(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１において、２５番から７９６番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳＦ−４、配列番号２において、２５番から７９６番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−１、および配列番号３において、２５番から６９３番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−２、よりなるグループから選ばれたタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１において、１番から２４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から７９６番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳＦ−４前駆体タンパク質、配列表の配列番号２において、１番から２４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から７９６番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−１前駆体タンパク質、および配列表の配列番号３において、１番から２４番目までのシグナルペプチドを含む、１番から６９３番目までのアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−４−２前駆体タンパク質、よりなるグループから選ばれたタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項４】
以下の手順を含む、請求項１のタンパク質を産生させる方法：
（ａ）  以下のＤＮＡ配列より構成される異種のＤＮＡを含む細胞集団を得ること。
（ｉ）  当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロールする配列。
（ｉｉ）  上記のコントロール配列の下に結合した、前記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
（ｂ）  当該細胞集団を前記のタンパク質が産生される条件下で培養すること。
【請求項５】
コントロール配列がさらに、請求項１のタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、前記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置するように含むことを特徴とする請求項４のタンパク質を産生させる方法。
【請求項６】
細胞集団が大腸菌または酵母または哺乳動物細胞である請求項４または５のタンパク質を産生させる方法。
【請求項７】
請求項１のタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な骨関連タンパク質を提供する。本発明のタンパク質はＯＳＦ−４と名付けられたものであり、カドヘリン分子の仲間に属する新規なタンパク質である。このＯＳＦ−４はマウスまたはヒトを含む哺乳動物の骨組織より得ることができる。本発明で提供される骨関連タンパク質は、骨代謝性疾患の診断及び治療に有用である。
【０００２】
【発明の背景】
骨代謝性疾患と総称される疾患の中には、骨粗鬆症（Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、ページェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、骨軟化症、過骨形成症、大理石病等が含まれ、このうち、特に骨粗鬆症は発生頻度が閉経後の女性及び老齢人口の約半分を越える程に高く、その診断と有効な治療法が強く望まれている。
【０００３】
骨代謝性疾患とは、何らかの骨組織における、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うものであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明を完成させるに至ったものである。
【０００４】
より詳しくは、本発明者等は、特に、骨形成において主要な働きをする骨芽細胞の細胞株を用い、この細胞株により特異的に生成されるタンパク性因子を同定したものである。さらに、本発明は、こうした研究によって得られた、従来知られている種々のカドヘリン型の細胞接着分子とアミノ酸配列上で強いホモロジーを有する実質的に骨特異的なＯＳＦ−４と名付けられた新規なタンパク質を提供する。
【０００５】
本発明のＯＳＦ−４は、本明細書に記載されたＤＮＡ配列から当業者において公知の通常の遺伝子工学的手法によっても生産でき、また本明細書に記載のアミノ酸配列から、化学的なペプチド合成法により、ＯＳＦ−４又はその断片を生産することができる。さらに、本発明に記載されたＯＳＦ−４のＤＮＡ配列のうち特に他のカドヘリン分子と比べてＯＳＦ−４に特徴的な部分配列を通常のオリゴヌクレオチド化学合成法により、１５〜５０塩基長で合成し、骨由来細胞を識別診断するＤＮＡプローブとして使用することができる。このような骨由来細胞の識別は、特に、転移再発性癌の由来を識別するために有用であり、適切な再発性癌の治療をもたらす。さらにＯＳＦ−４の部分ペプチドのうち、抗体の認識しうるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）部分のペプチドは、ＯＳＦ−４に特異的なモノクローナル抗体を作成するために使用できる。こうして得られたモノクローナル抗体は、免疫学的細胞組織染色法により骨由来細胞の同定に有用である。また、ＯＳＦ−４はその細胞接着分子との類似性から、骨折の治療にも有用である。
