(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0003584379.tif 000007
〔式中、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基、アリーレン基であり、１つ          以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよく、置換基を有し          ていてもよく、Ｚはカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カル          バモイル基、アリーロキシカルボニル基、ヒドロキシ基、シアノ基、          カルボキシイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ア          ジド基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基、ハロゲン化スルホニル          基、ハロゲン化カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニ          ル基またはＮ−フタルイミジルオキシカルボニル基であり、Ｒ1 はハ          ロゲン原子、アルキル基またはアリール基であり、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4           およびＲ5 は同一でも異なってもよく、水素原子、アルキル基、アリ          ール基、アルコキシ基、アセチル基、ニトロ基、ハロゲン原子または          カルボニル基であり、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 およびＲ5 は相互に隣合う基          が結合して環を形成してもよく、Ｙは、ハロゲンイオンまたは超強酸 の共役塩基である〕
で表されるアクリジニウム化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ2 〜Ｒ5 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ5 がアルキル基またはハロゲンであり、Ｒ2 〜Ｒ4 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項４】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ2 またはＲ3 の一方がニトロ基、アセチル基またはハロゲンであり、Ｒ5 がアルキル基または該アルキル基が隣接したＲとベンゼン環を形成しており、その他のＲが水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項５】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がメチル基であり、Ｒ2 〜Ｒ5 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項６】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がフェニル基であり、Ｒ2 〜Ｒ5 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項７】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がメチル基、Ｒ5 が塩素であり、Ｒ2 〜Ｒ4 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項８】
式（Ｉ）において、Ｒ1 およびＲ5 が塩素であり、Ｒ2 〜Ｒ4 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項９】
式（Ｉ）において、Ｒ1 およびＲ5 がメチル基であり、Ｒ3 がニトロ基であり、Ｒ2 およびＲ4 が水素である請求項４のアクリジニウム化合物。
【請求項１０】
式（Ｉ）において、Ｒ1 およびＲ5 がメチル基であり、Ｒ3 がアセチル基であり、Ｒ2 およびＲ4 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項１１】
式（Ｉ）において、Ｒ1 およびＲ5 がメチル基であり、Ｒ2 がアセチル基であり、Ｒ3 およびＲ4 が水素である請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項１２】
式（Ｉ）において、Ｒ1 がメチル基、Ｒ3 がアセチル基であり、隣接するＲ4 およびＲ5 が縮環してベンゼン環を形成した請求項１のアクリジニウム化合物。
【請求項１３】
前記超強酸の共役塩基は、CH3SO4- 、FSO3- 、CF3SO3- 、 C4F9SO3- 、または下記式：
【化２】
0003584379.tif 000008
で表される基である請求項１ないし１２のいずれかに記載のアクリジニウム化合物。
【請求項１４】
請求項１のアクリジニウム化合物と、該アクリジニウム化合物のＺ基を介して直接または間接に結合される、該アクリジニウム化合物によって標識される物質との複合体。
【請求項１５】
前記標識される物質は、蛋白質、抗原、抗体または核酸である請求項１４に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アクリジニウム化合物および複合体に関し、特に、高い発光効率を有し、かつ安定性に優れるため、化学発光標識として有用なアクリジニウム化合物および該アクリジニウム化合物と特異結合物質との複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクリジニウムエステルは、高い発光効率を持つことから化学発光標識として有用である。
ところで、一般に、化学発光標識として実用に供するためには、溶液中での安定性が優れていることが必須である。
【０００３】
一般に、アクリジニウムエステルは、共鳴により分子全体が平面構造をとっている場合、アクリジニウム環の強い電子吸引性のため、電子がアクリジニウム環に局在化した状態になるため、カルボニル基の炭素原子は電子不足の状態になり求核攻撃を受け易く、不安定な化合物である。
【０００４】
そこで、フェニル基またはアクリジニウム環の２−位に蛋白質等との結合活性基を有し、Ｎ−１０位にメチル基、さらにフェニル基の２，６−位にメチル基を有するアクリジニウムエステルが、特開昭６３−１０１３６８号公報および特開平３−５０１７７２号公報に提案されている。
【０００５】
一方、特開平１−１９９９４９号公報には、アクリジニウム環のＮ−１０位に蛋白質等との結合活性基を持つアクリジニウムエステルが開示されている。このこの公報に記載のアクリジニウムエステルがＮ−１０位に有する結合活性基は、カルボキシメチル基等の大きな置換基であるため、アクリジニウム環の４，５−位の水素原子とＮの置換基との間に立体的な反発を生み、アクリジニウム環自体が平面構造をとりにくくなっている点で、Ｎ−１０位がメチル基の化合物群と基本的に異なり、安定性については有利と考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
また、特開昭６３−１０１３６８号公報および特開平３−５０１７７２号公報に記載のアクリジニウムエステルは、蛋白質等との結合活性を有する官能基が脱離基であるベンゼン環側に結合しており、ベンゼン環の修飾に著しい制約を受ける。さらに、結合活性を有する官能基は、それ自体が反応性に富むため合成がかなり困難になる。これに対して、特開平１−１９９９４９号公報に記載のアクリジニウムエステルは、アクリジニウム環のＮ−１０位に蛋白質等との結合活性を持ち、脱離基側には官能基を持たない。そのため、脱離基の修飾は、かなり容易であり、なおかつ、合成も最終段階で結合性官能基を結合させるだけで済むため、合成法が簡便であり、その有用性は大きい。
【０００７】
しかし、特開平１−１９９９４９号公報に具体的に開示されたアクリジニウムエステル化合物は、フェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレート  ブロミドであり、脱離基のベンゼン環が置換されていないため、溶液中での安定性が低く、特異結合物質の標識剤として実用に供することが困難であった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、高い発光効率を有し、かつ安定性に優れるため、化学発光標識として有用なアクリジニウム化合物および該アクリジニウム化合物と特異結合物質との複合体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、アクリジン環のＮ−１０位に標識用活性基を導入したアクリジニウムエステル化合物であって、脱離基のベンゼン環のオルト位の少なくとも一つをアルキル基、アリール基またはハロゲンで置換したアクリジニウム化合物が、高い発光効率を有し、かつ安定性に優れることを知見し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、第１の態様として、一般式（Ｉ）：
【化３】
