(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
牡丹皮のメタノール粗抽出物及びからし油でなる群から選択される１種以上の物質を含む殺だに剤。
【請求項２】
前記からし油は、核酸及びエチルアセテートを含む溶媒により分画されることを特徴とする請求項１に記載の殺だに剤。
【請求項３】
前記からし油は、核酸及びエチルアセテートの体積比が異なる複数の溶媒により、段階的に分画されることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の殺だに剤。
【請求項４】
前記殺だに剤は、縦紋ほこりだにまたは大きい脚ほこりだにに対して殺だに効果があることを特徴とする請求項１に記載の殺だに剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物から抽出した殺だに性組成物に関するものであり、さらに詳細には、殺だに力を有する植物粗抽出物及び化合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
だには、人間住居地で最も核心的なアレルギー原として、特に喘息と鼻炎を誘発する因子である。(Ｍａｕｎｓｅｌｌ等、１９６８)また、ピログリピダエ(Ｐｙｒｏｇｒｙｐhｉｄａｅ)科に属するだにはほこり内に棲息して(Ｖｏｏｒhｏｒｓｔ等、１９６４)、縦紋ほこりだに(Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ)、大きい脚ほこりだに(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、マイクロセラスだに(Ｄ．ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ)、ヨーログリプス・マイネイ(Ｅｕｒｏｇｌｙｐhｕｓ  ｍａｙｎｅｉ)などがアトピー性(ａｔｏｐｙ)体質の人から鼻炎、喘息または湿疹のような症状を誘発する。(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓhｏｐ  Ｒｅｐｏｒｔ，１９８９と１９９２)
【０００３】
最近には中央暖房式管理方式のアパート世代増加、補助暖房装置の使用増加、カーペット利用量の増加などの住居環境の変化が、だに生育に最適条件を与えるようになり、それによってだには速い増殖と４季節室内条件下で生存できるようになった。国内で主に発見されるだには４種程度で、優占種は全世界的に最もありふれるように発見される縦紋ほこりだに(Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ)と大きい脚ほこりだに(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)である。
【０００４】
家ほこりだには、カーペット、衣類、家具、マットレス、寝具類等から発見されて、温帯性気候地域のみならずこのような居住地域全域に分布する特性を見せる。(Ｂｏｅｒ、１９９１)
【０００５】
家ほこりだに種は、光を嫌って、個体群増殖のために適切な温度と湿度、餌原として人間の皮膚角質物とを必要とする。したがって家ほこりだにを殺虫するために常に家の中のほこりを取り除いて、家ほこりだにが棲息できる家具類、衣類及びカーペットなどを７０℃以上で滅菌したり温湿度を調節する方法が研究された。しかしこのような方法は適用上多くの制約があって完全な駆除力を期待することは非常に難しい実情である。
【０００６】
だに防除能を有する物質は、リンデン(ｌｉｎｄａｎｅ)、ピリミポスメチル(ｐｉｒｉｍｉｐhｏｓ−ｍｅｔhｙｌ)、安息香酸ベンジル(ｂｅｎｚｙｌ  ｂｅｎｚｏａｔｅ)、フタル酸ジブチル(ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐhｔhａｌａｔｅ)及びジエチルｍ−トルアミド(ｄｉｅｔhｙｌｍ−ｔｏｌｕａｍｉｄ)がある。(Ｈｅｌｌｅｔ−Ｈａｕｐｔ等、１９７４)リンデンは最も強力な殺だに力と持続力を有するが高い毒性によって家庭用殺だに剤としては使用が制限されている。前記物質中二番目に活性が強いピリミポスメチルは哺乳毒性が低くて貯蔵穀物内に棲息するだにを抑制する手段として実用化された。そしてミッチェル等(１９８５）はピリミポスメチルがカーペットに棲息するだにの６０％を、椅子に棲息するだにの５０％を防除できると報告した。
【０００７】
現在だに防除用に商品化されているものは、安息香酸ベンジル(ｂｅｎｚｙｌ  ｂｅｎｚｏａｔｅ)、パラゼルム(ｐａｒａｇｅｒｍ)などがある。(Ｐｅｎａｕｄ等、１９７７；Ｓｃhｏｂｅｒ等 、１９８７)
【０００８】
