(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
９−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メチル−12−（４−メチルピペリジノメチル）−1H−オキセピノ［3',4':6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,13H）−ジオンのラセミ形もしくは鏡像異性形又はこれらの混合形、又はその製薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
上記塩が塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、二燐酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩，クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩,p−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（pamoate）、サルチル酸塩、シュウ酸塩及びステアリン酸塩の群から選ばれた少なくとも一種である請求項１に記載の製薬学的に許容し得る塩。
【請求項３】
上記塩が塩酸塩である請求項２に記載の製薬学的に許容し得る塩。
【請求項４】
医薬としての請求項１に記載の化合物又はその製薬学的に許容し得る塩。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物又はその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項６】
抗腫瘍剤を調製するための請求項１に記載の化合物又はその製薬学的に許容し得る塩の使用方法。
【請求項７】
抗ウイルス剤を調製するための請求項１に記載の化合物又はその製薬学的に許容し得る塩の使用方法。
【請求項８】
抗寄生虫剤を調製するための請求項１に記載の化合物又はその製薬学的に許容し得る塩の使用方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、天然のカンプトテシンのα−ヒドロキシラクトンがβ−ヒドロキシラクトンに置換されている新規なカンプトテシン類縁体である９−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メチル−12−（４−メチルピペリジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,3H）−ジオン又はその製薬学的に許容し得る塩に関する。本発明の化合物は、従来技術から予測し得ない高い生理活性を示す。
カンプトテシンは、カンプトテカ・アクミナタ（camptotheca acuminata）と呼ばれる中国産の植物の葉及び樹皮から初めて単離された天然化合物である〔Wallらの論文、J.Amer.Chem.Soc.,88,3888（1966）参照〕。カンプトテシンは、６員環α−ヒドロキシラクトンと縮合したインドリジノ［1,2−ｂ］キノリン部分から構成される五環式化合物である。α−ヒドロキシ基を有する20位の炭素原子は不斉性であり、分子に回転力を付与している。天然形のカンプトテシンは20位の炭素において“S"絶対配置を有しており、下記の式：
0003576175.tif 000002
で示される。
カンプトテシンは、数種の癌細胞系、例えばヒトの結腸、肺及び乳房の腫瘍の細胞系において増殖抑制活性を有する〔Suffness,Mらの著作:The Alkaloids Chemistry and Pharmacology,Bross A.編,Vol.25,p.73（Academic Press,1985）参照〕。カンプトテシンの増殖抑制活性はDNAのトポイソメラーゼＩに対する阻害活性に関係していることが示唆される。
α−ヒドロキシラクトンがカンプトテシンの生体内活性及び生体外活性の両方に絶対に必要であることが、すでに報告されている〔Camptothecins:New Anticancer Agents,Putmesil,M.らの編集、p.27（CRC Press,1995）;Wall,M.らの論文、Cancer Res.,55,753（1995）;Hertzbergらの論文、J.Med.Chem.,32,715（1982）及びCrowらの論文、J.Med.Chem.,35,4160（1992）〕。
カンプトテシン誘導体とは、カンプトテシンの構造骨格（すなわち、６員環α−ヒドロキシラクトンと縮合したインドリジノ［1,2−ｂ］キノリン部分）と同一の構造骨格を有し、その構造骨格上に他の化学置換基を有しているか又は有していない化合物を意味する。種々のカンプトテシン誘導体が、以下に記載するように、専門家によく知られている。β−ヒドロキシラクトンとは、α−ヒドロキシラクトンのカルボキシルの炭素原子と、ヒドロキシル基を有するα−炭素原子との間に追加の炭素原子を有するラクトンを意味する。
本発明の新規なカンプトテシン類縁体、９−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メチル−12−（４−メチルピペリジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,3H）−ジオンは、次の式（Ｉ）：
0003576175.tif 000003
（式中、R1はエチル基を表し、R2は塩素原子を表し、R3はメチル基を表し、R4はＨ原子を表し、R5は４−メチルピペリジノメチル基を表し、R18、R19及びR20はＨ原子を表す）で示される。
カンプトテシンについて認められているように、本発明の化合物のβ−ヒドロキシラクトンにおいてヒドロキシ基を有する炭素原子は不斉性である。従って、本発明の化合物は、２つの可能な鏡像異性体を、すなわち“Ｒ”及び“S"立体配置として有する。本発明は２つの鏡像異性体及びこれらの鏡像異性体の任意の組合せ、例えば“RS"ラセミ混合物を包含する。単純化するために、前記の構造式又は化学名において具体的な立体配置が示されていない場合には、２つの鏡像異性体及びこれらの混合物が示されていると理解すべきである。
本発明の化合物は、次の一般式：
0003576175.tif 000004
（式中、R1、R2、R3、R4、R5及びR20は前記の意義を有する）で示されるカンプトテシンのα−ヒドロキシラクトンを還元して、次の一般式A:
0003576175.tif 000005
（式中、R1、R2、R3、R4、R5及びR20は前記の意義を有する）で示されるα−ヒドロキシラクトールを得；
このようにして得られた前記一般式Ａで示される化合物の隣り合った２つのカルビノールを連結する炭素−炭素結合を、適当な酸化剤を用いて処理することにより切断して、次の式B:
0003576175.tif 000006
（式中、R1、R2、R3、R4、R5及びR20は前記の意義を有する）で示される化合物を得；
次いで、得られた前記の式Ｂで示される化合物を官能化アルキル化剤で処理し且つ前記の式Ｂで示される化合物のホルミル基を切断して、次の一般式C:
0003576175.tif 000007
（式中、R1、R2、R3、R4、R5、R18、R19及びR20は前記の意義を有し、且つR17は基OR6を表し、R6は低級アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキル低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、アリール基又はアリール低級アルキル基を表す）で示されるβ−ヒドロキシエステルを製造し；
得られた前記の一般式Ｃで示される化合物を環化させることによって製造される。
