(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プローブは、インターカレーター性蛍光色素が、一本鎖オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド中のリン酸と、リンカーを介して、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの相補結合部分にインターカレーション可能に結合されたものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法。
【請求項２】
試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する二本鎖核酸（標的核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と三重鎖核酸を形成させる工程を含む方法において、前記プローブは、インターカレーター性蛍光色素が、一本鎖オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド中のリン酸と、リンカーを介して、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブにより形成される三重鎖部分にインターカレーション可能に結合されたものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法。
【請求項３】
前記インターカレーター性蛍光色素が、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとの相補結合部分にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化する性質を有することを特徴とする請求項１の特定核酸配列の検出方法。
【請求項４】
前記インターカレーター性蛍光色素が、二本鎖標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブにより形成される三重鎖部分にインターカレーションすることにより蛍光特性が変化する性質を有することを特徴とする請求項２の特定核酸配列の検出方法。
【請求項５】
特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ及びインターカレーター性蛍光色素からなる標的核酸検出用の標識核酸プローブであって、前記プローブは、インターカレーター性蛍光色素が、一本鎖オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド中のリン酸と、リンカーを介して、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとの相補結合により形成される相補結合部分又は二本鎖標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブとにより形成される三重鎖部分にインターカレーション可能に結合されていることを特徴とする標識核酸プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子混合物が存在すると予想される試料の中に含まれる、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）の検出方法に関するものである。従って本発明は、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索等の分野で利用される。また本発明は、核酸増幅工程における反応条件の最適化を行う方法としても利用される。
【０００２】
【従来の技術】
標的核酸の検出及び定量には、標的核酸がその中の特定核酸配列、即ち特定の核酸塩基配列と相補的な配列を有する核酸プローブと相補結合を形成する性質が利用されている。
【０００３】
従来、相互に標的核酸の異なる部位の特定核酸配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる２種類の核酸プローブを用い、これら核酸プロ−ブで標的核酸を挟み込む、いわゆるサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が知られている。この方法では、第１の核酸プローブは不溶性担体に固定化されており、一方第２の核酸プローブは、その一部に可視部に色を持つ色素や蛍光物質、あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されており、試料にこれらの核酸プローブを添加することによって試料中の標的核酸は第１及び第２の核酸プローブと相補結合し、この結果、これら三者からなる複合体が不溶性担体上に形成される。複合体の形成に引き続き、反応液中の上清と不溶性担体とを濾別し、少なくとも上記複合体の形成に関与しなかった未反応の第２の核酸プローブを試料反応液から除去する（いわゆるＢ／Ｆ分離工程）。しかる後に、不溶性担体上の複合体の標識物質を測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその量が決定される。
【０００４】
尚、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を第２の核酸プローブの標識物質として用いた場合は、上記複合体形成工程及び未反応第２核酸プローブの除去工程の後、それらの前駆体である酵素基質を反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質等を測定することにより試料中の標的核酸の有無及びその量が決定される。
【０００５】
この方法では、不溶性担体を利用することから、第２の核酸プローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着してしまい、不溶性担体上の複合体中の標識物質を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着した第２の核酸プローブに由来する信号が測定結果に紛れ込み、試料中の標的核酸の有無及びその量の決定結果に誤差を生じ、正しい判定が困難になるという問題が生じる。
【０００６】
そこで従来は、この問題を回避する目的で、使用する不溶性担体表面の親水化処理や蛋白質等による担体表面の吸着点のブロッキング処理、更にはＢ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄する、等による非特異的吸着の低減が試みられている。
【０００７】
【発明が解決しようする課題】
しかしながら、例えばＢ／Ｆ分離工程において不溶性担体の洗浄回数を増やす等の対処ではこれに要する時間が長くなり、また例えば洗浄液に界面活性剤を用いて洗浄効率を高める等の対処では担体上に形成された複合体の分解を促す可能性を生じるため、現実的には困難である。
【０００８】
一方、担体表面を化学的に親水化処理すること等は、担体の材質にも依存し技術的に必ずしも容易ではない。更に担体表面を蛋白質等により被覆して吸着点を予めブロッキングする方法では、その蛋白質が第２の核酸プローブやその標識物質と相互作用し、新たな非特異的な吸着を招いてしまう恐れもある。
【０００９】
このように、いわゆるサンドイッチアッセイでは、標的核酸を特異的に捕捉する目的で核酸プローブを固定化した不溶性担体を使用するが、これが試料中の標的核酸の検出及び定量を精度良く達成する上で、基本的課題を生み出している。そこで、このような担体を使用しない、均一系での一段階の検出法の開発が近年求められている。
【００１０】
一方、近年ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法（特公平４−６７９５７号公報、特公平４−６７９６０号公報）が開発され、試験管内条件下で核酸を増幅することが可能となっている。
【００１１】
そこで、ＰＣＲ法を用いて試料中の標的核酸の特定の領域を増幅し、その後、増幅反応液等を試料として前記のサンドイッチアッセイを行い、増幅産物の測定を通して増幅前の試料中の標的核酸の有無及び量を検出ことが提案されている。しかしながら、この方法においても、既に説明したようなサンドイッチアッセイにおいて見受けられる基本的課題を解決し得るものではなく、精度の高い測定は難しい。
【００１２】
また、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅の後、特定配列部分に相補的な配列を有する核酸プローブを増幅反応液等に添加し、標的核酸と核酸プローブが相補結合を形成する条件下においた後、形成された複合体を電気泳動法等によって未反応の核酸プローブから分離し、更にその後、核酸プロ−ブの標識物質を測定することによって増幅後の増幅産物の分析を行い、その結果から増幅前の試料中の標的核酸の有無及ぶ量を決定する方法も提案されている。
【００１３】
しかしながら、このようなＰＣＲ法による増幅工程を含む標的核酸の測定法においては、いずれもＰＣＲ法による増幅工程の後に増幅された試料を反応容器等から取り出す必要があり、効率性や経済性が要求される臨床診断の現場に新たな労力と分析時間を要求するばかりか、更にはＰＣＲ法の実際的な応用における課題とされている、増幅産物の飛散（エアロゾルによる）に由来する擬陽性の惹起という深刻な課題を引き起こす恐れがある。
