(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用重合体ヒドロゲルにおいて、該ヒドロゲルが（ａ）Ｎ−置換メタクリルアミドもしくはアクリルアミド、（ｂ）架橋剤、および（ｃ）二重結合が導入されたグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンから選択される複合糖、二重結合が導入されたＮ−アセチルノイラミン酸およびポリシアリン酸から選択される糖誘導体、ならびに配列Arg−Gly−Asp,Ile−Lys−Val−Ala−Val,またはTyr−Ile−Gly−Ser−Argを含む二重結合が導入された組織接着オリゴペプチドから選択される組織接着ペプチドからなる群から選ばれる共重合性物質の共重合体であり、該重合体ヒドロゲルが異質性で、弾性的に変形可能で、少なくとも80％の平衡含水率を有する、前記治療用重合体ヒドロゲル。
【請求項２】
（ａ）該Ｎ−置換メタクリルアミドもしくはアクリルアミドがＮ−モノアルキルおよびN,N−ジアルキルメタクリルアミドおよびアクリルアミドからなる群から選ばれ、（ｃ）該重合性物質が二重結合が導入されたグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびノイラミン酸のＮ−アセチル誘導体からなる群から選ばれる糖である、請求項１に記載の重合体ヒドロゲル。
【請求項３】
（ａ）架橋剤を遊離基重合開始剤とともに溶媒に溶解して溶液を作り、（ｂ）Ｎ−置換メタクリルアミドもしくはアクリルアミドを（ａ）で得られた溶液に添加して混合物を作り、（ｃ）二重結合が導入されたグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンから選択される複合糖、二重結合が導入されたＮ−アセチルノイラミン酸およびポリシアリン酸から選択される糖誘導体、ならびに配列Arg−Gly−Asp,Ile−Lys−Val−Ala−Val,またはTyr−Ile−Gly−Ser−Argを含む二重結合が導入された組織接着オリゴペプチドから選択される組織接着ペプチドからなる群から選ばれる共重合性物質の溶液を、該重合体ヒドロゲルを与えるのに有効な条件下で、（ｂ）で得られた混合物に添加することからなる、請求項１または２に記載の治療用重合体ヒドロゲルを調製する方法。
【請求項４】
アゾビスイソブチロニトリルとメチレンビスアクリルアミドとを該溶媒に溶解して溶液を作り、該溶液をＮ−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドと混合し、二重結合が導入されたグルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルノイラミン酸をそこへ添加し、低分子量の残留生成物とそれから生じる開始剤痕跡を除去することからなる、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は重合体ヒドロゲルに関する。さらに詳細には、本発明は、例えば、軟弱な器官のいずれかの部分の内部組織の交換、傷治療、組織の再生、特に発達する成人の神経系における器官の一般的修復、および他の同様の治療などに使用できる治療用多孔質移植可能重合体ヒドロゲルに関する。本発明は特に重合体ヒドロゲルに向けられるが、これは移植されると生物流体と分子の充填する多孔質マトリックスになりいわゆる器官様ヒドロゲルを形成し、その後の組織や血管の内方生長により宿主に次第に一体化する。本発明はさらに、三次元細胞培養や組織再建に有用なバイオハイブリッド物質を産生するための生組織細胞、先駆体細胞、またはそのような重合体ヒドロゲル内で遺伝学的に改質された細胞を導入する方法に関する。本発明はさらに、本発明の重合体ヒドロゲルの製造方法、上記方法により産生されるバイオハイブリッド物質に関する。最後に、本発明は中枢神経系、特に脊髄および視神経、末梢神経、または本発明の重合体ヒドロゲルやビオハイブリッド物質を移植したことによる他の組織の損傷部分の治療方法に関する。
背景技術
臓器移植は現在では臓器不全を緩和し、臓器の機能と性能を回復または改善するための唯一の代案である。しかし、臓器移植治療の欠陥として、提供者から被提供者への病気感染の可能性、提供者の臓器不足と入手限定、免疫学上の交差反応の可能性などが挙げられる。
このように、例えば、脊髄移植は臨床的にも生物学的にも適したものではなく、したがってSCI患者にとって可能な治療はないのだが、一方合衆国だけでも25万人の慢性的麻痺患者がおり、毎年１万人の新たなSCI患者が増えている。
一方、欠けた細胞または組織器官の一部を修復するための体内への細胞の移植または投入は、宿主の器官と接触する一体構造へと組織拡大および組織化するために必要な組織骨組みとしての支持細胞外マトリックスの不足ゆえに、新しい組織の生成を適切になし得ない。さらに、細胞は移植後、高い細胞の生存能力と成長可能性を維持するために、栄養、酸素、体液および細胞成分の拡散を助長する生理学的に同等な環境に置かれる必要がある。
本発明の多孔質ヒドロゲルは、細胞組織の間にある流体や水で飽和された変形可能な多孔質重合体マトリックスであり、かくして機能的な新組織を得るために細胞が繁殖し、正しい組織構造で細胞上組織建築物へと集合するための必要な組織骨組みと水和空間を提供する。
脊髄（動物をモデルとして）の損傷を修復する試みとして、（１）生物学的組織および（２）人工器官物質と、大きく２つの移植組織群に分類される様々な移植物質を使っての脊髄移植の異なる実験的戦術が文献に開示されている。
