(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の開花時期を促進するDNAであって、配列番号：１に記載のイネ由来の野生型Ranタンパク質のアミノ酸配列の２７位のスレオニン残基、または他の植物由来のRanタンパク質のアミノ酸配列のそれと対応する部位のアミノ酸残基に、スレオニン残基からアスパラギン残基への置換変異を有するRanタンパク質変異体をコードするDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項７】
請求項１に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする植物の開花時期を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物のＲａｎ遺伝子変異体、および該変異体を用いた植物の開花時期促進に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物において開花を促進することは園芸や農業の分野において重要な意義を有する。植物の開花時期を促進することによって、例えば観賞用植物においては、商品を市場へ提供するまでの期間を短縮させること、イネなどの有用農作物においては収穫までの期間を短縮させることが可能となる。さらに、植物の開花時期を促進することによって、観賞用植物や有用農作物の増産が可能となる。
【０００３】
植物の開花時期の促進に関する研究としては、近年分子遺伝学的研究において解析が行われ報告されている。花成時期に関与する遺伝子としては、具体的にはＣＯ、ＦＴ、ＳＯＣ１遺伝子が知られており、特に、ＦＴ遺伝子においては、ＬＦＹ遺伝子を同時に強制発現すると早期に花成が誘導される（「花成を制御する複数の経路を統合する遺伝子」荒木崇、化学と生物、３８巻、１２号、８２６−８２９、２０００年発行）。
【０００４】
一方、核膜の形成や、有糸分裂の際の微小管の形成や細胞周期の制御など生体内の非常に重要な現象に関与する因子としてＲａｎタンパク質が知られている。Ｒａｎタンパク質はｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ  と呼ばれる一群のタンパク質のファミリーに属する。このファミリーのタンパク質には、ＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の２種類の存在形態があり、その変換のサイクルが生体機能に重要であることが一般に知られている。ＧＴＰ結合型Ｒａｎタンパク質はおもに核内に、ＧＤＰ結合型Ｒａｎタンパク質は主に細胞質に存在し、タンパク質などの生体物質の輸送の方向性を規定していると考えられている。
【０００５】
最近、酵母や動物のＲａｎタンパク質の解析から、Ｎ末端側に存在するスレオニン残基をアスパラギン残基に置き換えると、ＧＴＰに対する親和性が著しく低下することが明らかとなった。しかしながら、この変異の生体に対する影響は解明されていない。特に、この変異体が植物に与える影響に関する報告例は皆無である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物のＲａｎ遺伝子変異体の植物に与える影響を見出すことにある。さらに、本発明は、植物のＲａｎ遺伝子変異体の植物に与える影響を利用して植物を改変することを目的とする。より詳しくは、本発明は、植物のＲａｎ遺伝子変異体、および該変異体の植物の開花時期の促進における用途を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、イネ由来のＲａｎ遺伝子について変異体を作製し、該変異体の植物における影響を分子遺伝学研究のモデル植物として知られるシロイナズナを利用して検証した。
【０００８】
その結果、驚くべきことに、イネＲａｎ遺伝子変異体を導入したシロイナズナでは、その開花時期が促進されることが判明した。この事実は、植物のＲａｎ遺伝子変異体を利用して、植物の開花時期を促進できることを意味するとともに、このようなＲａｎ遺伝子変異体を利用した植物の改変が種の壁を越えて広く植物に適用できることを意味する。本発明によれば、例えば観賞用植物や有用農作物等の収穫時期を早め、早期に市場へ提供することが可能となる。また、これら植物の増産も可能となる。
【０００９】
即ち、本発明は、植物のＲａｎ遺伝子変異体、および該Ｒａｎ遺伝子変異体を利用した植物の開花時期の促進に関し、より具体的には、
〔１〕  植物の開花時期を促進するＤＮＡであって、植物由来のＲａｎタンパク質変異体をコードするＤＮＡ。
〔２〕  Ｒａｎタンパク質変異体が配列番号：１に記載のイネ由来の野生型Ｒａｎタンパク質のアミノ酸配列の２７位のスレオニン残基、または他の植物由来のＲａｎタンパク質のアミノ酸配列のそれと対応する部位のアミノ酸残基に変異を有するものである〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕  変異が、スレオニン残基からアスパラギン残基への置換変異である〔２〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
〔５〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換植物細胞。
〔６〕  〔５〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔７〕  〔６〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔８〕  〔６〕または〔７〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔９〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする植物の開花時期を促進する方法、を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、植物のＲａｎ遺伝子変異体を利用することにより、植物の開花時期を促進できることを初めて見出した。従って、本発明は、植物の開花時期を促進するＤＮＡであって、植物由来のＲａｎタンパク質変異体をコードするＤＮＡを提供する。
【００１１】
本発明のＲａｎタンパク質変異体をコードするＤＮＡの由来としては、植物であれば特に制限はない。本実施例において、単子葉植物であるイネに由来するＲａｎ遺伝子変異体が、双子葉植物であるシロイナズナの開花時期を促進した。このことは、種の壁はもちろんのこと、単子葉植物と双子葉植物の壁を越えてＲａｎ遺伝子変異体が機能することを意味する。従って、植物の開花時期の促進に用いるＲａｎ遺伝子変異体は、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよい。例えばイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物由来、あるいはタバコ、シロイナズナ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等の双子葉植物を例示することができる。
