(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサンタンガムを含有する発酵液の初期ｐＨを９〜１２．５、温度を４５〜７０℃として３０分間以上加熱処理をした後、該発酵液にポリリン酸を添加し、その後、該発酵液中の微生物細胞を可溶化するために酵素による処理を施すことを特徴とするキサンタンガムの製造方法。
【請求項２】
発酵液中の微生物細菌を可溶化するための上記酵素による処理工程が、（Ａ）該発酵液に対して１０〜５００ｐｐｍのアルカリプロテアーゼを添加し、ｐＨを６〜１０、温度を４０〜６５℃として３０分間以上処理し、次いで（Ｂ）該発酵液に対して０．５〜１００ｐｐｍのリゾチームを添加し、ｐＨを５．５〜８．０、温度を２５〜６０℃として３０分間以上処理することからなるか、または、該（Ｂ）工程の後、該（Ａ）工程を行うことからなることを特徴とする請求項１に記載のキサンタンガムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、透光度が良好で精製度の高いキサンタンガムの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に水溶性の粘性多糖類としては、デキストラン、キサンタンガム、ウェランガム、ラムザンガム、プルタン、スクレログルカン、ゲランガムなどがあり、食品、塗料、製紙、化粧品、石油回収など各種工業に幅広く利用されており、近年その需要は増加しつつある。とりわけ、キサンタンガムは、優れた増粘性、乳化安定性、耐塩性、耐酵素性などの特性をもつため、有用な添加剤として産業上での利用範囲が拡大している。
【０００３】
キサンタンガムは、従来、キサントモナス  （Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物、例えばキサントモナス・カンペストリス  （Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）  などを、グルコース、糖蜜、澱粉などの炭素源、ペプトン、酵母エキスなどの水溶性窒素源、マグネシウム塩、リン酸イオン、および他の微量成分を含む培地で好気的に培養して得られるものである。通常、培養後、滅菌し、エタノール、イソプロピルアルコールなどの低級アルコール類で沈澱させて、乾燥して製造される。キサンタンガムの製造方法は米国特許第３，０２０，２０６  号、同特許第３，２５１，４７９  号、同特許第３，３９１，０６０  号、同特許第３，４３３，７０８  号、同特許第３，５９４，２８０  号、同特許第４，２８２，３２１  号、同特許第３，６５９，０２６  号に記載されている。
【０００４】
キサンタンガムは、キサントモナス・カンペストリスの代わりに生産微生物として、他の公知のキサントモナス細菌、例えばキサントモナス・カロタテ  （Ｘ．ｃａｒｏｔａｔｅ）  、キサントモナス・インカナエ  （Ｘ．ｉｎｃａｎａｅ）、キサントモナス・ベゴニアエ  （Ｘ．ｂｅｇｏｎｉａｅ）  、キサントモナス・パパベリコラ  （Ｘ．ｐａｐａｖｅｒｉｃｏｌａ）  、キサントモナス・トランセルスンス  （Ｘ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・バスクロニウム  （Ｘ．ｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ）  及びキサントモナス・ヘデラエ  （Ｘ．ｈｅｄｅｒａｅ）を使用し、キサンタンガムの生産を行うことができる。
【０００５】
キサンタンガムの精製方法としては、一般に遠心分離、あるいはケーキろ過等を用いて、発酵中の菌体残渣および水不溶性の未消費窒素成分等の未溶解分を除去することが知られているが、これらは発酵液が高粘性であるため、水による希釈工程、さらに濃縮工程を必要とし、コスト的にも、操作的にも実用的ではない。
【０００６】
これに対し、菌体残渣の溶菌、可溶化、あるいはミクロゲルの除去を目的として発酵液を酵素により処理する精製方法が知られており、多くの提案がなされている。
例えば、菌体残渣の溶菌、可溶化を目的とした酵素処理方法としては、米国特許第３，９６６，６１８  号、同特許第４，０１０，０７１  号に酸性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼを用いた方法、米国特許第４，１１９，４９１  号にプロテアーゼ処理後、ケイ酸質固体と接触させ、菌体残渣をポリマー水溶液から除去する方法、さらに欧州特許第３９，９６２号にβ−１，３−グルカナーゼ活性及びプロテアーゼ活性を有する複合酵素を用いた方法、米国特許第４，７２９，９５８  号にヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いた方法などが提案されているが、十分な効果は得られていない。
