(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を有する、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７−ADCA）の製造及び回収方法：
（ａ）ペニシリウム・クリソゲナム菌株を、拡大酵素遺伝子を用いて糸状菌発現シグナルの転写及び翻訳調節下で形質転換する工程；
（ｂ）前記菌株を培養培地内で発酵させ、かつその場で拡大して３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを形成する、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−６−アミノペニシラン酸（３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−６−APA）を得るのに適する、3,3'−チオジプロピオン酸もしくはその塩またはエステルを、前記培養培地に添加する工程；
（ｃ）発酵ブロスから３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを回収する工程；
（ｄ）前記３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを脱アシル化する工程；及び
（ｅ）結晶性７−ADCAを回収する工程。
【請求項２】
前記ペニシリウム・クリソゲナム菌株が、AT（アシルトランスフェラーゼ）遺伝子発現シグナルの転写及び翻訳調節下において、拡大酵素遺伝子により形質転換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｅ）が濾過工程である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が濾過工程であって、約4.5より低いpHで、水と混和しない有機溶媒により該ブロス濾液を抽出し、それをpHが４〜10の水で逆抽出することによる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
拡大酵素遺伝子がストレプトミセス・クラブリゲラス又はノカルジア・ラクタムデュランス由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野及び先行技術の簡単な説明
本発明は、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸（７−ADCA）を製造及び回収するための生合成の方法に関する。
β−ラクタム抗生物質類は、臨床使用の長い歴史を持つ、抗生作用を有する化合物の最も重要な群を構成している。この群において突出したものは、ペニシリン類及びセファロスポリン類である。これらの化合物は、各々、糸状菌であるペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）及びアクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）によって、天然に産生される。
古典的菌株改良技術の結果、ペニシリウム・クリソゲナム及びアクレモニウム・クリソゲナムにおける前述の抗生物質の産生レベルは、過去数十年間に劇的に増加している。ペニシリン類及びセファロスポリン類を導く生合成経路に関する知識の増加、並びに組換えDNA技術の出現に伴って、産生菌株の改良及び化合物のin vivo誘導体化に関する新規道具が、利用可能になってきている。
β−ラクタム生合成に関連した酵素のほとんとは、同定されていて、かつそれらに対応する遺伝子がクローン化されていて、これらはIngolia及びQueenerらの論文（生合成経路及び酵素）（Med.Res.Rev.９:245−264（1989））、並びにAharonowitz、Cohen及びMartinの論文（遺伝子クローニング）（Ann.Rev.Microbiol.,46:461−495（1992））に見ることができる。
P.クリソゲナムにおけるペニシリンの生合成の最初の２工程は、３種のアミノ酸、Ｌ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン酸（Ｌ−α−アミノアジピン酸）（Ａ）、Ｌ−システイン（Ｃ）及びＬ−バリン（Ｖ）の、トリペプチドLLD−ACVへの縮合と、それに続くこのトリペプチドの環化による、イソペニシリンN.の形成である。この化合物は、典型的β−ラクタム構造を有している。
第３の工程は、アシル基転移酵素（AT）の作用による、Ｌ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン酸の親水性側鎖の、疎水性側鎖との交換である。ペニシリンＧ製造の工業的方法において、選択された側鎖は、フェニル酢酸（PA）である。欧州特許公開第0532341号において、アジピン酸塩（５−カルボキシペンタノエート）の供給原料の使用が開示されている。この基質の取込みは、５−カルボキシペンタノイル側鎖を有するペニシリン誘導体、すなわち５−カルボキシペンタノイル−６−アミノペニシラン酸を導く。この取込みは、アシル基転移酵素が、証明された広範な基質特異性を有するという事実に起因する（Behrensらの論文（J.Biol.Chem.,175:751−809（1948））;Coleの論文（Process.Biochem.,1:334−338（1966）;Ballioらの論文（Nature,185:97−99（1960））。欧州特許公開第0448180号に開示されているように、ATによって仲介された酵素的交換反応は、細胞のオルガネラである、ミクロボディー内部で生じる。