だにを防除するために、殺虫剤による化学的防除を主に用いているが、化学合成殺虫剤の使用でむしろだにの薬剤抵抗性をもたらし、ＤＤＴとリンデンとに対して抵抗性を示すほこりだに科(Ｐｙｒｏｇｌｙｐhｉｄ）のだに類が発見されている。(Ｂｒｏｎｓｉｊｋ等、１９７１)したがって既存に用いてきた殺だに剤を代えるための研究が全世界的に行なわれている。特に民間療法で薬物治療剤として用いられる植物体と香りが良い芳香性物質とを利用して天然殺だに剤を開発しようとする多くの研究が行なわれている。(Ｍｉｙａｚａｋｉ、１９８９；Ｗａｔａｎａｂｅ１９８９；Ｙａｔａｇａｉ、１９９１；Ｍｏｒｉｔａ,１９９１)
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明はだにを撲滅できる植物由来殺だに性化合物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するために本発明は、牡丹皮(Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ)のメタノール粗抽出物及びからし油(ｍｕｓｔａｒｄ  ｏｉｌ)でなる群から選択される１種以上の物質を含む殺だに剤を提供する。
【００１１】
また、本発明はからし油から選択された化学式４のアリルイソチオシアナート(ａｌｌｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)、化学式５のブチルイソチオシアナート(ｂｕｔｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)及びこの２種の化合物を含む殺だに剤を提供する。
【００１２】
【化１】
0003597479.tif 000002
【００１３】
【化２】
0003597479.tif 000003
【００１４】
【化３】
0003597479.tif 000004
【００１５】
【化４】
0003597479.tif 000005
【００１６】
【化５】
0003597479.tif 000006
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明者は殺だに効果(ａｃａｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ)を有する植物をスクリーニングして牡丹皮(Ｐａｅｏｎｉａ  ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ)、せんきゅう(Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ｃhｕａｎｘｉｏｎｇ)、肉桂（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ)、桂皮油(ｃｉｎｎａｍｏｎ ｏｉｌ)、からし油(ｍｕｓｔａｒｄ  ｏｉｌ)及び洋ワサビ油(hｏｒｓｅｒａｄｉｓh  ｏｉｌ)が殺虫性を有し、特に殺だに効果があることを確認した。殺だに効果はだに殺虫力を有することであり、本発明では我が国で優占種である縦紋ほこりだに(Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ)と大きい脚ほこりだに(Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ)とに対する殺だに効果を測定した。また、肉桂と同一な桂皮からも殺虫または殺だに効果があることを確認した。
【００１９】
前記植物の殺だに性物質を抽出するためにメタノール抽出方法を実施して牡丹皮、せんきゅう、肉桂から各々のメタノール粗抽出物を収得して、桂皮、からしと洋ワサビとは桂皮油、からし油、洋ワサビ油で収得した。前記６種の物質は家ほこりだに２種に対して殺だに効果を確認した。
【００２０】
本発明は殺だに剤を提供する。前記殺だに剤は、牡丹皮メタノール粗抽出物及びからし油(ｍｕｓｔａｒｄ  ｏｉｌ)でなった群から１種以上選択されることが良い。
【００２１】
また、本発明は殺だに性植物または植物抽出物を含む殺だに剤を提供する。殺だに剤は前記植物または植物のメタノール粗抽出物を単独で含んだりまたは通常の殺虫剤に混合する物質をさらに含むことができ、植物のメタノール粗抽出物を０．０１重量％ないし７０重量％に含むことが望ましい。しかし植物のメタノール粗抽出物の含有量は殺だに剤の剤形、撒布方法によって別に適用されることがさらに望ましい。殺だに剤の剤形はスプレー状、液体塗布状、固体塗布状、及びジェル状の剤形が望ましい。
【００２２】
また、前記肉桂メタノール抽出物は、ヘキサン、クロロホルム、エチルアセテート、ブタノールでさらに抽出し、ヘキサン層とクロロホルム層が殺だに活性を有することを確認した。したがって前記肉桂メタノール抽出物から収得したヘキサン層とクロロホルム層とは殺だに性組成物として利用でき殺だに剤としても活用できる。
【００２３】
