(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有する低温至適プロテアーゼ。
１）作用温度及び最適温度
０〜６０℃で作用し、最適温度は２５〜３０℃の間にある。Ｃａ2+イオンが存在すると最適温度は５０℃に上昇する。０℃（氷水中）でも最適温度活性値の２０〜３０％の活性を保持する。
２）温度安定性
pH７．０、１５分間の処理条件で４０℃まで安定であり、Ｃａ2+イオンが存在すると５０℃まで安定である。
３）作用pH及び最適pH
作用pH範囲は５〜１０であり、最適pHは７．０近傍にある。
４）pH安定性
２０℃、１５分間の処理条件でpH５．８〜９．８までの各pHで安定である。
５）分子量
ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、３８，０００±１，０００である。
６）等電点
pH９．７近傍にある。
７）基質特異性
天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、ヘモグロビン、ゼラチン及びケラチンに対して作用する。
８）金属イオンの影響
Ｈｇ2+イオンによって強く阻害される。
９）阻害剤
ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡによって強く阻害される。フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、キモスタチン、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）、５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）によって全く阻害を受けない。
10）界面活性剤の影響
ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）、ソジウムα−オレフィンスルホン酸（ＡＯＳ）、ソジウムアルカンスルホン酸（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）、ソフタノール（７０Ｈ）及びソジウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）に対して極めて安定である。
【請求項２】
バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−ＳＰ１０１と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３９号として寄託された請求項１記載の低温至適プロテアーゼを生産する微生物。
【請求項３】
請求項２記載の微生物を培養し、その培養物から低温至適プロテアーゼを採取することを特徴とする請求項１記載の低温至適プロテアーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な低温至適プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該低温至適プロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く分布している。その応用範囲としては、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なしめ剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤あるいは消炎剤があり、多分野で盛んに利用されてきた。
【０００３】
その中で最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及びプロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）などが知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの大半は最適温度が高温側にあるため、水道水をそのまま用いて低温領域で衣料等の洗浄を行う場合には、その酵素特性が十分に発揮されているとは言いがたい。また、前述のプロテアーゼは、その応用分野のほとんどにおいて、体温、室温又は低温条件下で使用されるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いて高温処理工程を行うことは、省エネルギーの観点からも好ましいとは言えない。一方、低温至適プロテアーゼは、反応系に熱を加えられないようなケース、すなわちチーズの熟成や肉の軟化等の食品の改質に有効であると思われる。
【０００５】
近年、洗剤をはじめとしてプロテアーゼの商品への配合や工業的プロセスなどにおける利用が考えられているのが、この場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を十分発揮させるうえで、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌等の寒冷環境に棲息する生物、海水あるいは冷蔵中のミルク等から分離されたプロテアーゼ生産菌及び生産されるプロテアーゼに関して数多くの報告例がある。すなわち、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｎｏ．５４８株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒア  フロインディ（Ｅｓｃｈｒｅｉｃｈｉａ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナス  マルトフィラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）０４７／０８株（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７９巻，２５７頁，１９９１年）、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｔ１６が（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＦＴ３６株（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモナス  エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）１４５−２株（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．，３６巻，７頁，１９８２年）、アエロモナス  サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモナス  パウシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｎｏｍｏｂｉｌｉｓ），バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１巻，３７７頁，１９９１年）、ビブリオ  エスピー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）ＳＡ１株（Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４４巻，１５７頁，１９７８年）、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＣＤＯ２０８５株（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．，５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．，５３巻，９７頁，１９８６年）、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＧＲ８３株（Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ．ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセス  マルクアンディ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｑｕａｎｄｉｉ）（ＷＯ８８／０３９４８）及びキサントモナス  エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｓ−１（特開平５−２１１８６８号公報）などの低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。また、好冷細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈ）が生産するプロテアーゼに関しては、Ｆａｉｒｂａｉｎらが要領よく総説にまとめている（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．，５３巻，１３９頁，１９８６年）。
