(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シネラリア植物の組織片を、植物ホルモンとしてオーキシニン類であるナフタレン酢酸と、サイトカイニン類とを含むカルス形成用固体培地上で培養してカルスを形成させるカルス形成工程（Ａ）、
得られたカルスを、ナフタレン酢酸と、サイトカイニン類とを含む不定芽形成用培地に移植し、光照射下で培養してカルスから不定芽を分化させる不定芽形成工程（Ｂ）、および
得られた不定芽をカルスから分離・採取し、ナフタレン酢酸を含む発根用培地で光照射下で培養して発根させ、幼苗とする発根工程（Ｃ）を含むことを特徴とするシネラリア植物の種苗生産方法。
【請求項２】
前記発根工程（Ｃ）にて前記不定芽を分離した後のカルスを、前記不定芽形成工程（Ｂ）に戻して再利用するカルス再利用工程（Ｃ’）を含むことを特徴とする請求項１記載のシネラリア植物の種苗生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、シネラリア植物の種苗を大量生産することが可能なシネラリア植物の種苗生産方法に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
シネラリア植物は、種子繁殖性の植物であり、従来ではシネラリア固体間での交配により品種改良した種子が園芸用に市販されていた。しかしながら、このような種子繁殖による品種生産にあっては、種子を播種して得られた植物体が、親株と同一の遺伝形質を発現するとは限らず、特に花色が固定化された園芸品種を安定生産することが困難であるという品質上の問題があった。
【０００３】
そこで、花色が固定化した品種を安定供給するために、従来よりシネラリア属植物の組織を培養し、この培養組織から分化した同一遺伝形質を有する種苗を得る組織培養法を適用した品種生産が試みられている。
【０００４】
例えば、このようなシネラリア植物の組織培養方法としては、シネラリアの生長点を、植物ホルモンとしてカイネチンおよびインドール酢酸を含む培地で培養して不定芽を形成させ、この不定芽を植物ホルモンとしてナフタレン酢酸を含む培地で培養・発根させて幼苗を得る方法〔ホートサイエンス（ＨＯＲＴＳＣＩＥＮＣＥ）  、第２１巻、第１号、第１３９  〜１４０  頁（１９８６年）  〕が提案されている。
【０００５】
しかしながら、この方法では、生長点から形成させた不定芽が、次の工程においてすべて正常に発根するわけではなく、また発根した場合にあっても完全な幼苗にならない場合があるため、生産効率が著しく低く、実用的なシネラリア植物の種苗生産方法とはいいがたいという問題があった。
【０００６】
このように、シネラリア植物では、組織培養方法にあっても、同一形質を有する種苗を大量生産することは未だ成功してしない。したがって、同一遺伝形質を有するシネラリア植物を固定化し、大量に生産し得る方法の開発が望まれている。
【０００７】
【発明の目的】
本発明は、このような従来技術に伴う問題点を解決しようとするものであり、花色などの遺伝形質が固定化され、品質が均一なシネラリア植物の種苗を大量に生産し得る方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【発明の概要】
本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法は、シネラリア植物の組織片を、植物ホルモンとしてオーキシン類であるナフタレン酢酸と、サイトカイニン類とを含むカルス形成用固体培地上で培養してカルスを形成させるカルス形成工程（Ａ）、得られたカルスを、ナフタレン酢酸とサイトカイニン類とを含む不定芽形成用培地に移植し、光照射下で培養してカルスから不定芽を分化させる不定芽形成工程（Ｂ）、および得られた不定芽を採取し、ナフタレン酸を含む発根用培地で光照射下で培養して発根させ、幼苗とする発根工程（Ｃ）を含むことを特徴としている。
【０００９】
本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法は、前記発根工程（Ｃ）にて前記不定芽を分離した後のカルスを、前記不定芽形成工程（Ｂ）に戻して再利用するカルス再利用工程（Ｃ’）を含んでいてもよい。
【００１０】
【発明の具体的説明】
以下、本発明に係るシネラリアの種苗生産方法を、さらに具体的に説明する。
