(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料茶を４５〜１００℃、ｐＨ２．０〜５．５の酸性熱水で抽出する工程と、茶抽出液又は茶調合液をｐＨ４．５以下に保持して保管する工程とを備えたストリクチニン含有茶飲料の製造方法。
【請求項２】
原料茶を４５〜１００℃、ｐＨ２．０〜５．５の酸性熱水で抽出する工程と、茶抽出液又は茶調合液をｐＨ４．５以下に調製した後に加熱殺菌する工程と、加熱殺菌後の茶抽出液又は茶調合液をｐＨ４．５以下に保持して保管する工程とを備えたストリクチニン含有茶飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストリクチニンをより高い濃度で含有せしめ得る茶飲料の製造方法、並びに、茶飲料のストリクチニン濃度を維持せしめるための保管方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ストリクチニンは、下記化学式で示される物質（１−Ｏ−ｇａｌｌｏｙｌ−４，６−Ｏ  −（Ｓ）−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）であって、茶から抽出されるタンニン、詳しくはエラジタンニン（ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｉｎｓ）の一種である（「Ｃａｓｕａｒｉｉｎ，Ｓｔａｃｈｙｕｒｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ，  ｎｅｗ  Ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｃａｓｕａｒｉｎａ  Ｓｔｒｉｃｔａ  ａｎｄ  Ｓｔａｃｈｙｕｒｕｓ  Ｐｒａｅｃｏｘ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３０（２）７６６−７６９（１９８２））。
【０００３】
【化１】
0003583411.tif 000002
【０００４】
このストリクチニンは、花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー症状の原因であるＩｇＥの産生を抑制する働きをもっていることが知られるようになり（中日新聞、２００１年７月８日掲載）、発明としても「ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも１種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤等」が開示（特開２００２−０１２５４５号公報）され、天然物由来の薬理成分として最近特に注目されている物質である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、本発明者が茶のストリクチニンについて種々研究をしたところ、茶葉中には多量のストリクチニンが含まれているものの、市販されている緑茶飲料中にはストリクチニンがほとんど含まれていないことが分かってきた。
【０００６】
そこで本発明は、ストリクチニンの薬理作用に鑑み、ストリクチニンをより高い濃度で含有せしめるための茶飲料の製造方法、並びに、茶飲料のストリクチニン濃度を維持せしめるための茶飲料の保管方法を提供せんとする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者が、茶のストリクチニンについて鋭意研究した結果、茶葉を通常の熱水で抽出するよりも、酸性熱水で抽出した方がストリクチニンの抽出率を高めることができることを見出し、かかる知見に基づいて本発明では、原料茶を約４５〜１００℃、ｐＨ約２．０〜５．５の酸性熱水で抽出する工程を備えたストリクチニン含有茶飲料の製造方法を提案する。
茶葉を酸性熱水、特にｐＨ約２．０〜５．５の酸性熱水で抽出することにより、中性領域の熱水で抽出した場合に比べ、ストリクチニンの抽出率をより一層高めることができ、抽出液中のストリクチニン含有量を有効に高めることができる。
【０００８】
また、本発明者は、市販の茶飲料（ｐＨ５．５〜６．７）をそのまま保管すると茶飲料中のストリクチニンは経時的に分解してしまうが、ｐＨを約４．５以下に保持して保管すればストリクチニンの経時的分解を抑えられることを見出し、かかる知見に基づいて、本発明は、ストリクチニンを含有する茶飲料をｐＨ約４．５以下に保持することを特徴とするストリクチニン含有茶飲料の保管方法、並びに、上記ストリクチニン含有茶飲料の製造方法に「茶抽出液又は茶調合液（茶抽出液及び茶調合液を総称して以下「茶液」という。）をｐＨ約４．５以下に保持して保管する工程」を挿入することを提案する。
このようにストリクチニン含有茶飲料を保管することによりストリクチニンの経時的分解を抑えることができ、抗アレルギー等の薬理効果に特に優れた茶飲料を提供することができる。そればかりか、茶飲料の保管中にストリクチニンが分解してエラグ酸を生じると、このエラグ酸がタンパク質などと結合して二次オリを形成することになるが、茶飲料のｐＨを約４．５以下に保持してストリクチニンの分解を抑えることにより、茶飲料の二次オリの発生を防ぐこともできる。
【０００９】
さらにまた、本発明者は、通常の茶飲料製造工程における茶液、言い換えれば弱酸性又は中性の茶液をレトルト殺菌やＵＨＴ殺菌などの加熱殺菌をすると、茶液中のストリクチニンはエラグ酸に分解するが、加熱殺菌に供する茶液のｐＨを約４．５以下に調整しておけば加熱殺菌によるストリクチニンの分解を抑えられることを見出し、かかる知見に基づき、本発明では、上記ストリクチニン含有茶飲料の製造方法に「茶液をｐＨ約４．５以下に調製した後に加熱殺菌する工程」を挿入することを提案する。
