(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
スポットの大きさが異なる複数のスポットが前記基板上に形成され、
前記キャプチャー溶液の濃度／感度に応じて前記スポットの大きさが調節されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
同一種類のキャプチャーについて、それぞれ前記基板上のスポットの大きさが異なる複数のスポットが形成され、
前記キャプチャー溶液の濃度／感度に応じて前記スポットの大きさが調節されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項３】
被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
各スポットに固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットが形成されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項４】
被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
同一種類のキャプチャーについて、それぞれ基板上に固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットが形成されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項５】
被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
同一のスポット形成位置にそれぞれ、種類の異なるキャプチャーからなるスポットが形成されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオチップにおいて、
各スポットの形状が略円形であり、且つ略円形の長軸と短軸の比が１０％以下であることを特徴とするバイオチップ。
【請求項７】
請求項３又は４記載のバイオチップにおいて、
前記スポットが少なくとも千鳥状に配列されており、且つ基板上における検査有効面積に対する前記スポットの非付着面積の割合が２２％以下であることを特徴とするバイオチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオチップにおいて、
前記キャプチャー溶液によるスポットがインクジェット方式にて形成されていることを特徴とするバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学上の被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために使用されるバイオチップ等に代表される検査機器に用いられ、特に顕微鏡スライドグラス等の基板上に、数千から数万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片をスポットとして高密度に整列固定させたＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を含むバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年における遺伝子構造の解析方法の進歩にはめざましいものがあり、ヒトの遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子構造が明らかにされてきている。このような遺伝子構造の解析には、顕微鏡スライドグラス等の基板上に数千から数万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片をスポットとして整列固定させたＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）が用いられるようになってきている。
【０００３】
近年、ＤＮＡマイクロアレイから得られる情報には、その再現性、定量性、及び情報量の更なる拡大が求められ、各スポットから得られる情報の正確さ、均一さ、複雑さが要求されている。
【０００４】
ところで、ＤＮＡマイクロアレイの製造におけるスポットの形成方法としては、一般的にＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、あるいはスプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのＤＮＡ断片を含んだ試料溶液の供給（打ち込み）を行う方式が広く用いられており、いずれの方法を採用した場合であっても、各スポットの容量と形状のばらつきを低く抑えて、各スポット間の距離を一定に保つことが重要となる。
【０００５】
一方、更なる高密度化に向けて、スポットの形状制御性が良好であり、生産性に優れた新しい方法の開発に対する期待も大きい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来のスポットの形成方法においては、ピンによる基板上への試料溶液の供給（打ち込み）であるため、ピンの先端形状や供給後にピンの先端に残存する試料溶液の残査等によってスポットの形状がまちまちとなり、図１８に示すように、外周部分において凹凸の多いスポット２００が基板２０２上に形成されることとなる。
【０００７】
形にばらつきのあるスポットが多数配列されたＤＮＡマイクロアレイを用いて未知のＤＮＡを検査した場合、スポットからの蛍光発光をＣＣＤカメラ等で認識することが困難になりやすく、検査精度が低下するおそれがある。
【０００８】
また、外周部分に凹凸が多いと、角の部分を通じて、試料溶液が流れてしまい、複数のスポット２００における試料溶液が混合するおそれもある。
【０００９】
本発明はこのような課題を考慮してなされたものであり、遺伝子解析のための検査精度を向上させ、得られる情報量の拡大を図ることができるＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、スポットの高集積化を達成させることができ、きめ細かい遺伝子解析を行うことができるＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップを提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、スポットに固定化されるＤＮＡ断片の量に対してどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができるＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップを提供することにある。
