(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学測定によるサンプル中のアルカリホスファターゼの測定方法であって、４５０±１０ｎｍを主要測定波長として用い、かつ４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍの波長のうちの少なくとも１つを二次測定波長として用いる上記方法。
【請求項２】
４８０±１０ｎｍを二次測定波長として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５４６±１０ｎｍを二次波長として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
５７５±１０ｎｍを二次波長として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
５７０ｎｍを二次波長として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が血清サンプルまたは血漿サンプルについて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
遊離ヘモグロビンまたはヘモグロビンをベースとして製造された代用血液を含有するサンプルを測定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記代用血液が誘導体化、多量体化、修飾もしくは架橋されたヒト・ヘモグロビン、ウシ・ヘモグロビンまたは組換え法により作製されたヘモグロビンを含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルのヘモグロビン含有量が６５００ｍｇ／ｄｌ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アルカリホスファターゼの測定方法において遊離ヘモグロビンまたは代用血液により生じる干渉を排除する方法であって、４５０±１０ｎｍの主要測定波長を用い、かつ４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍの波長のうちの少なくとも１つを二次測定波長として用いる上記方法。
【請求項１１】
アルカリホスファターゼの測定方法において遊離ヘモグロビンまたは代用血液により生じる干渉を排除するための、二次測定波長４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍのうちの少なくとも１つと組み合わせた４５０±１０ｎｍの主要測定波長の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、光学測定によるサンプル中のアルカリホスファターゼの測定方法であって、遊離ヘモグロビンまたは代用血液による干渉が特定の波長の組合せにより排除される該方法、アルカリホスファターゼの測定において遊離ヘモグロビンまたは代用血液により生じる干渉を排除する方法、ならびに遊離ヘモグロビンまたは代用血液による干渉を排除するための特定の波長の組合せの使用に関する。
【０００２】
溶血がアナライトを測定するための幾つかの診断方法にかなり干渉することが知られている。溶血は、赤血球の細胞膜に対する例えば機械的、浸透圧性、化学的または酵素的作用による赤血球の任意の破壊であると理解される。溶血が起こると、血色素であるヘモグロビン（Ｈｂ）が放出され、もはやサンプルから取り除くことはできない。一方で、ヘモグロビンの存在は問題をはらむ。というのも、ヘモグロビンの吸収スペクトルは場合によっては検出しようとする物質および指示物質（色原体）のスペクトルとかなり重複することがあり、このことが光度測定試験において測定誤差を生じ得るからである。他方、ヘモグロビンはまた、サンプル成分と化学的に反応して、これもまた誤った測定値をもたらし得る物質を形成することもある。
【０００３】
近年、ヘモグロビンをベースとして製造される代用血液は治療目的で（例えば多量の血液が失われた後で）ますます頻繁に用いられている。代用血液中のヘモグロビンは天然のものであっても合成によるものであってもよい。Ｈｂ様の化合物もしばしば用いられる。溶血の場合とは異なり、代用血液を用いる治療の際の血液中、血清中または血漿中のＨｂ含有量は２０００ｍｇ／ｄｌより多くてもよい。したがって、ヘモグロビンまたは合成類似体はまさに最初から遊離の形態であるので、代用血液を含むサンプルにおける干渉は溶血サンプルの場合よりもかなり顕著であることが多い。
【０００４】
遊離ヘモグロビンによる干渉は、アルカリホスファターゼの光度測定において特に深刻である。アルカリホスファターゼを測定するためには、４−ニトロフェノールの生成を４１５ ｎｍにおいて（吸光度の増大を）測定する。ヘモグロビンも４１５ｎｍにおいて吸収する。ヘモグロビンの存在は２つの点に関してアルカリホスファターゼの測定を干渉する：一方では、Ｈｂのスペクトルはアルカリ性媒体中で経時的に変化（吸光度が増大）し、他方では、特定のＨｂ含有量を越えると測定装置の光度計の限界に達してしまう。
【０００５】
