(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウムにおける抗生物質に対する耐性の検出方法であって、プラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn IフラグメントとハイブリタイズすることができるkatG遺伝子またはそのフラグメント中の突然変異を検出する方法。
【請求項２】
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの核酸の存在をインビトロで検出するための請求項１記載の方法において、以下の工程：
−必要であれば予めプローブに接触可能にした上記核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させる工程、
−上記核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する工程
を含み、
上記プローブが、プラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントまたはその一部分である核酸配列を含み、上記フラグメントはBamH I切断部位を含み、上記一部分はイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分に長いものである、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、以下の工程：
（Ａ）Mycobacterium tuberculosisの核酸を、プローブに接触可能になるように、固体支持体上におき、固定する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）からの固定化された核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと接触させる工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）から得られるフィルターを、ハイブリダイズしていないプローブを除去するように洗浄する工程；および
次に、
（Ｄ）工程（Ｃ）から得られた洗浄したフィルター上のハイブリダイズしたプローブを検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
上記プローブが、式：
APLNSWPDNASLDKAR−RLLWPSKKKYGKKLSWADLIV
で示されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
プローブが、放射活性標識、酵素標識、蛍光標識および発光標識よりなる群から選択される標識を有する、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを含有する疑いのある細菌含有試料中の、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの存在を検出するための、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法〔の使用〕において、特に上記試料中に初めに存在していたDNAと形成されるまたは形成されたハイブリッドDNA複合体の形態の、ハイブリダイズしたプローブの検出を、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの上記試料中の存在の指標として用いる方法。
【請求項７】
上記プローブとの上記DNAの接触に先立って、上記細菌を、上記試料から分離して、ニトロセルロースメンブレンのようなDNA結合性支持体上に固定化しておく、請求項６記載の方法。
【請求項８】
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの検出のためのキットであって、
（Ａ）プローブは、プラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントまたは該フラグメントの部分である核酸配列を含み、上記フラグメントはBamH I切断部位を含み、該部分は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分に長いものである、プローブを含んでいる容器；
（Ｂ）核酸の対照調製物を含んでいる容器
を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを検出するための核酸プローブであって、上記プローブが、プラスミドpYZ56の2.5kbのBamH I切断部位を含むEcoR V−Kpn Iフラグメント、またはイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分に長いものである上記フラグメントの一部分よりなる、プローブ。
【請求項１０】
ヒト血清タンパク質もしくはヒト組織またはその両方、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、および上記タンパク質をコードする核酸配列を含まないDNAである、請求項９記載のプローブ。
【請求項１１】
相補的な塩基配列のヌクレオチド配列に水素結合した、請求項９記載のプローブからなるハイブリッド二本鎖分子。
【請求項１２】
どのヌクレオチド配列が、請求項９または10に記載されたプローブにハイブリダイズするかを決定する工程を含むことを特徴とする、ヌクレオチド配列の群からイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのヌクレオチド配列を選択するための方法。
【請求項１３】
KatG遺伝子の点突然変異または部分的欠失を検出するための方法であって、Mycobacterium tuberculosisの試料を請求項９または10記載のプローブと接触させることを特徴とする方法。
【請求項１４】
選択した抗生物質に対する耐性を検出するための請求項１記載の方法であって、
−突然変異を有する可能性が高い適切な遺伝子またはその一部分を、選択した制限酵素により上記適切な遺伝子を消化することなどによって、複数のフラグメントにフラグメント化し、
−これらのフラグメントを、相補的なオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは、ストリンジェンシーの高い条件下で、対応する抗生物質に対して非耐性の株の対応する対照DNAの上記適切な遺伝子の全ての部分を認識する、標識したプローブのシリーズにハイブリダイズさせ、
−調べているマイコバクテリウムの上記適切な遺伝子のDNAフラグメントのいずれかに対する上記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのハイブリダイゼーションの欠如を、特に、上記抗生物質に対して耐性ではない株から得られた上記適切な遺伝子について同じオリゴヌクレオチドを用いて同じ条件下で試験を実施して得られた結果と比較して、突然変異の存在、およびおそらくは相当する抗生物質に対する耐性の存在の証拠として関連させること、ここで上記適切な遺伝子は、プラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn IフラグメントとハイブリタイズすることができるkatGまたはそのフラグメントであり、
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法において、
−解析すべきDNA、特に適切な遺伝子のDNAを消化し、
−得られたフラグメントを、例えばPCR法により増幅し、
−増幅されたフラグメントを回収し、
−例えば電気泳動ゲル上で、それらを移動させることなどにより、それらをサイズにしたがって互いに分離し、
−異なるフラグメントのサイズを、同様のアッセイに供した抗生物質に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のDNAから得られたものと比較し、そして
−おそらくは検出された多型を、上記適切な遺伝子中の突然変異の存在と関連させ、したがって、調べているDNAを得たもとの株の対応する抗生物質に対する可能性のある耐性と関連させること、
を含み、
上記適切な遺伝子は、katG遺伝子またはそのフラグメントであり、遺伝子はプラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントとハイブリタイズすることができる
を特徴とする方法。
【請求項１６】
イソニアジドに対するマイコバクテリウム属の細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−プラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn IフラグメントとハイブリタイズすることができるkatG遺伝子またはそのフラグメントのDNAの遺伝子を増幅する手段、
−そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段
−イソニアジドに対して感受性の上記細菌の株のプラスミドCNCM I−1209の2.5kbのEcoR V−Kpn IフラグメントとハイブリタイズすることができるkatG遺伝子またはそのフラグメントの対照DNA調製物、
−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のkatG遺伝子のDNAの対照調製物
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１７】
請求項８に記載のキットであって、プローブが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識及び発光標識からなる群より選択される標識によって標識されている、キット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗生物質、特にイソニアジド、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対して耐性であるMycobacterium tuberculosis株の迅速な検出に関する。より特定的には、本発明は、例えば、適切な遺伝子の突然変異の結果として、または核酸ハイブリダイゼーションにより、Mycobacterium tuberculosisにおける抗生物質耐性を検出する方法に関する。本発明は、核酸ハイブリダイゼーションを実施するための核酸プローブおよびキットにも関する。本発明は、さらに、katG遺伝子の染色体の位置およびそのヌクレオチド配列にも関する。
発明の背景
ロバート・コッホ（Robert Koch）による結核の原因学的因子であるMycobacterium tuberculosisの発見以来、一世紀を越える研究にもかかわらず、この疾患は依然として人間の罹患および死亡の主要原因の一つのままである。結核に起因する死亡は年間300万件と概算されており（Snider,1989）、これらの大部分は開発途上国におけるものではあるが、西側諸国においても、ホームレスの人々の数の増加およびAIDSの流行の衝撃のため、この疾患は復活した重要性を握っている（Chaisson et al.,1987;Snider and Roper,1992）。
イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちイソニアジド（INH）は、「結核（菌）」群のメンバー、すなわち、Mycobacterium tuberculosis、M.bovisおよびM.africanumに対するその絶妙な強さのため、過去40年間の間結核の治療に使用されてきた（Middlebrook,1952;Youatt,1969）。この薬物の正確な標的（ターゲット）も、その作用モードも、どちらも知られておらず、INH治療はいくつかの代謝経路の動揺をもたらす。INHはNADおよびピリドキサールホスフェートの代謝拮抗物質として作用し得ることを示すかなりの証拠があり（Bekierkunst and Bricker,1967;Sriprakash and Ramakrishnan,1970;Winder and Collins,1968,1969,1970）、また、この薬物が、マイコバクテリウムの細胞壁の抗酸性（acid−fast）特性に関連するミコール酸の合成を遮断することを示す他のデータも存在する（Winder and Collins 1970;Quemard et al.,1991）。その導入の少し後に、Mycobacterium tuberculosisのINH耐性単離株が出現し、これらは、特性付けによると、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を損失しており、モルモット（guinea pigs）において減少した毒力（virulence）を示すことがしばしば見出された（Middlebrook et al.,1954;Kubica et al.,1968;Sriprakash and Ramakrishnan,1970）。
