(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）オゴノリ属またはアマノリ属に属する海藻から酸性多糖を溶媒で抽出し、固液分離して得られる抽出液に該酸性多糖を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを作用させて酸性多糖を低粘化して得られる溶液、もしくは
（２）該海藻を該β−アガラーゼを含有する水性溶媒と接触させて酸性多糖の抽出と同時にその低粘性化を行い、ついで固液分離して得られる溶液
を、中性オリゴ糖を除去する精製操作に付して得られる溶液中の、主として低粘性酸性糖よりなる固形分を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は紅藻類から得られる免疫賦活性酸性多糖を酵素処理したものを有効成分とするより実用性に富んだ形態の免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
海藻類は日本では古くから食用として、また民間薬として用いられてきた。近年、その生理活性に注目した研究開発が行われるようになってきた。例えば、特開昭６３−３１６７３２  号公報には紅藻類由来の抗ウィルス剤が、また特開昭６４−６６１２６号公報には紅藻類由来の抗腫瘍剤が、それぞれ開示されている。
さらに、特開平３−２８４６２６号公報及び特願平３−３２９８７０号（未公開）には、いずれも紅藻類であるアマノリ属及びオゴノリ属の海藻から水性溶媒で抽出される物質を有効成分とする免疫賦活剤がそれぞれ開示されている。
オゴノリ属やアマノリ属に属する海藻から抽出される物質は、主としてアガロースを基本骨格に持つ高分子の酸性多糖を主成分とするものであることが知られている。これらの酸性多糖は粘性が高く、時によっては強いゲルを形成するため、これらの免疫賦活作用を利用して、ヒト、動物等の免疫機能を高めるために、食品や飼料に混合したり、これ自体を経口、非経口投与に適するような剤形に製剤することは極めて困難である。しかも製造工程での取扱いも難しく、操作が煩雑となるなどの大きな問題点があった。
【０００３】
かかる酸性多糖を加水分解する酵素として、シュードモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏｏｍｏｎｕｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、サイトファーガ・エスピー（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ    ｓｐ．）  、ビブリオ・エスピー  ＡＰ−２（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．  ＡＰ−２）等が、該酸性多糖中のβ−１，４結合を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを生産することが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０５，  ３１７−３２１（１９６７）、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｏｃｅａｎｏｌ．Ｌｉｍｎｏｌ．，  ８  （２）１３５−１４９（１９９０）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３，６７３−６８４（１９８３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８７，  ４６１−４６５（１９９０）等）  。
また、β−アガラーゼを利用して海藻類からオリゴ糖を製造する方法が、特開平２−６５７８８  号、特開平４−２７１７９１号公報等において提案されている。