【０００６】
【従来の技術】
本発明で提供されるＯＳＦ−４はカドヘリン様タンパク性因子であると考えられる。カドヘリンは、細胞接着作用を有し、次のことが知られている。
【０００７】
細胞群の区画化は動物体構築の最も基本的な要素の一つである。この区画化は発生のごく初期から始まり、各細胞の分化が進むにつれ、同種の細胞が秩序正しく移動し再配置することにより形態形成や組織の構築と維持が行われている。このような秩序正しい細胞の移動をコントロールする要素の一つに、細胞の選択的接着性がある。各細胞は隣接した細胞ないしは隣接した細胞外基質を認識し、特定のものとのみ接着する性質を有する。そして、細胞の分化に伴いこれらの接着特異性が変化することにより、特定の場所から離れて、本来あるべき場所へと移動し集合すると考えられている。これまでに、数多くの細胞接着分子が同定されているが、全て細胞タイプ特異性を示す。これらの分子を大別するとカドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー接着分子、インテグリンスーパーファミリー、セレクチン、およびこれらには属さないものの４つ以上のグループに分けることができる（Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．６８，  ｐ．３０３〜３２２）。
【０００８】
これらのなかでも、とりわけカドヘリンはその解析が進んでおり、構造はもちろんのこと機能面においても研究が進んでいる。カドヘリンは分子量約１２０ｋＤの糖タンパク質であり、カルシウムイオンに依存して働く細胞間接着分子である（Ｔａｋｅｉｃｈｉ，  （１９９１），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２５１，  ｐ．１４５１〜１４５５）。これまでに１０種類近くが同定されており、それぞれのタイプは結合特異性を有し、同じ分子同士がホモフィリックに反応する。その結果、同じタイプのカドヘリンを持つ細胞が選択的に結合し合い、細胞間接着の特異性を決めるために必須の因子であると考えられている。代表的なものに上皮由来のＥ（Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ）カドヘリン、胎盤由来のＰ（Ｐｌａｃｅｎｔａ）カドヘリン、神経細胞由来のＮ（Ｎｅｕｒａｌ）カドヘリン、肝細胞由来のＬ−ＣＡＭ（ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などが挙げられる。その構造はどれもほぼ類似しており、約１１０アミノ酸の４、５回の繰り返しから成る細胞外領域、細胞膜貫通領域と約１５０アミノ酸から成る細胞内領域で構成されている。各カドヘリンのサブクラスにおいて、それぞれ全体で約５０％のホモロジーが見られる。細胞外領域においてはアミノ末端に近い部位でホモロジーが高く膜貫通領域に近づくにつれ徐々に低くなり、細胞内領域において最も高いホモロジーが見られる。近年、新しいカドヘリンが次々と報告されつつある。たとえば、筋肉細胞由来のＭ（Ｍｕｓｃｌｅ）カドヘリン、脳細胞由来のＢ（Ｂｒａｉｎ）カドヘリンや胎児脳由来のＴ（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）カドヘリン、さらに、デスモソームに局在するデスモグレインなど、これら全ては同じ祖先を持つ１つの遺伝子に由来するものでカドヘリンファミリーを形成していると考えられている。
【０００９】
カドヘリン分子の詳細な研究により、そのＮ末端領域にはカルシウムイオンと結合する部位と接着特異性を決定する部位を有していることがわかっている。さらに、細胞内領域においては接着分子として機能的にも重要であることのみならず、カテニンやアクチン等の裏打ちタンパクと結合していることがわかっており、細胞内伝達に寄与していることが示唆されている。一方、癌細胞の侵入と転移において、これらカドヘリンの量的変化が認められ、腫瘍形成との関連でも興味がもたれている。しかしながら、これら多くのカドヘリン分子の報告があるにもかかわらず、骨細胞に特異性を持つカドヘリン分子の報告はない。
【００１０】
骨のリモデリングは、骨を形成する骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）と骨を吸収する破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）のバランスによって骨の形成・維持が担われている。骨芽細胞は間葉系の細胞由来で筋細胞や脂肪細胞と起源を同じくし、破骨細胞は造血幹細胞由来であり、好中球やマクロファージなどと同様な起源を持つ細胞であると考えられている。細胞接着分子としては、破骨細胞がインテグリンファミリーに属するビトロネクチンレセプターを発現していることが知られているのみであり、骨芽細胞についてはその存在が示唆されているにすぎない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、骨芽細胞に特異的に発現している新しいタイプの細胞接着因子を見い出すことである。こうした新しい細胞接着因子は、骨芽細胞の増殖、分化、移動や再配置に重要な分子である。この物質は、種々の骨代謝性疾患の診断、治療に用いることが期待できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