ごく最近、INH耐性は、Mycobacterium tuberculosisの多剤耐性（MDR）変異株による米国における結核の流行（CDC,1990;1991a,b）と、このような株がHIV感染者および医療従事者の広範な院内感染に関連することの証明（Snider and Roper,1992）とによって、新たな重要性を獲得してきた。この問題の重要性の点から見て、当業界には、INH耐性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産生との間の関係を決定する必要性が存在する。
より特定的には、当業界には、薬剤感受性に関与する分子メカニズムを理解する必要性がある。その上、当業界には、INH耐性株を迅速に同定することを可能にする簡便な試験を開発する必要性がある。さらに、当業界には、このような試験を実施するための試薬に対する必要性がある。
リファピシンもまた、マイコバクテリウム、特にMycobacterium tuberculosisおよびMycobacterium lepraeによる感染の治療のために使用される主要な抗生物質である。マイコバクテリウムのあるものは、ゆっくり生育するので、リファンピシンまたはその類縁体に対する耐性を試験するための迅速で効率的な試験が利用可能にされなければならない。同様に、本発明は、ストレプトマイシンに対して耐性であるMycobacterium tuberculosisのストレインの迅速な検出を目的とする。ストレプトマイシンに対する耐性の発達のため、後者の抗生物質は他の抗生物質、例えば、イソニアジドと共に使用されてきた。したがって、結核の適切な治療の前には、この３種の主要な抗生物質、すなわち、イソニアジド、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対する耐性の迅速で効率的な検出が先行すべきである。
発明の概要
以上のように、本発明は、イソニアジドおよび他の薬剤、例えばリファンピシンまたはその類縁体、およびストレプトマイシンに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの細胞の存在をインビトロで検出するための方法を提供することにより、当業界におけるこれらの必要性を充足することを助けるものである。
リファンピシンの類縁体、特に３−ホルミル−リファマイシンの誘導体、特に置換の結果として、……ナフトフラノニル基中またはナフトフラノニル基の７位の側鎖に存在する置換物……、または側鎖中に二重結合の導入もしくは除去により……。
本発明によれば、イソニアジドに対する耐性の検出は、特にイソニアジドに対して耐性ではないMycobacterium tuberculosisにおける同じkatG遺伝子のヌクレオチド配列に関して、Mycobacterium tuberculosisのkatG遺伝子内の１つまたはいくつかのミューテーションの検出を包含する。
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの核酸の存在をインビトロで検出するための別の代替法においては、その方法が、以下の工程：
−必要であれば予めプローブに接触可能にした上記核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させる工程、
−上記核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する工程
を含み、
上記プローブが、プラスミドpYZ56の2.5kb  EcoR V−Kpn Iフラグメントまたはその一部分である核酸配列を含み、上記フラグメントがBamH I切断部位を含み、上記一部分はイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分長いものである。
例えば、この代替的方法は、以下の工程を含む：
（Ａ）細胞の核酸を、核酸がプローブに接触可能になるように、固体支持体上におき、固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）からの固定された核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）から得られるフィルターを、ハイブリダイズしていないプローブを除去するように洗浄する工程、および次に
（Ｄ）工程（Ｃ）から得られる洗浄したフィルター上のハイブリダイズしたプローブを検出する工程。
プローブは、プラスミドpYZ56の2.5kb  EcoR V−Kpn Iフラグメントに存在する核酸配列を含み、上記フラグメントはBamH I切断部位を含む。このフラグメントは、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisの細胞内DNAと関連していることが見出されており、このような抗生物質感受性微生物を、以下に記載する条件下でこのフラグメントとハイブリダイズするDNAを含有しないイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisから区別することができる。
本発明は、さらに、イソニアジド耐性細胞から欠如しているイソニアジド感受性を与えるMycobacterium tuberculosisのkatG遺伝子の領域をコードしているイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisのRNAおよびDNAのようなヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、本発明のヌクレオチドに結合している放射性核種のような標識されたプローブをも提供する。
さらに、本発明は、相補的な塩基配列のヌクレオチド配列に水素結合した、実質的に本発明のヌクレオチド配列からなるハイブリッド二本鎖分子、例えばDNAまたはRNAを提供する。
また、本発明は、Mycobacterium tuberculosisのカタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子またはこのようなヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列のグループから選択する方法をも提供する。この方法は、どのヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズするかを決定する工程を含む。このヌクレオチド配列は、DNA配列またはRNA配列であることができる。この方法は、ヌクレオチド配列上の標識を検出する工程を含んでいてもよい。
さらに、本発明は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを検出するためのキットを提供する。キットは、プラスミドpYZ56の2.5kb  EcoR V−Kpn Iフラグメントであり、BamH I切断部位を含むフラグメントである核酸配列を含むプローブを含有している容器を含む。キットは、また核酸の対照調製物を含有している容器をも含む。
本発明は、酵素カタラーゼまたは同様の酵素のイソニアジドに対する作用の産物として得られる化合物をもカバーする。katG遺伝子、または同様の活性を有するこの遺伝子の誘導体を、カタラーゼタンパクの供給源として使用することができる。この新規の化合物は、H.David et al.の「臨床マイコバクテリウム学のための実験室方法（Methodes de laboratoire pour Mycobacteriologieclinique）」、パスツール研究所（Pasteur Institute）編集、ISBN番号0995−2454に記載されているようなアンチバイオグラム（antibiogram）方法により、INH耐性マイコバクテリウム株に対する反応性によって選択される。
【図面の簡単な説明】
本発明は、以下のような図面を参照してその詳細の大部分が記載される。
図１は、INH耐性M.smegmatis株BH1（Gayathri et al.,1975）（MC2−155株の誘導体）を、M.tuberculosis−H37Rvシャトルコスミド（New YorkのW.R.Jacobs博士の厚意により提供されたもの）のプールにより形質転換し、個々のクローンをINH感受性について採点したことを示す。コスミドpBH4は定常的に薬剤感受性を付与し、形質転換体はカタラーゼを過剰産生する（Heym,1992のようにアッセイした場合）。pBH4からのDNAインサートの制限地図を、pYZ55からのインサートのそれと共に示す。pYZ55は、E.coliヒドロペルオキシダーゼＩ（HP I）の保存された領域からのアミノ酸配列と一致するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ（５′−TTCATCCGCATGGCCTGGCACGGCGCGGGCACCTACCGC−３′）を用いたハイブリダイゼーションをもとに単離された、M.tuberculosis H37RvのkatGを含有するプラスミドである。以下の酵素に関する制限部位が示されている：Ｂ，BamH I;Ｃ，Cla I;Ｅ，EcoR V;Ｈ，Hind III;Ｋ，Kpn I;Ｍ，Sma I;Ｎ，Not I;Ｒ，EcoR I;Ｓ，Sac I。pYZ55からの4.5kbインサートと含有するマイコバクテリウムのシャトルプラスミドpBAK14（Zhang et al.,1991）を用いたBH1の形質転換も、同様にINH感受性を付与した。pYZ55に由来し、pBAK14中にある方向（＋）または逆の方向（−）に挿入されているサブフラグメントを用いて形質転換されたBH1について、MICも同様に示す。
図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミド構築物（Zhang et al.,1991）を用いて形質転換されたE.coliおよびM.tuberculosis H37Rv株からの抽出物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、WayneおよびDiazにより記載されているように（Wayne et al.,1986）カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）について染色した。レーン１、M.tuberculosis H37Rv;2、E.coli UM2（katE，katG）;3、E.coli UM2/pYZ55;4、E.coli UM2/pYZ56（pUC19中の2.9kb  EcoR V−Kpn Iフラグメント、図１のpBAK−KE＋に相当する）;5、E.coli UM2/pYZ57（BamH I−Kpn I欠失を有するpYZ55、図１のpBAK−KB＋に相当する）。M.tuberculosisカタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）。同じパターンは、pYZ55により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。pYZ56（レーン４）は、パネルＣに示すベクターからのlacZ′およびkatGの間の融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、E.coliのHP Iとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。
図３は、pUC19ベクター単独、M.tuberculosis katGを発現するpYZ55、およびM.tuberculosis katGの高レベル発現を伴うpYZ56を用いて形質転換された、katGおよびkatEの両方に突然変異を有するE.coli株（UM2、Mulvey et al.,1988）を示す。適切な抗生物質を添加したLuria−Bertani培地中の一晩培養を、種々の濃度のINHの存在下でプレーティングし、コロニー形成単位を評価した。代表的な実験の結果を、３組の試料について観察された標準偏差を示すエラーバーと共に示す。M.tuberculosisのkatGの過剰発現は、同様にE.coli UM255（katG、katE、Mulvey et al.,1988）において高濃度のINHに対する感受性を付与したが、E.coli TG1のようなカタラーゼ陽性株に対しては何の効果も示さなかった。いくつかの実験においては、高濃度のINHは、単独で、UM2およびUM255の生育に対して検出可能な阻害効果を有していたが、全ての実験において、pYZ56形質転換体の阻害は、相当するベクター対照において観察されたものよりも少なくとも10〜100倍大きいものであった。
