(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワイルドライスより抽出した下記化学式よりなる抗酸化物。
【化１】
0003584408.tif 000009
【化２】
0003584408.tif 000010
【請求項２】
脱穀したワイルドライスを粉砕した後６Ｌのｎ−ヘキサンで脱脂し、吸引濾過する操作を行った後、残渣を６Ｌの９５％エタノールによって抽出し吸引濾過したものを減圧濃縮し粗抽出物を得た。前記粗抽出物を、アンバーライトＸＡＤ−２カラムクロマトグラフィーを用いて水／メタノールの濃度勾配により分画し、その６０％〜８０％区分を抽出することを特徴としたワイルドライスより抽出する請求項１記載の抗酸化物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明はワイルドライスに含有している抗酸化物を抽出することを目的としたワイルドライスより抽出した抗酸化物及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来米種子の中には抗酸化因子が含まれていることが知られている。その代表的な物として、ビタミンＥがあげられている。またインディカタイプの米の籾殻からは、イソビテキシンという抗酸化因子が単離・同定されている。これらは、種子の貯蔵・保存面において、種子の酸化的傷害を防ぐ重要な役割を果たしている。この酸化的傷害は、種子の貯蔵・保存における生物活性の低下を引き起し、発芽率の低下にもつながる。従つて発芽率の高い米種子には強い抗酸化因子が含まれているという推測ができるが、白色米より有色米のほうが発芽率が高いことに着目され、インディカタイプの黒米からアントシアニンが単離・固定されている。
【０００３】
【発明により解決すべき課題】
然るに前記インディカタイプの黒米よりも強い抗酸化性をもつ物質を研究した結果、ワイルドライスに含まれる抗酸化因子に到達したので、これを抽出すると共に、科学構造の解析及びその機能を解明した結果、３種の抗酸化因子を単離し、その化学構造を同定した。これら３種には、ケイ皮酸類縁体（３、４、５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｓｉｄ）が含まれている。
【０００４】
フラボノイド類縁体の一つである８０％−３は、配糖体であり、アグリコンにフラボノイドのルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）を持つ。これはフェノール性水酸基をもつことで、脂質過酸化における脂質ラジカルの捕捉が考えられた。さらにオルトジヒドロオキシ（Ｏ−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ）構造より金属キレート能、これらにより強い抗酸化性を示した。
【０００５】
またケイ皮酸類縁体を含む物質、６０％−３、８０％−１、８０％−２、８０％−３（６０％−３と８０％−２は同一物質）は、８０％−３を除いてフェノール性水酸基を持っていないが、抗酸化性を示した。これは、脂質ラジカル捕捉能や金属キレート能ではなく、フェントン反応により生じたヒドロキシラジカル（・ＯＨ）の捕捉であると各種抗酸化試験より推測された。
【０００６】
即ち物の発明はワイルドライスより抽出した下記化学式よりなる抗酸化物である。
【化３】
0003584408.tif 000002
【化４】
0003584408.tif 000003
【０００７】
また製造方法の発明は脱穀したワイルドライスを粉砕した後６Ｌのｎ−ヘキサンで脱脂し、吸引濾過する操作を行った後、残渣を６Ｌの９５％エタノールによって抽出し吸引濾過したものを減圧濃縮し粗抽出物を得た。前記粗抽出物を、アンバーライトＸＡＤ−２カラムクロマトグラフィーを用いて水／メタノールの濃度勾配により分画し、その６０％〜８０％区分を抽出することを特徴としたワイルドライスより抽出する化学式１・化学式２よりなる抗酸化物の製造方法である。
【０００８】
前記発明により抽出分画した８０％−１、８０％−２、８０％−３について夫々につき考察する。
【０００９】
（１）  ８０％−１について、
図１より、ケミカルシフト６．４３（ｐｐｍ）と７．６１（ｐｐｍ）に、トランス型の二重結合の存在のを示すダブレット（Ｊ＝１６（Ｈｚ））が確認された。３．８（ｐｐｍ）付近のシングレットのピークから、メトキシ基が考えられた。またこの物質の  １Ｈ−ＮＭＲは、すでに発明者がブラウンマスタードから単離・同定されたシナピン酸メチルエステル（ｓｉｎａｐｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ）の  １Ｈ−ＮＭＲと同様であると当初考えられたが、ＦＴ−１Ｒから２９４７ｃｍ−１にカルボン酸の０Ｈの吸収があることと、図２に示す１３Ｃ−ＮＭＲの結果、図３に示した２次元ＮＭＲスペクトル（ＨＭＢＣ）により３つのメトキシ基のプロトンがベンゼン環の３，４，５位に相関があるため、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）であるとが判明した。これらの機器分析の結果をまとめて表１に示した。
【００１０】
【表１】
0003584408.tif 000004
【００１１】
（２）  ８０％−２について
