(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
触発済み樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化を可能とする条件下で、触発された樹枝状細胞とＮＫ細胞を、インビトロ又はエクスビボで接触させることを含む、ＮＫ細胞の活性化方法。
【請求項２】
樹枝状細胞が成熟樹枝状細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
樹枝状細胞が未成熟樹枝状細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
樹枝状細胞及びＮＫ細胞が自己由来のものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
樹枝状細胞及びＮＫ細胞が同種異系のものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該触発済み樹枝状細胞が、細胞外基質の細胞培養物及びそのような細胞の上清から選択される触発因子又は培地の存在下で、成熟又は未成熟樹枝状細胞を処理することによって得ることができる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＮＫ細胞に対する樹枝状細胞の比（ＮＫ細胞／樹枝状細胞比）が０．０１〜１０好ましくは０．０５〜５の範囲にある請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞を活性化するための、触発された樹枝状細胞又は触発された樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。
【請求項９】
in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製のための、触発された樹枝状細胞又は触発された樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。
【請求項１０】
in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組成物の調製のための触発された樹枝状細胞又は触発された樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。
【請求項１１】
in vivoでＮＫ細胞によるＩＦＮγの産生を増大させることを目的とする組成物の調製のための、触発された樹枝状細胞又は触発された樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。
【請求項１２】
触発された樹枝状細胞が成熟樹枝状細胞である請求項８〜１１に記載の使用。
【請求項１３】
触発された樹枝状細胞が未成熟樹枝状細胞である請求項８〜１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学及び免疫学の分野に関する。本発明はより具体的に言うと、活性化されたナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）の新しい調製方法及びこれらの新しい方法の実施手段、特に新しい樹枝状細胞個体群及び誘導産物に関する。本発明は同様に、本発明の方法によって得られた活性化された細胞の、免疫学、免疫療法又さらに一般的にはメディカルバイオテクノロジーの分野における使用にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）は、腫瘍細胞及びウイルスに対するきわめて早期の防御ラインを表すリンパ球個体群である。ＮＫ細胞は、ＤＣ５６及びＤＣ１６マーカーの存在及びＤＣ３マーカーの欠如によって特徴づけされ得る。ＮＫ細胞は、免疫適合宿主又は免疫抑制された宿主における原始腫瘍又は転移性腫瘍の発生防止のため、抗原非特異的抗腫瘍免疫に関与していた。特に、抗腫瘍免疫監視（原始腫瘍又は転移）におけるＮＫ細胞の役目は、腫瘍を持ち、しかも高い用量のＩＬ−２によりＮＫ細胞を刺激することによりex vivoで得られた接着性ＮＫ（「Ａ−ＮＫ」）又は非接着性ＮＫ（「ＮＡ−ＮＫ」）細胞を伴う又は伴わないＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２／ＩＬ−１５により処理されたマウスにおいて示唆されてきた。ＮＫ細胞は特に、腫瘍細胞又は陰性ＭＨＣクラスＩ変異体に対し主要な役割を果たすと思われる。
【０００３】
したがって、その抗原非特異的細胞傷害特性及びその効能のため、ＮＫ細胞は、ガン又は感染症の治療の養子免疫アプローチの開発のため特に有利なエフェクター細胞の個体群を構成する。この点で、抗腫瘍養子免疫療法アプローチが、先行技術において記載されてきた。したがって増大した悪性リンパ腫を持つ患者のような或る種の適応においては、少ない用量のＩＬ−２を伴うＡ−ＮＫの投与は、補助的状況において将来性ある結果をもたらした。ＮＫ細胞は同様に、種々のタイプの腫瘍の実験的治療のためにも使用されてきており、いくつかの臨床研究が行われた（Kuppen et al., Int. J Cancer. 56 (1994) 574; Lister et al., Clin. Cancer Res. 1 (1995) 607; Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 889）。
【０００４】
さらに、これらの細胞は同様に、クラスＩのＭＨＣの分子を発現しない細胞、より一般的にはＮＫ細胞に対する感受性を持つ全ての細胞に特異的でない溶解のためにin vitroで使用することもできる。
【０００５】
しかしながら、（マウス又はヒトの腫瘍の治療又は感染症のようなその他の疾病の治療のための）ＮＫ細胞を用いた養子療法又は、これらの細胞のin vitro又はin vivoでのその他の全ての使用には、ＮＫ細胞のex vivoでの拡大及び活性化が関与している。この点で、ＮＫ細胞の現在の活性化技術は全て、一般に宿主により寛容されにくい高い用量でのサイトカインの使用に基づくものである。実際、現在利用可能なデータは、ex vivoでＮＫ細胞が、栄養支持体もサイトカインも無しでは存続せず活性化され得ないということを示していると思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、現在のin vitroでのＮＫ細胞の活性化方法には、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ又はＤＣ７０のような接着又は同時刺激因子により著しく増大され得る活性化である、単独又は組合わせた形での（或る種の状況において例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８のような）異なるサイトカインの存在下でのこれらの細胞の培養が関与する。類似の要領で、in vivoで、抗腫瘍免疫におけるＮＫ細胞の効能は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５又はＩＬ−１２、ＩＬ−１８及びＩＬ−１０といったサイトカインの同時投与と切り離せないものである。ＩＦＮはまた、ＩＬ−２に会合した状態で活性化剤の役目も有する。したがって先行技術において記載された活性化方法は全て、サイトカインの使用に依存するものである。ところが、これらの方法には、特にサイトカインの調製コスト、in vivoでの応用分野に利用できない数多くのサイトカインの毒性、さらにはin vivoで使用した場合に数多くの望ましくない効果が伴う危険性がある数多くのサイトカインの非特異的性質に関連したいくつかの欠点がある。さらに「ナチュラルキリング」機能は腫瘍を持つ患者において変性を受けることが多いことから、ex vivoでの活性化を目的としてこれらの細胞を採取する可能性は著しく低下することがある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
したがって、ＮＫ細胞の新しい活性化方法を入手する必要性が真に存在する。本出願は、ＮＫ細胞の活性化のための新しい独創的アプローチを提案することにより、この問題に対し１つの解決法をもたらす。本出願は特に、初めて、休止状態のＮＫ細胞をもう１つの細胞個体群で活性化させる可能性を実証している。本発明は同様に、初めて、サイトカインの存在に依存せず、したがって先行技術において記載されてきた欠点を補正できるＮＫ細胞の活性化方法について記載している。したがって、本出願は、活性化されたＮＫ細胞の新しい調製方法、及びこれらの新しい方法の実施手段について記載している。
【０００８】
【発明の実施の形態】
したがって、本発明の第１の態様は、樹枝状細胞（ＤＣ）とＮＫ細胞を接触させる工程を含むＮＫ細胞の活性化方法にある。以下で記すとおり、接触はin vitro、ex vivo又はin vivoで実施可能である。また接触には、ＮＫ細胞と樹枝状細胞とのin vitroでの共存培養、又はin vitro又はin vivoでの樹枝状細胞から誘導された調製物、特に樹枝状細胞に由来するＮＫ細胞の刺激因子又は膜小胞（エキソゾーム）とＮＫ細胞とのインキュベーション、さらにまた、樹枝状細胞のinvivoでの受身移入、同様に又樹枝状細胞の単数又は複数の成長因子のin vivoでの投与も含まれる可能性がある。
【０００９】
本発明のもう１つの態様は、in vitro、ex vivo又はin vivoでのナチュラルキラー細胞の活性化のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用に関する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用に関する。
【００１１】
本発明のもう１つの態様は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養物に関する。
【００１２】
本発明の補足的態様は、樹枝状細胞に由来するＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、ＮＫ細胞刺激能力を改善（又は誘発）するための樹枝状細胞触発（「triggering」）方法、ならびに樹枝状細胞及びそれを含む全ての組成物の触発因子に関する。本発明は同様に、「触発済み樹枝状細胞」（triggered Dendritic Cells」）と呼ばれる新しい樹枝状細胞個体群ならびにそれを含む全ての組成物及びそれらの使用に関する。
【００１４】
本発明のその他の態様は、特に本発明の方法により活性化されたＮＫ細胞の亜個体群及びＮＫ細胞に対する感受性を持つ標的細胞に対する細胞傷害活性をin vivo又はin vitroで刺激するためのこれらの細胞又はＮＫ／ＤＣ共存培養の使用である。もう１つの形態に従うと、本発明は同様に、休止状態のＮＫ細胞のＩＦＮｇの細胞溶解及び分泌活性の著しい増大を可能にする方法にも関する。
【００１５】
本発明は同様に、とくに例えば先天的な又は移植に関連する感染症、腫瘍、自己免疫疾患の治療のための新しい治療アプローチにも関する。本発明の方法には、特に、（ｉ）ex vivoで樹枝状細胞により活性化されたＮＫ細胞、又は（ii）in situでＮＫ細胞を直接活性化するための、樹枝状細胞（特に触発済み樹枝状細胞）又は樹枝状細胞から誘導された調製物、又は（iii）ex vivoで同時インキュベーションされた２つの細胞個体群の受身移入、あるいはまた、（iv）例えばケモカイン又はサイトカインと組合せた形で、又は単独で投与される因子である、ＮＫ細胞を効果的に活性化する能力を持つようになるような形でin vivoで樹枝状細胞を触発させるための樹枝状細胞「触発」因子又は樹枝状細胞成長因子の投与、あるいはまた単独又は組合せた形での樹枝状細胞の成長因子又はＮＫ細胞刺激因子の投与が関与する。