本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法は、シネラリア植物の組織片から特定の固体培地上にてカルスを形成させるカルス形成工程（Ａ）と、得られたカルスを特定培地で、特定条件下で培養してカルスから不定芽を分化・形成させる不定芽形成工程（Ｂ）と、得られた不定芽をカルスから分離・採取し、それを特定培地上で、特定条件で培養して不定芽から発根させ、幼苗を得る発根工程（Ｃ）とを含んでいる。
【００１１】
以下、これら工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を、詳細に説明する。
カルス形成工程（Ａ）
本発明のカルス形成工程（Ａ）では、シラネリア植物の植物体から得られた組織片を原材料とし、この組織片を特定固体培地（カルス形成用固体培地）上で培養してカルスを生産する。
【００１２】
シネラリア（Ｃｉｎｅｒａｒｉａ）は、サワギク属の植物であり、本明細書において、シラネリア植物とは、サワギク属に属するすべての品種を含んでいる。
本工程（Ａ）で原材料として用いられるこのようなシネラリア植物の組織片は、例えばこの植物体の花茎、葉柄、葉身、茎頂、葯、根などの部位から分離・採取することができる。
【００１３】
組織片は、例えば、このような植物体の各部位を切除し、常法により減菌処理を施した後、無菌条件下で所望の大きさ、例えば花茎組織片を原料とする場合は、直径１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは３ｍｍ〜５ｍｍの小片に切断して調製される。
【００１４】
植物体から切除した部位の減菌処理は、通常では薬剤処理であり、７０％エタノールの他、適当な濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液の単独、あるいはこれらを組み合わせて行うことができる。
【００１５】
さらに具体的には、植物体から得た切除部位は、例えば、これらを７０％エタノール溶液に１０秒間、次いで有効塩素濃度０．１〜５％、好ましくは０．５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に２〜３０分間、好ましくは１５分間浸漬して殺菌処理することができる。このようにして殺菌処理された切除部位は、その表面に付着した次亜塩素酸ナトリウムなどの減菌剤を減菌水などで洗浄した後、上述したように所望の大きさの小片に切断し、組織片とされる。
【００１６】
本発明のカルス形成工程（Ａ）では、このようにして得られた組織片を特定の植物ホルモンを含有する固体培地上にて培養してカルスを形成させる。
このようなカルス形成用固体培地は、基本液体培地に、炭素源と特定植物ホルモンとを加え、ｐＨを調製し、さらにゲル化剤を加えて固化することによって調製することができる。
【００１７】
固体培地の調製に用いられる基本液体培地は、植物の育成に必要な窒素、リン、カリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデンおよび鉄などの元素を含む無機塩が含まれた水溶液であり、従来より植物体の培養に広く用いられたいずれであってもよい。具体的には、例えば、ムラシゲ・スクーグ培地、ガンボルグのＢ５培地（以下「Ｂ５培地」という）、ホワイト培地、ニッチ−ニッチ培地、Ｎ６培地などの組織培養用培地が挙げられ、特にＢ５培地が好ましい。これら培地は、例えば、竹内、中島、古谷著の「新植物組織培養」第３８６〜３９１頁（１９７９年、朝倉書店発行）に記載されている。
【００１８】
培地に添加される炭素源としては、ショ糖、ブドウ糖、果糖などの糖類などを挙げることができ、このうちショ糖が好ましい。これらの炭素源の濃度は糖類の種類によって適宜選択されるが、例えば１０〜６０ｇ／リットル、好ましくは３０ｇ／リットルで用いればよい。
【００１９】
また、本発明のカルス形成工程（Ａ）では、培地に加えられる植物ホルモンとして、オーキシン類としてのナフタレン酢酸（以下「ＮＡＡ」という）とサイトカイニン類とが組み合わせて用いられる。本工程（Ａ）でＮＡＡと組み合わせて用いられるサイトカイニン類としては、具体的には、ベンジルアデニン（以下「ＢＡ」という）、カイネチン（以下「ＫＩＮ」という）、ゼアチン、イソペンテニルアデニン、リボシルゼアチンおよびビフェニルウレアなどを挙げることができる。
