(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
沈降性の金属塩を含む細菌培養液に、アスコルビン酸、エチレンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸、ニトリロ三酢酸、trans-1,2-シクロヘキサンジアミン-N,N,N',N'−四酢酸、エチレングリコール-O,O'-ビス（アミノエチル）-N,N,N',N'−四酢酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種のキレート形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、これを被検液として、ハイブリダイゼーション法により該被検液中のサルモネラ菌ＲＮＡの存在を検出することを含む核酸の検出方法であって、該ハイブリダイゼーション法が２種の核酸プローブを用いる方法であって、サルモネラ菌ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、サルモネラ菌ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することによりサルモネラ菌ＲＮＡの存在を検出することを特徴とするハイブリダイゼーション法である、核酸の検出方法。
【請求項２】
部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列（Ａ）の５’末端が、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末端と部分配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることを特徴とする、請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
部分配列（Ａ）と（Ｂ）が離れていて、部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列（Ａ）の５’末端、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末端と部分配列（Ａ）の３’末端の距離が５塩基以内であることを特徴とする、請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
部分配列（Ｂ）の３’末端配列と部分配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末端配列と部分配列（Ａ）の３’末端配列が重複していて、該重複部分が５塩基未満であることを特徴とする、請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
標識物質が、ジゴキシゲニン又はビオチンである請求項１記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
ジゴキシゲニン又はビオチンを、抗ジゴキシゲニン抗体−酵素複合体又はビオチン−アビジン−酵素複合体を用いて検出する請求項５記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
被検ＲＮＡがリボゾームＲＮＡである請求項１記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は核酸の検出方法に関し、さらに詳しくは、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から核酸を高感度で検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌の培養液には、通常は２価以上の金属イオンは含まれていないが、例えば酸を生成する細菌の場合、その酸を中和するために沈降性の炭酸カルシウムなどを加える場合がある。この場合、菌の増殖とともに生成された酸の量に対応してカルシウムイオンは遊離イオンとなって溶解する。一方、細菌の核酸を抽出するために、従来ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤や水酸化ナトリウムなどのアルカリがよく使用されるが、上記のように酸によって溶解したカルシウムイオンなどが培養液中に存在する場合、これらの界面活性剤やアルカリの添加によってカルシウムが再沈殿してしまう。生じた沈殿は、例えば遠心分離操作といった手段で除くことが可能であるが、往々にしてそのような沈殿に核酸が吸着する傾向があり、よって沈殿の除去とともに核酸の収量の低下を招いてしまう。
本発明者らは先に、ＲＮＡ上で隣接しているハイブリダイゼーションする２種の核酸プローブを用いることにより、対象のＲＮＡを安定且つ高感度に検出する方法を開発した。この方法は、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）やメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などを検出する場合に極めて有効な方法である。しかしながら、沈降性の金属塩が存在している細菌の培養液を使用する場合、アルカリなどによる溶菌操作によって再び沈殿が形成され、この沈殿によってハイブリダイゼーションが阻害されてしまう。これを防ぐために、遠心分離操作などによって予め培養液を分離することが一般に行われるが、手間がかかり多量の検体をこなす上で不都合であり、また、対象となる核酸を損失する可能性がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、沈降性の金属塩を含む細菌培養液から、溶菌操作によってそれらの金属塩が再び沈殿することを阻止し、ハイブリダイゼーションが阻害されることなく、対象となる核酸を簡便・迅速に且つ高感度で検出する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を行った結果、溶菌操作を行う前にキレート形成化合物を添加しておくことで金属塩の沈殿形成が阻止され、その後の被検核酸の検出が簡便・迅速に且つ高感度で行われることを見出し、本発明を完成させるに至った。
従って本発明は、沈降性の金属塩を含む細菌培養液にキレート形成化合物を添加し、次いでアルカリ溶菌し、中和処理した後、ハイブリダイゼーション法により被検液中の核酸の存在を検出することを特徴とする核酸の検出方法に関する。
