(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と界面活性剤が存在する条件下で免疫担当細胞を培養し、前記免疫担当細胞の生存率を得ることによって被検物質の免疫毒性を評価する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の被検物質の免疫毒性を評価する方法であって、前記免疫担当細胞が樹状細胞および樹状細胞に由来する細胞からなる群より選択されることを特徴とする被検物質の免疫毒性を評価する方法。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の被検物質の免疫毒性を評価する方法であって、前記界面活性剤がポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルであって、前記免疫担当細胞がＪＡＷＳＩＩ細胞であることを特徴とする被検物質の免疫毒性を評価する方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の被検物質の免疫毒性を評価する方法であって、前記生存率がＭＴＴ法によって計測されることを特徴とする被検物質の免疫毒性を評価する方法。
【請求項５】
以下を具備することを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の被検物質の免疫毒性を評価する方法；
（１）被検物質と界面活性剤が存在する第１の培養系で免疫担当細胞を培養すること、同時に界面活性剤のみが存在する第２の培養系で免疫担当細胞を培養すること、
（２）（１）の培養後の前記免疫担当細胞の生存率を得ること、
（３）（２）によって得られた第１の培養系の生存率と第２の培養系の生存率を比較することによって被検物質の免疫毒性を評価すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質の免疫毒性を検出するインビトロの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ダイオキシンをはじめとする外因性内分泌撹乱物質の毒性が社会問題化している。外因性内分泌撹乱物質は一般的には環境ホルモンとも称され、その毒性は、生殖障害、免疫系の障害および中枢系の障害と多岐に亘る。
【０００３】
例えば、ダイオキシンなどの高濃度暴露によって急激な胸腺退縮が惹起されることが報告されている（Ｋｅｒｋｖｌｉｅｔ  Ｎ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２  ｐｐ１４６−１５４（１９９０））。このように、免疫系に対する急性毒性試験は、実験動物を用いるインビボ系で実施されるのが一般的であるが、これは多くの被検物質を簡便にスクリーニングするのには適切ではない。
【０００４】
一方、新規材料を含む様々な物質についての環境ホルモン毒性を検出するために用いられる従来のインビトロ試験法には、例えば、環境ホルモンのエストロゲン作用を特異的に検出するＥ−ＳＣＲＥＥＮ法（Ｓｏｔｏ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｃｅｔ，  １０３  ｐｐ１１３−１２２（１９９５））や、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｊ．  ｅ  ａｌ．  Ｔｏｘｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １５４  ｐｐ７６−８３（１９９９））などの幾つかの方法が用いられている。このような従来の方法は、エストロゲン作用やアンドロジェン作用などの生殖毒性を検出するものである。従って、内分泌撹乱物質の生殖毒性以外の毒性を簡便に且つ短時間に検出できるインビトロアッセイ系は確立されていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような状況において、内分泌撹乱物質の免疫毒性を簡易に且つ短時間に検出できるアッセイ系の確立が強く望まれている。本発明は、このような要望に応えるためになされたものである。即ち、本発明の目的は、被検物質、特に、内分泌撹乱物質、の免疫毒性を評価する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を解決するために、本発明者らは鋭意研究の結果、以下の手段を見出した。即ち、
被検物質と界面活性剤が存在する条件下で免疫担当細胞を培養し、前記免疫担当細胞の生存率を得ることによって被検物質の免疫毒性を評価する方法
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の検出の対象となる「内分泌撹乱物質」は、生体の恒常性、生殖、発生または行動に関する種々の生体内ホルモンの合成、貯蔵、分泌、体内輸送、受容体結合、ホルモン作用または排出等の諸過程を阻害する外因性化学物質のことをいい、一般的には、「外因性内分泌撹乱物質」、「内分泌撹乱物質」または「内分泌障害性物質」、或いは「環境ホルモン」と称される化学物質である。また、このような物質は、一般的に、ｐｐｂ  から  ｐｐｔ  のレベルの極微量で、生物の生殖系、神経系および免疫系等の種々の機能対して慢性的に影響を与えるものである。
【０００８】
上述した通り、内分泌撹乱物質は、非常に低濃度で慢性的に影響を与えるものである。従って、内分泌撹乱物質の免疫毒性を短時間で評価することは困難である。仮に、本発明を使用せずに、インビトロで培養する免疫担当細胞を内分泌撹乱物質に暴露し、従来の細胞毒性試験によってその毒性を検出するまでには非常に長時間が必要である。また、被検物質となった内分泌撹乱物質の毒性が、一般的な他の内分泌撹乱物質よりも更に低いような場合には、検出までに更なる時間を要するばかりではなく、従来の方法では見逃してしまう危険性が高い。従って、従来では内分泌撹乱物質の免疫毒性を検出することは困難である。
