(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素剤固形物あたり１０，０００ＬＩＵ／ｇ以上の脂質分解活性を有する酵素水和物を、ポリヒドロキシ化合物及び脂肪酸誘導体の存在下、乾燥することを特徴とする相対エステル交換活性Ｋｒ値が０．０１０ 以上の酵素剤の製造方法。
【請求項２】
ポリヒドロキシ化合物が、オリゴ糖及びその誘導体である糖アルコールである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
脂肪酸誘導体が、脂肪酸、脂肪酸の低級アルコールエステル、界面活性剤、及びトリグリセリドから選択される請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
乾燥が、１時間当たりの含水率の低下で０．５より遅い乾燥速度で実施される請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
酵素を用いたエステル化反応及びエステル交換反応は、特に脂質の改質において重要な技術である。本発明は脱水した乃至低水分の系で高いエステル交換活性を有する酵素剤及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
元来酵素は水溶性であるのに、脂質はそうでないため、リパーゼ等、脂質に作用する酵素は、水と脂質の界面で作用すると考えられており、油脂に対する水の溶解度が約０．２％であることと関連してか、酵素を活性化する少量の水、具体的には、基質に対して０．２％以上の水を存在させた系でエステル交換を行うことが提案されている（特開昭５２─１０４５０６号）。また、リパーゼの酵素活性が界面において著しいことに着目して、ポリヒドロキシ化合物と動植物起源のたんぱく質若しくはペプチドを用いて油脂類を比較的水の多い系で可溶化状態にし、エステル交換をする方法も提案されている（特開昭５７─１１１３９８号）。
【０００３】
そして特開昭５７─１１１３９８号において、ポリヒドロキシ化合物は、グルコース、フルクトース等の単糖類、シュクロース、マルトース等の少糖類、デキストリン等の多糖類、蜂蜜、糖蜜等のシロップ類、ソルビット、マンニット、キシリット等の糖アルコールが例示され、たんぱく質若しくはペプチドは、アルブミン、グロブリン、グルテリン、プロラミン等の単純たんぱく質、カゼインナトリウムのような複合たんぱく質、ゼラチン等の誘導たんぱく質、コラーゲン加水分解物のようなペプチドが例示されている。
【０００４】
しかし上記特開昭５２─１０４５０６号や特開昭５７─１１１３９８号のような水分の系では、ジグリセリドが多く生成するという難点があり、そのため、より低い水分の領域、特に  ”からからに乾燥  （ｂｏｎｅ  ｄｒｙ）”  された基質水分の系でも、高いエステル交換活性を示す酵素剤が探究されいくつかの提案がされた。例えば特開昭５６─１２７８０８７号は乾燥酵素剤調製の際の乾燥速度を緩慢に行うことが重要であることを開示し、特開昭６２─１３４０９０号、特開昭６３─２１４１８４号、特開平１─２５８８号、特開平１─１５３０９７号では、脂肪酸や脂肪酸誘導体を使用して酵素剤を製造することが有効であることを提案している。
【０００５】