図４より、〈８０％−１〉と同様にケミカルシフト６．４７（ｐｐｍ）と７．６０（ｐｐｍ）からトランス型の二重結合、３．８（ｐｐｍ）付近から３つのメトキシ基が考えられた。また、６．９（ｐｐｍ）から７．９（ｐｐｍ）にベンゼン環由来、３．３（ｐｐｍ）から５．１（ｐｐｍ）には糖由来のピークが認められる。１３Ｃ−ＮＭＲ［図５］では、１６８．３（ｐｐｍ）と１９９．１（ｐｐｍ）にカルボニル由来のピークがある。そして、６２（ｐｐｍ）から１０５（ｐｐｍ）の間に糖由来の１２本のピークがあるため、この物質は、糖２分子の配糖体であると考えられる。各種ＮＭＲの結果アグリコンは、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）とｐ−ヒドロキシアセトフェノン（ｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）であると同定された。。また、配糖体の構成糖を調べるため、酸加水分解を行いＴＭＳ化し、ＧＬＣ（ＧＬＣ条件については、下に示す。）を用いた結果、構成糖はグルコースであることが判明した。なお、ＧＬＣでは標準サンプルとしてＤ−グルコースを使用した。糖とアグリコンの結合は、ＨＭＢＣ［図６］より３，４，５−トリメトキシケイ皮酸（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）のカルボニルの炭素と糖の６位に相関があり、ｐ−ヒドロキシアセトフェノン（ｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）の４位と糖の１位に相関があったことから、糖とアグリコンの結合様式が判明した。また、２次元ＮＭＲより糖と糖の結合は、３位と１位で結合していることが推測される。よって８０％−２の機器分析の結果をまとめて表２に示した。
【００１２】
【表２】
0003584408.tif 000005
【００１３】
【８０％−２の構成糖確認のためのＧＬＣ条件】
0003584408.tif 000006
【００１４】
（３）  ８０％−３について、
図７より、〈８０％−１〉，〈８０％−２〉と同様にケミカルシフト６．２６（ｐｐｍ）と７．４２（ｐｐｍ）からトランス型の二重結合、３．８（ｐｐｍ）付近から３つのメトキシ基が考えられた。また、６．０（ｐｐｍ）から７．７（ｐｐｍ）にベンゼン環由来、３．３（ｐｐｍ）から５．０（ｐｐｍ）には糖由来のピークが認められた。図８では、１６８．３（ｐｐｍ）と１８３．４（ｐｐｍ）にカルボニル由来のピークがみられた。そして、６５（ｐｐｍ）から１０３（ｐｐｍ）の間に糖由来と考えられる６本のピークがあるため、この物質も、配糖体であると考えられる。各種ＮＭＲの結果からアグリコンの一つは、〈８０％−１〉，〈８０％−２〉と同様の３，４，５−トリメトキシケイ皮酸（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ  ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）であり、もう一つはフラボノイドのルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）であることが推測される。そこで、文献値のルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）の１３Ｃ−ＮＭＲと比較したところ、ケミカルシフトがほぼ一致した。また、配糖体の構成糖を調べるため、酸加水分解を行いＴＭＳ化し、ＧＬＣ（ＧＬＣ条件については、下に示す。）を用いた結果、構成糖はグルコースであることが判明した。なお、ＧＬＣでは標準サンプルとしてＤ−グルコースを使用した。糖とアグリコンの結合様式は、ＨＭＢＣより３，４，５−トリメトキシケイ皮酸の９位のカルボニルと糖の６位の水素に相関があった。しかし、ルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）の結合様式については確認できなかった。そこで、メタノリシスにより、構成糖をＴＭＳ化しＧＬＣで調べた結果、Ｄ−グルコースの１位がメチル化されたα−メチル−Ｄ−グルコシドであったため、糖の１位が結合に関与していることが示唆された。また、１３Ｃ−ＮＭＲにおけるルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）と文献値のルテオリンの比較から、３”位を中心にケミカルシフトがずれているため、糖の１位と結合していると推測された。そこで８０％−３の機器分析の結果を表３にまとめて示した。
【００１５】
【表３】
0003584408.tif 000007
【００１６】
【８０％−３の構成糖確認の為のＧＬＣ条件】
0003584408.tif 000008
【００１７】
【実施例】
脱穀したワイルドライス１ｋｇを粉砕した後６Ｌのｎ−ヘキサン１８リットルで脱脂し、吸引濾過する操作を２回行つた。この残渣を６Ｌの９５％エタノール１８リットルによって２回抽出し吸引濾過したものを減圧濃縮し粗抽出物６ｇを得た。
【００１８】
前記粗抽出物を、アンバーライトＸＡＤ−２カラムクロマトグラフィーを用いて水／メタノールの濃度勾配により分画し、６つの抽出分画とアセトン３リットルの抽出による画分を得た（図９）。
【００１９】
前記各画分について、リノール酸の過酸化誘導を用いた抗酸化試験により、抗酸化活性を測定した所（図１０）、８０％区分の前後で活性が強いことが判つた。そこでこの８０％区分を、さらに分取用ＨＰＬＣにより、８０％−１、８０％−２、８０％−３の３つの区分に分けて得られた各物質の抗酸化活性及びヒドロキシラジカル、スーパーオキサイドアニオンラジカル捕捉能について検討した（図１１）。
【００２０】
【試験例１】
リノール酸の過酸化誘導による抗酸化試験。
【００２１】
モル濃度を５０μＭに統一し、リノール酸のフェントン反応による過酸化誘導［図１２］を行った。重量濃度による抗酸化試験（図１３）と比較したところ、８０％−１と８０％−３の抗酸化性が強くなった。分子量の大きい８０％−３については、濃度が高くなったために抗酸化性が強くなったと予測される。また、８０％−１については、高濃度よりも低濃度において、より強い抗酸化性を示すことが予測される。