また、肉桂から分離したトランスシンナムアルデヒド(ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅhｙｄｅ)、シンナミルアルコール(Ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏhｏｌ)、またはサリチルアルデヒド(Ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅhｙｄｅ)の化合物は殺だに性を示す化合物である。トランスシンナムアルデヒドは化学式１で表現され、シンナミルアルコールは化学式２で表現され、サリチルアルデヒドは化学式３で表現される。
【００２４】
また、からし油と洋ワサビ油とから抽出したアリルイソチオシアナート(ａｌｌｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)とブチルイソチオシアナート(ｂｕｔｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)は家ほこりだにに対する強力な殺だに性を示す化合物である。アリルイソチオシアナートは化学式４で表現され、ブチルイソチオシアナートは化学式５で表現される。
【００２５】
また、殺だに剤はトランスシンナムアルデヒド(ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅhｙｄｅ)、シンナミルアルコール(Ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏhｏｌ)、またはサリチルアルデヒドを各々含むことができ、前記３種をすべて含むことができる。前記トランスシンナムアルデヒド、シンナミルアルコール、サリチルアルデヒドは各々単独で用いた時より混合した時殺だにに相乗效果を示すので混合して用いることが最も望ましい。
【００２６】
殺だに剤は、通常の殺虫剤に混合する物質をさらに含むことができ、混合物形態の場合トランスシンナムアルデヒド、シンナミルアルコール、またはサリチルアルデヒドを単独または混合物を０．０１重量％ないし７０重量％に含むことが望ましい。しかし前記殺虫剤に含まれるトランスシンナムアルデヒド、シンナミルアルコール、またはサリチルアルデヒドの含有量は、殺虫剤を用いる方法や提示される剤形によって適切に調節することは当然なことである。
【００２７】
また、トランスシンナムアルデヒド、シンナミルアルコール、またはサリチルアルデヒドは、殺だに活性を有し多様な虫に効果を有する新規化合物のための母核化合物の基質として利用できる。母核化合物は、既存に活性が知られた物質の構造を基盤に、化学合成を通して水酸化基または他の化学構造を付け加えたり取り除くことによって、既存に問題になった性質を取り除いたり効果を増進させた新しい物質を称する。
【００２８】
アリルイソチオシアナート(ａｌｌｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)とブチルイソチオシアナート(ｂｕｔｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)とはイソチオシアナートを変化させたり(Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ)、それを強化(ｂａｃｋｂｏｎｅ)して倉庫虫をはじめとする多様な害虫に対する殺だに性または防除性を増大させる母核化合物を作るための物質として使用できる。しかし、イソチオシアナート母核化合物は−ＮＳＣ機能群を維持すべきであるが、これはイソチオシアナートがバイオ活性化(ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ)を見せることに主要な役割をするためである。結局、この母核化合物に対する実施例はＲ−ＣｎＨ２ｎ−ＮＣＳ(Ｒ  ｉｓ  １  ｔｏ  ４Ｃ  ａｌｋｙｌ、ａｌｋｅｎｅ、ｂｅｎｚｙｌ  ｏｒ  ｐhｅｎｙｌ;ｎ  ｉｓ  ３ｔｏ１０)で示すことができる。
【００２９】
母核化合物の代表的な例であるピレスロイド系殺虫剤の場合、元来植物精油成分を母核化合物で新しく合成した殺虫剤として、元来の成分より光分解が不十分で魚毒性が低い類似物質を製造して現在用いられている。
【００３０】
したがって、前記トランスシンナムアルデヒド母核化合物、シンナミルアルコール母核化合物、またはサリチルアルデヒド母核化合物を含む殺だに剤を提供できる。
【００３１】
殺だに剤は、揮発性毒または接触毒として用いて、だにを殺だにさせることが望ましく、前記植物由来抽出物、肉桂から分離した３種の化合物及び前記３種の化合物の母核化合物は、だに以外の害虫に対して防除の目的に使用できる。
【００３２】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるだけであって本発明が下記の実施例に限定されることではない。
