(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−カルボキシメチルリジン残基を有するヘモグロビンに対する抗体を用いた糖尿病又は糖尿病合併症用免疫試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−カルボキシメチルリジン（以下ＣＭＬとも略す）に対する抗体、またはＮ−カルボキシメチルリジン残基を有するペプチドもしくはタンパク質（以下ＣＭ化物とも略す）に対する抗体から成る糖尿病、糖尿病合併症の診断試薬、或いは糖尿病治療薬、糖尿病合併症治療用の薬剤の薬効評価試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のタンパク質はグルコースと非酵素的に反応して糖化され、糖化タンパク質となることが知られている。該糖化反応はメイラード反応と呼ばれ、前期段階と後期段階の二つの反応に分けられる。前期段階の反応は、タンパク質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基と糖のカルボニル基が反応し、シッフ塩基を経由してアマドリ転位化合物を生成するまでとされている。該前期段階反応生成物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃや糖化アルブミン等が知られており、糖尿病の臨床マーカーとして用いられているのは周知の事実である。
【０００３】
前期段階反応の後、２つの方向に変化することが知られている。１つは、酸素と遷移金属が関与するアマドリ転位化合物の酸化的開裂であり、もう１つは、蛍光性、褐色変化、或いは分子内および分子間架橋形成を伴うメイラード反応後期生成物（以下ＡＧＥと略す）の生成である。該ＡＧＥは複数の化合物の集合体と考えられており、定性、定量は蛍光強度の測定或いは抗原抗体反応により行われている。
【０００４】
近年、該後期段階反応が生体内で起こり、血管障害合併症の発症に関与していると報告された（Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ３１４，ｐ４０３，１９８６）。特に、糖尿病患者に於いては後期段階反応で生成したＡＧＥが、糖尿病合併症の発症と進展に関与するものとして注目されるようになった。現在、ＡＧＥの構造の１つとして２−フロイル−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾル、ピラリン、ペントシジン、クロスリンＡ＆Ｂが提唱されているが、ＡＧＥの基本構造については、まだ不明な点が多いのが現状である。
【０００５】
一方、アマドリ転位化合物の酸化的開裂の結果生じるものとしてＣＭＬが同定され（Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２６１，ｐ４８８９，１９８６）、老人や糖尿病患者のレンズタンパク質、皮膚コラーゲン等に存在していることが報告されている（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ３０，ｐ１２０５，１９９１）。また、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）を構成しているリジンの側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基（以下ＣＭ基と略すこともある）で置換された修飾タンパク質は、レンズタンパク質中のＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との反応を強く阻害するとの報告もある（Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ３４，ｐ１０８７２，１９９５）。しかし、これらにおいては、レンズタンパク質や皮膚コラーゲンといった、臨床検査で用いることが困難なものを被検体としているという欠点があった。更に，これらはＣＭＬやＣＭ基で置換されたＢＳＡに対する抗体で免疫学的に直接測定したものではないため、操作が煩雑で測定に長時間を要していた。更にまた、ＣＭＬやＣＭ化物と糖尿病、糖尿病合併症の関連性は不明であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、血液や血清、尿など臨床検査に被検体として多用されている体液を用いて、ＣＭＬもしくはＣＭ化物を免疫学的に直接的、且つ簡単に測定できる糖尿病、又は糖尿病合併症用免疫試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＭＬに対する抗体もしくはＣＭ化物に対する抗体（以下両者を併せて抗ＣＭ抗体とも言う）を用いることによって、一般的に臨床検査に供される生体成分を被検体として、ＣＭＬもしくはＣＭ化物を簡単に定量することが可能になること、更に、ＣＭＬもしくはＣＭ化物は糖尿病又は糖尿病合併症と関連があることを見い出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は、Ｎ−カルボキシメチルリジン残基を有するヘモグロビンに対する抗体を用いた糖尿病又は糖尿病合併症用免疫試薬である。
【０００９】
以下、本発明の免疫試薬について詳細に述べるが、下記物質、製法に限定されるものではない。
【００１０】
本発明のＮ−カルボキシメチルリジンとは、リジンの側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換されたリジン、並びにα−アミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基やトシル基等で修飾されたリジンやα−カルボキシル基がメチルエステルやエチルエステル等で修飾されたリジン等のリジン誘導体の側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換されたものを言う。
【００１１】
側鎖アミノ基の水素をカルボキシメチル基で置換するには、公知の方法が何ら制限なく使用される。例えば、リジンのα−アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基やベンジルオキシカルボニル基等の保護基で保護した後に、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下で、該リジンとグリオキシル酸をｐＨ７以上で反応させればよい。
【００１２】
