(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)   配列番号１乃至１９に表示された塩基配列を有する、１９種のプローブを具備するＤＮＡチップと、
(ii)  臨床試料から得られたＤＮＡをＰＣＲによって増幅させるためのプライマーと、
(iii)  前記ＤＮＡチップのプローブと試料のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するための標識手段
とを含むヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の遺伝子型分析キット。
【請求項２】
前記プローブの位置を知らせる基準マーカーを追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キット。
【請求項３】
プライマーは配列番号２２の塩基配列を有するＧＰ５+、配列番号２３の塩基配列を有するＧＰ６+、配列番号２４の塩基配列を有するＧＰ５ｄ+及び配列番号２５の塩基配列を有するＧＰ６ｄ+であることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キット。
【請求項４】
前記標識手段はビオチンであることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キット。
【請求項５】
ストレプトアビジン-Ｒ-フィコエリトリンをビオチン-結合物質とすることを特徴とする、請求項４に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キット。
【請求項６】
（i）配列番号１乃至１９に表示された塩基配列を有する、１９種のＤＮＡプローブを調製する工程;
（ii）前記調製されたＤＮＡプローブをアルデヒドが結合されたガラス表面に結合させる工程;及び、
（iii）前記ＤＮＡプローブが結合されたガラス表面にアミンと結合せず残っているアルデヒドを還元させる工程を含むＤＮＡチップの製造方法。
【請求項７】
ガラス表面に結合したアルデヒドと反応するＤＮＡプローブの濃度は１００乃至３００ｐｍｏｌ/μｌであることを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項８】
ＤＮＡプローブとアルデヒドが結合されたガラス表面の結合は３０乃至４０℃、７０乃至１００％の条件でアミンとアルデヒドのシッフ塩基反応によって行われることを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項９】
アルデヒドの還元は還元剤であるＮａＢＨ4を使用して行われることを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項１０】
（i）請求項１に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キットのプライマーを使用して、検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる段階;
（ii）前記増幅されたＤＮＡを請求項１に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キットのＤＮＡチップに適用し、増幅されたＤＮＡとプローブをハイブリダイゼーションさせる段階;及び、
（iii）プローブとハイブリダイゼーションされたＤＮＡを請求項１に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キットの標識手段として標識付け、これを検出する段階を含むヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キットを利用したヒト乳頭腫ウイルス感染の診断方法。
【請求項１１】
試料から採取したＤＮＡの増幅はビオチン-１６-ｄＵＴＰを使用したポリメラーゼ連鎖反応で行われることを特徴とする、請求項１０に記載のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キットを利用したヒト乳頭腫ウイルス感染の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断するための遺伝子型分析キットに関する。より具体的に、本発明はＤＮＡチップを使用してヒト乳頭腫ウイルスに感染した患者の遺伝子型を分析するヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型分析キット及び前記分析キットを使用して患者の遺伝子型を分析することによって、ヒト乳頭腫ウイルスの感染の有無を診断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
子宮癌には子宮頚部癌、子宮内膜癌、子宮体部癌などがあるが、このうち子宮頚部癌の場合は毎年全世界的に約４５万名、韓国の場合約６，０００名の新たな患者が発生している。子宮頚部癌は韓国女性癌の２２．１％に達し（上皮内癌包含）、発生率１位、死亡率２位を占めて、子宮頚部癌の予防、診断及び治療は女性保健において重要な問題と見なされている。
【０００３】
子宮頚部癌は子宮頚部上皮内腫瘍という癌前段階を経て進行するが、ヒト乳頭腫ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ；以下、ＨＰＶと言う）の感染が子宮頚部腫瘍の発生に重要な役割をすると知られている。特に、特定遺伝子型のＨＰＶに感染された場合に、腫瘍に進行する可能性はさらに高まる。ＨＰＶが子宮頚部癌の主要原因として明らかになってから、現在までＨＰＶは７０余種類の遺伝子型が発見され、病巣の位置と病変の進行程度によって各々特異なＨＰＶ遺伝子型が選択的に発見されて、ＨＰＶ感染の生物学的特徴の多様性を認識するようになった。生殖器感染ＨＰＶ遺伝子型のうち１０個以上が高危険群に分類されて子宮頚部癌と関連があると知られているので、ＨＰＶ感染の生物学的特徴の多様性が子宮頚部癌の診断と予防に重要な意味をもつということを暗示している。
【０００４】
