(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、下記の式Ｉで表される配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片。
式Ｉ        ５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣ  ＧＴＣＴＡＣＡＧＧＧ
【請求項２】
ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３ＳリボゾームＲＮＡ上で請求項１記載の核酸断片の３’側もしくは５’側に隣接してハイブリダイゼーションする核酸断片。
【請求項３】
請求項１及び２の核酸断片の一方を標識プローブとして、もう一方を担体に固定した捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行いボルデテラ・ブロンキセプチカを検出することを特徴とするボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法。
【請求項４】
下記配列番号１で表わされるＤＮＡを標識プローブとして、及び下記配列番号２で表わされるＤＮＡを捕捉プローブとして用いることを特徴とする請求項３記載の検出法。
配列番号１          ＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣ  ＧＴＣＴＡＣＡＧＧＧ
配列番号２        ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＧ  ＣＣＴＡＧＴＴＣＣＡ  Ｃ
【請求項５】
下記の成分を含む、請求項３記載の方法に使用するための検出用キット。
（イ）請求項１記載の核酸断片を固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された請求項２記載の核酸断片；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液
【請求項６】
下記の成分を含む、請求項３記載の方法に使用するための検出用キット。
（イ）標識物質で標識された請求項１記載の核酸断片；
（ロ）請求項２記載の核酸断片を固定化した担体；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はボルデテラ・ブロンキセプチカの２３ＳリボゾームＲＮＡ（以下、２３Ｓ  ｒＲＮＡと記す）遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片、及びそれらを用いるボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法及び検出用キットに関する。
【０００２】
【従来技術】
ボルデテラ・ブロンキセプチカは豚、犬、ウサギ、モルモット、ラット及び七面鳥等の多種の動物に感染し、保菌されている。
とりわけ、豚においてはその養豚規模が拡大するにつれ各種の慢性呼吸器疾患の発生が増加しており、その最大の特徴である萎縮性鼻炎  （Ａｔｒｏｐｈｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ；以下ＡＲと略す）  は、我国のみならず世界の豚群で広く発生している。本病は、鼻甲介骨の萎縮・欠損及び顔面の変形のみならず、二次的に他の呼吸器感染症の誘発、発育の遅延などにより、大きな経済的損失を招いている。
本菌感染の診断法としては、動物の患部からの直接分離法、あるいは対象動物から凝集抗体を検出する血清学的診断方法が行われている。しかし、血清学的診断方法では、ワクチンを接種した対象動物では用いることができず、診断的意義は小さい。確実な診断法は本菌を直接分離・同定する方法である。
本菌は、グラム陰性の小桿菌で、主な生化学的性状としてはブドウ糖分解能陰性、尿素分解能陽性、クエン酸塩利用能陽性などがあげられる。但し、これらの性状の検査には熟練と日数を必要とすることから、本発明者は新たな方法を模索し、リボゾームＲＮＡ  （以下ｒＲＮＡと略す）を対象としたハイブリダイゼーション法によりボルデテラ・ブロンキセプチカの高感度・特異的検出に成功した（隣接ハイブリダイゼーション法、特願平６−０６１４６７号）。本方法は操作性・信頼性ともに非常に優れていることが様々な試験で立証されている。
【０００３】
しかしながら、上記方法に於いて用いた特異的検出用プローブを使用する際にわずかに問題点が見出された。非常にまれなケースであったが、ある種の細菌、具体的にはアルカリゲネス・シュードアルカリゲネス（以下  Ａ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  と略す）の野外分離菌の一部でわずかに交叉性が示されたのである。検出感度の上からはボルデテラ・ブロンキセプチカに比べ１／２０以下と非常に低いので比較検討は容易であるが、多量の混在菌の影響をなくすために、本発明者は上記方法においては、相当量の菌体を用いても検出値がバックグラウンドレベルであるということを「交叉しない」という定義として用いているため、用いたプローブには若干の問題があるといえる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカを特異的にかつ高感度で検出することができる核酸断片、及びそれらを用いてボルデテラ・ブロンキセプチカを特異的に高感度で検出する方法、さらに検出用キットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記問題を解決するために、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡに対する新たなプローブを模索し研究を行なった。その結果、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する特定の核酸断片を見出し、該核酸断片をプローブとして用いることによって、Ａ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓとの交叉性を完全にバックグラウンドレベルに落とすことに成功した。さらに他の菌との交叉性がなく、かつ偽陰性が出ないという条件も満たすものである。
従って本発明は、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、下記の式Ｉで表される配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片である。
式Ｉ        ５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣ  ＧＴＣＴＡＣＡＧＧＧ
