(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
3,4,8,9,10-pentahydroxy-dibenzo[b.d]pyran-6-one （化３）を有効成分として含有するキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【化３】
0003574001.tif 000006
d
【請求項２】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属する植物から抽出された成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出して得られる「粗抽出物」中の成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出し、得られた「粗抽出物」をスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂又はデキストラン系合成樹脂に吸着させて得られる「樹脂吸着成分」中の成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項５】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出し、得られた「粗抽出物」をスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂又はデキストラン系合成樹脂に吸着させ、得られた「樹脂吸着成分」を水と、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールのうちのいずれかの有機溶媒との分配操作で得られる「有機溶媒可溶成分」中の成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出し、得られた「粗抽出物」をスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂又はデキストラン系合成樹脂に吸着させ、得られた「樹脂吸着成分」を水と、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールのうちのいずれかの有機溶媒との分配操作で「有機溶媒可溶成分」を得、この「有機溶媒可溶成分」のうち、該「有機溶媒可溶成分」を高速液体クロマトグラフィーで分取した際に検出される５つのピークのうちの最初の第１ピークを除いた成分中の成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１の有効成分は、サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出し、得られた「粗抽出物」をスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂又はデキストラン系合成樹脂に吸着させ、得られた「樹脂吸着成分」を水と、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールのうちのいずれかの有機溶媒との分配操作で「有機溶媒可溶成分」を得、この「有機溶媒可溶成分」を高速液体クロマトグラフィーで分取した際に検出される５つのピークのうちの第３ピークの分取成分であることを特徴とする請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項８】
サルスベリ属に属するオオバナサルスベリ（Lagerstroemia speciosa）を、水、熱水、有機溶媒又はこれらの少なくとも２種類からなる混合溶液を用いて抽出し、得られた「粗抽出物」をスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂又はデキストラン系合成樹脂に吸着させ、得られた「樹脂吸着成分」を水と、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールのうちのいずれかの有機溶媒との分配操作で「有機溶媒可溶成分」を得、この「有機溶媒可溶成分」を高速液体クロマトグラフィーで分取し、この際に検出される５つのピークのうちの第３ピークを有効成分として分取することを特徴とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、植物由来の成分を有効成分とするキサンチンオキシダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
哺乳動物の肝臓、小腸粘膜、乳汁中に多く含まれるキサンチンオキシダーゼは、プリン化合物分解経路の最終段階においてヒポキサンチンからキサンチンを経て尿酸を生成する。
【０００３】
血中における尿酸濃度の上昇は、高尿酸血症としての痛風等の様々な疾病を引き起こすため、高尿酸血症を是正すべく臨床的に尿酸生成阻害剤つまりキサンチンオキシダーゼ阻害剤の投与が行われており、キサンチンオキシダーゼの活性を抑制し得る生理活性物質の開発が注視されている。
【０００４】
ところで、今日までキサンチンオキシダーゼ阻害作用を有する数多くの化合物が報告されているが、それらの多くは化学的手法により合成されたものであり、人体に対する安全性が高いとは決して言えなかった。また最近では、このような人体に対する安全性の観点から天然物由来のキサンチンオキシダーゼ阻害剤も開示されるようになってきたが（特開平５−２４４９６３号、特開平９−２０２７３３号など）、これらのキサンチンオキシダーゼ阻害効果は充分満足できるものではなかった。
【０００５】