他方、希酸による加水分解では該酸性多糖中のα−１，３結合が比較的選択的に切断される。しかし、酸による加水分解はこれら多糖に結合する硫酸基をも遊離させ、構成糖の基本構造をも変化させてしまう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、かかる免疫賦活活性を有する、紅藻類起源のアガロースを基本骨格とする酸性多糖について、その粘度及びゲル形成能を低下させてヒトや動物等への投与に適した製剤を得る目的で鋭意研究を続けた。その結果、該酸性多糖類を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを該酸性多糖に作用させ、これを加水分解して得られる生成物が該酸性多糖に比しはるかに低い粘性を有し、かつより優れた免疫賦活活性を有することを見い出し、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は紅藻類に属する海藻から酸性多糖を水性溶媒で抽出し、固液分離して得られる抽出液に該酸性多糖を加水分解する能力を有するβ−アガラーゼを作用させて酸性多糖を低粘性化して得られる溶液、もしくは該海藻を該β−アガラーゼを含有する水性溶媒を接触させて酸性多糖の抽出と同時にその低粘性化を行い、ついで固液分離して得られる溶液、または上記溶液を酸性糖を精製するための操作に付して得られる溶液中の、主として低粘性酸性糖よりなる固形分を有効成分として含有する免疫賦活剤に関する。
以下に本発明を詳しく説明する。
【０００６】
本発明では、原材料としてアガロースを基本骨格に持つ酸性多糖を主成分として含有する紅藻類に属する海藻を用いる。好適に用い得る海藻としては、オゴノリ属に属する海藻、例えばオゴノリ、ツルシラモ、シラモ、オオオゴノリ、ミゾオゴノリ、カバノリ、アマノリ属に属する海藻、例えばマルバアマノリ、ツクシアマノリ、オニアマノリ、コスジノリ、ウップルイノリ、アサクサノリ、スサビノリ、マルバチシマクロノリ、オオノノリ、フイリタサを挙げることができる。この他ウシケノリ属のウシケノリ、フノリノウシゲも本発明に使用でき、またイトグサ属及びフノリ属に属する海藻のなかにも本発明に使用できるものがある。
【０００７】
これらの海藻は最初から水性溶液による抽出に付しても活性成分を得ることもできるが、油分、少糖類、油溶性色素を除く意味でこれらを溶解し得る有機溶媒でまず海藻を処理するのがよい。かかる有機溶媒としては例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の低級アルカノール、アセトン等の低級アルカノン等を用いることができる。また、これらの溶媒と少量の水（８０：２０ｖ／ｖ程度まで）との混合物であってもよい。メタノール、エタノール及びこれらと水との混合溶媒が好ましい。かかる有機溶媒（水との混合溶媒を含む）の使用量は特に制限はないが、海藻（乾燥物基準）１００ｇに対して０．５  〜１０Ｌぐらいが適当である。有機溶媒抽出の温度時間は特に制限はないが、室温以上例えば３０℃〜有機溶媒の沸点で５分以上例えば１５分〜１時間が適当である。
【０００８】
次に有機溶媒をデカント、濾過、遠心分離等で除去して得られる残渣を水性溶媒による抽出に付す。水性溶媒としては水、酸性水溶液または塩基性水溶液が用いられるが、少量の例えば１０容量％以下の親水性有機溶媒をさらに含有していてもよい。「酸性」及び「塩基性」を与えるのは通常それぞれ酸及び塩基であるが、常用される緩衝剤であってもよい。酸としては特に制限はないが、塩酸、硫酸リン酸等の無機酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸を用いることができる。塩基としては特に制限はないが、アンモニア、アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等を通常使用する。塩基としてはさらにピリジン等の親水性有機塩基であってもよい。緩衝剤としてはトリス系、リン酸系、クエン酸系、ホウ酸系等の常用の緩衝剤を用いることができる。
【０００９】
水性溶媒のｐＨは特に制限はないが通常１〜１３、特に２〜１２が適当である。さらにｐＨ３．５  以下、特にｐＨ３以下で得られた活性成分はそれより上のｐＨで得られる活性成分に比し一般に免疫賦活剤作用が強い。またｐＨ３．５  以下、特にｐＨ３以下で処理する場合それより上のｐＨで処理する場合に比し、一般に活性成分の収率が優れている。水性溶媒の使用量は特に制限はないが通常原海藻（乾燥物基準）１００ｇに対して１〜１０  Ｌぐらいが適当である。水性溶媒による抽出の温度時間は特に制限はないが、４℃〜系の沸騰温度、通常室温〜系の沸騰温度で通常５分以上、例えば３０分〜２０時間が適当である。なお、水、酸性水溶液、塩基性水溶液による抽出は２つ以上直列に組み合わせて行ってもよい（例えば水抽出残渣を酸性水溶液で抽出する等）。
【００１０】
