(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）培地で、細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性をもつ、アルカリゲネス属の微生物、ラルストニア属の微生物、コリネバクテリウム属の微生物、バシラス属の微生物、メチロシナス属の微生物、ロドスピリラム属の微生物、及びプシュードモナス属の微生物から成る群から選択される微生物を培養して細胞内にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）を産生させ且つ蓄積させる工程、
（ｂ）該培地から培養した微生物を採取する工程、
（ｃ）採取した該培養微生物を分解溶液と接触させて微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡｓを自家分解させて対応する単量体を産生させ、産生された該単量体を該溶液中に分泌させる工程、及び
（ｄ）該溶液から産生された該単量体を分離する工程からなることを特徴とする、光学活性をもつ対応する（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法。
【請求項２】
上記の単量体は３−ヒドロキシプロピオン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシウンデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシテトラデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ酪酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシ吉草酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシペプタン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、（Ｒ）−（−）−５−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−６−ヒドロキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−4-トランス−ヘキセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−シス−ヘキセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−トランス−オクテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−シス−オクテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−デセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シス−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−シス−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５，８−シス−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシコハク酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアジピン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシスベリン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアゼライン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシスベリン酸エチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシン酸エチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシピメリ���酸プロピルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシン酸ベンジルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラ−ニトロフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸、（Ｒ）−（−）−３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３，８−ジヒドロキシ−５−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−シス−テトラデカン酸、７−シアノ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、（Ｒ）−（−）−６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸から成る群から少なくとも１種選択される請求項１記載の製法。
【請求項３】
上記の微生物はアルカリゲネス・ラタス、コリネバクテリウム種、バシラス種、メチロシナス・トリコスポリウム、ロドスピリラム・ルブラム、ラルストニア・ウートロファ、プシュードモナス・エールギノサ及びプシュードモナス・オレオボランスから成る群から１種選択される請求項１または２記載の製法。
【請求項４】
上記の微生物はプシュードモナス・エールギノサ（Pseudomonas aeruginosa）またはプシュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）であり、単量体は炭素数が６から１４の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸から少なくとも１種選択される請求項１、２または３記載の製法。
【請求項５】
上記の分解溶液は水、塩溶液、水と有機溶媒との混合液及び緩衝溶液からなる群から１種選択される請求項１、２または３記載の製法。
【請求項６】
上記の分解溶液のpHの範囲はpH２−１２であり、反応温度の範囲は４−６０℃で反応時間は０．５時間以上である請求項５記載の製法。
【請求項７】
生成された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離する工程をさらに含む請求項１記載の製法。
【請求項８】
純粋分離された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の精製及び粉末製剤化の工程をさらに含む請求項１または７記載の製法。
【請求項９】
ＬＣまたはＨＰＬＣのカラムはイオン交換または疏水性結合カラムであり、pHの範囲が１〜５の酸性水溶液を移動状で用いる請求項７記載の製法。
【請求項１０】
上記の精製及び粉末製剤化工程は
（ａ）純粋分離された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の含有溶液に強塩基を添加してpH９以上の塩基領域に調整する工程；
（ｂ）有機溶媒を用いた抽出により不純物を除去する工程；及び
（ｃ）精製された光学活性ヒドロキシカルボン酸を乾燥させる工程から成る請求項８記載の製法。
【請求項１１】
光学活性をもつヒドロキシカルボン酸単量体が高濃度のＰＨＡを含む細胞濃度で自家分解により高濃度に生産される請求項１、２または３記載の製法。
【請求項１２】
（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボキシル酸単量体の自家分解時ＰＨＡｓの副産物に生成される二量体を塩基性条件で加熱分解することにより生産収率を向上させる請求項１、２または３記載の製法。
【請求項１３】
上記のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）はポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）であり、上記の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−（３）−ヒドロキシ酪酸であることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項１４】
微生物はアルカリゲナス・ラタス（Alcaligenes latus ）の微生物、バシラス（Bacillus）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）種、メチロジナス・トリコスホリウム（Methylosinus trichosporium）、ロドスピリウム・ビラム（Rhodospirillum rubrum ）及びラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）（従来のアルカリゲネス・ユートロファス）Ｈ１６から成る群から選択される請求項１３記載の製法。
【請求項１５】
分解溶液は水、塩溶液、水及び有機溶媒の混合液、及び緩衝溶液から成る群から選択される１種である請求項１３または１４記載の製法。
【請求項１６】
分解溶液のpHの範囲はpH２−１２であり、反応温度の範囲は４−６０℃であり、そして反応時間は０．５時間以上である請求項１５記載の製法。
【請求項１７】
生成された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシ酪酸を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離する工程をさらに含む請求項１３記載の製法。
【請求項１８】
純粋分離された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシ酪酸の精製及び粉末製剤化の工程をさらに含む請求項１３または１７記載の製法。
【請求項１９】
上記のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）はポリ−３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレートであり、上記の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−（３）−ヒドロキシ酪酸及び４−ヒドロキシ酪酸であることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項２０】
上記の微生物はアルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus ）である請求項１９記載の製法。
【請求項２１】
上記のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）はポリ−３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシバレレートであり、上記の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び３−ヒドロキシ吉草酸であることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項２２】
微生物はラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha） (以前のアルカリゲネス・ユートロファス）である請求項２１記載の製法。
【請求項２３】
上記の細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性をもつ微生物が組換え微生物であることを特徴とする請求項１の製法。
【請求項２４】
上記の組換え微生物はラルストニア・ユートロファ（以前のアルカリゲネス・ユートロファス）である請求項２３記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は自家分解によりポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）から光学活性をもつ単量体ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関するものである。より具体的に、本発明は（ａ）多様な微生物の培養によりＰＨＡｓを生産・蓄積する段階、（ｂ）菌体を水、塩溶液、水と有機溶媒との混合液、緩衝溶液のような分解溶液にＰＨＡｓを含む細胞を入れてＰＨＡｓを自家分解させて、光学活性をもつその単量体の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を生産する段階で構成される単量体の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関するものである。また、本発明の製造方法は二つの以上の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の混合物が存在する場合、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用して精製される（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を分離する段階と有機溶媒の抽出により純粋精製される（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸から不純物を除去する段階、及び純粋（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の粉末製剤化する段階を含む。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸はヒドロキシル基とカルボキシル基の二つの機能基を同時にもち、機能基の転換が便利で、キラル誘導（ｃｈｉｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）による簡便な新しいキラル中心（ｃｈｉｒａｌ ｃｅｎｔｅｒ ）の導入を可能にするなどの長所があり、キラル性前駆体として広く用いることができる。また、（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は抗生物質、ビタミン、香料及びフェロモン（ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ ）などの合成のための前駆体として、医薬品デザインに用いられる非ペプチドリガンド（ｌｉｇａｎｄ）開発用の物質として、新規医薬品の開発のための前駆体として広く応用が期待されている。特に、ペニシリンを代替するβ−ラクタム系抗生物質で注目されているカルバぺネム系抗生物質（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ ）らの前駆体として用いられ（Ｓｃｏｔｔ， Ｉｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， Ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， １９８４ ）、メチル（Ｒ）−（−）−ヒドロキシ酪酸から（＋）−チエナマイシン（ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ ）を合成する方法が報告された。〔参照：Ｃｈｉｂａ ａｎｄ Ｎａｋａｉ， ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ６５１−６５４， （１９８５）； Ｓｅｅｂａｃｈ ａｎｄ Ｚｕｇｅｒ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， ６５： ４９５−５０３， （１９８２） 〕
【０００３】
現在、（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は醗酵工程による脂肪族グリコールの酸化反応〔参照：Ｈａｒａｄａ ａｎｄ Ｈｉｒａｙａｓｈｉ， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３２： １１７５， （１９６８）〕、微生物によるカルボン酸の（Ｒ）−β−ヒドロキシル化反応〔参照：Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６０： ５０１， （１９８２）〕、β−ジケトンのキラル触媒による水素化反応〔参照：Ｎｏｙｏｒｉ ｅｔ ａｌ，， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０９： ５８５６， （１９８７）； Ｂｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ． ＷＯ９７１４５００Ａ１， （１９９７） 〕などにより主に生産されている。
