(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組成物を含有する層を少なくとも１層含むイムノアッセイ要素。
【請求項２】
順に（Ａ）標識されたリガンドを含有する層、（Ｂ）ビーズ展開層、（Ｃ）架橋された親水性ポリマー層及び（Ｄ）支持体を含む、リガンドを検定するための乾式イムノアッセイ分析要素であって、
（１）前記（Ｂ）層と（Ｃ）層との界面における帯域（レセプターゾーン）に、前記標識されたリガンドに対する固定化レセプターが一定濃度で配置されており、
（２）前記レセプターは、前記（Ｂ）層におけるビーズよりも小さな高分子ビーズに共有結合されることによって固定化されており、そして
（３）前記帯域はさらに、（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組成物を含む乾式イムノアッセイ分析要素。
【請求項３】
順に（Ａ）標識されたリガンドを含有する層、（Ｂ）ビーズ展開層、（Ｃ）架橋された親水性ポリマー層及び（Ｄ）支持体を含む、リガンドを検定するための乾式イムノアッセイ分析要素であって、
前記ビーズ展開層が、
（１）粒径２０〜３５μｍのビーズを含有し、
（２）前記標識されたリガンドに対するレセプターを一定濃度で含有し、
（３）前記レセプターは、前記（１）におけるビーズよりも小さな高分子ビーズに共有結合されることによって固定化されており、そして
（４）（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組成物を含む乾式イムノアッセイ分析要素。
【請求項４】
前記ロイコ色素が４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の要素。
【請求項５】
ジメドン、ポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕コポリマー及び約１０個の重合グリシドール反復単位を有するイソノニルフェノキシポリ（グリシドール）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の要素。
【請求項６】
４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール、ジメドン、ポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕コポリマー及び約１０個の重合グリシドール反復単位を有するイソノニルフェノキシポリ（グリシドール）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の要素。
【請求項７】
水性液体試料中の免疫学的反応性リガンドを検定する方法であって、
Ａ．標識されたリガンドが酵素標識リガンドである請求項１〜３のいずれか一項に記載のリガンドを検定するための乾式イムノアッセイ分析要素を提供する工程；
Ｂ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記液体試料を接触させることにより（１）固定化されたリガンド−レセプター複合体及び（２）固定化された酵素標識リガンド−レセプター複合体の少なくとも一方を形成する工程；
Ｃ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記リガンドに対する基質の溶液を接触させることにより発色を触媒する工程；並びに
Ｄ．前記リガンドの濃度を比色測定する工程
を含む検定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床化学分野に関する。より詳細には、本発明は、ロイコ色素塗膜を含有するイムノアッセイ要素及びこのような要素の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｋｏｄａｋ社製Ｅｋｔａｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙスライドなど、様々な乾式分析アッセイ要素が市販されており、周知の乾式多層イムノアッセイ要素の中にはロイコ色素が含まれる層を含有するものがある。試料中の特定のアナライトを検定する際に、ロイコ色素は、過酸化水素とペルオキシダーゼ活性を有する物質との存在下で酸化されて着色形となる。周知のように、その色の反射濃度は試料中のアナライト濃度に比例する。反射濃度は反射率計を用いて測定することができる。この技術に関する詳細及び他の文献については、米国特許第４，６７０，３８５号、同第４，０８９，７４７号、同第５，０２４，９３５号及び同第４，２５８，００１号明細書を参照されたい。
【０００３】
この目的に用いられる典型的なロイコ色素は、水溶液として溶解、そして付着又は塗布することができない芳香族性の高いロイコ色素である。このようなロイコ色素に、米国特許第４，６７０，３８５号明細書に記載のジアリールメタンやトリアリールメタン、並びに米国特許第４，０８９，７４７号及び同第５，０２４，９３５号明細書に記載のジアリールイミダゾールやトリアリールイミダゾール系の色素がある。このような色素は、有機溶剤（メタノールやジメチルスルホキシド）に色素を溶解させ、そしてポリマー水溶液中で再沈殿させてポリマー溶液中で色素の塗布組成物を得るか、或いは色素を「カプラー溶剤」（ジエチルラウラミド）に溶解させ、そしてそのカプラー溶剤溶液を水溶液中に再分散させることによって、分散液として塗布されている。
【０００４】
このような色素塗布組成物の別の製造方法は、色素をその良好な溶剤（ジメチルスルホキシド）に溶解させ、そしてその色素を水性塗布組成物において再沈殿させる方法である。この方法では、塗布組成物における色素の粒径を最適化するため沈殿プロセスの制御を非常に慎重に行う必要がある。しかし、このプロセスは色素溶液の攪拌速度や添加速度に敏感であるため制御が難しく、こうして大きな粒子が形成されてしまい、結果としてアッセイにおける発色を十分なものとするため必要量以上の色素を使用しなければならなくなる。さらに、このプロセスは予想できないほどに再現性に欠ける。というのは、上記の理由の他、色素が凝集し易いことや、塗布組成物の保存寿命に限りがあることのためである。また、ＤＭＳＯの使用を回避できれば望ましいことである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
有機溶剤を使用しなくても形成され、色素使用量が半分以下で済み、再現性があり、そして厳密なプロセス制御操作を必要としない安定なロイコ色素塗布組成物を含むイムノアッセイ要素に対するニーズは大きい。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含むロイコ色素塗布組成物を含有する層を少なくとも１層含むイムノアッセイ要素を提供するものである。
【０００７】
本発明はまた、水性液体試料中の免疫学的反応性リガンドを検定する方法をも提供する。この方法は、
Ａ．標識されたリガンドが酵素標識リガンドである本発明による乾式イムノアッセイ分析要素を提供する工程；