セファロスポリン類は、ペニシリン類よりもはるかに高価である。その理由の一つは、いくつかのセファロスポリン（例えば、セファレキシン）は、ペニシリンから、いくつかの化学的転換を経て製造されるからである。別の理由は、これまでのところ、Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタノイル側鎖を有するセファロスポリンのみが、発酵することができるということである。セファロスポリンＣは、この点で非常に最も重要な出発物質であるが、これはいかなるpHにおいても水に易溶であり、従って、面倒かつ高価なカラム技術を用いる、長くて高コストの単離工程を伴う。この方法で得られたセファロスポリンＣは、いくつかの化学的かつ酵素的転化によって、治療に使用されるセファロスポリンに転換されなければならない。
中間体７−ADCAは、現在ペニシリンＧの化学的誘導によって製造される。７−ADCA製造に必要な化学的工程は、５員環ペニシリン環構造を、６員環セファロスポリン環構造へと拡大することを含む。しかし、菌糸状細菌ストレプトミセス・クラブリゲラス（Streptomyces clavuligerus）由来の拡大酵素（expandase）は、このような環拡大を行うことができる。Cantwellらの論文（Proc.R.Soc.Lomd.B.,24 8:283−289（1992））；欧州特許公開第0532341号及び欧州特許公開第0540210号に記載されているように、これはP.クリソゲナムへ導入された場合には、ペニシリン環構造を、セファロスポリン環構造へと転換することができる。この拡大酵素は、生化学的及び機能的の両面で非常に良く特徴付けられていて（欧州特許公開第0366354号）、その対応する遺伝子がある。cef Ｅ遺伝子の両方の物理的地図（欧州特許公開第0233715号）、DNA配列及びcef ＥによるP.クリソゲナムの形質転換の研究が明らかになっている。
適当な環拡大酵素の別の起源は、菌糸状細菌ノカルジア・ラクタムデュランス（Nocardia Lactamdurans）（以前はストレプトミセス・ラクタムデュランス）である。この酵素の生化学的特性及びこの遺伝子のDNA配列の両方が明らかになっている（各々、Cortesらの論文（J.Gene.Microbiol.,133:3165−3174（1987））；及びCoqueらの論文（Mol.Gen.Genet.,236:453−458（1993））である。）。
更に詳細に述べると、欧州特許公開第0532341号は、P.クリソゲナムにおいてアシル基転移酵素の基質として使用される、供給原料５−カルボキシペンタノイル側鎖と組み合せた、P.クリソゲナムの該拡大酵素の、in vivoでの使用を示している。これは、５−カルボキシペンタノイル−６−APAの形成をもたらし、これはP.クリソゲナム菌株へ導入された拡大酵素によって転化され、５−カルボキシペンタノイル−７−ADCAを生じる。最後には、５−カルボキシペンタノイル側鎖の除去が示されていて、最終生成物として７−ADCAが得られる。欧州特許出願第0540210号は、７−ACAの製造の類似の方法を記載し、これは更にADCA環の３−メチル側鎖を、ACAの３−アセトキシメチル側鎖へ転化する工程を含む。しかし前述の特許出願は、能率的かつ安価な有効な方法は示していず、その理由は第一にアシル基転移酵素の発現と同時の、その細胞内での拡大酵素の適時発現の問題が、解っていないからである。
対照的に、本発明は、拡大酵素及びアシル基転移酵素が同時に発現されるような、７−ADCAの効果的製造法を提供する。
更に、新規側鎖前駆体、すなわち3,3'−チオジプロピオン酸の使用が、本発明によって示されている。この前駆体は、P.クリソゲナムによって、対応するペニシリンに、非常に能率的に取り込まれ、これは続く該拡大酵素の作用によって、拡大される。
更に現在まで、７−ADCA誘導体を、発酵ブロスから、その脱アシル化前に回収する効果的な方法は明らかにされていない。本発明は、７−ADCA誘導体の回収のための効果的溶媒抽出法を提供する。
本発明によって、７−ADCA製造のための実質的に効果的な全工程が提供され、これはこれまでの先行技術において開示されていないだけではなく、示唆されてもいない、複数の反応工程を含んでいる。
更に本発明及び欧州特許公開第0540210号の説明に類似のものを使用することによって、７−ACAは、この方法の効果的全工程において製造される。
【図面の簡単な説明】
図1:プラスミドpMcTNEの制限地図（functional map）。
図2:プラスミドpMcTSEの制限地図。
図3:プラスミドpMcTNdeの制限地図。
図4:プラスミドpGNETAの制限地図。
図5:プラスミドpGSETAの制限地図。
図6:プラスミドpANETAの制限地図。
図7:プラスミドpASETAの制限地図。
図8:PCR生成物１の配列（上側）に類似の、ノカルジア・ラクタムデュランスのcef Ｅ（前述のCoqueらの論文）（下側）のDNA配列。
配列表の簡単な説明
配列番号１〜13:ストレプトミセス・クラブリゲラス及びノカルジア・ラクタムデュランスのcef Ｅ遺伝子のための、P.クリソゲナム発現カセット構築に使用された、オリゴヌクレオチド類。
配列番号14:ノカルジア・ラクタムデュランスcef ＥのDNA配列（前述のCoqueらの論文）。
発明の要約
従って本発明は、下記の工程を含む、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸（７−ADCA）の製造及び回収の方法を提供する：
ａ）ペニシリウム・クリソゲナム菌株を、拡大酵素遺伝子で、糸状菌発現シグナルの転写及び翻訳調節下で、形質転換する工程；
ｂ）前記菌株を培養培地内で発酵し、かつその場で拡大され３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを形成するような、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−６−アミノペニシラン酸（３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−６−APA）を得るのに適している、3,3'−チオジプロピオン酸もしくはその塩又はエステルを、該培養培地に添加する工程；
