(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される新規化合物Ｂ１３７１Ａ。
【化１】
0003584055.tif 000005
【請求項２】
式（ＩＩ）で表される新規化合物Ｂ１３７１Ｂ。：
【化２】
0003584055.tif 000006
【請求項３】
海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１５８）を培養し、その培養物より次式（Ｉ）または（ＩＩ）
【化３】
0003584055.tif 000007
【化４】
0003584055.tif 000008
で表される化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを採取することを特徴とするＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの製造方法。
【請求項４】
請求項１の式（Ｉ）で表される新規化合物Ｂ１３７１Ａまたは請求項２の式（ＩＩ）で表される新規化合物Ｂ１３７１Ｂを産生する、海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１５８）株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、システインプロテアーゼの酵素阻害活性を示す新規ペプチド系化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂ、それらの製法、生産菌及び用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
システインプロテアーゼの一種のカルパインは通常細胞内に存在し、中性条件下でＣａ２＋により活性化される酵素であり、Ｃａ２＋要求性を異にする二つの分子種（Ｉ型（μカルパイン）、ＩＩ型（ｍカルパイン））が存在する。通常、Ｉ型、ＩＩ型ともに分子量約８０Ｋ及び共通する３０Ｋのサブユニットから成る不活性前駆体として存在するが、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇すると、前駆体はＣａ２＋と結合し、活性型に変換する。しかし、何らかの原因、例えば虚血等により、Ｃａ２＋が細胞内に過剰流入すると、カルパインが無秩序に活性化される。その結果、細胞質内の蛋白質のプロセシングを必要以上に亢進させたり、細胞機能・構造維持に必須な酵素、蛋白質を不可逆的に切断・分解する。このようなカルパインの無秩序な活性化に基づく疾患として、筋ジストロフィー、脳梗塞、心筋梗塞、白内障、血栓、炎症などが挙げられる（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，  Ｓ．  ら，蛋白質核酸酵素，３７巻，２１４４〜２１６０，（１９９２））。
【０００３】
一方、システインプロテアーゼの一種カテプシンＢは好中球やマクロファージ等の食細胞のリソゾーム中に多く含まれ、細胞内外の異物を分解・消化する役割を果たす。しかし、カテプシンＢの活性が必要以上に亢進すると、異物だけでなく自己組織までも分解・消化する。このようなカテプシンＢ活性の亢進に基づく疾患としては、炎症、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、癌転移等が挙げられる（Ｋａｔｓｕｎｕｍａ，  Ｎ．  ら、実験医学，５巻，９２６〜９３０，（１９８７））。従って、これらの疾患に対してカルパイン、カテプシンＢ等のシステインプロテアーゼの酵素活性を阻害する物質を用いて、病状の進行を予防或いは治療することが可能である。
【０００４】
従来知られているシステインプロテアーゼに対する低分子量阻害剤のうち代表的なものとしてロイぺプチン（Ａｏｙａｇｉ，Ｔ．  ら，Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，  ｖｏｌ．２２，５５８−５６８，（１９６９））、Ｅ−６４（Ｈａｎａｄａ，  Ｋ．ら  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．  ４２（３），５２３〜５２８（１９７８））、カルペプチン（Ｔｓｕｊｉｎａｋａ，  Ｔ．  ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．  １５３，１２０１〜１２０８（１９８８）），ストレピン（Ｏｇｕｒａ，  Ｋ．  ら，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．４９，７９９〜８０５，（１９８５）），スタッコピン（Ｓａｉｔｏ，  Ｍ．  ら，Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｌｏ．  Ｃｈｅｍ，  ｖｏｌ．  ５１（３），８６１〜８６８，（１９８７））等が知られており、いずれもＣ未満にアルデヒド基を有する。
【０００５】
Ｅ−６４の類縁化合物としては、Ｅ−６４ｄ（Ｔａｍａｉ，  Ｍ．  ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ．，  ｖｏｌ．９，６７２−６７７，（１９８６）），ＮＣＯ−７００（Ｔａｋａｎｏ，  Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｅｄ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．４５（１），４１〜４７，（１９９１））等が知られており、いずれもエポキシコハク酸を活性中心に持つ。これらの化合物はセリンプロテアーゼは阻害しないが、システインプロテアーゼに対する阻害活性は必ずしも強くない。