Ｂ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に前記液体試料を接触させることにより（１）固定化されたリガンド−レセプター複合体及び（２）固定化された酵素標識リガンド−レセプター複合体の少なくとも一方を形成する工程；
Ｃ．前記酵素標識リガンドを含む層の有限領域に基質溶液を接触させることにより発色を触媒する工程；並びに
Ｄ．前記リガンドの濃度を比色測定する工程を含む。
【０００８】
本発明の方法によると、安定で再現性のあるトリアリールイミダゾール系ロイコ色素の塗布組成物を製造することができる。この方法では、該色素を何らかの有機溶剤に溶解させる必要がない。この方法は、（１）一方がアルキレンオキシドブロックコポリマーである２種の非イオン性界面活性剤の組合せと、（２）色素を保護するための酸化防止剤と、（３）適当な粉砕媒体との存在下で実施される。
【０００９】
より詳細には、この新規プロセスは下記の３工程を含む。
Ａ．（ａ）湿重量４〜６％、乾重量５５〜８０％（好ましくは湿重量約５％、乾重量約６６．４％）のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）湿重量１〜１．５％、乾重量７〜４０％（好ましくは湿重量約１．２５％、乾重量約１６．７％）の酸化防止剤（好ましくはジメドン）、（ｃ）湿重量０．７〜１．１％、乾重量６〜２０％（好ましくは湿重量約０．９０％、乾重量約１２．０％）のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、（ｄ）湿重量０．３〜０．４５％、乾重量１〜１６％（好ましくは湿重量約０．３７％、乾重量約４．９％）のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤及び（ｅ）湿重量残部（好ましくは湿重量約９２．４７％）の水を含む混合物を配合する工程。
【００１０】
Ｂ．工程Ａで調製された混合物の水性スラリーを、微粉砕媒体並びに常用の微粉砕装置及び手順、例えばボールミル、媒体ミル、アトリッターミル又は振動ミル、によって微粉砕する工程。微粉砕される混合物と微粉砕媒体との体積／体積比は約３：１〜１：３、好ましくは１：１付近である。微粉砕媒体の平均直径は約４ｍｍ未満、好ましくは約０．３〜２．０ｍｍである。微粉砕工程は、ロイコ色素の平均粒径が約０．０１〜４．０μｍ、より好ましくは約０．０１〜２．０μｍ、最も好ましくは約０．０５〜０．５μｍになるまで微粉砕を継続する。
微粉砕時間は、ボールミルや振動ミルを用いるような低エネルギー微粉砕法では１〜２０日を要する場合もあるが、エネルギーの高い媒体ミルやアトリッターミルが要する処理時間は短くなる。これらによると、ボールミルで１〜２０日かけて得られる量に匹敵する寸法減少量を、わずか数分〜数時間で達成することができる。
【００１１】
Ｃ．得られた色素塗布組成物と微粉砕媒体とを、好ましくは約０．１〜０．２ｍｍの開口部を有するスクリーンで篩分けする方法で分離する工程。
上記の方法によると、乾式多層分析要素に有用な新規乾式塗布組成物が得られる。この塗布組成物は、（ａ）乾重量５５〜８０％のトリアリールイミダゾール系ロイコ色素、（ｂ）乾重量７〜４０％の酸化防止剤、（ｃ）乾重量６〜２０％のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕系非イオン性ブロックコポリマー及び（ｄ）乾重量１〜１６％のアルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）系非イオン性界面活性剤を含む。上記重量％は、記載された成分にのみ関する。これらの塗布組成物はまた、ゼラチンなどのベヒクルや硬化剤、さらには必要に応じて緩衝剤や他の界面活性剤などその他常用の添加物を含む場合もある。
【００１２】
微粉砕工程は、得られる水性塗布組成物を安定化する２種の非イオン性界面活性剤の組合せを使用して水中で実施される分断化プロセスである。用いられる界面活性剤／安定化剤成分は、色素及び酸化防止剤の両方の沈降や凝集から塗布組成物を安定に維持し、各分散成分を凝集、凝結させることなく塗布組成物においえ離散した粒子として存在させるものである。
【００１３】
界面活性剤の一方は、２種のポリ（アルキレンオキシド）のブロック、好ましくはポリ（エチレンオキシド）のような直鎖ポリ（アルキレンオキシド）のブロック及びポリ（プロピレンオキシド）のような分岐鎖ポリ（アルキレンオキシド）のブロックを含む非イオン性ブロックコポリマーであり、最も好ましくはポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕コポリマーである。この界面活性剤は、微粉砕工程においても塗布組成物においてもロイコ色素をコロイド状で安定化するために必須である。このようなポリマーは市販されているが、例えば、ＢＡＳＦ社から「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」や「Ｔｅｔｒｏｎｉｃ」の商標で、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社から「Ａｎｔａｒｏｘ」の商標で、Ｗｉｔｃｏ社から「Ａｒｎｏｘ  ＢＦ−Ｓｅｒｉｅｓ」の商標で、ＰＰＧＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から「Ｍａｃｏｌ」の商標で、Ｏｌｉｎ社から「Ｐｏｌｙ−Ｔｅｒｇｅｎｔ」の商標で市販されている。好ましいブロックコポリマーは、ＢＡＳＦ社から市販されている商標Ｔｅｔｒｏｎｉｃ−９０８のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕コポリマーである。
【００１４】
他方の界面活性剤は非イオン性アルキルアリールオキシポリ（アルキレンオキシド）である。ここで、各アルキル基は炭素原子を６〜１６個有し（オクチル、イソオクチル、ノニル又はイソノニル）、アリール基は、フェニル又はさらに別のアルキル置換基を１個若しくは２個有するアルキル置換フェニルである。この界面活性剤は、微粉砕中の組成物及び塗布組成物において酸化防止剤をコロイド状で安定化するために必須である。関連するアルキル基は１〜１６個の炭素原子を有する。アルキレンオキシドポリマーのアルキレン部は、炭素原子数２〜４個の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基である。アルキレンはヒドロキシル基で置換されていてもよい。１分子当たりの重合したアルキレンオキシド基の数は、平均して約５〜３０個、好ましくは５〜１５個、最も好ましくは約１０個である。好ましい界面活性剤は、Ｏｌｉｎ  Ｃｈｅｍ社から商標「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  １０Ｇ」で市販されている約１０個の重合グリシドール反復単位を有するイソノニルフェノキシポリ（グリシドール）である。その他の好適な材料が、例えば、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ社から「Ｔｒｉｔｏｎ」の商標で、Ｗｉｔｃｏ社から「Ａｒｎｕｌ」及び「Ｄｅｓｏｎｉｃ」の商標で、Ｔｅｘａｃｏ  Ｃｈｅｍ社から「Ｓｕｒｆｏｎｉｃ」の商標で市販されている。
【００１５】