子宮頚部癌の最も簡単な早期診断法は病理細胞学的検査である子宮頚部細胞診検査（細胞診）であって、子宮表面の老化した細胞を採集、染色して上皮細胞核の周辺に核周囲にハロー（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｈａｌｏ）を見せるコイロサイトシス（ｋｏｉｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）などの特徴的な病理所見で診断する方法であるが、その診断率が１乃至１５％と低く、診断上多くの制限があって、これを補完するために膣拡大鏡診を施行してＨＰＶ感染を７０％まで診断することができるが、設備が高価であるため、高度に熟練した判読者が必要であり、悪性化危険度が他のＨＰＶ遺伝子型を分類できないという短所があった。これにより子宮頚部癌先駆病変の診断のための選別検査または子宮頚部細胞検査の補助的手段としてＨＰＶの存在と遺伝子型を確認する技法に関する研究が持続的に進められている実情である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記ＨＰＶの存在及び遺伝子型の確認方法は大きくＨＰＶ ＤＮＡの直接確認法とＨＰＶ ＤＮＡの増幅を利用する方法に分けられる。ＨＰＶ ＤＮＡの直接確認法としては液体ハイブリダイゼーション（ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｂｙ Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）、ＨＰＶのタイプ特異プローブ（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ）を利用したサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）及びドットブロット（Ｄｏｔ ｂｌｏｔ）、フィルターインシチューハイブリダイゼーション（Ｆｉｌｔｅｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＦＩＳＨ）などがあり、ＨＰＶ ＤＮＡの増幅を利用する方法としてはタイプ−特異ＰＣＲ（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ゼネラル−プライマーＰＣＲ（ｇｅｎｅｒａｌ−ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）などがあり、特にゼネラルプライマーセット（Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ）を利用して増幅されたＨＰＶ ＤＮＡはドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏｔ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、マイクロタイタープレートハイブリダイゼーション（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、またはラインプローブ分析（ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）等の方法によって遺伝子型を検索することが一般的に行われている。しかし、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）にオリゴヌクレオチドプローブを固定して２０余種類のタイプを検索するラインプローブ分析は検出感度が低くデータの解釈が不明確であって信頼性が低いという短所がある。また、商品化されているハイブリッドキャップチャーキット（Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ， Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ， ＭＤ， ＵＳＡ， ｗｗｗ．ｄｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ）はＨＰＶ ＤＮＡを試料から容易に分離してＰＣＲ増幅過程を通さずに検索することができるが、当該ＨＰＶ ＤＮＡが高危険群に属しているか低危険群に属しているかだけが分かるに過ぎず、正確な遺伝子型判別が不可能であるので、高危険群の中でも癌発生率と相関関係が非常に高いタイプを他の高危険群（中危険群（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｇｒｏｕｐ）と言ることができる）と区別できず、ＲＮＡプローブを利用するため安定性が低く汚染可能性を排除できない問題点がある。
【０００６】
従って、簡単な方法で患者の遺伝子型を分析して、ＨＰＶ感染の有無を診断し、感染したＨＰＶの種類を正確に判別できる方法を開発しなければならない必要性が絶えず台頭していた。
【０００７】
本発明者等は簡単な方法で患者の遺伝子型を分析してＨＰＶ感染の有無を診断し、感染したＨＰＶの種類を正確に判別できる方法を確立するために鋭意研究努力した結果、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合できるプローブを含むＤＮＡチップ、試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ方法で増幅させるためのプライマー及び前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼーションされる増幅されたＤＮＡを探知するための標識手段を含むＨＰＶの遺伝子型分析キットを製作し、前記分析キットを使用して患者の試料から採取したＤＮＡの遺伝子型を分析することによって、ＨＰＶ感染の有無を迅速で正確に診断できるだけでなく、感染したＨＰＶの種類を判別することができることを確認し、本発明を完成した。
【０００８】
結局、本発明の主な目的は、ＨＰＶの感染を診断するための遺伝子型分析キットを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ＨＰＶの遺伝子型分析キットに含まれたＤＮＡチップの製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記分析キットを使用してＨＰＶ感染の有無を診断する方法を提供することにある。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＨＰＶの感染を診断するための遺伝子型分析キットはＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合できる塩基配列を有するプローブを含むＤＮＡチップ、試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ方法で増幅させるためのプライマー及び前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼーションされる増幅されたＤＮＡを探知するための標識手段を含む。この時、ＤＮＡチップはプローブの位置を知らせる基準マーカー（ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むすることもでき、標識手段が特別に制限されることはないが、ビオチン−結合物質が含まれた標識手段で染色または標識付けすることが望ましく、特にビオチン−結合蛋白質が含まれた蛍光物質であるストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）を使用することが最も望ましい。
