(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩からなる群より選ばれる１種または２種以上を有効成分とするラクトシルセラミド合成酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症の発症や炎症、癌転移、血管新生及び感染に関与する細菌、ウイルス、毒素と細胞との接着、糖脂質代謝異常を起こす遺伝病、白内障などに関与すると考えられているラクトシルセラミド合成酵素の特異的な阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラクトシルセラミド合成酵素は、細胞の種々の認識機構に関与するといわれるスフィンゴ糖脂質の生合成に作用する。すなわちラクトシルセラミド合成酵素が、ＵＤＰ−ガラクトースからガラクトースをグルコシルセラミドに転移させてラクトシルセラミドを生成することにより、スフィンゴ糖脂質の生成が始まるといわれている。このため近年ラクトシルセラミド合成酵素の探索、研究が行われるようになった。
【０００３】
一方動脈硬化症は、高血圧、内分泌機能異常及び脂質代謝異常等に起因し、動脈が硬化又は攣縮する症状であるが、ラクトシルセラミド合成酵素は、この動脈硬化症の発症に関与することが近年明らかになりつつある。
【０００４】
また、細胞表面の糖脂質が癌細胞の転移に関与していることが近年明らかにされつつある。たとえば、グルコシルセラミドの合成を阻害するＤ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）は、癌細胞におけるグルコシルセラミドの合成を阻害することにより更に複雑な糖脂質の生合成を阻害し、その結果、ルイス肺癌細胞（３ＬＬ細胞）の肺への転移を阻害することなどが知られている（Ｊ．Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  ｅｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，６７３１−３７，１９９０）。更に、白血球の細胞膜由来のシアリルルイスＸ糖鎖は白血球のローリング、内皮細胞への細胞接着、組織浸潤などの過程に関与していることが明らかになりつつある。従って、これらの細胞表面の糖鎖の合成を阻害することにより、癌の転移抑制や局所組織炎症反応過程の初期の段階、すなわち白血球の血管内皮細胞膜上でのローリング、接着血管外組織への浸潤を阻害することが期待されている。
【０００５】
このため、今後ラクトシルセラミド合成酵素を阻害する物質、特に同様にＵＤＰ−ガラクトースからガラクトースを転移させる点で共通するガラクトース転移酵素（ガラクトースを糖蛋白質の糖鎖に転移する。Ｙａｄａｖ    Ｓ．Ｐ．    ａｎｄ    Ｂｒｅｗ    Ｋ．    Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．    Ｊａｎ．    １９９１，２６６（２）ｐ．６９８−７０３）の活性を阻害せず、ラクトシルセラミド合成酵素の活性のみを特異的に阻害する物質の研究が必要になると考えられるが、これまでラクトシルセラミド合成酵素を特異的に阻害する物質はほとんど見出されていないのが現状である。
【０００６】
したがって本発明は、ラクトシルセラミド合成酵素の特異的な阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究した結果意外にも、グルコシダーゼ阻害作用等を有することが知られているＮ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩が、特異的にラクトシルセラミド合成酵素の阻害作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩からなる群より選ばれる１種または２種以上を有効成分とするラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ノジリマイシンは、Ｄ−グルコースのピラノース環を構成する酸素原子がＮＨで置換された構造を有するものである。かかるノジリマイシン及びその誘導体は、従来抗生物質として知られている（Ｉｓｈｉｄａ    Ｎ．，    ＫｕｍａｇａｉＫ．，    Ｎｉｉｄａ    Ｔ．，    Ｈａｋｏｍｏｔｏ    Ｋ．，    Ｓｈｏｍｕｒａ    Ｔ．    Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．    Ｍａｒ．１９６７，２０（２）ｐ．６２−６５、及びＩｓｈｉｄａ    Ｎ．，    Ｋｕｍａｇａｉ    Ｋ．，    Ｎｉｉｄａ    Ｔ．，    Ｔｓｕｒｕｏｋａ    Ｔ．，    Ｙｕｍｏｔｏ    Ｈ．    Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．    Ｍａｒ．１９６７，２０（２）ｐ．６６−７１）。
【００１０】
ノジリマイシン及びその誘導体は、種々のグリコシダーゼ阻害剤としても知られている。例えばノジリマイシンＡは、α，β−グルコシダーゼを阻害することにより、癌の転移を抑制することが知られている（Ｔｓｕｒｕｏｋａ    Ｔ．，Ｆｕｋｕｙａｓｕ    Ｈ．，    Ｉｓｈｉｉ    Ｍ．，    Ｕｓｕｉ    Ｔ．，    Ｓｈｉｂａｈａｒａ    Ｓ．，    Ｉｎｏｕｙｅ    Ｓ．    Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．    Ｆｅｂ．１９９６，４９（２）１５５−１６１）。またカスタノスペルミンは、α−グルコシダーゼを阻害することにより、血管新生を阻止し腫瘍の増殖を抑制することが知られている（Ｐｉｌｉ    Ｒ．，    Ｃｈａｎｇ    Ｊ．，    Ｐａｒｔｉｓ    Ｒ．Ａ．，    Ｍｕｅｌｌｅｒ    Ｒ．Ａ．，    Ｃｈｒｅｓｔ    Ｆ．Ｊ．，    Ｐａａｓｓａｎｉｔｉ    Ａ．    Ｃａｎｃｅｒ    Ｒｅｓ．    Ｊｕｌｙ    １９９５，５５（１３）ｐ．２９２０−２９２６）。
