(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量を測定する方法において、
（ａ）固体支持体上に固定された、微生物またはその細胞内物質に結合可能な捕捉剤に試料をさらして、該微生物またはその細胞内物質を固体支持体に結合させ、
（ｂ）前記固体支持体を、微生物および／またはその細胞内物質に由来のアデニレートキナーゼが該固体支持体に添加された溶液に接触し易くすることのできる試薬にさらし、
（ｃ）存在するアデニレートキナーゼによりアデノシン三リン酸（ATP）を作ることのできる条件下に、アデノシン二リン酸（ADP）を含有する溶液を該支持体に添加し、
（ｄ）生成したアデノシン三リン酸（ATP）の量を測定し、これを微生物または細胞内含有物の存在および／または量に関連付けることからなる方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）が、色形成反応を伴うアッセイを用いて実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）が、生成するATPの量に比例する光を作るためにルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を用いて実施され、光がルミノメーターを用いて検出される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）に用いられる条件が、ADPのATPへの最大変換を可能にするのに十分な濃度のマグネシウムイオンの存在を含む請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）および（ｃ）が、抽出剤、ADPおよびマグネシウムイオンを試料に添加し、その混合物を所定時間インキュベートしてADPのATPへの変換を行なうことにより実施される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）で使用する捕捉剤が、微生物の属、種またはクラスに特異的な固定化抗体、または多数の異なる種類の微生物の細胞壁上の特定の物質に特異的な結合剤からなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
捕捉剤が共有結合またはストレプトアビジン／ビオチンの相互作用を用いて固体支持体に結合された抗体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
固体支持体が磁場により保持されることのできる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）が、抗体を表面に固定化した磁性ビーズを容器に添加し、溶液または懸濁液としてアッセイされる試料を加えて撹拌し、捕捉された微生物および／または物質を有するビーズを磁場を用いて固定し、残留溶液または懸濁液を除去し、ADP基質および、アデニレートキナーゼをADP溶液に接触させ易くするための抽出剤溶液を加え、磁場を除き、該ビーズを基質溶液中で撹拌し、磁場を再びかけることによりビーズを固定し、ADP、抽出剤および形成されたATPを含有する溶液を取出し、それをATPについて検定することにより実施される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
捕捉剤がカラム中に保持される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉剤がカラムに充填されたビーズ上に保持される請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
試料とアッセイ試薬が連続的にカラムに通され、合成されたATPを排出させて、これが測定され、捕捉剤目的物質の存在に関連付けられる請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
結合した試料がさらされるADPの量が0.005mM以上のADP濃度を提供するのに十分である請求項１〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ADPの量が０.1mMのADP濃度を提供するのに十分である請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
結合した試料がさらされるマグネシウムイオンの濃度が1mM以上である請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
