(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DSM6535として寄託された、シュードモナス属の微生物。
【請求項２】
pH3.5〜9.0で活性であり、かつ、５〜10mMのナトリウムデオキシコレートによる抑制を受けないリパーゼを製造する方法において、請求項１記載の微生物の培養物からリパーゼを精製し、かつこのリパーゼが、シュードモナス属DSM6483からのリパーゼに対する抗体と反応してプラスの免疫交差反応を示すことを確認することを特徴とする、pH3.5〜9.0で活性であり、かつ、５〜10mMのナトリウムデオキシコレートによる抑制を受けないリパーゼを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、医薬品を製造するための特殊なリパーゼの使用に関する。
リパーゼは脂肪消化の際に重要であり、それというのもリパーゼは脂肪から触媒作用により脂肪酸を分離するからである。従ってリパーゼは、酵素欠乏に起因する消化障害の治療のために、使用される。このような治療は、例えば膵臓機能不全症、慢性膵臓炎、および胃切除手術後の場合である。この場合使用されるリパーゼは、大部分が脱脂し、乾燥し、かつ粉砕した豚膵液を基礎とする生成物である。しかしこのような豚膵液調剤は、複数の重大な欠点を有する：
1.この調剤は僅かな比活性を有し、従って１日当たり５〜10gまでの量で使用されなければならない。
2.調剤の活性範囲はpH5〜９の間である。従って調剤は胃通過の際には脂肪分解活性を示さない。
3.調剤は６以上のpH値の場合に初めて十分な安定性を示す。従って調剤は、酸に強い形か、または著しく高い投与量で服用されなければならない。
4.医薬的な目的で製造されるリパーゼは、純粋な形では存在しない。このリパーゼはプロテアーゼおよびアミラーゼを含有し、従って所定の消化不良性疾病形の場合には禁忌症候を生じる。
消化不良を治療するリパーゼを、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、ムコール（Mucor）、カンジダ（Candida）またはリゾプス（Rhizopus）の種類の菌を培養することによって製造することは、既に提案されていた。ドイツ連邦共和国特許出願公開第1642654号および欧州特許出願公開第387945号明細書には、治療の目的のために、酵素による製造およびリゾプス・アルヒズス（Rhizopus arrhizus）菌からのリパーゼの洗浄が記載されている。
本発明の対象は、消化不良の治療用の薬剤を製造するため、微生物シュードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM6483および／またはシュードモナス・セパシア（Pseudomanas cepacia）IAM1057から形成されるリパーゼの抗体と反応してプラスの免疫学的交差反応を示す、細菌性のリパーゼの使用である。使用可能な細菌性リパーゼを分化するため、前記の微生物からリパーゼに対する抗体が必要とされる。リパーゼは培養基中で培養され、かつ酵素は培養液から単離されることによって、細菌から取得される。適当であるのは、炭素源、窒素源、無機塩および、場合によっては僅かな量の痕跡元素およびビタミンを含有する培養基である。窒素源としては、無機または有機窒素化合物、またはこれらの化合物を含有する材料が使用されてよい。例は次のものである：アンモニウム塩、硝酸塩、とうもろこし膨化水、酵母自家分解物、酵母抽出物および加水分解されたカゼイン。窒素源としては、砂糖、例えばブドウ糖、ポリオール、例えばグリセリンならびに有機酸、例えばクエン酸または脂肪酸が使用されてよい。炭素源として特に好適であるのは、植物油、例えば大豆油、亜麻仁油またはオリーブ油である。無機塩の例は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、錫、銅、鉄および他の金属の塩である。塩のアニオンとしては、特にリン酸イオンおよび硝酸イオンが挙げられる。有利な培養温度は25〜33℃である。媒体のpH値は６〜7.5、有利に6.5〜７に保たれる。これは2nの硫酸またはアンモニアによって調節され、かつ発酵の間一定に保たれる。培養は深部培養として、強力な通風および撹拌下に実施される。３時間の間隔で２回の順次連続した測定の場合に活性が一定になるまで、発酵は行なわれる。一般には40〜60時間の培養時間で十分である。
