(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３に特異的に反応し、メチルアルコール中ベンゼンの濃度が２０％の溶液に耐性を示すことを特徴とする、モノクローナル抗体。
【請求項２】
メチルアルコール中ベンゼンの濃度が３０％の溶液に耐性を示す、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１３４０１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１３４０２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１３４０３、又はＦＥＲＭ  Ｐ−１３４０４であるハイブリドーマにより産生される、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、下痢性貝毒の免疫学的検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそのモノクローナル抗体を用いる下痢性貝毒の検出方法に関する。本発明による前記モノクローナル抗体は、特には、有機溶媒耐性抗体である。
【０００２】
【従来の技術】
オカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３（即ち、７−Ｏ−アシル−ジノフィシストキシン−１）の４種の下痢性貝毒の内、オカダ酸は黒磯海綿の一種（Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ  ｏｋａｄａｉ  及び  Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ  ｍｅｌａｎｏｄｏｃｉａ）が、ジノフィシストキシン−１は渦鞭毛藻  （Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ  ｆｏｒｔｉｉ  ）  が産生する脂溶性化合物である。また、ジノフィシストキシン−３は、前記ジノフィシストキシン−１が貝の体内で変換されて生成する脂溶性化合物であり、７−Ｏ−アシルオカダ酸は合成によって得られたジノフィシストキシン−３の類縁物質である。これらの化合物は、或る任意の時期又は地域の食用二枚貝の中腸腺に蓄積し、貝を毒化する。食中毒の発生件数ではフグに次いで二位であるが、患者数では第一位であり、食品衛生上、大きな問題である。
【０００３】
従来、下痢性貝毒の検査法としてはマウスを用いた致死活性測定法が公定法として用いられているが、動物の管理、検出感度、精度及び特異性等の面で問題があった。一方、この検査を、高感度で、簡便かつ短時間に行うことを目的とした手法の開発が試みられている。
【０００４】
例えば特開平１−９６１９９号公報には、オカダ酸群に対するモノクローナル抗体及びその製法が開示されている。しかしながら、該抗体は、下痢性貝毒のうち、オカダ酸及びジノフィシストキシン−１に対して特異的に反応する抗体ではあるが、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−３を検出・測定することはできない。また、前記特開平１−９６１９９号公報には、有機溶媒存在下で活性を維持することのできるモノクローナル抗体を得ることに関して一切記載がなく、それを示唆する記載もない。
【０００５】
本発明者は、日本における下痢性貝毒による食中毒の主原因はジノフィシストキシン−３であること、及び、前記の各貝毒はいずれも脂溶性物質であるので、被検試料から貝毒成分を抽出するには有機溶媒の使用が避けられず、操作工程を簡略化するには、有機溶媒存在下で免疫反応を行うことが望ましいことに鑑み、前記下痢性貝毒本体のオカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモノクローナル抗体を見出し、ＰＣＴ／ＪＰ９２／０１０２１号に開示した。
【０００６】
本発明者は、更に、ジノフィシストキシン−３の合成類縁化合物である７−Ｏ−アシル−オカダ酸に対する反応性、並びにアルコール類及びケトン類以外の有機溶媒中での反応性、更には前記の４種類の貝毒に対する反応性の比較を目的として鋭意研究したところ、オカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモノクローナル抗体を見出すことに成功し、このモノクローナル抗体を用いると、有機溶媒存在下でも免疫学的に迅速かつ特異的に下痢性貝毒を検出することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００７】
従って、本発明は、オカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３（即ち、７−Ｏ−アシル−ジノフィシストキシン−１）に特異的に反応し、メチルアルコール中ベンゼンの濃度が２０％の溶液に耐性を示すことを特徴とする、モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする下痢性貝毒の免疫学的検出方法にも関する。
【０００８】
以下、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的検出方法の順に説明する。
本発明によるモノクローナル抗体及びハイブリドーマの調製は常法、例えば、続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法で行うことができる。具体的には、免疫原としては、オカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１及びジノフィシストキシン−３に特異的なモノクローナル抗体をもたらすものを任意に用いることができるが、特にはオカダ酸、７−Ｏ−アシル−オカダ酸、ジノフィシストキシン−１若しくはジノフィシストキシン−３、又は、これらの塩類、更にはこれらを生体高分子（例えば、ウシ血清アルブミン又は免疫グロブリン）担体に結合させたものを用いるのが好ましい。これらの免疫原溶液を用いて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をイン・ビボ免疫法により免疫する。例えば、免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳化混合し、マウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。