このうち特開昭６２─１３４０９０号は、酵素剤が脂肪酸や脂肪酸誘導体の他に２〜３価のアルコール、ポリヒドロキシ化合物、蛋白質等を任意に含めることができる旨記載しているが、高い脂質分解活性の酵素剤の場合に脂肪酸誘導体とポリヒドロキシ化合物を共に存在させて乾燥することにより、相乗的に著しく優れた効果が得られることを教示していない。又、特開昭６３─２１４１８４号や特開平１─２５８８号でも、界面活性剤、ポリオール化合物の使用に言及があるものの、酵素のロットにより効果が変動することや、粘稠性の故に問題があることが指摘されており（  特開平３─１８３４８０号  ）、また、脂肪酸誘導体とポリヒドロキシ化合物の共存下に相乗的効果が生じエステル交換の高活性が得られることを開示していない。
【０００６】
他方、酵素回収や、分散性向上等の目的で、リパーゼは担体上に固定化して使用されたり、修飾して用いられたりする。担体は一般に多孔質であるが、反応器容積の低減のためには、その多孔空隙（細孔）に可及的高密度にリパーゼを充填しようとする試みがなされている。細孔径は小さすぎると、酵素が入り込んで結合する余地がなくまた基質の出入りも困難になる反面、細孔径が大きすぎると、空隙表面積自体が減少してしまう（特開昭５９−１７９０９１）。担体の細孔径に言及したものには他に特公平４−１２７１６号、特公平４−５８９５８号、特表平４−５０１６６４号等がある。
【０００７】
しかしながら、脂質分解活性と、脱水乃至低水分系でのエステル交換活性とは必ずしも相応せず（特開昭５６─１２７８０８７号）、高い脂質分解活性を有する酵素剤だからといって高いエステル交換活性を示すとは限らない。特に酵素剤固形物あたり１０，０００ＬＩＵ／ｇを越え、５０，０００ＬＩＵ／ｇ、１００，０００ＬＩＵ／ｇと高くなるにつれ、脂質分解活性を増大（当然酵素価格も上昇）させるのにエステル交換活性の増大がわずかになり、頭打ちになり、ついには減少の傾向があらわれるので、結局担体の物理的な担持能力を大幅に下回った範囲でしか使用されないのが現実である。多くの場合担体乃至酵素剤固形物１ｇあたりの脂質分解活性は高々５０，０００ＬＩＵ程度に留まっている（例えば特開昭６０─９８９８４号）。
【０００８】
尤も、合成高分子樹脂系の担体、例えば、ポリオレフィン系、アクリル系といった合成多孔質担体を使用する場合には、担持させる脂質分解活性の増大に対するエステル交換活性の増大がそこそこ認められるものもあるが、未だ充分でなく、しかもそれら合成担体は原料モノマーの流出が懸念されるといった食用加工用途上の問題があって、従来から用いられている無機乃至天然有機物由来の担体を用いてエステル交換の高活性化をはかることも必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような従来技術の現状からして、この発明の課題は、酵素剤固形物あたりの脂質分解活性の高さに応じてエステル交換活性も高い酵素剤を得ることであり、また、無機乃至天然有機物由来の担体にも適用できる酵素のエステル交換高活性化方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、酵素剤固形物あたりの脂質分解活性を高くしても、低水分下で見合ったエステル交換活性を発現する高活性酵素剤を探究してその製造方法を種々検討した結果、高い脂質分解活性の酵素が水和された状態から低水分に調整される際に、ポリヒドロキシ化合物と脂肪酸誘導体がともに存在することが特に重要であり、それによって従来合成担体を用いた場合にすら未達であったエステル交換活性Ｋａ値が１５００以上という高エステル交換活性の酵素剤すら得ることができるとの知見を得、本発明に到達した。
【００１１】
即ちこの発明は、高い脂質分解活性を有する酵素水和物を、ポリヒドロキシ化合物及び脂肪酸誘導体の存在下、低水分に調整することを骨子とする高エステル交換活性酵素剤の製造方法、及び、エステル交換活性Ｋａ値が、１５００以上、且つ相対エステル交換活性Ｋｒ値が、０．０１０以上の酵素剤である。
【００１２】