上記の方法においては、基R1、R2、R3及びR4は、必要ならば標準的な保護方法〔Greene,T.の著作、Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons（1981）〕に従って保護し得る。この方法を行う際には、前記の還元は適当な溶媒中で還元剤を使用して、例えばメタノール中で水素化ホウ素ナトリウムを使用して行う。前記の一般式Ａで示される化合物から出発して前記の式Ｂで示される化合物を生成させる工程は、酸化条件下で、例えば酢酸のような適当な溶媒中で、例えば四酢酸鉛、過沃素酸又はメタ過沃素酸ナトリウムを使用して行う。前記の官能化（functionalized）アルキル化剤を用いた処理は、例えばテトラヒドロフランのような無水非プロトン性溶媒中で、金属誘導体、例えばリチウム又は亜鉛の誘導体を使用するか又はカルボン酸エステルを使用して行い得る。前記の一般式Ｃで示される化合物から出発して前記の一般式Ｄで示される化合物を得るラクトン化工程は、一般に酸性条件下で、例えばトリフルオロ酢酸で処理するかあるいはジクロロメタン又はジオキサンのような無水溶媒に溶解した塩酸ガスで処理することにより行う。
出発化合物として使用する置換カンプトテシンの具体例は、米国特許第473692号、同第4604463号、同第4894956号、同第5162532号、同第5395939号、同第5315007号、同第5264579号、同第5258516号、同第5254690号、同第5212317号及び同第5341745号各明細書、PCT特許出願第US91/08028号、同第US94/06451号、同第US90/05172号、同第US92/04611号、同第US93/10987号、同第US91/09598号、同第EP94/03058号及び同第EP95/00393号各明細書及び欧州特許出願第325247号、同第495432号、同第321122号及び同第540099号各明細書に記載されている。
また、本発明の化合物は、次の一般式M:
0003576175.tif 000008
（式中、R1、R18及びR19は前記の意義を有し、R20は水素原子又はハロゲン原子を表す）で示される化合物を、次の一般式N:
0003576175.tif 000009
（式中、R2、R3、R4及びR5は前記の意義を有し、Ｘはハロゲン原子を表す）で示される２−ハロ−３−キノリン−メタノールと連結させて、次の一般式O:
0003576175.tif 000010
（R1、R2、R3、R4、R5、R18、R19、R20及びＸは前記の意義を有する）で示される化合物を得；
次いで、前記の一般式Ｏで示される化合物を環化させることによって製造される。
上記の方法において、基R1、R2、R3及びR4は、必要ならば標準的な保護方法〔Greene,T.の著作、Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons 1981）〕に従って保護し得る。前記の一般式Ｍ及びＮで示される化合物から出発して前記の一般式Ｏで示される化合物を生成する反応は、光延反応〔Mitsunobu,O.らの論文、Synthesis,p.1（1981）参照〕の名前で当業者に知られている処理によって行われる。前記の一般式Ｎで示される化合物のヒドロキシル基は、非プロトン性溶媒、例えばテトラヒドロフラン又はN,N−ジメチルホルムアミド中で、ホスフィン例えばトリフェニルホスフィンとアゾジカルボン酸エステル誘導体例えばアゾジカルボン酸ジエチルで処理することにより、親核試薬例えば前記一般式Ｍで示される化合物又はその脱プロトン化誘導体で置換される。前記の一般式Ｏで示される化合物の環化は、非プロトン性溶媒、例えばアセトニトリル又はN,N−ジメチルホルムアミド中で、塩基性条件（例えば、場合によっては相間移動剤、例えばテトラブチルアンモニウムブロミドと組合せてもよいアルカリ性酢酸塩よって提供される）下でパラジウム触媒（例えば二酢酸パラジウム）の存在に50〜120℃の温度で行うことが好ましい〔R.Griggらの論文、Tetrahedron,46,4003（1990）〕。
前記の一般式Ｍで示される化合物は新規化合物である。この化合物は、次の一般式：
0003576175.tif 000011
（式中、R1及びR20は前記の意義を有し、R22はハロゲン原子又は低級アルコキシ基を表す）で示されるピリジンのカルボニル基をアセタールで保護して、次の一般式F:
0003576175.tif 000012
（式中、R1、R20及びR22は前記の意義を有し、基Ｚ及びＺ′はそれぞれ低級アルキル基を表すか又は一緒になって炭素原子を２〜４個有する飽和炭化水素環を形成する）で示される化合物を得；
得られた前記の一般式Ｆで示される化合物にヒドロキシメチル基を導入して、次の一般式G:
0003576175.tif 000013
（式中、R1、R20、R22、Ｚ及びＺ′は前記の意義を有する）で示される化合物を得；
次いで、得られた前記の一般式Ｇで示される化合物のアルコール官能基を保護して、次の一般式H:
0003576175.tif 000014
（式中、R1、R20、R22、Ｚ及びＺ′は前記の意義を有し、R23はアルコール基の保護基を表す）で示される化合物を得；
得られた前記の一般式Ｈで示される化合物のアセタール基を脱保護して、次の一般式Ｉ′：
0003576175.tif 000015
（R1、R20、R22及びR23は前記の意義を有する）で示される化合物を得；
得られた前記の一般式Ｉ′で示される化合物を官能化アルキル化剤で処理して、次の一般式J:
0003576175.tif 000016
（式中、R1、R20、R22及びR23は前記の意義を有し、且つR17、R18及びR19は前記の式IIに記載の意義を有する）で示されるβ−ヒドロキシエステルを得；
得られた前記の一般式Ｊで示される化合物の保護基R23を脱離させて、次の一般式K:
0003576175.tif 000017
（式中、R1、R18、R19、R20及びR22は前記の意義を有し、R17は基OR6又はNHR6を表し、R6はＨ原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキル低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキル低級アルコキシ基、アリール基又はアリール低級アルキル基を表す）で示される化合物を得；
得られた前記の一般式Ｋで示される化合物を次の一般式L:
0003576175.tif 000018
（式中、R1、R18、R19、R20及びR22は前記の意義を有する）で示される化合物に環化させて；最後に、
得られた前記の一般式Ｌで示される化合物の基R22をカルボニル基に転化させて、次の一般式M:
0003576175.tif 000019
（式中、R1、R18、R19及びR20は前記の意義を有する）で示される化合物を製造することを特徴とする方法に従って調製し得る。
４−アシル−２−ハロピリジン〔例えばLammattina,J.L.の論文、J.Heterocyclic Chem.,20,553（1983）に従って得られる〕のカルボニル基は、当業者に知られている標準的な条件〔Greene,T.の著作,Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons 1981）〕に従ってアセタール、好ましくは環状アセタールにより保護することが好ましい。このようにして得られる中間体を、非プロトン性溶媒（例えばアセトニトリル）中で又はアルコラートを誘導するアルコール中でナトリウムアルコラート又はカリウムアルコラートを用いて０℃〜100℃の温度で処理して、前記の一般式Ｆで示される化合物を製造する。一般式Ｆで示される化合物は、テトラヒドロフランのようなエーテル溶媒中でアリールリチウム又はアルキルリチウム（例えばメシチルリチウム）で−100℃〜０℃の温度で処理することにより３位をリチウム化し得る。このようにして得られたリチウム化中間体にN,N−ジメチルホルムアミドのようなホルミル化親電子試薬を加え、次いでこのようにして得られたアルデヒドを、加水分解した後に、水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤で処理して前記の一般式Ｇで示される化合物を製造する。一般式Ｇで示される化合物のアルコール官能基を当業者に知られている標準的な条件に従って保護して、前記の一般式Ｈで示される化合物を得る。