(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）
【化１】
0003598332.tif 000013
（式中、Ａは炭素数が４または５の、環内に一つの二重結合を有してもよく、またアルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基、アセトアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよい環状アルキル基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示す）
で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を有効成分とする活性酸素若しくはフリーラジカル補捉剤。
【請求項２】
請求項第１項記載の式（Ｉ）で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を有効成分とする活性酸素若しくはフリーラジカル検出用剤。
【請求項３】
予防剤または治療剤として用いるための請求項第１項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル補捉剤。
【請求項４】
診断剤として用いるための請求項第２項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル検出用剤。
【請求項５】
虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障または薬物による臓器障害の予防若しくは治療剤である請求項第１項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル補捉剤。
【請求項６】
ＥＳＲまたはＮＭＲの造影剤である請求項第２項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル検出用剤。
【請求項７】
Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物が次の式（II）
【化２】
0003598332.tif 000014
（式中ＸおよびＹは、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基、アセトアミノ基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ炭素数１から４までのアルキル基を示し、
【化３】
0003598332.tif 000015
は、単結合または二重結合を示し、ｍは０または１の数を示す）
で表されるものである請求項第１項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル補捉剤。
【請求項８】
Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物が、請求項第７項記載の式（II）で表されるものである請求項第２項記載の活性酸素若しくはフリーラジカル検出用剤。
【請求項９】
次の式（II'）
【化４】
0003598332.tif 000016
（式中、ｍは０または１の数を示し、ｍが０の場合は、Ｘ'およびＹ'はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基またはアセトアミノ基を示し、ｍが１の場合は、Ｘ'およびＹ'はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基またはアセトアミノ基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ炭素数１から４までのアルキル基を示し、
【化５】
0003598332.tif 000017
は、単結合または二重結合を示す。ただし、Ｘ’が水素原子の場合は、Ｙ’はカルバモイル基、スルフォン酸基またはフェニル基であり、ｍが１でかつＸ’がメチル基の場合は、Ｙ’は水酸基でもケト基でもない）
で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、修飾されたＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を有効成分とする医薬に関し、更に詳細には、活性酸素や生体内フリーラジカルを捕捉することができ、活性酸素や生体内フリーラジカルによる各種の疾患の予防および治療剤として、あるいはＥＳＲ（Electron Spin Resonance、電子スピン共鳴）を代表とする磁気共鳴法による非侵襲的に生体画像を得たり、採取された生体組織中の活性酸素やフリーラジカルの検出試薬としても有用なＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を含有する医薬品に関する。
背景技術
活性酸素とは、短寿命ながら反応性に富み、さまざまな生体酸化反応に関与する酸素種と定義できる。その範囲は定義によって違ってくるが、狭義の意味では、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキサイド（Ｏ2-）、一重項酸素（1Ｏ2）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を指す。広義の意味では、上記の活性種と生体成分（例えば不飽和脂肪酸  Ｌ）との反応に由来するペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）やアルコキシラジカル（ＬＯ・）およびＨ2Ｏ2とＣｌ-からミエロペルオキシダーゼなどとの反応で生成する次亜鉛素酸イオン（ＣｌＯ-）なども活性酸素である。
ラジカルとは、１個又はそれ以上の不対電子を有する原子あるいは分子と定義される。よって、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキサイド、ペルオキシラジカルおよびアルコキシラジカルはラジカルである。一方、一重項酸素や過酸化水素はそれ自身ラジカルではないが、ある種のラジカル反応から生じたり、他のラジカル反応を起こしたりするものである。
