(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の過程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）を経ることにより、交配過程なしに作成される、マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入植物。
（Ａ）目的遺伝子、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子、及び部位特異的組換え系に由来する脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、形態異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に存在し、また目的遺伝子は、この脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つにすることがない位置に存在する、植物への遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入する過程
（Ｂ）  このベクターにより遺伝子導入された植物細胞を培養し、その培養中に生ずる、植物組織の形態異常を検出し、この形態異常を示す組織を選抜する過程
（Ｃ）  前記（Ｂ）で選抜した形態異常を示す組織を培養し、その培養中に出現する、正常な形態を有する組織を検出して選抜する過程
（Ｄ）  前記（Ｃ）で選抜した正常な形態を有する組織を培養し、植物体を再生する過程
【請求項２】
次の過程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）を経ることにより、交配過程なしに作成される、２以上の目的遺伝子が導入された遺伝子導入植物。
（Ａ）目的遺伝子、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子、及び部位特異的組換え系に由来する脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、形態異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に存在し、また目的遺伝子は、この脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つにすることがない位置に存在する、植物への遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入する過程
（Ｂ）  このベクターにより遺伝子導入された植物細胞を培養し、その培養中に生ずる、植物組織の形態異常を検出し、この形態異常を示す組織を選抜する過程
（Ｃ）  前記（Ｂ）で選抜した形態異常を示す組織を培養し、その培養中に出現する、正常な形態を有する組織を検出して選抜する過程
（Ｄ）  前記（Ａ）〜（Ｃ）の過程を１回以上繰り返した後、（Ｃ）で選抜した正常な形態を有する組織を培養し、植物体を再生する過程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なベクターを用いて目的遺伝子が導入された植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術を利用した微生物、培養細胞などの形質転換は、現在、医薬品として有用な生理活性物質の生産等の目的に応用され、実産業においても多大の貢献をなしている。植物育種の分野においては、植物のライフサイクルが微生物等に比較してはるかに長いこと等の理由から、遺伝子工学技術の実産業への応用はやや遅れているが、この技術は、目的とする遺伝子を直接、育種の対象となる植物に導入することを可能とするため、（ａ）改変すべき形質のみが導入できる、（ｂ）植物以外の種（微生物等）の形質も植物に導入できる、（ｃ）育種期間の大幅な短縮ができるなど、交配を重ねて行う古典的な育種と比べて多くのメリットを有し、その応用は、植物育種の飛躍的進歩をもたらすものと期待され、またこの期待は現実のものとなりつつある。
【０００３】
具体的に、目的遺伝子を対象植物に導入し、遺伝子導入植物を作成するには（１）目的遺伝子の植物細胞への導入（染色体、核等に導入される場合も含む。）、（２）目的遺伝子が導入された細胞のみからなる植物組織の選抜、（３）選抜された植物組織からの植物体の再生、の３段階を必ず経ることになる。このうち目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、一般に、目的遺伝子の発現している組織（目的遺伝子が発現している組織は、当然これが導入された細胞からなる組織である。）を、植物体を再生することなく、しかも肉眼で確認することが困難なことから、目的遺伝子は、細胞培養の段階でその発現が容易に検出できるマーカー遺伝子と共に植物細胞に導入され、マーカー遺伝子の発現の有無（すなわちマーカー遺伝子の導入の有無）が目的遺伝子導入の指標として用いられるのが普通である。例えば、このようなマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性を付与するカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴＩＩ；ネオマイシンリン酸化酵素遺伝子）やハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ＨＰＴ；ハイグロマイシンリン酸化酵素遺伝子）、アミノ酸合成に関与するノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）やオクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）、農薬耐性を付与するスルフォニルウレア系抵抗性遺伝子（ＡＬＳ；アセトラクテート合成酵素遺伝子）などがある。
【０００４】
しかしマーカー遺伝子の発現はまた、このような遺伝子導入植物を食用等に供することを目的とした場合、重大な障害となる。つまり、かかるマーカー遺伝子が発現することによって生ずる遺伝子産物の、人体への安全性を担保することが非常に困難だからである。従って、これらマーカー遺伝子を指標として作成された遺伝子導入植物を食品として販売する場合には、その遺伝子産物の人体への影響について詳細な調査が必要とされる。例えば、ＮＰＴＩＩ遺伝子は、すでに１９８０年代前半から、マーカー遺伝子として実験室レベルでは盛んに用いられて来たが、１９９４年になってようやく、その遺伝子産物が米国食品衛生局（ＦＤＡ）により食品添加物として認可され、これをマーカー遺伝子として用い、形質転換された遺伝子導入植物が食用等に供されるようになった。しかし、実際にこれを口にすることになる肝心の消費者レベルでは、このようなＮＰＴＩＩ遺伝子産物への不安感は、依然として拭い去り難く存在し続けている。
【０００５】
また現在、マーカー遺伝子として実用化されているのは、このＮＰＴＩＩ遺伝子をはじめ、植物細胞に対する成長阻害物質の解毒作用に寄与する遺伝子のみであり、それ故、目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、これら成長阻害物質を含む培地でその培養を行い、マーカー遺伝子の発現の有無、つまりはかかる物質に対する耐性を評価し、これを指標とすることになる。しかしこの場合、耐性がある、すなわちかかる物質の存在下で植物組織が増殖するといっても、これは程度の問題であり、このような阻害物質の存在下での培養が、植物細胞にとって好ましからぬ影響を与えることは避け難く、現実に、植物細胞の活性低下に伴う遺伝子導入組織の増殖、再分化率の低下等の副作用が問題となっている。
【０００６】
さらに、遺伝子導入組織選抜後の植物細胞におけるマーカー遺伝子の発現は、遺伝子導入による植物育種を行うにあたっても、大きな障害を与える。すなわち、あるマーカー遺伝子を用いて作成された遺伝子導入植物に対して、さらに別の遺伝子を新たに導入しようとする場合には、二度と、同一のマーカー遺伝子を用いて遺伝子導入を行うことができない。すでにその植物にはこのマーカー遺伝子が存在しているため、再びこれを新たな目的遺伝子と共にその同じ植物に導入しても、新たな目的遺伝子が導入されようがされまいが、その植物の細胞や組織ではこのマーカー遺伝子が常に発現し、これを目的遺伝子導入の指標とすることはもはやできないからである。従って、このような遺伝子の多重導入は、各導入過程を繰り返す毎に異なるマーカー遺伝子を用いることになる。しかし、植物種によりマーカー遺伝子の有効性は異なり、それぞれのマーカー遺伝子の使用に際しては、その都度条件設定のための予備実験が必要となる（例えば、イネではＮＰＴＩＩ遺伝子よりＨＰＴ遺伝子の方が有効であると報告されている（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３８：２７４、１９８９）。また、そもそもマーカー遺伝子の種類には限りがあるため、マーカー遺伝子を換えるだけでは、遺伝子の多重導入を無制限に繰り返すことは不可能である。つまり、ある植物に対して遺伝子導入を繰り返すことのできる回数は、その植物に用いることのできるマーカー遺伝子の種類数によって、自ずから制約を受けることとなる。しかも、現在実用できるマーカー遺伝子の種類は、上記したようにごく限られているのである。従って、遺伝子導入植物組織の選抜後、その際用いたマーカー遺伝子を、それが存在し、機能する染色体等のＤＮＡから除去するなどして、これによる影響をその細胞、組織、さらには植物体から排除する技術は、遺伝子工学技術を用いた植物育種の新たな展開に必須のものである、と言うことができる。
【０００７】
現在、マーカー遺伝子の影響を排除するためのこうした技術としては、マーカー遺伝子と植物のトランスポゾンを一体として用い、このトランスポゾンと共にこれを、その導入された植物染色体から除去する方法（国際公開ＷＯ９２／０１３７０号公報）、及びこのトランスポゾンに代えてＰ１ファージの部位特異的組換え系を用いる方法（国際公開ＷＯ９３／０１２８３号公報）の二つが報告されている。これらの方法によれば、確率的にはかなり低いが、遺伝子導入後にある一定の割合でマーカー遺伝子が植物染色体から除去された細胞、すなわち目的遺伝子だけが染色体に残留して発現し、マーカー遺伝子の機能は消失した遺伝子導入植物細胞を得ることができる。
【０００８】
もっとも、これらの方法により、マーカー遺伝子がその染色体から除去された植物細胞が生じたとしても、この細胞は、これがなおそこに存在して発現している細胞中に点在しており、しかも、これら２種類の細胞は肉眼での識別が不可能なことから、これらをそのままで分離することはできない。目的遺伝子導入時のように、マーカー遺伝子が発現している細胞を選抜しようとする場合には、これが植物細胞に付与する薬剤耐性・栄養要求性等を指標とする選抜を行うこともできるが、この選抜の際、そのマーカー遺伝子の発現がない細胞は重度の成長障害を起こし、多くは死に至らしめられるので、マーカー遺伝子が除去された細胞を得る、というここでの目的には、かかる選抜方法は到底適用することができない。
【０００９】
そこで、これらの方法により、染色体からマーカー遺伝子が除去され、目的遺伝子だけが残留した植物を得るためには、マーカー遺伝子が染色体から除去された細胞と、これがなおそこに存在している細胞とを混在させたまま、ある程度培養して増殖させた後、その培養組織を再分化させて得られた植物体の組織を、サザンハイブリダイゼーション法、またはポリメラーゼ連鎖反応法などの手法を用いて解析することにより、選抜を行うことが考えられる。この場合において前提となるのは、このような再分化個体は単一の細胞に由来し、それ故これを構成する細胞はすべて等しい性質を持つ、例えば、マーカー遺伝子が除去された細胞に由来する個体は、すべてこうした細胞のみからなる、という仮定であることは言うまでもない。しかし多くの場合、かかる再分化個体を構成する細胞は必ずしも均一ではないことが既に良く知られており、マーカー遺伝子にしても、これが染色体から除去された細胞と、なおそこに存在している細胞とは、再生された植物の同一個体内、さらには同一組織内においてすら、全く不規則に共存・分布することとなる。従ってこれらの方法では、培養組織を再分化して植物個体を再生しただけの段階で、マーカー遺伝子が染色体から除去された細胞のみからなる個体を得ることは非常に困難である。また、これを選抜するための解析においては、たとえどのような手法であっても、上記の解析手法を始め現在知られている手法ではすべて、その適用に際し、共試試料としてその個体全体でも単一細胞でもなく、適当なマスを有する組織、例えば一枚の葉、を用いるため、その結果は、その葉一枚におけるマーカー遺伝子の存在状況等について、全体的傾向を測定・解析するものに止まる。従って、同一個体・組織内において、マーカー遺伝子が除去された細胞とこれが存在している細胞とが、混在しているのがむしろ普通の状態であるこのような場合において、仮にマーカー遺伝子が染色体から除去された細胞のみからなる個体が偶発的に生じたとしても、この解析結果をもってその個体を選抜することは到底不可能であると言わざるを得ない。この結果においてマーカー遺伝子の存在等が検出されなかったとしても、その同じ個体の他の部位の組織もそうであるとする保証は全くなく、また、そもそもマーカー遺伝子の存在等が検出されなかったからといって、これはその存在量等が単に検出限界以下であることを示すに過ぎず、その試料中に、マーカー遺伝子の存在する細胞が全く含まれていないとは、この場合には言い切れないからである。