【００１２】
なお、本発明の適用範囲は、ＤＮＡ断片をスポットとして整列固定させたＤＮＡマイクロアレイに限られたものではなく、生化学上の被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために使用されるバイオチップ全般に用いられる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、スポットの大きさが異なる複数のスポットが前記基板上に形成され、前記キャプチャー溶液の濃度／感度に応じて前記スポットの大きさが調節されていることを特徴とする。
【００１４】
これにより、各スポット間において、スポット上に固定化されるキャプチャー量が異なること、あるいは被検体を捕らえる能力が異なるキャプチャーによるスポット間の被検体を捕らえる能力のばらつきを抑え、スポット間の検出感度の違いによる検査結果のばらつき、定量性の劣化を抑えることが可能になる。
【００１５】
即ち、基板上に固定化される量が少ないキャプチャー、あるいは被検体を捕らえる能力が低いキャプチャーに対応するスポットは、その大きさ、一般的には円形状における径を大きくすることにより、１スポットあたりの検出感度を高め、結果として全スポットの検出感度を揃えることができる。
【００１６】
更に、一枚の基板上に同一種類のキャプチャーのスポットが複数個形成される場合は、同一種類のキャプチャーについて、それぞれ基板上のスポットの大きさが異なる複数のスポットが形成され、前記キャプチャー溶液の濃度／感度に応じて前記スポットの大きさが調節されていることを特徴とする。
【００１７】
このような構成にすることにより、同一種類のキャプチャーに対し、キャプチャーと反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、スポットの大きさに応じてどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができる。
【００１８】
勿論、アナログ的な検査結果は、１つのスポットに固定化されたキャプチャーに反応するプローブの量をアナログ的に検出することにより理論的には可能であるが、検出機器の検出感度、分解能、反応効率等の制限により、現実的には不可能であるため、本発明のように同一種類のキャプチャーについて、それぞれ基板上のスポットの大きさが異なる複数のスポットにより、検出自体はデジタルで行うが、複数のスポットを合わせることにより、アナログ的解析を可能にする。
【００１９】
また、本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、各スポットに固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットが形成されていることを特徴とする。
【００２０】
これにより、上記スポットの大きさを異ならせた場合と同じく、各スポット間において、被検体を捕らえる能力が異なるキャプチャーによるスポット間の被検体を捕らえる能力のばらつきを抑え、スポット間の検出感度の違いによる検査結果のばらつき、定量性の劣化を抑えることが可能になる。 即ち、被検体を捕らえる能力が低いキャプチャーに対応するスポットは、そこに供給するキャプチャー溶液の濃度を高くすることにより、スポット上に固定化されるキャプチャー量を単位面積あたり多くし、１スポットあたりの検出感度を高め、結果として全スポットの検出感度を揃えることができる。
【００２１】
また、１スポット上に固定化されるキャプチャー量の単位面積あたりの量を変化させる方法は、上述した供給するキャプチャー溶液の濃度を変更させて対応してもよいが、１スポットあたりに供給するキャプチャー量を変更することによって行ってもよい。
【００２２】
なお、１スポットあたりに固定化されるキャプチャー量には上限があるため、被検体を捕らえる能力が高いキャプチャーに対応するスポットは、スポット全体の平均より低い濃度のキャプチャー溶液、あるいは少ない量のキャプチャー溶液を供給する一方、被検体を捕らえる能力が低いキャプチャーに対応するスポットには固定化されるキャプチャー量の上限に相当、あるいは超える量に対応する、濃度、量のキャプチャー溶液を供給する。
【００２３】
ところで、このように各スポット間で供給するキャプチャー溶液の濃度、量を個別に管理することは、誤りを誘発することが多くなるため、なるべく工程を単純化することが有利である。その場合は、後述するようにインクジェット法を用いて基板上にキャプチャー溶液を供給する場合において、１スポットに対する吐出回数を変化させることによって供給する液量を変化させることが好適である。
【００２４】
また、供給するキャプチャー溶液の濃度を変更する、あるいは１スポットあたりに供給するキャプチャー量を変更することによって被検体を捕らえる能力が異なるキャプチャーによるスポット間の被検体を捕らえる能力のばらつきを抑える方法は、１スポットあたりの固定化するキャプチャーの固定化率が異なる場合にそのばらつきを低減するためにも用いられる。
【００２５】
つまり、固定化率の低いキャプチャーに対応するスポット形成には、供給するキャプチャー溶液の濃度を高くする、あるいは１スポットあたりに供給するキャプチャー量を多くすることにより、各スポットでの固定化効率のばらつきを抑えることができる。
【００２６】
更に、本発明においては、一枚の基板上に同一種類のキャプチャーのスポットが複数個形成される場合は、同一種類のキャプチャーについて、それぞれ基板上のスポットに固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットが形成されていることを特徴とする。
【００２７】
