(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体における病気または罹病性の特徴を検出する方法であって、該病気または該罹病性の特徴が対象遺伝子における生殖細胞系突然変異に関連し、
（ａ） 前記生体から単離した正常な生体サンプル中の前記対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量、および前記サンプル中の第二の遺伝子により発現される関連タンパク質の量を免疫学的に定量し、
（ｂ）  前記サンプル中の前記第二の遺伝子により発現される関連タンパク質の量に対する前記サンプル中の前記対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量の割合を計算し、
（ｃ） 前記計算された割合が、前記サンプル中における前記対象遺伝子により発現される前記野生型タンパク質が異常に低いレベルで存在することを示すか否かを決定し、
（ｄ） 前記工程（ｂ） で計算された割合により前記サンプル中で前記野生型タンパク質が異常に低いレベルで存在することが示される場合、前記対象遺伝子がその対立遺伝子の一つにおいて生殖細胞系突然変異を含有し、対象生体が前記生殖細胞系突然変異に関連する病気または罹病性の特徴に冒されているという結論を出す、
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ） が、前記工程（ｂ） で計算された割合を、前記病気によりまたは前記罹病性の特徴により冒されていない、対象生体と同じ分類学的分類の生体からの比較可能な生体サンプル中の、前記関連タンパク質の量に対する前記対象遺伝子から発現された前記野生型タンパク質の量の割合の平均と比較する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体における病気または罹病性の特徴を検出する方法であって、該病気または該罹病性の特徴が、二つ以上の対象遺伝子の一つにおける生殖細胞系突然変異と関連し、
（ａ）それぞれの対象遺伝子により発現される、前記生体から単離された正常な生体サンプル中の野生型タンパク質の量を免疫学的に定量し、
（ｂ）前記サンプル中で他の対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量、または前記サンプル中でそれぞれの他の対象遺伝子により発現される野生型タンパク質のそれぞれの量に対する、前記サンプル中で前記対象遺伝子の一つにより発現される野生型タンパク質の量の割合を計算し、
（ｃ）前記工程（ｂ）で計算された割合が、前記サンプル中で対象遺伝子のいずれかまたは任意の対象遺伝子により発現される野生型タンパク質が異常に低いレベルで存在することを示すか否かを決定し、
（ｄ）前記工程（ｂ）で計算された割合により対象遺伝子の一つにより発現される前記野生型タンパク質が前記サンプル中で異常に低いレベルで存在することが示される場合、前記対象遺伝子がその対立遺伝子の一つにおいて生殖細胞系突然変異を含有し、対象生体が前記生殖細胞系突然変異に関連する病気または罹病性の特徴に冒されているという結論を出す、
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ） が、前記工程（ｂ） で計算された割合を、前記病気によりまたは前記罹病性の特徴により冒されていない、対象生体と同じ分類学的分類の生体からの比較可能な生体サンプル中の、対象遺伝子により発現された野生型タンパク質の量から計算される割合の比較可能な平均と比較する工程を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記正常な生体サンプルが、体液、組織標本、組織抽出物、正常な細胞、正常な細胞からの溶解産物、正常な細胞抽出物、および正常な細胞の溶解産物からの上澄からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記体液が、血液、血清、血漿、精液、胸部滲出液、胃の分泌液、糞の懸濁液、胆液、唾液、涙、痰、粘液、尿、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および髄液からなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が末梢血リンパ球であり；前記細胞溶解産物が末梢血リンパ球の溶解産物であり；前記細胞抽出物が末梢血リンパ球からのものであり；前記上澄が末梢血リンパ球の溶解産物からのものであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記正常な細胞が末梢血リンパ球であり、前記生体がヒトであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記生体が脊椎動物であることを特徴とする請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記脊椎動物が哺乳類であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、癌または癌になる罹病性の診断、または診断／予後方法であることを特徴とする請求項１から１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記生殖細胞系突然変異が、切断を引き起こす突然変異または対立遺伝子を喪失させる突然変異からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から１２いずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記対象遺伝子が、毛細管拡張性運動失調、腺腫様結腸ポリポーシス、ＢＲＣＡ１ 、ＢＲＣＡ２ 、膵嚢胞性繊維症、ｃ−ｍｙｂ 、ジストロフィン、Ｅ− カドヘリン、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー、ファンコーニ貧血、ＩＤＳ 、ミスマッチ修復、神経繊維腫症タイプ１ 、神経繊維腫症タイプ２ 、ｐ１６ 、多発性嚢胞腎症タイプ１ 、多発性嚢胞腎症タイプ２ 、ＰＴＣＨ 、トランスホーミング増殖因子ベータレセプター２ 、およびリンダウ病の遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記病気が、または前記罹病性の対象の病気が、毛細管拡張性運動失調、血管芽細胞腫、腎細胞癌、褐色細胞腫、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膵癌、胆道癌、膵嚢胞性繊維症、血液内悪性腫瘍、デュシェーヌ筋ジストロフィー、尿生殖器癌、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー、ファンコーニ貧血、ハンター症候群、神経繊維腫症タイプ１ 、神経繊維腫症タイプ２ 、家族性黒色腫、多発性嚢胞腎症、母斑様基底細胞癌、およびリンダウ病からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から１４いずれか１記載の方法。
【請求項１６】
前記対象遺伝子または前記対象遺伝子の一つが結腸ポリポーシス遺伝子であり、前記病気または前記罹病性の特徴が家族性腺腫様ポリポーシスであることを特徴とする請求項１から１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記対象遺伝子または前記対象遺伝子の一つがミスマッチ修復遺伝子である、または前記対象遺伝子の両方がミスマッチ修復遺伝子であることを特徴とする請求項１から１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記対象遺伝子または前記対象遺伝子の一つが、ＭＬＨ１ 、ＭＳＨ２ 、ＭＳＨ６ 、ＰＭＳ１ 、およびＰＭＳ２ からなる群より選択され；前記病気または前記罹病性の特徴が、遺伝性非ポリポーシス結腸癌であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記対象遺伝子または前記対象遺伝子の一つが、ＭＬＨ１ 遺伝子またはＭＳＨ２ 遺伝子であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
それぞれの対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量、および／または関連タンパク質の量を、ウェスタンブロット分析、免疫沈降の後ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリ、酵素免疫測定法、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、競合免疫学的検定法、二重抗体サンドイッチアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、蛍光アッセイ、または凝集アッセイにより測定することを特徴とする請求項１から１９いずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
自動化されることを特徴とする請求項１から２０いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記野生型タンパク質の異常に低いレベルが、前記生殖細胞系突然変異に関連する前記病気または前記罹病性の特徴により冒されていない生体からの比較可能なサンプル中の前記タンパク質のレベルの５０ ％±２０ ％であり、該冒されていない生体は前記対象生体と同じ分類学的分類であることを特徴とする請求項１から２１いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
ここに開示される本発明は、病気および罹病性の診断および予後に関する遺伝医学の分野、特に腫瘍学の分野にある。より詳細には、本発明は、標的とされる全長タンパク質の細胞レベルを検出する免疫学的検定法に関し、標的とされる全長タンパク質の異常に低いレベルまたはそのような標的とされる全長タンパク質の不存在は、被験者の遺伝子における突然変異を示す。関心のある遺伝子突然変異は、病気または罹病性、例えば癌または癌になる素因に関するものである。
【０００２】
発明の背景
有害な突然変異対立遺伝子のキャリアの検出は、患者の臨床的治療を導くのに医学的に非常に有用である。すなわち、人が病気または罹病性と関係する生殖細胞系または後天性突然変異を有するか否かを知ることは重要である。
【０００３】
例えば、遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ） に関するミスマッチの修復遺伝子中に生殖細胞系突然変異を有する結腸癌患者を手術前に同定することにより、全結腸切除または部分的結腸切除を行うべきか否かの決定が外科医に導かれる。患者が生殖細胞系突然変異を有する場合、第二の一次結腸癌が生ずる可能性は非常に高い（おそらく７０ ％）。この場合、通常は全結腸切除が初期の手術による治療として推奨される。手術の目的は、すでに存在する結腸癌を治療し、新しい悪性腫瘍の発生を防ぐことにある。癌患者における生殖細胞系突然変異の存在により、癌の手術による治療において違いが生じるだけでなく、結腸切除後のアジュバント化学療法の必要性において違いが生ずる。
【０００４】
患者中の生殖細胞系突然変異の存在を同定できることにより、癌を予防するためのより有効なアプローチおよびそのような患者が発生させる危険のある他の癌のタイプ（例えば結腸癌を除く）の早期の検出も可能となる。言いかえれば、ＨＮＰＣＣ に冒された結腸癌患者を同定するテストからの情報は、同じく生命を脅かす結腸外の癌について患者を二次臨床スクリーニングするきっかけとなる。
【０００５】
さらに、癌患者における生殖細胞系突然変異の陽性診断により、家族構成員において生殖細胞系突然変異キャリアを検出するためのテストが容易になる。そのようなテストにより、より有効な癌予防方法および家族構成員において検出される癌のより良い臨床治療技術が生ずる。したがって、本発明により提供される情報はまた、生殖細胞系突然変異の発見により個人は結腸癌および他の癌になる高い危険性にあると推定されるので、医師が患者の家族の他の構成員のスクリーニングを推奨することにおいて有用である。
【０００６】
遺伝性の病気の診断／予後における主な問題は、ＨＮＰＣＣ のような病気または罹病性に関する遺伝性の特徴を同定するための現在の分子に基づくアッセイの実施に必要とされる大量の労力および費用である。本発明は、そのような遺伝性の特徴を検出するための、より実行可能な方法である、免疫学的検定法を提供する。本発明のアッセイは、相対的に簡単であり、素早く（２４ 時間の所要時間）、高処理量で費用がかからない。本発明のアッセイにより、そのような遺伝性の病気になる危険性のある全個体群のスクリーニングが可能となる。また、本発明のアッセイにより、癌のような病気を発生する前に、病気に関連する遺伝性の特徴のキャリアを同定することができる。
【０００７】
本発明のアッセイは、遺伝子発現は遺伝子量に直接関係する、すなわち二つの野生型の対立遺伝子はただ一つの野生型の対立遺伝子が存在する場合に生ずるよりも二倍量の全長野生型タンパク質を発現するという仮定に基づく。本発明によれば、免疫学的検定法を使用して、被験者の遺伝子により発現される全長タンパク質の量の正常からの減少を測定する。対照的に、ミスマッチ修復（ＭＭＲ） 遺伝子のような、遺伝子における突然変異を、高価で、時間がかかり、限られた学問的および商業的参考実験所でのみ提供されるＤＮＡ 配列分析および／またはインビトロにおける翻訳型アッセイ［Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ， Ｆ．Ｍ．，  「遺伝性結腸癌における遺伝子テスト」ＪＡＭＡ， ２７８： １２７８−１２８１（１９９７）］ により一般的に検出する。
【０００８】
遺伝性の結腸直腸癌（ＣＲＣ） のあるタイプまたは遺伝性ＣＲＣ の素因についてのスクリーニングに主に使用される典型的な免疫学的検定法が開示される。遺伝性ＣＲＣ またはその素因をスクリーニングするそのような典型的な免疫学的検定法は、（１）家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ） に関連する突然変異である、腺腫様ポリポーシス遺伝子（ＡＰＣ） の突然変異、または（２）遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ） に関連する突然変異である、ミスマッチ修復（ＭＭＲ） 遺伝子、特にＭＬＨ１ 、ＭＳＨ２ 、ＰＭＳ１ 、ＰＭＳ２ 、およびＭＳＨ６ の突然変異のいずれかによる細胞性全長タンパク質レベルの変化の検出に基づく。
【０００９】
関心のある遺伝子の対立遺伝子のＤＮＡ 配列中の突然変異の検出に基づくような分子遺伝学的方法が、ＨＮＰＣＣ およびＦＡＰ のような遺伝性結腸癌を有する個体の診断に使用されてきた。そのようなテストは非常に特異的であることが可能であり、正確な標的突然変異が分かっている場合、例えばＨＮＰＣＣ 家系をスクリーニングする場合に実施するのがかなり容易であるが、正確な標的突然変異がわかっていない場合にはそのようなテストは行うのが困難である。後者の場合、大きいＭＭＲ 遺伝子のパネルから小さいＤＮＡ 突然変異を見つけるのは、干草の山で針を見つけるのと同様に、困難である。この場合、本発明の免疫学的検定法は、素早く相対的に費用がかからないので、まさに非常に実際的である。
【００１０】
さらに、本発明の免疫学検定法のテストにおける陽性の所見は、ＤＮＡ テストだけが使用された場合に必要とされる時間のほんの一部の時間で、ＤＮＡ 配列により確かめることができる。したがって、本発明の免疫学的検定法は、補助的な「予備試験」として有用になるかもしれない。本発明はまた、突然変異がすでに同定されている既知の家系の病気に冒された構成員の診断において分子遺伝学的テストの補助となる。
【００１１】
上述のように、未知の突然変異は、分子遺伝学的テストにより検出することが非常に困難である。未知の突然変異は、まだ研究されていない発端者、隔離患者および家系において発見される突然変異である。主に単一の塩基対変化、小さい挿入、および小さい欠失を含むそのような個体群における生殖細胞系突然変異は、遺伝子の大部分に分布し、多くの可能な遺伝子座の任意の一つを含むかもしれない。さらに、コード領域のサイズが大きいことにより、遺伝子配列による突然変異の同定が非常に困難になり、大きな労力を要し、費用がかかる。したがって、他の技術が発達し、ＤＮＡ 変異および突然変異の存在を検出するために使用される。そのような技術には、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ） 分析およびＲＮＡ アーゼ保護分析が含まれる。しかしながら、これらの他のアプローチは、特に感度において、欠点および／または制限を有する。例えば、ＦＡＰ 患者においてＡＰＣ 突然変異を検出するためのこれらの技術の感度は、使用される方法に依存してわずかに３０ −７０％ である。インビトロにおいて合成された翻訳産物を分析することにより突然変異を検出するより新しい技術が発達したが、わずかに良い感度を有するに過ぎない。
【００１２】
上述される分子遺伝学的方法の大部分は、単一の塩基対変化、小さい挿入、および小さい欠失および／または翻訳を終了させる突然変異の検出を意図している。しかしながら、例えば、患者の生殖細胞系において全遺伝子の欠失が起こり得る。全遺伝子の欠失は、分子遺伝学的アプローチによると見逃されるので、これは初期の方法のさらに別の欠点である。さらに、正常な転写のレベルを減少させるプロモーターまたはスプライシングの突然変異、すなわち多くの分子的方法により分析されるコード領域の外側に位置する突然変異を有する患者もいる。対照的に、標準的な突然変異に加えて、対立遺伝子の喪失を含む突然変異、およびプロモーター、エンハンサーおよびスプライシング部位領域における突然変異を検出することができるので、本発明の免疫学的検定法は、野生型タンパク質のレベルを検出することにより、分子遺伝学的方法よりも大きい感度を有するかもしれない。
【００１３】
現在の分子遺伝学的技術の別の欠点は、分子遺伝学の技術は多くの病理学の研究所で確立されていないということである。また、分子遺伝学的アッセイの結果はしばしば、素早く、例えば手術の前に得ることができない。分子遺伝学的テストは癌組織サンプルにおいて行うことが可能であるが、癌細胞中の突然変異が後天性であるか生殖細胞系であるかの問題は解決されない。
【００１４】
例えば、現在調査されている一つのアプローチは、特定のＭＭＲ 突然変異の検出［Ｄｉｅｔｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「診断ミクロサテライト不安定性：定義およびミスマッチ修復タンパク質発現との相関」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５７： ４７４９−４７５６（１９９７）］ というよりも、腫瘍検体におけるミクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ） 不安定性（すなわち反復性ＤＮＡ 配列における突然変異）の検出である。ミクロサテライト法には、異なる遺伝子座のパネルにおける遺伝子変化についてスクリーニングするための分子生物学的技術（ＰＣＲ またはサザンブロット分析）が含まれる（通常５ つ以上の遺伝子がミクロサテライト不安定性について同時に分析される）。ミクロサテライト法は、分子遺伝学者によりかなり容易に行われ、その目的はいずれのポリープがＭＭＲ 突然変異から生じたかを同定することにある。しかしながら、この方法はまた、後天性および生殖細胞系ＭＭＲ 突然変異の区別をせず、５ つの既知のＭＭＲ 遺伝子のいずれが突然変異体であるかを同定する情報を何ら提供しない。
【００１５】
対照的に、本発明の免疫学的検定法は、任意の病理学の実験室で行うことができ、短い時間で多くの個体をスクリーニングするために、費用に対し最も効率良く発達させることができる。このアッセイは素早く行うことができ、結果が直ちに得られる。本発明の免疫学的検定法により、特定の遺伝子の産物における変化を同定した後、分子遺伝学的テストを使用して突然変異の正確な位置を決定することができる。
【００１６】
発明の概要
本発明の免疫学的検定法を適応させて、植物、ウィルス、動物、菌類、および細菌および原生動物のような原核生物上界および原生生物界の構成員における病気または罹病性の特徴を検出することができる。本発明の免疫学的検定法を使用して、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトにおいて病気または罹病性を検出する。
【００１７】
本発明の免疫学的検定法は、正常な個体、すなわち対象遺伝子中に突然変異を有しない個体は、対象の野生型遺伝子産物を１００％発現し、野生型関連遺伝子産物を１００％発現するという理論に基づく。対照的に、同じ遺伝子の１つの対立遺伝子に突然変異を有する個体は、理論上は、関連野生型遺伝子産物の発現を１００％維持するのに対し、対象野生型遺伝子産物を５０％しか発現しない。
【００１８】
ある好ましい実施の態様において、本発明の免疫学的検定法は、対象遺伝子の一方または両方の対立遺伝子における生殖細胞系突然変異に関連する病気または罹病性を検出する。本発明の免疫学的検定法はまた、この態様において、一個体の二つの異なる遺伝子における生殖細胞系突然変異は非常にまれであるという仮定を前提とする。
