(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１１】
0003589685.tif 000014
（式中、
Ｒ１は水素原子または保護されていてもよい水酸基を、Ｒ２は水素原子または水酸基が保護されていてもよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、またはＲ１とＲ２で二重結合を形成するかエポキシ環を形成することを示す。
Ｒ３は水素原子または保護基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ水素原子を示すか、Ｒ４とＲ５、Ｒ６とＲ７の一方もしくは両方が二重結合を形成しているか、Ｒ５とＲ６で二重結合を形成し、Ｒ４とＲ７で共役二重結合を保護し得るジエノファイルと結合していることを示す。
ＸはＣＨ２または酸素原子を示す。）
で表される化合物の２５位を水酸化するストレプトマイセス属の放線菌菌体またはその培養液に一般式（Ｉ）で表される化合物を加え２５位の水素原子を水酸基に変換する事を特徴とする２５−ヒドロキシステロイド類の製造方法。
【請求項２】
ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセス・スペシイズ ＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＨＢ１０３）（微生物の保管受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１８）である請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はステロイド類の２５位を生物学的に水酸化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロイド化合物は、その構造が複雑で取り扱いにくい為適切な化学処理を施すのが困難であり化学的にステロイド化合物の２５位を水酸化するには多くの部位を保護し、細かい注意を払いながら煩雑な作業を行わなければならない。
【０００３】
一方、酵素化学的に２５位に水酸基を導入する方法に関しては、動物臓器内の酵素を用いたビタミンＤ類の２５位水酸化法（ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティケーション［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．］第４８巻  ２０３２〜２０３７  １９６９）や放線菌類の菌体内酵素を用いたビタミンＤ類の２５位水酸化方法が報告されている（特公平４−６４６７８）。
【０００４】
微生物を用いた方法ではビタミンＤ類の２５位水酸化方法が報告されている（特公平４−６４６７８）がこれらの報告はビタミンＤ類についてであって、その閉環構造であるステロイド類についてのものではなく、微生物を用いステロイド類の２５位を直接水酸化する方法に付いては未だ報告がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ビタミンＤ類の毒性は一般に高くその取扱いには細心の注意を払わねばならい。また、ビタミンＤ類は安定性に欠け、生成物の２５位水酸化物は結晶性も悪く、その精製は困難である。
【０００６】
本発明は、基質として安価で、毒性が低く、生成物の精製も容易な、コレステロール類の２５位、さらには側鎖を有するステロイド類の２５位を、より容易な方法で水酸化する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ある種の微生物好ましくは放線菌を利用することにより側鎖を有するステロイド類の２５位に直接水酸基を導入することができることを見いだし本発明を完成した。用いる放線菌としてはストレプトマイセス属またはアクチノミセス属が好ましい。本発明に使用される微生物としては例えば本発明者らが、埼玉県春日部市の土壌から分離した放線菌の一菌株ストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＨＢ１０３）「微生物の保管受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１８」があげられる。ＨＢ−１０３はステロイド構造に関係なくステロイドの２５位の水素原子を水酸基に変換する事ができる。
【０００８】
すなわち本発明は、ステロイド類を直接水酸化する能力を有する放線菌の菌体叉は培養液中に側鎖を有するステロイドを加え直接水酸化する事を特徴とする２５−ヒドロキシステロイド類の製造方法である。
【０００９】
本発明は、側鎖を有するステロイド類の２５位を直接水酸化する方法で基質となるステロイド類は２５位が炭素原子であれば、他の炭素原子はいずれの元素でもよい。たとえば、２２位の炭素原子が酸素原子、イオウ原子、窒素原子などでも良い。また２５位以外に置換基として、低級アルキル基、環状炭化水素基、トリアゾリンなどのヘテロ環基、保護されていてもよい、水酸基、アミノ基、ヒドロキシ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルコキシ基、アシル基などを有していてもよい。またステロイド骨格中に１以上の不飽和結合を有していてもよく、さらにその不飽和結合が酸化されたエポキシ環を有していてもよい。
【００１０】
好ましくは一般式（Ｉ）
【化１】
0003589685.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子または保護されていてもよい水酸基を、Ｒ２は水素原子または水酸基が保護されていてもよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、またはＲ１とＲ２で二重結合を形成するかエポキシ環を形成することを示す。Ｒ３は水素原子または保護基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ水素原子を示すか、Ｒ４とＲ５、Ｒ６とＲ７の一方もしくは両方が二重結合を形成しているか、Ｒ５とＲ６で二重結合を形成し、Ｒ４とＲ７で共役二重結合を保護し得るジエノファイルと結合していることを示す。ＸはＣＨ２または酸素原子を示す。）で示される化合物である。
【００１１】
式中の保護基としては、例えば、アセチル基、ピバロイル基、メトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基などのアシル基、メチル基、メトキシメチル基などの置換されていてもよいアルキル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などの置換シリル基などがあげられ、好ましくはトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基などがあげられる。
