(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式
Ｗ1−Ｘ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−Ｗ2−Ｚ            （Ｉ）
式中、
Ｗ1は下記式（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）
【化１】
0003583489.tif 000049
ここで、
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和の    Ｃ1〜Ｃ10脂肪族炭化水素基、又は場合によりアルキル基、アルコキシ基、アルキル    チオ基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、ジアルキルアミノ基、シアノ基も    しくはニトロ基で置換されていてもよいアリールもしくはアラルキル基を表わし、
Ｒ3は水素原子、直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和のＣ1〜Ｃ10脂    肪族炭化水素基、場合によりアルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルコキ    シカルボニル基、ハロゲン原子、ジアルキルアミノ基、シアノ基もしくはニトロ基で    置換されていてもよいアリールもしくはアラルキル基、又は下記式（ａ）のビオチン    基を表わし、
Ｌ1は直接結合又は場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基で置換されてい    てもよいｏ−、ｍ−もしくはｐ−フェニレン基を表わし、そして
Ｑ-はカウンターアニオンを表わす、
【化２】
0003583489.tif 000050
ここで、
Ｒ4は水素原子又はＲ1を表わし、
Ｒ1、Ｒ3及びＱ-は前記と同義であり、
Ｒ5は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表わし、そして
ｍは０又は１である、
で示される３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基から選ばれ；
−Ｗ2−Ｚは窒素原子が下記式（ａ）のビオチン基で４級化され且つ環が場合により    アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原    子、ジアルキルアミノ基、シアノ基もしくはニトロ基で置換されていてもよい含窒素    複素環式基、下記式（ｆ）
【化３】
0003583489.tif 000051
ここで、
Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立に直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽        和のＣ1〜Ｃ10脂肪族炭化水素基、又は場合によりアルキル基、アルコキシ基、        アルキルチオ基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、ジアルキルアミノ          基、シアノ基もしくはニトロ基で置換されていてもよいアリールもしくはアラル        キル基を表わし、
Ｚは下記式（ａ）のビオチン基を表わし、
Ｌ2は直接結合又は場合によりＣ1〜Ｃ10アルキル基で置換されていてもよいｏ−        、ｍ−もしくはｐ−フェニレン基を表す、
で示される４級アンモニウム基、下記式（ｇ）
【化４】
0003583489.tif 000052
ここで、
Ｒ8は水素原子又はＲ6を表わし、
Ｒ6及びＺは前記と同義であり、
Ｒ9は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表わし、そして
１は０又は１である、
で示される複素環式４級アンモニウム基、或いは窒素原子が下記式（ａ）のビオチン    基及びＣ1〜Ｃ10アルキル基、又は場合によりアルキル基、アルコキシ基、アルキル    チオ基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、ジアルキルアミノ基、シアノ基も    しくはニトロ基で置換されていてもよいアリールもしくはアラルキル基で４級化され    たピロリジニウム又はピペリジニウム基を表わし；
Ｘ及びＹはそれぞれ独立に直接結合又は主鎖の炭素数が１〜２０であり且つ場合によ    り炭素数が２４以下の分岐を少なくとも１個有していてもよいアルキレン基を表わ      し；そして
Ｚは下記式（ａ）
【化５】
0003583489.tif 000053
ここで、ｎは０又は１である、
で示されるビオチン基を表わす、
で示されるカルボジイミド誘導体。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立にＣ1〜Ｃ10アルキル基又は場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基で置換されていてもいフエニル基を表わし、
Ｒ3が水素原子、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基で置換されていてもよいフエニル基又は式（ａ）のビオチン基を表わす、
請求項１に記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項３】
Ｗ1が
【化６】
0003583489.tif 000054
式中、
Ａ3は水素原子、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アル    キル基で置換されていてもよいフエニル基又は式（ａ）のビオチン基を表わし、
Ａ4は水素原子、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基又は場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10ア    ルキル基で置換されていてもよいフエニル基を表わし、そして
Ｑ-はカウンターアニオンを表わす、
から選ばれる請求項１に記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項４】
−Ｗ2−Ｚが窒素原子が式（ａ）のビオチン基で４級化され且つ環が場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基又は場合によりアルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、ジアルチルアミノ基、シアノ基もしくはニトロ基で置換されていてもよいアリールもしくはアラルキル基で置換されていてもよいピリジニウム基である請求項１〜３のいずれかに記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項５】
−Ｗ2−Ｚが
【化７】
0003583489.tif 000055
式中、
Ｂ1は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、Ｃ1〜Ｃ10アルコキシ基又は    場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基で置換されていてもよいアリール    もしくはアラルキル基を表わし、
Ｚ及びＱ-は請求項１に記載したと同義である、
から選ばれる請求項１〜４のいずれかに記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項６】
−Ｗ2−Ｚが
【化８】
0003583489.tif 000056
式中、
Ｂ2は水素原子、Ｃ1〜Ｃ10アルキル基又は場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10ア    ルキル基で置換されていてもよいフエニル基を表わし、そして
Ｚは請求項１に記載したと同義である、
から選ばれる請求項１〜４のいずれかに記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項７】
−Ｗ2−Ｚが
【化９】
0003583489.tif 000057
式中、
Ｂ3はＣ1〜Ｃ10アルキル基又は場合により少なくとも１個のＣ1〜Ｃ10アルキル基で    置換されていてもよいフエニルもしくはベンジル基を表わし、そして
Ｚ及びＱ-は請求項１に記載したと同義である、
から選ばれる請求項１〜４のいずれかに記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項８】
Ｘ及びＹがそれぞれ独立に主鎖の炭素数が１〜４であり且つ場合にり分岐鎖としてメチル基を有していてもよいアルキレン基を表わす請求項１〜７のいずれかに記載のカルボジイミド誘導体。
【請求項９】
下記一般式
【化１０】
0003583489.tif 000058
式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｘ及びＹは請求項１に記載したと同義である、
で示される化合物をハロゲン化ビオチンと反応させることを特徴とする請求項１に記載の一般式（Ｉ）で示されるカルボジイミド誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸又は蛋白質に標識としてビオチンを導入するための試薬として有用な新規なビオチン基含有カルボジイミド誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、核酸の標識は放射性同位体（３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈなど）を標識化合物として用い、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法、テーリング法などの方法で核酸に取り込ませることにより行われてきた。このような放射性同位体で標識した核酸を用いた検出法は、一般に、高感度で特異的であるという特徴を有しているが、安全性、経済性、安定性などの点では問題がある。すなわち、放射性同位体は半減期を考慮して保存、使用する必要があり、長期保存して繰り返し使用することができない。また、一般に人体に有害であり、取り扱いに専用の施設を必要とするなど厳密な注意をしなければならない。
