(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド増幅反応を行うことにより、試料中の予め選択されたポリヌクレオチドを増幅させるための装置であって：
試料注入ポートと；
該注入ポートから伸びる試料フロー・チャンネル；および
該フロー・チャンネルと流体連絡したポリヌクレオチド増幅チャンバーを含むメソスケール流動システム
とを形成するように微細加工された固体基材を含み、
該チャンバーが、ポリヌクレオチドを増幅するための試薬を含有し、かつ約0.1μｍないし500μｍの幅または深さの少なくとも一つの断面寸法を有し、該チャンバーおよび該チャンネルが異なる寸法である該装置。
【請求項２】
さらに、該チャンバーの内容物を熱循環させ、それによって各循環において、温度をコントロールして、二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、予め選択されたポリヌクレオチドの増幅を可能とする加熱手段を含む請求項１記載の装置。
【請求項３】
該試薬が、ポリメラーゼ鎖反応またはリガーゼ鎖反応を行うための試薬を含む請求項１または請求項２記載の装置。
【請求項４】
該増幅反応がポリメラーゼ鎖反応（PCR）であって、該増幅チャンバーが、予め選択されたポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、該試料ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる第一のプライマーおよび該ポリヌクレオチドに相補的な核酸配列とハイブリダイズできる第二のプライマーを含み、ここに該第一のプライマーおよび第二のプライマーが重合反応のポリヌクレオチド生成物の末端を形成する請求項１ないし３いずれか１記載の装置。
【請求項５】
該増幅チャンバーが：
第一のセクション；
第二のセクション；および
該第一のセクションおよび該第二のセクション間に配された流路を含み；
ここに、該装置が、さらに少なくとも該第一のセクションおよび該第二のセクション間に該チャンバーの内容物を繰り返し輸送する手段を含む請求項１ないし４のいずれか１記載の装置。
【請求項６】
熱循環させるための手段が、該第一のセクションを二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度にコントロールする手段を含み；かつ
該第二のセクションおよび該流路が、該第一のセクションから離れて位置し、それにより、該第一のセクションから該第二のセクションへ該チャンバーの内容物を輸送するに際して、一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングを可能とし、および該予め選択されたポリヌクレオチドの増幅を可能とするのに十分な温度まで試料が受動的に冷却される請求項５記載の装置。
【請求項７】
熱循環させるための手段が、該第一のセクションおよび該第二のセクションの温度を別々に熱コントロールするための手段、または該第一のセクションの温度を熱コントロールするための手段を含む請求項５または６記載の装置。
【請求項８】
該熱コントロールするための手段が、電気抵抗手段または電磁気エネルギー源を含む請求項７記載の装置。
【請求項９】
該基材が、さらに、該増幅チャンバーと流体連絡した第二のポートを含む請求項１ないし８いずれか１記載の装置。
【請求項１０】
さらに、該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための手段を含む請求項１ないし９いずれか１記載の装置。
【請求項１１】
該検出するための手段が、ポリヌクレオチド凝集によって引き起こされた該流路中の液体の流動に対する抵抗を検出するための手段を含む請求項10記載の装置。
【請求項１２】
該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための該手段が、該増幅チャンバーと流体連絡した該基材中に配されたメソスケール検出領域を含み；および
該装置が、さらに、該反応チャンバーを通して、該増幅されたポリヌクレオチドを該検出領域に輸送する流動を誘起させるための手段を含む請求項10記載の装置。
【請求項１３】
該検出領域が、該増幅されたポリヌクレオチドに検出可能に結合し得るポリヌクレオチド・プローブを含む請求項12記載の装置。
【請求項１４】
該ポリヌクレオチド・プローブが、磁性ビーズ上に固定化されている請求項13記載の装置。
【請求項１５】
該検出領域が、複数の第二のフロー・チャンネルに通じる分岐部を含み、該フロー・チャンネルに流体連絡したフラクタル流動領域を含む請求項13または14記載の装置。
【請求項１６】
該試料が、細胞試料であって、装置が、さらに：
該メソスケール流動システム中の該反応チャンバーに流体連絡し、細胞試料を溶解するための細胞溶解構造物；および
該細胞溶解構造物へ、次いで、該増幅チャンバーへの該試料の流動を誘起するための手段を含む請求項１ないし15いずれか１記載の装置。
【請求項１７】
さらに、予め選択された細胞集団を結合しうる結合部位を含む該細胞集団を選択的に捕捉するための、該細胞溶解構造物から上流にある細胞分離領域：および
該分離領域内において、流動を誘起するための手段を含む請求項16記載の装置。
【請求項１８】
該固体基材が、シリコンを含む請求項１ないし17いずれか１記載の装置。
【請求項１９】
さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具を含み、該器具が：
該基材を保持するための手段；および
該基材上の注入ポートと接合する流動ラインを含む請求項１ないし18いずれか１記載の装置。
【請求項２０】
さらに、該保持手段に保持させた場合に、該基材の流動システムを通して流体を通過させるためのポンプを含む請求項19記載の装置。
【請求項２１】
該器具が、さらに、該薬溜め、および試薬を該流動システムにデリバリーするための手段を含む請求項19または請求項20記載の装置。
【請求項２２】
該器具が、該増幅チャンバーを加熱するための手段を含む請求項19ないし21いずれか１記載の装置。
【請求項２３】
さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具を含み、該器具が：
該基材を保持するための手段；および
該基材中の該メソスケール流動システムの内容物を観察するための光学的装置を含む請求項10記載の装置。
【請求項２４】
該光学的装置が拡大光学装置およびビデオカメラを含み、該器具が、さらに：
該装置の角度および位置を手動的に調整するための傾斜機構；および
該流動システムの内容物を観察するためのビデオ・スクリーンを含む請求項23記載の装置。
【請求項２５】
該増幅チャンバーが予め選択されたポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド増幅試薬を含む請求項１ないし24いずれか１記載の装置。
【請求項２６】
該流動システムが、さらに、該増幅チャンバーと流体連絡した検出チャンバーを含む請求項25記載の装置。
【請求項２７】
さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具を含み、該器具が：
該基材上の注入ポートに接合した流体流入手段を含む該基材を支持するための収容部位を含む請求項19ないし26いずれか１記載の装置。
【請求項２８】
基材に加工された電気接触部を含む装置であって；
該収容部位が、さらに、該基材中にて該電気接触部と接合させるための電気コネクションを含む請求項27記載の装置。
【請求項２９】
該器具が、さらに、該保持手段に保持された場合に、該基材の該流動システムを通して流体を通過させるためのポンプ手段を含む請求項27または請求項28記載の装置。
【請求項３０】
該流動システムが、さらに、該増幅チャンバーと流体連絡した検出チャンバーを含む請求項29記載の装置。
【請求項３１】
該器具が、さらに、電源を含む請求項27ないし30いずれか１記載の装置。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド増幅反応を行うことによって試料中の予め選択されたポリヌクレオチドを増幅させるための方法であって、
（ｉ）  請求項１ないし31いずれか１記載の装置を供し；
（ii）  試料ポリヌクレオチドおよびin vitroポリヌクレオチド増幅反応に要する試薬を該注入ポートおよびメソスケール流動システムを通して、該装置中の該増幅チャンバーにデリバリーし、次いで
（iii）  該チャンバーの内容物の温度を熱コントロールして、該ポリヌクレオチドの増幅を可能とすることを特徴とする該方法。
【請求項３３】
工程（iii）が：
（ａ）第一のセクションの内容物の温度を、二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度に、および第二のセクションの内容物の温度を、一本鎖ポリヌクレオチドの相補領域のアニーリングおよびポリヌクレオチドの増幅を可能とする温度に熱コントロールし；次いで
