(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
0003558364.tif 000025
【請求項２】
下記の(1)ないし(3)を満たす、請求項１に記載の新規ポリペプチド。
(1)Ｎ末端アミノ酸が、
0003558364.tif 000026
(2)トリプシン阻害活性を有する、
(3)分子量が還元下のSDS-PAGEで25±３kD、非還元下のSDS-PAGEで20±３kDである。
【請求項３】
本質的にヒト由来の夾雑蛋白質を含まない請求項１または２に記載の新規ポリペプチド。
【請求項４】
Ｔ９８Ｇ細胞を培養し、その培養上清を精製することによって得られる請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡもしくは組換えＤＮＡ分子で形質転換された形質転換体を培養し、その培養混合物を精製することによって得られる請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする新規ＤＮＡ。
【請求項７】
下記塩基配列の少なくとも一部を有する請求項６に記載の新規ＤＮＡ。
0003558364.tif 000027
【請求項８】
下記塩基配列を有することを特徴とする新規ＤＮＡ。
0003558364.tif 000028
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１つに記載の新規ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項６ないし８のいずれか１つに記載の新規ＤＮＡで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項９に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
Ｔ９８Ｇ細胞を培養し、その培養上清から請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の形質転換体を培養し、その培養混合物から請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドを回収、精製することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
形質転換体が真核細胞である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
形質転換体が原核細胞である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１６】
少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドの精製方法。
【請求項１７】
少なくとも下記工程を含むことを特徴とする請求項１６に記載の精製方法。
ａ）硫安塩析を行い沈殿を回収する。
ｂ）ゲル濾過を行う。
ｃ）トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行う。
【請求項１８】
請求項１ないし５のいずれか１つに記載の新規ポリペプチドを認識する新規抗体。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１８に記載の新規抗体。
【請求項２０】
前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１８に記載の新規抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子、該ＤＮＡもしくは組換えＤＮＡ分子で形質転換された形質転換体に関する。本発明はまた、前記新規ポリペプチドの製造方法および当該ポリペプチドを認識する新規抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリプシンは生体内に存在する代表的なプロテアーゼである。トリプシンは、通常、生体内で消化酵素として、また、前駆体蛋白質を切断し活性化させる物質として、重要な役割を担っている。しかしながら、トリプシンは一方で、各種の炎症性の疾患のトリガーとなることも知られている。
トリプシンが関与する代表的な疾患に膵炎やショックがある。膵炎の場合、感染や胆道系の炎症等の原因により、通常は膵臓内で不活性型のプロエンザイムとして存在しているトリプシンが活性化し、膵臓の自己消化が起こる。ひとたび、トリプシンが活性型となると、キモトリプシン、エラスターゼ等他の種々のプロエンザイムを活性化し、循環不全や組織障害を引き起こす。ショックにおいても、種々の原因で活性化されたトリプシンが、血液凝固に関与する各種プロエンザイムの活性化やケミカルメディエーターの放出を促し、血管内で血液が凝固するために各臓器内では虚血による機能不全が生じ、腎、肺、肝等に障害が起こる。これらは互いに影響を及ぼしあって悪循環を形成し、末期には多臓器不全等の重篤な全身症状を引き起こす。
【０００３】
これらの症状においては、トリプシンの活性化阻止が重要であるため、現在、トリプシンが関与すると考えられる膵炎や、ショック、多臓器不全等の疾患の治療には、各種のトリプシンインヒビターが使用され、高い治療成績を治めている。
現在使用されているトリプシンインヒビターは大きく２つに分けられる。すなわち、１つはメシル酸ガベキセートやメシル酸ナファモスタットのような非蛋白性の化合物であり、他の１つは、アプロチニンやウリナスタチンのような蛋白性のトリプシンインヒビターである。前者は、広範な酵素阻害スペクトルを特徴とし、後者は、トリプシンインヒビターとしての作用の他に、細胞膜の安定化等、生体の恒常性を回復させる効果を有することを特徴としており、それぞれの特徴に応じて臨床の場で使い分けられている。
蛋白性のトリプシンインヒビターは、動物・植物界で広く分布しているが、医薬品として使用する場合には、抗原性を低下させるという面からヒト由来の物質である事が理想的である。ヒト由来の蛋白性トリプシンインヒビターとしては、これまでに上述のウリナスタチンを初めとして、α１アンチトリプシンや膵分泌性トリプシンインヒビター、ネキシン等が知られ、単離されている。
【０００４】
これらの生体内トリプシンインヒビターは、トリプシンに加えて、エラスターゼや、キニン、カリクレインを阻害するものもあり、その阻害スペクトルや生理活性に応じて生体内でそれぞれが特徴的な役割を担っていると考えられる。また、生体内には、未だ単離されていないトリプシンインヒビターが存在していると考えられ、それらを単離し、その生理活性を明らかにすることは、トリプシンが関与する疾患により効果的な薬剤を開発する上で重要である。より効果的な治療のためには、疾患や病態に応じ、適宜、これらの生体内トリプシンインヒビターを選択し、組合わせる事が重要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
現在、医薬品として使用されている蛋白性のトリプシンインヒビターは、主として組織や尿から精製されているが、供給量が一定しない、あるいは組織や尿中に混在する種々の蛋白によって精製品を均質に保つことが難しい、あるいは組織中に存在するウイルスのために精製に従事する者の安全を確保することが難しいといった問題があった。
【０００６】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決し、トリプシン阻害活性を有する新規なポリペプチド、およびその一部を提供し、新たな治療剤の開発を可能にすることにある。
本発明の他の目的は、上記新規蛋白質をコードするＤＮＡを提供し、当該新規ポリペプチドを遺伝子工学的に製造すること、および、診断用のＤＮＡプローブを製造することを可能にすることである。
本発明はまた、本発明の新規ポリペプチドを製造する方法を提供することをも目的とする。
さらに、本発明は、当該新規ポリペプチドを認識する抗体を提供し、当該抗体を使用して、本発明の新規ポリペプチドを検出することを可能にすることも目的とする。
【０００７】
【問題を解決するための手段】
本発明者等は、従来単離されていなかった新規なトリプシンインヒビターを得るべく鋭意研究を重ねた。すなわち、各種の培養細胞の上清中に見いだされるトリプシン阻害活性の本体を特定すべく研究を行い、新規なポリペプチドの単離および特定に成功した。さらに、本発明者等は、当該新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを得るべく、単離された新規ポリペプチドのアミノ酸配列をもとに作成したプライマーを使用してｃＤＮＡライブラリーを検索し、目的とするＤＮＡのクローニングに成功した。本発明者等はまた、得られた新規ポリペプチドを認識する抗体を得ることにも成功した。
本発明は上記の知見に基づき完成されたものである。以下に、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の第１の態様は、下記配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも一部を有することを特徴とする新規なポリペプチドである。
【０００９】
0003558364.tif 000002
【００１０】
0003558364.tif 000003
【００１１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡである。
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様のＤＮＡで形質転換させたことを特徴とする形質転換体である。
本発明の第５の態様は、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子で形質転換させたことを特徴とする形質転換体である。
本発明の第６の態様は、ヒト細胞を培養し、その培養上清から、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明の第１の態様の新規ポリぺプチドの製造方法である。
【００１２】
本発明の第７の態様は、本発明の第４の態様の形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造方法である。
本発明の第８の態様は、本発明の第５の態様の形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造方法である。
本発明の第９の態様は、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行うことを特徴とする、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの精製方法である。
本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを認識する抗体である。
【００１３】
以下に各態様について詳細に説明する。
本発明の第１の態様の新規ポリペプチドは前記配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列の少なくとも一部を有することを特徴とする。ここで「アミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは、そのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端のいずれか一方もしくはその両方に任意の１つ以上のアミノ酸が付加しているアミノ酸配列からなるポリペプチドのことである。したがって、本発明の新規ポリペプチドには、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列で規定されるポリペプチドのみではなく、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の任意の一部分からなるポリペプチド、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列もしくはその一部に任意の１つ以上のアミノ酸が付加した配列からなるポリペプチドが含まれる。しかしながら、本発明の新規ポリペプチドの好ましい例は、配列番号２のアミノ酸配列全体を有することを特徴とするものである。
また、他の好ましい例は、配列番号１  のアミノ酸配列全体を、そのＮ末端配列として有するポリペプチドである。
【００１４】
一般にポリペプチドは、種差や個体差、生体内の酵素や精製過程における修飾等により、そのアミノ酸配列に変異が生じることが多い。ここで言うアミノ酸配列の変異とは、そのアミノ酸配列中の任意の１つ以上のアミノ酸が欠失、もしくは他アミノ酸へ置換していること、および任意の位置に１つ以上のアミノ酸が挿入もしくは付加していることを意味する。これらのアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換は、複数箇所で同時に生じていることもある。
