(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための電気生化学系であって、該被検体が認識対の一構成員であり、
（ｉ）認識対の他の構成員が固定化されている電極であって、媒質中の該被検体の存在により電極上で対複合体の形成がもたらされるように該固定化構成員が連結基によって電極の表面に固定化されており、ここで認識対の固定化構成員は光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するか、もしくはそれに連結されており；該基は第一および第二の状態を有し、第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり；該露出は固定化構成員の結合部位の構造変化を誘導して該被検体への結合についての固定化構成員の親和性に変化をもたらし、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために該被検体が本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして第二状態にある場合には該固定化構成員は該被検体への低い結合親和性を有するために結合した被検体が容易に解離する、認識対の他の構成員が固定化されている電極；ならびに
（ｉｉ）電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与することによりレドックス状態を変化させることが可能なレドックス分子；
を含んでなる系であって、
電極上の対複合体の形成がその系の電気的応答に変化を及ぼし、このことにより媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することができる電気生化学系。
【請求項２】
連結基が以下の一般式（Ｉ）
Ｚ−Ｒ1−Ｑ                    （Ｉ）
［式中、
Ｚは、電極物質が金属である場合は該金属への化学会合、付着もしくは化学吸着をすることのできるイオウ含有性部分を表わし；そして電極物質がガラスである場合は該ガラスに化学会合、付着もしくは化学吸着をすることのできるメトキシもしくはアルコキシシラン残基を表わし；
Ｒ1は、連結基を表わし；
Ｑは、認識対の構成員である部分と共有結合を形成できる官能基である］
で表される請求項１に記載の系。
【請求項３】
被検体が認識対の内の一方であり、その対が抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる群から選択され、電極上の固定化構成員が該対の内の他方のものである、被検体の決定に利用する請求項１もしくは２に記載の系。
【請求項４】
作用物質が該被検体である、試料中の作用物質の決定のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の系。
【請求項５】
作用物質が該被検体とは異なり、該対複合体の形成の結果としての電気的応答の該変化が試料中の該作用物質の間接的決定に役立つ、生物学的試料中の作用物質の決定のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の系。
【請求項６】
該レドックス分子が溶液中を自由に動き回る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の系。
【請求項７】
該レドックス分子が被検体分子に連結されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の系。
【請求項８】
電極物質が金、プラチナ、もしくは銀である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の系。
【請求項９】
電極物質が導電ガラスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の系。
【請求項１０】
認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するか、もしくはそれに連結されており；該基は第一および第二の状態を有し、第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二の波長の光の照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり；該露出は該被検体への結合についての固定構成員の親和性に変化を誘導し、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、被検体が本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして第二状態にある場合には該固定化構成員は該被検体への低い結合親和性を有するために、結合した被検体が容易に解離する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の系。
【請求項１１】
（ａ）認識対の一構成員を連結基によって電極の表面に固定化させた電極（該対の他の構成員は被検体である）を、決定すべき被検体を含む媒質ならびにその電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与することによりレドックス状態を変化させることが可能なレドックス分子と接触させる段階であって、ここで認識対の固定化構成員は光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するか、もしくはそれに連結されており；該基は第一および第二の状態を有し、第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり；該露出は固定構成員の結合部位の構造変化を誘導して該被検体への結合についての固定化構成員の親和性に変化をもたらし、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、被検体が本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして第二状態にある場合には該固定化構成員は該被検体への低い結合親和性を有するために、結合した被検体が容易に解離する；接触の段階、
（ｂ）該電極を該媒質に接触させ、そして電気的応答を測定する段階、
（ｃ）該電極を第一の波長を有する光で照射する段階、
（ｄ）該溶液との接触の結果として電気的応答の変化を測定する段階（このことにより該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することが可能である）、
（ｅ）電極を取り囲む媒質から被検体分子を取り除くように電極をすすぐ段階、そして
（ｆ）該電極を第二の波長を有する光で照射し、このことにより電極の再利用のための準備が整う段階、
を含んでなる、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための方法。
【請求項１２】
被検体が抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる認識対の群中の対の一方であり、固定化構成員が該対の内の他方のものである、被検体の決定のための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が被検体であり、そして電極を、該作用物質を含む試料もしくはその分画と接触させることを含む、ある試料中の作用物質の決定のための、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質が被検体以外の分子であり、該作用物質を含む溶液と試薬溶液との接触により、試薬溶液中の該被検体の形成、もしくは該試薬溶液中の遊離被検体濃度の減少のいずれかがもたらされ、そして以下に示す、
（ａ）該作用物質を含む試料もしくはその分画を該試薬溶液と反応させる段階、
（ｂ）電極を反応（ａ）の産物と接触させる段階、
（ｃ）電極と該反応産物との接触によりもたらされる電気的応答の変化を測定し、このことにより該試料中の該作用物質の存在および場合によっては濃度を決定する段階、
を含む、ある試料中の作用物質の決定のための、請求項１１もしくは１３に記載の方法。
【請求項１５】
該被検体が、該作用物質に結合する分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該作用物質が固定化構成員と同一の該被検体への結合特性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該作用物質が、
（ｉ）酵素によりそれらの内の一つが該作用物質である複数の産物へと分解されるか、あるいは
（ｉｉ）酵素により該作用物質へと転化する前駆体分子であるか、
のいずれかである分子であり、該試薬溶液が該酵素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
レドックス分子が溶液中を自由に動き回る、請求項１１〜１７の内のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
レドックス分子が、レドックス分子に連結している被検体分子を含む修飾被検体の一部分を形成する、請求項１１〜１７の内のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
電極を、決定すべきものである被検体を含む媒質と該修飾被検体とに同時に接触させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
電極を最初に、決定すべきのもである被検体を含む媒質に、次に該修飾被検体に接触させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
被検体分子が大きな分子もしくは群をなす分子と結合しているもしくは複合体形成しており、このことにより感度が上昇する、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
電極がレドックス分子との電気通信が可能な電極物質を含み、その電極物質上に認識対の一構成員の層が連結基によって電極の表面に固定化されており（この対の他の構成員は被検体である）、レドックス分子と電極物質との間の電気通信が該被検体への該構成員の結合により修正され、固定化構成員は光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するか、もしくはそれに連結されており、該基は第一および第二の状態を有し、第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員は該作用物質に対して高い結合親和性を有するために、結合被検体は容易に解離せず、そして該第二状態にある場合には該固定化構成員は該被検体に対する低い結合親和性を有するため、結合作用物質は容易に解離し、そしてこれをこの系から取り除くことができ、そしてその後に電極を該第一状態への変化を誘導する第二波長の光に露出することができ、このことによりこの電極の再使用の用意を整えることができ、このことにより電極を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を再度決定することが可能である、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電気生化学系における利用のための実質的に再使用可能な電極。
【請求項２４】
連結基が以下の一般式（Ｉ）
Ｚ−Ｒ1−Ｑ                    （Ｉ）
［式中、
Ｚは、電極物質が金属である場合は該金属への化学会合、付着もしくは化学吸着をすることのできるイオウ含有性部分を表わし；そして電極物質がガラスである場合は該ガラスに化学会合、付着もしくは化学吸着をすることのできるメトキシもしくはアルコキシシラン残基を表わす；
Ｒ1は、連結基を表わす；
Ｑは、認識対の構成員である部分と共有結合を形成できる官能基である］
で表される請求項２３に記載の電極。
【請求項２５】
光エネルギーへの露出に対して反応性を示す該基を、アゾベンゼン類、スピロピラン類、フルギド類、チオフェネフルギド類、およびマラカイトグリーンよりなる群から選択する、請求項２３もしくは２４に記載の電極。
【請求項２６】
