(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素免疫測定法によりガラクトシルトランスフェラーゼ活性を測定する方法において、アクセプター基質として、下記化学式１で示される糖鎖高分子（ｐｏｌｙ−ｐ−ａｃｒｙｌｏｙａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を使用することを特徴とするガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法。
【化１】
0003578876.tif 000004
【請求項２】
アクセプター基質である前記糖鎖高分子を固相化する第１工程と、固相化した前記糖鎖高分子に、ガラクトシルトランスフェラーゼを含有する試料と、ドナー基質であるウリジンジフォスフェートガラクトースとを添加して、所定の条件で反応させる第２工程と、前記反応によって形成されたＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的に結合するレクチンを添加して反応させる第３工程と、前記レクチンに対する抗体と、酵素標識した二次抗体とを添加して反応させる第４工程と、前記二次抗体の標識酵素の基質を添加して所定の条件で反応させ、前記標識酵素の活性を測定する第５工程とを含む請求項１記載のガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌やリュウマチなどの疾病の臨床診断に応用可能な簡便で高感度、高精度なガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の癌化に伴い、細胞表層の糖脂質や糖タンパク質の糖鎖構造が変化することはよく知られている。この様な糖鎖構造の変化は癌化に伴う糖転移酵素の活性変動が一因と考えられ、実際に食道癌や胃癌患者では血清中のガラクトシルトランスフェラーゼ（以下「ＧａｌＴ」とする）活性が有意に上昇することが報告されている。また、リュウマチ性関節炎では血清中の免疫グロブリンＩｇＧ  の糖鎖にガラクトースが少なく、この糖鎖構造の変化が関節炎の原因となる免疫グロブリンの凝集に関与していると推定されている。このため、ＧａｌＴの活性を測定することにより、癌やリュウマチなど細胞の糖鎖構造の変化を伴う疾病を診断するという臨床医学的な試みがなされている。
【０００３】
従来、ＧａｌＴの活性測定法としては、放射性標識したオリゴヌクレオチド糖をドナー基質、オリゴペプチドなどをアクセプター基質として用いたラジオトレーサー分析法が一般的であった。
【０００４】
しかし、この方法では、酵素反応後、有機溶媒による反応生成物の抽出、薄層クロマトグラフィーによる分離、オートラジオグラフィーによる確認、薄層プレートからの掻き取り、液体シンチレーションカウンターによる放射性同位体の測定といった多段階の工程を必要とし、操作も煩雑で多くの熟練技術が要求されるという問題があった。更に、当然のことながら放射性同位体を使用するための特別な施設、設備を必要とし、実用化に当たってはコスト的にも問題があった。
【０００５】
一方、最近になって、上記ラジオトレーサー法に代わる方法として、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；  ＥＬＩＳＡ法）が開発された。
【０００６】
図２にはＥＬＩＳＡ  法による従来のＧａｌＴの活性測定法の一例が示されている。
すなわち、同図（１）に示すように、まずマイクロプレートウェル等の固相表面に、ＧａｌＴのアクセプターとなる合成糖脂質や合成糖タンパク質を固相化する。次に、同図（２）に示すように、ＧａｌＴを含む目的試料（血清など）と、ドナー基質であるウリジンジフォスフェートガラクトースとを添加し、ガラクトース転移反応を行う。次に、同図（３）に示すように、転移反応により生成したガラクトース残基を末端にもつ糖脂質や糖タンパク質、例えばパラグロボシドに特異的なモノクローナル抗体を添加して結合させる。更に、同図（４）に示すように、酵素標識した二次抗体（モノクローナル抗体に対する抗体）を添加して結合させる。最後に、同図（５）に示すように、二次抗体の標識酵素の基質、例えばｏ−フェニレンジアミンを添加して反応を行い、呈色度等によって酵素活性を測定する。この方法は、ラジオトレーサー法に比べ、多くの検体を一度に処理でき、測定法も簡単で反応生成物の定量と定性が同時にできるなど利点が多い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＥＬＩＳＡ  法では、アクセプターとして合成糖脂質や合成糖タンパク質を用いているため、これらの基質をプレート表面に固相化する際の吸着率が低く、かつ単位分子当たりのアクセプター残基（Ｎ−アセチルグルコサミン残基）の数が少なく、検出感度が低いという問題があった。また、これらの化合物は、天然物を化学的に修飾したものであるため、その調製が煩雑で、最終生成物の均一性やロット間の変動などがあり、活性測定の感度や精度に変動が予想され、臨床診断への応用における大きな問題となっていた。
【０００８】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、臨床診断への応用が可能な、高感度で、高精度なＧａｌＴ活性測定法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、アクセプター基質として、化学的に合成した特定の糖鎖高分子を用いることにより、プレート表面の吸着率が高まり、糖鎖密度も極めて高いことから、活性検出感度が格段に上昇することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第１は、酵素免疫測定法によりＧａｌＴ活性を測定する方法において、アクセプター基質として、下記化学式２で示される糖鎖高分子（ｐｏｌｙ−ｐ−ａｃｒｙｌｏｙａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、以下「ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ」とする）を使用することを特徴とするＧａｌＴ活性測定法である。
【００１１】
【化２】
0003578876.tif 000002
