(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を含んで成るDNA構築体
5'−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−3'
（式中、
Ｐはプロモーター配列、
SPは酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチドをコードするDNA配列、
LPはリーダーペプチドをコードするDNA配列、
ｎは０又は１、
PSは酵母プロセシング部位を規定するペプチドをコードするDNA配列、そして
HPは選択した宿主生物にとって異種であるポリペプチドをコードするDNA配列である）。
【請求項２】
前記プロモーター配列がサッカロマイセス・セレビジエのMFα1,TP I,ADH,BAR IもしくはPGKプロモーター、又はシゾサッカロマイセス・ポンベのADHプロモーターから選ばれたものである、請求項１記載のDNA構築体。
【請求項３】
前記YAP3シグナルペプチドが下記のDNA配列
0003542604.tif 000041
によりコードされる請求項１記載のDNA構築体。
【請求項４】
ｎが１である請求項１記載のDNA構築体。
【請求項５】
前記リーダーペプチドが酵母のMFα１リーダーペプチド又は合成リーダーペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項記載のDNA構築体。
【請求項６】
PSがLys−Arg,Arg−Lys,Lys−Lys,Arg−Arg又はIle−Glu−Gly−ArgをコードするDNA配列である、請求項１記載のDNA構築体。
【請求項７】
異種ポリペプチドがアプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくはその他のプロテアーゼインヒビター、インスリンもしくはインスリン前駆体、ヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、組織プラスミノゲンアクチベーター、トランスフォーミング成長因子αもしくはβ、血小板由来成長因子又は酵素より成る群から選ばれる、請求項１記載のDNA構築体。
【請求項８】
転写終止配列を更に含んで成る、請求項１記載のDNA構築体。
【請求項９】
前記転写終止配列がTP Iターミネーターである、請求項８記載のDNA構築体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のDNA構築体を含んで成る組換発現ベクター。
【請求項１１】
請求項10記載のベクターにより形質転換された細胞。
【請求項１２】
菌類細胞である、請求項11記載の細胞。
【請求項１３】
酵母細胞である、請求項12記載の細胞。
【請求項１４】
サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、クルイベロマイセス、ハンセヌラ又はヤロイアの細胞である、請求項13記載の細胞。
【請求項１５】
サッカロマイセス・セレビジエ又はシゾサッカロマイセス・ポンベの細胞である、請求項14記載の細胞。
【請求項１６】
異種ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドを発現することができ、且つ請求項１〜９のいずれか１項記載のDNA構築体により形質転換された細胞を適当な培地の中で培養してこの異種ポリペプチドを発現及び分泌させ、次いでこの異種ポリペプチドをこの培地から回収することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、異種ポリペプチドの分泌のためのYAP3シグナル・ペプチドを含んで成るDNA構築物、そのDNA構築物を含む酵母細胞並びにそのDNA構築物から酵母内で異種ポリペプチドを製造する方法に関する。
発明の背景
酵母生物は、細胞内で合成されるがその細胞の外での機能をもつ多くのタンパク質を生産する。このような細胞外タンパク質を分泌タンパク質という。これらの分泌タンパク質は、小胞体（endoplasmic reticulum（ER））の膜を通しての発現産物の有効な方向を確保する前配列（presequence）を含む前駆体又は前−タンパク質形態において細胞内に最初に発現される。通常、シグナル・ペプチドといわれる前配列は、輸送の間にそのタンパク質の残余から解裂される。一旦、分泌経路に入れば、そのタンパク質はゴルジ体（Golgi apparatus）に運ばれる。このゴルジ体から、このタンパク質は、区画、例えば細胞液胞（vacuole）又は細胞膜に継がる様々な経路に追従することができ、又は外部培地に分泌されるべきタンパク質がその細胞からの経路を定められることができる（Pfeffer,S.R.and Rothman,J.E.Ann.Rev.Biochem.56（1989）.829−852）。
酵母に対して異種であるタンパク質の酵母内での発現及び分泌についていくつかのアプローチが提案されている。欧州公開特許出願第88 632号は、所望のタンパク質及びシグナル・ペプチドをコードするDNAを宿す発現媒体により酵母生物を形質転換し、その形質転換された生物のカルチャーを調製し、そしてその培養基からそのタンパク質を回収することにより、酵母に対して異種のタンパク質を発現し、プロセシングし、そして分泌する方法について記載している。シグナル・ペプチドは、所望タンパク質のシグナル・ペプチド自体、異種シグナル・ペプチド又は生来及び異種シグナル・ペプチドのハイブリッドであることができる。
酵母に異種のシグナル・ペプチドの使用に伴う問題は、その異種シグナル・ペプチドが有効な輸送を確保せず、そして／又はそのシグナル・ペプチド後の解裂を確保しないということであろう。
サッカロマイセス・セレビジエ（S.cerevisie）MFα１（α−ファクター）は、19アミノ酸のシグナル又はプレペプチド、その後の64アミノ酸の“リーダー（leader）”又はプロペプチドであって３つのＮ−結合糖添加部位を含むもの、その後の（Lys Arg（Asp/Glu,Ala）2-3α−ファクター）４を含んで成る165アミノ酸のプレプロ形態として合成されている（Kurjan,J.and Herskowitz,I Cell 30（1982）,933−943）。このプレプロMFα１のシグナル−リーダー部分は、サッカロマイセス・セレビジエにおける異種タンパク質の合成と分泌を得るために広く使用されている。
酵母と同種のシグナル／リーダー・ペプチドの使用は、一般に、米国特許明細書第4,546,082号、欧州公開特許出願第116 201号、第123 294号、第123 544号、第163 529号、及び第123 289号並びにデンマーク国特許出願第3614/83号から公知である。
