(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出器を含む第１のルミネセンスレポータ分子、および分類器または識別子からなる群から選択される第２のルミネセンスレポータ分子を保有し、テスト物質で処理すべき細胞を含有する位置のアレイを提供し、
前記細胞による前記第１および第２のルミネセンスレポータの保有の前または後に前記細胞とテスト物質とを接触させ、ここに、第１および第２のルミネセンスレポータ分子は前記細胞がトキシンと接触されると修飾され、
前記複数細胞を含有する位置の各々において前記複数細胞をイメージまたは走査して前記検出器からルミネセンスシグナルが得られ、
前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、
前記検出器からの前記デジタルデータを利用して細胞上または細胞中の検出器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、前記検出器の位置、分布、構造または活性の変化は前記テスト物質におけるトキシンの存在を示し、
その中に前記トキシンを有することが示されたテスト試料と接触された前記細胞を含有する位置を選択的にイメージまたは走査して、第２のレポータ分子からルミネセンスシグナルが得られ、
前記第２のルミネセンスレポータ分子からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、
前記第２のルミネセンスレポータ分子からの前記デジタルデータを利用して細胞上または細胞中の分類器または識別子の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、前記分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在するトキシンによって乱される細胞経路を同定し、または識別子の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在する特異的なトキシンまたはトキシンの群を同定することを含む細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法。
【請求項２】
前記第２のルミネセンスレポータ分子が分類器であって、前記分類器に由来するデジタルデータを用いて、特異的なトキシンまたはトキシンの群の同定に適した識別子を選択する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出器を含む少なくとも第１のルミネセンスレポータ分子、分類器を含む第２のルミネセンスレポータ分子、および識別子を含む第３のルミネセンスレポータ分子を保有しテスト物質で処理すべき細胞を含有する位置のアレイを提供し、
前記細胞による前記第１、第２および第３のルミネセンスレポータ分子の保有の前または後に前記細胞をテスト物質と接触させ、ここに、第１、第２および第３のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞をトキシンと接触させると修飾され、
前記複数細胞を含有する位置の各々における前記複数細胞をイメージまたは走査して前記検出器からルミネセンスシグナルが得られ、
前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、
前記検出器からの前記デジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の検出器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、検出器の位置、分布、構造または活性の変化はテスト物質中のトキシンの存在を示し、
その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた前記細胞を含有する位置を選択的にイメージまたは走査して、分類器からルミネセンスシグナルが得られ、
前記分類器からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、
前記分類器からのデジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の分類器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在するトキシンによって乱される細胞経路を同定し、
その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた細胞を含有する位置を選択的にイメージまたは走査して、識別子からルミネセンスシグナルが得られ、
前記識別子からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、次いで、
前記識別子からのデジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の識別子の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、識別子の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在する特異的なトキシンまたはトキシンの数を同定することを含む細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法。
【請求項４】
前記分類器に由来するデジタルデータを用いて、特異的なトキシンまたはトキシンの群の同定に適した識別子を選択する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出器が熱ショックタンパク質、およびミトコンドリア膜ポテンシャル、細胞内遊離イオン濃度、細胞骨格組織化、一般的な代謝状態、細胞周期タイミング事象、および小器官の構造および機能の変化に応答する化合物からなる群から選択される分子を含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分類器がチューブリン、微小管−関連タンパク質、アクチン、アクチン−結合タンパク質、ＮＦ−κＢ、ＩκＢおよびストレス−活性化キナーゼからなる群から選択される分子を含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞経路が細胞ストレス経路、細胞代謝経路、細胞シグナリング経路、細胞増殖経路および細胞分裂経路からなる群から選択される請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のルミネセンスレポータ分子が識別子であって、前記識別子がプロテアーゼ、ＡＤＰ−リボシル化トキシン、細胞毒性ホスホリパーゼおよび剥奪性トキシンからなる群から選択されるトキシンまたはトキシンの群を同定する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記識別子がプロテアーゼ、ＡＤＰ−リボシル化トキシン、細胞毒性ホスホリパーゼおよび剥奪性トキシンからなる群から選択されるトキシンまたはトキシンの群を同定する請求項３乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１、第２または第３のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性の変化が、細胞質から核への移動、核または核小体から細胞質への移動、受容体内部化、ミトコンドリア膜ポテンシャル、シグナルの喪失、レポータ分子のスペクトル応答、リン酸化、細胞内遊離イオン濃度、細胞サイズ、細胞形状、細胞骨格組織化、代謝プロセス、細胞移動度、細胞基質付着、細胞周期事象、および小器官の構造および機能からなる群から選択される請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出器からルミネセンスシグナルを得るための複数細胞を含有する位置の各々における複数細胞のイメージングまたは走査が高スループットモードで行われる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出器からルミネセンスシグナルを得るための複数細胞を含有する位置の各々における複数細胞のイメージングまたは走査が高含有量モードで行われる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２または第３のレポータ分子からルミネセンスシグナルを得るための、その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた細胞を含有する位置の選択的イメージングまたは走査が高スループットモードで行われる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２または第３のレポータ分子からルミネセンスシグナルを得るための、その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触させた細胞を含有する位置の選択的イメージングまたは走査が高含有量で行われる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、データ保存および集積のためのデジタル保存媒体を提供することを含む請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、結果の自動制御、取得、処理および表示のための手段を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞を含有するプレートを保持するのに適合した段階を備えた光学系、前記段階または光学系を移動させるための手段、デジタルカメラ、細胞から放出された光をデジタルカメラに向けるための手段、および前記デジタルカメラからのデジタルデータを受け取りそれを処理するためのコンピュータ手段を含む細胞スクリーニングシステムに請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含むコンピュータ読み取り可能保存媒体。
【請求項１８】
検出器および分類器からなる群から選択されるレポータ分子を含む少なくとも第１のルミネセンスレポータ分子を保有しテスト物質で処理すべき細胞を含有する位置の第１のアレイを提供し、
前記細胞による前記第１のルミネセンスレポータ分子の保有前または後に細胞をテスト物質と接触させ、ここに、前記第１のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞をトキシンと接触させると修飾され、
前記複数細胞を含有する位置の各々における前記複数細胞をイメージまたは走査して前記検出器からのルミネセンスシグナルが得られ、
前記検出器からの前記ルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換し、
前記検出器からの前記デジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の検出器の位置、分布または活性を自動的に測定し、ここに、前記検出器の位置、分布、構造または活性の変化がテスト物質中のトキシンの存在を示し、
テスト物質で処理すべき細胞を含有する位置の第２のアレイを提供し、ここに、前記細胞は前記分類器および識別子からなる群から選択されるレポータ分子を含む少なくとも第２のルミネセンスレポータ分子を保有し、ここに、前記細胞を含有する位置の第２のアレイが、前記細胞を含有する位置の第１のアレイと同一または異なる細胞型いずれかを含むことができ、
前記細胞による前記第２のルミネセンスレポータ分子の保有の前または後に、前記細胞を含有する位置の第２のアレイをテスト物質と接触させ、ここに、前記第２のルミネセンスレポータ分子の位置、分布、構造または活性は、細胞がトキシンと接触されると修飾され、
前記第２のルミネセンスレポータ分子からのデジタルデータを利用して、細胞上または細胞中の分類器または識別子の位置、分布または活性を自動測定し、ここに、前記分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在するトキシンによって乱される細胞経路を同定し、または、ここに、識別子の位置、分布、構造または活性は、テスト物質に存在する特異的なトキシンまたはトキシンの群を同定することを特徴とする細胞ベースのトキシンを特徴づける自動方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は薬物発見のための蛍光−ベースの細胞および分子生化学アッセイの分野にある。
【０００２】
（背景技術）
相互参照
本出願は米国仮特許出願番号６０／１２２，１５２（１９９９年２月２６日）、６０／１２３，３９９（１９９９年３月８日）、０９／３５２，１４１（１９９９年７月１２日）、６０／１５１，７９７（１９９９年８月３１日）、６０／１６８，４０８（１９９９年１２月１日）に対する優先権を主張し、０９／４３０，６５６（１９９９年１０月２９日）、１９９７年２月２７に出願された米国出願Ｓ／Ｎ  ０８／８１０９８３の一部継続出願である１９９８年２月２７日に出願された出願番号０９／０３１，２７１の一部継続出願である１９９９年９月１７日に出願された０９／３９８，９６５の一部継続出願である。
【０００３】
当該分野で現在行われている薬物発見は、特異的病気標的の同定、特異的標的に基づくアッセイの開発、このアッセイの有効化、スクリーニングを得るためのアッセイの最適化および自動化、「ヒット」を同定するためのアッセイを用いる化合物ライブラリの高スループットスクリーニング、ヒット有効化およびヒット化合物の最適化を含む長い複数工程のプロセスである。このプロセスの結果は、前臨床および、有効化されれば、結局は臨床試験に至る先導的化合物である。このプロセスにおいては、スクリーニング相はアッセイ開発相から区別され、生きた生物学的系において化合物の効率をテストすることを含む。
【０００４】
歴史的には、薬物発見は遅くてコストがかかるプロセスであり、何年にもわたり、創製された薬物あたり数億ドルを消費する。ゲノミックスおよび高スループットスクリーニングの領域における開発の結果、評定の同定およびスクリーニングした化合物の容量の領域において能力および効率が増大した。自動ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ適用、位置クローニング、ハイブリッド形成アッセイおよび生物情報学におけるかなりの進歩は、潜在的薬物標的をコードする遺伝子（および遺伝子断片）の数を大いに増加させた。しかしながら、薬物スクリーニングについての基本的なスキームは依然として同一である。
【０００５】
現行の方法およびプロトコルを用いる治療的介入のためのポイントとしてのゲノム標的の有効化は、インビボ機能的モデル、組換えタンパク質の機能的分析、および候補遺伝子の安定な細胞系発現等の、使用される遅い手動方法のため、薬物発見プロセスにおいてネックとなった。自動配列決定を介して取得された一次ＤＮＡ配列データは遺伝子機能の同定を可能としないが、公知の配列データベースと比較すると、共通の「モチーフ」および特異的遺伝子相同性についての情報を提供することができる。減算ハイブリッド形成およびＲＡＤＥ（分別発現の迅速増幅）等のゲノム方法を用いて、病気状態モデルで上方または下方調節される遺伝子を同定することができる。しかしながら、同定および有効化は依然として同一経路を進む。いくつかのプロテオミック方法は逆遺伝学と組み合わせてタンパク質同定（全体的発現アレイ、２Ｄ電気泳動、コンビナトリアルライブラリ）を用いて注目する候補遺伝子を同定する。無傷ｃＤＮＡとして単離されたそのような推定「病気関連配列」またはＤＡＳはこれらの方法に対して大きな利点があるが、それらは、コードされたタンパク質のタイプ、活性および分布に関するいずれの情報も提供する事なく多くのものによって同定される。薬物スクリーニング標的としてのＤＡＳのサブセットの選択は「ランダム」であり、このように、病気とのメカニズム的結合を提供するための機能的データなくして、極端に非効率的である。従って、生物学的機能を達成するＤＡＳを迅速にスクリーニングし、それにより、薬物発見における標的有効化および候補最適化を改良する新しい技術を提供する必要がある。
【０００６】
初期の薬物発見の生産性を改良するには３つの主な道がある。まず、増大した情報取り扱い能力を提供するツールに対する要望がある。生物情報学はＤＮＡ配列決定システムの迅速な発展およびゲノミックスデータベースの進化で花咲いた。ゲノミックスは潜在的新しい標的の同定で非常に重要な役割を果たし始めている。プロテオミックスは、薬物相互作用を予測するためにタンパク質標的の構造および機能を関連づけるのに不可欠なものとなった。しかしながら、生物学的複雑性の次のレベルは細胞である。従って、細胞からの多次元情報を取得し、管理しサーチする要望がある。第２に、より高いスループットツールに対する要望がある。ＤＮＡ配列決定および高スループット一次スクリーニングにおいてすでに示されているように、自動化は生産性を改良する鍵である。本発明は、より高いスループットのツールに対する要望を満足する細胞から複数パラメータ情報を抽出する自動システムを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およびテスト化合物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大したスループットを可能とすることを提供する。
【０００７】
放射能は初期の薬物発見アッセイでは支配的な読み出し情報であった。しかしながら、より多い情報、より高いスループットおよび小型化に対する要望は、蛍光検出の使用に向けてのシフトを引き起こした。蛍光−ベースの試薬は、スループットおよび情報含有量が高いより強力な複数パラメータアッセイを生じさせることができ、より低い容量の試薬およびテスト化合物を必要とする。また、蛍光は放射能−ベースの方法よりも安全かつ安価である。
【０００８】
色素および蛍光試薬で処理した細胞のスクリーニングは当該分野でよく知られている。レポータ分子としての修飾された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質を生じる細胞の遺伝子工学に関連するかなり膨大な文献がある。野生型ＧＦＰのいくつかの特性はモリス（Ｍｏｒｉｓｅ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３（１９７４）２６５６−２６６２頁）およびワード（Ｗａｒｄ）ら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ，Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１（１９８０），６１１−６１５頁）によって開示されている。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰは３９５ｎｍにおける励起最大および５１０ｎｍにおける発光最大を有し、蛍光活性に外因的因子を要しない。文献に開示されたＧＦＰの使用は普及しており、細胞下小器官の可視化（リゾット（Ｒｉｚｚｕｔｏ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１９９５），６３５−６４２頁）、分泌経路に沿ったタンパク質輸送の可視化（ケーサー（Ｋａｅｔｈｅｒ）およびゲルデス（Ｇｅｒｄｅｓ），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６９（１９９５），２６７−２７１頁）、植物細胞（フー（Ｈｕ）およびチェン（Ｃｈｅｎｇ），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６９（１９９５），３３１−３３４頁）およびショウジョウバエ肺（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７０（１９９５），７２６−７２９頁）における発現のためのツールとして、および注目する別のタンパク質に融合したレポータ分子として（米国特許第５，４９１，０８４号）、遺伝子発現およびタンパク質位置決定（チャルフィー（Ｃｈａｌｆｉｅ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（１９９４），１２５０１−１２５０４頁）の研究を含む。同様に、ＷＯ９６／２３８９８は、タンパク質キナーゼ活性化部位を有するＧＦＰ構築体を利用することによる細胞内プロセスに影響する生物学的活性物質を検出する方法に関する。この特許、および本出願で引用した全ての他の特許は参照してその全体に組み込まれる。
【０００９】
多数の文献が生物学的系におけるＧＦＰタンパク質に関係する。例えば、ＷＯ９６／０９５９８はＧＦＰ様タンパク質の発現を利用する注目する細胞を単離するためのシステムを説明する。ＷＯ９６／２７６７５は植物におけるＧＦＰの発現を説明する。ＷＯ９５／２１１９１は、突然変異誘発を検出するための軽質転換生物で発現された修飾ＧＦＰタンパク質を説明する。米国特許第５，４０１，６２９号および第５，４３６，１２８号は、細胞表面受容体を発現し、細胞表面受容体の活性に応答する転写調節要素を含むレポータ遺伝子構築体を含有する組換え細胞を用いる細胞外シグナルの細胞内変換を検出し、評価するためのアッセイおよび組成物を説明する。
【００１０】
数千の化合物についてスクリーニングを行うには、多くの化合物および多くの成分試薬の平行した取り扱いおよび処理を必要とする。標準的な高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）は、９６または３８４ウェルを備えた標準的なマイクロタイタープレート中のウェルのアレイに負荷されたいくつかのインジケータ化合物と共に化合物および生物学的試薬の混合物を用いる。各ウェルから測定されたシグナル（蛍光または発光）、光学密度、または放射能はウェル中の全ての物質からのシグナルを統合し、ウェル中の全ての分子の総じての集団平均を与える。
【００１１】
サイエンス・アプリケーション・インターナショナル株式会社（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＳＡＩＣ））（１３０  ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ  ９８１０９）はイメージングプレートリーダーを説明する。このシステムはＣＣＤカメラを用いて、９６ウェルプレートの全領域をイメージする。このイメージは解析され、ウェル中のすべての物質につきウェル当たりの全蛍光が計算される。
【００１２】
モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕａｌｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）は、標準的な９６ウェルプレート中のウェルの底部のほぼ２００ミクロン内で選択的に蛍光を励起するのに低角レーザー走査照射およびマスクを用いて、細胞単層をイメージする場合のバックグラウンドを低下させるシステム（ＦＬＩＰＲ）を説明する。このシステムはＣＣＤカメラを用いてプレート底部の全領域をイメージする。このシステムはウェルの底部の細胞単層に由来するシグナルを測定するが、測定されたシグナルはウェルの領域にわたって平均化され、従って、細胞の集団の平均的応答の測定であると依然として考えられる。イメージを解析して、細胞−ベースのアッセイにつきウェル当たりの全蛍光を計算する。ＦＬＩＰＲシステム等の流体送達デバイスを細胞ベースのスクリーニングシステムに取り込んで、応答を開始させ、次いで、これは、マクロ−イメージングシステムを用いて全ウェル集団平均応答として観察される。
【００１３】
高スループットスクリーニングとは対照的に、細胞構成要素およびプロセスの時間的−空間的動力学についてのより詳細な情報に対する必要性に対処するために、種々の高含有量スクリーニング（「ＨＣＳ」）が開発されている。高含有量スクリーニングは、細胞に取り込まれた特異的蛍光−ベースの試薬に由来する多色蛍光情報の抽出を自動化する（ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）およびテーラー（Ｔａｙｌｏｒ）（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４、ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５）。空間的、ならびに時間的動力学を測定することができる光学システムを用いて細胞を分析する（ファーカス（Ｆａｒｋａｓ）ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｏｌ．５５：７８５、ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）ら（１９９０）Ｉｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂ．ＨｅｒｍａｎおよびＫ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ（編），５４３−５５７頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ハーン（Ｈａｈｎ）ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：７３６、ワグナー（Ｗａｇｇｏｎｅｒ）ら（１９９６）フー（Ｈｕ）ｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２７：４９４）。この概念は、標識された構成要素の活性についての空間的および時間的情報を有する「ウェル」として各細胞を処理することである。
【００１４】
今や、細胞に適用された蛍光−ベースの試薬を介して接近可能なタイプの生化学的および分子的情報はイオン濃度、膜ポテンシャル、特異的移動、酵素活性、遺伝子発現、ならびに代謝産物、タンパク質、脂質、炭水化物および核酸配列の存在、量およびパターンを含む（デビアシオ（ＤｅＢｉａｓｉｏ）ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：１２５９、ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５：ヘイム（Ｈｅｉｍ）およびＴｓｉｅｎ，（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８）。
【００１５】
高含有量スクリーニングは、蛍光標識された抗体、生物学的リガンド、および／または核酸ハイブリッド形成プローブを用いて固定細胞につき、あるいは多色蛍光インジケータおよび「バイオセンサー」を用いて生細胞につき行うことができる。固定もしくは生細胞スクリーニングの選択は、必要な特異的細胞−ベースのアッセイに依存する。
【００１６】
固定細胞アッセイは最も単純である。なぜなら、マイクロタイタープレート様式における最初に生きる細胞のアレイは、テストすべき種々の化合物および用量で処理することができ、次いで、細胞は固定し、特異的試薬で標識し、測定することができるからである。固定後に、細胞の環境の制御は必要でない。空間的情報が取得されるが、１つの時点におけるのみである。細胞に適用することができる数千の抗体、リガンドおよび核酸ハイブリッド形成の利用可能性は、これを、多くのタイプの細胞−ベースのスクリーニングに対する魅力的アプローチとする。固定および標識工程は自動化することができ、アッセイの効果的処理を可能とする。
【００１７】
生細胞アッセイはより技巧的かつ強力である。なぜなら、所望の試薬を含有する生細胞のアレイは時間、ならびに空間にわたってスクリーニングすることができるからである。細胞の環境的制御（温度、湿度および二酸化炭素）が測定の間に必要である。なぜなら、細胞の生理学的健康が、時間にわたっての複数蛍光測定で維持されなければならないからである。細胞内での生化学的および分子的活性の変化を報告することができる蛍光生理学的インジケータおよび「バイオセンサー」の増大するリストがある（ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５、ハーン（Ｈａｈｎ）ら（１９９３）Ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗ．Ｔ．Ｎａｓｏｎ（編），３４９−３５９頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【００１８】
蛍光−ベースの試薬の利用可能性および使用は、固定および生細胞高含有量スクリーニング双方の発達を進めるのを助けてきた。多色高含有量情報を自動的に抽出するための装置化の進歩は、最近、ＨＣＳを自動ツールに開発するのを可能とした。テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）らによる論文（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ８０（１９９２），３２２−３３５頁）は、これらの方法およびそれらの適用の多くを説明する。例えば、Ｐｒｏｆｆｉｔｔら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２０４−２１３（１９９６））は、種々の組織培養プレート様式、特に、９６−ウェルマイクロタイタープレートウェルにおいて原位置で相対的細胞数を定量するための半自動蛍光デジタルイメージングシステムを説明する。このシステムは電動段階を設けたエピ蛍光倒立顕微鏡、ビデオカメラ、イメージ増感剤、およびＰＣ−ビジョンデジタイザーを設けたマイクロコンピュータからなる。Ｔｕｒｂｏ  Ｐａｓｃａｌソフトウェアは段階を制御し、プレートを走査し、ウェル当たりの複数のイメージを撮る。このソフトウェアはウェル当たりの全蛍光を計算し、日キャリブレーションを提供し、種々の組織培養プレート様式につき容易に配置を形成する。デジタルイメージの閾値設定および生細胞によって取られる場合のみ蛍光を発する試薬を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなくバックグラウンド蛍光を減少させる。
【００１９】
走査共焦点顕微鏡イメージング（（ゴー（Ｇｏ））ら（１９９７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７：２１０−２１５、ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）ら（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２１：３１１−３１９）および多光子顕微鏡イメージング（デンク（Ｄｅｎｋ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：７３、グラトン（Ｇｒａｔｔｏｎ）ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１５４−１５５頁）もまた、顕微鏡試料の高分解能イメージを取得するための良く確立された方法である。これらの光学系の主な利点は、非常に浅い焦点深度であり、これは限定された軸方向の程度の特徴がバックグラウンドに対して分解されることを可能とする。例えば、細胞表面の特徴から接着性細胞の内部細胞質特徴を分解するのが可能である。走査多光子イメージングは必要な高光子束を達成するのに非常に短い持続のパルスレーザー系が必要であるので、蛍光の寿命もまたこれらの系で測定することができ（ラコウィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）ら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：３１６−３３０、Ｇｅｒｒｉｔｔｓｅｎら（１９９７），Ｊ．ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ７：１１−１５）、異なる検出モードに対してさらなる能力を提供する。半導体レーザーによるポンプドレーザー等の小さくて信頼ができかつ比較的安価なレーザー系が、今日、多光子共焦点顕微鏡がかなり日常的に適用されるのを可能とするために入手できる。
【００２０】
集団における細胞の生物学的不均一性（ブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）ら（１９８９），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：４１０、ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ），（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌ．３５：２３７））ならびに細胞内に存在する化学および分子情報の高い空間的および時間的頻度の組合せは、現存の全マイクロタイタープレートリーダーを用いて脂肪の集団から高含有量情報を抽出するのを不可能とする。個々に分析される細胞を用いる多色蛍光ベースのスクリーニングでは、高含有量スクリーニングプラットフォームでデザインされたものは現存しない。同様に、特にマイクロタイタープレートで増殖した細胞からＨＣＳ分析によって同定される細胞応答を誘導する能力につき化合物を組織的にスクリーニングする目的で、自動流体送達を細胞のアレインに組み合わせる方法現在利用できない。さらに、１つのアッセイで「ヒット」を同定するための高スループットウェル間測定、続いてのヒットと同定されたウェルのみの同一プレートについての第２の高含有量細胞間測定を組み合わせる方法は当該分野では存在しない。
【００２１】
本発明は、多くの細胞スクリーニング様式を蛍光ベースの分子試薬およびコンピュータベースの特徴抽出、データ解析、および自動化と組み合わせることによって標的の有効化および候補の最適化を有意に改良し、その結果データ収集の質およびスピードの増加、サイクル時間の短縮化、および最終的には有用な薬物候補のより早い評価をもたらす高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）および高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）を組み合わせるシステム、方法およびスクリーニングを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬およびテスト化合物の容量を減少させつつ、この方法を小型化し、それにより増大したスループットを可能とすることを提供する。
【００２２】
（発明の開示）
本発明の一つの特徴は、位置のアレイに蛍光レポータ分子を含有する細胞を提供し、位置のアレイにおける細胞を１以上の試薬で処理し、各位置における多数の細胞を蛍光光学でイメージングし、光学情報をデジタルデータに転換し、デジタルデータを利用して細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性および細胞の分布を測定し、次いで、生物学的機能についてテストすべき化合物の陽性効果、陰性効果、または無効果の項目につきその情報を解釈することを含む細胞の分析方法に関する。
【００２３】
この実施形態において、この特徴に係る方法は、特定の生物学的機能に特異的に影響するものにつき非常に多数の化合物をスクリーニングする目的で細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性を迅速に測定する。位置のアレイは、マイクロタイタープレート、または位置のアレイに細胞を有するマイクロプレートであるマイクロチップであって良い。好ましい実施形態において、この方法は受領したデータを取得し、処理し、表示し、保存するためのコンピュータ化手段を含む。好ましい実施形態において、この特徴に係る特徴に係る方法は、さらに、細胞のアレイへの自動流体送達を含む。別の好ましい実施形態において、同一プレートでの高スループット測定から得られた情報を用いて、プレート上の細胞位置のサブセットのみについて選択的に高含有量スクリーニングを行う。
【００２４】
本発明の他の特徴は、
・顕微鏡対物レンズを有する高倍率蛍光光学系、
・細胞のアレイを含有するプレートを保持し、適当な整列のためにプレートを移動させ、細胞アレイ上に焦点を合わせるための手段を有するのに適したＸＹ段階、
・デジタルカメラ、
・細胞アレイに励起光を向けるための光学手段および細胞から放出された蛍光をデジタルカメラに向けるための手段、および
・デジタルカメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データの保存および検索のためのデジタル保存媒体、結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含み、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するためのコンピュータ手段とを具備する細胞スクリーニングシステムを提供することである。
【００２５】
好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、データを表示するためのコンピュータと操作可能に関連するコンピュータ画面を含む。別の好ましい実施形態において、デジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するためのコンピュータ手段はこのデータをバイオインフォマティクスデータベースに保存する。さらなる好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは、さらに、多くのまたは全てのウェルからのシグナルを平行して測定するリーダーを含む。別の好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、システムの倍率を変化させて、高スループットおよび高含有量スクリーニングの間のモードの変化を可能とする機械、光学手段を含む。別の好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは、さらに、細胞を生かしておくために必要なレベルにプレートの周囲の温度、ＣＯ２濃度および湿度を維持するためのチャンバーおよび制御システムを含む。さらなる好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは共焦点走査照明および検出システムを利用する。
【００２６】
本発明のさらに他の特徴は、特異的細胞の構成要素およびプロセスの分布および活性を規定するための手法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を提供することである。好ましい実施形態において、この細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するのに適した段階および段階を移動させるための手段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、デジタルカメラからデジタルデータを受け取り、それを処理するための光源、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受け取り、それを処理するためのコンピュータ手段を含む。機械読み取り可能保存媒体の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムが、図９、１１、１２、１３、１４または１５に記載された手法を実行させるための指令の組を含むプログラムを含む。別の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムが、特異的細胞の構成要素およびプロセスの分布および活性を検出するための手法を実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定されるものではないが、タンパク質の核移動、細胞肥大、アポトーシス、およびタンパク質のプロテアーゼ−誘導移動を含む。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、転写因子活性、プロテインキナーゼ活性、細胞形態、微小管構造、アポトーシス、受容体内部化、およびタンパク質のプロテアーゼ−誘導移動に影響する化合物を同定するためのスクリーニングを含めた種々の細胞スクリーニング方法を提供することである。
【００２８】
別の態様において、本発明のさらに他の特徴は：
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列、
ｂ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結し、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列、および
ｃ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結し、少なくとも１つの反応体標的配列をコードする第３の核酸配列、
とを具備するプロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を提供することである。
【００２９】
また、本発明は、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸を発現することができる組換え発現ベクター、ならびにこの発現ベクターでトアンスフェクトされた遺伝的に修飾された宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明は、さらに、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第１のドメイン、
ｂ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む第２のドメイン、および
ｃ．少なくとも１つの反応体標的配列を含む第３のドメイン、を含み、ここに、第１のドメインおよび第３のドメインは第２のドメインによって分離されていることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提供する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明はトキシンの存在につき試料を特徴づけるためのアッセイおよび試薬を含む。この方法は種々のレベルのトキシンの特徴づけを提供するためのトキシンバイオセンサーの検出器、分類器、識別子のクラスの使用を含む。
【００３２】
（発明を実施するための最良の形態）
全ての引用された特許、特許出願および他の文献は、参照してその全体に組み込まれる。
【００３３】
本明細書中で用いるように、以下の用語は特定の意味を有する：
細胞ドメインのマーカ。特異的小器官または分子を含めた特異的細胞構成要素に対して高親和性を有するルミネセンスプローブ。これらのプローブは、「標識試薬」「環境インジケータ」または「バイオセンサー」として使用される小さなルミネセンス分子または蛍光タグ付きマクロ分子いずれかであり得る。
【００３４】
標識試薬。標識試薬は、限定されるものではないが、蛍光タンパク質アナログおよびバイオセンサーを含めたルミネセンス標識マクロ分子、緑色蛍光タンパク質およびその突然変異体とで形成されたものを含めたルミネセンスマクロ分子キメラ、生理学的応答に関与する細胞抗原と反応するルミネセンス標識一次または二次抗体、ルミネセンス染料、色素および他の小分子を含む。
【００３５】
細胞移動のマーカ。いくつかの細胞プロセスまたは生理学的応答の間に１つの細胞ドメインから別のドメインに移動するルミネセンスタグ付きマクロ分子または小器官。移動マーカは細胞ドメインのマーカに対する単にレポート位置であり得るか、あるいはそれらは同様にいくつかの生化学または分子活性を報告する「バイオセンサー」でもあり得る。
【００３６】
バイオセンサー。生物学的機能ドメインおよび内部またはその表面いずれかで起こる環境の変化を報告するルミネセンスプローブまたは複数プローブからなるマクロ分子。これらの変化を検知しそれを報告するほうにデザインされたルミネセンス標識マクロ分子のクラスは「蛍光−タンパク質バイオセンサー」と呼ばれてきた。バイオセンサーのタンパク質成分は高度に進化した分子認識部位を提供する。活性部位に隣接するタンパク質成分に付着した蛍光分子は、環境の変化を蛍光シグナルに変化させ、これは本発明の細胞スクリーニングシステム等の適当な時間および空間分解能を持つシステムを用いて検出される。生細胞内の天然タンパク質活性の変調は可逆的であるので、かつ蛍光−タンパク質バイオセンサーはタンパク質活性の可逆的変化を検知するようにデザインできるので、これらのバイオセンサーは実質的に再使用可能である。
【００３７】