【００２０】
このような組み合わせの植物ホルモンを含む固体培地をカルス形成用培地に用いることにより、効率よくカルスを形成させることができる。カルス形成用培地に、オーキシン類として、例えば、ＮＡＡ以外の２，４−ＰＡ、インドール酢酸を使用した場合、次の不定芽形成工程（Ｂ）において、得られたカルスから不定芽が形成されない。
【００２１】
このようなＮＡＡおよびサイトカイニン類は、用いられるサイトカイニン類の種類に応じて、適宜その添加量を選択して用いられる。例えば、ＮＡＡとＢＡとを組み合わせて用いる場合、ＮＡＡは、０．１ｍｇ／リットル〜１０ｍｇ／リットル、好ましくは０．５ｍｇ／リットル〜５ｍｇ／リットルの量で用いられ、ＢＡは、０．０１ｍｇ／リットル〜１０ｍｇ／リットル、好ましくは０．１ｍｇ／リットル〜１ｍｇ／リットルの量で用いられる。
【００２２】
また、固体培地には、所望により、さらに各種ビタミン類、アミノ酸、その他天然物などを加えてもよい。このようなビタミン類としては、グリシン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸および塩酸システインなどを挙げることができ、これらは単独あるいは任意の組み合わせで、適宜濃度を調節して用いられる。
【００２３】
このような炭素源、特定植物ホルモンおよびその他添加物などを加えた液体培地の固化に用いられるゲル化剤としては、寒天、アガロース、ゲルライト（ゲランガム）などを挙げることができ、特にゲルライトが好ましい。
【００２４】
このようなゲル化剤は、種類によってその使用量を適宜選択して用いられるが、例えば、０．１ｇ／リットル〜１０ｇ／リットル、好ましくは２ｇ／リットル〜５ｇ／リットル、さらに好ましくは３ｇ／リットルの量で用いられることが好ましい。
【００２５】
固体培地は、上記炭素源および植物ホルモンと、所望によるビタミンなどの添加物とを基本液体培地に添加し、これを所望のｐＨ、具体的には、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５．８に調節した後、さらに上記ゲル化剤を加えて固化することによって調製される。
【００２６】
このようにして得られた固体培地は、オートクレーブなどにより減菌して用いることが望ましい。
本発明のカルス形成工程（Ａ）では、このようなカルス形成用固体培地上にシネラリア植物の組織切片を置床し、これを培養することによって組織片からカスルを形成している。なお、ここで形成されるカルスは、細胞が密に集合した固い細胞集合塊である。
【００２７】
組織片の培養は、暗黒下で行なっても、光照射下で行なってもよいが、カルス形成促進のためには、光照射下での培養が好ましい。
光照射下で組織片の培養を行なう場合、光照射時間は、１日に５時間〜２４時間、好ましくは１６時間であり、照度は、５００ルクス〜１００００ルクス、好ましくは４０００ルクスである。
【００２８】
また、培養温度は、通常１５℃〜３０℃、好ましくは２５℃であり、培養期間は、３０日間毎に同一組成の固体培地に継代して、３０〜９０日間、好ましくは６０日間である。
不定芽形成工程（Ｂ）
本発明の不定芽形成工程（Ｂ）では、上記カルス形成工程（Ａ）で得られたカルスを、特定の培地（不定芽形成用培地）にて、光照射下で培養して不定芽を形成させる。
【００２９】
このような不定芽形成用培地は、基本液体培地に、炭素源および所望によりビタミン類、アミノ酸などの添加物を加えるとともに、特定の植物ホルモンを加えた培地である。不定芽形成用培地は、液体培地であっても、液体培地にゲル化剤を加えて固化した固体培地であってもよい。
【００３０】
不定芽形成用培地の調製に用い得る基本液体培地としては、上記カルス形成用固体培地の調製に用いられる基本液体培地を挙げることができる。
また、本発明の不定芽形成工程（Ｂ）では、培地に、オーキシン類としてのＮＡＡとサイトカイニン類とが組み合わせて用いられる。本工程（Ｂ）でＮＡＡと組み合わせて用いられるサイトカイニン類としては、上記カルス形成用培地の調製で例示した化合物を例示できる。
【００３１】
