(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素の酸化度を測定することを含む、補酵素の酸化を用いる酵素反応によって患者中に存在する目的物質を定量する方法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめる酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されており、且つ、遊離リン酸イオンを包含し、
該補酵素還元システムは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの本来の基質ではないＤ−グルコースとからなる、不完全な特異性を示す酵素と基質との組み合わせであり、
該目的物質は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、尿素及びアンモニアからなる群より選ばれる１種であることを特徴とする試薬。
【請求項２】
該連続的な再生が18〜25℃で0.01〜0.9mAbs/分の範囲内の速度で起きていることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
該目的物質がアスパラギン酸トランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
該目的物質がアラニントランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項５】
該目的物質が尿素であることを特徴とする請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項６】
該目的物質がアンモニアであることを特徴とする請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項７】
１液型試薬であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の試薬。
【請求項８】
補酵素の酸化度を測定することを含む、補酵素の酸化を用いる酵素反応によって体液試料中に存在する目的物質を定量する方法において、該補酵素と遊離リン酸イオンを包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめる酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含し、
該補酵素還元システムは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの本来の基質ではないＤ−グルコースとからなる、不完全な特異性を示す酵素と基質との組み合わせであり、
該目的物質が、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、尿素及びアンモニアからなる群より選ばれる１種であることを特徴とする方法。
【請求項９】
該連続的な再生が18〜25℃で0.01〜0.9mAbs/分の範囲内の速度で起きていることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該目的物質がアスパラギン酸トランスアミナーゼであることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
該目的物質がアラニントランスアミナーゼであることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
該目的物質が尿素であることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
該目的物質がアンモニアであることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、体液試料中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬に関する。具体的には、本発明は、反応後の試料中に存在する酸化された補酵素の量が、試料中の目的物質の濃度に相当する定量法のための試薬に関する。更に本発明は、目的物質の定量法に関する。
本発明の試薬によって定量が可能な目的物質はトランスアミナーゼ類、アンモニア、尿素、乳酸デヒドロゲナーゼ、トリグリセリド類及びサリチル酸等である。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは心臓、肝臓、赤血球及び骨格筋に高濃度で存在する酵素であり、以下のような反応を触媒する：
0003588124.tif 000002
肝細胞の破壊を生じる様々な肝臓病、例として、特に肝炎は、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇を伴う事が知られている。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇は、心筋梗塞の発症後及び筋疾患にも見られる。
アラニンアミノトランスフェラーゼも肝臓に高濃度で存在する酵素である。心臓、腎臓及び骨格筋にも存在するが、肝臓の場合ほど高濃度ではない。アラニンアミノトランスフェラーゼは以下の反応を触媒する：
0003588124.tif 000003
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度は通常、肝臓病、特に肝炎によって上昇する。
酵素、特に体液試料中のトランスアミナーゼ類、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼの間接的定量を行なうには、試料を含まない“ブランク（Blank）”の測定値と、定量の対象である酵素によって、この酵素と関連のある目的物質を変換した後の試料との測定値の比較を必要とする場合もある。
目的物質を酵素反応により変換するためには、基質特異的な酵素（ここではトランスアミナーゼ類）を、目的とする酵素の定量に用いる事が知られている酵素基質と反応せしめる。そして、ブランクに対して、反応混合物の組成に生じる変化を、吸光度の変化を測定する様々な方法を用いて計測することが可能である。吸光度の変化は試料中に存在するトランスアミナーゼ類の量に直接対応している。
比色定量法などの従来の方法は目的物質の定量法として適切であると認められているが、トランスアミナーゼ類の定量においては、酵素反応を用いる分析法の方が遥かに正確であり、信頼性も高く、従来の方法よりも簡便である。
試料中に存在するトランスアミナーゼ類を定量するための一般的な方法としては、酵素の連鎖反応を用いる、動力学的手法に基づく方法が挙げられる。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の場合、ASTにより生成されたオキサロ酢酸は、分析用の系に加えられているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）によってリンゴ酸に変換される。この反応は、補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化反応（NADHがNAD+になる）を伴い、この酸化反応は波長340nmにおける吸光度を分光光度計によって測定することにより追跡することができる。従って、上記の反応は、通常、以下に示す連鎖反応によって進行する：
0003588124.tif 000004
三番目の反応は、患者より得られた試料中に高濃度に含有されている可能性のあるピルビン酸を除去するために必要である。以下の理論に基づき、試薬中に高濃度の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）が加えられている。即ち、患者より得られた試料中に高濃度のピルビン酸が存在した場合、NADHとLDHにより試料中のピルビン酸は、目的とする反応を妨害することのない乳酸に速やかに変換される。副反応を省くために試薬に添加されるLDHは、不純物の混入を招くことにより、試薬の安定性に影響を与える。