【０００６】
このような観点から、システインプロテアーゼに対してロイペチン誘導体或いはＥ−６４類縁体ではなく、新規構造を有し、またシステインプロテアーゼに特異的な強い阻害活性を示す生理活性物質が望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、新規な構造を有し、システインプロテアーゼの一種カルパインの酵素阻害活性を示す生理活性物質を微生物代謝産物より見出すべく鋭意探索を行った。その結果、日本国宮城県牡鹿半島の海岸で採集したアオノリから分離した海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２株の培養液からシステインプロテアーゼに対して酵素阻害活性を示す新規生理活性物質Ｂ１３７１Ａ及びＢ１３７１Ｂが産生されることを見出し本発明を完成させた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）  新規化合物Ｂ１３７１Ａ、
（２）  新規化合物Ｂ１３７１Ｂ、
（３）  海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２を培養し、その培養物より新規化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを採取することを特徴とするＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの製造方法、
（４）  海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２株に関する。
【０００９】
本発明のＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂは下記の構造式および性状を有する。
【００１０】
［Ｂ１３７１Ａ］
（１）構造式
【００１１】
【化５】
0003584055.tif 000002
【００１２】
（２）物性
１）性質；中性脂溶性の白色、吸湿性粉末。アルカリ性溶液では室温で不安定。
【００１３】
２）溶解性；メタノールに易溶、水、クロロホルム、ヘキサンに難溶。
【００１４】
３）呈色試験；坂口反応、ニンヒドリン反応、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ  反応に陰性。
【００１５】
４）分子式；Ｃ４６Ｈ６７Ｎ５Ｏ１１
５）分子量；ＬＳＩ−ＭＡＳＳ法により決定（Ｍ＋Ｈ）＋
８６６．４９１８（測定値）
８６６．４９１５（計算値）
６）比施光度（測定値）；〔α〕Ｄ２５  −２６．４°（Ｃ  ０．２７，メタノール）
７）紫外線吸収スペクトル；λｍａｘ  ｎｍ（  ε）
メタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは以下に示す通りである。
２２７．４（３．４５×１０３）
２２３．６（１．９１×１０４）
８）赤外線吸収スペクトル；νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１
ＫＢｒ  ディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは以下の極大吸収を示す。
【００１６】
１５１６．９３９，１５３６．６２６，１６６８．２８４，１７４７．７３１，２９３１．５５９，２９６２．５８２，３３１５．９６３
９）１  Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用して測定した１  Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００  ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００１７】
０．９０（３Ｈ，ｔ），０．９５（６Ｈ，ｄ），１．０２（３Ｈ，ｄ），１．０７（３Ｈ，ｄ），１．２−１．５０（１２Ｈ，ｍ），１．９８（１Ｈ，ｍ），２．１４（１Ｈ，ｍ），２．２５−２．５０（４Ｈ，ｍ），２．７３（１Ｈ，ｄｄ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ），２．９３（３Ｈ，ｓ），３．２１（２Ｈ，ｍ），３．８０−４．１０（５Ｈ，ｍ），４．２０（１Ｈ，ｄ），４．４０（１Ｈ，ｄ），４．５２（１Ｈ，ｄｄ），４．７９（１Ｈ，ｍ），６．２５（１Ｈ，ｄ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ），６．７０（２Ｈ，ｄ），６．７５（２Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），７．０８（２Ｈ，ｄ）
１０）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（４００  ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００１８】
１４．４（１Ｃ，ｑ），１６．５  （１Ｃ，ｑ），１８．６  （１Ｃ，ｑ），１９．９  （１Ｃ，ｑ），２０．０  （１Ｃ，ｑ），２３．７  （１Ｃ，ｔ），２６．７  （１Ｃ，ｔ），３０．０  （１Ｃ，ｄ），３０．４  （１Ｃ，ｔ），３０．７  （１Ｃ，ｔ），３１．３  （１Ｃ，ｄ），３３．０  （１Ｃ，ｔ），３４．６  （１Ｃ，ｔ），３７．６  （１Ｃ，ｔ），３８．３  （１Ｃ，ｔ），４０．２  （１Ｃ，ｑ），４２．０  （１Ｃ，ｔ），４４．６  （１Ｃ，ｔ），５０．４  （１Ｃ，ｄ），５６．４  （１Ｃ，ｄ），５９．４  （１Ｃ，ｄ），６０．４  （１Ｃ，ｄ），６４．３  （１Ｃ，ｔ），６８．２  （１Ｃ，ｄ），６９．８  （１Ｃ，ｄ），７０．０  （１Ｃ，ｄ），１１６．２（２Ｃ，ｄ），１１６．６（２Ｃ，ｄ），１２６．１（１Ｃ，ｄ），１２９．９（１Ｃ，ｓ），１３０．５（１Ｃ，ｓ），１３１．２（４Ｃ，ｄ），１４１．１（１Ｃ，ｄ），１５５．５（１Ｃ，ｓ），１５６．０（１Ｃ，ｓ），１６９．０（１Ｃ，ｓ），１７０．８（１Ｃ，ｓ）１７１．５  （１Ｃ，ｓ），１７１．７（１Ｃ，ｓ），１７３．２（１Ｃ，ｓ），１７３．６（１Ｃ，ｓ）