本発明の色素塗布組成物には、微粉砕工程中及び微粉砕工程後並びに分析要素完成品の保存中に色素の酸化（望ましくない発色）を防止するために、酸化防止剤を存在させる。好ましい酸化防止剤はジメドンである。その他の好適な酸化防止剤は、４’−ヒドロキシアセトアニリド及びその３’位、５’位又は３’位と５’位に電子求引性基を有する誘導体、それらのナフタレン類似体、ヒドロキノン類並びにアミノフェノール類である。
【００１６】
分断化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）  は、ボールミル、媒体ミル、アトリッターミル及び振動ミルのような常用の粉砕プロセスにおいて粉砕媒体を使用して行われる。一般に粉砕媒体は平均直径が約４ｍｍ未満、好ましくは約０．３〜約２．０ｍｍの球形粒子である。好適な微粉砕媒体として、ガラス、セラミック（例、チタニア、ジルコニア及びアルミナ）、プラスチック、金属（例、スチール、窒化ケイ素及び炭化タングステン）、砂、その他当該技術分野で知られている物質の粒子が挙げられる。ガラスビーズやセラミックビーズが好ましい。酸化ジルコニウムが有用である。
【００１７】
ボールミル微粉砕は、円筒形容器の体積の約半分をビーズで満たすに十分量の粉砕媒体を円筒形容器に装填することにより行われる。その容器に色素混合物のスラリーを加えて、スラリー容積の２５〜１００％が粉砕媒体の隙間に入るようにする。スラリー容積の約７５％が媒体空隙に存在し、約２５％が粉砕媒体の上部に「上澄み液」として存在することが好ましい。容器を閉鎖し、そしてその軸を中心として「臨界速度」の約１０〜９０％の速度で同心回転させる。臨界速度１００％とは、粉砕媒体が容器壁に対して遠心分離し始め、容器回転時に自由に瀑落することができなくなる回転速度である。一般に、臨界速度の約４０〜７０％の回転速度で粉砕効率が最高になるので、これが好ましい速度である。
【００１８】
微粉砕工程は所望の粒径が得られた時点で終了する。粒径の測定は、試料を抜き取り、色素塗布組成物を粉砕媒体から分離し、そしてロイコ色素の平均粒径を光散乱測定やディスク遠心分離法などの常用の寸法測定法で測定することによって行われる。
微粉砕媒体と色素塗布組成物との分離は、粉砕ビーズを保持し且つ色素と酸化防止剤の色素塗布組成物を収集することができる常用の篩分け法によって行われる。
【００１９】
上記したように、この塗布組成物は多層乾式分析要素、とりわけイムノアッセイ要素に有用である。この要素は、単層若しくは多層又はこのような層内に複数の帯域を有する層の組合せであることができる。一般に、こうした要素は輻射線透過性支持体、一層又は二層以上の試薬層、粒状展開層、そして態様によっては試薬層と展開層の間にレセプター層を含むことができる。レセプター層又は展開層は、表面に抗体が固定化されているレセプタービーズを含有する。
【００２０】
これらの層は、当該技術分野に周知の塗布技法を用いて塗布することができる。例えば、米国特許第２，７６１，４１７号明細書に記載されているタイプのスライド押出式ホッパーは、少なくとも一層が固定化抗体ビーズを担持する高分子粒子を含む複数の層を同時に塗布するのに有利である場合が多い。より具体的には、ビーズを含有する塗布組成物をスライド押出式ホッパーの押出スロットを介して方向付けし、同時に第二の塗布組成物（所望により同様にビーズを含有することができる）の層をスライド押出式ホッパーのスライド表面の下方へ流動させることによって多層要素を塗布することができる。
【００２１】
抗体が固定化されている粒状層は多孔質である。このような層に用いられる材料は乾式分析要素の製造技術分野では周知である。好ましい粒状層はビーズ展開層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈された又は未希釈の試験試料（例、１〜１００μＬ）を収容するための本発明の要素に適した多孔性を有するように容易に構築することができる。展開層の気孔は等方性であることが好ましく、この特性は帯域を構成する粒子間の連続空間によって生まれる。等方性多孔質とは、展開層が、アプライされた流体を層全体に放射状に均一展開することを意味する。
【００２２】
ビーズ展開層をはじめとする有用な粒状展開層が米国特許第４，６７０，３８１号、同第４，２５８，００１号及び同第４，４３０，４３６号明細書に記載されている。
【００２３】
この要素の粒状層は適当な支持体上に担持されている。このような支持体は、適当な寸法安定性のあるものであればいずれのものであってもよいが、好ましくは波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明（すなわち輻射線透過性）且つ非孔質の材料である。特定の要素に対する支持体の選定は、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光分析法）に適合すべきである。有用な支持体として、ポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。
【００２４】
この要素は、さらに別の層、例えば、分離して或いは組み合わされている試薬／展開層及び他の必要な添加剤、結合性酵素、等を含有するゼラチン／緩衝剤層を１層又は２層以上含むことができる。
【００２５】
この要素のゼラチン／緩衝剤層又は試薬層又は展開層は、ゼラチン、又は他の天然コロイド、ホモポリマー及びコポリマー、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び同様のコポリマー、等の合成又は天然バインダー物質の１種又は２種以上に分散された１種又は２種以上の試薬を含むインジケーター組成物を含有することができる。
【００２６】
所望であれば、その他の任意の層、例えば、下塗層、輻射線遮断層、等を含めることができる。要素の層はすべて互いに液絡している。すなわち、流体及び流体中の試薬や複合化されていない反応生成物は隣接層の重畳領域間を通過することができる。
【００２７】
この要素の層は、その他の望ましい（しかし任意である）各種成分、すなわち界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤、その他当該技術分野で周知の物質、等を含有することができる。これら成分の量については当業者であれば設定することができる。
【００２８】
これらの要素を使用することで、生物学的流体（例、全血、血清、血漿、尿、脊髄流体、ヒト又は動物細胞の懸濁液、糞、唾液、リンパ流体、等）のような液体中に低濃度で含まれる免疫学的反応性リガンドを測定することができる。これらのリガンドは、約１０−１１  モル程度の低濃度で測定されることができるが、一般には約１０−１０  〜約１０−４モルの濃度で測定されることができる。
【００２９】
