(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の胚発生特異的に発現する、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載の胚発生特異的プロモータ活性を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１または３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項１もしくは３に記載のＤＮＡ、または請求項４に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換植物細胞を有する形質転換植物体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項９】
請求項６または７に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１もしくは３に記載のＤＮＡ、または請求項４に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１０】
被験化合物について、請求項３に記載のＤＮＡの胚発生特異的プロモータ活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項３に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が請求項３に記載のＤＮＡの胚発生特異的プロモータ活性を調節すると判定される方法。
【請求項１１】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項３に記載のＤＮＡの胚発生特異的プロモータ活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１０に記載の評価方法により、被験化合物について、請求項３に記載のＤＮＡの胚発生特異的プロモータ活性を調節するか否かを評価する工程。
（ｂ）被験化合物から、請求項３に記載のＤＮＡの胚発生特異的プロモータ活性を調節すると評価された化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の胚特異的遺伝子および該遺伝子のプロモータ、並びにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の種子は穀物や食品原料として利用されていることは言うまでもないが、それ自身が種苗産業における主たる商品として生産・販売されており、その品質や特性を制御し改良することの重要性は論を待たない。今後、ゲノム研究に代表される分子生物学研究の成果に基づき、種子形質の分子育種の重要性はますます大きくなるものと考えられる。遺伝子組換えによる種子形質の人為的改変によって農業生産技術の高度化をはかる上で、導入遺伝子を効率的かつ種子組織特異的に発現させる技術は重要である。
【０００３】
これまで胚および胚乳等の種子組織の形成に伴って特異的に発現する遺伝子が単離されるとともにその発現制御を司るプロモータについても数多くの報告があり、その作用機作を詳細に解析した例も多い。しかしながら、それらは種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に代表される種子発育の比較的後期に発現が誘導される遺伝子に関するものである。胚発生の極初期から種子胚特異的に任意の遺伝子発現を誘導できるプロモータは分子育種の観点から利用価値の高い素材であるが、発生極初期の胚組織は極めて小さくかつ花器官の内部に埋没しており母体側の栄養組織と分離することが困難であることから、これまで解析が進んでいなかった。
【０００４】
また、近年、胚発生過程、特に受精卵から球状胚を経て心臓型胚に至り頂端分裂組織が形成されるまでの胚発生の初期段階においては、葉や根等の栄養器官における遺伝子発現制御機構とは異なるメカニズムが存在することが明らかになりつつある。例えば、硝酸イオンによって一意的に誘導されると考えられていた硝酸還元酵素の発現が胚発生過程においては硝酸イオンの有無に関わらず発生ステージ特異的に活性化されることが明らかになっている（Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ，  Ｏｇａｗａ  Ｔ，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｈ，  Ｙａｎｏ  Ｈ，  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ  （１９９６）  Ｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１１：３９−４７）。また、植物の遺伝子操作の多くの場面で広く利用され、植物の全ての組織で構成的発現を誘導すると考えられてきたカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータが、胚発生の極初期では全く活性をもたないことが報告されている（Ｃｕｓｔｅｒｓ  ＪＢＭ  Ｓｎｅｐｖａｎｇｅｒｓ  ＳＣＨＪ．  Ｊａｎｓｅｎ  Ｈ  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  ｖａｎ  Ｌｏｏｋｅｒｅｎ  Ｃａｍｐａｇｎｅ  Ｍ  Ｍ．  （１９９９）  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ．  ２０８：  ２５７−２６４．）。このように、従来の遺伝子発現制御技術では、胚発生初期に胚組織特異的に任意の導入遺伝子の発現制御を行うことは困難である。これを可能とする技術は、単細胞不定胚誘導系を利用した遺伝子操作技術およびアポミクシスの人為的誘導技術の開発等、高等植物の生殖メカニズムを利用して品種育成および種苗生産技術の効率化・高度化を図る上で極めて有用であると考えられる。