【０００４】
一方、ＰＨＡｓは微生物の細胞内で合成・蓄積されるエネルギー及び／又は炭素の貯蔵物質である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＤａｗｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５４： ４５０４７２， １９９０）。１２０種類以上の単量体が培養微生物、使用される化学基質又は共基質、及び培養条件に依存して変化し得るＰＨＡｓの構成成分であることが知られている。〔参照：Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４９： １−１４， （１９９６）； Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉｎ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １２８： ２１９−２２８ （１９９５） 〕． 生合成酵素の光学特異性によりＰＨＡｓを構成するすべての単量体ユニットは光学活性をもつ形態（Ｒｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で存在するので、生合成されるＰＨＡｓを分解することにより容易に光学的に純粋な（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボキシル酸を生産し得る。
【０００５】
ＰＨＢ（ポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート）またはＰＨＢ／Ｖ（ポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシワレレート）を化学的な方法で分解して（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸を生産する方法が報告されている。〔参照： Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ．， Ｓｙｎｔｈ．， ７１： ３９−４７， （１９９２）； Ｓｅｅｂａｃｈ ａｎｄ Ｚｕｇｅｒ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， ６５： ４９５−５０３， （１９８２） 〕
【０００６】
しかし、前述した化学的な方法による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸の製造方法は多量の有機溶媒が用いられ、複雑な工程により生産效率が減少される問題点がある。したがって、このような問題点を解決し得る、光学活性をもつ（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が当業界で切実に必要されるようになった。
【０００７】
最近、微生物らにより（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産する方法が報告された。（Ａｋｉｒａ ａｎｄ Ｔａｔｓｕｈｉｋｏ， ＪＰ９−２３４０９１， １９９７ ）この方法はポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積する微生物が他の単量体の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産し得るという簡単な自明な仮定に基づく。これらは（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産する微生物を選別してプュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ）、バルクホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）及びアルカリゲネスユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ）の微生物が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産し得ることを確認した。ここで、アルカリゲネスユートロファスが最近ラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）と再命名されたので、アルカリゲネス族にはもはや属さない。（Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３９ ： ８９７−９０４， １９９５）上記の方法によると、４日ないし７日間微生物を培養した後、培養液を（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産のために燐酸ナトリウム緩衝溶液に移す。単量体の生産率は約２−８％でとても低い。さらに、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸だけでなく（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の生産も報告されなかった。単量体収率が極度に低く、（単位時間あたりの単位容量に対する生産された生成物のグラムとして定義して）低い生産を生ずるのに数日を要したので、上記の方法は産業上の適用に不適切である。
【０００８】
ＰＨＡは、炭素原は豊富であるが、他の成長因子（窒素、燐、酸素、硫黄など）が制限されるとき細胞内で通常合成され且つ蓄積される。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， Ｒｅｖ．， ５４： ４５０−４７２， １９９０）。したがって、微生物は成長環境が変わって制限された成長因子がまた提供されると、細胞は蓄積しておいたＰＨＡを分解し、そして成長する。
【０００９】
ＰＨＡｓを生産するすべての微生物は細胞内ＰＨＡ生合成酵素系とともにＰＨＡ生分解酵素を生産し、細胞内ＰＨＡ生分解酵素は細胞内に可溶性形態またはＰＨＡ粒子に付着される形態の二つの種類で存在することが知られている。（Ｍｅｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｄｏｕｒｄｏｒｏｆｆ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ８８： ６０−７１， １９６４； Ｍｅｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ８９： ２３４−２３９， １９６５； Ｍｅｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｙｕ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５： ３５６３−３５６８， １９９６； Ｇｒｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７： ３６７６−３６８１， １９６８； Ｇｒｉｅｂｅｌ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｃｋ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １０８： ７８２−７８９， １９７１； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５４： ４５０−４７２， １９９０）。メリック及びダドロフ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８８： ６０−７１， １９６４）はバシラスメガテリウムにより蓄積されるＰＨＢ顆粒がロドスピリラムルブラムのＰＨＢ−欠乏細胞の酵素分劃により（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸で加水分解されることを証明した（Ａｒｃｈ． Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ． ５６： ２７８−２９９， １９６７）。また、ヒッペ（Ｈｉｐｐｅ ）及びシュレゲル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）はアルカリゲネス種（ヒドロゲノモノス）から分離した可溶性分解酵素が天然のＰＨＢを（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸に分解し得ることを報告した。このような研究は細胞が細胞内ＰＨＡ分解酵素をもっており、ＰＨＡを単量体で分解し得ることを証明する。しかし、天然（無定形の）ＰＨＡ顆粒の分離は単に複雑だけでなく大規模では経済的ではない。さらに、ＰＨＡの分解のための細胞内分解酵素の分離もまた煩雑であり、非経済的である。もし、細胞内ＰＨＡ分解酵素を含む細胞抽出物をＰＨＡｓの単量体への分解に用いると、細胞抽出物に含まれる成分による汚染により生産物の純度に深刻な問題を引き起こす。細胞を用いることによってＰＨＡｓの分解により単量体の生産を阻害する他の問題点は細胞によってさらに代謝されることである。したがって、ヒドロキシカルボン酸単量体をさらに分解する代謝過程を不活性化または遮断しない限りＰＨＡ
ｓの分解によって単量体を生産することは不可能である。本発明は環境因子の調節により細胞内ＰＨＡ分解酵素の活性を維持しながらヒドロキシ酪酸の単量体を分解する代謝過程を不活性にすることが可能であることを仮定することに基づく。このような考えは細胞内ＰＨＡ分解酵素システムが本発明の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸単量体らの生産に用いられるアキラ及びタツヒコ（ＪＰ９−２３４０９１， １９９７）の方法とは完全に相違するものである。アキラ及びタツヒコの方法は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産し得る新しく分離される３種の微生物（プシュードモナス種、ブルクホリデリア種及びラルストニアユートロファ）の能力に起因する。しかし、本発明は合成されるＰＨＡｓが細胞により自家分解されて環境条件の調節により細胞外の環境へ排出されることができることを仮定することから始まる。したがって、本発明は多様に光学活性をもつ（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸単量体らを高效率で効果的に経済的に生産する方法を提供する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は自家分解〈又は自己分解〉によりポリヒドロキシアルカノエートから光学活性をもつ単量体ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、微生物内で産生され且つ蓄積されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）から光学活性をもつ単量体を製造する新規な方法を提供するものである。本発明の製造方法は、（ａ）培地で細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性をもつ微生物を培養して細胞内にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）を産生させ且つ蓄積させる工程、（ｂ）該培地から培養した微生物を採取する工程、（ｃ）採取した該培養微生物を分解溶液と接触させて微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡｓを自家分解させて対応する単量体を産生させ、産生された該単量体を該溶液中に分泌させる工程、及び〈ｄ〉該溶液から産生された該単量体を分離する工程から構成される。本発明の製造方法は上記単量体を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に純粋に分離する工程、有機溶媒抽出により純粋に分離された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸から不純物を除去する工程及び精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を乾燥させる粉末製剤化の工程をさらに含んでもよい。
【００１２】
結局、本発明の目的は（ａ）ＰＨＡを蓄積してそして細胞内分解し得る組換え菌株を含む各種微生物の培養によりＰＨＡｓを合成し且つ蓄積する工程；および（ｂ）ＰＨＡｓの自家分解により光学活性をもつ単量体（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を生産する工程から成る多様な光学活性をもつ（Ｒ）−（−）ヒドロキシカルボン酸単量体を製造する新規な方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用する上記の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸単量体を分離する工程を含む（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸単量体を製造する方法を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明の目的は有機溶媒抽出による純粋分離された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の不純物を除去する工程；及び乾燥により精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を粉末精製化する工程を含む粉末形製剤の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の製造方法を提供することである。
【００１５】
図１は、アルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢをｐＨ調節なく（初期のｐＨは７．０）分解溶液で自家分解する間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度（−●−）と分解溶液のｐＨの変化（−▲−）を示す図である。
【００１６】
図２は、アルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢをｐＨ７．０で維持される分解溶液で自家分解させる時、時間による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度変化を示す図である。
【００１７】
図３は、初期のｐＨが７．０または１０．０である時、コリネバクテリウムの中の細菌に蓄積されたＰＨＢが自家分解される間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度変化を示す図である。
【００１８】
図４は、ｐＨが７．０または１０．０である時、バシラスの細菌により蓄積されたＰＨＢが自家分解される間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度の変化を示す図である。
【００１９】
図５は、市販されている（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の標準ＨＰＬＣピークを示す（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＵＳＡ ）。
【００２０】
図６は、市販されている（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシ酪酸の標準ＨＰＬＣピークを示す（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）。
【００２１】
図７は、アルカリゲネスラタスに蓄積されたポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）の自家分解により生産されるヒドロキシブタン酸のＨＰＬＣピークを示す。
【００２２】
図８は、アルカリゲネスラタスに蓄積されたポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレートの共重合体の自家分解により生産された単量体（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と４−ヒドロキシ酪酸のＨＰＬＣピークを示す。
【００２３】