本発明の好ましい実施態様によれば、上記キレート形成化合物はクエン酸、酒石酸、アスコルビン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ニトリロ三酢酸、ｔｒａｎｓ−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
本発明の核酸の検出方法が利用される細菌の具体例として、サルモネラ菌が挙げられる。
本発明はまた、上記の核酸がＲＮＡである検出方法を提供する。
【０００５】
本発明におけるキレート形成化合物の添加は、細菌培養液にキレート形成化合物の水溶液を添加することによって実施される。
キレート形成化合物の添加量は、その種類によって多少異なるが、被検液中において一般に０．０２〜２．０Ｍ程度になるのが適当であり、さらに好ましくは０．０５〜１．０Ｍ程度が適当である。
本発明において、アルカリ溶菌は常法に従って実施することができ、使用するアルカリとしては、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどが挙げられる。もしこのような方法だけで溶菌しにくい場合には、細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよい。
アルカリ溶菌に次ぐ中和処理も常法に従って実施することができ、使用する中和液としては、リン酸バッファーやトリス塩酸バッファーなどの中性バッファーを含む塩酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。
【０００６】
本発明の核酸の検出方法に使用されるハイブリダイゼーション法の一具体例として、２種の核酸プローブを用いるＲＮＡの検出方法（以下、隣接ハリブリダイゼーション法という）を下記に説明する。
この方法は、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする。
この検出方法では、２種の核酸プローブを用いることでＲＮＡ分子の切断の影響を極力防ぎ、またＲＮＡを迅速・簡便に検出することができる。
被検ＲＮＡとしては、例えばリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。
【０００７】
上記隣接ハリブリダイゼーション法において、特定の細菌、例えばサルモネラ菌のｒＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ｒＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検ｒＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ｒＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより、その特定の細菌の存在を検出することができる。
【０００８】
使用する第１の核酸プローブは、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。この第１の核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
使用する第２の核酸プローブは、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。
部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好ましい。
配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複してもよいが、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、その重複部分で被検ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより好ましい。
一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）は重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよいが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、被検ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。
【０００９】
配列（Ａ）の逆相補鎖である特異配列ＤＮＡ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡである隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列はいずれを捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよい。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
この検出方法ではこの捕捉プローブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡを検出する。
【００１０】
被検ＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で３分〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、Ｄｉｇで標識されている場合には抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもでき、この場合にはより高い検出感度を得ることができる。
洗浄液１、２は、特定されるものではないが、例えば０．０５％程度の界面活性剤を含む生理食塩水等を用いることができる。
【００１１】
本発明の核酸の検出方法が特に有効であるサルモネラ菌は、最も重要な食中毒菌の１種であり、その迅速で確実な同定法は広く求められている。サルモネラ菌はわずかな数でも問題となるので、通常ＥＭＭブイヨンなどの培地でいったん増殖培養した後、ハーナテトラチオン酸塩基礎培地などで選択増殖培養する。サルモネラ菌は多量の酸を生成することから、上記の培地には炭酸カルシウムが多く含まれている。このような培養液で溶菌操作を直接実施し、これを検体として隣接ハイブリダイゼーション法による検出操作を行うと、ほとんど検出されなくなる。ここで、溶菌操作を行う前にキレート形成化合物を添加しておくことによって、通常と同等の感度で検出が可能となる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１２】
【実施例１】
サルモネラ菌のｒＲＮＡの検出
〔隣接ハイブリダイゼーション法に使用する捕捉プローブ及び標識プローブの調製〕
