(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサー部位、ステム部位および切断活性部位を有する核酸酵素であって、センサー部位と切断活性部位はステム部位を介して結合しており、切断活性部位が標的RNAと結合し、センサー部位が標的RNAと異なる別のRNAと結合した時のみ切断活性部位がマグネシウムイオンを捕捉する空洞を形成し標的RNAに対し切断活性を示し、センサー部位がウイルス自体が発現するmRNAと結合し、切断活性部位がアポトーシス阻止機能を有するbcl-2mRNAと結合し切断し、さらに下記のヌクレオチド配列(1)を含むRNA分子および下記のヌクレオチド配列(2)を含むRNA分子が形成する二量体の構造を有する核酸酵素。
0003595843.tif 000005
（ただし、ヌクレオチド配列(1)の１番目から９番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列(2)の２２番目から２７番目のヌクレオチドは標的RNAの切断部位周辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。また、ヌクレオチド配列(1)の２０番目から３２番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列(2)の１番目から１２番目のヌクレオチドはエイズの原因ウイルスであるHIV-1に特異的な他のmRNA中の配列、あるいはHIV-1のtatmRNA中の他の部位の配列に相補的になるように改変されてもよい。）
【請求項２】
センサー部位、ステム部位および切断活性部位を有する核酸酵素であって、センサー部位と切断活性部位はステム部位を介して結合しており、切断活性部位が標的RNAと結合し、センサー部位が標的RNAと異なる別のRNAと結合した時のみ切断活性部位がマグネシウムイオンを捕捉する空洞を形成し標的RNAに対し切断活性を示し、センサー部位が癌細胞マーカー由来のmRNAと結合し、切断活性部位がアポトーシス阻止機能を有するbcl-2mRNAと結合し切断し、さらに下記のヌクレオチド配列(3)を含むRNA分子および下記のヌクレオチド配列(4)を含むRNA分子が形成する二量体の構造を有する核酸酵素。
0003595843.tif 000006
（ただし、ヌクレオチド配列(3)の１番目から９番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列(4)の２３番目から２９番目のヌクレオチドは標的RNAの切断部位周辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。また、ヌクレオチド配列(3)の２０番目から３３番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列(4)の１番目から１４番目のヌクレオチドは慢性骨髄性白血病に特異的な他のmRNA中の配列、あるいはBCR-ABLmRNA中の他の部位の配列に相補的になるように改変されてもよい。）
【請求項３】
センサー部位がHIV由来のtat mRNAと結合する請求項１記載の核酸酵素。
【請求項４】
センサー部位が慢性骨髄性白血病由来のBCR-ABL mRNAと結合する請求項２記載の核酸酵素。
【請求項５】
核酸酵素配列の上流にリンカー配列、tRNAValプロモーター配列またはその両方が付加されている請求項１〜４のいずれかに記載の核酸酵素。
【請求項６】
核酸酵素配列の上流にpol II 系プロモーター配列またはpol III 系プロモーター配列）が付加されている請求項１〜４のいずれかに記載の核酸酵素。
【請求項７】
リンカー配列は下記のヌクレオチド配列(5)またはヌクレオチド配列(6)を含む請求項５記載の核酸酵素。
5'AAA 3'    (5)
5'UUU 3'    (6)
【請求項８】
tRNAValプロモーター配列が下記のヌクレオチド配列(5)を含む請求項５記載の核酸酵素。
0003595843.tif 000007
【請求項９】
核酸酵素配列にデリバリー剤が結合されている請求項１〜４のいずれかに記載の核酸酵素。
【請求項１０】
デリバリー剤がペプチド、ペプチド疑似物、ウイルス由来タンパク、コレステロール、ステロイド、コレステロール誘導体、脂肪、ビタミン、ビオチン、葉酸、レチン酸、タンパク、フェリチン、ＬＤＬ、インスリン、抗体、糖もしくはオリゴ糖、ポリエチレングリコール、またはアミノ酸のホモポリマー若しくはコポリマーである請求項９記載の核酸酵素。
【請求項１１】
核酸酵素配列の下流に付加配列、ターミネーター配列またはその両方が付加されている請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸酵素。
【請求項１２】
付加配列は下記のヌクレオチド配列(8)〜(10)のいずれかを含む請求項１１記載の核酸酵素。
5'AAA 3'    (8)
5'AACCGUA 3'    (9)
5'UUUUU 3'    (10)
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素をコードするDNAを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素をコードするDNAを含む発現ベクターDNAを鋳型として、RNAに転写することを特徴とする、該核酸酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素を含む遺伝子導入ベヒクル。
【請求項１６】
正電荷リポソームである、請求項１５記載のベヒクル。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素を用いて、標的RNAを特異的に切断する方法。
【請求項１８】
標的RNAが疾病の原因となる異常型mRNAである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素を含む宿主細胞であって、大腸菌などの原核細胞、ヒト細胞、哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞など真核細胞から選択される宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸酵素を含有する診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、核酸酵素およびその利用に関し、より詳細には、共存する他のＲＮＡ分子配列に相補結合することにより標的ＲＮＡに対するＲＮＡ切断活性を獲得する核酸酵素、たとえば感染細胞、癌化細胞などの有害細胞を選択的かつ効率的に死滅させるＲＮＡ切断活性をもつ核酸酵素あるいは細胞特異的、時限特異的または人為的に導入したＲＮＡによってＲＮＡ切断活性が調節可能な核酸酵素、およびその利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
１９８０年初頭、米国コロラド大学のＣｅｃｈらによるテトラヒメナのｒＲＮＡのセルフスプライシング現象の発見（Ｋ．Ｋｒｕｇｅｒ，  Ｐ．Ｊ．Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，  Ａ．Ｊ．Ｚａｕｇ，  Ｊ．Ｓａｎｄｓ，  Ｄ．Ｅ．Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，  Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，  Ｃｅｌｌ，  ３１，  １４７−１５７（１９８２））  と、米国エール大学のＡｌｔｍａｎが行ったＲＮＡとタンパク質の複合体酵素であるリボヌクレアーゼＰの解析結果（Ｃ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ，  Ｋ．Ｇａｙｄｉｎｅｒ，  Ｔ．Ｍａｒｓｈ，  Ｎ．Ｐａｃｅ，  Ｓ．Ａｌｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ３５，  ８４９−８５７（１９８３）  ）から、触媒機能を有するＲＮＡであるリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ＋ｅｎｚｙｍｅ）  が見いだされた。