【００１２】
本発明のＲａｎタンパク質変異体をコードするＤＮＡを導入する「植物」としては、特に制限はなく、その開花時期を促進させたい所望の植物を用いることができるが、鑑賞用植物や有用農作物が好適である。有用農作物としては、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、バラ、カーネーション、シクラメン等の花卉植物が挙げられる。
【００１３】
本発明の「Ｒａｎタンパク質変異体」における変異部位、変異数、および、変異タイプは、植物の開花時期を促進しうる限り制限はない。好ましい変異体は、Ｒａｎタンパク質のＮ末端に存在する生物種間で保存性の高いアミノ酸残基に変異を有する変異体である。このＮ末端の保存性の高いアミノ酸として、具体的には、イネＲａｎタンパク質のアミノ酸配列において２７位のスレオニン、またはイネ以外の植物においては、該２７位に対応する部位のアミノ酸残基（通常スレオニン）を例示することができる。このアミノ酸残基に変異を有すると、ＧＴＰに対する親和性が著しく低下することが知られている。本発明のＲａｎタンパク質変異体は、好ましくは、ＧＴＰに対する親和性が著しく低下しているものである。このＧＴＰに対する親和性の低下が、開花時期の促進に関連することが推察される。イネＲａｎタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）における、２７位のスレオニン残基、もしくはイネ以外の植物において該２７位に相当する部位のアミノ酸残基の他のアミノ酸への置換においては、植物の開花時期を促進しうる限り、置換後のアミノ酸残基の種類に特に制限はない。例えばアスパラギン残基への置換が挙げられる。
【００１４】
本発明におけるＲａｎタンパク質変異体は、例えば、野生型Ｒａｎ遺伝子（配列番号：１）を改変することにより取得することができる。Ｒａｎ遺伝子の改変は、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて行うことができる。例えば、Ｒａｎ遺伝子配列に基づいて作成した合成オリゴヌクレオチドプローブ、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用い、公知の方法でＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）によりＲａｎ遺伝子をクローニングした後、人工的に変異を導入する方法が挙げられる。ただし、本発明におけるＤＮＡは、このような人工的に作製されたもの以外に、天然に存在するものであってもよい。
【００１５】
以下に、植物のｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲによって本発明のＤＮＡの一部を合成し、それをプローブとして用いたハイブリダイゼーションによって、Ｒａｎ遺伝子をクローニングした後、変異を導入する具体的な方法を例示する。
【００１６】
（１）ｍＲＮＡの調製およびｃＤＮＡライブラリーの構築
植物の茎葉、根、カルス等の組織、好ましくは茎葉から、常法により全ＲＮＡを抽出した後、タンパク質、多糖類、その他の夾雑物を取り除き、さらにオリゴｄＴセルロースを充填したカラムを用いてＰｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡを精製することによって、ｍＲＮＡを得る。
【００１７】
次に、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをファージベクター、例えばλｇｔＩＩ、λＺＡＰＩＩ等に組み込み、組み換えファージを得る。これらを宿主（例えば大腸菌）に感染させることにより、プラークを多数得ることができる。これら一連の操作はｃＤＮＡクローニングキットが市販されているのでこれらを使用してもよい。
【００１８】
（２）クローニング用プローブの作製およびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリーの中から目的とするＲａｎタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するために、既知のＲａｎ遺伝子で保存されている塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして上記で抽出したｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によってＲａｎタンパク質の一部をコードするプローブとして使用し、ｃＤＮＡ断片を得る。このようなプライマーは、植物のＲａｎ遺伝子の塩基配列、およびアミノ酸配列を基に、化学合成によりプライマーを得ることができる。
【００１９】
次に、このプライマーを用いたＰＣＲにより、植物のｃＤＮＡを増幅してＲａｎタンパク質の一部をコードするプローブＤＮＡを取得する。得られたプローブＤＮＡを放射標識や蛍光標識により標識し、ハイブリダイゼーションを行う。
【００２０】
（３）クローニングされたＤＮＡの塩基配列解析
上記のハイブリダイゼーションで選抜されたプラークからファージを採取し、さらにその中からファージＤＮＡを回収して、ジデオキシ法等により、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。その塩基配列中のタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム）から推定されるアミノ酸配列を、既知のアミノ酸配列と比較する。比較を行うための配列整列化方法は、当技術分野において周知である。具体的には、ＢＬＡＳＴｎ（核酸レベル）またはＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラムを利用して配列の比較を行い、高い相同性であるかを検討することにより、目的とするＲａｎタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片であることを確認することができる。高い相同性とは、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を指す。配列分析プログラムＢＬＡＳＴｎまたはＢＬＡＳＴｘは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかのソース及びインターネット上から入手可能である。それは、ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。ＢＬＡＳＴｎに基づいて塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ  ＝  １００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  １２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴｘによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば  ｓｃｏｒｅ  ＝  ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  ３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２１】
