(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コッコミクサ藻体を、縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する培養法で、コッコミクサ藻体を、ＰＣＶ濃度０．９〜１．７ｍｌ／ｌの割合で接種して、水槽の前・後面の何れかの１面から、照度３０００〜９０００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ｍｌ／ｌまで培養する第一工程と、該ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ｍｌ／ｌの培養液に、水槽の前・後面の２面から、照度５５００〜１０５００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度が５．０〜７．０ｍｌ／ｌまで培養する第二工程と、該５．０〜７．０ｍｌ／ｌの培養液に、水槽の前・後面の２面から、照度６０００〜１７５００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度１０．０〜１１．０ｍｌ／ｌまで培養する第三工程とから成ることを特徴とする多糖体を生産させるコッコミクサ藻体の培養法。
【請求項２】
コッコミクサ藻体を、縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する培養法で、コッコミクサ藻体を、ＰＣＶ濃度０．９〜１．７ｍｌ／ｌの割合で接種して、水槽の前・後面と左・右側面との何れかの２面から、照度３０００〜９０００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ｍｌ／ｌまで培養する第一工程と、該ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ｍｌ／ｌの培養液に、水槽の前・後面と左・右側面との４面から、照度５５００〜１０５００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度が５．０〜７．０ｍｌ／ｌまで培養する第二工程と、該５．０〜７．０ｍｌ／ｌの培養液に、前・後面と左・右側面との４面から、照度６０００〜１７５００ｌｘの光を照射して、ＰＣＶ濃度１０．０〜１１．０ｍｌ／ｌまで培養する第三工程とから成ることを特徴とする多糖体を生産させるコッコミクサ藻体の培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、緑藻綱（Chlorophyceae)、クロロコックム目（Chlorococcales）に属するコッコミクサ藻体の培養法に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、エイコサペンタエン酸を含むナノンクロロプシス藻体を、透明な材質からなる縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、１０〜３５℃下で，炭酸ガス含有空気を通気しつつ、水槽の前・後の幅広面の何れかの片面から光を照射し培養し、次いで水槽の前後両面から光の照度を変えて照射し培養し、さらに、水槽の前後両面から光の照度変えて照射して、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を増産させるナンノクロロプシス藻体の培養法は、特開平９−２５２７６１号公報に開示されており公知である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コッコミクサ藻体を、無機液体接地に接種し、培養して、コッコミクサ藻体内に生理活性効果を持つ多糖体を増産させるコッコミクサ藻体の培養法を提供することを課題としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透明体からなる縦型の偏平形状の水槽中の無機液体培地に、コッコミクサ藻体を接種して、該水槽の前・後面の幅広の１面もしくは２面または前・後面と左・右側面との２面もしくは４面に、白色・昼色蛍光灯または白熱灯の光を照射することによりコッコミクサ藻体中に多糖体類を生産させるコッコミクサ藻体の培養法を提供するにある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、コッコミクサ藻体を、縦型偏平水槽中の無機液体培地（pH５．５〜pH８．０）に接種して、培養温度を５〜３０℃とし、光照射時間を１８時間／日とし、炭酸ガスを０．５〜５％含む空気を、０．２５〜５０ l／min の割合で通気しつつ培養する培養法で、無機液体培地にコツコミクサ藻体を濃度０．９〜１．７ml／l ＰＣＶの割合で接種して、該水槽の前・後面の何れかの１面、もしくは２面、または水槽の前・後面と左・右側面の何れか（前面と右面など）の２面、もしくは４面から照度３０００〜９０００ lx の光照射して、ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ml／l まで培養する第一工程と、該ＰＣＶ濃度１．８〜４．９ml／l の培養液に、水槽の前・後面の２面、または水槽の前・後面と左・右側面の４面から照度５５００〜１０５００ lx の光照射して、ＰＣＶ濃度５．０〜７．０ml／l まで培養する第二工程と、該ＰＣＶ濃度５．０〜７．０ml／l の培養液に、水槽の前・後面の２面、または水槽の前・後面と左・右側面との４面のから照度６０００〜１７５００ lx の光照射して、ＰＣＶ濃度が１０．０〜１１．０ml／l ま培養する第三工程とから成る多糖類を増産させることから成るコッコミクサ藻体の培養法である。