ｃ）該発酵ブロスから、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを回収する工程；
ｄ）前記３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを、脱アシル化する工程；及び
ｅ）この結晶性７−ADCAを回収する工程である。
好ましくは、工程（ｅ）は、ろ過工程である。
前記拡大酵素遺伝子の発現は、該AT−遺伝子の各々の調節要素の転写及び翻訳の調節を受けて生じ、これらの遺伝子の同時発現をもたらすことが好ましい。
好ましくは、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAは、発酵ブロスから、水と混和しない有機溶媒によるpH4.5以下での該ブロスろ液の抽出、並びにこれのpH4〜10の範囲での水による逆抽出によって回収される。
更に、P.クリソゲナムのAT−遺伝子又はA.ニジュランス（A.nidulans）gpd Ａ遺伝子の転写及び翻訳の調節要素に機能的に連結している、拡大酵素をコードしているDNAを含む組換えDNAベクター、並びにこれによって形質転換された宿主細胞を提供している。
発明の詳細な説明
本発明は、in vivoにおけるペニシリン環構造の拡張のための、P.クリソゲナムの機能的遺伝子構成体の使用と、セファロスポリン生合成における重要な中間体である誘導体、７−アミノデスアセトキシセファロスポラニック酸即ち７−ADCAを形成するための複数の生合成酵素の新規基質の使用の組み合わせに関する。この誘導体は、効果的溶媒抽出を可能にするような化学的組成を有し、その結果廉価な魅力ある回収方法を提供する。
原則的に、P.クリソゲナムの形質転換は、PEG−Caによるプロトプラストの取込み、電気穿孔法又は粒子ガン技術（particle gun techniques）などのDNA送達の様々な手段、及び形質転換体の選択によって達成することができる。例えば、Van den Hondel en Puntの糸状菌に関する遺伝子転移及びベクター開発（Applied Molecular Genetics of Fungi（編集Peberdy、Laten、Ogden、Bennett、ケンブリッジ大学出版（1991）））を参照。主要な及び主要でない選択マーカー類の適用が、明らかにされている（前述のVan den Hondelの論文）。同種（P.クリソゲナムに由来）及び異種（P.クリソゲナム以外に由来）を起源とする両方の選択マーカーが、明らかになっている。
形質転換体の選択において、同種又は異種、ベクター配列の存在する又は存在しない状態で、選択不能な（non−selectable）DNAと物理的に連結しているかどうかにかかわらず、異なる形質転換体選択マーカー類を適用することが、周知である。
好ましくは、同種選択マーカーが、P.クリソゲナムへ導入された異種DNAの量を制限するために、P.クリソゲナム形質転換体の選択に使用される。最も好ましくは、形質転換された菌株、例えばA.ニジュランス又は他の糸状菌のamd Ｓ遺伝子から選択的に取り除くことができるような、主要な選択マーカーが使用される（欧州特許出願第94201896.1号）。これらのP.クリソゲナム形質転換体の選択マーカーの好ましい特性は、抗生物質耐性マーカー類は、この方法に関連しない、もしくはその環境に導入されないであろうという理由から、工程および生成物の登録法において非常に有益である。
最も好ましい実施態様において、前記菌株から選択的に取り除くことができるamd Ｓ選択マーカーは、同じ支配的な選択を幾度もくり返し使用する形質転換の反復工程を可能にする。この新規な拡大酵素を発現しているP.クリソゲナム菌株が選択マーカーを有さないという特徴は、工業用菌株の改良プログラムにおいて高度に生産される菌株の迅速な開発にとって重要である。
前述の拡大酵素によって仲介された環拡大反応は、P.クリソゲナム、例えばウィスコンシン（Wisconsin）54−1255菌株内に、導入され、かつこの方法で発現される。この環拡大反応は、同じく改善されたβ−ラクタム収量を示す、それらの突然変異体においても行われる。その場合には、培地の条件が、効果的な増殖を得られるようにわずかに改良されなければならないことは明らかであろう。
更に、cef Ｅ遺伝子は、各糸状菌の遺伝子調節要素、好ましくはP.クリソゲナムのアシル基転移酵素（AT）遺伝子由来のものの、転写及び翻訳調節を受けるように配置され、その結果、最適の時間枠でのこの発現が、アシル基転移酵素それ自身の作用と同時性であることを可能にする。これらの測定は、ペニシリン分子における環拡大反応の効果にとって重要である。
前述の拡大酵素及びアシル基転移酵素をコードしている遺伝子類の同時性の発現に加え、ミクロボディー（アシル基転移酵素は細胞内に局在）中でのアシル基転移酵素と該拡大酵素を一部の細胞内同時局在化（co−localization）は、安価な製造法の開発にとって利益がある。これらの好ましい実施態様は、寄託機関によって７−ADCA最終生成物として認容されないペニシリン副生物の量を減少することに、大きく貢献するであろう。
要約すると、本発明は、P.クリソゲナムに導入された拡大酵素の活性が、同時性の発現に基づき、いかにしてペニシリン環の環拡大に貢献することができるかを示している。
本発明において、β−ラクタム中間体である３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAは、3,3'−チオジプロピオン酸もしくはそれらの塩又はエステルの添加によって、P.クリソゲナムにおいて製造される。適当な塩類は、例えばそれらのナトリウム又はカリウムの塩である。これらは、例えば下記の方法の、簡易溶媒抽出によって、培地から能率的に回収される：