【０００９】
驚くべきことに、本発明によれば、このような内分泌撹乱物質の免疫毒性を検出するインビトロアッセイ方法が提供される。その上、本発明によれば、簡易な手順により短時間に且つ正確に内分泌撹乱物質の免疫毒性を検出することが可能である。
【００１０】
本発明に従うと、被検物質と界面活性剤が存在する条件下で免疫担当細胞を培養し、前記免疫担当細胞の生存率を得ることによって被検物質の免疫毒性を評価する方法が提供される。
【００１１】
以下、図１を用いて本発明の態様を説明する。
【００１２】
本発明に従うの被検物質の免疫毒性を評価する方法は、以下の（ａ）および（ｂ）を順次に行うことによって実施される。
【００１３】
（ａ）外因性内分泌撹乱物質のインビトロアッセイ系
免疫担当細胞を２つの培養系で培養する。培養系１では、被検物質および界面活性剤を含む培地５で免疫担当細胞３を培養する。培養系２では、界面活性剤を含む培地５で免疫担当細胞３を培養する。即ち、培養系１は、当該免疫担当細胞を被検物質に暴露するための被検物質系である。培養系２は、当該免疫担当細胞を被検物質の非存在下で培養するためのコントロール系である。
【００１４】
（ｂ）外因性内分泌撹乱物質の免疫毒性評価
前記（ａ）で得られた２つの培養系の細胞について、夫々に生存率を求め、それらを比較することによって被検物質の免疫毒性を評価する。
【００１５】
本発明において使用可能な免疫担当細胞は、脾臓および胸腺などの免疫系組織から単離した細胞、精製したリンパ球、株化または癌化若しくは腫瘍化したそれら何れかの細胞、並びにそれ自身公知の細胞工学的技術で修飾されたそれら何れかの細胞であってよい。そのような細胞の例は、樹状細胞および株細胞ＪＡＷＳＩＩなどであるが、これに限られるものではない。また、何れかの手段によってダイオキシン受容性が亢進された細胞を使用してもよい。例えば、ダイオキシンと結合性のあるアリルハイドロカーボン受容体の発現を増強された樹状細胞がボルダーストラスらによって報告されている（Ｖｏｒｄｅｒｓｔｒａｓｓｅ  Ｂ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｌ．  １７１  ｐｐ１１７−１２５（２００１））。前記文献によると該細胞はダイオキシン受容性が顕著に上昇することが示されている。このような細胞も本発明に従って使用されてもよい。
【００１６】
本発明において使用可能な界面活性剤は、蛋白質の変性作用が低く、臨界ミセル濃度（以下、ｃｍｃと略す）が低いものが望ましい。例えば、ステロイド環を持つ陰イオン性界面活性剤であるコール酸系界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどや、ポリオキシレン鎖を持つ非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン系界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎ（２３）ｌａｕｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）などが使用されてもよい。ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルは、和光純薬社およびシグマ社から入手することが可能であり、また、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）としてＩＣＩ社から入手することも可能である。
【００１７】
本発明において使用される培地は、使用する免疫担当細胞に適切なそれ自身公知の従来の培地であればよい。また、培養時間は生存に影響が出る時間であればよく、温度およびＣＯ２濃度などの他の培養条件は、使用する細胞に適切なそれ自身公知の従来の条件であってよい。
【００１８】
細胞の生存率は、それ自身公知の何れの生細胞数を計測する方法を用いてもよい。例えば、ＭＴＴ法、３Ｈ−チミジン取り込み法、トリパンブルー排除試験などそれ自体公知の生細胞を計測する方法またはそれらの変法を用いてもよい。或いは、ダブリングタイムの違いや細胞密度による光透過性の違い等から免疫毒性を評価してもよい。
【００１９】
また、免疫毒性の評価は、被検物質系とコントロール系とで得られた生存率を統計学的に比較し、有意差の有無によって毒性の有無を評価してもよい。
【００２０】
また、上述の態様では、２つの培養系を用いて比較することにより免疫毒性を評価したが、被検物質と界面活性剤とを含む培養系のみにおいて免疫担当細胞を培養し、その成長曲線から、或いは予め任意に選択した閾値との比較から免疫毒性の評価を行ってもよい。
【００２１】
本発明に従うと、内分泌撹乱物質の免疫系への影響を、免疫担当細胞における致死的影響を検出することによって検出することが可能である。
【００２２】
本発明に従うと、免疫担当細胞における内分泌撹乱物質の致死的影響を測定可能な細胞培養系も提供される。基本的には、そのような培養系は、被検物質および界面活性剤を含む培地で免疫担当細胞を培養する系である。
【００２３】
本発明に従うと、内分泌撹乱物質が有する免疫毒性を急性免疫毒性のように検出することが可能である。
【００２４】
また、本発明に従うと、内分泌撹乱物質、化学物質、新規材料、廃棄物および天然物由来の物質などについて免疫毒性の判定を容易に、更に、極微弱な毒性を有する場合であっても、より確実に検出することが可能である。
【００２５】
以下、例を用いて本発明を更に詳しく説明する。しかしながら、これらの例によって本発明が制限されるものではない。
【００２６】
例
外因性内分泌物質のインビトロアッセイ系
（１）ＪＡＷＳ  ＩＩの培養