しかしこれらのプロテアーゼについても、低温域における作用は必ずしも満足できるものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は低温条件下においても高い活性を保持するプロテアーゼ、及びこれを生産する微生物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、かかる問題点を解決するため、低温領域において十分作用するプロテアーゼを自然界に求め、探索してきた。その結果、南氷洋に生息する甲殻類の一種であるイソポーダから至適温度を２５〜３０℃に有し、０℃以下の低温条件下でも十分に作用するプロテアーゼを生産するバチルス属細菌を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有する低温至適プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法を提供するものである。
１）作用温度及び最適温度（基質，カゼイン；ｐＨ７．０）
０〜６０℃で作用し、最適温度は２５〜３０℃の間にある。Ｃａ２＋イオンが存在すると最適温度は５０℃に上昇する。０℃（氷水中）でも最適温度活性値の２０〜３０％の活性を保持する。
２）温度安定性（基質，カゼイン；ｐＨ７．０）
ｐＨ７．０、１５分間の処理条件で４０℃まで安定であり、Ｃａ２＋イオンが存在すると５０℃まで安定である。
３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ（基質，カゼイン；２０℃）
作用ｐＨ範囲は５〜１０であり、最適ｐＨは７．０近傍にある。
４）ｐＨ安定性（基質，カゼイン；２０℃）
２０℃、１５分間の処理条件でｐＨ５．８〜９．８までの各ｐＨで安定である。
５）分子量
ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、３８，０００±１，０００である。
６）等電点
ｐＨ９．７近傍にある。
７）基質特異性
天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、ヘモグロビン、ゼラチン及びケラチンに対して作用する。
８）金属イオンの影響
Ｈｇ２＋イオンによって強く阻害される。
９）阻害剤
ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡによって強く阻害される。フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、キモスタチン、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）、５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）によって全く阻害を受けない。
１０）界面活性剤の影響
ソジウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）、ソジウムα−オレフィンスルホン酸（ＡＯＳ）、ソジウムアルカンスルホン酸（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）、ソフタノール（７０Ｈ）及びソジウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）（濃度はそれぞれ０．２重量％）に対して極めて安定である。
【０００９】
本発明の低温至適プロテアーゼは、例えばバチルス属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【００１０】
かかるバチルス属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、バチルス属に属し、上記の本発明プロテアーゼを生産する限り特に制限されないが、例えば次の分類学的性質を示すＫＳＭ−ＳＰ１０１株が挙げられる。
【００１１】
本発明の低温至適プロテアーゼを生産する微生物の分離同定に用いられる培地を以下に示す。
【００１２】
使用培地の組成（重量％で表示）
培地１．ニュートリエントブロス，０．８；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地２．ニュートリエントブロス，０．８
培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，２．０；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地４．バクトリトマスミルク，１０．５
培地５．ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮＯ３，０．１
培地６．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；ブドウ糖，０．５
培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地９．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５，可溶性澱粉，２．０；Ｋ２ＨＰＯ４，０．１；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地１０．Ｋｏｓｅｒの培地（栄研化学社製），指示量
培地１１．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地（栄研化学社製），指示量
培地１２．（１）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ２ＰＯ４，０．１；Ｎａ２ＳＯ４，０．１
（２）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ２ＰＯ４，０．１；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０２；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．０５；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．００１；ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ，０．００１；窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを各々０．２５，０．２，０．１６，０．２となるように、上記（１）及び（２）の培地に加えて用いた。
培地１３．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１４．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１５．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１６．チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙（日水製薬社製）
