(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロバクター・Ｇ−１株（微工研条寄第３１４０号）が生産するキチナーゼとマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとを用いて、キトサンを分解せしめ、低分子化して、重量平均分子量が５０００以下の低分子量化物とすることを特徴とするキトサンの低分子化方法。
【請求項２】
前記キトサンが、脱アセチル化度５０〜１００％のキトサンであることを特徴とする請求項１記載のキトサンの低分子化方法。
【請求項３】
前記キトサナーゼの使用量が、前記キチナーゼの使用量に対して１〜５０重量％である請求項１又は請求項２に記載のキトサンの低分子化方法。
【請求項４】
前記キチナーゼが、以下の（１）〜（８）の理化学的性質を有するものである請求項１乃至請求項３の何れかに記載のキトサンの低分子化方法。
（１）分子量：５０ｋＤａ
（２）至適ｐＨ：７．０
（３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０
（４）至適温度：５０℃
（５）温度安定性：２０〜５０℃
（６）等電点：ｐＩ６．６
（７）切断様式：エンド型
（８）基質特異性：脱アセチル化度８０％キトサン
【請求項５】
前記キトサナーゼが、以下の（１）〜（９）の理化学的性質を有するものである請求項１乃至請求項４の何れかに記載のキトサンの低分子化方法。
（１）分子量：３４ｋＤａ
（２）至適ｐＨ：４．０
（３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０
（４）至適温度：３０℃
（５）温度安定性：３０〜４０℃
（６）等電点：ｐＩ９．６
（７）酵素阻害物質：Ａｇ+
（８）切断様式：エンド型
（９）基質特異性：脱アセチル化度９０％キトサン、グリコールキトサン
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、キトサンの低分子化方法に係り、特に、脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサンを効率的に分解して、その低分子量化物を有利に得る方法に関するものである。
【０００２】
【背景技術】
近年において、キトサンは、次世代のバイオマスとして注目されており、その生体適合性や生分解性を応用した製品の開発が様々な分野で進められている。特に、高分子量のキトサンを低分子化して得られるキトサンオリゴマーは、抗菌性やエリシター活性等の様々な生理活性を有しているところから、注目度も高く、そのため、キトサンオリゴ糖の研究が盛んに行なわれてきているのである。
【０００３】
ところで、キトサンオリゴマーの製造方法としては、従来から、カニやエビ等の甲殻類から抽出したキチンを化学的に脱アセチル化してキトサンを得、そして該キトサンを塩酸等の酸によって加水分解して低分子化し、キトサンオリゴマーを製造する方法が知られているが（例えば、特公平１−２４１２１号公報、特開平３−８３５８４号公報、特開平３−２７７２７７号公報等）、その何れの方法にあっても、効率よく、キトサンオリゴマーを製造するには至っていない。
【０００４】
さらに、種々の微生物から単離・精製された種々のキトサナーゼがこれまでに報告されているが、脱アセチル化度５０〜１００％キトサンを基質とするキトサナーゼについての報告はほとんどない。これまでに単離・精製されたキトサナーゼとしては、例えば、脱アセチル化度７０〜９０％キトサンを基質とする  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＣＨＢ１０１  株由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度４０〜９９％キトサンを基質とする  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｎ１７４  株由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度７０〜１００％キトサンを基質とする  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｆ．ｓｐ．  ｐｈａｓｅｏｌｉ  由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度８１％キトサンを基質とする  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｐ１  株由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度１００％キトサンを基質とする  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ＣｓＯ−２  株由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度７０％キトサンを基質とする  Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ由来のキトサナーゼ、脱アセチル化度７０％キトサンを基質とする  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ  由来のキトサナーゼ等が報告されている。
【０００５】
また、本願出願人にあっても、先に、脱アセチル化度８０％のキトサンを基質とする  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ・Ｇ−１（微工研条寄第３１４０号）株由来のキチナーゼを用いて、キトサンを分解し、それを低分子量化する手法を明らかにしたが、その作用部分がキトサンポリマー中に存在するキチン部分のみであるために、かかる低分子量化反応が、重量平均分子量が約１００００〜２００００程度のところで止まってしまい、それ以下の分子量のものを得ることは困難であった。
