(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラテックス粒子上にプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の活性型、潜在型、及び複合体のいずれにも結合するポリクローナル抗体が固定化された、プラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１のラテックス凝集による免疫測定法に用いるための試薬。
【請求項２】
請求項１記載の試薬を用いたラテックス凝集により、試料中のプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の総抗原量を測定する免疫測定法。
【請求項３】
請求項２記載の方法によりプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の総抗原量を測定することを特徴とする、血管内皮障害に起因する疾患の検知法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１（以下、「ＰＡＩ−１」と略記することがある）測定用のラテックス試薬、及びそれを用いたＰＡＩ−１総量の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
血液線溶系は、血中のプラスミノーゲンがプラスミノーゲン  アクチベーターにより活性化されプラスミンとなることで開始し、血栓のフィブリンを溶解する。組織や尿のプラスミノーゲン  アクチベーターに対するインヒビターとして、実際に血液線溶系を制御しているとみられているのが、ＰＡＩ−１である。
【０００３】
ＰＡＩ−１は、分子量が約５万、３７９アミノ酸残基からなる一本鎖の糖蛋白であり、血中の組織プラスミノーゲン  アクチベーター（ｔＰＡ）のインヒビターであることが知られている（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，  Ｃｏｌｌｅｒ，  Ｂ．Ｓ．，  ｅｄ．  ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅａｒｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  （１９８９）  ８７−１１５）。血中ＰＡＩ−１は、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１など様々な形態で存在する。ＰＡＩ−１は血管内皮細胞より放出されると速やかにｔＰＡと結合してその活性を阻害し、血中の線溶活性を規定する重要な因子である。
【０００４】
血中ＰＡＩ−１濃度が高い場合、フィブリンによって形成された血栓が溶けにくい状態であると考えられる（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，  ８，  １０４−１１２（１９９４））。例えば急性心筋梗塞症、深部動脈血栓症、糸球体腎炎、アテローマ性動脈硬化症、敗血症、ＤＩＣ（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：播種性血管内凝固症候群）等の疾患では、ＰＡＩ−１の放出量が著しく増加し、血栓が極めて溶けにくくなり、虚血性臓器障害の原因となっている。このような場合、血中に放出されたＰＡＩ−１の総量は血管内皮障害を反映し、ＰＡＩ−１の総濃度の測定はこうした疾患の診断、重篤さの診断、予後の判断、治療に有効であると考えられ、迅速な測定が望まれている。
【０００５】
ところで従来、血中ＰＡＩ−１を測定するものとして、ＰＡＩ活性、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体量、ＰＡＩ−１総抗原量などが知られている。これらに対し、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、ＰＡＩ−１総抗原量は酵素免疫測定法で、ＰＡＩ活性はｔＰＡの作用により生じるプラスミンの活性を呈色性基質により測定する方法で、従来測定が行われてきた。しかし、これらはいずれも操作が煩雑で、２時間以上のインキュベーションが必要であるなど、反応、測定に要する時間が長いという問題を有していた。
【０００６】
さらに、ＰＡＩ活性を測定する方法では、活性型ＰＡＩ−１の生体内代謝時間は、半減期が６〜７分と短かく（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６７，  １２８１−１２８６  （１９９０））、特に活性型ＰＡＩ−１はインビトロでも不安定であり、３７℃での半減期は２〜４時間（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３９，  ４９７−５０３  （１９８６）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６，  ３，  １５４５４−１５４６１  （１９８８））と短く、冷凍保存や凍結融解に対する安定性も低いため、測定中あるいは測定前に失活してしまうという問題があった。
【０００７】
また、ＰＡＩ−１総抗原量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定している例では、２０時間以上もの長時間を必要としており（Ｂｌｏｏｄ，  ７７，  １９４９−１９５７（１９９１））、血液凝固疾患における血管内皮障害の指標とすることは困難であった。