培地１７．３％過酸化水素水
培地１８．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５；ＫＨ２ＰＯ４，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０２
培地１９．ペナッセイブロス（ディフコ社製），指示量
培地２０．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．５；ブドウ糖，０．５；Ｋ２ＨＰＯ４，０．１；ブロムチモールブルー，０．０６；寒天末，（和光純薬社製），１．５
培地２１．（ＮＨ４）２ＨＰＯ４，０．１；ＫＣｌ，０．０２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．０５；糖１．０
培地２２．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ２ＰＯ４，０．１；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．０２；寒天末，（和光純薬社製），１．５
【００１３】
ＫＳＭ−ＳＰ１０１株の分類学的性質を以下に示す。
【００１４】
〔分類学的性質〕
（ａ）顕微鏡的観察結果：
菌体の大きさは、１．０〜２．０μｍ  ×２．０〜８．０μｍ  の巨大桿菌であり、周鞭毛を有し、運動性がある。楕円形の胞子の形成が認められる。
（ｂ）グラム染色性：
陽性。
（ｃ）各種培地における生育状態：
（１）肉汁寒天平板培養（培地１）；
生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑で光沢がある。
また、集落の色調は、淡黄色で半透明である。
（２）肉汁寒天斜面培養（培地１）；
生育する。
（３）肉汁液体培養（培地２）；
生育は良好で、菌膜の形成は認められない。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）；
生育は良く、ゼラチンの液化が認められる。
（５）リトマスミルク培地（培地４）；
ペプトン化が認められ、弱い酸生成が観察される。
（ｄ）生理学的性質：
（１）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）；
いずれも陰性。
（２）ＭＲテスト（培地６）；
陰性。
（３）ＶＰテスト（培地６）；
陰性。
（４）インドールの生成（培地７）；
陰性。
（５）硫化水素の生成（培地８）；
陰性。
（６）澱粉の加水分解（培地９）；
陽性。
（７）クエン酸の利用（培地１０、１１）；
陽性。
（８）無機窒素源の利用（培地１２）；
アンモニウム塩及び硝酸塩を利用する。
（９）色素の生成（培地１３、１４）；
陰性。
（１０）ウレアーゼ（培地１５）；
陽性。
（１１）オキシダーゼ（培地１６）；
陰性。
（１２）カタラーゼ（培地１７）；
陽性。
（１３）生育のｐＨ範囲（培地１８）；
生育のｐＨ範囲は５〜９である。
生育の至適ｐＨ範囲は６〜８にある。
（１４）生育の温度範囲（培地１、１９）；
生育の温度範囲は５〜５０℃であり、最も生育が旺盛な温度は３０〜４０℃の間にある。
（１５）酸素に対する態度（培地２０）；
好気的。
（１６）Ｏ−Ｆテスト（培地２１）；
酸化型。
（１７）糖の利用性；
Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、Ｄ−マンニトール、イノシトール、グリセリン及び可溶性澱粉を利用することができる。
（１８）食塩含有培地における生育（培地１中）；
食塩濃度７％では生育するが、１０％では生育できない。
（１９）カゼインの分解（培地２２）；
陽性。
【００１５】
以上の分類学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、バチルス属の一種と判断された。類縁菌としてはバチルス  メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が挙げられるが、本菌より更に巨大桿菌であり、その他の分類学的性質で相違点が認められた。また、本発明菌は、中温バチルス属細菌に属するものであるが、通常の中温バチルス属細菌に比べ、低温適応している。
【００１６】
従って、本菌株を新菌種としてバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＳＰ１０１と命名し、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８３９号として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１７】
上記の菌株を用いて、本発明の低温至適プロテアーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００１８】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例えば炭素源として可溶性澱粉、アミロペクチン、グリコーゲン及びこれらの分解物やその他の資化しうる炭素源、例えばグルコース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、キシロース、マルトース、ラクトース、シュークロース、マンニトール、イノシトール、トレハロース、ラフィノース、グリセリンや資化しうる有機酸、例えばクエン酸や酢酸などが挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕、カルチベータ及びゼストなどの有機窒素源が有効である。更に、燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等の無機塩や、必要に応じて、無機又は有機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【００１９】
培養温度は、１２〜４５℃、特に２０〜３０℃前後が好ましく、培養初発ｐＨは５〜９、特にｐＨ６〜８が好ましい。この条件下において通常１〜３日間で培養が完了する。斯くして得られた培養液の中から目的の酵素である低温至適プロテアーゼを採取するには一般の酵素採取の手段に準じて行うことができる。すなわち、培養後、遠心分離又は濾過の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲル濾過などを適宜組合わせることによって精製することもできる。
【００２０】
斯くして得られる本発明低温至適プロテアーゼの酵素化学的性質について以下に説明する。
【００２１】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン１％を含む５０ｍＭの各種緩衝液１ｍｌを０．１ｍｌの酵素溶液と混合し、２０℃で１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、３０℃で２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５頁，１９５１年）によって測定した。
また、上記反応条件下において、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００２２】
〔酵素学的性質〕
（１）基質特異性：
５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に各種蛋白基質を０．１％又は１％になるように加えた後、精製酵素を適当量添加して２０℃で１５分間反応を行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を１００として、それぞれの基質に対する分解活性を表１に示した。
【００２３】
【表１】
0003595024.tif 000002
【００２４】
この結果から明らかなように、本酵素は水溶性のカゼイン、ジメチルカゼイン、ヘモグロビン、ゼラチン及びケラチンに対して分解活性を示した。一方、エラスチン、アルブミン、リゾチームやリボヌクレアーゼには作用しなかった。
