(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼの測定方法において、ペルオキシダーゼまたは過酸化水素のいずれか一方を他方に対して過剰とし、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりｐ−置換フェノール化合物から生成されるフェノキシラジカルを下記の化学式１で示されるヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成させて、安定ラジカル種の電子スピン共鳴を測定することを特徴とするペルオキシダーゼの測定方法。
【化１】
0003568371.tif 000006
ただし、Ｒは水素原子、アルキル基、アルコキシル基である。
【請求項２】
ヒドロキシルアミン化合物として、キレート試薬を含有した溶液を用いることを特徴とする請求項１記載のヒドロキシアミン化合物を用いたペルオキシダーゼの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシダーゼの測定方法に関するものであり、高感度の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼ（以下、本明細書中でＰＯＤの称する場合がある）の測定方法としてルミノール等を用いる化学発光方法が知られているが、増感発光やラジカル増感などを採用した検出方法によってもペルオキシダーゼの検出感度は充分とはいえず、特に、ラジカル増感によるペルオキシダーゼの検出感度は大きくても１０−３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ程度であり、酵素免疫測定試薬としては明らかに感度不足であった。
そこで、本発明者等は、特開平９−２８３９６号公報において、フェノール化合物とヒドロキシアミン体を併用したペルオキシダーゼの高感度測定方法を提案している。この方法では、フェノール化合物とヒドロキシルアミン体を併用し、ペルオキシダーゼ又は過酸化水素のいずれか一方を他方に対して過剰とし、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりｐ−置換フェノール化合物から生成されるフェノキシラジカルをヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成し、生成したラジカルを４−ヒドラゾノメチル−１−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＨＴＩＯ）またはＣａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ［２−（４−カルボキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル−３−オキシド）で捕捉して安定なラジカル種として生成させて、電子スピン共鳴を測定するものである。この方法では、高感度であるものの、ダイナミックレンジが狭いという問題を有している。
【０００３】
すなわち、測定に用いるヒドロキシルアミン体（＞ＮＯＨ）は、不安定であり、容易に酸化されて安定なニトロキシド化合物（＞ＮＯ）になることが知られており、これが高いブランク値が生じる原因である。また、ヒドロキシルアミン体は、過酸化水素を含む基質緩衝液中において経時的にブランク値が上昇する。このブランク値の存在、基質緩衝液中における経時的上昇により測定系に添加可能なヒドロキシルアミン量は制限を受けざるを得ない。そのために、高感度ではあっても実用的な測定にはダイナミックレンジが狭いという問題点を有していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高感度なペルオキシダーゼ、又は過酸化水素の測定方法を提供するものであり、とくに、測定値のバックブランク値が低く、ダイナミックレンジの広い測定方法を提供することを課題とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ペルオキシダーゼの測定方法において、ペルオキシダーゼまたは過酸化水素のいずれか一方を他方に対して過剰とし、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりｐ−置換フェノール化合物から生成されるフェノキシラジカルを下記の化学式１で示されるヒドロキシアミン化合物で捕捉して安定なラジカル種を生成させて、安定ラジカル種の電子スピン共鳴を測定するペルオキシダーゼの測定方法である。
【０００６】
【化２】
0003568371.tif 000002
【０００７】
ただし、Ｒは水素原子、アルキル基、アルコキシル基である。
また、ヒドロキシルアミン化合物として、キレート試薬を含有した溶液を用いた前記のヒドロキシアミン化合物を用いたペルオキシダーゼの測定方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりフェノール化合物から生成したフェノキシラジカルを捕捉するヒドロキシルアミン体としてとくに、化学式１で示される化合物が好ましいことを見出したものである。とくに、化学式１の化合物において、Ｒがアルキル基あるいはアルコキシル基である場合には炭素数１〜３のものが好ましい。また、水素である場合には高濃度領域が好ましく、アルキル基あるいはアルコキシ基である場合には、低濃度領域が好ましい。
とくに、１−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＴＩＯ）あるいは１−ヒドロキシ−２，２，４，５，５−ペンタメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＰＩＯ）が、低いブランク値を示すので好ましい。
【０００９】
また、過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼの作用によりフェノール化合物から生成したフェノキシラジカルをヒドロキシルアミン体によって捕捉しているので、ヒドロキシルアミン体の濃度を大きくするほど、高濃度のフェノキシラジカルの測定も可能となるが、従来のヒドロキシルアミン体ではバックグランド値も大きくなるので、実質的な測定可能な濃度範囲であるダイナミックレンジを広くすることは困難であったが、本発明の方法のヒドロキシルアミン体は、ブランク値が低いので大量に用いることが可能であり、低濃度から高濃度までのダイナミックレンジの広い測定が可能となる。
【００１０】
また、本発明の方法においては、キレート試薬を添加することによってブランク値を低下することができる。
とくにキレート試薬としては、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、ｏ，ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”Ｎ”−５酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”，Ｎ”−６酢酸（ＴＴＨＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＣｙＤＴＡ）が好ましい。