このように（定量的又は定性的に）測定できるリガンドには、治療薬（例、フェノバルビタール、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジン、フェニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラマイシン、リドカイン、プロカインアミド、等）、天然又は合成ステロイド（例、コルチゾル、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エストリオール、等）、ホルモン（例、チロイドホルモン、ペプチドホルモン、インスリン、等）、タンパク質（例、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フェリチン、血液凝固因子、Ｃ−反応タンパク質、イソ酵素、アポリポタンパク質、等）、抗原、モノクローナル抗体をはじめとする抗体、その他レセプターと自然に反応する種、が含まれる。本発明は、ジゴキシン、フェニトイン、テオフィリン又はフェノバルビタールのような治療薬及びチロキシン又はトリヨードチロニンのようなホルモンの測定に特に有用である。
【００３０】
アッセイは競争アッセイであってもサンドイッチアッセイであってもよい。アナライト誘導体又は（サンドイッチアッセイで用いられる）抗体に結合することができる適当ないずれの標識を使用してもアッセイを行うことができる。有用な標識には、放射性標識、色素、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、アロステリック作働子、コファクター、及びその他周知の酵素モジュレーターが含まれる。好ましい標識は酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼやアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ並びにガラクトシダーゼである。
【００３１】
酵素標識を使用する場合、その酵素の基質を、分析要素中に存在させるか、或いは展開液の中に添加する。基質は、液体試料の添加前又は添加と同時に、或いは結合反応完了後に、分析要素へ添加することができる。特定の標識に対して好適な基質を決定することは、臨床化学分野の当業者であれば容易になしうる事項である。基質は、酵素標識によって直接的に作用を受ける物質であっても、また該標識の酵素反応を含む一連の反応に関与する物質であってもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、基質は過酸化水素である。一例としてグルコースペルオキシダーゼを使用する場合、基質のグルコースは、一般に試薬層の中に存在させるか又は展開液中に添加し、約０．０１モル／ｍ２  、好ましくは約０．００１〜約０．１モル／ｍ２  が得られるようにする。当業者であれば、アッセイに用いられる酵素標識量に対して特定の基質の量を調整する方法については周知である。
【００３２】
このインジケーター組成物は、本発明によって提供されるロイコ色素塗布組成物を含む。すなわち、この組成物はロイコ色素を含み、そして該組成物にはペルオキシダーゼ又は、例えばグルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化した時に発生する過酸化水素の結果として検出可能な色素を生成する他の適当な過酸化性化合物が含まれるか又はアッセイの際に供給される。
【００３３】
イムノアッセイは手動式であっても自動式であってもよい。一般に、液体中のリガンドの定量は、供給ロール、チップパケット又は他の出所から分析要素を取り出し、そして展開層の有限領域に液体試料（例、１〜１００ｍＬ）を物理接触させることにより行われる。この接触を受ける有限領域は一般に約１５０ｍｍ２  以下である。
【００３４】
リガンドの量は、複合化したリガンド類似体を直接に検出するか或いは酵素標識と基質の酵素反応の結果生成した検出可能な種を検出するための適当な装置の中を分析要素を通過させることにより測定される。例えば、これらの種は、一般に知られた手順を用いて適当な分光光度測定装置で検出することができる。酵素反応の場合には、試験試料が接触した有限領域内の反射濃度又は透過濃度の変化速度を測定することによって、得られた生成物を定量することができる。測定される面積は一般に約５〜２５ｍｍ２  である。液体試料中のリガンド量は、有限領域内で測定された標識量に反比例する。一般には、基質溶液を適用した後に標識を測定する。
【００３５】
特に有用なイムノアッセイ要素がＳｕｔｔｏｎらにより１９９４年６月１６日に出願された米国特許出願第０８／２６０，９３９号明細書に記載されている。本明細書ではこの米国特許出願明細書を参照することにより取り入れたものとする。この明細書は、リガンドを検定するための乾式イムノアッセイ分析要素であって、順に（ａ）標識されたリガンドを含有する層、（ｂ）ビーズ展開層、（ｃ）架橋された親水性ポリマー層及び（ｄ）支持体を含み、
（１）（ｂ）層と（ｃ）層との界面における帯域（レセプターゾーン）に、前記標識されたリガンドに対する固定化レセプターが一定濃度で配置されており、そして
（２）前記レセプターは、前記（ｂ）層におけるビーズよりも小さな高分子ビーズに共有結合されることによって固定化されている乾式イムノアッセイ分析要素について記載している。
【００３６】
本発明によって提供される乾式ロイコ色素塗布組成物は、上記分析要素のレセプターゾーン又は展開層に内蔵されると特に有用である。
標識されたリガンドをグラビア塗布することで、（１）標識されたリガンド塗布組成物の湿被覆量を最小限に抑えて標識されたリガンドがレセプターと予め接触しないようにすると同時に標識されたリガンドが均一に被覆されるに十分な湿潤性を維持し、且つ（２）（ａ）実質的にすべての塗布溶剤を除去し、（ｂ）展開層の多孔性及び展開時間に悪影響が及ばないようにし、そして（ｃ）十分な酵素活性を維持するように、迅速な乾燥を達成する。
【００３７】
予め起こる結合を最小限に抑えるには、抗体と標識リガンドの互いの相対親和性も重要な因子である。この因子は、当業者には周知であるように、抗体を慎重に選定すると共に標識リガンドの構造を操作することによって制御される。
【００３８】
一般に、要素内で必要とされる標識リガンドの塗被量は、以下の手順に従い各々特定のイムノアッセイについて実験的に求められる。
１．試料と同時に標識リガンドと分析要素とを接触させてイムノアッセイを実施した場合に許容できるイミノアッセイ性能を達成するのに必要な標識リガンド濃度を決める。（ａ）アッセイを２０分未満で実施することができ、（ｂ）アッセイのダイナミックレンジが、検出可能なリガンドの最低濃度と最高濃度が臨床的に有用な濃度範囲をカバーするような範囲にあり、そして（ｃ）そのダイナミックレンジにわたり臨床的に意義のあるリガンド濃度が検出できる場合に、許容できるアッセイ性能が達成される。
【００３９】
２．下記Ａ〜Ｄによって、上記の許容できるアッセイ性能を達成するため同じ分析要素に必要とされる標識リガンド塗被量を実験的に求める。
Ａ）標識リガンドの最適スポット付着量を確立するために用いられる要素の粒状レセプターゾーンの上に直接、上記１において標識リガンドをスポット付着する際に用いられた標識リガンド濃度の何分の一か、何倍か、又は等濃度の塗被量（ｇ／ｍ２  ）で標識リガンドを塗布する。
Ｂ）既知濃度のリガンドを含有する試験試料を用いて一連のアッセイを行う。
Ｃ）既知濃度のリガンドによるアッセイの結果を比較する。そして
Ｄ）工程２Ｃで得られた結果により標識リガンド塗被量を変更して工程Ｂと工程Ｃを必要なだけ繰り返し、標識リガンドの必要な塗被量を決める。
【００４０】