生体でさまざまな生理活性を示す活性酸素やフリーラジカルが近年、生物学、医学及び薬学の分野で注目され、研究が進められている。この活性酸素や、フリーラジカルが生体内で生成する原因としては、紫外線、放射線、大気汚染、酸素、金属イオン、虚血・再灌流などが挙げられる。これらの原因により発生した活性酸素やフリーラジカルは、脂質を過酸化し、蛋白を変性し、核酸を分解するなど各種の生体内反応を起こす。そして、このような現象にともなう疾患としては、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などが知られている。このように活性酸素やフリーラジカルは、数々の疾患と関係しているので、これらを体外より非侵襲的に検出できれば、数々の疾患の原因究明ができ、医学上有用な情報となりうる。
従来より知られているフリーラジカルの検出法としては、反応系に反応試薬を入れ、その結果起こる反応系の吸光度を変化や発光を検出する間接法とフリーラジカルの不対電子を直接検出する電子スピン共鳴（Electron Spin Resonance；ＥＳＲ）法とがある。ＥＳＲ法は溶液、個体の何れの試料でも測定でき、不透明のものや不均一系試料でも測定対象になるため、採取された生体試料中や生体中の活性酸素の検出にはきわめて有利となる。
生体中の活性酸素やフリーラジカルを検出する問題点として、生体中の活性酸素やフリーラジカルは寿命が短いためＥＳＲでは直接測定できないことが挙げられる。この問題を解決するため生体へ薬剤を投与し、その薬剤の活性酸素やフリーラジカルによる化学変化をＥＳＲで測定して、間接的に生体内の活性酸素やフリーラジカルを観察する方法が採られている。このような目的のために、ヒドロキシルラジカルなど不対電子を持つ活性酸素を測定する目的でスピントラップ法が開発されている。この方法は下式に示すように、トラップ剤が短寿命のフリーラジカルとすばやく反応し、ＥＳＲで検出することができ、安定で長寿命のスピンアダクトを生成することを利用している。そして、スピントラップ剤は、狭義には下記の５，５−ジメチル−１−ピロリン−１−オキサイド（ＤＭＰＯ）のように、捕捉部位に二重結合を持つ化合物と定義されてきた。
0003598332.tif 000002
すなわち、速やかにラジカルと反応し、ＥＳＲ測定するのに十分安定であるスピンアダクトを生成する化合物をスピントラップ剤として測定系内に加え、安定なスピンアダクトを測定することにより、寿命の短い活性酸素の測定が可能となるのである。
従って、スピントラップ剤として使用される化合物は、前記の▲１▼活性酸素やフリーラジカルと速やかに反応すること、▲２▼十分安定なラジカルに変換されることの他、▲３▼取り扱いの点でそれ自身が化学的に安定であること、および▲４▼毒性が低いことなどの条件を満たすことが必要とされていた。
ところで、上記のスピントラップ剤を利用して生体中の活性酸素やフリーラジカルを直接検出または画像化しようとする試みがなされていたが、その場合の問題点として、これまで一般的に使用されてきたＥＳＲ装置は、Ｘ−バンド（約９．５ＧＨｚ）のマイクロ波が用いられるため、水による誘電損失が大きく、大容量の生体試料の計測は不可能であることが挙げられていた。しかし、最近では、低周波のマイクロ波を用いるＥＳＲ−ＣＴ（３００〜２０００ＭＨｚ）が開発されたため、水分の多い大容量試料、特に生物個体中のフリーラジカルの直接検出及び画像化が可能になりつつある。
一方、核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance；ＮＭＲ）法の原理は、１９４５年に発見されたが、それを医療用の画像化装置（Magnetic Resonance Imaging；ＭＲＩ）に応用したのは、１９７３年のLauterburが最初である。その後のこの診断法の進歩はめざましく、現在では、もっとも汎用される診断法の一つとなった。
ＭＲＩは当初、造影剤を必要としない診断方法として登場したが、陰影のつきにくい病変部位の検出能を高めるために、現在、造影剤の使用の有用性が認識され、一般化している。それに伴い、より検出能の高い造影剤の出現が望まれている。
ところで、最近、ＭＲＩ用造影剤、ＥＳＲ用造影剤としてのニトロキシド化合物の有用性や、その抗酸化作用が注目されている。たとえば、医療におけるＭＲＩ診断において、病変部のコントラストをつけるため、通常ガドリニウム等の常磁性無機化合物を造影剤として投与されているが、その毒性が問題になっており、ガドリニウムに変わる新しいＭＲＩ造影剤としてニトロキシド化合物が有望視されている。また、ＥＳＲイメージングが開発され、その有用性が注目されるにつれて、ニトロキシド化合物の画像化剤としての利用価値が高まりつつある。更に、ニトロキシド化合物の活性酸素消去剤としての可能性も示唆されている（たとえば、J．Biol．Chem．２６３：１７９２１；１９９８参照）。
非侵襲的測定法である磁気共鳴法により、生体組織内の活性酸素やフリーラジカルに関する情報が生体画像として得られれば、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などのような活性酸素やフリーラジカルが関与していると考えられる病態（以下、「活性酸素等関連疾患」という）の研究及びこれらの診断に有用である。
上記のような現状において、ある種のヒドロキシルアミン体は酸化的刺激（活性酸素等）により容易にフリーラジカル・活性酸素と反応し、ＥＳＲ信号の有るニトロキシド化合物に酸化されることが報告された（例えば、Biochem Biophys Res Commun 230，54-57，1997）。この化合物は、一般的に定義されているニトロン系やニトロソ系ではないので、厳密な意味でのスピントラップ剤とは言えないが、下式の如くスピンを捕捉するという意味では広義のスピントラップ剤であり、狭義のスピントラップ剤と同様な機能を有する。
0003598332.tif 000003
（式中、Ａ’は置換されていても良い環状アルキル基を示す）
上記反応で生成したニトロキシド化合物のＥＳＲ信号を測定することにより、溶液中や細胞中のスーパーオキサイドなどが検出されることは知られているが、上記反応を活性酸素やフリーラジカルの検出に利用するためには、ヒドロキシルアミン体自体に大きな問題があった。すなわち、ヒドロキシルアミン体から導かれるニトロキシド化合物は水溶液中で数週間、また、デシケーター中であれば結晶の状態で数年保存可能［たとえばArch．Biochem．Biophys．２１５：３６７−３７８；１９８２参照］なほど安定なものであるが、ヒドロキシルアミン体は不安定で用事調製の必要があるものである。
このため、ある種のヒドロキシルアミン体を利用して溶液中や細胞中のフリーラジカル、活性酸素を検出した例は有るが、ヒドロキシルアミン体を生体内に投与して臓器等で発生したフリーラジカル、活性酸素を画像化した例はない。この画像化が成功していない原因は、生体中でヒドロキシルアミン体とフリーラジカル、活性酸素との反応が速すぎるため臓器へ到達する前に血液中で代謝されるためであると考えられる。
