(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸類似体を標識する方法であって、標識化反応において酵素の基質として機能することができるペプチドモチーフに核酸類似体を連結すること及び該酵素により媒介される反応においてこの核酸類似体のペプチドモチーフを標識源と反応させ、該ペプチドモチーフを該標識で標識することを含む該標識化反応を行うことを含んでなる方法。
【請求項２】
該標識が放射−標識である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該標識源が放射−標識化ATPである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該酵素がプロテインキナーゼである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ペプチドモチーフがケンプチドモチーフ（kemptide motif）である、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標識化反応が該ペプチドモチーフのセリン残基におけるリン酸化である、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸類似体が連結したバックボーン部分からなるバックボーンに結合したリガンドの配列を含むポリマー鎖を含み、相補的配列の核酸とハイブリッドを形成することができ、そして該ペプチドモチーフをさらに含んでなるものである、請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該核酸類似体バックボーンがポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミド又はポリスルホンアミドのバックボーンである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該連結バックボーン部分がペプチド結合したアミノ酸部分である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該ペプチドモチーフがＮ−末端又はＣ−末端に存在するものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
核酸類似体が相補的配列の核酸とハイブリダイズして、配列上該類似体に相当する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対しより安定なハイブリッドを形成することができるものである、請求項１〜請求項10いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該核酸類似体がペプチド核酸であり、その該バックボーンがポリアミドバックボーンであり、該リガンドのそれぞれが直接又は間接に該バックボーン中のアザ窒素原子に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として該バックボーン中で４〜８個の介在原子により相互に隔てられているものである、請求項１〜請求項11いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該核酸類似体が、一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖核酸とハイブリダイズして該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである、請求項１〜請求項12いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸類似体が一般式１を有するものである、請求項１〜請求項13いずれか１項に記載の方法、
0003574134.tif 000007
式中、
ｎは少なくとも２であり、
L1〜Lnはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（C1〜C4）アルカノイル基、天然に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、DNAインターカーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、レポーターリガンド類及び該ペプチドモチーフからなる群より選択されるものであり、C1〜Cnはそれぞれ（CR6R7）ｙであり、ここでR6は水素であり、R7は天然に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はR6とR7は独立に水素、（C2〜C6）アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、水酸基、（C1〜C6）アルコキシ基、（C1〜C6）アルキルチオ基、NR3R4及びSR5からなる群より選択されるものであり、ここでR3とR4は以下に定義され、R5は水素、（C1〜C6）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、又はアルキルチオ基−置換（C1〜C6）アルキル基であり、又はR6とR7は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、
D1〜Dnはそれぞれ、（CR6R7）ｚであり、ここでR6とR7は上記のように定義され、
ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜10に整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜10であり、
G1〜Gnはそれぞれ−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−、又は−NR3SO2−でありいずれの方向でもよく、ここでR3は以下に定義され、
A1〜An及びB1〜Bnはそれぞれ以下のものから選択される、
（ａ）Ａは式（II a）、（II b）、（II c）又は（II d）の群であり、かつＢはＮ又はR3N+であり、又は
（ｂ）Ａは式（II d）の群であり、かつＢはCHであり、
0003574134.tif 000008
ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり、
Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり、
ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は10以下であり、
ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は10以下であり、
R1とR2はそれぞれ独立に水素、水酸基−，アルコキシ基−，又はアルキルチオ基−で置換されていてもよい（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、そして
R3及びR4はそれぞれ独立に水素、（C1〜C4）アルキル基、水酸基−，アルコキシ基−，アルキルチオ基−置換（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、
Ｑは−CO2H、−CONR'R"、−SO3H又は−SO2NR'R"、又は−CO2H又は−SO3Hの活性誘導体、及び
Ｉは−NR'R'''であり、ここでR'及びR''は独立に水素、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものであり、
−R'''はR''基又は該ペプチドモチーフであり、少なくともＬ基又は−R'''は、該ペプチドモチーフである。
【請求項１５】
該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含むものである、請求項14記載の方法、
0003574134.tif 000009
0003574134.tif 000010
0003574134.tif 000011
式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、
R7はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるものであり、
ｎは１より大きな整数であり、
ｋ、ｌ及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、
ｐはそれぞれゼロ又は１であり、
RhはOH、NH2又は−NHLysNH2であり、そして
Riは該ペプチドモチ−フである。
【請求項１６】
１×105cpm/μｇより大きな比放射能を有する放射標識化核酸類似体であって、標識化反応において酵素の基質として機能することができるペプチドモチ−フを有するものである、放射標識化核酸類似体。
【請求項１７】
標識が32P標識である請求項16記載の標識化核酸類似体。
【請求項１８】
標識がセリン残基に結合したリン酸基中に含まれるものである、請求項17記載の標識化核酸類似体。
【請求項１９】
該セリン残基がペプチドモチ−フの一部を形成するものである、請求項18記載の標識化核酸類似体。
【請求項２０】
該ペプチドモチ−フがケンプチドモチーフ（kemptide  motif）を含むものである、請求項19記載の標識化核酸類似体。
【請求項２１】
連結したバックボーン部分からなるバックボーンに結合したリガンドの配列を含むポリマー鎖を含み、相補的配列の核酸にハイブリダイズすることができ、標識化反応において酵素の基質として作用することができるペプチドモチ−フをさらに含んでなる核酸類似体。
【請求項２２】
該ペプチドモチ−フが放射標識ATPと反応してプロテインキナーゼの存在下に該ペプチドモチ−フをリン酸化することができるものである、請求項21記載の核酸類似体。
【請求項２３】
ペプチドモチ−フがケンプチドモチーフである、請求項22記載の核酸類似体。
【請求項２４】
バックボーンがポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミド、又はポリスルホンアミドのバックボーンである、請求項16〜請求項21いずれか１項に記載の核酸類似体。
【請求項２５】
該連結バックボーン部分がペプチド結合したアミノ酸部分である、請求項24記載の核酸類似体。
【請求項２６】
該ペプチドモチ−フがＮ−末端又はＣ−末端に存在するものである、請求項24又は請求項25記載の核酸類似体。
【請求項２７】
核酸類似体が相補的配列の核酸にハイブリダイズして、配列上該類似体に相当する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対しより安定なハイブリッドを形成することができるものである、請求項16〜請求項26いずれか１項に記載の核酸類似体。