【００１２】
一方、前記ＨＰＶの遺伝子型分析キットに含まれたＤＮＡチップの製造方法は、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合できる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する工程、前記調製されたＤＮＡプローブをアルデヒドが結合された固体の表面に結合させる工程、及び前記ＤＮＡプローブが結合された固体表面に存在するアミンと結合しないで残ったアルデヒドを還元させる工程とを含む。
【００１３】
以下、本発明のＤＮＡチップの製造方法を工程別に分けて、より具体的に説明する。
【００１４】
第１工程：プローブの調製
ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合できる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する。この時、プローブはＨＰＶのＤＮＡの塩基配列、好ましくはＨＰＶのＬ１ ＤＮＡと相補的に結合する塩基配列を有するように設計及び合成され、合成された塩基配列が固体の表面に結合できるように塩基配列の５’末端にアミン基を結合させてプローブを調製する。
【００１５】
第２工程：プローブの固定化
前記調製されたＤＮＡプローブをアルデヒドが結合した固体の表面に結合させる。この時、固体は特別に制限されるわけではないが、ガラスであるのが好ましく、固体表面のアルデヒドはプローブの５’に結合されたアミンと３０乃至４０℃、７０乃至１００％の湿度条件でシッフ塩基反応（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｂａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行って固体表面にプローブを結合させる。この時、プローブの濃度は１００乃至３００ｐｍｏｌ／μｌが好ましく、２００ｐｍｏｌ／μｌが最も好ましい。
【００１６】
第３工程：ＤＮＡチップの製造
前記ＤＮＡプローブが結合された固体表面でアミンと結合しないアルデヒドを還元させて、ＤＮＡチップを製造する。この時、アルデヒドの還元条件が特別に制限されるわけではないが、ＮａＢＨ４などの還元剤を使用するのが好ましい。
【００１７】
前記方法で製造されたＤＮＡチップを含むＨＰＶの遺伝子型分析キットを利用したＨＰＶ感染の診断方法は、ＨＰＶの遺伝子型分析キットのプライマーを用いて検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる段階、前記増幅されたＤＮＡをＤＮＡチップに適用して、増幅されたＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーション反応を行う段階、及びプローブとハイブリダイゼーションしたＤＮＡを標識手段で標識付けし、これを検出する段階とを含む。
【００１８】
以下、本発明のＨＰＶ遺伝子型分析キットを利用したＨＰＶ感染有無の診断方法を段階別に分けてより具体的に説明する。
【００１９】
第１工程：試料ＤＮＡの増幅
ＨＰＶ遺伝子型分析キットのプライマーを用いて検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる。この時、増幅された試料がビオチンを含有するためにビオチン−１６−ｄＵＴＰを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅試料を得る。
【００２０】
第２工程：ハイブリダイゼーション
前記増幅されたＤＮＡをＤＮＡチップに適用して、増幅されたＤＡＮとプローブのハイブリダイゼーション反応を行う。
【００２１】
第３工程：検出
プローブとハイブリダイゼーションされたＤＮＡを標識手段で標識付けし、これを検出して、ＨＰＶ感染の有無を判断する。この時、標識手段はストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを使用することが好ましいが、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンは吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）が非常に高いフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と四つのビオチン−結合部位を有する蛋白質のコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であって、ＤＮＡチップをコンフォーカルレーザースキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）でスキャンした時、ハイブリダイゼーションが起こった位置を高感度で検出できるようにする。
【００２２】
従って、本発明のＨＰＶ遺伝子型診断キットを使用して、ＨＰＶ感染の有無を診断する場合、迅速で正確にＨＰＶ感染の有無を診断できるだけでなくＨＰＶの種類判別もできるので、子宮頚部癌の早期診断、予防及び治療に寄与することができる。
【００２３】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、専ら、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨にしたがって本発明の範囲がこれら実施例に制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明なことである。特に、下記の実施例では１９個のプローブが固定されたＤＮＡチップを製造したが、プローブの種類及び個数が特別に制限されるわけではないので、ＨＰＶから誘導された塩基配列を有するプローブを利用したＤＮＡチップ及び前記ＤＮＡチップを利用した各種の分析キットまた発明の範疇に属すると見るべきである。
【００２４】
実施例１：ＤＮＡチップの製造
ＨＰＶを１３種類の高危険群（ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６）と６種類の低危険群（ＨＰＶタイプ６、１１、３４、４０、４２、４４）に分類し、ＨＰＶ遺伝子型検出のために用いられた各ＨＰＶ遺伝子型に特異なプローブは５´末端にアミン基が含まれるように調製した。