最近の技術によれば、これらのアミノ酸配列の変異を人為的に生じさせることも容易である。従って、本発明のポリペプチドには、それが本発明のポリペプチドの特徴を有している限り、前記配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、もしくはそれらの一部のアミノ酸配列に変異が生じたアミノ酸配列を有するものも含まれる。
【００１５】
本発明の新規ポリペプチドは、その好ましい特徴として、トリプシン阻害活性を有する。当該阻害活性は、少なくともヒトトリプシンに対するものであることが好ましい。
【００１６】
一般に、ポリペプチドを特徴づける要素の一つとして、分子量が挙げられる。ただし、分子量は、糖鎖の有無や糖鎖の種類、測定条件等によって変わるものなので、本発明のポリペプチドの分子量は特には限定されない。
しかしながら、細胞の培養上清や尿等の天然の材料から本発明のポリペプチドを得ようとする場合には、分子量は本発明のポリペプチドを特徴づける重要な情報となる。
本発明のポリペプチドの好ましい分子量は、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０ｋＤ以上３０ｋＤ以下であり、非還元下ではそれよりも小さいことが好ましい。より好ましくは、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２５±３ｋＤ、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０±３ｋＤである。
【００１７】
本発明の新規ポリペプチドには、糖鎖を有するもの、有さないものいずれもが含まれる。
配列番号２のアミノ酸配列には糖鎖認識部位（Ｎ−グリコシレーションサイト）がある（アミノ酸番号６４から６６の  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒの３残基）ので、当該ポリペプチドが動物細胞によって生産されたものであったり、遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細胞を宿主として生産させたものであったりした場合には、糖鎖が付加される可能性がある。一方、大腸菌等の原核細胞を宿主として遺伝子工学的に蛋白質を生産させた場合には、当該新規ポリペプチドは糖鎖を持たない。
【００１８】
本発明第１の態様の新規ポリペプチドは、いかなる方法で生産されたものであってもよい。例えば、ペプチド合成機（例えば、モデル４３０Ａ型  アプライドバイオシステムズ社）を使用して化学合成したものでも、ヒトおよびヒト以外のいかなる生物の組織や細胞、尿や血液等の体液から精製されたものであってもよく、また、遺伝工学的に生産されたものであってもよい。
しかしながら、当該ポリペプチドは、好ましくは、ヒト細胞を培養し、その培養上清から精製して得られたものである。特に好ましくは、ヒトのエピダモイドカルシノーマ（上皮性癌細胞）、ヒトのグリオブラストーマ（神経膠芽腫やグリア芽腫細胞）を培養し、その培養上清から得られたものである。これらの材料から当該新規ポリペプチドを得る方法や精製方法の好ましい例は、本発明第６の態様や第９の態様で説明している。
本発明のポリペプチドの他の好ましい例は、遺伝子工学的に生産されたものである。詳しくは、当該新規ポリペプチドをコードするＤＮＡもしくは、それを含む組換えＤＮＡ分子で適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、得られた培養混合物から精製されたものである。遺伝子工学的に生産されたものは、本質的にヒト由来の夾雑蛋白質を含まないという利点がある。遺伝子工学的に本発明の新規ポリペプチドを製造する方法については本発明第７および８の態様で説明している。
【００１９】
近年の技術により、ポリペプチドをポリエチレングリコールや、スチレンマレイン酸コポリマー、デキストラン、ピランコポリマー、ポリリジン等の高分子に結合させたり、多糖類や蛋白質などの天然高分子、ホルモンなどの生理活性物質、マグネタイトなどの無機物質に結合させたりすることが可能になった（例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４巻、１４８７〜１４９１頁、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８  巻、６６１９〜６６２４頁、１９８９年）。
従って、本発明の新規ポリペプチドは、このような修飾を受けたものであってもよい。
ポリペプチドにポリエチレングリコールを結合させる例を説明する。まず、ポリペプチドを、それが活性を失わないような範囲の塩基性ｐＨを有する緩衝液に溶解する。その溶液に、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルサクシネートのような活性化ポリエチレングリコールを混合し、室温で一定時間反応させる。
【００２０】
本発明第１の態様の新規ポリペプチドは、その好ましい特徴としてトリプシン阻害活性を有しているので、トリプシンに起因する各種疾患、たとえばショックや手術時のストレス、多臓器不全、膵炎等の治療薬として使用することができる。本発明の新規ポリペプチドを含有する医薬組成物は、通常の蛋白質を成分とする医薬組成物の製造方法に準じて製造される。例えば、医薬品として使用し得る純度の本発明の新規ポリペプチドを無菌状態で調製し、必要があれば、アルブミン等の安定化剤を加えてアンプルに充填し凍結乾燥する。これを使用時に、注射用蒸留水に溶解し、注射剤として使用する。
また、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドは、抗体の作成に使用することもできる。本発明のポリプペチドを用いて得られた抗体は、血中における当該ポリペプチドの濃度の測定に使用することができる。本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを認識する抗体の作成および使用方法は、本発明第１０の態様で詳細に説明する。
【００２１】
次に、本発明第２の態様のＤＮＡについて説明する。本発明第２の態様のＤＮＡは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする。すなわち、当該新規ＤＮＡは、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列を有するものである。ここで「塩基配列を有するＤＮＡ」とは、その塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは、その塩基配列の５’末端、３’末端のいずれが一方、もしくはその両方に任意の１つ以上の塩基が付加している塩基配列からなるＤＮＡのことである。
【００２２】
一般に、１つのアミノ酸をコードするＤＮＡに対応するトリプレットは、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類迄存在することが知られているので、前記配列番号１もしくは２のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、必ずしも１種類には限定されない。したがって、ＤＮＡが、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列を有する限り、いかなる配列からなるＤＮＡであっても、全て本発明の新規ＤＮＡに包含される。
配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の好ましい例は、配列番号３で示した塩基配列である。従って、本発明の新規ＤＮＡの好ましい例は、配列番号３の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡである。すなわち、本発明の新規ＤＮＡの好ましい例は、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列の一部からなるＤＮＡ、配列番号３の塩基配列のもしくはその一部に加え、その５’末端、３’末端のいずれか一方、もしくはその両方に任意の１つ以上の塩基が付加した塩基配列からなるＤＮＡである。たとえば、配列番号３の塩基配列もしくはその任意の一部分の配列の５’末端、３’末端のいずれか一方、もしくはその両方に、開始コドン、終止コドン、リンカー配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他の蛋白質をコードする塩基配列が付加されたようなものは、すべて本発明のＤＮＡに含まれる。また、当該ＤＮＡは、配列番号３の塩基配列もしくはその任意の一部からなる塩基配列に、ＤＮＡプローブ等を作製する際にその検出感度の増加を目的として付加される配列等、任意の１つ以上の塩基が付加されていてもよい。
【００２３】
本発明の第２の態様のＤＮＡは、いかなる方法で得られたＤＮＡであってもよい。すなわち、配列番号３を参考にして、化学合成されたものであっても、適当なＤＮＡライブラリーからクローニングされたものであってもよい。
本発明のＤＮＡを化学合成するには、たとえば、次のように行えばよい。すなわち、まず、配列番号３を参考にして所望の塩基配列を有するＤＮＡを、約２０塩基からなる断片に分けてＤＮＡ化学合成機（例えば、モデル  ３９４型  アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、その後、必要に応じて５’末端のリン酸化を行い、各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的とするＤＮＡを得る。
【００２４】
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションを基礎としたスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法等がある。本発明のＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とする  ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ミカエル  Ａ  Ｉ（  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ  Ｉ）等編、１９９０年、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））によっても得る事ができる。
ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、適当な細胞から公知の方法（サムブルック  Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ）等、    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，    コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），    ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  １９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、利用することができる。特にヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーや、Ｔ９８Ｇから作成したｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを得るのに適している。
【００２５】
イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明第１０の態様の抗体を使用することができる。
ハイブリダイゼーションで使用するプライマーは、配列番号１のアミノ酸配列の任意の一部をコードする塩基配列を化学合成して使用することができる。また、ＰＣＲで使用するプライマーは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列のプラス鎖とマイナス鎖の一部をそれぞれ化学合成し、センスプライマー、アンチセンスプライマーとして組み合わせて使用する。
【００２６】
ＤＮＡの塩基配列が提供されれば、それに相補的なＤＮＡの配列およびＲＮＡの配列が一義的に決定されるので、本発明の開示により、本発明の第２の態様のＤＮＡに対応するＲＮＡや、本発明の第２の態様のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡもまた提供される。
本発明の第２の態様のＤＮＡは、１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。
