(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素学的性質を有するラクトシルセラミド合成酵素。
（１）作用
ウリジンジホスフェート−ガラクトースからガラクトースをグルコシルセラミドに転移させ、ラクトシルセラミドを合成する。
（２）基質特異性
グルコシルセラミドに強く作用し、グロボシドに弱く作用し、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ２にほとんど作用しない。
（３）金属要求性
マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。
（４）至適pH
pH６．４〜７．４
（５）分子量
約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
【請求項２】
配列番号１、３若しくは５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するラクトシルセラミド合成酵素。
【請求項３】
配列番号１、３若しくは５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするラクトシルセラミド合成酵素遺伝子。
【請求項４】
配列番号２、４若しくは６で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するラクトシルセラミド合成酵素遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４記載のラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３又は４記載のラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項３又は４記載のラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を培養し、該培養物からラクトシルセラミド合成酵素を採取することを特徴とするラクトシルセラミド合成酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はスフィンゴ糖脂質の生合成の出発物質の一つであるラクトシルセラミドの合成酵素及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ糖脂質は細胞膜構成脂質のうち、種々の認識機構に関与するといわれており、その生合成はセラミドにグルコシルセラミド合成酵素（グルコース転移酵素）が作用してグルコシルセラミドが生成し、次いでこれにラクトシルセラミド合成酵素（ガラクトース転移酵素）が作用してラクトシルセラミドが生成することから始まる。又、このグルコシルセラミド合成酵素については、本出願人により既に部分精製されている（特開平５−６４５８４号公報）。
【０００３】
一方、ラクトシルセラミド合成に関与するラクトシルセラミド合成酵素はこれまでにその存在が指摘されてきたものの、生体内では他のガラクトース転移酵素がラクトシルセラミド合成に関与しているのか、又はラクトシルセラミド合成に特異的なガラクトース転移酵素が存在するのかは、蛋白、遺伝子レベルの解析がなされていなかったために十分解明されていない。これは糖蛋白やラクトサミンの合成に関与するガラクトース転移酵素が弱いながらもラクトシルセラミド合成活性を持つことが知られているためである。この酵素のラクトシルセラミド合成活性は糖蛋白糖鎖やラクトサミン合成活性に比べ非常に低い（Ｙａｍａｔｏ  Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ａ；  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）  Ｏｃｔ  １９８２，  ９２  （４）  ｐ１１２３−７）。従って、このガラクトース転移酵素は、特異的なラクトシルセラミド合成酵素とは言い難い。
【０００４】
一方、チャタジーらはヒトの腎臓からラクトシルセラミド合成酵素を精製したと報告した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  Ｓ，Ｃｈｏｓｈ  Ｎ，Ｋｈｕｒａｎａ  Ｓ；  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｐｒ．５，  １９９２，  ２６７  （１０）  ｐ７１４８−５３）が、その構造や遺伝子のクローニングは全く報告がなされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、ラクトシルセラミド合成酵素は様々な生理活性をもつスフィンゴ糖脂質の生合成の出発物質の一つであるラクトシルセラミドを合成する重要な酵素であるが、これを大量に製造する方法が確立されていない。
従って、本発明の目的は、グルコシルセラミドに特異的に作用してラクトシルセラミドを合成する高活性のラクトシルセラミド合成酵素、これをコードする遺伝子、及び該ラクトシルセラミド合成酵素の新規製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、酵素調製材料にラット脳組織を採用し、この膜画分からグルコシルセラミドに対する基質特異性の高いガラクトース転移酵素を単離すべく種々検討し、後記酵素学的性質を有するラクトシルセラミド合成酵素を得た。また、ラットから該酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功し、更にマウス及びヒトからも該酵素に近似する酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功した。更に該遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術によるラクトシルセラミド合成酵素の製造法の確立にも成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記の酵素学的性質を有するラクトシルセラミド合成酵素（以下、本酵素Ａと称することがある）を提供するものである。