（１）群に含まれるものには、胎児の神経組織などの脊髄の損傷を埋めるために共通遺伝型オートグラフト、あるいはホモグラフト、アログラフト、ゼノグラフトなど提供者の組織グラフトを、（ａ）固体グラフトとして（例、Bregman,Dev.Brain  Res.,34,265,1987;Houle  and  Reier,J.Comp.Neurol.,269,535,1988），または（ｂ）混合神経組織細胞を含む懸濁グラフトとして（例、Goldberg  and  Berstein,J.Neuroscience  Res.,19,34,1988;Hoovler  and  Wrathall,Acta  Neuropathol.,81,303,1991）；培養知覚ニューロンと組換えたSchwann細胞（Kuhlengel  et  al.,J.Comp.Neurol.,293,74,1990）；未熟星状細胞（例、Bernstein  and  Goldberg,Res.Neurol.Neurosci.,2,261,1991）；神経組織細胞の前駆体（Monteros  et  al.,Dev.Neurosci.,14,98,1992）、および不滅化確立細胞ライン（Zompa  el  al.,Int.J.Dev.Neurosci.,11,535,1993）；培養非ニューロン細胞を含む末梢神経セグメント（Wrathall  et  al.,Acta  Neuropathol.,57,59,1982）あるいは胎児の組織細胞（Horvat  et  al.,Res.Neurol.Neurosci.,2,289.1991）の使用がある。開示された（２）群の人工器官物質に含まれるものには、純コラーゲンマトリックス（de  la  Torre  and  Goldsmith  Brain  Res.,Bull.,35,418,1994;Marchand  and  Woerly,Neurosci.36,45,1990;Gelderg,Brain  Res.511,80,1990），含神経活性剤（Goldsmith  and  de  la  Torre,Brain  Res.,589,217,1992）あるいは含培養神経グラフト（Bernstein  and  Goldberg,Brain  Res.377,403,1986）；処理ニトロセルロース移植物質（Schreyer  and  Jones,Dev.Brain  Res.,35,291,1987;Houle  and  Johnson,Neurosci.Lett.103,17,1989）；コラーゲン移植物質（Paino  et  al.,Neurocytol.,23,433,1991）およびSchwann細胞を納めたポリ（アクリロニトリル−塩化ビニル）の重合体誘導チャンネル（Xu  et  al.,J.Comp.Neurol.,351,145,1995）がある。
これらのアプローチは、成長する軸索を支持および誘導するために、新しい軸索源として種々の組織基質を使用したり、複雑な人工器官基質を使用する軸索再生促進に著しく焦点を当てており、宿主組織の大部分の再生による脊髄や脳組織の臨床関連の問題や、例えば、負傷に伴う壊死または傷跡組織を除去した後の治癒する傷のリモデリングに向けていない。
重合体ヒドロゲルは神経系の移植物質として開示されている（Woerly  et  al.,Biomaterials,11,97,1990;Woerly  et  al.,Biomaterials,12,197,1991;Woerly  et  al.,J.Neural  Transpl.Plast.3,21,1992;Woerly  et  al.,Cell  Transpl.,2,229,1993;Woerly  et  al.,J.Neural  Transpl.Plast.5,245,1995）．これらのヒドロゲルは、過硫酸アンモニウム、メタ亜硫酸水素塩ナトリウムまたは過硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸をレドックス開始剤として使用して、水中でヒドロキシエチルメタクリレート（pHEMA）、グリシジルメタクリレート（pGMA）、もしくはＮ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（pHPMA）、または上記単量体とエチレングリコールとテトラエチレングリコールジメタクリレートもしくはメチレン−ビス−アクリルアミドである架橋剤との組成物との遊離基重合により調製された。これらのゲルは典型的には均質で、水銀ポロシメーターデータと走査エレクトロン鏡検法により示されるように、開放（入手しやすい気孔容積）および密閉気孔を含む二項の気孔性を有して光学的には透明である。典型的にはこれらのゲルの多孔構造は、平均気孔径が７〜13μｍの図１に示されるような円形断面の平行する円筒形細管からなる。分別気孔率はpHEMAヒドロゲルが50％から85％、pGMAヒドロゲルが60％から65％まで、pHPMAヒドロゲルが70％から94％までである。ヒドロゲルの気孔容積の少なくとも50％がpHEMAは1.2〜４μｍの気孔で、pGMAは６〜13μｍの気孔で、pHPMAは10〜14μｍの気孔で占められている。その生物学的活動はコラーゲンの架橋網状組織への導入あるいは共重合に依存することがわかった。出願人は脳への移植を実験したが、それによると、ある程度の組織修復は均質ゲルマトリックスへの組織の内方生長の程度により成就できることがわかった。この反応は単量体組成物と付加される官能基により変化する。しかし、均質ヒドロゲルはしばしば、移植物質を宿主から遊離する傾向がある繊維カプセルの生成を引き起こす。これは、生神経組織の機械的特質およびマクロ気孔の小容積画分に十分にマッチしないこれらのゲルの機械的特質によるものである。脊髄においては、これらの均質ヒドロゲルは宿主と一体化せず、図２に示すように、軸索と組織成分の貫通なしに、連結組織とグリアの傷跡により速やかにカプセル入りする。さらに、生成される表面積を限定する物理的考察、つまり、そのような均質ヒドロゲルにおいて円筒形気孔により生成される組織の相互作用の成功の重要なパラメーターがある。一定容積のゲルとしては、表面積はゲルの全容積を占める単独の気孔の最大半径という限定がある。一方、気孔サイズを低下することにより表面積を増加することは、組織内方生長とバイオマス堆積と両立しない全気孔率の低下に至るだろう。
