(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
0003603164.tif 000007
〔式中、Ｇ−ＯＨはグルコースである。Ｒは水素原子又はメチル基を示す。ｍは１を示す。ｎは２を示す。〕で表される糖含有重合性構成単位のホモポリマーに酵素を共有結合してなる酵素複合体。
【請求項２】
酵素がリパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれるいずれか１種である請求項１に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
酵素を不溶性担体に担持ないしはイオン結合や共有結合により固定化することによって複合化し、活性を安定的にかつ長期にわたって利用することが試みられている。このため、各種の複合化担体が酵素活性との相関から検討されている。
【０００３】
無機系の担体としては、例えば多孔性アルキルアミンガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ社）が挙げられる。また、有機系担体としては、セルロース、デキストラン、アガロース等の天然多糖誘導体、及び、ポリアクリルアミド、スチレン系誘導体、無水マレイン酸系重合体、ナイロンチューブ、ポリアクリロニトリルなどの合成系担体が報告もしくは市販されている（「固定化酵素」千畑一郎編、講談社、１９７５年、１１〜１４頁）。
【０００４】
しかしながら、無機系の担体では十分な酵素活性を発揮するだけの複合化、すなわち単位重量当たりの酵素結合量が十分でない場合が少なくない。また、合成高分子系担体の場合、一般に担体の親水性が乏しく、酵素並びに酵素反応によって生成した生体関連物質が非特異的に担体に吸着され、目的である酵素活性の長期間維持が困難である。
【０００５】
一方、多糖類の担体は親水性の官能基を有しており、酵素反応が本来水の存在下において実施されることから前２者が有する欠点は回避されるが、天然物であるが故に素材の均質性に難点があり、再現性が得られにくい欠点を有していた。また、多糖類は一般に広く存在するグリコヒドロラーゼによって容易に分解されるという欠点を有する。
【０００６】
上記の欠点を解消する方法として、特開平５−１３７５７０号公報には、骨格であるビニルポリマーにサッカライドが直接結合した構造を有するポリビニルサッカライドの糖残基に、酵素を共有結合したサッカライド−蛋白質複合体が開示されている。しかしながら、該複合体は酵素の安定化効果が不十分であった。
【０００７】
本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その目的とするところは、遊離の酵素と同等以上の酵素活性が長期にわたって保持される酵素複合体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、活性な水酸基を有しないスペーサーを介して糖残基をポリオレフィン系の骨格に結合した糖含有ポリマーに酵素を共有結合することにより、酵素活性と保存安定性がさらに改良されることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）
【００１０】
【化２】
0003603164.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｇ−Ｏ−は、保護基を有しない糖残基を示す。Ｒは水素原子又はメチル基を示す。ｍは１又は２を示す。ｎは１〜８の整数を示す。〕で表される糖含有重合性構成単位１〜１００モル％及びオレフィン系重合性構成単位９９〜０モル％からなる糖含有ポリマーに酵素を共有結合してなる酵素複合体を提供するものである。
【００１２】
一般式（１）の化合物において、Ｇ−Ｏ−は、保護基を有しない糖残基を表し、Ｇ−ＯＨとして、グルコース、マンノース、ガラクトースなどの単糖、マルトース、ラクトース、セロビオースなどの２糖、マルトトリオースなどの３糖が挙げられる。
【００１３】
ｎは、１〜８の整数好ましくは２又は３である。
【００１４】
ｍは、１又は２、好ましくは１を示す。
【００１５】
Ｒは、水素原子又はメチル基、好ましくはメチル基である。
【００１６】
オレフィン系重合性構成単位は、オレフィン系モノマーと一般式（２）
【００１７】
【化３】
0003603164.tif 000003
【００１８】
〔式中、Ｇ−Ｏ−、Ｒ、ｍ及びｎは前記に同じ〕で表される糖含有モノマーとの共重合に使用されるオレフィン系モノマーに由来する。該オレフィン系モノマーとしては、（メタ）アクリル酸及びその塩、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が例示される。
【００１９】
糖含有重合性構成単位とオレフィン系重合性構成単位の比率は、糖含有重合性構成単位：オレフィン系重合性構成単位＝１モル％〜１００モル％：９９モル％〜０モル％、好ましくは１０〜１００モル％：９０〜０モル％、最も好ましくは１００モル％：０モル％、すなわち、糖含有モノマーのホモポリマーが最も好ましい。
【００２０】
好ましい糖含有モノマーとして、グルコシルオキシエチルメタアクリレート（ｓｕｃｒａｐｈ−ＧＥＭＡ；日本精化株式会社製）、グルコシルオキシエチルメタアクリレート（例えば、ｓｕｃｒａｐｈ−ＧＥＡ；日本精化株式会社製）、グルコシルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グルコシルオキシブチル（メタ）アクリレート、グルコシルオキシオクチル（メタ）アクリレートが挙げられる。