以降、様々なリボザイムが発見され（Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｔｒｅｎｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １４，  ４４５−４５０（１９８９）  ；Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６１，  ６４１−６７１（１９９２）；Ｊ．Ｂｒａｔｔｙ，  Ｐ．Ｃｈａｒｔｒａｎｄ，  Ｇ．Ｆｅｒｂｅｙｒｅ，  Ｒ．Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２１６，  ３４５−３５９（１９９３）  ；Ｈａｓｅｈｏｆｆ．  Ｊ  ａｎｄ  Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４，  ５８５−５９１（１９８８）  ；Ｃ．Ｊ．Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ，  Ａ．Ｃ．Ｆｏｒｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １４，  ３６２７−３６４０（１９８６））、逆転写酵素、イントロンの発見、ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  などとあわせて、不動のセントラルドグマの概念をゆるがしたのである。同時に、それまでＤＮＡとタンパク質の間で情報の仲介屋程度にしか認識されていなかったＲＮＡが、（遺伝）情報と（触媒）機能の二役を兼ね備えていることから、ＲＮＡ分子こそが生命の起源とする“ＲＮＡワールド”説の中心的分子として注目されるようになった（Ｇ．Ｆ．Ｊｏｙｃｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８，  ２１７−２２４（１９８９）  ；Ｎ．Ｒ．Ｐａｃｅ，  Ｔ．Ｌ．Ｍａｒｓｈ，  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ，  １６，  ９７（１９８５）；Ａ．Ｌａｚｃａｎｏ，  Ｒ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，  Ｊ．Ｏｒｏ，  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  ２７，  ２８３（１９８８）  ；Ｌ．Ｅ．Ｏｒｇｅｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５８，  ２０３（１９９２）  ；Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，  Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，  Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ２４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））。
【０００３】
なかでもハンマーヘッド型リボザイム（図１Ａ、左）は、これまで最も良く研究がなされてきたリボザイムの一つである。これは、天然においては自己切断反応（シス型）として機能するリボザイムであるが（Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５９，  ５４３（１９９０）；Ａ．Ｃ．Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｃｅｌｌ，  ４９，  ２１１（１９８７）  ；Ａ．Ｃ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７，  １３７１（１９８９））、  ＵｈｌｅｎｂｅｃｋらとＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ  らのグループによって２本のＲＮＡ鎖（基質領域と酵素活性保持領域）に分割（トランス化）されたことから（Ｏ．Ｃ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２８，  ５９６（１９８７）  ；Ｊ．Ｈａｓｅｈｏｆｆ，  Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４，  ５８５（１９８８）  、リボザイムによる遺伝子治療への応用の可能性が示唆された。以降、癌やエイズなどを標的とした様々な応用研究が、数多く報告されている（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，  Ｍ．Ｌ．Ｂｉｍｓｔｉｅｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ８，  ８６１（１９８９）；Ｎ．Ｓａｒｖｅｒ，  Ｅ．Ｃａｎｔｉｎ，  Ｏ．Ｃｈａｎｇ，  Ｏ．Ｌａｎｄｅ，  Ｄ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｊ．Ｚａｉａ，  Ｊ．Ｒｏｓｓｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １２２２（１９９０）；Ｍ．Ｈｏｍａｎｎ，  Ｍ．Ｔｚｏｒｔｚａｋａｒｉ，  Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，  Ｓ．Ｓｃｚａｋｉｅｌ，  Ｍ．Ｔａｂｌｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１，  ２８０９（１９９３）；  Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ０，  ９２６（１９９３）；Ｓ．Ａｌｔｍａｎ：Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０．  １０８９８（１９９３）  ；Ｐ．Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，  Ｊ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １４，  ５２３（１９９４）  ；Ｓ．Ｍ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １０３，  ８５（１９９４）；Ｆ．Ｈ．Ｃａｍｅｒｏｎ，  Ｐ．Ａ．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．，  ４，  ８７（１９９４）  ；Ｌ．Ｑ．Ｓｕｎ，  Ｄ．Ｗａｒｒｉｌｏｗ，  Ｌ．Ｗａｎｇ，  Ｃ．Ｗｉｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｊ．Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ，  Ｇ．Ｓｙｍｏｎｄｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ９７１５（１９９４）；Ｒ．Ｅ．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，  Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｒ，  Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３８，  ２０２３（１９９５）  ；Ｇ．Ｆｅｒｂｅｙｒｅ，  Ｊ．Ｂｒａｔｔｙ，  Ｈ．Ｃｈｅｎ，  Ｒ．Ｃｅｄｅｒｇｅｒｎ，  Ｇｅｎｅ  １５５，  ４５（１９９５）  ；Ｍ．Ｋｉｅｈｎｔｏｐｆ，  Ｅ．Ｌ．Ｅａｑｕｉｖｅｌ，  Ｍ．Ａ．Ｂｒａｃｈ，  Ｆ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ７３，  ６５（１９９５）  ；Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．Ｍａｃｅｊａｋ，  Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １，  ２７７    （１９９５）；Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｊ．Ｂ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｃｕｒ���．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ２９６  （１９９５））。