【００１２】
また、本発明の第２は、アクセプター基質である前記糖鎖高分子を固相化する第１工程と、固相化した前記糖鎖高分子に、ＧａｌＴを含有する試料と、ドナー基質であるウリジンジフォスフェートガラクトース（以下「ＵＤＰ−Ｇａｌ  」とする）とを添加して、所定の条件で反応させる第２工程と、前記反応によって形成されたＮ−アセチルラクトサミン残基に特異的に結合するレクチンを添加して反応させる第３工程と、前記レクチンに対する抗体と、酵素標識した二次抗体とを添加して反応させる第４工程と、前記二次抗体の標識酵素の基質を添加して所定の条件で反応させ、前記標識酵素の活性を測定する第５工程とを含むＧａｌＴ活性測定方法である。
【００１３】
本発明によるＧａｌＴ活性測定法によれば、化学的に合成した糖鎖高分子をアクセプター基質として用いるため、調製ロット間の変動がない均一な固相化が可能である。また、固相プレートへの吸着効率が高く、糖鎖密度も極めて高いことから活性検出感度も優れている。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のＧａｌＴ活性測定法の好ましい態様を図１に従って説明する。
まず、図１（１）に示すように、ポリスチレン、ポリエチレン、ナイロン、ガラスなどの材質のプレート固相表面に、ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃを固相化する。固相の形は、小球、小円柱、マイクロタイタープレートウェルの内面、試験管内面など、いずれでもよい。多数の検体を処理する際にはマイクロタイタープレートが都合がよい。固相化は、糖鎖高分子の好ましくは０．００１  〜１０％水溶液をプレート表面に流し込み、必要に応じて乾燥させるだけでよく、それによって、ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃの疎水性骨格がプレートの疎水性表面と物理吸着し、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）が表面に露出した強固な固相が生成する。
【００１５】
次に、図１（２）に示すように、ＧａｌＴを含む試料溶液と、ドナー基質であるＵＤＰ−Ｇａｌ  とを添加し、所定の温度及び時間でインキュベートすると、ＧａｌＴの糖転移反応により、ガラクトース残基がβ−１，４結合でＮ−アセチルグルコサミン残基に導入され、Ｎ−アセチルラクトサミン単位（Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  ）が生成する。
【００１６】
次に、図１（３）に示すように、Ｎ−アセチルラクトサミン単位のガラクトース残基に特異的な認識結合能を有するレクチン、例えばヒマレクチン（Ｒｉｃｉｎｕｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  （ＲＣＡ−１２０））を添加する。ここで用いるレクチンは、ガラクトース又はガラクトース残基に特異的な認識結合能を有するものであれば、ＲＣＡ−１２０  に限定されるものではなく、アカインゲンマメレクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  （ＰＨＡ−Ｅ））、ピーナッツレクチン（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  （ＰＮＡ））なども使用できる。
【００１７】
次に、図１（４）に示すように、上記レクチンに対する抗体と、免疫グロブリンＩｇＧ  に酵素ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）を標識した二次抗体とを順次加え、Ｎ−アセチルラクトサミン単位のガラクトース残基に、上記抗レクチン抗体を介して、上記酵素標識二次抗体を結合させる。二次抗体を標識する酵素としては、ペルオキシダーゼの他に、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−  ガラクトシダーゼなど様々なものが使用できる。
【００１８】
最後に、図１（５）に示すように、上記二次抗体の標識酵素の基質を添加して所定の温度及び時間で反応させ、その酵素活性を、例えば比色法（吸光度法）、蛍光法、発光法などの方法で測定する。例えば、標識酵素としてペルオキシダーゼを用い、比色法で測定する場合、上記基質としては、Ｏ−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジジンなどが用いられる。
【００１９】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
製造例（ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成）
図３に示す製造工程に従って、前記化学式２で示される糖鎖高分子であるＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃを合成した。
【００２０】
図３における化合物１（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒ  ａｎｏｓｉｄｅ  （ｐＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ））、焼津水産化学工業（株）製）２ｇを、水：メタノール＝１：１の混合溶媒２００ｍｌ  に溶解し、活性炭−パラジウム触媒３６０ｍｇ  を添加して、水素気流下、室温で８  時間攪拌した。次いで、触媒を濾過によって除き、濾液を濃縮した。濃縮物を水５０ｍｌに再溶解し、氷浴にて冷却した。こうして、図３の化合物２を得た。
【００２１】
次に、少量の２，６−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌと、１．１ｇの１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｏ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  と、更に、０．４ｍｌ  のａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄとを添加混合し、２４時間攪拌した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、図３の化合物３（ｐ−ａｃｒｙｌｏｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−２  −ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）１．５ｇを得た。