【００１０】
結局のところ、このような場合には、花粉、卵細胞等の生殖細胞を経由することにより初めて、マーカー遺伝子の影響が排除された個体が得られることとなる。すなわち、これらの生殖細胞は単細胞であるので、例えばこれが、その細胞の染色体からマーカー遺伝子が除去された卵細胞であるならば、これを用いて自家受粉を行った場合、古典的遺伝法則に従う一定の確率で、マーカー遺伝子をその染色体に含まない受精卵が得られ、さらにこの受精卵からは、これと同一の特性を有する細胞のみからなる個体が生ずるであろう。サザンハイブリダイゼーション法等の解析手法による選抜は、この個体を対象として行えばよい。つまり、ここで挙げた報告に記載の方法による場合、マーカー遺伝子が染色体から除去された細胞が得られたとしても、これが存在する培養組織から植物体を再分化し、さらにこの再分化した植物体を用いて交配を行い、Ｆ１またはその後代の子孫を得て初めてかかる細胞のみからなる個体が得られ、そしてそれをマーカー遺伝子の影響が排除された個体として、選抜することができるようになるのである。
【００１１】
なお特開平６−２７６８７２では、やはりマーカー遺伝子の影響を排除するため、遺伝子導入の際、マーカー遺伝子を目的遺伝子とは別個のプラスミドベクターに組込んで用いることにより、導入後にマーカー遺伝子のみを細胞から除去する技術を報告しているが、これにしても、その除去のためには交配過程を必ず経なければならず、その点では上記の２報と同様である。
【００１２】
しかしこのような方法では、生長の遅い木本植物、不稔個体、もしくはＦ１であること自体に価値がある雑種個体への適用は難しい。またそうでなくとも、トランスポゾン等の脱離能を有するＤＮＡ因子は、これらがその存在し、機能する染色体ＤＮＡやウィルスベクターＤＮＡ等から除去される確率が極めて低いことが多いため、その除去、つまりはマーカー遺伝子の機能の消失は、実用上、少なくとも培養組織の段階で容易に検出できることが要求される。培養組織の再分化、そしてその再分化個体の交配による後代の作出を経なければ確実にこれを検出できないのであれば、その実用化は殆ど不可能である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規ベクターを用い、植物細胞の活性を低下させる植物細胞成長阻害物質等を用いることなく作成される遺伝子導入植物を提供することにある。
【００１４】
さらに本発明は、新規ベクターを用い、交配によるＦ１もしくはその後代の作出過程を経ることなく作成される、マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入植物、更には、マーカー遺伝子の影響が排除され、かつ、多重に遺伝子が導入された植物を提供することをも目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子、脱離能を有するＤＮＡ因子として部位特異的組換え系に由来するＤＮＡ因子を用い、形態異常誘導遺伝子が脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に存在し、また、目的遺伝子は、脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにすることのない位置に存在するベクターを用いることにより、達成することができる。
【００１６】
ここで形態異常誘導遺伝子とは、植物の組織に、例えば、矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根頭癌腫、毛状根、葉の波打ち等の、通常と異なる形態分化を引き起こす遺伝子を意味する。例えば、これらの形態異常誘導遺伝子としては、すでに、ｉｐｔ遺伝子（Ａ．Ｃ．Ｓｍｉｇｏｃｋｉ、Ｌ．Ｄ．Ｏｗｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５１３１、１９８８）、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ、１：８６、１９８７）、ｇｅｎｅ  ５遺伝子（Ｈ．ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１０：３９８３、１９９１）、ｇｅｎｅ  ６ｂ遺伝子（Ｐ．Ｊ．Ｊ．Ｈｏｏｙａａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：７９１、１９８８）、及びｒｏｌＡ〜Ｄのｒｏｌ遺伝子群（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４：３３、１９８５）等、それぞれ特異的な遺伝子が、各種の植物に癌腫、奇形腫（すなわち不定芽・不定根等の形成）を引き起こす細菌である、アグロバクテリウム等に存在していることが報告されており、また、シュードモナス・シリンガエの亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）ではｉａａＬ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｓｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２７：２０５、１９９１）の存在が、さらに種々の植物からもホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等の存在が報告されている。
【００１７】
これらの遺伝子は、いずれも本発明において使用することができるが、中でも特に、頂芽優勢の崩壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子や、毛状根の形成、及び毛状根から再生した植物の矮化や葉の波打ち等を引き起こすｒｏｌ遺伝子群は、種々の形態異常誘導遺伝子の中でも特徴的な形態の異常を引き起こすことから、本発明に使用するマーカー遺伝子として好ましい。さらに、これらはまた、それを組み合わせることにより、それが導入された特定の植物に、不定芽・不定根等の特定の構造を再分化させるよう設計することも可能である。本発明においては、このような遺伝子の組み合わせを利用し、遺伝子導入のターゲットとなる植物の種類等、遺伝子導入植物の作成条件に応じて形態異常誘導遺伝子を構築し、用いることもできる。
【００１８】
かかる形態異常誘導遺伝子の細胞への導入により生じた、異常な形態をした組織は、この遺伝子を有する細胞のみからなっているので、これをマーカー遺伝子として目的遺伝子と共にベクターを構築し、このベクターを植物細胞に導入してこの細胞を培養しさえすれば、これから生じる異常な形態を示す組織を肉眼で選抜することのみにより、マーカー遺伝子、つまりは目的遺伝子が導入された細胞だけからなる組織を選抜できることになる。なお、ここでベクターとは、外来遺伝子を宿主細胞に導入する目的に用いられるＤＮＡ配列であって、この外来遺伝子を宿主細胞内で発現させるために必要な機能を備えているものを指し、外来遺伝子は多くの場合、これに組み込まれた形で宿主細胞に導入される。
【００１９】
すなわち本発明のベクターを用いて遺伝子導入を行えば、遺伝子導入後の細胞をＭＳ培地等の通常の培地を用い、通常の培養条件で培養するだけで、目的遺伝子が導入された細胞のみからなる植物組織の肉眼による選抜が可能となる。従って、その選抜にあたっては、植物細胞成長阻害物質等、遺伝子導入組織選抜のための特別な物質を使用する必要がないので、作業が簡略化されるばかりではなく、これらの影響により植物細胞の活性が低下するおそれもない。
【００２０】
一方、脱離能を有するＤＮＡ因子とは、これらが存在し、機能する染色体ＤＮＡ等から、それ自身が脱離し得る能力を有するＤＮＡ配列をいう。かかるＤＮＡ因子としては、部位特異的組換え系（site-specific recombination system）に由来するものが知られている。
【００２３】
この部位特異的組換え系は、特徴的なＤＮＡ配列を有する組換え部位（本発明の脱離能を有するＤＮＡ因子にあたる。）、及びこのＤＮＡ配列に特異的に結合して、その配列が２以上存在したとき、その配列間の組換えを触媒する酵素、という２つの要素からなり、そして、このＤＮＡ配列が同一ＤＮＡ分子上に、同一方向を向いてある一定の間隔で２か所存在している場合には、これに挟まれた領域がこのＤＮＡ分子（プラスミド、染色体等）から脱離し、またこの配列が対向する方向を向いて２か所存在している場合には、この領域が反転する、という挙動を示す。本発明では、この前者の脱離作用を利用するが、このような組換え部位内部の脱離・反転は、部位特異的組換え系によるいわゆる相同的組換えの結果として生ずるものであり、これが、転移の過程としてその脱離を起こす、トランスポゾンを用いた場合の機構ともっとも異なる点である。なお組換え酵素をコードする遺伝子は、必ず組換え部位と同一のＤＮＡ分子上に存在する必要はなく、これと同一細胞内に存在し、発現していさえすれば、このＤＮＡ配列間の脱離・反転を生ぜしめ得ることが知られている（N.L.Craig、Annu.Rev.Genet.、22:77、1988）。
【００２４】
現在、部位特異的組換え系はファージ、細菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたＣｒｅ／ｌｏｘ系、ｐＳＲ１系、ＦＬＰ系、ｃｅｒ系、ｆｉｍ系等が知られているが（総説として、Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：１７、１９８８）、高等生物ではまだその存在を知られていない。しかし、これらの微生物から分離された部位特異的組換え系も、前記した国際公開ＷＯ９３／０１２８３号公報において、Ｐ１ファージ由来のＣｒｅ／ｌｏｘ系が植物への遺伝子導入用ベクターに利用されているように、その由来する生物種と異なる生物種（植物を含む）に導入された場合でも、そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっている。ちなみに本発明の一実施例では、酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の部位特異的組換え系であるｐＳＲ１系（Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２：６１０、１９９０）を、その組換え部位間に組換え酵素を挿入して利用したが、このｐＳＲ１系もまた、高等植物においてその本来の機能を維持することがすでに報告されている（Ｈ．Ｏｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９：６３７３、１９９１）。
【００２５】
また本発明において、形態異常誘導遺伝子を挿入する場所は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、これが脱離し得る位置でありさえすればよい。例えば、脱離能を有するＤＮＡ因子として、部位特異的組換え系のｐＳＲ１系を用いた場合には、組換え部位に挟まれた領域内で、組換え酵素の発現を阻害しない位置でありさえすれば、これをどこにでも挿入することができる。
【００２６】