従って、スピントラップ剤と同様な機能を有するヒドロキシルアミン体について、調製や投与時には安定でありながら、目的とする臓器中においては、迅速にフリーラジカルや活性酸素と反応させるための技術の提供が求められていた。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく、その化合物自身が安定で、生体内で活性酸素やフリーラジカルと速やかに反応して、その生成物が安定で、しかも生体に対する安全性が保証されている化合物を鋭意探索した。そしてその結果、ある種のヒドロキシルアミン体のヒドキシル基をアシル化して得られるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物が上記の条件を満足し、フリーラジカルや活性酸素を捕捉し、それらの検出や消去のために有効に利用できることを見出した。
また、スピントラップ剤による画像化は従来、困難と言われてきた。しかし、上記Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物はスピントラップ剤と同様の機能を有するヒドロキシルアミン体を安定化したものであるから、調製後も安定で、投与途中で代謝を受けず血液で目的臓器に運ばれ、そこで加水分解を受けヒドロキシルアミン体になり、臓器内の活性酸素・フリーラジカルと反応し、ＥＳＲ信号のあるニトロキシドになるため、そのＥＳＲ信号を検出することにより、生体中の活性酸素・フリーラジカルの画像化が可能であることを見出した。
更に、このＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物が、活性酸素やフリーラジカルを捕捉し、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などの疾患の予防・治療剤や、画像診断用医薬および検出試薬等の医薬品として利用できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明の第一の目的は、次の式（Ｉ）
0003598332.tif 000004
（式中、Ａは炭素数が４または５の、環内に一つの二重結合を有してもよく、またアルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基、アセトアミノ基などの置換基で置換されていてもよい環状アルキル基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示す）
で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を有効成分とする医薬品または試薬を提供することである。
また、本発明の第二の目的は、生体内に上記Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）を投与することを特徴とする生体内の活性酸素またはフリーラジカルを捕捉する方法を提供することである。
更に、本発明の第三の目的は、次の式（II’）
0003598332.tif 000005
（式中、ｍは０または１の数を示し、ｍが０の場合は、Ｘ’およびＹ’はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基またはアセトアミノ基を示し、ｍが１の場合は、Ｘ’およびＹ’はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基またはアセトアミノ基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ炭素数１から４までのアルキル基を示し、
0003598332.tif 000006
は、単結合または二重結合を示す）
で表される新規なＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
図１は１−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンを用いて、ＥＳＲ信号強度より溶液中のエステラーゼ濃度を求めるための検量線を示す図である。
図２は１−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンを投与したラット脳ＥＳＲ−ＣＴ像と脳内の位置関係を示す図である。
図３は図２中に書き込まれた解剖図が脳のどの部分を示すかを説明する図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）は、下記反応式に従い、式（III）で表されるニトロキシド化合物を還元して式（IV）で表されるヒドロキシルアミン化合物とした後、これを式（Ｖ）で表されるカルボン酸またはその反応性誘導体でエステル化することにより製造される。
0003598332.tif 000007
（式中、Ａは炭素数が４または５の、環内に一つの二重結合を有してもよく、またアルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基、アセトアミノ基などの置換基で置換されていてもよい環状アルキル基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示す）
上記反応において、出発原料として用いられるニトロキシド化合物（III）は、公知であるか、公知方法［例えば、A.M.Feldmanらの方法（米国特許第３３３４１０３号）や、W.Bueschkenらの方法（独国特許第４２１９４５９号）に記載の方法］に準じて容易に調製される化合物であり、その具体的なものとしては、以下に示す化合物が例示される。
0003598332.tif 000008
また、このニトロキシド化合物（III)の還元は、常法により行うことができるが、例えば、メタノール中にニトロキシド化合物（III)を溶解し、ヒドラジン−水和物を加えて還元する方法により行うことが好ましい。
更に、ニトロキシド化合物（III）の還元により得られたヒドロキシルアミン化合物（VI）のエステル化も常法により行うことができ、カルボン酸（Ｖ）を脱水縮合触媒の存在下反応させる方法や、カルボン酸（Ｖ）の活性エステル、酸無水物、酸ハライド等の反応性誘導体を用いる方法が例示される。
上記の化合物（Ｉ）のうち、好ましいものとしては、次の式（II）で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を例示することができる。
0003598332.tif 000009