（ａ）該連結基を金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる段階、および
（ｂ）固定化すべき認識対の一構成員を連結基の該官能基に結合させる段階、
を含む、請求項２４に記載の電極の製造方法。
【請求項２７】
固定化すべき認識対の一構成員を連結基の該官能基に結合させ、そして該連結基を、金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させることを含む、
請求項２４に記載の電極の製造方法。
【請求項２８】
（ａ）該連結基を、金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる段階、
（ｂ）該認識対の一構成員を光異性化可能物質で化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エネルギーへの露出により認識対の他の構成員に対する結合親和性を変化させる段階、および
（ｃ）認識対の修飾構成員を電極上に固定化させた連結基の該官能基に結合させる段階、
を含む、請求項２４もしくは２５に記載の電極の製造方法。
【請求項２９】
段階（ｃ）が段階（ｂ）の前にくる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
段階（ｂ）が段階（ａ）の前にくる、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は電気生化学的センサーの分野におけるものであり、そして液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度を決定するための系に関する。本発明に従うと、被検体を、その被検体の存在下において生じる電気的応答の変化により決定する。
【０００２】
【発明の背景および従来の技術】
レドックス酵素に基づくバイオセンサーは酵素特異的被検体に対し、測定可能な電流応答を提供するものであり、グルコース、乳酸、もしくはコリンのような被検体の決定用に提案されてきた（Ａ．Ｈｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２３、１２８（１９９０）、およびＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９６、３５７９（１９９２））。媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための有用なレドックス酵素によりコーティングされている電極を利用する他の種類のアッセイが、Ｉ．Ｗｉｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４、１０９６５−１０９６６（１９９２））により記載されている。この刊行物は、電極上の酵素固定化層の作製法、ならびに拡散電子媒体もしくは蛋白質結合電子媒体によるレドックス酵素と電極表面との間の電気通信について記載している。
【０００３】
シグナル増幅部材として電気活性性酵素複合体を必要とする電気化学的免疫アッセイの利用が、Ｇ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１−１５（１９８６）、および欧州特許出願第８５３０３３６７．８号（公開第１６７２４８号）に記載されている。酵素複合体の探索（プロービング）を必要とするこの免疫アッセイは、時間が経つにつれて、そしてこの酵素反応に必要な成分の添加の際に活性が減少するという大きな欠点を有する。
【０００４】
均質の電気化学的免疫アッセイの利用が米国特許第５，１９８，３６７号に開示されている。このアッセイは、各々の抗体の存在下における複合体と電極との電気通信が溶液中の被検体により調節される抗原性レドックス活性蛋白質複合体の製造を必要とする。三成分性の抗原−レドックスリレー蛋白質複合体の製造は困難である。そのうえ全ての電気化学的免疫アッセイは単一周期感知装置であり、再使用することができず、一回の測定後に探索用複合体の活動が終結する。
【０００５】
レドックス不活性生体分子、および特にサブマイクロモルおよびナノモル濃度の範囲内で生じる生体分子の検出のための電気生化学的センサーは、診断、食品分析、および環境分析における重要で将来性のある用途を有する。これらの例は、所望されない代謝産物および除草剤を探索するための抗体および抗原の検出から、毒素およびウイルスの存在の同定までの範囲に及ぶことができる。
【０００６】
液体媒質中の被検体（この被検体は認識対の一構成員である）の存在および場合によっては濃度の決定のための電気生化学系を提供することが、本発明の一つの目的である。
【０００７】
更に、実質的に可逆的でそして再使用可能な上記のような電気生化学系を提供することも本発明の一の態様に従う目的である。
【０００８】
更にまた、上記系で使用するための電極を提供することも本発明の目的である。
【０００９】
また、これらの電極を製造するための方法を提供することも本発明の別の目的である。
【００１０】
【発明の一般的な記述】
以下の記述においては用語「電気的応答」は、所定の電位下での電流もしくは電荷の流れを例とする電極の電流−電圧挙動を表すのに用いられる。この電気的応答は、電流もしくは電荷の流れを測定することにより決定することができる。本発明に従うと、新規の電気生化学系およびその生化学系における利用のための電極が提供される。本発明に従うこの系は、電気生化学的電極の電気的応答の変化によって液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度を決定することが可能である。この被検体は、抗原−抗体、リガンド−レセプター、糖−レクチン、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、およびオリゴヌクレオチド−細胞を例とする認識対の一部分を形成する。
【００１１】
本発明の第一の態様に従うと、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための電気生化学系が提供され、その系は、ある認識対の一構成員を固定化してある電極を含み（該対の他の構成員は該被検体である）、媒質中の該被検体の存在により該固定化構成員と該被検体との間に複合体の形成がもたらされ（今後これを「対複合体」とする）、この系は更に電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与することによりそれらのレドックス状態を変化させることが可能なレドックス分子を含み、その電極上での対複合体の形成によりその系の電気的応答の変化がもたらされ、そのことにより媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することができる。
【００１２】
固定化構成員は、特定認識対のいずれかの一構成員であることができる。このような認識対の例は、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、およびオリゴヌクレオチド−細胞である。抗原を例とするこのような対の内の一つを電極に固定化する場合には、これは抗体を例とする、液体媒質中の認識対の他の構成員の決定に適する。
【００１３】
電極上への被検体の結合、および電極上に固定化される認識対の２つの構成員からなる対複合体形成の結果、媒質中の該被検体の存在の指標を提供する電極の電気的応答の変化がもたらされる。電極の電気特性の変化の度合いは固定化構成員に対する該被検体の結合の程度に関連し、そしてその電極を取り巻く媒質中の該被検体の濃度に依存する。したがって電気特性の変化の程度を、本発明の好ましい態様により媒質中の該被検体の濃度の指標として使用することができる。
【００１４】
以下の記載においては、用語「決定」は包括的に、液体媒質中の存在のみの決定、もしくは存在および濃度の両方の決定の両者を表すのに用いられる。
【００１５】
本発明は、生物学的試料、水性試料、もしくは食品試料中のある作用物質の決定に有用である。この決定は、「直接モード」および「間接モード」として本文中に引用される２つのモードの内の一つにより実施することができる。直接モードに従うと、生物学的試料中の作用物質はこの系の被検体となる。間接モードに従うと、作用物質と被検体とは異なり、該系において決定される被検体は、該試料中の作用物質の決定のための尺度として作用する。
【００１６】
直接モードに従う生物学的試料中の作用物質の決定は、主に、該系中の電極を検査用生物学的試料で、もしくは該作用物質を含むその適切な分画で刺激する単一段階法である。本発明の直接モードの例は、生物学的試料中の抗体の決定（この場合、電極には抗原が固定化されており、その抗原に対して該抗体が特異的に結合する）、あるいは抗−抗原抗体が固定化されている電極の利用による抗原の決定である。
【００１７】
間接モードに従うと、生物学的試料中の作用物質は直接的には決定されず、本質的には２段階法によりむしろ間接的に決定される。このモードに従うと、生物学的試料を、第一段階においてある試薬溶液と反応させる。この反応により、該試料中の該作用物質の濃度に依存する様式での該被検体の形成、あるいは演繹的に、存在する該被検体の濃度の減少がもたらされる。したがって、この種の反応に依存して、被検体の濃度は該試料中の該作用物質の濃度に直接相関もしくは逆相関する。第二段階においては、この電極を第一段階の反応産物で刺激させ、そして後に決定される被検体は該試料中の該作用物質の間接的尺度として役立つ。
【００１８】
間接モードのある態様によると、この被検体は検査用作用物質に結合する分子である。この態様の試薬溶液は被検体を含み、そしてその試薬溶液と生物学的試料との間の反応後にその被検体は該作用物質に結合する。結果として、その溶液中の遊離被検体の濃度は減少し、すなわちその後に決定すべき被検体の濃度は該試料中の該作用物質の濃度に逆相関する。
【００１９】
具体例は、検査すべき生物学的試料中の相同なもしくは関連する抗原を決定する目的での固定化抗原の利用である。この具体例に従うと、血漿試料を例とする生物学的試料をまず最初に決定すべき抗原に特異的に結合する抗体を含む試薬溶液と反応させる。結合後、遊離抗体の濃度は低くなる。インキュベーション期間の後に、該抗原が固定化されている電極を反応用溶液で刺激化し、そしてその後遊離抗体の決定値が検査用生物学的試料中の該抗原の指標として役立つ。当業者は恐らく理解するであろうが、該遊離抗体の濃度は検査用試料中の抗原の濃度に逆相関する。
【００２０】
そのうえこれもまた理解されるであろうが、抗原ではなくむしろ検査用生物学的試料中の抗体を、必要な変更を加えて類似する様式において決定することができる。
【００２１】
この間接モードの他の態様に従うと、検査用抗原は酵素であり、そして被検体はこの酵素により破壊された分子であるか、あるいは他の前駆体分子からこの酵素により代謝される分子であるかのいずれかである。最初の事例においては、この試薬溶液は該被検体を含み、そして検査用試料との反応後に被検体の濃度は試料中の酵素濃度に相関して減少する。後述の事例においては、試薬溶液は該前駆体分子を含み、そして検査用試料との反応後に被検体が形成され、そしてその後にその濃度は試料中の酵素濃度に直接相関する。
【００２２】
間接モードの別の態様に従うと、この試薬溶液は該試料中の作用物質を該被検体へ転化させる酵素を含む。
【００２３】
先の２つの態様では、第一事例における検査用試料の酵素もしくは第二事例における試薬溶液の酵素をこれらの方法の第一段階の実施後に取り除くべきである。
【００２４】
本発明の一つの態様によるとレドックス分子は媒質中を自由に動き回っている。この態様に従うと、該被検体が固定化対構成員へ結合することで、電極表面は液体媒質中の該被検体の濃度に依存して、レドックス分子に対して絶縁状態もしくは部分的絶縁状態となる。
【００２５】
本発明の他の態様に従うと、このレドックス分子は被検体分子に連結してる（今後これを「修飾被検体」と称する）。この態様に従うと、修飾被検体と検査用試料中にもともと存在する被検体とは、固定化構成員への結合について競合する。比較的高濃度の該被検体が存在する場合には電極固定化構成員への修飾被検体の結合はほとんど生じない。それとは対照的に、試料中の決定すべき被検体が低濃度である場合には電極上に固定化された構成員に対する修飾被検体の広範囲にわたる結合が生じる。固定化構成員への修飾被検体の結合によって電極物質にレドックス分子が近接するようになり、これら２つの間の電子交換が容易になる。したがって、固定化構成員に修飾被検体が結合することにより電極の電気的応答が上昇する。この増加は検査用試料中の被検体の濃度に逆相関するため、大きく増加する場合は被検体の濃度が低いことを示し、その逆もまた同様である。