【０００８】
したがって、血液凝固疾患の病態を正確に把握するためには、分析時間の短いＰＡＩ−１の測定法の開発が望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく検討を重ねてきた結果、迅速、簡便な免疫測定法であるラテックス凝集法を応用したＰＡＩ−１測定用試薬及びＰＡＩ−１測定法を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ラテックス粒子上にプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１に結合する抗体が固定化されたプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１測定用ラテックス試薬である。
【００１１】
また本願発明は、上記ラテックス試薬を用いたラテックス凝集により、試料中のプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の存在または量を測定する免疫測定法を提供する。このプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の量は、プラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の総抗原量として測定することが好ましい。
【００１２】
さらに本願発明は、上記の方法によりプラスミノーゲン  アクチベーター  インヒビター−１の総抗原量を測定することを特徴とする血液凝固疾患の検知法を提供する。
【００１３】
尚、「ＰＡＩ−１総抗原量」とは、ＰＡＩ活性の有無に関わらず、フリー（遊離）のＰＡＩ−１、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン  アクチベーター）を始めとするプラスミノーゲン  アクチベーターとＰＡＩ−１との複合体など、様々な形態のＰＡＩ−１の抗原としての総量を意味する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞ＰＡＩ−１測定用ラテックス試薬
本発明のラテックス試薬は、ＰＡＩ−１の測定、特にＰＡＩ−１総抗原量を測定するための免疫試薬であり、ラテックス粒子上にＰＡＩ−１に結合する抗体が固定化されたものである。
【００１５】
本発明のラテックス試薬に用いるラテックス粒子としては、ラテックス凝集を利用した免疫測定に通常用いられるラテックス粒子を使用することができ、ポリスチレンラテックス、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とスチレンの共重合体、スチレンとマレイン酸の共重合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体、スチレンとアクリル酸とアルキルアクリレートなどの共重合体、酢酸ビニルとアクリル酸の共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては  ０．１〜１．０μｍ程度が好ましい。
【００１６】
上記ラテックス粒子の粒子上にＰＡＩ−１に結合する抗体（抗ＰＡＩ−１抗体）を固定化することによって、本発明のラテックス試薬が得られる。抗ＰＡＩ−１抗体は、ラット、モルモット、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、馬、牛などの哺乳動物をＰＡＩ−１で免疫することにより得られる。免疫後、これらの動物から採血し、血清を分離して得られる抗ＰＡＩ−１抗血清も本発明に使用することができるが、ラテックス粒子への固定化の効率等の観点からは、免疫グロブリン分画として精製した抗ＰＡＩ−１抗体を用いることが好ましい。抗ＰＡＩ−１の精製は、例えばＮｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｅｉｓｅｎ  Ｈ．  Ｎ．  （ｅｄ）．  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  （１９６４）  １０，  １３４−１４１）により行うことができる。また、ＰＡＩ−１で免役したマウスの脾細胞をミエローマ細胞と融合して得られるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体も本発明に適用することができるが、モノクローナル抗体を用いる場合は、認識するエピトープが異なる２種類以上のモノクローナル抗体が必要である。
【００１７】
免疫に用いるＰＡＩ−１は、例えば、ＷＩ３８  ＶＡ１３  ２ＲＡ株（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）、ＨＴ１０８０株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２１）、ＣａＳＫｉ株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５０）等のヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株の培養上清から精製することにより得られる。このような細胞株を、無血清ＤＭＥＭ培地等の適当な培地で培養すれば、培養液中にＰＡＩ−１が分泌される。その際、培地にデキサメタゾンを２×１０−６Ｍ程度添加しておくと、ＰＡＩ−１が効率よく産生される。
