(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0003542040.tif 000010
の化合物のアルキル(１−６Ｃ)ジエステル：
ここでｎは１であり；
Ｘは、ヒドロカルビル（１−２０Ｃ）部分であり；
Ｙは、
【化２】
0003542040.tif 000011
からなる群より選択され、
ここでｍは２であり；そして
ＡＡｃは、式（１）の化合物の残りの部分とペプチド結合を介して結合するフェニルグリシンである。
【請求項２】
Ｘが、置換または非置換のベンジルである、請求項１に記載のジエステル；またはその塩。
【請求項３】
Ｙが、
【化３】
0003542040.tif 000012
である、請求項１または２に記載のジエステル；またはその塩。
【請求項４】
前記式（１）の化合物が、γＥ−Ｃ（Ｐｒ）−ψＧおよびγＥ−Ｃ（Ｂｚ）−ψＧからなる群より選択される、請求項２または３に記載のジエステル；またはその塩。
【請求項５】
ジエチルエステルである、請求項１から４のいずれかに記載のジエステル；またはその塩。
【請求項６】
前記式（１）の化合物が、γＥ−Ｃ（Ｂｚ）−ψＧである、請求項４または５に記載のジエステル；またはその塩。
【請求項７】
請求項６に記載のジエステルの塩酸塩。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のジエステルまたは薬学的に受容可能なその塩を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
前記ジエステルが請求項７に記載の塩である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規グルタチオンアナログであるトリペプチド化合物に関する。さらに、本発明は、種々の特性を有し、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を特徴づけるのに有用なグルタチオンアナログであり、ＧＳＴの液相阻害剤としてのトリペプチドパネルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタチオン（ＧＳＨ）は、還元形態で、式γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを有するトリペプチドである。還元グルタチオンは、細胞において酸化還元状態を維持する主要な役割を有し、さらに、多くの機構により、外来物質の脱毒素化を促進する、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の必須基質でもある。これらの機構には毒素の求電子部分の、例えば、グルタチオンへの結合の触媒作用が含まれ、毒素をさらにクリアランスし易くする。これもまた、基質としてグルタチオンが関連する第二の機構は、グルタチオンの酸化に付随する過酸化物の還元に、起因する。
【０００３】
Ａｄａｎｇ，  Ａ．Ｅ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  （１９９０）  ２６９：４７−５４には、異なる濃度で種々のＧＳＴイソ酵素と相互作用するＧＳＨトリペプチドアナログが記載されている。これらのアナログは、グリシン、システイン、あるいは、γ−グルタミン残基のうちすくなくとも１つが、代替のアミノ酸残基で置換されている、ＧＳＨの改変形態である。
【０００４】
さらなる改変形態が、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐａｔｏ，  Ｇ．Ｂ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ  （１９８９）  ４１：１７５−１８０に記載されており、かれらは、ラット肝臓のグリオキサラーゼＩＩ酵素に対するトリペプチドＧＳＨアナログの効果を研究した。このグループにより使用されたトリペプチドは、式γ−Ｇｌｕ−ρ−クロロフェニルカルボニルメチル−Ｃｙｓ−Ｓｅｒのものである。Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （１９６０）  ７６：３４９−３５３には、γ−Ｇｌｕ−ベンジル−Ｃｙｓ−Ｖａｌの合成が記載されてる。３つのＧＳＨアミノ酸の１つのみの置換を含む多くのＧＳＨのトリペプチドアナログが報告され、商業的に入手可能である。
【０００５】
以下に記載されている本発明は、クロマトグラフィー支持体のアフィニティリガンドとして、ならびに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの種々のイソ酵素を特徴づけるために使用されるパネルのメンバーとして有用な新規グルタチオントリペプチドアナログに関する。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、特異的結合能、基質および阻害剤特異性、ならびに、組織分布において異なる多くのイソ酵素の形態で存在する。ＧＳＴイソ酵素の個々の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）は、特性が異なり、従って、腫瘍組織のような特定の組織あるいは細胞型に特徴的である。ＧＳＴは、組織あるいは細胞の、毒性物質に対する防御に関連する全代謝の中枢であるので、ＧＳＴの補体の細胞あるいは組織に対するの特性は、望ましくは腫瘍細胞の場合には、細胞あるいは組織の破壊のための、あるいは、正常組織の場合にはその代謝機能を促進するためのいずれかの方針立案に重要である。
【０００６】
種々のＧＳＴイソ酵素は、同じ遺伝子ファミリーからの優先的なダイマー化を考慮しても、理論的に数十種の異なるダイマーになる可能性のある、４種の遺伝子ファミリー中の少なくとも１５の既知遺伝子にコードされるモノマーの２元性組合せ体により形成されたダイマータンパク質である。これらの組合せの可能性から生じる可変性に加えて、ＧＳＴイソ酵素サブユニットは、ヒト個体群においては多形であり、ファミリーの縦列繰り返しメンバー中の遺伝子変換事象によるさらなる変化に提供されると考えれてきた。翻訳後の改変は、この可変性にさらに加える。各細胞および組織は、１つあるいは数種の理論的に可能な酵素を含有し得るので、ＧＳＴ補体の決定は、非常に重要である。
【０００７】
本発明は、吸着剤（ｓｏｒｂｅｎｔ）あるいは液相阻害剤として、ならびに、それらを含むパネルとして有用な新規グルタチオンアナログを提供することにより、個々のＧＳＴ酵素あるいはそれらのセットの特徴づけおよび操作のための改良法を提供する。
【０００８】
【発明の要旨】
本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼイソ酵素の特徴づけ、細胞および組織のＧＳＴ補体の決定、および、治療上の適用に有用な試薬に向けられている。本発明の化合物は、還元グルタチオンの系統的な改変形態、および、標的酵素に関する種々の特性を有するこのようなアナログを含むパネルである。本発明の化合物はまた、クロマトグラフィーのアフィニティリガンド、結合剤、および、酵素阻害剤として有用である。
【０００９】
本発明のトリペプチドのエステルは、治療および診断に特に有用であり、アミドは、薬学特性あるいは生理学的作用を改変し得る部分に誘導体化し得る。従って１つの局面においては、本発明は以下の式の化合物のアルキル（１−６Ｃ）エステル、アリールアルキル（７−１２Ｃ）エステル、およびアミドに向けられている。
【００１０】
【化１８】
0003542040.tif 000002
【００１１】
ここで、ｎは、１あるいは２であり、
ここで、ｎが１のときは、Ｘは、任意に、１つあるいは２つの非隣接ヘテロ原子（Ｏ、ＳまたはＮ）を有する、モノ−またはジ置換の、あるいは非置換のヒドロカルビル（１−２０Ｃ）部分であり、ここで、該置換基は、ハロ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−ＮＲ２、ＯＲ、および、ＳＲからなる群より選択され、ここで、各Ｒは独立して、Ｈあるいは低級アルキル（１−４Ｃ）であり；そして、ｎが２であるときは、１つのＸは、上記で定義されたものであり、他のＸは、低級アルキル（１−４Ｃ）であり；
Ｙは、
【００１２】
【化１９】
0003542040.tif 000003
【００１３】
からなる群より選択され、
ここにおいて、ｍは、１あるいは２であり；そして、
ＡＡｃは、ペプチド結合を介して、式１の化合物の残りの部分に結合されたアミノ酸である。
【００１４】
他の局面においては、本発明は、上記で定義された式１の化合物のシクロアミド形態に向けられており、ＸはまたＨであり得る。
【００１５】
さらに他の局面では、本発明は、ヒトのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）酵素を精製あるいは特徴づけるための方法に向けられており、該方法は、該酵素を含有すると考えられる試料を、上記で定義された構造式（１）の化合物が結合された固体支持体に、該固体支持体にヒトＧＳＴが吸着される条件下で、接触させる工程；該試料から該支持体を分離する工程；および、該ヒトＧＳＴを該支持体から溶出する工程；を、包含する。
【００１６】
さらに他の局面では、本発明は、試料中のＧＳＴ酵素の存在あるいは不存在を検出するための方法、および、必要に応じて、それをクラスに特徴づける方法に向けられており、該方法は、上記で定義された構造式（１）の化合物で試料を処理する工程；および、試料中に含有される任意のＧＳＴと構造式（１）の化合物との複合体の存在あるいは不存在を検出する工程；を、包含する。
【００１７】
本発明はさらに、構造式（１）（またはそのエステル、塩、アミド、またはそのシクロアミド形態）の少なくとも５つの異なるトリペプチドグルタチオンアナログを含有するパネルを包含し、このパネルの化合物は、異なる特性を有する。これらのパネルは、クロマトグラフィー支持体パネルとして構成され得、細胞のＧＳＴ補体の特徴づけに使用され得る。
【００１８】
最後に、本発明は、Ｘが、モノ−、ジ−、あるいは、トリ置換アリール（１−２０Ｃ）、好ましくは、ベンジルであり、ここで置換基が、Ｒ’、ハロ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、ＯＲおよびＳＲからなる群より選択され、ここでＲが、Ｈあるいはアルキル（１−６Ｃ）であり、そして、Ｒ’がアルキル（１−６Ｃ）、アルケニル（１−６Ｃ）あるいはアルキニル（１−６Ｃ）である、構造式（１）の化合物に向けられている。
【００１９】
【発明の構成】
本発明は、個々に、クロマトグラフィーリガンドとして、および、ＧＳＴ阻害剤として有用な化合物、ならびに、種々の特性を有し、例えば、ＧＳＴ酵素のプロフィールの決定、ならびに、プロフィール、例えば、ＧＳＴ酵素の決定および未知試料中のＧＳＴ補体の決定に有用な、関連化合物のパネルに向けられている。本発明の化合物は、還元グルタチオンの系統的に改変された形態、および、標的酵素に関して種々の特性を有するこのようなアナログを含むパネルである。
【００２０】
