(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酵素標識リガンドの帯域、
（ｂ）展開帯域、並びに
（ｃ）リガンド及び該酵素標識リガンドに対する固定化レセプターを一定濃度で含有し、その際前記レセプターは直径０．１〜５μｍのポリマービーズに共有結合されているレセプター帯域
を担持する支持体を含むリガンド分析用の乾式免疫分析要素であって、該要素がジアリールテルリド系化合物を含有し且つ前記複数の帯域が同じ層内に存在しても又は別々の層に存在してもよいことを特徴とする乾式免疫分析要素。
【請求項２】
（ａ）酵素標識レセプターの帯域、
（ｂ）展開帯域、並びに
（ｃ）リガンドに対する固定化レセプターを一定濃度で含有し、その際前記レセプターは直径０．１〜５μｍのポリマービーズに共有結合されているレセプター帯域
を担持する支持体を含むリガンド分析用の乾式免疫分析要素であって、該要素がジアリールテルリド系化合物を含有し且つ前記複数の帯域が同じ層内に存在しても又は別々の層に存在してもよいことを特徴とする乾式免疫分析要素。
【請求項３】
前記ジアリールテルリド系化合物が下記構造式（Ｉ）で示される、請求項１又は２に記載の乾式免疫分析要素：
Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａｒ2       （Ｉ）
〔上式中、Ａｒ1 及びＡｒ2 は、置換されていてもいなくてもよい同じ又は異なるアリール基又はヘテロアリール基を表し、下記置換基：
【化１】
0003545536.tif 000014
（上式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ41、Ｒ42及びＲ43は同じであるか又は異なり且つ水素、炭素原子数１〜５個のアルキル、ＯＨ、ＯＲ1 、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨＲ1 、ＮＨＲ12、ＮＲ1 Ｒ2 、ＣＯ2 Ｈ及びその塩、ＣＯ2 Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈ及びその塩、ＰＯ3 Ｈ2 及びその塩並びにＳＲ1 から成る群より各々選ばれ、その際、Ｒ1 とＲ2 は異なり且つ必要に応じて１個又は数個の親水性基、フェニル及び／又は置換フェニルを有する炭素原子数１〜１４個の炭素鎖を有するアルキルから成る群より各々選ばれ、
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ24及びＲ25は同じであるか又は異なり且つ水素、炭素原子数１〜５個のアルキル、炭素原子数１〜５個のアルコキシ、ＣＯ2 Ｈ及びその塩、ＣＯ2 Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈ及びその塩、ＰＯ3 Ｈ2 及びその塩から成る群より各々選ばれる）を有する〕。
【請求項４】
前記標識リガンド又は標識レセプターにおける標識が西洋ワサビペルオキシダーゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼの誘導体である、請求項１又は２に記載の乾式免疫分析要素。
【請求項５】
水性液体試料中に含まれる免疫学的に反応性のリガンドの分析方法であって、
（Ａ）請求項１又は２に記載の乾式免疫分析要素を準備し、
（Ｂ）前記要素の最上部の帯域又は層の有限領域に前記試料を接触させて（１）固定化リガンド−レセプター複合体、（２）固定化酵素標識リガンド−レセプター複合体もしくは（３）前記（１）と（２）の混合物、又は固定化レセプター−リガンド−標識レセプター複合体を形成させ、
（Ｃ）前記有限領域に基質溶液を接触させて発色反応を触媒し、そして
（Ｄ）前記リガンドの濃度を比色測定する工程を含む分析方法。
【請求項６】
ジアリールテルリドを含有する化合物及び西洋ワサビペルオキシダーゼ又はその複合体を含む、免疫学的に反応性のリガンドの分析に用いるための組成物。
【請求項７】
前記化合物が下式：
【化２】
0003545536.tif 000015
で示される化合物から成る群より選ばれた、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記化合物が下式：
【化３】
0003545536.tif 000016
で示される化合物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記化合物が下式：
【化４】
0003545536.tif 000017
で示される化合物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物が下式：
【化５】
0003545536.tif 000018
で示される化合物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物が下式：
【化６】
0003545536.tif 000019
で示される化合物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物が下式：
【化７】
0003545536.tif 000020
で示される化合物である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫分析要素とその免疫分析における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然の免疫反応を利用する免疫分析（イムノアッセイ）は、臨床化学分野における分析技法として幅広く使用されている。反応の特異性故、免疫分析は生物学的流体中に極低濃度で存在する生物学的アナライトを定量するのに特に有利である。このようなアナライトとして、例えば、抗原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク質、等が挙げられる。
分析のターゲットとなるアナライトを本明細書では「リガンド」と称する。このリガンドを特異的に認識し且つこれと反応して複合体を形成する化合物を本明細書では「レセプター」と称する。このレセプターとリガンドは複合対（コンジュゲートペア：conjugate pair）を形成する。この対のいずれの成分もレセプター又はリガンドとして機能しうる。
【０００３】
競合型アッセイの場合、標識化された免疫成分誘導体及びアナログをはじめとする標識アナライトがアッセイの必須成分であり、また、サンドイッチアッセイの場合、アナライトに対する標識レセプターを使用する必要がある。本明細書ではこれらをそれぞれ標識リガンド及び標識レセプターと称する。
競合型結合免疫分析では、一定量の適当なレセプターと反応させる際、標識リガンドを未標識リガンドと競合するように配置する。未知濃度のリガンドは、結合した又は結合していない（すなわち、遊離の）標識リガンドのシグナル測定値から定量することができる。以下のように反応は進行する。
リガンド＋標識リガンド＋レセプター−基質  ＜−−＞
リガンド−レセプター＋標識リガンド−レセプター−基質
【０００４】
「サンドイッチ」イムノアッセイ又はイムノメトリックアッセイとして知られている別の免疫分析では、リガンドの別々のエピトープ部位に結合する２種以上のレセプター分子にリガンドを接触させる。レセプターの一方を適当に標識化しておき、その他方を固体支持体上に固定化しておくか又はこれに固定化できる。リガンドの量は、リガンドと２種のレセプターとの中で結合された複合体の量に直接比例する。これは以下のように説明される。
基質−レセプター1 ＋リガンド＋レセプター2 −標識  ＜−−＞
基質−レセプター1 −リガンド−レセプター2 −標識
【０００５】
常用されている標識として放射性標識、酵素、発色団、蛍光団、安定ラジカル並びに酵素補助因子、阻害剤及びアロステリック作働子が挙げられる。
免疫分析要素は米国特許第４，５１７，２８８号及び同第４，２５８，００１号明細書からも周知である。一般に、このような要素には、粒状層内に固定化されたレセプター（例、リガンドに対する抗体）が含まれる。さらに、免疫分析要素は、結合された又は結合されていない種との相互作用を通して、試料中のリガンド濃度と相関関係をもちうるシグナルを発生させる試薬系を通常は含有する。使用に際しては、試料を酵素標識リガンドと手動で混合し、そして要素へ適用する。その後、標識リガンドに対する基質を含有する溶液を特定の層に適用する。基質との反応は、酵素によって触媒され、最終的にシグナルの発色を引き起こす反応生成物を形成させる。この色の反射濃度は試料中のリガンド濃度に相関させることができる。同様なシグナル発生系が、その他の既知の常用標識、例えば、放射性標識、発色団、蛍光団、安定ラジカル並びに酵素補助因子、阻害剤及びアロステリック作働子についても周知である。
【０００６】
多層免疫分析要素は、上記の免疫分析原理を利用して流体試料中のアナライトを測定する薄層要素である。競合型アッセイ要素では、発色速度がアナライト存在量に反比例し、またサンドイッチアッセイ要素では、発色速度がアナライト存在量に直接比例する。さらに、発色速度は、固定化レセプターに結合された酵素標識アナライト（例、薬物）又は酵素標識レセプターの活性にも直接比例する。免疫分析が安定な検量を維持するためには、その特定の検量期間中はいずれのスライドにおいても酵素活性（測定速度）が失われてはならない。
【０００７】
免疫分析要素は、必要な時に１個の要素を取り出すことができる５０個の要素を含むプラスチック製「カートリッジ」として顧客に供給される場合が多い。これらの要素は互いの上部に積み重ねられており、カートリッジ内の下側４９個の要素はいずれもその上面が上側の要素によって覆われている。しかしながら、この積重ね体の最上部に位置する要素にはこのような覆いがないため、その要素の表面はその他の４９個の要素は受けることのない環境因子に晒される。例えば、最上部（又は第一）の要素は、カートリッジが製造中に取り扱われている時や、カートリッジが臨床分析装置の要素供給部に配置されている時には、残りの要素よりも空気流や光に晒されやすい。
使用前の保存中には、封止されたフィルムでライニングされた袋の中にカートリッジ自体が保存されている。しかしながら、最上部の要素はその他の４９個の要素よりも封止袋内の残留空気や湿度に晒されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
カートリッジ内の要素に共通の試験流体を反応させた場合、最上部（又は第一）の要素で観測される発色速度は、同じカートリッジに含まれる最上部の要素の下方に位置する要素に同じ試験流体を適用した場合に観測される発色速度よりも常に低くなることがわかった。この事象を「第一スライドバイアス」と称する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの態様によると、
（ａ）酵素標識リガンド又は酵素標識レセプターの帯域、
（ｂ）展開帯域、並びに
（ｃ）リガンドに対する固定化レセプター及び場合により存在する標識リガンドを一定濃度で含有し、その際前記レセプターは直径０．１〜５μｍのポリマービーズに共有結合されているレセプター帯域
を担持する支持体を含むリガンド分析用の乾式免疫分析要素であって、該要素がジアリールテルリド系（ＤＡＴ）化合物を含有し且つ前記複数の帯域が同じ層内に存在しても又は別々の層に存在してもよいことを特徴とする乾式免疫分析要素が提供される。
【００１０】
上記の要素によると、第一スライドバイアス、すなわちカートリッジ内の最上部要素の発色速度が同じカートリッジ内のその他の要素の発色速度と差異があること、が低減される。その上、カートリッジ内のすべての要素がより長期間の保存性を示す。本発明の実施例は、いずれのジアリールテルリド（ＤＡＴ）化合物でもこれらの利点が得られることを確立するものである。
さらに、このＤＡＴ化合物は、一般に酵素組成物、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ及びこのような酵素が標識として用いられている複合体（コンジュゲート）を安定化する上でも有用である。例えば、該化合物は、本発明の乾式要素における場合と同様に溶液アッセイにおいても使用することができる。
【００１１】
本発明はさらに、水性液体試料中に含まれる免疫学的に反応性のリガンドの分析方法であって、
（Ａ）本発明による乾式免疫分析要素を準備し、
（Ｂ）前記要素の最上部の帯域又は層の有限領域に前記液体試料を接触させて（１）固定化リガンド−レセプター複合体、（２）固定化酵素標識リガンド−レセプター複合体もしくは（３）前記（１）と（２）の混合物又は固定化レセプター−リガンド−標識レセプター複合体を形成させ、
（Ｃ）前記有限領域に基質溶液を接触させて発色反応を触媒し、そして
（Ｄ）前記リガンドの濃度を比色測定する工程を含む分析方法を提供する。
【００１２】
上記の方法では、標識レセプター又は標識リガンドが、固定化標識リガンド又は固定化標識レセプターから分離されている。このような分離は、当該技術分野で知られている手段、例えば、過酸化水素溶液などの基質溶液を添加する方法によって行うことができる。
発明の詳細な説明