マウスＯＳＦ−４（ｍＯＳＦ−４）のｃＤＮＡは、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１由来のｃＤＮＡからＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法とサブトラクション（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）法を組み合わせた方法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、ディファレンシャルスクリーニング（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）法によりクローン化された。つづいて、マウスＯＳＦ−４ｃＤＮＡをプローブとして、ヒト骨肉種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、２種類のＯＳＦ−４が得られ、それぞれ、ｈＯＳＦ−４−１及びｈＯＳＦ−４−２  と名付けられ、その塩基配列を決定した。ＯＳＦ−４の塩基配列は、マウスとヒトの間で、非常に良く保存されている。ｍＯＳＦ−４とｈＯＳＦ−４−１、及びｈＯＳＦ−４−２とのアミノ酸配列との比較では、それぞれ９７．１％、及び９６．４％のホモロジーを示している（図１〜３）。これら種間での非常に高い保存性は、ＯＳＦ−４が脊椎動物の骨の代謝に必須な働きを持っていることを示唆している。ＯＳＦ−４は他の脊椎動物の骨抽出物からも分離精製できる。組換え遺伝子技術を用いて、他の動物種のＯＳＦ−４を、それぞれの骨、培養骨細胞、及び他の体組織から作成したｃＤＮＡライブラリー、またはゲノム遺伝子ＤＮＡライブラリーから、本発明のｃＤＮＡまたはそのＤＮＡ断片をプローブとして用いてクローニングすることが出来る。本発明で示されたｃＤＮＡの配列は現在利用できる種々のＤＮＡ及びアミノ酸配列データベースによる検索で、新規であることが明らかにされた。
【００１３】
ｍＯＳＦ−４のアミノ酸配列との比較で、ｈＯＳＦ−４−１は全ての領域において非常に保存されている。一方、ｈＯＳＦ−４−２はＮ末端から６３１番目のアミノ酸残基まではｈＯＳＦ−４−１と完全に一致しているのに対し、細胞膜貫通領域の中において、１７９塩基の挿入がある為にフレームシフトがおこり、６３２番目のアミノ酸残基から６９３番目のＣ末端までの６２アミノ酸残基は全く異なった構造をしている（図１〜３）。従って、細胞膜貫通領域のＣ末端９アミノ酸残基と細胞内領域はｈＯＳＦ−４−１とｈＯＳＦ−４−２では完全に異なっている。このようなＣ末端領域が欠失したカドヘリンはＴカドヘリンに相当するものであり、このタイプのカドヘリンの存在はＯＳＦ−４の細胞接着の制御に関与することを示唆している。
【００１４】
ｍＯＳＦ−４のＥＣ１ドメイン中の１０１番目から１１５番目までの親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）の１５アミノ酸残基に相当するペプチドを化学合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）と架橋し、ウサギの免疫に使用した。得られた抗ｍＯＳＦ−４ペプチド抗血清を新生児マウス全身切片中のＯＳＦ−４の免疫組織化学的検出に用いた。ＯＳＦ−４は骨芽細胞、軟骨細胞等に検出された。
【００１５】
一般に、ＯＳＦ−４は、ヒト、ウシ、マウス、または、その他の材料から、公知の生化学的技術により、直接骨組織または軟骨組織から抽出することが出来る。また、ＯＳＦ−４をコードするＤＮＡは、脊椎動物の骨組織から抽出したｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリー、または、ゲノムＤＮＡライブラリーから、本明細書中で開示されたヒトまたはマウスのｃＤＮＡ配列の断片を標識してプローブとして用い、得ることができる。全長ｃＤＮＡクローンは上記の及び他の標準的な分子生物学的な技術を組み合わせて得る事ができる。
【００１６】
このように、ＯＳＦ−４は既知の代表的なカドヘリン分子とホモロジーはあるが、これまでに報告されているものとは異なり新しいサブクラスに属するカドヘリン分子である。その構造は、細胞外領域において５回の繰り返し構造、細胞膜貫通領域、及び、細胞内領域から構成されている（図４）。ＯＳＦ−４と他のカドヘリンとの比較をすると、これまでの異なったカドヘリン分子間のホモロジー様式と同様に、細胞外領域ではＮ末端から膜貫通領域に近づくにつれてホモロジーは低くなり、細胞内領域で最も高いホモロジーが認められた（表１）。
【００１７】
【表１】
0003560252.tif 000002
表１はマウスＯＳＦ−４と他のカドヘリン分子とのアミノ酸比較表である。各領域ごとのアミノ酸での相同性を計算し％で表した。領域の略語はＥＣ１〜ＥＣ５：５つの細胞外領域、ＴＭ：細胞膜貫通領域、ＣＰ：細胞内領域、そしてＭＰは成熟タンパク質の全体での比較を示す。また、ＮはＮカドヘリン、ＥはＥカドヘリン、ＰはＰカドヘリン、ＭはＭカドヘリンを示す。比較したカドヘリンのタイプにおいて、ＯＳＦ−４：ＮはＯＳＦ−４とＮカドヘリン間でのアミノ酸配列の各領域ごとの比較を示す。以下同じ。
【００１８】
本発明により提供されるタンパク質は、骨形成において重要な役割を担っている新しいサブクラスのカドヘリンに属する糖タンパク質でＯＳＦ−４と名付けたグループであり、より具体的には本明細書中に記載されているヒト及びマウスのＯＳＦ−４である。ＯＳＦ−４は骨形成の過程において骨芽細胞で発現し、細胞接着分子及び形態形成関連物質として作用する。これらヒト又はマウスのＯＳＦ−４は、塩基配列やアミノ酸配列において類似した他の哺乳類由来のＯＳＦ−４タンパク質を分離同定するために使用できる。
【００１９】