Heavy  et  al.は、Brain  Res.,671,119,1995の中で、組織再生と軸索成長のために脳移植物質として使用されるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）の重合体スポンジを開示している。この製品は、組織バイオ接着剤としてSchwann細胞の含有後に、重合体網状組織にコラーゲンの追加とともに使用するのが最善である。
米国特許第4,902,295号には、膵臓組織細胞から人工組織を調製する方法が記載されている。その方法には、マトリックス前駆体、ゲル前駆体、および促進剤と生細胞との水性相における重合が含まれる。促進剤もすべての重合体前駆体も、体内へ速やかにバイオデグレーション（biodegration）できる生物学的化合物であり、移植後の長期安定性は有していない。
Bellamkonda,R.;Ranieri,J.P.;Bouche,N.;Aebischer,P.（“Hydrogel−Based  Three−dimensional  Matrix  for  Neural  Cells",J.Biomed.Mat.Res.1995,29,663−671）には、神経組織細胞をアガロースと細胞外同価（Matrigel▲Ｒ▼）ゲルへ固定する技術が記載されている。これらの物質は生物学的で微生物で分解できる。
Krewson,C.E;Chung,S.W.;Dai,W.;Saltzman,W.M.（“Cell  Aggregation  and  Neurite  Growth  in  Gels  of  Extracellular  Matrix  Molecules",Biotechnol.Bioeng.1994,43,555−562）には、PC12細胞をコラーゲンのみのまたはフィブロネクチンあるいはラミニンと結合したゲル、およびアガロースとコラーゲンのゲルに懸濁させる技術が記載されている。これらのゲルは微生物で分解できる。
Cascone,M.G.;Laus,M.;Ricci,D.;Sharbati  del  Guerra,R.（“Evaluation  of  Poly（vinyl  alcohol）Hydrogels  as  ａ  Component  of  Hybrid  Artificial  Tissues",J.Mat.Sci.Mat.Med.1995,6,71−75）には、物理的に架橋されたポリ（ビニルアルコール）ヒドロゲルを使用する技術が記載されているが、それには線維芽細胞が一凍結−霜解け周期で導入される。
Wald,H.K.;Sarakinos,G;Lyman,M.D.;Mikos,A.G.;Vacanti,J.P.;Langer,R.（“Cell  Seeding  in  Porous  Transplantation",Biomat.1993,14,270−278）には、肝細胞をポリ（Ｌ−乳酸）の分解されうる重合発泡体中にマイクロインジェクション技術により包む方法が記載されている。この技術は非分解マトリックスを提供しないし、重合体マトリックスを通じて均一な細胞分布を与えない。
Mikos,A.G.;Bao,Y.;Cima,L.G.;Ingber,D.E.;Vacanti,J.P.;Langer,R.（“Preparation  of  Poly（glycolic  acid）Bonded  Fiber  Structures  for  Cell  Attachment  and  Transplantation",J.Biomed.Mat.Res.1993,27,183−189）には、肝細胞を培養するために、ポリ（グリコール酸）が結合繊維と網状組織を構築する方法が記載されている。この重合体は微生物で分解でき、細胞をマトリックスに導入する方法は閉じ込めとは異なる。
Puerlacher,W.C.;Mooney,D.;Langer,R.;Upton,J.;Vacanti,J.P.;Vacanti,C.A.（“Design  of  Nasoseptal  Cartilage  Replacements  Synthetized  from  Biodegradable  Polymers  and  Chondrocytes",Biomat.1994,15,774−778）およびFreed,L.E.;Marquis,J.C.;Nohria,A.Emmanual;Mikos,A.G.;Langer,R.（“Neocartilage  Formation  in  Vitro  and  In  Vivo  Using  Cells  Cultured  on  Synthetic  Biodegradable  Polymers",J.Biomed.Mat.Res.1993,27,11−23）。これらの引例には、軟骨細胞をポリグリコール（PGA）もしくはポリ乳酸（PLLA）またはPGA−PLLAマトリックスに毛管作用により導入する方法が記載されている。この方法は微生物で分解できる重合体マトリックスを産生するが、一方細胞は重合体に均一に分布されず、細胞密度の制御はしない。
Cao,Y.;Vacanti,J.P.;Ma,X.;Paige;K.T.;Upton,J;Chowanski,Z.;Schloo,B.;Langer,R.;Vacanti,C.A.（“Generation  of  Neo−Tendon  Using  Synthetic  Polymers  Seeded  with  Tenocytes",Transpl.Proc.1994,26,3390−3391）には、腱細胞をポリグリコール酸の浮き出しの不織布メッシュに植え付ける方法が記載されている。