本発明に用いる上記ＣＭＬに対する抗体とは、側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換されたリジン、或いは側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換されたリジン誘導体と特異的に結合する抗体を意味する。該抗体を作成するための抗原、即ち免疫原は、側鎖アミノ基の水素がカルボキシメチル基で置換されたリジン或いはリジン誘導体であれば良いが、該リジン或いはリジン誘導体は免疫応答を誘導する能力が非常に弱いため、抗体を作成するにあたり、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ等、従来知られているキャリアータンパク質にＣＭＬを結合させたものを免疫原とする方が好ましい。該リジン或いはリジン誘導体のキャリアータンパク質への結合には、通常、本目的で行われている方法が何ら制限なく用いられる。
【００１３】
本発明のＮ−カルボキシメチルリジン残基を有するペプチド又はタンパク質とは、Ｎ−カルボキシメチルリジン残基を有するペプチド又はタンパク質を言う。ペプチドは、天然ペプチド、合成ペプチドのいずれであってもリジンを有していれば良く、又、アミノ酸数が２〜９個のオリゴペプチドであってもアミノ酸数が１０個以上のポリペプチドであっても良い。タンパク質は、アルブミン、グロブリン、プロラミン等の単純タンパク質であっても、糖タンパク質、リンタンパク質、リポタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質であってもリジンを有していれば良い。該ＣＭ化物を作製するには、リジンを有するペプチド又はタンパク質のリジン側鎖のアミノ基の水素をカルボキシメチル基で置換すれば良い。該置換には、公知の方法が何ら制限なく使用される。例えば「新生化学実験講座１、タンパク質４」（日本生化学会編、第１３〜１６頁、東京化学同人、１９９１年３月２０日発行）に記されている還元アルキル化法のように、グリオキシル酸とリジンを有するタンパク質をホウ酸緩衝液やリン酸緩衝液等の水溶液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤の存在下でｐＨ７〜１０で反応させればよい。これより低いｐＨだと水素化物還元剤が不安定になり、これより高いｐＨだとペプチドやタンパク質が変性する恐れがある。
【００１４】
本発明に用いる上記ＣＭ化物に対する抗体とは、Ｎ−カルボキシメチルリジン残基を有するペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を意味する。該抗体を作製するための抗原、即ち免疫原は、Ｎ−カルボキシメチルリジン残基を有するペプチド又はタンパク質であれば良い。
【００１５】
かかる抗原を用いて作製する抗体は、その由来を特に限定されるものではなく、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットなどの宿主動物に抗原を免疫して得られた抗血清、腹水液等を、そのままか或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製してポリクローナル抗体として用いることができる。更に、抗原で感作した哺乳動物の脾細胞やリンパ節細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合して得たハイブリドーマから調製したモノクローナル抗体を、そのままか或いは従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動等で精製して用いることができる。
【００１６】
このようにして得られる抗体は、該抗体分子自体を抗ＣＭ抗体として使用しても良く、或いはこれらの抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２といった抗体の活性フラグメント（抗体の抗原認識部位を含む部分）を抗ＣＭ抗体として使用しても良い。
【００１７】
本発明の免疫試薬とは、抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体或いは検体中の抗原を不溶性担体に担持し、検体中の抗原或いは抗ＣＭ抗体と接触させることによって起こる抗原抗体反応を、比色、発光、蛍光等を利用して検出する標識免疫測定試薬、不溶性担体の凝集等を利用して検出する免疫凝集試薬を言う。
【００１８】
定性試薬としては、ラテックス凝集試薬、マイクロタイター試薬等が、定量試薬としては、ラジオイムノアッセイ試薬、エンザイムイムノアッセイ試薬、蛍光イムノアッセイ試薬、ラテックス定量試薬等を、それぞれ例示できる。
【００１９】
抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原を担持する不溶性担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すればよく、例えば、ビーズ状、テストプレート状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が例示できる。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ガラス、多糖類又はその誘導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、赤血球、プロピレン、スチレン、アクリルアミド、アクリロニトリル等の合成樹脂、又はこれらに公知の方法によりスルホン基、アミノ基などの反応性官能基を導入したものが挙げられる。
【００２０】
不溶性担体への抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原の固定化法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等の公知の方法が何ら制限なく使用できる。
【００２１】
不溶性担体に担持する抗体には、抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体が用いられる。該生体成分に対する抗体としては、アルブミンに対する抗体やヘモグロビンに対する抗体、γ−グロブリンに対する抗体、低密度リポタンパク質に対する抗体、トランスフェリンに対する抗体、赤血球膜タンパク質に対する抗体等が例示できる。かかる生体成分に対する抗体は、１種類の生体成分に対する抗体だけを用いても、或いは２種類以上の生体成分に対する抗体を用いても良い。不溶性担体に生体成分に対する抗体を担持した場合は、検体中の抗原を接触させた後に、抗ＣＭ抗体を接触させれば良い。不溶性担体に抗ＣＭ抗体を担持した場合は、検体中の抗原を接触させた後に、再度、抗ＣＭ抗体を接触させれば良い。
【００２２】