本発明は、さらに、ＯＳＦ−４の類似体よりなるポリペプチド、即ち、ミュータント、融合タンパク、及びＯＳＦ−４の一部を含む断片を提供する。マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１から分離したマウスＯＳＦ−４のｃＤＮＡは、２４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含む７９６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。ヒト骨肉種細胞（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）ｃＤＮＡライブラリーより分離したヒトＯＳＦ−４は２種類あり、その内の１つヒトＯＳＦ−４−１  のｃＤＮＡは２４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含む７９６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。他の１つヒトＯＳＦ−４−２  のｃＤＮＡは２４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含む６９３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。本発明は、また組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−４の製造方法を提供する。
【００２０】
【実施例】
〔実施例１〕  サブトラクション／ＰＣＲによるｃＤＮＡライブラリーの作成この実施例では骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なｃＤＮＡライブラリーの構築について記述する。このｃＤＮＡライブラリーはサブトラクション法とＰＣＲ法を組み合わせることにより、マウス肝組織で発現している遺伝子を差し引いたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡライブラリーであり、各ｃＤＮＡクローンは平均約３００塩基の遺伝子断片を有し、さらに、本来含有量の少ない遺伝子をも増幅されるという特徴を有している。
【００２１】
全ての一般的な組換えＤＮＡ技術に関する手順（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、特に他に断らなければ、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍａｎｕａｌ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、米国、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）に準じて行った。総ＲＮＡは、グアニジン法により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス肝組織の、それぞれ、８×１０７個、約１ｇから抽出した。ポリＡ＋ＲＮＡは総ＲＮＡから市販の「オリゴｄＴラテックスｍＲＮＡ精製キット」（宝酒造（株））により精製した。各１μｇポリＡ＋ＲＮＡをテンプレートとし、ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。ただし、オリゴｄＴプライマーの代わりにランダムプライマーを用い、その量は通常使用量の１．５倍使用した。これにより、ｃＤＮＡ鎖伸長反応を平均約３００塩基に制限した。上記のキットを用いて２本鎖平滑末端にした後、下記の２種類の合成ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株））により、それぞれ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−１／２（配列表の配列番号４及び５）と、肝臓ｃＤＮＡはＡＴＯＳ−４／５（配列表の配列番号６及び７）と結合させた。
【００２２】
ＡＴＯＳ−１／２
ＡＴＯＳ−１      ５′−        ＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＣＴＡ−３′
ＡＴＯＳ−２      ３′−ＡＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＣＴＧＡＴ−５′
ＡＴＯＳ−４／５
ＡＴＯＳ−４      ５′−        ＣＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡ−３′
ＡＴＯＳ−５      ３′−ＡＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＴＧＡＴ−５′
【００２３】
次に、各反応産物をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、プライマーとして、それぞれ、ＡＴＯＳ−１とＡＴＯＳ−４を用いてＤＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡ濃度測定は「ＤＮＡ濃度測定キット“ＤＮＡ  Ｄｉｐｓｔｉｃｋ”」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。サブトラクション法はフォトビオチン（Ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ，  Ｐｉｒｃｅ社）を用いて行った。ＰＣＲ法により増幅した２０μｇの肝臓ｃＤＮＡに２０ｎｇのフォトビオチンを加え、サンランプを１０ｃｍ隔て１０分間照射することにより、ＤＮＡをビオチンで標識した。この標識した肝臓ｃＤＮＡ３．０μｇに、標識していないＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡ０．３μｇを加え、ハイブリダイゼーションを行った。次いで、これにストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，宝酒造（株））を反応し、フェノール抽出する事により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと共通のｃＤＮＡを除いた。サブトラクション法を再度繰り返し行い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡから肝臓ｃＤＮＡと共通なものをできるだけ除いた。