【００２５】
各プローブの塩基配列は次の通りである：
0003583757.tif 000002
【００２６】
前記調製されたそれぞれのプローブを３Ｘ ＳＳＣ（０．０５ Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ０．４５ Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．０）に２００ｐｍｏｌ／μｌになるように溶解させ、アルデヒド基が結合されたスライド（ｓｉｌｙｌａｔｅｄ ｓｌｉｄｅ， ＣＳＳ−１００， ＣＥＬ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）表面にチップ作製装置（ＧＭＳ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ， 宝酒造（株））を利用して大きさ１５０μｍ、間隔３００μｍでスポッティングし、次に、３７℃、湿度７０％以上の条件で４時間のシッフ塩基反応を行った。次に、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ， ＳＤＳ）溶液でスライドを洗浄して、３次蒸溜水で洗浄してから、ＮａＢＨ４溶液（０．１ｇ ＮａＢＨ４， ３０ｍｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）， １０ｍｌ ｅｔｈａｎｏｌ）に５分間浸漬してアミンが結合されていないアルデヒドを還元させた後、３次蒸溜水で洗浄し乾燥させてＤＮＡチップを製造した。
【００２７】
実施例２：試料の調製
ヒトの子宮頚部組織（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂｓ）がＨＰＶに感染されたか否かを確認するために、まず、前記組織でＤＮＡを抽出して、精製した。前記精製されたＤＮＡを鋳型として、ベータ−グロビンプライマー（β−ｇｌｏｂｉｎ ｐｒｉｍｅｒ）ＰＣ０３：５’−ａｃａｃａａｃｔｇｔｇｔｔｃａｃｔａｇｃ−３’（配列番号２０）及びＰＣ０４：５’−ｃａａｃｔｔｃａｔｃｃａｃｇｔｔｃａｃｃ−３’（配列番号２１）を利用してポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ）を行い、ベータ−グロビン遺伝子が増幅されたＤＮＡを選別して検索試料として使用した。
【００２８】
また、ＨＰＶタイプ６、１１、４０、４５及び５１（Ｄｒ． Ｅｔｈｅｌ−Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｔｕｍｏｒｖｉｒｏｌｏｇｉｅ， Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ， Ｉｍ Ｎｅｕｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｅｌｄ ２４２， ６９００９ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＨＰＶタイプ３５、４４及び５６（Ｄｒ． Ａｔｔｉｌａ Ｌｏｒｉｎｃｚ， Ｖｉｃｅ Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ， Ｒ＆Ｄ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ， Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ２３０１−Ｂ Ｂｒｏａｄｂｉｒｃｈ Ｄｒｉｖｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， ＭＤ ２０９０４， ＵＳＡ）；タイプ４２、５８及び５９（Ｄｒ． Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｍａｔｓｕｋｕｒａ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｔｏｋｙｏ １６２， Ｊａｐａｎ）；及び、タイプ３３、３４、３９、５２及び６６（Ｄｒ． Ｇｅｒａｒｄ Ｏｒｔｈ， Ｕｎｉｔｅ Ｍｉｘｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ／ＩＮＳＥＲＭ（Ｕ．１９０）， Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５， Ｆｒａｎｃｅ）のプラスミドＤＮＡを検索試料として使用した。
【００２９】
同時に、韓国細胞株銀行で購入したＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６， ＫＣＬＢ ３００３５， Ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ｃｅｒｖｉｘ）及びＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ１８， ＫＣＬＢ １０００２， Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌ’ｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ｃｅｒｖｉｘ）から抽出及び精製されたＤＮＡを陽性対照群として使用した。
【００３０】
前記選別されたＤＮＡを鋳型として使用し、ＧＰ５＋：５’−ｔｔｔｇｔｔａｃｔｇｔｇｇｔａｇａｔａｃｔａｃ−３’（配列番号２２）、ビオチンが結合されたＧＰ６＋（Ｂｉｏ−ＧＰ６＋）：５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ｇａａａａａｔａａａｃｔｇｔａａａｔｃａｔａｔｔｃ−３’（配列番号２３）、ＧＰ５＋を変形したＧＰ５ｄ＋：５’−ｔｔｔｋｔｔａｃｈｇｔｋｇｔｄｇａｔａｃｙａｃ−３’（配列番号２４）及びＧＰ６＋を変更したＧＰ６ｄ＋：５’−ｇａａａｈａｔａａａｙｔｇｙａａｄｔｃａｔａｙｔｃ−３’（配列番号２５）をプライマーとして用いたＰＣＲを遂行して増幅された試料を得た。この時、ｋはｇまたはｔであり、ｈはｔ、ａまたはｃであり、ｄはａ、ｔまたはｇであり、ｙはｔまたはｃである。
【００３１】
実施例２−１：陽性対照群試料の調製