【０００７】
また、ミクロゲルの除去を目的とした酵素による処理方法としては、米国特許第４，４３１，７３４  号にポリサッカラーゼ及びプロテアーゼを用いた酵素処理方法、米国特許第４，９０４，５８６  号にポリガラクツロナーゼ活性を有する酵素及びプロテアーゼ活性を有する酵素を併用した方法、米国特許第４，４１６，９９０  号にセルラーゼを用いた浄化方法等が提案されているが、十分な効果は得られていない。
【０００８】
また、細胞壁溶解酵素を用いる処理方法としては、日本国特許第１，３１８，５２０  号（特公昭６０−４４９１９号）に、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ及びペプチダーゼを同時に添加処理する方法が提案されている。これらの酵素は、細胞壁溶解酵素群として知られているが、グラム陰性菌には直接作用しがたく、また、長時間の処理が必要であるにもかかわらず、意外にも効果は十分ではない。
【０００９】
酵素で処理するこれらの方法は、いずれも従来のろ過、遠心分離等の精製方法に比べ、希釈、濃縮などの複雑な工程を省略できるため、経済的にも操作的にも有利な精製方法である。しかし、良好な精製キサンタンガムが得られていないのは、細胞残渣が酵素によって十分に可溶化されていないため、つまり、酵素の活性を十分に引き出していないか、あるいは好適な酵素を使用していないためである。
【００１０】
特開平５−２９２９８５号では、特定条件下で加熱処理を行った後、アルカリプロテアーゼ及びリゾチームで処理する方法を提供している。この方法では、良好な精製キサンタンガムが得られている。このように、酵素による処理方法は、好適な酵素を選択し、好適な条件下で酵素処理を行えば、キサンタンガム発酵液の精製方法として適している。
【００１１】
酵素による処理は、酵素の活性を得るため、温度やｐＨなどの好適な条件下で行うことが重要である。さらに、酵素を用いるのに好適な条件下で、酵素と基質の親和性を増大させ分解を促進させることによって、より酵素活性を高め、より良好な精製キサンタンガムを得ることが可能であると推定するに至った。
【００１２】
キサンタンガム発酵液の精製方法として、キレート剤の利用は提案されていない。しかし、一般にグラム陰性菌に対しては、ＥＤＴＡ−Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）などのキレート剤で外膜に損傷を与えることにより、リゾチームが溶菌活性を得ることが知られている。しかしながら、キサンタンガム発酵液に、ＥＤＴＡ−Ｎａを含むいくつかのキレート剤を共存させて、酵素による処理を行っても、透光度の低いキサンタンガムしか得られなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、細胞壁溶解酵素であるリゾチームの活性条件を高めることにより、より良好な精製キサンタンガム、つまり水溶液とした場合に透明性の高いキサンタンガムを得る方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載のキサンタンガムの製造方法は、キサンタンガムを含有する発酵液の初期ｐＨを９〜１２．５、温度を４５〜７０℃として３０分間以上加熱処理をした後、該発酵液にポリリン酸を添加し、その後、該発酵液中の微生物細胞を可溶化するために酵素による処理を施すことを特徴とする。
【００１５】
請求項２に記載のキサンタンガムの製造方法は、請求項１に記載の製造方法であって、発酵液中の微生物細胞を可溶化するための上記酵素による処理工程が、（Ａ）該発酵液に対して１０〜５００ｐｐｍのアルカリプロテアーゼを添加し、ｐＨを６〜１０、温度を４０〜６５℃として３０分間以上処理し、次いで（Ｂ）発酵液に対して０．５〜１００ｐｐｍのリゾチームを添加し、ｐＨを５．５〜８．０、温度を２５〜６０℃として３０分間以上処理することからなるか、または、該（Ｂ）工程の後、該（Ａ）工程を行うことからなることを特徴とする。
【００１６】
本発明では、リゾチームによるキサンタンガム発酵液の処理の際にポリリン酸を添加することにより、リゾチームの活性を高め、それにより、良好な精製キサンタンガム、つまり、水溶液とした場合に透明性の高いキサンタンガムを得ることができる。
【００１７】