（４）ＤＮＡの改変
ＤＮＡ配列の一部分の領域にある塩基配列を改変するための当業者によく知られた方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４巻，  ３６７号）およびオリゴヌクレオチド−ダイレクトデュアルアンバー法等が知られている。具体的には、植物のＲａｎタンパク質をコードするＤＮＡの断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ等のプラスミドベクターの制限酵素切断部位に挿入し、連結してなる組み換えプラスミドベクターを作製する。次に、４種類のプライマーを用いて、後記の実施例において記載した手順によるＤＮＡ改変方法により、改変ＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
また本発明は、本発明のＲａｎタンパク質変異体をコードするＤＮＡを有するベクター、該ＤＮＡを発現可能に保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００２３】
本発明のＤＮＡの植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００２４】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００２５】
また、本発明のＤＮＡを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００２８】
次いで、本発明のＤＮＡを導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉら  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００：１５０３−１５０７参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．  （１９９５）  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）  ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００，  １５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：  ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：  ２７１−２８２．）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２９】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、数ヶ月の栽培により花形成が認められ成熟して結実して種子を得ることができる。
【００３０】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡの存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。
【００３１】
この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に準じて実施することができる。
【００３２】
再生させた植物体中に存在する本発明のＤＮＡよりなる外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のＤＮＡ、あるいは本発明により改変されたＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００３３】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３４】
このように、変異体を植物に導入して、花形成を制御するには、例えば、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる方法等が挙げられる。また、本発明のＤＮＡを適当なベクター（ウイルスベクター）に挿入し、これを植物に感染させる方法等も挙げられる。
【００３５】
また本発明は、本発明のＤＮＡを植物に導入することを特徴とする植物の開花時期の促進方法を提供する。本発明においては、本発明のＤＮＡを上記の如く植物に導入することにより、植物の開花時期を促進することができる。本発明の方法で作製した植物は、商品を市場へ提供するまでの期間が短く、増産可能な観賞用植物や有用農作物として園芸や農業の分野において重要な意義を有する。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、以下の実施例に記載される実験操作の手順は、特に断らない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９年）に記載されている方法に従った。
【００３７】
［実施例１］イネＲａｎ遺伝子のクローニングと変異体の作製
（１）  イネｍＲＮＡの調製
イネ（品種：日本晴）の種子を播種した。栽培７日目の幼植物体の茎葉２ｇを液体窒素で凍結した。凍結した茎葉を乳鉢内で粉砕した。その粉砕物から公知のＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを使用）（実験医学、Ｖｏｌ．  ９  Ｎｏ．１５（１１月号）１９９１年、９９頁〜１０２頁）に従い、全ＲＮＡ約２ｍｇを抽出した。次に、得られた全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）により単離し、イネのｍＲＮＡを約３０μｇ得た。
【００３８】
（２）  イネのｃＤＮＡライブラリーの構築
上記（１）で得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）によりｃＤＮＡを得た。
【００３９】