【００１９】
本発明の典型的な免疫学的検定法は、ヒトにおけるＨＮＰＣＣ およびＦＡＰ に対する罹病性を検出するものである。ＨＮＰＣＣ の罹病性の特徴についてのスクリーニングの場合、ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ 野生型タンパク質（二つの主要なＭＭＲ 遺伝子の発現産物）の量を個体からのサンプルから、例えば新しく調製されたリンパ球から測定する。生殖細胞系ＭＭＲ 突然変異を有するほとんどすべての個体は、二つの全長ＭＭＲ タンパク質の一つを１００ ％有するが、他の全長タンパク質は５０ ％のみである。
【００２０】
これらの方法を、（ａ） 正常個体群および（ｂ） 証明されたＨＮＰＣＣ 患者の個体群に適用した後、本発明の免疫学的検定法により、全長ＭＭＲ タンパク質の発現の正常なおよび異常なレベルを識別することを可能にする基準の設定が見込まれる。本発明の方法は、関心のある対象野生型遺伝子産物と関連遺伝子産物との発現レベルの割合、および一方の他方に対する割合の予測に依存する。例えば、ＭＭＲ 突然変異の場合、ＭＳＨ２ タンパク質の量対ＭＬＨ１ タンパク質の量の割合を使用できる。次に、割合の絶対値が正常な範囲に明らかに下がるまたは対象遺伝子産物の発現が５０ ％失われると予測される範囲、例えばＨＮＰＣＣ についてスクリーニングする場合にＭＳＨ２ またはＭＬＨ１ のいずれかの発現が５０ ％失われる範囲に明らかに下がるか否かが決定される。
【００２１】
本発明の免疫学的検定法についての別の好ましい標的個体群は、ＣＲＣ を有するとして同定される患者である（ＣＲＣ 患者の１０ ％は、ＭＭＲ 突然変異を有すると予測される）。ＣＲＣ 患者がＭＭＲ 突然変異のキャリアであることが分かる場合、患者（例えば発端者）の血縁関係に、これらの血縁関係はＣＲＣ になる危険性が高いことが同定されているので、ポリープおよび／またはＣＲＣ 関連癌についてのスクリーニングを奨励することが望ましい。（発端者とは、ＨＮＰＣＣ の特徴のような遺伝的特徴を有するとして確定的に同定された家族の最初の構成員である。）
ある態様において、本発明の免疫学的検定法は、遺伝性ＨＮＰＣＣ およびＦＡＰ の特徴のような、病気に関連する遺伝的特徴のキャリアの同定を意図する。アッセイの読出し、すなわち野生型タンパク質のレベルは、遺伝子型と相関する。このようにして、本発明のアッセイにより野生型対立遺伝子について同型接合の細胞および異型接合の細胞が識別され、したがって遺伝的特徴を有するおよび有しない個体が識別される。本発明は、ＣＲＣ を有すると診断された患者の約１０ ％の原因である疾患である、遺伝性結腸癌のＨＮＰＣＣ の最も一般的な形態の改良されたおよびより早い診断を提供することにより、ＣＲＣ の不十分な治療技術の問題の一つを扱う。
【００２２】
本発明の免疫学的検定法を適応させて、タンパク質切断（生殖細胞系および後天性）を引き起こすまたは対立遺伝子タンパク質発現をなくす突然変異による多くの他の遺伝性および遺伝的疾患（癌および癌以外）に関連する全長（野生型）タンパク質を測定してもよい。切断を起こす突然変異および／または対立遺伝子の喪失を受ける典型的な遺伝子、およびそのような遺伝子における突然変異に関連する病気を以下に列挙する：
ＡＰＣ                  −ＣＲＣ およびＧＩ 癌
ＡＴＭ                  −毛細管拡張性運動失調；血管芽細胞腫；腎細胞癌；褐色細胞腫
ＢＲＣＡ１               −乳癌
ＢＲＣＡ２               −乳癌
ＣＦＴＲ               −膵嚢胞性繊維症
ｃ−ｍｙｂ               −血液悪性疾患
ジストロフィン      −デュシェーヌ筋ジストロフィー
Ｅ− カドヘリン        −乳癌および結腸癌
（ＨＳＥＣＡＤ）
ＥＭＤ                 −エメリー−ドライフス筋ジストロフィー
ＦＡＡ                 −ファンコーニ貧血
ＩＤＳ                 −ハンター症候群
ＭＬＨ１               −ＣＲＣ 、ＧＩ 、ＧＵ およびＧＹＮ 癌
ＭＳＨ２               −ＣＲＣ 、ＧＩ 、ＧＵ およびＧＹＮ 癌
ＮＦ１                 −神経繊維腫症タイプ１
ＮＦ２                 −神経繊維腫症タイプ２
ｐ１６（ＣＤＫＮ２Ａ        −家族性黒色腫
およびＭＴＳ１）
ＰＫＤ１ およびＰＫＤ２   −多発性嚢胞腎症
ＰＴＣＨ                −母斑様基底細胞癌
ＶＨＬ                 −リンダウ病
ＡＰＣ 遺伝子およびＭＭＲ 遺伝子中の突然変異を検出するための典型的なアッセイがここに開示される。しかしながら、当業者はそのようなアッセイを、他の遺伝子における類似する突然変異の検出に容易に適応させることができ、そのような突然変異は病気または罹病性と関連することが知られている（以下の、「他の全長タンパク質についての免疫学的検定法」参照）。
【００２３】
ある意味で、本発明の方法を使用して、標的とされる野生型タンパク質の異常に低いレベルまたは生体サンプル中の標的とされる野生型タンパク質の不存在についてスクリーニングすることができる。生体サンプル中の関連タンパク質の量に対する前記野生型タンパク質の量の割合を計算し、該割合が変化を受けていない個体の個体群研究において計算された類似する正常な割合と比較して正常であるか異常であるかを決定することにより、前記標的とされる野生型タンパク質のレベルを測定することができる。関連タンパク質は、アッセイを方向付ける病気または罹病性の特徴に関連しなくてもよい、またはアッセイを方向付ける病気または罹病性に関連する別の対象遺伝子の発現産物でもよい。後者の実施の形態において、アッセイは、多くの遺伝子のいずれが病気に関連する突然変異により影響を受けるかをあるアッセイにおいて決定する、差異に基づく診断／予後の一形態として特徴付けることができる。それについての例は、ここに明確に記載されるアッセイ方法であり、ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ は対象遺伝子であり、ＨＮＰＣＣ に対する罹病性は、アッセイを方向付ける特徴である。
【００２４】
ある好ましい実施の形態において、本発明の免疫学的検定法は、生体における病気または罹病性の特徴を検出することを意図し、前記病気または前記罹病性の特徴が対象遺伝子における突然変異に関連することを特徴とし、
（ａ） 前記対象生体から生体サンプルを単離し、
（ｂ） 前記サンプル中の前記対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量、および前記サンプル中の第二の遺伝子により発現される関連タンパク質の量を免疫学的に定量し、
（ｃ） 前記サンプル中の前記対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量対前記サンプル中の前記第二の遺伝子により発現される関連タンパク質の量の割合を計算し、
（ｄ） 前記対象遺伝子により発現される野生型タンパク質が前記サンプル中に存在するか否か、または前記計算された割合が、前記サンプル中における前記対象遺伝子により発現される前記野生型タンパク質の異常に低いレベルを表すか否かを決定し、
（ｅ） 前記サンプル中に野生型タンパク質が存在しない場合、前記対象遺伝子はそれぞれの対立遺伝子中に突然変異を含有する、または工程（ｃ） において計算された割合により前記サンプル中で野生型タンパク質のレベルが異常に低いことが示される場合、前記対象遺伝子は対立遺伝子の一つにおいて突然変異を含有する、およびいずれかである場合、対象生体は前記突然変異に関連する病気または罹病性の特徴に冒されているという結論を出す、
各工程を含む。そのような実施の形態における好ましい関連タンパク質の例は、アクチン、チューブリン、またはグリセルアルデヒド−３ −ホスフェートデヒドロゲナーゼである。
【００２５】
本発明の免疫学的検定法の実施の形態の工程（ｄ） は、工程（ｃ） で計算された割合を、前記病気によりまたは前記罹病性の特徴により冒されていない、対象生体と同じ分類学的分類の生体からの比較可能な生体サンプルにおいて、前記対象遺伝子から発現された前記野生型タンパク質の量対前記関連タンパク質の量の割合の平均と比較する工程を含んでもよい。
【００２６】
上述のように、切断を引き起こす突然変異または対立遺伝子の喪失を起こす突然変異の場合における全長タンパク質の細胞性レベルにおける予想される減少は、対象遺伝子により発現される全長タンパク質の量における５０ ％の減少である。両方の対立遺伝子がそのような突然変異により影響を受ける場合、一方は、前記全長タンパク質の発現において１００ ％減少すると予想される。しかしながら、生体変異性により、正常からの全長タンパク質発現における減少（単一の対立遺伝子突然変異について）は、一般個体群からの病気のない個体における正常値の範囲から統計的に測定される限界レベルにより、陽性の結果であると考えられる。対象遺伝子の残存する対立遺伝子が、癌の場合にしばしば起こるように、突然変異対になる場合、本発明の予想される読出しは５０ ％から０ ％に下がる。陽性の結果についての理論上の基準線からの変異性は、±２０ ％、好ましくは±１５ ％、より好ましくは±１０ ％である。
【００２７】
別の好ましい実施の形態において、本発明の免疫学的検定法により、生体における病気または罹病性の特徴を検出することができ、前記病気または前記罹病性の特徴は、二つ以上の対象遺伝子の一つにおける突然変異と関連することを特徴とし、
（ａ） 前記生体から生体サンプルを単離し、
（ｂ） それぞれの対象遺伝子から発現される、前記サンプル中の野生型タンパク質の量を免疫学的に定量し、
（ｃ） 前記サンプル中で他の対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量、または前記サンプル中で他の対象遺伝子のそれぞれにより発現される野生型タンパク質の量に対する前記サンプル中で前記対象遺伝子の一つにより発現される野生型タンパク質の量の割合を計算し、
（ｄ） 対象遺伝子のいずれかによりまたは任意の対象遺伝子により発現される野生型タンパク質が前記サンプルに存在しないか否か、または工程（ｃ） で計算された割合が、前記サンプル中で対象遺伝子のいずれかまたは任意の対象遺伝子により発現される異常に低いレベルの野生型タンパク質を表すか否かを決定し、
（ｅ）  対象遺伝子の一つにより正常に発現されることが知られる野生型タンパク質が前記サンプル中に存在しない場合、該対象遺伝子はそれぞれの対立遺伝子中に突然変異を含有する、または工程（ｃ） において計算された割合により前記サンプル中で対象遺伝子の一つにより発現される野生型タンパク質のレベルが異常に低いことが示される場合、該対象遺伝子は対立遺伝子の一つにおいて突然変異を含有するという結論を出す；および、いずれかである場合、対象生体は前記突然変異に関連する病気または罹病性の特徴により冒されていることを決定する、
各工程を含むことを特徴とする。
【００２８】
前記実施の形態の工程（ｄ） は、工程（ｃ） で計算された割合を、前記病気によりまたは前記罹病性の特徴により冒されていない、対象生体と同じ分類学的分類の生体からの比較可能な生体サンプルにおいて、対象遺伝子により発現された野生型タンパク質の量から計算された割合の比較可能な平均と比較する工程を含んでもよい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、生体における病気または罹病性の特徴を検出する方法であって、前記病気または前記罹病性の特徴は、対象遺伝子における突然変異と関連することを特徴とし、
（ａ） 前記生体から正常細胞のサンプルを単離し、
（ｂ） 前記サンプル中で対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量を免疫学的に定量し、
（ｃ） 前記サンプル中に野生型タンパク質が存在するか否か、およびその場合、前記サンプル中に存在する野生型タンパク質の量が、対照サンプル中で対象遺伝子により発現される野生型タンパク質の量と比較して異常に低いか否かを決定し、
（ｄ） 前記サンプル中に前記野生型タンパク質が存在しない場合、対象遺伝子はそれぞれの対立遺伝子中に突然変異を有すると結論する；または前記サンプル中の前記野生型タンパク質の量が、対照サンプル中の野生型タンパク質の量と比較して異常に低いと測定された場合、対象遺伝子は一つの対立遺伝子中に突然変異を有すると結論する；およびいずれかである場合、該結論と前記突然変異と関連する病気または罹病性の特徴を有する対象生体との相関関係を算定する、
各工程を含むことを特徴とする方法に関する。アッセイ結果により対象遺伝子が一つの対立遺伝子に突然変異を有することが示される場合、野生型タンパク質の異常に低い量は通常、正常な量の約５０ ％であり、上述の変異性は機能可能に作用している。
【００３０】
本発明の免疫学的検定法により検出される病気または罹病性の特徴に関連する突然変異は、生殖細胞系または体性でもよく、好ましくは生殖細胞系である。そのような突然変異は、切断を引き起こす突然変異または対立遺伝子の喪失を起こす突然変異である。突然変異の例は、ナンセンス突然変異、読み枠突然変異、プロモーター突然変異、エンハンサー突然変異、スプライシング部位突然変異、ヌル突然変異、およびポリ−Ａ テール突然変異からなる群より選択される。
【００３１】
生物学的サンプルが単離される生体は、ウィルス、植物、菌類、動物、または原核生物上界および原生生物界の構成員から単離される。前記生体は、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類、およびさらに好ましくはヒトである。
【００３２】
本発明の免疫学的検定法によりテストされる生物学的サンプルには、組織標本、体液（例えば、血液、血清、血漿）、組織抽出物、細胞、細胞溶解産物、細胞抽出物、正常な細胞溶解産物からの上澄、新生物発生前の細胞溶解産物からの上澄、および新生細胞溶解産物からの上澄が含まれる。
【００３３】
好ましい生物学的サンプルは、細胞サンプル、細胞抽出物、細胞溶解産物、細胞溶解産物からの上澄、組織サンプルおよび組織抽出物である。さらに好ましいのは、正常な細胞サンプル、正常な細胞抽出物、正常細胞からの溶解産物、および正常な細胞溶解産物の上澄である。特に好ましいのは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ） 、ＰＢＬ の溶解産物、ＰＢＬ の溶解産物からの上澄み、およびＰＢＬ の抽出物である。
【００３４】
体液のサンプルの例には、特に以下の液体が含まれる：血液、血清、血漿、精液、胸部滲出液、胃の分泌液、糞の懸濁液、胆液、唾液、涙、痰、粘液、尿、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液（ｂｌａｄｄｅｒ ｗａｓｈ） 、気管支肺胞洗浄液、および髄液。体液が、本発明の方法によりテストされる生物学的サンプルである場合、例えばウェスタンブロット、フローサイトメトリ、またはサンドイッチ免疫学的検定法によるような免疫学的方法により定量する前に、一つ以上の標的とされる全長、野生型遺伝子産物および、関係のある場合には、関連タンパク質を大量の体液から濃縮することが好ましい。
【００３５】
本発明の方法は、自動化に適合することができる。上記で概略されるアッセイは、自動化形式で実施できる。本発明の方法を適合させることができる好ましい自動化免疫学的検定法システムは、化学発光および磁気分離を使用するものである。
【００３６】
略語
以下の略語をここで用いる：
ＡＦＡＰ          −  弱毒化家族性腺腫様ポリポーシス
ＡＰＣ            −  腺腫様結腸ポリポーシス
ＡＴＣＣ          −  アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
ＡＴＭ            −  毛細管拡張性運動失調
ＢＬ            −  生物発光
ＣＬ            −  化学発光
ＣＲＣ            −  結腸直腸癌
ＤＧＧＥ          −  変性勾配ゲル電気泳動
ＤＭＥＭ          −  ダルベッコ調製イーグル培地
ＤＴＴ            −  ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ          −  エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ          −  ［ エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］ 四酢酸
ＥＩＡ            −  エンザイムイムノアッセイ
ＥＬＩＳＡ          −  酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＰ            −  家族性腺腫様ポリポーシス
ＦＢＳ            −  胎仔ウシ血清
ＦＩＴＣ          −  フルオレセインイソチオシアネート
ＧＡＰＤＨ   −  グリセルアルデヒド−３ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ
ＧＩ            −  胃腸の
ＧＵ            −  尿生殖器の
ＧＹＮ            −  婦人科の
ＨＮＰＣＣ  −  遺伝性非ポリポーシス結腸癌
ｋＤａ          −  キロダルトン
ＭＡｂ          −  モノクローナル抗体
ＭＣＲ          −  突然変異密集領域
ＭＭＲ          −  ミスマッチ修復
ＭＷ            −  分子量
ＰＢＬ          −  末梢血リンパ球
ＰＢＳ          −  リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＣＲ          −  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ            −  フィコエリトリン
ＰＭＰ          −  常磁性粒子
ＰＭＳＦ          −  フェニルメチルスルホニルフッ化物
ＰＰＶ          −  陽性の予測価
ＰＴＴ          −  タンパク質切断テスト
Ｒｂ            −  網膜芽細胞腫
ＲＢＣ          −  赤血球
ＲＩＡ          −  ラジオイムノアッセイ
ＲＩＰＡ          −  ラジオイムノプレシピテーションアッセイ
ＲＴ            −  室温
ＳＤＳ          −  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ      −  ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＳＣＰ          −  一本鎖立体配座多型分析
ＴＧＦＢＲ２        −  トランスホーミング増殖因子、ベータレセプター２
ＷＢＣ          −  白血球
ｗ／ｖ            −  溶液濃度の単位記号
詳細な説明
本発明のアッセイは、非常に感度が高く、特異的であり、容易で、素早く（２４ 時間の所要時間）、費用がかからず、自動化技術に適合することができる。本発明により、遺伝子の野生型産物の細胞性レベルが最終的に減少する対象遺伝子の突然変異と関連する遺伝性の病気についての診断／予後アッセイが提供される。本発明の免疫学的検定法により、関心のある遺伝子によりコードされる全長タンパク質について分析される。例えば、本発明の免疫学的検定法を使用して、ＦＡＰ に関連するＡＰＣ 遺伝子、およびＨＮＰＣＣ に関連するＭＭＲ 遺伝子のタンパク質産物の細胞性レベルにおける変化を検出する。
【００３７】
形質に関連する遺伝性突然変異を有する個体は、野生型対立遺伝子の遺伝子量が減少しておりそのため形質の素因がつくられると考えられる。以下に示される実施例により、本発明のアッセイは、遺伝子量に関連する遺伝子産物発現における変異を検出できることが示される。ここに記載される実験により、ウェスタンブロット分析のような免疫学的検定法がＭＭＲ およびＡＰＣ のような標的遺伝子タンパク質の細胞性発現レベルを検出し定量する能力、およびそのようなレベルが対象遺伝子の野生型遺伝子量に関連することを示す能力を確立する。
【００３８】
ここで「遺伝子」という用語は、タンパク質産物についての完全なコード配列を含有するヌクレオチド配列を意味すると定義される。通常、「遺伝子」には、コードされたタンパク質の発現に影響を与えるコード配列の上流（例えばプロモーター配列、エンハンサーなど）または下流（例えば転写終止シグナル、ポリアデニル化部位など）で見られるヌクレオチド配列を含むと考えられる。「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ） 」という用語は、ＤＮＡ 配列中で異なり、単一の産物（ＲＮＡ および／またはタンパク質）の機能に影響を与える所定の遺伝子の一連の可能な対の形態の一つである対立遺伝子（ａｌｌｅｌｏｍｏｒｐｈ） の速記形態である。
【００３９】
