(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも白金作用電極と対極を有するアンペロメトリック検出を行う装置を用いる測定方法において、白金作用電極に検出電位を対銀／塩化銀参照電極に対し＋０．３〜１．０Ｖとするように電圧を印加し、該電位を任意の時点であらかじめ定められた時間、０．０〜０．２Ｖの電位に保持するとともに、測定装置通電時にあって測定を行わない場合に、白金作用電極に印加した検出電位を、あらかじめ定められた検出電位保持時間が経過する毎に、別途あらかじめ定められた時間０．０〜０．２Ｖに保持し、その後再び検出電位に戻し、測定を行うことを特徴とする濃度測定方法。
【請求項２】
０．０〜０．２Ｖの電位に保持する時間が、作用電極の電位を検出電位に保持し続けた時間の０．０５％以上であることを特徴とする請求項１記載の濃度測定方法。
【請求項３】
少なくとも白金作用電極と対極を有するアンペロメトリック検出を行なう装置であり、（１）作用電極電位を銀／塩化銀電極に対して任意の値に保持する保持機構と、（２）一定の作用電極電位が印加された時間を積算し記憶する機構と、（３）作用電極を検出電位で保持した時間に対して一定の時間を算出する機構と、（４）前記（３）の機構で算出された一定時間、作用電極電位を０．０〜０．２Ｖに保持し、その後検出電位に戻す機構と、（５）対象測定物質濃度を測定する機構を有する濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体試料を分析するにあたり、簡単な構成でありながら、長時間安定性に優れ高精度測定が可能な測定方法および測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素の持つ分子認識・変換機能と電極とを組み合わせたバイオセンサーは、高感度かつ高選択的な分析デバイスとして広く研究されてきている。その原理は、酵素反応で消費される、あるいは生成する物質の量を測定することで基質に対する物質情報を得るというものである。例えばグルコース酸化酵素を電極上に固定化した固定化酵素電極を用いたバイオセンサーでは、酵素を触媒とするグルコースの酸化反応で生成する過酸化水素を電流検出することにより、測定溶液中のグルコース濃度を求めることができる。
【０００３】
過酸化水素の検出法としては、白金、金、パラジウム等の金属作用電極において、銀−塩化銀電極や飽和カロメル電極等の基準電位を示す参照電極に対し、＋０．３〜１．０Ｖの印加電圧で酸化電流として検出するのが一般的である。しかし、このような方法で過酸化水素を測定する場合、長時間の使用に伴い電極感度の低下が認められる場合が多い。これは、長時間にわたり作用電極に高い電位を印加し続けることにより、電極表面での酸化物被膜の生成や測定溶液中に共存する不純物の電位印加による吸着が起こり、これらの通電妨害物質が抵抗となって電極の活性を下げるためであると思われる。
【０００４】
このような不都合を解消する手段として種々の方法が考案されている。
【０００５】
例えば、特開昭５７−６０２５５号では測定前に、逆の極性の電圧を印加することで、下地白金電極上の通電妨害物質を除去する電極の活性化方法が提示されている。
【０００６】
また、特開平４−２３０８４１号では測定直前だけではなく所定時間毎に作用電極にリフレッシュ電位なる逆の極性の電圧を印加することで、下地白金電極上の通電妨害物質を除去するといった電極の活性化方法が提示されている。
【０００７】
さらに、特開昭６３−１９８８６１号では、ポーラログラフ電極に一定周波数のパルス状電圧を印加して電極使用開始時における安定化に要する時間を短縮し、加えて、パルスの周波数を適切に設定することで電極感度を増大させるといった方法が示されている。
【０００８】
さらにまた、作用電極への電圧印加を中止し、電位解放状態で作用電極電位を自然分極電位に保持することで、酸化物被膜の生成や不純物の吸着による感度低下を防ぐといった方法が一般に行われている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特開昭５７−６０２５５号で開示されているように、測定前に電位操作を行って電極表面の酸化物被膜や吸着物質等の通電妨害物質を除去する場合、濃度測定の間隔が長くなると間隔の増大にともない電極上の妨害物質量が増大するので、活性化処理を行っても通電妨害物質を完全に除去することができないという不都合があった。
【００１０】
また、特開昭５７−６０２５５号や特開平４−２３０８４１号で開示されている、測定前に逆の極性の電圧を印加する方法では、負電位印加により電極表面の過度の変化を招き、測定電位に戻した後、残余電流が計測可能な値に減少するまでの時間が長く、濃度測定を迅速に行うことができないといった問題がある。
【００１１】
