(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe（４−NO2）Phe−Ｄ−Cit−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2;及びNAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2
からなる群から選択されるペプチドまたはその医薬上許容可能な塩。
【請求項２】
医薬上許容可能な担体と組み合わせて治療上有効量の請求項１に記載のペプチドを含む、哺乳類の性ホルモンのレベルを抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生物学的活性を有する有機化合物、これらの化合物を含む医薬組成物、及び医学的治療法に関する。さらに特定すれば、本発明は、LHRH拮抗作用を有する特定のペプチド、これらのペプチドを含む組成物、及びそのような治療を要する哺乳類におけるLHRH作用を阻害する方法に関する。
発明の背景
ゴナドトロピン類、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、及び絨毛性腺刺激ホルモン（CG）は、排卵、精子形成及び性ステロイドの生合性に必要である。単一の視床下垂体ホルモンである性腺刺激ホルモン（GnRH、黄体形成ホルモン放出ホルモンLHRHとしても知られている）が哺乳類のFSH及びLH両方の分泌の調整役をしている。LHRHは、構造
0003568952.tif 000002
を有している。
近年、LHRHと同等若しくはそれを超える能力を有するLHRHの合成類似体の発見にかなりの研究努力が費やされている。これらの努力により、多くのLHRH作用薬及び拮抗薬が製造された。より大きな能力を得るための種々の位置での修飾並びにヒスタミン放出を刺激するこれらのLHRH類似体の傾向を低減させるための５位及び６位での修飾に特に注意が払われている。
発明の要旨
本発明により、強力なLHRHデカペプチド拮抗薬群として、５位及び６位にアミノアシル残基を有しており、該残基の側鎖部分に、４−（置換アミノ）フェニルアラニル、４−（置換アミノ）シクロヘキシルアラニル、又はΩ−（置換アミノ）アルキル基を有するものが見いだされた。さらに、本発明のペプチドの５位のアミノアシル残基は、ペプチド主鎖の窒素原子上でＮ−アルキル化される。
特に、本発明は、LHRH拮抗薬ペプチド群を提供し、該ペプチド群は、Ｎ−アルキルアミノアシル残基の存在、及びデカペプチドLHRH類似体の５位又は６位に修飾Ｎ−アルキル−４−（置換アミノ）フェニルアラニル若しくはＮ−アルキル−４−（置換アミノ）シクロヘキシルアラニル残基を有していることを特徴としている。特に、本発明の新規なペプチドは、構造：
A1−B2−C3−D4−E5−F6−G7−H8−I9−J10（ここで、各文字はアミノアシル残基を示す）
を有している。
Ａは、Ｎ−アセチル−Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニル;N−アセチルサルコシル;N−アセチル−Ｄ−フェニルアラニル;N−アセチル−Ｄ−（４−クロロフェニル）アラニル;N−アセチル−Ｄ−３−（３−キノリニル）アラニル；及びＮ−アセチルアザグリシルからなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｂは、Ｄ−フェニルアラニル;D−３−（４−クロロフェニル）アラニル;D−３−（４−フルオロフェニル）アラニル；及びＤ−３−（２−ナフチル）アラニルからなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｃは、Ｄ−３−（３−ピリジル）アラニル;D−３−（１−ナフチル）アラニル;D−３−（２−チアゾリル）アラニル；及びＤ−３−（２−ベンゾ［ｂ］チエニル）アラニルからなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｄは、Ｌ−セリル；及びＮ−（R1）−Ｌ−セリル（ここで、R1は１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アルキルである）からなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｅは、
0003568952.tif 000003
（ここで、R1は上記の定義の通りであり、R2及びR9は下記に記載の値に帰する値を有しており、
R2は、（１）−NO2;（２）−CH2Cl;（３）−CH2OH;（４）−CH2OCH3;（５）−CH2N3;（６）−CH2CN;（７）−（CH2）mNR3R4（ここで、ｍは１又は２であり、R3及びR4は独立に、水素、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル及びベンジルから選択されるか、又はR3及びR4は、結合している窒素原子と一緒になってピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル又はＮ′−アセチルピペラジニル環を形成する；但し、R3及びR4の一方がフェニル又はベンジルである場合、他方は水素である）；
0003568952.tif 000004
（ここで、ｎは０、１又は２であり、R5は水素又は１〜４個の炭素原子を有するアルキルである）；
0003568952.tif 000005
（ここで、ｎは０、１又は２であり、R6及びR7は独立に水素又は１〜４個の炭素原子を有するアルキルであるか、又はR6及びR7は一緒になって−CH2CH2−若しくは−CH2CH2CH2−である）；
0003568952.tif 000006
（ここで、ｍは上記の定義の通りであり、R8は、２−,3−及び４−ピリジニル、２−及び３−フリル、２−及び３−チエニル、並びに２−、３−及び４−キノリニルから選択される）
から選択され、
Ｘは、1,4−シクロヘキシレン又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレンであり、
R9は、
（１）−（CH2）mNR3R4（ここで、R3及びR4は上記の定義の通りである）；
0003568952.tif 000007
（ここで、ｎ及びR5は上記の定義の通りである）；
0003568952.tif 000008
（ここで、ｎ、R6及びR7は上記の定義のとおりである）；及び
0003568952.tif 000009
（ここで、ｍ及びR8は上記の定義のとおりである）
から選択される）からなる群から選択されるＬ−アミノアシル残基である。
Ｆは、（ａ）Ｄ−トリプトファニル；（ｂ）Ｄ−３−（３−ピリジル）アラニル；（ｃ）Ｄ−セリル；（ｄ）Ｄ−［ε−Ｎ−（Ｎ′−モルホリニルカルボニル）］リシル；（ｅ）Ｄ−［ε−Ｎ−（２−ピラゾリニルカルボニル）］リシル；（ｆ）Ｄ−［ε−Ｎ−（Ｎ′−ピペリジニルカルボニル）］リシル；（ｇ）Ｄ−［ε−Ｎ−（３−キノリニルカルボニル）］リシル；（ｈ）Ｄ−（ε−Ｎ−ニコチニル）リシル；（ｉ）Ｄ−シトルリル；（ｊ）Ｄ−ホモシトルリル；及び（ｋ）構造
0003568952.tif 000010
（ここで、R2及びR9は上記の定義のとおりである）
を有するアミノアシル残基からなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｇは、（ａ）Ｌ−ロイシル；（ｂ）Ｎ−（R1）−Ｌ−ロイシル；（ｃ）Ｌ−バリル；（ｄ）Ｌ−シクロヘキシルアラニル；（ｅ）Ｎ−（R1）−Ｌ−シクロヘキシルアラニル；（ｆ）Ｌ−iso−ロイシル；及び（ｇ）ｔ−ブチルグリシルからなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｈは、（ａ）Ｌ−（Ｎ−ε−イソプロピル）リシル；（ｂ）Ｌ−アルギニル；（ｃ）Ｌ−ホモアルギニル；及び（ｄ）Ｌ−ホモアルギニル−（NG,NG′−ジエチル）からなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｉは、（ａ）Ｌ−プロリル及び；（ｂ）Ｎ−（R1）−Ｌ−アラニルからなる群から選択されるアミノアシル残基である。
Ｊは、−NHC2H5、又は（ａ）Ｄ−アラニンアミド；（ｂ）Ｎ−（R1）−Ｄ−アラニンアミド；（ｃ）Ｎ−（R1）−Ｌ−アラニンアミド；（ｄ）サルコサミド；（ｅ）α−アザグリシンアミド；及び（ｆ）Ｄ−セリンアミド（ここで、R1は上記の定義のとおりである）
からなる群から選択されるアミノアシル残基である。
但し、Ｊが−NHC2H5の場合、ＩはＬ−プロリルである。
上記に定義のペプチドの医薬上許容可能な付加塩も本発明の範囲に包含されるものとする。
詳細な説明
定義
本願明細書及び添付請求の範囲全体に使用されているように、「ハロゲン化物」という用語は、ブロモ（Br）、クロロ（Cl）、フルオロ（Ｆ）又はヨード（Ｉ）を指す。