本発明のアッセイは、診断および／または予後（予測）である、すなわち診断／予後である。「診断／予後」という用語はここで、それぞれまたは漸増的に臨床的状況に依存して以下の工程を含むと定義される：病気になる素因を決定し、病気の性質を決定し、病気を識別し、病気の状態の可能性のある結果に関して予測し、症例の性質および症状により示されるような病気からの回復に関する見通し、患者の病気の状態の観察、病気の再発についての患者の観察、および／または患者についての好ましい治療養生法の決定。本発明の診断／予後方法は、例えば腫瘍性のまたは新生物発生前の病気の存在についての個体群のスクリーニング、腫瘍性の病気が発生するリスクの測定、腫瘍性のおよび／または新生物発生前の病気の存在の診断、腫瘍性の病気を有する患者の病気の状態の観察、および／または腫瘍性の病気の過程についての予後の決定に有用である。
【００４０】
任意の従来の免疫学的検定法の形式は、標的遺伝子タンパク質、または本発明に従って標的遺伝子タンパク質および一つ以上の関連タンパク質の検出および定量に適合することができる（少なくとも半定量的に）。そのような形式には、診断産業において通常使用される他のアッセイの中で、好ましくは免疫沈降されたタンパク質のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ 、ＲＩＡ 、競争的ＥＩＡ および二重抗体サンドイッチアッセイが含まれる。免疫沈降されたタンパク質のウェスタンブロットおよびサンドイッチ免疫学的検定法が好ましく、サンドイッチ免疫学的検定法が特に好ましい。
【００４１】
特に好ましいサンドイッチ免疫学的検定法は、蛍光標識された、酵素結合されたまたは化学発光結合したものである。ここに記載されるように自動化した免疫学的検定法も好ましい。
【００４２】
ＥＬＩＳＡ テストのあるタイプの例は、マイクロタイタープレートが、対象遺伝子により発現される全長タンパク質、またはそのアミノまたはカルボキシ末端に作製された抗体でコーティングされている形式である。それに、患者のサンプル、例えば組織または細胞抽出物あるいは細胞溶解産物が加えられる。一定時間インキュベーションしてタンパク質を抗体に結合させた後、プレートを洗浄し、標識された、例えば酵素に結合された関連抗体の別のセットを加え、インキュベートして、反応を起こさせ、その後プレートを再び洗浄する。その後、例えば酵素基質をマイクロタイタープレートに加え、一定時間インキュベートして酵素を基質に作用させ、採集標本の吸光度を測定する。吸光度における変化は、サンプル中の対象全長タンパク質の量に比例する。
【００４３】
脊椎動物サンプルにおける野生型標的遺伝子産物および関連タンパク質を検出および定量するための本発明の免疫学的検定法の例は、
ａ） 一つのセットは野生型標的遺伝子産物に結合し、他方のセットは関連タンパク質に結合する二つのセットの抗体であって、それぞれの抗体のセットは標識されているまたはそうでなければ他のセットと異なって検出可能である抗体とともに前記脊椎動物サンプルをインキュベートし、
ｂ） インキュベートされたサンプルを調べて、野生型標的遺伝子産物を含む免疫複合体の量および関連タンパク質を含む免疫複合体の量を測定し、該二つの量の比を計算する、
各工程を含む。
【００４４】
本発明による別の免疫学的検定法の例は、競争的免疫学的検定法を使用して、標的遺伝子中に突然変異が存在するか否かを決定するために脊椎動物中の野生型標的遺伝子産物および関連タンパク質を検出および定量するものであって、
ａ） 二つのセットの抗体であって、それぞれのセットが野生型標的遺伝子産物または関連タンパク質、およびある量の標識された（他の視覚化方法を含む）野生型標的遺伝子産物およびある量の標識された関連タンパク質にそれぞれ特異的であって、前記標識された遺伝子産物および標識された関連タンパク質は異なって標識され、前記それぞれの抗体への結合についてサンプル中に存在する野生型標的遺伝子産物および関連タンパク質と競合する抗体とともに脊椎動物サンプルをインキュベートし、
ｂ） 該インキュベートされたサンプルを調べて、前記抗体に結合した標識された野生型遺伝子産物または関連タンパク質の量を測定し、
ｃ） 工程ｂ） における調査の結果から、前記サンプル中に存在する標的遺伝子産物および関連タンパク質の量を測定し、その割合を計算し、前記サンプル中で標的全長タンパク質の量が減少している場合、標的遺伝子中に突然変異が存在することを決定する、
各工程を含む。
【００４５】
適切な特異性を有する抗体（生物学的に活性の抗体フラグメントを含む）を調製すると、様々の免疫学的アッセイ方法が特異的抗体−抗原複合体の形成の測定に利用できる。多くの競合および非競合タンパク質結合アッセイが科学および特許文献に記載されており、そのようなアッセイの多くは市販されている。抗原の検出に適切な免疫学的検定法の例には、米国特許第５，６８６，２５８ 号；同第５，６９５，９２８ 号；同第５，７７０，４５７ 号；同第３，９８４，５３３ 号；同第３，９９６，３４５ 号；同第４，０３４，０７４ 号；および同第４，０９８，８７６ 号のものが含まれる。
【００４６】
アッセイにおいて使用される抗体は、標識してもよく標識しなくてもよい。未標識の抗体を凝集反応に使用してもよい；様々の標識を使用して、標識した抗体を様々のアッセイに使用してもよい。
【００４７】
適切な検出方法には、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、フリーラジカル、粒子、色素などのような標識の使用が含まれる。そのような標識された試薬を、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ 、蛍光免疫測定法などのような様々のよく知られるアッセイに使用してもよい。例えば、米国特許第３，７６６，１６２ 号；同第３，７９１，９３２ 号；同第３，８１７，８３７ 号；および同第４，２３３，４０２ 号参照。
【００４８】
免疫学的検定法テストキット
上記で概略されたアッセイをテストキットで実施して、野生型標的遺伝子産物、または標的遺伝子産物および関連タンパク質を検出および定量することができる。関連野生型遺伝子産物および／または関連タンパク質を検出および定量するためのそのようなキットには、関心のある遺伝子産物または関連タンパク質およびそのような野生型遺伝産物または関連タンパク質に特異的なポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が含まれてもよい。そのような診断／予後テストキットには、サンドイッチ形式について一つ以上のセットのポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が含まれてもよく、該抗体は全長タンパク質上のエピトープを認識し、一つのセットは適切に標識されるまたはそうでなければ関心のあるそれぞれの遺伝子産物または関連タンパク質について検出可能である。
【００４９】
酵素免疫測定法において使用するためのキットには通常、酵素が結合した抗体および該酵素に対する基質が含まれる。酵素は例えば、関心のあるタンパク質に特異的な抗体またはそのような特異的な抗体に対する抗体に結合してもよい。
【００５０】
結腸直腸癌についてのアッセイ
結腸直腸癌（ＣＲＣ） の改良されより早い診断が必要である。米国で毎年約１４０，０００ の結腸癌の新しい症例が診断され、世界の他の国ではさらに多い。それらの症例の多く（約１０ ％）は、遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ） または家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ）  のような結腸癌の遺伝性のタイプの一つを有する。結腸癌のそれらの遺伝性形態の診断により、多くの場合、医師は、高い費用の手術をすべきである、および／または手術上のアジュバント化学療法に対する適応が異なるかもしれない、および／または患者の家族の構成員をスクリーニングしなければならないと考える。しかしながら、現在までのところ、本発明者は、結腸癌の遺伝性の形態を有する患者を同定するための実際的なテストを何ら認知していない。したがって、簡単で、広く利用でき、素早く、費用のかからない、遺伝性結腸癌についてのテストの発達が、医師にとって臨床的に価値がある。
【００５１】
前悪性の結腸病変の早期診断の価値を高めることが最近の研究であり、これにより、個人および家族におけるＨＮＰＣＣ を同定しその後精密な臨床的追跡調査（例えば腫瘍性ポリープについての定期的な結腸鏡検査）を行うことによって罹病率および死亡率の実質的なおよび大きな減少を達成できるということが示される。［Ｊａｒｖｉｎｅｎ， Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｃｋｌｉｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｓｉｓｔｏｎｅｎ， Ｐ．  「遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有する家族における結腸直腸癌の割合がスクリーニングにより減少する」 Ｇａｓｔｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， １０８： １４０５−１４１１（１９９５）］ 。
【００５２】
頻度
ミスマッチ修復遺伝子（ＨＮＰＣＣ の原因である）を含む生殖細胞系突然変異の頻度は、西洋人において２００ から３００ 人に約１ 人である。生殖細胞系ＭＭＲ 突然変異（すなわちＨＮＰＣＣ 患者）に付随する浸透率が少なくとも９０ ％存在するので、ほとんどすべてのキャリアは、寿命の間に癌を発生させる。西洋では１０ 億人を超える人が存在するので（米国およびヨーロッパ）、５００ 万人を超える人が生殖細胞系ＭＭＲ 突然変異を有すると予想される。キャリアが癌を発生させる前にそのようなＭＭＲ 突然変異を同定することが重要である。
【００５３】
西洋に住む１０ 億人以上のうち、約５０ ％（２ 人に１ 人）が、７０ 歳までに結腸直腸腫瘍性ポリープ（以下単に「ポリープ」と称する）を発生する。［Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ａｎｄ Ｌａｎｇ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２５： ３７（１９９１）．］ 西洋でＣＲＣ を発生する生涯の見込みは、約１０ 倍小さいまたは２０ 人に１ 人である。
【００５４】
米国癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ） は、５０ 歳を超えるすべての人はポリープについてスクリーニングすることを推奨する。そのようなスクリーニングの目的は、（１）治療可能な程度（通常は手術）でのＣＲＣ の早期検出；および癌に発達する前のポリープの同定および除去による癌予防である。
【００５５】
すべてのＣＲＣ 症例の約１０ ％は、遺伝性の癌であると判断される。それらのうち、ほんの一部のみが、ＡＰＣ 遺伝子中の生殖細胞系突然変異による。多くの遺伝性結腸癌は、生殖細胞系ＭＭＲ 突然変異と関連する。腺腫は、ＣＲＣ の散在性の非遺伝性形態を発生する患者よりも、ＭＭＲ 突然変異を有する患者においてより早く癌に進行することが知られている。柔軟なＳ 状結腸鏡検査法（ポリープまたはＣＲＣ についての最初の臨床スクリーニング）の結果が陽性である場合、胃腸病学者は通常、さらなるポリープまたは結腸直腸腫瘍を検出するために全結腸の検査（全結腸鏡検査）を続ける。この場合、胃腸病学者は、本発明の免疫学的検定法を使用してＭＭＲ 突然変異を検出することを勧める。
【００５６】
ＭＭＲ免疫学的検定法
ＨＮＰＣＣ に関連する突然変異を検出するための本発明の免疫学的検定法は、ＭＭＲ 突然変異に関する二つの仮定に基づく：（１）ＨＮＰＣＣ キャリアは、以下の４ つのＤＮＡ ミスマッチ修復（ＭＭＲ） 遺伝子−ｈＭＬＨ１ 、ｈＭＳＨ２ 、ｈＰＭＳ２ およびｈＰＭＳ１ の一つに単一の生殖細胞系突然変異を有する；および（２）そのような突然変異により、遺伝子によりコードされる全長野生型タンパク質の細胞レベルが減少する（遺伝子産物は、理論上遺伝子量に比例すると考えられる）。ＭＭＲ 遺伝子の二つの対立遺伝子の一つが突然変異体である場合、本発明に従って、個人の体組織中で合成される全長タンパク質の量が５０ ％減少すると想定される。そのような免疫学的検定法は、内視鏡検査中にポリープが陽性であることが発見された後に特に有用である。
【００５７】
以下の式１および２は、ＭＭＲ 遺伝子−ＭＳＨ２ およびＭＬＨ１ 中の突然変異を検出するためのアッセイの臨床的使用を示す。
【００５８】
【数 １】
0003542968.tif 000002
【数 ２】
0003542968.tif 000003
以下の実施例は、ＨＮＰＣＣ および他の癌に関連するＭＭＲ 突然変異を検出する本発明を発達させるために使用される免疫学的検定法を示す。本発明のＨＮＰＣＣ アッセイは、主に二つのＭＭＲ 遺伝子（ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ ）に集中する、なぜなら、該二つの遺伝子中の突然変異は、ＨＮＰＣＣ 症例における同定可能な突然変異の大部分（ 〜９０％） の原因であることが示されたからである。［Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ａｎｄ ｄｅ ｌａ Ｃｈａｐｅｌｌｅ，  「遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌になりやすい突然変異」 Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ．， ７１： ９３−１１９（１９９７）］ 。ＭＭＲ タンパク質中の既知の突然変異の多くにより、タンパク質が切断される。［Ｉｄ．］
生殖細胞系にミスマッチ修復遺伝子欠損を有する患者は、結腸癌を発生させやすいだけでなく、子宮、卵巣、前立腺、胃、小腸、膵臓、および胆道癌も発生させるリスクが非常に高い。隔離患者の浸透率および頻度に基づき、生殖細胞系ミスマッチ修復突然変異を有する患者の４０ ％以上が癌を発生させ、癌の家族歴を有しない（４００，０００ を超える遺伝性癌患者は、陰性の家族歴を有する）。
【００５９】
本発明のアッセイの潜在的な制限は、ミスセンス突然変異のような、全長遺伝子産物を生ずる突然変異を検出しないということである。ＭＭＲ 突然変異についての制限の評価は、以下の情報から測定できる［Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ａｎｄ ｄｅ ｌａ Ｃｈａｐｅｌｌｅ， ｓｕｐｒａ］ ：（１）異なる突然変異に起因するＨＮＰＣＣ 患者の割合−ＭＳＨ２ およびＭＬＨ１ が９０ ％を占め、その他（ＭＳＨ６； ＰＭＳ２； ＰＭＳ１； ＴＧＦＢＲ２） が残りの１０ ％を占める；（２）ＭＳＨ２ およびＭＬＨ１ 遺伝子中の切断および非切断突然変異は、ＭＳＨ２［ 非切断（ミスセンス）＝７ ％および切断（フレームシフト、ナンセンスおよびフレーム内欠失）＝９３ ％］ 、およびＭＬＨ１［ 非切断（ミスセンス）＝３１ ％および切断（フレームシフト、ナンセンスおよびフレーム内欠失）＝６９ ％］ である。該情報に基づき、本発明のアッセイにより抗ＭＬＨ１ および抗ＭＳＨ２ を使用して検出できるすべてのＭＭＲ 突然変異の割合は、少なくとも７０％ と予測される。
【００６０】
ＨＮＰＣＣ 症例の約３０ ％を検出できないことは、他の分子遺伝学的テストについて報告されるのとほぼ同じ大きさである。［Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ａｎｄ ｄｅ ｌａ Ｃｈｅｐｅｌｌｅ， ｓｕｐｒａ； Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ， Ｆ．Ｍ．， ｓｕｐｒａ］ 。しかしながら、非切断突然変異を含む半接合体症例の割合は過大評価されているかもしれない、なぜなら、対立遺伝子喪失のような他の突然変異およびプロモーター突然変異（他の分子遺伝学的テストにより容易に検出されない）は、対立遺伝子喪失またはプロモーター領域を含むそのような突然変異はＭＭＲ 遺伝子の一つの対立遺伝子からの発現を停止するまたは減少する場合、本発明のアッセイにより検出すべきだからである。さらに、ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ アッセイに関連して全長ＰＭＳ１ およびＰＭＳ２ タンパク質を検出するための本発明の免疫学的検定法により、同定されていないＭＭＲ 突然変異の数が大きく減少する。
【００６１】
さらに、タンパク質のポリペプチド主鎖の全長を変化させる変化である、アミノ酸の置換を含む非切断ミスセンス突然変異において、異なるアプローチを使用して、免疫学的検定法を診断に使用する場合に突然変異を検出することができる。例えば、アミノ酸置換の重大な潜在的結果として（それらを検出する能力に関して）、そのような置換により３ 次元天然タンパク質構造が天然ＭＭＲ タンパク質中のエピトープ表示を変化させるほど十分に変化し、これは特異的なエピトープに対する抗体を使用する免疫学的検定法により検出できる。
【００６２】
したがって、フローサイトメトリには浸透性の細胞の分析が含まれるので、フローサイトメトリ免疫学的検定法により、３ 次元天然ＭＳＨ２ およびＭＬＨ１ タンパク質構造が保たれている状態で、ミスセンス突然変異によるタンパク質変化のいくつかのタイプを検出することができる。ＭＭＲ 突然変異についてのアッセイは、細胞性ミスマッチ修復のための酵素活性における作用変化の検出に基づく他の実験室において発達しているので、そのような突然変異は、別の方法により検出できる［Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５７： ２９５６（１９９７）］ 。別の可能性には、異常血色素症を診断するためのアッセイに類似する２ 次元ゲル電気泳動システムまたは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ） を使用するタンパク質移動度の変化の検出が含まれる［ＥＳＡ， Ｉｎｃ．； Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ 。
【００６３】
ＭＭＲタンパク質に対する抗体
抗ヒトＭＬＨ１ 、抗ヒトＭＳＨ２ および抗マウスＰＭＳ２ は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ 社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） から市販されている。抗ヒトＭＬＨ１ および抗ヒトＭＳＨ２ は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） からも市販されている。表１は、これらの市販されている抗体の特性を示す。
【００６４】
【表１】
0003542968.tif 000004
ＡＰＣ免疫学的検定法
以下に示される実施例により、ＦＡＰ タイプの遺伝性結腸癌を同定するための免疫学的検定法の原理が提供される。ＦＡＰ はＨＮＰＣＣ より頻度はずっと少ないが、本発明の免疫学的検定法が遺伝性の特徴を検出する能力を評価するためのモデルシステムを提供する。
【００６５】
ＦＡＰ は、米国で５０００ 人に約１ 人（すなわち約５０，０００ 人）に影響を及ぼす常染色体優性遺伝病である。結腸および直腸において数百から数千の腺腫様ポリープを発生させることにより特徴付けられる［Ｂｏｍａｎ， Ｂ．Ｍ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎ， Ｂ．，  「家族性ポリポーシス」 Ｈｏｓｐ． Ｐｒａｃ．， ２１： １５５−１７０（１９８６）］ 。予防の結腸切除を行った場合、これらのポリープは癌に進行することはない［Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｈ． Ｔ．， Ｂｏｍａｎ， Ｂ．Ｍ．， Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎｓ， Ｒ．Ｊ．，  「家族性結腸ポリポーシス：遺伝的性質、サーベイランスおよび治療」Ｎｅｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ．， ７３： ３２９−３３４（１９８８）］ 。実際に、治療していないＦＡＰ 患者は、生涯に結腸癌を発生させる可能性をほぼ１００ ％有する。
【００６６】
腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ） 遺伝子の生殖細胞系突然変異は、家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ） において起こる。ＡＰＣ 突然変異は、ＦＡＰ 患者における遺伝性結腸癌の原因であり、散在性結腸直腸癌の発生における臨界開始因子であると考えられる。本発明の免疫学的検定法は、他の分子遺伝学的方法の欠点を回避できるので、まだ研究されていないＦＡＰ の発端者、隔離患者および家系における従来知られていないＡＰＣ を有する個体の診断において有用である。ＦＡＰ を含む生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異を保有する患者の診断により、有効な救命癌予防法が生ずる。
【００６７】