【０００８】
（１）作用
ウリジンジホスフェート−ガラクトースからガラクトースをグルコシルセラミドに転移させ、ラクトシルセラミドを合成する。
（２）基質特異性
グルコシルセラミドに強く作用し、グロボシドに弱く作用し、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ２にほとんど作用しない。
（３）金属要求性
マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。
（４）至適pH
pH６．４〜７．４
（５）分子量
約６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
【０００９】
また、本発明は、配列番号１、３若しくは５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を有するラクトシルセラミド合成酵素を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、配列番号１、３若しくは５で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、配列番号２、４若しくは６で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加してなる塩基配列を有するラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は上記ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡを提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は上記ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を培養し、該培養物からラクトシルセラミド合成酵素を採取することを特徴とするラクトシルセラミド合成酵素の製造法を提供するものである。
【００１５】
前記のラクトシルセラミド合成酵素のうち、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素はラット由来（本酵素Ａ）であり、配列番号３のアミノ酸配列を有する酵素はマウス由来（本酵素Ｂ）であり、配列番号５のアミノ酸配列を有する酵素はヒト由来（本酵素Ｃ）である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素は、例えばラット、マウス、ヒトの脳に代表される動物細胞の膜画分から得られる。具体的には、ラット、マウス、ヒト等の脳膜画分より、界面活性剤で可溶化後、各種アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等により精製できる。
【００１７】
本酵素Ａの精製を例示してより詳細に説明する。すなわち、ラット脳をホモジナイズし、細胞分画を行い、サスペンジョン用バッファーに懸濁して脳膜画分を得る。この脳膜画分にトライトンＸ−１００に代表される界面活性剤を加えて酵素を可溶化する。次いで可溶化酵素画分をレクチン−アガロース、及びウリジンジホスフェート−ヘキサノールアミンアガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーに付し、更にヒドロキシアパタイト、ミニＱなどのイオン交換クロマトグラフィーに付すことにより精製される。
【００１８】
このようにして得られた本酵素Ａの酵素学的性質を以下に示す。
（１）作用
ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）−ガラクトースからガラクトースをグルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）に転移させ、ラクトシルセラミドを合成する。
【００１９】
（２）基質特異性
グルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）に強く作用し、グロボシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）に弱く作用し、セラミド（Ｃｅｒ）、ラクトシルセラミド（Ｌａｃ−Ｃｅｒ）、ＧＡ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）及びＧＭ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ（ＮｅｕＡｃ）−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）にほとんど作用しない。
具体的には、Ｇｌｃ−Ｃｅｒに対する活性を１００％としたとき、グロボシドに対して１２％、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ２に対して１％未満である。
【００２０】
（３）金属要求性
マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。
具体的には、マンガン＞マグネシウム＞カルシウム＞カドミウム＞鉄の順に２価金属イオンを要求する（図１）。
【００２１】
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．４〜７．４付近