【００１１】
またＮ−ブチルデオキシノジリマイシンは、糖脂質の生合成の阻害剤であることが最近明らかになった（Ｐｌａｔｔ    Ｆ．Ｍ．，    Ｎｅｉｓｅｓ    Ｇ．Ｒ．，Ｄｗｅｋ    Ｒ．Ａ．，    ａｎｄ    Ｂｕｔｔｅｒｓ    Ｔ．Ｄ．    Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．    Ｍａｒ．１９９４，２６９（１１），ｐ．８３６２−８３６５）。すなわちラットの脳の破砕物をグルコシルセラミド合成酵素の酵素源とした場合、０．４５ｍＭ及び４．５ｍＭのＮ−ブチルデオキシノジリマイシンは、それぞれ２１％及び５７％のグルコシルセラミド合成酵素阻害作用を示した。かかる阻害作用を利用してテイ−サックス病等の遺伝病治療への応用が報告されている（Ｐｌａｔｔ    Ｆ．Ｍ．，    Ｎｉｅｓｅｓ    Ｇ．Ｒ．，    Ｒｅｉｎｋｅｎｓｍｅｉｅｒ    Ｇ．，    Ｔｏｗｎｓｅｎｄ    Ｍ．Ｊ．，    Ｐｅｒｒｙ    Ｖ．Ｈ．，    Ｂｕｔｔｅｒｓ    Ｔ．Ｄ．    Ｓｃｉｅｎｃｅ，    Ａｐｒ．１９９７，２７６（１８）ｐ．４２８−４３１）。
【００１２】
さらにＮ−（ｎ−ブチル）−デオキシガラクトノジリマイシンはα−Ｄ−ガラクトシダーゼ阻害作用、デオキシフコノジリマイシン塩酸塩はα−Ｌ−フコシダーゼ阻害作用、デオキシガラクトノジリマイシン塩酸塩はα−Ｄ−ガラクトシダーゼ阻害作用、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン塩酸塩はグルコシダーゼ阻害作用、Ｎ−メチルデオキシノジリマイシンはグルコシダーゼ活性を阻害することによるＮ−結合グリコプロテインの切断阻害作用、ノジリマイシン亜硫酸付加物は数種のグルコシダーゼ阻害作用を有することが知られている。
【００１３】
しかしながら、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩が、ガラクトース転移酵素を阻害せず、ラクトシルセラミド合成酵素を特異的に阻害することは全く知られていなかった。
【００１４】
ノジリマイシン亜硫酸付加物は、ノジリマイシンの１位の炭素原子の水酸基（α，βのいずれでもよい）の酸素原子にＨＳＯ３−が結合したものである。ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体としては、Ｎ−アルキルノジリマイシン亜硫酸付加物が挙げられるが、このうちＮ−Ｃ１−Ｃ１２アルキルノジリマイシン亜硫酸付加物が好ましい。
【００１５】
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエタノールアミン、カルシウム、リチウム塩等が挙げられるが、それらには限定されない。
【００１６】
かかるＮ−ドデシルデオキシノジリマイシン及びノジリマイシン亜硫酸付加物は、常法にしたがって合成することができる（例えばＩｎｏｕｙｅ    Ｓ．，    Ｔｓｕｒｕｏｋａ    Ｔ．，    Ｉｔｏ    Ｔ．，    Ｎｉｉｄａ    Ｔ．    Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ    Ｍａｒ．１９６８，２４（５）ｐ．２１２５−２１４４参照）。また市販品を用いることもできる。またノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体は、例えばノジリマイシン亜硫酸付加物に、常法にしたがいアルキルハライド等の疎水基を付加または置換することにより得ることができる。
【００１７】
これらのラクトシルセラミド合成酵素阻害剤は、他のガラクトース転移酵素を阻害せず、ラクトシルセラミド合成酵素を特異的に阻害する。従って、動脈硬化症治療剤、癌転移阻害、抗炎症剤、遺伝病治療剤、白内障予防剤等の医薬、その他の試薬として有用である。
【００１８】
本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を医薬として使用する場合、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体又はこれらの塩の成人１人当たりの１日の投与量は、例えば１００〜１００００ｍｇ、特に５００〜３０００ｍｇであることが好ましい。
【００１９】
本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を配合する医薬は、外用及び内服のいずれの方法でも投与可能であるが、内服剤として用いることが好ましい。本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、または水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。製剤化にあたっては、一般的に用いられる、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、懸濁化剤、乳化剤、保湿剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、矯味剤等を添加し、常法にしたがって製造することができる。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