【０００６】
このような状況の下において、キトサン、特に脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサンを効率よく低分子化して、重量平均分子量で１００００以下、更には５０００以下のものと為し得る有効な方法の開発が、切望されるに至っているのである。
【０００７】
【解決課題】
このため、本発明の課題とするところは、キトサンの有効な低分子化方法、特に、脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサンを効率よく低分子化する方法を提供することにある。
【０００８】
【解決手段】
かかる状況下、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エンテロバクター（ Enterobacter ）・Ｇ−１株が生産するキチナーゼと、マツエバクター・キトサノタビダス（ Matsuebacter chitosanotabidus）・３００１株が生産するキトサナーゼとを併用すると、キトサナーゼ活性が相乗的に増大することを見出したのであり、特に、驚くべきことに、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、脱アセチル化度が１００％のキトサンに対しては全くキトサナーゼ活性を有しないにも拘わらず、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼと併用すると、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを単独で用いる場合よりも、脱アセチル化度が１００％のキトサンに対するキトサナーゼ活性が増大することを見出したのである。
【０００９】
本発明は、かくの如き知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、エンテロバクター・Ｇ−１株（微工研条寄第３１４０号）が生産するキチナーゼとマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとを用いて、キトサンを分解して、低分子化することを特徴とするキトサンの低分子化方法にある。
【００１０】
このように、本発明にあっては、特定の２種の微生物が生産する酵素を組み合わせてなる複合酵素において、高分子量のキトサンに作用せしめることにより、かかるキトサンを高いキトサナーゼ活性をもって効率的に分解せしめ、また重量平均分子量が１００００以下の、更には５０００以下の低分子量化物を容易に形成し得ることとなったのである。
【００１１】
なお、そのような本発明に従う方法において、キトサンとしては、有利には、脱アセチル化度が５０〜１００％のキトサンが対象とされることとなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ところで、かかる本発明において用いられる、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼには、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼと同様の理化学的性質を有する全てのキチナーゼが含まれることが理解されなければならない。従って、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼには、エンテロバクター・Ｇ−１株自体から得られるキチナーゼの他、例えば、エンテロバクター・Ｇ−１株由来のキチナーゼ遺伝子を導入し、発現させた宿主から得られるキチナーゼも含まれるものである。また、前駆型キチナーゼから成熟型キチナーゼに至る全ての段階のキチナーゼも含まれることとなる。ここで、前駆型キチナーゼとは、翻訳後修飾を受けていないキチナーゼを意味し、成熟型キチナーゼとは、全ての翻訳後修飾を受けたキチナーゼを意味する。
【００１３】
なお、このエンテロバクター・Ｇ−１株が生産する成熟型キチナーゼの理化学的性質は、以下の通りである。
（１）分子量：５０ｋＤａ
（２）至適ｐＨ：７．０
（３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０
（４）至適温度：５０℃
（５）温度安定性：２０〜５０℃
（６）等電点：ｐＩ６．６
（７）切断様式：エンド型
（８）基質特異性：脱アセチル化度８０％キトサン
【００１４】
また、かかるエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとしては、例えば、エンテロバクター・Ｇ−１株の菌体を物理的に破砕して又は化学的に処理して細胞内容物を抽出した後、該細胞内容物からキチナーゼ活性を指標として単離・精製して得られるキチナーゼを用いることが出来る。その際、菌体の物理的な破砕、菌体の化学的な処理、細胞内容物の抽出、細胞内容物からのキチナーゼの単離・精製は、例えば、細胞内容物を常法に従って脱塩処理、硫安分画した後、適当なクロマトグラフィーを用いて行なうことが出来る。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等を用いることが出来る。
【００１５】