【００２１】
本発明の糖含有ポリマーの分子量は、１万〜５００万、好ましくは２万〜２００万である。
【００２２】
本発明の酵素複合体に用いられる糖含有ポリマーは上記糖含有モノマー（及び必要に応じてオレフィン系モノマー）と重合開始剤とを希釈剤に溶解し、−１０〜１００℃の温度下に０．５〜２０時間程度反応させる。重合開始剤としては、アセチルパーオキシド、ベンゾイルパーオキシドなどの有機過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチロアミドなどのアゾ化合物、過硫酸アンモニウムなどの既知ラジカル発生触媒がいずれも使用できる。
【００２３】
上記希釈剤は、重合が円滑に進行するために添加するものであり、上記単量体を溶解する有機溶媒がいずれも使用可能である。具体的には、酢酸エチル、メチルエチルケトン、水、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキサイド、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられ、これらを単独で、又は２種以上を混合して用いる。その使用量は特に限定されないが、単量体１重量部に対して１〜１０重量部の割合であるのが好ましい。
【００２４】
上記の方法で得られた重合体溶液を重合体が不溶でかつ希釈剤が溶解する有機溶媒にそそぎ込み、得られた沈殿を分離するか、重合体溶液を凍結乾燥することにより、本発明の酵素複合体調製用の糖含有ポリマーが得られる。
【００２５】
本発明の酵素複合体を得るためには、上記糖含有ポリマーの糖水酸基に、酵素を直接またはスペーサーを介して結合させる。複合化されうる酵素としては、例えばプロテアーゼ類、マンナナーゼ類、アミラーゼ類、グルコシダーゼ類、リパーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
これら酵素を糖水酸基へ共有結合し、固定化する方法としては、従来公知の方法がいずれも用いられる。具体的には、アルカリ性下で糖含有ポリマーをＣＮＢｒにより処理して活性化した後、酵素を作用させて結合させる方法、ＣＮＢｒに代えて１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム−テトラフルオロボレート（ＣＡＤＰ−ＢＦ４）を用いる方法、塩化シアヌルを用いる方法、アミノカルボン酸などの分子の両末端に糖の水酸基及び酵素との反応が可能な官能基を有するスペーサーを用いる方法がある。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の複合体は、糖残基と（メタ）アクリレートを−（ＣｎＨ２ｎＯ）ｍ−（ｎ、ｍは前記に同じ）で表される基を介して結合することで、糖残基と（メタ）アクリレート直接結合するのと比較して、酵素活性及び保存安定性をさらに高めることができる。
【００２８】
酵素の固定化により、通常は活性の低下がみられるが、本発明の酵素複合体は酵素活性はほとんど低下せず、遊離の酵素よりも酵素活性が上昇する場合もあり、しかも高い熱安定化効果を示す。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の実施例につき説明する。
【００３０】
実施例１
カタラーゼ剤（エンチロンＯＬ−５０Ｌ、５００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてポリグルコシルオキシエチルメタクリレート（日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を調製した。
【００３１】
具体的には、ポリグルコシルオキシエチルメタアクリレート（ｐ−ＧＥＭＡ；分子量９８万、日本精化株式会社製）２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００３２】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にカタラーゼ剤（０．５ｇ、２５０００Ｕ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌをイオン交換水２０Ｌに対して２０分間透析した。こうして、１０５Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化カタラーゼ液１８６ｍｌを得た（活性回収率７８％）。
【００３３】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化カタラーゼの酵素性質を図１に示す。
【００３４】
本発明の固定化カタラーゼは、未固定カタラーゼと比較して温度残存活性曲線及び作用ｐＨ曲線の結果は同等であり、作用温度は拡大することが明らかになった。
【００３５】
実施例２
β−１，４マンナナーゼ（商品名ピガラーゼＭ−５０、５００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてｐ−ＧＥＭＡ（分子量９８万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００３６】
