(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の鏡像異性体としてのまたは鏡像異性体的に富んだ形態での式（II a）、（II b）、（II c）、（II d）または（II e）のいずれかの化合物を得る方法であって、
0003593132.tif 000027
ラセミ形態の式（II a）、（II b）、（II c）、（II d）または（II e）の化合物の立体選択的生物還元からなり、
ａ）式（II a）の化合物については、生物還元を、
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Rhodobacter capsulatusまたは
R.capsulatusから単離したDMSOレダクターゼを
使用して実施し、
ｂ）式（II b）の化合物については、生物還元を、
Escherichia coliを
使用して実施し、
ｃ）式（II c）の化合物については、生物還元を、
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Rhodobacter capsulatusまたは
R.capsulatusから単離したDMSOレダクターゼを
使用して実施し、
ｄ）式（II d）または（II e）の化合物については、生物還元を、
Proteus mirabilisまたは
Escherichia coliを
使用して実施することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
式（II a）、（II b）、（II c）、（II d）または（II e）の化合物を単一の鏡像異性体として得る請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、単一の鏡像異性体としてまたは鏡像異性体的に富んだ形態で、以下に定義するような化合物を得る方法に関するものである。
発明の背景
本発明の方法によって製造された化合物のラセミ形態は、既知化合物である。化合物の若干は、また単一の鏡像異性体の形態で知られている。これらの化合物は、活性なH+K+ATPase阻害剤でありそして医薬的に許容し得る塩を包含するこれらの化合物は、有効な酸分泌阻害剤でありそして抗潰瘍剤として使用されることが知られている。既知化合物オメプラゾール（以下の式（II a）の化合物）、ランソプラゾール（以下の式（II c）の化合物）およびパントプラゾール（以下の式（II b）の化合物）を包含するこれらの化合物は、例えば欧州特許明細書EP 5129および124495、EP 174726およびEP 166287から知られている。
スルホキシドであるこれらの化合物は、硫黄原子において不斉中心を有している、すなわち、２種の光学異性体（鏡像異性体）として存在する。個人差の少ない治療プロフィルを与える改善された薬物動物学的および代謝的性質を有する化合物を得ることが望まれている。
分析的規模におけるオメプラゾールの鏡像異性体の分離は、例えばJ.Chromatography 532（1990）,305−319に記載されている。またオメプラゾールおよびパントプラゾールを包含する本発明が関係する化合物の鏡像異性体の分離は、ドイツ特許明細書DE 4035455に記載されている。
最近、生物触媒を使用した光学的に活性な化合物の合成に関する多数の文献が発行されている。これらの文献の多くは、単一の鏡像異性体の形態の薬剤を製造する方法を見出すことを目的としている。合成における化合物の官能性の一般的利用のためにそしてまた生物触媒が容易に入手できるために、もっとも注目される反応は、エステル、酸およびアルコールの製造に関係する反応である。
一つには、スルホキシド基を含有する薬剤が少数であるためと、一つには硫黄中心と反応する酵素を商業的に入手することができないという事実のために、光学的に活性なスルホキシドの合成に対する研究は、比較的まれである。スルフィドへのメチルフェニルスルホキシドのエナンチオ選択的還元は、Abo M.,Tachibana M.,Okubo A.およびYamazaki S.によって、Biosci.Biotech.Biochem.58,596−597（1994）において論じられている。
発明の説明
本発明によれば、ラセミ形態の式（II）の化合物の立体選択的生物還元（bioreduction）からなる、単一の鏡像異性体としてのまたは鏡像異性体的に富んだ形態での式（II）
0003593132.tif 000002
〔式中、
Het1は、
0003593132.tif 000003
であり、
Het2は、
0003593132.tif 000004
であり、
Ｘは、
0003593132.tif 000005
であり、
Het2のベンズイミダゾール部分におけるＮは、場合によってR6〜R9の何れかの１個によって置換されている炭素原子の１個を未置換の窒素原子に換え得ることができるということを意味し、
