(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物MO7株（FERM BP-5624)又はその類縁株を特異的に検出するためのプライマー対であって、
（１）配列番号：21に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマー(A2）と、配列番号：24に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌヌレオチドプライマー（C22）との対；
（２）配列番号：30に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマー（α2）と、配列番号：34に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレイチドプライマー（ω2）との対；或いは
（３）配列番号：31に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマー（β1）と、配列番号：33に記載の塩基配列又はこの配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマー（ω1）との対；
のいずれかであるプライマー対。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマー対を含んで成る、MO7株（FERM BP-5624)又はその類縁株検出用キット。
【請求項３】
MO7株（FERM BP-5624)又はその類縁株の検出方法において、
（１）被験試料、または被験試料から抽出した核酸を用意し、
（２）請求項請求項１に記載のプライマー対又は請求項２に記載のキットを用いて増幅反応を行い、そして
（３）増幅が生じたか否かを検定する、
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
MO7株（FERM BP-5624)又はその類縁株の検出方法において、
（１）被験試料、または被験試料より抽出した核酸を用意し、
（２）請求項１に記載のプライマー対又は請求項２に記載のキットを用いて、MO7株（FERM BP-5624)またはその類縁株の16S rDNA又はISR-DNAの一部を増幅し、
（３）増幅した核酸の塩基配列を決定し、当該決定された塩基配列と配列番号：１又は配列番号：26に示す塩基配列と比較して、
（４）配列番号：１又は配列番号：26の塩基配列中に、上記（３）で決定された塩基配列が存在するか否かにより、被験試料中にMO7株（FERM BP-5624)又はその類縁株が存在するか否かを検定する、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規微生物ＭＯ７株またはその類縁株の検出用試薬および検出方法に関する。本発明はまた、これらの検出の基礎となる前記微生物株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ，ＩＳＲ  ＤＮＡ及びオキシゲナーゼ類似遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有害物質分解菌を土壌や排水等の環境中に導入することにより環境中の有害物質を分解する方法においては、処理されている環境中に導入した菌株の挙動や消長を把握する必要がある。
被験試料中の特定の微生物の有無や数を遺伝子レベルで測定する方法としては、該微生物に由来するＤＮＡを該微生物に特異的なプローブにより検出する方法、該微生物に特異的なＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する方法等が知られている。この方法においては、検出対象となる微生物に特異的なＤＮＡを増幅するためのプライマーが必要である。また、この時に検出対象となる微生物の類縁株について範囲を広げて検出する（すなわち特異性を適度に調整する）ことも可能となる。このような場合には、検出対象およびその類縁株に共通する特徴的なＤＮＡ配列をプローブおよびプライマーとして用いることが重要である。
【０００３】
各種の重要な微生物（病原菌、有害物質分解菌、農業上の有用微生物等）の特異的検出には、その菌株固有のＤＮＡ配列に基づく分子系統分類学的解析法が最も有効であると考えられている（駒形和男、土と微生物、NO．４１，３−６，（１９９３））。この様な固有ＤＮＡ配列としては、１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いることが有効であると考えられている（Rudorf I. Amanr et al., Microbiological reviews, Vol. 59, CU, 143-164,(1995)) 。
【０００４】
しかしながら、有害物質の分解能力を有するＭＯ７株は新規微生物であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列は知られていない。この様なＤＮＡ配列が明らかになっていない場合には、通常選択培地を用いた希釈平板法による計数を行う。本発明で標的とした有害物質分解菌では、通常有害物質等の有機化合物の資化性および抗生物質耐性を利用した選択培地法が用いられる。すなわち、選択培地上で生育可能な菌株をすべて標的菌株とみなす。この方法によって、かなり特殊な一群の微生物に絞り込むことが可能となる。しかし、多種多様な微生物群から１種の株のみを特異的に選抜することは不可能に等しい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、新規微生物ＭＯ７株またはその類縁株が有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ，１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＩＳＲ）、又はオキシゲナーゼ類似遺伝子を検出することにより試料中のＭＯ７株またはその類縁株を検出する方法、並びにそのためのプローブ及びプライマーを提供するものである。本発明はさらに上記検出の基礎となる上記ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ，ＩＳＲ  ＤＮＡ及びオキシゲナーゼ類似遺伝子を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明は、表１（配列番号：１）、表５（配列番号：２６、並びに配列番号３９及び４０に示す塩基配列を有する新規微生物ＭＯ７株（ＦＥＲＭＢＰ−５６２４）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ，ＩＳＲ、及びフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子部分を提供する。
本発明はまた、表１（配列番号：１）、表５（配列番号：２６）、又は配列番号３９もしくは４０に示す塩基配列中の１部分、例えば１０塩基以上を含有するオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、新規微生物ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡもしくはＲＮＡ，ＩＳＲ  ＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子の検出のためのプローブとして、及びこれらのＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するための鎖延長反応のためのプライマーとして有用である。
【０００７】
本発明はさらに、前記のプローブ及び／又は前記のプライマーを含んで成る、ＭＯ７株又はその類縁株検出用キットを提供する。
本発明はまた、ＭＯ７株又はその類縁株の検出方法において、
（１）被験試料、または被験試料から抽出した核酸を用意し、
（２）前記のプライマーを用いて増幅反応を行い、そして
（３）増幅が生じたか否かを検定する、
ことを特徴とする方法を提供する。
また、前記（３）の検定を前記のプローブにより行うこともできる。
【０００８】
さらに前記（２）の段階において、１６Ｓ  ｒＤＮＡのユニバーサルプライマー、ＩＳＲ  ＤＮＡユニバーサルプライマー又はフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を用いて増幅反応を行い、そして前記のプローブによりハイブリダイゼーションすることにより、