形態異常誘導遺伝子を脱離能を有するＤＮＡ因子とこのようにして組合せてベクターを構築すれば、このベクターを用いて植物に遺伝子を導入した場合、導入後、マーカー遺伝子として用いた形態異常誘導遺伝子は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、植物の染色体等、それらが導入され機能していたＤＮＡ上から脱離し、その頻度に差はあるものの、ある一定の確率でその機能を失う一方、これとは挙動を一つにしない目的遺伝子は、おなじＤＮＡ上に残留し続けることになる。それ故このベクターは、導入しようとする目的遺伝子に関する構成を変更するのみで、ある一つの植物体へ遺伝子の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して用いることができる。しかもこの形態異常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と同様に、遺伝子導入組織の培養中に起こる、その形態の変化として肉眼で検出できるので、目的遺伝子だけが染色体等に残留してその機能を保持している細胞のみからなる組織を、何ら特別な操作を行うことなく、その組織を培養するだけで確実・容易に選抜できることとなる。従って、たとえかかる細胞が実際に生ずる確率は低くとも、このベクターは十分に実用に供することができ、これを用いた遺伝子の多重導入も、ただ何回でも繰り返せるばかりではなく、完全な植物体を再生する前の培養組織の段階でこれを繰り返せるため、効率良く行うことができる。また、かかる細胞だけからなる遺伝子導入個体を得るためには、上記のようにして選抜した組織から植物体を再生するだけでよく、交配過程を経る必要もない。そしてこのようにして得られた遺伝子導入個体はまさに、マーカー遺伝子の遺伝子産物がもたらすかもしれない人体への悪影響に対する危惧から、完全に解放されたものなのである。加えてこのベクターは、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を用いたことから由来する他の特徴、すなわち、遺伝子導入組織の選抜過程で、細胞活性の低下を招くおそれがある細胞成長阻害物質等を用いる必要がないという、前述したメリットをも合わせ持つことは言うまでもない。
【００２７】
本発明のベクターは、遺伝子工学的手法により遺伝子導入が可能な、いかなる植物においても用いることができ、また、本発明のベクターにより植物に導入できる目的遺伝子は、農業的に優れた形質を付与できる遺伝子、農業的に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、目的に応じて種々選択することができる。
【００２８】
なお一般に、遺伝子から酵素等のタンパク質が産生されるには、これらポリペプチドの情報をコードしている構造遺伝子配列の他に、構造遺伝子のプロモーター配列（発現開始配列）、ターミネーター配列（発現終結配列）などの調節配列が必要とされ、例えば、植物で機能するプロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｊ．Ｔ．Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１３：８１０、１９８５）、ノパリン合成酵素のプロモーター（Ｗ．Ｈ．Ｒ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、４：３５５、１９８５）、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットのプロモーター（Ｒ．Ｆｌｕｈｒｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：２３５８、１９８６）等が、またターミネーター配列としては、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナル（Ａ．Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：５６１、１９８２）、オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル（Ｊ．Ｇｉｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：８３５、１９８４）等が知られている。従って、本発明において単に遺伝子とした場合には、構造遺伝子及び遺伝子発現調節配列を指す。ちなみに、本発明においては、実施例で使用した遺伝子発現調節配列に限ることなく、上記のような種々の遺伝子発現調節配列を使用することができる。さらに、遺伝子、すなわちＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのクローニングにより得ることができるが、あらかじめそのシーケンスが明らかにされているものであれば、これを化学合成して得ることもできる。
【００２９】
本発明のベクターは、植物に感染するウイルスや細菌を介して、植物細胞に間接的に導入することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。この場合、例えば、ウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等が使用でき、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（以下、Ａ．リゾジェネスと略す。）等が使用できる。なおアグロバクテリウム属は、一般に単子葉植物には感染せず、双子葉植物にのみ感染するとされているが、最近では、これらを単子葉植物へ感染させて遺伝子導入を行った例も報告されている（例えば、国際公開ＷＯ９４／００９７７号公報）。
【００３０】
本発明のベクターはまた、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等の物理的・化学的手法によっても、植物細胞に直接導入することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、遺伝子導入法として汎用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用できないため、これらの直接導入法が有効である。
【００３１】
【作用】
本発明において、マーカー遺伝子として用いた形態異常誘導遺伝子は、これが発現することにより、その導入された植物細胞において、植物成長ホルモンの異常生産等、それぞれ、その細胞内の生理状態に異常をもたらし、結果としてその増殖・分化の方向を狂わせて様々な形態異常を引き起こす。つまり、ここで生じる異常な形態をした組織、例えば頂芽優勢の崩れた無秩序な芽の集合体（多芽体）や毛状根等は、こうした形態異常誘導遺伝子が導入された細胞に由来し、これが異常な増殖・分化をした結果生じたものであるので、この遺伝子を有する細胞のみからなっている。従って、これをマーカー遺伝子として目的遺伝子と共に植物細胞に導入してこの細胞を培養すれば、これから生じる異常な形態を示す組織を肉眼で選抜することのみにより、マーカー遺伝子、つまりは目的遺伝子が導入された細胞だけからなる組織を選抜できることとなるので、植物細胞成長阻害物質の培地中への添加等、特別な操作は何等行うことなく、肉眼による遺伝子導入組織の選抜が可能となる。
【００３２】
さらに本発明では、脱離能を有するＤＮＡ因子をこの形態異常誘導遺伝子と組合せ、形態異常誘導遺伝子が脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に組み込んで用いる。かかる構成を有するベクターを用いて植物に遺伝子を導入すれば、導入後、マーカー遺伝子である形態異常誘導遺伝子は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、それらが導入され機能していたＤＮＡ上から、一定の確率で脱離してその機能を失う一方、これとは挙動を一つにしない目的遺伝子は同じＤＮＡ上に残留して機能を保持し続けることとなる。それ故このベクターは、導入しようとする目的遺伝子に関する構成を変更するのみで、マーカー遺伝子を始めとする他の構成に何等変更を加えることなく、ある一つの植物体へ遺伝子の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して用いることができる。マーカー遺伝子が機能を失った遺伝子導入組織等では、そのマーカー遺伝子の発現はもはや起こり得ないので、同じマーカー遺伝子の発現を何度でも繰り返して、新たな目的遺伝子導入の指標とすることができるからである。
【００３３】
しかもこのマーカー遺伝子、つまり形態異常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と同様に、遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出できることから、この機能の消失した細胞だけからなる組織、換言すれば、目的遺伝子のみがその染色体等に残留して機能を保持している細胞だけからなる組織は、確実・容易に選抜できることとなる。すなわち、かかる細胞だけからなる組織を得るためには、まず、遺伝子導入処理後の細胞を培養して、形態異常誘導遺伝子の発現により生じてくる多芽体、毛状根等、異常な形態を示す組織を肉眼で選抜し、これを分離してさらに培養を続け、次いでこれらの形態異常を示す組織から生じてくる、今度は正常な形態を示す組織をやはり肉眼で選抜すればよい。つまり、選抜のための特別な操作は何等行わなくとも、培養と肉眼による選抜、そして分離を繰り返すだけでよいので、遺伝子の多重導入も効率良く行うことができる。さらに、かかる細胞だけからなる植物体も、得られた遺伝子導入組織から植物体を再生するだけで、交配過程を経ることなく取得することができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を実施例に基づいて説明する。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）、又は製造業者の取扱い説明書に従い行われた。
【００３５】
【実施例】
［参考例１］
Ｉ．ベクターの作成
病原性Ａ．ツメファシエンスＰＯ２２株のＴ−ＤＮＡ（我彦広悦、植物の化学調節、24:35、1989、（図１参照））上に存在するｉｐｔ遺伝子を制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、これをプラスミドｐＵＣ７（モレキュラー・クローニング第２版、第１巻、4.10）のＰｓｔＩ制限酵素部位と連結することにより、組換えプラスミドｐＩＰＴ１を得た。このプラスミドから、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含むｉｐｔ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切り出し、これをプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造（株）より購入）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ制限酵素部位間に連結することにより、プラスミドｐＩＰＴ２を得、次いで、このｉｐｔ遺伝子の内、構造遺伝子とポリアデニル化シグナルを制限酵素ＲｓａＩで切り出し、これをプラスミドｐＵＣ１１９のＳｍａＩ制限酵素部位と連結することにより、組換えプラスミドｐＩＰＴ３を得た。そしてさらに、ｐＩＰＴ３に挿入されたｉｐｔ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで切り出し、植物への遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入）のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ制限酵素部位間に連結することにより、プラスミドｐＩＰＴ４を作成した。このプラスミドを有するＡ．ツメファシエンスを植物に感染させた場合、その構造の内、いわゆるＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれるＬＢサイトとＲＢサイトの内側、ここではＮＰＴＩＩ遺伝子とｉｐｔ遺伝子を有する約５ｋｂの領域が植物染色体に組み込まれることになる。
【００３６】
なお、このプラスミドｐＩＰＴ４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＩＰＴ４）（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０６３号）として、国際寄託に付した。
【００３７】
ｐＩＰＴ４の作成スキムを図２〜４に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図５に示す。図２〜４及び図５中、丸で囲ったＰ、Ｔはそれぞれ、ｉｐｔ遺伝子自身のプロモーター及びポリアデニル化シグナルを、また３５Ｓ−Ｐはカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターを、Ｎｏｓ−Ｐはノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターを示し、Ｔ（図４）またはＮｏｓ−Ｔ（図５）は、ノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを示す。
【００３８】