欧州特許第123 289号中に、サッカロマイセス・セレビジエのα−ファクター前駆体の使用について記載されているが、WO 84/01153はサッカロマイセス・セレビジエのインベルターゼのシグナル・ペプチドの使用について示し、そしてデンマーク国特許出願3614/83は外来タンパク質のための、サッカロマイセス・セレビジエのPHO5シグナル・ペプチドの使用について示している。
米国特許明細書第4,546,082号、EP第116 201号、第123 294号、第123 544号、及び第163 529号は、サッカロマイセス・セレビジエからのα−ファクター・シグナル−リーダー（MFα１又はMFα２）が酵母における発現異種タンパク質の分泌方法において使用されるような方法について記載している。所望タンパク質のための遺伝子の５′末端においてサッカロマイセス・セレビジエＭα１シグナル／リーダー配列をコードするDNA配列を融合することにより、その所望タンパク質の分泌とプロセシングが立証された。
多数の分泌タンパク質は、２つの連続的塩基性アミノ酸のカルボキシ末端においてペプチド結合を解裂することができるタンパク質分解プロセシング系に晒されるように経路を定められる。この酵素活性は、KEX2遺伝子によりコードされたサッカロマイセス・セレビジエにある（Julius,D.A.et al.,Cell  37（1984b）,1075）。KEX2遺伝子産物によるその生成物のプロセシングは、活性なサッカロマイセス・セレビジエの接合因子α（MFα又はα−因子）の分泌に必要であるが、活性サッカロマイセス・セレビジエ接合因子ａの分泌においては関連しない。
酵母内で発現される異種タンパク質の分泌を提供するためのマウス唾液アミラーゼ・シグナル・ペプチド（又はその突然変異体）の使用は、WO 89/02463とWO 90/10095中に記載されている。本発明の目的は、異種タンパク質の酵母中でのより効率的な発現及び／又は分泌を提供することである。
発明の要約
酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（aspartic protease 3）のシグナル・ペプチドが、マウス唾液アミラーゼ・シグナル・ペプチドに比較して酵母内で発現されるタンパク質の改良された分泌を提供することができることが、驚ろくべきことに発見された。
従って、本発明は、以下の配列：
0003542604.tif 000002
｛配列中、
Ｐがプロモーター配列であり、
SPが酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナル・ペプチドをコードするDNA配列であり、
LPがリーダー・ペプチドをコードするDNA配列であり、
ｎが０又は１であり、
PSが酵母プロセシング部位を定めるペプチドをコードするDNA配列であり、そして
HPが選択された宿主生物に対し異種であるポリペプチドをコードするDNA配列である。｝を含んで成るDNA構築物に関する。
用語“シグナル・ペプチド”は、天然において優位に疎水性であり、そして酵母内で発現される細胞外タンパク質の前駆体形態のＮ−末端配列として存在する前配列（presequence）を意味すると解される。このシグナル・ペプチドの働きは、異種タンパク質が分泌されて小胞体に入ることを許容することである。このシグナル・ペプチドは、上記過程の経過において解裂除去される。このYAP3シグナル配列は、その生来の遺伝子に融合されたことが先に報告されている（M.Egel−Mitani et al.,Yeast  ６,1990,pp.127−137）。このYAP3シグナル配列が異種ポリペプチドをコードするDNA配列に融合されているようなDNA構築物は、新規であると信じられる。このYAP3シグナル・ペプチドは、酵母における異種ポリペプチドの効率的な分泌を提供することが先に報告されていない。
本明細書中、表現“リーダー・ペプチド”は、小胞体からゴルジ体そしてさらに培地への分泌ための分泌液胞まで異種ポリペプチドを向けること（すなわち、細胞壁を横切る又は少なくとも細胞膜を通しての細胞の細胞周辺腔への発現ポリペプチドの輸出を許容する機能を有するポリペプチドを示すと解される
表現“異種ポリペプチド（heterologous polypeptide）”は、天然における宿主酵母生物により生産されないポリペプチドを示すことを意図される。
他の態様においては、本発明は、本発明に係るDNA構築物を含んで成る組換え発現ベクターに関する。
さらなる態様においては、本発明は、本発明に係る組換え発現ベクターにより形質転換された細胞に関する。
そしてさらなる態様においては、本発明は、異種ポリペプチドの製造方法、すなわち、異種ポリペプチドを発現することができ、そして本発明に係るDNA構築物により形質転換される細胞を好的な培地中で培養して上記異種ポリペプチドの発現と分泌を得て、その後、この異種ポリペプチドをその培地から回収することを含んで成る方法に関する。
発明の詳細な説明
特定の態様においては、上記YAP3シグナル・ペプチドは以下の配列：
0003542604.tif 000003
又はこのYAP3シグナル・ペプチドと高程度の相同性（少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％の、配列同一性）をもつペプチドをコードする好適なその修飾物によりコードされる。“好適な修飾物”の例は、そのペプチドの他のアミノ酸配列を生じさせないが、このDNA配列がその中に導入される酵母生物のコドンの用い方に対応することができるヌクレオチド置換、あるいは（そのアミノ酸配列がシグナル・ペプチドとしてもはや機能しない程度まで修飾されてはならないけれども）そのペプチドの異なるアミノ酸配列を生じさせるヌクレオチド置換である。可能性のある修飾の他の例は、その配列のいずれかの末端における又は内部での３又は３の倍数のヌクレオチドの挿入、又はその配列のいずれかの末端における又は内部での３又は３の倍数のヌクレオチドの欠失である。
配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′中、ｎは好ましくは１である。換言すれば、YAP3シグナル・ペプチドはいくつかの場合においては、その自体、異種ポリペプチドの分泌及び／又はプロセシングを提供するけれども、リーダー又はプロ−ペプチド配列が好ましくは存在する。このリーダーは酵母MFα１リーダー・ペプチド又は合成リーダー・ペプチド、例えばWO 89/02463又はWO 92/11378中に開示されたリーダー・ペプチドの中の１又は酵母において異種ポリペプチド分泌を行うことができるその誘導体であることができる。用語“合成（synthetic）”は、着目のリーダー・ペプチドが天然においては存在しないことを示すと意図される。合成酵母リーダー・ペプチドは、例えば、WO 89/02463又はWO 92/11378中に記載された手順に従って構築されることができる。