【００１８】
またＰＡＩ−１は、遺伝子組換え技術により作製されたＰＡＩ−１を発現する大腸菌を培養することによっても得られる。
培養上清からのＰＡＩ−１の粗精製は、後記実施例では、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行ったが、モノクローナル抗体の代わりにコンカナバリンＡ固定セファロースによって粗精製することもできる。かくして得られる粗精製物をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画することによって、精製ＰＡＩ−１が得られる。各フラクション中のＰＡＩ−１の相対量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法で確認できる。
【００１９】
上記のようにして得られた抗ＰＡＩ−１抗体は、ＰＡＩ−１との反応性をイムノブロッティング等により調べることによって評価することができる。例えば、ＰＡＩ−１をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、泳動後のゲルをニトロセルロース膜等に転写し、抗ＰＡＩ−１抗体、抗ＰＡＩ−１抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する他の動物の抗体をアルカリフォスファターゼ等で標識した二次抗体、及び酵素反応により発色する基質色素と順次インキュベートして発色させることにより、ＰＡＩ−１と抗ＰＡＩ−１抗体との反応性を調べることができる。その際、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１、ｔＰＡとＰＡＩ−１との複合体等、種々の形態のＰＡＩ−１、及び他の血漿タンパクも同じゲルで泳動し、抗ＰＡＩ−１抗体がＰＡＩ−１の形態に関わらず結合し、他の血漿タンパクには結合しないことを確認しておくことが好ましい。
【００２０】
抗ＰＡＩ−１抗体をラテックス粒子上に固定化する方法としては特に制限はなく、例えば、ラテックス粒子と抗体を混合することによりおこる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジイミドなどのカップリング剤により、ラテックス粒子表面のカルボキシル基やアミノ基と抗体分子を化学的に結合させる化学結合法が用いられる。また、抗体分子をスペーサー分子を介してラテックス粒子に結合させてもよい。さらに、アルブミンなどの他のタンパク質に化学結合法を用いて抗体を結合させた後に、そのタンパク質をラテックス粒子に物理的あるいは化学的に固定化してもよい。
【００２１】
ラテックス粒子に固定化する抗ＰＡＩ−１抗体としては、ＩｇＧそのものでもよいが、ＩｇＧをペプシン、パパインなどの消化酵素、あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いてＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などにフラグメント化したものが用いられる。ＩｇＭなどの他のクラスの抗体も同様の処理をして使用することができる。
【００２２】
＜２＞ラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の免疫測定法
本発明の免疫測定法は、上記のラテックス試薬を用いたラテックス凝集により、試料中のＰＡＩ−１の存在または量を測定する方法である。すなわち、ラテックス試薬をＰＡＩ−１を含有する試料溶液に添加すると、抗ＰＡＩ−１抗体を介してラテックス粒子が結合し、凝集する。このラテックス粒子の凝集を測定することによって、ＰＡＩ−１の存在または量を測定することができる。ラテックスの凝集は、スライドラテックス凝集法によって検知することもできるが、可視光から近赤外域の光（４００〜２４００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の吸収の増加を、分光光度計を用いて経時的に測光することにより、正確に測定することができる。このような測定を行う装置として、三菱化学株式会社のＬＰＩＡ−２００ラテックス凝集全自動測定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システムズ社のＣＯＢＡＳ  ＦＡＲＡ装置およびＣＯＢＡＳ  ＭＩＲＡ装置、および日立製作所の日立７０４分析装置等が挙げられる。
【００２３】
試料とラテックス試薬との反応は、生理的食塩水、緩衝液等の液体中で行われる。ラテックス試薬と試料中のタンパクとの非特異的結合を抑制するために、界面活性剤等の吸着抑制剤を反応液に添加してもよい。
【００２４】
ＰＡＩ−１の絶対量を測定するためには、量が既知のＰＡＩ−１標準品を用いて検量線を作成しておけばよい。検量線は、例えば、ラテックス粒子の凝集量に対してＰＡＩ−１標準品の濃度またはＰＡＩ活性をプロットすることにより得られる。試料を適宜段階的に希釈し、この希釈液にラテックス粒子を加え、ラテックス凝集を測定し、得られた測定値と検量線から、試料中のＰＡＩ−１量（濃度）を知ることができる。
【００２５】
＜３＞本発明の免疫測定法の利用
本発明のラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の測定法によれば、血漿中のＰＡＩ−１総濃度を、ｔＰＡ等との複合体の形成の有無、活性型、潜在型の如何に関わらず、短時間、簡便、かつ再現性よく測定することができる。また、本発明の免疫測定法に用いる検体は、保存安定性に優れている。