（式中ＸおよびＹは、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基、アセトアミノ基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ炭素数１から４までのアルキル基を示し、
0003598332.tif 000010
は、単結合または二重結合を示し、ｍは０または１の数を示す）
さらに、上記式（II）で表されるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物のうち、次の式（II’）で表されるものは、文献未記載の新規化合物である。
0003598332.tif 000011
（式中、ｍは０または１の数を示し、ｍが０の場合は、Ｘ’およびＹ’はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基、アセトキシル基またはアセトアミノ基を示し、ｍが１の場合は、Ｘ’およびＹ’はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アミノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボキシル基、ケト基、水酸基、スルフォン酸基、フェニル基またはアセトアミノ基を示し、Ｒは炭素数１から３のアルキル基又はフェニル基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ炭素数１から４までのアルキル基を示し、
0003598332.tif 000012
は、単結合または二重結合を示す。ただし、Ｘ’、Ｙ’がともに水素原子である場合は、Ｒはフェニル基またはメチル基ではなく、Ｘ’が水素原子でかつＹ’が水酸基である場合は、Ｒはメチル基ではない）
斯くして得られる本発明のＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）を用いて、医薬や試薬を調製するには、当該化合物を適当な薬学的および化学的に許容される溶媒、例えば、生理食塩水、等張リン酸緩衝液等に溶解し、必要によりプロピレングリコール、ベンジルアルコール等に溶解して製剤化すれば良い。
本発明のＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）を用いた医薬あるいは試薬の好ましい剤型としては、注射剤、点滴用剤、塗布剤、点眼剤等が挙げられる。
本発明のＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）医薬としての使用の例としては、診断用薬剤が挙げられる。この診断用薬剤は、脈管内投与により活性酸素やフリーラジカルの存在を検出する活性酸素等関連疾患診断剤として利用することができ、例えば、脳、心臓などの疾患のＭＲＩ用造影やＥＳＲ用造影のために用いることができる。
上記薬剤におけるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（Ｉ）の使用量は、その目的や対象となる臓器、疾患によっても異なるが、一般的には０．１〜５００ｍｇ／ｋｇとなる程度の量を投与すれば良い。
一方、別の医薬の使用例としては、活性酸素や生体内フリーラジカルに起因する疾患の予防もしくは治療が挙げられる。この予防もしくは治療剤は、活性酸素やフリーラジカルと反応して、これを消去するので、前記の活性酸素等関連疾患の予防や治療に有効である。
また、上記薬剤は、正常動物や疾患モデル実験動物に投与し、正常または疾患時における組織や臓器より発生する活性酸素やフリーラジカルを外部より検出し、画像化できる。この結果より、活性酸素やフリーラジカルがどの疾患に関与するかを調べるための検出試薬として用いることができ、医学上有用な情報が得られる。
更に、採取された生体資料を均質化し、適当な緩衝溶液と上記薬剤を加え、適当な時間反応させた後、ＥＳＲを測定することにより、生体組織中の活性酸素やフリーラジカルの有無や量を測定することができる検出試薬として用いることができる。
以下、合成例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実施例  １
１−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成：
（１）１−ヒドロキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成；
３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イルオキシ１．０ｇ（５．４ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、ヒドラジン−水和物１０ｍｌを加え、室温で６時間攪拌、反応させた。溶媒を減圧下留去することにより白色結晶１．０ｇ（５．４ｍｍｏｌ；収率１００％）を得た。
融  点：２３０−２３４℃（分解）
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
０．８８，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．０２，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．０７，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１４，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．５２，ｄｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
１．９６，ｔ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
２．４８，ｄｄ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ）、
６．８１，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）
７．１２，ｓ，１Ｈ（ＯＨ）、
７．１５，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）
（２）１−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成；