マグネシウム濃度が10mM以上である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が陽イオン界面活性剤を含有する試薬を添加することにより実施される請求項１〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
試薬が三級ジアミンからなる請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜10のいずれか一項に記載の方法を実施するための検査キットであって、微生物または細胞内物質に結合可能である固定化された捕捉剤とアデノシン二リン酸試薬を含む検査キット。
【請求項２０】
さらにマグネシウムイオン源および／またはルシフェラーゼおよびルシフェリンを含有する請求項19に記載の検査キット。
【請求項２１】
自由ビーズの形で提供される固体支持体、ビーズで満たされたカラム、または被覆マイクロタイターウェル上に固定化された抗体;99.999％よりも高い純度を有するADP試薬；およびアデニレートキナーゼ活性のないBSAを含むルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を含有する請求項20に記載の検査キット。
【請求項２２】
捕捉剤が、微生物の属、種もしくはクラスに特異的な抗体であるか、または微生物の細胞壁上の特定物質に特異的な物質である、請求項19〜21のいずれか一項に記載の検査キット。
【請求項２３】
請求項３〜18のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置であって、該装置が、固定化された捕捉剤が試料と相互作用することが可能である反応室（５）と、ステップ（ａ），（ｂ）および（ｃ）で必要な試薬を連続的に反応室（５）に供給する手段と、ルミノメーターフローセル（11）とを含み、該ルミノメーターフローセル（11）が、反応室（５）とルシフェラーゼ／ルシフェリン供給源（13）とに接続され、ステップ（ａ），（ｂ）および（ｃ）の完結時に、生成したATPが、放出光の量と相関させることによって直接測定されるように配置されている、前記装置。
【請求項２４】
反応室（５）で懸濁された磁性ビーズを固定できるように配置された電気的に作動可能な磁石（７）をさらに含む、請求項23に記載の装置。
【請求項２５】
反応室（５）が反応カラムを含む、請求項23に記載の装置。
【請求項２６】
反応カラムが、微生物またはその細胞内物質に結合可能な捕捉剤で被覆された支持材料を含有している、請求項25に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物を検出し検定する方法、該方法に用いられる試薬、および該方法を実施するために必要な試薬を含有する検査キットに関する。
欧州特許出願公開第217,583号明細書には、細胞から抽出されたリガンドのアッセイ法が記載されており、このリガンドは、同時に細胞から抽出され、２種類の抗リガンドと反応して検出可能な物質を生成する。
すべての生物は化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ATP）を利用しており、ATPによって推進されるルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を用いるこの検定法が知られている。この酵素反応により生成する光をルミノメーター（発光測定器）で測定し、存在するATPの量に関連付けることができる。微生物数の指標としてのATPの有用性が1960年代中頃より知られており（Stanlleyら編、Blackwell  Scientific  Publications（ロンドン）出版のATP  Luminescence  Rapid  Methods  in  Microbiology（1989）の１〜10ページを参照されたい）、その主な利点は速度と感度である。このアッセイ法を用いれば、10-12モル/lのATPまでの検出能力により簡単な試料はおよそ数分間で分析でき、複雑な試料も数分間で分析でき、複雑な試料な日常的な方法で30分かかるだけである。しかし、微生物またはそれらの含量を検出するときに、実施の速度と容易性を維持しながら、さらに高い感度を提供する方法に対する必要性がある。
