(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号20で記載されるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖の可変領域でできたHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体。
【請求項２】
配列番号21で記載されるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖の可変領域でできたHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト化抗体は、配列番号21で記載されるアミノ酸配列を含むヒト化重鎖の可変領域で、リジン12→バリン12、スレオニン28→アラニン28、スレオニン30→セリン30、メチオニン48→イソロイシン48、アルギニン67→リジン67、バリン68→アラニン68、メチオニン70→ロイシン70、バリン79→アラニン79、及びチロシン95→フェニルアラニン95の場合の中の少なくとも一つ以上のアミノ酸の変形がなされることを特徴とする請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
配列番号23で記載されるアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖の可変領域でできたHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のヒト化抗体における可変領域を含むヒト化重鎖を暗号するヒト化重鎖遺伝子。
【請求項６】
配列番号20で記載されたアミノ酸配列を含むヒト化重鎖の可変領域を暗号する請求項５に記載のヒト化重鎖遺伝子。
【請求項７】
配列番号21で記載されたアミノ酸配列を含むヒト化重鎖の可変領域を暗号する請求項５に記載のヒト化重鎖遺伝子。
【請求項８】
配列番号23で記載されたアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化軽鎖を
暗号するヒト化軽鎖遺伝子。
【請求項９】
請求項５の遺伝子を含む重鎖発現ベクター 。
【請求項１０】
請求項６の遺伝子がpRC/CMVに挿入されたことを特徴とする請求項９に記載の重鎖発現ベクター pCMV-HKR127HC(寄託番号: KCTC0531BP)。
【請求項１１】
請求項７の遺伝子がpRC/CMVに挿入されたことを特徴とする請求項９に記載の重鎖発現ベクター pCMV-HKR127(III)HC(寄託番号: KCTC0691BP)。
【請求項１２】
請求項８の遺伝子を含む軽鎖発現ベクター 。
【請求項１３】
請求項８の遺伝子がpCMV-dhfrに挿入されたことを特徴とする請求項１２に記載の軽鎖発現ベクター pKC-dhfr-HKR127(寄託番号: KCTC0529BP)。
【請求項１４】
請求項１、請求項２、請求項３または請求項４のHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を含む、HBV感染の予防とB型慢性肝炎の治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、HBVの表面抗原 pre-S1に対するヒト化抗体に関するものである。
【０００２】
より詳しくは、重鎖(heavy chain)及び軽鎖(light chain)で構成されたHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体、重鎖と軽鎖を暗号する遺伝子、上記の遺伝子各々を含む発現ベクター、発現ベクターを含む形質転換体及び、HBV肝炎を予防したり、Ｂ型慢性肝炎を治療するために投与される上記のヒト化抗体を含む薬学的組成物に関するものである。
【０００３】
発明の背景
ＨＢＶは、人体に侵入して慢性及び急性肝炎を起し、悪化した場合には、肝硬変と肝癌の原因になる病原体である。全世界的に患者数が３億に上るものと推計されている（Ｔｉｏｌｌａｉｓ ａｎｄ Ｂｕｅｎｄｉａ， Ｓｃｉ． Ａｍ．， ２６４， ４８， １９９１）。ＨＢＶの皮膜は、お互いに異なった表面抗原を持った３個の蛋白質で構成されている。具体的に、Ｓ抗原を含む主（ｍａｊｏｒ）蛋白質、Ｓ抗原とｐｒｅ−Ｓ２抗原を含む中（ｍｉｄｄｌｅ）蛋白質、及びＳ抗原、ｐｒｅ−Ｓ２抗原とｐｒｅ−Ｓ１抗原を含む大（ｌａｒｇｅ）蛋白質で構成される（Ｎｅｕｒａｔｈ， Ａ． Ｒ． ａｎｄ Ｋｅｎｔ， Ｓ．Ｂ．Ｈ．， Ａｄｖ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．， ３４： ６５−１４２， １９８８）。