(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロフィルを抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムをそれぞれ所定の濃度となるように添加した後、過酸化水素を添加しクロロフィルを酸化して生じる化学発光の化学発光強度を測定し、クロロフィル濃度と化学発光強度との相関について予め測定された検量結果に基づいて、試料液中のクロロフィル濃度を定量することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、クロロフィルをアセトン中に抽出することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、試料液中のアセトニトリル濃度が３０〜５０ｖｏｌ％となるようにアセトニトリルを添加することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、試料液中の水酸化ナトリウム濃度が２．５×１０−４〜５．０×１０−４Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、試料液中の過酸化水素濃度が０．１〜０．２Ｍとなるように過酸化水素を添加することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項６】
請求項２ないし５に記載のいずれかの方法において、アセトン−アセトニトリルの混合溶媒中における試料液の水分量が７〜１２ｖｏｌ％となるように水分量を調製することを特徴とするクロロフィル定量方法。
【請求項７】
請求項１ないし６に記載のいずれかの方法において、クロロフィルの化学発光強度は、過酸化水素添加直後に生じる発光ピークの高さとすることを特徴とするクロロフィル定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、環境水中に広く存在する植物や植物性プランクトンの葉緑素に含まれるクロロフィルの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
緑色色素クロロフィルは、地球上の生物に不可欠な有機物や酸素を供給する植物の光合成の中で、重要な役割を演じている。クロロフィルが太陽光を吸収することから始まる光合成電子伝達系は、人工光合成を目指す多くの研究者によってその過程が解明されつつある。光合成は、クロロフィルにより太陽からの光エネルギーを効率良く化学エネルギーに変換する。
【０００３】
植物に由来するクロロフィルは、環境評価の重要な指標となる。例えば、環境水中のクロロフィル濃度は、水中の全窒素や全リン濃度および生体有機態炭素量を示す。そのため、クロロフィルの簡便かつ高感度・高精度な分析法の開発が強く望まれている。これまで、クロロフィルの定量は、主に、吸光光度法あるいは蛍光光度法などの分析法により行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記吸光光度法あるいは蛍光光度法においては、フェオフィチン等のクロロフィル分解生成物を分離しなければならない。従って、繁雑な操作を必要とした。また、これらの従来法では光源が必要であるため、光源の光量変動や、蛍光法では励起波長と蛍光波長の受光部での分離精度など、感度の面で高感度化に限界があった。
【０００５】
この発明は、従来の分析法の上述したような欠点を解決するためになされたもので、本発明の課題は、光源を用いない方法によりクロロフィルを簡便かつ高感度・高精度に分析できるクロロフィル定量方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前述の課題を解決するため、請求項１の発明では、クロロフィルを抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムをそれぞれ所定の濃度となるように添加した後、過酸化水素を添加しクロロフィルを酸化して生じる化学発光の化学発光強度を測定し、クロロフィル濃度と化学発光強度との相関について予め測定された検量結果に基づいて、試料液中のクロロフィル濃度を定量することとし、請求項２ないし７の発明では、さらに具体的かつ最適な方法を特定する。
【０００７】
例えば、アセトン中に抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムを、好ましくはそれぞれ３０〜５０ｖｏｌ％、２．５×１０−４〜５．０×１０−４Ｍ（Ｍｏｌ／ｌ）となるように添加した後、過酸化水素を好ましくは０．１〜０．２Ｍ（Ｍｏｌ／ｌ）となるように添加し、クロロフィルを酸化して生じる化学発光量から試料液中のクロロフィル濃度を定量することとした。その際、試料中の水分量を好ましくは７〜１２ｖｏｌ％とすることによって最大発光量が得られるようにする。また、クロロフィルの化学発光強度は、過酸化水素添加直後に生じる発光ピークの高さとする。
【０００８】