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の定量の場合、乳酸デヒドロゲナーゼを含む反応混合物を用いることにより、ALTにより生成されるピルビン酸は乳酸に変換される。この反応は、補酵素NADHをNAD+に酸化する反応を伴うため、やはり反応の進行を波長340nmにおける吸光度を分光光度計を用いて測定することにより追跡することが可能である。従って、定量用試薬を用いた際の連鎖反応は以下のように進行する：
0003588124.tif 000005
ALTの測定法は、試薬に加えるべき酵素がただ一種、すなわちLDHしか必要としない以外は（ASTの場合はLDHとMDHの２種が必要とされる点で異なる）、AST定量用試薬と同様の理論及び方法論を用いる。従って、ALT定量用試薬に混入する不純物は、AST定量用試薬に混入する不純物よりも少量となるため、一般的に、試薬の再構成後の貯蔵寿命（shelf life）はAST定量用試薬よりも若干長くできると考えられる。
どちらの試薬の場合も、NAD+の生成速度は、元々試料中に存在するトランスアミナーゼ濃度に対応する。
尿素は、蛋白の異化により生じる主要な窒素含有代謝産物であり、肝臓に存在する酵素によって合成され、主に腎臓を経て排出される。血清中の尿素濃度の上昇は腎機能の不全、肝臓病、食生活の変化、うっ血性心不全、糖尿病及び感染症の結果であることも考えられる。
ヒトの血清及び尿中の尿素の定量には、直接法又は間接法を用いることができる。尿素の直接定量法においては、通常、各種のフィアロン反応（Fearon reaction）の変法を用いる。この反応系においては、ジアセチルが尿素と反応して540nmに強い吸収を示す発色体であるジアジン（chromogen diazine）を生成するので、その吸光度を分光光度計により測定することができる。ヒトの血清及び尿に存在する尿素の定量法として最も一般的な方法は、一組の連鎖酵素反応系を用いて間接的に尿素を測定する方法である。反応系の第１の酵素であるウレアーゼは、尿素をアンモニウムイオンと重炭酸イオンに変換する。反応系の第２の酵素であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GLDH）はNADHとアンモニウムイオンからNAD+とグルタミン酸を生成する。この第２反応では、NADHがNAD+へ変換されるので、波長340nmにおける吸光度を分光光度計で測定することにより追跡できる。又、アンモニウムイオンを電位差測定法又は電気伝導度測定法によって測定することも可能である。
従って、一般的な尿素の定量法は以下に示す反応プロセスにより行われる：
0003588124.tif 000006
NADHのNAD+への変換に伴って生じる、340nmにおける吸光度の低下は、元の試料中に存在していた尿素濃度に比例する。
体内を循環するアンモニアの発生源は主に消化管である。アンモニアは肝臓で代謝され、クレブス−ヘンセライト経路（Krebs−Henseleit cycle）によって尿素に変換される。ヒト血清中のアンモニア濃度の上昇は、重度の肝臓障害と関連する場合が非常に多い。高アンモニア血症は中枢神経系に対して毒性を示す。
ヒト血清中のアンモニアの定量法としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによる１段階の酵素反応を用いて直接測定するのが最も一般的である。この反応では、アンモニア、α−ケトグルタル酸及びNADH（又はNADPH）をグルタミン酸とNAD+（又はNADP+）に変換し、この反応を340nmにおける吸光度を分光光度計を用いて測定する。試料中のアンモニア濃度の測定は一般的に以下の反応式により行う：
0003588124.tif 000007
NADPHのNADP+への変換は340nmにおける吸光度の低下として測定され、この測定値は患者より得られた試料中のアンモニア濃度に比例する。
上記したように、従来のトランスアミナーゼ定量用試薬は再構成後の保存安定性に劣っていた。このような試薬、特に１液型試薬の安定性は、冷蔵状態において最大でも１ヶ月程度である。この不安定性の原因は試薬中の成分の劣化及び溶液中でのNADHの不安定性によると考えられる。溶液中のNADHの不安定性の主な原因は、試薬に含まれる酵素、即ち、AST定量用試薬の場合はLDHとMDH、ALT定量用試薬の場合はLDHの存在と直接関連している。試薬に含まれている酵素である市販のMDH及びLDHは、動物起源の酵素であっても、微生物起源の酵素であっても、最終的に再構成された後のNADHの安定性に影響を与える不純物を含み、更には試薬そのものの安定性に影響を与える。このような不純物は通常、低濃度のAST及びALTのような測定の対象となる酵素や、NADHオキシダーゼであって、これらはいずれも試薬中のNADHの酸化を開始させる。
NADHは溶液中、特に酸性の溶媒において急速に分解するため、試薬のpHもNADHの不安定性に影響を与える。大部分のトランスアミナーゼ定量試薬はpH7.3から8.0の範囲内に調製されている。試薬のアルカリ性が強いほど、溶液中のNADHの安定性は向上する。
更に、アンモニア定量用試薬及び尿素定量用試薬も安定性に問題があり、一液型試薬の冷蔵下における一般的な安定保存期間は、アンモニア定量用試薬の場合は最大１ヶ月、尿素定量用試薬の場合は最大２ヶ月である。この不安定性の原因は、試薬中の成分の劣化、溶液中のNADH又はNADPHの不安定性、並びに粉末状の試薬を再構成する際に用いる水に含まれるアンモニア等に起因すると考えられる。
溶液中のNADH又はNADPHの不安定性の主な原因は、試薬に含まれる酵素の存在と直接関係している。NADH及びNADPHは溶液中、特に酸性の溶媒中で急速に分解されるため、試薬のpHもNADH又はNADPHの不安定性に影響すると考えられる。
通常、アンモニア定量用試薬には、患者の血清試料中に存在する乳酸デヒドロゲナーゼによる検査反応の妨害を克服する目的で（NADHよりも好ましくは）NADPHが用いられる。患者の血清試料中に存在する乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸は以下に示す反応式に従ってNADHと特異的に反応する：
0003588124.tif 000008
市販のグルタミン酸デヒドロゲナーゼに含まれる、アンモニア定量用試薬中のNADPHの酸化を開始する不純物によって、やはり溶液中のNADPHの安定性も影響を受ける。同様に、市販のウレアーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼに含まれる不純物は、尿素定量用試薬中に存在するNADHの酸化反応を開始する。
溶液中のNADH及びNADPHの安定性に関する上記の問題点を克服するための一つの方法は、使用の直前に還元された補酵素を溶液中で発生させる方法である。
上記のような方法の一つがF.Hoffmann La Roche AGによる豪州特許願AU−Ａ−61906/90に開示されており、その方法は、血清中の重炭酸及びアンモニアを測定するための特定の酵素反応系に関するものである。この開示においては、目的物質、基質及び特定の酵素による酸化反応と同時又はその反応開始以前にin situで還元された補酵素を発生させる。反応混合物中に酸化された補酵素の還元を可能とする酵素と酵素基質を含むことにより、上記の方法は達成される。F.Hoffmann La Roche AGに開示され、好ましく用いられる反応を以下に示す：
0003588124.tif 000009
上記反応によって、還元されたニコチンアミドジヌクレオチドが得られる。
このNADHの発生させるための反応に伴う問題点は、１液型試薬の調製が不可能な点にある。
F.Hoffmann La Roche AGは試薬を２本のバイアルに分けて調製することにより、上記の問題点の一部を克服した。アンモニア定量試薬の場合、第１試薬はNADP+及びＧ−６−Ｐからなり、第２試薬はα−ケトグルタル酸、Ｇ−６−Ｐ−DH及びGLDHからなる。測定反応は以下のように進行する：
0003588124.tif 000010
式中、（Ａ）及び（Ｂ）は選択的な、同一の工程を示す。
しかし、この検査試薬にも問題点は残る。２本の試薬バイアルが必要であるため費用、説明書及び廃棄物が嵩む以外に、非常に厳密な量のグルコースー６−リン酸が必要であり、更には特定の分析装置を用いて測定しなければならない。２種の試薬を合一した途端に、グルコース−６−リン酸を消費しながらNAD+からNADHが発生する。従って、２種の試薬の混合後、直ちに試薬を使用しなかった場合、グルコース−６−リン酸がすべて消費され、混合された試薬の安定性に多大な影響を与える。試薬中に不正確又は過剰な量のグルコース−６−リン酸が存在する場合、反応を行なうための保温時間が重要になる。測定結果は、実際よりも低い吸光度変化となり、全体としては不正確な結果しか得られない。