【００１６】
したがって前述のとおり、本発明の第１の目的は、樹枝状細胞を用いたＮＫ細胞の活性化のための方法に関する。この方法は特に、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の存在下にＮＫ細胞をおくことを含む。本発明は特に、休止状態にあるＮＫ細胞を活性化させる樹枝状細胞の能力を出願人が実証したことに由来するものである。
【００１７】
本出願において示されている結果は、特に、樹枝状細胞の存在下で共存培養された休止状態のＮＫ細胞が存続し、その溶解能力及びＩＦＮγ産生能力がきわめて強く活性化されるということを実証している。そのうえ、このようにして得られた活性化された細胞は、感受性のあるＮＫ標的を溶解するが感受性のあるＬＡＫ標的は溶解せず、こうしてこの活性化現象は、ＩＬ−２依存性の従来のＬＡＫ現象と区別されることになる。本出願は同様に、同種樹枝状細胞が自己由来の樹枝状細胞と同様に、in vitroでＮＫ細胞を活性化でき、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の存在下でのＮＫ細胞の活性化メカニズムには、ＩＬ−１２もＩＬ−２も、またＩＬ−１５もＩＦＮαも関与しない、ということを立証している。一方、示された結果は同様に、活性化プロセスにおけるＮＫ細胞と樹枝状細胞膜の間の相互作用の関与をも示し、この活性化に介入する樹枝状細胞の膜因子の存在を実証している。得られた結果は同様に、樹枝状細胞によって産生された膜小胞が同様にＮＫ細胞を活性化する能力を持つことをも示し、このことはすなわち、樹枝状細胞により発現されたＮＫ細胞の刺激因子が前記ＮＫ細胞内に存在することを表している。
【００１８】
樹枝状細胞によるＮＫ細胞のこの活性化が適切であることはさらにin vivoで、陰性ＭＨＣクラスＩ腫瘍のモデルにおいて実証された。この腫瘍を持つマウスにおいて、樹枝状細胞の拡大のみがＮＫ依存的な腫瘍の除去を可能にする。さらに、腫瘍を持ちＴ及びＢ細胞が欠損している免疫抑制された動物への樹枝状細胞の受身養子移入によって、腫瘍の成長を著しく緩慢にさせることもできる。
【００１９】
したがって、これらの結果は、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物が、in vitro、ex vivo又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化を誘発する能力を有すること、そしてこの活性化がin vitroではＮＫ感受性細胞の溶解を刺激しin vivoでは宿主生体の自然免疫を刺激できるようにし、したがって腫瘍、感染細胞又はその他の病理過程に関与する細胞（自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主反応など）をin vivoで除去することができることを実証している。
【００２０】
本発明において得られた結果は、今日まで、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＤＣ７０をコードするトランスフェクタントを除いて、in vitroでもう１つの細胞型によりＮＫ細胞を活性化させることができるということを示唆した研究がほとんど又は全くなかったためになお一層驚くべきことである。逆に、いくつかの研究活動は、ＰＧＥ２を介してＮＫ細胞のＩＬ−２依存型の活性化に対するマクロファージの阻害的役割をむしろ示唆しているように思われた。
【００２１】
本発明は、我々の知るかぎり、サイトカインに依存せずしかももう１つの細胞個体群又は調製物又はそれから誘導された因子を用いた、ＮＫ細胞の活性化を初めて立証したものである。
【００２２】
本発明でいうＮＫ細胞の「活性化」という語は、特に、ＩＦＮγの産生及び／又はＮＫ細胞の細胞傷害活性の増大を意味する。これら２つのパラメータは、当業者にとっては公知の、例中で示された技術に従って容易に測定可能である。一般に、本発明に従った活性化は、全ての個体群を統合してＮＫ細胞の増殖の重大な増加が伴っておらず、その亜個体群の増殖を誘発することができる。反対にこの活性化には、in vitroでのＮＫ細胞の生存の著しい増大が伴っている。より具体的に言うと、本発明の意味におけるＮＫ細胞の活性化は、従来のサイトカインの使用とは無関係である。「活性化された」ＮＫ細胞という語は、本発明においては、上記の特性のうちの少なくとも１つを呈するＮＫ細胞のことを意味する。
【００２３】
本発明によるＮＫ細胞の活性化方法は、in vitro、ex vivo又は直接in vivoで実施可能である。
【００２４】
樹枝状細胞（ＤＣ）の存在下でのＮＫの活性化
第１の特定の実施態様においては、本発明の方法は、成熟又は未成熟の、自己由来又は同種異系の、好ましくは触発済みの（triggered）樹枝状細胞とＮＫ細胞の共存培養による、in vitro又はex vivoでのＮＫ細胞の活性化を含む。
本発明の方法のこの第１の実施態様に従うと、ＮＫ細胞は樹枝状細胞と共存培養される。この実施態様では、使用される樹枝状細胞は、自己由来（すなわちＮＫ細胞と同じ実験動物に由来するもの）であってもよいし、また同種（すなわち同じ種の他の実験動物に由来するもの）であってもよい。実際、例中に示された結果は、ＮＫ細胞の活性化が樹枝状細胞の同種性によって著しい影響を受けないということを示している。これにより、きわめて有利な形で、ＮＫ細胞の活性化のために樹枝状細胞の「万能」バンクを使用することが可能となる。このようなバンクは、以下に記載されているように、例えば、不死化するような形での樹枝状細胞の修飾によって構成することができる。この点で、本発明の実施のためには、好ましくは未成熟のヒト樹枝状細胞から確立される異なる樹枝状細胞系統を使用することができる。
それらの使用に先立ち、その特性を改善し薬学的用途と適合性あるものにするべく、樹枝状細胞を前処理に付すことも可能である。したがって樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の活性化のためのその使用に先立ち、照射を受けることができる。このような照射により、特に、不死化された樹枝状細胞のような樹枝状細胞の或る種の個体群に関連するあらゆる発ガンの危険性を除去することが可能となる。照射による前処理は、樹枝状細胞及び共存培養物がin vivoで使用される場合、特に望ましい。樹枝状細胞のもう１つの前処理は、そのＮＫ細胞刺激活性を改善する形で、又はデキソゾームの産生を触発する形で、樹枝状細胞刺激因子（サイトカイン、ケモカイン、熱ショックタンパク質など）の存在下でインキュベーションすることからなる。
【００２５】
触発済み樹枝状細胞（ＤＣ）の調製及び使用
樹枝状細胞の特に好都合な処理には、触発培地の存在下でのこれらの細胞の処理が含まれる。実際、本発明は、きわめて改善されたＮＫ刺激能力を持つ樹枝状細胞の新しい個体群の産生及び特徴づけについて記載している。これらのいわゆる「触発済み」樹枝状細胞、それらの調製及びそれらの使用は、本出願のもう１つの目的を構成している。
「触発（trigger）」という語は、本発明の意味合いでは、樹枝状細胞内で強いＮＫ細胞刺激能力を誘発する、その分化段階の変調とは異なるシグナルの存在下におくことを意味している。したがって「触発培地」には、一般に、高いＮＫ細胞刺激能力を誘発するシグナルを樹枝状細胞に提供することのできる生物学的なあらゆる物質が含まれる可能性がある。このように処理された樹枝状細胞は同様に、本出願において「触発済み」樹枝状細胞（又は「triggered dendritic cells」を略して「ｔＤＣ」）としても表されている。
したがって、本発明の特定の目的は、ＮＫ細胞を刺激するその能力を改善する（又は誘発する）ことのできる触発培地と樹枝状細胞とを接触させる工程を含む、樹枝状細胞処理方法に関する。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、樹枝状細胞触発培地、すなわちＮＫ細胞を刺激する樹枝状細胞の能力を改善（又は誘発）できるようにする培地にある。
本発明に適した触発培地は、例えば、樹枝状細胞に適切なシグナルを提供することのできる細胞、そのような細胞から誘導された調製物、そのような細胞から誘導された因子、又は好ましくは樹枝状細胞を触発することのできる好ましくは生物学的なあらゆる物質を含み得る。触発培地はさらに、好都合には、成長因子及び／又はサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ及び／又はインターロイキン−４ならびに場合によっては哺乳動物細胞培地の成分（血清、ビタミン、アミノ酸など）を含んでいる。
樹枝状細胞の触発のために使用し得る細胞としては、より具体的には、細胞外基質、特に間質細胞、内皮細胞又は線維芽細胞を挙げることができる。これらの細胞は、より具体的にはそれらが分裂段階にあるときに、樹枝状細胞を触発することができる。例えば肥満細胞腫といったような或る種の腫瘍細胞についても同様のことが言える。本発明の特定の実施態様には、触発のための線維芽細胞の使用が含まれる。実際、出願人は、線維芽細胞が、はるかに高い効率で樹枝状細胞にＮＫ細胞を刺激させることができるということを示した。この点において、これは、予め又は即時に調製された、活性化された又はされていない一次培養の形質転換された系統の不死化された線維芽細胞であり得る。好ましくは、触発細胞とＤＣの共存培養のために用いられる細胞は、分裂段階にあるか又は分裂可能である。使用可能な線維芽細胞系統としては、例えば系統ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ−９２９、ＭＲＣ５又はＴＩＢ８０を挙げることができる。
【００２７】
この方法の実施のためには、使用される線維芽細胞（又はその他の細胞）は、樹枝状細胞に対し自己由来、同種異系又は異種のものであってよい。実際、驚くべきことに、例の中で紹介されている結果は、ヒトの樹枝状細胞が異なる種の線維芽細胞、特にマウスの線維芽細胞によって触発され得るということを示している。この実施態様（in vitroでの共存培養）においては、触発（処理）は、約０．１〜１００、好ましくは０．５〜１０、特に１〜５の間で変動するＤＣ／細胞比で実現され得る。当然のことながら、この比は、当業者により適合可能である。さらに、この実施態様においては、好ましくは照射（例えば２０００〜８０００rad）を受けた細胞が使用される。
【００２８】
触発培地としては、完全な細胞の代りに、それから誘導された調製物又は因子を使用することも可能である。したがって、例えば、上清、リゼイト、無細胞調製物、単離された及び／又は精製された因子などを使用することも可能である。例で紹介された結果は、特に、線維芽細胞の培養上清が、樹枝状細胞を触発する、つまり休止状態にあるＮＫ細胞をきわめて効果的に（特に、より迅速に）活性化する能力を樹枝状細胞に与えることができるということを示している。この実施態様においては、例えば、最終容量約３０mlの中で、１０6個の樹枝状細胞について約１〜２０mlの細胞上清（例えば線維芽細胞）を使用する。したがって１．５〜３０倍、好ましくは２〜５倍に希釈された上清を使用することが可能である。これらの条件は、当然のことながら、使用される細胞個体群に応じて当業者によって適合されてよい。なお、培養上清について上記した活性は、触発の実現を担当する又は触発を実現するのに充分な、細胞、それも特に線維芽細胞により分泌される可溶性因子の存在を明らかにしている。したがって、もう１つの触発培地は、例えば上清の濃縮物／ろ過物、特に、単離及び／又は精製及び／又は組換え形態での上記の可溶性因子を含んでいる。したがって、触発培地として、上記の可溶性因子、又はこの因子を発現する組換え細胞を使用することが可能である。同様に、ＮＫ細胞の活性化のため樹枝状細胞を触発することを可能にする、特に生物学的な他のあらゆる物質を使用することが可能である。