【００２５】
また、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）が結合した合成オリゴペプチド基質を用いて、これらの分解活性を調べた。しかし、Ｎ−スクシニル化したＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ  、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ  、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ  、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ  、Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ  、Ａｌａ−ｐＮＡ  やＮ−カルボベンゾイル化したＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ  やＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ  等の合成基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離は認められなかった。
【００２６】
（２）作用ｐＨ及び最適ｐＨ：
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、２０℃で１５分間反応を行い、各ｐＨでの活性を測定した。図１から明らかなように、本プロテアーゼの最適ｐＨは５〜７付近に認められる。また、その作用ｐＨは、ｐＨ５〜１０と幅広いことがわかる。
【００２７】
（３）ｐＨ安定性：
ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（５ｍＭ，各ｐＨ）中に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置し、カゼインを基質として残存活性を２０℃で測定した。その結果、図２示すとおり、本酵素はｐＨ５．８〜９．８の広い範囲で安定であった。
【００２８】
（４）作用温度及び最適温度：
基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行った。図３から明らかなように、本酵素の最適温度は２５〜３０℃であった。Ｃａ２＋イオン（ＣａＣｌ２として５ｍＭ）が存在すると、最適温度は約５０℃に移行し、Ｃａ２＋イオン非存在下の最適温度に比べ、約４倍の活性促進が認められた。特徴的なことに本酵素は０℃（氷水中）でも最適温度の活性は約２０〜３０％の活性を示し、低温条件下でも十分作用することがわかる。
【００２９】
（５）温度安定性：
５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に本酵素を加え、各温度で１５分間熱処理した後氷冷した。カゼインを基質として、２０℃で残存活性を求め、その結果を図４に示す。本酵素はＣａ２＋イオン非存在下で４０℃、５ｍＭＣａ２＋イオン存在下で５０℃まで極めて安定であった。
【００３０】
（６）分子量：
本酵素の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子量マーカーキット（バイオラッド社製）のホスホリラーゼｂ（分子量：９７，４００）、牛血清アルブミン（分子量：６６，２００）、卵白オブアルブミン（分子量：４５，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３１，０００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量：２１，５００）、リゾチーム（分子量：１４，４００）を用いた。図５から明らかなように、本精製プロテアーゼ標品は電気泳動的に均一であり、その分子量は３８，０００±１，０００と推定される。
【００３１】
（７）等電点：
等電点電気泳動法により、本プロテアーゼの等電点を求めた。アクリルアミドゲル（６．０％）のｐＨ勾配は、両性電解質であるファーマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ，ｐＨ３〜１０；ファルマシア社製）を使用した。その結果、本プロテアーゼの等電点はｐＨ９．７近傍にあることが判明した。
【００３２】
（８）金属イオンの影響：
各種金属塩が１ｍＭになるように添加した２０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０分間放置した。その後、５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適当希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性を１００％として処理群の残存活性を求めた。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0003595024.tif 000003
【００３４】
表２から、本酵素活性はＨｇ２＋イオンにより強く活性が阻害され、Ｃｕ２＋、Ａｇ２＋、Ｎｉ２＋イオンやＣｏ２＋イオンにも若干の阻害作用が認められる。
【００３５】
（９）阻害剤の影響：
１０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０；２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加し、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
0003595024.tif 000004
【００３７】
表３から、キレート剤であるＥＤＴＡとＥＧＴＡによって強く阻害され、ＰＭＳＦなどのセリン酵素阻害剤で全く影響を受けないので金属プロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）であると考えられる。
【００３８】
（１０）界面活性剤の影響：
本酵素を、０．２％の界面活性剤を含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０；２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）に加えて、２０℃で４時間放置した後、残存活性を測定した。結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
表４から、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡＳ、α−ＳＦＥ、ソフタノール７０ＨやＬＡＳ（それぞれ０．２％濃度）などの界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活せず、強力な界面活性剤耐性を有していることがわかる。
【００４１】
このように、本発明の低温至適プロテアーゼは、過去に報告の無い新規酵素である。最近、南極の海水から分離されたバチルス属の一種が熱に不安定なズブチリシン型の酵素を生産することが報告されているが（Ｄａｖａｉｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９巻，１７４４８頁（１９９４年））、最適温度が４０℃近傍にあり、ＥＧＴＡとＰＭＳＦで阻害されることから一種の金属セリンプロテアーゼであるので、明らかに本発明の酵素とは異なっていることが認められる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、作用最適温度を低温領域に有し、前述の界面活性剤によってもほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、低温下で有利に使用できるものである。また、低温条件下における、食肉の軟化あるいはチーズの熟成といった食品の改質にも有効である。また、本低温至適酵素の生産菌がバチルス属細菌の一種であることから、培養条件の検討、突然変異やホスト−ベクター系（ＥＫ系やＢＳ系）などの育種による著量の酵素を菌体外生産することが可能になった。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