【０００３】
このような理由により非放射性標識物質を用いた核酸、蛋白質の標識が盛んに利用されはじめている。特にアビジンまたはストレプトアビジンと高い親和性を有するビオチンを用いた方法が多用されたいる。そのような方法としては、酵素標識したアビジンを、核酸に取り込ませたビオチンに結合させた後、結合した酸素の活性を測定する方法が一般的である。
【０００４】
ビオチンを核酸に導入する方法としては、ランガーら（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．）により提案されたピリミジン環にリンカーを介してビオチンを結合させた２′−デオキシウリジントリホスフエート誘導体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８，６６３３−６６３７（１９８１））を、ニックトランスレーション法（Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ    ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，２３７−２５７（１９７７））、ランダムプライマー法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７，２６６−２６７（１９８３））またはテーリング法（Ｒｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，５，３３３−３３７（１９８６））により核酸に取り込ませる方法がよく知られている。
【０００５】
また、光に対して活性な芳香族アジドをリンカーアームによってビオチンと結合させた化合物を用いる方法も開発されており［Ｆｏｒｓｔｅｒ    ｅｔ．  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，７４５−７６１（１９８５）］、そのための試薬としてブレザ（ＢＲＥＳＡ）社からフオトビオチンＲ（Ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ  Ｒ）が市販されている。
【０００６】
さらに、ジアゾ化合物を用いる方法［Ｍ．Ｓｈｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，９，５５３−５５６（１９９３）］、ビオチンヒドラジドを用いる方法［Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２，５１９（１９８７）］、ビオチンヒドラジド誘導体やビオチンスペルミン誘導体などのようなアミノ基を側鎖に有するビオチン誘導体を、グルタルアルデヒドやビスエポキシドなどの２官能性架橋剤を用いて核酸に結合させる方法［特開平１−２２８５００号公報、ＡＬ−Ｈａｋｉｍ，Ａ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，２５１，９３５（１９８８）］、ホルミル基を有するビオチン誘導体を用いる方法（特開平６−９２９６８号公報）なども知られている。
【０００７】
蛋白質へのビオチンの導入は、蛋白質の遊離アミノ基とビオチンのパラニトロフエニルエステル［Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ｆｏｇａｎ．Ｄ．Ｔ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９９，２３５（１９７７）］またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［Ｊａｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１００，２１３（１９７６）］を反応させることにより行なうことができる。そのほかにもジアゾアニリド誘導体を用いる方法［Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．，２６，１（１９８０）］、ヒドラジド誘導体を用いる方法［Ｈｅｉｔｚｍａｎｎ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７１，３５３７（１９７４）］などが知られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前述のニックトランスレーション法、ランダムプライマー法、テーリング法のように酵素を用いる方法は、標識に時間がかかること（通常１時間以上）、温度を厳密に制御する必要があること（１５℃ないし３７℃）、さらにニックトランスレーション法では１本鎖核酸に対して標識することができないことなど種々の問題がある。また、酵素法では標識された核酸断片の分子量分布が広くなり、しばしば低分子量の核酸断片を生じてしまうという問題や、ある程度以上の長さの標識核酸を合成できない、標識操作に多数の工程を必要とし煩雑であるなどの問題がある。さらに、酵素法では核酸オリゴマーなどの短い核酸にビオチンを導入することができず、しかも用いる酵素及びビオチン導入試薬であるヌクレオシド三燐酸にビオチンを付加したものは非常に不安定で取り扱い、保存などに注意を要する。
【０００９】
光に対して活性なアジド基を含む化合物を用いたビオチン標識法では、比較的短時間で標識反応が終わるものの、アジド基含有化合物の光に対する安定性が低いために暗所での操作が必要であり、標識反応に特別な光源を必要とするなど、用いる試薬の取り扱い、保存方法や操作の煩雑さなどに問題点がある。またこの方法は、比較的短い核酸に対する標識効率が悪いため、核酸オリゴマーなどの短い核酸へのビオチン導入に用いることができない。
【００１０】
ホルミル基含有ビオチンを用いた標識法では、アルデヒドとアミノ基の間で生成するシッフ塩基が、加水分解されやすく不安定であり、安定化するためにさらに還元する必要がある。また、ジアゾ基を利用する標識法では、ジアゾ基含有ビオチンが水に不溶であるためクロロホルムなどの有機溶媒を使用しなければならないという問題がある。側鎖にアミノ基を有するビオチンヒドラジド誘導体などを２官能性架橋剤を使用して核酸に導入する方法は、ビオチンヒドラジド同士あるいは核酸同士の副反応が起こりやすく、標識効率の低下、ハイブリダイゼーションの特異性の低下などを招きやすいという問題がある。
【００１１】
核酸と同様に蛋白質への標識においてもこれらの方法が使用されるが、核酸の場合と基本的に同じ問題が生じている。
【００１２】
最近、特別な反応装置、条件が不要で簡便に短時間で効率よくビオチンを核酸または蛋白質に導入することができる試薬の開発が強く望まれている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
カルボジイミド化合物が核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジイミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグアニンおよびチミン塩基と反応し付加体を形成する［Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８４，６８８（１９６２）］
本発明者は簡便で高効率な核酸および蛋白質へのビオチン導入法に関して鋭意研究を重ねた結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質などへの高い反応性を利用して、カルボジイミド化合物にビオチン部分を導入することにより、短時間で効率よくビオチン標識することができるビオチン導入試薬を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、下記一般式
Ｗ１−Ｘ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ−Ｗ２−Ｚ          （Ｉ）
式中
Ｗ１は直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基、場合により置換されていてもよいアリール基、ヘテロアリール基、３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基を表わし、
−Ｗ２−Ｚは４級アンモニウム基を表わし、
Ｘ及びＹはそれぞれ独立に直接結合又は主鎖の炭素数が１〜２０であり且つ場合により炭素数が２４以下の分岐を少なくとも１個有していてもよいアルキレン基を表わし、
Ｚは下記式
【００１５】
【化６】
0003583489.tif 000002
【００１６】
で示されるビオチン基を表わし、そして
ｎは０又は１である、
で示されるカルボジイミド誘導体を提供するものである。
【００１７】
本明細書において、「直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基」には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が包含され、アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、２−エチルヘキシル、ノニル、デシル等が挙げられ、通常、炭素数が１〜２０、特に１〜６のものが好ましく；