参考例１
ラクトシルセラミド合成酵素の製造法
（１）ラットの脳膜画分の調製方法：
全ての操作は０〜４℃で行った。２〜３週齢のウイスター系ラット（雄雌混合）を頸椎脱臼により屠殺した後、脳を摘出した。摘出した脳は使用まで−８０℃で保存した。
ラット脳膜画分の採取に当たり脳をはさみで細断し９倍容のホモジナイズ用バッファー（０．３２Ｍの蔗糖、０．２５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えホモジナイズした。ホモジネートを８００×ｇで遠心分離した上清を更に１０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈澱をサスペンジョン用バッファー（０．２５Ｍの蔗糖、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、プロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．４）に懸濁してラット脳膜画分とした。実験に使用するまで−１４５℃にて保存した。
【００２２】
（２）酵素の可溶化：
懸濁した脳膜画分に蛋白の最終濃度が４ｍｇ／ｍｌ、トライトンＸ−１００が１％になるようにトライトンＸ−１００を加え、０℃で２時間放置した後１００，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清を可溶化画分とした。
【００２３】
（３）ＷＧＡ（小麦胚芽レクチン）−アガロースによるアフィニティクロマトグラフィー：
５００ｍＭの塩化ナトリウム、１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロック（プロテアーゼインヒビター）を含む１０ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化された小麦胚芽レクチン−アガロースのカラム（１５０ｍｌ）に約１５０個のラット脳から調製した可溶化画分をアプライした後、カラム容量の約１０倍量の同バッファーでカラムを洗浄し、２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃを含む同バッファーで酵素を溶出した。
【００２４】
（４）ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースによるアフィニティクロマトグラフィー：
ＷＧＡ−アガロースから特異的に溶出された酵素サンプルにＭｎＣｌ２を１０ｍＭになるように添加した後、５００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化したＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースのカラム（４０ｍｌ）にアプライした。非吸着画分を洗浄して除いた後１ｍＭのＵＤＰを含む同バッファーで酵素を溶出した。
【００２５】
（５）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー：
（４）のサンプルのバッファーをリン酸バッファーに交換するためにＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースのカラムから溶出されたサンプルを１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８で平衡化したＰＤ−１０カラムにアプライし同バッファーで溶出し、蛋白画分を得た。これを同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトのカラム（０．５ｍｌ）にアプライし、酵素活性を有する非吸着画分を次のステップに用いた。
【００２６】
（６）ミニＱによるイオン交換クロマトグラフィー：
（５）のサンプルを１％のトライトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のアジ化ナトリウム、１００μＭのペファブロックを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８で平衡化したミニＱカラム（ファルマシア社製）にアプライし０から２Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法で酵素を溶出し、酵素活性を有する画分を回収した。
【００２７】
得られたラクトシルセラミド合成酵素は、下記の酵素学的性質を有していた。（１）作用
ウリジンジホスフェート−ガラクトースからガラクトースをグルコシルセラミドに転移させ、ラクトシルセラミドを合成する。
（２）基質特異性
グルコシルセラミドに強く作用し、グロボシドに弱く作用し、セラミド、ラクトシルセラミド、ＧＡ２及びＧＭ２にほとんど作用しない。
（３）金属要求性
マンガン、マグネシウム、カルシウムを要求する。
（４）至適ｐＨ
ｐＨ６．４〜７．４付近
（５）分子量
５４，０００〜６８，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
【００２８】
試験例１