【０００４】
リボザイムは、基質と相補的な塩基対を形成することによって、基質ＲＮＡと結合する。その後、反応に必須となるマグネシウム存在下で、基質ＲＮＡ分子の切断が起こる。基質の認識は、ＳｔｅｍＩとＳｔｅｍ  ＩＩＩ  の双方の基質結合領域がそれに対応した基質配列と適切な塩基対を形成することによってなされるので、リボザイムの基質特異性は非常に高い。基質特異性が非常に高いと、細胞内に於いてほとんど副作用が起こらないため、リボザイムを遺伝子発現阻害剤として用いる場合の大きなメリットとなる。
【０００５】
しかし、このリボザイムの高い基質特異性にも例外がある。それは、ターゲットとなる基質がキメラ（二つ以上の異なる遺伝子配列が結合して一つの遺伝子として機能する）の場合である。本来、ある配列（ｅｘｏｎ  ２）  に別の配列（ｅｘｏｎ  ３）  がつながるべきところへ、スプライシングのミスなどが起きて別のキメラ配列（ｅｘｏｎ  １−ｅｘｏｎ  ３）が誤って生じ、癌などの発病を招く場合、リボザイムを用いてこの異常なＲＮＡの発現を抑制するという遺伝子治療が考えられる。それぞれの配列自体（ｅｘｏｎ  １、ｅｘｏｎ  ２、ｅｘｏｎ  ３）  は正常なメッセージであるので、異常型のジャンクション配列（ｅｘｏｎ  １−ｅｘｏｎ  ３）をもつｍＲＮＡのみを特異的に切断し、その発現を抑えることが重要となってくる。つまり、正常なｍＲＮＡ（ｅｘｏｎ  ２−ｅｘｏｎ  ３）には全く影響を及ぼさないリボザイムを用いなくてはならない（例：ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡ、図２）。
【０００６】
従来のハンマーヘッド型リボザイムを用いてこのような遺伝子の発現抑制を行おうとする場合、異常型のｍＲＮＡに特異的な配列部分であるｅｘｏｎ  １−ｅｘｏｎ  ３  のジャンクション部位に、リボザイムの切断可能な配列のＧＵＣトリプレット（一般にはＮＵＸ（Ｎ；Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ    Ｘ；Ａ，Ｃ，Ｕ））がある場合には、問題は生じない。しかし、運良くジャンクション部位またはその近傍に、リボザイムの切断配列があることはまれである。ジャンクション部位に切断可能な配列がない場合、ジャンクション部位から遠く離れた部位にある切断配列をターゲットとするしかない。しかしジャンクションから遠く離れた切断部位自体の配列は、正常なｍＲＮＡにも異常型のｍＲＮＡにも存在している。結局、正常型のｍＲＮＡへの非特異的な切断が起こってしまうことがどうしても避けられなくなる（例：ＡＢＬ  ｍＲＮＡへの切断、図２）。また、たとえジャンクション部位またはその近傍にリボザイムの切断配列であるＮＵＸ配列があったとしても、それがハンマーヘッド型リボザイムが好んで効率的に切断できる配列のトリプレット（ＧＵＣトリプレット）である可能性はさらに低い。従って、このようなケースに於いても、高い切断活性を保ったまま、特異性の非常に高いリボザイムを構築することは困難であった。
【０００７】
実際このようなある特定のキメラ型ｍＲＮＡが発病の原因になる有名な例として、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）やＡＬＬ（急性リンパ性白血病）の原因となるフィラデルフィア染色体の形成がある。これらの白血病では染色体相互転座ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）  が生じてＢＣＲ−ＡＢＬ  融合遺伝子が生成する。ＣＭＬではＫ２８  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  とＬ６  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎの２つのタイプの染色体相互転座により、２つのタイプのＢＣＲ−ＡＢＬ  融合遺伝子が生じ、最終的に２種類のキメラｍＲＮＡがスプライシングの結果生成する（Ｋ２８ジャンクション（ｂ３ａ２）ｍＲＮＡとＬ６ジャンクション（ｂ２ａ２）ｍＲＮＡ）（図２）。そのうちのひとつにはＢＣＲ−ＡＢＬ  ジャンクション部位の近くにハンマーヘッド型リボザイムが切断できる配列（ＧＵＵトリプレット）があるが（Ｋ２８ジャンクション（ｂ３ａ２）ｍＲＮＡ）  、もう一つのタイプのｍＲＮＡにはジャンクション部位の近傍に、有力な切断配列が存在しない（Ｌ６  ジャンクション（ｂ２ａ２）ｍＲＮＡ）  。そのため、従来のハンマーヘッド型リボザイムでは後者のｍＲＮＡからの発現を特異的に阻害することができない。現在までに報告されているＬ６  ｍＲＮＡからの異常なタンパク質（ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ  ）  の発現をリボザイムで阻害する試みは、ハンマーヘッド型リボザイムに長いアンチセンス部分を足し、それをジャンクション部位に相補的に結合させて、切断特異性を獲得しようとしたものがほとんどである。しかし、この長いアンチセンス部分の付加によってリボザイムの基質結合部分が長くなると、いったんリボザイムが基質に結合した後、基質から解離するステップが非常に遅くなる。そのため、酵素としてのターンオーバーができず切断効率が低下してしまう。さらにそうまでして獲得しようとした基質特異性は期待したほど高くない。これは長すぎるアンチセンス部分の配列が、正常型ｍＲＮＡであるＡＢＬ  ｍＲＮＡやＢＣＲ  ｍＲＮＡへ部分的に結合してしまい、リボザイムの基質認識力を甘くさせてしまうからである。その結果正常型ｍＲＮＡへの非特異的切断が避けられないといった状況になっている（図２）。
【０００８】
この解決策として、本発明者らは、先に、基質に対してアロステリックな切断活性を示す核酸酵素を構築した（ＷＯ９９／４６３８８）。すなわち、１つの活性中心領域と２つの基質結合領域を持ち、一方の基質結合領域でＬ６（ｂ２ａ２）キメラ型ｍＲＮＡのジャンクション部位に結合し、もう一方の基質結合領域でジャンクション部位から遠く離れた効率の良い切断配列に結合して、その切断配列の後で基質を切断することができる核酸酵素（リボザイム）を構築した。このような核酸酵素は、標的ＲＮＡが疾患の原因となるキメラ型ｍＲＮＡなどで有用である。
【０００９】
しかしながら、上記の技術は、特定配列認識と酵素活性が同一ＲＮＡ分子内で生じることに限定され、分子間での認識、そして、酵素活性の発現が可能かどうか定かでないという問題点を有している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明者らは、２種類のＲＮＡ分子の一方を認識することより、他方のＲＮＡ分子の切断が可能になれば、ＨＩＶ感染やがん治療等において、感染細胞や癌化細胞のみを選択的に殺すことも可能になるのではないかとの発想のもと、研究を進めた。
【００１１】
すなわち、本発明は、共存するＲＮＡ分子を認識することにより他の特定のＲＮＡに対する切断活性を獲得する核酸酵素を提供することを目的とする。このような酵素を、本明細書ではトランス・マキシザイムともいう。
また、本発明は、前記核酸酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、あるいは前記核酸酵素を含む遺伝子導入ベヒクル、を提供することも目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記核酸酵素または前記発現ベクターまたは前記遺伝子導入ベヒクルを有効成分として含む医薬組成物を提供することも目的とする。