さらに、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとしては、エンテロバクター・Ｇ−１株の培養物を遠心分離し、その遠心上清からキチナーゼ活性を指標として単離・精製して得られるキチナーゼを用いることも出来る。エンテロバクター・Ｇ−１株の培養は、常法に従って行なうことが出来る。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育促進物質を含有する培地であれば、合成培地及び天然培地の何れを用いてもよく、例えば、２％粉末キチン培地、１％コロダイルキチン培地等の培地を用いることが出来る。培養に際しては、温度を２５〜３５℃、好ましくは３０〜３５℃、ｐＨを６．５〜８．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０に維持するのが望ましい。以上のような条件で６〜７日間培養すると、培養液中にキチナーゼが分泌される。培養物の遠心分離は、例えば６０００〜８０００ｒｐｍで１０〜３０分間行なえばよい。培養物の遠心上清からのキチナーゼの単離・精製は、上記と同様にクロマトグラフィーを用いて行なうことが出来る。
【００１６】
更にまた、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとして、エンテロバクター・Ｇ−１株由来のキチナーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを適当な宿主に導入して発現させた後、該宿主から単離・精製して得られるキチナーゼを用いることも出来る。
【００１７】
なお、エンテロバクター（  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ）・Ｇ−１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、微工研条寄第３１４０号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１４０）として寄託されており（昭和６３年１１月１４日に寄託された微工研菌寄第Ｐ−１０３９２号より移管）、その菌学的性質等については、本願出願人によって特公平６ー６０号公報に詳細に明らかにされているところであって、公知のものである。
【００１８】
また、このエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、精製して用いるのが好ましいが、未精製のまま用いることも可能である。例えば、エンテロバクター・Ｇ−１株又はエンテロバクター・Ｇ−１株由来のキチナーゼ遺伝子を導入した宿主を物理的に破砕して又は化学的に処理して得られる細胞内容物をそのまま用いてもよいし、エンテロバクター・Ｇ−１株又はエンテロバクター・Ｇ−１株由来のキチナーゼ遺伝子を導入した宿主の培養物を遠心分離して得られる遠心上清をそのまま用いてもよい。更に、かかるエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、常法に従って固定化し、固定化酵素として用いることも可能である。
【００１９】
一方、本発明において、上記したエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼと組み合わせて用いられる、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼには、マツエバクター・キトサノタビダス・３０００１株が生産するキトサナーゼと同様の理化学的性質を有する全てのキトサナーゼが含まれることが理解されなければならない。従って、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株自体から得られるキトサナーゼの他、例えば、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を導入し、発現させた宿主から得られるキトサナーゼも含まれるものである。また、前駆型キトサナーゼから成熟型キトサナーゼに至る全ての段階のキトサナーゼも含まれることとなる。ここで、前駆型キトサナーゼとは、翻訳後修飾を受けていないキトサナーゼを意味し、成熟型キトサナーゼとは、全ての翻訳後修飾を受けたキトサナーゼを意味する。
【００２０】
なお、かかるマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産する成熟型キトサナーゼの理化学的性質は、以下の通りである。
（１）分子量：３４ｋＤａ
（２）至適ｐＨ：４．０
（３）ｐＨ安定性：４．０〜８．０
（４）至適温度：３０℃
（５）温度安定性：３０〜４０℃
（６）等電点：ｐＩ９．６
（７）酵素阻害物質：Ａｇ＋  
（８）切断様式：エンド型
（９）基質特異性：脱アセチル化度９０％キトサン、グリコールキトサン
【００２１】
また、このマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、例えば、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株の菌体を物理的に破砕して又は化学的に処理して細胞内容物を抽出した後、該細胞内容物からキトサナーゼ活性を指標として単離・精製して得られるキトサナーゼを用いることが出来る。その際、菌体の物理的な破砕は、例えば、乳鉢にマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株の菌体の他、アルミナ、ガラス粉末、海砂、ケイ砂等を加えて、磨砕することにより、行なうことが出来る。市販の乳鉢式電動磨砕機を使用すれば、大量の菌体を容易に破砕することが出来る。菌体の化学的な処理は、例えば、細胞壁を分解する酵素（例えば、卵白リゾチーム等）や界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｅｅｐｏｌ  ＸＬ  ）で菌体を処理することにより、行なうことが出来る。細胞内容物の抽出は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ等）を用いて行なうことが出来る。細胞内容物からのキトサナーゼの単離・精製は、例えば、細胞内容物を常法に従って脱塩処理、硫安分画した後、適当なクロマトグラフィーを用いて行なうことが出来る。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等を用いることが出来る。