そこで本発明は、安全性の高い天然物由来の成分を有効成分とし、しかも優れたキサンチンオキシダーゼ活性阻害作用を有するキサンチンオキシダーゼ阻害剤を提供せんとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決するために、既に多年にわたって食用に供され人体に対する安全性が確認されている植物についてキサンチンオキシダーゼ阻害剤として利用価値のあるものを検討した。その結果、ミソハギ科サルスベリ属の植物であるオオバナサルスベリ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）の抽出物に強いキサンチンオキシダーゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を想到するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、サルスベリ属に属する植物から抽出された成分を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
本発明においては、サルスベリ属に属する植物であれば全て使用可能であるが、中でも「オオバナサルスベリ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）」を好適に使用することができる。この「オオバナサルスベリ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ  ｓｐｅｃｉｏｓａ）」は、フィリピンをはじめとする熱帯地方に生育し、バナバと呼ばれており、この抽出液はフィリピンなどでは日常的なお茶として飲用されているため、人体に対する安全性は保証されていると言える。
【０００９】
本発明において抽出に供し得る植物体の部位は、葉はもちろん、茎、花、木質部、木皮部、根部等すべて利用可能であり、抽出の際にはこれら植物体を乾燥させ粉砕して用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明における「抽出成分」としては、先ず、上記植物体を水（熱水を含む）、有機溶媒またはその混合溶液を用いて抽出して得られる「粗抽出物」を使用することができる。この時の抽出温度は、４０〜１００℃、中でも特に９５〜１００℃に設定するのが好ましい。
有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトンのような水溶性有機溶媒を使用するのが好ましく、必要に応じて水と有機溶媒の組み合わせを使用することもできる。
また、植物体を抽出する熱水、有機溶媒、有機溶媒と熱水の混合溶液の量は、乾燥させた植物体重量に対し、１：１０乃至１：１００、特に１：２５程度とするのが好ましい。
【００１１】
上記「粗抽出物」をクロマトグラフィー技術によって分離精製して得られる「樹脂吸着成分」も本発明における「抽出成分」として用いることができる。すなわち、スチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂（三菱化成工業株式会社製Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−１０，２０，３０，４０，５０、オルガノ株式会社製アンバーライトＸＡＤ−２，４  、或いは住友化学工業株式会社製デュオライトＳ  シリーズなど）、又はデキストラン系合成樹脂（ファルマシア社製ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０  など）に上記「粗抽出物」を吸着させ、「樹脂吸着成分」を有機溶媒、必要に応じて水と有機溶媒の混合溶液によって溶出させて得ることができる。例えば、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０を充填したカラムに「粗抽出物」を供し、水にて非吸着成分を洗浄し、次いでメタノールにて「樹脂吸着成分」を溶出させ回収することができる。
【００１２】
さらに、上記「樹脂吸着成分」を、水とクロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル、ブタノールなどの有機溶媒との分配操作で得られる「有機溶媒可溶成分」も本発明における「抽出成分」として好ましく用いることができる。
【００１３】
またさらに、上記「有機溶媒可溶成分」を高速液体クロマトグラフィーを用いて精製若しくは単離して得られる「高速液体クロマトグラフィー分取成分」も本発明における「抽出成分」として用いることができる。
高速液体クロマトグラフィーは、逆相、順相、ゲルろ過、イオン交換、疎水などの分離モードを用いたカラムで行うことができるが、経済的な面から逆相モードで行うのが好ましい。好適な一例としては、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０樹脂吸着フラクションを酢酸エチル、ブタノールで分配操作し、それぞれの酢酸エチル可溶フラクション、ブタノール可溶フラクションを得、酢酸エチル可溶フラクションについて、逆相ＯＤＳ  カラム、溶離液に５０％メタノール（１％酢酸を含む）を使用し、主成分を分取することができる。
【００１４】
「高速液体クロマトグラフィー分取成分」には、エラグ酸、エラグ酸誘導体、エラグ酸類似化合物、リグナン類が主成分として含まれており、これらいずれのフラクションについても優れたキサンチンオキシダーゼ阻害作用が確かめられている。したがって、このようにして得られるエラグ酸、エラグ酸誘導体、エラグ酸類似化合物、リグナン類のいずれか、又はこれらの２以上の混合物も本発明における「抽出成分」として極めて有効に用いることができる。
【００１５】
なお、上記エラグ酸、エラグ酸誘導体、エラグ酸類似化合物、リグナン類の精製方法は上記方法に限られるものではないし、また、その他の植物から得られるならばそれらも同様にキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分として用いることができる。更に、上記各段階で得られる抽出成分を組み合わせて用いることもできる。