R1、R2およびR3は、同一または異なりそして水素、アルキル、場合によっては弗素によって置換されていてもよいアルコキシ、アルキルチオ、アルコキシアルコキシ、ジアルキルアミノ、ピペリジノ、モルホリノ、ハロゲン、フェニルアルキル、フェニルアルコキシから選択されたものであり、
R4およびR4′は、同一または異なりそして水素、アルキル、アルアルキルから選択されたものであり、
R5は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシであり、
R6〜R9は、同一または異なりそして水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、オキサゾリル、トリフルオロアルキルから選択されたものであるかまたは隣接基R6〜R9は、これらが結合している炭素原子と一緒になって場合によっては置換されていてもよい環構造を完成することができ、
R10は、水素またはアルコキシカルボニルオキシメチルであり、
R11は、水素であるかまたはR3と一緒になってアルキレン鎖を形成し、
R12およびR13は、同一または異なりそして水素、ハロゲンまたはアルキルから選択されたものである〕の化合物を得る方法が提供される。
式（II）の化合物は、活性なH+K+APTase阻害剤である。
式（II）の化合物は、Het1−Ｘ−およびHet2部分の間のスルホキシド基を形成する硫黄原子である立体発生（不斉）中心を有している。式（II）の化合物は、一般に、はじめに、ラセミ混合物である。
本発明による方法においては、ラセミ形態における式（II）の出発化合物を、式
Het1−Ｘ−Ｓ−Het2                        （Ｉ）
（式中、Het1、ＸおよびHet2は上述した通りである）の相当するスルフィドに立体選択的に生物還元する。すなわち、生成されたスルフィドから分離することのできる単一の鏡像異性体としてのまたは鏡像異性体的に富んだ形態での式（II）の化合物が得られる。
上記の定義において、アルキル基またはアルキル部分は、分枝鎖状または直鎖状であるかまたは環状アルキル基、例えばシクロアルキルアルキルからなる。
好ましくは、
Het1は、
0003593132.tif 000006
であり、
Het2は、
0003593132.tif 000007
であり、
Ｘは、
0003593132.tif 000008
であり、そして
R1、R2、R3、R6〜R9、R10およびR11は、上述した通りである。
もっとも好ましくは、本発明の方法が関係する化合物は、次の式（II a）〜（II e）の化合物である。
0003593132.tif 000009
0003593132.tif 000010
R10がアルコキシカルボニルオキシメチルである式（II）の化合物の例は、
0003593132.tif 000011
である。
化合物（II a）〜（II f）から形成されたスルフィドは、それぞれ次式を有する化合物である。
0003593132.tif 000012
0003593132.tif 000013
本発明による立体選択的生物還元は、微生物またはそれから得ることのできる酵素系を使用して実施することができる。本発明による方法に使用される微生物は、好ましくはDMSOレダクターゼを含有する微生物、例えば腸内細菌科の菌、例えばE.ColiおよびProteus種およびRhodobacter属の紅色非−硫黄細菌である。
また、生物還元を行うために、DMSOレダクターゼを使用することもできる。
嫌気性条件下でDMSOレダクターゼを使用する場合は、例えば補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）またはフラビンモノヌクレオチド（FMN）は、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）の存在下において光−還元される。FADまたはFMNの再酸化は、DMSOレダクターゼによるスルホキシドの還元に連結している。それ故に、人工生物触媒サイクルは、細胞の自然嫌気性電子伝達機構の不存在で生じしめられる。
光接触されたDMSOレダクターゼ反応。
0003593132.tif 000014
式（II）の化合物は、一般に、酸不安定でありそしてその結果、酸性条件の使用は避けられる。一般に、本発明による方法は、7.6〜８、好ましくは約7.6のpHおよび25〜35℃、好ましくは約28℃の温度で実施することができる。
本発明の一つの実施化によれば、方法は、式（II）の化合物を
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Rhodobacter capsulatus
の微生物と接触させることからなる。
使用される微生物は、好ましくは
Proteus vulgaris NCIMB 67
Proteus mirabilis NCIMB 8268
Escherichia coli ATCC 33694
Rhodobacter capsulatus DSM 938
である。
これらの微生物は、以下の寄託機関から入手することができる。
NCIMB
National Collection Of Industrial And Marine Bacteria
