(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）オリゴマーの塩基単位に相補的な塩基単位を含むオリゴ−又はポリヌクレオチド上の隣接した位置に、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを可逆的に結合する工程であって、オリゴヌクレオチドのうち１つは、他のオリゴマーのヌクレオチドと近接した3'または5'末端ブロモアセチルアミノを有する第１の反応基を有するヌクレオチドを含み、該他のオリゴマーが、該第１の反応基と共有結合を自発的に形成し得る、3'または5'末端ホスホロチオエートを有する第２の反応基を含む、工程と、
ｂ）追加の試薬または酵素の非存在下において、ポリヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドの結合においてお互いに近接する第１及び第２の反応基を介して、チオホスホリルアセチルアミノ結合を自発的に形成して、オリゴヌクレオチドを付可逆的に共有結合する工程と、
ｃ）該オリゴヌクレオチドを含む溶液を凍結する工程とによるオリゴヌクレオチドの形成方法。
【請求項２】
前記第１の反応基がα−ハロアシルであり、前記第２の反応基がホスホロチオエートであり、前記工程（ｂ）が前記反応基を通して自発的にチオホスホリルアセチルアミノ結合を形成するものとしてさらに定義される請求項１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
【請求項３】
オリゴマーの各々が８〜20ヌクレオチドからなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）及び（ｂ）が水溶液中で生じる請求項１記載のオリゴヌクレオチド形成方法。
【請求項５】
ａ）オリゴヌクレオチドのうち１つが3'または5'末端ブロモアセチルアミノ基を含み、他のヌクレオチドが3'または5'末端ホスホロチオエート基を含む、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液に配置する工程と、
ｂ）該3'または5'末端ブロモアセチルアミノ基及び3'または5'末端ホスホロチオエート基を通して、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成して、共にオリゴヌクレオチドを共有結合する工程と、
ｃ）該オリゴヌクレオチドを含む水溶液を凍結させることにより反応を促進し、高い完結度で反応を行う工程とによるオリゴヌクレオチドの形成方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はオリゴヌクレオチドの形成方法に関し、特にウイルス性疾患、ガン、及び遺伝子障害などを処置するのに可能性がある新規な治療方法、並びにオリゴヌクレオチドの診断応用としての使用を有する方法に関する。
発明の背景
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ウイルス性疾患、ガン、及び遺伝子障害のような疾患及び障害、並びに他の疾患及び障害を処置する新規なタイプの治療薬としての可能性が示されている１。広範囲に研究が行われており、工業及び大学の研究室でこの可能性を探求する研究が続けられている２。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを治療薬として利用するアプローチにおいて生じる問題は、生体での（in vivo）その治療薬の選択性に関するものである。細胞内に導入することができる細胞内ポリヌクレオチド・ターゲットが低濃度であること、及び細胞内に導入することができる治療オリゴヌクレオチドが低濃度であることを考慮して、高い結合親和力を有するオリゴヌクレオチドが必要であることが理解される。結合親和力は、オリゴヌクレオチドの長さと関連があり、20量体及びそれ以上であるのが好ましい。しかし、短鎖のオリゴヌクレオチドの場合と比較して、長鎖のオリゴヌクレオチドの場合、塩基対の不整合（mismatch）によって不安定にならない。ゆえに、所望である不安定にする効果が長鎖のオリゴヌクレオチドを用いることによって減少するが、選択性は増加する。
専門家は『高配列特異性（“high sequence specificity"）』及び『高親和性』とは矛盾する要求であると注記している３。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは完全に一致していないターゲット部位でRNAの開裂を生じさせることができるという程度をベースとして、多くの非ターゲットRNAの部分的な崩壊を少なくとも生じさせないで、試験された系内で、意図したターゲットRNAの特定の開裂を得ることは多分不可能であったと、さらに結論づけている４。ゆえに、この分野の専門家は、行った研究に基づき、特異性及び親和性という対立する要求は、克服するための大きなハードルであると結論づけている。