（ｂ）第一のセクションおよび第二のセクション間にチャンバーの内容物を繰り返し輸送させて該ポリヌクレオチドの複数サイクルの増幅を行う工程を含む請求項32記載の方法。
【請求項３４】
工程（iii）が：
（ａ）該チャンバー中の第一のセクションの温度を熱コントロールし、第一のセクションおよび第二のセクション間にチャンバーの内容物を繰り返し輸送させてポリヌクレオチドの複数サイクルの増幅を行う工程を含む請求項32記載の方法。
【請求項３５】
該装置が、さらに、該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための手段を含み、当該方法が、さらに、
（iv）該増幅されたポリヌクレオチドを検出することを含む請求項32ないし35いずれか１記載の方法。
【請求項３６】
該検出手段が、ポリヌクレオチド凝集によって引き起こされた該チャンバー内の液体の流動に対する抵抗を検出するための手段を含み；および
工程（iv）が、流動に対する抵抗を該検出手段で検出する工程を含む請求項35記載の方法。
【請求項３７】
該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための該手段が、該基材の中に該増幅チャンバーと流体連絡して配されたメソスケール検出領域を含み；および
該装置が、さらに、該増幅チャンバーを通る流動を誘起して、該増幅されたポリヌクレオチドを該検出領域へ輸送するための手段を含み；ならびに
工程（iv）が、該試料を該増幅チャンバーから該検出領域へ該輸送手段でデリバリーし、次いで、該増幅されたポリヌクレオチドを該検出領域中で検出する工程を含む請求項35記載の方法。
【請求項３８】
該検出領域が、該試料ポリヌクレオチドに検出可能に結合できるポリヌクレオチドプローブを含み；および
工程（iv）において、該試料ポリヌクレオチドの該プローブへの結合が検出される請求項37記載の方法。
【請求項３９】
該検出領域が、該フロー・チャンネルと流体連絡し、複数の第二のフロー・チャンネルに通じる分岐部を含むフラクタル流動領域を含み；および
工程（iv）において、該フラクタル流動領域を通して試料流体の流動が検出される請求項37または請求項38記載の方法。
【請求項４０】
該試料が細胞試料であって、該装置が、さらに：
該反応チャンバーにデリバリーされる前に細胞試料が溶解させるための、該反応チャンバーと流体連絡した該メソスケール流動システム中の細胞溶解構造物；および
該細胞溶解構造物を通して該増幅チャンバーへの該試料の流動を誘起させるための手段を含み；ならびに
工程（ii）が、該試料を該溶解構造物へ、次いで該増幅チャンバーへとデリバリーする工程を含む請求項32ないし39いずれか１記載の方法。
【請求項４１】
装置が、さらに：
該細胞溶解構造物の前にあって、予め選択された細胞集団を選択的に捕捉するための、該細胞集団へ結合できる結合部位を含む細胞分離領域を含み；および
工程（ii）が、該細胞試料を該細胞溶解構造物へデリバリーする前に、
第一に、該試料中の該細胞集団が、該結合部位によって捕捉されて該試料から該細胞集団を分離するのに十分に遅い流速；次いで、
第二に、該分離された細胞集団を、該領域から該細胞溶解構造物へ放出させるのに十分に高流速で、該試料を該細胞分離領域にデリバリーする工程を含む請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は以下の関連する同時係属出願:1992年５月１日出願のUSSN  07/877,702;1992年５月１日出願のUSSN07/877,701;1992年５月１日出願のUSSN  07/877,536;および1992年５月１日出願のU.S.シリアルナンバー  07/877,661と同時に出願されており、これらの開示を引用して本明細書の一部とみなす。
発明の背景
本発明は、一般的に、分析を行うための方法と装置に関する。より具体的には、本発明はポリメラーゼ鎖反応（PCR）を含む分析が可能な小さく、典型的には単一使用法のモジュールのデザインと構成に関する。
ここ何十年かの間に、種々の診断および監視の目的のための生物学的試料の分析を行うための非常に多数のプロトコル、試験キット、およびカートリッジが当該技術により開発されてきた。イムノアッセイ、凝集アッセイ、ポリメラーゼ鎖反応に基づく分析、種々のリガンドーレセプター相互作用、そして複雑な試料中の種の分別移動が全て種々の生物学的化合物もしくは汚染物の存在または濃度、または特定の細胞のタイプの存在を決定するために用いられてきた。
最近、生物学的試料を取り扱うため、またある種の臨床テストを行うために小さく使い捨ての装置が開発されてきた。ショウジ（Shoji）らは、シリコンウエハーの上に加工された小型の血液のガスアナライザーの使用を報告している。ショウジ（Shoji）らの、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Sensors and Actuators）、第15巻：第101頁〜第107頁（1988年）、サトウ（Sato）らは、微小機械加工法によるシリコン装置を用いた細胞融合技術を報告している、サトウ（Sato）ら、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Sensors and Actuators）、A21−A23:第948頁〜第953頁（1990年）。チバ・コーニング・ダイアグノスティックス・コーポレイション（Ciba Corning Diagnostics Corp.）USAは血液凝固を探知するマイクロプロセッサで制御されたレーザー光度計を製造した。
微小機械工学はマイクロ電子工業から起こった。アンゲル（Angell）ら、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American）、第248巻：第44頁〜第55頁（1983年）。微小機械工学により、最小寸法を何十ミクロン（生物の細胞の寸法）からナノメーター（いくつかの生物学的高分子の寸法）まで変化させる構成要素を有する微小工学装置の製造が可能となった。このスケールは本明細書中において”メソスケール”と呼ばれる。メソスケールの構造を伴う大部分の実験は微小機構の研究、すなわち、機械の運転および流れの特性の研究を伴う。メソスケールの構造の潜在的な能力は生命化学において十分には開発されてきていない。
ブルーネット（Brunette）（エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Exper.Cell Res.）、第167巻:203頁〜217頁（1986年）および第164巻：第11頁〜第26頁（1986年））は、シリコン、チタン被覆ポリマー等の溝中における繊維芽細胞および上皮細胞の行動を研究した。マッカートニー（McCartney）ら（キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）、第41巻：第3046頁〜第3051頁、1981年）は、溝を彫ったプラスチックの基材中の腫瘍細胞の行動を試験した。ラセル（LaCelle）（ブラッド・セルズ（Blood Cells）、第12巻：第179頁〜第189頁（1986年）は、微小循環を洞察するためにマイクロキャピラリー中における白血球と赤血球の流れを研究した。フング（Hung）とワイスマン（Weissman）は微小機械加工したチャンネルの流動動力学の研究を報告したが、分析装置に関連するデータは作成していない。フング（Hung）ら、（メディカル・アンド・バイオロジカル・エンジニアリング（Med.and Biol.Engineering）、第９巻：第237頁〜第245頁（1971年）；およびワイスマン（Weissman）ら、（アム・インスト・ケム・イング・ジャーナル（Am.Inst.Chem.Eng.J.）、第17巻：第25頁〜第30頁（1971年））。コロンブス（Columbus）らは、実験上のマルチ−チャンネル試験装置においてイオン選択的電極を分離するために、生物学的液体の毛管流の制御において、２枚の直角に配置されＶ型溝にエンボス加工したシートからなるサンドイッチを利用した。コロンブス（Columbus）ら（クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）、第33巻：第1531頁〜第1537頁（1987年））。マスダ（Masuda）らおよびワシズ（Washizu）らは細胞の操作（例えば細胞融合）のための流体流動チャンバーの使用について報告している。マスダ（Masuda）ら、プロシーディングス・アイイーイーイー／アイエーエス・ミーティング（Proceedings IEEE/IAS Meeting）、第1549頁〜第1553頁（1987年）；およびワシズ（Washizu）ら、プロシーディングス・アイイーイーイー／アイエーエス・ミーティング（Proceedings IEEE/IAS Meeting）、第1735頁〜第1740頁（1988年）。本技術は生物学的流体の分析のためのメソスケールの装置の使用の潜在力を十分に探求していない。
