(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の混合物である水性溶液から目的の酵素を結晶質の形態で得るための方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記水性溶液から低イオン強度の溶液を形成して前記水性溶液から塩を浸出するステップ、ここで当該低イオン強度の溶液が10mS/cm以下のコンダクタンスを有する；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記低イオン強度の溶液のpHを目的の酵素のpI付近に調節すること、ここで前記酵素が結晶化する；そして
（ｃ）目的の酵素を結晶質の形態で回収すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ダイアフイルトレーション、透析、又は電気透析より又はゲル濾過により、又はクロマトグラフィー法により、又は沈殿により塩を浸出する、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
水性溶液のpHを酵素のpI±３付近の範囲内のpH値に調節する、請求の範囲第１又は第２項に記載の方法。
【請求項４】
水性溶液のpHをギ酸、クエン酸又は酢酸を用いて調節する、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酵素がリパーゼである、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
水性リパーゼ浸有溶液が５％（w/w）以上のリパーゼ含量を有する、請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
リパーゼが真菌類起源でありそしてアスペルギルス（Aspergillus）の菌株、カンジダ（Candida）の菌株、フミコラ（Humicola）の菌株又はリゾムコーム（Rhizomucor）の菌株から得ることのできる請求の範囲第５又は６項記載の方法。
【請求項８】
リパーゼが、細菌由来のものでありそしてシュードモナス（Pseudomonas）の菌株から得ることのできる、請求の範囲第５又は６項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、他のタンパク質を有する混合物中に酵素を含んでなる水性溶液から酵素を分離しそして所望の酵素を結晶形で回収する方法に関する。
背景技術
酵素は、工業的目的に対し液体又は非晶質の物質として通常提供される。液体として提供されないときは、酵素は通常非晶質として提供される；何故なら酵素の結晶化のための公知方法は、余りに高価であり工業的規模で用いられないとして通常見なされている。これは結晶が非常に純粋でかつ濃厚溶液からのみ成長し得るという仮定に起因する。実際、結晶を形成する能力は、タンパク質化学者により高純度のタンパク質溶質の証拠としてしばしば見なされている。
高純度の酵素結晶のため、酵素の結晶化のための安価かつ簡易な方法（これは工業的規模に容易に適合し得る）の提供は産業界において明らかに必要なことである。
酵素の結晶化に関し十分な文献がある。今日まで知られている結晶化方法の特徴は、比較的純粋でかつ濃厚初期溶液、低収率、極めて長い結晶化時間、有機溶剤を含有する化学薬品の高消費および低工業的適合性である。
低伝導率およびpI付近のpHの使用は、それ自身タンパク質の結晶化に対する新規な方法からほど遠い。それは文献中に十分記載されている技術でありそしてしばしば高純度のタンパク質溶液からＸ線回析のための単結晶の製造に対してしばしば用いられる。マクファーソンは彼の書物「Preparation and Analysis of Protein Crystals」（ワイリー、ニューヨーク、1982）において、「Salting in］としても知られているこの技術が結晶化においてどのように用いられるか記載している。それ以来、幾人かの他の人々がこの方法を用いたが、精製された溶液から結晶化のためにのみであった。実際、不純物そして特に他のタンパク質は高度に好ましくないとして報告されている（例えば、A.マクファーソンEur.J.Biochem.289,1990,1−23頁参照）。従って、技術それ自身は新規ではないが、しかし何人もそれを他のタンパク質を有する混合物中の酵素の精製のための精製技術としてこれまで用いてはいない。そのようなものとして極めて不純な溶液に対する驚くべき良好な適合性のためこの技術は経済的に実行可能となり、そして例えばクロマトグラフィーの如き予備精製を必要としない。
結晶化と沈殿を区別することは重要であり、後者は純度の低い非晶質形を生成する。
ヨーロッパ特許193,046において、その溶液から酵素の回収方法が開示されている。この方法により、酵素含有溶液は、酵素の等電点付近の範囲内のpHにおいて濃縮され過飽和となり、そして結晶化が誘起される。塩又は有機溶剤の存在は、全ての結晶化方法に必須であると考えられてきた。前記ヨーロッパ特許193,046において、塩又は有機溶剤の導入は、記載された方法に対し不必要であるが、しかし記載された実験から次の内容が明らかである；すなわちこの特許公報において研究された酵素は高い塩濃度の存在下、すなわち限外濾過が真空蒸発後に行なわれるとき、最も結晶化する。更に、該方法はアミラーゼに対してのみ適合し、長い結晶化時間を必要とし、そして該方法は好ましくない非晶質でかつミクロ結晶質の沈殿を生じる。