アフィニティクロマトグラフィーにより試験されるときには、これらの異なる吸着剤は、以下のＭａｎｎｅｒｖｉｋ，  Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （１９８５）  ８２：７２０２−７２０６によって提唱された分類スキームに従った特定のクラス（単数または複数）の、哺乳類ＧＳＴイソ酵素に選択的に結合する：α（例えば、ヒトαおよびＡｌ−ｌ、ラット  １−１および２−２）、Ｍｕ（ヒトμ、Ｍｌａ−ｌａ、ラット  ３−３および４−４）、Ｐｉ（ヒトπおよびＰ１−１、ラット  ７−７）、ならびに、さらに最近に提案されたクラスであるテトラ（ラット  ５−５）。ＧＳＴ酵素活性の阻害について試験されるときは、数種の吸着剤はさらに、ＧＳＴイソ酵素クラスの選択的あるいは特異的阻害剤としても作用する。従って、本発明の化合物、パネル、および、方法は、特定のＧＳＴイソ酵素のレベルを上昇した細胞を標的する薬剤を設計するための新規戦略になり得る。
【００２１】
〔本発明の化合物〕
本発明の新規化合物には、構造式（１）の部分が含まれる。ここにおいて、Ｘは、任意に１つあるいは２つの非隣接ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、あるいは、Ｎ）を有する、モノ−あるいはジ−置換の、または、非置換のヒドロカルビル（１−２０Ｃ）部分であり、そして、他は、存在しないか、あるいは、低級アルキル（１−４Ｃ）である。好ましい実施態様では、ｎは１であり、Ｘは非置換ヒドロカルビルである。Ｘの好ましい実施態様には、メチル、プロピル、ヘキシル、オクチル、ベンジル、およびトリチルが含まれる。シクロアミド形態では、ＸはまたＨであり得る。
【００２２】
本明細書では、「ヒドロカルビル」とは、１−２０Ｃの、直鎖あるいは分枝鎖、または、環状、飽和あるいは不飽和、脂肪族あるいは芳香族のヒドロカルビル残基のことである。１−２０のＣに加えて、構造上現実的であれば、このヒドロカルビルはさらに、１つあるいは２つの非隣接ヘテロ原子、すなわちＯ、ＳまたはＮを含有し得る。従って、このヒドロカルビル基は改変されて、エーテル、ジエーテル、チオエーテル、あるいは、ジチオエーテル、または、二級あるいは三級アミンまたはジアミンであり得る。このような置換基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、２，３−ジメチルオクチル、ドデシル、９，９−ジメチルウンデシル、アリル、２−ブテニル、イソブテニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロヘプチル、フェニル、ベンジル、４−メチルベンジル、トリフェニルメチル、メトキシエチル、エチルチオエチル、ジエチルアミノプロピルなどが含まれる。
【００２３】
さらに、このヒドロキシカルビル、あるいは、１つあるいは２つのヘテロ原子を有するヒドロキシカルビルは、任意に１つあるいは２つの置換基で置換され得る。これらの置換基は、ハロ、すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、あるいはヨード、または、ヒドロキシあるいはスルフィドリル、および／または、アルキルオキシ、または、アルキルチオ、例えばメチルチオ、ブチルチオ、プロポキシあるいはエトキシ、および／または、−ＮＯ、−ＮＯ２、または−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）あるいは−Ｎ（アルキル）（アルキル）であり得る。
【００２４】
ＡＡｃは、任意の遺伝子にコードされるアミノ酸であり得る。ＡＡｃはまた、ヒドロキシプロリン（ＨＰ）、４−アミノ酪酸（４ＡＢｕ）、β−アラニン（β−ａｌａあるいはβＡ）、フェニルグリシン（ＰＧあるいはφＧ）、バリン、アラニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、置換されたファニルアラニンなどの、遺伝子にコードされないアミノ酸残基であり得る。ＡＡｃは、構造式（１）の化合物の残りの部分に、ペプチド結合を介して結合される。
【００２５】
Ｘが置換ベンジルである本発明の化合物において  、構造式（１）の遊離酸あるいは塩の形態で、または、エステル、アミド、あるいはシクロアミド形態のとき、ヒトＧＳＴの種々サブタイプに対する特異性は、ベンジル部分のパラ置換基を変化させることにより制御され得る。ｔ−ブチルあるいはメチルまたはベンジルのような疎水性パラ置換基を有するＸの実施態様は、ＧＳＴ−Ｍｌａ−ｌａのようなμ（Ｍ１）クラスのヒトＧＳＴに優先的に結合する。パラ位の電子吸引置換基、例えば、ニトロあるいはクロロは、好ましくは、π（Ｐ１−１）酵素を結合する。イソ酵素結合のｌｏｇ画分に対するハメットシグマ／メタ値のプロットは、直線の相関性を示すが、シグマ／パラ値が使用されるときは、明白な相関性は現れない。一般に、なんらかの立体的なかさ高い基（ｂｕｌｋ）がＧＳＴを結合するのに必要であるように思われる。非置換あるいはフッ素化物置換基のみを有するベンジル置換基は、容易に結合しない。
【００２６】
本発明の化合物には、アルキルあるいはアリールアルキルエステル、または、アルキルアミドあるいはアリールアルキルアミドがそれらの塩として含まれ得、あるいは、環状アミド形態であり得る。遊離カルボキシルのアルキルエステルは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ヘキサノールのような、直鎖あるいは分枝鎖のアルキルアルコール（１−６Ｃ）のエステルである。適切なアルキル（１−６Ｃ）アミドは、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソペンチルアミン、および、イソヘキシルアミンのような、一級の直鎖あるいは分枝鎖のアルキルアミンである。アリールアルキルエステルは、７−１２のＣを有し、ベンジル、２−フェニルエチル、２−フェニルプロピルのような、フェニル−低級アルキル誘導体を包含し得る。フェニル基は、非置換であり得るか、あるいは、メチル、クロロなどの、本発明の化合物の特性に実質的に影響しない、１−２個の置換基により置換され得る。エステルおよびアミドは、構造式（１）の基質化合物中の任意のアルコールあるいはアミノ官能基を適切に保護して、従来の方法により調製される。
【００２７】
化合物は、モノエステルあるいはジエステル、または、モノアミドあるいはジアミド（または、ＡＡｃの選択に依存して、トリエステルあるいはトリアミド）であり得ることは注目されるべきである。従って、本発明には、１つのみのカルボキシル基がエステル化されているエステル、２つのカルボキシル基がエステル化されているエステル、あるいは、全ての（２つを超える場合には）カルボキシル基がエステル化されているエステルが含まれる。同様の実施態様が、対応のアミドに適応される。さらに、化合物は、１つのカルボキシルがエステルであり、そしてもう１つのカルボキシルがアミドである、混合エステル／アミドとして調製され得る。
【００２８】
本発明の化合物の塩は、水酸化ナトリウムあるいは水酸化カリウムのような無機塩基、あるいは、カフェインあるいはピペリジンのような有機塩基から形成されて、遊離カルボキシル基の塩基性塩を得るか、または、有機酸あるいは無機酸から形成されて遊離アミノ基の酸付加塩が得られ得る。従って、塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムのような無機塩基、あるいは、トリメチルアミン、ピリジン、ピリミジン、リシン、カフェインのような有機塩基の塩であり得る。酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸のような無機酸から形成され得るか、あるいは、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸のような有機酸から形成され得る。
【００２９】
塩は、適切な塩基あるいは酸で、約０℃から約１００℃で、好ましくは、室温で、水のみの中で、あるいは、メタノール、エタノールあるいはジオキサンのような不活性な水混和性有機溶媒との組合せのいずれかの中で、処理することにより、標準的なプロトコルで生成される。
【００３０】
構造式（１）の化合物の環状形態は、基質化合物中の遊離アミノ基および遊離カルボキシル基を架橋することにより調製される。環状化合物の形成は、本質的に当該分野に公知である手段により、必要に応じて適切な保護をなし、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤で通常のように処理することによりなされる。
【００３１】
構造式（１）の化合物のほとんどの実施態様では、シクロアミドが、Ｙのアミノ末端に存在する遊離アミノ基と、ＡＡｃにより示されるカルボキシ末端のカルボキシル基とで形成される。しかし、ＡＡｃが、側鎖アミノ基（ＡＡｃがリシンであるようなもの）を有する限定された実施態様では、シクロアミド化合物の代替形態もまた、ＡＡｃの側鎖アミンおよびＹの側鎖カルボキシルに関して調製され得る。適切な保護基が、当該分野に公知であるように、シクロアミド化をするために使用され得る。
【００３２】
本発明の化合物は、Ｙ、ｎ、ＸおよびＡＡｃの固有名（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅ）を命名することにより、さらに特徴づけられ得る。Ｙを命名するために、構造式（１）のＹ置換基の隣に示されているカルボニル基は、便宜上命名に含まれ；この場合には、「Ｙ−ＣＯ」の種々の実施態様には、γ−Ｇｌｕ、β−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、β−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、および、Ａｓｐ−Ｇｌｙが含まれ、１文字アミノ酸コードでは、それぞれに、γＥ、βＤ、Ｅ、Ｄ、γＥ−Ｇ、Ｅ−ＧおよびＤ−Ｇで示される。
【００３３】
Ｘで示される種々の置換基は、標準的な略語で示され得、本発明の化合物のトリペプチドアナログに含まれるものは、ｎ＝１のときにはＣ（Ｘ）、あるいは、ｎ＝２のときにはＣ（Ｘ）（Ｘ）で示した。ｎ＝２のときの構造式（１）の化合物では、システイン残基のイオウは、正電荷を有し、スルホニウムイオンとして存在する。
【００３４】
ＡＡｃの表示も、標準的な１文字アミノ酸略語コード、あるいは、他の適切な、遺伝子にコードされないアミノ酸のための略語であり得る。
【００３５】
従って、この表示を用いた構造式（１）の適切な化合物には以下のものが含まれる。
【００３６】
【化２０】
0003542040.tif 000004
【００３７】
構造式（１）のこれらの化合物は、環状化されるか、あるいは、エステル化／アミド化されて、本発明の化合物が得られる。
【００３８】
〔本発明の化合物の特徴〕
本発明の化合物は、グルタチオンを基質として利用するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ような酵素の、液相、あるいは固定化された阻害剤として有用である。このような阻害は、分析あるいは治療の両方法に望まれ得る。
【００３９】