前記精製されたＨＰＶ１６とＨＰＶ１８のＤＮＡを鋳型とし、ＧＰ５＋及びＢｉｏ−ＧＰ６＋をプライマーとして用いてＰＣＲを次の通りに行った：ＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ， ４ｍＭ ＭｇＣｌ２， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．３）、０．１μｇのＤＮＡ、４．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各５０ｐｍｏｌのプライマー、４０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３０μＭのｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０μＭのビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ ＧｍＢＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１ユニットタクポリメラーゼ（ｕｎｉｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， 宝酒造（株））を含む５０μｌの反応混合物をＰＣＲサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）に入れて、９４℃で１分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、４０℃で２分間プライマー結合（ｐｒｉｍｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で１分３０秒間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）過程を４０回繰り返して、ビオチンが結合された増幅されたＤＮＡ試料を得た。
【００３２】
実施例２−２：ＨＰＶ標準試料の調製
前記調製した各種ＨＰＶのプラスミドＤＮＡを鋳型とすることを除いては、実施例２−１と同様な方法でビオチンが結合された増幅されたＤＮＡ試料を得た。
【００３３】
実施例２−３：臨床試料からのＤＮＡ試料の調製
前記調製した子宮頚部組織のＤＮＡを鋳型とし、ＧＰ５ｄ＋及びＧＰ６ｄ＋をプライマーとして用い、ＰＣＲの条件が９４℃で１分間変性、５５℃で２分間プライマー結合、７２℃で１分３０秒間伸長過程であることを除いては、実施例２−１と同様な方法でビオチンが結合された増幅されたＤＮＡ試料を得た。
【００３４】
実施例３：ＤＮＡチップを使用した感染有無の確認
前記実施例１で製造したＤＮＡチップに実施例２で得た増幅された試料を適用して、ハイブリダイゼーション反応を次の通りに行った。この時、ハイブリダイゼーション反応室（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）として１００μｌ容量のカバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ， ＧＲＡＣＥ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ， ＵＳＡ， ＰＣ４Ｌ−１．０）を使用した。
【００３５】
陽性対照群とプラスミドＤＮＡの場合は１０μｌの増幅産物、子宮頚部組織のＤＮＡの場合はＨＰＶ増幅産物１０μｌとβ−ｇｌｏｂｉｎ増幅産物５μｌの混合物を反応試料として使用した。前記反応試料に３Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液を１０％（ｖ／ｖ）添加して室温で５分間変性させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２）を５％（ｖ／ｖ）添加して中和させたてから、３Ｎ塩酸を１０％（ｖ／ｖ）添加した後、氷で５分間放置した。次に、試料を６×ＳＳＰＥ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及び０．２％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）でつくったハイブリダイゼーション溶液と混合させた後、ＤＮＡチップにセットした。ハイブリダイゼーション反応は、４０℃で２時間行い、そして３×ＳＳＰＥで２分間、１×ＳＳＰＥで２分間ＤＮＡチップを洗浄し、室温で空気乾燥させた。その後、５μｌストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン抱合体（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ， ｃｏｎｃ． ５０μｇ／ｍｌ）を９５μｌ３Ｘ ＳＳＰＥに混合した溶液をＤＮＡチップと２５分間反応させ、３Ｘ ＳＳＰＥで洗浄した後、コンフォーカルレーザースキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ， ＧＭＳ ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ， ＴａＫａＲａ， Ｊａｐａｎ）を利用して蛍光信号を分析した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８０ ｎｍ， ｅｍｉｓｓｉｏｎ ＞５２０ｎｍ）（参照：図１、図２ａ乃至図２ｍ、図３ａ乃至図３ｆ、図４ａ乃至図４ｌ）。図１はＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図であって、表示された番号はそれぞれのプローブを示し、（◯）は試料と結合できるプローブが結合された部位を示し、（●）はプローブの位置を示すための基準マーカーを示し、項目でｂｇと表示されたものは反応が起こったかどうかを確認するための背景マーカーである。図２ａ乃至図２ｍは高危険群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真である。この時、図２ａはＨＰＶ１６ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｂはＨＰＶ１８ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｃはＨＰＶ３１ ＤＮＡの分析結果を、図２ｄはＨＰＶ３３ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。また、図２ｅはＨＰＶ３５ ＤＮＡの分析結果を、図２ｆはＨＰＶ３９ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｇはＨＰＶ４５ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｈはＨＰＶ５１ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。