オリゴヌクレオチドのブロックを水性溶媒内で共有結合する、いくつかの方法が報告されている5a−１。これらの方法はすべて、安定な連結生成物（ligated product）を得るために、さらに化学薬品を必要とする。このアプローチによって、加えられた薬品は、水溶性カルボジイミド又はシアノイミダゾール5a-kのような『活性化剤』であってもよく、ナトリウム・シアノボロヒドリド51のような還元剤であってもよい。そのような化合物は、毒性があり、水と反応し、かつ所望のカップリング反応を引き起こすのに十分な量で生体系内に導入することができないので、いずれの場合も、第３の薬品の必要性により、生体内での化学連結（chemical ligation）を妨げる。
本発明は、低濃度で存在するオリゴヌクレオチドのブロックを、さらに縮合剤又は安定化剤を必要としないで、水性媒体中で共有結合させる新規な方法を提供する。ゆえに、本発明は、生体系内で現場で（in situ）化学連結させる門戸を開く。相補的オリゴヌクレオチド配列の存在下で、反応は非常に促進するので、各々のオリゴヌクレオチド・ストランドに相補的で、共役な（consective）ヌクレオチド配列を含むターゲット・ポリヌクレオチド（例えば、ウイルス又はガン細胞からのｍ−RNA又はDNA）が存在する場合、原則として長いオリゴヌクレオチド・ストランドを生体内で（in vivo）選択的に形成することができる。ターゲット・ヌクレオチドが存在するとき、高い親和力で結合する、長いオリゴヌクレオチド・ストランドを、ゆえに現場で（in situ）低い親和力で結合する短いストランドから発生させることができる。ゆえに、本発明は、治療上の応用及び診断の応用において、高い親和力と高い特異性を達成するという矛盾する問題を解決することができる。
発明の概要
本発明により、オリゴマーの対の配列に相補的なヌクレオチド塩基配列を含むターゲット・ポリヌクレオチド上の適切な位置に水素結合することによりそれら自身可逆的に結合した、少なくとも２つのオリゴマーを非可逆的に共有結合することによるオリゴヌクレオチド形成方法であって、オリゴヌクレオチドのうち１つが他のオリゴマーのヌクレオチドに隣接した第１の反応基を有するヌクレオチドを含み、他のオリゴマーが自発的に第１の反応基と共有結合を形成することができる第２の反応基を含む、オリゴヌクレオチド形成方法が提供される。オリゴヌクレオチドは、第１及び第２の反応基を通じて一緒に結合し、ポリヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドの結合によりお互いに近接することができる。
さらに本発明は、オリゴヌクレオチドのうち１つがα−ハロアシル基を含み、他のヌクレオチドがホスホチオエート（phosphotioate）基を有する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液中に配置する（dispose）ことによる、オリゴヌクレオチド形成方法を提供する。オリゴヌクレオチドはα−ハロアシル基及びホスホチオエート基を通じてともに共有結合され、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成する。
【図面の簡単な説明】
本発明の他の利点は、添付図面に関連して考慮すると、以下の詳細な説明を参照することによって、よく理解できるようになり、そのとき、本発明の他の利点は即座に評価されるであろう。
ここで、図１は、ターゲット鋳型（template）を利用する、本発明の２つの短いオリゴマーのカップリングを示す。
図２は、本発明による、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートとα−ハロアシル・オリゴヌクレオチド誘導体との容易な（facile）反応を示す。
図３は、実験１による生成物のイオン交換高速液体クロマトグラフィー（IEHLPC）の結果を示す。ここで、Ａ、０℃で溶液中２時間後;B、０℃で２日後;C、溶液を凍結し−18℃で５日間貯蔵した最終工程後であり、ピークは約17分、21分、及び24分で、それぞれ化合物１、化合物２、及び化合物３に対応する。
図４は、第２の実験（凍結、全体が−18℃）による生成物のIE HPLCを示す。ここで、Ａ、０℃で溶液中２時間後;B、０℃で２日後;C;A、５時間後、Ｂ、２日後、Ｃ、５日後であり、ピークは約17分、21分、及び24分で、それぞれ化合物１、化合物２、及び化合物３に対応し、27分のピークは、空気酸化により製造された化合物２の２量体誘導体に対応する。
図５は、次のものを示す。Ａ、鋳型４の存在下、０℃で２時間後、化合物１及び２の反応による生成物のIE HPLCで、主なピークはカップリング生成物３及び鋳型４に対応し、化合物１（ピークが17分）はほとんど完全に消費されたことを注記する;B、KI3で処理した後、ジチオトレイトール（Dithiothreitol）（DTT）によって処理した同じ生成物；化合物３は２つのオリゴヌクレオチド開裂生成物により置換され、18分及び22分で溶出した。
発明の詳細な説明
本発明は、一般に少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを水溶液中に配置する工程であって、オリゴヌクレオチドのうち１つがα−ハロアシル基を含み、他のヌクレオチドがホスホチオエート基を含み、その後、α−ハロアシル基及びホスホチオエート基を通じてオリゴヌクレオチドが共有結合し、それらの間にチオホスホリルアセチルアミノ基を自発的に形成する工程による、オリゴヌクレオチド形成方法を提供する。