【００２９】
一般に、触発は、１５〜７２時間、より通常的には約２０〜４８時間に至る可能性のある時間中、触発培地の存在下で樹枝状細胞のインキュベーションによって実現される。樹枝状細胞の「触発された」状態は、その免疫学的表現型の修飾をひき起こさない。したがって、未成熟の樹枝状細胞は、触発の後、未成熟状態にとどまる（ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＣ４０、ＤＣ８０、ＤＣ８６、ＤＣ８３、ＤＣ１ａの発現）。「触発された」段階は、異なる形で明らかにできるが、一般的には、例の中で記載されているとおりin vitroでＮＫ細胞を活性化する細胞の能力を試験することによって、又は培養上清内の可能性触発因子を測定することによって明らかにされ得る。
なお、ＮＫ細胞の活性化の枠内で、樹枝状細胞の触発は、ＮＫ細胞の存在下でのインキュベーション又はこれと同時に実施することができる。
上記のとおり、本発明は同様に、触発済み樹枝状細胞の個体群にも関する。したがって、この点で、本発明の目的は、成熟又は未成熟の、特にヒトの触発済み樹枝状細胞、すなわちＮＫ細胞刺激能力が、特に未触発樹枝状細胞に比べ少なくとも２倍高くなった樹枝状細胞を含む組成物にもある。
本発明に従った触発済み樹枝状細胞は、より具体的に言うと、それが休止状態のＮＫ細胞を活性化すること、そして好ましくは細胞外基質の細胞培養物又はその細胞の上清を含む、上記のとおりの触発因子又は培地の存在下での成熟又は未成熟の樹枝状細胞の処理により得ることができることを特徴とする。
【００３０】
ＤＣ−ＮＫの共存培養
本発明の活性化方法を実施するためには、使用される樹枝状細胞は、成熟樹枝状細胞（特にマウスの系において）又は好ましくは未成熟樹枝状細胞（ヒト及びマウスの系において）であってよい。例に示されているように、樹枝状細胞は、上記のように特に触発の後、その成熟段階の如何に関わらず、ＮＫ細胞を活性化する特性を有する。
活性化がより効率の高いものとなるためには、好都合には、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の比及び／又は同時インキュベーション時間のようないくつかのパラメータを尊重するのがよい。したがって、出願人により実現された実験から、invitro又はex vivoでの活性化方法の最高の成果は、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期比が０．０１〜１０、好ましくは０．０５〜５の間に含まれている場合に得られる、ということが立証された。当然のことながら、当業者は、樹枝状細胞の量が多すぎる場合にみられるＮＫ細胞の窒息効果及び樹枝状細胞数が少なすぎる場合にみられることがある低い活性化レベルを考慮に入れて、使用される細胞個体群に応じてこの比率を適合させることができる。特に好ましい条件は、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期比が０．１〜１の間、特に約０．１〜０．５の間に含まれている条件である。
【００３１】
共存培養時間に関しては、これは当業者により、使用される細胞個体群特に樹枝状細胞の成熟及び触発段階に応じて適合させることができる。一般に、ＮＫ細胞の最適な活性化は、共存培養の後約１８時間〜４８時間の期間中に見られる。好ましくは、樹枝状細胞が上記のとおりに触発された場合、休止状態にあるＮＫ細胞の活性化は、２０時間未満の共存培養期間の後で得られる。上記の共存培養期間は、特に、活性化されたＮＫ細胞の割合と生存可能な細胞の割合の間の最高の組合せを得ることを可能にする。この点に関して、樹枝状細胞による活性化期間中、ＮＫ亜個体群の隔離された特異的な増殖が起こっている一方で、ＮＫ細胞の有意な包括的増殖が全く観察されていないこと（係数およそ２）に留意されたい。そのうえ、特に思いがけず、樹枝状細胞は培養状態にあるＮＫ細胞の生存に対しプラスの効果を及ぼすと思われる。このため、本発明の方法は、必ずしもサイトカインに助けを求める必要なく、改良された収量で、活性化されたＮＫ細胞を得ることを可能にする。同様にして、戻りのＮＫ細胞は成熟ＤＣの生存を増大させる。
in vitroでのＮＫ細胞の活性化及び樹枝状細胞の触発は、好ましくは滅菌条件下で細胞培養に適したあらゆる装置の中で実施することができる。すなわち、特に平板、培養皿、フラスコ、ガラスびん、袋などが考えられる。なお、共存培養は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の培養に適合させたあらゆる培地の中で実行される。より一般的に言うと、これは、例えばＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地又はＧＢＥＡ（ＡＩＭＶ、Ｘ−ＶＩＶＯ）培地などのような哺乳動物細胞の培養向けの市販の培地であってよい。
【００３２】
本発明の特別な第１の変形形態によると、ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細胞と成熟樹枝状細胞の共存培養によって実現される。
標準的な実験においては、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４での処置により骨髄から誘導され、ＬＰＳで成熟させられた樹枝状細胞、又は樹枝状細胞の確立された１系統の成熟状態にある細胞は、１００万個／mlの割合で、その培地の中に再懸濁される。その後、これらの細胞は、平板又は他のあらゆる適切な装置で培養に付される。付着段階の後に得られる休止状態の新鮮なＮＫ細胞（自己由来又は同種異系）を、１００万個／mlの濃度で適切な培地（例えば補足されたＲＰＭＩ培地）で再懸濁する。これらを次に、ＮＫ：ＤＣの初期比が約０．１〜０．３となるような形で、樹枝状細胞を含む平板に添加する。約１８〜３６時間で共存培養を収集する。ＮＫ細胞の活性化された性質は、上清中のＩＦＮγの産生の測定及び標的細胞に対する細胞傷害性の測定によって制御される。ＮＫ細胞も同様に、特徴的マーカー（例えばマウスにおけるＮＫ１．１Ｄ×５、又はasialo−ＧＭ１）の発現のため及び細胞死亡率を評価するため、計数（例えばトリパンブルー）され分析（例えばフラックス血球計算法で）される。
【００３３】
本発明の方法の特別なもう１つの変形形態に従うと、ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細胞と未成熟細胞の共存培養によって実現される。標準的な実験においては、細胞は上記のものと同一のやり方で処理するが、樹枝状細胞を未成熟段階に維持するように、成熟培地中でインキュベーションしない。この実施態様においては、共存培養は、好都合には、ＮＫ細胞の最適な活性化を可能にするため、少なくとも３６〜７２時間維持される。活性化されたＮＫ細胞は、次に、上記のように分析され制御され得る。
【００３４】
本発明の方法の好ましい一実施態様では、ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細胞と触発済み樹枝状細胞の共存培養によって実現される。この実施態様においては、ＮＫ細胞の最適な活性化を可能にするためには、２０時間未満の共存培養で充分である。活性化されたＮＫ細胞は、次に以上で記載されているとおりに分析及び制御することができる。より好ましくは、これは、触発培地の存在下で予めインキュベーションされた未成熟樹枝状細胞である。さらに一層好ましくは、これは、線維芽細胞の存在下で予めインキュベーションされた未成熟樹枝状細胞、又は線維芽細胞の上清又は線維芽細胞から産生されたタンパク質因子である。
ＮＫ細胞がこのように活性化された時点で、ＮＫ細胞を樹枝状細胞から分離すること、又はＮＫ細胞と樹枝状細胞の共存培養を直接収獲することが可能である。この点で、本発明は同様に、ＮＫ細胞及び樹枝状細胞、特にＮＫ細胞と樹枝状細胞の共存培養物を含む組成物をもその目的としている。前記のとおり、これは、好都合には活性化されたＮＫ細胞である。そのうえ、好ましくは触発された成熟又は未成熟樹枝状細胞であってもよい。最後に、本発明によるこれらの組成物においては、細胞個体群は、好ましくは自己由来すなわち同じ生体に由来している。これらの組成物は、好都合には、分離された細胞個体群で構成されている。すなわち２つの細胞個体群は各々少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、特に少なくとも５０％の対応する細胞型（ＮＫ又は樹枝状細胞）で構成される。なお、本発明に基づく好ましい組成物は、一般に少なくとも１０％、好ましくは２０〜６０％、さらに好ましくは３０〜６０％のＮＫ細胞そして少なくとも４０％好ましくは４０〜８０％の樹枝状細胞を含む。本発明は同様に、本出願で記載するとおり、活性化されたＮＫ細胞を含むあらゆる組成物にも関する。本発明の組成物は、袋、バイアル、アンプル、注射器、小びんの適合されたあらゆる装置の中に包装することができ、また以下で記載するとおり（冷所に）保管されてもよいし、即時使用することもできる。好都合には、これらの組成物は、１０4〜１０9個のＮＫ細胞、好ましくは約１０6〜１０8個（特に人間に投与する場合）さらには１０5〜１０6個（特にマウスに投与する場合）のＮＫ細胞を含む。
【００３５】
ＤＣから誘導された調製物の存在下でのＮＫの活性化
もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、樹枝状細胞から誘導された調製物をＮＫ細胞の存在下におくことにより、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化することを含む。樹枝状細胞から誘導された調製物は分離、富化又は精製された形での樹枝状細胞のあらゆる調製物又は膜画分、樹枝状細胞の細胞リゼイト、樹枝状細胞の膜小胞又は樹枝状細胞から誘導された刺激因子であると考えられる。
実際、本出願に例示されているように、ＮＫ細胞の活性化は、完全な樹枝状細胞の存在下のみならず、この樹枝状細胞の膜調製物、特に膜小胞（例えばデキソゾーム）、又はタンパク質性の刺激因子の存在下でも得ることができる。
【００３６】
第１の変形形態によると、本発明の方法は、樹枝状細胞により産生された膜小胞の存在下にＮＫ細胞をおくことにより、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化することを含む。この点で、樹枝状細胞がデキソゾームと呼ばれる一般に５０nm〜１００nmの直径を持つ膜小胞を産生することが実証された（ＦＲ９７０９００７；ＦＲ９８０１４３７）。ここで本発明は、これらの小胞が同様にＮＫ細胞刺激活性を備えていることを示している。特に、本出願は、ヒト又はマウスの樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが、マウスのＮＫ細胞を活性化する能力を持つことを示している。そのうえ、得られた結果は、この活性化が、未触発樹枝状細胞によって産生されたデキソゾームについてさえ観察されるということを示している。