また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質等で標識されていてもよい。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを大量に生産するために使用することができる。当該ＤＮＡを使用して本発明第１の態様の新規ポリペプチドを生産させる方法の例は、本発明第７、第８の態様で説明する。当該ＤＮＡはまた、上述のように酵素等で標識して、組織における本発明第１の態様のポリペプチドの発現状況を検査するために使用することも可能である。当該ＤＮＡを使用して細胞における本発明の第１の態様の新規ポリペプチドの発現量を確認することにより、本発明第１の態様の新規ポリペプチドの製造に適した細胞や細胞の培養条件を決定することができる。
さらには、本発明の新規ＤＮＡを生体内の細胞に導入して遺伝子治療に使用したり、本発明のＤＮＡが有する塩基配列をもとにアンチセンス医薬品を開発することもできる。
【００２８】
次に、本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子について説明する。
本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子は、上述した本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子である。本発明の組み換えＤＮＡ分子は、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、本発明の組換えＤＮＡ分子はいかなる用途に使用されるものであってもよい。
例えば、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを産生させる際に用いるものであってもよいし、本発明の第２の態様のＤＮＡを増幅させ大量に得るために用いるものであってもよい。
【００２９】
本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子は、本発明の第２の態様のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー、プロモーター、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点配列、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。これらの塩基配列の必要性は、組換えＤＮＡ分子の使用目的によって決定されるが、複製開始点およびマーカー遺伝子はいずれの場合も必要である。マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等があげられる。
【００３０】
当該組換えＤＮＡ分子は、好ましくは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを発現するように大腸菌を形質転換させうるものがよい。すなわち、当該組換えＤＮＡ分子の好適な例は、少なくとも大腸菌の複製開始点、マーカー配列に加えて大腸菌内で機能するプロモーター配列を有していることが好ましい。また、これらに加え、少なくともシグナルペプチドをコードする配列を有していることが好ましい。大腸菌で機能するプロモーター配列の好適な例は  ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターであり、大腸菌で機能しうるシグナルペプチドの好適な例は、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドである。
当該組換えＤＮＡ分子の他の好ましい例は、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを発現するように動物細胞を形質転換しうるものである。すなわち、当該組換えＤＮＡ分子は、少なくとも、マーカー配列に加えて、ポリＡ付加配列を有していることが好ましい。これらに加えて、少なくともＳＶ４０のプロモーターやヒトエロンゲーションフアクター１α（ＥＦ１α）  のプロモーター、大腸菌の複製開始点を有するものも動物細胞を形質転換しうる組換えＤＮＡ分子の好適な例として挙げられる。
【００３１】
本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡを任意の塩基配列を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションしたり、任意のベクターに導入して得ることができる。ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（サムブルック  Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ）等、    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），    ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等いかなるものでもよい。たとえば、  ｐＵＣ１１８  、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ  、λＺａｐＩＩ  、λｇｔ１０、ｐＡｃ７００、ＹＲＰ１７  、ｐＥＦＢＯＳ、  ｐＥＦＮ−ＩＩ等から適宜選択して使用することができる。
【００３２】
次に、本発明の第４の態様の形質転換体について説明する。
本発明の第４の態様の形質転換体は、本発明の第２の態様の新規ＤＮＡで形質転換されたことを特徴とする。すなわち、本発明第４の態様の形質転換体は、宿主となる適当な細胞や微生物に、本発明第２の態様の新規ＤＮＡを直接導入する事によって形質転換されたことを特徴とする。本発明の第４の態様の新規ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポーレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年  ３月２０日発行、羊土社）があるがいずれの方法を用いても構わない。
【００３３】
本発明の形質転換体は、本発明の第４の態様のＤＮＡ分子を大量に製造する目的や、本発明の第１の態様の新規ポリプペチドを製造する目的等に使用できる。
【００３４】
次に、本発明の第５の態様の形質転換体について説明する。
本発明第５の態様の形質転換体は、本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子を宿主となる細胞や微生物に導入する事によって形質転換されたことを特徴とする。ただし、該組換えＤＮＡ分子の作成に使用したベクターは、宿主細胞に適した種類のものである必要がある。同様に、組換えＤＮＡ分子内に含まれるプロモター、シグナルペプチドをコードする塩基配列、マーカー遺伝子等は、宿主細胞に適したものである必要がある。
組み換えＤＮＡ分子に使用したベクターと宿主の好ましい組み合わせの例としては、ｐＵＣ１１８と大腸菌、ｐＥＦＢＯＳと  ＣＯＳ細胞あるいは  ＣＨＯ細胞、  Ｙａｃベクターと酵母、  ＡｃＮＰＶとＳｆ細胞等（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年  ３月２０日発行、羊土社参照）があげられる。ここで用いる組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞にあったものを使用する必要がある。
【００３５】
本発明の第３の態様の組み換えＤＮＡ分子を宿主細胞に導入する方法としては、上記第４の態様の形質転換体の作成方法と同様に、エレクトロポーレイション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いてインフェクションさせる方法、その他の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年  ３月２０日発行、羊土社）が挙げられる。
本発明の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のいずれであってもよい。原核細胞の代表的な例としては大腸菌と枯草菌があげられる。真核細胞の代表的な例としては  ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、  ＣＯＳ細胞、  Ｎａｍａｌｗａ細胞等の動物細胞の他、Ｓｆ細胞等の昆虫細胞や酵母があげられる。しかしながら、本発明の形質転換体は好ましくは、大腸菌もしくは  ＣＨＯ細胞もしくは酵母を形質転換させたものである。
【００３６】
本発明の形質転換体は、いかなる目的で使用されるものであってもよい。例えば、本発明第２の態様の新規ＤＮＡを大量に得る目的で使用されるものであっても、本発明第１の態様の新規ポリペプチドを生産するために使用されるものであってもよい。しかしながら、好ましくは、当該形質転換体は本発明の新規ポリペプチドを産生するものがよく、より好ましくは、本発明の新規ポリペプチドを培地中に分泌するものがよい。
本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを産生する形質転換体を得るためには、宿主細胞に導入する本発明の第３の態様の組換えＤＮＡ分子中に、少なくとも、その宿主細胞で機能しうるプロモーター配列が含まれていること、および本発明第２の態様のＤＮＡの５’末端に開始コドンが存在することが必要である。
宿主細胞が大腸菌等の原核細胞である場合には、ここで導入する組換えＤＮＡ分子には上記配列に加え、複製開始点が含まれている必要がある。また、宿主細胞が動物細胞等の真核細胞である場合には、組換えＤＮＡ分子中には、上記配列に加え、ポリＡ付加サイトが含まれていることが必要である。なお、いずれの場合にも、使用する組換えＤＮＡ分子にはマーカー配列が含まれていることが好ましい。
【００３７】
また、当該形質転換体が本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを発現し分泌するためには、形質転換に使用する組換えＤＮＡ分子中には、上記の産生に必要な配列に加えて、本発明の第２の態様のＤＮＡの５’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基配列を有している必要がある。
【００３８】
本発明の形質転換体のより好ましい例の一つは、複製開始点、  ｔｒｐプロモーター、マーカー配列、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列および本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌である。
他の好ましい例は、ヒト  ＥＦ１αのプロモーターもしくはＳＶ４０のプロモーター、マーカー配列、ポリＡ付加配列、本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で形質転換された  ＣＨＯ細胞である。また、アルコールオキシターゼ（ＡＯＸ）  のプロモーターおよび本発明第２の態様のＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子で、形質転換されたＰｉｃｈｉａ属の酵母も、当該形質転換体の好ましい例である。
【００３９】
次に本発明の第６の態様を説明する。
本発明の第６の態様の製造方法は、ヒト細胞を培養し、その培養上清から本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製することを特徴とする。詳しくは、ヒト細胞を培養し、その培養上清を得、得られた培養上清を材料とし、必要に応じて濃縮、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明第１の新規ポリペプチドを得る方法である。
【００４０】
ここで用いる細胞は、本発明のポリペプチドを産生するヒト細胞であればいかなる細胞であってもよいが、培養の容易さ等の点から株化された細胞が好ましい。株化細胞の中でも、グリオブラストーマ（神経膠芽腫細胞やグリア腫細胞）等の神経系の株化細胞やエピダモイドカルシノーマ（上皮性癌細胞）等の上皮系の株化細胞は、本発明の製造方法に使用する細胞として適している。
本発明の製造方法のより好ましい例は、神経膠芽腫細胞であるＴ９８Ｇ細胞、もしくは上皮性癌細胞であるＡ４３１細胞を培養し、その培養上清から、本発明の新規ポリペプチドを回収、精製する方法であり、特に好ましくは、Ｔ９８Ｇ細胞を用いた方法である。なお、Ｔ９８Ｇ細胞およびＡ４３１細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されている。
【００４１】
これらの細胞の培養は一般的な条件で行うことが可能であり、細胞の培養については各種の成書（たとえば「組織培養の技術」、日本培養学会編、１９８２年、朝倉書店）があるので、それらを参考にして行うことができる。