このアルコール官能基の保護基の例としては、エーテルを形成する基〔すなわちメチル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、２−メトキシメトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブチル基及びベンジル基（置換されていてもよいし又は置換されていなくともよい）〕及びエステル（例えばギ酸エステル、酢酸エステル及びイソブチルエステル）を形成する基が挙げられる。第一級ヒドロキシ基の別の保護基の例については、Greene,T.の著作、Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons 1981）が参照される。前記の一般式Ｈで示される化合物を脱保護して一般式Ｉ′で示される化合物を製造する反応は、基R2をそのままの形で保持する選択的な条件下で、例えば酸性条件下（例えば、トリフルオロ酢酸により）で処理することにより行う。官能基の保護及び脱保護に関する選択的な条件は当業者には既知である〔Greene,T.の著作、Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons 1981）〕。一般式Ｊで示されるβ−ヒドロキシエステルを製造することを目的とした官能化アルキル化剤による一般式Ｉ′で示される化合物の処理は、無水非プロトン性溶媒、例えばテトラヒドロフラン中でカルボン酸エステルのリチウムエノーラート又は亜鉛誘導体を使用して実施し得る。前記の一般式Ｊで示される化合物の保護基R23は、当業者に公知の脱保護条件下で脱離させて一般式Ｋで示される化合物を生成させる。例えば、R23がベンジル基である場合には、一般式Ｊで示される化合物のアルコール溶液とそれに添加されるパラジウム触媒とを0.5〜10バールの圧力下の水素雰囲気に供し得る。このようにして得られる前記の一般式Ｋで示される化合物を、酸性条件（例えば、トリフルオロ酢酸で処理するか、あるいはジクロロメタン又はジオキサンのような無水溶媒に溶解した塩酸ガスで処理することにより）環化させて、前記の一般式Ｌで示される化合物におけるように７員β−ヒドロキシラク��ン環を得る。得られた一般式Ｌで示される化合物は、例えば、熱塩酸で処理するか又はトリメチルシリルヨージドで処理することにより一般式Ｍで示されるピリドンに転化し得る。
前記の一般式Ｎで示される２−ハロ−３−キノリン−メタノールは、次の一般式P:
0003576175.tif 000020
（式中、R2、R3及びR4は前記の式Ｉ及びIIに記載の意義を有する）で示されるアセトアニリドから製造し得る。以下の方法においては、基R2、R3及びR4は、必要に応じて標準的な保護方法〔Greene,T.の著作、Protective Groups in Organic Synthesis,10−86（John Wiley ＆ Sons 1981）〕に従って保護することができる。
従って、前記の一般式Ｎで示される化合物は下記の方法に従って調製し得る：すなわち、前記の一般式Ｐで示されるアニリンを、例えば無水酢酸のようなアセチル化剤で処理することによりＮ−アセチル化する。このようにして得られたアセトアニリドをビルスマイヤー（Vilsmeyer）試薬の名前で当業者に知られている試薬（オキシ塩化リンをN,N−ジメチルホルムアミドに０℃〜10℃の温度で作用させることにより得られる）で50℃〜100℃の温度、好ましく75℃の温度で処理して、対応する２−クロロ−３−キノリンカルボアルデヒドを製造する〔例えば、Meth−Cohnらの論文、J.Chem.Soc.,Perkin Trans.I,1520（1981）;Meth−Cohnらの論文、J.Chem.Soc.,Perkin Trans.I,2509（1981）；及びNakasimhanらの論文、J.Am.Chem.Soc.,112,4431（1990）参照〕。得られた２−クロロ−３−キノリンカルボアルデヒドの２位の塩素原子は、この化合物を沃素塩又は臭素塩（例えば、沃化ナトリウム又はテトラブチルアンモニウムブロミド）の存在下でアセトニトリルのような不活性溶媒中で加熱することにより沃素原子又は臭素原子で置換することができる。この転位を触媒するのに微量の酸、例えば濃塩酸が必要である場合もある。得られた２−ハロ−３−キノリンカルボアルデヒドは、当業者に既知の条件下で、例えばアルコール溶媒（例えばメタノール）中で水素化ホウ素ナトリウムを用いて０℃〜40℃の温度で処理して、前記の一般式Ｎで示される対応する２−ハロ−３−キノリンメタノールに容易に還元される。
また、前記の一般式Ｎで示される化合物は下記の方法によっても製造することができる：すなわち、前記の一般式Ｐで示されるアニリンを、非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒混合物中で、三塩化ホウ素と別のルイス酸例えば三塩化アルミニウム、四塩化チタン又はジエチルアルミニウムクロリドの存在下でニトリル（例えば、クロロアセトニトリル又はプロピオンニトリル）と反応させることによりアシル化し、次いで加水分解する〔Sugawara,T.らの論文、J.Am.Chem.Soc.,100,4842（1978）参照〕。次いで、このようにして得られた中間体を、アセトニトリルのような非プロトン性溶媒中でトリエチルアミンのような塩基の存在下にエチルマロン酸クロリドで処理し、次いでアルカリ性アルコール、例えばメタノールに溶解したナトリウムメチラートで処理して、４位が置換された２−ヒドロキシ−３−キノリンカルボン酸エチルを得る。これをオキシ塩化リンで処理することにより２−クロロ−３−キノリンカルボン酸エチルに転化させる。前記キノリンの４位がクロロメチル基を有する場合には、親核試薬置換は、第二級アミン例えばジメチルアミン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン又はピペリジンで処理することにより行うことができる。次いで、得られた２−クロロ−３−キノリンカルボン酸エチルを、ジクロロメタンのような非プロトン性溶媒中で水素化ジイソブチルアルミニウルで還元して、前記の一般式Ｎで示される２−クロロ−３−キノリンメタノールを得る。前記の一般式Ｎで示される中間体化合物の類縁体は文献、特にPCT出願第95/05427号明細書に記載されている。
本発明の化合物は、常用の方法に従って製薬学的に許容し得る塩の形態で調製し得る。許容し得る塩としては、無機酸との付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩、二燐酸塩、臭化水素酸塩及び硝酸塩又は有機酸との付加塩、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（pamoate）、サルチル酸塩、シュウ酸塩及びステアリン酸塩が挙げられる。塩基、例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムから形成される塩もまた、これらが使用可能である場合には本発明の適用分野に包含される。製薬学的に許容し得る塩の別の例については、“Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,1（1977）を参照し得る。
本発明の化合物は有用な薬理学的性質を有する。従って、本発明の化合物はトポイソメラーゼＩ及び／又はII型に対する阻害効果並びに抗腫瘍活性を有する。現在の技術水準によれば本発明の化合物が抗寄生虫活性及び／又は抗ウイルス活性を有することが示唆される。従って、本発明の化合物はまた種々の治療用途にも使用することができる。
本発明の化合物の薬理活性は以下の実験の部において例証する。
本発明の化合物は、患者、例えば哺乳動物、例えばヒトに、治療有効量を投与することにより、患者のトポイソメラーゼ、例えばＩ及び／又はII型のトポイソメラーゼを阻害することができる。
本発明の化合物はまた抗腫瘍活性も有する。本発明の化合物は、治療有効量を患者に投与することにより、患者の腫瘍、例えばトポイソメラーゼを発現する腫瘍の治療に使用できる。腫瘍又は癌の例としては、食道、胃、腸、直腸、口腔、咽頭、喉頭、肺、結腸、乳房、子宮頸管、子宮内膜体、卵巣、前立腺、精巣、膀胱、腎臓、肝臓、膵臓、骨、結合組織、皮膚、眼、悩及び中枢神経系の癌、並びに甲状腺の癌、白血球、ホジキンス病、ホジキンス病以外のリンパ腫、多発性黒色腫などが挙げられる。