病気関連配列。（「ＤＡＳ」）。この用語は、薬物候補化合物についてのように、一次ＤＮＡ配列データ等の標準的な技術、減算ハイブリッド形成およびＲＡＤＥ等のゲノム方法、および逆遺伝子学と組み合わせたプロテオミック方法によって同定された核酸配列をいう。この用語は、配列が病気状態に関連するに過ぎないということを意味しない。
【００３８】
高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）を用いて、シグナル変換経路等の複雑な分子事象、ならびに限定されるものではないがアポトーシス、細胞分裂、細胞接着、移動、エキソサイトーシスおよび細胞間通信を含めた細胞機能に対する薬物の効果を測定することができる。多色蛍光は複数の標的および細胞プロセスが単一のスクリーニングでアッセイできることを可能とする。細胞応答の交差−相関は標的の有効化およびリード最適化に要する価値のある情報を生じるであろう。
【００３９】
本発明の１つの態様において、顕微鏡対物レンズ、細胞を保持する位置のアレイを備えたプレートを保持し、顕微鏡対物レンズとこの位置を整列させるためにプレートを移動させるための手段を有するＸＹ段階、および焦点合わせを行う方向にプレートを移動させるための手段を有する高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、位置のアレイにおける細胞に励起光を向けるための光学手段および細胞から放出された蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受け取りそれを処理するためのコンピュータ手段、ここに、このコンピュータ手段はこのカメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレームグラバー、使用者対話のためのディスプレイおよびアッセイ結果のディスプレイ、データの保存および検索のためのデジタル保存媒体、および結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含む、を含む細胞スクリーニングシステムを提供することである。
【００４０】
図１は細胞走査システムの好ましい実施形態の概略図である。このカメラに対して１−１００倍の倍率を持つ標準的な対物レンズ、および電源２を備えた白色光源（例えば、１００Ｗの水銀灯ランプまたは７５Ｗキセノンランプ）を用いるツァイス・アキシオバート（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）倒立蛍光顕微鏡等の倒立蛍光顕微鏡１を用いる。顕微鏡対物レンズ上方にＸＹ方向にプレート４を移動させるためのＸＹ段階３がある。Ｚ−軸焦点駆動５は焦点合わせのために対物レンズをＺ方向に移動させる。操作レバー６はＸＹＺ方向の段階の手動移動を提供する。高分解能デジタルカメラ７はプレート上の各ウェルまたは位置からイメージを取得する。カメラ電源８、自動コントローラ９および中央処理ユニット１０がある。このＰＣ１１はディスプレイ１２を提供し、関連するソフトウェアを有する。プリンタ１３はハードコピーレコードの印刷を提供する。
【００４１】
図２は本発明の顕微鏡アセンブリ１の１つの実施形態の概略図であり、詳細に、ＸＹ段階３、Ｚ−軸焦点合わせ駆動５、操作レバー６、光源２、および自動コントローラ９を示す。コンピュータ１５および顕微鏡１６へのケーブルが各々設けられる。加えて、図２はＸＹ段階３上にＸＹ方向に移動する９６ウェルのマイクロタイタープレート１７を示す。抗原２からの光はＰＣ制御のシャッター１８を通って励起フィルタ２０を備えた電動フィルタホイール１９へと通過する。この光は、ダイクロイックミラー２６および発光フィルタ２７を有するフィルタキューブ２５に通過する。励起光はこのダイクロイックミラーで反射されてマイクロタイタープレート１７中のウェルに向かい、蛍光２８はダイクロイックミラー２６および発光フィルタ２７を通ってデジタルカメラ７へと通過する。
【００４２】
図３は好ましいカメラアセンブリの概略図を示す。露出制御のための自動シャッターおよび電源３１を含有するデジタルカメラ７は顕微鏡アセンブリからの蛍光２８を受け取る。デジタルケーブル３０はデジタルシグナルをコンピュータにまで輸送する。
【００４３】
上述した標準的な光学配置は、カメラセンサー上の検体の拡大されたイメージを直接的に生じさせて、この検体の高分解能イメージを取得するための顕微鏡光学を使用する。この光学系は通常「広視野」顕微鏡といわれる。当業者であれば、検体の高分解能イメージは、限定されるものではないが、検体にわたって操作した照明の焦点を合わせた点または線の標準的な走査共焦点検出（ゴー（Ｇｏ）ら，１９９７，上記）、および多光子走査共焦点顕微鏡（デンク（Ｄｅｎｋ）ら，１９９０，上記）（これらの双方はＣＣＤ検出器にて、または光電子増倍管のアナログ出力の同調デジタル化によってイメージを形成できる）を含めた種々の他の光学系によって生じさせることができるのを認識できるであろう。
【００４４】
スクリーニング適用において、しばしば、特定の細胞系または一次細胞培養を用いて、それらの細胞の特定の特徴を利用するのが必要である。細胞培養の分野の当業者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、それらは他の細胞に囲まれるようになると増殖を停止することを意味し、他方、他の細胞はそれらの条件下で継続して増殖し、細胞は文字通り積みあがり、多くの層を形成することを認識するであろう。そのような細胞系の例はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）系である。多層調製物における単一の細胞層のイメージを取得できる光学系が、層を形成する蛍光にある細胞系での使用に必要である。広視野顕微鏡の大視野深度は、多くの層の細胞を通じての投影であるイメージを生じ、層−形成細胞で極端に困難な細胞下空間分布の解析を行う。別の方法として、共焦点顕微鏡で達成することができる非常に狭い視野深度（約１ミクロン）は高分解能にて単一の細胞層の区別を可能とし、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、蛍光寿命イメージング等の検出モードが必要な場合には共焦点イメージングが好ましい。
【００４５】
顕微鏡のための標準的共焦点イメージングアタッチメントの出力はデジタルイメージであり、これは上述した他の細胞スクリーニングシステムの実施形態によって生じるイメージと同一の様式に変換でき、従って、イメージと正確に同一の方法で処理できる。この実施形態における全制御、取得および解析は実質的に同一である。共焦点顕微鏡システムの光学配置は、照明器および検出器を除いて上述したものに実質的に同一である。共焦点顕微鏡に必要な照明および検出系は、本発明のもののような標準的な顕微鏡光学系に取り付けられるアクセサリとしてデザインされてきた（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ），ドイツ国）。従って、これらの別の光学系は上述した体系に容易に取り込むことができる。
【００４６】
図４は、参照してその全体に組み込まれる同時係属米国出願Ｓ／Ｎ  ０８／８６５，３４１に記載された、細胞アレイがマイクロプレート４１上のマイクロウェル４０にある本発明の別の実施形態を示す。典型的には、このマイクロプレートは、８６ｍｍ×１２９ｍｍである標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレートと比較して２０ｍｍ×３０ｍｍである。マイクロプレート上の細胞のより高い密度のアレイは、高スループットで画素当たり数ミクロンの低分解能にてイメージされることを可能とし、このマイクロプレート上の特定の位置が画素当たり０．５ミクロン未満の高分解能にてイメージされることを可能とする。これらの２つの分解能濃度は、この系の全スループットを改良することを助ける。
【００４７】
マイクロプレートチャンバー４２は化合物の細胞への添加のためのミクロ流動送達システムとして働く。マイクロプレートチャンバー４２中のマイクロプレート４１はＸＹマイクロプレートリーダー４３に入れられる。デジタルデータは上述したように処理される。このマイクロプレートシステムの小さなサイズはスループットを増加させ、試薬容量を最小化し、速くて正確な細胞ベースの分析のための細胞の分布および設置の制御を可能とする。処理されたデータはＰＣ画面１１上に表示でき、バイオインフォマティクスデータベース４４の一部をなす。このデータベースは本発明の方法を通じて得られたデータの保存および検索を可能とするのみならず、細胞に関する外部データの取得および保存を可能とする。図５は、ソフトウェアの操作を説明するＰＣディスプレイである。
【００４８】
代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）は同一プラットホーム上または（ローカルエリアネットワークを介して）電子的に結合した２つの別々のプラットフォーム上のＨＣＳと直接連結される。デュアルモード光学系と言われる本発明のこの実施形態は、それをＨＴＳと連結させることによってＨＣＳのスループットを増加させる利点を有し、それにより、連結したＨＴＳにおける応答を示すウェルの小さなサブセットについてのみより遅い高分解能データ取得および分析を要する。
【００４９】
高スループット「全プレート」リーダーシステムは当該分野でよく知られており、多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるＨＴＳシステムの成分として通常は使用される（ベグス（Ｂｅｇｇｓ）（１９９７），Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２：７１−７８、マカフレー（Ｍａｃａｆｆｒｅｙ）ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １：１８７−１９０）。
【００５０】
デュアルモード細胞ベースのスクリーニングの１つの実施形態において、高スループット取得が１つのプラットフォームで起こり、高含有量取得が第２のプラットフォームで起こる２つのプラットフォーム構築体を提供することである。（図６）。処理は各プラットフォームで独立して起こり、結果はネットワークインターフェースを通過し、あるいは単一のコントローラを用いて両プラットフォームからのデータを処理する。
【００５１】
図６に示すように、例示された２つのプラットフォームデュアルモード光学系は２光の光学装備、高スループット６０および高含有量プラットフォーム６５よりなり、これはマイクロプレート上のマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中で培養した細胞から放出された蛍光シグナルを読み取り、電子的結合６４を介して相互に通信する。高スループットプラットフォーム６０は全プレート中の全てのウェルを平行してまたは迅速系列様式いずれかで分析する。スクリーニングの分野の当業者であれば、デュアルモード細胞ベースのスクリーニングシステムに取り込むことができる多くのそのような商業的に入手可能な高スループットリーダーシステムがあることを認識するであろう（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード・インスツルメント社（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｌｕｍｉｓｋａｎ（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ），Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。上述した高含有量プラットフォーム６５はウェル間を走査し、ウェル内の個々の細胞から収集された高分解能イメージデータを取得し、それを分析する。
【００５２】
システムのコンピュータ６２に存在するＨＴＳソフトウェアは高スループット装備を制御し、結果はモニター６１に表示される。そのコンピュータのシステム６７に存在するＨＣＳソフトウェアは高含有量装備ソフトウェア６５、および任意のデバイス（例えば、プレートローダー、環境チャンバー、流体ディスペンサー）を制御し、プレートからのデジタルイメージデータを分析し、結果をモニター６６に表示し、取り込まれたデータベースで測定されたデータを管理する。また、２つのシステムは単一のコンピュータを共有し、この場合、全てのデータは、データを移動するためのローカルエリアネットワークの必要性なくして、そのコンピュータで収集され、処理され、表示される。マイクロタイタープレートは、当該分野で知られているように、手動により、またはロボットプレート移動デバイスによって、高スループットシステムから高含有量システム６３に移動される（ベグス（Ｂｅｇｇｓ）（１９９７），上記、マカフレー（Ｍｃａｆｆｒｅｙ）（１９９６），上記）。
【００５３】
好ましい実施形態において、デュアルモード光学系は単一のプレートシステムを利用する（図７）。それは、２つの別々の光学モジュール、ＨＣＳモジュール２０３およびＨＴＳモジュール２０９よりなり、これは、一度に１つのみを用いてマイクロタイタープレート２０１からのデータを収集することができるように、独立してまたは集合的に移動させることができる。マイクロタイタープレート２０１は電動Ｘ，Ｙ段階に設置され、そこで、それはＨＴＳまたはＨＣＳモードいずれかでのイメージングのために位置させることができる。後記するＨＴＳデータを収集し、それを分析した後、ＨＴＳ光学モジュール２０９を光路から外して移動させ、ＨＣＳ光学モジュール２０３が所定の位置に移動される。
【００５４】
ＨＴＳ２０９についての光学モジュールは投影レンズ２１４、励起波長フィルタ２１３およびダイクロイックミラー２１０よりなり、これを用いて、通常の顕微鏡ランプシステム（図示せず）からの特異的波長のバンドでプレート上の全底部を照明する。蛍光発光は、センサー２１５を備えたカメラ２１６上にイメージを形成するレンズ２１２によってダイクロイックミラー２１０および発光波長フィルタ２１１を通じて収集される。
【００５５】
ＨＣＳ２０３についての光学モジュールは投影レンズ２０８、励起波長フィルタ２０７、ダイクロイックミラー２０４よりなり、これを用いて顕微鏡対物レンズ２０２の裏開口を照明し、それにより、標準的顕微鏡照明システム（図示せず）からその対物レンズの視野を照明する。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ２０２によって収集され、ダイクロイックミラー２０４および発光波長フィルタ２０５を通って通過し、センサー２１５を備えた同一カメラ２１６上にイメージを形成するチューブレンズ２０６によって焦点を結ぶ。
【００５６】
本発明の別の実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、さらに、細胞スクリーニングの方法の生細胞実施形態での使用のための流体送達デバイスを含む（以下参照）。図８は本発明のシステムで用いる流体送達デバイスを例示する。それは単一のモータ駆動によって駆動される１２のシリンジポンプ７０１のバンクからなる。各シリンジ７０２は各ウェルへ送達されるべき容量、典型的には、１および１００μＬの間に従ったサイズとされる。各シリンジは柔軟なチューブ７０３を介して、標準的なピペット先端７０５を許容するコネクタの同様のバンクに付着される。ピペット先端のバンクは駆動システムに付着され、従って、それは、マイクロタイタープレート７０６に対して下降および上昇させて各ウェルへ流体を送達することができる。このプレートはＸ，Ｙ段階に設置され、データ収集目的で光学系７０７に対する移動を行う。この設定はピペット先端の１つの組、または単一のピペット先端のみでさえプレート上の全てのウェルに試薬を送達するのを可能とする。シリンジポンプのバンクを用いて同時に１２のウェルに、または先端のいくつかを除くことによってより少数のウェルに流体を送達することができる。
【００５７】
別の態様において、本発明は、複数細胞を含有する位置のアレイを提供し、ここに、この細胞は１以上の蛍光レポータ分子を含有し、細胞を含有する位置の各々における複数細胞を走査して、細胞中の蛍光レポータ分子からの蛍光シグナルが得られ、蛍光シグナルをデジタルデータに変換し、次いで、このデジタルデータを用いて、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性を測定することを含む細胞の分析方法を提供する。
【００５８】
細胞アレイ
特定の生物学的機能に関する活性についての非常に多数の化合物のスクリーニングは、細胞および試薬の平行した取り扱いのために細胞のアレイを調製することを必要とする。９ｍｍピッチの６ｍｍ直径のウェルを備えた、８６ｍｍ×１２９ｍｍである標準的な９６ウェルのマイクロタイタープレートは、現行の自動ローディングおよびロボット取り扱いシステムでの適合性にて使用される。このマイクロプレートは典型的には２０ｍｍ×３０ｍｍであり、約５００ミクロンのピッチで寸法が１００−２００ミクロンである細胞位置を備えている。マイクロプレートを作成する方法は、参照してその全体に組み込まれる米国特許出願番号０８／８６５，３４１に記載されている。マイクロプレートは、それに細胞が付着しない材料でパターン化された、それに細胞が接着する材料の共平面層、または同様にパターン化された材料のエッチングされた三次元表面からなることができる。以下の議論の目的では、用語「ウェル」および「マイクロウェル」とは、それに細胞が接着し、その中で細胞がイメージされるいずれかの構築物のアレイにおける位置をいう。マイクロプレートはウェルの間の空間に流体送達チャネルを含むことができる。マイクロプレートの同様の様式は、調製の間の試薬、保存および取り扱いの量ならびに走査操作に必要な全移動を最小化することによって、システムの全効率を増加させる。加えて、マイクロプレートの全領域はより効果的にイメージすることができ、本明細書中で後に説明するようにマイクロプレートリーダーのための第２のモードの操作を可能とする。
【００５９】
蛍光レポータ分子
新しい薬物発見のパラダイムの主要な要素は、細胞内イオン、代謝産物、マクロ分子および小器官の時間的および空間的分布、含有量および活性を測定するのに使用される継続的に増大する一群の蛍光および蛍光試薬である。これらの試薬のクラスは、生細胞および固定細胞における分子の分布および量、時間および空間におけるシグナル変換事象を報告するための環境インジケータ、および生細胞の標的分子活性を測定するための蛍光タンパク質バイオセンサーを測定する標識試薬を含む。単一の細胞中でいくつかの試薬を組み合わせるマルチパラメータアプローチは薬物発見のための強力な新しいツールである。
【００６０】
本発明の方法は、特異的細胞成分に対する蛍光またはルミネセンス分子の高親和性に基づく。特異的成分に対する親和性は、イオン相互作用、共有結合（これは、タンパク質ベースの発色団、フルオロフォア、およびルミフォアを含む）、ならびに疎水性相互作用、電気的ポテンシャル、およびある場合には、細胞成分内での単純な取得等の物理的力によって支配される。ルミネセンスプローブは、限定されるものではないが緑色蛍光タンパク質キメラを含めた、小分子、標識されたマクロ分子、または遺伝子工学作成タンパク質であり得る。
【００６１】
当業者であれば、限定されるものではないが、タンパク質、リン脂質およびＤＮＡハイブリダイジングプローブ等の蛍光標識生体分子を含めた、広く種々の蛍光レポータ分子を本発明で用いることができるのを認識するであろう。同様に、特異的に結合または会合の特定の化学的特性で合成された蛍光試薬が蛍光レポータ分子として使用されてきた（バラク（Ｂａｒａｋ）ら（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７４９７−２７５００、サウスウィック（Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ）ら（１９９０），Ｃｏｔｏｍｅｔｒｙ  １１：４１８−４３０、Ｔｓｉｅｎ（１９８９）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９  テーラー（Ｔａｙｏｒ）およびワン（Ｗａｎｇ）（編），１２７−１５６頁）。蛍光標識抗体は、細胞または組織としての複合体としての分子の混合物中の単一分子標的に付着させるためのそれらの高度な特異性のため特に有用なレポータ分子である。
【００６２】
ルミネセンスプローブは生細胞内で合成することができるか、あるいは拡散、促進または能動輸送、シグナル配列−媒介輸送、およびエンドサイトーシスまたはピノサイトーシス摂取を含めたいくつかの非機械的モーデを介して細胞に輸送することができる。当該分野でよく知られた機械的バルクローディング方法を用いて、ルミネセンスプローブを生細胞に負荷することもできる（バーバー（Ｂａｒｂｅｒ）ら（１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７−２０、ブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）ら（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６−２３３、ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，テーラー（Ｔａｙｏｒ）およびワン（Ｗａｎｇ）（編），１５３−１７３頁）。これらの方法はエレクトロポレーションおよびスクレイプ−ローディング、ビード−ローディング、インパクト−ローディング、シリンジ−ローディング、低張および高張ローディング等の他の機械的方法を含む。加えて、細胞を遺伝子工学的に作成して、上述した注目するタンパク質に連結された、ＧＦＰ等のレポータ分子を発現するようにすることができる（チャルフィー（チャルフィー（Ｃｈａｌｆｉｅ）およびＰｒａｓｈｅｒ，米国特許第５，４９１，０８４号、Ｃｕｂｉｔｔら（１９９５），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４４８−４５５）。
【００６３】
一旦細胞内に入れば、ルミネセンスプローブは、標的ドメインとの特異的かつ高親和性相互作用の結果として、あるいはシグナル配列−媒介輸送等の分子標的化の他の様式にてそれらの標的において蓄積する。蛍光標識レポータ分子は、レポータの位置、量および化学的環境を測定するのに有用である。例えば、レポータが親油性膜中にあるか、またはより水性の環境にあるかは決定することができる（ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）およびテーラー（Ｔａｙｏｒ）（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。レポータのｐＨ環境は測定することができる（ブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）ら（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４：１０１９−１０３３、ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：３６２−３７１、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら（１９７９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２１０−２２１８）。キレート化基を有するレポータがＣａ＋＋等のイオンに結合しているか否かは測定することができる（ブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）（１９８９），Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，テーラー（Ｔａｙｏｒ）およびワン（Ｗａｎｇ）（編），１５７−１９２頁、Ｓｈｉｍｏｕｒａら（１９８８），Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）２５１：４０５−４１０、Ｔｓｉｅｍ（１９８９）Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０，テーラー（Ｔａｙｏｒ）およびワン（Ｗａｎｇ）（編），１２７−１５６頁）。
【００６４】
さらに、生物内のある細胞タイプは、特異的に標識することができる成分を含有することができ、これは他の細胞タイプでは起こり得ない。例えば、上皮細胞は、しばしば、極性化膜成分を含有する。すなわち、組織細胞は、それらの原形質膜に沿ってマクロ分子を非対称に分布させる。結合もしくは支持組織は、しばしば、その細胞型に特異的な分子（例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン等）がそれに取得される顆粒を含有する。ほとんどの筋肉組織細胞は筋形質小胞体、その機能が細胞質内のカルシウムイオンの濃度によって調節されるべき特殊化された小器官を含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝達物質がそこに取得されている、分泌顆粒および小胞体を含有する。従って、蛍光分子は、特異的細胞内の特異的成分のみならず、混合された細胞型の集団内の特異的細胞も標識するようにデザインできる。
【００６５】
当業者であれば、蛍光を測定する広く種々の方法を認識するであろう。例えば、いくつかの蛍光レポータは励起または発光スペクトルの変化を呈し、いくつかは１つの蛍光レポータが蛍光を失い、他方、第２のものが蛍光の利得を得る共鳴エネルギー移動を呈し、いくつかは蛍光の喪失（消光）または出現を呈し、他方、いくつかは合理的移動を報告する（ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、ジュリアノ（Ｇｕｉｌｉａｎｏ）ら（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。
【００６６】
走査細胞アッセイ
図９を参照し、実行されるべきアッセイに基づいて選択されるべきオペレータ−指向性パラメータ、試料内の蛍光シグナルの分布についての細胞スクリーニングシステムによるデータ取得、および対話形式のデータレビューおよび解析を含む細胞を分析するための好ましい実施形態が提供される。自動走査の開始において、オペレータは、試料を説明する情報１００を入力し、フィルタ設定および蛍光チャネルを測定して、使用される生物学的標識および求められる情報を適合させ、カメラ設定を調整して、試料の明るさを適合させる。ある範囲の試料を取り扱う柔軟性のためには、ソウトウェアは、核および細胞質を同定するのに使用される種々のパラメータ設定の選択および異なる蛍光試薬の選択、形態または明るさに基づく注目する細胞の同定、およびウェル当たりの分析すべき細胞の数の同定を可能とする。これらのパラメータは、各自動実行につき容易な検索のために、システムに保存される。このシステムの対話形式細胞同定モードは、分析すべき細胞のサイズ、形状および同一性の範囲等の形態学的パラメータの限界の選択を単純化する。使用者は、プレートのいずれのウェルをシステムが走査するか、およびいくつの視野およびいくつの細胞を各ウェルで分析すべきかを特定する。工程１０１において使用者によって選択された設定に基づいて、システムは、プレート１０２の「焦点を見出す」ためのオートフォーカス手法を用いて走査されるべきプレートの領域を自動的に予め焦点合わせし、あるいは使用者は、走査されるべき三角形領域を規定する３つの「タグ」点を選択することによって走査領域を予め焦点合わせする１０３。次いで、それらのタグ点から最小二乗適合「焦点面デモル」を計算して、自動走査の間に各ウェルの焦点を評価する。各ウェルの焦点は、走査の間に焦点面モデルから内挿することによって評価される。
【００６７】
自動走査の間に、ソウトウェアは、分析された細胞の数、分析されるべき現在のウェル、それらが取得しつつある各独立した波長のイメージ、およびそれが決定されつつある各ウェルのイメージを含めた、走査状態を動的に表示する。プレート４（図１）はサーペンタインスタイルで走査される。なぜなら、ソウトウェアは、９６−ウェルプレートの各ウェル内のウェル間および視野間から電動顕微鏡ＸＹ段階３を自動的に移動させるからである。プログラミングの分野の当業者であれば、２４、４８および３８４ウェルプレート等の他のマイクロプレート様式の走査のためにソウトウェアをいかにして適合させるかを認識するであろう。全プレートの走査パターンならびに各ウェル内の視野のパターンがプログラムされる。システムは、Ｚ軸焦点駆動５を介してオートフォーカス手法１０４（図９）で試料の焦点を調整し、電動フィルタホイール１９を介してフィルタ選択を制御し、４つの異なる色（「チャネル」または「波長」）からなるイメージを取得し解析する。
【００６８】
オートフォーカス手法は、典型的には、各ウェル内の、各ウェル中で第１の視野、次いで各４−５の視野毎に１回、使用者が選択した頻度で呼ばれる。オートフォーカス手法は、予め計算された面焦点モデルから内挿することによって出発Ｚ−軸を計算する。この設定点を超えるまたはそれ未満のプログラム可能な距離で出発し、この手法は、多数の異なる位置を介して機械的Ｚ−軸を指導させ、各地点でイメージを取得し、各イメージのコントラストを評価する計算された焦点スコアの最大を見出す。最大焦点スコアを持つイメージのＺ位置は、特定の視野のための最良焦点を決定する。当業者であれば、ハームス（Ｈａｒｍｓ）ら，ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５（１９８４），２３６−２４３，Ｇｒｏｎｅｎら，ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ６（１９８５），８１−９１，およびファイヤストン（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ）ら，ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １２（１９９１），１９５−２０６に記載された自動焦点合わせ方法の変形としてこれを認識するであろう。
【００６９】
イメージ取得では、カメラの露出時間は、各色素につき別々に調整されて、各チャネルからの最高品質のイメージを保証する。ソフトウェア手法は、使用者のオプションにより、いずれかのさらなる測定をなす前に波長間で線状（ＸおよびＹ）シフトを説明することによって、波長間の登録シフトを修正するために呼ぶことができる。電子シャッター１８は、試料フォト−ブリーチングが最小に保持されるように制御される。バックグラウンド遮光および不均一な照明は、当該分野で知られている方法を用いるこのソフトウエアによって修正することができる（ブライト（Ｂｒｉｇｈｔ）ら（１９８７），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０４：１０１９−１０３３）。
【００７０】
１つのチャネルにおいて、適合した閾値設定手法を用いて分割される（「同定される」）一次マーカ１０５（図９）（典型的には、ＤＡＰＩまたはＰＩ蛍光色素で逆染色された細胞核）からイメージが取得される。この適合閾値設定手法１０６を用いてバックグラウンドから細胞を分離するため、イメージの閾値を動的に選択する。蛍光色素での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試料中の細胞を横切って、並びにマイクロタイタープレートの各ウェル内の細胞の視野のイメージ内で未知の程度変化し得る。この変化は、試料の調製および／または細胞の動的性質の結果として起こり得る。全体的閾値は、バックグラウンドから細胞を分離し、視野間変化を説明するために、完全なイメージについて計算される。これらの全体的結合技術は当該分野で記載されているものの変形である。（キトラー（Ｋｉｔｔｌｅｒ）ら，ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ３０（１９８５），１２５−１４７，リドラー（Ｒｉｄｌｅｒ）ら，ｉｎ  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ，ａｎｄ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（１９７８），６３０−６３２）。
【００７１】
別の適合閾値設定方法は、全体的イメージ閾値設定とは対照的に、局所領域閾値決定を利用する。局所領域のイメージ分析は、良好な総じての細分化に導く。なぜなら、細胞核（ならびに他の標識成分）の染色はイメージを横切って変化し得る。この全体的／局所的手法を用い、減少した分解能イメージ（２から４の因子だけサイズが減少）を、（適合閾値設定を用いて）まず全体的に分割して、イメージ中の注目する領域を見出す。次いで、これらの領域を、十分な分解能において同一領域をより十分に分析するためのガイドとして働かせる。次いで、（再度、適合閾値設定を用いて）注目する各領域につき、より局所化された閾値を計算する。
【００７２】
細分化手法の出力は、物体が白色であって、バックグラウンドが黒色であるバイナリーイメージである。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用いて、視野が物体１０７を含有するかを決定する。このマスクを小斑点標識方法で標識し、それにより、各物体（または小斑点）は、それに帰属されるただ１つの数を有する。この小斑点の面積および形状等の形態学的特徴を用いて、人口物と考えられるものから細胞であるように見える小斑点を区別する。既知の細胞の形態学的特徴においてタイプ分けすることによって、あるいは対話形式トレーニング用途を用いることによって、使用者は形態学的選択基準をあらかじめ設定する。注目する物体が視野で見出されれば、すべての他の活性はチャネル１０８についてイメージを取得し、そうでなければ、段階を現在のウェル中の次の視野１０９に進める。注目する各物体をさらなる分析１１０のためにイメージ中に位置させる。その形態学的特徴（サイズおよび形状）を測定することによって、このソウトウェアは、物体が有効な細胞核１１１についての基準を満たすかを決定する。各有効な細胞については、ＸＹＺ段階の位置を記録し、細胞の小さなイメージを保存し、特徴を測定する１１２。
【００７３】
多数の分析方法を同時に適用して複数の波長において特徴を測定することによって、本発明の細胞スクリーニング方法を用いて、細胞試料について多くの異なるアッセイを行うことができる。１つのそのようなアッセイの例は以下の測定を提供する：
１．色１−４についての細胞核内の全蛍光強度
２．色１についての細胞核の面積（一次マーカ）
３．色１についての細胞核の形状は：
ａ）周辺の四角の面積
ｂ）ボックスの面積比
ｃ）高さ幅比
によって記載される。
【００７４】
４．色１−４についての細胞核内の平均蛍光強度（すなわち、番号１を番号２で割る）
５．色２−４について細胞の細胞質の蛍光を表す（細胞質マスク）核の外側のリングの全蛍光強度（図１０参照）
６．細胞質マスクの面積
７．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度（すなわち、番号６割る番号６）
８．色２−４についての細胞核内の平均蛍光強度に対する細胞質マスクの平均蛍光強度の比率（すなわち、番号７割る番号４）
９．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度および細胞核内の平均蛍光強度の差（すなわち、番号７から番号４を引く）
１０．色２−４について、細胞核内の蛍光ドメイン（スポット、ドットまたは粒とも呼ばれる）の数
特徴１から４は、本発明の異なる細胞スクリーニングアッセイの一般的特徴である。これらの工程は種々のイメージ解析適用で通常用いられ、当該分野でよく知られている（Ｒｕｓｓ（１９９２）Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ハン（Ｈａｎ）ｄｂｏｏｋ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｏｎｚａｌｅｓら（１９８７），Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．３９１−４４８頁）。特徴５−９は、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子および細胞質から核への蛍光分子の移行（すなわち、移動）の測定を供するために特異的に開発された。これらの特徴（工程５−９）は、各移動の阻害用のマイクロプレートにおいて細胞を分析するために使用される。例えば、転写因子の核移動の阻害は、無傷細胞をスクリーニングするための新規なアプローチを提供する（他のタイプのスクリーニングの詳細な例は後に提供する）。具体的な方法は、各細胞の核領域における（特徴４）対局所細胞質領域における（特徴７）プローブの量を測定する。これらの２つの細胞下区画間の差異の定量は、多数の細胞質−核移動（特徴９）を提供する。
【００７５】
特徴１０は、色２−４における核領域内のＤＮＡまたはＲＮＡプローブのカウントで用いられるスクリーニングを説明する。例えば、プローブは、染色体−特異的ＤＮＡ配列を同定するために商業的に入手可能である（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ、Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ、Ｂｉｏ  １０１，Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）。細胞は性質が三次元的であり、顕微鏡下で高倍率で調べると、１つのプローブは焦点内に有り得るが、別のプローブは完全に焦点外となり得る。本発明の細胞スクリーニング方法は、複数の焦点面からイメージを取得することによって、核中の三次元プローブの検出を提供する。このソウトウェアは小工程にてＺ−軸モータ駆動５（図１）を移動させ、ここに、広い範囲の異なる核の直径を説明するには、工程距離は使用者が選択する。焦点工程の各々において、イメージが取得される。各イメージ中の各画素からの最大灰色レベル強度が見出され、得られた最大投影イメージに保存される。次いで、最大投影イメージを用いて、プローブをカウントする。この方法は、別のものの上方または下方に直接積まれないプローブをカウントするのによく働く。Ｚ−方向に相互の頂部に積まれたプローブにつきカウントするには、使用者は、取得した焦点面の各々においてプローブを分析するというオプションを選択することができる。このモードにおいて、走査システムは、上述した最大面投影方法を行い、このイメージ中の注目するプローブ領域を検出し、次いで、さらに、すべての焦点面イメージにおいてこれらの領域を分析する。
【００７６】
細胞の特徴１１２を測定した後（図９）、システムは、現在の視野１１３にいずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体があれば、それは次の物体１１０を位置付け、それが有効な細胞核１１１についての基準を満たすか否かを決定しその特徴を測定する。一旦現在の視野中の全ての物体が処理されれば、システムは、現在のプレートの分析が完了したか否かを決定する１１４、完了してなければ、それは現在のウェル１１５中により多くの細胞を見出す必要性を判断する。その必要性が存在すれば、システムは現在のウェル１０９内の次の視野にＸＹＡ段階を進め、あるいは段階をプレートの次のウェル１１６に進める。
【００７７】
プレートの走査が完了すれば、イメージおよびデータは、システムのイメージレビュー、データレビュー、および要約レビュー設備でレビューすることができる。走査からの全てのイメージ、データおよび設定は、後のレビューのために、またはネットワーク情報管理システムとインターフェースするためにシステムのデータベースで検索される。また、データを他の第三者の統計的パッケージに輸出して、結果を表にし、他の報告を作成することもできる。使用者は、対話形式イメージレビュー手法１１７を備えたシステムによって分析された各細胞のイメージ単独をレビューすることができる。使用者は、対話形式グラフ、測定された特徴のデータスプレッドシート、および対話形式細胞間データレビュー手法１１８での注目する細胞の全ての蛍光チャネルのイメージの組合せを用い、細胞間ベースでデータをレビューすることができる。ヒストグラムおよびばらつきプロット等の対話形式グラフを介してデータを解析することができるグラフプロッティング能力が提供される。使用者は、対話形式ウェル間データレビュー手法１１９でプレートの各ウェル内の全ての細胞について蓄積され、要約される要約データをレビューすることができる。グラフおよびイメージのハードコピーは、広い範囲の標準的なプリンタで印刷することができる。
【００７８】
完全な走査の最終相として、測定された特徴の１以上の統計についてレポートが作成できる。対話形式レポート作成手法１２０を用い、プレートの走査された領域につきウェル間ベースで要約されたデータのグラフレポートを作成することができる。このレポートは、試料についての表およびグラフ様式および同定情報においてウェルによる統計の要約を含む。レポートウインドゥは、オペレータが、後の検索のために走査についてコメントを入力することを可能とする。複数のレポートが多くの統計について作成でき、１つのボタンに触れて印刷することができる。印字する前に、配置およびデータにつきレポートをあらかじめレビューすることができる。
【００７９】
この方法の上述した実施形態は、高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）モードという単一の高分解能モードで走査される。このＨＣＳモードは、ウェル内、ウェル中の個々の細胞内の物質の分布を規定するための（１μｍのオーダーの）ウェル内の十分な空間的分解を提供する。そのモードで接近可能な高度な情報含有量は、必要なシグナル処理のスピードおよび複雑性を犠牲にして出現する。
【００８０】
代替実施形態において、高スループットシステム（ＨＴＳ）を同一プラットフォーム、または（例えば、ローカルエリアネットワークを介して）電子的に結合された２つの別々のプラットフォームいずれかでＨＣＳに直接連結される。デュアルモード光学システムと言われる本発明のこの実施形態は、それをＨＣＳと連結されることによって、ＨＣＳのスループットを増加させる利点を有し、それにより、連結されたＨＴＳにおける応答を示すウェルの小さなサブセットについてのみより遅い高分解能データ取得および分析を必要とする。
【００８１】
高スループット「全プレート」リーダーシステムは当該分野でよく知られており、多数の化合物をスクリーニングするのに用いられるＨＴＳシステムの成分として通常は使用される（ベグス（Ｂｅｇｇｓ）ら（１９９７），上記、マカフレー（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ）ら（１９９６），上記）。本発明のＨＴＳは、十分な分解能にてプレート中の多くのまたは全てのウェルを同時に読んで、ウェル間ベースで測定を行うことによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイで行われる。すなわち、各ウェル中の多くのまたは全ての細胞または多量の物質の全シグナル出力を平均することによって計算がなされる。ＨＴＳにおいていくつかの規定された応答を呈するウェル（「ヒット」）が、このシステムによって伝えられる。次いで、同一のマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイについて、ヒットとして同定された各ウェルは上述したようにＨＣＳを介して測定される。このように、デュアルモードプロセスは以下のものを含む：
１．マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイの多数のウェルの迅速な測定、
２．ウェル間ベースで蛍光標識レポータ分子の全活性を測定して「ヒット」（規定された応答を呈するウェル）を同定するためのデータの解釈、
３．各「ヒット」ウェルにおける多数の細胞のイメージング、および
４．個々の細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境または活性（すなわち、細胞内測定）および細胞の分布を測定して、特異的生物学的機能につきテストするためのデジタルイメージデータの解釈。
【００８２】
デュアルモード処理の好ましい実施形態において（図１１）、ラン３０１の開始において、オペレータは、プレートおよびその内容を説明する情報３０２を入力し、フィルタ設定および蛍光チャネルを特定して、使用される生物学的標識を適合させ、求められる情報およびカメラ設定を測定して、試料の明るさを適合させる。これらのパラメータは、各自動ランについての容易な検索のためにシステムのデータベースに保存される。マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイは、ロボットーローディングデバイスを制御することによって、手動または自動にて細胞スクリーニングシステム３０３にロードされる。任意の環境チャンバー３０４はこのシステムによって制御されて、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中の生細胞を囲う空気中の温度、湿度およびＣＯ２レベルを維持する。任意の流体送達デバイス３０５（図８参照）は、走査の間に流体をウェルに分注するためのシステムによって制御される。