0003584379.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基、アリーレン基であり、１つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよく、置換基を有していてもよく、Ｚはカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリーロキシカルボニル基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルボキシイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アジド基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基、ハロゲン化スルホニル基、ハロゲン化カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基またはＮ−フタルイミジルオキシカルボニル基であり、Ｒ１  はハロゲン原子、アルキル基またはアリール基であり、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  およびＲ５  は同一でも異なってもよく、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アセチル基、ニトロ基、ハロゲン原子またはカルボニル基であり、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  およびＲ５  は相互に隣合う基が結合して環を形成してもよく、Ｙはカウンターイオンである〕
で表されるアクリジニウム化合物を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、第２の態様として、前記アクリジニウム化合物と特異結合物質との複合体をも提供するものである。
【００１３】
以下、本発明のアクリジニウム化合物（以下、「本発明の化合物」という）および該アクリジニウム化合物と特異結合物質との複合体について説明する。
【００１４】
本発明の化合物を表す前記一般式（Ｉ）において、Ａは介在基であり、特異結合物質との結合活性は持たない基である。具体的には、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基、アリーレン基である。炭素数１〜４のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、ブチレン基等が代表的であり、アリーレン基としては、例えば、フェニレン基、ナフチレン基等が代表的である。また、このＡを構成する１つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい。このヘテロ原子としては、例えば、酸素、イオウ等が代表的である。さらに、Ａは１つまたは２つ以上の置換基を有していてもよく、この置換基の代表例として、アルキル、アリール、アルキレン、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、保護アミノ、保護ヒドロキシ、オキソ、チオ、イミノ、メルカプト基等が挙げられる。
【００１５】
Ｚは、特異結合物質との結合活性を持った標識用活性基であり、具体的には、Ｚはカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリーロキシカルボニル基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルボキシイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アジド基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基、ハロゲン化スルホニル基、ハロゲン化カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基またはＮ−フタルイミジルオキシカルボニル基等が代表的である。
【００１６】
Ｒ１  は、ハロゲン原子、アルキル基またはアリール基であり、代表例として、塩素原子、メチル基、フェニル基等が挙げられる
【００１７】
Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  およびＲ５  は同一でも異なってもよく、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アセチル基、ニトロ基、ハロゲン原子またはカルボニル基である。このアルキル基としては、メチル基、エチル基等が代表的である。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が代表的である。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基等が代表的である。ハロゲン原子としては、塩素、臭素、フッ素等が代表的である。また、このＲ２  、Ｒ３  、Ｒ４  およびＲ５  は相互に隣合う基が結合して環を形成してもよく、例えば、ベンゼン環、シクロヘキサン環等の環を形成していてもよい。さらに、Ｒ２  〜Ｒ５  は、隣接するＲ同志が結合して縮環し形成された芳香環または複素環となっていてもよい。
【００１８】
また、本発明の化合物において、Ｒ１  〜Ｒ５  も特異結合物質との結合活性は持たない。また、脱離基の構造上、Ｒ１，Ｒ２，…Ｒ５  をＲ５，Ｒ４，…Ｒ１  の位置に置き換えた化合物は、置き換え前の化合物と同一であり、本発明に包含される。
【００１９】
Ｙは、カウンターイオンであり、具体的には、ＣＨ３ＳＯ４−  、ＦＳＯ３−  、ＣＦ３ＳＯ３−  、  Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−  、ハロゲンイオン、あるいは下記式：
【００２０】
【化４】
0003584379.tif 000003
【００２１】
で表される基などが挙げられる。
【００２２】
前記式（Ｉ）で表される本発明の化合物の中でも、式（Ｉ）において、Ｒ１  がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ２  〜Ｒ５  が水素である化合物は、１分子当りの発光量が高く、溶液中で安定であり、さらに原料が安価で、容易に入手できる点で、有用である。特に、式（Ｉ）において、Ｒ１  がメチル基であり、Ｒ２  〜Ｒ５  が水素であるアクリジニウム化合物、または式（Ｉ）において、Ｒ１  がフェニル基であり、Ｒ２  〜Ｒ５  が水素であるアクリジニウム化合物が、有用である。
【００２３】
また、式（Ｉ）において、Ｒ１  がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ５  がアルキル基またはハロゲンであり、Ｒ２  〜Ｒ４  が水素であるアクリジニウム化合物が、１分子当りの発光量が高く、溶液中で安定であり、かつ原料が容易に入手でき、合成が容易である点で、有用である。特に、式（Ｉ）において、Ｒ１  がメチル基、Ｒ５  が塩素であり、Ｒ２  〜Ｒ４  が水素であるアクリジニウム化合物、および式（Ｉ）において、Ｒ１  およびＲ５  が塩素であり、Ｒ２  〜Ｒ４  が水素であるアクリジニウム化合物が、有用である。
【００２４】
さらに、式（Ｉ）において、Ｒ１  がアルキル基、アリール基またはハロゲンであり、Ｒ２  またはＲ３  の一方がニトロ基、アセチル基またはハロゲンであり、Ｒ５  がアルキル基または該アルキル基が隣接したＲとベンゼン環を形成しており、その他のＲが水素であるアクリジニウム化合物が、１分子当りの発光量が高く、溶液中で安定である点で、有用である。特に、式（Ｉ）において、Ｒ１  およびＲ５  がメチル基であり、Ｒ３  がニトロ基であり、Ｒ２  およびＲ４  が水素であるアクリジニウム化合物、式（Ｉ）において、Ｒ１  およびＲ５  がメチル基であり、Ｒ３  がアセチル基であり、Ｒ２  およびＲ４  が水素であるアクリジニウム化合物、式（Ｉ）において、Ｒ１  およびＲ５  がメチル基であり、Ｒ２  がアセチル基であり、Ｒ３  およびＲ４  が水素であるアクリジニウム化合物、および式（Ｉ）において、Ｒ１  がメチル基、Ｒ３  がアセチル基であり、隣接するＲ４  およびＲ５  が縮環してベンゼン環を形成したアクリジニウム化合物が、有用である。
【００２５】
本発明の化合物の具体例として、下記式（Ｉ−ａ）〜（Ｉ−ｈ）で表される化合物が挙げられる。
【００２６】
【化５】
0003584379.tif 000004
【００２７】
【化６】
0003584379.tif 000005
【００２８】
これらの化合物の中でも、式（Ｉ−ａ）で表される２′−メチルフェニル  アクリジニウム−９−カルボキシレート  トリフルオロメタンスルフォネートは、原料が安価で入手が容易で、反応工程が簡便であるため合成が容易であり、なおかつ安定性に優れる点で、有用である。
【００２９】
本発明の化合物の製造は、例えば、まず、目的のアクリジニウム化合物に対応するフェノール誘導体と、アクリジンカルボン酸誘導体とを、縮合剤の存在下に反応させ、アクリジンカルボン酸フェノールエステルを製造する。次に、得られたアクリジンカルボン酸フェノールエステルをアルキル化剤を用いてＮ−１０位をアルキル化することにより、アクリジニウムエステルを得る等の方法にしたがって行なうことができる。より具体的には、フェノール誘導体と９−クロロカルボニルアクリジンとを、塩基の存在下、溶媒中で反応させてアクリジンカルボン酸フェノールエステルを得ることができる。この反応において、用いられる塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン等が挙げられ、また、溶媒としては、例えば、塩化メチレン、エーテル、トルエン等が挙げられ、好ましい溶媒としては、塩化メチレンが挙げられる。
【００３０】
次に、保護基で結合性官能基を保護したアルキル化剤を、溶媒中もしくは溶媒の非存在下に、前記のアクリジンカルボン酸フェノールエステルと反応させて、結合性官能基を保護したアクリジニウムエステルを得ることができる。この反応において、用いられる保護基で結合性官能基を保護したアルキル化剤としては、例えば、置換ベンジル基またはｔ−ブチル基で保護したカルボン酸で置換した、ハロゲン化アルキル、またはトリフルオロメタンスルホン酸等の超強酸のアルキルエステル、好ましくはトリフルオロメタンスルホン酸のアルキルエステルなどが挙げられる。また、溶媒を用いる場合、その溶媒としては、例えば、塩化メチレン、クロロホルム等が挙げられる。