１１）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μＣ１８−１００Ａ（カラムサイズ、Φ３．９×１５０ｍｍ，ウオーターズ社製）
溶媒；      ３７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速；      １．０ｍｌ／分
検出；      ＵＶ２２０ｎｍ
保持時間；  ９．６８分
［Ｂ１３７１Ｂ］
１）構造式
【００１９】
【化６】
0003584055.tif 000003
【００２０】
２）性質；中性脂溶性の白色、吸湿性粉末。アルカリ性溶液では室温で不安定。
【００２１】
３）溶解性；メタノールに易溶、水、クロロホルム、ヘキサンに難溶。
【００２２】
４）呈色試験；ニンヒドリン反応、坂口反応、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ  反応に陰性。
【００２３】
５）分子式；Ｃ５６Ｈ８３Ｎ７Ｏ１４
６）分子量；ＬＳＩ−ＭＡＳＳ法により決定（Ｍ＋Ｈ）＋
１０７８．６０８３  （測定値）
１０７８．６０７６  （計算値）
７）比施光度（測定値）；〔α〕Ｄ２５  −３８．０°（Ｃ０．３７，メタノール）
８）紫外線吸収スペクトル；λｍａｘ  ｎｍ（  ε）
メタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは以下に示す通りである。
【００２４】
２７８．２（２．９３×１０３）
２２３．５（２．１６×１０４）
９）赤外線吸収スペクトル；νｍａｘ  ｃｍ−１
臭化カリウム（ＫＢｒ）  ディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、以下の極大吸収を示す通りである。
【００２５】
１５１６．６９４，１５３４．７０１，１６４２．７７５，１７４６．６４２，２９２９．２４０，２９６２．４９８，３３１０−３３３０，３３６０−３４００
１０）１  Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した１  Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００  ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００２６】
０．８９（３Ｈ，ｔ），０．９５（６Ｈ，ｄ），０．９８（６Ｈ，ｄ），０．９９（３Ｈ，ｄ），１．０４（３Ｈ，ｄ），１．２０−１．４２（８Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｍ），２．０３（２Ｈ，ｍ），２．１０−２．２５（２Ｈ，ｍ），２．３２−２．５５（４Ｈ，ｍ），２．７１（１Ｈ，ｄｄ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ），２．９２（３Ｈ，ｓ），２．９７（２Ｈ，ｄ），３．１６（１Ｈ，ｄｄ），３．２２（１Ｈ，ｄｄ），３．５６（１Ｈ，ｄｄ），３．６６（１Ｈ，ｄｄ），３．９０（１Ｈ，ｍ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ），４．０１（１Ｈ，ｄｄ），４．０５−４．１８（３Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄ），４．２３（１Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｄ），４．４８（１Ｈ，ｄｄ），４．７５（１Ｈ，ｍ），５．４２（１Ｈ，ｍ），５．５４（１Ｈ，ｍ），６．２５（１Ｈ，ｄ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ），６．６６（２Ｈ，ｄ），６．７０（２Ｈ，ｄ），７．００（２Ｈ，ｄ），７．０４（２Ｈ，ｄ）
１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；（δ：ＰＰＭ）
重メタノール中、内部基準にＴＭＳを使用して測定した１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（４００  ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
【００２７】
１４．４（１Ｃ，ｑ），１４．８（１Ｃ，ｑ），１６．６（１Ｃ，ｑ），１８．４（１Ｃ，ｑ），１８．６（１Ｃ，ｑ），１９．９（１Ｃ，ｑ），２０．０（１Ｃ，ｑ），２３．７（１Ｃ，ｔ），２８．４（１Ｃ，ｔ），３０．１（１Ｃ，ｔ），３０．１（１Ｃ，ｄ），３０．５（１Ｃ，ｔ），３１．２（１Ｃ，ｄ），３１．３（１Ｃ，ｄ），３２．９（１Ｃ，ｔ），３４．６（１Ｃ，ｔ），３５．６（１Ｃ，ｔ），３７．８（１Ｃ，ｔ），４０．２（１Ｃ，ｑ），４１．７（１Ｃ，ｔ），４１．８（１Ｃ，ｔ），５０．４（１Ｃ，ｄ），５６．０（１Ｃ，ｄ），５６．３（１Ｃ，ｄ），５９．３（１Ｃ，ｄ），６０．５（１Ｃ，ｄ），６１．３（１Ｃ，ｄ），６２．４（１Ｃ，ｔ），６４．２（１Ｃ，ｔ），６８．０（１Ｃ，ｄ），６８．５（１Ｃ，ｄ），７０．０（１Ｃ，ｄ），１１６．２（２Ｃ，ｄ），１１６．３（２Ｃ，ｄ），１２３．１（１Ｃ，ｄ），１２６．１（１Ｃ，ｄ），１２９．８（１Ｃ，ｓ），１３０．５（１Ｃ，ｓ），１３１．３（４Ｃ，ｄ），１３４．７（１Ｃ，ｄ），１４１．１（１Ｃ，ｄ），１５６．９（１Ｃ，ｓ），１５７．６（１Ｃ，ｓ），１７０．９（１Ｃ，ｓ），１７３．１（１Ｃ，ｓ）１７３．２（１Ｃ，ｓ），１７３．３（１Ｃ，ｓ），１７４．１（２Ｃ，ｓ），１７４．５（１Ｃ，ｓ），１７４．６（１Ｃ，ｓ）