図２ｉはＨＰＶ５２ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｊはＨＰＶ５６ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｋはＨＰＶ５８ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｌはＨＰＶ５９ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図２ｍはＨＰＶ６６ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。また、図３ａ乃至図３ｆは低危険群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真である。この時、図３ａはＨＰＶ６ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図３ｂはＨＰＶ１１ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図３ｃはＨＰＶ３４ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図３ｄはＨＰＶ４０ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図３ｅはＨＰＶ４２ ＤＮＡの分析結果を示す写真であり、図３ｆはＨＰＶ４４ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。図２ａ乃至図２ｍ及び図３ａ乃至図３ｆから、ＨＰＶプラスミドスタンダード及びＨＰＶ陽性対照区（子宮頚部癌の細胞株）の増幅されたＤＮＡのハイブリダイゼーションシグナルは、有意なクロスハイブリダイゼーションが発生することなく、対応するプローブが明瞭に観察することができた。
【００３６】
実施例４：ＤＮＡチップを使用して臨床試料におけるＨＰＶ感染の検出
本発明のＤＮＡチップを利用したＨＰＶの感染診断結果の正確性を確認するために、同一試料から得たＤＮＡを対象にして、前記ＤＮＡチップを利用した診断方法を行い、また前記ＤＮＡを鋳型として使用して、配列番号２０乃至２５の塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲを行って感染の有無を直接的に確認した。
【００３７】
まず、実施例２−３と同様な方法を使用して、子宮頚部組織から１２４種類の増幅されたＤＮＡを調製した。次に、本発明のＤＮＡチップを使用して増幅されたＤＮＡのＨＰＶ感染の有無を分析し、感染されたと分析されたＨＰＶの種類を判別した。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）方法で前記１２４種類のＤＮＡを増幅させ、制限酵素Ａｖａ ＩＩ、Ａｆａ Ｉ、ＢｇｌＩＩ、Ａｃｃ ＩまたはＡｖａＩで処理してそれぞれのバンドパターンを分析してＨＰＶ感染の有無及び感染されたＨＰＶの６種の類型（ＨＰＶ １６， １８， ３１， ３３， ５２， ５８）を知った後、この６種類に対する各類型の特異な塩基配列を有する断片をプライマーとして用いたＰＣＲを行い、前記１２４種類のＤＮＡを増幅させて、感染したＨＰＶの種類を確認した（参照：Ｔａｅｓｏｏｋ Ｈｗａｎｇ， Ｊ． Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．， １５：５９３−５９９， １９９９；Ｆｕｊｉｎａｇａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：１０３９−１０４４， １９９１）。次に、前記２種類の方法の結果が一致した場合の比率を測定した（参照：図４ａ乃至図４ｌ、表１）。本発明の図４ａ乃至図４ｌは子宮頚部組織で調製したＤＮＡ試料を対象としてＨＰＶ感染の有無を分析した結果を示す写真である。図４ａ乃至図４ｌから見るように、本発明のＤＮＡチップを使用して各試料に感染したＨＰＶの類型を具体的に診断することができた。また、同じ試料を使用して制限酵素処理及びＰＣＲの方法で確認した結果と図４ａ乃至図４ｌで得られた結果を比較した（参照：表１）。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
前記表１で、“ｎｏ ｔｙｐｉｎｇ”と表示されたものはＨＰＶが増幅されたが、ＤＮＡチップで診断されていないことを意味し、“−”はＨＰＶが増幅されていない場合を示す。表１に認められるように、２種類の方法で診断した結果が大部分一致しており、１９種のプライマーを使用したＰＣＲ方法で各検査試料を増幅させて分析した結果、前記制限酵素及びＰＣＲによった診断方法より本発明のＤＮＡチップを利用した分析方法によるＨＰＶ感染有無を診断する方法がさらに正確であることが認められ、本発明のＤＮＡチップを使用した診断成功率は９６．５％であり、９５％の診断再現性を示すことが分かった。たとえ、ＨＰＶ感染を診断するための従来方法である、ハイブリッドキャプチャー（ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ）方法を使用する場合、診断成功率が９８％であったとしても、この方法では感染したＨＰＶの類型を把握できないことを鑑みると、類似した診断成功率で感染したＨＰＶの種類まで同時に把握できる本発明のＨＰＶ遺伝子型分析キットを使用したＨＰＶ感染診断方法が従来の診断方法より非常に優れていることが分かる。
【００４０】
【発明の効果】
以上で詳細に説明して立証したように、本発明はＤＮＡチップを使用してＨＰＶに感染された患者の遺伝子型を分析するＨＰＶの遺伝子型分析キット及び前記分析キットを使用して患者の遺伝子型を分析することによって、ＨＰＶ感染の有無を診断する方法を提供する。本発明のＨＰＶ遺伝子型分析キットはＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合できる塩基配列を有するプローブを含むＤＮＡチップ、試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ方法で増幅させるためのプライマー及び前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼーションされる増幅されたＤＮＡを探知するための標識手段を含み、前記ＨＰＶの遺伝子型分析キットを利用してＨＰＶ感染を診断する方法はＨＰＶの遺伝子型分析キットのプライマーを使用して検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる段階、前記増幅されたＤＮＡをＤＮＡチップに適用して、増幅されたＤＮＡとプローブをハイブリダイゼーションさせる段階、及びプローブとハイブリダイゼーションされたＤＮＡを標識手段で標識付けし、これを検出する段階を含む。本発明の遺伝子型分析キットはＨＰＶ感染の有無を容易に診断できるだけでなく、感染されたＨＰＶの遺伝子型を判別することができるので、子宮頚部癌の早期診断、予防及び治療に寄与することができる。