【００３１】
さらに、得られた結合性官能基を保護したアクリジニウムエステルに、溶媒の存在下もしくは非存在下に、酸触媒を作用させることにより、本発明のアクリジニウム化合物を製造することができる。この反応において、溶媒を用いる場合、用いられる溶媒としては、例えば、酢酸、塩化メチレン等が挙げられ、酸触媒としては、例えば、臭化水素酸、トリフルオロメチル酢酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明の化合物は、高い発光効率と、安定性に優れる特性を利用して、抗原、抗体、核酸等の特異結合物質の標識物質として有用である。
【００３３】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表されるアクリジニウム化合物が、活性基Ｚのみを介して特異結合物質と結合してなる複合体を提供するものである。この複合体は、前記式（Ｉ）で表されるアクリジニウム化合物が、Ｚを介して特異結合物質と直接的もしくは間接的に結合したものである。
【００３４】
本発明において、前記アクリジニウム化合物と結合される特異結合物質とは、ある特定の構造を有する物質と該物質と特異的に結合する物質の組み合わせにおける一方の物質をさし、該組み合わせの例としては、抗原と抗体、核酸と相補的核酸配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素とインヒビター、アビジンとビオチン、糖鎖を有する物質とレクチン等が挙げられる。
【００３５】
本発明の複合体において、前記式（Ｉ）で表されるアクリジニウム化合物と特異結合物質との結合は、共有結合で行なわれる。
【００３６】
本発明の複合体の製造は、前記式（Ｉ）で表されるアクリジニウム化合物と特異結合物質とを、通常の化学的反応によって結合させることによって行うことができる。例えば、特異結合物質が蛋白質であり、特異的結合物質構造中の結合部位がアミノ基である場合には、Ｚとして、−ＳＯ２Ｃｌ、Ｎ−スクシンイミジル基、Ｎ−フタルイミド基、−ＣＯＯＨ  、−ＣＯＣｌ  、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、等が好ましく選択され、Ｚと特異結合物質との結合方法としては、石川栄治他編「酵素免疫測定法」（第３版）、医学書院、７５−１５１（１９８７）等に記載された公知の方法を用いればよい。例えば、混合酸無水物法やコハク酸イミド等を用いる活性エステル化法等の脱水縮合反応やチオイソシアネートやアジドを用いる付加反応による方法が挙げられる。
【００３７】
また、前記式（Ｉ）で表されるアクリジニウム化合物と特異結合物質とを、間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のアクリジニウム化合物と特異結合物質との間に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のような蛋白質、または架橋試薬として知られる公知の物質を介在させてもよい。
【００３８】
本発明の複合体は、アクリジニウム環の１０−位のＮが非常に大きな分子と結合した形となり、アクリジニウム環の歪が大きくなるため、安定な標識化合物である。従って、該複合体は、化学発光物質を利用した免疫化学的アッセイ、ＤＮＡプローブアッセイ、レセプターアッセイ等への応用に大変有用である。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げ、本発明をより具体的に説明する。
【００４０】
（実施例１）
（１）２′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
アクリジン−９−カルボン酸０．４２ｇ（１．８７ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍｌに懸濁させ、加熱下に２時間還流させた。反応混合物から過剰の塩化チオニルを減圧下に留去し、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（収率：９６％）を得た。次に、得られた９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇと２−メチルフェノール０．２ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを、塩化メチレン１５ｍｌに懸濁させ、撹拌しながらトリエチルアミン１．０ｍｌと触媒量のジメチルアミノピリジンを加えた。反応混合物を１５時間室温にて撹拌した後、１規定塩酸、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層を分離して無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下に溶媒を蒸発させた。得られた残分を塩化メチレン−ヘキサンを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的とする２′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．３３ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．３７（３Ｈ，ｓ），  ７．３−８．３（１２Ｈ，ｍ），
ＭＳ：Ｍ＋  ３１３
【００４１】
（２）２′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート１４２ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌに溶解し、  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，９８，  ｐ２６４  （１９８６）  に記載の方法により得られたベンジルオキシカルボニルメチル  トリフルオロメタンスルフォネート１．４ｇを加えた後、アルゴン雰囲気下、室温にて４日間攪拌しながら反応させた。反応混合物にエーテル２０ｍｌを加え、生じた沈澱を濾別し、さらにエーテルで洗浄した。得られた２′−メチルフェニル  １０−ベンジルオキシカルボニルメチルアクリジニウム−９−カルボキシレート  トリフルオロメタンスルフォネートを、２５％臭化水素酸−酢酸溶液５ｍｌに加え、５０℃で２時間撹拌して反応させた。反応混合物にエーテル１００ｍｌを加え、生じた沈澱を濾過した。得られた粗生成物をエーテルで洗浄後、逆相ＨＰＬＣで精製し、目的とする２′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２」という）２０２ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ３７２
【００４２】
（実施例２）
（１）２′−ビフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２−フェニルフェノール０．３３ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−ビフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５７ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．３−８．３（１７Ｈ，ｍ），
ＭＳ：Ｍ＋  ３７５
【００４３】
（２）２′−ビフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−ビフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′−ビフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−３」という）５０ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４３４
【００４４】
（実施例３）
（１）２′−メチル−６′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と２−メチル−６−クロロフェノール０．２８ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−メチル−６′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４３（３Ｈ，ｓ），  ７．２−８．６  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３４７
【００４５】
（２）２′−メチル−６′−クロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−メチル−６′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２８ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′−メチル−６′−クロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−４」という）３０ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４０６
【００４６】
（実施例４）