次に、ＥｃｏＲ  Ｉ切断末端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ処理したλｇｔＩＩファージベクター（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ４９巻（１９８５年）参照；ｌａｍｂｄａ  ｇｔＩＩ／ＥｃｏＲ  Ｉ／ＣｌＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製））に、このｃＤＮＡを連結して得られた組み換えファージを、イン−ビトロパッケージング・キット（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））によりラムダファージにパッケイジングした。
【００４０】
こうして得られた組み換えファージを大腸菌Ｙ１０８８（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に感染させて増殖させた。大腸菌の溶菌プラークとして多数の組み換えファージが得られた。プラーク中のファージは、イネ由来の全ｃＤＮＡを含有する多種多様のファージから成るものであり、イネのｃＤＮＡライブラリーとして利用した。
【００４１】
（３）  ＰＣＲ用のプライマーの構築
イネＲａｎをコードするｃＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーション法によってクローニングするためのＤＮＡプローブを得る必要があった。そこで、該ＤＮＡプローブの作製をＰＣＲ法により行うため、まずプライマーの設計を行った。そのために、既知のイネＲａｎ遺伝子がコードするアミノ酸配列を参考にして、下記の塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド（プライマーＡおよびプライマーＢ）を作製した。
プライマーＡ；  ５’−  ｃｃｇａａｔｔｃｃｃａｃａｃｃｔｃｃｇｃｇｔｇｃｃｔｃ  −３’  （配列番号：５）
プライマーＢ；  ５’−  ｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｔｇｔａｃｇｔｃａｇｃｃｇａ  −３’  （配列番号：６）
【００４２】
上記のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【００４３】
（４）プローブＤＮＡの作製
次に、上記（３）の２種類の合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐｍｏｌ（最終濃度０．２μＭ）を第１のプライマーおよび第２のプライマーとして用い、上記（２）で得られた組み換えファージよりなるｃＤＮＡライブラリーの１μｌを鋳型として用い、これらをＰＣＲ法用の増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、ｐＨ８．３；４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各２．５ｍＭの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼ  Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、２．５単位）５０μｌに加えて、増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）により調製した。
【００４４】
ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を７２℃、２分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００４５】
その結果、イネＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡ配列のうちの一部分であるＤＮＡ断片の増幅生成物が生成できた。これをプローブＤＮＡとして、以下のｃＤＮＡライブラリーのクローニングに用いた。
【００４６】
（５）  イネのｃＤＮＡライブラリーからのイネＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡを有するファージＤＮＡの選択
上記（２）で作製したイネのｃＤＮＡライブラリーである組み換えファージから、上記（４）で作製したプローブＤＮＡにより、イネＲａｎ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を組込まれた組み換えファージをスクリーニングする。この目的のために、上記（２）で得られたイネｃＤＮＡライブラリーである組み換えファージのプラークを１．５％寒天培地上に形成させた。それらプラークをナイロン膜（アマシャム社製）ハイボンドＮに転写した。こうしてナイロン膜に転写されたファージのプラークに含まれているファージＤＮＡは、アルカリ変性液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．０Ｍ  ＮａＯＨ）および中和液（１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ５、２．０Ｍ  ＮａＣｌ）でそれぞれ１０分間処理し、その後にＵＶ照射によりナイロン膜上に固定した。
【００４７】
次に、上記（４）で得られたプローブＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして得られた標識プローブＤＮＡを、ファージＤＮＡを固定したナイロン膜に対してプラーク・ハイブリダイゼーションさせた。プローブＤＮＡのラベリングはＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）により行った。
【００４８】
この場合、ファージＤＮＡの固定されたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ  Ｎａ−ＰｉバッファーｐＨ７．２、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に浸し、さらに６５℃、１０分間、浸漬処理を行った。次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、６５℃、１５時間にわたりハイブリダイゼーション反応を行った。
【００４９】
反応終了後、洗浄液（４０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、１％  ＳＤＳ）で２０分間ずつ３回洗浄した。その後、上記のＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、目的の組み換えファージの検出を行った。その結果、Ｘ線フィルム上で４個の強いシグナルが検出された。よって、３０万個のファージプラークからＲａｎ遺伝子が組み込まれていると思われるファージのプラークを４個単離選抜できた。
【００５０】