さらにまた、特開昭６３−１９８８６１号で提示されている方法では、電極に一定周波数のパルス状電圧を印加するための回路が必要であり、かつ検出タイミングを正確に規制する機構が測定装置に必要となり、機構の複雑化および装置コストを押し上げる要因となる問題があった。
【００１２】
さらに、測定前あるいは非測定時に電位を開放する場合においては、長時間にわたり高い電位を印加し続けた電極の自然分極電位は容易には下がらず、通電妨害物質の離脱が迅速に行われないので、短時間で電極の活性化を行うことは困難である。
【００１３】
本発明は上記の問題点に鑑みて行われたものであり、固定化酵素を利用するバイオセンサーの検出器となる電極において、使用に伴い劣化した活性を短時間で回復させ、高感度かつ精度良く濃度測定を行うことができる電極活性維持を実現する濃度測定方法およびその装置を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、少なくとも白金作用電極と対極を有するアンペロメトリック検出を行なう装置を用いる測定方法において、白金作用電極に検出電位を対銀／塩化銀参照電極に対し＋０．３〜１．０Ｖとするように電圧を印加し、該電位を任意の時点であらかじめ定められた時間、０．０〜０．２Ｖの電位に保持するように電圧を印加し、その後再び前記検出電位に戻し、測定を行うことを特徴とする測定対象物質の濃度の測定方法について開示する。
【００１５】
また測定装置通電時にあって測定を行わない場合に、白金作用電極に印加した検出電位を、あらかじめ定められた検出電位保持時間が経過する毎に、別途あらかじめ定められた時間０．０〜０．２Ｖに保持し、その後再び検出電位に戻し、測定を行うことが望ましい。
【００１６】
さらに、０．０〜０．２Ｖの電位に保持する時間が、作用電極の電位を検出電位に保持し続けた時間の０．０５％以上であることがより望ましい。
【００１７】
本発明ではさらに、少なくとも白金作用電極と対極を有するアンペロメトリック検出を行なう装置であって、以下の機構を有する濃度測定装置を開示する。
【００１８】
（１）作用電極電位を銀／塩化銀電極に対して任意の値に保持する保持機構と、
（２）一定の作用電極電位が印加された時間を積算し記憶する機構と、
（３）作用電極を検出電位で保持した時間に対して一定の時間を算出する機構と、
（４）前記（３）の機構で算出された一定時間、作用電極電位を０．０〜０．２Ｖに保持し、その後検出電位に戻す機構と、
（５）対象測定物質濃度を測定する機構を有する
ことを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する白金作用電極は、たとえば測定対象物質である過酸化水素、アスコルビン酸、尿酸、アミン類などを適当な電位で検出することができる。過酸化水素検出電位は銀／塩化銀参照電極に対して＋０．３〜１．０Ｖであることが望ましい。＋０．３Ｖ以下であると充分な応答値が得られず、また測定値の安定性にも問題があり、また１．０Ｖ以上であると過度の白金表面の酸化をまねく。
【００２０】
また、白金電極表面あるいは電極表面近傍に酵素を公知の方法で固定化することにより、機能性酵素電極として利用することができ、固定化酵素リアクターでＨ２Ｏ２を生成させ、流れにのせて電極に導く場合も利用可能である。また、酵素を適当な担体に担持させたカラムと白金作用電極を組み合わせた場合には、酵素反応により消費された物質、あるいは生成した物質の検出部として用いることも可能である。さらに、適当な流路系との組み合わせでフローインジェクション方式の濃度測定装置に、あるいはバッチ方式の濃度測定装置における検出器として利用できる。
【００２１】
本発明は２電極および３電極方式の測定装置に適用可能であるが、２電極方式の場合、活性化処理時に流れる電流により対極の表面が変化し、対極の自然分極電位が変動しやすい。その結果、対極を基準として作用電極に印加される電圧が変化するので、常に一定の活性化効果が得られず、活性化処理終了状態における作用電極の表面状態が異なることになり、得られる電気信号レベルが変化すると思われるので、３電極方式がより望ましい。
【００２２】
一般的に白金作用電極をアノーディックに分極して物質濃度の測定を実施する場合、白金表面の酸化皮膜形成、吸着物質による検出の妨害などが起こる。そこで作用電極上に形成された酸化物被膜や吸着物質等の通電妨害物質が除去される電位を作用電極に印加する活性化処理を所定時間毎に行うことで、電極表面の通電妨害物質量の増大を抑えることができ、その結果電極の活性低下を防ぐことができる。
【００２３】
この電極の活性低下を防ぐ電位としては０．０〜０．２Ｖが望ましく、該電位に保持する時間を、作用電極の電位を検出電位に保持し続けた時間の０．０５％以上とすることにより通電継続時間に依存して電極活性が低下する場合でも効果的に活性低下を防ぐことができる。
【００２４】