以下に示すＴｒｉｎｃｈｅｒａらの方法（Ｔｒｉｎｃｈｅｒａ    Ｍ．ｅｔ    ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ    ３０，２７１９−２７２４（１９９１））を改変した方法により、ノジリマイシン亜硫酸付加物、そのアセチル化誘導体、及びＮ−ドデシルデオキシノジリマイシンのラクトシルセラミド合成酵素阻害効果を測定した。すなわち５本の試験管に、ノジリマイシン亜硫酸付加物を最終濃度がそれぞれ０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、及び５ｍＭとなる量、有機溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）に溶解したグルコシルセラミド２０μｇ、並びにメタノールに溶解したＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度が０．４％となる量をとり、よく混合した。次いで窒素気流下で有機溶媒を除去し、脂質膜を作成した後、これを真空減圧下で１時間以上放置した。これにＭｎＣｌ２  を１．０μｍｏｌ、ＣＤＰ−コリンを７５０ｎｍｏｌ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ    Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ、ｐＨ７．２）を２０．０μｍｏｌ加えて撹拌、超音波処理した。さらに前記で得られた精製ラット脳ラクトシルセラミド合成酵素（約０．４ｐｍｏｌ／分のラクトシルセラミド合成活性）、ＤＯＰＣを０．１５ｍｇ、及びＵＤＰ−［Ｕ−１４Ｃ］ガラクトースを２．１ｎｍｏｌ（２３ｋＢｑ）を加えて最終容量を１００μｌとした。ＵＤＰ−［Ｕ−１４Ｃ］ガラクトースを添加してから３０分間、３７℃でインキュベーションした。その後メタノールを１ｍｌ添加して反応を停止した。これに蒸留水を０．３ｍｌ及びクロロホルムを０．５ｍｌ添加し、Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒ法により反応溶液中の総脂質を抽出した。パッカード社製トップカウントを用いて放射活性を測定することにより、かかる総脂質画分中の放射標識されたラクトシルセラミド量を測定し、ラクトシルセラミド合成酵素活性を算出した。結果を図１に示す。図１は、ノジリマイシン亜硫酸付加物濃度及びそのアセチル化誘導体が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、及び５ｍＭの場合の、また、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシンの濃度が５ｍＭの場合のラクトシルセラミド合成酵素の活性を示したものである。
【００２９】
図１より、ノジリマイシン亜硫酸付加物及びその疎水性誘導体、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシンの添加により、ラクトシルセラミド合成酵素活性が阻害されることが確認された。
【００３０】
試験例２
本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤の阻害作用が、ラクトシルセラミド合成酵素に特異的であることの試験を、Ｈｉｌｌらの方法に準じて行った（Ｔｒａｙｅｒ    Ｉ．Ｐ．    ａｎｄ    Ｈｉｌｌ    Ｒ．Ｌ．    Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．    Ｎｏｖ．１９７１，２４６（２１），ｐ．６６６６−６６７５）。すなわち２本の試験管に、０ｍＭまたは５ｍＭノジリマイシン亜硫酸付加物、０．２Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）、アクセプターとして１００μＭグルコース、０．５ｍｇ／ｍｌα−ラクトアルブミン、０．３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２０μＭ    ＭｎＣｌ２  、２３ｋＢｑ    １４Ｃ−ＵＰＤ−ガラクトース（１１．３ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）、及び２０ｍｕｎｉｔウシミルク由来ガラクトース転移酵素（１ｕｎｉｔは１μｍｏｌ／分に相当）を添加し、最終容量を１００μｌとして３７℃で１０分間反応させた。未反応の１４Ｃ−ＵＰＤ−ガラクトースをＤｏｗｅｘ１−Ｘ８の小カラムを用いて除去し、生成物の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。結果を図２に示す。図２は、ノジリマイシン亜硫酸付加物濃度が０ｍＭ及び５ｍＭの場合のガラクトース転移酵素の活性を示したものである。
【００３１】
図２より、ノジリマイシン亜硫酸付加物は５ｍＭの濃度でウシミルク由来のガラクトース転移酵素の活性を全く阻害せず、本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤はラクトシルセラミド合成酵素を特異的に阻害するものであることが確認された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のラクトシルセラミド合成酵素阻害剤は、基質類似性を有する他の酵素の活性を阻害することなく、ラクトシルセラミド合成酵素の活性を特異的に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ノジリマイシン亜硫酸付加物及びそのアセチル化誘導体濃度が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、及び５ｍＭの場合の、またＮ−ドデシルデオキシノジリマイシンの濃度が５ｍＭの場合のラクトシルセラミド合成酵素の活性を示したものである。
【図２】ノジリマイシン亜硫酸付加物濃度が０ｍＭ及び５ｍＭの場合のガラクトース転移酵素の活性を示したものである。
【図１】
0003545601.tif 000002
【図２】
0003545601.tif 000003