具体的には、カコジル酸バッファーではｐＨ６．４〜７．４の範囲で活性を示し、ｐＨ７．２で最も高い活性を示す。またＭＥＳバッファーではｐＨ６．２〜７．０で活性はほとんど変化しないが、カコジル酸バッファーに比べ活性は低い。（図２）。
【００２２】
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、５４，０００〜６８，０００である。
また、グリカナーゼ処理で分子量が約５０，０００に低下するので、本酵素Ａの本質は糖蛋白質であり、糖鎖部分が約１０，０００又はそれ以上あると考えられる。上記分子量の範囲は糖鎖の付き方に由来する。
【００２３】
（６）部分アミノ酸配列
本酵素Ａをリジンペプチダーゼで消化後、逆相カラムでペプチド断片を分離し、その断片のうち、４断片につき、アミノ酸配列を決定した。その結果、少なくとも下記の４つのペプチド断片を有していることが判明した。
【００２４】
（１）Ｌｙｓ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｌｙｓ
（２）Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
（３）Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
（４）Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
【００２５】
本発明におけるラクトシルセラミド合成酵素の活性測定はガラクトースの供与体であるＵＤＰ−ガラクトースの放射ラベルガラクトースが受容体であるグルコシルセラミドに転移されて生成するラクトシルセラミドの放射活性を測定することにより行うことができる。
具体的には、ＭｎＣｌ２  を１μモル、ＣＤＰ−コリンを０．７５μモル、カコジル酸ナトリウムを５μモル、界面活性剤  トライトンＸ−１００を０．４ｍｇ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルフォスファチジルコリン）を１５０μｇ、ＵＤＰ−〔Ｕ−１４Ｃ〕ガラクトースを２．１ｎモル（２３ｋＢｑ）含む最終反応液１００μｌ中に酵素として１２０μｇ以下の蛋白を加え、３７℃、３０分反応させ、反応生成物をブライ−ダイヤーの方法（Ｂｌｉｇｈ，  Ｅ．Ｇ．  ＆  Ｄｙｅｒ，  Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９５９，  ３７，  ｐ９１１）で抽出し、その放射活性を測定することにより酵素活性を測定する。
【００２６】
次に本発明酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングについて説明する。
まず、ｃＤＮＡライブラリーは、ファージ、プラスミド、コスミドのいずれをベクターとするものでもよく、本酵素Ａの場合には市販のラット脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用いるのが好ましい。
【００２７】
本酵素ＡをコードするｃＤＮＡのプローブとしては、前記のペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を合成し、これを直接用いてもよいが、該ＤＮＡ断片は短いので、一度ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、前記のペプチド断片をコードするＤＮＡ断片をプライマーとしてＰＣＲを行い、プローブとして有用なＤＮＡ断片を得るのが好ましい。
【００２８】
かくして得られたＤＮＡ断片をプローブとし、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを用いたクローニングは、常法に従って行えばよいが、例えば、サウスウエスタン法、ノースウエスタン法、ウエストウエスタン法、リガンドクローニング法、発現クローニング法、ポジショナルクローニング法等も挙げられる。このうち、大腸菌を宿主とするｃＤＮＡライブラリーを用い、プローブをビオチン標識しておき、プローブと結合したｃＤＮＡをストレプトアビジンで選択した後、コロニーの選択は前記のプライマーを用いたＰＣＲにより行うのが好ましい。
【００２９】
得られた本酵素ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号２に示す通りであり、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。
【００３０】
本酵素ＢについてはｃＤＮＡライブラリーとしてマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用い、本酵素ＣについてはｃＤＮＡライブラリーとしてヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用い、前記本酵素Ａの場合と同様にしてクローニングを行えばよい。その結果、本酵素Ｂ（マウス由来）をコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号４に示す通りであり、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列番号３に示す通りである。また、本酵素Ｃ（ヒト由来）をコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号６に示す通りであり、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列番号５に示す通りである。
【００３１】