【００８３】
高スループット処理３０６は、プレート中のウェルの各々からのシグナルを取得し分析することによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイでまず行われる。高スループットモード３０７で行われる処理は図１２に示され、以下に述べる。この高スループットモードにおいていくつかの選択された強度応答を呈するウェル（「ヒット」）はこのシステムによって同定される。このシステムは、ヒットについてテストする条件付操作３０８を行う。ヒットが見出されれば、それらの特異的ヒットウェルは、さらに、高含有量（ミクロレベル）モード３０９で分析される。高含有量モード３１２で行われる処理は図１３に示される。次いで、システムは、プレート上の測定の結果と共に情報化学データベース３１１を更新する３１０。分析すべきより多くのプレートがあれば３１３、システムは次のプレート３０３をロードし、そうでなければ、プレートの分析は終了する３１４。
【００８４】
以下の議論は、図１２に示された高スループットモードを説明する。システムの好ましい実施形態、単一プラットフォームデュアルモードのスクリーニングシステムを説明する。当業者であれば、操作的にはデュアルプラットフォームシステムは、光学を移動させるよりはむしろ２つの光学系の間でプレートを移動させることを単に含む。一旦システムが設定され、プレートがロードされれば、システムはＨＴＳ取得および分析４０１を開始する。ＨＴＳ光学モジュールは、デュアルモードシステムで電動任意位置決定デバイス４０２を制御することによって選択される。１つの蛍光チャネルにおいて、プレート上の一次マーカからのデータが取得され４０３、マスキング手法４０４を用いてウェルをプレートのバックグラウンドから単離する。また、使用されるべき他の蛍光チャネルでイメージが取得される４０５。各ウェル４０６に対応する各イメージ中の領域が測定される４０７。特定のウェルについての測定から計算された特徴をあらかじめ規定された閾値または強度応答４０８と比較し、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」４０９として伝え、または伝えない。ヒットとして伝えられたウェルの位置は、引き続いての高含有量モード処理のために記録される。処理すべきウェルが残っていれば４１０、全てウェルが処理され４１１、且つシステムが高スループットモードから出るまでプログラムはループバックする４０６。
【００８５】
ＨＴＳ分析に続き、システムは図１３で規定された高含有量モード処理５０１を開始させる。このシステムは、電動位置決定システムを制御することによってＨＣＳ光学モジュール５０２を選択する。高スループットモードでよく同定された各「ヒット」では、ウェルのＸＹ段階位置をメモリーまたはディスクから検索し、次いで、段階を選択された段階位置５０３まで移動させる。各ヒットウェルにおける最初の視野、次いで、各ウェル内の５から８視野ごとに１回、オートフォーカス手法５０４が求められる。１つのチャネルにおいて、一次マーカ５０５（典型的には、ＤＡＰＩ、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）またはＰＩ蛍光色素で逆染色した細胞核）でイメージが取得される。次いで、適合閾値決定手法５０６を用いてイメージが分割される（核および非核の領域に分離される）。細分化手法の出力はバイナリーマスクであり、ここに、物体は白色であって、バックグラウンドは黒色である。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用いて、視野が物体５０７を含有するかを決定する。マスクを小斑点標識方法で標識し、それにより、各物体（または小斑点）はそれに帰属されるただ１つの数を有する。物体が視野で見出されれば、全ての他の活性チャネル５０８でイメージが取得され、そうでなければ、段階は現在のウェル中の次の視野５１４に進められる。さらなる分析５０９のために、各物体はイメージ中に位置させる。物体の面積および形状等の形態学的特徴を用いて、細胞核５１０であるように見える物体を選択し、人工物であると考えられるものを捨てる（それをさらに処理しない）各有効細胞核では、ＸＹＺ段階の位置を記録し、細胞の小さなイメージを保存し、アッセイ特異的特徴を測定する５１１。次いで、いくつかの分析方法を適用していくつかの波長の各々で特徴を測定することによって、システムは細胞について多数のテストを行う。細胞の等張を測定した後、システムは、現在の視野５１２中にいずれかの未処理物体があるかをチェックする。いずれかの未処理物体があれば、それは次の物体５０９を位置決定し、それが有効細胞核５１０についての基準を満たしているか否かを決定し、その特徴を測定する。現在の視野中で全ての物体を処理した後、システムは、それが現在のウェル５１３中により多くの細胞または視野を見出す必要があるか否かを決定する。現在の視野中でより多くの細胞または視野を見出す必要があれば、それはＸＹＺ段階を現在のウェル５１５内の次の視野に進める。そうでなければ、システムは、それが測定すべきいずれかの残りのヒットウェルを有するか否かをチェックする５１５。そうであれば、それは次のヒットウェル５０３に進み、取得および分析の別のサイクルを通じて進め、そうでなければ、ＨＣＳモードは終了する５１６。
【００８６】
本発明の代替実施形態において、動的生細胞スクリーニングの方法が提供される。本発明のすでに記載した実施形態を用いて、時間において特定した時点で細胞成分の空間的分布を特徴づける（化学的固定の時間）。それ自体、イメージ取得の順次の性質およびプレート上の全てのウェルを読むのに必要な量のため、これらの実施形態は動的ベースのスクリーニングを実行するための限定された利用性を有する。例えば、プレートは全てのウェルを読み終えるのに３０から６０分要するので、生細胞のプレートを単に調製し、次いで、１回以上全てのウェルを読み終えることによって、非常にゆっくりとした動的プロセスが測定できるのにすぎない。より速い動的プロセスは、次のウェルに進む前に各ウェルの複数の読みを行うことによって測定できるが、最初および最後のウェルの間に経過する時間はあまりにも長く、速い動的プロセスは最後のウェルに到達する前に完了するようである。
【００８７】
本発明の動的生細胞の延長は、その空間的特徴の代わりに、またはそれに加えてその速度論によって生物学的プロセスを特徴づけるデザインおよびスクリーニングの使用を可能とする。多くの場合、生細胞における応答は、試薬を特異的ウェルに添加し、適当なタイミングでそのウェルについて複数の測定をなすことによって測定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞実施形態は、ウェルを読む進行において特定の時点に試薬を各ウェルに送達するためのシステムの個々のウェルへの流体送達用の装置を含む。この実施形態は、それにより、動的測定が、プレートの各ウェルについて数秒から数分の時間的分解でなすことを可能とする。動的生細胞システムの全効率を改良するために、取得制御プログラムを修飾して、プレートのサブ領域からの反復的データ収集を可能とし、システムが個々のウェルに必要な時点の間に他のウェルを読むことを可能とする。
【００８８】
図８は、本発明の生細胞実施形態で用いる流体送達デバイスの一例を記載し、それは上述した。この設定は、ピペット先端７０５の１つの組、または単一のピペット先端でさえ、プレート上の全てのウェルに試薬を送達するのを可能とする。シリンジポンプ７０１のバンクを用いて、流体を１２のウェルに同時に、または先端７０５のいくつかを取り除くことによってより少数のウェルに流体を送達することができる。従って、システムの時間的分解は、以下のように、先端および走査パターンの数を変更することによって、データ収集効率を犠牲にすることなく調整することができる。典型的には、単一ウェルからのデータ収集および分析は約５秒を要する。ウェル間の移動およびウェル中の焦点合わせは約５秒要し、従って、ウェルについての全サイクル時間は約１０秒である。従って、単一のピペット先端を用いて流体を単一のウェルに送達し、データをそのウェルから反復して収集するならば、測定は約５秒の時間的分解にて行うことができる。６つのピペット先端を用いて流体を６つのウェルに同時に送達し、システムが全ての６つのウェルを反復して走査するならば、各走査は６０秒を要し、それにより、時間的分解を確立する。８分ごとにデータ収集を要するにすぎないより遅いプロセスでは、流体送達相の間にプレートを移動させ、次いで、プレートのその半分を反復して走査することによって、流体をプレートの半分まで送達することができる。従って、プレート上で走査すべきサブ領域のサイズを調整することによって、取得の間に待ち時間を挿入する必要なくして時間的分解を調整することができる。システムは継続してデータを走査し取得することができるので、従って、プレートからの動的データ組を収集するための全時間は、単に、プレートの単一走査を行うための時間に必要な時点の数を乗じたものである。典型的には、化合物の添加前の１時点および添加に続いての２または３時点はスクリーニング目的で十分なはずである。
【００８９】
図１４は、動的分析で用いられる取得系列を示す。処理８０１の開始はシステムの配置であり、その多くは標準的なＨＣＳ配置と同一である。加えて、オペレータは、サブ領域のサイズ、必要な時点の数、および必要な時間の増分等の、実行すべき動的分析に特異的な情報８０２を入力しなければならない。サブ領域は、動的データを蓄積するために反復して走査それるウェルの群である。サブ領域のサイズは、単一時間増分の間に全サブ領域を１回走査し、このように、待ち時間を最小化するように調整される。最適サブ領域サイズは設定パラメータから計算され、必要であればオペレータが調整する。次いで、システムはプレートを第１のサブ領域８０３に、およびそのサブ領域８０４中の最初のウェルに移動させて、予備刺激（時間＝０）時点を取得する。各ウェルで行われる取得系列は、動的モードで実行される特異的ＨＣＳで必要はものと正確に同一である。図１５はその処理についてのフローチャートを詳細に示す。開始９０１および復帰９０２の間の工程の全ては、図１３中の工程５０４−５１４として記載されたものと同一である。
【００９０】
サブ領域中の各ウェルを処理した後、システムは、サブ領域中の全てのウェルが処理されたか否か８０６（図１４）をチェックし、全領域が処理されるまで全てのウェルを通じてサイクルする。次いで、システムはプレートを流体添加のための位置に移動させ、全サブ領域８０７への流体の流動システム送達を制御する。これは、プレート上のいくつかの列にわたるサブ領域についての複数添加を必要とし、システムはＸ，Ｙ段階上のプレートを添加の間に移動させる。一旦流体が添加されれば、システムは第１のウェルをサブ領域８０８まで移動させて、時点の取得を開始する。データは各ウェル８０９から取得され、上述したように、システムはサブ領域８１０中の全てのウェルを通じてサイクルする。各々がサブ領域を通った後、システムは、全ての時点が収集されたか否かをチェックし８１１、そうでなければ、必要であれば８１２休み８１３、必要な時間増分と同調したままとする。そうでなければ、システムはプレート８１４上のさらなるサブ領域をチェックし、次のサブ領域８０３まで移動するか、あるいは終了する８１５。このように動的分析モードは、引き続いてのサブ領域中でのデータ取得に先立ってのサブ領域内でのデータ取得と共に、調べるべき動的応答に基づいて、スクリーニングすべきマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルのサブ領域のオペレータによる同定を含む。
【００９１】
特異的スクリーニング
本発明の他の特徴は、細胞スクリーニング方法および特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を規定するための手法を細胞スクリーニングシステムが実行させる指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を提供することである。好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するのに適した段階および段階を移動させるための手段、デジタルカメラ、デジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するための光源、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するためのコンピュータ手段を含む。本発明のこの態様は、細胞スクリーニングシステムが、ルミネセンスプローブ、任意のイメージングシステム、および本発明のパターン認識ソフトウェアを用いて、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を規定するように指令するプログラムを含む。機械読み取り可能保存媒体の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムに図９、１１、１２、１３、１４または１５に記載された手法を実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。別の好ましい実施形態は、細胞スクリーニングシステムら、特異的細胞構成要素およびプロセスの分布および活性を検出するための手法を実行させるための指令の組からなるプログラムを含む。最も好ましい実施形態において、細胞プロセスは、限定されるものではないが、タンパク質の核移動、細胞形態、アポトーシス、受容体内部化、およびタンパク質のプロアーゼ−誘導移動を含む。
【００９２】
好ましい実施形態において、細胞スクリーニングシステムを用いて、種々の細胞プロセスを修飾する化合物を同定する。細胞をテスト化合物と接触させ、特定の細胞プロセスに対するテスト化合物の効果を分析することができる。別の方法として、細胞をテスト化合物および特定の細胞プロセスを修飾する既知の剤と接触させて、テスト化合物が既知の剤の効果を阻害または増強するかを測定することができる。このように、この特徴に係る方法を用いて、特定の細胞応答を増加または減少させるテスト化合物を同定し、ならびに特定の細胞応答を増加または減少させる他の剤の能力に影響するテスト化合物を同定することができる。
【００９３】
別の実施例において、高スループットモードで低分解能でこの方法を用いて細胞を含有する位置が分析させ、細胞を含有する位置のサブセットのみが高含有量モードで分析させて、分析すべき細胞の細胞下区画においてルミネセンス標識受容体分子からのルミネセンスシグナルが得られる。
【００９４】
以下の実施の形態は説明目的のためだけを意図し、添付の特許請求の範囲で規定される本発明の範囲を限定されるものと解釈されるべきではない。
【００９５】
以下の実施の形態で言及される種々の化学化合物、試薬、色素、および抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓおよびクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）等の入手源から商業的に入手可能である。
【００９６】
実施形態１  細胞質から核への移動スクリーニング
ａ．転写因子
いくつかの遺伝子の転写の調節は、細胞質における転写因子の活性化を含み、その結果、その因子は核に移動され、そこでそれは特定の遺伝子または複数遺伝子の転写を開始することができる。転写因子分布のこの変化は、特定の遺伝子または遺伝子の群の転写を阻害または誘導する化合物を検出する細胞ベースのスクリーニングシステムのためのスクリーニングの基礎である。スクリーニングの一般的説明をし、続いて具体的な例を説明する。
【００９７】
転写因子の分布は、核をヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ３３４２３等のＤＮＡ特異的フルオロフォアで、および転写因子を特異的蛍光抗体で標識することによって測定される。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）標識核に自動焦点合わせした後、細胞ベースのスクリーニングシステムで核のイメージを取得し、それを用いて、上述したように、いくつかの任意閾値設定方法のうちの１つによってマスクを作成する。このマスクによって規定される領域の形態学的記述子を使用者規定のパラメータと比較し、有効核マスクを同定し、転写因子分布を抽出するための以下の方法で用いる。各有効核マスクを腐食させて、わずかにより小さな領域を規定する。次いで、元の核マスクを２つの方法で膨張させて、核の周りのリング形状領域を規定し、これは、細胞質領域を表す。これらの２つの領域の各々における平均抗体蛍光を測定し、これらの平均の間の差異をＮｕｃＣｙｔ差異として規定する。核移動を測定するための２つの例を以下で記載し、図１０Ａ−図１０Ｊに示す。図１０Ａは、青色フルオロフォアで標識したその核２００および緑色フルオロフォアで標識した細胞質２０１における転写因子を備えた未刺激細胞を示す。図１０Ｂは細胞ベースのスクリーニングシステムによって誘導された核マスク２０２を示す。図１０Ｃは緑色波長でイメージした未刺激細胞の細胞質２０３を示す。図１０Ｄは、核マスク２０２を一旦腐食させて（還元して）、最小細胞質分布を持つ核サンプリング領域２０４を規定することを示す。核境界２０２を数回膨張（拡大）して、２−３画素の広さであるリングを形成し、これを用いて、同一細胞につき細胞質サンプリング領域２０５を規定する。図１０Ｅは、さらに側面図を示し、これは、核サンプリング領域２０４および細胞質サンプリング領域２０５を示す。これらの２つのサンプリング領域を用い、細胞間ベースで細胞ベーススクリーニングシステムによって、核移動についてのデータを自動的に分析することができる。図１０Ｆ−Ｊは刺激した細胞における核移動を測定するための戦略を示す。図１０Ｆは、青色フルオロフォアで標識した核２０６および緑色フルオロフォアで標識した細胞質２０７における転写因子を備えた刺激細胞を示す。図１０Ｇにおける核マスク２０８は、細胞ベースのスクリーニングシステムによって駆動される。図１１は、緑色波長でイメージした刺激細胞の細胞質２０９を示す。図１０Ｉは刺激細胞の核サンプリング領域２１１および細胞質サンプリング領域２１２を示す。図１０Ｉは、さらに、側面図を示し、これは核サンプリング領域２１１および細胞質２１１を示す。
【００９８】
この方法の具体的適用を用いて、スクリーニングとしてこの方法を有効化した。ヒト細胞系を９６ウェルマイクロタイタープレートで平板培養した。ウェルのいくつかの列をＩＬ−１（ＭＦ−ＫＢ転写因子の既知の誘導因子）で力価測定した。次いで、細胞を固定し、転写因子に対するフルオレセイン標識抗体、およびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３４２３での標準的な方法によって染色した。細胞ベースのスクリーニングシステムを用いて、このプレートからのイメージを取得し分析し、ＮｕｃＣｙｔ差異は、図１６に示すように、ウェルに添加されたアゴニストの量と強く相関することが見出された。第２の実験において、ＩＬ−１、ＩＬ−１ＲＡに対する受容体に対するアンタゴニストをＩＬ−１αの存在下で力価測定し、ＩＬ−１αによって誘導された移動を徐々に阻害した。ＮｕｃＣｙｔ差異は、図１７に示すように、移動のこの阻害を強く相関することが見出された。
【００９９】
さらなる実験は、ＮｕｃＣｙｔ差異、ならびにＮｕｃＣｙｔ比率が、広い範囲の細胞密度および試薬濃度にわたって合致する結果を与え、従って、これを日常的に用いて特異的核移動活性のための化合物ライブラリをスクリーニングすることができるのを示した。さらに、同一方法は、他の転写因子、またはＧＦＰ−転写因子キメラ、あるいは生細胞または固定細胞に導入された蛍光標識転写因子に対する抗体で用いて、転写因子活性の調節に対する効果につきスクリーニングすることができる。
【０１００】
図１８は、実施の形態１に従って得られたデータのＰＣ画面上での代表的なディスプレイである。グラフ１  １８０は、核サンプリング領域および細胞質サンプリング領域における平均抗体蛍光の間の差異、ＮｕｃＣｙｔ差異対ウェル番号をプロットする。グラフ２  １８１は、核サンプリング領域における抗体の平均蛍光、ＮＰ１平均、対ウェル番号をプロットする。グラフ３  １８２は、細胞質サンプリング領域における平均抗体蛍光、ＬＩＰ１平均、対ウェル番号をプロットする。ソフトウェアは各細胞からのデータの表示を行わせる。例えば、図１８はスクリーンディスプレイ１８３、核イメージ１８４、および細胞番号２６についての蛍光抗体イメージ１８５を示す。
【０１０１】
図１８のグラフ１  １８０において言及したＮｕｃＣｙｔ差異は、平均細胞質プローブ（蛍光レポータ分子）強度および平均核プローブ（蛍光レポータ分子）強度の間の差異である。図１８のグラフ２  １８１で言及したＮＰ１平均は、核サンプリング領域内の細胞質プローブ（蛍光レポータ分子）平均である。図１８のグラフ３  １８２で言及したＬ１Ｐ１平均は、細胞質サンプリング領域内の平均プローブ（蛍光レポータ分子）強度である。
【０１０２】
当業者であれば、本発明のこの特徴は、活性化に際して細胞質から核に移動する他の転写因子を用いて実施できることを理解するであろう。別の特別の例において、細胞内のその空間的位置を規定することによって、ｃ−ｆｏｓ転写因子の活性化を評価した。活性化されたｃ−ｆｏｓは核内のみに見出され、他方、不活化ｃ−ｆｏｓは細胞質内に存在する。
【０１０３】
３Ｔ３細胞を、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ９６−ウェルプレート中、ウェル当たり５０００−１００００細胞で平板培養した。細胞を付着させ、一晩増殖した。細胞を１００μｌの無血清培地で２回濯ぎ、無血清ＭＥＭ培養基中で２４−３０時間インキュベートし、次いで、１−５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度にて無血清培地に直接希釈した血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で平均２０分間刺激した。
【０１０４】
刺激に続き、１Ｘハンクスの緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）中の３．７％ホルムアルデヒドで２０分間細胞を固定した。固定の後、細胞をＨＢＳＳで洗浄して、残存する固定剤を除去し、ＨＢＳＳ中の０．５％トリトンＸ−１００溶液で９０秒間浸透させ、ＨＢＳＳで２回洗浄して残存する洗剤を除去した。次いで、ＨＢＳＳ中のＢＳＡの０．５％溶液で細胞を１５分間ブロックし、さらに、希釈された一次抗体溶液の希釈に先立ってＨＢＳＳで洗浄した。
【０１０５】
ｃ−ｆｏｓウサギポリクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＰＣ０５）をＨＢＳＳ中に１：５０希釈し、５０μｌの希釈を各ウェルに適用した。室温にて、一次抗体の存在下で細胞を１時間インキュベートし、次いで、ＡＬＥＸＡＴＭ４８８（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））にコンジュゲートしたヤギ抗−ウサギ二次抗体を含む光密容器中、室温にて１時間インキュベートし、ＨＢＳＳ中の１００μｇ／ｍｌストックから１：５００希釈した。次いで、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ＤＮＡ色素（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を製造業者のストック溶液の１：１００希釈にて添加した（１０ｍｇ／ｍｌ）。次いで、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、本発明の細胞スクリーニングシステムでの分析に先立ってプレートを密封した。これらの実験からのデータは本発明の方法を用いて、細胞内のその空間的位置を規定することによってｃ−ｆｏｓの転写活性化を測定することができるのを示した。
【０１０６】
以下の方法をｃ−ｆｏｓ活性化の検出に適用するが、それを、活性化に際して細胞質から核に移動するいずれの転写因子の分析にも適用できることを当業者は認識するであろう。そのような転写因子の例は、限定されるものではないが、ｆｏｓおよびｊｕｎホモログ、ＮＦ−ＫＢ（Ｂ細胞からの核因子κ）、ＮＦＡＴ（活性化されたＴ−リンパ球の核因子）、およびＳＴＡＴ（転写のシグナルトランスデューサおよびアクチベータ）因子を含む（例えば、Ｓｔｒｅｈｌｏｗ，Ｉ．およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｃ．１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８０４９−２８０５６、Ｃｈｏｗら，１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７８：１６３８−１６４１、Ｄｉｎｇら，１９９８  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２８８９７−２８９０５、Ｂａｌｄｗｉｎ，１９９６．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：６４９−８３、Ｋｕｏ，Ｃ．Ｔ．，およびＪ．Ｍ．Ｌｅｉｄｅｎ．１９９９．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１４９−８７、ラオ（Ｒａｏ）ら，１９９７．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７０７−４７、マスダ（Ｍａｓｕｄａ）ら，１９９８．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．１０：５９９−６１１、Ｈｏｅｙ，Ｔ．，およびＵ．Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ．１９９８．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．８：５８２−７、リュー（Ｌｉｕ）ら，１９９８．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２７１−８参照）。
【０１０７】
このように、本発明のこの態様において、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、ルミネセンス標識転写因子の分布を、前述した開示のもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間にて測定する。ルミネセンス標識転写因子は、テスト化合物と細胞とを接触させる前に、それと共に、またはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができる。
【０１０８】
例えば、転写因子は、トランスフェクトされたインジケータ細胞によってルミネセンス標識タンパク質キメラとして発現することができる。別の方法として、ルミネセンス標識転写因子を、上述したように発現させ、単離し、インジケータ細胞にバルク−ロードすることができるか、あるいは転写因子を単離後にルミネセンス標識することができる。さらなる代替として、転写因子は、インジケータ細胞によって発現され、これを引き続いて転写因子を検出する抗体等の蛍光標識と接触させる。
【０１０９】
さらなる態様において、注目する転写因子を特異的に認識する抗体、上述した方法を実施するために抗体を用いる指令を含む、転写因子活性化を分析するためのキットを提供することである。好ましい実施形態において、転写因子−特異的抗体、転写因子抗体を検出する二次抗体をルミネセンス標識する。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、注目する転写因子を発現する細胞を含有し、および／またはこのキットは、限定されるものではないが、共にｆｏｓ活性化を修飾する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血清、および共にＮＦ−ＫＢ活性化を修飾するインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含めた注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を含有する。
【０１１０】
別の実施形態において、このキットは、活性化に際して細胞質から核に移動する注目する転写因子をコードする核酸を含む組換え発現ベクターおよび注目する細胞において転写因子活性化を修飾する化合物を同定するのに発現ベクターを用いる指令を含む。別の方法として、このキットは精製されたルミネセンス標識転写因子を含有する。好ましい実施形態において、転写因子は、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、またはその突然変異体もしくは断片を含めた、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現される。種々の好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、注目する転写因子に特異的に結合する抗体または断片、および／または（上述した）注目する転写因子の活性化を修飾することが知られている化合物を含む。
【０１１１】
ｂ．プロテインキナーゼ
また、細胞質から核へのスクリーニング方法を用いて、細胞質に不活性状態で存在し、活性化に際して核に輸送されるか、あるいはリン酸化に際して細胞質から核に移動する基質をリン酸化するいずれのプロテインキナーゼの活性化も分析することができる。適当なプロテインキナーゼの例は、限定されるものではないが、細胞外シグナル−調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、Ｆｏｓ調節プロテインキナーゼ（ＦＲＫ）、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）を含む。（例えば、ハル（Ｈａｌｌ）ら，１９９９．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：３７６−８３、ハン（Ｈａｎ）ら，１９９５．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２６５：２２４−２２７、Ｊａａｒｏら，１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：３７４２−３７４７、テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０８−３１８、Ｚｈａｏ，Ｑ．，およびＦ．Ｓ．リー（Ｌｅｅ）．１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：８３５５−８、Ｐａｏｌｉｌｌｏｅｔら，１９９９．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：６５４６−５２、Ｃｏｓｏら，１９９５．Ｃｅｌｌ  ８１：１１３７−１１４６、Ｔｉｂｂｌｅｓ，Ｌ．Ａ．およびＪ．Ｒ．Ｗｏｏｄｇｅｔｔ．１９９９．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５５：１２３０−５４、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｈ．Ｊ．およびＭ．Ｊ．Ｗｅｂｅｒ．１９９９．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：２４３５−４４参照）。
【０１１２】
別の方法として、プロテインキナーゼ活性は、注目するプロテインキナーゼによってリン酸化された後、細胞質から核へのルミネセンス標識プロテインキナーゼ基質の移動をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態において、この基質は非リン酸化されており、リン酸化に先立っては細胞質のものであり、プロテインキナーゼによるリン酸化に際して核へ移動する。この実施形態では、プロテインキナーゼそれ自体が細胞質から核へ移動するという用件はない。そのような基質（および対応するプロテインキナーゼ）の例は、限定されるものではないが、ｃ−ｊｕｎ（ＪＮＫ基質）、ｆｏｓ（ＦＲＫ基質）、およびｐ３８（ｐ３８ＭＡＰＫ基質）を含む。
【０１１３】
このように、これらの実施形態においては、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質の分布は、前述で開示したもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定される。ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、細胞とテスト化合物とを接触させる前、それと共にまたはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができる。例えば、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、トランスフェクトされたインジケータ細胞によってルミネセンス標識タンパク質キメラとして発現され得る。別の方法として、ルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、上述したように、発現され、単離され、インジケータ細胞にバルク−ロードできるか、あるいはプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は単離後にルミネセンス標識することができる。さらなる代替として、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質はインジケータ細胞によって発現され、これは引き続いてプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質を検出する標識抗体等のルミネセンス標識と接触させる。
【０１１４】
さらなる実施形態において、プロテインキナーゼ活性は、プロテインキナーゼ基質のリン酸化状態（すなわち：リン酸化されているまたはリン酸化されていない）をモニターすることによってアッセイされる。この実施形態において、活性化に際して、プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質が細胞質から核へ移動する要件はない。好ましい実施形態において、リン酸化状態は、注目するプロテインキナーゼ基質のリン酸化形態にのみ結合する抗体と細胞とを接触させることによってモニターされる（例えば、米国特許第５，５９９，６８１号に開示）。
【０１１５】
別の好ましい実施形態において、リン酸化のバイオセンサーが用いられる。例えば、ルミネセンス標識タンパク質またはその断片は、（ａ）注目するプロテインキナーゼによって認識されるリン酸化部位、および（ｂ）リン酸化によってマスク解除される核局所化シグナルを含有するように作成されたタンパク質に融合させることができる。このように、そのようなバイオセンサーはリン酸化に際して核に移動し、その移動はプロテインキナーゼ活性化の尺度として用いることができる。
【０１１６】
別の態様において、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ基質、または注目するプロテインキナーゼ基質のリン酸化形態に特異的に結合する一次抗体および注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物を同定する一次抗体を用いる指令を含むプロテインキナーゼ活性化を分析するためのキットを提供することである。好ましい実施形態において、一次抗体、またはこの一次抗体を検出する二次抗体はルミネセンス標識される。他の好ましい実施形態において、このキットは、さらに、注目するプロテインキナーゼを発現する細胞、および／または限定されるものではないが、ジブチリルｃＡＭＰ（修飾されたＰＫＡ）、フォルスコリン（ＰＫＡ）、およびアニソマイシン（ｐ３８ＭＡＰＫ）を含めた、注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化合物を含む。
【０１１７】
別の方法として、このキットは、活性化に際して、細胞質から核に移動する注目するプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質をコードする発現ベクター、および注目する細胞においてプロテインキナーゼ活性化を修飾する化合物を同定するために発現ベクターを用いる指令を含む。別の方法として、このキットは、精製されたルミネセンス標識プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質を含有する。好ましい実施形態において、注目するプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質は、蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現される。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、さらに、発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、注目するプロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼ基質に特異的に結合する抗体またはその断片、および／または（上述した）注目するプロテインキナーゼの活性化を修飾することが知られている化合物を含む。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、細胞スクリーニングシステムに転写因子またはプロテインキナーゼ活性化の分析につき開示した方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、細胞スクリーニングシステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適した段階を備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラに向けるための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するためのコンピュータ手段を含む。
【０１１９】
実施形態２  細胞形態を修飾する化合物についての自動スクリーニング
細胞サイズの変化は、肥大、細胞付着および展延、分化、成長および分裂、壊死およびプログラムされた細胞死滅、細胞移動度、形態形成、チューブ形成、およびコロニー形成等の多数の細胞条件に関連する。
【０１２０】
例えば、細胞肥大は遺伝子発現の改変のカスケードと関連づけられており、カバーグラス上で増殖する接着性細胞で明瞭に見ることができる細胞サイズの変化によって細胞培養で特徴づけることができる。
【０１２１】
また、細胞サイズを測定して、接着性細胞の付着および展延を決定することもできる。細胞展延は、基質リガンドへの細胞表面受容体の選択的結合およびシグナリング経路の細胞骨格への引き続いての活性化の結果である。基質分子に対する細胞の付着および展延は、癌細胞の転移、炎症反応の間の白血球活性化、創傷治癒の間のケラチノサイトの移動、および血管形成の間の内皮細胞の移動のための重要な工程である。これらの表面受容体、シグナリング経路、または細胞骨格に影響する化合物は細胞展延に影響し、細胞サイズを測定することによってスクリーニングすることができる。
【０１２２】
全細胞面積は、ＤＮＡ標識と組み合わせて、細胞骨格マーカ、サイトゾル容量マーカ、細胞表面マーカを用いて全細胞体または細胞質を標識することによってモニターすることができる。そのような標識（多くはモレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯｒｅＧｏｎ）およびシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手可能）の例は以下のものを含む。
【０１２３】
【表１】
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これらの種々の剤での細胞染色のためのプロトコルは当業者によく知られている。細胞を生きたまま、または固定後に染色し、細胞面積を測定することができる。例えば、ＤｉＩＣ１６で染色した生細胞は均一に標識された原形質膜を有し、細胞の突出した断面積は色素の蛍光強度によってバックグラウンドから均一に区別される。ＣＭＦＤＡ等のサイトゾル染料で染色した生細胞は、細胞の厚みに比例する蛍光強度を生じる。細胞標識は細胞の薄い領域では薄暗いが、全細胞面積はバックグラウンドから区別することができる。固定細胞は、重合されたアクチンを標識するＡＬＥＸＡＴＭ４８８ファロイジン等の細胞骨格マーカで染色することができる。ファロイジンは細胞質を均一に染色しないが、依然として、全細胞面積をバックグラウンドから区別する。
【０１２４】
細胞肥大
以下の戦略を用い、細胞肥大を分析するスクリーニングを実行する。初代ラット筋細胞を９６ウェルプレート中で培養し、種々の化合物で処理し、次いで、固定し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）等のＤＮＡ標識と組み合わせて、細胞表面マーカまたはローダミン−ファロイジン等の細胞骨格のための蛍光マーカに対する抗体等の、細胞膜または細胞質、または細胞骨格のための蛍光マーカで標識する。
【０１２５】
ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）標識核に焦点を合わせた後、２つのイメージを取得し、１つはヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）標識核のイメージであり、１つの蛍光細胞質イメージである。この核は、閾値設定してマスクを形成させ、次いで、マスクの形態学的記述子を使用者規定記述子値の組と比較することによって同定される。次いで、各非核イメージ（または「細胞質イメージ」）を別々に処理する。元の細胞質イメージは閾値設定でき、細胞質マスクイメージを生じる。細胞を含有する局所領域が核のまわりに定義される。次いで、それらの領域における細胞の制限は、蛍光抗体イメージ中の同一領域に対する局所的動的閾値操作によって規定することができる。腐食および膨張の系列を用いて、わずかに触れる細胞を分離し、形態学的記述子の第２の組を用いて単細胞を同定する。個々の細胞の面積を表にして、正常および肥大細胞からのサイズデータとの比較のために細胞サイズの分布を規定する。
【０１２６】
（平均細胞質面積／細胞として測定された）全９６−ウェルプレートからの応答は上述した方法によって分析され、結果は、このアッセイがウェル間、プレート間、および日間ベースで同一のものを実行することを示した（最大シグナルにつき１５％ｃｏｖ）。このデータは毎日について非常に良好な相関を示し、プレート中のウェル位置による変動はないことを示した。
【０１２７】
以下のものは全て視野につき計算できる。凝集体全核面積は核マスクにおける非ゼロ画素の数である。平均全核面積は凝集体全核面積を核の全数で割ったものである。各細胞質イメージでは、いくつかの値を計算することができる。これらは全細胞質面積であり、これは細胞質マスクにおける非ゼロ画素のカウントである。凝集体細胞質強度は細胞質マスクにおける全ての画素の強度の合計である。核当たりの細胞質面積は全細胞質面積を全核カウントで割ったものである。核当たりの細胞質強度は、凝集体細胞質強度を全核カウントで割ったものである。平均細胞質強度は、凝集体細胞質強度を細胞質面積で割ったものである。細胞質核比率は、全細胞質面積を全核面積で割ったものである。
【０１２８】
加えて、主要な筋肉タンパク質等の他の細胞タンパク質に対する１以上の蛍光抗体を含めることができる。これらのさらなる標識タンパク質のイメージを取得し、後のレビューのために、このイメージに関して保存して、肥大細胞中のこれらのタンパク質の分布および形態の異常を同定することができる。マルチパラメータスクリーニングのこの例は、細胞肥大およびアクチンもしくはミオシン分布の変化の同時分析を可能とする。
【０１２９】
当業者であれば、この例は筋細胞を分析するが、この特徴に係る方法は全ての細胞型における肥大または一般的な形態学的変化を分析するのに適用できることを認識するであろう。
【０１３０】
前立腺癌についての細胞形態アッセイ