DNA配列PSによりコードされた酵母プロセシング部位は、好適には、LysとArgのいずれかの対の組合せ、例えばLys−Arg,Arg−Lys,Lys−Lys又はArg−Argであって他の種内でのサッカロマイセス・セレビジエのKEX2プロテアーゼ又は等価なプロテアーゼによる異種ポリペプチドのプロセシングを許容するものであることができる（D.A.Julius et al.,Cell  37,1984,1075ff.）。KEX2プロセシングが便利でない場合、例えばそれがポリペプチド産物の解裂を導くであろう場合には、他のプロテアーゼのためのプロセシング部位であって、そのポリペプチド産物内にはないアミノ酸の組合せを含んで成るもの、例えばFXaのためのプロセシング部位、Ile−Glu−Gly−Argが代わりに選ばれることができる（Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989参照）。
本発明に係る方法により作られる異種タンパク質は、酵母内で有利には生産されることができるいずれかのタンパク質であることができる。このようなタンパク質の例は、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼ・インヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、トランスフォーミング成長因子α又はβ、血小板由来成長因子、酵母、又はその機能的アナログである。本明細書中、用語“機能的アナログ（functional analogue）”は、生来のタンパク質と同様の機能をもつポリペプチドを示すと意味され（これは、生来のタンパク質の生物学的活性のレベルよりもむしろその性質に関するものとして理解されることを意図される）。このポリペプチドは生来のタンパク質と構造的に類似のものであることができ、そして生来のタンパク質のＣ−とＮ−末端のいずれか又は両方への１以上のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列内の１又は多数の異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、アミノ酸配列内の１又はいくつかの部位における又は生来のタンパク質のいずれのの又は両端における１以上のアミノ酸の欠失、あるいは生来のアミノ酸配列内の１以上のアミノ酸部位における１以上のアミノ酸の挿入により、生来のタンパク質から誘導されることができる。このような修飾は上述のタンパク質のいくつかについてよく知られている。
本発明に係るDNA構築物は、確立された標準的な方法、例えばS.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859−1869により記載されたホスホアミジット法、又はMatthes et al.,EMBO Journal ３,1984,pp.801−805により記載された方法により、合成により製造されることができる。このホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば自動DNA合成装置内で合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、そして酵母発現ベクター内にクローン化する。配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′が単一操作で調製される必要はないが、この方法で合成により調製された２以上のオリゴヌクレオチドからアセンブルされることができることに留意すべきである。
DNA配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′の１以上の部分はゲノム又はcDNA起源をもつこともでき、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準的な技術（Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989参照）に従って合成オリゴヌクレオチド・プローブを使用したハイブリダイゼーションにより上記部分をコードするDNA配列（典型的にはHP）をスクリーニングすることにより得られることができる。この場合においては、シグナル・ペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列は、異種タンパク質をコードするゲノム又はcDNA配列に連結されることができ、その後、そのDNA配列は、よく知られた手順に従って、配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′をコードする合成オリゴヌクレオチドの挿入により修飾されることができる。
最終的に、DNA配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′は、（適宜）合成、ゲノム又はcDNA起源の断片、すなわち標準的な技術に従って上記DNA配列の全体の中のさまざまな部分に対応する断片をアニーリングすることにより調製された、混合された合成とゲノム、混合された合成とcDNA、又は混合されたゲノムとcDNA起源を有することができる。従って、シグナル・ペプチド又は異種ポリペプチドをコードするDNA配列がゲノム又はcDNA起源を有することができる、一方、配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PSが合成により調製されることができることが構想されることができる。
配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′を担持する組換え発現ベクターは、酵母生物内で複製することができるいずれかのベクターであることができる。このベクターにおいては、プロモーター配列（Ｐ）は、酵母内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であることができ、そして酵母に対して同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子から得られることができる。プロモーターは好ましくは、酵母と同種のタンパク質をコードする遺伝子から得られる。好適なプロモーターの例は、サッカロマイセス・セレビジエのMFα1,TP I,ADH I,ADH II又はPGKプロモーター、又は他の酵母種、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）からの対応のプロモーターである。好適なプロモーターの例は、例えば、Russell and Hall,J.Biol.Chem.258,1983,pp.143−149;Russell,Nature  301,1983,pp.167−169;Ammerer,Meth.Enzymol.101,1983,pp.192−201;Russell et al,J.Biol.Chem.258,1983,pp.2674−2682;Hitzeman et al,J.Biol.Chem.225,1980,pp.12073−12080;Kawasaki and Fraenkel,Biochem.Biophys.Res.Comm.108,1982,及びT.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.１,1982,pp.419−434により記載されている。