【００３３】
[実施例]試料調剤と殺だに活性植物体及び精油
メタノール粗抽出物
牡丹皮(Ｐａｅｏｎｉａ  ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ)、せんきゅう(Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ｃhｕａｎｘｉｏｎｇ)、肉桂(Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）は各３００ｇをミクサ機できれいに磨碎して、５００ｍｌ三角フラスコに入れた次に、メタノール５００ｍｌを混合して室温暗室で３日間放置した。３日後ろ過した次に、ろ過液を回転真空濃縮機(ＥＹＥＬＡ  ａｕｔｏｊａｃｋ  ＮＡＪ−１６０、Ｊａｐａｎ)で濃縮した。濃縮物を再びメタノールに混合する過程を２回繰り返して、メタノール粗抽出物を製造した。桂皮油(Ｃ．ｃａｓｓｉａ(Ｃｉｎｎａｍｏｎ  ｏｉｌ))、からし油(Ｂ．ｊｕｎｃｅａ(Ｍｕｓｔａｒｄ  ｏｉｌ))と洋ワサビ油(Ｃ．ａｒｏｒａｃｉａ(Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓh  ｏｉｌ)）とは購入して用いた。
【００３４】
[実験例１]
殺だに活性検定に用いられただに
殺だに活性は、２種のほこりだにに対して実施した。大きい脚ほこりだに(Ａｍｅｒｉｃａｎ  hｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ、Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ)と縦紋ほこりだに(Ｅｕｒｏｐｅａｎ  hｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ、Ｄｅｒｍａｔｏｐhａｇｏｉｄｅ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ)は相対湿度７５±５％、温度２５±１℃を維持した飼育室で飼育し、１２．５×１０．５×５ｃｍ容器に稚魚飼料と複合ビタミン剤(Ｅｂｉｏｓｅ［登録商標］)とを１：１で混合した飼料及び、１７．５×１７．５×１７．５ｃｍ体積の容器底に食塩水を適当量そそいで、飼育室に入れて与えた。前記だには、殺だに剤に露出しなくて飼育した。
【００３５】
殺だに活性検定
植物体抽出物及び精油を利用した生物活性物質探索のための１次スクリーニングで最も重要な点が、初期出発濃度の設定である。本発明では、だにの形態的な特徴が顕微鏡学的構造を持っているために、数回の予備実験を通して２ミリリットルマイクロチューブ当たり、試料１ｍｇを設定した。メタノール粗抽出物または精油物１ｍｇを４０μリットルのメタノールに溶かして、無色のマイクロチューブ(２ミリリットル)に処理して、チューブの壁面とふたに物質が均等に分散して付くように、数回上下に揺さぶった後、凍結乾燥器で１時間溶媒を揮発させた。各々のチューブに２５個体のだにを入れた後、２５±１℃の条件下で検定をした。だには顕微鏡で観察して活動力が優秀な個体のみを微細な筆を利用して選別した。検定結果は処理２４時間、４８時間後に光学顕微鏡２０倍下で調査したが、微細な筆を利用し附属肢及び胴を刺激して全く動かない個体は死亡したことに見なした。あらゆる検定は４回以上繰り返し、殺だに率に対する平均間の比較はシェフェー(Ｓｃhｅｆｆｅ'ｓ  ｔｅｓｔ、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、１９９６)を利用した。メタノール粗抽出物を無処理した対照区も同一に処理して調査した。殺だに率は、アークサイン自乗根に変形させて示した。
【００３６】
下記表１は、メタノール粗抽出物と精油とに対する、殺だに率を測定したものである。
【００３７】
【表１】
0003597479.tif 000007
【００３８】
前記表１の列で同一な文字は、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００３９】
前記表１の殺だに率は、メタノール粗抽出物と精油各々１ｍｇを２ｍｌマイクロチューブに処理した時の値であり、時間はメタノール粗抽出物と精油とを処理した後経過した時間を意味する。前記表１の結果は、チューブ当たり各だに種２５個体ずつを放飼して、５回繰り返した値である。
【００４０】
せんきゅうを除いた牡丹皮、肉桂(桂皮)、桂皮油、からし油及び洋ワサビ油は、処理４８時間以後に二種の家ほこりだにに対して１００％の強い殺だに活性を見せており、特に肉桂と桂皮油とは処理２４時間以後にも二種のだにすべてに対して、１００％の高い殺だに活性を示した。
【００４１】
[実施例２]