【００２２】
また、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株の培養物を遠心分離して、その遠心上清から、キトサナーゼ活性を指標として単離・精製して得られるキトサナーゼを用いることが出来る。
【００２３】
その際、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株の培養は、常法に従って、行なうことが出来る。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育促進物質を含有する培地であれば、合成培地及び天然培地の何れを用いてもよく、例えば、０．５％粉末キトサン培地、０．５％液体キトサン培地、０．５％コロダイルキトサン培地等の培地を用いることが出来る。また、かかる培養に際しては、温度を２５〜３５℃、好ましくは３０〜３５℃、ｐＨを４．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．０〜５．０に維持するのが望ましい。以上のような条件で６〜７日間培養すると、培養液中にキトサナーゼが分泌される。培養物の遠心分離は、例えば６０００〜８０００ｒｐｍで１０〜３０分間行なえばよい。培養物の遠心上清からのキトサナーゼの単離・精製は、上記と同様にクロマトグラフィーを用いて行なうことが出来る。
【００２４】
さらに、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとしては、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを適当な宿主に導入して発現させた後、該宿主から単離・精製して得られるキトサナーゼを用いることも出来る。
【００２５】
なお、かかるマツエバクター・キトサノタビダス・３００１（  Ｍａｔｓｕｅｂａｃｔｅｒ  ｃｈｉｔｏｓａｎｏｔａｂｉｄｕｓ  ３００１  ）株は、「  ＩＡＭ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  １９９８」に「  ＩＡＭ  １４７１１ｔ  」として掲載されており、ＩＡＭより容易に入手可能である。また、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株の菌学的性質は、以下に示す通りである。
【００２６】
0003599640.tif 000002
【００２７】
そして、このマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼは、精製して用いるのが好ましいが、未精製のまま用いることも可能である。例えば、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株又はマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を導入した宿主を物理的に破砕して又は化学的に処理して得られる細胞内容物をそのまま用いてもよいし、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株又はマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株由来のキトサナーゼ遺伝子を導入した宿主の培養物を遠心分離して得られる遠心上清をそのまま用いてもよいのである。また、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼは、常法に従って固定化し、固定化酵素して用いることも可能である。
【００２８】
ところで、上記した二つの特定の酵素を複合酵素として、本発明に従ってキトサンを分解して低分子量化せしめるに際して、用いられるキトサンの脱アセチル化度は、特に限定されるものではないが、好ましくは５０〜１００％であり、更に好ましくは８０〜１００％であり、最も好ましくは９０〜１００％である。また、そのようなキトサンの分子量も特に限定されるものではないが、通常１０万〜１００万程度であり、好ましくは５０万〜１００万程度であり、更に好ましくは５０万程度である。
【００２９】
また、本発明におけるエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼの使用量は、基質であるキトサンの量や反応条件等に応じて適宜に調整し得るものであるが、キトサンの０．５〜１ｇ／ｍＬに対して、通常、０．５〜１ｍｇ／ｍＬ程度であり、好ましくは０．７５〜１ｍｇ／ｍＬ程度であり、更に好ましくは１ｍｇ／ｍＬ程度である。
【００３０】
さらに、本発明におけるマツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼの使用量は、前記エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼの使用量に対して、一般に、１〜５０重量％程度であり、好ましくは１０〜２０重量％程度であり、更に好ましくは１０重量％程度である。
【００３１】
そして、そのような複合酵素を用いたキトサンの低分子量化のための反応条件は、一般的な加水分解反応と同様の条件であれば、特に限定されるものではないのである。また、反応温度は、通常２０〜４０℃程度であり、好ましくは３０〜４０℃程度である。ｐＨは、通常４．０〜８．０程度であり、好ましくは４．０〜６．０程度である。更に、反応時間は、通常６〜１２時間程度であり、好ましくは６時間程度である。反応媒体としては、加水分解反応を行ない得る溶媒であれば特に限定されず、例えば、希塩酸、酢酸、アスコルビン酸溶液等を用いることが出来る。
