(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなることを特徴とする造血幹細胞を含む細胞集団の培養に用いる血液細胞培養支持体。
【請求項２】
少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなる培養支持体を用いて細胞培養用液体培地中で造血幹細胞を含む細胞集団を培養し、次いで該液体培地から造血幹細胞または造血幹細胞から分化した特定の血液細胞を得ることを特徴とする血液細胞製造方法。
【請求項３】
少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなる培養支持体と細胞培養用液体培地と、造血幹細胞からなる血液細胞製造用原料組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨髄、末梢血あるいは臍帯血などの、少なくとも造血幹細胞及び／または造血前駆細胞（以下、単に「造血幹細胞」と略す）を含む細胞集団を培養し所望の血液細胞（造血幹細胞から、分化した各種血球まで全てを含む。以下同じ）を得る際に有用な血液細胞培養支持体、血液細胞の製造方法及び血液細胞製造用原料組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、骨髄移植療法が広く施行されている。骨髄移植療法とは、移植骨髄による致死的造血障害の回復法であるため、患者にとって致死的な大量放射線及び／または大量化学療法（以下、単に「大量化学療法」と略す）の施行が可能となり、白血病や固形癌の治療につながる。また、近年、骨髄と同様に末梢血中にも、これらの治療に必要な造血幹細胞が含まれていることが明らかになった。通常、これらの細胞の末梢血中での含有率はかなり低値であり、採取して骨髄移植の代わりに用いることは困難であるが、抗癌剤及び／またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等のサイトカインを投与することにより、その含有率が増大することが明らかにされ、骨髄採取と比べると、全身麻酔が不要で安全なことから、さかんに臨床応用が行われている。更に近年、臍帯血中にも末梢血よりもはるかに高濃度で造血幹細胞が含有されていることが明らかになり、臨床応用が始まった。以下、本明細書では末梢血、臍帯血を用いる移植も、骨髄移植という語で代表させることにする。
【０００３】
ここで、移植法は細胞を誰から得るかによって同種移植と自家移植に分けられる。前者は健康な他人（血縁者または非血縁者）が細胞提供者（ドナー）となるもので、後者は患者本人の細胞を用いるものである。いずれの移植法でも、移植に必要な量の細胞を得るにはドナーへの侵襲が大きい。即ち、骨髄を利用する場合、全身麻酔が必要であり、末梢血を利用する場合には全身麻酔は必要無いが、抗癌剤及び／またはＧ−ＣＳＦ等のサイトカインを数日間投与し、数時間かけてアフェレーシスにより採取しなければならない。一方、臍帯血の場合、ドナー侵襲は全く無いと言えるが、得られる細胞量が限られているため、移植可能な患者は小児に限られてしまう。これらの問題を解決するために、造血幹細胞を体外で培養により増幅する試みが近年、非常に活発に行われている（特表平４−５０６１５３、特表平６−５０８９８７、特表平７−５０４５７０、特表平７−５０３１２７など多数）。一方、造血幹細胞は全ての血液細胞の源の細胞であるので、造血幹細胞を培養して各種血液細胞を製造する試みも盛んに行われている（特開平７−１３５９６９、特表平５−５０２３８５など多数）。ここで、前述の培養が造血幹細胞のまま増幅させることを目的としているのに対し、この培養では造血幹細胞のままではなく、分化させて各種血球を製造するのが目的である。しかしながら、いずれの培養でも所望とする血液細胞を簡便かつ効率的に得られているとは言えなかった。また、特開平７−１９４３７３には骨髄細胞をリン酸カルシウム系化合物を支持体として培養すると所望の骨系細胞が得られることが開示されている。ところで、骨髄中の未分化細胞は造血系の未分化細胞（＝造血幹細胞。Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）と骨、軟骨など結合組織系の未分化細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）に分けられる。同公報では結合組織系未分化細胞への検討はなされているが、造血幹細胞への検討はなされていない。また、特願平７−９５８７４ではリン酸カルシウム系化合物であるハイドロキシアパタイトが造血幹細胞の濃縮に有用であることが開示されているが、培養の記述は一切ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は造血幹細胞または造血幹細胞から分化した特定の血液細胞が簡便かつ効率的に得られる培養支持体、該培養支持体を利用した血液細胞の製造方法及び血液細胞製造用原料組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、表面がハイドロキシアパタイトからなることを特徴とする造血幹細胞を含む細胞集団の培養に用いる血液細胞培養支持体に関する。また、少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなる培養支持体を用いて細胞培養用液体培地中で造血幹細胞を含む細胞集団を培養し、次いで該液体培地から造血幹細胞または造血幹細胞から分化した特定の血液細胞を得ることを特徴とする血液細胞製造方法に関する。
また、少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなる培養支持体と細胞培養用液体培地と、造血幹細胞からなる血液細胞製造用原料組成物に関する。
本発明に用いるハイドロキシアパタイトの化学組成に関してであるが、アパタイトはギリシャ語で「人を欺く」という意味で、しばしば各種元素でＣａ、ＰＯ４ 、ＯＨの一部が置換される。実際、脊髄動物の骨や歯のアパタイトはＣａが主にＦｅやＭｇや空孔（ｖａｃａｎｃｙ）に、ＰＯ４ が主にＣＯ３ に、ＯＨが主にＣＯ３ やＦに置換したものであるが、構造的・物性的にあまり差が無いことからこれらを総称してハイドロキシアパタイトと呼んでいる（空孔に置換したものをカルシウム欠損アパタイトと呼ぶこともある）。