【００４１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されることがないということは明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項等とそれらの等価物によって定義されると言える。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図である。
【図２ａ】ＨＰＶ１６ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｂ】ＨＰＶ１８ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｃ】ＨＰＶ３１ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｄ】ＨＰＶ３３ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｅ】ＨＰＶ３５ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｆ】ＨＰＶ３９ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｇ】ＨＰＶ４５ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｈ】ＨＰＶ５１ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｉ】ＨＰＶ５２ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｊ】ＨＰＶ５６ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｋ】ＨＰＶ５８ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｌ】ＨＰＶ５９ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図２ｍ】ＨＰＶ６６ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ａ】ＨＰＶ６ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ｂ】ＨＰＶ１１ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ｃ】ＨＰＶ３４ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ｄ】ＨＰＶ４０ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ｅ】ＨＰＶ４２ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図３ｆ】ＨＰＶ４４ ＤＮＡの分析結果を示す写真である。
【図４ａ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号４３の分析結果を示す写真である。
【図４ｂ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号４６の分析結果を示す写真である。
【図４ｃ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号４７の分析結果を示す写真である。
【図４ｄ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号５１の分析結果を示す写真である。
【図４ｅ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号５２の分析結果を示す写真である。
【図４ｆ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号５３の分析結果を示す写真である。
【図４ｇ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号５４の分析結果を示す写真である。
【図４ｈ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号５７の分析結果を示す写真である。
【図４ｉ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号９５の分析結果を示す写真である。
【図４ｊ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号１０７の分析結果を示す写真である。
【図４ｋ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号１１５の分析結果を示す写真である。
【図４ｌ】本発明のＤＮＡチップを使用した試料番号１２４の分析結果を示す写真である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
0003583757.tif 000036
【図２ｇ】
0003583757.tif 000037
【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｊ】
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【図２ｋ】
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【図２ｌ】
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【図２ｍ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図４ｊ】
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【図４ｋ】
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【図４ｌ】
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