【０００９】
なお、本明細書で「アシル」とは、芳香族アシル基、及び飽和又は不飽和で、直鎖又は分枝鎖の脂肪族アシル基のいずれでもよく、例えば、炭素数８〜３０個、好ましくは８〜２４個の飽和又は不飽和脂肪酸（具体的には、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸又はリノレン酸など）から誘導されるアシル基である。
【００１０】
細胞融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例えば、ｐ３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）［Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，４９５−４９７  （１９７５）］、ｐ３−Ｕ１［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８１；１−７（１９７８）  ］、ＮＳ−１［Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６；５１１−５１９（１９７６）  ］、ＭＰＣ−１１［Ｃｅｌｌ，８；４０５−４１５（１９７６）  ］、ＳＰ２／０［Ｎａｔｕｒｅ，  ２７６；２６９−２７０（１９７８）  ］、ＦＯ［Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  ３５；１−２１（１９８０）］、×６３．６．５５．３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２３；１５４８−１５５０（１９７９）  ］、Ｓ１９４［Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １４８；３１３−３２３（１９７８）  ］、又はラットにおけるＲ２１０［Ｎａｔｕｒｅ，  ２７７；  １３１−１３３（１９７９）］などを使用することができる。
【００１１】
細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融合促進剤（ポリエチレングリコールなど）及び場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を用いて行うことができ、使用比率も常法と同様に、例えば、脾臓細胞に対してミエローマ細胞を約１〜１０倍程度の量で用いる。融合用培地としては、例えば、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって行う。
【００１２】
続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ培養上清の抗体（即ち、オカダ酸と７−Ｏ−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−１とジノフィシストキシン−３とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体）産生の有無を、例えばＥＬＩＳＡ法によって検出・測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。特に、有機溶媒に対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する場合には、各種濃度で前記有機溶媒を含む有機水性溶液ないし無水有機溶媒中に抗体を入れた後、下痢性貝毒を添加し、抗原抗体反応が正常に進行することを確認することによって、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。
【００１３】
こうして得られた、目的のモノクローナル抗体を分泌する本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素等の中で容易に長期間保存することができる。ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地を用いることができ、好適にはＤＭＥＭにウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。ハイブリドーマの培養は、イン・ビトロの場合には例えば培地中で５％二酸化炭素濃度及び３７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合には約１４日間程度実施するのが好ましい。
【００１４】
前記のハイブリドーマを常法によって培養した培養液から、あるいはハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製することが可能である。培養液又はマウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ又はプロテインＧ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥の方法等がある。
【００１５】