【００２６】
内皮細胞刺激により、ＰＡＩ−１と共にｔＰＡの放出が亢進している場合、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体形成のため、血漿中ＰＡＩ活性は低下し、その値は血管内皮のＰＡＩ−１放出量を反映しない。一方、本発明により測定されるＰＡＩ−１総濃度は、ＰＡＩ−１放出量を通して血管内皮の状態を常に反映する指標として有益であると考えられる。
【００２７】
また、血漿検体中のＰＡＩ−１総濃度はＰＡＩ活性を測定するよりも安定であり、臨床検体として扱いやすい。本発明により測定されるＰＡＩ−１総抗原量は、ＰＡＩ活性との相関性が高く、ＰＡＩ活性をよく反映する。
【００２８】
以上のことから、本発明の免疫測定法によりＰＡＩ−１総抗原量を測定することは、血液凝固疾患の診断に利用できることが期待される。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３０】
【実施例１】抗ＰＡＩ−１抗体結合ラテックス試薬
＜１＞ＰＡＩ−１の調製
ヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株ＷＩ３８  ＶＡ１３  ２ＲＡ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５．１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＤＭＥＭ培地（日水製）で、ローラーボトル中で増殖させ、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した後、デキサメタゾン２×１０−６Ｍを含む無血清ＤＭＥＭ培地中で１０日間培養した。その後、培養上清を回収し、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂアフィニティカラムに通してＰＡＩ−１を吸着させた後、３ＭＭｇＣｌ２で溶出し、粗精製ＰＡＩ−１を得た。抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂは、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（米国カリフォルニア、ラ  ジョラのスクリップスクリニック  アンドリサーチファウンデーション（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のＤ．Ｊ．ロスクトフ（Ｄ．  Ｊ．  Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）博士より恵与された。Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ８３，  １７４７−１７５２  （１９８９）参照）から抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体を調製し、これをＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合することにより作製した。
【００３１】
上記で得られた溶出物を３Ｍ  ＭｇＣｌ２で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、精製ＰＡＩ−１を得た。この精製ＰＡＩ−１を、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、泳動後ゲルを銀染色した結果、分子量約５万のほぼ単一のバンドが認められた。
【００３２】
＜２＞抗ＰＡＩ−１ウサギポリクローナル抗体の調製
上記で得られたＰＡＩ−１を、限外濾過膜（アミコン社、ＹＭ−１０）を用いて４００μｇ／ｍｌに濃縮した。これとフロイントの完全アジュバントとの混合物でニュージーランド白色ウサギを免疫し、８〜１０週間後に追加免疫を行った。初回免疫より１０〜１４週間後に採血し、抗ＰＡＩ−１抗血清を得た。
【００３３】
上記抗ＰＡＩ−１血清を、Ｎｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｅｉｓｅｎ  Ｈ．  Ｎ．  （ｅｄ）．  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  （１９６４）  １０，  １３４−１４１）により精製し、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を得た。すなわち、抗血清から硫酸アンモニウム塩析により、粗γ−グロブリン分画を得、ペプシン消化によりＦ（ａｂ’）２を得た。
【００３４】
＜３＞抗ＰＡＩ−１抗体の評価
（１）精製ＰＡＩ−１の活性化
精製ＰＡＩ−１の活性化は、Ｈｅｋｍａｎらの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０，  １１５８１−１１５８７  （１９８５）  ）、すなわち、精製ＰＡＩ−１を２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６）に対して透析後ＳＤＳを添加し、０．１％ＳＤＳ存在下で３７℃で３０分インキュベートすることにより行った。活性化させたＰＡＩ−１は、４℃で２０時間、３０００倍容の２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に対して十分に透析した。