これら全ての表面抗原蛋白質は、ＨＢＶを中和させて無力化する抗体を誘導し、特にｐｒｅ−Ｓ部位により誘導される抗体は、ウイルスの除去及び急性ＨＢＶ感染からの回復と関連があり、Ｓ抗原に対する無免疫反応（Ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）を克服できる（Ｉｗａｒｓｏｎ等， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． １６： ８９−９６， １９８５； Ｉｔｏｈ， 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ  ８４：９１７４−９１７８， １９８６； Ｎｅｕｒａｔｈ 等，Ｖａｃｃｉｎｅ ７： ２３４−２３６， １９８９； Ｂｕｄｋｏｗｓｋａ等， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ２０： １１１−１２５， １９８６； Ｍｉｌｉｃｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ８１６８−８１７２， １９８５； Ｍｉｌｉｃｈ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７． ３１５−３２２， １９８６）。
【０００４】
その中でpre-S1抗原は、pre-S2抗原やS抗原とは異なり、感染性ウイルス粒子等(infectious virus particles)に主に存在し(Heermann等, J. Virol. 52: 396-402, 1984)、人間肝細胞の感染に関与するために、pre-S1に特異な単一クローン抗体は、HBV中和にとても効果的に作用し(Neurath et al., Cell, 46, 429, 1986; Pontisso, et al., Virol., 173. 533 1989; Neurath et al., Vaccine, 7, 234, 1989)、HBV感染の予防とB型慢性肝炎の治療に有用であると考えられている。
【０００５】
ＨＢＶに感染した場合、例えば、ＨＢＶ陽性の母親から生まれた新生児やＨＢＶに露出した医療機関従事者達または、慢性ＨＢＶ関連肝疾患による肝移植手術患者等のＨＢＶ感染を防止するために現在までは、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（以下“ＨＢＩＧ”と略称）を使用した（Ｂｅａｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， ２， １０９９， １９８３； Ｔｏｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ．， １３， ６１９， １９９１）。しかし、現在使用されているＨＢＩＧは、制限的な利用度、抗原に対する低い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、製造過程中、汚染源に露出する心配等の短所があり、人間の血清を継続供給しなければならないという問題点があった。
【０００６】
上記の問題点を解決するために、二十日鼠のＨＢＶ表面抗原に対する単一クローン抗体を使用する方法が開発された。しかし、二十日鼠の単一クローン抗体は、一般的に抗原に対する親和度が高く、大量生産が可能であるが、人間に注射した時に体内で免疫反応を誘発するという短所があった（Ｓｈａｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３５， １５３０， １９８５）。
【０００７】
上記の問題点を解決するために、ヒトの単一クローン抗体を使用する技術が報告されたが、親和度が高いヒト単一クローン抗体の生産技術は、実用化されていなかった。
【０００８】
代りに、二十日鼠由来の単一クローン抗体の高い親和度と特異性を維持したまま、人体内での免疫誘発能を最大限に減らす方法として、“ヒト化抗体”が開発された。ヒト化抗体は、二十日鼠抗体の抗原結合部位(CDRs)を遺伝工学的にヒト抗体に移植させたもので、大量生産が可能で、遺伝子の大部分をヒト化することにより人体内での免疫反応を大幅に減らせる長所がある(Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988; Nakatani et al., Protein Engineering, 7, 435, 1994)。
【０００９】
本発明者達は、HBVの表面抗原pre-S1に対する二十日鼠の単一クローン抗体KR127を開発したことがあり、KR127抗体の可変領域を暗号する遺伝子を分離して、その塩基配列を決定したことがある(大韓民国特許出願第97-30696号)。
【００１０】
本発明では、上記二十日鼠の単一クローン抗体KR127からヒト化抗体を製造し、HBV感染とB型慢性肝炎の治療に利用しようと、KR127抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域配列と最も類似の人間の遺伝子を検索し、これを対象にヒト化抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を製造後、これらを発現ベクターにクローニングして宿主細胞を形質転換した後、これらを培養してヒト化抗体を得、二十日鼠単一クローン抗体KR127と類似した抗原結合能を維持することを確認して本発明を完成した。
【００１１】
発明の要旨
本発明の目的は、HBV表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127で抗原結合能を維持した状態で二十日鼠由来のアミノ酸残基を大部分ヒト化させ、人体内での免疫反応誘発能を減少させたHBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を提供することである。