この方法で、自然生息域から直接単離された細菌株を用いて、培養液1l当たり50〜500mgの酵素収量が達成される。酵素収量は化学薬剤またはUV光を用いた突然変異および次に続く淘汰によって、改善されたリパーゼの生産性へと高められることができる。
酵素は培養液から常法により分離される。液体は遠心分離されるか、または濾過され、その結果、微生物および不溶性材料は分離される。次に、液体相が蓄積され、リパーゼが取得される。これは、水と混合可能な有機溶剤（例えば、アルコールまたはアセトン）を用いて沈殿させることによってか、または塩、例えば硫酸アンモニウムを添加することによって、行なわれる。比放射能を増大させるため、および前記した方法により得られた粗製生成物の汚染を減損させるため、例えば溶剤または塩の添加により分画沈殿させることによって、粗製生成物を再び溶解し、かつ新たに沈澱させることができる。粗製生成物を洗浄するためのもう１つの方法は、適当な限外濾過膜を通した、酵素含有溶液の逆流濾過であり、この場合低分子の汚染は膜を通過するが、酵素は留まったままである。
このようにして得られたリパーゼの有用性を試験するため、シュードモナス種DSM6483ならびにシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）から前記のように取得されることができるリパーゼに対する抗体が必要とされる。更に、これらのリパーゼの１つは10〜20日の間隔で、家兎の漿液が十分に高い抗体滴定濃度を示すまでの間、家兎に注射される。リパーゼの試験のため、このようにして得られた漿液は直接ELISA中で使用される。
前記したリパーゼと反応してプラスの免疫学的交差反応を示す細菌性リパーゼは、例えばクロモバクター・ビスコスム（Chromobacter viscosum）（イムノ・バイオロジー・ラボラトリーズ社（Immuno Biology Laboratories GmbH）、2000  ハンブルク  20、から入手可能）からのリパーゼ、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）IAM1057（アマノ・ファーマシューティカル社（Amano Pharmaceutical Co.Ltd.）名古屋、日本、から入手可能）からのリパーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（エンザイマチックス社（Enzymatix Ltd.）、ケンブリッジ、UK、から入手可能）からのリパーゼおよびシュードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM6535からのリパーゼである。
細菌性リパーゼはpH3〜pH9の活性範囲を示す。その上、本発明による細菌性のリパーゼには、リゾプス・アルヒズス（Rhizopus arrhizus）からの真菌性リパーゼと比較して、デオキシコール酸により明らかに少ない抑制作用が確認されることができる。これは、市場の製品よりも良好な効率を有する、本発明による細菌性リパーゼの脂肪分解活性が、胃腸域内での消化不良の治療のために使用されてよいことを意味する。
前記の方法により得られた生成物は更に、生成物中でのリパーゼ濃度が著しく高く、その結果、専ら僅かな量の物質（約0.2g）が投薬されればよいだけであるという利点を有する。これはパンクレアチンと比較しても、真菌リパーゼと比較しても、激烈な改善を表わす。
細菌性酵素の他の利点としては、前記の沈澱が、付随する蛋白質分解の酵素作用ならびにアミノリシスによる酵素活性のない単一薬剤として製造されうることが挙げられる。このことは、プロテアーゼおよびアミラーゼの存在に基づいてリパーゼがパンクレアチンの場合には必ずしも治療のために使用可能ではないという点で利点である。それというのも、ムコビシドーシスのある子供の場合、アミラーゼの成分は好ましくなく、急性膵炎もしくは慢性膵炎の活発な追発のある患者の場合にはリパーゼは治療上好ましいが、しかしプロテアーゼは配合禁忌である。
このリパーゼは発生の異なる消化不良、即ち（例えば胃切除手術後、膵臓機能不全、肝臓病もしくは胆汁欠乏症の場合の）酵素欠乏症に起因する腸内容の不十分な消化作用の治療のため、著しく好適である。リパーゼは錠剤、糖衣錠の形および他の固体の投薬型で経口的に服用される。個々の投薬形の含量は、F.I.P.によれば有利に10,000〜100,000酵素単位である。（＝特殊研究論文“Pankreas−Pulver"DAB9、1127頁/Ph.Eur.、第２版、通しナンバー350）。患者１人および１日あたり、酵素単位20,000〜40,000個が服用される。
