(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインを分解することにより得られるカゼインホスホペプチドと陽イオン交換樹脂を接触させて前記カゼインホスホペプチドから金属イオンを分離する工程、及び該工程により得られた脱金属イオンカゼインホスホペプチドとカルシウム塩とを反応させて、脱金属イオンカゼインホスホペプチドにカルシウムイオンを導入する工程を含む、カルシウム及びリンの利用性が改善されたカルシウム含量が５０〜８０ｍｇ／ｇであるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物の製造方法。
【請求項２】
脱金属イオンカゼインホスホペプチドとカルシウム塩との反応をｐＨ４．０〜８．０で行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
カルシウム−カゼインホスホペプチド調製物が、Ｎ／Ｃａ比が重量基準で１〜３であり、Ｃａ／Ｐ比が重量基準で１〜３である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
カゼインが全カゼインである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項５】
カゼインが分画カゼインの少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項６】
カルシウム塩が、水酸化カルシウム又は炭酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか一つに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法により得られるカルシウム含量が５０〜８０ｍｇ／ｇであるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法により得られるカルシウム含量が５０〜８０ｍｇ／ｇであるカルシウムカゼインホスホペプチド調製物を含む骨塩減少抑制食品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法により得られるカルシウム含量が５０〜８０ｍｇ／ｇであるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物を含む骨塩減少抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、カルシウム及びリンの利用性が改善されたカルシウム−カゼインホスホペプチドの製造方法、骨塩減少抑制食品、及び骨塩減少抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カゼインホスホペプチド（以下、ＣＰＰという。）は、乳蛋白カゼインをトリプシンで分解したペプチドであり、カルシウム吸収促進作用を示すＣＰＰの製造方法については、特開昭５８−１７０４４０  号公報、特開昭５９−１５９７９３  号公報等に開示されている。また、同様の効果を示すその他のカゼインペプチドが特開平４−２６４１００号公報、特開平６−７０７２６  号公報等に開示されている。
【０００３】
ところが、ＣＰＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕ  の実験においてカルシウム吸収促進作用を示すことは証明されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏ  においての効果については未だ議論のあるところである。食餌中のカルシウムはその起源や共存する食餌成分の影響により多様な吸収性を示すことは数多く報告されている。また、カルシウム塩単独としてみた場合でもその吸収性は様々であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ  においてＣＰＰによるカルシウム吸収促進作用を証明することは難しい面がある。
【０００４】