増幅が生じたか否かを検定することもできる。
本発明ではさらに、ＭＯ７株またはその類縁株の検出方法において、
（１）被験試料をＭＯ７株又はその類縁株増殖培地とともにインキュベートし、
（２）増殖した微生物またはそのＤＮＡ又はＲＮＡ、及び前記のプローブをハイブリダイゼーション可能な条件下に置き、そして
（３）ハイブリダイゼーションが生じたか否かを検定する、
ことを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
また、上記の方法において、段階（１）の被験試料のインキュベートを行わずに直接に段階（２）のハイブリダイゼーション処理をすることもできる。
本発明ではさらにＭＯ７株又はその類縁株の検出方法において、
（１）被験試料、または被験試料より抽出した核酸を用意し、
（２）前記のプライマーまたは１６Ｓ  ｒＤＮＡ用のユニバーサルプライマー、ＩＳＲ  ＤＮＡ用ユニバーサルプライマー又はフェノールヒドロキシラーゼ用ユニバーサルプライマーを用いて、ＭＯ７株またはその類縁株の１６Ｓ  ｒＤＮＡＩＳＲ  ＤＮＡ又はフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子あるいはその一部を増幅し、
（３）増幅した核酸の配列を決定し、表１（配列番号：１）、表５（配列番号：２６）又は配列番号３９もしくは４０に示す塩基配列と比較し、
（４）被験試料中にＭＯ７株又はその類縁株が存在するか否かを検定する、
ことを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
本発明では、さらにＭＯ７株を特異的に検出するためのプライマーおよびプローブを設計する段階において、特に高い特異性を必要とする時に有用な、表２に記載の配列番号２〜９のＭＯ７株１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列を提供する。本発明はさらに、配列番号：２９〜３４に示す１６Ｓ  ｒＤＮＡ用プローブ、配列番号：２９〜３４に示すＩＳＲ用プライマー、及び配列番号：３５〜３８に示すフェノールヒドロキシラーゼ用のプライマーを提供する。各配列の一部または全部を用いて前記した各種検出方法に適用することによって、より高い特異性を確保することが可能となる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
新規微生物ＭＯ７株又はその類縁株検出用プローブおよびプライマーとしては、ＭＯ７株に特異的である配列とハイブリダイズする必要がある。本発明においては、そのような標的配列として１６Ｓ  ｒＤＮＡ，ＩＳＲ又はオキシゲナーゼ類似遺伝子を用いる。
ハイブリダイズ条件（例えばアニーリング温度）を適度に設定することにより、ＭＯ７株を特異的に検出／類縁株を検出を選択することができる。この選択は、使用するプライマーおよびプローブの配列によって調節することもできる。
【００１２】
新規微生物ＭＯ７株の分類方法、菌学的性質等は、平成８年８月１９日出願の「新規微生物とそれを利用した環境浄化方法」と題する特許出願（特願平８−２１７４５６）に記載されており、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５６２４として平成８年８月１２日に寄託されている。
ＭＯ７株から１６Ｓ  ｒＤＮＡをクローニングしてその塩基配列を決定する方法については本発明の実施例１の項に示した。
本発明においてＭＯ７株の類縁株とは、表１（配列番号：１）に示すＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列と高度の相同性、すなわち９９．８％以下（これ以上の相同性を有する株は同種と判断される；小柳津広志、日本細菌学会誌、４９，５／６，８１２−８２２，（１９９４））ではあるが、これに近い相同性（例えば９０％以上）を有する菌株を意味する。
【００１３】
【表１】
0003540132.tif 000002
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プローブまたはプライマーとしての使用において、ＭＯ７株またはその類縁株のＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズする必要があり、そのためには表１、表５又は表９に示す配列の一部のヌクレオチドを含んで成る必要がある。特異的検出を目的とする場合は、これらの配列の一部と完全に一致している必要があるが、類縁株の検出を目的とする場合には、検出範囲（閾値）を任意に設定するために適当な塩基置換（例えばイノシン酸等；この置換によりこの塩基の選択性はなくなる）によって修飾しても良い。
【００１５】
この時、区別したい（境界線を引きたい）相手株（例えば、同属他種株、近縁他属の基準種等各種遺伝的距離は必要に応じて選択可能）のＤＮＡとを比較した場合に、ｉｄｅｎｔｉｔｙ（自己特異性）のある配列（ｓｉｇｎａｌ配列とよばれる）の置換を行ってはならない。プライマーとして使用する場合、オリゴヌクレオチドの長さは１０〜３０程度であり、好ましくは１５〜２５である。プローブとして使用する場合、オリゴヌクレオチドの長さに制約はないが、好ましくは１０塩基以上である。さらには、表１（配列番号：１）に示す塩基配列の全長であってもよい。
【００１６】
表１（配列番号：１）に示す配列の１部分をプローブとして使用する場合、ＭＯ７株に特異的な領域中の配列を用いることが必要であり、この様な領域として、配列番号：２〜９に示したいずれかの塩基配列の一部又は全部が挙げられる。
プライマー又はプローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチド）は、前記のごとく表１（配列番号：１）の配列中の一部分の塩基配列を有すればよいが、さらに、このように設計された塩基配列の一端または両端に他のモノ又はオリゴヌクレオチドが結合して延長されていてもよく、また、他の方法により修飾されていてもよい。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、上に定義したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを有するものであってもよい。
本発明はまた、上記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから成る、ＭＯ７株又はその類縁株検出用プローブを提供する。検出方式にもよるが、プローブとして機能するためには、標識されていることが好ましい。標識としては32Ｐ，35Ｓ、等による放射性標識、フルオレッセイン等の蛍光物質による標識、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素等による標識による標識等、オリゴヌクレオチドを標識するために常用されている標識を用いることができる。
【００１８】
本発明はまた、ＭＯ７株又はその類縁株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に増幅するためのプライマーを提供する。プライマーとしては、増幅すべき配列の両端を規定する１対のオリゴヌクレオチドから成る必要があるが、前記定義した本発明のオリゴヌクレオチドの１つと、ユニバーサルプライマー１つとから成る１対のオリゴヌクレオチドから構成してもよい。
表１（配列番号：１）に示すヌクレオチド配列の１部分をプライマーとして使用する場合、そのプライマー配列はＭＯ７株にとって特異的である必要がありそのような領域としては、配列番号：２〜９に示したいずれかの塩基配列の１部又は全部が挙げられる。また、具体的なプライマーの配列としては、例えば表３（配列番号：２〜９）、あるいは表４（配列番号：２０〜２５）に示す配列が挙げられる。
【００１９】
これらのプライマーは、増幅すべき配列の鎖を延長するものであり、いわゆるＰＣＲ法、ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の増幅法において使用することができる。これらの増幅方法自体は本願発明の特徴を構成するものではなく、本願発明のプライマーの用途が、特定の増幅方法に限定されるものではない。