さらにまた、本発明は、前記の核酸酵素の製造方法および利用方法を提供することも目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、以下に記載する発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、その一の態様において、共存するＲＮＡ分子を認識することにより他の特定のＲＮＡに対する切断活性を獲得する核酸酵素を提供する。具体的には、本発明は、センサー部位と切断活性部位を有する核酸酵素であって、切断活性部位が標的ＲＮＡと結合し、センサー部位が標的ＲＮＡと異なる別のＲＮＡと結合した時のみ標的ＲＮＡに対し切断活性を示す、前記核酸酵素を提供する。ここでセンサー部位とは、標的ＲＮＡと異なる別のＲＮＡの核酸配列に相補的な配列を含むために該ＲＮＡの核酸配列に結合性を有する部位をいう。
【００１４】
本発明の核酸酵素は、モノメリックでもよいし、あるいは（ホモもしくはヘテロ）ダイメリックでもよいが、好ましくはヘテロダイメリックである。本発明の核酸酵素は、センサー部位と切断活性部位が２つの異なるＲＮＡの各々と正しく結合したときに該酵素がＭｇ２＋イオンを捕捉する空洞を分子内または分子間で形成するようにコンホメーション変化することによって、標的ＲＮＡの特異的切断を可能にする。このため、本発明の酵素のセンサー部位と切断活性部位の核酸配列は、これらに結合するＲＮＡ配列と完全にもしくは実質的に相補的な関係にあるのがよい。「実質的に」とは、該酵素の配列と該酵素に結合するＲＮＡ配列が互いに、マグネシウムイオンを捕捉する空洞を形成しうる程度の相補性を有していることを意味する。
【００１５】
本発明の核酸酵素は、下記のヌクレオチド配列（１０）  を含むＲＮＡ分子および下記のヌクレオチド配列（２０）  を含むＲＮＡ分子が形成する二量体の構造を有するとよい。
５’Ｘ１１  …    Ｘ１ｈ  Ｙ１１  …  Ｙ１ｉ  Ｚ１１  …    Ｚ１ｊ  ３’    （１０）
５’Ｚ２１  …    Ｚ２ｎ  Ｙ２１  …  Ｙ２ｍ  Ｘ２１  …    Ｘ２ｋ  ３’    （２０）
（配列中、Ｘ１１〜Ｘ１ｈ、  Ｘ２１〜Ｘ２ｋ、  Ｙ１１〜Ｙ１ｉ、Ｙ２１〜Ｙ２ｍ、Ｚ１１〜Ｚ１ｊ  およびＺ２１〜Ｚ２ｎ  は、各々独立に、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれかであり、
ｈおよびｋは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｉおよびｍは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｊ  は１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
ｎは１以上の整数（例えば、１〜１００の整数）であり、
Ｘ１１  …  Ｘ１ｈおよびＸ２１  …  Ｘ２ｋは、センサー部位を構成するヌクレオチド配列であり、Ｙ１１  …  Ｙ１ｉおよびＹ２１  …  Ｙ２ｍは、ステムを形成し、センサー部位にＲＮＡが結合したときのみ安定にＭｇ２＋イオンを捕捉する空洞を形成しうる領域を含むヌクレオチド配列であり、Ｚ１１  …    Ｚ１ｊおよびＺ２１  …    Ｚ２ｎは、標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的である領域を含むヌクレオチド配列である。）
【００１６】
標的ＲＮＡの例としては、細胞の生命維持に不可欠な（言い換えれば、細胞が生存するのに必要な）蛋白質をコードするｍＲＮＡ、あるいはウイルスＲＮＡまたは癌等の疾患に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡが挙げられる。たとえば、アポトーシス阻止因子であるＢｃｌ−２ファミリー（ｂｃｌ−２，  ｍｃｌ−１，  ｂｆｌ−１，  ｂａｘ−α，  ｂａｋ，  ｂｉｋ，  ｂｃｌ−ＸＬ，  ｂｃｌ−ＸＳ）が挙げられる（ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを切断する野生型のハンマーヘッド型リボザイムを図３Ａに示す）。一方、標的ＲＮＡと共存し、トランス・マキシザイムのセンサー配列に認識されるＲＮＡとしては、疾病の原因となるｍＲＮＡが適当である。たとえば、エイズの原因ウイルスであるＨＩＶ−１のｔａｔ  ｍＲＮＡが挙げられる。このトランス・マキシザイムの構築例を図３Ｂに示す。この場合の核酸酵素は、例えば、下記のヌクレオチド配列（１）を含むＲＮＡ分子および下記のヌクレオチド配列（２）を含むＲＮＡ分子が形成する二量体の構造を有するとよい（図３Ｂ参照）。
【００１７】
５’ＧＧＵＣＣＵＧＧＣＣ  ＵＧＡＵＧＡＧＡＧＵ  ＧＡＵＧＡＧＣＵＣＵ  ＵＣ  ３’    （１）      （配列番号１）
５’ＧＵＣＵＧＡＣＵＧＵ  ＵＣＡＵＣＧＡＡＡＣ  ＣＧＧＧＵＣＣ  ３’  （２）      （配列番号２）
（ただし、ヌクレオチド配列（１）の１番目から９番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列（２）の１９番目から２７番目のヌクレオチドは標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。また、ヌクレオチド配列（１）の２０番目から３２番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列（２）の１番目から１２番目のヌクレオチドはエイズの原因ウイルスであるＨＩＶ−１に特異的な他のｍＲＮＡ中の配列、あるいはＨＩＶ−１のｔａｔ  ｍＲＮＡ中の他の部位の配列に相補的になるように改変されてもよい。）
【００１８】
さらに、別の疾病として慢性骨髄性白血病を狙ったトランス・マキシザイムをの構築例を図３Ｃに示す。センサー配列に認識されるＲＮＡとしては、疾患関連蛋白質をコードするｍＲＮＡ、組織特異的または時限特異的に発現するｍＲＮＡ、あるいは核酸酵素の活性調節を目的として人為的に導入したＲＮＡである。たとえば疾病の原因となるＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡが例示される。この場合の核酸酵素は、例えば、下記のヌクレオチド配列（３）を含むＲＮＡ分子および下記のヌクレオチド配列（４）を含むＲＮＡ分子が形成する二量体の構造を有するとよい（図３Ｃ参照）。
【００１９】
５’ＧＧＵＣＣＵＧＧＣＣ  ＵＧＡＵＧＡＧＡＧＵ  ＵＡＵＵＧＡＵＧＧＵ  ＣＡＧ  ３’  （３）    （配列番号３）
５’ＧＡＡＧＧＧＣＵＵＣ  ＵＵＵＣＡＵＣＧＡＡ  ＡＣＣＧＧＧＵＣＣ  ３’  （４）    （配列番号４）
（ただし、ヌクレオチド配列（３）の１番目から９番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列（４）の２０番目から２９番目のヌクレオチドは標的ＲＮＡの切断部位周辺の配列に相補的になるように改変されてもよい。また、ヌクレオチド配列（３）の２０番目から３３番目のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列（４）の１番目から１４番目のヌクレオチドは慢性骨髄性白血病に特異的な他のｍＲＮＡ中の配列、あるいはＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡ中の他の部位の配列に相補的になるように改変されてもよい。）
【００２０】
核酸酵素配列（たとえば上記ヌクレオチド配列（１）〜（４））の上流にリンカー配列、プロモーター配列（たとえばｔＲＮＡＶａｌプロモーター配列、ｐｏｌ  ＩＩ系もしくはｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーター配列（ｔＲＮＡ，  ｓｎＲＮＡなど）等）またはその両方が付加されていてもよい。核酸酵素配列の上流に付加されているリンカー配列は下記のヌクレオチド配列（５）またはヌクレオチド配列（６）を含むとよい。
５’ＡＡＡ  ３’    （５）
５’ＵＵＵ  ３’  （６）
【００２１】
また、ｔＲＮＡＶａｌプロモーター配列は下記のヌクレオチド配列（７）を含むとよい（図７Ａ参照）。
５’  ＡＣＣＧＵＵＧＧＵＵ  ＵＣＣＧＵＡＧＵＧＵ  ＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣ  ＡＣＧＵＵＣＧＣＣＵ  ＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡ  ＡＧＧＵＣＣＣＣＧＧ  ＵＵＣＧＡＡＡＣＣＧ  ＧＧＣＡＣＵＡＣＡＡ  ＡＡＡＣＣＡＡＣ  ３’    （７）  （配列番号５）