本書に使用されている用語「樹脂」又は「ペプチド樹脂」は、合成ペプチド製剤業界において一般的に用いられているタイプの樹脂を指す。かかる樹脂の例としては、メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）又はベンズヒドリルアミン（BHA）が含まれるが、それらには限定されない。
本書に用いられている用語「アルキル」は、炭素原子１個を除去することにより飽和炭化水素から誘導される一価の直鎖若しくは分枝鎖の基を指す。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、iso−プロピル、ブチル、sec−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがふくまれるが、それらには限定されない。
用語「アルキレン」は、炭化水子２個を除去することにより飽和炭化水素から誘導される二価の直鎖若しくは分枝鎖の基を指す。アルキレンの例としては、−CH2−、−CH2CH2−、−CH（CH3）CH2−などが含まれる。
用語「シクロアルキル」は、水素原子１個を除去することにより環式飽和炭化水素基から誘導される一価の環式炭化水素基を指す。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［2.2.2］オクタンなどが挙げられる。
用語「シクロアルキレン」は、水素２個を除去することにより飽和環式炭化水素から誘導される二価の基を指す。その例には、シクロペンチレン、シクロヘキシレンなどが含まれる。
殆どの場合、本書に用いられている自然発生又は非自然発生アミノアシル残基の名称は、“Nomenclature of α−Amino Acids（Recommendations,1974）",Biochemistry,14（２）:1975）に記載されているように、Organic Chemistry and the IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureに関してIUPAC Commissionによって推奨された命名法に従っている。本願明細書及び添付請求の範囲に用いられている名称及び略称がこれらの指示とは異なっている場合には、それらは下記の表を参照することにより明らかになるであろう。
0003568952.tif 000011
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0003568952.tif 000013
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本発明の範囲に包含される化合物は下記に代表される実施例を含むが、それらには限定されない：
0003568952.tif 000019
0003568952.tif 000020
0003568952.tif 000021
0003568952.tif 000022
0003568952.tif 000023
本発明の好ましい化合物は、R2が（ａ）−NO2、（ｂ）−CH2OH、（ｃ）−CH2OCH3及び構造：
0003568952.tif 000024
を有する基からなる群から選択され、R9が、
0003568952.tif 000025
からなる群から選択される化合物である。
本発明の特に好ましい化合物は下記を含む；
0003568952.tif 000026
0003568952.tif 000027
LHRH拮抗薬作用
本発明の代表的な化合物を、受容体結合（pKI）及びLHRH拮抗薬能力（pA2）について試験管内試験で評価した。該試験には、F.HavivらのJ.Med.Chem.,32:2340−2344（1989）に詳記されている方法を用いた。受容体結合親和力（pKI）は平衡解離定数の負の対数であり、pA2の値は、作用薬ロイプロリドによって生成された応答曲線を２倍高い濃度にする拮抗薬濃度の負の対数である。（ロイプロリドは、構造５−オキソ−Pro1−His2−Trp3−Ser4−Tyr5−Ｄ−Leu6−Leu7−Arg8−Pro9−NHEtを有するLHRH作用薬であり、米国特許第4,005,063号に開示且つ特許請求されている）。一般に、9.5以上のpA2値は良好なLHRH拮抗薬能力を示す。
本発明の代表的な化合物についてのこれらの試験の結果を表２に示す。
0003568952.tif 000028
本発明のLHRH拮抗薬は、女性及び男性のいずれの生殖の調節にも有用である。本発明の化合物はゴナドトロピン及びアンドロゲンのレベルの抑制に有用である。
本発明の方法を実施する際には、拮抗薬を含む有効量の本発明の化合物又は医薬組成物をそのような治療を要するか若しくは望むヒト又は該治療を要する動物に投与する。これらの化合物又は組成物は、特定の最終用途に応じて、経口、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、膣内（特に避妊用に）、腸内、口腔内（舌下を含む）、経皮又は鼻孔内を含む種々の経路のいずれを介して投与してもよい。任意の所定の場合における最も好適な経路は、用途、特定の有効成分、関連する被験者及び医者の判断による。下記にさらに詳細に述べるように、化合物又は組成物を緩放出、デポー又はインプラント剤によって投与してもよい。
上記の使用については、雌又は雄の哺乳類の性ホルモンのレベルを調節するために、一般に、１日につき体重1kg当たり約0.01〜10mg/kgの範囲、好ましくは１日につき体重1kg当たり約0.1〜5.0mgの範囲の量で有効成分を投与するのが適当である。この投与は、最も有効な結果を得るために、１日につき１回の投与、数回の分割投与または遅延放出により行ってよい。
これらの化合物及び組成物の投与のための具体的な用量及び投与法は治療を受ける個々の被験者のニーズ、治療のタイプ、苦痛又は必要の程度及び医者の判断に従う必要がある。一般に、非経口投与の場合には、吸収によることが多い他の投与法に比べて低い用量しか必要としない。
本発明の別の態様は、有効成分として本発明の化合物を含む医薬組成物に関し、該組成物は、医薬上許容可能な非毒性担体と混合したかかる化合物を含んでいる。上記のように、そのような組成物は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内）投与用に、特に液剤若しくは懸濁剤の形態で；膣内若しくは腸内投与用に、特にクリーム及び座薬のような半固体形態で；経口若しくは口腔投与用に、特に錠剤若しくはカプセル剤の形態で；又は鼻孔内投与用に、特に粉末、点鼻薬若しくはエアロゾルの形態で調剤してよい。
組成物は、単位剤型で投与してよく、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,ペンシルベニア州,1970に記載の方法のような医薬業界において周知のいずれの方法によって調剤してもよい。非経口投与用調剤は、慣用の賦形剤として滅菌水又は塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール類、植物由来の油類、水素化ナフタレンなどを含んでいてよい。吸入投与用の調剤は、固体であり、且つ賦形剤として、例えば、ラクトースを含んでいるか、又は点鼻薬の形態で投与するための水性若しくは油性溶液であってよい。口腔投与用の典型的な賦形剤には、砂糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、前ゼラチン化スターチなどが含まれる。
被験者に、長期間、例えば、１週間〜１年に亘る期間、単一の投与により本発明の化合物を与えることが特に望ましい。種々の緩放出、デポー又はインプラント剤型を用いてよい。例えば剤型は、体液中への溶解性に乏しい、本発明の化合物の医薬上許容可能な非毒性塩、（ａ）例えば、リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノスルホン酸若しくはナフタレン二スルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような多塩基性酸を含む酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどのような多価の金属カチオンを含む塩、又は、例えば、N,N′−ジベンジルエチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンを含む塩；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛の塩を含んでいてよい。さらに、本発明の化合物又は好ましくは上記の塩が比較的不溶な塩の場合は、ゲル、例えば、注入用に好適な胡麻油を含むモノステアリン酸アルミニウムのゲルに調剤してよい。特に好ましい塩は、亜鉛の塩、タンニン酸亜鉛の塩、パモエートの塩などである。他のタイプの注射用緩放出デポー剤は、例えば、米国特許第3,773,919号に記載のような、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのような、ゆっくり分解し、非毒性で非抗原性のポリマー中に分散又は封入される化合物又は塩を含んでいる。本発明の化合物、又は好ましくは上記の塩のような比較的不溶な塩は、特に動物に使用するために、コレステロールマトリックスペレット中に調剤してもよい。他の緩放出、デポー又はインプラント調剤、例えば、リポソームは当該技術文献において周知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編、Marcel Dekker,Inc.,ニューヨーク,1978を参照されたい。LHRHタイプの化合物に関する特定の参考文献は、例えば、米国特許第4,010,125号に見ることができる。