細胞展延は、基質付着リガンドに対する細胞表面受容体の応答の尺度である。展延はリガンドの濃度に、または受容体−リガンド機能を低下させる化合物の濃度に比例する。選択的な細胞−基質付着の１つの例は、細胞外マトリックスタンパク質コラーゲンに対する前立腺癌細胞接着である。前立腺癌細胞はコラーゲンに対する選択的接着を介して骨に転移する。
【０１３１】
前立腺癌細胞の転移に干渉する化合物を以下のようにスクリーニングした。ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を適当な刺激体を含む培地中で培養し、それをコラーゲン被覆９６プレートに継代する。リガンドの濃度は変化させることができ、あるいは細胞展延の阻害剤をウェルに添加することができる。展延に影響し得る化合物の例は、インテグリン−またはプロテオグリカン−ブロッキング抗体、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤を含めたシグナリング阻害剤、およびサイトカラシンＤ等の細胞骨格阻害剤等の受容体アンタゴニストである。２時間後、細胞を固定し、細胞肥大についてのプロトコルのように、ＡＬＥＸＡＴＭ４８８ファロイジン（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））およびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２で染色する。細胞質染色によって測定されたこれらの条件下での細胞のサイズは、バックグラウンドレベルを超えて区別できる。視野当たりの細胞の数は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ＤＮＡ色素で染色した核の数を測定することによって決定される。細胞当たりの面積は、細胞質面積（ファロイジンイメージ）を細胞数（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）イメージ）で割ることによって見出される。細胞のサイズはリガンド−受容体の機能に比例する。この面積はリガンド濃度によって、および細胞の得られた結果によって決定されるので、薬物の効力ならびに薬物能力はこの細胞ベースのアッセイによって決定することができる。他の測定は細胞肥大について上述したようになすことができる。
【０１３２】
細胞形態を分析するための方法は、組み合わせた高スループット−高含有量スクリーニングで用いることができる。１つの例において、高スループットモードは蛍光ファロイジン強度の増加につき全ウェルを操作する。閾値は、核（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）および細胞（ファロイジン）が高含有量モードで測定されるものを超えるように設定される。別の例において、環境バイオセンサー（その例は、限定されるものではないが、カルシウムおよびｐＨ変化に感受性のバイオセンサーを含む）を細胞に添加し、この細胞を化合物と接触させる。細胞を高スループットモードで走査し、バイオセンサーのルミネセンスについての所定の閾値を超えるウェルを高含有量モードで走査する。
【０１３３】
さらなる態様において、（上述したもののように）細胞の細胞質、膜または細胞骨格を特異的に標識するのに用いることができるルミネセンス化合物、およびこの方法に従って細胞形態の変化を誘導または阻害するテスト刺激物を同定するために蛍光化合物を用いる指令を含む細胞形態を分析するためのキットを提供することである。好ましい実施形態において、このキットは、さらに、細胞核についての蛍光マーカを含む。さらなる好ましい実施形態において、このキットは、限定されるものではないが、インテグリン−もしくはプロテオグリカン−ブロッキング抗体、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ阻害剤を含めたシグナリング阻害剤、およびサイトカラシンＤ等の細胞骨格阻害剤を含めた細胞形態を修飾することが知られている少なくとも１つの化合物を含む。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、細胞スクリーニングシステムに細胞形態を分析するための開示方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、この細胞スクリーニングシステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適合した段階を備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラに向けるための手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するためのコンピュータ手段を含む。
【０１３５】
実施形態３  デュアルモードの高スループットおよび高含有量スクリーニング  以下の実施例は、原形質膜から基部側核位置へのＧＰＣＲの移動によって検出されるＧ−プロテイン結合受容体（ＧＰＣＲ）の活性化のためのスクリーニングである。本実施例は、どのようにして、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムにおいて高スループットスクリーニングを高含有量スクリーニングと結合させることができるかを示す。
【０１３６】
Ｄ−プロテイン結合受容体は７つの膜貫通ドメイン細胞表面受容体の大きなクラスである。これらの受容体についてのリガンドは細胞中で二次シグナルのカスケードを刺激し、これは、限定されるものではないが、Ｃａ＋＋トランジエント、環状ＡＭＰ生産、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびリン酸化を含むことができる。数秒から数分に起こる、これらのシグナルの各々は迅速であるが、一般的でもある。例えば、多くの異なるＧＰＣＲは活性化されると二次Ｃａ＋＋シグナルを生じる。また、ＧＰＣＲの刺激の結果、ＧＰＣＲが、細胞表面膜から内部の基部側核区画に輸送される。この内部化は、上述した二次シグナルよりも特定の受容体の活性化のかなりより受容体−特異的なインジケータである。
【０１３７】
図１９はＧＰＣＲの活性化についてのデュアルモードスクリーニングを示す。ＧＰＣＲと青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）との安定なキメラを運ぶ細胞には、Ｆｌｕｏ−３のアセトキシメチルエステル形態（エステルの加水分解によって生細胞に取得される細胞浸透性カルシウムインジケータ（緑色蛍光））がロードされるであろう。次いで、それらをマイクロタイタープレート６０１のウェルに沈積されるであろう。次いで、このウェルを流体送達システムを用いてテスト化合物のアレイで処理し、全マイクロタイタープレートのＦｌｕｏ−３イメージの短い系列が取得され、カルシウム応答を提示するウェルを分析する（すなわち、高スループットモード）。このイメージは、図１９においてマイクロタイタープレート６０１の例のように見える。この例におけるウェルＣ４およびＥ９等の少数のウェルは、受容体の刺激に際して放出されるＣａ＋＋のためより明るく蛍光を発するであろう。次いで、応答６０２を誘導した化合物を含有するウェルの位置をＨＣＳプログラムに移し、核周辺領域へのＧＰＣＲ移動の焦点となる青色蛍光の詳細な細胞間分析のために光学をスイッチする。図１９の底部は、高分解能細胞データの分析の２つの可能な結果を示す。このカメラはウェル領域６０３のサブ領域６０４をイメージし、蛍光細胞６０５のイメージを生じる。ウェルＣ４において、細胞中の蛍光の均一な分布は、受容体が内部化されていないことを示し、これは観察されたＣａ＋＋応答が細胞中のいくつかの他のシグナリングシステムの刺激の結果であったことを意味する。他方、ウェルＥ９  ６０６中の細胞は、核周辺領域の受容体の濃度を明瞭に示し、これは受容体の十分な活性化を明瞭に示す。少数のヒットウェルのみが高分解能で分析される必要があるため、デュアルモードシステムの全スループットはかなり高く、高スループットシステム単独と匹敵する。
【０１３８】
実施形態４  動的高含有量スクリーニング
以下は受容体の内部化の動力学を測定するためのスクリーニングの例である。上述したように、ＧＰＣＲの刺激の結果、約１５分の時間経過で受容体が内部化される。内部化されたまたはそうでないとして終点を単に検出するのは、ＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストとしての化合物の効力を否定するのに十分ではないであろう。しかしながら、５分間隔での３時点は、測定の時間経過の間の効力についての情報を提供するのみならず、このデータのより長時間への外挿を可能とする。このアッセイを行うには、サブ領域を２つの列として規定し、サンプリング間隔を５分とし、時点３の全数とする。次いで、２つの列を走査し、次いで、剤を二列に添加し、時間＝０参照を確立することによってシステムを開始させる。試薬の添加の後に、システムは二列のサブ領域を再び走査し、最初の時点のデータを取得する。このプロセスはサブ領域の開始までの戻り走査を含めて約２５０秒必要とするので、このシステムは第２の時点の取得を開始するのに５０秒待つであろう。２以上のサイクルが３地点を生じ、システムは第２の二列サブ領域に移動するであろう。最後の２つの二列サブ領域を走査してプレート上の全てのウェルを終了し、その結果、全プレートにわたって各ウェルについて４時点が得られる。ウェルについての時点は時間＝０に対してわずかに相殺されるが、時点の間隔は必要な５分に非常に近く、現実の取得時間および結果は固定された細胞スクリーニングよりもかなり正確に記録される。
【０１３９】
実施形態５  ヒトグルココルチコイド受容体移動の高含有量スクリーニング
ＨＣＳの１つのクラスは、細胞内構成要素の薬物−誘導動的再分布を含む。ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ（細胞の複雑な環境応答機構における単一「センサー」）は、細胞に拡散したステロイド分子に結合する。リガンド−受容体複合体は核に移動し、そこで転写活性化が起こる（Ｈｔｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４８４５，１９９６）。
【０１４０】
一般に、それらの活性は鍵となる細胞内シグナリング経路の先端にあるので、ホルモン受容体は優れた薬物標的である。従って、ｈＧＲ移動の高含有量スクリーニングはインビトロリガンド−受容体結合アッセイよりも優れた区別された利点を有する。本発明の細胞スクリーニングシステムにおける蛍光の２以上までのチャネルの利用性は、スクリーニングが、他の受容体、他の区別される標的または他の細胞プロセス等の、２つのさらなるパラメータを平行して含有するのを可能とする。
【０１４１】
プラスミド構築体。緑色蛍光タンパク質−ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＦＰ−ｈＧＲ）キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドは、ＧＦＰ突然変異体を用いて調製した（Ｐａｌｍら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：３６１（１９９７））。この構築体を用いてヒト頸癌細胞系（ＨｅＬａ）をトランスフェクトした。
【０１４２】
細胞の調製およびトランスフェクション。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）はトリプシン処理し、トランスフェクションに１２から２４時間先立って、５％木炭／デキストラン−処理胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含有するＤＭＥＭを用いて平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈殿によって（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）によって、またはリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で行った。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、トランスフェクションに先立って、５％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培地を置き換えた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にてリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共に４から５時間インキュベートし、ＤＭＥＭで３から４回洗浄して沈殿を除去し、続いて、Ｃ−ＤＭＥＭを添加した。
【０１４３】
製造業者の指示に従って、抗生物質を含まない無血清ＤＭＥＭ中でリポフェクタミントランスフェクションを行った（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ＤＮＡ−リポソーム複合体での２から３時間のインキュベーションに続き、培地を取り出し、Ｃ−ＤＭＥＭで置き換えた。９６−ウェルマイクロタイタープレート中の全てのトランスフェクトされた細胞を、薬物処理に先立って、３３℃および５％ＣＯ２にて２４時間から４８時間インキュベートした。実験は、ＨｅＬａ細胞中にて一過的に発現された受容体で行った。
【０１４４】
ＧＦＰ−ｈＧＲ移動のデキサメタゾン誘導。受容体−リガンド移動動的データを得るために、トランスフェクトされた細胞の核を、まず、３３℃および５％ＣＯ２にて、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）  ３３３４２（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））で２０分間標識した。細胞をハンクスの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）中で１回洗浄し、１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳと共にＨＢＳＳ中の１００ｎＭデキサメタゾンを添加した。固定時点デキサメタゾン滴定データを得るために、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞をまずＤＭＥＭで洗浄し、次いで、１％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の０から１０００ｎＭデキサメタゾンの存在下で、３３℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。細胞を生きたまま分析するか、あるいはそれをＨＢＳＳで濯ぎ、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２で染色し、分析前に洗浄した。細胞内ＧＦＰ−ｈＧＲルミネセンスシグナルはこの固定手法によっては減少しなかった。
【０１４５】
イメージの取得および分析。動的データは、デキサメタゾンの添加後、１分間間隔で３０分間、生細胞の視野から蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ｈＧＲおよびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２−標識核）を取得することによって収集した。同様に、イメージ対は、デキサメタゾンの添加１時間後に、固定された時点のスクリーニングプレートの各ウェルから得た。両方の場合において、各地点で得られたイメージ対を用いて、各細胞中の核および細胞質領域を規定した。ＧＦＰ−ｈＧＲの移動は、核におけるＧＦＰ−ｈＧＲの積分した蛍光強度を細胞質中のキメラの積分した蛍光強度で割ることによってあるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として計算した。固定時点スクリーニングにおいて、テストしたデキサメタゾンの核濃度において少なくとも２００細胞から得られたデータから計算した。従って、細胞質から核へのＧＦＰ−ｈＧＲの薬物−誘導移動は移動比の増加と相関した。
【０１４６】
結果。図２０は、ヒトグルココルチコイドの薬物に誘導された細胞質２５３から核２５２への移動を概略的に表示する。この概略図の上方対は、デキサメタゾンでの刺激の前２５０（Ａ）およびこの刺激の後２５１（Ｂ）の細胞内のＧＦＰ−ｈＧＲの局所化を示す。これらの実験条件下で、薬物は細胞質ＧＦＰ−ｈＧＲの大部分を誘導して、核に移動させる。この再分布は、処理された２５５および未処理の２５４細胞における細胞質および核蛍光の積分強度比率を決定することによって定量される。蛍光ミクログラフの下方対は、処理の前２５４および後２５５における、単一細胞中のＧＦＰ−ｈＧＲの同定再分布を示す。数１００から数１０００の細胞を含有するウェルでＨＣＳを行い、移動は、ＧＦＰ蛍光を呈する視野中で各細胞につき定量した。安定にトランスフェクトされた細胞系の使用は最も首尾一貫して標識された細胞を生じるが、一過性トランスフェクションによって誘導された異なるレベルのＧＦＰ−ｈＧＲ発現は、本発明の細胞スクリーニングシステムによる分析に干渉しなかった。
【０１４７】
スクリーニングを実行するためには、この細胞スクリーニングシステムはプレートの各ウェルを走査し、各々において細胞の集団をイメージし、個々に細胞を分析する。ここに、２つのチャネルの蛍光を用いて、各細胞内でＧＦＰ−ｈＧＲの細胞質および核分布を規定する。図２１には、ＧＦＰ−ｈＧＲスクリーニングの終わり近くにおける細胞スクリーニングシステムのグラフによるユーザインターフェースが描かれる。ユーザインターフェースは、システムの平行データ収集および分析能力を示す。「核」２６１および「ＧＦＰ−ｈＧＲ」２６２と記されたウインドウは、単一視野で得られ分析した蛍光イメージの対を示す。「色オーバーレイ」２６０と記されたウインドウは、このイメージを偽着色し、それらを一緒にすることによって形成され、従って、使用者は細胞変化を直ちに同定することができる。「保存された物体領域」ウインドウ２６５内では、各分析された細胞およびその隣の細胞を検出するイメージが、それが検索されるにつれて提示される。さらに、ＨＣＳデータが収集されるにつれて、それは分析され、ＧＦＰ−ｈＧＲ移動のこの場合には、直後の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーン２６７の下方ウインドウに描かれた９６ウェルプレートは、いずれのウェルが使用者−規定のスクリーニング基準の組に合致するかを示す。例えば、白色ウェル２６９は、薬物−誘導移動が５０％の所定の閾値を超えたことを示す。他方、黒色ウェル２７０は、テストすべき薬物が１０％未満の移動を誘導したことを示す。灰色ウェル２６８は、移動値が１０％および５０％の間にある「ヒット」を示す。分析すべき９６ウェルプレート２６６上の列「Ｅ」は、ＧＦＰ−ｈＧＲ移動を活性化することが知られている薬物であるデキサメタゾンでの滴定を示す。本実施例のスクリーニングは２つの蛍光チャネルを用いたに過ぎなかった。２つのさらなるチャネル（チャネル３  ２６３および４  ２６４）は他の特異的標識、細胞プロセス、または細胞毒性の平行した分析のために複数のパラメータスクリーニングを作成するのに利用できる。
【０１４８】
新しいスクリーニングの有効化プロセスの間に強力なツールであるイメージデータベースおよび情報データベースの間にリンクがある。スクリーニングの完了において、使用者はイメージおよび計算されたデータに全てアクセスできる（図２２）。細胞スクリーニングシステムの包括的なデータ分析パッケージは、使用者が、複数のレベルにおいてＨＣＳデータを調べるのを可能とする。個々の細胞についてのスプレッドシート２７９中のイメージ２７６および詳細なデータは別々に見ることができるか、あるいは要約データをプロットすることができる。例えば、９６ウェルプレート中の各細胞についての単一パラメータの計算された結果はグラフ１  ２７５と記されたパネルに示される。このグラフ中で単一の点を選択することによって、使用者は、存在するデータベースから要求された特定の細胞についての全データ組を表示することができる。ここでは、単一細胞（細胞番号１１８、灰色線２７７）からのイメージ対２７６および詳細な蛍光および形態データが示される。大きなグラフ挿入２７８は、ＧＦＰ−ｈＧＲの移動についてのデキサメタゾンの濃度の結果を示す。各点は少なくとも２００細胞からのデータの平均である。このアッセイにおいてデキサメタゾンについての計算されたＥＣ５０は２ｎＭである。
【０１４９】
細胞スクリーニングシステムでのＨＣＳの強力な態様は、生細胞における多色蛍光および形態パラメータを用いる動的測定の能力である。時間および空間測定は、視野中の細胞の集団内の単一細胞で行うことができる。図２３は、単一視野内のいくつかの細胞におけるＧＦＰ−ｈＧＲのデキサメタゾン−誘導移動についての動的データを示す。ＧＦＰ−ｈＧＲでトランスフェクトされたヒトＨｅＬａ細胞を１００ｎＭデキサメタゾンで処理し、ＧＦＰ−ｈＧＲの移動は単一細胞の集団で経時的に測定した。グラフは、トランスフェクトされた細胞２８５、２８６、２８７および２８８および非トランスフェクト細胞２８９の応答を示す。また、これらのデータは、異なる発現レベルでの細胞を分析する能力を示す。
【０１５０】
実施形態６  薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニング
アポトーシスは、膨大な分子事象および経路を含む複雑な細胞プログラムである。このプロセスに対する薬物作用のメカニズムを理解するには、時間および空間分解にて可能な限り多くのこれらの細胞内事象を測定するのが必須である。従って、細胞試料調製をほとんど要求しないアポトーシススクリーニングは、いくつかのアポトーシス−関連パラメータの自動読み出しを提供し、理想的であろう。細胞スクリーニングシステムのためにデザインされた細胞ベースアッセイは、パクリタキセル−誘導アポトーシスの形態学的、小器官およびマクロ分子ホールマークのいくつかを同時に定量するのに用いられてきた。
【０１５１】
細胞調製。この実験で選択された細胞はマウス結合組織繊維芽細胞（Ｌ−９２９、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）および高度に侵入的な神経膠細胞腫細胞系（ＳＮＢ−１９、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２１９）（ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）ら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１：６１０，１９９５）であった。アポトーシス誘導薬物での処理の前日、３５００細胞を９６−ウェルプレートの各ウェルに入れ、湿潤５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、培養基を各ウェルから取り出し、ＤＭＳ中で作成された２０ｍＭストックからの種々の濃度のパクリタキセル（０−５０μＭ）を含有する新鮮な培地で置き換えた。これらの実験で用いたＤＭＳＯの最大濃度は０．２５％であった。次いで、細胞を上述したように２６時間インキュベートした。パクリタキセル処理時間の最後において、各ウェルに、７５０ｍＭ  Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および３μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２  ＤＮＡ−結合色素（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を含有する新鮮な培地を与え、上述したように２０分間インキュベートした。次いで、プレート上の各ウェルをＨＢＳＳで洗浄し、室温にて、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定した。ホルムアルデヒドをＨＢＳＳで洗浄し、細胞を０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００で９０秒間浸透させ、ＨＢＳＳで洗浄し、２Ｕ  ｍｌ−１  Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジン（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））と共に３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した。次いで、プレート上のウェルに２００μｌのＨＢＳＳを満たし、密封し、必要であればプレートを４℃で保存した。このようにして保存したプレートからの蛍光シグナルは調製後に少なくとも２週間安定であった。核移動アッセイにおけるように、蛍光試薬を、生細胞高含有量スクリーニングにこのアッセイを変換するようにデザインすることができる。
【０１５２】
アレイ走査（ＡｒｒａｙＳｃａｎ）システムでのイメージの取得および分析。細胞内Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ，ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２およびＢｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジンの蛍光強度は、上述したように細胞スクリーニングシステムで測定した。また、各ウェルから得られたイメージの各対からの形態データを得て、イメージ視野中の各物体（例えば、細胞および核）を検出し、そのサイズ、形状および積分強度を計算した。
【０１５３】
計算および出力。合計５０−２５０細胞をイメージ視野当たり測定した。細胞の各視野については以下の計算を行った：（１）平均核面積（μｍ２）は、視野中の全核面積を検出された核の数で割ることによって計算した。（２）平均核周囲（μｍ）は、視野中の全ての核の周囲の合計をその視野で検出された核の数で割ることによって計算した。高度に複雑なアポトーシス核は最大の核周囲値を有した。（３）平均核明るさは、核の全視野の積分強度をその視野における核の数で割ることによって計算した。核明るさの増加は増大したＤＮＡ含有量に相関した。（４）平均細胞明るさは、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ色素で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ミトコンドリア内に蓄積されるＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ色素の量はミトコンドリアポテンシャルに比例するので、平均細胞明るさの増加はミトコンドリアポテンシャルの増加と合致する。（５）平均細胞明るさは、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジン色素で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって計算した。ファロトキシンは高い親和性を持ってアクチンの重合形態に結合するので、細胞内に蓄積するＢｏｄｉｐｙ  ＦＬファラシジン色素の量はアクチン重合状態に比例する。平均細胞明るさの増加はアクチン重合の増加と合致する。
【０１５４】
結果。図２４（頂部パネル）は、Ｌ−９２９細胞の核形態でパクリタキセル誘導された変化を示す。増大させる量のパクリタキセルは核を拡大させ、断片化させた２９３（アポトーシスのホールマーク）。細胞スクリーニングシステムによって得られたこれらのおよび他のイメージの定量分析は同一図面に提示する。測定された各パラメータは、Ｌ−９２９細胞２９６がＳＮＢ−１９細胞２９７よりも低濃度のパクリタキセルに対して感受性が低かったことを示した。しかし、より高い濃度では、Ｌ−９２９細胞は測定された各パラメータにつき応答を示した。このアッセイのマルチパラメータアプローチは、薬物作用のメカニズムを解剖するのに有用である。例えば、核２９８の面積、明るさおよび断片化、ならびにアクチン重合値２９４は、ＳＮＢ−１０細胞を１０ｎＭのパクリタキセルで処理した場合に最大値に到達した（図２４、頂部および底部グラフ）。しかしながら、ミトコンドリアポテンシャル２９５は、パクリタキセルの同一濃度で最小であった（図２４、中央グラフ）。測定された全てのパラメータは、増大するパクリタキセル濃度（＞１０ｎＭ）で対照レベルに到達したという事実は、ＳＮＢ−１０細胞が、薬物の十分に高いレベルで補償的である低親和性薬物代謝またはクリアランス経路を有することを示唆する。ＳＮＢ−１９細胞２９７の薬物感受性と対照させると、Ｌ−９２９はパクリタキセル２９６に対して異なる応答を示した。これらの繊維芽細胞は、５μＭのパクリタキセル（ＳＮＢ−１９細胞よりも５００倍高い用量）にて多くのパラメータで最大応答を示した。さらに、Ｌ−９２９細胞は、テストしたパクリタキセル濃度のいずれにおいてもミトコンドリアポテンシャル２９５の鋭い減少は示さなかった。この結果は、正常および癌細胞系の間の唯一のアポトーシス経路の存在と合致する。従って、これらの結果は、比較的単純な蛍光標識プロトコルを本発明の細胞スクリーニングシステムと連結させて、プログラムされた細胞の死滅と関与する鍵となる事象の高含有量スクリーニングを得ることができることを示す。
【０１５５】
バックグラウンド
アポトーシスのメカニズムの鍵は、致死的刺激とは無関係に、死滅の結果、細胞および小器官の分解および再パッケージング、ヌクレオソームサイズの断片へのＤＮＡの切断、および炎症応答を回避する断片化細胞の巻き込みを含む同一のアポトーシス形態がもたらされるという発見であった。従って、アポトーシスは、細胞に対する急性外傷によって媒介され、その結果、潜在的に毒性および抗原性細胞成分が細胞媒体にこぼれ、炎症応答に至る壊死とは区別される。
【０１５６】
細胞がアポトーシスを受けているか否かを判断するための基準（ワイリィー（Ｗｙｌｌｉｅ）ら，１９８０，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ．６８：２５１−３０６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７：１４５６−６２、Ｍａｊｎｏおよびヨリス（Ｊｏｒｉｓ），１９９５，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１４６：３−１５、アレン（Ａｌｌｅｎ）ら，１９９８，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：４２７−４５）は、細胞の外観の区別される形態学的変化、ならびに生化学および分子マーカの変化を含む。例えば、アポトーシス細胞は、しばしば、細胞質膜ブレッビングを受け、それらの染色体は迅速に凝縮し、核周囲の回りに凝集し、核断片および小さなアポトーシス体が形成される。全てではないが多くのアポトーシス細胞では、クロマチンはＤＮＡを切断する特異的ヌクレアーゼに対する標的となる。
【０１５７】
アポトーシスには、通常、核形態の特徴的変化（クロマチンの凝縮または断片化）およびＤＮＡの段階的断片化が伴い、結局は２００塩基対のモノ−および／またはオリゴマー断片が形成される。ミトコンドリア膜ポテンシャル等の小器官機能の特異的変化が起こる。加えて、特異的アスパラギン酸残基後のタンパク質切断によってタンパク質分解の高度に選択的なパターンを触媒する特異的システインプロテアーゼ（カスパーゼ）が活性化される。加えて、ホスファチジルセリン残基（通常は、内部膜リーフレット上にある）の外部表面暴露は、膜が破壊され、サイトゾルまたは小器官が細胞内空間にこぼれ、炎症反応を惹起する前に、アポトーシス細胞の認識および排除を可能とする。さらに、アポトーシスを受けつつある細胞は、減少した細胞内カリウムレベルも有しつつ、収縮する傾向にある。
【０１５８】
アポトーシスシグナルの一般的パターンは、異なる細胞型およびアポトーシス誘導因子の間で非常に似ている。しかしながら、この経路の詳細は、現実には細胞型および誘導因子に応じてかなり変化する。アポトーシスに関与する種々のシグナル変換経路の依存性および独立性は、現在、盛んな研究のトピックスである。我々は、ここに、この経路が特異的細胞型における誘導因子の用量に依存して変化することを示す。
【０１５９】
核形態
アポトーシスを受けつつある細胞は、一般に、２つのタイプの核変化、断片化または凝縮を呈する（（Ｍａｊｏｎｏおよびヨリス（Ｊｏｒｉｓ），１９９５）、（Ｅａｒｎｓｈａｗ，１９９５））。所与の細胞型における応答は、アポトーシス誘導因子に依存して変化するように見える。核断片化の間に、円形または長円形の核は徐々に耳たぶ状になる。結局は、核は多数のサブ核に劇的に断片化する。時々、耳たぶ状の核内のクロマチンの密度は分布の空間的変化を示し得るが（ヘテロクロマチン化）、核凝集で見られる縁形成に近づく。
【０１６０】
核凝縮はＭＣＦ−７等のいくつかの細胞型で報告されている（サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）ら，１９９７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．７０：２１４−２０）。凝縮はユウクロマチン、核マトリックスおよび核ラミナの構造的一体性の喪失の結果として生起するのである（Ｈｅｎｄｚｅｌら，１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：２４４７０−８）。核凝縮の間、クロマチンは核の縁近くで凝縮し、核の全体的収縮に至る。このように、アポトーシスの尺度としての核形態の使用は凝縮および断片化を共に考慮しなければならない。
【０１６１】
材料および方法
細胞を３×１０３から１×１０４で細胞／ウェルの密度で９６−ウェルプレートに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示された濃度にて添加し、細胞を示された時間（通常、１６から３０時間）インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞を新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌ  ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））で染色し、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞をハンクスの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を室温にてＨＢＳＳで２回洗浄し、プレートを密封した。
【０１６２】
アポトーシスの誘導に際しての核形態の変化の定量は、（１）核領域の有効サイズを測定し、（２）周囲の複雑性の程度を測定することによって達成された。サイズパラメータは核凝縮のより感受性な尺度を提供し、他方、周囲尺度は各断片化のより感受性の尺度を提供する。
【０１６３】
結果および考察
Ｌ９２９細胞は、核形態の用量依存的変化にて、スタウロスポリン（３０時間）およびパクリタキセル（３０時間）双方に対して応答した（図２５Ａおよび２５Ｂ）。ＢＨＫ細胞はわずかにより複雑であるが明瞭に見える応答を示した。スタウロスポリンはより低い用量で核凝縮を刺激し、より高い用量で核断片化を刺激するように見えた（図２５Ｃおよび２５Ｄ）。対照的に、パクリタキセルは、濃度を増加させていくと、核断片化の合致した増加を誘導した。ＭＣＦ−７細胞の応答は、アポトーシス誘導因子に依存して劇的に変化した。スタウロスポリンは核凝縮を誘導するようにみえ、他方、パクリタキセルは核断片化を誘導した（図２５Ｅおよび２５Ｆ）。
【０１６４】
図２６は、核サイズおよび核周囲複雑性双方の点で細胞の用量応答を示す。断片化に先立つ核の膨潤があるようである。
【０１６５】
評価の結果、細胞系によるおよびアポトーシス誘導因子による異なる応答が用量依存的に観察され、これは、このアッセイがアポトーシスの核特徴の変化を検出するのに有用であることを示す。
【０１６６】
アクチン再組織化
我々は、アポトーシス変化に関連する潜在的パラメータとしてアクチン細胞骨格の変化を評価した。これは、蛍光ファロイジン標識で検出したｆ−アクチン含有量の初期増加、ｆ−アクチンの特異的染色の予備的観察に基づくことであった（我々の未公表データ、Ｌｅｖｅｅら，１９９６，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｃ１９８１−９２、Ｍａｅｋａｗａら，１９９６，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：３８９−９６）。アポトーシスの間のアクチン細胞骨格の変化は全ての細胞型で観察されなかった（Ｅｎｄｒｅｓｅｎら，１９９５．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２０：１６２−７１，ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌａｎｄら，１９９７，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５：４２１−３０）。
【０１６７】
材料および方法
細胞を３×１０３から１×１０４細胞／ウェルの密度にて９６−ウェルプレートに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示された濃度にて添加した。細胞を示された時間（通常、１６−３０時間）インキュベートした。翌日、培地を取り除き、細胞を、新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））で染色し、３０℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。プレートをＨＢＳＳで洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１０で浸透させた。プレートをＨＢＳＳ中で洗浄し、１００μｌの１Ｕ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８ファロイジンストック（１００μｌ／ウェル，モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），Ｉｎｃ）で染色した。細胞を室温にてＨＢＳＳで２回洗浄し、プレートを密封した。
【０１６８】
ｆ−アクチン含有量の定量は、核の回りのファロイジン染色の強度を測定することによって達成された。これは、強度の十分な細胞質平均の理想的な近似であると判断された。この細胞質測定を近似するのに用いるマスクは、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色によって規定された核マスクに由来した。誘導は、腐食および膨張の組合せによって達成された。
【０１６９】
結果および考察
ｆ−アクチン含有量の変化は細胞型およびアポトーシス誘導因子に基づいて変化した（図２７）。スタウロスポリン（３０時間）はＬ９２９（図２７Ａ）およびＢＨＫ（図２７Ｂ）細胞においてｆ−アクチンの増加を誘導した。ＭＣＦ−７細胞は濃度−依存的応答を呈した。低濃度（図２７Ｅ）では、ｆ−アクチン含有量の減少があるようであった。より高い濃度では、ｆ−アクチン含有量は増加した。パクリタキセル（３０時間）処理は、広く種々の応答に至った。Ｌ９２９細胞はｆ−アクチンの漸次の増加に応答し（図２７Ｂ）、他方、ＢＨＫおよびＭＣＦ−７応答は共に高度に変化した（各々、図２７Ｂおよび２７Ｄ）。
【０１７０】
評価の結果：シグナル強度の増加および減少は共にいくつかの細胞系で測定し、濃度依存的応答を呈することが判明した。ある種の細胞系／アポトーシス誘導因子対では、これは統計的に有意なアポトーシスインジケータとなり得た。
【０１７１】
ミトコンドリア質量／ポテンシャルの変化
導入
ミトコンドリアの変化はアポトーシスで中枢的な役割を演じる（ＨｅｎｋａｒｔおよびＧｒｉｎｓｔｅｉｎ，１９９６，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８３：１２９３−５）。ミトコンドリアは外方膜を通じてアポトーシス性因子を放出し、内方膜の電気化学勾配を消失させる。これはミトコンドリア浸透性転移（ＭＰＴ）の形成を介して起こると考えられるが、それは全ての場合に当てはまるのではないようである。ＭＰＴの形成の明白な発現はミトコンドリア膜ポテンシャルの崩壊である。抗−アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の薬理学的介入またはミトコンドリア発現によるＭＰＴの阻害は細胞死滅を妨げ、これは、ＭＰＴの形成は死滅プロセスの律速事象であり得ることを示唆する（レビューについては：クレーマー（Ｋｒｏｅｍｅｒ）ら，１９９８，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：６１９−４２参照）。また、アポトーシスの刺激の間にミトコンドリアが増殖できることも観察された（マンシーニ（Ｍａｎｃｉｎｉ）ら，１９９７，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３８：４４９−６９、Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ−Ｂｒｏｅｔら，１９９８，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３９：２７７−９２）。
【０１７２】
ミトコンドリアにおけるアポトーシス−誘導変化を測定するための１つのアプローチは、ミトコンドリア膜ポテンシャルを測定することである。利用できる方法のうち、最も簡単な測定は、膜ポテンシャルに基づく細胞内小器官内で分布するカチオン色素の再分布である。そのようなアプローチは、伝統的には、測定に生細胞を必要とする。Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ色素の最近の導入（ポート（Ｐｏｏｔ）ら，１９９７，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２７：３５８−６４、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．），Ｏｒｅｇｏｎから入手可能）は、固定後にミトコンドリア膜ポテンシャルを測定する手段を提供する。
【０１７３】
アポトーシスの間におけるミトコンドリア質量の可能な増加の観察を仮定すれば、ミトコンドリアを標識する色素の量は膜ポテンシャルおよびミトコンドリアの数の双方に関連する。ミトコンドリアの数は一定であれば、色素の量は膜ポテンシャルに直接関連する。ミトコンドリアの数が一定でなければ、シグナルは質量の増加によって支配されるようである（Ｒｅｉｐｅｒｔら，１９９５，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２１：２８１−８）。
【０１７４】
ＨＣＳアッセイにおいて質量およびポテンシャルの変化の間の明瞭な分離を可能とするプローブが入手できる。ミトコンドリア質量はＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（ポート（Ｐｏｏｔ）およびピアース（Ｐｉｅｒｃｅ），１９９９，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．３５：３１１−７、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．），Ｏｒｅｇｏｎから入手可能）で標識することによって直接測定される。この標識はミトコンドリア膜ポテンシャルと独立しているが、ミトコンドリア質量に比例する。また、これはミトコンドリア質量に関して各細胞における他のミトコンドリア測定を正規化する手段を提供する。
【０１７５】
細胞を３×１０３から１×１０４細胞／ウェルの密度にて９６−ウェルプレートに平板培養した。翌日、アポトーシス誘導因子を示した濃度で添加し、細胞を示された時間（通常、１６−３０時間）インキュベートした。細胞を、新鮮な培地中の５μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））および７５０ｎＭ  Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＣＭＸＲｏｓ，モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））で染色し、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、室温にてＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。プレートをＨＢＳＳで洗浄し、室温にて、ＨＢＳＳ中の０．５％ｖ／ｖトリトンＸ−１００で浸透させた。細胞を室温にてＨＢＳＳで２回洗浄し、プレートを密封した。ミトコンドリアのデュアル標識では、細胞を２００ｎＭ  Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎおよび２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで固定前に０．５時間処理した。