前記実施例１で製造した肉桂メタノール粗抽出物の殺だに活性成分を分離、精製した。メタノール粗抽出物２０ｇを蒸溜水８００ｍｌとヘキサン(ｎ−Ｈｅｘａｎｅ)８００ｍｌに溶かし、２Ｌ分液漏斗に入れた後、栓を閉じてよく混合した次に、水層とヘキサン層とに分離した。３０分後に他の分液漏斗を利用して、１次ヘキサン層を分離させて、水層に新しいヘキサン８００ｍｌをそそいで、同一な方法で２次のヘキサン層を分離させた。残っている水層に、クロロホルム８００ｍｌを混合して栓を閉じた後、十分に揺さぶって水層とクロロホルム層とに分離させて、３０分後に１次クロロホルム層を分離した。再び水層に新しいクロロホルム８００ｍｌを混合して、同一な方法で２次のクロロホルム層を分離した。残っている水層にエチルアセテート８００ｍｌをそそいで、ヘキサン分配時と同一な方法でエチルアセテート層を２回にかかって分離して、残った水層にブタノール８００ｍｌをそそいで、同一な方法でブタノール層を分離した。前記のような溶媒分画法でヘキサン層、クロロホルム層、エチルアセテート層、ブタノール層及び水層の５画分を収得し、水層は凍結乾燥器(Ｖｅｒｔｉｓ、ＵＳＡ)で濃縮させて、ヘキサン層、クロロホルム層、エチルアセテート層、及びブタノール層は各々回転真空濃縮機(ＥＹＥＬＡ  ａｕｔｏｊａｃｋ  ＮＡＪ−１６０、Ｊａｐａｎ)で濃縮させた。
【００４２】
濃縮された分画物に対して、前記実験例１の殺だに活性実験を同一に４回反復実施して殺だに活性層を決定し、結果は下記表２に示した。
【００４３】
【表２】
0003597479.tif 000008
【００４４】
前記表２の同一な文字ａ、ｂは、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根で変形させて示した。
【００４５】
前記表２に示されたように、肉桂(桂皮)分画分のヘキサン層とクロロホルム層とが二種の実験だにに対して１００％殺だに活性を示した。
【００４６】
[実施例３]殺だに活性物質分離
前記実施例２で殺だに活性を示すヘキサンとクロロホルム層中ヘキサン層に対して、殺だに活性物質を分離した。図１にヘキサン層の活性成分を分離する過程を図示した。
【００４７】
１次シリカゲルクロマトグラフィー
ヘキサン分画１０ｇを、シリカゲルコラム(ｂｅｒｃｋ  ７０−２３０ｍｅｓh、６００ｇ、５．５×７０ｃｍ)に吸着させた後、ヘキサンとエチルアセテートとの段階的勾配(ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ)で１次色層分析した。使用した段階的勾配は、ヘキサン：エチルアセテート比率を１００：１、９９：１、９５：５、９０:１０、８０:２０、７０:３０、６０:４０、５０:５０、０:１００エチルアセテート、メタノール順に進めて、各比率による分画をＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８で溶離した。前記の８個分画は実施例１の殺だに活性検定法でだに防除性を確認して、その結果、活性を有する３個の分画Ｈ２  ４０．１％、Ｈ３  ４．２％、Ｈ６  ８．８％を分離できた。各分画を薄層クロマトグラフィーして、一つの点(ｓｐｏｔ)として確認される、すなわち、一つの化合物でなった分画を確認した。
【００４８】
２次クロマトグラフィー
１次で分離した活性分画に対するシリカゲルクロマトグラフィーをさらに実施した。
【００４９】
Ｈ２、Ｈ３、Ｈ６分画は、高速液体クロマトグラフィー(Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐ２０００、Ｔhｒｍｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ)を利用してさらに精製した。
【００５０】
Ｈ２は、流速４．０ｍｌ/ｍｉｎ、ヘキサン−エチルアセテート(９：１)、μポラシルシリカ(μＰｏｒａｓｉｌ ｓｉｌｉｃａ)(１９×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ)コラム、吸光度２６０ｎｍで実施して、Ｈ２１、Ｈ２２、Ｈ２３分画を収得して、活性分画Ｈ２３を化合物Ｉとして収得した。
【００５１】
Ｈ３分画は、ヘキサン−エチルアセテート(８：２)で高速液体クロマトグラフィーを実施して、Ｈ３１、Ｈ３２、Ｈ３３、Ｈ３４分画を収得して、殺だに活性を有する分画Ｈ３２を収得した。
【００５２】
Ｈ６分画は、ヘキサン−エチルアセテート(７：３)で高速液体クロマトグラフィーを実施して、Ｈ６１、Ｈ６２、Ｈ６３分画を収得して、活性分画Ｈ６２を化合物ＩＩとして収得した。
【００５３】
３次クロマトグラフィー
２次で活性を有する分画Ｈ３２をさらに精製した。
【００５４】
Ｈ３２分画は、シリカゲルクロマトグラフィーでヘキサン：エチルアセテート比率を１０：１で溶離して活性を有する分画Ｈ３２２と、非活性分画Ｈ３２１、Ｈ３２３、Ｈ３２４とを分離した。
【００５５】