本発明による下痢性貝毒検出方法は、前記の本発明のモノクローナル抗体（即ち、オカダ酸と７−Ｏ−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−１とジノフィシストキシン−３とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体）を用いて実施するので、下痢性貝毒を漏れなく検出することができる。また、本発明検出方法の好ましい態様では、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を用いるので、検査対象の下痢性貝毒を充分に溶解することのできる量の有機溶媒を含有する有機水性系（又は無水有機系）中で正確な抗原抗体反応を進行させることができる。
【００１６】
本発明方法は、オカダ酸と７−Ｏ−アシル−オカダ酸とジノフィシストキシン−１とジノフィシストキシン−３とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体を用いること、そして好ましくは有機溶媒耐性抗体を用いること（従って、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施すること）を除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的検出方法にそのまま適用することができる。従って、本発明方法は、具体的には例えば、
（１）試料を有機溶媒（例えば、水混和性有機溶媒）で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、
（２）下痢性貝毒に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体と、前記有機溶媒抽出液を接触させる工程、
（３）標識を有する既知量の下痢性貝毒を前記工程（２）と同時又は前記工程（２）の終了後に前記抗体と接触させる工程、
（４）前記抗体と結合した標識化下痢性貝毒と、前記抗体と結合していない標識化貝毒とを分離する工程、
（５）前記工程（４）で分離したいずれか一方の標識化下痢性貝毒が有する標識からの信号を検出又は測定する工程を含む、試料中の下痢性貝毒の検出方法（競合法及び非競合法）からなる。
【００１７】
更に、本発明方法の具体的態様としては、例えば
（１）試料を有機溶媒（例えば、水混和性有機溶媒）で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、
（２）下痢性貝毒に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する第１抗体を、不溶性担体に固定させる工程、
（３）下痢性貝毒を含む有機溶媒抽出液を、前記工程（２）の固定化第１抗体に接触させる工程、
（４）前記下痢性貝毒に対して、前記第１抗体とは異なる部位で結合すると共に標識を有する第２抗体を過剰量添加する工程、
（５）第１抗体と下痢性貝毒との複合体上の標識の信号を検出する工程を含む、試料中の下痢性貝毒の検出方法（サンドイッチ法）も含む。本発明は、その他公知の免疫反応検出方法に広く応用することができる。
【００１８】
本発明で用いる有機溶媒は、アルコール類、ケトン類、エーテル類又はベンゼンであって、検査対象の試料から下痢性貝毒を抽出、希釈又は保存する際に用いる溶媒である。水混和性の有機溶媒を用いると、有機水性溶媒で抽出工程を行ったり、場合により有機溶媒抽出液を水で適当に希釈してから、抗原抗体反応を有機水性溶媒中で実施することができ、あるいは有機溶媒抽出液をそのまま用いて、無水有機溶媒中あるいは有機水性溶媒中で抗原抗体反応をさせることができるので好ましい。有機溶媒としては、例えば、アルコール化合物（例えば、炭素原子１〜３個の低級アルコール、特には、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、ケトン化合物（例えば、炭素原子１〜３個の低級脂肪族ケトン、特には、メチルエチルケトン、アセトン）、エーテル化合物（例えば、炭素原子１〜３個の低級脂肪族エーテル、特には、メチルエーテル、エチルエーテル、ｍ−プロピルエーテル）及びベンゼン、あるいはこれらの混合物を挙げることができる。
【００１９】
本発明の検出方法を具体的に実施する際には、最初に食用二枚貝の中腸腺検体を前記の有機溶媒で抽出する。得られた抽出液をそのまま又は水で希釈して次の接触工程に用いる。次に、例えばマウスから得た本発明のモノクローナル抗体であって、有機溶媒に対し耐性を有する抗体を、前記の方法で予め調製しておく。この抗体（サンドイッチ法では第１抗体）と前記有機溶媒抽出液とを接触させると、その有機溶媒抽出液に下痢性貝毒（抗原）が存在する場合には、有機溶媒存在下で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、有機溶媒存在下で実施することを除けば、通常の抗原抗体反応と同様に行うことができる。例えば、抗体を適当な不溶性支持体（ウエル又はラテックス粒子）上に担持させ、有機溶媒抽出液中の抗原と特異的に反応させる。
【００２０】
本発明方法を競合法又は非競合法で実施する場合には、既知量の標識化抗原を用いて下痢性貝毒の存在の確認又は定量を行うことができる。また、サンドイッチ法を用いる場合には、過剰量の標識化第２抗体を用いる。貝毒の標識には、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、 ３Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム）を用いることができる。
【００２１】
標識化抗原は、前記抗体と有機溶媒抽出液との接触工程が終了してから（即ち、前記抗体と有機溶媒抽出液中の抗原との抗原抗体反応が終了してから）（非競合法）、あるいは前記抗体と有機溶媒抽出液との接触工程と同時に（即ち、前記抗体と有機溶媒抽出液中の抗原との抗原抗体反応と同時に）（競合法）、反応系に加えることができる。非競合法では、有機溶媒抽出液中の下痢性貝毒と結合していない抗体が標識化抗原と結合する。一方、競合法では、既知量の標識化抗原と前記有機溶媒抽出液中の未知量の抗原とが拮抗的に抗体と結合する。サンドイッチ法では、第１抗体を前記有機溶媒抽出液と接触させた後、非競合抗原を洗浄除去してから標識化第２抗体を加えると、第１抗体と抗原との複合体に対して標識化第２抗体が結合する。