抽出液を残渣の海藻から通常の固液分離手段（デカンテーション、濾過、遠心分離等）により分離し、ついで通常この段階で酵素処理に付す。抽出を酸性水溶液または塩基性水溶液を用いて行った場合には酵素処理に適したｐＨに調整した後酵素処理に付すか、または好ましくは一旦抽出液を中和し（中和に用いる塩基、酸はそれぞれ塩基性水溶液及び酸性水溶液に用いる塩基、酸でよい）、ついで脱塩処理（有機溶媒沈澱後水に溶解、透析、限外濾過等）を行った後に酵素処理に付す。
【００１１】
酵素処理に使用する酵素β−アガラーゼとしては、前記紅藻類に含まれる酸性多糖を加水分解（β−１，４結合の加水分解）する能力を有するものであれば、起源を問わず使用することができ、例えば先に例示したシュードモナス・アトランティカ、サイトファーガ・エスピー、ビブリオ・エスピーＡＰ−２起源のβ−アガラーゼを使用することができる。このうち、シュードモナス属の微生物を起源とするβ−アガラーゼ製剤が市販されている。
【００１２】
酵素処理は、多糖１ｇ当たりβ−アガラーゼ０．０１〜５０，０００ユニット、より好ましくは０．１  〜１，０００  ユニットを、ｐＨ５〜９、温度１５〜６０℃で  ０．５〜７２時間、より好ましくは５〜４８時間作用させることにより行うことができる。反応は静置状態で進行させることができるが、攪拌し、さらにはｐＨを常に酵素反応が最も効率的に行える値に調整しながら行うこともできる。酵素反応後、通常酵素を加熱等により失活させる。
上記酵素処理によって酸性多糖はそのβ−１，４結合が、通常部分的に、加水分解されて低粘性の酸性糖（酸性多糖＋酸性オリゴ糖）になる。該酸性糖の分子量分布は通常３００  〜１，４００，０００  の範囲内の範囲である。
なお、酵素処理は、上記においては水性溶媒抽出液に対して行っているが、水性溶媒抽出と同時に、すなわちβ−アガラーゼ含有水性溶媒を用いて抽出を行うことにより行うこともできる。この場合には酵素反応条件は上記と同様でよいが、抽出条件は酵素反応条件による制約を受ける。また水性溶媒抽出液から酸性多糖を一旦後述の精製手段により精製し、ついで水に再溶解した後、β−アガラーゼを作用させてもよい。
【００１３】
酵素処理液は、そのまままたは濃縮、乾燥して免疫賦活剤またはその有効成分として使用することもできるが、酸性糖を精製するための一般的処理に付してもよい。かかる精製処理としては除蛋白、中和、脱塩、有機溶媒添加による沈澱、塩析、透析、限外濾過、分配クロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理、電気泳動等があり、これらは単独で、または通常組み合わせて用いられる。これらの精製処理は公知の方法（例えば特開平３−２８４６２６号記載の方法）に準じて行うことができる。
【００１４】
例えば、除蛋白はトリクロロ酢酸等により蛋白質、ポリペプチド等を沈澱させる等の手段により行うことができる。
有機溶媒による沈澱は通常活性成分を溶解しないか少ししか溶解しない親水性有機溶媒を添加して有効成分を沈澱させることにより行う。かかる有機溶媒としては通常メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の低級アルカノール、アセトン等の低級アルカノン等を用いることができる。メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の低級アルカノールが好ましい。
塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭酸バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。また塩析工程の後処理（脱塩）として通常透析、限外濾過、ゲル濾過、逆浸透膜処理等のいずれか１つまたはこれらの２以上の工程を組み合わせて行う
【００１５】
透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜を用いて行う。ゲル濾過はデキストランまたはポリアクリルアミドゲルなどを充填したカラムを用いて行う。セファデックス、バイオゲルの名称で販売されている充填剤が通常用いられている。
限外濾過、逆浸圧法はいずれも加圧下で膜を用いて分面する方法である。前者は  ０．５〜５ｋｇ／ｃｍ２、後者は２０〜３５ｋｇ／ｃｍ２で行うのが通常である。
分配クロマトグラフィーについては疏水性基の結合した担体を用いた逆相分配クロマトグラフィーを用いて低分子分画を除去する、あるいは親水性基の結合した担体を用いた順相分配クロマトグラフィーを用いて極性の低い画分を除去する等の処理を行う。