簡単に説明すると、培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）やＲＰＭＩ１６４０、  Ｆ−１２等の合成培地から適宜選択し、必要であれば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  やウシ胎児血清（ＦＢＳ）  、グルコース等を適宜加えてもよい。これらＢＳＡや  ＦＢＳ等が添加された培地は、細胞の維持や継代時の培地としては適しているが、培養上清からポリペプチドを精製する場合には、ポリペプチドの単離を困難にし、精製効率を下げるという欠点がある。従って、本発明の製造方法においては、まず、これらの添加物を含む培地で細胞を維持した後、添加物を含まない培地に交換して細胞を培養し、培養上清を回収して精製を行うことが好ましい。培養温度は３７℃付近、炭酸ガス濃度は５％、細胞の植え込み濃度は４×１０４  〜１×１０５  細胞／ｍｌ  、培地交換の頻度は３日に１度ぐらいを目安として行えばよい。
【００４２】
培養上清から、本発明の新規ポリペプチドを精製するには、塩析法、等電点沈殿法等の分別沈殿、限外濾過法等の濃縮、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび逆相クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーといった公知の精製方法（たとえば、「生化学実験講座１、タンパク質の化学Ｉ」、日本生化学会編、１９７６年、東京化学同人）から、本発明のポリペプチドの活性が失われないような方法を適宜選択し、組み合わせて行うことができる。しかしがら、好ましくは、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを精製の工程で行うことがよい。好ましい精製方法の具体例は第９の態様で説明する。
【００４３】
次に、本発明の第７および第８の態様を説明する。本発明第７および第８の製造方法は、いずれも、形質転換体を培養し、その培養混合物から本発明第１の態様のポリペプチドを回収、精製することを特徴とする。ただし、本発明第７の態様で用いる形質転換体は本発明第４態様の形質転換体であり、本発明第８の態様で用いる形質転換体は本発明第５の態様の形質転換体である。
当該製造方法では、まず、本発明第４もしくは第５の態様の形質転換体を培養し、必要に応じて、遺伝子の増幅や発現誘導をおこなう。次に、培養混合物を回収し、それらを材料として、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行い、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを精製する。当該製造方法で使用する形質転換体は、いかなる細胞を形質転換したものであってもよい。しかしながら、好ましくは、  ＣＨＯ細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
【００４４】
形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（たとえば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。また、遺伝子の増幅や発現誘導の方法および必要性は、宿主となる細胞の種類や、使用するプロモーターによって異なる。例えば、プロモーターがｔｒｐプロモーターである時には３β−インドールアクリル酸で、ＭＭＴＶプロモーターである場合にはデキサメサゾンで発現誘導することができる。
以下に、形質転換体として大腸菌および  ＣＨＯを使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。
ｔｒｐプロモーターを有する発現プラスミドが導入された大腸菌の形質転換体では、Ｌ−ブロース（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ）  で菌体を前培養し、それを  Ｍ９−ＣＡ培地に対して１／５０量となるように植え込み、３７℃で培養を行う。培養開始数時間後に培地のＯＤ５５０  値が１〜３（すなわち対数増殖期）に達した時点で、３β−インドールアクリル酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、発現誘導を行う。さらに約２０時間の培養を行うことにより、目的ポリペプチドを含む培養混合物を得ることができる。
【００４５】
一方、エロンゲーションファクターのプロモーターを有する発現プラスミドが導入された  ＣＨＯ細胞等の動物細胞の形質転換体では、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養する。細胞は、約５×１０４  細胞／ｍｌ  の濃度で植え込み、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養を行う。通常、２〜３日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で、培地を血清不含のＤＭＥＭに交換する。さらに引き続き、２〜３日間の培養を行うことにより目的ポリペプチドを含む培養混合物を得ることができる。なお、目的ポリペプチドの産生量が少ない場合にはｄｈｆｒ遺伝子欠損  ＣＨＯ細胞を使用し、メソトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることも可能である。
【００４６】
上述の培養混合物とは、培養上清もしくは細胞のライセートのことである。すなわち、形質転換体が、当該ポリペプチドを細胞外に分泌する場合にはその培養上清を材料として、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドを回収、精製する。一方、当該新規ポリペプチドが宿主細胞内に蓄積される場合には、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破砕した後、遠心分離して上清を回収し、濾過等により不要な細胞断片等を取り除いた後に、それを材料として本発明第１の態様の新規ポリペプチドを精製する。
使用する形質転換体が大腸菌である場合に、産生された当該新規ポリペプチドが、ペリプラズムに蓄積される場合は、ウィルスキー（Ｗｉｌｓｋｙ）等の方法（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １  巻，  ５９５  頁、１９７６年）等が使用できる。
精製方法としては、第６の態様と同様、ポリペプチドの精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。精製方法の例は第６の態様で説明したとおりであるが、好ましくは、少なくともトリプシンアフィニティークロマトグラフィーを精製の工程で行うのがよい。精製方法の好ましい例については本発明第９の態様で説明する。
【００４７】
当該製造方法において、本発明第１の態様の新規ポリペプチドは他のポリペプチドとの融合蛋白として、形質転換体に生産させてもよい。たとえば、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡの下流に目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを接続し、目的のポリペプチドをベータガラクトシダーゼとの融合蛋白として発現させる方法は、高い生産量が期待できることから、一般に行われている方法である。
当該ポリペプチドを他のポリペプチドとの融合蛋白として発現させた場合には、精製工程のいずれかのステップにおいて、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該ポリペプチドを切り出す操作が必要になる。
【００４８】
また、使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、当該ポリペプチドを不溶化蛋白であるインクルージョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に、インクルージョンボディーを可溶化し、デネイチャーし、リフォールディングするという操作を精製の適当なステップで行えばよい（トマス  Ｅ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｅ）及びクライトン  Ｊ．（  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｊ．  ）  ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．８７，  ｐｐ５６３−５７７，１９７４年）。たとえば、まず、菌体を破砕し、遠心分離してペレットを回収する。次に、尿素もしくはグアニジン塩酸、界面活性剤、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを適量含む可溶化バッファー（たとえば、５Ｍグアニジン塩酸、  ０．００５％    Ｔｗｅｅｎ８０  、５０ｍＭ    トリス塩酸（ｐＨ８．０）  、５ｍＭ    ＥＤＴＡ  、２ｍＭ  還元型グルタチオン、０．０２ｍＭ    酸化型グルタチオンを含む緩衝液）をペレットに加え、２ーメルカプトエタノールを加えてデネイチャーし、上記可溶化バッファーからグアニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析してリフォールディングする。融合蛋白質として発現させている場合には、これらの操作の後で、ブロムシアン等の化学物質もしくはフロテアーゼ等の酵素で不要なポリペプチド部分を切断し、その後、適当なクロマトグラフィーを行う。
【００４９】
次に、本発明の第１１の態様の精製方法について説明する。
本発明の第１１の態様の精製方法は、トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行うことを特徴とする。
トリプシンアフィニティークロマトグラフィーに使用する樹脂は、ウシトリプシン、ブタトリプシン、もしくはヒトトリプシンを吸着させたものが好ましい。吸着させる樹脂は特に限定されないが、アガロースが好ましい。また、溶出はトリフルオロ酢酸溶液を使用しすることが好ましい。
得られた各画分のトリプシン阻害活性を測定することにより、本発明の新規ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、トリプシン阻害活性の確認には、参考例で示したリバースザイモグラフィーの手法が便利である。
【００５０】
本発明の精製方法は、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを複数回繰り返すことを含むものであってもよい。その場合、試料中に混在する他のトリプシン吸着性の物質と分離するために、１回目のトリプシンアフィニティークロマトグラフィーでは、非吸着画分を回収し、回収した非吸着画分に対して再度トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行い、本発明の新規ポリペプチドを含む吸着画分を回収するのが好ましい。
【００５１】
本発明の精製方法は、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの前後に、他の工程を含むものであってもよい。すなわち、本発明の精製方法には、上記トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの前後に、濃縮や各種クロマトグラフィーなどの操作の中から当該ポリペプチドを失活させない方法を選択し組み合わせて行う方法も含まれる。
【００５２】
本発明の精製方法のより好ましい例は、少なくとも、下記ａ）〜ｃ）の工程を含む精製方法である。
ａ）硫酸アンモニウムを加えて塩析し、沈殿物を回収する。
ｂ）ゲル濾過を行う。
ｃ）トリプシンアフィニティークロマトグラフィーを行う。
工程ａ）の塩析は、約８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを試料に加えて行うのが好ましい。硫酸アンモニウムを加えた後、約一晩静置したものを遠心分離することにより沈殿が得られる。沈殿を、ｐＨが中性付近の緩衝液に溶解し、必要があれば、適当な透析外液に対して透析する。
工程ｂ）のゲル濾過は、排除体積  ３００万ダルトンの樹脂を使用し、中性付近のｐＨで行うのが好ましい。特に、  ｐＨ７．５付近で行うのが好ましい。樹脂の種類は特に限定されないが、好ましくはセロースがよい。ゲル濾過で得られた各画分のトリプシン阻害活性を測定することにより、本発明の新規ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、トリプシン阻害活性の確認には、参考例で示したリバースザイモグラフィーの手法が便利である。