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明では、HBVの表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127の可変領域と最も類似したヒト抗体遺伝子を選別し、これらを対象
に製造したヒト化抗体及びその軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【００１３】
また本発明は、HBVの表面抗原pre-S1に対する上記のヒト化抗体の軽鎖及び重鎖を暗号するヒト化抗体軽鎖及び重鎖遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明は、上記のHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を含む発現ベクターで形質転換させた形質転換体を培養して、HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を製造する方法を提供する。
【００１５】
併せて、本発明は、HBV肝炎を予防したり、Ｂ型慢性肝炎を治療用に上記のヒト化抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明では、配列19のアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化重鎖からなるHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体及び、配列22のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖からなるHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を提供する。
【００１８】
また、本発明では、配列19のアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化重鎖を暗号するHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化重鎖遺伝子HKR127HC及び配列22のアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化軽鎖を暗号するHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化軽鎖遺伝子 HKR127KCを提供する。
【００１９】
また、本発明では、上記の遺伝子ＨＫＲ１２７ＨＣを含む発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣ（寄託番号：ＫＣＴＣ０５３１ＢＰ）及び上記の遺伝子ＨＫＲ１２７ＫＣを含む発現ベクターｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７ （寄託番号：ＫＣＴＣ０５２９ＢＰ）を提供する。
【００２０】
また、本発明では、発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣと発現ベクターｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７でＣＯＳ７細胞を形質転換して得た形質転換体ＨＺＩＫＲ１２７を提供する。
【００２１】
また、本発明では、上記の形質転換体HZIKR127を培養して、HBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体HZKR127の製造方法を提供する。
【００２２】
本発明では、HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を製造するために、まず、HBVの表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127の可変領域配列と最も類似なヒト抗体を検索する。
【００２３】
ジェンバンクデータベース(GenBank data base)から人間の免疫グロブリン生殖細胞株(germline)遺伝子を選別した結果、DP7が二十日鼠抗体KR127重鎖の可変領域遺伝子と最も類似したヒト抗体遺伝子であり、DPK12が二十日鼠抗体KR127軽鎖の可変領域遺伝子と最も類似したヒト抗体遺伝子であることを確認した。
【００２４】
したがって、上記のヒト抗体遺伝子DP7、DPK12に二十日鼠抗体KR127のCDRsを移植して本発明のヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を製造する。
【００２５】