４次クロマトグラフィー
３次で活性を有する分画Ｈ３２２をさらに精製した。
【００５６】
Ｈ３２２分画は、シリカゲルクロマトグラフィーでヘキサン：エチルアセテート比率を２５：１で溶離して、活性を有する分画Ｈ３２２３と、非活性分画Ｈ３２２１、Ｈ３２２２とを分離した。
【００５７】
５次クロマトグラフィー
４次で活性を有する分画Ｈ３２２３をさらに精製した。
【００５８】
Ｈ３２２３分画は、シリカゲルクロマトグラフィーでクロロホルム：メタノール比率を５：１で溶離して、活性を有する分画Ｈ３２２３２を分離した。
【００５９】
６次クロマトグラフィー
５次で活性を有する分画Ｈ３２２３２をさらに精製した。
【００６０】
Ｈ３２２３２分画は、シリカゲルクロマトグラフィーでクロロホルム：メタノール比率を３０：１で溶離して、活性を有する分画Ｈ３２２３２２を分離した。
【００６１】
分離したＨ３２２３２２分画は、流速４．０ｍｌ/ｍｉｎ、ヘキサン−エチルアセテート(１００：１)、μポラシルシリカ(μＰｏｒａｓｉｌ ｓｉｌｉｃａ)(１９×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ)コラム、吸光度２６０ｎｍで実施して、Ｈ３２２３２２１、Ｈ３２２３２２２、Ｈ３２２３２２３分画を収得して、活性分画Ｈ３２２３２２３を化合物ＩＩＩとして収得した。
【００６２】
(ｂ)前記実施例１で、からし油に対して生化学的活性要素を分離した。図２にからし油の活性成分を分離する過程を図示した。
【００６３】
１次クロマトグラフィー
からしオイル１２ｇをシリカゲルコラム(Ｍｅｒｃｋ  ７０−２３０  ｍｅｓh、６００ｇ、５．５ｉ．ｄ．ｘ７０ｃｍ)に吸着させた後、核酸とエチルアセテートとの段階的勾配で１次色層分析した。段階的勾配に用いた核酸とエチルアセテート比率を１００:０、９５:５、９０:１０、８０:２０、７０:３０、５０:５０、３０:７０、０:１００で、各比率による分画をＭＯ１、ＭＯ２、ＭＯ３、ＭＯ４、ＭＯ５で溶離した。前記５分画は実施例１の殺だに活性検定法で、だに防除性を確認したし、ＭＯ２  ２．２３ｇ分画は強い殺だに活性を見せた。コラム分画は薄層クロマトグラフィーして一つの点で確認される、すなわち、一つの化合物でなった分画を確認した。
【００６４】
２次クロマトグラフィー
１次シリカゲルクロマトグラフィーで分離した活性分画を、１次クロマトグラフィーと同じ方法を用いてクロマトグラフィーをさらに実施した。四つの分画を収得して、ＭＯ２１分画２３．２ｍｇは家ほこりだにに対して強力な活性物質を生成した。
【００６５】
３次クロマトグラフィー
活性分画ＭＯ２１は、生化学的活性要素を分離しようと、高速液体クロマトグラフィーを利用してさらに分画した。ＭＯ２１分画は核酸:エチルアセテート比率を９５:５で溶離した。コラムはμポラシルシリカ(μＰｏｒａｓｉｌ  ｓｉｌｉｃａ)(１９×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ)吸光度２６０ｎｍで実施した。ＭＯ２１１、ＭＯ２１２の二分画を収得して、結果的に二つの活性要素である化合物１と化合物２とで収得した。
【００６６】
(ｂ)前記実施例１で洋ワサビ油に対して生化学的活性要素を分離した。図３に洋ワサビ油の活性成分を分離する過程を図示した。
【００６７】
１次クロマトグラフィー
洋ワサビ油１２ｇをシリカゲルコラム(Ｍｅｒｃｋ  ７０−２３０  ｍｅｓh、６００ｇ、５．５ｉ．ｄ．ｘ  ７０ｃｍ)に吸着させた後、核酸とエチルアセテートとの段階的勾配で１次色層分析した。段階的勾配に用いた核酸とエチルアセテート比率を１００:０、９５:５、９０:１０、８０:２０、７０:３０、０:１００で、各比率による分画をＨＯ１、ＨＯ２、ＨＯ３で溶離した。前記３分画は実施例１の殺だに活性検定法でだに防除性を試験したし、ＨＯ１、４．５２ｇ分画は強い殺だに活性を見せた。コラム分画は薄層クロマトグラフィーして一つの点で確認される、すなわち、一つの化合物でなった分画を確認した。
【００６８】
２次クロマトグラフィー
１次シリカゲルクロマトグラフィーで分離した活性分画ＨＯ１をヘキサン:エチルアセテート９５:５、Ｖ/Ｖ比率でシリカゲルコラムで連続的にクロマトグラフィーを実施した。二つの分画を収得したし、ＨＯ１１分画３．７ｇは家ほこりだにに対して強力な活性物質を生成した。
【００６９】
３次クロマトグラフィー
活性分画ＨＯ１１は、生化学的活性要素を分離しようと高速液体クロマトグラフィーを利用してさらに分画した。ＨＯ１１分画は核酸:エチルアセテート比率を９５:５で溶離した。コラムはμポラシルシリカ(μＰｏｒａｓｉｌ  ｓｉｌｉｃａ)(１９×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ)吸光度２６０ｎｍで実施した。収得された三分画ＨＯ１１１、ＨＯ１１２、ＨＯ１１３中、ＨＯ１１１とＨＯ１１２とが強い殺だに活性を見せた。結果的に二つの殺だに活性を有する要素１(化合物１)と要素２(化合物２)とが各々分離された。