本参考例では、図５より明らかなように、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子のうち、頂芽優勢の崩壊を引き起こして多芽体形成に寄与するｉｐｔ遺伝子を、また、目的遺伝子としてＮＰＴＩＩ遺伝子をモデル的に用いた。ｉｐｔ遺伝子は病原性Ａ．ツメファシエンスが保持する腫瘍化遺伝子の一員であり、この遺伝子を導入された植物細胞は、植物ホルモンの一種であるサイトカイニンの過剰発現により、分化の方向が多芽体形成に向かうことになる。
【００３９】
また本参考例では、ｉｐｔ遺伝子の発現調節配列として、プロモーター配列はカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを、ターミネーター配列はｉｐｔ遺伝子自身のポリアデニル化シグナルを用いた。
【００４０】
ＩＩ．アグロバクテリウムへのｐＩＰＴ４の導入
Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入）を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合は、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間の遠心で集菌し、次いでこの菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。
【００４１】
１５ｍｌチューブ（ファルコン社）内で、プラスミド導入用菌液２００μｌとＩで作成したプラスミドｐＩＰＴ４  ６μｇを混合し、これを、あらかじめ液体窒素中で３０〜４０分間冷却しておいたエタノールにチューブごと５分間浸して冷却した後、２９℃の水浴中に２５分間置き、次いで、７５０μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２９℃で１時間振盪して培養した。この菌液を、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．２ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種して２８℃で２日間培養し、得られた菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植してさらに培養した後、その菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用いて切断し、これをアガロースゲル電気泳動にて分析することにより、このＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株にプラスミドｐＩＰＴ４が導入されていることを確認した。
【００４２】
ＩＩＩ．アグロバクテリウムからタバコへのｐＩＰＴ４の導入
温室内で成育させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｘａｎｔｈｉ、特に記載する場合を除き、以下同じ。）の成葉を、１ｖ／ｖ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸漬して殺菌し、滅菌水で３回洗浄した後、中脈を取り除いて約８ｍｍ角の葉片となるよう調製した。このタバコ葉片を、ＩＩにおいてｐＩＰＴ４を導入したＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調製。）に約１分間浸してこれに感染させた後、滅菌した濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフリー）ＭＳ寒天培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５：４７３、１９６２、但し、寒天０．８ｗ／ｖ％を添加。）に、葉の裏が上になるように置床した。これを２５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組織・植物体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養後、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌのみを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、不定芽２２個が再分化し、この不定芽を分離してさらに同組成の培地で培養した結果、多芽体６系統が得られた。これらは１か月ごとに同培地に継代し、さらに３か月目からはカルベニシリンを含まないホルモンフリーＭＳ寒天培地で数回継代して、アグロバクテリウムの増殖がないことを確認した後、カナマイシン耐性試験およびＰＣＲ分析に供した。
【００４３】
ＩＶ．遺伝子導入を行ったタバコの解析
Ａ．カナマイシン耐性試験
ＩＩＩにおいて得られた６系統の多芽体を、継代せずにそのまま培養することにより、これから展開してきた葉を切り取り、これを約３ｍｍ角に調製して、カナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天培地（ＢＡ１ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．２ｍｇ／ｌ添加）に置床し、培養１か月後に観察を行った。その結果、同培地においてもこれら多芽体の系統より得た葉片からはすべて、多芽体形成が認められた。
【００４４】
Ｂ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた多芽体６系統のすべてより染色体ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて導入遺伝子の確認を行った。
【００４５】
染色体ＤＮＡの抽出は、以下の改良ＣＴＡＢ法を用いて行った。
まず、多芽体の葉、約１ｇを液体窒素下で乳鉢を用いて粉砕し、これをあらかじめ６０℃に保温しておいた、２ｗ／ｖ％  ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｖ／ｖ％  β−メルカプトエタノール、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）よりなる緩衡液５ｍｌに懸濁した。この懸濁液を６０℃で３０〜６０分間、緩やかに振盪させながら加温し、次いで室温まで冷却した後、これに等容のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加えて穏やかに混和した。続いて、１６００×ｇで５分間の遠心分離を行って上清を回収し、この上清に２／３容のイソプロピルアルコールを加え、再び穏やかに混和した後、氷上に１０分間静置して染色体ＤＮＡを析出させ、これを１６００×ｇで１０分間の遠心により沈殿させた。沈殿させた染色体ＤＮＡは、７０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄した後、真空乾燥し、３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。
【００４６】
一方、ｉｐｔ遺伝子をＰＣＲ法にて検出するため、ｉｐｔ遺伝子に結合した場合、２つのプライマー間の間隔が約８００ｂｐとなるように、用いるプライマー（オリゴヌクレオチド）をＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて合成した。ｉｐｔ遺伝子の増幅のために、抽出した染色体ＤＮＡ１μｇを、このプライマー０．２μＭを含む、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ社より購入）という組成を有する混合液５０μｌ中に溶解し、これを９４℃で１分３０秒間加温した後、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分の加温サイクルを３０回繰り返して反応させた。得られた反応混合物をアガロースゲル電気泳動を用いて分析し、染色体ＤＮＡ中のｉｐｔ遺伝子の存在を、これに由来する約８００ｂｐの遺伝子が増幅されたことにより確認した。
【００４７】
その結果を図６に示すが、図より明らかなように、この約８００ｂｐの遺伝子増幅は６系統の多芽体すべてにおいて認められた。なお図中、左に示した数値は、ＤＮＡサイズマーカーを泳動した際に検出される各バンド成分の塩基数を表す。
【００４８】
［参考比較例１］
参考例１のＩＩＩにおいて、Ａ．ツメファシエンス感染葉より再分化した不定芽から得られた、多芽体形成能のない芽、１６系統についても解析を行った。すなわち、同ＩＩＩで不定芽２２個を分離して培養した結果、多芽体６系統が選抜された時点で、多芽体ではなく正常な芽の形態（以下、正常体という）をしていたものについても、同ＩＩＩ、ＩＶで多芽体の系統にて行ったのと同様に、除菌し、カナマイシン耐性試験を行い、さらに、そのうちの９系統につきＰＣＲ分析を行った。しかし、これら正常体の系統では、カナマイシン添加培地に置床した葉片は約３か月程度ですべて褐変して枯死に至り、またＰＣＲ分析においても、ｉｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は、分析した９系統のいずれからも検出することができなかった。
ＰＣＲ分析の結果を図６に示す。
【００４９】
［参考例２］
Ｉ．ベクターの作成
プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）より購入）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その切断により生じた突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ（大サブユニット）にて平滑化した後、この末端を再び連結してプラスミドｐＮＰＩ１００を得た。すなわちこのｐＮＰＩ１００は、ｐＨＳＧ３９８のＢａｍＨＩ制限酵素部位を消失させたものである。また一方、プラスミドｐＣＫＲ９７（T.Izawa et al.、Mol.Gen.Genet.、227:391、1991）を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、トウモロコシのトランスポゾンＡｃを切り出して、これをｐＮＰＩ１００のＰｓｔＩ制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１０２を得た。
【００５０】
次に、参考例１で作成したプラスミドｐＩＰＴ４（図５）から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結されたｉｐｔ遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで切り出し、その突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩにて平滑化した後、これをプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位に挿入して、プラスミドｐＮＰＩ１０１を得た。このプラスミドｐＮＰＩ１０１から、再びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとｉｐｔ遺伝子を、今度は制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、その突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩにより平滑化した後、これを、制限酵素ＢａｍＨＩで切断して突出末端を同様に平滑化したプラスミドｐＮＰＩ１０２と連結させ、プラスミドｐＮＰＩ１０３を得た。すなわちこのプラスミドｐＮＰＩ１０３において、３５Ｓプロモーターに連結されたｉｐｔ遺伝子は、トランスポゾンＡｃ内部の旧ＢａｍＨＩ制限酵素部位に存在することとなる。
【００５１】
目的とするベクターは、このプラスミドｐＮＰＩ１０３から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター及びｉｐｔ遺伝子を含むトランスポゾンＡｃを、制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、これを植物への遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＢＩ１２１のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入することにより得られ、これをプラスミドｐＮＰＩ１０６とした。
【００５２】
なお、このプラスミドｐＮＰＩ１０６もまた、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ１０６）（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５０６４号）として、国際寄託に付した。