さらに、上記のＡＴＯＳ−１を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ濃度を測定した。このｃＤＮＡ１０ｎｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し末端を脱燐酸化したファージベクターλｇｔ１０（λｇｔ１０／ＥｃｏＲＩクローニングキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）１μｇとＴ４リガーゼを用いて連結した。これを市販のインビトロパッケイジングキット（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ）「ギガパックゴールド（Ｇｉｇａｐａｃｋ−ｇｏｌｄ）」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によりλファージ粒子にパッケイジングした。この組換え体ファージを、大腸菌Ｃ６００（日本予防衛生研究所、日本癌研究資源バンクにＨＴ００３として保存されている）に感染させ、軟寒天培地とともに寒天培地の上にまきファージプラークを形成させ感染効率を測定したところ、１μｇのｃＤＮＡあたり３×１０６のファージプラークが得られた。
【００２４】
さらに、このｃＤＮＡライブラリーをディファレンシャルスクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）法を用い、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異性の高いクローンを選択した。つまり、２．２５×１０４個のファージを計１０枚のプレートにまき、それぞれ２枚（計２０枚）のナイロンメンブレンフィルターに移した。これらの一方を放射能でラベルしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡと、また、他方を同様にラベルした肝臓のｃＤＮＡをプローブとして、プラークハイブリダイゼーション法を行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ｃＤＮＡプローブでシグナルが認められ、しかも、肝臓のｃＤＮＡプローブでシグナルの認められない２７３クローンをミニライブラリーとし、以後の実験に用いた。
【００２５】
〔実施例２〕  マウスＯＳＦ−４クローンの単離
この実施例では、上記の実施例１で作成したミニライブラリーから、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に特異的なクローンとして、ＯＳＦ−４の部分的ｃＤＮＡ断片を同定し、さらに、これを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡをクローニングする方法について記述している。
【００２６】
実施例１で調製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及び肝臓の各総ＲＮＡを、それぞれ１μｇづつナイロンメンブレンフィルターにスポットし、このフィルターを２７３個作成し、以下のハイブリダイゼーションに用いた。一方、実施例１で作成した２７３個のファージクローンの挿入部分のＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅した。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、主なバンドを切り出し精製し、放射能ラベルしてプローブとして用いた。オートラジオグラフィーの結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１でシグナルが認められ、しかも肝臓でシグナルの認められないクローンについてプラスミドベクターにリクローニング（ｒｅｃｌｏｎｉｎｇ）した。つまり、ＰＣＲ法により増幅し精製した挿入部分のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株））のＥｃｏＲＩサイトにリクローニングした。これらのクローンについて市販の「ＤＮＡシーケンスキット」（宝酒造（株））を用いユニバーサルプライマーにて塩基配列を決定した。得られた塩基配列をＤＮＡ及びタンパク質データベースを検索したところ、既存のカドヘリンとホモロジーを示すクローンが得られ、これをＤ４５と命名し、これを用いて以後の完全長ｃＤＮＡのクローニングを行った。
【００２７】
完全長ｃＤＮＡクローニングのために、実施例１で精製したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のポリＡ＋ＲＮＡ５μｇから「ｃＤＮＡ合成キット」（ｃＤＮＡ  ｓｙｓｔｈｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｌｕｓ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて平滑末端２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター（宝酒造（株））をＴ４リガーゼを用いて連結した後、アガロースゲル電気泳動し、約７００塩基対以上のフラクションを精製した。この断片をλｇｔ１０ファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＥｃｏＲＩサイトに連結し、実施例１と同様にファージ粒子にパッケイジングした後、大腸菌に感染させ感染効率を測定したところ、１μｇのベクターＤＮＡあたり、１．５×１０７であった。前述のＤ４５を放射能ラベルしてプローブとして用い、このｃＤＮＡライブラリー１．０×１０６個のファージクローンをプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。その結果、１４個のポジティブシグナルが得られ、その内、最も挿入断片の長いファージクローンのＮｏｔＩ断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｏｔＩサイトにリクローニングし、これをｐＫＯＴ１６４と命名した。