アルケニル基としては、例えばビニル、アリル、クロチル、チグリル、プレニル等が挙げられ、中でも炭素数が２〜１０、特に２〜５のものが好適であり；
アルキニル基としては、エチニル、プロパルギル等を例示することができ、一般に炭素数が２〜１０、特に２〜５のものが好適であり；そしてシクロアルキル基は、場合により環上にアルキル基を有しているものを包含し、具体的には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシル、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル、シクロオクチル等を例示することができ、一般に炭素数が３〜１４、特に６〜１０のものが好適である。
【００１８】
また、「アリール基」は、単環式又は多環式のいずれのタイプのものであってもよく、例えば、フエニル、ナフチル等が挙げられる。これらのアリール基は場合によりカルボジイミド基と実質的に反応しない基により置換されていてもよく、置換基としては、例えば、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基；メトキシ、エトキシなどのアルコキシ基；メチルチオ、エチルチオなどのアルキルチオ基；メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル基；フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子；ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどのジアルキルアミノ基；シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。このような基で置換されたアリール基の例としては、トリル、キシリル、メトキシフエニル、メチルチオフエニル、メトキシカルボニルフエニル、クロロフエニル、ブロモフエニル、ヨードフエニル、ジメチルアミノフエニル、ジエチルアミノフエニル、シアノフエニル、ニトロフエニル等が挙げられる。
【００１９】
「アラルキル基」は、以上に述べた場合により置換されていてもよいアリール基で置換されたアルキル基を意味し、例えばベンジル、フエネチル等が挙げられる。
【００２０】
「ヘテロアリール基」には、ヘテロ原子として窒素、酸素及びイオウから選ばれる少なくとも１個、好ましくは１〜３個の原子を含有する単環式又は多環式の芳香族系複素環式基が包含され、具体的には、フリル、チエニル、ピロール、ピリジルなどの５〜６員の単環式複素環式基や、ベンゾフリル、キサンテニル、ジベンゾフリル、チアントレニル、インドリル、アクリゾニルなどの多環式複素環式基等を例示することができ、これらは場合により、アリール基について前述した如き置換基により置換されていてもよい。
【００２１】
前記一般式（Ｉ）において、Ｗ１として好適な１つの基としては、Ｃ１〜Ｃ２０特にＣ１〜Ｃ１０のアルキル基又は場合により置換されていてもよいアリール基、殊に、少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、例えばメチル基で置換されたフエニル基が挙げられる。
【００２２】
また、前記一般式（Ｉ）において、Ｗ１が３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基を表わす場合、これらの基として好適な基としては以下に述べるものが挙げられる。
【００２３】
（１）  窒素原子が水素原子、直鎖状、分岐鎖もしくは環状で飽和もしくは不飽和の炭化水素基、場合により置換されていてもよいアリール基、アラルキル基、前記式（ａ）のビオチン基で４級化されていてもよい場合によりアリール基について前述した如き置換基により置換されていてもよい含窒素複素環式基、例えばピリジニウム基、特に、窒素原子がＣ１〜Ｃ１０アルキル基、例えばメチル基又は前記式（ａ）のビオチン基で４級化されていてもよい、場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基、例えばメチル基で置換されていてもよい２−、３−もしくは４−ピリジル又はピリジニウム基。具体的には下記式で示される基：
【００２４】
【化７】
0003583489.tif 000003
【００２５】
上記式中、
Ａ１は存在しないか（この場合、窒素原子の＋及びＱ−は存在しない）、或いは水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、少なくとも１個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいアリール基、アラルキル基又は前記式（ａ）のビオチン基を表わし、
Ａ２は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、場合により少なくとも１個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基、好ましくは水素原子、塩素原子、臭素原子、メチル基又はメトキシ基を表わし、そして
Ｑ−はアニオン、例えばサルフエートイオン、アルキルサルフエートイオン、アリールサルフエートイオン、ハロサルフエートイオン、ハライドイオンなどを表わす。
【００２６】
（２）  下記式
【００２７】
【化８】
0003583489.tif 000004
【００２８】
式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ１０脂肪族炭化水素基、場合により置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基、殊に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基又は場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基を表わし、
Ｒ３は水素原子、直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ１０脂肪族炭化水素基、場合により置換されていてもよいアリール基、アラルキル基又は前記式（ａ）のビオチン基を表わし、
Ｌ１は直接結合又は少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいｏ−、ｍ−もしくはｐ−フエニレン基を表わし、そして
Ｑ−は前記と同義である、
で示される３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基。
【００２９】
（３）  下記式
【００３０】
【化９】
0003583489.tif 000005
【００３１】
式中、
Ｒ４は水素原子又はＲ１を表わし、
Ｒ１、Ｒ３及びＱ−は前記と同義であり、
Ｒ５は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表わし、そして
ｍは０又は１である、
で示される複素環式３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基。より具体的には下記式で示される基：
【００３２】
【化１０】
0003583489.tif 000006
【００３３】
式中、Ａ３は水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基又は前記式（ａ）のビオチン基を表わし、
Ａ４は水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基又は場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基、好ましくは水素原子又はメチル基を表わし、そして
Ｑ−はカウンターアニオンを表わす。
【００３４】
（４）  １−位がＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基で置換されたピロリジル、ピペリジリル、ピロリジニウム又はピペリジニウム基、或いは窒素原子がＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により置換されていてもよいアリール基、アラルキル基又は前記式（ａ）のビオチン基で４級化された２−もしくは３−ピロリジニウム又は２−、３−もしくは４−ピペリジニウム基。具体的には下記式で示される基：
【００３５】
【化１１】
0003583489.tif 000007
【００３６】
式中
Ａ５及びＡ７はそれぞれＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基又はベンジル基を表わし、
Ａ６及びＡ８はそれぞれ水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基、ベンジル基又は前記式（ａ）のビオチン基を表わし、そして
Ｑ−はカウンターアニオンを表わす。
【００３７】
一方、前記一般式（Ｉ）において、−Ｗ２−Ｚによって表わされる４級アンモニウム基としては、以下に示すものを例示することができる。
【００３８】
（１）  窒素原子が前記式（ａ）のビオチン基（Ｚ）で４級化された、場合によりアリール基について前述した如き置換基により置換されていてもよい含窒素複素環式基、例えばピリジニウム基、特に、窒素原子が式（ａ）のビオチン基（Ｚ）で４級化された、場合により少なくとも１個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基で置換されていてもよい２−、３−もしくは４−ピリジニウム基。具体的には下記式で示される基：
【００３９】
【化１２】
0003583489.tif 000008
【００４０】
上記式中、