上記配列は、また、好適なターミネーター、例えばTP Iターミネーター（T.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.１,1982,pp.419−434参照）、又は酵母CYC1ターミネーターに作用可能な状態で接続されなければならない。
本発明に係る組換え発現ベクターは、さらに、そのベクターが酵母内で複製することを可能にするDNA配列を含んで成る。このような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1−３と複製起点である。このベクターは、選択マーカー、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベTP I遺伝子であって、P.R.Russell,Gene 40,1985,pp.125−130により記載されるようなもの、又は酵母URA3遺伝子をも含んで成る。
配列５′−Ｐ−SP−（LP）ｎ−PS−HP−３′を酵母複製に必要な情報を含む好適な酵母ベクターに挿入するために使用される手順は当業者によく知られている（例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,引用書中、参照）。このベクターは、この配列全体を含むDNA構築物を最初に調製し、そしてその後この断片を好適な発現ベクター中に挿入するか、又は個々の要素のための遺伝情報を含むDNA断片（例えば、プロモーター配列、シグナル配列、リーダー配列、又は異種ポリペプチドをコードするDNA）を順番に挿入してその後ライゲーションするかのいずれかにより構築されることができる。
本発明に係るベクターにより形質転換される酵母生物は、培養の間に、大量の着目の異種ポリペプチドを作り出すいずれかの好適な酵母であることができる。好適な酵母生物の例は、サッカロマイセス（Saccharomyces）の株、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces  cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces  Kluyveri）、又はサッカロマイセス・ウバラムエ（Saccharomyces  uvarum）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces  pombe）、クルイベロマイセス（Kluiveromyces）、例えばクルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces  lactis）、ヤロウイア（Yarrowia）、例えばヤロウイア・リポリチカ（rarrowia  Llipolytica）、又はハンセヌラ（Hansenula）、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula  polymorpha）であることができる。上記酵母細胞の形質転換は例えばプロトプラスト形成その後のそれ自体公知のやり方での形質転換により行われることができる。
これらの細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖させるのに好適ないずれかの慣用培地であることができる。分泌された異種タンパク質であって、そのかなりの部分が正しくプロセシングされた形態でその培地中に存在するであろうものが、酵母細胞をその培地から遠心分離又は濾過により分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムによりその上清又は濾液のタンパク質成分を沈澱させ、その後、各種クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーその他による精製することを含む慣用の手順により、その培地から回収されることができる。
【図面の簡単な説明】
本発明を添付図面を参照しながら以下の実施例においてさらに記載する。ここで、
図1Aと1BはプラスミドpLaC257の構築を図示し；
図２は、pLaC257内のEcoR I−Xba I挿入物のDNA配列及び誘導アミノ酸配列（配列番号:2）を示し；
図3Aと3BはプラスミドpLaC242Aprを図示し；
図４はpAPRSc1のEcoR I−Xba I断片のDNA配列及び誘導アミノ酸配列（配列番号:4）を示し、ここで、イタリック体で示されるタンパク質配列がランダムな発現クローン化DNA断片から誘導されており；
図５はプラスミドpLaC263の構築を図示し；
図６はpLaC263のEcoR I−Xba I断片のDNA配列及び誘導アミノ酸配列（配列番号:6）を示し；
図7Aと7Bは、その生来のシグナル・ペプチドを含むヒト組織因子経路インヒビター（TFP I）のDNA配列及び誘導アミノ酸配列（配列番号:8）を示し；
図8Aは、プラスミドpYES−212 TFPT161−117Q内のTFP I配列のＮ末端に融合された（WO 89/02463中に示された）spx3シグナル・ペプチドと212リーダー・ペプチドのDNA配列及び誘導アミノ酸配列（配列番号:10）を示し；
図8Bは、プラスミドpYES−yk TFPT161−117Q内のTFP I配列のＮ−末端に融合されたYAP3シグナル・ペプチドと212リーダー・ペプチドのDNA配列及び誘導アミノ酸配列を示し；そして
図９は、プラスミドpYES21、pP−212TFP I161−117Q;pYES−212TFP I161−117QとpYES−ykTFP I161−117Qの制限マップを示す。
本発明をさらに以下の実施例により説明する。これらの実施例はいかなる方法においても請求するものとして本発明の範囲を限定することを意図されない。
実施例
プラスミドとDNA材料
全ての発現プラスミドは酵母内での複製のための２μDNA配列を含み、そして酵母内での選択マーカーとしてサッカロマイセス・セレビジエURA3遺伝子又はシゾサッカロマイセス・ポンベのトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子（POT）のいずれかを使用する。POTプラスミドは、EP特許出願第171 142号中に記載されている。このPOT−遺伝子を含むプラスミドは寄託されたE.コリ（E.cloi）株（ATCC 39685）から得ることができる。さらにこのPOTプラスミドはサッカロマイセス・セレビジエのトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ・プロモーターとターミネーター（PTPIとTTPI）を含む。それらは、pMT742（M.Egel−Mitani et al.,Gene 73,1988,pp.113−120）と同一である（図１参照）。但し、このPTPIを含むSph−Xba I制限部位により定められる領域とシグナル／リーダー／生成物のためのコード領域は同一でない。このURA3のプラスミドはPTPIとイソ−Ｉ−シトクロームＣターミネーター（TcycI）を使用する。