本発明または、上記のプライマー又はプローブを用いてのＭＯ７株又はその類縁株の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、前記菌株を含有すると予想される種々の検体に適用することができ、検体の種類は特に限定されない。しかしながら、本株は現在までに近縁（属レベル）の株の存在が全く知られていない新属新種の菌株であるため、本発明によってこの類縁株を検出できることは非常に有用性が高い。
【００２０】
環境中の微生物からＰＣＲ増幅用にＤＮＡを精製する方法はすでに記載されている（例えば、J.T.Trevors(Eds.),Nucleic Acids in Environment,Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York,(1995)または特願平８−242503明細書）。従って、本発明の方法においては、既知のＤＮＡ抽出法又は他の適当なＤＮＡ抽出法を用いることができる。
抽出されたＤＮＡの増幅は、任意の増幅方法、例えばＰＣＲ法等により行うことができる。
【００２１】
増幅操作からの生成物は、例えば、電気泳動、例えばアガロースゲル電気泳動によって常法により、例えばエチジウムブロマイドにより染色した後ＵＶ照射により検出することができる。あるいは、本発明のプローブによって検出することができる。本発明の方法によれば、ＭＯ７株または類縁株が被験試料中に存在しない場合には増幅が生じないから、例えば、ブロティング法、逆ブロティング法等増幅生成物の分離を伴わない検出方法を用いることもできる。
【００２２】
本発明の方法の他の態様によれば上記のごとき特異的増幅を用いないで、微生物自体を増殖させることにより、ＭＯ７株及びその類縁株を検出することができる。例えば、被験試料を、ＭＯ７株及びその類縁株増殖用培地中でインキュベートすれば、被験試料にＭＯ７株及びその類縁株が存在すれば該培地中に増殖するから、この培養液から核酸を抽出し、抽出された核酸中にＭＯ７株またはその類縁株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ又はＲＮＡが存在するか否かを、本発明のプローブにより決定することができる。あるいは、被験試料を直接に、又は上記のごとく集積培養した後にＭＯ７株及びその類縁株増殖用培地に塗布し、生成したコロニーを、本発明のプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション法により検出することができる。さらに各種環境試料そのものに直接ハイブリダイゼーションを行うＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎに用いることもできる。
【００２３】
本発明の検出の対象になるＭＯ７株及びその類縁株増殖用培地としては、これらの株が増殖できる任意の培地を使用することができるが、有害物質分解菌が特異的に分解することができる有機化合物を基質（炭素源）として含む培地が好ましい。ＭＯ７株の場合、例えばフェノールを含有する培地、あるいは上記芳香族化合物に加えて、又はこれに代えてグルコース等、ＭＯ７株及びその類縁株が資化しうる基質（炭素源）を含有する培地が使用される。この様な培地の１例として、例えばＮＹＧ培地（ＮＭＳ培地１Ｌに酵母エキス０．５ｇ及びグルコース０．１８ｇを添加したもの）が使用される。なお、ＮＭＳ培地は次の組成を有する。
【００２４】
【表２】
0003540132.tif 000003
【００２５】
上記において、本発明の実施の形態の具体例として、１６Ｓ  ｒＤＮＡについて記載したが、１６Ｓ  ｒＤＮＡのみならず、１６Ｓ  ｒＤＮＡと２３Ｓ  ｒＤＮＡとの間に存在する１６−２３Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＩＳＲ）の配列を用いることもできる。この場合、ＭＯ７株を検出するための方法は１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いる場合と同様である。しかしながら、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列が微生物間で比較的よく保存されているために、目的とするＭＯ７株の配列のみを特異的に増幅又は検出するためには比較的厳格な増幅条件、及びハイブリダイゼーション条件の選択が必要であるのに対して、ＩＳＲの塩基配列は比較的微生物間で保存性が低く可変性に富み、従ってＭＯ７株に特異的である。従って、より厳格にＭＯ７株のみを特異的に検出する場合の標的配列として好ましい。
【００２６】
ＩＳＲを用いる場合のプライマーの設計と調製、プローブの設計と調製、これらを用いたＭＯ７株の検出方法等は、１６Ｓ  ｒＤＮＡについて前記したのと同様であり、さらに詳しくは、実施例４〜６に記載する。
本発明の検出の対象となる菌株はＭＯ７株であり、この株はトリクロロエチレン（ＴＣＥ）等の分解菌であり、その分解のためには、芳香環に対するオキシゲナーゼが関与している。そこで、本発明の１つの態様によれば、ＭＯ７株のオキシゲナーゼ類似遺伝子を検出の対象とする。
【００２７】
このような酵素として知られているフェノールヒドロキシラーゼは、フェノールに水酸基を導入し、カテコールを生成するモノオキシゲナーゼであり、フェノール分解のキーエンザイムの１つである。フェノールヒドロキシラーゼの中には、ＴＣＥと反応し、ＴＣＥ−エポキシドを経て分解するものが知られている。フェノールヒドロキシラーゼには、１つのペプチドからなるシングルコンポーネントの酵素と複数のサブユニットからなるマルチコンポーネントの酵素がある。
【００２８】
これまでに知られているＴＣＥを分解するフェノールヒドロキシラーゼは、すべてマルチコンポーネント酵素である。ＴＣＥを分解するフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）等をはじめとするグラム陰性菌群で配列が明らかになっている。ＭＯ７株の属するグラム陽性菌群では、遺伝子配列が報告されているものはない。
【００２９】
新規のフェノール分解菌であるＭＯ７株のオキシゲナーゼ類似酵素は、従来のものと比較して、基本的な機能は類似しているものの、必ずしも同一ではないことが予想された。そこで、既報のグラム陰性菌のフェノールヒドロキシラーゼに加えて、ＴＣＥを分解するモノオキシゲナーゼとして知られているトルエンモノオキシゲナーゼおよびメタンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列を比較し、保存性の高い領域を探索した。配列のアラインメントには、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた。
【００３０】
フェノールヒドロキシラーゼのサブユニット（６種）の中で、最も機能上重要だと考えられている“ｌａｒｇｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ”の領域を増幅するようにＰＣＲ用のユニバーサルプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅産物をｐＴ７  Ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、シークエンシングに用いた。シークエンシング方法はＩＳＲの場合と同様の方法で行った。
【００３１】
オキシゲナーゼ類似遺伝子をＭＯ７株の検出のための標的として用いる場合の、プライマーの設計と調製、プローブの設計と調製、これらを用いたＭＯ７株の検出方法は１６Ｓ  ｒＤＮＡの場合と同様であり、具体的には実施例７〜９に示す。
本発明のさらなる態様によれば、上記１６Ｓ  ｒＤＮＡ，ＩＳＲ  ＤＮＡ又はオキシゲナーゼ類似遺伝子を標的としてＭＯ７株を検出するにあたって、被験試料中の微生物をＭＯ７株用選択培地により濃縮した後、前記の選択を行う。
一方、Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ技術の開発のためには、導入した菌株の活性または分解能力の指標として生菌数を把握する事も重要な知見である。この目的のためには死菌由来のＤＮＡも検出してしまう方法では、定量的な評価が難しい事等の理由によりＰＣＲ法は不適当であるため、希釈平板法による計数に頼らざるを得ない。
【００３２】