【００１４】
本出願人は、このような状況の中で、ＰＣＲ法による増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度を増大する等の性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲ法によって標的核酸の特定領域の増幅を開始する前に試料溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定することによって増幅前の標的核酸の有無及び量を決定する方法を創作した（特開平５−２３７０００号公報）。この方法によれば、用いるインターカレーター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長において光学的に透明な材質からなる反応容器を使用すれば、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度の測定からＰＣＲの進行を追跡することが可能となり、いちいち試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がなく、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避することが可能となる。
【００１５】
本出願人が創作した上記方法は、担体を必要としない均一系での一段階の分析法として優れた特徴を有するが、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖核酸に非特異的にインターカレーションすることに由来する、新たな課題も内包している。すなわち、試料中に標的核酸以外の、例えば大量のゲノムＤＮＡが混在する場合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにインターカレーションすることにより大きなバックグラウンド蛍光が生じ、標的核酸の増幅に由来する蛍光強度の増大を充分な精度で測定することが困難となり得る。
【００１６】
またＰＣＲ法では、標的核酸の配列に相補的な一対の核酸を伸張反応用のプライマーとして使用するが、プライマ−の核酸配列の選択によってはそれらが相互に相補結合してしまい、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがある。インターカレーター性蛍光色素は、プライマーダイマーへも非特異的にインターカレーションすることから、これに由来するバックグラウンド蛍光の増加が、本来目標とする標的核酸の増幅にもとづく蛍光強度の変化を経時的に追跡していく上で、大きな障害となる恐れもある。
【００１７】
そこで、この解決策として、上記のインターカレーター性蛍光色素に特定の核酸配列を認識し得る特異性を付与することが求められることとなる。
【００１８】
本発明は、以上に述べた従来技術が内包する課題を解決すべくなされたものであり、その目的は試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）について、従来のサンドイッチアッセイ等における相補結合に寄与しなかった余剰の標識された核酸プローブの分離やＰＣＲ法による増幅におけるバックグラウンド蛍光等の増加を生じることなしに、従ってその存在の有無及び量を高精度に決定することを可能とする、均一系での簡便な一段階の検出方法であって、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索等の分野、あるいは核酸増幅工程における反応条件の最適化を行うための方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる目的を実現すべく鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブの相補結合部分にインターカレーションするものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法である。
【００２０】
また標的核酸が二本鎖核酸である場合にも核酸プロ−ブはこれと相補結合して三重鎖核酸を形成し得ることから、本発明は更に、試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する二本鎖核酸（標的核酸）を測定する方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と三重鎖核酸を形成させる工程を含む方法において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブにより形成される三重鎖部分にインターカレーションするものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法である。
【００２１】
次に本発明は、特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）中の該特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブ及びインターカレーター性蛍光色素からなる、標的核酸検出用の標識核酸プロ−ブであって、インターカレーター性蛍光色素は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブとの相補結合により形成される相補結合部分又は二本鎖標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブとにより形成される三重鎖部分部分にインターカレーションし得るように一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブに結合されていることを特徴とする標識核酸プロ−ブである。
【００２２】
また本発明は、試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する核酸（標的核酸）を測定するために少なくとも当該特定の核酸配列部分を、例えばポリメラ−ゼチェ−ンリアクション（ＰＣＲ）法等により増幅する工程を含む方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブの相補結合部分にインターカレーションするものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法である。
【００２３】
更に本発明は、上述の通り標的核酸が二本鎖核酸である場合にも核酸プロ−ブはこれと相補結合して三重鎖核酸を形成し得ることから、試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する二本鎖核酸（標的核酸）を測定するために少なくとも当該特定の核酸配列部分を、例えばポリメラ−ゼチェ−ンリアクション（ＰＣＲ）法等により増幅する工程を含む方法であって、標的核酸の前記特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法において、前記プローブがインターカレーター性蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該インターカレーター性蛍光色素が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブの三重鎖部分にインターカレーションするものであることを特徴とする特定核酸配列の検出方法である。以下本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、従来知られていない核酸プロ−ブを使用することにより従来のサンドイッチアッセイ等における相補結合に寄与しなかった余剰の標識された核酸プローブの分離を不要とし、又例えばＰＣＲ法等による増幅におけるバックグラウンド蛍光等の増加を生じることなく標的核酸の検出を可能とするものである。即ち本発明の標識核酸プロ−ブは、標的核酸との親和性を有する一本鎖オリゴヌクレオチド部分、インタ−カレ−タ−性蛍光色素からなる標識部分及び必要に応じてこれらを結合するリンカ−部分からなり、インタ−カレ−タ−性蛍光色素が標的核酸とプロ−ブにより形成される相補結合部分又は三重鎖部分にインターカレーションし、更にその蛍光特性が変化することから、その蛍光特性の変化から試料中に含まれていた特定の配列からなる核酸の存在の有無及びその量を定めることを可能とするものである。
【００２５】