多くの生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異（＞９０％） は、カルボキシル部分の様々なサイズの欠失を有する切断されたＡＰＣ タンパク質を産生する機構である、翻訳終了の原因となる新しい停止コドンおよび他の遺伝的変化を引き起こす［Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， 「５３ の家族性腺腫様ポリポーシス患者におけるＡＰＣ 遺伝子の生殖細胞系突然変異」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８９： ４４５２−４４５６（１９９２）； Ｓｐｉｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７５： ９５１−９５７（１９９３）； Ｇｒｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６６： ５８９（１９９１）］ 。ＦＡＰ 患者におけるすべての生殖細胞系突然変異が結腸癌になるのに対し、切断されたＡＰＣ タンパク質の長さにおける変化は、ＦＡＰ 患者における他の形質発現に関すると考えられる。例えば、コドン１２５０ と１４６４ との間の領域で生ずる生殖細胞型突然変異は、多量のポリープ（ｃｍ２ 毎に１０ 以上）の臨床的発見に関連するのに対し、この領域外で生ずる突然変異は、散在性のポリープ（ｃｍ２ 毎に１０ 未満）の観察に関する［Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２： ４０５５（１９９２）］ 。さらに、突然変異が５ ’からエキソン９ までで生ずる場合、ＦＡＰ に関連する眼底損傷はほとんど存在しない［Ｏｌｓｃｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７５： ９５９（１９９３）］ 。最後に、第５ エキソンの前で生ずるＡＰＣ 突然変異により、ポリポーシスのより軽い形態および腫瘍形成の後の発症が起こる。ＡＰＣ 突然変異が細胞学的変化および表現型の相違を起こす機構をさらに洞察するには、結腸上皮細胞および他の細胞タイプにおいてＡＰＣ が実際に果たす役割の決定が必要である。
【００６８】
ＦＡＰ におけるＡＰＣ 遺伝子の突然変異の多くは、細胞中で切断されたＡＰＣ タンパク質を生ずる新しい停止コドンを産生するので、発現された全長ＡＰＣ タンパク質の量は減少ずると仮説を設けた。したがって、ＡＰＣ 突然変異を検出する方法は、全長遺伝子産物の５０ ％減少したレベルを検出する簡単な免疫学的検定法に基づく。したがって、野生型に加えて突然変異対立遺伝子を含む、ＡＰＣ 遺伝子座に異なる対立遺伝子を有する細胞において、前記仮説により、そのような異型接合体は、全長ＡＰＣ タンパク質のレベルの５０ ％しか有しないということが予測される。
【００６９】
この仮説をテストするために、定量的免疫沈降分析を使用して、ＦＡＰ 患者からの細胞を、抗ＡＰＣ 抗体と共に「モデル」システムとして使用した［Ｂｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２０６： ９０９（１９９５）； Ｃｈｏｐ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １５：９９１（１９９５）］ 。以下の実施例１により該仮説が立証され、生殖細胞系においてＡＰＣ 突然変異を保有する個体を診断するための臨床的に有用なアッセイを発達させることができることの証拠が提供される。
【００７０】
本発明の免疫学的検定法は、全長ＡＰＣ タンパク質のレベルを検出する。ウェスタンブロットにおいてより低い分子量の位置に移動することにより決定されるものとして、切断されたＡＰＣ タンパク質を同定する方法がとられてきた［Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．，  「正常および腫瘍細胞中のＡＰＣ 遺伝子産物」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９０： ２８４６−２８５０（１９９３）］ 。切断されたＡＰＣ タンパク質の分子量は、突然変異部位の配置において有用な情報を提供するが、多くの短くなったＡＰＣ タンパク質は不安定であり、ウェスタンブロットにおける検出を妨げる［Ｉｄ．］ 。例えば、ウェスタンブロット分析は、タンパク質切断を引き起こすＡＰＣ 突然変異を含有するとして以前同定された７ つのＦＡＰ リンパ芽球細胞系の３ つにおける切断されたＡＰＣ タンパク質に対応するより低い分子量バンドを検出できなかった［Ｉｄ．］ 。本発明のアッセイは、切断されたＡＰＣ タンパク質を検出しないが、残っている全長ＡＰＣ タンパク質の存在および量を測定する。
【００７１】
免疫学的方法を、どうやって生殖細胞系突然変異の検出のための他の分子遺伝学的方法と比較するか疑問かもしれない。ＡＰＣ 突然変異がすてに特徴付けられているＦＡＰ 家系において、関連した突然変異について直接テストする分子遺伝学的方法を使用して簡単におよび正確に、病気に冒されている構成員においてこれらの突然変異を容易に検出および同定することができる。したがって、分子遺伝学的テストを使用して、そのような家族において危険性のある構成員を、生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異を有するまたは有しないとして正確に診断することができる。それにもかかわらず、免疫学的検定法は実際的であるので、ＡＰＣ 突然変異がすでに同定されている既知のＦＡＰ 家系の病気に冒されている構成員の診断において補足的なテストとして有用である。
【００７２】
対照的に、おもに単一の塩基対変化、小さい挿入、および小さい欠失を含む様々の生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異はＡＰＣ 遺伝子の大部分に分布することが知られているので、未知のＡＰＣ 突然変異は、まだ調査されていないＦＡＰ 発端者、隔離患者および家系において検出するのがずっと困難である［Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。また、ＡＰＣ コード領域のサイズが大きいこと（８５３５ 塩基対）により、遺伝子配列決定による突然変異の同定は、非常に困難で、大きな労力を必要とし、費用がかかる。したがって、ＡＰＣ 遺伝子内の突然変異の位置を検出および同定するための他の技術が発達し使用された。
【００７３】
そのような技術には、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ） 、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ） 分析およびＲＮＡ アーゼ保護分析が含まれる。ＦＡＰ 患者においてＡＰＣ 突然変異を検出するためのこれらの技術の感度は、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，  「家族性腺腫様ポリポーシスの分子的診断」 Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２９： １９８２−１９８７（１９９３） に記載されるように、使用される方法に依存してわずかに３０ −７０％ である。インビトロにおいて合成されたＡＰＣ 翻訳産物の分析を含むＡＰＣ 突然変異を検出するために発達したより新しい技術は、わずかに良い感度を有するに過ぎない［Ｉｄ．； ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｉｊｔ ｅｔ ａｌ．，  「直接のタンパク質切断テストによる結腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ） 遺伝子における翻訳を終了させる突然変異の急速な検出」 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２０： １−４（１９９４）］ 。さらに別の新しいアッセイには、クローン化されたＡＰＣ 遺伝子断片と共にフレームに挿入されたβ−ガラクトシダーゼコード配列を使用する急速比色法が含まれる［Ｖａｒｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，  「ナンセンスおよびフレームシフト突然変異を検出するための急速なスクリーニング方法：病気を引き起こすＡＰＣ 対立遺伝子の同定」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３： ５５８１−５５８４（１９９３）］ 。しかしながら、臨床的設定におけるこの後者の技術の感度は、まだ測定していない。
【００７４】
上述の分子遺伝学的方法の多くは、単一の塩基対変化、小さい挿入、および小さい欠失および／または翻訳を終了させる突然変異の検出を目的とする。しかしながら、いくつかの例において、全ＡＰＣ 遺伝子の欠失がＦＡＰ 患者の生殖細胞系において起こり［Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，  「５ｑ の間質性欠失を有するヒトにおけるガードナー症候群」Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２５： ４７３−４７６（１９８６）； Ｊｏｓｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，  「家族性ポリポーシス遺伝子座における欠失突然変異および３ つの遺伝子の同定」Ｃｅｌｌ， ６６：６０１−６１３（１９９１）； Ｇｒｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，  「腺腫様ポリポーシスを有する患者の突然変異分析：血縁でない個体における突然変異の同一不活性化」 Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５２： ２６３−２７２（１９９３）］ 、これは分子遺伝学的方法によって見落とされるイベントである。さらに、正常な転写のレベルを減少させるプロモーターまたはスプライシングの突然変異を有するＦＡＰ 患者もいる［Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， ｓｕｐｒａ］ 。したがって、ある最近の分子遺伝学的方法は、生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異の検出において８９ ％の改良された感度を共に有する、インビトロで合成されるＡＰＣ 翻訳産物の分析によるＡＰＣ の切断を引き起こす突然変異の分子的検出と、対立遺伝子特異的発現アッセイとを組み合わせた［Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， ｓｕｐｒａ］ 。
【００７５】
例えばＡＰＣ のような全長遺伝子産物のレベルを測定できることに基づく本発明の免疫学的検定法の予想される感度は、例えばＡＰＣ 生殖細胞系突然変異のような生殖細胞系突然変異の存在の検出においてほぼ１００ ％である。この方法は、タンパク質切断並びに対立遺伝子発現の喪失を含む突然変異の検出において重要である。
【００７６】
全体的に、細胞中の全長ＡＰＣ タンパク質の量を測定するための免疫沈降分析は、ＦＡＰ 患者において異型接合状態で存在する生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異の検出において特に有用である。他の分子的テストを使用することができるが、本発明の免疫学的検定法は、比較的簡単で、信頼でき、費用がかからないので、および全長遺伝子産物の検出により他のアッセイの欠点が開比されるので、多くの利点を有する。本発明の免疫学的検定法は、多くの病因または病理学研究室において実施が比較的容易である。さらに、ＡＰＣ−１ およびＡＰＣ−２ 以外の多くの抗ＡＰＣ 抗体を利用できる。本発明の免疫学的検定法の予想される感度は非常に高いので、このアッセイは、所定のＦＡＰ 家系において以前に特徴付けられたＡＰＣ 突然変異を検出し、そのような家族における病気に冒された構成員を評価することを目的とする分子遺伝学に基づく他の方法の増加にも有用である。
【００７７】
さらに、全長ＡＰＣ タンパク質についての免疫学的検定法は、別な方法では診断が困難な個体群である、まだ調査されていないＦＡＰ 発端者、隔離患者および家系における、以前は未知のＡＰＣ 突然変異の検出において特に有用である。ＦＡＰ 患者についての本発明の発見の最大の価値は、全長ＡＰＣ レベルの免疫学的検定法により臨床的背景において有用な役割を発見する場合に認識される。この場合、予防的方法（例えば結腸切除）を行って、生殖細胞系に有害な突然変異体のＡＰＣ 対立遺伝子を保有すると同定される個体群において結腸直腸癌が発生することを予防できる［Ｂｏｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎ，  「家族性ポリポーシス」 Ｈｏｓｐ． Ｐｒａｃｔ．， ２１： １５５−１７０（１９８６）； ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．  「家族性結腸ポリポーシス：遺伝的性質、サーベイランスおよび治療」 Ｎｅｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ．， ７３： ３２９−３３４（１９８８）］ 。
【００７８】
ＰＢＬ中のタンパク質レベルを分析するための技術
ヒト血液の小さいサンプル（２０ｍＬ）からのリンパ球の精製
リンパ球を単離するための市販されている方法は、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ （登録商標）ＣＰＴＴＭ 単核細胞精製チューブ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ； Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ） のものである。血液をＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ （登録商標）チューブに入れ、遠心させる。チューブ中のゲルの境界により、底部の遠心されたＲＢＣ および好中球と上部のリンパ球および単球とが分離される。
【００７９】
タンパク質抽出
精製されたリンパ球からタンパク質を抽出する方法を、定量的および再現可能に設定し、免疫学的技術によりアッセイ可能なタンパク質を生ずる。タンパク質抽出方法の例は以下のようである。サンプルを５ｍＬ のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ） で１ −２ 回洗浄し、４ ℃で１０ 分間２０００ｒｐｍ で遠心する。細胞を溶解するために、１ ×強度のＳＤＳ ゲルローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ ６．８］ 、１００ｍＭ ジチオスレイトール［ 新鮮なＤＴＴ］ 、２％ ＳＤＳ 、０．１％ ブロモフェノールブルー、１０％ グリセロール）をそれぞれの洗浄したペレット（培養した結腸癌について１ｍＬ 、リンパ球およびリンパ芽球細胞について２００ μＬ ）に加える。細胞を完全に混合し（ボルテックス）、沸騰水中に配置する（１０ 分間）。次に細胞をミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．； Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ） 中で１０ 分間遠心し、不溶性の物質を沈殿させ、捨てる。
【００８０】
他の全長タンパク質についての免疫学的検定法
本発明の免疫学的検定法を利用して、タンパク質切断の原因となる（生殖細胞系および後天性）または対立遺伝子タンパク質発現欠如の原因となる突然変異による多くの他の遺伝性および遺伝学的な疾患（癌および癌以外）に関連する全長（野生型）タンパク質を測定できる。例として、切断されたタンパク質または対立遺伝子喪失の原因となる突然変異を受ける以下の対立遺伝子がある。
【００８１】
野生型標的タンパク質を検出および定量するための本発明のアッセイを、標的タンパク質に対する抗体が市販されている場合、抗体を使用して発展することができる。標的タンパク質に対するそのような抗体が市販されていない場合、または標的タンパク質に対する市販されている抗体が適切でない場合、従来の方法により標的タンパク質に対する適切な抗体を調製できる［ 以下の表題「抗体」を参照］ 。本発明の好ましい例としての免疫学的検定法の形式は、サンドイッチ型の、ビーズ結合免疫学的検定法である。
【００８２】
１．ＢＲＣＡ１ 遺伝子中の突然変異は、乳癌のある遺伝性形態の原因である［Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ ＦＢＬ， Ｃｏｒｎｅｌｉｓ ＲＳ， Ｂｏｕｔ Ｍ， ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｍ， Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ ＪＣ， Ｏｌｍｅｒ Ｒｅｎｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，  “タンパク質切断テストによるＢＲＣＡ１ 突然変異の素早い検出” Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０： ２０８−２１２（１９９５）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｒｘ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｉｒｘ＿ｄｏｃ？ｇｅｎｂａｎｋ］ 。ｍＲＮＡ は５７１１ 塩基対の長さであり、染色体１７ｑ２１ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは９０ ％である［Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， ｓｕｐｒａ］ 。ＢＲＣＡ１ タンパク質に対するモノクローナル抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社［Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ およびＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｔｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００８３】
２．ＢＲＣＡ２ 中の突然変異は、乳癌のある遺伝性形態の原因である［Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｊ．Ｍ．， Ｗｏｏｓｔｅｒ， Ｒ．， Ｍａｎｇｉｏｎ， Ｊ．， Ｐｈｅｌａｎ， Ｃ．Ｍ．， Ｃｏｃｈｒａｎ， Ｃ．， Ｇｕｍｂｓ， Ｃ． ｅｔａｌ．，  “一次乳癌および卵巣癌におけるＢＲＣＡ２ 突然変異” Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １３： ２３８−２４０（１９９６）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は１０，９８７ 塩基対の長さであり、染色体１３ｑ１２−ｑ１３ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは９０ ％である［Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＢＲＣＡ２ タンパク質に対するポリクローナル抗体は、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ 社［Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｔｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００８４】
３．ＡＴＭ 遺伝子中の突然変異は、毛細管拡張性運動失調の原因である［Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｍ．Ｇ．， Ｂｅａｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｈｅｇｄｅ， Ｓ．Ｒ．， Ｕｎｓａｌ， Ｈ．， ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｄ．Ｊ．， Ｈａｒｋｉｎ， Ｄ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，  “異型接合体ＡＴＭ 突然変異は、乳癌の初期段階の一因ではない” Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １５： ３０７−３１０（１９９７）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は９３８５ 塩基対の長さであり、染色体１１ｑ２２−ｑ２３ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは９０ ％である［Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＡＴＭ タンパク質に対する抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ 社［Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ（ＵＫ）］ から市販されている。