この方法を適用するためにはできるだけ厳密な（選択性の高い）選択培地が必要であるという前提がある。そこで本発明者らはＭＯ７株の自然抗生物質耐性を詳しく調べ、さらにフェノール資化性を利用した選択培地を開発した。これにより、実用域（１０5 ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ程度以上）での菌数計測が可能になったが、土着の耐性菌（放線菌が主体）の生育のために希釈平板法の検出限界である１０3 ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌには至っていない。したがって本選択培地によって計数を行う際には、検出限界付近では（１０5 ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ程度）非ＭＯ７株が混入してくることが予想される。そこで本発明者らは、この様なケースにおいて、出現したコロニーがＭＯ７株かどうか判別する手法として直接コロニーＰＣＲ法の利用を考案した。すなわち平板上のコロニーを釣菌し、これをＰＣＲ溶液中に懸濁し直接ＰＣＲ増幅することによって判別を行う手法である。
【００３３】
選択培地については、「特定微生物の計数方法およびトリクロロエチレン分解菌ＭＯ７株用選択培地」と題する平成９年７月３０日に出願した特許出願の明細書に詳細に説明されており、具体例を実施例１０に記載する。
選択培地上に生育した細菌コロニーの中より、ＭＯ７株のみをＰＣＲ法で判別する手法を用いることにより、希釈平板法での計数時に土着耐性菌生育に起因して生じていた検出限界を、１オーダー以上下げる（高感度にする）事が可能となる。
【００３４】
【実施例】
以下に例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は以下に示す実施例によって限定されるものではない。
実施例１． ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡのクローニングとシークエンシング
本発明の微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡは平石の方法（日本微生物生態学会誌、vol.１０（１），３１−４２，１９９５）に従いＰＣＲで増幅した。ＰＣＲには 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′（配列番号：１０）及び 5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CCG CAG GTT-3′（配列番号：１１）の塩基配列を持つプライマーを使用し、以下のプログラムに従いサーマルサイクラー（パーキンエルマー社）で行った。すなわち前加熱を９６℃３０秒行い、９６℃６０秒／５５℃１２０秒／７２℃１８０秒のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で３００秒後加熱処理した。
【００３５】
増幅したＰＣＲ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ（キアゲン社）にて精製し、平石の方法（日本微生物生態学会誌、vol.１０（２），８１−１０２，１９９５）に従い、ＰＣＲ産物を直接鋳型とする方法でシークエンスを行った。シークエンス反応には 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′（配列番号：１２）、 5′-GGC CGG ACG GGT GAG T-3′（配列番号：１3 ）、 5′-TAC GGG AGG CAG CAG-3′（配列番号：１４）、 5′-GTG CCA GCA GCC GCG CG-3 ′（配列番号：１５）、 5′-G ATT AGA TAC CCT GGT AG-3 ′（配列番号：１６）、 5′-ACT CAA AGG AAT TGA CGG-3′（配列番号：１７）、 5′-GCA ACG AGC GCA ACC A-3′（配列番号：１８）、 5′-TGT ACA CAC CGC CCG T-3′（配列番号：１９）の塩基配列を持つプライマーを各々使用し、Dye terminator cycle sequencing kit （パーキンエルマー社）を用いて、本キット指定のプログラムに従いシークエンス反応を行った。
【００３６】
シークエンス反応を行ったサンプルはＡＢＩ３７３Ａシークエンサー（パーキンエルマー社）により電気泳動及び配列の解析を行った。これらの操作により決定された本発明の微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を表１（配列番号：１）に示す。
【００３７】
実施例２． ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅
実施例１で得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を公知の微生物の配列と比較し、分類上の位置づけを行った。その結果を参考に類縁菌株の配列とＭＯ７株の配列とを更に詳細に比較して、ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に特異的な塩基配列（表３）を決定した。これらの配列から設計した特異的ＰＣＲプライマー（表４）を用いて、ＭＯ７株のＰＣＲ増幅による検出を行った。
【００３８】
【表３】
0003540132.tif 000004
【００３９】
【表４】
0003540132.tif 000005
【００４０】
先ず、このプライマーを用いて平石の方法（日本微生物生態学会誌、vol.１０（１），３１−４２，１９９５）に従いＰＣＲの反応液を調製し、ＭＯ７株のコロニーを１白金耳釣菌し、これを直接懸濁したものを鋳型としたＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲには表３に記載のプライマーを組み合わせた８種のプライマーセット（図１）を用いた。ＰＣＲ増幅は以下のプログラムに従いサーマルサイクラー（パーキンエルマー社）で行った。
【００４１】
すなわち前加熱を９６℃１２０秒行い、９６℃６０秒／５５℃６０秒／７２℃９０秒のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で１２０秒後加熱処理した。このＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を図１に示す。何れのプライマーセットでもＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列から予測される長さに等しい増幅産物が検出され、本発明のプライマーセットによりＭＯ７株のＰＣＲによる検出が可能であると証明された。
【００４２】
実施例３． ＭＯ７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの特異的ＰＣＲ増幅
次に、モデル土壌として草地土壌（サンプル名；ＨＯ土壌）と掘削土壌（サンプル名；ＳＢ土壌）を用いて、本発明者らが開発した簡易抽出法（平成８年８月２７日出願の「土壌核酸の分析方法」と題する特願平８−２４２５０３の明細書に記載されている）を１ｇの土壌試料を用いる系にスケールアップした方法によって土壌ＤＮＡを調製し、２０μリットルの滅菌水に再溶解した。それらのＤＮＡは、溶液中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質（腐植等）を除去するため、土壌ＤＮＡの電気泳動を行ったアガロースゲルから後に数十kbp の断片が含まれると考えられる部分を切り出し、ＧｅｎｅＣｒｅａｎIIキット（フナコシ社）を用い、本キット所定のプロトコルに従い精製を行った。
【００４３】
精製後のＤＮＡは１０μリットルの滅菌水に再溶解した。その１μリットルを鋳型ＤＮＡとし、表３記載のプライマーのうち名称Ａ２及び名称Ｃ２２の組み合わせによりＰＣＲ増幅を行った。本組み合わせではＭＯ７株由来のＤＮＡを鋳型とした場合、９５２bpの増幅断片が得られる。ＰＣＲ増幅は以下のプログラムに従いサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社）で行った。すなわち前加熱を９６℃３０秒行い、９６℃３０秒／７４℃３分のサイクルを３０回繰り返し、７４℃で６分間の後加熱処理をした。なお増幅反応の開始時には、プライマーの非特異的な結合を起点としたＤＮＡ鎖伸長反応を押さえてプライマーの特異性を高めるため、酵素を除くＰＣＲ反応液をあらかじめ９４℃に加熱したものに酵素を加えることで増幅反応を開始するホットスタート法を行った。