【００２８】
〔実施例３〕  マウスのＯＳＦ−４のＤＮＡ配列の決定
ｐＫＯＴ１６４、及びこのｃＤＮＡ断片を有するサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）から「キロシークエンス用デレーションキット」（宝酒造（株））を用いて、それぞれ約３００塩基対おきに両方向からのデレーションミュータントを作成した。それぞれのデレーションミュータントの塩基配列の決定は、米国Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の自動ＤＮＡシークエンサー・モデル３７３Ａ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて行った。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列と、塩基配列より翻訳したアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。このｃＤＮＡにコードされるタンパク質をマウスＯＳＦ−４と名付けた。アミノ酸残基の番号１は予想されるマウスＯＳＦ−４前駆体タンパク質のＮ末端に相当する。また、このＤＮＡの制限酵素地図を図５に示した。
【００２９】
〔実施例４〕  マウスＯＳＦ−４の組織特異的発現
マウスＯＳＦ−４の組織特異的発現をみるためにＲＮＡドットブロッティング（ＲＮＡ  ｄｏｔ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。マウス（日本クレアから購入）の胸腺、脾臓、脳、腎臓、肝臓、肺、睾丸、及び心臓の総ＲＮＡをグアニジン法で調製した。頭蓋冠由来の骨芽細胞を多く含む細胞は、新生児マウスの頭蓋冠より調製し、これを培養して得られた。さらに、この細胞から総ＲＮＡを前述と同様な方法で抽出した。上記の組織、頭蓋冠培養細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及びマウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、の各総ＲＮＡ１μｇをナイロンメンブレンフィルター（Ｂｉｏｄｙｎｅ，  ＰＡＬＬ社）にドットし、加熱固定した後に、ハイブリダイゼーションに用いた。一方、ｐＫＯＴ１６４をＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動による分離精製を行った後、放射能でラベルしプローブとして用いた。オートラジオグラフィーの結果、頭蓋冠培養細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に強いシグナルが見られ、睾丸で弱いシグナルが見られた（図６）。
【００３０】
〔実施例５〕  ヒトＯＳＦ−４をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｐＫＯＴ１６４のｃＤＮＡ領域を含むＮｏｔＩ断片を精製し、これをプローブとして用い、１．３×１０５個のクローンから成るヒト骨肉腫ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、２１個のポジティブシグナルが得られた。そのうち、５クローンを分離し、挿入断片の大きい２つのクローンについてプラスミドベクターｐＨＳＧ３９８にリクローニングした。この結果、得られたプラスミドをｐＫＯＴ１６１、およびｐＫＯＴ１７０と名付けた。
【００３１】
〔実施例６〕  ヒトのＯＳＦ−４のＤＮＡ配列の決定
上記の実施例５でクローン化されたｐＫＯＴ１６１、ｐＫＯＴ１７０、及びそれらのサブクローンについても実施例３に示した方法と同様にデレーションミュータントを作成し、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。これらのｃＤＮＡの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２及び３に示した。これらのｃＤＮＡにコードされるタンパク質をヒトＯＳＦ−４−１、ヒトＯＳＦ−４−２と名付けた。各々アミノ酸残基の番号１は予想されるＯＳＦ−４前駆体タンパク質のＮ末端に相当する。
【００３２】
〔実施例７〕  抗ＯＳＦ−４抗血清の調製
マウスＯＳＦ−４の抗ペプチド抗体を作成するにあたり、Ｍカドヘリンの実験報告例（Ｄｏｎａｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌｅ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．８８，  ｐ．８０２４−８０２８）に従い、これに相当するＥＣ１領域内の１５アミノ酸残基をペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、モデル４３０Ａ）により、固相合成法で合成した。合成したペプチドはＯＳＦ−４．１（ＦＶＩＤＤＫＳＧＮＩＨＡＴＫＴ：配列表の配列番号８）である。合成ペプチドはグルタルアルデヒドをカップリング剤としてＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）担体と結合し、ウサギの免疫に使用した。得られた抗血清は、新生児マウス全身切片中で、組織免疫化学的に、ＯＳＦ−４の存在を検索したり、大腸菌、酵母及び動物細胞でのＯＳＦ−４の発現を検出するのに使用できた。
【００３３】
〔実施例８〕  動物細胞でのＯＳＦ−４の発現
