(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を乾固する段階を含む、試料中の有機酸を分析する方法に付するための試料の前処理方法において、試料を乾固する段階よりも前の段階で試料にアンモニアを加えることを特徴とする、有機酸分析に付する試料の前処理方法。
【請求項２】
前記有機酸分析は定量分析である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、尿をウレアーゼ処理後、有機溶媒で抽出したものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記アンモニアは水溶液の形態で試料に加えられる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機酸は、乳酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、メチルマロン酸、２−ヒドロキシ−３−メチル吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸、エチルマロン酸、コハク酸、メチルコハク酸、フマル酸、グルタル酸、３−メチルグルタル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル乳酸、２−ヒドロキシグルタル酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタル酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリストレイン酸、ミリスチン酸、ペンタデシ酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、γ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸及びステアリン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機酸は、乳酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、メチルマロン酸、２−ヒドロキシ−３−メチル吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸、エチルマロン酸、３−メチルグルタル酸、グリセリン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデシル酸及びラウリン酸から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機酸分析における試料の前処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中の有機酸を分析することは、有機酸代謝異常症の診断のために有用である。有機酸の分析は、ガスクロマトグラフィーや質量分析等により行われるが、これらの分析方法に付す前に試料を乾固することが行われる。臨床試験で尿中の有機酸を分析する場合も、尿をウレアーゼ処理した後に有機溶媒で抽出し、これを乾固した試料にトリメチルシリル化等の誘導体化処理を行った後、ガスクロマトグラフィーにかけることが行われている（山口清次：丹羽利充編：  ”最新のマススペクトロメトリー”  ．化学同人、京都、１９９５，  ｐｐ．５８−７９）  。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法では、乾固の際に有機酸がかなり蒸発してしまい、ガスクロマトグラフィー後の回収量が少なすぎるため、定性分析は可能であるが正確な定量分析は困難である。また、有機酸の回収量を多くするべく、尿を有機溶媒で抽出することなく乾固し、ガスクロマトグラフィーにかける方法も知られている（久原とみ子：松本勇、坂元正一監修：  ”臨床化学診断学”  ．ソフトサイエンス社、東京、ｐｐ．２７−４１）  。しかしながら、この方法では、回収量は多くなるものの、定量を行うと定量値のばらつきが大きく、再現性が低いため、やはり定量法としては用いることができない。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、有機酸の回収率が大きくて定量が可能であり、かつ、再現性の高い、有機酸分析に付する試料の前処理方法を提供することである。
【０００５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、乾固の前に試料にアンモニアを添加することにより乾固時における有機酸の蒸発を抑えることができ、それによって有機酸の回収量が大きくなり、かつ、再現性にも優れ、有機酸の定量が可能になることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、試料を乾固する段階を含む、試料中の有機酸を分析する方法に付するための試料の前処理方法において、試料を乾固する段階よりも前の段階で試料にアンモニアを加えることを特徴とする、有機酸分析に付する試料の前処理方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ガスクロマトグラフィーや質量分析等により有機酸を分析する方法における試料の前処理において、乾固工程を含むあらゆる方法に適用可能である。本発明の方法では、乾固工程の前に試料にアンモニアを加える。
【０００８】
アンモニアは、いずれの前処理においても乾固工程の直前に加えることが好ましい。
【０００９】
試料に添加するアンモニアの量は、特に限定されないが、試料中の予想される有機酸量に対して、重量基準で２．５％以上、さらに好ましくは５％以上が好ましい。なお、アンモニアは過剰に加えても乾固工程で揮散するので特に上限はない。アンモニアは水溶液の形態で試料に添加することが好ましい。この場合、アンモニア水の濃度は特に限定されないが、２０〜３０％程度が適当である。市販のアンモニア水の濃度は２５％であるので、市販のアンモニア水をそのまま用いることができる。例えば、尿の分析においては、もとの尿試料が２００μｌの場合には、添加する２５％アンモニア水の量は５０μｌ〜２００μｌ程度が特に好ましい。
【００１０】
アンモニア水を添加する段階を有することを除けば、その他の工程は従来と全く同様でよい。また、本発明の方法は、分析方法がガスクロマトグラフィー及び質量分析に限定されるものではなく、前処理工程において乾固段階を含むあらゆる分析方法に適用可能である。
【００１１】