【００３２】
なお、本発明において、低分子化とは、グルコサミンのポリマーである高分子量のキトサンを、グルコサミンのオリゴマーであるキトサンオリゴマーに分解することを意味している。キトサンオリゴマーにおけるグルコサミンの重合度は、通常２〜７程度である。また、キトサンオリゴマーの分子量は、通常、４４２〜１５４７程度である。
【００３３】
また、かかる本発明に従ってキトサンを低分子化して得られるキトサンオリゴマーは、反応液から、次のようにして単離・精製することが出来る。即ち、反応液中のキトサンオリゴマーを活性炭カラム又はイオン交換カラムに吸着させ、イオン交換水で洗浄した後、エタノールで回収し、濃縮乾固することにより、白色結晶として、キトサンオリゴマーを得ることが出来るのである。
【００３４】
かくして得られる、低分子化されたキトサンは、例えば、医用材料、抗菌剤、化粧品、農業資材等として有用であり、従来と同様にして、各種の用途に有利に用いられることとなる。
【００３５】
【実施例】
以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記した具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが理解されるべきである。
【００３６】
実施例  １
［Ａ］マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼと市販のキトサナーゼとの、脱アセチル化度８０〜１００％のキトサンに対するキトサナーゼ活性の比較
（１）マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼの単離・精製
キトサンを基質として、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株を培養して得られた培養液から、遠心分離により、キトサンの残渣物や菌体を除去して、濁りのない茶色溶液を上清液として得た。そして、その上清液に、硫酸アンモニウムを４７２ｇ／Ｌ（７０％飽和）になるように、少しずつ加えた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）して、生じた沈殿物を回収した。その上清を捨て、得られた沈殿物を、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液に溶解させた。このようにして回収された沈殿物の溶液を、透析チューブに収容し、０．０１〜０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  塩酸緩衝液中で、４℃×２４時間の透析を行ない、硫酸アンモニウムを排除せしめた。そして、その得られた沈殿物の容液を、フリーズドライして、長期保存可能なキトサナーゼ粗酵素を得た。
【００３７】
次いで、かかるキトサナーゼ粗酵素を用いて、イオン交換法により、キトサナーゼの精製を行なった。具体的には、カラムとして、ＨｉＬｏａｄ  １６／１０Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（スウェーデン国：ファルマシア社製）を用い、また緩衝液としては、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ：８．０）を用いて、流速４ｍＬ／分にて、下記のグラジエントを行ない、酵素活性を有する画分を取り出すことにより、精製を行なった。即ち、グラジエントは、緩衝液濃度を５０％（０．０５Ｍ）として、カラム体積の１０倍量を流した後、緩衝液濃度を１００％（０．１Ｍ）にして、カラム体積の２倍量の緩衝液を流すことにより、行なった。
【００３８】
（２）マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼ及び市販のキトサナーゼの各酵素液の調製
マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼ及び市販のキトサナーゼをそれぞれ  Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ：７．０）に溶解し、各酵素液を調製した。この際、市販のキトサナーゼとしては、バチルス・パミルス（  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ）ＢＮ−２６２株が生産するキトサナーゼ（和光純薬工業株式会社製）を使用した。
【００３９】
（３）各酵素液中のタンパク質含量の定量
各酵素液中のタンパク質含量を、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製のプロテイン・アッセイ・キットを使用して、以下のように定量した。
【００４０】
先ず、１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（アルブミン）を、０、０．５、１  、２  、３  、１０μｌずつ採り、それぞれ、最終容量が８００μｌとなるように滅菌水を加えて、サンプルとした。そして、各サンプルにプロテイン・アッセイ溶液を２００μｌずつ加え、暗所にて１５分間放置した。その後、各サンプルの吸光度ＯＤ５９５  を測定した。この際、滅菌水のみのサンプル（１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ０μｌ）を、ブランクとして使用した。横軸をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、縦軸をＯＤ５９５  として、検量線を作成した。