エラグ酸誘導体としては、後述するｖａｌｏｎｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｌａｃｔｏｎｅ  以外、基本骨格としてエラグ酸構造を有し、その水酸基に糖、脂質、アミノ酸、ポリフェノールなどが結合したもの、或いはその水酸基がメチル基、アセチル基等に置換・抱合されたものを挙げることができ、これらであればｖａｌｏｎｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｌａｃｔｏｎｅ  と同様の効果を発揮するものと考えられる。
エラグ酸類似化合物としては、３，４，８，９，１０−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ．ｄ］ｐｙｒａｎ−６−ｏｎｅ  などのエラグ酸に構造が似ている化合物、例えば加水分解するとエラグ酸を生成するエラジタンニン（ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｉｎ）  等であり、これらは３，４，８，９，１０−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ．ｄ］ｐｙｒａｎ−６−ｏｎｅ  と同様の効果を発揮するものと考えられる。
【００１６】
本発明に係わるバナバの抽出物は、後記する実施例からも明らかなように、キサンチンオキシダーゼの活性を阻害する作用を有し、尿酸の生成を抑制することができる。このため、痛風など高尿酸血症に起因して生じる様々な疾患の予防及び治療に利用することができ、更には炎症、老化、発癌、動脈硬化、脳障害など活性酸素に起因して生じる様々な疾患の予防及び治療にも効果を発揮する。
【００１７】
本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、飲料（缶、ペットボトル、瓶等）などとして様々に提供することができる。例えば、キサンチンオキシダーゼ阻害作用を有するバナバ茶飲用として提供することもできる。
剤型としては、凍結乾燥或いは噴霧乾燥等により乾燥させて乾燥粉末として提供することもできるし、また液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、液剤、乳剤、アンプル、注射剤等とすることもできる。
【００１８】
また、上述の「抽出成分」のみを単独でキサンチンオキシダーゼ阻害剤の有効成分とすることもできるが、その他キサンチンオキシダーゼ阻害作用を有する食品、或いは抗高尿酸血症剤として知られているアロブリノールやアロキサンチン、尿酸利尿剤として知られるブロベネシド、ベンズブロマロンなどを併用すれば一層効果を高めることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
（植物素材からのスクーリニング）
いわゆる健康茶として知られいる１０種類の植物素材を集め、これらのキサンチンオキシダーゼ酵素活性阻害効果を比較検討した。
各植物素材をミルにて粉砕後、その０．５ｇをねじ付き三角フラスコに入れ、熱湯５０ｍｌを加え、３０分間抽出した。得られた抽出液をフィルターでろ過し、後述する測定方法によってキサンチンオキシダーゼ酵素活性阻害効果を調べた。この結果は図１に示した。
【００２０】
図１の結果より、バナバ葉を抽出して得られた成分（粗抽出物）は、その他の素材と比較して優れていることが判明した。
そこで、バナバ葉の熱水抽出エキス（粗抽出物）を作成し、以下のようにＨＰ−２０  カラムクロマトグラフィー、有機溶媒抽出による分画操作を行い、各分画についてキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定することとした。
【００２１】
（バナバ葉の抽出及び精製）
図２に示す工程でバナバ葉の抽出及び精製を行い、各分画について後述する測定方法によってキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。
【００２２】
すなわち、フィリピン産バナバ生葉を適宜量強制的に充分乾燥させ、これを粉砕してよく混合したバナバ葉１ｋｇを、５０リットル、９５〜１００℃の熱水で３０分間抽出した。この時の抽出溶液のブリックス（ｂｒｉｘ）は約１．５％であった。得られた抽出液をろ過、遠心分離させた後、更にエバポレーターで濃縮し、これを噴霧乾燥させて「熱水抽出物」すなわち粗抽出物を得た。
【００２３】
次に、直径１０ｃｍ、長さ１００ｃｍのガラスカラムにスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂（三菱化成工業株式会社製ダイヤイオンＨＰ−２０  ）を２．５リットル充填し、この充填剤をメタノールで洗浄しさらに蒸留水で洗浄した後、上記「熱水抽出物」（全量）を１リットルの蒸留水に溶かしてこれをガラスカラム内に流し、次いでカラムに対して約６倍量相当の蒸留水を流してスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂に吸着されなかった分画（以下「ＨＰ−２０非吸着分画」という。）を取り除き、その後カラム容量に対して約５倍量相当のメタノールを流してスチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂に吸着された分画（以下「ＨＰ−２０吸着分画」という。）を溶出させた。
こうして得られた「ＨＰ−２０非吸着分画」及び「ＨＰ−２０吸着分画」をそれぞれ濃縮し、凍結乾燥して乾燥物として得た。
【００２４】
次に、得られた「ＨＰ−２０吸着分画」２００ｇを１．５リットルの蒸留水に溶解し、２リットルの酢酸エチルを加え、分液ロートにて充分に振った後、酢酸エチル可溶成分として「酢酸エチル抽出分画」を採取すると共に、続いてこのような酢酸エチル抽出操作を２回繰り返して「酢酸エチル抽出分画」を得、これを濃縮し、凍結乾燥して乾燥物として得た。