【００８５】
４．ＣＦＴＲ 遺伝子中の突然変異は、膵嚢胞性繊維症の原因である［Ｒｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，  “逆転写ポリメラーゼ連鎖反応技術およびタンパク質切断テストの使用によるリンパ球中のＣＦＴＲ フレームシフト突然変異の転写分析” Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ９８： ３２８−３３２（１９９６）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は６１２９ 塩基対の長さであり、染色体７ｑ３１．３ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは１５ ％である［Ｒｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＣＦＴＲ タンパク質に対する市販されている抗体は、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００８６】
５．ＤＭＤ 遺伝子中の突然変異は、デュシェーヌ筋ジストロフィーの原因である［Ｒｏｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，  “翻訳を終了させる突然変異を素早く検出するためのタンパク質切断テスト（ＰＴＴ） ” Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２： １７１９−１７２１（１９９３）； Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，  “逆転写ＰＣＲ およびタンパク質切断テストの使用によるデュシェーヌ筋ジストロフィー患者における点突然変異の同定” Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５７： ３１１（１９９５）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は２１１０ 塩基対の長さであり、染色体ｘｐ２１．３−ｐ２１．１ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは９５ ％である［Ｒｏｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＤＭＤ タンパク質のカルボキシ末端部に対する抗体は、Ｂｉｏｍｅｄｉａ 社［Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ 社［Ｓａｎｄｏｗｎ， ＮＨ（ＵＳＡ）］ 、およびＢｉｏｇｅｎｉｘ Ｌａｂｓ［Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。ＤＭＤ タンパク質のＮ 末端部に対する抗体もまた、これらの会社から市販されている。
【００８７】
６．ＥＭＤ 遺伝子中の突然変異は、エメリー−ドライフス筋ジストロフィーの原因である［Ｌｅｉｄｅｎ， ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ ｃｉｔｅｄ ｉｎ Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ， Ｆ．Ｂ．Ｌ．， ”タンパク質切断テスト” Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ， ６２： ７−１４（１９９７）］ 。ｍＲＮＡ は５０３ 塩基対の長さであり、染色体Ｘｑ２８ 上に位置する。タンパク質切断を有する症例のパーセンテージは８０ ％である［Ｌｅｉｄｅｎ， ｓｕｐｒａ］ 。ＥＭＤ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００８８】
７．ＦＡＡ 遺伝子中の突然変異は、ファンコーニ貧血の原因である［Ｌｏ Ｔｅｎ Ｆｏｅ ｅｔ ａｌ．，  “主要なファンコーニ貧血遺伝子であるＦＡＡ についてのｃＤＮＡ の発現クローニング” Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， １４： ３２０−３２３（１９９６）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は５５０３ 塩基対の長さであり、染色体１６ｑ２４．３ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは８０ ％である［Ｌｏ Ｔｅｎ Ｆｏｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＦＡＡ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００８９】
８．ＩＤＳ 遺伝子中の突然変異は、ハンター症候群の原因である［Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５５： Ａ２２３（１９９４）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は３６８４５ 塩基対の長さであり、染色体ｘｑ２７．３−ｑ２８ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは〜５０ ％である［Ｈｏｇｅｒｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）， ｓｕｐｒａ］ 。ＩＤＳ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００９０】
９．ＮＦ１ 遺伝子中の突然変異は、神経繊維腫症タイプＩ の原因である［Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，  “切断されたＮＦ１ タンパク質についてのスクリーニング” Ｎｅｔ． Ｇｅｎｅｔ． ８： ２１８−２１９（１９９４）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は９０２６ 塩基対の長さであり、染色体１７ｑ１１．２ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは５０ ％である［Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＮＦ１ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００９１】
１０．ＮＦ２ 遺伝子中の突然変異は、神経繊維腫症タイプＩＩ の原因である［ＭａｃＣｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，  “神経繊維腫症２ を有する患者の突然変異分析” Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５５： ３１４（１９９４）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は３３９ 塩基対の長さであり、染色体２２ｑ１１−ｑ１３．１ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは６５ ％である［ＭａｃＣｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ］ 。ＮＦ２ タンパク質に対する抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ［Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＫＹ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００９２】
１１．ＰＫＤ１ 遺伝子中の突然変異は、多発性嚢胞腎症の原因である［Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，  “多発性嚢胞腎症１ 遺伝子は、１４ｋｂ の転写物をコードし、染色体１６ 上の重複領域内に存在する” Ｃｅｌｌ， ７７： ８８１−８９４（１９９４）； Ｒｏｅｌｆｓｅｍａ ａｎｄ Ｂｒｅｕｎｉｎｇ（Ａｂｓｔｒａｃｔ）， Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．： Ａ２４０（１９９４）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は５３５２２ 塩基対の長さであり、染色体１６ｐ１３．３ 上に位置する。突然変異を起こすタンパク質切断を有する症例のパーセンテージは９５ ％である［Ｒｏｅｌｆｓｅｍａ ａｎｄ Ｂｒｅｕｎｉｎｇ， ｓｕｐｒａ］ 。ＰＫＤ１ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００９３】
１２．ＰＴＣＨ 遺伝子中の突然変異は、母斑様基底細胞癌の原因である［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，  “基底細胞母斑症候群についての候補遺伝子であるパッチ物のヒト相同体” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７２， １６６８−１６７１（１９９６）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は６５６８ 塩基対の長さであり、染色体９ｑ２２／３ 上に位置する。ＰＴＣＨ 遺伝子中の突然変異は、タンパク質を切断し得ることが知られている［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ８５： ８４１−８５１（１９９６）； Ｇａｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．， １４： ７８−８１（１９９６）； Ｕｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６： ４５６２−４５６５（１９９６）； およびＷｉｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ６０： ２１−２６（１９９７）］ 。ＰＴＣＨ タンパク質に対する抗体は、市販されているものとしてＬｉｎｓｃｏｔｔ の索引に記載されていない。
【００９４】
１３．ｃ−ｍｙｂ 遺伝子中の突然変異は、血液内悪性腫瘍の原因である［Ｂａｄｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８（７）： ７７０−７８２（１９９４）； Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（２３）： １３４８４−１３４９６（１９９６）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は４０４３３ 塩基対の長さであり、染色体６ｑ２２ 上に位置する。この遺伝子中の突然変異はタンパク質切断を起こし得ることが知られている［Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，  “ヒト白血性細胞系ＴＫ−６ 中の切断されたｃ−ｍｙｂ 発現” Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １２： １４２２−１４９９（１９９８）； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，  “急に始まるＢ 細胞リンパ腫におけるｃ−ｍｙｂ 遺伝子産物の最小切断” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７１： ６５２６−６５３３（１９９７）］ 。ｃ−ｍｙｂ タンパク質に対する抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社［Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００９５】
１４．ＶＨＬ 遺伝子中の突然変異は、リンダウ病の原因である［Ｌａｔｉｆ ｅｔ ａｌ．，  “リンダウ病腫瘍抑制遺伝子の同定” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０： １３１７−１３２０（１９９３）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は１４５４３ 塩基対の長さであり、染色体３ｐ２５ 上に位置する。この遺伝子中の突然変異はタンパク質切断を起こし得ることが知られている［Ｏｌｓｃｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，  “リンダウ病および散在性血管芽細胞腫中のＶＨＬ 遺伝子の生殖細胞系突然変異特性” Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ， １２： ４２４−４３０（１９９８）； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，  “リンダウ病遺伝子産物の亜細胞性局在は、細胞周期依存性である” Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ７８： ６２−６９（１９９８）； Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，  “リンダウ病における表現型発現−生殖細胞系ＶＨＬ 遺伝子突然変異との相関” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３３： ３２８−３３２（１９９６）； Ｃｒｏｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，  “リンダウ病腫瘍抑制遺伝子における遺伝子内突然変異の同定および病気の表現型との相関” Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３： １３０３−１３０８（１９９４）； Ｓｈｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，  “頻繁な体細胞突然変異および一次ヒト腎細胞癌におけるリンダウ病腫瘍抑制遺伝子の異型接合の喪失” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ２８５２−２８５５（１９９４）］ 。リンダウ（ＶＨＬ） 病は、優性遺伝性家族性癌症候群であり、網膜、小脳および脊髄性血管芽細胞腫、腎細胞癌、褐色細胞腫および膵臓癌になりやすい［Ｇｌａｖａｖｃ ｅｔ ａｌ．，  “ＶＨＬ 腫瘍抑制遺伝子中の突然変異および中央ヨーロッパからのリンダウ病を有する家族における関連する病巣” Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ９８（３）： ２７１−２８０（１９９６）］ 。対立遺伝子喪失およびＶＨＬ 遺伝子の突然変異は、散在性腎細胞癌 ［Ｂｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，  “ヒッペル−ランドー症候群および散在性腎細胞癌” Ｐａｔｈｏｌｏｇｅ， １６（５）： ３２１−３２７（１９９５）］  および小脳血管芽細胞腫［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，  “散在性小脳血管芽細胞腫におけるリンダウ遺伝子の異型接合および突然変異の喪失” Ｐｒｏｃ． Ａｎｎｕ． Ｍｅｅｔ． Ａｍ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ３８： Ａ３６００（１９９７）］ に関係するのと同様に腫瘍発生に関係することが示されている。タンパク質に対する抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） およびＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ［Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００９６】
１５．Ｅ− カドヘリン（ＨＳＥＣＡＤ） 遺伝子中の突然変異は、乳癌および結腸癌の原因である［Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，  “ヒトＥ− カドヘリンｃＤＮＡ の分子クローニングおよび特徴付け” Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．， １７： １２３−１２８（１９９３）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は２４８ 塩基対の長さであり、染色体１６ｑ２２．１ 上に位置する。この遺伝子中の突然変異は、タンパク質を切断し得ることが知られている［Ｇｕｉｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，  “家族性胃癌におけるＥ− カドヘリン生殖細胞系突然変異” Ｎａｔｕｒｅ， ３９２： ４０２−４０５（１９９８）； Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，  “胸部におけるインサイチュの小葉癌中のＥ− カドヘリン不活性化：腫瘍形成の初期イベント” Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ７６： １１３１−１１３３（１９９７）； Ｂｅｒｘ ｅｔ ａｌ．，  “Ｅ− カドヘリンは、細胞外領域における切断突然変異により多くの侵入性ヒト小葉乳癌において不活性化される” Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １３： １９１９−１９２５（１９９６）； Ｂｅｒｘ ｅｔ ａｌ．，  “Ｅ− カドヘリンは、ヒト小葉乳癌において突然変異される腫瘍侵入抑制遺伝子である” ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １４： ６１０７−６１１５（１９９５）］ 。Ｅ− カドヘリンタンパク質に対する抗体は、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ［Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ Ｌａｂｓ［Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ［Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ， ＭＡ） 、およびＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ＳＡ［Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ］ から市販されている。
【００９７】
１６．ｐ１６ 遺伝子（ＣＤＫＮ２Ａ 腫瘍抑制遺伝子およびＭＴＳ１ 遺伝子としても知られる）中の突然変異は、家族性黒色腫の原因である［Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，  “家族性黒色腫中の生殖細胞系ｐ１６ 突然変異” Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８： １５（１９９４）； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ， ｓｕｐｒａ］ 。ｍＲＮＡ は４２２ 塩基対の長さであり、染色体９ｐ２１ 上に位置する。この遺伝子中の突然変異は、タンパク質を切断し得ることが知られている［Ｍｏｎｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，  “多発性一次黒色腫中のＣＤＫＮ２Ａ 突然変異” Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３８（１３）： ８７９−８８７（１９９８）］ 。Ｐｐ１６ タンパク質に対する抗体は、Ａｌｅｘｉｓ 社［Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ［Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ およびＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ から市販されている。
【００９８】
自動化免疫学的検定法システム
本発明の方法は、自動化免疫学的検定法分析に容易に適合できる。本発明の方法の自動化を容易にするためにおよび所要時間を短くするために、本発明の免疫学的検定法において捕捉抗体を磁気粒子に結合してもよい。
【００９９】