発明の要約
本発明の目的は、結晶質の酵素を回収する方法を提供することであり、この方法は塩又は有機溶剤の添加を必要とせず、そして短い結晶化時間と高収率を可能とし、そして簡易かつ安価で、しかも工業的要求に適合し得る。
かくして、本発明は他のタンパク質を有する混合物中に酵素を含んでなる水性溶液から酵素を分離する方法を提供し、この方法は溶液から塩を浸出し、次いで酵素のpI付近のレベルに溶液のpHを調節し、次いで引き続き酵素を結晶質の形態で回収することを含んでなる。
発明の詳細な開示
これまで、濃厚溶液はタンパク質結晶の生成に必須であると考えられた。しかし、今や以下の内容が見出された；すなわち飽和および過飽和は、結晶化工程前のプロセス工程中避けるべきである；何故なら、飽和そして特に過飽和は、未制御の条件中沈殿によるタンパク質のより好ましくない非晶質の形態の形成を助成する。
今や驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち本発明方法を用いることにより、酵素は他のタンパク質を有するそれらの、混合物から分離し（たとえその混合物が他の酵素を含んでいても）、次いで目的の酵素は結晶質の形態で沈殿する。
従って、本発明は異なる結晶化性質を有する他のタンパク質を含んでなる水性混合物から酵素を分離する方法を提供する。この方法は溶液から塩および他の低分子量の不純物を浸出し、これにより溶液中の低イオン強度を得、次いで目的のタンパク質のpI付近のレベルにpHを調節することを含んでなる。この方法により酵素は結晶質の形態で沈殿する。
本発明方法は、酵素の分離／結晶化に適用できる。しかしながら、好ましい態様において、本発明方法は脂肪分解酵素を含有するあらゆる混合物に適用される。
本発明方法により、１％（w/w）程度に低い濃度の目的リパーゼを含んでなるリポーゼ含有混合物は、結晶化により酵素分離に成功裏に委ねることができる。加えて、総タンパク質含量の50％（w/w）超、好ましくは50％（w/w）未満の濃度で他のタンパク質（他の酵素を含む）を含んでなるリパーゼ含有混合物は、結晶化により酵素分離に成功裏に委ねることができる。
脂肪分解酵素は、菌類又は細菌起源のものであってよい。好ましい態様において、プロセスはグリコリパーゼに適用される。他の好ましい態様において、プロセスは酸性リパーゼ、すなわち３〜７の範囲内、より好ましくは3.5〜5.5の範囲内のpI値を有するリパーゼに適用される。
本発明のプロセスに適当な菌類起源のリパーゼの例は、属アスペルギルス（Aspergillus）（例えばA.ニガー（niger））；カンジダ（Candida）（例えばC.アンタルクチカ（antarctica））；フミコラ（Humicola）（例えばH.ラヌギノザ（lonuginosa）およびH.インソレンス（insolens））；およびリゾムコーム（Rhizomucor）（例えばR.マイヘイ（miehei））の構成員から得ることのできるリパーゼである。
本発明方法に適した細菌由来のリパーゼの例は、属シュドモナス（Pseudomonas）（例えばPs.セパシア（cepacia））の構成員から得ることのできるリパーゼである。
リパーゼ含有溶液は、リパーゼ生産微生物の発酵によって得ることができる。しかしながら、大抵の場合、リパーゼ生産生物体は例えばアスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）中で発現されたフミコラ（Humicola）リパーゼ又はリゾムコール（Rhizomucor）リパーゼの如き目的リパーゼをコードする挿入された遺伝子を有する宿主生物体であろう（ヨーロッパ公開番号238,023および305,216参照）。
好ましい態様において、本発明方法はリパーゼの分離に適用され、リパーゼは培養ブロスからの細胞内又は細胞外のいずれかであってよい。培養後細胞溶解は達成され、そして培養ブロスは遠心分離により固体／液体分離に委ねられる。
本発明方法により、塩および他の低分子量の不純物が水性溶液から浸出され、これにより低イオン強度の溶液が得られる。これらの低分子物質は、ダイアフイルトレーション（doafiltration）、透析、又は電気透析、又はゲル濾過により又はクロマトグラフィー法により、又は沈殿により除去できる。ダイアフイルトレーション、透析又は電気透析は、対象のリパーゼの分子量未満のカットオフ値を有する膜を用いるのが好ましい。
溶液のイオン強度は、伝導計を用いて好都合に監視できる。本発明に関し、低イオン強度は10mS/cm以下、好ましくは5mS/cm以下、最も好ましくは2mS/cm以下のコンダクタンスによって表される。
低分子不純物の除去に引き続き、水性溶液のpHをリパーゼのpI±３付近の端部に内のpH値、より好ましくはリパーゼのpI±1.5付近の範囲内のpH値、更に一層好ましくはリパーゼのpI±１付近の範囲内のpH値、最も好ましくはリパーゼのpI±0.5付近の範囲内のpH値に調節される。
水性溶液のpHは、実質的に酸又は塩基の使用により調節できる。酸は有機酸又は無機酸であってよい。幾つかの例は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびギ酸である。好ましい酸はギ酸、クエン酸、又は酢酸である。