【００２２】
前記の抗体と有機溶媒抽出液との接触工程、及び標識化抗原又は標識化第２抗体の添加工程では、下痢性貝毒の溶解度と標識の不活性化とを考慮して有機溶媒の濃度を選択する。なお、非競合法においては抗原抗体反応を実施する条件と異なる条件下（例えば、水を添加して有機溶媒濃度を低下させるか、あるいは水系に完全に置き換える）で、前記標識化抗原を加えることもできる。一方、競合法では標識化抗原を前記抗原抗体反応と同時に行うので、その反応系に存在する有機溶媒によって標識が不活性化しないようにする必要がある。
【００２３】
競合法及び非競合法では、標識化抗原と抗体との反応が終了した後で、抗体と結合した標識化抗原と、抗体と結合しなかった標識化抗原とを分離する。分離は、例えば、濾過、遠心処理又は緩衝液による洗浄によって行うことができる。サンドイッチ法では、第１抗体結合抗原と標識化第２抗体との反応が終了した後で、第１抗体結合抗原と結合しなかった標識化第２抗体を除去し、続いて、第１抗体結合抗原と結合した標識化第２抗体の標識からの信号を検出又は測定する。
【００２４】
こうして分離した標識抗原に由来する信号（競合法又は非競合法）、あるいは、第１抗体結合抗原と結合した標識化第２抗体の標識に由来する信号（サンドイッチ法）を検出又は測定する。信号を検出又は測定する際には、標識化抗原を含む反応系を信号検出又は信号測定に好ましい条件に変えるのが好ましい。例えば、ビオチン−標識化アビジンの系を用いた場合には、反応系を水系に変えてから基質を加え、酵素活性を検出又は測定する。また、標識として蛍光又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を検出又は測定する。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成
下痢性貝毒の一種であるオカダ酸（和光純薬）（以下、ＯＡと称す）２ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド０．３１ｍｇ及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．５７ｍｇをジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと称す）１２０μｌに溶かし、室温で２時間反応させた。得られた反応液を２分割し、一方の反応液３９μｌにヒトＩｇＧ１．５ｍｇを加えて溶解し、他方の反応液８１μｌにはウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称す）１．９ｍｇを加えて溶解し、各々を室温で更に２時間反応させた。最後に、得られた反応液のゲル濾過を、リン酸含有生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと称す）で平衡させたセファデックスＧ−２５カラムによって行った。得られたＯＡ−ヒトＩｇＧ及びＯＡ−ＢＳＡをそれぞれ０．８２６ｍｇ／ｍｌ及び１．０４ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶かし、ＯＡ−ヒトＩｇＧを免疫原、ＯＡ−ＢＳＡを分析用抗原として用いた。
ＯＡ−ＩｇＧ溶液３００μｌに同量のフロインド完全アジュバントを加え、良く混合して均質のゾルを調製した。このゾル２００μｌを雌マウス（４週令；Ａ／Ｊ）の腹腔内に投与した。２ケ月後に、同様に調製した抗原ゾルを同じ量で腹腔内に投与した。
【００２６】
血清中の抗ＯＡ抗体の力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、５％ウシ胎児血清を含んだＴ−２培地によりシャーレ内で摘出脾臓を３回洗浄した後、注射針で傷を付けてから、絞り出すようにして単細胞の懸濁液を調製した。単細胞懸濁液をメッシュで濾過して大きな固形物を除いた。得られた濾液に、マウスのミエローマ細胞Ｐ３Ｘ−６３−Ａｇ８−６．５．３を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混ぜ、遠心（３００×ｇ，４分）して細胞を集めた。次に、血清を含まないＴ−３培地に前記の沈殿細胞を再懸濁し、同じ条件で遠心し、遠心管を指で弾いて沈渣を攪拌してから、３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００  ）溶液１ｍｌを、遠心管を回転させながら、６０秒かけてゆっくり加えた。細胞融合の停止は、細胞融合が進行している遠心管に、血清を含まないＴ−３培地を３回に分けて添加する（最初は前記培地３ｍｌ、次に前記培地９ｍｌ、そして最後に前記培地３８ｍｌをそれぞれ３０秒かけて添加する）ことにより行った。前記培地の添加が終了した後、３７℃で２分間、及び室温で８分間保持してから遠心し、得られた細胞を細胞数が１×１０６ ／ｍｌになるようにＴ−２培地に懸濁した。この細胞懸濁液を９６穴のプラスチックプレートに１００μｌ／ウエルの量で分注して、３７℃にて５％二酸化炭素−９５％空気の気相で培養した。２４時間後に、Ｔ−４培地を１００μｌ／ウエルの量で添加して、更に１０日間から１４日間、同じ条件で培養を続けた。培養液中の抗ＯＡ抗体の活性を調べ、目的とする抗体を産生しているウエルの細胞について、２４穴のプラスチックプレートで、ＨＴ培地を用い、限外希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行った。クローニングした結果、抗ＯＡ抗体を産生しているハイブリドーマ（細胞融合）２０株を得た。
【００２７】
実施例２：モノクローナル抗体の調製