Ｄｙｎａｌ 社［Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ， ＮＹ（ＵＳＡ）］ からのＭ−２８０ ヒツジ抗ウサギＩｇＧ コーティングＤｙｎａｂｅａｄｓ （登録商標）および標的タンパク質に対するウサギ抗体のような市販されている技術を使用することにより、またはＤｙｎａｌ 社からのＭ−４５０ トシル活性化Ｄｙｎａｂｅｓｄｓ を使用し関連抗体を共有結合させることにより、抗体をそのような磁気ビーズに結合できる。あるいは、グルタルアルデヒドのような試薬を使用して、対象抗体を固体支持体、好ましくは磁気粒子に共有結合させてもよい。結合剤の例には、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンのような有機化合物が含まれる。
【０１００】
標的野生型遺伝子産物および関連タンパク質は、例えば定量的な磁気ビーズに基づく、サンドイッチ型の免疫学的検定法で定量することができる。そのようなアッセイは、市販されている自動化免疫学的検定法システムに統合できる。
【０１０１】
好ましい自動化／免疫学的検定法システムは、ＡＣＳ：１８０ （登録商標）自動化化学発光システム［Ｂａｙｅｒ 社； Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ およびＭｅｄｆｉｅｌｄ， ＭＡ（ＵＳＡ）； ＡＣＳ：１８０ ＰＬＵＳ システム； ＡＣＳ：１８０ ＳＥ システム； およびＡＣＳ： ＣＥＮＴＡＵＲ （登録商標）システムを含む］ である。ＡＣＳ：１８０ （登録商標）自動化免疫学的検定法システムは、Ｄｕｄｌｅｙ， Ｂ．Ｓ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， １４（２）： ７７（Ｓｕｍｍｅｒ １９９１） に記載されている。該システムは、トレーサーとして化学発光標識をおよび固相試薬として常磁性粒子（ＰＭＰ） を使用する。ＡＣＳ：１８０ システムは、競合結合およびサンドイッチ型アッセイを適応させ、それぞれの工程は自動化されている。ＡＣＳ：１８０ は、利用可能な表面積を最大にするミクロンのサイズの常磁性粒子を使用し、遠心分離せずに結合したトレーサーを結合していないトレーサーと急速に磁気で分離する方法を提供する。試薬は、同時にまたは連続的に加えてもよい。酵素的標識のような他の標識を、アクリジニウムエステルのような化学発光標識の代わりに使用してもよい。化学発光シグナルは、好ましくはルミノメーターにより検出する。また好ましいのは、Ｂａｙｅｒ Ｉｍｍｕｎｏ １ （登録商標）免疫学的検定法システムである。
【０１０２】
そのような自動化免疫学的検定法システムについての対照は、ここに記載されるＭＭＲ タンパク質についてのウェスタンブロット分析について使用されるものにより例示される。ポジティブコントロールは、健康な正常体からの細胞系でもよい。ネガティブコントロールは、突然変異遺伝子産物についての同型接合であることが知られている細胞系、例えばＨＣＴ１１６ 細胞（突然変異ＭＬＨ１ タンパク質についての同型接合）およびＬｏＶｏ 細胞（突然変異ＭＳＨ２ タンパク質についての同型接合）でもよい。
【０１０３】
ＭＬＨ１ および／またはＭＳＨ２ のような全長遺伝子産物を検出および定量するための自動化免疫学的検定法形式の例には、以下のものが含まれる：（１）磁気ビーズに結合した、遺伝子産物に特異的な、例えば該遺伝子産物のアミノ末端に特異的な第一の一次抗体；（２）細胞溶解産物を前記第一の一次抗体によりコーティングされた前記磁気ビーズと共にインキュベートし；（３）非特異的結合を減少させるために洗浄し；（４）全長遺伝子産物のカルボキシル末端に特異的な大にの一次抗体であって、直接標識されている、このましくは化学発光標識されている抗体；および（５）前記標識から、シグナルレベルが前記細胞溶解産物中の遺伝子産物の量に比例するシグナルを検出および定量する。遺伝子産物のカルボキシル末端に特異的な抗体につながったレポーターシステムは、定量されるのが全長タンパク質である場合に好ましい。
【０１０４】
前記基礎自動化免疫学的検定法形式に対する様々の変更は、当業者により容易に考えられる。例えば、そのようなアッセイ形式を変更して、例えばＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ のような二つの遺伝子産物、または例えばＡＰＣ およびチューブリンのような遺伝子産物および関連タンパク質、またはβ−アクチンまたはＧＡＰＨ を、同じ細胞溶解産物サンプル中で、好ましくは同時に、検出および定量できる。概説された形式の例において、二つの抗体のセットを使用し、それぞれのセットは標的タンパク質上の異なるエピトープを認識する二つの一次抗体を含む。
【０１０５】
ＭＳＨ２／ＭＬＨ１自動化免疫学的検定法の例
全長ＭＳＨ２ タンパク質を検出および定量するために、例えばＭＳＨ２ のアミノ末端に対するマウスの抗ＭＳＨ２ ＭＡｂ を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ （登録商標）（Ｍ−４５０ トシル活性化； Ｄｙｎａｌ 社）のようなビーズに共有結合させてもよい。前記モノクローナル抗体に結合されたビーズを細胞溶解産物と共にインキュベートし、その後洗浄する。次に前記洗浄されたビーズを、例えば第二の一次抗体として、ＭＳＨ２ のカルボキシル末端に対するマウスＭＡｂ のような、マウスの抗ＭＳＨ２ 、ＡＢ１ と共にインキュベートする。
【０１０６】
同様に、ＭＬＨ１ に対するウサギポリクローナル（例えばＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ からのＡＢ２ ）のような抗ＭＬＨ１ 抗体を、Ｍ−２８０ ヒツジ抗ウサギＩｇＧ コーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ （登録商標）に結合してもよい。第二の一次抗体は、突然変異体ＭＬＨ１［Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６： ４８３６（１９９６）］ ではなく全長ＭＬＨ１ に結合するマウスの抗ＭＬＨ１ ＭＡｂ［ 例えばＣｌｏｎｅ Ｇ１６８−７２８； ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）］ でもよい。
【０１０７】
ＭＬＨ１／ＭＳＨ２ アッセイの結果、単一のサンプルにおける、好ましくは細胞溶解産物サンプルにおける、より好ましくは結腸腫瘍（腺腫、癌）を有する被験者のＰＢＬ から、または結腸腫瘍を有する被験者および対照の被験者の家族構成員からの溶解産物における、ＭＬＨ１ 対ＭＳＨ２ の全長タンパク質レベルの割合、または野生型タンパク質対関連タンパク質のレベルの割合が得られる。異常なＭＬＨ１／ＭＳＨ２ は、発現する野生型の、全長遺伝子産物の量が減少することが示される遺伝子中の突然変異を示す。
【０１０８】
抗体
「抗体」という用語はここで、抗体全体、並びに抗体の生物活性断片、好ましくは抗原結合領域を含有する断片を含むと定義される。さらに抗体の定義には、二重特異性抗体が含まれる。
【０１０９】
本発明の抗体は好ましくは、従来の方法によりおよび／または遺伝子工学により調製してもよい。抗体断片は、好ましくは超可変領域を含む軽鎖および／または重鎖の可変領域（ＶＨ およびＶＬ） から、およびさらに好ましくはＶＨ およびＶＬ の両方から遺伝的に処理してもよい。例えば、ここで用いたように「抗体」という用語には、特に「一価」抗体［Ｇｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９５： ７１２（１９８２）］ ；共有結合したまたは共有結合していないＦａｂ ’およびＦ（ａｂ ’）２ 断片を含むＦａｂ タンパク質；軽鎖または重鎖のみ、好ましくは可変重鎖および軽鎖領域（ＶＨ およびＶＬ 領域） を含み、より好ましくは超可変領域［ さもなければ前記ＶＨ およびＶＬ 領域の相補性決定領域（ＣＤＲ） として知られる］ ；Ｆｃ タンパク質；一つ以上の抗原を結合できる「ハイブリッド」抗体；恒常可変領域キメラ；異なる起源の重鎖および軽鎖を有する「合成」免疫グロブリン；一般的なっ組換え技術およびオリゴヌクレオチド有向突然変異誘発技術により調製された改良された特異性および他の特性を有する「変化した」抗体［Ｄａｌｂａｄｉｅ− ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ７９： ６４０９（１９８２）］ を含む、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびその生物学的活性断片が含まれる。
【０１１０】
二重特異性抗体は、所望の特異性の二つの抗体を化学的に結合することにより産生できる。二重特異性ＭＡｂ は好ましくは、二つのハイブリドーマの体細胞ハイブリダイゼーションにより発生できる。二つの標的タンパク質を標的とするための二重特異性ＭＡｂ は、一つの標的の特異的ＭＡｂ を産生するハイブリドーマを別の標的タンパク質に特異的なＭＡｂ を産生するハイブリドーマと融合することにより産生できる。生じたクアッドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ） をスクリーニングして、親のＭＡｂ の特異性を有するハイブリッド抗体を産生するクアッドローマを選択することができる。
【０１１１】
免疫学的検定法の分野でよく知られる、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するための従来技術が存在する［ 例えば、Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  “モノクローナル抗体の調製：方法および工程” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７３： １−４６（Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｖａｎａｔｉｓ （ｅｄｓ）； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； １９８１）； ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７（１９７５）］ 。本発明のための特異的なモノクローナル抗体は、適切な哺乳類、好ましくは必要ならキャリアタンパク質に結合した、適切な免疫抗原を有するネズミ、より好ましくはウサギ、ラット、またはマウスを免疫化することにより調製できる。本発明のアッセイにおいて有用な特に好ましい抗体は、対象野生型タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端上のエピトープに方向付けられたネズミモノクローナル抗体である。
【０１１２】
本発明のハイブリドーマの例は、ネズミ細胞系の融合により形成することができ、ヒト／ヒトハイブリドーマ［Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ７７： ５４２９（１９８０）］ およびヒト／ネズミハイブリドーマ［Ｓｃｈｌｏｍ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ７７： ６８４１（１９８０）； Ｓｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４６： ９２８−９３５（１９９１）； ａｎｄ Ｇｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ８８： ４１８１−４１８５（１９９１）］ を特に調製することができる。
【０１１３】
抗ペプチド抗体もまた、欧州特許公報第４４，７１０ 号（１９８２ 年１ 月２７ 日に刊行された）に記載されているように当該技術における従来の方法により作製される。簡単に言えば、そのような抗ペプチド抗体は、標的のアミノ酸配列からペプチドを選択し、化学的に合成し、適切な免疫原性タンパク質に結合させ、適切な動物、通常ウサギまたはマウス中に注射することにより調製される；次に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、後者を例えばＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ 法により作製する。
【０１１４】
従来のハイブリドーマ技術の他に、より新しい技術を使用して、本発明による抗体を産生することができる。例えば、抗体Ｖ 遺伝子をクローン化し発現するためのＰＣＲ を使用することによりおよび結合活性を有する断片をコードする抗体遺伝子を選択するためのファージ表示技術を使用することにより、免疫化されたマウスまたはヒトを使用するＰＣＲ 増幅されたＶ 遺伝子のレパートリーから抗体断片が単離される［ 参考のためＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０： ７７９（１９９２ 年７ 月）； Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７（４）： ３６０（１９８９）； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ５４４（１９８９ 年１０ 月）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１（１９９１）； Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２（１９９１ 年８ 月１５ 日）； ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ８７： ８０９５（１９９０ 年１０ 月）］ 。
【０１１５】
生物学的活性抗体断片を含むとここで定義される用語である、組換え技術により抗体を調製するための方法の記載は、米国特許第４，８１６，５６７ 号（１９８９ 年３ 月２８ 日に出願された）；欧州特許出願公開番号（ＥＰ） 第３３８，７４５ 号（１９８９ 年１０ 月２５ 日に出願された）；同第３６８，６８４ 号（１９９０ 年５ 月１６ 日に出願された）；同第２３９，４００ 号（１９８７ 年９ 月３０ 日に出願された）、国際特許出願公開第９０／１４４２４ 号（１９９０ 年１１ 月２９ 日に出願された）；同第９０／１４４３０ 号（１９９０ 年５ 月１６ 日に出願された）；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５（Ｄｅｃ． ８， １９８９）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０： ７７９（Ｊｕｌｙ １９９２）； Ｌａ Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ８６： ５７２８（Ａｕｇｕｓｔ １９８９）； Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ７（４０）： ３６０（１９８９）； Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ８６： ３８３３（Ｍａｙ １９８９）； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ５４４（Ｏｃｔｏｂｅｒ １２， １９８９）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１（１９９１）； ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９（１５）： ４１３３（１９９１） に見ることができる。
【０１１６】
固相
本発明のアッセイにおいて使用できる固相は、免疫学的検定法において通常使用される任意の表面でよい。例えば、固相は粒子からなってもよい；例えばガラス、ポリスチレンビーズのようなビーズの表面でもよい；または、例えば遠心分離管、カラム、マイクロタイタープレートウェル、フィルタ、膜およびチューブのような任意の様々の容器の固体の壁面でもよい。
【０１１７】
固相として粒子を使用する場合、約０．４ から２００ ミクロンまで、通常は約０．８ から４．０ ミクロンまでの範囲のサイズであることが好ましい。磁性または磁化可能な粒子は好ましい粒子からなる固相であり、マイクロタイタープレートウェルは好ましい固体壁面である。磁性または磁化可能な粒子は、本発明の方法の工程を自動化免疫学的検定法システムにおいて行う場合に特に好ましい。
【０１１８】
標識
適切なら、本発明の免疫学的検定法においてトレーサーとして使用される抗体を、可視のまたは可視にできるシグナルを生ずる任意の方法で、直接または間接に標識してもよい。検出可能なマーカー物質には、３Ｈ 、１２５Ｉ および１３１Ｉ のような放射性核種；フルオレセインイソチオシアネートおよび他の蛍光色素、フィコビリタンパク質、フィコエリトリン、希土類キレート、テキサスレッド、ダンシルおよびローダミンのような蛍光剤；比色試薬（クロモーゲン）；コロイド金のような電子不透明物質；生物発光；化学発光；色素；特にホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、α−、β−ガラクトシダーゼのような酵素；酵素基質；酵素補因子；酵素阻害剤；酵素サブユニット；金属イオン；フリーラジカル；または形成された免疫複合体の存在または量を検出または測定する方法を提供する任意の他の免疫学的に活性のまたは不活性の物質が含まれる。酵素基質の組合せの例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） 、およびあるか理性ホスファターゼおよびパラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ） である。
【０１１９】
本発明による好ましい検出、または検出および定量システムにより、発光シグナル、生物発光（ＢＬ） または化学発光（ＣＬ） が産生される。化学発光（ＣＬ） または生物発光（ＢＬ） アッセイにおいて、強度または全体の発光が測定され、未知の分析物の濃度に関連する。ルミノメーター（検出器としての光電子増倍管）または電荷結合素子を使用して定量的に、または写真またはＸ 線フィルムにより質的に光を測定できる。そのようなアッセイを使用する主な利点は、簡単さおよび分析の感度であり、非常に少量の分析物の検出および／または定量が可能となる。
【０１２０】
発光標識の例は、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホニルカルボキシアミド、ルミノール、ウンベリフェロン、イソルミノール誘導体、エクオリンのような発光タンパク質、およびホタル、海洋性のバクテリア、Ｖａｒｇｕｌｌａ およびＲｅｎｉｌｌａ からのルシフェラーゼである。ルミノールは、必要に応じて、好ましくは４ −ヨードフェノールまたは４ −ヒドロキシ−ケイ皮酸からなる群より選択されるエンハンサー分子と共に使用してもよい。アクリジニウムエステルは、本発明によるＣＬ 標識の好ましいタイプの一つである。通常、ＣＬ シグナルは、基礎条件下で酸化剤の処理により産生される。
【０１２１】
好ましい発光検出システムは、基質上の酵素反応によりシグナル（検出可能なマーカー）が産生されるものである。ＣＬ およびＢＬ 検出計画が、特にアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ） 、グルコースオキシダーゼ、グルコース６ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） 、およびキサンチン−オキシダーゼ標識のアッセイについて発達した。ＡＰ およびＨＲＰ は、ＣＬ およびＢＬ 反応の範囲により定量できる二つの好ましい酵素標識である。例えば、エンハンサー分子、好ましくは１ −（トリオクチルホスフォニウムメチル）−４ −（トリブチルホスフォニウムメチル）ベンゼンジオクロライドを使用してまたは使用せずに、アダマンチル１，２ −ジオキセタンアリールホスフェート基質（例えばＡＭＰＰＤ またはＣＳＰＤ ；［Ｋｒｉｃｋａ， Ｌ．Ｊ．，  “化学発光および生物発光による分析” ａｔ ｐ． １６７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ｅｄ． Ｒ．Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ）（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； Ｎ．Ｙ．， Ｎ．Ｙ．； １９９５）］ ；好ましくは４ −メトキシ−４ −（３ −ホスフェートフェニル）スピロ［１，２ −ジオキセタン−３，２ ’−アダマンタン］ の二ナトリウム塩）と共にＡＰ を使用してもよい。ＨＲＰ は好ましくは、２ ’、３ ’、６ ’−トリフルオロフェニル３ −メトキシ−１０ −メチルアクリダン−９ −カルボキシレートのような基質と共に使用する。
【０１２２】
ＣＬ およびＢＬ 反応は、酵素、並びに他の基質、補因子、阻害剤、金属イオンなどの分析に適合できる。例えば、ルミノール、ホタルルシフェラーゼ、および海洋性バクテリアのルシフェラーゼ反応は、それぞれペルオキシド、ＡＴＰ 、およびＮＡＤＰＨ の産生または消費の指示反応である。これらをオキシダーゼ、キナーゼ、およびデヒドロゲナーゼを含む他の反応物に結合してもよく、結合した反応物の任意の成分（酵素、基質、補因子）の測定に使用できる。
【０１２３】
検出可能なマーカーを、本発明のアッセイにおいて使用する抗体に直接または間接に結合してもよい。検出可能な標識の間接結合の例は、抗体とマーカーとの間の結合対の使用またはシグナル増幅システムの使用である。