サルモネラ菌の２３ＳｒＲＮＡ塩基配列から４つの部分配列を選択し、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４で表される４本の逆相補鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と配列番号２、及び配列番号３と配列番号４のＤＮＡはそれぞれ隣接してサルモネラ菌２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする。標識プローブには配列番号１と配列番号３、捕捉プローブには配列番号２と配列番号４のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡの合成にはＤＮＡ合成装置（ＰＣＲ−ＭＡＴＥ  モデル３９１、ＡＢＩ社）を用いた。なお、配列番号１と２を用いた系をセットＡ、配列番号３と４を用いた系をセットＢと記す。
0003598127.tif 000002
【００１３】
捕捉プローブを０．０２μｇ／μｌ  になるように５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ８．０に溶解した。これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、ＭＳ−３６０８ＦＡ）の各ウエルに５０μｌ  加え、８０℃で乾燥させた。紫外線を１２０ｍＪ／ｃｍ２  照射した後、３０ｍＭクエン酸ナトリウム／３００ｍＭ  塩化ナトリウム（２ｘＳＳＣ）  ２００μｌ  で３、４回洗浄し乾燥させた。得られた捕捉プローブ固定プレートは４℃で半年以上安定である。
標識プローブは表１の組成の反応液でＤｉｇ標識を行なった。
【００１４】
【表１】
0003598127.tif 000003
【００１５】
標識反応後、１／１０容の０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、１／１０容の４Ｍ  ＬｉＣｌ  、３  μｇ  のグリコーゲン及び２．５倍容のエタノールを加え−８０  ℃で、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、７０％エタノールで洗浄し乾燥させた後、０．２ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  に溶解した。
得られた標識プローブの４μｌ  を表２に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液）。なお、標識プローブ液は４℃で１ヶ月以上の保存が可能である。
【００１６】
【表２】
0003598127.tif 000004
【００１７】
〔サルモネラ菌培養液からの被検液の調製〕
平板培地上のサルモネラ菌２種（Ｓ．  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，  Ｓ．  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）  のコロニーを１０ｍｌのハーナテトラチオン酸塩基礎培地（下記表３）に植菌し３７℃で一晩培養した。培養液を１０分放置し、上澄み液を０．８ｍｌ取り、下記表４に示される各種キレート形成化合物の水溶液０．４ｍｌを加えた。１．８Ｎ  ＮａＯＨを０．１５ｍｌ加え、３７℃、１０分放置後、中和液（１．８Ｎ  ＨＣｌ／０．２Ｍ  リン酸バッファー  ｐＨ７．２）０．１５ｍｌを加えて、これを被検液とした。なお、菌濃度測定のため、１０分放置した後の培養液を一部を取り、適当に希釈して普通寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをカウントし、生菌数を計算した。
【００１８】
下記の操作に従って、サルモネラ菌の２３ＳｒＲＮＡを検出した。
被検液５０μｌ  と標識プローブ液５０μｌ  を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、３７℃、１時間振盪した。なお、ここでの振盪はわずかでも液が揺れていればよい。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、１％ブロッキング剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で１００００  倍に希釈した抗Ｄｉｇヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガー・マンハイム社）を加え３０分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：０．１２％  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／０．１Ｍ  酢酸ナトリウム，ｐＨ５／３０％ジメチルホルムアミド、Ｂ液：０．０３％  過酸化水素／０．２％  リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混合）１００  μｌ  を加え５−１５分放置する。得られた青色液の吸光度を６５５ｎｍ  の波長で測定した。表４にその結果を示す。
【００１９】
0003598127.tif 000005
【００２０】
0003598127.tif 000006
【００２１】
上記表４からわかるように、各種キレート形成化合物によってカルシウムの沈殿形成が阻止され、ハイブリダイゼーションがよく達成されている。また、沈殿形成量が少ないほど、検出値が高くなっている。
【００２２】
【実施例２】
実施例１と同様の方法を用い、上記プローブセットＢを用いてＳ．  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ検出試験を行った。ただし、被検液の調製において、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加濃度を変化させて、検出値への影響を調べた。結果を表５に示す。
【００２３】
【表５】
0003598127.tif 000007
【００２４】
【発明の効果】
溶菌後の金属塩の沈殿形成を阻止することができ、さらにハイブリダイゼーションが阻害されることなく迅速・簡便に且つ高感度で核酸の検出ができる。
【００２５】
【配列表】
0003598127.tif 000008
【００２６】
0003598127.tif 000009
【００２７】
0003598127.tif 000010
【００２８】
0003598127.tif 000011