なお、本発明における「加熱殺菌」とは、レトルト殺菌及びＵＨＴ殺菌などの１２０℃前後以上に加熱する加熱殺菌を意味し、９５℃前後以下で行われるホットパックなどは包含していない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１１】
本発明のストリクチニン含有茶飲料は、原料茶を酸性熱水で抽出する抽出工程、抽出液を濾過する濾過工程、抽出液の濃度及びｐＨを調製する調合工程を経て製造することができる。以下、各工程について詳しく説明する。但し、本発明のストリクチニン含有茶飲料の製造方法はこのような方法に限定されるものではなく、工程順序の入れ替え、工程の削除、新たな工程の追加などを適宜行うことが可能である。
【００１２】
「原料茶」としては、茶樹（学名：Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ）から摘採した葉や茎であればその品種、産地、摘採時期、摘採方法、栽培方法などに限らず、どのような茶種も使用することができる。生茶葉等（葉や茎を含む）を原料茶とすることも可能である。また、これらの生茶葉等を蒸すか或いは炒るかなどの手段で酵素活性を停止させる荒茶加工を施した荒茶すなわち不発酵茶であれば、煎茶、釜炒り茶、かぶせ茶、玉露、てん茶、抹茶、番茶、焙じ茶、蒸製玉緑茶、釜炒製玉緑茶等のいずれの種類も原料茶として用いることができる。これらの不発酵茶を二種類以上組合わせてもよいし、香料を入れて作製してもよい。加えて、ジャスミン茶などの弱発酵茶、烏龍茶などの半発酵茶、紅茶などの発酵茶並びにプーアル茶などの後発酵茶のいずれか或いは前記二種類以上の組合わせからなるものを原料茶として用いることもできる。
また、上記の荒茶に現在公知の仕上加工を施して得られる仕上茶も原料茶として用いることができる。
【００１３】
上記の原料茶は、そのまま抽出工程に供することも可能であるが、粉砕や磨砕などによって細かくしてから抽出すればストリクチニンの抽出効率をより一層高めることができる。
【００１４】
「抽出工程」の抽出装置としては、カラムに原料茶を充填し、当該カラムに酸性熱水を順次送水して抽出液を得る抽出装置、或いは、抽出釜に原料茶を充填し所定量の酸性熱水で一定時間浸漬するニーダーと呼ばれる抽出装置など、処理する原料茶の量などに応じて適宜好ましい抽出装置を選択して用いることができる。
原料茶の抽出は、約４５〜１００℃好ましくは約７０〜９０℃、ｐＨ５．５以下例えばｐＨ２．０〜５．５、好ましくはｐＨ約４．５以下例えばｐＨ２．０〜４．５の酸性熱水（ニーダー等の場合には原料茶に対して２０〜５０倍量の酸性熱水）で、約１分〜２０分間、必要に応じて１回〜数回攪拌して常圧で抽出を行うようにすればよい。但し、抽出方法及び抽出条件を特に限定するものではなく、必要に応じて加圧抽出を行ってもよい。
抽出の際に用いる抽出水としては、硬水、軟水、イオン交換水、天然水などを用い、酸性水になるようにｐＨ調製するのが好ましい。その際、使用するｐＨ調製剤としては、リン酸などの鉱酸やアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸、重曹などのいずれか、或いはこれらのうち二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。但し、これらに限定するものではない。
【００１５】
抽出によって得られた抽出液は、必要に応じて５℃〜４０℃程度に冷却するのが好ましい。同時に又はその前後に、必要に応じて、抽出液にアスコルビン酸やアスコルビン酸ナトリウムなどを加えて酸性（ｐＨ約３．０〜４．５）に調製してもよい。抽出液の冷却或いはさらなる酸性調製によって、抽出成分の酸化を防ぐことができると共にストリクチニン濃度を維持することができる。
【００１６】
「濾過工程」では、茶葉や大きな微粉などの抽出残渣を除去する粗濾過を行った後、遠心分離に次いで珪藻土濾過或いは適当な膜濾過を行うようにするのが好ましい。但し、これらの濾過を製造工程中のどこに挿入するかは任意である。
粗濾過は、ネル、ステンレスフィルター、ストレーナーその他抽出残渣を除去するために現在採用されている濾過方法を任意に採用することができる。
遠心分離は、例えば５０００〜１００００ｒｐｍの回転数で行えばよく、遠心分離するに当たっては上記の如く予め抽出液又は調合液を５〜４０℃程度に冷却するのが好ましい。
珪藻土濾過の条件は適宜設定すればよい。なお、珪藻土濾過を行う場合には必ずしも遠心分離を挿入する必要はないが、珪藻土濾過の前工程に遠心分離を挿入することにより珪藻土濾過の負担軽減、例えば透過流量の増加により濾過時間を短縮することができる。
膜濾過としては、微細濾過、精密濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過、電気透析、生物機能性膜などの膜分離を挙げることができ、上記珪藻土濾過などの濾過助剤を用いた濾過と組合わせて行うようにしてもよい。
【００１７】
「調合工程」は、通常の茶飲料の製造方法と同様、水（硬水、軟水、イオン交換水、天然水その他）、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、重曹、糖類、デキストリン、果汁、香料、乳化剤、安定剤、或いはその他の呈味原料などのいずれか或いはこれらのうち二種以上の組合わせを添加し、主にｐＨ調製、濃度調製、味の調整を行うことができる。
茶飲料の香味を考慮すると、茶調合液の濃度（Ｂｒｉｘ値）は０．１〜０．４、特に０．２〜０．３に設定するのが好ましい。
【００１８】