【０１７６】
結果および考察
スタウロスポリンおよびパクリタキセルによるアポトーシスの誘導は、刺激体に応じて種々のミトコンドリア変化に至った。Ｌ９２９は、増大するスタウロスポリン濃度でミトコンドリア質量の明瞭な増加を呈した（図２８）。ＢＨＫ細胞は、低濃度のスタウロスポリンにて膜ポテンシャルの減少、または高濃度のスタウロスポリンにて質量の増加を呈した（図２８Ｃ）。ＭＣＦ−７細胞は、増大する濃度のスタウロスポリンに応答してミトコンドリア膜ポテンシャルの終始一貫した減少によって応答した（図２８Ｅ）。増大する濃度のパクリタキセルは、ミトコンドリア質量の終始一貫した増加を引き起こした（図２８Ｂ、２８Ｄおよび２８Ｆ）。
【０１７７】
ミトコンドリア膜ポテンシャルは、ミトコンドリアをＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭおよびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ））双方で標識することによって測定される。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ標識は質量および膜ポテンシャル双方に比例する。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ標識は質量に比例する。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭシグナルに対するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄシグナルの比率は、ミトコンドリア膜ポテンシャルの尺度を提供する（ポート（Ｐｏｏｔ）およびピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）），１９９９）。この比率はＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄシグナルに関してミトコンドリア質量を正規化する（図２８参照）。ミトコンドリア質量に対して正規化する能力を膜ポテンシャルの尺度と組み合わせると、両方のパラメータの独立した評価を可能とする。
【０１７８】
評価の結果：ポテンシャルの減少および質量の増加は共にテストした細胞系および誘導因子に依存して観察された。用量依存的相関は、これが有望なアポトーシスインジケータであることを示す。
【０１７９】
蛍光分光学のスペクトルドメインを開発することによって、アポトーシスの複数尺度を組み合わせることが可能である。事実、前述で示した核形態／ｆ−アクチン含有量／ミトコンドリア質量／ミトコンドリアポテンシャルデータの全てはマルチパラメータアッセイとして収集されたが、明瞭性のため個々に提示された。
【０１８０】
実施形態７  細胞質から核への、病気−関連配列を含有するシグナリング酵素のプロテアーゼ誘導移動
プラスミド構築体。緑色タンパク質−カスパーゼ（Ｃｏｈｅｎ（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．３２６：１−１６、梁（Ｌｉａｎｇ）ら（１９９７），Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７４：２９１−３０２）キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドは、ＧＦＰ突然変異体を用いて調製される。この構築体を用いて真核生物細胞をトランスフェクトする。
【０１８１】
細胞の調製およびトランスフェクション。
【０１８２】
細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションに２４時間先立って平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションは、限定されるものではないが、リン酸カルシウム共沈殿またはリポフェクションを含めた方法によって行われる。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２にて、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共に４から５時間インキュベートし、ＤＭＥＭで３から４回洗浄して沈殿を除去し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加する。リポフェクタミントランスフェクションは、製造業者の指示に従って抗生物質を含まない無血清ＤＭＥＭ中で行う。ＤＮＡ−リポソーム複合体との２から３時間のインキュベーションに続き、培地を除去し、ｃ−ＤＭＥＭで置き換えた。
【０１８３】
カスパーゼ−ＧＦＰ移動のアポトーシス誘導。カスパーゼ−ＧＦＰ移動動的データを得るには、トランスフェクトされた細胞の核を、３７℃および５％ＣＯ２にて、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））でまず２０分間標識する。細胞をハンクスの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）中で１回洗浄し、続いて、アポトーシスを誘導する化合物を添加する。これらの化合物は、限定されるものではないが、パクリタキセル、スタウロスポリン、セラミドおよび腫瘍壊死因子を含む。固定時点滴定データを得るには、トランスフェクトされた細胞をまずＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭ中の０から１０００ｎＭの化合物の存在下３７℃および５％ＣＯ２にて１時間インキュベートする。細胞を生きたまま分析するか、あるいはそれをＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２で染色し、分析前に洗浄する。
【０１８４】
イメージの取得および分析。動的データは、化合物の添加後３０分間、１分間隔にて生細胞の視野から蛍光イメージ対（カスパーゼ−ＧＦＰおよびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２−標識核）を取得することによって収集する。同様に、イメージ対は、化合物の添加から１時間後に固定された時点のスクリーニングプレートの各ウェルから得られる。両方の場合、各時点で得られたイメージ対を用いて、各細胞中の核および細胞質領域を規定する。カスパーゼ−ＧＦＰの移動は、核中のカスパーゼ−ＧＦＰの積分蛍光強度を細胞質中のキメラの積分蛍光強度で割ることによって、あるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として計算される。固定時点スクリーニングにおいては、この移動比率は、テストした各濃度の化合物にて少なくとも２００細胞から得られたデータから計算される。細胞質から核へのカスパーゼ−ＧＦＰの薬物−誘導移動は、従って、移動比率の増加に相関する。限定されるものではないが、アポトーシス−活性化酵素の推定アクチベータまたはインヒビターを含むものを含めた分子相互作用ライブラリを用いて、インジケータ細胞系をスクリーニングし、ＤＡＳに対する特異的リガンド、および化合物活性によって活性化された経路を同定する。
【０１８５】
実施形態８  ＤＡＳからの新規ステロイド受容体の同定
特徴づけされていない遺伝子の機能の評価を可能とする、本実施形態を利用するには材料および／または情報の２つの源が必要である。まず、哺乳動物細胞へのトランスフェクションに適したｃＤＮＡ配列を含有する病気関連配列バンクを用いることができる。各ＲＡＤＥまたは異なる発現実験は数１００の配列を生成するので、ＤＡＳの豊富な供給を得るのが可能である。第２に、限定されるものではないが、シグナル配列、７つの膜貫通モチーフ、保存されたプロテアーゼ活性部位ドメイン、または他の同定可能なモチーフを含有するものを含めた、一次配列データベースサーチからの情報を用いてＤＡＳを広いカテゴリーに入れることができる。これらの源から取得された情報に基づいて、方法タイプおよびトランスフェクトすべきインジケータ細胞系を選択する。多数のモチーフがすでによく特徴づけられており、現存するゲノムデータベース中の多数の遺伝子内に含有された線状配列にコードされている。
【０１８６】
１つの実施形態において、以下の工程が取られる：
１）（データベースサーチを含めた）ＤＡＳ同定実験からの情報を関連する生物学的プロセスを選択するための基礎として用いる（例えば、細胞周期変調、アポトーシス、転移プロテアーゼ等については腫瘍系からのＤＡＳ参照）。
【０１８７】
２）同定可能なモチーフによるＤＮＡ配列またはＤＡＳの分類（すなわち、シグナル配列、７−膜貫通ドメイン、保存されたプロテアーゼ活性部位ドメイン等）。この最初のグループ分けは、上述したように、蛍光タグ付け戦略、宿主細胞系、インジケータ細胞系、およびスクリーニングすべき生物活性分子のバンクを決定するであろう）。
【０１８８】
３）よく確立された分子生物学方法を用い、この目的でデザインされた発現ベクターにＤＡＳを連結する。一般化された発現ベクターは、一過性発現のために細胞に標的配列を送達するプロモータ、エンハンサーおよびターミネータを含有する。そのようなベクターは、宿主によって発現された場合に検出を容易にするために、抗体タグ付け配列、直接的会合配列、ＧＦＰ等の発色団融合配列等を含有することもできる。
【０１８９】
４）リン酸カルシウム共沈殿、リポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、ウイルス媒介、またはエレクトロポレーションを含めた標準的なトランスフェクションプロトコルを用い、細胞をＤＡＳ含有ベクターで一過的にトランスフェクトし、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイに平板培養する。別の方法として、トランスフェクションはマイクロタイタープレートそれ自体中で直接行うことができる。
【０１９０】
５）上述したように細胞スクリーニング方法を行う。
【０１９１】
この実施形態において、転写活性化ポテンシャルを示唆するモチーフ（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、アミノ末端変調ドメイン、ヒンジ領域、またはカルボキシ末端リガンド結合ドメイン）を保有することが示されたＤＡＳを利用して、新規ステロイド受容体を同定する。
【０１９２】
この実験のための蛍光タグを規定することは、染色を通じての核の同定、ＧＦＰをコードする遺伝子に基部側に融合した、発現ベクターへのＤＡＳの挿入を介してＧＦＰキメラを作成することによるＤＡＳのタグ付けを含む。別の方法として、発現されたＤＡＳのいくつかの部分に対する高親和性を持つ一本鎖抗体断片は、当該分野で利用できる技術（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて構築し、フルオロフォア（ＦＩＣＴ）に連結して、細胞中の推定転写アクチベータ／受容体をタグ付けすることができた。この別の方法は、ＤＮＡトランスフェクションを必要としない外部タグを提供し、従って、分布データが、ＤＡＳを作成するのに使用される元の一次培養から集めるべき場合には有用であろう。
【０１９３】
プラスミド構築体。緑色蛍光タンパク質キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドは、ＧＦＰ突然変異体を用いて調製される。この構築体を用いて、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする。このプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされると、ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐと命名されたＤＡＳタンパク質産物に融合したＧＦＰを生じる。
【０１９４】
細胞の調製およびトランスフェクション。ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションに１２から２４時間先立って、５％木炭／デキストラン−処理胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含有するＤＭＥＭを用いて平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートする。トランスフェクションはリン酸カルシウム共沈殿によって、またはリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行う。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、トランスフェクションに先立って培地を５％木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで置き換える。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４から５時間リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共にインキュベートし、ＤＭＥＭで３から４回洗浄して、沈殿を除去し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加する。リポフェクタミントランスフェクションは、製造業者の指示に従って、抗生物質を含有しない無血清ＤＭＥＭ中で行う。ＤＮＡ−リポソーム複合体との２から３時間のインキュベーションに続き、培地を除去し、Ｃ−ＤＭＥＭで置き換える。９６−ウェルマイクロタイタープレート中の全てのトランスフェクトされた細胞を、薬物処理の２４から４８時間先立って、３３℃および５％ＣＯ２にてインキュベートする。実験は、ＨｅＬａ細胞中で一過的に発現された受容体で行う。
【０１９５】
細胞内部で発現されたＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの局所化。細胞分布データを得るためには、トランスフェクトされた細胞の核を、３３℃および５％ＣＯ２にて、２０分間、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））でまず標識する。細胞をハンクスの平衡食塩水（ＨＢＳＳ）中で１回洗浄する。細胞を生きたまま分析するか、あるいはそれをＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２で染色し、分析前に洗浄する。
【０１９６】
好ましい実施形態において、イメージの取得および分析は、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて行う。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光シグナルは、視野細胞からの蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２−標識核）を取得することによって収集する。各時点で得られたイメージ対を用いて、各細胞において核および細胞質領域を規定する。細胞質における分散したシグナルを示すデータは、ＤＮＡ転写アクチベータである既知のステロイド受容体と合致するであろう。
【０１９７】
ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ移動の誘導のためのスクリーニング。インジケータ細胞系としての、ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの適切な発現につき確認されたこの構築体を用い、限定されるものではないが、エストロゲン、プロゲステロン、レチノイド、成長因子、アンドロゲン、および多くの他のステロイドおよびステロイドベースの分子を含めた、種々のステロイドタイプのリガンドを用いて、種々の脂質のスクリーニングを行う。イメージの取得および分析は、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて行う。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光シグナルは、視野細胞からの蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐおよびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２−標識核）を取得することによって収集する。各時間で得られたイメージ対を用いて、各ウェルにおいて核および細胞質領域を規定する。ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの移動は、核中のＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの積分蛍光強度を細胞質中のキメラの積分蛍光強度で割ることによって、あるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として計算される。細胞質から核への移動は、ＤＡＳｐｐのリガンド結合活性化を示し、このように、潜在的受容体クラスおよび作用を同定する。このデータをステロイド受容体の既知のインヒビダーおよびモディファイアーを用いて同様に得られた他のデータと組み合わせると、ＤＡＳｐｐを標的として有効化し、より多くのデータは種々の源から生じるであろう。
【０１９８】
実施形態９  さらなるスクリーニング
原形質膜および細胞質の間の移動
プロフィラクチン複合体の解離およびプロフィリンの原形質膜への結合。１つの実施形態において、プロフィリン膜結合の蛍光タンパク質バイオセンサーは、精製されたプロフィリン（Ｆｅｄｅｒｏｖら（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４１：４８０−４８２、Ｌａｎｂｒｅｃｈｔｓら（１９９５），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２８１−２８６）を、２−３００ｎ秒の範囲の蛍光寿命を保有するプローブで標識することによって調製される。バルクローディング方法を用い、標識されたプロフィリンを生きたインジケータ細胞に導入し、インジケータ細胞をテスト化合物で処理する。蛍光非等方性イメージング顕微鏡（ゴフ（Ｇｏｕｇｈ）およびテーラー（Ｔａｙｌｏｒ）（１９９３），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：１０９５−１１０７）を用いて、０．１秒から１０時間の範囲の処理後の時間に、細胞質および膜の間のプロフィリンの蛍光誘導体のテスト−化合物依存性移動を測定する。
【０１９９】
膜へのＲｈｏ−ＲｈｏＧＤＩ複合体移動。別の態様において、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、次いで、固定し、洗浄し、浸透させる。インジケータ細胞原形質膜、細胞質および核を全て着色マーカで区別して標識し、続いて、第４の色で標識された抗体でのＲｈｏタンパク質で免疫化する（Ｓｅｌｆら（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２５６：３−１０、Ｔａｎａｋａら（１９９５））。４つの標識の各々を、細胞スクリーニングシステムを用いて別々にイメージし、このイメージを用いて、テスト化合物によって行われた移動の阻害または活性化の量を計算する。この計算を行うには、原形質膜および細胞質をマークするのに使用されるプローブのイメージを用いて、細胞内Ｒｈｏタンパク質の位置をマークする免疫学的プローブのイメージをマスクする。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、原形質膜積分明るさ／面積を細胞質積分明るさ／免疫によって割ることによって、移動商を形成する。対照および実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パーセント移動を、各潜在的リード化合物につき計算する。
【０２００】
Ｇ−プロテイン受容体活性化に際しての原形質膜へのβ−アレスチン移動
細胞質から膜への移動の高含有量スクリーニングの別の実施形態において、細胞質から原形質膜へのβ−アレスチンタンパク質の移動は細胞処理に応答して測定される。この移動を測定するには、蛍光ドメインマーカを含有する生きたインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、β−アレスチンマーカの移動を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて時間および空間において測定する。好ましい実施形態においては、インジケータ細胞は、一過性または安定な細胞トランスフェクションを通じてインジケータ細胞によって発現される緑色蛍光タンパク質β−アレスチン（ＧＦＰ−β−アレスチン）タンパク質キメラ（バラク（Ｂａｒａｋ）ら（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７４９７−２７５００、Ｄａａｋａら（１９９８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６８５−６８８）および細胞質および膜ドメインをマークするのに使用される他のレポータからなる蛍光マーカを含有する。インジケータ細胞が休止状態にある場合、ドメインマーカ分子は原形質膜または細胞質に支配的に分配される。高含有量スクリーニングにおいて、これらのマーカを用いて、蛍光の区別されるチャネルにおいて細胞質および原形質膜を描く。インジケータ細胞をテスト化合物で処理すると、ＧＦＰ−β−アレスチンの動的再分布は、０．１秒から１０時間の範囲の時間スケールにわたって一連のイメージとして記録される。好ましい実施形態において、この時間スケールは１時間である。各イメージは、原形質膜および細胞質の間のＧＦＰ−β−アレスチンタンパク質キメラの移動を定量する方法によって分析される。この計算を行うには、原形質膜および細胞質をマークするのに使用されるプローブのイメージを用いてＧＦＰ−β−アレスチンプローブのイメージをマスクし、細胞内ＧＦＰ−β−アレスチンタンパク質の位置をマークする。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、原形質膜積分明るさ／面積を細胞質積分明るさ／面積で割ることによって、移動商を形成する。対照および実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パーセント移動を各潜在的リード化合物につき計算する。高含有量スクリーニングの出力は、注目するテスト化合物で処理されている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的データに関する。
【０２０１】
小胞体およびゴルジ体の間の移動
小胞体からゴルジ体への移動の高含有量のスクリーニングの１つの実施形態において、小胞体からゴルジ体ドメインへの水疱性口内炎ウイルスのｔｓ０４５突然変異体株（エレンバーグ（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら（１９９７），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３８：１１９３−１２０６、プレスリー（Ｐｒｅｓｌｅｙ）ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：８１−８５）からのＶＳＶＧタンパク質の移動が細胞処理に応答して測定される。この移動を測定するには、ルミネセンスレポータを含有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポータの移動を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。このインジケータ細胞は、一過性または安定な細胞トランスフェクションの使用を介してインジケータ細胞によって発現されるＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質および小胞体およびゴルジ体ドメインの位置を測定するのに用いられる他のドメインマーカからなるルミネセンスレポータを含有する。インジケータ細胞が４０℃にてその休止状態にある場合、このＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラ分子は小胞体に支配的に分配される。この高含有量スクリーニングにおいて、区別される色のドメインマーカを用いて、蛍光の区別されるチャネルにおいて小胞体およびゴルジ体ドメインを描く。インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、かつ温度を同時に３２℃まで低下させる場合、このＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラの動的再分布は、０．１秒から１０時間の範囲の時間スケールにわたって一連のイメージとして記録される。各イメージは、小胞体およびゴルジ体ドメインの間のＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質キメラの移動を定量する方法によって分析される。この計算を行うためには、小胞体およびゴルジ体ドメインをマークするのに使用されるプローブのイメージを用いて、ＧＦＰ−ＶＳＶＧプローブのイメージをマスクし、細胞内ＧＦＰ−ＶＳＶＧタンパク質の位置をマークする。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、小胞体積分明るさ／面積をゴルジ体積分明るさ／面積で割ることによって移動商を形成する。対照および実験ウェルからの商値を比較することによって、各潜在的リード化合物につき％移動を計算する。高含有量スクリーニングの出力は、１分から１０時間の範囲の間の時間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度にて注目するテスト化合物で処理されている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的データに関する。
【０２０２】
小器官機能の誘導および阻害
細胞内微小管の安定性
本発明の他の特徴は、微小管構造を修飾する化合物を同定するための自動方法を提供することである。この実施形態において、インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、ルミネセンス微小管−標識分子の分布を、前述で開示のもののような細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。ルミネセンス微小管−標識分子は、細胞をテスト化合物と接触させる前、それと共に、またはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加することができる。
【０２０３】
本発明のこの態様の１つの実施形態において、生細胞は、ルミネセンスタンパク質に融合した微小管を標識するタンパク質を含む、微小管の動力学のルミネセンス標識タンパク質バイオセンサーを発現する。本発明のこの態様についての適切な微小管−標識タンパク質は、限定されるものではないが、αおよびβチューブリンイソ形態およびＭＡＰ４を含む。ルミネセンスタンパク質の好ましい実施形態は、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＧＦＰ突然変異体を含む。好ましい実施形態において、この方法は微小管標識ルミネセンスタンパク質で細胞をトランスフェクトすることを含み、ここに、微小管標識タンパク質は、限定されるものではないが、α−チューブリン、β−チューブリン、または微小管−結合タンパク質４（ＭＡＰ４）であり得る。ここに概説したアプローチは、当業者が、生細胞測定を行って、チューブリンの活性および微小管の安定性に対するリード化合物のインビボでの効果を決定するのを可能とする。
【０２０４】
最も好ましい実施形態において、ＭＡＰ４をオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の修飾されたバージョンに融合させる。（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手可能な）ＥＧＦＰコーディング配列およびマウスＭＡＰ４についてのコーディング配列の間の融合からなるＤＮＡ構築体は作成されている（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら（１９９５），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０（３）：６３９−６５０）。ＭＡＰ４は、相間の微小管並びにマイトジェン細胞と相互作用することが知られている普遍的微小管−結合タンパク質である（ＯｌｍｓｔｅｄおよびＭｕｒｏｆｕｓｈｉ，（１９９３），ＭＡＰ４．Ｉｎ「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＹｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｔ．ＫｒｅｉｓおよびＲ．Ｖａｌｅ，編）。次いで、その位置は、細胞ベースのＨＣＳアッセイについての細胞周期の全ての段階において、生きた（または固定した）細胞中の微小管の位置、組織化および一体性のインジケータとして働くことができる。ＭＡＰ２およびタウ（ニューロン細胞で特異的に発現される微小管結合タンパク質）を用いてＧＦＰキメラが形成されているが（Ｋａｅｃｈら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ．１７：１１８９−１１９９、ハル（Ｈａｌｌ）ら（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４７３３−４７３８）、束微小管に対するそれらの制限された細胞型分布およびこれらのタンパク質の傾向は、過剰発現されると、これらのタンパク質を、種々の組織および器官に由来する生細胞中での分析のための分子試薬としてより望ましくなくする。ＧＦＰ−ＭＡＰ４の中程度の過剰発現は微小管の機能または一体性を破壊しない（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら，１９９５）。同様の構築体は、当該分野における標準的な技術を介してβ−チューブリンまたはα−チューブリンを用いて作成することができる。これらのキメラは、細胞周期の全ての段階の間に生細胞における微小管活性を観察し分析する手段を提供するであろう。
【０２０５】
別の実施形態において、微小管動力学のルミネセンス標識タンパク質バイオセンサーを、マイクロインジェクション、スクレイプローディング、およびインパクト−媒介ローディング等のバルクローディング技術を介して、発現させ、単離し、分析すべき細胞に添加する。この実施形態において、細胞内に過剰発現の論争はなく、このように、αおよびβチューブリンイソ形態、ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および／またはタウは全て用いることができる。
【０２０６】
さらなる実施形態において、タンパク質バイオセンサーは細胞によって発現され、細胞は、タンパク質バイオセンサー、タンパク質抗原の内因性レベル、または双方を検出する、標識抗体等の、蛍光標識と引き続いて接触させる。この実施形態において、αおよびβチューブリンイソ形態、ＭＡＰ４、ＭＡＰ２および／またはタウを検出するルミネセンス標識を用いることができる。
【０２０７】
限定されるものではないが、商業的に入手可能な（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＧＦＰ突然変異体を含めた種々のＧＦＰ突然変異体が入手でき、その全ては本発明で効果的であろう。
【０２０８】
ＭＡＰ４構築体はいくつかの哺乳動物細胞系（ＢＨＫ−２１，Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３，ＨｅＬａ，ＨＥＫ  ２９３，ＬＬＣＰＫ）に導入されており、チューブリンの組織化および局所化は、ＭＡＰ４局所化のインジケータとしてのＧＦＰ蛍光によって生細胞で可視化されている。この構築体は一過的に発現できるか、安定な細胞系は標準的な方法によって調製することができる。ＥＧＦＰ−ＭＡＰ４キメラを発現する安定なＨｅＬａ細胞系が得られており、これは、このキメラの発現が毒性ではなく、有糸分裂に干渉しないことを示す。
【０２０９】
安定な細胞系の確立および維持のための可能な選択マーカは、限定されるものではないが、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、ゼオシン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ブレオマイシン抵抗性遺伝子、およびブラスタシジン抵抗性遺伝子を含む。
【０２１０】
微小管の組み立て、分解および再配置をモニタリングするこの方法の利用性は、パクリタキセル、ノコタゾール、ビンクリスチンまたはビンブラスチン等の微小管薬物での一過的および安定にトランスフェクトされた細胞の処理によって照明されている。
【０２１１】
本発明の方法は、特にマルチパラメータ癌標的スクリーニングにおける１つのパラメータとして、抗−微小管薬物についての高含有量および組み合わせた高スループット−高含有量細胞ベースのスクリーニングを提供する。ここに用いられるＥＧＦＰ−ＭＡＰ４もまた、複数シグナリング経路または生理学的事象を測定する高含有量スクリーニングの構成要素の１つとして用いることができる。好ましい実施形態において、組み合わせた高スループットおよび高含有量スクリーニングが用いられ、ここに、細胞を含有する位置の各々における複数細胞が高スループットモードで分析され、細胞を含有する位置のサブセットのみが高含有量モードで分析される。高スループットスクリーニングは、限定されるものではないが、増大したルミネセンス強度を持つ位置、レポータ遺伝子の発現を呈するもの、カルシウム変化を受けているもの、およびｐＨ変化を受けているものの同定を含めた、さらに分析すべき細胞を含有する位置を同定するのに有用であろういずれのスクリーニングでもあり得る。
【０２１２】
薬物スクリーニング適用に加えて、本発明は、臨床診断、化学および生物兵器の検出、および基本的な研究市場に適用することができる。なぜなら、細胞分裂および移動度等の基本的な細胞プロセスは微小管動力学に大いに依存するからである。
【０２１３】
イメージの取得および分析
イメージデータは、固定されたまたは生きたインジケータ細胞から得ることができる。得られたイメージの各々から形態データを抽出するには、以下の分析方法が用いられる：
１．各核および細胞質イメージを閾値設定して、核または細胞境界の外側の各画素について値＝０を有するマスクを作成する。
【０２１４】
２．元のイメージの上にマスクをおき、視野中の各物体（すなわち、核または細胞）を検出し、そのサイズ、形状および積分強度を計算する。
【０２１５】
３．対応する蛍光微小管イメージ上に前述で得られた全細胞マスクをおき、１以上の分類器の以下の組を適用して、微小管の形態および微小管の形態に対する薬物の効果を測定する。
【０２１６】
微小管形態は、微小管の形状、サイズ、凝集状態および従業状態の態様を定量するための分類器の組を用いて規定される。これらの分類器は、共出現マトリックス、テクスチャ測定、スペクトル方法、構造方法、小波トランス形態、統計的方法、その組合せを含むアプローチに基づくことができる。そのような分類器の例は以下の通りである：
１．各細胞内で全エッジ強度を計算するために、Ｋｏｌｅｇａら（個々の細胞においてエッジ郷土を測定するための非自動方法を開示する（１９９３）．ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  １：１３６−１５０）に記載されたもののようなエッジ検出方法を用いて微小管の長さおよび幅を定量する分類器。細胞のサイズにつき正規化するには、全エッジ強度を細胞面積で割って、「微小管形態」値を得ることができる。大きな微小管形態値は強いエッジ強度値と関連し、従って、区別される微小管構造を含有する細胞において最大である。同様に、小さな微小管形態値は弱いエッジ強度に関連し、脱重合微小管を持つ細胞で最小である。微小管形態値の生理学的範囲は、微小管安定化薬物パクリタキセル（１０μＭ）または微小管脱重合薬物ノコダゾール（１０μｇ／ｍｌ）いずれかで細胞を処理することによって設定される。
【０２１７】
２．上述した受容体内部化方法からの方法を用いて点状スポットまたは焦点の微小管凝集を定量するための分類器。
【０２１８】
３．イメージテクスチャの尺度を用いて微小管脱重合を定量するための分類器。
【０２１９】
４．微小管の見かけの相互結合、または分岐（または双方）を定量するための分類器。
【０２２０】
５．テスト化合物で処理した細胞の時間シリーズのイメージについてのこの分類器を用いる微小管再組織化の速度論の測定。
【０２２１】
さらなる態様において、微小管標識タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、および上述した方法を実施するための発現ベクターを用いる指令を含む、微小管の安定性を分析するためのキットを提供することである。好ましい実施形態において、発現ベクターは、さらに、ルミネセンスタンパク質をコードする核酸を含み、ここに、微小管結合タンパク質およびそのルミネセンスタンパク質は融合タンパク質として発現される。別の方法として、このキットは微小管−標識タンパク質に特異的に結合する抗体を含有することができる。さらなる実施形態において、このキットは微小管標識タンパク質を発現する細胞を含む。好ましい実施形態において、細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。別の好ましい実施形態において、このキットは、さらに、限定されるものではないが、クラシン、ノコダゾール、ビンクリスチンまたはビンブラスチンを含めた、微小管構造を破壊することが知られている化合物を含有する。別の好ましい実施形態において、このキットは、さらに、限定されるものではないが、タキソール（パクリタキセル）およびディスコデルモリドを含めた、微小管構造を安定化させることが知られている化合物を含む。
【０２２２】
別の態様において本発明は、細胞スクリーニングシステムに、微小管安定性を分析するための開示された方法を実行させるための指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能保存媒体を含み、ここに、この細胞スクリーニングシステムは、細胞を含有するプレートを保持するのに適した段階を備えた光学系、デジタルカメラ、細胞から放出された蛍光またはルミネセンスをデジタルカメラに向ける手段、およびデジタルカメラからのデジタルデータを受領し処理するコンピュータ手段を含む。
【０２２３】
マクロ分子の機能的局所化を含む高含有量スクリーニング
このクラスの高含有量スクリーニング内では、外部刺激体に応答しての微小管の機能的局所化を生細胞内で測定する。
【０２２４】
解糖酵素の活性調節。細胞酵素活性高含有量スクリーニングの好ましい実施形態において、鍵となる解糖調節酵素の活性を処理細胞において測定する。酵素活性を測定するには、ルミネセンス標識試薬を含有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポータの活性を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。
【０２２５】
１つの実施形態において、細胞内酵素活性のレポータはフラクトース−６−リン酸、２−キナーゼ／フラクトース−２，６−ビスリン酸（ＰＦＫ−２）、そのリン酸化状態が細胞内炭水化物同化および異化を示す調節酵素である（デプレ（Ｄｅｐｒｅｚ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７２６９−１７２７５、Ｋｅａｌｅｒら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９５：２２５−２２７、リー（Ｌｅｅ）ら（１９９６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６０１０−６０１９）。インジケータ細胞は、ＰＦＫ−２−リン酸化の蛍光タンパク質バイオセンサーからなるルミネセンスレポータを含有する。蛍光タンパク質バイオセンサーは、環境的に感受性の蛍光色素を、この酵素の既知のリン酸化部位近くに導入することによって構築される（デプレ（Ｄｅｐｒｅｚ）ら（１９９７），上記、ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）ら（１９９５），上記）。この色素はケトシアニンクラスのものである（ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）およびＷｏｌｆｂｅｉｓ（１９９１），Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４７Ａ：１８７−１９２）、あるいはタンパク質反応性部位、およびその励起または発光スペクトルが溶液極性に対して感受性であるフルオロクロームを含有するいずれかのクラスであり得る。蛍光タンパク質バイオセンサーは、バルクローディング方法を用いて、インジケータ細胞に導入される。
【０２２６】
生細胞インジケータ細胞は、０．１秒から１０時間の間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度にて、テスト化合物で処理する。好ましい実施形態において、比率イメージデータは、各時点において、蛍光イメージのスペクトル対を収集することによって、生きた処理インジケータから得られる。各時点から形態データを抽出するには、各時点における２つのスペクトルイメージを数字的画素間に分割することによって、イメージの各対の間で比率が取られる。次いで、各画素値を用いて、ＰＦＫ−２のリン酸化分率を計算する。リン酸化の小さな分率値では、ＰＦＫ−２は炭水化物異化を刺激する。リン酸化の高い分率値では、ＰＦＫ−２は炭水化物同化を刺激する。
【０２２７】
プロテインキナーゼＡの活性およびサブユニットの局所化。高含有量スクリーニングの別の実施形態において、インジケータ細胞内のドメイン局所化およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性双方が、テスト化合物での処理に応答して測定される。
【０２２８】
インジケータ細胞はＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーを含めたルミネセンスレポータを含有する。蛍光タンパク質バイオセンサーは、環境的に感受性の蛍光色素を、ＰＫＡの調節ブユニットと相互作用することが知られている部位近くにＰＫＡの触媒サブユニットを導入することによって構築される（ハルーツニアン（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ）ら（１９９３），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ４：９９３−１００２、Ｊｏｈｏｎｓｏｎら（１９９６），Ｃｅｌｌ  ８５：１４９−１５８、ジュリアノ（Ｇｉｕｌｉａｎｏ）ら（１９９５），上記。この色素はケトシアニンクラスのものであるか（ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）、およびＷｏｌｆｂｅｉｓ（１９９１），  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４７Ａ：１８７−１９２）、あるいはタンパク質反応性部位およびその励起もしくは発光スペクトルが溶液極性に対して感受性であるフルオロクロームを含有するいずれかのクラスであり得る。ＰＫＡ活性化の蛍光タンパク質バイオセンサーは、バルクローディング方法を用いてインジケータ細胞に導入される。
【０２２９】