【００２５】
他方、上記分液ロート内に残った蒸留水残存成分に１．５リットルのブタノールを加えて充分に振った後ブタノール抽出分画を採取すると共に、続いてこのようなブタノール抽出操作を２回繰り返して「ブタノール抽出分画」得、これを濃縮し、凍結乾燥させて乾燥物とした。
【００２６】
上記「酢酸エチル分画」については更に、分取型高速液体クロマトグラフィーを用いて精製操作を行った。カラムはＹＭＣ  社製カラムＯＤＳ  １２０Ａ（内径２０ｍｍ×２５０ｍｍ  ）を使用し、５０％メタノール（１％酢酸含有）を室温条件下、流速６ｍｌ／ｍｉｎで流した。溶出した成分は紫外部吸収２５４ｎｍでモニタリングした。このとき、大きく５つのピークを検出し（図３）。それぞれのピークに関し、フラクションコレクターを用いて回収し、濃縮後、凍結乾燥によって乾燥物（「高速液体クロマトグラフィー分取成分」）を得た。
【００２７】
そして、上述の各段階で得られた「熱水抽出物」「ＨＰ−２０非吸着分画」「ＨＰ−２０吸着分画」「酢酸エチル抽出分画」「ブタノール抽出分画」「高速液体クロマトグラフィー分取成分」について、後述する測定方法にてキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定し比較検討した。
【００２８】
図４には、分画段階におけるキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示した。
これより、粗抽出エキスをＨＰ−２０  に吸着させることによって活性を上昇させることができ、さらにＨＰ−２０吸着分画を酢酸エチル、ブタノールにて抽出操作することにより活性を更に上昇させることができ酢酸エチル、ブタノール抽出成分はより一層高い活性を示すことが判明した。
【００２９】
図５には、酢酸エチル分画を高速液体クロマトグラフィーで精製し、得られたピークのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示した。
これより、ピークＮｏ．１以外は酢酸エチル分画自身の阻害活性以上を示していた。特に阻害活性の強かったピークＮｏ．２についてＮＭＲ  及びマススペクトルを用いて機器分析したところ、リグナン類である２，５−ｂｉｓ−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３，４−ｂｉｓ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−（２，３，４，５）−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ  （化１）とエラグ酸誘導体であるｖａｌｏｎｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｌａｃｔｏｎｅ  （化２）の混合物であると同定できた、。さらに、ピークＮｏ．３についてはエラグ酸類似化合物である３，４，８，９，１０−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ．ｄ］ｐｙｒａｎ−６−ｏｎｅ  （化３）であると同定でき、ピークＮｏ．４についてはエラグ酸（化４）であると同定できた。
【００３０】
【化１】
0003574001.tif 000002
【００３１】
【化２】
0003574001.tif 000003
【００３２】
【化３】
0003574001.tif 000004
【００３３】
【化４】
0003574001.tif 000005
【００３４】
（キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定）
キサンチンを基質としてその酸化酵素であるキサンチンオキシダーゼによって生成する尿酸量を測定した。使用した試薬はすべて和光純薬工業社の製品を使用した。予め分光光度計のセルに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）  を０．３ｍｌ、サンプル溶液を０．０２ｍｌまたは０．１ｍｌ、蒸留水を０．１８ｍｌまたは０．１ｍｌ、０．１２Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼを０．１ｍｌ混合しておき、０．１ｍＭ  キサンチンを添加することによって反応を開始させた。生成した尿酸は２９５ｎｍにおける吸光度をモニタリングした。また、リファレンスセルにはキサンチンオキシダーゼの代わりにリン酸緩衝液を加えた。キサンチンオキシダーゼ阻害活性は、コントロールとしてサンプルを添加しない場合を１００％として、サンプル溶液添加による吸光度上昇の抑制により評価した。
【図面の簡単な説明】
【図１】１０種類の植物素材を熱水で抽出し、得られた抽出液のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を比較したグラフである。
【図２】オオバナサルスベリ（バナバ）の抽出及び精製の工程例を示した図である。
【図３】分取型高速液体クロマトグラフィーによる溶出パターンを示したグラフである。
【図４】オオバナサルスベリ（バナバ）の熱水抽出物、ＨＰ２０吸着、ＨＰ２０非吸着、更にＨＰ２０吸着分画を酢酸エチル、ブタノールで分配した分画、及びその水残査のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を比較したグラフである。
【図５】分取型高速液体クロマトグラフィーで得られたピークのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を比較したグラフである。
【図１】
0003574001.tif 000007
【図２】
0003574001.tif 000008
【図３】
0003574001.tif 000009
【図４】
0003574001.tif 000010
【図５】
0003574001.tif 000011