このような構成にすることにより、上記スポットの大きさを異ならせた場合と同じく、同一種類のキャプチャーに対し、キャプチャーと反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、スポットの単位面積あたりの固定化されているキャプチャー量に応じてどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができる。勿論、アナログ的な検査結果は、１つのスポットに固定化されたキャプチャーに反応するプローブの量をアナログ的に検出することにより理論的には可能であるが、検出機器の検出感度、分解能、反応効率等の制限により、現実的には不可能であるため、本発明のように同一種類のキャプチャーについて、それぞれ基板上のスポットの単位面積あたりに固定化されているキャプチャー量が異なる複数のスポットにより、検出自体はデジタルで行うが、複数のスポットを合わせることにより、アナログ的解析を可能にする。
【００２８】
更に、本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、同一のスポット形成位置にそれぞれ、種類の異なるキャプチャーからなるスポットが形成されていることを特徴とする。この場合、スポットの配置面積を大幅に低減することができ、バイオチップ自体の小型化を図ることができる。
【００２９】
また、本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、各スポットの形状が略円形であり、且つ略円形の長軸と短軸の比が１０％以下であることを特徴とする。
【００３０】
これにより、各スポットにおいて形状上のばらつきが低減され、スポットからの蛍光発光をＣＣＤカメラ等で認識することが容易になり、検査精度が向上することとなる。特に、スポットの平面形状が略円形であることから、スポット形成の際に試料溶液が流れるということが回避され、複数のスポットにおいて試料溶液が混合するという不都合を防止することができる。そして、前記スポットが少なくとも千鳥状に配列されており、且つ基板上における検査有効面積に対する前記スポットの非付着面積の割合を２２％以下としてもよい。この場合、スポットの高集積化を達成させることができるため、一度に大量で且つきめ細かい生化学試料の解析を行うことができる。
【００３１】
また、以上述べてきたバイオチップは、試料溶液によるスポットがインクジェット方式にて形成されていることが好ましい。
【００３２】
インクジェット方式は、キャプチャー溶液を大気中に吐出して基板上に着弾させることによりスポットを形成するため、試料の表面張力によりスポットの形状は真円に近い円形になり、各スポットにおいて形状上のばらつきが低減される。 また吐出の勢い、単位時間あたりの吐出の回数（吐出周波数）を電気的に制御できることにより、基板上の１つのスポットに供給されるキャプチャー量を自由に変化させることができるため、スポットの大きさ、基板上のスポットに固定化されている単位体積あたりのキャプチャー量が可変となる。
【００３３】
特に、単位体積あたりのキャプチャー量を可変とすることは、インクジェット方式において基板上の１つのスポットに複数回キャプチャー溶液を吐出・供給することによって行われることがよい。 即ち、一度に大量のキャプチャー溶液を吐出・供給するのではなく、複数回にわけて吐出・供給し、且つ吐出間隔を調整し、１回の吐出によるスポットが次の吐出のキャプチャー溶液に重なってスポット径が広がることがないようにすることにより、スポットの大きさを変化させることなく、該スポットに供給するキャプチャー量を増減でき、単位面積あたりのキャプチャー密度を可変とすることができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るバイオチップの実施の形態例のうち、ＤＮＡマイクロアレイの実施の形態例を図１〜図１７を参照しながら説明する。
【００３５】
本実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイ２０は、図１及び図２に示すように、基板１０上に試料溶液の供給（滴下を含む）による微小スポット８０が多数配列されて構成されている。基板１０は、その表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２が形成されている。
【００３６】
そして、基板１０上に試料溶液の供給による微小スポット８０を形成してＤＮＡマイクロアレイ２０を製造するには、例えば図３に示す製造工程を踏んで行われる。
【００３７】
即ち、基板１０の表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２（図２参照）を形成する前処理工程Ｓ１と、ＤＮＡ断片を含む試料溶液を調製する試料調製工程Ｓ２と、得られた試料溶液を基板１０上に供給する供給工程Ｓ３とを踏んでＤＮＡマイクロアレイ２０が製造される。
【００３８】
前記試料調製工程Ｓ２は、図４に示すように、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する増幅工程Ｓ１１と、得られたＰＣＲ産物を精製・乾燥してＤＮＡ粉末とする精製工程Ｓ１２と、得られたＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす混合工程Ｓ１３とを含む。
【００３９】
具体的に説明すると、前処理工程Ｓ１は、まず、基板１０をアルカリ溶液に浸し、室温で少なくとも２時間ゆっくりと振盪する。前記アルカリ溶液は、例えばＮａＯＨを蒸留水に溶かし、更にエタノールを加えて、完全に透明になるまで撹拌した溶液である。
【００４０】
その後、基板１０を取り出して、蒸留水中に移し、リンスして、アルカリ溶液を除去する。次いで、蒸留水中にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを加えて調製されたｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液に基板１０を浸し、１時間放置する。
【００４１】
その後、基板１０を取り出して、遠心機にかけて遠心し、余分なｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液を除去する。次いで、基板１０を４０℃、５分ほど乾燥させて、表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２が形成された基板１０を得る。
【００４２】
次に、試料調製工程Ｓ２は、まず、既知のＰＣＲ機で増幅したＰＣＲ産物（増幅工程Ｓ１１）に、３Ｍｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅとイソプロパノールとを加え、数時間放置する。その後、このＰＣＲ産物溶液を遠心機で遠心し、ＤＮＡ断片を沈殿させる。
【００４３】
