(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列STLEKINKT およびKASEKIFYV からなる群より選択される単離されたペプチド。
【請求項２】
HLA 分子と請求項１に記載のペプチドとからなる複合体であって、細胞溶解性T 細胞の増殖を刺激する複合体。
【請求項３】
前記HLA 分子がHLA-A2である請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
HLA 分子に結合して、細胞溶解性T 細胞の増殖を刺激する単離されたペプチドを含有する癌の治療薬または診断薬であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列KASEKIFYV およびSTLEKINKT からなる群より選択される治療薬または診断薬。
【請求項５】
MHC またはHLA 分子をその表面に提示する細胞を請求項１に記載の単離されたペプチドおよびT 細胞含有試料と、前記HLA 分子と前記ペプチドとの複合体の形成および前記複合体に特異的な細胞溶解性T 細胞の増殖に有利な条件で混合することを含む、インビトロで細胞溶解性T 細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項６】
前記HLA 分子がHLA-A2である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドがSTLEKINKT である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
MHC またはHLA 分子をその表面に提示する細胞を請求項１に記載の単離されたペプチドと、前記MHC またはHLA 分子と前記ペプチドとの複合体の形成および前記複合体に特異的な細胞溶解性T 細胞の増殖に有利な条件下で接触させることを含む、インビトロで細胞溶解性T 細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項９】
MHC またはHLA 分子をその表面に提示する細胞を請求項４に記載の治療薬または診断薬と、前記MHC またはHLA 分子と前記治療薬または診断薬に含まれるペプチドとの複合体の形成および前記複合体に特異的な細胞溶解性T 細胞の増殖に有利な条件下で接触させることを含む、インビトロで細胞溶解性T 細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項１０】
MHC またはHLA 分子と請求項１に記載の単離されたペプチドとの複合体を特異的に認識する単離された細胞溶解性T 細胞。
【請求項１１】
前記HLA 分子がHLA-A2である請求項１０に記載の単離された細胞溶解性T 細胞。
【請求項１２】
前記単離されたペプチドがSTLEKINKT である請求項１０に記載の単離された細胞溶解性T 細胞。
【請求項１３】
HLA 分子とアミノ酸配列KASEKIFYV からなる単離されたペプチドとの複合体を特異的に認識する単離された細胞溶解性T 細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の複数の異なる単離されたペプチド、および医薬的に許容しうる担体を含んでなる、癌の治療または診断用の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離されたペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項１６】
前記ペプチドがSTLEKINKT である請求項１５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１に記載の単離されたペプチドまたは請求項４に記載の治療薬または診断薬に含まれるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１に記載の複数の異なる単離されたペプチドをコードする1 つの核酸配列からなる単離された核酸分子。
【請求項１９】
プロモーターに機能可能な形で連結された請求項１５、１７または１８に記載の単離された核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１５、１７または１８に記載の単離された核酸分子を含んでなる組換え細胞。
【請求項２１】
さらにHLA 分子をコードする核酸分子を含んでなる請求項２０に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、本明細書に述べる「ＳＳＸ 」ファミリーのメンバーである遺伝子の単離およびクローニング、ならびに癌の決定を含むその使用に関する。またそれらＳＳＸ 遺伝子およびＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子に由来するペプチドも、本発明の一部を構成する。これらのペプチドは細胞溶解性Ｔ 細胞の増殖を刺激するので、癌などの疾患の存在およびＨＬＡ−Ａ２細胞に関するマーカーとして、また癌治療用の治療薬として有用である。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、１９９７年５月５日に出願された特許出願第０８／８５１，１３０号および１９９８年６月２６日に出願された同第０９／１０５，８３９号の一部継続出願であり、両者を参照文献として援用する。
【０００３】
【従来の技術】
感染症、癌、自己免疫異常などの多くの病理学的状態が特定分子の不適切な発現を特徴とすることは、かなり確証されている。したがってこれらの分子は特定の病理学的状態または異常状態の「マーカー」として役立つ。診断上の「標的」、すなわち、前記異常状態を診断するために同定されるべき物質として使用することの他に、前記分子は、診断薬および／ または治療薬を創出するために使用できる試薬としても役立つ。その一例は（決してこれに限るわけではないが）、癌マーカーを使用して特定のマーカーに特異的な抗体を作成することである。さらにもう一つの非限定的な例は、ＭＨＣ 分子との複合体を形成するペプチドを使って、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ 細胞を生成することである。
【０００４】
前記のような物質の調製は、もちろん、それらを生成するために使用される前記試薬の供給源を前提とする。細胞からの精製は、これを行なう一方法であるが、面倒で、決して確実ではない。もう一つの好ましい方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離した後、単離されたそのコード分子を使って所望の分子を発現させることである。