DNA断片を増幅させるためのポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いる方法論は十分に確立されている（例えば、マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトーリ・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトーリ・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1989年、頁14.1〜14.35参照）。PCR増幅反応は耐熱性DNAポリメラーゼ、例えば、タック（Taq）DNAポリメラーゼ（チエン（Chien）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）：第127巻：第1550頁（1976年））と、ヌクレオチド三リン酸、そして鋳型DNAと相対している二本の鎖に存在する配列とそれぞれ相補的であり、増幅されるべきDNA断片に隣接する、異なる配列を有する２個のオリゴヌクレオチド（”プライマー”）を用い鋳型DNA上でなされる。反応成分は二本鎖鋳型DNAのハイブリッドを壊す（”融解する”）ための高い方の温度（例えば94℃）に続いてアニールし重合するための低い方の温度（例えば65℃）の間を循環する。ハイブリッド崩壊、アニーリング及び重合の間の継続的な反応サイクルにより鋳型DNAの指数関数的増幅が供給される。例えば、長さが2kbまでで１μｇまでの鋳型DNAは出発時のDNAのわずか10-6μｇから30から35サイクルの増幅により得られる。サーマル・サイクラーを用い、自動化されたPCR鎖反応を行うための機械が入手可能である（パーキン・エルマー・コーポレーション（Perkin Elmer Corp））。
PCR増幅は遺伝的な病気の診断に応用されてきた（エンゲルケ（Engelke）ら、プロシーディングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第85巻：第544頁（1988年）、臨床試料の病原生物の核酸配列の検出、（オウ（Ou）ら、サイエンス（Science）、第239巻：第295頁（1988年））、裁判試料、例えば精子の遺伝的同定（リー（Li）ら、ネイチャー（Nature）、第335巻：第414頁（1988年）、活性化された癌遺伝子における変異の分析（ファー（Farr）ら、プロシーディングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第85巻：第1629頁（1988年））および分子クローニングの多くの態様において（オステ（Oste）、バイオテクニックス（BioTechniques）、第６巻：第162頁（1988年））。PCRによる分析は、プローブとしての使用のためのクローン化した二本鎖DNAの特定の配列を生成するため、cDNAの特定の断片を選択的に増幅させることにより、クローン化されていない遺伝子に特定なプローブを生成するため、少量のmRNAからcDNAのライブラリーを調製するため、塩基配列決定のための大量の試料の調製のため、変異の分析のため、の様に広い応用範囲で用いることができる。父系と、遺伝的または伝染性の病気の試験のごとき試験で広範囲の潜在的適用において臨床的に用いることのできる、PCR分析のための簡便で迅速なシステムが必要とされている。
本発明の一つの目的は、微少な体積の試料を分析でき、非常に低い濃度のポリヌクレオチドを検出でき、分析結果を迅速に出せるような最適の反応環境を伴う分析システムを供給することにある。もう一つの目的は、一連の応用において前もって選択した細胞または無細胞試料の、迅速で自動化されたPCR分析用試料が行えるメソスケールの機能要素を備えた、容易に大量生産できる、使捨ての小さな（例えば体積にして1cc以下）装置を供給することにある。本発明のさらなる目的は、迅速な臨床試験、例えばウイルスまたは細菌による感染の試験、細胞培養の汚染物の試験、もしくは細胞中の組換えDNAまたは遺伝子の存在の試験等の一連の迅速な臨床試験を実施するために個々の使用できるような一群の装置を供給することにある。
発明の要約
本発明は試料中のポリヌクレオチドの迅速な増幅を可能にするポリヌクレオチド重合反応を行うための小さく、大量生産できる、典型的には単一使用の一連の装置を供給する。一つの具体例において、本装置は、数ミリメーターの厚さで約0.2ないし2.0センチメーター平方の大きさであって、試料の注入ポートとメソスケールのフロー・システムを形成するように微細加工された固体基材よりなる。本装置のフロー・システムは、注入ポートから伸びる試料のフロー・チャンネル、およびフロー・チャンネルのポリヌクレオチドと流体連絡したポリヌクレオチド重合反応チャンバーを含む。”メソスケール”という用語は本明細書中において横断面の寸法が0.1μｍないし500μｍであって、好ましい反応チャンバーの幅が2.0ないし500μｍであり、より好ましくは３ないし100μｍであるようなチャンバーと流路を定義するのに用いる。多くの適用において、５ないし50μｍの幅のチャンネルが有用であろう。増幅が起こる基材中のチャンバーは多少それより大きい寸法、例えば１ないし5mmにすることができる。好ましい反応チャンバーおよびチャンネルの深さは0.1ないし100μｍ、典型的には２ないし50μｍである。本装置のフロー・チャンネルは、反応チャンバーに通じており、好ましい幅は2.0ないし200μｍであり、深さは0.1ないし100μｍである。
一つの具体例において、本装置は反応チャンバー中でポリメラーゼ鎖反応（PCR）を実施するために利用することができる。反応チャンバーには、試料のポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、試料のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な一番目のプライマー、試料のポリヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズ可能な二番目のプライマー（ここに一番目と二番目のプライマーは重合するポリヌクレオチド生成物の両末端を定義する）を含むPCRのための試薬を供給することができる。本装置は、各サイクルにおいて、温度を制御して１）二本鎖ハイブリッドを壊す（”融解する”）、２）プライマーを一本鎖DNAにアニールさせる、および３）プライマーの間で増幅されたポリヌクレオチドを合成するようにPCRチャンバーの内容物の温度を循環的に変化させるための手段をも含む。一つの具体例において、PCRチャンバーは、PCRのために必要な温度に連続的に温度が循環するような一個のセクションからなるものとすることができる。別法として、PCRチャンバーは、ハイブリッド崩壊、アニーリングおよび重合のために必要とされる異なる温度に設定された二個もしくはそれ以上のセクションからなり、この場合、本装置はさらに、例えば、本明細書中で開示するごとく、PCRを実施するためにセクション間にチャンバーの内容物を循環させる手段、例えば、ポンプその他の手段を含む。本装置は、さらに、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段をも含む。本装置は、マーカーとしてのある特定のポリヌクレオチドの存在を用いた、細胞中または溶液中のポリヌクレオチドの存在の分析、あるいはウイルスまたは細胞のタイプの分析を含めた、種々の自動化された、感度が良好な迅速なポリヌクレオチドの分析を実施するために使用することができる。
一般的に、本明細書中で開示するごとく、固体基材はメソスケールのフロー・システムと反応チャンバーを含むチップからなる。メソスケールのフロー・システムと反応チャンバーは確立された微小機械加工方法を用いシリコンおよび他の固体基材からデザインされ加工される。装置中のメソスケールのフロー・システムはフロー・チャンネルと一個またはそれ以上の反応チャンバーを基材の表面に微細加工し、次いでカバー、例えば透明なガラスのカバーを表面上に付着させることにより組み立てることができる。本装置は、例えば、基材またはカバーを貫いて連絡する孔によって形成される注入ポートを通ってフロー・システムに導入される微少体積（＜10μＬ）の試料を分析する。メソスケールのフロー・システムの体積は、典型的には、５μＬより小さいであろうし、個々のチャンネル、チャンバー、または他の機能要素の体積は、しばしば、１μＬより小さく、例えばナノリッターもしくはピコリッターの範囲であることさえある。非常に低い濃度で存在するポリヌクレオチド（たとえばナノグラム量）が迅速に（＜10分）増幅され検出され得る。ポリヌクレオチドの重合分析が完結した後、装置を捨てることができる。
チップは、典型的には、チップを保持するための収容部位を備え、一個またはそれ以上の該チップ上の注入ポートが一個またはそれ以上のフロー・ラインとその中で対合するような器具と共に用いられるであろう。ある特定のポリヌクレオチドを含むと思われる生物学的流体試料を基材の注入ポートに適用した後、該チップを器具内に据え付けポンプ、例えば器具内のそれを試料をフロー・システムに強制的に通すために作動させる。別法として、試料は本器具によりチップ内に注入できる。ポリメラーゼのような分析に必要とされる試薬類はチップへの注入の前にポリヌクレオチドの試料に添加できる。別法として、分析を完結させるために必要な試薬類を別々の注入ポートから、例えば、本器具によって反応チャンバーに注入できる。流体試料と試薬類は毛管作用によってもメソスケールのフロー・システムに入れることができる。