本発明の要素は、標識リガンド又は標識レセプター、展開帯域及びレセプター帯域を含む。これら各種帯域は一つの塗布層に存在してもよいし、また別々の塗布層に存在してもよい。例えば、展開帯域とレセプター帯域が単一層内にあっても、或いはそれらが別々の層にあってもよい。別々の層の場合、それらは支持体上で任意の順序で配置されることができる。また、別々の層を、支持体上にレセプター層が直接位置し、そのレセプター層の上に展開層が直接位置し、そしてその展開層の上に標識リガンド又は標識レセプター帯域が位置するように配置することができる。レセプター帯域が完全に分離された層を形成する場合、該層は下記のタイプのバインダーをさらに含む。本発明の要素は以下に記載するようなさらに別の層を含むことができる。このような層はいずれも当該技術分野で周知の塗布技法によって塗布することができ、これについては以下、簡単に説明する。
【００１３】
展開層又は展開帯域は多孔質である。それは必須成分としてジアリールテルリドを含有する。代表的な化合物である下式：
Ａｒ1 −Ｔｅ−Ａｒ2 
で示されるジアリールテルリドは、以下に記載するＨＣＧ又はＣＲＰアッセイ用スライドに内蔵された場合、第一スライドバイアスを著しく低減させる。これらの化合物群はまた、化合物又はそれらの第一スライドバイアス防止能を評価するために設計されたモデル系においてＨＲＰ活性を維持する。
有用なジオルガノテルリドとして、Ａｒ1 及びＡｒ2 が、置換されていてもいなくてもよい同じ又は異なるアリール基又はヘテロアリール基である物質が挙げられる。その置換基を下記に定義する。
【００１４】
【化８】
0003545536.tif 000002
【００１５】
上式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであり、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ41、Ｒ42及びＲ43は同じであるか又は異なり且つ水素、炭素原子数１〜５個のアルキル、ＯＨ、ＯＲ1 、ＳＨ、ＮＨ2 、ＮＨＲ1 、ＮＨＲ12、ＮＲ1 Ｒ2 、ＣＯ2 Ｈ及びその塩、ＣＯ2 Ｒ1 、ＳＯ3 Ｈ及びその塩、ＰＯ3 Ｈ2 及びその塩並びにＳＲ1 から成る群より各々選ばれ、その際、Ｒ1 とＲ2 は異なり且つ必要に応じて１個又は数個の親水性基、フェニル又は置換フェニルを有する炭素原子数１〜１４個の炭素鎖を有するアルキルから成る群より各々選ばれ、
Ｒ14、Ｒ15、Ｒ24及びＲ25は同じであるか又は異なり且つ水素、炭素原子数１〜５個のアルキル、炭素原子数１〜５個のアルコキシ、ＣＯ2 Ｈ及びその塩、ＣＯ2 Ｒ1 （Ｒ1 は上記した通り）、ＳＯ3 Ｈ及びその塩、ＰＯ3 Ｈ2 及びその塩から成る群より各々選ばれる。
【００１６】
上記において、「アルキル」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、イソアミル又はネオペンチルのような基を意味する。
「炭素原子数１〜５個の炭素鎖」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、イソアミル又はネオペンチルのような直鎖又は分岐鎖の炭素鎖を意味する。
「炭素原子数１〜１４個の炭素鎖」には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、イソアミル、ネオペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、テトラデシル、等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００１７】
「親水性基」とは、スルホン酸、ホスホン酸、カルボン酸、ヒドロキシル及びアミノ基のような基を意味する。これらの化合物の一部は酸又は塩基のいずれかと塩を形成することができる。ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウムの塩、塩酸、臭化水素酸、リン酸及び硫酸との塩、並びにシュウ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、クエン酸及びコハク酸との塩が好適である。
好ましいＤＡＴは、水溶性を付与する基、例えば、限定するものではないが、ヒドロキシル基、アミン及びその塩並びにカルボン酸及びその塩、を含有する置換基を芳香族環上に有する化合物である。具体的に、単独で又はバナジル化合物との協同においてＨＲＰ活性を保護する水溶性化合物を以下に挙げる。
【００１８】
【化９】
0003545536.tif 000003
【００１９】
展開層に用いられる他の材料については、例えば米国特許第４，２５８，００１号明細書に開示されている乾式分析要素の製造技術においてよく知られている。このような層は、布、紙、等から製造されたマクロ多孔質層を含む。好ましい粒状層はビーズ展開層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈された又は希釈されていない検査試料（例、１〜１００μＬ）を収容する本発明の要素において使用するのに適した多孔性を有するように簡単に構築することができる。展開層は等方性多孔質であることが好ましく、この特性は、帯域を構成する粒子間の連続空間によって得られる。「等方性多孔質」とは、適用された流体が展開層内部のすべての方向に均一に展開される展開層を意味する。
【００２０】
ビーズ展開層をはじめとする有用な展開層が米国特許第４，６７０，３８１号、同第４，２５８，００１号及び同第４，４３０，４３６号明細書に記載されている。特に有用な展開層は、米国特許第４，２５８，００１号明細書に記載されている有機ポリマー粒子とそれ用の高分子接着剤とから形成された粒状構造を有する展開層である。展開層に有用な有機ポリマー粒子は、一般に熱安定性の高い粒径約１０〜４０μｍの又はこれより小さい球形ビーズである。
これらの粒子は、必要な特性を有する、天然及び合成の両方のポリマーをはじめとする多種多様な有機ポリマーから構成されることができる。しかしながら、上記特許明細書に記載されている一種又は二種以上の付加ポリマーから構成されることが好ましい。
【００２１】
レセプター層は、別の層である場合には、支持体の上で、又は支持体上の試薬層もしくは下塗層の上で、調製され且つ塗布される。レセプターは、その表面の反応性基（求核性遊離アミノ基やスルフヒドリル基）を介してポリマー粒子に共有結合される。
レセプターを小さなポリマービーズに結合させる一般的手順として、特定のレセプターを一般に知られている反応によってビーズに共有結合させる方法がある。多くの側基、例えば、ハロアルキル、２−置換活性化エチルスルホニル及びビニルスルホニルによって、レセプターをビーズに直接結合させることができる。一般に、ビーズとレセプターの混合は、水性緩衝液（ｐＨは一般に約５〜約１０である）において約０．１〜約４０重量％（好ましくは約０．１〜約１０重量％）のポリマー粒子濃度で行われる。レセプターの量は、ポリマーに対する比率として約０．１：１０００〜約１：１０、好ましくは約１：１００〜約１：１０の範囲とする。混合は、約５〜約５０℃、好ましくは約５〜約４０℃の温度範囲において約０．５〜約４８時間実施される。適当ないずれの緩衝液でも使用可能である。
【００２２】
場合によっては、外表面の反応性側基を、リガンドを共有結合させるために修飾又は活性化する必要がある。例えば、カルボキシル基は、１９９２年７月２２日発行の欧州特許出願公開第３０８２３５号公報や米国特許第５，１５５，１６６号明細書に記載されている既知のカルボジイミド又はカルバモイロニウム化学法によって活性化しなければならない。
【００２３】
しかしながら、カルボキシル基含有単分散ポリマービーズへのレセプターの結合は２段階で行われ、その第一段階は、粒子の水性懸濁液にカルボジイミド又はカルバモイロニウム化合物を接触させて、カルボキシル基の代わりに中間体反応性基を有する反応性の中間体ポリマー粒子を生成させる段階である。この段階は、所望のｐＨを提供するために適した酸又は緩衝剤を用いて適当なｐＨにおいて実施される。一般に、望ましいｐＨは６未満であるが、反応が進行できる限り重要ではない。より好ましくは、ｐＨは約３．５〜約７である。粒子表面のカルボキシル基に対するカルボジイミド又はカルバモイロニウム化合物のモル比率は約１０：１〜５００：１である。
【００２４】
本発明の方法の第二段階では、第一段階で形成された反応性中間体に反応性アミン基又はスルフヒドリル基含有レセプターを接触させる。これにより粒子とレセプターの間に共有結合が形成される。ポリマー粒子に対するレセプターの重量比は、一般に約１：１０００〜約１：１、好ましくは約１：１００〜約１：１０である。
別の場合として、外表面のエポキシ基を加水分解して、免疫学的種に含まれるアミン基に対してカップリング剤として作用しうる臭化シアンと反応できるジオール化合物を生成させることができる。アルデヒドをアミンと直接反応させてシッフ塩基を生成させ、続いてこれを還元することにより共有結合を形成させてもよい。別法として、アルデヒドを酸化して酸にし、そして先にカルボキシル基について記載した方法によってアミド結合を形成させることもできる。
【００２５】
ポリマーが反応性カルボキシル基を有する場合の粒子表面のカルボキシル基とカルボジイミドもしくはカルバモイロニウム化合物との反応により生成した中間体と反応する又はポリマー表面の反応性基と反応する反応性アミン又はスルフヒドリル基をそれぞれ含有する限り、いずれの反応性アミン又はスルフヒドリル含有レセプターでも単分散ポリマービーズに結合させることができる。
レセプター表面のアミン又はスルフヒドリル基と直接に反応しやすい反応性基を有する小さなポリマービーズを、必要があれば適当な緩衝液中で、レセプターと単に混合して反応させる。
【００２６】
レセプター用のビーズを選定することができるポリマーとして、ポリ（ｍ−及びｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−クロロメチルスチレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）〔モル比６７：３０：３〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）〔モル比９５．５：４．５〕、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド｝〔モル比９９．３：０．７〕、ポリ（ｍ−及びｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比９５：５、９８：２及び９９．８：０．２〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比９３．５：４．５：２〕、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸｝〔モル比９７．３：０．７：２〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−クロロメチルスチレン）〔モル比７０：３０〕、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕〔モル比９７．６：２．４〕、ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジルクロリド−コ−アクリル酸）〔モル比８５：１０：５〕、ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）〔モル比９９：１〕、ポリ（スチレン−コ−メタクリル酸）〔モル比９０：１０〕、ポリ（スチレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ−及びｐ−ジビニルベンゼン）〔モル比８９：１０：１〕、ポリ（スチレン−コ−２−カルボキシエチルアクリレート）〔モル比９０：１０〕、ポリ（メチルメタクリレート−コ−アクリル酸）〔モル比７０：３０〕、ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−ビニルベンズアルデヒド）〔モル比９５：５〕及びポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−ビニルベンズアルデヒド−コ−メタクリル酸）〔モル比９３：５：２〕が挙げられる。
【００２７】
要素の層は適当な支持体の上に担持される。レセプター層は支持体上に塗布されるが、支持体とレセプター層の間にゼラチン／緩衝剤層のような中間介在層が存在してもよい。支持体は、寸法安定性がよく、好ましくは非多孔性で波長約２００〜約９００ｎｍの電磁輻射線を透過する透明な（すなわち、輻射線透過性）材料であればいずれの適当な材料であってもよい。個々の要素について、所期の検出様式（反射、透過又は蛍光分光分析法）に適合するように支持体を選定する必要がある。有用な支持体材料としてポリスチレン、ポリエステル〔例、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例、酢酸セルロース）、等が挙げられる。
【００２８】
レセプター層のための高分子バインダーについては、カナダ国特許第１，２４０，４４５号明細書に一般的に記載されており、本明細書ではこれを援用する。有用なポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのようなＮ−アルキル置換アクリルアミドの重合体を約３０〜９７重量％含むポリマーである。その他の有用なＮ−アルキル置換アクリルアミドとして、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド及びＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドが挙げられる。これらのバインダーの有用性を例示するために、実施例ではポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドが使用されている。