このようなＮＡＡおよびサイトカイニン類は、用いられるサイトカイニン類の種類に応じて適宜その添加量を選択して用いられが、通常ＮＡＡは、０．０１ｍｇ／リットル〜１ｍｇ／リットル、好ましくは０．０１ｍｇ／リットルの量で用いられ、サイトカイニン類は、０．００１ｍｇ／リットル〜１ｍｇ／リットル、好ましくは０．０１ｍｇの量で用いられる。
【００３２】
不定芽形成用培地に用いられる炭素源、ビタミン類、アミノ酸、その他の添加物など、およびこれらの濃度は、上記カルス形成用培地の場合と同様である。
不定芽形成用培地は、液体培地である場合には、上記炭素源および任意に加えられる植物ホルモンと、所望による添加物とを液体培地に添加し、これを所望のｐＨ、具体的には、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５．８に調節して得ることができる。また、固体培地である場合には、上記ｐＨを調節した液体培地に、さらに上記ゲル化剤を加えて固化することによって調製される。
【００３３】
このようにして得られた不定芽形成用培地は、オートクレーブなどにより減菌して用いることが望ましい。
本発明の不定芽形成工程（Ｂ）では、このような不定芽形成用培地に、上記カルス形成工程（Ａ）で得られたカルスを、そのまま、あるいは２〜８個に分割して移植し、これを特定条件、即ち光照射下で培養することによって、カルスから不定芽を形成する。
【００３４】
光照射時間は、１日に５時間〜２４時間、好ましくは１６時間であり、照度は、１０００ルクス〜１００００ルクス、好ましくは４０００ルクスである。
このような光照射条件下で、通常１５℃〜３０℃、好ましくは２５℃の温度で、３０日間毎に継代して、３０〜６０日間、好ましくは６０日間培養することにより、カルス上に不定芽が分化・形成される。
発根工程（Ｃ）
本発明の発根工程（Ｃ）では、上記不定芽形成工程（Ｂ）で分化・形成された不定芽を、メスなどを用いてカルスから切除して分離・採取し、特定の培地（発根培地）にて、光照射下で培養して不定芽から発根させ、幼苗を生産する。
【００３５】
このような発根培地は、基本液体培地に特定の植物ホルモンおよび炭素源と、所望によりビタミン類、アミノ酸などの添加物とを加え、ゲル化剤を加えて固化した固体培地である。
【００３６】
発根培地の調製に用いられる基本液体培地としては、上記カルス形成用固体培地の調製に用いられる基本液体培地を挙げることができる。
また、本発明の発根工程（Ｃ）で発根培地に加えられる植物ホルモンは、ＮＡＡであり、通常、０．０１ｍｇ／リットル〜１ｍｇ／リットル、好ましくは０．０１ｍｇ／リットルの量で用いられる。
【００３７】
発根培地に用いられる炭素源、および所望により加えるビタミン類、アミノ酸などの添加物およびこれらの濃度は、上記カルス形成用培地の場合と同様である。
【００３８】
発根培地は、上記炭素源および植物ホルモンと、所望によりビタミン類などの添加物とを基本液体培地に添加し、これを所望のｐＨ、具体的にはｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５．８に調節した後、さらに上記ゲル化剤を加えて固化することによって調製される。
【００３９】
このようにして得られた発根培地は、オートクレーブなどにより減菌して用いることが望ましい。
本発明の発根工程（Ｃ）では、このようにして調製された発根培地上に、上記不定芽形成工程（Ｂ）で得られた不定芽を、メスなどでカルスから分離して移植し、これを特定条件、即ち光照射下で培養することによって、不定芽から発根させて幼苗を生産する。
【００４０】
光照射時間は、１日に５時間〜２４時間、好ましくは１６時間であり、照度は、１０００ルクス〜１００００ルクス、好ましくは４０００ルクスである。
このような光照射条件下で、通常１５℃〜３０℃、好ましくは２５℃の温度で、通常１５〜６０日間、好ましくは３０日間培養を行なうことにより、不定芽が発根し、幼苗が得られる。
【００４１】
以上説明した本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法によれば、上述した工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を順次行なうことにより、原料であるシラネリア植物の組織片から、遺伝形質が統一された複数の幼苗を効率よく生産することができる。
【００４２】