本発明者は、ATPに基づく方法の速度と感度が、アッセイの標的をATPから、ATPを作る酵素、特にアデニレートキナーゼ（アデニル酸キナーゼ）へと変更することにより顕著に向上させることができることを確認した。アデニレートキナーゼはアデノシン二リン酸（ADP）のアデノシン三リン酸（ATP）への変換のためにすべての生物により用いられている酵素である。本発明の好適な方法、試薬およびキットを用いることにより、ATPよりもむしろこの酵素が標的となり、細胞内マーカーとしてのアデニレートキナーゼを少なくとも10-20モルまで検出することが可能となる。アデニレートキナーゼを、その活性を測定するためにルシフェラーゼ／ルシフェリン系を用いて定量することは知られており（Brolinら,Journal  of  Biochemical  and  Biophysical  Methods  １（1979）163−169およびShutenkoら,Biotekhnologiya,No.4（1988）542−547を参照されたい）、これを用いてある種の哺乳動物と植物の組織が研究された（例えばRodionovaら,Fiziologiya  Rastenii（1978）25,4,P731−734を参照されたい）。しかし、そうしたアッセイ系を微生物の検出とアッセイに用いることは示唆されておらず、それを行なう利点（すなわち、そうして提供される向上した感度）は酵素それ自体を研究する者には問題とされることはなかった。
アデニレートキナーゼはADPよりも少ない量で存在するが、該酵素を微生物のマーカーとして利用することは、該酵素が作るATPによりその存在を測定することによって、向上した感度、典型的には400,000（すなわち、存在する酵素１モルにつき、ADPの400,000モルが10分間のインキュベーションでATPに変換される）の増幅をもたらす。したがって、該酵素が触媒する反応の基質または生成物を測定することにより該酵素を定量することは10-20モルのの低い濃度の検出を提供する。
本出願人の同時係属中のPCT出願PCT/GB94/00118およびPCT/GB94（本出願人の参照番号1GP0036WOD）は、試料中の微生物を、ADPをATPに変換する能力から定量し、それを微生物またはそれらの細胞内物質の存在に関連付ける方法に関する。これらの出願は、２分子のADPと各アデニレートキナーゼ活性部位との反応に必要なマグネシウムイオンが試薬として添加されるか、または存在する微生物細胞により付与され且つ他の試薬中の不純物として付与される方法を例示している。そのような技術を用いる実施例で検出される細胞数は約102であることが証明され、さらに統計学的に有効な結果が103以上の細胞数で得られ、発光測定器による計数と細胞数との間に直線的な関係を得ることができた。
本発明は、アデニレートキナーゼ活性が捕捉アッセイ（capture  assay）での微生物の標識として用いられる改良法に関し、この方法において微生物が一旦捕捉され他の試薬が除去されると、こうして捕捉された微生物の数は、それらの細胞内含有物をADPに接触させて、次に、作られたATPの量を、特にルシフェリン／ルシフェラーゼ反応の実施で作られた光を測ることで測定することにより測定され、前記測定により迅速な測定能が提供される。所望であれば、試料中に存在するATPの量を測定するために比色定量法（例えばピルビン酸キナーゼに基づく反応）を用いてもよいことが理解されよう。アデニレートキナーゼアッセイに組み合わせたそのような比色定量アッセイは優れた感度を提供する。
微生物は管用の捕捉アッセイ、例えば、マイクロタイターウエルプレートまたはラテックスビーズ等の固体表面に固定化され、該微生物に特異的な抗体を用いて捕捉してもよい。免疫アッセイ法に適する多くのそれに代わる表面が当業者に思い当るであろう。本発明に特に好ましいのは、磁性ビーズ上に抗体を固定化することであり、それによって抗体に結合した微生物が磁場内に捕捉され、それらのアデニレートキナーゼ活性を定量し、次に該微生物を放出し、検査物質のさらに別の試料を分析することができる。よって、そのような好適な方法において、試料（例えば空気中の微生物含量をモニターするサイクロンサンプラーからの試料）の連続的なフローアッセイを実施してもよい。
特にアデニレートキナーゼとATP不含有試薬を用いるアデニレートキナーゼアッセイ法を用いれば、連続的方法でオンラインで検出することのできる試料中に存在する微生物数は試料200μｌあたりで十の位のオーダーであり、細胞とATP由来の光との定量的関係を用いる読み取りは、反応体積が減少するにしたがって10細胞、さらには10細胞未満まで可能である。
したがって、本発明の第１の態様において、試料中に存在する微生物および／またはその細胞内物質の存在および／または量を測定する方法において、
（ａ）固体支持体上に固定化され、微生物またはその細胞内物質に結合可能な捕捉剤に試料をさらして微生物またはその細胞内物質を固体支持体に結合させ、
（ｂ）該固体支持体を、微生物および／またはその細胞内物質に結合したアデニレートキナーゼが基質を添加した溶液に接触し易くすることのできる試薬にさらし、