【００４４】
この時、それぞれのモデル土壌に１０10〜１０11細胞／ｇ  ｓｏｉｌになるようにＭＯ７株を接種した土壌から同様に抽出したＤＮＡについても、同条件でＰＣＲ増幅を行った。これらのＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果は図２に示す様に、ＭＯ７株を接種したモデル土壌では増幅がみられたが、ＭＯ７株を接種しない土壌では増幅はみられなかった。なお、ＭＯ７株を接種した、またはしていない土壌から抽出されたＤＮＡを鋳型に、実施例１記載の平石の方法で非特異的な（ユニバーサルプライマーによる）１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅を行ったところ、何れの場合にも１．５kbp のあたりに増幅がみられたことから、何れの土壌から抽出されたＤＮＡも充分ＰＣＲ反応の鋳型となることは確認されている。
【００４５】
これらの結果から、ＰＣＲ反応阻害のない純度の高い土壌ＤＮＡを鋳型とした場合でさえも、本プライマーを用いたＰＣＲでは土着菌群由来の増幅がみられない事、および同時にＭＯ７株を接種した場合のみＭＯ７株特異的な増幅がみられる事から、本発明のＤＮＡプライマーを用いることにより、土壌のように様々な微生物の生息する環境中からＭＯ７株のみを特異的に検出可能であると証明された。
【００４６】
実施例４． ＭＯ７株のＩＳＲのクローニング及びシークエンス
ＭＯ７株のＩＳＲは、１６Ｓ  ｒＤＮＡの３′末端側保存領域の配列をもとに作製したプライマー（Ｇ１；５′GAA GTC GTA ACA AGG −３′）（配列番号：２７）（Appl. Environ. Microbiol., (1993), p.945-952）、及び２３Ｓ  ｒＤＮＡの５′末端側保存領域の配列をもとに作製したプライマー（Ｌ１；５′−CAA GGC ATC CAC CGT −３′）（配列番号：２８）（Environ. Microbiol., (1993),p.945-952）を使用し直接コロニーＰＣＲ（Journal of Microbiological Methods, 11, p.121-126 (1990)）で増幅した。反応液は平石の方法（日本微生物生態学会誌No.10 (1), p.32-42 (1995））に準じて調製したが、滅菌水を５３．５μｌ（改変前５２．５μｌ）とする点のみ改変した。そこにＭＯ７株のコロニーをエーゼで掻き取り直接懸濁した後、表１のプログラムに従いサーマルサイクラー（Perkin Elmer社）でＰＣＲを行った。
【００４７】
ＰＣＲによる増幅断片は、２％のアガロースゲルを用いて電気泳動した後切り出し、ＧｅｎｅＣｒｅａｎII（フナコシ社）を用いて付属のプロトコルに従い精製した。精製したＰＣＲ断片は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて付属のプロトコルに従い、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｅｒ（Novagen 社）にライゲーションした後、その反応溶液で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体のうち複数のクローンを選択し、それぞれを常法（Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory）に従って培養とプラスミド調製を行った。
【００４８】
それらのプラスミドを鋳型に、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒプライマー（Novagen 社）またはＭ１３プライマーＭ４（宝酒造）を使用してジデオキシ・チェイン・ターミネーション（J. Mol. Biol. 94, p.441-448 ）によるシークエンス反応を行った。同反応はABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit（Perkin Elmer社）により、その付属のプロトコルに従いthermal cycler（Perkin Elmer社）で行った。反応生成物の精製とローディング溶液の調製も同プロトコル中記載の方法に従った。
【００４９】
シークエンス反応後の電気泳動および塩基配列の解析はABI automatical sequencer model 373A stretch（Perkin Elmer社）により、その付属のプロトコルに従い行なった。電気泳動板は３４cm標準型または４８cm延長型を用い、ゲルも同プロトコルに記載の方法で作製した。
その結果、およそ４３０bpの増幅断片が１本のみ見られた。この断片をサブクローンした大腸菌のコロニー８個を無作為に選びシークエンスを行なったところ、Ｇ１プライマー３′末端直後からＬ１プライマー５′末端直前までの塩基配列は何れも同じであった。この配列をＭＯ７株の１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎの塩基配列として表５に示した。
【００５０】
【表５】
0003540132.tif 000006
【００５１】
実施例５． ＰＣＲによるＩＳＲの特異的検出のためのプライマーの作製
プライマー配列の検索
ＭＯ７株のＩＳＲの塩基配列は、ＤＤＢＪ（国立遺伝研データベース）に対し、検索プログラムＢＬＡＳＴによって条件設定はデフォルトのままホモロジー検索をおこなった。ホモロジー（スコアー値）の高かった上位１００項のうち、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー領域の配列を含むもの３１項の配列を、同データベースから検索した。それらの配列から１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＤＮＡの配列部分は削除した後、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  ８．０のＵＰＧＭＡ法により解析を行ない、よりホモロジーが高いと思われる６属２２種を選択した。
【００５２】
スペーサー領域のみの配列は上記の属毎にまとめ、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  ８．０のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ機能にて比較した。それぞれのグループでＭＯ７株の配列とホモロジーが低い部分を検索し、次に各グループに共通している部分を選定した。そこに相当するＭＯ７株の配列から、Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  ８．０のＰＣＲプライマー検索機能により１５〜２５塩基でＴｍが４０〜７０℃程度になるような配列を検索した。これらのプライマー配列は各属毎にａｌｉｇｎｍｅｎｔしたスペーサー領域の配列と比較し、なるべく３′末端側にＭＯ７株の配列でのみ異なる塩基を多く含み、パリンドロームを含まず３′末端のループを形成しないような配列を選択した。プライマーのセットはＴｍが同じもの同士を組み合わせた。
【００５３】
なお、選択した各プライマーの配列は、ＤＤＢＪに対しＢＬＡＳＴにより条件設定はデフォルトのままホモロジー検索をおこない、既知の配列と相同性が認められないことを確認した。
決定したプライマーの配列は表６に示した。基本的にはＴｍが同じもの（α１とΩ１，α２とΩ２，β１とβ２，β１とΩ１）を組み合わせ、プライマーセットとした。また、これら組み合わせのうち、比較的長い断片を得られるα１とΩ１、及びα２とΩ２をｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ時の１ｓｔ  ＰＣＲ用、その内側を増幅するβ１とβ２、及びβ１とΩ１を２ｎｄ  ＰＣＲ用とした。これらの相互位置を図３に示す。
【００５４】
【表６】
0003540132.tif 000007
【００５５】
プライマーは上述の配列に基づき、 ABI DNA／RNA synthesizer model 392 Perkin Elmer社）によりＴｒｉｔｙｌ−ｏｆｆで合成した後、時に精製は行なわず滅菌水に再溶解した。これらのプライマーは使用時まで−２０℃にて保存した。