【００４１】
ＢＳＡの代わりに各酵素を用いて、上記と同様にして、吸光度ＯＤ５９５  を測定し、検量線に基づいて、各酵素液中のタンパク質含量を定量した。
【００４２】
（４）Ｓｃｈａｌｅｓ  変法を用いたキトサナーゼ活性の測定
各試験管に、０．１Ｍ  クエン酸及び０．２Ｍ  Ｎａ２  ＨＰＯ４  を含む  Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ：７．０）を１ｍＬずつ分注した後、各試験管に同様の  Ｂｕｆｆｅｒ  で適当に希釈した各酵素液を０．５ｍＬずつ加えた。コントロールとして使用する試験管は、酵素を失活させるために１５分間煮沸し、その間、他の試験管は氷中に放置した。その後、各試験管に、基質である０．５％キトサン８Ｂ又は１０Ｂ塩酸溶液（ｐＨ：５．２）０．５ｍＬを加えた。なお、キトサン８Ｂは脱アセチル化度８０％のキトサンを意味し、キトサン１０Ｂは脱アセチル化度１００％のキトサンを意味する。
【００４３】
各試験管を３０℃で３０分間インキュベートした後、煮沸により酵素を失活させた。次いで、室温において３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その遠心上清１．５ｍＬを別の試験管に移した。更に、この遠心上清を移した各試験管に、Ｓｃｈａｌｅｓ  試薬（組成：Ｋ３  Ｆｅ（ＣＮ）６    ０．２５ｇ／０．５Ｍ  Ｎａ２  ＣＯ３    ５００ｍＬ）２ｍＬを加え、軽く攪拌した後、１５分間煮沸した。次いで、室温にて３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた遠心上清の吸光度ＯＤ４２０  を測定した。
【００４４】
そして、上記条件で毎分１μｍｏｌのグルコサミンに相当する還元糖量を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とし、キトサンの場合のＫｍを２．０７として、各酵素液のキトサナーゼ活性を、以下の式に従って計算した。
［（Ｃ−Ｓ）×２］／［Ｋｍ×Ｘ（ｍＬ）］
＝μｍｏｌ／ｍＬ酵素／基質反応時間（分）
＝Ｕ／ｍｇ／ｍＬ
＝Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ
【００４５】
なお、式中、「Ｃ」はコントロールのＯＤ４２０  を表わし、「Ｓ」は各サンプルのＯＤ４２０  を表わし、「Ｘ」は各酵素液量を表わす。
【００４６】
（５）各酵素のキトサン１０Ｂ及びキトサン８Ｂに対するキトサナーゼ活性
各酵素のキトサン１０Ｂ及びキトサン８Ｂに対するキトサナーゼ活性を、表１に示す。
【００４７】
【表１】
0003599640.tif 000003
【００４８】
かかる表１に示されるように、キトサン８Ｂ［脱アセチル化度（Ｄａｃ）８０％のキトサン］及びキトサン１０Ｂ［脱アセチル化度（Ｄａｃ）１００％のキトサン］に対するキトサナーゼ活性は、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼの方が、バチルス・パルミス  ＢＮ−２６２株が生産するキトサナーゼよりも約３倍程度高かった。
【００４９】
この結果により、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼが、脱アセチル化度８０〜１００％キトサンに対して優れたキトサナーゼ活性を有することが明らかとなった。即ち、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを利用することにより、脱アセチル化度８０〜１００％キトサンを効率よく低分子化出来ることが明らかとなったのである。
【００５０】
［Ｂ］マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを複合した場合のキトサナーゼ活性の変化
（１）エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼの単離・精製
キチンを基質として、エンテロバクター・Ｇ−１株を培養して得られた培養液から、遠心分離により、キチンの残渣物や菌体を除去することによって、濁りのない黒褐色溶液を得た。次いで、この溶液に、硫酸アンモニウムを５６ｇ／Ｌ（１０％飽和）となるように、少しずつ加えた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×１５分）を行ない、生じた沈殿物を除去して、上清液を回収した。次いで、その得られた上清液に、硫酸アンモニウムを４０６ｇ／Ｌ（７０％飽和）となるように、少しずつ加えた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）を実施し、その上清を捨てる一方、沈殿物をＴｒｉｓ塩酸緩衝液に溶解させることにより、生じた沈殿物を溶液として回収した。そして、その回収した沈殿物の溶液を透析チューブに入れて、０．０１〜０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  塩酸緩衝液中で、４℃×２４時間、透析を行ない、硫酸アンモニウムを排除した。その後、かかる透析処理された沈殿物の溶液をフリーズドライして、長期保存可能なキチナーゼ粗酵素を得た。
【００５１】