Mooney,D.J.;Park,S.;Kaufman,P.M.;Sano,K.;McNamara,K.;Vacanti,J.P.;Langer,R.（“Biodegradable  Sponge  for  Haptocyte  Transplantation",J.Biomed.Mat.Res.1995,29,959−965）およびTakeda,K.;Kim,T.H.;Lee,S.K.;Langer,R.;Vacanti,J.O.（“Hepatocyte  Transplantation  in  Biodegradable  Polymer  Scaffolds  Using  the  Baltimatian  Dog  model  of  Hyperuricosuria",Transpl.Proc.1995,27,635−636）には、肝細胞をポリグリコール酸重合体フィルトのシート、もしくはポリ乳酸とポリビニルアルコールおよびポリ乳酸ポリグリコール酸から製造した重合体のスポンジに吸着と毛管作用により吸収させる方法が記載されている。この方法は微生物で分解できる重合体マトリックスを産生するが、一方細胞は重合体に均一に分布されず、細胞密度の制御はしない。
Woerly,S.;Plant,G.W.;Harvey,A.R.（“Cultured  Rat  Neuronal  and  Glial  Cells  Entrapped  within  Hydrogel  Polymer  Matrices:A  Potential  Tool  for  Neural  Tissue  Replacement",Neurosci.Lett.1996,205,197−201）には、神経組織細胞をコラーゲンを付加基質として含むことのできるポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド］の均質移植重合体ゲル中に閉じ込める手順が開示されている。この手順には、細胞懸濁液の重合体混合物への添加と、細胞−重合体混合物の室温または37℃に維持される培養器での重合が含まれる。結果として得られるゲルは光学的に透明で、細胞は架橋ゲル内で無作為に分散される。免疫細胞化学研究は、生体外での６日後の細胞生存能力は０から６％の間で変化することを示した。
発明の開示
本発明の目的は、空間充填物質として、また組織の再生、形態発生、一体化した構造から器官へのリモデリングを刺激する足場構築物（scaffold builders）として働く非分解重合体ヒドロゲルのような非生物学的な人工装具を使用して従来技術の欠陥を防ぐことである。
本発明の別の目的は、組織治療を組織生成へと改善することで、それは安定した重合体マトリックス内で細胞増殖、細胞侵入および組織の組織化を制御することにより達成できる。
本発明の別の目的は、脊髄（SCI）および脳損傷もしくは発展性欠陥脊髄（二分脊椎）に苦しむ人々に大きな利益と重要な臨床的ならびに経済的影響をもたらす重合体マトリックスにより、組織再生を可能にすることである。
本発明の別の目的は、視覚神経と末梢神経の再生用重合体マトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、異方性多孔性構造、有効表面積、良好な組織接着力と相溶性をもち、軟組織構造、特に神経系における移植のために設計され、進行的に器官の一部となる非分解合成重合体ヒドロゲルマトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、制御された気孔構造を有し界面活性剤を含有する合成重合体マトリックスの治療的使用を可能にすることである。
本発明の主要な目的は、軟器官の修復のための組織再生用人工器官装具として膨脹した状態で使用される新規な水不溶性重合体ヒドロゲルからなる重合体マトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、最終的な人工器官装具の形を有する型でヒドロゲル製品を製造する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、従来技術の欠陥をひとつあるいはそれ以上克服することと、標準的な外科手順により脳や脊髄に移植することができる重合体神経人工器官を提供することである。
本発明の別の目的は、細胞または遺伝学的に改質された細胞を重合体網状組織に導入する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、生細胞と混合され、それにより重合体マトリックスの物理的特徴をヒドロゲル型挙動（気孔率、安定性、誘導表面、透過性）および細胞の生物学的要子（例、成長要子）と結び付ける、重合体混合物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、軟器官の組織の一部と交換するために使用できるビオハイブリッド装具を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、生体外で長期に渡って種々な細胞を培養するために使用できる三次元培養系を提供することである。
本発明の別の目的は、生物学的に活性の分子を組織または器官に取り付けるための支持マトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、細胞組織の間にある流体または水で飽和している変形可能な多孔質重合体マトリックスである多孔質ヒドロゲルを提供することであり、それにより機能的な新組織を与えるために細胞が繁殖し、正しい組織構造で細胞上組織構築物へと集合するための必要な組織骨組みと水和空間を提供する。
本発明の別の目的は、薬物や高分子、特にインドメタシンなどの抗炎症性物質、細菌性リポポリサッカライドなどのシトキン（cytokins）刺激剤、メチルプレニゾロンなどのステロイドおよび線維芽細胞成長因子などの神経活性因子、の制御された放出のためのシステム用成分を提供することである。
