(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明材料から形成され、複数列からなる多数の反応兼検出用ウェル及び該反応兼検出用ウェル内に嵌合される同一素材の反応ウェルからなることを特徴とするマイクロプレート。
【請求項２】
前記反応ウェルの少なくとも側面部が貫通した構造となっていることを特徴とする請求項１記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記反応ウェルのさらに底面部も貫通した構造となっていることを特徴とする請求項２記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記貫通した構造がスリットであることを特徴とする請求項２又は請求項３記載の何れかのマイクロプレート。
【請求項５】
前記貫通した構造が孔であることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の何れかのマイクロプレート。
【請求項６】
前記反応ウェルの試薬液接部表面、及び反応兼検出用ウェルの底面中央部近傍を除いた試薬液接部表面がマット処理されていることを特徴とする請求項１乃至請求項５記載の何れかのマイクロプレート。
【請求項７】
前記透明材料に−Ｃ−Ｏ−結合が５％以内導入されていることを特徴とする請求項１乃至請求項６記載の何れかのマイクロプレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素免疫反応による病理診断のための固相免疫測定検査用治具に関するもので、特には、マイクロプレートと呼ばれる反応と検出を兼用する成型品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年医学の幅広い分野で免疫反応を利用した分析手法が取り入れられ、癌性蛋白質の検出や血中薬物の定量等に用いられ、非常に有用な臨床データーが得られている。
この免疫反応を利用するもののうち、抗原抗体反応を利用して微量の抗原物質を精度良く分析測定する免疫分析法、特に固相抗体を用いる免疫分析法が注目されている。
【０００３】
固相抗体を用いる免疫分析法は、固相上に抗原もしくは抗体を固定し、ラジオアイソトープ、蛍光性物質もしくは酵素等の標識物を結合させた抗体もしくは抗原と抗原抗体反応を行わせる。反応物と未反応物の分離は洗浄によって容易に行うことができ、固相表面上に抗原抗体反応によって固定された抗原もしくは抗体は標識物質を定量することによって定量できる。
【０００４】
ところで、この方法では抗原もしくは抗体を固相に多量に且つ安定性良く、反応性部位が上向きになるように吸着（特異吸着）させることが重要である。
これまでは固相としてポリスチレン樹脂を軸に各種のプラスチック素材にガンマー線照射等の物理処理を行うことや化学的に官能基を導入するなどで特異吸着を多量に固定して反応性向上を図ってきた（特開昭６２−２４２６５７号公報、特開昭５９−８０４４２号公報、特開昭４８−７３０３号公報参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のマイクロプレートでは抗体及び抗原吸着部位は接液部である側面部及び底面部に吸着され、ＥＩＡ法により免疫測定が行われている。ここで、本発明者の知見によれば接液面積が大きく影響している。現在まではウェルの底面部及び側面部のみが反応部位であり、マット処理で表面積を稼ぐ程度の発明は行われているが十分な感度をえるために試薬を多量に必要としており大部分を無駄にしているのが現状である。
【０００６】
本発明の目的は、従来の固相免疫測定用成型品の固相特異吸着性を改善することで、反応性を向上させるため表面積を拡大し、かつ、試料を節約する構造のマイクロプレートを提案することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は抗原または抗体が現在ウェルでは側面部及び底面部に吸着することになり、ウェルの上方及びウェル接液面以外の試薬中の浮遊抗体も吸着に関与しないことが予想される。本発明は液中浮遊抗体及び抗原の吸着効率を高めるために反応兼検出用ウェルである通常のウェル内部に、もう一枚の反応ウェルである穴あきウェルを嵌め込み２重のウェルを形成させる。そして、試薬液が十分行き渡るように反応兼検出用ウェルと反応ウェルの間に隙間を設ける。この反応ウェルは発色試薬で発色させてから取り外してＯＤ値（光学濃度）測定を行う。更に、表面積を大きくするために反応ウェルである穴あきウェルは全体をマット処理することでさらに吸着効率アップが可能となる。
【０００８】