【００２９】
この高分子バインダーはさらに、１分子当たり２個以上の付加重合性基を有する架橋性モノマーの重合体の一種又は二種以上を約３〜２５重量％含む。これらの架橋性モノマーは当該技術分野では一般に周知である。好適な架橋性モノマーは、Ｎ−アルキル置換アクリルアミドとの重合を促進するためにアクリルアミド基又はメタクリルアミド基を含有する。
有用な架橋性モノマーの例として、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、エチレンジメタクリレート、２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート、ジビニルベンゼン、モノ〔２，３−ビス（メタクリロイルオキシ）プロピルホスフェート、Ｎ，Ｎ’−ビス（メタクリロイル）ウレア、トリアリルシアヌレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、Ｎ−アリルメタクリルアミド、４，４’−イソプロピリデンジフェニレンジアクリレート、１，３−ブチレンジアクリレート、１，４−シクロヘキシレンジメチレンジメタクリレート、２，２’−オキシジエチレンジメタクリレート、ジビニルオキシメタン、エチレンジアクリレート、エチリデンジアクリレート、プロピリデンジメタクリレート、１，６−ジアクリルアミドヘキサン、１，６−ヘキサメチレンジアクリレート、１，６−ヘキサメチレンジメタクリレート、フェニルエチレンジメタクリレート、テトラメチレンジメタクリレート、２，２，２−トリクロロエチリデンジメタクリレート、エチレンビス（オキシエチレン）ジアクリレート、エチレンビス（オキシエチレン）ジメタクリレート、エチリジントリメタクリレート、プロピリジントリアクリレート、ビニルアリルオキシアセテート、１−ビニルオキシ−２−アリルオキシエタン、２−クロトノイルオキシエチルメタクリレート、ジアリルフタレート及び２−（５−フェニル−２，４−ペンタジエノイルオキシ）エチルメタクリレートが挙げられる。
【００３０】
これらの高分子バインダーは、さらに親水性モノマーの重合体を０〜６０重量％含むことができる。また、５〜３５重量％の量も有用である。親水性モノマーについてはカナダ国特許第１，２４０，４４５号明細書に記載されている。具体的には、このようなモノマーはヒドロキシ、ピロリドン、アミン、アミド、カルボキシ、スルホ、カルボン酸塩、スルホン酸塩及び硫酸塩の中から選ばれた基を一つ又は二つ以上有する。一般に、これら塩の基の対イオンはアルカリ金属又はアンモニウムである。有用な親水性モノマーはアクリル酸及びメタクリル酸並びにそれらの塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート及びグリセリルメタクリレートである。
【００３１】
さらに、先に列挙したバインダーによると、押出ホッパー塗布工程中の剪断薄化により実現される非常に低いバインダー粘度のため、均一なレセプター層塗膜を形成することができる。列挙したバインダーによると、均一塗膜の形成直後にバインダーの粘度が著しく上昇し、バインダーの乾燥や湿式輸送中に安定性及び均一性が維持される「セット層」が得られる。
レセプターはまた、分子量８０００〜４００，０００を有するポリ（ビニルアルコール）、牛血清アルブミン、アラビアゴム及びＮ−ビニルピロリドンのホモポリマー、並びにアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキル置換アクリルアミド、Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−アルキル置換−１−ビニルイミダゾール、２−ヒドロキシアルキル置換−１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アクリル酸及びメタクリル酸から成る群より選ばれた二種以上のモノマーを有する水溶性ビニル付加コポリマー（該コポリマー中のアルキル及びヒドロキシアルキルはメチル、エチル、プロピル及びヘキシルのように１〜６個の炭素原子を含有する）から成る群より選ばれたポリマーバインダー中に分散させてもよい。
【００３２】
本発明の要素は、一つ又は二つ以上の別の層、例えば、電子移動剤のような他に必要な添加剤を含有するゼラチン／緩衝剤層と試薬／展開層との混合層又は別々の層を含むことができる。
要素のゼラチン／緩衝剤層又は試薬層又は展開層は、一種以上の合成又は天然バインダー材料、例えば、ゼラチン又はその他の天然コロイド、ホモポリマー及びコポリマー、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び同様なコポリマーに分散された一種以上の試薬を含む指示組成物を含有することができる。この指示組成物はレセプター層に分散されてもよい。
【００３３】
その他の任意の層、例えば、下塗層、輻射線遮断層、等を所望であれば含めることもできる。要素のすべての層は互いに流体接触状態にある、すなわち、流体及び該流体中の試薬や未複合体化反応生成物は隣接層の重畳領域間を透過することができる。
本発明の要素の層は、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤及びその他当該技術分野で周知の材料をはじめとする他の望ましいが任意である各種成分を含有することができる。これら成分の量についても、当該技術分野の当業者であれば適宜選定することができる。
【００３４】
本発明の要素を使用して、生物学的流体（例、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒト又は動物細胞の懸濁液、排泄物、唾液、リンパ液、等）のような液体中の低濃度の免疫学的に反応性のリガンドを測定することができる。これらのリガンドは１０-15 モル程度の低濃度で、最も一般には約１０-11 〜約１０-4モルの濃度範囲で測定することができる。
このように、定量的又は定性的に、測定することができるリガンドとして、治療薬（例、フェノバルビタール、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリン、ゲンタマイシン、キニジン、フェニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラマイシン、リドカイン、プロカインアミド、等）、天然又は合成ステロイド（例、コルチゾル、アルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エストリオール、等）、ホルモン（例、甲状腺ホルモン、ペプチドホルモン、インスリン、等）、タンパク質（例、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、フェリチン、血液凝固因子、Ｃ−反応性タンパク質、イソ酵素、ｈＣＧ、アポリポタンパク質、等）、抗原、モノクローナル抗体をはじめとする抗体、その他レセプターと自然に反応する種が挙げられる。本発明は、ジゴキシン、フェニトイン、カルバマゼピン、テオフィリン又はフェノバルビタールのような治療薬、チロキシン又はトリヨードチロニンのようなホルモン並びにｈＣＧ及びＣ−反応性タンパク質のようなアナライトの測定に特に有用である。
【００３５】
本発明の分析は、リガンドに結合して標識リガンドを生成することができる何らかの酵素標識を使用して実施することができる。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ〔例、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）〕、アルカリ性ホスファターゼ及びガラクトシダーゼのような酵素が好適な標識である。
特定の標識に適した基質を決めることは臨床化学分野における当業者であれば適宜行うことができる。基質は、酵素標識によって直接に作用を受ける物質であっても、或いは該標識の酵素反応を含む一連の反応に関与する物質であってもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、その基質は過酸化水素と適当な還元剤である。一例としてグルコースオキシダーゼを使用すると、その基質であるグルコースは、試薬層内に一般に存在するか又は基質溶液として添加されて、約０．０１モル／ｍ2 、好ましくは約０．００１〜約０．１モル／ｍ2 になるようにされる。当業者であれば、分析に用いられる酵素標識の量に対して特定の基質の量を調整する方法を知っている。
【００３６】
試薬層は、標識によって触媒される反応の結果として検出可能な種を提供する試薬を一種又は二種以上含む指示組成物を含有することができる。この検出可能な種は、発色性のもの、放射性のもの、蛍光性のもの、又は化学発光性のものであることができる。本発明の説明では、酵素標識リガンド類似体と基質との酵素反応の結果として比色定量法で検出可能な種を提供する比色定量用指示組成物を使用する。
【００３７】
この指示組成物は、酵素反応時に検出可能な色素を生成する単一化合物であっても、或いは色素を生成する試薬の組合せであってもよい。例えば、基質としてグルコースを使用し且つ酵素標識としてグルコースオキシダーゼを使用する場合、比色定量用指示組成物は、反応して色素を生成する被酸化性化合物とカプラーを含むことができる。別法として、この組成物は、ロイコ色素とペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化する際に発生する過酸化水素の生成の結果として検出可能な色素を生成する別の適当な過酸化性化合物を含むことができる。有用なロイコ色素は当該技術分野では周知であり、例えば、米国特許第４，０８９，７４７号明細書（１９７８年５月１６日発行、Ｂｒｕｓｃｈｉ）及び米国特許出願第６１２，５０９号明細書（１９８４年５月２１日、Ｂａｂｂら）に記載されているものが挙げられる。比色定量用指示組成物の具体的量及びその各種成分については当業者であれば適宜選定することができる。
【００３８】
標識リガンドは、既知の出発物質及び手順を用いて調製すること、或いは市販品を入手することができる。一般に、リガンドは標識（例、酵素部分）に共有結合で結合される。
免疫分析法は手動式であっても自動化されていてもよい。一般に、液体中のリガンドの量は、供給ロール、チップパケット又はその他のソースから本発明の要素を取り出して、その展開層の有限領域に試料液（例、１〜１００μＬ）を物理的に接触させることにより測定される。接触を受ける有限領域の面積は、一般に約１５０ｍｍ2 以下である。
【００３９】
リガンドの量は、複合体化リガンド類似体を直接検出するための、又は酵素標識と基質の酵素反応の結果として生成した検出可能な種を検出するための、適当な装置に要素を通過させることによって測定される。例えば、一般に知られている手順を用いて適当な分光光度分析装置によってこれらの種を検出することができる。酵素反応においては、得られた生成物を、例えば、検査試料を接触させた有限領域における反射濃度又は透過濃度の変化速度を測定することによって、分析する。測定される領域の直径は約３〜約５ｍｍである。液体試料中のリガンド量は、有限領域において測定された標識量に、競合型アッセイ法の場合には反比例し、またサンドイッチアッセイの場合には直接比例する。一般に、標識測定は基質溶液を適用した後に行われる。
【００４０】
本発明の詳細な説明
１．ジアリールテルリドの合成
ＤＡＴの合成には多くの合成経路がある。個々の化合物に対して採用される合成経路は芳香族環上の置換基によって大きく異なる。既知の合成経路のいくつかを下記の例で説明する。これらの合成経路の補外経路や他の文献に記載されているその他のＤＡＴの合成方法については明白であろう。
【００４１】
合成１：４，４’−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）−１，１’−テルロビスベンゼン（１）
（ａ）〔２−（４−ブロモフェノキシ）エトキシ〕（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシラン（１ａ）の合成
１５０ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中に〔２−（４−ブロモフェノキシ）エタノール（１０．０ｇ、４６ミリモル）を含む溶液にｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（８．３４ｇ、５５ミリモル）とイミダゾール（７．８２ｇ、１１５ミリモル）を加えた。これらの物質を反応フラスコ中へ洗い流すためにさらに新たなジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）を使用した。得られた溶液をニューマン管を用いて室温で一晩攪拌した。それを水（２００ｍＬ）に注ぎ込み、エーテル（３×７５ｍＬ）で抽出した。抽出物を一緒にしたものを０．５ＮＨＣｌ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3 （２００ｍＬ）、水（４×１５０ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。溶剤をロータリーエバポレーターで減圧除去すると粗生成物（１６．５ｇ、＞１００％）が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．３４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．９）、６．７８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．９）、４．００−３．９３（４Ｈ、ｍ）、０．８９（９Ｈ、ｓ）、０．０８（６Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１５８．１、１３２．２、１１６．４、１１２．８、６９．６、６１．９、２５．９、１８．４。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）３３０（Ｍ+ 、79Ｂｒ）。この粗生成物は精製せずに１００％として使用した。