【００１２】
また、共役二重結合を保護し得るジエノファイルとしては、一般式（ＩＩ）
【化２】
0003589685.tif 000003
（式中ＡおよびＢは、同一または異なる基で１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表すか、あるいはＡとＢとは一緒にフェニルイミノ基またはｏ−フェニレン基を表す。Ｙは窒素原子またはメチン基（＝ＣＨ−）を表す。）で示される化合物が用いられ、好ましくは、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン、マレイン酸ジエチルなどが用いられる。
【００１３】
本発明の方法が適用できる化合物としては、たとえばコレステロール、１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β−オール、３β−ヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエン、１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β−オール、１α，２α−エポキシ−３β−ヒドロキシ−５，７−コレスタジエン、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオール、２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール等があげられる。
【００１４】
本発明の方法によるとステロイド中の水酸基の位置あるいは水酸基の数に関係なく２５位を水酸化しさらに二重結合の位置あるいは数に関係なく２５位を直接水酸化することができる。
【００１５】
ストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３の菌学的性状を以下に示す。
菌学的性状
１）形態
４種の寒天培地（ＩＳＰ  Ｎｏ．２，３，４，５：放線菌学会指定）上にて２７℃、２週間成育させた後観察した。菌糸の形状は０．５〜０．６μｍの太さで、直鎖状であり、菌糸の分岐法は気菌糸および基底菌糸ともに分岐は認められない。胞子の形状は空中に伸びた気菌糸が分断し、短桿状の胞子を形成する。その後、培養が進むにつれて膨潤して球状を呈するが、球状化に順序はなく一本の鎖状に桿状と球状が入り混じった不規則な形態を呈する。なお胞子の表面は平滑である。
【００１６】
２）培地上での生育状態
ＩＳＰ  Ｎｏ．２，３，４，５培地で２７℃培養し２週間観察しその結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
0003589685.tif 000004
【００１８】
３）生理学的性状
（１）生育温度範囲
ＩＳＰ  Ｎｏ．２培地で１８〜３３℃の範囲で良好に生育する。１７℃以下、３６℃以上の温度範囲では生育しない。
（２）生化学的性質
ａ）好気性、嫌気性の区別；好気性
ｂ）ゼラチンの変化      ；なし
ｃ）脱脂乳の凝固        ；なし
ｄ）脱脂乳のペプトン化  ；なし
ｅ）スターチの加水分解  ；有り（ＩＳＰ  Ｎｏ．４）
ｆ）メラニン様色素の生成；なし（ＩＳＰ  Ｎｏ．６，７）
ｇ）細胞壁タイプ        ；ＩＡ（ＬＬ−Ａ２ｐｍ）
（３）炭素源の利用
ＩＳＰ  Ｎｏ．９培地による調査において下記の全ての炭素源を利用する。
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−キシロース、ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−マンニトール、シュクロース、ラフィノース、ラムノース
ただし、ラフィノース、ラムノースは炭素源無添加の場合と同程度であった。以上の培養性状、細胞壁組成などから放線菌に属するものと思われるが、胞子鎖の特異な形状や温度感受性などから既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の菌株中に同定の候補となるものが見出せず、本菌株をストレプトマイセス・スペイシズＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＨＢ１０３）と命名した。
【００１９】
本発明の製造方法は本菌を好気的条件下で培養し、基質を好気的条件下で反応を行なう。
【００２０】
本発明の培養方法は主に液体培養法を用いる。培地としては炭素源としてグルコース、ラクトース、シュクロース、スターチ、グリセリンなどを単独叉は混合して用いる。窒素源としてはきな粉、粉末酵母、肉エキス、コーンスターチリカー、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキスなどを単独叉は混合して用いる。その他微量成分として無機塩類、有機化合物を用いる。培養法としては振とう培養法、通気攪拌培養法が適している。培養温度は２５〜３７℃、培養日数は１〜８日間である。
【００２１】
本発明の２５位水酸化反応に用いる菌体は培養液そのままか、培養液を集菌し菌体を緩衝液で洗浄し緩衝液でけん濁するか、凍結菌体を緩衝液でけん濁して用いる。用いるけん濁液は生理食塩水、シュクロース溶液、ＰＢＳ−、トリス−塩酸などの緩衝液を用い、反応に必要な無機塩類及び有機化合物を添加して用いる。
【００２２】
本発明の基質添加方法は粉末のままか、水溶性有機溶剤に溶解するか、界面活性剤等でけん濁して反応液に添加する。基質の添加量は反応液１ｍｌ当たり０．１〜１０ｍｇ添加して行なう。基質添加後の反応条件は振とう、通気攪拌の様な好気条件下で反応温度２５〜３７℃、反応時間３０分〜９６時間行なう。
【００２３】
反応終了後生成した２５−ヒドロキシステロイド類は常法により精製することができる。たとえば反応液を有機溶剤で抽出し脱水、濃縮しシリカゲルクロマトグラフィーを行い次に逆層カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ基質に対応する２５−ヒドロキシステロイド類を精製する。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により容易に一段階で直接ステロイド類の２５位を水酸化することが可能になり、各種の２５−ヒドロキシステロイド類を安価に供給することが可能となった。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるものではない。
【００２６】
【実施例１】
２５−ヒドロキシコレステロールの合成