工程ｃ）のトリプシンアフィニティークロマトグラフィーについては既に説明した通りである。
【００５３】
上記好ましい例では、工程ａ）からｃ）は連続して行ってもよいし、これらの操作の間に他の操作を行ってもよい。また、工程ａ）からｃ）はそれぞれ１回に限らず複数回繰り返して行ってもよい。
【００５４】
本発明の精製方法は、それが培養上清を材料とする場合でも、尿を材料とする場合でも、細胞や組織の破砕物を材料とする場合でも適用することができる。しかしながら、細胞や組織の破砕物を材料とする場合には、遠心分離等を行ってこれらの組織や細胞の断片を取り除いたものに対して本発明の精製方法を行うことが望ましい。
【００５５】
次に、本発明の第１０の態様の抗体について説明する。
本発明の第１０の態様の新規抗体は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドに結合することを特徴とする。
本発明の第１０の態様の新規抗体は、本発明の第１の態様の新規ポリペプチドと結合する限り、モノクローナル抗体であっても、ポリクリーナル抗体であってもよい。
【００５６】
抗体、すなわち、免疫グロブリンの構造は、Ｈ鎖とＬ鎖とからなり、物理化学的性質や免疫学的性質は、５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）  に分けられる。このうち、ＩｇＧ  、ＩｇＡ  はさらにＨ鎖のタイプによって、サブクラスに分けられる。本発明の新規抗体は、これらのいずれのクラス、サブクラスに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンは例えばペプシンで分解すると、Ｆ（ａｂ’）２  と  Ｆｃ’に別れ、パパインで分解すると  ＦａｂとＦｃに分かれる。本発明の抗体は、抗原と結合するものであれば完全な抗体分子でもその一部のフラグメントでもよい。
また、本発明の抗体はキメラ抗体であってもよい。
【００５７】
本発明の抗体は、それがポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、公知方法を参考にして得ることができる（例えば免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の第１の態様の新規ポリペプチドもしくはその断片を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）  や不完全アジュバント（ＦＩＡ）  等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の新規ポリペプチドは、それが抗体の精製用に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。また、免疫抗原として、ポリペプチド断片を使用する場合には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）  等のキャリアを結合させることが好ましい。
当該新規ポリペプチドを用いて免疫する動物もいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる様な動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００５８】
また、モノクローナル抗体を得るには、以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。本発明の第１ないし第３の態様の新規ポリペプチドに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の上述のような公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００５９】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られ得る。すなわち、本発明第１ないし第３の態様の新規ポリペプチドもしくはポリペプチド断片で免疫した動物の脾細胞、リンパ球、あるいは、本発明第１の態様の新規ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を、公知方法を組み合わせて精製することができる。
【００６０】
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
なお、以下に示す実施例中の諸操作は、主に下記の雑誌、成書を参考として実施した。
【００６１】
（参考文献）
１．生化学実験講座１  タンパク質の化学Ｉ  、日本生化学会編、１９７６年、東京化学同人
２．新生化学実験講座１  タンパク質ＩＩ    一次構造、日本生化学会編、１９９０年東京化学同人
３．新生化学実験講座１８    細胞培養技術、日本生化学会編、１９９０年、東京化学同人
４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ  ；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  等編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９  年
５．組換え遺伝子の細胞への導入と発現、今本文男等編、蛋白質核酸酵素臨時増刊  ２８（１４）  、１９８３年
６．細胞工学的技術総集編、岡田善雄監修、実験医学臨時増刊７（１３）、１９８９年
【００６２】
【実施例】
〔実施例１〕Ｔ９８Ｇ細胞の培養および培養上清の調製
Ｔ９８Ｇ細胞を１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ  ）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１  ）中に懸濁し、１０５  細胞／ｍｌ  に調製した。この細胞懸濁液２００ｍｌ  を８００ｍｌ  のローラーボトルに植え込み、５％炭酸ガス／９５％空気下、３７℃で培養した。２  日間培養した後、培養液を除去し、Ｃａ、Ｍｇ不含  １５０ｍＭりん酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（以下  ＰＢＳ−  と略す）  さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１  ）を用いて細胞を洗浄した。次いで、改めて、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１）をローラーボトル当り２００ｍｌ  加え、さらに培養を２  日間継続した。その後、培養上清をローラーボトルから回収した。
【００６３】
〔実施例２〕Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清からの本発明の新規蛋白質の精製および分析
実施例１  で得られた各培養上清より、以下の方法にて本発明の新規蛋白質を分析した。
【００６４】
▲１▼硫安塩析
実施例１で得られた培養上清３．２Ｌに、８０％  飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４  ℃にて一晩静置した。静置後、４  ℃、９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して沈殿を回収し、２５ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５  に溶解した。これを、同緩衝液に対して一晩透析し、４  ℃、１８，０００  ｒｐｍで、３０分間遠心分離して沈殿を除去したのち、以下のゲル濾過に供した。
【００６５】
▲２▼ゲル濾過
あらかじめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５  で平衡化したセルロファインＧＣＬ−２０００（チッソ社製）カラム（φ２６ｍｍ×９４ｃｍ）に、上述の試料２５ｍｌをアプライし、同緩衝液にて流速２０ｍｌ／時間で展開した（図１  ）。各画分を５ｍｌ  ずつ分取し、その一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行い、トリプシン阻害活性を示すバンドを検出した（図２  ）。フラクション６５〜７４の画分をプールし以下のトリプシン固定化カラムに供した。
【００６６】
▲３▼トリプシンアフィニティークロマトグラフィー
後述の方法で作製したトリプシンセファロース４Ｂのうち３．５ｍｌ  をカラム（φ１０ｍｍ×４．５ｃｍ  ）に充填し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５  で平衡化した。このカラムに▲２▼でプールしたサンプル５０ｍｌを流速５ｍｌ／時間でアプライした後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／１．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１％Ｂｒｉｊ３５  、続いて２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．０１％Ｂｒｉｊ３５  にて洗浄した。さらに０．０５％  トリフルオロ酢酸にて流速１０ｍｌ／  時間で溶出し、溶出画分を２ｍｌ  ずつ分取した（図３  ）。分取した画分の一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、フラクション３９にトリプシン阻害活性のあるバンドが認められた（図４  ）。
【００６７】
▲４▼アミノ酸配列分析
▲３▼で得られた部分精製標品を、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ  ）の方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７巻，  ６８０−６８５  頁，  １９７０年）を参考にして還元下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）に供した後、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）  の方法（  Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，  Ｐ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６２  巻，  １００３５−１００３８，  １９８７  年）  に従ってＰＶＤＦ（  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ）膜にブロッティングした。続いて、分子量約２５ｋＤ付近のバンドを切断した後、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（アプライドバイオシステム社製）を使用してアミノ酸配列の分析を行った。その結果、配列番号３のアミノ酸配列が確認された。
【００６８】
0003558364.tif 000004
【００６９】
［実施例３］Ｔ９８Ｇ培養上清からの本発明の新規蛋白質の精製
実施例１  で得られた培養上清より以下の方法にて本発明の新規蛋白質を回収、精製した。
【００７０】
▲１▼硫安塩析
実施例１  で得られた培養上清に、８０％  飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４  ℃にて一晩静置した。静置後、４  ℃、９，０００ｒ．ｐ．ｍ．  で３０分間遠心分離して沈殿を回収し、６０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５  に溶解した。これを、同緩衝液に対して一晩透析し、４  ℃、１８，０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離して沈殿を除去したのち、以下のゲル濾過に供した。
【００７１】
▲２▼ゲル濾過
あらかじめ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  で平衡化したセルロファインＧＣＬ−２０００（既出）カラム（φ５０ｍｍ×１００ｃｍ  ）に、上述のサンプル６０ｍｌをアプライし、同緩衝液にて流速８０ｍｌ／  時間で展開した。各画分を１２ｍｌずつ分取し、その一部を用いて後述の方法でリバースザイモグラフィーを行い、トリプシン阻害活性を示すバンドを検出した。ここで活性を示したフラクションをプールし以下のトリプシン固定化カラムに供した。
【００７２】
▲３▼トリプシンアフィニティークロマトグラフィー