【００４２】
（ｂ）４，４’−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）−１，１’−テルロビスベンゼン（１）の合成
５００ｍＬの三口フラスコを窒素雰囲気下に置き、凝縮器及び添加漏斗を備えつけた。マグネシウムターニング（turning ）（０．８９ｇ、３７ミリモル）を添加した。臭化物（１ａ）（１２．３ｇ、３７ミリモル、１００％として使用）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍＬ）に吸収させ、そして添加漏斗へ移した。その臭化物溶液約１０ｍＬと、１，２−ジブロモエタンと、ヨウ素を用いてグリニャール反応を開始させた。残りの臭化物溶液を加え、その反応を一晩還流させた後は、Ｍｇはまったく残存していなかった。加熱マントルを３０分間取り外し、次いでテルル粒体（４．７４ｇ、３７ミリモル）を加え、そして反応を加熱して７時間還流させた後は、ほぼすべてのＴｅが消費されていた。反応を室温まで冷却し、次いで激しく攪拌されている１０％ＮＨ4 Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）に注ぎ込み、そして１５分間攪拌した。析出したＴｅをセライト（商標）珪藻土で濾過して分離し、その濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾液を分液漏斗に移し、エーテルで３回（２００ｍＬ、１００ｍＬ、１００ｍＬ）抽出した。これらの抽出物を一緒にして水及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。溶剤を減圧除去すると粗生成物（１２．４ｇ）が赤い油状物として得られた。それを銅粉末（２．５ｇ）と共にトルエン（５０ｍＬ）に吸収させ、ニューマン管で２．５時間加熱還流すると、色が赤から灰色に変化した。その反応を室温まで冷却し、セライト（商標）珪藻土で濾過し、エーテルで洗浄し、そして濃縮すると、琥珀色の油状物（１２．４ｇ）が得られた。これを 1Ｈ  ＮＭＲで分析すると、所望の生成物と、失活したグリニャール試薬と、残留トルエンとの混合物であった。この混合物をメタノール（５０ｍＬ）及びＴＨＦ（２０ｍＬ）にフッ化カリウム（５．０２５、８６ミリモル）と共に吸収させ、そして２４時間還流させた。メタノールを減圧除去し、そしてエーテル／酢酸エチルと水の間で分配させた。その水相を酢酸エチルでさらに２回抽出し、そして抽出物を一緒にしたものを水及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、その後濾過した。溶剤を減圧除去すると粗生成物（８ｇ）が淡褐色の固体として得られた。エーテルを用いて粉砕して濾過分離すると白色固体が得られ、これをエーテルで洗浄し、風乾し、粗生成物（１．７４ｇ）を得た。それをジクロロメタンを用いてフラッシュ(flash) シリカゲル（２０ｍＬ）に吸着させた。２００ｍＬのフラッシュシリカゲルによって、ジクロロメタン、次いで９５：５ジクロロメタン：メタノールで溶離させるフラッシュクロマトグラフィーを慎重に実施し（生成物は対応する少量のビアリール化合物の直前に溶離する）、エーテルで粉砕し、そして濾過すると、白色固体（１．２ｇ）の純物質（１）が得られた。粗生成物のエーテル粉砕で得られたエーテル濾液を上記と同様にクロマトグラフィーにかけた。エーテル粉砕及びエタノールからの再結晶化によりさらに新たな純物質（１）が０．２ｇ得られた。全収量：１．４ｇ（１９％）。 1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ７．５２（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、６．８０（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、４．８２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．５）、３．９１（４Ｈ、ｔ、��＝５．０）、３．６５（４Ｈ、ａｐｐ  ｑ、Ｊ＝５．１）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１５９．２、１３９．８、１１６．５、１０４．５、６９．９、５９．９。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）４０４（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。
【００４３】
合成２：Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（２）
（ａ）Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン（２ａ）の合成
丸底フラスコ中、室温、アルゴン雰囲気下にある乾燥エーテル（５０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジメチルベンゼンメタンアミン（２．７０ｇ、０．０２０モル）を含む溶液に、シリンジでｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、１０ｍＬ、０．０２５モル）を滴下した。その反応混合物を室温で５時間攪拌した後、乾燥テトラヒドロフラン中にフェニルテルレニルブロミドを含む溶液（０．５Ｍ）をシリンジで滴下した。３８ｍＬ（０．０１９モル）を添加した後、反応液はフェニルテルレニルブロミドに特徴的なオレンジ色に変わり、添加を停止した。その反応混合物をエーテル（１００ｍＬ）に注ぎ込み、得られた溶液を飽和ＮａＣｌ（１×１００ｍＬ、２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濃縮した。その残留物をアセトン（１００ｍＬ）に溶解させ、そしてヨウ素（５．０８ｇ、０．０２０モル）を加えた。得られた溶液を冷却して生成物を析出させた。黄色の結晶物を濾過して集め、低温のアセトンで洗浄し、そして乾燥すると、ヨウ素付加体（２ａ）（５．９５ｇ、５０％、融点１７８〜１７９℃）が得られた。そのヨウ素付加体（５．９３ｇ、０．０１０モル）をジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）に溶解させた。水（１００ｍＬ）に重亜硫酸ナトリウム（５．２ｇ、０．０５モル）を含む溶液を徐々に添加し、そして反応混合物を室温で１時間攪拌し、その間に反応混合物は無色になった。その反応混合物を水（５００ｍＬ）に注ぎ込み、次いでエーテル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。その水層を１０％ＮａＯＨによって塩基性にし、そして該アミンをエーテル（３×１００ｍＬ）中に抽出させた。抽出物を一緒にしたものを飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濃縮した。その残留物をメタノールから再結晶化すると、純粋生成物（３．１４ｇ、９３％）が白色固体（融点５１〜５４℃）として得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．８８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９）、７．３５（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３）、７．２６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３）、７．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７）、７．１０−７．０４（２Ｈ、ｍ）、６．９４−６．８９（１Ｈ、ｍ）、３．５３（２Ｈ、ｓ）、２．２５（６Ｈ、ｓ）。
【００４４】
（ｂ）Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（フェニルテルロ）ベンゼンメタンアミン塩酸塩（２）の合成
水浴内に配置したエーテル（５０ｍＬ）中に２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１−フェニルテルロベンゼン（１．０２ｇ、３．０ミリモル）のスラリーに、塩化水素／エーテル溶液（３．１５ｍＬ、１．０Ｍ、３．１５ミリモル）をシリンジで滴下した。この濃厚なスラリーをイソプロパノール（２０ｍＬ）で希釈した後、濾過した。その白色固体をエーテルで洗浄し、風乾すると、生成物（１．１３ｇ、９５％）が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ２．６（１Ｈ、ｂｒ、ｓ）、８．１３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５）、７．８０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７）、７．５２−７．４８（３Ｈ、ｍ）、７．２６−７．１７（４Ｈ、ｍ）、４．４４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．８）、２．６８（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．５）。Ｃ15Ｈ18ＣｌＮＴｅの元素分析理論値：Ｃ＝４８．００；Ｈ＝４．８３；Ｎ＝３．７３、測定値：Ｃ＝４７．９７；Ｈ＝４．８７；Ｎ＝３．６５。
【００４５】
合成３：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−４，４’−テルロビスベンゼンアミン（３）
（ａ）Ｎ，Ｎ−ビス〔２−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕エチル〕ベンゼンアミン（３ａ）の合成
下記の物質を用いて前記（１ａ）について記載した類似の手順を採用した：２，２’−（フェニルイミノ）ジエタノール（９．０ｇ、５０ミリモル）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１８．１ｇ、０．１２モル）、イミダゾール（１７．０ｇ、０．２５モル）及びジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）。反応混合物を便宜上一晩攪拌した。（１ａ）と同様に処理すると、淡色の油状物（３ａ）が得られた（２１．６ｇ、＞１００％）。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．２１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）、６．６８（３Ｈ、重複するｄ、ｔ）、３．７７（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．６）、３．５２（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．６）、０．９２（１８Ｈ、ｓ）、０．０６（１２Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１４７．８、１２９．２、１１５．７、１１１．４、６０．３、５３．５、２５．９、１８．３、−５．３。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）４０９（Ｍ+ ）。この油状物は精製せずに１００％として使用した。
【００４６】
（ｂ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（２−〔〔（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル〕オキシ〕エチル〕−４，４’−テルロビスベンゼンアミン（３ｂ）の合成