本発明の化合物の合成
一般に本発明の化合物は、当業者には公知の方法、例えば、いわゆる「固相」ペプチド合成又は通常の液相化学法によって合成される。使用可能な固相ペプチド合成法は、その概略が、J.M.Stewart及びJ.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,サンフランシスコ,1963、並びにJ.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,第２巻,46ページ,Academic Press（ニューヨーク）,1973に見られる。慣用の溶液合成については、G.Schroder及びK.Lupke,The Peptides,第１巻,Academic Press（ニューヨーク）,1965を参照されたい。
一般にこれらの方法は、順次１種以上のアミノ酸又は好適に保護されたアミノ酸を好適な樹脂に結合された、成長するペプチド鎖に加えることを含む。出発アミノ酸は市販されているが、本発明の化合物において新規なものを用いる場合には、容易に入手可能な出発物質から下記に詳記される方法により合成する。
通常、最初のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基は適当な保護基によって保護されている。さらに、保護又は誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合の形成を促す条件下に、好適に保護された相補（アミノ若しくはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を加えることにより、不活性固体担体（樹脂）に付着するか又は溶液状で用いることが可能である。次いで保護基をこの新規に加えられたアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸（適当に保護されている）を加え、以下同様にする。全ての所望のアミノ酸を適切な順序で結合し、全ての残留保護基を逐次又は同時に除去した後、固相法により合成を行う場合には、ペプチド鎖を固体担体から開裂して最終ポリペプチドを得る。この一般的な手順の単純な改変により、例えば、保護された三ペプチドを適切に保護された二ペプチドにカップリングすることによって、一度に２個以上のアミノ酸を成長する鎖に付加して、脱保護後に六ペプチドを形成することが可能になる。
特に好ましいペプチド合成法は固相ペプチド合成を含む。このペプチド製造法において、アミノ酸のα−アミノ官能基は酸性又は塩基性感受性基によって保護されている。そのような保護基は、ペプチド結合形成条件に対して安定であるという特性を有している必要があるが、成長するペプチド鎖を破壊したり、又は該鎖中に含まれるキラル中心のいずれをもラセミ化することなく容易に除去し得る。適当な保護基には、ｔ−ブチルオキシカルボニル（BOC）、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、（α，α）−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルなどがある。ｔ−ブチルオキシカルボニル（BOC又はｔ−BOC）保護基が好ましい。
特に好ましい側鎖保護基は、リシン及びアルギニンにおけるような側鎖アミノ基に対しては：ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼンスルホニル、Cbz、BOC及びアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに対しては：ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、2,6−ジクロロベンジル、イソプロピル、シクロヘキシル、シクロペンチル及びアセチル；セリンに対しては：ベンジル及びテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに対しては：ベンジル、Cbz、ｐ−トルエンスルホニル及び2,4−ジニトロフェニル；トリプトファンに対しては：ホルミルである。
固相ペプチド合成法においては、Ｃ末端アミノ酸を適当な固体担体に付着させる。上記の合成に有用な適当な固体担体は、試薬及び逐次縮合−脱保護反応の反応条件に対して不活性であり、且つ用いられる溶媒媒体中に不溶な物質である。適当な固体担体には、クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー、ヒドロキシメチル−ポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマーなどがある。クロロメチルポリスチレン−１％−ジビニルベンゼンポリマーが特に好ましい。化合物のＣ末端がグリシンアミドである特殊な場合に特に有用な担体は、P.Rivailleら，Helv.Chim.Acta.,54,2772（1971）により記載されているベンズヒドリル−アミノポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマーである。クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン型の樹脂へのカップリングは、α−Ｎ−保護アミノ酸、特にBOCアミノ酸のセシウム、テトラメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、1,5−ジアザビシクロ−［5.4.0］ウンデク−５−エン又は同様な塩の反応によって行われる。カップリング反応は、クロロメチル樹脂を用いて、昇温下、例えば、約40℃〜60℃の範囲の温度で、約12〜48時間の間、エタノール、アセトニトリル、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）などのような溶媒中で行う。好ましい試薬及び反応条件は、α−Ｎ−BOCアミノ酸セシウム塩と樹脂を約50℃で約24時間DMF中でカップリングすることを含む。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）若しくはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（BOPCl）を含んでいても含んでいなくてもよいN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）若しくはN,N′−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）を用いて、約１〜約24時間の間、好ましくは約12時間、約10℃〜約50℃の範囲、最も好ましくは25℃の温度で、ジクロロメタン又はDMFのような溶媒、好ましくは、ジクロロメタン中でカップリングすることにより、α−Ｎ−BOC−アミノ酸をベンズヒドリルアミン樹脂に結合させる。ペプチド樹脂に結合されたＮ−メチル−Ser（OBzl）へのカルボキシル基のカップリングには、カルボジイミド試薬の他に、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）触媒が必要である。
保護アミノ酸を順次カップリングするには、当業界では周知の自動ポリペプチド合成器内で行うことが可能である。α−Ｎ−保護基の除去は、例えば、トリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液、塩化水素のジオキサン溶液、塩化水素の酢酸溶液又は他の強酸溶液、好ましくはジクロロメタン中50％のトリフルオロ酢酸の存在下に、ほぼ周囲温度で行ってよい。各保護アミノ酸を0.4M濃度且つ実質的に3.5モル過剰で導入するのが好ましく、カップリングは、ジクロロメタン、ジクロロメタン/DMF混合物、DMFなど、特に塩化メチレン中、ほぼ周囲温度で行ってよい。カップリング剤は通常ジクロロメタン中のDCCであるが、N,N′−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）若しくはカルボジイミドのみ、又はHOBt,N−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミド若しくはオキシムの存在下の、DIC若しくはカルボジイミドであってもよい。あるいは、保護アミノ酸の活性エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニルなど）又は対称無水物を用いてもよい。