本発明により提供される標的核酸検出用の標識核酸プロ−ブは、一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブとインタ−カレ−タ−性蛍光色素を含むものである。該一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブは、標的核酸中の特定の核酸配列に完全に相補的な核酸配列を有することが好ましいが、一部に塩基のミスマッチがあってもその特異性及び相補性に支障のない範囲であれば制限はない。特定の核酸配列は、例えば１０〜３０塩基程度、好ましくは１５〜２５塩基程度の一連の塩基配列であって、標的核酸を他の核酸から識別し得るような他の核酸中には見出だされないものであることが特に好ましいが、標的核酸のみに存在するような配列である必要は必ずしもなく、試料中に存在することが予想される他の核酸との関係で充分に特異的な配列であれば良い。従って本発明の標識核酸プロ−ブは、上述の特定の核酸配列に対応して１０〜３０塩基、特に好ましくは１５〜２５塩基程度の配列を有するものを標的核酸との関連で適宜選択して使用すれば良い。なお、二本鎖核酸に対してもオリゴヌクレオチドプロ−ブが相補結合し得ることを利用して、本発明を二本鎖標的核酸の検出に適用する場合においては、当該二本鎖核酸のいずれかが特定の核酸配列を有していれば良い。また本発明において、複数の特定の核酸配列を設定し、それに対応する複数の標識核酸プロ−ブを使用することも当然に可能である。
【００２６】
インターカレーター性蛍光色素は、二本鎖又は三本鎖核酸にインターカレーションし、インタ−カレ−ションによって遊離状態とは蛍光特性が変化する物質であれば特に制限はない。本発明においては、インターカレーションにより例えば主としてその蛍光強度が著しく増加又は減少するアクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー等、主として励起光の吸収スペクトルのピ−ク波長のみが変化するもの、主として放射光スペクトルのピ−ク波長のみが変化するビスベンチミド等又は主として励起光の吸収スペクトルと放射光スペクトルのピ−ク波長の両者が変化するもの等、種々のインタ−カレ−タ−性蛍光色素を使用することができるが、検出の容易性等の観点からインターカレーションによりその蛍光強度が著しく増加するものが特に好ましく使用される。このような特に好ましいインタ−カレ−タ−性蛍光色素として、例えば、チアゾールオレンジやオキサゾールイエローを例示することができる。
【００２７】
インタ−カレ−タ−性蛍光色素は、例えば共有結合によって前述の一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブと結合される。この場合、適当な分子長のリンカーを介して結合しても良い。リンカーとしては、インタ−カレ−タ−性蛍光色素が一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブと標的核酸により形成される相補結合部分、又標的核酸が二本鎖核酸である場合にはこれらにより形成される三重鎖部分にインタ−カレ−トすることを妨げない分子であれば特に制限はない。結合のための操作の容易性等の観点から、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素を用いることが好適な一例として例示できる。また、市販の試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）等を使用することもできる。
【００２８】
本発明の標識核酸プロ−ブは、二本鎖の標的核酸を検出するために用いることも可能である。この場合、核酸プロ−ブは二本鎖核酸の一方の核酸が有する特定核酸配列と特異的に相補結合し、この結果、少なくとも一部分が三重鎖状態の核酸が生じることになる。この場合インタ−カレ−タ−性蛍光色素は、核酸プロ−ブと特定核酸配列を有する核酸とにより形成される相補結合部分のみならず、標的核酸が形成している相補結合部分にもインタ−カレ−トするため、このような場合には前記リンカ−として、比較的長めの分子長を有するものを使用することが好ましい。
【００２９】
インターカレーター性蛍光色素の一本鎖オリゴヌクレオチドプロ−ブとの結合部位は、インタ−カレ−タ−性蛍光色素のインターカレーション及び標識核酸プロ−ブの標的核酸への相補結合を妨げない部位であれば制限はなく、プロ−ブの５´末端、３´末端又は中央部分のいずれであっても良いが、特に５´末端又は３´末端が好ましい。後に説明するように、本発明の標識核酸プロ−ブを共存させた状態でＰＣＲ法を実施する場合において、核酸プロ−ブをＰＣＲにおけるプライマ−として機能させる場合には、ＤＮＡ合成酵素による核酸の伸長反応を阻害しないようにインタ−カレ−タ−性蛍光色素を５´末端に結合させることが好ましい。
【００３０】
このように調製された本発明の標識核酸プロ−ブは、標的核酸と相補結合を形成すると結合されているインターカレーター性蛍光色素が相補結合部分又は三重鎖部分にインタ−カレ−トすることで、蛍光強度が増加等することから、相補結合に寄与しなかった余剰のプローブを分離する工程を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となる。従って本発明の標識プロ−ブによれば、特定の核酸配列を有する標的核酸の均一系での簡便な一段階の検出方法を実施することが可能となる。
【００３１】
以上のような特質を有する本発明の標識プロ−ブは、例えば不溶性担体を用いる従来のサンドイッチアッセイ等に使用することによっても余剰プローブの分離工程を排除し得る等、充分に効果的である。しかし、標的核酸の均一系での簡便な一段階の検出方法を可能とする本発明の標的プロ−ブによれば、これまで説明してきたように、単に試料にこれを添加するのみで標的核酸を検出することが可能である。
【００３２】
また本発明は、標的核酸を測定するために少なくともその中の特定核酸配列部分を例えばＰＣＲ法等で増幅する工程を含む方法であって、標的核酸の特定核酸配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そのプローブを試料に添加し標的核酸と相補結合を形成させる工程を含む方法における標識核酸プロ−ブの使用をも提供する。ＰＣＲ法等によれば試料中の微量の標的核酸を数千倍以上に増幅し得るため、通常の方法（ＰＣＲ法等を利用しない方法）では検出し得ない標的核酸の存在の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となる。特にヒト免疫不全ウイルスやＣ型肝炎等の病原ウイルスに由来する微量核酸の検出に対しては、ＰＣＲ法を利用する本発明の検出方法を適用することが好ましい。
【００３３】
以下、標的核酸をＰＣＲ法で増幅する工程を含む方法に対する本発明の適用を詳細の述べるが、標的核酸を増幅する工程はＰＣＲ法に限定されず、その他に例えばＬＣＲ法等も例示することができる。また例えば、標的核酸を適当な細胞に導入してｍＲＮＡを発現させるような操作も、実質的には標的核酸を増幅する工程と見なすことができる。従って、これらの操作においても下記のごとく本発明を適用することが可能である。
【００３４】
ＰＣＲ法の操作自体については、例えば前述の特公平４−６７９５７号公報や特公平４−６７９６０号公報等を参照して実施することができる。
【００３５】
ＰＣＲ法を利用する本発明の検出方法においては、本発明の標的核酸プロ−ブをＰＣＲ法による特定の核酸配列部分の増幅工程に先だって試料に添加し、プロ−ブの共存下、例えばプロ−ブ中のインターカレーター性蛍光色素の励起波長及び蛍光波長において光学的に透明な材質からなる密閉可能な反応容器中で温度サイクリング等によるＰＣＲ工程を行えば、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度から標的核酸の増幅されていく様子を経時的に追跡し、かつ、標的核酸の存在の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能である。従って、いちいち試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がなく増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題をも回避可能である。
【００３６】
ＰＣＲ法を利用する本発明の標的核酸の検出方法においては、標識核酸プロ−ブをＰＣＲにおけるプライマ−として使用することができる。従って、標識核酸プロ−ブさえ調製しておけば、同一標的核酸の検出に際してはＰＣＲ法を利用した検出とＰＣＲを利用しない検出を任意に選択して実施することが可能である。
【００３７】
また、ＰＣＲ法を利用する本発明の標的核酸の検出方法において、標識核酸プロ−ブをＰＣＲにおけるプライマ−として使用しない場合には、標識核酸プロ−ブをプライマ−として機能しないように、即ち、ＤＮＡ合成酵素による核酸の伸長反応の進行を阻害するように修飾しておけば良い。例えば、インタ−カレ−タ−性蛍光色素の結合部位をＰＣＲにおける伸長反応の進行方向である３´末端に導入したり、３´末端に適当な化学的修飾を施したりして前記伸長反応が生じないようにすれば良い。なかでも、標識核酸プロ−ブの３´末端に、意図的に標的核酸とは相補結合を生じない塩基を導入する方法が簡便で好ましい。この場合、相補結合を生じない塩基は１塩基以上導入すれば充分である。
【００３８】
