(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクトース、及びＤ−ガラクツロン酸を含有する多糖類を形成することができる、登録番号Ｉ−1507を有するCollection Nationale de Cultures de Microorganismesで付着した属Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae微生物及びその変異菌。
【請求項２】
次の化学構造：
0003555957.tif 000008
（式中、ヒドロキシル基の幾つかはアセチル化されている。）
を有する多糖類の製造方法において、（ａ）請求項１に定義した微生物を、同化可能な糖質源の好気的発酵により水性栄養培地中で増殖し、次に（ｂ）工程（ａ）終了時に得られた懸濁物から前記多糖類を回収する、ことからなる製造方法。
【請求項３】
同化可能な糖質源がソルビトールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、酵素経路を用いて培養懸濁物中で蛋白質を加水分解することを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、Klebsiella pneumoniae,subsp.pneumoniaeの新規な菌株及びこの菌株を用いたＬ−フルコース含有多糖類の製造方法に関する。
本発明のKlebsiella pneumoniae,subsp.pneumoniae（以下、BEC1000と呼ぶ）の新規な菌株は、ブダペスト条約の規定に従い、1994年12月16日にフランス、パリ  セデックス15、75724、ドクテール  ル  通り、25のCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された。それには登録番号Ｉ−1507が与えられている。
Ｌ−フコース含有多糖類を製造するために属Klebsiellaの菌株を使用することは、それ自体知られている。
J.P.ジョセロ（Joseleau）及びM.F.マレイス（Marais）によるCabohydrate Research.77（1979）,pp.183−190には、KlebsiellaK−63生成させた1:1:1の比でＤ−ガラクトース、Ｌ−フコース、及びＤ−ガラクツロン酸を含有するカプセル化多糖類が記載されている。
G.T.ビーダー（Veeder）及びK.S.カング（Kang）による米国特許第4,298,691号明細書には、加水分解した澱粉のような同化可能な糖質源の好気的発酵により水性栄養媒地中で、番号ATCC31646として、1988年５月12日にAmerican Type Culture Collectionに寄託された、上記Ｋ−63に近いKlebsiella pneumoniaeの株の培養によりＳ−156へテロ多糖類を製造する方法が記載されている。そのヘテロ多糖類は、23:21:26の適当なモル比でＤ−ガラクツロン酸、Ｄ−ガラクトース、及びＬ−フルコースを含んでいる。
本発明者は、鋭意研究した結果、BEC1000と呼ばれるK.pneumoniae subsp.pneumoniaeの新規な株を発見した。それは感触、湿潤能力、エマルジョン安定化能力、及び芳香持続力のような化粧品工業に重要な性質を有するＬ−フコース含有多糖類を、工業的に有用な量で生成することができることが示された。
株BEC1000は、廃水プラントからのスラッジから分離されている。100mlの三角フラスコに入れた10mlの培地に接種するため、1gスラッジ試料を用いた。培地は１リットル当たり0.02gのイースト抽出物、10gのグルコース、9gのK2HPO4、3gのKH2PO4、1gの（NH4）2SO4、及び0.2gのMgSO4・7H2Oを含み、7.2のpHをもち、使用する前に110℃で30分間オートクレーブにかけた。培養期間は、120rpmで撹拌しながら、30℃で６日間であった。次第に希釈した一連の培地を調製し、夫々を、２重量％の寒天を添加した培地の入ったペトリ皿へ入れた。２日後、顕著なムコイド状態になったコロニーを分離した。
本発明の株は、強く粘液性になったコロニーを培地で培養した後に選択した。なぜなら、それは次の決定法に対し特に陽性の反応を与えるからである：
−  Z.デシェ（Dische）及びL.B.シェトレス（Shettles）による「メチルペントースの特性着色反応及びそれらを決定するためのマイクロ分光光度法」（A specific color reaction of methyl−pentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination）、J.Bilo.Chem.,175,595−603（1948）の分光光度法を用いた６−デオキシヘキソース（メチルペントース）の決定；