また、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を行ってもよい。
【００１６】
酵素処理液からの酸性糖の精製において、低分子量物質、特に中性オリゴ糖（糖の重合度が１０以下）を除去することにより低粘性酸性糖の免疫賦活活性が飛躍的に増大することが判明した。中性オリゴ糖の除去は上記精製手段により行うことができるが、具体的には例えば、分画分子量が５，０００  〜１０，０００の限外濾過膜（例えばミリポア社製ＰＴＧＣ膜、アドバンテック東洋社製ＱＯ１００等）で排除される画分、または陰イオン交換樹脂（例えば、東ソー社製ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ、ファルマシア社製Ｑ−セファロースＨＰ等）に保持されない画分として中性オリゴ糖の除去を行うことができる。
また本発明の免疫賦活剤の有効成分である低粘性酸性糖を上記精製手段によって分画したもの（例えば免疫賦活活性に特に寄与する分子量分画、酸性多糖分画等）を有効成分としてもよい。
【００１７】
以上の精製操作を経るか、また経ないで得られる低粘性酸性糖を含有する溶液中の固形分（免疫賦活在の有効成分）は、後記分析法によるものとして、一般に次の物性を有する。
0003568214.tif 000002
【００１８】
以上の精製操作を経て得られる低粘性酸性糖を含有する溶液はそのまま免疫賦活剤として用いることもできるが、通常、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱風乾燥等から適宜選ばれる方法で乾燥し、それ自体としてまたは製薬上許容される種々の担体を混合した剤型で免疫賦活剤として用いる。
経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などは、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、滑沢剤、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有する。また経口用液体剤として用いる場合は、内用水剤、振盪合剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であっても良く、また使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であってもよい。さらに、このような液体製剤は通常用いられる添加剤、保存剤のいずれを含有していても良い。
注射用の場合には、その組成物は通常安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤などの添加剤を含有し、通常単位投与量アンプルまたは多投与量容器の形態で提供される。なお、上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中の乳液のような形態であっても良く、一方活性成分は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉末であっても良い。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤はヒトまたは動物、例えば免疫力が低下している人、特に高齢や疾病等により免疫機能が低下している人に経口または非経口的に投与される。経口投与は舌下投与を包含する。非経口投与は注射剤たとえば皮下、筋肉、静脈注射、点滴を含む。
本発明の免疫賦活剤中の有効成分固形物の量は種々変えることができるが、通常５〜１００％（ｗ／ｗ）  、特に１０〜６０％（ｗ／ｗ）が適当である。
本発明の免疫賦活剤の投与量は動物かヒトにより、また年齢、個人差、病状などに影響されるので、場合によって下記範囲外の量を投与する場合も生ずるが、一般にヒトを対象とする場合の経口投与量は活性成分固形物量として大人１日体重１ｋｇ当たり  ０．５〜１，０００ｍｇ  、好ましくは１〜３００ｍｇ  であり、１回または２もしくは３回に分けて投与する。
なお本免疫賦活剤活性成分（具体的には各実施例で得られる乾燥物）の急性毒性はいずれもＬＤ５０（ＩＣＲ  系マウス、経口投与）＞３ｇ／ｋｇ  であった。