本発明の化合物はまた、住血性鞭毛虫（例えばトリパノソーマ又はリーシュマニアの感染）の抑制又はマラリア原虫（例えばマラリア）の抑制による寄生虫感染症の治療に使用できるばかりではなく、ウイルス感染症及び疾患の治療にも使用できる。
これらの性質は、本発明の化合物を医薬用途に使用するのに適当なものにしている。また、本発明の主題は、医薬としての９−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メチル−12−（４−メチルピペリジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,3H）−ジオン及びその製薬学的に許容し得る無機酸又は有機酸との付加塩、並びにそれを有効成分として含有する医薬組成物である。
従って、本発明は、選択される投与方法（例えば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮又は皮下）に従って、本発明の化合物又はその製薬学的に許容し得る酸との付加塩を製薬学的に許容し得る担体と一緒に含有する医薬組成物に関する。
前記の医薬組成物（例えば治療剤組成物）は固体、液体、リポソーム又は脂質ミセルの形態であり得る。
前記の医薬組成物は固体の形態、例えば粉剤、ピル、顆粒、錠剤、リポソーム、ゼラチンカプセル又は坐薬の形態であり得る。ピル、錠剤又はゼラチンカプセルは、この医薬組成物を消化されない形態で服用者の小腸に通送するのに十分な時間、該医薬組成物を服用者の胃の中で胃液又は酵素の作用から保護することのできる物質で被覆することができる。また本発明の化合物は、例えば腫瘍と同じ部位で局所的に投与することもできる。また、本発明の化合物は、徐放方法に従って（例えば、徐放性組成物又は注入ポンプにより）投与することもできる。適当な固体支持体は、例えば燐酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及びワックスであり得る。本発明の化合物を含有する医薬組成物はまた、液体の形態、例えば溶液、エマルジョン、懸濁液又は徐放性製剤の形態でも提供し得る。適当な液体支持体は、例えば水、有機溶媒例えばグリセロール又はグリコール、例えばポリエチレングリコール並びにこれらと種々の割合の水との混合物であり得る。
また、本発明の主題は、トポイソメラーゼ、特にＩ及び／又はII型のトポイソメラーゼ阻害用の医薬、腫瘍治療用の医薬、寄生虫感染症治療用の医薬並びにウイルス性疾患治療用の医薬を調製するための前記化合物の使用である。
前記の病気又は疾患の治療を目的とした本発明の化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢及び体重並びに患者の状態に従って変化させ、しかも治療を行っている医師又は獣医により正確に決定される。このような医師又は獣医のよって決定される量を本明細書では“治療有効量”という。
本明細書において使用される技術用語及び科学用語の全ては、別の方法で定義されない限りは、本発明が属する分野における通常の専門家によって現在理解されている意味と同一の意味を有するものである。同様に、本明細書において挙げた刊行物の全て、特許出願明細書及び特許明細書の全て並びに他の参考文献の全ては、参考文献として参照される。
下記の参考例及び実施例は前記の方法を例示するために示すものであり、いずれも場合も本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
実験の部
参考例１:8−エチル−2,3,8,9−テトラヒドロ−８−ヒドロキシ−10H,12H−［1,4］ジオキシノ［2,3−ｇ］オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−10,13（15H）−ジオン
１.a.  ２−エチル−２−（２−メトキシ−４−ピリジル）−1,3−ジオキソラン（Ｆ）
Dean Stark装置を用いて、トルエン150ml中で２−クロロ−４−プロピオニルピリジン（10g、59ミリモル）〔Lamattina,J.L.の論文、J.Heterocyclic Chem.,20,553（1983）に記載のようにして得た〕、エチレングリコール（20ml）及びｐ−トルエンスルホン酸（250mg）の混合物から水を（一夜）共沸蒸留した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、前記の酸を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（100ml）で中和し、反応生成物をエーテルで抽出した。エーテル抽出液を一緒にして食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、次いで溶媒を蒸発させて、カルボニル基で保護された粗生成物13.3g（収率96％）を得、これをアセトニトリル中で３当量のナトリウムメトキシドと共に反応が終結するまで還流した〔薄層クロマトグラフィー；固定相:SiO2、溶出液:tert−ブチルメチルオキシド／ヘキサン（TBMO/HX）50/50により追跡した〕。次いで、得られたアセトニトリル溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。次いで残留物をエーテルに溶解し、水及び食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、次いで溶媒を蒸発させて褐色油状物を得、これを蒸留した（70〜75℃、0.04ミリバール）。表記の化合物（Ｆ）を透明液体の形で10.7g（全収率81％）得た。
１.b.  ２−エチル−２−（３−ヒドロキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−1,3−ジオキソラン（Ｇ）
ブロモメシチレン（13ml、85ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（300ml）に溶解した溶液に、tert−ブチルリチウム（1.7Mペンタン溶液、100ml、170ミリモル）を、カニューレ（cannula）を使用してアルゴン雰囲気下に−78℃で滴加した。生成した白色沈殿を−78℃で１時間攪拌し、次いで２−エチル−２−（２−メトキシ−４−ピリジル）−1,3−ジオキソラン（10g、44.8ミリモル）を加え、反応混合物を−78℃で15分、０℃で１時間、次いで周囲温度で１時間攪拌した。−78℃に再度冷却した後に、無水N,N−ジメチルホルムアミド（100ミリモル）を加え、反応混合物を周囲温度まで自然昇温させ、次いで16時間攪拌した。その後に薄層クロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX 50/50）により分析すると、出発化合物が完金に消費されていることが判明した。飽和塩化アンモニウム溶液を用いて反応を停止させ、反応混合物を複数回、ジエチルエーテル（それぞれ200ml、50ml、50ml）で抽出した。抽出液を一緒にして硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を蒸発させて黄色油状物を得、これをカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX:0/100〜5/95の混合液でメシチレン誘導体を溶出し、次いで20/80〜50/50の混合液で生成物を溶出させた）により精製して、中間体アルデヒド（7g）を得た。得られたアルデヒドをメタノール（100ml）に溶解し、水素化硼素ナトリウム（5g、132ミリモル）を用いて処理し、得られた混合物を薄層クロマトグラフィーにより分析しながら中間体アルデヒドが完全に消費されるまで（約１時間）攪拌した。次いで、溶媒を蒸発させ、残留物をエーテルに溶解し、水及び食塩水で洗浄し、乾燥し、次いで溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX10/90〜50/50）により精製して、表記の化合物（Ｇ）を黄色油状物の形で7g（全収率62％）得た。
