(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミノ成分をアシル化する段階と、アシル化後に残留する活性化カルボキシル官能基の除去剤として潜在アニオンを含むアミンを使用する段階とを含み、該潜在アニオンは伸長中のペプチドに結合したいかなる永久保護基の存在下でも選択的に除去できる一時保護基を有していることを特徴とする１つまたは複数のアミド結合を含む化合物の製造方法。
【請求項２】
除去用アミン中の潜在アニオンが、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の置換活性と同様の置換活性を示す一時保護基を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一時保護基が水素化分解的に除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除去可能な基であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
一時保護基がベンジル型の基であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
除去剤が潜在アニオンを含む第一級アミンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一級アミンがＣ末端で保護されたアミノ酸誘導体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸がβ−アラニンまたはその誘導体であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
除去剤がベンジルβ−アラニネートまたはその塩であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
溶液中で処理することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドを製造することを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、１つまたは複数のアミド結合を含む化合物、特にペプチドの製造を目的とする新規な汎用方法、特に溶液中で行われる方法に関する。
【０００２】
ペプチドは溶液中で合成されるかまたは固体支持体上で合成される。いずれの合成方法でも、結合段階と脱保護段階とを交互に繰り返し、双方の段階の間に断続的な精製を行ってもよい。各結合段階ではアミノ成分に対する定量的な結合を確保するために好ましくは過剰量の活性化カルボキシル成分を使用する。これによって最終生成物中に欠失配列が生じることを防止できる。固相ペプチド合成では、残留する活性化カルボキシル成分を通常は各結合段階が終了したときに濾過によって除去する。溶液相合成では、残留する活性化カルボキシル成分が断続的な水性処理中に破壊されて除去されるということが通常は想定されている。しかしながら溶液相合成ではしばしば、挿入ペプチド配列が最終ペプチドの不純物として存在している。その理由は、結合段階後に残留する（活性化）カルボキシル成分が不完全にしか除去されないので、脱保護後に結合が生じるからである。このような副反応の発生を回避するために、残留する活性化カルボキシル官能基を除去（ｓｃａｖｅｎｇｅ）する（失活させる）除去段階を結合段階の直後に導入し得る。通常は除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）としてアミンを使用する。除去剤としてポリアミンを使用するとき、除去された化合物はそれぞれの極性に依存して、好ましくは酸性の水相に活発に抽出され得る［例えば、Ｋｉｓｆａｌｕｄｙ，Ｌ．ら（１９７４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９，１７８５−１７８６］。伸長中のペプチドが水相中に失われることを避けるために、この抽出は通常は脱保護段階の前に行う。しかしながら多くの場合にこの手順では、除去された化合物の疎水性が原因で断続的な精製が不完全になることが知見された。カルボキシル成分のアミノアシル部分に固有の疎水性は、まだ存在しているアミノ保護基によって強化される。従って水性抽出が完全に有効ではない。
【０００３】
最近では、Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら［（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４３２４−４３３８］が除去法の改良を報告した。該方法では、ポリアミンを除去剤として使用することに加えて、アミノ保護基１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメトキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）を使用した。Ｂｓｍｏｃ官能基は塩基に対して極めて高い置換活性を有している。その結果として、ポリアミンを使用する単一段階で、残留する活性化カルボキシル官能基が除去されかつＢｓｍｏｃ官能基が除去される。
【０００４】
新規なペプチド製造方法がここに知見された。該方法は、過剰量の活性化カルボキシル成分を使用してアミノ成分をアシル化する段階から成り、アシル化後に残留する活性化カルボキシル官能基の除去剤として遊離アニオンまたは潜在アニオン（即ち、脱保護によって形成されるアニオン）を含むアミンを使用する。この新規な方法によれば、活性化カルボキシル成分のＮ末端保護基を本質的に随意に選択できる。何故ならば、Ｃａｒｐｉｎｏの方法と対照的に、過剰量の活性化カルボキシル官能基の除去と同じ反応条件下ではＮ末端の脱保護が必ずしも生じないからである。本発明方法によれば更に、ポリアミンを除去剤として使用する別の従来技術の方法に見られる疎水性の問題を伴うことなく、残留する活性化カルボキシル成分を極めて効率的に除去し得る。本発明方法は溶液中で行うのが好ましい。しかしながら、方法を固相ペプチド合成に使用することも可能である。本発明方法はまた、１つまたは複数のアミド結合を含む別の化合物の製造にも適している。好ましい実施態様では、潜在アニオンを含むアミンを除去剤として使用する。好ましくは、除去用アミン中の潜在アニオンは一時保護基を有しており、該一時保護基は伸長中のペプチドに結合したいかなる永久保護基の存在下でも選択的に除去され得る。特に好ましい実施態様では、除去用アミン中の潜在アニオンの保護基は、伸長中のペプチドのＮ末端に存在する一時保護基の置換活性と同様の置換活性を示す。このため、アニオンを生じる除去剤の脱保護と伸長中のペプチドのＮ末端脱保護とを単一の処理段階で行うことができる。本発明方法では、伸長中のペプチドのＮ末端に存在しまた場合によっては除去剤に存在する一時保護基が水素化分解的に除去可能な基であり、永久保護基がアシドリシス的に除去可能な基であるのが特に好ましい。好ましくは、該一時保護基がベンジル型の基、例えば、（置換）ベンジル及びベンジルオキシカルボニル基である。好ましい除去剤は、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含む第一級アミン、特にＣ末端が保護されたアミノ酸誘導体である。除去用アミンは、カルボキシレート以外に、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェートまたはフェノレートなどを非限定例とする別のアニオン性官能基を含有してもよい。除去剤として使用し得る極めて好ましいアミノ酸は、β−アラニンまたはその誘導体（例えば、エステルまたはシリルエステル誘導体）である。最も好ましい除去剤はベンジルβ−アラニネートまたはその塩である。