標識されたリガンドによっては、分析要素上に標識リガンドを直接スポット付着して同じアッセイを実施する場合に必要な標識リガンド濃度よりも、標識リガンド塗被量が少なくなる場合、同等となる場合、又は数倍（２×、３×、４×、等）多くなる場合がある。
【００４１】
上記のガイドラインに沿って、慎重に制御したグラビア塗布手順を以下の塗布及び乾燥プロトコルを用いて首尾よく実施する。本発明の要素における標識リガンドのコーティングはグラビア装置（日本のヤスイ製）で調製した。乾燥条件は、第一乾燥セクションのみ、一般に約１２０°Ｆ（４９℃）とした。第二セクションは使用しなかった。使用した典型的なグラビアシリンダーは１インチ当たり２９５個のセル（１ｍ２  当たり１．３４４×１０８  個のセル）を含有した。セルの深さは１９μｍ、幅は７２μｍ、そしてセル間のランド幅は１２μｍであった。このシリンダーは、塗布装置速度５０ｆｔ／分（１５．２４ｍ／分）の直接グラビア法により標識リガンドを含有する塗布組成物約４．３ｇ／ｍ２  をビーズ展開層へ送ることができる。塗布溶液約２．５〜６．８ｇ／ｍ２  を送ることができる別のグラビアシリンダーもある。当業者であれば、どのグラビア塗布装置にも容易に上記の手順を適合させることができる。標識リガンドの塗布組成を以下に記載する。
【００４２】
湿塗被量４．３ｇ／ｍ２  を基準とした標識リガンド塗布組成
成分 乾燥塗被量ｇ／ｍ２  
ＭＯＰＳ緩衝剤                                        ０．００４５
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）                          ０．０００２１５
ポリ（アクリルアミド）                                ０．００１０８
４’−ヒドロキシアセトアニリド                        ０．０００３２５
＊標識リガンド                                        ０．００００１６
＊標識リガンドは４〜６４μｇ／ｍ２  の範囲内で塗布された
【００４３】
分析要素の残りの層は、当該技術分野で周知の塗布技法によって塗布することができる。しかしながら、各層は別々に塗布し、そして乾燥してから次の層を適用する。
【００４４】
以下の実施例で使用する分析要素を形成する層を以下の手順で調製した。各層を乾燥してからその上に別の層をオーバーコートした。
１．下塗済のポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に架橋ゼラチン層を塗布する。この塗布組成物はゼラチン、電子移動剤〔例えば、４’−ヒドロキシアセトアニリド（４’−ＨＡ）〕、緩衝剤、界面活性剤及びゼラチン硬化剤を含有する。
【００４５】
２．レセプターゾーンを塗布する。このゾーンの塗布組成物は、（ａ）ポリマー中の０．１〜５μｍのポリマービーズ表面に固定化された、アナライト（リガンド）に対する抗体と（ｂ）本発明によって提供されるロイコ色素塗布組成物とを含有する。必要に応じて、ロイコ色素を代わりにビーズ展開層に内蔵させることもできる。
３．乾燥後のレセプターゾーンの上にビーズ展開層を塗布する。この塗布組成物は、大きな（２０〜３５μｍ）ポリマー粒子又はビーズ〔典型的には、ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸）（重量比９８：２）ビーズ〕をラテックスポリマー接着剤、好ましくはポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重量比９０：４：６）で接着させたものを含む。この層はロイコ色素、電子移動剤、ジメドン、緩衝剤、ウシ血清アルブミン及び界面活性剤を含むことができる。
【００４６】
４．ビーズ展開層の最上部に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（通常はアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識アナライト組成物をグラビア塗布する。この組成物は、必要に応じて、電子移動剤（４’−ＨＡ）、緩衝剤（ＭＯＰＳ）、ウシ血清アルブミン及び親水性ポリマーベヒクル（例、ポリアクリルアミド）を含むことができる。
【００４７】
レセプターゾーンには、グループ（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）に従うポリマーを塗布しなければならない。しかしながら、要素完成品におけるゾーンは本質的にポリマーを含まない場合もある。ビーズ展開層（ｂ）をレセプターゾーンコーティングの上に塗布した場合には、層（ｂ）の中にポリマーの一部が移行する場合、まったく移行しない場合、また本質的にすべてが移行する場合がある。
【００４８】
レセプターゾーンには、下記のグループ（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）から成る群より選ばれたポリマーを塗布しなければならない。
（１）重合したＮ−アルキル置換アクリルアミドモノマー約３０〜９７重量％、架橋性モノマー１分子当たり付加重合性基を２個以上有する重合した架橋性モノマー約３〜２５重量％及び他の重合した親水性モノマー０〜６０重量％を含む架橋したポリマー；
（２）ポリ（ビニルアルコール）；
（３）ウシ血清アルブミン；
（４）アラビアゴム；
（５）分子量８０００〜４００，０００のポリ−Ｎ−ビニルピロリドンホモポリマー；並びに
（６）アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキル置換アクリルアミド、Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−アルキル置換−１−ビニルイミダゾール、２−ヒドロキシアルキル置換−１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アクリル酸、スルホアルキルアクリレート、スルファトアルキルアクリレート、スルホアルキルメタクリレート、スルファトアルキルメタクリレート、Ｎ−スルホアルキルアクリルアミド、Ｎ−スルファトアルキルアクリルアミド、Ｎ−スルホアルキルメタクリルアミド、Ｎ−スルファトアルキルメタクリルアミド、エチレンスルホン酸及びスルホ置換スチレンから成る群より選ばれた２種以上のモノマーを有する水溶性ビニル付加コポリマー。グループ（６）には、スルファト部分及びスルホ部分を含有するモノマーのアルカリ金属（ナトリウム、リチウム及びカリウム）塩並びにアンモニウム塩も含まれる。グループ（１）〜（６）のモノマーに含まれるアルキル基は、いずれも１〜６個の炭素原子を含むものである。
【００４９】
レセプターゾーンには、グループ（１）、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）に従うポリマーを塗布しなければならない。しかしながら、要素完成品におけるゾーンは本質的にポリマーを含まない場合もある。ビーズ展開層（ｂ）をレセプターゾーンコーティングの上に塗布した場合には、層（ｂ）の中にポリマーの一部が移行する場合、まったく移行しない場合、また本質的にすべてが移行する場合がある。