【０００５】
今まで、例えばヒト腫瘍中の上記のような抗原の検出には、２ つの戦略が使用されてきた。それらを遺伝子的アプローチおよび生化学的アプローチと呼ぶことにする。遺伝子的アプローチは、例えば参照文献としてここに援用するデプラエン（ｄｅＰｌａｅｎ ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２２７５ （１９８８）に例示されている。この方法では、腫瘍から得たｃＤＮＡライブラリーのプラスミド数百プールを、例えばＣＯＳ 細胞などの受容細胞または腫瘍細胞株の抗原陰性変異種にトランスフェクトする。トランスフェクタントは、抗腫瘍細胞溶解性Ｔ 細胞クローンによる応答を誘発するというその能力により、腫瘍抗原の発現についてスクリーニングされる。例えば参照文献としてここに援用するマンデルボイム（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６９ （１９９４）に例示される生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ クラスＩ 分子に結合しているペプチドの酸溶離と、それに続く逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に基づく。抗原性ペプチドは、それらが抗原プロセシングに欠損を持つ突然変異体細胞株の空のＭＨＣ クラスＩ 分子に結合して、細胞傷害性Ｔ リンパ球との特異的反応を誘導することで、同定される。それらの反応には、ＣＴＬ 増殖の誘導、ＴＮＦ 放出、およびＭＴＴ 測定法または５１Ｃｒ放出測定法で測定できる標的細胞の溶解が包含される。
【０００６】
抗原を分子的に定義づけるこれら２ つのアプローチには、次の短所がある。第一に、それらは著しく面倒で、時間と費用がかかる。第二に、それらは前もって定められた特異性を持つ細胞傷害性Ｔ 細胞株（ＣＴＬ ）の樹立に依存する。第三に、各ＣＴＬ は各疾患を持つ患者からだけでなく健康な個体からも、そのＴ 細胞レパートリーに依存して得ることができるので、問題としている疾患の病状の経過とのインビボでの関連性は証明されていない。
【０００７】
抗原を同定し分子的に定義づける前記２ つの既知のアプローチに固有の課題は、どちらの方法でも、現在までに定義づけることに成功したヒト腫瘍中の新規抗原は極めてわずかにすぎないという事実に、最も顕著に表れている。例えばファンデアブルッゲン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７ （１９９１）；ブリカード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１７８：４８９−４９５ （１９９３）；クーリー（Ｃｏｕｌｉｅ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１８０：３５−４２ （１９９４）；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５−３５１９ （１９９４）を参照されたい。
【０００８】
さらに上記の方法論は、検討中の癌タイプの樹立永代細胞株が利用可能であることに依拠している。例えばエットゲン（Ｏｅｔｔｇｅｎ ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．１０：６０７−６３７（１９９０）に示されているように、一定の癌タイプから細胞株を樹立することは極めて困難である。また、一部の上皮細胞タイプの癌はインビトロでＣＴＬ に対する感受性が弱く、常套的な分析が不可能であることも知られている。これらの課題は、当技術分野が癌関連抗原を同定するためのさらなる方法論を開発しようとする動機になっている。
【０００９】
重要な一つの方法論は、参照文献としてここに援用するザーイン（Ｓａｈｉｎ ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１８１０−１１９１３ （１９９５）に記載されている。米国特許出願第０８／５８０，９８０号と１９９６年１ 月３ 日に出願された米国特許出願および米国特許第５，６９８，３９６ 号も参照されたい。これら３ つの文献はすべて参照文献としてここに援用される。要約すると、その方法には、原核宿主におけるｃＤＮＡライブラリーの発現が含まれる（ライブラリーは腫瘍試料から得られる）。次いで、発現されたライブラリーは、高力価の体液性応答を誘発する抗原を検出するために、吸収および希釈血清で免疫スクリーニングされる。この方法論はＳＥＲＥＸ 法（「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）」）として知られている。この方法論は、新しい腫瘍関連抗原を検出するためだけでなく、先に同定された腫瘍関連抗原の発現を確認するためにも使用されている。上に引用した特許出願およびザーインら（前掲）ならびにクルー（Ｃｒｅｗ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ １４４：２３３３−２３４０（１９９５）を参照されたい。
【００１０】
ＳＥＲＥＸ 法は食道癌試料に適用されており、参照文献としてここに援用する米国特許出願第０８／７２５，１８２号（出願日１９９６年１０月３ 日）によれば、現在では食道癌関連抗原が同定され、そのコード核酸分子が単離、クローニングされている。
【００１１】
腫瘍関連遺伝子の一部と、ＳＳＸ 遺伝子として知られる３ つの遺伝子との関係が、現在研究されている。ザーインら（前掲）；ツレキー（Ｔｕｒｅｃｉ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：４７６６−４７７２ （１９９６）を参照されたい。ＳＳＸ２と呼ばれるそれらＳＳＸ 遺伝子の一つは、先ず最初は、滑膜肉腫の７０％に見られる染色体転座（ｔ（Ｘ；１８）（ｐ１１．２；ｑ１１．２））に関与する２ つの遺伝子の一つとして同定された。クラーク（Ｃｌａｒｋ ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：５０２−５０８ （１９９４）；クルー（Ｃｒｅｗ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ １４：２３３３−２３４０ （１９９５）を参照されたい。ＳＳＸ２は後にかなりの数の腫瘍細胞で発現していることが見出され、現在では、ツレキーら（前掲）がＨＯＭ−ＭＥＬ−４０と呼ぶ腫瘍関連抗原であるとみなされている。現在のところ、その発現は、癌細胞と正常精巣細胞にのみ観察されている。したがってこれは、「ＣＴ」腫瘍抗原ファミリーの他のメンバーと類似している。というのは、それら他のメンバーは癌と精巣細胞でしか発現されないからである。クルーらは、ＳＳＸ２と８９％のヌクレオチド配列相同性を有するＳＳＸ１遺伝子も単離し、クローニングした。ＳＳＸ１とＳＳＸ２に関する配列情報を、それぞれ配列番号１ および２ に示す。クルーら（前掲）を参照されたい。デレオイ（ＤｅＬｅｅｕｗ ）ら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｅｔ ７３：１７９−１８３（１９９６）に記載されているように、ＳＳＸ 遺伝子の同定を目指したさらなる研究により、ＳＳＸ３が同定された。ＳＳＸ の提示が他のＣＴ抗原と類似しているという事実から、本発明者らは、他のＳＳＸ 遺伝子が単離されるかもしれないと考えた。前掲の親出願には、参照文献としてここに援用するグレ（Ｇｕｒｅ）ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７２：９６５−９７１ （１９９７）と同様に、この研究が開示されている。