目的物質の定量に関わる問題点の解決方法の一つが、既にModrovichによる米国特許４、394、449号に開示されている。この方法においては、基質と酵素の組み合わせを用い、還元された補酵素をRocheによる解決策と同様の方法によって発生するが、下記の式に従い、グルコース−６−リン酸はグルコースより生成される：
0003588124.tif 000011
その後、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下でNAD+は生成されたグルコース−６−リン酸と反応し、NADHを発生する。Modrovichの組成には、NADHが酸化又は分解された場合、試薬中のNAD+がNADHの再生を補うように、NADHとNAD+の両方が含まれている。この試薬も二液型に調製されている。
既に、Klose et alの米国特許第４、019、961号の発明がその他の選択肢として提供されている。この発明は、様々の個別の反応工程及びNADH再生酵素システムを用いる。このシステムには、複数の反応工程及び分離工程を必要とするために生じる信頼性の低下と、検査に時間がかかるという障害がある。更に、この試薬システムはリン酸化が可能な基質にのみ適している。
上記した発明に用いられている、NADH及びNADPHの発生機構に関する一般的な問題点は、
0003588124.tif 000012
で表わされる反応においては、一液型試薬を調製し、一工程で反応を行なうことが不可能な点にある。試薬に患者より得られた血清試料を添加すると、以下の２つの反応が同時に起る：
（ａ）  NADH（又はNADPH）がNAD+（又はNADP+）に変換される際に吸光度が減少し、
（ｂ）  NADH（又はNADPH）がNAD+（又はNADP+）より発生する際に吸光度が上昇する。
この２つの反応は同等の反応速度で起るため、測定値として得られる吸光度の変化は実際よりも低い値となり、不正確な結果しか得ることができない。
従って、本発明の一つの目的は、従来の、補酵素の酸化を用いる酵素反応による血清中の目的物質の定量法の問題点、特に、試薬に含まれる成分に由来する物質及び試薬に含まれない物質の試薬への混入に伴う問題点を実質的に克服した試薬を提供することにある。本発明の他の一つの目的は、患者試料中の目的物質濃度の改良された定量法であって、従来の方法における問題点、すなわち定量値の決定要因である補酵素の早過ぎる酸化、並びに試薬の分解を最小限にとどめるため多液型試薬の形で提供しなければならない点を改良した定量法が提供される。
本発明の他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中のトランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中のアスパラギン酸トランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中のアラニントランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の尿素の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中のアンモニアの酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
好ましくは、補酵素還元システムは酵素と基質を包含し、該酵素は該基質に対して不完全な特異性を有するため、反応速度が減少する。
本発明の試薬は一液型試薬として調製されるのが好ましい。
本願明細書において、選択された酵素と基質の組み合わせに対して用いられる“不完全な特異性”とは、選択された基質が、選択された酵素の本来の基質ではないため、この基質に対する酵素の特異性が、酵素の本来の基質に対する特異性と比較して100％未満であることを意味する。
本発明は、お互いに対して不完全な特異性しか示さない酵素と基質を反応させた場合、補酵素の還元速度は著しく遅いという発見に基づくものである。補酵素の還元反応を遅くすることにより、定量用試薬の必須成分を１本の保存用バイアル中に調製することが可能となり、低濃度の連続的な補酵素の還元反応により、汚染に対して安定化される。還元反応速度を遅くすることにより、目的物質の測定に影響を与えることなく、NADH又はNADPHの再生が可能となる。補酵素の再生は試薬を使用しない間に起こり、その再生速度は再生システムに用いられる酵素と基質の組み合わせの性質及びそれぞれの濃度を制御することにより、厳密に調整することが可能である。
本発明の更なる態様の一つとして、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生が340nmで0.01〜0.9mABS/分の範囲内の速度で起きているように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。
本発明の上記態様における好ましい再生速度は、室温（18〜25℃）、340nmで0.05〜0.9mAbs/分であり、さらに好ましくは0.01〜0.4mAbs/分である。
本発明の好ましい態様においては、補酵素還元システムの酵素と基質の特異性は、好ましくは等モル基準で100％未満、より好ましくは50％未満、更に好ましくは10％未満である。最適な条件としては、等モル基準の交差反応性が５％未満である酵素と基質の組み合わせを用いることができる。
本発明の試薬に用いられる補酵素は、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）及び還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）であるが、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸又はチオNADH等の補酵素のアナログも用いることのできる。
驚くべきことに、本発明の試薬の更に有利な点は、特にアンモニア定量用試薬及び尿素定量用試薬として用いることができることである。尿素定量用試薬又はアンモニア定量用試薬のNADH及び／又はNADPH濃度は、粉末状の試薬を再構成する際に用いられる水によって混入する不純物としてのアンモニアによって減少する。同様に、空気中のアンモニアも時間とともに液状の尿素／アンモニア定量用試薬に溶解し、NADH及び／又はNADPH濃度を減少させる。アンモニア定量用試薬及び尿素定量用試薬に存在する不純物としてのアンモニアは、尿素及びアンモニアの定量を不正確にするだけでなく、GLDHの存在下で、α−ケトグルタル酸とNADHの反応が試料の添加以前に開始されてしまうことを意味する。その結果、NADH又はNADPH濃度は減少し、試料中のアンモニア及び尿素の定量に誤りが生じる。しかしながら、本発明においては、混在するアンモニアの除去、更にはNADH又はNADPHの再生を可能とすることにより、患者試料中のアンモニア及び尿素の正確な定量を可能とする。
血清試料中のトランスアミナーゼ定量用試薬の補酵素還元システムに用いられる好ましい酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−DH）又はグルコースデヒドロゲナーゼである。
血清試料中の尿素又はアンモニア定量用試薬の補酵素還元システムに用いられる酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−DH）又はグルコースデヒドロゲナーゼである。
ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Lactobacillus sp．由来）又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素も適切である。トランスアミナーゼ定量用試薬並びにアンモニア及び尿素定量用試薬に用いられる酵素としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。この酵素は、Leuconostoc mesenteroides，Bacillus stearothermophilus，Zymomonas mobilus又は酵母のような適切な材料より得ることができる。