23 Saint Machar Drive
Aberdeen AB2 1RY
United Kingdom
ATCC
American Type Culture Collection
12301 Parklawn Drive
Rockville Maryland 20852
United States of America
DSM
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Mascheroder Weg 1b
Ｄ−38124
Braunschweig
Germany
本発明を、さらに実施例に関して説明する。
実施例  １
E.Coli ATCC 33694,Proteus vulgaris NCIMB 67,Proteus mirabilis NCIMB 8268の全細胞およびRhodobacter capsulatus DSM 938からのDMSOレダクターゼの製剤（preparation）を使用して、式（II a）の化合物の還元的分割を調査した。E.coliおよびProteusの２種の菌株は、本質的に嫌気条件下で培地800mlを含有する1lのねじ蓋をしたフラスコ中で、回転振盪機上で35℃で48時間生長させた。使用した基培地は、次の組成（g/l）を有す:NaH2PO41.56;K2HPO41.9;（NH4）2SO41.8;MgSO4・7H2O0.2;FeCl30.005;Na2MoO4・2H2O0.001;カサミノ酸1.5。オートクレーブ処理した後、次の成分（g/l）を補給した：グリセロール（Escherichia Coliに対して）またはグルコース（Proteus mirabilisに対して）5;チアミン・HCl0.03;ニコチン酸0.007。ジメチルスルホキシド（70mM）を、無気呼吸に対する末端電子受容体としておよびジメチルスルホキシド（DMSO）レダクターゼに対するインデューサーとして役立たせるために、培地に加えた。微量の元素溶液（1ml/l）も、また培地に加えた。微量の元素の原溶液は、次の成分（g/l）を含有する:CuSO4・5H2O0.02;MnSO4・4H2O0.1;ZnSO4・7H2O0.1;CaCO31.8。E.Coliはまた、電子受容体としてフマール酸40mMを使用する以外は、同じ条件下で同じ培地上で嫌気的に生長させた。
細胞を遠心分離によって採取しそして10mMの燐酸塩緩衝液（pH7.6）中で２回洗浄した。それから、細胞を100mMの燐酸塩緩衝液（pH7.6）に再懸濁して、３〜6g/lの乾燥細胞重量濃度を得た。
それから、それぞれの細胞懸濁液50mlを、自動滴定容器に入れそして0.1〜0.3g/lの基質およびグルコース（2.5％）の存在下で35℃で通気なしに撹拌した。pHは、0.5mM NaOHによる自動滴定によって7.6に維持した。
以下の実施例２に記載したようにして、Rhodobacter capsulatus DSM 938を生長させそしてDMSOリダクターゼ酵素を製造した。それから、該酵素製剤を使用した式（II a）の化合物の還元的分割を、式（II a）の化合物を2.9mMの基質濃度で存在させる以外は実施例２に記載したように実施した。
生成物の検出
式（II a）の化合物の生物還元後に、Spherisorb S5−ODS逆相カラム上で逆相HPLC処理した。この処理において、アセトニトリルおよび25mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）の50:50混合物を使用して、0.8ml/分の流速で溶離した。このような条件下において、式（II a）および（I a）の化合物は、それぞれ5.2および9.8分の保持時間でよく分割された。両方の化合物は、300nmの波長で検出した。
残留する式（II a）の鏡像異性体組成を、次の方法により調査した。生物体量の除去後、水性培地をアンモニウム飽和ジクロロメタンの２容量で抽出した。合した有機抽出液を無水の硫酸ナトリウム上で乾燥しそして溶剤を減圧下で蒸発して淡褐色の固体を得た。それから、スルホキシドの鏡像異性体組成を、次の条件下でChiralpak ADカラム上のHPLC処理によって測定した：
カラム    Chiralpak AD 250mm×4.6mm内径、50mmガードカラム
溶離剤    ヘキサン：エタノール：メタノール
（40:55:5V/V％）
流速      1.0ml/分
注入容量  20μｌ
波長      300nm
保持時間
式（I a）の化合物  5.1分
式（II a）の化合物：
（＋）鏡像異性体  8.5分
（−）鏡像異性体  13.4分
表１における結果が、E.Coli ATCC 33694に対して得られた。
0003593132.tif 000015
によって、変換の程度および未反応化合物の鏡像体余剰から測定することのできるエナンチオ特異性定数である。
上記式において、
Ｃ＝変換
ees＝未反応化合物の鏡像体余剰。