（１）２′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成    出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と２，６−ジクロロフェノール０．３２ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４２ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．３−８．７  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３５７
【００４７】
（２）２′，６′−ジクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−５」という）２８ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４１６
【００４８】
（実施例５）
（１）２′，６′−ジメチル−４′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と２，６−ジメチル−４−ニトロフェノール０．３３ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジメチル−４′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５０ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．５２  （６Ｈ，ｓ），  ７．９−８．４  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３７２
【００４９】
（２）２′，６′−ジメチル−４′−ニトロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジメチル−４′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート１２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−４′−ニトロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−６」という）８ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４３１
【００５０】
（実施例６）
（１）２，６−ジメチル−４−アセチルフェノールの合成
氷冷した２，６−ジメチルフェノール１２．２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液に、攪拌しながら無水塩化アルミニウム１４．４ｇを徐々に加え、さらに塩化アセチル９．４ｇを徐々に加えた。反応混合物を１０℃以下で１時間、続いて室温で３時間攪拌した後、氷水中に投入した。次に、塩化メチレンを用いて反応生成物を抽出した後、抽出層を水で洗浄した。さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。残分をベンゼンで再結晶させ、目的とする２，６−ジメチル−４−アセチルフェノール１．９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．２５  （６Ｈ，ｓ），  ２．５１  （３Ｈ，ｓ），  ５．７  （１Ｈ，ｂｒ），  ７．５１  （２Ｈ，ｓ）
ＭＳ：Ｍ＋  １６４
【００５１】
（２）２′，６′−ジメチル−４′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
上記の（１）で得られた２，６−ジメチル−４−アセチルフェノール０．３０ｇと、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とを、出発原料として用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジメチル−４′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５４ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．５０  （６Ｈ，ｓ），  ２．６４  （３Ｈ，ｓ），  ７．６−８．５  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３６９
【００５２】
（３）２′，６′−ジメチル−４′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（２）で得られた２′，６′−ジメチル−４′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２６ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−４′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−７」という）１６ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４２８
【００５３】
（実施例７）
（１）２，４−ジメチル−３−ニトロアセトフェノンの合成
冷却した発煙硝酸−無水酢酸混液に、２，４−ジメチルアセトフェノン７５ｇ（０．５ｍｏｌ）を徐々に加え、１０℃以下で３時間撹拌した。反応混合物を氷水中に投入し、析出した沈澱を濾別した。次に、得られた沈澱を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム、水の順に用いて洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。残分をヘキサン−酢酸エチルを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的とする２，４−ジメチル−３−ニトロアセトフェノン８．９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．３２  （３Ｈ，ｓ），  ２．３８  （３Ｈ，ｓ），  ２．５６  （３Ｈ，ｓ），  ３．３  （１Ｈ，ｂｒ），                    ７．３８  （２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２５Ｈｚ）
ＭＳ：Ｍ＋  １９３
【００５４】
（２）２，４−ジメチル−３−アミノアセトフェノンの合成
上記の（１）で得られた２，４−ジメチル−３−ニトロアセトフェノン８．９ｇ（４６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液に、１０％パラジウム炭素１００ｍｇを加え、撹拌しながら水素ガスを１時間３０分吹き込んで反応させた。反応混合物からパラジウム炭素を濾別した後、濾液を減圧下に濃縮し、目的とする２，４−ジメチル−３−アミノアセトフェノン７．５ｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  １６３
【００５５】
（３）２，４−ジメチル−３−ヒドロキシアセトフェノンの合成
上記の（２）で得られた２，４−ジメチル−３−アミノアセトフェノン７．５ｇ（４６ｍｍｏｌ）を１．５規定塩酸に溶解した溶液を氷冷し、攪拌しながら水１７ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム３．３ｇを加え、氷冷下に１時間、さらに１５時間加熱下に還流して反応させた。次に、反応混合物を塩化メチレンで抽出し、抽出層を水で洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に溶媒を留去した。残分を、ヘキサン−酢酸エチルを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的とする２，４−ジメチル−３−ヒドロキシアセトフェノン１．２ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．２５  （３Ｈ，ｓ），  ２．３６  （３Ｈ，ｓ），  ２．５４  （３Ｈ，ｓ），  ５．３１  （１Ｈ，ｂｒ），                  ７．０３  （２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１８Ｈｚ）
ＭＳ：Ｍ＋  １６４
【００５６】
（４）２′，６′−ジメチル−３′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
上記の（３）で得られた２，４−ジメチル−３−ヒドロキシアセトフェノン０．３０ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とを、出発原料として、実施例１の（１）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−３′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．３６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．５３  （６Ｈ，ｓ），  ２．６４  （３Ｈ，ｓ），  ７．３−７．９  （８Ｈ，ｍ），                  ８．３７  （２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１０Ｈｚ），
ＭＳ：Ｍ＋  ３６９
【００５７】