次いで、かかるキチナーゼ粗酵素に対して、以下の精製操作を施し、キチナーゼの精製を行なった。先ず、カラムとしては、ＨｉＬｏａｄ  １６／１０Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（スウェーデン国：ファルマシア社製）を用い、また緩衝液としては、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ：８．０）を使用すると共に、流速４ｍＬ／分にて、以下のグラジエントを行ない、酵素活性を有する最初の素通り画分を取り出すことにより、精製酵素溶液を分離、採取した。即ち、グラジエントは、緩衝液濃度を５０％（０．０５Ｍ）として、カラム体積の１０倍量を流した後、緩衝液濃度を１００％（０．１Ｍ）にして、カラム体積の２倍量の緩衝液を流すことにより、行なった。
【００５２】
（２）各酵素と複合酵素とのキトサナーゼ活性の比較
キトサン８Ｂ（脱アセチル化度８０％のキトサン）及びキトサン１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキトサン）に対するキトサナーゼ活性を、▲１▼マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを単独で使用した場合、▲２▼エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼを単独で使用した場合、▲３▼マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用した場合において、比較した。
【００５３】
各酵素液中のタンパク質含量の定量、並びに各酵素液のキトサナーゼ活性の測定は、前記と同様にして行なった。
【００５４】
各酵素及び複合酵素のキトサン１０Ｂ及びキトサン８Ｂに対するキトサナーゼ活性を、下記表２に示す。
【００５５】
【表２】
0003599640.tif 000004
【００５６】
かかる表２に示される結果より明らかなように、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、キトサン１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキトサン）に対して全くキトサナーゼ活性を示さないにも拘わらず、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用する場合には、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを単独で使用する場合と比較して、キトサン８Ｂ（脱アセチル化度８０％のキトサン）及びキトサン１０Ｂ（脱アセチル化度１００％のキトサン）に対するキトサナーゼ活性が１０〜１５％以上増大しているのである。即ち、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用することにより、キトサナーゼ活性が相乗的に増大することが、明らかとなったのである。
【００５７】
実施例  ２
実施例１において得られたエンテロバクター・Ｇ−１株が生産した精製キチナーゼと、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産した精製キトサナーゼを用い、下記の４種の試料溶液を調製した。
【００５８】
▲１▼対  照：蒸留水２ｍＬ＋１％キトサン−ＨＣｌ  ８ｍＬ＝１０ｍＬ
▲２▼キチナーゼ単独：精製キチナーゼ２ｍＬ＋１％キトサン−ＨＣｌ  ４ｍＬ＝６ｍＬ
▲３▼キトサナーゼ単独：精製キトサナーゼ溶液２ｍＬ＋１％キトサン−ＨＣｌ  ４ｍＬ＝６ｍＬ
▲４▼複合酵素（キチナーゼ＋キトサナーゼ）：精製キチナーゼ溶液１ｍＬ＋精製キトサナーゼ溶液１ｍＬ＋１％キトサン−ＨＣｌ  ８ｍＬ＝１０ｍＬ
【００５９】
上記の４種の試料溶液に対して、それぞれ、３０℃×１２０分の酵素反応操作を実施した後、２０分間煮沸することにより、酵素活性を失活せしめ、その後、下記条件にてゲル濾過クロマトグラフィー法（ＧＰＣ）により、分子量測定を行なった。
【００６０】
ＧＰＣ分子量測定条件
・カラム：  Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ    ＳＢ−Ｇ＋ＳＢ−８０６ＨＱ＋ＳＢ−８０５ＨＱ
・移動相：０．５Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液
・流  量：１．０ｍＬ／ｍＬ
・検出器：ＲＩ
・カラム温度：４０℃
・注入量：２００μＬ（約０．０５％濃度の溶液として）
・標    品：  Ｓｈｏｄｅｘ  Ｐｕｌｌｕｌａｎ    Ｐ−５、Ｐ−１０、Ｐ−２０、Ｐ−５０、
Ｐ−１００、Ｐ−２００、Ｐ−４００、Ｐ−８００
【００６１】
かくして得られたＧＰＣ分子量測定の結果を、下記表３に示すが、その結果から明らかなように、本発明に従って複合酵素（キチナーゼ＋キトサナーゼ）を用いた場合にあっては、キトサンが効果的に分解せしめられて、分子量のより小さな低分子が形成されているのである。
【００６２】
【表３】
0003599640.tif 000005
【００６３】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明に従って、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用することにより、キトサナーゼ活性が相乗的に増大せしめられ得て、キトサンを効率よく低分子化出来るのである。特に、エンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼは、脱アセチル化度１００％のキトサンに対して全くキトサナーゼ活性を示さないにも拘わらず、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼとエンテロバクター・Ｇ−１株が生産するキチナーゼとを併用することにより、マツエバクター・キトサノタビダス・３００１株が生産するキトサナーゼを単独で使用する場合よりも、効率よく、脱アセチル化度の高いキトサンを低分子化出来るのである。