本実施例ではマウスＯＳＦ−４の動物細胞での発現プラスミドベクターの作製と発現、及び機能解析について記載する。
配列表の配列番号１に示される塩基配列中にはＯＳＦ−４をコードする領域の５′上流に他のオープンリーディングフレームが存在する。このため、この配列によるＯＳＦ−４の翻訳効率の低下が予想された。そこで、実施例３で作製したデレーションミュータントの中からＯＳＦ−４のコーディング領域のみを含むクローンを選びＯＳＦ−４発現ベクターの作製に用いた。このクローンから配列表の配列番号１の１９１番目のＧから２７００番目のＡまでの断片を切り出し、５′上流にＸｈｏＩとＢａｍＨＩサイトのリンカーを、３′下流にＸｈｏＩサイトのリンカーを結合した。ついで、このＸｈｏＩ断片を動物細胞発現用プラスミドベクターｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｉ．，  （１９９１），  Ｇｅｎｅ，  １０８，  １９３−２００）のＸｈｏＩサイトに挿入しクローニングした。得られたＯＳＦ−４発現ベクターをｐＭＳＳ６０と命名した（図７）。
【００３４】
カルシウム・リン酸共沈法を用いて、この発現ベクターｐＭＳＳ６０をマウス表皮由来繊維芽細胞株のＬ細胞に導入した。ついで、このｐＭＳＳ６０により形質転換したＧ４１８耐性のコロニーを分離培養し１２個のクローン化細胞株を得た。これらのクローン化細胞株のそれぞれからＲＮＡを抽出した。これらのＲＮＡを用いてマウスＯＳＦ−４をプローブとしたＲＮＡドットブロット法により、ＯＳＦ−４のｍＲＮＡ発現量の高いクローン化細胞株３個を選択した。それぞれ、Ｃ１、Ｃ７、Ｃ１１と名付けた。
これらの細胞株を用いてウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により生成された蛋白質を解析したところ、抗ＯＳＦ−４抗体に反応する約１００キロダルトンのバンドが検出された。
【００３５】
さらに、これらのクローン化細胞株を用いて、カドヘリンの細胞接着性を調べるアグリゲーションアッセイ法（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によりＯＳＦ−４の活性の解析を行った。アグリゲーションアッセイ法の詳細は竹市らの方法（Ｔａｋｅｉｃｈｉ，（１９７７），  Ｊ．Ｃ．Ｂ．，  ｖｏｌ．７５，  ｐ．４６４−４７４）に従って行った。
まず、各クローン化細胞の単層細胞からＴＣ処理群とＴＥ処理群の２種類の細胞懸濁液を調製した。
【００３６】
ＴＣ処理群は以下の様に調製した。即ち、単層細胞を１ｍＭ塩化カルシウムを含むＣＭＦ溶液（パックのＧａ２＋，Ｍｇ２＋フリー生理食塩水：Ｊ，  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ｖｏｌ．１０８，  ｐ．９５４−９５６，  １９５８）で３回洗った後に、０．０１％トリプシンと０．１ｍＭ塩化カルシウムを含むＨＣＭＦ溶液（ＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水：ＮａＣｌ  ８．０ｇ，ＫＣｌ  ０．４ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．０９ｇ，グルコース１ｇ，ＨＥＰＥＳ  ２．３８ｇを水に溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨ  ４．８ｍｌを加えｐＨ  ７．４とし、最終的に１リットルの水溶液にする）中で３７℃、１５分間処理しＴＣ処理群の細胞懸濁液を調製した。
また、ＴＥ処理群の細胞懸濁液は１ｍＭ  ＥＤＴＡと０．０１％トリプシンを含むＨＣＭＦ溶液中で３７℃、１５分間処理する事以外は、ＴＣ処理群と同様の方法により調製した。
【００３７】
ついで、それぞれの処理群の細胞懸濁液をＣＭＦ溶液で２回洗った後に、各細胞懸濁液をさらに二分し、それぞれ１ｍＭ塩化カルシウムを含むものと含まないＨＣＭＦ溶液に再懸濁し、細胞濃度が３ｍｌ当たり１×１０６個になるように細胞懸濁液を調製した。これらの各細胞懸濁液を１５ｍｌコニカルチユーブに移し、３７℃で毎分８０回転、１時間攪拌する事により細胞のアグリゲーションを行わせた。攪拌前の細胞数（Ｎ０）と１時間攪拌後の細胞の塊の数（Ｎ１）をコールターカウンターにより測定し、その割合（Ｎ１／Ｎ０）を求めた。その結果、以下の表２に示すようにＯＳＦ−４を発現しているクローン化細胞株でのみカドヘリンと同様のカルシウム依存性の細胞接着性を示した。カドヘリン分子はカルシウム存在下ではトリプシンの分解を受けない事が知られている。従って、ＥＤＴＡで処理したトリプシンの分解を受けたものは細胞接着性を示さなかった。
【００３８】
【表２】
0003560252.tif 000003
＊  １時間後に細胞塊の数が少ないほど細胞同士が凝集している事を示している。その数が１の時は細胞接着性がない。
＊＊    ｍｏｃｋはベクターのみを導入したＬ細胞を示す。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により提供されるＯＳＦ−４は、骨代謝性疾患の治療剤として用いることができ、また、骨に対する臓器特異性が高いので骨代謝性疾患の診断剤として用いることできる。
【００４０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５８１
配列の型：核酸
鎖の数：二重鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：
生物名：マウス  （Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株名：骨芽細胞株  ＭＣ３Ｔ３Ｅ１
配列の特徴：
0003560252.tif 000004
0003560252.tif 000005
0003560252.tif 000006