上記の酵素は、微生物より抽出された酵素が好ましい。微生物由来の酵素を試薬に用いることにより、NADHオキシダーゼ及びプロテアーゼのような、従来試薬の安定性に深刻な影響を与えていた生体由来の不純物の混入が最小限に押さえられることが見出された。更に、微生物由来の酵素は熱安定性を有するため、試薬溶液の長期保存安定性を向上するという利点がある。
最も好ましいグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの材料はLeuconostoc Mesenteroidesである。Bacillus stearothermophilus又はZymomonas mobilus由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用した場合、反応速度が遅い。また、酵母より抽出されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはNADP+に特異的な酵素であるため、この酵素を使用する際には、補酵素NADPHをNADHの代わりに用いらければならない。本発明の試薬に存在するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの適切な量は、希望する再生時間により異なる。AST定量用試薬において好ましい量は2000U/Lであるが、この値は時間とともに生じる濃度の低下を考慮した値である。ALT定量用試薬において好ましい量は2000U/Lである。尿素定量用試薬において好ましい量は2000U/Lであり、アンモニア定量用試薬において好ましい量は3500U/Lである。
補酵素還元システムにおいて、お互いに対して不完全な特異性を示す酵素と基質を選択しなければならないという観点から、本発明の試薬に用いられる適切な基質はリボース−５−リン酸、グルコース−１−リン酸、６−フォスフォグルコン酸、２−デオキシグルコース−６−リン酸、２−デオキシ−２−フルオログルコース、デオキシ−２−クロログルコース−６−リン酸、２−デオキシ−２、２−ジフルオログルコース−６−リン酸、２−Ｏ−メチルグルコース−６−リン酸、マンノース−６−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、３−デオキシグルコース−６−リン酸、３−デオキシ−３−フルオログルコース−６−リン酸、３−Ｏ−メチルグルコース−６−リン酸、アロース−６−リン酸、アフロース−６−リン酸、４−デオキシ−４−フルオログルコース−６−リン酸、ガラクトース−６−リン酸、５−チオグルコース−６−リン酸、ホスホン酸アナログ、グルコース−６−スタレート、β−Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、２−デオキシグルコース、アラビノース、キシロース、１−ソルボース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、サッカロース、イノシトール及びマルトースである。
NADHを好ましい補酵素として用いる場合、好ましい酵素と基質の組み合わせはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−DH）とＤ−グルコースである。グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）とＧ−６−Ｐ−DHの間の特異性を基準として、酵素であるＧ−６−Ｐ−DHと選択した基質の反応速度が50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満である基質が、Ｄ−グルコースの代わりとして好ましい。やはりこの場合も、必要な再生速度という観点から本発明の試薬に用いる最も適切なＤ−グルコースの量は、約100mmol/Lであるが、約1000mmol/Lまで使用することが可能である。高濃度で用いる場合は、Ｄ−グルコースの試薬に対する溶解度が問題となる。
好ましい組み合わせであるＤ−グルコースとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合、リン酸カリウムイオンをリン酸二カリウムとして試薬の組成に加えてもよい。目的とする再生速度に応じて適切なリン酸イオン濃度は異なる。しかし、例えば、Ｄ−グルコースの濃度が約100mmol/L（しかし、20〜200mmol/Lの範囲内であればよい）の場合、それに対するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は約2000U/L（しかし、500〜3500mmol/Lの範囲内であればよい）であり、適切なリン酸イオン濃度は2.0mmol/Lから20mmol/Lの範囲内である。リン酸イオン濃度の上昇は再生速度を上昇する。好ましいリン酸イオン添加量は、AST定量用試薬で約10mmol/L、ALT定量用試薬で約5mmolである。尿素定量用試薬の場合は5mmolであり、アンモニア定量用用試薬でも5mmolである。
Ｄ−グルコースとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる好ましい組み合わせが用いられた場合、又は遊離したリン酸イオンが存在しない系においては、リン酸イオンを試薬に添加することは必須である。具体的には、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下で、遊離したリン酸イオンはＤ−グルコースと非特異的な複合体を形成することにより、再生反応を開始する。
Ｄ−グルコースとＧ−６−Ｐ−DHの組み合わせの代わりに、下記の反応に従ってグルコースデヒドロゲナーゼ（GLD）を好ましく用いることもできる。
0003588124.tif 000013
（上記反応において、Ｄ−グルコースは反応性が100％の基質である。）
酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合、補酵素NADの還元には、下記の基質を用いることが好ましい。これらの基質の反応性をＤ−グルコースと比較したときの相対的な反応性は、次の通りである。
基質       相対的反応性
キシロース            8.9％
Ｌ−ソルボース        0.3％
Ｄ−マンノース        2.4％
Ｄ−フルクトース      0.8％
Ｄ−ガラクトース      0.1％
Ｄ−ラクトース        1.2％
Ｄ−ソルビトール      0.1％
イノシトール          0.2％
マルトース            3.9％
（上記の値は、本来の基質である１β−Ｄ−グルコースの存在下でのグルコースデヒドロゲナーゼの反応速度に対する反応速度の比を表す。）
また、酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼ（GLY.DH）を使用する場合、下記の反応：
0003588124.tif 000014
において、下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性をグリセロールに対する反応性（100％）と比較した相対的な反応性は、次の通りである。
基質                 相対的反応性
グリセロール−α−モノクロロヒドリン  48.5％
エチレングリコール                     7.8％ｖ
2,3−ブタンジオール                   52.6％
また、酵素としてロイシンデヒドロゲナーゼ（L.D）を使用する場合、下記の反応：
0003588124.tif 000015
において、下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性をＬ−ロイシンに対する反応性（100％）と比較した相対的な反応性は、次の通りである。
基質       相対的反応性
Ｌ−バリン              74％
Ｌ−イソロイシン        58％
Ｌ−ノルバリン          41％