本発明では、ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を製造するにあたり、抗原結合部位に該当する二十日鼠抗体の重鎖と軽鎖のCDRsは、大部分二十日鼠抗体KR127のものをそのまま使用したが、抗原結合に参与しないものであると推定されるアミノ酸は、ヒト抗体のアミノ酸に置換した。また、上記のヒト抗体可変領域のアミノ酸中にCDRsの構造(conformation)に影響をおよぼすフレームワーク(framework region, FR)のいくつかのアミノ酸残基を二十日鼠抗体KR127の可変領域アミノ酸のものに替えてやる。
【００２６】
具体的にヒト化抗体の重鎖遺伝子を製造するために、上記の二十日鼠単一クローン抗体KR127の重鎖可変領域中でCDR1、2、3の一部分及びFR残基いくつかをヒト抗体重鎖可変領
域DP7に移植させ、ヒト化重鎖遺伝子の可変領域HKR127HCv(HZII)を製造した(図1参照)。
【００２７】
しかし、HKR127HCv(HZII)を使用して製造したヒト化抗体は、その抗原結合能を全く示さなかった。したがって、本発明では、抗原結合能を維持させるために二十日鼠抗体KR127のアミノ酸残基をさらに多く移植させたヒト化重鎖遺伝子の可変領域HKR127HCv(HZI)及びHKR127HCv(HZIII)を考案した(図1参照)。
【００２８】
ＨＫＲ１２７ＨＣｖ（ＨＺＩ）は、ＣＤＲ１、３の全体及び一部分のＣＤＲ２と１１ＦＲ残基を含む反面、ＨＫＲ１２７ＨＣｖ（ＨＺＩＩＩ）は、ＣＤＲ１、３の全体及び一部分のＣＤＲ２と２ＦＲ残基を含む（図１参照）。
【００２９】
完全な長さのHKR127HC(I)を製造するために、上記の新しいヒト化重鎖遺伝子の可変領域HKR127HCv(HZII)と重鎖のリーダーシークエンス(leader sequence)及びヒト抗体重鎖γ1の不変領域配列を持っているpRC/CMV-HC-HuS(KCTC 0229BP)を鋳型にして配列1と配列2、配列3と配列4、配列5と配列6、配列7と配列8、配列9と配列10、そして配列11と配列12の始発体を各々利用してPCRを行った(図2a参照)。
【００３０】
上記の配列1と配列2、配列3と配列4、配列5と配列6、配列7と配列8、配列9と配列10によるPCR産物を接合(annealing)させ、これを再び鋳型にして配列1と配列10の始発体を利用して再組み換えPCRを行うことによって約431bpの断片を得た。これを配列11と配列12の始発体を各々利用したPCR産物と一緒に鋳型にして、配列1と配列12の始発体を利用してPCRを行うことによって、1431bpのヒト化重鎖遺伝子HKR127HC(I)を得、pBluescript SK(+)にクローニングしてpHKR127HC(I)と命名した。
【００３１】
上記のヒト化重鎖遺伝子を合成する過程に使用された配列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12の始発体の塩基配列を配列表に示した。具体的に、配列1の始発体は、その末端に制限酵素EcoRI配列を持ち、配列12の始発体は、その末端に制限酵素SalI配列を持っている。
【００３２】
上記のように、製造されたヒト化重鎖遺伝子HKR127HC(I)の可変領域は、12、28、30、48、67、68、70、72、74、79及び95位置にKR127二十日鼠抗体の可変領域アミノ酸残基11個を含み、全体87個のFR残基中変更されないFR残基は、76個で、ヒトDP7遺伝子と87%の類似性を示す(図1参照)。
【００３３】
HKR127(I)をさらにヒト化するために製造されたHKR127(III)は、72及び74位置に2個の二十日鼠由来のFR残基を持つ。また、完全な長さのHKR127HC(III)を製造するために、配列1と配列24、配列25と配列26、配列27と配列28そして配列11と配列12を利用して上記HKR127HC(I)の製造と同一の方法で(図2b)1431bpのヒト化重鎖遺伝子HKR127HC(III)を得、pBluescript SK(+)にクローニングしてpHKR127HC(III)と命名した。
【００３４】
また、ヒト化抗体の軽鎖遺伝子を製造するために、上記の二十日鼠単一クローン抗体KR127の軽鎖可変領域中で、CDR1、3の全体とCDR2の一部分をヒト抗体軽鎖DPK12に移植させ、ヒト化軽鎖遺伝子の可変領域HKR127KCv(HZII)を製造した(図3参照)。
【００３５】
しかし、HKR127KCv(HZII)を使用して製造したヒト化抗体は、その抗原結合能を全く示さなっかった。したがって、抗原結合能を維持させるために、二十日鼠抗体KR127のアミノ酸残基をさらに多く移植させたヒト化軽鎖遺伝子HKR127KCv(HZI)を考案した(図3参照)。
【００３６】
完全な長さの新しいヒト化軽鎖遺伝子HKR127KC(I)を製造するために、上記HKR127KCv(HZII)と軽鎖のリーダーシークエンス(leader sequence)及びヒト抗体軽鎖κの不変領域配列を持っているpKC-dhfr-HuS(KCTC 0230BP)を鋳型にして、配列13と配列14、配列15と配列16そして配列17と配列18の始発体を各々利用してPCRを行った。
【００３７】
具体的に、配列13と配列14、配列15と配列16の始発体を各々利用したPCR産物を一緒に鋳型にして、配列13と配列16の始発体を利用してPCRを行い、360bpの断片を合成した。これを再び配列17と配列18の始発体を利用したPCR産物と一緒に鋳型にして、配列13と配列18の始発体を利用して、PCRを行って739bpのヒト化軽鎖遺伝子HKR127KC(I)を得、pBluescript SK(＋)にクローニングしてpHKR127KC(I)と命名した。