しかし、そのような目的に利用可能なプロモータに関する報告は皆無であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物において、胚特異的かつ胚発生の極初期段階から発現する遺伝子、並びに、該遺伝子のプロモータであって、胚特異的かつ胚発生の極初期段階から任意の遺伝子を誘導可能なプロモータを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、ナタネの未熟花粉培養法（Ｋｅｌｌｅｒ  ＷＡ，  Ｆａｎ  Ｚ，  Ｐｅｃｈａｎ  Ｐ，  Ｌｏｎｇ  Ｎ，  Ｇｒａｉｎｇｅｒ  Ｊ  （１９８７）  Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  ７ｔｈ  Ｉｎｔｌ．  Ｒａｐｅｓｅｅｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ．  Ｐｏｚｎａｎ，  Ｐｏｌａｎｄ，  ｐｐ  １５２−１５７．；  Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ，  Ｏｇａｗａ  Ｔ，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｈ，  Ｙａｎｏ  Ｈ，  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ  （１９９６）  Ｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１１：３９−４７）を用い、小胞子胚発生を誘導した細胞と通常の花粉形成を継続する細胞との間で遺伝子発現を網羅的に解析した。具体的には、ディファレンシャルディスプレー法（Ｉｔｏ，  Ｔ，  Ｓａｋａｋｉ，  Ｙ．  （１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８，  ２２９−２４５，  １９９６．）を用いて、高温処理による胚発生誘導に伴って強く発現が誘導される遺伝子を検出し、そのクローニングを行った。クローニングした遺伝子の発現の時期・器官特異性を、ノーザンブロッティング法およびＲＴ−ＰＣＲ法によって解析したところ、該遺伝子は胚発生の極初期から胚組織特異的に発現が強く誘導され、単離直後の花粉、葉、カルス等においては検出限界以下であることが明らかとなった。次に、この遺伝子の発現制御部位と考えられる上流領域を、ナタネゲノムＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲ法によってクローニングした。クローニングしたＤＮＡ断片がプロモータ活性を有するか否かは、レポーター遺伝子を用いた遺伝子組換え植物作製実験によって検討した。その結果、該ＤＮＡ断片はナタネ花粉胚発生およびアラビドプシス（シロイヌナズナ）接合子胚発生のどちらの過程においても、胚発生極初期から胚組織特異的に外来遺伝子の発現を強く誘導する性質を持つことが明らかとなった。
【０００７】
また、該ＤＮＡ断片の塩基配列情報を用い、公開されている遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた相同性検索を行ったところ、高い相同性を持つ既知の塩基配列は検索されなかった。そこで、上記遺伝子のｃＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を、シロイヌナズナの全ゲノムシークエンス情報より検索し、該アミノ酸配列をコードすると推定されている領域の上流域をＰＣＲ法を用いてクローニングした。クローニングしたＤＮＡ断片がプロモータ活性を有するか否かは、レポーター遺伝子を用いた遺伝子組換え植物作製実験によって検討した。その結果、ナタネからクローニングされたＤＮＡ断片と同様に、初期胚特異的な遺伝子発現誘導パターンを示すことが明らかになった。このことは、上記遺伝子を利用することで、種の違う植物からも、同様の特性を持つプロモータ活性を有するＤＮＡを得ることが可能であることを示している。以上の結果から、該プロモータ活性を有するＤＮＡは、植物の胚発生誘導に伴い、極初期から胚組織特異的な遺伝子発現をもたらす作用があることが示された。
【０００８】
遺伝子組換え技術を高等植物を利用した新品種育成・物質生産等に用いる場合、導入した遺伝子の発現を植物の目的とする組織特異的、あるいは発育の時期特異的に制御することは重要な技術である。本発明におけるプロモータ活性を有するＤＮＡは、植物の種子が形成される際、その胚に特異的に、かつ胚発生の極初期段階から任意の遺伝子の発現を強く誘導する。そのため、各種代謝系酵素遺伝子の発現誘導による有用物質の胚組織における産生・蓄積技術、胚致死をもたらすような遺伝子の強制発現による種子の不活化、ホルモン合成系関連遺伝子等、形態形成関連遺伝子の胚組織での発現誘導による種子胚の形態改変等に利用できるものと期待される。
【０００９】
さらに、本発明におけるプロモータ活性を有するＤＮＡを、遺伝子組換え操作時の選抜マーカー遺伝子の発現制御に用いることにより、単細胞からの不定胚誘導系を利用した形質転換技術において、抗生物質耐性等の選抜マーカー遺伝子を不定胚形成の初期段階から発現させることができるものと期待される。
【００１０】
また、胚組織に特異的に任意の遺伝子発現が誘導されるため、胚以外の組織に対する導入遺伝子の影響を軽減することができるものと期待される。例えば種子胚以外の葉、根、果肉等を可食部とする農作物においては、収穫物において蓄積していないことが望ましい選抜マーカー遺伝子産物の産生を防止することができる。その他、高等植物における遺伝子工学系の産業分野において、胚組織に特異的に導入遺伝子を発現させることが必要とされる際に広汎に利用可能である。
【００１１】
即ち、本発明は、植物において、胚特異的かつ胚発生の極初期段階から発現する遺伝子、並びに、該遺伝子のプロモータであって、胚特異的かつ胚発生の極初期段階から任意の遺伝子を誘導可能なプロモータに関し、より具体的には、
〔１〕  植物の胚発生特異的に発現する、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の天然由来のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕  〔１〕に記載のＤＮＡの人工的な改変体、
〔３〕  〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、