【００５６】
実施例６． ＰＣＲ法による土壌中のＭＯ７株の特異的検出（ＩＳＲ配列による検出）
ＭＯ７株に対するＰＣＲ増幅産物の確認
実施例５で作製したプライマーを用いて、実施例４に記載の方法でＭＯ７株を鋳型としたＰＣＲを行なった。ＰＣＲによる増幅断片は、２％のアガロースゲルで電気泳動後臭化エチジウムで染色し、紫外光による発光を目視にて確認した。
【００５７】
ＭＯ７株を鋳型とした、各１ｓｔ用プライマーセット（α１とΩ１、及びα２とΩ２）によるＰＣＲと、これらの反応液を鋳型とした、各２ｎｄ用プライマーセット（β１とβ２、及びβ１とΩ１）による２ｎｄ  ＰＣＲの結果を図４に示した。アニーリング温度は何れも５５度とした。
何れのプライマーセットでも、ＭＯ７株のＩＳＲの塩基配列からの予測値（図３）と同じ長さの増幅断片が見られたが、β１とβ２のセットでは若干長めの増幅断片も見られた。一方、β１とΩ１では明瞭な１本の増幅断片が見られるので、以後の実験には２ｎｄ用プライマーセットとしてβ１とΩ１を用いた。
【００５８】
Ｎ１６−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５０４）について上記と同じ実験を行なったところ、何れの１ｓｔ用プライマーセットでも１ｓｔＰＣＲでは増幅断片は見られなかった。１６Ｓ  ｒＤＮＡによる系統解析上ＭＯ７株に近縁のテラバクター・ツメッセンス（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ  ｔｕｍｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１２９６０について３．３．１と同じ実験を行なったところ、α２とΩ２による１ｓｔＰＣＲと、β１とΩ１による２ｎｄＰＣＲの何れでも増幅断片は見られなかった。
【００５９】
土壌ＤＮＡの調製
土壌ＤＮＡは、表７の記載の各種土壌０．１ｇから実施例３と同様に簡易抽出法で抽出した。抽出後の精製は、スピンカラム法にて行ない、得られた土壌ＤＮＡをＧｅｎｅＣｒｅａｎIIキット（フナコシ社）を用いて再精製を行った後、２０μｌの滅菌水に再溶解した。ＧｅｎｅＣｒｅａｎIIによる精製では、アガロースゲルの切り出し断片を溶解するステップは省略し、土壌ＤＮＡ溶液に５μｌのＧｌａｓｓｍｉｌｋと２．５倍量のＮａＩ溶液を加えた。時々転倒混和しながら、５０℃にて５分間加温してＤＮＡをＧｌａｓｓｍｉｌｋの吸着させた。その後の洗浄・溶出は付属のプロトコルに従った。
土壌ＤＮＡ溶液は使用時まで−２０℃にて保存した。
【００６０】
【表７】
0003540132.tif 000008
【００６１】
ＭＯ７株の土壌への接種
ＭＯ７株はＮＹＧ培地で３日間培養後に集菌し、培養液と等量の生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）に再懸濁した。菌体懸濁液は生理食塩水で１０倍づつ段階的に希釈し、各段階の希釈菌体懸濁液１０μｌを０．１ｇのＨＯ土壌に接種した。その後、前記の方法に従い、土壌ＤＮＡ溶液を調製した。なお、菌体懸濁液中の生菌数は希釈平板法で測定し、土壌へ接種した菌数を算出した。
土壌ＤＮＡ溶液のＰＣＲ
土壌ＤＮＡ溶液のＰＣＲは平石ら（日本微生物生態学会誌Ｎｏ１０（１），ｐ．３２−４２（１９９５））の方法に従い、表６のプライマー（α２，ω２）を用いて、土壌ＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として表８のサイクルで行った。なおアニーリング温度は５０℃で行った。
【００６２】
【表８】
0003540132.tif 000009
【００６３】
ＰＣＲを行った結果を図５に示す。結果は図５に示すように、何れの土壌からも非特異的な増幅は見られず、１０8 ｃｆｕ／ｇのＭＯ７株を接種したＨＯ土壌から抽出したＤＮＡでのみ所定の長さの増幅断片が見られた。なお、土壌ＤＮＡの抽出段階から再実験を行ったところ、結果は再現した。
検出感度の確認
ＭＯ７株の希釈菌体懸濁液を接種したＨＯ土壌０．１ｇから土壌ＤＮＡの抽出を行った後、イソプロパノール法で精製した土壌ＤＮＡ溶液５０μｌをＧｅｎｅＣｒｅａｎにて更に精製し、最終１０μｌの滅菌水に溶出して土壌ＤＮＡ溶液を得た。それらを鋳型としてアニーリング温度６０℃にてＰＣＲを行なった結果を図６に示す。
【００６４】
ＰＣＲによる増幅はＭＯ７株数が６．６×１０3 ｃｆｕ／ｇレベルまでは３つのロットすべてで、理論的検出限界と考えられる６．６×１1 ｃｆｕ／ｇレベル（使用した０．１ｇ土壌あたりでは６．６菌体相当）までは１つのロット以上で見られた。なお、ＭＯ７株を接種していないＨＯ土壌からは増幅断片は見られなかった。従って、本方法によれば土壌に接種したＭＯ７株を理論的検出限界のレベルまで検出できることを確認した。
【００６５】
実施例７． ＭＯ７株のオキシゲナーゼ類似遺伝子のクローニング
フェノール分解菌シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＢＨ株（J.Ferment. Bioeng. 79, p.485-488, 1995)、Ｐ３５Ｘ株（G ene 151 (1-2), p.29-36, 1994）、及びＨ株（Mol. Gen. Genet. 247(2), p.240-264, 1995) 、シュードモナス・ｓｐ．ＣＦ６００株（J. Bacteriol. 172, p.6826-6833, 1990）、並びにアシネトバクター・カルコアセティカクス（Acinetobacter calcoaceticus ）（文献：Mol.Microbiol., 18, p.13-20)(1995)）；トルエン分解菌バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）Ｇ４株（Gene, 154, p.65-70, 1995）、バークホルデリア・ピケッチ（Burkholderia pickettii）ＰＫ０１株（Gene, 154, p.65-70, 1995）、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina ）ＫＲ１株（J. Bacteriol., 174, p.7253-7261 (1992)、及びシュードモナス・ｓｐ  ＪＳ１５０株（Appl. Environ. Microbiol. 61(9), p.3336-3346, 1995）；並びにメタン分解菌メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）Ｂａｔｈ株（Gene, 91, p.27-34, 1990 ）、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）ＯＢ３ｂ株（Mol. Microbiol. 5, p.335-342, 1991）及びメチロシスチスｓｐ．（Methylocystis sp. ）Ｍ株（Appl. Environ. Microbiol. 63(5), p.1898-1904, 1997）のモノオキシゲナーゼのlarge oxygenase subunit のアミノ酸配列を比較した。
【００６６】
その結果、Asp-Glu-X-Arg-His から成る２ケ所の保存領域が見いだされた。この領域を中心に、それぞれｆｏｒｗａｒｄプライマーＰ２及びｒｅｖｅｒｓｅプライマーＰ３を設計した。また、それ以外にGlu-Tyr-X-Ala 及びTrp-X-X-X-X-Tyr-Pro の２種の保存領域を中心に、ｆｏｒｗａｒｄプライマーＰ１及びｒｅｖｅｒｓｅプライマーＰ４を設計した。保存されていないアミノ酸については、フェノールヒドロキシラーゼのアミノ酸を採用した。また、２種の縮重コドンのｔｈｉｒｄ  ｌｅｔｔｅｒは、ＭＯ７株のＧ＋Ｃ含量が７３％であることを考慮してＧまたはＣとした。４種の縮重コドンの場合の第３塩基は、４種の混合とした。
【００６７】
フェノールヒドロキシラーゼ類似遺伝子の部分配列をＰＣＲ増幅しうるユニバーサルプライマーとして、
0003540132.tif 000010
【００６８】
プライマーセットとしてＰ１−Ｐ３及びＰ２−Ｐ４を用いてアニーリング温度５５℃でＰＣＲ増幅を行ったところ、シングルバンドが得られた。このとき対照株としてバークホルデリア  ｓｐ．（Burkholderia sp.）Ｎ１６−１株およびバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）Ｇ４株、バークホルデリア・ピケッティ（Burkholderia pickettii）Ｂ１株という３種のＴＣＥ分解菌を用いた。