図４は、Kpn Iで消化し、（Ａ）katG（4.5kb  Kpn Iフラグメント）および（Ｂ）SOD遺伝子（1.1kb  EcoR I−Kpn Iフラグメント、Zhang et al.,1991）をプローブとして調べた、異なるM.tuberculosis株からのゲノムDNAを用いて調製したサザンブロットを示す。プローブの標識およびブロットの処理は、以前記載されたように実施した（Eiglmeier et al.,1991;Maniatis et al.,1989）。レーン１、H37Rv;2、株12−MIC  1.6μg/ml  INH;3、B1453−MIC  ＞50μg/ml INH（Jackett et al.,1978）;4、株24−MIC  ＞50μg/ml INH;5、79112−INH感受性（Mitchison et al.,1963）;6、12646−INH感受性（Mitchison et al.,1963）;7、79665−INH感受性（Mitchison et al.,1963）。INH感受性は、異なる濃度のINHを含有するLowenstein−Jensenスロープ（斜面）の接種により確認した。
図５は、katG遺伝子座の編成である。上部のバーは、katG領域にわたるM.tuberculosis染色体のストレッチに相当し、地図の作製に用いた個々のコスミドの位置は、もとのシャトルコスミドpBH4およびpYZ55と共に下部に示されている。いくつかの重要な制限部位の位置（Ｂ，BamH I;Ｋ，Kpn I）は、公知の遺伝子マーカーのおよその位置と共に示されている：fbpB、αまたは85B抗原（Matsuo et al.,1988）をコードする；katG、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ;LL105、Å  Andersenの厚意により供給された無名のλgt11クローン;MPTR、主要多型タンデムリピート（Hermans et al.,1992）。
図６のＡは、katGを担持するKpn Iフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、EMBLデータライブラリーに受託番号X68081として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、700bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図2Aでの位置を引用する。
図７は、マイコバクテリウムにおけるkatGの分布である。A.は、異なる細菌DNA（1.5μｇ）の試料をRsr IIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロミドで染色したもの。レーン１および７、サイズマーカー；M.leprae；レーン３、M.tuberculosis H37Rv;レーン４、M.gordonae；レーン５、M.szulgai；レーン６、M.avium。B.は、Ａのゲルを、サザンブロッティングした後、katG特異的プローブでハイブリダイゼーションしたもの。
図８は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造の整列図である。配列は、M.tuberculosis H37Rv、mtkatg;E.coli、eckatg（Triggs−Raine et al.,1988）；S.typhimurium、stkatg;B.stearothermophilus、bspera（Loprasert et al.,1988）および酵母シトクロムｃペルオキシダーゼ（ccp;Finzel et al.,1984）からのものである。整列図は、PILEUPおよびPRETTYを用いて作製した（Devereux et al.,1984）。「・」は、相同性を最大にするように導入したギャップを表わす。本文中で考察している活性部位およびペルオキシダーゼモチーフからの重要な残基（Welinder,1991）は、コンセンサスの下に示されている。
図９は、異なる細菌において産生されたM.tuberculosis KatGのウエスタンブロット解析である。タンパク質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、次いでイムノブロッティングと、Zhang et al.,1991に記載されているようにBCGに対して生成された抗血清を用いた検出を行った。
レーン１、M.tuberculosis H37Rvの可溶性抽出物；レーン２、ベクターpBAK14を担持するM.smegmatis  MC2155;レーン３、pBAK−KKを担持するMC2155（katG＋）；レーン４、E.coli UM2（katＥ、katG）；レーン５、pYZ55を担持するUM2（katG＋）；レーン６、pYZ56を担持するUM2（lacZ′::katG）。
好ましい態様の詳細な説明
最近の米国における多剤耐性を示すM.tuberculosisの多数の株の出現は、この生物の非常な伝染性（うつり易さ）の点から、大変警告的な状況である。この危険は、いくつかの小規模の結核の流行によって際立って示されており、これらにおいてはMDRのM.tuberculosisに感染した一人の患者が、HIV陽性者、監獄警備員および健康な看護員を感染させた（CDC 1990,1991;Daley et al.,1992;Snider and Roper,1992）。現在の世界的なHIVの流行の重大さの点から、西側諸国のAIDS患者がアフリカの患者のように（M.avium/M.intracellulareコンプレックスのメンバーよりむしろ）MDRのM.tuberculosis株に感染するようなら、この疾患の広範な蔓延が起こるであろうということが考えられる。
イソニアジド（INH）は、マイコバクテリウムの結核菌のグループ（Mycobacterium tuberculosis、M.bovisおよびM.africanum）に対して特に強力な殺菌性薬剤であり、結果としてそれは結核の治療において特に効果的であった。標準的な対結核療法は、一般にINHおよびリファンピシンを、しばしばピラジナミド、エタンブトールまたはストレプトマイシンのようなより弱い薬剤との組合せで含む。療法におけるその用途に加えて、INHは予防的手段として患者の近接者にも与えられる。
ヒトの疾患の因子であるM.tuberculosisのINH耐性突然変異体は、２レベルの耐性を示し、低レベルは１〜10μg/ml、高レベルは10〜100μg/mlである。INH耐性は、しばしばカタラーゼ活性の損失および毒力と関連している。近年、AIDSの流行、ホームレスの増加および社会状態の低下により、先進国、特に米国において、結核は主要な公衆衛生問題として再出現してきた。今日のこの疾患の警告的な特徴は、多剤耐性生物の出現と、医療従事者およびHIV感染患者への迅速な院内伝播である。このことは、CDCによる、多剤耐性株（少なくともINHおよびリファンピシン）の治療および伝播の防止のための新規な推薦の提案を促した、INH耐性の問題の新鮮な洞察を入手し、迅速な診断試験を開発するために、以下の研究を実施した。
明らかに、主な抗結核剤であるINHおよびリファンピシンに対する耐性のメカニズムを理解することは必須である。これは、そのことが、新規な化学療法的戦略の開発を可能にし、MDR株に対して活性な新規化合物の設計を容易にするからである。
本発明は、INHターゲットがカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素HP Iであること、およびこの酵素が単独で毒性を媒介することを明らかにする。この結論を強要する証拠は、E.coliのカタラーゼ陰性突然変異体におけるM.tuberculosis katG遺伝子の発現が、この細菌をINHに対して感受性にするという結果をもたらしたことによって得られた。さらに、M.tuberculosisのINH感受性遺伝子katGの単離は、ハイブリダイゼーションおよびPCRベースのアプローチによるINH耐性株の迅速な検出を容易にするので、重要である。ここで示されるように、臨床株における高頻度のkatG欠失は、この手順を簡便化するはずである。
INH感受性に関与するM.tuberculosis遺伝子の同定
INH感受性に関与するM.tuberculosis遺伝子を単離するため、非相同のアプローチを用いた。BH1は、容易に形質転換可能なM.smegmatis株MC2155の偶発突然変異体（Snapper et al.,1990）であり、これは512μg/mlのINHに対して耐性で、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を欠いている（Heym et al.,1992）。INH感受性とこれらの酵素活性との間には厳密な相関があるので、M.tuberculosisからの適切な遺伝子を担持するプラスミドを用いたBH1の形質転換は、それらの回復および付随するINH感受性を導くはずである。
結果として、DNAを、Escherichia coli中のM.tuberculosisシャトルコスミドのプールから調製し、電気的形質転換（エレクトロトランスフォーメーション）によりBH1中に導入した。次いで1000を越えるカナマイシン耐性形質転換体をINH感受性に関して採点し、MC2155野生型株からのMICである32g/mlのINHを含有する培地上で生育しない４個のクローンを得た。
BH1の再形質転換の後、これらのうちの１つであるpBH4のみが一貫してINH感受性表現型を与えた。BamH I、Kpn I、Not I、Cla IおよびHind IIIを用いた制限酵素消化物は、pBH4に担持されているM.tuberculosis染色体DNAが約30kbの大きさであることを示した。最後の３種の酵素を用いて作製した地図を図１に示す。
pBH4をライブラリー中の相同クローンを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いた場合、さらに８個のシャトルコスミドが単離された。BH1の形質転換の際に、これらの５種（T35、T646、T673、T79、T556）はINH感受性を回復し、pBH4と同様の制限プロフィールを示した。特に、4.5kbのKpn Iフラグメントは、全ての場合に存在した。
個々のBamH Iフラグメントをサブクローニングする試みは、BH1の傷を相補することができる形質転換体を与えず、BamH I部位が目的の遺伝子中に位置している可能性があることが示唆された。これに対して、pBH4の誘導体であるpBH5を、EcoR Iフラグメントの欠失によって構築したところ、これはINH感受性の回復には7kbセグメントが必要ではないことを示した。
BH1のINH耐性突然変異を相補したシャトルコスミドを担持する形質転換体を注意深く検査し、いくつかの抗生物質に関するMICを確立した。全ての場合において、INHに関するMICは512μg/mlから８μg/mlに減少し、この値は感受性株MC2155の値（32μg/ml）よりも低い値であった。この高度感受性の表現型は、組換えクローンがINH毒性を強化し得る酵素を過剰産生している可能性があることを示唆した。酵素学的研究は、これらの形質転換体は全て、INH感受性である野生型株MC2155よりも約２倍多いペルオキシダーゼおよびカタラーゼを産生することを示した。
INHに加えて、M.tuberculosisの多くのMDR株は、リファンピシン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびピラジナミドに対しても、もはや感受性ではない。INHに対する耐性とこれらの化合物との間に関係がある可能性を検査するために、種々のM.smegmatis株およびそれらのpBH4形質転換体についていくつかの薬剤のMICを決定したが、差異は見られなかった。
M.tuberculosisカタラーゼ遺伝子のクローニング
45merのオリゴヌクレオチドプローブを、E.coli（Triggs−Raine et al.,1989）およびBacillus stearothermophilus（Loprasert et al.,1988）のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素HP Iの高度に保存された領域の一次構造に基づいて設計した。M.tuberculosis DNAのゲノムブロットを、このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて調べると、ほとんどの場合に特異的バンドが検出された。Kpn Iは強くハイブリダイズする4.5kbの独自の（ユニーク）フラグメントを生成したので、この酵素を、pUC19にサイズ選択ライブラリーを作るために用いた。
このオリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングを行うと、適切なクローンpYZ55が得られた。そのインサートDNAの制限地図を図１に示す。図１では、これがpBH4の部分に正確に対応することがわかる。独立した確認もまたクロスハイブリダイゼーションにより得られた。