【０００６】
本発明で使用する藻体は、緑色植物門(Chlorohta) 、緑藻綱(Chlorophyeae)、クロロコックム目(Chlorococcales)、クロロコックム科(Chlorococcaceae) に属するコッコミクサ・ミノール(Coccomyxa minor) 、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス（Coccomyxa gloeobotrydiformis）である。
【０００７】
本発明の無機液体培地は、培地１００ lに対して、ＫＮＯ3 が２００〜３００ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 が１００〜１６０ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが２００〜３００ｇ、ＥＤＴＡが０．５〜１ｇ、クエン酸第二鉄が０．４９〜２．４５ｇ、Ｈ3 ＢＯ3 が０．１１〜０．５５ｇ、ＭｏＯ3 が３０〜１５０mg、ＣｏＣｌ2 が１０〜５０mg、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏが１０〜５０mg、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが１０〜５０mgの割合で含有されて成る無機液体培地を意味する。
【０００８】
本発明で、培養に使用する水槽は、高さが１．５〜２．５ｍ、前・後の表裏面の幅が０．５〜２．５ｍ、左・右の側面の幅が７〜３０cmで、底部が培養液排出管が設けられた船底形状に形成されて成る、ガラス製・アクリル製の縦型偏平水槽で、上端の開口部には、周側壁に適数個の小通気孔が設けられ、先端開口部が閉鎖された炭酸ガス含有空気の通気管が、その先端部から挿入される縦型偏平形状の水槽である。
【０００９】
本発明で、第一・二・三の各工程を通じて、培養温度を５〜３０℃とし、炭酸ガスを含む空気の炭酸ガス含有量を０．５〜５％とし、該炭酸ガス含有空気の通気量を１０〜５０ml／l としたのは、コッコミクサ藻体が、５℃未満では殆ど増殖せず、３０℃を超えると藻体が凝集し増殖できないからてあり、また炭酸ガス含有空気の炭酸ガス含量量が０．５％未満では少なすぎ、５％を超えては藻体が凝集し増殖ができず、かつ該炭酸ガス含有空気の通気量が、１０ml／min 未満では藻体が水槽低部に溜まり増殖できず、５０ml／min を超えると水槽内の対流圧により藻体が潰れてしまい、増殖できないからである。そして、上記条件での、白熱・昼色蛍光灯、または白熱灯の光照射の時間は、１８〜２４時間／日範囲内で照射するのが好ましいのである。
【００１０】
縦型偏平水槽内の無機液体培地に、第一工程で、コッコミクサ藻体の培養開始濃度として、０．９〜１．７ml／l ＰＣＶ範囲を接種して、白色・昼色蛍光灯または白熱灯の光の照度を３０００〜９０００ lx 範囲として、水槽の前・後面の何れかの片面、または水槽の前・後面と左・右面との何れかの２面（例えば、前面と左側面の２面）から照射するのは、良好に培養することができ、濃度１．８〜４．９ml／l ＰＣＶ範囲となったとき照射を止めるのは、これ以上照射培養しても増殖が望めないからであり、第二工程で、上記濃度１．８〜４．９ml／l ＰＣＶの培養液に、照度を５５００〜１０５００ lx 範囲として、水槽の前・後面の両面、または水槽の前・後面と左・右面との４面から照射するのは、良好に培養ができて、濃度５．０〜７．０ml／l ＰＣＶ範囲で照射を止めるのは、これ以上照射培養しても、増殖が望めないからであり、第三工程で、上記濃度５．０〜７．０ml／l ＰＣＶの培養液に、照度を５０００〜１７５００ lx 範囲として、水槽の前・後面の両面、または左・右面との４面から照射して、濃度１０．０〜１１．０ml／l ＰＣＶ範囲になるまで好適に培養することができるのである。
【００１１】
本発明で、上記のように、第一工程で、前・後面の何れかの片面（１面）に、第二・三工程で、前・後面の２面に光を照射し、かつ第三工程で、濃度１０．０〜１１．０ml／l ＰＣＶまで光を照射するのは、側面幅の長さが７〜１７cmの縦型偏平水槽を使用した場合、有効に培養できるからであり、また、第一工程で、前・後面と左・右面との何れかの２面（前・左面、後・右側面など）に、第二・三工程で、前・後面と左・右側面との４面に光を照射し、かつ第三工程で、濃度１０．０〜１１．０ＰＣＶにまで照射したのは、側面の幅が１８〜３０cmの縦型偏平水槽を使用した場合に有効であるからである。
【００１２】
【実施例１】