図９は、アルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢの自家分解により生産され精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸のＨ１ ＮＭＲピークを示す。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明では、ＰＨＡｓは多様な微生物の培養により合成されそして蓄積され、光学活性をもつ多様な範囲の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸単量体は上記微生物を水、塩溶液、水と有機溶媒との混合液及び緩衝溶液のような分解溶液、及び適当なｐＨに調整された緩衝液中に放置することによってＰＨＡｓの自家分解により高效率で製造される。次いで製造された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸が、もし、二つの種類以上の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の混合物として存在するならば、上記の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸はＬＣまたはＨＰＬを用いて分離する。有機酸を分離し得る多様な種類のクロマトグラフィーまたはイオン交換カラムをＬＣまたはＨＰＬＣに使用するのができる。
【００２５】
上記のように、微生物はＰＨＡｓを蓄積して細胞内分解酵素活性をもつ野生型、突然変異株または組換え菌株であることができ（Ｄｏｉ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ， ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０； Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｉｎ： Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｂｙｒｏ， Ｅｄｓ．， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂｕｓｉｎｇｓｔｏｋｅ， １９９１； Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４９： １−１４， １９９６）そして下記のような微生物群から選択することができる。アクロモバクター種、アクロモバクターキシロキシタンス等を包含するアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生物；アシドボラックスデラフィールジー、アンドバラックスファシリス等を包含するアシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属の微生物；アシネトバクターカルコアセチカス、アシネトバクタールウオフィー（ｌｗｏｆｆｉｉ ）等を包含するアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生物；アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種；アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ）種；アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ）キャビア；アルカリゲネスエスタス、アルカリゲネスデニトリフィキャンス、アルカリゲネスファエカリス、アルカリゲネスラタス、アルカリゲネスパシフィカス、アルカリゲネスパラドラックス、アルカリゲネスベヌスタス等包含するアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ）属の微生物；アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ）マクレオジー；アモエボバクターロースー、アモエボバクターペンデンス等を包含するアモエボバクター（Ａｍｏｅｂｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物；アファノカプサ（Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ ）種；アファノゼセ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ ）種；アクアスピリラム（Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ）オートトロフィカム；アンリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）コーリノダンス；アゾスピリラムブラシレンズ、アゾスピリラムリポフェラム等を包含するアゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属の微生物；アゾトバクターアギリス、アゾトバクターベイジェリンキー、アゾトバクタークローコッカス、アゾトバクターマクロシトゲネス、アゾトバクターサリネストリス、アゾトバクタービネランジー等を包含するアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生物；バシラスアンスラシス、バシラスセレウス、バシラスメガテリウム、バシラススブチリス、バシラススリンジエンシス等を包含するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物；ベギアトアアルバ等を包含するベギアトア（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ ）属の微生物；ベイジェリンキアフルミネンシス、ベイジリンキアモビリス等を包含するベイジリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属の微生物；ベネケッアネレイダ、ベネッケアペラギア等を包含するベネッキア（Ｂｅｎｅｃｋｅａ）属の微生物；ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）ペルツシス；ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ジポニカム；カリオフォモン（Ｃａｒｙｏｐｈａｍｏｎ ）ラタム；カーロバクターバクテロイデス、カーロバクタークレセンタス等を包含するカーロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔ��ｒ ）属の微生物；クロロフレラックス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）オーランチアカヌ；クロログロアフリチシー等を包含するクロログロア（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅａ ）属の微生物；クロマチウムミヌチシムン、クロマチウムオケニー、クロマチウムプルプラタム、クロマチウムテピダム、クロマチウムビソサム等を包含するクロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属の微生物；クロモバクテリウムビオラセウム等を包含するクロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属の微生物；クロストリジウムボツリヌム、クロストジウムスフェノイデス等を包含するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ）属の微生物；コマモナスアシドボランス、コマモマステストステロニ等を包含するコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ）属の微生物；コリネバクテリウムオートフィカム、コリネバクテリウムヒドロカルボオキシタンス等を包含するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属の微生物；デルキシアギュモサ等を包含するデルキシア（Ｄｅｒｘｉａ）属の微生物；デスルホコカス（Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ）マルチボランス；デスルホネマリミコカ、デスルフォネママグヌム等を包含するデスルホネマ（Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ）属の微生物；デスルホサシナ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓａｃｉｎａ ）バリアビリス；デスルホビブリオカルビノリカス、デスルホビブリオサポボランス等を包含するデスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ）属の微生物；エクロチオロドスピラハロクロリス、エチトチオロドスピラモビリス、エクトチオロドスピラシャポスニコビー、エクトチオロドスピラバクオラタ等を包含するエクトチオロドスピラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）属の微生物；フェロバシラス（Ｆｅｒｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）フェロオキシダンス；フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種；ハエモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ）インフルオンザエ；ハロバクテリウムギボニシー、ハロバクテリウムボルカニー等を包含するハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属の微生物；ハロフェラックス（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ）メジテラネイ；ヒドロクラスラタス（Ｈｙｄｒｏｃｌａｔｈｒａｔｕｓ ）クラスラタス；ヒドロゲノモナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）フェシリス；ヒドロゲノファガフラバ、ヒドロゲノファガプシュードフラバ、ヒドロゲノファガタエニノスピラリス等を包含するヒドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）属の微生物；ハイホミクビウムブルガレ、ハイホミクロビウムザバルジニー等を包含するハイホミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属の微生物；イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）デラフィールジー；ラブリス（Ｌａｂｒｙｓ）モナチュス；ラクトバシラスブレビス、ラクトバシラスブルグリシス、ラクトバシラスカセイ等を包含するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）属の微生物；ラクトコッカスクレモリス、ラクトコッカスラクチス等を包含するラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ）属の微生物；ランプロシスチス（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓ）ロセオペルシシナ；ランプロペジア（Ｌａｍｐｒｏｐｅｄｉａ ）ハイアリナ；レギオネラ（Ｌｅｇｉｏ��ｅｌｌａ）種；レプトシリックス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）ジスコホラス；メチロバクテリウムエキトルクエンス、メチロバクテリウムオルガノフィラム、メチロバクテリウムロデシアヌム等を包含するメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物；メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）ゼルモフィラス；メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ）パルブス；メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）メタニカ；メチロシヌススポリウム、メチロシヌストリチョスポリウム等を包含するメチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属の微生物；メチロビブリオ（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｉｂｒｉｏ ）ソエーンゲニー；ミクロコッカスデニトリフィキャンス、ミクロコッカスハロデニトリフィキャンス等を包含するミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ）属の微生物；ミクロコレウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ）属の微生物；ミクロシスチス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ）属の微生物；モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ）属の微生物；マイコバクテリウムアルブム、マイコバクテリウムバカエ等を包含するマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属の微生物；マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ）ルベラ；ニトロバクターアギリス、ニトロバクターウィノグラドスキー等を包含するニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生物；ニトロコッカス（Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ）属の微生物；ノコルジアアルバ、ノコルジアアステロイデス、ノカルジアブラシリエンシス、ノカルジアコラリナ、ノカルジアペトロレオフィラ等を包含するノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属の微生物；オスシラトリア（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）リモサ；パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）デントリフィカンス；ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）ハロフィラス；ペニシリウムシクロピウム；ホトバクテリウムマンダパメンシス、ホトバクテリウムホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等を包含する微生物；フィサルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）ポリセファルム；プロトモナス（Ｐｒｏｔｏｍｏｎａｓ）エキストクエンス；プシュードモナスアエルキノサ、プシュードモナスアルカリゲネス、プシュードモナスアスプレニー、プシュードモナスブタノボラ、プシュードモナスセパシア、プシュードモナスシトロネロリス、プシュードモナスコロナファシエンス、プシュードモナスダクンハエ、プシュードモナスデニトリフィカンス、プシュードモナスジミナタ、プシュードモナスエチノイデス、プシュードモナスフルオレスセンス、プシュードモナスグラセリ、プシュードモナスインジゴツェラ、プシュードモナスレモニエリ、プシュードモナスマレイ、プシュードモナスマリナ、プシュードモナスメンドシナ、プシュードモナスミックスタ、プシュードモナスオレオボランス、プシュードモナスオキサラチカス、プシュードモナスプシュードアルカリゲン、プシュードモナスプシュードフラバ、プシュードプチダ、プシュードモナスレジノボランス、プシュードモナスサッカロフィラ、プシュードモナスタツトゼリ、プシュードモナスシリンガエ、プシュードモナスサーモフィラス、プシュードモナスビリジフラバ等を包含するプシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ��ｍｏｎａｓ ）属の微生物；ラルストニアユートロファ（従来アルカリゲネスユートロファスとして知られている；Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３９： ８９７−９０４， １９９５ ）を包含するラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ）属の微生物；リゾビウムガレガ、リゾビウムヘジサルム、リゾビウムレグミノサルム、リゾビウムルピニ、リゾビウムメリロチ、リゾビウムファセオリ、リゾビウムトリホリ等を包含するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ）属の微生物；ロドバシラス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）属の微生物；ロドバクターカプスラタス、ロドバクタースファエロイドス等を包含するロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生物；ロドコッカスオパカス、ロドコッカスロドクロウス、ロドコッカスルベル等のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ）属の微生物；ロドサイクラスゲラチノスス、ロドサイクラステヌイス等を包含するロドサイクラス（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌｕｓ ）属の微生物；ロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）ベニエリー；ロドプシュードモナスアシドフィラ、ロドプシュードモナスカプスラタ、ロドプシュードモナスパルストリス等を包含するロドプシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物；ロドスピリラムモリスチアヌム、ロドスピリルムルプルム等を包含するロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属の微生物；スファエロチルス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ）ナタンス；スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）パウシモビリス；スピリルムイテルソニー、スピリルムリポフィルム、スピリルムセルペンス等を包含するスピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ）属の微生物；スピルリナジェネリ、スピルリナマツキシヌ、スピルリナプラテンシス、スピルリナスブサルサ等を包含するスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ）属の微生物；スタフィロコッカスアウレウス、スタフィロコッカスエピデルミジス、スタフィロコッカスキシロスス等を包含するスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物；ステラヒューモサ、ステラバクオレータ等のステラ（Ｓｔｅｌｌａ）属の微生物；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）セルモフィラス；ストレプトマイセスアンチビオチカス、ストレプトマイセスコエリカラー、ストレプトマイセスベネズエラエ等を包含するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物；シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ）属の微生物：シントロホモナス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）ウルフェイ；チオバシラスアシドフィラス、チオバシラスベルスタス等を包含するチオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物；チオカプサフェンニジイ等を包含するチオカプサ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ）属の微生物；チオシスチス（Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ）ビオラセア；チオジクチオン（Ｔｈｉｏｄｉｃｔｙｏｎ ）属の微生物；チオスファエラ（Ｔｈｉｏｓｐｈａｅｒａ ）パントトロファ；トリコデスミムン（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｍｕｍ）チエパウチィー；ビフリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）パラハエモリチカス；キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）オートトロフィカス；キサン��モナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ）マルトフィリア；ズーグロエアラミゲラを包含するズーグロエア（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）属の微生物。
【００２６】
多様な微生物により合成されたＰＨＡｓの自家分解により製造される（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸単量体は下記に記載された１種以上であり、そして微生物の培養の間用いられる炭素源または化学成分にしたがってＰＨＡｓに重合され得る他の単量体である。（Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４９： １−１４， １９９６；Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉｎ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １２８： ２１９−２２８， １９９５ ａｎｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ）：（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸、Ｃ６ 〜Ｃ１４の中位鎖の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシウンデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサデカン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシ吉草酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、（Ｒ）−（−）−５−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−６−ヒドロキシドデカラン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−トランス−ヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−シス−ヘキセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−トランス−オキテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−シス−オクテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−オネン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−デセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シス−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−ヒドロキシ−６−シス−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シス−テトラドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５，８−シス−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−六−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、（Ｒ）−（−���−３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシコハク酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアジピン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシスベリン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアゼライン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシン酸メチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシスベリン酸エチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシ酸エチルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシピメリン酸プロピルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシセバシン酸ベンジルエステル、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、パラ−シアノフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、パラニトロフェノキシ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸、（Ｒ）−（−）−３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３，８−ヒドロキシ−５−シス−テトラデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−シス−テトラデカン酸、７−シアノ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−クロロヘサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、（Ｒ）−（−）−６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−２，６−メチル−５−ヘプテン酸などである。
【００２７】
上記のＰＨＡｓの単量体の中で、３−ヒドロキシプロピオン酸、４−ヒドロキシ酪酸、−５ヒドロキシ吉草酸及び３−ヒドロキシ−２−ブテン酸などはキラル中心がないので、光学異性体が存在せず、キラル中心をもつ他の単量体はすべて（Ｒ）−（−）−形態で存在する。
【００２８】
上述した色々な種の単量体の中で本発明の望ましい例として、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸／４−ヒドロキシ酪酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸／（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸、炭素数６〜１４の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の単量体及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸は自家分解により高い収率に生産された。具体的に、ＰＨＢと他のＰＨＢｓはアルカリゲネスラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ ）ＤＳＭ  １１２３、ラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（従来、アルカリゲネスユートロファス）（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ）として知られている）ＮＣＩＭＢ  １１５９９、ラルストニアユートロファ（従来、アルカリゲネスユートロファスとして知られている）Ｈ１６  ＡＴＣＣ  １７６９９、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ）（Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｋｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １２： ５５４−５５９， １９９７ ）、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＳＳ−１９（Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｋｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １２： ５５４−５５９， １９９７）、メチロシナストリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＫＣＴＣ  ２５９１、ロドスピリラムルビルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ）ＫＣＴＣ  １３７２、プシュードモナスオレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ  ２９３４７、プシュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１  ＤＳＭ  １７０７または増幅されたＰＨＡ生合成酵素活性をもつ組換えラルストニアュートロファ（Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｈｗａｈａｋ Ｋｏｎｇｈａｋ， ３５： ６８４−６８９， １９９７）などを適当な炭素源が含まれる培地で培養することにより生成される。培養された細胞を遠心分離により分離した後、分解溶液に分散させて多様な条件下で自家分解させて生成された単量体の濃度を測定した。
【００２９】
その結果、（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の単量体はＰＨＡの自家分解により効果的に生産されることを確認して、自家分解に適当な条件が決定された。
【００３０】
このように決定された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシ酪酸の生産のための適当な自家分解の条件は、微生物がアルカリゲネスラタスＤＳＭ  １１２３の場合、分解溶液のｐＨは２〜１１、望ましくはｐＨ２〜５、もっと望ましくはｐＨ３〜４であり、反応温度は４〜５５℃、望ましくは３０〜５０℃、もっと望ましくは３７℃であり、そして反応時間は３０分〜１０時間が適当であり；微生物がラルストニアユートロファＮＣＩＭＢ  １１５９９（ラルストニアユートロファ  Ｈ１６  ＡＴＣＣ  １７６９９のグルコースを利用する突然変異株）の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上が適当であり；微生物がコリネバクテリウム種ＳＳ−１５の場合、分解溶液のｐＨは５〜９、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２時間〜３０時間が適当であり；微生物がバシラス種ＳＳ−１９の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は１０時間が適当であり；微生物がメチロシナストリコスポリウムＫＣＴＣ  ２５９１の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上が適当であり；微生物がロドスピリラムルビルムＫＣＴＣ  １３７２の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上が適当であり；微生物がラルストニアユートロファＨ１６  ＡＴＣＣ  １７６９９の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上が適当であり；微生物が増幅されたＰＨＡ合成酵素活性をもつ組換えラルストニアユートロファの場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上が適当である。
【００３１】
