(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ蛋白質と、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体。
【請求項２】
リポ蛋白質が可溶性である請求項１記載の選択的複合体。
【請求項３】
リポ蛋白質が、脂質と蛋白質が弱く相互作用したものである請求項１または２記載の選択的複合体。
【請求項４】
リポ蛋白質の脂質が、蛋白質を含む標品から抽出した脂質である請求項３記載の選択的複合体。
【請求項５】
リポ蛋白質の脂質が、炭素数の異なるまたは不飽和度の異なる脂肪酸側鎖を含む脂質である請求項３記載の選択的複合体。
【請求項６】
リポ蛋白質の脂質が、トリグリセリドを主成分とする脂質である請求項３記載の選択的複合体。
【請求項７】
リポ蛋白質を検体と接触させて、検体中に存在するヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質と反応させ、リポ蛋白質とヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体を形成せしめることを特徴とするヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定方法。
【請求項８】
リポ蛋白質が可溶性である請求項７記載の測定方法。
【請求項９】
リポ蛋白質が、脂質と蛋白質が弱く相互作用したものである請求項７または８記載の測定方法。
【請求項１０】
リポ蛋白質の脂質が、蛋白質を含む標品から抽出した脂質である請求項９記載の測定方法。
【請求項１１】
リポ蛋白質の脂質が、炭素数の異なるまたは不飽和度の異なる脂肪酸側鎖を含む脂質である請求項９記載の測定方法。
【請求項１２】
リポ蛋白質の脂質が、トリグリセリドを主成分とする脂質である請求項９記載の測定方法。
【請求項１３】
糖化ヘモグロビンを測定するための請求項７記載の測定方法。
【請求項１４】
リポ蛋白質を検体と接触させて、検体中に存在するヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質と反応させ、リポ蛋白質とヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体を形成せしめることを特徴とするヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定方法を利用するヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定キットであって、検体中に存在するヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質と反応するリポ蛋白質からなる試薬を含むことを特徴とする測定キット。
【請求項１５】
リポ蛋白質が可溶性である請求項１４記載の測定キット。
【請求項１６】
リポ蛋白質が、脂質と蛋白質が弱く相互作用したものである請求項１４または１５記載の測定キット。
【請求項１７】
リポ蛋白質の脂質が、蛋白質を含む標品から抽出した脂質である請求項１６記載の測定キット。
【請求項１８】
リポ蛋白質の脂質が、炭素数の異なるまたは不飽和度の異なる脂肪酸側鎖を含む脂質である請求項１６記載の測定キット。
【請求項１９】
リポ蛋白質の脂質が、トリグリセリドを主成分とする脂質である請求項１６記載の測定キット。
【請求項２０】
糖化ヘモグロビンを測定するための請求項１４記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床検査におけるリポ蛋白質とヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体形成を特徴とするキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査においては、多種類の共存物質を含む試料の中から対象物質を選択的に測定することが要求される。このため従来は、抗原（ハプテンを含む）−抗体、リガンド−受容体、基質あるいは阻害剤−酵素等の鍵と鍵穴ように対象物と対になって特異的に結合する物質が多く用いられている。
【０００３】
例えば、抗体を用いる免疫測定法にサンドイッチ法があり、よく使われている。この方法は測定対象物である抗原を２種類の抗体でサンドイッチすが、この際、抗原捕捉用に一方の抗体を固相に固定化しておき、もう一方の抗体を標識しておく。測定対象物である抗原と抗体を反応させ、固相化抗体−抗原−標識抗体のサンドイッチ複合体を形成させ、未反応の標識抗体を除いた後、標識量の計測から抗原量を測定する。
【０００４】