ポリリン酸の添加前に、キサンタンガム含有の発酵液を初期ｐＨ９〜１２．５、好ましくはｐＨ１０〜１２、温度４５〜７０℃、好ましくは５０〜６０℃で、３０分以上加熱処理を施す。ｐＨ９未満では菌の可溶化が効率良く達成されない場合があり好ましくない。ｐＨが１２．５より大きいと発酵液の着色や製品の粘度物性に悪影響を及ぼすことがあり好ましくない。温度が４５℃未満では、酵素による処理における菌の可溶化が効率良く達成されない場合があり好ましくない。７０℃より高いと、発酵液の着色や製品の粘度物性に悪影響を及ぼすことがあり好ましくない。処理時間は、３０分以上であれば十分効果があるが、２時間以上の熱処理は生産性の低下をまねく場合があり好ましくない。この前処理がないと、酵素による処理の効果が発揮されないか、効果を発揮するまで長時間要する場合があるため、好ましくない。
【００１８】
上記熱処理後にポリリン酸を添加する。ポリリン酸を熱処理前に添加すると、ポリリン酸が分解されることがあり、十分な効果が発揮されない場合があり好ましくない。ポリリン酸は、ｐＨ６〜９．５、温度６５℃以下でキサンタンガム発酵液に対し、０．０１〜１重量％好ましくは０．０５〜０．２重量％添加する。０．０１重量％未満であると、ポリリン酸の十分な効果が発揮されず、好ましくない。１重量％より多いと、さほど溶菌効果もあがらず、コスト的にも好ましくない。６５℃よりも高いとポリリン酸が分解されることがあり、十分な効果が発揮されない場合があり好ましくない。ｐＨが６未満では、ポリリン酸のキレート効果が十分に発揮されない場合があり、好ましくない。ｐＨが９．５より大きいとポリリン酸が分解されることがあり、十分な効果が発揮されない場合があり好ましくない。
【００１９】
酵素による処理は、アルカリプロテアーゼとリゾチームの２段で実施される。アルカリプロテアーゼによる処理は、ｐＨ６〜１０好ましくは７．５〜９．０、濃度１０〜５００ｐｐｍ、温度４０〜６５℃、好ましくは５０〜６０℃で、３０分以上行われる。ｐＨ６未満ではアルカリプロテアーゼの活性が劣化する場合があり好ましくない。ｐＨが１０より大きいと製品の物性を劣化させる場合があり好ましくない。濃度が１０ｐｐｍ未満では、アルカリプロテアーゼの作用が十分に発揮されず好ましくない。濃度が５００ｐｐｍより大きいと、酵素の使用量が多くなるだけで、さほど溶菌効果が上がらず、コスト的に好ましくない。温度が４０℃未満ではアルカリプロテアーゼの作用が十分に発揮されず好ましくない。温度が６５℃より大きいと、アルカリプロテアーゼの活性を劣化させる場合があり好ましくない。処理時間が３０分未満ではアルカリプロテアーゼの作用が十分に発揮されず好ましくない。
【００２０】
リゾチームによる処理は、ｐＨ５．５〜８．０好ましくは６．５〜７．５、濃度０．５〜１００ｐｐｍ、温度２５〜６０℃、好ましくは５０〜６０℃で、３０分以上行われる。ｐＨが５．５未満あるいは８．０より大きいと、リゾチームの活性が十分発揮されず好ましくない。濃度が１００ｐｐｍを超えると酵素の使用量が多くなるだけで、さほど溶菌効果が上がらず、コスト的に好ましくない。温度が２５℃未満ではリゾチームの作用が十分に発揮されず好ましくない。温度が６０℃より大きいと、リゾチームの活性を劣化させる場合があり好ましくない。なお、アルカリプロテアーゼ処理とリゾチーム処理の順番はどちらが先でもかまわないが、アルカリプロテアーゼによる処理の後に、リゾチームによって処理する方が、発酵液のｐＨ調節を効率的に実施できるという点でより好ましい。
【００２１】
【実施例】
実施例１〜３、比較例１
種菌（キサントモナス・カンペストリス）（ＡＴＣＣ５５２９８）  ２ｍｌを下記Ａから成る培地液１００ｍｌの入った５００ｍｌフラスコに接種し、初期ｐＨ７．０、３０℃にて２４時間、振盪培養を行いながら１段目培養を行った後、この培養液を下記Ｂから成る培地液９０ｍｌの入った５００ｍｌフラスコに１０ｍｌ植菌して、１段目と同様の操作条件で２段目の前培養を行い、その後この培養液１００ｍｌを３本、計３００ｍｌを下記Ｃから成る培地液２．７Ｌの入った５Ｌ発酵槽に植菌して、ｐＨ６．５〜７．５、３０℃にて４８時間の通気発酵を行い、キサンタンガムを含有する発酵液を得た。
【００２２】
Ａ．
前培養（１段目）の培地成分
グルコース                                ５ｇ／Ｌ
ポリペプトン                    ５．２ｇ／Ｌ
酵母エキス                        ２．６ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                    ９ｇ／Ｌ
水                                            １００ｍｌ
Ｂ．
前培養（２段目）の培地成分
グルコース                                ５ｇ／Ｌ
ポリペプトン                    ５．２ｇ／Ｌ