ところで、現代の高齢化社会においては、特に、成長期以降の加齢に伴う原因不明の骨塩減少と、それによる易骨折性や腰背痛等の臨床像を呈する症候群として、退行期骨粗鬆症が注目されてきている。しかしながら、これら骨粗鬆症の患者への対症療法に使用可能な十分に効果のあるカルシウム含有食品や医薬品は未だ提供されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、生体内における骨塩減少抑制作用がより発現し易いカルシウム−ＣＰＰの製造方法、骨塩減少抑制食品及び骨塩減少抑制剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＰＰ製造時に結合したカルシウムなどの金属イオンを一旦除去した後、再度カルシウムと反応させると、溶解性に優れ、かつ安定性の高いカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物を得ることができるという知見を得た。さらに、このようにして得られたカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物は、カルシウム及びＣＰＰ由来のリンの利用性が高く、骨塩形成に有効に作用するという知見を得て本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、カゼインを分解することにより得られるＣＰＰと陽イオン交換樹脂を接触させて前記ＣＰＰから金属イオンを分離する工程、及び該工程により得られた脱金属イオンカゼインホスホペプチドとカルシウム塩とを反応させて、脱金属イオンカゼインホスホペプチドにカルシウムイオンを導入する工程を含む、カルシウム及びリンの利用性が改善されたカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物の製造方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、上記製造方法により得られるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物を提供する。
更に、本発明は、上記製造方法により得られるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物を含む骨塩減少抑制食品を提供する。
更に、本発明は、上記製造方法により得られるカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物を含む骨塩減少抑制剤を提供する。
【０００９】
以下、本発明のカルシウム−カゼインホスホペプチド調製物（以下、カルシウム−ＣＰＰ調製物という。）の製造方法を具体的に説明する。
原料のカゼインとしては、全カゼイン、分画カゼインのいずれも使用することができる。ここで、全カゼインとは、全乳や脱脂乳から調製した酸カゼイン、ナトリウムカゼイン、カルシウムカゼイン及びレンネットカゼインをいう。また、分画カゼインは、上記全カゼインから分離されたαカゼイン（αｓ、κ及びλカゼインに分別される。）、βカゼイン及びγカゼインをいい、これらは１種単独でも２種以上の組み合わせでも使用可能である。分画カゼインの調製法としては、例えば、全カゼインから尿素分画法によりαカゼインとβカゼインを分離する方法（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ３５，  ２７２（１９５２））、カルシウム塩添加により全カゼインからκカゼインを得る方法（Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  ４３，  ３９７  （１９７８））、全カゼインから得られたκカゼインを加水分解してβカゼインを得る方法  （特表平６−５０１４５５号公報）  等が知られている。分離カゼインの中で、本発明においては、αｓ、κ及びβカゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種を使用するのが好ましい。
【００１０】
カゼインを分解することによるＣＰＰの製造は、従来公知の方法により行うことができる。例えば、以下の方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。まず、カゼイン溶液をトリプシンを用いてｐＨ８．０、３７℃で２０時間加水分解する。次いで得られた反応混合液のｐＨを４．６に調節し、遠心分離により沈殿を除去する。得られた上澄み液に塩化カルシウム溶液を、カルシウムイオンが２０ｍＭとなるように添加し、さらに、等量のエタノールを添加する。生成した沈殿を遠心分離により回収し、乾燥することによりＣＰＰが得られる。
【００１１】