【０００５】
本発明の方法ではまた、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むアミンの代わりに、遊離アニオンまたは潜在アニオンを含むチオールを除去剤として使用し得る。除去剤は好ましくは、除去が必要な残留活性成分に対して２倍−６倍のモル過剰量で使用する。
【０００６】
本発明の除去剤を使用すると、除去された親水性化合物が得られる。このような化合物は脱保護段階後に塩基性水相に活発に抽出され得る。（本発明の除去剤を使用したとき）脱保護後に、除去された種には遊離アミノ官能基と遊離カルボキシル官能基との双方が存在するので親水性が強化される。従って、本発明方法によれば、除去された親水性化合物を活発に抽出することができるので断続的な精製が極めて効率的になる。更に、場合によって存在する活性化されなかった余剰のカルボキシル成分は、脱保護中にその一時的保護基もまた除去されるので、同時に反応混合物から抽出される。
【０００７】
本発明の新規な方法はオリゴペプチド及びポリペプチドの製造、より一般的には１つまたは複数のアミド結合を含む化合物の製造に好都合に使用し得る。
【０００８】
本発明の好適な方法は、過剰量のカルボキシル成分をアミノ成分に結合させる方法であり、該方法では結合試薬及び所望の場合には添加剤を使用してカルボキシル官能基を予め活性化するかまたはｉｎ  ｓｉｔｕ活性化する。結合段階後に残留する活性化カルボキシル官能基は、反応混合物に除去剤を添加することによって除去する。引き続いて、当業界で公知の適当な方法を使用して一時的保護基を除去し、次いで、除去された化合物を塩基性水性抽出によって除去する。同時に、場合によっては存在する活性化されなかった余剰のカルボキシル成分は、脱保護中にその一時的保護基もまた除去されるので、反応混合物から抽出される。
【０００９】
アミノ成分という用語は、遊離アミノ官能基を含む分子を意味する。より特定的には、アミノ成分は、遊離アミノ官能基を含み別の官能基が所望の結合反応を妨害しないように保護されている任意のアミン、アミノ酸またはオリゴペプチドでよい。使用されるアミノ酸またはオリゴペプチドのＣ末端官能基は、置換もしくは未置換のアミドとしてまたはエステルとして保護され得る。エステルの非限定例は、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、フェンアシル、３−（３−メチル）ペンチル（Ｍｐｅ）、２−（２−フェニル）プロピル（Ｐｐ）、２−クロロトリチル（Ｃｌｔ）、ジフェニル（４−ピリジル）メチル（ＰｙＢｚｈ）、ジシクロプロピルメチル（Ｄｃｐｍ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、アリル（Ａｌｌ）、２−（トリメチルシリル）エチル（Ｔｍｓｅ）、４−｛Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］−アミノ｝ベンジル（Ｄｍａｂ）エステル及び酵素的に開裂可能なエステルである［Ｒｏｅｓｋｅ，Ｒ．Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０１−１３６；Ｍｐｅについては：Ｋａｒｌｏｓｔｒｏｍ，Ａ．ａｎｄ  Ｕｎｄｅｎ，Ａ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７，４３４３−４２４６；Ｐｐについては：Ｙｕｅ，Ｃ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４，３２３−３２６；Ｃｌｔについては：Ａｔｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．ら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６，５６４５−５６４８；ＰｙＢｚｈについては：Ｍｅｒｇｌｅｒ，Ｍ．ら（２００１）Ｐ１５４，２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ＆１７ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｄｃｐｍについては：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０，７７１８−７７１９；Ｆｍについては：Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ，Ｆ．ら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５，２１５−２１８；Ａｌｌについては：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２６，４９３−４９７；Ｔｍｓｅについては：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．（１９７７）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ６０，２７１１−２７１６；Ｄｍａｂについては：Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２０９−２２１０］。アミノ成分中の別の官能基を永久保護するためにはｔ−ブチル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ましい。