【００２６】
先の態様のある変法に従うと、電極を修飾被検体と試料中の決定すべき被検体とで同時に刺激する。
【００２７】
この態様を実施する他の変法に従うと、電極を、被検体の存在が決定すべきものとなっている試料で最初に刺激し、そしてその次に修飾被検体を含む溶液で刺激する。
【００２８】
電極物質は、種々の導電物質、具体的にはイオウ含有性部分と化学的に会合付着するか、もしくは化学吸着する可能性を有するようなものから選択することができる。電極物質は、金、プラチナ、銀、もしくは銅のような金属類からできているか、あるいはこれらによりコーティングされていることが好ましい。他の態様においては、電極は、電極表面に官能基付加済みアルコキシシランが会合しているインジウム−すずオキシド（Ｉｎｄｉｕｍ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ）（ＩＴＯ）を例とする導電ガラス電極からできていてもよい（ＩＴＯ電極のシラン化は、アルゴン雰囲気下、無水トルエン中、３−アミノプロピルトリエトキシシランでのその電極の還元、およびその後のオーブン内での乾燥により吸着を行うことができる）。
【００２９】
レドックス分子は、電子の受容もしくは供与によりそのレドックス状態を変化させることが可能な分子である。レドックス分子の例はＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６［ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩］である。他の例は、Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムである。
【００３０】
固定化構成員は、連結基により電極表面上に固定化されることが好ましく、この連結基は典型的には、以下の一般式（Ｉ）
Ｚ−Ｒ１−Ｑ                      （Ｉ）
［式中、
Ｚは、電極物質が該金属の内の一つである場合には、該金属と化学的に会合付着するか、もしくは化学吸着することが可能なイオウ含有性部分を表し、そして電極物質がガラスである場合には、該ガラスとの化学的会合付着、もしくは化学吸着が可能なメトキシもしくはアルコキシシラン残基を表し、
Ｒ１は連結基を表し、
Ｑは、認識対の一構成員である部分と共有結合を形成することが可能な官能基である］
を有することができる。
【００３１】
Ｚは、電極物質がある金属である場合には、例えばチオール基、あるいはジスルフィド基、スルホン酸もしくは硫酸基から得られるイオウ原子であることができる。
【００３２】
Ｒ１は共有結合であることができるか、あるいはペプチドもしくはポリペプチドであることができるか、あるいはアルキレン、アルケニレン、アルキニレンフェニル含有性鎖、および他の多くのもののような非常に広範囲にわたる種々の適切な基から選択することができる。
【００３３】
Ｒ１の具体例は、ある化学結合であるか、あるいは以下に示す式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、もしくは（ＩＩｃ）
【００３４】
【化１】
0003583496.tif 000002
【００３５】
［式中、
Ｒ２もしくはＲ３は同一もしくは異なることができ、そして１−１６の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン、アルケニレン、アルキニレンを表すか、あるいは共有結合を表し、
ＡおよびＢは同一もしくは異なることができ、そしてＯもしくはＳを表し、
Ｐｈは、ＳＯ３−もしくはアルキル基からなる群から選択される一つもしくは複数の構成成分を例とするものにより場合によっては置換されるフェニル基である］を有する基である。
【００３６】
Ｑは、認識対の一構成員のカルボキシル残基に結合することができる官能基、例えばアミン基、認識対の構成員のアミン残基に結合することが可能なカルボキシル基、認識対の一構成員のアミン残基に結合することが可能なイソシアネートもしくはイソチオシアネート基あるいはアシル基、あるいは蛋白質もしくはポリペプチドのヒドロキシ残基に結合することが可能なハライド基のようなものである。具体例は、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏのような基、もしくは式−Ｒａ−ＣＯ−Ｇ［式中、ＧはＣｌのようなハロゲンである］、のアシル基もしくはＯＨ、ＯＲｂ、−ＯＣＯＲｂ基、もしくは
【００３７】
【化２】
0003583496.tif 000003
【００３８】
基であり、ここでＲａおよびＲｂは独立にＣ１−Ｃ１２アルケニル、アルケニル、もしくは場合によっては例えばハロゲンにより置換されるフェニル含有性鎖である。
【００３９】
このような連結基の具体例は、式
【００４０】
【化３】
0003583496.tif 000004
【００４１】
を有するシステアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）（ＩＩＩ）、シスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）（ＩＶ）、およびシステイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミオールエステルである。
【００４２】
結合カップルである２つの対構成員の互い同士の結合は典型的には高親和性結合であり、すなわちこれら２つの対構成員は互いが容易には解離せず、そしてこの電極をすすいだ後でさえも被検体は依然として固定化構成員に実質的に結合したままになっている。別の測定にこの電極を再利用する目的においては、固定化構成員から被検体を解離させ、そしてこの系から被検体を取り除く必要がある。本発明の好ましい態様に従うと、この解離は、２つの異性化状態を有し、そして２つの異なる波長の光エネルギーへの露出（または暴露）によりその２つの状態の間を可逆的に切り替わることが可能な電極上に固定化されている構成員に結合しているある基により達成する。このような基は典型的には第一および第二異性化状態を有し、そして一つの状態から他へと可逆的に切り替わることにより、該被検体に対する固定化構成員の結合親和性に変化をもたらす固定化構成員の立体配座の変化を引き起こす。このような立体配座の変化は、例えば結合部位の閉塞もしくは結合部位内の立体配座の変化を生じることがあり、このことにより被検体に対する固定化構成員の結合親和性の減少を生じ、これが今後、高親和性状態から低親和性状態への変化もしくは切り替えとして定義される。
【００４３】
最初の状態においては固定化構成員は該被検体への結合に対する高い親和性を有し、そして測定実施後には電極を該基が第二状態へと切り替わるように処理し、そしてその後該被検体は固定化構成員から解離する。典型的にはすすぎ用溶液のすすぎおよび洗浄によりこの系から該被検体を取り除いた後に、電極を該基が該第一状態に切り替わって戻るように別の処理を施し、このことにより電極の再利用のための準備が整う。
【００４４】
この２つの状態の間の切り替えは、赤外、可視、もしくは紫外の範囲内の適切な波長の光への露出により達成する。反応基は、第一波長の光エネルギーへの露出により該第一状態から該第二状態へと、そして第一波長とは異なる第二波長への露出により第二状態から第一状態へと切り替わる。これらの切り替えの内の一つを緩和な熱処理により達成することも可能である。
【００４５】
したがって、本発明の一つの態様に従って、認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するかもしくはそれに連結されている系が提供され、該基が第一および第二状態を有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対して高い結合親和性を有するために、該被検体が本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして第二状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対して低い結合親和性を有するために、結合被検体が容易に解離する。
【００４６】
本発明の他の態様に従うと、第一状態からの第二状態への該切り替えが光エネルギーへの露出によるものであるが、第二状態からの第一状態への切り替えが緩和な熱処理によるものである系も提供される。
【００４７】
本発明の系の感度は、大きな分子もしくは一群の分子と結合しているかもしくは複合体形成している被検体分子の利用により増加させることができる（今後これを「複合化被検体」と称する）。固定化構成員へ結合する際、複合化被検体は電極物質へのレドックス分子の接近を立体的に妨げる。ある態様によると、これは例えば被検体である抗体に対する抗−抗体、および蛋白質被検体に対する抗体などのような大きな分子もしくは分子の複合体に対して結合している被検体の利用により達成する。
【００４８】
他の態様によると、被検体が固定化構成員に結合可能になった後に、この電極を結合被検体に結合可能な作用物質で刺激し、このことにより結合被検体と複合体形成した作用物質が立体障害を引き起こす。立体障害を増大させる目的で、最初の複合体の形成後、電極を、例えば抗−抗体のような、固定化被検体と既に結合しているかもしくは複合体形成している作用物質に対して結合もしくは複合体形成する抗−作用物質と反応させ、そしてこのことにより複合体のサイズの増加を引き起こし、そしてこれにより立体障害の増加をも引き起こす。
【００４９】
先に記載の様式においてこの系の感度を増加させることにより、電極の電気的応答の変化を、電極に対するわずかな被検体分子の結合後に測定することができる。
【００５０】
本発明の他の態様に従うと、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための先の電気生化学系における利用のための電極が提供され、この電極は認識対の一つの構成員の層が固定化されている電極物質を含み、該対の他の構成員は該被検体であり、この電極物質はレドックス分子との電気通信が可能であり、この電気通信は固定化構成員への該被検体の結合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することができる。
【００５１】
本発明のある態様により、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための先の電気生化学系における利用のための実質的に再利用可能な電極が提供され、この電極はレドックス分子との電気通信を可能にする電極物質を含み、この電極物質上には認識対の一つの構成員の層が固定化されており（この対の他の構成員は該被検体である）、レドックス分子と電極物質との間の電気通信は該被検体への該構成員の結合により修正され、固定化された構成員は光エネルギーへの露出に反応性を示す基を有するかあるいはそれに連結されており、該基は第一および第二状態を有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態と転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態である場合には固定化構成員は該被検体に対して高い結合親和性を有するために、結合被検体は容易には解離せず、そして第二状態である場合には固定化構成員は該被検体に対して低い結合親和性を有するため、結合作用物質は容易に解離し、そしてこの系から取り出すことができ、そしてその後にこの電極を第二波長の光に露出させて該第一状態への変化を誘導することができ、このことによりこの電極の再利用の準備が整い、このことによりこの電極を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を再度決定することができる。
【００５２】
本発明の好ましい態様に従うと、光エネルギーへの露出に反応性を示す基は、これを第一状態から第二状態へと変化させるような第一波長の光の照射に反応性を示す一つを上回る安定な構造もしくは異性体状態を有する化合物である。この状態変化は可逆的であり、それはこの基がこれを第二状態から第一状態へと変化させる第二波長（もしくは熱処理により）での光照射にも反応性を示すためである。典型的には、第一および第二波長は、赤外、可視、もしくは紫外領域内にある。