（５）２′，６′−ジメチル−３′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（４）で得られた２′，６′−ジメチル−３′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−３′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−８」という）２１ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４２８
【００５８】
（実施例８）
（１）２′，６′−ジメチル−４′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と２，６−ジメチル−４−クロロフェノール０．３０ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジメチル−４′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４４ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４１  （６Ｈ，ｓ），  ７．２−８．５  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３６１
【００５９】
（２）２′，６′−ジメチル−４′−クロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジメチル−４′−クロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３６ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−４′−クロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−９」という）４７ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４２０
【００６０】
（実施例９）
（１）２′，６′−ジメチル−４′−ブロモフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，６−ジメチル−４−ブロモフェノール０．３９ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジメチル−４′−ブロモフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４１ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４１  （６Ｈ，ｓ），  ７．３−８．４  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ４０６
【００６１】
（２）２′，６′−ジメチル−４′−ブロモフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジメチル−４′−ブロモフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３８ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジメチル−４′−ブロモフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１０」という）４６ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４６５
【００６２】
（実施例１０）
（１）２−メチル−４−アセチル−１−ナフトールの合成
氷冷した２−メチル−１−ナフトール７．９ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液に、攪拌しながら無水塩化アルミニウム７．２ｇを徐々に加え、さらに塩化アセチル４．７ｇを徐々に加えて反応させた。反応混合物を１０℃以下で１時間、さらに室温で３時間攪拌して反応させた後、氷水中に反応混合物を投入した。次に、塩化メチレンを用いて反応生成物を抽出した後、抽出層を水で洗浄した。さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。残分をベンゼンで再結晶させ、目的とする２−メチル−４−アセチル−１−ナフトール３．９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４５  （３Ｈ，ｓ），  ２．７１  （３Ｈ，ｓ），  ５．８  （１Ｈ，ｂｒ），  ７．３−９．０  （５Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ２００
【００６３】
（２）１′−（２′−メチル−４′−アセチル）ナフチルアクリジン−９−カルボキシレートの合成
上記の（１）で得られた２−メチル−４−アセチル−１−ナフトール０．３６ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とを、出発原料として用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、目的とする１′−（２′−メチル−４′−アセチル）ナフチルアクリジン−９−カルボキシレート０．６７ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．７６  （３Ｈ，ｓ），  ２．８０  （３Ｈ，ｓ），  ７．５−８．８  （１３Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ４０５
【００６４】
（３）１′−（２′−メチル−４′−アセチル）ナフチル−１０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（２）で得られた１′−（２′−メチル−４′−アセチル）ナフチルアクリジン−９−カルボキシレート３３ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、目的とする１′−（２′−メチル−４′−アセチル）ナフチル−１０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１１」という）３５ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４６４
【００６５】
（実施例１１）
２′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
実施例１で得られた２′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３０ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）に、  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，７７，  ｐ８５５  （１９８８）  に記載の方法により得られた６−ヨウ化ペンタン酸ベンジルエステル２．４ｇを加えた後、１１０℃で２４時間攪拌して反応させた。反応混合物にエーテルを加え、生じた沈澱を濾別し、さらにエーテルで洗浄した。得られた２′−メチルフェニル１０−ベンジルオキシカルボニルブチルアクリジニウム−９−カルボキシレートヨーダイドを、２５％臭化水素酸−酢酸溶液５ｍｌに加え、５０℃で２時間撹拌して反応させた。その後、反応混合物にエーテルを加え、生じた沈澱を濾別した。得られた沈澱をエーテルで洗浄後、逆相ＨＰＬＣで精製し、２′−メチルフェニル  １０−カルボキシブチルアクリジニウム−９−カルボキシレートブロマイド（以下、「ＭＡＣ−１２」という）３０ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４１４
【００６６】
（実施例１２）
（１）２′−メチル−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２−メチル−４−フルオロフェノール０．２４ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、目的とする２′−メチル−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．３７  （３Ｈ，ｓ），  ７．０−８．４  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３３１
【００６７】
（２）２′−メチル−４′−フルオロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−メチル−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３１ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′−メチル−４′−フルオロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１３」という）４９ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ３９０
【００６８】
（実施例１３）
（１）２−メチル−６−ニトロフェノールの合成
氷冷した２−メチルフェノール１０．８ｇ（０．１ｍｍｏｌ）の酢酸溶液に、発煙硝酸６．３ｇを攪拌しながら徐々に加えて反応させた。反応混合物を２０℃以下の温度で１時間攪拌した後、氷水中に投入した。酢酸エチルを用いて反応生成物を抽出し、抽出層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水の順に用いて洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残分を、ベンゼン−酢酸エチルを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的とする２−メチル−６−ニトロフェノール１．３ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．２９  （３Ｈ，ｓ），  ５．７  （１Ｈ，ｂｒ），  ６．７−８．０  （３Ｈ，ｓ）