【００１２】
ＳＳＸ ファミリーに関するその他の文献については、その大半がＳＳＸ１に関するものである。ＳＳＸ１またはＳＳＸ２の決定による滑膜肉腫の決定に関する研究が詳述されているクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）らのＰＣＴ 出願Ｗ／９６ ０２６４１ Ａ２ を参照されたい。また、やはり滑膜肉腫およびＳＹＴ−ＳＳＸ１またはＳＳＸ２転座についての記載があるデレオイら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ４（６）：１０９７−１０９９（１９９５）にも留意されたい。またカワイ（Ｋａｗａｉ ）ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８ （３）：１５３−１６０ （１９９８）；ノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ ）ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７２（６）：９９５−１００２（１９９７） 、ヒブシューシ（Ｈｉｂｓｈｏｏｓｈ ）ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２４（５）：５１５−５２５ （１９９７）、シップレー（Ｓｈｉｐｌｅｙ ）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ ．１４８（２）：５５９−５６７（１９９６）；フリグマン（Ｆｌｉｇｍａｎ ）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ ．１４７（６）：１５９２−１５９９（１９９５）も参照されたい。またチャンド（Ｃｈａｎｄ ）ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０（３）：５４５−５５２（１９９５）、ブレット（Ｂｒｅｔｔ ）ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ６（９）：１５５９−１５６４（１９９７）、デブルイン（ｄｅＢｒｕｙｎ ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ （１３／３）：６４３−６４８ も参照されたい。ＳＳＸ３遺伝子はデレオイら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ７３（３）：１７９−１９８３ （１９６６）に記載されている。
【００１３】
上記のＳＥＲＥＸ 法の変法を他の技術と一緒に応用することにより、さらに２ つのＳＳＸ 遺伝子（以下、ＳＳＸ４およびＳＳＸ５という）ならびにＳＳＸ４遺伝子の選択的スプライス変異体をクローン化した。具体的に述べると、ＳＥＲＥＸ 法では自己血清を使用するのに対し、下記の方法では同種異系血清を使用する。
【００１４】
モチーフ分析は、長いタンパク質のうちのどの領域が実際にＭＨＣ またはＨＬＡ 分子の結合物質として特に重要であるかを突き止めることを可能にする手段である。基本的には、８ 〜１２アミノ酸の配列中に一般に少なくとも２ つ、時にはそれ以上の確定したアミノ酸を含むアミノ酸モチーフが扱われる。次に、このモチーフを使って、さらに長い配列をスクリーニングすることにより、その長い配列内のどの配列が、ＨＬＡ またはＭＨＣ 分子に結合するであろうペプチドを構成し、そのペプチドとＭＨＣ／ＨＬＡ 分子との複合体に対して特異性を有する細胞溶解性Ｔ リンパ球の増殖を刺激しそうであるかを決定する。ＭＨＣ／ＨＬＡ 分子が異なるとモチーフも異なる。この領域では多くの研究がなされているが、それらはまだ進行中である。以下の開示からわかるように、本発明者らは、モチーフ分析を使用して、ＨＬＡ 分子、特にＨＬＡ−Ａ２分子に結合するペプチドを同定した。
【００１５】
（好ましい態様の詳細な説明）
実施例１
ヒト精巣ｃＤＮＡ発現ライブラリーを入手し、ＭＺ２ という黒色腫患者から得られた血清でスクリーニングした。例えば参照文献としてここに援用する親出願、米国特許出願第０８，４７９，３２８号を参照されたい。また、やはり参照文献としてここに援用する米国特許出願第０８／７２５，１８２号；ザーインら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１８１０−１１８１３ （１９９５）も参照されたい。上記の血清は、これらの文献に記載の方法を用いて処理したものである。簡単に述べると、血清を１ ：１０に希釈した後、トランスフェクト大腸菌溶解物を使って前吸収を行なった。この前吸収段階の後、最終希釈率が１ ：１００ になるように、その吸収血清を１ ：１０に希釈した。その最終希釈の後、それらの試料を、上記の方法を用いて調製したファージプラークを含むニトロセルロース膜と共に、室温で一晩インキュベートした。そのニトロセルロース膜を洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦｃγ 二次抗体と共にインキュベートし、基質５−ブロモ−４− クロロ−３− インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムとの反応を観察した。二次スクリーニングでは、ヒト免疫グロブリンをコードするファージミドをすべて排除した。
【００１６】
合計３．６ ×１０５ｐｆｕをスクリーニングして、８ つの陽性クローンを得た。標準的な配列決定反応を行なって、それらの配列を既知配列の配列バンクと比較した。
【００１７】