本発明の核酸断片の１具体例として、下記配列番号１で示されるＤＮＡ断片が挙げられる。
配列番号１          ＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣ  ＧＴＣＴＡＣＡＧＧＧ
本発明はまた、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ上で上記核酸断片の３’側もしくは５’側に隣接してハイブリダイゼーションする核酸断片である。このような核酸断片の１具体例として、上記配列番号１のＤＮＡ断片に隣接してハイブリダイゼーションする下記配列番号２で示されるＤＮＡ断片が挙げられる。
配列番号２        ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＧ  ＣＣＴＡＧＴＴＣＣＡ  Ｃ
本発明の核酸断片は１０塩基以上で、好ましくは１５〜５０塩基である。
【０００６】
本発明の核酸断片は、本発明者らが先に開発した隣接ハイブリダイゼーション法（特願平６−０６１４６７号明細書）に使用することができる。
この隣接ハイブリダイゼーション法とは、２種の核酸プローブを用いたＲＮＡの検出方法において、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法である。上記配列（Ａ）と配列（Ｂ）が完全に隣接していることが最も好ましい。
【０００７】
従って本発明はまた、上記２種の核酸断片の一方を標識プローブとして、もう一方を担体に固定した捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行いボルデテラ・ブロンキセプチカを検出することを特徴とするボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法に関し、さらに具体的には上記配列番号１で表わされるＤＮＡを標識プローブとして、上記配列番号２で表わされるＤＮＡを捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行いボルデテラ・ブロンキセプチカを検出することを特徴とするボルデテラ・ブロンキセプチカの検出法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、下記の成分を含む、上記方法に使用するための検出用キットを提供する。
（イ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、上記式Ｉで表される配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片を固定化した担体；
（ロ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ上で上記（イ）の核酸断片の３’側もしくは５’側に隣接してハイブリダイゼーションする核酸断片であって、標識物質で標識された核酸断片；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液
【０００９】
本発明はまた、下記の成分を含む、上記方法に使用するための検出用キットを提供する。
（イ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、上記式Ｉで表される配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片であって、標識物質で標識された核酸断片；
（ロ）ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片であって、ボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ上で上記（イ）の核酸断片の３’側もしくは５’側に隣接してハイブリダイゼーションする核酸断片を固定化した担体；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；及び
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液
これらの検出用キットにおいて使用する核酸断片の好ましい例として、配列番号１のＤＮＡと配列番号２のＤＮＡが挙げられ、さらに好ましくは配列番号１のＤＮＡが標識プローブとして、配列番号２のＤＮＡが担体に固定した捕捉プローブとして使用される。
【００１０】
標識プローブの調製法は特定されるものではなく、標識物質としては、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
捕捉プローブは適当な担体に固定すればよく、担体としては、例えば核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は特に限定されるものでないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に被検  ｒＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検  ｒＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。次いで被検  ｒＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検  ｒＲＮＡを検出する。
【００１１】
被検  ｒＲＮＡの調製法は、特定されるものではないが、安全かつ簡便におこなるためには、例えば水酸化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸などで中和すればよい。
調製された  ｒＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、一般に１５〜６０℃で３分〜１８時間程度ハイブリダイゼーションを行う。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）  で標識されている場合には抗Ｄｉｇ  免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適当な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもできる。
洗浄液１、２は特定されるものではないが、例えば０．０５％  程度の界面活性剤を含む生理食塩水などを用いることができる。
【００１２】
以下、例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１  ボルデテラ・ブロンキセプチカ特異プローブの作製とハイブリダイゼーションによる検出