本明細書で記述するカップリング反応は、非常に希釈な水溶液では非常に遅いが、鋳型ポリヌクレオチドの存在下では速いという事実を本方法は活用する。即ち、プローブ・オリゴマーに相補的な配列部分を有するターゲット・ポリヌクレオチドの存在下で、反応は促進される。本発明は、治療薬として、ターゲット・ポリヌクレオチド上の適切な位置に結合した後、自発的にともに共有結合することができる、２つの短いオリゴマー（例えば、８〜20量体）を使用する。この系で、16〜40量体のような長いオリゴマー・プローブの結合親和力及び認識特性に近づくが、短いプローブ（８〜20量体）の依存性及び塩基対特質を保持する。換言すれば、本発明は、長いポリヌクレオチドの効果を保持しながら短いポリヌクレオチドの選択性を提供する。
反応基が空間的にお互いに近接しているとき、自発的に反応して反応基の間に共有結合を形成する反応基を含むポリヌクレオチドの必要性及び使用は、本発明に固有のものである。特に、本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを利用し、オリゴヌクレオチドの第１のセットは第１の反応基を含み、オリゴヌクレオチドの第２のセットはお互いに近接するように第２の反応基を含み、これらの反応基は、自発的に反応して、安定な共有結合を形成する。そのような反応基のペアとして、エステル＋ヒドラジン、RC（Ｏ）S-＋ハロアルキル及びRCH2S-＋α−ハロアシルが挙げられる。好ましくは、本発明は、ブロモアセチルアミノ基のようなα−ハロアシル基及びチオホスホリル基を利用し、それらは希釈水性媒体中で、チオホスホリルアセチルアミノ架橋を効率的、選択的、非可逆的に形成する。以下に示すように、生成物は水中で安定で、相補的なポリヌクレオチドとよくハイブリッドする。
オリゴマーが１μＭ未満のような低濃度で、かつ相補的鋳型が存在しないとき、反応は非常に遅いが、その溶液を凍結することによって、２〜３日以内で高転化率で行うことができる。凍結の技術は、以下に詳細に記述する。鋳型として働く相補的なオリゴヌクレオチドの存在下の溶液内でカップリングが行われると、カップリングは極めて速い（20分間に90％の転化率より大きい）。以下の実施例のセクションでこれについて示す。
本発明の診断応用において、及び一般にオリゴヌクレオチドの使用において、選択性も大きな関心事である。本発明の新規な化学的性質により治療への応用に魅力的である本発明の特徴の同じ部分が、診断での使用にも魅力である。例えば、本発明は次の診断システムに利用することができる。
図１を参照すると、Ａは例えば鎖中にマーカー（＊）及び3'−末端にブロモアセチルアミノ基を有する10量体からなるオリゴマーである。Ｂは、5'末端にチオホスホリル基を有する他の短いオリゴマーである。Ｃは、Ａ＋Ｂに相補的な配列を有するターゲット・オリゴヌクレオチド配列である。希釈溶液で、鋳型の存在下のカップリングと比較して、鋳型の不存在下、ＡとＢとのカップリングは十分に遅く、単に鋳型上のカップリングのみが重要となる。ゆえに、この化学連結系は、酸素連結系（リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction）即ち、LCR）に類似した増幅及び検知に用いることができる。ある非特異的なカップリングは、酵素機構中に誤りの源を導くので、優れている可能性がある。オリゴヌクレオチドが非常に低い濃度で（即ち、診断応用に興味がある範囲で）、鋳型の不存在下での化学連結の速度が極度に遅くなるという事実は、鋳型不存在に従った（non−template directed）カップリングが本ケースでは重要ではないことを示す。
実施例
図２に示されるように、オリゴマー１及び２との式１で示される連結は、ホスホロチオエートとα−ハロアシル誘導体との容易な反応を活用する。
特に、図２の化合物１（配列番号１）は、3'−末端に3'−（ブロモアセチルアミノ）−3'−デオキシチミジン単位を有する。化合物１の調製で、0.4M水性Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（Ｎ−succinimidyl bromoacetate）15μＬ（キャルバイオケム（Calbiochem）より得た）を、3'−アミノデオキシリボ−オリゴヌクレオチド前駆体の4.9A260単位、ACACCCAATT−NH2に加えた。調製方法は、グリアズノフ（Gryaznov）ら（1992年）に記載されている６。室温、0.2Mホウ酸ナトリウム緩衝液10μＬ中で反応を行った。35分後、混合物を水0.5mLで希釈し、NAP−５カラム（ファルマシア（Pharmacia）製）上のゲル濾過により脱塩化し、RP HPLC高速液体クロマトグラフィーによって精製し、再度脱塩化して、化合物１の4A260単位を得た。溶出時間は、次の通りである。RP HPLC,17.4分;IE HPLC,17.4分。