【００２２】
更に、１．８ｇの化合物３と、重合開始剤１ｍｏｌｅ  ％を、重合用アンプル中でＭｅ２ＳＯ    ５ｍｌに溶解した。溶液の凍結脱気を３  回繰り返し、アンプルを溶封後、６０℃で８  時間重合反応した。アンプルを開き、冷メタノール中に反応液を投入して反応を停止し、析出した沈澱をＭｅ２ＳＯ  に再び溶解して、メタノールに再沈澱する操作を３  回行った。Ｍｅ２ＳＯ  に再溶解後、セルロースチューブに入れて水中で透析を行い、最終的に凍結乾燥品（白色粉末）として、図３の目的化合物４（ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を１．５３ｇ  得た。
【００２３】
こうして得られた目的化合物４の分子量を光散乱法により、固有粘度［η］をウベローベ型粘度計により、旋光度［α］Ｄ２５  を旋光度計によりそれぞれ測定した結果は、表１に示す通りであった。
【００２４】
【表１】
0003578876.tif 000003
【００２５】
実施例（ＧａｌＴの活性測定）
上記製造例で調製したＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ  ）に１  μｇ  ／ｍｌ濃度で溶解した。この溶液をＥＬＩＳＡ  用プレート（ＮＵＮＣ社製）に４  ℃で３  時間コーティングした。ＰＢＳ  で゛４回洗浄後、１  ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ  ）ＰＢＳ  溶液を加えて、室温下１  時間静置してブロッキングした（図１（１）参照）。
【００２６】
プレートを洗浄後、種々の濃度に調製した市販ＧａｌＴ（ＳＩＧＭＡ  社製）と、ドナー基質としての  ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ  社製）の３０ｍＭ  ＭＯＰＳ  緩衝液（何れも１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１  ％ＢＳＡ  含有、ｐＨ７．４  ）を各ウェルに添加して酵素反応を行った。反応は３７℃で１  時間行い、２０μｌ  の２００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加して反応を停止した（図１（２）参照）。
【００２７】
次に、プレートをＰＢＳ  で洗浄後、１  μｇ  ／ｍｌのヒマレクチン（ＲＣＡ−１  、ＳＩＧＭＡ  社製）を加え、３７℃で９０分間インキュベートした（図１（３）参照）。
【００２８】
次に、プレートをＰＢＳ  で洗浄後、ウサギＲＣＡ−１  抗体（ＳＩＧＭＡ  社製）０．５  μｇ  ／ｍｌを加え、３７℃で１  時間静置した。続いて、プレートを洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ  ）標識した抗ウサギＲＣＡ−１  抗体（ＳＩＧＭＡ  社製）を添加し、３７℃で１  時間インキュベートした（図１（４）参照）。
【００２９】
最後に、ＰＯＤ  の基質として、０．３  ％の過酸化水素を含む濃度１ｍｇ  ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解した０．１Ｍクエン酸緩衝液１００  μｌ  を添加し、室温で１５分間発色させた。２．５Ｍの硫酸５０μｌ  で反応を停止し、波長４９２  ｎｍにおける吸光度を測定した。図４にその結果を示した。
【００３０】
図４に示されるように、ＧａｌＴ濃度が０〜２．５  ｍＵ／ｍｌの範囲では、ＧａｌＴ濃度が高くなるほど、吸光度が上昇することがわかる。したがって、ＧａｌＴ濃度を適当に調整することにより、本発明の方法により、ＧａｌＴ活性を簡単に精度よく測定できることがわかる。
【００３１】
また、図５には、プレートにコーティングしたＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ溶液の濃度と、酵素活性との相関性を同様の方法で調べた結果を示した。このように、ＰＡＰ−ＧｌｃＮＡｃ溶液の濃度を高めてプレートへの吸着量を高めるほど、ＧａｌＴ活性の測定感度が向上することがわかる。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、前記化学式１で示される特定の糖鎖高分子をアクセプター基質として用いることにより、固相プレートへの吸着効率が高くなり、糖鎖密度も極めて高いことから、ＧａｌＴ活性の検出感度を向上させることができる。また、化学的に合成した糖鎖高分子をアクセプター基質として用いるため、調製ロット間の変動がない均一な固相化が可能となり、臨床診断に応用しやすいという効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法の好ましい例を示す工程図である。
【図２】従来のガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法の一例を示す工程図である。
【図３】本発明で用いる糖鎖高分子の製造工程を示す説明図である。
【図４】ガラクトシルトランスフェラーゼの濃度が異なる試料を、本発明のガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法で測定した結果を示す図表である。
【図５】プレートにコーティングしたアクセプター基質である糖鎖高分子溶液の濃度と、酵素活性との相関性を、本発明のガラクトシルトランスフェラーゼ活性測定法により測定した結果を示す図表である。
【図１】
0003578876.tif 000005
【図２】
0003578876.tif 000006
【図３】
0003578876.tif 000007
【図４】
0003578876.tif 000008
【図５】
0003578876.tif 000009