(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＨ基を保有する非架橋デキストランまたはアミノデキストランからなるシェルを有してなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子を取り囲んでなるコア−シェル金属粒子。 
【請求項２】
さらなる分子がＳＨ− 基を介して金属粒子に結合されている請求項１記載のコア−シェル金属粒子。
【請求項３】
請求項２に記載のコア−シェル金属粒子における該分子がＳＨ− 反応性リンカー分子であって、該リンカー分子に生体分子が結合されているコア−シェル金属粒子と生体分子とのコンジュゲート。 
【請求項４】
免疫学的試験手順におけるマーカーまたは検出試薬としての請求項１もしくは２記載のコア−シェル金属粒子または請求項３記載のコンジュゲートの使用。 
【請求項５】
ＳＨ− 基が挿入されたアミノデキストランを用いてコロイド金属粒子を被覆する、活性ＳＨ− 官能基を含むシェルを有するコア−シェル金属粒子の製造方法。
【請求項６】
コロイド金属粒子の被覆または安定化のためのＳＨ− アミノデキストランの使用。
【請求項７】
分析物の検出において請求項３記載のコンジュゲートを検出試薬として用いる、サンプルにおける分析物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、非架橋ＳＨ− 活性化デキストランまたはアミノデキストランで被覆されたコロイド金属粒子、ならびに免疫学的試験方法におけるかかる粒子の製造および使用に関する。
【０００２】
説明：
近年、コロイド金属粒子は、生物学的、生化学的および免疫学的研究において広範囲に使用されている。特に、免疫学的アッセイの分野において、いずれの型の生体分子の標識に対するコロイド金属粒子の適用も、非常に成功している。
【０００３】
コロイド金属粒子、特にコロイド金粒子の製造に関して、多くの異なる方法が記載されている。コロイド金粒子は、テトラクロロ金酸溶液の還元により通常得られ、関連する生体分子は、１つまたはいくつかのさらなるステップにおける吸着によりこれらの粒子に結合される。コロイド金属粒子のサイズは、種々の反応パートナーの初期濃度により厳密に調節されうる（Ｇ．Ｆｒｅｎｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１， ｐ．２０−２２（１９７３））。粒子サイズ変動はまた、ＥＰ−Ｂ−４２６ ３００に記載される製造手順の特異的な選択により最適化されうる。
【０００４】
例えば、抗体、レクチンまたは核酸までのような生体分子の結合は、生体分子の物理化学特性（例えば、等電点）に強く依存するそれぞれの負荷条件を伴って主に吸着性である。コロイド金属粒子の被覆の主な所見は、関連技術文献に見出されうる（例えば、ｄｅＭｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、金プローブの調製および使用、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ およびＳ．ｖ． Ｎｏｏｒｄｅｎ， ｐｐ．１１５−１４５， Ｗｒｉｇｈｔ， Ｂｒｉｓｔｏｌ， １９８６ またはＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，コロイド−金属−標識タンパク質の調製、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｐｕｅｓ 、ｐｐ． ５９３−６０４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６ ）。
【０００５】
さらなる適切な物質を添加することにより生体分子で被覆されたコロイド金属粒子を安定化することが必要であり、かつ有用であることが証明されている。かかる安定化物質およびブロッキング物質の添加は、おそらく粒子上の不飽和の「接着」部位がブロックされるという効果を生じる。さらに、これらの物質により、粒子の凝集が最小化され、関連生体分子の再拡散が低減する。
