(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物材料から濁り安定性抽出物を製造する方法であって、ガラクタナーゼ、α−アラビノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼおよびラムノガラクツロナーゼからから成る群から選択される１又は複数の酵素を使用し、添加される酵素が、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ又はペクタートリアーゼの有意な活性を有しない、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
抽出物がジュース、ネクター、ベース又は濃縮物である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
前記植物材料が野菜又は果実から得ることのできる、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
前記果実が、りんご、なし、カンキツ類、トマト、ぶどう、黒すぐり、赤すぐり、きいちご、ストロベリー、つるこけもも、干しすもも、さくらんぼ、パイナップルおよび、全ての種類のトロピカルフルーツから成る群から選ばれる、請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
前記果実がりんごである、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
前記野菜が、ニンジン、セロリーおよびたまねぎから成る群から選ばれる、請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項７】
前記カンキツ類が、オレンジ、レモン、ライムおよびマンダリンみかんから成る群より選択される、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項８】
更に、ラムノガラクツロナン  アセチルエステラーゼを使用する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】
更に、エンドグルカナーゼを使用する、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
近年の植物抽出技術における傾向は、多種類の原料の使用、これらの原料のより完全な利用、加工のスピード化および多様の基盤および完成品の紹介への移行にある。これらの幾つかの開発は、存在するプロセスおよびプロセス装置の改善を通じて、並びに新しいプロセスおよび装置を通して可能になっている。プロセス助剤としての酵素調製品の使用は、これらの開発における重要な役割を演じている。
果物ジュース製造間中、酵素調製品が、果実の抽出と液化および果汁の清澄化の工程においてしばしば用いられる。商業上の酵素調製品には、ペクチンポリマー（ペクチン  リアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ガラクツロナーゼ、アラビナーゼを含めて）並びにセルラーゼおよびキシラナーゼのような酵素を分解する酵素の混合物が含まれる。
新しい開発が、植物材料からの濁ったジュースおよび抽出物の方向へと進んでいる。幾つかのこれらの抽出物が濁った状態に留まり、一方ほかの抽出物が自然に清澄化するメカニズムについては十分に理解されていない。従って、濁りと濁り安定性についてより多く学ぶための研究が強調されている。
ペクチン（ペクチン−ポリマー）は、より高等植物細胞壁の成分として天然に発生している。それらは、第一次細胞壁中並びにそれらがセルロース繊維中埋め込まれている真中の薄層中に見出される。ペクチンの組成は、植物と植物の間で変化することができそして更に果物の年令と成熟度に依存する。ペクチンに最も富む起源の中では、レモンとオレンジが存在し、これはこの30％までの多糖類を含有できる。
大抵のペクチン−ポリマーは、平滑な領域、すなわち線状ホモガラクツロナンおよび毛状の（枝状に広がった）領域から成り立っている。
線状ホモガラクツロナンは、1,4−結合のα−Ｄ−ガラクツロナン酸の鎖から構成され、ガラクツロナン酸は、様々の程度までメトキシル化されており、そして更に部分的にアセチル化されていてもよい。線状ホモガラクツロナンは、種々の酵素により分解されることができ解重合されることができる：β分解により高度にメトキシル化されたペクチンのガラクツロノシル基を分解するペクチン  リアーゼ。ペクチン  リアーゼは、β脱離により非メトキシル化部分中のガラクツロノシル結合を分解し、そしてポリガラクツロナーゼは、ホモガラクツロナン中のグリコシド結合（glycosidic linkages）を加水分解する。ペクタート  リアーゼおよびポリガラクツロナーゼの作用は、ホモガラクツロナンからメタノールの除去を触媒するペクチン  メチルエステラーゼにより促進され、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）の形成をもたらす。ホモガラクツロナンを解重合すべき能力を有する酵素又は酵素の組み合わせは、以下の記載においてホモガラクツロナン解重合酵素と称される。
毛状領域は、長さが変化する側鎖を有するラムノガラクツロナン主鎖から成る。ペクチンの毛状領域は不均一であるかもしれず、多数の枝分れを有する領域を有し、より少ない程度に多数の枝分れを有する領域を有しそして主鎖がβ−結合キシロースを有する多数の枝分れを有するガラクツロン酸（キシロガラクツロナン）に富む領域を有する。