これら４個の組み換えファージから、λＤＮＡ単離キット（Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））により、４個のファージプラークそれぞれについて別々にλＤＮＡを単離した。
【００５１】
この際のλＤＮＡの単離は次のようにして行った。即ち、各々のファージを大量に増殖させた培養液５ｍｌに、ＤＮａｓｅＩ（２０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＲＮａｓｅＡ（２ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを加え、室温で１５分間、放置した。得られたファージ増殖溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた上清に８０％ＤＥＡＥ−セルロース  ２５ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートした。このようにインキュベートされた混合液を遠心分離し、得られた上清に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ２ｍｌ、Ｐｒｏｔｅｎａｓｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）７７０μｌを加え、３７℃で１５分間放置した。さらに、５％  ＣＴＡＢ溶液（１％  ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１．５ｍｌを加えた。得られた混合物を６５℃、３分間処理した後、氷中で５分間放置した。こうして得られたそれぞれの反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後、この溶液を遠心分離し、沈澱したファージＤＮＡを乾燥させ、５ｍｌの水に溶解して保存した。
【００５２】
上記のようにして単離された４種類のファージＤＮＡの各々  ５μｌを、Ｈバッファー中で制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して、その消化反応液を分析した。その結果、これらファージＤＮＡはいずれも同一のＤＮＡ配列であることが確認された。
【００５３】
イネのＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたファージ中の挿入ＤＮＡ断片は、上記のように選抜された採取ファージのＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩで切出すことにより収得された。
【００５４】
（６）  イネのＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡのクローニング
上記のようにイネのＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたＤＮＡ断片として、ファージから切出して収得されたＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーション・キットにより挿入し、連結した後、組み換えプラスミドベクターを構築した。このように構築された組み換えプラスミドベクターの導入により大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を形質転換した。
【００５５】
具体的には、上記で得られた組み換えファージＤＮＡの１０μｇを、Ｈバッファー中で、制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して消化反応液を得た。また、プラスミドベクターｐ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）の１０μｇを同様にＥｃｏＲＩで消化して消化反応液を得た。それぞれの消化反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後に各々から得られたＤＮＡ溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。こうして得られたファージ由来のＤＮＡの水溶液とプラスミド由来のＤＮＡ水溶液の各々５μｌを混合し、得られた混合物をＤＮＡリゲーション・キット（宝酒造（株）製）で処理して、それら２種のＤＮＡを連結させた。得られた連結反応液に１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間放置した。得られた混合液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させた。こうして得られた連結ベクターＤＮＡを１０μｌの水に溶解した。
【００５６】
次に、得られた連結ベクターＤＮＡの水溶液１０μｌ  （ＤＮＡ  １０ｎｇ）と、市販の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’コンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１００μｌとを、１．５ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０秒間、そして再び氷中で２分間インキュベートした。その後に、インキュベートされた混合物に対してＳＯＣ液体培地（２％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  グルコースを含有）  ９００μｌを加えてから、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養した。
【００５７】
得られた大腸菌の培養液の１００μｌを、アンピシリンを５０ｍｇ／ｌの濃度、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度で添加したＬＢ寒天培地（１％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母抽出物、０．５％  ＮａＣｌ、０．１％  グルコース、ｐＨ  ７．５、寒天１．５％含有）にプレーティングした。３７℃で１６時間、大腸菌を培養後、白色に発色してない大腸菌コロニーから、白色に発色している大腸菌コロニーを、前記の連結ベクターＤＮＡで形質転換された大腸菌として分離した。
【００５８】
このようにして分離された白色、かつ、アンピシリン耐性である大腸菌コロニー１０個を、アンピシリン５０ｍｇ／ｌを含む液体培地で増殖させ、さらに増殖された大腸菌から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ，  ＱＩＡＧＥＮ社製）によりプラスミドを分離、精製した。この精製により、上記で得られた耐性コロニーの形質転換大腸菌から５０μｇ（５０μｌ）のプラスミドを得た。
