(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖受容体となるスフィンゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体とを、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルの存在下に反応させることを特徴とする糖受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はスフィンゴ糖脂質の製造法に関し、更に詳細には２種以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質の効率的な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシン等の長鎖塩基と長鎖脂肪酸と糖とが結合した複合脂質の１種であり、下等動物から高等動物まで広く分布しており、動物中では細胞表層に存在し、各種の認識機構に関与するといわれている。
【０００３】
かかるスフィンゴ糖脂質は、例えばＮ−アシルスフィンゴシンであるセラミドに種々の糖鎖が順次結合して生合成されることが判明している。そして、当該セラミドに代表される糖受容体と、これに反応する糖供与体とは、これら糖受容体と糖供与体の組み合せに特異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用により反応することもまた判明している。このスフィンゴ糖脂質合成酵素としては、ガラクトシルセラミド合成酵素（セラミドとＵＤＰ−ガラクトースとからガラクトシルセラミドを合成する酵素）、グルコシルセラミド合成酵素（セラミドとＵＤＰ−グルコースとからグルコシルセラミドを合成する酵素）、ラクトシルセラミド合成酵素（グルコシルセラミドとＵＤＰ−ガラクトースとからラクトシルセラミドを合成する酵素）、等の外、ＧＤ３合成酵素、ＧＭ２／ＧＤ２合成酵素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成酵素等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このようにスフィンゴ糖脂質は、糖受容体及び糖供与体を原料とし、これらの原料に特異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用により、順次糖が結合していくのであるから、２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を得るためには、糖受容体と、２以上の糖供与体と、２種以上の対応するスフィンゴ糖脂質合成酵素とを作用させればいいはずである。ところが、このような２段階以上の酵素反応は１ポットでは生起せず、２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を製造するためには、１段階目の反応を行い、当該１段階目の反応物を単離した後に２段階目の反応を行わなければならなかった。
【０００５】
従って、本発明の目的は、糖受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を、容易な操作で製造するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、２段階以上の酵素反応を途中の単離操作なしに進行させ、糖受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を効率良く得るべく種々検討した結果、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有させ、当該脂質ベシクルの存在下に糖受容体と２以上の糖供与体とを反応させれば、所望の２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、糖受容体となるスフィンゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体とを、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルの存在下に反応させることを特徴とする糖受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質の製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法は、糖受容体に２以上の糖が結合する２段階以上の酵素反応を連続して行わせようとするものであり、当該反応を触媒する２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有させて用いることを特徴とする。糖受容体は、スフィンゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質であり、スフィンゴ脂質としては、セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）、フィトスフィンゴシン等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、当該スフィンゴ脂質に糖が結合したものであり、ガラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＧＭ４（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＳＭ４（ＨＳＯ３−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、グルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、ラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｇｂ３Ｃｅｒ（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、ＧＭ３（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、ＧＤ３（Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｌｃ３Ｃｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）等が挙げられる。