電極表面の通電妨害物質等に起因する活性低下は、通電継続時間に依存しており、妨害物質の除去等による活性の回復は通電電流に基づいて行われるのであるから、活性化処理の時間を通電継続時間に対して一定の比率以上にすることで、活性化処理効果を得ることができる
上記の電位で電極の活性化が達成される理由は必ずしも明らかではないが以下のように推定される。
【００２５】
図８に白金作用電極を０．１Ｍの硫酸水溶液中に浸漬し、対銀／塩化銀参照電極に対し−０．３５Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲で、１．０Ｖ／秒の速度で電位を掃引した際の電流値を記録したいわゆるサイクリックボルタモグラムを示す。この図において電流値がプラスの範囲で第２象限に水素の吸着波が観察され、続いて第１象限で一旦電流値はほぼ０を示し、次に０．３Ｖ付近からプラス方向に増大する。この増大は白金表面の酸化にもとづくものである。＋１．３Ｖで電位掃引方向を逆転すると電流値は第４象限をとおり、約＋０．２５Ｖにおいて比較的大きな還元電流が記録される。これは前記の正方向電位掃引において形成された白金酸化皮膜が還元され白金面が復活する際に認められるものである。さらにマイナス方向に電位を掃引すると酸素の還元電流が観察される（第３象限）。サイクリックボルタモグラムは上記の操作を繰り返し記録したものである。
【００２６】
さて、処理電位を電極のボルタモグラムにおいて還元波がほぼ消失する電位である０．２Ｖ以下に設定することで、通電妨害物質の除去を効果的に行うことが可能であることがわかった。その上処理電位を０Ｖ以上とすることで、電極表面を過度に変化させることなく活性化処理を行い、しかも処理後に検出電位に戻した際に残余電流が計測可能な値にまで減少する時間を短縮し、迅速かつ高精度な濃度測定が可能となる。
【００２７】
活性化処理時に用いる電位に関しては、より低い電位では処理電位印加時間を短くすることができるが、検出電圧に戻した際の残余電流の安定化に時間がかかり、また、白金作用電極のボルタモグラムにおける還元ピーク電位より高い処理電位では、充分な活性化の効果が得られないので、活性化処理時に印加する電位は過度の電極表面の変化をもたらす負電位を避け０．０Ｖから白金作用電極のボルタモグラムにおいて還元波が消失する電位までの範囲、すなわち銀／塩化銀参照電極に対して０．０〜０．２Ｖの範囲とすることが好ましい。
【００２８】
なお、実際の測定に用いられるたとえばリン酸ナトリウム緩衝液中でサイクリックボルタモグラムを記録すると図９のようになる。硫酸水溶液中では観察された白金表面の酸化にもとづく酸化波や、＋０．２５Ｖ付近の還元波は明瞭には観察されない。しかし実際に本発明の測定方法および測定装置を用いると感度の安定性が飛躍的に改善される。したがって、前記の硫酸水溶液中の挙動から推定される電極表面の変化が実際にも起きていると推定される。
【００２９】
処理電位の印加方法としては、電位発生回路が発生する電位を一定の掃引速度で変化させる装置構成を用いた測定方法が考えられるが、＋０．３〜１．０Ｖの電位を発生させる回路と０．０〜０．２Ｖの電位を発生させる回路を切り替え可能な装置構成が簡便であり、好んで用いられる。
【００３０】
通常、電圧印加回路を開放した場合には、白金電極はその電極の有する自然分極電位となる。この電位は白金のような不溶性固体電極に場合非常に不安定であり、放置することにより０．０〜０．２Ｖに保つことは実質上不可能である。
【００３１】
通電中ではあるが測定を行わない時の活性化処理に関しては、電極表面の通電妨害物質による活性低下は、酸化物被膜の形成や不純物の吸着が起こり得る電位を印加し続けた時間に依存する。そこで、処理間隔を長くする場合は処理電位を低くする、あるいは処理時間を長くするといったことが必要となる。活性化処理の簡便性等を考慮すると、非測定時の活性化処理は、過酸化水素検出電位の連続印加時間を積算し、その積算時間が予め定められた時間経過する毎に１回の割合で行い、処理時間は検出電位を連続して印加した時間の０．０５％以上とすることが望ましい。０．０５％未満では活性化処理が不充分であり、電極感度の低下を防ぐことができない。逆にあまり長時間過ぎると検出電位にもどした後で残余電流が減少するのに要する時間が極端に大きくなり測定速度が低下する。したがって、最大検出電位を印加し続けた時間の１０％以下であることが望ましい。好ましい処理時間は０．０５〜１０％である。
【００３２】
測定前に行う活性化処理に関しては、前回行われた活性化処理からの経過時間が１０分以内であれば、電極感度はそれほど低下していないので、測定前の活性化処理を定間隔の活性化処理と兼用してもよい。しかし、短時間で繰り返し測定を行う場合は、試料中に含まれる汚染物質の付着等による電極感度の低下を防ぐために測定毎に活性化処理を行うことがより望ましい。
【００３３】