【００５９】
このようにクローニングされて得られた前記のプラスミドは、イネＲａｎ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡである目的の組み換えプラスミドであり、そして約４ｋｂのサイズを有した。
【００６０】
（７）  クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析
上記のクローニングされたＤＮＡである組み換えプラスミド（約４ｋｂのサイズ）を市販の塩基配列決定キットで処理すると、そのＤＮＡ断片の全体の塩基配列を決定することができる。そして、そのＤＮＡ断片内部に含有されたイネＲａｎ遺伝子に該当するＤＮＡ配列の塩基配列を判定できる。なお、上記のＤＮＡの塩基配列の決定を行うに当っては、塩基配列決定キット（Ａｕｔｏｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、変性処理を行った後に自動ＤＮＡシーケンサＡＬＦ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＩＩ（ファルマシア社製）で前記ＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００６１】
（８）改変されたＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎの作製
以下に、上記で得られたイネＲａｎ遺伝子を基にＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎと命名されたＤＮＡ配列（配列番号：３）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する。ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、２７位のスレオニンをコードするコドンＡＣＣが、ＡＡＣに改変された塩基配列からなるＤＮＡに相当する。
【００６２】
（ｉ）  ＰＣＲ用のプライマーとしての合成オリゴヌクレオチドの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１，アプライドバイオシステムズ社製）を利用して、プライマー１、プライマー２、プライマー３、およびプライマー４とを化学合成により構築した。各プライマーの塩基配列は次の通りである。
プライマー１；  ５’−  ｇａｃｇｇｃｇｇｃａｃｇｇｇｃａａａａａｃａｃｃｔｔｔｇｔｇａａｇａｇ  −３’  （配列番号：７）
プライマー２；  ５’−  ｃｔｃｔｔｃａｃａａａｇｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｇｃｃｇｔｃ  −３’  （配列番号：８）
プライマー３；  ５’−  ｃｃｇａａｔｔｃｃｃａｃａｃｃｔｃｃｇｃｇｔｇｃｃｔｃ  −３’  （配列番号：５）
プライマー４；  ５’−  ｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔｔｃｔｔｇｔａｃｇｔｃａｇｃｃｇａ  −３’  （配列番号：６）
【００６３】
（ｉｉ）改変されたＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
改変されたＤＮＡ断片をＰＣＲ法による増幅反応により収得するために、ＰＣＲ法の第１回段階として下記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行った。
【００６４】
即ち、その（Ａ）反応では、鋳型として用いられる前記の組み換えプラスミドベクターｐＯｓＲａｎ１の５μｌと、プライマー１の１μＭと、プライマー４の１μＭとを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，  ４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この（Ａ）反応で得られたＤＮＡの増副生成物を、ＤＮＡ断片−Ａと称する。
【００６５】
また、（Ｂ）反応では、鋳型として用いられる前記ベクターｐＯｓＲａｎ１の５μｌと、プライマーとして用いられる前記のプライマー２の１μＭと、プライマー３の１μＭとを、（Ａ）反応で用いたと同じ組成の増幅反応液に加えて、増幅反応を行った。この（Ｂ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物をＤＮＡ断片−Ｂと称する。
【００６６】
なお、前記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣ−７００（アステック社製））内で、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５０℃で３０秒間、伸張を７２℃で２分間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施した。
【００６７】
増幅反応の終了後、（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての約２５０ｂｐのＤＮＡ断片−Ａを含むバンドをアガロースゲルから切出した。また、（Ｂ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動にかけて分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての約１５０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出した。
【００６８】
これらのゲル切片から、ＧＥＮＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）により分離してＤＮＡ断片−Ａの精製品とＤＮＡ断片−Ｂの精製品を得た。
【００６９】
次に、ＰＣＲ法の第２回段階として、前記のプライマー３の１μｌおよびプライマー４の１μｌ、ならびに前記の（Ａ）反応および（Ｂ）反応で増幅したＤＮＡ断片−Ａの１μｌとＤＮＡ断片−Ｂの１μｌを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，  ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼの２．５ユニットを含有）１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を９４℃、３０秒、アニーリングを５０℃、３０秒、伸張を７２℃、２分行う３つの反応操作を３０回繰り返して実施した。