【０００６】
従来の安定剤は、特に、例えばウシ血清アルブミンなどの不活性タンパク質、またはポリエチレングリコール（分子量２０，０００Ｄ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルフェート、デキストランならびにゼラチンなどの水溶性工業用ポリマーである（例えば、ｄｅ Ｍｅｙ， 上記； Ｂｅｅｓｌｙ， Ｊ．Ｅ．、コロイド金：細胞化学構造のための新しい観点、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ、１７、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９，特にｐｐ． １−１４；Ｂｅｈｎｋｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４１（１９８６）． ｐｐ．３２６−３３８；ＤＥ ２４２０５３１ Ｃ３；Ｍｅｉｓｅｌら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ８５（１９８１）， ｐｐ．１７９−１８７ を参照）。
【０００７】
しかしながら、コロイド金属粒子の表面上の生体分子の直接被覆はまた、いくつかの重大な不利益を有する。かかる不利益は、例えば、成功した方法が、１つの生体分子から第２のものへ容易に移され得ないこと、かかる粒子の安定性に問題があることが証明されていることである（ｄｅ Ｍｅｙ， 上記、ｐ．１１６ およびｐｐ．１２２−１２３を参照）。
【０００８】
従来技術のかかる問題を避けるために、いくつかの新しい方法が近年開発されている。特に、いわゆるコア−シェル粒子が、本明細書で言及されている。コア−シェル粒子は、（通常）金属コアおよび完全に粒子を取り囲むシェルからなる。かかるシェル物質の重要な例は、例えばＥＰ ２５８ ９６３およびＥＰ ４２８ ４１２に記載のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） 、例えばゼラチンなどの変性タンパク質、例えばアミノデキストラン（ＵＳ ５，２４８，７７２ ） などの水溶性ポリマー、または低分子チオール化合物またはチオール化タンパク質（ＥＰ ４８９ ４６５）から作製されるシェルである。
【０００９】
シェルを安定化するために、シェル物質は通常架橋されている（ 例えば、ＵＳ ５，２４８，７７２） 。かかるシェルは、所望の生体分子が一般に公知の共有結合で結合しうる官能基を含む。
【００１０】
コア−シェル粒子への生体高分子の共有結合は、コロイド表面への直接の吸着結合を上回るいくつかの利点を有する。共有結合により、生体分子の流出が避けられうる。さらに、吸着性負荷手順の間に吸着に利用できない残っているフリーな表面領域により誘発される非特異的相互作用が停止する。安定剤の添加による表面の後処理は、コア−シェル粒子に必要でない。十分溶解性のある親水性のシェルの使用により、得られたコア−シェル−タンパク質コンジュゲートの安定性は、著しく改良されうる。したがって、吸着的に負荷されたコロイド−タンパク質コンジュゲートで繰り返し観察されるようなコンジュゲートの凝集により生じる不安定性が、避けられうる。さらに、コア−シェル粒子へのタンパク質の共有結合は、タンパク質の物理化学特性からは大いに独立しているので、吸着結合に適さないタンパク質でさえも使用されうる。
【００１１】
従来技術で使用されているシェル物質は、複合体により金属表面に吸着し、静電気的ならびに疎水的相互作用を含む機構を従来完全には理解していない。シェル物質がコロイド金属粒子に結合する際にどの結合型が優勢であるか、シェル物質の型を決定する。
【００１２】
硫黄を含む化合物と金属、特に金の相互作用は、強化した吸着結合を導く。ＥＰ ３６９ ５１５は、チオールを含む低分子化合物を有するコロイド金粒子の被覆を記載する。さらなる官能基により、関連する生体分子がこのチオールシェルに結合されうる。
【００１３】