調製Ａ〜Ｇにおいて下記に詳記する方法により、本発明のペプチドの５位及び６位の側鎖の修飾を行う。
調製Ａ
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（モルホリノ−Ｎ′−メチル）］フェニルアラニン
米国特許第4,026,887号に４−（クロロメチル）フェニルアラニンについて記載されている合成手順に類似の手順を用いて、BOC−Ｎ−Me−PheからBOC−Ｎ−Me−（４−クロロメチル）フェニルアラニンを合成する。
クロロメチルエーテル中のＮ−トリフルオロアセチル−Ｎ−メチルフェニルアラニン（１当量）及び塩化亜鉛（0.9〜2.2当量）を10〜24時間65℃で加熱する。真空下に過剰な試薬を除去し、残渣をCH2Cl2に溶解、飽和NaHCO3溶液、次いで飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄する。有機相を脱水（Na2SO4）、濃縮する。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、４−（クロロメチル）フェニルアラニンメチルエステルを得る。これを水性塩酸で処理してメチルエステルを切り離す。THF中のトリエチルアミン（１当量）の存在下に、０℃で１時間、Ｎ−メチル−（４−クロロメチル）フェニルアラニンヒドロクロリドをジ−ｔ−ブチルカルボナート（1.2当量）で処理する。処理後、精製して、BOC−Ｎ−メチル−（４−クロロメチル）フェニルアラニンを得る。これを、過剰モルホリンの存在下にエタノール中に溶解し、60〜100℃で２時間加熱する。加熱後に精製して、BOC−Ｎ−メチル−（４−モルホリノメチル）フェニルアラニンを得る。これを１当量のｐ−トルエンスルホン酸で処理して、BOC−NMe−４−（モルホリノメチル）フェニルアラニン−ｐ−トルエンスルホナート塩を得、次のペプチド固相合成に用いる。
調製Ｂ
調製Ａに記載の手順を用いるが、モルホリンを適切なアミン類又は第２級アミン類で置換して、下記のアミノ酸をトシラート塩として得、その後の本発明のLHRH拮抗薬の合成に用いる：
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ピペリジノ）Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ピロリジノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（Ｎ′−アセチルピペラジノ−Ｎ″−メチル）］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ジエチルアミノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ジ−ｔ−ブチルアミノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ジメチルアミノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−（ジイソプロピルアミノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−［４−Ｎ−プロピルアミノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン。
調製Ｃ
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−［４−（モルホリノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニン
調製Ｂに記載の手順を用いるが、BOC−Ｎ−Me−PheをBOC−Ｎ−Ｄ−Pheで置換する。処理後、精製して、トシラ−ト塩としてＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−Ｄ−［４−（モルホリノ）−Ｎ′−メチル］フェニルアラニンを得る。
調製Ｄ
調製Ｃに記載の手順を用いるが、モルホリンを適切な第１級及び第２級アミン類で置換して、トシラート塩として下記のＤ−アミノ酸を得、その後のLHRH拮抗薬の合成に用いる：
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−ピペリジノ−Ｎ′−メチル）フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ピロリジノ−Ｎ′−メチル））フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（Ｎ′−アセチル）−Ｎ″−ピペラジノメチル））フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ジエチル）−Ｎ′−メチル））フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ジ−ｔ−ブチル−Ｎ′−メチル）フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ジメチル）−Ｎ′−メチル））フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ジイソプロピル）−Ｎ′−メチル））フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（プロピル）メチル））−Ｎ′−フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（エチル）メチル）−Ｎ′−フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（フェニル）メチル）−Ｎ′−フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−（ベンジル）メチル−Ｎ′−フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−｛４−［ｐ−クロロベンジル］−Ｎ′−メチル｝フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−｛４−［ｐ−フルオロベンジル］−Ｎ′−メチル｝フェニルアラニン；
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−｛４−［ｐ−ニトロベンジル］−Ｎ′−メチル｝フェニルアラニン。
調製Ｅ
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−（４−FMOC−アミノメチル）フェニルアラニン
調製Ａに記載の手順により得られたBOC−Ｎ−Me−（４−クロロメチル）フェニルアラニンを、メタノール中の過剰なアジ化ナトリウム及び触媒量のヨー化ナトリウムを用いて、４〜24時間加熱還流する。残渣を希塩酸で処理してpH6にし、酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を脱水、濃縮して、BOC−Ｎ−メチル−（４−アジドメチル）フェニルアラニンを得る。これをメタノール中のPd/C触媒上で水素化して、BOC−Ｎ−メチル−（４−アミノメチル）フェニルアラニンを得る。M.Bodanszky及びA.Bodanszkyによる“The Practice of Peptide Synthesis"の24ページに記載のような塩基性条件下に、最終化合物をクロロ炭酸９−フルオレニルメチルで処理する。処理後、精製して、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−（４−FMOC−アミノメチル）フェニルアラニンを得る（図式１参照）。
0003568952.tif 000029
調製Ｆ
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）フェニルアラニン
上記の調製ＣによりBOC−Ｄ−（４−クロロメチル）フェニルアラニンを合成する。先ず、調製Ｅに記載のものと類似の手順を用いて、生成物をメタノール中のアジ化ナトリウムで処理し、次いで水素化して、Ｎ−BOC−Ｄ−（４−アミノメチル）フェニルアラニンを得、これを既に記載のようにしてFMOCで置換して、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）フェニルアラニンを得る。
調製Ｇ
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−（４−FMOC−アミノエチル）フェニルアラニン