〔４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のプロモータ活性を有するＤＮＡ、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御に関与するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むＤＮＡ、
〔５〕  〔１〕、〔２〕または〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
〔６〕  〔１〕、〔２〕もしくは〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔５〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔７〕  〔６〕に記載の形質転換植物細胞を有する形質転換植物体、
〔８〕  〔７〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔９〕  〔７〕または〔８〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔１０〕  〔７〕または〔８〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕、〔２〕もしくは〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔５〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔１１〕  被験化合物について、〔４〕に記載のＤＮＡのプロモータ活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔４〕に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が〔４〕に記載のＤＮＡのプロモータ活性を調節すると判定される方法、
〔１２〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、〔４〕に記載のＤＮＡのプロモータ活性を調節する化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔１１〕に記載の評価方法により、被験化合物について、〔４〕に記載のＤＮＡのプロモータ活性を調節するか否かを評価する工程、
（ｂ）被験化合物から、〔４〕に記載のＤＮＡのプロモータ活性を調節すると評価された化合物を選択する工程、を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、植物の胚発生極初期から活性を持ち、かつ、胚組織に特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。該遺伝子ＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に記載する。さらに本発明者らは、該遺伝子を利用して、該遺伝子の発現制御に関与する、プロモータ活性を有するＤＮＡを単離することに成功した。
【００１３】
本発明は、植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡ（ＢＥＳ１（Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  １）遺伝子）を提供する。本発明の上記ＤＮＡは、プロモータ活性を有する胚特異的遺伝子の発現制御に関与するＤＮＡの取得（単離）に利用することができる。本発明の好ましい態様においてはまず、本発明のＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、または、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、所望の植物から上記ＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡの単離を行う。当業者においては、この単離の工程を周知の方法に従って行うことができる。このように本発明の上記ＤＮＡを利用して取得されるＤＮＡは、胚組織特異的に発現するものと考えられることから、取得される上記ＤＮＡには、胚特異的遺伝子の発現制御に関与する領域（プロモータ）が含まれることが期待される。該ＤＮＡに発現制御領域が含まれない場合であっても、該ＤＮＡが位置するゲノムＤＮＡの近傍には、発現制御ＤＮＡ領域が存在するものと考えられる。該発現制御ＤＮＡ領域は、当業者においては本発明の上記ＤＮＡを利用することにより、一般的に周知の方法により取得することが可能である。さらに本発明のＤＮＡは、植物の胚発生特異的に発現することから、植物の胚発生初期段階のマーカーとして使用することも可能である。
【００１４】
本発明の上記ＤＮＡとしては、好ましくは配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。また、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９８：  ５０３，  １９７５）またはＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：  １３５０，  １９８５、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  ４８７，  １９８８）によって単離可能な、配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の植物から配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。
【００１５】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：６に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００１６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３，  １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３，  １９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００１７】