好ましくは、この変形形態の実施のためには、好ましくは自己由来又は同種異系の未成熟樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが使用される。in vitro又はex vivoでの使用分野については、１００万個のＮＫ細胞について１０〜１００μgのエキソゾームタンパク質という濃度範囲内でデキソゾームを使用することが好ましい。エキソゾームタンパク質の量は、例えばブラッドフォード試験によって当業者により容易に決定され得る（Annal. Biochem. 72 (1976) 248）。より好ましくは、１０6個のＮＫ細胞につき１５μg以上、さらに好ましくは１０6個のＮＫ細胞につき２０μg以上の濃度でデキソゾームを使用する。これらの濃度は当業者によって適合させることができ、in vivoでの使用に移行し得るものであるということに留意されたい。特にin vivoでの使用のためには、１回の注射につき５０〜１００μgを上回るエキソゾーム用量を使用することが可能である。
【００３７】
デキソゾームは、例中に示されている例えばＦＲ９７０９００７及びＦＲ９８０１４３７のような出願の中で記載された技術に従って調製可能である。簡単に言うと、樹枝状細胞は、好ましくは未成熟段階で、好ましくはデキソゾームの産生に有利に作用する培地の中で培養される。その後デキソゾームは、遠心分離（特に７０，０００ｇでの分画超遠心分離）のような方法又は当業者にとって公知の他のあらゆる技術によって単離される。デキソゾームはこのように単離され、アリコートにされ、保存されるか又はＮＫ細胞の刺激のために即時使用される。
【００３８】
もう１つの変形形態に従うと、本発明の方法は、樹枝状細胞、特に触発済み樹枝状細胞に由来する刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくことによって、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化させることを含む。
本出願の中で示されている結果は、実際、樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化の特異性を例示しており、ひいてはこの効果の実現における、樹枝状細胞が産生又は発現する単数又は複数の因子の関与を示している。この点で、本出願は同様に、「トランスウェル」実験において、ＮＫ細胞と樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された膜調製物の間の細胞間接触が活性化に必要であると思われるということをも示している。したがってこれらの結果は、ＮＫ細胞のこの活性化の原因であるか又は少なくともこの活性化に必要なものである、デキソゾーム及び樹枝状細胞により（表面で）発現されるＮＫ細胞の刺激因子の存在を明確に例示している。したがってこの（膜）（同時）刺激因子又はこれを含むあらゆる無細胞調製物、又はこの因子のあらゆる誘導体又は組換え型形態ならびに対応する核酸は同様にＮＫ細胞を活性化するため、特に抗腫瘍又は抗ウイルス免疫化における使用分野のために、in vitro又はin vivoで使用することもできる。なお、この因子は、移植片対宿主病又は移植片拒絶といった或る種の状況下で、競合体、特異的抗体、さらにはアンチセンスの使用により遮断することが可能である。
【００３９】
本発明のもう１つの目的は、同様に、樹枝状細胞から誘導されたＮＫ細胞の刺激因子、特に樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化に関与する膜因子を含む組成物に関する。「関与する」という語は、この因子が樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化に必要であるか又は少なくとも、これに参加することを意味している。この組成物は例えば、前記因子を含む樹枝状細胞の無細胞抽出物、膜小胞又はこの因子の単離された又は精製されたあらゆる形態で構成されている。「誘導された」という語は、基本的にタンパク質性のこの因子が、特に、細胞溶解とそれに続くさまざまな遠心分離工程（分画遠心分離、超遠心分離など）及び／又はクロマトグラフィー、電気泳動、中和抗体産生及び免疫親和性による分離のためのそれらの使用、のような当業者にとって周知のさまざまな分離方法によって精製され得るということを表している。これらの技術の各々は、単独か又は組合わされた形で、本出願の中で記載されているようなＮＫ細胞の活性化試験により精製のさまざまな工程に従うことによって、活性化に関与する刺激因子を単離するのに使用することができる。この因子の同定のためのもう１つのアプローチは、樹枝状細胞のＤＮＡバンクの使用及び活性を有するか又はこの活性を持たない樹枝状細胞の突然変異体を補完する能力を持つクローンの探求にある。この展望の下で、（触発済み樹枝状細胞と未触発樹枝状細胞の間の減算による）ディファレンシャルＤＮＡバンクを確立することができる。
【００４０】
より一般的な形で、本発明はここで、ＮＫ細胞と試験組成物の間の膜間接触が関与する、ＮＫを刺激する能力を持つ因子の調製方法について記載する。より具体的に言うと、本発明は、膜画分を含む生体材料とＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生体材料中に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞刺激因子の同定及び／又は調製方法に関する。より好ましくは、膜画分を含む生体材料は、樹枝状細胞、樹枝状細胞の細胞下調製物（特に膜小胞）又はポリペプチド産物をコードする核酸により形質転換される細胞であってよい。したがってこれは、ヒト由来のＤＮＡバンク、特に樹枝状細胞のｃＤＮＡバンクにより形質転換された哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞）であり得る。ＮＫ活性の刺激を誘発するクローンが選択され、それに含まれる挿入物が分離され精製され特徴づけされる。したがってこの方法は、ＮＫ細胞の刺激因子をコードするあらゆる核酸のクローニングを可能にする。得られた核酸は、改変し、発現ベクター内に導入し、タンパク質性の刺激因子の産生方法の中で使用することができる。
【００４１】
したがって、本発明は、膜画分を含む生体材料とＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の実証、及び生体材料内に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞の刺激因子の同定及び／又は調製方法にも関する。
したがって本発明の特別な組成物は、成熟樹枝状細胞膜から又は未成熟樹枝状細胞により産生される膜小胞から得ることができる基本的にタンパク質性の、ＤＣから誘導されたＮＫ細胞の刺激因子を含む。
より具体的な組成物には、ヒトの未成熟樹枝状細胞により産生されるエキソゾームから得ることができ、しかも休止状態のＮＫ細胞によりガンマインターフェロンの分泌を刺激することのできる基本的にタンパク質性の因子を含む。
【００４２】
なお、「誘導された」という語は同様に本発明の組成物が、特に酵母又は哺乳動物細胞のような培養中の組換え型細胞から発現された、上で同定された刺激因子のあらゆる変異体又は組換え型形態を含むことができる、ということを表している。
この点において、本発明の組成物は同様に上記のような樹枝状細胞（特に触発されたもの）の刺激膜因子をコードするあらゆる核酸を含有することができる。この核酸は、当業者にとって公知のあらゆる技術によって、特に触発済み樹枝状細胞のＤＮＡバンクから得ることができる。最後に、本発明による組成物は同様に、ＮＫ細胞のその他のあらゆる同時刺激因子、そして特に、上記の刺激因子と組合わされてＮＫ細胞を活性化させることのできる全てのリンホカイン又はサイトカインを含有することができる。
したがって、特定の一実施態様に従うと、本発明は、樹枝状細胞から誘導された刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくことによってin vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化する方法を含む。
【００４３】
したがって、本発明はさらに、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増大あるいはin vivoでのＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの産生を目的とする組成物の調製のための、上記のとおりの刺激因子の使用に関する。
本発明は同様に、１つの生体の自然免疫の増大を目的とした組成物の調製のための上記のとおりの刺激因子の使用にも関する。
本発明はさらに、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増大in vitro又はex vivoでのＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの産生のための、上記のとおりの刺激因子の使用にも関する。
本発明は同様に、ＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の相互作用に干渉する（すなわち少なくとも部分的に阻害する）能力を持つ化合物の存在下にＮＫ細胞をおくことを含む、in vitro又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化の負の制御を行うための方法に関する。このような化合物は、例えば、刺激因子の可溶形態（可溶性レセプター）又はその他のあらゆるフラグメント（特に細胞外ドメイン、特に結合部位）、アナログ、アンタゴニスト、競合体、抗体又は抗体フラグメント、アンチセンスなどを含むことができる。このような化合物は、前述の刺激因子からのスクリーニング試験又はＮＫの活性化のあらゆる直接的又は間接的機能試験において、同定及び／又は特徴づけすることができる。
この点で、本発明は同様に、休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞、好ましくは触発済み樹枝状細胞又はデキソゾーム又は上記のとおりのＮＫ刺激因子と共に、１つの試験化合物又は単数又は複数の試験組成物を含む組成物をインキュベーションする工程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程、及び試験化合物／組成物の不在下で実施された対照実験との関係においてＮＫ細胞の活性化を阻害（すなわち削減）する能力を持つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の活性化を阻害する能力を持つ化合物の同定及び／又は特徴づけ方法にも関する。
【００４４】
したがって本発明は外用（ex vivo）又は内用（in vivo）で使用する医薬品又は薬学的組成物としての樹枝状細胞によるＮＫのこの活性化の阻害化合物の使用にも関する。
この点で、本発明は同様に、樹枝状細胞と細胞の間の相互作用と干渉する能力、したがって樹枝状細胞（又はデキソゾーム）とＮＫ細胞の間の接触を少なくとも部分的に阻害する能力を持つあらゆる化合物にも関する。この化合物は上記のとおり、中和抗体、競合的リガンド、刺激因子の類似体、フラグメント又は誘導体、全ての化学分子などであり得る。本発明は同様に、特に移植片拒絶及びＧＶＨの予防といった応用分野における、in vivo又はin vitroでＮＫ細胞の活性化を制御するためのこのような化合物の使用にも関する。さらに、本発明は同様に、特に Grouard et al. (Nature 384, 364-367, 1996）により記載されているＧＣ−ＤＣのような「寛容原性の」表現型を持つ樹枝状細胞又は寛容原性樹枝状細胞の誘導産物の、ＮＫ細胞活性化阻害のための使用にも関する。