化学架橋アミノデキストランがシェル物質として使用されうることも従来技術から公知である（ＵＳ ５，２４８，７７２）。アミノデキストランの架橋は、かかる方法で製造されている粒子に十分な安定性を与えるために必要である。ＵＳ ５，２４８，７７２に記載される方法のさらなる不利益は、結合に適切なＳＨ− 基を架橋アミノデキストランのシェルに後で挿入する必要があることである。かかる手順は、いくつかのさらなる作業ステップを必要とする。さらに、ＳＨ− 基の挿入率は低い正確性でしか調節されず、挿入効率の解析はほとんど可能でない。
【００１４】
従来技術において、容易に、迅速に、かつ高いコストを伴なわずに製造することができ、例えばアミノデキストランシェルの架橋または続く官能基の挿入（例えば、ＳＨに基づく結合化学のため）などのいずれのさらなる処理ステップも必要としない、アミノデキストランに基づくコア−シェル粒子は公知でない。
【００１５】
したがって、可能なかぎり従来技術の不利益を避ける改良されたコア−シェル粒子を提供することが目的であった。
【００１６】
この目的は、特許請求の範囲においてより詳細に規定される本発明により達成される。
【００１７】
本発明は、容易にかつ再現性よく製造され得、使用時、特に免疫アッセイにおいて多くの利点を有する、ＳＨ− デキストランまたはＳＨ− アミノデキストランシェルを有するコロイド金属粒子を提供する。本発明は、特に、ＳＨ− 基を保有する非架橋デキストランまたはアミノデキストランからなるものではないシェルを有してなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子を取り囲んでなるコア−シェル金属粒子に関する。
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する：
コロイドコア−シェル粒子またはシェルを有するコロイド金属粒子という用語が、金属コアと１つまたは数個の非金属成分からなるシェル／被覆とを有する粒子を説明するために以下で適用される。
【００１９】
金属コア粒子として、従来技術の方法により製造しうる全てのコロイド金属粒子が考慮されうる。好ましくは、金属は、貴金属、特に金または銀、および特に好ましくは金に関係する。
【００２０】
デキストランは、当業者に公知の多糖類群に属する。好ましくは、分子量５０００〜２００ 万Ｄ 、また好ましくは２００００ 〜１００ 万Ｄ 、および特に好ましくは３００００ 〜１０００００Ｄ を有する分子が使用される。
【００２１】
商業的に入手可能なデキストランまたはアミノデキストランにＳＨ− 基が挿入される； 本明細書において、アミノデキストランが特に好ましい。ＳＨ− 基の挿入は、例えば、活性化カルボン酸のアミノ基との化学反応である。Ｓ−アセチル− チオプロピオニル− 酸−Ｎ− ヒドロキシスクシニミドエステル（ＳＡＴＰ）、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ− アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）またはＳ−アセチル− メルカプト− 無水コハク酸（ＳＡＭＢＡ） 型の試薬が、好適に使用される。デキストランのＯＨ基の活性化は、例えば、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）により開始され、ＳＨ− 基の挿入は、ＳＨ保護アミノチオール（ 例えば、Ｓ−アセチルシステアミン） の続く添加により開始される。
【００２２】
アミノデキストランにおけるＳＨ− 基の挿入にＳＡＴＰを用いる場合、アミノ基の非常に大部分が変換されるはずである。ＳＨ− 基は、ヒドロキシルアミンの添加により次いで放出される。特に有利なのは、少なくとも７０％、特に好ましくは８０％および非常に特に好ましくは９０％の程度で変換されたアミノ基を有し、ＳＨ官能基を保有するＳＨ− アミノデキストランである。
【００２３】
ＳＡＴＰによるアミノデキストランの活性化は、好ましくはｐＨ７．５ 〜９．０ 値および温度４ ℃または室温および２ 〜２４時間の間である非常に種々の条件下で行われうる。室温でｐＨ８．５ で作用させ、約３ 時間の間反応を固定するのが特に適切であることが証明されている。例えば、ヒドロキシアミンの添加によるＳＨの放出は、弱酸ｐＨ条件下、特に好ましくはｐＨ６．０ 〜６．５ で特に好ましい。