上記工程で得られた茶液は、そのｐＨを４．５以下例えばｐＨ２．０〜４．５に調整した後、容器にホットパックするのが好ましい。
ホットパックの後に追加して或いはその代わりに、レトルト殺菌（１２１℃で７分間加熱）或いはＵＨＴ殺菌（１２０〜１５０℃で１秒〜数十秒保持）などの加熱殺菌をすることも可能である。通常、ｐＨ４．６未満の酸性飲料はレトルト殺菌、ＵＨＴ殺菌などの加熱殺菌はしないが、加熱殺菌する場合であっても加熱殺菌に供する茶液のｐＨを上記範囲に調製することにより、加熱殺菌によるストリクチニンの分解を抑えることができ、加熱殺菌後もストリクチニン濃度をより高く維持することができる。
【００１９】
更に、上記ホットパック後或いは加熱殺菌後は、容器への充填前後を問わず、茶液のｐＨを４．５以下例えばｐＨ２．０〜４．５に保持して保管するのが好ましい。
茶液のｐＨを４．５以下に維持して保管することにより、ストリクチニンの経時的分解を抑えることができ、薬理作用を備えたストリクチニンの含有濃度をより高く維持することができると共に、二次オリの発生を防ぐこともできる。
【００２０】
試験１（沈殿形成試験）
市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを７０℃の蒸留水（ｐＨ５．９）８００ｍｌで３．５分間抽出し、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分）により不溶性画分を除去し、その上清をポリスチレン樹脂（商品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（三菱化学社製））を充填したカラムに通して「ＨＰ−２０非吸着画分」を得た。次いで、蒸留水で当該カラムを洗浄後、８０％メタノール水溶液で溶出し、濃縮乾固して「ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」を得た。
【００２１】
上記で得られた各画分について次のように沈殿形成試験を行った。
「ＨＰ−２０非吸着画分」は、得られた「ＨＰ−２０非吸着画分」Ｂｘ０．４、２００ｍｌ、「ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」は、得られた「ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」０．５ｇ、また、「ＨＰ−２０非吸着画分＋ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」は、「ＨＰ−２０非吸着画分」Ｂｘ０．４、２００ｍｌに「ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」０．５ｇを加えて、それぞれアスコルビン酸、重曹及びイオン交換水を用いてアスコルビン酸５００ｐｐｍ、５００ｍｌ、ｐＨ６．０に調製し、１２１℃、７分間の加熱殺菌後、３７℃で保管して観察した。
上記観察の結果を下記表１に示す。
【００２２】
【表１】
0003583411.tif 000003
【００２３】
「ＨＰ−２０非吸着画分＋ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」のみに二次オリ（フロック状の沈殿）の発生が認められた。このことから、「ＨＰ−２０非吸着画分」「ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」のそれぞれに二次オリの原因となる物質が少なくとも一成分ずつ含まれているものと考えることができた。
【００２４】
試験２（オリの成分分析試験）
本試験の作業手順の概略を図１に示す。
市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを７０℃の蒸留水（ｐＨ５．９）８００ｍｌで３．５分間抽出し、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分）により不溶性画分を除去し、その上清をポリスチレン樹脂（商品名：ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０（三菱化学社製））を充填したカラムに通し、次いで、蒸留水で当該カラムを洗浄後、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％メタノール水溶液で段階的に溶出させた。
【００２５】
得られた各画分を、試験１と同様、「ＨＰ−２０非吸着画分」（Ｂｒｉｘ０．４）に添加して沈殿形成試験を行ったところ、「ＨＰ−２０吸着２０％メタノール画分」及び「ＨＰ−２０吸着４０％メタノール画分」に二次オリ（フロック状の沈殿）の生成が確認された。特に「ＨＰ−２０吸着２０％メタノール画分」での生成量は多かった。
【００２６】
そこで、「ＨＰ−２０吸着２０％メタノール画分」を濃縮乾固後、ＯＤＳ（：逆相系樹脂（商品名：コスモシール７５Ｃ１８ＯＰＮ（ナカライテスク社製））を充填したカラムに通し、次いで、蒸留水で当該カラムを洗浄後、１０％、２０％、３０％メタノール水溶液で段階的に溶出させた。
【００２７】
得られた各画分について、ＨＰ−２０の分画物と同様の沈殿形成試験を行ったところ、「ＯＤＳ吸着１０％メタノール画分」の沈殿生成量が多かったため、この「ＯＤＳ吸着１０％メタノール画分」を更に逆相系カラム（Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ  Ｐｒｅｐ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ＬＣ−９０８  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ（ＪＡＰＡＮ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ  ＣＯ．ＬＴＤ社製）で分取し、メタノール：水：酢酸＝２２：７８：０．１からなる溶媒で得られた６つのピークのそれぞれについて更に同様の沈殿形成試験を行った。