【００２２】
【試験例２】
ウサギ赤血球膜ゴースト脂質酸化による抗酸化試験。
【００２３】
リノール酸の過酸化誘導の結果から、抗酸化性の強い８０％−１と８０％−３について、ここでは、生体のモデル系としてウサギ赤血球膜ゴーストの脂質酸化系を用いて抗酸化性を検討した（図１４）。脂質酸化抑制率は低いものの、８０％−３には弱いながらも抗酸化性が見られた。フェノール性水酸基を持たない８０％−１については、ほとんど抗酸化性が見られなかった。
【００２４】
【試験例３】
２−デオキシリボースの酸化分解による抗酸化試験。
【００２５】
収量が高くフェノール性水酸基を持たない８０％−１について、２−デオキシリボースの酸化分解により、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）の捕捉能について検討した（図１５）。対照として用いたα−トコフェロールと同等の強い抗酸化性を示したことから、８０％−１におけるヒドロキシラジカルの捕捉能が確認された。
【００２６】
【試験例４】
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ／ＮＢＴ法による試験。
【００２７】
２−デオキシリボースの酸化分解と同様に、収量が高くフェノール性水酸基を持たない８０％−１について、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２  −  ）の捕捉能について検討した（図１６）。２ｍＭという高濃度においてほとんど活性を示さなかったため、８０％−１は、スーパーオキシドアニオンラジカルの捕捉能がないと考えられる。
【００２８】
前記抗酸化試験の結果、ワイルドライスから単離・同定された４種の抗酸化因子には、それぞれ抗酸化性が認められた。中でも、８０％−１，８０％−３は、リノール酸のヒドロキシラジカルによる過酸化誘導を用いた抗酸化試験から、抗酸化性が強いことが確認された。８０％−３については、ウサギ赤血球膜ゴーストの脂質酸化から、脂質ラジカルの捕捉能が推測された。また、８０％−１については、２−デオキシリボースの酸化分解から、ヒドロキシラジカルの捕捉能が推定された。これらの結果から、リノール酸の過酸化誘導において、８０％−１，８０％−３に抗酸化性が見られた要因としては次のことが考えられる。８０％−１では、フェントン反応によって生じたヒドロキシラジカルの捕捉により、リノール酸の過酸化を抑制するものと推定される。また、８０％−３では、脂質ラジカルの捕捉による抑制が主であると推測される。
【００２９】
【発明の効果】
この発明によれば、ワイルドライスから単離・同定した抗酸化物は、それぞれ高い抗酸化性が認められたので、これを抗酸化剤として使用することができる、然してこの発明の製造法によればワイルドライスから、抗酸化性物質を容易に単離できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明における８０％−１とシナピン酸メチルエステルの  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルの比較。
【図２】同じく８０％−１とシナピン酸メチルエステルの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの比較。
【図３】同じく８０％−１の２次元ＮＭＲスペクトル（ＨＭＢＣ法）。
【図４】同じく８０％−２の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図５】同じく８０％−２１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図６】同じく８０％−２の２次元ＮＭＲスペクトル（ＨＭＢＣ法）。
【図７】同じく８０％−３の  １Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図８】同じく８０％−３の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図９】同じくワイルドライスのアルコール抽出物のアンバーライトＸＡＤ−２カラムクロマトグラフィーによる分離。
【図１０】同じく図９で分けた区分の抗酸化活性。
【図１１】同じく８０％メタノール区分の分取用ＨＰＬＣによる分離。
【図１２】リノール酸を基質とし、フェントン反応による過酸化誘導を行つたモデル系による抗酸化試験。
【図１３】同じく重量法による抗酸化試験。
【図１４】同じくうさぎ赤血球膜ゴースト脂質過酸化系における抗酸化試験。
【図１５】同じく２−デオキシリボースの酸化分解によるヒドロキシラジカル捕捉能活性。
【図１６】同じくキサンチン／キサンチンオキシダーゼ／ＮＢＴ法によるスーパーオキシドアニオンラジカル捕捉能試験。
【図１】
0003584408.tif 000011
【図２】
0003584408.tif 000012
【図３】
0003584408.tif 000013
【図４】
0003584408.tif 000014
【図５】
0003584408.tif 000015
【図６】
0003584408.tif 000016
【図７】
0003584408.tif 000017
【図８】
0003584408.tif 000018
【図９】
0003584408.tif 000019
【図１０】
0003584408.tif 000020
【図１１】
0003584408.tif 000021
【図１２】
0003584408.tif 000022
【図１３】
0003584408.tif 000023
【図１４】
0003584408.tif 000024
【図１５】
0003584408.tif 000025
【図１６】
0003584408.tif 000026