Ｂ１は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、場合により少なくとも１個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基、好ましくは水素原子、塩素原子、臭素原子、メチル基又はメトキシ基を表わし、
Ｚ及びＱ−は前記と同義である。
【００４１】
（２）  下記式
【００４２】
【化１３】
0003583489.tif 000009
【００４３】
式中、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に直鎖状、分岐鎖状もしくは環状で飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ１０脂肪族炭化水素基、場合により置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基、殊に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基又は場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基を表わし、
Ｚは前記と同義であり、
Ｌ２は直接結合又は場合によりＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいｏ−、ｍ−又はｐ−フエニレン基を表わす、
で示される４級アンモニウム基。
【００４４】
（３）  下記式
【００４５】
【化１４】
0003583489.tif 000010
【００４６】
式中、
Ｒ８は水素原子又はＲ６を表わし、
Ｒ６及びＺは前記と同義であり、
Ｒ９は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表わし、
そして
ｌは０又は１である、
で示される複素環式４級アンモニウム基。具体的には例えば下記式で示される基：
【００４７】
【化１５】
0003583489.tif 000011
【００４８】
式中、
Ｂ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基又は場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基により置換されていてもよいフエニル基、好ましくは水素原子又はメチル基を表わし、そして
Ｚは前記と同義である。
【００４９】
（４）  窒素原子が前記式（ａ）のビオチン基（Ｚ）及びＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により置換されていてもよいアリール基又はアラルキル基で４級化された２−もしくは３−ピロリジル又は２−、３−もしくは４−ピペリジル基。具体的には例えば下記式で示される基：
【００５０】
【化１６】
0003583489.tif 000012
【００５１】
上記式中
Ｂ３はＣ１〜Ｃ１０アルキル基、場合により少なくとも１個、好ましくは１〜２個のＣ１〜Ｃ１０アルキル基で置換されていてもよいフエニル基又はベンジル基、好ましくはメチル基、エチル基、フエニル基又はベンジル基を表わし、そして
Ｚ及びＱ−は前記と同義である。
【００５２】
さらに、前記一般式（Ｉ）において、Ｗ１とカルボジイミド基又は−Ｗ２−Ｚとカルボジイミド基を結合するためのリンカー部分であるＸ及びＹによって表わされうる「主鎖の炭素数が１〜２０であり且つ場合により炭素数が２４以下の分岐を少なくとも１個有していてもよいアルキレン基」としては、例えば次のものが挙げられる。
【００５３】
メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、１，２−ジメチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、テトラメチレン、１−メチルテトラメチレン、２−メチルテトラメチレン、３−メチルテトラメチレン、４−メチルテトラメチレン、１，１−ジメチルテトラメチレン、１，２−ジメチルテトラメチレン、１，３−ジメチルテトラメチレン、１，４−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジメチルテトラメチレン、２，３−ジメチルテトラメチレン、２，４−ジメチルテトラメチレン、３，３−ジメチルテトラメチレン、３，４−ジメチルテトラメチレン、４，４−ジメチルテトラメチレン、ペンタメチレン、１−メチルペンタメチレン、２−メチルペンタメチレン、３−メチルペンタメチレン、４−メチルペンタメチレン、５−メチルペンタメチレン、１，１−ジメチルペンタメチレン、１，２−ジメチルペンタメチレン、１，３−ジメチルペンタメチレン、１，４−ジメチルペンタメチレン、１，５−ジメチルペンタメチレン、２，２−ジメチルペンタメチレン、２，３−ジメチルペンタメチレン、２，４−ジメチルペンタメチレン、２，５−ジメチルペンタメチレン、３，３−ジメチルペンタメチレン、３，４−ジメチルペンタメチレン、３，５−ジメチルペンタメチレン、４，４−ジメチルペンタメチレン、４，５−ジメチルペンタメチレン、５，５−ジメチルペンタメチレンなど。
【００５４】
これらのうち特に好ましいものは、主鎖の炭素数が１〜４であり且つ場合により分岐鎖としてメチル基を有していてもよいアルキレン基、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、１−メチルテトラメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン等が挙げられる。
【００５５】
本発明のビオチン導入試薬であるカルボジイミド誘導体の合成は、通常１級アミン誘導体を出発原料として尿素またはチオ尿素誘導体へと導き、さらに脱水あるいは酸化的脱硫によるカルボジイミド化により達成される。対称型カルボジイミドの合成にはイソシアネート化合物からの脱炭酸を伴う縮合反応を用いることもできる。
【００５６】
例えば、１級アミン（ＩＩ）と尿素を縮合させ１置換尿素（ＩＩＩ）を得、さらに第２のまたは同一の１級アミン（ＩＶ）を反応させることにより２置換尿素中間体（Ｖ）を合成することができる。すなわち、１級アミン（ＩＩ）またはその塩と尿素を水またはその他適当な溶媒中で加熱し数時間反応させ、この時点で１置換尿素（ＩＩＩ）を単離した後、あるいは系中に第２のまたは同一の１級アミン類（ＩＶ）を添加し、同様の条件で反応させることにより２置換尿素中間体（Ｖ）が合成することができる［Ｔ．Ｌ．Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｋ．Ｃ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．，１，４５３（１９４１）］。
【００５７】
【化１７】
0003583489.tif 000013
【００５８】
また、１置換尿素（ＩＩＩ）は１級アミン（ＩＩ）とシアン酸またはその塩とを反応させることによっても合成することができる［Ｆ．Ｋｕｒｚｅｒ，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．，４，４９（１９６３）］。
【００５９】
【化１８】
0003583489.tif 000014
【００６０】
このようにして得られる１置換尿素誘導体（ＩＩＩ）は上述の方法により２置換誘導体（Ｖ）へと導くことができる。２置換尿素誘導体（Ｖ）を直接得る方法としては、イソシアネート化合物（ＶＩ）と１級アミン類（ＩＶ）との反応を用いることもできる（Ｊ．Ｈ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓｌｏｃｏｍｂｅ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，４３，２０３（１９４８））。
【００６１】
【化１９】
0003583489.tif 000015
【００６２】
一方、チオ尿素誘導体（ＶＩＩＩ）は１級アミン（ＩＶ）とイソチオシアネート（ＶＩＩ）との反応により合成することが一般的に行われる［Ｎ．Ａ．Ｉｖａｎｏｖ，Ｒ．Ｖ．Ｖｉａｓｏｖａ，Ｖ．Ａ．Ｇａｎｃｈａｒａｖａ，ａｎｄ  Ｌ．Ｎ．Ｓｍｉｒｎｏｖ，  Ｉｚｖ．Ｖｙｓｓｈ．Ｕｃｈｅｂｎ．Ｚａｖｅｄ．Ｋｈｉｍ．Ｋｈｉｍ．Ｔｅｋｈｎｏｌ．，１９（７），１０１０（１９７６）］。
【００６３】
【化２０】
0003583489.tif 000016
【００６４】
この他に１級アミン（ＩＩ）と二硫化炭素との反応により合成することもできる［Ｗ．Ｗ．Ｌｅｖｉｓ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｗａｉｐｅｒｔ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．３，１６８，５６０（１９６５）］。
【００６５】
【化２１】
0003583489.tif 000017
【００６６】
このようにして合成される２置換尿素誘導体（Ｖ）及びチオ尿素誘導体（ＶＩＩＩ）は脱水あるいは酸化的脱硫反応によりカルボジイミド誘導体（ＩＸ）へと導くことができる。
【００６７】
尿素誘導体（Ｖ）の脱水反応によるカルボジイミド誘導体の合成は、３級アミン中で尿素誘導体（Ｖ）をパラトルエンスルホン酸クロリドと共に加熱することで容易に達成できる［Ｇ．Ａｍｉａｒｄ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｅｙｍｅｓ，Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒ．，１３６０（１９５６）］。
【００６８】
【化２２】
0003583489.tif 000018
【００６９】
また、２置換尿素誘導体（Ｖ）の脱水は、４級アンモニウム塩の存在下でパラトルエンスルホン酸クロリド及び炭酸カリウムを用いて行なうこともできる［Ｚｓｕｚｓａ  Ｍ．Ｊａｓｚａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５２０（１９８７）］。