ＭＳ：Ｍ＋  １５３
【００６９】
（２）２′−メチル−６′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、上記の（１）で得られた２−メチル−６−ニトロフェノール０．２８ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−メチル−６′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５３ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４６  （３Ｈ，ｓ），  ７．４−８．６  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３５８
【００７０】
（３）２′−メチル−６′−ニトロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（２）で得られた２′−メチル−６′−ニトロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２４ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）を用い、実施例１の（２）と同様にして、２′−メチル−６′−ニトロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１４」という）１２ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４１７
【００７１】
（実施例１４）
（１）２′，６′−ジブロモフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，６−ジブロモフェノール０．４９ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジブロモフェニル
アクリジン−９−カルボキシレート０．５５ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．０−８．８  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ４５７
【００７２】
（２）２′，６′−ジブロモフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジブロモフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３５ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、目的とする２′，６′−ジブロモフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１５」という）３６ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ５１６
【００７３】
（実施例１５）
（１）２′−フルオロ−６′−メトキシフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２−フルオロ−６−メトキシフェノール０．２８ｇ（１．９ｍｍｏｌとを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−フルオロ−６′−メトキシフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．３９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ４．０３  （３Ｈ，ｓ），  ６．８−８．５  （１１Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３４７
【００７４】
（２）２′−フルオロ−６′−メトキシフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−フルオロ−６′−メトキシフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート１９ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′−フルオロ−６′−メトキシフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１６」という）３０ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４０６
【００７５】
（実施例１６）
（１）２′−メチル−４′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２−メチル−４，６−ジクロロフェノール０．３４ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−メチル−４′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．３６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４１  （３Ｈ，ｓ），  ７．３−８．６  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３８１
【００７６】
（２）２′−メチル−４′，６′−ジクロロフェニル  １０−カルキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成上記の（１）で得られた２′−メチル−４′，６′−ジクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３９ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′−メチル−４′，６′−ジクロロフェニル  １０−カルキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１７」という）２８ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４４０
【００７７】
（実施例１７）
（１）２′，４′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，４，６−トリクロロフェノール０．３８ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，４′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．５−８．６  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ４０１
【００７８】
（２）２′，４′，６′−トリクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，４′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２７ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′，４′，６′−トリクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１８」という）１４ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４６０
【００７９】
（実施例１８）
（１）２′，３′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，３，６−クリクロロフェノール０．３８ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，３′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．５−８．７
ＭＳ：Ｍ＋  ４０１
【００８０】
（２）２′，３′，６′−トリクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，３′，６′−トリクロロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′，３′，６′−トリクロロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−１９」という）４１ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４６０
【００８１】
（実施例１９）
（１）２′，６′−ジクロロ−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，６−ジクロロ−４−フルオロフェノール０．３５ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジクロロ−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５９ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．３−８．６  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３８５
【００８２】