【００５０】
グループ（１）とグループ（６）のポリマーとして有用なＮ−アルキル置換アクリルアミドには、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド及びＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドが含まれる。これにはＮ−イソプロピルアクリルアミドのようなＮ−アルキル置換アクリルアミド重合体を約３０〜９７重量％含む架橋ポリマーが含まれる。実施例では、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体を６０〜９７重量％含むポリマーを使用してグループ（１）のポリマーの有用性を明らかにする。
【００５１】
グループ（１）のポリマーはまた、１分子当たり２個以上の付加重合性基を有する１種又は２種以上の架橋性モノマー重合体を約３〜２５重量％含む。一般に、これらの架橋性モノマーは当該技術分野では周知である。好ましい架橋性モノマーは、Ｎ−アルキル置換アクリルアミドとの重合を促進するためにアクリルアミド基又はメタクリルアミド基を含有する。
【００５２】
グループ（１）のポリマーに有用な架橋性モノマーの例を以下に挙げる。
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド；
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド；
エチレンジメタクリレート；
２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート；
ジビニルベンゼン；
モノ〔２，３−ビス（メタクリロイルオキシ）プロピル〕ホスフェート；
Ｎ，Ｎ’−ビス（メタクリロイルオキシ）ウレア；
トリアリルシアヌレート；
アリルアクリレート；
アリルメタクリレート；
Ｎ−アリルメタクリルアミド；
４，４’−イソプロピリデンジフェニレンジアクリレート；
１，３−ブチレンジアクリレート；
１，４−シクロヘキシレンジメチレンジメタクリレート；
２，２’−オキシジエチレンジメタクリレート；
ジビニルオキシメタン；
エチレンジアクリレート；
エチリデンジアクリレート；
プロピリデンジメタクリレート；
１，６−ジアクリルアミドヘキサン；
１，６−ヘキサメチレンジアクリレート；
１，６−ヘキサメチレンジメタクリレート；
フェニルエチレンジメタクリレート；
テトラメチレンジメタクリレート；
２，２，２−トリクロロエチリデンジメタクリレート；
エチレンビス（オキシエチレン）ジアクリレート；
エチレンビス（オキシエチレン）ジメタクリレート；
エチリジントリメタクリレート；
プロピリジントリアクリレート；
ビニルアリルオキシアセテート；
１−ビニルオキシ−２−アリルオキシエタン；
２−クロトノイルオキシエチルメタクリレート；
ジアリルフタレート；及び
２−（５−フェニル−２，４−ペンタジエノイルオキシ）エチルメタクリレート。
【００５３】
グループ（１）のポリマーは、重合した親水性モノマーを０〜６０重量％含むことができる。５〜３５重量％の量もまた有用である。詳細には、このようなモノマーは、ヒドロキシ、ピロリドン、アミン、アミド、カルボキシ、スルホ、カルボン酸塩、スルホン酸塩及び硫酸塩から選ばれた１種又は２種以上の基を有する。一般に、これら塩基の対イオンはアルカリ金属又はアンモニウムである。有用な親水性モノマーとして、アクリル酸及びメタクリル酸並びにその塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ｏ−及びｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、ナトリウム塩；エチレンスルホン酸、ナトリウム塩；２−スルホエチルメタクリレート、３−アクリロイルオキシプロパン−１−スルホン酸、ナトリウム塩；２−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；４−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；Ｎ−（２−メタクリロイルオキシ）エチルスルフェート並びにグリセリルメタクリレートが挙げられる。
【００５４】
グループ（１）の代表的ポリマーとして、
１．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８０：１０：１０）；
２．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８０：１０：１０）；
３．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８５：５：１０）；
４．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８０：５：５：１０）；
５．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８３：５：２．５：９．５）；
６．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８４．５：５：０．５：１０）；
７．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８３：５：２：１０）；
８．ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８０．９：４．８：４．８：９．５）。
【００５５】
スルホン酸塩基を有するグループ（１）のポリマーの利点は、アッセイ要素に塗被される酵素及び／又は抗体の活性を損なう恐れのある界面活性剤を存在させずに調製することができる十分な親水性を有する点である。界面活性剤を重合工程において使用する場合には、重合混合物中に最大約９％まで存在させることができる。
【００５６】
グループ（６）の水溶性ビニル付加コポリマーを形成する代表的モノマーは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリウム塩；ｏ−及びｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩；ｐ−スチレンスルホン酸、ナトリウム塩；エチレンスルホン酸、ナトリウム塩；２−スルホエチルメタクリレート、ナトリウム塩；２−スルホエチルメタクリレート；３−アクリロイルオキシプロパン−１−スルホン酸、ナトリウム塩、３−メタクリロイルオキシプロパン−１−スルホン酸、ナトリウム塩；３−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；４−スルホブチルメタクリレート、ナトリウム塩；Ｎ−（２−スルホ−１，１−ジメチルエチル）アクリルアミド、カリウム塩；並びに２−メタクリロイルオキシエチル硫酸ナトリウムから成る群より選ばれる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム）（重量比８５：１５）が特に有用である。
【００５７】