【００７０】
チオ尿素誘導体（ＶＩＩＩ）の脱硫は一般に酸化水銀を脱硫剤として使用することにより行われる。この反応で好ましく用いられる溶媒としては、例えば、エーテル、ベンゼン、アセトンなどが挙げられる。
【００７１】
【化２３】
0003583489.tif 000019
【００７２】
脱硫剤としては、酸化水銀以外にも、酸化鉛［Ｆ．Ｚｅｔｚｅｈｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｆｒｅｄｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍ，Ｂｅｒ．，７３，１１１４（１９４０）］、酸化亜鉛［Ｒ．Ｆ．Ｃｏｌｅｓ，Ｕ．Ｓ，Ｐａｔ．２，９４６，８１９（１９６０）］、炭酸鉛、硝酸鉛、塩化鉛［Ｊ．Ｃ．Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．３，１３５，７４８（１９６４）］などを用いることもできる。さらにアルカリ性で次亜塩素酸ナトリウムを作用させることによって合成することもできる［Ｈ．Ｓｔｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗｕｌｆｆ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，９５，２３０２（１９６２）］。例えば、チオ尿素誘導体を塩化メチレンなどのような溶媒中で次亜塩素酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化銅と共に０℃以下で一昼夜反応させる。その後一般的に用いられている方法で単離、精製することによりカルボジイミド誘導体（ＩＸ）が得られる。
【００７３】
このようにして得られるカルボジイミド誘導体（ＩＸ）を、ハロゲン化ビオチン、好ましくは臭素化ビオチン又はヨウ素化ビオチンと反応させることにより、本発明の式（Ｉ）のカルボジイミド誘導体を製造することができる。
【００７４】
【化２４】
0003583489.tif 000020
【００７５】
本発明のカルボジイミド誘導体は、ビオチン導入試薬として、核酸や蛋白質をビオチン標識するのに有用である。
【００７６】
例えば、本発明のカルボジイミド誘導体を用いて核酸にビオチン基を導入する場合、本発明のカルボジイミド誘導体を核酸と、ホウ酸緩衝液などの適当な緩衝液中で混合し、室温ないし約１００℃、好ましくは室温ないし約９０℃の温度で約１〜約１０分間反応させるだけで、極めて簡単かつ短時間で核酸をビオチン標識することができる。
【００７７】
本発明のカルボジイミド誘導体は、長さや形態（一本鎖であるか二本鎖であるか）等にかかわらず、通常入手しうるすべての核酸に対してビオチン基を導入することができる。例えば、前述の酵素を用いる方法や、光に対して活性なアジド基を含む化合物を用いたビオチン標識法では、核酸オリゴマーなどの比較的短い核酸にビオチンを導入できないが、本発明のカルボジイミド誘導体を用いれば、それらの比較的短い核酸に対しても効率よくビオチン基を導入することができる。また、酵素法では標識反応の結果分子量の低下を招きやすく、従って、長鎖の核酸に対してもビオチン基を導入することができないが、本発明のカルボジイミド誘導体を用いれば、Ｍ１３系、λ系核酸などの長鎖核酸に対しても分子量を低下させることなくビオチンを効率よく導入することができる。さらに、これらの短鎖又は長鎖の核酸は一本鎖であっても二本鎖であっても、本発明のカルボジイミド誘導体を用いれば、同様に効率よくビオチン基を導入することができる。しかも、本発明のカルボジイミド誘導体は水溶液中、明所でも安定である。例えば本発明の化合物の水溶液を実験室内で約一ヶ月放置しても全く性能に変化がなく、取り扱い、保存などに特別の管理をする必要が全くない。
【００７８】
蛋白質もまた上記と同様にしてビオチン標識することができる。
【００７９】
上記の如くしてビオチン標識された核酸及び蛋白質は、例えば、エタノール沈殿、セファデックス  Ｇ−５０（ファルマシア製、ゲル濾過クロマトグラフイー用担体）による分画、電気泳動などの種々の方法で精製することが可能であり、またはそのままハイブリダイゼーションに用いることができる。さらに、長期間保存することも可能である。
【００８０】
ビオチン標識された核酸又は蛋白質は一般に次のようにして核酸や蛋白質の検出に用いることができる。検出しうる核酸または蛋白質としては動物、植物、微生物などの生物由来のものが挙げられる。
【００８１】
まず核酸では、ブロッティング用メンブレン、マイクロタイタープレート、ビーズなどの固相に共有結合、物理的吸着などにより固定した核酸と、ビオチン標識したプローブを接触させ、ハイブリダイゼーションを行った後、末反応のビオチン標識したプローブを洗浄により除去する。核酸を固定する固相担体としては、例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、変成セルロース膜、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜などが挙げられる。検出する核酸を固相に固定する方法としてはそれ自体既知の方法を使用することができ［マニアチィス・エム（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍ．）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）１９８９年］、サザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニープラークブロッティングなどを使用することができる。固相に固定した核酸とビオチン標識核酸とのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションする部分の塩基長および組成などから最適と考えられる溶液および温度を用いて行うことができる。非特異的吸着を抑えるために、必要に応じてデンハルト溶液、スキムミルク、ラウリル硫酸ナトリウムなどを適宜添加してもよい。
【００８２】
次に、酵素、蛍光物質などにより標識したアビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、固相担体に固定化した核酸と結合しているプローブのビオチンに、ビオチン・アビジンまたはビオチン・ストレプトアビジン複合体を形成させることにより標識物を結合し、この標識物を酵素活性や蛍光強度測定などにより検出する。酵素活性を測定する方法の場合には、アビジンまたはストレプトアビジンとアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素との複合体を用い、酵素反応によって発色するか、発光する基質を加える。その発色度、発光強度などから酵素活性を測定することができる。
【００８３】
一方、ビオチン標識された蛋白質は酵素免疫測定（ＥＩＡ）にも用いることができる。この場合、抗体を結合したメンブレン、マイクロタイタープレート、ビーズなどの固相担体で目的物を捕捉し、ビオチン標識抗体を接触させることにより目的物にビオチンを結合させる。以後は核酸の場合と同様の検出法を用いることができる。
【００８４】
これらの検出法は、ビオチン・アビジン複合体の結合定数が１０−１５モル−１であり極めて高いこと［グリーン・エヌ・エム（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｍ．）、アドバンス・イン・プロテイン・ケミストリー（Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．）２９巻、８５ページ、１９７５年］およびアビジンが４ヶ所のビオチン結合部位を持つことなどにより、核酸や蛋白質を高感度で検出することができる。
【００８５】
以上述べたとおり、本発明のカルボジイミド誘導体を用いれば、特別な反応装置、反応条件を必要とせずに、極めて効率よく核酸や蛋白質にビオチン基を導入することができ、そのようにしてビオチン標識された核酸や蛋白質を用いることにより、生物由来の核酸や蛋白質を高感度で検出することが可能である。
【００８６】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００８７】
【実施例】
化合物の合成例
合成例１：対称尿素の合成（化合物３６−２前駆体）
３−（１−ピロリジル）プロピルアミン３２ｇ（０．２５ｍｏｌ）、尿素６ｇ（０．１ｍｏｌ）およびキシレン５０ｍｌを混合し２４時間還流した。放冷後析出結晶を濾別、ベンゼン洗浄した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製することにより尿素誘導体２８ｇ（収率７９％）を得た。
【００８８】
合成例２：非対称尿素の合成１（化合物１９−２前駆体）
パラトルイジン塩酸塩３５．９ｇ（０．２５ｍｏｌ）、イソシアンカリウム４０．１ｇ（０．５０ｍｏｌ）および水酸化カリウム１４．０ｇ（０．２５ｍｏｌ）を水３００ｍｌに溶解し、２時間還流、撹拌した。冷却した後クロロホルムで抽出し炭酸カリウムで乾燥した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し尿素誘導体を２２ｇ（収率５９％）得た。
【００８９】
これを１５ｇ（０．１ｍｏｌ）とり、３−アミノメチル−４−メチルピリジン１２ｇ（０．１ｍｏｌ）、キシレン２００ｍｌとともに２４時間還流した。冷却後析出した結晶を濾別洗浄後シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し二置換尿素誘導体１３ｇ（収率５１％）を得た。
【００９０】
合成例３：非対称尿素の合成２（化合物１５−２前駆体）