前記８ クローンのうち、２ つは既知の自己免疫疾患関連分子、すなわちゴルジン（Ｇｏｌｇｉｎ）−９５ （Ｆｒｉｔｚｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１７８：４９−６２ （１９９３））およびヒト上流結合因子（Ｃｈａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１７４：１２３９−１２４４ （１９９１））をコードすることがわかった。他の３ つのクローンは、ヒト組織に広く発現するタンパク質、すなわちリボソームレセプター、ＶＩ型コラーゲン球状ドメインおよびラパマイシン結合タンパク質をコードすることがわかった。残り３ つの配列のうち、１ つはどの既知配列とも非相同であることがわかったが、ヒト組織では広範に発現していた（これはＲＴ−ＰＣＲ分析でわかったことであるが、その詳細はここには記載しない）。残りの２ つは、０８／４７９，３１８に記載の全長ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０と同一であることがわかると共に、８ 番目のクローンはデレオイら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ７３：１７９−１８３ （１９９６）に記載の「ＳＳＸ３」とほとんど同一であって、コード領域中の２ 塩基対が異なっているに過ぎないことがわかった。これらの相違はおそらく人為産物であると思われるが、そのクローンは４３塩基対の３’非翻訳領域も含んでいた。
【００１８】
実施例２
以下に述べるサザンブロッティング実験を行なうために、ＳＳＸ 遺伝子をＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。
【００１９】
これを行なうために、公表されたＳＳＸ２配列を使って２ つのプライマー、すなわち、
ＭＥＬ−４０Ａ ：
５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴ ＣＣＡＴＧＡＡＣＧＧ ＡＧＡ
（配列番号３）
と、
ＭＥＬ−４０Ｂ ：
５’−ＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣ ＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡ ＧＴＴＡＣＴＣＧＴＣ ＡＴＣ
（配列番号４）
を作成した。クルーら，ＥＭＢＯ Ｊ １４：２３３３−２３４０ （１９９５）を参照されたい。次に、０．２５Ｕ のＴａｑ ポリメラーゼを使用し、２５μｌ の液量で、６０℃のアニーリング温度を使って増幅を行なった。合計３５サイクル行なった。
【００２０】
実施例３
前記ＲＴ−ＰＣＲ法を精巣全ＲＮＡ に対して行ない、その増幅産物をサザンブロッティング実験に使用した。
【００２１】
ゲノムＤＮＡ を非腫瘍性組織試料から抽出して、制限酵素消化（ＢａｍＨＩ 、ＥｃｏＲＩ またはＨｉｎｄＩＩＩ を個別の実験で使用）にかけ、それを０．７ ％アガロースゲルで分離した後、ニトロセルロースフィルターにブロットした。前記増幅産物を周知の方法により３２Ｐ で標識し、標識された物質を高ストリンジェンシー条件（６５℃、水性緩衝液）でプローブとして使用し、次いで０．２ ×ＳＳＣ 、０．２ ％ＳＤＳ 、６５℃での最終洗浄で終わる高ストリンジェンシー洗浄を行なった。
【００２２】
このサザンブロッティングではいずれの場合も（すなわち、ＢａｍＨＩ 、ＥｃｏＲＩ 、ＨｉｎｄＩＩＩ 消化物のいずれにも）１０本を超えるバンドが明らかになったことから、先に同定された３ つのＳＳＸ 遺伝子より多くの遺伝子を含むＳＳＸ 遺伝子のファミリーがあることが強く示唆された。この観察結果に鑑み、他のＳＳＸ 遺伝子を同定するために、ＰＣＲ クローニングと制限地図分析の両方を組み合わせた方法を立案した。
【００２３】
実施例４
ＳＳＸ１、ＳＳＸ２およびＳＳＸ３の配列を比較したところ、それらは高度に保存された５’および３’領域を共有していて、それが、配列番号３ および４ のオリゴヌクレオチドが前記条件で３ つの配列すべてを増幅できる理由の説明になっていることが見出された。また、この相同性は、ＳＳＸ 遺伝子のファミリーによって、そのサイズのいかんを問わずに共有されていることが示唆された。したがって、ＳＳＸ 遺伝子ファミリーの他のメンバーを増幅するには、配列番号３ および４ のヌクレオチドで十分だろう。
【００２４】
ＳＳＸ１、ＳＳＸ２およびＳＳＸ３の配列を分析したところ、ＳＳＸ１とＳＳＸ２はＢｇｌＩＩ 部位を含み、ＳＳＸ３はこれを持たないことが明らかになった。同様に、ＳＳＸ３は、他の遺伝子にはないＥｃｏＲＶ 部位を含んでいた。
【００２５】
この情報に鑑み、上述のように配列番号３ および４ を用いて精巣ｃＤＮＡを増幅し、それをＢｇｌＩＩ 消化にかけた。次にＢｇｌＩＩ 耐性配列をすべてクローニングし、配列決定し、既知の配列と比較した。
【００２６】
これにより、過去に同定されていない２ つの配列が同定された（以下、それらをＳＳＸ４およびＳＳＸ５といい、配列番号５ および６ に示す）。ＧｅｎＢａｎｋ データベースの検索では、アクセッション番号Ｎ２４４４５およびＷ００５０７によって特定される２ つのクローン（両者とも配列タグ由来のｃＤＮＡセグメントからなる）が見出された。Ｎ２４４４５によって特定されるクローンはＳＳＸ４の３’非翻訳領域とそのコード配列の一部とを含み、一方、Ｗ００５０７と特定されるクローンはより短いＳＳＸ４の３’非翻訳領域の断片と、より長いコード領域の一部とを含んでいた。具体的に述べると、Ｎ２４４４５はＳＳＸ４（配列番号５ ）の塩基３４４ からその３’末端までと、停止コドンの３’側にある３１９ 塩基とからなる。Ｗ００５０７配列は、ＳＳＸ 遺伝子に対して相同性を示さない９９塩基対の配列と、それに続く配列番号５ のヌクレオチド２８０ から末端まで、および配列番号１ の停止コドンの３’側にある６７塩基までと同一の領域からなる。
【００２７】
２ つの型のＳＳＸ４（配列番号５ ）が同定された。これらのうちの一方は、ヌクレオチド３３１ 〜４４６ を欠くが、それ以外は配列番号５ に示すＳＳＸ４と同一だった。以下に述べるように、この短縮型は選択的にスプライシングされた変異体である。
【００２８】
下記の表１ に、ＳＳＸ ファミリーの５ つの既知メンバーのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を比較する。この表は、ヌクレオチド相同性については水平に、アミノ酸相同性については垂直に読む。
【００２９】
【表１】
0003572316.tif 000002
したがってＳＳＸ１とＳＳＸ４は、ヌクレオチドレベルで８９．４％ 、アミノ酸レベルで７９．３％ の相同性を持つ。
【００３０】