一つの具体例において、本装置はPCR分析を行うために使用でき、反応チャンバー中の一個またはそれ以上のセクションの温度は、例えば、基材にある反応チャンバーの近くに一個またはそれ以上の電気抵抗加熱器を設けることにより、あるいは反応チャンバーに向けたパルススレーザーまたは他の電磁気エネルギー源を用いることにより制御することができる。本器具は収容部位に、チップの構造に組み込まれた接点と対合するような、例えば、反応チャンバーを加熱する電気抵抗に電力を供給するための電気的接点を含む。反応チャンバーの温度制御において補助するために器具内には冷却要素を設けることもできる。本器具には、ハイブリッド崩壊と重合反応のため必要とされるPCR温度サイクルを温度的に制御するための、装置内のセンサーと接続された通常の回路素子センサーを設けることができる。
メソスケールの反応チャンバー中のポリヌクレオチド増幅反応により生成した増幅ポリヌクレオチドは基材中のポートを通じて収集することができて、例えば、ゲル電気泳動その他の方法により検出できる。別法として、装置中の反応チャンバーと流体連結したメソスケールの検出領域を、メソスケールのフロー・システムの一部として、基材中に微細加工できる。該検出領域は、増幅したポリヌクレオチドと検出可能に結合できる、ラベルされたポリヌクレオチドあるいは抗体プローブのごときラベルされた結合部分を包含することができる。重合したポリヌクレオチド生成物の検出領域における存在は、例えば、重合したポリヌクレオチドと結合部位との凝集の、検出領域の上のガラスのカバーを通した、あるいは基材それ自体の半透明なセクションを通した光学的検出によって検出できる。
陽性の分析は、反応チャンバー中での重合したポリヌクレオチドの生産の際のフロー・システムの異なる地点における圧力または電気伝導度の変化のごとき試料流体の流れの特性における検出可能な変化によっても示指できる。一つの具体例において、本装置はポリヌクレオチド増幅反応チャンバーを備えたメソスケールのフロー・システムからなり、検出領域は、例えば、当該検出領域の上部に設けた光学的窓を通して陽性の結果を読取れるような分光光度計のごとき感知機器を備えた器具と組み合わせて用いることができる。本器具は反応チャンバー、検出領域、もしくはフロー・システムのどこか他の領域で感知される圧力の表示、導電度等を示す電気的信号を受け取るように設計することができる。
本基材は混合物中のポリヌクレオチドの迅速な平行した検出を可能にする複数の検出／反応チャンバーからなるものとすることができる。本メソスケールのフロー・システムは、微量試料中の細胞の溶解を反応チャンバーに運ばれる前に可能にするための突出部分、あるいは減少した断面積のセクションを含む。流路の中に入れられたシリコンの鋭い角を持つ断片もまた溶解の手段として用いることができる。メソスケールのフロー・システムにはまた例えば、フロー・チャンネルの壁に固定化され、細胞が、細胞を溶解する領域に、次いで反応チャンバーに運ばれる前に、液体の流れの低い速度においては不均一な細胞の集団の中のある特定のタイプの細胞を結合し、液体の流れの高い速度においては、そのタイプの細胞を放出するような結合部位からなる細胞捕獲領域を含めることができる。この具体例において、選択された細胞の副集団から細胞内DNAまたはRNAは単離され、一個の装置内でのポリヌクレオチド分析のためにメソスケールの反応チャンバーに運ばれる。
もう一つの具体例において、磁性ビーズがメソスケールのフロー・システムに設けられ、これは、例えば、器具中の外部磁場によりフロー・システムにそって動くことができる。一つの具体例において、ポリヌクレオチドのプローブが磁性ビーズに固定化され、このことによりビーズが反応チャンバー中の増幅したポリヌクレオチドに結合することができる。固定化されたポリヌクレオチドのプローブを含む磁性ビーズは、例えば、重合化したポリヌクレオチド生産物を結合するために、分析の終わりに、フロー・システムを通し反応チャンバーに送られるであろう。結合したポリヌクレオチドは、次いで、フロー・システム中の検出あるいは精製チャンバー、もしくは収集ポートに、磁性ビーズにのせて送ることができる。
本装置の幾つかの特徴と利点を表１に示す。本装置は病原体である細菌またはウイルスの検出のため、もしくはある細胞のタイプの存在、もしくは細胞における遺伝子または組換えDNAの配列の存在のための迅速な試験を供給する。本明細書中に開示される装置は全て、試料中のポリヌクレオチドを増幅するために用いられるPCRチャンバーを含むメソスケールのフロー・システムにより特徴付けられ、これにはPCRのために必要とされるポリメラーゼおよび他の試薬が供給される。本装置は広範囲の適用でポリヌクレオチドを増幅するのに使用できる。分析の終わりに、チップを一般的には捨てる。
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図面の簡単な記載
図１は、基材の表面に付着した透明なカバー12を有し、その上には注入ポート16とPCR反応チャンバー22に連結されたメソスケールのフロー・チャンネル20が形成された本発明の装置の模式的縦断面図である。
図２は、図１の装置の斜視図である。
図3Aは、それを示持するために使用することができ、その中の反応チャンバー22の温度を制御するための加熱要素57を含む、模式的に示した器具50内に収容された分析装置10の模式図である。
図3Bは、それを示持するために用いることができ、その中の反応チャンバー22の温度を制御するための加熱要素53を含む、器具50内に収容された分析装置10の模式図である。
図４は、基材の表面に付着した透明なカバー12を有し、その上には注入ポート16とPCR反応チャンバーセクション22に連結されたメソスケールのフロー・チャンネル20が形成された本発明の装置の模式的縦断面図である。
図５は、図４の装置の斜視図である。
図6Aは、それを示持するために用いることができ、その中の反応チャンバーセクション22の温度を制御するための加熱要素57を含む、器具50内に収容された分析装置10の模式図である。
図6Bは、それを示持するために用いることができ、その中の反応チャンバーセクション22Aの温度を制御するための加熱要素57を含む、器具50内に収容された分析装置10の模式図である。
図７は、基材上に対称的に設けられた、フロー・チャンネルのフラクタル分岐システム40からなる検出チャンバーと流体連絡したメソスケールのPCRチャンバーセクション22Aと22Bを微細加工した当該基材14の模式的平面図である。
図８は、チャンネルの壁から延びた、細胞または破片を濾過する突出物80を備えた基材14中のフロー・チャンネル20の断面斜視図である。
図９は、チャンネルの壁から延びた、細胞を突き通す突出物90を備えた基材14中のフロー・チャンネル20の断面斜視図である。
図10は、シリコン基材14中の微細加工したPCRチャンバーセクション22Aと22Bを含むメソスケールのPCR分析装置の模式的平面図である。
図11は、シリコン基材14中に微細加工したPCRチャンバー22Aを含むもう１つのメソスケールのPCR分析装置の模式的平面図である。
図12は、細胞の分別、細胞の溶解およびPCR分析を含む種々の機能を実施するのに適した一連のメソスケールのチャンバーを加工した分析装置の模式的平面図である。
図13はフラクタル分岐フロー・チャンネル40の一対を加工した分析装置の模式的平面図である。
図14、15および16は分析装置10中のフロー・チャンネル20中に微細加工したメソスケールのフィルター24の異なる具体例の計画の頂面図を示す。
図17は、装置10の内容物をみるために装置10と組み合わせて用いられる装置60の模式的斜視図である。
図18は、図17の装置60の模式的断面図である。
角図面中の同様の参照符号は対応する部分を示す。
詳細な記述
本発明は、流体試料中のポリヌクレオチドの迅速な増幅を可能にするポリヌクレオチド重合反応を実施するための小さくて、大量生産できる、典型的には一回使用の一連の装置を提供する。本装置は、数ミリメーターの厚さで約0.2ないし2.0センチメーター平方のような大きさであって、試料の注入ポートとメソスケールのフロー・システムを形成するように微細加工された基材よりなる。メソスケールのフロー・システムは、注入ポートから伸びる少なくとも一つの試料フロー・チャンネル、およびフロー・チャンネルと流体連絡した少なくとも一つのポリヌクレオチド重合反応チャンバーを含む。チャンネル、チャンバー、および複数のポートを配置することにより、試料および試薬の連続的で、適宜で、かつ容積が正確な装置内への添加を容易とする。反応チャンバーおよびフロー・チャンネルは、好ましくは、メソスケールの寸法、即ち、断面の寸法が0.1μｍないし500μｍである。反応チャンバーの好ましい深さは0.7ないし100μｍであり、好ましい幅は2.0ないし500μｍである。好ましいフロー・チャンネルの深さは0.1ないし100μｍ、好ましい幅は2.0ないし200μｍである。