【００７０】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として３６０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｃを含有するバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片−Ｃを分離して且つＤＮＡ断片−Ｃの精製品を得た。
【００７１】
（ｉｉｉ）改変ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃを利用して、目的の改変ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングにより十分な量で収得する操作を次に行う。
【００７２】
まず、上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃの１０μｇを、Ｈバッファー（宝酒造（株）社製）中で制限酵素ＸｈｏＩの１０ユニットとＮｃｏＩの１０ユニットで消化した。この消化で得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片−Ｄと称する。他方、プラスミドベクターｐＯｓＲａｎ１の１０μｇをＨバッファー中で、ＸｈｏＩの１０ユニットとＮｃｏＩの１０ユニットで消化した。この消化で得られた約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片−Ｅと称する。これらのＤＮＡ断片−ＤとＤＮＡ断片−Ｅとを含む消化反応液にそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。その後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。
【００７３】
こうして得られたＤＮＡ断片−Ｄの水溶液の５μｌと、ＤＮＡ断片−Ｅの水溶液の５μｌとを混合し、次に、得られた混合物（１０μｌ）に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡリゲーション・キット（宝酒造（株）社製）により連結反応させた。その連結反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。インキュベートされた反応溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解して水溶液にした。
【００７４】
この連結させたＤＮＡプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に導入した。さらに形質転換された大腸菌細胞を液体培地中で培養した。
【００７５】
培養された大腸菌細胞から、さらにプラスミドを抽出した。こうして改変ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ配列を含有する組み換えプラスミドがクローニングできた。この改変ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ配列を含有する組み換えプラスミド（ｐＯｓＲａｎ１−Ｔ２７Ｎと命名）を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＯｓＲａｎ１−Ｔ２７Ｎと命名）を以下の場所に寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧  通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１３年４月２７日
（ハ）寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３１６
【００７６】
［実施例２］  Ｒａｎ遺伝子変異体によるシロイナズナの形質転換と形質転換体の評価
（１）  外来遺伝子の導入用の組み換えベクターの作製
選抜マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含む公知の外来遺伝子導入用組み換えベクターｐＵＢ−Ｈｍ（Ｕｒｕｓｈｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５１巻、３３−３８頁、２００１年）のＤＮＡ（１０μｇ）を、Ｍバッファー  （宝酒造（株）製）中で制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉの１０ユニットで消化した。その消化反応液からＤＮＡを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させて約１３．６ｋｂのサイズのベクター断片を得た。
【００７７】
また、実施例１に記載のＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎの塩基配列を有するプラスミドの１０μｇを、Ｈバッファー  （宝酒造（株）社製）中で制限酵素ＸｈｏＩの１０ユニットとＢｇｌＩＩの１０ユニットで消化した消化反応液にそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させて、約７６０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を得た。上記で得られたそれぞれのＤＮＡ断片を５μｌの水に溶解して水溶液にした後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）を用いて処理し、それぞれのＤＮＡ断片の両端を平滑化した。
【００７８】
上記の約１３．６ｋｂのサイズのベクター断片を含む水溶液を脱リン酸化処理した後、上記のＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎの塩基配列を含むＤＮＡと混合し、得られた混合物をＤＮＡリゲーション・キット（宝酒造（株）製）で処理して、ＤＮＡの連結反応を行った。こうしてプラスミドベクターｐＵＢ−Ｈｍの制限酵素サイトＳｓｅ８３８７Ｉ切断ベクターに対して、前記の改変されたＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ配列を含むＤＮＡ断片を連結してなる環状の組み換えベクターを作製した。この組み換えベクターをｐＵＢ−ＯｓＲａｎ１Ｔ２７Ｎと称する。ベクターｐＵＢ−ＯｓＲａｎ１Ｔ２７Ｎは、トウモロコシのユビキチンプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に、ＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ  領域が挿入、連結されてあり、かつハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する構造を有し、１５．６ｋｂのサイズを有した。
【００７９】
（２）  シロイヌナズナ植物の調製