沈殿させたＤＮＡ断片をエタノールでリンスし、遠心した後、乾燥させてＤＮＡ粉末を生成する（精製工程Ｓ１２）。得られたＤＮＡ粉末に×１ＴＥバッファを加え、数時間放置して完全に溶かすことによって（混合工程Ｓ１３）、試料溶液が調製される。この段階での試料溶液の濃度は０．１〜１０μｇ／μリットルである。
【００４４】
そして、本実施の形態では、得られた試料溶液を基板１０上に供給してＤＮＡマイクロアレイ２０を製造する（供給工程Ｓ３）。なお、試料調製工程Ｓ２を経て得られた試料溶液に固定化液を混合するようにしてもよいし、試料溶液を希釈するようにしてもよい。この場合、希釈液として前記緩衝液又は水やＮａＣｌを含んだ水溶液又はポリマーを含んだ水溶液を使用することができる。
【００４５】
更に、この実施の形態においてＤＮＡマイクロアレイ２０を製造する場合、例えば図５Ａ〜図７に示す分注装置３０が有効に使用される。
【００４６】
この分注装置３０は、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、矩形状の固定板３２の上面に例えば１０個のマイクロピペット３４を５行２列に配列し、各列方向に整列されたマイクロピペット３４群をそれぞれ固定治具３６を介して固定板３２に固定させた構成を有する。
【００４７】
マイクロピペット３４は、図５Ｃ及び図６に示すように、略直方体の形状を有する基体５０の上面に形成された試料注入口５２と、該基体５０の下面に形成された試料吐出口５４と、内部に試料注入口５２と試料吐出口５４との間に形成されたキャビティ５６と、基体５０を振動させたり、キャビティ５６の体積を変化させたりするアクチュエータ部５８とを有して構成されている。
【００４８】
従って、図６に示すように、前記固定板３２には、マイクロピペット３４の試料吐出口５４に対応する箇所にそれぞれ貫通孔４０が設けられている。これにより、マイクロピペット３４の試料吐出口５４から吐出された試料溶液が、前記貫通孔４０を通じて、例えば固定板３２の下方に固定された基板１０に供給されることになる。
【００４９】
このマイクロピペット３４は、試料注入口５２から基体５０の内部にかけて開口幅の大きい略Ｌ字状の導入穴６０が形成されている。この導入穴６０とキャビティ５６との間には、径の小さい第１の連通孔６２が形成され、試料注入口５２から注入された試料溶液が導入穴６０及び第１の連通孔６２を通じてキャビティ５６に導入されるようになっている。
【００５０】
キャビティ５６のうち、前記第１の連通孔６２とは異なる位置に、試料吐出口５４に連通し、かつ、第１の連通孔６２よりも径の大きい第２の連通孔６４が形成されている。本実施の形態では、キャビティ５６の下面のうち、試料注入口５２寄りに第１の連通孔６２を形成し、同じくキャビティ５６の下面のうち、試料吐出口５４に対応した位置に第２の連通孔６４を形成するようにしている。
【００５１】
更に、この実施の形態では、基体５０のうち、キャビティ５６の上面が接する部分が薄肉とされ、外部応力に対して振動を受けやすい構造となっており、振動部６６として機能するようになっている。振動部６６の上面に前記アクチュエータ部５８が形成されている。
【００５２】
基体５０は、複数枚のジルコニアセラミックスのグリーンシート（第１の薄板層５０Ａ、第１のスペーサ層５０Ｂ、第２の薄板層５０Ｃ、第２のスペーサ層５０Ｄ及び第３の薄板層５０Ｅ）を積層し、一体焼成して構成されている。
【００５３】
つまり、基体５０は、試料注入口５２を構成する窓部が形成され、一部において振動部６６を構成する薄肉の第１の薄板層５０Ａと、導入穴６０の一部及びキャビティ５６を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された厚肉の第１のスペーサ層５０Ｂと、導入穴６０の一部、第１の連通孔６２及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された薄肉の第２の薄板層５０Ｃと、導入穴６０の一部及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された厚肉の第２のスペーサ層５０Ｄと、試料吐出口５４を構成する窓部が形成された薄肉の第３の薄板層５０Ｅとを積層し、一体焼成して構成されている。
【００５４】
アクチュエータ部５８は、前記振動部６６のほか、該振動部６６上に直接形成された下部電極７０と、該下部電極７０上に形成された圧電／電歪層や反強誘電体層等の圧電層７２と、該圧電層７２の上面に形成された上部電極７４とを有して構成されている。
【００５５】
下部電極７０と上部電極７４は、図５Ｃに示すように、それぞれ基体５０の上面に形成された複数のパッド７６及び７８を通じて図示しない駆動回路に電気的に接続される。
【００５６】
上記のように構成されたマイクロピペット３４によれば、上部電極７４と下部電極７０との間に電界が生じると、圧電層７２が変形し、それに伴って振動部６６が変形し、振動部６６に接しているキャビティ（加圧室）５６の容積が減少することになる。
【００５７】
このキャビティ５６の容積の減少によってキャビティ５６内に充填された試料溶液がキャビティ５６に連通する試料吐出口５４から所定速度で吐出され、図１に示すように、マイクロピペット３４から吐出された試料溶液が顕微鏡スライドガラス等の基板１０上に微小スポット８０として整列固定されたＤＮＡマイクロアレイ２０を作製することができる。
【００５８】
この場合、基板１０上に形成される微小スポット８０の配列ピッチよりも分注装置３０における試料吐出口５４の配列ピッチが大きい場合は、分注装置３０での供給位置をずらしながら試料溶液を供給することになる。
【００５９】
なお、アクチュエータ部５８の駆動によって、キャビティ５６の容積が減少する構造としては、いわゆるインクジェット方式の装置構造を採用することができる（特開平６−４００３０号公報参照）。
【００６０】
そして、キャビティ（加圧室）５６は、ＤＮＡ断片などを含む試料溶液が層流で移動するような流路寸法に形成されていることが好ましい。
【００６１】
つまり、キャビティ５６の寸法は、試料の種類、作成する液滴の大きさ、形成密度により異なるが、例えば、塩基対長１〜１００００ｂｐ程度のＤＮＡ断片を０．５μｇ／μリットルの濃度で緩衝液（ＴＥバッファ）に溶解させた試料を数百μｍピッチで数百μｍφ液滴径の滴下を行う場合においては、図７に示すように、キャビティ長（Ｌ）は、１〜５ｍｍ、キャビティ幅（Ｗ）は、０．１〜１ｍｍ、キャビティ深さ（Ｄ）は、０．１〜０．５ｍｍが好ましい。またキャビティ５６の内壁は、流れを乱すような突起物がなく滑らかであることがよく、その材質は、試料溶液と親和性のよいセラミックスからなることが好ましい。