また、本発明は、上記の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質（例えば、配列番号：６）と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡもまた、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡの単離に利用される。
【００１８】
上記の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、上記ハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１９】
また、本発明は、上記の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡの人工的な改変体を提供する。該改変体とは、上記ＤＮＡにおいて、１または複数の塩基が、人工的に、置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるＤＮＡを意味する。このような改変体としては、例えば、活性が改変されたタンパク質を調製するために塩基が置換等されたＤＮＡやタンパク質の精製と容易にするためにＨｉｓタグやＧＳＴタグが付加されたＤＮＡ等が例示できる。該改変体の調製方法としては、特に制限はなく、例えば、通常の遺伝子組み換え技術を用いて組み換え体を作製する方法、さらに、本発明の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｈ−Ｊ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：  ３５０，  １９８７）により変異を導入する方法等が挙げられる。このような改変体は、後述する形質転換植物体の作製の他、本発明の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡの単離に利用できる。
【００２０】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、上記の植物の胚発生特異的に発現する遺伝子を有する植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作製し、これを展開して、該タンパク質をコードするＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、上記の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有する植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーション、またはＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００２１】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供する。
【００２２】
また本発明は、上記タンパク質をコードする遺伝子の発現制御に関与する、プロモータ活性を有するＤＮＡを提供する。本発明においては、該プロモータ活性を有するＤＮＡを植物に導入することにより、任意の遺伝子について、胚発生の極初期から後期まで胚組織特異的に転写活性化を行うことが可能である。
【００２３】
上記プロモータ活性を有するＤＮＡは、例えば、本発明の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡを利用して単離することができる。この単離方法としては、例えば上記のハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって、本発明の植物の胚発生特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングした後に、ＰＣＲ法等で該ＤＮＡの上流領域を単離する方法等を挙げることができる。単離された上流領域がプロモータ活性を有するか否かは、当業者においてはレポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、本発明の上記遺伝子をレポーターとして、該遺伝子の発現を検討することにより、該遺伝子の上流領域がプロモータ活性を有するか否かを検討することも可能である。
【００２４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００２５】
また、本発明の上記遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、本発明のＤＮＡ断片から発現する遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の転写レベルを測定することも可能である。また、該遺伝子からコードされるタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、本発明のタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、該遺伝子からコードされるタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。該遺伝子からコードされるタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。本発明のタンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００２６】
本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとして具体的には、配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡを例示することができる。また、配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡと構造的に類似しており、かつ、配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡと同等あるいは改善されたプロモータ活性能を持つＤＮＡも、本発明の「プロモータ活性を有するＤＮＡ」に含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７、８または９のいずれかに記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むＤＮＡが例示できる。該ＤＮＡは、上記ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の方法により調製することが可能である。