さらに、核酸酵素配列（たとえば上記ヌクレオチド配列（１）〜（４））の下流に付加配列、ターミネーター配列またはその両方が付加されていてもよい。付加配列は下記のヌクレオチド配列（８）〜（１０）のいずれかを含むとよい。
５’ＡＡＡ  ３’          （８）
５’ＡＡＣＣＧＵＡ  ３’    （９）
５’ＵＵＵＵＵ  ３’        （１０）
【００２２】
本発明はさらに、核酸酵素配列にデリバリー剤が結合されている核酸酵素を提供する。デリバリー剤は、たとえばペプチド、ペプチド疑似物、ウイルス由来タンパク、コレステロール、ステロイド、コレステロール誘導体、脂肪、ビタミン、ビオチン、葉酸、レチン酸、タンパク、フェリチン、ＬＤＬ、インスリン、抗体、糖もしくはオリゴ糖、ポリエチレングリコール、またはアミノ酸のホモポリマー若しくはコポリマーから選択される。
【００２３】
また、本発明は、前記の核酸酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。ベクターは、核酸酵素合成用ベクターおよび遺伝子導入（遺伝子治療）用ベクターの両方を含む。
さらに、本発明は、前記の核酸酵素の製造方法であって、該核酸酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡに転写することを特徴とする、前記の方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、前記の核酸酵素を含む遺伝子導入ベヒクルを提供する。ベヒクルの例は正電荷脂質、特に正電荷リポソーム（たとえば、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、正電荷コレステロールなど）である。この場合、ベヒクルは遺伝子導入ベクターの代用として使用されるが、本発明の核酸酵素であるトランス・マシキザイムＲＮＡ  に化学修飾をほどこして生体内のＲＮＡ  分解酵素に対して抵抗性をもたせてもよい。正電荷脂質を介して遺伝子を細胞内へ導入する方法に関する文献として、例えば蛋白核酸酵素第４４巻（第１１号）第１５９０〜１５９６頁（１９９９年）が挙げられる。
【００２５】
さらにまた、本発明は、前記の核酸酵素、または該核酸酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、または正電荷リポソームを有効成分として含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、標的ＲＮＡが原因となって生じる疾病を予防および／または治療するためのものであるとよい。例えば、標的遺伝子としては、アポトーシス阻止因子として上述したｂｃｌ−２などがよく、一方、共存することにより認識されるＲＮＡとしては、ＨＩＶ（エイズ）のｔａｔ蛋白質をコードするｍＲＮＡや各種癌の特異的表面抗原をコードするｍＲＮＡなどが挙げられる。本発明の医薬組成物は、この場合、ＨＩＶ等のウイルスに感染した細胞や癌細胞などの有害細胞のみを選択的に殺すことが可能となる。
【００２６】
本発明はさらに、上記定義の核酸酵素を含む宿主細胞であって、大腸菌などの原核細胞、ヒト細胞、哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞など真核細胞から選択される宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、前記の核酸酵素を用いて標的ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで特異的に切断する方法を提供する。ここで、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの方法の場合、動物（特に哺乳類）および植物が対照となる。標的ＲＮＡとしては、疾病の原因となる異常型ｍＲＮＡが例示される。
【００２８】
本発明はさらに、上記定義の核酸酵素を含有する診断薬を提供する。本発明の核酸酵素は正常細胞に対して不活性であるが、一方有害細胞のアポトーシスに導くことができるため、この診断薬は、たとえばエイズなどのウイルス感染または癌の診断に使用できる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面を参照しながら詳細に説明する。
特定のＲＮＡ配列に結合することにより別の特定の標的ＲＮＡに対する切断活性を発現する核酸酵素（トランス・マキシザイム）の設計について説明する。
【００３０】
これまでに、本発明者らが開発したマキシザイムは、そのダイマー構造ゆえに活性中心領域と基質結合領域を２つずつ持っている（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．，  Ｗａｒａｓｈｉｎａ，  Ｍ．，  Ｔａｎａｂｅ，  Ｔ．，  Ｔａｎｉ，  Ｋ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  （１９９８ａ）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ，  ｔｈｅ  ｍａｘｉｚｙｍｅ，  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２，  ６１７−６２７）（図１Ｂ）。そこで、一方の基質結合領域で異常なＢＣＲ−ＡＢＬ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍＲＮＡのジャンクション部位に結合し、もう一方の基質結合領域で、ジャンクションから遠く離れた箇所にある、最も効率のよい切断配列に結合し、その（ＧＵＣ）トリプレットの後で基質を切断するというシステムが構築された（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．ら、上記）。いわば、片方の基質結合領域は異常型の基質を認識する“目”として働き、もう片方の基質結合領域が基質を切断するリボザイムの働きの“実”を担う腕として機能する。
【００３１】
この構築では、マキシザイムの一方の基質結合領域が異常なＢＣＲ−ＡＢＬキメラｍＲＮＡのジャンクション部位に結合したときに初めて、リボザイムとして活性を発現できる安定なダイマー構造が形成された。すなわち、ダイマーの安定性を左右するのが、ｓｔｅｍ  ＩＩ部分の塩基対の形成にある。この塩基対の安定性が高過ぎると、ダイマー型ミニザイムは（基質がなくても）それ自体でダイマー構造を形成してしまう。マキシザイムの基質を切断する側の基質結合領域が、“目”として基質を認識するもう片方の基質結合領域が機能する、しないにかかわらず、対象となる基質領域に結合してしまう。そうすると、切断する部分の配列は正常型ｍＲＮＡであるＡＢＬ  ｍＲＮＡやＢＣＲ  ｍＲＮＡ上にもあるので、結局従来のハンマーヘッド型リボザイムで問題となっている非特異的な切断が生じることに変わりはなくなってしまう。そうかといってｓｔｅｍ  ＩＩ部分の塩基対の安定性が低過ぎると、活性型のダイマー構造が形成しにくくなり、基質切断効率の非常に低い、従来のミニザイム（図１Ａ、右）と同様の問題点が生じてくる。
【００３２】
本発明では、この双方の問題を克服できるような、微妙なｓｔｅｍ  ＩＩ部分の塩基対の安定性の獲得と異常ｍＲＮＡ存在下でのみ活性型リボザイムを形成するような塩基配列の工夫がなされた。
【００３３】
またさらに本発明では、このシステムの構築の場合、異常型のｍＲＮＡを認識して特異的に結合する側は、基質を切断するわけではない。そこでＲＮＡ鎖切断に必要な、金属イオンを捕らえる足場を提供する活性中心領域の配列を削ることができる。よって、これまでのマキシザイムをさらに小型化することができる（図４の右）。活性型ダイマー構造は、ターゲットとするｍＲＮＡ（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ  キメラｍＲＮＡ）と、マキシザイムの２カ所の基質結合領域が正しく結合したときのみ形成される。ターゲットとしない正常型ｍＲＮＡ（例えばＡＢＬ    ｍＲＮＡ）  の存在下では、不活性型の構造しかできないように設計されている。ジャンクションを認識する側の基質結合領域に正常型ｍＲＮＡ  配列がやってきた場合、不活性型構造をとる。ハンマーヘッド型リボザイムの切断活性にとって必須なマグネシウムイオンを捕らえる活性中心部位の構造が、活性型ダイマー構造と違って、崩れている。この結果、このダイマー型ミニザイムによる正常型ｍＲＮＡ  への、非特異的切断は起こらない。また、基質を切断する側の基質結合領域が、単独で基質と結合したとしても（※この場合、結合する基質としては正常型ｍＲＮＡ  と標的ｍＲＮＡの双方が考えられる。）、もう一方の基質結合領域に標的のＢＣＲ−ＡＢＬ  キメラｍＲＮＡの配列が来ない限り、活性部位が閉じた構造を形成する。この結果、切断に必須となるマグネシウムイオンを捕らえられないので、切断は起こらない（図５）。