【請求項２８】
核酸類似体が該バックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド核酸であり、該リガンドがそれぞれ直接的に又は間接的に該バックボーン中のアザ窒素原子に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として該バックボーン中で４〜８個の介在原子により相互に隔てられているものである、請求項16〜請求項27いずれか１項に記載の核酸類似体。
【請求項２９】
核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖核酸にハイブリダイズして、該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである、請求項16〜請求項28いずれか１項に記載の核酸類似体。
【請求項３０】
核酸類似体が一般式１を有するものである、請求項16〜請求項29いずれか１項に記載の核酸類似体、
0003574134.tif 000012
式中、
ｎは少なくとも２であり、
L1〜Lnはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（C1〜C4）アルカノイル基、天然に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、DNAインターカーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、レポーターリガンド類及びペプチドモチ−フからなる群より選択されるものであり、
C1〜Cnはそれぞれ（CR6R7）ｙであり、ここでR6は水素であり、R7は天然に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はR6とR7は独立に水素、（C2〜C6）アルキル基、アリール基、アラルキル基、へテロアリール基、水酸基、（C1〜C6）アルコキシ基、（C1〜C6）アルキルチオ基、NR3R4及びSR5からなる群より選択されるものであり、ここでR3とR4は以下に定義され、R5は水素、（C1〜C6）アルキル基であり、又はR6とR7は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、
D1〜Dnはそれぞれ、（CR6R7）ｚであり、ここでR6とR7は上記のように定義され、
ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜10の整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜10であり、
G1〜Gnはそれぞれ−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−、又は−NR3SO2−でありいずれの方向でもよく、ここでR3は以下に定義され、
A1〜An及びB1〜Bnはそれぞれ以下のものから選択される、
（ａ）Ａは式（II a）、（II b）、（II c）又は（II d）の群であり、かつＢはＮ又はR3N+であり、又は
（ｂ）Ａは式（II d）の群であり、かつＢはCHであり、
0003574134.tif 000013
式中、
ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり、
Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり、
ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は10以下であり、
ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は10以下であり、
R1とR2はそれぞれ独立に水素、水酸基−，アルコキシ基−，又はアルキルチオ基−で置換されていてもよい（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基−置換、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、そして
R3及びR4はそれぞれ独立に水素、（C1〜C4）アルキル基、水酸基−，アルコキシ基−，アルキルチオ基−置換（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、
Ｑは−CO2H、−CONR'R"、−SO3H又は−SO2NR'R"、又は−CO2H又は−SO3Hの活性誘導体であり、及び
Ｉは−NR'R'''であり、ここでR'及びR''は独立に水素、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものであり、−R'''は、−R''基又はペプチドモチ−フであり、少なくとも１個のＬ基又は−R'''基は、該ペプチドモチ−フである。
【請求項３１】
該核酸類似体が一般式III、IV又はＶの化合物を含んでなるものである、請求項11記載の核酸類似体、
0003574134.tif 000014
0003574134.tif 000015
0003574134.tif 000016
上式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、
R7はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるものであり、