撹拌しているＮ，Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン１．０７ｇ（７．８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液２０ｍｌに氷冷下シクロヘキシルイソシアネート１ｍｌ（７．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。滴下終了後室温で一晩撹拌を続けた。反応液に水を加え塩化メチレン抽出後、炭酸カリウムで乾燥した。これを濃縮しエーテル洗浄することにより尿素誘導体を１．９７ｇ（収率９６％）得た。
【００９１】
合成例４：対称チオ尿素の合成（化合物３０−１前駆体）
Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン８．８ｇ（０．１ｍｏｌ）をエタノール７ｍｌに溶解し氷冷した。これに二硫化炭素３．８ｇ（０．０５ｍｏｌ）を５分間かけて加え、そのまま１時間撹拌した後５時間還流させた。エタノールを留去後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製しチオウレアを８．７ｇ（収率８０％）得た。
【００９２】
合成例５：非対称、対称チオ尿素の合成（化合物１９−１前駆体）
フェニルイソチオシアネート１．３５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン７ｍｌに溶解し氷浴で冷却した。これに無水塩化メチレン３ｍｌに溶解した２−（２−アミノエチル）ピリジン１．２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え室温で１５分撹拌した。反応混合物に水を加えた後塩化メチレンで抽出した。無水炭酸カリウムで乾燥後濃縮し、粗生成物２．８ｇを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製しＮ−フェニル−Ｎ’−２−ピリジルエチルチオウレアを２．３ｇ（収率８８％）得た。
【００９３】
合成例６：尿素からカルボジイミドの合成１（化合物１９−２前駆体）
Ｎ−ｐ−トリル−Ｎ’−（４−メチル−３−ピリジル）メチル尿素１２ｇ（４７ｍｍｏｌ）、塩化メチレン３５ｍｌおよびトリエチルアミン１８ｍｌを加え撹拌する。これに１０℃以下でｐ−トルエンスルホン酸クロリド１０．５ｇ（５９ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液を滴下し、３０分撹拌した。さらに３時間還流し、冷却した。不溶物を濾別後、溶媒を留去すると結晶が得られた。エーテルで３回洗浄することによりカルボジイミドを６．９ｇ（収率６２％）得た。
【００９４】
合成例７：尿素からカルボジイミドの合成２（化合物１５−２前駆体）
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（４−ジメチルアミノフェニル）尿素２．６１ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド１．９１ｇ（１０ｍｍｏｌ）のベンゼン−クロロホルム（２：１）溶液７０ｍｌに、炭酸カリウム３．５３ｇ（４０ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド０．２３ｇ（１ｍｍｏｌ）を加え還流下３時間反応させた。不溶分を濾別後、濾液を水１０ｍｌで２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、カルボジイミドを２．０２ｇ（収率８３％）得た。
【００９５】
合成例８：チオ尿素からカルボジイミドの合成（化合物１９−１前駆体）
Ｎ−フェニル−Ｎ’−２−ピリジルエチルチオウレア３．８ｇ（１５ｍｍｏｌ）をアセトン５０ｍｌに溶解し、酸化水銀６ｇ（２８ｍｍｏｌ）を加え６時間還流した。反応混合物を濾過した後溶媒を留去した。これにエーテルを加え析出物を濾別した後シリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製しＮ−フェニル−Ｎ’−２−ピリジルエチルカルボジイミド２．０ｇ（収率６０％）を得た。
【００９６】
合成例９：４級塩（１種×１）の導入（化合物１５−２）
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（４−ジメチルアミノフェニル）カルボジイミド０．２１ｇ（０．８１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド９ｍｌに溶解しＮ−（６−ヨードヘキシル）ビオチンアミド０．３７ｇ（０．８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去し得られた白色粉末をエーテルで洗浄した後メタノールに溶解させた。エーテルで再沈澱させ化合物１５−２を０．１５ｇ（収率７７％）得た。
【００９７】
合成例１０：４級塩（２種×１）の導入（化合物２９−１）
Ｎ−（２ーピリジルメチル）−Ｎ’−（２−ジエチルアミノエチル）カルボジイミド０．２１ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）をベンゼン１０ｍｌに溶解し、これにヨウ化メチル０．１３ｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を加え一昼夜撹拌した。析出物を濾別後ベンゼンで洗浄しアンモニウム塩を０．３１ｇ（収率９２％）得た。このアンモニウム塩０．３１ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、Ｎ−（６−ヨードヘキシル）ビオチンアミド０．３８ｇ（０．８４ｍｍｏｌ）を加え２０時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを留去した後、水を加え、不溶物を濾別し、濾液を凍結乾燥することにより化合物２９−１を０．４８ｇ（収率７０％）得た。
【００９８】
合成例１１：４級塩（１種×２）の導入（化合物２７−２）
Ｎ−３−ピリジルーＮ’−２−（Ｎ−メチルピロリジル）エチルカルボジイミド０．２２ｇ（０．９６ｍｍｏｌ）をベンゼン１０ｍｌに溶解し、Ｎ−（６−ヨードヘキシル）ビオチンアミド０．４４ｇ（０．９７ｍｍｏｌ）を加え一昼夜撹拌した。析出物を濾別後ベンゼンで洗浄することでピリジニウム塩を得た。これを０．３４ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）とりジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解させＺ１−Ｉを０．３１ｇ（０．５０ｍｍｏｌ）加え２６時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去後水を加え、不溶物を濾別後凍結乾燥することにより化合物２７−２を０．４８ｇ（収率７３％）得た。
【００９９】
合成例１２：Ｚ０−Ｉの合成
ビオチン２．０ｇ（８．２ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド１６０ｍｌに溶解し、トリブチルアミン２．６ｍｌを加え１０分間撹拌後さらにクロロギ酸イソブチル１．２ｍｌを加え３０分間撹拌する。この溶液を−５℃に冷却した６−アミノ−１−ヘキサノール１．１ｇ（９．６ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１６０ｍｌ）の溶液に−５℃以下で３０分間かけて加えた。さらに０℃で３時間撹拌を続けた後ジメチルホルムアミドを減圧留去し粗生成物を得る。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しアルコール体を２．２ｇ（収率７８％）得た。このＮ−（６−ヒドロキシヘキシル）ビオチンアミド２．２ｇ（６．４ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド６５ｍｌに溶解しヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウム５．２ｇ（１３ｍｍｏｌ）を加え遮光下室温で１時間撹拌した。メタノール１．７ｍｌを加え、さらに２０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しビオチンヨウ化物２．２ｇ（収率７６％）を得た。
【０１００】
合成例１３：Ｚ０−Ｂｒの合成
Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）ビオチンアミド２．２ｇ（６．４ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン７０ｍｌに溶解し窒素雰囲気下室温でトリフェニルホスフィン２．０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）および四臭化炭素３．２ｇ（９．６ｍｍｏｌ）を添加し１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え洗浄し、さらに有機層を飽和食塩水で洗浄する。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しビオチンブロム体を２．０ｇ（収率７７％）得た。
【０１０１】
合成例１４：Ｚ０−Ｃｌの合成
Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）ビオチンアミド２．２ｇ（６．４ｍｍｏｌ）と無水四塩化炭素７０ｍｌを混合し窒素雰囲気下室温でトリフェニルホスフィン２．０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）を加え加熱還流した。１時間後飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しビオチンクロル体を１．４ｇ（収率６０％）得た。
【０１０２】
合成例１５：Ｚ１−Ｉの合成
