(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸桿菌であるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４）を用いて原料乳を発酵させて整腸作用を付与したことを特徴とするヨーグルト，乳酸菌飲料等の機能性発酵乳製品。
【請求項２】
乳酸桿菌であるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４）を用いて原料乳を発酵させて整腸作用を付与することを特徴とするヨーグルト，乳酸菌飲料等の機能性発酵乳製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はヨーグルト，乳酸菌飲料等の機能性発酵乳製品およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
この種機能性発酵乳製品として，例えば整腸作用を有するとされるヨーグルトが市販されているが，整腸作用を付与するために使用される乳酸菌が有する，例えばビフィズス菌が産出する酢酸臭やアシドフィラス菌が産出するすえた臭いが製品に残ることによって製品の風味が損なわれる結果，機能性発酵乳製品が嫌われてその普及を阻害する要因ともなっている。
【０００３】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので，その解決課題とするところは，優れた整腸作用を備えるとともに嗜好性に富む機能性発酵乳製品及びその製造方法を提供するにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題に沿って鋭意研究した結果，例えば中央アジアの発酵乳から分離したラクトバチルス・ヘルベティカスに属する乳酸桿菌である，ラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４）を使用し，該菌株によって原料乳を発酵させるようにすると，該菌株が高度な整腸作用を呈するものとなるとともに上記特有の臭気が解消し，逆に発酵乳製品として好ましいさわやかな香り，換言するとさわやかな香り備えた嗜好性に富んだ香りを呈するものとなり，整腸作用と嗜好性を両立した機能性発酵乳製品とし得るとの知見を得た。
【０００５】
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので，請求項１に記載の発明を，乳酸桿菌であるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４）を用いて原料乳を発酵させて整腸作用を付与したことを特徴とするヨーグルト，乳性乳酸菌飲料等の機能性発酵乳製品としたものである。
【０００６】
また請求項２に記載の発明は，その製造方法を提供するように，これを，乳酸桿菌であるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４）を用いて原料乳を発酵させて整腸作用を付与することを特徴とするヨーグルト，乳性乳酸菌飲料等の機能性発酵乳製品の製造方法としたものである。
【０００７】
本発明において使用するラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株は，独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５４として寄託してあり，その分類学的性質は表１に示すとおりであり，また該菌株は，Ｍ．  Ｖｅｎｔｕｒａらが報告（Ｍ．  Ｖｅｎｔｕｒａ，  Ｍ．Ｌ．  Ｃａｌｌｅｇａｒｉ，  Ｌ．  Ｍｏｒｅｌｌｉ，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １８９  ２７５−２７９（２０００））したラクトバチルス・ヘルベティカスの特異的プライマーを用いたＰＣＲにより，表２に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅させることによって他の菌株と識別することが可能である。
【０００８】
【表１】
0003579031.tif 000002
【０００９】
【表２】
0003579031.tif 000003
【００１０】
本発明の機能性発酵乳製品は，例えばヨーグルト，乳酸菌飲料等の各種の製品とすることができ，その原料乳は，乳成分の無脂乳固形分が必須であるが，その基質を特に問わず，例えば牛乳等の獣乳，その脱脂乳等とし，必要に応じて乳脂肪分，砂糖，果実，ゲル化剤，香料等を添加し又は強化するようにすればよい。
【００１１】
原料乳の発酵は，常法に従って配合，殺菌した原料乳（発酵基質）に上記ラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株のスターターを植菌し，発酵温度を，例えば３０〜４５℃程度，望ましくは３８〜４５℃程度とし，発酵時間を，例えば２〜１０時間程度，望ましくは４〜６時間程度として，これを行なうようにすればよい。
【００１２】
ラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を用いた発酵乳製品は，該菌株が人工胃液，腸液に強い耐性を示し，整腸作用を呈するものとなし得る一方，嗜好性を増進するさわやかな香りを備えたものとなり，整腸作用と嗜好性を両立した機能性発酵乳製品とすることができる。なお発明者らの実験によれば，該菌株の人工胃液に対する耐性は，３時間経過後においても減少せず，人工腸液に対する耐性は，１２時間経過後約５割という強い結果を示すものであった。また整腸作用は，例えばヨーグルトの健常成人の摂取量を１日に１００ｇ以下，例えば８０〜９０ｇとすることによってその効果を発揮し得るものとなる。