ショ糖１％、きな粉２％、乾燥ブイヨン１％（栄研製）、炭酸カルシウム０．２％からなる培地（以下培地Ａと略す）５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え、１２０℃、１５分間加圧滅菌しこれにストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＨＢ１０３）を一白金耳接種し、３０℃、２０５ｒｐｍで３日間振とう培養する。次に培地Ａ５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに加え加圧滅菌したフラスコ２０本に上記条件で培養した種母菌１ｍｌをそれぞれ移植し３０℃、２０５ｒｐｍで４８時間振とう培養する。培養終了後、培養液を遠心分離し菌体を集菌し、１ＬのＰＢＳ−で懸濁し、この懸濁液を再び遠心分離し、菌体を集菌する。集菌した菌体を８００ｍｌのＰＢＳ−で懸濁し４０ｍｌずつ５００ｍｌ三角フラスコに分注し、この５００ｍｌ三角フラスコにそれぞれ４０ｍｇのコレステロールを粉末のままで添加し、３０℃、２０５ｒｐｍ、２４時間振とうし、変換培養を行なう。変換培養後、培養液を集め遠心分離し、遠沈物にエタノール４００ｍｌを加え抽出、抽出後、遠心分離し遠沈残渣にさらにエタノール４００ｍｌを加え抽出、抽出後遠心分離し、先のエタノール抽出液と合わせ５０℃以下で減圧濃縮した。濃縮後、酢酸エチル２００ｍｌで２回抽出、無水硫酸マグネシウムで脱水、脱水後ろ過し５０℃以下で減圧濃縮乾固した。
【００２７】
次に、３０ｇのシリカゲルを塩化メチレンで充填したカラムに濃縮乾固物を少量の塩化メチレンに溶解しカラム上端に吸着させ塩化メチレン２００ｍｌ、エタノール：塩化メチレン＝１：９  ２００ｍｌを展開し溶出する。溶質分画をＴＬＣで展開、（ＴＬＣ：メルク社製Ａｒｔ．５７１５  展開溶剤；エタノール：塩化メチレン＝１：１９  発色；２％硫酸）標品２５−ヒドロキシコレステロール（自社合成品）と同一のＲｆ値（０．１５）を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮した。濃縮物を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記す）にて２５−ヒドロキシコレステロールを分離した。
0003589685.tif 000005
標品と同一の溶出時間（１９．６分）示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、７．２ｍｇ（変換率０．９％）の２５−ヒドロキシコレステロールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２５−ヒドロキシコレステロールであることを確認した。
【００２８】
【図１】
【００２９】
【実施例２】
１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで７時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．２５）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃度乾固物をＨＰＬＣにて１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを分離した。
0003589685.tif 000006
標品と同一の溶出時間（３２．１分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、８．２ｍｇ（変換率１０．２％）の１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンであることを確認した。
【００３０】
【図２】
【００３１】
【実施例３】
２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで２２時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．０５）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを分離した。
0003589685.tif 000007
標品と同一の溶出時間（２９．３分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．８％）の２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンであることを確認した。
【００３２】
【図３】
【００３３】
【実施例４】
５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオールの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β−オール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４１）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオールを分離した。
0003589685.tif 000008
標品と同一の溶出時間（２６．３分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、１６．１ｍｇ（変換率２０．１％）の５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオールであることを確認した。
【００３４】
【図４】
【００３５】
【実施例５】
３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンの合成実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に３β−ヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４８）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンを分離した。
0003589685.tif 000009
標品と同一の溶出時間（１４．８分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、４．０ｍｇ（変換率２．５％）の３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンであることを確認した。
【００３６】
【図５】
【００３７】
【実施例６】