該ブロスを、ろ過し、かつこのろ液に、水と混和しない有機溶媒を添加する。このpHを、セファロスポリンを水相から抽出するために調節する。このpHの範囲は、4.5よりも低く；好ましくは４〜１、より好ましくは２〜１の範囲である。この方法で、セファロスポリンは、該発酵ブロス中に存在する多くの他の不純物から分離される。好ましくは少量の有機溶媒を使用し、濃縮セファロスポリン溶液を得、その結果容積流量の低下を達成する。第二の可能性は、pH4以下での全ブロスの抽出である。好ましくは該ブロスは、水と混和しない有機溶媒で、pH4〜１の範囲で抽出される。
セファロスポリン分子を妨害しないような溶媒のいずれかを使用することができる。適当な溶媒は、例えば酢酸ブチル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン、ブタノールのようなアルコール類などである。好ましくは１−ブタノール又はイソブタノールが使用される。
その後セファロスポリンは、pHが４〜10、好ましくは６〜９の範囲で、水を用いて逆抽出される。この最終容積もまた、劇的に減少する。この回収は、温度が０〜50℃、好ましくは室温において、行うことができる。
こうして得られたセファロスポリン水溶液は、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル側鎖を除去するために、適当な酵素で処理され、所望の７−ADCAが得られる。
好ましくは、この酵素を反復して使用することができるように、固定された酵素が使用される。このような粒子の調製及び該酵素の固定の方法は、欧州特許公開第0222462号において広く開示されている。この水溶液のpHは、例えばpH4からpH9の範囲の値を有し、このpHでセファロスポリンの分解反応は最少化され、かつ該酵素による所望の転化が最適化される。従って該酵素は、水酸化カリウム溶液などの無機塩の添加、もしくは陽イオン交換樹脂の使用によって、適当なレベルのpHを維持しながら、セファロスポリン水溶液に添加される。この反応が完了した時点で、この固定化された酵素を、ろ過によって除去する。別の可能性は、固定床又は流動床カラム中で、この固定化された酵素を適用するか、もしくは溶液中で該酵素を使用し、かつ膜ろ過によって生成物を除去することである。その後、この反応混合物を、水と混和しない有機溶媒の存在下で、酸性にする。
適当な酵素は、例えば、第62、177、178及び179位の１個以上の位置に突然変異を有する、シュードモナスSY77微生物由来のものである。更に他のシュードモナス微生物、好ましくは、任意にシュードモナスSY77の第62、177、178及び179位に相当する位置の１個以上に突然変異を有する、シュードモナスSE83由来の酵素も使用することができる。
pHを約0.1〜1.5に調節した後、その相を分離し、かつ水相のpHを２〜５に調節する。その後結晶性７−ADCAをろ過する。
同じく脱アシル化も、先行技術において公知の方法、例えば10℃より低い温度での五塩化リンの添加、及びそれに続く環境温度以下でのイソブタノールの添加による、塩化イミノ側鎖の形成を介し、化学的に行うことができる。
下記の実施態様は、詳細に説明するために提供するが、限定を意図するものではない。
実施例
実施例１
ペニシリウム・クリソゲナムにおけるストレプトミセス及びノカルジアcef Ｅ遺伝子の発現
a.  一般的な遺伝子クローニング及び遺伝子形質転換の方法
遺伝子クローニング法で使用される通常の技術を、本出願において使用した。これらの技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、合成オリゴヌクレオチドの合成法、DNAのヌクレオチド配列解析、DNAの酵素的連結及び切断、エシェリヒア・コリ（以下E.coli）ベクターのサブクローニング、形質転換及び形質転換体の選択、DNAの単離及び精製、サザンブロット分析及び32P標識されたプローブによるDNAの特定化、ランダムプライマー法によるDNAの32P標識である。これらの技術は、全て当該技術分野において良く周知のものであり、かつ多くの文献において十分に記載されている。例えば、Sambrookらの論文（分子クローニング、実験操作法、コールド・スプリング・ハーバー、U.S.A.（1989））、Innesらの論文（PCRプロトコール、方法及び使用のガイド、アカデミック出版（1990））、及びMcPhersonらの論文（PCR、実際のアプローチ、IRL出版（1991））を参照。
糸状菌の形質転換及び形質転換体の選択に使用される一般的方法は、菌のプロトプラストの調製、DNA転移及びプロトプラスト再生の条件、形質転換体の精製及び特定化を含む。これらの方法は、全て当該技術分野において公知であり、かつ下記の文献に非常に良く記載されている:Finkelstein及びBall（編集）、糸状菌の生化学、技術及び方法、Butterworth−Heinemann（1992）;Bennett及びLasure（編集）、真菌における遺伝子操作、アカデミック出版（1991）;Turnerの論文、Puhler（編集）の生化学、第二改訂版、VCH（1992）である。
ペニシリン・クリソゲナムに対する遺伝子クローニング及び遺伝子形質転換技術のより詳細な適用は、Bennett及びLasure（前記）並びにFinkelstein及びBall（前記）に、非常に良く記載されている。
−合成DNAオリゴヌクレオチドは、市販されているDNA合成装置（バイオシステム社、CA,U.S.A.）を、製造者の指示に従って用いて合成した。
−PCRは、市販されている自動PCR装置（パーキン・エルマー社、U.S.A.）、及びウルトマ（Ultma）DNAポリメラーゼ（パーキン・エルマー社）を、製造者の指示に従って用いて行った。
−hGC PCRプロトコール（Duttonらの論文、Nucleic Acids Res.,21（12）:2953−2954（1993））を用いて、N.ラクタムデュランス及びS.クラブリゲラスの染色体DNAの、cef Ｅコード領域の増幅を可能にした。
−制限酵素及び他のDNA修飾酵素は、BRL社（MD,U.S.A.）から入手し、製造者の指示に従って使用した。
−E.coliベクタ−pBluescript▲Ｒ▼は、ストラタジーン社（CA,U.S.A.）から入手した。