シロイヌナズナの種子を７０％エタノール溶液に６０秒間、ついで有効塩素約２％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。
【００８０】
Ｂ５培地の無機成分組成にショ糖２％、寒天０．８％を添加してなる培地に、上記で殺菌したシロイヌナズナ種子を置床した。２２℃で２０日間、１００００ルックスの光を１日当たり１２時間照明しながらインキュベーター内で栽培した。抽台を開始し、腋芽が見えてきた植物体の花茎を腋芽を残すようにメスで切断したものを遺伝子導入に用いた。
【００８１】
（３）アグロバクテリウムの調製
上記（１）で作製した形質転換用ベクターをアグロバクテリウム法によりシロイヌナズナに遺伝子導入するために、上記ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に公知の凍結融解法（植物細胞工学、４巻、３号、１９３〜２０３頁、１９９２年）により移行させた。
【００８２】
（４）シロイヌナズナ植物体への外来遺伝子の導入の操作
上記のようにして得られた本発明ＤＮＡ配列を含有する組換えベクターを導入してなる形質転換アグロバクテリウムを用いて、植物体に遺伝子導入操作を行った。
【００８３】
アグロバクテリウム培養液を１／２濃度のＭＳ培地の無機塩組成にショ糖５％を添加してなる液体培地に懸濁し菌液を得た。シロイヌナズナの鉢を逆さにして植物を懸濁液に浸け、デシケーターにいれた。真空ポンプで吸引し、圧を４０ｍｍＨｇに調整して、５から１０分間おいた後、常圧に戻し、植物を取り出した。余分な菌液を除去した後、植物体をインキュベーター内で栽培する。これらの感染処理された植物体は正常に生育し自殖種子（Ｔ１世代）を得る事ができた。
【００８４】
次ぎに、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖１％、寒天０．８％、ハイグロマイシン２０ｍｇ／ｌを添加してなる培地に、上記自殖種子を７０％エタノール溶液に１分間、次いで有効塩素約２％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬して種子を殺菌処理し、滅菌水で洗浄したのち、置床した。４℃で５日間、低温処理をした後、２２℃で、１００００ルックスの光を恒常的に照明しながらインキュベーター内で栽培した。この際、形質転換された種子のみで正常な生育が認められた。生育した植物体は寒天培地から抜き取り、培養土をいれたポットに移植し、前記のインキュベーター内で栽培して、自殖種子（Ｔ２世代）を得る事ができた。
【００８５】
（５）形質転換植物の遺伝子解析
上記のように得られた植物体が、遺伝子の導入された形質転換体であることを、次の手順により確認した。
【００８６】
前項（４）で得た形質転換シロイヌナズナ植物から葉を採取した。その葉５０ｍｇを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．５）３００μｌを添加し、これを磨砕した。磨砕物に２０％  ＳＤＳを２０ｍｌ加えて、６５℃で１０分間加温した。得られた混合物に５Ｍ酢酸カリウムを１００μｌ加え、氷中に２０分間置いた後、１７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清にイソプロパノール２００μｌを加え、転倒攪拌し、これを再び１７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を減圧下で乾燥した。１００μｌのＴＥ緩衝液にそのＤＮＡを溶解した。
【００８７】
上記で得られたＤＮＡの１μｇを、Ｈバッファー（宝酒造（株）社製）中で、制限酵素ＳａｌＩの１０ユニットで消化して消化反応液を得た。消化反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後にそれぞれの得られたＤＮＡ溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、１０μｌの水に溶解した。０．８％  アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ナイロン膜（アマシャム社製）ハイボンドＮに転写し、ＵＶ照射により転写されたＤＮＡをナイロン膜上に固定し、以下のようにサザンブロッティング解析を行った。
【００８８】
ハイグロマイシン耐性遺伝子のプローブＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして得られた標識プローブＤＮＡを、ファージＤＮＡを固定したナイロン膜に対してプラーク・ハイブリダイゼーションさせた。プローブＤＮＡのラベリングはＤＩＧ  −  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）により行った。
【００８９】
ＤＮＡの固定されたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ  Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に浸し、さらに６５℃、１０分間、浸漬処理を行った。次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、６５℃、１５時間にわたりハイブリダイゼーション反応を行った。
【００９０】
反応終了後、洗浄液（４０ｍＭ  Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、１％  ＳＤＳ）で２０分間ずつ３回洗浄した。その後、上記のＤＩＧ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、目的の組換え  ＤＮＡの検出を行った。シロイヌナズナ植物から抽出した染色体ＤＮＡの中に、導入したＤＮＡが組み込まれていることが確認された。
【００９１】
（６）  形質転換シロイヌナズナ植物の開花
上記（４）で得られた、本発明のＯｓＲａｎ１  Ｔ２７Ｎ  配列を含有する組み換えベクターｐＵＢ−ＯｓＲａｎ１Ｔ２７Ｎが導入された形質転換植物体から得た自殖種子Ｔ２世代を培養土をいれたポットに播種し、インキュベーター内で２２℃、１００００ルックスの光を１日当たり１２時間照明しながら栽培して開花させた。対照のシロイヌナズナ植物として、通常の種子を用いた。結果を次の表１に示す。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
【発明の効果】
本発明により、植物のＲａｎ遺伝子変異体を利用した植物の開花時期を促進する方法が提供された。本発明の方法によって植物の開花時期を促進させることにより、商品を市場へ提供するまでの期間を短くし、増産可能な観賞用植物や有用農作物等の作製が可能となった。
【００９４】
【配列表】
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