【００２８】
その結果、そのうちの「ピーク３」に沈殿形成が認められたため、「ピーク３」をＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲで同定したところ、ストリクチニンであることが分かった。
なお、「ＨＰ−２０吸着４０％メタノール画分」についても上記同様試験したところ、やはりストリクチニンが含まれていた。また、この画分中のストリクチニン以外の成分は沈殿形成に関与していないことも分かった。
【００２９】
試験３（ストリクチニンの飲料加工特性）
７０℃、８００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ５．９）に市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら３．５分間抽出した。その後、メッシュ（１５０メッシュ）で粗濾過し、室温まで冷却し、ネル（５０μｍ）により濾過した。得られた抽出液にアスコルビン酸０．４ｇを添加し、７０００ｒｐｍ、１０分遠心分離後、その上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、濾液にアスコルビン酸０．６ｇを更に加え、イオン交換水と重曹とを用いてＢｒｉｘ０．３、ｐＨ６．０に調製して「加熱殺菌前調合液」を得た。
この「加熱殺菌前調合液」を９７℃まで加熱した後、缶に充填し、急冷後１２１℃、７分間のレトルト殺菌を行い、その後冷却して「加熱殺菌後調合液」を得た。
得られた「加熱殺菌前調合液」及び「加熱殺菌後調合液」を攪拌して０．４５μｍフィルターで処理した後、下記条件（ＨＰＬＣ条件・表２）の下で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にてストリクチニン濃度を測定した。
【００３０】
（ＨＰＬＣ条件）
装置：日立Ｄ−７０００アドバンストＨＰＬＣ、Ｄ−７０００型アドバンストＨＰＬＣシステムマネージャー
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ  φ４．６×（３０＋２５０）ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０
移動相Ａ：１５％ＭｅｔＯＨ（０．１％リン酸）
移動相Ｂ：４５％ＭｅｔＯＨ（０．１％リン酸）
【００３１】
【表２】
0003583411.tif 000004
【００３２】
サンプルは５μＬインジェクションし、１９ｍｉｎ付近に現れるピークを、試験２で抽出・精製したストリクチニンを標品として絶対検量線法により定量した。結果を下記表３に示す。
【００３３】
【表３】
0003583411.tif 000005
【００３４】
この結果から、ストリクチニンは加熱殺菌によって分解又は沈殿したものと考えることができた。また、茶飲料の製造工程で一般的に行われている加熱殺菌によって飲料中のストリクチニンはほぼ完全に分解するため（ＵＨＴ殺菌の場合には若干分解されないものがあった。）、通常市販されている茶飲料にはストリクチニンはほとんど含まれないことが分かった。
【００３５】
試験４（ストリクチニンの加熱分解試験）
精製ストリクチニン５ｍｇとアスコルビン酸２５０ｍｇとをイオン交換水に溶かし、イオン交換水と重曹とを用いてｐＨ６．０、５００ｍｌに調製し、この調製液を１２１℃、７分間のレトルト殺菌に供した。
そして、「加熱殺菌前調製液」及び「加熱殺菌後調製液」のそれぞれについて、試験３と同様に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけたところ４０分付近にピークが現れた。このピークをＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲで同定したところ、エラグ酸であることが分かった。結果を図２に示す。
この結果、ストリクチニンをレトルト殺菌すると、エラグ酸を生成するという結果を得ることができた。
【００３６】
また、精製ストリクチニン５ｍｇを試験１で得た「ＨＰ−２０非吸着画分」（Ｂｒｉｘ０．４）２００ｍｌに添加し、イオン交換水と重曹とを用いてｐＨ６．０、５００ｍｌに調製した後、この調製液を１２１℃、７分間のレトルト殺菌に供し、上記同様、「加熱殺菌前調製液」及び「加熱殺菌後調製液」のそれぞれについてＨＰＬＣでストリクチニン及びエラグ酸を測定した。この結果を図３に示す。ところが、この場合には「加熱殺菌後調製液」中にエラグ酸はほとんど検出されなかった。これより、茶飲料を加熱殺菌すると、飲料中のストリクチニンが分解してエラグ酸を生成し、このエラグ酸が「ＨＰ−２０非吸着画分」に含まれる成分と結合して沈殿すなわち二次オリを形成するものと考えることができた。
【００３７】
試験５（抽出時ｐＨの比較試験）
酸性水溶液又は塩基性水溶液で茶を抽出した場合のストリクチニン抽出量を比較した。
【００３８】