酵母エキス                        ２．６ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                    ９ｇ／Ｌ
水                                                ９０ｍｌ
Ｃ．
本培養の培地成分
グルコース                            ５０ｇ／Ｌ
ポリペプトン                            ４ｇ／Ｌ
ＫＨ２  ＰＯ４                          ２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ    ０．５ｇ／Ｌ
微量成分                                １ｍｌ／Ｌ
水                                        ２．７Ｌ
【００２３】
この後の酵素処理は、発酵液３００ｇをビーカーに分注して行った。発酵液をｐＨ１１に調整し、５５℃で９０分間加熱処理した。次に発酵液に対して０〜０．２重量％になるようにポリリン酸（ポリリン酸ナトリウム：和光純薬製）水溶液を添加した。その後、温度を５５℃に保温した状態で、１０％硫酸水溶液を添加してｐＨを８．５に調整した。発酵液に対して３００ｐｐｍのアルカリプロテアーゼ（ビオプラーゼ：ナガセ生化学製）を含む水懸濁液を、０．４μｍのマイクロフィルターで吸着剤を除去した後、ｐＨ調製した発酵液に添加し、攪拌しながら２時間処理を行った。なお、処理中、１時間後の時点でｐＨを８．５に再度調整した。次に、温度を５５℃に保温した状態で、１０％硫酸水溶液を添加してｐＨを６．５に調整し、発酵液に対して３ｐｐｍのリゾチーム（リゾチーム太陽：太陽化学製）を添加し、攪拌しながら、１時間処理を行った。
【００２４】
分析を行うため、発酵終了後、熱処理後、酵素処理第１段後、及び酵素処理第２段後の各工程後に発酵液を採取して、処理液の濁度を測定した。また、酵素処理終了後のキサンタンガム含有の発酵液を１．５重量倍の８５％イソプロピルアルコールと混合し、キサンタンガムを析出させ分離して、送風乾燥した。その後、得られた固体キサンタンガムの１重量％水溶液を調製し、透光度、黄色度及び粘度を測定した。
【００２５】
以上の結果を表１に示す。なお、各分析方法は以下に示すとおりである。
処理液濁度：液を７倍に希釈後、６６０ｎｍの可視光により測定した。
透光度        ：層長２ｃｍの石英セルを用い、可視光領域の透過率により測定した。
黄色度        ：ＳＭカラーコンピューター（スガ試験機株式会社製）を用いて測定した。
粘度            ：ブルックフィールド粘度計（３０ｒｐｍ）により測定した。
【表１】
0003584340.tif 000002
【００２６】
実施例４、比較例２
実施例１と同様に発酵および加熱処理を行った。次に発酵液に対して０〜０．１重量％になるようにポリリン酸（ポリリン酸ナトリウム：和光純薬製）水溶液を添加した。次の酵素処理を実施例１と逆の順序で行った。
すなわち、温度５５℃に保温した状態で、１０％硫酸水溶液を添加してｐＨ６．５に調整し、発酵液に対して３ｐｐｍのリゾチーム（リゾチーム太陽：太陽化学製）を添加し、攪拌しながら、１時間処理を行った。次に、温度５５℃に保温した状態で、２０％水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ８．５に調整し、発酵液に対して３００ｐｐｍのアルカリプロテアーゼ（ビオプラーゼ：ナガセ生化学製）を添加し、攪拌しながら２時間処理を行った。なお、処理中、１時間後の時点でｐＨ８．５に再度調整した。
酵素処理の終了後、発酵液をｐＨ７．０に調整してから、実施例１と同様の処理によってキサンタンガムの回収を行なった。
その結果を表２に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
なお、熱処理とリゾチーム処理だけでは、十分な精製効果が得られなかった。
【００２７】
【表２】
0003584340.tif 000003
【００２８】
実施例５、比較例３