【００６２】
このような形状にすることにより、キャビティ５６を試料注入口５２から試料吐出口５４に至る流路の一部として、試料注入口５２から導入穴６０、第１の連通孔６２を経てキャビティ５６内に移動する試料溶液の流れを乱すことなく試料吐出口５４に導くことができる。
【００６３】
ところで、図５Ａに示すように、固定板３２の上面には、マイクロピペット３４を位置決め固定するための複数のピン３８が設けられている。マイクロピペット３４を固定板３２上に固定する場合は、マイクロピペット３４の基体５０の両側に設けられた位置決め用孔９０（図５Ｃ参照）に固定板３２のピン３８を挿入させながら、マイクロピペット３４を固定板３２に載置することで、自動的に複数のマイクロピペット３４が所定の並びで配列位置決めされることになる。
【００６４】
また、各固定治具３６は、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付ける押さえ板１００を有する。押さえ板１００の両端には、それぞれネジ１０２が挿通される挿通孔が形成され、この挿通孔にネジ１０２を挿通して、固定板３２にねじ込むことによって、前記押さえ板１００で複数のマイクロピペット３４を一度に固定板３２に押さえ付けることができるようになっている。そして、１つの押さえ板１００で押さえ付けた複数のマイクロピペット３４で１つのユニットが構成される。図５Ａの例では列方向に配列された５つのマイクロピペット３４で１つのユニットが構成された例を示している。
【００６５】
また、押さえ板１００には、複数のマイクロピペット３４を押さえ付けたときに、各マイクロピペット３４の試料注入口５２に対応する箇所にそれぞれ試料溶液を供給するための導入孔１０４（図５Ｂ参照）が形成されており、各導入孔１０４の上端部にはそれぞれ試料溶液を導入孔１０４に導くためのチューブ１０６が保持されている。
【００６６】
なお、押さえ板１００の幅は、配線作業の効率化を考慮すると、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付けた際に、アクチュエータ部５８の各電極７０及び７４につながるパッド７６及び７８が上方に臨むような寸法であることが好ましい。
【００６７】
このように、上述の分注装置３０は、試料注入口５２及び試料吐出口５４を有するマイクロピペット３４の複数個をそれぞれ試料吐出口５４を下方向に向けた状態で立設させて構成されている。
【００６８】
即ち、各マイクロピペット３４は、それぞれの試料注入口５２を上側とし、試料吐出口５４を下側とし、かつ、各試料吐出口５４が縦横に配列配置されて、試料吐出口５４からそれぞれ種類の異なる試料溶液が吐出されるようになっている。
【００６９】
このような構成を有する分注装置３０において、各試料注入口５２に対応してそれぞれ種類の異なる試料溶液を供給する方法としては、一般的にＸＹロボットとディスペンサを組み合わせた自動分注機等が用いられるが、図８に示すように、例えば多数の断面略Ｖ字状の凹部（溜め部）１１０が配列されたカートリッジ１１２を使用する方法がある。この方法は、カートリッジ１１２の各凹部１１０にそれぞれ種類の異なる試料溶液を入れ、該カートリッジ１１２を各凹部１１０とチューブ１０６とがそれぞれ対応するように取り付け、針等で各凹部１１０の底を開封することによって、各凹部１１０にあった試料溶液をチューブ１０６を介して各マイクロピペット３４に供給する方法である。
【００７０】
また、チューブ１０６を用いない場合は、カートリッジ１１２を各凹部１１０と固定治具３６の各導入孔１０４とがそれぞれ対応するように取り付け、針等で各凹部１１０の底を開封することによって、各凹部１１０にあった試料溶液を導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４に供給する方法のほか、予め、固定治具３６における各導入孔１０４の近傍に針等を形成し、カートリッジ１１２を固定治具３６に取り付けると同時に各凹部１１０が開封されるようにしてもよい。
【００７１】
なお、開封後に気体等を圧送し、試料溶液を強制的に押し出す機構を加えてもよく、更には、各マイクロピペットの吐出口から吸引する機構を付加してもよい。また、各マイクロピペット３４の基体５０内に形成された試料注入口５２から試料吐出口５４に至る空間を洗浄する機構を備えることは、数千から数万種類以上という多種類のＤＮＡ断片などを汚染なく、しかも純度よく微小スポット８０として吐出するために望ましい。
【００７２】
図５Ａの例では、押さえ板１００の両端をネジ１０２で固定板３２に締め付けることで行っているが、押さえ板１００の固定法は、ネジ、バネ等で機械的に行うほか、接着剤等で行ってもよい。
【００７３】
また、マイクロピペット３４を構成する基体５０は、上述したように、セラミックスで形成されており、例えば、安定化ジルコニアや部分安定化ジルコニア、アルミナ、マグネシア、窒化珪素等を用いることができる。
【００７４】
このうち、安定化／部分安定化ジルコニアは、薄板においても機械的強度が大きいこと、靱性が高いこと、圧電層７２や電極材との反応性が小さいことから、最も好適に採用される。
【００７５】
そして、基体５０等の材料として安定化／部分安定化ジルコニアを使用する場合には、少なくとも、アクチュエータ部５８が形成される部分（振動部６６）には、アルミナあるいはチタニア等の添加物が含有されることが好ましい。
【００７６】
また、アクチュエータ部５８を構成する圧電層７２は、圧電セラミックスとして、例えば、ジルコン酸鉛、チタン酸鉛、マグネシウムニオブ酸鉛、マグネシウムタンタル酸鉛、ニッケルニオブ酸鉛、亜鉛ニオブ酸鉛、マンガンニオブ酸鉛、アンチモンスズ酸鉛、マンガンタングステン酸鉛、コバルトニオブ酸鉛、チタン酸バリウム等やこれらのいずれかを組み合わせた成分を含有する複合セラミックスを用いることができるが、本実施の形態においては、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛からなる成分を主成分とする材料が好適に用いられる。
【００７７】
これは、このような材料が、高い電気機械結合係数と圧電定数を有することに加え、圧電層７２の焼結時における基体材料との反応性が小さく、所定の組成のものを安定に形成することができることに基づくからである。
【００７８】