南氷洋に棲息するイソポーダ（甲殻類の一種）を２尾、滅菌人工海水（ジャマリン・ラボラトリー社製）２０ｍｌに入れ、ホモゲナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を、以下に示す組成を有する人工海水平板培地に塗抹し、５℃で５〜７日間培養した。
【００４５】
【表５】
人工海水平板培地（ｐＨ７．６）
（成分）                                              （配合量）
バクトペプトン（ディフコ社製）                          ２．５ｇ
酵母エキス（ディフコ社製）                              １．２５ｇ
肉エキス（ディフコ社製）                                １．２５ｇ
スキムミルク（ディフコ社製）（別滅菌）                １０ｇ
グルコース                                              ０．５ｇ
寒天                                                  ２０ｇ
人工海水                                          １０００ｍｌ
【００４６】
生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。得られた分離株の中から、低温至適プロテアーゼ生産性を調べ、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株を選抜した。
【００４７】
実施例２
実施例１で得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株を以下に示す液体培地で好気的に２０℃、２日間培養した。
【００４８】
【表６】
液体培地（ｐＨ７．６）
（成分）                                                （配合量）
バクトペプトン                                          ２．５ｇ
酵母エキス                                              １．２５ｇ
肉エキス                                                １．２５ｇ
人工海水                                          １０００ｍｌ
【００４９】
培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ，２０分間）して得られた上清液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）で５℃において一昼夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼインを基質として２０℃で測定したところ（５０ｍＭ燐酸緩衝液中，ｐＨ７．０）、０．３Ｕ／ｌ培養液に相当するプロテアーゼの生産が認められた。
【００５０】
実施例３
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株を以下に示す液体培地で２０℃、４８時間培養した。
【００５１】
【表７】
ＴＳＢ改変培地（ｐＨ７．２）
（成分）                                              （配合量）
トリティケースソイブロス（ＢＢＬ）                    ３０ｇ
酵母エキス                                              ０．５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                      ０．２ｇ
イオン交換水                                      １０００ｍｌ
【００５２】
培養後、遠心分離して得られた上清液のプロテアーゼ活性を実施例２に従って定量したところ、０．６〜３．２Ｕ／ｌ培養液に相当する生産性が認められた。
【００５３】
実施例４
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株をＴＳＢ改変培地に接種し、２０℃で４０時間培養した。培養後、遠心分離して得られた上清液を限外濾過膜（分画分子量３，０００；アミコン社製）で濃縮した。この濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３；５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）で５℃において一昼夜透析した。この透析内液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３；５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）で平衡化したＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムを通過させ、その非吸着画分をプールした。再度、ＤＥＡＥ−バイオゲルＡのカラムを通過させて非吸着画分を限外濃縮した。この濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３；５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）で平衡化したＣＭ−バイオゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムに添着した後、同平衡緩衝液（ｐＨ８．３；５ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）を用いて蛋白質を溶出させた。本発明の低温至適プロテアーゼは非吸着画分の溶出領域から若干遅れて分画された。活性画分を限外濾過膜上で約１．０ｍｌまで濃縮した後、平衡化したセファクリルＳ−２００スーパーファイン（ファルマシア社製）のカラムでゲルクロマトグラフィーを行った。得られた活性画分を最終精製酵素標品として使用した。
この結果、約８倍まで精製され（回収率１４％）、本精製標品は約３８Ｕ／ｍｇ蛋白質（仔牛血清アルブミン単位）の比活性を有していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株のプロテアーゼのｐＨ−活性曲線を示す図である。
【図２】バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株のプロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株プロテアーゼの温度−活性曲線を示す図である。
【図４】バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株のプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図５】バチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＳＰ１０１株のプロテアーゼの分子量測定結果を示す図であり、（ａ）は分子量とＳＤＳ電気泳動距離の相関を示す図、（ｂ）は完全精製標品のＳＤＳ電気泳動写真（１２％アクリルアミドゲル）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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