配列番号１、２、３及び４で示されるＤＮＡをＤＮＡ合成装置（ＰＣＲ−ＭＡＴＥ    モデル３９１  、ＡＢＩ社）を用いて合成した。配列番号２及び４のＤＮＡは担体への捕捉用プローブ、配列番号１及び３は標識プローブとして用いた。配列番号２のＤＮＡはボルデテラ・ブロンキセプチカ２３Ｓ  ｒＲＮＡ上で配列番号１の５’側に隣接してハイブリダイゼーションする配列である。また、配列番号３及び４のセットは特願平６−０６１４６７号で実施例として示した配列のＤＮＡである。
配列番号３        ＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣ  ＡＡＡＡＧＴＧＣＴＴ  ＴＣＣＡＡ
配列番号４          ＧＧＡＴＡＴＴＡＧＣ  ＣＣＧＴＧＣＣＧＴＴ  Ｔ
捕捉用ＤＮＡとして使用する配列番号２及び４のＤＮＡををれぞれ、０．０２μｇ／μｌ  になるように５０ｍＭ    リン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ８．０に溶かし、これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、ＭＳ−３６０８ＦＡ）の各ウェルに５０μｌ  加え、８０℃で乾燥させる。紫外線を１２０ｍＪ／ｃｍ２  照射した後、３０ｍＭクエン酸ナトリウム／３００ｍＭ  塩化ナトリウム（２ｘＳＳＣ）  ２００  μｌ  で３、４回洗浄し乾燥させた。
標識プローブは配列番号１及び配列番号３のＤＮＡを各々、下記表１の組成の反応液でジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識したものを用いた。
【００１３】
【表１】
0003589714.tif 000002
【００１４】
標識後、１／１０容の０．２Ｍ  ＥＤＴＡ  、１／１０容の４Ｍ  ＬｉＣｌ  、３μｇ  のグリコーゲン及び２．５  倍容のエタノールを加え−８０  ℃、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、７０％  エタノールで洗浄し乾燥させた後、１００  μｌ  の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  塩酸，ｐＨ８／１ｍＭエチレンジアミンテトラ四酢酸ナトリウム塩  （ＴＥ）  に溶かした。
得られた標識プローブの一定量を表２に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液）。
【００１５】
【表２】ハイブリダイゼーションバッファー
0003589714.tif 000003
【００１６】
各種細菌からの被検  ｒＲＮＡは全て平板培地上のコロニーから調製した。即ち、ボルデテラ・ブロンキセプチカ及びＡ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ    野外分離株は、ヒツジ血液加ボルデジャング寒天培地で培養しコロニーを得た。他の菌については、特に記載はしないが、それぞれの菌で通常用いられている寒天培地を用いた。菌の集落を爪楊枝でとり、０．１１ｍｌのリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）  に懸濁した。うち１０μｌ  をとり適当に生理食塩水で希釈し、それぞれの菌で用いられる平板培地に塗抹して菌数を測定した。これに１２．５μｌ  の１Ｎ水酸化ナトリウムを加え３７℃、１０分放置後、１２．５μｌ  の１Ｎ塩酸／０．２Ｍ  リン酸バッファーを加え中和した。
ハイブリダイゼーションとその検出は以下のようにして行なった。即ち、各種菌溶菌液５０μｌ  と標識プローブ液５０μｌ  を捕捉ＤＮＡが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、３７℃、２時間静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液  （１％    ブロッキング試薬，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）  で１０，０００倍に希釈した抗Ｄｉｇ  ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガーマンハイム社製）  １００  μｌ  を加え３０分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：０．１２％  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／０．１Ｍ  酢酸ナトリウム，ｐＨ５／３０％ジメチルホルムアミド、Ｂ液：０．０３％  過酸化水素／０．２％  リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混合）１００μｌ  を加え５−１５分放置した。得られた青色液の吸光度を６６０ｎｍ  の波長で測定した。下記表３にその結果を示す。
【００１７】
【表３】
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【００１８】
表３の結果より、本発明の核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして使用することによって、Ａ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  野外分離株を含めその他の菌との交叉性をバックグラウンドレベルに落としてボルデテラ・ブロンキセプチカを特異的に検出することができることがわかる。
【００１９】
実施例２
以下の成分を含む、約５００検体分のキットを作成した。
0003589714.tif 000005
【００２０】
【発明の効果】
本発明の核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして用いハイブリダイゼションを行うことにより、Ａ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びその他の菌との交叉性をバックグラウンドレベルに落とし、かつ偽陰性もなく、ボルデテラ・ブロンキセプチカを特異的に検出することができる。
【００２１】
【配列表】
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【００２２】
0003589714.tif 000007
【００２３】
0003589714.tif 000008
【００２４】
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