後述の方法で作製したトリプシンセファロース４Ｂのうち３．５ｍｌ  をカラム（φ８ｍｍ  ×７ｃｍ  ）に充填し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  で平衡化した。このカラムに▲２▼でプールしたサンプル８０ｍｌを流速１０ｍｌ／  時間でアプライした後、非吸着画分をトリプシンセファロース４Ｂカラムでリクロマトグラフィーを行った。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５／１．０Ｍ  ＮａＣｌ  、続いて２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５  にてこのカラムを洗浄した。
さらに０．０５％  トリフルオロ酢酸にて流速１０ｍｌ／  時間で溶出し、溶出画分を３．５ｍｌ  ずつ分取した。分取した画分の一部を用いて、後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、０．０５％  トリフルオロ酢酸の溶出画分にトリプシン阻害活性のあるバンドが検出された。この溶出画分を減圧乾固し、本発明の新規蛋白質の精製標品を得た。
得られた精製標品を使用して、実施例８  に示す活性測定および以下のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸配列の分析を行った。
【００７３】
▲４▼ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
▲３▼で得られた精製標品を、ラエムリの方法を参考にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、非還元下で約２０ｋＤ付近に、還元下で約２５ｋＤ付近に単一のバンドが認められた（図５  ）。
【００７４】
▲５▼アミノ酸配列の分析
▲３▼で得られた精製標品のアミノ酸配列を以下の方法で決定した。すなわち、精製標品を５０％  酢酸に溶解した後、モデル４７７Ａプロテインシークエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（既出）を使用して、アミノ酸配列の分析を行った。その結果、下記のアミノ酸配列が確認された。
【００７５】
0003558364.tif 000005
【００７６】
［実施例４］Ａ４３１細胞の培養
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１）を用いて、９０ｍｍφディッシュでコンフレントになるまで培養した。細胞がコンフレントになった時点でＭｇ、Ｃａ不含ＰＢＳ  さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１）を用いて細胞を洗浄した。次いで改めてＤＭＥＭ／Ｆ−１２  培地（１：１）を１０ｍｌ加え２  日間培養後、上清を回収した。
【００７７】
［実施例５］Ａ４３１細胞培養上清のリバースザイモグラフィー
実施例４  で得られた培養上清１０ｍｌを実施例１  ▲１▼に従って硫安塩析し、さらに後述の方法でリバースザイモグラフィーを行った。その結果、本発明の新規蛋白質のバンドと同じ２０ｋＤ付近にバンドが確認された（図６）。
【００７８】
［実施例６］トリプシン阻害活性
実施例３  で得られた精製標品を１００  μｌ  の蒸留水に溶解後、実施例３  ▲４▼のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さより推定した蛋白濃度をもとに、約５６ｎＭとなるように０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐＨ７．８  で希釈し、ウシトリプシン阻害活性測定用サンプルとした。このサンプルのウシトリプシン阻害活性を、合成基質Ｓ−２４４４（第一化学薬品株式会社製）を基質として、カッセル（Ｋａｓｓｅｌｌ）の方法（Ｋａｓｓｅｌｌ  Ｂ  等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９  巻，８４４−８５２  頁，１９７０年）に準じて以下のように測定した。
まず、ウシトリプシン（Ｔｙｐｅ  ＸＩＩＩ  、シグマ社製）を０．００１Ｍ塩酸に溶解し、１３６００（α−Ｎ−  ベンゾイル−Ｌ−  アルギニン、ＢＡＥＥ）Ｕ／ｍｌ  に調製し、それを０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８  ）にて希釈し、１．２ＢＡＥＥＵ／ｍｌ  のトリプシン溶液を調製した。
一方、合成基質Ｓ−２４４４を蒸留水に溶解し、２ｍＭ  のＳ−２４４４溶液を調製した。次にサンプル５０μｌ  もしくは、対照として５０μｌ  の０．１％ＢＳＡ／０．２Ｍトリエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐＨ７．８  を各々トリプシン溶液５０μｌ  と混合した。３７℃にて１０分間静置後、あらかじめ３７℃に保温しておいた２５μｌ  の２ｍＭ  Ｓ−２４４４溶液を添加し、反応を開始した。反応開始後１５分間の４０５ｎｍ  の吸光度を、分光光度計にて経時的に測定した。その結果、本発明の新規蛋白質は、反応時濃度約２２ｎＭで、８４％  ウシトリプシンを阻害することが確認された（図７）。
【００７９】
（参考例）
▲１▼リバースザイモグラフィー
リバースザイモグラフィーは、プロテアーゼに対する阻害活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル中で見ることのできるアッセイ法である。通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、クマシーブリリアントブルーで染色を行うと、濃く染色されるバンドに近接しているバンドや、きわめて薄く染色されるバンドは、検出が難しい。
しかし、このアッセイ法を用いることにより、微量の蛋白であっても検出が可能となる。このアッセイ法の検出感度は１  μｇ  以下であり、強いインヒビター活性を有する蛋白では数十ｎｇでも検出することができる。
【００８０】
原理を簡単に説明する。まず、予めゼラチンを含むＳＤＳ−ゲルを調製し、試料を通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に泳動させる。ついで、トリプシンでゲル全体を処理する。このとき、トリプシン阻害活性のない蛋白は、ゼラチンとともに消化され、トリプシン阻害活性のある蛋白だけがゲル内に残される。このゲルをクマシーブリリアントブルーで染色すると、トリプシンインヒビターだけを同定することが可能となる。
リバースザイモグラフィーは以下のように行った。
まず、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有した１４％  のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に被験物質を６２．５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５／２％ＳＤＳ／７％グリセロール／０．００２５％ブロモフェノールブルー中で２５℃、１時間静置した後、ゲルにアプライし泳動した。
【００８１】
泳動終了後ゲルを２．５％トライトンＸ１００／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５  に浸し、１．５  時間振とうした。続いて１０ｎｇ／ｍｌ  のウシトリプシンを含有した５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５  中に入れ、３７℃で一晩酵素反応を行った。反応終了後、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０  で３０分間ゲルを染色した。染色後、２５％  エタノール／８％  酢酸中で２０分間浸し、続いて５％エタノール／７．５％  酢酸中で本発明のトリプシンインヒビターが検出できるようになるまで脱色した。
【００８２】
▲２▼トリプシンセファロース４Ｂの作製
ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）２ｇを約２００ｍｌ  の１ｍＭ  塩酸に懸濁し、膨潤させた。これをグラスフィルター上で濾過し、さらに約１００ｍｌ  の１ｍＭ  塩酸での懸濁、濾過を２  回くり返した。次に１０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  緩衝液ｐＨ８．３  に懸濁した。この懸濁液に、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン溶液１０ｍｌを添加し、４  ℃で一晩振とうした。次に０．２Ｍグリシン溶液ｐＨ８．３  で、室温で２  時間反応させて過剰活性基をブロッキングしたのち、０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ４．０  で、続いて０．０５％  トリフルオロ酢酸でゲルを洗浄した。
【００８３】
〔実施例７〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−１
（１）Ｔ９８Ｇ細胞の培養
Ｔ９８Ｇ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６９０）  を１０％ＦＢＳ含有  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）  中に懸濁し、  ６×１０４  細胞／ｍｌ  に調製した。この細胞懸濁液５０ｍｌを培養面積１５０ｃｍ２のルーフラスコに植え込み、３７℃，５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養した。２日間培養した後、培養液を除去し、  ＰＢＳ−  で洗浄し、さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地で細胞を洗浄した。次いで、改めて、５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地を加え、約２４時間の培養を行った。その後、培養液を除去し、  ＰＢＳ−  を用いて洗浄した。洗浄後の細胞を材料としてポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  の抽出を行った。
【００８４】
（２）Ｔ９８Ｇ細胞からのポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  の抽出
（１）で調製した細胞より、トータルＲＮＡセパレーターキットおよびｍＲＮＡセパレーターキット（ともにクローンテック社）を用いて、そのプロトコールに従いポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  の抽出を行った。以下のバッファーは、特に記載がない限り、上記キット付属のバッファーである。
まず、（１）で準備した細胞に変性用溶液を加え、細胞を回収し、激しく撹拌した。さらに２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）  、水飽和フェノール、クロロホルムを加えて、再度、激しく撹拌した。このサンプルを遠心分離後、上清にイソプロパノールを加え、イソプロパノール沈殿を行った。さらに沈殿物を前述の変性用溶液に溶解し、再度、イソプロパノール沈殿を行い、  ８０％エタノールでリンスすることによりトータル  ＲＮＡを得た。
【００８５】
次に、得られたトータルＲＮＡ  をＴＥバッファーに溶解し、サンプルバッファーを加え６８℃、３分間の熱処理を行った。これを、キット付属の高塩濃度バッファーで平衡化したオリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムにアプライした。さらに高塩濃度バッファーおよび低塩濃度バッファーでカラムを洗浄した後、６５℃に暖めておいた溶出用バッファーを用いて溶出を行った。溶出液をエタノール沈殿させることによりポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  を得た。
【００８６】
（３）一本鎖ｃＤＮＡの合成
（２）で得られたポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  をテンプレートとして、スーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ：  ＢＲＬ社）を用いて、そのプロトコールに従い一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