【０１２４】
本発明のアッセイの抗体を検出可能なマーカーに結合させるために使用できる結合対の例は、ビオチン／アビジン、ストレプタビジン、または抗ビオチン；アビジン／抗アビジン；チロキシン／チロキシン−結合グロブリン；抗原／抗体；抗体／抗−抗体；炭水化物／レクチン；ハプテン／抗ハプテン抗体；色素および疎水性分子／疎水性タンパク質結合部位；酵素阻害剤、補酵素または補因子／酵素；ポリ核酸／相同性ポリ核酸配列；フルオレセイン／抗フルオレセイン；ジニトロフェノール／抗ジニトロフェノール；ビタミンＢ１２ ／内因子；コルチゾン、コルチゾル／コルチゾル結合タンパク質；および特異的なレセプタータンパク質に対するリガンド／膜関連特異的レセプタータンパク質である。本発明による好ましい結合対は、ビオチン／アビジンまたはストレプタビジン、より好ましくはビオチン／ストレプタビジンである。
【０１２５】
標識を直接または間接に抗体に結合するための様々の方法が当該技術において知られている。例えば、抗体は共有結合でまたは非共有結合で結合してもよい。抗体結合方法の例は、Ａｖａｒｍｅａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８（Ｓｕｐｐｌ． ７）： ７（１９７８）； Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６２： ３０８（１９７９）； Ｃａｈｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ５３： １８７（１９８２）； Ｅｋｅｋｅ ａｎｄ Ａｂｕｋｎｅｓｈａ， Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１： １５７９（１９７９）； Ｅｎｇｖａｌｌ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １０９： １２９（１９７２）； Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｏｍｍ．， ７： １（１９７８）； ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｎｅ， Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐ． ２１５［Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ； Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９７８）］ に記載されている。
【０１２６】
標識の性質に依存して、様々の技術を使用して標識を検出および定量できる。蛍光剤について、多くの蛍光計を利用できる。化学発光について、ルミノメーターまたはフィルムを利用できる。酵素により、蛍光、化学発光、または色のついた産物を、蛍光計により、ルミノメーターにより、吸光光度計によりまたは視覚的に測定できる。
【０１２７】
アクリジニウム、ベンゾアクリジニウム、またはアクリダンタイプの複素環系を有する様々の種類の化学発光化合物が、好ましい標識である。アクリジニウムおよびベンゾアクリジニウムエステルは、目下より好ましい化学発光化合物であり、好ましいアクリジニウムエステルには、当該技術においてよく知られるアクリジニウム、ベンゾ［ａ］ アクリジニウム、ベンゾ［ｂ］ アクリジニウム、ベンゾ［ｃ］ アクリジニウム、ベンゾイミダゾール陽イオン、キノリニウム、イソキノリニウム、キノリジニウム、環状の置換されたキノリニウム、フェナントリジニウム、およびキノキサリニウムのような環式系を含む陽性酸化状態で異種原子を含有する複素環または複素環系を有する化合物が含まれる。
【０１２８】
例えばＷｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９（８）， １４７４−１４７９， （１９８３） のように当業者によく知られる、アクリジニウムまたはベンゾアクリジニウムエステル上に存在する反応性の官能基を直接または間接に選択された抗体に結合させることにより、トレーサーを調製してもよい。特に好ましい化合物は、アリール環のパラまたはメタ位置に存在するアリール環遊離基および反応性の官能基を有するアクリジニウムおよびベンゾアクリジニウムエステルである［ 米国特許第４，７４５，１８１ 号および国際特許出願公開第９４／２１８２３ 号参照］ 。
【０１２９】
本発明の範囲および物質から外れずに、本発明について様々の変更をすることは、当業者にとって明らかであり、容易に行うことができるということを理解すべきである。以下の実施例は例示のためのものであり、いかなる意味においても本発明を制限するものではない。
【０１３０】
実施例１
（ａ）  全長ＡＰＣ遺伝子産物の免疫沈降
生殖細胞系に一つの突然変異および一つの残存野生型ＡＰＣ 対立遺伝子を有することが知られるＦＡＰ 患者のリンパ球から全長ＡＰＣ を免疫沈降するために、本研究において抗ＡＰＣ 抗体を使用した。この研究により、ＦＡＰ 患者からのリンパ芽球細胞は生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異を有しない対照と比較して約５０ ％少ない（５０．１％ ±５．１％） 免疫沈降可能な全長ＡＰＣ タンパク質を有することが示されたことにおいて、本発明の免疫学的検定法の根底にある理論が支持される。結果は、ＦＡＰ 細胞中の異型接合ＡＰＣ 遺伝子型と相関する。
【０１３１】
物質および方法
抗ＡＰＣ 抗体。他の文献に記載されるように［Ｂｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，  “中央およびカルボキシル領域に対する抗体を使用するＡＰＣ 遺伝子産物のラジオイムノアッセイ” Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２０６： ９０９−９１５（１９９５）； Ｃｈｏｐ ｅｔ ａｌ．，  “ヒト結腸組織中の全長ＡＰＣ 遺伝子産物の存在または不存在の免疫検出” Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １５： ９９１−９９８（１９９５）］ 、本発明者の実験室で産生された抗ＡＰＣ ポリクローナルウサギ抗体（ＡＰＣ−２） を使用して、免疫沈降分析を行った。ＡＰＣ−２ 抗体は、ＡＰＣ タンパク質の中央領域に位置する限定されたエピトープ（アミノ酸１３３６ −１３５０ ）を標的とする。この抗体は、全長ＡＰＣ タンパク質に対して活性であるが、多くのＦＡＰ 個体中で生殖細胞系ＡＰＣ 突然変異により引き起こされる切断されたＡＰＣ タンパク質（ＡＰＣ−２ エピトープを欠く）に対して活性ではない。
【０１３２】
細胞系。全長ＡＰＣ を含有することが知られるヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６ を、アメリカンタイプカルチャーコレクション［ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ（ＵＳＡ）］ から得た。ＨＣＴ１１６ 細胞を、３７ ℃において１０ ％の胎仔ウシ血清［Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ（ＵＳＡ）］ を含有するＤＭＥＭ および９５ ％空気／５ ％ＣＯ２ の湿った空気中で培養した。２５ｃｍ２ のプラスチック組織培養フラスコ［Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ（ＵＳＡ）］ 中で約６０ −８０ ％融合したＨＣＴ１１６ 細胞の培養物（約３ ×１０６ 細胞）を、リン酸緩衝化生理食塩水［ＰＢＳ， Ｓｉｇｍａ］ で３ 度洗浄し、フラスコの底を機械でこすり、遠心分離によりペレット状にし、その後免疫沈降のために溶解させた。
【０１３３】
「結婚している」個体に由来する４ つの細胞系を含む５ つのリンパ芽球細胞を調べた。培養液への末梢リンパ球のエプスタイン−バーウィルス形質転換によるこれらの細胞系の確立は、他の文献に記載されている［Ｓｐｉｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，  “ＡＰＣ 遺伝子の対立遺伝子：家族性ポリープ症の弱毒化形態” Ｃｅｌｌ， ７５： ９５１−９５７（１９９３）］ 。そのような細胞を、１０ ％のＦＢＳ を含有するＲＰＭＩ １６４０ を有する懸濁培養液中で培養した。リンパ芽球懸濁培養液を、フラスコからこすらずに遠心分離によりペレット状にした以外はＨＣＴ１１６ 細胞と同様に処理した。
【０１３４】
これらのＦＡＰ リンパ芽球細胞系は、既知のＡＰＣ 突然変異を有する３ つの血縁でないＦＡＰ 家族において病気に冒されている構成員から生じた［Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，  “結腸腹臥家系の平面腺腫” Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８０： ２７８−２８２（１９８８）； Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，  “遺伝性結腸直腸癌” Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １８： ３３７−３６６（１９９１）］ 。これらの家族は、詳細な家族歴および遺伝連鎖に基づくＦＡＰ の基準を満たした［Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）， ｓｕｐｒａ； Ｓｐｉｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，  ”腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ） 遺伝子座への腺腫様結腸ポリポーシス変化したまたは弱毒化した形態の結合” Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５１： ９２−１００（１９９２）］ 。
【０１３５】
リンパ芽球細胞系には、ＦＡＰ＃１ （家系２７６４ 中の個体Ｖ−２７ から）、ＦＡＰ＃２ （家族２７６４ 中の個体ＩＶ−１７ から）、ＦＡＰ＃３ （家系３１０１ 中の個体ＩＶ−２６ から）、およびＦＡＰ＃４ （家系６ 中の個体Ｖ−１５ から）が含まれた。ＡＰＣ 生殖細胞系突然変異を、以下のようにしてこれらの家族において同定した［Ｓｐｉｒｉｏ（１９９３）， ｓｕｐｒａ］ 。二つの血縁でない家族２７６４ および３１０１ は、エキソン４ に同一のＡＰＣ 突然変異を有し（ヌクレオチドの変化：ＴＣＡＴＴＧ →ＴＣＴＧ ）、これにより１４５ アミノ酸のＡＰＣ ペプチドが切断される。家系６ は、エキソン３ にＡＰＣ 突然変異を含み（ＴＡＧＡＴＡＧＣ →ＴＡＧＣ ）、これにより長さ８３ アミノ酸のＡＰＣ ペプチドが切断される。
【０１３６】
ＡＰＣ の免疫沈降。半融合性ＨＣＴ１１６ （２５ｃｍ２ のプラスチック組織培養フラスコ中約３ ×１０６ 細胞）、並びに懸濁培養されたリンパ芽球細胞（１０７ の正常なまたはＦＡＰ 不朽化ＷＢＣ ）を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ ＥＧＴＡ， １２ｍＭ ＥＤＴＡ， ４．３ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４， １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４， ５０ｍＭ  リン酸塩［Ｎａ＋ 塩］， ０．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）， および０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフッ化物［ＰＭＳＦ］ ）を含有する３ｍＬ のＲＩＰＡ 緩衝剤（０．１％ ＳＤＳ， ０．５％  デオキシコール酸塩，１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４９， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ ７．４］ ）で溶解した。細胞溶解産物をボルテックスし、ミクロフュージ（エッペンドルフ）中４ ℃で１０ 分間１３，０００ｒｐｍ で遠心分離し、上澄を集めた。それぞれの上澄中のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ タンパク質アッセイキット（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ） を使用して測定した後、それぞれの上澄のタンパク質濃度を等しく４．３５ｍｇ／ｍｌ に調整した。
【０１３７】
非特異的結合を除去するために、上澄（２００ μｌ のアリコート）を、免疫前のウサギ血清（２５ μｌ／ｍｌ） および５０ ％スラリーのタンパク質Ａ− セファロースＣＬ４８ ビーズ（１５ μｌ／ｍｌ， Ｓｉｇｍａ） とともに４ ℃で１ 時間インキュベートした。サンプルを１５ 分間上述のように遠心分離し、上澄を免疫沈降のために保持した。次に抗ＡＰＣ 血清（ＡＰＣ−２） を溶解産物に加えた。サンプルを４ ℃で一晩インキュベートした。次にタンパク質Ａ− セファロース４Ｂ ＣＬ ビーズを加え（５０ ％スラリーの１５ μｌ／ｍｌ ）、サンプルを４ ℃で１ 時間ロッキングプラットホーム（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ） 上でインキュベートした。タンパク質Ａ− セファロース４Ｂ ＣＬ 混合物を、上述のように３ 分間遠心分離することによりペレット状にし、１０ｍＭ ＮａＣｌ を含有するＲＩＰＡ 溶解緩衝剤で１ 度、０．５ｍＭ ＮａＣｌ を含有する緩衝剤で６ 度、１００ｍＭ ＮａＣｌ 緩衝剤でさらに１ 度洗浄した。タンパク質Ａ− セファロース４Ｂ ＣＬ ペレットをゲルローディング緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］， １００ｍＭ ＤＴＴ， ２％ ＳＤＳ， ０．２％ ブロモフェノールブルー， ２０％ グリセロール）に再び懸濁し、３ 分間煮沸し、遠心分離した。上澄中に含有される免疫沈降タンパク質を、２．８ ％アガロースゲルを使用して電気泳動により分離した。
【０１３８】
アガロースゲル上で分別されたタンパク質を、従来の垂直毛細管作用ブロッティングにより一晩ニトロセルロース膜（０．４５ μｍ， ＭＳＩ ）に移した。膜を１０ ％の無脂肪粉乳（ＰＢＳ 中）で処理し、抗体の非特異的結合を防止し、次に室温で一晩ポリクローナル抗ＡＰＣ 抗体（１：７５００ の希釈におけるＡＰＣ−２ ）とともにインキュベートした。ブロット上のタンパク質バンドを、使用説明書に従って増幅したアルカリ性ホスファターゼヤギ抗ウサギ免疫ブロットシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） を使用して検出した。免疫沈降ブロット上のＡＰＣ タンパク質の量を、濃度計［Ｓｐｅｅｄｍａｓｔｅｒ Ｄｕｏ−Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ， Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．， Ｃｕｓｈｉｎｇ， ＯＫ（ＵＳＡ）］ を使用して測定した。
【０１３９】
結果
ＨＣＴ１１６ 細胞、健康な被験者からのリンパ芽球細胞、および３ つの血縁でないＦＡＰ 家族における病気に冒された構成員に由来する４ つのＦＡＰ リンパ芽球細胞系における全長ＡＰＣ の存在を、免疫沈降分析により検出した。この分析により、ＨＣＴ１１６ 関連細胞系（全長ＡＰＣ タンパク質を含有することが知られている）は、野生型ＡＰＣ タンパク質に対応する３００ｋＤａ のバンドのタンパク質をはっきりと発現することが示される。またこの分析により、ＨＣＴ１１６ 細胞系と比較して、健康な被験者からのリンパ芽球細胞は等量の全長ＡＰＣ タンパク質を有し、ＦＡＰ 被験者からのリンパ芽球細胞は野生型ＡＰＣ タンパク質がより少ないことが示される。
【０１４０】
表２は、免疫沈降ブロットの濃度計評価により測定された、異なる被験者からのリンパ芽球細胞系における免疫沈降された全長ＡＰＣ の相対的レベルを示す。ＨＣＴ１１６ 培養された癌細胞は、基準レベル（１００ ％）を定めるのに適した。健康な個体に由来するリンパ芽球細胞は、ＨＣＴ１１６ と比較して相対的に同様の量の野生型ＡＰＣ タンパク質（１１０ ％）を有した。対照的に、ＦＡＰ 細胞系は、対照の３９ ％から６０ ％までの範囲のＡＰＣ レベルを有した（平均＝５０．５ ％、ＳＥＭ ＝５．１ ％）。
【０１４１】
【表２】
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実施例には、ＡＰＣ 突然変異が全長ＡＰＣ タンパク質の発現を減少させることを示す最初の研究（本発明者が知る限り）が記載されている。これは、結腸細胞中の全長ＡＰＣ タンパク質の量はおそらく結腸腫瘍形成の基礎をなす機構における基準因子であるので、生物学的関連性を有すると考えられる。例えば、以前は、一つのＡＰＣ 対立遺伝子を含むＡＰＣ 突然変異により、細胞は細胞成長において他の後天性遺伝的変化または癌原性物質により誘発される有害な効果を受けやすくなると仮設が設けられていた［Ｂｏｍａｎ， Ｂ． Ｍ．，  “癌の生物分子遺伝学” Ｉｎ： Ｌｙｎｃｈ， Ｈ．， （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ｐｐ． ３４３−３４７， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］ 。本発明の結果により、全長ＡＰＣ タンパク質のレベルの減少は、一つのＡＰＣ 対立遺伝子を含むＡＰＣ 突然変異の結果として生ずることが示される。
【０１４２】
定量的に、この結果により、ＦＡＰ リンパ芽球細胞系における抗ＡＰＣ 抗体免疫沈降タンパク質のレベルは、正常な対照の約５０ ％であったことが示される。免疫反応性のこのレベルは、ＦＡＰ 患者は一つの突然変異対立遺伝子に加えて野生型ＡＰＣ 対立遺伝子を一つだけ保有すると言う事実、および遺伝子産物発現は遺伝子量に比例するという推定と一致する。
【０１４３】
モデルシステムとしてＦＡＰ 細胞を使用するこの実施例により、本発明の免疫学的検定法は、標的全長タンパク質レベルを減少させる生殖細胞系突然変異の検出に有用であることが示される。この実施例は、そのようなアッセイを、有害な突然変異対立遺伝子を保有する個体を診断するための簡単で、信頼でき、低費用の方法とする助けとなる。全長ＡＰＣ レベルのレベルについての免疫学的検定法は、ＦＡＰ に冒されている個体を検出するための実際の診断テストとして有用でなければならない。
【０１４４】
（ｂ）ＡＰＣ 自動化免疫学的検定法の代表例
全長ＭＳＨ２ タンパク質を検出および定量するために、マウス抗ＡＰＣ ＭＡｂ 、例えばＡＰＣ のアミノ末端に対するＡＢ１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） を、Ｄｙｎａｂｅｒｄｓ （登録商標）（Ｍ−４５０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ； Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．） のようなビーズに共有結合させる。前記モノクローナル抗体に結合されたビーズを、細胞溶解産物と共にインキュベートし、その後洗浄した。次に前記洗浄されたビーズを、第二の一次抗体として、例えばＡＰＣ のカルボキシル末端に対するマウスＭＡｂ であるＡＢ２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） のようなマウス抗ＡＰＣ と共にインキュベートする。
【０１４５】
実施例２
ＭＬＨ１およびＭＳＨ２タンパク質についてのウェスタンブロット免疫学的検定法
この実施例には、新しく調整されたリンパ球および不朽化したリンパ球におけるＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ タンパク質（２ つの主要なＭＭＲ 遺伝子の発現産物）の測定が記載される。ウェスタンブロット分析を含むこのアッセイにより、単一のリンパ球サンプルにおける両方の全長タンパク質のレベルが同時に評価される。ウェスタンブロットによるＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ のレベルの半定量的分析により、同じサンプルについて全長ＭＬＨ１ ／全長ＭＳＨ２ タンパク質を容易におよび直接測定できる。
【０１４６】
サンプルローディングにおける変異性および他の混乱させる因子のために、使用された方法により二つのタンパク質のそれぞれの個体の発現レベルを測定し、一方の他方に対する割合を計算する。次に、割合の絶対値が正常な範囲に明らかに下がるか、または二つのタンパク質の一つの発現が５０％ 失われた場合に予測される範囲に明らかに下がるか否かを決定する。
【０１４７】
方法
サンプル調整