実施例１で選抜したハイブリドーマ２０株の各々を、ペニシリン及びストレプトマイシンをそれぞれ２．５μｇ／ｍｌずつ含む組織培養用無血清培地セルグロッサーＨ（ハイブリドーマ用）（住友製薬）で培養した。得られた細胞を同じ培地に懸濁し、抗ＯＡ抗体を産生させる目的でミリポアダイナセルカルチャーシステム（ミリポア社）を用いて５％二酸化炭素−９５％空気の気相の下で、３７℃にて培養した。培養終了後、培養液を硫安分画し、得られたモノクローナル抗体を０．９％ＮａＣｌ含有５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶かして透析した。
【００２８】
実施例３：モノクローナル抗体の選定
２０株のハイブリドーマが産生した各抗ＯＡモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ用プレートを作成した。即ち、実施例２で調製した抗ＯＡモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌになるように、０．０８３Ｍ硼酸含有生理食塩水（ｐＨ８．０）（以下、ＢＢＳと称す）に溶かし、９６穴プレートに１００μｌ／ウエルの量で洗浄した後、ＢＢＳに溶かしたゼラチン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを各ウエルに分注し、室温で１時間放置してブロッキングを行った。
一方、水中のメチルアルコール濃度を０％（水）から１００％（無水アルコール）まで１０％ずつ徐々に変化させて調製したメチルアルコール水溶液のシリーズを調製した。
【００２９】
前記の各ＥＬＩＳＡ用プレートに、前記のアルコール性水溶液１００μｌを各ウエルに加え、室温に放置した。一時間後に各ウエルをＢＢＳ２５０μｌで３回洗浄した。次に、パーオキシダーゼで標識したＯＡ（以下、ＯＡ−ＰＯＤと称す）２５〜１００ｎｇ／ｍｌを含む溶液（１．０％ゼラチンを含むＢＢＳ）１００μｌを各ウエルに加え、室温で一時間放置した。続いて、ＢＢＳ２５０μｌで５回洗浄してから、基質溶液［３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン１００ｍｇをＤＭＦ１０ｍｌに溶かした溶液１００μｌを０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）９．９ｍｌで希釈した後、３％過酸化水素水溶液１５μｌを加えて調製した；以下、ＴＭＢＺ溶液と称す］１００μｌを各ウエルに分注し、室温で５〜４０分間反応させ、１Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を止めた。反応液の吸光度を４５０ｎｍ又は４１５ｎｍにて分光光度計（日立分光光度計Ｕ−１１００）で測定し、検量線を作成した。
【００３０】
その結果、ハイブリドーマＯＡ９５８−２株（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３４０４）が産生する抗ＯＡモノクローナル抗体（以下、ＯＡ９５８−２抗体と称す）が１００％メチルアルコール中でも正しく抗原を認識して、正常な抗原抗体反応を行うことがわかった。更に、ハイブリドーマＯＡ８−２株（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３４０１）が産生する抗ＯＡモノクローナル抗体（以下、ＯＡ８−２抗体と称す）、ハイブリドーマＯＡ１０−８株（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３４０２）が産生する抗ＯＡモノクローナル抗体（以下、ＯＡ１０−８抗体と称す）、ハイブリドーマＯＡ２２−２２株（ＦＥＲＭ    Ｐ−１３４０３）が産生する抗ＯＡモノクローナル抗体（以下、ＯＡ２２−２２抗体と称す）が産生する各抗ＯＡモノクローナル抗体についても、５０％メチルアルコール中でも正しく抗原を認識して、正常な抗原抗体反応を行うことがわかった。前記４種類の抗ＯＡ抗体の免疫グロブリンクラスをマウスＩｇＧサブクラス識別用ビオチン標識抗体（Ｉｇ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１  、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３  、ＩｇＡ、λ型Ｌ鎖、κ型Ｌ鎖）を用いてＥＬＩＳＡ法で調べたところ、ＯＡ９５８−２抗体はＩｇＧ  １κ、ＯＡ８−２抗体はＩｇＧ２ａκ、ＯＡ１０−８抗体はＩｇＧ  １κ、そしてＯＡ２２−２２抗体はＩｇＧ２ａκであった。
【００３１】
実施例４：非競合法による下痢性貝毒の測定
非競合法により、ＯＡ、７−Ｏ−パルミトイル−オカダ酸（以下、７−ＯＡと称す）、ジノフィシストキシン−１（以下、ＤＴＸ１と称す）及びジノフィシストキシン−３（７−Ｏ−パルミトイル−ＤＴＸ１）（以下、ＤＴＸ３と称す）の標準品を測定した。使用したＥＬＩＳＡ用プレートはそれぞれＯＡ９５８−２抗体、ＯＡ８−２抗体、ＯＡ１０−８抗体、そしてＯＡ２２−２２抗体を用いて、実施例３に記載した条件下に調製した。標準試料溶液は、実検体からの抽出操作を考慮し、下痢性貝毒の１００％メチルアルコール溶液を一度乾固させた後、各々の濃度のメチルアルコールを含むＢＢＳに再溶解する方法で調製して用いた。
【００３２】
前記ＯＡ９５８−２抗体を担持したＥＬＩＳＡ用プレートを用いて、実施例３に記載した非競合法によりＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３の標準品を測定した。メチルアルコール濃度を２０％刻みで０％から１００％までの６段階について調べ、検量線を作成し、結果を図１〜図４に示した。メチルアルコールに換えてアセトンを用いて、アセトン濃度を２０％刻みで０％から７０％までの５段階について調べ、検量線を作成し、結果を図５〜図８に示した。
また、前記ＯＡ８−２抗体、ＯＡ１０−８抗体及びＯＡ２２−２２抗体をそれぞれ担持したＥＬＩＳＡ用プレートを用いて、実施例３に記載した非競合法によりＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３の標準品を測定した。メチルアルコール濃度３０％における検量線を作成し、結果を図９〜図１１に示した。