【００２７】
また本発明は、本発明のＤＮＡ、および本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御に関与するプロモータ活性を有するＤＮＡを含むベクター、並びに、本発明のＤＮＡまたは上記ベクターを保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を有する形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、上記の形質転換植物体の製造方法であって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、もしくは本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御に関与するプロモータ活性を有するＤＮＡ、または、該ＤＮＡを含むベクターを植物の細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターの植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法等により実施することができる。
【００３０】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ６７：  ３２５，  １９９０）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。また、上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、該ＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモータを含む。一般に、該プロモータの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモータとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモータ（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。
【００３１】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモータやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００３２】
また、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００３５】
次いで、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。本発明において使用可能なベクターは、特に制限されず、例えば実施例で使用したｐＢＩ１２１等を適宜改変して使用することができる。また、本発明のベクターを、例えばアグロバクテリウムに導入して、カルスまたは幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、さらに、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを植物に導入する形質転換法はアグロバクテリウムによるバイナリーベクター法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の方法を用いることも可能である。
【００３６】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培する。
【００３７】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡの存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からの核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に準じて実施することができる。
【００３８】
再生させた植物体中に存在する外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、該核酸がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡを含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００３９】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００４０】
さらに本発明は、被験化合物について、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡのプロモータ活性を調節するか否かを評価する方法を提供する。本発明の評価方法に用いられる被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。
【００４１】
この方法においては、まず、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる。
【００４２】
本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡに転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡに転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。本方法に用いるレポーター遺伝子としては、前出の遺伝子を使用することが可能である。
【００４３】
本方法における「本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、上記ＤＮＡを含むベクターを導入した細胞を挙げることができる。該ベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。