【００５３】
この基を製造するのに使用することができる５つの系統の化合物の例を図１９において読み取ることができ、構造（１）から（５）まではすなわち、アゾベンゼン類（１）、スピロピラン類（２）、フルギド類（３）、チオフェネフルギド類（４）、もしくはマラカイトグリーン（５）を含む。これら５つの系統の化合物の内の３つのものにおける構造変化の例を図１９の構造（６）から（８）までにより説明するが、これらの変化は適切な波長の光エネルギー照射にそれらを露出させる際に生じるものである。具体的には、項目（６）はアゾベンゼン類を、構造（７）はスピロピラン類を、そして構造（８）はマラカイトグリーンを示す。これらの化合物全ては、電極表面上に固定化すべき認識対の構成員に連結することができる基を製造するための構造修飾を必要とする。したがって好ましい態様においては、これらの化合物を化学的に修飾して活性エステル、アミン、カルボン酸、もしくはハロゲン化物誘導体を形成させる。これらの部分の存在により、認識対の構成員へのこの基の連結が容易になる。構造（１３）および（１４）は両者とも、スピロピランを第一状態（ａ）からスピロピランがメロシアニン形態をとっている第二状態（ｂ）へと変化させるのに必要な光エネルギーの適切な波長、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を有するおよび有さない第一および第二異性体状態の構造をも示している。
【００５４】
図１９において示される光異性化可能な活性エステルの例は、Ｎ−プロピオン酸スピロピランのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１５）、４−カルボキシアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１７）である。
【００５５】
本発明はまた、
（ａ）金属もしくはガラス電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）連結基の該官能基に対して固定化すべき認識対の構成員を結合させること、
を含む、先の電極を製造するための方法も提供する。
【００５６】
段階（ａ）および（ｂ）は、固定化を結合前に実施するよう逆転させることができる。
【００５７】
本発明は更に、
（ａ）金属もしくはガラス電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）該認識対の一つの構成員を光異性化可能な基電極で化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エネルギーへの露出による認識対の他の構成員に対する結合親和性を変化させること、
（ｃ）電極上に固定化された連結基の該官能基に、認識対の修飾構成員を結合させること、
を含む、光エネルギに対して反応性を示す基を取り込む先の電極を製造するための方法を提供する。
【００５８】
段階（ａ）および（ｃ）は、異性化可能基を、これを電極上に固定化させた後に認識対の構成員に結合させるよう逆転させることができ、そして段階（ａ）および（ｂ）についてもやはり同様である。
【００５９】
本発明はここで、以下に示す幾つかの具体的態様の記述においてより詳細に説明されるであろうし、時としては添付される図面を参考にすることがあるが、このことにより前述の記述の一般性を損なうことはない。
【００６０】
本発明の詳細な記述
本発明はここで、幾つかの具体的態様により詳細に説明されるであろうが、本発明はそれらにより制限されることがないものとして理解される。当業者は、開示される本発明の態様および他の態様の様々な修飾によっても本発明を実施できることを恐らく認めることであろうし、そして当業者がこの明細書中の開示物により基づくそのような他の態様を実施することは難しいことではないであろう。
【００６１】
最初に、本発明の直接モードの態様の概略図である図１を参照する。電極１の表面は、認識対３の一構成員に共有結合している連結基２を含む複合体の固定化層により覆われている。この電極は典型的には金でできているか、あるいは金によりコーティングされているが、銀もしくはプラチナのような他の金属からできているかもしくはコーティングされていることもある。この電極はまた、ＩＴＯ電極を一例とする非金属製電極であることもできる。この電極を緩衝液およびレッドクスカップルＲ＋／Ｒ４を含む液体媒質中に浸す。他の２本の電極（図示されていない）を使用するが、対極は典型的にはプラチナワイヤーもしくはグラファイトでできており、そして参照電極は典型的にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極である。この系は、認識対の被検体構成員５の感度の良い電気生化学的検出を可能にする。電極固定化層を、電気的応答を生じるため電極の表面上に固定化されている相手側構成員に結合する認識対５の被検体構成員で刺激する。被検体構成員の結合により電極はレドックス分子に対して絶縁状態となり、これによりサイクリックボルタングラム（ｃｙｃｌｉｃ  ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍ）を例とする電気的応答が減少する。被検体構成員の結合量は溶液中の被検体の濃度に依存する。特定される期間、種々の濃度の被検体による刺激に対する電極固定化層の電気的応答を測定することによって検量線が得られ、この検量線により既知の試料中の抗体を正確に決定することが可能になる。ナノモル範囲を下回る濃度を容易に検出することができる。認識対が抗原−抗体を含む場合の固定化構成員による電極表面の典型的な適用範囲は１０−１２モルｃｍ−２の桁である。表面の１０％もしくはそれを上回る結合が検出可能である。
【００６２】
この方法はまた、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素のような他の認識対の分析に適用することも可能である。
【００６３】
レドックス分子の性質は、認識対の性質、ならびにそのレドックス分子がその対の一構成員に結合するか否かに依存して変化する。図１におけるもののような最も単純な系においてはレドックス分子は溶液中を自由に動きまわり、そして電極から電子を受容するもしくはそこへ電子を供与することによりそれらのレドックス状態を変化させることが可能である。一例はヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩、もしくは図１９（１１）において示される式を有する化合物である。
【００６４】
連結基は、電極表面との会合付着、もしくはその表面上への化学吸着を容易にさせる部分（これは典型的には、金属電極上への固定化のためのイオウ含有性部分、あるいはＩＴＯ電極上への固定化のためのアルコキシシラン残基である）、ならびに結合基を含み、そして認識対の固定化構成員のある部分と共有結合を形成することが可能な官能基を含む化合物である。連結基の例はシスタミンである。認識対の一構成員を直接固定化することができる場合には、この連結基を場合によって選択できる。
【００６５】
図２は本発明の直接モードの他の態様であり、この場合にはレドックス分子は被検体に結合している。層が固定化させてある電極は、認識対の被検体構成員を含む試料により（段階（１））、そしてその後にレドックス分子Ｒを連結させることによる修飾を施した被検体を含む溶液により刺激した（段階２）。
【００６６】
検査のためには、この電極を固定時間の間、未知の濃度の被検体を含む生物学的もしくは他の被検体試料で刺激し、そしてその後に修飾被検体の溶液で刺激した。電極の固定化層に結合した修飾被検体の量は未修飾被検体結合の量に依存する。より多くの固定化層部位が未修飾被検体に占領されるに従って、修飾被検体が利用できる部位は少なくなって行く。したがって電気的応答は、検査用試料中の被検体の濃度に逆相関する。
【００６７】
この系は、既知の異なる濃度の被検体で、そして次に固定濃度の修飾被検体で電極を刺激し、そしてその後に電気的応答を測定することにより検量することができる。
【００６８】
ここでは図３を参照する。この図中に略記される態様は図２中に示されるものに非常に類似しているが、相違点は、この態様においては電極を既知の被検体濃度を含む試料と修飾被検体とで同時に刺激することである。得られる電気的応答の質は類似している。
【００６９】
恐らく理解されるであろうが、先に示す態様は、ある態様における被検体が他の態様における固定化構成員であることができ、その逆も同様であるという点で交換可能である。例えば、ある試料中の所定の抗原の存在の検出の目的においては、固定化構成員はこの抗原に対して特異的な抗体であることができる一方で、抗体の存在を検出する目的においては、固定化構成員は抗原であることができる。このことは図４および５において示されており、そして被検体と固定化構成員との役割が逆転しているものの、これらは本質的には図２および３と相同である。
【００７０】
ここでは図６を参照するが、これは本発明の直接モードにより従う他の態様の概略図である。この態様により測定の実施後の電極の再生が可能となって、次の測定における再使用が可能となる。この功績は、この態様に従い、図６のｃにおいて示されるように２つの異性化状態、すなわちＡおよびＢを有し、そしてエネルギーｈν１（波長λ１を有する）およびエネルギーｈν２（波長λ２を有する）の光への露出によりこれら２つの状態の間を可逆的に切り替わることが可能な基１２により固定化構成員１１を修飾することにより達成される。これら２つの異性化状態ＡおよびＢの間の切り替わりにより、修飾を施した固定化構成員の立体配座変化が生じ、これにより被検体１３に対する結合親和性に変化が生じ、状態Ａの場合には、修飾を施した固定化構成員は高親和性での被検体１３への結合が可能であり、状態Ｂの場合には、被検体に対する結合の親和性は非常に低くなる。
【００７１】
図式６のａとｂとは非常に類似しており、相違点は、図６のｂの被検体１３と固定化構成員１１が各々固定化構成員１１’と被検体１３’になっているという点で、図６のａの固定化構成員１１とリガンド１３の役割が逆転しているということである。これらの態様が相同であるということの他に、以下に示される記述が図式６のａについてのみ関連するものであったとしても、これをまた図６のｂにおいて示される態様にも同様に適用することができるということが理解され、したがって利用周期ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、およびａ５での各段階はそれぞれ図６（ｂ）における各段階ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ４、およびｂ５に相当する。
【００７２】
最初の段階ａ１においては、基１２は異性化段階Ａにあり、この場合この基は被検体１３に対する高親和性結合を有する。被検体１３の存在下では、この被検体は固定化構成員に結合しており（段階ａ１）、この結合により電気化学反応の変化がもたらされる（ａ３）。測定の実施後、電極を波長λ１の光で照射し、そしてその後に基１２はその異性化状態Ｂとなり、そしてその後に固定化構成員１１の立体配座変化がもたらされ、これにより被検体１３への低結合親和性が生じる。その結果、段階ａ４においては、被検体１３は固定化構成員１１から解離する。その後、この系をすすいで未結合被検体を除去し、そして除去後（段階ａ５）、電極を波長λ２の光で照射し、そしてその後に基１２を異性化によって状態Ａへと戻し、そして修飾を施した固定化構成員はそのもともとの立体配座になる（ａ１）。この段階（ａ１）においては電極を再利用する準備が整っている。
【００７３】
図５の態様ならびに図６の態様に類似して、図２および３において示される修飾被検体も利用することができるということが理解されよう。
【００７４】
ここでは図７を参照するが、これは本発明の間接モードに従う態様を示している。この態様においては、固定化構成員２２の層を有する電極２１を含む系を生物学的試料２４中の作用物質２３の決定のために利用するが、この作用物質は固定化構成員と相同（固定化されていないとはいえ）である。この態様に従うと、既知の濃度の被検体２６を含む溶液２５を試料２４と反応させる。この反応後に被検体分子２６と作用物質分子２３との間に結合が生じるが、この結合の度合いは作用物質の濃度に依存する。その後に電極を反応用溶液２７で刺激し、そしてこの後に遊離被検体分子が固定化構成員に結合するが、この結合濃度の度合いは溶液２７中の遊離被検体分子の量に依存する。電気的応答の変化により溶液２７中の遊離被検体２６の濃度の決定が可能になり、この変化が次には試料２４中の作用物質２３の決定に役立つ。