１.c.  ２−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−２−エチル−1,3−ジオキソラン（Ｈ）
２−エチル−２−（３−ヒドロキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−1,3−ジオキソラン（7g、30ミリモル）と塩化ベンジル（5ml、45モリモル）とを無水テトラヒドロフラン（150ml）に溶解した溶液を、水素化ナトリウム（80％鉱油分散物、1.85g、61ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（100ml）に懸濁した懸濁物に滴加し、反応混合物を還流温度で16時間保持した。次いで、反応混合物を周囲温度まで自然冷却し、水（50ml）を用いて反応を停止させ、反応混合物を減圧濃縮した。残留物をジエチルエーテル（150ml）に溶解し、水及び食塩水で洗浄し、乾燥し、次いで溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX 5/95〜20/80）により精製して、表記のベンジル基で保護された表記の化合物（Ｈ）を透明油状物の形で9g（収率87％）得た。
１.d.  １−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−プロパン−１−オン（Ｉ′）
２−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−２−エチル−1,3−ジオキソラン（9g、27ミリモル）を120℃の温浴中でトリフルオロ酢酸（10ml）と水（5ml）と用いて３時間処理した。得られた反応混合物を減圧濃縮し、残存している酸を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を加えて中和した。エーテル抽出を行い、次いでカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX 10/90）により精製して、化合物（Ｉ′）を5.5g（収率70％）得た。
１.e.  β−エチル−β−ヒドロキシ−γ−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）プロピオン酸tert−ブチル（Ｊ）
亜鉛（5.3g、80ミリモル、6N HClで10秒間処理し、次いで中性になるまで水で洗浄し、さらにアセトン及びジエチルエーテルで連続的に洗浄することによって活性化させたもの）を無水テトラヒドロフラン（60ml）に懸濁させた懸濁物に、ブロモ酢酸tert−ブチル（13ml、80ミリモル）を還流下に滴加した。滴加終了後に反応混合物を還流下でさらに10分間保持した。次いで、１−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）−プロパン−１−オン（5.8g、20ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（20ml）に溶解した溶液を加え、反応混合物を還流下で１時間攪拌した。塩化アンモニウム飽和水溶液（100ml）を用いて０℃で反応を停止させ、反応混合物をジエチルエーテルで抽出した。抽出液を一緒にして硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を蒸発させて黄色油状物を得、これをカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:TBMO/HX 5/95〜10/90）により精製して、表記の化合物tert−ブチルエステル（Ｊ）を透明液体の形で得た（7g、収率95％）。
１.f.  β−エチル−β−ヒドロキシ−γ−（３−ヒドロキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）プロピオン酸tert−ブチル（Ｋ）
β−エチル−β−ヒドロキシ−γ−（３−ベンジルオキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）プロピオン酸tert−ブチル（1g、2.5ミリモル）を、触媒として５％パラジウム担持炭素（50mg）を用い且つ溶媒として無水エタノール（10ml）を用いて、大気圧及び周囲温度で水素添加した。反応が完結した（６時間）後に、触媒を濾過して除去し、溶媒を蒸発させて、以後の合成用途に十分な純度をもつ表記の化合物（Ｋ）を0.7g（収率90％）得た。
１.g.  ５−エチル−1,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−９−メトキシ−オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−３（4H）−オン（Ｌ）
β−エチル−β−ヒドロキシ−γ−（３−ヒドロキシメチル−２−メトキシ−４−ピリジル）プロピオン酸tert−ブチル（8.8g、28ミリモル）を、トリフルオロ酢酸（30ml）を用いて周囲温度で３時間処理した。揮発性成分を蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:CH2Cl2/MeOH 100/0〜98/2）により精製して透明油状物を得、これをトルエンで処理した後に、表記の化合物（Ｌ）を白色結晶の形で5.9g（収率89％）得た。融点97〜98℃
１.h.  ５−エチル−1,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−3,9（4H,8H）−ジオン（Ｍ）
５−エチル−1,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−９−メトキシ−オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−３（4H）−オン（0.5g、2.1ミリモル）を1N塩酸（20ml）中で９時間加熱還流させた。得られた反応混合物を減圧濃縮し、残留物にトルエンを加えてこれを蒸発させることを２回行うことにより乾燥し、次いで五酸化燐の存在下に減圧下で一夜放置した。得られた油状物を無水アセトニトリル（5ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下で24時間攪拌した。生成した沈澱を濾取し、乾燥して、表記の化合物（Ｍ）を白色固体の形で0.23g（収率49％）得た。融点118〜119℃。
１.i.  6,7−エチレンジオキシ−２−ヨード−３−キノリン−メタノール（Ｎ）
Meth−Cohnらの論文:J.Chem.Soc.Perkin.Trans.I,p.1520（1981）;Meth−Cohnの論文:J.Chem.Soc.Perkin.Trans.I,p.2509（1981）及びNakasimhanらの論文、J.Chem.Soc.,112,4431（1990）に記載の方法を使用した。無水ジメチルホルムアミド（23ml、0.28モル）にオキシ塩化燐（71ml、0.77モル）を滴加することによって得たVilsmeyer試薬に、3,4−エチレンジオキシアセトアニリド（22g、113ミリモル）を加え、氷水浴を用いて冷却し、次いでアルゴン雰囲気下でさらに0.5時間攪拌した。得られた混合物を75℃で16時間加熱した。得られた反応混合物を、周囲温度まで冷却した後に氷水（300ml）に加え、ジクロロメタン（20 0ml×５回）で抽出した。有機抽出液を一緒にして硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。固体残留物をジクロロメタン（20ml）に懸濁し、濾過し、次いで減圧乾燥して、２−クロロ−6,7−エチレンジオキシキノリン−３−カルボアルデヒドを融点222〜224℃の黄色固体の形で10g（収率35％）得た。得られたこの中間体を、アセトニトリル（150ml）中でヨウ化ナトリウム（30g、0.2モル）と濃塩酸（1.5ml）とを用いて還流下で24時間処理した。周囲温度まで冷却した後に、溶媒を減圧下で除去し、残留物を50％テトラヒドロフラン水溶液（200ml）に溶解し、濾過し、テトラヒドロフランで洗浄し、次いで減圧乾燥して6,7−エチレンジオキシ−２−ヨードキノリン−３−カルボアルデヒドを融点155〜157℃の黄色固・体の形で12g得た。この中間体をメタノール（200ml）中で水素化硼素ナトリウム（2g、52ミリモル）を用いて周囲温度で0.5時間処理した。得られた反応混合物から溶媒を減圧除去し、残留物を水に溶解し、濾過した。得られた固体を五酸化燐の存在下で減圧乾燥して、（6,7−エチレンジオキシ−２−ヨードキノリン−３−イル）−メタノールを融点178〜180℃の黄色固体の形で11g得た。