更に本発明を詳細に述べると、抗原や抗体を特異吸着させる素材はポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、トリメチルペンテン樹脂、ポリメタクリレート樹脂等がある。このうち、本発明のマイクロプレートの場合は外側の比色測定を行うセルを兼ねる反応兼検出用ウェルは特に透明性が必要なため、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリアクリルニトリルスチレン共重合体樹脂等が適している。内側の反応ウェルである穴あきウェルの素材には特に限定はない。
【０００９】
上述の素材を用いたウェルの形状は一般的には円柱状であるが四角柱状でも良い。また、射出成形法で製造されているため底部ほど円の直径は小さくなっている。通常のマイクロプレートは全体で９６穴で構成されており、８×１２の格子状でウェル内径は開口部６．５ｍｍ、底面部６．１５ｍｍ、深さ１１．４ｍｍとされている。
【００１０】
ウェル底面部の周辺を吸光度測定に支障無い範囲でマット処理することも可能である。更に、このマイクロプレートに低温プラズマ処理（２５０ｗ〜１ｋｗ、真空度１．０Ｔｏｒｒ以内）や紫外線処理（１５０〜３００ｎｍ）、ガンマー線処理（１ｋＧｙ以上）等により−Ｃ−Ｏ−官能基を５％以内導入する手段を併用することでマイクロプレートの感度向上が期待できる。
【００１１】
本発明のマイクロプレートによれば、抗体及び抗原吸着部位の表面積が格段に拡がり、濃度の低い試薬でも十分な感度を得ることができる。また、ウェルを反応兼検出用ウェルの内側に反応ウェルを嵌合させた２重ウェルにすることで試薬使用量は削減できる。更に物理処理による−Ｃ−Ｏ−官能基導入も表面積が格段に増したので感度アップがはかれる。また、場合により抗原や抗体の濃度が低くても十分な感度が得られることが判明した。
【００１２】
【実施例】
以下、図面により本発明の実施形態にかかるマイクロプレートを説明する。
〈実施例１〉
（１）本発明のマイクロプレート１は、図１、２、３、に示すように、マイクロプレート本体１０の上に上部マイクロプレート２０を重ね合わせた構成で、ウェル２は２重構造となっている。
【００１３】
（２）マイクロプレート本体１０は、ポリスチレン樹脂を用い射出成形法により作製される。このマイクロプレート本体の平面部１１には反応用凹部としての反応兼検出用ウェル１２が９６穴（８×１２）形成されている。個々の反応兼検出用ウェル１２は円柱形状を有し、内寸が底面部は直径６．１５ｍｍ、開口部は直径６．４ｍｍ、高さは１２．５ｍｍである。また肉厚は０．６ｍｍである。
【００１４】
（３）上部マイクロプレート２０も、ポリスチレン樹脂を用い射出成形法により作製される。この上部マイクロプレートの平面部２１には反応用凹部としての反応ウェル２２が９６穴（８×１２）形成されている。個々の反応ウェル２２は円柱形状を有し、外寸が底面部は直径５．１５ｍｍ、開口部は直径５．４ｍｍ、高さは８．５ｍｍである。また肉厚は０．６ｍｍである。
なお、底面部には内径３ｍｍの孔２３が１か所穿設されている。また、反応ウェル２２の側面部には、自動洗浄機のノズルが通過できるようにスリット２４が十文字状に形成されている。
【００１５】
（４）こうして作製したマイクロプレート本体１０の上から、上部マイクロプレート２０を被せるように重ねると、マイクロプレート本体の個々の反応兼検出用ウェル１２の内側に上部マイクロプレートの対応する反応ウェル２２が嵌合され、反応兼検出用ウェル１２と反応ウェル２２との間に側面部で１ｍｍ、底面部で４ｍｍの隙間を有する２重構造のウェル２が形成される。
この２重構造を有するウェル２の内側の反応ウェル底面には孔２３が穿設されているので、試薬が内側の反応ウェルと外側の反応兼検出用ウェル双方を自由に流れるように構成されている。
また、内側の反応ウェル側面には十文字状にスリット２４が設けられているので、自動洗浄機のノズルが通過可能になっている。
【００１６】
（５）つぎに、このマイクロプレート１にて免疫反応試験を行った。この試験において、マイクロプレート１のウェル２には、ＨＣＧ補足抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）の濃度が１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌに区別されるように、リン酸バッファー調製液を調製した。各濃度のリン酸バッファー調製液をそれぞれ１つのウェルあたり、２００μｌ／ウェル塗布した。塗布したマイクロプレートは４°Ｃで１昼夜放置した。
なお、ＨＣＧはヒト絨毛性ゴナドトロピンを示し、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧはマウスのモノクロナール抗体を示す。
【００１７】