本発明による少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなることを特徴とする造血幹細胞を含む細胞集団の培養に用いる血液細胞培養支持体は、前記ハイドロキシアパタイトを顆粒状、ペレット状、繊維状あるいは多孔質体状に成型するのが望ましい。
更に、繊維学会誌第４９巻１１号２９〜３０頁の方法等によりレーヨン等の不織布にコーティングしたものも用いることができる。
【０００６】
本発明による血液細胞製造方法で用いる、原料となる造血幹細胞を含む細胞集団としては、骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離器により分離したもの、フィルターにより不要細胞を除去したもの、免疫磁気ビーズ等のモノクローナル抗体固定細胞分離器により不要細胞を除去及び／またはＣＤ３４陽性細胞に精製したもの等があげられる。
本発明で言う血液細胞とは造血幹細胞から、分化した血球まで、全ての段階の細胞を意味するが、具体的に挙げると、造血幹細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、赤芽球、巨核球、前Ｂリンパ球、前Ｔリンパ球、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、血小板、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、肝クッパー細胞などが含まれる。  本発明の血液細胞製造方法は、原料となる造血幹細胞を含む細胞集団を、少なくとも表面がハイドロキシアパタイトからなる支持体に常法で播種し、細胞培養用液体培地中で培養するものであるが、用いる液体培地は製造を所望する血液細胞種によって異なり、通常動物細胞の培養で用いられるイスコフ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地などに、公知文献等により、製造を所望する血液細胞の製造に有効であることが知られているサイトカイン等を添加する。例えば、造血幹細胞を得る、即ち造血幹細胞のまま増幅したい場合の例を挙げると、特表平６−５０８９８７で提案されているＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＭＧＦ（ＳＣＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ３融合タンパクから選ばれた１種以上のサイトカインを、または、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９２，Ｐ２８５９−２８６３で提案されているＳＣＦ、ＩＬ６、可溶性ＩＬ６レセプターをベースにしたサイトカインの組合せ等を用い、また、血小板を製造したい場合には特表平５−５０２３８５で提案されているＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＥＰＯの組合せ等を用い、また、ナチュラルキラー細胞を製造したい場合には特開平７−１３５９６９で提案されているＩＬ３、ＩＬ２、ＳＣＦの組合せ等を用いるといったように適宜選択する。本発明によるハイドロキシアパタイトの細胞培養支持体で血液細胞が好適に培養できる理由は明らかではないが、本発明者らは、実際の体内での造血作用が、リン酸カルシウム製チャンバーとも言える骨の中で起こっていることから、体外培養においてもこの環境を模倣することができたためではないかと推察している。本発明の血液製造方法における培養条件は通常、血液細胞の培養が行われている条件、即ち温度約３７度、ＣＯ２ インキュベータ内が好ましい。
本発明により得られた血液細胞は、このまま、あるいは遠心分離、モノクローナル抗体固定細胞分離器による不要細胞の除去または必要細胞の精製、遺伝子導入等、必要な操作を行った後患者に輸注されるか、輸血用として保存される。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
▲１▼血液細胞培養支持体の作製
リン酸水溶液と水酸化カルシウム懸濁液を用いる公知の湿式法で合成したハイドロキシアパタイトスラリーを吸引濾過後、乾燥、粉砕してハイドロキシアパタイト顆粒を作成した。本顆粒を１０００度で４時間、電気炉にて焼成後、ステンレス製ふるいにて分級し、約３０μｍに揃えた後、オートクレーブ滅菌を行い、血液細胞培養支持体とした。
▲２▼培養出発細胞の調製
健常人ドナーから採取した骨髄を公知のＦｉｃｏｌｌ比重遠心分離法により単核球分離を行い、造血幹細胞含有液を調製した。この造血幹細胞培養液を、アプライドイミュンサイエンス社製「マイクロセレクターステムセルキット」を用いて、同社の使用説明書にしたがって造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を分離し、培養出発細胞とした。この培養出発細胞の細胞数、ＣＤ３４陽性細胞比率（フローサイトメーターによる）、それらより計算したＣＤ３４陽性細胞数は表１のとおりである。
0003594208.tif 000002
【０００８】
▲３▼造血幹細胞培養
１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地５ｍｌにＩＬ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）を添加して細胞培養用培地とした。この培地に▲１▼で作製した血液細胞培養支持体１０ｍｇと▲２▼で調製した培養出発細胞１．２１×１０６  を添加し２５ｍｌの培養用フラスコに入れ、温度３７度５％ＣＯ２  のインキュベーターで培養を開始した。培養１０日後の細胞を収集し、培養後細胞の細胞数、ＣＤ３４陽性細胞比率（フローサイトメーターによる）、それらにより計算したＣＤ３４陽性細胞数、また表１から算出した細胞増幅倍率は表２のようであった。これにより、総細胞数だけでなく、所望とする造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）も高倍率で増幅されていることがわかる。
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【０００９】
【発明の効果】
以上示したように、本発明によれば造血幹細胞から所望とする血液細胞が簡便かつ効率的に得られる培養支持体、それを利用した血液細胞製造方法及び血液細胞製造用原料組成物を提供することができる。