１.j.  ５−エチル−８−（6,7−エチレンジオキシ−２−ヨード−３−キノリンメチル）−1,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−3,9（4H,8H）−ジオン（Ｏ）
THF/DMSOの無水混合物（容量比8/1、45ml）に５−エチル−1,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−3,9（4H,8H）−ジオン（400mg、1.79ミリモル）、前記の工程11.i.で得られた化合物（770mg、2.23ミリモル）及びトリフェニルホスフィン（934mg、3.58ミリモル）を溶解した溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル（570μｌ、3.6ミリモル）を５分間にわたって滴加し、得られた混合物をアルゴン雰囲気下に周囲温度で16時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧濃縮し、残留物をクロロホルム（100ml）に溶解した。得られたクロロホルム溶液を食塩水（50ml×４回）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでクロロホルムを蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液:CH2Cl2/MeOH 99/1〜98/2）により精製して、表記の化合物（Ｏ）を白色固体の形で650mg（収率66％）得た。融点165〜167℃。
１.k  ８−エチル−2,3,8,9−テトラヒドロ−８−ヒドロキシ−10H,12H−［1,4］ジオキシノ［2,4−ｇ］オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−10,13（15H）−ジオン
５−エチル−８−（6,7−エチレンジオキシ−２−ヨード−３−キノリン−３−イル）メチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−（1H,3H）オキセピノ［3,4−ｃ］ピリジン−3,9（4H,8H）ジオン（600mg、1.1ミリモル）、tert−ブチルアンモニウムブロミド（352mg、1.1ミリモル）、酢酸ナトリウム（359mg、4.4ミリモル）及び酢酸パラジウム（98mg、0.43ミリモル）を無水アセトニトリル（40ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下で90℃で16時間加熱した。周囲温度まで冷却した後に、赤色の反応溶液から白色沈澱が分離した。この沈澱を濾過し、減圧乾燥した。得られた粗生成物を水に懸濁し、濾取し、五酸化燐を用いて減圧乾燥して、目的化合物を澄明黄色固体の形で250mg得た。融点＞250℃
1H−NMR（DMSO）:0.91（t,3H）;1.87（m,2H）;3.08（d,1H）;3.51（d,1H）；
4.45（s,4H）;5.19（s,2H）;5.47（dd,2H）;6.02（se,1H）;7.33（s,1H）；
7.54（s,1H）;7.55（s,1H）;8.43（s,1H）
13C−NMR（DMSO）:8.43;36.47;42.54;50.52;61.43;64.43（2C）;73.31;
99.07;112.27;113.14;122.00;124.24;128.18;129.74;144.59;145.01;
145.33;147.63;150.88;155.88;159.23;172.07
参考例２:9−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メトキシ−12−（４−メチルピペラジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,13H）−ジオン
２.a.  ５−クロロ−２−クロロアセチル−４−メトキシアニリン
この化合物は、Sugasawa T.;Toyoda T.;Adachi M.;Sasakura K.の論文、J.Am.Chem.Soc.,100（1978）,p.4842−4852に従って得られる。ヘキサンに溶解した三塩化硼素の１モル溶液（164ml、164ミリモル）、クロロアセトニトリル（11.4ml、180ミリモル）、及びヘキサンに溶解したジエチルアンモニウムクロリドの１モル溶液（164ml、164ミリモル）それぞれを、３−クロロ−４−メトキシアニリン（23.6g、150ミリモル）の溶液に、不活性雰囲気下に０℃で連続して滴加した。反応混合物を１時間加熱還流し、０℃に冷却し、2N塩酸（90ml）を注意深く加えることによって加水分解し、次いで１時間還流した。反応混合物を冷却し、pH14になるまで炭酸水素ナトリウムの濃厚溶液を加えた。得られた溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗し、次いで食塩水で洗浄した。この有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物をイソペンタンに溶解し、デカントし、次いで不溶物を最小限の量のイソプロピルエーテルに溶解し、イソペンタンを加えて生成物を沈殿させ、次いで沈殿物を濾取し、真空乾燥した。褐色固体が17.26g得られた。
1H−NMR（CDCl3）:3.82（s,3H）;4.60（s,2h）;6.11（s,2H）;6.78（s,1H）；
7.11（s,1H）
２.b.  ７−クロロ−４−クロロメチル−２−ヒドロキシ−６−メトキシ−３−キノリンカルボン酸エチル
５−クロロ−２−クロロアセチル−４−メトキシアニリン（17g、73ミリモル）とトリエチルアミン（18.5ml、131ミリモル）とを無水アセトニトリル（310ml）に溶解した溶液に、エチルマロニルクロリド（17ml、131ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気下に０℃で滴加した。得られた混合物を周囲温度で２時間攪拌し、次いで、エタノールに溶解したナトリウムエチラートの溶液（エタノール90ml中にナトリウム1.88g、80ミリモルを溶解することによって調製したもの）を０℃で滴加した。次いで周囲温度で12時間攪拌した。得られた反応混合物に水300mlを加え、さらに20分間攪拌した。生成した沈殿を濾取し、水、エタノール及びエチルエーテルで洗浄した。真空乾燥した後に、黄色固体が16.7g得られた。
1H−NMR（DMSO）:1.31（t,3H）;3.95（s,3H）;4.36（q,2H）;4.95（s,2H）；
7.46（s,1H）;7.49（s,1H）
２.c.  2,7−ジクロロ−４−クロロメチル−６−メトキシ−３−キノリンカルボン酸エチル
７−クロロ−４−クロロメチル−２−ヒドロキシ−６−メトキシ−３−キノリンカルボン酸エチル（116.7g、50ミリモル）を塩化ホスホリル（100ml）に懸濁した懸濁液を６時間加熱還流した。塩化ホスホリルを留去した。残留物を水に溶解し、30分間攪拌した。生成した沈殿を濾取し、中性になるまで水洗した。この沈殿物をジクロロメタンに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。セライトを用いて濾過し、濾液をデカントした。得られた有機層を飽和食塩水で再度洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで溶媒を減圧下で蒸発させた。褐色油状物が15.88g得られた。1H−NMR（CDCl3）:1.47（t,3H）;4.08（t,3H）;4.55（q,2H）;4.87（s,2H）；