また、本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法は、発根工程（Ｃ）の不定芽分離・採集時に不定芽から分離されたカルスを再利用するカルス再利用工程（Ｃ’）を含んでいてもよく、以下この工程（Ｃ）を詳細に説明する。
カルス再利用工程（Ｃ’）
本発明のカルス再利用工程（Ｃ’）では、上記発根工程（Ｃ）において、カルス上に分化・形成した不定芽を分離した後のカルスを、再度不定芽形成工程（Ｂ）に戻してカルスとして再利用している。
【００４３】
このようにして再利用した不定芽分離後のカルスからは、工程（Ｂ）に戻すことにより、再度不定芽が分化・形成される。
このようにして得た不定芽は、上記発根工程（Ｃ）にて、発根させて幼苗とすることができる。このようなカルス再利用工程（Ｃ’）によるカルスの再利用は、２〜１０回の範囲で行なうことができる。
【００４４】
以上説明した本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法で得られた幼苗（種苗）は、順化した後、土壌を詰めたポットに移植し、栽培・育成して開花させると、花色などの発現形質が均一な植物体であった。
【００４５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るシネラリア植物の種苗生産方法によれば、植物の組織片を、植物ホルモンとしてオーキシン類であるＮＡＡと、サイトカイニン類とを含むカルス形成用固体培地上で培養してカルスを形成させ、得られたカルスを、ＮＡＡと、サイトカイニン類とを含む不定芽形成用培地に移植し、光照射下で培養してカルスから不定芽を分化させ、次いで得られた不定芽をＮＡＡを含む発根用培地で光照射下で培養して発根させて幼苗としているため、花色などの遺伝形質が均一な種苗を効率よく大量生産することが可能である。
【００４６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定して解釈されるものではない。
【００４７】
【実施例１】
カルス形成工程（Ａ）
シネラリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｃｒｕｅｎｔｕｓ  ＤＣ．）の花茎を、７０％エタノール溶液に１０秒間、次いで１０％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分間浸漬して殺菌処理した後、滅菌水で３回洗浄した。減菌処理した花茎をメスで直径５ｍｍに切断して小片とし、これらを試験組織片として用いた。
【００４８】
所定の無機成分組成を有するＢ５培地に、ＢＡ０．１ｍｇ／リットル、ＮＡＡ０．１ｍｇ／リットル、ショ糖３０ｇ／リットル、ゲルライト３ｇ／リットルを添加し、シャーレに導入し固化させて固体培地（ｐＨ５．８）を調製した。
【００４９】
試験組織片を、上記固体培地上に置床し、温度２５℃、１日当り４０００ルクスの明期１６時間および暗期８時間からなる光照射（明）下にて、６０日間（３０日目に同一組成の固体培地に継代）培養し、組織片の周辺にカルスを形成させた。
【００５０】
下記式にしたがって、組織片１個あたりのカルス誘導率（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００５１】
【数１】
0003578440.tif 000002
【００５２】
不定芽形成工程（Ｂ）
上記工程（Ａ）で得たカルスを、所定の無機成分組成を有するＢ５培地に、ショ糖３０ｇ／リットル、表１に示される組成の植物ホルモンを加え、さらにゲルライト３ｇ／リットルを加えてシャーレに導入し固化させた固形培地（ｐＨ５．８）に置床した。
【００５３】
カルスを、置床後、温度２５℃、１日当り４０００ルクスの明期１６時間および暗期８時間からなる光照射（明）下にて、６０日間（３０日目に同一組成の固体培地に継代）培養し、カルスから不定芽を分化・形成させた。このようなカルス培養によって、生長点を有する正常な不定芽が形成された。
【００５４】
下記式にしたがって、カルス１個あたりの不定芽形成率（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００５５】
【数２】
0003578440.tif 000003
【００５６】
発根工程（Ｃ）