（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸／４−ヒドロキシ酪酸の生産のために適当な自家分解の条件は次の如くである。微生物がアルカリゲネスラタスＤＳＨ１１２３の場合、分解溶液のｐＨは７の以下、望ましくはｐＨ２〜５、反応温度は３０〜４０℃、望ましくは３７℃、そして反応時間は３０分〜１０時間であった。また、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸／（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸の生産のための適当な自家分解の条件は次の如くである。；微生物がラルストニアユートロファＮＣＩＭＢ  １１５９９の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は２０時間以上である。
【００３２】
炭素数６〜１４の（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の単量体の生産のために適当な自家分解の条件は次の如くである。微生物がプシュードモナスオレオボランスＡＴＣＣ  ２９３４７またはプシュードモナスエアルギノサＰＡＯ１ＤＳＭ  １７０７の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は１０時間以上である。
【００３３】
（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸の生産のための適当な自家分解の条件は次の如くである。微生物がプシュードモナスＡＴＣＣ  ２９３４７の場合、分解溶液のｐＨは２〜１２、反応温度は３０〜４０℃、そして反応時間は１０時間以上である。
他の単量体も多様な菌株及び炭素源／化合物を使用することによって簡単に得られる。（Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４９： １−１４， １９９６； Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉｎ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １２８： ２１９−２２８， １９９５ ）
【００３４】
本発明では、高濃度のＰＨＡｓが自家分解されてその単量体を高濃度で生産する。そしてさらに、ＰＨＡｓ自家分解時、副産物として生成される二量体を塩基性の条件で加熱分解することにより単量体の生産収率を向上させることができる。
【００３５】
自家分解のための分解溶液は水、水と有機溶媒との混合液または多様な塩を含むまたは含まない緩衝溶液を使用することができる。使用する分解溶液に起因する相異点はないしまたは無視し得るが、単量体の追後の分離及び精製の優利性にかんがみ水を使用することが望ましい。
【００３６】
もし分解されるＰＨＡｓが共重合体であるならば、上記の条件下での自家分解の産生物は単量体の混合物である。このような単量体はイオン交換、電気透析、抽出、蒸溜、液体クロマトグラフィー及び高性能液体クロマトグラフィーそして望ましくはＬＣまたはＨＰＬＣなどのような多様な一般的な方法により容易に分離できる。
【００３７】
純粋分離された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は有機溶媒抽出のような一般的な方法により不純物が除去され、さらに精製されて乾燥工程のような単純な方法により簡単に粉末製剤化される。より具体的には、自家分解によって得られる純粋な（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸含有溶液に水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの強塩基を添加して溶液のｐＨを９以上に調整する。次いで、有機溶媒中に抽出された不純物を除去し、そして水相中に存在する（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を乾燥させて９０％以上の純度をもつ粉末製剤が得られる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３９】
＜実施例１＞：アルカリゲネスラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
アルカリゲネスラタスにより合成されたＰＨＢの適合な自家分解の条件を決定した。まず、上記の微生物を窒素制限条件下で砂糖３０ｇ／Ｌが添加された下記の表１に示めされ化学的に定義された培地に接種し回分（バッチ）式培養で培養してＰＨＢを蓄積させた後、遠心分離して菌体を回収した。細胞内に蓄積されたＰＨＢは下記に示す方法により自家分解される。多様な条件下で、自家分解されて生成された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸とその二量体（ｄｉｍｅｒ ）の濃度を測定した。
自家分解の条件は分解溶液のｐＨ（表２）、分解溶液内の炭素源の存在有無及び分解時の攪拌有無（表３及び表４）、自家分解時の反応温度（表５及び表６）などを試験した。その結果、ｐＨ４．０及び３７℃の条件で攪拌なしに（そして無酸素の条件で）自家分解される場合、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が最も効果的に生産されることを確認した。
【００４０】
分解溶液では多様な酸（塩酸、硫酸、酢酸の使用）または塩基（水酸化ナトリウム、アンモニア水の使用）でｐＨを調節した水及び塩水溶液（炭素源を除外した単純培地、等張液）または緩衝溶液（４０ｍＭ燐酸緩衝溶液、４０ｍＭアセテート緩衝溶液、４０ｍＭシトレート（ｃｉｔｒａｔｅ ）緩衝溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液、ＭＯＰＳ緩衝溶液）を反相に比較したが、同一のｐＨでは種々の分解溶液で得られる結果の差異はないかまたは、無視できた（収率に関しては最大の差異は３％未満であった）。したがって、以後の分離及び精製に及ぼすその優利な影響を考慮して実施例のすべてにおいて分解溶液としてｐＨを調整した水を用いた。
【００４１】
【表１】
0003579352.tif 000002
【００４２】
表２：分解溶液のｐＨを変化させて得られる（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）及びその二量体（ｄｉｍｅｒ ）の生産濃度（初期ＰＨＢの濃度：１．０７ｇ／Ｌ、反応温度：３７℃、反応時間：３０分）
【００４３】
【表２】
0003579352.tif 000003
【００４４】
表３：攪拌し又は攪拌せずに砂糖濃度を変化させることによって得られる（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）及びその二量体の濃度、最終収率及び最終のｐＨ（初期のＰＨＢ濃度：１０．１ｇ／Ｌ、初期のｐＨ：７．０、反応温度；３７℃、反応時間：８時間）
【００４５】
【表３】
0003579352.tif 000004
【００４６】
表４：攪拌し又は攪拌せずに砂糖濃度を変化させて得られる（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）及びその二量体の濃度及び収率（初期のＰＨＢ濃度：１．０７ｇ／Ｌ、初期のｐＨ：４．０、反応温度；３７℃、反応時間：３０分）
【００４７】
【表４】
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【００４８】
表５：反応温度を変化させて得られる（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の時間に依存する変化（初期のＰＨＢ濃度：１０．９ｇ／Ｌ、初期のｐＨ：７．０）
【００４９】
【表５】
0003579352.tif 000006
【００５０】
表６：お互いに違相する反応温度で得られる（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）及びその二量体の濃度及び収率（初期のＰＨＢ濃度：１．０７ｇ／Ｌ、初期のｐＨ：４．０）
【００５１】
【表６】
0003579352.tif 000007
【００５２】
さらに、分解溶液のｐＨと自家分解反応との間の相関関係をより具体的に調べるために、初期のｐＨが７．０に調整された分解溶液中で調製された、ｐＨの変化に従って製造された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブタン酸の生産量を反応時間によって測定した（図１）。
第１図に示めされるように、ＰＨＢの自家分解反応は分解溶液のｐＨに極めて敏感であった。初期のｐＨを７に調整する場合、自家分解は初期にはほとんど起らなかったが、ｐＨの減少にしたがって、自家分解が促進された（反応をはじめた後６時間からｐＨがすみやかに減少し、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がすみやかに生産された）。
【００５３】
また、このようなｐＨの影響がｐＨ７で操作される醗酵機で起こる自家分解反応でも観察された（第２図）。すなわち、初期のＰＨＢ濃度が１０．１ｇ／Ｌの菌体を醗酵機に入れて、窒素を充填した状態で反応を行なった。その後、自家分解反応は４Ｎ  ＮａＯＨを添加してｐＨを７．０で維持しながら行った。その結果、３０時間後でさえもたった１６％のＰＨＢが分解されて、たった ２ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が得られた。
【００５４】
したがって、アルカリゲネスラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ ）ＤＳＭ  １１２３により合成されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産には分解溶液のｐＨがもっとも重要な影響因子であることが明らかにされ、そして低いｐＨ条件がその単量体の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸へのＰＨＢの自家分解を促進することを明らかにした。
【００５５】
以上の結果のように、多様な条件下でＰＨＢの自家分解によって（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸は効率的に生産される。特に初期のｐＨが４であり、反応温度が３４℃〜５０℃の場合、３０分内に、９０％以上の収率を得ることができる。この結果は６〜８日間後ただ２〜８％の収率をしめすアキラ及びタツヒコ（ＪＰ−２３４０９１， １９９７ ）により報告された先の実験結果と比べると著じるしく優れている。
【００５６】
また、生成物が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸であるのを確認するために、ＨＰＬＣで生成物の検出時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を米国Ｓｉｇｍａ社で販売している（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸ラセミク混合体（ｒａｃｅｍｉｃ ｍｉｘｕｒｅ）の検出時間と比べた（第５図及び第７図）。同一な条件下で二つの場合すべて１２．９分でピークが検出されることにより、生成物質が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸であるのを確認した。この結果は核磁気共鳴分析（ＮＭＲ ａｎａｌｙｓｉｓ）によってさらに確実になった（実施例１８）。
【００５７】
同様に、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸はアルカリゲネスラタスＤＳＭ  １１２３及びアルカリゲネスラタスＤＳＭ  １１２４を含む他のアルカリゲネスラタスによって蓄積されたＰＨＢの自家分解により８０〜９０％の収率で生産され得た。
【００５８】
＜実施例２＞：アルカリゲネスラタス内に合成・蓄積された高濃度のＰＨＢの自家分解による高純度の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産及び副産物として生成された二量体の分解
【００５９】
実施例２−１：
実施例１の例のように、底濃度（約１０ｇ／Ｌ以下）のＰＨＢは自家分解により、高い収率と短い反応時間内に効率的に（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産し得る。しかし、実際製造方法は分離工程を単純化させることができ、使用溶媒の量及び反応容器の容積を減少させることができるので、高濃度のＰＨＡの使用が経済的に有利である。
【００６０】
したがって、この実施例ではアルカリゲネスラチスＤＳＭ  １１２３をフェド・バッチ式培養方法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｍｏｄｅ）で培養し、そして本発明者らがすでに報告した方法により（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６３： ３７０３−３７０６， １９９７）高濃度のＰＨＢを生産した。ＰＨＢの初期濃度は相当に高い濃度の１１５．３ｇ／Ｌに調整し、自家分解反応を１時間、ｐＨ４、温度３７℃で行なった。  その結果、１１７．８ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（約８４％収率）及び１５．２ｇ／Ｌのその単量体を生産した。したがって、高濃度のＰＨＢが自家分解により高效率で（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産するためにまた使用できたことを証明した。
【００６１】
実施例２−２：
実施例２−１で、高濃度のＰＨＢの不完全な自家分解により二量体が副産物として生産された。この実施例でいっしょに生成された二量体の完全な分解によって単量体の収率を向上させることが試みられた。すなわち、実施例２−１により製造された１１７．８ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と１５．２ｇ／Ｌの二量体とを含有する混合溶液に５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを１１に調整した後、この溶液を試験管に入れて密封した。９５℃で２時間の間自家分解反応を行った。その結果、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の最終濃度が１３１．９ｇ／Ｌ（約９５％）に増加し、二量体は単量体に完全に分解されたので検出されなかった。
【００６２】
したがって、実施例２−１と２−２に例示されるように、高濃度の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸は高濃縮されたＰＨＢから効率的に生産することができ、そして、もし必要であれば、収率はアルカリ条件下で二量体の分解によりさらに増加され得る。
【００６３】
＜実施例３＞：アルカリゲネスラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ ）内に合成・蓄積されたポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレートと４−ヒドロキシブチレートの共重合体の自家分解による単量体の生産
アルカリゲネスラタスＤＳＭ  １１２３を１０ｇ／Ｌのスクロース及び３ｇ／Ｌの４−ヒドロキシ酪酸が添加された単純培地でフラスコ培養した。細胞は共重合体の高分子のポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレートを細胞乾燥重量の７０％まで蓄積して、この高分子の１２ ｍｏｌ％が４−ヒドロキシブチレートであった。培養した細胞を遠心分離した後、２１ｇ／Ｌの共重合体濃度を分解溶液内に分散させ自家分解させた。自家分解反応を３７℃で初期のｐＨ４の条件下で４時間行なった場合、１３．６ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と２．４ｇ／Ｌの４−ヒドロキシ酪酸が生産された。この時の収率は各々６８％と７９％であった。同様に、二つのモノマーをヒラミツ他により報告された方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １５： ４６１−４６４， １９９３）にしたがって、スクロースとγ−ブチロラクトンとを含む培地でアルカリゲネスラタスＤＳＭ  １１２３を培養して生産したポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレートの自家分解により生産した。