7.35（s,1H）;8.09（s,1H）
２.d.  2,7−ジクロロ−６−メトキシ−４−（４−メチルピペラジノメチル）−３−キノリンカルボン酸エチル
2,7−ジクロロ−４−クロロメチル−６−メトキシ−３−キノリンカルボン酸エチル（6.9g、20ミリモル）とＮ−メチルピペラジン（9ml、80ミリモル）との混合物を60℃で30分間加熱した。得られた反応物を水に希釈し、酢酸エチルで抽出した。デカントし、有機層を水洗し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物を水に溶解し、15分間攪拌し、濾取し、水洗し、真空乾燥した。得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（固定相:SiO2、溶出液：
MeOH/CH2Cl2 5/95〜8/92）により精製した。ベージュ色の固体生成物が6.7g得られた。
1H−NMR（CDCl3）:1.45（t,3H）;2.28（s,3H）;2.35−2.70（m,8H）;3.86（s,2H）；
4.04（s,3H）;4.48（q,2H）;7.77（s,1H）;8.05（s,1H）
２.e.  2,7−ジクロロ−６−メトキシ−４−（４−メチルピペラジノメチル）−３−キノリンメタノール
2,7−ジクロロ−６−メトキシ−４−（４−メチルピペラジノメチル）−３−キノリンカルボン酸エチル（6g、14.5ミリモル）を塩化メチレン（120ml）に溶解した。塩化メチレンに溶解した水素化ジイソブチルアルミニウムの１モル溶液（60ml、60ミリモル）を徐々に加えた。周囲温度で１時間攪拌した。得られた反応物を20％ロシェル塩水溶液（300ml）に徐々に注加した。１時間攪拌し、次いでセライトで濾過し、デカントした。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させた。得られた固体をイソプロピルエーテルに溶解し、濾過し、真空乾燥した。目的化合物が黄色固体の形で4.3g（収率80％）得られた。
1H−NMR（CDCl3）:2.27（s,3H）;2.30−2.80（m,8H）;4.03（s,3H）;4.08（s,2H）；
4.96（s,2H）;5.95（s,1H）;7.37（s,1H）;8.05（s,1H）
２.f.  ９−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メトキシ−12−（４−メチルピペラジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,13H）−ジオン
2,7−ジクロロ−６−メトキシ−４−（４−メチルピペラジノメチル）−３−キノリン−メタノールを、参考例１の工程１.j.に記載のようにして化合物（Ｍ）に結合させた。得られた結合生成物を、参考例１の工程１.k.に記載の方法に従って環化させた。融点＞250℃の黄色固体が得られた。
1H−NMR（DMSO）:0.87（t,3H）;1.84（q,2H）;2.53（s,4H）;3.08（d,1H）；
3.47（d,1H）;3.58（s,4H）;4.06（s,5H）;5.30（s,2H）;5.42（q,2H）；
6.03（s,1H）;7.31（s,1H）;7.91（s,1H）;8.16（s,1H）
13C−NMR（DMSO）:8.42;36.53;50.65;53.30;56.67;62.00;66.50;73.32;
99.31;104.86;122.32;126.94;127.70;129.83;130.44;138.89;144.22;
144.85;151.05;153.17;155.92;159.19;172.06
IR（KBr）:862;1063;1116;1248;1595;1655;1744;3449
実施例１:9−クロロ−５−エチル−4,5−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−10−メチル−12−（４−メチルピペリジノメチル）−1H−オキセピノ［３′,4′:6,7］インドリジノ［1,2−ｂ］キノリン−3,15（4H,13H）−ジオン
参考例２の工程２.a.、２.b.及び２.c.に記載の方法を３−クロロ−４−メチルアニリンに適用して2,7−ジクロロ−４−クロロメチル−６−メチル−３−キノリンカルボン酸エチルを得、これを実施例30の工程30.d.に記載の方法に従ってＮ−メチルピペラジンに代えてピペリジンを用いて処理し、次いで参考例２の工程２.e.に記載の方法に従って還元して、対応するキノリンメタノールを得た。得られたキノリンメタノールを、参考例１の工程１.j.に記載のようにして化合物（Ｍ）に結合させた。得られた結合生成物を工程１.k.に記載の方法に従って環化させた。黄色固体が得られた。融点＞275℃
1H−NMR（DMSO）:0.86（m,6H）;1.15（m,2H）;1.37（m,1H）;1.60（m,2H）；
1.80（m,2H）;2.10（m,2H）;2.60（s,3H）;2.80（m,2H）;3.05（d,1H）；
3.48（d,1H）;4.02（s,2H）;5.30（s,2H）;5.45（dd,2H）;6.02（s,1H）；
7.40（s,1H）;8.20（s,1H）;8.40（s,1H）
13C−NMR（DMSO）:9.10;21.28;22.61;31.07;34.89;37.18;43.22;54.53;
56.83;62.10;73.94;80.06;100.43;123.41;127.08;129.11;130.58;
135.88;136.89;141.00;145.28;148.49;153.51;156.60;159.85;172.77;174.05
IR（KBr）:1605;1657;1734;3342
本発明の化合物の薬理学的研究
1.トポイソメラーゼＩで誘発させたDNAの緩和活性の研究
反応は全て、50mMトリス−HCl（pH7.5）、50mM KCl、0.5mMジチオトレイトール、10mM MgCl2、0.1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ウシ血清アルブミン30μg/ml及び超らせんpUC19〔Pharmacia Biotech社（フランス国オルセー所在）製〕300ngからなる反応用緩衝液20μｌ中で、所定濃度の供試化合物を使用して又は使用せずに行った。試験すべき化合物は全て最初にジメチルスルホキシド（DMSO）に50mMに溶解し、他の希釈は蒸留水を用いて行った。DMSO中の最終濃度は１％（容量／容量）を越えない。反応は精製した子ウシ胸腺のDNAのトポイソメラーゼＩ〔Gibco BRL社（英国Paisley所在）製〕を１単位添加することによって開始させ、37℃で15分間行った。この反応は１％ドデシル硫酸ナトリウム、20mM EDTA及びプロテイナーゼＫ〔Boehringer Mannheim社（フランス国Meylan所在）製〕500μg/mlを含有する混合物３μｌを加えることにより停止させた。37℃でさらに30分間インキュベーションを行った後に、10mM Na2HPO4、0.3％ブロモフェノールブルー及び16％フィコール（Ficoll）を含有する添加用緩衝液２μｌを試料に加え、試料をpH7.8の36mMトリス−HCl、30mM Na2HPO4、1mM EDTA及びクロロキン（chloroquin）２μg/mlを含有する緩衝液中で1.2％寒天ゲル電気泳動に1V/cmで20時間供した。得られたゲルを臭化エチジウム２μg/mlで染色し、写真機を用いて312nmのUV線下で写真を撮り、次いでbioProfilカメラ〔Vilber Lourmat社（フランス国リヨン所在）製〕で蛍光の強さを測定し、緩和されたDNAの百分率を測定した。それぞれの実験は２重に行い少なくとも３回行った。