７０℃、８００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ５．９）、酸性水溶液又は塩基性水溶液を用意し、これに市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら３．５分間抽出した。その後、メッシュ（１５０メッシュ）で粗濾過し、室温まで冷却し、ネル（５０μｍ）により濾過した。得られた塩基性抽出液及びイオン交換水抽出液にアスコルビン酸０．５ｇを加え、酸性抽出液は無添加のまま７０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離にかけ、その上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、濾液にアスコルビン酸０．５ｇを加え、更にイオン交換水を用いて最終液量２０００ｍｌに調製して調合液を得、当該調合液のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで定量した（表４）。
【００３９】
なお、上記酸性水溶液は、イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌにアスコルビン酸０．５ｇを加えてｐＨ３．４に調製し、塩基性水溶液は、イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌに重曹０．５ｇを加えてｐＨ８．５に調製した。
【００４０】
【表４】
0003583411.tif 000006
【００４１】
この結果、酸性抽出するとストリクチニン抽出量が多くなることが分かった。
【００４２】
試験６（酸性抽出でのストリクチニン抽出量の比較）
イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌにアスコルビン酸０．５ｇを添加してｐＨ３．４とし、９０℃、７０℃、５０℃、３０℃の各温度で１０分間抽出し、試験５の酸性水溶液と同様に調製した調合液を得、当該調合液のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで定量した（表５）。
【００４３】
【表５】
0003583411.tif 000007
【００４４】
この結果、７０℃以上でストリクチニンの抽出量が多いことが分かった。
【００４５】
試験７（抽出時間の比較）
イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌにアスコルビン酸０．５ｇを添加してｐＨ３．４、抽出時間を３分、５分又は２０分間とし、試験５の酸性水溶液と同様に調製した調合液を得、当該調合液のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで定量した（表６）。
【００４６】
【表６】
0003583411.tif 000008
【００４７】
試験６に示した７０℃、１０分の抽出と、試験７に示した７０℃、２０分での抽出は、ストリクチニン濃度の比較で差は見られなかった。従って、試験５から試験７よりストリクチニン抽出量を多くするには７０℃以上、ｐＨ４．５以下の酸性水溶液で５分以上抽出するのが好ましいと考えられる。
【００４８】
試験８（エラグ酸添加試験）
試験１で得た「ＨＰ−２０非吸着画分」にエラグ酸を添加して沈殿形成を確認した。
【００４９】
試験１で得た「ＨＰ−２０非吸着画分」（Ｂｒｉｘ０．４）２００ｍｌに市販エラグ酸（シグマ社製）２．１ｍｇ及びアスコルビン酸２５０ｍｇを添加し、イオン交換水と重曹とを用いてｐＨ６．０、５００ｍｌに調製し、この調製液を１２１℃、７分間のレトルト殺菌に供し、得られた「エラグ酸＋ＨＰ−２０非吸着画分」溶液を３７℃で保管し経時変化を観察した。
また、市販エラグ酸（シグマ社製）２．１ｍｇ及びアスコルビン酸２５０ｍｇをイオン交換水に添加し、イオン交換水と重曹とを用いてｐＨ６．０、５００ｍｌに調製し、この調製液を１２１℃、７分間のレトルト殺菌に供し、得られた「エラグ酸のみ」溶液を上記同様に観察した。
この結果を下記表７に示す。
【００５０】
【表７】
0003583411.tif 000009
【００５１】
上記の試験結果を総合して考察すると、茶抽出液中のストリクチニンは加熱殺菌によって分解されてエラグ酸を生成し、このエラグ酸が「ＨＰ−２０非吸着画分」に含まれる成分と結合することにより茶飲料でフロック状の沈殿物すなわち二次オリを生成することが解明された。
【００５２】
試験９（「ＨＰ−２０非吸着画分」中の沈殿生成に関与する成分の分析）
茶飲料で生成したフロック状の沈殿物（オリ）を塩酸−メタノール処理し、当該沈殿物に含まれるエラグ酸を溶解させて当該沈殿物の成分分析を行った。
【００５３】
試験１の方法で製造した茶飲料（「ＨＰ−２０非吸着画分＋ＨＰ−２０吸着８０％メタノール画分」）を５日間、３７℃にて保管して沈殿物を生成させ、ＭＳｆｉｌｔｅｒ（０．４５μｍ）を用いて当該沈殿物を回収した。次いで当該ｆｉｌｔｅｒをメタノールで洗浄後、遠心分離にかけて沈殿物を回収し、更に１％塩酸−メタノールで洗浄後、再び遠心分離にかけ風乾した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで沈殿物に含まれる成分を分析した結果、当該沈殿物中にはタンパク質が多く含まれることが判明した。また、当該沈殿物中の糖質分析を行ったところ、糖質はほとんど検出されなかった。
【００５５】
試験１０（アミノ酸、タンパク質を用いたモデル試験）
試験管にエラグ酸１ｍｇ、下記表８に示す各アミノ酸標品（協和発酵社製）及び牛血清アルビミン（シグマ社製）をそれぞれ表８に示す添加量にて投入し、イオン交換水を加えて１０ｍｌにした。その後、１２１℃、１５分の加熱殺菌を行い、室温にて保管して観察した。
また、コントロール（エラグ酸１ｍｇにイオン交換水を加えて１０ｍｌ溶解したもの）も同様に加熱殺菌及び保管して観察した。
【００５６】
【表８】
0003583411.tif 000010
【００５７】
各アミノ酸標品は、室温にて１８日間保管するとフロック状の沈殿が観察された。