治療剤としては、細胞膜透過が、これらの疎水性形態により最もよく達成されるので、本発明のエステル化化合物が、最も有用である。特に好ましいエステルは、ベンジルエステルおよび誘導体化ベンジルエステルである。さらに好ましくは、エチルエステルである。
【００４０】
従って、細胞培養におけるインビトロ使用には、例えば、スクリーニングアッセイでは、本発明の好ましい化合物はエステル化形態である。さらに、エステルおよびアミドの両方が、治療剤、診断薬、および固体支持体へ結合するリガンドとして適合するように、本発明の化合物を改変する好機を提供する。エステルあるいはアミド基は、細胞透過を促進する疎水性部分、他の基質への結合を促進する反応基のようなさらなる有用なリガンド、および、抗体あるいはそれらのフラグメント、免疫原性を高めるキャリアなどのようなさらなるリガンドを含み得る。さらに、化合物は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製を促進するキレート剤、ペプチドの溶解性を変える置換基、またはポリエチレングリコール付加のような薬物動態学に影響する置換基のような置換基を含むことにより改変され得る。
【００４１】
従って、種々の状況において、構造式（１）の化合物のエステルおよびアミドは、遊離酸あるいは塩の形態により明確な利点を提供する。
【００４２】
構造式（１）の化合物のシクロアミド形態は、標的ＧＳＴに、高められた特異性および選択性の利点を提供する。一般に環状形態は、クロマトグラフィーリガンドとしては開鎖形態よりも優れている。さらに、それらの阻害特性はこの特徴により調節される。
【００４３】
Ｘの実施態様として置換ベンジルを有する本発明の化合物は、種々のＧＳＴに対する化合物の選択性を系統的に制御する好機を提供する利点がある。例えば、本明細書の実施例８に示すように、ヒトＧＳＴのμおよびπグループの結合特異性は、本発明の特定の化合物のＣｙｓ残基のイオウ原子に結合されたベンジル部分のパラ置換基の特性により制御される。結合特異性は、Ｓ−ベンジルＣｙｓ部分のパラ置換基のシグマ（メタ）値と相関性がある。
【００４４】
〔クロマトグラフィーリガンドおよび分析試薬としての使用〕
本発明の化合物はまた、個々に診断用クロマトグラフィー支持体、およびクロマトグラフィー用手段として有用である。特徴づけおよび精製のため、ならびに診断アッセイのための、アフィニティクロマトグラフィーでのこれら化合物の使用は、ヒトＧＳＴの場合には特に重要である。本発明の化合物のパネルは、組織のＧＳＴ補体を決定するのに最も都合がよいが、個々の化合物は、一般的にＧＳＴの存在の検出、およびヒトにおける特定の型のＧＳＴの検出、ならびに特定の型のヒトＧＳＴの精製に使用され得る。従って、以下の実施例８に示すように、本発明の種々の化合物は、μ（Ｍ１）およびπ（Ｐ１）クラスのヒトＧＳＴを結合する、それぞれの傾向を有する。
【００４５】
本発明の化合物群、または遊離酸あるいは塩として構造式（１）の単独化合物が、リガンドの選択に依存して、集合的に、ヒトＧＳＴの精製および特徴づけ、ＧＳＴのヒトクラスの精製および同定、または個々のヒトＧＳＴ酵素の精製あるいは分離のために、クロマトグラフィーリガンドとして使用され得る。
【００４６】
クロマトグラフィー支持体のアフィニティリガンドとしての使用には、構造式（１）を含む化合物は、セファロース、ポリアクリルアミド、シリカなどのような適切な固体マトリックスに標準的な結合方法により結合される。本発明の非環状形態の化合物は、適切なリンカーに、あるいは直接支持体に誘導体化され得る、アミノ官能基およびカルボキシル官能基を少なくとも有する。固体支持体の特性に依存して、アフィニティリガンドの結合は、直接共有結合を用いるか、またはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）から入手可能なもののような、モノあるいはヘテロ二官能性リンカーの使用が必要とされ得る。さらに、接近しやすくするために支持体表面からアフィニティリガンドで距離をおくことが望まれ得る。このような距離をおくことは、一般的に理解されているように、スペーサーアームを使用してなされ得る。さらに、支持体は、特に支持体が、生物学的試料のクロマトグラフィーに使用されなければならないときには、望ましくない相互作用を最少限にするために、不活性物質で処理され得る。
【００４７】
誘導体化クロマトグラフィー支持体は、１種以上のこのようなリガンドに固体支持体を結合することで構造式（１）の構造を含む種々の化合物を利用する。リガンドは、グラジエントに、混合物としてランダムに、あるいは所望の予め決定されたパターンに整えられ得る。さらに、本発明の化合物の組合せは、アフィニティリガンドとして作用する１種以上の化合物と、クロマトグラフィー分離あるいは特徴づけを受ける物質の溶出を行う、アフィニティリガンドに対する競合物として使用される１種以上の化合物との間で平衡を達成するクロマトグラフィーの適用に使用され得る。クロマトグラフィー手法を受ける部分の親和性を変える物質が、リガンドおよび溶出剤に使用される。
【００４８】
構造式（１）を含む化合物で誘導体化されたクロマトグラフィー支持体は、次に、ヒトＧＳＴ、あるいは、そのリガンドが親和性を有する他の酵素、基質としてグルタチオンを利用する他の酵素、グルタチオンと反応する抗体、あるいはリガンドに穏和な親和性で結合する他の部分を調製分離するために使用され得る。本発明の化合物に結合されたクロマトグラフィー支持体はまた、グルタチオンと同様の構造を有する物質を含有することが考えられる、生物学的試料あるいは他の試料中の物質の、存在、不存在、量、あるいは特性の決定をする診断に使用され得る。
【００４９】
このような分離あるいは分析に有用な構造式（１）の構造を含む適切な化合物は、調製が望まれる分析物あるいは物質の特性から明白になり得るか、あるいは、化合物の種々のパネルを調製し、最も有効なアフィニティリガンドに対するパネルをスクリーングすることにより容易に決定され得る。
【００５０】
構造式（１）の構造を含む化合物はまた、一般的にヒトＧＳＴの存在あるいは不存在の検出、または、特定クラスあるいはそれらのイソ酵素用に使用され得る。このようなアッセイのプロトコルは、イムノアッセイに使用されるプロトコルを模倣する。これらのプロトコルは、一般的に、アッセイの特異性が結合特異性に依存する特異結合パートナーを含む任意のアッセイに適用され得る。従って、このようなアッセイでは、構造式（１）の構造を含む化合物は、分析物、この場合には特定のＧＳＴに、特異的な抗体あるいは他の免疫反応試薬の役割をなす。このようなプロトコルには、「免疫複合体」（この場合には、ＧＳＴと構造式（１）の構造を含む化合物との複合体）の形成に対する種々広範囲の検出方法による、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、直接結合アッセイなどが含まれる。このような検出方法には、蛍光タッグ、酵素標識、放射活性標識、および、それらの組合せが含まれる。
【００５１】
〔パネル〕
本発明のパネルは、構造式（１）のグルタチオンの、少なくとも５つの異なるトリペプチドアナログで構成される。ここにおいて、Ｘ、ＡＡｃ、およびＹは、上記のように定義されるが、ＸはさらにＨであり得る。パネルは、最大限に特性が異なる場合に最も有用である。この多様性は、Ｙ、ＡＡｃ、およびＸの特性を変えることにより供給され得る。一般的には、Ｘ置換基を用いて、例えば、疎水性を変えることにより、このような疎水性の特性範囲が得られ得る。Ｘはまた、種々の得られる化合物のハメット定数（シグマ／メタおよびシグマ／パラ）の変化に便利な置換基である。ＡＡｃの変化から得られる多様性は、いくぶん焦点が合わされておらず、Ｙの多様性により提供される多様性は、その構造上の制限によって限定される。  ハメット定数は、安息香酸のイオン化定数に及ぼす置換基の電子的影響を示す得られた値に類似する値である。この初期の研究の結果として、異なる置換基の大きな集団に数値が割り当てられた。種々の置換基に対するこのような値の表は、例えば、Ｒｉｔｃｈｉｅ，  Ｃ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｇ  Ｐｈｙｓ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  （１９６４）  ２：３２３に記載されている。
【００５２】
本発明の一連のアナログの構築は、例えば、Ｘの実施態様として、パラ位で、ニトロ、クロロ、メトキシあるいはメチルのような、さらなる置換基でさらに置換されたベンジル基を使用することにより、このパラメーターの値を系統的に変化させることによりなされ得る。
【００５３】
この立体特性、および、パネルのメンバーである構造式（１）の化合物の得られる特性はまた、パネルの１つ以上のメンバーの環状化により制御され得る。
【００５４】
例えば、適切な二次元パネルを形成する本発明のグルタチオンアナログトリペプチドの二次元マトリックスは、ＡＡｃ成分を小さな疎水性残基から大きな疎水性残基に、正に荷電された残基に、中性残基に、そして最後に負に帯電した残基にすることにより構築され得、このように後者３つのアナログでは誘導電子効果に影響する。同様に、Ｘ置換基は、第二の次元で小さな疎水性から大きな疎水性に、正に帯電、中性から負に帯電される同じ範囲で変化され得る。得られたマトリックスは、例えば、吸着剤としての使用に適切な化合物を決定するための使用のための適切なパネルを提供する。
【００５５】
特に有用なＸの実施態様は、置換ベンジルであり、ここにおいて、疎水性、および、パラ置換基の電子供与あるいは吸引能力の変化が、ヒトＧＳＴの特定のクラスを結合する能力と系統的な相関性を有する。
【００５６】［本発明のパネルの使用］本発明のパネルは、正常細胞（望ましくない細胞（ｕｎｗａｎｔｅｄ  ｃｅｌｌ）に比較して）および組織に存在するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼイソ酵素（ＧＳＴ）の異なる相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（本明細書では「補体」とも称する）を決定するために有用である。「ＧＳＴ相補体」とは、正常細胞または腫瘍細胞または正常組織または腫瘍組織に存在するＧＳＴイソ酵素レベルのパターン、あるいはこのようなＧＳＴの発現の誘発または抑制が操作され得るように遺伝的にプログラムされているＧＳＴイソ酵素レベルのパターンを意味する。上記の従来技術の項に説明されているように、ＧＳＴは、サブユニットから形成されるホモあるいはヘテロダイマーであり、少なくともそのうちの７つが知られている。さらに、これらのイソ酵素は、広く分類されているが、各クラス内の個々のメンバーは、遺伝子的多様性により個々は区分され得る。種々のイソ酵素の特性は、基質特異性、阻害感受性、特異試薬への結合、および、発現の誘発可能性を含む、測定可能な一連のパラメーターに関して異なる。
【００５７】
〔ＧＳＴのプロフィールを決定するための本発明のパネルの使用：背景〕