炉乾燥しアルゴン雰囲気下に置いた５００ｍＬの三口フラスコに塩化テルル（ＩＶ）（５．９３ｇ、２２ミリモル）を入れた。乾燥エーテル（１００ｍＬ）をシリンジで加えると薄い黄色のスラリーが得られ、そしてフラスコを水浴中に配置した。乾燥エーテル（５０ｍＬ）に３ａ（１８ｇ、４４ミリモル）を含む溶液アルゴン雰囲気下で調製し、その溶液をカニューラで反応混合物へ激しく攪拌しながら移した。最初に非常に濃厚な黄色の析出物が形成し、これをアニリン溶液を添加し続けて希釈した。添加完了後、緑味がかった黄色のスラリーを一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、その濾液を減圧下でエバポレートした。得られた黄緑色の油状物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に吸収させ、そして水（２００ｍＬ）にメタ重亜硫酸ナトリウム（８．３６ｇ、４４ミリモル）を含む溶液を攪拌しながら添加した。得られた二相混合物を室温で３０分間攪拌した後、セライト（商標）珪藻土で濾過した。固体のＮａＨＣＯ3 を添加してｐＨを９にし、その後反応混合物を分液漏斗に移した。ジクロロメタン層を捨てて、水層をさらに新たなジクロロメタンで抽出した。抽出物を一緒にしたものを水／飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ／５０ｍＬ）で、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、濾過し、そして溶剤を減圧除去した。得られた赤色の油状物（２１．４ｇ）をトルエン（８０ｍＬ）に吸収させ、そして銅粉末（４ｇ）を添加した。反応をニューマン管で一晩加熱還流した。得られた灰色の反応混合物を室温まで冷却し、セライト（商標）珪藻土で濾過し、そして溶剤を減圧下で除去した。得られた琥珀色の油状物（１８ｇ）を３：１のシクロヘキサン：ジクロロメタンで２回クロマトグラフィーにかけて、生成物と回収された出発物質とを分離すると、純粋な３ｂが黄色の油状物（５．０ｇ、理論量の４８％）として得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．５４（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６）、６．５３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、３．７２（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．４）、３．４７（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５）、０．８８（１８Ｈ、ｓ）、０．０３（１２Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１４７．６、１３９．７、１１２．７、９８．２、６０．２、５３．４、２５．９、１８．３、−５．３。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）９４６（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。
【００４７】
（ｃ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（２−ヒドロキシエチル）−４，４’−テルロビスベンゼンアミン（３）の合成
シリルエーテル（３ｂ）（２．７ｇ、２．８６ミリモル）と、フッ化カリウム（０．６６ｇ、１１．４ミリモル）と、メタノール（２０ｍＬ）との不均一混合物を２０時間加熱還流した。この白色スラリーを氷浴で冷却し、次いでその生成物を濾過して単離し、低温のメタノールで洗浄し、そして風乾した（０．８０ｇ、５７％）。分析試料用に少量をメタノールから再結晶化させた（融点１６９〜１７０℃）。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ７．５４（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６）、６．５３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、３．４５（４Ｈ、ａｐｐ  ｑ、Ｊ＝５．７）、３．３３（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．９）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：δ１４８．１、１３９．８、１１３．１、９７．６、５８．４、５３．５。ＩＲ（ＫＢｒ）：３３５０、１５８５、１４９５、１３５０ｃｍ-1。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）４９０（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。Ｃ20Ｈ28Ｎ2 Ｏ4 Ｔｅの元素分析理論値：Ｃ＝４９．２２；Ｈ＝５．７８；Ｎ＝５．７４、測定値：Ｃ＝４８．７８；Ｈ＝５．７２；Ｎ＝５．６６。
【００４８】
合成４：２，２’−〔テルロビス（４，１−フェニレンオキシ）〕ビス酢酸二ナトリウム塩（４）
（ａ）４−（ブロモフェノキシ）（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシラン（４ａ）の合成
乾燥ジメチルホルムアミド（４５０ｍＬ）にｐ−ブロモフェノール（１０４ｇ、０．６モル）を含む溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１０８ｇ、０．７２モル）とイミダゾール（１０２ｇ、１．５モル）を添加した。得られた淡黄色の溶液をニューマン管で室温で３時間攪拌した。それを水（１．２Ｌ）に注ぎ込み、そしてエーテル（９００ｍＬ、３００ｍＬ、３００ｍＬ）で３回抽出した。抽出物を一緒にしたものを水（１５０ｍＬ）で４回、１Ｎ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3 （３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）で１回洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。溶剤をロータリーエバポレーター、次いで真空ポンプで減圧除去すると、加水分解した出発物質から比率６：１のシラノールとして粗生成物（１８３ｇ、＞１００％）が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．３１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７）、６．７１（２Ｈ、δ、Ｊ＝８．７）、０．９７（９Ｈ、ｓ）、０．１８（６Ｈ、ｓ）。この粗生成物は精製せずに１００％として使用した。
【００４９】
（ｂ）４，４’−ジ（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１，１’−テルロビスベンゼン（４ｂ）の合成
炉乾燥した後アルゴン雰囲気下に置いた２Ｌの三口フラスコに、オーバーヘッド式スターラーと添加漏斗を備えつけた。マグネシウムターニング（１５．２ｇ、０．６６モル）を添加した。臭化物４ａ（１７．２ｇ、０．６モル、１００％として使用）を乾燥ＴＨＦ（６００ｍＬ）に吸収させ、そして添加漏斗に移した。その臭化物溶液２５ｍＬといくつかの結晶ヨウ素を用いてグリニャール反応を開始させた。反応の還流が継続するような速度で残りの臭化物溶液を添加した。添加完了後、その反応をさらに３０分間還流させると、わずかな量のＭｇしか残存しなかった。反応混合物を水浴において若干冷却し、次いでテルル粒体（７６．８ｇ、０．６モル）を加え、そして反応を加熱して２．５時間還流させた後は、ほぼすべてのＴｅが消費されていた。反応混合物を室温まで冷却し、次いで激しく攪拌されている１０％ＮＨ4 Ｃｌ水溶液（２Ｌ）に注ぎ込み、そして３０分間攪拌した。析出したＴｅをセライト（商標）珪藻土で濾過して分離し、その濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾液を分液漏斗に移し、エーテルで３回（１２００ｍＬ、３００ｍＬ、３００ｍＬ）抽出した。これらの抽出物を一緒にして水及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そしてセライト（商標）珪藻土で濾過して処理中に析出したＴｅとＭｇＳＯ4 の両方を分離した。溶剤を減圧除去すると粗生成物（１９４ｇ）が赤い油状物として得られた。それを銅粉末（３８ｇ）と共にトルエン（９００ｍＬ）に吸収させ、ニューマン管で２．５時間加熱還流すると、色が赤から灰色に変化した。その反応混合物を室温まで冷却し、セライト（商標）珪藻土で濾過し、そして濃縮すると、琥珀色の油状物（１８１ｇ）が得られた。これを 1Ｈ  ＮＭＲで分析すると、所望の生成物と、失活したグリニャール試薬と、残留トルエンとの混合物であり、計算から４ｂを０．２３モル含有することがわかった。ヨウ素付加体４ｂによる精製を行った。粗生成物をアセトン（０．６Ｌ）に吸収させ、そして攪拌しながらヨウ素（５８ｇ、０．２３モル）を少しずつ添加した。１５分後、非常に濃厚な析出物が生成した。エタノール（１．２Ｌ）を加え、そしてオレンジ色の固体と濃い真珠色の結晶性固体を濾過して単離し、風乾した。その濾液を再濾過して第二の収量を得た。合わせた収量は２０６ｇとなり、ＮＭＲ上では純粋物質であり、唯一の汚染物は残留エタノールであった。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．９５（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７）、６．８６（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７）、０．９８（１８Ｈ、ｓ）、０．２５（１２Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１５８．６、１３８．４、１２１．９、２５．５、１８．２、−４．３。このヨウ素付加体をジオキサン（５００ｍＬ）、ジクロロメタン（５００ｍＬ）及び５％ＮａＨＳＯ3 水溶液（１．１Ｌ）に吸収させ、そしてその二相系を激しく攪拌した。１時間後、下部（有機）層はまだ赤色をしており、還元が不完全であることを示していた。黄色水性層の本体をデカントして保存し、そしてオレンジ色の層を減圧下で蒸発させた。その残留物にジオキサン（２００ｍＬ）、ジクロロメタン（２００ｍＬ）及び５％ＮａＨＳＯ3 水溶液（４００ｍＬ）を加え、そしてその混合物をさらに１時間攪拌した。それを減圧下で蒸発させて有機溶剤を部分的に除去し、そして残りの水性ジオキサンを分液漏斗に移してエーテルで３回抽出した。抽出物を一緒にし、これを水、飽和ＨａＨＣＯ3 及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。先にデカントした水層についても同様に処理してこれら二つを一緒にした。溶剤を減圧除去すると純粋な４ｂ（９７．３ｇ、６０％）が琥珀色の油状物として得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．５４（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）、６．８０（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）、０．９６（１８Ｈ、ｓ）、０．１７（１２Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１５５．８、１３９．６、１２１．５、１０５．２、２５．７、１８．２、−４．４。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）５４４（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。
【００５０】
（ｃ）４，４’−テルロビスフェノール（４ｃ）の合成
５００ｍＬの丸底フラスコにおいてシリルエーテル４ｂ（５４．２ｇ、０．１モル）をメタノール（２００ｍＬ）に吸収させた。フッ化カリウム（１１．６ｇ、０．２モル）を添加し、その反応混合物をアルゴン雰囲気下、１．５時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却した後、それを激しく攪拌されている水（１．２Ｌ）に注ぎ込み、その際、さらに新たなメタノール（２０ｍＬ）を用いて移行を促進した。ｐＨを１０％ＮａＯＨ（約４０ｍＬ）で１４に調整し、そして反応混合物をセライト（商標）珪藻土で濾過した。その濾液を分液漏斗に移してジクロロメタンで２回洗浄した。その水層を氷浴において２Ｌの三角フラスコに移し入れ、そして２５％酢酸水溶液を加えてｐＨを６にすると、クリーム色の析出物が生成した。その生成物を濾過して単離し、水で洗浄し、風乾すると、粗生成物（２９ｇ）が得られた。それをフラッシュシリカゲル（１５０ｍＬ）にエーテルを用いて吸着させた。１Ｌのフラッシュシリカゲルで真空クロマトグラフィーを実施し、ジクロロメタンに続いて１：４の酢酸エチル：ジクロロメタンで溶離させると、純粋な生成物が得られた。ジクロロメタンを用いて粉砕すると、２部の収穫で、純粋な４ｃが黄色固体（２４ｇ、７６％）として得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 、５滴のＤＭＳＯ）：δ８．７７（２Ｈ、ｓ）、７．２９（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）、６．４７（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）。
【００５１】