具体的には、ｐ−ＧＥＭＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００３７】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にβ−１，４マンナナーゼ１ｇを溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌを０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０Ｌに対して一晩透析した。こうして、２００Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化β−１，４マンナナーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率７４％）。
【００３８】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化β−１，４マンナナーゼの酵素性質を図２に示す。
【００３９】
本発明の固定化β−１，４マンナナーゼは、未固定β−１，４マンナナーゼと比較して作用ｐＨ曲線及び作用温度曲線の結果は同等であり、熱安定性が向上することが明らかになった。
【００４０】
実施例３
プロテアーゼ（商品名エンチロンＡＳＮ−３０、３００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてｐ−ＧＥＭＡ（分子量４２万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００４１】
具体的には、ＧＥＭＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００４２】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にプロテアーゼ剤（１ｇ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌを０．０５Ｍ炭酸ほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）２０Ｌに対して６０分間透析した。こうして、１６８Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率１０４％）。
【００４３】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化プロテアーゼの酵素性質を図３に示す。
【００４４】
本発明の固定化プロテアーゼは、未固定プロテアーゼと比較して作用ｐＨ曲線及び作用温度曲線の結果は同等であり、熱安定性が向上することが明らかになった。
【００４５】
実施例３−１
酵素の固定化剤であるＣＮＢｒ（３ｇ）に代えてＣＤＡＰ−ＢＦ４（３ｇ）を用いた以外は実施例３の操作を繰り返し、１７３Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ（分子量４２万）固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率１０７％）。
【００４６】
実施例４
リボプロティンリパーゼ（商品名エンチロンＬＰ、１０００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてｐ−ＧＥＭＡ（分子量４２万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００４７】
具体的には、ｐ−ＧＥＭＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００４８】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にリボプロティンリパーゼ剤（０．５ｇ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌをイオン交換水２０Ｌに対して２０分間透析した。こうして、２８２Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化リボプロティンリパーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率１０５％）。
【００４９】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化リボプロティンリパーゼの酵素性質を図４に示す。
【００５０】
本発明の固定化リボプロティンリパーゼは、未固定リボプロティンリパーゼと比較して作用ｐＨ及び作用温度が拡大し、熱安定性も向上することが明らかになった。
【００５１】
実施例５
セルラーゼ剤（商品名エンチロンＣＢ、４００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてｐ−ＧＥＭＡ（分子量４２万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００５２】
具体的には、ｐ−ＧＥＭＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００５３】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にセルラーゼ剤（０．５ｇ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌをイオン交換水２０Ｌに対して２０分間透析した。こうして、８６Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化セルラーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率８０％）。