これらの本発明酵素をコードするｃＤＮＡを用いて、本発明酵素を得るには、通常の遺伝子組換え技術に従えばよい。すなわち、これらの遺伝子を適当なベクターに組み込んで組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを用いて作製した形質転換体を培養して、該培養物から採取するのが好ましい。この組換えＤＮＡとしては、形質転換に用いられる宿主中での発現に適した発現用ベクターに本発明ＤＮＡを挿入して得られる発現ベクターが好ましい。宿主としては、原核生物、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌、真核性微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ等の酵母、昆虫を含む高等真核生物の培養細胞、例えばＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞等を使用することができるが、このうち昆虫細胞が特に好ましい。発現用ベクターとしては、前記の宿主細胞中で複製でき且つ目的のポリペプチドを発現できる任意のベクター、例えばプラスミド、バクミド等を使用できる。
【００３２】
このような発現用ベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ系、ｐＭＡＭ系、ｐＢａｃＰＡＫ系、ｐＣＲ３系、ｐＢｌｕｅＢａｃ系、ｐＧＥＸ系などが挙げられる。ＤＮＡの発現用ベクターへの挿入は、常法、例えばＴ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応等によって行われる。
【００３３】
ｐＦａｓｔＢａｃ系ベクターとして、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴを用いた場合について説明する。このｐＦａｓｔＢａｃＨＴは、プラスミドであり、トランスポゾンｍｉｎｉ  ＴＮＴ配列を含み、かつその両腕にゲンタマイシン耐性マーカー、バキュロウイルスプロモーター及び目的遺伝子挿入部位を含む。ギブコビーアールエル社から入手可能である。
【００３４】
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴへのラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の挿入は、例えばラクトシルセラミド合成酵素遺伝子のＥｃｏＲＩ断片をｐＦａｓｔＢａｃＨＴのＥｃｏＲＩ切断部位に挿入するのが好ましい。
【００３５】
かくして得られたｐＦａｓｔＢａｃＨＴ組換えプラスミドを挿入するためのバクミドＤＮＡとしては、ヘルパープラスミドとバキュロウイルスとのシャトルベクターとなるものであれば特に制限されないが、例えば大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに含まれているバクミドＤＮＡが好ましい。このバクミドには、コピー数を抑えるｍｉｎｉ  Ｆレプリコン、カナマイシン耐性マーカー及びｐＵＣ由来のｌａｃＺα遺伝子が含まれている。またこのｌａｃＺα中には、リーディングフレームを損なわないようにｍｉｎ−ａｔｔＴＮ７が挿入されている。
【００３６】
バクミドＤＮＡの組換えは、ＤＨ１０Ｂａｃのコンピテントセル中に前記ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ組換えプラスミドを導入すればよい。形質転換体の選択は、ｌａｃＺの欠失及びゲンタマイシン耐性獲得を指標にすればよい。
【００３７】
得られたクローンからバクミドＤＮＡを抽出すれば本発明の組換えバクミドが得られる。なお、ラクトシルセラミド合成酵素遺伝子のバクミドＤＮＡへの挿入の有無はＰＣＲにより確認できる。
【００３８】
本発明組換えバクミドを導入するための宿主細胞としては、バキュロウイルスが感染する細胞であれば特に制限されないが、通常昆虫細胞が用いられる。昆虫細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ５等が挙げられるが、通常Ｓｆ９が用いられる。導入手段としてはセルフェクチンを用いたリポソーム法が好ましい。感染培養細胞からバキュロウイルスを得、このウイルスを宿主細胞に再度感染させれば、ラクトシルセラミド合成酵素を発現する形質転換昆虫細胞が得られる。
【００３９】
得られた形質転換細胞を培養し、該培養物からラクトシルセラミド合成酵素を採取すれば、ラクトシルセラミド合成酵素が大量に生産できる。形質転換細胞の培養は、用いた宿主細胞が増殖する条件であれば特に制限されない。また該培養物からのラクトシルセラミド合成酵素の採取は、例えば硫安分画、塩析、各種クロマトグラフィー等を適宜組合わせて行うことができる。
【００４０】
なお、本発明においては遺伝子は、示した塩基配列からなる遺伝子だけでなく、該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有する遺伝子であっても、同様の機能を有する限り含まれる。また酵素は、示したアミノ酸配列からなる酵素だけでなく、該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する酵素も同様の性質を有する限り含まれる。
【００４１】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００４２】
実施例１
ラクトシルセラミド合成酵素の製造法
（１）ラットの脳膜画分の調製方法：
全ての操作は０〜４℃で行った。２〜３週齢のウイスター系ラット（雄雌混合）を頸椎脱臼により屠殺した後、脳を摘出した。摘出した脳は使用まで−８０℃で保存した。