−使用した他の化学物質は、様々な供給者から入手した、全て分析用等級のものであった。
−DNAヌクレオチド配列分析は、配列に特異的な蛍光標識の検出を基にした、DNA配列自動分析装置（バイオシステム社）を用い、製造者の指示に従って行った。
b.  微生物の培養
ストレプトミセス・クラブリゲラスATCC 27064は、トリプシン添加ダイズブロス（ディフコ社）で増殖した。この菌株の染色体DNAは、cef Ｅ遺伝子の単離に使用した（Kovacevicらの論文、J.Bacteriol.,754−760（1989））。
ノカルジア・ラクタムデュランスATCC 27382も、同じくトリプシン添加ダイズブロス（ディフコ社）で増殖した。この菌株の染色体DNAは、cef Ｅ遺伝子の単離に使用した（前記Coqueらの論文）。
ペニシリウム・クリソゲナム・ウィスコンシン54−1255（ATCC 28089）は、YPD完全培地（YPD;1％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）で増殖した。この菌株の染色体DNAは、cef Ｅ遺伝子発現に必要なpen DE遺伝子の5'及び3'調節領域の単離に使用した。ペニシリウム・クリソゲナムATCC 28089は、同じくcef Ｅ遺伝子形質転換実験用の宿主として使用した。ウィスコンシン54−1255の突然変異体を含み、改善されたβ−ラクタム収量を示す、ペニシリウム・クリソゲナムの他の菌株も適している。使用した形質転換体の選択マーカーに応じて、pyr Ｇ、nia Ｄ又はfac Ａ遺伝子の突然変異を有するP.クリソゲナム菌株を使用することもできる。これらの突然変異菌株は、当該技術分野において周知の方法で得ることができる（Cantoralの論文、Bio/Technol.,5:494−497（1987）;Goukaらの論文、J.Biotechn.,20:189−200（1991）；及びGoukaらの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.,514−519（1993））。
形質転換で使用するプロトプラスト形成のためのP.クリソゲナムの培養も、同じくYPD−培地で行った。
プロトプラスト形成及び再生の方法は、使用したペニシリウム・クリソゲナムの具体的な菌株、並びに適用した形質転換体選択法に応じ、幾分異なることができることは、当該技術分野において周知である。
E.coliWK6（Zell及びFritzの論文、EMBO J.,6:1809−1815（1987））、XLI−Blue（ストラタジーン社）及びHB101（Boyer及びRoulland−Dussoixの論文、J.Mol.Biol.,41:459（1969）;Bolivar及びBeckmanの論文、Messages Enzymol.,68:2040（1979））は、標準的E.coli培養培地（前述のSambrookの論文）を使用して保存培養した。
c.  cef Ｅ発現カセットを構築
cef Ｅ発現カセットを、表Ｉに列挙し、これは更にこれらのプラスミドのために使用される命名も示している。
0003574453.tif 000002
S.クラブリゲラスcef Ｅ遺伝子（前述のKovacevicの論文）;N.ラクタムデュランスcef Ｅ遺伝子（前述のCoqueの論文）;A.ニジュランスgpd Ａ遺伝子（Puntらの論文、Gene,69:49−57（1988））；及びP.クリソゲナムpen DE遺伝子（Barredoらの論文、Gene,83:291−300（1989）;Diezらの論文、Mol.Gen.Genet.,218:572−576（1989））の発表されたヌクレオチド配列を、表IIに列記した合成オリゴヌクレオチドのデザインに使用している。
0003574453.tif 000003
c1.  E.coli cef Ｅ発現プラスミドpMCTSE及びpMCTNEの構築
PCR,1:N.ラクタムデュランスcef Ｅ
N.ラクタムデュランスの染色体DNA、並びにオリゴヌクレオチド１及び２を用いた第一のPCRにおいて、N.ラクタムデュランスcef Ｅの読み取り枠は、5'−末端に特有のNde Ｉ制限部位を、並びに3'−末端に特有のXba Ｉ制限部位を有する、0.9kb PCR生成物として得られた。
PCR,2:S.クラブリゲラスcef Ｅ
S.クラブリゲラスの染色体DNA、並びにオリゴヌクレオチド３及び４を用いた第二のPCRにおいて、S.クラブリゲラスcef Ｅの読み取り枠も、同様に5'−末端に特有のNde Ｉ制限部位を、並びに3'−末端に特有のXba Ｉ制限部位を有する、0.9kb PCR生成物として得られた。
E.coliにおけるcef Ｅ遺伝子の発現を得、かつDNA配列分析によってPCR生成物を特定化する目的で、PCR生成物１及び２を、ベクターpMCTNde、pMC−５の誘導体（Stanssensらの論文、Nucleic Acids Res.,17:4441（1989））においてクローン化した。プラスミドpMCTNdeは、RBS部位及びNde Ｉクローニング部位の上流にtacプロモーターをコードしているフラグメントを挿入することによって、pMC5−８から得た（欧州特許出願第0351029号）（図３）。
PCR生成物１及び２は、Nde Ｉ及びXba Ｉで切断し、かつNde Ｉ−Xba Ｉ切断ベクターpMCTNdeに連結した。この連結混合物を用いて、E.coli WK6を形質転換した。形質転換体は、クロラムフェニコール耐性に関して選択した。これらの形質転換体を用いて、プラスミドDNAを単離した。cef Ｅ発現カセット挿入は、制限酵素による切断によって、制限断片の予測された発生をまず分析した。最後に予測された制限酵素部位を有するプラスミドを、DNA配列自動分析装置によって分析した。
プラスミドpMCTSE（図２）中のS.クラブリゲラスcef Ｅ読み取り枠のDNA配列は、公開された配列（前述のKovacevicの論文）と100％同一であった。