【００６４】
したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と４−ヒドロキシ酪酸は共重合体のポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレートの自家分解により効果的に生産されて、これらはＬＣまたはＨＰＬＣにより純粋に分離された。（実施例１６）
【００６５】
＜実施例４＞：ラルストニアエートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）内に合成且つ蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産  従来の方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４３： ８９２−８９８， １９９４）にしたがって、窒素制限条件下でラルストニアエートロファＨ１６  ＡＴＣＣ  １７６９９グルコース利用突然変異菌株であるラルストニアエートロファＮＣＩＭＢ１１５９（以前のアルカリゲネスユートロファ）を培養し、そして菌体乾燥重量の７０％までＰＨＢを含む菌体を得た。ＰＨＢの初期濃度が３４ｇ／Ｌになるように調整して自家分解反応を３０℃で初期ｐＨ４．０または７．０の二つの場合に分けて３４時間行なった。初期のｐＨが４．０の場合には５．２ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び０．４ｇ／Ｌの二量体が生成され、初期ｐＨが７．０の場合には９．３ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び０．９ｇ／Ｌの二量体が生成された。総収率は各々１４％と２５％であった。アルカリゲネスラタスの場合とは異なりラルストニアユートロファではＰＨＢの完全分解が起こらなかった。また、単量体の生産の最適な条件もアルカリゲネスラタスとは異なった。しかし、ラルストニアユートロファを使用する生産方法はアルカリゲネスラタスを使用するよりも効果が低かったけれども、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸はラルストニアユートロファにより蓄積されたＰＨＢの自家分解により生産することができた。
【００６６】
＜実施例５＞：ラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）内に合成・蓄積されたポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシブチレートの共重合体の自家分解による単量体の生産
従来の方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １６： ５５６−５６１， １９９４）にしたがって、ラルストニアユートロファＮＣＩＭＢ  １１５９９を１０ｇ／Ｌのグルコース及び１ｇ／Ｌのプロピオン酸が添加された培地で培養した。ＰＨＢ／Ｖ（ポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシブチレート）の共重合体（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸８ ｍｏｌ％を含む）、を菌体乾燥重量の６３％に達する濃度まで蓄積し、これを自家分解させて（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸を生産した。２７．４ｇ／Ｌの共重合体の濃度を含む細胞を水に分散させた後ｐＨ７、３０℃で３５時間自家分解反応を行なった。その結果、５．８ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と０．６ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸が生産された。したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸の混合物は共重合体の自家分解により蓄積されたＰＨＢ／Ｖ高分子から効率的に生産されることができ、これらはＬＣまたはＨＰＬＣを用いて分離することもできる （実施例１６）。
【００６７】
＜実施例６＞：コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
土壌から純粋分離したコリネバクテリウム種ＳＳ−１５（Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｋｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １２： ５５４−５５９， １９９７）を炭素源で２０ｇ／Ｌのキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）が添加された単純培地で３日間フラスコ培養し、菌体乾燥重量の３３％に達するＰＨＢが蓄積された菌体を遠心分離により回収した。上記の菌体をｐＨが４．０、７．０または１０．０で調整された水に分散して初期ＰＨＢ濃度を３．４ｇ／Ｌになさしめそして３０℃に放置した。時間経過とともに（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産量を測定した（第３図）。初期ｐＨが７．０の場合に反応が始まって４１時間が経過した後の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の最大量は３．４２ｇ／Ｌであって、これは８３％の単量体収率を示す。したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸はコリネバクテリウム中のグラムポジテイブ細菌の内に蓄積されたＰＨＢの自家分解により効率的に生産されることができた。
【００６８】
＜実施例７＞：バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
土壌から純粋分離したバシラス種ＳＳ−１９（Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｋｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １２： ５５４−５５９， １９９７）を炭素源で２０ｇ／Ｌのキシロースが添加された単純培地で３日間フラスコ培養して、１５％菌体乾燥重量に達するＰＨＢが蓄積された菌体を遠心分離により回収した。上記の菌体をｐＨが４．０、７．０または１０．０で調整された水に初期ＰＨＢ濃度が１．４ｇ／Ｌになるように分散して３０℃に放置した。時間経過とともに（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産量を測定した（第４図）。初期ｐＨが７．０の時反応が始まって２０時間が経過した後の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の最大量が０．９６ｇ／Ｌであって、これは５７％の単量体収率を示す。したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸はコリネバクテリウムの中のグラムポジテイブ細菌により蓄積されたＰＨＢの自家分解により効率的に生産されることができた。
【００６９】
＜実施例８＞：メチロシナストリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
上記の実施例ではすべて好気性または通性好気性の微生物を用いた。しかし、本実施例では嫌気性菌株でメタン利用細菌であるメチロシナストリコスポリウム（ＫＣＴＣ ２５９１ ）を培養してＰＨＢを蓄積した後、自家分解による３ＨＢ（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸）の生産を試みた。Ｗｈａｎｇ及びＰａｒｋの方法（Ｗｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｋ， Ｋｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １１： ２４６−２５３， １９９６）にしたがって上記の細菌を細胞濃度が１．１ｇ、菌体乾燥重量／Ｌに達する時まで培養した。この時ＰＨＢ含有量は細胞乾燥重量の１０％に達した。ＰＨＢ濃度を自家分解の前１０．５ｇ／Ｌになるように調整して、ｐＨ４の水溶液で３７℃の温度で上記実施例（実施例１〜７）と同じ方法を用いて自家分解を行った。その結果、２４時間後（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸１．１５ｇ／Ｌを得た。これは９％の単量体収率を示す。したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸はまた嫌気性メタン利用細菌の培養により蓄積されたＰＨＢの自家分解により（たとえ効率が低くても）生産され得ることが証明された。
【００７０】
＜実施例９＞：光合成細菌のロドスピリラムルビルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
他の嫌気性菌株で光合成細菌のロドスピリラムルビルム（ＫＣＴＣ １３７２ ）を橋本他〔（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｊａｐａｎ， ２６： ５６−５８， （１９９３） 〕の方法で培養して、４０時間後に１．５ｇ菌体乾燥量／Ｌの菌体を得た。この時ＰＨＢの含量は菌体乾燥重量の１６％に達した。これをＰＨＢの濃度が１２ｇ／Ｌになるように濃縮して、ｐＨ４の水溶液で３７℃の温度で上記実施例（実施例１〜８）と同一の方法で自家分解を行った。その結果、２４時間後、１．６１ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を得た。これは１１％の単量体収率を示す。したがって、（Ｒ）−（−）−３−酪酸が光合成細菌の培養により蓄積されたＰＨＢの自家分解によりまた生産され得たことが証明された。
【００７１】
＜実施例１０＞：フルクトースを炭素源として用いるラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６（ＡＴＣＣ１７６９９ ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
フルクトースを炭素源として用いるラルストニアユートロアＨ１６（ＡＴＣＣ１７６９９ ）をＨｕｇｈｅｓ他の方法〔（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＵＳＰａｔｅｎｔ４，４３３，０５３， （１９８４） 〕で流加式培養した。７０時間後、細胞濃度及びＰＨＢ含量は各々４２ｇ菌体乾燥重量／Ｌ、及び６５％であった。これをＰＨＢの濃度が４２ｇ／Ｌになるように濃縮して、ｐＨ７の水溶液で３０℃の温度で自家分解を行った。その結果、３６時間後、１１．７ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を得た。これは単量体収率で２３％に該当する。したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸は、炭素源としてフルクトースを利用する野生型ラルストニアユートロファを培養することによって蓄積されたＰＨＢの自家分解によってもまた生産され得ることができる。
【００７２】
＜実施例１１＞：プシュードモナスオレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による光学活性をもつ中間鎖の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアルカノエートの生産
プシュードモナスオレオボランスを炭素源で多様なアルカノエート、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌｓ， ａｌｋａｎｏｌｓ）、炭化水素系（ａｌｋａｎｅｓ， ａｌｋｅｎｅｓ）を用いて培養する場合、炭素数が６〜１４の中間鎖のヒドロキシカルボン酸（ＨＡ）単量体で構成されるＰＨＡｓを合成・蓄積して、またＰＨＡ高分子内の単量体の種類及び組成は用いた炭素源の種類にしたがって異なることが報告されている。（Ｂｒａｎｄｌ ｅｔａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５４： １９７７−１９８２， １９８８； Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｉｎ： Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｂｙｒｏｍ， Ｅｄｓ．， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂｕｓｉｎｇｓｔｏｋｅ， １９９１； Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４９： １−１４， １９９６）
たとえば、ヘキサン酸を炭素源とする場合、合成されたＰＨＡはすべての（Ｒ）−（−）形態の炭素数が六つの３−ヒドロキシヘキサン酸、炭素数が７つの３−ヒドロキシへプタン酸、炭素数が８つの３−ヒドロキシオクタン酸及び炭素数が１０の３−ヒドロキシデカン酸の単量体で構成される。この中で、３−ヒドロキシヘキサン酸は主単量体で約８２％のモル分率を占め、３−ヒドロキシへプタン酸と３−ヒドロキシデカン酸は合わせて約１％のモル分率に過ぎない。
【００７３】
へプタン酸を炭素源とする場合、合成されたＰＨＡは炭素数６つから１１の化合物ですべて（Ｒ）−（−）形態の６種の単量体（３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシへプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸）を含んで、この中で３−ヒドロキシへプタン酸が主単量体で約９４％のモル分率で存在する。
【００７４】
オクタン酸を炭素源とする場合、合成されたＰＨＡは偶数、すなわち６つ、８つ、１０の単量体の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸で構成され、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸が主単量体でモル分率が約８６％であり、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸は約１０％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸は４％のモル分率を示す。特に、この場合には合成されたＰＨＡ内に含まれる単量体の大部分が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸と（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸だから、合成された高分子がポリ−（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸−３−ヒドロキシオクタン酸〔Ｐ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ）〕と言われる。
【００７５】
ノナン酸を炭素源とする場合、合成されたＰＨＡはへプタン酸の場合と同様で６種の単量体で構成される。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸は主単量体で約５８％モル分率を示して、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシへプタン酸は３１％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸は６％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸は３％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸は１％ぐらいのモル分率を示して（Ｒ）−（−）−ヒドロキシデカン酸は微量存在する。
【００７６】
デカン酸を炭素源とする場合、合成されたＰＨＡは炭素数が６つ、８つ、９つ、１０及び１１の５種類の単量体で構成され、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸は主単量体で約５８％モル分率を示して、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸は２０％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸は１１％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシウンデカン酸は３％、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸は１％ぐらいのモル分率で存在する。