１つの実施形態において、生きたインジケータ細胞を、０．１秒から１０時間の間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの範囲の最終濃度にて、テスト化合物で処理する。好ましい実施形態において、比率イメージデータは、生きた処理インジケータ細胞から得られる。各時点からバイオセンサーデータを抽出するには、イメージの各対の間で比率を取り、次いで、各画素を用いて、ＰＫＡの分率活性化を計算する（例えば、ｃＡＭＰ結合後における触媒および調節サブユニットの分離）。活性の高い分率値において、ＰＧＫ−２は生細胞内の生化学カスケードを刺激する。
【０２３０】
ＰＫＡの触媒サブユニットの移動を測定するには、ルミネセンスレポータを含有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポータの移動は、細胞スクリーニングシステムを用いて空間および時間において測定する。インジケータ細胞は、細胞質および核ドメインの位置を測定するのに使用されるドメインマーカからなるルミネセンスレポータを含有する。インジケータ細胞をテスト化合物で処理すると、ＰＫＡ蛍光タンパク質バイオセンサーの動的再分布を、０．１秒から１０時間の時間スケールにわたって一連のイメージとして細胞内で記録される。各イメージは、細胞質および核ドメインの間のＰＫＡの移動を定量する方法によって分析される。この計算を行うには、細胞質および核ドメインをマークするのに使用されるプローブのイメージを用いて、ＰＫＡ蛍光タンパク質バイオセンサーのイメージをマスクする。各マスク下の単位面積当たりの積分明るさを用いて、細胞質積分明るさ／面積を核積分明るさ／面積で割ることによって、移動商を形成する。対照および実験ウェルからの移動商値を比較することによって、パーセント移動が、各潜在的リード化合物につき計算される。高含有量スクリーニングの出力は、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの濃度範囲のテスト化合物で処理されている多数の個々の細胞内の移動の大きさを説明する定量的データと関係する。
【０２３１】
遺伝子発現の誘導または阻害に関する高含有量スクリーニング
ＲＮＡ−ベースの蛍光バイオセンサー
細胞骨格タンパク質の転写およびメッセージの局所化。細胞−基質接着、細胞間接着、シグナル変換、細胞周期事象、媒介およびシグナリング分子代謝、細胞移行、細胞間通信、および細胞死滅を含めた、細胞の生理学的応答の一般的クラスの調節は、このクラスの生理学的応答を測定するようにデザインすることができる。
【０２３２】
１つの実施形態において、細胞内遺伝子発現のレポータは、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズでき、そのルミネセンスシグナルを変更できるオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは分子ビーコン（Ｔｙａｇｉおよびクレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８）、そのルミネセンスシグナルが分子間および分子内相互作用に依存するルミネセンス−ベースの試薬である。蛍光バイオセンサーは、試薬の各端部（５’および３’）に１つがあるように、蛍光色素の蛍光エネルギー移動対を導入することによって構築される。この色素はタンパク質反応性部位、およびその励起および発光スペクトルが十分重複して、限定されるものではないが、フルオレセインおよびローダミン（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を含めた、休止状態にある色素の間の蛍光エネルギー移動を供する。好ましい実施形態において、β−アクチンをコードするメッセージの部分（Ｋｉｓｌａｕｓｋｉｓら（１９９４），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２７：４４１−４５１、マッキャン（ＭｃＣａｎｎ）ら（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５６７９−５６８４、Ｓｕｔｏｈ（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：３６５４−３６６１）を、分子内ハイブリッド形成により一緒に連結された端部を持つヘアピン−形状のオリゴクレオチドのループ領域に挿入される。バイオセンサーの各端部において、蛍光ドナー（フルオレセイン）および蛍光アクセプタ（ローダミン）が共有結合している。連結状態において、蛍光エネルギー移動は最大であり、従って、非ハイブリダイズ分子を示す。β−アクチンをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすると、この連結体は破壊され、エネルギー移動は喪失される。完全な蛍光バイオセンサーは、バルクローディング方法を用いてインジケータ細胞に導入される。
【０２３３】
１つの実施形態において、生きたインジケータ細胞を、０．１秒から１０時間の範囲の間、１０−１２Ｍから１０−３Ｍの最終濃度にて、テスト化合物で処理する。好ましい実施形態において、比率イメージデータは生きた処理インジケータ細胞から得られる。各時点からの形態データを抽出するには、イメージの各対の間で比率を取り、次いで、各画素値を用いて、標識されたヌクレオチドの分率ハイブリッド形成を計算する。ハイブリッド形成の小さな分率値では、β−アクチンの発現はほとんど示されない。ハイブリッド形成の大きな分率値では、β−アクチンの最大発現が示される。さらに、インジケータ細胞の細胞室内のハイブリダイズした分子の分布もまたインジケータ細胞の生理学的応答の尺度である。
【０２３４】
リガンドの細胞表面結合
生細胞におけるその細胞表面受容体に対する標識インスリン結合。その原形質膜ドメインが特定の色の標識試薬で標識されている細胞を、適当な条件下で、適当な時間、異なる色のルミネセンスプローブで標識されたインスリン分子を含有する溶液と共にインキュベートした（リー（Ｌｅｅ）ら（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２７０１−２７０８、Ｎａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎら、（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｃ１４３８−Ｃ１４４６）。インキュベーションの後、未結合インスリン分子を洗浄除去し、細胞を固定し、原形質膜上のインスリンの分子および濃度を測定する。これを行うために、細胞膜イメージを、インスリンイメージのためのマスクとして用いる。マスクされたインスリンイメージからの積分強度を、既知量の標識インスリンを含有するイメージの組と比較する。細胞に結合したインスリンの量は標準から測定し、細胞と共にインキュベートした全濃度のインスリンと用いて、その細胞表面受容体に対するインスリンの解離定数を計算する。
【０２３５】
細胞区画の標識
全細胞標識
全細胞標識は、細胞形状の動力学および細胞の移動度が細胞の蛍光イメージを分析することによって経時的に測定できるように、細胞成分を標識することによって達成される。
【０２３６】
１つの実施形態において、小さな反応性傾向分子を生細胞に導入する。これらの膜−浸透分子は、原形質膜中のタンパク質成分を通って拡散し、それと反応する。色素分子は細胞内分子と反応して、各分子から放出されたルミネセンスシグナルを増大させ、生細胞内で蛍光色素を取得する。これらの分子は、アミノクマリン、ヒドロキシクマリン、エオシンジアセテート、フルオレセインジアセテート、いくつかのＢｏｄｉｐｙ色素誘導体、およびテトラメチルローダミンの反応性クロロメチル誘導体を含む。マクロ分子に向けられたこれらの色素の飯能性は、遊離第１級アミノ基および遊離スルフヒドリル基を含む。
【０２３７】
別の実施形態において、細胞表面は、細胞を、細胞表面上の分子と特異的に反応する傾向標識抗体またはレクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍａｐｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と相互作用されることによって標識される。緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体成分を含有する注目する細胞によって発言された細胞表面タンパク質キメラを用いて、全細胞表面を蛍光標識する。一旦全細胞が標識されれば、全細胞または細胞アレイのイメージは、高含有量スクリーニングにおけるパラメータとなることができ、細胞の形状、移動度、ならびに増殖および分裂の測定に関連する。
【０２３８】
原形質膜標識
１つの実施形態において、全原形質膜の標識は、全細胞を標識するための上述した同一の方法のいくつかを使用する  。全細胞表面を標識するルミネセンス分子は原形質膜を描くように作用する。
【０２３９】
原形質膜の第２の実施形態のサブドメインにおいて、細胞外表面、脂質二層、および細胞内表面は別々に標識することができ、高含有量スクリーニングの成分として用いられる。最初の実施形態において、細胞外表面は、スクシンイミジルエステル等の反応性蛍光分子またはフルオレセイン、ローダミン、シアニン、Ｂｏｄｉｐｙｓ等の蛍光色素のヨードアセトアミド誘導体での簡単な処理を用いて標識する。
【０２４０】
第３の実施形態において、細胞外表面は、細胞表面分子に対して高親和性を持つ蛍光標識マクロ分子を用いて標識する。これらは、タチナタマメ（Ｃｏｎ  Ａ）、インゲンマメ（エリスロアグルチニンＰＨＡ−Ｅ）、または小麦胚芽に由来するレクチンのシアニン誘導体に由来するレクチンのフルオレセイン、ローダミン、およびシアニン誘導体等の蛍光標識レクチンを含む。
【０２４１】
第４の実施形態において、細胞表面区画に対して高親和性を持つ蛍光標識抗体を用いて、原形質膜の細胞外領域を標識する。細胞表面受容体およびイオンチャネルの細胞外領域は、抗体で標識することができるタンパク質の例である。
【０２４２】
第５の実施形態において、原形質膜の脂質二層は蛍光分子で標識する。これらの分子は、原形質膜脂質二層の中央にある疎水性領域と強く相互作用する長鎖疎水性分子に付着した蛍光色素を含む。これらの色素の例は色素のＰＫＨシリーズ（米国特許第４，７８３，４０１号、第４，７６２，７０１号および第４，８５９，５８４号、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）、ニトロベンゾオキサジアゾールグリセロホスホエタノールアミンおよびフルオレセイン−誘導体化ジヘキサデカノイルグリセロホスホエタノールアミン等の蛍光リン脂質、５−ブチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ，ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナン酸および１−ピレンデカン酸（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））等の蛍光脂肪酸、コレステリル４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４，ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノエートおよびコレステリル１−ピレンヘキサノエートを含めた蛍光ステロール、およびアネキシンＶのフルオレセイン誘導体（Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）等の脂質二層成分と特異的に相互作用する蛍光標識タンパク質を含む。
【０２４３】
別の実施形態において、原形質膜の細胞内成分は蛍光分子で標識する。これらの分子の例はトリマーＧ−プロテイン受容体、アデニリルシクラージ、およびイオン輸送タンパク質の細胞内成分である。これらの分子は、蛍光標識特異的抗体への密接な結合の結果として、または膜−結合タンパク質および緑色蛍光タンパク質、およびその突然変異体である蛍光タンパク質キメラの取り込みによって標識することができる。
【０２４４】
エンドソーム蛍光標識
１つの実施形態において、受容体−媒介エンドサイトーシスによって細胞に輸送されるリガンドを用いて、エンドソーム小器官の動力学を追跡する。標識リガンドの例はＢｏｄｉｐｙ  ＦＬ−標識低密度リポタンパク質複合体、テトラメチルローダミントランスフェリンアナログ、および蛍光標識表皮成長因子（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を含む。
【０２４５】
第２の実施形態において、エンドソームリガンドを特異的に標識する蛍光標識一次または二次抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて細胞中のエンドソーム区画をマークする。
【０２４６】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体を、その内部化がエンドソームを標識する受容体と融合させることによって形成されたタンパク質キメラを発現する細胞において、エンドソームを蛍光標識する。ＥＧＦ、トランスフェリン、および低密度リポタンパク質受容体のキメラはこれらの分子の例である。
【０２４７】
リソソーム標識
１つの実施形態において、膜浸透リソソーム−特異的蛍光試薬を用いて、生細胞および固定細胞のリソソーム区画を標識する。これらの試薬は、蛍光分子ニュートラルレッド、Ｎ−（３−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）プロピル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）メチルアミン、およびリソソーム内ｐＨならびにリソソームの動的分布を報告するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を含む。
【０２４８】
第２の実施形態において、リソソーム抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて、特異的リソソームドメインに局在するリソソーム成分を標識する。これらの成分の例はコレステロースエステル加水分解に関与する分解酵素、膜タンパク質プロテアーゼ、およびヌクレアーゼならびにＡＴＰ−駆動リソソームプロトンポンプである。
【０２４９】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したリソソームタンパク質からなるタンパク質キメラを用いてリソソームドメインを標識する。これらの成分の例はコレステロースエステル加水分解に関与する分解酵素、膜タンパク質プロテアーゼ、およびヌクレアーゼならびにＡＴＰ−駆動リソソームプロトンポンプである。
【０２５０】
細胞質蛍光標識
１つの実施形態において、反応性基を持つ細胞浸透蛍光色素（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を生細胞と反応させる。モノブロモビマン、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、およびクロロメチルテトラメチルローダミンを含めた反応性色素は、細胞の細胞質の長期標識で用いられる細胞浸透蛍光色素の例である。
【０２５１】
第２の実施形態において、ルシフェールイエローおよびカスケードブルー−ベースの蛍光色素（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））等の極性トレーサー分子をバルクローディング方法を用いて細胞に導入し、細胞質標識で用いる。
【０２５２】
第３の実施形態において、細胞質成分に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて細胞質を蛍光標識する。細胞質抗原の例は、中間代謝に関与する酵素の多くである。エノラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、およびアセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは均一に分布した細胞質抗原の例である。
【０２５３】
第４の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した細胞質タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて細胞質を標識する。均一に分布したタンパク質の蛍光キメラを用いて、全細胞質ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、中間代謝に関与するタンパク質の多くであり、エノラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼを含む。
【０２５４】
第５の実施形態において、細胞質抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．）、Ｃａｌｔａｌｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて、特異的細胞質サブドメインに局在する。細胞質成分を標識する。これらの成分の例は細胞骨格タンパク質アクチン、チューブリン、およびサイトケラチンである。細胞内のこれらのタンパク質の集団を、この場合線維状である区別される構造に組み立てる。従って、抗体−ベースの試薬でのこれらのタンパク質の蛍光標識は、細胞質の特異的サブドメインを標識する。
【０２５５】
第６の実施形態において、細胞質タンパク質と強く相互作用する非−抗体−ベースの蛍光標識分子を用いて、特異的細胞質成分を標識する。１つの例は酵素ＤＮＡｓｅ  Ｉの蛍光アナログである（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））。この酵素の蛍光アナログは細胞質アクチンに密接かつ特異的に結合し、このように、細胞質のサブドメインを標識する。別の例において、キノコの毒素ファロイジンまたは薬物パクリタキセルの蛍光アナログ（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、各々、アクチン−および微小管−細胞骨格の成分を標識する。
【０２５６】
第７の実施形態において緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した細胞質タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて、細胞質の特異的ドメインを標識する。強度に局所化したタンパク質の蛍光キメラを用いて、細胞質サブドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、細胞骨格を調節するのに関与するタンパク質の多くである。それらは構造タンパク質アクチン、チューブリン、およびサイトケラチンならびに調節タンパク質微小管結合タンパク質４およびαーアクニチンを含む。
【０２５７】
核標識
１つの実施形態において、膜浸透拡散−特異的ルミネセンス試薬（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），Ｉｎｃ，）を用いて、生細胞および固定細胞の核を標識する。これらはシアニンベースの色素（例えばＴＯＴＯＲ，ＹＯＹＯＲおよびＢＯＢＯＴＭ）、フェナンチジンおよびアクリジン（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、およびアクリジンオレンジ）、インドールおよびイミダゾール（例えば、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８，Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、および他の同様の試薬（例えば、７−アミノアクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、およびプソラレン）を含む。
【０２５８】
第２の実施形態において、核抗原に対する抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），Ｉｃｎ．、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用い、特異的核ドメインに局在する核成分を標識する。これらの成分の例はＤＮＡの構造および機能を維持するのに関与するマクロ分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、およびアクチン等の細胞質タンパク質の核変種は核抗原の例である。
【０２５９】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性蛍光タンパク質に遺伝子的に融合した核タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて核ドメインを標識する。これらのタンパク質の例は、ＤＮＡの構造および機能を維持するのに関与するタンパク質の多くである。ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、およびアクチン等の細胞質タンパク質の核変種は核タンパク質の例である。
【０２６０】
ミトコンドリア標識
１つの実施形態において、膜浸透ミトコンドリア−特異的ルミネセンス試薬（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、生細胞および固定細胞のミトコンドリアを標識する。これらの試薬はローダミン１２３、テトラメチルロザミン、ＪＣ−１、およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ反応性色素を含む。
【０２６１】
第２の実施形態において、ミトコンドリア抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて、特異的ミトコンドリアドメインに局在するミトコンドリア成分を標識する。これらの成分の例は、ミトコンドリアＤＮＡの構造および機能を維持するに関与するマクロ分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびミトコンドリアｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ等の細胞質マクロ分子のミトコンドリア変種はミトコンドリア抗原の例である。ミトコンドリア抗原の他の例は、ミトコンドリアで見出される酸化的リン酸化系の成分である（例えば、チトクロームｃ、チトクロームｃオキシダーゼ、およびコハク酸デヒドロゲナーゼ）。
【０２６２】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したミトコンドリアタンパク質からなるタンパク質キメラを用いて、ミトコンドリアドメインを標識する。これらの成分の例は、ミトコンドリアＤＮＡの構造および機能を維持するのに関与するマクロ分子である。その例はヒストン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびミトコンドリアで見出される酸化的リン酸化系の成分を含む（例えば、チトクロームｃ、チトクロームｃオキシダーゼ、およびコハク酸デヒドロゲナーゼ）。
【０２６３】
小胞体標識
１つの実施形態において、膜浸透小胞体−特異的ルミネセンス試薬（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、生細胞および固定細胞の小胞体を標識する。これらの試薬は短鎖カルボシアニン色素（例えば、ＤｉＯＣ６およびＤｉＯＣ３）、長鎖カルボシアニン色素（例えば、ＤｉＩＣ１６およびＤｉＩＣ１８）およびコンカナバリンＡ等のルミネセンス標識レクチンを含む。
【０２６４】
第２の実施形態において、小胞体抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて、特異的小胞体ドメインに局在する小胞体成分を標識する。これらの成分の例は、脂肪酸延長系に関与するマクロ分子、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ  ＣｏＡ−レダクターゼである。
【０２６５】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質等の内因性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合した小胞体タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて、小胞体ドメインを標識する。これらの成分の例は脂肪酸延長系に関与するマクロ分子、グルコース−６−ホスファターゼ、およびＨＭＧ  ＣｏＡ−レダクターゼである。
【０２６６】
ゴルジ体標識
１つの実施形態において、膜浸透ゴルジ体−特異的ルミネセンス試薬（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、生細胞および固定細胞のゴルジ体を標識する。これらの試薬は小麦胚芽アグルチニンおよびブレフェルジンＡ等の蛍光標識マクロ分子ならびにルミネセンス標識セラミドを含む。
【０２６７】
第２の実施形態において、ゴルジ体抗原に対する抗体（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｌｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）を用いて、特異的ゴルジ体ドメインに局在するゴルジ体成分を標識する。これらの成分の例はＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的ホスホジエステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸受容体タンパク質である。
【０２６８】
第３の実施形態において、緑色蛍光タンパク質またはその突然変異体等の内因性ルミネセンスタンパク質に遺伝子的に融合したゴルジ体タンパク質からなるタンパク質キメラを用いて、ゴルジ体ドメインを標識する。これらの成分の例はＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的ホスホジエステラーゼ、およびマンノース−６−リン酸受容体タンパク質である。
【０２６９】
提示した実施例の多くは単一細胞プロセスの測定に関係するが、これは、再度、説明のみの目的を意図する。複数パラメータ高含有量スクリーニングは、いくつかの単一パラメータスクリーニングをマルチパラメータ高含有量スクリーニングに組み合わせることによって、あるいは細胞パラメータをいずれかの既存の高含有量スクリーニングに付け加えることによって作り出すことができる。さらに、各実施例は生細胞または固定細胞のいずれかに基づくものとして記載したが、各高含有量スクリーニングは、生細胞および固定細胞双方で用いられるようにデザインすることができる。
【０２７０】
当業者であれば、ここに提供された開示に基づいて開発することができる広く種々のスクリーニングを認識するであろう。細胞内の特異的成分の移動または再組織化に関係する細胞中の既知の生化学および分子プロセスの大きくかつ増大するリストがある。細胞内の部位を標的化する細胞表面からのシグナリング経路は、原形質膜−結合タンパク質から細胞質への移動を含む。例えば、タンパク質チロシンキナーゼのｓｒｃファミリーの１つ、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（Ｗａｌｋｅｒら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２６８：１９５５２−１９５５８）は、血小板、由来成長因子（ＰＤＧＦ）での繊維芽細胞の刺激に際して原形質膜から細胞質に移動することが知られている。加えて、スクリーニングのための標的は、それ自体、リガンド−結合および移動後修飾を含めた分子の変化を報告する蛍光−ベースの試薬に変換することができる。
【０２７１】
実施形態１０  プロテアーゼバイオセンサー
（１）背景
本明細書で用いるように、以下の用語は次のように定義される、
・試薬−タンパク質分解酵素と相互作用する親バイオセンンサー。
【０２７２】
・生成物−反応体と酵素の相互作用によって生じたシグナル−含有タンパク質分解断片。
【０２７３】
・反応体標的配列−反応体の細胞分布についての制限を細胞の特定の細胞下ドメインに付与するアミノ酸配列。
【０２７４】
・生成物標的配列−標的化酵素反応のシグナル−含有生成物の細胞分布を細胞の特定の細胞下ドメインに付与するアミノ酸配列。生成物が最初に膜結合区画内に局在すれば、生成物標的配列は、この生成物を膜結合区画から外に輸送する能力を持っていなければならない。まず、生成物を膜−結合区画の外に移動し、次いで、この生成物を最終区画に標的化する二機能性配列を用いることができる。一般に、同一のアミノ酸配列を、反応体標的配列および生成物標的配列いずれかまたは双方として作用することができる。この例外は、核エンベロープ、ゴルジ装置、小胞体を標的化し、ファルネシル化に関与し、反応体標的配列としてより適したアミノ酸配列を含む。
【０２７５】
・プロテアーゼ認識部位−基質を模倣し、プロテアーゼのための特異的結合および切断部位を供することによって特異性を付与するアミノ酸配列。典型的には、アミノ酸の短い配列はプロテアーゼのための最小切断部位を表すが（例えば、カスパーゼ−３ではＤＥＶＤ、Ｖｉｌｌａ，Ｐ．，Ｓ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，およびＷ．Ｃ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，１９９７，Ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２２：３８８−９３）、より大きな特異性は、確立された基質からのより長い配列を用いて確立する事ができる。
【０２７６】
・区画−それがタンパク質、脂質、炭水化物または核酸で作成されているかにかかわらず、細胞のいずれかの細胞サブ−構造またはマクロ分子成分。それはマクロ分子アセンブリまたは小器官（膜で境界が定められた細胞成分）で有り得る。区画は、限定されるものではないが、細胞質、核、核小体、核エンベロープの内部および外部表面、細胞骨格、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム、原形質膜の内部リーフレット、原形質膜の外部リーフレット、ミトコンドリア膜の外部リーフレット、ミトコンドリア膜の内部リーフレット、ゴルジ体、小胞体、または細胞外空間を含む。
【０２７７】
シグナル−検出ことができるアミノ酸配列。これは、限定されるものではないが、固有に蛍光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、蛍光または蛍光タンパク質を必要とする補因子（例えば、フィコビリプロテインまたはルシフェラーゼ）、および、限定されるものではないが、蛍光またはルミネセンス標識された、色素、酵素補因子および作成された結合分子を含めた、特異的抗体または他の特異的天然または非天然結合プローブによって認識できるエピトープを含む。タンパク質の部位−特異的標識のための方法は、限定されるものではないが、作成された色素−反応性アミノ酸（Ｐｏｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２８８０−１２８８７（１９９４））、タンパク質へのルミネセンス基質の酵素−ベースの取り込み（バックラー（Ｂｕｃｋｌｅｒ）ら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２０−３１（１９９３）、タカシ（Ｔａｋａｓｈｉ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７：９３８−９４３（１９８８））、およびタンパク質への非天然標識アミノ酸の取り込み（ノーレン（Ｎｏｒｅｎ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４−：１８２−１８８（１９８９））を含む。
【０２７８】
・検出−シグナルの存在、位置または量を記録するための手段。このアプローチは、シグナルが固有に蛍光性であれば直接的であり、または例えば、シグナルが標識抗体で引き続いて検出されなければならないエピトープであれば間接的で有り得る。検出の様式は、限定されるものではないが、蛍光、ルミネセンスまたはリン光の空間的位置：（１）強度、（２）偏光、（３）寿命、（４）波長、（５）エネルギー移動、および（６）フォトブリーチング後の回復を含む。
【０２７９】
本発明のプロテアーゼバイオセンサーの基本的原理は、タンパク質分解反応の間に生じた生成物から反応体を空間的に分離することである。反応体からの生成物の分離は、バイオセンサー内のプロテアーゼ認識部位のタンパク質分解切断に際して起こり、生成物が、反応体のものとは異なる細胞の区画に結合し、それに拡散し、またはそれに輸入されるのを可能とする。この空間的分離は、生成物または固定細胞においてタンパク質分解プロセスを間接的に定量する手段を提供する。バイオセンサーのデザインは、バイオセンサーを細胞の区画に結合させ、またはそこに輸入するタンパク質配列（「反応体標的配列」）によって反応体（未切断バイオセンサー）を特定の区画に制限する手段を提供する。これらの区画は、限定されるものではないが、いずれかの細胞構造、マクロ分子細胞成分、膜−制限小器官、または細胞外空間を含む。タンパク質分解反応の特徴は、生成物濃度を反応体濃度で割ったものに関係すると仮定すれば、生成物および反応体の空間的分離は、単一細胞中の生成物および反応体を独自に定量する手段を提供し、タンパク質分解活性のより直接的な測定を可能とする。
【０２８０】
分子−ベースのバイオセンサーは、一過性細胞集団または安定な細胞系で分析されたトランスフェクションおよび発現されたキメラタンパク質を介して細胞に導入することができる。それらは、例えば、原核生物または真核生物発現系における生産によってあらかじめ形成することもでき、精製されたタンパク質は、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、スクレイプローディング、エロクトロポレーション、シグナル配列媒介ローディングを含めた多数の物理的メカニズムを介して細胞に導入される。
【０２８１】
測定様式は、限定されるものではないが、蛍光、ルミネセンスまたはリン光の比率または差異：（ａ）強度−（ｂ）偏光、または（ｃ）反応体および生成物の間の寿命を含むことができる。これらの後者の様式は、生成物および反応体の間の適当な分光学的差異を要する。例えば、限定された移動性シグナルを含有する反応体を非常に小さな移動成分および比較的大きな非移動性成分に分割することは偏光によって検出することができる。別の方法として反応体および生成物の間のかなり異なる発光寿命は、イメージングおよび非イメージングの様式での検出を可能とする。
【０２８２】
そのためにこのバイオセンサーを構築して活性を報告する酵素のファミリーの１つの例はこのカスパーゼである。カスパーゼは、アポトーシスの間に広く種々の標的のタンパク質分解切断を触媒するタンパク質のクラスである。アポトーシスの開始に続き、クラスＩＩ「下流」カスパーゼを活性化し、それは細胞の死滅に至る経路における復帰なしの地点であり、その結果、下流の標的タンパク質が切断される。具体的な例において、ここに説明するバイオセンサーは、カスパーゼ活性化の測定可能なインジケータとして切断されたＧＦＰの核移動を用いるように作成された。加えて、天然に生じるタンパク質における二次構造形成に関与する周囲のアミノ酸を取り込む特異的認識配列の使用は、このクラスのバイオセンサーの特異性および感度を増加させることができる。
【０２８３】
そのためにこのバイオセンサーを構築して活性を報告するプロテアーゼクラスの別の例は亜鉛メタロプロテアーゼである。このクラスの２つの具体的な例は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ）種（ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびテタニー菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ））および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．）に由来する生物学的トキシンである（エレロス（Ｈｅｒｒｅｏｓ）ら，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ．Ｊ．Ｅ．ＡｌｏｕｆおよびＪ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ編，第２版，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９、２０２−２２８頁）。これらの細菌は、真核生物細胞に侵入し、種々の標的タンパク質を特異的に切断する亜鉛メタロプロテアーゼを発現し、それを分泌する。例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からの炭疽プロテアーゼは、アクセサリポア−形成タンパク質を介して標的細胞の細胞質に送達され、そこで、そのタンパク質分解活性は、マイトジェン活性化プロテアーゼキナーゼのキナーゼ１または２（ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）の切断を通じてＭＡＰ−キナーゼシグナリングカスケードを不活性化する（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ａ．Ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ．Ｊ．Ｅ．ＡｌｏｕｆおよびＪ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ編，第２版，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９、２４３−２６３頁）。ここに記載されたトキシンバイオセンサーは、反応体標的化を達成するために、これらおよび他の標的タンパク質の天然細胞下局所化を利用する。切断に際して、シグナル（生成物標的配列を含むまたは含まない）は反応対から分離されて高含有量バイオセンサーを生じる。
【０２８４】
当業者であれば、本発明のこの態様のタンパク質バイオセンサーを適用して、この構築物のいずれかにおける適切なプロテアーゼ認識部位の置換によって、プロテアーゼのカスパーゼファミリーのいずれかのメンバー、ならびにいずれかの他のプロテアーゼの活性を報告することができるのを認識するであろう（図２９Ｂ参照）。これらのバイオセンサーは、高含有量スクリーニングで用いて、酵素活性のインビボ活性化を検出し、既知の認識モチーフの切断にもどいて特異的活性を同定することができる。このスクリーニングは生細胞および固定終点アッセイ双方で用いることができ、さらなる測定と組み合わせてマルチパラメータアセイを提供することができる。
【０２８５】
このように、別の態様において本発明は、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列、
ｂ．少なくともつのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列、ここに、第２の核酸配列は、少なくともふつの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結され、および
ｃ．少なくとも１つの反応体標的配列をコードする第３の核酸配列、ここに、第３の核酸配列は、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結し、
を含む、プロテアーゼバイオセンサーをードする組換え核酸を提供する。
【０２８６】
この態様において、第１および第３の核酸配列は、プロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸配列によって分離されている。
【０２８７】
さらなる実施形態において、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は少なくとも１つの生成物標的配列をコードする第４の核酸配列を含み、ここに、第４の核酸配列は、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結している。
【０２８８】
さらなる実施形態において、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルをコードする第５の核酸配列を含み、ここに、第５の核酸配列は、反応体表解き配列をコードする第３の核酸配列に作動可能に連結している。
【０２８９】
好ましい実施形態において、検出可能なポリペプチドシグナルは蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質、および配列エピトープからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、ポリペプチド配列をコードする第１の核酸は配列番号：３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される配列を含む。
【０２９０】
別の好ましい実施形態において、プロテアーゼ認識部位をコードする第２の核酸は配列番号：５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９および１２１からなる群から選択される配列を含む。別の好ましい実施形態において、反応体標的配列をコードする第３の核酸は配列番号：１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９および１５１からなる群から選択される配列を含む。
【０２９１】
最も好ましい実施形態において、プロテアーゼバイオセンサーをコードする組換え核酸は配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３よるなる群から選択される配列と実質的に同様の配列を含む。
【０２９２】
別の態様において、本発明は、この組換え核酸に作動可能に連結した核酸制御配列を含む組換え発現ベクターを提供する。なおさらなる態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターでトランスフェクトされている遺伝子工学作成宿主細胞を提供する。
【０２９３】
別の態様において、本発明は、
ａ．少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第１のドメイン、
ｂ．少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む第２のドメイン、および
ｃ．少なくとも１つの反応体標的配列を含む第３のドメイン、
を含み、ここに、この第１のドメインおよび第３のドメインは第２のドメインによって分離されていることを特徴とする組換えプロテアーゼバイオセンサーを提供する。
【０２９４】
この実施形態に固有なものは、反応体標的配列が反応体の細胞分布を制限し、生成物の再分布は活性化（すなわち、プロテアーゼ切断）後に起こるという概念でる。この再分布は生成物および反応体の完全な隔離を必要としない。なぜなら、生成物の分布は、生成物標的シグナルの不存在下で反応体分布と部分的に重複することができるからである（以下参照）。
【０２９５】
好ましい実施形態において、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、さらに、少なくとも１つの生成物標的配列を含み第４のドメインを含み、ここに、この第４のドメインおよび第１のドメインは作動可能に連結しており、第２のドメインによって第３のドメインから分離されている。別の実施形態において、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、さらに、少なくとも１つの検出可能なポリペプチドシグナルを含む第５のドメインを含み、ここに、この第５のドメインおよび第３のドメインは作動可能に連結しており、第２のドメインによって第１のドメインから分離されている。
【０２９６】
好ましい実施形態において、検出可能なポリペプチドシグナルドメイン（第１または第５ドメイン）は蛍光タンパク質、ルミネセンスタンパク質および配列エピトープからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、検出可能なポリペプチドシグナルドメインは、配列番号：３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０および５２からなる群から選択される配列を含む。