未知組織試料のＧＳＴイソ酵素補体を決定する、最も容易に理解される方法は、まず、決定されたまたは決定され得る反応性プロフィールを有する全ＧＳＴイソ酵素のリファレンスセットを推定する。このように十分な高分解分離を仮定し、例えば高分解クロマトグラフィーフォーカシングに類似する任意の分析法を用いて、溶出パターンを一連の既知酵素と比較する。既知イソ酵素の分離および特徴づけの他の方法には、数種のＧＳＴヒトイソタイプに対して調製され、候補組織中のこれらのイソタイプのＧＳＴ成分を評価するために使用される抗体の使用が含まれ得る（Ｈｏｗｉｅ，  Ａ．Ｆ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  （１９９０）  １１：４５１−４５８；  Ｂｅｃｋｅｔｔ，  Ｇ．Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  （１９８４）  １４１：２６７−２７３）。ゲル電気泳動分離もまた使用され得る。非変性条件下での電気泳動後のＧＳＴバンドの位置は、例えば、Ｒｉｃｃｉ，  Ｇ．ら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９８４）  １４３：２２６−２３０の方法により決定され得る。クロマトグラフィー分離から得られた種々のイソ酵素の位置は、１ークロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）のような、全イソ酵素に共通である基質を用いて検出され得る。事実、種々の組織でＣＤＮＢによりアッセイされたように、活性の分布は、Ｐｉｃｋｅｔｔ，  Ｃ．Ｂ．、および、Ｌｕ，  Ａ．Ｙ．Ｈ．，  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９８９）  ５８：７４３−７６４によりなされた。
【００５８】
目的の細胞および組織におけるＧＳＴイソ酵素分布のパターンを得るためのこれらの直接分離法の使用は、活性を保持する個々のイソ酵素の単離をなし得る分離方法の前にあらかじめ決定された反応性のプロフィールを、これらの各イソ酵素が有する場合には、治療法の設計に有用であって、このような細胞および組織のＧＳＴ補体を得るために使用され得る。このような反応性のプロフィールは、有効な基質である物質、有効な阻害剤である物質、および、ＧＳＴ活性の誘導物質あるいは活性化物質である物質を考慮し得る。一旦、ＧＳＴイソ酵素が、溶出パターンあるいは電気泳動ゲルの位置により同定ならびに定量されると、例えば治療プロトコルを予測あるいは設計するために、既知で前もって単離されたイソ酵素の反応性のプロフィールと参照される。
【００５９】
この方法は、容易に理解され得るが、補体に包含される潜在的な候補であるＧＳＴイソ酵素が多く存在することにより、およびＧＳＴイソ酵素自身のレパートリーの変化しやすさにより実用的ではない。このように入手できるＧＳＴイソ酵素集団中の多形性は、例えば溶出パターンにおいて、移動度が変化しないタンパク質であるが、基質特異性あるいは阻害特異性が変化したタンパク質になるか、またはその逆のタンパク質になると考えられる。いずれの場合にも、溶出パターンにおける位置のリファレンスセットの特徴と当てはめた結果は誤った結果を得る。
【００６０】
いくぶん改良された結果が、複数の分離法の使用により得られ得、１つの分離系に比較して、複数の分離系では、移動度は影響されないことは殆どありそうにない。このような系は、一般的に、第一の吸着剤Ｐ１が溶出パターンにおいて４つのイソ酵素ピークをつくり、そして５つのピークが第二の吸着剤Ｐ２で得られる、１つの仮定の系により説明される。基質特異性パターン（例えば、基質Ａ、ＢおよびＣに対する）が、Ｐ１で与えられたピーク（例えば、１．２として同定された）が、吸着剤Ｐ２で分離された特定のピーク（ピーク２．４）として、基質プロフィールにおいて実質的に同じであることを示す場合には、次に、吸着剤Ｐ１でピーク１．２を提供し、吸着剤Ｐ２でピーク２．４を提供する組織試料は、ピーク１．２および２．４を形成するイソ酵素と同じ反応性のプロフィール（Ａ、ＢおよびＣを有する）を有することが考えられる。
【００６１】
この仮定の系で説明された方法は、親和性にもとづく吸着剤として、本発明の新規グルタチオントリペプチドアナログ、またはさらなるアナログとの組合せたこのような１つの新規トリペプチド、または種々の特性を有する類似のグルタチオンアナログのパネルとの組合せを使用することにより適用され得る。有効な特徴づけを実施するために、少なくとも２つ、そして好ましくは３つ、さらに好ましくは５つの、このようなアナログが使用されるべきである。パネルのメンバーは、補体中で種々ＧＳＴイソ酵素の区別を確実にするために、十分に多様である特性を有するべきである。
【００６２】
分離方法が、酵素活性を保持する場合には、潜在薬剤に対する各酵素の反応性が直接決定され得る。しかし、当該分野の非変性分離は、分離能の欠如あるいは構造変化に高度に過敏であるかのいずれかであるので、有効な治療法のガイダンス用には、ピーク同定をなすことは非常に問題である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは、個々のＧＳＴイソ酵素の精製のための工程として使用され得るが、分析手段としては、不十分あるいは不適切な分離能を有する。当該分野で利用可能なもう１つの方法、ＩＥＦは、タンパク質のインビボあるいはインビトロにおける翻訳後の改変による、多くの他のピークを発生する傾向があり、構造変化と機能変化に必要な関連がない。
【００６３】
従って、従来の方法により、個々のイソ酵素を分離しそして全ての可能な化学療法薬剤に対して、各イソ酵素について活性プロフィールを決定することにより、細胞および組織中のＧＳＴ補体の活性プロフィールを決定することは困難であるが、しかし、本発明の新規ＧＳＨーアナログトリペプチドの利用可能性により促進される。本発明の化合物は、ＧＳＴ酵素の変性を伴わずに分離を可能にする。  より効果的な方法は、特異結合活性および反応特性を同時に測定するＧＳＴイソ酵素補体のプロフィールを利用する。特性調査（ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）  のプロフィールまたは「ＳＣ」プロフィールと称される、これらのプロフィールは、基質特異性、特異誘導物質に対する応答の誘導など、およびさらなる結合あるいは電気泳動移動度特徴についての情報を含む、ＳＣプロフィールのリファレンスセットの決定を可能にする。これらのプロフィールの比較にコンピューター法を適用することにより、治療に適したガイドを提供するために必要とされる情報、治療モジュレーターの設計および付随するプロトコルに必要な情報、ならびに、提案されたプロトコルの成功あるいは失敗の予測に必要な情報について、従来技術によるよりも、十分に多くの標本について得られ得る。ＳＣプロフィールを得るために使用され得るパラメーターには、本発明のトリペプチドＧＳＨアナログのパネルのメンバーに結合する能力、あるいは、このようなパネルのメンバーの活性に対する効果がある。
【００６４】
細胞および組織の未知試料のＧＳＴ補体を決定するこの方法では、パターン認識法が利用される。この方法と結び付いて、本明細書でＳＣプロフィールと称されるものが、一般的には、特異的かつ微分的に種々のＧＳＴイソ酵素と反応する試薬のパネルに関して決定される。これは、交差反応イムノアッセイにより得られるプロフィールの決定に類似し、候補ＧＳＴイソ酵素あるいはイソ酵素と試薬パネルの混合物の反応性の任意パターンのことである。従って、ＳＣプロフィールは、種々の基質回転率；種々の阻害剤の阻害剤濃度の有効レベル；特定の宿主細胞の状況で、ＧＳＴイソ酵素の遺伝子発現を誘導するに必要な誘発物質のレベル；阻害剤あるいは基質の存在または不存在下での電気泳動移動度；パラログあるいは他のアフィニティカラムからの溶出時間；または、実際の、古典的な抗体パネルとの結合パターン；に関して決定され得る。種々の濃度レベルでの、個々のＧＳＴイソ酵素あるいはイソ酵素の混合物に対して得られたＳＣプロフィールは、本明細書に記載されているさまざまな方法で操作され得て、未知試料のＳＣプロフィールが比較され得るリファレンスセットを提供する。
【００６５】
一般に、ＳＣプロフィールは、「情報チャンネル」の各パネルに対して値を提供し得、ここにおいて各情報チャンネルは、抗体に対する結合親和性、基質親和性、溶出時間などのような、ＧＳＴ補体あるいは標準の特徴を示す。少なくともいくつかの情報チャンネルはＧＳＴ濃度で変化する値に関連するべきである。
【００６６】
細胞あるいは組織のＧＳＴ補体の決定は、それ自体試料の診断および特徴づけに有用である。さらに、望ましくない組織を弱めるかあるいは破壊するための戦略実施態様の設計に使用するには、ＳＣプロフィールは、正常組織と望ましくない組織と間で活性の相違が決定され得るようなＧＳＴ活性に関する情報を提供しなければならない。従って、望ましくない組織のＳＣプロフィールはリファレンス標準と容易に比較されなければならず、そのことは治療モジュレーターの設計および薬剤あるいはプロドラッグの選択を助ける反応パターンに少なくとも部分的に基づかなければならない。この適用には、少なくともリファレンスプロフィールの一部が、基質回転速度データ、阻害データ、あるいは、イソ酵素生産レベルの誘導に関するデータ、または、インシチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）におけるＧＳＴイソ酵素の操作を可能にする他の任意の反応性に基づかなければならない。本発明のパネルは、活性に関するこのような効果を決定するために使用され得る。これらの標準の反応性に影響する試薬に関するＳＣプロフィールの調製とともに、本発明の新規化合物を用いて、活性が保持されるクロマトグラフィー分離の組合せは、必要とされるデータを得るための１つの方法である。
【００６７】
リファレンス標準および未知試料のＳＣプロフィールは、「特異反応試薬」のパネルについて決定される。これらの試薬には、パラログ、基質、阻害剤、誘導物質、抗体、を含む種々の基質、ならびに、反応性の範囲が電気泳動の移動度あるいは溶出時間として決定される、ゲル電気泳動あるいはアフィニティクロマトグラフィーのような実際的な方法である「試薬」が含まれ得る。従って、「特異反応試薬」は、化学反応に影響する試薬に限定されず、その試薬に関して、試料の特徴のパラメーターを得ることを可能にする任意の試薬、あるいは、方法を含む。
【００６８】
もちろん、本発明のアナログのパネルは、結合剤、クロマトグラフィー支持体、あるいは、溶液中の酵素作用に対する阻害剤としてのいづれかで、「特異反応試薬」として使用され得る。ＧＳＴに触媒される酵素反応を阻害するパネルのメンバーとして、これらの化合物の相対的な能力は、アフィニティリガンドとしてトリペプチドアナログを含有するカラムからの溶出パターンとして得られる、特徴的なＳＣプロフィールとして使用され得る。
【００６９】
〔リファレンスＳＣプロフィールの決定〕
以下に記載するように、いくつかの目的のためのリファレンス標準は、特定の被検体の正常組織から直接に調製され得るが、また、特徴的な反応パターンを有する、予め単離された種々のＧＳＴイソ酵素につてのＳＣプロフィールのデータバンクを提供するのに有用である。これらの反応パターンを、望ましくない組織の生体組織検査試料からのパターンに当てはめることにより、治療モジュレーターの適切な設計およびプロドラッグあるいは毒素の選択がなされ得る。