【００４５】
in vivoでのＤＣの増大によるＮＫの活性化
もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、in vivoでの樹枝状細胞レベルの上昇による、in vivoでのＮＫ細胞の活性化を含む。このin vivoでの増大は、実際にＮＫ細胞のin situ活性化を行い、ひいては特に腫瘍細胞又は感染細胞に対する生体の自然抗体を強化することを可能にする。
樹枝状細胞レベルのin vivoでの上昇は、場合によっては触発済みの樹枝状細胞のin vivo投与（受身移入）によっても、あるいは樹枝状細胞の単数又は複数の成長及び／又は触発因子のin vivo投与によっても更にはそれらを組み合わせた形でも実現できる。この投与は、例えば注射、好ましくは皮下注射又は全身注射によって実施される。注射は、好ましくは局部又は局所注射、特に腫瘍近くのような治療すべき部位又はその近くへの注射である。例中で紹介されている結果は、特に、腫瘍の部位における未成熟又は成熟の、同種異系又は自己由来の樹枝状細胞のin vivoでの皮下又は静脈内注射による投与が、陰性ＭＨＣクラスＩ腫瘍の成長を低下させ得ることを実証している。注射は一般的には、１０4〜１０8個、好ましくは１０5個以上１０7個以下の樹枝状細胞という細胞用量をベースとして実施される。さらに、注射プロトコルは、状況に応じて（予防用、治療用、隔離された腫瘍、転移、重大な又は局所的な感染など）当業者により適合化され得る。したがって、例えば数ヵ月にわたり一週間に１〜２回の投与といった反復した投与により樹枝状細胞の受身移入を行うことが可能である。
【００４６】
in vivoでの樹枝状細胞の増大は同様に、in vivoでの樹枝状細胞成長因子の注射によって実現できる。このような因子は例えばLyman S.D et al., (Blood 83,2795-2801, 1994, 早期造血始原細胞のための成長因子であるマウスFlt３Lのヒトホモログのクローニング）及び Maraskovsky E. et al., (J. Exp. Med. 184.1953-1962, 1996)によって記載されている化合物Flt３Ｌ（以下「ＦＬ」化合物と呼ぶ）又はＧＭ−ＣＳＦなどである。例が示しているとおり、自然免疫（ひいてはＮＫ細胞の活性）のin vivoでの刺激は、Flt３Ｌを毎日注射した後に得られる。紹介された結果は、この注射が、in situでのＮＫの絶対数の増大を生じ、リンパ球様樹枝状細胞及びＢ７／ＤＣ２８とＩＦＮγのin vivoでの相互作用に依存する抗腫瘍効果を誘発する。以下で示すとおり、ＦＬ化合物は好都合に樹枝状細胞触発因子と組み合わせることができる。
したがってこの実施態様は、in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を増大させるのに特に有効なアプローチである。このアプローチは好都合には、in vivoでのＮＫ細胞の成長因子の同時投与と関連づけることができる。
【００４７】
したがって、本発明は、in vivoでＮＫ細胞を活性化させるための組成物を調製するための樹枝状細胞の使用をも目的としている。本発明は同様に、in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組成物の調製及び活性化されたＮＫ細胞によるＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの産生のための樹枝状細胞の使用にも関する。以上で記したとおり、この目的で使用される樹枝状細胞は、特に触発済みの、自己由来又は同種異系の成熟又は未成熟細胞である。そのうえ、これは同様に単数又は複数の抗原に対し感作された樹枝状細胞であってもよい。
本発明は同様に、in vivoでＮＫ細胞を活性化することを目的とする組成物の調製のため、ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化することを目的とする組成物の調製のための樹枝状細胞成長因子の使用にも関する。成長因子は、好ましくはＦＬ化合物である。成長因子は好都合には、in vivoでの樹枝状細胞触発因子と組み合わせることができる。
本発明はさらに、場合によっては樹枝状細胞成長因子及び／又は単数又は複数のケモカイン又はサイトカインと組合わせた状態で、ＮＫ細胞をin vivoで直接活性化するための、タンパク質性、より一般的には生物学的な樹枝状細胞触発因子の使用にも関する。
【００４８】
本発明の方法の特定の１実施態様においては、in vivoでの樹枝状細胞レベルの上昇は、先に記載したようなin vitroで触発された樹枝状細胞も前述の条件下でin vivo投与すること（受身移入）によって、又は同様に単数又は複数の樹枝状細胞成長因子及び単数又は複数の樹枝状細胞触発因子をin vivo投与することによっても実現することができる。この実施態様は、投与された細胞又は化合物がin vivoで触発済み樹枝状細胞を高レベルで得ることを可能にするかぎりにおいて、in vivoでのＮＫ細胞の活性化の有効性を改善させることができる。
この点で、本発明は同様に、同時に又は別々にあるいは時間的に間隔をおいた形態で使用することを目的とした、前述のとおりの樹枝状細胞触発因子及び樹枝状細胞成長因子を少なくとも１つ含む組成物にも関する。より具体的に言うと、このような組成物には、ＦＬ化合物及び可溶性触発因子を含む線維芽細胞から誘導された調製物が含まれる。さらに具体的には、かかる組成物には可溶性組換え型因子が含まれる。本発明は同様に、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組成物の調製のための、このような組成物の使用にも関する。それらの使用のためには、これらの化合物は、好ましくは等張のあらゆる適切な培地（食塩水、緩衝液など）の中に入れて、かつ当業者にとって公知のあらゆる装置（アンプル、小びん、チューブ、注射器、袋など）の中に包装することができる。
【００４９】
休止状態のＮＫ細胞の調製
本発明の実施のためには、ＮＫ細胞は、当業者にとって公知のさまざまな技術により得ることができる。より具体的に言うと、これらの細胞は、末梢血の単核細胞からのさまざまな単離及び富化方法（lymphoprep、leucaph#r#seなど）により得ることができる。したがって、これらの細胞は、Percoll密度勾配（Timonenet al., J. Immunol. Methods 51 (1982) 269）、負の枯渇法（Zarling et al., J. Immunol. 127 (1981) 2527）又はＦＡＣＳによる分類段階（Lanier et al., J. Immunol. 131 (1983) 1789）により調製することができる。これらの細胞は同様にアビジン−ビオチン系を使用したカラム上の免疫吸着法（Handgretinger et al., J. Clin. Lab. Anal. 8 (1994) 443）によって、さらにまた、抗体とグラフト化された微粉を用いた免疫選択（Geiselhart et al., Nat. Immun. 15 (1996-97) 227）により、分離することができる。同様に、場合によって塑性付着方法と組合わせてこれらの異なる技術の組合せを使用することも可能である。これらの異なる技術は、好ましくは休止状態のＮＫ細胞を７０％以上含む、休止状態のＮＫ細胞が高度に富化された細胞個体群を得ることを可能にする。より好ましくは、本発明の実施のために使用されるＮＫ細胞の個体群は、３０％、好都合には５０％を上回るＮＫ細胞を一般に有している。細胞個体群の純度は、必要とあらば、抗ＣＤ５６抗体及び／又は抗ＣＤ１６抗体及び／又は抗ＣＤ３抗体（枯渇）といった特異的抗体を使用することによって改善することができる。
ＮＫ細胞は、後日使用するために冷凍した形で培地内に保存できる。好都合には、ＮＫ細胞は即時調製される、すなわち獲得後活性化のために使用される。
【００５０】
樹枝状細胞の調製
本発明の枠内で使用される樹枝状細胞は、異なる技術に従って調製可能である。これらの細胞は、好ましくは触発された「生来の」又は単数又は複数の特定の抗原に感作された、自己由来又は同種異系の、未成熟又は成熟細胞であってよい。なお、使用される樹枝状細胞は、樹枝状細胞が富化された細胞培養、さらには基本的に樹枝状細胞を含む細胞培養であってよい。好都合には、これは、当然ヒトの樹枝状細胞である。
樹枝状細胞の調製は、文献中で充分に考証されてきた。したがって、これらの細胞が、造血幹細胞又は単球前駆物質から得られるか、さらにはまた分化形態で直接単離されるものであり得ることが知られている（Hart, Blood 90 (1997) 3245で概説）。
【００５１】
株細胞からの樹枝状細胞の獲得については、例えば、マウスにおいてはInaba et al.(J. Exp. Med. 176 (1992) 1693）によって、またヒトにおいてはCaux etal. (Nature 360 (1992) 258）又はBernhard et al. (Cancer Res. 55 (1995) 1099）によって例示されている。これらの研究は、特に樹枝状細胞が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下での骨髄の培養によって、あるいは、より精確に言うと、サイトカインの組合せの存在下での培養（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦα±ＩＬ−３及びＩＬ−４又はＣＤ４０Ｌで）によって造血幹細胞（ＣＤ３４＋）から産生できる、ということを示している。
単球前駆物質からの樹枝状細胞の獲得については、例えばRomani et al. (J.Exp. Med. 180 (1994) 83), Sailusto et al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 1109),Inaba et al. (J. Exp. Med. 175 (1992) 1157）さらにまたJansen et al. (J.Exp. Med. 170 (1989) 577）によって例示されている。これらの方法は、基本的に、血液中の単核細胞の採取及びサイトカインのさまざまな組合せの存在下での培養に基づいている。特定の１つの方法は、例えばインターロイキン−４＋ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−１３＋ＧＭ−ＣＳＦといったサイトカインの組合せの存在下で血液の単球前駆物質を処理することからなる。この技術は、同様に、Mayordomo et al., 1995（マウス）によっても例示されている。なお、同様に、直接的にＣＤ４０Ｌ又はカルシウムチャンネル活性化剤といった薬学的細胞分化剤により単球前駆物質を処理することも可能である。
【００５２】
樹枝状細胞を得るためのもう１つのアプローチは、生物学的標本から、すでに分化された樹枝状細胞を単離することからなる。このアプローチは、例えばHsu et al. (Nature Medicine 2 (1996) 52）によって記載された。この研究班が記載した方法は、基本的に、末梢血標本を収集し、樹枝状細胞を抽出するような形で異なる勾配及び遠心分離によりこれらを処理することからなる。