培地１００  ｌに対して、ＫＮＯ3 が２５０ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 が１３５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが２５０ｇ、ＥＤＴＡが０．７ｇ、クエン酸第二鉄が０．９ｇ、Ｈ3 ＢＯ3 が０．１１ｇ、ＭｏＯ3 が３０ｍｇ、ＣｏＣｌ2 が１０ｍｇ、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏが１０ｍｇ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが１０ｍｇを含む無機液体培地（ｐＨ７．５）１００  ｌを、高さ２ｍ、前・後面の幅１ｍ、左・右側面の幅１３ｃｍのアクリル製の縦型偏平薄型水槽に入れて、培養温度２５℃とし、照射時間１８時間／日として、炭酸ガス１％を含む空気を２０  ｌ／ｍｉｎの割合で通気しつつ、第一工程で、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス藻体を、ＰＣＶ濃度１．２ｍｌ／ｌの割合で接種して、水槽の前面に６０００ｌｘの白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が２．２ｍｌ／ｌとなった後、第二工程で、水槽の前後面の両面に１０５００ｌｘの白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が５．５ｍｌ／ｌとなった後、第三工程で、水槽の前・後面の両面に１００００ｌｘの白色蛍光灯を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が１０．６ｍｌ／ｌとなった時、培養を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（１５０００回転／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから、凍結乾燥して、乾燥藻体２０３ｇを得た。とのご指摘に対して、本出願人は、明細書００１２欄の実施例１の第二工程について詳査したところ、照度が「１５０００ｌｘ」と記載されていることがわかりましたので、実施例１の第二工程で「１５０００ｌｘ」を「１０５００ｌｘ」と補正して、実施例１の第二工程の照度を、請求項１に記載の「５５００〜１０５００ｌｘ」の照度範囲内に致しました。これにより本願発明は、特許請求の範囲と明細書の対応関係が明瞭になったものと思料致します。
【００１３】
得られた乾燥藻体は、塩酸で加水分解した後、ピリジンと無水酢酸とを加えてアセチル化した後、ガスクロマトグラフィー分析法で定量した結果、３２．２ｇの多糖体を得た。
【００１４】
【実施例２】
実施例１記載と同様に、無機液体培地１００ lを縦型偏平水槽に入れ、培養温度を３０℃、照射時間を１８時間／日とし、炭酸ガス１％含有空気の通気を２０l／min の割合で通気しながら、第一工程として、培地にコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミスを、ＰＣＶ濃度１．２ml／l の割合で接種し、水槽の前面に６２５０ lx の昼色蛍光灯を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が２．１ml／l となってから、第二工程として、水槽の前後両面に８０００ lx の昼色蛍光灯を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が５．４ml／l となってから、第三工程として、水槽の前後両面から１００００ lx の昼色蛍光灯を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が１０．３ml／l となったときに、培養を止めて得られた１００ lの培養液から分別して得た７０ lの培養液をシャープレス遠心分離機（１５００回転／分）で分別した藻体を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して得られた１２８ｇの乾燥藻体中の多糖体を、実施例１記載と同様に定量した結果、２１．９ｇの多糖体を得た。
【００１５】
上記培養液１００ lから７０ lを分別した残余の、ＰＣＶ濃度１０．３ml／l の３０ lに、実施例１記載と同様に、無機液体培地を加え、縦型偏平水槽に入れて、実施例２の第三工程と同様に、１００００ lx の昼色蛍光灯を１８時間／日照射しつつ培養することを繰り返して培養して得た培養液をシャープレス遠心分離機（１５０００回転／分）で分別した藻体を洗浄し、凍結乾燥した乾燥藻体中の多糖体を定量した結果、７８．２ｇであった。
【００１６】
【実施例３】
高さ１．５ｍ、前・後面の幅０．５ｍ、左・右側面の幅７cmのアクリル製の縦型偏平水槽中に、５０ lの無機液体培地（pH５．５）を入れ、培養温度５℃とし、照射時間を１８時間／日として、炭酸ガス０．５％含有空気を１０ l／min の割合で通気しつつ、第一工程で、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミスを濃度０．９ml／l の割合で接種し、水槽の前面に、６０００ lx の白色蛍光灯を照射し、培養して、濃度が１．８ml／l となった後、第二工程で、水槽の前・後の両面に、５５００ lx の白色蛍光灯を照射し、培養して、濃度が５．０ml／l となった後、第三工程で、水槽の前・後の両面に、６０００ lx の白色蛍光灯を照射し、培養して、濃度が１０．０ml／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシヤープレス遠心分離機（１５０００回転／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して、９７ｇの乾燥藻体を得た。得られた乾燥藻体中の多糖体を、実施例１と同様にして定量した結果、１７．１ｇであった。