毛状領域の非常に複雑な構造を有する組成は、植物細胞壁の起源に従って変化する：注Schols et al.in Carbohydrate Research 206,1990,pp.117−129;O'Neill et al.in“Methods in Plant Biochemistry",Vol.2,Carbohydrates,P.M.Dey（Ed.）,1990,Academic Press,London,pp.415−441;Voragen and Schols in“Structural Studies of Plant Cell−Wall Polysaccharides Using Enzymes",Special Publication No.134,The Royal Society of Chemistry 1993 and Carpita and Gibeaut in The Plant Journal 3（１）,1993,pp.1−30。ラムノガラクツロナンは、主鎖中に多少規則的に変化するラムノースおよびガラクツロン酸を有する多糖である。毛状領域中のラムノガラクツロナン主鎖は、ガラクツロン酸残基上にアセチル基を有する（注H.A.Schols in Carbohydrate Research 206,1990,pp.117−129）。
毛状領域の主鎖の分解は、ラムノガラクツロナーゼ（RGases）と称される酵素により行なわれる。RGasesは、ラムノースとガラクツロン酸間の結合を加水分解すると信じられている。RGasesの活性を促進するために、例えば酵素ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼの使用により、主鎖のアセチル化の程度を減少させることが望ましい（注Searle−van Leeuwen et al.in Appl.Microbiol.Biotech.38,1992,p.347−349）。更に、毛状領域の部分の枝分れの減少程度は、ラムノガラクツロナーゼの活性を促進し得る。枝分れの減少程度は、側鎖を攻撃する酵素によって得ることができる。
アスペルギルスアクレタス（Aspergillus aculeatus）由来のRGaseの単離および精製は、Schols et al.in Carbohydrate Research 206,1990,p.105−115より記載されている。A.アクレタス由来の他のタイプのRGaseは国際公開公報（WO）92/19728に記載されている。
毛状領域の主鎖を攻撃する酵素は、毛状領域の主鎖を（加水分解、β−脱離又は他の方法により）攻撃する能力を有する全ての酵素又はこれらの酵素の組み合わせとして次の記載において明定されており、例えばラムノガラクツロナーゼ含有酵素調製品である。
キシロース、ガラクトースおよびアラビノースの如き単糖類、および少糖類並びにアラビナン、ガラクタンおよびアラビノガラクタンの如き多糖類は側鎖を含む。
ガラクタンは、主鎖中にβ−1,4結合のガラクトースを含有する。ガラクタンは、β−1,4−ガラクタナーゼ（EC 3.2.1.89）（簡単にはガラクタナーゼ）により分解される。R.F.H.Dekker and G.N.Richards,“Hemicellulases,their Occurence,Purification,Properties and Mode of Action"in R.S.Tipson and D.Horton,Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,Academic Press 32,277−352（1976）;R.F.H.Dekker,“The Hemicellulase Group of Enzymes",in J.M.V.Blanchard and J.R.Mitchell,Polysaccharides in Food,Butterworths,93−108（1979）,and A.G.J.Voragen,F.Geerst and W.Pilnik“Hemicellulases in Enzymatic Fruit Processing",in P.Depuy,Use of Enzymes in Food Technology,Technique et Documentation Lavoisier,497−502（1982）を参照することができる。ガラクタナーゼの一つの例は、WO92/13945中に記載されたガラクタナーゼである。
更に、ガラクタンおよびガラクトースの側鎖は、エキソ使用酵素のβ−ガラクトシダーゼにより分解される。
ガラクタンは、アラビノース側鎖（アラビノガラクタン）を有し、これらの側鎖はα−アラビノシダーゼにより加水分解される。アラビノース側鎖の部分又は完全除去は、ガラクタナーゼの活性を促進するであろう。アラビナンは、互いにα−（１−＞５）結合したα−Ｌ−アラビノースサブユニットおよび主鎖にα−（１−＞３）又はα−（１−＞２）結合した側鎖から構成される。アラビナン主鎖を分解し得る酵素は、アラビナナーゼと称される。アラビナンの側鎖は、α−アラビノシダーゼ（Rombouts et al.,Carbohydrate Polymers ９,1988,p.25）（これは、また非還元末端から線状アラビナンを加水分解できる）により加水分解され得る。