加熱殺菌前の牛血清アルブミン添加溶液はフロック状の沈殿を生成することはなかったが、加熱殺菌した当該溶液にはフロック状の沈殿の生成が見られた。
以上の結果から、エラグ酸と結合してフロック状の沈殿（二次オリ）を形成する物質は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質であり、これらの成分が加熱処理或いは長期保存によって変性するためフロック状の沈殿を形成するものと考えることができた。
【００５８】
試験１１（茶中ストリクチニン濃度とオリ形成の相関性１）
１４種類の茶葉（静岡産荒茶）のそれぞれについてストリクチニン含有濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで測定した。
【００５９】
原料茶葉中のストリクチニン濃度を測定するために、茶のタンニン定量における公定分析法の測定用試料溶液調製法（農林水産省野菜・茶業試験場「茶の分析法」茶業研究報告  第７１号ｐ５２（１９９０））で採用されている「熱水抽出法」によって測定用試料溶液を調製する一方、当該熱水抽出法を酸性熱水抽出に変更した「酸性熱水抽出法（本発明独自の方法）」によっても測定用試料溶液を調製した。
【００６０】
熱水抽出法では、緑茶のミル粉砕物０．５ｇを１００ｍｌメスフラスコに秤量し、これを、沸騰イオン交換水約８０ｍｌ（ｐＨ５．９）で１０分間、３分毎に攪拌しながら抽出して「熱水抽出液」を得た。
【００６１】
他方、酸性熱水抽出法では、緑茶のミル粉砕物０．５ｇを１００ｍｌメスフラスコに秤量し、この緑茶粉砕物を沸騰イオン交換水に０．１％リン酸を添加した水溶液約８０ｍｌ（ｐＨ２．０）で１０分間、３分毎に攪拌しながら抽出して「酸性抽出液」を得た。
【００６２】
そして、「熱水抽出液」「酸性抽出液」をそれぞれ冷却し、「熱水抽出液」にはイオン交換水（ｐＨ５．９）を加え、「酸性抽出液」には前記リン酸添加水溶液を加え、それぞれ全量を１００ｍｌとし、これをフィルター（アドバンテック社製Ｎｏ．２フィルター使用）で濾過した後、試験３と同様にＨＰＬＣでストリクチニン濃度を測定した。結果は下記表９に示す。
【００６３】
また、上記の各茶葉（静岡産荒茶）２０ｇを、それぞれ７０℃、８００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ５．９）に添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら３．５分間抽出を行い、得られた抽出液をメッシュ（１５０メッシュ）で濾過し、室温まで急冷した後ネル濾過（５０μｍ）した。この抽出液にアスコルビン酸０．４ｇを添加し、これを７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、アスコルビン酸を加えてイオン交換水と重曹とによりアスコルビン酸５００ｐｐｍ、ｐＨ６．０、Ｂｒｉｘ０．１（茶固形量換算０．０３）〜０．３（茶固形量換算０．２３）に調製し、この調合液中のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで測定した。
そして更に、オリ観察用に上記調合液を９７℃まで加熱して耐熱広口ビンに充填した後、急冷し、１２１℃、７分の条件でレトルト殺菌を行い、冷却後に３７℃で保管し、経時変化を観察した。結果は下記表９〜表１１、図４及び図５に示した。
【００６４】
なお、表９中の茶固形量中のストリクチニン固形量比とは、調合液中の全茶固形分に対するストリクチニンの含有割合（％）を示した値である。
表１０は、表９のデータを熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度が高い順に並べ替えた表であり、表１１は、表９のデータを酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度が高い順に並べ替えた表である。
図４は、横軸：熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上に二次オリ発生の有無をプロットしたグラフである。
図５は、横軸：酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上に二次オリ発生の有無をプロットした図である。
【００６５】
【表９】
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【００６６】
【表１０】
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【００６７】
【表１１】
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【００６８】
茶のタンニン定量の公定法で採用されている熱水抽出法ではストリクチニンの抽出量が少なかったが、酸性熱水抽出法によればストリクチニンの抽出量を有効に増加させることができた。しかも、図４及び図５を見ると明らかなように、酸性熱水抽出法による方が二次オリ発生との相関がより一層大きいことが判明した。このような点からすると、原料茶葉中のストリクチニン含有濃度の測定には、酸性熱水抽出法、好ましくはｐＨ２〜４、７０〜１００℃で行う酸性熱水抽出法を採用するのが好ましいと考えることができる。
【００６９】
表１０及び図４を見ると、熱水抽出法によって測定した茶中ストリクチニン含有濃度が０．１４％以下であれば二次オリをほとんど発生せず、更に茶中ストリクチニン含有濃度が０．１０％以下になると二次オリを全く生じないことが分かった。