１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β−オール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．３５）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを分離した。
0003589685.tif 000010
標品と同一の溶出時間（２１．９分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、１４．２ｍｇ（変換率１７．１％）の１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールであることを確認した。
【００３８】
【図６】
【００３９】
【実施例７】
１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエンの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に１α，２α−エポキシ−３β−ヒドロキシ−５，７−コレスタジエン２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで８時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエン標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．４４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを分離した。
0003589685.tif 000011
標品と同一の溶出時間（９．９分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、１３．４ｍｇ（変換率１６．７％）の１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエンを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエンであることを確認した。
【００４０】
【図７】
【００４１】
【実施例８】
２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．１４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールを分離した。
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標品と同一の溶出時間（２１．２分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、１７．２ｍｇ（変換率２１．５％）の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールであることを確認した。
【００４２】
【図８】
【００４３】
【実施例９】
２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールの合成
実施例１と同条件でストレプトマイセス・スペシイズＨＢ−１０３菌を培養、集菌、ＰＢＳ−で洗浄しＰＢＳ−で懸濁した４０ｍｌの入った５００ｍｌ三角フラスコ２０本を作成。この２０本に２０（Ｓ）−（３−メチルブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール２０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液０．２ｍｌをそれぞれに添加し３０℃、２０５ｒｐｍで９時間振とう変換培養した。変換培養後、実施例１と同条件でエタノール抽出しシリカゲルクロマトを行ないＴＬＣ（実施例１と同条件）で２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオール標品（自社合成品）と同一のＲｆ（０．１４）値を示す分画を集め５０℃以下で減圧濃縮乾固した。この濃縮乾固物をＨＰＬＣにて２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールを分離した。
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標品と同一の溶出時間（２３．５分）を示す分画を集め５０℃以下で濃縮乾固、７．３ｍｇ（変換率９．１％）の２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールを得た。この分離物の核磁気共鳴、及びマススペクトルを測定し構造解析を行ない分離物が２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールであることを確認した。
【００４４】
【図９】
【図面の簡単な説明】
【図１】２５−ヒドロキシコレステロールのＮＭＲチャートである。
【図２】１α  ３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンのＮＭＲチャートである。
【図３】２β−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−５，７−コレスタジエンのＮＭＲチャートである。
【図４】５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フエニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−１，６−コレスタジエン−３β，２５−ジオールのＮＭＲチャートである。
【図５】３β，２５−ジヒドロキシ−１，５，７−コレスタトリエンのＮＭＲチャートである。
【図６】１α，２α−エポキシ−５α，８α−（３，５−ジオキソ−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリジノ）−６−コレステン−３β，２５−ジオールのＮＭＲチャートである。
【図７】１α，２α−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシ−５，７−コレスタジエンのＮＭＲチャートである。
【図８】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５，７−ジエン−１α，３β−ジオールのＮＭＲチャートである。
【図９】２０（Ｓ）−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルオキシ）−プレグナ−５−エン−１α，３β−ジオールのＮＭＲチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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