しかしながら、これらの抗体、受容体、酵素等は、一般的に作製に多くの労力と時間がかかり、高価である。その上、入手し難い材料を含むものもある。
【０００５】
ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の関与する臨床検査においても同様であり、ヘモグロビンと特異的親和性を有するハプトグロビンなどは価格、安定供給に問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、安価にかつ安定提供できる素材であるリポ蛋白質を用いて、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質を、リポ蛋白質とこれらの選択的複合体として測定する方法およびキットを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
課題を解決するために、本発明は、リポ蛋白質と、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体である。また本発明は、当該選択的複合体を利用することを特徴とする、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定方法を提供するものである。また本発明は、当該選択的複合体を利用することを特徴とする、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定キットを提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の結合性について検討を重ねた結果、リポ蛋白質がヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質と選択的に結合し、複合体を形成することを発見した。更に、この選択的複合体を臨床検査に適用できることを確かめ、抗体やハプトグロビンなどを用いることなく、ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の測定方法を見出し、本発明に至った。以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
本発明で用いる「リポ蛋白質」とは、脂質と蛋白質からなる系で、蛋白質の一部分以上が脂質と複合体を形成しているものを意味する。当該リポ蛋白質としては、天然のリポ蛋白質、または脂質と蛋白質を人為的に組み合わせたものが含まれる。
【００１０】
リポ蛋白質における脂質としては、蛋白質と共存するときに水系に分散可能な脂質であれば、単品でも混合物でも、天然物由来でも、合成品でも、これらの混合物でもよい。分散時から使用時までの温度を想定すると、これらの温度範囲で蛋白質と共存するときに分散可能な、異なる鎖長の、または異なる不飽和度の脂肪酸を側鎖成分として含む脂質が好ましい。
【００１１】
天然物由来の脂質として、オリーブ油、アマニ油、ヤシ油等の植物性の油脂でも、鶏卵黄あるいは牛乳由来の脂質等動物性脂質でもよい。トリグリセリドを主成分とする脂質は安価で入手しやすく、本発明で好ましく使用できる。
【００１２】
蛋白質を含む標品から脂質を抽出し、その脂質を用いることもできる。例えば、ミルク製品、あるいはカゼイン標品から抽出した脂質などを挙げることができる。蛋白質を含む標品からの脂質抽出法は、通常用いられている手法でよい。
【００１３】
リポ蛋白質の蛋白質成分としては、その一部分以上が脂質と複合体を形成し、脂質を分散可能にするものであればよい。天然のリポ蛋白質の蛋白質や、加えた成分の殆ど全てが脂質と複合体を形成する蛋白質でも構わなく、一部だけが脂質と複合体を形成する蛋白質でも構わない。また、それらの混合物でもよい。
【００１４】
リポ蛋白質の蛋白質成分のなかでも、脂質と弱く相互作用する周辺蛋白質、または、一般的には可溶性蛋白質と分類されているが脂質と弱く相互作用する蛋白質は好ましい。後群には、カゼイン、牛血清アルブミン等が相当し、価格面、供給面からも好ましい。
【００１５】
本発明においてリポ蛋白質を水系に分散させるには、用手法による分散、機械的分散、あるいは超音波による分散等、いずれの方法をも用いることができる。温度を上げて分散させる方法も好ましく用いられる。分散時の脂質と蛋白質の比は、用途に合わせて変えることができる、また脂質と蛋白質のそれぞれの種類によっても比は変わりうる。分散されたリポ蛋白質液は、通常無色透明から乳白色である。
【００１６】
前述のように調製されたリポ蛋白質液は、液系そのままでも用いることができるし、固相に結合させて用いることもできる。その形状は用途に合わせて選択できる。例えば、固相としてニトロセルロース膜などの多孔性膜を挙げることができる。
【００１７】