（ｄ）４，４’−ジ（エトキシカルボニルメトキシ）−１，１’−テルロビスベンゼン（４ｄ）の合成
オーバーヘッド式スターラーと添加漏斗を具備した炉乾燥済の２５０ｍＬ三口フラスコをアルゴン雰囲気下に置き、水素化ナトリウム（６０％、１．７６ｇ、４４ミリモル）を加えた。それをシクロヘキサンで３回洗浄し、次いで乾燥した（シーブ）ジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）を加えた。そのフラスコを水浴に配置し、そして乾燥ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中にビスフェノール４ｃ（６．２８ｇ、２０ミリモル）を含む溶液を添加漏斗から滴下した（激しくＨ2 が発生）。得られたスラリーを油浴において８５℃に２０分間加熱した（さらにＨ2 が発生）。そのスラリーを室温まで冷却し、そして乾燥ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）にブロモ酢酸エチル（６．６８ｇ、４０ミリモル）を含む溶液を添加漏斗から滴下すると、その間に析出物が透明になった。その反応混合物を４５分間攪拌した後、激しく攪拌されている水（３２０ｍＬ）に注ぎ込んだ。得られた淡褐色の析出物を濾過して単離し、水で洗浄した。それを水（５０ｍＬ）とジクロロメタン（８０ｍＬ）との間で分配させた。その水相をジクロロメタンでさらに２回抽出し、その抽出物を一緒にしてこれを水、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。溶剤を減圧下で除去し、そして得られた固形分をエタノール（５０ｍＬ）から再結晶化し、冷却し、そして濾過した。その生成物は白色固体（５．３ｇ、５５％、融点８８．５〜８９℃）として得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．６０（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、６．７５（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、４．５８（４Ｈ、ｓ）、４．２５（４Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１）、１．２８（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１）。ＩＲ（ＫＢｒ）：１７６５、１７２０、１５８０、１４８０ｃｍ-1。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）４８８（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。Ｃ20Ｈ22Ｏ6 Ｔｅの元素分析理論値：Ｃ＝４９．４３；Ｈ＝４．５６、測定値：Ｃ＝４９．３６；Ｈ＝４．５５。
【００５２】
（ｅ）４，４’−ジ（カルボキシメトキシ）−１，１’−テルロビスベンゼン二ナトリウム塩（４）の合成
ジエステル４ｄ（３９．２ｇ、８１ミリモル）をメタノール（４００ｍＬ）に吸収させ、１０％ＮａＯＨ水溶液（４７ｍＬ、１７０ミリモル）を加えた。非常に濃厚なスラリーが得られた。その反応混合物を１時間加熱還流した。得られたスラリーを氷浴で冷却した。固形分を濾過して単離し、エタノールで洗浄し、風乾し、そして乳鉢と乳棒で磨砕すると淡いクリーム色の固体（３７．６ｇ、９８％）として４が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 、５滴のＤ2 Ｏ）：δ７．４６（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４）、６．６６（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５）、４．０６（４Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：δ１７６．６、１５８．０、１３９．８、１１５．９、１０４．８、６６．５。ＩＲ（ＫＢｒ）：３５４０、３４３０、１５９５、１４９０、１４１５、１２３０ｃｍ-1。Ｃ16Ｈ12Ｎａ2 Ｏ6 Ｔｅ１．５Ｈ2 Ｏの元素分析理論値：Ｃ＝３８．３７；Ｈ＝３．０２、測定値：Ｃ＝３８．３３；Ｈ＝３．０５。
【００５３】
合成５：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（カルボキシメチル）−４，４’−テルロビスベンゼンアミン四ナトリウム塩（５）
（ａ）Ｎ−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニルグリシン、エチルエステル（５ａ）の合成
ニューマン管を具備したフラスコ内で、アニリン（９．３ｇ、０．１モル）、ブロモ酢酸エチル（３６．７ｇ、０．２２モル）及び２，６−ルチジン（２３．５ｇ、０．２２モル）をアセトニトリル（２００ｍＬ）中で１日還流させた。反応はＴＬＣ（ジクロロメタン）によって完了させた。反応混合物を室温にまで冷却し、そしてエーテル（２００ｍＬ）で希釈した。析出したルチジン塩酸塩を濾過して分離し、その濾液を減圧下で蒸発させた。その残留物をエーテルと水の間で分配させ、そしてその水層をエーテルでさらに２回抽出した。抽出物を一緒にし、これを１Ｎ  ＨＣｌ、水、飽和ＮａＨＣＯ3 及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、そして減圧下で蒸発させると、暗色の液体として粗生成物５ａが得られた。これをジクロロメタンに吸収させ、シリカゲルで濾過して色を除くと、淡色の油状物として生成物（２３．２ｇ、８８％）が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．２１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．９）、６．７７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３）、６．６１（２Ｈ、δ、Ｊ＝８．４）、４．２０（４Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．２）、４．１３（４Ｈ、ｓ）、１．２６（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１）。
【００５４】
（ｂ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（エトキシカルボニルメチル）−４，４’−テルロビスベンゼンアミン（５ｂ）の合成
炉乾燥し、添加漏斗を具備し、そしてアルゴン雰囲気下に置いた５００ｍＬの三口フラスコに、塩化テルル（ＩＶ）（１１．９ｇ、４４ミリモル）を添加した。乾燥エーテル（２００ｍＬ）をシリンジで添加すると、薄い黄色のスラリーが得られ、そしてそのフラスコを氷浴内に配置した。乾燥エーテル（５０ｍＬ）に５ａ（２３．２ｇ、８９ミリモル）を含む溶液をアルゴン雰囲気下で調製し、そしてその溶液をカニューレで添加漏斗に移した。その溶液を反応混合物へ激しく攪拌しながら滴下した。すぐに濃厚なスラッジが形成され、スターラー棒が停止した。残りの添加は反応混合物を手動で攪拌して渦運動をさせながら実施した。一晩攪拌することなく反応混合物を静止させ、次いでスラッジのすべてが塊状の固体になるまで音波処理した。反応混合物を濾過し、そして濾過ケークをエーテルで洗浄した。その濾過ケークをジクロロメタン（２００ｍＬ）に吸収させ、そして水（２００ｍＬ）にメタ重亜硫酸ナトリウム（１７．０ｇ、８９ミリモル）を含む溶液を攪拌しながら添加した。得られた二相混合物を室温で３０分間攪拌した。固体のＮａＨＣＯ3 を添加してｐＨを７にし、その反応混合物をセライト（商標）珪藻土によって濾過した。その濾液を分液漏斗に移し、ジクロロメタン層を分離し、そして水層をさらに新たなジクロロメタンで抽出した。抽出物を一緒にし、これを水及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、そして濾過した。次いで、溶剤を減圧除去した。得られた赤色の油状物（１７．９ｇ）をトルエン（１００ｍＬ）に吸収させ、そして銅粉末（９ｇ）を添加した。その反応混合物をニューマン管で２時間加熱還流させた。得られた灰色の反応混合物を室温にまで冷却し、セライト（商標）珪藻土によって濾過し、そして溶剤を減圧除去した。粗生成物（１８ｇ、琥珀色の油状物）を、ジクロロメタン、次いで９８：２のジクロロメタン：メタノールで２回フラッシュクロマトグラフィーにかけ、生成物と回収された出発物質とを分離すると、淡いオレンジ色の粘性油状物（７．３６ｇ、理論量の５０％）として純粋な５ｂが得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ７．５２（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６）、６．４３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．７）、４．１９（８Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１）、４．０８（８Ｈ、ｓ）、１．２５（１２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１７０．７、１４７．６、１３９．５、１１３．６、１０１．３、６１．２、５３．３、１４．２。ＩＲ（塩プレート）：１７３０、１５８０、１４９０、１１８０ｃｍ-1。ＦＤＭＳ（ｍ／ｅ）６５８（Ｍ+ 、 130Ｔｅ）。
【００５５】
（ｃ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（カルボキシメチル）−４，４’−テルロビスベンゼンアミン四ナトリウム塩（５）の合成
ジエステル５ｂ（４．３５ｇ、６．６３ミリモル）をメタノール（６０ｍＬ）に吸収させ、１０％ＮａＯＨ水溶液（７．４ｍＬ、２６．５ミリモル）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流した。得られたスラリーを氷浴で冷却した後、濾過した。その固形分を低温のメタノールで洗浄し、風乾すると、淡いクリーム色の固体（３．８１ｇ、９１％）として物質５が得られた。 1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：δ７．５６（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６）、６．３８（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．６）、３．８３（８Ｈ、ｓ）。13Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）：δ１７９．４、１４８．７、１３９．６、１１３．０、９８．３、５５．５。ＩＲ（ＫＢｒ）：３２５０（ｂｒ）、１５７５、１４０５、１２１０ｃｍ-1。Ｃ20Ｈ16Ｎａ4 Ｎ2 Ｏ8 Ｔｅ・３Ｈ2 Ｏの元素分析理論値：Ｃ＝３５．０２；Ｈ＝３．２３；Ｎ＝４．０８、測定値：Ｃ＝３４．８２；Ｈ＝３．０３；Ｎ＝４．０４。
【００５６】
【実施例】
下記の実施例により本発明の実施を説明する。
実施例１
記載の被膜を細長く切ってスライドとして載せた。スライドを含むカートリッジを製作し、これをベンチトップの上に置いて実験室の照明をつけたまま１６〜２４時間放置しておいた。ベンチトップでのインキュベーションが終了した日に、プロトタイプの自動薄層イムノアッセイ分析装置を用いてスライドを試験した。１０，０００ｍＩＵ／ｍＬのｈＣＧを含有する１１μＬのヒト血清マトリックス溶液を各スライドにアプライした。次いで、各スライドを３７℃で５分間インキュベートし、その後、Ｎａ2 ＨＰＯ4 （１０ｍＭ、ｐＨ６．８）と、４’−ヒドロキシアセタナリド（５ｍＭ）と、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（０．１％）と、Ｈ2 Ｏ2 （８ｍＭ）と、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（１０μＭ）とを含有する洗浄液１２μＬを各スライドにアプライした。この洗浄液は、結合していない抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を読取り領域から完全に洗い流し、且つＨＲＰ−触媒発色反応を開始させるように働く。洗浄液を加えた後、各スライドに３７℃における第二のインキュベーションを施し、その間に、６７０ｎｍの波長で３秒のインターバルを置いて反射濃度の読取りを行った。反射濃度の測定値から各被膜のスライドの発色速度を算出した。
【００５７】
血清試料中のヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を分析するための下記組成の薄い被膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。（被膜構造における用語はまとめて後述してある。）
【００５８】
0003545536.tif 000004
【００５９】
0003545536.tif 000005
【００６０】
0003545536.tif 000006
【００６１】
0003545536.tif 000007
【００６２】