種々のサブクローニング実験によって、M.tuberculosisカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性をE.coli中で発現する最小のフラグメントは2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントであることが見出され、これは予想されたようにBamH Iの切断部位を含んでいた。部分的DNA配列解析は、pYZ56に担持されているkatG遺伝子が、E.coliおよびB.stearothermophilusのHP I酵素に高度に相同なカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることを示した：
0003579049.tif 000002
（図2:Triggs−Raine et al.,1988）；（Loprasert et al.,1988）。同一の残基は「＊」で示す。HP I活性は、染色によりE.coliおよびM.smegmatisの両方において検出された（以下を参照されたい）。
INH感受性におけるカタラーゼ−ペルオキシダーゼの関与
M.tuberculosisのkatG遺伝子をクローニングしたので、カタラーゼ陰性とイソニアジド耐性との間の関連の遺伝的基礎を調べることが、直ちに興味のあることであった。シャトルベクターpBAK14中に構築物のシリーズを確立し、INH耐性M.smegmatis突然変異体BH1を形質転換するために用いた。完全なkatG遺伝子を担持するプラスミドのみが、HP Iを産生し、INH感受性を回復した。これらの中で最小のものであるpBAK14は、2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントを担持しており、したがって、katG遺伝子の上流の2kb領域は関与していないこと、およびカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性が単独でマイコバクテリウムをINHに感受性にするのに充分であることが明らかになった。
無細胞抽出物を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼ活性について染色した。これらの条件下で、このM.tuberculosis酵素は、カタラーゼ活性（Heym et al.,1992）と共に移動するペルオキシダーゼ活性（レーン１）の２本のバンドを示した。
E.coli中に導入すると、katG遺伝子は同タンパク質の合成を指示したが、一方、pYZ56は大きさがやや大きいタンパク質を産生した。これは、フレームの合ったlacZ′::katG遺伝子融合の構築によるものである。活性染色は、M.smegmatisの細胞抽出物を用いても実施した。BH1におけるM.tuberculosisからのkatG遺伝子の存在は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導き、これはM.tuberculosis中またはE.coli中で作られた酵素、およびM.smegmatisのネイティブHP Iと同じ電気泳動移動度を示した。
M.tuberculosisにおけるINH耐性の基盤
多年の間、INH耐性株のサブセット、特に最も高い薬剤濃度に対して耐性のものが、モルモットにおいて毒力が低く、カタラーゼ活性を持たないものであることが知られていた。ゲノムDNAをM.tuberculosisのいくつかの臨床単離株から調製し、プローブとして4.5kb  Kpn Iフラグメントを用いてサザンブロッッティングにより解析した。２つの高度に耐性の株、B1453および24においては、カタラーゼ遺伝子は染色体から欠失していたが、一方、例えば株12のように低レベルの耐性を示す他のものにおいては（図３）、それはなお存在するが発現されていない。さらに研究すると、katGのすぐ前の領域は高度に再配列を受け易いことが示された。
M.tuberculosis HP IはE.coliをINH感受性にする
M.tuberculosisのHP I酵素がE.coliにINH感受性を付与することが可能かどうかを決定するために、カタラーゼ突然変異体のシリーズをpYZ56を用いて形質転換し、MICを決定した。野生型株はINHに対して感受性ではなかったが、両方の内在性カタラーゼ活性を欠くがpYZ56を有している突然変位体は、高レベルのINH（500μg/ml）が存在する場合、生育阻害を示した。一方、形質転換されていない株は非感受性であった。
本発明の目的のために、図１に示す制限エンドヌクレアーゼ地図を有するプラスミドは、株中において、National Collection of Cultures of Microorganisms（CNCM）、Institut Pasteur、Paris,Franceに、受託番号（culture collection accession No.）Ｉ−1209として1992年５月18日付けで受託された。このプラスミドは、本発明の核酸配列、すなわち、プラスミドpYZ56の4.5kb  Kpn I−Kpn Iフラグメントを含んでおり、そのフラグメントは中にBamH I切断部位を有している。
一般に、本発明は、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisDNAに選択的にハイブリダイズして検出可能な複合体を形成することができる少なくとも１つのDNAまたはRNAプローブを提供することを含む、試料中のイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisの存在を検出する方法を備えている。検出は、試料を用いて、試料中に存在するイソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisDNAにプローブがハイブリダイズしてハイブリッド複合体を形成することを可能にする条件下で、およびハイブリッド複合体を試料中のイソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisの存在の指標として検出することを可能にする条件下で実施する。（「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ここで使用される場合は、DNAまたはRNAプローブが、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisのみにハイブリダイズし、イソニアジド非感受性Mycobacterium tuberculosisにはハイブリダイズしないことを表わす。）試料は、Mycobacterium tuberculosis細胞、またはその細胞の一部分、またはMycobacterium tuberculosis核酸、特にDNAを豊富にした細胞内容物からなっていることが可能である。ハイブリダイゼーションは、従来のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することができる。特定のハイブリダイゼーション条件は本発明に重要ではないことが見出されている。
より詳細には、Mycobacterium tuberculosisからのDNA配列は、サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションにより解析することができる。本発明に用いられた技法はManiatis et al.（1989）に記載されている。DNAフラグメントは、アガロースゲル上で分離し、その場所で（in situ）変性させる。フラグメントは、次いでゲルから水不溶性固体多孔性支持体、例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンメンブレン、または活性化セルロースペーパーのようなものにトランスファーし、そこでそれらを固定する。例えば、Amershamにより市販されているHybond（商標）メンブレンを用いることができる。プローブとの非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるためのプレハイブリダイゼーションの後、固体支持体を、本発明の核酸プローブとハイブリダイズさせる。固体支持体を洗浄して、非結合および弱く結合しているプローブを除去し、結果として得られるハイブリッド二本鎖分子を検査する。好都合な代替的アプローチは、ゲル中で変性させたDNAにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることである。
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、フィルターに妥当に結合し得る標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションの強度（ストリンジェンシー）に依存して大きく変化する。一般に、固定されたDNAに対するプローブの結合率を増強するために、化学量論に対してかなり過剰を用いる。
種々の程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを用いることができる。条件が厳密になればなる程、二本鎖形成のためにプローブとポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションのために必要とされる相補性が大きくなる。厳密さは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによって制御することができる。好都合には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、反応溶液の極性を変えることにより変化させる。用いるべき温度は、経験的に決定するか、またはこの目的のために開発された周知の公式から決定することができる。
DNAフラグメントをアガロースゲルから固体支持体にトランスファーするサザンブロッティングとは異なって、本発明の方法は、乾燥アガロースゲル中でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても実施することができる。この手順においては、アガロースゲルを乾燥し、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いてin situでハイブリダイゼーションを実施する。この手順は、検出の速度および感度が望ましい可能性がある場合に好ましい。この手順はMycobacterium tuberculosisのゲノムDNAまたはクローニングされたDNAを含有するアガロースゲルについて実施することができる。
さらに、本発明の方法は、エレクトロブロッティングによるポリアクリルアミドゲルからナイロンフィルターへのMycobacterium tuberculosisDNAのトランスファーによっても実施することができる。エレクトロブロッティングは、典型的にはアガロースゲルからDNAをトランスファーするために開発するためにキャピラリブロッティングよりも速いので、時間が重要である場合に望ましい可能性がある。この方法は、UV架橋と組合せて実施することができる。試験すべき試料を含有するポリアクリルアミドゲルを、適切に準備したナイロンフィルターと接触する状態に置く。これらを次いでエレクトロブロッティング装置中にサンドイッチにし、電流を用いてDNAをゲルからフィルター上へトランスファーする。緩衝液ですすいだ後、フィルターは、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションまたはUV架橋に供する準備ができている。
本発明の方法は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを検出するための本発明の核酸プローブを用いて実施することができる。プローブは従来の技法を用いて検出することができる。
本発明の方法は、katG遺伝子の点突然変異もまた、この遺伝子の部分的欠失同様に検出することが可能である。
本発明のヌクレオチドは、生物学的試料中のM.tuberculosisのヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは、原子または無機ラジカル、最も普通には放射性核種を用いて標識することができるが、おそらくは重金属を用いて標識することもできる。放射活性標識としては、32P、3H、14Cまたは同様のものが挙げられる。適切なシグナルを提供し、充分な半減期を有する、いかなる放射活性標識を用いることも可能である。他の標識としては、標識抗体に対する特異的結合メンバーとして役立ち得るリガンド、蛍光物質（fluorescers）、化学発光物質（chemiluminescers）、酵素、標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして役立ち得る抗体、などが挙げられる。標識の選択は、ハイブリダイゼーション率およびDNAもしくはRNAに対するプローブの結合に対する標識の効果により支配される。標識が、ハイブリダイゼーションに利用可能なDNAまたはRNAの量を検出するのに充分な感度を提供することが必要となる。