固相への結合方法は物理的吸着でも化学的結合でもよい。本願明細書では、固相に結合されたリポ蛋白質を、固相化リポ蛋白質と呼称する。
【００１８】
本発明で用いるヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質は、正常ヘモグロビン、異常ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、アセチルヘモグロビン等のヘモグロビンまたはヘモグロビン誘導体に加えて、ヘモグロビンの単量体とも見なされるミオグロビンまたはその誘導体も含む。
【００１９】
ヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質と、リポ蛋白質あるいは固相化リポ蛋白質とが結合することで形成される複合体は、通常使われる測定方法で確認または測定できる。例えば、吸光度等のヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質の物理化学的な性質を利用する方法や、構成成分のいずれかを標識する方法も有力な方法として挙げられる。その標識法も、対象物へ直接標識する方法、あるいは抗体などを介して間接的に標識する方法もある。標識の種類も、酵素、色素、放射性物質等が用いられる。
【００２０】
本発明の特異的複合体形成を特徴とする測定方法は臨床検査において特に有用であり、後述のように体外診断用に適用できる。他方、ヘモグロビンを放射性同位体標識し、体内に注入し、動脈硬化部にあるリポ蛋白質に結合させてその像を撮るなど、体内診断用としての応用も望むことが出来る。
【００２１】
体外診断用への重要な適用の１例として、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ測定が挙げられる。ヒトヘモグロビンＡ１ｃを含むかも知れない検体を固相化リポ蛋白質に加えると、ヘモグロビンとその誘導体であるヘモグロビンＡ１ｃは同じ割合で固相化リポ蛋白質に結合する。そこへ、標識した抗ヒトヘモグロビンＡ１ｃ抗体を加えて反応させる。未結合物質を洗浄後、固相化リポ蛋白質に結合したヒトヘモグロビンＡ１ｃを標識物の量から測定する。このとき別に検体中の全ヘモグロビン量を測っておけば、ヘモグロビンＡ１ｃ量と全ヘモグロビン量から、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）を求めることが出来る。
【００２２】
あるいは更に望ましいことであるが、固相化リポ蛋白質に結合する全ヘモグロビン量が一定であれば、全ヘモグロビン量を一々測ることなく、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）が求められる。
【００２３】
【実施例】
次に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２３】
実施例  １
（固相化リポ蛋白質の作製）
エバンスらの方法（Ｒ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｓ．Ｌ．Ｂａｎｄｅｍｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｋ．Ｈｅｉｎｌｅｉｎ，Ｓ．Ｓ．Ｖａｇｈｅｆｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４，５６６（１９６８）．）に従い、卵黄リポ蛋白質ＬＤＦ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を抽出した。得られた卵黄リポ蛋白質液にニトロセルロース膜（ミリポア社、孔径８μｍ）を浸漬し、卵黄リポ蛋白質を膜へ吸着させてブロッキング後、洗浄・乾燥し、固相化リポ蛋白質膜とした。また、卵黄リポ蛋白質を含まない液で同様に処理したものを対照膜とした。
【００２４】
（固相化リポ蛋白質への１２５Ｉ標識ヘモグロビンの結合）
ヘモグロビンを、クロラミンＴ法に従い１２５Ｉで放射性標識した。そして、１２５Ｉ標識ヘモグロビン溶液を、固相化リポ蛋白質膜と対照膜へ反応させた。３分後に洗浄し、膜上に結合して残った１２５Ｉ標識ヘモグロビンをガンマーカウンター（ＡＲＣ−１０００Ｍ、アロカ社）で計測した。固相化リポ蛋白質膜からは１０９６０ｃｐｍが測定されたのに比べて、対照膜からは８７２ｃｐｍであった。対照膜に比べて、固相化リポ蛋白質膜上へ明らかに多くの１２５Ｉ標識ヘモグロビンが結合したことが判る。
【００２５】
実施例２
（１）カゼインからの脂質抽出
牛乳製カゼイン（ナカライテスク社製、ＣＰグレード）５００ｇから、メタノール５００ｍｌとクロロホルム１０００ｍｌの混合液で脂質を抽出し、２．７ｇの脂質抽出物が得られた。