これらの官能基の非限定例として、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ側鎖の保護には−ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ及びＴｒｐ側鎖の保護にはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＨｉｓ側鎖の保護にはトリチル（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ側鎖の保護には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）または２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）��ある［Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．２（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８４；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）には：Ｆｒａｎｚｅｎ，Ｈ．ら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６９９−１７００；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）及びＧｌｎ（Ｔｒｔ）には：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２，７３９−７４２；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）には：Ｓｉｅｂｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｎｉｋｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８，６０３１−６０３４；Ｐｍｃには：Ｒａｍａｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８，２２８７−２２９０；Ｐｂｆには：Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４，７８２９−７８３２］。
【００１０】
カルボキシル成分という用語は、遊離カルボキシル官能基を含む分子を意味する。より特定的には、カルボキシル成分は、遊離カルボキシル官能基を有しており別の官能基が所望の結合反応を妨害しないように保護されている任意のカルボン酸、アミノ酸またはオリゴペプチドでよい。好ましい実施態様では、使用されたアミノ酸またはオリゴペプチドのアミノ基がベンジルオキシカルボニル（Ｚ）官能基によって一時的に保護されている。官能基の別の非限定例は、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）官能基、オルトニトロベンゼンスルホニル（ｏ−ＮＢＳ）のようなアリールスルホニル型の官能基、及び、酵素的に開裂可能な官能基である［Ｇｅｉｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ，Ｋｏｎｉｇ，Ｗ．（１９８１）：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．３（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−９９；Ａｌｌｏｃには：Ｋｕｎｚ，Ｈ．ａｎｄ  Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ，Ｃ．（１９８４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．９６，４２６−４２７；アリールスルホニルには：Ｆｕｋｕｙａｍａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，５８３１−５８３４］。カルボキシル成分中の別の官能基を永久保護するためには、アミノ成分に関して上述したようなｔ−ブチル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基が好ましい。カルボキシル成分を、活性エステル、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル、ペンタフルオロフェニルまたは４−ニトロフェニルエステル、ハロゲン化物、Ｎ−カルボキシ無水物としてまたは対称無水物として予め活性化してもよい。あるいは、カルボキシル成分を、混合無水物として、または、好ましくはＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）もしくは１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）のようなカルボジイミド、ウロニウムまたはホスホニウム塩などの結合試薬を、場合によっては結合用添加剤、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）の存在下、及び、必要な場合には第三級アミンの存在下で使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕで活性化してもよい［Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ′，ｖｏｌ．１（１９７９）（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｘｕ，Ｊ．−Ｃ．（２０００）Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１８，４５６−４６６］。
【００１１】
一時的保護基は当業界で公知の方法によって除去し得る（上記参照）。Ｚ官能基は、例えば水素ガスまたはホルミエート（ｆｏｒｍｉａｔｅ）を水素供与体として用いた（標準）手順を使用する水素化分解によって除去し得る。この処理中に、ベンジル型保護基は完全に除去され、ｔ−ブチル型の官能基または同様の置換活性をもつ官能基は保存される。後者は、当業者に公知のアシドリシスによって除去し得る。
【００１２】
塩基性水性抽出という用語の意味は当業者に理解されるであろう。しかしながら、塩基性水性抽出は好ましくは、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの水溶液を使用し、所望の場合には塩化ナトリウムまたは硝酸カリウムの存在下で行う。活性水性抽出という用語は、酸性条件下でアミノ成分をプロトン化形態（アンモニウム）で抽出するかまたは塩基性条件下でカルボキシル成分を脱プロトン形態（カルボキシレート）で抽出するような処理を意味する。
【００１３】
本発明を以下の実施例でより詳細に説明する。本発明がこれらの実施例の記載に限定されないことは理解されよう。
【００１４】
実施例１
Ｈ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ
２０℃の酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物中に５．５２ｇのＨ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌを含む撹拌懸濁液に、７．７６ｇのＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、３．２４ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、４．２０ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び４．６２ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた溶液を反応が完了するまで撹拌後、１．２１ｍｌの４−メチルモルホリン及び３．５１ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００１５】
保護されたジペプチドＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕを含む有機層をパラジウム付着チャコールの存在下で接触水素化分解処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルとジクロロメタンとの混合物で洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、３０％ＮａＣｌ及び水で抽出した。有機層を蒸発乾固すると、所望のジペプチドが定量的収率で得られた。逆相ＨＰＬＣによる純度：９８．４％（２９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，５ミクロンのＣ１８カラム）。エレクトロスプレーＭＳによる同定：ｍ／ｚ３９３．４［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．６３（ｂｓ，２Ｈ），２．３９（ｄｄ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．３９（ｄ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），４．７２（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３２（ｍ，５Ｈ），７．８１（ｄ，１Ｈ）。
【００１６】
実施例２
Ｈ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３
２０℃の酢酸エチル中の２．１２ｍｌのｎ−オクチルアミンの撹拌溶液に、４．６１ｇのＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ、２．０８ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２．７１ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及び１．５５ｍｌの４−メチルモルホリンを添加した。得られた懸濁液を反応が完了するまで撹拌後、０．７８ｍｌの４−メチルモルホリン及び２．２６ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。
【００１７】
Ｚ−Ｐｈｅ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３を含む有機層を１−メチル２−ピロリジノンで希釈し、パラジウム付着チャコールの存在下で接触水素化分解処理した。反応の完了後、３０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を濾過した。残渣を酢酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ及び３０％ＮａＣｌで抽出した。
【００１８】
Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３を含む２０℃の有機層に、４．０９ｇのＺ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．０８ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２．７１ｇの１−（３′−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、１．５５ｍｌの４−メチルモルホリン及び１−メチル−２−ピロリジノンを添加した。得られた懸濁液を反応が完了するまで撹拌した後、０．７８ｍｌの４−メチルモルホリン及び２．２６ｇのベンジルβ−アラニネートｐ−トルエンスルホネート塩を添加した。混合物を更に３０分間撹拌し、３０％ＮａＣｌ、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、５％ＫＨＳＯ４／１０％ＮａＣｌ及び５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌで抽出した。  Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＨ３を含む有機層を１−メチル−２−ピロリジノンで希釈し、パラジウム付着チャコールの存在下で接触水素化分解処理した。反応の完了後、５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌを添加し、得られた懸濁液を４５℃で濾過した。残渣を酢酸エチルで洗浄し、集めた有機濾液を５％Ｎａ２ＣＯ３／１０％ＮａＣｌ、３０％ＮａＣｌ及び水で抽出した。有機層を蒸発乾固すると所望生成物が８５％の収率で得られた。逆相ＨＰＬＣによる純度：９９．３％（２９分で０．１％トリフルオロ酢酸中に２４％から６８％までのアセトニトリル，２２０ｎｍ，２．０ｍｌ／分，５ミクロンのＣ１８カラム）によって測定。エレクトロスプレーＭＳによる同定：ｍ／ｚ３９０．４［Ｍ＋Ｈ］＋，４１２．４［Ｍ＋Ｎａ］＋，３８８．２［Ｍ＋Ｈ］−，４３４．２［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８９（ｍ，９Ｈ），１．１２−１．３９（ｍ．１４Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，３Ｈ），３．０１−３．２２（ｍ，４Ｈ），３．３５（ｄｄ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ，１Ｈ），５．９０（ｔ，１Ｈ），７．１９−７．３２（ｍ，５Ｈ），７．８３（ｄ，１Ｈ）。
【００１９】
結論：得られた生成物の純度及び同定は、本発明の方法を使用したとき、余剰の（活性化）カルボキシル成分が完全に除去されており挿入ペプチド配列が全く形成されなかったことを証明する。