（ｃ）アデノシン二リン酸（ADP）を含有する溶液を該支持体に添加し、
（ｄ）生成したアデノシン三リン酸（ATP）の量を測定し、これを微生物または細胞内含有物の存在および／または量に関連付けることからなる方法が提供される。
ステップ（ｄ）はATPのアッセイに利用できる慣用のアッセイのいずれを用いて実施してもよい。これらのアッセイは発色反応を伴ってもよいが、最も好ましくは、当業者に知られ広く用いられているルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬を用いてADPからATPへの変換を検出するのが便利である。微生物および／または細胞内含有物の量に対してATP量を関連付けるには、既知量の目的とする微生物または細胞内物質を用いて作成した検定曲線を用いて、これとの比較により未知量を予測するアッセイ法を行なうことで容易に実施される。好適な方法のために、微生物数あたり発する光の検定曲線を作成し、試料中の未知量の物質から単位時間あたり発する光を読み取り、それから予測を行なう。
生成するATPの量を最大とするために（すなわちアッセイで固体支持体に結合させたアデニレートキナーゼ量を増幅するために）、ADPからATPへの最大変換を行なうのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在下でADPからATPへの変換を実施するのが好ましい。存在させるマグネシウムの量は、すべてのADP分子が少なくとも１個のマグネシウムイオンに結合するように１モルのADPに対して約１モルのマグネシウムを提供するために十分に存在させることが好ましい。但し、この反応は
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であるために、ADP:マグネシウムイオンの比が1:1であることは有用な指針ではあるが、実際には必要ではないことに注意されたい。
本発明のこの態様の好ましい実施態様において、試料は水性懸濁液または水溶液の形で提供され、試料中の目的とする微生物または物質が捕捉され、存在するアデニレートキナーゼがADPをATPに変換する条件下にADPとマグネシウムイオンを試料に添加して、試料を所定時間インキュベートして前記変換を行い、ルシフェラーゼとルシフェリン試薬を添加し、試料から発する光の量を測定し、これをアデニレートキナーゼの存在とその量に関連付けることにより、該微生物または物質に結合したアデニレートキナーゼの予測を行なう。
前記の捕捉ステップは好ましくは微生物の属、種またはクラスに特異的な固定化抗体を用いて実施されるが、多くの異なる種類の微生物の細胞壁上の特定の物質に特異的な結合剤、例えばレクチン類等の試薬であってもよい。最も便利には、捕捉剤は抗体であり、これを慣用の結合技術、例えば共有結合またはストレプトアビジン／ビオチン相互作用を用いて固体支持体に結合させる。例えば、特異的な抗体をビオチニル化することにより該抗体をストレプトアビジン被覆表面に結合させる。
好ましい方法において、磁性固体支持体、特にDynal（英国）社（Station  House,26  Grove  Street,New  Ferry,Wirral,Merseyside所在）から入手できる磁性ビーズが用いられる。特異的な抗体をこれらのビーズに結合するための方法は当業者に知られており、製造業者からの説明書に記載されている。
そうしたビーズを用いることで溶液中の目的とする微生物をビーズ固体化抗体に結合させることができ、例えば、該溶液を連続的サンプリング装置などの導管を通過させ磁場をかけて処理ステーションに集めて、これを処理してアデニレートキナーゼに接触可能とする一方でADPとATP測定アッセイ試薬を供給する。好ましくは、ADP、マグネシウムおよびルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を添加し、一方、ビーズは固定されており、該ステーションに隣接するルミノメーター等の光検出器を用いて放出される光を測定する。このルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬をADPおよびマグネシウムの添加と同時か、またはその後に添加してもよい。