0003545536.tif 000008
【００６３】
0003545536.tif 000009
【００６４】
0003545536.tif 000010
【００６５】
このカートリッジスライドの比較は、被膜中にＶＯＳＯ4 又はＤＡＴ化合物のいずれも含まれていない場合に、カートリッジ内の第一番目のスライドの速度低下率が大きいことを明確に示している。この第一スライドにおける発色速度の低下は、検査を受ける試料について間違ったアナライト濃度の予測をもたらすことになる。ＶＯＳＯ4 （被膜２）、ＤＡＴ化合物（被膜３及び４）又はＶＯＳＯ4 とＤＡＴ化合物の組合せ（被膜５及び６）を内蔵させると、最上部スライドにおいて保持される速度率が著しく改良される。
【００６６】
実施例２
調査したＤＡＴ化合物の効果をさらに明確にするため、各被膜からのスライドをベンチトップ上で上向きに配置し、カートリッジ内に残されたスライドと同じ条件に晒した（蛍光灯をつけたまま室温で１６〜２０時間のインキュベーション）。インキュベーション期間後、先に記載したものと同じ材料及びプロトコールを使用したプロトタイプの自動薄層イムノアッセイ分析装置でスライドを試験した。予想される結果は、スライドを環境因子（光、空気、等）により多く暴露したことによる発色速度のより大幅な低下である。環境への暴露を増加させたことによる効果を観測する方法として、ベンチトップスライドの発色速度と（最上部スライドを除く）各条件についてのカートリッジスライドの発色速度とを比較した。上記のように処理したスライドの結果は以下の通りであった。
【００６７】
0003545536.tif 000011
【００６８】
このベンチトップスライド試験は、ＶＯＳＯ4 （被膜２）、ＤＡＴ化合物（被膜３及び４）又はＶＯＳＯ4 とＤＡＴ化合物の組合せ（被膜５及び６）を被膜に内蔵させると、環境への暴露による速度低下が防止されることを示している。この試験はまた、同じ被膜中にＶＯＳＯ4 と化合物１を内蔵させた場合（被膜５）の協同的な作用についても示している。このため、いずれかの化合物を単独で内蔵させた場合（被膜２及び被膜３）よりも速度低下率が小さくなっている。
ＤＡＴ（１〜５）は、ＨＲＰ活性の低下を強調するように設計されたモデル系でどれも評価した。この系では、次の実施例に示したように、ＤＡＴの１、４及び５が、単独で又はバナジル塩との協同において、ＨＲＰ活性を保護した。
【００６９】
0003545536.tif 000012
【００７０】
この分析要素を使用して、下記のプロトコールでＨＲＰの安定性を測定した。本発明のジアリールテルリド化合物の一種を各種量で含有し且つ約３×１０-8ＭのＨＲＰを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の試料１０μＬを、上記の被覆要素の離れた１ｃｍ2 部分の各々に点着した（各化合物について及び各濃度において４個の試料）。これらの要素を乾燥し、そして暗い引出しの中に入れておいた。３０分後及び２４時間後（すなわち、翌日）、要素を引出しから取り出して、各要素を、試験管内の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％牛血清アルブミンを含む溶液（ｐＨ７．０）１ｍＬの中に浸漬してＨＲＰを抽出した。その試験管をボルテックスで１分間攪拌した後〔分析要素成分がポリ（エチレンテレフタレート）支持体から分離〕、得られた懸濁液を遠心分離して溶液を分離した。この溶液中の活性なＨＲＰの量を、１００μＬのアリコートを分光光度計のキュベットに加え且つ５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭの４’−ヒドロキシアセトアニリド、０．６２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）界面活性剤、０．００５％の４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール系ロイコ色素、及び０．８５ｍＭの過酸化水素を含む最終溶液１ｍＬを提供する試薬溶液を添加することによって測定した。アッセイの温度は３０℃とした。青色の発色があり、その発色速度を６５５ｎｍにおいて分光光度法で測定した。この発色速度は、抽出物中の活性酵素の量に直接比例した。
【００７１】
これらのデータは、各試料について２４時間時点で抽出された活性を３０分時点で抽出された活性で割り算して得られた活性比として表現した。活性比１は、酵素が２４時間にわたって添加物によって完全に保護されたことを示す。実験間でデータのばらつきが多少認められたが、これは恐らく環境の湿度や温度が日によって異なるためである。このことは、被膜におけるＨＲＰの乾燥速度に影響を及ぼし、引いては酵素の見かけの安定性に影響を与える恐れがある。従って、データの比較は実施例３〜５の内部では可能であるが、これら実施例間では不可能である。
【００７２】
実施例３
化合物１、２、３及び４の１ｍＭにおける効果を、単独で又は１ｍＭのＶＯＳＯ4 の存在下で、比較した（図１）。化合物１及び４は、モデル系の乾燥定着フォーマットにおいて、添加剤を含まないものに関してＨＲＰ活性を保護した。化合物２及び３は、このフォーマットでは有効な安定化剤ではなかった。ＶＯＳＯ4 と化合物１又は４との両方が含まれる場合には、いずれか一方が単独で存在する場合よりも多くのＨＲＰ活性が保持された。
実施例４
化合物１及び４のＨＲＰ安定化能に対する濃度の効果を示す（図２）。ＨＲＰ溶液において、１、０．１又は０．０１ｍＭの化合物１及び１０、１又は０．１ｍＭの化合物４を使用した。さらに、緩衝液のみを含有する又は１ｍＭのＶＯＳＯ4 を含有するＨＲＰ溶液を点着した。化合物１及び４共に、活性低下には試薬濃度依存性があった。１０ｍＭの化合物４が存在すると、ＨＲＰ活性は２４時間のインキュベーション後でも完全に保護されていた。
【００７３】
実施例５
この実施例は、抗−ＣＲＰ−ＨＲＰ酵素複合体（２．８５×１０-8Ｍ）の安定性に対する化合物４及び５の効果を示すものである。点着液には、緩衝液のみを含むもの、１、２、４もしくは８ｍＭの化合物４を含むもの、又は１もしくは８ｍＭの化合物５を含むものを使用した。化合物４及び５のどちらも複合体ＨＲＰの活性を保護し、またその保護には濃度依存性があった（図３）。
実施例６
下記被膜構造体７〜１０に示したような被膜７〜１０を製作し、スライドとして載せ、約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨで２日間コンディショニングし、そして凍結した。
【００７４】
被膜（７）
血清試料中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を分析するための下記組成の薄い被膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。
層 材料 乾燥塗布量(g/m2)ビーズ        ＴＥＳ緩衝液                                      0.219 展開層        ジメドン                                          0.450 ＣａＣｌ2                                         1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.22グリセロール                                      2   牛血清アルブミン                                  0.5 マゼンタ色素                                      0.0538接着剤ポリマー                                    2.538 ポリマービーズ                                  130 レセプター    ＴＥＳ緩衝液                                      0.1 層            ＴＸ−１００                                      0.02ポリマーバインダー                                0.8 ロイコ色素                                        0.2 ＰＣビーズ                                        0.3 抗−ＣＲＰ抗体                                    0.05抗−ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ複合体                      0.0005Tetronic T908                                     0.02Olin 10G                                          0.01ゲル          ゼラチン                                         10   ＴＥＳ緩衝液  ｐＨ７．０                          4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.44ＢＶＳＭＥ                                        0.15
【００７５】
被膜（８）
血清試料中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を分析するための下記組成の薄い被膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。
層 材料 乾燥塗布量(g/m2)ビーズ        ＴＥＳ緩衝液                                      0.219 展開層        ジメドン                                          0.450 ＣａＣｌ2                                         1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.22グリセロール                                      2   牛血清アルブミン                                  0.5 マゼンタ色素                                      0.0538接着剤ポリマー                                    2.538 ポリマービーズ                                  130 １                                                0.08レセプター    ＴＥＳ緩衝液                                      0.1 層            ＴＸ−１００                                      0.02ポリマーバインダー                                0.8 ロイコ色素                                        0.2 ＰＣビーズ                                        0.3 抗−ＣＲＰ抗体                                    0.05抗−ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ複合体                      0.0005Tetronic T908                                     0.02Olin 10G                                          0.01ゲル          ゼラチン                                         10   ＴＥＳ緩衝液  ｐＨ７．０                          4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.44ＢＶＳＭＥ                                        0.15
【００７６】
被膜（９）
血清試料中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を分析するための下記組成の薄い被膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。