１２）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μＣ１８−１００Ａ（カラムサイズ、Φ３
．９×１５０ｍｍ，ウオーターズ社製）
溶媒；      ３７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速；      １．０ｍｌ／分
検出；      ＵＶ２２０ｎｍ
保持時間；  １４．２８分
本発明のペプチド系化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを生産する上記ＳＡＮＫ７０９９２株は宮城県の牡鹿半島の海岸で採取したアオノリから分離した海洋細菌である。Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１  Ｂの生産菌であるＳＡＮＫ７０９９２株の菌学的性状は次の通りである。
【００２８】
１．形態学的性状
マリンアガー（ディフコ社製）上で２３℃、２４時間培養後の観察では、細胞は直径０．３〜０．４μｍ、長さ１．５〜２．０μｍ、螺旋形である。単極毛を有し、運動する。大型球状細胞（ｃｏｃｃｏｉｄ  ｂｏｄｙ）  を形成しない。胞子を形成せず、グラム染色は陰性である。
【００２９】
２．マリンアガー上での生育状態
２３℃で、４８時間培養したコロニーはいくぶんピンク白をおびた灰白色、不透明で円形、全縁である。水溶性の色素を生成しない。
【００３０】
３．生理学的性状
１）海水の要求性（プロテオースペプトンＮｏ．３（ディフコ社製）０．１％、酵母エキス（ディフコ社製）０．１％、ファイトンペプトン（ＢＢＬ社製）０．１％の組成の培地を用いた場合）：生育に海水を要求する。
【００３１】
２）Ｏ−Ｆ（オキシダティブ−ファーメンタティブ）テスト〔ヒュー・レイフソン（Ｈｕｇｈ  Ｌｅｉｆｓｏｎ）  法、酵母エキス（ディフコ社製）０．０５％添加、７５％人工海水で調整］：グルコースを酸化的に分解する。
【００３２】
３）カタラーゼ：＋
４）酸素に対する挙動：好気的
５）硝酸塩の還元：−
６）デンプンの加水分解：−
７）寒天の分解：−
８）ゼラチンの液化：−
９）生育温度：８℃では微弱に生育し、１２℃〜４０℃では良好な生育を示す。５０℃では生育しない。
【００３３】
１０）栄養要求性（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）  ，１０７巻，２６８−２９４頁（１９７１年）記載の基礎培地を用いた場合）：酵母エキスを要求する。
【００３４】
１１）炭素化合物の利用性（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）  ，１０７巻，２６８−２９４頁（１９７１年）記載の基礎培地に酵母エキスを０．０２％加え、７日間静置培養を行った場合）：Ｌ−アラビノース  −，蔗糖  −，Ｄ−キシロース  −，コハク酸ソーダ  ＋，Ｄ−グルコース  ＋，酢酸ソーダ  ＋，麦芽糖  −，グリセロール  ＋
４．化学分類学的性状
１）ＤＮＡのＧ＋Ｃ（グアニン＋シトシン）含量：４９．８モル％（ＨＰＬＣ法）
２）キノン系：ユビキノンＱ−１０
以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ７０９９２株はバージーズ  マニュアル  オブ  システマティック  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）  ，１巻（１９８４年）の分類にしたがえば、海洋環境から分離され、生育に海水を要求、細胞が螺旋状、ＤＮＡのＧ＋Ｃの含量が４９．８％であることからオーシャノスピリレム（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属にもっとも近いと考えられる。しかし、ＳＡＮＫ７０９９２の鞭毛は単極毛で細胞の一方の極のみ着生されるのに対し、オーシャノスピリレム属細菌の鞭毛は多極毛、稀に単極毛であるが細胞の両極に着生される。また、ＳＡＮＫ７０９９２株は糖から好気的に酸を生成するのに対し、オーシャノスピリレム属細菌は酸を生成しない。さらに、ＳＡＮＫ７０９９２株にはオーシャノスピリレム属細菌に観察される大型球状細胞はみられない。それ故、本発明者らは本菌をオーシャノスピリレム属に近い新属、新種の海洋細菌ＳＡＮＫ７０９９２株（寄託機関、工業技術院生命工学工業技術研究所：寄託番号、微工研条寄第４１５８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１５８）号：寄託日、平成５年（１９９３年）１月５日）とした。
【００３５】
以上、ＳＡＮＫ７０９９２株について説明したが、海洋細菌の諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使用しうる菌株は海洋細菌に属するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを生産する全ての菌株を包含するものである。
【００３６】
本発明の化合物Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの効率的な工業的製造法は該化合物の生産能を有するＳＡＮＫ７０９９２株を好適な培地で培養し、その培養物から分離する方法である。
【００３７】