本発明の方法が適用可能な有機酸の好ましい例としては、特に限定されるものではなく、例えば乳酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、メチルマロン酸、２−ヒドロキシ−３−メチル吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸、エチルマロン酸、コハク酸、メチルコハク酸、フマル酸、グルタル酸、３−メチルグルタル酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル乳酸、２−ヒドロキシグルタル酸、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタル酸等の有機酸や、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリストレイン酸、ミリスチン酸、ペンタデシ酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、γ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸及びステアリン酸等の脂肪酸を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、乳酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、メチルマロン酸、２−ヒドロキシ−３−メチル吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸、エチルマロン酸、３−メチルグルタル酸、グリセリン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプリン酸、ウンデシル酸及びラウリン酸において特に顕著な効果が得られる。なお、元々揮散しにくい有機酸については、アンモニアを添加しても揮散抑制効果はほとんど得られないが、アンモニアを添加することによる弊害は生じないので、このような元々揮散しにくい有機酸についても本発明の方法により前処理を行った試料を用いて他の有機酸と一括して分析に付すことが可能である。
【００１２】
アンモニアを試料に添加することにより有機酸の揮散がなぜ抑制されるのかははっきりとはわからないが、アンモニアが有機酸のカルボキシル基と反応して塩を形成することが関与しているものと推測される。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１４】
実施例１、比較例１
ヒトの尿２００μｌをねじ口試験管にとり、ウレアーゼ１００μｌ（６０単位）を添加し、３７℃の恒温槽で３０分間インキュベートした。インキュベート後、塩酸−塩化カリウム溶液（ｐＨ０．５）５００μｌ、ＮａＣｌ  １ｇを添加撹拌し、さらに内部標準としての２０％テトラコサン溶液５０μｌと抽出用の有機溶媒（酢酸エチル／イソプロパノールの５０：１（ｖ／ｖ）混合物）８ｍｌを加えて振盪機で室温で５分間抽出後、遠心分離（３０００  ｒｐｍ、５分間）し、有機溶媒相７ｍｌをねじ口沈殿管に分取した。分取した抽出溶液に２５％アンモニア水１００μｌを加えて混和後、真空エバポレーターで乾固した。次いで、Ｎ−ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）  １００μｌを添加撹拌して１２０℃、１０分間インキュベートして第１段階のｔ−ブチルジメチルシリル（ＢＤＭＳ）  化を行った後、すぐにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１００μｌ添加撹拌し、１２０℃、５分で第２段階のＢＤＭＳ化を行い、遠心分離（３０００ｒｐｍ  、５分間）後、上層を測定用のサンプルとした。また、比較のため、アンモニア水を加えなかったこと以外は上記と全く同じ処理を行って測定用のサンプルを得た（比較例１）。
【００１５】
測定用のサンプルを次いで、ガスクロマトグラフィーにかけた。ガスクロマトグラフィーカラムは、ＤＢ−５キャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ社製、内径０．２５  ｍｍ    ｘ  ３０  ｍ）を用いて、１００℃で４分保持した後、２８０℃まで４℃／分で昇温分析を行った。２８０℃で１０分間保持して分析を終了した。
【００１６】
各種有機酸について、ピークエリアの相対値（内部標準物質を１とする）を求めた。また、アンモニア水を加えた場合（実施例１）と加えなかった場合（比較例１）の相対値の比率（実施例１／比較例１）を算出し、百分率で表示した。結果を下記表１に示す。なお、分析は２回行い、その平均値をとった。
【００１７】
【表１】
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＊Ｅｘ１／Ｃｏｍｐ１：実施例１の測定値／比較例１の測定値
【００１８】
表１から明らかなように、アンモニアを添加した実施例１の方が添加しない比較例１に比べて有機酸の回収量が有意に増大した。
【００１９】
実施例２
有機酸標準試料及び尿試料に１０μｇずつ各有機酸の標準物質を加えた有機酸添加尿試料をサンプルとして、実施例１と同様な操作を行った。実施例２では、内部標準としてテトラコサン及びマルガリン酸を用い、ピークエリアの相対値はマルガリン酸のピークエリアを１として求めた。測定は５回行い、その平均値及び標準偏差を測定し、さらにばらつき（標準偏差／平均値）を算出し、百分率で表した。各有機酸についての測定値のばらつきを下記表２に示す。
【００２０】
【表２】
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0003579542.tif 000004
【００２１】
表２から明らかなように、本発明の方法によれば、測定値のばらつきが小さく、再現性が高いことがわかる。
【００２２】
実施例３、比較例２
尿サンプルに各脂肪酸を１０μｇずつ添加したものをサンプルとして用い、実施例１及び比較例１と同様な操作を行った。ただし、内部標準としてはスベリン酸を用いた。測定は３回行い、平均値を算出した。さらに、アンモニアを加えた場合（実施例３）と加えなかった場合（比較例２）の平均値の比（実施例３／比較例２）も算出した。結果を下記表３に示す。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
表３から明らかなように、アンモニアを添加した実施例３の方が添加しない比較例２に比べて有機酸の回収量が有意に増大した。
【００２５】
比較例３
従来法（山口清次：丹羽利充編：  ”最新のマススペクトロメトリー”  ．化学同人、京都、１９９５，  ｐｐ．５８−７９）  に記載された方法により、有機酸標準試料及び尿試料に各有機酸を１０μｇずつ添加した有機酸添加尿試料を分析した。すなわち、サンプルに内部標準物質としてマルガリン酸及びテトラコサンをそれぞれ２０μｇずつ加え、水を加えて総量２ｍｌとした。２Ｎ  ＮａＯＨを数滴滴下して強アルカリ（ｐＨ１２〜１４）として、５％塩酸ヒドロキシルアミン溶液１ｍｌを加えて室温で６０分間オキシム化した。６Ｎ塩酸を滴下して強酸性（ｐＨ１〜２）にし、ＮａＣｌ  １ｇを加え、酢酸エチル６ｍｌで２回、ジエチルエーテル６ｍｌで１回溶媒抽出した。３０ｍｌの遠沈管に有機溶媒相を集め、無水硫酸ソーダ５ｇを加えて振盪し（脱水）、遠沈して上清をとった。上清を窒素気流下で乾固した。残渣は実施例１と同様のＢＤＭＳ化を行い、測定用サンプルとした。ガスクロマトグラフィーは実施例１と同様に行った。測定は５回行い、その平均値をとった。
【００２６】
サンプルは上記実施例２で用いたものと同じであるので、上記実施例２で得られた各有機酸の回収量と比較例３の方法により得られた回収量の比率を算出した。結果を下記表４に示す。
【００２７】
【表４】
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【００２８】
表４から明らかなように、本発明の方法によれば、従来の方法よりも有機酸の回収量が大きくなる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、有機酸を分析に付す前の乾固工程における有機酸の蒸発を抑制することができ、有機酸の正確な定量が可能になった。また、本発明の方法は測定の再現性も高い。従って、本発明により、例えば従来不可能であった尿中の有機酸の定量測定が初めて可能になった。