この明細書において脂質分解活性は、国際単位でＬＩＵと表し、また酵素剤固形物あたり（酵素剤全固形物１ｇあたり。担体を含む場合は担体込みの値。以下同様）の脂質分解活性は、ＬＩＵ／ｇで表す。エステル交換活性Ｋａ及び相対エステル交換活性Ｋｒについては、次の方法に準じて測定することができる。
【００１３】
パーム油中融点画分とステアリン酸エチルとの等重量混合物２０ｇ、及び酵素剤２０ｍｇ（系中水分の合計は０．０２±０．０１％の範囲内）を１００ｍｌ容のアルミシールバイアルに仕込み、窒素ガスで空気を全置換後２５０ｒｐｍで攪拌し４０℃で２４時間（１日）反応させる。反応後試料をガスクロマトグラフィーで脂肪酸エステル画分の脂肪酸組成を分析する。標識脂肪酸をパルミチン酸とし、エチルエステル画分における標識脂肪酸の値について、完全に反応した状態（充分な反応時間をとって脂肪酸分布が実質的に一定した状態）の値をａ、時間ｔ＝１日における値をｂ、として反応率ｘ＝ｂ／ａ、反応速度定数ｋ＝１／ｔ｛ｌｎ（１／（１−ｘ））｝、エステル交換活性Ｋａ≡ｋ×基質量／酵素剤量＝１０００×ｌｎ（ａ／（ａ−ｂ））とする。また、Ｋｒは乾燥酵素剤１ｇの脂質分解活性（国際単位）でＫａを除した値とする。
【００１４】
この発明の酵素剤の製造方法の適用は、酵素剤固形物あたり１０，０００ＬＩＵ／ｇ以上の「高い脂質分解活性」の場合に効果が顕著かつ有用であり、またより高い脂質分解活性の領域、５０，０００乃至１００，０００ＬＩＵ／ｇ程度にしてもエステル交換活性の頭打ちが生じず、さらには１００，０００乃至５００，０００ＬＩＵ／ｇ程度にしてもエステル交換活性の減少が生じない。
【００１５】
酵素剤固形物あたりの脂質分解活性を高めるには、市販酵素の活性を可及的落とすことなく剤を調製する留意のもとに、リパーゼの精製度を高めること、又は／及び、担体を使用する場合は可及的多量を担持できる担体を選択することにより行うことができる。
【００１６】
リパーゼの精製度を高めるには、例えば、市販の粗酵素を一般的な酵素精製方法に従って精製純度をあげていくことが出来るし、また近年著しく進歩した遺伝子工学の手法によってリパーゼを高分泌生産させることが可能になっており、高純度・高脂質分解活性の酵素を容易に入手することもできる。
【００１７】
担体は、例えば、ケイソウ土、パーライト、アルミナ、多孔性ガラス、シリカ等の無機担体、セルロース、キトサン等天然物由来の有機担体、イオン交換樹脂、吸着樹脂等の有機高分子担体等、水や各種有機溶剤、油脂類に不溶性の従来エステル交換に使用される担体として公知のものが使用できる。酵素を可及的多量に担持できるために、担体は酵素が入り込める程度の大きさ以上の平均細孔径を有するが、細孔径が大き過ぎて担体単位重量当たりの表面積（比表面積）が減少しない範囲のものを採用すればよい。一般に平均細孔径が５００Å以上の多孔性担体が好ましく、より好ましくは１００，０００Å以下であるのが良い。この明細書で平均細孔径は、水銀圧入法による積算細孔容積が全細孔容積の５０％の時の細孔径を表す。
【００１８】
脂質分解活性を有する酵素は、α又はα’位に特異性を示す酵素（例えばリゾープス属、アスペルギルス属、カンディダ属、ムコール属に属する微生物に由来する酵素、膵臓リパーゼ、米糠リパーゼ等）が有用である他、α又はα’位に非特異性である酵素（例えば、ペニシリウム属、ジオトリクム属、コリネバクテリウムー属、に属する微生物に由来する酵素）、さらには、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ等といった名称の如何にかかわらず、アシル基転移能を有する酵素であれば適用可能である。
【００１９】