更に、ＯＡ９５８−２抗体を担持したＥＬＩＳＡ用プレートを用いて、実施例３に記載した非競合法により、無水有機溶媒系でＯＡ標準品を測定した。メチルアルコール中のエチルアルコール濃度を０％及び７０から１００％までの５段階、メチルアルコール中のアセトン、エチルエーテル、ベンゼンの濃度を各々０から５０％までの５段階について調べ、検量線を作成し、結果を図１２〜図１５に示した。
【００３３】
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるメチルアルコール中での測定結果によれば、メチルアルコール濃度が高くなるに従い抗体活性は徐々に低下するものの、１００％メチルアルコール中でも、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３のすべてについて十分に測定可能であった。各々の測定感度は、２０％メチルアルコールではＯＡが０．１ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが１．０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が０．３ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ３が１．０ｎｇ／ｍｌであった。また１００％メチルアルコールではＯＡが１０ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが３０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が３０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ３が３０ｎｇ／ｍｌであった。また、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対するＯＡ９５８−２抗体の反応性の比は、６０％メチルアルコールでは１：０．３：１：０．２であり、８０％メチルアルコールでは１：０．３：０．６：０．３であるが、１００％メチルアルコールでは１：０．８：２：１．４となり、メチルアルコール濃度が増すにつれ反応性の差は少なくなった（図１〜図４）。
【００３４】
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるアセトン中での測定結果によれば、メチルアルコールと同様にアセトン濃度が高くなるに従い抗体活性は徐々に低下し、７０％アセトン中ではＤＴＸ３が多少の影響を受けるものの、測定は可能であった。その他のＯＡ、７−ＯＡ及びＤＴＸ１は共に十分測定可能であった。アセトン濃度が７０％を越えるとＥＬＩＳＡ用プレートの材質が変化するため測定不可能であった。各々の測定感度は、１０％アセトンではＯＡが０．３ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが１．０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が１．０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ３が３．０ｎｇ／ｍｌであった。また７０％アセトンではＯＡが１０ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが３０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が１００ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ３が３０ｎｇ／ｍｌであった。また、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対するＯＡ９５８−２抗体の反応性の比は、アセトン濃度による差は余りなく、５０％アセトンでは１：０．２：０．５：０．１となり、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対する反応性が低下する傾向が見られた（図５〜図８）。
【００３５】
ＯＡ８−２抗体を用いた非競合法による３０％メチルアルコール中での測定結果によれば、ＯＡに対する反応性が最も高く、測定感度は３．０ｎｇ／ｍｌであった。また７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対する反応性は等しく、測定感度は１０ｎｇ／ｍｌであった（図９）。
ＯＡ１０−８抗体を用いた非競合法による３０％メチルアルコール中での測定結果によれば、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対する反応性が、ＯＡ及び７−ＯＡに対する反応性よりも高かった。測定感度はＯＡが３．０ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが３０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が１．０ｎｇ／ｍｌ、そしてＤＴＸ３が１．０ｎｇ／ｍｌであった（図１０）。
ＯＡ２２−２２抗体を用いた非競合法による３０％メチルアルコール中での測定結果は、ＯＡ８−２抗体の場合と類似しており、ＯＡに対する反応性が最も高く、他の７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３に対する反応性は、ほぼ等しかった。測定感度はＯＡが０．３ｎｇ／ｍｌ、７−ＯＡが３．０ｎｇ／ｍｌ、ＤＴＸ１が１０ｎｇ／ｍｌ、そしてＤＴＸ３が３．０ｎｇ／ｍｌであった（図１１）。
【００３６】