本発明においては、上記のようにして得られたＣＰＰと、陽イオン交換樹脂とを接触させて、該ＣＰＰから、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄等の金属イオンを分離除去する。ＣＰＰと陽イオン交換樹脂との接触方法としては、ＣＰＰの水溶液と陽イオン交換樹脂を容器内で混合後（この場合、ｐＨは通常２．０〜７．０になる。）、陽イオン交換樹脂を除去する方法や、陽イオン交換樹脂を充填したカラムにＣＰＰの水溶液を通液する方法が挙げられる。
【００１２】
次に、上記の陽イオン交換樹脂との接触により金属イオンが分離除去されたＣＰＰ（以下、脱金属イオンＣＰＰという。）と、カルシウム塩とを反応させることにより、脱金属イオンＣＰＰにカルシウムイオンを導入する。脱金属イオンＣＰＰとカルシウム塩との反応は、例えば、イオン交換水に脱金属イオンＣＰＰを懸濁した液に、カルシウム塩を添加・混合することにより行う。また、その際、反応液のｐＨは４．０以上であるのが好ましく、更に４．０〜８．０の範囲であるのが好ましい。ｐＨが低すぎると、脱金属イオンＣＰＰの溶解性が低いために反応性が低下する。従って、添加するカルシウム塩の種類、量により、必要に応じて、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸等を用いて反応液のｐＨを４．０以上に調整するのが好ましい。また、カルシウム塩としては、例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム等の食品添加物として通常使用されているカルシウム塩が挙げられるが、上記反応を好ましくはｐＨ４．０以上で行うという点を考慮すれば、水酸化カルシウム及び炭酸カルシウムを用いるのが好ましい。このようにしてカルシウムイオンを導入した後、例えば、凍結乾燥することによりカルシウム−ＣＰＰ調製物が得られる。
【００１３】
上記のようにして得られたカルシウム−ＣＰＰ調製物のカルシウム含量は、通常、該調製物１０ｇ当たり、５００〜８００ｍｇと高い。また、該調製物は、安定性が高く、溶解性に優れる。そして、かかる調製物は、カルシウム及びリンの利用性が高く、骨塩形成に有効に作用する。特に、かかる調製物のＮ／Ｃａ比が重量基準で１〜３であり、Ｃａ／Ｐ比が重量基準で１〜３である場合、カルシウム及びリンの利用性が高く、骨塩形成に有効に作用する。
従って、上記カルシウム−ＣＰＰ調製物は、機能性食品又は健康食品として利用することにより、成人、老人などの骨粗鬆症に罹患した人や、罹患しやすい人をはじめとして、乳幼児や成長期の子供、青年に対しても骨塩減少抑制作用、骨塩形成促進作用を示す。また、動物の飼料の添加物としても有用である。
【００１４】
更に、上記カルシウム−ＣＰＰ調製物は、骨粗鬆症やカルシウム吸収不全、その他代謝性骨疾患の患者用の骨塩減少を抑制し、骨塩形成を促進するための医薬品としても有用である。その場合、上記カルシウム−ＣＰＰ調製物を製剤化して経口的に投与する。剤形の例としては、溶液、懸濁液、カプセル剤、粉末、顆粒、細粒、錠剤等が挙げられる。また、製剤化する場合には、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の添加剤を使用することができる。製剤の投与量は、通常、成人１日当たり、調製物重量にして、５０〜４００ｍｇ  ／ｋｇ（体重）の範囲（Ｃａが３〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重））が適当である。
【００１５】
【実施例】
（実施例１）
カルシウム−ＣＰＰ調製物の製造例１
乳酸カゼイン（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｄａｉｒｙ  Ｂｏａｒｄ  製）５．０ｋｇを５５℃の水９５．０ｋｇに分散させた後、水酸化カルシウムを徐々に添加してｐＨ７．８とした。次に、トリプシン（Ｎｏｖｏ社製）５０．０ｇを添加した後、水酸化カルシウムを用いてｐＨを７．８に維持しながら５０℃で４時間加水分解を行った。その後、得られた反応混合液を３０℃まで冷却して、５０％乳酸溶液を添加してｐＨ４．６とした。生成した沈殿をセパレーター（α・ラバル社製）にて除去した。得られた上澄み液９１．２ｋｇを陰イオン交換体（富士紡績社製、Ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ）  ６Ｌと混合し、１０℃で２０分間保持した。濾過により陰イオン交換体を回収し、該陰イオン交換体を洗浄した後、水酸化カルシウム水溶液を添加してｐＨ８．０で４５分間保持し、吸着していたＣＰＰを溶出させた。溶出液を減圧濃縮した後電気透析処理により脱塩し、次いで噴霧乾燥することによりＣＰＰ粉末８３０ｇを得た。