【００４４】
また、「本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡ構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。用いられる「細胞」は、例えば、ナタネ、シロイヌナズナ等に由来する細胞が挙げられるが、その由来は特に制限されない。
【００４５】
本方法における「本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
【００４６】
本方法における「接触」は、本発明のプロモータ活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞の培養液に被験化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、該細胞へ導入する、または該ベクターを該細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
【００４７】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、前記の方法により測定することができる。
【００４８】
本方法においては、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、被験化合物がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が本発明のＤＮＡのプロモータ活性を調節したと判定される。
【００４９】
さらに、本発明においては、上記評価方法を利用して、複数の被験化合物について、本発明のＤＮＡのプロモータ活性を調節するか否かを評価し、プロモータ活性を調節する化合物を選択することにより、効率的にプロモータ活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。本発明は、このようなプロモータ活性を調節する化合物のスクリーニング方法も提供する。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００５１】
［実施例１］  胚発生特異的遺伝子のクローニング
植物の胚発生は外界から隔てられた花組織の深部で進行し、受精卵および極初期の受精胚を人為的に単離することは一般的に困難である。そこで、単細胞から同調的かつ高頻度に胚発生を誘導できる実験系として、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の未熟花粉培養法を用いる。この培養法は、開花前の蕾より単核期後期の未熟花粉を取り出し、これを人工培養する（Ｋｅｌｌｅｒ  ＷＡ，  Ｆａｎ  Ｚ，  Ｐｅｃｈａｎ  Ｐ，  Ｌｏｎｇ  Ｎ，  Ｇｒａｉｎｇｅｒ  Ｊ  （１９８７）  Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  ７ｔｈ  Ｉｎｔｌ．  Ｒａｐｅｓｅｅｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ．  Ｐｏｚｎａｎ，  Ｐｏｌａｎｄ，  ｐｐ  １５２−１５７．；  Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ，  Ｏｇａｗａ  Ｔ，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｈ，  Ｙａｎｏ  Ｈ，  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ  （１９９６）  Ｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１１：３９−４７）。この操作によって単核の未熟花粉は、成熟花粉形成の経路から逸脱し、胚発生を開始する。この手法を用い、小胞子胚発生を誘導した細胞と通常の花粉形成を継続する細胞との間で遺伝子発現を網羅的に解析し、胚発生誘導に伴って強く発現が誘導される遺伝子を検出し、そのクローニングと構造解明を行った。
【００５２】
ここで用いたナタネ未熟花粉培養法においては、培養開始後２４ないし９６時間の間、３２℃の高温処理を与えることが胚形成の誘導のために必須である。一方、２０℃の培養温度条件下では未熟花粉は自然条件下と同様に成熟花粉を形成し、胚発生は観察されない。すなわち、この３２℃の温度条件が未熟花粉の発生運命を成熟花粉形成から胚発生へと変更する引き金の役割を果たしており、遺伝子発現の総合的パターンも胚発生を開始し進行させるためのものへと大きく変化していくものと考えられる。そこで、この高温処理に呼応して発現が誘導される遺伝子を以下のようにして単離した。
【００５３】
単離した未熟花粉は３２℃、２日間（以下サンプル２３２）、または２０℃、２日間（サンプル２２０）暗黒下で培養し、それぞれから全ＲＮＡを定法に基づいて抽出した。その２種類のＲＮＡサンプルについて、それぞれ３種類の１本鎖ＤＮＡプライマー（５’−  ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ  −３’（配列番号：１）、５’−  ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ  −３’（配列番号：２）、５’−  ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ  −３’（配列番号：３）、以下それぞれＧＴ１５Ａ、ＧＴ１５Ｃ、ＧＴ１５Ｇ、また、これら３つを総称してＧＴプライマーと呼ぶ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。この操作により、サンプル２２０＋ＧＴ１５Ａ、サンプル２２０＋ＧＴ１５Ｃ、サンプル２２０＋ＧＴ１５Ｇ、サンプル２３２＋ＧＴ１５Ａ、サンプル２３２＋ＧＴ１５Ｃ、サンプル２３２＋ＧＴ１５Ｇ、の合計６種類のｃＤＮＡ混合物を得た。これらのｃＤＮＡ混合物を鋳型とし、１２ｍｅｒの任意プライマー（和光純薬製）と個々のＧＴプライマー（ｃＤＮＡ合成に用いたものと同じ配列のもの）とを用い、それぞれ別々にＰＣＲ反応によってｃＤＮＡを増幅した。その際、ＧＴ１５Ａ、ＧＴ１５Ｃ、ＧＴ１５Ｇは蛍光色素ＦＩＴＣで５’末端を標識したものを用いた。この操作によって、１種類の任意プライマーおよび１種類のＧＴプライマーの組み合わせについて、サンプル２２０およびサンプル２３２より２種類の増幅産物が得られた。