【０００９】
また、糖供与体としては、糖ヌクレオチドであれば特に制限されないが、ガラクトシルヌクレオチド、グルコシルヌクレオチド、シアリルヌクレオチド、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド等が挙げられる。ここで、ヌクレオチド部としては、ＵＤＰ、ＣＭＰ、ＧＤＰ等が挙げられる。本発明においては、これらの糖供与体の２以上が組み合せて用いられる。例えばグルコースとガラクトースを結合させようとする場合、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌが用いられる。
【００１０】
また、目的物である原料糖受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質としては、少なくとも２個以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質、例えばＧＭ４、ＳＭ４、Ｌａｃ−Ｃｅｒ、Ｇｂ３Ｃｅｒ、Ｇｂ４Ｃｅｒ、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＤ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＡ２、ＧＡ１、Ｌｃ３Ｃｅｒ、Ｌｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ６Ｃｅｒ等が挙げられる。
【００１１】
本発明に用いられる２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素は、２段階以上の連続して生起し得る糖結合反応を触媒する２種以上の酵素であり、前記糖受容体と２以上の糖供与体との組み合せにより適宜選択して用いればよい。具体的には、ガラクトシルセラミド合成酵素、グルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素、ＧＤ３合成酵素、ＧＭ２／ＧＤ２合成酵素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成酵素等の他、種々のフコシルトランスフェラーゼ等から２種以上を選択して用いる。
【００１２】
本発明に用いられる脂質ベシクルは、一の脂質ベシクル中に前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有しているものであれば特に制限されず、前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を添加する以外は通常のリポソーム等の脂質ベシクル調製法に従って調製すればよいが、前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素は、脂質ベシクル中の膜の構成成分として含有せしめるのが望ましい。このような脂質ベシクルの調製法としては、リン脂質等のベシクル形成能のある脂質、界面活性剤及び酵素の混合ミセルから界面活性剤を除く方法が一般的である。界面活性剤を除く方法としては透析、ゲル濾過、希釈法等が挙げられる。
【００１３】
ここで用いられる脂質としてはレシチン類、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、プラズマローゲン、カルジオリピン、コレステロール等が挙げられる。また、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡＰ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド等が用いられる。
【００１４】
また、本発明で用いる脂質ベシクルは、通常のリポソームの形態でもよいが、粒子の表面を脂質でコートした形態、磁性化無機コロイド表面を脂質膜でコートした形態、ゲルマトリックスにリポソームが不動化された形態、あるいはシリカゲルビーズ上に脂質膜が形成された形態であってもよい。
【００１５】
反応は、糖受容体と、２以上の糖供与体と、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルとを混合し、通常の酵素反応の条件（例えば、２０〜５０℃）に従って行えばよい。
【００１６】
反応終了後の目的物の単離は、目的スフィンゴ糖脂質の性質に応じた手段で行えばよい。
【００１７】
以上の方法はスフィンゴ糖脂質の一種であるスルファチドの合成にも、供与体としてホスホアデノシンホスホ硫酸を、酵素の一つとして糖脂質スルホトランスフェラーゼを用いることにより応用することができる。
【００１８】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
（１）グルコシルセラミド合成酵素の調製
ラット脳のホモジェネートを８００×ｇにて１０分間遠心した上清を１０，０００×ｇにて３０分間遠心して得られた膜画分を０．２５Ｍ蔗糖、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に懸濁し、界面活性剤ＣＨＡＰＳを加え、最終蛋白質濃度４ｍｇ／ｍｌ、ＣＨＡＰＳ濃度３％（ｗ／ｖ）とし、４℃にて２時間攪拌した。これを１００，０００×ｇにて６０分間遠心し、上清を可溶化酵素とした。１％ＣＨＡＰＳを含む上記緩衝液（０．２５Ｍ蔗糖、１ｍＭＤＴＴを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムに可溶化酵素溶液を添加、洗浄した後、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で蛋白質を溶出した。これをグルコシルセラミド合成酵素とした。
【００２０】
（２）ラクトシルセラミド合成酵素の精製
ラット脳のホモジェネートの１０，０００×ｇ沈殿画分を０．２５Ｍ蔗糖、１ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４に懸濁し、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、最終蛋白質濃度４ｍｇ／ｍｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度１％（ｗ／ｖ）とし、２時間氷中で処理した後、１００，０００×ｇにて６０分間遠心し、上清を得た。この上清画分を可溶化酵素液として下記精製過程に供した。