更に、本発明の標識核酸プロ−ブを用いれば、ＰＣＲ法による核酸の増幅工程に関する至適サイクル数等の反応条件を最適化することも容易に実施できる。また本発明の標識核酸プロ−ブを利用することにより、核酸配列に生じた突然変異等の塩基の変異の存在を検出することも可能である。即ち本発明の標識核酸は、特に一本鎖の標的核酸と容易に相補結合し、これにより標識物質であるインタ−カレ−タ−性蛍光色素の蛍光特性が変化するため、突然変異等を生じていない場合に当該蛍光特性の変化が認められる温度等と比較して低温で蛍光特性の変化が認められれば、その対象となった核酸中には突然変異等が生じており、その結果これが形成する二本鎖核酸の安定性が変化していることになる。また例えば、任意温度における前記蛍光特性の変化の度合いを測定し、これを比較することでもその対象となった核酸中に突然変異等が生じているか否かを知ることができる。この場合には、例えば二本鎖核酸のうち５０％が一本鎖に分離する温度（Ｔｍ）における前記蛍光特性の変化の割合等を目安とする方法が特に好ましく例示できる。
【００３９】
【実施例】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一例であり、本発明を限定するものではない。
【００４０】
実施例１  標識核酸プロ−ブの調製
以下のようにして本発明の核酸プローブを調製した。下記式の化合物１（７．５６ｇ、５０ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（６．２５ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．８２ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びアセトン（５００ｍｌ）の混合物を２時間リフレックス（ｒｅｆｌｕｘ）し、反応混合物を室温で放冷した。その後不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。残査に塩化メチレンを加え不溶物を濾過により除去し、濾液を減圧濃縮した後、蒸留により黄色油状物（下記式の化合物２）を６．８３ｇ得た。収率は８２．３％であった。化合物２は、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）でδ２．７３にδＣＨ３基のシグナルを示した。
【００４１】
【化１】
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【００４２】
下記式の化合物３（０．８５６ｇ、５．９８ｍｍｏｌ）及び１，３−ジヨ−ドプロパン（５．３８ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）を１１０℃にて２０分間加熱した。反応混合物を室温まで放冷した後、ヘキサン及びエ−テルの混合液を加え、析出した黄色固体（下記式の化合物４）を濾過により集め、２．３６ｇ得た。収率は９６．７％であった。化合物４は、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）でδ２．６７、δ３．４６及びδ５．４５に−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｉの３つのメチレン基のシグナル及びδ３．０３にＣＨ３基のシグナルを示した。
【００４３】
【化２】
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【００４４】
前記化合物２（９９０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）にパラトルエンスルホン酸メチル（１１１６ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃にて５時間加熱した。これにより下記式の化合物７が生じた反応容器を室温まで放冷した後、前記化合物４（２６．３４ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加え、９０℃にて１時間リフレックス（ｒｅｆｌｕｘ）した。この後、反応溶液を室温まで放冷し、不溶物を濾過により除去し、濾液を減圧濃縮した。残査にメタノ−ルを加えて析出した黄色固体（下記式の化合物８）を濾過により集め、５１２ｍｇ得た。収率は２９．９％であった。また化合物８はＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）でδ５．９５にメチンの特徴的なシグナルを示した。
【００４５】
【化３】
0003572340.tif 000004
【００４６】
一方、リンカ−として市販のリンカ−（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、カタログ＃５２１１−１）を、プロ−ブ用のオリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した、配列番号１の核酸を用い、これらを結合して下記式のようなリンカ−の結合したオリゴヌクレオチドを得た。なお式中前記オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍｅｒで示されている。
【００４７】
【化４】
0003572340.tif 000005
【００４８】
次に、オリゴヌクレオチド溶液について、３〜５  ＯＤ（Ａ２６０）を乾燥させ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ  ７．５）４０μｌに溶解し、１．０Ｍ  ＡｇＮＯ３を溶液を７．５μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｌｔｅｘ）し、室温にて４０分インキュベ−トした。続いて１．０Ｍ  ＤＴＴを１０μｌ加えボルテックス（ｖｏｌｔｅｘ）し、室温にて３０分インキュベ−トした。この後１５分間遠心して上澄を取得し、一方沈殿に０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ  ７．５）４０μｌを加え、ボルテックス（ｖｏｌｔｅｘ）し、５分遠心し前記上澄と合わせて全量９７．５μｌの、下記式の化合物９を得た。
【００４９】
【化５】
0003572340.tif 000006
【００５０】
次に、ＤＭＦ  ２００μｌ、１．０Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  １０．０）３００μｌ及びＨ２０  ５００μｌを混合し、化合物８を添加して飽和させ、その後アルゴン置換した。一方、高速液体クロマトグファフィ−により精製した前記化合物９の溶液に、０．０１Ｍ  ＤＴＴを２０μｌ加え、ボルテックス（ｖｏｌｔｅｘ）し、アルゴン置換した。ここに前記のようにして調製した化合物８の溶液を、化合物９の溶液と化合物８の溶液が２：１〜３：１になるように加え、２時間放置し、セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過に供し、取得物を乾燥した後高速液体クロマトグファフィ−により精製し、下記式の化合物１０（前記化合物８として表されたインタ−カレ−タ−性蛍光色素、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−［［１−［３−ｉｏｄｅｐｒｏｐｙｌ］−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ｙｌｉｄｅｎｅ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｏ−１，３−ｏｘａｚｏｌｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（オキサゾ−ルイエロ−）を有する本発明の標識核酸プロ−ブ、以下ＹＯ−ＰＵ−１）を取得した。なお、高速液体クロマトグファフィ−操作において使用した緩衝液は０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ  ７．０）／５０％アセトニトリルであり、セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過操作において使用した緩衝液は０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  （ｐＨ  ７．０）／５％アセトニトリルである。
【００５１】
【化６】
0003572340.tif 000007
【００５２】
以上のようにして調製された本発明の標識核酸プロ−ブＹＯ−ＰＵ−１のＵＶスペクトルを図１に示す。図１によれば、ＹＯ−ＰＵ−１には核酸由来及び前記つ化合物８由来の吸収が認められる。
【００５３】
実施例２  標的核酸の検出  １
実施例１で調製したＹＯ−ＰＵ−１を用いて標的核酸の検出を行った。なお用いた標的核酸ＤＳ１の核酸配列は配列番号２の通りであり、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成したものである。
【００５４】
調製されたＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌを０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）０．６ｍｌに溶解し、その蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよび蛍光波長５１０ｎｍにて室温下で測定した結果、蛍光強度は、８．２であった。
【００５５】