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるエチルアルコールとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、エチルアルコール濃度が７０％及び８０％では、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化が無かった。エチルアルコール濃度が９０％及び１００％になっても抗体の反応性の低下は僅かであった（図１２）。
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるアセトンとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、アセトン濃度が高くなるに従い、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化は無かった。アセトン濃度が５０％を越えるとＥＬＩＳＡ用プレートの材質が変化するため測定不可能であった（図１３）。
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるエチルエーテルとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、エチルエーテル濃度が高くなるに従い、バックグラウンド値が僅かに上昇する傾向が見られたが、抗体の反応性には変化は無かった。エチルエーテル濃度が５０％を越えるとＥＬＩＳＡ用プレートの材質が変化するため測定不可能であった（図１４）。
ＯＡ９５８−２抗体を用いた非競合法によるベンゼンとメチルアルコールの混合物中での測定結果によれば、ベンゼン濃度が１０％以下では、抗体の反応性に変化は無かった。ベンゼン濃度が２０％になると抗体の反応性は約２／３、ベンゼン濃度が３０％では抗体の反応性は約１／３になり、ベンゼン濃度が５０％になると反応性はほぼ完全に失われた。また、ベンゼン濃度が５０％になるとＥＬＩＳＡ用プレートの材質が変化するため測定が非常に困難となった（図１５）。
【００３７】
【発明の効果】
従来の致死活性測定法には、動物の管理、検出感度や精度及び特異性に問題があり、従来の競合酵素免疫学的測定法にも、下痢性貝毒のうちの７−Ｏ−アシル−オカダ酸及びＤＴＸ３を検出・測定することができないという問題点があったのに対し、本発明によれば、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３の４種の下痢性貝毒の全てに特異性を有するモノクローナル抗体が提供されるので、従来の欠点を解消することができる。また、前記モノクローナル抗体が有機溶媒耐性を有する場合には、試料からの有機溶媒抽出液をそのまま又は単に希釈するだけで検出又は測定工程に用いることができるので、検出又は測定工程が簡便になるだけで無く、高精度及び高感度を達成することができる。従って、食品衛生等に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メチルアルコール濃度０〜１００％の溶液中にてＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図２】メチルアルコール濃度０〜１００％の溶液中にて７−ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図３】メチルアルコール濃度０〜１００％の溶液中にてＤＴＸ１を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図４】メチルアルコール濃度０〜１００％の溶液中にてＤＴＸ３を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図５】アセトン濃度０〜７０％の溶液中にてＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図６】アセトン濃度０〜７０％の溶液中にて７−ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図７】アセトン濃度０〜７０％の溶液中にてＤＴＸ１を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図８】アセトン濃度０〜７０％の溶液中にてＤＴＸ３を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図９】ＯＡ８−２抗体を用いてメチルアルコール濃度３０％の溶液中で、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１０】ＯＡ１０−８抗体を用いてメチルアルコール濃度３０％の溶液中で、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１１】ＯＡ２２−２２抗体を用いてメチルアルコール濃度３０％の溶液中で、ＯＡ、７−ＯＡ、ＤＴＸ１及びＤＴＸ３を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１２】ＯＡ９５８−２抗体を用いてメチルアルコール中エチルアルコールの濃度が０％及び７０〜１００％の溶液中で、ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１３】ＯＡ９５８−２抗体を用いてメチルアルコール中アセトンの濃度が０〜５０％の溶液中で、ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１４】ＯＡ９５８−２抗体を用いてメチルアルコール中エチルエーテルの濃度が０〜５０％の溶液中で、ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１５】ＯＡ９５８−２抗体を用いてメチルアルコール中ベンゼンの濃度が０〜５０％の溶液中で、ＯＡを非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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