（６）マイクロプレートの放置により、ＨＣＧ補足抗体がウェル底部に吸着しているので上澄み液を捨てる。上澄み液を廃棄したマイクロプレートを洗浄する。この洗浄にはＴｗｅｅｎ２０（関東化学株式会社製の界面活性剤＝ポリオキシエチレンソルビタレモノラウレート（しょ糖脂肪酸エステル））を０．０１％含有させた純水液を用いた。洗浄回数は３回であった。
【００１８】
（７）洗浄後、ＨＣＧ補足抗体が吸着したウェル内にブロッキング液（カゼイン２５％）を２５０μｌ／ウェル分注して２時間以上室温放置する。
【００１９】
（８）ブロッキング液を捨てて、再度３回洗浄する。
【００２０】
（９）抗原（ＨＣＧ）の添加を行って免疫反応を行う。４．０ｎｇ／ｍｌの試験用バッファーで調製したものを２００μｌ／ウェル分注して４°Ｃで２時間以上反応させる。
【００２１】
（１０）上澄み除去後、（６）工程と同様の洗浄を４回繰り返し、抗ＨＣＧ抗体ＨＲＰ（ペルオキシターゼ）の標識溶液を２００μｌ／ウェル分注して１．５時間反応させる。この抗ＨＣＧ抗体ＨＲＰの標準溶液には、リン酸バッファー０．２％を含むＴｗｅｅｎ２０が０．１モル濃度含まれる。
【００２２】
（１１）再度上澄みを除去した後、洗浄を３回繰り返す。
【００２３】
（１２）発色基質テトラメチルベンジレン（ＴＭＢ）溶液２０ｍｌに過酸化水素５μｌ調製したものを２００μｌ／ウェル分注して発色１時間室温放置する。
【００２４】
（１３）２規定の硫酸５０μｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍのＯＤ値（光学濃度）を吸光光度計で測定し、表１に示す結果を得た。なお、ＯＤ値は半透明物質の不透明の程度を示す値であり、入射光ＩＯ  と透過光Ｉとの比率ＩＯ  ／Ｉの対数Ｌｏｇ（ＩＯ  ／Ｉ）で示される。
【００２５】
〈実施例２〉
（１）実施例１において、反応兼検出用ウェルの内側側面全体と、底面の周囲を側端から内方に向けて１ｍｍまでをマット処理Ｍしたマイクロプレート本体１０ａと、反応ウェルの内側全体をマット処理Ｍした上部マイクロプレート２０ａを、ポリスチレン樹脂を用いて２１０〜２３０°Ｃで射出成形法により作製した。マイクロプレート本体１０ａの上から上部マイクロプレート２０ａを被せるように重ねて、２重構成のウェル２ａを有するマイクロプレートが作製された（図４参照）。
（２）このマイクロプレートを用いて実施例１と同様の免疫反応試験を行い、表１に示す結果を得た。
【００２６】
〈実施例３〉
（１）実施例２のマイクロプレートに窒素ガス雰囲気下で低温プラズマ処理を施した。このプラズマ処理の条件は、真空度１Ｔｏｒｒ、出力５００ｗ×２基、発振時間  約３０秒とした。
（２）このマイクロプレートを用いて実施例１と同様の免疫反応試験を行い、表１に示す結果を得た。
【００２７】
〈比較例１〉
（１）比較例として、図５に示すような円筒状のウェル５１を有し、ウェル５１の側面部５２および底面部５３が平滑なポリスチレン樹脂製のマイクロプレートを射出成形法により成形した。
（２）このマイクロプレートを用いて実施例１と同様の免疫反応試験を行い、表１に示す結果を得た。
【００２８】
【表１】
0003584616.tif 000002
【００２９】
【発明の効果】
本発明の固相免疫反応測定用のマイクロプレートは、抗原もしくは抗体の吸着反応性に優れ、感度の高い免疫学的分析結果が得られることから、医療検査において癌等の早期発見が可能で、治癒の確率が高くなる。また、試験試薬の削減効果もあり医療費抑制政策が予想されるおり、合理化に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例のマイクロプレートの（ａ）はウェルの断面図であり、（ｂ）はウェルの斜視図である。
【図２】同実施例のマイクロプレート本体の（ａ）は斜視図であり、（ｂ）は断面図である。
【図３】同実施例の上部マイクロプレートの（ａ）は斜視図であり、（ｂ）は断面図である。
【図４】同実施例で、マット処理を施したマイクロプレートのウェルの（ａ）は断面図であり、（ｂ）は斜視図である。
【図５】マイクロプレートのウェルの従来例を示し、（ａ）は断面図であり、（ｂ）は斜視図である。
【符号の説明】
１‥‥マイクロプレート
２‥‥ウェル
２ａ‥ウェル
１０‥‥マイクロプレート本体
１０ａ‥マイクロプレート本体
１１‥‥平面部
１２‥‥反応兼検出用ウェル
２０‥‥上部マイクロプレート
２０ａ‥上部マイクロプレート
２１‥‥平面部
２２‥‥反応ウェル
２３‥‥孔
２４‥‥スリット
５１‥‥ウェル
５２‥‥側面部
５３‥‥底面部
Ｍ‥‥マット処理
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0003584616.tif 000006
【図５】
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