一方、ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標的核酸ＤＳ１の４５ｐｍｏｌとを２０倍ＳＳＣの２．５μｌ及び５０μｌのＨ２Ｏに溶解し、９０℃まで加熱後放冷して室温に戻した。続いて０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の６０μｌ及び４９０μｌのＨ２Ｏを添加し、溶液の蛍光強度を測定した。その結果、測定値は１７．０であり、有意な蛍光強度の増大が確認された。
【００５６】
測定された蛍光スペクトルを図２に示す。
【００５７】
一方、ＹＯ−ＰＵ−１に対して非相補的な核酸配列からなる（相補的な核酸配列を含まない）配列番号３の核酸の４５ｐｍｏｌとＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌとを２０倍ＳＳＣの２．５μｌ及び５０μｌのＨ２Ｏに溶解し、９０℃ま
で加熱後放冷して室温に戻した。続いて０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の６０μｌ及び４９０μｌのＨ２Ｏを添加し、溶液の蛍光強度を測定した。その結果、測定値は８．５であった。
【００５８】
これらの結果から、ＹＯ−ＰＵ−１については、その核酸配列と相補的な核酸配列を有するＤＳ１とのみ相補結合を形成すること及び結合されたインタ−カレ−タ−性蛍光色素が相補結合部分にインタ−カレ−トする結果、蛍光強度の増大を有意に増大させることが分かる。従って、試料中に本発明の標識核酸プローブを添加するだけで特定核酸の検出を行うことが可能であることが確認された。
【００５９】
実施例３  標的核酸の検出  ２
ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標的核酸ＤＳ１の０．１、０．２、０．５、１．０又は１．５当量とを、実施例２の記載と同様にしてアニ−リングさせ、各標的核酸濃度における各蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよび蛍光波長５１０ｎｍにて室温下で測定した。
【００６０】
結果を図３に示す。図３からは、試料中の標的核酸の量に比例して、反応液からの蛍光強度が増加していることが分かる。従って、試料に核酸プローブを添加しその蛍光強度を測定するだけで試料中の特定核酸の量（濃度）を決定することが可能であることが確認された。
【００６１】
実施例４  標的核酸の検出  ３
標的核酸ＤＳ２（配列番号４）をＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００６２】
ＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌと標的核酸ＤＳ２の各０．１、０．２、０．５、１．０又は１．５当量とを、実施例２の記載と同様にしてアニ−リングさせ、各標的核酸濃度における各蛍光強度を励起波長４８０ｎｍおよび蛍光波長５１０ｎｍにて室温下で測定した。
【００６３】
結果を図４に示す。図４からは、試料中の標的核酸の量に比例して、反応液からの蛍光強度が増加していることが分かる。従って、試料に核酸プローブを添加しその蛍光強度を測定するだけで試料中の特定核酸の量（濃度）を決定することが可能であることが確認された。
【００６４】
実施例５  ＹＯ−２７１の調製
図５の通り、化合物１（１０ｍｍｏｌ）と化合物２（１０ｍｍｏｌ）を混合し、１５０度Ｃで３時間加熱し、Ａｒｂｕｚｏｖ反応により化合物３を生成した。その後、加水分解することによって化合物４を収率７０％で得た。ここで、Ｚ（ＯＭｅ）は保護基でパラメトキシベンジルオキシカルボニル基を指す。
【００６５】
デオキシヌクレオシドは、化式７
【００６６】
【化７】
0003572340.tif 000008
【００６７】
で一般的に示されるが、これを以下、
【００６８】
【化８】
0003572340.tif 000009
【００６９】
化式８の如く略記する。尚、Ｂはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）の塩基の任意の一つを意味する。
【００７０】
図６の通り、化合物４（７ｍｍｏｌ）と化合物５（７ｍｍｏｌ）とを無水ピリジン７０ｍｌに溶かしＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）３５ｍｍｏｌを加え、４５度Ｃにて１日反応させた。生成するジシクロヘキシルウレアを反応液から濾去して、化合物６を得た（収率６０％）。ここで、ＤＭＴは保護基でジメトキシトリチル基を指す。
【００７１】
図７の通り、化合物６（４ｍｍｏｌ）と化合物７（４ｍｍｏｌ）とを無水ピリジン４０ｍｌに溶かしＤＣＣ（２０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃にて１日反応させた。生成するジシクロヘキシルウレアを反応液から濾去して、化合物８を得た（収率７０％）。ここで、Ａｃは保護基でアセチル基を指す。
【００７２】
図８の通り、化合物８（２．５ｍｍｏｌ）とパラトルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ）とをアセトニトリルーアセトン（１：１）混合液５０ｍｌに溶かし、室温にて１日反応し、化合物９を得た（収率８５％）。
【００７３】
図９の通り、化合物９（２ｍｍｏｌ）と化合物１０（２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ  （２０ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、この溶液にＤＣＣ（２．４ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）４ｍｍｏｌを添加した。０℃にて１時間、さらに室温で１時間反応した後、生成するジシクロヘキシルウレアを反応液から濾去して、化合物１１を得た（収率８０％）。ここで、Ｔｒｔは保護基でトリチル基を指す。
【００７４】
図１０の通り、化合物１１（１ｍｍｏｌ）をメタノール−濃アンモニア水（１：１）５０ｍｌに溶かし，室温で１日反応させ、化合物１２を得た。これを真空で乾燥させ水分を充分除いた後、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解した。さらにここへジイソプロピルエチルアミン（５ｍｍｏｌ）及び化合物１３（５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させ化合物１４を得た（収率８０％）。
【００７５】
Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃを塩基とする３｀−Ｏ−ホスホアミダイト型ヌクレオシドとともに化合物１４を原料の一部として、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、配列番号５の塩基配列を有するプローブ用合成オリゴヌクレオチドＹＰＦ−２７１を合成した。
【００７６】
ただし、５番目のＣの位置のリン酸エステルのリン原子に以下に示す修飾を有する。
【００７７】
Ｐ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｔｒｔ
この合成オリゴヌクレオチドＹＰＦ−２７１から実施例１で述べた手順に従ってトリチル基を除去し、実施例１中の化合物８と反応させ、図１１に示す標識核酸プローブＹＯ−２７１を得た。
【００７８】
実施例６  標的核酸の検出  ４
以下に示す標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ  １（配列番号６）およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ  ２（配列番号７）を、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００７９】
これらの標的合成オリゴヌクレオチドは実施例５で得た標識核酸プローブＹＯ−２７１に対して、図１２のように部分的に２本鎖を形成することが可能である。
【００８０】
ただし、図中「＊」は標識核酸プローブＹＯ−２７１における標識部位を表す。また、同じく式中「｜」は標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２と標識核酸プローブＹＯ−２７１との間の相補部分を示し、「＃」は標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１と標識核酸プローブＹＯ−２７１との間にのみ生じる１塩基ミスマッチ部位を表している。
【００８１】
２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７１と、０、５、１０、２０、または３０ｐｍｏｌの標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１またはＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２を７５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で混合し、５０℃で保温してアニーリングさせた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定した。