ラット脳膜画分の採取に当たり脳をはさみで細断し９倍容のホモジナイズ用バッファー（０．３２Ｍの蔗糖、０．２５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えホモジナイズした。ホモジネートを８００×ｇで遠心分離した上清を更に１０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈澱をサスペンジョン用バッファー（０．２５Ｍの蔗糖、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、プロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．４）に懸濁してラット脳膜画分とした。実験に使用するまで−１４５℃にて保存した。
【００４３】
（２）酵素の可溶化：
懸濁した脳膜画分に蛋白の最終濃度が４ｍｇ／ｍｌ、トライトンＸ−１００が１％になるようにトライトンＸ−１００を加え、０℃で２時間放置した後１００，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清を可溶化画分とした。
【００４４】
（３）ＷＧＡ（小麦胚芽レクチン）−アガロースによるアフィニティクロマトグラフィー：
５００ｍＭの塩化ナトリウム、１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロック（プロテアーゼインヒビター）を含む１０ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化された小麦胚芽レクチン−アガロースのカラム（１５０ｍｌ）に約１５０個のラット脳から調製した可溶化画分をアプライした後、カラム容量の約１０倍量の同バッファーでカラムを洗浄し、２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃを含む同バッファーで酵素を溶出した（図３）。
【００４５】
（４）ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースによるアフィニティクロマトグラフィー：
ＷＧＡ−アガロースから特異的に溶出された酵素サンプルにＭｎＣｌ２を加えて１０ｍＭとし、５００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化したＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースのカラム（４０ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を洗浄後１ｍＭのＵＤＰを含む同バッファーで酵素を溶出した（図４）。
【００４６】
（５）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー：
（４）のサンプルのバッファーをリン酸バッファーに交換するためにＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースのカラムから溶出されたサンプルを１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８で平衡化したＰＤ−１０カラムにアプライし同バッファーで溶出し、蛋白画分を得た。これを同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトのカラム（０．５ｍｌ）にアプライし、酵素活性を有する非吸着画分を次のステップに用いた。
【００４７】
（６）ミニＱによるイオン交換クロマトグラフィー：
（５）のサンプルを１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８で平衡化したミニＱカラム（ファルマシア社製）にアプライし０から２Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法で酵素を溶出し、酵素活性を有する画分を回収した（図５）。
【００４８】
上記各精製ステップにおける酵素回収率を表１に示す。また、得られた酵素の性質は、前記の通りであった。
【００４９】
【表１】
0003578904.tif 000002
【００５０】
ミニＱカラムで得られた各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図６に示す。
【００５１】
実施例２
ラットラクトシルセラミド合成酵素の部分アミノ酸配列の解析
酵素標品をクロロホルム／メタノール濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行った。
染色された部分を切り取り、リジンペプチダーゼにて一夜消化後、消化液を逆相カラムＲＰ−１８にアプライし、ペプチドを分離した。
液体クロマトグラフィーにより分取したペプチド断片のうち、４つのペプチドにつきアミノ酸配列をアプライドバイオシステムズ社製のプロテインシーケンサーを用いて解析し、表２の結果を得た。
【００５２】
【表２】
0003578904.tif 000003
【００５３】
上記４つのうち、逆相カラムで得られたペプチド（１）と（２）については糖蛋白質糖転移酵素（β１  −４ＧａｌＴ、ＥＣ２．４．１．３８）とそれぞれ４７．５％、４７％の相同性がありこれらの配列はその間に約８０個のアミノ酸をはさんでペプチド（１）がＮ末側にあると推測された。
しかし、ペプチド（３）と（４）については上記糖転移酵素と３０％程度の相同性のある場所がＮ末側からＣ末側まで点在しているため、場所の特定はできなかった。
【００５４】
実施例３
ラットラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニング：
ｃＤＮＡライブラリーはラット脳より得られたマラソンレディー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ）ｃＤＮＡｓをクローンテック社より購入した。