１−ヒドロキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン０．５０ｇ（２．７ｍｍｏｌ）にジクロロメタン２０ｍｌ、トリエチルアミン３ｍｌを加え、氷浴中で無水酢酸０．３８ｍｌ（４．０ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間攪拌した。反応溶液を水、希塩酸、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順序で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製後、更に酢酸エチルで再結晶することにより白色結晶０．５３ｇ（２．３ｍｍｏｌ；収率８６％）を得た。
融  点：１５０−１５１℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
０．９７，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１０，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１２，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１５，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．６４，ｄｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
２．０６，ｓ，３Ｈ（ＣＯＣＨ3）、
２．０７，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ2）、
２．６２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ）、
６．９４，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
７．２７，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２２８．３（Ｍ+）
実施例  ２
１−プロピオニロキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成：
無水酢酸０．３８ｍｌを無水プロピオン酸０．５２ｍｌに代える以外は実施例１（２）と同様にして白色結晶０．５６ｇ（２．３ｍｍｏｌ；収率８５％）を得た。
融  点：１１６−１１７℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
０．９７，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．０６，ｔ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），３Ｈ（ＣＨ3）、
１．０９，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１１，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１４，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．６４，ｄｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
２．１２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ2）、
２．３６，ｑ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
２．６２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ）、
６．９４，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
７．２７，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２４２．３（Ｍ+）
実施例  ３
１−ブチリロキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成：
無水酢酸０．３８ｍｌを無水酪酸０．６６ｍｌに代える以外は実施例１（２）と同様にして白色結晶０．６１ｇ（２．４ｍｍｏｌ；収率８８％）を得た。
融  点：１０３−１０４℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
０．９１，ｔ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），３Ｈ（ＣＨ3）、
０．９７，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．０９，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１１，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．１４，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．５８，ｓｅｘ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．６４，ｄｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
２．１２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ2）、
２．３２，ｔ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
２．６２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ）、
６．９４，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
７．２７，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２５６．３（Ｍ+）
実施例  ４
１−ベンゾイロキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの合成：
無水酢酸０．３８ｍｌを無水安息香酸０．７６ｍｌに代える以外は実施例１（２）と同様にして白色結晶０．７２ｇ（２．５ｍｍｏｌ；収率９２％）を得た。
融  点：１９９−２０１℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）
１．１０，ｓ，３Ｈ（ＣＨ3）、
１．２０，ｂｒ．ｓ，１２Ｈ（ＣＨ3×３）、
１．７２，ｄｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１Ｈ（ＣＨ2）、