【００７０】
その開示が本明細書に参考として援用されている、米国特許第４，９６３，２６３号および第５，１３３，８６６号は、密接に関連する基質のクロマトグラフィー分離に有用なパラログ親和性試薬のパネルを記載している。本発明のパネルは、同様に多様である。本発明のＧＳＨトリペプチドアナログを用いたパラログ型パネルは、各場合において、天然イソ酵素の活性を維持しているが、精製形態の種々ＧＳＴイソ酵素を分離するためのアフィティ支持体の調製に都合よく使用され得る。従来技術の逆相ＨＰＬＣあるいはウエスタンブロット法とは違って、本発明の化合物に対する親和性に基づいたクロマトグラフィーを用いて調製された、分離イソ酵素は、天然に存在するイソ酵素と実質的に正確に同様の様式で挙動する。次に、このような精製イソ酵素について、基質反応性、あるいは、本発明の化合物により提示されるような活性に影響する試薬の反応性に関するＳＣプロフィールが、構成され得る。これらの精製イソ酵素の多くの特徴的なＳＣプロフィールの有用なデータバンクが、望ましくない組織から得られた試料と比較するための、数学的あるいはコンピューター的に入手可能な形態で、維持され蓄えられ得る。
【００７１】
構造式（１）の構造を含む少なくとも１つのメンバーである、トリペプチドグルタチオンアナログパネルは、リファレンスセットにＳＣプロフィールを提供する情報パネルの収集のための基礎として使用され得る。パネルメンバーへの、既知イソ酵素の特異的基質の結合、あるいは、パネルメンバーの吸着剤への直接結合は、結合性質の系統的な多様化をさらに増大する。標準および未知試料のプロフィールは、アフィニティカラムのような適切な立体配置で本発明のパネルを用いることにより得られ得、そして比較され得る。従って、構造式（１）を含む少なくとも１つのアナログを包含する多種のトリペプチドのアナログのパネルが、特に有用であり、ここにおいて、Ｘは、必要に応じて１つあるいは２つの非近接ヘテロ原子（Ｏ、ＳあるいはＮ）を有する、モノあるいはジ置換ヒドロカルビル、または、非置換ヒドロカルビル（１−２０Ｃ）部分であり、該置換が、ハロ、ＮＯ、ＮＯ２、ＮＲ２、ＯＲ、および、ＳＲからなる群より選択され、ここにおいて、ＲはＨあるいは低級アルキル（１−４Ｃ）であり、そして、ＡＡｃは、構造式（１）の化合物の残りの部分に、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸である。
【００７２】
〔ＧＳＴ補体の決定〕
一般に、「未知の」試料細胞または組織のＧＳＴ補体を決定するために、二つの異なるアプローチが行われ得る。第一のアプローチでは、上述のように、当該分野で現在実施されている一般的な手法を用いて、試料中に含まれる個々のイソ酵素がアフィニティ支持体を用いて分離され得、そしてその活性パターンが個別に試験され得る。試料由来の個々のイソ酵素が得られ得、次いで個別にその基質特異性、阻害剤特異性の評価、およびそのイソ酵素の活性または産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を誘起する物質を同定するための評価がなされ得る。
【００７３】
第二の、より労力の少ないアプローチでは、パターン認識手法が用いられ、上記のように調製したリファレンスのセットに対してこれらのパターンをマッチングすることにより、個々の被験体の望ましくない（ｕｎｗａｎｔｅｄ）組織試料および正常組織試料のどちらか、または両者の試料の即時の読みだし（ｒｅａｄｏｕｔ）が成される。このアプローチでは、必要な試料の量はより少量であり、分離も不必要である。この方法は、ＧＳＴ活性のための組織化学的染色を用いた組織切片への応用の際にも有用である。
【００７４】
第一のアプローチについては、Ｖｏｓ，  Ｒ．Ｍ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８８）３７：１０７７−１０８２によって用いられた分離法の改変が用いられ得る。この方法では、ラットの全肝臓から得られた細胞質ゾル画分を、Ｓ−ヘキシルＧＳＨセファロースをもちいたアフィニティカラムにかけた。このアフィニティカラムは、ＧＳＴ類全体に対してのアフィニティ試薬として用いられた。溶出したＧＳＴ混合物は、濃縮され、そしてモノ−ＰＨＲ  ５／２０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いたクロマトフォーカシングによって分離された。個々のイソ酵素は別々の画分として集められ、そして分析された。これらの画分は、その溶出プロフィール中の位置、そのサブユニットの分子量、および既知のＧＳＴ類の大部分に対しての基質である１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンに対しての特異的活性によって同定された。
【００７５】
本発明の化合物の中から選択されたパラログをアフィニティリガンドとして用いることにより、より温和な条件が用いられ得、そしてＧＳＴイソ酵素のより活性な形態が回収され得る。次いで、これらは基質特異性などについて、試験される。
【００７６】
上記のように、種々のＧＳＴイソ酵素の溶出パターンの特徴を提供するＶｏｓなどの任意の分離手法を単に用いる可能性、および未知のＧＳＴ補体の細胞または組織に対しての溶出パターンをあらかじめ決定された（ｐｒｅｓｅｔ）溶出パターンとマッチングして未知のＧＳＴ補体の性質を決定することの可能性が考慮されるだろう。しかし、このアプローチのひとつの問題点は、ＧＳＴの遺伝的突然変異性（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｕｔａｂｉｌｉｔｙ）にあり、そのため推測された特徴が保持され、従って同様の反応性パターンを有することが確実であるような、信頼性のあるマッチングを行うことは困難である。イソ酵素の遺伝的突然変異性およびその翻訳後の改変に対しての鋭敏さ（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、どの特定のケースにもかなりよくあることで、基質特異性や阻害パターンなど、並びに結合特性および例えばｐＩのような物理的特性に対して深刻な影響を有する。反応性の多様さと、物理的性質あるいは結合の多様さとの間に相関があるという保証はない。実際、このような影響は相関づけられないという確率が高い。上記のように、この問題は、複数のアフィニティ試薬を用いることにより、軽減し得る。これらも本発明の化合物で与えられる。
【００７７】
パターンマッチングのアプローチにおいて、より信頼性の高いアッセイは、未知の試料の反応性のプロフィールをリファレンスのＳＣプロフィールのセットと比較することによって行われる。一般的な分析物の組成物の決定のためのこのアプローチの応用は、係属中の同種出願である、１９９１年４月２日出願の米国特許出願番号Ｎｏ．０７／６７８，０４９に記載されており、この開示は本明細書中に参考として援用される。この出願に記載されている手法によれば、既知の分析物の組成物の試料から得られたプロフィールのあらかじめ決定されたプロットがリファレンスとして用いられ、これと試験される試料のＳＣプロフィールとが比較され得る。一般に、既知の組成物の試料のプロフィールを提供するために、２から１０の、好ましくは４から６の、異なった、特異な反応性の試薬のパネルが最初に用いられる。この参考の出願では、結合試薬のパネルに交差する（ａｃｒｏｓｓ）分析物の候補による交差反応性がある、特定の結合アッセイが用いられ、種々の分析物による既知の結合パートナーに対する結合の阻害定数を測定することによりプロフィールが得られた。プロフィールの集合は、次に、未知の試料の対応するＳＣプロフィールとの信頼性を有する比較ができる多数の手法のうち任意のものにより、数学的に処理される。
【００７８】
本発明の治療方法を実行するために必要なＧＳＴ補体の決定に使用するためのアナログのＳＣプロフィールは、単離されたＧＳＴイソ酵素または既知の組成物を含有するそれらの混合物のいずれか、あるいはその両方を用いて決定され得る。特異な反応性の試薬は、パネルとして、少なくとも１つの、好ましくは３つの、さらに好ましくは５つの、構造式（１）のＧＳＨアナログを、所望により添加試薬（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）と共に、含有しなければならない。このような添加試薬には、回転率が測定されている既知の基質の系列が包含され得る。好適な基質の候補は、例えば、エタクリン酸、ブロモスルホフタレイン、クメンヒドロペルオキシド、ＢＣＮＵ、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、トランス−スチルベンオキシドのようなものを包含する。
【００７９】
ＳＣプロフィールを提供するためのパネルのメンバーである特異な反応性の試薬としての使用するために入手可能なものとしては、多様なレベルでＧＳＴイソ酵素と相互作用する阻害剤もあげられる。これらの阻害剤は、例えば、ピリプロスト（ｐｉｒｉｐｒｏｓｔ）、シバクロンブルー、およびヘマチンを包含する。種々のイソ酵素に対する特異な免疫反応性の抗体、および、パラログタイプのアフィニティ試薬が用いられ得る。プロフィールが治療方針の立案のための根拠を提供するためのものである場合には、パネルのメンバーの少なくともいくつかは、ＧＳＴの酵素的活性を記述しなければならない。
【００８０】
ＳＣプロフィールを得るための他の手法は、Ｔａｋｅｏ，Ｋ．，らによってＪ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７８）１２１：２３０５−２３１０に記載されたものの類似の手法である。このアプローチでは、個々のタンパク質に対しての種々の結合試薬の存在下での分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）電気泳動が、移動度の値の測定を可能とする。Ｔａｋｅｏによって記載されたこの特定の応用においては、ポリアクリルアミド中でデキストラン特異性（ｄｅｘｔｒａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）骨髄腫タンパク質の電気泳動の測定が行われ、デキストランを分離ゲルに添加すると遅延が起こることが示された。その遅延はハプテンイソマルトースオリゴ糖を添加することにより逆転し得る。このアプローチを用いると、既知の組成物に対して、例えば、遅延試薬の選択に依存した移動度の一連の系列が得られ得た。この手法は、遅延試薬または移動試薬として本発明の新規な化合物またはパネルを用いることによる応用が可能である。
【００８１】