調製Ａに記載の手順により得られたBOC−Ｎ−Me−（４−クロロメチル）フェニルアラニンを、メタノール中の過剰な青酸ナトリウム及び触媒量のヨー化ナトリウム溶液を用いて４〜24時間加熱還流する。残渣を希塩酸で処理してpH6にし、酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を脱水、濃縮して、BOC−Ｎ−メチル−（４−シアノメチル）フェニルアラニンを得る。これを、メタノール中のラネー/Ni触媒で水素化するか、又はTHF中のトリフルオロアセトキシホウ水酸化ナトリウムで処理［N.Uminoら,Tetraheron Letters 2875−2876（1976）］して、BOC−Ｎ−メチル−（４−アミノエチル）フェニルアラニンを得る。この最終化合物を、M.Bodanszky及びA.Bodanszkyによる“The Practice of Peptide Synthesis"の24ページに記載の塩基性条件下にクロロ炭酸９−フルオレニルメチルで処理する。処理後、精製して、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−（４−FMOC−アミノエチル）フェニルアラニンを得る（図式２参照）。
実施例１
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe（４−NO2）Phe−Ｄ−Cit−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2
Milligen−Biosearch 9500ペプチド合成器の反応槽中に、Ｄ−Ala−NH−樹脂（４−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂）1g（0.6mmol）を充填した。下記の合成サイクルに従って順次アミノ酸を添加した：
1.  45％トリフルオロ酢酸（TFA）、2.5％のアニソール、2.0％の亜燐酸ジメチル及び50.5％の塩化メチレン溶液を用いて、ペプチドのα−アミノ官能基からｔ−BOC基を除去するための脱保護を行った。脱保護溶液を用いて１分間樹脂を予洗浄し、次いで20分間脱保護反応を行った。
2.  塩化メチレン中10％のN,N′−ジイソプロピルエチルアミン溶液を用いて、脱保護用に用いたTFAの除去及び中和のための塩基洗浄を行った。各脱保護段階後に樹脂を３回１分間塩基で洗浄した。
3.  活性剤としてのジイソプロピルカルボジイミドの３倍モル過剰の0.3M塩化メチレン溶液と共に、３倍モル過剰のｔ−BOC保護アミノ酸誘導体の0.3MDMF溶液を用いて、カップリング反応を行った。次いで活性化アミノ酸をペプチド樹脂の遊離αアミノ基とカップリングした。反応時間は合成プロトコルに記載の通りであった。
4.  洗浄。各反応段階後、各１分で、塩化メチレンで１回、塩化メチレン/DMFで１回及びDMFで１回、都合３回の洗浄を行った。
合成プロトコル：
下記のカップリング順序、回数及び時間で、アミノ保護アミノ酸を樹脂にカップリングした：
0003568952.tif 000030
合成完了後直ぐに、ペプチド樹脂を真空下にP2O5上で一晩脱水し、次いでアニソールの存在下に０℃で1.25時間乾燥HFで処理して、樹脂からペプチドを切り離した。真空下に過剰な試薬を除去した。樹脂を先ずエーテルで洗浄し、次いで、水／アセトニトリル／酢酸（50ml）の溶液（1:1:0.1）と共に15分間室温で撹拌し、濾過した。濾液を凍結乾燥して毛羽状粉末として粗ペプチドを得た。これを、90％H2O/10％CH3CN/0.1％TFAから50％H2O/50％CH3CN/0.1％TFAまでの勾配範囲で60分間にわたって変動する溶媒混合物を用いて、（25×2.5cm）DynamaxC−18カラム（８ミクロン）のHPLCによって精製した。紫外検出器を260nMに設定した。生成物を40.40分で単一のピークとして溶離、収集、凍結乾燥して、トリフルオロ酢酸塩として純粋なNAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（4NO2）Phe−DCit−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2を得た。FAB質量分析  m/e  1473.（Ｍ＋Ｈ）＋。アミノ酸分析:1.01Ala;1.03Pro;0.95Arg;1.01Leu;1.00Cit;0.42Ser;1.05 3Pal;1.09 4ClPhe。
実施例２
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe（４−NO2）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2
実施例１に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−CitをBOC−DLys（Nic）で、さらにBOC−Arg（Tos）をBOC−Lys（Isp,Cbz）で置換する。合成終了後直ぐ、ペプチド樹脂をP2O5で一晩脱水し、次いで上記の条件下にHF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥した後、HPLCによりペプチドを精製して、トリフルオロ酢酸塩としてNAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe（４−NO2）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2を得る。
実施例３
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例２の手順を用いるが、BOC−NMe−（４−NO2）PheをBOC−NMe−（４−FMOC−アミノ）Pheで置換する。合成終了後直ぐ、ペプチド樹脂を30％ピペリジン/DMFで２〜24時間処理して、Ｎ−Me−Phe5残基のＮ−４−アミノ位からFMOC基を切り離す。ペプチド樹脂を、塩化メチレンで３回、DMFで３回洗浄し、DMF中の10〜20倍過剰のジフェニルシアノカルボジイミダートと一晩反応させ（下記の図式２参照）、塩化メチレンで３回、DMFで３回浄し、次いでDMF中の20〜100倍過剰なヒドラジンと一晩反応させる。ペプチド樹脂を既に記載のように洗浄し、P2O5上で一晩脱水し、上記のようにHF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥後、粗生成物を得る。該生成物をHPLCで精製して、トリフルオロ酢酸塩としてNAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
Rt＝20.56min;FAB質量分析m/e 1615（Ｍ＋Ｈ）。アミノ酸分析:1.03Ala;0.98Pro;1.02Lys（Isp）;0.98Leu;1.00Lys;0.51Ser。
0003568952.tif 000031
実施例４
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTry−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−NMe−（４−Ｎ−FMOC）PheをBOC−Ｎ−Me−Tyr（Ｏ−３−Br−Cbz）で、さらにBOC−DLys（Nic）をBOC−Ｄ−（４−Ｎ−FMOC）Pheで置換する。合成完了後直ぐ、ペプチド樹脂を30％ピペリジン/DMFで２〜24時間処理して、NMe−Ｄ−Phe6残基の４−アミノ基からFMOC保護基を切り離す。ペプチド樹脂を、塩化メチレンで３回、DMFで３回洗浄し、DMF中の10〜20倍過剰なジフェニルシアノカルボイミダートと一晩反応させ、塩化メチレンで３回、DMFで３回洗浄、次いでDMF中の20〜100倍過剰なヒドラジンと一晩反応させる。ペプチド樹脂を再び上記のように洗浄し、P2O5上で一晩脱水し、上記のようにHF/アニソールで処理する。処理及び凍結乾燥後に粗生成物を得る。該生成物をHPLCで精製して、NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTry−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
Rt＝17.61min;FAB質量分析m/e 1545（Ｍ＋Ｈ）。アミノ酸分析:1.01Ala;1.00Pro;0.91Lys（Isp）;1.00Leu;1.05NMeTyr;0.50Ser;0.98 3Pal;1.00 4ClPhe。
実施例５
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2