従来技術には、血清サンプルまたは血漿サンプルの分析に対するヘモグロビンのスペクトル的および化学的影響を排除するための種々の方法が公表されている。
【０００６】
自動分析装置は取り扱いが簡易であるので、ヘモグロビン、ビリルビンおよびリパエミア（ｌｉｐａｅｍｉａ）のような干渉物質の干渉作用を排除するために、あるいはこの作用を少なくとも最小限に抑えるために、第１の測定波長（主要波長）に加えて第２の測定波長（二次波長）がしばしば用いられる。Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ２５／６， ９５１−９５９（１９７９）において、Ｈａｈｎらは、二次波長は、色原体の吸収極小付近であり、かつ干渉物質の吸収極大付近のものであるように選ばなければならないと述べている。しかし、この記載の測定法を用いてアルカリホスファターゼの測定における干渉を排除することは不可能である。
【０００７】
ＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋはＣｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９／９， １８０４−１８１０（１９９３）において、アルカリホスファターゼの測定のヘモグロビン干渉がＨｂスペクトルの経時的変化により起こると記載している。この干渉は、数学的補正アルゴリズム（サンプル中のＨｂ濃度の測定およびＨｂの測定量に相当する特定量によるアルカリホスファターゼの測定値の補正）により排除することができる。
【０００８】
ＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋが述べているこの数学的補正は少なくとも８００ｍｇ／ｄｌまでのＨｂの干渉を排除するが、しかしあまり使い易いものではない。何故ならば、それはＨｂ含有量の追加の測定と、それに続いて追加の数学的補正工程を必要とするからである。
【０００９】
ＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋ（前掲）は、いわゆる速度−ブランク測定（ｒａｔｅ−ｂｌａｎｋ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）により干渉を排除するためのさらなる方法を記載している。速度−ブランク測定による溶血干渉の補正はまた、ＥＰ−Ａ−０ ６９５ ８０５にも記載されている。この方法では、サンプル中に含まれる成分の実際の光度測定の前に、該サンプルを予備反応に供して該サンプルの溶血の程度を測定する。次いで、得られた測定値を、溶血の程度を干渉成分が測定誤差をもたらす量と関連付けることにより予め求めた値で補正する。
【００１０】
Ｈｂ干渉は、速度−ブランク測定により排除することができるが、それはわずかに約１２００ｍｇ／ｄｌのＨｂ含有量までである。何故ならば、より高いＨｂ含有量においては光度計の限界に達してしまうからである。これは、溶血干渉を排除するのには十分であると思われるが、代用血液による干渉を排除するには全く不十分である。
【００１１】
アルブミンの測定の場合においてヘモグロビン干渉を排除するための別の方法が公表されており（ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４５７２８）、その方法では、ヘモグロビン干渉の排除は、主要波長と二次波長との特定の組合せにより達成されていた。しかし、このＰＣＴ出願に述べられている波長の組合せは、アルカリホスファターゼの測定に用いることはできない。何故ならば、これらの波長では４−ニトロフェノールについての測定シグナルを得ることができないからである。
【００１２】
公開公報ＷＯ９７／４５７３３は、ヘモグロビンによる干渉は、それぞれのＵＶ試験において波長５４６および５７０を用いることにより排除することができると記載している。しかし、この方法は、主要測定波長３４０ｎｍを用いる酵素的ＵＶ試験にしか用いることができない。ただ単に二次波長５４６ｎｍまたは５７０ｎｍを用いるだけでＨｂ干渉の完全な排除を達成することができるが、これは、主要測定波長が４１５ｎｍの範囲にあるアルカリホスファターゼの測定のような酵素的色原体試験では不可能である。
【００１３】
米国特許第５，７６６，８７２号では、アミラーゼの測定において５７７ｎｍの二次波長が溶血干渉を低減することが述べられている。しかし、引用されている測定データは、Ｈｂの含有量５００ｍｇ／ｄｌにおいて既に最大８％の測定値の有意なずれがあることを示している。これは、溶血干渉を排除するには十分であると思われるが、おそらく、約４１５ｎｍという主要波長を用いているために、Ｈｂ濃度が高くなる程（例えば代用血液による処置の際に起こるもの）この測定値のずれは大きくなるであろうし、Ｈｂ干渉の適切な排除とはならないであろう。
【００１４】
遊離ヘモグロビンの存在により生じる干渉を排除するための方法は、ＤＥ−Ａ−１９６ ２８ ４８４に記載されている。アルカリホスファターゼの測定のような光度測定におけるヘモグロビン干渉は、測定しようとするサンプルに過酸化物化合物を添加することにより排除される。これにより、ヘモグロビンにより生じる色の速やかな脱色が起こり、関連するスペクトル的干渉が排除される。過酸化物により処理したサンプルは、約３８０〜４５０ｎｍおよび／または５２０〜５９０ｎｍの波長で測定する。過酸化物処理をしないアルカリホスファターゼの測定は開示もされていないし自明とされてもいない。