ｎは１より大きな整数であり、
ｋ、ｌ及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、
ｐはそれぞれゼロ又は１であり、
RhはOH、NH2又は−NHLysNH2であり、そして
Riはキレート化部分である。
【請求項３２】
請求項１〜請求項15いずれか１項に記載の方法又は請求項16〜請求項20いずれか１項に記載の方法により作成された放射標識核酸類似体を核酸にハイブリダイズさせ、こうして生じたハイブリッドの存在を放射標識により検出することを含んでなる分析方法。
【請求項３３】
検出対象である核酸を支持体に結合させ、該標識化核酸類似体をプローブとして検出する、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、標識核酸類似体の生産及び分析手法におけるそれらの使用に関する。
分析手法及び診断の分野において、重要な新しい有用性をもつ核酸類似体類はWO92/20703に記載されている。これらの核酸類似体類は、診断並びにアンチセンス療法の分野において、それらが特殊な重要性を得る新しい特性を多く有していた。
それらは、核酸塩基であるリガンドの配列を生じるポリアミドバックボーンを特徴とする。前述の類似体は、相補的な配列の天然の核酸と非常な特異性と安定性でハイブリダイズする性質を有する。
診断又は他の分析手法及び手術などにおいて、そのような核酸類似体の検出及び取り扱いを促進するために、検出可能な標識を有する核酸類似体を提供することが望まれている。
該核酸類似体を放射標識することが提案された。他の標識技法も提案された。今我々は、前述の核酸類似体がペプチド部分（ペプチド結合した一連のアミノ酸など）と連結する一定のキメラ構造を開発した。ペプチド部分は該キメラが簡便な標識反応を受けられるように選ばれる。
従って、第１の側面において、本発明は、標識反応における酵素の基質として機能できるペプチドモチ−フを有する核酸類似体を提供することを含む核酸類似体を標識するための方法、及び該標識源を持つ酵素の影響下に核酸類似体のペプチドモチ−フを反応させることを含む該標識反応を行うための方法を提供する。該標識は放射性標識、好ましくは放射性標識されたATPが好ましい。
放射性標識中の放射活性原子は、γ位の32Pが好ましい。しかし、該標識は、代わりにビオチン標識のような酵素介在反応中のペプチドに付与できる他のどんな検出可能なモチーフであってもよい。
酵素は、プロテインキナーゼが好ましい。
ペプチドモチ−フは、ケンプチド（kemptide）モチーフ、すなわちＨ−leu−Arg−Arg−Ala−Ser−Leu−Gly−が好ましい。このモチーフがプロテイン又はペプチド中に存在すると、プロテインキナーゼＡの作用に対する基質として作用し標識反応を受けることは知られている。他のリン酸化可能なモチーフも使用できる。これらは、例えば最初の５個のアミノ酸残基がケンプチドモチーフであるＨ−Arg−Ala−Ser−Leu−Gly−のような短縮されたケンプチドモチーフを含む。
従って、標識反応は、該ペプチドモチ−フのセリン残基でのリン酸化が好ましい。
核酸類似体は、連結したバックボーン部分から構成されるバックボーンに結合するリガンドの配列を含むポリマー鎖からなるものが好ましい。該類似体は、核酸の相補的配列にハイブリダイズすることができ、及び該ペプチドモチ−フをさらに含んでなるものである。
該核酸類似体バックボーンは、ポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミド又はポリスルホンアミドバックボーンが好ましい。
該連結バックボーン部分は、ペプチド結合したアミノ酸部分が好ましく、該ペプチドモチ−フはＮ末端又はＣ末端に存在することが好ましい。
核酸類似体は、該類似体の配列に対応する通常のデオキシリボヌクレオチドの該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成する核酸の相補的配列とハイブリダイズできることが好ましい。
該核酸類似体は、該バックボーンがポリアミドバックボーンであり、該リガンドがそれぞれ該バックボーンのアザ窒素原子に直接又は間接に結合しており、そして窒素原子を持つ該リガンドが主として該バックボーンの中で４〜８個の介入原子だけ相互に隔てられている、ペプチド核酸であることが好ましい。
また、核酸類似体は、一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有しておりそのため該核酸が他方の鎖を該一方の鎖から置き換える（displace）ことができる二本鎖核酸にハイブリダイズすることができることが好ましい。
核酸類似体は、一般式１を有することが好ましい、
0003574134.tif 000002
式中、ｎは少なくとも２であり、L1〜Lnはそれぞれ独立に、水素、水酸基、（C1〜C4）アルカノイル基、天然に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、DNAインタ−カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、レポーターリガンド類及び該ペプチドモチ−フからなる群より選択されるものであるが、通常少なくとも１つのＬは、天然に生ずる核酸塩基類のような核酸塩基結合基であり、及び少なくとも90％のＬ基がそのような核酸塩基結合基であることが好ましく、