サンプルを、不朽化したリンパ球の培養物から調製した。健康な個体からの単離した末梢リンパ球を、エプスタイン−バーウィルス形質転換により不朽化し、Ｓｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７５： ９５１（１９９３） に記載されるようにリンパ芽球細胞系を産生する。培養液中で７ 日間後得られたリンパ芽球性リンパ球（６０ から１２０ ×１０６ 細胞）の懸濁倍溶液（１５ｍＬ） 中に含有される不朽化したリンパ球を使用した。
【０１４８】
それぞれのサンプルを、５ｍＬ のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ） で１ から２ 回洗浄し、４ ℃で１０ 分間２０００ｒｐｍ で遠心分離した。細胞を溶解するために、１ ×強度のＳＤＳ ゲルローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ６．８］ 、１００ｍＭ ジチオトレイトール［ 新しく作製されたＤＴＴ］ 、２％ ＳＤＳ 、０．１％ ブロモフェノールブルー、１０％  グリセロール）を、それぞれの洗浄したペレットに加えた（培養した結腸癌細胞および結腸上皮について１ｍＬ 、リンパ球およびリンパ芽球細胞について２００ μＬ ）。ボルテックスを使用して細胞を完全に混合し、１０ 分間沸騰水槽に入れた。次に細胞をマイクロ遠心分離機で（Ｂｅｃｋｍａｎ）１０ 分間遠心分離し、不溶性の物質を沈降させ捨てた。
【０１４９】
ウェスタンブロット
上述の細胞溶解工程から上澄（２０ μＬ の与えられた細胞溶解産物）を、調製されたゲルのウェルの一つの中に入れた［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： １８．４９−１８．５４［Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（ＵＳＡ）； １９９５］］ 。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールおよびタンパク質マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｃａｔ＃１６１０３０９） が常に含まれた。ポジティブコントロールには、ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ タンパク質の両方を有する正常な粘膜、ＳＷ４８０ およびＤｉＦｉ 細胞［ ヒト直腸腺癌細胞系；Ｎｏｖｏｔｎｙ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １５７： ２５３−２６２（１９９３）］ が含まれた。突然変異ミスマッチ修復タンパク質についての対照には、ＨＣＴ１１６ 細胞（ＭＳＨ２ ポジティブ；ＭＬＨ１ ネガティブ） およびＬｏＶｏ 細胞（ＭＬＨ１ ポジティブ；ＭＳＨ２ ネガティブ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９； ヒト腺癌細胞系）が含まれた。毎回泳動されたネガティブコントロールは、２ ％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ； Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＣＡ； Ｃａｔ．＃３０００） を含有する溶解産物緩衝剤であった。トラッカー色素がゲルの底を流れ出るまで、ゲルをＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ ゲル電気泳動装置［Ｂｉｏｒａｄ； Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ（ＵＳＡ）］ 上で電気泳動した（６０ から７０ ボルトで一晩）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ 装置を使用して（Ｂｉｏ−Ｒａｄ の使用説明書に従い）ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜［ＮＦ； ＭＳＩ， Ｗｅｓｔｂｏｒｏ， ＭＡ（ＵＳＡ）］ に移した。
【０１５０】
次に、ブロッキングバッファー［５０ｍＬ の５ ％［ｗ／ｖ］ 無脂肪粉乳［Ｃａｒｎａｔｉｏｎ］ ｉｎ ＰＢＳ］ 中でＮＦ をプレハイブリダイズした後、ロッキングプラットフォーム上で室温で２ 時間５ｍＬ のブロッキングバッファー中で二つの一次抗体（マウスモノクローナル抗ＭＳＨ２［Ｃａｔａｌｏｇ ＃ＮＡ２７； Ｔｉｔｅｒ＝１：５００； Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］ およびマウスモノクローナル抗ＭＬＨ１［Ｃａｔａｌｏｇ ＃１３２９１Ａ； Ｔｉｔｅｒ＝１：５００； ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ］ ）とともにインキュベートすることにより、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【０１５１】
次にフィルタを２００ｍＬ のＰＢＳ で３ 度およびＴＴＢＳ 緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ７．５， ５００ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０） で１ 度洗浄した後、室温で１ 時間５ ％粉乳中で第二の抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ヤギ抗マウス抗体［ＧＡＭ］［Ｃａｔａｌｏｇ ＃１７０６４６１； Ｔｉｔｅｒ＝１：１０００］ ）と共にインキュベートした。ＮＦ を２００ｍＬ のＴＴＢＳ 緩衝剤で３度洗浄した後、製造者のプロトコルに従いＢｉｏ−Ｒａｄ 発色溶液（Ｃａｔａｌｏｇ ＃１７０６４６１） 中でインキュベートした。Ｇａｔｅｗａｙ ２０００ コンピュータ（Ｇ６−２００ ＸＬ） 、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｊｅｔ ５Ｐ スキャナ、およびＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴＴＭ スキャニングソフトウェア［ 自動化デジタルシステム、Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社；Ｏｒｅｍ， ＵＴ ８４０５９（ＵＳＡ）］ を使用して、ＭＳＨ２ またはＭＬＨ１ タンパク質についてバンドを定量的に分析した。
【０１５２】
結果
末梢リンパ球中のＭＭＲ タンパク質のレベルの検出。予備データにより、ウェスタンブロット分析を使用してＭＭＲ タンパク質を検出できることが示される。市販されている特異的抗体を使用して（表１）、全長タンパク質についてのバンドを、抗体が利用可能な二つのＭＭＲ 遺伝子タンパク質のそれぞれについて検出した。ウェスタンブロット分析には、抗ＭＬＨ１ および抗ＭＳＨ２ の両方の抗体とのハイブリダイゼーションを使用して、それぞれのタンパク質についてのバンドを、ＭＳＨ２ について１００ｋＤａ およびＭＬＨ１ について８０ｋＤａ と示した。これにより、ＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ のレベルの半定量（ゲルバンド上の濃度計による測定を使用する）および同じサンプルについて全長ＭＬＨ１ タンパク質対全長ＭＳＨ２ の割合の直接の測定が可能となった。予想されたように、バンドの分子量（ＭＷ） は、実験の誤差の範囲内で、分析されるタンパク質についての既知の分子量と同じであった。さらに、ＭＳＨ２ およびＭＬＨ１ タンパク質について異なる市販の抗体製剤（表１）を使用した場合、非特異的な交差反応タンパク質による偽陽性の可能性を実質的に除外して、同一の結果が得られた。
【０１５３】
ウェスタンブロット分析からの予備データからの結果。［１］ＭＭＲ タンパク質に対する抗体の信頼できる供給源が存在し、本発明の典型的な免疫学的検定法に使用するプロトコルにおいて良好におよび低費用で作用するようである。［２］ＭＭＲ タンパク質は、ヒトリンパ球において十分なレベルで発現され、免疫学的検定法により検出される。このことは、テストされるＭＭＲ タンパク質のそれぞれについて実質的なシグナルを検出し、これらのバンドが正しいＭＷ 範囲にあることを発見できることに基づく。［３］ ウェスタンブロット分析によるＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ のレベルの半定量により、同じサンプルについての全長ＭＬＨ１ ／全長ＭＳＨ２ タンパク質の比を容易におよび直接測定できる。
【０１５４】
表３は、本発明のＭＬＨ１ およびＭＳＨ２ アッセイの結果の予想される意味を示し、「プロモーター突然変異」とは、ＭＳＨ２ またはＭＬＨ１ 遺伝子の一つの対立遺伝子からの転写を除去するものである。
【０１５５】
【表３】
0003542968.tif 000006
実施例２に含まれる研究により、正常な対照として使用されたＭＭＲ タンパク質の完全な補体［ＤｉＦｉ およびＳＷ４８０］ を発現する細胞系と比較してネガティブコントロール［ＨＣＴ１１６（ＭＳＨ２＋； ＭＬＨ１ −）；  およびＬｏＶｏ（ＭＳＨ２＋； ＭＬＨ１ −）］ として使用した細胞系である、ＭＬＨ１ またはＭＳＨ２ において不完全な細胞系中のそれぞれの全長ＭＭＲ タンパク質の量が減少することが示された。正常なＰＢＬ 中のＭＭＲ タンパク質のレベルは、ポジティブコントロールとして作用する細胞系において見られるレベルと近いことが分かった。
【０１５６】
実施例３
フローサイトメトリによる完全なリンパ球中の全長ＭＭＲタンパク質の検出
この実施例により、全長ＭＭＲ タンパク質は、フローサイトメトリにより完全なリンパ球中で良好に検出できることが示される。細胞中の全長ＭＭＲ タンパク質レベルを、フローサイトメトリにより正確に測定できる。フローサイトメトリにより、完全な定量的データが作製されることが予想される。
【０１５７】
予備データにより、フローサイトメトリを使用してＭＳＨ２ タンパク質を検出できることが示される。リンパ芽球系を使用して、二つの異なる抗ＭＳＨ２ 抗体を使用して細胞内ＭＳＨ２ タンパク質を検出するための条件を設定した。細胞を固定し、透水性にした（Ｆｉｘ ＆ ＰｅｒｍＴＭ 細胞透水性キット； Ｃａｌｔａｇ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ を使用する）。二つの一次抗体の一つと共に細胞をインキュベートした。一つは、蛍光プローブ（フィコエリトリン［ＰＥ］ ）で予め標識した抗ＭＳＨ２ ＡＢ１ である（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） 。他方の抗体は、蛍光イソチオシアネート［ＦＩＴＣ］ で予め標識した抗ＭＳＨ２ ＡＢ２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） である。この抗体は、ＭＳＨ２ のカルボキシル末端に特異的である。それぞれの抗体についてのＮ／Ｓ 比に適当なシグナルを与える抗体力価を測定した。細胞内ＭＳＨ２ に結合する好体の量を、ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳ フローサイトメーターシステム（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ； Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ） を使用して定量した。計器の設定（蛍光チャンネル番号または光電子増倍管ボルト）を調整して、相対的な蛍光強度を検出した。
【０１５８】
結果。両方の抗体（ＡＢ１−ＰＥ およびＡＢ２−ＦＩＴＣ ）により、全長ＭＳＨ２ タンパク質のみを有することが知られている培養されたリンパ芽球細胞系中の細胞内ＭＳＨ２ レベルが再現可能に検出された。抗体Ａｂ１−ＰＥ （ＭＳＨ２ アミノ末端に対する）およびＡｂ２−ＦＩＴＣ （ＭＳＨ２ カルボキシル末端に対する）を使用するフローサイトメトリ分析により、リンパ芽球細胞系における細胞内ＭＳＨ２ タンパク質の存在が示される。
【０１５９】
フローサイトメトリデータからの結論：［１］ フローサイトメトリ分析を使用し、ＭＳＨ２ タンパク質を不朽化リンパ球細胞系において質的に検出できる。［２］ 全長ＭＳＨ２ タンパク質のフローサイトメトリ検出は、二つの異なる抗ＭＳＨ２ 抗体−ＡＢ１−ＰＥ およびＡＢ２−ＦＩＴＣ −を使用する検出可能なシグナルが得られるので、ほぼ間違いなく特異的である。実際に、免疫蛍光による核染色を確かめた。［３］ さらに、本発明の好ましい自動化免疫学的検定法による分析に好ましい種類の細胞系であるリンパ芽球細胞系を使用して、フローサイトメトリ分析を行った。
【０１６０】
実施例４
ビーズ結合したサンドイッチ免疫学的検定法
（１）ＭＭＲタンパク質についてのビーズ結合したサンドイッチ免疫学的検定法
最近の実験により、好ましい自動化した、ビーズ結合した、サンドイッチ型の、本発明の分析システムの実施可能性が確立された。抗ＭＳＨ２ 抗体を、３ つの異なる技術を使用してビーズに結合させた：１）Ａｂ１ 抗体（ＭＳＨ２ のアミノ末端に対する）を、Ｄｙｎａｌ トシル活性化磁気ビーズに結合させた；２）ウサギポリクローナル抗ＭＳＨ２ 抗体を、ストレプタビジンコーティングされたビーズに結合させた；および３）Ａｂ１ を、架橋させるためにグルタルアルデヒドを使用して磁気ビーズに結合させた。レポーター分子を、二つの技術によるサンドイッチに基づく分析において使用される第二の一次抗体（Ａｂ２） と結合させた：ａ）Ａｂ２ 抗体（ＭＳＨ２ のカルボキシル末端に対する）を、ＦＩＴＣ と結合させた（蛍光のために）；これらの同じ抗体を、アクリジニウムエステルに結合させた（化学発光のために）。意義深いことに、二つのタイプのコーティングされたビーズ（トシル活性化ビーズおよびストレプタビジンでコーティングされたビーズ）を使用して、およびＦＩＴＣ 結合した第二の一次抗体によるサンドイッチに基づくアッセイを使用して、同様のＭＭＲ アッセイ結果を得た。例えば、フローサイトメトリにより、それぞれ全長ＭＳＨ２ タンパク質のみを含有するＤｉＦｉ 細胞およびＨＣＴ−１１６ 細胞は、予想されたように、測定可能なシグナルを有したのに対し（５５ ％陽性のビーズ）、突然変異切断されたＭＳＨ２ タンパク質のみを有することが知られるネガティブコントロール細胞系（ＬｏＶｏ） は、予想されたように、ごくわずかなシグナルを有したということが示された。
【０１６１】
磁気ビーズに基づく免疫学的検定法からの結論。１）この実施例により、ビーズ結合した分析システムからの蛍光シグナルを検出するためにフローサイトメトリを使用するＭＳＨ２ についてのビーズに基づくサンドイッチ分析が作用し、定量的であることが示される。２）このビーズに基づく技術は、自動化サンドイッチ型免疫学的検定法方式に容易に適合できる。
【０１６２】
（２）臨床的／群集研究におけるＨＮＰＣＣ検出
上述のセクション１の方法を使用して、ＣＲＣ 患者のコホートをテストできる。ＭＭＲ タンパク質のレベルの減少は、ＣＲＣ 患者の約１０ ％で生ずると予想される。陽性テストにより、ＨＮＰＣＣ の予備的診断が示される。続いて、該予備的診断を、切断されたタンパク質の発現と矛盾しない遺伝子型を示す分子遺伝学的テストにより確かめることができる。
【０１６３】
また、二重性抗体アッセイを使用して、特に（１）ＨＮＰＣＣ 遺伝子型が知られている不朽化リンパ球を使用するＨＮＰＣＣ リンパ球；（２）ＨＮＰＣＣ 家族の構成員からの新しいリンパ球；および（３）ＣＲＣ 患者からの新しい、または冷凍されたリンパ球からのタンパク質をテストできる。
【０１６４】
（２ａ ）ＨＮＰＣＣリンパ球におけるアッセイのテスト
２ａ．ｉ．ＨＮＰＣＣ遺伝子型が知られている場合の不朽化リンパ球におけるＭＭＲレベルのテスト
分子／遺伝的テストの結果として遺伝子型が知られているＨＮＰＣＣ 患者からのリンパ球を使用して、全長ＭＭＲ タンパク質のレベルを測定することが可能である。基準の対照は、遺伝子型テストにおいてＨＮＰＣＣ についての陰性の、および正常なレベル（１００ ％）のＭＭＲ タンパク質を有すると考えられる家族構成員からの不朽化ＷＢＣ である。
【０１６５】
ｈＭＬＨ１ についてのテストは、「サンドイッチ」型の免疫学的検定法により行い、ビーズ結合したタイプのアッセイを行う。そのような「サンドイッチ」型の免疫学的検定法により、免疫学的検定法の特異性が増加する。
【０１６６】
ＨＮＰＣＣ 陽性患者からの細胞は、非常に狭い範囲の統計的分散の中で、正確に一つのＭＭＲ タンパク質のレベルが５０ ％減少することを示すと予想される。比較群は、（ａ） 正常なヒト志願者からの新しく単離されたリンパ球；および（ｂ） 遺伝子型テストにおいてＨＮＰＣＣ について陰性の家族構成員からのＷＢＣ である。また、正常なヒト志願者からの不朽化ＷＢＣ をテストして、不朽化工程自体によりＭＭＲ タンパク質のレベルが変化する可能性を評価する。この研究により、ＭＭＲ タンパク質分析における標的ＭＭＲ タンパク質対関連タンパク質の割合の５０ ％の減少という低い値は、遺伝性ＣＲＣ のＨＮＰＣＣ 形態と関連し、その予測を可能とすることが確かめられる。
【０１６７】
２ａ．ｉｉ．ＨＮＰＣＣ診断が行われた場合のＨＮＰＣＣ家族の構成員からの新しいリンパ球における全長ＭＭＲレベルのテスト
ＨＮＰＣＣ （不朽化されていない；利用できる遺伝子型がない）について陽性の家族歴を有するＣＲＣ 患者からのＷＢＣ サンプルを使用して、テストを行った。アムステルダム基準（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｃｒｉｔｅｒｉａ） および遺伝的テストの使用により、そのような家族のＣＲＣ 患者の７０ から８０ ％が、ＨＮＰＣＣ について（４ つのミスマッチ修復遺伝子の１ つにおける突然変異）陽性の遺伝子型（分子遺伝学的テストから）を有することが示される。
【０１６８】
（ａ） 突然変異ＭＭＲ 遺伝子を受け継いだ危険が５０ ％である（なぜならこれは常染色体優性遺伝子だからである）ＨＮＰＣＣ 家族の構成員のうち５０ ％は、ＭＭＲ タンパク質のレベルが著しく減少していることを示す；（ｂ） 突然変異遺伝子（二つの野生型対立遺伝子の一つの欠失による）を含有する細胞により発現される一つのＭＭＲ タンパク質のレベルは約５０ ％減少する；（ｃ） 分子遺伝学的テストを使用して、本発明の免疫学的検定法により測定されるＨＮＰＣＣ の陽性および陰性診断を確かめることができるということが予想される。このサブセクションに記載されるテストにより、現地条件下でＨＮＰＣＣ 家族の構成員のＨＮＰＣＣ を診断することについて本発明のアッセイの予想される価値が確かめられる。
【０１６９】
２ａ．ｉｉｉ．結腸直腸癌を有する患者の一般個体群のテスト
この実験は、より多様な患者の個体群、すなわちＣＲＣ を有するすべての患者の個体群を研究した以外は、前記の方法（２ａｉｉ） と同様である。（１）すべてのＣＲＣ 患者の１０ ％は、アッセイ（公表されている研究に基づく）において陽性の調査結果の特徴により、ＨＮＰＣＣ を有することが分かる；（２）分子遺伝学的テストにより、アッセイにおいて陽性の個体はＨＮＰＣＣ 陽性であることが確かめられるということが予想される。
【０１７０】
このサブセクションに記載されるテストにより、現地条件下でＣＲＣ 患者の構成員についてＨＮＰＣＣ を診断するための本発明のアッセイの予測される価値を確かめられる。テストを変化させて、ＣＲＣ 以外の癌を有するが、子宮癌のようなＨＮＰＣＣ と関連することが知られる患者を研究する。そのような患者の一部がＭＭＲ 突然変異について陽性であるか否かが決定される。
【０１７１】
２ａ．ｉｖ．癌および癌でない患者におけるＭＭＲ値のデータベースの確立
正常なヒト志願者およびＨＮＰＣＣ 患者についての「全長」ＭＭＲ 値のデータベースを確立し、全長ＭＭＲ タンパク質レベルについての「正常な」範囲を測定できる。ＨＮＰＣＣ は現在、ＣＲＣ のすべてのケースの約１０ ％、およびすべての癌のより小さい部分を示すと考えられているので、癌の他の形態を有するＣＲＣ 患者の大多数は「正常な」範囲の全長ＭＭＲ 値を有すると予想される。このデータベースには、ＨＮＰＣＣ の診断におけるＭＭＲ タンパク質テストの正確性を確かめる分子遺伝学的テストからの結果が含まれる。
【０１７２】
（２ｂ ）二つの抗体および「サンドイッチ」技術を使用し自動化に適合可能な、様々の免疫学的検定法のテスト
このアッセイにおいて、ＭＭＲ タンパク質の一つを認識する抗体を固定する（例えば、９６ 穴マイクロタイタープレートのウェル中）。患者からの末梢リンパ球のサンプルの溶解産物を加えて、特定のＭＭＲ タンパク質をプレートに結合させる。溶解産物を洗浄により除去し、ＭＭＲ タンパク質上の異なるエピトープを認識しサンプル中の全長タンパク質の量を定量するためのレポーター分子を組み込んだ第二の抗体を加える。サンドイッチアッセイを、自動化したＥＬＩＳＡ に基づくシステムに適合させる。
【０１７３】
本発明の実施の形態に関する以上の記述は、説明を目的とするものである。それらは明確な形式で開示されている本発明を網羅するものでも制限するものでもなく、上述の教示に照らし合わせることにより、多くの変形および変更が可能であることは明らかである。本発明の原理およびその実際的な用途を説明するために実施の形態を選択して記載しており、それにより、当業者は、多様な実施の形態において、および特定の利用に適するように多様な変形を行って本発明を利用することが可能である。
【０１７４】
本明細書中に引用している全ての参考文献をここに引用する。