また非通電時には、作用電極と参照電極とを電気的に接続することにより、作用電極電位を０Ｖに保持する機構を測定装置に組み込むことも可能であり、または、バックアップ回路で作用電極電位を０．０〜０．２Ｖに保持する機構を組み込み、非通電時に酸化物被膜の生成や不純物の吸着による感度低下を防ぐことも可能である。
【００３４】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】
【実施例１】
図２に示すように、緩衝液槽（１）より緩衝液（２）をポンプ（３）により送液し、オートサンプラー（４）より試料１０μｌを注入し、これをフローセル（５）中で３ｍｍ２の白金を作用極、１．５ｍｍ２の白金を対極、銀−塩化銀電極を参照極とする３電極方式で電流検出した。（６）は検出に用いた電気回路である。また（７）は記録計である。
【００３６】
図３は、１ｍＭ過酸化水素を参照極に対し０．６Ｖの電圧で１５分間隔で６回測定したときの応答電流値の変化を示したものである。測定電極には図１に示すように、測定前に０．１Ｖの電位を１５分に対し０．２％となる２秒間印加する活性化処理を行い、処理後１２０秒間経過したところで測定を開始した。６回の測定における応答電流の平均値は    ４２１．５ｎＡ、平均変動率（ＣＶ％）は１．２％であった。また、応答の初期値を１００％とした時の相対応答値は６回目の測定で１０３．５％であった。
【００３７】
【実施例２】
実施例１と同じ装置を用いた。
【００３８】
白金電極上にグルコース酸化酵素を公知の方法で固定化した酵素電極を作用極として用い、５ｍＭ過酸化水素と１５ｍＭグルコースの測定を行った。測定直前に実施例１と同様の活性化処理を行い、処理後１２０秒間経過した時点で測定動作を開始した。１５分間隔で８時間にわたり計３３回の測定を行なった。図４は応答の初期値を１００％とした時の相対応答値の変化を示すものである。８時間後においても応答の低下は認められず、３３回の測定における応答の平均値は、過酸化水素で４３９．０ｎＡ、グルコースで３６２．６ｎＡ、標準偏差はそれぞれ０．７１％、０．７５％であり、再現性の良い応答が得られた。
【００３９】
【比較例１】
実施例１に示す測定装置において、活性化処理を行わなわずに１ｍＭ過酸化水素の電流検出を、参照極に対し０．６Ｖの電圧で１５分間隔で行なった。図５に示すとおり、６回の測定で相対応答値は７８．６％にまで減少した。
【００４０】
【比較例２】
実施例１に示す測定方法において、活性化処理電位を０．４５Ｖとして同様の測定を行った場合、応答感度が徐々に低下し、６回の測定で相対応答値は図６に示すように８８．２％にまで減少した。
【００４１】
【実施例３】
処理時間を０．４秒として実施例１と同様に測定を行った場合、６回の測定後の相対応答値は９１．３％となった。この応答値は実施例１よりやや低下した。
【００４２】
【比較例３】
実施例２に示す電極で、活性化処理を行なわずに５ｍＭ過酸化水素と１５ｍＭグルコースの測定を行った。図７に示すように１５分間隔の６回の測定で、相対応答値は過酸化水素で８１．６％、グルコースで８２．９％に減少した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の濃度測定装置を用いることにより、短時間で電極の活性化を行い、高感度に再現性よく濃度測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１での電位印加モードを示す図である。
【図２】本発明の実施例１で用いた濃度測定装置の図である。
【図３】本発明の実施例１における１ｍＭ過酸化水素の応答電流値の変化を示す図である。
【図４】本発明の実施例２における５ｍＭ過酸化水素と１５ｍＭグルコースの相対応答値の変化を示す図である。
【図５】本発明の比較例１における１ｍＭ過酸化水素の相対応答値の変化を示す図である。
【図６】本発明の比較例２における１ｍＭ過酸化水素の相対応答値の変化を示す図である。
【図７】本発明の比較例４における５ｍＭ過酸化水素と１５ｍＭグルコースの相対応答値の変化を示す図である。
【図８】硫酸水溶液中で記録した白金電極のサイクリックボルタモグラムである。
【図９】リン酸緩衝液中で記録した白金電極のサイクリックボルタモグラムである。
【符号の説明】
１・・・緩衝溶液槽
２・・・緩衝液
３・・・ポンプ
４・・・オートサンプラー
５・・・フローセル
６・・・検出用電気回路
７・・・記録計
【図１】
0003552362.tif 000002
【図２】
0003552362.tif 000003
【図３】
0003552362.tif 000004
【図４】
0003552362.tif 000005
【図５】
0003552362.tif 000006
【図６】
0003552362.tif 000007
【図７】
0003552362.tif 000008
【図８】
0003552362.tif 000009
【図９】
0003552362.tif 000010