切断型のＳＳＸ４を分析すると、それは、選択的スプライシングおよび下流オープンリーディングフレームのシフトにより、他者とは全く異なるアミノ酸配列を持つ。推定タンパク質は１５３ アミノ酸長であり、そのカルボキシ末端アミノ酸４２個は、他のＳＳＸ タンパク質に対して相同性を示さない。
【００３１】
実施例５
次にＳＳＸ２遺伝子のゲノム編成を調べた。これを行なうために、サザンブロット法に関して上述したものと同じプロトコールおよび同じプローブを使用して、ヒト胎盤ゲノムライブラリー（λファージ）をスクリーニングした。すべての一次陽性クローンをさらに２ ラウンドのクローニングによって精製した。
【００３２】
複数の陽性クローンを単離し、そのうちの一つを部分配列決定して、ＳＳＸ２のゲノムクローンであると同定した。次に、エキソン− イントロン境界を確定するために、標準的なサブクローニングおよび配列決定を行なう一連の実験を実施した。
【００３３】
分析により、ＳＳＸ２遺伝子は６ つのエキソンを含み、少なくとも８ キロ塩基に及ぶことが明らかになった。確定された境界はすべて、エキソン／ イントロン接合部のコンセンサス配列（すなわちＧＴ／ＡＧ ）に従うことがわかった。
【００３４】
上述したＳＳＸ４の選択的スプライス変異体は、そのコード領域中に第５ エキソンを欠くことがわかった。このことは、ＳＳＸ４の選択的スプライス変異体をＳＳＸ２ゲノムクローンと比較して、そこから相互関係を引き出すことによって確認された。
【００３５】
実施例６
次に、正常組織および腫瘍組織における個々のＳＳＸ 遺伝子の発現を調べた。これには、既知配列に基づく特異的プライマーを構築する必要があった。それらのプライマーを、配列番号７ 〜１６として、以下に示す。
【００３６】
【表２】
0003572316.tif 000003
各クローンの特異性は、先に同定されたＳＳＸ１〜ＳＳＸ５のｃＤＮＡを増幅することによって確認した。ＳＳＸ１およびＳＳＸ４については６０℃で、またＳＳＸ２、ＳＳＸ３およびＳＳＸ５については６５℃で、Ｔａｑ ポリメラーゼを使用した。ＳＳＸ２プライマーが極わずかな量（ＳＳＸ２の１／２０未満）のＳＳＸ３プラスミドＤＮＡ を増幅することがわかった点を除いて、プライマー対の各セットは特異的であることがわかった。
【００３７】
特異性を確認してから、それらのプライマーを使って、上述のＲＴ−ＰＣＲプロトコールにより、精巣ｍＲＮＡを分析した。
【００３８】
予想されるＰＣＲ 産物が５ 例全てに見出された。ＳＳＸ４対による増幅は２ つの増幅産物をもたらしたが、これは選択的スプライス変異体と一致する。
【００３９】
次に、培養メラノサイトにおけるＳＳＸ 遺伝子の発現を調べた。上述のプロトコールを使って、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ 産物は認められなかった。再増幅によって両方の選択型を含む少量のＳＳＸ４産物が生じたことから、培養メラノサイトにおけるＳＳＸ４発現は一貫せず、それが起こる場合にも極めて低レベルで起こることが示された。
【００４０】
次に、この分析を１２種類の黒色腫細胞株のパネルに拡大した。それらの結果を次の表に示す。
【００４１】
【表３】
0003572316.tif 000004
実施例７
様々な腫瘍におけるＳＳＸ ファミリーのメンバーの発現を分析するために、さらなる実験を行なった。これを行なうために、参照文献としてここに援用するチョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ） ら，Ａｎｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２：１５６−１５９ （１９８７）に記載されるように、グアニジウムイソチオシアネートを使って変性した後、酸フェノール抽出およびイソプロパノール沈殿を行なうことにより、凍結組織標本から全細胞ＲＮＡ を抽出した。標準的な方法に従って、全ＲＮＡ の試料（４ μｇ ）をオリゴＤＴ（１８）プライマーでプライミングし、逆転写した。このようにして得たｃＤＮＡの完全性は、ツレキーら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６：４７６６−４７７２（１９９６）に記載されているように、２５サイクルの標準的ＰＣＲ でＢ−アクチン転写物を増幅することによって検証した。
【００４２】
ＰＣＲ 分析を行なうために、配列番号５ 〜１４として上に列挙したプライマーならびに配列番号１７および１８、すなわち、
ＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣ ＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣ ＡＧＣＣＡＣＣ
ＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡ ＡＧＡＴＧＣＡＴＡＣ ＣＡＧＧＧＡＣ
を使用した。
【００４３】
これら２ つの配列は、クラークら（前掲）とクルーら（前掲）が滑膜肉腫について報告しているＳＹＴ／ＳＳＸ 融合転写物を検出するために、それぞれ配列番号６ および８ の両者と共に使用した。増幅は、３０μｌ の反応液中、１０ｐＭｏｌの各ｄＮＴＰおよび１．６７ｍＮ ＭｇＣｌ２を使って１ μｌ の第１ 鎖ｃＤＮＡを増幅することによって行なった。酵素を活性化するために９４℃に１２分間保った後、３５サイクルのＰＣＲ を行なった。各サイクルは、１ 分間のアニーリング（配列番号７ および８ の場合は５６℃、配列番号９ および１０の場合は６７℃、配列番号１１および１２の場合は６５℃、配列番号１３および１４の場合は６０℃、配列番号１５および１６の場合は６６℃、配列番号１７および８ ならびに１８および１０の場合は６０℃）、次に７２℃で２ 分間および９４℃で１ 分間からなり、最終伸長段階は７２℃で８ 分間とした。各反応液のうち１５μｌ を２ ％アガロースゲルでサイズ分画し、臭化エチジウム染色で可視化し、予想サイズについて評価した。予想サイズは配列番号７ および８ の場合は４２１ 塩基対、配列番号９ および１０の場合は４３５ 塩基対、配列番号１１および１２の場合は３８１ 塩基対、配列番号１３および１４の場合は４１３ 塩基対、配列番号１５および１６の場合は３２４ 塩基対である。プライマーがＳＳＸ ファミリーの他のメンバーに交差アニーリングしないように、ストリンジェントな条件を選択した。ＲＴ−ＰＣＲ産物がｃＤＮＡに由来するものであって混入したＤＮＡ ではないことを保証するために、追加の処置も行なった。各実験を３ 連で行なった。合計３２５ 個の腫瘍検体を分析した。その結果を下記の表４ 、表５ および表６ に示す。
【００４４】
ＳＳＸ 陽性腫瘍の大半はＳＳＸ ファミリーの１ メンバーのみを発現したが、いくつかの腫瘍タイプは２ またはそれ以上の遺伝子の共発現を示したことに注目すべきである。