【００５４】
この２種類の増幅産物を電気泳動法によって分子量の違いに基づいて分離し、その分離像を蛍光画像解析装置によって検出し、サンプル２２０とサンプル２３２との間で比較した。双方のサンプルに共通して発現している遺伝子に対応するｃＤＮＡは、２サンプル間で共通に観察されるが、胚発生特異的に発現する遺伝子に由来するｃＤＮＡはサンプル２３２においてのみ認められた。このようにして特異的に発現する遺伝子を検出する手法は一般にディファレンシャルディスプレー法と呼ばれるものであり、本実施例では（Ｉｔｏ，  Ｔ，  Ｓａｋａｋｉ，  Ｙ．  （１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８，  ２２９−２４５，  １９９６．）の方法に従った。
【００５５】
この手法を用い、高温処理を行った細胞のみに存在するｍＲＮＡ分子によるバンドを電気泳動ゲル上で複数種類検出した。そのうちの１つであるＢＥＳ１はＧＴ１５Ａと任意プライマー（５’−  ＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＧ  −３’（配列番号：４））を用いた反応産物から見いだされた。その増幅ＤＮＡ産物を泳動ゲルから抽出・精製し、クローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ、プロメガ社）に挿入してクローン化し、その塩基配列を決定した。さらに、その塩基配列を元にライフテック・オリエンタル社の５’ＲＡＣＥシステムを用いて全長のｃＤＮＡを単離し、前述のｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してクローニングし、その全塩基配列を決定した。そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に、その塩基配列を元に推定されるアミノ酸配列を配列番号：６にそれぞれ示す。ノーザンブロッティング法およびＲＴ−ＰＣＲ法によって該遺伝子の発現の時期・器官特異性を解析したところ、図１および図２に示されたとおり、ＢＥＳ１遺伝子の転写産物は胚発生の極初期から胚組織特異的に発現が強く誘導され、単離直後の花粉、葉、カルス等においては検出限界以下であることが明らかとなった。
【００５６】
［実施例２］  胚発生時特異的遺伝子の発現制御部位のクローニング
このＢＥＳ１の発現制御部位と考えられるＢＥＳ１の翻訳領域の上流領域をナタネゲノムＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲ法によってクローニングした。ナタネゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２重消化し、両端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化したのち、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって自己環状化した。これを鋳型として、ＢＥＳ１  ｃＤＮＡの配列より設計した２種類の逆ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらにその増幅産物の塩基配列データよりＢＥＳ１遺伝子の翻訳開始点上流２１７９ｂｐをＰＣＲ法によってクローン化した。その全塩基配列を決定し、既知のＤＮＡ配列データベースに対してＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて相同性検索を行ったところ、得られた２１７９ｂｐのうち５’側約１．１ｋｂｐの部分は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の既知遺伝子のタンパク質コード領域と非常に高い相同性を示したため、この領域はＢＥＳ１の転写制御領域ではないものと判断し、この５’側の領域を除く３’側１０３５ｂｐをＢＥＳ１の転写制御領域としてクローン化した。その塩基配列を配列番号：７に示し、このＤＮＡ断片を以下ＰＢＥＳ１と記載する。なお、本発明におけるＤＮＡおよびアミノ酸配列データおよびこれを利用した相同性検索は、インターネットを介して公開されている米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の運営するコンピュータシステム上のプログラムおよび当該システム上で公開されている遺伝子データベースによった。
【００５７】
［実施例３］  遺伝子発現制御パターンの特異性の検討
ＰＢＥＳ１のプロモータとしての活性はレポーター遺伝子を用いた遺伝子組換え植物作製実験によって検討した。用いたベクターは、植物形質転換遺伝子ベクターとして一般的に用いられるｐＢＩ１２１である。このベクターは、レポーター遺伝子としてカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ−３５Ｓプロモータに制御されるβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）をもつ。本実験においては、このＣａＭＶ−３５Ｓプロモータを取り除き、そこにＰＢＥＳ１を挿入して作製した改変ベクターを用いた。このベクターをアグロバクテリウムを介したバイナリーベクター法によってナタネおよびシロイヌナズナに形質転換した。その形質転換植物におけるＧＵＳの発現誘導パターンを指標としてＰＢＥＳ１の持つプロモータとしての遺伝子発現誘導能およびその時期・組織特異性を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を基質として組織化学的に活性染色して検出した。その結果、該ＤＮＡ断片ＰＢＥＳ１はナタネ花粉胚発生およびシロイヌナズナ接合子胚発生のどちらの過程においても、胚発生極初期から胚組織特異的に外来遺伝子の発現を強く誘導する性質を持つことを明らかにした（図３−１、２、３および５を参照）。また、図３−４に示すように、葉、根、等の栄養組織における活性は検出されなかった。以上の結果から、該プロモータ配列は植物の胚発生誘導に伴い、極初期から胚組織特異的な遺伝子発現をもたらす作用があることが示された。その時間的、空間的な制御は極めて厳密なものであり、その特異性は極めて高いものであることは明瞭である。