Ｌ−ノルロイシン        10％
Ｌ−メチオニン         0.6％
Ｌ−システイン         0.3％
ロイシンデヒドロゲナーゼを使用する上記の反応と同様の反応系において、酵素としてＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（A.D）を使用する場合、下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性をＬ−アラニンに対する反応性（100％）と比較した相対的な反応性は、次の通りである。
基質    相対的反応性
Ｌ−セリン      ５％
また、酵素として、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（H.DH）を下記の基質と組み合わせて使用してもよい。また、コール酸に対するその反応性も示す。
基質      相対的反応性
リトコール酸        96％
エチオコール酸      60％
下記の反応において、酵素としてLactobacillus sp．由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を使用する場合、
0003588124.tif 000016
下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性を、Ｌ−乳酸に対する反応性と比較した相対的な反応性は、次の通りである。
基質         相対的反応性
２−オキソグルタル酸      0.09％
オキサロ酢酸                36％
例えば、NADP+が酵母由来の補酵素である場合、下記の基質／酵素の組み合わせが好ましい。
Ｇ−６−Ｐ−DH/ガラクトース−６−Ｐ         25％
Ｇ−６−Ｐ−DH/2−デオキシグルコース−６−Ｐ18％
Ｇ−６−Ｐ−DH/グルコサミン−６−Ｐ         ２％
上記の右側の数値は、Ｇ−６−Ｐ−DH/G−６−Ｐの組み合わせにおける反応性に対する相対的な反応性を表す。
また、補酵素としてNADP+を使用し、酵素と基質の組み合わせとしてグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとジヒドロキシアセトンリン酸を組み合わせることも可能である。
本願明細書の序文で述べたように、血清中に存在するASTの濃度を測定するために用いられる本発明の試薬において必要とされる成分は乳酸デヒドロゲナーゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）、アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸である。ALT定量用試薬においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは必要なく、アスパラギン酸の代りにＬ−アラニンが必要である。尿素定量用試薬においては、上記成分の他にウレアーゼとα−ケトグルタル酸が必要であり、アンモニア定量用試薬においても、α−ケトグルタル酸が上記成分の他に必要である。
アスパラギン酸は、ナトリウム塩及びカリウム塩のような様々なアスパラギン酸塩として入手可能である。本発明に用いられるアスパラギン酸は、ナトリウム塩よりも溶解度が高く、水和の程度が少ないと考えられるカリウム塩が好ましい。本発明に用いることが可能なアスパラギン酸の濃度範囲は180〜240mmol/Lである。最も好ましい濃度は200mmol/Lであり、この濃度はIFCCにより推奨されている濃度である。
本発明の定量用試薬にとって好ましい２−オキソグルタル酸濃度は約１〜15mmol/Lであるが、２−オキソグルタル酸は340nmの光を吸収するので、高濃度の２−オキソグルタル酸は、NADHに基づく吸光度に対して、高いバックグラウンド値となるので、試薬に用いることのできるNADHの量を制限することになる。従って、試薬に含まれる２−オキソグルタル酸の濃度を押さえることにより、大部分の分光光度計で本発明の試薬を用いた測定が可能となる。AST定量用試薬及びALT定量用試薬に用いられる２−オキソグルタル酸濃度は好ましくは12mmol/Lであり、やはりこの値もIFCCに推奨されている値である。尿素定量用試薬及びアンモニア定量用試薬に用いられる２−オキソグルタル酸濃度は好ましくは7.5mmol/Lである。
ALT定量用試薬中に存在するアラニンの量は、アラニンの溶解度によりある程度決定される。具体的には、好ましいアラニン濃度の範囲は200〜500mmol/Lであるが、この範囲の上限に近い値においては顕著な酵素活性の増加は見られない。アラニンの溶解度に基づく最も好ましいアラニン濃度は400mM/Lである。
定量用試薬中の補酵素の濃度は以下の要因によって変化する：
・測定に必要な直線性
・使用する波長
・検査試料と試薬の容量比
・分析装置に用いられる分光系
一般的に、試料の容量を増加することにより、測定感度は上昇するが、測定値の直線性は低下する。一方、試料の容量を減少することにより測定値の直線性を上昇するが、測定感度は低下する。
吸光度測定に用いられる好ましい波長は320〜400nmであり、試料中の補酵素の濃度は吸光度が2.0Aを超えないように調整することが好ましい。本発明に用いられる最も好ましい波長は340nmである。
本発明に用いられるMDHとしては、試薬中に不純物の混入を防ぐ目的と共に、優れた熱安定性を有する微生物由来のMDHが好ましい。本発明に用いられるMDHの濃度は200〜800U/Lであり、好ましい濃度は250U/Lである。
AST定量用試薬において、LDHは試料中のピルビン酸を除去する。AST定量用試薬に含まれるLDHの濃度は、試料と試薬の比が1:10の時に、1.0mmol/Lの試料中のピルビン酸を１分間で除去するようなLDHの濃度が好ましい。このような条件を満たす濃度は約2000U/Lである。
ALT定量用試薬において、LDHは以下の２つの反応に関与する：（ｉ）ALT測定のための２段階の酵素反応及び（ii）試料中に含まれるピルビン酸の除去。ALT定量用試薬に含まれるLDHの濃度は、AST定量用試薬の場合と同様に、1.0mmol/Lの試料中のピルビン酸を１分間で除去するような濃度が用いられる。反応開始１分後には、試料中のピルビン酸による影響を受けることなく、目的とする反応を測定することができる。試料中のピルビン酸の除去に必要なLDHの最小濃度は約1500U/Lであると見出された。ALT定量用試薬中に含まれるLDHの好ましい濃度は約2000U/Lである。
尿素定量用試薬において、動力学的見地から、pH8.5の条件下において律速酵素とならないために必要とされる最小ウレアーゼ活性は約5000U/Lである。長期保存における安定性を高める目的で、尿素定量用試薬は上記の値を超える量のウレアーゼを含んでいても構わない。
尿素定量用試薬とアンモニア定量用試薬における目的物質定量の好ましい方法は動力学的原理に基づいた方法である。定量用試薬の組成物中でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GLDH）は律速酵素なので、試薬中に含まれているGLDHの活性量が直線性のある測定結果を得るために非常に重要である。要求されるGLDH活性量は試薬系のpHによっても変化する。好適なGLDH活性は250−10000U/Lの範囲間で変化する。動物由来の市販GLDH製剤は通常不安定であり、NADHオキシダーゼ活性の高い混入物を含有し易いので、微生物由来の酵素が最も好ましい。尿素定量用試薬の好ましいGLDH活性は、pH8.50で、約500U/Lであり、アンモニア定量用試薬の好ましいGLDH活性は、pH8.50で、約8500U/Lである。
本発明の試薬は、補酵素還元システムや目的物質濃度の測定に必要なその他の必須の基質と酵素に加えて、保存剤、キレート剤、表面活性剤、蛋白質分解酵素阻害剤、緩衝剤、補足因子、抗菌剤等の、安定性促進機能を示し、かつ本発明の特徴に影響を与えない成分を含有することができる。