リパーゼは常用のガレーン式服用形で固体または液体で、例えば錠剤、フィルム錠剤、カプセル、粉末、顆粒、糖衣錠または溶液として、使用されることができる。これらは常法により製造される。この場合、作用物質は常用の製薬助剤、例えば錠剤結合剤、充填剤、防腐剤、錠剤砕解剤、流動調整剤、軟化剤、架橋剤、分散剤、乳化剤、溶剤、遅延剤、酸化防止剤および／または噴射ガスを用いて加工されてよい（H.Sucker他、Pharmazeutische Technologie,チーメ社（Thieme−Verlag）、シュツットガルト、1978）。このようにして得られた投薬形は、作用物質を通常10〜90重量％の量で含有する。
例１
ａ）シュードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM6483からのリパーゼの製造および洗浄
微生物シュードモナス種DSM6483の培養のため、次の媒体を使用した：
g/l
KH2PO4                                      20
Na2HPO4                                     10
MgSO4                                        5
CaCl2×2H2O                                  3
FeSO4×7H2O                                  0.5
MnSO4×4H2O                                  0.005
CoCl2×6H2O                                  0.005
CuSO4×5H2O                                  0.005
ZnSO4×7H2O                                  0.005
酵母抽出物                                   5
炭素源としては精製した大豆油を使用したが、この大豆油は1g/l×ｈの所定の供給率を用いてポンプ供給した。pH値を全発酵時間に亙って、2nのH2SO4および25％のNH4OHの助けを用いてpH6.5に保った。
接種培養液を、栄養素液媒体400mlを接種することによって、微生物シュードモナス種DSM6483を用いてpH6.5に保った。
接種培養液を振動装置上で30℃で10時間培養した。
媒体に30℃および6.5のpH値で、媒体100容量部当たり接種培養液５容量部を接種した。主な培養を30℃で10lの撹拌培養器中で内容物8lを用いて実施した。据付けの羽根型撹拌器の撹拌速度は、毎分1000回転であり、通風率は毎分および１発酵液量当たり１空気量であった。60時間後、発酵液は２回連続して測定した場合F.I.P.によれば酵素単位300個の一定の活性を示した。そこで発酵を中断し、かつ形成されたリパーゼを次のように発酵液から単離した：
発酵器搬出物をｎ−プロパノールを用いてアルコール65％の容量部に希釈した。生物体量と沈澱した副生成物とを遠心分離によって分離した。澄んだアルコール性酵素溶液を、真空下に出発物質の３分の１に蒸発濃縮した。
このようにして得られた酵素濃縮液を透析濾過方法（セルローストリアセテートー逆流濾過方法、分離限界20.000規定モル重量、ザルトリウス社（Fa.Sartorius）、ゲッティンゲン）で、H2O  ３回量を用いて洗浄し、次いで濾過により出発量の４分の１に蒸発濃縮した。この酵素濃縮液から、85％の容量部になるまでｎ−プロパノールを添加することによって、リパーゼを沈澱させた。このリパーゼ活性を含有する沈澱を、遠心分離によって取得し、かつｎ−プロパノール65容量部を含有する水溶液中で摂取した。沈澱物対ｎ−プロパノール／水−混合物の重量比は、1:10であった：
遠心分離によって、溶解しない沈澱を分離した。ｎ−プロパノール含分を80容量分に増大することによって、遠心分離の澄明な上澄みからリパーゼを沈澱させた。沈澱を遠心分離によって取得し、かつ冷凍乾燥した。このようにして得られた酵素粉末はF.I.P.によればプロテイン１ミリグラム当たり酵素単位7000個の比活性を示した。
ｂ）同様の方法で、他のシュードモナダセエ（Pseudomonadacee）もしくはクロモバクター・ビスコスムからのリパーゼも製造し、かつ単離することができる。