【００５４】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化セルラーゼの酵素性質を図５に示す。
【００５５】
本発明の固定化セルラーゼは、未固定セルラーゼと比較して作用ｐＨ、作用温度及び熱安定性が同等以上であることが明らかになった。なお、酵素活性はＣＭＣａｓｅ活性を測定した。
【００５６】
実施例６
精製パパイン（商品名ラクトーパパイン、１０００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製）をＣＮＢｒ法にてｐ−ＧＥＭＡ（分子量９８万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００５７】
具体的には、ｐ−ＧＥＭＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＭＡ液１８５ｍｌを得た。
【００５８】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）に精製パパイン剤（０．５ｇ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌをイオン交換水２０Ｌに対して２０分間透析した。こうして、２６８Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＭＡ固定化パパイン１８６ｍｌを得た（活性回収率１００％）。
【００５９】
得られたｐ−ＧＥＭＡ固定化パパインの酵素性質を図６に示す。
【００６０】
本発明の固定化パパインは、未固定パパインと比較して保存安定性が向上したことが明らかになった。
【００６１】
実施例７
α−アミラーゼ（商品名ラクトーゼＳＭＴ、２５０００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属起源）をＣＮＢｒ法にてポリグルコシルオキシエチルアクリレート（ｐ−ＧＥＡ、分子量３９万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００６２】
具体的には、ｐ−ＧＥＡ  ２ｇを０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９．５）１８０ｍｌに溶解し、４℃に冷却した。さらに、アセトニトリル５ｍｌ中にＣＮＢｒを３ｇ溶かした溶液を加えて、４℃に保持しながら３０分間撹拌した。次いで、該反応液（１８５ｍｌ）をセロハンチューブで透析し、ＣＮＢｒ活性のｐ−ＧＥＡ液１８５ｍｌを得た。
【００６３】
次に、２０ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）にα−アミラーゼ剤（１ｇ）を溶かし、全量を上記調製の活性ＣＮＢｒ液１８５ｍｌに加え、温度１５℃にて１２０分間撹拌混合した。その後、本混合液１８６ｍｌをイオン交換水２０Ｌに対して２０分間透析した。こうして、９７Ｕ／ｍｌのｐ−ＧＥＡ固定化アミラーゼ１８６ｍｌを得た（活性回収率７２％）。
【００６４】
得られたｐ−ＧＥＡ固定化アミラーゼの酵素性質を図７に示す。
【００６５】
本発明の固定化アミラーゼは、未固定アミラーゼと比較して熱安定性が向上したことが明らかになった。
【００６６】
実施例８
プロテアーゼ（商品名エンチロンＡＳＮ−３０、３００００Ｕ／ｇ、洛東化成工業株式会社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属起源）を塩化シアヌル法にてｐ−ＧＥＡ（分子量３９万、日本精化株式会社製）と共有結合し、水溶性の固定化酵素を作製した。
【００６７】
具体的には、ｐ−ＧＥＡ（１．０ｇ）を５０ｍｌの水に溶解した。これに室温で水−アセトン混合溶媒（体積比１：２５）３５ｍｌに溶解した１，３，５−トリクロロトリアジン（塩化シアヌル）１ｇをｐＨ８〜１１に調整しながら８分間で滴下した。ｐＨの調整は１Ｎ  ＮａＯＨを用いて行った。
【００６８】
滴下終了後、０．１Ｎ  ＨＣｌを加え、ｐＨを３に調整した。これをアセトン５００ｍｌ中に加え、析出した結晶を濾過し、アセトン洗浄して活性化重合体を得た。
【００６９】
次に、プロテアーゼ５００ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）１０ｍｌに溶解し、これに上記活性化重合体０．５ｇを加え、４℃にて２４時間反応させた。この反応液を限外濾過により精製し、さらにこれを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）で希釈して全量を１００ｍｌとし、固定化プロテアーゼ溶液とした。固定化プロテアーゼ溶液は、１４０Ｕ／ｍｌであった（活性回収率９３％）。
【００７０】
参考合成例１
１−メタクリルアミド−１−デオキシマルチトールの重合
特開平５−１３７５７０号の例８に記載の方法に準じて標記重合反応を行った。
【００７１】
すなわち、１−メタクリルアミド−１−デオキシマルチトール１５ｇを蒸留水７０ｍｌに溶解した。この溶液に過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）４０ｍｇを添加し、窒素ガス気流中撹拌下に５０℃で１２時間反応させた。反応終了後、反応液を１リットルのアセトンに投入し、析出した白色沈殿を濾取し、アセトンで洗浄した後減圧乾燥した。得られた白色沈殿を１００ｍｌの蒸留水に溶解し、これを１リットルのアセトンに投入した。析出した沈殿を濾取し、減圧乾燥して９．５ｇのポリ（１−メタクリルアミド−１−デオキシマルチトール）を得た。該ポリマーの分子量は４０万であった。以下、得られたポリマーを「比較重合体−１」と略す。