本発明物質を製造するのに使用される培地は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も適しているが、これに限定されない。培地はＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂ生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するものが望ましい。例えば、炭素源としてはグルコース、グリセリン、糖蜜、有機酸類などが使用できる。また窒素源としては、例えばバクトトリプトン、イーストエキストラクト、ペプトン、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩その他の各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムや、各種燐酸塩等を添加してもよい。また、菌の成育及びＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの生産を促進するようなビタミン類、補酵素類等を添加してもよい。
【００３８】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂ生産菌の培養における培養温度、培養期間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなどの条件は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの蓄積量が最大となるように適当に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養の場合、培養温度２３℃〜３０℃、１〜３日間の培養が好ましく、また培養液のｐＨはｐＨ５．０〜８．５に調節するのが好ましい。
【００３９】
培養の経過に伴って培養液中に蓄積されるＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの量の経時変化は、後述の阻害活性或いは逆相ＨＰＬＣにより測定することができる。通常は、４８時間から７２時間の培養でその生産量は最大に達する。培養終了後、主としてその液体部分に蓄積するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂは、菌体その他の固形部分を濾過操作または遠心分離によって除去し、その濾液または上清液から分離するのが好ましいが、必要に応じて菌体を除去することなく培養液から該化合物を分離することも可能である。培養液からのＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの分離、精製には、その物理化学的特性に基づく種々の方法を用いることができる。例えば、濾液または上清中に存在するＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂは、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶媒、例えば酢酸エチル、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独またはそれらの組み合わせにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤として、例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱（株）製）等が使用される。Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを含む含む画分を、上記の吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、または、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを吸着させた後、メタノール水、アセトン水などを用いて溶出させることにより該化合物を得ることができる。更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー（株）製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ２５（ファルマシア社製）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィー、および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどでＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを精製することができる。
【００４０】
本発明は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを有効成分とする、抗脳梗塞剤、抗心筋梗塞剤、抗血栓症剤、抗白内障剤、抗筋ジストロフィー剤、抗炎症剤、抗骨粗鬆症剤または癌転移防止剤に関するものである。
【００４１】
本発明のＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを抗脳梗塞剤、抗心筋梗塞剤、抗血栓症剤、抗白内障剤、抗筋ジストロフィー剤、抗炎症剤、抗骨粗鬆症剤または癌転移防止剤として用いる場合、種々の形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与また注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、座薬等による非経口投与を挙げることができる。
【００４２】