更に、本実施の形態では、前記圧電セラミックスに、ランタン、カルシウム、ストロンチウム、モリブデン、タングステン、バリウム、ニオブ、亜鉛、ニッケル、マンガン、セリウム、カドミウム、クロム、コバルト、アンチモン、鉄、イットリウム、タンタル、リチウム、ビスマス、スズ等の酸化物、もしくはこれらいずれかの組み合わせ、又は他の化合物を適宜、添加したセラミックスを用いてもよい。
【００７９】
例えば、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛を主成分とし、これにランタンやストロンチウムを含有するセラミックスを用いることもまた好ましい。
【００８０】
一方、アクチュエータ部５８における上部電極７４及び下部電極７０は、室温で、固体であって導電性の金属で構成されていることが好ましく、例えば、アルミニウム、チタン、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、パラジウム、ロジウム、銀、スズ、タンタル、タングステン、イリジウム、白金、金、鉛等の金属単体、あるいはこれらのいずれかを組み合わせた合金が用いられ、更に、これらに圧電層７２や基体５０と同じ材料を分散させたサーメット材料を用いてもよい。
【００８１】
次に、この分注装置３０を使ってＤＮＡマイクロアレイ２０を製造するいくつかの方法について図９〜図１２を参照しながら説明する。
【００８２】
まず、第１の方法は、図９に示すように、各チューブ１０６からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内にそれぞれ種類の異なる試料溶液を充填し、次いで、各アクチュエータ部５８を駆動して、各マイクロピペット３４の試料吐出口５４から試料溶液を吐出させる。キャビティ５６内に溶液を充填する方法は、試料注入口５２より導入された溶液の毛細管力により注入してもよいが、試料吐出口５４から真空吸引して充填する方法が確実である。
【００８３】
ここで、アクチュエータ部５８の各電極７０及び７４に印加する電圧波形のうち、アクチュエータ部５８がオン動作して、キャビティ５６の容積を減少させる場合、各電極７０及び７４にはパルス的な電圧が印加されることになる。この場合、パルスの振幅を上げることによって、振動部６６の変形が大きくなり、その分、試料溶液の吐出の勢い、吐出量も多くなる。また、一定期間に複数のパルスを印加する場合は、パルス周期を短くし、各パルスの振幅を小さくすることによって、少量の試料溶液を多数吐出させることができる。
【００８４】
なお、特に複数のマイクロピペット３４を用いてＤＮＡマイクロアレイを製造する場合の１スポットあたりに供給される試料の量の制御の精度が高く求められる場合は、少量の試料溶液を多数吐出する方法を採用することが好ましい。何故なら吐出回数は電気的に完全に制御できるため、各マイクロピペット３４毎の細かい吐出能力（吐出量）のばらつきを吐出回数により補正できるからである。
【００８５】
また、このとき、供給位置を適宜変えることによって、供給された試料溶液が基板１０上で組み合わされて（合体）、１つのスポット径を有する試料溶液とし、供給する試料溶液の種類に応じて、供給数、供給位置及び１回の供給量を制御することで、基板１０上に形成されるスポット径の均一化を図ることもできる。
【００８６】
次に、分注装置３０を使った第２の方法について説明する。この第２の方法は、図１０に示すように、各チューブ１０６からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内に緩衝液やＮａＣｌを含んだ水溶液、ポリマーを含んだ水溶液などの置換液を充填し、次いで、試料を試料注入口５２からキャビティ５６内に層流置換させながら注入した後、置換の完了を待つ。その後、アクチュエータ部５８を駆動させて、試料溶液を基板１０上に吐出供給させる。
【００８７】
キャビティ５６内における試料の層流置換完了は、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知することにより把握することが好ましい。
【００８８】
なお、キャビティ５６内の置換液と試料の置換は層流で行われることが好ましいが、試料の種類が変わった場合や、液体の移動速度が非常に速い場合においては、キャビティ５６のうち、第１の連通孔６２の近辺部分は、必ずしも層流でなくてもよい。この場合、試料と置換液の混合により試料溶液のパージ量は増大するが、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知して置換完了を判断することにより、パージ量の増大を最小に抑えることができる。
【００８９】
ここで、キャビティ５６内の流体特性の変化は、アクチュエータ部５８に振動を励起する程度の電圧を印加し、その振動に伴う電気的定数の変化を検出することにより把握する。このような流体特性の変化の検知については、例えば、特開平８−２０１２６５号公報に開示されている。
【００９０】
具体的には、アクチュエータ部５８に対して、所定の間隔で、吐出駆動用の電源からの電気的接続をリレーで切り離し、同時に、共振周波数を測定する手段をリレーにより接続し、その時点でのインピーダンスあるいは共振特性、例えば共振周波数や減衰率等を電気的に測定する。
【００９１】
これにより、液体の粘度、比重等が目的の試料（ＤＮＡ断片などを含む液体）であるかどうかを把握することができる。即ち、各マイクロピペット３４においては、マイクロピペット３４自体がセンサとして機能するため、マイクロピペット３４の構成も単純化することができる。
【００９２】
そして、アクチュエータ部５８を、求められるスポット径に応じた液滴量に対応した駆動条件にて駆動し、試料溶液の供給を繰り返すことにより、ＤＮＡマイクロアレイ２０を製造する。通常、１つの微小スポット８０を形成するのに、マイクロピペット３４から１〜数百滴を吐出して行う。
【００９３】
なお、試料注入口５２中の試料の量が減少した際には、緩衝液を追加し、流路中に気泡が入らないようにして、吐出を続けることにより、試料溶液をマイクロピペット３４内に残すことなく使い切ることができる。試料から置換液への置換の完了（試料吐出の終了）は、同じく、アクチュエータ部５８を用いた液体の粘度、比重の検出で行う。
【００９４】
また、使用する置換液、試料としては、予め脱気操作を通して溶液中の溶存気体を取り除いたものを使用することが好ましい。そのような溶液を用いることにより、マイクロピペット３４の流路内に溶液を充填する際に、流路途中で気泡がひっかかり充填が不備になる場合でも、その気泡を溶液中に溶かし込んで不具合を回避できると共に、吐出の途中において、流体中に気泡が発生することがなく、吐出不具合を生じることもない。