N.ラクタムデュランスcef Ｅ読み取り枠を含む、分析した全てのクローンのDNA配列（図８）は、公開された配列（前述のCoqueの論文）と異なっていた。
公開されたN.ラクタムデュランスcef Ｅ遺伝子の誘導されたアミノ酸配列は、アミノ酸第41位にプロリンを有する（配列番号14参照）。このプロリンは、PCR1で得られたクローンにおいては消失している。このプラスミドを、pMCTNEと称する（図１）。
c2.  P.クリソゲナムcef Ｅ発現プラスミドの構築
PCR,3:gpd Ａプロモーター
第三のPCRにおいて、A.ニジュランスgpd Ａプロモーターの調節下のE.coli hph遺伝子並びにオリゴヌクレオチド５及び６を含むgpd Ａプロモーターは、pAN7−１プラスミドDNA（Puntらの論文、Gene,56:117−124（1987））を用い、5'−末端に特有のEco R I制限部位を、並びに3'−末端に特有のNde Ｉ部位を有する、0.9kb PCR生成物として得られた。
PCR,4:ATプロモーター
第四のPCRにおいて、P.クリソゲナムの染色体DNA、並びにオリゴヌクレオチド７及び８を使用し、1.5kbのATプロモーター断片を得たが、これは同じく5'−末端に特有のEco R I制限部位を、並びに3'−末端に特有のNde Ｉ部位を有した。
PCR,5:ATターミネーター及びN.ラクタムデュランスcef Ｅ遺伝子の3'−末端
第五のPCRにおいて、0.5kb pen DE（AT）ターミネーター領域は、P.クリソゲナムの染色体DNA、並びに各々オリゴヌクレオチド９及び10、及び11及び10を使用して得られた。従ってこれらのPCR生成物は、Ｃ−末端アミノ酸配列ARLから成る、ミクロボディー標的シグナルの有無にかかわらず、前述のcef Ｅ遺伝子の3'−末端配列を含んでいる（Mullerらの論文、Biochimica et Biophysica Acta,111 6:210−213（1992））。
前記オリゴヌクレオチド類は、特有のBsp E I部位が、該PCR生成物の5'−末端に導入され、かつ特有のSpe Ｉ部位が、該PCR生成物の3'−末端に導入されるようにデザインされた。
PCR,6:ATターミネーター及びS.クラブリゲラスcef Ｅ遺伝子の3'−末端
この第六のPCRにおいて、0.5kb pen DE（AT）ターミネーター領域は、P.クリソゲナムの染色DNA、並びに各々オリゴヌクレオチド12及び10、及び13及び10を使用して得られた。従ってこれらのPCR生成物は、Ｃ−末端アミノ酸配列SKLから成り、ミクロボディー標的シグナルの有無にかかわらず、S.クラブリゲラスcef Ｅ遺伝子の3'−末端配列を含んでいる（De Hoopらの論文、Biochem.J.,286:657−669（1992））。
前記オリゴヌクレオチド類は、特有のBgl Ｉ制限部位が、該PCR生成物の5'−末端に導入され、かつ特有のSpe Ｉ部位が、該PCR生成物の3'−末端で得られるようにデザインされた。
P.クリソゲナムにおいてcef Ｅ遺伝子の発現を得るために、gpd Ａプロモーター及びATプロモーター断片を、プラスミドpMCTNE及びpMCTSE由来のcef Ｅ断片に連結した。これらの連結した断片を、ベクターpBluescript II KSにクローン化した。
PCR3は、Eco R I及びNde Ｉで切断した。pMCTNE及びpMCTSEは、Nde Ｉ及びXba Ｉで切断した。これらの制限断片は、アガロースゲル電気泳動で分離した。このアガロースゲルから、0.9kbのcef Ｅをコードしている断片を精製した。Eco R I−Nde Ｉプロモーター断片は、Nde Ｉ−Xba I cef Ｅ断片と共に、Eco R I−Xba Ｉで切断したベクターpBluescript II KSに連結した。その結果、次のプラスミドが得られた:pGSE及びpGNE。
P.クレソゲナムにおいてcef Ｅ遺伝子の最適の発現を得るために、前述のペニシリウム発現プラスミドのcef Ｅ遺伝子下流に、ATの終止コドン配列をクローン化することを選択した。
pGNETA−pGNEWA
PCR5生成物を、Bsp E I及びSpe Ｉで切断し、かつBsp E I及びSpe Ｉで切断したベクターpGNEに連結した。連結混合物を用いて、E.coli HB101を形質転換した。形質転換体は、アンピシリン耐性について選択した。これらの形質転換体から単離したプラスミド類は、制限断片解析によって、かつその後のDNA配列分析によって、特徴付けた。その結果、次のプラスミド類が得られた:pGNEWA及びpGNETA（図４）。
pGSETA−pGSEWA
PCR6生成物を、Bgl Ｉ及びSpe Ｉで切断し、かつBgl Ｉ及びSpe Ｉで切断したベクターpGSEに連結した。連結混合物を用いて、E.coli HB101を形質転換した。形質転換体は、アンピシリン耐性について選択した。同じくこれらの形質転換体から単離したプラスミド類も、制限断片解析によって、かつその後のDNA配列分析によって、特徴付けた。その結果、次のプラスミド類が得られた:pGSEWA及びpGSETA（図５）。
pANETA、pANEWA及びpASETA及びpASEWA
プラスミドpGNETA、pGNEWA、pGSETA及びpGSEWAを、Eco R I及びNde Ｉで切断した。これらの制限断片を、アガロースゲル電気泳動で分離し、かつ該ゲルから4.5kb断片を精製した。
PCR4生成物を、Eco R I及びNde Ｉで切断し、かつ前述の精製した断片類に連結した。これらの連結混合物をE.coli HB101に形質転換した後、形質転換体をアンピシリン耐性について選択した。
形質転換体を増殖し、かつこれらのプラスミドを単離し、制限断片解析、並びに最後にDNA配列分析によって、特徴付けた。その結果、所望の構成体、すなわちpANETA（図６）、pANEWA、pASETA（図７）及びpASEWAが得られた。
d.  P.クリソゲナムの形質転換
Ca−PEGによるプロトプラスト形質転換法を用いた。