２．２２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ2）、
２．７２，ｂｒ，１Ｈ（ＣＨ）、
６．９９，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
７．３２，ｓ，１Ｈ（ＣＯＮＨ2）、
７．５６，ｔ（Ｊ＝８．１Ｈｚ），２Ｈ（ＡＲＨ）、
７．６８，ｔ（Ｊ＝７．４Ｈｚ），１Ｈ（ＡＲＨ）、
７．９７，ｄｄ（Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），２Ｈ（ＡＲＨ）
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２９０．４（Ｍ+）
実施例  ５
１，４−ジアセトキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの合成：
（１）１，４−ジヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの合成；
４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イルオキシ１．０ｇ（５．８ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、ヒドラジン−水和物１０ｍｌを加え、室温で６時間攪拌、反応させた。溶媒を減圧下留去することにより白色結晶１．０ｇ（５．８ｍｍｏｌ；収率１００％）を得た。
融  点：１６７−１６８℃（分解）
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
１．０２，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．０４，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．２４，ｔ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．７０，ｄｄ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
３．７４，ｍ，１Ｈ（ＣＨ）、
４．３８，ｄ（Ｊ＝５．０Ｈｚ），１Ｈ（ＯＨ）、
７．０１，ｓ，１Ｈ（Ｎ−ＯＨ）．
（２）１，４−ジアセトキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン９の合成；
１，４−ジヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン０．５０ｇ（２．９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン２０ｍｌ、トリエチルアミン３ｍｌを加え、氷浴中で無水酢酸０．８０ｍｌ（２．９ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間攪拌した。反応溶液を水、希塩酸、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順序で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製することにより白色結晶０．５７ｇ（２．２ｍｍｏｌ；収率７６％）を得た。
融  点：７２−７３℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
１．００，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．１７，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．５４，ｔ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．９１，ｄｄ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．９９，ｓ，３Ｈ（Ｃ−ＯＣＯＣＨ2）、
２．０６，ｓ，３Ｈ（Ｎ−ＯＣＯＣＨ3）、
４．９８，ｍ，１Ｈ（ＣＨ）．
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２５７．３（Ｍ+）
実施例  ６
１−アセトキシ−４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの合成：
（１）１−ヒドロキシ−４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの合成；
４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イルオキシ１．０ｇ（５．８ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、ヒドラジン−水和物１０ｍｌを加え、室温で６時間攪拌、反応させた。溶媒を減圧下留去することにより白色結晶１．０ｇ（５．８ｍｍｏｌ；収率１００％）を得た。
融  点：１１５−１１７℃（分解）
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
１．００，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．０１，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．１０，ｔ（Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．５９，ｄ（Ｊ＝９．９Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
２．８４，ｍ，１Ｈ（ＣＨ）、
７．０５，ｓ，１Ｈ（Ｎ−ＯＨ）．
（２）１−アセトキシ−４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンの合成；
１−ヒドロキシ−４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン０．５０ｇ（２．９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン２０ｍｌ、トリエチルアミン３ｍｌを加え、氷浴中で無水酢酸０．８０ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）を滴下し、３時間攪拌した。反応溶液を水、希塩酸、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順序で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製後、更に酢酸エチル−ヘキサンで再結晶することにより白色結晶０．５４ｇ（２．１ｍｍｏｌ；収率７２％）を得た。