この発明で高い脂質分解活性を有する酵素は、一旦水和物とし、ポリヒドロキシ化合物及び脂肪酸誘導体の存在下、低水分に調整する。
【００２０】
水和の状態は、水性媒体例えば、水、緩衝溶液、アセトン水溶液、アルコール水溶液が、被水和物たる酵素の全体にいきわたる状態であり、後の乾燥等、水分低下の工程の時間を短くするために、水性媒体の量は過剰に多くないのが好ましい。
【００２１】
水和させた状態から水分を低下させる際に存在すべきポリヒドロキシ化合物としては、２〜６糖のオリゴ糖又はその誘導体が、単糖類や多糖類に比べて好適である。
【００２２】
オリゴ糖は、マルトース，マルトトリオース，マルトテトラオース，マルトペンタオース，マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ糖、イソマルトース，イソマルトトリオース，イソマルトテトラオース，イソマルトペンタオース，イソマルトヘキサオースなどのイソマルトオリゴ糖、並びに、セロオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、トレハロース、ゲンチオビオース、ショ糖、乳糖、ガラクトビオース、ラフィノース、スタキオース等が例示される。
【００２３】
又それらの誘導体としては、マルチトール，マルトトリイトール，マルトテトライトール、イソマルチトール，イソマルトトリイトール，イソマルトテトライトールなどの糖アルコールが例示される。ポリヒドロキシ化合物として他にシクロデキストリンも例示される。
【００２４】
これらポリヒドロキシ化合物の中では、特にマルトオリゴ糖及びトレハロースが好ましい。
【００２５】
上記ポリヒドロキシ化合物の使用量は、酵素の種類や酵素剤中のリパーゼの純度により多少異なるが、酵素剤固形物に対して０．１〜４０％、好ましくは１〜３５％、より好ましくは１０〜３０％において効果が優れている。なお高純度の酵素の場合は、酵素重量に対し数倍以上例えば５倍以上となる糖の量が好ましい。
【００２６】
また同じく存在させることが必要な脂肪酸誘導体としては、脂肪酸、脂肪酸のアルカリ金属塩、ポリカルボン酸、置換カルボン酸、オキシ酸、アミノ酸、アミド、及び脂肪酸エステル（例えば脂肪酸の低級アルコールエステル、脂肪酸の高級アルコールエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、その他の界面活性剤、及びトリグリセリド）等が例示される。脂肪酸誘導体の使用量は、酵素剤固形物に対して０．０２〜１０％で足りる。この量が不足すると効果に乏しいが、この範囲を越えての使用は、使用量増大の効果が顕著でない。
【００２７】
ポリヒドロキシ化合物及び脂肪酸誘導体の添加時期及び添加方法は、低い水分に調整する際に酵素剤と共存させておくことが必要である他は特に制限はないが、好ましくは、酵素を水溶液にして担体と混合する時の水溶液中に溶解或いは、分散させたり、或いは、酵素水和物に噴霧しながら混合する方法が、有効である。
【００２８】
脂肪酸誘導体はこのような分散の目的からすると水溶性または酵素の作用する温度で液状であるのが一般に望ましい。また、この発明により得る酵素剤の用途によっては、酵素基質の汚染を避ける目的で適当な脂肪酸誘導体を選択するのが好ましく、本発明者の一部が先の特開昭６２−１３４０９０  号でも例示したように、エチルラウレートやエチルオレートといった、炭素数１２以下の飽和脂肪酸若しくは炭素数２２以下の不飽和脂肪酸の１価低級アルコールとのエステルが好適例である。
【００２９】