C1〜Cnはそれぞれ（CR6R7）ｙであり、ここでR6は水素であり、R7は天然に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はR6とR7は独立に水素、（C2〜C6）アルキル基、アリール基、アラルキル基、へテロアリール基、水酸基、（C1〜C6）アルコキシ基、（C1〜C6）アルキルチオ基、NR3R4及びSR5からなる群より選択されるものであり、ここでR3とR4は以下に定義され、R5は水素、（C1〜C6）アルキル基であり、又はR6とR7は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、
D1〜Dnはそれぞれ、（CR6R7）ｚであり、ここでR6とR7は上記のように定義される、
ｙ及びｚはそれぞれゼロ又は１〜10に整数であり、ｙ＋ｚの和は２〜10であり（好ましくは２より大きく、好ましくはｘ及びｙはそれぞれ１又は２であり）、
G1〜Gn-1はそれぞれ−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−、又は−NR3SO2−でありいずれの方向でもよく、ここでR3は以下に定義される、
A1〜An及びB1〜Bnはそれぞれ以下のものから選択される、
（ａ）Ａは式（II a）、（II b）、（II c）又は（II d）の群であり、かつＢはＮ又はR3N+であり、又は
（ｂ）Ａは式（II d）の群であり、かつＢはCHであり、
0003574134.tif 000003
式中、ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2又はＣ（CH3）２であり、
Ｙは単結合、Ｏ、Ｓ又はNR4であり、
ｐとｑはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｐ＋ｑの和は10以下であり、
ｒとｓはそれぞれゼロ又は１〜５の整数であり、ｒ＋ｓの和は10以下であり、
R1とR2はそれぞれ独立に水素、水酸基−，アルコキシ基−，又はアルキルチオ基−で置換されていてもよい（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、そして
R3及びR4はそれぞれ独立に水素、（C1〜C4）アルキル基、水酸基−，アルコキシ基−，アルキルチオ基−置換された（C1〜C4）アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、
Ｑは−CO2H、−CONR'R"、−SO3H又は−SO2NR'R"、又は−CO2H又は−SO3Hの活性誘導体、及び
Ｉは−NR'R'''であり、ここでR'及びR''は独立に水素、アルキル基、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチチド二リン酸、ヌクレオチド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものであり、
−R'''はR''基すなわち該ペプチドモチーフであり、少なくとも１つのＬ基又は−R'''は、該ペプチドモチーフである。
該核酸類似体は、一般式III、IV、又はＶの化合物よりなることがより好ましい、
0003574134.tif 000004
0003574134.tif 000005
0003574134.tif 000006
式中、Ｌはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、
R7はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるものであり、
ｎは１より大きな整数であり、
ｋ、ｌ及びｍはそれぞれ独立にゼロ又は１〜５の整数であり、
ｐはそれぞれゼロ又は１であり、
RhはOH、NH2又は−NHLysNH2であり、そして
Riは該ペプチドモチ−フである。
標識は、32P標識が好ましい。
この標識は、好ましくはペプチドモチーフの一部を形成するセリン残基に結合したリン酸基であるのが好ましい。
ペプチドモチーフはケンプチドモチーフ（Kemptide motif）を含むことが好ましい。
第三の側面において本発明は、連結したバックボーン部分からなるバックボーンに結合したリガンドの配列を含むポリマー鎖を含んでなる核酸類似体を提供する。この類似体は相補的配列の核酸にハイブリダイゼーションすることができ、標識化反応における酵素の基質として働くことができるペプチドモチ−フをさらに含んでなるものである。
該ペプチドモチーフは、プロテインキナーゼの存在下に放射標識ATPと反応して該ペプチドモチーフをリン酸化することができ、従ってこのペプチドモチーフはケンプチドモチーフであることが好ましい。
核酸類似体は本発明の第一の側面との関係において、上述したようなものであることが好ましい。
第四の側面では、本発明は、本発明の第一の側面に関連して記載した方法により作成される又は本発明の第二の側面に従っている放射標識核酸類似体を核酸にハイブリダイズすること、そしてこうして放射標識により作成されるハイブリッドの存在を検出することを含んでなる分析方法を提供する。
検出対象となる核酸は支持体に結合させそして該標識核酸類似体をプローブとして用いて検出することが好ましい。
本発明は、本発明の好ましい特徴についての以下の記述により及び下記の添付の図面を参照しながら実施例により、さらに詳細に記載し例示される。
図１は、下記実施例３で作成されたオートラジオグラフである。
図２は、下記実施例４で作成されたオートラジオグラフである。