【００７２】
参考合成例２
１−メタクリルアミド−１−デオキシソルビトールの重合
特開平５−１３７５７０号の例８に記載の方法に準じて標記重合反応を行った。
【００７３】
すなわち、１−メタクリルアミド−１−デオキシソルビトール１０ｇを蒸留水７０ｍｌに溶解した。この溶液に過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）４０ｍｇを添加し、窒素ガス気流中撹拌下に５０℃で１２時間反応させた。反応終了後、反応液を１リットルのアセトンに投入し、析出した白色沈殿を濾取し、アセトンで洗浄した後減圧乾燥した。得られた白色沈殿を１００ｍｌの蒸留水に溶解し、これを１リットルのアセトンに投入した。析出した沈殿を濾取し、減圧乾燥して９．５ｇのポリ（１−メタクリルアミド−１−デオキシマルチトール）を得た。該ポリマーの分子量は４２万であった。以下、得られたポリマーを「比較重合体−２」と略す。
【００７４】
比較例１及び２
実施例３において、ｐ−ＧＥＭＡに代えて比較重合体−１又は比較重合体−２を用いた以外は、実施例３の操作を繰り返し、ＣＮＢｒ法により比較重合体−１については１２５Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを、比較重合体−２については１１８Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを各々得た。活性回収率は、各々７８％（比較重合体−１）、７３％（比較重合体−２）であった。
【００７５】
比較例３及び４
実施例３−１において、ｐ−ＧＥＭＡに代えて比較重合体−１又は比較重合体−２を用いた以外は、実施例３−１の操作を繰り返し、ＣＤＡＰ−ＢＦ４法により比較重合体−１については１３０Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを、比較重合体−２については１１８Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１８６ｍｌを各々得た。活性回収率は、各々８１％（比較重合体−１）、７３％（比較重合体−２）であった。
【００７６】
比較例５及び６
実施例８において、ｐ−ＧＥＡに代えて比較重合体−１又は比較重合体−２を用いた以外は、実施例８の操作を繰り返し、塩化シアヌル法により比較重合体−１については１０８Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１００ｍｌを、比較重合体−２については１０３Ｕ／ｍｌの固定化プロテアーゼ１００ｍｌを各々得た。活性回収率は、各々７２％（比較重合体−１）、６９％（比較重合体−２）であった。
【００７７】
試験例１
実施例３及び比較例１及び２で得られた３種の固定化プロテアーゼを実施例３と同一条件で熱安定性試験を実施した。７０℃で６０分間熱処理した後の残存活性率を表１に示す。
【００７８】
【表１】
0003603164.tif 000004
試験例２
実施例３−１及び比較例３及び４で得られた３種の固定化プロテアーゼを試験例１と同一条件で熱安定性試験を実施した。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
0003603164.tif 000005
試験例３
実施例８及び比較例５及び６で得られた３種の固定化プロテアーゼを試験例１と同一条件で熱安定性試験を実施した。結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
0003603164.tif 000006
上記の結果から、高分子主鎖と糖残基の間に活性な水酸基をもたないスペーサーを有する本発明の酵素複合体は、活性な水酸基を持つスペーサーを有する公知の複合体と比較して明らかに酵素の熱安定性を改善することが明らかになった。
【００８１】
なお、図１〜図７中、●は未固定酵素の結果を示し、○は、本発明の固定化酵素の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】カタラーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び温度残存活性曲線を示す。
【図２】β−１，４マンナナーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び熱安定性曲線を示す。
【図３】プロテアーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び熱安定性曲線を示す。
【図４】リボプロティンリパーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び熱安定性曲線を示す。
【図５】セルラーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び熱安定性曲線を示す。
【図６】精製パパインについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び保存安定性曲線を示す。
【図７】α−アミラーゼについての作用ｐＨ曲線、作用温度曲線及び熱安定性曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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