標識免疫測定試薬におけるＣＭＬ又はＣＭ化物の測定の基本操作は、通常の検定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等に従うことができる。これら各検定法における操作、手順等は、一般に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競合法、競合法、サンドイッチ法等に準じることができる。
【００２３】
例えば、抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体、或いは検体中の抗原を不溶性担体に０．０１〜１０００μｇ／ｃｍ２の割合で担持し、０．００１〜１０００μｇの検体中の抗原、或いは抗ＣＭ抗体を接触させて測定に供する。抗ＣＭ抗体又は生体成分に対する抗体を不溶性担体に担持した場合には、上記したように、検体中の抗原を接触させた後、更に抗ＣＭ抗体を接触させる。不溶性担体に担持されていない当該抗ＣＭ抗体は、標識剤で標識されたものを使用することが好ましい。
【００２４】
該標識剤としては、放射性ヨード、放射性炭素等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光物質、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素等をそれぞれ例示できる。かかる方法にて得られた抗原抗体反応生成物は比色、蛍光、発光等を利用して検出される。
【００２５】
免疫凝集試薬におけるＣＭＬ又はＣＭ化物の測定の基本操作は、通常の検定法、例えば赤血球凝集反応法、受身凝集反応法、免疫比蝋法、免疫比濁法等に従うことができる。これら各検定法における操作、手順等は、一般に採用されているそれらに準じることができる。
【００２６】
例えば、粒子状の不溶性担体１ｇ当たり０．００１〜１００ｍｇの抗ＣＭ抗体を上記方法にて担持した粒子（以下、感作粒子と略す）を、０．００１〜１５重量％となるように水性媒体に分散させて免疫試薬の有効成分として使用すればよい。抗体を担持する不溶性担体の粒径は、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝集の判別のし易さなどの観点から平均粒径が０．０５〜１０μｍの不溶性担体を使用するのが好適である。かかる方法にて作成した感作粒子を検体中の抗原と接触させ、該感作粒子の凝集の度合を測定する。粒子の凝集の度合は、目視、光学的測定等従来の方法が制限なく使用できる。
【００２７】
上記各種免疫測定法を利用して、本発明の糖尿病または糖尿病合併症用免疫試薬は、糖尿病、糖尿病合併症用診断試薬、或いは糖尿病治療用、糖尿病合併症治療用の薬剤の薬効評価試薬として有益に用いられる。
【００２８】
診断試薬として用いる場合は、抗ＣＭ抗体を用いて検体中の抗原、即ち特定の生体成分に含まれるＣＭＬもしくはＣＭ化物の割合を測定する。該生体成分としては、例えば血液、尿、リンパ液、羊水、随液、唾液等の体液、皮膚コラーゲン、レンズタンパク質、動脈、腎臓等の組織等が挙げられるが、臨床検査に被検体として多用されている体液を用いる方がより好ましい。
【００２９】
薬効評価試薬として用いる場合は、糖尿病治療薬または糖尿病合併症治療薬の投与によって、特定の生体成分に含まれるＣＭＬもしくはＣＭ化物の割合の減少度を測定する。
【００３０】
【発明の効果】
ＣＭＬもしくはＣＭ化物を含むヒト血清アルブミンをウサギに免疫する通常の方法によって、ＣＭＬもしくはＣＭ化物に対する抗体を得た。この抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成した各種糖化タンパク質と有意に反応したが、非修飾化物とは反応しなかった。更に、該抗体はヒト由来のヘモグロビンとも反応し、それは健常者に比べて糖尿病患者や糖尿病合併症患者の方が有意に強く反応することが明らかになった。また、ＣＭＬもしくはＣＭ化物に対する抗体とＡＧＥは免疫交差性を示した。糖尿病患者では健常者に比べて、高い酸素ストレス下に置かれていることが種々の研究結果より明らかになっており、糖化反応と酸化反応によって生成するＣＭＬもしくはＣＭ化物は、糖尿病合併症の発症や進行を診断する新しい指標として有用性の高いものである。
【００３１】
本発明の、ＣＭＬもしくはＣＭ化物に対する抗体を用いた免疫試薬を使用することにより、体液や組織を被検体として糖尿病、糖尿病合併症の診断を容易に行うことが可能になった。更に、本発明によって完成した診断試薬を糖尿病治療用、糖尿病合併症治療用の薬剤の薬効評価に利用することもできる。
【００３２】
【実施例】
以下に本発明をより具体的に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１
（１）  ＣＭ化物の調製
ＣＭ化物を調製するために、タンパク質の側鎖アミノ基の水素をカルボキシメチル基に置換した（以下、この操作をカルボキシメチル化とも言う）。
【００３４】
ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、シグマ社製）１ｍｌに、ｐＨ９に調整した１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを含む０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１時間放置した。対象として、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法でヒト血清アルブミンを処理した。
【００３５】
アミノ基の水素のカルボキシメチル基への置換を確認するために、作製したアミノ基の水素がカルボキシメチル基へ置換されたヒト血清アルブミン（以下置換ヒト血清アルブミンと略す）の未反応アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸（以下ＴＮＢＳと略す）を用いて定量した。また、対象としてグリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミンのアミノ基を定量した。前記試料０．５ｍｌを０．１Ｍの四ほう酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍｌに各々加えた。次いで、再結晶化し、希塩酸で洗浄した１．１ＭのＴＮＢＳを２０μｌ加え、攪拌した。３０分後に１．５ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定した。併せて、作製した置換ヒト血清アルブミンまたはグリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミンを含まないこと以外は同様の方法で、ＴＮＢＳによる反応を行い、吸光度を測定したところ、作製した置換ヒト血清アルブミンのそれは０．０３、グリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミンのそれは１．２５、作製した置換ヒト血清アルブミンおよびグリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブミンを含まない試料のそれは０．０３であり、置換ヒト血清アルブミンのカルボキシメチル化率は１００％であった。