【００７５】
ここでは図８を参照するが、これは本発明の間接モードに従う他の態様を表す。図８の態様は図７のものに本質的には類似しており、相違点は、固定化構成員２２’は試料２４’中における決定すべき作用物質２３’に相同ではなく、むしろ被検体２６’に対する類似する結合特性のみを有するということである。
【００７６】
ここでは図９を参照するが、これは本発明の間接モードに従うさらに別の態様を示す。この態様により、被検体３２が産物３３および３４に分解する反応に、図９のａにより示されるような触媒作用を及ぼす酵素３１の決定が可能になる。
【００７７】
図９のｂにおいて示されるように、既知の濃度の被検体３２を含む溶液３５を、未知の濃度の酵素３１を含む生物学的試料３６と反応させるが、この酵素が、この生物学的試料中の決定すべき作用物質である。この反応後に、被検体３２の内の幾つかはこの酵素により分解されて反応産物３３となるが、この分解の度合いは試料３６中の酵素３１の濃度に依存する。その後に固定化構成員３８の層を保持する電極３７を反応用溶液３９と反応させるが、この際に遊離被検体３２はこの電極上の固定化構成員３８に結合する。電気的応答の変化により、溶液３９中の被検体の決定が可能になり、このことにより次には試料３６中の酵素３１の決定が可能になる。
【００７８】
ここでは図１０を参照するが、これは図９の実施例に類似しており、そしてそのため類似する構成員にはプライム符号を付けた類似番号が与えられている。この態様においては、酵素３１’が反応を開始させるが、この反応においては前駆体被検体分子３３’および３４’の異化作用が生じて被検体分子３２’を生じる。図１０のｂにおいて示されるように、この態様においては既知の濃度の前駆体被検体３３’を含む溶液３５’を未知の量の酵素３１’を含む試料３６’と反応させる。その後、構成員３８’の層を固定化させてある電極３７’を反応用溶液３９’で刺激するが、この際に被検体分子３２’は固定化構成員３８’に結合し、結合の度合いは溶液３９’中の被検体分子のレベルに依存する。電気的応答の変化を決定することにより、溶液３９’中の被検体３２の濃度が決定され、このことにより次には試料３６’中の酵素３１’の決定が可能となる。
【００７９】
今度は図１１を参照するが、これは本発明の間接モードのさらに別の態様を説明する。この態様においては、図１０の態様における酵素３１’のものに類似する反応の異化作用を生じる未知の量の酵素４１を、決定すべき生物学的作用物質４３の未知の量を含む試料４２に添加する。この作用物質は、実際には酵素４１により被検体４４へと転化する前駆体被検体である。この反応後、固定化構成員４６の層が固定化されている電極４５を溶液５５と反応させ、この後に固定化構成員４６への被検体分子４４の結合が生じ、結合の度合いは溶液５５中の被検体４４の濃度に依存する。決定される電気的応答の変化は、その後に溶液５５中の被検体４４の濃度の決定のための測定物として役立ち、これが次に生物学的試料４２中の作用物質４３の濃度を決定するのに役立つ。
【００８０】
ここでは図１２を参照するが、これは結合構成員への被検体の結合によりもたらされる電極の電気的応答の変化を、結合被検体に結合する作用物質の利用により増幅させる本発明のある態様を示す。図１２（ａ）においては電極５１が固定化構成員５２を保持していることが示されているが、この場合においてはこの固定化構成員は抗体５３に特異的に結合する抗原である。この電極のサイクリックボルタングラムにより対照反応５４が得られる。この電極を抗体５３を含む溶液で刺激した際には、図１２（ｂ）において示されるように、電極に対する抗体の結合が生じる。サイクリックボルタングラム５４’は電気的応答の減少を示す。しかしながら検査用試料中に少量の抗体５３のみが存在する場合には、対照５４と比較するとこの反応の変化は少ない。
【００８１】
電気的応答の変化を増幅させる目的で、その後電極を抗体５３に特異的に結合する抗−抗体５５を含む溶液で刺激する。その結果、結合抗体上における分子複合体５６の形成が生じ、この抗体は更に電極の電極物質の表面へのレドックスカップルＲ＋／Ｒの接近を妨げ、そしてその結果、サイクリックボルタングラム５４”は対照５４と比較すると際立った減少を示す。
【００８２】
本発明はここで、以下の実施例により更に詳細に説明されるであろう。
【００８３】
【実施例】
実施例１：抗原−抗体認識対（直接モード）
ＤＮＰを含む層を固定化させた電極による抗−ＤＮＰ−抗体の決定。
【００８４】
この実施例において用いられる電極の製造の方法を図１３に示す。みがき金電極（領域  ３×１０−２ｃｍ２）を脱水ＤＭＦ中の３，３’−ジチオジプロピオン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）  ０．１Ｍの溶液中に２時間浸した。この電極を脱水ＤＭＦで洗浄し、そしてその後ＤＭＳＯ：ＴＨＦ（１：１）と１５μＬ（５ｃｃ当たり）のジエチルプロピルアミン中のＮε−２，４−ＤＮＰ−リシンの０．０２５Ｍ溶液中に、室温において一晩浸した。
【００８５】
この電気化学的実施例は、作動電極としてＮε−２，４−ＤＮＰ−リシン抗原単一層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の、１．１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６（レドックス分子である）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温度は３７±２℃であり、そして走査速度は２００ｍＶ／秒であった。この電極を１５分間、抗体である抗−ＤＮＰの溶液中に浸した。抗体である抗−ＤＭＰ抗体の様々な濃度におけるＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６（レドックス探索子）の電流応答を記録した。
【００８６】
抗−ＤＮＰ抗体なしの場合（対照−ａと表示される曲線）、および抗−ＤＮＰ抗体の濃度を上昇させた場合のサイクリックボルタングラム（ｂ−ｅと表示される曲線）を図１４に示す。図示されるように、電気的応答は抗体濃度の関数として減少している。図１５は、抗体濃度の関数としての、対照に対するピーク時の電流反応の変化（ΔＩｐｃ）を示している。図示されるように、電流応答の変化は、抗体濃度の直線関数である。更に図示されるように、０．５μＭのような低い抗体濃度も検出することができる。
【００８７】
実施例２：抗原−抗体認識対（直接モード）
フルオレセイン層を固定化させた電極による抗−フルオレセイン−抗体の決定
本実施例において用いられる電極の製造の方法を図１６に示す。みがき金電極（領域  ３・１０−２ｃｍ２）を、ＤＭＳＯ中の３，３’−ジチオジプロピオン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）  ０．０２Ｍの溶液中に浸した。電極をＤＭＳＯで、次にＴＨＦで洗浄し、そしてその後室温において２．５ｍｌのＴＨＦ中の１，１２−ジアミノドデカン、２５ｍｇを含む溶液中に２４時間浸した。
【００８８】
修飾電極を室温において更に２４時間、３００μｌの無水ＤＭＦ中に溶解させた２０ｍｇのイソチオシアン酸フルオレセインの溶液に浸した。
【００８９】
この電気化学的実施例は、作動電極としてフルオレセイン抗原単一層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６（レドックス分子である）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温度は３７±１℃であり、そして走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
【００９０】
図１７は、抗−フルオレセイン抗体濃度の関数としてのフルオレセイン電極の電流応答を示している。この電流応答は、抗体溶液中で電極を１分間インキュベートした後に測定した。図示されるように、抗体濃度と電流応答の変化との間には直線依存性が存在する。
【００９１】
実施例３：抗原−抗体認識対（直接モード）
ペプチド層を固定化させた電極の利用による抗−ペプチド抗体の決定
図１８のａにおいて示される抗原としてのペプチドは、Ｆ−ＭＯＣ脱離（Ｇ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３３、１９８９、２９８−３０３）のために用いられる、酸不安定性であるが塩基性（ピペリジン）条件下においては安定である保護処理済みＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ側鎖を用いるＦ−ＭＯＣ固体相ペプチド合成により合成した。粗生成ペプチドはＨＰＬＣ（ＲＰ−１８）により精製した。
【００９２】
図１８のｂに概略が示されている固定化層抗原電極は、３時間の期間、（２：１）Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ、ｐＨ＝１、の３００μｌの０．１Ｍペプチド溶液中にみがき金電極（領域  ３×１０−２ｃｍ２）を浸すことにより製造した。
【００９３】
電気化学的測定は、作動電極として固定化電極（図１８のｂ）を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質の組成物は、リン酸緩衝液、０．０１Ｍ（ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．１５ＭのＣａＣｌであった。温度は２０±１℃であり、そして操作速度は２００ｍＶ／秒であった。レドックス分子であるヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩は電極から電子を受容するかあるいは電極へと電子を供与し、そしてレドックス分子が電極から絶縁される率が高まると、この増加を示す値は抗原固定化層電極への抗体の結合を決定するための測定値として機能する。図１９は、レドックス分子の存在下における抗原固定化層電極の電気的応答のサイクリックボルタングラムを示す。０．２３μｇ／ｍｌの濃度の抗体の添加の際には電気化学的応答が徐々に減少することが示される（曲線ｂからｄまで）。３５分後（曲線ｄ）における陰極の減少率は抗体の非存在下におけるもともとの値の５５％に相当する。
【００９４】
実施例４：糖−レクチン認識対（直接モード）
糖の層を固定化させた電極の利用によるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の決定
蛋白質であるＣｏｎＡは、単糖であるα−Ｄ−マンノピラノースに特異的に結合するレクチンである。ＣｏｎＡを図２０の式（１１）を有するレドックス分子、Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムに対して連結させることにより修飾した。
【００９５】
ＣｏｎＡに対するＮ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムの化学的結合は、蛋白質分子のリシン残基のアミノ基へのカルボキシ基のカルボジイミドカップリングにより実施した。２３ｍｇのＮ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウム、８０ｍｇのＨＥＰＥＳ、および１８４ｍｇの尿素を１．６ｍｌの蒸留水中に溶解し、この溶液のｐＨを７．２に調節し、そしてその後４℃に冷却した。１ｍｌの水溶液（４℃）中の５０ｍｇのＣｏｎＡをこの溶液に添加し、そしてその後カップリング用再利用性被検体（ｒｅａｎａｌｙｔｅ）としての５．５ｍｇのＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドナトリウム塩（スルホ−ＮＨＳ）および１２ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加した。得られる混合物を一晩反応させた（４℃）。得られる溶液をリン酸緩衝液、ｐＨ＝７（０．０８７５Ｍ、ＭｎＣｌ２  ０．１ｍＭ、ＣａＣｌ２  ０．１ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ）に対して透析し、そしてその後水に対して透析した。透析済み溶液を遠心し（３０分、４℃、１５０００ｒｐｍ）、そしてこの上清を凍結乾燥して化学的に修飾されたＣｏｎＡ（３０ｍｇ）の粉末を取得した。Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムに関するコンカナバリンＡの堆積量は、蛋白質分子当たり３つのピリジニウム基に相当する。