【００４５】
滑膜肉腫におけるＳＳＸ 遺伝子の発現を分析した。なぜなら、文献によれば、分析された滑膜肉腫症例は全て、本明細書に記載のプライマーセット（すなわち配列番号１７／ 配列番号８ 、配列番号１７／ 配列番号１０、配列番号１７／ 配列番号８ 、配列番号１８／ 配列番号１０）が隣接する切断点に、ＳＹＴ／ＳＳＸ１またはＳＹＴ／ＳＳＸ２転座を保有することが明らかになったと報告されているからである。前記ＰＣＲ 実験により、ＳＹＴ／ＳＳＸ１転座は試験した滑膜肉腫試料のうち３ 例に見出され、一方、ＳＹＴ／ＳＳＸ２は１ 例に見出されることが明らかになった。ＳＹＴ／ＳＳＸ２が見出された１ 例は、ＳＹＴ／ＳＳＸ１が見出された１ 例でもあった。ＳＳＸ の発現は転座とは無関係であると思われた。
【００４６】
【表４】
0003572316.tif 000005
【表５】
0003572316.tif 000006
【表６】
0003572316.tif 000007
実施例８
本実施例では、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合してＣＴＬ 増殖を刺激する他のペプチドを同定するために立案したさらなる実験を詳述する。
【００４７】
まず、末梢血単核細胞（以下「ＰＢＭＣ」）を、健康なＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１＋ 献血者の血液から、標準的なフィコール− ハイパック法で単離した。次に、それらのＰＢＭＣをプラスチック面上、３７℃で、１ 〜２ 時間培養することにより、付着単球を非付着末梢血リンパ球（「ＰＢＬ 」）から分離する処理を行なった。非付着ＰＢＬ は後の実験で必要になるまで冷凍保存しておいた。１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを添加したＡＩＭＶ培地で付着細胞を培養することにより、それら付着細胞を刺激して樹状細胞に分化させた。その細胞を５ 日間培養した。
【００４８】
培養を始めてから７ 日後に、樹状細胞の試料（８ ×１０５ 細胞）に、外因的に添加されるペプチド５０μｇ／ｍｌを負荷した。（ペプチドの詳細については後述する）。負荷は１０００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１０，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βを含む培地中３７℃で２ 時間続けた。次に、そのペプチド添加樹状細胞を過剰の無ペプチド培地で２ 回洗浄した。前記ようにして得た自己ＰＢＬ を融解し、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地中で、４ ×１０７ 細胞のＰＢＬ を８ ×１０５ 細胞のペプチドパルス樹状細胞（比５０：１ ）と混合した。次に、その培養物を３７℃で培養した。
【００４９】
１４、２１および２８日の時点でリンパ球培養物を、７ 日後に行なった実験と同じ方法で、再刺激した。１４、２１および２８日の時点で、参照文献としてここに援用するブロムバーグ（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１４ ：１９１−１９５ （１９８８）に記載されるようにユーロピウム放出測定法を用いて、またはＩＦＮ−γ放出を測定する市販のＥＬＩＳＰＯＴ 測定法を用いて、細胞毒性測定を行なった。
【００５０】
試験したペプチドはすべて、参照文献としてここに援用するチェン（Ｃｈｅｎ）ら  の米国特許第５，８０４，３８１ 号に記載されるＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸配列またはＳＳＸ−４ のアミノ酸配列に由来した。試験したペプチドは、
ＲＬＬＥＦＹＬＡＭ   （配列番号  ）および
ＳＬＡＱＤＡＰＰＬ   （配列番号  ）
（どちらもＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する）と、
ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ   （配列番号  ）
（ＳＳＸ４に由来する）であった。前記２ つのＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドはＥＬＩＳＰＯＴ 測定法で試験した。その結果を以下に示す。要約すると、３ 回の実験を行なった。その結果を（ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞にペプチドをパルスした時に生じるスポット（陽性）の数）−（非パルス細胞を使って得られるスポットの数）として表す。前記のように、測定は１４、２１および２８日の時点で行なった。
【００５１】
以下の結果はペプチドＲＬＬＥＦＹＬＡＭ に関する結果である。
【００５２】
0003572316.tif 000008
実施例９
追跡実験として、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１コードｃＤＮＡをトランスフェクトして上述のように内因性ペプチドをパルスしたＣＯＳ 細胞、またはＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１コード配列とＮＹ−ＥＳＯ−１コード配列の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ 細胞で、上記のＴ 細胞培養物を試験した。ここでも、両タイプのＣＯＳ トランスフェクタントに、ＥＬＩＳＰＯＴ 測定法を使用した。６ 種類のＴ 細胞培養物を、各培養につき二実験ずつ試験した。
【００５３】
0003572316.tif 000009
内因性ＮＹ−ＥＳＯ−１が溶解を引き起こしたという事実から、ＮＹ−ＥＳＯ−１はＨＬＡ−Ａ２陽性細胞によってこのペプチドにプロセシングされることが示唆される。
【００５４】
同様の実験を第二のＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチド、すなわちＳＬＡＱＤＡＰＰＬ を使って行なった。その結果を以下に示す。
【００５５】
0003572316.tif 000010
実施例１０
さらなる実験では、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１コード配列をトランスフェクトしてからペプチドをパルスしたＣＯＳ 細胞と、先の実験で生成したＣＴＬ とを組み合わせることにより、それらＣＴＬ の特異性を調べた。まず、ペプチドＲＬＬＥＦＹＬＡＭ を３ 回の実験で調べ、次にＳＬＡＱＤＡＰＰＬ を６ 回の実験で調べた。上述のようにユーロピウム放出を測定し、溶解された標的細胞の百分率を決定した。その結果を以下に示す。