ビオチン２．０ｇ（８．２ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド１６０ｍｌに溶解し、トリブチルアミン２．６ｍｌを加え１０分間撹拌後さらにクロロギ酸イソブチル１．２ｍｌを加え３０分間撹拌する。この溶液を−５℃に冷却した８，１２−ジオキソ−７，１３−ジアザ−１６−アミノ−１−ヘキサデカノール２．８ｇ（９．８ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１６０ｍｌ）の溶液に−５℃以下で３０分間かけて加えた。さらに０℃で３時間撹拌を続けた後ジメチルホルムアミドを減圧留去し粗生成物を得る。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しアルコール体を３．１ｇ（収率７４％）得た。このＮ−（５，９−ジオキソ−４，１０−ジアザ−１６−ヘキサデカノール）ビオチンアミド３．３ｇ（６．４ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド６５ｍｌに溶解しヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウム５．２ｇ（１３ｍｍｏｌ）を加え遮光下室温で１時間撹拌した。メタノール１．７ｍｌを加え、さらに２０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール）で精製しビオチンヨウ化物３．０ｇ（収率７６％）を得た。
【０１０３】
合成例１６：メチルトシレートでの４級化（化合物３０−８前駆体）
ビス（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド３．６１ｇ（１７ｍｍｏｌ）を無水ジエチルエーテル３５ｍｌに溶解し１０℃以下に冷却した。これにｐ−トルエンスルホン酸メチル２．２３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加え一昼夜撹拌した。析出結晶を濾別しエーテルで３回洗浄することにより化合物３０−８前駆体を４．２１ｇ（収率８８％）得た。
【０１０４】
以上に述べた合成例に記載の方法に準じて、本発明の化合物を合成した。なお、本発明の化合物の合成に際して、（チオ）尿素合成、カルボジミド合成及び４級塩合成の各工程に利用した合成例の番号及び収率を下記表−１にまとめて示す。
【０１０５】
0003583489.tif 000021
0003583489.tif 000022
0003583489.tif 000023
0003583489.tif 000024
0003583489.tif 000025
合成された本発明の化合物をその同定資料とともに以下に示す。なおＺ０及びＺ１はそれぞれ次のとおりである。
【０１０６】
【化２５】
0003583489.tif 000026
【０１０７】
【表１】
0003583489.tif 000027
【０１０８】
【表２】
0003583489.tif 000028
【０１０９】
【表３】
0003583489.tif 000029
【０１１０】
【表４】
0003583489.tif 000030
【０１１１】
【表５】
0003583489.tif 000031
【０１１２】
【表６】
0003583489.tif 000032
【０１１３】
【表７】
0003583489.tif 000033
【０１１４】
【表８】
0003583489.tif 000034
【０１１５】
【表９】
0003583489.tif 000035
【０１１６】
【表１０】
0003583489.tif 000036
【０１１７】
【表１１】
0003583489.tif 000037
【０１１８】
【表１２】
0003583489.tif 000038
【０１１９】
【表１３】
0003583489.tif 000039
【０１２０】
【表１４】
0003583489.tif 000040
【０１２１】
【表１５】
0003583489.tif 000041
【０１２２】
【表１６】
0003583489.tif 000042
【０１２３】
【表１７】
0003583489.tif 000043
【０１２４】
【表１８】
0003583489.tif 000044
【０１２５】
【表１９】
0003583489.tif 000045
【０１２６】
【表２０】
0003583489.tif 000046
【０１２７】
【表２１】
0003583489.tif 000047
【０１２８】
【表２２】
0003583489.tif 000048
【０１２９】
使用例１：ＤＮＡへのビオチン標識
ＤＮＡをビオチン標識するために、反応溶液［Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ  （宝酒造株式会社）１μｇ  ，０．１Ｍ  ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５），０．２５％  ＳＤＳ，０．１Ｍの化合物３０−１］を８５℃で１分間インキュベートした。次に未反応のカルボビオチンを除去するために、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量の冷エタノールを加え混合し、−８０℃で４５分間静置した。遠心機（国産Ｈ−１５００ＦＲ）により、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上層を除去し、７０％エタノール５００μｌを加え、４℃、１２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去した後、１００μｌの滅菌水に沈澱を溶解し、−２０℃で保存した。
【０１３０】
使用例２：ドットブロット検出
使用例１でビオチン標識したＤＮＡを用いドットブロット検出を以下に述べるようにして行った。
【０１３１】
（ＤＮＡの固定化）
ビオチン標識ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ濃度をＵＶ測定機（ＵＶ−ＶＩＳＩＢＬＥＲＥＣＯＲＤＩＮＧ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  ＵＶ−２１００）（島津製作所）によって調べた。次にこのビオチン標識ＤＮＡの希釈系列を作製し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）（アマシャム社製）に各１μｌドットブロットした。メンブレンを乾燥させた後、ＵＶ  ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒＴＭ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）でオートクロスリンクし、ＤＮＡをメンブレン上に固定した。
【０１３２】
（化学発色）
メンブレンをハイブリバック（ＢＲＬ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に入れ、バッファーＢ溶液［３％  ＢＳＡ，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］５ｍｌ／１００ｃｍ２フィルターに浸し、室温で３０分間静置した。次にバッファーＡ溶液［０．２Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］１ｍｌに対してＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）２．５μｌを加えた溶液１ｍｌ／１００ｃｍ２フィルターにメンブレンを浸し、室温で２５分間静置した。バッファーＡ溶液１００ｍｌにて１０分間のメンブレン洗浄操作を３回繰り返し、バッファーＣ溶液［０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２］５ｍｌに対してＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）３２μｌ、Ｘ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １６μｌを加えた溶液５ｍｌ／１００ｃｍ２フィルターでハイブリバック中のメンブレンを浸し、暗所で３０分間発色させた。メンブレンを滅菌水にてよく洗い、乾燥して保存した。化合物３０−１を用いて標識したＤＮＡは０．０１ｐｇまで検出できた。フォトビオチンで標識ＤＮＡを同様の操作で発色させたところ１ｐｇまで検出できた。
【０１３３】
使用例３：ドットハイブリダイゼーション
化合物１５−１を用いて使用例１と同様の操作（但し反応時間は４０℃、５分間）で標識したＤＮＡとフォトビオチンを用いて標識したＤＮＡをプローブとして、以下に述べるようにしてドットハイブリダイゼーションを行った。
【０１３４】
（ＤＮＡの固定）
未標識のＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ（宝酒造株式会社）の希釈系列を作製し、各２μｌを１００℃１０分間インキュベートした後、氷中に５分間静置した。０．４Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を各２μｌ加えて混合し、室温で２０分間アルカリ変性させた。３Ｍ酢酸ナトリウム１．５μｌで中和し、氷中に移し、滅菌水を各４．５μｌ添加し混合した。ナイロンメンブレンに各１μｌをドットブロットし、乾燥させ、オートクロスリンクしてメンブレンにＤＮＡを固定した。
【０１３５】
（ハイブリダイゼーション）