実施例４の手順を用いるが、BOC−NMeTyr（Ｏ−3Br−Cbz）をBOC−NMe（４−FMOC−アミノ）Pheで置換する。合成完了後直ぐ、ペプチド樹脂を30％ピペリジン/DMFで２〜24時間処理して、NMe−Phe5及びＤ−Phe6残基の４−アミノ基からFMOC保護基を切り離す。ペプチド樹脂を、塩化メチレンで３回、DMFで３回洗浄し、DMF中の10〜20倍過剰なジフェニルシアノカルボイミダートと一晩反応させ、塩化メチレンで３回、DMFで３回洗浄し、次いでDMF中の20〜100倍過剰なヒドラジンと一晩反応させる。ペプチド樹脂を上記のようにして再び洗浄し、P2O5上で一晩脱水し、上記のようにHF/アニソールで処理する。処理且つ凍結乾燥させた後で粗生成物を得る。該生成物をHPLCにより精製し、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
Rt＝14.83min;FAB質量分析m/e 1626（Ｍ＋Ｈ）。アミノ酸分析:1.01Ala;1.00Pro;0.89Lys（Isp）;1.00Leu;1.00Lys;0.5Ser;1.02 3Pal;0.92 4ClPhe。
実施例６
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−Lys（Isp,Cbz）をBOC−Arg（Tos）で置換する。合成完了後直ぐにペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、次いで上記のようにHF/アニソールで処理して、樹脂及び保護基からペプチドを切り離す。開裂、凍結乾燥及びHPLCによる精製後に、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例７
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Arg−Pro−Ｄ−AlaNH2
実施例４に記載の手順を用いるが、BOC−Lys（Isp,Cbz）をBOC−Arg（Tos）で置換する。合成完了後直ぐにペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、次いで上記のようにHF/アニソールで処理して、樹脂及び保護基からペプチドを切り離す。開裂、凍結乾燥及びHPLCによる精製の後で、NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−D3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例８
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2
実施例５に記載の手順を用いるが、BOC−Lys（Isp,Cbz）をBOC−Arg（Tos）で置換する。合成完了後直ぐに、ペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、次いで上記のようにHF/アニソールで処理して樹脂及び保護基からペプチドを切り離す。開裂、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ（４−Atza）Phe−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例９
NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−２−NalをBOC−Sarで、BOC−Ｄ−３−PalをBOC−Ｄ−１−Nalで置換する。合成完了後直ぐにペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、次いで上記のようにHF/アニソールで処理して樹脂及び保護基からペプチドを切り離す。開裂、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例10
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Morphme）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−Ｎ−Me−（４−Ｎ−FMOC）PheをBOC−Ｎ−Me−（４−モルホリノメチル）Pheトシラート塩で置換し、合成プロトコルのカップリング時間を２回−６時間に延長する。上記のように、HF/アニソールで処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製の後で、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Morphme）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例11
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Morphme）Phe−Ｄ−（４−Morphme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例10に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−Lys（Nic）をBOC−Ｄ−（４−モルホリノメチル）Pheで置換する。ペプチド樹脂のHF/アニソールによる処理、反応処理、生成物の凍結乾燥及び精製の後で、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Morphme）Phe−Ｄ−（４−Morphme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例12
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Morphme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例11に記載の手順を用いるが、BOC−Ｎ−Me−（４−モルホリノ−Ｎ′−メチル）PheトシラートをBOC−Ｎ−Me−Tyr（Ｏ−３−Br−Cbz）で置換する。ペプチド樹脂のHF/アニソールによる処理、反応処理、生成物の凍結乾燥及び精製後に、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Morphme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例13
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Morphme）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2
実施例10に記載の手順を用いるが、BOC−Lys（Isp,Cbz）をBOC−Arg（Tos）で置換する。ペプチド樹脂のHF/アニソールによる処理、反応処理、生成物の凍結乾燥及び精製後に、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Morphme）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例14
実施例10に記載の手順を用いるが、BOC−Ｎ−Me−４−（モルホリノ−Ｎ′−メチル）Pheトシラートの代わりに、調製Ｄに記載の適切なアミノ酸で置換する。置換、HPLCによる精製後、下記の化合物を得る：
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ピペリジノ−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ピロリジノ−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（Ｎ′−アセチル−Ｎ″−ピペラジノメチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ジエチル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ジ−ｔ−ブチル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ジメチル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４（ジイソプロピル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（ジプロピル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（プロピル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（エチル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（フェニル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（ベンジル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（ｐ−クロロベンジル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（ｐ−フルオロベンジル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2;