一つの具体例において、本装置は反応チャンバー（PCRチャンバー）中でポリメラーゼ鎖反応（PCR）を実施するために利用することができる。PCRチャンバーには、試料ポリヌクレオチド、タック（Taq）ポリメラーゼのごときポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、試料ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な一番目のプライマー、ポリヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズ可能な二番目のプライマー（ここに一番目と二番目のプライマーは重合する生成物ポリヌクレオチドの両末端を定義する）を含むポリメラーゼ鎖反応に必要なPCR用試薬を供給することができる。ポリメラーゼ鎖反応は、当該分野で確立された方法（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloing）：ア・ラボラトーリ・マニュアル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトーリ・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1989年）により実施できる。本装置には、各サイクルにおいて、温度を制御して二本鎖ポリヌクレオチドを脱ハイブリダイズさせて、一本鎖ポリヌクレオチドを得、次いで、プライマーをアニールし、ポリヌクレオチドの重合を起こすようにチャンバーの内容物の温度を循環的に変化させるための手段を包含させることができる。それに加え、制限酵素/DNAポリメラーゼシステムによる等温のDNAのインビトロ増幅を含めた当該分野で公知の他のポリヌクレオチド重合反応も使用することもできる。ウォルカー（Walker）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.、第89巻：第392頁〜第396頁（1992年）。リガーゼ反応もまた使用できる。ベックマン，ケイ（Beckmann,K）、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）、第38巻：第457頁〜第458頁。
一つの具体例において、本装置には、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段を含ませることもできる。本装置は、細胞中または溶液中のポリヌクレオチドの分析を含めた、種々の自動化された、感度良好で迅速なポリヌクレオチドの分析を実施するために使用することができる。分析の終わりには、装置を一般的には捨てる。使捨ての装置の使用により、試料間のコンタミネーションが排除される。試料および反応混合物は常に葬ったままに維持でき、小容量により廃棄物の処理が単純化される。
メソスケールのフロー・チャンネルおよび反応チャンバーを持つ分析装置は、固体基材から設計することができ、大量に加工できる。これらは容易に滅菌できる。シリコンは、よく発達した技術によりその正確で能率的な加工が可能であるので好ましいが、ポリテトラフルオロエチレンを含むポリマーのごとき他の材料も使用できる。試料の注入その他のポート、試料のフロー・チャンネル、反応チャンバー、もしくは他の機能的要素を含むメソスケールのフロー・システムは、かくして、当業者に公知の種々の微小機械加工方法のいずれによっても大量に、費用をかけてシリコン基材から加工できる。使用可能な微小機械加工の方法はスピンコーティングおよび化学蒸着、レーザー加工、またはUVまたは、Ｘ線のプロセスのごとき写真平板技術、あるいは、湿式化学プロセスもしくはプラズマプロセスのいずれかによりなされるエッチングの方法といったフィルム析出方法を含む。（例えば、マンツ（Manz）ら、トレンズ・イン・アナリティカル・ケミストリー（Trends in Analytical Chemistry）、第10巻：第144頁〜第149頁（1991年）参照）。
変化する幅と深さのフロー・チャンネルはメソスケールの寸法で加工できる。加工されたメソスケールのフロー・チャンネルを含むシリコン基材は、アノードに結合された薄いガラスのカバーで覆い、密閉することができる。他の透明な、あるいは不透明なカバー材質も使用できる。別法として、二個のシリコン基材をサンドイッチとし、または一個のシリコン基材を２枚のガラスカバーの中にはさみこむことができる。透明なカバーを用いることにより、メソスケールのフロー・システム中の内容物を動的に眺めることが容易になる。他の加工へのアプローチも用いることができる。
一つの具体例において、PCR分析が本装置の反応チャンバー中で実施できる。図１および図２中に模式的に示すごとく、装置10には、注入ポート16、メソスケールのフロー・チャンネル20、およびPCRチャンバー22を微細加工したシリコン基材14を包含させることができる。重合反応に必要とされるポリヌクレオチド試料と試薬は、フロー・チャンネル20のいずれかの端部に加工された注入ポート16を通り、フロー・チャンネル20および反応チャンバー22を通って添加され、生成物は（もし必要ならば）取り出される。基材14はガラスまたはプラスチックのカバースリップ12により覆われる。分析の間中、装置10は図3Aに模式的に示された器具50のごとき器具と組み合わせて用いることができる。器具50はフロー・ライン56をその中に備えており、装置10を保持するための、そして、例えば、装置10上のポート16のようなポートと対合させるための、収容部位58を含む。器具50中のポンプ52は、試料および／または試薬を注入ポート16を介し本器具内のフロー・ライン56から反応チャンバー22間で輸送するのに用いられる。
器具50には、例えば、電気的加熱要素および／または冷却コイルのような、PCRチャンバー中の温度を制御するための加熱／冷却要素57を包含させることができる。電気的加熱要素を、別法として、反応チャンバー22の下方の器具中のマッチング電気接点に対して対合する電源用の接点と共に、基材10中に組み込むこともできる。別法として、図3Bに示すごとく、本器具には、装置10中の反応チャンバーの上方に配置された、レーザーまたは他の電磁気エネルギーのごとき加熱手段53を包含させることができる。別法として、レーザーは反応チャンバーの下方の器具内に設けることもできる。器具中のマイクロプロセッサはハイブリッド崩壊に適した温度、例えば94℃とアニーリングおよび重合に適した温度、例えば65℃の間のPCRチャンバー中での温度サイクルを供給するための加熱要素を制御するために用いることができる。マイクロプロセッサが反応チャンバー中の温度サイクルを検出し維持するために、器具と電気的に接触させて、基材中に熱電対を設けることもできる。小型の熱電によるヒートポンプ（マテリアルズ・エレクトロニック・プロダクツ・コーポレーション（Materials Electric Products Corporation）、トレトン（Treton）、ニュージャージー（New Jersey）のごとき冷却要素もまた反応チャンバーの温度を調節するために器具中に含めることができる。もう一つの具体例において、図3B中に示される器具50中で、PCRサイクルのため要求される温度に試料を連続的に加熱し冷却するために、ガラスカバー12を通しての反応チャンバーに向けた時間を定めたレーザーパルスにより反応チャンバーの温度を制御することができる。シリコンの温度的特性により、迅速な加熱および冷却のサイクルが可能となる。
分析装置は、当該装置内のメソスケール・チャンネルの内容物を見るための器具と組み合わせて用いることもできる。一つの具体例における本器具は、装置内のメソスケールのチャンネルの内容物を見るための顕微鏡よりなるものであってもよい。もう一つの具体例において、図17および18に模式的に示した器具60内で図示したごとく、カメラを器具内に含めることもできる。器具60には、ハウジング62、眺めるためのスクリーン、およびチップを本器具中に挿入するためのスロット66を設ける。図17の断面図に示されるように、器具60には、ビデオカメラ68、光学系70、および、装置10を保持し、かつ装置10の配置と角度を手動で調節できるようにするための傾斜機構装置72をも含ませることができる。光学系70には、光源だけでなくチャンネルの内容物を拡大するためのレンズ系を含ませることもできる。ビデオカメラ68およびスクリーン64により、重合したポリヌクレオチドの存在によって引き起こされる、流れの特性または色の変化のごとき試料流体の特性の変化が視覚的に監視され、また、所望により該器具を用いて記録することが可能となる。