すなわち、（２）で得られた  ２μｇのポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  を９７．５μｌのジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）処理済みの蒸留水に溶解し、  ７．５μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマーを加え、７０℃、１０分間の熱処理を行った後、氷中にて急冷した。
次に、１５μｌの１０×反応バッファー、  ７．５μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）  溶液、１５μｌの  ０．１ＭＤＴＴ、および  ７．５μｌのスーパースクリプト逆転写酵素（２００Ｕ／  ｍｌ）を加え、  １５０μｌの反応液とした。室温で１０分間、４２℃で５０分間、９０℃で１０分間、氷中で１０分間反応させた後、  ７．５μｌの  ＲＮａｓｅ  Ｈを加えてさらに３７℃で２０分間反応させた。こうして得られた反応液（一本鎖ｃＤＮＡ）を、以後の実験の  ＰＣＲ用テンプレートとした。
【００８７】
（４）新規ｃＤＮＡのクローニング
実施例２▲４▼で確認した本発明の新規ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）を基に、次に示す３種類のセンスプライマーをＤＮＡ合成機にて（３９４型、アプライドバイオシステムズ社）合成した。さらにポリ  （Ａ）＋  ＲＮＡ  を認識する１種類のアンチセンスプライマーも同様に合成した。
【００８８】
0003558364.tif 000006
（配列中、ＹはＴまたはＣ、ＨはＴまたはＣまたはＡ、ＲはＡまたはＧの塩基を示す）
【００８９】
次に、センスプライマー１とアンチセンスプライマー１、センスプライマー２とアンチセンスプライマー１、センスプライマー３とアンチセンスプライマー１の組合わせおよび順番で３回の  ＰＣＲを行った。すなわち、１回目の  ＰＣＲは（３）で調製した一本鎖ｃＤＮＡを、２回目の  ＰＣＲは１回目の  ＰＣＲで得られたＤＮＡの増幅産物を各々テンプレートとして用いた。３回目の  ＰＣＲは２回目の  ＰＣＲで得られたＤＮＡの増幅産物をテンプレートとして用いて行った。
なお  ＰＣＲはテンプレート１μｌに  ０．１μｇ／μｌの濃度のセンスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ１μｌ、ｄＮＴＰ（各１．２５ｍＭ）溶液を  ３．２μｌ、アンプリタック（  ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、  ５Ｕ／μｌ：宝酒造株式会社）を  ０．２μｌ、キット付属の１０×反応バッファーを２μｌ、蒸留水１１．６μｌを添加して、２０μｌとした反応液を９４℃にて３０秒間、６０℃にて  １２０秒間、７２℃にて６０秒間反応させることを１サイクルとし、サーマルサイクラー（ジーンアンプ  ＰＣＲシステム９６００  （Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００）：パーキン−エルマー社）を用いて４０サイクルの反応を行った。
３回目の  ＰＣＲ終了後の反応液を  １．５％アガロースゲル電気泳動にて解析したところ、鎖長約  ７００ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅されており、そのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルより回収し、Ｍ１３  ｍｐ１８を用いてクローニングした。
【００９０】
（５）塩基配列の確認
（４）でクローニングされた約７００ｂｐ  のＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を行った。すなわち、  Ｔａｑダイデオキシターミネイターサイクルシーケンシングキット（Ｔａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  ＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ：アプライドバイオシステムズ社）を用いてそのプロトコールに従いシーケンシング反応を行った後、ＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ型  アプライドバイオシステムズ社）にて解析した。その結果、Ｍ１３  ｍｐ１８にクローニングされた約７００ｂｐ  のＤＮＡフラグメントは配列番号１に示されたアミノ酸配列の一部、および同じ読み取り枠で新規な蛋白質をコードする塩基配列を有していることが判明した。
【００９１】
〔実施例８〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−２
（１）ｃＤＮＡ    のクローニング
本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を確定するため、実施例７（５）で得られた塩基配列の一部をプライマーとする  ＰＣＲを行い、再度、ＤＮＡのクローニングを行った。すなわち、実施例７（５）で確認された塩基配列の終止コドンの下流の塩基配列をもとに、次に示す２種類のアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機（既出）にて合成した。また、配列番号１のアミノ酸配列を参考に次に示すセンスプライマーをＤＮＡ合成機（既出）にて合成した。
【００９２】
0003558364.tif 000007
（配列中、ＹはＴまたはＣ、ＨはＴまたはＣまたはＡ、ＲはＡまたはＧの塩基を示す）
【００９３】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）およびＴ９８Ｇ細胞一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、実施例７（４）で行った方法に準じて、センスプライマー１とアンチセンスプライマー２、センスプライマー４とアンチセンスプライマー３の組合わせおよび順番で２回の  ＰＣＲを行った。それぞれのテンプレートより増幅された約６００ｂｐ  のＤＮＡフラグメントをそれぞれプラスミドｐＵＣ１１８のマルチクローニングサイトに組み込んだ。これらを用い、ハナハンの方法（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ，  Ｉｎ：  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌ．１，  グローバー，  Ｄ．Ｍ．（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．）  編），  １０９−１３６頁、ＩＲＬ出版  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），  １９８５  年）で大腸菌ＪＭ１０９  株を形質転換させ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）  およびイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレートに播種した。白いコロニーを選択し、目的の形質転換体を得た。これらのコロニーよりＳＤＳ−アルカリ法にてプラスミドＤＮＡを回収した。
【００９４】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメント、すなわち、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）およびＴ９８Ｇ細胞一本鎖ｃＤＮＡそれぞれのテンプレートより増幅されたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を実施例７（５）の方法に準じて行った。確認された塩基配列および対応するアミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号４、５及び６に示した。ここでクローニングされたＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列番号の１１番め以降をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記二種類のテンプレートから増幅されたＤＮＡでともに確認された。
配列番号４及び５に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２００と称する）により大腸菌ＪＭ１０９  株をハナハン等の方法（既出）で形質転換させ、得られた形質転換体    大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２００）  を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに２月２日付けで寄託した（寄託番号Ｐ−１４１０５）。
【００９５】
〔実施例９〕本発明の新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定−３
（１）ｃＤＮＡのクローニング
実施例８で確認された塩基配列のさらに上流の配列を確認する目的で、５’−ＲＡＣＥ−レディーｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−ＲｅａｄｙＴＭ    ｃＤＮＡ、ヒト胎盤ｃＤＮＡ：クローンテック社）を用いてそのプロトコールに従い  ＰＣＲを行った。まず、配列番号４及び５に示した新規蛋白質ｃＤＮＡの塩基配列を基に、次に示す２種類のアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機（既出）を用いて合成した。
【００９６】
0003558364.tif 000008
【００９７】
キットに添付されている５’−ＲＡＣＥ−レディーｃＤＮＡをテンプレートとして用い、実施キット付属のアンカープライマーと上述のアンチセンスプライマー４、アンチセンスプライマー５とを組合わせ、この順番で実施例７（４）の方法に準じて２回の  ＰＣＲを行った。増幅された約２８０ｂｐ  のＤＮＡフラグメントを、実施例８（１）の方法に準じてプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９  株の形質転換体を得、プラスミドＤＮＡを回収した。
【００９８】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を、実施例７（５）の方法に準じて行った。その結果、（１）で得られたクローンは配列表の配列番号７に示した塩基配列を含むことが確認された。この塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列に加え、そのＣ末端にさらに３７アミノ酸が付加されたアミノ酸配列をコードしていた（配列番号８）。ここで確認された塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列は、実施例８で得られた結果と一致していた。
配列番号７に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２０１と称す）で大腸菌ＪＭ１０９  株を形質転換させて得られた形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２０１）を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに２月２日付けで寄託した（寄託番号Ｐ−１４１０６）。
【００９９】
〔実施例１０〕
（１）ｃＤＮＡのクローニング
新規蛋白質をコードするｃＤＮＡの全長をクローニングする目的で、実施例９において確認された塩基配列を基に、新規蛋白質のＮ末端の上流に位置する２種類のセンスプライマーを合成した。一方、実施例７で確認された塩基配列を基に、終止コドンの下流に位置するアンチセンスプライマーの合成も行った。プライマーの合成はＤＮＡ合成機（既出）を用いて行い、それらの配列は次に示した。
【０１００】
0003558364.tif 000009
【０１０１】
次に、Ｔ９８Ｇ組胞一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてセンスプライマー５とアンチセンスプライマー２、センスプライマー６とアンチセンスプライマー６の組合わせおよび順番で２回の  ＰＣＲを行った。増幅された約６６０ｂｐ  のＤＮＡフラグメントを実施例８（１）の方法に準じてプラスミドｐＵＣ１１８に組込み、大腸菌ＪＭ１０９  株の形質転換体を得、プラスミドＤＮＡを回収した。
【０１０２】
（２）塩基配列の確認