生検のＧＳＴ補体の決定のための好ましい一方法では、Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ，Ｂ．らのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９８５）８２：７２０２−７２０６により研究された既知のＧＳＴ基質を用いて、一連のＨＰＬＣカラムが作成される。これらの基質は、カラムの支持体へ直接結合するか、またはＡｄａｎｇ，Ａ．Ｅ．Ｐ．らによってＢｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．（１９９０）２６９：４７−５４に記載されたＧＳＨアナログ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）に付着する。基質と構造式（１）のＧＳＨアナログとの種々の可能な組合せから得られた５０〜１００の異なるカラムの一連の系列が、候補の吸着剤の系列を表す。これらの吸着剤は、その性質が最大の多様性を有するものを選択するために、各々を既知のＧＳＴイソ酵素の混合物の分離に用いることにより、試験される。次に、最大の識別能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を有する４個あるいは５個のカラムが、未知の試料および標準試料中のＳＣプロフィールを決定するためのパネルのメンバーとして選ばれる。
【００８２】
このように、それぞれの個別の吸着剤による溶出パターンとして分離を表示するよりもむしろ、各吸着剤に対しての吸着能がイソ酵素のＳＣプロフィールにおいて情報チャンネル（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）を表すように、データが再配列される。誘導物質、活性化物質、基質、および阻害剤に関した反応性パターンもまた、各イソ酵素のために決定され、そして情報チャンネルとして用いられる。既知の各イソ酵素ための完成されたプロフィールは次に、リファレンスのセットのメンバーとして用いられる。リファレンスのセットの他のメンバーは、正常組織から得られた試料を用い、そして同じ情報チャンネルのセットに帰属された値を求めることにより決定される。未知の、望ましくない組織から得られた生検試料の対応するプロフィールは、次に、このリファレンスのセットと比較される。
【００８３】
既知の組成物のためのプロフィールは、同様に決定された未知の試料のプロフィールとの比較のために、コンピューターでアクセス可能な形態で保存される。このようにして、未知の試料のＧＳＴ補体を決定するためのキットが提供され得る。このキットには、リファレンスのプロフィールの決定に用いられる試験パネルのメンバーと共に、未知の試料のＳＣプロフィールの決定のための指示書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）が含まれる。リファレンスのプロフィールにアクセスするために適したソフトウェアも含まれ得る。ＧＳＴ補体は、試験される試料を特徴づけるために用いられ得、そして、もし適切であれば、治療を設計するために用いられ得る。
【００８４】
疾患組織に対して、処置のための適切な方針が選択され得る。補体は、望ましくない細胞または組織に適用された場合に、標準的な処置のプロトコルが成功するかどうかを決定するために、評価され得、あるいは、毒素またはプロドラッグの選択および治療上のモジュレーターの含有または非含有を包含する異なるプロトコルを設計するために用いられ得る。
【００８５】
〔新規なトリペプチドアナログの合成〕
本発明の新規なトリペプチドアナログ、または、他の、様々のパネルのトリペプチドアナログのメンバーは、一般に当該分野で公知の方法を用いて合成され得るが、これらの一般的な方法を所望のトリペプチドに適用可能とするような改変が用いられる。固相合成の方法論も用いられ得るが、これらの短いペプチドのためには液相のペプチド合成の方が優っていると考えられる。もともとは固相合成のために開発されたＦｍｏｃ試薬が、量にして１００ｍｇ程度のトリペプチドアナログを生成するための液相法に適用され得る。
【００８６】
液相のＦｍｏｃ化学を用いて合成された、中間体の保護されたジペプチドおよびトリペプチドが、シリカゲルのクロマトグラフィーで単離され、温和な塩基中で脱保護され、このようにして酸に不安定な（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ）チオ抱合体が合成される（Ｉｓｅｌｉｎ，Ｂ．らのＨｅｌｖ．  Ｃｈｅｍ．  Ａｃｔａ．（１９５５）３８：１５０８−１５１６）。このアナログは精製および回収され得る。あるいは粗生成物の混合物は直接固体支持体に結合して親和性に誘導体化された支持体を提供し得る（Ｓｕｎｄｂｕｒｇ，Ｌ．らのＪ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．（１９７４）９０：８７−９８）。
【００８７】
Ｃ−末端アミノ酸ＡＡｃのエステルが得られないようなこれらの条件下では、このエステルはＮ−Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸を合成し（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．らの「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、イギリス、オックスフォード、（１９８９）、４７−６１ページ）、次に、濃硫酸の存在下で所望のアルコールで処理してエステル化（Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｌ．，Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．（１９６２）４０：５７０−５７２）することにより得られる。エステル化されていない物質が温和な塩基で抽出され、そして所望のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸エステルがエバポレーションによって単離される。
【００８８】
イオウ官能化されたＦｍｏｃシステイン誘導体は、システインをＦｍｏｃ−ＯＳｕで処理してｐＨ９とし、そして次にこの混合物を適切なアルキル化剤で処理することによる、一容器内の調製により合成される。
【００８９】
この合成は、反応式１で示されるように行われる。
【００９０】
【化２１】
0003542040.tif 000005
【００９１】
システイン誘導体のＣ−末端アミノ酸へのカップリングは、水溶性のカルボジイミドＥＤＣ（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｊ．らのＪ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．（１９６１）２６：２５２５−２５２８）およびＨＯＢＴ（Ｋｏｎｉｇ，  Ｗ．らのＣｈｅｍ．  Ｂｅｒ．（１９７０）１０３：７８８−７９８）（望ましくないラセミ化を遅らせ、反応の速度を上げるために添加される）と共にＤＭＦ中で行われる。カップリングが完了した後（通常、室温で約１時間）、混合物は減圧下で濃縮（ｒｅｄｕｃｅｄ）され、ＫＨＣＯ３溶液中に注がれる（Ｊｏｈｎ  Ｈｕｇｈｅｓ，私信）。この工程により、ＤＭＦ、ＥＤＣ、およびＥＤＣ尿素の大部分と、カップリングしなかったＦｍｏｃ−システインの一部が抽出される。この液体をデカントすると、得られるゴム状の残渣が残る。この粗製ジペプチドをＥｔＯＡｃ中に溶解し、１Ｎ塩酸および水で洗浄し、カップリングしていないＣ−末端アミノ酸エステルの残りすべて、および、残留しているＥＤＣおよびＥＤＣ尿素を除去する。この溶液を濃縮し、ジペプチドをクロマトグラフィーで精製する。
【００９２】
回収されたジペプチドを、２５％のピペリジン−ＤＭＦ溶液で３０分間処理し、Ｆｍｏｃ基を除去する。Ｆｍｏｃの除去によって生じたジベンゾフルベンまたはそのピペリジン付加物は、次のカップリングの結果には影響しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．らのＪ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ（１９８１）１：５３８−５４６）。しかし、過剰のピペリジンはすべて除去しなければならない。この除去は、脱ブロック（ｄｅｂｌｏｃｋｅｄ）物質中にピペリジン臭が検出されなくなるまでＤＭＦとの共沸を繰り返すことにより行われる。次にグルタミン酸誘導体との第二のカップリングを行い、その後ジペプチドの場合と同様のワークアップ（ｗｏｒｋｕｐ）を行う。
【００９３】
市販のグルタミン酸α−ベンジルエステルから、良好な収率および純度でＦｍｏｃ−グルタミン酸α−ベンジルエステルが合成される。Ｆｍｏｃ−グルタミン酸α−ｔｅｒｔブチルエステルも市販されており、使用し得るが、これは別の（ｓｅｐａｒｅｔｅ）酸処理工程をワークアップ中に必要とする。保護されたトリペプチドのうちのいくつかにはこの工程における溶解度に問題があり、不純な、部分的に脱保護された生成物がしばしば得られる。
【００９４】
グルタミン酸誘導体のジペプチドへのカップリングとワークアップとによって生成された物質は、いくつかのクロマトグラフィーの移動物質を含有する。最後のカラムから最初に溶出する物質は、蛍光物質であり、これはジベンゾフルベンであることが示唆される。推定の所望の生成物は、他のＵＶ吸収物質と共に、次に溶出する。このＵＶ吸収物質は、おそらくジベンゾフルベンのピペリジン付加物である。最終のワークアップ中に同様の生成物が生じ、そして脱ブロックされたトリペプチドから分離されるので、これらの混入物はこの段階では除去されない。
【００９５】
保護されたトリペプチド（および不純物）は、単離されるとすぐに、減圧下で乾燥され、そして０．２５ＮのＮａＯＨ溶液（３：１のエタノール：水）で１８時間処理される。この処理により、Ｆｍｏｃおよびエステル保護基が除去される。ｔ−ブチル保護グルタミン酸を用いた場合、塩基処理に先だって、ｔ−ブチル基を除去するために３ＮのＨＣｌ溶液（エタノ−ル／水の３／１（ｖ／ｖ）溶液）で３時間処理する。この酸は、ロータリーエバポレーションおよびエタノールおよび水との共沸により除去され、上記と同様の塩基処理で残りの保護基を除去する。塩基処理を一晩行った後、水を添加し、ヘキサンで抽出することにより、脱保護反応の有機副生成物が除去される。ペプチドの水溶液を酸性にし、そして濃縮して固体にする。このペプチドをエタノールに溶解し、塩を除去するために濾過する。これをエバポレートして泡状とし、高真空下に一晩置く。
【００９６】
この化合物をＨＰＬＣ、ＴＬＣおよびＦＡＢマススペクトル装置で分析する。ほとんどの場合、ＴＬＣ分析では良好な結果が得られるが、ＨＰＬＣの結果では分離していない。この理由の一つとして、用いられる分析条件がより疎水性の（Ｓ−アルキルＣ−末端バリン、β−アラニン、および４ＡＢｕ）ペプチドのいくつかに適するように最適化されていないことがあげられる。
【００９７】
塩基による最終の脱保護の間に、少量のラセミ化が、特にフェニルグリシンアナログに起こり得る（Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．らの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン（１９８４））。これは、Ａｄａｎｇ，Ａ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．（１９８９）２６４：７２１−７２４）によって以前用いられたナトリウム−アンモニア条件下で起こるラセミ化よりも少ない。