低水分の調整は、酵素剤中の水分が数％以下、好ましくは３％程度以下になるように行う。この水分が高すぎると、エステル交換反応等に供して初期の反応油の品質を低下させる（部分加水分解物の生成）。水分を低下させる方法は、水和状態からある程度水分が低下するまでの水分減少速度を緩慢にすることが好ましい。この水分低下速度は、酵素剤中の成分や、使用する担体の種類等により異なり、一律には定められないが、次の要領により実験的に容易に定めることができる。即ち、最初数種の水分低下速度で実施することにより適当な水分の初期低下速度を求め、次にどの程度の水分まで低下すれば水分低下速度を速めることができるか実験的に定めることができる。一般的には、１時間当たりの含水率の低下で０．５より遅い初期速度が望ましく、より好ましくは、０．１の低下より遅い範囲にある。水分低下の手段としては、減圧乾燥、或いは、相対的に低湿度の気体、流体と接触させる、乾燥担体と混和する、等の方法がとられるが、酵素を変性或いは失活させる条件例えば数十℃の高温流体や、アルコール等蛋白質変性剤との接触は避けるべきである。
【００３０】
かくして得られる酵素剤は、酵素剤の脂質分解活性に相応しい高いエステル交換活性を示す。とくに、酵素剤固形物あたり脂質分解活性が例えば５０，０００ＬＩＵ以上の酵素を用い、またポリヒドロキシ化合物の選択も適当であると、エステル交換活性Ｋａ値が１５００以上、且つ相対エステル交換活性Ｋｒ値が、０．０１０以上の酵素剤といった、従来合成担体を用いた場合にすら得られなかった高エステル交換活性が得られる。
【００３１】
即ち、この発明は、エステル交換活性Ｋａ値が、１５００以上、且つ相対エステル交換活性Ｋｒ値が、０．０１０以上の酵素剤を包含する。該酵素剤はポリヒドロキシ化合物及び脂肪酸誘導体を含有し、ポリヒドロキシ化合物として、前記マルトオリゴ糖やトレハロース及びその誘導体が特に好適である。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実施例１及び比較例１
リゾプス属由来の精製リパーゼ（脂質分解活性５０００ＬＩＵ／ｍｇ）を５ｍｇずつ、３画分（Ａ〜Ｃ）に分け、各々にマルトース２００ｍｇ及びオレイン酸エチル１５ｍｇ、更に０．１Ｍのマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５。以下同じ）１．２ｍｌを加え、４℃で充分攪拌した。Ａ〜Ｃの画分に、担体としてＪｏｈｎｓ  Ｍａｎｖｉｌｌｅ社から購入されるスタンダードスーパーセル（細孔径約  ３５，０００  Å）（以下担体Ａという），セライト５００（細孔径約  １９，６００  Å）（担体Ｂ），または富士シリシア化学から購入されるＣＡＲＩＡＣＴ−１００（細孔径約  ９１７Å）（担体Ｃ）をそれぞれ１ｇ加え、充分に混合した。
【００３４】
これらの水和物を、４℃，５  ｔｏｒｒ  で３日間、更に２０℃，５  ｔｏｒｒ  で１日間、真空乾燥し、水分約１〜３％の酵素剤を調製した。比較として、マルトースまたは及びオレイン酸エチルを使用せず、かつ担体Ｃを用いる他は同様にして酵素剤を調整した。
【００３５】
調製された酵素剤は４０ｍｇを用いパーム油中融点画分とステアリン酸エチルとの等重量混合物２０ｇ（基質油の水分量は０．０１％）を１００ｍｌ容のアルミシールバイアルに仕込み、窒素ガスで空気を全置換後２５０ｒｐｍで攪拌し４０℃で２４時間（１日）反応させた。反応後試料をガスクロマトグラフィーで脂肪酸エステル画分の脂肪酸組成を分析し、各々の酵素剤のエステル交換活性Ｋａ値及び相対エステル交換活性Ｋｒ値を算出し、その結果を表１に示した（表中、Ｋｒ値はＫａ値を脂質分解活性で除した値を示す）  。
【００３６】
【表１】
0003603325.tif 000002
【００３７】