従来技術では、代用血液を含有するサンプル中に見られるような高濃度のＨｂの存在下でも干渉を受けずに実施可能な、過酸化物を添加しないアルカリホスファターゼの測定方法は知られていない。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、従来技術の不利な点を大幅に克服した、サンプル中のアルカリホスファターゼの改善された測定方法を開発することである。特に、アルカリホスファターゼを測定する場合に、ヘモグロビンおよびヘモグロビンをベースとする代用血液による干渉を排除するための簡易で使い易い方法を提供することを意図している。
【００１６】
この目的は、特許請求の範囲にさらに詳細に記載されている光学測定によるサンプル中のアルカリホスファターゼの測定方法により達成される。該方法は、４５０±１０ｎｍを主要測定波長として用い、かつ４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍの波長のうちの少なくとも１つを二次測定波長として用いることを特徴とする。好ましくは、該二次測定波長の中の１つだけを用いる。
【００１７】
驚くべきことに、主要波長だけでなく二次波長も変化させた場合にアルカリホスファターゼの測定のＨｂ干渉が有効に排除できることが判明した。主要波長だけまたは二次波長だけを変化させただけではＨｂ干渉の満足な排除には不十分である。
【００１８】
４−ニトロフェノールの吸収スペクトルのために、アルカリホスファターゼを４１５ｎｍにおいてだけでなく、４５０±１０ｎｍにおいても測定することが可能である。その際の主要測定波長は検出反応の通常の吸収極大にあるのではなくその近くにあるが、それにもかかわらず、得られる測定シグナルは、アルカリホスファターゼの正確な測定に適するものである。
【００１９】
この新たな主要測定波長である４５０±１０ｎｍを選択するだけでも、ヘモグロビン干渉のわずかな低減がもたらされるが、驚くべきことに、この主要波長４５０±１０ｎｍを二次波長である４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍの少なくとも１つと組み合わせるだけで干渉の完全な排除が得られる。５７０ｎｍの二次波長が特に好適であることが判明している。特にＩＦＣＣ法に従ってアルカリホスファターゼを測定する場合、Ｈｂ干渉を排除するためには、４８０±１０ｎｍの二次波長が非常に好適であることが判明している（実施例２）。
【００２０】
３４０ｎｍ、３７６ｎｍ、５０５ｎｍ、６００ｎｍ、６６０ｎｍおよび７００ｎｍなどの他の二次波長は、ヘモグロビン干渉の排除には不適当であることが判明している。
【００２１】
本発明による方法によれば、初めて、ヘモグロビンまたはヘモグロビン様化合物によるアルカリホスファターゼ測定の干渉が、簡易な方法で、少なくとも３０００ｍｇ／ｄｌのＨｂ含有量まで排除できる。Ｈｂ干渉の排除の上限は、光度計の性能により決定される限界である。したがって、本発明による方法は、最大６５００ｍｇ／ｄｌまでのヘモグロビン含有量の良好な干渉の排除を達成すると予期できる。さらに、本発明は、実施例１〜３に示すように、アルカリホスファターゼの測定のための種々の試薬に適用できる。
【００２２】
本発明による方法は、遊離ヘモグロビンが存在するどのようなサンプルの測定にも好適である。本発明の意味における遊離ヘモグロビンという用語は、それを無傷の赤血球内に存在するヘモグロビンと区別するのに用いられる。遊離ヘモグロビンを含有するサンプルの例は、溶血性の血清もしくは血漿サンプル、または代用血液を含有するサンプルである。本発明の意味における遊離ヘモグロビンという用語の範囲に含まれる代用血液の例は、誘導体化、多量体化、修飾化または架橋されたヘモグロビン、特にヒト・ヘモグロビンまたはウシ・ヘモグロビンの誘導体、例えば、ＤＣＬヘモグロビン（ジアスピリン架橋ヘモグロビン）、または組換えにより作製したヘモグロビンである。
【００２３】
本発明はまた、アルカリホスファターゼの測定方法において遊離ヘモグロビンにより生じる干渉を排除するための方法に関する。該方法は、４５０±１０ｎｍを主要測定波長として用い、かつ４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍの波長のうちの少なくとも１つを二次測定波長として用いることを特徴とする。
【００２４】
本発明のさらなる主題は、アルカリホスファターゼの測定方法において遊離ヘモグロビンまたは代用血液により生じる干渉を排除するために、二次測定波長４８０±１０ｎｍ、５４６±１０ｎｍまたは５７５±１０ｎｍのうちの少なくとも１つと組み合わせた４５０±１０ｎｍの主要測定波長の使用である。
【００２５】
本発明を以下の実施例により説明する。
【００２６】
実施例
概略的方法