ペクチンの毛状領域の毛を攻撃する酵素は、以下の記載において、ペクチンの毛状領域の毛を完全に又は部分的に分解する能力を有する全ての酵素を含み、この全ての酵素には、ガラクタナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−モシロシダーゼ、アラビナナーゼおよびα−アラビノシダーゼ、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
語句酵素を分解する毛状領域は、毛状領域の毛又は主鎖を攻撃する双方の酵素を含むことを意味する。ジュースの如き植物抽出物の製造のために用いられる酵素調製品は、ホモガラクツロナン解重合酵素並びにペクチンおよび／又はセルロースの毛状領域を攻撃する酵素の如き他の酵素を含む。そのような酵素の組み合わせは、低い濁りおよび／又は低い濁った安定性をしばしば導く。ホモガラクツロナン解重合活性は、PSU活性（ノボノルディスクA/SからAF−269として入手できる分析方法）として測定できる。
発明の要約
本発明の目的は、植物材料から、改善された濁った安定性を有する濁った抽出物を製造することを目的とする。驚くべきことに、以下の内容が見出された；すなわち目的にあった単一成分の酵素調製品の使用は、この目的を達成するための重要な役割である。
従って、本発明は植物材料中の毛状領域を攻撃する１種又はそれ以上の酵素を使用することを含んでなる、植物材料から濁った安定性のある抽出物を製造する方法を提供する。
発明の詳細な開示
抽出物
本発明に関連して、植物材料からの抽出物は抽出、加工により又は他の分離技術により植物材料から誘導され得る全ての材料である。抽出物はジュース、果肉飲料、ベース（base）又はこれらから製造した濃縮物であってよい。植物材料は、野菜、例えばにんじん、セロリ、たまねぎ又は果物、例えばなし状果又は種果実（りんご、なし等）、ぶどう、トマト、カンキツ属の木（オレンジ、レモン、ライム、マンダリンみかん）、干しすもも、さくらんぼ、黒すぐり、赤すぐり、きいちご、ストロベリー、つるこけもも、パイナップル、全ての種類のトロピカルフルーツであってよい。本発明によれば、特にりんごからのジュースが好ましい。
酵素
濁った抽出物および／又は改善された濁った安定性を有する抽出物を製造するため、種々の酵素（１以上）又は種々の酵素の組み合わせを用いることができる。ペクチンの毛状領域の毛を攻撃する酵素例えばガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼおよび／又はα−アラビノシダーゼ、例えばWO92/123945に記載されるようにして得られたガラクタナーゼを添加することが好ましい。
追加的に、毛状領域の主鎖を攻撃する酵素、例えばラムノガラクツロナーゼ、好ましくはラムノガラクツロナーゼII（WO92/19728で記載されるようにして得られた）を、単独で又は毛状領域の毛を攻撃する１以上の酵素と共に添加することができる。抽出物の濁り安定性を更に増加するため、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ（これはWO93/20190において記載されるようにして得られる）を添加することができる。追加的に、植物材料の他の部分を攻撃する酵素、例えばキシラナーゼおよびエンドグルカナーゼが添加できる。
好ましくは、酵素調製品はホモガラクツロナン解重合能を有すべきではなく、何故ならそのような酵素は毛状領域分解酵素によって得ることのできる濁りおよび濁った安定性を減少するものとして理解されるからである。
濁り
植物抽出物の濁りは、例えばDIN38404ホルマジンDIN標準を用いるISO7027に適合するネフラ（Nephla）濁度光度計により濁度として測定できる。
濁った安定性
本発明によれば、濁った粒子の安定性ΔTz（％）は、未遠心分離した抽出物の濁度に関連して15分間、4160×ｇで遠心後抽出物の上澄み液の濁度により測定される。与えられた抽出物中の濁った粒子の強制された沈殿は、分散液中に粒子を保つために連続層の安定度に対する指標である。
より詳しくは、本法はガラス遠心管中での60mlの抽出物サンプルの遠心に基づきそして416×ｇで15分間遠心する。遠心前の濁度（To)および遠心後の濁度（Tz）を、DIN38404およびホルマジンDIN標準を用いるISO7027に適合するネフラ濁度光度計により測定する。濁った安定性ΔTz（％）を次いで次の如く計算する：
ΔTz（％）＝［（Tz）／（To）］×100
リンゴジュースの様な植物抽出物の濁りおよび濁った安定性は、りんごの種類およびりんごの成熟度に従って著るしく変化する。本発明に従った酵素（１以上）は、酵素の使用なしで得られたものに対し濁りと濁った安定性を増加するであろう。
本発明に従った酵素は、植物材料が粉砕され、切断され又はさもなくば破片化されるプロセスにおいて用いることができる。次いで破片化植物材料を１分〜48時間、好ましくは10分〜８時間、最も好ましくは30分〜４時間、10〜60℃で、好ましくは15〜50℃で、最も好ましくは15〜40℃で処理する。次いで抽出物を加圧、デカント法、遠心により又は他の分離技術により得ることができる。更に抽出物は、例えば酵素により、濾過により、濃縮又は他の手段により加工できる。
本発明を更に次の実施例により説明するが、その実施例は請求の範囲をいかなる場合も制限するものではない。
例１
濁った安定性のりんごジュース
濁った安定性を、３つのりんごの種類（Jona Gold,MutzuおよびBelle de Boskop）について種々の酵素組み合わせを用いて試験した。各りんごにおいて次の手順を用いた：