上記アミノ酸配列のうちペプチド（１）と（２）からβ１−４ＧａｌＴと相同性が低く、アミノ酸に対するコドンの縮重度の低い部分を選択し、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）プライマーを作成し、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはベーリンガーマンハイム社のエキスパンドＴＭハイファイＰＣＲシステムを用いた。
これにより増幅されたＤＮＡ断片のうち、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲでも主に増幅した約３００ｂｐのものについてプラスミドベクターにクローニング（インビトローゲン社のオリジナルＴＡクローニングキットを使用、ベクターはｐＣＲ２．１、大腸菌はＩＮＶαＦ’、少量のプラスミドの抽出はストラテジーン社のクリアーカットミニプレップキットを使用）し、シークエンスを行った。
シークエンスはアマシャム社のサーモシーケンス蛍光シークエンサー用サイクルシークエンシングキットでサンプルをラベルし、ファルマシア社のＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＴＭ  ＤＮＡシーケンサーを用いて行った。
その結果、プライマーに用いた配列をはさんで約２００ｂｐの塩基配列を得ることができた。
この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はペプチド（１）と（２）を含み、更にペプチド（３）を含むことが判明した。
ペプチド（３）についてはその質量分析の結果から、ＸＸＸＸの配列がＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ  であることが推測されていたが、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列に、まさにＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ  の配列が含まれていた。
次いで、上記３’側のｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒを用いて５’ＲＡＣＥを行ったところ、新たに、６０ｂｐの塩基配列が判明した。
その塩基配列から推定されるアミノ酸配列の中に、部分アミノ酸配列解析から判明したペプチド（４）が存在した。
これですべての部分アミノ酸配列の位置関係を特定することができた。
【００５５】
これまでに判明した塩基配列をもとにオリゴＤＮＡプローブを作成し、ギブコ−ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）社のジーントラッパーｃＤＮＡポジティブセレクションシステムを用いてラットラクラトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニングを行った。
プローブのオリゴＤＮＡをビオチン標識し、ジーンＩＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ  により１本鎖にしたｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズした。
ｃＤＮＡライブラリーはギブコ−ビーアールエル社のスーパースクリプトｃＤＮＡライブラリー（ベクターｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ２、大腸菌ＤＨ１２Ｓ）を用いた。ｃＤＮＡライブラリーからプラスミドの精製はクイアゲン（ＱＵＩＡＧＥＮ）社のプラスミドミディキット（Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を用いて行った。
プローブと結合したｃＤＮＡをストレプトアビジンで選択し、得られたｃＤＮＡを２本鎖に修復後、大腸菌（ＤＨ１０Ｓ）にトランスフェクトした。
大腸菌にラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡが含まれるかはＰＣＲにより確認した。
その結果、２７４コロニー中７８コロニーにおいて、ラクトシルセラミド合成酵素特異的プライマーでＤＮＡ断片の増幅が見られた。
そのコロニーの大腸菌を培養し、ストラテジーン社のクリアーカットミニプレップキットによりプラスミドを抽出し、ＮｏｔＩ、Ｓａｌによる制限酵素処理（ダブルダイジェスチョン）を行った。
制限酵素切断パターンより得られたクローンは、８種類のインサートを持つと推定された（インサート長０．８、１．４、１．５、１．８、３．０、３．３、４．７、５．３Ｋｂｐ）。
これら８種類のクローンの一部の塩基配列を決定したところ、何れもすでに決定したラットラクトシルセラミド合成酵素の塩基配列を含んでいた。
判明した塩基配列を配列番号２に、その推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５６】
実施例４
ヒト、マウスのラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニング：
用いたヒト、マウスｃＤＮＡライブラリーは何れも脳から得られたマラソン−レディーｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡｓ）をクローンテック社より購入した。
ラットに用いたのと同じプライマーを用いてマウスとヒトのラクトシルセラミド合成酵素のｃＤＮＡの一部をＰＣＲ法によりクローニングした。
ＰＣＲはベーリンガーマンハイム社のエキスパンドＴＭハイファイＰＣＲシステムを用いた。
その結果、マウスとヒト共にラットと同じく２０３ｂｐの配列を得ることができた。