Ｈｂを含有する溶液を血清プールの一部に添加して、少なくとも３０００ｍｇ／ｄｌのＨｂ含有量とした。同じ血清プールの別の部分の同容量を等量のＮａＣｌ溶液（１５４ｍｍｏｌ／ｌ）と混合した。続いて、両者の一部分を各種の割合で混合して、最低のサンプルにはＨｂが全く含まれず、最高のサンプルには少なくとも３０００ｍｇ／ｄｌのＨｂが含まれる一連のＨｂ濃度の１１サンプルを得た。
【００２７】
実施例１  ＳＦＢＣ法によるアルカリホスファターゼの測定
Ａｎｎ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｖｏｌ． ３５， ２７１ （１９７７）によるＳｏｃｉｅｔｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅの推奨に従う測定
この測定は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１アナライザーで行った。
【００２８】
以下の試薬を用いた：
0003598273.tif 000002
【００２９】
試験手順は次のとおりとした。２５０μｌの試薬１を１１μｌのサンプルに添加し、５分後に５０μｌの試薬２を添加した。さらに５０秒後に、４分間にわたってアナライトを測定したが、この４分の間に吸光度の変化を測定した。測定には次の主要測定波長（λ１）と二次測定波長（λ２）との組合せ、λ１／λ２＝４１５／５４６ｎｍ、４１５／５７０ｎｍ、４１５／６６０ｎｍおよび４５０／６６０ｎｍ（比較）、ならびに４５０／５４６ｎｍおよび４５０／５７０ｎｍ（本発明）を用いた。
【００３０】
さらなる比較として、アルカリホスファターゼをＪａｙおよびＰｒｏｖａｓｅｋにより述べられている速度−ブランク測定により測定した（４１５／６６０ｎｍ ＲＢという）。
【００３１】
結果を表１に示す。本発明の測定波長の組合せである４５０／５４６ｎｍまたは４５０／５７０ｎｍを用いた場合、ヘモグロビンの作用は、他の測定波長の組合せと比較して、または速度−ブランク測定と比較して、有意に低下することがわかる。
【００３２】
【表１】
３７℃におけるアルカリホスファターゼの測定含有量（Ｕ／ｌ）
0003598273.tif 000003
実施例２  ＩＦＣＣ法によるアルカリホスファターゼの測定
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｖｏｌ． ２１， ７３１−７４８（１９８３）によるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの推奨に従う測定
この測定は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１アナライザーで行った。
【００３３】
以下の試薬を用いた：
0003598273.tif 000004
【００３４】
試験手順は次のとおりとした。２５０μｌの試薬１を７μｌのサンプルに添加し、５分後に６０μｌの試薬２を添加した。さらに５０秒後に、４分間にわたってアナライトを測定したが、この４分の間に吸光度の変化を測定した。測定には次の主要測定波長（λ１）と二次測定波長（λ２）との組合せ、λ１／λ２＝４１５／７００ｎｍ （比較）および４５０／４８０ｎｍ（本発明）を用いた。
【００３５】
結果を表２に示す。本発明の測定波長の組合せである４５０／４８０ｎｍを用いた場合、ヘモグロビンの作用は、従来の測定波長の組合せである４１５／７００ｎｍと比較して有意に低下し、非常に高いＨｂ含有量においてさえも負の値は生じないことがわかる。
【００３６】
【表２】
３７℃におけるアルカリホスファターゼの測定含有量（Ｕ／ｌ）
0003598273.tif 000005
実施例３  ＤＧＫＣ法によるアルカリホスファターゼの測定
Ｚ． Ｋｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｋｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｖｏｌ． １０， ２９０ （１９７２）による”Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ”の推奨に従う測定
この測定は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１アナライザーで行った。
【００３７】
以下の試薬を用いた：
0003598273.tif 000006
【００３８】
試験手順は次のとおりとした。２５０μｌの試薬１を４μｌのサンプルに添加し、５分後に５０μｌの試薬２を添加した。さらに５０秒後に、４分間にわたってアナライトを測定したが、この４分の間に吸光度の変化を測定した。測定には次の主要測定波長（λ１）と二次測定波長（λ２）との組合せ、λ１／λ２＝４１５／７００ （比較）および４５０／５４６ｎｍ（本発明）を用いた。
【００３９】
結果を表３に示す。本発明の測定波長の組合せである４５０／５４６ｎｍを用いた場合、ヘモグロビンの作用は、従来の測定波長の組合せである４１５／７００ｎｍと比較して有意に低下し、非常に高いＨｂ含有量においてさえも負の値は生じないことがわかる。
【００４０】
【表３】
３７℃におけるアルカリホスファターゼの測定含有量（Ｕ／ｌ）
0003598273.tif 000007