Cantoralの論文（上記参照）、Goukaらの論文（上記J.Biotechn.参照）及びGoukaらの論文（上記Appl.Microbiol.Biotechnol.参照）に記載された方法に従って、全てのプラスミド又は前述の精製したcef Ｅ発現カセット（E.coliベクター配列無し）を使用し、選択マーカーとして、それぞれpyr Ｇ、nia Ｄ、fac Ａ又はamd Ｓ（Beriらのの論文、Curr.Genet.,11:639−641（1987））遺伝子を有する、P.クリソゲナム菌株を形質転換した。
精製された形状で、E.coliベクター配列を欠いている、同種のpyr Ｇ、nia Ｄ又はfac Ａ選択マーカーを用いることによって、形質転換されたP.クリソゲナム菌株は、細菌の耐性遺伝子を有しないものを得た。
欧州特許出願第94201896.1号は、選択マーカー遺伝子を含まない組換え菌株を得る方法を記載している。この方法は、主要な選択マーカーとして、A.ニジュランスamd Ｓ遺伝子を含むP.クリソゲナム形質転換体を使用し成功した。
従って異種の性質の唯一の要素は、0.9kb cef Ｅコード領域、及び任意に0.9kb gpd Ａプロモーター領域である。
e.  形質転換体の分析
P.クリソゲナム形質転換体は、選択培地で繰り返し培養することによって、精製した。単一の安定したコロニーを用いて、胞子を形成する寒天斜面培地を調製し、かつ前記cef Ｅ発現カセットを含む形質転換体をスクリーニングした。寒天平板上の形質転換体からの新鮮な菌糸体の断片を煮沸したものを使用して、PCR技術を用いて該cef Ｅ遺伝子の存在について数百の形質転換体を効果的にスクリーニングするために十分な鋳型DNAを得た。（Sethの論文、菌類遺伝子学会、アシロマ（1991）、菌類遺伝子ニュースレターの要約、38:55）。これによって、形質転換の効率を概算した。
同じく形質転換体のスクリーニングも、バイオアッセイを用いて行った。形質転換体を、選択された側鎖前駆体を含有した寒天培地上で増殖した。寒天上層中の指示菌として、E.coli ESS2231を使用し、これは更に当該技術分野において周知の方法、例えばGuttierezらの論文（Mol.Gen.Genet.,225:56−64（1991））に記載された方法に従って、ペニシリン及びセファロスポリンの産生を区別することができるバクトペナーゼ（Bacto penase）も含有した。
菌糸を用いて、d.項に記載したP.クリソゲナム培養培地に接種した。培養（25℃）を72時間行った後、染色体DNAを菌糸体から単離した。このDNAを、Eco R I又はPst Ｉのような6bp認識配列を有する制限酵素で切断した。
これらのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動で分離し、かつジーンスクリーンナイロン膜（ニューイングランドニュークリア社）上に写し取った。サザンブロット法では、cef Ｅ遺伝子配列のプローブとして、32P標識したPCR2生成物を用い、ハイブリッド形成した。精製したPCR2生成物の32P標識は、市販されている標識キット（ボーリンガー・マンハイム社）を用いて、α32P dCTPの存在下でのランダムプライマー標識によって行った。
cef Ｅコード配列を有する形質転換体は、cef Ｅ遺伝子生成物の発現について試験し、これを拡大酵素活性とした。
選択した形質転換体は、ペニシリン産生培地で培養した（実施例２参照）。
経時的実験において、菌糸体試料を、発酵の48、72及び96時間後に採取した。菌糸体抽出物を調製し、かつ拡大酵素活性を、Rollinsらの論文（Can.J.Microbiol.,34:1196−1202（1988））に記載されたように、実質的に粗抽出物において測定した。拡大酵素活性を有する形質転換体は、更にAlvarezらの論文（Antimicrob.Agent Chem.,31:1675−1682（1987））に記載された方法によって、アシル基転移酵素活性を測定した。
これらの分析を基に、アシル基転移酵素及び拡大酵素の酵素的活性が異なる形質転換体を、７−ADCA誘導体の発酵製造のために選択した。
実施例２
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの発酵製造及びその単離
P.クリソゲナム菌株ウイスコンシン54−1255（ATCC 28089）を、実施例１に記載されたDNA構成体の１種で形質転換し、グルコース30（全てg/l）；（NH4）2SO4,10;KH2PO4,10;微量元素溶液Ｉ（MgSO4.7H2O,25;FeSO4.7H2O,10;CuSO4.5H2O,0.5;ZnSO4.7H2O,2;Na2SO4,50;MnSO4.H2O,2;CaCl2.2H2O,5）10（ml/l）から成る種菌用培地（滅菌前のpHは6.5）に、２＊106分生子/mlで接種した。
この種菌用培地を、25〜30℃で、48〜72時間インキュベートし、続いてこれを用いて、乳糖、80（全てg/l）；マルトース、20;CaSO4,4;尿素、3;MgSO4.7H2O,2;KH2PO4,7;NaCl,0.5;（NH4）2SO4,6;FeSO4.7H2O,0.1;3,3'−チオジプロピオン酸、5;微量元素溶液II（CuSO4.5H2O,0.5;ZnSO4.7H2O,2;MnSO4.H2O,2;Na2SO4,50）10（ml/l）を含む生産培地10〜20倍容（滅菌前のpHは5.5〜6.0）に接種した。その後インキュベーションを、更に96〜120時間続けた。