本発明の枠内で優先されている方法は、単球前駆物質又は骨髄からの樹枝状細胞の産生に基づいている。これらの方法については、例において示されている。より具体的に言うとＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１３の存在下で（血液又は骨髄の中に含有されている）単球前駆物質を処理することによって得られる樹枝状細胞を本発明の枠内で使用することが好ましい。
【００５３】
前述のとおり、本発明の実施のためには、未成熟及び／又は成熟樹枝状細胞を含む樹枝状細胞の個体群を使用することが可能である。好都合には、好ましくは触発済みの未成熟樹枝状細胞で主として（すなわち少なくとも６０％好ましくは７０％）構成された樹枝状細胞個体群が使用される。樹枝状細胞の未成熟状態は、それが強い細胞内活性を呈しその表面でＭＨＣのクラスＩ及びIIの分子及びリンパ球同時刺激分子の低いレベルを発現するような、その発達の早期段階に対応する。
なお、本発明の枠内では、樹枝状細胞系統を使用することも同様に可能である。これは、例えば樹枝状細胞内に発ガン遺伝子を導入することによって産生される不死化された樹枝状細胞系統であってもよい。かかる系統のマウスの例としては、先行技術において記載された以下の系統が考えられる：すなわち、系統Ｄ１（Winzler et al., J. Exp. Med. 185, 317-328, 1997）、系統ＸＳ（A. Takashima et al., J. Immunol. 1995; Vol. 154: 5128-5135）、 系統 tsＤＣ（Volkmann et al., Eur. J. Immunol. 26; 2565-72, 1996）。樹枝状細胞系統を使用することの利点は、異なる実験動物に由来する同種異系のＮＫ細胞個体群を活性化するため工業的に使用可能な「ユニバーサル」細胞バンクの構成にある。この実施態様においては、系統は好ましくは、３０％の触発培地内で又は最適な触発因子濃度で保持される。
【００５４】
樹枝状細胞が調製された時点で、これらを培養状態に維持すること、さらに一層精製すること、保存すること、又は直接本発明の実施において使用すること（ＮＫ細胞のin vitro、ex vivo又はin vivoでの活性化、無細胞抽出物、デキソゾームの産生、膜刺激因子の獲得）が可能である。さらに、ＮＫ細胞の活性化のためのそれらの使用に先立って、このように調製された樹枝状細胞を、１つの抗原又は一群の抗原に対して感作させることができる。樹枝状細胞表面に抗原パターンが存在することにより、実際、特にin vivoでの使用の場合に、その免疫原性活性（獲得免疫）を改善（交差プライミングにより）するか又は阻害する（ＫＩＲモードについて）ことができるだろう。
【００５５】
この観点からみると、抗原に対し樹枝状細胞を感作させるためにさまざまな技術を使用することができる。これらの技術には、特に次のものが含まれる：
−  抗原ペプチドと樹枝状細胞の接触（「ペプチドパルシング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペプチドすなわち抗原提示細胞によるその抗原の処理の結果としてもたらされるような、１つの抗原に由来するペプチドと共に、可変的な時間（一般に約３０分〜５時間）中、樹枝状細胞をインキュベーションすることからなる。このタイプのアプローチは、例えば、ＨＩＶウイルス、インフルエンザ又はＨＰＶの抗原ペプチドについて、又は例えば抗原Muc−１, Mart, Her２/Neuから誘導されたペプチドについて記載された。（Macatonia et al., J.Exp. Med. 169 (1989) 1255; Takahashi et al., Int. Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa, J. Exp. Med. 182 (1995) 255; Ossevoort et al., J.Immunother. 18 (1995) 86; 前出のMayordomo et al., ; Mehta Damani et al.J. Immunol. (1994) 996）。Zitvogel et alにより記載された（前出、1996）方法に従って腫瘍細胞の酸性ペプチド溶出液を用いて樹枝状細胞をインキュベーションすることも同様に可能である。
−  単数又は複数の抗原と樹枝状細胞の接触（「抗原パルシング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペプチドではなく単数又は複数の完全な抗原を用いて、樹枝状細胞をインキュベーションすることからなる。この技術の利点は、抗原が、樹枝状細胞の自然のメカニズムによって抗原ペプチドに形質転換され、そのため樹枝状細胞により提示される結果として得られた抗原ペプチドはより優れた免疫原性を手に入れることとなるということにある。このアプローチについては、例えばInaba et al. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631）又はHsu et al., (Nature Medicine 2 (1996) 52）によって例示されている。−  単数又は複数の抗原タンパク質複合体と樹枝状細胞の接触。このアプローチは、前述のものと類似しているが、抗原の形質転換及び／又は提示の効率を改善することができる。特に、抗原を可溶形態又はターゲティング要素に複合された形で使用することができ、こうして特に、マンノースレセプター又は免疫グロブリンレセプター（ＲＦｃ）のような膜レセプター（免疫複合体）を標的化することが可能となる。また、細胞によるその食作用又はその侵入を改善するような形で、抗原を粒子化することも可能である。
【００５６】
−  抗原又は抗原ペプチドを発現する細胞（融合ハイブリドーマ様の）又はその膜、リゼート又は音波処理物と樹枝状細胞の接触。この技術は、細胞又は細胞膜の融合による抗原又は抗原ペプチドの直接移入に基づくものである。このアプローチは、例えば樹枝状細胞と、腫瘍細胞膜の間の融合によって例示された（Zou et al., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992) 1, 及び前出のGilboa.）。−  抗原又は抗原ペプチドを含む膜小胞（特に上記のとおりの腫瘍細胞のエキソゾーム）と樹枝状細胞の接触。本発明において立証されているような、このエキソゾームを使用した樹枝状細胞の感作アプローチは、それが特定の抗原についての知識を必要とせず、そして投入される抗原ペプチドが未変性の固有の立体配座を持つという点において、特に好都合である。この技術については、例の中で示されている。
−  抗原又は抗原ペプチドを含有するリポソームと樹枝状細胞の接触（Nair et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 609）。
−  抗原又は抗原ペプチドをコードするｓＲＮＡと樹枝状細胞の接触（前出のBoczkowsky et. al., 1996.参照）。
−  抗原又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡ又は（場合によってはプラスミド，ウイルス又は化学タイプのベクター内に取込まれた）タンパク質抗原に結合された核酸配列と樹枝状細胞の接触。したがって、樹枝状細胞感作様式は、それに対する防御が求められているウイルスで樹枝状細胞を感染させることからなる。これについては、例えばインフルエンザウイルスに関して記載されている（Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994) 797; 前出のMacatonia et al.,)。もう１つのアプローチは、ウイルス又はその他の核酸移入ベクターを用いて、目的の単数又は複数の抗原又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡを送達することからなる。このようなアプローチは、例えば、Arthur et al. (Cancer Gene Therapy, 1995）又はAlijagle et al. (Eur. J. Immunol. 25 (1995) 3100）によって例示されている。アデノウイルス、ＡＡＶ又はレトロウイルスのような或る種のウイルスが、樹枝状細胞内で核酸を送達するため、この目的で使用できると思われる。
【００５７】
利用分野
本発明は同様に、特に免疫学、免疫療法又はメディカルバイオテクノロジーの分野における上記の方法、細胞及び組成物の使用にも関する。前述のとおり、これらの使用は、ＮＫ細胞の活性を制御する目的で、in vitro及びin vivoの両方で数多く存在する。このような使用分野は特に、ガン又は特にウイルス又はその他の病原体による感染症、自己免疫疾患、移植に関連する疾病（移植片拒絶、ＧＶＨＤ）、先天性疾患（例えばインターフェロン又はインタロイキン−１２レセプターの欠損）などである。本発明の方法、細胞及び組成物は特に、腫瘍（特にＭＨＣのクラスＩの分子の発現力が低い腫瘍）又はその他の異常細胞の成長を遅らせさらにはそれを消失させるために使用可能である。このタイプの使用分野については、上記のとおり、細胞組成物（活性化されたＮＫ細胞、ＮＫ／ＤＣの共存培養物又は樹枝状細胞）は好ましくは、皮下又は全身注射により局所−局部的に投与可能である。細胞の用量は、以上においてと同様以下の実験部分の中でも記されている。本発明は同様に、細胞調製物の処理、特にＮＫ細胞に対する感受性を持つ細胞の破壊のためにも同様に使用可能である。本発明は同様に、組合わせた形で、又は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球活性の発達に基づく免疫化のアジュバントとしても使用することもできる。さらに本発明は、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫリンパ球個体群の生存を増大させるため、ならびに場合によってはＮＫリンパ球亜個体群の増殖を増大させるための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞の膜因子の使用にも関する。
本発明はさらに、in vitro、ex vivo又はin vivoでの成熟樹枝状細胞の生存を増大させるための、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞の膜因子の使用にも関する。
【００５８】
本発明のその他の利点は、制限的な意味のない例示目的のものとして考えるべきである以下の例を読むことにより明らかになることだろう。
【００５９】
したがって、本発明のＮＫ細胞の活性化方法は、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又はex vivoで接触させることを含む。このような樹枝状細胞は、成熟樹枝状細胞であってもよいし、未成熟樹枝状細胞であってもよい。また、このような樹枝状細胞及びＮＫ細胞は、自己由来のものであってもよいし、同種異系のものであってもよい。また、このような樹枝状細胞は触発（トリガー）された細胞であってもよい。前記ＮＫ細胞に対する樹枝状細胞の比（ＮＫ細胞／樹枝状細胞比）は、０.０１〜１０好ましくは０.０５〜５の範囲にある。
本発明の共存培養物は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養物である。
本発明の組成物は、活性化された又は休止状態のＮＫ細胞及び自己由来の樹枝状細胞を含む組成物である。