表１１及び図５より、酸性抽出法によって測定した茶中ストリクチニン含有濃度が０．４３％以下であれば二次オリをほとんど発生せず、更に茶中ストリクチニン含有濃度が０．３７％以下になると二次オリを全く生じないことが分かった。
【００７０】
表１１より、調合液中のストリクチニン含有量が６ｐｐｍ以下、より確実には５ｐｐｍ以下であれば二次オリが発生しないことが判明した。
茶固形分に対するストリクチニン含有量比という観点から考察すると、緑茶飲料の場合、調合液濃度（Ｂｒｉｘ）約０．２（茶固形量換算０．１３）〜０．３（茶固形量換算０．２３）が一般的であるから、茶抽出液又は茶調合液中の茶固形分に対するストリクチニン含有量が約０．２〜０．５％、特に約０．２〜０．４％以下となるように管理すれば二次オリの発生を無くすことができる。詳しく言えば、調合液の茶固形分濃度（Ｂｒｉｘ）によって指標とする茶固形分に対するストリクチニン含有量の上限値を調整するのが好ましく、茶抽出液又は茶調合液の茶固形量換算濃度（Ｂｒｉｘ）が０．２３の場合には０．２７％、０．１８の場合には０．３４％、０．１３の場合には０．４８％を茶固形分に対するストリクチニン含有量比の上限とするのが好ましい。
【００７１】
試験１２（茶中ストリクチニン濃度とオリ形成の相関性２）
１３種類の中国産釜炒り茶（ジャスミン茶）それぞれについて、ストリクチニン含有濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで測定し、各茶葉毎に各段階でのストリクチニン濃度を観察結果と共に下記表１２に示した。
【００７２】
また、上記１３種類の各茶葉（中国産釜炒り茶葉（ジャスミン茶））４０ｇを、それぞれ８０℃、１０００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ５．９）に添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら３．５分間抽出を行い、得られた抽出液をメッシュ（１５０メッシュ）で粗濾過し、室温まで急冷した後ネル濾過（５０μｍ）した。
これを７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、アスコルビン酸を加えてイオン交換水と重曹とによりアスコルビン酸５００ｐｐｍ、ｐＨ６．０、Ｂｒｉｘ０．１（茶固形量換算０．０３）〜０．３（茶固形量換算０．２３）に調製し、この調合液中のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで測定した。
そして更に、オリ観察用に調合液を９７℃まで加熱して耐熱広口ビンに充填した後、急冷し、１２１℃、７分の条件でレトルト殺菌を行い、冷却後に３７℃で保管し、経時変化を観察した。結果は下記表１２〜１４、図６及び図７に示した。
【００７３】
なお、表１２中の茶固形量中のストリクチニン固形量比とは、調合液中の全茶固形分に対するストリクチニンの含有割合（％）を示した値である。
表１３は、表１２のデータを熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度が高い順に並べ替えた表であり、表１４は、表１２のデータを酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度が高い順に並べ替えた表である。
図６は、横軸：熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットしたグラフである。
図７は、横軸：酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットした図である。
【００７４】
【表１２】
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【００７５】
【表１３】
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【００７６】
【表１４】
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【００７７】
この結果、ジャスミン茶の場合も、茶のタンニン定量の公定法で採用されている熱水抽出法ではストリクチニンの抽出量が少なかったが、酸性熱水抽出法によればストリクチニンの抽出量を有効に増加させることができた。しかも、酸性熱水抽出法による方が二次オリ発生との相関がより一層大きいことが判明した。このような点からすると、ジャスミン茶の場合においても、原料茶葉中のストリクチニン含有濃度の測定は酸性熱水抽出法、例えばｐＨ約４．５以下、約６０〜１００℃、約５〜６０分間、好ましくはｐＨ２．０〜４．０、７０〜１００℃の酸性熱水で、１０〜３０分間抽出を行う酸性熱水抽出法を採用するのが好ましいと考えることができる。
【００７８】
表１３及び図６を見ると、熱水抽出法によって測定した茶中ストリクチニン含有濃度が０．４９％以下であれば二次オリをほとんど発生せず、更に茶中ストリクチニン含有濃度が０．３３％以下になると二次オリを全く生じないことが分かった。
表１４及び図７より、酸性抽出法によって測定した茶中ストリクチニン含有濃度が０．９０％以下であれば二次オリをほとんど発生せず、更に茶中ストリクチニン含有濃度が０．６１％以下になると二次オリを全く生じないことが分かった。
【００７９】
表１４より、調合液中のストリクチニン含有量が１４ｐｐｍ以下、より確実には１３ｐｐｍ以下であれば二次オリが発生しないことが判明した。