上記のような溶液中での化学発光反応を利用する化学発光分析法の最大の特徴は、簡便な装置で高い感度が得られることである。しかし、化学発光分析法を他の高感度な発光法である蛍光分析法や汎用されている吸光光度法と比較すると、分析法としての利用頻度にかなりの差があるのが実状である。これは、既存の化学発光反応が選択性に欠けるとともに、利用できる化学発光反応系の絶対数が少ないことに起因している。
【０００９】
この発明は、クロロフィルが、アセトニトリルと水酸化ナトリウム存在下で過酸化水素で酸化すると強い化学発光が生じること、に着目してなされたもので、上記各数値限定の範囲は、クロロフィル定量法として最適な範囲を示す。
【００１０】
上記化学発光分析法によれば、励起光源を必要としないため簡便な装置で測定ができる。また、吸光光度法、蛍光分析に比べ高感度となる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
図面に基づき、本発明の実施の形態について以下にのべる。
【００１２】
（実施例１：前処理条件の最適化）
クロロフィルａを発光基質とする反応系の検討を行ったところ、アセトニトリルと水酸化ナトリウム存在下、過酸化水素添加（０．１３Ｍ）によりクロロフィルａを酸化すると強い化学発光が得られることを見い出した。図１にクロロフィルａより得られた化学発光シグナルを示す。図１中（ａ）のチャートは、クロロフィルａの濃度が０ｎｇ／ｍＬの時の化学発光シグナルの経時変化を示す。（ｂ）のチャートは、クロロフィルａの濃度が１８ｎｇ／ｍＬ（３×１０−８Ｍ）の時のシグナルの経時変化を示すもので、反応開始後、約１分間以内に鋭いピークが認められた（チャート速度５ｍｍ  ／  ｍｉｎ）。
アセトニトリルと水酸化ナトリウム共存下、クロロフィルを過酸化水素により酸化することで得られる化学発光（クロロフィル化学発光）の各因子（アセトニトリル濃度、水酸化ナトリウム濃度、過酸化水素濃度、水分率）の最適条件の設定を下記のように行った。
【００１３】
先ず、アセトンと混合させる極性溶媒の種類について検討した。表１は、［クロロフィルａ］＝３×１０−８Ｍ、［ＮａＯＨ］＝４．３×１０−４Ｍ、［Ｈ２Ｏ２］＝０．１３Ｍとしたときの種々の極性溶媒３４ｖｏｌ％におけるクロロフィルａの化学発光強度を比較したものである。
【００１４】
【表１】
0003594287.tif 000002
この結果から明らかなように、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を用いた場合のみ、特異的に強い化学発光が得られた。これは、図２の反応スキームに示されるように、反応系に添加されたアセトニトリルは、過酸化水素と反応しＯ２−の生成を導き、他の極性溶媒を用いた場合には殆どＯ２−の生成がないために、化学発光に際が生じたものと考えられる。
反応系におけるアセトニトリルの濃度を変化させた時の影響を図３に示す。図３において、クロロフィルａ濃度は３×１０−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０−４Ｍである。最大レベルの化学発光強度は、アセトニトリルが３０〜５０ｖｏｌ％のほぼ平坦領域として観測された。
【００１５】
反応系における過酸化水素濃度の影響を図４に示す。図４において、クロロフィルａ濃度は３×１０−８Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。化学発光強度は過酸化水素濃度０．１Ｍまで急激に増加し、０．１〜０．２Ｍの領域（極大点０．１３Ｍ）で最大発光強度が観測された。極大値以上の濃度では発光強度の減少が見られた。
【００１６】
図５に水酸化ナトリウム濃度を変化させた時の化学発光強度の影響を示す。図５において、クロロフィルａ濃度は３×１０−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。水酸化ナトリウム濃度は２．５×１０−４〜５×１０−４Ｍの間で化学発光量は最大となり、この時の反応系のｐＨは１１程度である。水酸化物イオンは図２に示したようにアセトニトリルとＨ２Ｏ２の反応により生じたＨＯＯからＯ２−を導いている。５×１０−４Ｍ以上では溶液の白濁が観測され、５×１０−４Ｍ以上での化学発光強度の減少はアセトン−アセトニトリル溶媒における水酸化ナトリウムの塩析による影響と考えられる。
【００１７】
反応系における水分率の影響を検討した結果を図６に示す。図６において、クロロフィルａ濃度は３×１０−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。反応溶液中の水の量が増加するに従って、化学発光シグナルが急増し、７〜１２ｖｏｌ％で発光量のピークが見られた。
以上の結果をまとめると、極性溶媒としてアセトニトリルを用い、アセトニトリル３０〜５０ｖｏｌ％、水酸化ナトリウム濃度２．５×１０−４〜５×１０−４Ｍ、水分量７〜１２ｖｏｌ％、過酸化水素濃度０．１〜０．２Ｍとなるように、クロロフィルのアセトン抽出試料に添加することによって、クロロフィルの最大化学発光量が得られる。
クロロフィルと化学的構造が似ており、かつ自然界に広く分布するものに、ポルフィリンがある。本発明の反応のクロロフィル特異性を調べるため、クロロフィルで最大化学発光量の得られる条件で種々のポルフィリン化合物による化学発光の検討を行った。