本発明の別の目的は、体内の軟組織交換、急速な付着と同時に止血に適する強力なバイオ接着性と止血特性を有する物質を提供することである。
本発明の主要な目的は、器官の一部交換においてマトリックス中に成長した新しい組織の網状組織を損なう減成を生じることなく、体内に長期に渡り移植を維持する機械的化学的安定性を有する重合体マトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、マトリックスの内部構造と機械的特性を変えることなくオペレーターが重合体マトリックスをカット、寸法決め、取扱いできる機械的コンプライアンスを有するマトリックスを提供することである。
本発明の別の目的は、CAMやL1分子などの接着分子、あるいはセマフォリンまたは適当な溶液に溶解したネトリンなどの誘導分子など本発明の目的のために有意義な量の生物学的利益を吸着でき、それにより該分子が次いで重合体マトリックスの網状組織の表面に吸着できる、水性媒体で高い膨脹能力を有する膨脹性物質を提供することである。
本発明により、弾性的に変形可能で、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも96％の平衡含水量を有する多孔質の、柔らかい、高吸着重合体マトリックスを形成できる新しい親水性高分子ヒドロゲルが提供される。
また本発明により、生細胞と混合できる重合体混合物が提供される。
本発明は治療用重合体ヒドロゲルであり、これは（ａ）Ｎ−置換メタクリルアミドまたはアクリルアミド、（ｂ）架橋剤、および（ｃ）糖、糖誘導体、組織接着ペプチド、骨形態発生プロテインなどの組織分化分子プロテインやリピド誘導体に対する抗体と結合した重合体からなる群から選ばれる重合物質の共重合体であって、弾性的に変形可能で、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも96％の平衡含水量を有する。
好ましくは、Ｎ−置換メタクリルアミドまたはアクリルアミド（ａ）は、Ｎ−モノアルキルおよびN,N−ジアルキルメタクリルアミドおよびアクリルアミド、架橋剤からなる群から選ばれ、（ｂ）はアクリルアミドまたはその前駆体と重合性物質を含み、（ｃ）はグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびノイラミン酸のＮ−アセチル誘導体とポリシアリン酸などのその重合形からなる群から選ばれる糖である。
本発明はまた、（ａ）架橋剤を遊基重合開始剤とともに気孔形成溶媒中に溶解して溶液を形成し、（ｂ）Ｎ−置換メタクリルアミドまたはアクリルアミドを（ａ）で得られた溶液に添加して混合物を形成し、（ｃ）糖、糖誘導体、組織接着ペプチド、形態発生プロテインもしくは誘導されたバイオ活性ペプチド、またはリピド誘導体に対する抗体と結合した重合体の溶液を（ｂ）で得られた混合物に添加することからなる治療用重合体ヒドロゲルを調製する方法に関する。
好ましい実施態様によれば、本方法はアゾ−ビスイソブチロニトリルとメチレンアクリルアミドを溶媒に溶解して溶液を形成し、その溶液をＮ−２（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドと混合し、グルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルノイラミン酸をそれに添加し、低分子残留生成物とそれから生じる開始剤痕跡を除去することからなる。
他の実施態様によれば、本方法は生組織細胞もしくは遺伝学的に改質された細胞を（ｃ）で得られた生成物に添加し、該生成物内で細胞の重合を実施することからなる。
さらに他の実施態様によれば、本発明による重合体ヒドロゲルは細胞もしくはそれと重合させた遺伝学的に改質された細胞を含む。
さらに他の実施態様によれば、本発明は人体もしくは動物の損傷大脳組織もしくは脊髄を除去し、損傷大脳組織もしくは脊髄を本発明による重合体ヒドロゲルと交換することからなる損傷大脳組織もしくは脊髄の治療方法に関する。
本発明によるヒドロゲルは、共有架橋させた、非透明の、異質性物質で、好ましくはヒドロゲルが宿主組織と接触するよう意図されている比較的粗大な気孔率（マクロ気孔）の領域と、内方生長する組織と接触するよう意図されている比較的細かい気孔率（メゾ気孔）の領域とを与えるように約１〜10、好ましくは３〜５μｍの重合体粒子からなる透明相分離構造を示す。
このことは結果として好ましくはマクロ気孔構造を有するスポンジ状構造；例えば、少なくとも80〜90％（ゲルの全容積に対する水銀侵入容積）の分別気孔率；ゲルの好ましくは数百平方メートル／グラムの範囲における比表面積；例えば、約15〜35μｍの中間気孔直径（容積）；ヒドロゲルの分別気孔率100％に相当する10μｍもしくはそれ以上の気孔の気孔容積；および20〜30μｍの超多孔質特性（ゲル容積の少なくとも50％のゲル分別多孔率）をもたらす。
ヒドロゲルのマクロ構造と気孔率は、組成物と使用される気孔形成溶媒の特性に依存する粒子のサイズと多孔質構造、重合体容積画分、重合体−溶媒の相互作用、重合温度、使用される架橋単量体の特性を制御することにより操作できる。バイオマス堆積と細胞の相互作用の成功は、重合体粒子のマイクロおよびメゾ気孔率から生じる水銀ポロシメーターデータが示すように、そのような最適表面／容積の相互作用から生まれる。
本物質の重要な最後の面はその開放性質と、バイオマス細胞堆積と生組織との細胞／分子相互作用とに適する内部連結性である。走査エレクトロン鏡検法の下では、図３に示されるように、これらの異質性ゲルは典型的に非円形気孔を有するコロイダル型三次元構造と、図面に示されるように、重合体凝結体の表面の接触により示される気孔系の壁を示す。有効表面積は粒子表面の気孔率の機能である。同族ゲルと対照的に、そのような異質性ゲルの主要利点は、粒子により生じた表面積が、表面積が凝結体（１）に反比例するように凝結体（１）のサイズが低下するにつれて、実質的に無制限である点である。また、同族ゲルと比較して、本発明の異質性ゲルははるかに大きな気孔容積を示し、したがって細胞侵入とバイオマス堆積にとってより有効である。さらに同族ゲルと比較して、本発明によるヒドロゲルは、成人の発達する神経組織の機械的コンプライアンス特性に匹敵する機械的コンプライアンス特性を有する。