PTPIは構築作業を容易にするためにのみ、pMT742内にある配列に関して修飾されている。内部Sph I制限部位はSph I解裂、一本鎖尾の除去、そしてライゲーションにより除去されている。さらに、プロモーターに対するいずれの影響をもたず、かつ上流にあるDNA配列が、Bal31エクソヌクレアーゼ処理その後のSph I制限部位リンカーの付加により除去された。373塩基対のSph I−EcoR I断片上に存在するこのプロモーター構築物は、ＰTPIδと命名され、そして既に記載したプラスミド内で使用されるとき、このプロモーター修飾はこのプラスミド名へのδの付加により示される。
最後に、多数の合成DNA断片を使用した。これらの断片のすべては、ホスホルアミジット化学及び商業的に入手可能な試薬（S.L.Beaucage and M.H.Caruthers（1981）Tetrahedron Letters 22,1859−1869）を使用して自動DNA合成装置（Applied Biosystems model 380A）上で合成された。これらのオリゴヌクレオチドを変性条件下ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により精製した。このようなDNA一本鎖の相補対のアニーリングに先立って、これらをT4ポリヌクレオチド・キナーゼとATPによりリン酸化した。
使用した他の方法と材料の全ては、一般的技術水準の知識である（J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1988）。
実施例１
インスリン前駆体M13（Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21））をコードするDNA配列を含むプラスミドpLSC6315D3（WO 92/11378のExample 3に記載）の発現カセットの改変マウス唾液腺アミラーゼシグナルペプチド（MSA3sp）（WO 89/02463に記載）を以下の工程でYAP3シグナルペプチドに置き換えた。
シグナルペプチドの簡単な交換のための構築体を作った。部位特異的突然変異誘発を通じ、突然変異誘発プライマーNOR494
0003542604.tif 000004
（ここで太字は突然変異を示し、そして下線を付した配列は開始コドンを示す）を適用するダブルプライマー法により、pLaC196δにおける開始コドンの直前（WO 89/02463、fig.5参照）に導入した。
得られるプラスミドをpLaC196δ−Asp718と称する（図１参照のこと）。
pLSC6315D3中の発現カセットのシグナルペプチドとリーダーペプチドとの間の接合点を含む領域のヌクレオチド配列を、Apa1−HgiA I制限フラグメントを合成DNAストレッチNOR2521/2522に置き換えることにより改良した：
0003542604.tif 000005
0003542604.tif 000006
得られるプラスミドをpLSC6315D3Rと称する（図１参照のこと）。
pLaC196δ−Asp718のSph I−Asp718フラグメントを、Sph1−Mlu1で切断しておいたpLSC6315D3Rプラスミド及びYAP3シグナルペプチドをコードするDNAの合成ストレッチ：
0003542604.tif 000007
0003542604.tif 000008
得られるプラスミドpLaC257は本質的に、MSA3シグナルペプチドがYAP3シグナルペプチドに置き換えられているpLSC6315D3より成る（図２参照のこと）。
酵母の形質転換:S.セレビジエ株MT663（E2−7B XE11−36a/α、Δtpi/Δtpi、pep4−3/pep4−３）（酵母株MT663は出願92/11378との関係でドイツェ・サムルング・フォン・マイクロオルガニズメン・ウンド・ゼルクルツレンに寄宅してあり、そして寄託番号DSM6278が付与されている）をYPGal（１％のBacto酵母抽出物、２％のBactoペプトン、２％のガラクトース、１％のラクテート）上で0.6の600nmでのO.D.にまで増殖させた。
100mlの培養物を遠心により回収し、10mlの水で洗い、再遠心して、そして1.2Mのソルビトール、25mMのNa2EDTA pH8.0及び6.7mg/mlのジチオトレイトールを含む溶液10mlに再懸濁した。その懸濁物を30℃で15分インキュベートし、遠心し、そしてその細胞を1.2Mのソルビトール、10mMのNa2EDTA、0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH0 5.8及び2mgのNovozym（商標）234を含む溶液10mlに再懸濁した。その懸濁物を30℃で30分インキュベートし、その細胞を遠心により回収し、1.2Mのソルビトール10ml及びCAS（1.2Mのソルビトール、10mMのCaCl2、10mMのトリスHCl（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH＝7.5）10mlで洗い、そしてCAS2mlに再懸濁した。形質転換のため、1mlのCAS懸濁細胞を約0.1μｇのプラスミドpLaC257と混合し、そして室温で15分放置した。1mlの20％のポリエチレングリコール4000、20mMのCaCl2、10mMのCaCl2、10mMのトリスHCl、pH＝7.5を加え、そしてその混合物を室温で更に30分放置した。その混合物を遠心し、そしてそのペレットを0.1mlのSOS（1.2Mのソルビトール、33％v/vのYPD、6.7mMのCaCl2、14μg/mlのロイシン）に再懸濁し、そして30℃で２時間インキュベートした。その懸濁物を遠心し、そしてそのペレットを1.2Mのソルビトール0.5mlに再懸濁した。次いで1.2Mのソルビトールと2.5％のアガーとを含む6mlのトップアガー（Shermanら、Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）のSC培地）を52℃で加え、そしてその懸濁物を同一のアガー固形化ソルビトール含有培地を含むプレートの上に注いだ。
形質転換コロニーを30℃で３日経過後に拾い、そして液体培養を開始するのに使用した。一つの形質転換体を更なる特性決定のために選択した。
発酵：プラスミドpLaC257で形質転換された酵母株MT663をYPD培地（１％の酵母抽出物、２％のペプチン）（Difco Laboratoriesより）上で増殖させた。１リットルの株培養物を650の光学密度で24となるまで30℃で振盪した。遠心後、その上清液を単離した。