【００２４】
以下でＳＨ− アミノデキストランまたは活性ＳＨ− 基を有するアミノデキストランまたはＳＨ活性化アミノデキストランが記載される場合、これは、例えば、前記方法により製造されうるようなＳＨ− アミノデキストランまたはＳＨ− デキストランを一般に含む。
【００２５】
従来技術において（ＥＰ ４８９ ４６５）、後被覆（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔｉｎｇ）、安定化および反応基の提供に対して、単鎖分子、例えば２４Ｃ−原子の最大鎖長を有するアルキルチオールが使用されるであろうことが明白に記載されている。ＥＰ ４８９ ４６５において、鎖長の上限が２４Ｃ−原子に設定されるのには、十分な理由がある。２または３より多くのＳＨ− 基を有する長鎖分子のこの恐れの理由は明白である。当業者は、例えば、ＳＨ− アミノデキストランなどの長鎖分子は、金属− ゾル粒子を安定化しないが、凝集を導くと考えたはずである。
【００２６】
正確には、多くのコロイド金属粒子のこれらの凝集またはかたまり（ｎｕｇｇｅｔ）は、科学技術分野で最大の問題を構成し、不安定性、および非特異的結合により生じる問題をもたらす。
【００２７】
しかしながら、驚くべきことに、ＳＨ− アミノデキストランは、コロイド金属粒子の後被覆および安定化に使用される際、非常に有利であることが示されている。この後処理は、著しく安定な粒子をもたらすので、通常行なわれるようなアミノデキストランモノマーの架橋（ＵＳ ５，２４８，７７２）は、もはや全く必要でない。明らかに、ＳＨ− 官能性による金属表面への結合はかなり安定であるので、遊離の「接着」表面成分の飽和のためのさらなる後被覆も、ＳＨ− アミノデキストラン分子の架橋も、再拡散（不安定な分子結合の流出）を避けるために必要でない。それゆえ、本発明の主題は、コロイド金属粒子の被覆および安定化のためのＳＨ− アミノデキストランの使用である。
【００２８】
本発明は、コロイド金属粒子およびＳＨ− 活性化アミノデキストランを適切な条件下でインキュベートする、ＳＨ− アミノデキストランシェルを有するコロイド金属粒子の製造方法に関する。驚くべきことに、本発明によるコア−シェル粒子は、調製が容易である。室温で、制御されたｐＨ下に、コロイド金溶液とＳＨ− 修飾アミノデキストラン溶液とを単純に混合することにより、本発明のコア−シェル粒子の形成を誘発する。このようにして得られた粒子を、洗浄するだけで、架橋による安定化の発生なしにリンカーまたは生体分子への結合に使用しうる。
【００２９】
ＳＨ− アミノデキストランを用いる標準法により製造される金ゾルの被覆は、好ましくはｐＨ５．０ 〜７．０ の範囲、特に好ましくはｐＨ５．５ 〜ｐＨ６．５ で行なわれる。反応温度および反応時間は広く変化しうるが、４ ℃または室温で２ 〜２４時間が好ましい。
【００３０】
本発明は、特に、ＳＨ− 基を保有する非架橋アミノデキストランからなるシェルを有してなるコロイド金属粒子であって、該シェルで金属粒子を取り囲んでなるコア−シェル金属粒子に関する。
【００３１】
特に好ましくは、本発明のこれらのコロイド金属粒子は、貴金属、特に金および銀、非常に特に好ましくは金からなる。
【００３２】
被覆および金属表面との相互作用により、全てのＳＨ− 基がブロックされるわけではない。驚くべきことに、多くのＳＨ− 基は、金属表面との相互作用に関与しない。被覆の後もまだ利用できるこれらのＳＨ− 基は、さらなる分子、特に生体分子に対する最適の結合部位を表わす。
【００３３】
従って、これは、一方でＳＨ− アミノデキストランのＳＨ− 基への共有結合を誘発し、他方で特異的に選択された官能基を介して必要とされる生体分子に共有結合するＳＨ− 反応性ホモ− またはヘテロ二− 官能基リンカーを使用することが非常に有利であることを証明した。カップリング対象の生体分子上の好ましい官能基は、例えばＮＨ２−基またはＳＨ− 基である。