本発明の組成物は上記の方法により活性化されたＮＫ細胞の含む組成物である。
【００６０】
本発明は、in vitro又はex vivoでＮＫ細胞を活性化するための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用にも関する。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用にも関する。本発明は、in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用にも関する。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞によるＩＦＮγの産生を増大させることを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用にも関する。この使用において、樹枝状細胞は、成熟樹枝状細胞であってもよいし、未成熟樹枝状細胞であってもよい。また、この使用において、樹枝状細胞は、触発された樹枝状細胞であることができる。この使用において、樹枝状細胞は、単数又は複数の抗原に感作されていてもよい。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞の成長因子の使用にも関する。この使用において、成長因子はＦＬ化合物である。
【００６１】
本発明の組成物は、樹枝状細胞から誘導された、ＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物である。
本発明の組成物は、樹枝状細胞とＮＫ細胞の間の相互作用に干渉する能力を持つ化合物を含む組成物である。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することを目的とする組成物の調製のための、上記の因子の使用にも関する。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞の活性化の負の制御を行うことを目的とする組成物の調製のための上記の化合物の使用にも関する。
本発明の組成物は、腫瘍治療向けの薬剤の調製のために使用することができる。
本発明の組成物は、感染細胞治療向けの薬剤の調製のために使用することができる。本発明の組成物は、腫瘍又は感染細胞の治療向けの薬剤の調製のためにも使用することができる。本発明の組成物は、移植片拒絶又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防処置向けの薬剤の調製のためにも使用することができる。
【００６２】
本発明は、ＮＫ活性のin situ増大により陰性又は弱陽性のクラスＩの腫瘍の治療向け組成物を調製するための、樹枝状細胞成長因子の使用にも関する。
本発明は、ＮＫリンパ球亜個体群の生存又は増殖を増大させることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細胞の膜因子の使用にも関する。本発明はまた、成熟樹枝状細胞の生存を増大させることを目的とする組成物の調製のためのＮＫ細胞の膜因子の使用にも関する。
本発明は、ＮＫ細胞の活性化を阻害することを目的とする組成物の調製のための寛容原性表現型の樹枝状細胞又は寛容原性樹枝状細胞から誘導された産物の使用にも関する。
本発明は、ＮＫ細胞を刺激するその能力を改善する（又は誘発する）ことを可能にする、触発培地と樹枝状細胞の接触を含む、樹枝状細胞処理方法にも関する。
【００６３】
本発明の組成物は、同時に又は時間的に分離した又は間隔を開けた形態で使用するための、少なくとも１つの樹枝状細胞触発因子及び樹枝状細胞成長因子を含む組成物である。
本発明の組成物は、特に人間の触発された樹枝状細胞を含む組成物である。
本発明の樹枝状細胞触発培地は、細胞外基質の細胞、そのような細胞から誘導された調製物又はそのような細胞から誘導された因子含む、樹枝状細胞触発培地である。
上記の方法においては、樹枝状細胞から誘導された調製物は膜小胞を含む。また、上記の方法においては、膜小胞は未成熟樹枝状細胞から産生される。
上記使用においては、樹枝状細胞から誘導された調製物は膜小胞を含む。
【００６４】
本発明は、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞の活性を刺激するための組成物を調製するための、樹枝状細胞から産生された膜小胞の使用にも関する。本発明は、膜分画を含む生体材料及びＮＫ細胞の個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生体材料内に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞の刺激因子の同定及び／又は調製方法にも関する。
本発明は、試験化合物或いは単数又は複数の試験化合物を含む組成物を、休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞又はエキソゾーム、又は上記のＮＫ刺激因子と共にインキュベーションする工程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程及びＮＫ細胞の活性化を阻害する（すなわち低減させる）能力を持つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の活性化を阻害する能力を持つ化合物の同定方法にも関する。
【００６５】
図面の説明
図１：未成熟樹枝状細胞はin vitroでＮＫ活性を刺激する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄から誘導した、すなわちＧＭ−ＣＳＦ及びインタロイキン−４で培養した未成熟自己由来樹枝状細胞を３０％の線維芽細胞Ｌ−９２９の中で２４時間インキュベーションするか又は照射されたＬ−９２９をと共に共存培養した。２４時間後、これらを計数し、従来の培地（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４）で再懸濁し、９６ウェルの平板の中で丸底ウェル内で１mlあたり１００万個の細胞という濃度で４０〜７２時間、同じ濃度のＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスの脾臓由来の休止状態の脾細胞（そのうち１０〜３０％はＮＫ）と共に同時インキュベーションした。標的細胞ＹＡＣ及びＰ８１５に対する細胞傷害性ならびにＮＫ細胞によるインターフェロンγの塩析は、「材料と方法」の中で決定されている。
【００６６】
図２〜３：成熟樹枝状細胞は、in vitroでＮＫ活性を直接刺激する。
（図２）  成熟した（動物Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓から誘導された）脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性をきわめて顕著な形で刺激する。まずはＬ−９２９（３０％）の上清の存在下で、次にＴＮＦαを含む培地の中で２４時間インキュベーションした樹枝状細胞を、４０〜４８時間、１：１の比でＢ６−Rag-/-マウス又はＳＣＩＤマウスに由来する脾臓の非接着性単核細胞と共存培養した。生存可能なリンパ球を４時間、クロム５１の塩析試験の中で細胞ＹＡＣ−１に対し試験した。結果は、異なるエフェクター細胞/標的細胞比における特異的溶解の百分率によって表されている。これらの実験は、５回行われ、結果は同じであった。
（図３）  成熟脾臓由来樹枝状細胞は、ＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生を刺激する。同系又は同種異系で異なる濃度比で別々に又は一緒に培養されたＮＫ細胞又は樹枝状細胞の上清を４８〜７２時間で収集し、ＥＬＩＳＡによりマウスインターフェロンγの存在について試験した。この図では、ＮＫ：ＤＣの比が実際Ｔ／Ｂ／Ｍacが枯渇した動物の脾細胞（１０〜３０％の純粋ＮＫを含む）：ＤＣの比に対応するという点に留意されたい。対照として別々に培養された樹枝状細胞又はＮＫ細胞の上清中には、インターフェロンγの痕跡は全くみられなかった。
【００６７】
図４：  活性化には、ＮＫ細胞と樹枝状細胞の接触が関与している。
２つの細胞個体群が多孔質膜（白い三角形）によって物理的に分離され互いに１mmの距離のところにある「トランスウェル」系における又は共存培養（黒い三角形）による、樹枝状細胞系統によりin vitroで活性化されたＮＫ細胞により誘導された標的細胞（ＹＡＣ−１）の特異的溶解の研究。対照は、ＮＫ細胞と培養済み樹枝状細胞により別々に表されている。
【００６８】
図５：  腫瘍ＡＫ７を有するＢ６ヌードマウスにおけるＦＬの投与は、腫瘍の成長の著しい抑制を誘発する。
発生２０日目のＡＫ７中皮腫腫瘍を有するＢ６−ヌードマウスに対し２０日間毎日、１０μgのＦＬを投与した。一週間に２回、６０日間にわたり腫瘍の成長を検査した。５匹のマウスの群についての腫瘍の平均サイズは図中に標準偏差と共に表されている。この実験を４回くり返すと、腫瘍成長の抑制は類似していた。Rag２ Ｂ６-/-マウスにおいても類似の結果が得られた。
【００６９】
図６〜７：  ＦＬにより誘発される抗腫瘍効果はＮＫ細胞に依存している。
（図６）  ＦＬ化合物は、Ｂ６−ベージュマウスにおいていかなる効果ももたらさない。発生２０日目のＡＫ７腫瘍を有するＢ６−ベージュマウスにおいて２０日間毎日１０μgのＦＬを投与した。一週間に２回、５０日間にわたり腫瘍の成長を検査した。５匹のマウスの群についての腫瘍の平均サイズは、図に標準偏差と共に表されている。この実験を２度くり返し、同一の結果を得た。
（図７）  ＦＬと同時に抗−ＮＫ１．１を中和するモノクローナル抗体の同時投与は、ＦＬの抗腫瘍効果を阻害する。発生２０日間の腫瘍を有する免疫適格マウスＢ６に、抗−ＮＫ１．１抗体をマウス一匹につき３００μgずつＦＬと同時に毎日同時投与した。ＰＢＳリン酸緩衝液により処理されたマウスの群は、ベージュマウス及びヌードマウス（*）において類似の腫瘍成長速度を呈していた。は、ＦＬのみで処理した動物と比較して、ＮＫ１．１により枯渇されたマウスの群においてはるかに大きい腫瘍を表している。この実験を２度再現し、同一のデータを得た。
【００７０】
図８：  ＦＬによる治療には、マウスＢ６の脾臓において増大したＮＫ活性が伴っている。
腫瘍ＡＫ７を有するマウス又は腫瘍の無いマウスの脾細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はＦＬで２０日間の処理した後に調製し、標的細胞としてＹＡＣ−１細胞を使用するクロムの塩析試験の中でエフェクター細胞として使用した。結果は、異なるエフェクター：標的比での特異的溶解百分率によって表現されている。各群には、３匹のマウスを含んだ。
【００７１】
図９〜１２：  ＦＬにより誘発されたＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果における、リンパ球様樹枝状細胞、Ｂ７／ＣＤ２８の相互作用及び分化に関連したサイトカインＴｈ１の役割。
（図９）  Ｂ６−ヌードマウスにおける抗ＣＤ８α抗体又は抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験。腫瘍を有するＢ６ヌードマウスを、「材料及び方法」の中で記載されるプロトコルに従って抗ＣＤ８α又は抗ＣＤ４と結びつけた形で又は単独で、ＦＬで処理した。腫瘍のサイズを、５匹の動物からなる群について一週間に２度測定した。（*）は抗ＣＤ８α抗体で処理された動物と比べた、ＦＬの注入を受け枯渇されていないマウスの群における、著しく小さくなった寸法の腫瘍を表す。これらのデータは２回再現され、類似の結果を伴っていた。