【００１８】
種々のポルフィリン類、クロロフィル類により得られた化学発光強度の結果を表２に示す。また、検討を行ったポルフィリン化合物の構造を図７に示す。
【００１９】
【表２】
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最大の化学発光強度は、クロロフィルａおよびｂにより得られた。クロロフィルａの中心金属イオンであるマグネシウムの脱離したフェオフィチンａとさらにフィトール基の解離したフェオフォルバイドａでは弱い化学発光が観測された。ポルフィン環を有した化合物はいずれも強い化学発光を示さなかった。また、テトラピロール鎖からなるビリルビンも非常に弱い化学発光強度を示しただけであった。しかし、コプロ−、ウロポルフィリンでは微弱発光が長時間（２時間以上）観測された。
【００２０】
表２に示されているように今回、使用された合成ポルフィリンＴＰＰ（ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＣＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＨＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＭＰｙＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−４−ｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＳＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、Ｍｇ−ＴＳＰＰでは、殆ど化学発光が観測されなかった。クロロフィル類縁体であるクロリンｅ６とその亜鉛錯体であるＺｎ−クロリンｅ６は比較的大きな化学発光を示した。
【００２１】
図８にクロロフィルａの化学発光スペクトルを示す。図８において、過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。得られた化学発光スペクトルの極大波長はよく知られた蛍光スペクトルの極大波長６８０ｎｍと異なり、化学発光スペクトルでは３０ｎｍ〜５０ｎｍブルーシフトしている。また、発光スペクトル全体の形状も異なる。このことより、本反応系で生じた励起生成物（発光体）はクロロフィル自身ではなく反応生成物、つまりクロロフィル分解物であることが予測できる。
【００２２】
図９にクロロフィルｂの化学発光スペクトルを示す。図９において、過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。クロリン環の第３位にアルデヒド基を持つクロロフィルｂは、アルデヒドの電子吸引性により１８ｐ電子系の電子移動が抑制されている。そのため、クロロフィルａとは異なった分光特性を持っている。クロロフィルｂでも、蛍光スペクトルと化学発光スペクトルの間で大きな違いが観測された。したがって、クロロフィルｂにおいても発光化学種はクロロフィルｂの分解生成物であることが推定される。
【００２３】
以上のことから、この化学発光反応がポルフィリン類縁体の中でクロロフィルに特異的である理由として、３つのことが上げられる。１つは、クロロフィルがクロリン環骨格を有しているためである。図１０にクロリン環とポルフィン環の構造式を示したが、クロリン環はポルフィン環と比較して二重結合が一つ少ないため、共鳴系の広がりが小さく、共鳴安定性がポルフィン環に比べて低く分解し易い。そのためＯ２−の付加反応による１，  ２−ジオキセタン誘導体（１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が生成しやすい。
【００２４】
２つ目は、クロロフィルの中心金属であるマグネシウムにより発光体の蛍光強度および蛍光量子収率が増加するためである。一般にポルフィリン化合物は、マグネシウムや亜鉛などの閉殻反磁性金属イオンと錯形成すると剛直性が増し、励起状態が安定化され蛍光強度の増加が観測される。クロロフィルａとフェオフィチンａの蛍光量子収率を比較しても約３倍、クロロフィルａが大きな値を持つ。
【００２５】
最後に、３つ目として、マグネシウムの正電荷の影響が考えられる。中心原子部分の正電荷の強さとクロロフィルと酸素分子の相互作用の大きさには相関性があることが知られている。本反応系で生成しているＯ２−との反応性もＯ２と同様にＭｇ（ＩＩ）錯体であるクロロフィルが大きくなり反応速度が大きくなったと考えられる。実際に、クロロフィルａとフェオフィチンａとの化学発光シグナルを比較すると極大ピークの出現時間が異なっている（クロロフィル０．５ｍｉｎ、フェオフィチン１ｍｉｎ、表２の条件）。
【００２６】
（実施例２：クロロフィル定量手順）
上記新しい特異的な化学発光系に基づいて、環境水中の超微量クロロフィルの定量を行うための手順を次に述べる。
【００２７】