【０２９７】
別の好ましい実施形態において、プロテアーゼ認識部位を含む第２のドメインは、配列番号：５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２からなる群から選択される配列を含む。別の好ましい実施形態において、反応体および／または標的配列ドメインは、配列番号：１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０および１５２からなる群から選択される配列を含む。
【０２９８】
最も好ましい実施形態において、組換えプロテアーゼバイオセンサーは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２および３４からなる群から選択される配列と実質的に同様の配列を含む。
【０２９９】
なおさらなる実施形態において、本発明は、本発明のプロテアーゼバイオセンサーを保有して、プロテアーゼ活性に影響する化合物を同定することを含む、細胞の自動分析の方法およびキットを提供する。この方法は、種々の可能なマルチパラメータアッセイにおいて、本発明の他の方法と組み合わせることができる。
【０３００】
これらの種々の実施形態において、基本的なプロテアーゼバイオセンサーは、少なくとも第１の検出可能なポリペプチドシグナルドメイン、少なくとも１つの反応体標的ドメイン、および少なくとも１つのプロテアーゼ認識ドメインを含めた複数ドメインから構成され、ここに、検出可能なシグナルドメインおよび反応体標的ドメインはプロテアーゼ認識ドメインによって分離される。このように、プロテアーゼ認識ドメインが反応体標的および第１の検出可能なシグナルドメインを分離する限り、分子中のドメインの正確な順序は一般的に臨界的ではない。各ドメインでは、１以上の特定された認識配列が存在する。
【０３０１】
いくつかの場合において、バイオセンサー中のドメインの順番は生成物および／または反応体を適切な細胞区画に適切に標的化するのに臨界的であり得る。例えば、生成物または反応体をペルオキシソームに標的化することは、ペルオキシソーム標的化ドメインがこのタンパク質の最後の３つのアミノ酸を含むことを必要とする。バイオセンサー内の標的化ドメインの相対的な配置が臨界的であるバイオセンサーの決定は、日常的な実験を通じて当業者が判断することができる。
【０３０２】
プロテアーゼバイオセンサー内のドメインの基本的な組織化のいくつかの例は図３０に示される。当業者であれば、適当なコーディング配列をマルチドメイン構築体に置き換えることによって、本発明のタンパク質バイオセンサーにおける種々の組合せで、広く種々のプロテアーゼ認識部位、生成物標的配列、ポリペプチドシグナルおよび／または生成物標的配列の内のいずれか１つを用いることができるのを認識するであろう。そのような代替配列の非限定的な例は図２９Ａ−図２９Ｃに示される。同様に、当業者であれば、このドメインの機能を保持しつつ、このバイオセンサー内の各個々のドメインのコーディング配列およびアミノ酸配列に対して修飾、置換および欠失をなすことができるのを認識するであろう。個々のドメインのそのような種々の組合せおよび個々のドメインに対する修飾、置換および欠失は本発明の範囲内のものである。
【０３０３】
本明細書中で用いるように、用語「コーディング配列」または特定のポリペプチド配列を「コードする」配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボにてポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列をいう。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳呈停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含むことができる。転写終止配列は通常はコーディング配列の３’側に位置するであろう。
【０３０４】
本明細書中で用いるように、用語ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモータ配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等を集合的にいい、これは宿主細胞におけるコーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する。注目するＤＮＡ配列が適切に転写、翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが組換えベクターに常に存在する必要はない。
【０３０５】
本明細書中で用いるように、「作動可能に連結した」とは、記載された構成要素がその通常の機能を行うように配置される要素の配置をいう。このように、コーディング配列に作動可能に連結した制御配列は、コーディング配列の発現を行うことができる。その発現を指令するように機能する限り、制御配列はコーディング配列に隣接する必要はない。このように、例えば、翻訳されていないが転写された配列への介入は、プロモータ配列およびコーディング配列の間に存在させることができ、プロモータ配列は依然として、コーディング配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【０３０６】
さらに、両方の核酸分子についてのコーディング領域が同一のリーディングフレームにおいて発現できる場合、核酸コーディング配列は別の核酸コーディング配列に作動可能に連結している。同一のリーディングフレームにおいて発現できる限り、核酸配列は隣接する必要はない。このように、例えば、コーディング領域への介入は、特定された核酸コーディング配列の間に存在でき、特定された核酸コーディング領域は、依然として、「作動可能に連結している」と考えることができる。
【０３０７】
バイオセンサーの種々のドメインの間のコーディング配列への介入は、各ドメインの機能が保持される限り、いずれの長さのものであっても良い。一般に、これは、介入タンパク質配列の二次元および三次元構造が、生成物または反応体の標的化、注目するプロテアーゼのバイオセンサーへの結合、検出可能なポリペプチドシグナルの蛍光またはルミネセンス、または蛍光標識エピトープ−特異的抗体の結合等の、バイオセンサーのドメインの結合または相互作用要件を排除しないことを要する。
【０３０８】
プロテアーゼバイオセンサーのドメイン間の距離が重要である１つの場合は、蛍光共鳴エネルギー移動対を生じさせるのが目標の場合である。この場合、ドナーおよびアクセプタの距離がエネルギー移動を可能とするのに十分小さければ、ＦＲＥＴシグナルは存在する（Ｔｓｉｅｎ  ヘイム（Ｈｅｉｍ）  および  Ｃｕｂｂｉｔ，ＷＯ９７／２８２６１）。ドナーおよびアクセプタ部位の間の平均距離は１ｎｍおよび１０ｎｍの間であるべきであり、１ｎｍおよび６ｎｍの間が好ましい。これは、ドナーおよびアクセプタの間の物理的距離である。ぺピチドの三次元構造はドナーおよびアクセプタの間の物理的距離を決定するので、介入配列の長さはかなり変動し得る。
【０３０９】
「組換え発現ベクター」とは、核酸コーディング配列または遺伝子を、遺伝子産物の発現を行うことができるいずれかのプロモータに作動可能に連結するベクターを含む。プロテアーゼバイオセンサーの発現を駆動するのに用いられるプロモータ配列は構成的（限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含めた種々のプロモータのいずれかによって駆動される）、または誘導性（限定されるものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド−応答性を含めた多数の誘導プロモータのいずれかによって駆動される）であって良い。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込によって、宿主生物中で複製可能でなければならない。好ましい実施形態において発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明はウイルスベクター等のいずれかの他の適当な発現ベクターを含むことを意図する。
【０３１０】
語句「実質的に同様」は、ここでは、限定されるものではないが、欠失、負荷または置換を含めた、ここに開示するプロモータバイオセンサー配列からの１以上の保存的または非保存的変形を有する、ＤＮＡのヌクレオチド配列、またはタンパク質のアミノ酸配列を参照する場合に用い、ここに、得られた核酸および／またはアミノ酸配列はここに開示し特許請求する配列と機能的に同等である。機能的に同等な配列は、実質的に同一に機能して、ここに開示し特許請求する核酸およびアミノ酸組成物と実質的に同一のプロテアーゼバイオセンサーを生じる。例えば、機能的に同等なＤＮＡは、ここに開示するものと同一である、または他の非極性残基に代えての非極性残基の置換または同様に荷電した残基に代えての荷電残基の置換、機能には臨界的でないプロテアーゼバイオセンサーの領域への負荷／この領域からの欠失等の、１以上の保存的アミノ酸変形を有するプロテアーゼバイオセンサーをコードする。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実質的に変更しない置換、欠失および／または負荷として当業者に認識されているものを含む。
【０３１１】
本明細書中で用いるように、ヌクレオチドまたはアミノ酸の実質的に同様な配列は、少なくとも７０％−７５％同一性、より好ましくは８０−８５％同一性、最も好ましくは９０％−９５％同一性を保有する。しかしながら、（遺伝子暗号の縮重により）上述したレベル未満の相同性を含む，または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）によって修飾されたそのタンパク質（およびそのようなタンパク質をコードするＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は本発明の範囲内にあると考えることができると認識される。
【０３１２】
用語「異種」とは、それがコーディング配列および制御配列等の核酸配列に関する場合には、組換え構築体の領域に通常は結合しておらず、および／または特定の細胞に通常は会合していない配列を示す。このように、核酸構築体の「異種」領域は、天然では他の分子と会合して見出されない別の核酸分子内にあるまたはそれに付着した核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築体の異種領域は、天然ではコーディング配列と会合して見出されない配列によって近接挟まれたコーディング配列を含み得る。異種コーディング配列の別の例は、コーディング配列それ自体が天然で見出されない構築体である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、通常は宿主差異ぼに存在しない構築体で形質転換した宿主細胞は本発明の目的では異種と考えられるであろう。
【０３１３】
この出願内では、特記しない限り、利用する技術は：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｉｎｎｉｓら，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ，１０９−１２８頁，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ  フー（Ｈｕ）ｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ  Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）等のいくつかの良く知られた文献のいずれかで見出すことができる。
【０３１４】
本発明のバイオセンサーは、分子生物学の分野における標準的な技術を用いて構築し、それを用いて宿主細胞をトランスフェクトする。その全部が本発明の範囲内にあるいずれかの数のそのような技術を用いて、プロテアーゼバイオセンサー−をコードするＤＮＡ構築体およびこのバイオセンサーを発現する遺伝子的にトランスフェクトされた宿主細胞を得ることができる。以下の非限定的実施例は、本発明のバイオセンサーを構築するための１つのそのような技術を示す。
【０３１５】
プロテアーゼバイオセンサーの構築および使用の実施例
以下の実施例においては、特異的生成物標的配列を持つカスパーゼ−特異的バイオセンサーが、４つのプライマー（２つのセンスおよび２つのアンチセンス）の組を用いて構築された。これらのプライマーはその末端に重複する領域を有し、プライマーウォーキング技術を介してＰＣＲで用いられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。２つのセンスプライマーを選択して、ＧＦＰ−含有ベクター（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の５’ポリリンカー（ＢｓｐＩ）から示されたバイオセンサー配列の中央にかけて出発した。２つのアンチセンスプライマーは３’ＧＦＰベクター部位ＢａｍＨＩから出発し、中央の１２個のヌクレオチドだけセンスプライマーと重複する。
【０３１６】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：変性のための３０秒間の９４℃、アニーリングのための３０秒間の５５℃、および延長のための３０秒間の７５℃で１５サイクル。このプライマーは両方の端部に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、得られたＰＣＲ産物の引き続いてのクローニングを容易とする。
【０３１７】
得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーに存在するＢｓｐＥ１およびＢａｍＨ１制限部位で切断し、得られた断片をゲル精製した。同様に、ＧＦＰベクター（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）をポリリンカー中のＢｓｐＥ１およびＢａｍＨ１部位で消化した。ＧＦＰベクターとＰＣＲ産物の連結は、標準的な技術を用いて１６℃にて一晩行った。大腸菌細胞は標準的な技術を用いて連結混合物でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は適当な抗生物質を含むＬＢ−寒天で選択した。
【０３１８】
細胞およびトランスフェクション。３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベータ中で、１０％胎児ウシ血清、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、０，１ｍＭ非必須アミノ酸１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび（ＭＣＦ−７細胞のみについては）１０μｇ／ｍｌを含む３ｍｌの最小イーグル培地（ＭＥＭ）を含有する６ウェルプレート中で、ＤＮＡトランスフェクションのために、ＢＨＫ細胞およびＭＣＦ−７細胞を約３６時間で５０−７０％密集まで培養した。細胞を無血清ＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＭＥＭ培地中に１μｇの適当なプラスミドおよび４μｇのリポフェクタミン（ＢＲＬ）を含有する１ｍｌのトランスフェクション混合物と共に５時間インキュベートした。引き続いて、トランスフェクション培地を除去し、３ｍｌの通常培養基で置き換えた。標準的な分子生物学的方法（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９５）に基づいて安定な細胞の選択を行う前に、このトランスフェクトした細胞を増殖培地中に少なくとも１６時間維持した。
【０３１９】
アポトーシスアッセイ。アポトーシスアッセイでは、適当なプロテアーゼバイオセンサー発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞（ＢＨＫ，ＭＣＦ−７）を、５０−６０％密集にて、組織培養処理９６−ウェルプレート上で平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した。通常の培養基中の変更する濃度のシスプラチン、スタウロスポリンまたはパクリタキセルをストックから新たに調製し、細胞培養皿に添加して、古い培養基を置き換えた。次いで、生細胞実験として、または固定終点実験として、示された時点において、本発明の細胞スクリーニングシステムで細胞を観察した。
【０３２０】
１．３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの構築
ａ．アネキシンＩＩ反応体標的化ドメインを持つカスパーゼ−３バイオセンサー（ｐｌｊｋＧＦＰ）
このバイオセンサーのデザインは図３１に概略を示し、その配列は配列番号：１および２に示す。
【０３２１】
カスパーゼ３についてのプライマー、生成物標的配列＝無し（ＣＰ３ＧＦＰ−ＣＹＴＯ）：
１）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＧＣＡ（配列番号：１５３）
２）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ（配列番号：１５４）
３）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ（配列番号：１５５）
４）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ（配列番号：１５６）
このバイオセンサーは反応体標的配列によって細胞質に制限される。反応体標的配列はアネキシンＩＩ細胞骨格結合ドメインである（ＭＳＴＶＨＥＩＬＣＫＬＳＬＥＧＶＨＳＴＰＰＳＡ）（配列番号：１２４）（図２９Ｃ）（エーベルハルト（Ｅｂｅｒｈａｒｄ）ら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８：２９３ａ）。酵素認識部位は２コピーのアミノ酸ＤＥＶＤ（配列番号：６０）（図２９Ｂ）に対応し、これはカスパーゼ−３の認識部位として働く。天然に生じるプロテアーゼ認識部位からの異なる数のプロテアーゼ認識部位および／またはさらなるアミノ酸を持つ他の例は以下に示す。シグナルドメインはＥＧＦＰ（配列番号：４６）（図２９Ａ）（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。親バイオセンサー（反応体）は、アネキシンＩＩドメインを細胞骨格に結合させることによって細胞質に制限され、したがって、核から排除される。カスパーゼ３によるプロテアーゼ認識部位の切断に際して、シグナルドメイン（ＥＧＦＰ）が反応体標的化ドメインから放出され（アネキシンＩＩ）、これは全容量の細胞を通じて分布する。なぜなればそれはいずれかの特定の標的化配列を欠き、受動的に核に侵入するのに十分小さいからである（図３２）。
【０３２２】
バイオセンサーの応答は、シグナルの効果的な細胞質から核への移動を定量することによって測定される（前述を参照）。この応答の測定は、積分もしくは平均核領域強度、積分もしくは平均核強度に対する積分もしくは平均細胞質強度の比率または差異を含めたいくつかの様式の内の１つによる。核はヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２等のＤＮＡ−特異的色素を用いて規定される。
【０３２３】
このバイオセンサーは、細胞内のアネキシンＩＩ細胞骨格の回りのタンパク質分解活性の尺度を提供する。細胞骨格の分散された性質およびサイトゾルの酵素の効果的に拡散した状態を仮定すれば、これは、一般に、細胞質の効果的な尺度を提供する。
【０３２４】
結果および考察
図３２は、カスパーゼ３バイオセンサーでトランスフェクトされた、ＢＨＫ細胞中でのシスプラチンによるアポトーシスの刺激の前および後におけるイメージを示す。このイメージは核中の蛍光の蓄積を明瞭に示す。蛍光の空間的変化の創製は非可逆的であり、このように、このアッセイのタイミングは柔軟的である。このバイオセンサーについての制御は、カスパーゼ−３−特異的部位が省かれたバージョンの使用を含む。加えて、引き続いて細胞が丸くなる細胞骨格の破壊は蛍光分布の変化を生じなかった。我々の実験は、核凝縮とカスパーゼ活性の活性化との相関を示す。また、我々は、ＭＣＦ−７細胞においてこのバイオセンサーをテストした。最近の報告では、ＰＡＲＰの切断を伴うＭＣＦ−７細胞のエトポシドの刺激から６時間後にカスパーゼ−３活性においてピーク応答が測定されている（ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）ら，１９９８，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３：４４６−５０）。しかしながら、別の最近の報告は、ＭＣＦ−細胞がカスパーゼ−３活性を保有せず、事実、カスパーゼ−３遺伝子は機能的に欠失されていることを見出している（イェーニッケ（Ｊａｎｉｃｋｅ）ら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，９３５７−６０）。カスパーゼ−３活性は、１００μＭのエトポシドでの１５時間の処理の後にＭＣＦ−７細胞でカスパーゼバイオセンサーにて検出されなかった。
【０３２５】
また、イェーニッケ（Ｊａｎｉｃｋｅ）ら（１９９８）は、カスパーゼ−３の通常の基質の多くがスタウロスポリンでの処理に際してＭＣＡ−７細胞で切断されたことを示した。我々の実験は、カスパーゼ活性が、スタウロスポリンで処理された場合にＭＣＦ−７細胞でバイオセンサーを用いて測定できることを示す。スタウロスポリンによる活性の最大の大きさは、ＢＨＫ細胞においてシスプラチンで示されたもののほぼ半分であった。また、これは、カスパーゼ−３−特異的であるように設計されたが、現行のバイオセンサーは、事実、カスパーゼ−３に対して独自に特異的であるよりもむしろカスパーゼのあるクラスに対して特異的であることを意味する。もっともありそうな候補はカスパーゼ−７である（イェーニッケ（Ｊａｎｉｃｋｅ）ら，１９９８）。また、これらの実験は、バイオセンサーがマルチパラメータ実験で使用できることを示し、ミトコンドリア膜ポテンシャル、核凝縮およびカスパーゼ減少の相関がある。
【０３２６】
我々は、具体的には、バイオセンサーを用いてカスパーゼ活性化に対するパクリタキセルの効果をテストした。ＢＨＫおよびＭＣＦ−７細胞におけるカスパーゼ活性はパクリタキセルによって刺激された。また、カスパーゼの活性化は核形態の変化後に起こったように見える。１つの抗議は、この考察に基づき、このアッセイにおいてバイオセンサーによって報告されたカスパーゼ活性は、カスパーゼ−３および、少なくともカスパーゼ−７の活性の組合せによるものらしいということである。
【０３２７】
ＭＣＦ−７細胞に対するスタウロスポリン刺激を用いるこの結果と一致して、パクリタキセルもまたカスパーゼ活性の活性化を刺激した。その大きさはスタウロスポリンのものと同様であった。この実験は先の実験よりもかなりせまい範囲のパクリタキセルを用い、ここに、核凝縮はこの応答を支配するように見える。
【０３２８】
ｂ．微小管結合タンパク質４（ＭＡＰ４）突出ドメインを持つカスパーゼバイオセンサー（ＣＰ８ＧＦＰＮＬＳ−ＳＩＺＥＰＲＯＪ）
反応体を細胞質に制限するための別のアプローチは、バイオセンサーを核ポアを貫通するにはあまりにも大きくすることである。そのようなバイオセンサーの切断は、核に拡散することができる生成物を遊離する。
【０３２９】
このバイオセンサーに要求されるさらなるサイズは、ＭＡＰ４の突出ドメイン（配列番号：１４２）（図２９Ｃ）（ＣＰ８ＧＦＰＮＬＳ−ＳＩＺＥＰＲＯＪ）を用いて提供される。ＭＡＰ４の突出ドメインはそれ自体上の微小管と相互作用せず、発現されると細胞質を通じて拡散により分布するが、そのサイズ（〜１２０ｋＤ）のため核から排除される。このように、このバイオセンサーは全長ＭＡＰ４配列を用いるものとは区別される（以下参照）。当業者であれば、限定されるものではないが、いずれかのＧＦＰの複数コピー、または活性なＮＬＳを欠き、核への拡散のための最大サイズを超える（ほぼ６０ｋＤ、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｂｒａｙ，Ｄ．，Ｒａｆｆ，Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第３版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４．５６１−５６３頁）いずれかの他のタンパク質の１以上のコピーを含めた多くの他のそのようなドメインが、ＭＡＰ４突出ドメインに代えて置き換えることができるのを認識するであろう。得られたバイオセンサーの完全な配列は配列番号：３−４に示す。異なるプロテアーゼ認識ドメインを持つ同様のバイオセンサーは配列番号：５−６に示す。
【０３３０】
ｃ．核輸出シグナルを持つカスパーゼバイオセンサー
反応体を細胞質に制限するための別のアプローチは、核輸出シグナルを用いることによって核から反応体を能動的に制限することである。そのようなバイオセンサーの切断は、核へ拡散できる生成物を遊離する。
【０３３１】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は炭疽プロテアーゼと呼ばれる亜鉛メタロプロテアーゼタンパク質複合体を発現する。ヒトマイトジェン活性化プロテインキナーゼのキナーゼ１（ＭＥＫ１）（Ｓｅｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５６２８−２５６３１，１９９２）は、アミノ酸８の後で切断された炭疽プロテアーゼ認識部位（アミノ酸１−１３）（配列番号：１０２）（図２９Ｂ）、並びにアミノ酸３２−４４における核輸出シグナル（配列番号：１４０）（図２９Ｃ）を保有する。ヒトＭＥＫ２（ＺｈｅｎｇおよびＧｕａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１４３５−１１４３９，１９９３）は、アミノ酸残基１−１６を含む炭疽プロテアーゼ認識部位（配列番号：１０４）（図２９Ｂ）およびアミノ酸３６−４８における核輸出シグナル（配列番号：１４８）（図２９Ｃ）を保有する。
【０３３２】
炭疽プロテアーゼバイオセンサーはシグナルとしてのＦｒｅｔ２５（配列番号：４８）（図２９Ａ）、炭疽プロテアーゼ認識部位、ＭＥＫ１またはＭＥＫ２からの核輸出シグナル（配列番号：７−８（ＭＥＫ１）、９−１０（ＭＥＫ２））を含む。無傷バイオセンサーは、この各輸出シグナル（例えば、反応体標的部位によって細胞質に保持されるであろう）。炭疽プロテアーゼによる融合タンパク質の切断に際して、ＮＥＳはＧＦＰから分離され、ＧＦＰを核に拡散させる。
【０３３３】
２．４−および５−ドメインバイオセンサーの構築
３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーにつき前述で示した例のすべてについて、核局所化配列（ＮＬＳ）等の、制限されるものではないが図２９Ｃにおけるものを含めた生成物標的化配列はシグナル配列に作動可能に連結でき、このように、シグナル配列が、タンパク質分解切断後に反応体標的ドメインから分離するようにする。反応体標的ドメインと作動可能に連結した、限定されるのではないが図２９Ａにおけるものを含めた第２の検出可能なシグナルドメインの付加は、複数手段による反応の測定を行うのに有用である。そのようなバイオセンサーの具体的な例を以下に示す。
【０３３４】
ａ．４ドメインバイオセンサー
１．核局所化配列を持つカスパーゼバイオセンサー
（ｐｃａｓ３ｎｌｓＧＦＰ、ＣＰ３ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯ）：
バイオセンサーのデザインは図３３に概略を示し、その配列は配列番号：１１−１２に示される。以下のオリゴヌクレオチドを用いた以外は、上述したようににＰＣＲおよびクローニング手法を行った。
【０３３５】
カスパーゼ３についてのプライマー、生成物標的配列＝ＮＬＳ（ＣＰ３ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯ）：
１）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＧＣＡ（配列番号：１５７）
２）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ（配列番号：１５４）
３）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ（配列番号：１５８）
４）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ（配列番号：１５６）
プロテアーゼ認識部位の認識および切断に際して、生成物が放出され、このシグナルに付着した核局所化配列ＲＲＫＲＱＫ（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）（ブリッグズ（Ｂｒｉｇｇｓ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２７４５，１９９８）の存在のためこのシグナルは核に特異的に蓄積する以外は、このバイオセンサーは配列番号：２に示したものと同様である。この構築体の特別の利点は、生成物が明らかに反応体から分離されることである。反応体は細胞質に止まるが、酵素反応の生成物は核区画に制限される。応答は、上述したように、シグナルの効果的な細胞質から核への移動を定量することによって測定される。
【０３３６】
親バイオセンサーには生成物および反応体標的化配列双方が存在し、反応体標的配列はバイオセンサーの活性化（例えば、プロテアーゼ切断）に先だって支配的であるはずである。これを達成するための１つの方法は、プロテアーゼ切断後までに親バイオセンサーにおける生成物標的化配列をマスクすることによる。そのような例の１つにおいて、生成物標的配列は、ポリペプチド鎖の末端に比較的近い場合にのみ（すなわち、プロテアーゼ切断後）機能的である。別の方法として、その三次構造がプロテアーゼ切断後まで標的配列の機能をマスクするようにバイオセンサーをデザインすることができる。これらのアプローチは共に標的化配列を標的化のために異なる相対的長さと比較することを含む。核局所化配列（ＮＬＳ）およびアネキシンＩＩ配列の例を用い、異なる長さのＮＬＳを、親バイオセンサーの細胞質制限に基づくクローン選択で試した。活性化に際して、生成物標的化配列は、当然に、その結合した検出可能な配列ドメインの局所化を支配するであろう。なぜならば、それは次いで反応体標的化配列から分離させるからである。
【０３３７】
このバイオセンサーの使用のさらなる利点は、生成物が標的化されて、このように、細胞のより小さな領域に濃縮されるからである。このように、生成物の増大した濃度のため、より少量の生成物が検出可能である。この濃度効果は、反応体の細胞濃度に対して比較的非感受性である。そのような測定のシグナル−対−ノイズ比率（ＳＮＲ）はバイオセンサー番号１のより分散された分布よりも改良される。
【０３３８】
カスパーゼ６（配列番号：６６）（図２９Ｂ）またはカスパーゼ８プロテアーゼ認識配列（配列番号：７４）（図２９Ｂ）いずれかを取り込む同様のバイオセンサーは、以下のプライマー組を用いる以外は上述した方法を用いて作成することができる。
【０３３９】
カスパーゼ６についてのプライマー、生成物標的配列＝ＮＬＳ（ＣＰ６ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯ）
１）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＣ（配列番号：１５９）
２）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ（配列番号：１６０）
３）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ（配列番号：１５８）
４）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ（配列番号：１５６）
カスパーゼ８についてのプライマー、生成物標的配列＝ＮＬＳ（ＣＰ８ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯ）
１）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ（配列番号：１６１）
２）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＣＴＣ（配列番号：１６２）
３）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ（配列番号：１５８）
４）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＣＴ（配列番号：１５６）
得られたバイオセンサーの配列を配列番号：１３−１４（カスパーゼ６）および配列番号：１５−１６（カスパーゼ８）に示す。さらに、プロテアーゼ認識部位の複数コピーをバイオセンサーに挿入し、配列番号：１７−１８（カスパーゼ３）および配列番号：１９−２０（カスパーゼ８）に示されたバイオセンサーが得られる。
【０３４０】
２．第２のシグナルドメインを持つカスパーゼ３バイオセンサー
別の実施形態は、反応体標的ドメインに作動可能に連結した第２のシグナルドメインを用いる。この例では、全長ＭＡＰ４は反応体標的配列として働く。認識および切断に際して、反応体標的配列を含有する反応の１つの生成物はそれ自体の唯一のシグナルで細胞質中の微小管に結合したままであり、他方、生成物標的配列を含有する他の生成物は核に拡散する。このバイオセンサーは一度に２つの活性を測定する手段を提供する：シグナリングカスケードに応答した、核および微小管細胞骨格一体へのＧＦＰの移動を用いるカスパーゼ３活性は、ＭＡＰ４反応体標的配列によってモニターして、アポトーシスの間に開始された。
【０３４１】
このバイオセンサーについての基本的な仮定は、反応体は、全長微小管結合タンパク質ＭＡＰ４（配列番号：１５２）（図２９Ｃ）を含む反応体標的配列によって微小管細胞骨格に連結されていることである。この場合、ＤＥＶＤ（配列番号：６０）（図２９Ｂ）認識モチーフは、反応体標的配列に作動可能に連結したＥＹＦＰシグナル（配列番号４４）（図２９Ａ）、並びにＭＡＰ４のＣ−末端に作動可能に連結したＥＤＦＰシグナル（配列番号：４８）（図２９Ａ）の間に位置する。得られたバイオセンサーは配列番号：２１−２２に示される。
【０３４２】
また、このバイオセンサーは、シグナルドメインに作動可能に連結した、ＮＬＳ等の、生成物標的化ドメインを含むことができる。
【０３４３】
このバイオセンサーでは、カスパーゼ−３切断は依然としてＮ−末端ＧＦＰを放出し、これは（ＮＬＳによって指令され）核への移動を受ける。また、カスパーゼ−３によるタンパク質分解後に依然として無傷であるＭＡＰ４は、バイオセンサーのＣ−末端に融合した第２のＧＦＰ分子を介して、アポトーシスのプロセスの間に微小管細胞骨格の一体性について報告し続ける。したがって、この単一キメラタンパク質は、種々の剤によって誘導されたアポトーシスの間のカスパーゼ−３活性および重合状態の同時分析を可能とする。また、このバイオセンサーは微小管細胞骨格に特異的に標的化する潜在的薬物候補の分析で有用である。なぜなら、微小管に影響するに加えて、特定の薬物がアポトーシスを誘導したか否かを判断することができるからである。
【０３４４】
このバイオセンサーは、反応体についての唯一のシグナル、シグナル２からシグナル１への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および生成物についてのシグナル局所化、シグナル１の核蓄積を潜在的に組み合わせる。また、ＦＲＥＴにおける喪失の大きさによって生じた生成物の量が示されるが、これは、反応体のＦＲＥＴ検出および生成物の空間的局所化の組合せよりも小さなＳＮＲであろう。
【０３４５】
ＦＲＥＴは、ドナーの発光スペクトルがアクセプタ分子の吸収スペクトルとかなり重複する場合にのみ起こり得る（ｄｏｓ  Ｒｅｍｅｄｉｏｓ，Ｃ．Ｇ．，およびＰ．Ｄ．Ｍｏｅｎｓ，１９９５，蛍光共鳴エネルギー移動分光学は、タンパク質における構造変化を測定できるため信頼性のある「ものさし」である。知られていないオリエンテーション因子の問題の払拭、Ｅｍｍａｎｏｕｉｌｉｄｏｕ，Ｅ．，Ａ．Ｇ．Ｔｅｓｃｈｅｍａｃｈｅｒ，Ａ．Ｅ．Ｐｒｏｕｌｉ，Ｌ．Ｉ．Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｅ．Ｐ．Ｓｅｗａｒｄ，およびＧ．Ａ．Ｒｕｔｔｅｒ．１９９９．組換え目標カメレオンを備えた分泌気孔表面でのＣａ（２＋）の濃度変化のイメージング。Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．９：９１５−９１８）。ドナーおよびアクセプタ分子の間の平均物理的距離は１ｎｍおよび１０ｎｍの間であるべきであり、１ｎｍおよび６ｎｍの間が好ましい。ペプチドの三次元構造はドナーおよびアクセプタの間の物理的距離を決定するので、介入配列長さはかなり変化し得る。このＦＲＥＴシグナルは、（１）アクセプタの存在下でのドナーの消光の量、（２）ドナーを励起した場合のアクセプタ発光の量、および／または（３）ドナーおよびアクセプタの発光の間の比率として測定することができる。別の方法として、ドナーおよびアクセプタの蛍光および寿命を測定することができる。
【０３４６】
反応体標的化配列の存在の性質によって、このケースはこのＦＲＥＴバイオセンサーに価値を付け加える。この配列は、原形質膜の内部表面等の区画において、活性のより直接的な読み出しのための細胞の特異的区画へのバイオセンサーの設置を可能とする。
【０３４７】
細胞質第２シグナルは、もとの反応体＋生成物の１つの部分を共に表す。核の第１のシグナルは反応の別の生成物を表す。このように、酵素反応は、それが（１）核強度、（２）核／細胞質比率、（３）核／細胞質ＦＲＥＴ比率、（４）細胞質／細胞質ＦＲＥＴ比率として表すことができる点で柔軟性を付け加えた。
【０３４８】
本ＦＲＥＴバイオセンサーのデザインは、そのシグナル測定が強度よりもむしろ空間的位置に基づく点で以前のＦＲＥＴ−ベースのバイオセンサー（ＷＯ９７／２８２６１、ＷＯ９８３７２２６参照）とは異なる。反応の生成物は反応体から分離される。測定されるのは空間的位置におけるこの変化である。ＦＲＥＴ−ベースのバイオセンサーはドナーおよびアクセプタ対の分離に基づくが、次の区画に対してはそうではない。強度の変化は、タンパク質分解切断に際してのドナーおよびアクセプタの物理的分離による。ＦＲＥＴ−ベースのバイオセンサーの不利な点は、（１）ＳＮＲがかなり低く、測定が困難であり、（２）シグナルが固定できないことである。それは生細胞を用いて記録されなければならない。例えばホルムアルデヒドでのか化学的固定は親および得られたシグナル双方を保持できる、（３）波長の範囲は制限され、２つのフルオロフォアまたはフルオロフォアおよび発色団の存在のためスペクトルの大きな範囲をカバーする、（４）構築は、ドナーおよびアクセプタが正確に配置されて、距離が１−１０ｎｍ内に入ることを保証しなければならない点で大きな制限を有する。
【０３４９】
位置バイオセンサーの利点は（１）より高いＳＮＲを達成するためのシグナルを濃縮する能力、（２）生細胞または固定細胞いずれかで使用される能力、（３）単一の蛍光シグナルが必要なのに過ぎない、（４）バイオセンサーのドメインの配置がより柔軟であることを含む。位置バイオセンサーの適応における唯一の制限因子は、反応体区画および生成物区画の間の差異を分解するのに十分な空間的分解能を持つイメージング方法を必要とするシグナルの空間的位置を規定する必要性である。
【０３５０】
当業者であれば、限定されるものではないが、図２９Ａ−Ｃに示された配列を含めた、プロテアーゼ認識配列および反応体標識配列のための適当な置換を単になすことによって、このアプローチを適合させていずれかの所望の活性の組合せを報告することができるのを認識するであろう。
【０３５１】
３．核小体局所化ドメインを持つカスパーゼ８バイオセンサー（ＣＰ８ＣＦＰＮＵＣ−ＣＹＴＯ）
（図３４に示された）このアプローチはカスパーゼ−８活性の検出にバイオセンサーを利用する。このバイオセンサーでは、核小体局所化シグナル（ＲＫＲＩＲＴＹＬＫＳＣＲＲＭＫＲＳＧＦＥＭＳＲＰＩＰＳＨＬＴ）（配列番号：１３０）（図２９Ｃ）（Ｕｅｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５２：９７−１００，１９９８）を生成物標識配列として用い、これは後記するプライマーを用いてＰＣＲによって作成した．ＰＣＲ産物ＢｓｐＥ１およびＰｖｕ１で消化し、ゲル精製した。ベクターおよびＰＣＲ産物を上述したように連結した。
【０３５２】
カスパーゼ８に対するプライマー、核小体局所化シグナル（ＣＰ８ＧＦＰＮＵＣ−ＣＹＴＯ）
１）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  ＣＧＴ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ（配列番号：１６３）
２）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＴ（配列番号：１６４）
３）  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ（配列番号：１６５）
４）  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＡＡＧ（配列番号：１６６）
得られたバイオセンサーの配列を配列番号：２３−２４に示す。このバイオセンサーはカスパーゼー８についてのプロテアーゼ認識部位（配列番号：７４）（図２９Ｂ）を含む。同様のバイオセンサーはカスパーゼ−３についてのプロテアーゼ認識部位（配列番号：２５−２６）を利用する。
【０３５３】
これらのバイオセンサーは、ＣＰ３ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯ等の、区画を分離するために標的化された同一の生成物シグナル色を保有する他のバイオセンサーで用いることができる。各バイオセンサー反応の生成物は、生成物標的化配列に基づく生成物の分離のため独自に測定することができる。ＣＰ８ＧＦＰＮＵＣ−ＣＹＴＯおよびＣＰ３ＧＦＰＮＬＳ−ＣＹＴＯからの双方の生成物は、異なる空間的位置（核対核小体）のため分離可能であるが、生成物の色は正確に同一である。２つのシグナルの空間的重複を回避するための非核小体、核領域の評価は、ＣＰ８ＧＦＰＮＵＣの存在下でＣＰ３ＧＦＰＮＬＳの測定を行う。核シグナルからの核小体領域の喪失は重要ではなく、ＳＮＲに有意には影響しない。同一の生成物色を用いる複数パラメータの評価の原理は、生細胞で同時に評価することができるパラメータの数をかなり拡張する。この概念は、他の非重複生成物標的区画まで拡大することができる。
【０３５４】
核小体区画への移動の測定は、（１）限定されるものではないが、ヌクレオリンに対する抗体（Ｌｉｓｃｈｅｗｅら，１９８１，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１３６：１０１−１０９）を含めた、核小体−特異的マーカに基づく核小体に対応するマスクを規定し、（２）反応体標的区画に対するマスクを規定し、（３）これらの２つの区画の間のシグナルの相対的分布を測定することによって行う。この相対的分布は、２つの強度の差異、または好ましくは、区画の間の強度の比率によって表すことができる。
【０３５５】
反応体区画が重複すれば、複数の位置バイオセンサーの組合せが複雑になり得る。各シグナルは、各生成物標的区画におけるシグナルの量を単に決定することによって測定できるが、各反応体が独自に同定され定量されれば、より高いＳＮＲが可能であろう。このより高いＳＮＲは、蛍光特性を対比する第２のシグナルドメインを付加することによって最大化することができる。この第２のシグナルは、生成物標的化配列に作動可能に連結したシグナルドメインによって、またはＦＲＥＴ（上記参照）によってまたは色、空間的位置、または限定されるものではないが、偏光または寿命を含めた蛍光特性に基づいて反応体区画内でそれを独自に同定する反応体標的化配列によって生じさせることができる。別の方法として、細胞質等の大きな区画では、同一区画の異なる部分に異なる点同一のバイオセンサーを置くのが可能である。
【０３５６】
４．反応体標的ドメインとして働く第２のシグナルドメインの複数コピーを持つプロテアーゼバイオセンサー
