクション技術を用いてインフェクトした。標準リン酸カルシウム・トランスフェクションの場合、細胞を機械的に単細胞サスペンションに分離し、組織培養処理皿に50％集密度（50,000−75,000細胞/cm2）で置き、一晩接触させた。
修飾リン酸カルシウム・トランスフェクション法を次のように行った。無菌TE緩衝液（トリス10mM、EDTA0.25mM、pH7.5）中のDNA（15−25μｇ）をTEで440μｌに希釈し、2M  CaCl2（1M  HEPES緩衝液でpH5.8までにした）60μｌをこのDNA/TE緩衝液に加えた。全体積500μｌの２×HeBS（HEPES緩衝塩溶液;275mM  NaCl、10mM  KCl、1.4mM  Na2HPO4、12mMデキストローゼ、40mM  HEPES緩衝粉末、pH6.92）をこの混合物に滴下した。この混合物を20分間室温に放置した。細胞を１×HeBSで簡潔に洗浄し、リン酸カルシウム沈澱したDNA溶液1mlを各々のプレートに加え、細胞を37℃で20分間培養した。この培養に続いて、完全培地10mlを細胞に加え、プレートをインキュベーター（37℃、9.5％CO2）内にさらに３−６時間置いた。DNA及び培地を培養期間の最後に吸引により除去し、細胞を完全成長培地で３回洗浄し、その後インキュベーターに戻した。
実施例５
NGFを発現する遺伝子修飾前駆細胞
組替えレトロウィルス又は直接DNAトランスフェクション技術を用いて、ラットNGF遺伝子の発現を指示する、ヒト・サイトメガロウィルスCMVプロモーターから成るキメラ遺伝子を神経球細胞へ導入した。さらに、ベクターは、ウィルスプロモーターを追い払うE.coliネオマイシン抵抗遺伝子を含む。G418選択の２週間後、細胞を、96個のくぼみを有するプレート中に限界希釈を用いてクローンし、得られたクローンを、ニューロトロフィン受容体（trkファミリー）ホスホリル化バイオアッセイを用いてニューロトロフィンタンパク質発現を分析した。
NGFを高レベルで発現するクローンを、分化前にＴフラスコ中で拡大させた。その後、細胞をEGF含有完全培地から取り除き、血清の組合せ及び成長因子の混合物で処理し、神経膠星状細胞の分化を誘発した。神経膠星状細胞を再度NGF発現のために分析し、分化細胞が栄養因子を発現しつづけるように保証した。NGFを分泌する神経膠星状細胞をその後、コリン作動性ニューロンを保護するために、障害後即座にフィンブリン／脳弓障害のラットの脳に注入した。NGFを分泌しないコントロールの神経膠星状細胞を同様に障害のある動物に注入した。障害モデルにおけるコリン作動性ニューロンを節約すること（sparing）は、ChAT（これらのコリン作動性ニューロンのマーカー）の免疫細胞化学を用いて評価した。
実施例６
CGATを発現する遺伝子修飾前駆細胞
前駆細胞を実施例１のように増殖した。この細胞を機械的に分離して、プラスチック皿に置き、CGAT  cDNAを含むレトロウィルスでインフェクトした。CGAT  cDNAの発現（リュー（Liu）ら、上述）は、構成プロモーター（CMV、又はSV40、又はレトロウィルスLTR）又は細胞特異性プロモーター（TH、又は他のドーパミン作用性もしくはカテコールアミン作用性細胞特異性調節要素など）によって、指示される。細胞をCGATタンパク質の発現のためにスクリーンした。選択された細胞をその後、試験管中（in vitro）で成長因子又は成長因子の組合せを用いて分化させ、ドーパミン作用性又は前ドーパミン作用性ニューロンを製造することができた。
【図１】
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【図２】
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