もう一つの具体例において、図４、５および6Aに模式的に示すごとく、メソスケールのPCRチャンバーには、複数のセクション、例えば、フロー・チャンネル20Bにより連結された２個のセクション22Aとセクション22Bを微細加工することができる。この具体例において、セクション22Aをハイブリッド崩壊に適した温度に加熱し、セクション22Bを、アニーリングおよび重合に適した温度に加熱する。分析の間、装置10は器具50の中に置くことができる（図6A）。器具50には、反応チャンバーセクションの温度を制御するための手段57を設ける。別法として、これらのセクションを加熱するためにレーザーを使用することもできる。反応チャンバー中のこれらのセクションの温度を監視するために基材中に熱電対を含め、その出力をマイクロプロセッサの助けを借りて温度の入力を制御するために用いることができる。操作にあたり、器具中のポンプ52は、ポリヌクレオチド試料を輸送し、また必要とされるPCR試薬を注入ポート16Aを通しセクション22Aまで輸送するために用いられる。器具中のマイクロプロセッサによっても制御できるポンプ52は、次いで、連続的なポリメラーゼ鎖反応を実施するために試料をチャンネル20Bを通ってセクション22Aとセクション22Bの間を連続的に循環させるために使用され、ここにポート16Bはベントとして供される。反応の完結時には、器具50中のポンプ52は生成物を回収するため、器具中において試料をポート16Bとライン56を通ってポート59に輸送するために使用することができる。もちろん、３個またはそれ以上のチャンバーを用いることもでき、その各々は個々の反応を行うのに適した温度に維持される。
もう一つの具体例において、図４、５および6B中に示される装置10では、二本鎖DNAのハイブリッド崩壊に適した温度、例えば、94℃にセクション22Aを加熱するために加熱要素が用いられ、一方セクション22Bとチャンネル20Bは、セクション22A、セクション22Bと連結しているが、加熱された試料の、セクション22Aからセクション22Bまでの輸送の際に、試料の温度が、試料がさらなる循環のためにセクション22Aに戻る前に、その温度がアニーリングおよび重合に必要とされる温度まで下がるように熱を効率的に放散させることができるように、セクション22Aから一定の間隔をおいて配置される。これは、シリコンが比較的高い熱伝導度を有し、液体試料と基材との界面の面積が非常に高いことにより容易に達成することができる。この具体例において、器具50内のマイクロプロセッサは、セクション22Aと22Bの間の試料の流れのサイクルを調節するポンプ52を制御するために用いることができる。それゆえ、動的熱平衡によってチャンバー間の流路に沿った温度勾配がつくられ、双方において単一の加熱源を用いることにより適切な温度が達成される。他の設計も可能である。例えば、アニーリングおよび重合反応は、異なる最適温度に設定した一個のPCRチャンバー中の異なるセクションで行うことができる。
ポリメラーゼ鎖反応は、タック（Taq）ポリメラーゼのごときいずれの耐熱性ポリヌクレオチド・ポリメラーゼを用いても実施することができる。タック（Taq）ポリメラーゼのごとき試薬は試料に添加され、次いで、メソスケールの反応チャンバーへの注入ポートを通して輸送されるか、あるいは試薬は試料とは別に、別々の注入ポートを通し反応チャンバー中に輸送され得る。
本装置の容量は非常に小さく、それゆえ一回の分析に必要な試料流体の量は非常に少ない。例えば、その表面に幅10ミクロン×深さ10ミクロン×長さ1cm（104ミクロン）の500の溝が整列している1cm×1cmのシリコンの基材において、各溝の体積は10-3μＬであって、500の溝の全体積は0.5μＬである。メソスケールのフロー・システムの体積が小さいことにより、流体試料の非常に小さい量（＜５μＬ）で分析がなされる。本装置のメソスケールのフロー・システムはマイクロリットルの体積にて微細加工されるかまたは、別法としてナノリッターの体積もしくはそれより少ない体積にて微細加工され、このことにより一回の分析に必要とされる試料および／または試薬の流体の量を有利に限定する。
本発明の装置は生物学的な流体試料においてポリヌクレオチドの迅速な増幅のために用いられるメソスケールのポリヌクレオチド重合反応チャンバーを供給する。本装置は増幅したポリヌクレオチド生成物を検出するための基材中あるいは器具中にある手段をも含む。装置中における増幅したポリヌクレオチド生成物の存在はメソスケールのフロー・システム中の反応チャンバーに入るおよび／または存在する試料流体の圧力もしくは電気伝導度を監視することを含めた多くの方法のいずれによっても検出可能である。増幅されたポリヌクレオチド生成物の存在は、ラベルされたオリゴヌクレオチドまたは抗体プローブのごときラベルされたプローブによる結合アッセイ、もしくはゲル電気泳動によっても検出できる。
一つの具体例において、増幅したポリヌクレオチド生成物は基材中にあって反応チャンバーと流体で連絡したメソスケールのフロー・システム中に加工された検出チャンバーを用いて検出可能である。検出チャンバーには増幅されたポリヌクレオチドと結合可能な結合部位を設ける。結合部位は、例えば、ポリヌクレオチドまたは抗体プローブからなるものとすることができる。検出チャンバーはU.S.シリアルナンバー［代理人明細書No.UPA001（8261/2）］、メソスケール・ディテクション・ストラクチャーズ（Mesoscale Detection Structures）、に開示されている方法により加工でき、その開示を引用により本明細書の一部とみなす。本装置は分析中に得られるデータを検出し記録するマイクロプロセッサを含む器具と組み合わせて用いることができる。
一つの具体例において、メソスケールの検出チャンバーには、重合したポリヌクレオチド生成物の存在下において、検出可能なビーズの凝集を引き起こすために、重合したポリヌクレオチドに結合することのできる不活性粒子、例えば、ビーズあるいは他の粒子を設けることができる。粒子により誘導される凝集は、抗体のごとき結合部位の粒子への付着により促進できる。
重合したポリヌクレオチドに結合可能な抗体あるいは他の結合部位は、結合を誘導するために検出チャンバーに導入されるか、あるいは化学的かもしくは吸収によるかのいずれかにより検出領域の表面に被覆されるか、あるいは別法として、検出領域の不活性粒子の表面に被覆されるかされ、ポリヌクレオチドが陽性であるかどうかの試験が行える。シリカ質の表面の化学的活性化技術は、特にクロマトグラフィーの方面においてよく発達している。（例えば、ソリッド・フェース・バイオケミストリー（Solid Phase Biochemistry）、ダブリュー・エイチ・スコーテン（W.H.Scouten）編、ジョン・ウィリー（John Wiley）、ニューヨーク、第535頁〜第597頁（1983年）：におけるハラー（Haller）の文献；およびマンデニウス（Mandenius）らの、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、第170巻：第68頁〜第72頁（1988年）参照）。一つの具体例において、結合部位は抗体からなり、当該分野において公知のイムノアッセイの技術を検出領域において実施することができる。（ボルトン（Bolton）らの、ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・イムノロジー（Handbook of Experimental Immunology）、ビア，ディ・エム（Wier,D.M）編、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）、オックスフォード（Oxford）、1986年、第１巻、第26章をイムノアッセイの一般的議論のために参照されたし）。
蛍光分子または蛍光ビーズのごとき光学的に検出できる標識を該結合部位に結合させて、重合されたポリヌクレオチドの検出を向上させることもできる。別法として、蛍光標識抗体のごとき二次標識物質を、該流動システムを通してデリバリーして、該検出領域中の結合したポリヌクレオチド／結合部位に結合させて、分析物の存在の指標となる光学的に検出可能な部分を含有する「サンドウィッチ」を形成させることもできる。該検出領域における増幅されたポリヌクレオチドの結合は、該検出領域にわたり配された透明窓を通して、例えば、光学的に、視覚的または機械により検出することができる。一の具体例において、増幅されたポリヌクレオチドの生成は、臭化エチジウムのごとき染料の添加により検出することができ、これは二重鎖ポリヌクレオチドへの結合に際し蛍光の向上を示す（ヒグチ（Higuchi）ら、バイオテクノロジー（Biotechnology）、第10巻：第413頁（1992年））。
また、増幅されたポリヌクレオチドの１方の鎖に結合しうる標識した相補的ポリヌクレオチド鎖、例えば、ビーズ上に固定化させた標識ポリヌクレオチドを該検出領域に配してもよく、ビーズ凝集の手段により、重合されたポリヌクレオチド生成物を検出できる。当該分野で公知のポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション技術を利用することができる（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Moleclar Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、1989年）；ベナー（Vener）ら、アナリティカル・ケミストリー（Anal.Chem.）、第198巻：第308〜第311頁（1991年））。ポリヌクレオチドプローブを、例えば、サブミクロンのラテックス粒子に、結合させることもできる（ウルフ（Wolf）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第15巻：第2911〜第2926頁（1987年））。