プラスミドpLSC6315D3により形質転換され、且つ上記の通りに培養されたMT663細胞をMI3インスリン前駆体の収率の比較のために用いた。MI3の収率はSnel,Damgaard and MollerupのChromatographia  24,pp.329−332の方法により、培養上清液に基づいて直接決定した。結果を以下に示す。
プラスミド         MI3の収率
pSLC63.15D3（Msa3sp）      100％
pLaC257（YAP3）            120％
実施例２
プラスミドpLSC6315D3を２工程で改変させた。第一に、MSA3シグナルペプチドを、Sph I−Apa IフラグメントをpLaC212spx3（WO 89/02463参照のこと）由来の類似のフラグメントと交換することによりspx3シグナルペプチドに置き換えた。得られるプラスミドpSLC63.15spx3から、302bpのEcoR I−Dde Iフラグメントを単離し、そしてアプロチニンをコードするDNA配列を含むpKFN1003（WO 90/10075）の204bpのNco I−Xba Iフラグメントに、合成リンカーDNA、NOR2101/2100
0003542604.tif 000009
0003542604.tif 000010
を通じて融合した（図３参照）。
得られるプラスミドpLaC242−Apr（図３参照）をCla Iで切断し、脱リン酸化し、そしてS.セレビジエ株MT663から単離したランダム５′−CG−突出しフラグメントのクローニングに、WO 92/11378の詳細に従って適用した。酵母株MT663の形質転換及び発酵は実施例１記載の通りに行った。
得られるライブラリーから、配列を図４に提示しているリーダーを含むプラスミドpAPR−Sc1（WO 92/11378に記載の方法により調製）を有する酵母形質転換体をスクリーニングにより選別した。pAPR−Sc1のspx3シグナルペプチドを、pLaC257由来のSph1−Sty1フラグメントをpAPR−Sciの300bpのNhe1−Xba Iフラグメントに合成リンカーDNA MH1338/1339
0003542604.tif 000011
0003542604.tif 000012
を介してpAPR−Sc1の300bpのNhe I−Xba Iフラグメントに融合することによりYAP3シグナルペプチドと交換した（図５参照）。
得られるプラスミドをpLaC263と称する（図５参照）。pLaC263のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列及び誘導アミノ酸配列を図６に示す。
プラスミド       アプロチニン収率
pAPR−Sc1（Spx3sp）         100％
pLaC263                     136％
実施例３
DNA配列がヒト組織因子経路インヒビター（TFP I）をコードするcDNAの公開配列（Wunら、J.Biol.Chem.263（1988）6001−6004）に由来するヒトTFP Iコードする合成遺伝子を、プラスミドpBS（＋）への合成制限フラグメントの段階式クローニングにより調製した。得られる遺伝子は928塩基対（bp）のSal I制限フラグメント上に含まれていた。cDNAが14個の固有制限エンドヌクレアーゼ部位をもたらしているのに対して、この遺伝子は縮重コドンにおける26個のサイレントヌクレオチド置換を有していた。この928bpのSal IフラグメントのDNA配列及びヒトTFP Iの対応のアミノ酸配列（プレ形態）を図７に示す（SEQ ID NO:8）。
このDNA配列を次に、最初の161個のアミノ酸より成るTFP I変異体をコードするために、トランケーションに付した。Asn117についてのAATコドンがGlnをコードするCAAに置き換えられているグリコシル化変異体TFP I1-161−117Glnを合成オリゴヌクレオチドを用いる公知の方法の部位特異的突然変異誘発により構築した。TFP I1-161−117GlnをコードするDNA配列には合成シグナル−リーダー配列212spx3が先行する（WO 89/02463を参照のこと）。図8A参照のこと。この構築体をプラスミドpP−212TFP I161−117Q（POT型のベクターに基づく）（G.Kawasaki and L.Bell,米国特許第4,931,373号）に挿入した。図８参照のこと。
212spx3−TFP I1-161−117Glnをコードするコード領域を含む1.1kb Sph I−Xba Iフラグメントを単離し、そして市販のベクターpYES2.0（Stratagene）由来のプラスミドpYES32にクローンした（図８参照）。このプラスミドは酵母における複製のための２μ配列、ura3株におけるプラスミド選別のための酵母URA3遺伝子、E.コリにおける選別のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、E.コリにおける複製のためのColE1複製起点、超感染E.コリ株からの一本鎖DNAプラスミドの回収のためのf1起点、及び酵母CYC1転写ターミネーターを含む。Sph I−Xba IフラグメントをCYC1ターミネーターの前においてpYES2.0にクローニングした。得られるプラスミドpYES−212TFP I161−117Q（図９参照）をPf1M I及びEcoR Iで切断してマウス唾液アミラーゼシグナルペプチドをコードする領域を除き、YAP3シグナルペプチドをコードする二本鎖合成オリゴヌクレオチド配列
0003542604.tif 000013
0003542604.tif 000014
と交換し、プラスミドpYES−ykTFP I161−117Qを得た（図8B及び図９を参照のこと）。
プラスミドpYES−212TFP I161−117Q及びpYES−ykTFP I161−117Qをハプロイド酵母株YNG318（MATα ura3−52 leu2−Δ2 pep4−Δ1 his4−539〔cir+〕）に形質転換した。プラスミド選択はUra+細胞についてである。再単離した形質転換体を、ウラシルを欠く50mlの合成完全培地（SC−ura）の中で30℃で３日増殖させた。細胞密度（OD600）を測定後、その培養物を遠心し、そして得られる上清液を分泌したFXa/TF/FV II a依存性染色体TFP I活性のレベルについて分析した（P.M.Sandsetら、Thromb.Res.47,1987,pp 389−400）。プラスミドpYES−212TFP I161−117Q（即ち、マウス唾液アミラーゼシグナル配列を含むプラスミド）を含む株由来の上清液に関して測定された平均活性値は0.65U/ml・ODであった。プラスミドpYES−ykTFP I161−117Qを含む株由来の上清液について測定された平均活性値は1.00U/ml・ODであった。
配列表
（１）  一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称:Novo Nordisk A/S