また、本免疫賦活剤活性成分は多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有せしめて免疫賦活作用の機能をもたせた機能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままあるいは各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機能性食品、健康食品としての本免疫賦活剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上記製薬における含有量、投与量と同様でよい。
【００２０】
【実施例】
参考例１
オゴノリ原藻５０ｇ  を十分量の水で洗浄後、さらに８５％（ｖ／ｖ  ）  温メタノールで繰り返し洗浄した。この繰り返し洗浄は該メタノール  ５００ｍｌを加え、４５〜５０℃で１５分間攪拌し、ヌッツェで濾過する操作を２回繰り返すことにより行った。洗液を十分に除去した後、蒸留水  １．５リットルを加え、沸騰水浴中で３０分間、適宜攪拌しながら抽出した。抽出液を遠心分離により回収し、残渣に再び蒸留水を１リットル加え、同様に加温抽出し、抽出液を回収した。得られた抽出液を合わせ、ヌッツェで吸引濾過して固形成分を完全に除去した。得られた濾液に９９．５％エタノールを加え良く攪拌した後、１晩放置し沈澱を十分に析出させた。沈澱を回収し、蒸留水に膨潤溶解後、凍結乾燥して乾燥物  ４．８６ｇを得た（試料Ａ）。
なお、「原藻」は通常、市場にはアルカリ溶液で煮た物が塩蔵して出回っているため、かかる処理をしていないものという意味で使用した。なお、かかる市場品からも本発明の免疫賦活剤の有効成分を得ることができる。
【００２１】
実施例１
参考例１で得られた乾燥物（試料Ａ）１ｇを蒸留水に溶解し（０．１  ％）、シュードモナス属由来β−アガラーゼ（シグマ社製）１，０００  ユニットを加えて３０℃に保温し適宜攪拌しつつ、４８時間反応させた。反応液を沸騰水溶中で１５分間加熱して酵素を失活させた後凍結乾燥し、酵素処理物を得た（試料Ｂ）。
実施例２
実施例１と同様に操作して得た酵素反応液を熱失活させた後、公称分画分子量５，０００  の限外濾過膜（日本ミリポア・リミテッド製）で１０倍に限外濾過濃縮した。処理後、蒸留水を加えて１０倍に希釈して上記膜処理を再度行い、得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥物を得た（試料Ｃ）。
【００２２】
実施例３
オゴノリ原藻５０ｇ  を十分量の水で洗浄後、さらに８５％（ｖ／ｖ）温メタノールで参考例１と同様にして繰り返し洗浄した。洗液を十分に除去した後、蒸留水１リットルを加え、沸騰水浴中で３０分間、攪拌抽出した。抽出液を３０℃まで冷却し、シュードモナス属由来のβ−アガラーゼ（シグマ社製）  ５，０００ユニットを加え、３０℃に保温し適宜攪拌しながら２４時間反応させた。反応終了後熱失活を施し、ヌッツェで吸引濾過して固形分を除去した。濾液にトリクロロ酢酸を終濃度が１０％となるように加え、氷水中で３０分保持した後、セライトでプリコートしたヌッツェで吸引濾過し、濾液を回収した。濾液を２Ｎ水酸化ナトリウムで中和後、セファデックスＧ−２５を充填したカラムで脱塩し、凍結乾燥して乾燥物６．３７ｇ  を得た（試料Ｄ）。
【００２３】
参考例２
スサビノリ原藻５０ｇ  を粉砕し、８５％（ｖ／ｖ）  温メタノールで参考例１と同様にして繰り返し洗浄した。洗液を十分に除去した後、蒸留水０．７５リットルを加え、沸騰水浴中で３０分間、攪拌抽出し、遠心分離により沈澱を回収した。沈澱は  ０．５リットルの蒸留水で洗浄した後、１リットルの蒸留水を加え、濃塩酸でｐＨを２に調整し、室温で１晩放置した。抽出液をヌッツェで吸引濾過して固形分を除去し、得られた濾液を２Ｎ水酸化ナトリウムで中和後、４倍量の９９．５％エタノールを加え良く攪拌し、１晩放置し沈澱を十分に析出させた。沈澱を回収し、蒸留水に膨潤溶解後、凍結乾燥して乾燥物４．１ｇを得た（試料Ｅ）。
【００２４】
実施例４
参考例２で得られた乾燥物（試料Ｅ）１ｇを蒸留水に溶解し（０．１  ％）、シュードモナス属由来β−アガラーゼ（シグマ社製）２，０００  ユニットを加えて３０℃に保温し適宜攪拌しつつ、４８時間反応させた。反応液は、前記と同様に加熱失活と凍結乾燥を行い、酵素処理物を得た（試料Ｆ）。
実施例５