また、（出典明示して本明細書の一部とみなす）USSN［代理人ファイル番号UPA002（8261/3）］、アナリシス・ベースド・オン・フロー・レストリクション（Analysis Based on Flow Restricttion）に開示されているように、該反応チャンバーで生成させた重合ポリヌクレオチドの存在により引き起こされる流動制限に敏感な検出領域を用いてポリヌクレオチド重合を検出することもできる。また、増幅されたポリヌクレオチドの存在は、該流動システムを出入りする流体試料の圧力または電気の導電性を検知することによっても検出することができる。該導電性は、他えば、該基材を通して伸び該装置と組み合わせて用いる器具の電気接触部と接触する電気接触部を用いて測定することができる。電気接触部は、公知の熱勾配帯溶融により加工できる（ファンダメンタルズ・アンド・アプリケーションズ・オブ・ケミカル・センサーズ（Fundamentals and Applications of Chemical Sensors）、ディー、シュエッツェル（D.Schuetzle）およびアール、ハメール（R.Hammerle）編、エイシーエス・シンポジウム・シリーズ・309（ACS Symposium Series 309、ワシントン，ディーシー（Washington,DC）中のゼーメル（Zemel）ら、1986年、第２頁参照）。
該反応チャンバー中の増幅されたポリヌクレオチドは、該試料流体の圧力をモニターすることにより検出できる。例えば、図6Aに模式的に図示する、器具50に収容させた装置10においては、ポート16を通して該メソスケール流動システムを出入りする試料流体に連結した圧力検出器54により、重合された生成物および生成した目詰まりの存在または流動制限により引き起こされる圧力の下降を検出することができよう。また、メソスケール圧力センサーを直接シリコン基材上に加工してもよい（アンゲル（Angell）ら、サイエンティフィック・アメリカン（Sientific American）、第248巻：第44〜第55頁（1983年））。
流動制限に敏感で、例えば、連続して流動チャンネルを分岐させる形状の、「フラクタル（fractal）」形状で構築されているメソスケール流動システムを用いることにより、ポリヌクレオチド重合を検出できる。該フラクタル分岐チャンネルは、一連の狭い流動チャンネルを供するの各々の分岐点で、直径が小さくなるシリコン基材上に加工してもよい。図７は、チャンネル20を介してポート16に連結した流動チャンネルのフラクタル分岐システム40、ならびに、部分22Aおよび22BよりなるPCR反応チャンバーを加工した基材14の模式的な平面図である。試料中の増幅されたポリヌクレオチド生成物の存在は、該フラクタル中における流動特性に影響するであろう。この具体例における該チャンネル40は、対称に配されており、該フラクタルの中心に向かって連続して狭くなる直径を有する。このフラクタルを通る流動は、重合された生成物の存在により引き起こされる流体粘度の変化に敏感である。別法として、図13に図示するごとく、さらに複雑なフラクタル流動システムを利用することもできる。図13は一対のフラクタル分岐流動チャンネル40Aおよび40Bを図示する。該フラクタル流動チャンネル40Aは、該フラクタルの中心に向かって連続して狭くなる流動チャンネルで構築されており、その結果、流動制限に対する感受性が向上している。
該フラクタル領域中の流動制限は、該検出領域にわたる透明カバーを通して、例えば、光学的に、検出することができる。別法として、１またはそれを超える圧力センサーを利用して、該フラクタル流路の中またはそれを越える増幅されたポリヌクレオチドの存在により引き起こされる流体特性の変化に起因する圧力変化を検出してもよい。また、ポリヌクレオチド生成上の導電性の変化も、該流動領域に接合する電気的な導電センサーを通して容易に検出できる。例えば、流入ポート16Aから排出ポート16Bへの流動が遮断する該フラクタル領域40の目詰りは、通常の導電プローブ17により検出できる。該プローブの出力は、外部流動チャンネルにおける水性流体の存在または不在の指標である。標識した抗体またはポリヌクレオチドプローブのごとき結合部位は、フラクタル領域中に、例えば、固定化するか、あるいは、ビーズのごとき固相反応物の上に含有させてもよく、生成ポリヌクレオチドに結合して該フラクタル流路中の流動制限を誘起する。
一の具体例において、該メソスケール流動システムは、下流のポリヌクレオチド分析の準備として、試料からの細胞を溶解するためのチャンバーを含有する。また、該装置は、異種細胞集団中の特定の細胞型を分離するために適用される領域を含有してもよい。該細胞分離領域は、該基材の構造上に固定化させた固定化結合部位を含有し、これはタンパク質のごとき特徴的な細胞表面分子を介して標的細胞に選択的に可逆的に結合する。該試料中の他の細胞は下流へ通過し、排水溜または排出ポートを通して排出する。例えば、緩衝液の流動で、流動を続けて該細胞を洗浄する。高流速および高流圧では、該洗浄した細胞は表面から剥ぎ取られて、分離領域から放出され、下流の溶解手段へ移動され、該手段において、細胞内のRNAまたはDNA分子のPCR分析の前に該細胞が溶解される。
該細胞溶解手段は、典型的には、該細胞分離領域および該ポリヌクレオチド重合反応チャンバーの間の流路に配されて、細胞内ポリヌクレオチドの分析の前に該細胞を溶解できる。図９に図示するように、該細胞溶解手段は、流動チャンネル20の表面から伸びる細胞膜を貫通する突起物90よりなるものとすることができる。該貫通する突起物90を通して流体流動を押し込むと細胞が破壊される。もう一つの具体例において、該細胞溶解は、単純に十分な流動圧の適用で細胞を溶解する、制限された断面直径の領域よりなっていてもよい。該細胞溶解手段は、メソスケール溶解チャンバーに捕捉された鋭利なシリコンピースよりなっていてもよい。ポンプのごとき、該細胞を含有する試料を該細胞溶解手段へ押し込むための手段を含有する器具は、十分な流動圧の適用で細胞を溶解し、続いて流動システムを通して該試料を該反応チャンバーへデリバリーする。もう一つの具体例において、該細胞溶解手段は、細胞溶解剤を含有していてもよい。当該分野で公知の細胞溶解剤を利用することができる。
該反応チャンバーに流体連絡した該基材中の離れた流入ポートから、剤を該反応チャンバーに添加してもよい。シリコン基材上の該流動チャンネルに微細加工されたフィルターを用いて、ポリヌクレオチド分析の前に細胞夾雑物を濾過することができる。一の具体例において、図14、15および16に示すように、装置10の該フィルター24は、チャンネル20に比して減少した直径のメソスケール流動チャンネルよりなっていてもよい。操作において、試料はフィルター24を通って試料流動チャンネル20Aから流動する。次いで、試料濾液がフィルター24から排出されて、チャンネル20Bを通って流動する。該フィルター24が、０〜１ないし20μｍの単位の深さおよび幅で微細加工される一方、流動チャンネル20AおよびＢは、約500μｍの単位の最大深さおよび幅を有する。また、図８に図示するように、流動チャンネル20の表面は、PCR分析チャンバーから上流の、大きさより細胞を分離するための細胞ふるい（cell seive）を構成する突出物80も含有してもよい。典型的には、低圧下にて、細胞試料を該流動チャンネルを通して流動させると、該突出物80の間を通るのに十分に小さな細胞のみが下流の機能要素（functional element）にたどり着く。続いて、これらの細胞は、細胞溶解領域を通り、次いで、分析用のPCR反応チャンバーにデリバリーされうる。
もう一つの具体例において、常磁性または強磁性のビーズを該メソスケール流動システム内に配して、例えば、器具のような、外部的な磁場により該流動システムに沿って動かすことができる。該ビーズを用いて該装置中の機能要素間に試薬を移動することができるか、あるいは、試料、試薬または反応混合物を置き換えることもできる。一の具体例において、ポリヌクレオチドプローブを該磁性ビーズ上に固定化させて、該ビーズが該増殖させたポリヌクレオチドに結合できるようにしてもよい。ポリヌクレオチドプローブのコーティングよりなる磁性ビーズは、アッセイの終了時に、該流動システムを通って該反応チャンバーに移動させて、該重合させたポリヌクレオチド生成物に結合させてもよい。次いで、結合した重合ポリヌクレオチドを該磁性ビーズ上にて、該流動システムの検出チャンバーまたは精製チャンバー、あるいは収集ポートへ移動させてもよい。