また、上記表において、eeは、式（II a）の化合物の（＋）鏡像異性体に対する鏡像体余剰値である。鏡像体余剰値は、得られたそれぞれの鏡像異性体の相対的量の指標である。この値は、２種の鏡像異性体に対する相対的百分率の差である。すなわち、例えば、残留するスルホキシドの（−）鏡像異性体の百分率が97.5％でありそして（＋）鏡像異性体に対する百分率が2.5％である場合は、（−）鏡像異性体に対する鏡像体余剰は95％である。
0.3g/lの出発濃度においては、P.vulgaris NCIMB 67およびP.mirabilis NCIMB 8268は、それぞれ32％および５％の収率において、48時間後に＞99％の鏡像体余剰の式（II a）の化合物の（＋）鏡像異性体を与えた（表２）。
0003593132.tif 000016
48時間後の式（II a）の化合物の最終濃度は、P.vulgaris NCIMB 67に対しては48mg/lでありそしてP.mirabilis NCIMB 8268に対しては8mg/lであった。
0.1g/lの低出発濃度においては、微生物P.vulgaris NCIMB 67およびP.mirabilis NCIMB 8268は、再び、それぞれ44％および40％の収率において、24時間後に＞99％鏡像体余剰の式（II a）の化合物の（＋）鏡像異性体を与えた（表3A）。
0003593132.tif 000017
24時間後の式（II a）の化合物の最終濃度は、P.vulgaris NCIMB 67に対しては22mg/lでありそしてP.mirabilis NCIMB 8268に対しては20mg/lであった。
式（II a）の化合物は、表3Bに示されるように、Rhodobacter capsu−latusから単離されたDMSOレダクターゼに対する基質としての役目をする。15分後および１時間後の全スルホキシドの変換は、それぞれ80％および＞90％であった。
0003593132.tif 000018
実施例  ２
式（II b）および（II c）の化合物の還元的分割を、E.Coli ATCC 33694、P.vulgaris NCIMB 67およびR.capsulatus DSM 938からのDMSOレダクターゼの製剤を使用して調査した。反応条件は、式（II b）および（II c）の化合物を0.1g/lの基質濃度で存在させる以外は、E.ColiおよびP.vulgarisに対して実施例１において記載した通りである。DMSOレダクターゼの製剤を使用する場合は、反応条件は、次の通りである。
R.capsulatus DSM 938の細胞を、二列の100Wタングステン電球の間で、50mMのDMSOを補給したRCV培地を含有する25lのカーボイ中で光線栄養的に生長させた。細胞は、クロス−フロー（cross−flow）濾過次いでベックマンGSAローター中における10,000rpmでの遠心分離によって採取した。ペレットを、50mMのトリス/HCl（pH8.0）で１回洗浄しそして50mMのトリス/HCl（pH8.0）＋0.5Mのスクロースおよび1.5mMのEDTA（STE緩衝液）中で約2g/mlに再懸濁した。リゾチームを0.6mg/mlで加えそして懸濁液（約1l）を30℃で15分撹拌した。上述したように遠心分離した後、上澄液（原形質フラクション）を傾瀉分離しそして硫酸アンモニウムで50％飽和にした。遠心分離後、上澄液を70％飽和にしそして再遠心分離した。50〜70％ペレットを、50mMのトリス/HCl（pH8.0）の最小容量に再懸濁しそして同じ緩衝液３×100容量に対して透析し、Amicon PM 10膜を通した限外濾過によって約5mlに濃縮した。濃縮した試料を150mM NaClに入れ、Sephacryl S200ゲル濾過カラム（カラム容量＝510ml）に充填しそして50mMトリス/HCl（pH8.0）＋150mM NaClの700mlで溶離した。ピーク酵素活性度は、約320mlにおいて溶離し（データは示されていない）そしてピークフラクションをプールしそして上述したように濃縮した。
この実施例において使用した“RCV"培地は、次の組成（脱イオン化水1l当りのｇまたはmMとして）を有す。
プロピオネート                              30mM
（NH4）2SO4                                   1g
KPO4緩衝液                                  10mM
MgSO4・7H2O                                120mg
CaCl2・2H2O                                 75mg
EDTAナトリウム                              20mg
FeSO4・7H2O                                 24mg
チアミン塩酸塩                               1mg
微量の元素溶液                               1ml
微量元素溶液（250ml当り）
H3BO3                                       0.7g