これらのヒドロゲルマトリックスは、細胞相互作用がゲル構造、いわゆる類器官ヒドロゲルを通して組織化された組織の網状組織に帰するので、真の組織特殊構築物を有する。
重合体マトリックスは、下記成分のそれぞれの有効量を同時沈殿もしくは沈殿重合と架橋共重合させて形成できる：（ｉ）Ｎ−モノアルキルメタクリルアミドなどのＮ−置換メタクリルアミドもしくはＮ−モノアルキルアクリルアミドなどのＮ−置換アクリルアミド、またはN,N−ジアルキルアクリルアミドなどのN,N−置換アクリルアミド；（ii）アクリルアミドもしくはその前駆体またはジビニル化合物などの架橋剤；（iii）アゾビスイソブチロニトリル、種々な過酸化物、アスコルビン酸、ペルオキシ硫酸塩、置換アゾ化合物、その他当業界で公知の物を含む遊離基重合開始剤を、共重合体もしくは三元共重合体に関しては0.01〜２％の間で変化する量で；（iv）グルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミンもしくはＮ−アセチルノイラミン酸もしくはポリシアリン酸もしくは他の糖誘導体もしくはArg−Gly−Asp,Ile−Lys−Val−Ala−Val,Ala  His−Ala−Val−Ser−Glu,Tyr−Ile−Gly−Ser−Argなどの配列を含む組織接着オリゴペプチド、組織分別分子誘導オリゴペプチド（例、骨形態発生プロテイン）もしくはミエリンおよび軸索関連リピド，好ましくはアセトン／ジメチルスルフォキシド、アセトンもしくはアセトン／エタノールなどの溶媒中のその誘導体などの複合糖。
アルキル群は好ましくは１個または２個の炭素原子、例えば、C1〜C2のヒドロキシアルキルおよびアミノアルキル基を有する。ここで用いられるＮ−置換には、OH,アミノ基もしくはその組合せを含むC1−８置換基が含まれる。
反応はふつう密閉アンプルからなる重合器中で40℃〜60℃の温度で約12時間実施される。
【図面の簡単な説明】
図１は同族ゲルの顕微鏡図である。
図２は脊髄に移植された同族ゲルの顕微鏡図である。
図３はHPMAの同族ゲルの顕微鏡図である。
図は神経組織に移植された図３のゲルの顕微鏡図である。
発明の実施態様
本発明を下記の実施例により説明する。
実施例１
AIBN（アゾビスイソブチロニトチル）（1.2％  w/w）とメチレンビスアクリルアミド（１モル％）を乾燥アセトンに溶解する。溶液をＮ−２−（ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミドとアセトン／ジメチルスルフォキシド（93:7  v/v）の混合物を有する30％HPMAの容量率に混合する。Ｎ−メタクリロイルグルコサミン（５％  wt）、もしくは１−メチル−２−メタクリロイルアミドエチル−２−アセタミド−２−デオキシディ−β−Ｄ−グルコシド（6.5％  wt）、もしくは２−［１−メチル−２−メタクリロイルアミドエチル］５−アセタミド  3,5−ジデドキシ−Ｄ−グルセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシドン酸（5.2％  wt）、もしくはメタクリロイルグリシルグリシルアルギニルグリシルアスパラギン酸（1.4％  wt）をジメチルスルフォキシドに溶解し、重合混合物に添加する。混合物を完全に均質化し、シリンジに充填し、アンプルに投入する。反応混合物を次いで窒素でパージし、アンプルを有炎燃焼で密閉する。溶媒の蒸発を避けるために、混合物をアンプルの有炎燃焼に先だって、初めにドライアイスとエタノールの混合物中に凍結することができる。密閉アンプルを次いで50℃と水浴に24時間浸漬する。
好ましくは、本発明によれば、未反応単量体などの低分子量残留生成物、網状組織に包含されなかったオリゴマーおよび開始剤痕跡は、使用に先だってヒドロゲル製品から除去される。これはキセロゲルをエタノールに20時間浸漬、次いでエタノール／水（1:1  v/v）の混合物に20時間、およびときどき水を交換しながら蒸留水に１週間浸漬を、膨脹平衡が得られ、抽出率が低く、好ましくはゼロになるまで実施することにより達成される。本発明の別の重要な面は、汚染を避けることである。重合体ゲルの調製は好ましくは、濾過された気流でバイオハザード室で実施される。洗浄段階は好ましくは、無菌物質を使ってなされ、ゲルは無菌蒸留水中に４℃で貯蔵される。
重合体装具と提供者の組織細胞の両方を含むハイブリッド装具を形成するために、細胞を該細胞懸濁液を含むHamiltonセリング（seringue）を使用して、重合体網状組織の微細孔により重合体ヒドロゲルの多孔質構造に接種することができる。細胞の該重合体ヒドロゲルへの導入は、ヒドロゲルを対象とする器官領域に移植後十分な時間をとって、生体外と生体内のいずれでも実施できる。細胞はヒトの脳もしくは筋肉組織もしくは死体解剖物質から分離できる。
実施例2:細胞のPHPMAヒドロゲルへの生体外接種
ニューロンをDMEM中で、髄膜と血管なしでラットの胚の大脳半球から分離し、小さな組織破片に切り刻んだ。組織をDMEM含有遠心管に、パスツールピペットで機械的に分離した。上澄液をとっておき、沈降組織破片を先端を狭めるために火で磨いたパスツールピペットでさらに引き裂いた。細胞の再懸濁／分離サイクルを数回行った後、とっておいた上澄液を遠心分離し、細胞を媒体100μｌにつき106細胞となるまで濃縮した。画分は細胞閉じ込めに使用するまで氷の上に置いておく。細胞が重合体ヒドロゲルに効率良く信頼できる貫通をするように、細胞をマイクロ操縦器に取り付けたHamiltonセリングに導入し、最小の圧力ダメージで所望の濃度で、双眼顕微鏡の下無菌条件で膨脹PHPMAヒドロゲルに接種した。細胞含有ヒドロゲルを最小容積の培養媒体中に保ち、37℃、５％CO2、増湿雰囲気中で接種する。いったん細胞が十分な成長度合いに達したら、ハイブリッド装具は脳中に移植でき、組織再建と修復を助長する。