茶固形分に対するストリクチニン含有量比という観点から考察すると、ジャスミン茶飲料の場合、調合液濃度（Ｂｒｉｘ）約０．２（茶固形量換算０．１３）〜０．３（茶固形量換算０．２３）が一般的であるから、茶抽出液又は茶調合液中の茶固形分に対するストリクチニン含有量が約０．５〜１．１％、特に約０．６〜０．８％以下となるように管理すれば二次オリの発生を無くすことができる。詳しく言えば、調合液の茶固形分濃度（Ｂｒｉｘ）によって指標とする茶固形分に対するストリクチニン含有量の上限値を調整するのが好ましい。茶抽出液又は茶調合液の茶固形量換算濃度（Ｂｒｉｘ）が０．２３の場合には０．６２％、０．１８の場合には０．８０％、０．１３の場合には１．１１％を茶固形分に対するストリクチニン含有量比の上限とするのが好ましい。
【００８０】
試験１３（調合液ｐＨのストリクチニン濃度比較試験）
イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌにアスコルビン酸０．５ｇを添加してｐＨ３．４とし、７０℃に調製した酸性水溶液に市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら１０分間抽出した。その後、メッシュ（１５０メッシュ）で濾過し、室温まで冷却し、ネル（５０μｍ）により濾過した。得られた抽出液を７０００ｒｐｍ、１０分遠心分離後、その上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、この濾液をアスコルビン酸、重曹、イオン交換水を用いて各種ｐＨに調製して液量２０００ｍｌとした後、それぞれの調合液を１２１℃、７分間のレトルト殺菌し、その後３７℃で保管した。そして、各調合液のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで定量した。
【００８１】
【表１５】
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【００８２】
表１５を見ると、調合液のｐＨが約６（正確には６．００）以上の場合、レトルト殺菌によって調合液中のストリクチニンは略全てが分解したのに対し、ｐＨが約５（正確には５．０４）の場合にはレトルト殺菌前の約２０％以上のストリクチニンが保持され、ｐＨが約４．５（正確には４．４３）の場合には約６０％以上のストリクチニンが保持され、更にｐＨが約４．０（正確には４．０３）の場合には約８５％以上のストリクチニンが保持された。これより、レトルト殺菌に供する茶液をｐＨ約４．５以下、好ましくは約４．０以下に調製することにより、レトルト殺菌による茶液中のストリクチニンの分解を抑えてストリクチニン含有量を高く保持できることが分かった。
【００８３】
試験１４（調合液ｐＨのストリクチニン濃度比較試験）
イオン交換水（ｐＨ５．９）８００ｍｌにアスコルビン酸０．５ｇを添加してｐＨ３．４とし、７０℃に調製した酸性水溶液に市販の緑茶（仕上茶：伊藤園社製「おーいお茶」高地初摘み１５００）２０ｇを添加し、攪拌した後１分毎に攪拌しながら１０分間抽出した。その後、メッシュ（１５０メッシュ）で濾過し、室温まで冷却し、ネル（５０μｍ）により濾過した。得られた抽出液を７０００ｒｐｍ、１０分遠心分離後、その上清を微細濾過（アドバンテック社製１μｍＭＦ膜）し、この濾液をアスコルビン酸、重曹、イオン交換水を用いて各種ｐＨに調製して液量２０００ｍｌとした後、それぞれの調合液を９０℃でホットパックし、調合液のストリクチニン濃度を試験３と同様にＨＰＬＣで定量した。
【００８４】
【表１６】
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【００８５】
表１６を見ると、茶液のｐＨが約６（正確には６．００）以上の場合には、ホットパックによってストリクチニン濃度が低下するのに対し、ｐＨが約５（正確には５．０４）以下であればホットパックによる影響はほとんど無いことも分かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験２（オリの成分分析試験）の作業手順の概略を示した図である。
【図２】試験４（ストリクチニンの加熱分解試験）において、精製ストリクチニン溶液をレトルト殺菌に供し、「加熱殺菌前調製液」及び「加熱殺菌後調製液」のストリクチニン含有量及びエラグ酸含有量をＨＰＬＣで測定した結果を示すグラフである。
【図３】試験４（ストリクチニンの加熱分解試験）において、試験１で得た「ＨＰ−２０非吸着画分」に精製ストリクチニンを添加した調製液をレトルト殺菌に供し、「加熱殺菌前調製液」及び「加熱殺菌後調製液」のストリクチニン含有量及びエラグ酸含有量をＨＰＬＣで測定した結果を示すグラフである。
【図４】試験１１（茶葉中ストリクチニン濃度とオリ形成の相関性１）において、横軸：熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットしたグラフである。
【図５】試験１１において、横軸：酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットしたグラフである。
【図６】試験１２（茶葉中ストリクチニン濃度とオリ形成の相関性２）において、横軸：熱水抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットしたグラフである。
【図７】試験１２において、横軸：酸性抽出による茶葉中ストリクチニン濃度（重量％）、縦軸：Ｂｒｉｘ０．３（茶固形量換算０．２３）に調製した場合の調合液中ストリクチニン濃度（ｐｐｍ）からなる座標上にオリ発生の有無をプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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