【００３５】
（２）抗ＰＡＩ−１抗体と活性化ＰＡＩ−１、ｔＰＡ、及びｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体との反応
得られた活性化ＰＡＩ−１と一本鎖ｔＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製）とを３７℃で３０分間混合することにより、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体を作製し、１／４容のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（０．２５Ｍ  トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４．４％  ＳＤＳ、４０％グリセロール、０．０５％  ブロモフェノールブルー）を加えてｔＰＡの結合反応を停止させた。
【００３６】
活性化ＰＡＩ−１、ｔＰＡ、及びｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体は、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７，  ６８０−６８５  （１９７０））にしたがったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。アクリルアミド濃度は、スタッキングゲルは４％、ランニングゲルは９％とした。泳動後、ゲルは銀染色、あるいはウェスタンブロッティング解析を行った。ウェスタンブロッティングは、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗ＰＡＩ−１抗体、アルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇヤギ抗体、及び基質色素と順次インキュベートして発色させることにより行った。
【００３７】
ゲルを銀染色した結果、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体はおよそ１２０ｋｄの大きさを示した。また、過剰のｔＰＡを加えると、ＰＡＩ−１の分解物が認められた。イムノブロッティングの結果、抗ＰＡＩ−１抗体は、ＰＡＩ−１、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、及びこれらの分解物を認識し、ｔＰＡとのクロス反応は認められなかった。また、正常ヒト血漿などのその他のタンパクに対して上記と同様にしてイムノブロッティングを行った結果、これらのタンパクとのクロス反応は認められなかった。こうして、抗ＰＡＩ−１抗体の特異性が確認された。
【００３８】
＜４＞抗ＰＡＩ−１抗体結合ラテックス試薬の調製
抗ＰＡＩ−１抗体を、硫酸アンモニウムを用いた塩析によりγ−グロブリン分画として粗精製した後、ペプシン消化して抗ＰＡＩ−１  Ｆ（ａｂ’）２を得た。このＰＡＩ−１  Ｆ（ａｂ’）２を、平均粒径０．５３μｍのポリスチレンラテックス（セラダイン社製）表面に常法により固定し、ラテックス試薬とした。試薬中のラテックス濃度は０．１〜０．５％であり、ＰＡＩ−１  Ｆ（ａｂ’）２の濃度は０．０２５〜０．２５μｇ／μｌであった。
【００３９】
【実施例２】血漿ＰＡＩ−１の測定
＜１＞ＰＡＩ−１標準品を用いたＰＡＩ−１測定用検量線の作成
Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７２，  ２４８−２５４  （１９７６））を用いて精製ＰＡＩ−１のタンパク質量を定量し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）添加トリス緩衝液で１５、３０、９０、２７０ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＰＡＩ−１測定用標準品とした。
【００４０】
上記ＰＡＩ−１標準品溶液５μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液２７０μｌ、実施例１で得られたラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、近赤外（９５０ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定することにより、免疫反応を観察した。測定は、ラテックス凝集全自動測定器（三菱化学（株）製：ＬＰＩＡ−２００システム）を用いて行った。測定は、２０分以内に完了した。その結果、ＰＡＩ−１量とラテックス凝集率は、直線性を示した。
【００４１】
＜２＞ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体に対するラテックス試薬の反応性