【００９８】
上記で説明した手法を用いて、表１のアナログは調製された。
【００９９】
【表１】
0003542040.tif 000006
【０１００】
さらに、構造式（１）の他の化合物（それらの化合物のシクロアミド形態、並びに、それらのエチルエステルおよびベンジルエステルを包含する）を調製した。
【０１０１】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、限定することを意図しない。
【０１０２】
（実施例１）９−フルオレニルメトキシカルボニル−４−アミノ酪酸エチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ４５ｇ（０．１３３９Ｍ、０．９４当量）を、脱イオン水３００ｍＬおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬに４−アミノ酪酸（４−ＡＢｕ）１４．７５ｇ（０．１４３Ｍ、１当量）およびＮａ２ＣＯ３  ２０ｇを溶かした溶液に、ゆっくりと加えた。ｐＨをモニターし、ｐＨが８より上になるようにＮａ２ＣＯ３をさらに加えた。反応物を２時間撹拌し、次いで濃ＨＣｌで酸性にした。得られた濁った懸濁液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）６００ｍＬで抽出し、その後、有機層を０．５ＮのＮａＯＨ  ３００ｍＬでさらに抽出した。氷水５００ｍＬ中に濃ＨＣｌ  ２０ｍＬを加えた溶液に、水層をすばやく注ぎ入れた。得られた白色の懸濁液をＥｔＯＡｃ  ３００ｍＬで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４  ５０ｇで乾燥し、蒸発させて、Ｆｍｏｃ−４−ＡＢｕ  ３５ｇ（収率７６％）を白色の粉末として得た。これを無水エタノール５００ｍＬに溶解し、濃Ｈ２ＳＯ４  ４０ｍＬを加えた。４時間後、この溶液は半固体の白色塊となった。これを水２Ｌ中に注ぎ入れ、濾過した。この白色物質をＥｔＯＡｃ  ５００ｍＬに溶解し、０．５Ｎの  ＮａＯＨ  ２００ｍＬで一回抽出し、乾燥し、蒸発させて、Ｒｆ  ０．７１（２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）、ｍｐ８３−８６°の総化合物３０ｇ（収率７９％）を得た。Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ４の分析計算値：Ｃ，７１．３７；Ｈ，６．５６；Ｎ，３．９６。実測値；Ｃ，７１．４２；Ｈ，６．６７；Ｎ，３．７２。
【０１０３】
（実施例２）９−フルオレニル（ｆｌｏｕｒｅｎｙｌ）メトキシカルボニルフェニルグリシンエチルエステルの合成
同様の合成手順により、フェニルグリシン２０ｇからＦｍｏｃ−フェニルグリシン３３．７ｇ（収率６８％）を得た。この生成物１９ｇを、Ｒｆ  ０．９５（同じＴＬＣ系）、ｍｐ１３０−１３３°の生成物１０ｇ（収率５７％）に変換した。Ｃ２５Ｈ２３ＮＯ４の分析計算値：Ｃ，７４．８０；Ｈ，５．７７；Ｎ，３．４９。実測値；Ｃ，７４．７２；Ｈ，５．９１；Ｎ，３．２０。
【０１０４】
（実施例３）９−フルオレニルメトキシカルボニルアスパルギン酸ジメチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ  ４５ｇ（０．１３４Ｍ、０．９６当量）を、水４００ｍＬおよびジオキサン２００ｍＬにアスパラギン酸２０ｇ（０．１５Ｍ、１当量）およびＮａ２ＣＯ３  ２０ｇを溶かした溶液に加えた。少量のＮａ２ＣＯ３を加えて、ｐＨを約９に維持しながら、混合物を２時間撹拌した。次に、この白濁した混合物を濃ＨＣｌ  ４０ｍＬを含有する氷水５００ｍＬ中に注ぎ入れた。白色固体をＥｔＯＡｃ  ５００ｍＬで抽出し、これをヘキサン５００ｍＬと混合した。この混合物を一晩冷却し、次の日に撹拌して、濾過と空気乾燥によりＦｍｏｃ−アスパラギン酸３８ｇ（収率７１％）を結晶として得た。この生成物１０ｇ（０．２８Ｍ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、濃Ｈ２ＳＯ４  ２０ｍＬを加えた。この溶液を一晩静置した。この混合物を水１Ｌ中に注ぎ入れ、濾過した。得られた白色固体を乾燥し、ＥｔＯＡｃに再溶解した。ヘキサンをゆっくりと加え、そして冷却することにより、ｍｐ７８−８０°の生成物９ｇ（収率８３％）を白色の針状物として得た。［ａ］ｄ＝−１３．９°。Ｃ２１Ｈ２１ＮＯ４の分析計算値：Ｃ，６５．７８；Ｈ，５．５２；Ｎ，３．６５。実測値；Ｃ，６６．１８；Ｈ，５．６８；Ｎ，３．６９。
【０１０５】
（実施例４）９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−ヘキシルシステインＡ．  システイン塩酸塩２０ｇ（０．１２７Ｍ、１当量）およびＮａ２ＣＯ３    ２０ｇをアルゴン気流下で水８００ｍｌに溶解した。ＣＨ３ＣＮ  ２００ｍＬを加え、次いで、Ｎａ２ＣＯ３  ５ｇを少量づつ加えて、ｐＨを約９に維持しながら、Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ  ４２ｇ（０．１２２Ｍ、０．９６当量）を少量づつ加えた。この反応液をさらに２時間撹拌し、１−ヨードヘキサン  １８．６ｍＬ（２６．８ｇ、０．１２６Ｍ、０．９９当量）をＣＨ３ＣＮ  ２００ｍＬに溶かした溶液を加えた。この反応液をさらに２時間攪拌し、氷水１Ｌと濃ＨＣｌ  ５０ｍＬの混合溶液中に注ぎ入れた。この白色の混合物をＥｔＯＡｃ  ６００ｍＬで抽出し、この有機層を１ＮのＫＯＨ  ５００ｍＬずつで２回抽出した。これらの各抽出液をすぐに、水５００ｍＬと濃ＨＣｌ  ３０ｍＬとの混合溶液に別々に滴下し、得られた濁った混合物をそれぞれＥｔＯＡｃ  ５００ｍｌで抽出した。これらをそれぞれＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。総収量は２４．６ｇ（４５％）であった。２番目の画分（３．５ｇ）を静置して結晶化し、ｍｐ１０１−１０３°、Ｒｆ＝０．５７、［ａ］ｄ＝−１４．３°であった。Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ４Ｓの分析計算値：Ｃ，６５．４２；Ｈ，６．０１；Ｎ，３．６３。実測値；Ｃ，６５．５３；Ｈ，５．７４；Ｎ，２．９１
Ｂ．  他のＳ−官能化Ｆｍｏｃシステイン誘導体をＡ項に記載した方法で調製した。
【０１０６】
（実施例５）Ｆｍｏｃ−グルタミン酸α−ベンジルエステルの合成
グルタミン酸α−ベンジルエステル２５ｇ（０．１０５Ｍ）およびＮａ２ＣＯ４２５ｇを水４００ｍＬに溶解し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬを加えた。Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ（０．１０１Ｍ、０．９６当量）３４ｇを少量づつ撹拌しながら加え、必要に応じてＮａ２ＣＯ３を加えてｐＨを約９に維持した。１時間後、反応物を水５００ｍＬに注ぎ入れ、濃ＨＣｌで酸性にした。この白色の懸濁液をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させて、固体の塊とした。これを温ＥｔＯＡｃ  ５００ｍＬに溶解し、ヘキサン３００ｍＬを加えた。一晩冷却し、採取および空気乾燥することにより、３８．７ｇ（収率８３％）の白色結晶を得た。これはｍｐ１１０−１１２°、［ａ］ｄ＝−１３．８°であった。Ｍ／ｅ（相対感度）：４６０．２（１９），３６３．４（８），３４５．４（１９），３０７．２（１０），２８９．２（１２），２３８．２（１２），１９１．２（１０），１７８．２（８９），１６５．１（２３），１５４．１（５７），１３６．１（４８）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ｍＨｚ）、ＰＰＭ：１．９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４  （Ｍ，  ２Ｈ），  ４．１  （ｔ，  １Ｈ），  ４．４  （ｄ，  ２Ｈ），  ４．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ５．１  （ｓ，２Ｈ），  ５．６  （ｄ，  １Ｈ），  ７．３  （ｍ，  ９Ｈ），  ７．５  （ｄ，２Ｈ），  ７．７  （ｄ，  ２Ｈ），  ９．４−９．６  （ブロードＳ，  １Ｈ）。１３Ｃ（１００ｍＨｚ）、ＰＰＭ：２７．５，  ３０．０，  ４７．３，  ５３．５，  ６７．３，  ６７．７，  １２０．２，  １２５．０，  １２７．３，  １２８．５，  １２８．８，１２９．２，  １３５．２，  １４１．５，  １４３．６，  １４３．９，  １５６．３，  １７１．４，  １７７．８：Ｃ２７Ｈ２５ＮＯ６の分析計算値：Ｃ，７０．５７；Ｈ，５．４８；Ｎ，３．０５。実測値；Ｃ，６９．７１；Ｈ，５．５８；Ｎ，２．８８。
【０１０７】
（実施例６）γ−グルタミルＳ−ベンジルシステイニルβ−アラニンの合成
β−アラニンエチルエステル塩酸塩１．５ｇ（９．７６ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ  ５０ｍＬに加え、ＤＩＰＥＡ  １．８ｍＬを加えた。Ｆｍｏｃ−Ｓ−ベンジルシステイン３．５ｇ（８．１ｍＭ，０．８３当量）を加え、溶液をかき混ぜて溶解させた。次に、ＥＤＡＣ  ２ｇおよびＨＯＢＴ  ２５０ｍｇを加え、かき混ぜ固体を溶解させた。この混合物を１時間静置し、減圧下で濃縮し、約５ｍＬ量の流動性の油状物を得た。ここに１０ｗ／ｖ％のＫＨＣＯ３を含有する水１００ｍＬを加え、この混合物を振盪し、濾過して液体を除去した。残渣をＥｔＯＡｃ１００ｍＬに溶解し１ＮのＨＣｌ  ５０ｍＬと水５０ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を濾過し、減圧下で濃縮して泡状物を得た。これを、２ｘ６ｃｍのシリカゲルの充填床（ｂｅｄ）を用いて、ＣＨ２Ｃｌ２によりクロマトグラフにかけた。最初のＵＶ吸収物質が現れるまで、このカラムから溶出させ、次いで、１％メタノールから３％メタノールまで勾配をかけて１００ｍＬで溶出させた。３％メタノールの部分を２回加えた後、強いＵＶ吸収バンドが溶出した。これらの純度をＴＬＣで確認し、プールして、減圧下で蒸発させ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−ベンジル）−β−アラニンエチルエステル４．６ｇ（収率８３％）を得た。この半量（４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ３０ｍＬとピペリジン１０ｍＬの混合物に溶解し、３０分間静置した。この溶液を減圧下で濃縮して、固体とした。この工程をＤＭＦ  ５０ｍＬで２回繰り返した。得られた白色固体を高真空下に１時間置き、次に、ＤＭＦ  ５０ｍＬに溶解した。第二のカップリング工程のために、Ｆｍｏｃ−グルタミン酸（α）ベンジルエステル（ｖ）１．６ｇ（３．