0003560252.tif 000007
0003560252.tif 000008
0003560252.tif 000009
【００４１】
配列番号：２
配列の長さ：３７１２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：
生物名：ヒト  （Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
細胞の種類：原発生骨腫瘍
配列の特徴：
0003560252.tif 000010
0003560252.tif 000011
0003560252.tif 000012
0003560252.tif 000013
0003560252.tif 000014
0003560252.tif 000015
0003560252.tif 000016
【００４２】
配列番号：３
配列の長さ：３９１４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
起源：
生物名：ヒト  （Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
細胞の種類：原発生骨腫瘍
配列の特徴：
0003560252.tif 000017
0003560252.tif 000018
0003560252.tif 000019
0003560252.tif 000020
0003560252.tif 000021
0003560252.tif 000022
【００４３】
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一重鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴：リンカーＤＮＡ。  配列番号５と相補的配列。名称「ＡＴＯＳ−１」
0003560252.tif 000023
【００４４】
配列番号：５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一重鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴：リンカーＤＮＡ。配列番号４と相補的配列。名称「ＡＴＯＳ−２」
0003560252.tif 000024
【００４５】
配列番号：６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一重鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴：リンカーＤＮＡ。  配列番号７と相補的配列。名称「ＡＴＯＳ−４」
0003560252.tif 000025
【００４６】
配列番号：７
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一重鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸
起源：なし
生物名：なし
株名：なし
配列の特徴：リンカーＤＮＡ。配列番号６と相補的配列。名称「ＡＴＯＳ−５」
0003560252.tif 000026
【００４７】
配列番号：８
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
起源：
生物名：マウス
配列の特徴：ＯＳＦ−４−１  （抗原ペプチド）
存在位置：マウスＯＳＦ−４の断片で１０１番目から１１５番目まで。
0003560252.tif 000027
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１とヒトＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）である。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。
【図２】図１のマウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１とヒトＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図の続きを示す。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。
【図３】図２のマウスＯＳＦ−４とヒトＯＳＦ−４−１とヒトＯＳＦ−４−２の各々のアミノ酸配列の比較図の続きを示す。マウスとヒトのＯＳＦ−４の間で全て共通なアミノ酸残基はコンセンサスとして示した。
【図４】マウスＯＳＦ−４前駆体タンパク質の構造の模式図である。ＯＳＦ−４前駆体タンパク質は８つの領域に分けることができ、シグナル領域（斜線部）、５つの細胞外領域（ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、及びＥＣ５）、細胞膜貫通領域（ＴＭ）、及び細胞内領域（ＣＰ）である。
【図５】マウスＯＳＦ−４をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図である。太字はＯＳＦ−４のアミノ酸をコードする領域を示す。ＫｐｎＩとＳａｌＩサイトは存在しない。
【図６】マウスＯＳＦ−４の組織特異的発現を示す図である。ＲＮＡを種々の組織や細胞株から精製し、ＲＮＡドットブロット法により解析したものであり、オートラジオグラフィーの結果を示す。
【図７】発現ベクターｐＭＳＳ６０の模式図である。
【図１】
0003560252.tif 000028
【図２】
0003560252.tif 000029
【図３】
0003560252.tif 000030
【図４】
0003560252.tif 000031
【図５】
0003560252.tif 000032
【図６】
0003560252.tif 000033
【図７】
0003560252.tif 000034