所望のアミノ酸配列のペプチド伸長を有するPNAは、WO92/20703に記載されたBoc固相合成を用いることにより適当な固体支持体上で出発PNA配列が作成されるときは、当該技術分野でよく知られているBoc又はFmoc固相法により便利に作成され得る。また、PNA配列の合成を開始する前にまずペプチド伸長部を合成してもよい。
ペプチドモチーフのアミノ酸配列は放射標識用のケンプチドモチーフであってもよい。ビオチン標識のためには、シャッツ（Schatz,P.J.）による「バイオテクノロジー」11巻、10月、1993年、1138−1142頁に記載されたような配列であってもよい。適当な配列は、Leu−ｘ−Leu−Zle−Phe−Glu−Ala−Gln−Lys−Zle−Glu−Trp−Argであり、これは大腸菌ビオチンシンテターゼホロ酵素により、リジン残基の所でビオチン化され、ビオチニル−5'−アデニレートすなわちビオチンアドATP（biotin ad ATP）として供給される。
該ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジンで検出され得る標識として使用することもでき、またそれ自体3Hなどの放射標識を保持してもよい。
図３は通常のDNAと対比したPNA（ペプチド核酸）分子の構造を示す。
図４は、本明細書で使用されるPNAの一部の特徴的な配列及び核酸ハイブリダイゼーションを示す。
図５は、本発明による該分子の酵素標識の経時的研究のHPLC分析を示す。
実施例１
PNA−ケンプチドキメラの調製
WO92/20703号に記載された固相PNA合成を用い次の配列を作成した。
Boc−NH（CH2）5CONH−TG（Ｚ）T.A（Ｚ）Ｃ（Ｚ）Ｇ（Ｚ）.TC（Ｚ）Ａ（Ｚ）.C（Ｚ）Ａ（Ｚ）Ａ（Ｚ）.C（Ｚ）TA（Ｚ）−CONH−樹脂
Ｎ末端Boc基をTFAで処理して除去し、リンカー６−アミノ−ヘキサン酸を介するケンプチドモチーフの標準的bocタイプ固相ペプチド合成のための出発点として用い、下記キメラを作成する。
Boc−Leu−Arg（Tos）−Arg（Tos）−Ala−Ser−（Bzl）−Leu−Gly−NH（CH2）５−CONH−TG（Ｚ）T.A（Ｚ）Ｃ（Ｚ）Ｇ（Ｚ）.TC（Ｚ）Ａ（Ｚ）.C（Ｚ）Ａ（Ｚ）Ａ（Ｚ）.C（Ｚ）TA（Ｚ）−CONH−樹脂
保護基を除去し、生成物をロウ−ハイTFMSA操作により樹脂から切断する。粗生成物を分取用HPLC（逆相C18、A:水（ミリQTM）中0.1％TFA及びB:0.1％TFA、10％水、90％アセトニトリルの勾配で溶出）で精製した。精製キメラPNA−ケンプチドは分析用HPLC及びFAB−MSで特性を明らかにした。
実施例２
ケンプチドモチーフ（Leu−Arg−Arg−Ala−Ser−Leu−Gly）はPNAに共有結合したプロテインキナーゼＡの基質として機能する
下記式のPNA−ケンプチドキメラ：
Ｈ−Leu−Arg−Arg−Ala−Ser−Leu−Gly−TGTACGTCACAACTA−NH2
を下記の反応混合物中、32Pで標識した。
PNA−ケンプチド、10μＭ                     ５μｌ
10×プロテインキナーゼＡ緩衝液              ５μｌ
γ32P  ATP（＞5000Ci/mモル、50μCi/μｌ）   10μｌ
プロテインキナーゼＡ（ベーリンガー、5mU/μｌ） 0.2μｌ
H2O                                         30μｌ
反応物は30℃で30分間インキュベートし、ついで65℃で10分間インキュベートした後、15000gで30秒間遠心分離した。上清を新たなエッペンドルフ管に移した。水を1mlまで添加し、標識化PNA−ケンプチドを、DEAEセファデックスTMA−50アニオン交換カラムを用いるアニオン交換クロマトグラフィーにより、組み込まれていないγ32P  ATPから分離した。
PNA−ケンプチドの比放射能は１×108cpm/μgPNA−ケンプチドと評価された。
実施例３
PNAのハイブリダイゼーション特性はPNA−ケンプチドキメラにおいても保持される
非標識化/32P標識PNA62−ケンプチドの相補的な非標識化/32P標識オリゴヌクレオチドへの溶液中でのハイブリッド形成能を、20％非変性ポリアクリルアミドゲル中におけるゲルシフトにより分析した。ハイブリッド形成の厳格性は、約1/2℃/1％ホルムアミドでPNA62/DNA二本鎖のTmを低下させるホルムアミドの添加により制御した。ハイブリダイゼーションは図面の説明で示したように、10mMのトリス−Cl、pH8.0、1mMのEDTA、及びPNA、DNA及びホルムアミドを含む20μｌの反応容量中で行われた。ハイブリダイゼーション混合物を37℃で15分間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりの４μｌの負荷緩衝液（50％グリセロール、５×TBE緩衝液及び0.25％（w/v）ブロムフェノールブルー）を反応混合物に添加し、続いてこの試料を20％非変性ポリアクリルアミドゲル/1×TBEに負荷し、400Vで１時間電気泳動を行った。最後に、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。図１はハイブリダイゼーション分析の結果を示す。レーン１は標識オリゴヌクレオチド単独（移動度の対照）、レーン２〜４は、対照PNA62（ケンプチドの付加なしのPNA62）を０％（２）、30％（３）及び60％（４）のホルムアミドの存在下に標識化・相補的オリゴヌクレオチドとインキュベートした。レーン５〜７は、非標識化PNA62−ケンプチドを０％（５）、30％（６）及び60％（７）のホルムアミドの存在下に標識化・相補的オリゴヌクレオチドとインキュベートした。レーン８〜10は、32P標識PNA62−ケンプチドを０％（５）、30％（６）及び60％（７）のホルムアミドの存在下に非標識・相補的オリゴヌクレオチドとインキュベートした。