【００７０】
活性物質分析
前記で分離した最終活性分画(化合物Ｉ、化合物ＩＩ、化合物ＩＩＩ）の活性溶離物質の構造決定は分光分析に基づいた。ＥＩ質量分析機(ＪＥＯＬＧＳＸ  ４００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ)、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ(標準物としてはＴＭＳを利用)で同定しており、高速液体クロマトグラフィーで不明瞭なピーク(ｐｅａｋ)に対しては１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹとＤＥＰＴ−ＮＭＲとで物質同定を実施した。前記で分離した活性物質はトランスシンナムアルデヒド(ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅhｙｄｅ)、シンナミルアルコール(Ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏhｏｌ)、サリチルアルデヒド(Ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅhｙｄｅ)である。実施例３(ｂ)と(ｃ)で分離した二つの活性化合物は、ブチルイソチオシアナートとアリルイソチオシアナートとの特性を帯びる。これによりからし油と洋ワサビ油との活性化合物は同じものである。
【００７１】
[実験例２]
前記実施例３の活性物質に対する殺だに活性を測定した。
【００７２】
殺だに活性検定
前記実験例１で実施した殺だに活性検定法でトランスシンナムアルデヒド(ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅhｙｄｅ)、シンナミルアルコール(Ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏhｏｌ)、サリチルアルデヒド(Ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅhｙｄｅ）のだに殺だに効果を測定して下記表３と表４に示した。
【００７３】
【表３】
0003597479.tif 000009
【００７４】
前記表３の同一な文字ａ、ｂは平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示して、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００７５】
前記表３は、縦紋家ほこりだにに対する殺だに活性結果として、処理４８時間後に肉桂由来３種化合物すべて１ｍｇ処理水準で、１００％の殺だに活性を示して、０．５ｍｇ処理水準では処理２４時間後にトランスシンナムアルデヒド８４．０％、シンナミルアルコール９０．０％、サリチルアルデヒド８９．０％の殺だに力を見せたが、０．４ｍｇ以下水準処理では有意すべき殺だに活性が観察できなかった。
【００７６】
【表４】
0003597479.tif 000010
【００７７】
前記表４の同一な文字ａ、ｂは、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００７８】
前記表４は、大きい脚ほこりだにに対する殺だに活性を示したことである。処理４８時間後、１ｍｇ処理水準で３種化合物すべて、１００％の殺だに活性を示して、０．５ｍｇ水準では処理２４時間後に、トランスシンナムアルデヒド９４．０％、シンナミルアルコール９０．０％、サリチルアルデヒド９９．０％の高い殺だに力を見せたが、０．３ｍｇ以下水準処理では有意すべき殺だに活性が観察できなかった。
【００７９】
(ｂ)前記実験例１で実施した殺だに活性検定法で、からし油と洋ワサビ油とに含まれたアリルイソチオシアナート(ａｌｌｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ)と、ブチルイソチオシアナート(ｂｕｔｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ）とのだに殺だに効果を測定して、下記表５と表６に示した。
【００８０】
【表５】
0003597479.tif 000011
【００８１】
前記表５の同一な文字ａ、ｂは、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００８２】