本発明の方法は単一のアッセイ容器で実施してもよく、この場合は、抗体を表面に固定化した磁性ビーズを該容器に加え、アッセイしようとする試料を溶液または懸濁液として加え、これを撹拌し、捕捉された微生物および／またはその物質を有するビーズを磁場を用いて固定し、残っている溶液または懸濁液を除去し、ADP基質、およびアデニレートキナーゼをADP溶液に接触させるための抽出剤溶液を加え、磁場を除き、ビーズを基質溶液中で撹拌し、磁場を再びかけることにより該ビーズを固定し、前記のADP、抽出剤および形成されたATPを含有する溶液を取出し、この溶液をATPについて定量することにより行なうことができる。このATPのアッセイは比色定量法または好ましくはルミノメトリー（発光測定法）で実施しうる。
さらに別の好ましい方法は、結合剤（例えば抗体）をビーズなどの固体支持体に固定化させた捕捉カラムを用いるもので、試料および多様な試薬をカラムに順に通してATPを合成し、このATPを測定し、抗体の標的とする物質の存在に関連付ける。
これらのすべての場合で、試料に混合するADPの量は、混合物中のADP濃度で好ましくは0.005mM以上、さらに好ましくは0.01mM以上、最も好ましくは0.08mM以上とするのに十分な量とする。前記の変換ステップの混合物中でADPの特に好ましい量は約0.1mMである。これはADPの純度に依存し、ATPが不純物として高いレベルで含まれる場合、使用される高い濃度での使用が制限される。ADPについて実用的に有用な範囲は約10mMから約0.1μＭである。ADPからATPへの変換中の懸濁液または溶液中のマグネシウムイオンの好ましい濃度は、上記のADPの好ましい濃度では、1mM以上、さらに好ましくは5mM以上、最も好ましくは10mM以上である。このマグネシウムイオンはマグネシウム塩の形で提供してもよいが、好ましくは酢酸マグネシウムとして提供する。Mg2+について実用的な範囲は約0.1mMから約25mMである。存在するMg2+の量は他のなかでもADP濃度および存在するキレーター（例えばEDTA）の量に依存する。
本発明のさらに好ましい方法では、インキュベーションの始めにルシフェリン／ルシフェラーゼ発光測定試薬を好ましくはADPとマグネシウムイオン源を有する単一試薬として試料に添加する。この方法はATPの生成中でのアデニレートキナーゼの除去の点で高純度であるルシフェラーゼ試薬の提供を必要とする。すべての試薬がADPからATPへの変換の開始時にこのようにして包含させる場合、および／または独立した段階のルシフェリンル／シフェラーゼ添加後に、ルミノメーターでの計数（カウント）を続ける場合の本発明の方法において、マグネシウムをルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬が提供してもよい。しかし、ルシフェラーゼおよびEDTAがマグネシウムイオンを結合するために、マグネシウムイオンの量は前もって実験または計算によりはっきりと確めておくことが必要である。所与のADP、試料およびルシフェリン／ルシフェラーゼ混合物に加えられるマグネシウム塩の最適量は、既知量の細菌（例えば大腸菌）を含有する試料を日常的実験に用いて最大信号を得ることによって容易に決定することができることは当業者であれば理解されよう。
マグネシウムイオンは、（汚染するアデニレートキナーゼがADPを早期にATPに変換させうるという点で）ADPを不安定とし得るので、これらを使用前に溶液中で一緒に保つことは望ましくはなく、それらは使用の直前またはADP変換ステップで一緒にするのが好ましい。マグネシウムイオンはアデニレートキナーゼの活性に必要とされるので、これらのものと試料とをADPの添加前に一緒に混合することが好ましいであろう。試薬を一緒に保とうとする場合、それら試薬を凍結乾燥の形として保つことで不安定作用を避けることが好ましい。
上記のように、アデノシン三リン酸（ATP）を、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系を用いる光測定法で試料中のATPの量を示す検出可能な信号を得ることにより検出するのが好ましい。ATPのアッセイに使用されるルシフェリン／ルシフェラーゼ調製物と方法は当業者にはよく知られており、市販品を利用できる（例えばBrolinらを参照されたい）。典型的な組成物は、例えば0.1〜10mg/リットルのルシフェラーゼ、15〜1000μmol/リットル、好ましくは15〜100μmol/リットル（例えば〜36μmol/リットル）のＤ−ルシフェリンを含有し、MgCl2（2.5〜25mmol）、EDTA、BSA、およびpH7の緩衝液（例えばEP  054676を参照）典型的にはpH7.8の緩衝液等の試薬をさらに含有する。