【００３４】
さらに、本発明は、生体分子、特に抗体とコロイドＳＨ− アミノデキストラン金属粒子とからなるコンジュゲートの製造方法に関する。
【００３５】
生体分子での粒子の負荷は、適切な緩衝液条件下で行われる。特に好ましくは、６．５ 〜７．０ の範囲のｐＨで、マレイミドにより活性化される生体分子は、ＳＨ− アミノデキストランを負荷された金粒子に共有結合を介してカップリングされうる。生体分子のカップリングは、好ましくは、約４℃または室温でありうる臨界ではない温度で一晩、すなわち、約１０〜３０時間にわたり行われる。さらなる本発明の反応性マレイミド基のブロッキングのために、システインのチオグルコース等の試薬が使用される。ＳＨ基は、ヨードアセトアミド、Ｎ−メチルマレイミド（ＮＭＭ ）またはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ ）等の試薬を添加することによりブロックされる。
【００３６】
生体分子として、通常の診断試験方法に使用される全ての分子が考慮される。本発明に従って、これらは、好ましくは核酸、ペプチドおよびタンパク質である。例えば、ハプテン、脂質またはポリサッカリド等の他の生体分子もまた、使用される場合有益な効果を有する。
【００３７】
特に好ましくは、タンパク質、特にさらなる生体分子に対して良好な結合パートナーを示すタンパク質等のグループに由来する生体分子であり、非常に好ましくは、本明細書中ではレクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体である。
【００３８】
本発明によれば、抗体という用語はまた、完全な免疫グロブリンの他に、全ての抗体断片を含む。これらは、例えば、Ｆａｂ 、Ｆ（ａｂ’）２ 断片のＦａｂ’である。接頭語「モノクローナル」または「ポリクローナル」を有さない用語、抗体は、両方のタイプの抗体ならびにキメラ構築物および上記記載の全ての断片を常に含む。
【００３９】
本発明はそれゆえ、ＳＨ− アミノデキストランのＳＨ− 基を介してさらなる分子が結合した非架橋のＳＨ− アミノデキストランの被覆を有する別の型のコアシェル粒子に関する。
【００４０】
生体分子のこの共有結合またはカップリングのために、ＳＨ− 反応性リンカー分子、すなわち、好ましくはＳＨ− 基と反応する少なくとも１つの基とのカップリングに適した少なくとも２つの基を有する分子を使用することが有利である。本発明はまた、それゆえ、ＳＨ反応性リンカー分子を保有する非架橋ＳＨ− アミノデキストランの被覆を有するコロイド金属粒子に関する。本発明は、特に、生体分子がカップリングしたコア− シェル粒子を含む。ここで、生体分子のカップリングが、ＳＨ− アミノデキストランのＳＨ− 官能基に直接行われているかどうか、またはホモもしくはヘテロ二官能基リンカーがカップリングに使用されているかどうかは重要ではない。生体分子にカップリングしたコア− シェル粒子はまたコンジュゲートと呼ばれる。
【００４１】
特に好ましい形態では、さらなる生体分子の結合パートナー、特に抗体は、本発明のコロイド金属粒子にカップリングされる。
【００４２】
本発明の抗体コンジュゲート、すなわち、本発明の金− コア− シェル粒子と抗体とのコンジュゲートは、粒子の従来技術の類似物を上回って有利である。従来技術に従って金粒子を用いて（図１）、または本発明に従ってコア− シェル− 粒子を用いて（図２）それぞれ製造された抗体− 金− 粒子コンジュゲートの保存安定性を比較すると、後者の方が大いに安定であることが明らかである。驚くほどに良好な安定性の他に、本発明のコンジュゲートは、免疫学的試験システムにおいてより良好な挙動を示す。図３に示す２つの異なる抗体− 金− 粒子コンジュゲートの免疫学的感度に関する結果は、試験片フォーマットのいわゆるクイック試験（ｑｕｉｃｋ ｔｅｓｔ）に由来する。図３から、当業者は、本発明のコンジュゲートを用いる場合、前記試験がより感度が高いことを理解しうる。
【００４３】