実施例４と同様に操作して得た酵素反応液を熱失活させた後、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（１．６  ×  ２０ｃｍ）にのせ、蒸留水  ２００ミリリットルで洗浄後、保持された画分を０．５Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。溶出液は濃縮後、セファデックスＧ−２５を充填したカラムで脱塩し、濃縮後、凍結乾燥を行って乾燥物０．６ｇを得た（試料Ｇ）。
実施例６
実施例４と同様に操作して得た酵素反応液を熱失活させた後、公称分画分子量５０００の限外濾過膜（日本ミリポア・リミテッド製）で１０倍に限外濾過濃縮した。処理後、蒸留水を加えて１０倍に希釈して上記濃縮操作を再度行い、得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥物を得た（  試料Ｈ）。
【００２５】
参考例１〜２及び実施例１〜６で得られた乾燥物の各種分析結果を表１に示した。なお、分析項目中の全糖はフェノール硫酸法〔Ｄｕｂｏｉｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８，  ３５０−３５６（１９５６）  〕を用い、ガラクタンとして算出した。蛋白質はローリー法〔Ｌｏｗｒｙ  Ｏ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９３  ，  ２６５−２７５（１９５１）  〕を用いて、３，６−アンヒドロガラクトースはＷ．  Ｙａｐｈｅらの方法〔Ｙａｐｈｅ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３，  １４３−１４８（１９６５）  〕で、それぞれ測定した。硫酸エステルは酸加水分解後、遊離した硫酸イオンをイオンクロマトグラフィー・システムにて測定した。分子量はＧＰＣによりプルランを基準として測定した。粘度は  １．０％の水溶液について、表１のものでは５０℃、表２のものでは２５℃で、それぞれＢ型粘度計を用いて測定した。
【００２６】
【表１】
0003568214.tif 000003
【００２７】
【表２】
0003568214.tif 000004
【００２８】
実施例７（酵素分解試料のマクロファージ活性化作用）
免疫賦活作用の指標としてマクロファージ活性化作用を調べた。
常法によりプロテオースペプトンで誘導したマウスの腹腔細胞を採取し、４×１０５／ウェルとなるよう９６穴プレートに分注し、１時間培養してマクロファージを付着させた。浮遊細胞を除去した後試料を加え１０％牛胎児血清、ぺニシリン、ストレプトマイシンを含む  ＲＰＭＩ−１６４０培地中で７２時間培養し、培養上清中の残存グルコース及び分泌された亜硝酸イオン濃度を測定し、マクロファージ活性化の指標とした。すなわち、グルコース消費量と亜硝酸イオン産生量は、いずれも値の大きい程マクロファージ活性化作用が大きいことを示す。対照としてマクロファージ活性化物質であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）及びラミナリンを用いた。結果を表３に示した。
【００２９】
【表３】
0003568214.tif 000005
【００３０】
表３から明らかなように、酸性多糖を酵素処理することにより、マクロファージの亜硝酸産生能が著しく上昇し、グルコース消費量は殆どそのまま維持された。
このことは、酵素処理により免疫能が増強されることを如実に示すものである。
【００３１】
実施例８  注射剤
試料Ｃ                            ６００ｇ
ポリエキシエチレン硬化ヒマシ油    ５００ｇ
局方蒸留水                          １０リットル
上記成分を用い常法により注射剤を調製し、１アンプルに５ミリリットルずつ充填した。
実施例９  カプセル剤
試料Ｄ                            ２００ｇ
コーンスターチ                    １５０ｇ
タルク                              ８０ｇ
ステアリン酸マグネシウム            ３０ｇ
上記成分を十分混和し、６０メッシュの金網を通過させて粒度を調整した後、１，０００  個のゼラチンカプセルに充填した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の免疫賦活剤の有効成分である低粘性酸性糖は原料酸性多糖に比べ、低粘度で取扱い易く各種の剤型に製剤化が可能であり、かつ免疫賦活作用がより優れている。