【００９６】
Ａｕ電極と会合させてある単糖固定化層は、図２２において示される一連の変換により製造した。みがき金電極（領域−３×１０−２ｃｍ２）を２時間、シスタミンの０．０２Ｍ水溶液で処理した。得られるシスタミン修飾電極をその後、この電極固定化層を３００μＬのリン酸緩衝液  ０．１Ｍ、ｐＨ＝７．３、中の１ｍｇのｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マンノピラノシドの溶液中に浸すことにより、官能基付加済み単糖であるｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マンノピラノシド（図２３の式（１２））と反応させて、チオ尿素に連結している単糖固定化層電極を得た。
【００９７】
この電気化学的実施例は、作動電極として単糖固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質はリン酸緩衝液、０．１Ｍ（ｐＨ＝８）中の１ｍＭのＫＣｌであり、温度は２０±１℃であり、そして走査速度は１０００ｍｖ／秒であった。
【００９８】
ＣｏｎＡの様々な濃度、およびレドックス分子に連結させることにより修飾を施したＣｏｎＡ（修飾ＣｏｎＡ）の一定濃度をこのセル内に導入した。この系を２時間平衡化させ、そしてサイクルボルタモグラムを記録した。
【００９９】
図２３は、様々なＣｏｎＡ濃度および修飾ＣｏｎＡの一定濃度（２５μ）における電気化学的応答を示す。曲線（ａ）はＣｏｎＡの濃度が０Ｍでありそして陰極電流が高い場合の電気化学的応答であり、ＣｏｎＡの濃度は、（ｂ）２．５μＭ、（ｃ）５μＭ、（ｄ）１０μＭ、（ｅ）２０μＭとなっている。コンカナバリンＡの濃度が上昇するに連れて陰極電流は減少する。
【０１００】
図２４は、未修飾ＣｏｎＡの濃度に対する修飾ＣｏｎＡの減少に関する電荷の検量曲線を示す。この電荷は、図２５において示されるボルタングラムの還元もしくは酸化曲線の積分領域を表す。この検量曲線を使用することによりＣｏｎＡの未知の濃度を１×１０−６Ｍという低いレベルまで決定することができる。
【０１０１】
図２５は、未修飾コンカナバリンＡの関数としての、修飾ＣｏｎＡの還元時に必要とされる陰極電流を示す。
【０１０２】
実施例５：糖−レクチン認識対（間接モード）
糖の層を固定化させた電極の利用によるＣｏｎＡの決定
みがき金電極（領域  ３×１０−２ｃｍ２）を２時間０．０２Ｍシスタミンの水溶液中に浸した。この電極をＨ２Ｏで洗浄し、その後室温において、０．１２５ｍｌのＤＭＳＯおよび０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７、中に溶解させてある１．５ｍｇのα−Ｄ−マンノピラノシルフェニルイソチオシアン酸エステルの溶液中に浸した。
【０１０３】
リン酸一カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．８、１ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、１×１０−７ＭのＣｏｎＡからなる溶液を、１×１０−４Ｍ、１×１０−５Ｍ、１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、および１×１０−８Ｍのα−Ｄ−マンノピラノシドからなる溶液と混合した。この混合物を室温において３０分間インキュベートし、そしてその後修飾電極を６分間この混合物中に浸した。その後この電極を先と同一の緩衝液で洗浄し、そして電気化学的測定に用いた。
【０１０４】
この電気化学的実施例は、作動電極としてのマンノピラノシド単一層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．８）中の１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６（レドックス探索用分子である）および１ｍＭのＫＣｌからできていた。走査速度は２００ｍＶ／ｓであった。
【０１０５】
図２６は、様々な濃度のα−Ｄ−マンノピラノジドを含む先のＣｏｎＡ溶液と相互作用させた際の、マンノース層を固定化させてある電極の電流応答を示す。この曲線は、このような電極による未知の試料中のマンノースの分析のための検量曲線として役に立つことができる。
【０１０６】
実施例６：抗原−抗体認識対（直接モード）の可逆的結合
ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）を固定化させた電極による抗−ＤＮＰ抗体の決定
抗ＤＮＰの親和性は、ジニトロスピロピラン（図２０中の式１３（ａ））に対しては高いが、その異性体であるジニトロメロシアニン（図２０中の式１３（ｂ））に対しては低い。
【０１０７】
ジニトロスピロピラン化合物およびその誘導体は可逆的光異性化特性を示す。３００ｎｍと４００ｎｍとの間の波長でのジニトロスピロピラン（式１３（ａ））の照明によりこの化合物はジニトロメロシアニン（式１３（ｂ））に異性化するが、一方で４８０ｎｍを上回る領域の可視スペクトルでのジニトロメロシアニンの照射によってはジニトロスピロピランを生じる異性化がもたらされる。
【０１０８】
ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）の層を固定化してある電極は、図２６に示されるスキームに従って製造した。みがき金電極（領域  ３×１０−２ｃｍ２）を２時間，０．２Ｍのシスタミン二塩酸塩水溶液中に浸した。このシスタミン修飾電極を脱水ＤＭＦで洗浄し、そしてその後、脱水ＤＭＦ溶液中の、図２０および２７の式１４（ａ）を有する０．２Ｍのスピロピラン官能基付加済み活性エステル内に浸した。
【０１０９】
ＤＮＳＰ抗原固定化層電極を、抗−ＤＮＰ−抗体のための電気的免疫センサーとして、そして抗体の可逆的解離について、その両方を調査した。第一段階（図２７のａ）におけるＤＮＳＰ電極を、抗原−抗体対複合体が形成されるように抗−ＤＮＰ−抗体により刺激し、そしてその後、その第二状態（図２７のｂ）への抗原の転化および抗体の放出のための４００ｎｍと３００ｎｍとの間の連続照射、ならびに第一活性状態への固定化抗原層の回復のための４８０ｎｍを上回る後続照射（もしくは熱処理）による再利用のための処理を施した。
【０１１０】
電気化学的測定は、作動電極としてＤＮＳＰ抗体固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．１５ＭのＮａＣｌ、ならびに８μＭの抗−ＤＮＰからできており、温度は３７±１℃であり、そして走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
【０１１１】
ここでは図２８を参照するが、これは抗−ＤＮＰ抗体での電極の１６分間のインキュベーション（ｔ＝０では曲線（ｃ）、ｔ＝１６分の時間では曲線ｚ）の後のＤＮＳＰ電極のサイクリックボルタングラムを示している。図２８のａは、抗原がそのもともとの状態（図２７の状態ａ）にある電極での結果を示している一方で、図２７のｂは、抗原が二価イオン性メロシアニン立体配座（図２７の状態ｂ）に光異性化している電極での結果ある。これらの結果は、ＤＮＳＰに結合する抗体は電極を絶縁状態にさせ、そして電気的応答が減少することを明確に示している。それと比較して、最初の電極反応（曲線ｃ）と比較するとボルタングラムがほとんど変化を示さないままでいるという事実により証拠が示されるように、この抗体は実際に不活性なメロシアニン異性体には結合しない。
【０１１２】
ここでは図２９を参照するが、これは様々な電気状態における、対照に対する電流測定応答の変化を示している。各状態においては電極を１６分間、抗−ＤＮＰ抗体とインキュベートした。この実施例においては電極は当初、固定化抗原が二価イオンであるメロシアニン立体配座をとっている状態にあった（図２７の立体配座ｂ）。抗−ＤＮＰ抗体とのインキュベーションの後に高い電流測定反応（黒塗り丸、表示ａ）を示し、このことにより、この抗体は固定化抗体層とは活発には相互作用を行わないことが示される。４８０ｎｍを上回る波長でのこの電極の照射により、スピロピラン立体配座（図２７の立体配座ａ）への抗原の異性化がもたらされた。この電極を抗−ＤＮＰ抗体と１６分間インキュベートしたところ電極の電流応答の減少がもたらされ（白抜き四角、表示ｂ）、このことにより電極に対する抗体の結合ならびにその後の絶縁状態が証明された。３００−４００ｎｍの間の波長において更に照射を続けると抗原層がメロシアニン立体配座へと戻る転移がもたらされ、そしてこの状態においては電極は再び抗−ＤＮＰ抗体（黒塗り丸、表示ｃ）に対して再び不活性となっており、得られる電極の電流応答が高くなることにより電極表面からの抗体の放出が生じていることが示される。４８０ｎｍを上回る波長でこの電極を更に照射すると抗原はスピロピラン立体配座に戻る転移を行い、そしてこの電極はこの状態において再び抗−ＤＮＰ抗体に結合することができる（白抜き四角、表示ｄ）。したがって、このような電極を反復測定に使用することができる。
【０１１３】
実施例７：抗原−抗体認識対（間接モード）
抗−ＤＮＰ抗体との反応によるそしてＤＮＰ層を固定化させた電極の利用によるＮε−２，４−ＤＮＰ−リシンの決定
この電極の製造法は実施例６に記載され、そして図２７において説明されるように実施した。
【０１１４】
作用物質溶液は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の０．１５ＭＮａＣｌ、および様々な濃度の抗原Ｎε−２，４−ＤＮＰ−リシン（図２０の式１９を有する）からできていた。被検体である抗−ＤＮＰ−抗体（５０μＭ）をこの作用物質溶液に添加し、そして３７±２℃において５分間混合した。
【０１１５】
この電極をλ＞４５０ｎｍの光で照射して、固定化抗原単一層が確実に図２６の立体配座ａをとるようにさせた。その後電極を１８分間抗原溶液中でインキュベートし、そして蒸留水で洗浄し、そして電気化学的測定に用いた。
【０１１６】
電気化学的測定は、作動電極として、被検体溶液中での処理後のＤＮＰ−単一層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そして対照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６（レドックス分子である）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温度は３７±２℃であり、走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
【０１１７】
図２９は、作用物質溶液中の様々な作用物質濃度における電気的応答の検量曲線を示す。ΔＩｐｅは、レドックス探索子のみの存在下における抗原電極の電流応答と、先に記載の処理後の電極の反応との間の、様々な抗原濃度に関する差異である。
【０１１８】
実施例８：
光エネルギーに対する反応性を示す基による蛋白質修飾のための方法
光エルギーへの露出に対する反応性を示す基よる蛋白質の修飾は、一例としては、各々の光異性化可能な活性エステル基の、蛋白質分子の一部分であるリシン残基のアミノ基とのカルボジイミドカップリングにより実施した。この方法による修飾を施した蛋白質はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、パパイン、およびキモトリプシンであった。各々の光異性化可能な活性エステルは、Ｎ−プロピオン酸スピロピランのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（式１４（ａ）および１５）、４−カルボキシアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１７）（これらの式は図２０に説明してある）である。
【０１１９】
この修飾法は、０℃において２４−４８時間、２５０ｍｇのＮａＨＣＯ３を含む６ｍｌの水溶液中の５０ｍｇの蛋白質を、２００μＬのＴＨＦ中に溶かした５−１５ｍｇ（必要とされる積載量に従う）の活性エステルと反応させることにより実施した。