【００９５】
また、上述の第２の方法において、試料溶液を吐出しつつ、緩衝液やＮａＣｌを含んだ水溶液、ポリマーを含んだ水溶液のような置換液を試料注入口５２からキャビティ５６に注入し、キャビティ５６内に残留する試料溶液を完全に吐出し、次の試料注入に備えることができる。
【００９６】
そして、キャビティ５６内に試料溶液が残留しているかどうか（試料溶液として吐出できるかどうか）を検知する際にも、同じく、キャビティ５６内の流体特性の変化を検知することにより把握できる。この場合、置換完了検出機構により使用に供しない試料のパージ量を極めて少なくすることができると共に、試料溶液の使用効率を向上させることができる。
【００９７】
また、試料を試料注入口５２からキャビティ５６に充填する際に、アクチュエータ部５８を駆動させながら試料を試料注入口５２からキャビティ５６内に置換させてもよい。この場合、予め安価な置換液によりキャビティ５６内を確実に置換でき、その結果、吐出不良が発生することを完全に防止でき、高価な試料を効率よく吐出できる。
【００９８】
更に、キャビティ５６内に緩衝液やＮａＣｌを含んだ水溶液、ポリマーを含んだ水溶液などの置換液を充填し、キャビティ５６内と試料注入口５２内にある置換液の量を調整して所定の量にし、次に、試料溶液を試料注入口５２から所定の液量だけ注入した後、アクチュエータ部５８を所定のパルス数だけ駆動し、キャビティ５６内と試料注入口５２内にある置換液の量だけ排出してもよい。
【００９９】
そうすることにより、キャビティ５６内と試料注入口５２内にある置換液の量だけ正確に排出され、無駄なく試料溶液の充填を完了することができる。
【０１００】
そして、上述の第１及び第２の方法等においては、図１１に示すように、基板１０上に形成されるスポット８０の平面形状が略円形となる。この場合、各スポット８０の長軸Ｌａと短軸Ｌｂの比が１０％以下である。
【０１０１】
これにより、各スポット８０において形状上のばらつきが低減され、未知のＤＮＡを検査した場合においても、スポット８０からの蛍光発光をＣＣＤカメラ等で認識することが容易になり、検査精度が向上することとなる。特に、スポット８０の平面形状が略円形であることから、スポット８０の形成の際に試料溶液が流れるということが回避され、複数のスポット８０において試料溶液が混合するという不都合を防止することができる。
【０１０２】
また、本実施の形態では、図１２に示すように、多数のスポット８０を配列する際に、隣接するスポット８０が接触する位置まで集積させることができ、更には、図１３に示すように、多数のスポット８０を千鳥状に配列することも可能となる。この場合、隣接するスポット８０が接触する位置まで集積させたとき、基板１０上における検査有効面積Ａａ（スポット８０が配列された略矩形状の領域の面積Ａａ）に対するスポット８０の非付着面積Ａｂ（スポット８０が形成されていない部分の面積Ａｂ）の割合は２２％以下となる。
【０１０３】
このように、本実施の形態では、スポット８０の高集積化を達成させることができるため、一度に大量且つきめ細かい遺伝子解析を行うことができる。
【０１０４】
また、本実施の形態では、図１４Ａに示すように、スポットの大きさが異なる複数のスポットを基板上に形成することができる。図１４Ａの例ではＤＮＡ断片の種類が異なる１Ａ〜３Ｄの各スポット間において、スポット上に固定化されるＤＮＡ量が異なる、あるいは被検体とハイブリダイゼーションする効率が異なるＤＮＡ種が固定化された場合、スポットの大きさ、一般的には円形状における径を変化させている。
【０１０５】
具体的には、スポット上に固定化されるＤＮＡ量が少ない、あるいは被検体とハイブリダイゼーションする効率が低いＤＮＡ種が固定化された１Ａ、１Ｄ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、３Ａ、３Ｄのスポットは、スポット径を大きく形成し、中間の１Ｂ、２Ａ、３Ｂのスポットはスポット径を中間に形成し、スポット上に固定化されるＤＮＡ量が多い、あるいは被検体とハイブリダイゼーションする効率が高いＤＮＡ種が固定化された１Ｃ、３Ｃのスポットは、スポット径を小さく形成している。このようにすることにより、被検体を捕らえる能力のばらつきを抑え、スポット間の検出感度の違いによる検査結果のばらつき、定量性の劣化を抑えることが可能になる。
【０１０６】
また、本実施の形態では、図１４Ｂに示すように、同一のＤＮＡ断片について、それぞれ大きさ（スポット径）の異なる複数のスポットを形成することができる。図１４Ｂの例では、同一のＤＮＡ断片１Ａ、２Ａ、３Ａに対してそれぞれ大きさ（スポット径）の異なる４つのスポットＡ１〜Ａ４を形成した状態を示す。この場合、対応するＤＮＡ断片のスポットにおいて、反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、スポットの大きさに応じてどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができる。
【０１０７】
また、本実施の形態では、図１５Ａに示すように、各スポットに固定化されているＤＮＡ断片の量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットを形成することができる。図１５Ａの例ではＤＮＡ断片の種類が異なる１Ａ〜３Ｄの各スポット間において、被検体とハイブリダイゼーションする効率が異なるＤＮＡ種が固定化された場合、各スポットに固定化されているＤＮＡ断片の量の単位面積あたりの量を変化させている。
【０１０８】
具体的には、被検体とハイブリダイゼーションする効率が低いＤＮＡ種が固定化された１Ａ、１Ｄ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、３Ａ、３Ｄのスポットは、固定化されているＤＮＡ断片の量の単位面積あたりの量を多く形成し、中間の１Ｂ、２Ａ、３Ｂのスポットは固定化されているＤＮＡ断片の量の単位面積あたりの量を中間に形成し、被検体とハイブリダイゼーションする効率が高いＤＮＡ種が固定化された１Ｃ、３Ｃのスポットは、固定化されているＤＮＡ断片の量の単位面積あたりの量を少なく形成している。このようにすることにより、被検体を捕らえる能力のばらつきを抑え、スポット間の検出感度の違いによる検査結果のばらつき、定量性の劣化を抑えることが可能になる。