レーン８〜10は、32P標識PNA62−ケンプチドを０％（８）、30％（９）及び60％（10）のホルムアミドの存在下に非標識・相補的オリゴヌクレオチドとインキュベートした。結論的には、これらの結果は次のことを明らかにする。
1.PNA62へのケンプチド伸長の付加は相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成能を大きく変えない。
2.非標識及び32P標識PNA62−ケンプチドは同様のハイブリダイゼーション特性を示す。
3.ケンプチドモチーフを保持するPNAはプロテインキナーゼＡによるリン酸化の基質である。
実施例４
32P標識化PNA62−ケンプチドは濾過膜に結合した相補的DNA断片を検出するためのプローブとして用いることができる
標識化PNA62−ケンプチドは膜上に固定されたDNA断片（サザンハイブリダイゼーション）中の相補的配列を検出するためのプローブとして使用された。PNA62−ケンプチドに相補的な配列を含むDNA断片及びPNA62−ケンプチドに１個だけ不適合な配列を含むDNA断片を、適当なプラスミドのPCR増幅により作成した。これらのDNA断片を１％TAEアガロースゲル中でゲル電気泳動により分離し、標準的アルカリブロッティング手順によりハイボンドTMN+膜に移した。フィルターへのプローブの非特異的吸着を阻害するための阻止剤として非標識PNA  T10−ケンプチド4ngを含む5mlのハイブリダイゼーション溶液（10mMのトリス−塩酸、pH7.5、1mMのEDTA）中、ロータリーオーブン内で50℃で、このフィルターをプレハイブリダイズさせた。１時間のプレハイブリダイゼーションの後、32P標識PNA62−ケンプチドの５μｌをプレハイブリダイゼーション溶液に加え、そして50℃で16時間インキュベーションを続けた。このフィルターを10mMトリス−塩酸、pH7.5、1mMのEDTA中、50℃で30分間の洗浄を２回行い、風乾し、10時間オートラジオグラフィーに付した。図１に示すように、PNA62−ケンプチドプローブはフィルター上の相補的なDNA断片と効率的にハイブリダイズする（レーン４）。さらに、それはＣからＴへの点変異を持つDNA断片にある程度までハイブリダイズする（レーン２）。これは、PNA62G/T  DNA不適合二本鎖が溶液中で61℃のTmを有し、これは、ハイブリダイゼーションに課される厳格性のレベルよりも高いからである。ＧからＴへの変異に反して、ＣからＧへ及びＣからＡへの変異は、その結果生ずるPNA/DNA二本鎖の溶液中での安定性に対し大きな効果を有する（PNA62G/A  DNA:Tm＝51℃、そしてPNA62G/G  DNA:Tm＝53℃）。これらのTmデータと一致して、PNA−ケンプチドプローブはフィルター上の対応するDNA断片にハイブリダイズしない（それぞれレーン１とレーン３）にハイブリダイズしない（それぞれレーン１とレーン３）。結論として、これらの結果は、標識化PNA−ケンプチドは、フィルターハイブリダイゼーション測定においてプローブとして使用することができ、そしてこのようなプローブは標的核酸の完全の相補性と１塩基の不適合の間を効果的に区別することができることを明らかにする。同様な結果は、他の膜（ジーンスクリーンTM＋イモビロンSTM）や他の阻止剤（１％カゼイン及び１％トリトンTM−100）を用いても得られた。
実施例５
該キメラのペプチドセグメントの機能分析
キメラ（20ピコモル）と対照DNA（（Ado）３−PNA）（20ピコモル）を、32Pγ−ATP1（アマシャム）（100ピコモル＞5000Ci/ミリモル）、50mMのMES（pH6.9）、10mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、1mMのDTT、1mg/mlのBSA及び5mUのPKA1（ベーリンガーマンハイム）を含む反応容積（50μｌ）中で別々にインキュベートした。30℃で30分間の後、ジエチルアミノエチル（DEAE）セフエデックスＡ−501（シグマ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより組み込まれていないγ−ATPからPNAを分離した。キメラを含む試料は、2.4×106cpm/pmolPNAの比放射能を有していた。比放射能5000Ci/mmolで32Pγ−ATPを用いると、キメラの最大可能比放射能は６×106dpm/pmolであると計算される。
このキメラの酵素的リン酸化を、経時的実験で研究した。1mUのPKAを使用して1nmolのキメラをリン酸化した。試料を反応中の時間を変えて採取し、HPLCで分析した。60秒以内に約20％のキメラがリン酸化され（図５）そして120秒後には50％以上がリン酸化された。反応は300秒以内に完了した。リン酸化生成物の同定は質量スペクトルにより（ESI、計算値／測定値:5371.1/5370.9）確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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