本発明の好ましい態様においては、プローブは、例えばニックトランスレーションによりプローブ中に取り込まれ得る放射活性同位元素、例えば、32Pまたは125Iで標識する。
別の好ましい態様においては、プローブは、化学的実体に結合したアビジンと反応するビオチンで標識する。この化学的実体は、アビジンがビオチンと結合すると、ハイブリッドDNA複合体を検出され得るようにするものであり、例えば、ハイブリッドDNA複合体を蛍光計測的に検出可能にする蛍光団（fluorophore）；ハイブリッドDNA複合体を電子顕微鏡により検出可能にし得る電子密度の高い化合物；ハイブリッドDNA複合体を免疫学的に検出可能にし得る抗体；または、ハイブリッドDNA複合体を酵素的に検出可能にする触媒／基質対などがある。細菌をプローブと接触させる前に、M.tuberculosis細菌を溶菌してそのDNAを放出させ、次いでそれを変性させ、ニトロセルロースメンブレンのような適切な固体のDNA結合支持体上に固定化することができる。
別の検出方法は、プローブの標識を必要としない、いわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション技法である。このアッセイにおいては、一本鎖ベクターに含有されている標識されていないプローブが、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisDNAにハイブリダイズし、プローブを含有していない標識された一本鎖ベクターがプローブを含有するベクターにハイブリダイズして、ハイブリッド複合体全体が標識される。
本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配列決定法（シークエンシング法）により誘導された。ヌクレオチドの塩基配列は、５′→３′方向に書かれている。示されている各文字は、以下のヌクレオチドについての従来の命名である：
A:アデニン
G:グアニン
T:チミン
C:シトシン
本発明のヌクレオチドは、従来の化学合成技法を用いて、ヌクレオチド単位間の３′→５′ホスフェート連結の形成により調製することができる。例えば、周知のホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、およびホスファイトトリエステル技法を、これらのアプローチの変法と同様に、用いることができる。デオキシリボヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法に基づくもののような自動合成機械を用いて調製することができる。オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドも、従来の技法を用いるRNA連結を使って得ることができる。
本発明のヌクレオチドは精製された形態である。例えば、本発明のヌクレオチドは、ヒト血液由来のタンパク質、ヒト血清タンパク質、ウイルスタンパク質、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト組織成分を含まない。さらに、本発明のヌクレオチドは、他の核酸、外来性タンパク質および脂質、ならびに細菌およびウイルスのような外来の微生物を含まないことが好ましい。
本発明は、当然のことながら、本発明のヌクレオチド配列の変異種、またはここにおける同一のプローブと同じ選択的ハイブリダイゼーション特性を現す本発明のプローブの血清型的変異種を包含する。
本発明のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）として知られるDNA増幅法において使用することができる。例えば、Kwok et al.（1987）を参照されたい。PCRは、迅速な方法であるので、有利である。
増幅すべきDNAのプラス鎖およびマイナス鎖に相補的な、10〜300塩基対離れて位置する既知の配列のDNAプライマー対は、オリゴヌクレオチドの合成のための既知の技法により調製することができる。プライマーがPBMC  DNAにアニーリングする場合、各プライマーの一端を、延長し、改変し、制限エンドヌクレアーゼ部位を創り出すことができる。このPCR反応混合物は、PBMC  DNA、DNAプライマー対、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、MgCl2、DNAポリメラーゼおよび従来の緩衝剤を含有することができる。DNAは、ある数のサイクルで増幅させ得る。一般に、各サイクルが上昇させた温度での短時間のPBMC  DNAの変性、反応混合物の冷却、およびDNAポリメラーゼによる重合からなる複数のサイクルを用いて、検出感度を増加させることが可能である。
増幅された配列は、オリゴマー制限（OR）と呼ばれる技法を用いることによって検出することができる。一本鎖コンフォメーション多型（SSCP）解析を、DNAフラグメント中の種々の位置における点突然変異およびDNA多型を検出するために用いることができる。Saiki et al.（1985）、Orita et al.（1989）を参照されたい。例えば、増幅の後、PCR反応混合物の一部を分離し、末端標識されたヌクレオチドプローブ、例えば32P−アデノシン三リン酸で末端標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションに供することができる。ORにおいては、末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブは増幅された配列のある領域に溶液中でハイブリダイズし、このプロセスにおいて特異的エンドヌクレアーゼ部位を再構成する。したがって、増幅されたkatG配列との標識プローブのハイブリダイゼーションは、選択的制限酵素消化に対して感受性の二本鎖DNA形態を生じる。エンドヌクレアーゼによる制限処理の後、結果として生じる試料をポリアクリルアミドゲル上で解析することができ、診断的標識フラグメントを用いてゲルの一部分のオートラジオグラムを得ることができる。オートラジオグラムにおける診断的フラグメント（例えば、長さ10〜15塩基の）の出現は、PBMC中のkatG配列の存在を示す。
もとのテンプレート（鋳型）として染色体DNAの代わりにRNAを用いることにより検出感度を増加させ得る可能性があるので、本発明は、ここに記載されているDNA配列に対して相補的なRNA配列を使用することを企図する。このRNAは、逆転写酵素によって相補的DNAに変換することができ、次いでDNA増幅に供することができる。
実験手順
細菌株およびプラスミド
表１は、本発明において使用した細菌株およびプラスミドの特性を概略的に示す。
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M.tuberculosis H37RVゲノムライブラリーは、シャトルコスミドpYUB18（Snapper et al.,1988）中に構築され、W.R.Jacobs博士の厚意により供給された。用いた他のシャトルベクターは、pYUB12（Snapper et al.,1988）およびpBAK14（Zhang et al.,1991）であった。
微生物学的技法および酵素学
用いた抗生物質、生育条件、酵素学およびMIC決定の詳細は、Heym et al.（1992）中に見出すことができる。
核酸技法
サブクローニング、サザンブロッティング、DNAシークエンシング、オリゴヌクレオチド生合成などには、標準的プロトコールを用いた（Maniatis et al.,1989;Eiglmeier et al.,1991）。
活性染色
E.coliおよびマイコバクテリウムの無細胞抽出物の調製は記載されてきた（Heym et al.,1992;Zhang et al.,1991）。ネイティブタンパク質試料は、全ての緩衝液からSDSを除外し、試料を煮沸せず、β−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に包含させなかったことを除き、Laemmli（1970）により記載されたようにポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。7.5％ポリアクリルアミドゲル上での50〜100μｇタンパク質試料の電気泳動の後、ゲルを3mM  H2O2中に20分間、緩やかに振とうしつつ浸漬することにより、カタラーゼ活性を検出した。等容量の２％塩化鉄および２％フェリシアン化カリウムを添加し、光で照らすことによりカタラーゼ活性の明らかなバンドを解明した。ペルオキシダーゼ活性は、0.2〜0.5mg/mlジアミノベンジジンおよび1.5mM  H2O2を含有する溶液中にゲルを30〜120分間浸漬した後、褐色のバンドとして検出した。
高度に毒性の化合物を生成するためには、M.tuberculosis HP I酵素がペルオキシダーゼによりINHを活性化する可能性が最も高いように考えられる（Youatt,1969;Gayathri−Devi et al.,1975）。katG遺伝子が単離され、特徴付けられたので、同様にして活性化され得るINHの新規な誘導体を作ることが可能なはずである。
例１
M.tuberculosisのイソニアジド耐性に関連するkatG遺伝子中の点突然変異
最近の研究において、katG遺伝子によりコードされるMycobacterium tuberculosisのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが強力な抗結核剤のイソニアジドまたはINHの毒性を媒介することに関与していることが示された。臨床レベルのINHに対して耐性の突然変異体は、減少したカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を示し、ある場合においては、このことは染色体からのkatG遺伝子の欠失によってもたらされている。クローニングされたkatG遺伝子を用いたMycobacterium smegmatisおよびM.tuberculosisのINH耐性株の形質転換は、薬剤感受性の回復をもたらす。E.coliのいくつかの株におけるkatGの発現は、この天然には耐性の生物を、高濃度のINHに対して感受性にする。
M.tuberculosisのいくつかのINH耐性臨床単離株はインタクトなkatG遺伝子を保持していたので、その耐性の分子的基盤を調べた。この研究は、染色体のkatG領域からの4.7kb  Kpn Iフラグメントのヌクレオチド配列の利用可能性により容易になった。これは、このことがPCR解析に好適なプライマー対の設計を可能にしたためである。11対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し（表２参照）、完全katG遺伝子およびフランキング配列のいくらかをカバーする280bp程度のPCR産物を生成するために用いた。対照実験においては、全ての実験で11対のプライマー全てが予想されたサイズのPCR産物を生成し、SSCP解析に非常に好適であったので、オランダまたはフランス起源のM.tuberculosisの36のINH耐性株のパネルを試験した。これらの株の多くが多剤耐性であり、HIV血清陽性患者から単離されたものである。
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それらのうちの２つは、どのプライマーを用いてもPCRフラグメントを生じず、katG遺伝子が欠失してしまっていることが示された。残りの34株は、全て予想されたPCR産物を生じ、存在する可能性がある点突然変異を検出し得るようにこれらをSSCPゲルで解析した。20のケースにおいて、薬剤感受性M.tuberculosisのkatGと比較して異常なストランド移動度が観察され、突然変異的事象が実際に起こっていたことが示唆された。PCRプライマーにより決定したこれらの突然変異のおよその位置を表３に示す。
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５つの独立した株（9188、9106、9441、9444、9363）からのkatG遺伝子の200bpセグメントを検査すると、単一の塩基の差異が見出された。これは全てのケースで同じであり、位置3360でのＧからＴへのトランスバージョンであって、結果としてArg−461のLeuによる置換をもたらしていた。したがって、katGの不活性化に加えて、INH耐性は変化したカタラーゼ−ペルオキシダーゼを結果として生じるミスセンス突然変異からも派生し得る。この突然変異は、薬剤と酵素との間の相互作用の部位を規定する可能性がある。残りの突然変異体を用いたDNA配列研究の結果が待ち望まれる。
