(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の凍結保存菌体を水性媒体に懸濁し次いで破砕してモノアミン酸化酵素を水性媒体中に抽出する方法において、破砕時に二価の銅イオンまたは二価の銅錯体を水性媒体中に４μＭ以上存在させることを特徴とするモノアミン酸化酵素の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はモノアミン酸化酵素生産菌からモノアミン酸化酵素を抽出する方法に関するものであり、本発明により、酵素生産菌、特に酵素生産菌の凍結保存菌体から効率よく酵素を抽出することができる。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の産生するモノアミン酸化酵素は、ベンジルアミン類の高感度定量法、エキソペプチダーゼの高感度活性測定法、塩素イオンの定量法、酢酸イオンの定量法等に使用できる有用な酵素である。本酵素は菌体内酵素であるので、単離する場合には第一段階で必ず微生物菌体を破砕し、酵素を含むタンパク質を抽出しなければならない。菌体の破砕は、通常適当な水性媒体に菌体を懸濁し、機械的摩擦、超音波処理などにより実施する。
【０００３】
従来、微生物の産生するモノアミン酸化酵素を酵素生産菌から抽出する場合、水性媒体としては緩衝液、塩化ナトリウム溶液等を使用し、該媒体中で酵素生産菌を破砕して抽出していた［アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２９巻、６４９頁（１９６５年）、アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、５４巻、８５１頁（１９９０年）］。しかし、上記方法では酵素が失活するため酵素抽出液中に抽出される酵素の比活性が低いという欠点を有していた。また、菌体を保存する場合は通常凍結保存をするが、この凍結保存菌体を同じく上記方法で破砕して酵素を抽出すると比活性の低下が特に顕著に認められた。
【０００４】
一般に酵素抽出の際の酵素の安定化については、グリセロールや糖などの安定化剤、基質類似物質、蛋白質分解酵素阻害剤等の水性媒体への添加が有効であると言われている。しかしながら、グリセロール、糖の添加は菌体懸濁液の粘性を増加させ破砕時の温度上昇が激しくなり失活し易くなり、また基質類似物質の添加も、酵素と安定な複合体を形成し酵素からの分離が困難となる恐れがあり何れも好ましい方法ではない。蛋白質分解酵素阻害剤の添加は、一般的にごく少量で効果が認められる有効な方法であるが、モノアミン酸化酵素の場合は効果が認められなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
モノアミン酸化酵素の失活を極力抑え、効率の良いモノアミン酸化酵素の酵素生産菌、特に酵素生産菌凍結保存菌体からの抽出方法を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、モノアミン酸化酵素生産菌であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の凍結保存菌体を二価の銅イオンまたは二価の銅錯体の存在下で破砕することで、モノアミン酸化酵素の失活を抑え効率よくモノアミン酸化酵素を抽出できることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の凍結保存菌体を水性媒体に懸濁し次いで破砕してモノアミン酸化酵素を水性媒体中に抽出する方法において、破砕時に二価の銅イオンまたは二価の銅錯体を水性媒体中に４μＭ以上存在させることを特徴とするモノアミン酸化酵素の抽出方法である。
【０００８】
本発明におけるモノアミン酸化酵素とは、次式に示すアミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化によるアルデヒド化合物、アンモニア、過酸化水素の生成反応を触媒する酵素を指す。
【０００９】
アミン化合物＋酸素＋Ｈ２Ｏ → アルデヒド化合物＋アンモニア＋過酸化水素
モノアミン酸化酵素生産菌としては、上記の性質を有する酵素を生産する微生物である、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の凍結保存菌体を用い、本発明の酵素の抽出方法を適用する。
【００１０】
本発明に用いる水性媒体とは、アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を懸濁し、そして菌体破砕により酵素を抽出するために使用されるもので、モノアミン酸化酵素が安定に存在し得るものであれば特に限定されない。例えば、水、塩化ナトリウム水溶液、緩衝液等を好適に用いることができる。また、菌体破砕後に得られる酵素抽出液の粘性を低下させ、菌体破砕時の温度を低下させる目的で、モノアミン酸化酵素が失活しない濃度範囲、一般的には10〜50%容量の範囲で、水溶性有機溶媒を添加することもできる。該水溶性有機溶媒としてメチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル、ジオキサン等が使用されるが、モノアミン酸化酵素の安定性という点で、上記の低級アルコール類が好適に使用される。
【００１１】