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、縣濁剤、コーティング剤等既知の医薬製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して１日５０ｍｇ乃至１０００ｍｇを投与することができる。
【００４３】
【実施例】
次に実施例、及び製剤例をあげて本発明を更に具体的に説明する。
【００４４】
（実施例１）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの精製
（Ａ）培養
ＳＡＮＫ７０９９２株を滅菌した後述の組成の培地１リットルを含む５リットルの三角フラスコ（種フラスコ）に接種した。次いでこれを２６℃で３日間、２００ｒｐｍのロータリー振盪機で前培養した。更に同培地１００  リットルを含む２００  リットルタンクに、この種培養液を１  リットル入れ、２６℃で４７時間、通気量１．０ｖｖｍで攪拌速度を１１０ｒｐｍにして攪拌培養した。
【００４５】
【表１】
培地組成
バクトトリプトン（ディフコ社製）                              １６ｇ
イーストエキストラクト（ディフコ社製）                        １０ｇ
……………………………………………………………………………………………
人工海水  Ｊａｍａｒｉｎ  Ｓ  （ジャーマリン・ラボラトリー製）    １０００ｍｌ
ｐＨ６．８
（Ｂ）単離
Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，  Ｈ．らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．    ２６，２８６３−２８７０（１９８７））に準じ、ウシ腎臓より調製したＩＩ型カルパインに対する阻害活性を測定することにより、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂを単離精製した。
【００４６】
ＩＩ型カルパインの活性はＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ  らの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５８，８８８３−８８８９（１９８３））に準じた下記の方法により測定した。
【００４７】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  、１００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液に酵素標品を添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ２８０  を測定した。５ｍＭ  ＣａＣｌ２  の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、ＩＩ型カルパイン活性とした。この方法で測定し、Ａ２８０  を１増加させるＩＩ型カルパイン活性を１酵素単位と定義した。
【００４８】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、０．１酵素単位を含む上記反応液に、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加して同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。
【００４９】
５０％阻害に必要なＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの濃度を算出し、ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）値とした。
【００５０】
２００  リットルタンク２基分の培養液２００  リットルを連続遠心分離し、得られた上清１９０  リットルを塩酸でｐＨ７．０に調整した後、２００  リットルの酢酸エチルエステルを添加し、抽出操作を行った。酢酸エチルエステル層を無水硫酸ナトリウムによる脱水後、濃縮し、１０７ｇの黒色シロップ状物質を得た。この黒色シロップ状物質をジクロロメタンに溶解し、ジクロロメタンで平衡化したシリカゲルを充填した４００ｍｌのカラムに供与し、ジクロロメタンで洗浄後、ジクロロメタン／メタノール（７５／２５：ｖ／ｖ  ）の混合液で溶出した。カルパイン阻害活性画分を集め濃縮し、４３ｇの黒色シロップ状物質を得た。この黒色シロップ状物質をメタノールに溶解した後、３０％メタノール溶液になるように調製し、同じ組成の溶媒で平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）カラムに供与し、同じ溶媒で洗浄後、６０％メタノールで溶出した。カルパイン阻害活性画分を集め濃縮し、２３．６ｇの褐色シロップ状物質を得た。この褐色シロップ状の物質をアセトニトリルに溶解した。この画分を３０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸溶液になるように調製し、同じ組成の溶媒で平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）カラムにこの画分を供与し、同じ溶媒で洗浄後、５０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。阻害活性画分を集め濃縮し、褐色シロップ状物質１７．６ｇを得た。このものを分取用逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。すなわち、一回の操作において約２ｇの上述の褐色シロップ状物質をメタノールに溶解した後、分取用逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔ，直径２１．５ｍｍ×長さ３００ｍｍ，東ソー（株）製）に供与し、室温、流速９．９ｍｌ／分，３０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、３７％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸で溶出し、保持時間が５４分（Ｂ１３７１Ａが溶出）、及び９６分（Ｂ１３７１Ｂが溶出）前後の画分をそれぞれ集めた。残りの褐色シロップ状物質についても同様な操作を行い、採取した溶出液をそれぞれプールした。それぞれの溶出液を減圧下において濃縮、凍結乾燥し、Ｂ１３７１Ａは９．１ｍｇ、Ｂ１３７１Ｂは２７．３ｍｇの白色粉末を得た。