【０１２０】
図３０は、ＣｏｎＡを光異性化可能な化合物に連結させることによるＣｏｎＡの修飾の実施例を示す。活性エステルである、チオフェネフルギド（式１７）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＣｏｎＡと反応させ、そして得られる溶液を遠心した（１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃）。その後この上清を凍結乾燥させて修飾蛋白質の粉末を取得した。堆積の度合いは、修飾蛋白質に会合した発色団の吸光度測定（ε  ２２００ｃｍ−１、λ＝５３２ｎｍ）、およびローリー方（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １０３、２６５（１９５１））による各試料中の総蛋白質含有量の決定を初めとする常法により決定した。
【０１２１】
全ての修飾蛋白質は、実質的に可逆的な様式で第一状態から第二状態へと、そして第二状態から第一状態へと転化させることができ、そしてこれらの状態を分光法により追跡した。
【０１２２】
実施例９：感度の増大
抗−ＩｇＥ抗体を用いる抗−ＤＮＰ−抗体分析の感度の増加
ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）の層を固定化させた電極は、実施例６に記載されそして図２７に説明される方法により製造した。ＤＮＳＰ電極は様々な期間にわたって１００μＭの抗−ＤＮＰ−抗体を含む溶液で刺激したが、この際に、抗原−抗体対複合体が電極表面上に形成した（インキュベーションの期間が長いほど複合体形成の量が多くなる）。その後様々な電極について、実施例６において記載される電気化学的セル中での電気化学的分析を実施した。これらの電極の電流応答を記録した。
【０１２３】
その後電極を３７℃において１０分間、２．５ｍｇ／ｍｌの抗−マウスＩｇＥ抗体を含むＰＢＳ緩衝溶液中でインキュベートした。（この抗−ＤＮＰ−抗体はマウスＩｇＥであり、そしてそのため抗−マウスＩｇＥは電極表面に結合した抗−ＤＮＰ−抗体上に複合体を形成する）。その後これらの電極を実施例６に記載される電気化学的セルに移し、そして電極の電流応答を記録した。
【０１２４】
ここでは図１を参照するが、この図においてはΔｉ（１）ｐｃは、電極を抗−ＤＮＰ−抗体で刺激した後の電極の電流応答の変化を表し（この刺激の前の反応と比較するもの）、そしてΔｉ（２）ｐｃは、抗マウスＩｇＥ抗体での第二刺激後の電流応答の変化を表す。この図に示されるように、Δｉ（１）ｐｃ（Ｘ−軸）の値と、Δｉ（２）ｐｃ（Ｙ−軸）の値とは直線関係を示す。このプロットの傾きは抗−ＩｇＥ抗体での刺激後の電極の感度の増幅因子を表す。この事例においては、感度は約２．３の因子により増幅された。
【０１２５】
実施例１０：金以外の電極の利用
インジウム−すずオキシド（ＩＴＯ）ガラスでできている電極を、その電極を、アセトン、トルエン、もしくはベンゼンのような有機溶媒に関して１％（ｖ／ｖ）の３−アミノプロピルトリエトキシシランと共にインキュベートすることによって修飾する。インキュベーションの後には、この連結基が電極上に固定化される。その後、様々な抗原および蛋白質を、この連結基のアミノ残基を介して固定化することができる。
【０１２６】
本発明の主な特徴または態様は以下のとおりである。
【０１２７】
１．  認識対の一構成員が固定化されている電極を含み、該対の他の構成員が該被検体であり、媒質中の該被検体の存在により該固定化構成員と該被検体との間の複合体である対複合体の形成がもたらされ、そして更に電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与することによりレドックス状態を変化させることが可能なレドックス分子を含み、電極上の対複合体の形成がその系の電気的応答に変化を及ぼし、このことにより媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することができる、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための電気生化学系。
【０１２８】
２．  被検体が認識対の内の一つであり、その対が抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる群から選択され、電極上の固定化構成員が該対の内の他方のものである、上記被検体の決定に利用する、上記１に記載の系。
【０１２９】
３．  作用物質が該被検体である、試料中の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記載の系。
【０１３０】
４．  該作用物質が該被検体とは異なり、該対複合体の形成の結果としての電気的応答の該変化が試料中の該作用物質の間接的決定に役立つ、生物学的試料中の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記載の系。
【０１３１】
５．  該レドックス分子が溶液中を自由に動き回る、上記１−４の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３２】
６．  該レドックス分子が被検体分子に連結されている、上記１−４の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３３】
７．  電極物質が金、プラチナ、もしくは銀である、上記１−６の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３４】
８．  電極物質が導電ガラスである、上記１−６の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３５】
９．  認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有しているもしくはそれに連結されており、該基は第一および第二状態を有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、この被検体が本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして該第二状態である場合には該固定化構成員は該被検体ヘの低い結合親和性を有するために、結合した被検体が容易に解離する、上記１−８の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３６】
１０．以下に示す、
（ａ）認識対の一構成員を固定化させた電極（該対の他の構成員は該被検体である）を、決定すべき被検体を含む媒質ならびにその電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与することによりレドックス状態を変化させることが可能なレドックス分子と接触させること、
（ｂ）該溶液との接触の結果として電気的応答の変化を測定すること（このことにより該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することが可能である）、
を含む、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための方法。
【０１３７】
１１．該固定化構成員が該対の内の他方のものである、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる対の群の内の一つの認識対である被検体の決定のための、上記１０に記載の方法。
【０１３８】
１２．該作用物質が該被検体であり、そして電極を、該作用物質を含む該試料もしくはその分画と接触させることを含む、ある試料中の作用物質の決定のための、上記１０もしくは１１に記載の方法。
【０１３９】
１３．作用物質が該被検体以外の分子であり、該作用物質を含む溶液の試薬溶液との接触により、試薬溶液中の該被検体の形成、もしくは該試薬溶液中の遊離被検体濃度の減少のいずれかがもたらされ、そして以下に示す、
（ａ）該作用物質を含む該試料もしくはその分画を該試薬溶液と接触させること、
（ｂ）電極を反応（ａ）の産物と接触させること、
（ｃ）電極の該反応産物との接触によりもたらされる電気的応答の変化を測定し、このことにより該試料中の該作用物質の存在および場合によっては濃度を決定すること、
を含む、ある試料中の作用物質の決定のための、上記１０もしくは１２に記載の方法。
【０１４０】
１４．該被検体が、該作用物質に結合する分子である、上記１３に記載の方法。
【０１４１】
１５．該作用物質が固定化構成員と同一の該被検体への結合特性を有する、上記１４に記載の方法。
【０１４２】
１６．該作用物質が、
（ｉ）酵素によりそれらの内の一つが該作用物質である複数の産物へと分解されるか、あるいは
（ｉｉ）酵素により該作用物質へと転化する前駆体分子であるか、
のいずれかである分子であり、該試薬溶液が該酵素を含む、上記１３に記載の方法。
【０１４３】
１７．レドックス分子が溶液中を自由に動き回る、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１４４】
１８．レドックス分子が、レドックス分子に連結している被検体分子を含む修飾被検体の一部分を形成する、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１４５】
１９．電極を、決定すべきものである被検体を含む媒質と該修飾被検体とに同時に接触させる、上記１８に記載の方法。
【０１４６】
２０．電極を最初に、決定すべきのもである被検体を含む媒質に、次に該修飾被検体に接触させる、上記１８に記載の方法。
【０１４７】
２１．認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそれに連結されており、該基は第一および第二状態を有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、この被検体は本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして該第二状態である場合には固定化構成員は該被検体ヘの低い結合親和性を有するために、結合した被検体は容易に解離し、かつ
（ａ）該電極を該媒質に接触させ、そして該電気的応答を測定すること、
（ｂ）該電極を該第一波長を有する光で照射すること、
（ｃ）電極を取り囲む媒質から被検体分子を取り除くように電極をすすぐこと、そして
（ｄ）該電極を該第二波長を有する光で照射し、このことにより電極の再利用のための準備が整うこと、
を含む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１４８】
２２．認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそれに連結されており、該基は第一および第二状態を有し、そして緩和な熱処理により第一状態から第二状態へ転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、この被検体は本質的に固定化構成員に結合したままになっており、そして該第二状態である場合には固定化構成員は該被検体ヘの低い結合親和性を有するために、結合した被検体は容易に解離し、かつ
（ａ）該電極を該媒質に接触させ、そして該電気的応答を測定すること、
（ｂ）該電極を該第一波長を有する光で照射すること、
（ｃ）電極を取り囲む媒質から被検体分子を取り除くように電極をすすぐこと、そして
（ｄ）電極を緩和な熱処理に供し、このことにより電極の再利用のための準備が整うこと、
を含む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１４９】
２３．被検体分子が大きな分子もしくは群をなす分子と結合しているもしくは複合体形成しており、このことにより感度が上昇する、上記１０−２２の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１５０】
２４．電極が認識対の一構成員の層を固定化させた電極物質を含み、該対の他の構成員が該被検体であり、電極物質がレドックス分子との電気通信が可能であり、その電気通信が該被検体の固定化構成員への結合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定することができる、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定において利用するための電極。