上記可溶化酵素液にＮａＣｌを加え５０ｍＭとし、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化したＷＧＡ−アガロースカラムに供与し、同緩衝液にて洗浄した後、ＧｌｃＮＡｃを２００ｍＭ含む同緩衝液で溶出した。この溶出画分にＭｎＣｌ２を加えて１０ｍＭとし、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化したＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラムに供与、洗浄後、１ｍＭ  ＵＤＰを含む同緩衝液にて酵素を溶出した。
【００２１】
この溶出画分中の緩衝液をゲル濾過により１ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８に交換した。これを同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに供与し、活性のある非吸着画分を集めた。この活性画分を同緩衝液で平衡化したＭｉｎｉＱカラム（ファルマシア社製）に供与後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の代わりに１％ＣＨＡＰＳを加えた同緩衝液で洗浄した後、ＮａＣｌの直線的濃度勾配により吸着蛋白質の溶出を行い、塩濃度約２５０ｍＭ付近に精製酵素を得た。
【００２２】
（３）リン脂質ベシクルへの酵素の再構成
▲１▼再構成の方法
リン脂質、界面活性剤、膜蛋白質の混合ミセルから界面活性剤を除くことによりリン脂質ベシクルへ膜酵素を再構成した。界面活性剤を除く方法としてセファデックスＧ１００によるゲル濾過法を用いた。すなわち、１ｍｌ容のセファデックス  Ｇ−１００の小カラムを作製し、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．４で洗浄した。これを１０００ｒｐｍ  で５分間遠心した後、１５０μｌのサンプルを添加し再度１５００ｒｐｍ  で５分間遠心し、得られた濾液を再構成サンプルとした。全ての操作は氷上、又は５℃で行った。
【００２３】
再構成の際、脂質と基質濃度を保つためにサンプル５０μｌに対して１５ｍｇ／ｍｌの大豆レシチン、１ｍｇ／ｍｌのセラミド（タイプ３）を含むＣＨＡＰＳ溶液５０μｌを添加した。これに５０μｌのもう１つの酵素サンプル又は１％ＣＨＡＰＳを含み、脂質や基質を含まないバッファーを添加し再構成に供した。この脂質、基質添加のための溶液（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）は以下のように作製した。１．５ｍｌのクロロホルム：メタノール２：１に溶かした１５ｍｇの大豆レシチン（シグマＰ３６４４）、１ｍｌのメタノールに溶かした１０ｍｇＣＨＡＰＳ、１ｍｌのクロロホルム：メタノール＝２：１に溶かした１ｍｇセラミド（シグマＣ２１３７、Ｎｏｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ）を混合し、窒素ガスで溶媒を蒸発させた後、真空下で１時間以上減圧することによりリピッドフィルムを作製した。これを１ｍｌの水にサスペンド、温浴で超音波処理して得られた均一な液をＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液とした。
【００２４】
▲２▼混合酵素の再構成
前記（１）及び（２）の方法により得られたグルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素を混合した後、ゲル濾過で再構成を行った。すなわち、５０μｌのグルコシルセラミド合成酵素可溶化画分に５０μｌのラクトシルセラミド合成酵素（いずれもバッファー中の界面活性剤はＣＨＡＰＳ）、５０μｌの１５ｍｇ／ｍｌ大豆ＰＣ、１ｍｇ／ｍｌセラミド（タイプ３）を含む１％ＣＨＡＰＳ（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）を加えよく混合した後、１ｍｌ容のセファデックスＧ−１００のスピンカラムによりＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプルＡ）。
【００２５】
▲３▼ラクトシルセラミド合成酵素の再構成
前記（２）の方法により得られたバッファーの界面活性剤をＣＨＡＰＳに置換されたラクトシルセラミド合成酵素の５０μｌに５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、５０μｌのＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した後、１ｍｌ容のセファデックスＧ−１００のスピンカラムに添加しＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプルＢ）。
【００２６】
▲４▼グルコシルセラミド合成酵素の再構成
前記（１）の方法で得られた５０μｌのグルコシルセラミド合成酵素可溶化画分に５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、５０μｌのＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した後、１ｍｌ容のセファデックスＧ−１００のスピンカラムに添加しＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプルＣ）。
【００２７】
（４）酵素反応
それぞれの酵素及び、２段階酵素反応は以下のように別々な反応系で行った。混合ミセル系では界面活性剤を加えて、また、再構成酵素の系では界面活性剤を加えずに反応を行った。
【００２８】
▲１▼再構成グルコシルセラミド合成酵素の活性