【００５１】
（製剤例１）経口用カプセル剤
【００５２】
【表２】
0003584055.tif 000004
上記処方の粉末を混合し、３０メッシュのふるいを通したのち、この粉末３５０ｍｇをゼラチンカプセルにいれ、カプセル剤とした。
【００５３】
【発明の効果】
次に試験例を挙げて本発明の効果を説明する。
【００５４】
（試験例１）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＩＩ型カルパインに対する阻害活性
実施例１で得られたＢ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂについて、ＩＩ型カルパインに対する阻害活性を実施例１に記載した方法で測定した。
【００５５】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  、１００ｍＭ
イミダゾール塩酸（Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５）を含む溶液に０．１酵素単位ＩＩ型カルパインを添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ２８０  を測定した。５ｍＭ  ＣａＣｌ２  の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、ＩＩ型カルパイン活性とした。
【００５６】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、及びＥ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ５０値で表す）を以下に示す。
【００５７】
【表３】
ＩＩ型カルパイン阻害活性（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ      ０．０３８
Ｂ１３７１Ｂ    ０．０８０
ロイペプチン    ０．１１９
Ｅ−６４        ０．３００
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはＩＩ型カルパインに対して、ロイペプチン及びＥ−６４より強い阻害活性を示した。
【００５８】
（試験例２）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＩ型カルパインに対する阻害活性
Ｉ型カルパインはウシ腎臓より、Ｉｎｏｍａｔａ，  Ｍ．  らの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．  ９３，２９１−２９４（１９８３））に準じて調製した。
【００５９】
Ｉ型カルパインの活性はＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ  らの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．  ２５８，８８８３−８８８９（１９８３））に準じた下記の方法により測定した。
【００６０】
０．２５％カゼイン、５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  、１００ｍＭ
イミダゾール塩酸（Ｉｍｉｄａｚｏｌ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５）を含む溶液に０．１酵素単位Ｉ型カルパインを添加し、反応を開始した。最終液量は５００μｌとした。３０℃、３０分反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ２８０  を測定した。５ｍＭ  ＣａＣｌ２  の代わりにＥＤＴＡを５ｍＭとして反応させたものをブランクとして差し引き、Ｉ型カルパイン活性とした。
【００６１】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ５０値で表す）を以下に示す。
【００６２】
【表４】
Ｉ型カルパイン阻害活性（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ      ０．０４０
Ｂ１３７１Ｂ    ０．０９１
Ｅ−６４        ０．２９５
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはＩ型カルパインに対して、Ｅ−６４より強い阻害活性を示した。
【００６３】
（試験例３）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのカテプシンに対する阻害活性
カテプシンＢの活性はＢａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８０，５３５−５６１（１９８１））に準じて測定した。
【００６４】