湖水、河川水、海水等の環境試料水０．５  〜  ３  ｄｍ３をガラス繊維フィルターでろ過する。フィルター上のアオコ等の残留物を１０  ｍｌアセトンで粉砕し抽出する。その後、遠心分離（２０００ｒｐｍ，  １５ｍｉｎ）により浮遊物を除去し、上澄み液をクロロフィルを含む試料とする。その後、化学発光用ガラス製試験管にクロロフィルを含む試料２５０  ｌを注入し、アセトニトリル１６０  ｌ、５  ｘ  １０−３Ｍ  ＮａＯＨ水溶液４０  ｌを入れ化学発光装置のセルホルダーにセットする。アセトニトリルで３Ｍに調製した過酸化水素２０  ｌを注入し反応を開始させ、注入して数秒後に現れる化学発光シグナルを測定する。
【００２８】
なお、クロロフィルａ、ｂをそれぞれ測定する時は、ペーパーあるいは薄層クロマトグラフィーにより分離後測定する。本操作では分離中に起こる変性の少ないＣ１８修飾シリカを固定相とする逆相薄層クロマトグラフィーで分離を行った。展開溶媒としては、メタノール−石油ベンジン溶媒系（８  ：  ２）が適する。
【００２９】
クロロフィル化学発光系に金属イオンおよび蛍光物質を共存させた時の影響を検討した。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
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本反応系ではアセトニトリルと過酸化水素が反応しＯ２−が生成する。そのため、多くの化学発光系（ルミノールＣＬ、ルシゲニンＣＬなど）に見られるような金属イオンによる触媒作用は見られなかった。鉄（ＩＩ）によるフェントン反応や他の遷移金属イオンと過酸化水素の反応による大きな影響は観測されなかったが、多少の化学発光強度の減少が観測された。しかし、アセトニトリルが反応系に３４ｖｏｌ％存在しており図２の反応が進行するため大きな妨害にはならなかった。金属イオンについては、環境水のろ過により完全な除去が可能である。
【００３１】
蛍光物質の影響はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、９，１０−ｄｉｐｈｅｎｙｌａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、９，１０−ｂｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌ）−  ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、において見られなかった。ＲｈｏｒｄａｍｉｎｅＢでは同条件においてキサンテン系色素による化学発光が進むため発光強度の増加が見られた。ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎなどの蛍光物質による発光が見られなかったことより本反応系が色素増感発光ではないことがわかる。
【００３２】
クロロフィルａ、ｂ標準溶液により得られた検量線を図１１，  図１２に示す。図１１，  図１２において、光電子増倍管の印加電圧は、８００Ｖとした。最適条件下でクロロフィルａ、ｂの検量線を作成した結果、それぞれ０．９０  ｎｇ／ｍｌ〜  ９．０  ｇ／ｍｌ、０．７２  ｎｇ／ｍｌ〜  ９．０  ｇ／ｍｌの範囲で良好な直線が得られた。相関係数は０．９９９であった。クロロフィルａ濃度１８  ｎｇ／ｍｌにおける相対標準偏差は２．５２％（８回測定）であった。
【００３３】
前記手順と、上記検量線に基づいて、実際の測定対象とする例えば環境水中のクロロフィル濃度を、簡便かつ高精度に定量することができる。
【００３４】
【発明の効果】
上記のとおり、請求項１ないし７の発明によれば、クロロフィルを抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムをそれぞれ所定の濃度となるように添加した後、過酸化水素を添加しクロロフィルを酸化して生じる化学発光の化学発光強度を測定し、クロロフィル濃度と化学発光強度との相関について予め測定された検量結果に基づいて、試料液中のクロロフィル濃度を定量することとしたので、従来のように、光源を用いることなく、簡便かつ高感度・高精度にクロロフィルの濃度を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】クロロフィルａの化学発光信号を示す図である。
【図２】アセトニトリル中におけるＯ２−  ラジカルの生成反応スキームを示す図である。
【図３】クロロフィルの化学発光強度に対するアセトニトリル濃度の影響を示す図である。
【図４】クロロフィルの化学発光強度に対する過酸化水素濃度の影響を示す図である。
【図５】クロロフィルの化学発光強度に対する水酸化ナトリウム濃度の影響を示す図である。
【図６】クロロフィルの化学発光強度に対する水分量の影響を示す図である。
【図７】この発明の実施例で用いたポルフィリン化合物の化学構造を示す図である。
【図８】クロロフィルａの化学発光スペクトルを示す図である。
【図９】クロロフィルｂの化学発光スペクトルを示す図である。
【図１０】クロリン環とポルフィン環の共鳴状態の違いを示す図である。
【図１１】クロロフィルａの検量線を示す図である。
【図１２】クロロフィルｂの検量線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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