上記で行われたIE HPLC、及び以下で行われる同様な手順は、ダイオネクス・オムニ・パックNA100（Dionex Omni Pak NA100）４×250mmカラム上、pH12（水酸化ナトリウム10mM）で、10M水酸化ナトリウムに１分間に２％の割合で1.0M塩化ナトリウムを濃度勾配をつけて行った。RP HPLCの場合、ハイパージルODS（Hypersil ODS）カラム（4.6×200mm）をpH7のトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液0.03Mに、アセトニトリルを毎分１％の割合で濃度勾配をつけて行った。
化合物２（配列番号２）を、ミリゲン／バイオサーチ・サイクロン・DNAシンセサイザー（Milligen/Biosearch Cyclone DNA Synthesizer）で、5'−ジメトキシトリチル−Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシンを担持したLCAA CPGを用いて、１μモルのスケールで合成した。標準シアノエチルホスホルアミダイト（cyanoethyl phosphoramidite）の化学的性質を用いた。鎖の伸びが完了したとき、末端5'−ヒドロキシル基を、アセトニトリル中『ホスフェートON（登録商標PhosphateON）』試薬（クルアケム（Cruachem）製）0.1M溶液150μＬ及びアセトニトリル中0.5Mテトラゾール150μＬで亜リン酸化した。得られた亜リン酸塩を、ピリジン／二硫化炭素（1:1、v/v、室温で45分）のイオウ５％溶液で処理することによって、硫化した。DMT基（ジクロロメタン中DCA3％、1.5分）の開裂後、担持されたポリマーを、化合物１のケースとして取り上げた。
DMS及び水中でのハロアセチルアミノ芳香族誘導体とチオホスホリル−オリゴヌクレオチドとの反応が、染料−オリゴヌクレオチド共役体（dye−oligonucleotide conjugate）を調製するのに用いられた７。
本発明の使用及び所望の速度論に依存して、オリゴヌクレオチドのカップリングは、上述したように、水溶液中、氷中の凍結状態、又は鋳型の存在下での水溶液中のいずれかで行われ、それについて以下に示す。
最初の実験で、化合物１（0.39A260単位、４μＭ）を含む溶液1.0mL（pH7.05、リン酸塩15mM、NaCl85mM）を調製し、０℃で５日間貯蔵した。溶液を50℃まで2.5時間あたため、最後に凍結し、−18℃でさらに５日間貯蔵した。２時間後及び48時間後のサンプルのIE HPLCの分析により、ゆっくり溶出する生成物、オリゴマー３（図２）が、各々約25％及び80％の収率で形成したことがわかった。０℃又は50℃にあたためてさらに３日経過後も著しい変化は観察されなかった。しかし、反応は凍結状態でさらに進行し、図３に示すように、５日以内に高い転化率で化合物３（配列番号３）を得た。氷のマトリクス中での反応の増大の程度は、氷の穴の中にオリゴヌクレオチド反応体が高い局所濃度で存在することによるものである。他の反応も、氷のマトリクス中で同様に行われた８。
この結果から、同じ緩衝液中の化合物１及び２の当モル量の混合物（各々２μＭ）を直接凍結し、−18℃に保った。５時間後及びその後の日毎の、サンプルから得られたHPLCプロファイルから、５日中３日で高い収率が得られる進行が見られ、図４に代表的なデータを示す。
相補的オリゴヌクレオチド鋳型（CCATTTTCAGAATTGGGTGT、化合物４（配列番号４））の存在下、溶液中での化合物１及び２をカップリングするデータを図５を示す。この系は、鋳型４が存在すること（４μＭ）を除いて、最初の実験と同じであった。この場合、反応は20分以内に＞90％完了するまで進行し、本質的に２時間以内で完了した。
化合物３とした構造は、モデル化合物（Ｔ−NHC（Ｏ）CH2−SP（Ｏ）（O-）Ｏ−Ｔ、化合物３に用いるものより大きな規模で溶液中で調製した）の特性、ゲル電気泳動上の化合物３の移動度（化合物１、２及び４のそれぞれRm0.89、0.95及び0.61と比較して、Rm0.58）、及び相補的なオリゴヌクレオチド４と形成した複合体の安定性によって支持されている。保持時間、RP HPLC 10.5分;FAB＋質量分析スペクトル、Ｍ＋H+620、Ｍ＋Na+642;31P  NMR、D2O中のδ18.7ppm、先行文献にはアルキルチオホスフェート基の特質が開示されている９。
Rm値は、20％ポリアクリルアミド/5％ビスアクリルアミド・ゲル中のブロモフェノール・ブルーに関する。Tm値は0.1M  NaCl中56℃で、対応するすべてのホスホジエステル20量体と化合物４（60℃）とから形成される複合体の値に近づき10、化合物１又は２と化合物４（37℃及び31℃）とから形成される複合体の値とは著しく異なる。さらに、ヌクレオチド内−NH（CO）CH2SP（Ｏ）（Ｏ−）−結合は、KI39での酸化で選択的に開裂することがわかった（図５）。特に、水100μＬ中の化合物３及び４（各々0.3A260単位）を含む二本鎖分子を0.2M  KI3aq.100μＬで15分間、50℃で処理した。その後、1M  DTT aq.10μＬを溶液に加えた。５分後、混合物をNAP−５カラム上で脱塩化し、IE HPLCで分析した。