製造発酵の最後に、該菌糸体を、遠心分離又はろ過によって除去し、かつ３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを、逆相カラム上で、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析した。使用したHPLC装置は、ベックマン・システム・ゴールド社の、モデル126プログラム可能な溶媒システム、モデル507自動試料採取機、モデル168ダイオードアレイ検出装置及びシステム・ゴールド・データシステム（5.10）から成る装置であった。固定相として、直列のクロモスファー（Chromspher）C18カートリッジカラム２本（100×3mm、クロムパック社）を使用した。移動相は、0.07Mリン酸バッファー（pH4.8）100％から、アセトニトリル25％及びリン酸バッファー（pH4.8）75％までの直線勾配から成り、15分間、流量0.5ml/分で行った。３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの産生は、対照物質として合成３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAを用い、260nmで定量した。
ピークの同一性は、オンラインでの、UV及びNMRスペクトルの比較によって確認した。
このブロスをろ過後に、ろ液に１−ブタノールを約0.1倍容加えた。pH値を希塩酸で２に調節し、この混合物を５分間、室温で撹拌した。分離後、有機相を蒸発し、かつ更に化学的脱アシル化に使用する（実施例３）か、もしくはpH8の水0.33倍容で逆抽出し、かつ更に酵素的脱アシル化に使用する（実施例４）かのいずれかを行った。
実施例３
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの脱アシル化
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCA 3g（8mmol）を、N,N−ジメチルアニリン3.5ml（36mmol）、塩化メチレン13ml、及びトリメチルクロロシラン2.6ml（21mmol）の混合物に、室温で添加した。この反応混合物を30分間撹拌した後、約−50℃に冷却し、かつ五塩化リン1.8g（8.5mmol）を全て、一度に添加した。この温度を２時間、−40℃に維持し、かつ続いてこの反応混合物を、−65℃に冷却した。その後これを、イソブタノール12ml（137mmol）で、温度が−40℃を越えないような速度で処理した。更に２時間撹拌した後、この溶液を水15mlに注ぎ、その後直ちに4.5Nのアンモニア5mlを添加した。固形の炭酸水素アンモニウムを徐々に添加して、pHを４に調節した。この混合物を、５℃に冷却した後ろ過し、結晶性７−ADCAをアセトン水溶液（1:1）5mlで洗浄し、単離した。
実施例４
シュードモナスSY77アシラーゼ突然変異体を用いた３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの酵素的脱アシル化
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの転化は、領域が直接的な突然変異誘発を経たシュードモナスSY77アシラーゼに由来している。特異的アシラーゼを用いて、酵素的に１工程で行った。３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル側鎖に対し増強された活性を有するシュードモナスSY77アシラーゼ突然変異体の構築及び同定は、欧州特許公開第0453048号に開示されている。この突然変異体においては、シュードモナスSY77アシラーゼのαサブユニットの第178位のチロシンが、ヒスチジンで置換されている。この突然変異体アシラーゼは、E.coliにおいて産生される。細胞を、遠心分離によって収集し、NaCl 140mMを含有するpH7.4の10mMリン酸バッファー中に、再懸濁した。続いて、この細胞を、超音波処理によって破砕した。細胞の破片を除去後、アシラーゼ活性を有する上清を回収した。更にこのアシラーゼの精製を、下記の一連のクロマトグラフィー工程で行った：（１）pH8.8でＱ−セファロース高速流（fast−flow）上でのイオン交換クロマトグラフィー；（２）フェニルセファロース上での疎水的相互作用クロマトグラフィー；及び（３）セファクリル（Sephacryl）S200HRカラム上でのゲル浸透クロマトグラフィーである。
精製したアシラーゼを、ゼラチン及びキトサンの混合物から成る粒子上に固定した。この粒子を、該酵素添加直前に、グルタルアルデヒドで処理した。
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの転化は、撹拌しているタンク型反応器中で行った。最初にセファロスポリン水溶液を該反応器に添加した。次に、該溶液を、一定に撹拌しながら、温度を30℃にし、かつpHを水酸化カリウムを用いて８に保った。その後前述の固定された酵素を添加し、転化を開始した。転化の間は、該反応器のpHを、連続的に記録し、かつ８を維持した。この反応時に遊離された3,3'−チオジプロピオン酸を、KOHで滴定した。添加したKOH量を合計し、かつ平面記録計（flatbed recorder）で記録した。この転化は、実施例２に記載したように、３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCA及び７−ADCAについて分析する試料を、該反応器から採取し、HPLCでモニタリングした。
前述の反応が完了した時点で、固定化された酵素をろ過によって除去し、ろ液が酢酸ブチルを含有する状態で、ろ液のpHを１に調節した。これらの相を分離し、かつ７−ADCAを含有する水相のpHを、３に調節した。その後結晶性７−ADCAをろ過によって取り出した。
実施例５
シュードモナスSE83アシラーゼを用いる３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの酵素的脱アシル化
３−（カルボキシエチルチオ）プロピオニル−７−ADCAの転化を、アシラーゼとしてシュードモナスSE83アシラーゼを用いて、実施例４に従って行ったが、同様の結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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