【００１１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１（ヒドロキシアミン体ブランク値の比較）
１−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＴＩＯ；ＡＣＲＯＳ社製）、１−ヒドロキシ−２，２，４，５，５−ペンタメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＰＩＯ；ＡＣＲＯＳ社製）をそれぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ  関東化学製）によって２ｍｍｏｌ／ｌの濃度に調製した。
３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ  同仁化学研究所）の０．１Ｍ、ｐＨ６．５の基質緩衝液に１重量％の過酸化水素水を添加し、最終濃度が０．０１５重量％となるように調製し、ｐ−アセトアミドフェノール（和光純薬）の３ｍｇ／ｍｌ（２０ｍｍｏｌ／ｌ）の濃度の水溶液を調製した。
水１６０μｌに、調製した基質緩衝液１００μｌ、ｐ−アセトアミドフェノール水溶液３０μｌ、ヒドロキシアミン溶液１０μｌをそれぞれ混合し、３７℃において、３０分間反応させた。アジ化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／ｌ）の５０μｌを混合後、生成したＮＯラジカルの量を電子スピン共鳴装置（日本電子製ＪＥＳ−ＦＲ８０）によって中心磁場：３３６．２ｍＴ、変調磁場：０．１ｍＴ、マイクロ波出力４ｍＷ、増幅率：５００倍、応答時間：０．３秒の条件で測定した。その測定結果を図１に示す。図１（Ａ）は、ＨＴＩ０であり、（Ｂ）は、ＨＰＩＯについての測定結果である。
【００１２】
比較例１（ヒドロキシアミン体ブランク値の比較）
ヒドロキシルアミンとして、４−ヒドラゾノメチル−１−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＴＴＩＯ）に変えた点を除き実施例１と同様にして測定し、その結果を図１において、（Ｃ）で示す。
また、実施例１および比較例１のブランクの信号強度の比較を表１に示す。
【００１３】
0003568371.tif 000003
【００１４】
ＨＴＩＯ、ＨＰＩＯは、ＨＴＴＩＯに比し低いブランク値を示し、Ｓ／Ｎ比の向上に有効であることが示される。
【００１５】
実施例２（ペルオキシダーゼのＳ／Ｎ比の改善）
西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ  和光純薬製  ＭＷ４０，０００２５０Ｕ／ｍｇ）を５０重量％エチレングリコール水溶液で希釈して１０−５Ｕ／ｍｌの溶液を調製し、ＨＲＰ水溶液５０μｌ、実施例１で調製した基質緩衝液１００μｌ、ｐ−アセトアミドフェノール水溶液３０μｌ、およびヒドロキシアミン溶液１０μｌを水１１０μｌに混合し、３７℃において、３０分間反応させた。アジ化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／ｌ）の５０μｌを混合後、生成したＮＯラジカルの量を実施例１と同様の方法によって測定し、その結果を表２に示す。
【００１６】
比較例２（ペルオキシダーゼのＳ／Ｎ比の改善）
ヒドロキシルアミンとして、４−ヒドラゾノメチル−１−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−３−イミダゾリン−３−オキシド（ＨＨＴＩＯ）に変更した点を除き実施例２と同様にして測定し、その結果を表２に示す。
【００１７】
0003568371.tif 000004
【００１８】
本発明の方法では、大幅にブランク値が低下し、Ｓ／Ｎ比が改善されることが確認できた。
【００１９】
実施例３（ダイナミックレンジの改善）
水７０μｌに、実施例２と同様に調製した基質緩衝液１００μｌ、ｐ−アセトアミドフェノール水溶液３０μｌ、ヒドロキシルアミン溶液５０μｌに、濃度が１０−６Ｕ／ｍｌ〜１０−２Ｕ／ｍｌのＨＲＰ溶液の５０μｌを混合し、３７℃において３０分間反応させて、アジ化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／ｌ）の５０μｌを混合後、生成したＮＯラジカルの量またはニトロキシドラジカルの量を実施例１と同様の方法によって測定し、その結果を図２に示す。なお、ヒドロキシルアミン体として、ＨＨＴＩＯは、濃度が０．４ｍｍｏｌ／ｌの溶液を用い、ＨＴＩＯとＨＰＩＯはそれぞれ、ＨＨＴＩＯの５倍の濃度である２ｍｍｏｌ／ｌの溶液を用いた。
図２では、横軸に１３０μｌの測定用試験管当たりのモル数を、アトモル（ａｍｏｌすなわち１０−１８ｍｏｌ  ）で対数表示をし、縦軸には測定強度の対数の値を示す。
【００２０】
実施例４（キレート試薬によるブランク値の低下）
キレート試薬として、ｏ，ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”，Ｎ”−６酢酸（ＴＴＨＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”Ｎ”−５酢酸（ＤＴＰＡ）のそれぞれを実施例１と同様のＭＯＰＳ基質緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）によって１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度に調製した。
水１１０μｌに上記の各キレート試薬の溶液５０μｌおよび基質緩衝液１００μｌ、実施例１と同様に調製したｐ−アセトアミドフェノール水溶液３０μｌ、実施例１と同様に調製した濃度６ｍｍｏｌ／ｌのＨＴＩＯの１０μｌを混合し、３７℃において、３０分間反応させ、次いでアジ化ナトリウム５０μｌを添加した後に、実施例１と同様に電子スピン共鳴装置によって測定し、測定結果を表３において、キレート試薬無添加のものの強度を１００として、相対強度で示す。
【００２１】
0003568371.tif 000005
【００２２】
これらのキレート試薬の添加によって、ブランク値を低下させることができることが示される。
【００２３】
【発明の効果】
ペルオキシダーゼ、過酸化水素をパラアセトアミドフェノールとの反応によって生成するフェノキシラジカルを、ヒドロキシルアミンに捕捉させた後に、電子スピン共鳴装置によって高感度の測定をすることができる。
【００２４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒドロキシアミン化合物の種類とブランク値の関係を説明する図である。
【図２】ヒドロキシルアミンを増量した場合のダイナミックレンジを説明する図である。
【図１】
0003568371.tif 000007
【図２】
0003568371.tif 000008