著しく良好なリパーゼはシュードモナス種DSM6535から取得することができる。
菌株DSM6535の分類学的実験から次の性質が判明した：
細胞形態学：長さ1.5〜2.0μｍで、直径0.8〜1.0μｍ
グラム染色：全成長段階において陰性
胞子：無
運動性：有
45℃もしくは41℃で成長なし
37℃で成長
30℃で最適な成長
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：弱く陽性
グルコースの発酵使用なし
厳密に好気性の成長
表示した性質はDSM6535のシュードモナス属への配属を許容する。
次の生理学的特徴の一致によって、種配属が可能になるはずである。
アルギニンジヒドロラーゼ：有
リジンデカルボキシラーゼ：無
オルニチンデカルボキシラーゼ：無
キング（King）Ｂ−媒体上の顔料形成：陰性
ツウィーン80（Tween▲Ｒ▼80）の加水分解：陽性
カゼインの加水分解：弱く陽性
ゼラチンの加水分解：弱く陽性
澱粉の加水分解：陽性
尿素の加水分解：陽性
エスクリンの加水分解：弱く陽性
硝酸塩から亜硝酸塩への還元：陽性
サッカロースからのレバン形成：陰性
レシチナーゼ：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陽性
グルコースの利用：陽性
マンノースの利用：陽性
マンニットの利用：陽性
イノシットの利用：陽性
Ｎ−アセチルグルコースアミンの利用：弱く陽性
グルコン酸の利用：陽性
クエン酸の利用：陽性
リンゴ酸の利用：陰性
フェニル酢酸の利用：陰性
ベンジルアミンの利用：陽性
トレハローゼの利用：陽性
DSM6535の生理学的性質に基づいて、一義的な種配属は不可能である。
従って、細胞壁の脂肪酸組成をおおう十分な類別を試みた：
次の脂肪酸の発生は、DSM6535からシュードモナードのrRNA−同族群２への疑問のない類別を許容する:14:0  ３−OH、16:0  ３−OH、16:1  ２−OHおよび18:1  ２−OH。
脂肪酸標準型とそれの植物病原性細菌との比較は、rRNA−同族群２の範囲内でのシュードモナス・セパシア／グラジオリ錯体と類似していることを示す。
しかしDSM6535の抜きんでた生理学的特徴は、リパーゼ生産性である：前記した発酵条件下に、DSM6535を用いて発酵媒体1l当たりリパーゼ3.2gまでを製造できる。
例２
抗体の製造およびElisaの実施
抗原（＝シュードモナス種DSM6483からのリパーゼ）0.1mg/mlとフロイトアジュバントとからなる同量の溶液を、均一な乳濁液が生じるまで混合した。２匹の雌の家兎に次の予定表に応じて、この乳濁液の2mlの試料を注射した：
０日目に、フロイト完全アジュバント中の抗原を与えた。次に14日の間隔をおいてフロイト不完全アジュバント中の抗原を２回与え、次に、以下に記載するElisa試験に十分な抗体を提供する抗体滴定量が得られるまで、アジュバントのない抗原を与えた。抗シュードモナス種DSM6483漿液の滴定量は、Elisaで次の処理方法により測定した：
段階（１）
微量滴定板に抗原を塗布したが、この場合、抗原を１〜10μg/mlの濃度でNaHCO3  0.05モル、pH9.2中に溶解した。
段階（２）
過剰の結合箇所をリン酸塩緩和した塩（PBS）中に牛漿液アルブミン１％を用いて飽和した。
段階（３）
微量滴定容器を、PBS中にツウィーン20（Tween▲Ｒ▼20）0.05％を用いて３回洗浄した。
段階（４）
ツウィーン20  0.5％を有するPBS（第２段階）中に家兎抗血清の希釈液1lを塗布した。
段階（５）
段階３と同様に洗浄。
段階（６）
PBS中の牛漿液アルブミン0.1％に希釈したビオチニル化した家兎IgG抗体1:10000を塗布した。
段階（７）
段階３と同様に洗浄。
段階（８）
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ錯体と抗体−免疫グロブリン錯体とを反応させた（希釈度1:10000）。
段階（９）
段階３と同様に洗浄。
段階（10）
ペルオキシダーゼ基質溶液として、３％H2O2  14.7μｌを含有するNa−酢酸塩0.1モル、pH4.9中テトラメチルベンチジン0.42ミリモルを使用した。
段階（11）
酵素反応をH2SO4  ２モルを用いて停止させた。
抗シュードモナス種6483の滴定量を、450nmでの吸収を測定することによって測定した。