上記工程（Ｂ）で得た不定芽をメスで切除・分離し、所定の無機成分組成を有するＢ５培地に、ショ糖３０ｇ／リットル、ＮＡＡ０．１ｍｇ／リットルを加え、さらにゲルライト３ｇ／リットルを加えてシャーレに導入し固化させた固形培地（ｐＨ５．８）に置床した。
【００５７】
置床された不定芽を、温度２５℃、１日当り４０００ルクスの明期１６時間および暗期８時間からなる光照射（明）下にて、３０日間培養し、不定芽から発根させて幼苗を得た。
【００５８】
下記式にしたがって、発根率（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００５９】
【数３】
0003578440.tif 000004
【００６０】
【実施例２〜１７】
カルス形成工程（Ａ）において、培地に加える植物ホルモンを、表１に示される組成とした以外は、実施例１と同様にして、工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行なった。
【００６１】
各工程（Ａ）〜（Ｃ）で得られたカルス誘導率、不定芽形成率および発根率を、表１に示す。
【００６２】
【実施例１８】
カルス形成工程（Ａ）において、培養を暗黒条件（１日当たり暗期２４時間）下で行なう以外は、実施例１と同様にして、工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行なった。
【００６３】
各工程（Ａ）〜（Ｃ）で得られたカルス誘導率、不定芽形成率および発根率を、表１に示す。
【００６４】
【実施例１９〜２１】
カルス形成工程（Ａ）において、培地に加える植物ホルモンを、表１に示される組成とした以外は、実施例１８と同様にして、工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行なった。
【００６５】
各工程（Ａ）〜（Ｃ）で得られたカルス誘導率、不定芽形成率および発根率を、表１に示す。
【００６６】
【実施例２２】
カルス形成工程（Ａ）
シネラリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｃｒｕｅｎｔｕｓ  ＤＣ．）の花茎から、実施例１の工程（Ａ）と同様にして得られた組織片を、所定の無機成分組成を有するＢ５培地に、ＮＡＡ５．０ｍｇ／リットル、ＢＡ０．５ｍｇ／リットル、ショ糖３０ｇ／リットル、ゲルライト３ｇ／リットルを添加し、シャーレに導入して固化させて得た固体培地（ｐＨ５．８）上に、１００片置床した。
【００６７】
置床した組織片を、実施例１の工程（Ａ）と同様にして６０日間培養し、組織片の周辺にカルスを形成させた。各組織片の周辺からカルスが誘導され、１００個のカルスを得ることができた。
不定芽形成工程（Ｂ）
上記工程（Ａ）で得た１００個のカルスを、所定の無機成分組成を有するＢ５培地に、ショ糖３０ｇ／リットルを加え、表１に示される組成の植物ホルモンを加え、さらにゲルライト３ｇ／リットルを加えてシャーレに導入し固化させた固形培地（ｐＨ５．８）に置床した。
【００６８】
置床後のカルスを、実施例１の工程（Ｂ）と同様にして、６０日間培養し、カルスから不定芽を分化・形成させた。このようなカルス培養によって、生長点を有する正常な不定芽が１７１３本形成された。
発根工程（Ｃ）
上記工程（Ｂ）で得た不定芽をメスで切除・分離し、実施例１の工程（Ｃ）と同様にして３０日間培養し、不定芽から発根させたところ、１７１３本の幼苗を得た。
カルス再利用工程（Ｃ’）
上記工程（Ｃ）において、不定芽を切除されたカルスを、再度不定芽形成工程（Ｂ）に戻し、不定芽を形成させた。得られた不定芽は、上記工程（Ｃ）にて発根させて幼苗とした。
【００６９】
またこの際不定芽を切除されたカルスは、カルス再利用工程（Ｃ’）により、工程（Ｂ）に戻して再度再利用できた。即ち、このような再利用工程（Ｃ’）を、７回通過させることにより、シラネリア組織片１００片から、１年間で、１１８２８本の幼苗を得ることができた。
【００７０】
【比較例１】
ＢＡ培地に加える植物ホルモンを、表１に示す濃度のＢＡ単独とし、カルス形成用固体培地を調製した以外は、実施例１と同様にして、カルス形成工程（Ａ）を行なったところ、全くカルスが形成されなかった。
【００７１】
【表１】
0003578440.tif 000005
【００７２】
【表２】
0003578440.tif 000006
【００７３】
【表３】
0003578440.tif 000007