５ｍｍｏｌ、０．９当量）を加え、次にＥＤＡＣ  ０．８ｇ（４．２ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＨＯＢＴ  ２００ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１時間静置し、減圧下で濃縮し、５ｍＬ量とした。これを１０％ＫＨＣＯ３水溶液１００ｍＬに注ぎ入れ、振盪した。液体を流し出して、残渣を酢酸エチル１００ｍＬに溶解した。有機層を１ＮのＨＣｌ  ５０ｍＬ、次いで水５０ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。これをタール状になるまで濃縮し、保護されたジペプチドの場合と同様の方法でクロマトグラフにかけた。保護されたトリペプチド１．２ｇ（収率４２％）が得られた。この物質を無水エタノール３０ｍＬに溶解し、１ＮのＮａＯＨ溶液１０ｍＬを加えた。この混合物を１８時間静置し、水４０ｍＬとヘキサン４０ｍＬと共に、分液漏斗に注いだ。振盪して層を分離し、水相をさらに４０ｍＬのヘキサンで洗浄した。数滴の濃ＨＣｌを加えることで水層のｐＨを約３に調整し、この濁った溶液を減圧下で濃縮して固体とし、高真空下に数時間静置した。残渣を  ２０ｍＬの無水エタノールで２回洗浄した。エタノール−ＮａＣｌスラリーを濾過し、透明な溶液を蒸発させてタール状物を得た。この重量は６２０ｍｇであった（保護されたトリペプチドからの収率は８９％、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ベンジル）−ＯＨからの収率は１９％）。酢酸エチル／ピリジン／水／酢酸＝５／５／３／１（ｖ／ｖ）でＴＬＣプレートにかけ、ニンヒドリンスプレーと加熱により検出した（Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｊ．らの「Ｓ���ｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）  ５３−１２４頁、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ）。Ｒｆは０．６６であった。ＨＰＬＣ分析からＵＶ吸収物質のエリア積分値により純度７４％であることが示された。ファーストアトムボムバードメントマススペクトル法（ＦＡＢＭＳ）からイオンピークは４３４．２Ｍ／ｅであることが示され、これはトリペプチドのモノナトリウム塩と一致する。他のより大きなマスピークも存在し、これは脱保護が不完全なペプチドにある程度起因し得る。市販の遊離アミノＣ−末端アミノ酸エステルの代わりにＦｍｏｃで保護されたＣ−末端アミノ酸エステルを用いた場合、この物質は上記の保護されたジペプチドの脱ブロックの場合と同様の手順で脱ブロックされ、次に、上記したように第一のカップリング反応を続ける。
【０１０８】
（実施例７）セファロース樹脂への誘導化
エポキシセファロースＴＭ  ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）０．６６ｇを１５分間、１０ｍＬの水で膨潤させ、１５ｍＬの焼結ガラス漏斗中で１０ｍＬの水で２回すすいだ。５ｍＬエタノールおよび１０ｍＬ水中の１００−５００ｍｇの粗トリペプチド溶液をポリコーンキャップを備えた２０ｍＬのシンチレーションバイアル中で６ＮＮａＯＨでｐＨ１１−１２に調節した。すすいだ樹脂を加えて、３７゜Ｃ水浴で一晩緩やかに攪拌した。ｐＨを翌日チェックし、必要であれば６ＮＮａＯＨでｐＨ１１−１２に戻した。さらに一日攪拌した後、樹脂を濾過し（ペプチド含有溶液を濃ＨＣｌで酸性化し、蒸発させ、保存した）、１０ｍＬの水で３回すすいだ。官能化されていないエポキシ基は、樹脂を約０．１ｍＬのエタノールアミンを含有する１０ｍＬの水に１時間浸漬することによりキャップした。そして、この樹脂を１０ｍＬの水で３回すすぎ、このサンプルを分析用に採取した。残りを０．１ＭＮａＯＡｃと０．５ＭＮａＣｌとのｐＨ４．０の緩衝液１０ｍＬですすぎ、続いて０．１Ｍトリスクロライドと０．５ＭＮａＣｌとのｐＨ８．０の緩衝液１０ｍＬですすいだ。この樹脂をこのｐＨ８緩衝液中で４℃で保存した。
【０１０９】
（実施例８）本発明の化合物のアフィニティ吸着剤としての使用
ＹＣＯがγ−Ｇｌｕ、ＡＡｃがＧｌｙ、そしてＸがパラ位にニトロ、クロロ、メトキシおよびメチル置換基を有するベンジルである、構造式（１）の一連の化合物を構成した。適切なアナログを上述したようにセファロース樹脂に誘導化し、３種の組み換えヒトＧＳＴ酵素の分離にアフィニティ吸着剤として用いた。ＨＰＬＣを、支持体に結合した酵素の相対量を測定するのに用いた。表２に結果を示した。
【０１１０】
【表２】
0003542040.tif 000007
【０１１１】
πおよびμのイソ酵素の百分率をそれらのシグマ（メタ）値に対してプロットすると、良好な一次の相関が得られた。しかしながら、シグマ（パラ）値を用いたときには、相関があまりなかった。シグマ（メタ）値は純粋に誘起効果の測定であるが、シグマ（パラ）値は、置換基が結合点の隣の環原子に電荷を部分的に配置し得るような共鳴に依存する。
【０１１２】
本発明の種々の化合物によるラット肝臓の細胞質ゾルＧＳＴのイソ酵素のアフィニティ精製後の溶出画分中のタンパク質およびＧＳＴ（ＣＤＮＢ−結合）活性の回収を表３に示した。
【０１１３】
【表３】
0003542040.tif 000008
【０１１４】
従来のＳ−Ｌ−ＧＳＨおよびＨｘＧＳＨ吸着剤は高い結合性および広範囲のイソ酵素認識を示した。この新規吸着剤は、より少量のＧＳＴイソ酵素を保持し、新規吸着剤のうち３種のタンパク質回収は従来の吸着剤の半分未満であった。
【０１１５】
ＨｘＧＳＨと比べて、新規吸着剤はタンパク質回収とＣＤＮＢ−結合活性との直接的関連を示さなかった。例えば、γＥ−Ｃ（Ｂｚ）−βＡおよびγＥ−Ｃ（Ｂｚ）−Ａ吸着剤はＨｘＧＳＨに対して比較すると３３％および１６％のタンパク質回収を与えたが、溶出リガンドの阻害性能に対しての補正後のＣＤＮＢ−結合活性は、はるかに高かった（それぞれ５２％および３３％）。これに対してγＥ−Ｃ（Ｃｕ）−Ｇ吸着剤では活性は５０％減少するのに対して、タンパク質回収の減少はは最も少なかった。異なったＧＳＴイソ酵素がそれぞれ異なるＣＤＮＢに対しての特異的活性を示すことはよく知られている。タンパク質回収と活性回収との間の不一致は、それぞれの吸着剤の溶出画分中のイソ酵素組成物の違いによる。この仮説は、溶出画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ分析により支持される。
【０１１６】
表３に挙げられた吸着剤からの画分は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析し、続いて銀染色された。Ｓ−Ｌ−ＧＳＨおよびＨｘＧＳＨ吸着剤は、先に観測されたラット肝臓ＧＳＴサブユニットの電気泳動バンドパターンに対応したタンパク質を結合する。新規吸着剤は異なったバンドパターンを示した。例えば、上述したγＥ−Ｃ（Ｂｚ）−βＡ溶出液は、μ−クラスイソ酵素と仮定される、高度に濃縮されたバンドを示した。πクラスＧＳＴ７−７はラット肝臓細胞ゾル中で低レベルであるので、このイソ酵素が高いレベルを示すことが知られている、他のラットの組織も試験した。γＥ−Ｃ（Ｈｘ）−φＧ吸着剤から溶出したラット腎臓細胞質ゾルのタンパク質のＧＳＴゲルパターンは、ラットＧＳＴサブユニット７がこの溶出液の特有の成分であるという、同じ分子量移動を示し、この吸着剤がπ選択性試薬であることを示す。
【０１１７】
他のＧＳＨ−依存酵素、グリオキサラーゼＩと同様の分子移動を有するタンパク質もまた、γＥ−Ｃ（Ｂｚ）−ＡおよびγＥ−Ｃ（Ｂｚ）−βＡ吸着剤からの溶出液中に存在したが、他の吸着剤からの溶出液中には検出されなかった。これらの実験において、先にグリオキサラーゼＩを結合することが示されたＨｘＧＳＨは、検出可能レベルの、このＧＳＨ依存酵素を全く示さなかった。グリオキサラーゼＩは、金属依存酵素であることが知られており、緩衝剤中のＥＤＴＡの存在は、結合活性を妨げ得る。
【０１１８】
アフィニティ溶出タンパク質のＳＤＳ／ＰＡＧＥで得られた、適切に分画された純度の高さは、観測されたバンドが正にＧＳＴであることを示唆した。この結論の独立した確証は、高分解能で、異なった吸着剤からの溶出液中のＧＳＴイソ酵素の逆相ＨＰＬＣ分析によって与えられる。精製したＧＳＴ標準と比較することによって、新規吸着剤から溶出したイソ酵素が既知のＧＳＴイソ酵素に相当することが示された。これらの手順は、ＧＳＴサブユニット３が１４分で、サブユニット４が１７分で、サブユニット７が１８分で、サブユニット２が２３分で、サブユニット６が２５分で、サブユニット１ａおよび１ｂが３７分および４０分で、そしてサブユニット８が４２分で溶出することを示した。サブユニット３，４および６はμクラスイソ酵素であり、サブユニット１ａ，１ｂ，２および８はαクラスイソ酵素であり、そしてサブユニット７はπクラスイソ酵素である。Ｓ−Ｌ−ＧＳＨおよびＨｘＧＳＨ吸着剤は、予想されるとおり、θクラスイソ酵素である５−５以外の全てに結合した。
【０１１９】
γＥ−Ｃ（Ｃｕ）−Ｇはイソ酵素２の比率を増加させたが、なお全てのイソ酵素にいくらかの割合で結合した。これに対して、他の吸着剤は、イソ酵素の結合において非常に選択的であった。
例えば、γＥ−Ｃ（Ｂｚ）−βＡは、μクラスイソ酵素３および４を選択的に結合し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの結果を確証した。
【０１２０】
ラット細胞質ゾルのＧＳＴイソ酵素用の種々の新規吸着剤の特異性を表４にまとめた。リガンドのある種の構造的改変は、いずれのイソ酵素とも効果的に結合しない吸着剤を提供した。これらのいくつかを補足のために挙げた。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
先に定義したＨ−部位（疎水性ポケット）を測定するためのＣｙｓ残基の系統的な変更が、イソ酵素に結合可能なリガンドをもたらした。Ａｄａｎｇら（１９９０）はＣｙｓ部分に結合した基の系統的な改変によるいかなる類似体も検討しなかった。この基の変更は、いくつかの場合にはタンパク質回収のレベルおよびイソ酵素結合の特異性に効果を有する。例えば、グルタチオンのＳ−結合部分の、αクラス基質であるクメンヒドロペルオキシド構造と同様の構造への変更は、αクラスのイソ酵素２−２に優先的な吸着剤を生成した。Ａｌａを末端アミノ酸として用いたときには、Ｃｙｓ上のプロピル部分およびベンジル部分の両方が、μクラスイソ酵素に特異的な吸着剤を与えた（表４）。イソ酵素４に高度に特異的であるベンジル吸着剤と比較して、プロピル吸着剤は、イソ酵素３および４の両方を捕らえるという理由もあって、ＧＳＴタンパク質をより保持する。Ｈｉｓを末端アミノ酸として用いたとき、ベンジル部分は全く結合性を与えなかったが、プロピル部分は、高いμクラス特異性となった。これらの吸着剤と比較して、ＶａｌおよびＡｓｐ置換吸着剤のＣｙｓ部分の変更は、低い結合性に効果を持たなかった。従って、末端アミノ酸で決定される吸着剤の全ての特異性を改変する上で、Ｃｙｓ置換は重要であり得る。