【００３４】
このように、キメラＲＮＡを破壊することができるリボザイムを設計するために、ジャンクション配列を標的にし、該キメラＲＮＡの一部を共有する正常なＲＮＡのリボザイムによる切断を制御し、宿主細胞もしくは組織には害を与えないマキシザイムを見出した。適用しうる宿主としては動物、特にヒトを含む哺乳類、または植物である。
【００３５】
以上、説明したマキシザイムにおいては、同一分子（ｍＲＮＡ）内に、目となる配列認識部位（センサー部位）とマキシザイムが切断する標的配列が存在するように設計された。本発明では、マキシザイムの目により認識される部位と切断活性部位が同一分子上にない場合を想定している。すなわち、マキシザイムがあるｍＲＮＡを認識した時に、異なるｍＲＮＡを切断するように設計される。本発明のマキシザイムを用いることによって、特定のｍＲＮＡの発現を条件とした、別のｍＲＮＡの発現阻害が可能となる。このことは、例えば、ウイルス感染細胞或いはウイルス自体が発現する特定のｍＲＮＡの存在下、宿主細胞の生存に不可欠なｍＲＮＡを切断することにより、ウイルス感染した細胞のみ、選択的に殺すことができることを示唆する。
【００３６】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明する。本発明の範囲は、これらの実施例に限定されることはない。
（実施例１）トランス・マキシザイムの設計
図３Ｂおよび図３Ｃに示した、トランスマキシザイムの各モノマーを、ＤＮＡ／ＲＮＡ  合成機  （モデル３９４；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．  （ＡＢＩ），  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）  で化学合成したＲＮＡ  を、脱保護、脱塩、ＰＡＧＥによる精製を行うことにより製造した。Ｔ−ＭｚＬ、  Ｂ−ＭｚＬの３’側とＴ−ＭｚＲとＢ−ＭｚＲの５’側は、アポトーシス阻止機能を有するｂｃｌ−２ｍＲＮＡの標的サイトに対して相補的に結合し、切断活性部位を形成するように設計した。Ｔ−ＭｚＬの５’側とＴ−ＭｚＲの３’側は、ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｍＲＮＡを認識するように設計した（ＨＩＶ−１系トランス・マキシザイム，  Ｔ−Ｍｚ：図３Ｂ）。Ｂ−ＭｚＬの５’側とＢ−ＭｚＲの３’側は、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを認識するように設計した（ＣＭＬ系トランス・マキシザイム，  Ｂ−Ｍｚ：図３Ｃ）。一方、ＨＩＶ−１感染がなく、細胞内にＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｍＲＮＡが存在しない場合には、図３Ｂの右側に示したように、活性中心部位を含んだ大幅な構造変化により、活性に必須となる金属イオンの取り込みが不可能となり、宿主のｂｃｌ−２ｍＲＮＡの切断は生じないように設計した。また、慢性骨髄性白血病のマーカー遺伝子であるＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡが細胞内に存在しない場合には、図３Ｃの下側に示したように、たとえ部分的に同じ配列を含むＡＢＬ  ｍＲＮＡと結合しても活性中心部位を含んだ大幅な構造変化により、活性に必須となる金属イオンの取り込みが不可能となり、宿主のｂｃｌ−２ｍＲＮＡの切断は生じないように設計した。さらに評価のコントロールとして、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ上の同じ部位を切断する野生型のハンマーヘッド型リボザイム（図３Ａ，  Ｗｔ  Ｒｚ）、ＨＩＶ−１系，  ＣＭＬ系の両ＭｚＲの活性中心部位（ＣＵＧＡＵＧＡ）配列を（ＣＵＡＡＵＧＡ）配列に変えることによって金属イオンの補足を不可能にした不活性型のトランス・マキシザイム（Ｉ−Ｔ−ＭｚおよびＩ−Ｂ−Ｍｚ）も作成した。
【００３７】
従来のマキシザイム（Ｍｚ）が同一ｍＲＮＡに対してセンサー機能と切断機能を発揮するのに対して、本発明で設計したマキシザイムは、２分子のｍＲＮＡ間で、センサー機能と切断機能を発揮することが期待されることより、トランス・マキシザイムと命名した。
【００３８】
（実施例２）トランス・マキシザイムの試験管内での切断活性と基質特異性
トランス・マキシザイムの切断活性および基質特異性は、以下のようにして評価することができる。ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの一部の配列  （３００  ｍｅｒ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造、京都、日本）により［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した。各酵素を１μＭ  の濃度で、２  ｎＭ  の５’末端を３２Ｐ  で標識したｂｃｌ−２  ｍＲＮＡと共にインキュベートした。これとトランス・マキシザイムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）緩衝液中に混合させた。各酵素および基質を含む緩衝化溶液に１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えることにより反応を開始させ、３７℃で６０分間反応させる。最後に、反応混合物を５％ポリアクリルアミド／７  Ｍ  尿素ゲルを用いた電気泳動にかけた。切断の有無をＢＡＳ２０００イメージアナライザーで検出した。
【００３９】
図６ＡにＨＩＶ−１系，  図６ＢにＣＭＬ系の実験結果を示す。ＨＩＶ−１系では、ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｍＲＮＡ存在下において初めてｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを特異的に切断していることが確認された（Ｔ−Ｍｚ）。ＣＭＬ系では、正常型ＡＢＬ  ｍＲＮＡ存在下ではｂｃｌ−２  ｍＲＮＡは切らずに、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡ存在下において初めてｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを特異的に切断していることを確認した（Ｂ−Ｍｚ）。トランス・マキシザイムの活性のアッセイは、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）を用いて、酵素飽和（１代謝回転）条件下で３７℃で６０分間のインキュベーションを行なって実施した。
【００４０】
また、どちらの場合も野生型のリボザイムＷｔ  Ｒｚ（図３Ａ）は疾病特異的ｍＲＮＡの存在有無に拘らず、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを切断した。また金属イオンの取り込み能を不活化したＩ−Ｔ−Ｍｚ，  Ｉ−Ｂ−Ｍｚ、およびトランス・マキシザイムのモノマー成分（Ｔ−ＭｚＬ，  Ｔ−ＭｚＲ，  Ｂ−ＭｚＬ，  Ｂ−ＭｚＲ）単独では切断は生じないことも確認した。
【００４１】
（実施例３）トランス・マキシザイムの遺伝子治療への応用