層 材料 乾燥塗布量(g/m2)ビーズ        ＴＥＳ緩衝液                                      0.219 展開層        ジメドン                                          0.450 ＣａＣｌ2                                         1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.22グリセロール                                      2   牛血清アルブミン                                  0.5 マゼンタ色素                                      0.0538接着剤ポリマー                                    2.538 ポリマービーズ                                  130 ２                                                0.075 レセプター    ＴＥＳ緩衝液                                      0.1 層            ＴＸ−１００                                      0.02ポリマーバインダー                                0.8 ロイコ色素                                        0.2 ＰＣビーズ                                        0.3 抗−ＣＲＰ抗体                                    0.05抗−ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ複合体                      0.0005Tetronic T908                                     0.02Olin 10G                                          0.01ゲル          ゼラチン                                         10   ＴＥＳ緩衝液  ｐＨ７．０                          4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.44ＢＶＳＭＥ                                        0.15
【００７７】
被膜（１０）
血清試料中のＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を分析するための下記組成の薄い被膜をポリ（エチレンテレフタレート）支持体の上に製作した。
層 材料 乾燥塗布量(g/m2)ビーズ        ＴＥＳ緩衝液                                      0.219 展開層        ジメドン                                          0.450 ＣａＣｌ2                                         1.0 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.22グリセロール                                      2   牛血清アルブミン                                  0.5 マゼンタ色素                                      0.0538接着剤ポリマー                                    2.538 ポリマービーズ                                  130 ＶＯＳＯ4                                         0.04レセプター    ＴＥＳ緩衝液                                      0.1 層            ＴＸ−１００                                      0.02ポリマーバインダー                                0.8 ロイコ色素                                        0.2 ＰＣビーズ                                        0.3 抗−ＣＲＰ抗体                                    0.05抗−ＣＲＰ抗体−ＨＲＰ複合体                      0.0005Tetronic T908                                     0.02Olin 10G                                          0.01ゲル          ゼラチン                                         10   ＴＥＳ緩衝液  ｐＨ７．０                          4.580 3',5'-ジクロロ-4'-ヒドロキシアセトアニリド        0.44ＢＶＳＭＥ                                        0.15
【００７８】
カートリッジを解凍してＥ２５０分析装置に装填した。
各スライドに、約２０ｍｇ／ＬのＣＲＰを含有するヒト血清試料１１μＬをアプライした。次いで、各スライドを３７℃で５分間インキュベートし、その後、Ｎａ2 ＨＰＯ4 （１０ｍＭ、ｐＨ６．８）、４’−ヒドロキシアセトアニリド（５ｍＭ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（０．１％）、Ｈ２０２（８ｍＭ）及びＤＴＰＡ（１０μＭ）を含有する洗浄液１２μＬを各スライドにアプライし、結合していない抗体−ＨＲＰ複合体を読取り領域から洗い流して、ＨＲＰを触媒とする色素生成反応を開始させた。３７℃における２．５分間のインキュベーション後、６７０ｎｍにおける反射濃度を測定し、これを検量線によってＣＲＰ濃度に変換した。
最上部スライドの予測濃度を、次の６枚のスライドの予測濃度平均値と比較した。この種の数回の実験結果を以下に示す。
バイアス＝最上部スライド予測値−スライド２〜７の平均予測値
【００７９】
0003545536.tif 000013
【００８０】
これらの結果は、いずれの保護剤も存在しない場合に、最上部スライドの予測値は以降のスライドよりも実質的に小さくなることを示している。ＤＴＡの１もしくは２又はＶＯＳＯ4 を添加すると、最上部スライドとそれ以降のスライドとの間のバイアスが縮小する。化合物１による改良が最大であった。
【００８１】
実施例７
被膜７〜１０を製作し、スライドとして載せ、約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨで２日間コンディショニングし、そして凍結した。
カートリッジを解凍した。各カートリッジの最上部のスライドを取り出し、そしてそのカートリッジを約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨで３日間インキュベートした。
これらのスライドを、実施例６に記載したように、約２０ｍｇ／ＬのＣＲＰを含有するヒト血清を用いて試験した。
約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨに３日間暴露した最上部スライドの予測値を、スライド２〜７の平均予測値と比較した。その結果を以下に示す。
バイアス＝最上部スライド予測値−スライド２〜７の平均予測値
【００８２】
被膜 試薬 ２カートの平均７        無し                  -26.4     ８          １                   -4.5     ９          ２                   -8.2     １０        VOSO4                  -5.6 
【００８３】
これらの結果は、新たに暴露された最上部スライドが３日間で変化をし、保護剤が存在しない場合には下部のスライドよりも実質的に低い予測値をもたらすことを示している。ジアリールテルリド１及び２並びにＶＯＳＯ4 はスライドを保護し、同じカートリッジ内の下部のスライドに対するバイアスを縮小する。ここでもまた、化合物１による改良が最大であった。
【００８４】
実施例８
被膜７〜１０を製作し、スライドとして載せ、約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨで２日間コンディショニングし、そして凍結した。
カートリッジを解凍し、そして約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨで７日間インキュベートした。
インキュベート後のカートリッジと解凍したばかりのカートリッジとを、実施例６に記載したように、約１０〜３０ｍｇ／ＬのＣＲＰを含有する３種類のヒト血清試料を用いて分析した。インキュベートしたスライドの予測値を、解凍したばかりのスライドの予測値と比較した。３種類の流体について解凍直後のスライドに対するインキュベート後のスライドの平均バイアスを測定し、これを以下に示す。
【００８５】
被膜 試薬 平均バイアス７        無し                  -7.8    ８          １                   0.8    ９          ２                  -2.62   １０        VOSO4                 -0.26 
【００８６】
これらの結果は、保護剤が存在しない場合、約２１℃（７０°Ｆ）／３３％ＲＨに７日間暴露されたスライドは、解凍したばかりのスライドに対してバイアスを生じていることを示している。化合物１もしくは２又はＶＯＳＯ4 が存在する場合には、この暴露によるバイアスは実質的に縮小する。
【００８７】
本発明によると、ＨＲＰの安定性が、単独で又はバナジル系化合物のような他の安定化剤との併用において、改良される。
【００８８】
一覧表
接着剤ポリマー：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
抗体ビーズ：ヒト絨毛膜ゴナドトロピンに対する抗体が結合しているポリ（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸
ＰＣビーズ：ホスホリルコリンが結合しているポリ（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＢＶＳＭＥ：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン五酢酸
標識：抗−ヒト絨毛膜ゴナドトロピン抗体とチオレート化西洋ワサビペルオキシダーゼとの複合体
ロイコ色素：４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール
マゼンタ色素：４，５−ジヒドロキシ−３−（６，８−ジスルホ−２−ナフチランゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸ナトリウム
ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤
Ｏｌｉｎ  １０Ｇ：１分子当たり平均約１０個のグリシドール単位を有するイソノニルフェノキシポリグリシドール界面活性剤（Ｏｌｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）
ポリマービーズ：平均直径２０〜４０μｍのポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸）粒子
ポリマーバインダー：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）
ポリマーバインダーＩ：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（ＩＭｎＡｇ）
ＴＥＳ：Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤
ＴＸ−１００：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤／オクチルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ製）
Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  Ｔ９０８：酸化エチレンと酸化プロピレンのブロックコポリマーである非イオン性界面活性剤（ＢＡＳＦ社製）
【００８９】
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら説明してきたが、本発明の精神及び範囲内で種々の置換や変更が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３の結果を示すグラフである。
【図２】実施例４の結果を示すグラフである。
【図３】実施例５の結果を示すグラフである。
【図１】
0003545536.tif 000021
【図２】
0003545536.tif 000022
【図３】
0003545536.tif 000023