本発明方法は、１％（w/w）の低いリパーゼ含量を有する水性リパーゼ含有溶液に加えられる。好ましくは、本発明方法は、５％（w/w）超、特に５−20％（w/w）、より好ましくは10−20％（w/w）のリパーゼ含量および総DS（乾燥物質）の10％超のリパーゼ含量、好ましくは総DSの30％のリパーゼ含量を有する水性リパーゼ含有溶液に適用される。
本発明のより特異的態様において、常法による限外濾過コンセントレートの予備的沈殿は、例えば硫酸ナトリウム又はアンモニウムを用い、次いでフィルターケークの再溶解および再溶解リパーゼの限外濾過およびダイアフイルトレーション（diafiltratio）および／又は希釈による塩の除去によって行うことができる。
もしも極めて高い純度の結晶質生成物、（例えば治療適用のためのリパーゼが望まれる場合、本発明方法はくり返され、すなわち本発明方法の結晶質目的生成物は再溶解されそして１以上の付加的結晶化プロセスに委ねられる。
次の実施例は更に本発明を説明し、そしてそれらは権利要求される本発明の範囲を制限するものではない。
例１
この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得られた培養ブロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼの分離に適用された。
培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして3mS/cmのコンダクタンスまでダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、13％のリパーゼ（w/w）および20％の総乾燥物質（w/w）を含有し、このことは総乾燥物質の65％がリパーゼであることを意味する。pHをクエン酸で4.5に調節した。
表１に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表に測定された収率の％および純度を示す。
純度をリパーゼ活性で示す。１リパーゼ単位（LU;1000LU＝1KLU）は、乳化剤としてガムアラビック（Gum Arabic）および基質としてトリブチリンを用い、30.0℃、pH7.0で１分当たり１μmolの滴定可能な酪酸を遊離する酵素の量である。
0003542601.tif 000002
この例は本発明方法の驚くべき効果：高収率、高純度および短い結晶化時間を実証している。
例２
この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得られた培養ブロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼの分離に適用された。
培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして3mS/cmのコンダクタンスまでダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、11％のリパーゼ（w/w）および20％の総乾燥物質（w/w）を含有した。pHをクエン酸で4.3に調節した。
表２に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表に測定された収率の％を示す。
0003542601.tif 000003
この例は、本発明方法の高収率を実証する。
例３
この例は、ヨーロッパ特許公開第238,023号に記載される如く得られた培養ブロスから得られるリゾムコールマイヘイ（Rhizomucormiehei）リパーゼの分離に適用された。
培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして2.5mS/cmのコンダクタンスまでダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、10％のリパーゼ（w/w）および16％の総乾燥物質（w/w）を含有した。pHをクエン酸で5.0に調節した。
表３に、塩の添加を含む通常の結晶化方法と比較してこの例の結果を示す。表に測定された収率の％を示す。
0003542601.tif 000004
この例は本発明方法の高収率および短い結晶化時間を実証している。
例４
この例は、ヨーロッパ特許公開第305,216号に記載される如く得られた培養ブロスから得られるフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼの分離に適用された。
５回の実験を行った。前記培養ブロスを遠心分離およびカットオフ値20kDを有する膜を用い限外濾過／ダイアフイルトレーションに委ね、そして1mS/cmのコンダクタンスまでダイアフィルターにかけた。ダイアフイルトレートは、18％の総乾燥物質（w/w）を含有した。pHをクエン酸で4.3に調節した。溶液を28℃で20時間撹拌した。結果を下記の表４に示す。
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この例は、たとえ本発明方法が低濃度のリパーゼに適用されたとしても、そしてたとえ他の酵素が比較的高濃度で存在したとしても、委ねた収率が本発明方法によって得られることを実証している。