【０１５１】
２５．電極がレドックス分子との電気通信が可能な電極物質を含み、その電極物質上に認識対の一構成員の層が固定化されており、この対の他の構成員が被検体であり、レドックス分子と電極物質との間の電気通信が該被検体への該構成員の結合により修正され、固定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそれに連結されており、該基は第一および第二状態を有し、そして第一波長の光の照射への露出によ第一状態から第二状態へと、そして第二波長の光の照射への露出により第二状態から第一状態へと転化することが可能であり、この露出により該被検体への結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一状態にある場合には該固定化構成員は該作用物質に対して高い結合親和性を有するために、結合被検体は容易に解離せず、そして該第二状態にある場合には該固定化構成員は該被検体に対する低い結合親和性を有するため、結合作用物質は容易に解離し、そしてこれをこの系から取り除くことができ、そしてその後に電極を該第一状態に変化を誘導する第二波長の光に露出することができ、このことによりこの電極の再使用の用意を整えることができ、このことにより電極を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を再度決定することが可能である、液体媒質中の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための先の電気生化学系における利用のための実質的に再使用可能な電極。
【０１５２】
２６．光エネルギーへの露出に対して反応性を示す該基を、アゾベンゼン類、スピロピラン類、フルギド類、チオフェネフルギド類、およびマラカイトグリーンよりなる群から選択する、上記２５に記載の電極。
【０１５３】
２７．以下に示す、
（ａ）該連結基を、金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させること、
（ｂ）固定化すべき認識対の一構成員を連結基の該官能基に結合させること、
を含む、上記２５に記載の電極の製造のための方法。
【０１５４】
２８．固定化すべき認識対の一構成員を連結基の該官能基に結合させ、そして該連結基を、金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させることを含む、
上記２５に記載の電極の製造のための方法。
【０１５５】
２９．以下に示す、
（ａ）該連結基を、金属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させること、
（ｂ）該認識対の一構成員を光異性化可能物質で化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エネルギーへの露出により認識対の他の構成員に対する結合を変化させること、および
（ｃ）認識対の修飾構成員を電極上に固定化させた連結基の該官能基に結合させること、
を含む、上記２６に記載の電極の製造のための方法。
【０１５６】
３０．段階（ｃ）が段階（ｂ）の前にくる、項目２９に記載の方法。
【０１５７】
３１．段階（ｂ）が段階（ａ）の前にくる  項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の直接モードに従う態様に従う電極表面の概略図であり、この場合、認識対の一構成員が電極（ａ）の表面上に固定化されており、この電極をレッドクス分子Ｒ＋／Ｒを含む液体媒質中に浸し、そしてこの後に認識対の被検体構成員の既知の濃度を含む溶液で刺激し、この被検体構成員はその後該表面（ｂ）上に固定化された認識対の相手側構成員と結合する。この結合により電気的応答の減少がもたらされる。
【図２】図２は、本発明の直接モードの他の態様の概略図であり、この場合、認識対の一構成員を電極（ａ）の表面上に固定化し、そしてこれを次に認識対の被検体構成員の未知の濃度を含む溶液により刺激する（段階（１））。被検体による幾つかの固定化部位の結合が生じ（ｂ）、そしてその後この電極を、レドックス分子Ｒに連結させることにより修飾を施した被検体により刺激する（段階（２））。該修飾被検体による結合（ｃ）により電気的応答（ｄ）が生じ、この電気的応答の程度は段階１後に残存する空の部位の数に依存し、これは次には被検体の濃度に依存している。
【図３】図３は、図２の態様の変法の該略図であり、この場合、認識対の一構成員は電極表面上に固定化されており、これをその後、（ｉ）認識対の被検体構成員の未知の濃度を含む溶液と、（ｉｉ）レドックス分子（ａ）を連結させることにより修飾を施した被検体構成員との両方で同時に刺激する。被検体および修飾被検体の各濃度に依存する競合的結合が生じて電気的応答（ｂ）が産生され、これが結局は（ｉ）の濃度に依存する電気的応答（ｃ）を誘導する。
【図４】図４は、各々図２および図３に類似する態様の概略図であり、この場合、図２および図３の被検体は固定化構成員である一方、図２および図３の固定化構成員がここでは被検体となっている。
【図５】図４と同様な概略図である。
【図６】図６は、本発明の直接モードの更に別の態様の概略図であり、この場合、固定化構成員を光エネルギーへの露出に反応性を示す基に連結することにより修飾する。この基は２つの異性化状態を有するが、これらは図中ではＡおよびＶとして示されており、そして図６のｃにおいて説明されるようにこれは光エネルギーｈν１への露出によりＡからＢへと切り替わり、そして光エネルギーｈν２ヘの露出により切り替わってＢからＡへと戻る。適切な波長の光への露出により、修飾を施した固定化構成員は立体配座変化を受け、これは被検体に対する結合親和性を変化させ、そしてそのために、被検体の結合後この修飾を施した固定化構成員が放出され、そしてすすぎの後にこれは再使用のためにもともとの状態に転化することが可能となる。図６のａおよびｂは操作周期を説明しているが、これら２つの図の間の違いは、図６のａとｂとにおける被検体と固定化構成員の役割が逆転していることであり、これはつまり、図６のａの被検体が図６のｂの固定化構成員であり、そしてその逆もまた同じであるということである。
【図７】図７は、生物学的試料中の作用物質の決定のための本発明の間接モードに従う態様を示し、この作用物質は固定化構成員と相同である。この態様においては、未知の試料をまず第一に被検体と反応させ、そしてその後この被検体の決定値が、生物学的試料中の作用物質のための間接的測定値として役立つ。
【図８】図８は、本発明の間接モードに従う態様の概略図であり、これは図７のものに類似するが、違いは、この場合においては検査用作用物質が固定化構成員と相同ではないが、固定化構成員と類似する被検体への結合親和性を有しているということである。
【図９】図９は、固定化構成員に結合しない産物へと被検体を破壊することが可能な酵素の決定のための本発明の間接モードに従う態様の概略図である。被検体を未知の試料と反応させた後に、被検体の一部分が生物学的試料中の酵素の量に依存して分解し、そしてその後被検体の決定により試料中の酵素の間接的決定が可能になる。
【図１０】図１０は、図９の態様に類似する本発明の間接モードに従う態様を説明しており、違いは、前駆体被検体を後にある系内において決定される被検体へと転化させる反応の異化作用を酵素が行うということである。ここでもまた、被検体の決定により生物学的試料中の酵素の間接的決定が可能となる。
【図１１】図１１は、本発明の間接モードの更に別の態様を説明しており、この場合、被検体はある酵素反応の産物であり、この酵素反応においては生物学的試料中に存在する前駆体被検体が、その後ある系において決定される被検体へとある酵素により転化され、この被検体の決定により生物学的試料中の検査作用物質である前駆体被検体の間接測定物が提供される。
【図１２】図１２は、本発明の一つの態様を説明しており、この場合、感度が結合被検体上での分子複合物の形成により増大する。
【図１３】図１３は、実施例１において記載される金電極の修飾の方法を説明する。
【図１４】図１４は、抗−ＤＮＰ抗体の非存在下（曲線ａ）および抗−ＤＮＰ抗体の様々な濃度（曲線ｂ−ｅ）での、実施例１のＤＮＰ電極のサイクリックボルタングラム反応を示す。
【図１５】図１５は、対照（抗体なし）に対する様々な抗体濃度におけるピークの電流反応の変化（ΔＩｐｃ）を示す。
【図１６】図１６は、実施例２に記載される金電極上のフルオレセイン単一層の固定化の方法を説明する。
【図１７】図１７は、実施例２において記載される様々な抗−フルオレセイン抗体濃度における最大電流の変化（ΔＩｐｃ）を示す。
【図１８】図１８は、実施例３において記載される様式における金電極（図１８のｂ）上に固定化された抗原性ペプチド（図１８のａ）を示す。
【図１９】図１９は、抗−ペプチド抗体の添加後の、時間０（曲線Ａ）、３分後（曲線Ｂ）、５分後（曲線Ｃ）、および３５分後（曲線Ｄ）における図１８の抗原性ペプチドでの修飾を施した金電極のサイクルボルタモグラムを示す。
【図２０】図２０は、本文中に引用される化合物１−１０の式を示す。
【図２１】図２１は、本文中に引用される化合物１１−１７の式を示す。
【図２２】図２２は、実施例４に記載される金電極の表面上の単糖α−Ｄ−マンノピラノース層の固定化の方法を説明する。
【図２３】図２３は、Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムであるレドックス分子を連結させることによる修飾を施したコンカナバリンＡの２５μＭという一定濃度の存在下における、様々な濃度のコンカナバリンＡでの電極の刺激後の、図２０および２１に説明される、α−Ｄ−マンノピラノシド単糖層での修飾を施した金電極のサイクルボルタモグラムを示す。未修飾のコンカナバリンＡの濃度は、０（曲線ａ）、２．５μＭ（曲線ｂ）、５μＭ（曲線ｃ）、１０μＭ（曲線ｄ）、および２０μＭ（曲線ｅ）であった。
【図２４】図２４は、図２２の系における未修飾コンカナバリンＡ濃度の関数としての電荷移動の減少の検量曲線を示す。
【図２５】図２５は、未修飾コンカナバリンＡの増加濃度の存在下における、レドックス分子を連結させることによる修飾を施したコンカナバリンＡの一定濃度の存在下における、図２２に説明されるα−Ｄ−マンノピラノシド単一層電極の陰極電流を示す。
【図２６】図２６は、様々な濃度のα−Ｄ−マンノピラノジドを含むコンカナバリンＡ溶液に露出させた際の、マンノース層を固定化させてある電極の電流測定反応を示す。
【図２７】図２７は、実施例６において記載される金電極上のジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）単一層の固定化を説明する。
【図２８】図２８のａは、抗−ＤＮＰ抗体との１６分間のインキュベーションの後の、ＤＮＳＰの層を固定化させてある電極のサイクリックボルタングラムを示すが、図２８のａはもともとの状態におけるＤＮＰでのある電極の結果である一方、図２８のｂは二価イオン性メロシアニン立体配座へのＤＮＳＰの光異性化後の同一電極の結果である。
【図２９】図２９は、抗−ＤＮＰ抗体とのインキュベーション後の、固定化抗原の２つの異なる異性化状態における図２７の電極中に生じるピーク電流を示し、（ｂ）および（ｄ）はスピロＤＮＳＰ立体配座のものを、（ａ）および（ｃ）は二価イオン性メロシアニン立体配座への光異性化後のものを示す。スピロ状態からメロシアニン状態への異性化およびその逆は光により誘導した。
【図３０】図３０は、光異性化可能な基を連結させることによる蛋白質コンカナバリンＡの修飾の方法を説明する。
【図３１】図３１は、抗−ＤＮＰ−抗体でのＤＮＰ固定化電極の刺激後の応答の変化を（Δｉ（１）ｐｃ）、抗−ＤＮＰ−抗体に対する抗−抗体での電極の更に別の刺激の後の電気的応答の変化と比較して示す。
【図３２】図３０は、３−アミノプロピルトリエトキシシランである連結基を固定化することによる、透過性ガラス電極であるインジウム−すずオキシド（ＩＴＯ）の修飾の方法を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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