【００８２】
結果を図１３に示す。図１３からは、反応液中の標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２の量に依存して蛍光強度が増大し、標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２の量が２０ｐｍｏｌ（等量）となったところで蛍光強度の増大が飽和に達することがわかる。また、標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１を用いた場合、その量を３０ｐｍｏｌまで増加させても反応液の蛍光強度はほとんど増加しなかった。したがって、標識核酸プローブＹＯ−２７１は標的核酸を量依存的に認識し、かつ標的核酸中の１塩基ミスマッチの識別が可能であることが確認された。
【００８３】
実施例７  標的核酸の調製
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの５’非翻訳領域をＰＣＲにて増幅するためのプライマーとして、以下の式に示す合成オリゴヌクレオチドを実施例６と同様に機械合成した。
【００８４】
Ｕ２５：配列番号８
Ｌ２９６：配列番号９
米国人Ｃ型肝炎患者のプール血清、および日本人Ｃ型肝炎患者のプール血清それぞれ１００μｌから「ＴＯＳＯＨ核酸抽出キット」（東ソー（株）製）を用いてＨＣＶ  ＲＮＡを抽出し、抽出ペレットを１２μｌの１００μｇ／ｍｌのｙｅａｓｔ  ＲＮＡを含むＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。得られたＨＣＶ  ＲＮＡ溶液１０μｌと逆転写反応液５μｌを混合し、終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／各１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ／１．１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）／２Ｕ／μｌ  ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）／１ｍＭ  ＤＴＴ／１．２μＭ    Ｌ２９６の反応液１５μｌ中４２℃にて１０分間逆転写反応を行い、さらに９９℃にて６分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【００８５】
上記逆転写反応液１５μｌとＰＣＲ反応液６０μｌを混合し、終濃度１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／各０．２８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ／０．０３Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造（株）製）／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．２４μＭ  Ｕ２５／０．２４μＭ  Ｌ２９６の反応液７５μｌ中で９５℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分の温度サイクルを４０サイクル行うことにより、ＰＣＲ反応を行った。
【００８６】
得られた反応液より、ＰＣＲ産物を「ＳｐｉｎＢｉｎｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔｓ」（宝酒造（株）製）を用いて精製した。得られた精製ペレットをそれぞれ１０μｌのＴＥに溶解した後、「ＤＮＡ  ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ」（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化した。その後、常法によりフェノール処理・エタノール沈澱を行い、得られた沈澱物をそれぞれ１０μｌのＴＥに再溶解した。
【００８７】
一方、市販のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（東洋紡績（株）製）２μｇを制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造（株）製）により酵素添付の反応バッファー中で酵素消化した後、さらにＣａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造株式）で脱リン酸化を行い、常法によりフェノール処理・エタノール沈澱を行い、得られた沈澱物を１０μｌのＴＥに再溶解した。
【００８８】
上記のようにして得られたプラスミド消化物１μｌと米国人血清または日本人血清由来のＰＣＲ産物２μｌを混合し、「ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（宝酒造（株）製）を用いて連結反応を行わせ、「ＪＭ１０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ」（宝酒造（株）製）に導入し、５０μｇ／μｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で組換え体コロニーを形成させた。得られた組換え体コロニーを５０μｇ／μｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。「Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ」（ＡＢＩ製）及びＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ製、３７３Ａ）を用いて塩基配列決定を行い、文献上のＨＣＶ  ＲＮＡの塩基配列と一致するクローンをそれぞれ得た。得られた米国人血清由来のクローンをＳＫＰ／ＳＣ１−１、日本人血清由来のクローンをＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６と命名した。いずれのクローンもプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の有するＴ７プロモーターの転写方向にＨＣＶ  ＲＮＡの塩基番号２５→３１４の２９０ｂｐが挿入されていた（塩基番号は文献Ｃｈｏｏ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８巻、ｐ２４５１−２４５５、１９９１年に従った）。
【００８９】
それぞれのクローンの塩基配列中、実施例５で得た標識核酸プローブＹＯ−２７１に対応する領域は、図１４のように部分的に相補的な２本鎖を形成することが可能である。
【００９０】
ただし、図中「＊」は標識核酸プローブＹＯ−２７１における標識部位を表す。また、同じく図中「｜」はＳＫＰ／ＳＣ１−１およびＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６と標識核酸プローブＹＯ−２７１との間の相補部分を示し、「＃」はＳＫＰ／ＳＣ１−１と標識核酸プローブＹＯ−２７１との間にのみ生じる１塩基ミスマッチ部位を表している。
【００９１】
ＳＫＰ／ＳＣ１−１、およびＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６それぞれ１ｍｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより酵素添付の反応バッファー中で酵素消化した。その後、常法によりフェノール抽出・エタノール沈澱を行い、沈澱物を５００μｌのＴＥに再溶解した。
【００９２】
上記ＳＫＰ／ＳＣ１−１、およびＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６のＨｉｎｄＩＩＩ消化物それぞれ３μｌ（約６μｇ）を、終濃度４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／８ｍＭ  ＭｇＣｌ２／２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ／５ｍＭ  ＤＴＴ／各０．４ｍＭ  ＮＴＰｓ／１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）／５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの反応液それぞれ２７５μｌ中３７℃にて１時間反応させてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写を行わせた。その後、２８μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（ナカライテスク製）を加え、３７にて３０分間反応させて鋳型ＤＮＡを分解し、常法にてフェノール抽出・エタノール沈澱を行った。得られた沈澱物を２５０μｌのＴＥに再溶解し、波長２６０ｎｍにおける吸光度よりいずれも約１０１２分子／μｌの濃度と見積もられた。