緩衝剤は、主に、選ばれたpHで、最小限の２価のカチオンとしか結合せずに良好な緩衝能力を持つことを第一の基準として選ばれる。AST定量用試薬とALT定量用試薬のpHと緩衝系は、トランスアミナーゼ類の測定についての国際臨床化学連合（IFCC）の勧告に従って選択される。大まかな基準は、ある緩衝剤のpKaが選ばれたpHから±1.0pH単位以内であればその緩衝剤は有効であると考えるというものである。本発明の試薬の好ましいpHは、30℃で７〜９である。アスパラギン酸トランスアミナーゼの至適触媒活性は、30℃でpHが約7.0〜8.2において見られる。AST定量用試薬の最適なpHは20℃で約8.1±0.1であるが、その理由は、このpHの範囲内ではNADHが安定であるからである。ALT定量用試薬では、最高触媒活性は、20℃で約7.3〜7.9のpH内に見られる。ALT定量用試薬の最も好ましいpHは20℃で約7.7である。ここに述べた好ましいpHにおいては、至適酵素活性と、酵素や補酵素の溶液中の安定性とが両立する。これより低いpHでは補酵素の分解が増加する。
尿素定量用試薬に用いられる緩衝剤系としては、pHが7.5〜9.5の範囲内でのTris緩衝液が使用可能と考えられるが、好ましくはpH8.50のTris緩衝液である。緩衝剤濃度としては20〜200mMの範囲内のTrisが使用可能であるが、効果的な緩衝能を持つ好ましい緩衝剤濃度は100mMである。この試薬系では、pHが7.5−8.5の範囲で有効な緩衝能力を示す広範囲な他の緩衝剤が使用できる。
アンモニア定量用試薬に用いられる緩衝剤系としては、TrisがpH7.5〜9.5の範囲内のいずれでも使用可能と考えられるが、好ましくはpH8.50〜9.0のTris緩衝液である。緩衝剤濃度としては20〜200mMの範囲内のTrisが使用可能であるが、効果的な緩衝能力を持つ好ましい緩衝剤濃度は100mMである。
AST定量用試薬及びALT定量用試薬に適した緩衝剤の例は、HEPES、４−モルホリンプロパンスルホン酸（MOPS）、２−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−エタンスルホン酸（TES）、ジメタノールアミン等のGOOD緩衝剤、トリシン、バイシン、TEA及びTAPS、TAPSO及びPOPSOである。本発明で用いられる好ましい緩衝剤はTRISであり、そのTRISの濃度は好ましくは30〜150mmol/L、より好ましくは約70〜100mmol/Lであり、約80mmol/Lが最も好ましい。緩衝剤濃度が高くなるに従い、AST活性の阻害は大きくなる。リン酸緩衝剤は、NADHの分解速度を増大させ、ピリドキサール−５−リン酸（Ｐ−５−Ｐ）とトランスアミナーゼのアポ酵素との会合を阻害するように思われる点に注目されたい。試験に用いられる試料は、所望により、脱イオン水や食塩水のような適当な希釈剤で希釈してもよい。アンモニア定量用試薬と尿素定量用試薬としては、上記したAST定量用試薬及びALT定量用試薬に適した緩衝剤に加えて、GOOD緩衝剤、CAPSO、CHES、AMPSOが挙げられる。
保存剤としては、アジ化ナトリウム（NaN3）、ヒドロキシ安息香酸、ゲンタミシン、チモール及びメチルイソチアゾロンベーリンガーマンハイム社製の水銀非含有保存剤類などが好適である。保存剤の適当な添加量は、２〜８℃で保存した時、少なくとも６〜８ヶ月は保存剤としての機能を保持し、試薬中に存在する酵素の活性を阻害することのない量である。この基準を満たす適当な範囲は、0.1〜1.0g/Lである。
EDTA、EGTA、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（HEDTA）等のような多種類のキレート剤が非特異的な安定剤としても好適である。本発明のAST定量用試薬及びALT定量用試薬において、EDTAは、２−オキソグルタル酸を安定化するために約2.0−10.0mmol/Lの濃度で好適に使用されてきた。この化合物は四ナトリウム塩としてもカリウム塩としても入手できるが、本発明で使用するには二ナトリウム塩が好ましい。尿素定量用試薬及びアンモニア定量用試薬においては、EDTAは0.2mMから10mMの範囲で用いられる。特に好ましいEDTAの濃度は1mMである。
酵素安定剤も本発明の試薬に添加することができる。好ましい安定剤はプロテアーゼ（蛋白質分解酵素）を含有しないウシ血清アルブミンである。そのほかの好適な例は、ウシγ−グロブリン、Ｎ−アセチルシステイン及びグリセリンである。
所望により適当な消泡剤を添加することができる。使用できる界面活性剤の例は、両性イオン性の界面活性剤及び非イオン性の界面活性剤であり、試薬中に存在する酵素を阻害しない量で使用される。
本発明の他の態様として、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中の目的物質を酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のトランスアミナーゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアラニンアミノトランスフェラーゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中の尿素を酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアンモニアを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供される。
本発明の方法においては、酵素と基質の組み合わせにおいて、基質に対する酵素の特異性が不完全であることによって、酵素と基質の反応速度は遅いものである。
本発明の好ましい態様において、補酵素還元システムに含まれる酵素と基質の組み合わせにおける互いの特異性は、酵素の本来の基質に対する特異性を100％とした場合、50％未満であることが好ましく、更には10％未満であることが好ましい。より好ましくは、酵素と基質の組み合わせにおける互いの特異性は５％未満であることが好ましく、約２％であることが最も望ましい。
補酵素、基質及び酵素は、本発明の試薬に関する上記の説明どおり、定量すべき目的物質に応じて適宜に選択される。本発明のこの態様において、目的物質の定量測定に用いられる補酵素還元システムの成分として好ましいものは、NADH、Ｇ−６−Ｐ−DHおよびＤ−グルコースであり、次のような補酵素再生反応を起こす。
0003588124.tif 000017
Ｄ−グルコースに対するＧ−６−Ｐ−DHの基質特異性が低いため、この補酵素再生反応の速度は遅く、従って目的物質の定量に関わる主反応と競合しない。
好適な実施態様
本発明の１つの好ましい態様によれば、ALT定量用試薬は、本質的に下記の成分で構成される：
0003588124.tif 000018
また、好ましくは、TRIS緩衝液、TRIS−HCl、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含んでもよい。
本発明における処方によるALT定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000019
特に、本発明における処方による好ましいALT定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000020
本発明の１つの好ましい態様によれば、AST定量用試薬は、本質的に下記の成分で構成される：
0003588124.tif 000021
また、好ましくは、TRIS緩衝液、TRIS−HCl、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含んでもよい。
本発明における処方によるAST定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000022
特に、本発明における処方による好ましいAST定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000023
本発明の１つの好ましい態様によれば、尿素定量用試薬は、本質的に下記の成分で構成される：
0003588124.tif 000024
本発明における処方による尿素定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000025
特に、本発明における処方による好ましい尿素定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000026