この研究から導き出される別の結論は、種々のM.tuberculosis株に関連する多剤耐性の分子的基盤に関する。ある与えられた患者がHIVに関して血清陽性であるかまたは血清陰性であるかに関係なく、同じ突然変異が見出される。例えば、株9291は、あるHIV血清陽性結核患者から単離されたものであり、katG（R461L）、rpoB（S425L）およびrpsL（K42R）遺伝子に各々INH、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する突然変異を有している。同じ突然変異が、HIV血清陰性個人からの株に、別々に、または組合せで、見出されている。このことは、研究した株のセットに関して、いくつかの薬剤に対する耐性を付与する新規な単一のメカニズムは存在せず、むしろ多剤耐性は異なる薬剤ターゲットに関する遺伝子中の突然変異の蓄積の結果として生じることを意味する。
例２
M.tuberculosisのkatG遺伝子座の染色体中の位置およびヌクレオチド配列
細菌株、プラスミドおよび生育条件。我々の研究室のコレクションから以下の細菌株をこの研究に使用した：M.tuberculosis H37Rv;M.smegmatisMC2155（Snapper et al.,1990）；E.coli  Ｋ−12  UM2（katE katG;Mulvey et al.,1988）。組換えプラスミド、pYZ55（pUC19,katG＋）、pYZ56（pUC19,lacZ′::katG）およびシャトルクローン、pBH4（pYUB18,katG＋）およびpBAK−KK−（pBAK14,katG＋）は最近記載されており（Zhang et al.,1992,Nature）、M.tuberculosisのkatG遺伝子座は図５に模式化して示す。マイコバクテリウムは、Middlebrook 7H9培地で37℃で生育させ、一方、E.coli株は、適切な添加栄養と抗生物質を含むＬブロス中で培養した。
核酸技法。DNAの調製、標識およびハイブリダイゼーションには、標準技法を用いた（Eiglmeier et al.,1991;Zhang et al.,1992,Infect.Immun.;Zhang et al.,1992,Nature）。pYZ55のランダムフラグメントのショットガンライブラリーは、以前記載されたようにM13mp18中に調製し（Garnier et al.,1986）、ジデオキシ変法を用いてシークエンシングした（Biggin et al.,1983）。配列は、蓄積し、SAPを用いてコンティグ（contigs）に集合させ、Vax3100ワークステーションで作動させてNIP、SIPおよびPIPを用いて解析した（Staden,1987）。ギャップ閉鎖（gap closure）は、ABI  381装置上で合成した合成オリゴヌクレオチドプライマーと、T7DNAポリメラーゼ（Pharmacia）を用いて得、pYZ55から直接配列を得た。GenBankデータベース（リリース73.1）中の関連配列を検索するためには、FASTA（Pearson et al.,1988）およびBLAST（Altschul et al.,1990）プログラムを用いた。タンパク質配列中に存在する可能性のあるモチーフを検出するために、PROSITE（Bairoch,1992）カタログをスクリーニングし、GCG配列解析パッケージのPILEUPおよびPRETTYモジュールを用いて整列（アラインメント）を行った（Devereux et al.,1984）。
ウエスタンブロッティングおよびカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性染色。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解像されたポリペプチドのイムノブロッティングおよびM.bovisBCGに対して生成されたポリクローナル抗体（DAKOより購入）を用いた検出は、記載されたとおり行った（Zhang et al.,1992,Infect.Immun.，Nature，Mol.Microbiol.）。カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性を検出するための手順は、最近概略的に示されている（Heym et al.,1992;Zhang et al.,1992.Nature）。
結果
M.tuberculosisのkatG遺伝子座のヌクレオチド配列。以前の研究においては、完全katG遺伝子は、シャトルコスミドpBH4上に、およびpYZ55を与えるために4.5kb Kpn I制限フラグメント上に、E.coliにおいて別々にクローニングされた（図5;Zhang et al.,1992,Nature）。カタラーゼ−ペルオキシダーゼの構造遺伝子は、続いてサブクローニングにより2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントに位置決定された。この重要な酵素の一次構造を推定し、それにより強力な抗結核誘導体へのINHの変換におけるその推定上の役割についての洞察を得るために、pYZ55からの完全インサートのヌクレオチド配列を決定した。これは、ジデオキシ−ショットガンクローニング手順の変法（Biggin et al.,1993）により達成し、コンティグ間のギャップは特異的プライマーを用いて閉鎖した。
結果として得られた図6Aに示す配列を調べると、この4.5kbフラグメントは、4,795ヌクレオチドを含み、総体的dG＋dC含量が64.4％であることが見出された。高コーディング確率値を用いてオープンリーディングフレームの存在に関してこれを解析すると、単一の候補が検出され、その大きさ、組成および位置から、これをkatGとして同定した。Kpn Iフラグメントのどちらのストランドにもそれ以外のオープンリーディングフレームが存在しないことは、katG以外の遺伝子がINH感受性の付与に関与している可能性を除外した。
この配列をさらに解析すると、katGが、それに先行する２コピーの700bpのダイレクトリピートを有することが示された。これらは68％同一であり、同一である最長のストレッチは58bpであった（図6B）。この配列を用いてデータベースをスクリーニングしたところ、有意な相同性は全く検出されなかった。それがM.tuberculosisの新規な反復要素に相当する可能性を試験するために、58bpのリピートを含む336bpのプローブを用いて部分的に整理したコスミドライブラリーを調べた。陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、katGを担持することが既知であるクローンからのみ得られた。同様に、制限酵素BamH I、Kpn IおよびRsr IIを用いて消化したM.tuberculosis DNAのサザンブロット中には単一の制限フラグメントが検出され、それによりこの反復配列が分散していないことが示された。
katGの染色体での位置。M.tuberculosisゲノム計画の一部として、プローブが利用可能であるほとんどの遺伝子をコンティグ地図上で位置決定した。図５に示す重複するコスミドのシリーズから、katGにリンクしたマーカーは、それぞれ無名の抗原および推定上のフィブロネクチン結合タンパク、またはα抗原（Matsuo et al.,1988）をコードする、LL105およびfbpBであることがわかる。既知の挿入配列IS6110およびIS1081（Collins et al.,1991;McAdam et al.,1990;Thierry et al.,1990,J.Clin.Microbiol.;Thierry et al.,1990,Nucleic Acids Res.）のどれ一つとして染色体のこの領域にマップされないが、katGの上流領域には主要多型タンデムリピートであるMPTR（Hermans et al.,1992;Zhang and Young,1993）が密に存在する。
他のマイコバクテリウムにおけるkatG相同体（ホモログ）の存在。INHは結核コンプレックスのメンバーに対して絶妙に強力であるが、他のマイコバクテリウムに対しては、あるとしてもわずかの活性しか示さない。katGに相同な遺伝子が他のマイコバクテリウムに存在するかどうかを決定するために、Rsr IIで消化したDNAのサザンブロットを、M.tuberculosisのkatGを担持する2.5kbのEco R V−Kpn I制限フラグメントから調製したプローブにハイブリダイズさせた。高ストリンジェンシー条件下で、M.lepraeおよびM.aviumから良好なシグナルが得られた（図７）が、一方、M.gordonaeおよびM.szulgaiについては、かろうじて識別できるハイブリダイゼーションが観察された。最近、katGホモログはM.smegmatisおよびM.aurumにも存在することが示された（Heym et al.,1992）。
M.tuberculosisのカタラーゼ−ペルオキシダーゼの予測される特性。katGのヌクレオチド配列から推定されるカタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造を図６に示す。この酵素は、735アミノ酸を含み、80,029ダルトンの分子量を有すると予測される。このサイズのタンパク質は、M.tuberculosis、およびM.smegmatisとE.coliの両方の組換え体において観察された（以下を参照されたい）。
一次構造は、E.coli、Salmonella typhimuriumおよびBacillus stearothermophilusを含むいくつかの他の細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼについても入手可能であり（Loewen et al.,1990;Loprasert et al.,1988;Triggs−Raine et al.,1988）、これらは酵母シトクロムｃペルオキシダーゼと遠く関連していることが示されている（Welinder,1991）。後者の結晶構造は決定されており（Finzel et al.,1984）、これを細菌の酵素の配列を解釈するために使用することができる。M.tuberculosisの酵素はエンテロバクテリアのHP I酵素と53.3％の保存を示し、B.stearothermophilusからのタンパク質と45.7％の同一性を共有する。これらの４つの酵素の配列の整列図を、酵母シトクロムｃペルオキシダーゼのそれ（Welinder,1991）と共に図８に示す。NH2末端は、酵母の酵素には対応物がなく、最も変化の多い部分であることは明らかであり、タンパク質のこのドメインが広範な変動を許容することができ、触媒に必要とされないことが示唆される。この解釈の実験的支持は、さらに40アミノ酸残基を含有するLacZ−KatG融合タンパクの形態において提供される（図９、レーン6;Zhang et al.,1992,Nature）。このNH2末端セグメントの付加は、活性染色による判定から、KatGにより行われるカタラーゼまたはペルオキシダーゼ反応のどちらかに、認め得る程度に干渉しない（Zhang et al.,1992,Nature）。
細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、遺伝子重複事象により進化したものであり、両方とも酵母の酵素との相同性を示し、約50アミノ酸残基のユニークなNH2末端配列と融合した２つのモジュールからなると考えられている（Welinder,1991）。M.tuberculosisの酵素はこのパターンに従っており、SIPを用いて内部的相同性について検索したところ（Staden,1987）、残基55〜422の間の領域がアミノ酸423〜735からなるカルボキシ末端ドメインと関連していることが明らかであった。PROSITEカタログに存在する、ペルオキシダーゼに典型的な２つの活性部位モチーフ（Bairoch,1992）の一方のみが、M.tuberculosisカタラーゼ−ペルオキシダーゼ一次構造をスクリーニングした場合に見出された。これは、第二のモチーフがあるはずのところであるHis269周辺のコンセンサスから２つの逸脱が存在するためである。（ペルオキシダーゼ１についてのコンセンサスパターン：〔DET〕−〔LIVMT〕−ｘ（２）−〔LIVM〕−〔LIVMSTAG〕−〔SAG〕−〔LIVMSTAG〕−Ｈ−〔STA〕−〔LIVMFY〕；ペルオキシダーゼ２についてのコンセンサスパターン：〔SGAT〕−ｘ（３）−〔LIVMA〕−Ｒ−〔LIVMA〕−ｘ−〔FW〕−Ｈ−〔SAC〕；（Bairoch,1992）。さらに、可能性があるATP結合モチーフ（Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｋ−Ｔ）が検出された（Balroch,1992）が、これは活性部位と部分的に重複するため、その存在は純粋に偶然である可能性がある（図８）。