前記のように製造されたシュードモナス種DSM6483抗体と反応してプラスの免疫性交差反応を示す全てのリパーゼは、本発明によるリパーゼである。そのようなリパーゼの典型的な例は次のものである：
クロモバクター・ビスコスム（Chromobacter Viscosum）（イムノ・バイオロジー・ラボラトリーズ社（Immuno Biology Laboratories GmbH）、2000  ハンブルク  20、から入手可能）からのリパーゼ、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）IAM  1057（アマノ・ファーマシューティカル社（Amano Pharmaceutical Co.Ltd.）名古屋、日本、製、アマノＰ（Amano P）の商標名下に入手可能）からのリパーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（エンザイマチックス社（Fa.Enzymatix Ltd.）、ケンブリッジ  UKの製品）からのリパーゼおよびシュードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM6535からのリパーゼ。
有利に本発明によるリパーゼは、同様にシュードモナス・セパシア  IAM  1057からのリパーゼに対する抗体と反応してプラスの免疫性交差反応を示すはずである。
リパーゼの性質
例３
パンクレアチンと比較して、細菌性の起源の種々のリパーゼ調整の比活性。
活性測定を２つの異なった測定方法により実施した。
１）膵液粉末用のリパーゼ活性測定
（特殊研究論文”膵液粉末"DAB9、1127頁/Ph.欧、第２版、通しナンバー350）37℃、pH9、タウロコール酸塩10ミリモルでの酵素試験
２）細菌性リパーゼのためのリパーゼ活性測定（薬剤酵素、発行者:R.Ruyssen、A.Lauwers、E.Story−Scientia P.V.B.A.1978年、210〜213頁）、37℃、pH7、タウロコール酸塩0.5ミリモルでの酵素試験。
プロテイン測定のため、ビオ−ラート・ラボラトリーズ社（Bio−Rad Laboratories GmbH）のテストキット（Testkit）を使用した。このテストキットはＭ・ブラッドフォード（（M.Bradford）Anal.Biochem.（72）、248（1976））の方法に基づく。下記の表Ｉが示すように、ここに記載した細菌性リパーゼには、前記したドイツ薬局方のパンクレアチン用の方法を用いて、真菌性リパーゼの場合またはパンクレアチンの場合よりも明らかに高い比活性を測定した。パンクレアチンと細菌性リパーゼとの間の一致は、この２つの酵素の場合、pH9で測定した比活性がpH7で（微生物のリパーゼに対する試験において）測定した比活性を上回っている限り存在する。
試験した真菌性リパーゼはこの点で逆に働く。従って、真菌性リパーゼの最大比活性は、パンクレアチンの比活性と直接には比較できない。
0003593550.tif 000002
例４
パンクレアチンとの比較における細菌性リパーゼのpH依存性
pH値と脂肪分解活性との関係を調べるため、微生物性および動物性リパーゼ用の変性した試験系を使用した（Ch.Unterberg in:Fette,Seifen,Anstrichmittel;第88巻、561〜564頁）。第II表にまとめた数値は、細菌性リパーゼがパンクレアチンと比較して、酸性のpH範囲内に大きく広がった活性範囲を有することを示している。従ってこのリパーゼは、活性を既に胃内で発揮できるという利点を有する。
0003593550.tif 000003
例５
シュードモナス種DSM6535ならびにリゾプス・アルヒズスからのリパーゼに対するナトリウムデオキシコレート作用
胆汁塩ナトリウムデオキシコレートの微生物性リパーゼの活性への影響を検査するため、膵液粉末のための活性測定（特殊研究論文"Pankreas−Pulver"DAB9,1127頁/Ph.Eur.,第２版、通しナンバー350）を使用した。タウロコレートの代わりに０〜10ミリモルの濃度のナトリウムデオキシコレートを酵素試験で使用した。
下記の第III表に明らかなように、本発明による細菌性リパーゼは、比較のために取り上げたリゾプス・アルヒズスからの真菌性リパーゼに対して次の利点を有する：
殊に５ミリモルを上回るナトリウムデオキシコレート濃度の場合、シュードモナス種DSM6535からのリパーゼは抑制されないが、これに反して真菌性酵素は既に明らかな不活性化を示す。
0003593550.tif 000004