【００３６】
かかる方法で作製された置換ヒト血清アルブミンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４℃にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、ＣＭ化物に対する抗体の作成に供された。
【００３７】
（２）  ＣＭ化物に対する抗体の作成
体重が２ｋｇ以上のウサギに、作成したＣＭ化物を抗原として以下の要領で免疫した。
【００３８】
２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原溶液０．５ｍｌに、フロイントの完全アジュバント０．５ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌにフロイントの不完全アジュバント０．２５ｍｌを加えたものを追加免疫した。この間、ＣＭ化物に対する抗体が産生されたか否かを確認するために、２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血した。６週間後、ＣＭ化物に対する抗体が産生されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で確認し、全採血した。
【００３９】
（３）  アフィニティ精製カラムの作成
２５ｍｌのアフィゲル１５（バイオラッド社製）を７５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン溶液を６２．５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。次いで、未反応のヒト血清アルブミンを濾過にて除去し、１Ｍのエタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに攪拌し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブロッキングした。該ヒト血清アルブミンを固定化した支持体をカラムに詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水で洗浄した。更に、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。
【００４０】
（４）  ＣＭ化物に対する抗体のアフィニティ精製
作成したＣＭ化物に対する抗体を１ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したものを、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０になるまで前記リン酸緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流した。カラムに結合しなかった抗体をＣＭ化物に対する抗体として回収した。２８０ｎｍの吸光度が０になったところでリン酸緩衝液から０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラムに結合している抗体を溶離させ、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収した。この操作を、更に１回繰り返し、ビオチン標識用の抗体に供された。
【００４１】
（５）  ＣＭ化物に対する抗体のビオチン標識
精製した抗体のビオチン標識はプロテインビオチレーションシステム（ギブコ社製）を用いて行った。
【００４２】
精製したＣＭ化物に対する抗体を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈または濃縮した溶液に、０．０５Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに、説明書に従って作成した５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、０．１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液を脱塩した。更に、キット付属のＡｖｉｄｉｎ／ＨＡＢＡで導入されたビオチンのモル数を計算したところ、ＣＭ化物に対する抗体１モルに対してビオチンは１４モル結合していた。
【００４３】
（６）  ＣＭ化物に対する抗体の抗原特異性
ビオチンを標識したＣＭ化物に対する抗体の抗原特異性は競合法ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００４４】
１μｇ／ｍｌとなるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す）で希釈したＣＭ化物に対する抗体に、作成したＣＭ化物をそれぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ化物で阻害された抗体溶液として使用した。
【００４５】
ＣＭ化物の調製と同様の方法で、α−トシル−リジンメチルエステル（以下ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓと略す）（シグマ社製）より作成したカルボキシメチルｔｏｓｙｌ−ｌｙｓ（以下ＣＭ−ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓ）と略す）を調製した。該ＣＭ−ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓを１μｇ／ｍｌのＣＭ化物に対する抗体溶液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置し、ＣＭ−ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓで阻害された抗体溶液として使用した。
【００４６】