重合体混合物はまた、生細胞とも混合でき、それにより重合体マトリックスの物理的特性をヒドロゲル型挙動（気孔率、安定性、誘導表面、透過性）および細胞の生物学的因子（例、成長因子）と結び付ける。
細胞の重合体マトリックスへの導入は、０℃以下の温度でゲル閉じ込め方法、つまり、細胞が固定され再組織化、続く移植のための成長および／または分別が達成できる多孔質マトリックスを生むクリオ重合により達成される。溶媒は、細胞と適当なクリオ保護剤（グリセロール／ジメチルスルフォキシドもしくはグリセロールもしくはDMSOもしくはポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシエチルスターチ、カルボキシメチルセルロース）と組み合わせた組織培養液中に一般に使用される同位体溶液もしくは同タイプの組織培養媒体とすべきである。本方法は２、３の細胞から組織の細胞密度に近い細胞密度、およそ109から1010細胞/cm3まで、最終細胞密度を制御できる。本方法はまた、細胞含有重合混合物（液体窒素もしくは冷却イソペンタン）の冷却率と温度を変化させることにより、マトリックスの気孔率を変化させたり制御することができる。本方法は、栄養とマクロ分子（例、成長因子）が重合体ゲルマトリックスに閉じ込められた細胞を行ったり来たりする拡散と細胞泳動を可能にする気孔サイズを有するクリオゲルに典型的なマクロ多孔質のスポンジ状構造、および有効なバイオマス堆積、拡張（細胞分裂）および組織発達と成熟中の組織化（細胞から細胞への接触）を生み出す。
実施例3:HPMAのクリオ重合による星状細胞のゲル閉じ込め
星状細胞を生後２日のラットの大脳皮質を、0.1％トリプシン−EDTA、Hepes緩衝DMEM中の0.001％DNAseを含む溶液中、37℃、30分、機械的分離での培養により得た。細胞をプラスチック製フラスコに、106細胞/10mlで延ばし、10％胎児ウシ血清でDMEM中37℃で維持した。生体外で７日後、星状細胞を取り入れ、20％グリセロールを含むHankの均合塩溶液（HBSS、pH7.4）に懸濁し、100μｌにつき106に濃縮し、６℃で維持した。閉じ込め手順は薄膜フローキャビネット中で、無菌物質を使って実施された。予備重合溶液は、20％グリセロールを含む2.3mLのHBSSに溶解した0.69gのＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドと0.010gのメチレンビスアクリルアミド、および開始剤としてHBSS（1:1  v/v  HBSS;3.3X10-5M）中で稀釈したN,N,N′,N′−テトラメチレチレンジアミンと過硫酸アンモニウム（100mg/mL  HBSS;4.3X10-3M）からなっていた。pHはHCl  0.1Nで7.0に調整し、予備重合溶液は窒素で脱気し、使用前に４℃で予備冷却した。細胞を高密度初期重合体混合物に106細胞/mlの密度で懸濁し、混合物を完全に混合し、Hamiltonセリングを使用して、シリコーンゴムのシーラントで0.75mm離して、最終容積が3mLとなるように２枚の予備冷却したガラス板に投入した。型をほぼ１分、液体窒素への侵漬により−170℃に冷却し、細胞を−15℃に冷却した水浴に移す前に液体窒素中に３分放置した。重合反応を冷却水浴中で５時間実施し、その後型を37℃浴で解かした。氷分解後、ゲルを型から外し、HBSSで洗浄してクリオ保護剤と未反応生成物を除き、直径0.8mmの円形ディスクに並べた。ゲルディスクを増湿雰囲気下、37℃、５％CO2、10％FBSと１％抗体（ストレプトマイシン−ペニシリン）で補足したDMEM中で培養した。
重合体ヒドロゲルハイブリッド組織製造のためのこのアプローチは、Woerly等（1996）が開示した手順に比較して２つの主な利点がある：低温度での重合による膜細胞損傷の予防と、増加する気孔率と一定の気孔構造（異質性ヒドロゲル）を生じる細胞周辺の氷の結晶の生成である。結果として細胞は、組織化、大きな内部表面積、細胞拡張のための十分な空隙、増加した透過率のために骨組み構築物をもつ重合性マトリックス内に閉じ込められる。さらに細胞重合体混合物は、上記したように、続く重合用にいったん凍結させて、貯蔵される。
細胞発達のどの段階においても、結果として生じるハイブリッドマトリックスは、多孔質マトリックス、細胞と細胞外マトリックス、および細胞培養媒体に相当する流体相と細胞外流体からなる固体相からなりなっている。
当業者が認めるように、この方法は、マイクロもしくはマクロ被包技術を用い、そこでは細胞は変化する直径の球形をもつ重合体膜内で囲まれるにすぎない、いわゆる「細胞被包」方法とは異なる。
ここで使われる「細胞」という語には、組織断片、細胞群、胚の、新出生の、もしくは成人起源からの単独細胞、遺伝学的に改質された細胞、主要細胞もしくは不滅化細胞、存在する癌細胞ラインもしくは不滅化前駆体細胞ラインからの不滅化細胞ライン、茎もしくは先祖細胞、いずれかの組織および器官の成長因子の選択前駆体細胞ラインが含まれるものとする。本発明の方法と製品は、広範囲に渡る移植もしくは三次元培養系の人工組織もしくは器官を調製するのに適している。