本明細書に記載されているようなアデニレートキナーゼ試験方法により単一試薬を利用するには、そのpHは、ADPのATPへの変換中に計数（カウント）を続けるために両方の酵素に最適（すなわち両方に妥当）となるように調節することが望ましい。これは、試料中の既知の微生物数を用いるごく通常の実験により決定することができる。試料、ADPおよびマグネシウムイオン源は、アデニレートキナーゼ反応に適するpHを提供するのであればどの緩衝液に混合してもよい。他の試薬は必要ではない。よって、pH5.5〜8.5を提供し、最適pHがpH6〜７、好ましくはpH6.5であるどの緩衝液を用いてもよい。適当な緩衝液の例としては、トリスおよびリン酸緩衝液がある。最も好適には、本発明の方法を実施するための調製物に用いられるそうした緩衝液に試料を集め、またそれを用いて希釈する。
増幅アッセイと同様に、本発明のアデニレートキナーゼアッセイの感度は試薬の純度により限定される。この場合の重要な汚染物質はADP基質中のATPおよびルシフェラーゼ調製物中のアデニレートキナーゼである。微生物の感度のよいアッセイとして用いるために、特にこれらが潜在的に有害であり、少ない数での検出を必要とする場合に、各試薬の純度はそれがアッセイで反応させる物質に関してできるだけ高いものであることが必要である。
20mMリン酸カリウム（pH4.6）で平衡化された好ましいEconopaq  Ｑ強陰イオン交換体ゲルカートリッジ（BioRad）を用い、400mMまでのKPi（リン酸カリウム）濃度で段階的に溶出することで、ADPはその後に溶出するATPに密着したピークとして溶出することがわかった。このようにして、２×10-8のモル％ATP上限を有するADPを得ることができた。本出願人が文献から気付いている最も純粋なADPは0.001％のATPを含有するために（上記のShutenkoらを参照）、本発明は0.001モル％未満のATP、さらに好ましくは２×10-8モル％未満のATPを有するADPを本発明の方法の利用のために提供する。
第二の問題に関して、主要な「ハウスキーピング」酵素としてのアデニレートキナーゼは事実上すべての生物に存在しており、通常はルシフェラーゼ調製物中に存在する。これはわずかな汚染にすぎないかもしれないが、その目的は試料中の非常に低い濃度のアデニレートキナーゼを測定することであるので、ルシフェラーゼに該酵素が存在することは制限因子となりうる。
ルシフェラーゼとアデニレートキナーゼの分子量はそれぞれ61kDおよび21kDであってかなり異なっている。さらに、ルシフェラーゼは膜関連タンパク質であるために比較的疎水性であるが、アデニレートキナーゼは可溶性酵素として存在する。したがって、アデニレートキナーゼをルシフェラーゼ調製物から、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、または両方のクロマトグラフィーにより分離することができる。あるいは、さらにこれに加えて、ルシフェラーゼのアデニレートキナーゼ汚染問題は、生物発光試薬（ルシフェラーゼとルシフェリン）を測定の直前に添加するか、または汚染アデニレートキナーゼが顕著に作用する時間を持たないように測定することで避けることができる。
ルシフェラーゼの適当な精製方法は低い多孔度のゲル、例えばセファデックスＧ−25を用いるカラムクロマトグラフィー分画（NielsenとRasmussen,Acta  Chemica  Scandinavica  22（1968）p.1757−1762を参照）、セファデックスカラムとセファローズカラム（例えばブルーセファローズ）とを組合わせての利用およびSDS電気泳動（Devineら,Biochimica  et  Biophysica  Acta  1172（1993）121−132を参照）によるか、または高温の周囲温度でのエージングを用いる。
市販のルシフェラーゼ／ルシフェリン調製物の１成分である、アデニレートキナーゼ不含有のBSA源はSigmaおよびBDHから入手可能な化学処理された試薬アセチル化BSAである。他の化学処理BSAも適当であることは当業者ならば理解されよう。
目的とする微生物に関連したすべてのアデニレートキナーゼを本発明のADP、マグネシウムイオンおよびルシフェラーゼ／ルシフェリンアッセイ試薬に利用可能とするには、細胞内物質を放出するか、該物質が試薬にさらされるように微生物を破壊することが必要である。そのような破壊は、超音波発生器等の機械的手段を用いるか、または任意に冷却ショックまたはリゾチーム等の試薬と組み合わせた浸透圧ショックによるか、さらに慣用的には界面活性剤を用いて行なうことができる。そうした界面活性剤は市販されており、通常、「抽出剤」と呼ばれている。典型的な抽出剤としては、一般的な陽イオン界面活性剤、例えばCTAB（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、および専売試薬、例えばEnzymatics  ATP放出剤、Biotrace  XM抽出剤（イギリス国Bridgend所在のBiotraceより入手可能）、Celsis（英国）陽イオン抽出剤およびLumac  NRM（オランダ国Lumac社から入手できるヌクレオチド放出剤）が挙げられる。CTABを用いる場合、便利な調製物としては0.01〜１％（例えば0.2％）のCTAB水溶液が挙げられるが、他の濃度も当業者に思い付くであろう。