【００２６】
（２）固相化リポ蛋白質膜の作製
脂質抽出物に、カゼイン水溶液を加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、井内盛栄堂社）で分散させ、うすい乳白色のリポ蛋白質分散液を得た。ニトロセルロース膜（ミリポア社、孔径８μｍ）を分散液に浸漬し、リポ蛋白質を吸着させ、洗浄後、乾燥し、固相化リポ蛋白質膜とした。
【００２７】
（３）標識抗体の作製
青色ラテックス（Ｂａｎｇｓ社、平均直径０．２μｍ）へ抗ヒトヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体を常法に従い吸着させ、青色ラテックス標識抗ヒトヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体（標識抗体）を作製した。
【００２８】
（４）測定
ヒトヘモグロビンＡ１ｃを含む試料として、グリコヘモグロビンコントロールレベルＩ、ＩＩ（それぞれヘモグロビンＡ１ｃ＝５・３％、１０．４％、いずれも国際試薬社）及び含まない試料としてウシヘモグロビン（シグマ社）を希釈液（１．２５ｍｏｌ／ｌチオシアン酸リチウム、０．２ｍｏｌ／ｌグリシン、０．２５％フェリシアン化カリウム，ｐＨ＝９．０）でヘモグロビン濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、希釈試料とした。
【００２９】
希釈試料と青色ラテックス標識抗体とを混合し、固相化リポ蛋白質膜と反応させた。４分後固相化リポ蛋白質膜を洗浄し、吸光度を測定した。なお、ヒトアルブミン（シグマ社）を添加するときには、希釈試料中に０．０８３ｍｇ／ｍｌ、０．８３ｍｇ／ｍｌ（ヘモグロビンに対して健常人血液中１０倍相当濃度）になるように加え、同様の操作をした。
【００３０】
（５）結果
結果を図１に示す。図１の吸光度は固相化リポ蛋白質膜に結合した青色ラテックスの量を示し、ヒトヘモグロビンＡ１ｃが固相化リポ蛋白質膜に結合していることを表している。ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有率に応じた吸光度が得られ、ヒトヘモグロビンＡ１ｃが測定できることを示している。また、図からも明らかなように、吸光度は添加したヒトアルブミンの濃度によらず一定である。
【００３１】
実施例３
実施例２での（２）固相化リポ蛋白質膜の作製における脂質抽出物の代わりに、オリーブ油、アマニ油またはヤシ油（いずれも、ナカライテスク社）を用いた以外は、全ての実験を実施例２と同様に行った。結果を図３に示す。表より明らかなようにこれらの油を使っても、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ含有率に応じた吸光度が得られており、ヒトヘモグロビンＡ１ｃが測定できる。
【００３２】
実施例４
（相関性の確認）
実施例２の（１）から（３）までと同様にした。
【００３３】
（４）測定
ヒト全血を試料とし、実施例２の（４）測定法に準じて、予め含有率既知のヘモグロビンＡ１ｃサンプルから検量線を作成しておき、ヒト全血試料の測定吸光度をヘモグロビンＡ１ｃ（％）に換算し、他のＨＰＬＣ測定法（ＨＬＣ−７２３ＧヘモグロビンＩＩＩ型、東ソー社）と比較した。
【００３４】
（５）結果
図２に両測定法の相関結果を示した。相関式Ｙ（本方法）＝０．９４０Ｘ（ＨＰＬＣ）＋０．４０２、相関係数Ｒ＝０．９８８の非常に良い相関を示している。
【００３５】
【発明の効果】
本発明による、リポ蛋白質とヘモグロビンまたはヘモグロビン類似物質との選択的複合体形成を用いて、臨床検査における測定が可能になった。また、抗体等の高価な材料を用いることなく、安価でかつ安定して供給できる材料を本法では用いることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】濃度の違うヒト血清アルブミン共存下及び非共存下で、カゼイン由来の固相化リポ蛋白質膜とグリコヘモグロビンコントロール  レベルＩ、ＩＩ及びウシヘモグロビンとの反応を、青色ラテックス標識抗Ａ１ｃ抗体で測定した際の吸光度を示す図である。
【図２】ヒトヘモグロビンＡ１ｃについての、本リポ蛋白質による測定法と他のＨＰＬＣ測定法との相関関係を示す図である。
【図３】実施例２での脂質抽出物の代わりに、オリーブ油、アマニ油またはヤシ油を用いた際の、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ測定における吸光度を示す図である。
【図１】
0003541352.tif 000002
【図２】
0003541352.tif 000003
【図３】
0003541352.tif 000004