【００５３】
プラスミドｐＮＰＩ１０６の作成スキムを図７〜９に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図１０に示す。図７〜９及び図１０中、トランスポゾンＡｃの範囲は対向する黒三角形で示した。また図１０中、Ａｃ−ＰはＡｃに内在するプロモーターを示す。その他の記号は図２〜５と同様である。
【００５４】
図１０より明らかなように、このプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域、すなわち植物染色体に組み込まれることになる領域内に、マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子を、目的遺伝子のモデルとしてＮＰＴＩＩ遺伝子及びＧＵＳ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を有しており、かつ、ｉｐｔ遺伝子はトランスポゾンＡｃの内部に挿入された形で存在している。なおこのＧＵＳ遺伝子は、これを有する細胞が特殊な基質を代謝し、青色の色素を生産することから、これを検出して遺伝子の発現を知ることができるので、植物における遺伝子発現の解析に汎用されている遺伝子である。
【００５５】
ＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ１０６の導入及び遺伝子導入を行ったタバコの解析
Ａ．タバコへのｐＮＰＩ１０６の導入及び導入遺伝子の発現試験
参考例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に、ｐＮＰＩ１０６をＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入して、このＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させた後、感染葉を、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて培養し、次いでカルベニシリンのみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地で培養して、その培養２か月目に多芽体６３系統を分離した。
【００５６】
これらをさらに、同組成の培地（カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地）に移植して培養を続け、１か月後に、やや伸長した多芽体のシュート（以下、多芽体において発生する個々の芽のことを、シュートと呼ぶこととする。）の中から、他のシュートと比べて２倍程度以上の大きさに伸長し、かつ、側芽の発達も認められず、ｉｐｔ遺伝子の影響が弱まっていると思われるシュートを肉眼により９個選抜し、そのシュートについた葉を用いて、参考例１のＩＶ−Ａと同様のカナマイシン耐性試験、及びJeffersonらの方法に準拠したＧＵＳ遺伝子の発現試験（ＧＵＳ活性試験）を行った。また、葉を切り出した後のシュートについても、ホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植してさらに培養を続け、その１か月後の形態を観察し、そのシュートの多芽体形成能、すなわちｉｐｔ遺伝子の発現を検定した。
【００５７】
結果を表１に示す。
【表１】
0003584924.tif 000002
【００５８】
表１から明らかなように、Ｎｏ．８のシュートでは、これより得られた葉がカナマイシン耐性及びＧＵＳ活性を有しているにもかかわらず、これ自体を１か月培養しても多芽体を形成しない。これは、ここで用いたベクターｐＮＰＩ１０６において、多芽体の形成に寄与するｉｐｔ遺伝子はトランスポゾンＡｃの内部に挿入された形で存在しているため、このベクターを保持するＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させてその培養を始めた当初は、タバコ染色体中に導入され、発現していたｉｐｔ遺伝子が、その後の培養中に、このＡｃの働きにより、これと共に脱離してその機能を消失したためであると考えられる。一方、同じベクター上でも、ＮＰＴＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子は、Ａｃと挙動を一つにすることのない位置に挿入されているので、これらはＮｏ．８のシュートにおいてもなお、その染色体中に残留して発現しているのである。
【００５９】
また、表１中、Ｎｏ．３、５及び６のシュートでは、カナマイシン耐性、多芽体形成能が認められるにもかかわらず、ＧＵＳ活性のみが陰性を示している。すなわち、これらのシュートではｐＮＰＩ１０６を用いて導入した遺伝子のうち、ＧＵＳ遺伝子のみが発現していないことになるが、これは、これらの遺伝子が植物染色体に導入される時に起こった組込みミスによるものと考えられる。つまり、Ａ．ツメファシエンスを介して遺伝子導入を行った場合、ｐＮＰＩ１０６のような構造を有するプラスミドでは、本来、Ｔ−ＤＮＡ領域、すなわちＲＢサイトとＬＢサイトの内側領域全体が植物染色体に組み込まれるはずであるが、時としてこの組込みが完全には行われず、これがＬＢ末端側のある部分で千切れたような状態で組み込まれることがある。ここで用いたｐＮＰＩ１０６では、そのＴ−ＤＮＡ領域に挿入した遺伝子の中でＧＵＳ遺伝子が、最もＬＢサイトに近い位置に存在していることから、このような遺伝子導入時の組込みミスにより、これが千切れてその機能を失った状態で染色体に組み込まれたか、あるいは全く組み込まれなかったため、これらのシュートではＧＵＳ遺伝子の発現がなく、その活性も認められないものと考えられる。
ここで、Ｎｏ．２及びＮｏ．８のシュートの１か月培養後の形態を図１１、１２に示す。
【００６０】
なお、この時Ｎｏ．８のシュートから得られ、カナマイシン耐性試験に供した葉について、試験後も培養を続けたところ、５個の不定芽がこの葉から得られたが、これらはすべて正常体であった。
【００６１】
Ｂ．ＰＣＲ分析
表１におけるＮｏ．１〜９のシュートにつき、その多芽体形成能を観察した後、参考例１のＩＶ−Ｂと同様にしてＰＣＲ分析を行い、染色体中のｉｐｔ遺伝子の存在等についてさらに検討を加えた。ただしここでは、参考例１のＩＶ−Ｂで用いたプライマーに加えて、ＮＰＴＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子上に結合すべく設計されたプライマーも使用したが、これを用いてＰＣＲを行うと、ｐＮＰＩ１０６のＴ−ＤＮＡ領域から、Ａｃ、及びその内部に挿入されたｉｐｔ遺伝子の脱離が起こった場合、約３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されるため、この増幅を指標として、Ａｃ及びｉｐｔ遺伝子の染色体ＤＮＡからの脱離を検出できることとなる。
ここで行ったＰＣＲ分析のうち、Ｎｏ．８のシュートについての結果を図１３に示す。なお図中、左に示した数値については図６と同様である。
【００６２】
これより明らかなように、Ｎｏ．８のシュートより抽出した染色体ＤＮＡにおいては、ｉｐｔ遺伝子とＡｃの脱離を示す約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められる一方、ｉｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は認められない。これは、ｉｐｔ遺伝子がＡｃと共に、このシュートの染色体ＤＮＡから脱離・消失したことを意味するものである。
【００６３】
なお、これに対してＮｏ．１〜７、及び９のシュートでは、このとき、その染色体ＤＮＡ試料のいずれからも約３ｋｂのＤＮＡ増幅は検出されず、その一方で、約８００ｂｐの増幅はすべてにおいて検出された。従って、これらのシュートにおいてはｉｐｔ遺伝子がなお、Ａｃと共にその染色体ＤＮＡ中に存在しているものと考えられる。
【００６４】
［参考比較例２］
参考例２のＩＩ−ＡのＡ．ツメファシエンス感染葉の培養において、多芽体と共に分化してきた正常体のうち３個を分離し、これらについて参考例２のＩＩと同様に、カナマイシン耐性試験、ＧＵＳ活性試験、及び培養１か月後の形態観察、さらにＰＣＲ分析を行った。
【００６５】
結果を表１に示すが、これらはいずれもカナマイシン耐性、ＧＵＳ活性、及び多芽体形成能を有さず、さらにＰＣＲ分析においても、約８００ｂｐ及び約３ｋｂのＤＮＡ断片は、いずれもその増幅が検出されなかった。
【００６６】
［参考例３］
参考例２で分離した多芽体６３系統のそれぞれ一部を、さらにホルモンフリーＭＳ寒天培地に植え継いで培養を継続し、約２か月後に、２系統の多芽体から肉眼で識別できる正常な形態、すなわち頂芽優勢を示すシュート、Ｎｏ．１３−１〜３、１４−１〜４の計７個を得た。このシュートを分離して同組成の培地に移植すると正常な形態の伸長発根個体が得られ、そのうち、シュートＮｏ．１３−１及び１４−１より得られた個体について、参考例２のＩＩ−Ｂと同様にＰＣＲ分析を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅はどちらからも検出されず、その一方、約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅は両者で共に検出され、ｉｐｔ遺伝子がＡｃと共に、これらの個体の染色体ＤＮＡから脱離・消失していることが確認された。結果を図１４に示す。図中、左に示した数値については図６と同様である。またＧＵＳ遺伝子の発現は、７個のシュートより得られたすべての個体において検出された。
なお、ここで多芽体から正常なシュートが分化してきた状態を図１５に示す。
【００６７】
［参考例４］
参考例２で選抜した９個のシュートのうち、表１においてＮｏ．７としたシュートより得られた葉を、ホルモンフリーＭＳ寒天培地で約１か月培養し、そこから分化してきた６個の不定芽より、正常体１個を肉眼により選抜・分離した。これを同組成の培地に移植すると正常な形態の伸長発根個体が得られ、さらに、これについて参考例２のＩＩ−Ｂと同様にＰＣＲ分析を行ったところ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片の消失と約３ｋｂの同断片の増幅により、その染色体ＤＮＡからｉｐｔ遺伝子がＡｃと共に脱離・消失したことが確認された。結果を図１６に示す。図中、左に示した数値については図６と同様である。また同じ個体について、ＧＵＳ遺伝子の発現も確認された。
【００６８】
［実施例１］
Ｉ．酵母からの部位特異的組換え系（ｐＳＲ１系）の分離
酵母（Zygosaccharomyces rouxii、（財）発酵研究所より購入）を５ｍｌのＹＰＡＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、ポリペプトン２０ｇ／ｌ、アデニン０．４ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）に接種し、３０℃で一昼夜培養した。培養液を、６９００×ｇ、２０℃、３分間遠心して集菌（以下、菌体の回収はすべて同条件で行なった。）し、得られた菌体を２ｍｌの０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５ｖ／ｖ％  β−メルカプトエタノールに懸濁して、時折軽く撹拌しつつ２５℃で３０分間放置した後、回収した。この菌体に、ザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業（株）より購入）２．５ｍｇ／ｍｌを含む１０ｗ／ｖ％  ソルビトール−５ｗ／ｖ％  ＫＰＯ4（ｐＨ６．８）１ｍｌを加えて懸濁し、３０℃、９０分間放置し、再び遠心分離により集菌した後、これを１ｍｌの溶解液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、５ｗ／ｖ％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に懸濁し、さらにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え混合して、６０℃で１時間放置した。次いでこの混合液を室温に戻し、フェノール：クロロホルム、クロロホルム抽出により順次精製した後、得られた上清にイソプロパノールを等量加え、染色体ＤＮＡ及びプラスミドｐＳＲ１を析出させ、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心してこれを沈殿させた。沈殿させたＤＮＡは、７０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄した後、真空乾燥し、１００μｌのＴＥに溶解した。