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−４−（ｐ−ニトロベンジル−Ｎ′−メチル）Phe−DLys（Nic）−Leu−Arg−Pro−DAlaNH2。
実施例15
NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例９に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−（４−Atza）PheをBOC−Lys（Nic）で置換する。ペプチド樹脂のHF/アニソールによる処理、反応処理、生成物の凍結乾燥及び精製後に、NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例16
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−NMe−［４−FMOC−アミノ］−PheをBOC−NMe−［４−（FMOC）−アミノメチル）］−Pheで置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例17
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例16に記載の手順を用いるが、BOC−DLys（Nic）をBOC−Ｄ−［４−（FMOC）−アミノエチル］−Pheで置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−Ｄ−（４−Atzame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例18
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Harg（Et2）−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、BOC−Lys（Isp,Cbz）をBOC−Harg（Et2）トシラート塩で置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−DLys（Nic）−Leu−Harg（Et2）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例19
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ（４−Atza）Phe−Leu−Harg（Et2）−Pro−DAlaNH2
実施例18に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−Lys（Nic）をBOC−Ｄ−（４−Atza）Pheで置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Harg（Et2）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例20
実施例９に記載の手順を用いるが、上記に適切な保護アミノ酸で置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。処理、凍結乾燥、HPLCによる精製後、NAc−Sar−D4ClPhe−D1Nal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例21
実施例９及び20に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−１−NalをBOC−Ｄ−３−Balと置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、下記の化合物を得る：
NAc−Sar−D4ClPhe−D3Bal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−D3Bal−Ser−NMe−（４−Atza）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−D3Bal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atza）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2。
実施例22
実施例21に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−３−BalをBOC−Ｄ−１−Nalで、BOC−NMe−（４−Atza）PheをBOC−NMe−（４−Atzame）Pheで、BOC−Ｄ−（４−Atza）PheをBOC−Ｄ−（４−Atzame）Pheで置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、下記の化合物を得る：
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−1Nal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−Ｄ−（４−Atzame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−1Nal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−1Nal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atzame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2。
実施例23
実施例22に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−１−NalをBOC−Ｄ−３−Balと置換する。置換処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、下記の化合物を得る：
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−3Bal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−Ｄ−（４−Atzame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−3Bal−Ser−NMe−（４−Atzame）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2;
NAc−Sar−D4ClPhe−Ｄ−3Bal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Atzame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2。
実施例24
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Imame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例５に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノ）PheをBOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）Pheと置換する。合成完了後直ぐ、樹脂を30％ピペリジンで一晩処理してFMOC基を除去、CH2Cl2で数回洗浄し、次いでDMF中の過剰な1,1′−チオカルボニルジイミダゾールで１時間処理する（下記の図式３参照）。再度樹脂を洗浄し、CH2Cl2/DMF（1:1）中の過剰なＮ−BOC−エチレンジアミンで４〜24時間処理する。溶液を排水し、樹脂をCH2Cl2で数回洗浄、次いでCH2Cl2/DMF（1:1）中の過剰なCH3Iで４〜24時間処理する。標準的な脱保護及び塩基洗浄条件によりBOC保護基を除去し、樹脂を10％ジイソプロピルエチルアミン/CH2Cl2で24時間処理する。溶液を排水し、樹脂を洗浄、P2O5上で脱水、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Imame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2を得る。
0003568952.tif 000032
実施例25