【００１６】
上記のようにして得られたＣＰＰを５．０％（ｗ／ｗ）  の濃度で水に溶解して水溶液１０．０ｋｇとし、その水溶液に、活性化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオン、三菱化成社製）２．３ｋｇを添加・混合した。次いで、溶液のｐＨが２．０になったところで陽イオン交換樹脂を濾過により除去し、濾液を凍結乾燥した。このようにして得られた脱金属イオンＣＰＰをイオン交換水に５．０％（ｗ／ｗ）  の濃度で懸濁した懸濁液２．０ｋｇに、室温に保持しながら、攪拌下に水酸化カルシウム１１．５ｇを添加・混合し（ｐＨ６．８）、続いてこれを凍結乾燥してカルシウム−ＣＰＰ調製物１０８ｇを得た。得られた調製物の組成を表１に示す。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
（実施例２）
カルシウム−ＣＰＰ調製物の製造例２
乳酸カゼイン（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｄａｉｌｙ  Ｂｏａｒｄ  製）４．０ｋｇを６．６Ｍ尿素溶液４１ｋｇに混合し、室温で溶解させた。得られた溶液に水１６．５ｋｇを添加して尿素の濃度を４．６Ｍとし、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分間）により上澄み５２ｋｇを得た。この上澄み５２ｋｇに水２０ｋｇを添加して尿素の濃度を３．３Ｍとし、前記と同様の遠心分離により上澄み６９ｋｇを得た。この上澄み６９ｋｇに水６５ｋｇを添加して尿素濃度１．７Ｍの溶液とした後、０．１Ｎ塩酸溶液を用いてｐＨ４．７に調整した。この溶液を遠心分離して得られた沈殿を、４．６Ｍ尿素溶液２０ｋｇに再度溶解させた。以下、前記と同様に加水することにより尿素の濃度を３．３Ｍとし、遠心分離により上澄み４５ｋｇを得た。この上澄み４５ｋｇに加水して尿素の濃度を１．７Ｍとした後、０．１Ｎ塩酸溶液にてｐＨを４．７に調整した。この溶液を遠心分離することにより得られた沈殿を、水、メタノール、アセトンの順で洗浄した後、自然乾燥した。こうして、βカゼイン  ５００ｇが得られた。
【００１９】
得られたβカゼイン４００ｇを蒸留水３８００ｇに溶解し、溶液のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて８．０に調整した。次いでトリプシン（Ｎｏｖｏ社製）４００ｍｇを添加した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ８．０に維持しながら、３７℃で２４時間加水分解を行った。その後、得られた反応混合液を１Ｎ塩酸溶液にてｐＨ４．６とし、次いで遠心分離により沈殿を除去した。得られた上澄み液８２００ｍｌに対し、１Ｍ塩化カルシウム溶液１７０ｍｌを混合し、さらにエタノール８３７０ｍｌを添加混合した。生成した沈殿を遠心分離によって分離し、該沈殿を５０％エタノール及び９７％エタノールで順次洗浄した後、凍結乾燥することにより、βＣＰＰ２８ｇを得た。
【００２０】
上記のようにして得られたβＣＰＰを５．０％（ｗ／ｗ）  の濃度で水に溶解して水溶液５００ｇとし、その水溶液に、活性化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオン、三菱化成株式会社製）１１５．０ｇを添加・混合した。次いで、溶液のｐＨが２．０５になったところで陽イオン交換樹脂を濾過により除去した後、凍結乾燥し、脱金属イオンＣＰＰ２１．５ｇを得た。このようにして得られた脱金属イオンβＣＰＰの２０．０ｇをイオン交換水に５．０％（ｗ／ｗ）  の濃度で懸濁した懸濁液４００ｇに、室温に保持しながら、攪拌下に水酸化カルシウム３．０ｇを添加・混合し（ｐＨ６．８）、続いてこれを凍結乾燥してカルシウム−ＣＰＰ調製物２１．０ｇを得た。得られた調製物の組成を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
（実施例３）
製剤例
錠剤の製造