生体内でリボザイムを発現させる場合、外部から合成リボザイムをカチオン性の脂質膜などで包んで導入する方法（Ｍａｌｏｎｅ，  ＲＷ．  Ｆｅｌｇｎｅｒ，  ＰＬ．，  Ｖｅｒｍｎ，  ＩＭ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８６，  ６０７７）と、ベクターＤＮＡ（ウイルスベクターなどを用いて）として導入して細胞内で発現させる方法（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ．  Ｔ．，  Ｒｏｂｌｉｎ．  Ｒ．  （１９７２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７５，  ９４９）の２種類がある。
【００４２】
本発明のトランス・リボザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、ｐｏｌ  ＩＩ  系プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩＩ  系プロモーター（ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等）などのＲＮＡ  ポリメラーゼプロモーター、ターミネーター配列及びマキシザイムの配列を連結したもの（ｔＲＮＡｖａｌ−ＭｚＬ、ｔＲＮＡｖａｌ−ＭｚＲ）をｐＵＣ１９  （Ｔａｋａｒａ）、ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ  （ライフテックオリエンタル株式会社製）  、ｐＨａＭＤＲ  （ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ６：９０５−９１５  （Ｊｕｌｙ  １９９５））  などのベクターに組み込むことにより、作製することができる。発現されるｔＲＮＡｖａｌＴ−ＭｚＬの２次構造を一例として図７Ａに示す。
【００４３】
上記のようにして作製した発現ベクターは、以下のようにして細胞内へ導入することができる。
▲１▼リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）  法
細胞の表面は負に荷電している。そこで、目的のベクター（ＤＮＡ２本鎖環状プラスミド）  とカチオン性の脂質  （リポフェクション試薬  （リポフェクチンなど））とで複合体をつくり、それを細胞内へ導入する。
▲２▼ウイルスベクター法
▲１▼に比べ効率が高い。ウイルスの遺伝情報のうち遺伝子発現に必要な部分のみを残し、そこへ治療効果をもつ配列（ｔＲＮＡｖａｌ  ＭｚＬ、ｔＲＮＡｖａｌ  ＭｚＲのＤＮＡ  配列）  を組みこんだものを用意する。このベクターをウイルスの力によって目的細胞のＤＮＡ  に組み込む。
【００４４】
ベクター配列中のマキシザイムには、ＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩＩ  のプロモーター配列が付加されている（例、図７Ａ）  。細胞内に導入されたベクターＤＮＡ  から、元来細胞内で機能しているＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩＩ  の働きにより、治療効果をもつＲＮＡ  配列が転写されることにより、高い発現力でトランス・マキシザイムが発現される。
【００４５】
ＨＩＶ−１系トランス・マキシザイムはＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞  （東大医化学研究所より入手）、ＣＭＬ系トランス・マキシザイムはＢＶ１７３細胞内でのトランス・マキシザイムの発現をノーザンハイブリダイゼーションにより調べた結果を図７Ｂに示す。細胞抽出ＲＮＡをアガロースゲルで泳動し、核酸吸着メンブレンにトランスファーさせた後、５’末端標識したトランス・マキシザイムに相補的な配列を持つＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。その後、発現および局在の有無をＢＡＳ２０００  イメージアナライザーで検出した。どのトランス・マキシザイムも高発現しており、用いたｔＲＮＡプロモーター依存性の発現により、細胞質に輸送、局在していることが分かった。また、ｂｃｌ−２，  Ｔａｔ，  ＡＢＬ，  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡの発現も同様に調べたところ、どれも細胞質に主に局在していることが分かった（図７Ｃ）。図中、Ｃは細胞質、Ｎは核を示す。トランス・マキシザイム、標的ｍＲＮＡ、疾病特異的ｍＲＮＡが同じ局在を示すことは、細胞内で効果を発揮する上で重要である。
【００４６】
（実施例４）トランス・マキシザイムのウイルス感染抑制効果
ＨＩＶ−１系のトランス・マキシザイムの効果を調べた。トランス・マキシザイムが効率良くｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを切断することができると、  ｂｃｌ−２タンパク質の発現が抑制され、細胞はアポトーシスを起こす。そこで、アポトーシスが生じたかどうかをＴｕｎｅｌ法によって調べた。アポトーシスが進行すると、ＤＮＡ分解が起きるが、  Ｔｕｎｅｌ法ではＴｄＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いてそのＤＮＡ断片にＦＩＴＣ標識ｄＵＴＰを結合させる。それを蛍光顕微鏡で観察すると、アポトーシスを起こしている細胞は蛍光を発する。本実験ではＩｎ  ｓｉｔｕ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。
【００４７】
図８Ａに示されているように、  ＨＩＶ−１系トランス・マキシザイム（Ｔ−Ｍｚ）を導入した細胞が蛍光を発し、かなり進行したアポトーシスが観察された。しかし、ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｍＲＮＡが発現していない細胞（（−）Ｔａｔとして表示）では、  Ｔ−Ｍｚを導入してもアポトーシスは起こらず、センサー能の高さが証明された。Ｗｔ  Ｒｚでも若干のアポトーシスは観察されたが、その進行度はかなり遅いものであることが細胞像を併せ見ると良く分かる。またモノマー（Ｔ−ＭｚＬ，  Ｔ−ＭｚＲ）、不活性型のトランス・マキシザイム（Ｔ−Ｉ−Ｍｚ）では全くアポトーシスは観察されなかった。
【００４８】
次に、実際のＨＩＶ−１のウイルス感染をどの程度阻害するかを調べた。２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３万の細胞を撒き、翌日、トランス・マキシザイム（Ｔ−Ｍｚ）を導入して、さらにその翌日（トランスフェクションより２４時間後）、ＨＩＶ（ｐ２４の濃度で１０ｎｇ／ｍＬ）を感染させた。その後２日毎（Ｄ２、Ｄ４、Ｄ６；図８Ｂ右）にアッセイを行った。アッセイ法はＨＩＶ患者血清を一次抗体にした蛍光抗体法によって行った。ＨＩＶ抗原陽性細胞の％を求め、２回の平均値を図８Ｂに示している。野生型リボザイム（Ｗｔ  ＲＺ、図３Ａ）は４日後には、ある程度までウイルス感染が抑制されたが６日後にＨＩＶ−１のウイルス感染が一気に進むと、その抑制能が大幅に低下した（Ｄ６、中央の青色バー）。トランス・マキシザイムは安定して極めて高い効果を発揮し、６日後にはウイルス感染細胞を死滅させることによりＨＩＶ抗原陽性細胞はほぼ０％になった（Ｄ６、右側の赤色バー）。
【００４９】
（実施例５）トランス・マキシザイムの癌細胞死滅効果
つぎに、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）系のトランス・マキシザイムの効果を調べた。Ｔｕｎｅｌ法の原理および実験方法は上述と同じであるが、ここでは多種の細胞を用いた。まずＣＭＬの特異的なｍＲＮＡであるＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを発現していない細胞として、Ｈ９細胞とＨＬ６０細胞、ＣＭＬヒト細胞としてＢＶ１７３細胞、Ｐｒｉｍａｒｙ  ＣＭＬ細胞、最後にネズミから樹立されたＢａＦ３細胞にヒトのＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを発現させたＢａＦ３／ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞である。また均等にＤＮＡを染色する細胞を固定化した後にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を添加し、低波長側（赤色）で全細胞を発光させた。赤色蛍光の全細胞中に緑色蛍光のアポトーシス細胞がどれだけいるかが、アポトーシスの度合いを示すことになる。