（１）で得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列の確認を実施例７（５）の方法に準じて行った。その結果、（１）で得られたクローンは配列表の配列番号３に示した塩基配列を含むことが確認された（配列番号９）。この配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードしており、（１）で得られたクロ一ンは新規ポリペプチドの全長をコードしていることが確認された。
配列番号９に示される塩基配列を有するプラスミドｐＵＣ１１８（プラスミドｐＭ１２０２と称す）で大腸菌ＪＭ１０９  株を形質転換させて得られた形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＭ１２０２）を通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号Ｐ−１４２０２）。
【０１０３】
〔実施例１１〕ポリクロ一ナル抗体の作製
実施例３と同様な方法で作製した新規蛋白質２０μｇを  ２００μｌの生理食塩水に溶解し、これを  ＦＣＡと等量混合してエマルジョンを作製し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、４週齢、日本チャールズリバー株式会社）の皮下に、１週間の間隔で４回投与した。最終投与後、全採血、血清分離を行い抗血清を得た。
２ｍＬのプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂをカラムに充填し、３ＭのＮａＣｌを含む１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ  緩衝液ｐＨ８．９（以下、平衡化バッファーと略す）で平衡化した。
得られた抗血清を平衡化バッファーで２倍に希釈し、カラムにアプライし、平衡化バッファーで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ  緩衝液  ｐＨ４．０で溶出し、ポリクローナル抗体を得た。
【０１０４】
〔実施例１２〕
（１）抗原不溶化プレートの作製
実施例３で得た新規蛋白質を０．０７６Ｍりん酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．４（以下、  ＰＢＳと略）で希釈し１μｇ／ｍｌ  に調整する。希釈した新規蛋白質溶液  １００μｌを９６ウェルマイクロプレートに分注し、４℃で一晩静置した。  ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水（以下、洗浄液と略）で各ウェルを５回洗浄後、  ０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ１５０μｌを分注し、４℃で一晩静置してブロッキングを行い、抗原不溶化プレートを作製した。
【０１０５】
（２）モノクローナル抗体の作製
実施例３と同様な方法で精製した新規蛋白質２０μｇを  ２００μｌの生理食塩水に溶解し、これを  ＦＣＡと等量混合してエマルジョンを作製し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、４週齢、日本チャールズリバー株式会社）の皮下に１週間の間隔で３回投与した。さらに１週間後に    ２０μｇの抗原溶液のみを静脈内投与し、最終免疫を行った。
最終免疫の４日後に同マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。これを細断した後、ステンレス・メッシュを通し、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、脾細胞浮遊液を得た。この脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）を１０：１の割合で混合して遠心分離  （１，４００ｒｐｍで８分間）した。得られた沈殿に  ０．５ｍｌの  ４２．５％のポリエチレングリコール１５４０と１５％のジメチルスルフォキサイドを含むＲＰＭＩ１６４０をすばやく加え、さらに１分間激しく細胞を振とうした後、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０をゆっくり加えた後、遠心分離  （８００ｒｐｍで５分間）を行った。
この沈殿を  ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ  、アミノプテリン４×１０−７Ｍ  、チミジン  １．６×１０−５Ｍ  、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に２×１０５  細胞／ｍｌ  になるように懸濁し、９６穴マイクロプレートのウェル当り  ０．２ｍｌを分注した。２〜３日毎に半量の培地を交換し、その後ＨＴ培地（ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ  、チミジン  １．６×１０−５Ｍ  、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に交換した。
【０１０６】
ハイブリドーマ細胞の生育が認められたところで、  ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行った。すなわち、実施例１０（１）で作製した新規蛋白質を不溶化させた９６ウェルプレートを洗浄液で２回洗浄後、１０％ウサギ血清および  ０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈した培養上清  １００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。反応終了後、洗浄液で５回洗浄し、第２抗体として１０％ウサギ血清および  ０．１％ＢＳＡを含む  ＰＢＳで  ２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇｓ抗体（ダコ  パッツ  デンマーク（ＤＡＫＯ  ＰＡＴＳ  Ｄｅｍｍａｒｋ）社）１００  μｌを添加し、室温で２時間反応させた。
反応終了後、洗浄液で５回洗浄後、３ｍｇ／ｍｌ  オルトフェニレンジアミンおよび０．０２７％過酸化水素を含む０．１Ｍマッキルベイン緩衝液  ｐＨ５．０を  １００μｌ添加し、室温で１０分間酵素反応を行い、  １００μｌの２Ｎ硫酸で反応を停止し、  ４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ＥＬＩＳＡ法で陽性であったウェルのハイブリドーマを、９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２個、１個、あるいは０．５個となるよう１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。ウィスターラットの胸腺細胞をフィーダー細胞として加えて、プレートの各ウェルに植え込み、クローニングを行った。顕微鏡下で観察して、確実にシングルセルコロニーであるウェルを選択し、それらの培養上清を前述の  ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ５株を得た。
【０１０７】
次に、大量にモノクローナル抗体を産生させるために、抗体を産生しているハイブリドーマ細胞約１０７  細胞を、各々プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。９日目に採取した腹水液を  １０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清をとり、モノクローナル抗体  １Ｂ６、３Ｄ４  、３Ｇ１  、４Ａ７  および  ４Ｃ３を得た。
得られたモノクローナル抗体のクラスを、クラス特異的抗マウス血清を使用してオクタロニーゲル拡散試験で決定した。その結果、モノクローナル抗体  １Ｂ６のクラスは  ＩｇＭで、その他の４抗体は  ＩｇＧであった。
【０１０８】
（３）ウエスタンブロッティング
実施例１２（２）  で得たモノクローナル抗体  ３Ｄ４を用いてウエスタンブロッティングを行った。実施例３で精製した新規蛋白質をラムエリの方法を参考にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲルをニトロセルロースメンブレンにのせ、転写用バッファー（２５ｍＭ  トリス塩酸／１９２ｍＭグリシン，ｐＨ８．３）中、１５０ｍＡ  の定電流で１．  ５時間トランスファーを行った。各細胞の蛋白質をトランスファーしたメンブレンを、１．５％のブロッキング試薬（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ．）  社）を含む  ＰＢＳに浸し、３時間ブロッキングを行った。
上述のようにして得たモノクローナル抗体を１％の  ＢＳＡを含む  ＰＢＳで  ５，０００倍希釈し、その中にブロッキングを行ったメンブレンを入れ１時間室温にて反応させた。その後、蒸留水で１度軽くリンスし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む  ＰＢＳで１０分間軽く振とうしながら洗浄した。この洗浄操作を５回繰り返した後、１％の  ＢＳＡを含む  ＰＢＳで  ５，０００倍希釈した  ＥＩＡ級アフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＩＡ  Ｇｒａｄｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ  ＋Ｌ）Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  、バイオラッド（ＢＩＯ  ＲＡＤ  ）社、ＵＳＡ）中にメンブレンを１時間軽く振とうさせて反応させた。
その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む  ＰＢＳで１０分間軽く振とうしながら５回洗浄し、同様に  ＰＢＳで最後に１回洗浄した。続いて、  ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社、ＵＫ）  の発光試薬液を使用直前に調製し、上述のように処理したメンブレンを浸し、室温で１分間反応させた。発光試薬液中からメンブレンを取り出し、ハイパーフィルム−ＥＣＬ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社、ＵＫ）  を感光させ、現像した。
その結果、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０ＫＤ付近に単一のバンドが認められた。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明により新規なポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドはトリプシン阻害活性を有するため、膵炎や、ショック、多臓器不全、播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、ＤＩＣ）等トリプシンが関与する疾患の治療剤の開発に利用できる。
【０１１０】
【配列表】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ゲル濾過の溶出プロファイルを示すグラフである。
【図２】図２は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清のゲル濾過後のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図３】図３は、トリプシンアフィニティークロマトグラフィーの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図４】図４は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞の培養上清のトリプシンアフィニティークロマトグラフィー後のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図５】図５は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ｔ９８Ｇ細胞より精製した本発明の新規蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６】図６は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、Ａ４３１細胞の培養上清のリバースザイモグラフィーの結果を示す写真である。
【図７】図７は、本発明の新規蛋白質のトリプシン阻害活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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