【００１３】
【実施例】
以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するが，実施例は本発明の実施形態を限定するものではない。
【００１４】
生乳，脱脂粉乳，クリーム，砂糖，ゼラチン，クエン酸ナトリウム及び活性炭処理水にて，乳脂肪分３．６５％，無脂乳固形分１２．７２％，ゼラチン０．５％，クエン酸ナトリウム０．１４％，総固形分２６．１６％に調整した発酵基質９９７０ｋｇを作製した。これをプレート式殺菌機にて８０℃で加温後乳脂肪分の均質化処理をなし，９８℃にて５秒間の殺菌後，４２℃に冷却した。無脂乳固形分１０％の還元脱脂粉乳で作製した発酵基質にて別途作製したラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株スターター３０ｋｇを衛生的に添加し，攪拌均一後４２±２℃にて発酵した。攪拌冷却により発酵を停止させ，停止後の乳酸酸度が１．０５％になるようにして発酵ベースを作製した。
【００１５】
砂糖１９．１５％，寒天０．６８％，香料０．２４％及び活性炭処理水７９．９３％の割合で配合したシラップ液を９５℃にて１０分間保持殺菌することで寒天を溶解した後，５２℃に冷却して寒天シラップを作製した。
【００１６】
発酵ベースをプレート式加温機にて５２℃に加温し，寒天シラップと７２：２８の比率で混合後，ホモゲナイザーにて均質化処理をなし，容器に８４ｇを充填・密封後急冷して，乳脂肪分２．５％，無脂乳固形分９．０％，乳酸菌数が約１０８／ｍｌのヨーグルトを製造した。
【００１７】
このように製造したヨーグルトは，淡い甘さのさわやかな香りを呈するものとなり，極めて嗜好性に富んだ味と香りを備えたものであった。
【００１８】
一方このように製造したヨーグルトについて，以下の試験を行い，該ヨーグルトの整腸作用を確認した。
【００１９】
【試験１】
上記ヨーグルトを，健常成人１６名（男性，２５〜６０歳，平均年齢４１．４歳，糞便内細菌叢解析は男性７名２５〜６０歳，平均年齢４５．４歳）に摂取させた。被験者には試験期間中に本試験で提供されるヨーグルト以外の発酵乳や納豆，オリゴ糖，食物繊維，その他腸管内細菌叢に影響の大きい食品を摂取しないよう指示した。試験期間は８週とし，これを４期に分けた。第１〜２週を摂取前期間としてヨーグルトを摂取しない状態を調査した。第３〜４週を８４ｇ摂取期間として１日に８４ｇのヨーグルトを摂取させた。第５〜６週を２５２ｇ摂取期間として１日に２５２ｇのヨーグルトを摂取させ，第７〜８週を非摂取期間とした。
【００２０】
結果を表３，表４及び図１に示す。表３によれば，糞便色調は摂取前期間の値と比較して，毎日８４ｇ及び２５２ｇのヨーグルトを摂取することにより糞便色調が有意に黄色化することが判明した。また毎日２５２ｇ摂取することにより糞便臭気が弱くなることが判明した。一方，図１によれば，毎日８４ｇ及び２５２ｇのヨーグルトを摂取することにより糞便形状における適正状態の出現率が，摂取前の約６５％程度から約８０％程度に有意に増加し，摂取後は徐々に摂取前の状態に戻ることが判明した。また表４により，ヨーグルトを摂取すると善玉菌と称されるビフィズス菌の菌数及び占有率が増加し，悪玉菌と称されるクロストリディウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びその他のクロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−ｏｔｈｅｒｓ）が減少する。これらはラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を使用したヨーグルトを１日８４ｇ摂取することにより，整腸作用が得られることを示している。
【００２１】
【試験２】
上記ヨーグルトを健常成人３９名（男性２６名，女性１３名，２３〜６１歳，平均年齢３４．７歳，糞便内細菌叢解析は男性８名，２５〜６１歳，平均年齢３２．９歳）に摂取させた。被験者には試験期間中に本試験で提供されるヨーグルト以外の発酵乳や納豆，オリゴ糖，食物繊維，その他腸管内細菌叢に影響の大きい食品を摂取しないよう指示した。試験期間は１０週とし，これを５期に分けた。第１〜２週を非摂取期間として非摂取中の状態を調査した。第３〜４週をヨーグルト摂取期間として１日に８４ｇのヨーグルトを摂取させた。第５〜６週を非摂取期間として非摂取中の状態を調査した。７〜８週をプラセボ摂取期間として，プラセボ，即ち上記ラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を使用する以外は同一の配合成分とし，これを乳酸によって酸度を調整し，味覚において供試発酵乳と差のない疑似発酵乳を１日に８４ｇ摂取させ，第９〜１０週を非摂取期間とした。
【００２２】
結果を表５及び表６に示す。表５によればヨーグルトを摂取することにより，排便日数，排便回数，排便量が非摂取期間と比較して増加することが判明した。また排便日数および排便回数はプラセボ摂取期間と比較しても有意に多くなることが判明した。一方，表６によればヨーグルト摂取によるビフィズス菌の菌数増加及びビフィズス菌占有率の有意な増加は，ヨーグルトに含まれるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１の働きによるものであることがわかる。
【００２３】
調査１及び調査２で示された糞便内細菌叢における善玉菌と称されるビフィズス菌菌数の増加及びこれによる糞便性状の改善効果は，このヨーグルトの特徴であるラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を使用して発酵基質を発酵させることにより得られることを示している。