前記表５は、濃度によって縦紋家ほこりだに(Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ)と大きい脚ほこりだに(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)とに対するからし油と洋ワサビ油抽出のアリルイソチオシアナートの殺だに活性結果で、処理４８時間後にアリルイソチオシアナートは１ｍｇ処理水準で二だにに対して１００％の殺だに率を示して、０．５ｍｇ処理水準では、処理４８時間後に縦紋ほこりだにと大きい脚ほこりだにとに対して各々９４％、９７％の殺だに率を見せたが、０．４ｍｇ以下水準処理では有意すべき殺だに活性が観察できなかった。
【００８３】
【表６】
0003597479.tif 000012
【００８４】
前記表６の同一な文字ａ、ｂは、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００８５】
前記表６は、縦紋ほこりだにと大きい脚ほこりだにとに対するブチルイソチオシアナート(ｂｕｔｙｌ  ｉｓｏｔhｉｏｃｙａｎａｔｅ）の効果を示したことである。処理４８時間後、１ｍｇ/チューブ処理水準で二だにに対してすべて１００％の殺だに性を示して、０．５ｍｇ水準では処理４８時間後に縦紋家ほこりだにと大きい脚ほこりだにとに対して各々９６％と９４％の殺だに力を見せたが０．４ｍｇ以下水準処理では有意すべき殺だに活性が観察できなかった。
【００８６】
前記のように、５種活性化合物の殺だに活性は化合物の使用分量及び露出時間に依存する。
【００８７】
[実施例４]
前記実施例３で確認された３種の殺だに活性物質の相乗效果を調べてみるために、各化合物単独処理時全く活性を見せない濃度を選定した。０．２５ｍｇ単独処理時２種だにに対して活性を見せなかったために本濃度を相乗效果を確認する濃度として設定した。
【００８８】
活性成分を各々０．２５ｍｇずつ１：１の比率で混ぜて混合物を準備した。
【００８９】
(１)トランスシンナムアルデヒド＋シンナミルアルコール混合物、
(２)トランスシンナムアルデヒド＋サリチルアルデヒド混合物、
(３)サリチルアルデヒド＋シンナミルアルコール混合物、
(４)トランスシンナムアルデヒド＋シンナミルアルコール＋サリチルアルデヒド混合物。
【００９０】
殺だに活性物質の相乗效果は、大きい脚ほこりだにと縦紋ほこりだにとに対して実施した。下記表７は殺だに活性物質の相乗效果を示したことである。
【００９１】
【表７】
0003597479.tif 000013
【００９２】
前記表７の同一な文字ａ、ｂは、平均が統計上(Ｐ＝０．０５、Ｓhｅｆｆｅ検定)特別な差が無いことを示し、殺だに率はアークサイン自乗根に変形させて示した。
【００９３】
活性物質処理２４時間後、各混合物は強い殺だに活性を示した。だに２種に対する混合物の相乗作用は、処理２４時間後までは３種の活性化合物をすべて混合した混合物(ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍａｌｄｅhｙｄｅ・ｃｉｎａｍｙｌａｌｃｏhｏｌ・ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅhｙｄｅ)で最も強く示されたが、４８時間後には比較的差を見せなかった。各化合物の混合処理を通した相乗效果(ｓｙｎｅｒｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）があることを確認して、本発明者は合成殺だに剤として活性が卓越したことが報告された３種(ｂｅｎｚｙｌ  ｂｅｎｚｏａｔｅ、ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐhｔａｌａｔｅ、ＤＥＥＴ)有機合成化合物とその活性比較を実施した。有機合成化合物０．２５ｍｇ単独処理時、大きい脚ほこりだにと縦紋ほこりだに各々に対して処理２４時間後に安息香酸ベンジルは１００％と８８．８％、フタル酸ジブチルは９２．０％と９５．２％そしてＤＥＥＴは９６．８％と１６．８％の活性を示した。したがって肉桂由来化合物はこれら合成化合物の殺だに力より優れたり大同小異であった。
【００９４】
【発明の効果】
前記に言及したように、牡丹皮(Ｐａｅｏｎｉａ  ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ)及びからし油(ｍｕｓｔａｒｄ  ｏｉｌ)は殺だに能を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】肉桂メタノール粗抽出物のヘキサン分画を、クロマトグラフィーを実施して殺だに活性成分を分離する過程を図示したものである。
【図２】からし油から殺だに活性成分を分離する過程を図示したものである。
【図３】洋ワサビから殺だに活性成分を分離する過程を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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