【００９３】
上記ＲＮＡ溶液をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのｙｅａｓｔ  ＲＮＡを含むＴＥにてそれぞれ１０７倍および１０９倍希釈し、それぞれ約１０５分子／μｌおよび約１０３分子／μｌ濃度の標的核酸液を得た。
【００９４】
実施例８  標的核酸の検出  ５
ＨＣＶ  ＲＮＡの５’非翻訳領域をＰＣＲにて増幅するためのプライマーとして、以下の合成オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３９１ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００９５】
Ｕ２３：配列番号１０
Ｌ２９４：配列番号１１
実施例７で得られた１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＣ１−１由来のＲＮＡ溶液および１０３分子／μｌおよび１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡ溶液それぞれ１０μｌと逆転写反応液５μｌを混合し、終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／各１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ／１．１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）／２Ｕ／μｌ  ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．０５μＭ  Ｌ２９４の反応液１５μｌ中４２℃にて１０分間逆転写反応を行い、さらに９９℃にて６分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【００９６】
上記逆転写反応液１５μｌとＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外の反応成分を含むＰＣＲ反応液５０μｌを混合し、７２℃まで加温した。これに７２℃に加温したＰＣＲ酵素液（０．５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造（株）製）１０μｌを混合し、終濃度１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／各０．２８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．５μＭ  Ｕ２３／０．０１μＭ  Ｌ２９４／０．０６７Ｕ／μｌの反応液７５μｌ中で、９５℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分の温度サイクルを５０サイクル行うことにより、（＋）鎖を過剰増幅する非対称ＰＣＲ反応を行った。
【００９７】
非対称ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを２％アガロースゲル電気泳動にかけ、１０μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド液で染色し、近紫外光下でバンドを観察した。その結果、いずれの場合も目的の位置にバンドが観察され、非対称ＰＣＲ増幅が起こっていることが確認された。
【００９８】
２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７１を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２液１０μｌと、上記非対称ＰＣＲ反応液６５μｌを混合し、９９℃にて６分間加熱後、４５℃で保温してアニーリングさせた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで４５℃にて測定した。結果を図１５に示す。図１５からは、ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡからの（＋）鎖過剰の非対称ＰＣＲ産物に対して蛍光強度が増大していることがわかる。また、ＳＫＰ／ＳＣ１−１由来のＲＮＡからの（＋）鎖過剰の非対称ＰＣＲ産物に対して蛍光強度は増加しなかった。したがって、標識核酸プローブＹＯ−２７１は特異的な（＋）鎖過剰の非対称ＰＣＲ産物を認識でき、その１塩基ミスマッチの識別が可能であることが確認された。
【００９９】
実施例９  標的核酸の検出  ６
実施例７で得られた１０３分子／μｌおよび１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡ溶液それぞれ１０μｌを用いて、実施例８と同様に（＋）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲを行った。ただし、あるＰＣＲ反応液中には２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７１を非対称ＰＣＲ開始時に加えた。
【０１００】
また、同様に１０５分子／μｌ濃度のＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡ溶液１０μｌを用いて、実施例８と同様に（−）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲを行った。この場合には、ＲＴ反応液には終濃度２．５μＭとなるようにプライマーＬ２９４を加え（ＰＣＲ時には０．５μＭとなる）、ＰＣＲ反応時には終濃度０．０１μＭとなるようにプライマーＵ２３を加えた。ただし、あるＰＣＲ反応液中には２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７１を非対称ＰＣＲ開始時に加えた。各非対称ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを２％アガロースゲル電気泳動にかけ、１０μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド液で染色し、近紫外光下でバンドを観察した。その結果、いずれの場合も目的の位置にバンドが観察され、非対称ＰＣＲ増幅が起こっていることが確認された。
【０１０１】
非対称ＰＣＲ時に標識核酸プローブＹＯ−２７１を加えなかった反応液の場合には、２０ｐｍｏｌの標識核酸プローブＹＯ−２７１を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２液１０μｌと、上記非対称ＰＣＲ反応液６５μｌを混合し、９９℃にて６分間加熱後、４５℃で保温してアニーリングさせた。非対称ＰＣＲ時に標識核酸プローブＹＯ−２７１を加えた反応液の場合には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２液１０μｌと、上記非対称ＰＣＲ反応液６５μｌを混合し、同様にアニーリングさせた。各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで４５℃にて測定した。
【０１０２】
結果を図１６に示す。図１６からは、非対称ＰＣＲ開始時に標識核酸プローブＹＯ−２７１を加えなかった場合、ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６由来のＲＮＡからの（＋）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産物に対して蛍光強度が増大しているが、（−）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産物に対しては蛍光強度が増大していないことがわかる。したがって、標識核酸プローブＹＯ−２７１は特異的な非対称ＰＣＲ産物の認識が可能であることが確認された。さらに、非対称ＰＣＲ開始時に標識核酸プローブＹＯ−２７１を加えた場合も、同様の結果が得られていることがわかる。したがって、特異的な非対称ＰＣＲ産物の検出を行おうとする場合、後処理の操作手順を省略するために非対称ＰＣＲ開始時にあらかじめ標識核酸プローブＹＯ−２７１を加えておくことが可能であることが確認された。
【０１０３】
実施例１０  インビトロ転写系における転写産物量のモニター
インビトロ転写の鋳型ＤＮＡとして、実施例７で構築したＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６を制限酵素で切断した直鎖状ＤＮＡを用いた。図１７はその構造を示したものである。制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断したものはＴ７プロモーターから転写を行わせる場合の、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで切断したものはＴ３プロモーターから転写を行わせる場合の鋳型とした。それぞれの鋳型ＤＮＡを含み、以下に示した組成の反応液５００μｌを蛍光測定用セルに入れ、蛍光分光光度計内で４０℃にて反応させた。