それぞれの実験において、超らせんDNAプラスミドは単独でインキュベートするか又はトポイソメラーゼＩと一緒にインキュベートした。反応は15分以内に完結した。それぞれの供試化合物又は対照として用いた化合物については、超らせんDNAプラスミドを試験すべき化合物500μＭの存在下で、酵素と共に又は酵素と化合物とを一緒に用いずに、10μＭ、100μＭ、200μＭ及び500μＭの濃度でインキュベートした。
2.細胞増殖に対する試験
a.この試験では、次の８種類の腫瘍細胞：すなわち、L1210（マウスのリンパ性白血病）、HCT15及びLOVO（ヒトの結腸の腺癌細胞）、A549（ヒトの肺癌腫）、A172,U373及びU87（ヒトのグリア芽細胞腫）を使用した。これらの細胞は全て米国メリーランド州ロックビル（Rockville）所在のAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手した。懸濁状態のL1210細胞の培養は、加熱することにより不活性化させた10％子ウシ胎児血清、2mMグリタミン、ペニシリン50U/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを補完したダルベッコ（Dulbecco）の変性イーグル培地（DMEM）〔BioWhitaker社（ベルギー国Verviers所在）製〕中で培養した。HT29細胞は、加熱することにより不活性化させた10％子ウシ胎児血清、2mMグルタミン及びゲンタマイシン50μg/mlを補完したMcCoy 5a培地〔Gibco社（英国Paisley所在）製〕中で単層培養法で培養した。その他の前記細胞は、加熱することにより不活性化させた５％子ウシ胎児血清、2mMグルタミン、ペニシリン50U/ml及びストレプトマイシン50μg/mlを補完したアール（Earle）の変性必須培地〔EMEM;Gibco社（英国Paisley所在）製〕中で培養した。前記の細胞は全て空気95％とCO2 5％を含有する湿潤雰囲気中で37℃で培養した。
前記の腫瘍細胞の増殖阻止を、MTT試験法を使用して調べた。培地中のL1210細胞1500個（細胞培養の必要性に応じて）をマイクロプレート〔組織培養レベル:96ウェル（穴）、平底〕のウェル中に植菌し、その24時間後に供試化合物で処理した。これらの投薬量応答研究に関しては、前記の細胞をそれぞれの供試化合物又はその対応溶媒（対照）と共に１×10-10〜１×10-4Mの最終濃度にわたって48時間培養した。供試化合物は金て、使用する直前にジメチルスルホキシド（DMSO）に50mMの濃度に溶解した。他の薬剤の希釈は培地中で行った。DMSOの最終濃度は0.2％（容量／容量）を越えてはならない。対照として、薬剤溶液を溶媒に置き代え、これを供試化合物と同じ方法で連続的に希釈した。
一定時間培養した後に、それぞれのウェルに、標識試薬MTT〔３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾールブルー（Thiazol blue）、Sigma社（米国ミズリー州セントルイス所在）製〕を0.3mg/mlの最終濃度で加えた。細胞を湿潤雰囲気中で37℃で４時間培養した。この段階では、生存細胞のミトコンドリア・デヒドロケナーゼが前記の黄色のテトラゾリウム塩MTTを赤紫色のホルマザン結晶に変化させる。上清の一部を取り除き、生成したホルマザン結晶をDMSOに溶解した。得られた着色溶液を、走査型マルチキューブ分光光度計を使用して570nmにおける吸光度により定量した。細胞増殖に関するデータは、薬剤処理したウェル中の生存細胞数を対照標準の生存細胞数で割った百分率として表した。それぞれの点は独立した３回の実験の平均を表し、それぞれの実験は６個の測定値を表す。
その他の細胞系（HCT15、LOVO、A549、A172、U373、U87）については、細胞1000〜2000個をマイクロプレートのウェルに植菌し、その24時間後に薬剤処理した。これらの細胞をそれぞれの供試化合物又はその対応溶媒（対照）と共に１×10-10〜１×10-6Mの最終濃度にわたって72時間培養した。
得られた結果は、薬剤処理した細胞の光学密度（DO）を対照の細胞（DMSOで処理した細胞）のDOで割ることによって算出した増殖率として表した。供試化合物は投与量に応じて細胞の増殖を阻止した。
b.この試験では、次の９種類の腫瘍細胞：すなわち、PC3、DU145（ヒトの前立腺細胞）、MCF7及びMCF7−ADR（哺乳類の細胞系、前記の記号“ADR"は該細胞系がアドリアマイシン耐性になっていることを示す）、A427（ヒトの肺の腺癌細胞）、HT29（ヒトの結腸の腺癌細胞）、T24s及びT24r（ヒトの膀胱の細胞系、T24rはその他の細胞系の中でアドリアマイシン耐性である）を使用した。前記の腫瘍細胞PC3、DU145及びA427は、米国メリーランド州ロックビル（Rockville）所在のAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手した。前記の腫瘍細胞MCF7及びMCF7−ADRは、Jacques Soudon博士（フランス国パリ所在のPharmacell所属）にから無料で提供されたものである。前記の腫瘍細胞T24s及びT24rは、Robert Kiss博士（ベルギー国ブラッセルの私立大学所属）から無料で提供されたものである。前記のHT29細胞は、加熱することにより不活性化された10％子ウシ胎児血清、グルタミン2mM及びゲンタマイシン〔Gibco社（英国Paisley所在）製〕50μg/mlを補完したDMEM培地〔Gibco社（英国Paisley所在）製〕4.5g/l中で単層培養で培養した。その他の前記細胞は、加熱することにより不活性化させた５％子ウシ胎児血清、グルタミン2mM〔Gibco社（英国Paisley所在）製〕、ペニシリン500U,ml及びストレプトマイシン50μg/ml〔BioWhitaker社（ベルギー国Verviers所在）製〕を補完したアールの変性必須培地〔EMEM;Gibco社（英国Paisley所在）製〕中で培養した。前記の細胞は全て、空気95％とCO2 5％を含有する湿潤雰囲気中で、37℃で培養した。
前記の腫瘍細胞の増殖阻止を、WST1比色分析法を使用して調べた。培養中の細胞500〜4000個（細胞培養の必要性に応じて）をマイクロプレート〔96ウェル（穴）、平底〕のウェル中に植菌し、その24時間後に供試化合物で処理した。これらの濃度応答研究に関しては、細胞をそれぞれの供試化合物又はその対応溶媒（対照）と共に１×10-13〜１×10-5Mの最終濃度にわたって72時間培養した。供試化合物は全て、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解するか、供試化合物が水溶性である場合には水に溶解した。本発明の化合物の下記の稀釈は、DMSOの最終濃度が、DMSOがビヒクルの組成の一部である場合には常に0.1％（容量／容量）であるように培地中で行った。対照として、薬剤溶液を溶媒に置き代え、これを供試化合物と同じ方法で連続的に希釈した。
一定時間培養した後に、それぞれのウェルに標識試薬WSTI〔４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−2h−５−テトラゾリオ］−1,3−ベンゼン〕〔Boehringer社（ドイツ国マンハイム所在）製〕を９％の最終濃度で加えた。細胞を湿潤雰囲気中で37℃で２〜４時間培養した。この段階では、生存細胞のミトコンドリア・デヒドロゲナーゼが前記の橙色のテトラゾリウム塩WST1を赤紫色のホルマザン結晶に変化させる。得られた着色溶液を、走査型マルチキューブ分光光度計を使用して２つの波長の光（450nm及び690nm）の読み取り値により定量した。得られた結果は、モル/l、例えば50％阻止濃度（IC50）で表した濃度表の形で表した。得られた結果を表III A）及び表III B）に示す。実施例番号の後の“s"は化合物が塩であることを意味する。Cpt、Adr及びTptはそれぞれカンプトテシンン、アドリアマイシン及びトポテカン（topotecan）を表す略号である。
0003576175.tif 000021
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