【００３８】
上記のヒト化軽鎖遺伝子を合成する過程に使用された配列13、14、15、16、17、18の始発体の塩基配列を配列表に示した。具体的に配列13の始発体は、その末端に制限酵素HindIII配列を持ち、配列18の始発体は、その末端に制限酵素SalI配列を持っている。
【００３９】
上記のように製造されたヒト化軽鎖遺伝子HKR127KC(I)の可変領域は、二十日鼠単一クローン抗体KR127軽鎖中の５個のアミノ酸残基を含み、全体83個のFR残基中変更されないFR残基は、78個で、ヒトDP7遺伝子と94%の同一性を示す(図3参照)。
【００４０】
本発明は、HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の上記軽鎖及び重鎖遺伝子を含む発現ベクターで形質転換させた形質転換体を培養し、HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を製造する方法を提供する。
【００４１】
HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を製造するために、まず、本発明では、上記のヒト化抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を含む発現ベクターを製作する。
【００４２】
具体的に、ヒト化重鎖を含む上記pHKR127HC(I)及びpHKR127HC(III)から本発明のヒト化重鎖を制限酵素を利用して分離した後、pRc/CMV(Invitrogen社製品)に挿入し、本発明のヒト化重鎖発現プラスミドpCMV-HKR127HCとpCMV-HKR127(III)HCを製造した(図5a及び図5c参照)。また、ヒト化軽鎖を含む上記のpHKR127KCから本発明のヒト化軽鎖を制限酵素を利
用して分離した後、本発明者達が開発したことがあるpCMV-dhfr(KCTC 8671P)に挿入し、本発明のヒト化軽鎖発現プラスミドpKC-dhfr-HKR127を製造した(図5b参照)。
【００４３】
上記の発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣ、ｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７（ＩＩＩ）ＨＣ、または、ｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌株を各々形質転換し、大腸菌形質転換体を製造し、ｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７を韓国科学技術研究院附設生命工学研究所遺伝子銀行に１９９８年１０月１２日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ０５３１ＢＰ， ＫＣＴＣ０５２９ＢＰ ）。また、ｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７（ＩＩＩ）ＨＣを１９９９年１１月１５日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ０６９１ＢＰ）。
【００４４】
本発明では、HBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体を発現するために、本発明のヒト化重鎖及びヒト化軽鎖遺伝子を含む発現ベクターpCMV-HKR127HCとpKC-dhfr-HKR127でCOS7細胞を一時的に形質転換させ、形質転換体を得た後、これを培養して本願発明のヒト化抗体HZKR127Iを分離する。
【００４５】
また、ｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７を利用して上記と同じ方法でＨＺＫＲ１２７ＩＩＩを分離する。
【００４６】
あわせて、本発明は、上記ヒト化抗体を含有する薬学的組成物を提供する。
本発明のヒト化抗体は、HZKR127IとHZKR127IIIを二十日鼠単一クローン抗体KR127との抗原結合親和度を比較して表1及び表2に示した(図6a及び図6b参照)。
【００４７】
HBV抗原pre-S1に対するヒト化抗体の有効量を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、抗-S単一クローン抗体またはラミブディン(lamivudin)と同様な抗-肝炎薬剤を含むことができる。
【００４８】
また、上記ヒト化抗体は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に処方でき、静脈内、皮下内及び筋肉内注入による処方が可能だ。
【００４９】
本発明の薬学的組成物は、通常的に使用される固体または液体賦形剤、稀釈液及び注射剤の形態で使用できる。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、１週間に約１〜１０ ｍｇ／ｋｇ で服用が可能で、望ましくは、３〜５ｍｇ／ｋｇ で服用する。