一般に、緩衝能のない水性媒体中でモノアミン酸化酵素生産菌の凍結保存菌体を破砕すると破砕前後で水性媒体のpHが大幅に変動する。多くの場合pHは菌体破砕により低下するので、破砕後のpHがモノアミン酸化酵素が安定に存在し得るpHとなるように水性媒体のpHを設定することが好ましい。従って、水性媒体として緩衝液を使用するとモノアミン酸化酵素の抽出操作を非常に狭いpH範囲内で行うことが可能となり、操作性、簡便性の点から好ましい。緩衝液のpHは、菌体を破砕した後に得られる酵素抽出液のpHがモノアミン酸化酵素が安定に存在し得るpHになる限り特に限定されないが、一般的には、pH5〜10の範囲、特にpH7〜9の範囲が好適である。緩衝液の種類は抽出されるモノアミン酸化酵素の活性を失わせることのないものであれば特に限定されず使用できる。例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用できる。緩衝液の濃度は、1〜500mMの濃度で使用されるが、特に2〜100mMの濃度で好適に使用される。
【００１２】
本発明における菌体の破砕法は、特に限定されず公知の一般的な細胞を破砕する手段が採用できる。例えば、超音波処理、機械的摩擦等が挙げられる。少量の菌体を破砕する場合には超音波処理が適しており、大量に破砕する場合には機械的摩擦が適している。超音波処理としては、超音波発生装置を用いて、9〜20kHzの振動をアスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体に与えることにより菌体を破砕する方法がある。機械的摩擦としてはダイノミル細胞破砕装置を用いてガラスビーズとの摩擦により菌体を破砕する方法がある。
【００１３】
本発明に用いる二価の銅イオンは塩の水溶液の形で供給されるのが一般的である。塩の種類については水性媒体中で二価の銅イオンを生ずるものであれば特に限定されず公知の物質が使用できる。例えば、硫酸銅、硝酸銅、塩化銅、酢酸銅、臭化銅、フッ化銅、ギ酸銅等があり、特に硫酸銅、硝酸銅、塩化銅等が好適に使用できる。二価の銅錯体も特に限定されることなく公知の物質を使用することができる。例えば、ビス（アセチルアセトナト）銅、ビス（ヘキサフルオロアセチルアセトナト）銅、ビス（トリフルオロ−２，４−ペンタンジオナト）銅等があり、特にビス（アセチルアセトナト）銅が好適に使用できる。水性媒体中の二価の銅イオンおよび二価の銅錯体は４μＭ未満の場合その効果は認められないので、４μＭ以上の濃度で存在することが必須である。一方、廃液処理の点ではできるだけ低濃度の銅が適しているので、４〜５０μＭの濃度で使用されることが好ましい。
【００１４】
当該二価の銅イオンまたは二価の銅錯体は、アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を破砕する際に存在すれば良く、その添加方法は限定されない。予め二価の銅イオンまたは銅錯体を含有する水性媒体を調製し該媒体中にアスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を懸濁しても良いし、水性媒体にアスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を懸濁した後に添加しても良い。
【００１５】
本発明の酵素の抽出方法による代表的なモノアミン酸化酵素の抽出は、アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を二価の銅イオンまたは二価の銅錯体を含有する水性媒体に懸濁し、超音波処理または機械的摩擦により菌体を破砕し、得られた菌体破砕液を遠心分離し、上清を酵素抽出液として回収することにより実施される。
【００１６】
本発明の酵素の抽出方法は、アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を4〜50μＭの二価の銅イオンまたは二価の銅錯体を含有するpH7〜9、10〜100mMの濃度の緩衝液からなる水性媒体に懸濁し、超音波処理または機械的摩擦により菌体を破砕することで実施されるのが好ましい。
【００１７】
【発明の効果】
アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体からモノアミン酸化酵素を抽出する際の本発明における二価の銅イオンまたは二価の銅錯体の効果は、二価の銅特有のものであり、その他の金属イオンや一価の銅イオンには効果が認められない。また従来からの酵素抽出時の酵素の安定化方法である蛋白質分解酵素阻害剤にも効果は認められない。即ち、本発明によってアスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体からモノアミン酸化酵素を安定に効率よく抽出することが初めて可能となる。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
参考例  アミン酸化酵素生産菌の培養
３．０％  グルコース、０．３％  硝酸ナトリウム、０．１％  リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％  塩化カリウム、０．００１％  硫酸第一鉄、０．１％  酵母エキス、０．０２％  消泡剤から成る前培養培地（ｐＨ５．０）１００ｍｌの入った坂口フラスコを１０本用意し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，ＡＴＣＣ２８３２５）の胞子懸濁液を接種し、３０℃、攪拌回転数１１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この坂口フラスコ１０本分の培養液を、２０Ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに移し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気２５Ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌した。