【００５０】
図９に示されているように、Ｔ−ＭｚはＣＭＬヒト細胞であるＢＶ１７３細胞、Ｐｒｉｍａｒｙ  ＣＭＬ細胞のみに高い頻度でアポトーシスを生じさせた。ＢａＦ３／ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞はＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡは発現しているが、ネズミ由来の配列をもつｂｃｌ−２  ｍＲＮＡが発現しているため、アポトーシスは生じない。Ｗｔ  Ｒｚは、ＢａＦ３／ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞と同じように標的ｍＲＮＡ配列がないためアポトーシスを生じさせなかったが、それ以外の細胞ではＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを発現している、いないに拘らずアポトーシスを生じさせた。
【００５１】
（実施例６）トランス・マキシザイムの細胞内での標的ｍＲＮＡ切断効果
つぎに、トランス・マキシザイムの標的ｍＲＮＡ切断効果を調べた。アポトーシスシグナルの伝達およびアポトーシスの達成には、いくつかのアスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ〔カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）として知られている〕の協調作用（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ａｃｔｉｏｎｓ）が必要である。図１０ＡにＨＩＶ−１系のトランス・マキシザイムのｂｃｌ−２タンパク質発現阻害を見たＷｅｓｔｅｒｎブロットの結果、図１０Ｂにアポトーシスのカスケード中最後に活性化されるＣａｓｐａｓｅであるＣａｓｐａｓｅ−３の活性化を見たＷｅｓｔｅｒｎブロットを示した。細胞抽出物を１５％  ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。プロカスパーゼ−３およびプロセシングされた  ｐ１７（カスパーゼ−３）の両方を認識するウサギポリクローナル抗体αＣＰＰ３２  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｆｌｏｒｉｄａ，  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨｏｎｇ−Ｇａｎｇ  Ｗａｎｇ教授から好意により提供された）を用いて、プロカスパーゼ−３の活性化を検出した。ブロッキングおよび検出はＤｕｂｒｅｚらの方法に従って実施した（Ｄｕｂｒｅｚら，Ｂｌｏｏｄ，  ７，  ２４１５−２４２２，  １９９８）。一方、ｂｃｌ−２については、ｂｃｌ−２に対するウサギポリクローナル抗体（コスモバイオ）を用いてｂｃｌ−２を検出した。
【００５２】
図１０Ａをみて分かるように、Ｗｔ  Ｒｚでは、ｔａｔ  ｍＲＮＡの有無によらず、ｂｃｌ−２の発現阻害が若干観察された。これに対してトランス・マキシザイムの場合では、ｔａｔ  ｍＲＮＡが存在しない場合はｂｃｌ−２の発現量に変化がなく、ｔａｔ  ｍＲＮＡが存在する時のみ発現阻害が観察された。他のマキシザイムモノマー（ＭｚＬ，  ＭｚＲ）や不活性化マキシザイムでは、ｂｃｌ−２の発現の低下は観察されなかった。
【００５３】
一方、ｂｃｌ−２の発現阻害に伴い、アポトーシス誘導に関連するプロカスパーゼ−３の低下とカスパーゼ−３の活性化を指標としてみてみると、Ｗｔ  Ｒｚではｔａｔ  ｍＲＮＡの有無によらずカスパーゼ−３が活性化しているのに対して、トランス・マキシザイムでは、ｔａｔ  ｍＲＮＡが存在する場合でのみ、カスパーゼ−３の活性化が確認できた。他のマキシザイムモノマーや（ＭｚＬ，  ＭｚＲ）不活性化マキシザイムでは、ｔａｔ  ｍＲＮＡが存在する場合においてもカスパーゼ−３の活性化は確認できなかった（図１０Ｂ）。
【００５４】
また図１０ＣにＣＭＬ系のトランス・マキシザイム（Ｂ−Ｍｚ）のアポトーシス効果を、以前に構築したＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを切断するマキシザイム（Ｍｚ）と比較したグラフを示す。ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを認識してそれ自身を切断する前回までの構築より、  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡを認識して細胞により必要不可欠な（つまり、実際にアポトーシスをより強く阻害している）ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを切断するトランス・マキシザイム構築の方が、より優れていることが分かった。また図１０Ｄに示したＣＭＬ系のトランス・マキシザイムによるｂｃｌ−２タンパク質発現阻害を見たＷｅｓｔｅｒｎブロット、図１０Ｅに示したＣａｓｐａｓｅ−３の活性化を見たＷｅｓｔｅｒｎブロットをからも、ＨＩＶ−１系と同様に、ＣＭＬ系のトランス・マキシザイムの高い細胞内での活性と非常に高い特異性が証明された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の核酸酵素であるトランス・マキシザイムを用いれば、正常細胞のｍＲＮＡに全く影響を与えることなく、ウイルス感染細胞や癌化した細胞の増殖を特異的に抑制したり、アポトーシスを誘導することが可能となり、有効で安全な各種疾患の治療に有効である。したがって、本発明は、医薬、特に、癌細胞やウイルス感染細胞などにアポトーシスを特異的に誘導させることにより治療効果を発揮する医薬として使用することができる。
【００５６】
【配列表】
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【００５７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１  −  人工配列の説明：マキシザイムを構成するＲＮＡ分子
配列番号２  −  人工配列の説明：マキシザイムを構成するＲＮＡ分子
配列番号３  −  人工配列の説明：マキシザイムを構成するＲＮＡ分子
配列番号４  −  人工配列の説明：マキシザイムを構成するＲＮＡ分子
配列番号５  −  人工配列の説明：ｔＲＮＡＶａｌプロモーター配列
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、ハンマーヘッド型リボザイムおよびマキシザイムの二次構造を示す。
【図２】この図は、ＣＭＬの転座の種類とＢＣＲ−ＡＢＬキメラｍＲＮＡをターゲットとしたリボザイムの問題点を示す。
【図３】この図は、ｂｃｌ−２を狙った野生型のリボザイム、ＨＩＶ−１系のトランス・マキシザイム、ＣＭＬ系のトランス・マキシザイムのデザインを示す。トランス・マキシザイムについては活性化構造および不活性化構造も併せて示す。
【図４】この図は、同一分子内をセンサー認識して切断するマキシザイムの模擬図と、その小型化について示す。
【図５】この図は、同一分子内をセンサー認識して切断するマキシザイムのアロステリック制御について示す
【図６】この図は、トランス・マキシザイムの試験管内での切断実験結果を示す。
【図７】この図は、細胞内で発現されるｔＲＮＡｖａｌ付加型トランス・マキシザイムの二次構造および細胞内での発現、局在を調べたノーザンブロットの結果を示す。
【図８】この図は、  ＨＩＶ−１系トランス・マキシザイムによるアポトーシスを見たＴｕｎｅｌ実験結果およびＨＩＶ−１のウイルス感染阻害効果を示す。
【図９】この図は、  ＣＭＬ系トランス・マキシザイムによる種々の細胞でのアポトーシスを見たＴｕｎｅｌ実験結果を示す。
【図１０】この図は、トランス・マキシザイムを培養細胞で発現させた際のウエスタン・ブロッティング解析によるｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３の活性化の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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