【０１０９】
また、本実施の形態では、図１５Ｂに示すように、同一のＤＮＡ断片について、それぞれ基板上に固定化されているＤＮＡ断片量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットを形成することができる。図１５Ｂの例では、同一のＤＮＡ断片１Ａ、２Ａ、３Ａに対してそれぞれの基板上に固定化されているＤＮＡ断片量の単位面積あたりの量が異なる４つのスポットＡ１〜Ａ４を形成した状態を示す。この場合、対応するＤＮＡ断片のスポットにおいて、反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、単位面積あたりのＤＮＡ断片量に応じてどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができる。
【０１１０】
また、本実施の形態では、図１６及び図１７に示すように、例えば、マイクロピペット３４の吐出力等を調整することにより、基板１０上に形成される例えば１層目のスポット８０Ａを、周縁部分１２０（図１７参照）が盛り上がった、いわゆるドーナツ形状にし、更に、これらドーナツ形状のスポット８０Ａを乾燥した後に、該スポット８０Ａ上に異なるＤＮＡ断片を含む平面略円形のスポット８０Ｂを形成する。これによって、同一のスポット形成位置にそれぞれ試料の異なるスポット８０Ａ及び８０Ｂを形成することができる。この場合、スポット８０の配置面積を大幅に低減することができ、ＤＮＡマイクロアレイ２０自体の小型化を図ることができる。
【０１１１】
なお、同一のスポット形成位置にそれぞれ、種類の異なる試料からなるスポットを形成することは、このようにスポットの周辺と中心部にその形成位置を割り振る配置に限定されることではないが、このように同心円上にスポット有効エリアを配置することは、異なるスポット間での形状のばらつきを低減するのに効果的である。
【０１１２】
以上のようなＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップは、インクジェット方式によって好適に製造される。特に異なる試料を同一のスポット内に形成する場合や、異なる試料のスポットを接触させて配置する場合は、従来のピン方式では、ピンの汚染の問題から製造不可であるが、非接触でスポットを形成するインクジェット方式では、精度よく効率的に実現できる。
【０１１３】
なお、この発明に係るＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップは、上述の実施の形態に限らず、この発明の要旨を逸脱することなく、種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【０１１４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るＤＮＡマイクロアレイを含むバイオチップによれば、以下のような効果を奏することができる。
【０１１５】
（１）遺伝子解析のための検査精度を向上させ、定量評価が可能となる。
（２）スポットの高集積化を達成させることができ、一度に大量且つきめ細かい遺伝子解析を行うことができる。
（３）反応するか、反応しないかというデジタル的な検査結果に加えて、スポットに固定化されるＤＮＡ断片の量に応じてどのくらい反応するかを把握することが可能となり、被検体に対してアナログ的な検査結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイを示す斜視図である。
【図２】本実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイの構成を示す拡大断面図である。
【図３】本実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイの製造方法を示す工程ブロック図である。
【図４】試料調製工程の内訳を示す工程ブロック図である。
【図５】図５Ａは第１の実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイの製造方法で使用される分注装置の構成を示す平面図であり、図５Ｂはその正面図であり、図５Ｃは分注装置を構成する１つのマイクロピペットを示す拡大平面図である。
【図６】マイクロピペットの構成を示す縦断面図である。
【図７】マイクロピペットの基体内に形成されるキャビティを含む流路の形状を示す斜視図である。
【図８】カートリッジと共に示す分注装置の分解斜視図である。
【図９】分注装置を使用してＤＮＡマイクロアレイを製造する場合の第１の方法を示す説明図である。
【図１０】分注装置を使用してＤＮＡマイクロアレイを製造する場合の第２の方法を示す説明図である。
【図１１】本実施の形態に係るＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの形成状態を示す説明図である。
【図１２】スポットをマトリクス状に配列した状態を示す説明図である。
【図１３】スポットを千鳥状に配列した状態を示す説明図である。
【図１４】図１４Ａはスポットの大きさが異なる複数のスポットが基板上に形成された状態を示す説明図であり、図１４Ｂは同一のＤＮＡ断片についてそれぞれ大きさが異なる４つのスポットを形成した状態を示す説明図である。
【図１５】図１５Ａは各スポットに固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる複数のスポットが形成された状態を示す説明図であり、図１５Ｂは同一のＤＮＡ断片についてそれぞれ固定化されているキャプチャー量の単位面積あたりの量が異なる４つのスポットを形成した状態を示す説明図である。
【図１６】同一のスポット形成位置に種類の異なるスポットを形成した状態を示す説明図である。
【図１７】図１６におけるＸＶＩＩ−ＸＶＩＩ線上の断面図である。
【図１８】従来のスポットの形状を示す説明図である。
【符号の説明】
１０…基板 １２…ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層
２０…ＤＮＡマイクロアレイ ３０…分注装置
８０、８０Ａ、８０Ｂ…スポット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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