酵母シトクロムｃペルオキシダーゼとの類似性により（Welinder,1991）、全てがNH2末端リピート中に位置する、構造的におよび触媒的に重要な残基の数を予測することが可能であった。His269はヘム鉄の５番目のリガンドとして役立つはずであり、一方、Asp380はその水素結合した相手であるはずである。活性部位のモジュレーションおよびH2O2結合に関与すると予測される他の残基は、Arg104、Trp107、His108、Asn138、Thr274およびHis275である（図４）。Welinderの予測によれば、Trp320は重要な残基であり、タンパク質−ラジカル部位の形成に必要なはずである（Sivaraja et al.,1989）。
M.tuberculosis KatGに対する抗体応答。KatGの免疫原としての可能性がある値を評価するために、ウエスタンブロットを、ウサギにおいてM.bovis  BCGに対して生成させた抗血清を用いてプローブした。図９に示すように、80kDカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、M.tuberculosis、およびクローニングされたkatG遺伝子を発現しているM.smegmatisの無細胞抽出物において認識される顕著な抗原の一つである（レーン１、３）。同様に、E.coli中にこの遺伝子を導入すると、有意なレベルのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが産生され、85kD融合タンパクの合成を指示するlacZ′−katG遺伝子融合から顕著な発現の増加が得られた（図９、レーン６）。
本研究の目的は、KatG遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、得られた情報を用いてその産物がいかにしてM.tuberculosisのINH感受性を媒介するかを理解しようとすることと、およびおそらくはゲノムのKatG領域の見かけ上の不安定性を説明することであった。反復DNAはしばしば染色体再配列の源であり、KatGの上流のDNA配列の解析から、２コピーの700bpダイレクトリピートが明らかになった。この要素は、この遺伝子座に限られているように見えるので、このように頻繁に観察されるこの遺伝子の欠失を導き得る、相同組換えのような事象のターゲットとして役立つ可能性は低い（Zhang et al.,1992,Nature;Zhang and Young,1993）。同様に、KatGを包含するM.tuberculosis H37Rvの染色体の70kbストレッチにはIS6110およびIS1081のコピーが存在しないので、これらの挿入配列が不安定性の源である可能性は高いようには見えない。むしろ、KatGの上流に位置する主要多型タンデムリピート、MPTR（図5;Hermans et al.,1992）のクラスターの存在は、これが組換えホットスポットとして作用する可能性があることを示唆する。これは、MPTRクラスターとKatGの両方を除去する可能性がある（Zhang and Young,1993）。KatG領域の配列の利用可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応に好適なプライマーの設計を可能にし、したがってINH耐性の迅速な検出および染色体不安定性の分子的基礎の理解の両方に向けられた研究を容易にする。
M.tuberculosisカタラーゼ−ペルオキシダーゼのおそらく最も興味深い特徴は、INH感受性を媒介するその能力である。我々の現在の作動仮説においては、この薬剤はその酵素と相互作用し、ペルオキシダーゼ活性によって毒性誘導体に変換され、それが未知の第二の部位に作用する（Zhang et al.,1992,Nature）。西洋ワサビペルオキシダーゼはこの反応を実行することができ（Pearson et al.,1988;Shoeb et al.,1985）、ヒロドキシルおよび有機を含まないラジカルを生成し得るが、他のマイコバクテリウムを含め、ごくわずかの細菌しかINHに対して感受性を有さない。それらはKatGに相同な遺伝子を有するので、このことは興味深い（図７）。これについての１つの説明は、ほとんどの細菌は２つのカタラーゼを含み、それらの一方はペルオキシダーゼ活性を有する広いスペクトルの酵素であり、また、第二のカタラーゼはH2O2を優先的に除去することによりこのカタラーゼ−ペルオキシダーゼの能力をINHを酸化することに制限するという事実によって提供され得る。M.tuberculosisは後者の活性を欠いているので、そのKatG酵素は、電子受容体についての競合なしにINHをその致死形態に変換することができる。
あるいはそうでなければ、毒性を助長するか、またはその薬剤との相互作用を好む、M.tuberculosis酵素の何らかの独自の特徴が存在する可能性がある。細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造を調べることは、この点に関して指示を与えるものではない。これは、それらが皆広範な配列の同一性を共有し、ペルオキシダーゼの活性部位に特徴的な２つのモチーフを含むためである。さらに、E.coli KatG遺伝子の発現はM.tuberculosisの薬剤耐性突然変異体にINH感受性を部分的に回復させ得ることが最近示され、この内在性酵素はいかなる薬剤特異的特性も有さない可能性があることが示唆された（Zhang et al.,1993）。酵母からのシトクロムｃペルオキシダーゼとの配列の比較は、KatGタンパク質の構造的および機能的編成についての重要な情報を提供し、推定的に重要な触媒残基の同定に導いた（図８）。
KatGの完全配列が利用可能になったので、位置指定突然変異誘発によりこれらの仮説のいくつかを試験すること、および酵素的反応およびその生成物の詳細な解析をインビトロで実施し得るように酵素を過剰産生させることが可能である。同様に、酵素的活性を保持しているが、INHへの結合またはその酸化ができない突然変異体を単離することも比較的簡便なことのはずである。特に興味深いのは、この酵素の反復構造、およびNH2末端リピートがペルオキシダーゼの活性部位を含むという予測である。これは、突然変異を起こした、または３′端で短縮されたKatG遺伝子が生じ得る可能性を提起する。その生成物は、サブユニット−サブユニット相互作用に必要であり得る正常なCOOH末端（Welinder,1991）を欠いており、不安定ではあるが、低い酵素活性をなお保持しているであろうということは考えられる。それらは、したがって、臨床的な場においてしばしば観察されるように、この遺伝子を完全に欠いている突然変異体とKatG+株との間の、中間的レベルのINH感受性を付与するであろう。
本発明は、当然のことながら、上述した2.5kbのEcoR V−Kpn Iフラグメントの一部分を使用してもよく、上記一部分はそれでもなおイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロ検出の選択性を提供するのに充分に長いものである。
本発明は、M.tuberculosisの多剤耐性変異体の検出のためのキットにも関し、上記キットは、
（ａ）薬剤耐性をコードしている遺伝子についてのプローブを含有している容器；および
（ｂ）核酸の対照調製物を含有している容器
を含む。
いうまでもなく、その使用は、イソニアジドに対して耐性のMycobacteriumの核酸に特異的なヌクレオチド配列を利用するあらゆる代替的検出方法であってよく、例えば、増幅技法およびプライマーを用いる方法であって、そのプライマーは、上述のプローブのヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含有するフラグメントの増幅を提供するために上記特異的なヌクレオチド配列内に包含されていてもよく、それにもかかわらずイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロ検出の選択性を提供するのに充分に長いものであり、最終的に増幅された配列のいずれかの中の可能性がある突然変異を検出する。
選択した抗生物質に対する耐性の検出のための好ましい代替的方法（オリゴタイピング）は、以下の工程を含む：
−突然変異を有している可能性が高い適切な遺伝子またはその一部を、選択した制限酵素により上記適切な遺伝子を消化するなどによって、複数のフラグメントにフラグメント化する工程、
−これらのフラグメントを、好ましくは、ストリンジェンシーの高い条件下で、対応する抗生物質に対して耐性ではない株の対応する対照DNAの上記適切な遺伝子の全部または一部を認識する標識プローブのシリーズである、相補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる工程、
−そして、調べているマイコバクテリウムの上記適切な遺伝子のいずれかのDNAフラグメントへの、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの欠如を、特に上記抗生物質に対して耐性ではない株から得られた上記適切な遺伝子上での同じオリゴヌクレオチドを用いた同じ条件下での試験の結果と比較して、突然変異の存在、そしておそらく対応する抗生物質に対する耐性の証拠として関連させる工程。
別の代替的方法（SSCP解析、すなわち、一本鎖コンフォメーション多型の解析）は、以下の工程を含む：
−解析すべきDNA、特に適切な遺伝子のDNAを消化する工程、
−得られたフラグメントを、例えばPCRにより増幅する工程、
−増幅されたフラグメントを回収する工程、および
−例えば、電気泳動ゲルなどでそれらを移動させることによって、サイズにしたがってそれらを互いに分離する工程、
−更なるフラグメントのサイズを、同様のアッセイに供した、抗生物質に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のDNAから得られたものと比較する工程、および
−おそらく検出される多型を、上記適切な遺伝子中の突然変異の存在と関連させ、したがって調べているDNAを得たもとの株の対応する抗生物質に対する可能性のある耐性と関連させる工程。いうまでもなく、古典的なシークエンシング技法を含め、他のあらゆる方法を、同じ目的の達成のために行使することができる。
この方法は、多型の検出のための「オリゴタイピング」という表現で知られるものを含み、Orita et al.（本明細書中以前に既にこれを参照している）により開示された一本鎖のコンフォメーションに基づいた多型の検出のための方法を参照するのが有利である。
イソニアジドに対する耐性の場合の適切な遺伝子は、当然のことながらkatG遺伝子またはそのフラグメントである。
リファンピシンに対する耐性の場合には、適切な遺伝子は、上記マイコバクテリウムのRNAポリメラーゼのβサブユニットをコードするrpoB遺伝子であり、あるいはその遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくはrpoB遺伝子のコドン400〜450を含む部分である。
最後に、ストレプトマイシンに対する耐性の場合には、企図される適切な遺伝子は、小リボソームサブユニットのS12タンパク質をコードするrpsL遺伝子のそれであり、あるいは上記遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくは位置43のコドンを含む部分である。
好ましい手順を、特にPCR増幅法を利用する代替的方法に関して、以下に開示する。
生物学的試料（例えば、血液または唾液）から、細胞破砕物を除去し、適切な溶解緩衝液を用いて細菌細胞を溶解した後、DNAを得る。PCR増幅法を、それぞれ増幅すべきDNAの各ストランドのフラグメントに相補的な１対のプライマーを用いて、古典的な方法により実施する。
この手順は、さらに以下のように実施してもよい：
−増幅産物（例えば、100〜300ヌクレオチドを含む）を、好適なエンドヌクレアーゼにより消化し、
−増幅媒体から得られたDNAストランドを変性処理に付し、
−一本鎖にしたDNAストランドを中性５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、
−上記一本鎖にしたDNAストランドを、電気泳動により上記ゲル上を移動させ、
−ポリアクリルアミドゲル上を移動したDNAフラグメントを通常のエレクトロブロッティング技法に従ってナイロンメンブレンにトランスファーし、例えば、32P標識したプローブのような標識プローブとハイブリダイズさせ、そして
−解析に供したDNAフラグメントの移動距離を、同じ条件下の増幅、消化、変性電気泳動およびナイロンメンブレンへのトランスファーで得た対照から得られたものと比較する。上記DNAは同一ではあるが調べている抗生物質に対して感受性の細菌株から得られていたものである。
上記で開示した「オリゴタイピング」手順に用いるオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにPCRプライマーの作製のためには、1992年９月15日にCNCMに番号Ｉ−12167として寄託されているプラスミドに挿入された野生型M.tuberculosisのrpoB遺伝子に相補的なものを、有利に利用する。