本発明の１つの好ましい態様によれば、アンモニア定量用試薬は、本質的に下記の成分で構成される：
0003588124.tif 000027
また、好ましくは、TRIS緩衝液、TRIS−HCl、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、ADP−Ｋ、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含んでもよい。
本発明における処方によるアンモニア定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000028
特に、本発明における処方による好ましいアンモニア定量用試薬は、下記の通りである。
0003588124.tif 000029
本発明の試薬は、一液型の形態で調製することが好ましいが、二液型の形態で調製することもできる。補酵素の再生に関する成分は、１本のバイアルのみに配合されればよい。特に、IFCCは、ALT定量用試薬及びAST定量用試薬について、組成の内、２−オキソグルタル酸を他の成分とは別にして調製することを奨励している。試薬Ａ（２−オキソグルタル酸を含んでいない）を、患者から採取したサンプルと共に５〜10分間インキュベートし、副反応を全て完結させた後、２−オキソグルタル酸を加えて主反応を開始することができる。２−オキソグルタル酸が存在することによって、副反応の間にAST及びALTが不活性化しないよう保護するので、主反応の開始成分として、２−オキソグルタル酸の代わりにアスパラギン酸又はアラニンを同様にして使用することもできる。適合しない酵素と基質の組み合わせで構成される再生システムは、二液型の成分のうちのNADHを含む方へ導入するべきである。二液型試薬の場合、試料の存在下でＰ−５−Ｐを血清に添加することによって、インキュベーションの間にアポ酵素が活性化されるので、Ｐ−５−Ｐで完全に飽和された状態で血清中のAST及びALTの全触媒活性濃度を測定できる。従って、組成中にＰ−５−Ｐが含まれることが奨励される。二液型試薬に使用するＰ−５−Ｐ濃度は、約80−120μmol/Lが好ましく、100μmol/Lがより好ましい。
実施例１
本発明における処方による４種類の定量用試薬の安定性を、下記のように試験した。
処方：
AST定量用試薬：
0003588124.tif 000030
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ALT定量用試薬：
0003588124.tif 000032
0003588124.tif 000033
保存条件：
蓋をして冷蔵（２〜８℃）する。
分光光度測定パラメータ（機種:Shimadzu PC2101）：
・反応温度                                    37℃
・サンプル：試薬（体積比）              1:10〜1:25
・波長                                       340nm
・キュベットの光路長                           1cm
測定の遅滞時間（lag phase）はおよそ１分以下で、測定時間は遅滞時間後から３分以内である。
これらの分光光度測定パラメータは、下記の値を求める際に用いた：
・340nmでの試薬の初期吸光度
・20℃での再生速度（単位:Abs/min）。
コントロール標準の測定値を求めるために、コバス・ミラ（Cobas Mira）を使用した。
下記の結果が得られた。
0003588124.tif 000034
0003588124.tif 000035
下記の表（表10A及び表10B）より、AST定量用試薬とALT定量用試薬の両方について、７ヶ月に渡り、定量用試薬としての機能が保持されていることが分かる。各試験において、血清中のAST及びALT濃度の高いものと低いものについて、新たに調製した試薬と、８℃で各々の期間保存した試薬の両方を使用した。
0003588124.tif 000036
0003588124.tif 000037
0003588124.tif 000038
0003588124.tif 000039
上記の結果から、補酵素再生式AST定量用試薬及びALT定量用試薬は、蓋をして２〜８℃で保存した場合、少なくとも６〜７ヶ月は安定であることが分かる。試薬が機能するためには、初期の吸光度が1.0Aでなければならない。７ヶ月後も、まだ試薬の吸光度は少なくとも1.0Aとなる。
表10A及び表10Bの結果より、保存前の新しい試薬によるコントロール血清の測定値と、８℃で29週間にわたって保存した試薬の測定値との間に、顕著な差異がないことが明らかである。また、表11A及び表11Bの結果より、補酵素再生技術を導入したAST定量用試薬及びALT定量用試薬は、８℃で31週間の保存の後もまだ、試験結果が直線性を示し得る。
本発明で用いる再生システムを導入することによって、蓋をして２〜８℃で１ヶ月から、２〜８℃で少なくとも６〜８ヶ月間保存した、血清中のAST及びALT定量用試薬の、再構成後の安定性が増加した。
実施例２
尿素定量用試薬は、処方中のNADH濃度を0.33mMとしたこと及び試薬のうちの一方についてＤ−グルコースの濃度を20mMに下げたことを除き、表5Bに示す成分により調製した。従って、処方された試薬のpHは8.5であった。コントロールとして従来の処方の尿素定量用試薬を用いた。各試薬には、不純物として0.15mM（最終濃度）のアンモニアを混入した。この濃度のアンモニアは、各々の試薬においてNADPH  0.15mM（340nmにおける吸光度単位0.93に相当）を消費するのに十分である。反応完了後（即ち、試薬処方中のアンモニアの除去後）、島津製作所製分光光度計を用い、20℃で340nmにおける種々の溶液（密封キュベット中）の吸光度を測定した。
図１に示した結果は、アンモニア0.15mM混入後の本発明の尿素定量用試薬におけるNAD+からNADHへの経時的な再生を示している。
図１において、
パネルＡは、従来の尿素定量用試薬におけるNADH再生を示している。
パネルＢは、リン酸ナトリウム5mM、Ｇ−６−PDH  2000U/L及びＤ−グルコース20mMを含有する尿素定量用試薬におけるNADHの再生を示している。
パネルＣは、リン酸カリウム5mM,G−６−PDH  2000U/L及びＤ−グルコース100mMを含有する尿素定量用試薬におけるNADHの再生を示している。
従来の試薬では、試薬にアンモニアを混入させた後、20℃で48時間経過しても、消費されたNADHは全く再生されなかった。
同一時間経過後、Ｄ−グルコース20mMを含有する本発明の尿素定量用試薬は、0.23吸光度単位，即ち0.04mMのNADHが再生された。
48時間経過後、Ｄ−グルコース100mMを含有する本発明の尿素定量用試薬は、0.70吸光度単位、即ち0.11mMのNADHが再生された。
これらの結果は、前記の尿素定量用試薬が、アンモニアの混入による試薬中のNADHの消費を克服する能力を有することを示している。
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各々の尿素定量用試薬におけるNADH再生の最大速度を、表12に示す。従来の尿素定量用試薬においては、混入したアンモニアの除去により、吸光度は経時的に緩やかに減少したが、本発明の処方においては、NADHの再生速度は試薬中のＤ−グルコースの濃度の増加に伴って増加した。
試薬のpH値が8.0〜9.3の範囲となるよう、TRIS/TRIS−HCl緩衝液の比率（緩衝液の全濃度100mM）を種々変更したことを除いて、アンモニア定量用試薬を、上記表6Bに示すような成分を用いて調製した。また、アンモニア定量用試薬におけるNADPHの最終濃度0.2mMとした。また、コントロール用のアンモニア定量用試薬として、Ｄ−グルコース，リン酸カリウム及びＧ−６−PDHを加えない溶液も調製した。試薬には、アンモニア0.1mM（最終濃度）を混入した。この濃度のアンモニアの混入は、各々の試薬において0.1mMのNADPH（340nmにおける吸光度単位0.62に相当）を消費するのに十分である。反応完了後（即ち、試薬処方中のアンモニアの除去後）、島津製作所製分光光度計を用い、20℃で340nmにおける種々の溶液（密封キュベット中）の吸光度を測定した。