支持体は、適当な寸法安定性を示すものであればいずれのものであってもよいが、好ましくは波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明（すなわち輻射線透過性）且つ非孔質の材料である。特定の要素に対する支持体の選定は、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光分析法）に適合すべきである。有用な支持体として、ポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。
【００５８】
以下の実施例で使用する分析要素を形成する層を以下の手順で調製した。各層を乾燥してからその上に別の層をオーバーコートした。
１．下塗済のポリ（エチレンテレフタレート）支持体上に架橋ゼラチン層を塗布する。この塗布組成物はゼラチン、電子移動剤〔例えば、４’−ヒドロキシアセトアニリド（４’−ＨＡ）〕、緩衝剤、界面活性剤及びゼラチン硬化剤を含有する。
【００５９】
２．レセプターゾーンを塗布する。このゾーンの塗布組成物は、ポリマー中の０．１〜５μｍのポリマービーズ表面に固定化された、アナライト（リガンド）に対する抗体を含有する。場合によって、このゾーンは色素、緩衝剤及び界面活性剤を含む。
３．乾燥後のレセプターゾーンの上にビーズ展開層を塗布する。この塗布組成物は、大きな（２０〜３５μｍ）ポリマー粒子又はビーズ〔典型的には、ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸）（重量比９８：２）ビーズ〕をラテックスポリマー接着剤、好ましくはポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重量比９０：４：６）で接着させたものを含む。この層はロイコ色素、電子移動剤、ジメドン、緩衝剤、ウシ血清アルブミン及び界面活性剤を含むことができる。
【００６０】
４．ビーズ展開層の最上部に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（通常はアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識アナライト組成物をグラビア塗布する。この組成物は、必要に応じて、電子移動剤（４’−ＨＡ）、緩衝剤（ＭＯＰＳ）、ウシ血清アルブミン及び親水性ポリマーベヒクル（例、ポリアクリルアミド）を含むことができる。
【００６１】
【実施例】
本発明の実施について以下の実施例で説明する。
実施例１：ロイコ色素／酸化防止剤を含む安定な塗布組成物の調製
第１部：粉砕媒体の予備状態調整
４．０Ｌのガラス瓶に、平均直径１ｍｍの酸化ジルコニウム粉砕球体（Ｚｉｒｃｏａ社より市販されているＺｉｒｂｅａｄｓ  ＸＲ）２２００ｃｃと１Ｎ硫酸１６００ｃｃとを装填し、蓋をし、そして臨界速度の５０％で１２時間回転させた。保持スクリーンを用いて酸性溶液と粉砕ビーズとを分離し、そして振動させたスクリーン上でビーズに水を連続噴霧して洗浄し、残留する酸及び寸法不足の媒体フラグメントを除去した後、対流炉内で乾燥して湿分を除去した。
【００６２】
第２部：微粉砕すべきスラリーの調製
以下の組成の混合物を調製した。
４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素〔重量４９．５０、湿（％）４．８、乾（％）６８〕；ジメドン（５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン）酸化防止剤〔重量１２．３８、湿（％）１．２、乾（％）１７〕；Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（活性８３％）〔重量８．９５、湿（％）０．７３、乾（％）１０〕；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  １０Ｇ（１０％水溶液）〔重量３７．１２（乾燥３．７１２）、湿（％）０．００４、乾（％）５〕；水〔重量８８２．０５、湿（％）残部〕。
【００６３】
第３部：微粉砕工程
２．５Ｌのガラス瓶に、第１部で調製した状態調整された乾燥ビーズ１３７５ｃｃと第２部で調製したスラリーとを装填し、次いで窒素ガスでパージして容器をガスシールし且つ色素の空気酸化を最小限に抑え、蓋をし、そして常用のローラーミルに配置した。ローラーの駆動速度は、容器の臨界速度（常用のタコメーターで測定して７０．４ｒｐｍ）の６０％の回転速度が得られるように設定した。５日後、微粉砕を停止し、そして平均直径０．２ｍｍの開口部を有するスクリーンを介して組成物を注入することによって媒体を分離した。集めた安定な色素／酸化防止剤の塗布組成物を保存のため窒素で再度ガスシールしてから最終の塗布組成物を配合した。粒子の主要部分は、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒによる光散乱測定で約３００〜６００ｎｍの塗布組成物中の固体の粒径であった。
【００６４】
実施例２
この実施例では、従来技術のロイコ色素塗布組成物と本発明により調製した塗布組成物とを比較した。この比較は、ジゴキシンのアッセイにおいて多層乾式イムノアッセイ要素を用いて行った。本発明により調製したロイコ色素塗布組成物を、要素の展開層と架橋親水性層との界面に配置したレセプターゾーンに含有させた。従来技術の塗布組成物は、下記の対照要素の展開層中に内蔵させた。要素の図式を以下に示す。
手順：
２組の要素を製造した。第一は、ジメチルスルホキシドを用いた常用の手順によって展開層中にロイコ色素を内蔵させた対照要素である。第二は、実施例１に記載したように調製した色素塗布組成物を上記レセプターゾーン内にレセプターと共に塗布した要素である。塗布組成物は微粉砕時には以下の濃度であった。
ロイコ色素（実施例１と同じ）                  ５％
ジメドン                                      １．２５％
Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（活性８３％）        ０．５０％
Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  １０Ｇ                  ０．２５％
【００６５】
得られた微粉砕色素塗布組成物を、レセプター層の他の成分を含む水性塗布組成物に加えた。ビーズ展開層は別の新たなジメドンを含有した。色素（９．７６％）及びジメドン（２．４４％）をジメチルスルホキシドに溶解し、その溶液を、別の新たなジメドンをさらに含むビーズ展開層の残りの成分を含む十分に攪拌されている水性塗布組成物へ加えて、色素を析出させ水性色素塗布組成物を形成させた。
【００６６】
上記のＤＭＳＯ／色素／ジメドン溶液をレセプターゾーン内へ含有させようとすると、凝集した塗布することのできないレセプター層塗布組成物になった。この塗布組成物は対照の展開層中に含有させる他なかった。対照用及び実験用の塗布組成物を、それぞれビーズ展開層及び別のレセプター層として塗布し、試験要素のその他必要な層はジゴキシン検定用に設計した。最終要素の配置及び塗布組成は、図式１（対照）及び図式２（実験）に示した通りである。これらの要素を切断して処理用のスライドマウントに取り付けた。