【００２４】
これら試験におけるアンケート調査及び糞便内細菌叢の解析は，以下に示す方法により行った。
【００２５】
即ちアンケート調査方法は被験者に実施記録，排便記録の記入を依頼し，毎日の排便状況，毎回の糞便性状及び特記事項の有無を調査することで実施した。実施記録に体調，食事内容，薬の服用の有無及び腹痛などの消化器症状を記録させた。排便記録に毎回の糞便量および糞便性状（糞便色調，糞便臭気，糞便形状および排便後の感覚）を記録させた。糞便量は，調査１においては直径４０ｍｍのピンポン玉の個数に，また調査２においては直径２０ｍｍ長さ１００ｍｍの円柱棒に換算して記録させた。糞便性状のうち糞便色調，糞便臭気および排便後の感覚は，被験者の判定を数値化した。すなわち糞便色調はＤＩＣカラーガイド１７版（大日本インキ化学（株））の１黄色（ＤＩＣ２０６），２薄い黄土色（ＤＩＣ３３６），３黄土色（ＤＩＣ２４０），４茶色（ＤＩＣ３４１），５焦げ茶色（ＤＩＣ３０８），６黒に近い焦げ茶色（ＤＩＣ３１１）を標準色として被験者に配布し，最も近いと思われる色を記入させた。糞便臭気は１非常に弱い，２弱い，３普通，４強い，５非常に強い，の５段階に分け記録させた。排便後の感覚は，１非常にスッキリ，２おおむねスッキリ，３普通，４スッキリせず残便感あり，の４段階に分け記録させた。この記録から各被験者の排便１回あたりの平均値を期間毎に算出した。糞便性状のうち糞便形状は，１下痢または水状，２泥状，３半練り状，４バナナ状，５固い，６コロコロ状，の６段階に分け記録させ，試験１においては期間毎に被験者全体の回答に対する各状態の出現率を算出し，試験２においては数値化し平均値を期間毎に算出した。試験２においては３回の無摂取期間の平均を被験者の無摂取期間の値とした。
【００２６】
糞便内細菌叢の解析方法は，同意の取れた被験者から各期間の終了時に１回ずつ糞便を採取して実施した。
【００２７】
排泄された糞便１回の全量をポリ袋に採取し，脱酸素剤（アネロパックケンキ，三菱ガス化学（株））とともに酸素非透過性のパウチ袋に入れ，保冷剤にて低温を維持し輸送した。採取した糞便を均質化した後，嫌気性希釈液に懸濁した。系列希釈によって１０８倍までの糞便希釈液を作成し，３種類の非選択培地（ＢＬ，ＥＧ，ＴＳ）および５種類の選択培地（ＢＳ，ＮＮ，ｍＬＢＳ，ＤＨＬ，ＴＡＴＡＣ）に塗布した。ＴＳ，ＤＨＬおよびＴＡＴＡＣは好気的に，その他の培地はスチールウール法により嫌気的に培養した。また等量のエタノールと糞便希釈液を混合し室温に３０分保持した後，ＢＬおよびＥＧに塗布し嫌気的に培養することで芽胞形成菌を分離した。出現したコロニーを釣菌し，集落形態，グラム染色性，菌形態，レシチナーゼ反応，好気条件下での発育および芽胞の有無を観察し，バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ），ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ペプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｃｅａｅ），メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ），クロストリディウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ），その他のクロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−ｏｔｈｅｒｓ），ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ），腸球菌科（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に群分けした。菌数は糞便１ｇあたりの常用対数（ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｇ）で示した。特にビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）については，その菌数に加えて各被験者の総菌数に対するビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌数の割合を，ビフィズス菌占有率として百分率で示した。
【００２８】
以上のようにラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を使用して製造したヨーグルト（発酵乳）は，善玉菌と称されるビフィズス菌菌数の増加，ビフィズス菌の糞便中での占有率をアップさせ，一方で悪玉菌と称されるクロストリディウム・パーフリンゲンスを減少させ，その結果，整腸作用，便性状の改善をもたらすことが確認された。
【００２９】
【表３】
0003579031.tif 000004
【００３０】
【表４】
0003579031.tif 000005
【００３１】
【表５】
0003579031.tif 000006
【００３２】
【表６】
0003579031.tif 000007
【００３３】
【図１】調査１でのアンケート調査における糞便形状の結果を示す。
0003579031.tif 000008
【００３４】
【発明の効果】
以上のとおり，請求項１に記載の発明は，ラクトバチルス・ヘルベティカスＧＣＬ１００１菌株を用いて原料乳を発酵させることによって優れた整腸作用を備えるとともに嗜好性に富む機能性発酵乳製品を提供することができる。また請求項２に記載の発明は，この機能性発酵乳製品の製造方法を提供することができる。