（２）２′，６′−ジクロロ−４′−フルオロフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジクロロ−４′−フルオロフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート３６ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′，６′−ジクロロ−４′−フルオロフェニル１０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２０」という）５０ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４４４
【００８３】
（実施例２０）
（１）２′，６′−ジブロモ−４′−シアノフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２，６−ジブロモ−４′−シアノフェノール０．５４ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′，６′−ジブロモ−４′−シアノフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．６４ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．８−８．６  （１０Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ４８２
【００８４】
（２）２′，６′−ジブロモ−４′−シアノフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′，６′−ジブロモ−４′−シアノフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート４１ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′，６′−ジブロモ−４′−シアノフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２１」という）２４ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ５４１
【００８５】
（実施例２１）
（１）１′−（２′−クロロ）ナフチル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐ５８２  （１９７４）  に記載の方法により得られた２−クロロ−１−ナフトール０．３５ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、１′−（２′−クロロ）ナフチル  アクリジン−９−カルボキシレート０．５５ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ７．５−８．７  （１４Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３８３
【００８６】
（２）１′−（２′−クロロ）ナフチル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた１′−（２′−クロロ）ナフチル  アクリジン−９−カルボキシレート３７ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、１′−（２′−クロロ）ナフチル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２２」という）５３ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４４２
【００８７】
（比較例１）
（１）３′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、３−メチルフェノール０．２１ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、３′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４８ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４７（３Ｈ，ｓ），  ７．２−８．４  （１２Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３１３
【００８８】
（２）３′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた３′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２７ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、３′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２３」という）４２ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ３７２
【００８９】
（比較例２）
（１）４′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、４−メチルフェノール０．２１ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、４′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４７ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．４３（３Ｈ，ｓ），  ７．３−８．４  （１２Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３１３
【００９０】
（２）４′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた４′−メチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２６ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、４′−メチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２４」という）３７ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ３７２
【００９１】
（比較例３）
（１）２′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレートの合成
出発原料として、９−クロロカルボニルアクリジン塩酸塩０．５ｇ（１．８ｍｍｏｌ）と、２−アセチルフェノール０．２６ｇ（１．９ｍｍｏｌ）とを用いた以外は、実施例１の（１）と同様にして、２′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート０．４２ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：δ  ２．５８（３Ｈ，ｓ），  ７．５−８．５  （１２Ｈ，ｍ）
ＭＳ：Ｍ＋  ３４１
【００９２】
（２）２′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネートの合成
上記の（１）で得られた２′−アセチルフェニル  アクリジン−９−カルボキシレート２７ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１の（２）と同様にして、２′−アセチルフェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフォネート（以下、「ＭＡＣ−２５」という）３４ｍｇを得た。
ＭＳ：Ｍ＋  ４００
【００９３】
（実施例２２）
前記の実施例１〜実施例２４で得られたアクリジニウム化合物のＭＡＣ−２〜ＭＡＣ−２５と、フェニル  １０−カルボキシメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートブロマイド（以下、「ＭＡＣ−１」という）とを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、１×１０−３Ｍの溶液をそれぞれ調製した。さらに、各溶液をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ６．４）を用いて希釈し、１×１０−９Ｍの溶液にした。それぞれの希釈溶液１０μｌに、０．５％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液３００μｌを加えた後、０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液３００μｌを加え、生じた化学発光を化学発光測定装置  ＡｕｔｏＣｌｉｎｉＬｕｍａｔ  ＬＢ９５２  Ｔ／１６  （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  ＦＲＧ）を用いて２秒間（但し、これよりも長い間隔の場合は、表１中に特に表示した）測定し、各化合物の発光量をモル当りの発光量（カウント／モル）で表した。
【００９４】
（実施例２３）
ＭＡＣ−１〜ＭＡＣ−２５をそれぞれＤＭＦに溶解して１×１０−３Ｍ  ＤＭＦ溶液を調製し、さらに、ＰＢＳを用いて希釈し、１  ×１０−７Ｍの溶液にした後、遮光下、４５℃で１週間保存した。各保存溶液をＰＢＳを用いて希釈し、１  ×１０−９Ｍの溶液にした。これらの希釈溶液のそれぞれについて、実施例２５と同様にして化学発光を測定し、下記式（ａ）に基づいて１週間放置後の発光活性残存率を算出し、安定性の指標とした。表１に、各化合物の安定性を発光活性残存率（％）で示した。