【０１０４】
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反応させるのと同時に、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光を３０分間モニターした結果が図１８で、反応後の転写産物１０μｌを電気泳動した結果が図１９である。いずれの場合も転写産物が生成されているが、蛍光として検出されるのはセンスのみである。この結果から転写産物を特異的に測定することが可能であるといえる。
【０１０５】
さらに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとセンス鋳型ＤＮＡを用いて上と同条件で反応させ、反応液１０μｌを経時的に採取し、電気泳動した結果が図２０で、図２０の結果のバンド濃度をデンシトメーターで測定した結果が図２１である。図１８の反応曲線は図２１の曲線とよく相関しており、産物量に応じた蛍光が得られていることが確認できた。したがって、この測定系によって試料を取り出すことなく、ＲＮＡ産物量の特異的な定量が可能であることが証明された。
【０１０６】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、例えば遺伝子混合物からなると予想される試料の中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を有する標的核酸について、ＰＣＲ法による増幅後の反応液の分析や相補結合に関与していない余剰プローブの分離を行うことなしに、標的核酸の存在の有無及び量を決定することを可能とする均一系での簡便な一段階の方法が提供される。従って本発明によれば、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索等の分野でより簡便に標的核酸に標的核酸を検出することが可能となり、更にはＰＣＲ法による増幅工程に関するサイクル数等の反応条件の最適化を行うことが可能となる。
【０１０７】
本発明によれば、標識核酸プローブが標的核酸と相補結合を形成するとプローブに結合されたインターカレーター性蛍光色素の蛍光強度が増加することを利用することにより、相補結合に関与しなかった余剰プローブを分離する工程等を必要とせずに、その相補結合の形成の有無の検出及び形成された相補結合体の定量が可能となり、特定の核酸配列からなる核酸の均一系での簡便な一段階の分析方法が提供される。特に本発明では、不溶性担体を使用する必要がないため、これに対する標識核酸プロ−ブの非特異的吸着等の課題を生じ得ない。
【０１０８】
また本発明によれば、標識核酸プローブをＰＣＲ法による標的核酸の増幅に先だって試料に添加することにより、増幅工程中の反応液の蛍光強度を測定することで標的核酸の増幅されていく様子を経時的に追跡することが可能となる。仕上って、増幅前の試料中の標的核酸の有無の判定及び量の決定を、増幅後の反応液の分析を行うこと無しに決定することが可能となる。
【０１０９】
本発明によれば、更に、出願人が先に創作した、遊離のインタ−カレ−タ−性蛍光色素共存下でＰＣＲを実施する方法（特開平５−２３７００号）における、遊離インタ−カレ−タ−性蛍光色素が二本鎖核酸に非特異的にインタ−カレ−トすることに由来するバックグランドの増加を排除することが可能となる。即ち、本発明の標識核酸プロ−ブは、標識物質であるインタ−カレ−タ−性蛍光色素にいわば特異性を付与するものだからである。
【０１１０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ−１の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】図２中の１は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ−１と標的核酸ＤＳ１とからなる水溶液について、相補結合を形成する条件下において測定された蛍光スペクトルであり、２はＹＯ−ＰＵ−１水溶液の蛍光スペクトルである。いずれも励起波長は４８０ｎｍである。
【図３】図３は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌに対して標的核酸ＤＳ１の添加量を変化させた場合の各反応液の蛍光強度を示し、いずれも励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで測定したものである。
【図４】図４は、本発明の標識核酸プローブＹＯ−ＰＵ−１の３０ｐｍｏｌに対して標的核酸ＤＳ２の添加量を変化させた場合の各反応液の蛍光強度を示し、いずれも励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで測定したものである。
【図５】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図６】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図７】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図８】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図９】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図１０】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図１１】実施例５における、化合物の反応を示す図である。
【図１２】実施例６における合成オリゴヌクレオチドと実施例５におけるプローブが形成する２本鎖を示す図である。
【図１３】標識核酸プローブＹＯ−２７１の２０ｐｍｏｌに対して標的合成オリゴヌクレオチドＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ１およびＴａｒｇｅｔＴｙｐｅ２の添加量を変化させた場合の各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、標的核酸非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示したものである。
【図１４】実施例７におけるクローン中の塩基配列と、実施例５におけるプローブが形成する２本鎖を示す図である。
【図１５】標識核酸プローブＹＯ−２７１の２０ｐｍｏｌに対して（＋）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲ産物を初期分子数を変化させた場合の各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、標的核酸非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示したものである。
【図１６】（＋）鎖過剰増幅または（−）鎖過剰増幅非対称ＰＣＲに際して、標識核酸プローブＹＯ−２７１の２０ｐｍｏｌを非対称ＰＣＲ開始時あるいは終了時に添加した場合の各反応液の蛍光強度を励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで５０℃にて測定し、標的核酸非存在下を１としたときの蛍光強度の比を示したものである。
【図１７】ＳＫＰ／ＳＲ１Ｐ２−６を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した直鎖状ＤＮＡはＴ７プロモーターから転写を行わせる場合の鋳型（センス）とし、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで切断したものはＴ３プロモーターから転写を行わせる場合の鋳型（アンチセンス）とした。
【図１８】センスおよびアンチセンスのそれぞれについて、反応液を蛍光測定用セルに入れ、分光光度計内で反応させると同時に励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで３０分間測定した結果である。
【図１９】図１８のそれぞれの産物１０μｌを２％アガロースにて、電気泳動しエチジウムブロマイドで染色した結果である。サイズマーカーはφＸ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩである。
【図２０】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとセンス鋳型を用い、図１８と同条件で反応を行い、経時的に反応液１０μｌを採取し、３％アガロースにて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。コントロールＲＮＡは、転写産物と同じＲＮＡを精製し、２６０ｎｍの吸光度から濃度決定したもので、サイズマーカーはφＸ１７４／  Ｈａｅ  ＩＩＩである。
【図２１】図２０について、バンドの黒化度をデンシトメーターで測定し、コントロールＲＮＡと比較定量した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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