【００５６】
0003572316.tif 000011
追加の実験では、ＲＬＬＥＦＹＬＡＭ／ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なＣＴＬ が、ＨＬＡ−Ａ２とＮＹ−ＥＳＯ−１の両方を発現することが知られている黒色腫細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−３７ も認識し、溶解した。この認識は、標的細胞をＨＬＡ−Ａ２結合性モノクローナル抗体ＢＢ７．２ と共にプレインキュベートすることによって阻害された。これにより、前記ＣＴＬ は、前記ペプチドとＨＬＡ−Ａ２の複合体に関してＨＬＡ−Ａ２特異的であることが確認された。
【００５７】
実施例１１
ＳＳＸ−４ 由来のもう一つのペプチド、すなわちＳＴＬＥＫＩＮＫＴ （配列番号  ）も、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドを試験した方法と同じ方法で試験した。まず、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１を発現し、かつ、全長ＳＳＸ−４ タンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトされているためにＳＳＸ−４ を発現するか、または前記ペプチドをパルスされたＣＯＳ 細胞を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴ 測定を行なった。３ つの培養物を２ 回の実験で試験した。その結果を以下に示す。
【００５８】
0003572316.tif 000012
さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの場合と同様に、上記と同じ測定法を用いて、すなわち複合体に対して生成したＣＴＬ を、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１をトランスフェクトしペプチドをパルスしたＣＯＳ 細胞と組み合わせて、ＣＴＬ の特異性を確認した。上記のユーロピウム放出測定法を使用した。その結果を以下に示す。
【００５９】
0003572316.tif 000013
ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドの場合と同様に、ＣＴＬ 認識はモノクローナルＢＢ７．２ とのプレインキュベーションによって阻害されたことから、ＨＬＡ−Ａ２とペプチドとの複合体に対するＣＴＬ の特異性が確認された。
【００６０】
実施例１２
さらなる実験を、ＳＳＸ２に由来するペプチド（すなわちＫＡＳＥＫＩＦＹＶ ）およびＮＹ−ＥＳＯ−１に由来するペプチド（すなわちＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ 、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ およびＱＬＳＬＬＭＷＩＴ ）で行なった。いずれの場合も、実施例８ 〜１１で行なったものと同じタイプの測定法を行なった。その結果は、各ペプチドについて各ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ 複合体に特異的なＣＴＬ が生成した点で、類似していた。
【００６１】
実施例１３
ＳＳＸ 遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＬＡ 結合モチーフに一致するペプチド配列について分析した。これは、参照文献としてここに援用するパーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１４２：１６３ （１９９４）によって教示されるアルゴリズム（２ 位がＴｈｒ またはＡｌａ であり９ 位がＴｈｒ またはＡｌａ であるノナマーを追加モチーフとして使用することにより強化したもの）を使用することによって行なった。以下に示す情報には、アミノ酸配列、それがおそらく結合するであろうＨＬＡ 分子、および当該ＳＳＸ 分子における位置を記載する。生成する複合体は細胞溶解性Ｔ 細胞応答を誘発するはずである。当業者はこれを、例えば参照文献としてここに援用するファンデアブルッゲンら，Ｊ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．２４：３０３８−３０４３（１９９４）によって教示される方法ならびに前記実施例８ 〜１１に記載のプロトコールに従って決定することができるだろう。
【００６２】
0003572316.tif 000014
0003572316.tif 000015
0003572316.tif 000016
0003572316.tif 000017
前記の実施例には、ＳＳＸ４、ＳＳＸ４のスプライス変異体、およびＳＳＸ５遺伝子に関する核酸分子の単離およびクローニング、ならびに癌の指標候補として種々のＳＳＸ 遺伝子の発現を決定する方法を記載した。前記のようにこれらの遺伝子は腫瘍細胞中で発現されるので、当業者は例えば癌の検査にこれらを利用することができる。発現の決定は、例えば、核酸配列ハイブリッド形成による（例えばポリメラーゼ連鎖反応などによる）１ または複数のＳＳＸ 遺伝子の転写物の決定によって行なうことができる。好ましい一態様では、ＳＳＸ 遺伝子の転写物の存在が、試料を当該転写物に特異的にハイブリダイズする核酸分子と接触させることによって決定される。
【００６３】
標的への核酸分子のハイブッド形成は、ＳＳＸ 遺伝子の発現を示し、癌の可能性を示す。好ましくは、これを、ポリメラーゼ連鎖反応の場合のように、２ つのプライマー分子を用いて行なう。これらの測定法によるこの関連での２ 種類以上のＳＳＸ 遺伝子の発現の決定も、本発明の一部を構成する。当業者の便宜を考慮して、ＳＳＸ１およびＳＳＸ２の既知のヌクレオチド配列を、本明細書の配列番号１および２に記載する。
【００６４】
代替測定法も本発明の一部を構成する。ＣＴファミリーのメンバーは、１つのＣＴファミリーメンバーを発現する個体の体内で抗体を誘発することが知られている。したがって、本明細書に記載の測定は、例えば当該被験者から採取した試料中の抗体を決定することによって行なうことができる。分析される試料は血清であることが最も好ましい。そのような決定は、任意の標準的な抗体測定法で、例えば試料を、ある量の１ または複数のタンパク質、および抗体が結合するかどうかを決定するために必要な他の試薬類と接触させることなどによって行なうことができる。一方法として、固定化タンパク質を使用する。この場合は、そのタンパク質を当技術分野で知られる任意の標準的方法で固定化し、次に試料と接触させ、次いで例えば抗ＩｇＧ 抗体や抗Ｆｃ抗体などと接触させる。逆に、前記測定法のタンパク質の代わりに抗体を使用して、ＳＳＸ タンパク質の存否も決定できる。