種菌（１０１０コ／ｍｌ）２ｍｌを下記Ｄからなる培地液の入った５Ｌ発酵槽に接種し、ｐＨ６．５〜７．５、３０℃にて２４時間通気を伴いながら１段目の前培養を行った後、この培養液を下記Ｅからなる培地液の入った２００Ｌ発酵槽に植菌して、１段目と同様の操作条件で２段目の前培養を行い、その後この培養液を下記Ｆからなる培地液の入った２０００Ｌ発酵槽に植菌して、ｐＨ６．５〜７．５、３０℃にて４８時間の通気発酵を行い、キサンタンガム含有の発酵液を得た。この後、２０００Ｌ発酵槽内でｐＨ１１に調整し、５５℃で９０分間加熱処理した。その後、温度５５℃に保温した状態で、１０％硫酸水溶液を添加してｐＨ８．５に調整し、発酵液に対して０．１重量％になるようにポリリン酸（ポリリンサン５−Ａ：武田薬品工業製）水溶液を添加した。その後、温度５５℃、ｐＨ８．５を保持した状態で、発酵液に対して３００ｐｐｍのアルカリプロテアーゼ（ビオプラーゼ：ナガセ生化学製）を添加し、攪拌しながら２時間処理を行った。次に、温度５５℃に保温した状態で、１０％硫酸水溶液を添加してｐＨ６．５に調整し、発酵液に対して３ｐｐｍのリゾチーム（リゾチーム太陽：太陽化学製）を添加し、攪拌しながら、１時間処理を行った。
【００２９】
Ｄ．
前培養（１段目）の培地成分
グルコース                                ５ｇ／Ｌ
ポリペプトン                    ５．２ｇ／Ｌ
酵母エキス                        ２．６ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                    ９ｇ／Ｌ
水                                            ３Ｌ
Ｅ．
前培養（２段目）の培地成分
グルコース                                ５ｇ／Ｌ
ポリペプトン                    ５．２ｇ／Ｌ
酵母エキス                        ２．６ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                    ９ｇ／Ｌ
水                                            １３０Ｌ
Ｆ．
本培養の培地成分
グルコース                            ５０ｇ／Ｌ
ポリペプトン                            ２ｇ／Ｌ
ＫＨ２  ＰＯ４                          ２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ    ０．５ｇ／Ｌ
微量成分                                １ｍｌ／Ｌ
水                                        １１７０Ｌ
その結果を表３に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３０】
比較例３
キレート剤を添加しない他は実施例５と同様にして、発酵、酵素処理、キサンタンガムの回収を行なった。その結果を表３に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３１】
【表３】
0003584340.tif 000004
【００３２】
比較例４、５
キレート剤として、発酵液に対して０．１〜１．０重量％のＥＤＴＡ−Ｎａ（和光純薬製）を添加した他は実施例１と同様にして、発酵、酵素処理、キサンタンガムの回収を行った。その結果を表４に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３３】
比較例６、７
キレート剤として、発酵液に対して０．１〜０．２重量％のピロリン酸（ピロリン酸ナトリウム：和光純薬製）を添加した他は実施例１と同様にして、発酵、酵素処理、キサンタンガムの回収を行った。
その結果を表４に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３４】
比較例８
キレート剤として、発酵液に対して０．１重量％のトリポリリン酸（トリポリリン酸ナトリウム：和光純薬製）を添加した他は実施例１と同様にして、発酵、酵素処理、キサンタンガムの回収を行った。その結果を表４に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３５】
比較例９
キレート剤として、発酵液に対して０．１重量％のクエン酸（クエン酸ナトリウム：和光純薬製）を添加した他は実施例１と同様にして、発酵、酵素処理、キサンタンガムの回収を行った。その結果を表４に示す。なお、分析方法は実施例１におけるものと同様である。
【００３６】
【表４】
0003584340.tif 000005
【００３７】
【発明の効果】
本発明によって、固有の粘度を損なうことなく、透光度が良好で黄色成分を低減した、精製度の高いキサンタンガムを得ることができる。