これを成就するためには、例えば、10％〜20％のグリセロールをクリオ保護剤として含むHankの均合塩溶液（無菌HBSS、pH7.4）中の細胞懸濁液を、４℃で10分間培養した。実施例１で記載した重合性組成物からなる予備重合溶液を、10％〜20％のグリセロールを含むHBSSに溶解する。溶液を多孔質ガラスフィルターで濾過し、真空下で脱気し、氷中で予備冷却する。遊離基重合を、過硫酸アスコルビン酸もしくはHBSSに溶解した過硫酸テトラメチレンジアミンで開始する。溶液のpHはHCl  1Nで中和に調整する。細胞を重合溶液に変化する密度で、好ましくは重合混合物1mlにつき106細胞で懸濁する。混合物を完全に混合し、シリンジに充填し、アンプルもしくは様々なサイズの、もしくはアンプル入りのシリコーンゴムのシーラントで離した、２枚のガラス板で作られた型に投入する。型もしくはアンプルを液体窒素への浸漬により急速に冷却し、−10℃〜−30℃に冷却した水浴に移す。クリオ重合反応を少なくとも５時間、好ましくは12時間実施する。重合後、型もしくはアンプルを37℃の水浴に解かし、ゲルを外し、HBSSで洗浄し、適当な形に寸法を決めることができる。ゲルを抗体と抗菌薬物を含む好ましい培養媒体入りの５％CO2培養器に移す。この手順は、フローキャビネット中、無菌器具を用いてなされる。
実験１
本発明の重合体ヒドロゲルの生物学的許容度を、ラットの切開した脊髄と脳損傷への移植により研究した。実験のサンプルは移植後、１週間から10か月して取り上げた。生物学的許容度は優れていた。肉眼では、ゲルは良好な安定性を示す宿主組織に一体化し、宿主の器官が完全に見える場合もある。顕微鏡使用では、本重合体ヒドロゲル処方は、半球および切開ラット脊髄の移植箇所における組織再建と軸索再生を促進し、かくして組織の連続性修復を100％まで達成することを研究は示した（図４）。データは下記のように要約される：（ｉ）ヒドロゲルの統合と器官の連続性の修復；新しい組織が発達してその多孔質表面が傷口に接着して損傷に取って代わることができるように、ヒドロゲルが損傷容積を一定に保つ；（ii）全有効重合体表面との滑らかな接触面；（iii）隣接する宿主組織中の最小の傷と嚢胞性空洞現象の不在；（iv）移植物質の宿主への付着を強化する重合体網状組織内のグリア型組織の網状組織の内方生長；（ｖ）異質性起源の細胞の内方生長；（vi）細管内方生長；（vii）免疫組織化学により見られるように、細胞外マトリックス分子（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン）の重合体網状組織の表面における堆積；および（viii）バイオ移植物質を通しての軸索成長。対外移植ヒドロゲルの赤外分光学研究は、自然のままのヒドロゲル（移植されていない）の赤外スペクトルが、隣接する脊髄組織に類似するリピドやプロテイン化合物の典型的な赤外特徴に取って代わられたことを示し、脊髄組織要素はヒドロゲルの多孔質網状組織に一体化することを確証する。
実験２
クリオ重合は、細胞が固定される一定のマクロ多孔性構造をもつ異質性ゲルを生むことができた。細胞ラベリング、免疫細胞化学など細胞ラベリング技術を用いる研究は、細胞が重合体網状組織を通して、ゲル内で異なるレベルで、個々の分離した細胞としてもしくは２、３個の小さな群れに配列して均一に分布されていることを示す。生存する細胞は、生体外培養で３週間に渡って、発達する神経組織細胞の抗原性プロフィールで明確に免疫着色された。したがって、ラットの新出生の脳から分離された星状細胞を、高レベルの保持性をもつクリオ重合反応により新水性ヒドロゲル内に閉じ込めることができ、閉じ込められた細胞は生存でき、単分子層培養条件におけるように正常に分化する。生体外で10日後、閉じ込められた細胞の生存能力は細胞ラベリング技術使用で90％である。さらに、細胞は、単分子層培養におけるように、重合体マトリックス内でラミニンおよびフィブロネクチンと合成すると機能的である。
重合体ヒドロゲルは主に、トラウマもしくは外科的操作もしくは生来の不具から生じる体の軟器官の組織欠陥もしくは組織不足に、新しい機能的に一体化した組織−器官の形成を助長することにより、取って代わる組織エキスパンダーとして、および組織生成遺伝子母型として使用されるよう意図されている。それはまた、傷治療、組織レモデリング、組織再生、肝臓、膵臓、皮膚、筋肉など軟器官の組織発達の処理に使用されるよう意図されている。また骨再生や修復のための他の材料と組み合わせて使用することもできる。
重合体ヒドロゲルの別の適用は、特殊なヒトの神経系疾患の治療を提供するための手順を開発することであり、該重合体ヒドロゲルは、病気の性質やタイプおよび機能的欠陥の程度に応じて２つの異なる方法で使用できる。先ず、それは組織再生遺伝子母型として、もしくは細胞グラフトの合併後の細胞キャリアとして使用できる。本発明による重合体ヒドロゲルは、例えば、発展病期もしくは成人の病期において脳や脊髄の特殊な領域の損傷もしくは生来の欠陥（例、脊髄の傷）を治療するために使用されるよう意図されている。典型的には、手順は損傷組織、傷組織もしくは神経組織の不全部分を除去し、大脳組織もしくは脊髄組織を上記の重合体ヒドロゲルと取り換えることからなる。本発明による重合体ヒドロゲルはまた、発展病期もしくは成人の病期における中枢神経系の軸索通路と結ばれたニューロンの回路を再建するのにも有用である。例えば、アルツハイマー病で損なわれる記憶機能に関係する中隔海馬回路、あるいはパーキンソン病もしくはハンチントン病の線条の一部、あるいは下垂体−ハイポ視床系に関係するホルモン生殖機能不全に関係する黒質線状体回路である。これは、脳組織の欠陥部分を外科的に除去し、本発明によるゲルを、好ましくは新しい機能的な軸索回路の形成を起こすために神経細胞グラフトとともに移植することにより達成される。同様に、脊髄回路の不全（例、二分脊椎）を起こす不具は、器官の異常形成部分を除去し、欠陥部分を好ましくは神経細胞グラフトとともに本発明による神経ゲルにより取り換えることにより治療できる。本発明によるヒドロゲルの別の適用は、同様に本発明による重合体ヒドロゲルを通して軸索の再成長を起こすことによる視神経と末梢神経の治療である。
本発明は上記の好ましい実施態様に限定されるものでなく、本発明の精神と範囲から逸脱しないかぎり変更は可能であると理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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