【００５１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
<実施例 1> ヒト化重鎖遺伝子の製造
ヒト化重鎖可変領域を製造するためにまず、二十日鼠単一クローン抗体KR127の重鎖可変領域遺伝子とアミノ酸配列が最も類似したヒト抗体DP7をジェンバンクデータベースから選抜し、上記KR127の重鎖可変領域とDP7抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び塩基配列を比較し、これを根拠に最初のヒト化重鎖HKR127HCv(HZII)を考案後、考案した最初のヒト化重鎖を改善して、二番目のヒト化重鎖HKR127HCv(HZI)を考案した。
【００５３】
具体的に、ヒト化重鎖可変領域遺伝子HKR127HCv(HZI)は、ヒト化抗体で抗体の構造に影響を与えるものと推定されるいくつかの二十日鼠フレームワークアミノ酸残基とCDR1、3及びCDR2の一部をヒト抗体重鎖可変領域DP7に移植させて、上記HKR127HCv(HZII)を製造した後、これから下記のPCRによって製造した。
【００５４】
重鎖の分泌に必要な重鎖リーダーシークエンスとヒト抗体重鎖不変領域遺伝子は、 pRC/CMV-HC-HuS(KCTC0229BP)から合成した。
【００５５】
上記のリーダーシークエンス、ヒト化重鎖可変領域遺伝子HKR127HCv(HZII)、ヒト化重鎖不変領域遺伝子を再組み換えPCRによって連結して最終的にヒト化重鎖遺伝子HKR127HC(I)を製造した(図2a参照)。
【００５６】
PCRに使用した始発体を配列1ないし配列12に記述した。
PCR反応条件は、94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分、Taq DNA 重合酵素(polymerase)を使用して、30回行った。まず、配列1と配列2、配列3と配列4、配列5と配列6、配列7と配列8、配列9と配列10、配列11と配列12の始発体を使用して得たDNA断片の中から、配列1と配列2(113bp)、配列3と配列4(96bp)、配列5と配列6(120bp)、配列7と配列8(78bp)、配列9と配列10(87bp)の始発体を使用して得たDNA断片をアニーリングして配列1と配列10の始発体で再組み換えPCRして連結した。上記の合成された断片(431bp)を配列11と配列12の始発体を使用して合成されたDNA断片(1015bp)と配列1と配列12の始発体を使用して連結した。
【００５７】
最終的に合成されたヒト化抗体重鎖遺伝子(約1431bp)を制限酵素EcoRIと制限酵素SalIで両端を切り、pBluescript SK(＋)にクローニングしてpHKR127HC(I)と命名した。製造されたヒト化抗体重鎖遺伝子の塩基配列は、DNAシークエンシング(Sequencing)によって確
認した。
【００５８】
また、HKR127HC(I)をさらにヒト化するために二十日鼠フレームワークアミノ酸残基をより少なく含むHKR127(III)を製造した。上記のHKR127HC(I)と同一の製造方法で PCRには、配列24ないし配列28を始発体に使用した。
【００５９】
<実施例 2> ヒト化軽鎖遺伝子の製造
ヒト化軽鎖可変領域を製造するために、まず、KR127の可変領域遺伝子とアミノ酸配列が最も類似したヒト抗体DPK12をジェンバンクデータベースから選抜し、上記KR127の軽鎖可変領域とDPK12抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び塩基配列を比較して、これを根拠に最初のヒト化軽鎖遺伝子HKR127KCv(HZII)を考案した後、考案された最初のヒト化軽鎖を改善して二番目のヒト化軽鎖遺伝子HKR127KCv(HZI)を考案した(図３参照)。
【００６０】
二番目のヒト化軽鎖は、二十日鼠抗体のCDR1、2、3といくつかのFR残基をヒト抗体軽鎖に移植させたものである。
【００６１】
軽鎖の分泌に必要な軽鎖リーダーシークエンスとヒト抗体軽鎖不変領域遺伝子は、 pKC-dhfr-HuS(KCTC 0230BP)から合成した。
【００６２】
上記のリーダーシークエンス、ヒト化軽鎖可変領域遺伝子HKR127KCv(HZI)、ヒト化軽鎖不変領域遺伝子を再組み換えPCRによって連結し、最終的にヒト化軽鎖遺伝子HKR127KC(I)を製造した(図4参照)。
【００６３】
PCRに利用した始発体を配列13から配列18に記述した。
PCR反応条件は、94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分、30回行った。まず、配列13と配列14、配列15と配列16、配列17と配列18の始発体を使用して得たDNA断片中、配列13と配列14(101bp)、配列15と配列16(159bp)の始発体を使用して得たDNA断片をアニーリングして配列3と配列16の始発体で再組み換えPCRして、連結し合成された断片(248bp)を配列17と配列18の始発体で合成されたDNA断片(515bp)と配列9と配列18の始発体で連結し、最終的にヒト化抗体軽鎖遺伝子(736bp)を合成した。