−  薄層クロマトグラフ（TLO）によるＬ−フコースの決定；
−  高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によるＬ−フコースの決定。
本発明のBEC1000株は、次の特性を有する：
細胞外観−顕著な配列のない均一な桿菌：
鞭毛                          ：不動株
グラム                        ：陰性着色
基礎条件                      : 30℃、周囲圧力
寒天及びブロス上の培養状態    ：過剰培養、着色せず
寒天深部での好気・嫌気培養    ：
塩分（培地は、１リットル当たり次のものを含有：ペプトン10g、イースト抽出物3g、グルコース5g;pH7.0〜7.2;30℃、通気及び撹拌）
−  NaCl  ０％  ３  ３  ３
−  NaCl  ２％  ３  ３  ３
−  NaCl  ４％  ３  ３  ３
−  NaCl  ６％  ３  ３  ３
−  NaCl  ８％  ２  ２  ２
−  NaCl  10％  ０  １  １
温度（コロンビア培地、pH7.0〜7.2、通気）
−  ５゜    ０  ０  ０
−  10゜    ０  １  ２
−  15゜    １  ２  ３
−  30゜    ３  ３  ３
−  41゜    ３  ３  ３
−  45゜    ３  ３  ３
原栄養培養  ３  ３  ３
培地は、１リットル当たり次のものを含有:KH4PO43.9g、K2HPO411.2g、（NH4）2SO22g、MgSO4・7H2O  200mg、FeSO4・7H2O、50mg/l溶液1ml;pH7.1〜7.3。
−  カタラーゼ              ３
−  オキシダーゼ反応        ０
−  硫酸塩還元酵素          ３  ３
−  テトラチオン酸塩還元酵素  ０  ０
−  チオ硫酸塩還元酵素        ０  ０
酸生成（培地は１リットル当たり次のものを含有：バクトペプトン3g、NaCl  5g、グルコース10g;フェノールレッドの存在下でpH7.2〜7.4）
−  開口管    ３  ３  ３
−  閉鎖管    ３  ３  ３
フォゲス−プロスカウエル試験
BHI（ブレーン・ハート・インフェージョン）培地、pH7.0〜7.2:
−  グルコースからのガス生成（mm）70
−  ウレアーゼ                      ０  ０
−  インドール生成                  ０  ０
−  γ−グルタミルトランスフェラーゼ０  ０
−  フェニルアラニンデアミナーゼ    ０  ０
−  アルギニンジヒドロラーゼ            ０
−  リシンデカルボキシラーゼ            ３
−  オルニチンデカルボキシラーゼ        ０
−  ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトシドの加水分解        ３  ３
−  ｐ−ニトロフェニルキシロシドの
加水分解                        ３  ３
−  エスクリンの加水分解            ３  ３
−  トウィーン80の加水分解          ０  ０
−  細胞外DNアーゼ                  ０  ０
−  ゼラチナーゼ
（フラジール法）                ０  ０
合成培地：培地は１リットル当たり次のものを含有:KH2PO43.9g、K2HPO411g、（NH4）2SO42g、MgSO4・7H2O  200mg、FeSO4・7H2O、50mg/l溶液1ml;通気及び撹拌。
−  クエン酸塩                      ３  ３  ３
−  グルコース                      ３  ３  ３
−  ヒドロキシ−３−ベンゾエート    ０  ０  ０
−  ヒドロシキ−５−プロリン        ０  ２  ３
−マロン酸塩                        ２  ３  ３
注：結果について異なった欄は、試験毎に変えた場合の異なった時間での読みに対応する。
記号の説明：
0:陰性反応又は培養
1:弱い陽性反応
2:陽性反応
3:強い陽性反応
BEC1000株は、次の栄養プロフィルを持っていた。比較としてATCC31646株についてのプロフィルも与えてある。異なった反応を与える物質は星印を付けて明示してある。
0003555957.tif 000002
0003555957.tif 000003
0003555957.tif 000004
0003555957.tif 000005
株BEC1000及びATCC31646は、異なった99の中から11の応答を生じ、これらの株が互いに区別されるものであることを示していることが分かる。