【００６９】
しかし得られたバンドが薄い（増幅量が少ない）ため、アニーリング温度を５０℃より１０サイクルごとに５℃ずつ下げるＳｔｅｐｄｏｗｎ−ＰＣＲ法で増幅した。本手法を用いることにより特異性を維持しつつ増幅効率を高める事が可能となった（図７）。このバンドをゲルより切り出し精製後、再度５０℃でＰＣＲ増幅を行った。この断片を再度精製後シークエンシングに用いた。この結果、６５１bpの領域のＤＮＡ配列が明らかになった。得られた配列を表９（配列番号：３９）に示す。
【００７０】
【表９】
0003540132.tif 000011
【００７１】
実施例８． 特異的検出用ＰＣＲプライマーの設計とフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅
得られた配列を既報の配列とアライメントした。アミノ酸配列に変換後、類似遺伝子とアライメントして作製した系統樹において比較的近縁であったＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＪＳ１５０株のトルエンベンゼンモノオキシゲナーゼの配列（アクセッション番号はＬ４００３３）に比較すると決定した配列は、Ｌａｒｇｃ  ＆  ｂ  Ｕｎｉｔｅ  ＯＲＦであるｔｂｍ  Ｄ（１５４２bp）の配列番号２４６６−３１５８の６９２bpの領域に相当した。
【００７２】
このアライメント結果を解析し、特異的ＰＣＲ増幅用プライマーとしてｆｏｗａｒｄプライマーＭＰ２、並びにｒｅｖｅｒｓｅプライマーＭＰ５Ｒ及びＭＰ６Ｒを設計した。これらの８通りの組み合わせにより、ＭＯ７株の直接コロニーＰＣＲ増幅を試みた。このときの対照株として、フェノール分解菌Ｎ１６−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５０４）を用いた。
【００７３】
ＰＣＲは前加熱として９４℃１分サイクル、９４℃１分−５０℃１分−７２℃１．５分のサイクルを３０サイクル、７２℃２分を１サイクルとした。３０サイクルの増幅反応中のアニーリング温度（前記では５０℃）を５℃ずつ変えて特異的増幅が得られる値を探索した。Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Takara製）を用いた。ＰＣＲ反応は１００μｌの系で行い、ｄＮＴＰおよびｘ１０Ｂｕｆｆｅｒを各１０μｌ、無菌水を５２．５μｌ、５ｐｍｏｌプライマーを各１３μｌ、Ｔａｑを０．５μｌ、鋳型ＤＮＡ溶液１μｌとした組成で行った。
ＭＯ７株では予想される長さと一致する増幅断片が得られた。Ｎ１６−１株では全くＰＣＲ増幅が見られなかった（図８）。
【００７４】
【表１０】
0003540132.tif 000012
【００７５】
実施例９． ＭＯ７用選択培地に生育した土着細菌に対するＰＣＲ増幅
ＭＯ７用選択培地（スペクチノマイシン５０μｇ／ml、ナリジキシン酸７．５μｇ／ml、カルベニシリン５０μｇ／ml、シクロヘキシミド２００μｇ／mlを含む５００ppm フェノール、０．５％グルコース、５ppm Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔを含むＮＭＳ寒天培地）に生育した草地土壌中の細菌コレクション１００株を用いて、同様にＤｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法でＰＣＲ増幅を行い識別を試みた。菌株の懸濁液（２０μｌの無菌水に１コロニーを懸濁）を１μｌ用いて１００μｌの系でＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ条件を検討した結果、９４℃１分１サイクル、９４℃３０秒−７４℃３分を２５サイクル、７４℃６分１サイクルの条件で両プライマーセットともにＭＯ７株のみを増幅可能であることが明らかになった。結果の１部を図９に示す。
【００７６】
この結果により、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を増幅するプライマー（ＭＰ２，ＭＰ６Ｒ、増幅素物は５８２bp）を用い、ＭＯ７用選択培地希釈平板上に出現したコロニーをＰＣＲにかけることにより、ＭＯ７株を特異的に検出することができることが確認された。サイクル数を３０サイクルにすると、サイズは同じであるがＭＯ７に比較するとかなり弱いバンドが幾つかの株で見られた。この事実は類似の配列を持つ遺伝子が存在することを示唆している。したがって、アニーリング温度等のＰＣＲ条件をコントロールすることによって、類似のフェノールヒドロキシラーゼを持つ細菌を探索する事も可能であると考えられる。
【００７７】
実施例１０． ＭＯ７選択培地で選択したコロニーについてのプライマー増幅による検出
評価に用いた系
選択培地上に生育した菌株についてＭＯ７株と土着耐性菌の判別を行うことを目的とした。このための手法として、選択培地に生育したコロニーを直接コロニーＰＣＲ法によって判別する技術を採用し、その妥当性を確認した。
【００７８】
すなわち、本発明者らがＭＯ７株の選択培地として開発した培地（ＮＭＳ培地に５００ppm フェノール、５ppm 酵母エキス、０．５％グルコース、スペクチノマイシン５０μｇ／ml、ナリジキシン酸３．７５μｇ／ml、カルベニシリン５０μｇ／ml、シクロヘキシミド１００μｇ／mlを添加）を用いてＨＯ土壌（草地土壌）中の耐性菌コロニーを得た。これらの細菌について、ＩＳＲを標的としたＤｉｒｅｃｔ  Ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法による増幅を行い、ＭＯ７以外からは増幅産物が得られないことの確認を行った。
【００７９】
選択培地に生育したＨＯ土壌中の土着菌の分離
本選択培地シクロヘキシミドを添加しているので糸状菌コロニーはほとんど生育しないが、生育した糸状菌（明らかに糸状菌と判断される直径５mm程度以上の菌糸状コロニー）は分離対象から除外した。肉眼による判別により、（１）細菌コロニー、（２）細菌コロニーの中で明確な気菌糸が観察されるもの（放線菌コロニー）、（３）前記２種に分類しにくい細菌コロニーの３種に分類しつつ、ランダムに１００株釣菌した。すなわち株番号１〜３０までは細菌（放線菌以外の）と考えられたコロニー、３１〜５３までは放線菌かどうか判別できないもの、５４〜１００までは気菌糸が観察され放線菌と判断されるものであった。
【００８０】
また、これを上記選択培地およびＤＮＢ（１／１００ＮＢ；栄研製ＮＢを１／１００に希釈）に植菌し、分離を試みた。また、この培地上に出現するコロニーの出現を経時的に観察した。
分離した土着菌懸濁液をＤＮＢ培地上に接種したものでは、６日目までに８６株が生育した。この中で８２株は２日目までにコロニーを形成した。前コロニーのうち、５６株が糸状菌様のコロニーを形成した。同様に選択培地上に接種したものでは６８株が生育し、４４株が２日目までにコロニーを形成した。しかし選択培地上では、ＤＮＢ上で観察されたような糸状菌様コロニーは全く見られなかった。栄養状態により形態が変化する典型的な放線菌であると考えられる。
【００８１】
ＭＯ７株の直接コロニーＰＣＲ法による増幅
ＭＯ７株の菌体懸濁液１μｌを用いて１００μｌの系でＰＣＲ増幅を行い、増幅のみられるアニーリング温度の上限を検討した。ＰＣＲプライマーセットは、ＩＳＲのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ検出用プライマーとして開発したα２−ω２（１ｓｔ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；２４０bp）、及びβ１−ω１（２ｎｄ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；１８４bp）を用いた。ＰＣＲ条件は全て常法で行った。アニーリング温度を５０〜６５℃の範囲または７４℃（２Ｓｔｅｐ−ＰＣＲ）に設定して、最適温度（ＭＯ７からの増幅が起きる温度）を探索した。
【００８２】
α２−ω２（１ｓｔ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；２４０bp）ではアニーリング５０℃以上では増幅がみられない、もしくは非常に弱い増幅しか生じなかった。β１−ω１（２ｎｄ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；１８４bp）では６５℃まで明確な増幅が見られた。