活性型ＰＡＩ−１に対するｔＰＡ量を増加させて、上記と同様にしてこれらを反応させ、ＰＡＩ−１総濃度、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度、及びＰＡＩ活性を測定した。ＰＡＩ−１総濃度はＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、ＴｉｎｔＥｌｉｓｅ）を用いて、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度はサンドウィッチＥＩＡキット（帝人（株）社製、ｔＰＡＩ−Ｃ  ｔｅｓｔ）を用いて、ＰＡＩ活性は合成基質法による測定キット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｙｓｅ／ｆｉｂｌｉｎ）を用いて、それぞれ測定した。結果を図１に示す。図中、●はＰＡＩ−１総濃度（ｎｇ／ｍｌ）、□はｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度（ｎｇ／ｍｌ）、○はＰＡＩ活性（Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ表す。図に示されるように、ｔＰＡ量が増加するにつれてｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度は増加し、ＰＡＩ−１に対するｔＰＡのモル濃度比が１：１以上になると飽和した。ＰＡＩ活性は、ｔＰＡの増加に伴い低下したが、ＰＡＩ−１総濃度は変化しなかった。
【００４２】
また、種々の形態のＰＡＩ−１、すなわち、活性型、潜在型（ｌａｔｅｎｔ：活性型ＰＡＩ−１血漿を凍結融解を２回繰り返すことにより得た）、及び一本鎖ｔＰＡ（ｏｃｔＰＡ）、組換えｔＰＡ（三菱化学（株）製）またはヒト重鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）との複合体について同様の測定を行ったところ、すべての形態においてほぼ１００％の試薬反応性を示した（表１）。
【００４３】
【表１】
0003542664.tif 000002
【００４４】
また、本発明のラテックス試薬は、ＰＡＩ活性が低下した潜在型ＰＡＩ−１血漿に対する反応性も変化は無かった。
【００４５】
＜３＞ＰＡＩ−１の抗原としての保存安定性
４℃で５日間、及び凍結融解を３回繰り返した健常人血漿試料中のＰＡＩ活性は経時的に活性が低下したが、ラテックス試薬に対する反応性は変化せず、安定であった。
【００４６】
＜４＞本発明の方法と他のＰＡＩ−１測定法との相関
健常人及び各種血液凝固疾患患者の血液を０．１％クエン酸ナトリウムに加え、２０００×ｇで１５分遠心して血小板に乏しい血漿を得た。全ての試料は、−４０℃で保存した。
【００４７】
正常人及び患者の血漿中のＰＡＩ活性と、本発明の方法により測定したＰＡＩ−１総濃度との相関を図２に示す。これらの相関係数（ｒ）は、０．７９であった。また、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、ＴｉｎｔＥｌｉｓｅ）により測定したＰＡＩ−１総濃度と本発明の方法による測定値との相関係数は０．９４と高かったが、サンドウィッチＥＩＡキット（帝人（株）社製、ｔＰＡＩ−Ｃ  ｔｅｓｔ）で測定したｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体とＰＡＩ−１との相関係数は０．３４であった。
【００４８】
＜５＞ＰＡＩ−１総濃度の希釈直線性の評価
急性心筋梗塞患者のクエン酸添加血漿３検体について、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で２倍づつ連続希釈した試料用いて、直線性を調べた。これらの試料５μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液２７０μｌ、実施例１で得られたラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、上記と同様にしてラテックス粒子の凝集を測定した。ＰＡＩ−１標準品の検量線から、検体中のＰＡＩ−１総濃度を算出した。結果を図３に示す。いずれの検体においても良好な希釈直線性を示した。
【００４９】
反応系に加えたＰＡＩ−１標準品の回収率は、８０〜１１０％であった。測定領域全域にわたって、同時再現性の検討結果は、標準品及び健常人血漿試料についての変動係数は２−５％（ｎ＝１０）であった。
【００５０】
これとは別に測定した日本人の健常人（ｎ＝６７）のＰＡＩ−１総濃度は、２２．３７±１５．１８ｎｇ／ｍｌ、９５パーセンタイルは５０ｎｇ／ｍｌ以下であった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の測定法によれば、短時間で再現性よくＰＡＩ−１総濃度を測定することができる。また、本発明の方法に用いる検体は、保存安定性に優れている。本発明のＰＡＩ−１総濃度の測定法は、血液凝固疾患における血管内皮障害の指標となると期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体のラテックス試薬に対する反応性を示す図。図中、●はＰＡＩ−１総濃度（ｎｇ／ｍｌ）、□はｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度（ｎｇ／ｍｌ）、○はＰＡＩ活性（Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ表す。
【図２】ＰＡＩ活性と本発明の方法により測定したＰＡＩ−１総濃度との相関を示す図。
【図３】血液凝固疾患患者のクエン酸添加血漿中のＰＡＩ−１総濃度の希釈直線性を示す図。
【図１】
0003542664.tif 000003
【図２】
0003542664.tif 000004
【図３】
0003542664.tif 000005