MnSO4・H2O                                 398mg
Na2MoO4・2H2O                              188mg
ZnSO4・7H2O                                 60mg
Cu（NO3）２・3H2O                           10mg
Rhodobacter capsulatus DSM 938からの精製されたDMSOレダクターゼを、スルホキシドの還元に対する光−接触試験に使用した。5mlの気密の注射器に、脱ガスした試験緩衝液、50mMトリス/HCl、10mM EDTA（pH8.0）約3mlを充填した。フラビンモノヌクレオチド（FMN）およびスルホキシドを注射器に加えて、それぞれ250μＭおよび0.3mMの最終濃度を与えた（5mlの最終容量を基にして）。それから、FMNをタングステンランプによる照明によって還元した。それから、DMSOレダクターゼ試料（２〜10mg:2〜10μＭ）を溶液に加えて容量を脱ガスした緩衝液で5mlまでにする。それから、注射器を前述したように照明した。1mlの試料をすぐに（ｔ＝ｏ）除去しそしてその後望ましい時間的経過にわたって試料採取を反復した。
生成物の検出
式（II b）および（II c）の化合物の生物還元後に、保持時間が以下の通りである以外は実施例１において記載したように、逆相HPLC処理を行った。
0003593132.tif 000019
キラルHPLC工程において、溶剤組成、流速および保持時間が以下の通りである以外は実施例１の方法によって、残留する式（II b）および（II c）の化合物の鏡像異性体組成を調査した。
0003593132.tif 000020
最初に溶離した鏡像異性体は、鏡像異性体Ａと称しそして第二の鏡像異性体は、鏡像異性体Ｂと称す。
次の結果が得られた。
0003593132.tif 000021
変換値は、式（II b）の化合物の式（I b）の化合物への変換率である。
0003593132.tif 000022
変換値は、式（II c）の化合物の式（I c）の化合物への変換率である。
実施例３
式（II d）および（II e）の化合物の還元的分割を調査した。
E.Coli ATCC 33694およびProteus mirabilis NCIMB 8268を、式（II d）および（II e）の化合物の還元的分割に対して選別した。末端電子受容体としてフマール酸をそして炭素源としてグリセロール（E.coli）またはグルコース（Proteus mirabilis）を使用して、実施例１によって両微生物を嫌気的に生長させた。35℃で48時間の生長後に、細胞を8k rpmおよび４℃で遠心分離することにより採取しそして10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）に再懸濁しそして上述したように遠心分離することにより洗浄した。最後に、細胞を、100mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）に再懸濁した。乾燥細胞重量は、式（II d）の化合物に対しては8g/l（E.Coli）および4.5g/l（Proteus mirabilis）でありそして式（II e）の化合物に対しては4.3g/l（E.Coli）および3.9g/l（Proteus mirabilis）であった。式（II d）および（II e）の化合物の還元的分割は、細胞懸濁液40ml、基質100ppmおよびエネルギー源としての1w/v％のグルコースを含有する自動滴定器中で調査した。
生成物の検出
式（II d）および（II e）の化合物の生物還元後、保持時間が以下の通りである以外は実施例１に記載したようにして逆相HPLC処理を行った。
0003593132.tif 000023
キラルHPLC工程において、溶剤組成、流速および保持時間が以下の通りである以外は実施例１の方法によって、残留する式（II d）および（II e）の化合物の鏡像異性体組成を調査した。
0003593132.tif 000024
最初に溶離された鏡像異性体は、鏡像異性体Ａと称されそして第二の鏡像異性体は、鏡像異性体Ｂと称される。
E.Coli ATCC 33694およびP.mirabilis NCIMB 8268による式（II d）の化合物の還元の結果は、次の通りである。
0003593132.tif 000025
変換値は、式（II d）の化合物の式（I d）の化合物への変換率である。
E.ColiおよびP.mirabilisによる式（II e）の化合物の還元は、高い鏡像体余剰で鏡像異性体Ｂを与える。
0003593132.tif 000026
変換値は、式（II e）の化合物の式（I e）の化合物への変換率である。
これらの変換数字は、反応の終りにおけるスルホキシドの水性溶解濃度から測定された。エナンチオ特異性定数の大きさは、E.Coli ATCC 33694およびProteus mirabilis NCIMB 8268による式（II a）の化合物の還元的分割に対して得られた定数と類似している。