よって、微生物を含有すると疑われるアッセイ試料にADPおよびルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬を添加する前に、これら微生物を破壊してそれらの細胞内の含有物が破壊剤の使用により発光測定試薬に接触させ易くすることが望ましい。目的とする細胞を菌類の胞子などの細胞から区別するために、所望ならば、胞子および多細胞の動物「体」細胞のみを壊すことのできる非イオン界面活性剤（例えばSigmaより入手可能なトリトンＸ−100）で一方を処理し、他方を上記のカチオン性界面活性「抽出剤」で処理しすべての細胞を壊す二つの独立したアッセイを実施することができる。これらのアッセイは、プロテアーゼの添加前に、アピラーゼ等のATPアーゼを界面活性剤／ルシフェラーゼ／測定サイクル間に添加するならば同じ試料について行なうことができ、最初のサイクルステップの１サイクルで非イオン界面活性剤を使用し、他のサイクルでカチオン性界面活性剤を使用する。
ルシフェラーゼ／ルシフェリン系に対する抽出剤の効果は重要であることが知られている（Simpsonら（1991）,J.Biolumin  Chemilumin  ６（２）pp97−106を参照；陽イオン界面活性剤は該反応を増強するがルシフェラーゼを徐々に失活させることが知られており、陰イオン界面活性剤は該反応を抑制し、非イオンおよび双イオン性界面活性剤は広い範囲にわたって該反応を増強することが知られている）。0.25％の三級ジアミン界面活性剤（英国CambridgeのCelsisから入手したもの）と0.15％の陽イオン界面活性剤の混合物は本目的に十分であることがわかったが、当業者はアデニレートキナーゼおよびルシフェラーゼ活性の最適混合を得るために、他の「抽出剤」を、同溶液にともに共存させてスクリーニングすることは問題がないであろう。典型的には、約0.05％〜1.0％の範囲の界面活性剤濃度を用いるのがよい。
すべての必須のステップ（ADPのATPへの変換とその後のルシフェリンに対するルシフェラーゼの作用）の終了後に混合物から発する光を、光検出器内の例えば発光測定管に試料体積を入れてルシフェラーゼおよびルシフェリンまたは前記の必須のステップを進めることができる他の試薬の添加直後またはそれらの添加と同時に測定してもよい。
本発明の第二の態様において、本発明の方法に必要とされる必須の試薬、すなわち固定化捕捉剤、アデノシン二リン酸および好ましくはマグネシウムイオン源および好ましくはルシフェラーゼおよびルシフェリンからなる検査キットが提供される。好ましくは、本キットはこれらの試薬を含有し、該キット中の界面活性剤はアッセイを意図する目的とする細胞を壊すために適当なものとし、これらをルシフェラーゼとルシフェリンをとともに単一の試薬溶液として提供する。通常、微生物をアッセイするには陽イオン界面活性剤のみが必要であるが、菌類の胞子および体細胞が顕著と思われる場合にはさらに別の非イオン界面活性剤を含有させてそれらの数を評価してもよい。本キットは、好適には本発明の方法の実施法についての使用説明書を含む単一のパッケージの形態にあり、これら試薬は容器中に含まれ直接の使用または希釈後に適する濃度を有するものとする。
本発明の好ましい検査キットは、固定化抗体を、自由（loose）ビーズ、ビーズで満たされたカラム、または被覆マイクロタイターウエルの形で有し;99.999％よりも高い純度を有するADP試薬；およびアデニレートキナーゼ活性を実質的に持たないBSAを含むルシフェラーゼ／ルシフェリンを包含する。もしくは、キット使用説明書および／またはそれらの相対的濃度において示される使用するルシフェラーゼ／ルシフェリン比は、ルシフェラーゼがルシフェリン基質に十分速く作用することができるようなものとして、最初の発光が終了した後にルシフェラーゼに結合したアデニレートキナーゼはATPを作る。よって、微生物由来のアデニレートキナーゼは迅速な動力学的反応により示され、汚染ATPはグロー（glow）により示される。
さらに、本発明によれば、固定化捕捉剤が使用試料と相互作用する反応室を有する本発明の方法を実施するための装置が提供され、該反応室は本発明のアッセイの結合ステップ、抽出剤とADPの添加ステップを実施するように試薬を連続的に供給するための入口と出口手段を有し、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬源でルミノメーター・フロー・セルに結合され、これらのすべてのステップの終了の際に作られたATPが放出光の量に関連付けられることにより直接に測定することができる。本発明の装置の好適な反応室は、