株BEC1000を病原性について試験し、人間に対する毒性は完全にもたないことが判明した。
本発明は、株BEC1000から得られた変異菌株にも関する。有用な変異菌株は、発酵槽内での培養又はBEC1000の培養を変異誘発因子、例えば強力な輻射線（例えば、UV又はＸ線）の作用、化学物質〔例えばオゾン、亜硝酸、NTG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、又はEMS（エタン−メタン−スルホネート）〕の作用にかけ、微生物の大部分を殺し、次に微生物を培養し、一層多糖類を生ずるものを選択することにより分離された自然的変異株を単に選択することにより得ることができる。
最後に、本発明は、次の化学的構造を有する多糖類の製造方法にも関する。
0003555957.tif 000006
式中、ヒドロキシル基の幾つかはアセチル化されている。その方法は（ａ）請求の範囲１に定義した微生物を水性栄養培地で、同化可能なグルシド（糖質）源の好気的発酵により増殖し、次に（ｂ）工程（ａ）が終わった時に得られた懸濁物から多糖類を回収することからなる。
多糖類は、株BEC1000を接種した適当な水性栄養培地を制御した条件下で好気的発酵することにより製造する。その培地は、炭素、窒素、及び鉱物塩の源を含有するどのような通常の培地でもよい。
一般にグルシド（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、サッカロース、マンニトール、澱粉、コーンシロップ、ソルビトール等）を、栄養培地に同化可能炭素源として単独又は組合せて用いることができる。ソルビトールは好ましい炭素源である。典型的には、培地中のグルシドの量は、培地の約２〜６重量％である。
種々のタンパク質物質を窒素源として用いることができる（例えば、イースト抽出物、大豆粉末、タンパク質加水分解生成物、コーン浸出液等）。窒素源は、培地の0.05〜0.5重量％を構成するのが典型的である。
通常栄養培地に用いられる塩は、鉱物塩として用いることができる。例としてナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウムのリン酸塩、硫酸塩、塩化物、及び炭酸塩があるが、それらに限定されるものではない。
発酵は25℃〜35℃、好ましくは28℃〜32℃の程度の温度で、約6.0〜7.5のpHで通気及び撹拌して２〜４日間程度の期間行うことができる。
発酵は、栄養培地（例えば、120℃程度の温度まで加熱するか、又は殺菌濾過することにより予め殺菌しておく）に株BEC1000の培養物を接種することにより、慣用の発酵槽中で行うことができる。
発酵期間が終わった時、培養懸濁物をタンパク質分解処理にかけ、次にオートクレーブにかけ、冷却し、塩で処理し、酸性化する。得られた生成物を、例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、又はイソプロパノール）、又は他の多糖類非溶媒（アセトンのようなもの）を用いて多糖類を沈澱させることにより多糖類を分離するように処理し、次にその沈澱物を流出及び洗浄することにより精製する。もし望むならば、精製工程を、目的とする用途に適した純度を持つ生成物が得られるまで、何回も繰り返すことができる。
使用する時、その精製生成物を防腐剤を入れた水溶液に溶解するか、又はもし望むならば乾燥して粉末にし、保存してもよい。
次の実施例は本発明を例示するために与えられており、本発明を限定するものではない。
実施例:L−フコース含有多糖類の製造
Ｌ−フコース含有多糖類を、ソルビトールを基にした培地中で発酵させることにより製造した。生成は、培地の明らかな大きな粘度上昇により示された。発酵が終わるころに、この粘度が培地の通気を困難にする要因になった。増殖及び多糖類の生成反応速度は、ソルビトールの消費に関係している。
接種材料の調製
培地：
ネオソーブ（Neosord）（登録商標名）70−07
〔ソルビトール含有量：固体70％；フランス、リレのロケット・フレレ（ROQUETTE FRERES）から販売〕:17.90g/l（即ち、ソルビトールの12.5g/l）
バイオカール（Biokar）（登録商標名）104003ペプトン〔蛋白質加水分解生成物、フランス、パンティンのソラビア・バイオカール（SOLABIA−BIOKAR）から販売〕:4.50g/l
イースト抽出物                          :0.05g/l
KH2PO4                                  :1.50g/l
K2HPO4                                  :4.50g/l
MgSO4・7H2O                             :0.20g/l