【００６５】
ＳＳＸ 発現と癌との相関関係から、異常のＳＳＸ 発現に関係する状態の治療に有用な種々の治療法および組成物も示唆される。この文脈で「異常なＳＳＸ 発現」とは、正常な個体のものとは異なる発現そのものまたは発現レベルを意味し、すなわちそれらは、より低くても、より高くてもよい。
【００６６】
本発明では、アンチセンス分子の使用による発現の抑制または遮断などの治療法が考えられる。このアンチセンス分子は、核酸分子にハイブリダイズし、その発現を抑制するオリゴヌクレオチドである。それらは好ましくは１７〜５０ヌクレオチドの長さである。それらのアンチセンスヌクレオチドは、好ましくは、適当な担体（例えば陽イオン性リポソームなど）と組み合わせて投与される。
【００６７】
他の治療法には、ＳＳＸ タンパク質そのもの、ＳＳＸ タンパク質に由来する１ または複数の抗原性ペプチドおよびいわゆるポリトープ型ワクチン（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ）の投与が包含される。それらは、好ましくはリンカー配列によって互いに解き放たれた複数の抗原性ペプチドを含む。その結果得られるペプチドは、ＭＨＣ クラスＩ またはクラスＩＩ分子に結合できる。これらのタンパク質、ペプチドまたはポリトープ型ワクチンは、適当なアジュバントと組み合わせて投与できる。それらは、当該タンパク質、ペプチド、ポリトープ型構造物などの発現を可能にするように設計された遺伝子コンストラクトの形で投与することもできる。ペプチドおよびポリトープ型構造物は、いわゆる「ミニ遺伝子」（すなわち、ＳＳＸ 分子全体の一部または上述のように互いに連結されたＳＳＸ 分子の様々な部分を発現するように設計されたＤＮＡ 分子）によって発現させることができる。ここに記載する治療用組成物および方法は、１ 種類または複数種類のＳＳＸ タンパク質が組成物の原料として使用されるように処方することができる。言い換えると、全タンパク質法を用いる場合は、１ 種類のＳＳＸ 分子を使用してもよいし、２ 種類またはそれ以上のＳＳＸ 分子を１ つの製剤で併用してもよい。ペプチドの場合は、それらをすべて１ 種類のＳＳＸ 分子から選択してもよいし、それらは２ 種類以上のＳＳＸ 分子から選択されたペプチドの組み合せであってもよい。ここに記載するポリトープ型構造物も、１ 種類のＳＳＸ 分子または２ 種類以上のＳＳＸ 分子の成分から構成させることができる。
【００６８】
薬剤の投与量とその投与方法は処置される状態とその個体によって異なるだろう。静脈内、皮内、皮下、経口、直腸および経皮投与などの標準的な投与形式を使用できる。製剤については、当該タンパク質またはペプチドを、例えばサポニン、ＧＭ−ＣＳＦ、１ または複数のインターロイキン、ビタミンＥ などの乳化性油、１ または複数の熱ショックタンパク質などのアジュバントおよび／ または担体と組み合わせることができる。
【００６９】
核酸法を使用する場合は、ワクシニアまたはアデノウイルス系ベクターなどの様々なベクターを使用できる。ヒト細胞のトランスフェクションなどの真核トランスフェクションに有効な任意のベクターを使用できる。これらのベクターは、例えば当該ペプチド／ＭＨＣ複合体をその表面に提示する樹状細胞などの細胞を作出するために使用できる。次に、その細胞を、その投与に先立って、標準的な方法で非増殖性にすることができる。
【００７０】
ＳＳＸ 分子またはＮＹ−ＥＳＯ−１分子の一部に相当するアミノ酸配列からなるペプチド（例えば前記のペプチド配列など）も、本発明の一部を構成する。前記のように、それらのペプチドはＨＬＡ−Ａ２分子などのＭＨＣ 分子に結合し、形成される複合体に対する細胞溶解性Ｔ 細胞の増殖を誘発する。全長分子（ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＳＳＸ 分子）を発現する細胞は、適切なペプチドによる細胞のパルス処理後に生成するＣＴＬ によって実際に認識されることが明らかになった。この結果は前記ペプチドとＣＴＬ の両方が有用な治療薬になるはずであることを示している。したがって本発明のもう一つの側面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１または前記のＳＳＸ 分子に由来する１ または複数のペプチドを単独で、もしくは組み合わせて（例えば抗原「カクテル」などとして）投与することである。そのようなカクテルは、特定の患者のＨＬＡ タイプの型別に従って処方されたペプチドの混合物を含みうる。同様に、全長分子の内因的発現に続いてペプチドが提示されるという認識に照らして、インビトロで発生させたＣＴＬ を患者に投与することもできる。
【００７１】
ＭＨＣ 分子、例えばＨＬＡ−Ａ２などに言及する場合、それはその分子の全ての対立遺伝子型を包含することに注意されたい。ＨＬＡ−Ａ２分子には様々なタイプが知られていて、それらは数個のアミノ酸が異なっているが、相違の程度はその分子の全長にわたって一般に１０アミノ酸未満であり、その相違はその型の分子のペプチド結合能に影響しないと予想される。したがって、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１分子に結合するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０２、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０４、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０５、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０６、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０７、ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０９などにも結合すると考えることができる。
【００７２】
本発明の他の側面は当業者には明白であり、本明細書に繰返して述べる必要はないだろう。
【００７３】
上で使用した用語および表現は説明のために使用したのであって限定を意図するものではなく、そのような用語および表現の使用に、上述した特徴またはその一部に等価な事項を排除しようとする意図はなく、様々な変更態様が本発明の範囲内で可能であると考えられる。