【００６９】
このようにして抽出したＤＮＡ（染色体ＤＮＡ及びプラスミドｐＳＲ１の両方を含む）より、ＰＣＲ法を用い、プラスミドｐＳＲ１に存在している部位特異的組換え系（これをｐＳＲ１系という。）のみを増幅した。ｐＳＲ１系は、組換え酵素遺伝子であるＲ遺伝子と、組換え配列Ｒｓとから構成され、その塩基配列もすでに明らかとなっている（Ｈ．Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８２：１９１、１９８５）。本発明においては、Ｒ遺伝子の増幅のため、プラスミドｐＳＲ１の配列中、５５９６〜５６１７番目に当たる２２塩基の５′位に、ＸｂａＩ制限酵素部位を付加したプライマー（５′−ＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＴＧ−３′）と、４１２６〜４１４７番目に当たる２２塩基の５′位に、ＳａｃＩ制限酵素部位を付加したプライマー（５′−ＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡ−３′）を合成して使用し、一方、Ｒｓの増幅には、２セット各３０塩基（計４種類）のプライマーを合成・使用した。すなわち１セットは、プラスミドｐＳＲ１の塩基配列中、２８７〜３１６番目に当たる配列のうち３塩基を置換して、ＳｓｅＩ制限酵素部位を導入した塩基配列を有するプライマー（５′−ＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣＡ−３′）と、６９０〜７１９番目に当たる配列のうち４塩基を置換して、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とＸｈｏＩ制限酵素部位を導入したものであるプライマー（５′−ＣＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴＡＧＴＣ−３′）とからなり（このプライマーセットで増幅されるＲｓをＲｓ１と呼ぶ。）、もう１セットは、同じくプラスミドｐＳＲ１の塩基配列中、２８７〜３１６番目に当たる配列のうち３塩基を置換して、ＸｈｏＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＩ制限酵素部位を導入した塩基配列を有するプライマー（５′−ＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡ−３′）と、６８８〜７１７番目に当たる配列のうち５塩基を置換して、ＳｓｅＩ制限酵素部位を導入したものであるプライマー（５′−ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＡ−３′）とからなっている（このプライマーセットで増幅されるＲｓをＲｓ２と呼ぶ。）。
【００７０】
Ｒ遺伝子とＲｓの増幅のため、ＴＥ溶液とした抽出ＤＮＡ１００μｌの内１μｌを、それぞれのプライマーセット０．２μＭを含む、参考例１のＩＶ−Ｂで使用した混合液各５０μｌ中に混合し、これらを、９５℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分３０秒の加温サイクル３０回で反応させた。得られた反応混合物をアガロースゲル電気泳動を用いて分析し、Ｒ遺伝子とＲｓの増幅を確認した。
【００７１】
ＩＩ．ベクターの作成
ＰＣＲ法により増幅したＲｓ１を、制限酵素ｐｓｔＩ及びＸｈｏＩで切断し、これをｐＳＬ１１８０（ファルマシア  バイオテク（株）より購入）のＰｓｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１２６を得た。
【００７２】
次に、ｐＨＳＧ３９８のＥｃｏＲＩ制限酵素部位、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を消失させるため、これらの制限酵素による切断、Ｔ４ポリメラーゼＩ（大サブユニット）による切断末端の平滑化、さらにその平滑末端の再連結を順次繰り返し、これらの制限酵素部位が消失したプラスミドｐＮＰＩ１２１を得、そのＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位に、ＰＣＲ法により増幅したＲｓ２を制限酵素ＸｈｏＩ及びＰｓｔＩで切断して挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１２７を作成した。
【００７３】
そしてこのｐＮＰＩ１２７のＳｍａＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位に、ｐＮＰＩ１２６から制限酵素ＳｍａＩ及びＳｐｅＩで切り出されたＲｓ１を挿入して、プラスミドｐＮＰＩ１２８を得た。
【００７４】
Ｒ遺伝子は、ＰＣＲ法により増幅したその断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断して、ｐＨＳＧ３９８のＸｂａＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位に挿入した。これにより得られたプラスミドをｐＮＰＩ１２４とした。
【００７５】
次に、ｐＢＩ２２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入）を制限酵素ｐｓｔＩで切断し、常法によりその切断末端を平滑化・連結して、そのＳｓｅＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位の消失したプラスミドｐＮＰＩ１１１を得た。続いて、このｐＮＰＩ１１１のＸｂａＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位に、そのＧＵＳ遺伝子と置換する形で、ｐＮＰＩ１２４より制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで切り出されたＲ遺伝子を挿入して、プラスミドｐＮＰＩ１２５を作成し、さらに、これから、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結されたＲ遺伝子、及びノパリンシンターゼのポリアデニル化シグナルを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切り出して、これをｐＮＰＩ１２８のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入することにより、プラスミドｐＮＰＩ１２９を得た。
【００７６】
また、ｐＮＰＩ１０１は制限酵素ＳｍａＩで切断し、その切断部位に５′リン酸化ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（宝酒造（株）より購入）を挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１２２とした。すなわちこのｐＮＰＩ１２２は、ｐＮＰＩ１０１のＳｍａＩ制限酵素部位をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に置換したものである。さらに、このｐＮＰＩ１２２を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、常法によりその切断末端を平滑化・連結して、そのＳｓｅＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位が消失した、プラスミドｐＮＰＩ１２３を作成し、次いでこれから、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結されたｉｐｔ遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切り出して、ｐＮＰＩ１２９のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ１３０を得た。
【００７７】
目的とするベクターは、このｐＮＰＩ１３０から、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターにそれぞれ連結されたｉｐｔ遺伝子とＲ遺伝子、及びこれらの両端にあるＲｓを、制限酵素ＰｓｔＩで切り出して、ｐＢＩ１２１のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入することにより得られ、これをプラスミドｐＮＰＩ１３２と命名した。
【００７８】
なお、このプラスミドｐＮＰＩ１３２もまた、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ１３２）（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５０６５号）として、国際寄託に付した。
【００７９】
ｐＮＰＩ１３２の作成スキムを図１７〜１９に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図２０に示す。図１７〜１９、及び２０中、網かけした三角形は酵母のプラスミドｐＳＲ１に由来する組換え配列Ｒｓと、その配列方向を表す。その他は図２〜５と同様である。
【００８０】
図２０より明らかなように、このプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ領域にマーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子を、目的遺伝子のモデルとしてＮＰＴＩＩ遺伝子及びＧＵＳ遺伝子を有している点では、ｐＮＰＩ１０６と同様である。しかしこの場合、脱離能を有するＤＮＡ因子として機能するのは、酵母の部位特異的組換え系であるｐＳＲ１系の組換え配列、Ｒｓ間の領域であり、従って、ｉｐｔ遺伝子は、同一方向を向いたこの二つの組換え配列Ｒｓに挟まれた形で挿入されている。
【００８１】
ＩＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ１３２の導入及び遺伝子導入を行ったタバコの解析
参考例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に、ｐＮＰＩ１３２をＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入して、このＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片（ここでは、Nicotiana tabacum cv.  SR1を材料として用いた。）に感染させた後、感染葉を、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて培養し、次いでカルベニシリンのみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地で培養した。これを１か月後に同組成の培地に植え継いでさらに１か月培養を続け、多芽体４８系統を分離した。
【００８２】
これらを再び同組成の培地に移植してなお培養を続けたところ、約１か月後（すなわちＡ．ツメファシエンス感染後、約３か月）に、その４８系統のうち７系統から、肉眼で見て正常な形態を示すシュートが生じ、これを分離してやはり同組成の培地に移植すると、結局１０株の正常個体を得ることができた。
【００８３】
これらについて、参考例２のＩＩ−Ｂと同様にＰＣＲ分析を行った結果を図２１〜２３、及び表２に示す。但しここでは、参考例２のＩＩ−Ｂで用いたプライマーの他に、ＧＵＳ遺伝子の存在を確認できるプライマーも併せて使用した。これらを用いてＰＣＲ分析を行うことにより、ｉｐｔ遺伝子が存在する場合には約８００ｂｐ、ｉｐｔ遺伝子がｐＮＰＩ１３２のＴ−ＤＮＡ領域から、Ｒｓに挟まれた部分もろとも脱離した場合には約３ｋｂ（ここまでは、参考例２のＩＩ−Ｂで分析を行った場合と同様である。）、そしてＧＵＳ遺伝子が存在している場合には約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されることとなる。なお図２１〜２３中、左に示した数値については図６と同様である。
【００８４】
【表２】
0003584924.tif 000003
【００８５】
表２より明らかなように、ここで、肉眼によりその形態を観察することのみで選抜された個体の染色体からはいずれも、マーカー遺伝子であるｉｐｔ遺伝子の存在は検出されず、かわってその脱離を示すＤＮＡ断片の増幅が検出された。一方、目的遺伝子として用いたＧＵＳ遺伝子の存在は、すべての個体において検出された。
【００８６】