図10に図示した本発明の一の具体例は、流路20Bで連結されたセクション22Aおよび22BよりなるメソスケールPCRチャンバーが微細加工された基材14よりなる装置10である。該PCRチップ10は、該チップを支持するための収容部位を含有する図6Aに示す器具50のごとき、器具と組み合わせて用いる。該器具50は装置10中でポート16A、16B、16Cおよび16Dに連結した流路56を配する。また、該器具は、該ポート16A、16B、16Cおよび16Dを機械的に開閉するバルブも含有する。一の具体例において、該装置の流動システムを液圧的に満たしたまま維持し、該器具中、または別法として、該装置中のバルブを利用して流体流動を向ける。該PCRチャンバーのセクション22Aおよび22Bを94℃および65℃に各々加熱し、PCRに必要な融解温度およびアニーリング温度にする。前記で論じたごとく、反応チャンバーセクションは、該セクションの下に基剤中に組み込まれた電気接触部の手段により加熱してもよく、該セクションは該器具の中の電気接触部と連結することができる。別法として、光学的レーザーを用いて、支持体にわたり配されているガラスカバーを通して、該反応チャンバー部分を加熱してもよい。加熱センサーを、該器具の電気接触部中の該基材中に配してもよい。該器具中のマイクロプロセッサーを用いて、該反応チャンバーセクションの温度、ならびに該流動システム中の流体の流動を制御することができる。
最初に、該チャンネルおよび緩衝液を満たしたチャンバーの操作において、ポート16Aおよび16Cを開ける一方で16Bおよび16Dを閉める。該器具中のポンプ52は、該試料流体、ならびに、所望により、タック・ポリメラーゼ、プライマーおよびヌクレオシド三リン酸のごときPCRに要する試薬を、ポート16Aを介して、フィルター24を通して反応チャンバーセクション22Aにデリバリーする。次いで、ポート16Aを閉め、16Bを開け、該器具中の該ポンプ52を用いて、ポリヌクレオチド脱ハイブリダイゼーション（dehybridization）を起こすセクション22Aと、アニーリングおよび重合反応を起こすセクション22Bとの間に流動チャンネル20Bを通して流体流動を相互循環させる。ポート16Cを用いれば、該システムを排出でき、また、所望により、タック・ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、プライマーおよび他の試薬等をデリバリーすることもできる。例えば、30ないし35循環後の該ポリメラーゼ循環反応が完了したら、ポート16Cを閉め、ポート16Dを開けて、該器具中のポンプを作動させて該反応生成物をPCRチャンバーセクション22Aおよび22Bから、例えば、ビーズ92に固定化させた増幅されたセンスおよび／またはアンチセンス鎖に相補的なポリヌクレオチドを含有する検出チャンバー22Cにデリバリーする。重合生成物は、例えば、該検出領域にわたり配した透明カバーを通して、ビーズ92の凝集を観察することにより視覚的に検出する。
もう一つの具体例を図11に図示する。この装置の機能、構造および操作は、単一のPCR反応チャンバー22Aよりなることを除き、図10に示したものと同一である。該装置は、図3Aに器具50のごとき器具と組み合わせて用いる。該装置は、融解に要する温度およびアニーリングまたは重合に要する温度のいずれかに、反応チャンバー22Aを加熱および冷却するための手段を含有する。
操作においては、該器具を用いて、PCRに要するポリメラーゼおよび他の試薬を流入ポートを通して反応チャンバー22Aにデリバリーする。次いで、該器具に連結したバルブを用いてポート16Aおよび16Dを閉める一方、16Bおよび16C開けたまま維持する。次いで、該器具中の加熱要素を利用して、脱ハイブリダイゼーションに適当な温度と、アニーリングおよび重合に適当な温度との間に該反応チャンバーを熱循環させる。該PCR反応循環を完了したら、ポート16Cを閉め、ポート16Dを開けて該試料を、例えば、ビーズ92上に固定化させた、ポリヌクレオチドプローブを含有する該検出チャンバー22Bにデリバリーする。該ポリヌクレオチドの陽性アッセイは、該検出チャンバー中のポリヌクレオチドプローブの凝集によって示される。
本発明は、以下の限定されない実施例からさらに理解されよう。
実施例１
図11に模式的に図示した装置の中でポリメラーゼ鎖反応を行う。細胞中のポリヌクレオチドを検出するためにPCR分析を行うには、試料細胞溶解物をタック・ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドプライマーおよび他のPCRに要する試薬の緩衝液に添加する。該細胞試料溶解物を流入ポート16Aを通して該器具を介して、PCR反応チャンバー22Aにデリバリーする。該器具中に含有されるバルブ手段によりポート16Aおよび16Dを閉じる一方、ポート16Bおよび16Cを開ける。該器具中のマイクロプロセッサーおよび温度制御要素を用いて、反応チャンバー22Aにて、ポリヌクレオチド脱ハイブリダイゼーションのための94℃、およびポリメラーゼ反応のための65℃の間に温度循環させる。該ポリメラーゼ鎖反応が完了した後に、ポート16Cを閉め、16Dを開けて、ポート16Bに連結した該器具中のポンプを用いて、該PCRチャンバー22Aからの試料を流動チャンネル20Bを通して該検出チャンバー22Bにデリバリーする。ビーズ92を含有する検出チャンバー22Bは、増幅させたポリヌクレオチドに結合できる表面に固定化した相補的なポリヌクレオチドよりなる。増幅させたポリヌクレオチドおよび相補的なポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーション反応により引き起こされるビーズの凝集は、該検出領域22Bにわたり配された窓を通して観察し、増幅させたポリヌクレオチド生成物の存在テストを提供する。
実施例２
図12は、生物流体試料混合物中の細胞亜集団から核酸を単離するのに用い、次いで、特定のヌクレオチド配列のアッセイを行うために用いる基材14を含有する装置10を模式的に図示する。装置10上に微細加工されているのは、細胞分離チャンバー22A、細胞溶解チャンバー22B、フィルター領域24、セクション22Cおよび22DよりなるPCR反応チャンバー、ならびにフラクタル検出領域40を含有するメソスケール流路20である。また、該メソスケール流動システムには、流体投入／排出ポート16A、16B、16Cおよび16Dが配されている。該装置は、図6Aに示す器具50のごとき器具と組み合わせて用いる。
最初に、該器具中のバルブを用いてポート16Cおよび16Dを閉める一方、ポート16Aおよび16Bを開ける。細胞混合物を含有する試料を、該器具中のポンプ52により試料インレット口16Aに向け、メソスケール流路20を通して分離チャンバー22Aに流動させる。チャンバー22Aは、該チャンバーの壁に固定化した結合部位を含有し、これは試料中の所望の細胞型上の表面分子に選択的に結合する。残りの細胞成分は、ポート16Bを介して基材の外に排出される。チャンバー22A中の所望の細胞集団に結合した後も緩衝液を流動させて洗浄し、該細胞集団の単離を確認する。次に、ポート16Bを閉じ16Cを開ける。次いで、流動を十分に増加させて固定化している細胞を剥ぎとる。流動を続けて、チャンバー22B中の膜を貫通する突出物90を通して細胞を押し込み、細胞を破壊して細胞内物質を放出させる。
フィルター24の後に試料を流動させ続け、大きな細胞膜成分および他の夾雑物を、流動チャンネル20BによりPCRチャンバーセクション22Dに連結したメソスケールPCRチャンバーセクション22Cに濾別する。次に、PCRアッセイに要するタック・ポリメラーゼ、プライマーおよび他の試薬を、該器具中の連結したポートおよび流路からポート16Cを通してセクション22Dに添加すると、分離した細胞亜集団からの細胞内可溶性成分と該PCR試薬とが混合する。ポート16Aを閉じるとともに、ポート16Bを介して連結した該器具中のポンプを用いて、PCR試料および試薬を各々94℃および65℃に設定したセクション22Cおよび22Dの間に流動チャンネル20Bを通して循環させ、複数のポリヌクレオチド融解および重合の循環を行い、生成物ポリヌクレオチドを増幅させる。次に、該器具のバルブを用いてポート16Cを閉じ、ポート16Dを開ける。次いで、ポート16Bに連結した該器具中のポンプを用いて、細胞集団から単離した該増幅させたポリヌクレオチドを、流路40の一連のフラクタル分岐よりなる検出領域に向ける。該フラクタル領域40における流動制限は、増幅させたポリヌクレオチド生成物の存在の陽性指標として配され、該検出領域にわたり配されたガラスカバーを通して光学的に検出される。
前記の記載が図示の方法により記載されたもので、本発明が、本明細書中に記載した構造および方法の意図の範囲内の他の形態をとりうることは理解されよう。当業者なら変形および修飾を思い付くであろうし、かかる全ての変化および修飾は請求の範囲に定義したごとく、本発明の一部分と考えられよう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１７】
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【図１８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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