【００９５】
発光活性残存率（％）＝（１週間後の発光量／調製時の発光量）×１００
【００９６】
【表１】
0003584379.tif 000006
【００９７】
（実施例２４）
（１）アクリジニウムエステル標識抗体の作製
実施例１で得られたＭＡＣ−２の１．５×１０−２Ｍ  ＤＭＦ溶液８０μｌを調製し、これに０．１６Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのＤＭＦ溶液２０μｌと、０．１２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩のＤＭＦ／水（４／６）混合溶液２０μｌを加え、室温で３時間反応させた。次に、反応混合物７μｌを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）にて３ｍｇ／ｍｌに調製した抗ｈＣＧモノクローナル抗体溶液７０μｌに添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア）に付し、ＰＢＳで溶出して、アクリジニウム標識モノクローナル抗体を調製した。
【００９８】
得られたアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース  （Ｗｈａｔｍａｎｎ）  を担体とする陰イオン交換カラムに付し、０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の塩濃度勾配により溶出させて精製した。次に、得られた標識モノクローナル抗体の発光量を測定し、またタンパク定量を行なった。
その結果、得られたアクリジニウムエステル標識モノクローナル抗体において、発光量から得られたアクリジニウムエステルの濃度と抗体のタンパク濃度の比により、抗体１分子当り約１個のＭＡＣ─２が標識されていることが分かった。
【００９９】
（２）アクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブの作製
実施例１で得られたＭＡＣ−２の６×１０−２Ｍ  ＤＭＦ溶液４０μｌを調製し、これに０．２４Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＭＦ溶液１０μｌと０．１８Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／ＤＭＦ−水（４：６）溶液１０μｌとを加え、室温で３時間反応させた。反応混合物８μｌを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）によって０．１５ｍｇ／ｍｌに調製されたオリゴマープローブ［ＨＢＶＣ領域１９４１−１９７０，３０ｍｅｒ（ＨＢ１０１０−ＮＨ２  （３′））／核酸合成機にて合成］溶液２０μｌに添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応液をセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア）に入れ、０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）−アセトニトリル（８：２）で溶出し、標識化ＨＢ１０１０を得た。
【０１００】
さらに、得られた標識化ＨＢ１０１０を逆相ＨＰＬＣにてトリエチルアミンアセテート／水−アセトニトリルの濃度勾配により溶出させた。各分画の２６０ｎｍにおける吸光度と発光強度を測定し、両者の一致した分画を集めた。集めた分画を、エタノール沈澱によって脱塩し、５０μｌのアッセイバッファー［４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ）、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ］を加え溶解してアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブを作製した。
【０１０１】
（３）アクリジニウムエステル標識抗体を用いた化学発光免疫測定
２μｇの抗ｈＣＧβサブユニットモノクローナル抗体（持田製薬製）を固相化したポリスチレンチューブにアッセイ用緩衝液（１０％正常家兎血清（ペルフリーズ社製）、１％マウス血清（実験動物協会製）、０．１％牛血清アルブミン（生化学工業社製）／ＰＢＳ）１５０μｌと、各濃度のｈＣＧスタンダード（１ｓｔ．ＩＲＰ  ７５／５３７）５０μｌを加え室温で１時間振とうした。つぎに洗浄液（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を用いて３回洗浄後、上記の（１）で作製されたアクリジニウムエステル標識抗ｈＣＧモノクローナル抗体をアッセイ用緩衝液で希釈した溶液２００μｌを加え、室温で１時間振とうした。洗浄液を用いて３回洗浄後、０．５％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液３００μｌを加え、次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液３００μｌを加え、生じる化学発光を化学発光測定装置  ＡｕｔｏＣｌｉｎｉＬｕｍａｔ  ＬＢ９５２  Ｔ／１６  （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  ＦＲＧ）を用いて２秒間測定した。得られた標準曲線を図１に示す。この標準曲線より求められるｈＣＧの検出限界は、０．１ＩＵ／Ｌであった。
【０１０２】
（４）アクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブを用いたＨＢＶ−ＤＮＡの測定
ＨＢＶ−ＤＮＡ（３．２ｋｂ）配列がクローニングされたｐＢＲＨＢａｄｒ４ベクターより、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて、３．２ｋｂ配列を切り出し、アガロース電気泳動により分離精製した。得られたＨＢＶ−ＤＮＡの濃度を２６０ｎｍの吸光度より求めた。次に、得られたＨＢＶ−ＤＮＡを、ＥＤＴＡを０．００１Ｍ含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、１〜１００ｐｇ／ｍｌの標準溶液を調製した。この標準溶液を、１００℃で１０分間処理して熱変性した後、９６ウエルマイクロタイタプレートに吸着固定化させた。洗浄後、２００μｌのアッセイバッファーを加え、６０℃で１時間プレインキュベーションした。次いで、上記の（１）で作製したアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブ溶液を１×１０６  ＲＬＵ／ウェルとなるように加え、６０℃で１時間反応（ハイブリダイゼーション）させた。反応混合物から上清を除去後、５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを加え、５分間インキュベーションした（洗浄）。この操作を５回繰り返した。マイクロプレートを化学発光測定装置  Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ＣＴ−９０００Ｄ（中央化学工業）に設置し、０．５％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液１２０μｌを加え、次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液１２０μｌを加え、生じる化学発光を２秒間測定したところ、図２に示すごとく、１ｐｇ／ｍｌまで測定可能であった。
【０１０３】
（５）アクリジニウムエステル標識抗体の安定性
上記の（１）で調製したアクリジニウムエステル標識抗体を、抗体濃度で０．１μｌ／ｍｌとなるように、１０％正常家兎血清、１％マウス血清、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（アッセイ用緩衝液）で希釈し、さらに凍結乾燥したものを、温度４５℃、湿度９０％にて１４日間保存した。保存した凍結乾燥品を経時的に取り出し、水を用いて溶解後、上記の（３）に準じて発光量を測定した結果、標識物の化学発光活性に減少は認められなかった。
【０１０４】
（５）アクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブの安定性
上記の（２）で作製したアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブをアッセイブッファーで希釈し５０ｎｇ／ｍｌの溶液とした。この溶液を用いて作製したプローブのハイブリダイゼーションの条件（６０℃、１時間処理）下での安定性を検討したところ、約６０％の発光活性が保持されていた。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明のアクリジニウム化合物は、高い発光効率を有し、かつ安定性に優れるものである。そのため、本発明のアクリジニウム化合物は、化学発光標識として有用である。
また、本発明の複合体は、このアクリジニウム化合物と特異結合物質との複合体であるため、高い発光効率を有し、かつ安定性に優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２８で調製されたアクリジニウムエステル標識抗体を用いた化学発光免疫測定の結果。
【図２】実施例２８で調製されたアクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブを用いたＨＢＶ−ＤＮＡの測定結果。
【図１】
0003584379.tif 000009
【図２】
0003584379.tif 000010