一方、ここで多芽体４８系統とほぼ同時に生じた正常体（正常な芽の形態をしたもの）から得られ、正常な伸長・発根を示した個体についても、その頂芽を用いてカナマイシン耐性を検定したところ（カナマイシン２００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地使用）、その１６個体のうち２個体がカナマイシン耐性を有することが判明した。
【００８７】
そこで、このカナマイシン耐性個体についてさらに検討を加えるため、他のカナマイシン非耐性１４個体のうちの３個体と共に、多芽体より得られたものの場合と同様にしてＰＣＲ分析を行った。この結果を図２４に示す。図中の左に示した数値については、図６と同様である。
【００８８】
図２４より明らかなように、カナマイシン耐性を示す２個体では、それぞれ、ｉｐｔ遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の脱離、及びＧＵＳ遺伝子の存在を示すＤＮＡ断片の増幅が検出され、これらの染色体には、ｐＮＰＩ１３２に由来すると考えられる遺伝子が組込まれていることを確認した。なお、カナマイシン非耐性の３個体ではかかる増幅は全く検出されず、また、ｉｐｔ遺伝子の存在を示すＤＮＡ断片の増幅は、いずれの個体からも検出されなかった。
【００８９】
本来、多芽体形成能のない系統より得られたこれらの個体は、そもそもＡ．ツメファシエンス感染時に、ｐＮＰＩ１３２が染色体中に導入されなかった細胞を起源とするはずであるが、そう仮定する以上、このベクターに由来する遺伝子がその染色体に存在することは考えられない。ましてや、その染色体中に、これに由来する遺伝子のうち、ｉｐｔ遺伝子のみが存在せず、ＮＰＴＩＩ遺伝子（これらの個体がカナマイシン耐性を示すことより、その存在は明らかである。）、ＧＵＳ遺伝子は完全な形で存在する個体が、かかる頻度で出現することはまず有り得ないことである。
【００９０】
従って、これらの個体では、ｐＮＰＩ１３２が染色体に導入されなかったのではなく、一旦は導入されたと考えるのが妥当である。つまり、ｐＮＰＩ１３２のＴ−ＤＮＡ領域は、Ａ．ツメファシエンスの感染によってこれらの染色体に導入されたが、ここでマーカー遺伝子の脱離に利用したｐＳＲ１系の性能が良すぎたため、そのＡ．ツメファシエンスの感染後、多芽体を形成する前に、その働きによってｉｐｔ遺伝子が染色体から脱離し、結局、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子だけが、そのままそこに残留し続けることになったのであろう。ＰＣＲ分析により、かかるカナマイシン耐性個体において、ＧＵＳ遺伝子の存在と同時に認められたｉｐｔ遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の脱離も、これを裏付けるものである。
【００９１】
［実施例２］
Ｉ．ベクターの作成
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（東洋紡績（株）製）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入された、ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ、及びｒｏｌＣを含む、全長７．６ｋｂのｒｏｌ遺伝子群（S.Kiyokawa、Plant Physiol.、104:801、1994）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、これをｐＮＰＩ１２９のＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入して、プラスミドｐＮＰＩ７００を作成した。
【００９２】
次いでこのｐＮＰＩ７００から、ｒｏｌ遺伝子群、及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとそれに連結されたＲ遺伝子、及びこれらの両端にあるＲｓを、制限酵素ＳｓｅＩで切り出し、これをｐＢＩ１２１のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入して、目的とするプラスミドｐＮＰＩ７０２を得た。
【００９３】
なお、このプラスミドｐＮＰＩ７０２もまた、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｐＮＰＩ７０２）（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５０６６号）として、国際寄託に付した。
【００９４】
ｐＮＰＩ７０２の作成スキムを図２５に、また、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図２６に示す。なおこれらの図中、用いた記号は図２〜５と同様である。
【００９５】
図２６より明らかなように、このプラスミドはマーカー遺伝子をｐＮＰＩ１３２のｉｐｔ遺伝子から、ｒｏｌ遺伝子群に置き換えたものである。なお、本実施例で用いたｒｏｌ遺伝子群は、天然にはＡ．リゾジェネスのＴ−ＤＮＡ上に存在し、これが植物細胞に導入されると、その植物組織に毛状根を発生させ、またこれから再生した植物体においても矮化等の形態異常を引き起こすことが知られている。
【００９６】
ＩＩ．タバコへのｐＮＰＩ７０２の導入及び遺伝子導入を行ったタバコの解析
参考例１のＩＩ、ＩＩＩ と同様に、ｐＮＰＩ７０２をＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入して、このＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染させ、感染葉をアセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地にて３日間暗所で培養した。次いでチカルシリンのみ４００ｍｇ／ｌを添加した同培地で培養したところ、毛状根の分化が培養開始後１５日過ぎ頃より認められたので、この毛状根を順次分離し、シュート誘導培地（α−ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン２．０ｍｇ／ｌ、チカルシリン４００ｍｇ／ｌ添加ＭＳ寒天培地）に置床・培養して不定芽を分化させ、そのうち正常な形態をしていると思われるもの１８個体を肉眼で選抜した。これらについて参考例２のＩＩ−Ｂと同様にＰＣＲ分析を行い、そのうちの９個体について、その染色体から、ｒｏｌ遺伝子を含むＲｓで挟まれた領域が脱離していることを確認した。なお、ここではプライマーとして、かかる脱離が検出されるプライマー（実施例１、参考例２〜４及び参考比較例２で用いたものと同じ。すなわち、約３ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検出。）と、ｒｏｌ遺伝子の存在を検出するためのプライマー（約１．１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検出）を用いた。
【００９７】
［参考例５］
参考例２で作成したベクター、ｐＮＰＩ１０６を用いて、木本植物である交雑ヤマナラシ（ポプルス・シーボルディ×ポプルス・グランディデンタータ：Populus Sieboldii×Populus grandidentata）への遺伝子導入を行った。
【００９８】
交雑ヤマナラシＹ６３株（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌フラスコ苗の茎を、節を含まないように長さ５ｍｍに切断し、これをさらに縦に二つ割りにして材料として用い、ｐＮＰＩ１０６を導入したＡ．ツメファシエンスを参考例１のＩＩＩと同様にして感染させた。感染後、この茎切片を、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加したホルモンフリー修正ＭＳ寒天培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、寒天０．８ｗ／ｖ％）に置床して３日間培養し、次いでカルベニシリンのみ５００ｍｇ／ｌを添加した同培地に移植して培養を続けた。なお、ここで用いた修正ＭＳ培地とは、通常のＭＳ培地の組成のうち、アンモニア態窒素、及び硝酸態窒素の濃度を、それぞれ１０ｍＭ、３０ｍＭに変更したものである。
【００９９】
約２か月後、この切片から生じた不定芽を分離し、さらに２か月間培養を行うことにより多芽体６系統が得られたが、これらについて引き続き継代培養を行ったところ、約４か月経過後（Ａ．ツメファシエンス感染より約８か月後）から、この多芽体より伸長する、正常な形態のシュートが認められ始めた。これらのシュートは、ＩＢＡ０．０５ｍｇ／ｌを添加した２／３倍稀釈ＭＳジェランガム培地（シュークロース２ｗ／ｖ％、ジェランガム０．３ｗ／ｖ％）に移植して培養することにより、正常な発根個体となすことができ、結局、Ａ．ツメファシエンス感染１０か月目までには、２系統の多芽体より、合わせて７個の正常個体を得ることができた。
【０１００】
これらについて、実施例１のＩＩＩと同様にＰＣＲ分析を行ったところ、ｉｐｔ遺伝子はその全ての個体において検出されず、またＧＵＳ遺伝子に関しては、このうち２個体においてその存在が検出され、本発明のベクターが、木本植物においても有効に機能することが確認された。なお、残りの５個の正常個体については、ＧＵＳ遺伝子はその一部分の存在のみしか検出されなかったが、かかる個体は、ここで用いたベクター、ｐＮＰＩ１０６により導入されたトランスポゾンＡｃが、ｉｐｔ遺伝子と共にその染色体より脱離する際に、その近辺にあったＧＵＳ遺伝子をも巻き込み、これを引き千切るようにして脱離してしまった結果、生じたものであると考えられる。
ここで、多芽体から正常なシュートが分化してきた状態を図２７に示す。
【０１０１】
［実施例３］
実施例１において、ｐＮＰＩ１３２により遺伝子を導入された正常個体（多芽体を経由したもの）に対し、さらに本発明のベクターを用いて遺伝子導入を行った。
【０１０２】
ｐＮＰＩ１３２のＧＵＳ遺伝子のみをＨＰＴ遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）に置き換え、これ（ｐＮＰＩ１４０、図２８）を用いて上記正常個体に対し、参考例１のＩＩ、ＩＩＩと同様に遺伝子導入操作を行った。多芽体は、このベクターを導入したＡ．ツメファシエンスの感染から４０日後に１０系統を得ることができ、これを分離し、同組成の培地（カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ添加ホルモンフリーＭＳ寒天培地）に移植してなお培養を続けたところ、２０日後（すなわち、Ａ．ツメファシエンスの感染から約２か月後）には、そのうち１系統で、肉眼で見て正常な形態を示すシュートの分化が認められた。
【０１０３】
この分化してきた正常なシュートのうちの１個について、参考例１のＩＶ−Ｂと同様にＰＣＲ分析を行った結果を図２９に示す。但しここでは、参考例１のＩＶ−Ｂで用いたプライマーの他に、ｉｐｔ遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の染色体ＤＮＡからの脱離を検出するため、ＮＰＴＩＩ遺伝子とＨＰＴ遺伝子上に結合すべく設計されたプライマー、及びＨＰＴ遺伝子の存在を検出するためのプライマーを併せて使用した（それぞれ、約４ｋｂ及び約１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅により検出。）。なお図中、左に示した数値については図６と同様である。
【０１０４】
図２９より明らかなように、このシュートから抽出した染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析においては、Ｒｓに挟まれた領域と共にｉｐｔ遺伝子が脱離したことを示す約４ｋｂのＤＮＡ断片、及びＨＰＴ遺伝子の存在を示す約１ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められる一方、ｉｐｔ遺伝子の存在を示す約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は認められない。これは、このシュートの染色体ＤＮＡ中に、一旦は導入されたｉｐｔ遺伝子が、その後、Ｒｓに挟まれた領域と共にそこから脱離・消失した一方、ＨＰＴ遺伝子はそのＤＮＡ中に残留していること、つまり、先にｐＮＰ１１３２により目的遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子及びＧＵＳ遺伝子）を導入された個体に対し、その構成のうち目的遺伝子に関する構成のみを変えたベクターにより、ｉｐｔ遺伝子という同じ遺伝子をマーカーとして、新たな目的遺伝子（ＨＰＴ遺伝子）が重ねて導入されたこと、さらには再び同じマーカー遺伝子を用いて、第３、第４、あるいはそれ以上の目的遺伝子の導入が可能であることを示すものである。