【００７７】
したがって、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸は炭素源のヘキサン酸から生産されて、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシへプタン酸はへプタン酸から、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸はオクタン酸から、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸はノナン酸から、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸と（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシウンデカン酸はデカン酸から生産することが望ましい。
【００７８】
この実施例では中間鎖の長さのヒドロキシカルボン酸を自家分解により生産するために、オクタン酸ナトリウムまたはノナン酸を用いた。プシュードモナスオレオボランスＡＴＣＣ  ２９３４７を先に報告された方法（Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．， １： ５１−５３， １９９６）にしたがってオクタン酸ナトリウムまたはノナン酸を唯一の炭素源として添加した単純培地で培養した。乾燥菌体重量の５〜４０％のレベルに達するまで共重合体高分子を蓄積した菌体を得た。オクタン酸ナトリウムを炭素源として用いた場合、細胞は乾燥菌体重量の２０％に達するＰＨＡ共重合体を蓄積された。ノナン酸を炭素源として用いた場合、細胞は乾燥菌体重量の１８％に達するＰＨＡ共重合体を蓄積した。上記の細菌を遠心分離して集めた後、これらをｐＨ７．０で調整した水に菌体濃度を基準として７５ｇ／Ｌになるように調整して分散させた後３０℃で４日間自家分解反応を行った（表７及び表８）。
【００７９】
表７：オクタン酸ナトリウムを炭素源として用いて培養したプシュードモナスオレオボランスＡＴＣＣ  ２９３４７中で生産されたＰＨＡｓの自家分解による中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産（初期のｐＨ：７．０、反応温度：３０℃、反応時間：４日）
【００８０】
【表７】
0003579352.tif 000008
【００８１】
表８：ノナン酸を炭素源として用いて培養したプシュードモナスオレオボランスＡＴＣＣ  ２９３４７中で生産されたＰＨＡｓの自家分解による中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産（初期のｐＨ：７．０、反応温度：３０℃、反応時間：４日）
【００８２】
【表８】
0003579352.tif 000009
【００８３】
上記の表７及び表８のように、自家分解により生産された主単量体らの収率は約８−１０％だった。
今まではこの中間鎖長さのヒドロキシアルカン酸を生産する方法は報告されていなかった。一方、中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産効率より多少低いけれども本発明の製造方法により生産できた。さらに、他の中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸もＰＨＡが蓄積される間炭素源を変えることによりまた生産できる。
【００８４】
＜実施例１２＞：プシュードモナスエアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）内に合成・蓄積されたＰＨＡｓの自家分解による中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産
プシュードモナスエアルギノサＡＯ２３２を酢酸を炭素源として用いて培養する場合、炭素数が６つ、８つ、１０及び１２の単量体（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸）で構成されたＰＨＡが合成・蓄積され、プロピオン酸を炭素源として用いて培養する場合、炭素数が６〜１２の間のお互いに相違する７種単量体（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシへプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシウンデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸）で構成されたＰＨＡが合成・蓄積されることが報告された。（Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｄｏｉ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ．， １５： ２８７， １９９３； Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ．， ５２： ２７−５８， １９９５ ）
【００８５】
また、プシュードモナスエアルギノサＰＡＯＩのＰＨＡ合成遺伝子を含むｐｌａｓｍｉｄで形質転換されたプシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）が報告されたが、ＰＡＯ１は炭素源でグルコン酸をもちいて培養する場合、炭素数が６つ、８つ、１０及び１２の単量体（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシヘキサン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸）で構成されたＰＨＡを生産し得るのが報告された。（Ｔｉｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０９： １５−３０， １９９２）
したがって、プシュードモナスエアルギノサを利用する自家分解により多様な中間鎖の長さの炭素数をもつ多様な（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産することができ、特に（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸を生産し得ることが知れた。
【００８６】
この実施例では中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を自家分解により生産するため、既存に報告されているところにしたがって（Ｔｉｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０９： １５−３０， １９９２）、グルコン酸を唯一の炭素源として添加した単純培地でプシュードモナスエアルギノサＰＡＯＩ  ＤＳＭ  １９０７を培養した後、これを回収してＰＨＡ濃度が１５ｇ／ＬになるようにｐＨ７で調整された水に分散させた後３０℃で４日間自家分解反応を行った（表９）。
【００８７】
表９：グルコン酸を炭素源として用いて培養したプシュードモナスエアルギノサＰＡＯＩ  ＤＳＭ  １９０７の自家分解による中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産（初期ｐＨ：７．０、反応温度：３０℃、反応時間：４日）
【００８８】
【表９】
0003579352.tif 000010
【００８９】
上記の表９で示すように、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシオクタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸が６〜１０％の収率で各々生産され、これらの三つの化合物はＬＣまたはＨＰＬＣによって分離される。
したがって、中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸がプシュードモナスエアルギノサ内に蓄積されたＰＨＡの自家分解により生産され、この実施例では（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシデカン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシドデカン酸の生産法を提供する。
【００９０】
＜実施例１３＞：ノナン酸を共基質にして５−フェニル吉草酸を用いてプシュードモナスオレオボランス内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による光学活性をもつ中間鎖の長さの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシアルカン酸及び（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレル酸の生産
この実施例では非正常的な単量体の組成を含むＰＨＡｓがその光学活性をもつ単量体で自家分解されることができるかを調べた。
すでに報告された如く（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９１： １９５７， １９９０； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌ．， ２４： ５２５６， １９９１ ）、プシュードモナスオレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が５−フェニル吉草酸の存在下で培養される場合、光学活性をもつ３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸単量体単位を含むＰＨＡｓを生産し得る。この実施例では、プシュードモナスオレオボランスＡＴＣＣ  ２９３４７を混合基質（５−フェニル吉草酸とノナン酸が２：１モル分率で混合されて合計で１０ｍＭ濃度）で培養した。最終ＰＨＡｓ含量は２２％であって、ＰＨＡの内の３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸単量体単位の分劃は３５ ｍｏｌ％であった。ＰＨＡ含有菌体を回収して初期ｐＨは７で、初期ＰＨＡ濃度は２０ｇ／Ｌに調整された水に溶解させた後３７℃で４日間培養した。生産された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシへプタン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシノナン酸、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸の最終生産量は各々０．１８、０．６５及び０．６２ｇ／Ｌであり、その収率は各々７．０％、８．１％、８．０％であった。
【００９１】
上記の実施例は、たとえ単量体単位が微生物学のＰＨＡについて異常であるとしても、（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸単量体単位がこの単量体を含むＰＨＡの自家分解により生産されることができることを証明した。この結果から微生物内に蓄積された異常なＰＨＡｓは対応する光学活性をもつ単量体を得るために本発明の自家分解方法を用いることにより分解される。
【００９２】
上記の実施例に記載したように、多様な（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸が多様な微生物内に蓄積されたＰＨＡｓの自家分解により効率的に生産されることができた。単量体収率がとても高く、このことが本発明の製造方法を経済的に魅力あるものにする。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブタン酸の場合、本発明の製造方法により生産される単量体収率はアキラ及びタツヒコにより報告された結果（ＪＰ９−２３４０９１， １９９７）と比較できる。下記に要約したように（表１０）、本発明の製造方法により生産される（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の収率はＪＰ９−２３４０９１に記載された方法によって生産されたものより５０倍以上高かった。したがって、本発明の製造方法は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を生産するより効率的で経済的な方法を提供する。さらに、本発明の製造方法は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産が限定されるものではなく、上記の実施例で立証された如く多様な（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産に用いられ得る。ＰＨＡｓを蓄積する細胞内分解酵素活性をもつ任意の野生型微生物が多様な（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産に使用できることは明白である。また、上記の微生物の突然変異株もこれらが細胞内ＰＨＡ分解酵素活性をもっている限り（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産に用いられ得る。
【００９３】
表１０：自家分解により生産された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の収率の要約
【００９４】
【表１０】
0003579352.tif 000011
【００９５】
＊「比較実施例１」及び「比較実施例２」はＰＨＢ含量を菌体乾燥重量５０〜８０％と仮定した日本特許ＪＰ９−２３４０９１に報告された換算された数値である。
【００９６】
＜実施例１４＞：組換えラルストニアユートロファ内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
上記実施例（実施例１〜１３）で、非組換え菌株により生産・蓄積されたＰＨＡ高分子の自家分解による単量体の（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産する方法が提示された。最近、多様な微生物からのＰＨＡ合成に関与する遺伝子のクロニング（ｃｌｏｎｉｎｇ ）及び増幅されたＰＨＡ生合成酵素活性を含む組換え微生物により高分子の生産が向上されたことが報告された。（Ｌｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４９： １−１４， １９９６； Ｌｅｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４： ４３１−４３８， １９９６； Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， １０３： ２１７−２３０， １９９２ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ ）
この実施例ではＰＨＡを合成・蓄積する組換え菌株を自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の生産に用いた。
【００９７】
ラルストニアユートロファＡＴＣＣ  １７６９９のＰＨＡ生合成遺伝子を含む広範囲宿主のプラスミドｐＶＫ１０１（Ｋｎａｕｆ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ， Ｐｌａｓｍｉｄ， ８： ４５， １９８２）により形質転換されたラルストニアユートロファＮＣＩＭＢ  １１５９９（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７０： ５８３７−５８４７， １９８８； Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｈｗａｈａｋ Ｋｏｎｇｈａｋ， ３５： ６８４−６８９， １９９７ ）を従来の方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４３： ８９２−８９８， １９９４）にしたがって培養した。菌体は乾燥重量の約６６％に該当する濃度でＰＨＢを蓄積した。これを遠心分離で回収した後、初期のＰＨＢの濃度が３０ｇ／Ｌであり、初期のｐＨを４．０または７．０に調整した水に分散させて３０℃で３５時間間自家分解した。
【００９８】