１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．０４５％Ｂｒｉｊ３５、２ｍＭ  ＤＴＴ，１μｇ／ｍｌカテプシンＢを含む溶液に、１０μＭ  Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｅ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ（Ｃｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を添加し、最終液量を１０００μｌとして反応を開始した。３０℃、３０分間反応させた後、５０％トリクロロ酢酸１００μｌを加えて反応を停止させた。遊離したアミノメチルクマリンを蛍光光度計にて測定した（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：  ３７０ｎｍ、Ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ：４６０ｎｍ）。
【００６５】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、上記反応液よりＣｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ  を除いたものに、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌ  を添加し３０℃、５分間インキュベートした後、Ｃｂｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ  を添加し、同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ５０値で表す）を以下に示す。
【００６６】
【表５】
カテプシンＢ阻害活性（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ      ０．００３４
Ｂ１３７１Ｂ    ０．０１２１
ロイペプチン    ０．００７０
Ｅ−６４        ０．０１８９
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢはカテプシンＢに対して、Ｅ−６４より強い阻害活性を示した。
【００６７】
（試験例４）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのパパインに対する阻害活性
パパインの活性はＯｇｕｒａ，Ｋ．らの方法（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．４９，７９９−８０５（１９８５））に準じて測定した。
【００６８】
０．２５％カゼイン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭシステインを含む溶液に、０．１酵素単位パパインを添加し、最終液量は５００μｌとして反応を開始した。３７℃、１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ２８０  を測定した。なお、この方法で測定し、Ａ２８０  を１増加させるパパイン活性を１酵素単位と定義した。
【００６９】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、該化合物を含まないＤＭＳＯ溶液のみを加えたときの比較によって求めた。対照としてロイペプチン、Ｅ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ５０値で表す）を以下に示す。
【００７０】
【表６】
パパイン阻害活性（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ      ０．２７
Ｂ１３７１Ｂ    ０．４０
ロイペプチン    ０．２２
Ｅ−６４        ０．０９
（試験例５）Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂのトリプシンに対する阻害活性
トリプシンの活性はＯｇｕｒａ，Ｋ．らの方法（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．４９，７９９−８０５（１９８５））に準じて測定した。
【００７１】
０．２５％カゼイン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む溶液に、０．１酵素単位トリプシンを添加し、最終液量は５００μｌとして反応を開始した。３７℃、１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸５００μｌを加えて反応を停止させ、４℃で３０分間放置後遠心し、上清のＡ２８０  を測定した。なお、この方法で測定し、Ａ２８０  を１増加させるトリプシン活性を１酵素単位と定義した。
【００７２】
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂの阻害活性は、Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１ＢのＤＭＳＯ溶液５μｌを添加し、最終液量を５００μｌとして同様に測定し、対照（ＤＭＳＯ）との比較により求めた。ロイペプチン、及びＥ−６４の阻害活性も同時に測定した。結果（ＩＣ５０値で表す）を以下に示す。
【００７３】
【表７】
トリプシン阻害活性（ＩＣ５０；μｇ／ｍｌ）
Ｂ１３７１Ａ      ＞２５０
Ｂ１３７１Ｂ    ＞３５０
ロイペプチン    ０．８６
Ｅ−６４        ＞３６０
Ｂ１３７１ＡまたはＢ１３７１Ｂはロイペプチンと異なり、トリプシンに対して阻害活性を示さなかった。