【００５８】
このような胚特異的発現制御を司る領域を特定する目的で、ＰＢＥＳ１を５’側から削った欠失断片を用いて形質転換植物による同様の解析を行った。形質転換体の未熟種子（開花後４日目）から粗タンパクを抽出し、Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）を基質とした発光強度を指標として、ＧＵＳ活性をフォトンカウンティングによって定量的に測定した。その結果、図４に示すように、ＰＢＥＳ１の３’側から２９７塩基と４００塩基の間の長さ１０４ｂｐの領域に当該プロモータの胚特異的な発現制御に重要な働きを持つ配列が存在することが明らかになった。この領域の塩基配列を配列番号：８に示す。
【００５９】
［実施例４］  他の植物種からの類似プロモータのクローニング
ＰＢＥＳ１の塩基配列情報を用い、公開されている遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた相同性検索を行ったが、高い相同性を持つ既知の塩基配列は検索されなかった。しかし、先に単離したＢＥＳ１遺伝子のｃＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列（配列番号：６）は、シロイヌナズナの全ゲノムシークエンス情報より推定される推定タンパク質Ｆ２０Ｏ９．３０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：  Ｔ０４６０５）と高い相同性を示すことがＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたデータベース検索によって明らかとなった。そこで、Ｆ２０Ｏ９．３０遺伝子の座乗しているシロイヌナズナのゲノム配列をデータベースより取得し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：  ＡＬ０２１７４９）、Ｆ２０Ｏ９．３０をコードすると推定されている領域の上流域４２１ｂｐをＰＣＲ法を用いてクローニングした。その塩基配列を配列番号：９に示し、以下ＰＡｔＢＥＳ１とする。ＰＡｔＢＥＳ１をＧＵＳの上流につなぎ、バイナリーベクター法を用いてシロイヌナズナに導入し、同様の形質転換実験を行った。その結果、図３−６に示すように、ＰＡｔＢＥＳ１もＰＢＥＳ１と同様に初期胚特異的な遺伝子発現誘導パターンを示すことが明らかになった。このことは、ＢＥＳ１タンパクのアミノ酸配列情報を利用して、種の違う植物からも同様の特性を持つプロモータ配列を得ることが可能であることを示している。
【００６０】
【発明の効果】
遺伝子組換え技術を高等植物を利用した新品種育成・物質生産等に用いる場合、導入した遺伝子の発現を植物の目的とする組織特異的、あるいは発育の時期特異的に制御することは重要な技術である。本発明におけるプロモータ活性を有するＤＮＡは、植物の種子が形成される際、その胚に特異的に、かつ胚発生の極初期段階から任意の遺伝子の発現を強く誘導する。そのため、各種代謝系酵素遺伝子の発現誘導による有用物質の胚組織における産生・蓄積技術、胚致死をもたらすような遺伝子の強制発現による種子の不活化、ホルモン合成系関連遺伝子等、形態形成関連遺伝子の胚組織での発現誘導による種子胚の形態改変等に利用可能である。
【００６１】
さらに、本発明におけるプロモータ活性を有するＤＮＡを、遺伝子組換え操作時の選抜マーカー遺伝子の発現制御に用いることにより、単細胞からの不定胚誘導系を利用した形質転換技術において、抗生物質耐性等の選抜マーカー遺伝子を不定胚形成の初期段階から発現させることが可能となる。
【００６２】
また、胚組織に特異的に任意の遺伝子発現が誘導されるため、胚以外の組織に対する導入遺伝子の影響を軽減することが可能となる。例えば種子胚以外の葉、根、果肉等を可食部とする農作物においては、収穫物において蓄積していないことが望ましい選抜マーカー遺伝子産物の産生を防止することができる。その他、高等植物における遺伝子工学系の産業分野において、胚組織に特異的に導入遺伝子を発現させることが必要とされる際に広汎に利用可能である。
【００６３】
【配列表】
0003593565.tif 000002
0003593565.tif 000003
0003593565.tif 000004
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0003593565.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲ法により検出されたナタネＢＥＳ１転写産物を示す写真である。１〜１２は、それぞれ、単離直後の未熟花粉、２０℃２日間培養後の未熟花粉、３２℃４日間培養後の未熟花粉、３２℃４日間培養後の未熟花粉、数細胞期胚、球状胚、心臓型／魚雷型胚、子葉胚、完熟種子、葉、カルス（培養温度２０℃）、カルス（培養温度３２℃）から調製したサンプルを示す。
【図２】ノーザンハイブリダイゼーション法により検出されたナタネＢＥＳ１転写産物を示す写真である。１〜７は、それぞれ、単離直後の未熟花粉、２０℃２日間培養後の未熟花粉、３２℃２日間培養後の未熟花粉、３２℃４日間培養後の未熟花粉、球状胚、心臓型／魚雷型胚、葉から調製したサンプルを示す。
【図３】遺伝子組換え実験により検出されたプロモータの遺伝子発現制御パターンを示す写真である。全てのサンプルはＸ−Ｇｌｕｃを基質として組織化学的に活性染色した。黒色の部位がＧＵＳの活性を示している。１〜６は、それぞれ、ＰＢＥＳ１：：ＧＵＳを導入した形質転換ナタネより単離した花粉胚の培養４日目、同８日目、同１４日目、ＰＢＥＳ１：：ＧＵＳを導入したシロイヌナズナ形質転換体の実生（播種後７日目）、同形質転換体の未熟胚（開花４日後）、ＰＡｔＢＥＳ１：：ＧＵＳを導入したシロイヌナズナ形質転換体の未熟胚（開花４日後）の写真である。
【図４】ＰＢＥＳ１を５’側から削った７種類の断片および該断片のプロモータ活性（ＧＵＳの活性）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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