【００６７】
製造した対照要素と本発明の要素の配置及び成分濃度を以下の図式１と図式２に示す。
0003574232.tif 000002
0003574232.tif 000003
【００６８】
0003574232.tif 000004
0003574232.tif 000005
【００６９】
図式１及び図式２の要素並びに後記図式３の要素における名称、略称は以下を表すものである。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＩ水：蒸留脱イオン水
ジゴキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）：ジゴキシンと西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体
ＭＯＰＳ：３−モルフォリノプロパンスルホン酸緩衝剤
ＴＥＳ：Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤
ジメドン：５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン
トリアリールイミダゾールロイコ色素：４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール青発色性ロイコ色素
Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ：ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ製の非イオン性フッ素化界面活性剤
ポリマー接着剤：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
ポリマービーズ：ポリ（ｍ−、ｐ−ビニルトルエン−コ−メタクリル酸）
抗体ポリマーＡ粒子：抗体が共有結合されているポリ〔スチレン−コ−ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕ポリマー粒子
抗体ポリマーＢ粒子：抗体が共有結合されているポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロパン酸〕ポリマー粒子
硬化剤：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテルゼラチン硬化剤
ＴＸ−１００：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社製のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール非イオン性界面活性剤
Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８：ＢＡＳＦ社製のポリ〔ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）〕ブロックコポリマー
Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  １０Ｇ：Ｏｌｉｎ  Ｃｈｅｍ社製の重合したグリシドール単位を約１０個有するイソノニルフェノキシポリグリシドール界面活性剤
マゼンタ色素：４，５−ジヒドロキシ−３−（６，８−ジスルホ−２−ナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸、ナトリウム塩
ポリマーバインダー：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（重量比８０／１０／１０）
【００７０】
各要素に、ジゴキシンを含有しない血清又は６ｎｇ／ｍＬ含有する血清を１１ｍＬスポット付着し、その後３７℃で５分間インキュベートした。これらの要素をインキュベーターから取り出し、そして下記組成を有する洗浄流体１２μＬで洗浄した。
過酸化水素（ＨＲＰ）                                    ０．０３％
４’−ヒドロキシアセトアニリド（４’−ＨＡ）            ５ｍＭ
ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）                  １０μＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）                  ０．０１Ｍ
塩化ヘキサデシルピリジニウム                            ０．１％
【００７１】
洗浄後、再び要素を３７℃のインキュベーターに入れ、そしてロイコ色素の酸化速度を反射率濃度計によって６７０ｎｍで測定した。表１に記載した結果は、感度の向上と不正確さの減少を示している。すなわち、レートレンジとはジゴキシンを含まない場合と６ｎｇ／ｍＬのジゴキシンを含む場合とにおける速度の差を表し、このレンジが幅広いほど感度は高くなる。不正確さは変動係数％として測定し、変動が少ないほど不正確さも小さくなる。Ｎは反復回数である（レートレンジと不正確さはこの反復回数の平均である）。
【００７２】
0003574232.tif 000006
【００７３】
比較例３：ジゴキシンアッセイ要素における色素塗布組成物法の比較
実施例１と同様に別の色素塗布組成物を調製したが、但し、本発明の界面活性剤の組合せ、すなわちＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８とＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  １０Ｇの代わりに、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｈｅｍ社製のアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムアニオン界面活性剤Ａｌｋａｎｏｌ  ＸＣを０．９５２％使用した。塗布組成物を、実施例２で対照を製造するのに使用した同じ技法により対照用ジゴキシンアッセイ要素の展開層に含有させた。このビーズ展開層はレセプター層でもあった。さらに、ＤＭＳＯ溶液を用いて実施例２に記載したものと同様の対照要素も製造した。これら両方の配置と塗布組成を図式３に記載する。これらのコーティングで製造した要素を実施例２に記載したように製作して試験し、それらの結果を表２に記載した。実施例２に記載したように、微粉砕された塗布組成物から製造された本発明の試験要素は、ＤＭＳＯ系塗布組成物から製造された要素よりも高い感度及び低い不正確さを示したが、微粉砕された（本発明の界面活性剤／安定化剤の組合せを含まない）塗布組成物は、調製後すぐに塗被したが、不安定であり、そして約２４時間で沈降してしまった。これでは、生産規模の製造には適したものとはならない。対照的に、実施例２で調製された本発明の塗布組成物は２週間にわたり安定であった。
【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら詳細に説明してきたが、本発明の精神及び範囲内での変更、改変が可能であることを理解されたい。