上記の結果から、マルトース及びオレイン酸エチルの併用は、それらの単独使用に比べて、顕著なエステル交換活性の増大が認められ、併用による相乗的効果が明らかであった。
【００３８】
実施例２，３及び比較例２，３
リゾプス属由来の精製リパーゼ（脂質分解活性５０００ＬＩＵ／ｍｇ）を２５ｍｇ、マルトース２００ｍｇ及びオレイン酸エチル１５ｍｇ、更に０．１Ｍのマッキルベイン緩衝液１．２ｍｌを加え、４℃で充分攪拌した。担体Ｂ（実施例２），または担体Ｃ（実施例３）をそれぞれ１ｇ加え、充分に混合した。これらの水和物を、４℃，５  ｔｏｒｒ  で３日間、更に２０℃，５  ｔｏｒｒ  で１日間、真空乾燥し、水分約１〜３％の酵素剤を調製した。マルトースを用いない以外は実施例２及び実施例３と同様に調製した酵素剤（比較例２及び比較例３）を調製した。これらの酵素剤２０ｍｇを用い、パーム油中融点画分とステアリン酸エチルとの等重量混合物２０ｇ（基質油の水分量は０．０１％）を１００ｍｌ容のアルミシールバイアルに仕込み、窒素ガスで空気を全置換後２５０ｒｐｍで攪拌し４０℃で２４時間（１日）反応させた。各々の酵素剤のエステル交換活性Ｋａ値及び相対エステル交換活性Ｋｒ値は表２に示した。
【００３９】
【表２】
0003603325.tif 000003
【００４０】
表２に示すように、マルトースとオレイン酸エチルの併用によって、脂質分解活性の高さに相応しいエステル交換活性Ｋａ値の極めて高い酵素剤を得ることができた。
【００４１】
なお、実施例３と同様に、リパーゼ、マルトース、オレイン酸エチル、緩衝液を加え、更に担体Ｃを加え充分に混合した水和物についての乾燥速度を速めた比較例も実施した。即ち、水和物を、凍結乾燥機（棚温度２０℃，真空度０．０１ｔｏｒｒ）で１日乾燥し、水分約１％の酵素剤を調製した場合は、Ｋａ値＝７８０，Ｋｒ値＝０．００７であった。
【００４２】
実施例４
リゾプス属由来の精製リパーゼ（脂質分解活性５０００ＬＩＵ／ｍｇ）を各々２５ｍｇ、糖類としてマルトテトラオース、マルトヘキサオース、トレハロース、グルコース、デキストリン、キトオリゴ糖をそれぞれ２００ｍｇ用い、更にオレイン酸エチル１５ｍｇ、０．１Ｍのマッキルベイン緩衝液１．２ｍｌをそれぞれに加え、４℃で充分攪拌し、担体Ｃをそれぞれ１ｇ加え、充分に混合した。これらの水和物を、４℃，５  ｔｏｒｒ  で３日間、更に２０℃，５  ｔｏｒｒ  で１日間、真空乾燥し、水分約１〜３％の酵素剤をそれぞれ調製した。これらの酵素剤２０ｍｇを用い、パーム油中融点画分とステアリン酸エチルとの等重量混合物２０ｇ（基質油の水分量は０．０１％）を１００ｍｌ容のアルミシールバイアルに仕込み、窒素ガスで空気を全置換後２５０ｒｐｍで攪拌し４０℃で２４時間（１日）反応させる。反応後試料をガスクロマトグラフィーで脂肪酸エステル画分の脂肪酸組成を分析した。各々の酵素剤のエステル交換活性Ｋａ値及び相対エステル交換活性Ｋｒ値の結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
0003603325.tif 000004
【００４４】
表に示されるように、マルトオリゴ糖やトレハロースの使用は高いエステル交換活性を示し、Ｋｒ値も０．０１０  より高かったのに比べると、グルコース、デキルトリン、キトオリゴ糖の効果は低いものであった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素剤固形物あたりの脂質分解活性の高さに応じてエステル交換活性も高い酵素剤を得ることができる。また条件によりエステル交換活性Ｋａ値が１５００以上という高エステル交換活性の酵素剤すら得ることができる。