（ａ）容器中の反応液体に懸濁した磁性ビーズが試薬の変化に応じて、例えばポンプ手段の影響下に固定できるように電気的に作動可能な磁石の範囲内に配置された反応容器、または
（ｂ）捕捉剤で被覆された慣用の捕捉剤支持材料、例えばラテックスビーズからなる反応器カラムからなる。
本発明の方法、装置、試薬およびキットは以下の実施例と図面によりさらに詳細に説明するが、これらにより本発明が限定されるものではない。さらに別の実施態様がこれらを鑑みて当業者には明らかであろう。
図面の説明
図１は、磁性ビーズへの捕捉剤の固定化を用いた自動化フローシステムを用い、且つ該ビーズを捕捉するために選択的に磁化された磁石を用いる本発明の方法の実施のための装置の概略図を示す。
図２は、反応器カラムへの捕捉剤の固定化を用いた自動化フローシステムを用いる本発明の方法の実施のための装置の概略図である。
図３は、数が少ない大腸菌細胞に関するアデニレートキナーゼアッセイをグラフで示す。
図４は、捕捉のために磁性ビーズ、検出のためにアデニレートキナーゼを用いる大腸菌の特異的アッセイを棒グラフで示す。
実施例1:図１の装置を用いる大腸菌のアッセイ
試料源（１）から５方向バルブ（２）、ペリスタチュービング（３）および可逆ポンプ（４）を用いて、アッセイ用大腸菌を含有する液体試料が反応容器（５）に供給される。該反応容器は慣用の共有結合によりDynal磁性ビーズ上に固定化された、大腸菌に特異的な抗体を有する。このビーズと試料を、捕捉時間、例えば１〜30分間、スターラー（６）、ビーズを固定化するために賦活化された磁石（７）を用いてとともに撹拌し、試料液体を可逆ポンプ（４）およびバルブ（２）を経て排出部（８）に移す。これらビーズを供給源（９）からの洗浄緩衝液の供給、磁石（７）の脱賦活化（deenergisation）、スターラー（６）の作動、磁石（７）の賦活化および緩衝液の排出部への移動により洗浄される。
ADP基質（ATPに関して＞99.999％純粋なもの）、酢酸マグネシウムおよび抽出剤（最終体積あたり0.15％陽イオン界面活性剤と0.25％第三ジアミン）を供給源（10）から十分な量で供給して反応容器中0.1mM  ADPと10mMマグネシウムイオンを提供し、磁石が脱賦活化され、スターラーが作動され、スターラー停止前の１〜５分間の一定時間、抽出/ADP変換が進められ、磁石が賦活化され、該液体は、ペリスタチュービング（３）および可逆ポンプ（４）と（12）を用いてルミノメーター・フロー・セル（11）に移されると同時に、供給源（13）からのアデニレートキナーゼ含量を除去した効果的な量のルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬と混合される。アデニレートキナーゼ改良Celsis  LDR試薬、もしくは有効成分の標準量を用いる場合、この体積は試料体積の約半分である。既知数の細胞を用いるアッセイの実施により得られる標準曲線を参照しながら、フローセルで発する光を、捕捉された大腸菌の量に関連付ける。
反応容器磁性ビーズの再生は、使用されたビーズをポンプで排出部に移動させ、供給源（14）からの新しいビーズを供給することによるか、またはビーズの再生のためにビーズから試料を解離する試薬または溶液を用いて実施し、例えば、抗体から再生する場合、〜0.1M  HClを用いることができる。
実施例2:図２の装置を用いる大腸菌のアッセイ
容器（５）、磁石（７）およびスターラー（６）を、ルミノメーター・フロー・セルと一列に並ばせて前記の供給源から試薬を供給した反応器カラムに置き換え以外はアッセイを実施例１に示されたように行なう。単一の５方向バルブではなく３個の２方向バルブ（２）を用い、ポンプは可逆性ではない。試料源は同時係属中の英国特許出願GB9405392.3に記載されているようにヒドロシクロン（hydrocyclone）から直接に得られる。
実施例１の５方向バルブ装置を該反応器カラム法とともに用い、一列に並んだ３個の２方向バルブを実施例２の反応容器とスターラーとともに用いてもよいことが理解されよう。同様に、アッセイステップは、磁石の手動操作と試薬の手動添加により容易に行なうことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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