【００６４】
合成されたヒト化抗体軽鎖遺伝子を制限酵素HindIIIと制限酵素SalIで両端を切り、pBluescript SK(＋)にクローニングしてpHKR127KCと命名した。合成されたヒト化抗体軽鎖遺伝子の塩基配列は、DNAシークエンシングによって確認した。
【００６５】
<実施例 3> ヒト化重鎖発現プラスミドの製造
プラスミドpHKR127HC(I)及びpHKR127HC(III)を制限酵素SalIで切断後、クレナウ(Klenow)酵素で端をブラント(blunt)にした後、制限酵素NotIで再び切って、ヒト化重鎖遺伝子を分離した。
【００６６】
一方、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を制限酵素ＸｂａＩで切って、クレナウ酵素で端をブラントにした後、制限酵素ＮｏｔＩで再び切ってベクターを分離した。
【００６７】
分離したベクターに上記のヒト化重鎖遺伝子を連結し、ヒト化重鎖発現ベクターpCMV-HKR127HC及びpCMV-HKR127(III)HCを製作した。製作したヒト化重鎖発現ベクターpCMV-HKR127HC及びpCMV-HKR127(III)HCは、KCTCに寄託した(寄託番号:KCTC0531BP、KCTC0691BP)、完成したベクターは、図5a及び図5cに示した。
【００６８】
<実施例 4> ヒト化軽鎖発現プラスミドの製造
プラスミドpHKR359KCを制限酵素HindIIIとApaIで切って、ヒト化軽鎖遺伝子を分離し、これをpCMV-dhfr(KCTC8671P)のHindIIIとApaI位置に挿入し、ヒト化軽鎖発現ベクターpKC-dhfr-HKR127を製作した。
【００６９】
製作したヒト化軽鎖発現ベクターpKC-dhfr-HKR127をKCTCに寄託した(寄託番号:KCTC0529BP )。 完成したベクターは、図5bに示した。
【００７０】
<実施例 5> ヒト化抗体のCOS7細胞で発現
仔牛血清が10%添加されたDMEM培養培地(GIBCO社製品)で37℃、5%炭酸ガスを維持しながらCOS7細胞を継代培養した。上記の細胞を100mm皿に接種して、37℃で一晩培養した。
【００７１】
一方、上記の実施例３と実施例４で得た、発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＫＲ１２７ＨＣとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＫＲ１２７の５μｇを各々ＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉ ８００μｌで稀釈して、５０μｌのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ， ＧＩＢＣＯ社製品）もＯＰＴＩ  ＭＥＭ Ｉ ８００μｌで稀釈した。上記の混合物を１５ｍｌチューブで混合後、１５分以上室温で放置した。混合物を放置する間に、前日接種しておいたＣＯＳ７細胞をＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉ （ＧＩＢＣＯ社製品）で２回洗浄した。
【００７２】
DNA-リポフェクタミン混合物に6.4mlのOPTI MEM Iを添加して混合した後、上記で洗浄したCOS7細胞上に均一に注いだ。炭酸ガス恒温器で72時間の間培養後、培養液の上層液を集め、超遠心濾過装置(Ultrafiltration Kit)で濃縮後、抗-ヒト抗体(anti-human IgG)と抗-ヒト抗体-HRPコンジュゲート(conjugate)を利用したサンドイッチエリサ(Sandwich ELISA)によって抗体の濃度を測定した。
【００７３】
<実施例 6> ヒト化抗体のHBV表面抗原pre-S1に対する結合能
本研究室で製造したHBVの表面抗原pre-S1(アミノ酸1-56)をマイクロプレートの各ウェルに1μgずつコーティングし、実施例5で定量された抗体の濃度に基づき、抗体0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、7.5、10、20、40ngずつを添加した後、抗-ヒト抗体(Fc specific)に西洋ワサビ過酸化酵素(horseradish peroxidase)が結合(conjugation)された抗体を2次抗体として結合させる間接エリサを行い、492nmで吸光度を測定した。
【００７４】
対照群には、精製したＫＲ１２７を使用し、その結果は、表１と表２に示した。ＫＲ１２７の抗原結合能を分析する時には、抗−二十日鼠抗体（Ｆｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に西洋ワサビ過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された抗体を２次抗体に使用した。
【００７５】
【表１】
0003552103.tif 000002
【００７６】
【表２】
0003552103.tif 000003
【００７７】
<実施例 7> ヒト化抗体の抗原結合親和度