この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイにつき１０μｌの０．５Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．４（５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２  、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む）及び、水５０μｌを混合した反応液に再構成サンプル（サンプルＣ）を１５μｌ、〔１４Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌｕ    ２５μｌを添加し３７℃、３０分反応を行った。
【００２９】
▲２▼再構成ラクトシルセラミド合成酵素の活性
この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイにつき２０μｌの１Ｍカコジル酸バッファー  ｐＨ７．２、５μｌの２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、更に、１５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣを１０μｌ、７５ｍＭ  ＣＤＰコリンを１０μｌ添加、攪拌し、基質液とした。これにサンプルＢ１５μｌ、水１５μｌ、〔１４Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇａｌ２５μｌを添加し３７℃、３０分反応を行った。
【００３０】
▲３▼２段階反応
ａ．サンプルＡの反応
２つの酵素を混合した後、リン脂質ベシクルに再構成したサンプルＡを用いた２段階反応の測定は以下のように行った。すなわち、１アッセイにつき１０μｌの０．５Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．４（５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２  、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ（非標識）、３０μｌの水を混合した反応液にサンプルＡを２５μｌ、水５μｌ、〔１４Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌｃ    ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１時間、２時間、４時間反応を行った。
【００３１】
ｂ．サンプルＢとサンプルＣの混合物の反応
コントロール実験として、２つの酵素をそれぞれ別々に再構成したサンプルＢ及びサンプルＣを混合して２段階反応が行われるか否かを検討した。上記ａ．の測定系ではサンプルＡの代わりにサンプルＢを、水の代わりにサンプルＣを添加し同様に反応を行った。すなわち、１アッセイにつき１０μｌの０．５Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．４（５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２  、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ（非標識）を混合した反応液にサンプルＢ２５μｌ、サンプルＣ２５μｌ、水１０μｌ、〔１４Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌｃ    ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１時間、２時間、４時間反応を行った。
２段階反応では、生成したグルコシルセラミド、ラクトシルセラミドをＴＬＣで分離（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４で展開）して各々のバンドを定量した。
【００３２】
（５）結果
▲１▼再構成グルコシルセラミド合成酵素の活性
サンプルＣをＣＨＡＰＳを含まない系で活性測定を行った。
グルコシルセラミド合成酵素に大豆レシチンと基質のセラミドを添加して再構成したサンプルＣのグルコシルセラミド合成酵素の比活性は１０〜２０ｐｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎであった。１ｍｌの酵素液当りの活性は５〜１０ｐｍｏｌ／ｎｉｍであった。
【００３３】
▲２▼ラクトシルセラミド合成酵素
ラット脳から精製したラクトシルセラミド合成酵素とグルコシルセラミド合成酵素を混合して再構成したサンプルＡ、ラクトシルセラミド合成酵素だけを再構成したサンプルＢ中のラクトシルセラミド合成酵素活性はそれぞれ６．８、６．０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌであった。
【００３４】
▲３▼２段階反応
２つの酵素を界面活性剤存在下で混合した後、界面活性剤を除去し、リン脂質ベシクルに再構成したサンプルＡはサンプルＢ、Ｃの混合サンプルと比べ、同一脂質ベシクルにグルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素の２つの酵素が存在する確立が高いと考えられる。このサンプルＡには１段階目の基質であるセラミドが含まれているが、これに１４ＣラベルＵＤＰ−Ｇｌｃと２段階目の反応の基質である（非標識）ＵＤＰ−Ｇａｌを添加して行った反応では３０分、１時間、２時間、４時間と、時間の経過と共にラクトシルセラミドの生成量が増加した（図１サンプルＡ）。これに対して、２つの酵素をそれぞれ別々に再構成したサンプルＢ及びサンプルＣの混合サンプルで同様に反応を行った場合、全くラクトシルセラミドの生成は認められなかった（図１サンプルＢ＋Ｃ）。
以上の結果から、２つ以上の膜酵素による２段階反応は２つ以上の酵素が同一の脂質ベシクル上に存在することが必須であることが判明した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば２段階以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素による反応を、１ポットにより、簡便かつ効率的に行うことができ、種々のスフィンゴ糖脂質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２段階反応による反応量を示す図である。
【図１】
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