その結果、初期のｐＨが４．０に調整された場合には、５ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と０．３ｇ／Ｌの二量体が生産され、そして初期が７．０に調整された場合には、８．７ｇ／Ｌの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と０．６ｇ／Ｌの二量体が生産され、この時の総収率は各々１４．７％と２６．８％であった。したがって、組換え菌株が細胞性分解酵素活性をもっている限り、これらも組換え菌株内に蓄積されたＰＨＡの自家分解により（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産するために使用できる。
【００９９】
＜実施例１５＞：異種ＰＨＡ生合成遺伝子を含む組換え大腸菌内に合成・蓄積されたＰＨＢの自家分解による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の生産
実施例１４で用いられた宿主微生物であるラルストニアユートロファＮＣＩＭＢ  １１５９９（以前にはアルカリゲネスユートロファス）はＰＨＡ生合成遺伝子による形質転換前ですら、ＰＨＡ合成能をもっている。この実施例では本来ＰＨＡの生合成能が全然ない二つの大腸菌を宿主微生物として用いて、ラルストニアユートロファＨ１６  ＡＴＣＣ  １７６９９またはアルカリゲネスラタスＤＳＨ  １１２３のＰＨＡ合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換させた。
この実施例で用いた菌株はアルカリゲネスユートロファスＰＨＡ生合成遺伝子を含む高複製ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＳＹＬ１０５またはアルカリゲネスラタスＰＨＡ生合成遺伝子を含むプラスミドｐＪＣ４（ＫＣＴＣ ０４８１ＢＰ ）によって形質転換された大腸菌Ｂ  ＡＴＣＣ  １１３０３とＸＬ１−Ｂｌｕｅである。（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４４： １３３７−１３４７， １９９４）これらの組換え菌株を２０ｇ／Ｌの葡萄糖を炭素源として添加したＬＢ培地（ｐＨ７．０）で従来の方法（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ４４： １３３７−１３４７， １９９４）にしたがってフラスコ培養した。各々乾燥菌体濃度の７５％〜８０％に達するまで高分子ＰＨＡを蓄積する菌体を遠心分離で回収した。これらを多様な初期ｐＨ（ｐＨ４，７及び１０）と多様な温度（２０，３０，３７及び４５℃）で自家分解反応を行った。種々の組換え大腸菌株を用いるすべての条件下で、４日間の反応後でさえも（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。
【０１００】
上記の二つの実施例（実施例１４及び１５）に示されている如く、組換え菌株が本来ＰＨＡ合成能をもつ場合には、この菌株もまた細胞内ＰＨＡ分解酵素をもつので、この微生物から自家分解により（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸が生産できる。一方、大腸菌のように本来ＰＨＡ合成活性をもたない組換え菌株の場合、この菌株は細胞内ＰＨＡ分解酵素をもってないので自家分解により（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸を生産できない。しかし、本来ＰＨＡ合成活性がない組換え菌株をＰＨＡ合成遺伝子だけでなく細胞内ＰＨＡ分解酵素遺伝子を含むプラスミドで形質転換させると、単量体が自家分解方法により形質転換菌株から生産され得る。したがって、組換え菌株が本来もってあるかまたは組換えＤＮＡ技術により細胞内ＰＨＡ分解活性を獲得する限り組換え菌株内に蓄積されたＰＨＡの自家分解により組換え菌株は（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸単量体を生産するために用いられる。
【０１０１】
＜実施例１６＞：ＨＰＬＣを利用する光学的に純粋なヒドロキシカルボン酸単量体らの分離
ＰＨＡｓの共重合体の自家分解により生産されたヒドロキシカルボン酸単量体の混合物はイオン交換、電気透析、抽出、蒸溜、ＬＣ及びＨＰＬＣ等の一般的によく知られている方法により容易に分離できる。望ましい一つの例として実施例３で生産された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸及び４−ヒドロキシ酪酸をＨＰＬＣを利用して分離した。（第５図、第６図及び第８図）
【０１０２】
具体的には、ヒドロキシカルボン酸単量は日立Ｌ−６０００ポンプとＬ−３３００  ＲＩ検出器が装着されているＨＰＬＣ（日立社製、日本）にＡｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂ．社製、米国）またはＯＲＨ−８０１  ｃｏｌｕｍｎ（Ｒａｉｎｉｎ社製、米国）の有機酸分離カラムを装着させた後、０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４水溶液を流動状で用いて、分離精製された。図５、６及び８に明示する如く、二つの単量体らが効率的に分離された。Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈ  カラムは糖と有機酸の分離及び分析に一般的に用いられるイオン交換カラムである。したがって、イオン交換カラムが装着されているＬＣまたはＨＰＬＣはヒドロキシカルボン酸単量体を効率的に分離できる。なおさら、イオン交換カラムの使用は容易に大規模化することができるメリットがある。中間鎖の長さのヒドロキシカルボン酸のようにより長い鎖をもつ単量体の分離のために、疏水性吸着カラムの使用も可能である。
【０１０３】
＜実施例１７＞：（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸の精製
ポリ− （Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシブチレートのような同種高分子から得た単量体及び共重合体の自家分解の後に実施例１６で記述した方法により純粋に分離された単量体（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は以後その用途にしたがって最終産物をつくるため下記に記述された方法または通常の化学的方法によりさらに精製することができる。
この実施例では、前記の実施例１及び２の方法で生産した（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の分離精製のために二つの好ましい方法を試験した。
【０１０４】
この１つの方法はＳｅｅｂａｃｈ他の方法を変形した方法である（Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｓｙｎｔｈ．， ７１： ３９−４７， １９９２）。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸−硫酸水溶液１０ｍＬ（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸２００ｇ／Ｌ）に１ｍＬの０．１Ｎの水酸化ナトリウムを添加して中和させた後、回転蒸発乾燥機（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ ）で水を蒸発させた。次いで２０ｍＬのエーテルを加えてこの混合物を溶解させて無水硫酸マグネシウム塩を添加して水分を除去してろ過した。もう一度回転蒸発乾燥機で溶媒のエーテルを除去・濃縮した後、Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ装置（Ａｌｄｒｉｃｈ 社製、米国）を用いて１００℃で減圧蒸溜した。その結果約１．５８ｇの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（約７９％の収率）を９０％以上の純度で得た。
上記方法において減圧状態での蒸溜のように分離精製処理に必要な多量のエネルギーは生産単価を上昇させる。したがって、他の精製法が下記に示すように開発された。
【０１０５】
最初に、自家分解により得られた（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の溶液１０ｍＬ（（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸２００ｇ／Ｌ）に水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１１に調整した。次いで１０ｍＬのクロロホルムまたはエーテルを添加して有機相中に抽出された不純物を除去した。水溶相を９５℃で乾燥機中で乾燥した。得られた乾燥物をエタノールに溶解させて再び乾燥した。最後に、約１．９７ｇの（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸−ナトリウム塩を９０％以上の高純度をもつ粉末（約８２％の収率）の形態として得た。この方法で、ｐＨをアルカリ領域に調整するために添加した水酸化ナトリウムに加えて最終の塩の形態の種類の変化以外には方法に影響を与えない、水酸化カリウムの如き他の強アルカリが使用できる。
さらに、この実施例では、不純物の除去のために抽出溶媒として用いられたクロロホルム及びエーテルの代りに水と混ざらない任意の他の有機溶媒がこの方法にほとんど影響することなく使用できる。
上記の二つの方法は収率または純度の面で大きい相違はないが、Ｓｅｅｂａｃｈ他の（Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｓｙｎｔｈ．， ７１： ３９−４７， １９９２）の方法は、操作経費が高く複雑な装置を必要とするので、実際に採用することは困難である。従って、本発明で開発された後者の方法が実際の使用により適合しやすく、そしてこの方法によって（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を効率的に精製及び粉末製剤化することができる。
この実施例は、単に（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸のみを精製するだけでなく、この精製方法は他の全ての（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシカルボン酸単量体の精製にも使用することができ、その場合にもこれらの化合物を効率的に精製及び粉末製剤化することができる。
【０１０６】
＜実施例１８＞：精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の同定及び光学純度の試験
上記の実施例１７により精製した生産物が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸であるものを同定するためにこれをＣＤＣｌ３ に溶解させプロトンＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）で分析した。図９に示した如く、精製産物が（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸であることを確認した。微生物中に蓄積されたＰＨＡｓは、もし単量体単位が光学異性体（３−ヒドロキシプロピオン酸、４−ヒドロキシ酪酸、５−ヒドロキシ吉草酸及び３−ヒドロキシ−２−ブテン酸の異性体ではない）をもつならば、生合成酵素の光学特異性に基づく（Ｒ）−（−）−立体配置をもつ光学活性単量体単位のみから構成される。したがって、生産されたすべての単量体単位は理論的には光学的に純粋である。これを証明するために、精製粉末を蒸溜水に溶解させて旋光度（ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎ）を旋光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．， ＵＳＡ ）を用いて測定した。測定された旋光度は−２４．７°でＳｅｅｂａｃｈ他が報告した（Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｓｙｎｔｈ．， ７１： ３９−４７， １９９２）値と全く一致した。従って、精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が光学的に純粋であることを証明した。
【０１０７】
【発明の効果】
上記に詳細に説明し立証したように、多様な微生物中に高濃度で生産・蓄積される多様なＰＨＡｓの自家分解によって生産される各種の光学活性をもつ（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸が生産され、そして生産された単量体は、もしこれらが二つ以上の単量体の混合物として存在するならば、ＬＣまたはＨＰＬＣを用いて容易に分離・精製できる。さらに、純粋に分離された（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸は不純物を除く有機溶媒抽出によってさらに精製され、そして乾燥して粉末製剤化される。本発明で開発された多様な（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、単純な方法で高収率でしかも高純度で（Ｒ）−（−）−ヒドロキシカルボン酸を、効果的に生産し得るので経済的である。また、従来の製造方法で多量に必要とされた有機溶媒の量を本発明の方法ではわずかに最少の量で使用されるので、環境に優しい方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はアルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢをｐＨ調節なく（初期のｐＨは７．０）分解溶液で自家分解する間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度（−●−）と分解溶液のｐＨの変化（−▲−）を示す図である。
【図２】図２はアルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢをｐＨ７．０で維持される分解溶液で自家分解させる時、時間による（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度変化を示す図である。
【図３】図３は初期のｐＨが７．０または１０．０である時、コリネバクテリウムの中の細菌に蓄積されたＰＨＢが自家分解される間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度変化を示す図である。
【図４】図４はｐＨが７．０または１０．０である時、バシラスの細菌により蓄積されたＰＨＢが自家分解される間、時間にしたがう（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の濃度の変化を示す図である。
【図５】図５は市販されている（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の標準ＨＰＬＣピークを示す（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＵＳＡ ）。
【図６】図６は市販されている（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸の標準ＨＰＬＣピークを示す（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＵＳＡ ）。
【図７】図７はアルカリゲネスラタスに蓄積されたポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の自家分解により生産されるヒドロキシ酪酸のＨＰＬＣピークを示す。
【図８】図８はアルカリゲネスラタスに蓄積されたポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレートの共重合体の自家分解により生産された単量体（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸と４−ヒドロキシ酪酸のＨＰＬＣピークを示す。
【図９】図９はアルカリゲネスラタスに蓄積されたＰＨＢの自家分解により生産され精製された（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸のＨ１ ＮＭＲピークを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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