【００１７】
【実施例４】
高さが２ｍ、前・後面の幅が２ｍ、左・右側面の幅が１３cmのアクリル製の縦型偏平水槽に、培地２００ lに対して、ＫＮＯ3 が５００ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 が２７０ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ4 が５００ｇ、ＥＤＡＴが１．４ｇ、クエン酸第二鉄が０．９８ｇ、Ｈ3 ＢＯ3 が０．２２ｇ、ＭｏＯ3 が６０mg、ＣｏＣｌ2 が２０mg、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏが２０mg、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが２０mgを含む無機液体培地（pH７．５）２００ lを入れ、培養温度２３℃とし、照射時間を１８時間／日として、炭酸ガス１％含有空気を５０ l／min の割合で通気しつつ、第一工程として、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミスを、ＰＣＶ濃度１．３ml／l の割合で接種して、水槽の前面片面から６０００ lx の白熱蛍光灯の光を照射し、ＰＣＶ濃度が２．３ml／l となった後、第二工程として、水槽の前・後の両面から７５００lxの白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が５．０ml／l となった後、第三工程として、水槽の前・後の両面に１００００lx の白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が、１０．０ml／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（１５０００回転／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、３９５ｇの乾燥藻体を得た。得られた乾燥藻体中の多糖体を、実施例１と同様にして定量した結果、７２ｇであった。
【００１８】
【実施例５】
高さ２ｍ、前・後面の幅２ｍ、左・右側面２６ｃｍのアクリル製の縦型偏平水槽に、培地４００ lに、ＫＮＯ3 が１０００ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 が５４０ｇ、ＭｇＳ０4 ・７Ｈ2 Ｏが１０００ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 が５４０ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが１０００ｇ、ＥＤＡＴが２．８ｇ、クエン酸第二鉄が１．９６ｇ、Ｈ3 ＢＯ3 が０．４４ｇ、ＭｏＯ3 が１２０mg、ＣｏＣｌ2 が４０mg、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏが４０mg、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが４０mgを含む無機液体培地（pH７．５）４００ lを入れて、培養温度を２３℃とし、照射時間を１８時間／日として、炭酸ガス１％含有空気を１００ml／min の割合で通気しつつ、第一工程で、コッコミクサ・グロエオボトリディフォルミスを、ＰＣＶ濃度１．３ml／l の割合で接種して、水槽の前面と左面の２面に、６０００ lx の白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が２．３ml／l となった後とき、第二工程で、水槽の前・後面と左・右面との４面に、７５００ lx の白色蛍光灯を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が５．０ml／l となったとき、第三工程で、水槽の前・後面と左・右面との４面に、１００００ lx の白色蛍光灯の光を照射し、培養して、ＰＣＶ濃度が１０．１ml／l となったとき、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（１５０００回転／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、８０５ｇの乾燥藻体を得た。得られた乾燥藻体中の多糖体を、実施例１と同様に定量した結果、１４３．３ｇであった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、コッコミクサ藻体の大量培養が容易にでき、多糖体を能率よく生産できる有用なコッコミクサ藻体の培養法が得られたのである。