マウス骨髄由来樹状細胞種ＪＡＷＳ  ＩＩを、２０％のウシ胎児血清と５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（即ち、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）を含むα−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。
【００２７】
（２）ダイオキシン異性体のインビトロアッセイ
前記（１）で培養した細胞を０．２５％のトリプシン処理によって回収した。これを１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞濃度に２０％のウシ胎児血清と５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含むα−ＭＥＭ培地を用いて細胞液に調製した。この細胞液を１０個の滅菌済みエッペンドルフチューブにそれぞれ０．７ｍＬずつ分注した。１０個のうちの１つに、水中（即ち水溶液）で１０ｍＭのＢｒｉｊ３５を０．７μＬ添加した。残りのチューブには、チューブ毎に以下のダイオキシン異性体（Ａ）〜（Ｉ）の群から選択された１をトルエンまたはイソオクタン中で１００μＭに調製した溶液を７μＬと、水中（即ち水溶液）で１０ｍＭのＢｒｉｊ３５を０．７μＬとを添加した。
【００２８】
使用したダイオキシン異性体；
（Ａ）  １−クロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１−Ｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｂ）  ２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（２，７−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｃ）  １，２，４−トリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，４−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｄ）  ２，３，７，８−テトラオロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（２，３，７，８−Ｔｅｔｒａｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下２３７８−ＴＣＤＤと称する）
（Ｅ）  １，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，３，７，８−Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下１２３７８−ＨＣＤＤと称する）、
（Ｆ）  １，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，３，４，７，８−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｇ）  １，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，３，７，８，９−Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｈ）  １，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，３，４，６，７，８−Ｈｅｐｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、
（Ｉ）  １，２，３，４，５，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（１，２，３，４，５，６，７，８，９−Ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）。
【００２９】
これをボルテックスミキサーで撹拌し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。６時間後、ＭＴＳ溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、フェナジンエチトスルフェート含有）を２０μＬ添加してよく混和し、更に４時間、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。その後、各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【００３０】
（３）毒性の判定
前記（２）で得られた各ウェルの吸光度を、ダイオキシン未添加細胞ウェルの吸光度に対して比をとった。図２は、ダイオキシン未添加細胞の生存率を１００とした場合の被検物質（Ａ）〜（Ｉ）添加群の生存率を１００分率で示した図である。
【００３１】
図２から明かであるように、従来毒性のあることが知られいた２３７８−ＴＣＤＤおよび１２３７８−ＨＣＤＤ以外の異性体にも毒性があることが示された（図２）。
【００３２】
以上のように、本発明に従うと、内分泌撹乱物質の免疫担当細胞に対する致死的影響を測定することによって、前記内分泌撹乱物質の免疫毒性を評価することが可能であった。本発明は、今後、新規材料の毒性の判定に利用されることが期待される。
【００３３】
【発明の効果】
本発明に従うと、被検物質の免疫毒性を免疫毒性を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従う方法の例を示す図。
【図２】本発明に従う免疫毒性評価方法によって内分泌撹乱物質を評価した結果を示すグラフ。
【図１】
0003593078.tif 000002
【図２】
0003593078.tif 000003