競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成したＣＭ化物を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ化物溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、該ＣＭ化物をイムノプレートに固定した。１時間後、該ＣＭ化物溶液を除去し、０．５％のゼラチンを含むＰＢＳを１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置し、ＣＭ化物が固定されていない部分をブロッキングした。１時間後、該ゼラチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、上記濃度のＣＭ化物で阻害された抗体溶液、又は上記濃度のＣＭ−ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓで阻害された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼで標識された抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（コスモバイオ社製）を１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放置した。更に、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質キット（バイオラッド社製）を用いて能書に従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライした。室温で５分間放置した後、０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ加え、アルカリホスファターゼの反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。この結果から、作成したＣＭ化物に対する抗体は、ＣＭ化物のみならず、ＣＭ−ｔｏｓｙｌ−ｌｙｓでもＣＭ化物とＣＭ化物に対する抗体の抗原抗体反応が阻害されたことから、ＣＭＬとも反応性を示すことが示唆された。
【００４７】
（７）  糖尿病患者由来血液中のＣＭ化物の測定
合併症を発症していない糖尿病患者１０人よりＥＤＴＡ−２Ｋを含む真空採血管にて採血した血液５０μｌを、２５０μｌの生理食塩水で１回洗浄した後、１ｍｌの精製水を加え溶血させたものを被検体とした。該患者の平均年齢は６１．３歳であった。
【００４８】
被検体中のＣＭ化物の測定はドットブロッティング法にて行った。ヘモグロビン濃度をシアンメトヘモグロビン法にて測定した後、該ヘモグロビンが５００ｎｇとなるようにドットブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いてＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に吸着させた。該膜を０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で１時間浸せきし、該膜を取り出し、前記ビオチン標識した１μｇ／ｍｌのＣＭ化物に対する抗体溶液を５ｍｌ加えた。室温で１時間のインキュベーションの後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した。次いで、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチン複合体溶液（ベクタステインＡＢＣキット：フナコシ社製）を５ｍｌ加え、室温で１時間のインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜における発光強度の検出は、バイオラッドＧＳ−３６３モレキュラーイメージャーを用いて行った。
【００４９】
対象として市販のヘモグロビン（シグマ社製）を被検体として上記と同様の方法にてＣＭ化物の測定を行った。該市販ヘモグロビンの発光強度を１００として、上記糖尿病患者由来のヘモグロビンの発光強度を表示した。測定結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
0003542227.tif 000002
【００５１】
実施例２  糖尿病合併症患者由来血液中のＣＭ化物の測定
実施例１で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病の他に腎症または網膜症を併発している糖尿病合併症患者由来血液を被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化物の測定を行った。該患者の平均年齢は６０．４歳であった。測定結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
比較例１
実施例１で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病ではない健常者由来の血液を被検体としたこと以外は、実施例１の方法に従って被検体中のＣＭ化物の測定を行った。該健常者の平均年齢は６１．２歳であった。測定結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
健常者群と実施例１で測定した糖尿病患者群の発光強度の間には、統計学的に差があることを検証した。即ち、「差がない」と考えられる確率を計算し、その確率が非常に小さいから「差がある」という手順を取り、統計学的に検証した（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ統計マニュアル、長田  理、１９９５年２月１０日発行、真興交易医書出版部）。該検証にはウェルチのｔ検定を用いた。その結果、「差がない」と考えられる確率は５％未満で、糖尿病患者群の発光強度と健常者群の発光強度の間には有意に差があった。このことは、糖尿病患者由来の血液には、健常者由来の血液よりも、有意にＣＭ化物が多いことを意味する。
【００５６】
また、健常者群と実施例２で測定した糖尿病合併症患者群の発光強度の間に差があるか否かをウェルチのｔ検定にて検証したところ、「差がない」と考えられる確率は５％未満で、糖尿病合併症患者群の発光強度と健常者群の発光強度の間には有意に差があった。このことは、糖尿病合併症患者由来の血液には、健常者由来の血液よりも、有意にＣＭ化物が多いことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【図１】作製したＣＭ化物に対する抗体の抗原特異性を競合法ＥＬＩＳＡにて調べた結果を示す図である（縦軸が４０５ｎｍの吸光度、横軸が各阻害剤の添加量）。
【図１】
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