塩基配列の相同性はラットとマウスで９０．６％、ラットとヒトで８７．７％であり、塩基配列から推定されるアミノ酸配列では、ラットとマウスで９７％、ラットとヒトで９７％であり、非常に相同性が高かった。
【００５７】
マウスとヒトのラクトシルセラミド合成酵素のｃＤＮＡの一部の塩基配列をもとにオリゴＤＮＡプローブを作成し、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブセレクションシステムを用いてマウスラクトシルセラミド合成酵素ｃＤＮＡのクローニングを行った（方法はラットの場合と同様）。
プローブのオリゴＤＮＡをビオチン標識し、ジーンＩＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ  により１本鎖にしたｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズした。
プローブと結合したｃＤＮＡをストレプトアビジンで選択し、得られたｃＤＮＡを２本鎖に修復後、大腸菌にトランスフェクトした。
この大腸菌のコロニー中にラクトシルセラミド合成酵素が含まれるか、ＰＣＲで確認した。
その結果、９６コロニーに中９コロニーにおいて、ラクトシルセラミド合成酵素特異的プライマーでＤＮＡ断片の増幅が見られた。
制限酵素切断パターンより、得られたクローンは、４種類のインサートを持つと推定された（インサート長０．９、２．４、３．２、４．５ｋｂｐ）。
これら４種類のクローンの一部の塩基配列を決定したところ、すべてすでに決定したマウスラクトシルセラミド合成酵素の塩基配列を含むことが判明した。
更にマウスラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の塩基配列の解析を続けたところ配列番号４の塩基配列を有することが判明した。配列番号３にその推定アミノ酸配列を示す。
一方、ヒトラクトシルセラミド合成酵素遺伝子の塩基配列は配列番号６であることが判明した。配列番号５にその推定アミノ酸配列を示す。
【００５８】
実施例５
（１）発現用組換えバクミドの作製
配列番号６の塩基配列のうち、配列番号５に相当する部分を含むＤＮＡ断片を両端のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅させた。
得られた増幅ＤＮＡをＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）を用いてｐＣＲ２．１ベクター中へクローニングした。
【００５９】
（２）ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂへの挿入
得られた遺伝子をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂもまたＥｃｏＲＩで切断し、ホスファターゼ処理後、ライゲーション反応を行った。遺伝子を挿入したプラスミドは大腸菌中に形質転換した後、個々のクローンにつていプラスミドを抽出し、挿入方向を確認した。挿入されたプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂＧＣＳとする。
【００６０】
（３）バクミドＤＮＡへの挿入
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂＧＣＳは、大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（ギブコＢＲＬ社）へ形質転換されると、大腸菌中に含まれるバクミドＤＮＡに挿入される。これにより得られた形質転換体をαコンプリメンテーションアッセイにより選択した。すなわち、基質としてハロゲン化インドリル−β−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ、ギブコビーアールエル社）を使用し、寒天培地にはＬＵＲＩＡ  ＡＧＡＲ（ギブコビーアールエル社）を使用した。この寒天培地には５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌＢｌｕｏ−Ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して使用した。この培地に形質転換体を植菌後３７℃で２４時間培養し、更に４℃で２日間培養した後カラーセレクション、すなわち、出現したブルー及びホワイトコロニーのうち、ホワイトコロニーを採取した。
【００６１】
（４）組換えバクミドの採取
得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む２×ＹＴ１４培地を用いて培養を行った。１．５ｍｌの培地から集菌を行い、３００μｌ  ＳｏｌＩ（１５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ）に菌体を懸濁した後、３００μｌ／Ｓｏｌ  ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加え穏やかに攪拌し５分間室温で静置した。更に、３００μｌのＳｏｌ  ＩＩＩ（３Ｍ酢酸カルシウム）をゆっくり加え、穏やかに攪拌した後、氷上に１０分静置した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の上清にイソプロパノール８００μｌを加え穏やかに攪拌、−２０℃で一晩放置した。１４，０００×ｇ、１０分間遠心の沈殿物を、冷７０％エタノールでよくリンスして自然乾燥後、穏やかに１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）中に溶解した。
【００６２】
（５）昆虫細胞の形質転換