（Ｂ）通り:Novo Alle
（Ｃ）市:Bagsvaerd
（Ｅ）国:Denmark
（Ｆ）郵便番号:2800
（Ｇ）電話番号：＋45 4444 8888
（Ｈ）ファックス番号：＋45 4449 3256
（ii）発明の名称:YAP3シグナルペプチドをコードするDNA構築体
（iii）配列の数:24
（iv）コンピューター読取フォーム：
（Ａ）媒体タイプ:Floppy disk
（Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible
（Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.25（EPO）
（２）  SEQ ID NO:1についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:63塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:cDNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アセチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：サッカロマイセス・セレビジエ
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1:
0003542604.tif 000015
（２）  SEQ ID NO:2についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:476塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置  81:452..
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:81..293
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:294..452
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:2:
0003542604.tif 000016
（２）  SEQ ID NO:3についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:124アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（iv）配列の詳細:SEQ ID NO:3:
0003542604.tif 000017
（２）  SEQ ID NO:4についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:450塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:76..441
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:76..267
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:268..441
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:4:
0003542604.tif 000018
（２）  SEQ ID NO:5についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:122アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:5:
0003542604.tif 000019
（２）  SEQ ID NO:6についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:470塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:81..461
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:81..287
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:288..461
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:6:
0003542604.tif 000020
（２）  SEQ ID NO:7についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:127アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:7:
0003542604.tif 000021
（２）  SEQ ID NO:8についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:928塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：ヒト
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:8..919
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:81..91
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:92..919
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:8:
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0003542604.tif 000023
（２）  SEQ ID NO:9についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:304アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:9:
0003542604.tif 000024
0003542604.tif 000025
（２）  SEQ ID NO:10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:234塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:76..234
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:76..222
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:223..234