【００８３】
土着菌の直接コロニーＰＣＲ法による判別
前述したコロニーを１０μｌの菌体懸濁液とし、その１μｌを用いて１００μｌの系でＰＣＲ増幅を行い、ＭＯ７株の場合との比較を行った。ＰＣＲプライマーセットは、同様にα２−ω２（増幅産物；２４０bp）、β１−ω１（増幅産物；１８４bp）を用いた。ＰＣＲ条件は全て常法で行った。前節の結果の増幅可能なアニーリング温度の上限より順次アニーリング温度を下げ、最適温度（ＭＯ７のみ増幅が起きる温度）を探索した。
【００８４】
土着菌の直接コロニーＰＣＲ法による判別
α２−ω２（１ｓｔ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；２４０bp）を用いた際には、アニーリング温度を５０℃にした際に供試した土着菌１００株からの増幅が全く生じなかった（図１０）。また、この際にはＭＯ７株の増幅は可能であった。一方、β１−ω１（２ｎｄ−ＰＣＲ用プライマーとして用いたもの、増幅産物；１８４bp）でもアニーリング６５℃でＰＣＲを行うことにより判別が可能であった。但し、この際に１株だけ増幅が見られた（図１１−ａ）。参考までに示すと、この増幅はアニーリング温度５０℃でも見られていたので再現性のある結果である（図１１−ｂ）。
【００８５】
ＩＳＲは全ての細菌が持つ１６Ｓ  ｒＤＮＡおよび２３Ｓ  ｒＤＮＡのスペーサー配列であるため、ｒＤＮＡよりははるかに保存性が低いものの、土壌中に類似の配列を持つ菌株がいても不思議はない。事実、ＭＯ７株のＩＳＲも１６Ｓ  ｒＤＮＡと同様に保存領域と可変領域が存在し、保存領域は系統的にかなり広い範囲の細菌と相同性を有していた* 。今回２種のプライマーセットを用いて供試した１００株中で、１００株（１００％）もしくは９９株（９９％）で増幅が起きなかった事実から、本遺伝子を標的としてこのような手法で菌株の判別を行う事は、実用上問題はないと結論した。
【００８６】
実施例１１． 選択培地による計数値の妥当性評価および培地の選択性評価
ＨＯ土壌に、ｃｆｕ値既知のＭＯ７株のリファンピシン耐性変異株ＭＯ７Ｒ株の菌体液の１０倍希釈系列をそれぞれ１／１０量添加し、この土壌中の菌数をリファンピシン５０μｇ／ml、シクロヘキシミド１００μｇ／mlを含む１／３ＬＢを用いた計数した。土着菌数に添加したＭＯ７株数（ｃｆｕ値に希釈数を乗じて算出）を加えたものを理論値として算出し、実測値との比較を行った。さらに、計数に用いた平板上のコロニーを任意に１００個ずつ釣菌し、Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法によって判別を行った。尚、ＭＯ７株添加量の少ない試料で、計数に用いた平板上にコロニーが１００個存在しない場合は、可能な限りのコロニーを用いた。
【００８７】
このＰＣＲの結果から、陽性（増幅産物が得られる）である比率（陽性コロニー数／供試コロニー数）を計数値に乗じて、ＭＯ７株数を厳密に推定する方法を検討した。ＰＣＲの標的遺伝子はＩＳＲ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ；１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー配列）とし、これを標的としたプライマーセット（α２−ω２）を用いた。平板から釣菌したコロニーを１０μｌの滅菌水に懸濁し、その１μｌを用いて１００μｌの系で反応を行った。プライマーを各６０pmol、またTakara製Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。
【００８８】
サーマルサイクラーはTakara製サーマルサイクラーＭＰを用いた。ＰＣＲ条件は以下の通り、９４℃１分１サイクル、９４℃１分／５０℃１分７２℃１．５分のサイクルを３０サイクル、７２℃２分、４℃に冷却。反応液をアガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色し、ＵＶ検出した際の増幅産物の有無で判定した。実験結果を図１２に示した。全ての次数において計数値と理論値は非常によく一致し、本培地による計数の精度が確認された。しかし、１０5 ｃｆｕ／ｇ  soil以下では、土着菌の影響で計数ができない検出限界に達していた。Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲによる判別結果によって計数値を補正し、ＭＯ７Ｒ株数を推定した結果は、接種したＭＯ７Ｒ株数と非常によく一致していた。また、選択培地による希釈平板法では計数できなかった１０5 ｃｆｕ／ｇ  soilと１０4 ｃｆｕ／ｇ  soilにおいても、定量的な計数が可能であった。
以上の結果から本プライマーセットはＭＯ７株を識別するために有効であることが示された。
【００８９】
【配列表】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、表１（配列番号：１）のヌクレオチド配列の１部分からなる種々のプライマーの対を用いてＰＣＲを行った場合の増幅生成物の電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図２】図２は、土壌にＭＯ７株の菌を人為的に加えたもの、及びそれを加えない土壌から抽出したサンプルを本発明のプライマーによりＰＣＲ増幅した結果を示す電気泳動物であり、図面代用写真である。
【図３】図３は、ＩＳＲとそれを増幅するためのプライマーの位置関係を示す図である。
【図４】図４は、各種のＩＳＲ用プライマーを用いてＩＳＲを増幅した場合の結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図５】図５は、種々の土壌から抽出したＤＮＡ及びＭＯ７株を添加した土壌から抽出し、スピンカラム法で抽出したＤＮＡを、α２−β２プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図６】図６は、ＭＯ７株を添加した土壌から抽出したＤＮＡについて、希釈によってＤＮＡの濃度レベルを変化させた後に、１ｓｔ  ＰＣＲをプライマーセット（α２−β２），２ｎｄ  ＰＣＲ（β１−ω１）を用いてＰＣＲ増幅した結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図７】図７は、４種類の微生物株のオキシゲナーゼ類似遺伝子を種々のプライマー対を用いて増幅した場合の結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図８】図８は、ＭＯ７株およびＮ１６−１株についてオキシゲナーゼ類似遺伝子を標的としたプライマーによって増幅した結果を示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図９】図９は、１００個の土壌サンプルの微生物をＭＯ７株選択培地で培養した後のコロニーについて、オキシゲナーゼ類似遺伝子を増幅するプライマーを用いてＤＮＡの増幅を行った結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図１０】図１０は、土壌微生物をＭＯ７株選択培地で培養し、生成したコロニー１００個についてＩＳＲ増幅用プライマー（α２−β２）によりＤＮＡの増幅を行った場合の結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図１１】図１１は、土壌微生物をＭＯ７株選択培地で培養し、生成したコロニー１００個についてＩＳＲ増幅用プライマー（β１−ω１）によりＤＮＡの増幅を行った場合の結果の１部を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図１２】図１２は、土壌に既知量のＭＯ７Ｒ株の菌体を接種した際に、ＭＯ７Ｒ株用選択培地で計数した値をＤｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法で補正した結果のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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