別の例において、反応体のサイズを増加させる（ＣＰ８ＹＦＰＮＬＳ−ＳＩＺＥＣＦＰｎ）は、第２のシグナル配列の複数挿入、例えば、ＥＣＦＰ（配列番号：５０）（図２９Ｃ）（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ，１９９８，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９−４４）を用いることによって達成される。このように、第２のシグナル配列の複数コピーは、核へ拡散するバイオセンサーの能力を排除することによって反応体標的ドメインとして働く。このタイプのバイオセンサーは、バイオセンサー分子あたりの利用できるさらなるシグナルの付加的利点を提供する。また、複数ルミネセンスプローブの集合の結果、ＲＦＥＴ、自己消光、エキサイマー形成等の、発言される唯一のシグナルがもたらされ得る。これは反応体に唯一のシグナルを提供できる。
【０３５７】
５．膜貫通標的化ドメインを持つ破傷風／ボツリヌスバイオセンサー
別の実施形態において、膜貫通標的化配列を用いて、反応体を細胞質小胞に連結し、別のプロテアーゼ認識部位を用いる。破傷風／ボツリヌスバイオセンサー（配列番号：２７−２８）（セルブレビン）、２９−３０（シナプトブレビン）は、ＮＬＳ（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）、Ｆｒｅｔ２５シグナルドメイン（配列番号：５２）（図２９Ａ）、セルブレビン（配列番号：１０６）（図２９Ｂ）（マクマホーン（ＭｃＭａｈｏｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：３４６−３４９，１９９３、マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）またはシナプトブレビン（配列番号：１０８）（図２９Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ６４５２０）からの破傷風またはボツリヌス亜鉛メタロプロテアーゼ認識部位、および細胞小胞へバイオセンサーを連結する３’−末端におけるセルブレビン（配列番号：１４６）（図２９Ｃ）またはシナプトブレビン（配列番号：１４４）（図２９Ｃ）からの膜貫通配列からなる。各タンパク質のＮ−末端は細胞質に向けられる。無傷バイオセンサーにおいて、ＧＦＰは小胞に連結される。破傷風またはボツリヌス亜鉛メタロプロテアーゼによる切断に際しＧＦＰは小胞ともはや会合せず、遊離されて細胞質および核全体に拡散する。
【０３５８】
ｂ．５−ドメインバイオセンサー
１．核局所化ドメインおよびアネキシンＩＩドメインに作動可能に連結した第２のシグナルドメインを持つカスパーゼ３バイオセンサー
このバイオセンサーのデザインは図３５に概略が示され、配列は配列番号：３３−３４に示される。このバイオセンサーは、反応体標的配列に作動可能に連結した第２の検出可能なシグナルＥＣＦＰ（配列番号：５０）（図２９Ａ）（シグナル２）を含めることによって配列番号：１１−１２とは異なる。
【０３５９】
２．各局所化配列およびＮＡＰ４突出ドメインに作動可能に連結した第２のシグナルドメインを持つカスパーゼ−３バイオセンサー（ＣＰ３ＹＦＰＮＬＳ−ＣＦＰＣＹＴＯ）
このバイオセンサー（配列番号：３１−３２）においては、ＮＬＳ生成物標的化ドメイン（配列番号：１２８）（図２９Ｃ）はＥＹＦＰシグナルドメイン（配列番号：４４）（図２９Ａ）の上流に存在する。ＤＥＶＤプロテアーゼ認識ドメイン（配列番号：６０）（図２９Ｂ）は、ＥＹＦＰシグナルドメインの後およびＭＡＰ４突出ドメイン（配列番号：１４２）（図２９Ｃ）の前の間にある。
【０３６０】
実施形態１１  蛍光バイオセンサートキシンの特徴づけ
本明細書中で用いるように「トキシン」とは、細胞内で見出される正常な生理学的プロセスを変更するいずれかの生物、マクロ分子、または有機もしくは無機の分子もしくはイオン、あるいは既知の生理学的プロセスのモジュレータに対する生理学的応答を変更するいずれかの生物、マクロ分子、または有機もしくは無機の分子もしくはイオンをいう。このように、トキシンは正常な細胞の刺激体を模倣することができるか、あるいは正常な細胞刺激体に対する応答を変更することができる。
【０３６１】
生細胞は、生物、マクロ分子、または有機もしくは無機分子を含むことができる毒性剤の標的である。トキシン検出、分類および同定に対する細胞−ベースのアプローチは、その外部媒体中の微小な変化を検知する細胞によって発達された感度が良くて特異的な分子検出および増幅系を開発するであろう。細胞の進化した検知能力と本明細書中に記載したルミネセンスレポータ分子およびアッセイとを組み合わせることによって、毒性剤によって引き起こされた細胞内分子および化学事象を検出可能な空間および時間ルミネセンスシグナルに変換することができる。
【０３６２】
トキシンが細胞と相互作用する場合、それが細胞表面にあるか、または特異的細胞内区画内になるかを問わず、このトキシンは細胞内で活性な分子経路の１以上の成分を不可避的に害する。細胞は相互結合した分子経路の複雑なネットワークから構成されるので、トキシンの効果は多くの細胞経路を通じて伝達されるようである。したがって、我々の戦略は、限定されるものでないが、細胞ストレス経路、代謝経路、シグナリング経路、および増殖および分裂経路を含めた、トキシンによって影響されるようである鍵となる経路内で分子マーカを用いることである。
【０３６３】
我々は、毒性治療剤のレポータとして働く３つのクラスの細胞ベースのルミネセンスレポータ分子を開発し、特徴づけた。これらの３つのクラスは以下の通りである。
【０３６４】
（１）検出器：トキシンの一般的な細胞ストレス検出、
（２）分類器：トキシンの検出および分類のための鍵となる分子経路の乱れ、および
（３）識別子：トキシンまたは一群のトキシンの活性媒介検出および同定
このように、本発明の他の特徴は、毒性剤の存在についての環境を問うバイオセンサーとして生細胞が使用される。この態様の１つの実施形態において、細胞ベースのトキシン特徴づけのための自動方法が開示され、これは、テスト物質で処理すべき細胞を含有する位置のアレイを提供し、ここに、細胞は、検出器を含む第１のルミネセンスレポータ、および検出器および分類器または識別子からなる群から選択される第２のルミネセンスレポータ分子を保有し、細胞が第１および第２のルミネセンスレポータ分子を保有する前または後に細胞をテスト物質と接触させ、複数細胞を含有する位置の各々において複数細胞をイメージまたは走査して検出器からルミネセンスシグナルを得、検出器からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換して、テスト物質中のトキシンの存在を示す、細胞上または中の検出器の位置、分布または活性の変化を自動的に測定し、その中にトキシンを有することが示されたテスト試料と接触された細胞を含有する位置を選択的にイメージし走査して、第２のレポータ分子からのルミネセンスシグナルを得、第２のルミネセンスレポータ分子からのルミネセンスシグナルをデジタルデータに変換して、細胞上または中の分類器または識別子の位置、分布または活性の変化を自動的に測定し、ここに、分類器の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在するトキシンによって乱された細胞経路を同定し、またはここに、識別子の位置、分布、構造または活性の変化は、テスト物質に存在する特異的トキシンを同定することを含む。好ましい実施形態において、細胞は少なくとも１つの検出器、分類器、および識別子を保有する。さらなる好ましい実施形態において、分類器からのデジタルデータを用いて、特異的トキシンまたはトキシンの群を同定するのにいずれの識別子を使用するかを決定する。
【０３６５】
本明細書で用いるように、語句「細胞は１以上のルミネセンスレポータ分子を保有する」は、ルミネセンスレポータ分子を、細胞によるルミネセンスレポータ分子として発現でき、ルミネセンスレポータ分子として細胞に添加することができ、またはレポータ分子に結合する色素または抗体等の、レポータ分子に結合するルミネセンス標識分子と細胞を接触させることによってルミネセンス標識することができる。ルミネセンスレポータ分子は、テスト物質での処理の前または後に発現させることができるか、または細胞に添加することができる。
【０３６６】
検出器、分類器および識別子を含むルミネセンスレポータは、別々に単一または複数の細胞型に分布させることができる。例えば、１つの細胞型はトキトン検出器を含有し、これは、トキシン活性によって活性化されると、トキシン検出器を含有する細胞と同一またはそれと異なる細胞のさらに別の集団において分類器または識別子型のレポータで同一トキシンがスクリーニングされるべきことを使用者に伝える。
【０３６７】
検出器、分類器、および識別子は同一のレポータ分子を含むことができ、あるいはそれらは異なるレポータを含むことができる。
【０３６８】
検出器、分類器および／または識別子の位置、分布、構造または活性の変化についてのスクリーニングは高スループットまたは高含有量モードで行うことができる。一般に、高含有量アッセイにより描かれる空間的情報が、もはや細胞または細胞下レベルで光学的空間分解能を要しないように記録することができれば、高含有量アッセイは高スループットアッセイに変換することができる。例えば、微小管再組織化についての高含有量アッセイは、ルミネセンス標識細胞微小管を光学的に分解し、それらの形態（例えば、束となった−対−束となっていない、または正常）を測定することによって行うことができる。微小管再組織化アッセイの高スループットバージョンは、洗剤で細胞を抽出した後に全微小管ポリマー質量を測定することのみを含むであろう。すなわち、より容易に抽出される脱安定化微小管の結果、別の処理細胞集団において、乱されないまたは薬物−安定化ルミネセンス標識微小管よりも低い全微小管質量がもたらされるであろう。従って、１以上のウェルを含有するドメインから放出されるルミネセンスシグナルは、トキシン処理および洗剤抽出の後には細胞に残存する全微小管質量に比例するであろう。
【０３６９】
トキシンを検出し、分類し、同定する方法は、限定されるものではないが、細胞質から核への移動、核から核小体への移動、受容体内部化、ミトコンドリア膜ポテンシャル、シグナル強度、レポータ分子の空間的応答、リン酸化、細胞内遊離イオン濃度、細胞サイズ、細胞形状、細胞骨格組織化、代謝プロセス、細胞移動度、細胞基質付着、細胞周期事象、および小器官の構造および機能を含めた、本出願を通じて記載された同一スクリーニング方法を利用することができる。
【０３７０】
これらの実施形態の全てにおいて、この方法は毒性−模倣および毒性−阻害モード双方で操作することができる。
【０３７１】
トキシンの存在を評価するためのかかる技術は、限定されるものではないが、テスト試料中の環境トキシンの存在をモリタリングする方法で、および化学兵器および生物兵器で利用されるトキシンで、および環境矯正の間のトキシンの存在および特徴の測定、薬物発見、臨床的適用で、および限定されるものではないが、農業、食品加工、自動車、電子、テキスタイル、医療機器、および石油産業を含めたいずれかの種々の産業による通常の開発および製造の間に有用である。
【０３７２】
我々は、３センサークラスを横切って分布した、ルミネセンス細胞ベースのレポータの例を開発し特徴づけた。ここに開示された方法は、毒性剤に応答しての各個々のレポータまたはレポータのコンビナトリアルによって創製された膨大なデータ組から有意義なパターンを抽出するために、コンピュータデータベース、およびデータの管理、採用、検索、および表示方法と組み合わせて利用することができる。そのようなデータベースおよび生物情報学方法は、限定されるものではないが、１９９９年１１月１０日に出願された米国特許出願第０９／４３７，９７６号、１９９９年７月２７日に出願された第６０／１４５，７７０号および２０００年２月１９日に出願された、割り当てられるべき米国特許出願（９８，０６７−Ｃ）に開示されたものを含む。
【０３７３】
細菌および古細菌等の原核生物、および単一細胞の真菌（例えば、酵母）、黴（例えば、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、および原生動物（例えば、Ｅｕｇｌｅｎａ）等の真核生物を含めた、いずれの細胞型を用いて本発明の態様を行うこともできる。限定されるものではないが、鳥類、両生類、昆虫、および哺乳動物細胞を含めた高等真核生物にも使用できる。
【０３７４】
バイオセンサーの例
【表２】
0003576491.tif 000003
センサークラス：Ｄ＝トキシンの検出器、Ｃ＝トキシンの分類器、Ｉ＝トキシンまたはトキシンの群の識別子
モデルトキシンは、一般に、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入できる。
【０３７５】
検出器の例：このクラスのセンサーは、毒性剤の存在を示す第１の系のシグナルを提供する。このクラスのセンサーは、測定がなされるドメインのみに限定される分解を要する一般的細胞ストレスの検出を提供し、それらは同様に高含有量スクリーニングに使用できる。このように、限定されるものではないが、細胞質から核への熱ショック因子の移動、およびミトコンドリア膜ポテンシャル、細胞内遊離イオン濃度検出（例えば、Ｃａ２＋、Ｈ＋）、一般的代謝状態、細胞周期タイミング事象、および小器官の構造および機能を含めた、高スループットおよび高含有量スクリーニングモードいずれかを使用することができる。
【０３７６】
１．ミトコンドリアポテンシャル
細胞ホメオスタシスの維持に対する鍵は一定のＡＴＰエネルギーチャージである。ＡＴＰおよびその代謝産物ＡＤＰ、ＡＭＰ、無機リン酸塩、および溶液−相プロトンのサイクリングを連続的に調整して、細胞の異化および同化必要性に適合させる。ミトコンドリアは、一義的には、全細胞を通じて一定のエネルギーチャージの維持を担う。その構成要素からＡＴＰを生産するには、ミトコンドリアはオルガモラそれ自体内に一定の膜ポテンシャルを維持しなければならない。従って、特異的ルミネセンスプローブでのこの電気ポテンシャルの測定は、細胞ストレスの感受性で迅速な読み出しを提供する。
【０３７７】
我々は、ミトコンドリアポテンシャルの測定のために、細胞に拡散し、ミトコンドリア膜に容易に分配される、正に荷電したシアニン色素ＪＣ−１（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を利用した。ＪＣ−１の光物理学は、プローブがミトコンドリア膜に分配され、それが電気ポテンシャル＞１４０ｍＶを経験すると、プローブが集合し、そのスペクトル応答が赤色にシフトするようなものである。膜ポテンシャル値＜１４０ｍＶにおいて、ＪＣ−１は一義的にモノマーであり、そのスポクトル応答は青色にシフトする。従って、ミトコンドリアに分配されたＪＣ−１の２つの発光（６４５ｎｍおよび５３０ｎｍ）の比率は、ミトコンドリア膜ポテンシャルの感受性で連続的測定を提供する。
【０３７８】
我々は、トキシンストレスの一般化されたインジケータの基礎として高スループットモードにおいて生細胞測定を行ってきた。我々の初期実験の目標は、トキシンストレスの前および後におけるそのモノマー形態に対するＪＣ−１色素のＪ−凝集体の比率を測定することであった。
【０３７９】
手法
１．細胞を平板培養し、一晩まで培養した。
【０３８０】
２．細胞をＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて、ＪＣ−１（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間染色した。
【０３８１】
３．次いで、細胞を３７℃でＨＢＳＳで迅速に洗浄し（２回、１５０μｌ／ウェル）、必要であれば、トキシンを添加し、全プレートをプレートリーダーで走査した。ＪＣ−１モノマーは４８５ｎｍ励起／５３０ｎｍ発光波長フィルタ組で最適に測定され、凝集体は５９０ｎｍ励起／６４５ｎｍ発光波長組で最良に測定された。
【０３８２】
結果
いくつかのタイプの生細胞内のミトコンドリアポテンシャル、およびポテンシャルに対するトキシンの効果は、蛍光比率Ｅｍ６４５（５９０）／Ｅｍ５３０（４８５）（括弧中は励起波長）を用いて測定した。例えば、我々は、ＬＬＣＰＫ細胞（ブタ上皮）内のミトコンドリアポテンシャルに対する１０μＭバリノマイシンの効果を測定した。数秒の測定内で、トキシンは、未処理細胞で見出されるものよりもミトコンドリアポテンシャルでより迅速で高い大きさの減少（ほぼ５０％減少）を誘導した。また、肝臓細胞は、バリノマイシンに感受性であると測定され、ミトコンドリアポテンシャルの変化は、種々の濃度のトキシンの添加後に数秒から数分内でほとんど完了した。
【０３８３】
これらの結果は、細胞ストレスのモデル細胞内検出器であるミトコンドリアポテンシャルと合致する。これらの測定は、個々の細胞内で空間的分解能を要しないので、ミトコンドリアポテンシャル測定は全細胞アレイで迅速になすことができる（例えば、高スループット）。これは、例えば、多くの細胞型の複合体アレイが、一般化されたトキシン応答として同時に連続的にプローブできることを意味する。そのようなインジケータは、一般的なトキシンストレスが試料に存在することを示す第１の系のシグナルを提供することができる。次いで、さらなるアッセイを行って、細胞分類器もしくは識別子タイプのレポータ分子を用いトキシンをより特異的に同定することができる。
【０３８４】
２．熱ショックタンパク質
ほとんどの哺乳動物細胞は、ストレスタンパク質と呼ばれるタンパク質のファミリーの誘導で種々の環境刺激に応答するであろう。酸素欠乏、アミノ酸アナログ、スルフヒドリル−反応試薬、遷移金属イオン、酸化的リン酸化脱カップラー、ウイルス感染、エタノール、抗生物質、イオノフォア、非ステロイド抗炎症薬物、熱ストレスおよび金属キレーターは、全て、細胞ストレスタンパク質合成、機能または双方の誘導因子である。誘導に際しては、細胞ストレスタンパク質はタンパク質を折り畳み、ほどき、異常立体配置でタンパク質を安定化し、ＤＮＡ損傷を修復するのに役割を演じる。
【０３８５】
細胞のストレス活性化に際して、少なくとも４つの熱ショックタンパク質が細胞質から核に移動する証拠がある。これらのタンパク質は熱ショックタンパク質ＨＳＰ２７およびＨＳＰ７０、熱ショック同族体ＨＳＣ７０、および熱ショック転写因子ＨＳＦ１を含む。従って、これらのタンパク質（および細胞ストレスに際して細胞質から核へ移動する他のストレスタンパク質）の細胞質から核への移動の測定は、細胞ストレスの迅速な読み出しを提供するであろう。
【０３８６】
我々は、細胞にストレスを与える生物学的トキシンとしての重金属化学化合物のライブラリを用いて、２つの細胞系において（ＢＨＫおよびＨｅＬａ）ＨＳＰ２７−ＧＦＰバイオセンサー（配列番号１６９−１７０）の応答をテストした。略言すれば、ＨＳＰ２７−ＧＦＰバイオセンサーを発現する細胞を９６−ウェルマイクロプレートに平板培養し、付着させる。次いで、細胞を細胞ストレス−誘導化合物のパネルで処理する。融合タンパク質の絶対的細胞質局所化が未刺激細胞で見出された。
【０３８７】
他の同様の熱ショックタンパク質バイオセンサー（ＨＳＰ−７０、ＨＳＣ７０、およびＧＦＰに融合したＨＳＦ１）を検出器として使用することができ、これを配列番号：１７１−１７６に示す。
【０３８８】
分類器の例
このクラスのセンサーは、トキシンで乱された細胞経路を同定することによって、トキシンの存在を検出し、さらにそれを分類する。それ自体、この組のセンサーは、トキシンを検出しおよび／または限定されるものではないが、「シグナル変換に影響するトキシン」、「細胞骨格に影響するトキシン」および「タンパク質合成に影響するトキシン」を含めた広いカテゴリーにトキシンを分類することができる。高スループットまたは高含有量スクリーニングモードいずれかを用いることができる。分類器は、限定されるものではないが、チューブリン、微小管−結合タンパク質、アクチン、限定されるものではないがビンキュリン、α−アクチン、アクチン脱重合因子／コフィリン、プロフィリン、およびミオシンを含めたアクチン−結合タンパク質、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ、限定されるものではないがｒａｃ、ｒｈｏおよびｃｄｃ４２を含めたＧＴＰ−結合タンパク質、および限定されるものではないがｐ３８マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼを含めたストレス−活性化プロテインキナーゼを含めた化合物を含むことができる。
【０３８９】
１．チューブリン−細胞骨格
細胞骨格はエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、小胞輸送、および有糸分裂等の、細胞機能およびプロセスで主要な役割を演じる。Ｃ２トキシン、およびいくつかのクラスのエンテロトキシン等のタンパク質性および非タンパク質性形態の細胞骨格−影響トキシンは細胞骨格に直接的に作用するか、あるいは細胞骨格の組織化を制御する調節成分を介して間接的に作用する。従って、細胞骨格における構造変化の測定は、トキシンの細胞骨格−影響トキシンへの分類を提供することができる。このアッセイは、上述したように高含有量モードで、あるいは高スループットモードで行うことができる。高スループットについては、上述した通りである。
【０３９０】
かかる測定は、限定されるものではないが、抗−微小管剤、一般に細胞周期進行および細胞増殖、細胞会シグナル変換、および代謝プロセスに一般に影響する剤を含めたトキシンの同定で価値があるであろう。
【０３９１】
微小管破壊アッセイでは、チューブリン−ＧＦＰバイオセンサープラスミドで安定に形質転換したＬＬＣＰＫ細胞を５０−６０％密集にて９６ウェル細胞培養皿で平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。通常の培養培地中の一連の濃度（１０−５００ｎＭ）の５つの化合物（パクリタキセル、クラシンＡ、ノコダゾール、ビンクラスチン、およびコルヒチン）をストックから新たに調製し、細胞培養皿に添加して、古い培養培地を置き換えた。次いで、１２時間時点で、細胞を上述した細胞スクリーニングシステムで観察した。
【０３９２】
我々のデータは、チューブリンキメラが細胞を通じて微小管に局所化し、それに組み立てられることを示す。このキメラを発現する細胞における微小管アレイは、以下のように、種々の抗−微小管化合物に応答する：
薬物 応答
ビンブラスチン  脱安定化
ノコダゾール    脱安定化
パクリタキセル  安定化
コルヒチン      脱安定化
クラシンＡ      脱安定化
（出典明示して全体に参照として組み込まれる、１９９７年５月２９日に出願された米国特許第０８／８６５，３４１号に記載されたもののような）細胞アレイにパターン化されたチューブリンバイオセンサーを発現する細胞を用いて同様のデータが得られ、上述したように投与した。
【０３９３】
２．ＮＦ−κＢ
ＮＦ−κＢは基本的レベルの刺激では細胞質にあり、負傷に際して核に移動し、そこで、それは特異的ＤＮＡ応答要素に結合し、多数の遺伝子の転写を活性化する。特異的リン酸化および普遍的事象に応答してプロテオソームによってＩκＢが分解されると、移動が起こる。ＩκＢは、通常は、タンパク質との直接的相互作用を介してＮＦ−κＢを細胞質に保持し、ＮＦ−κＢのＮＬＳ配列をマスクする。従って、全シグナルカスケードの初期または規定する事象ではないが、核へのＮＦ−κＢ移動は細胞ストレスのインジケータとして働くことができる。
【０３９４】
我々は、生細胞における分析のためにＮＦ−κＢ−ＧＦＰキメラを創製した。これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られたＥＹＦＰ  ＰＣＲアンプリマーに融合したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した特徴づけられたＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｃＤＮＡを用いて、標準的なポリメラーゼ鎖反応を用いて達成された。得られたキメラは配列番号：１７７−１７８に示す。２つのＰＣＲ産物を、普遍的ＣＭＶプロモータを用いて高レベルでキメラタンパク質を生じるように設計された真核生物発現ベクターに連結した。
【０３９５】
ＮＦ−κＢ免疫局所化
さらなる実験のために、我々は、トキシン処理細胞における免疫局所化によって内因性ＮＦ−κＢ活性化を特徴づけた。この実験で使用したＮＦ−κＢ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入し、二次抗体はモレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）からのものである。
【０３９６】
３Ｔ３およびＳＮＢ１９細胞タイプでは、我々は、容量当たりの質量（ｎｇ／ｍｌ）の単位およびモル濃度の単位で表した、最大の５０％の応答レベル（ＥＣ５０）を生じた有効濃度を決定した。ＴＮＦαおよびＩＬ−１α双方についての１７ｋＤの分子量に基づき、３Ｔ３およびＳＮＢ１９細胞型でのこれらの２つの化合物についてのＥＣ５０レベルを表１にモル濃度の単位で与える。我々の結果は、ゼロから最大用量の相対応答の再現性を示し、しかし試料間では、ゼロ濃度での応答のベースライン強度で場合によってはシフトがあった。
【０３９７】
これらの実験では、１０または１００ＴＮＦα−処理３Ｔ３またはＳＮＢ１９細胞／ウェルをテストした。これらの試料について測定された標準偏差に基づき、かつスチューデントｔ−検定でｔ−値を取ることによって、我々は、細胞型、化合物、ウェル当たりの細胞数の各々の場合につき、および条件当たりいくつのウェルがサンプリングされたかの異なる選択につき、最小検出可能用量を評価した。後者の因子は、データの試料で提供される自由度の数を決定する。ウェルの数を４から１６に増加させ、ウェル当たりの細胞の数を１０から１００に増加させると、最小検出可能用量をかなり改良する。ＳＮＢ１９細胞よりも低い最小検出可能用量を示す３Ｔ３細胞では、および１％偽陰性および１％偽陽性率の場合では、我々は、ウェル当たり１００細胞および１２または１６ウェルのサンプリングが、０．１５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値とほぼ等しい用量を検出するのに十分である。偽陽性率が２０％まで緩和されると、その値のほぼ半分の濃度が検出することができる（０．８３ｎｇ／ｍｌ）。便宜には、１ｍｍ２未満の細胞培養表面にわたり、１００細胞をサンプリングすることができる。
【０３９８】
表１．（双方について１７ｋＤの分子量に基づく）ＴＮＦαおよびＩＬ−１αに対するＥＣ５０レベル
【表３】
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３．ホスホ−ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐｐ３８ＭＡＰＫ）
ＭＡＰＫは細胞増殖および分裂においてのみならず、細胞ストレス応答のメディエイターとして役割を演じる。１つのＭＡＰＫであるｐ３８は、超オスモルソルビトール、過酸化水素、亜ヒ酸塩、カドミウムイオン、アニソマイシン、サリチル酸ナトリウムおよびＬＰＳ等の化学ストレス誘導因子によって活性化される。ｐ３８の活性化もまた核から細胞質への移動によって達成される。
【０３９９】
ＭＡＰＫ  ｐ３８はキナーゼのカスケードである経路にある。このように、ｐ３８は１以上のキナーゼの基質であり、それは、生細胞内で時間および空間的に１以上の基質をリン酸化するように作用する。
【０４００】
ここに我々が提示するアッセイは、トキシン−処理細胞においてｐ３８のリン酸化形態の免疫局所化を用い、そのパラメータの１つとしてｐ３８活性化を測定する。このアッセイは同一の個々の細胞内で他のパラメータの同時測定を誘導するのに十分柔軟であるように開発された。転写因子ＮＦ−κＢによって媒介されるシグナル変換経路もまた細胞ストレス応答に関与することが知られているので、我々はＮＦ−κＢの活性化を同一アッセイにおける第２のパラメータとして含めた。
【０４０１】
我々の実験は、免疫蛍光アプローチを用いて、ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化を単独で、または同一細胞におけるＮＦ−κＢ活性化と組み合わせて測定することができる。複数細胞型、モデルトキシン、および抗体をテストし、双方の経路の有意な刺激を高含有量モードで測定した。この実験で用いたホスホ−ｐ３８抗体は、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から購入した。我々は、少なくとも１つの細胞ストレスシグナリング経路が同時に測定できるのみならず、モデルトキシンのクラスに異なって応答することを報告する。図３６は３ｚｋモデルトキシンおよび２つの異なる細胞型を横切ったｐ３８  ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢ経路の異なる応答を示す。単独で添加すると、モデルトキシン（ＩＬ  １α、ＴＮＦαおよびアニソマイシン）の３つは、特異的経路のアクチベータして２つのアッセイによって区別できることに注意されたし。
【０４０２】
ＩκＢキメラ
ＩκＢ分解は、ＮＦ−κＢの核移動およびＮＦκＢ−媒介ストレス応答の活性化に至る鍵となる事象である。我々は、高スループットモードで分類器としてＮＦ−κＢセンサーを補充するためにこのセンサーを選択した：ＩκＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の分解のためシグナルの喪失の測定は、個々の細胞内で空間的分解能は必要とせず、それ自体は、我々はＩκＢ分解測定は全細胞基質で迅速になされると考える。
【０４０３】
このバイオセンサーはＩκＢの最初の６０個のアミノ酸のＧＦＰのＦｒｅｄ２５変種への融合に基づく。配列番号１７９−１８０。ＩκＢのこの領域は、プロテオソーム分解をバイオセンサーに付与するのに必要なリン酸化部位および普遍化部位を含めた、全ての調節配列を含有する。これを知り、ＮＦκＢ移動に典型的には至るいずれかの経路の刺激の結果、このバイオセンサーの分解がもたらされる。ＩκＢ−ＧＦＰを発現する細胞の蛍光強度のモニタリングは、分解プロセスを同定する。
【０４０４】
識別子の例
我々のトキシン同定戦略では、最初の２つのレベルの特徴づけは、多くの新しい突然変異体トキシンを検出し、または既知のトキシンのいくつかの複雑な混合物を明らかにする能力を犠牲とすることなく、トキシンクラスの迅速な読み出しを確実とする。第３のレベルのバイオセンサーは識別子であり、これは、特異的なトキシンまたはトキシンの群を同定することができる。１つの実施形態において、識別子は、特異的トキシンの活性に応答するプロテアーゼバイオセンサーを含む。他の識別子はそれらの活性に特異的なレポータ／バイオセンサーで生成される。これらは、限定されるものではないが、リン酸化またはＡＤＰ−リボシル化、細胞小器官または区画の間の移動、特異的小器官または細胞構成要素に対する効果（例えば、膜浸透性、細胞骨格再配置等）等の翻訳後修飾を含む。
【０４０５】
ＡＤＰ−リボシル化トキシン−これらのトキシンは、シュードモナストキシンＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｘｉｎ  Ａ）、ジフテリアトキシン、ボツリヌストキシン、百日咳トキシンおよびコレラトキシンを含む。例えば、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ２トキシンは細胞骨格タンパク質アクチンにおいてＡｒｇ１７７のＡＤＰ−リボシル化を誘導し、このように、この組み立て特性を改変する。アクチン−細胞骨格調節を測定するための分類器アッセイの構築以外に、特異的アクチンＡＤＰ−リボシル化を検出するために識別子アッセイを構築することができる。ＡＤＰ−リボシル化は、もはや修飾されたアッセイに重合させない立体配置変化を誘導するので、ルミネセンス試薬を用いて、いくつかの可能な方法で、この立体配置変化を細胞内で検出することができる。例えば、アクチンは、定常状態蛍光異方性を用いて細胞内アクチンの回転拡散の測定を可能とする適当な励起状態寿命を持つ蛍光試薬を用いて、ルミネセンス標識することができる。すなわち、トキシン−修飾アクチンは、もはや、剛直なフィラメントに組み立てることができず、従って、比較的低い異方性を持つルミネセンスシグナルを生じるに過ぎず、これは、シメージングシステムで容易に測定することができる。別の実施形態において、アクチンは、付着された試薬のスペクトルシフトを通じてアクチン−立体配置の変化を報告する極性−感受性蛍光試薬で標識することができる。すなわち、トキシン−処理は、２つの蛍光波長の比率がアクチンＡＤＰ−リボシル化の測定を提供するように、細胞内アクチンの立体配置変化を誘導するであろう。
【０４０６】
細胞毒性ホスホリパーゼ−いくつかのグラム陰性細菌種は細胞毒性ホスホリパーゼを生産する。例えば、ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は、ホスホイノシチドの切断に特異的なホスホリパーゼＣを生産する。これらのホスホイノシチド（例えば、イノシトール１，４，５−三リン酸）は、細胞内小器官からカルシウムイオンを放出する。高含有量または高スループットいずれかとして行うことができるアッセイは、金属イオンと複合体化させた場合に改変されたスペクトル特性を有する蛍光試薬を用いてカルシウムイオンの放出を測定するように構築することができる。従って、ホスホリパーゼＣベースのトキシンの作用の直接的結果は、細胞カルシウムイオン濃度の変化として測定することができる。
【０４０７】
剥離トキシン−これらのトキシンはいくつかのブドウ菌種属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）によって生産され、いくつかの血清型からなる。これらのトキシンの特異的識別子は、それらの標的小器官であるデスモソームの形態的変化（これは細胞間の接合で起こる）を測定することによって構築することができる。剥離トキシンは、デスモソームの形態を、ヘミデスモソームと呼ばれる２つのより小さい区画に変化させることが知られている。剥離トキシンについての高含有量アッセイにおいて、そのデスモソームがルミネセンス標識された上皮細胞はイメージ分析に付される。デスモソームおよびヘミデスモソームの間の形態変化を検出する方法を用いて、細胞に対するトキシンの活性を定量する。
【０４０８】
これらの識別子のほとんどは、空間分解能を要しない高スループットアッセイ、ならびに高含有量アッセイで用いることができる。
【０４０９】
いくつかの生物学的危険剤は特異的プロテアーゼとして作用し、このように、我々は、標的タンパク質内に見出される特異的アミノ酸配列のタンパク質分解切断を報告する蛍光タンパク質バイオセンサーの開発に焦点を当ててきた。
【０４１０】
カスパーゼバイオセンサー、炭疽、破傷風、ボツリヌス、および亜鉛メタロプロテアーゼ等の多数のそのようなプロテアーゼバイオセンサー（ＦＲＥＴバイオセンサーを含む）を前述で開示する。ＦＲＥＴは、そのうち多くがトキシン活性に関連するタンパク質立体配置の小さな変化が生細胞内で時間および空間にて高い精度で測定できるのみならず、上述したように高スループットモードで測定することができる点で強力な技術である。
【０４１１】
上述したように、当業者であれば、本発明のこの態様のプロテアーゼバイオセンサーは、構築体のいずれかにおいて適当なプロテアーゼ認識部位の置換によって、いずれかのプロテアーゼの活性を報告するように適合できることを認識するであろう（図２９Ｂ）。前述で開示したように、これらのバイオセンサーは高含有量または高スループットスクリーニングで用いて、トキシンによる酵素活性のインビボ活性化を検出し、既知の認識モチーフの切断に基づく特異的活性を同定することができる。これらのバイオセンサーは生細胞および固定終点がアッセイ双方で用いることができ、さらなる測定と組み合わせてマルチパラメータアッセイを提供することができる。
【０４１２】
炭疽ＬＦ
炭疽は生物兵器のよく知られた剤であって、識別子クラスにおけるバイオセンサーの開発のための優れた標的である。致死因子（ＬＦ）は、炭疽に毒性を付与するタンパク質成分の１つであり、最近、細胞内のその標的の２つが同定された。ＬＦは、ＭＡＰ−キナーゼシグナリング経路の一部であるキナーゼであるＭｅｋ１およびＭｅｋ２タンパク質を特異的に切断するメタロプロテアーゼである。致死因子プロテアーゼバイオセンサーの構築は前述する。（配列番号：７−８、９−１０）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）はＭｅｋ１またはＭｅｋ２（または双方）のアミノ末端でインフレーム融合しており、その結果、標的分子の双方に存在する核輸出配列（ＮＥＳ）の存在のため細胞質に保持されるキメラタンパク質が得られる。活性致死因子による切断に際して、ＧＦＰはキメラから放出され、遊離されて核に拡散する。従って、核におけるＧＦＰの蓄積を測定すると、その天然標的（生細胞）に対するＬＦ活性の直接的測定を提供する。
【０４１３】
本発明の好ましい形態を図面で示し、記載してきたが、好ましい形態において変形は当業者に明らかであるので、本発明は示され記載された特定の形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、その代わり、特許請求の範囲に記載したように解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、細胞ベースの走査システムの構成要素の図を示す。
【図２】図２は、顕微鏡サブアセンブリの概略図を示す。
【図３】図３は、カメラサブアセンブリを示す。
【図４】図４は、細胞走査システムのプロセスを示す。
【図５】図５は、使用者を導く主な機能を示すユーザインターフェースを示す。
【図６】図６は、１つのプラットフォームがマイクロタイタープレートの全てのウェルを読むために望遠鏡レンズを用い、第２のプラットフォームがウェル中の個々の細胞を読むために高倍率レンズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムの２つのプラットフォーム構築体のブロック図である。
【図７】図７は、マイクロタイタープレートの全てのウェルを読むために移動可能な「望遠鏡」レンズおよびウェル中の個々の細胞を読むための移動可能な高倍率レンズを用いる、細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムの単一プラットフォーム構築体についての光学系の詳細である。
【図８】図８は、細胞ベースのスクリーニングシステムについての動的データを取得するための流体送達システムの説明である。
【図９】図９は、細胞ベースの走査システムについての処理工程のフローチャートである。
【図１０】図１０Ａから図１０Ｊは、核移動アッセイの戦略を示す。
【図１１】図１１は、マイクロタイタープレートの高スループットおよび高含有量スクリーニングを組み合わせる細胞ベースのスクリーニングのためのデュアルモードシステムにおける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１２】図１２は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高スループットモードにおける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１３】図１３は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高含有量モードにおける処理工程を規定するフローチャートである。
【図１４】図１４は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高含有量モードにおいて動的データを取得するのに必要な処理工程を規定するフローチャートである。
【図１５】図１５は、動的データの取得の間にウェル内で行われた処理工程を規定するフローチャートである。
【図１６】図１６は、移動の既知の阻害剤からのデータの例である。
【図１７】図１７は、移動の既知の刺激体からのデータの例である。
【図１８】図１８は、グラフ表示についてのデータ提示を示す。
【図１９】図１９は、細胞ベースのスクリーニングのためのシステムの高スループットモードからのデータ、高含有量モードまで通過したデータの例、高含有量モードで取得されたデータ、そのデータの解析の結果の説明である。
【図２０】図２０は、薬物−誘導の細胞質から核への移動の測定を示す。
【図２１】図２１は、図２０に示された測定のグラフ使用者インターフェイスを示す。
【図２２】図２２は、図２０に示された測定の、データ提示での、グラフ使用者インターフェイスを示す。
【図２３】図２３は、図２０に示された測定から得られた動的データを表すグラフである。
【図２４】図２４は、薬物−誘導アポトーシスの高含有量スクリーニングの詳細を示す。
【図２５】図２５は、アポトーシスの誘導に際しての形態の変化を示すグラフ。スタウロスポリン（Ａ）およびパクリタキセル（Ｂ）はＬ９２９細胞において古典的な核断片化を誘導する。ＢＨＫ細胞はスタウロスポリン（Ｃ）に応答するが、パクリタキセル（Ｄ）に対してより古典的に応答する濃度依存的変化を呈する。ＭＣＦ−７細胞は、各々、スタウロスポリンおよびパクリタキセルに応答する核凝縮（Ｅ）または断片化（Ｆ）いずれかを呈する。全ての場合において、細胞は化合物に３０時間暴露された。
【図２６】図２６は、核のサイズおよび核の周囲の複雑性双方の項目におけるスタウロスポリンに対する細胞の用量応答を示す。
【図２７】図２７は、核周囲ｆ−アクチン含有量の変化に至る、スタウロスポリンおよびパクリタキセルによるアポトーシスの誘導を示すグラフ。（Ａ，Ｂ）双方のアポトーシス刺激体はＬ９２９細胞においてｆ−アクチン含有量の用量−依存的増加を誘導する。（Ｃ）ＢＨＫ細胞においては、スタウロスポリンはｆ−アクチンの用量−依存的増加を誘導し、他方、パクリタキセル（Ｄ）はより変化する結果を生じる（Ｅ）ＭＣＦ−７細胞は、スタウロスポリンの濃度に応じて減少または増加いずれかを呈する。（Ｆ）ｆ−アクチン含有量のパクリタキセル誘導変化はかなり変化し、有意ではなかった。細胞は３０時間化合物に暴露した。
【図２８】図２８は、アポトーシスの誘導に応答するミトコンドリア変化を示すグラフ。Ｌ９２９（Ａ，Ｂ）およびＢＨＫ（Ｃ，Ｄ）細胞はスタウロスポリン（Ａ，Ｃ）およびパクリタキセル（Ｂ，Ｄ）双方に応答し、ミトコンドリア質量の増加が伴った。ＭＣＦ−７細胞は刺激体に応じて、膜ポテンシャルの減少（Ｅ，スタウロスポリン）またはミトコンドリア質量の増加（Ｆ，パクリタキセル）いずれかを呈する。細胞は３０時間化合物に暴露した。
【図２８Ｇ】図２８Ｇは、ＢＨＫ細胞におけるミトコンドリア質量およびミトコンドリアポテンシャルに対するスタウロスポリン効果の同時測定を示すグラフである。
【図２９Ａ】図２９Ａは、種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す。（Ａ）シグナル配列。（Ｂ）プロテアーゼ認識部位。（Ｃ）生成物／反応体標的配列。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す。（Ａ）シグナル配列。（Ｂ）プロテアーゼ認識部位。（Ｃ）生成物／反応体標的配列。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、種々のタイプのプロテアーゼバイオセンサードメインについての核酸およびアミノ酸配列を示す。（Ａ）シグナル配列。（Ｂ）プロテアーゼ認識部位。（Ｃ）生成物／反応体標的配列。
【図３０】図３０は、本発明のプロテアーゼバイオセンサーにおけるドメインのいくつかの基本的組織化を概略的に示す。
【図３１】図３１は、特異的３−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの概略図である。
【図３２】図３２は、図３２に示されたカスパーゼバイオセンサーを発現する発現ベクターでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞に対するシスプラチンによるアポトーシスの刺激の効果を示す写真である。
【図３３】図３３は、特異的４−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの概略図である。
【図３４】図３４は、核小体局所化シグナルを含有する特異的４−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの概略図である。
【図３５】図３５は、特異的５−ドメインプロテアーゼバイオセンサーの概略図である。
【図３６】図３６は、３つのモデルトキシンおよび２つの異なる細胞型を横切るｐ３８  ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢ経路のデュアル標識アッセイにおける異なる応答を示す。星印でマークした処理は９９％信頼レベル（ｐ＜０．０１）で対照とは異なる。
【配列表】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３６】
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