融  点：１１５−１１７℃
1Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ；δ）：
０．９６，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．１４，ｓ，６Ｈ（ＣＨ3×２）、
１．４０，ｔ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．６９，ｄ（Ｊ＝１２．４Ｈｚ），２Ｈ（ＣＨ2）、
１．７８，ｓ，３Ｈ（Ｃ−ＯＣＯＣＨ2）、
２．０５，ｓ，３Ｈ（Ｎ−ＯＣＯＣＨ2）、
３．９７，ｍ，１Ｈ（ＣＨ）、
７．７４，ｄ（Ｊ＝８．１Ｈｚ），１Ｈ（ＮＨＣＯ）
マススペクトル（Ｅｌ+）：ｍ／ｚ  ２５６．４（Ｍ+）
実施例  ７
酵素活性測定試験：
１−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンを用いて、酵素活性（エステラーゼ等）がＥＳＲで定量的に測定可能か検討した。
まず、１ｍＭ被験物質溶液１００μｌに、エステラーゼ（シグマ社Esterase（from Procine Liver）３３６０Ｕ／ｍｌ）を燐酸緩衝生理食塩液で希釈調製した溶液（０．２、２、２０、２００Ｕ／ｍｌ）１００μｌを加え、１分間放置した。即ち、被験物質をエステラーゼでヒドロキシルアミン体にした。次に、１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム燐酸緩衝生理食塩液１０μｌを加えた。即ち、生成したヒドロキシルアミン体を酸化し、ＥＳＲの測定できるニトロキシド体にした。最後に、この溶液をフラットセル（ラボテック製）に吸引し、１分後にＥＳＲスペクトルを測定した（使用ＥＳＲ装置  ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ、日本電子製）。
図１に得られたＥＳＲスペクトルの信号強度とエステラーゼ濃度との関係を示す。
この結果から、被験物質は短時間でエステラーゼにより加水分解を受けること、および、その反応が定量的であることが判明した。また、この反応を利用することによりエステラーゼの活性の計測が可能であること示している。
実施例  ８
ラット脳ＥＳＲ−ＣＴ像の測定：
ペントバルビタール麻酔したＷｉｓｔｅｒ系雄性ラット（２００ｇ、９周齢）に１５０ｍＭ  １−アセトキシ−３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジンの生理食塩液６ｍｌを腹腔内投与した。ラット頭部を外耳道孔より９ｍｍ前方が共振器の中心になるように固定した。投与２０分後、ＥＳＲ−ＣＴ計測を行った。ＥＳＲ−ＣＴの測定条件は、以下のとおりであった。
（ＥＳＲ−ＣＴの測定条件）
測定装置  ７００ＭＨｚ帯域電子スピン共鳴装置
マイクロ波周波数  ７２０ＭＨｚ
マイクロ波電力  ５２ｍＷ
中心磁場  ２５ｍＴ
磁場掃引幅  １５ｍＴ
磁場変調幅  ０．２ｍＴ
磁場変調周波数  １００ｋＨｚ
磁場勾配強度  １ｍＴ／ｃｍ
磁場勾配回転角  ２０度
計測結果の白黒画像を図２に示し、カラー画像を参考図として添付する。なお、図２中、Ａは外耳道孔より１ｍｍ下部のラット脳ＥＳＲ−ＣＴの画像を示し、Ｂは外耳道孔より３ｍｍ下部のラット脳ＥＳＲ−ＣＴの画像を示す。また、図３は図２中に書き込まれた解剖図が脳のどの部分を示すかを説明する図面である。
得られた結果から、脳の海馬、皮質、線条体、扁桃体および視床下部においてニトロキシドラジカルの信号が観測され、その信号よりラット脳ＥＳＲ−ＣＴ画像が得られた。このことより、修飾されたヒドロキシルアミン体が脳内に取り込まれた後に加水分解を受け、それが脳内活性酸素・フリーラジカルにより酸化されＥＳＲ信号のあるニトロキシド体になることにより、そのＥＳＲスペクトルが観測され、画像化できることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明の診断用薬剤の有効成分であるＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物（修飾ヒドロキシルアミン化合物）は、血液中で十分な半減期を有し、生体中の活性酸素やフリーラジカルと相互作用するので、磁気共鳴法によるフリーラジカルの分布の生体画像を得るのに有用で、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などのような活性酸素やフリーラジカルが関与していると考えられる活性酸素等関連疾患叉は症状の診断薬として使用することができる。
すなわち、Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物を含む本発明の診断用薬剤を生体に投与した後、当該化合物の生体内でのシグナル変化をＥＳＲ、ＮＭＲ等で検出することにより、上記の活性酸素等関連疾患を診断することができる。
従って、本発明の診断用薬剤は、ＭＲＩのために使用される他、ヒトのような極めて大容量の生体試料の測定を可能にするＥＳＲ装置が開発された後は、ＥＳＲ法によりヒト体内フリーラジカルの分布の画像を得て、活性酸素等関連疾患叉は症状の非侵襲的診断を行うことが期待できる。
一方、本発明のＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物は、生体中の活性酸素やフリーラジカルと反応し、これを消去するので、活性酸素等関連疾患の予防もしくは治療薬剤として使用することができる。
また、Ｎ−アシルオキシ環状アルキル化合物は、正常実験動物や疾患モデル実験動物に投与し、正常または疾患時における組織や臓器より発生する活性酸素やフリーラジカルを外部より検出し、画像化できる。この結果より、活性酸素やフリーラジカルがどの疾患に関与するかの検出用試薬として用いることができ、医薬上有用な情報が得られる。
更に、採取された生体試料を均質化し、適当な緩衝溶液とＮ−アシルオキシ環状アルキル化合物を加え、適当な時間反応させた後、シグナル強度をＥＳＲで測定することにより、生体組織中の活性酸素やフリーラジカルの有無、その量を測定することができる。
【図１】
0003598332.tif 000018
【図２】
0003598332.tif 000019
【図３】
0003598332.tif 000020