りんごを室温で少なくとも12時間保存し、りんごが対象の酵素と共にインキュベーションするために適した温度を有することを確保した。
1.1kgのりんごを４個の部分に切断し、そして植物用切断機（1.5mmのすりおろし器具を備えたブルトナータイプR301）中で粉砕した。アスコルビン酸を、どろどろにすりつぶしたもの（マッシュ）に加え、酸化を防止するためマッシュに対し0.1％の濃度を得た。次いで種々の酵素の組み合わせ（以下に記載する組み合わせ）を、1kgの塊体当たり各酵素の純粋な酵素タンパク質25mgの量で加えた。種々の酵素をマッシュに同等に加えた（純粋な酵素タンパク質の量を、SDS−PAGEにより推定した;SDS−PAGEゲル上のバンド（これは対象の酵素に対応する）を、当業者に公知の方法により酵素を精製することにより同定できる）。
マッシュを室温で２時間酵素処理し、しかる後マッシュをHAFICOプレス機を用い300kg/m2で５分間加工した。次いで、新たに加圧したりんごジュースを低温殺菌し（85〜90℃,15分）、室温に冷却し（20〜25℃）、次いで濁りと濁った安定性を前記の如く測定した。
以下の酵素を実験において用いた：
ガラクタナーゼＩは、WO92/13945に記載の如く得られた。ラムノガラクツロナーゼIIは、WO93/19728に記載の如く得られた。ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼは、WO93/20190に記載の如く得られた。エンドグルカナーゼIIIは、T.Ooi et all in Nucleic Acids Res.18,1990,p.5884,およびin Biotech.Biochem.57,1993,p.1960−1961によって記載され、WO93/11249において記載されるセルラーゼ検出方法を用い、デンマーク特許DK 0245/93で記載の如くクローン化されそして発現されたエンドグルカナーゼ（FI−CMCase）に相当する。
ポリガラクツロナーゼは、デンマーク出願DK 1545/92に記載の如く得られる。
ペクチンメチルエステアーゼは、デンマーク出願DK 487/93で記載の如く得られる。
４種の別個の実験を行った。各実験において比較される全ての酵素を３回の実験日の各々について試験した。
実験1:
りんごの種類：ジョナ  ゴールド（Jona Gold）
試験される酵素：
１）ガラクタナーゼＩ（Gal I）
２）Gal I＋ラムノガラクツロナーゼII（Rham II）＋ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ（Rham Ac）
３）Gal I＋Rham II＋Rham Ac＋エンドグルカナーゼIII（End III）結果を表１に示す。
実験2:
りんごの種類：レッドベレデボスクップ（Red Belle de Boskop）
１）Gal I
２）Gal I＋Rham II＋Rham Ac
３）Gal I＋Rham II＋Rham Ac＋End III
結果を表２に示す。
同じタイプの酵素作用が、ジョナゴールドおよびレッドベレデボスコプ（Red Belle de Boskop）について見られる（注  表１および表２）。毛状領域枝切り酵素ガラクタナーゼは、濁りおよび濁った安定性を増加せしめることが分かる。これらの効果はラムノガラクツロナーゼおよびラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼの酵素組み合わせを更に添加することによって著るしく改善され、これらの組み合わせは毛状領域の主鎖を攻撃する。エンドグルカナーゼの添加は濁った安定性を更に改良するであろう。
実験3:
りんごの種類：ムツ（Mutzu）
１）Gal I
２）Gal I＋Rham II＋Rham Ac
３）Gal I＋Rham II＋Rham Ac＋End III
結果を表３に示す。
表３の内容から、ガラクタナーゼのみがりんごの種類ムツ（Mutzu）の濁りを改善できないことが判明する。枝切り酵素ガラクタナーゼおよび主鎖分解酵素組み合わせ（ラムノガラクツロナーゼおよびラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）の組み合わせは、濁りと濁った安定性を改善する。これらの品質の因子は、エンドグルカナーゼにより更に改良される。
実験4:
りんごの種類：レッドベレデボスクップ（Red Belle de Boskop）
１）Gal I＋Rham II
２）Gal I＋Rham II＋Rham Ac＋ペクチン  メチルエステラーゼ（Pme）＋ポリガラクツロナーゼ（Polygal）
結果を表４に示す。
表４より、ガラクタナーゼおよびラムノガラクツロナーゼの組み合わせ（ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）は、濁りおよび濁った安定性の秀れた改善を与えることができることが判明する。更に、以下の内容が証明される；すなわち、ポリガラクツロナーゼおよびペクチンメチルエステラーゼのホモガラクツロナン解重合酵素調製品の添加は、その酵素調製品がまたかりにガラクタナーゼ、ラムノガラクツロナーゼおよびラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼを又含有したとしても濁った安定性を破壊するであろう、もしそうでなければそれは濁った安定なジュースを与えるであろう。
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