図２に示した結果は、アンモニア0.1mM混入後の、本発明の、pH8.0〜9.3の間のアンモニア定量用試薬におけるNADP+からのNADPHへの経時的な再生を示している。
NADPHの再生は、アンモニア混入後、20℃、24時間以内に完了した。各々のアンモニア定量用試薬におけるNADPH還元の最大速度を表13に示す。pH8.0である従来のアンモニア定量用試薬においては、溶液の吸光度は0.6〜0.65の間にとどまり、しかも徐々に減少した。本発明の処方では、全てのpH値においてNADPHの再生速度はほとんど同一であった。NADPHの再生速度が最大となるのはpH8.50の試薬であった。
これらの結果は、前記のアンモニア定量用試薬が、アンモニアの混入による試薬中のNADPHの消費を克服する能力を有することを明確に示している。
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実施例３
アンモニア及び尿素定量用試薬中のNAD（Ｐ）Ｈ損失速度
Ａ  尿素定量用試薬
尿素定量用試薬は、表5Bに示すような処方により調製したが、以下のような点を変更した。
NADHの最終濃度を、0.25mMとした。尿素定量用試薬のpH値は、TRIS/TRIS−HClの混合比を変えることにより調整した（緩衝液濃度100mM）。コントロール用尿素定量用試薬として、Ｄ−グルコース、リン酸塩及びＧ−６−PDHを加えない溶液も調製した。
20±２℃で、密閉されたキュベットで保存された試薬のサンプル溶液の340nmにおける吸光度をモニターした。
20±２℃で一定時間モニターした、尿素定量用試薬の340nmにおける吸光度の減少を、表14に示す。
補酵素還元システムが存在するか否かに関わらず、pH8.5の試薬溶液と比較して、pH8.0の試薬溶液の吸光度はより急速に減少することが明白である。しかし、本発明の処方においては、試薬の吸光度の減少速度も又、かなり低下した。言い換えれば、pHを高め、補酵素還元システムを導入することにより、尿素定量用試薬中のNADPHの消失速度をかなり下げる事ができる。
試薬のpHを8.5以上に上げることにより、NADHの安定性は向上するが、試薬中の市販のウレアーゼやグルタミン酸デヒドロゲナーゼの安定性や活性が低下してゆくことに注意すべきである。従って、十分な酵素活性や安定性を維持しつつ、適切なNADHの安定性を確保するためには、適切な試薬のpHを選択する必要がある。このことから、試薬の処方はおよそpH8.5が好ましい。
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Ｂ  アンモニア定量用試薬
アンモニア定量用試薬は、表6Bに示すような処方により調製したが、以下のような点を変更した。
NADPHの最終濃度を、0.2mMとした。アンモニア定量用試薬のpH値は、TRIS/TRIS−HClの混合比を変えることにより調整した（緩衝液濃度100mM）。コントロール用アンモニア定量用試薬として、Ｄ−グルコース、リン酸塩及びＧ−６−PDHを加えない溶液も調製した。
20±２℃で、密閉されたキュベットで保存された試薬のサンプル溶液の340nmにおける吸光度をモニターした。
20±２℃で一定時間モニターしたアンモニア定量用試薬の340nmにおける吸光度の減少を、表15に示す。
補酵素還元システムが存在するか否かに関わらず、pHの低下に伴い、溶液の吸光度がより急速に減少することは明白である。しかし、本発明の処方においては、試液の吸光度の減少速度も又、かなり低下した。言い換えれば、pHを高め、補酵素還元システムを導入することにより、アンモニア定量用試薬中のNADPHの消失速度をかなり下げる事ができる。
試薬のpHを上げることにより、NADPHの安定性は向上するが、pHを8.5以上に上げると試薬中の市販のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの安定性や活性が低下してゆくことに注意すべきである。従って、十分な酵素活性や安定性を維持しつつ、適切なNADPHの安定性を確保するためには、適切な試薬のpHを選択する必要がある。このことから、試薬の処方はpH8.5−9.5が好ましい。
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実施例４
アンモニアおよび尿素試薬の機能性
Ａ  尿素定量用試薬
尿素定量用試薬は、表5Bにまとめた組成に従い、Ｄ−グルコース、リン酸塩およびＧ−６−PDHを含有する試薬及び含有しない試薬をそれぞれ調製した。しかし、いずれの試薬構成においても、NADHの最終的濃度は0.25mMとした。試薬を用いた際に測定値の直線性を、Verichem  Levelが正常値のサンプルと異常値のサンプルをROCHE▲Ｒ▼  COBAS  MIRATMで測定した結果と比較した。測定は下記特定のパラメーターを用いて行なわれた。
反応温度:37℃
試料と試薬の容量比:1:100
波長:340nm
表16に示した結果から、本発明の尿素定量用試薬は、pH8.50において、試検に用いられた最も高い尿素値を示する試料（Verichem  level  E,37.4mMの尿素）においても測定値は直線性を示し、特定の試料濃度における測定値の変動は５％以内であることがわかった。更に、本発明の尿素定量用試薬は、正常値のサンプルおよび異常値のサンプルのいずれの測定においても、測定値の変差は誤差範囲内であった。
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Ｂ  アンモニア試薬
アンモニア試薬は表6Bにまとめた組成に従い、Ｄ−グルコース、リン酸塩およびＧ−６−PDHを含有する試薬及び含有しない試薬をそれぞれ調製した。試薬を用いた際に得られる測定値の直線性を、アンモニア水溶液を、ROCHE▲Ｒ▼  COBAS  MIRATMで測定した結果と比較した。測定は下記特定のパラメーターを用いて行なわれた。
反応温度:37℃
試料と試薬の容量比:1:10
波長:340nm
表17に示した結果から本発明のアンモニア定量用試薬は、pH8.50において、試検に用いられた最も高いアンモニア値を示す試料（1200μＭのアンモニア）においても測定値は直線性を示し、特定の試料濃度における測定値の変動は５％以内であった。
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実施例５
尿素定量用試薬は、下記の処方に従って二液型に調製することができる。混合試薬を得るために必要なＡ液試薬とＢ液試薬の添加の相対量は、Ａ液:B液として5:1である。
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アンモニア定量用試薬、二液型
アンモニア定量用試薬は、下記の処方に従って二液型に調製することができる。
混合試薬を得るために必要なＡ液試薬とＢ液試薬の添加の相対量は、Ａ液:B液として5:1である。ここで提供する処方例においては、NADHがNADPHの代りに用いられている。従って、主分析反応の開始の前に、干渉患者試料中のピルビン酸を除去する目的でLDHがＡ液に含まれている。
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本発明の試薬と方法の他の主要な優位性は、試薬の最も好ましい形態が一液型試薬であることであり、それにより保存場所を減らし、かつ従来の試薬における在庫に関する問題を解消することができる点である。さらに、本発明の試薬は様々な測定方法に適応することができる。
本発明の試薬と方法において、補酵素の再生を遅らせるために用いることが可能な非特異的な基質と酵素の組み合わせはぼう大に存在することを認識しなければならない。ここに記載したもの以外にも商品として入手できないものや法外に高価なものがある。
また、本発明はAST、ALT、アンモニアおよび尿素以外の目的物質、たとえばLDH（ピルビン酸を乳酸に変換する）、トリグリセリド類、およびサリチル酸の定量に用いられる試薬の安定化に適応可能である。本発明は、本明細書中の例示によって、AST、ALT、アンモニアおよび尿素の定量用試薬及び定量方法として制限されるものではない。
【図１】
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【図２】
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