通常、クイック試験は、１つのキャリア構造体（例えば、試験手順それ自身のためにサンプル流体を提供するのに十分であるような試験片の形態）にしみ込ませた単一または全ての反応性試験成分を有する試験システムであると理解すべきである。サンプル中の分析分子は、しみ込んだ検出試薬と反応し、一方、サンプル流体は試験片を通過する。一般に、試験片は、例えば、分析物− 検出試薬複合体を集めるために密接に結合した特異的結合パートナーのラインの形態で、検出ゾーンとしての装置を含む。この検出ゾーンにおけるシグナル強度は、次いで、肉眼または適切な分析装置により測定されうる。種々のかかるクイック試験の態様が当業者に公知である（例えば、ＥＰ−Ｂ−１８６ ７９９またはＥＰ−Ａ−２９９ ４２８）。
【００４４】
このようにして、本発明のコンジュゲートは、例えば、抗ＨＩＶ 抗体の検出のためにクイック試験に使用されうる。
【００４５】
比色計を介する軽減（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ）測定による試験片結果の定量的評価は、本発明により生産されたコンジュゲートが、吸着的に負荷されたコンジュゲートを有する他の比較可能な試験片よりも有意に高いシグナルを有することを示した。比較のために、図３は、両方のコンジュゲートのＨＩＶ 陽性サンプルの希釈系列を示す。より低い軽減は、測定した濃度系列に関してより高い感度と同義である。試験片の性能に対して、これは顕著な利点である。
【００４６】
特に免疫学的試験手順および特に好ましくはいわゆるクイック試験における、マーカーまたは検出試薬としての試験システム中の生体分子、特に抗体とコロイドＳＨ− アミノデキストラン− 金属粒子とからなる本発明のコンジュゲートの使用は、それゆえ、本発明のさらにとりわけ好ましい態様である。
【００４７】
本発明のコンジュゲートの使用は、当業者に公知の全ての通常の免疫学的試験において可能である。全ての公知の免疫アッセイにおいて、分析物は、１つまたはいくつかの免疫学的結合パートナーへの結合によりサンプル中で直接または間接的に特異的に検出される。通常の試験フォーマット、例えば、異種または同種の試験手順は、当業者に公知であり、本明細書中でさらに説明する必要はない。
【００４８】
従って、本発明のさらなる主題は、手順、特に、サンプル中の分析物の検出のための免疫学的手順であり、ここで本発明のコア− シェル粒子のコンジュゲートは、マーカーまたは検出試薬として生体分子とともに使用される。
【００４９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する：
【００５０】
実施例１
アミノデキストランへのＳＨ− 基の挿入
約４００００ の分子量および１分子当たり約３０アミノ基の濃度を有する５ｇのアミノデキストランを、２００ｍｌ のリン酸緩衝液、ｐＨ８．５ に溶解させる。１．２２５ｇのＳＡＴＰを６２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、アミノデキストラン溶液に添加した。この混合物を室温で３時間撹拌し、次いで透析する。ＳＨ− 基の放出は、２ｍｌの水に溶解させた６９４ｍｇ のヒドロキシルアミンの添加により達成する。ｐＨを６．０ に調整し、その後１時間リン酸緩衝液ｐＨ６．０ に対して透析した。
【００５１】
実施例２
ＳＨ− 修飾アミノデキストランでのコロイド状金の被覆
４００ＯＤ の濃度で従来技術に従って製造した４００ｍｌ の金ゾルをｐＨ５．６ に調整する。続いて、実施例１で作製した４００ μｇ のＳＨ− アミノデキストランを１０ｍＭのＫ−アセテート ｐＨ５．６に添加し、２時間撹拌する。
【００５２】
実施例３
抗体へのマレイミド基（ＭＨ）の挿入
ジゴキシゲニンに対するモノクローナルマウス抗体の１８ｍｇの免疫グロブリン（ＭＡＢ＜Ｄｉｇ＞Ｍ−ＩｇＧ ）を１ｍｌのリン酸緩衝液ｐＨ７に溶解させる。６．９ｍｇ のＭＨＳ を６９０ μｌ のＤＭＳＯに溶解させる。３３０ μｌ の抗体溶液と１０μｌ のＭＨＳ 溶液とを続いて混合し、４℃で２時間撹拌する。その後、透析を一晩行う。
【００５３】
実施例４
ＭＨ−ＩｇＧおよびＳＨ− アミノデキストラン金に由来するコンジュゲートの製造