本発明は、より詳細には、小リボソームサブユニットのS12タンパク質をコードするMycobacterium tuberculosisのrpsL遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列、並びにストレプトマイシンに対する耐性に関連があると認められている突然変異を起こしたrpsL遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列にも関する。
そのヌクレオチド配列の増幅により、rpsL遺伝子全体のヌクレオチド配列を得ることができる。
本発明のさらなる説明は、以下の別の例の記載において提供され、そこで関連する図面においては：
−図10は、異なるM.leprae単離株の研究のために用いたPCR戦略をダイアグラムにより表すものであり、rpoBのコーディング配列を示す。シークエンシングされた領域は、陰影をつけた部分で示し、用いた増幅プライマーの位置および参考は上部の線により示し、シークエンシングプライマーはその下に示してある。
−図11は、（Ａ）リファンピシンに対する耐性を付与する突然変異を有するrpoBの短い領域のヌクレオチド配列を、対応する対立遺伝子中の塩基の変化と共に示すもの、および（Ｂ）E.coliおよびM.lepraeのRNAポリメラーゼのβサブユニットの領域IIのドメインＩのアミノ酸配列間の比較であり、ここで、突然変異を起こしたアミノ酸の差異および残基の番号を示してある。リファンピシン耐性と関連する突然変異を起こしたアミノ酸残基並びにその出現頻度も示してある。
−図12は、M.lepraeのrpoB遺伝子の完全配列を示す。
−図13は、M.tuberculosisのrpoB遺伝子の一部の配列を表す。
−図14は、M.tuberculosisのrpsL遺伝子の一部の配列を表す；M.lepraeの完全rpsL遺伝子の配列と、その発現産物であるS12タンパク質（その出発アミノ酸は１で記してある）のそれとを両方示してある。ML51およびML52プライマーの位置、並びにM.tuberculosisのrpsL遺伝子の一部の配列は、M.lepraeのそれらの下に提供してある。それらの位置のうち異なるものおよび相当するアミノ酸変化のみを示す。
−図15は、ストレプトマイシンに対する耐性に関連する、小リボソームサブユニットのS12タンパク質をコードするrpsL遺伝子フラグメントの野生型DNA配列、並びにS12タンパク質の対応するアミノ酸配列を示す。
例
リファンピシンに対する感受性を、Grosset et al.（およびInt.J.Lepr.57:607−614）により開示されているように、マウスにおいて決定した。M.lepraeの細胞は、古典的手順によってマウスの足から得た。耐性株は全て、20mg/kgの日用量のリファンピシンを受けたマウスにおいて生育することができたが、一方、感受性株は2mg/kg未満の低いリファンピシン濃度で殺菌された。
抽出したDNAのrpoB遺伝子の適切な領域を２対のビオチン化したプライマーを用いて開始した。その配列を以下の表に示す。
0003579049.tif 000008
従来の技法を用いて、310bpおよび710bpを含む増幅産物を、図10に示すようにそれぞれ得た。表に用いた異なるプライマーの配列の局在も、図10に示す。
得られたDNAを、リファンピシンに対して感受性の単離株のrpoB配列に基づいてシークエンシングした。その遺伝子の配列を含むプラスミドは、番号Ｉ−1266として1992年９月15日にCNCMに寄託されている。ビオチニル化したPCR産物を、攪拌しながらストレプトアビジンでコーティングしたビーズに接触させることにより、PCR反応混合物から濃縮した。ビーズに付着したビオチニル化されたストランドを、次いで回収し、シークエンシングした。得られた配列を、野生型株のrpoB遺伝子の配列と比較した。野生型遺伝子（リファンピシンに対して感受性のマイコバクテリウムの）、およびリファンピシンに対して耐性の４つの突然変異体のβサブユニットの対応する配列のシークエンシングの結果として、有為な結果が得られた（図11）。
M.tuberculosisに感染した患者から得た102ストランドから始めて、結果が得られた。この102ストランドのうち、53はリファンピシンに対して感受性であり、49はリファンピシンに対して耐性であった。後者のうちでは、突然変異は、突然変異体のうち43において400〜450の領域中に位置決定され、突然変異は425Serの領域でLeuへ起こっていた。
ストレプトマイシンに対するマイコバクテリウムの耐性の検出の例
M.tuberculosis株の培養およびストレプトマイシンに対するその感受性の試験は、
0003579049.tif 000009
培地上での比例法により実施した〔「臨床マイコバクテリウム学の実験室方法
0003579049.tif 000010
M.lepraeのrpsL遺伝子のヌクレオチド配列は、配列類似性により、ストレプトマイシン耐性に関連のあることに責任がある、推定突然変異部位を含む領域を取り囲む、PCR反応に好適なML51（CCCACCATTCAGCAGCTGGT）およびML52（GTCGAGCGAACCGCGAATGA）の２つのプライマーの構築に導いた。マトリックスとして使用した、用いたM.tuberculosisのDNAは、306bpのrpsLフラグメントを得ることを可能にした。配列決定したフラグメントのヌクレオチド配列は、M.lepraeのそれと28か所の差異を呈していた。
rpsL遺伝子またはM.tuberculosisの43ストランド（そのうち28は耐性であった）を、PCRおよびSSCP技法の両方で増幅した。
凍結−解凍（congelation−decongelation）技法により、100μｌの鉱物油でカバーされたM.tuberculosis試料の200μｌアリコートからDNAを抽出した（Woods and Cole,1989,FEBS Microbiol.Lett.,65:305−308）。
試験したDNAストランドの電気泳動後、突然変異体のうち16に突然変異が示された。考慮中の16ストランドにおける突然変異の性質を確立するために、ML51およびML52プライマーを用いてPCRにより相当するrpsL遺伝子フラグメントを増幅し、それらの各々のヌクレオチド配列を決定した。
得られた配列を野生型rpsL遺伝子の配列と比較した。野生型に関して単一の差異が見出された。コドン43のAAGが突然変異によりAGGとなり、結果として、Lys−42アミノ酸がArgに置き換わっていた。
本発明は、「突然変異を起こした」DNAフラグメントにも関する。それらは、次に、好適なハイブリダイゼーション手順における検出のための、および上記で説明したいずれかの抗生物質に対して耐性を有する疑いのあるM.tuberculosis株から抽出したDNAにおける同様の突然変異の検出のための、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
本発明は、さらに、イソニアジド、リファンピシンまたはその類似体、およびストレプトマイシンに対するマイコバクテリウム科の耐性についてのキットにも関する。
本発明は、さらに、イソニアジドに対するマイコバクテリウム属細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−katG遺伝子またはそのフラグメントのDNAの遺伝子を増幅する手段、
−そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−イソニアジドに対して感受性の上記細菌の株のkatG遺伝子またはそのフラグメントの対照DNAの調製物、
−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のkatG遺伝子のDNAの対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
本発明は、さらに、リファンピシンまたはその類似体に対するマイコバクテリウム属細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−上記マイコバクテリウムのrpoB遺伝子もしくはRNAポリメラーゼのβサブユニットのDNAまたはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段、
−そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−リファンピシンに対して感受性の上記細菌の株のRNAポリメラーゼのβサブユニットをコードするrpoB遺伝子またはそのフラグメントの対照DNAの調製物、
−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のrpoB遺伝子のDNAの対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
同様に、本発明はストレプトマイシンに対するM.tuberculosisの耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−小リボソームサブユニットのS12タンパク質をコードするrpsL遺伝子またはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段、
−得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−ストレプトマイシンに対して感受性のM.tuberculosis株のリボソームの小サブユニットのS12タンパク質をコードするrpsL遺伝子のDNA配列の対照調製物、および
−場合によっては、ストレプトマイシンに対して耐性のM.tuberculosis株のリボソームの小サブユニットのS12タンパク質をコードするrpsL遺伝子のDNA配列の対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図１】
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【図２Ｃ（１）】
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【図２Ｃ（２）】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ（１）】
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【図６Ａ（２）】
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【図６Ａ（３）】
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【図６Ａ（４）】
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【図９】
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【図６Ｂ（１）】
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【図６Ｂ（２）】
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【図７】
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【図８（１）】
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【図８（２）】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（１）】
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【図１２（２）】
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【図１２（３）】
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【図１２（４）】
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【図１２（５）】
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【図１３】
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【図１４（１）】
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【図１４（２）】
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【図１５】
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