【０１０５】
以上の実施例及び参考例より明らかなように、ここで得られた多芽体の系統は、必ずｉｐｔ遺伝子をその染色体中に有し（図６）、また、この多芽体という、肉眼で識別可能な顕著な形態異常を示す組織はすべて、ｉｐｔ遺伝子と共に導入したモデル的な目的遺伝子である、ＮＰＴＩＩ遺伝子の発現によるカナマイシン耐性を例外なく示した。これは、かかる形態異常誘導遺伝子が、植物へ遺伝子導入を行う際のマーカー遺伝子として十分に適用可能であり、これをマーカー遺伝子とする本発明のベクターもまた、植物への遺伝子導入用ベクターとして有用であることを証明するものである。
【０１０６】
また、このｉｐｔ遺伝子をトランスポゾンＡｃの内部に組み込んだベクター、ｐＮＰＩ１０６を用いて植物への遺伝子導入を行うと、遺伝子導入操作を行った直後の培養当初には多芽体を形成した組織から、目的遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子及び／またはＧＵＳ遺伝子）により付与される特性は保持したまま、ｉｐｔ遺伝子が染色体から消失して多芽体形成能を失ったシュート等が得られ（表１、図１３、１４、１６）、しかも、かかるシュート等の形態は肉眼で識別可能であり（図１５、２７）、これらを選抜・分離して培養することにより、正常な形態をした伸長発根個体が得られた。また、このシュートより得られた組織からさらに再分化した組織も、すべて多芽体形成能はなく正常な形態を示し、このようなシュート等が均一な細胞からなることを明示した。
【０１０７】
さらに同様の結果は、脱離能を有するＤＮＡ因子として部位特異的組換え系に由来するものを用いた場合、形態異常誘導遺伝子としてｒｏｌ遺伝子を用いた場合にも観察された。すなわち、かかるベクターを用いて植物への遺伝子導入を行った場合（実施例１、２）でも、遺伝子導入操作後ある時期までは異常な形態を形成した組織から、目的遺伝子は保持したまま、形態異常誘導遺伝子がその染色体から消失し、正常な形態を示す組織、そして個体が得られ（図２１〜２３、表２）、しかもこの同じ個体に対し、目的遺伝子に関する構成のみを変えたベクターにより、同じ形態異常誘導遺伝子をマーカーとして、遺伝子導入操作・培養・肉眼による選抜を繰り返すことにより、目的遺伝子を多重に導入することも可能であった（実施例３、図２９）。
【０１０８】
従って、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子、脱離能を有するＤＮＡ因子として部位特異的組換え系に由来するＤＮＡ因子を用い、この形態異常誘導遺伝子が脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に組込んだ、かかるベクターを用いれば、まず、遺伝子導入操作後の細胞を培養して生じてくる異常な形態を示す組織を肉眼で選抜し、これを分離してさらに培養を続け、次いで生じてくる今度は正常な形態を示す組織をやはり肉眼で選抜するだけで、目的遺伝子のみが染色体等に残留してその機能を保持している細胞のみからなる組織、さらには植物体が得られることとなる。
【０１０９】
しかも脱離能を有するＤＮＡ因子として、部位特異的組換え系を用いると、かなり高い確率で形態異常組織から正常個体が得られる。加えて、その脱離も速やかに起こるため、正常な形態をした組織もまた、より速やかに効率よく検出可能となるのである。
【０１１０】
脱離能を有するＤＮＡ因子として、トランスポゾンを用いた場合、及び部位特異的組換え系に由来するものを用いた場合に、生じた形態異常組織から目的遺伝子を保持した正常個体が得られる効率を、表３に比較して示す。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
なお、実施例１及び参考例１〜４においてはいずれの場合にも、植物ホルモン無添加の条件で、遺伝子導入細胞を含む組織は増殖し、不定芽を分化し、さらには植物体を再生したが、これは、マーカー遺伝子として遺伝子導入細胞の染色体に組込まれた、ｉｐｔ遺伝子の働きによるものと考えられる。つまり、これらの遺伝子の発現により、その連結されたプロモーターの働きによる多少はあるものの、植物ホルモンがその細胞内で過剰に生産されるため、その細胞自体が多芽体等の組織を分化するだけではなく、これが隣接する組織にもその産生する植物ホルモンがある程度作用し、結局、培地中に植物ホルモンを人為的に添加したのと同様な状態になったのである。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明で使用するベクターは、マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を使用したものである。このため、これを用いて植物への遺伝子導入を行った場合、目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、遺伝子導入操作後の細胞を通常の培地を用い、通常の培養条件で培養して、生じてくる異常な形態をした組織を肉眼により識別するだけでよく、選抜のため化学物質等を培地中へ添加する必要がないため、作業が簡略化され、またその選抜中に植物細胞の活性低下を招くおそれもない。
【０１１４】
また、この形態異常誘導遺伝子としてｉｐｔ遺伝子を用いた場合には、その働きにより、遺伝子導入細胞を含む組織は増殖し、不定芽等を分化するので、通常は植物細胞の培養において、その増殖・分化のために必須とされる、培地中への植物ホルモン添加も不要とすることができる。
【０１１５】
加えて、このベクターは、形態異常誘導遺伝子を、部位特異的組換え系に由来する脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に組み込んで使用する。すると、このマーカー遺伝子は、植物細胞への遺伝子導入後に一定の確率で、かかるＤＮＡ因子と共に、これが存在し機能するＤＮＡ上から脱離してその機能を失い、同時に導入されたこれとは挙動を一つにしない位置に存在する目的遺伝子のみが、同じＤＮＡ上に発現可能な状態で残留することとなる。このため、このような構成をとった場合、このベクターは、導入しようとする目的遺伝子に関する部分を変更するのみで、マーカー遺伝子を始めとする他の構成に何らの変更をも加えることなく、ある一つの植物体へ遺伝子の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して用いることができる。
【０１１６】
しかもこの場合も、マーカー遺伝子である形態異常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と同様に、遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出できるので、目的遺伝子のみが染色体等に残留してその機能を保持している細胞だけからなる組織を、確実・容易に選抜できることとなる。従って、遺伝子の多重導入も効率良く行え、また、かかる細胞だけからなる遺伝子導入個体、すなわちマーカー遺伝子の影響が排除され、その遺伝子産物がもたらす危惧から完全に解放された個体も、交配過程を経ることなく得ることができる。
【０１１７】
つまり、マーカー遺伝子の影響が排除され、その遺伝子産物がもたらす危惧から完全に解放され、かつ、遺伝子導入に用いたベクターに由来する構成以外の部分が、遺伝子導入の対象となった親植物と同一の遺伝子構成を有する個体が作成されるのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔｉプラスミドの一般的構造、及びＡ．ツメファシエンスＰＯ２２株Ｔ−ＤＮＡ領域のＰｓｔＩ断片制限酵素地図を含む概念図である。
【図２】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２の作成までを示す図である。
【図３】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２からｐＩＰＴ３の作成までを示す図である。
【図４】ｐＩＰＴ４作成スキムのうち、ｐＩＰＴ３からｐＩＰＴ４の作成までを示す図である。
【図５】ｐＩＰＴ４の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。
【図６】ｐＩＰＴ４を用いて遺伝子導入を行ったタバコより生じた、多芽体のＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図７】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１０２の作成までを示す図である。
【図８】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＩＰＴ４及びｐＮＰＩ１０２からｐＮＰＩ１０３の作成までを示す図である。
【図９】ｐＮＰＩ１０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１０３からｐＮＰＩ１０６の作成までを示す図である。
【図１０】ｐＮＰＩ１０６の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。
【図１１】生物の形態を示す写真であり、参考例２におけるＮｏ．２のシュートの１か月培養後の状態を示している。
【図１２】生物の形態を示す写真であり、参考例２におけるＮｏ．８のシュートの１か月培養後の状態を示している。
【図１３】参考例２におけるＮｏ．８のシュートのＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図１４】参考例３におけるＮｏ．１３−１、１４−１のシュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図である
【図１５】生物の形態を示す写真であり、参考例３においてタバコの多芽体から正常なシュートが分化してきた状態を示している。
【図１６】参考例４において、参考例２におけるＮｏ．７のシュートより生じた葉から得られた、正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図１７】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１２８の作成までを示す図である。
【図１８】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１２８からｐＮＰＩ１２９の作成までを示す図である。
【図１９】ｐＮＰＩ１３２作成スキムのうち、ｐＮＰＩ１０１及びｐＮＰＩ１２９からｐＮＰＩ１３２の作成までを示す図である。
【図２０】ｐＮＰＩ１３２の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。
【図２１】実施例１において、系統Ｎｏ．１５〜２１のシュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図のうち、ｉｐｔ遺伝子の存在が検出されるプライマーを使用して行った結果を示すものである。
【図２２】実施例１において、系統Ｎｏ．１５〜２１のシュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図のうち、ｉｐｔ遺伝子を含むＲｓに挟まれた領域の脱離が検出されるプライマーを使用して行った結果を示すものである。
【図２３】実施例１において、系統Ｎｏ．１５〜２１のシュートより得られた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図のうち、ＧＵＳ遺伝子の存在が検出されるプライマーを使用して行った結果を示すものである。
【図２４】実施例１において、多芽体形成能のない系統より生じた正常個体のＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図２５】ｐＮＰＩ７０２の作成スキムを示す図である。
【図２６】ｐＮＰＩ７０２の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。
【図２７】生物の形態を示す写真であり、参考例５において交雑ヤマナラシの多芽体から正常なシュートが分化してきた状態を示している。
【図２８】ｐＮＰＩ１４０の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。
【図２９】実施例３において、遺伝子の多重導入後、多芽体より分化してきた正常なシュートのＰＣＲ分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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