３６０ＯＤ のＳＨ− アミノデキストラン金をｐＨ６．６ に調整する。続いて、４０ｍｌのアセテート／Ｔｒｉｓ 緩衝液ｐＨ６．６ に溶解させた７２０ μｇ のＭＨ− 修飾抗体を添加し、ｐＨを７．０ に設定し、混合物を４℃で一晩撹拌する。次に完全に反応しなかった過剰のＳＨ− 基およびマレイミド基を、チオグルコースおよびヨードアセトアミドを添加することにより停止する。続いて、４００ｍｇ のウシ血清アルブミンを添加し、ｐＨを７．８ に設定する。
【００５４】
実施例５
吸着により負荷したコンジュゲートの製造
負荷すべき抗体の溶液を適切なローディング緩衝液に対して透析する（例えば、Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．０ ）。おそらく存在する凝集体を濾過により除去する。金ゾル溶液のｐＨ値をタンパク質溶液のｐＨに調整する。抗体溶液（１０μｇ タンパク質／ＯＤ 金）を金ゾル溶液に添加し、２時間インキュベートする。続いて、これを、１０％ＢＳＡ 溶液を添加（約１％のＢＳＡ 最終濃度）することにより飽和させる。コンジュゲートの精製を透析により達成する。
【００５５】
実施例６
本発明のコンジュゲートに関する機能評価
ａ）液体安定性
ＭＡＢ＜Ｄｉｇ＞Ｍ−ＩｇＧ−アミノデキストラン−ＳＨ コンジュゲートならびに従来技術のＭＡＢ＜Ｄｉｇ＞Ｍ−ＩｇＧ および金ゾル粒子に由来するコンジュゲートを４℃で７ヶ月間保存した。観察した期間にわたって本発明のコンジュゲートは、そのＵＶ／Ｖｉｓスペクトルに関して不変であった。しかし、吸着負荷コンジュゲートは、より大きい粒子サイズ分布に従って変化したスペクトルを示す（図１および２参照）。
【００５６】
ｂ）機能性試験
記載されたＭＡＢ＜Ｄｉｇ＞Ｍ−ＩｇＧ−アミノデキストラン−ＳＨ コンジュゲートを、抗ＨＩＶ 抗体試験において評価し、吸着負荷コンジュゲートと比較した。
【００５７】
試験フォーマットを、１つのキャリアフリース（ｆｌｅｅｃｅ）において乾燥したＨＩＶ 特異的反応パートナー（脱酸素化した（ｄｉｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ））を有する試験片を用いる乾燥試験として設計する。ＭＡＢ＜Ｄｉｇ＞Ｍ−ＩｇＧ−金コンジュゲートを別のキャリアフリース上で乾燥する。
【００５８】
液体サンプル（例えば、血清、血漿）の適用により、乾燥試薬および反応パートナーを再溶解させ、サンプルからの検出対象のＨＩＶ 特異的抗体と反応させ、金コンジュゲートの赤い色により別々の検出フィールドに示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来技術により製造した抗体金コンジュゲートのＵＶ／Ｖｉｓ 解析である。選択された貯蔵条件下（４℃で約７ヶ月）で、ＵＶ／Ｖｉｓ 解析は、両方のコンジュゲートバッチの曲線がストレス前後の曲線型において著しい変化を示すことを示す。これは、約７ヶ月間４℃での貯蔵により、試験したコンジュゲートが非常に変化していることを意味する。換言すれば、これらのコンジュゲートは、試験した条件下で安定でない。
【図２】図２は、本発明のコア−シェル粒子を用いて製造した抗体金コンジュゲートのＵＶ／Ｖｉｓ 解析である。ＵＶ／Ｖｉｓ 解析におけるストレス前後の両方の調製物のほとんど同一の曲線型は、本発明により製造された両方のバッチが、選択された貯蔵条件下（４℃で約７ヶ月）で同一の挙動を示し、変化が生じていないことを証明する。これは、コンジュゲートが試験した条件下で安定であることを意味する。
【図３】図３は、本発明のコア−シェル粒子および従来技術の粒子の軽減解析である。モノクローナル抗体（ＭＡＢ ）を、本発明により製造したコロイド金粒子に結合させた。さらに、ＭＡＢ−金コンジュゲートは、従来技術の方法により製造した。両方のコンジュゲートを、軽減解析により評価した。より低い軽減値は、試験におけるコンジュゲートの改良された感度に一致する。
【図１】
0003583415.tif 000002
【図２】
0003583415.tif 000003
【図３】
0003583415.tif 000004