次いで、１６０Ｌの前培養液を仕込んだジャーファーメンターに植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０Ｌ／ｍｉｎで一晩培養した後、集菌し、３．０％  グルコース、０．１％  ブチルアミン、０．１％  リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％  塩化カリウム、０．００１％  硫酸第一鉄、０．０２％  消泡剤から成る本培養培地（ｐＨ５．０）を１６０Ｌ仕込んだジャーファーメンターに菌体を植菌し、３０℃、攪拌回転数２００ｒｐｍ、通気１８０Ｌ／ｍｉｎで一晩本培養を行い集菌した。
【００２０】
実施例１
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２と種々の濃度の硫酸銅（二価）からなる水性媒体に０．３ｇのアスペルギルス・ニガー非凍結菌体または、アスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を懸濁し、４℃、１００Ｗ、２０ｋＨｚの条件で５分間超音波破砕を行いモノアミン酸化酵素を抽出した。得られた菌体破砕液を４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を酵素抽出液とした。活性測定は、１００ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ７．０、５ｍＭベンジルアミンからなる酵素活性測定溶液０．９８ｍｌに酵素抽出液０．０２ｍｌを加え、３０℃で５分間酵素反応の結果生じるベンズアルデヒド量を２５０ｎｍの吸光度で測定することにより実施した。１分間に１μｍｏｌのベンズアルデヒドを生成する酵素量を１単位とした。酵素抽出液の蛋白質量を測定し、酵素抽出液の比活性（活性／蛋白量）を算出した。結果を表１に示す。非凍結菌体、凍結菌体共に４μＭ以上の硫酸銅を添加することで酵素が効率良く抽出され、比活性が上昇した。特に凍結保存菌体において効果的であった。
【００２１】
【表１】
0003593172.tif 000002
【００２２】
実施例２
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２と種々の濃度の硝酸銅（二価）からなる水性媒体を使用した以外は実施例１と同様の方法でモノアミン酸化酵素を抽出した。結果を表２に示す。この場合も、４μＭ以上の硝酸銅を添加することで酵素が効率良く抽出され、比活性が上昇した。特に、凍結菌体において効果的であった。
【００２３】
【表２】
0003593172.tif 000003
【００２４】
実施例３
二価の銅錯体であるビス（アセチルアセトナト）銅［Ｃｕ（Ｃ５Ｈ７Ｏ２）２］についてその効果を調べた。
【００２５】
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２と８μＭ  ビス（アセチルアセトナト）銅からなる水性媒体を使用した以外は実施例１と同様の方法で酵素抽出を行った。酵素抽出液中のアミン酸化酵素活性、蛋白質量、比活性は、非凍結菌体では０．１６８１単位、３０ｍｇ、０．００５６単位／ｍｇ、凍結保存菌体では０．１６９６単位、３１ｍｇ、０．００５５単位／ｍｇであった。
【００２６】
二価の銅錯体であるビス（アセチルアセトナト）銅にも二価の銅イオンと同様の効果が認められた。この場合も凍結保存菌体において特に効果的であった。
【００２７】
比較例１
蛋白質分解酵素阻害剤であるフェニルメタンスルフォニルフルオリド（以下ＰＭＳＦと略す）の効果を調べた。
【００２８】
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２と０．２ｍＭ  ＰＭＳＦからなる水性媒体を使用した以外は実施例１と同様の方法で酵素を抽出した。酵素抽出液中のアミン酸化酵素活性、蛋白質量、比活性は、非凍結菌体では０．１３１４単位、３１ｍｇ、０．００４２単位／ｍｇ、凍結保存菌体では０．０９５１単位、３１ｍｇ、０．００３１単位／ｍｇであった。
【００２９】
蛋白質分解酵素阻害剤には二価の銅のような効果は認められなかった。
【００３０】
比較例２
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２と銅（二価）以外の種々の金属塩（８μＭ）を含む水性媒体を使用した以外は実施例１と同様の方法により酵素抽出を行った。非凍結菌体の結果を表３、凍結保存菌体の結果を表４に示す。一価の銅イオン、銅以外の金属イオンでは比活性の上昇は認められなかった。
【００３１】
【表３】
0003593172.tif 000004
【００３２】
【表４】
0003593172.tif 000005
【００３３】
実施例４
２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２からなる水性媒体と２０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ８．２または、８μＭ  硫酸銅（二価）からなる水性媒体に、２，５００ｇのアスペルギルス・ニガーの凍結保存菌体を懸濁し、ダイノミル細胞破砕機を用いて、ガラスビーズ径０．５〜０．７５ｍｍ、回転数３，２００ｒｐｍ、冷却媒温度−１５℃の条件で機械的摩擦により菌体を破砕しモノアミン酸化酵素を抽出した。得られた菌体破砕液を４℃、９，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を酵素抽出液として回収した。実施例１と同様の方法で酵素抽出液の酵素活性を測定した。酵素抽出液中のアミン酸化酵素活性、蛋白質量、比活性は、硫酸銅非存在の場合は４１０単位、４０３，２００ｍｇ、０．００１０単位／ｍｇ、硫酸銅存在の場合は８３０単位、４１２，０００ｍｇ、０．００２０単位／ｍｇであった。
【００３４】
ダイノミルを用いた機械的摩擦による大量破砕の場合でも、硫酸銅の添加は有効であった。