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:10:
0003542604.tif 000026
（２）  SEQ ID NO:11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:53アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:11:
0003542604.tif 000027
（２）  SEQ ID NO:12につていの情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:190塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（iii）ヒポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）位置:17..190
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:sigペプチド
（Ｂ）位置:17..178
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:matペプチド
（Ｂ）位置:179..190
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:12:
0003542604.tif 000028
（２）  SEQ ID NO:13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:58アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：タンパク質
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:13:
0003542604.tif 000029
（２）  SEQ ID NO:14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:27塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:14:
0003542604.tif 000030
（２）  SEQ ID NO:15についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:60塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:15:
0003542604.tif 000031
（２）  SEQ ID NO:16についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:62塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:16:
0003542604.tif 000032
（２）  SEQ ID NO:17についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:87塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:17:
0003542604.tif 000033
（２）  SEQ ID NO:18についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:87塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:18:
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（２）  SEQ ID NO:19についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:19:
0003542604.tif 000035
（２）  SEQ ID NO:20についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:10塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:20:
0003542604.tif 000036
（２）  SEQ ID NO:21についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:21:
0003542604.tif 000037
（２）  SEQ ID NO:22についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
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0003542604.tif 000038
（２）  SEQ ID NO:23についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:88塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:23:
0003542604.tif 000039
（２）  SEQ ID NO:24についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:81塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ:DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：合成
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:24:
0003542604.tif 000040
【図１ａ】
0003542604.tif 000042
【図１ｂ】
0003542604.tif 000043
【図２】
0003542604.tif 000044
【図３ａ】
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【図３ｂ】
0003542604.tif 000046
【図４】
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【図５】
0003542604.tif 000048
【図６】
0003542604.tif 000049
【図７ａ】
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【図７ｂ】
0003542604.tif 000051
【図８ａ】
0003542604.tif 000052
【図８ｂ】
0003542604.tif 000053
【図９】
0003542604.tif 000054