振盪培養のＳｆ９細胞（対数増殖期のもの）９×１０５（５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む２ｍｌのＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地中）を３５ｍｍウエル上にまいた。１時間以上２７℃で静置し、細胞が付着することを確認した。
（４）により得たバクミドＤＮＡ５μｌを抗生物質を含まないＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地１００μｌ中に希釈し、これをＡ液とした。６μｌのセルフェクチン試薬を同様に抗生物質を含まないＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地１００μｌ中に希釈しこれをＢ液とした。２つの溶液Ａ、Ｂを穏やかに混合し、室温で３０分放置した。この混合液全量を、８００μｌのＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地を含むチューブ中に添加し、Ｃ液とした。
抗生物質を含まないＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地約２ｍｌで２回細胞を洗浄した後、Ｃ液をウエル中に加え、２７℃で５時間放置した後、抗生物質を含むＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地２ｍｌに置換した。ＤＮＡを接種して７２時間後、培養上清を回収しこれをウイルス液とした。
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの振盪培養細胞に１／１００量の上記ウイルス液を加え、３日間培養した上清を標準ウイルス液とした。以下の実験ではこの標準ウイルス液のタイターを２×１０７ＰＦＵと仮定して使用量などを計算し、順次Ｓｆ９細胞を感染させ、ラクトシルセラミド合成酵素を発現させた。
【００６３】
（６）昆虫細胞の培養法及びホモジェネートの作成
Ｓｆ９細胞は、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの抗生物質を含むＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地に馴化し、主に振盪培養で培養した。振盪培養は２７℃、振盪速度１３０ｒｐｍで、２×１０５〜４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲内で行った。培養した細胞は、２，０００ｒｐｍ  、１０分間遠心して収穫し、約１０倍量のホモジェネートバッファー（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）に懸濁し、更に１０ｍｌのガラスホモジェナイザーを使用して１，０００ｒｐｍ  、１０ストロークのホモジェナイズを行った。これを電気泳動や活性測定のサンプルとした。
【００６４】
（７）ヒトラクトシルセラミド合成酵素の発現
（５）で得られた形質転換細胞をＳＦ９００ＩＩ  ＳＦＭ培地で培養した後、細胞をホモジェネートした。この酵素画分０．５〜１ｍｇ／ｍｌ、グルコシルセラミド２００μｇ／ｍｌ、トリトンＸ１００  ０．６％（ｗ／ｖ）、カコジル酸２００ｍＭ、ＭｎＣｌ２  １ｍＭ、ＣＤＰコリン７５ｍＭ、及びＵＤＰ−〔１４Ｃ〕−Ｇａｌ  １１．５μＭ（３０２Ｃｉ／ｍｏｌ）を含む反応液１００μｌを作成し、３７℃、１時間反応させた。メタノールを添加して反応を停止させ、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ法にて脂質を抽出した。
この脂質画分１／５量をＨＰＴＬＣで展開（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６５：２５：４）し、ＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）で画像化し、アイソトープ量を定量した。その結果、本形質転換細胞は、２２．０ｐｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎのラクトシルセラミド合成酵素活性を発現した。この比活性はラット脳膜画分の３８倍以上であった。
【００６５】
実施例６
ラット、マウスについてもｐＦａｓｔＢａｃＩを用いて同様に遺伝子を発現させた結果、それぞれ１７３ｐｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ、１３ｐｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎのラクトシルセラミド合成酵素活性を発現した。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によればスフィンゴ糖脂質の原料であるラクトシルセラミドが大量に生産できる。
【００６７】
【配列表】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本酵素Ａの金属イオン要求性を示す図である。
【図２】本酵素Ａの至適ｐＨを示す図である。
【図３】本酵素ＡのＷＧＡ−アガロースカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】本酵素ＡのＵＤＰ−アガロースカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】本酵素ＡのミニＱカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６】ミニＱカラムクロマトグラフィーの主要フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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