ヒト化抗体のHBVpre-S1抗原に対する親和度を調べるために、競争的エリサ方法(Competitive ELISA; Ryu et al., J. Med. Virol., 52, 226, 1997)を利用して抗原結合親和度を測定した。
【００７８】
まず、１×１０−７〜１×１０−１２Ｍ濃度のＨＢＶ抗原に対して各々ＣＯＳ７でから生産した抗体と対照群のＫＲ１２７ ５ｎｇずつを３７℃で２時間の間結合させた後、その反応物を９６ウェルにコーティングされている抗原と結合させた。
【００７９】
上記の結果からＨＢＶと結合した抗原の量を最終的に測定し、その結果を図６に示した。ＫＲ１２７とＨＺＫＲ１２７Ｉの抗原結合親和度を比較した結果、ＫＲ１２７とよく似た値（７×１０７Ｍ−１）を示した（図６ａ参照）。
【００８０】
ＨＺＫＲ１２７ＩとＨＺＫＲ１２７ＩＩＩの抗原結合親和度を比較してみた結果、ＨＺＫＲ１２７Ｉは７×１０７Ｍ−１、ＨＺＫＲ１２７ＩＩＩは５×１０７Ｍ−１で大きな差は見られなかった（図６ｂ参照）。
【００８１】
発明の効果
上記で詳しく見たように、本発明のHBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体は、二十日鼠単一クローン抗体と類似した抗原結合能を示す反面、二十日鼠単一クローン抗体よりアミノ酸残基が、さらにヒト化され人体内での免疫誘発能が顕著に減少することにより、HBV感染の予防及び治療に有用に利用できる。
【００８２】
【配列表】
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【００８３】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】HBV表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127及びヒト化抗体重鎖の可変領域（ＶH領域）のアミノ酸配列及び塩基配列を比較したものである。
【図１ｂ】HBV表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127及びヒト化抗体重鎖の可変領域（ＶH領域）のアミノ酸配列及び塩基配列を比較したものである。
【図２ａ】HBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の重鎖遺伝子を暗号するHKR127HC(I)を得る過程を概略的に示したものである。
【図２ｂ】HBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の重鎖遺伝子を暗号するHKR127HC(III)を得る過程を概略的に示したものである。
【図３ａ】HBV表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127及びヒト化抗体軽鎖の可変領域（ＶL領域）のアミノ酸配列及び塩基配列を比較したものである。
【図３ｂ】HBV表面抗原pre-S1に対する二十日鼠単一クローン抗体KR127及びヒト化抗体軽鎖の可変領域（ＶL領域）のアミノ酸配列及び塩基配列を比較したものである。
【図４】HBV表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の軽鎖遺伝子HKR127KC(I)を得る過程を概略的に示したものである。
【図５ａ】本発明のHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の重鎖発現ベクターpCMV-HKR127HCを示したものである。
【図５ｂ】本発明のHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の軽鎖発現ベクターpKC-dhfr-HKR127を示したものである。
【図５ｃ】本発明のHBVの表面抗原pre-S1に対するヒト化抗体の重鎖発現ベクターpCMV-HKR127HC(III)を示したものである。
【図６ａ】本発明のヒト化抗体HZKR127Iの抗原に対する結合親和度を二十日鼠単一クローン抗体KR127と比較して示したものである。
【図６ｂ】本発明のヒト化抗体HZKR127IとHZKR127IIIの抗原に対する結合親和度を比較して示したものである。
【符号の説明】
◇ : KR127 ;         ● : HZKR127I ; ○ : HZKR127III
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
0003552103.tif 000018
【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0003552103.tif 000021
【図４】
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【図５ａ】
0003552103.tif 000023
【図５ｂ】
0003552103.tif 000024
【図５ｃ】
0003552103.tif 000025
【図６ａ】
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【図６ｂ】
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