実施例２で調製したカルシウム−βＣＰＰ調製物８００重量部と、乳糖１７０重量部とを混合した後、５０％エタノール１００ｍｌを添加して、混練した。得られた混練物を押出式造粒機を用いて顆粒化し、熱風乾燥機にて７０℃で２時間乾燥した。次いで、得られた乾燥顆粒にショ糖脂肪酸エステル（ＤＫエステルＦ２０Ｗ、第一工業製薬社製）３０重量部を混合し、打錠機にて直径５ｍｍ、１個当たり１００ｍｇの錠剤を作製した。得られた錠剤１０錠中のカルシウム含量は５８ｍｇ、リン含量は２９ｍｇであった。
【００２３】
（実施例４）
骨密度低下抑制試験
閉経後骨粗鬆症のモデル動物として、卵巣摘除術を施した５８週齢Ｗｉｓｔｅｒ系雌ラットを用いて本発明のカルシウム−ＣＰＰ調製物の骨密度低下抑制効果を調べた。
実施例１で調製したカルシウム−ＣＰＰ調製物を８．３重量％の割合で配合したラット用粉末飼料を調製した。該飼料中のカルシウム含量は０．５重量％であり、カルシウムはすべて上記カルシウム−ＣＰＰ調製物に由来するものである。また、該飼料中のリン含量は０．４重量％であり、その６２．５％が上記カルシウム−ＣＰＰ調製物に由来するものである。更に、ミネラル以外の成分は、ＡＩＮ−７６（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  １０７，  １３４０−１３４８  （１９７７））  に準じて調製した。
【００２４】
上記飼料を卵巣摘除術（ＯＶＸ）  を施した５８週齢Ｗｉｓｔｅｒ系雌ラット（７匹）に与えて１６週間飼育し、この間、大腿骨の骨塩量を、二重エネルギーＸ線吸収法による骨密度測定装置（アロカ社製、ＤＣＳ−６００）にて経時的に測定した。その結果を図１に示す。尚、図１は、試験開始前の各ラットの大腿骨の骨密度を１００％とした場合の、各週における各ラットの大腿骨の骨密度の相対値の平均値±標準誤差をプロットしたものである。
また、対照として、炭酸カルシウムをカルシウム源とし、卵アルブミンを蛋白源とする飼料を与えた卵巣摘除術（ＯＶＸ）  を施した５８週齢Ｗｉｓｔｅｒ系雌ラット（７匹）についても上記と同様に大腿骨の骨密度を経時的に測定した。その結果を図１に示す。
【００２５】
更に、上記対照飼料を与えた偽手術（ＳＨＡＭ）ラット（７匹）についても上記と同様に大腿骨の骨密度を経時的に測定した。その結果を図１に示す。
上記の結果から、対照飼料を与えたＯＶＸラット群の骨密度は、試験期間中低下し続けたのに対し、カルシウム−ＣＰＰ調製物を含む飼料を与えたＯＶＸラットでは骨密度低下抑制効果が認められ、これは、対照飼料を与えたＳＨＡＭラットとほぼ同等であった。特に、飼育４、１２、１６週では対照飼料を与えたＯＶＸラットとの間に統計学的に有意な差が認められた。
【００２６】
また、各ラットの飼育１６週間後の大腿骨のカルシウム含量及びリン含量を測定したところ、カルシウム−ＣＰＰ調製物を含む飼料を与えたＯＶＸラットのカルシウム含量及びリン含量は、対照飼料を与えたＳＨＡＭラットと比較して低値であったが、対照飼料を与えたＯＶＸラットとの間に統計学的に有意な差が認められた（図２参照）。
【００２７】
（実施例５）
急性毒性試験
７週齢の雌雄ＳＤラット６匹を用いて、実施例１で調製したカルシウム−ＣＰＰ調製物の３０％蒸留水懸濁液の経口投与１回による急性毒性試験を実施した。かかる懸濁液を２０ｇ／ｋｇ（体重）の用量で強制投与して１４日間観察したが、すべて正常な成長を示し、死亡例はなかった。また、異常所見も認められなかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、カルシウム含量が高く、しかもカルシウム及びリンの利用性が高く、骨塩形成に有効に作用するカルシウム−ＣＰＰ調製物が得られる。この調製物は、機能性食品又は健康食品として利用することにより、成人、老人をはじめ乳幼児や成長期の子供、青年の骨塩減少抑制作用や骨塩形成促進作用を示す。また、動物の飼料の添加物としても有用である。更に、かかる調製物は、骨粗鬆症やカルシウム吸収不全その他代謝性骨疾患の患者用の骨塩減少抑制、骨塩形成促進のための医薬品としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４における、ラットの大腿骨の骨密度の経時変化を示す図である。
【図２】実施例４における、ラットの大腿骨のカルシウム含量及びリン含量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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