プルロニック（Pluronic）（登録商標名）PE61000〔消泡剤、ドイツ、ルドウィグシャーフェンＤ−6700のBASFから販売〕                            :0.50g/l
水に溶解
培養条件  :121℃で30分間殺菌
培養温度  :30℃
接種度    :5％〜10％
通気      :1VVM（分当たり体積当たりの体積）
非制御pH（約7.00のpH）
培養期間  :24時間
培地の生成
培地：
ネオソーブ70−07                       :54.00g/l
（即ち、ソルビトールの38g/l）
バイオカール104003ペプトン              :4.50g/l
イースト抽出物                          :0.05g/l
KH2PO4                                  :1.50g/l
K2HPO4                                  :4.50g/l
MgSO4・7H2O                             :0.20g/l
プルロニックPE61000                      :0.5g/l
水に溶解
培養条件〔有効体積350リットルのチェマプ（Chemap）発酵槽〕:120℃で45分間殺菌
培養温度         :30℃
接種度          ：約５％
撹拌             :300rpm〔ラシェトン（Rushton）型撹拌器〕
通気             :1VVM
7NのNaOHで7.0に調節したpH
圧力             :100〜200ミリバール
培養期間           :60〜65時間
平均生成値       :
工程終了時の粘度:40,000MPa.s（ブルックフィールドDV−II＋LV型粘着度計、SP31ローター、SC4−34/13R室、30℃）
培地中に生成した多糖類の濃度、
Ｌ−フコースとして計算     :2g/l〔デッシェ・シェトルス（Dische and Shettles）法〕
消費ソルビトール        ：＞35g/l（ソルビトール）
20％NaOH消費量           :15リットル/m3
pH調節の開始            ：発酵槽の接種後16〜17時間
0003555957.tif 000007
多糖類回収
培養懸濁物500mlを、苛性ソーダを用いてpH8.2に調節し、次に0.5リットルのアルカラーゼ（Alcalase）（登録商標名）〔デンマーク、ノボ・ノルディスク（MOVO NORDISK）により販売されているBacillus licheniformisからのズブチリシンＡ〕を用いて６時間50℃でタンパク分解処理にかけた。６時間後、pHを7.0に持って行き、加水分解生成物を撹拌しながら15分間120℃のオートクレーブにかけて導入微生物を不活性にし、然る後、急速に30℃に冷却し撹拌を止めた。次に20kgの塩化ナトリウムを撹拌しながら添加し、HClを用いてpHを4.5〜5.0に調節した。撹拌は15分間続けてその塩を完全に溶解した。激しく撹拌しながら、生成物の体積の1.1倍に相当する割合で少なくとも85゜のエタノールを添加した。生成物が析出し、撹拌を止めた後、４時間〜12時間それを沈降させた。上澄み液を濾過し、蒸留器に戻し、エタノールを回収して沈澱工程へ再循環した。水・アルコール混合物で浸漬した沈澱物を、ブフナーロートで脱水し、空気凝集物分散器中で撹拌し、凝集物を除去し、等体積の再循環エタノールで撹拌しながら洗浄し、ブフナーロートで再び脱水し、凝集物分散器で再び撹拌し、95℃のエタノールで洗浄し、撹拌し、最後にブフナーロートで脱水した。得られた脱水沈澱物を次に40℃の炉中で皿上で20時間乾燥した。乾燥生成物を使用する必要ができるまで保存した。使用する時、その生成物を激しく撹拌しながら水に溶解し、例えば、約１重量％の割合で、好ましくは保存剤、例えば、SIPCA（フランス、パリ）により販売されているフェノニップ（Fhenonip）（登録商標名）を添加して溶解する。
溶液のpHは約7.0に調節するのが有利である。
最終的に得られた生成物は、非常にかすかな匂いがする1000±200MPa・ｓの粘度を有する粘稠な虹色の乳白光を放つ溶液の形をしていた。この生成物は次の顕著な性質を持っていた：
−  比較的大きなＬ−フコール含有量で、その物質の抗アレルギー力は膨大な研究の主題になってきている；
−  濃化性；
−  広い範囲のpH、温度及び塩分に亙って良好な安定性を持つ；
−  「自己乳化」能力；
−  レオ流動化（rheofluidifying）挙動。
これらは、アイライナー（eye liner）製品、ボディーミルク（body milk）、敏感な皮膚のための製品、乳児衛生製品、その他のような化粧品配合物に極めて適したものにする。
アルカラーゼと同等な他の市販酵素調製物を用いることができることに注意すべきである。