上記の実験から、本発明は、水溶液中で、オリゴマー濃度４μＭ以上の範囲で、選択的かつ不可逆的にオリゴヌクレオチドをカップリングする簡易な手段をもたらす新規の化学的性質を提供するという証拠をもたらす。生成物は、中性溶液中で安定であり、室温pH12であっても数時間安定であることがわかった。１μＭ以下の濃度では液相での速度は極めて遅くなる。しかし、凍結状態で反応を完了近くまでに行わせることができる。カップリングの速度は、相補的オリゴヌクレオチド鋳型の存在によって著しく促進される。これらの特性は、化学増幅系（chemical amplification system）の設計、及びアンチセンス応用における現場での（in situ）連結、並びに既知の化学的性質に基づき、オリゴヌクレオチド・ブロックから複合体構造を建てるのに可能性をもたらす。
本発明を例を挙げて説明したが、用いられる用語は、限定のためというよりむしろ説明のための言語として用いられるものと理解すべきである。
本発明の多くの改良及び変形が、上記の教示から可能であることが明らかである。
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0003593344.tif 000003
配列表
（１）一般的な情報
（ｉ）出願人：レットシンガー・ロバート・エル（Letsinger,Robert L.）
グリアズノフ・セルゲイ・エム（Gryaznov,Sergei M.）
（ii）発明の名称：オリゴヌクレオチドの形成方法
（iii）配列の数:4
（iv）通信住所：
（Ａ）住所：ライジング、エシントン、バーナード、ペリー・アンド・ミルトン（Reising,Ethingthon,Barnard,Perry ＆ Milton）
（Ｂ）街:P.O.Box 4390
（Ｃ）市：トロイ（Troy）
（Ｄ）州：ミシガン（Michigan）
（Ｅ）国:USA
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:48099
（ｖ）コンピュータ読取りフォーマット：
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM PCコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.0,バージョン＃1.25（PatentIn Release＃1.0,Version＃1.25）
（vi）出願データ：
（Ａ）出願番号:US 08/046,032
（Ｂ）出願日:1993年４月12日
（Ｃ）クラス：
（viii）代理人（ATTORNEY/AGENT）情報：
（Ａ）名前：コーン、ケネス・アイ（Kohn,Kenneth I.）
（Ｂ）登録番号:30.955
（Ｃ）参照／事件番号（REFERENCE/DOCKET NUMBER）:NU9310
（ix）テレコニュニケーション情報：
（Ａ）電話：（313）689−3554
（Ｂ）テレファックス：（313）689−4071
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:11塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前/KEY:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（1..11、""）
（Ｄ）他の情報:/注記＝"Nはブロモアセチルアミノ基である”
（xi）配列：配列番号１
0003593344.tif 000004
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:11塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前/KEY:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（1..2、""）
（Ｄ）他の情報:/注記＝"Nはチオホスホリル基である”
（xi）配列：配列番号２
0003593344.tif 000005
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前/KEY:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（11..12、""）
（Ｄ）他の情報:/注記＝"NNはチオホスホリルアセチルアミノ基である”
（xi）配列：配列番号３
0003593344.tif 000006
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：両形態
（Ｄ）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名前/KEY:misc_difference
（Ｂ）存在位置:1..20
（Ｄ）他の情報:/注記＝"NNのない配列番号３に相補的である”
（xi）配列：配列番号４
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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