ハイブリバック中のメンブレンをプレハイブリダイゼーション溶液［５ｘＳＳＣ（注１参照），５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（注２参照），２５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５），５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，０．５ｍｇ／ｍｌ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ］５ｍｌ／１００ｃｍ２フィルターに浸し、４２℃で２時間インキュベートした。次にメンブレンをハイブリダイゼーション溶液［５ｘＳＳＣ，１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．５），４５％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，０．２ｍｇ／ｍｌ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ，２０ｎｇ／ｍｌ  化合物１５−１で標識したＤＮＡプローブ、あるいはフォトビオチン標識ＤＮＡプローブ］１ｍｌ／１００ｃｍ２フィルターに浸し、４２℃で一晩インキュベートした。
【０１３６】
（ポストハイブリダイゼーション洗浄）
２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液１００ｍｌにメンブレンを浸し、室温で５分間振とうする洗浄操作を２回行った。同様に０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液１００ｍｌでの洗浄操作を２回行い、０．１６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液５０ｍｌで５０℃１５分間インキュベートを２回行った。２ｘＳＳＣ溶液２５ｍｌでメンブレンを洗浄し、以下の化学発色操作を行った。
【０１３７】
（化学発色）
使用例２の化学発色操作と同様であるが、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１／３倍量で行い、発色を５時間行った。フォトビオチン標識ＤＮＡプローブを用いた場合、鋳型ＤＮＡを１０ｐｇまで検出できた。化合物１５−１で標識したＤＮＡプローブを用いた場合、０．１ｐｇまで検出することができた。
【０１３８】
使用例４：サザンハイブリダイゼーション
化合物４３−２を用いて使用例１と同様の操作（但し反応時間は３０℃、１０分間）で標識したＤＮＡをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを以下の操作によって行った。
【０１３９】
λ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ  ＤＮＡｓ（宝酒造株式会社）の希釈系列各１０μｌを作製し、ゲルローディング液［３０％  グリセロール，０．２５％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ），０．２５％キシレンシアノール（ＸＣ）］１μｌを加え、１％アガロース電気泳動［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／第２版、６頁（１９８９年）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ］に供し、１００Ｖで２時間泳動した。泳動後、ゲルの端を切断し、変性溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ，０．６Ｍ  ＮａＣｌ）に浸し３０分間振とうした。次にイオン交換水でゲルを洗浄した後、中和溶液［０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．６Ｍ  ＮａＣｌ］に３０分間、２回浸した。ゲル中のＤＮＡをイオン交換水、１０ｘＳＳＣ溶液に浸したナイロンメンブレンに１０ｘＳＳＣ溶液で、一晩トランスファーした。トランスファーしたメンブレンを乾燥した後、オートクロスリンクでＤＮＡをメンブレンに固定した。使用例３と同様にハイブリダイゼーション、化学発色を行ったところ、０．５ｐｇまで検出できた。フォトビオチンで標識したＤＮＡプローブを用い同様の操作を行った場合には５ｐｇまで検出できた。
【０１４０】
注１：２０ｘＳＳＣ溶液組成
３    Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ７．０
注２：５０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１％  Ｆｉｃｏｌ
１％  Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ
１％  ＢＳＡ，Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ．
使用例５：マイクロタイタープレートを用いたハイブリダイゼーション
（固定化核酸の変性）
制限酵素（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）で直鎖化したＭ１３ｍｐ１８ＲＦを２ＭＮａＣｌ中で４８ｎｇ〜４８０ｆｇ／１００μｌの１０倍希釈系列を作製し１００℃、１０分間熱処理し、氷中で５分間急冷させた。
【０１４１】
（変性核酸のプレート上への固定）
ヌンク社製イムノモジュールマイクロタイタープレートの各ウェルに熱変性させた各濃度の核酸を加え、プレートシールをした。３７℃で１２時間固定化した。
【０１４２】
（プレハイブリダイゼーション）
変性Ｍ１３ＲＦを固定したプレートを蒸留水で洗浄後、プレハイブリダイゼーション溶液１００μｌを各ウェルに加え、プレートシールをし、６０℃で１．５時間インキュベートした。
【０１４３】
用いたプレハイブリダイゼーション溶液の組成は以下のとおりであった。
【０１４４】
５ｘＳＳＣ、５ｘデンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）５０％フォルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ
（ハイブリダイゼーション）
プレート中のプレハイブリダイゼーション溶液をすて、ハイブリダイゼーション溶液を各ウェルに１００μｌ加え、４２℃で１２時間インキュベートした。
【０１４５】
用いたハイブリダイゼーション溶液の組成は以下のとおりであった。
【０１４６】
５ｘＳＳＣ、１ｘデンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）４５％フォルムアミド、０．２ｍｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ、６４０ｎｇ／ｍｌビオチン導入Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ
但し、ビオチン導入Ｍ１３一本鎖ＤＮＡは、使用例１に示した方法に従い化合物２４−１を用いビオチンを導入したものである。ビオチン導入ＤＮＡはハイブリダイゼーション溶液の各構成溶液を混合した後、７５℃で１０分間熱処理し、氷中で５分間急冷したものを加えた。
【０１４７】
（未反応ビオチン導入核酸の除去）
固定した熱変性Ｍ１３ＲＦとハイブリッドを形成しなかったビオチン導入一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを以下の操作で除去した。
【０１４８】
各ウェルのハイブリダイゼーション溶液を除去した後、２ｘＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１５０μｌ加え、室温で５分間プレートミキサーで振盪させた。同操作をあと２回行なった。ウェル中の溶液を捨て、予め４２℃にした０．２ｘＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１５０μｌ加え４２℃で５分間振盪させた。同操作をあと２回行なった。ウェル中の溶液を捨て、２ｘＳＳＣを３００μｌ加え、室温で５分間放置した。
【０１４９】
（ハイブリッド核酸の検出）
プレート中の溶液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（組成は使用例１で使用したものと同じ）を各ウェルに３００μｌ加え室温下で３０分間放置した。ウェル中の溶液を捨て、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを各ウェルに１００μｌ加えて２５分間インキュベートした。ウェル中の溶液を捨て、ＢｕｆｆｅｒＡ（組成は使用例１で使用したものと同じ）を２００μｌ加え、室温で５分間振盪させた。あと２回同操作を行なった。ウェル中の溶液を捨て、ｐＮｐｐ溶液を各ウェルに１００μｌ加え、プレートシールをした。３０℃で３０分間反応させた。マイクロプレートリーダーＭＴＰ−１２０（コロナ電気製）で４０５ｎｍの吸収を測定した。その結果、４．８ｐｇのＭ１３ＲＦが検出できた。ｐＮｐｐ溶液の組成を以下に示す。
【０１５０】
５０ｍＭ四ほう酸ナトリウム（ｐＨ１０．０）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭパラニトロフェニルリン酸ナトリウム
使用例６：ビオチン導入ＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション
化合物２９−１を用いて使用例１と同様の操作（但し反応時間は２０℃、５分間）で標識したＭ１３ＤＮＡに相補的なオリゴマーＤＮＡ（３０ｍｅｒ）を用い以下の実験を行った。使用例３の方法と同様にしてＭ１３ＲＦ、λＤＮＡ、を変性させナイロンメンブレン上に固定化させ、ビオチン導入オリゴマーをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後洗浄を行い、使用例２に記載した化学発色に従い検出した。Ｍ１３ＲＦを固定した箇所にのみシグナルを検出した。