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Imame）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例24に記載の手順を用いるが、BOC−NMeTyr（Ｏ−3Br−Cbz）をBOC−NMe−（４−FMOC−アミノメチル）Pheで、BOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノ）PheをBOC−DLys（Nic）で置換する。合成完了後直ぐに、ペプチドをHF/アニソールで切り離し、処理、凍結乾燥、HPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Imame）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例26
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Imame）Phe−Ｄ−（４−Imame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例25に記載の手順を用いるが、BOC−DLys（Nic）をBOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノ）Pheで置換する。合成完了後直ぐにペプチドをHF/アニソールで切り離し、処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Imame）Phe−Ｄ−（４−Imame）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例27
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−Tyr−Ｄ−（４−Nicme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例４に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノ）PheをBOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）Pheで置換する。合成完了後直ぐに、30％ピペリジン/DMFにより処理してFMOC基を除去し、２回−６時間プロトコルを用いてペプチド樹脂のＤ−（４−アミノメチル）Phe6残基の遊離アミノ基をニコチン酸とカップリングする。樹脂を脱水、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−Tyr−Ｄ−（４−Nicme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例28
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−Tyr−Ｄ−（４−Niceth）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例27に記載の手順を用いるが、BOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）PheをBOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノエチル）Pheで置換する。合成完了後直ぐに、30％ピペリジン/DMFにより処理してFMOC基を除去し、２回−６時間プロトコルを用いてペプチド樹脂のＤ−（４−アミノエチル）Phe6残基の遊離アミノ基をニコチン酸とカップリングする。樹脂を脱水、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−Tyr−Ｄ−（４−Niceth）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例29
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Nicme）Phe−Ｄ−（４−Nicme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例27に記載の手順を用いるが、BOC−NMe−Tyr（Ｏ−３−Br−Cbz）をBOC−NMe−（４−FMOC−アミノメチル）Pheで置換する。合成完了後直ぐに、30％ピペリジン/DMFで処理してFMOC基を除去し、２回−６時間プロトコルを用いてペプチド樹脂のＤ−（４−アミノメチル）Phe6残基の遊離アミノ基をニコチン酸とカップリングする。樹脂を脱水、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−DNa−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Nicme）Phe−Ｄ−（４−Nicme）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例30
NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Niceth）Phe−Ｄ−（４−Niceth）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例29に記載の手順を用いるが、BOC−NMe−（４−FMOC−アミノメチル）PheをBOC−NMe−（４−FMOC−アミノエチル）Pheで、BOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノメチル）PheをBOC−Ｄ−（４−FMOC−アミノエチル）Pheで置換する。合成完了後直ぐに、30％ピペリジン/DMFで処理してFMOC基を除去し、２回６時間プロトコルを用いて、ペプチド樹脂のＤ−（４−アミノエチル）Phe6残基の遊離アミノ基をニコチン酸とカップリングする。樹脂を脱水し、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−Ｄ−２−Nal−Ｄ−４−ClPhe−Ｄ−３−Pal−Ser−NMe−（４−Niceth）Phe−Ｄ−（４−Niceth）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例31
NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe−（４−Etcng）Phe−Ｄ−Lys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例３に記載の手順を用いるが、ヒドラジンをエチルアミンで置換し、反応時間を24時間から72時間に延長する。樹脂を脱水し、HF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥及びHPLCによる精製後、NAc−D2Nal−D4ClPhe−D3Pal−Ser−NMe（４−Etcng）Phe−DLys（Nic）−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2を得る。
実施例32
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Etcng）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2
実施例４に記載の手順を用いるが、ヒドラジンをエチルアミンで置換し、反応時間を24時間から72時間に延長する。ペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、上記のようにHF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥後、粗生成物を得る。該生成物をHPLCにより精製して、NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMeTyr−Ｄ−（４−Etcng）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2を得る。
実施例33
NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe−（４−Etcng）Phe−Ｄ−（４−Etcng）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−DAlaNH2
実施例５に記載の手順を用いるが、ヒドラジンをエチルアミンと置換し、反応時間を24時間から72時間に延長する。ペプチド樹脂をP2O5上で一晩脱水し、上記のようにHF/アニソールで処理する。処理、凍結乾燥、HPLCによる精製後、粗生成物を得る。該生成物をHPLCにより精製して、NAc−Ｄ−2Nal−Ｄ−4ClPhe−Ｄ−3Pal−Ser−NMe−（４−Etcng）Phe−Ｄ−（４−Etcng）Phe−Leu−Lys（Isp）−Pro−Ｄ−AlaNH2を得る。