（図１０）  in vivoでのＣＴＬ４Ｉｇの同時投与。「材料及び方法」の中で記載されているようなマウスの抗体（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）で、類似の実験を実施した。（*）は、ＦＬのみで処置された動物と比較した、ＣＴＬＡ４１ｇで処置した動物の群におけるはるかに大きいサイズの腫瘍を表している。これらのデータは２度再現され、同じ結果を伴っていた。
（図１１）  in vivoでの抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２のモノクローナル抗体の同時投与。「材料及び方法」で記載されているように、抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２抗体を用いて類似の実験を実施した。抗腫瘍活性の著しい遮断は全く観察されなかった。これらのデータは２度再現され、結果は類似していた。
（図１２）  in vivoでの抗−ＩＦＮ−γモノクローナル抗体の同時投与。抗−ＩＦＮ−γ抗体を用いて、類似の実験を実施した。（*）は、ＦＬのみで処置された動物と比べた、抗ＩＦＮγ抗体により処置された群内の著しい大きいサイズの腫瘍を表している。これらのデータは、２度再現され、結果は類似していた。
【００７２】
図１３〜１４：  ＡＫ７腫瘍を有するＢ６−ヌードマウスにおける脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入：予防的及び治療的抗腫瘍効果。
図１３：  １日目にＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウスの体内に直接的腫瘍内皮下注射により未成熟樹枝状細胞を２００〜５００万個投与した（予防的に）。注射は１５日間１週間に２度実施された。ｔ−student試験に従って、腫瘍の成長を検査し、ＰＢＳにより処理された動物の群（１群５匹のマウス）と比較した。９５％での有意な結果を１つの（*）で表している。
図１４：  同上であるが、２０日前から発生したＡＫ７腫瘍の中に樹枝状細胞を注射した（治療的に）。
【００７３】
図１５〜１６：  線維芽細胞（Ｌ細胞）又は上清（ＳＮＬ細胞）の存在下で触発された未成熟の樹枝状細胞による、健康な又は病気のドナーのＰＢＬから精製されたヒトＮＫ細胞の活性化。
図１５：  ＩＦＮγ分泌の測定。結果は、少なくとも別々の３つの実験において反復されてul/ml単位で表されている。
図１６：  遊離クロムの測定による腫瘍標的の細胞溶解の測定（ｔＤＣ＝触発（又は「トリガー」）済み樹枝状細胞）。
【００７４】
図１７〜２０：  マウス樹枝状細胞のエキソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化する。
図１７：ガンマインターフェロンの産生の測定；
図１８：ＹＡＣ１細胞の細胞溶解の測定；
図１９：ＮＫ細胞の生存率の測定；
図２０：in vivoでの腫瘍の平均サイズの測定。Ｄｅｘ ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導された樹枝状細胞から産生されたデキソゾーム。Ｅ：Ｔ比：標的細胞に対するエフェクター細胞の比。ＳＮ ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導された樹枝状細胞の直接上清。
【００７５】
図２１：  ヒト樹枝状細胞のエキソゾーム（ＤＥＸｈ）は、休止状態のマウスのＮＫ細胞を活性化させる。Ｄｅｘ ＭＤ−ＤＣ：単球から誘導された樹枝状細胞から産生された産物。ＳＮ ＭＤ−ＤＣ：単球から誘導された樹枝状細胞の直接上清。
【００７６】
図２２〜２３：  ベータ−２−ミクログロブリン（図２２）又はクラスIIのＭＨＣの分子（図２３）についての「ノックアウト」マウスの樹枝状細胞のエキソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化する。Ｂ６ｗｔ：野生型Ｂ６マウス；β２ｍ-/-：ベータ−２−ミクログロブリンの遺伝子についての「ノックアウト」マウス；ＣｌII-/-：クラスIIのＭＨＣの分子についての「ノックアウト」マウス。
【００７７】
図２４〜２５：  ＮＫ細胞を刺激するための、樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾームの相対的活性。
図２４：低い用量又は高い用量のインターロイキン４で産生された樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾームの活性の比較研究。
図２５：触発済み又は未触発の樹枝状細胞とそれが産生するデキソゾームの活性の比較研究。
【００７８】
材料及び方法
１．動物
雌マウスＣ５７−ＢＬ／６（Ｂ６）及びＢＡＬＢ／ｃ scid／scid（ＳＣＩＤ）は、ジャンヴィエ飼育センター（Le Genest St-Isle, フランス）から入手した。雌マウスＣ５７／ＢＬ／６−bg/bg（Ｂ６−ベージュ）は、Harlan UK Limited（Oxon, イギリス）から購入した。雌マウスＳ５７−ＢＬ／６−Ｂ６−nude（Ｂ６−ヌード）は、Mollegaard研究・飼育センターＡ／Ｓ（Skensved, デンマーク）から入手した。雌及び雄のマウスＣ５７ＢＬ／６Rag２-/-（Ｂ６−Rag-/-）は、国立科学研究センターの先新技術開発センター（オルレアン、フランス）から購入した。ＳＣＩＤベージュ及びＢ６−ヌードマウスは、病原体のいない条件下に維持した。各実験の初めで、マウスを月齢別にまとめた（８〜１０週）。
【００７９】
２．細胞培養
A. Kane（Brown University, Providence, Rhode Island）により提供された細胞ＡＫ７は、Ｂ６マウスの体内でクロシドライトアスベスト腹腔内注入により生成されたマウスの中比腫細胞系統である。この細胞系統を、１０％の熱処理により不活性化されたウシ胎児血清、１．０mMのピルビン酸ナトリウム、２mMのＬ−グルタミン、１０UI/mlのペニシリン、及び１００μg/mlのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地の中で維持した。in vivoでの実験前１ヵ月未満の期間中、腫瘍細胞系統をin vitroで維持した。マウスの樹枝状細胞系統を、１０％の不活性化されたウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミン、５０μMの２βＭＥ，１００Ul/mlのペニシリン、及び１００μg/mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（「ＩＭＤＭ培地」）の中に維持する。細胞の成熟を誘発するため、組換え型マウスのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Systems, Abingdon, ＵＫ）を、２４時間１０ng/mlの濃度で添加した。成熟は、ＬＰＳ（１〜１０μg/ml）の存在下で細胞をインキュベーションすることによっても誘発可能である。ＹＡＣ−１細胞系統は、ＮＫ細胞に対する高い感受性を持つＡ／Ｓｎという状況下のリンパ腫系統である。Ｐ８１５細胞は、ＮＫ細胞に対する耐性を持つＤＢＡ／２状況下の肥満細胞である。全ての培地及び試薬は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Life Technologies, Merelbeke, ベルギー）から入手した。
【００８０】
３．骨髄から誘導された樹枝状細胞の生成と培養
マウスの樹枝状細胞は、１０％の子牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン及びβ−２ＭＥを補足したＲＰＭＩ １６４０培地内で６日間、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養された骨髄の前駆細胞を分化することに由来するものである。これらの細胞はMayordomo et al.(1996）が記載したプロトコルに従って得られた。簡単に言うと、骨髄を、脛骨及び大腿骨から抽出し、リンパ球及びマクロファージを枯渇させ、ｒｍＩＬ−４及びｒｍＧＭ−ＣＳＦ（各々１０００Ul/mlずつ）を補足した上記のＲＰＭＩ １６４０培地の中で２４ウエル（０．２５・１０6細胞／ml）の培養平板上に播種した。３日目に、全く又はわずかしか接着性を持たない細胞を収穫し、新しい同じ培地で補足的培養を３日行うため、２４ウエルの培養平板（０．３・１０6細胞／ml）上に播種した。こうして得られた樹枝状細胞は、予想された表現型を持つ。こうして得られた樹枝状細胞は未成熟細胞である。これらは、インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦをＴＮＦ−α（１０ng/ml）及び／又はＬＰＳ（１〜１０μg/ml）と組合わせた培養での成熟のために誘発され得る。細胞は、共存培養のため成熟刺激から２４／４８時間後に使用される。自己由来及び同種異系の樹枝状細胞を共存培養に使用することができ、効率は同じである。さらに、成熟及び未成熟樹枝状細胞も区別なく使用できる。
【００８１】
４．樹枝状細胞の触発
樹枝状細胞は、異なるプロトコルに従って触発させることができる。例中で使用されている方法の１つは、分裂中の線維芽細胞（特にＬ−９２９又はＮＩＨ ３Ｔ３系統の細胞）の存在下での樹枝状細胞（成熟又は未成熟）の共存培養を含む。この共存培養は一般に、２４〜４８時間維持され、ｔＤＣは約２０時間の共存培養後に得ることができる。もう１つの方法に従うと、樹枝状細胞は、好都合には分裂中の線維芽細胞（特にＬ−９２９、ＮＩＨ３Ｔ３又はＭＲＣ５系統の細胞、ヒトの肺線維芽細胞の一次培養）の培養上清を含む触発培地の中でインキュベーションされる。以下の例においては、使用される上清は、３倍に希釈され、培養はＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地内で行われた。腫瘍細胞（肥満細胞）の培養上清を含む培地を触発・培地として使用して、もう１つの触発実験を実施した。
【００８２】
５．ＮＫ細胞の生成
ＮＫ細胞は、３７℃で２〜３時間塑性付着段階の後、ＳＣＩＤ又はＲag２-/-マウスの脾臓から休止状態で得られる。簡単に言うと、Ｂ６−Ｒag-/-マウス又はＳＣＩＤマウスの脾臓を上記のとおりにＲＰＭＩ １６４０完全培地内で解離させ、懸濁状態の細胞培養を生成した。赤血球の溶解後、細胞を１回洗浄し３７℃で２〜３時間播種した（２．５・１０6細胞／ml）。その後、非接着性細胞を収獲し計数した。これらの細胞は基本的に、休止状態のＮＫ細胞で構成されている。
【００８３】
６．ＮＫ／ＤＣ共存培養
共存培養のためには、触発済み又は未触発で自己由来又は同種異系の、未成熟又は成熟樹枝状細胞を収穫し、３回洗浄し、Ｕ字形の底を持つ９６ウエルの平板内で分離されたばかりの休止状態のＮＫ細胞（１・１０6個のＮＫ細胞／ml）に対して異なる混合比で添加した。個別にインキュベーションした細胞（樹枝状細胞及びＮＫ細胞）を、対照として類似の濃度で播種した。
【００８４】
７．インターフェロン−γの分泌試験
樹枝状細胞／ＮＫ細胞の共存培養上清を収集し、場合によって−７０℃で凍結させる。インターフェロンγの塩析測定試験は、市販のＥＬＩＳＡキット（Genzyme Corp. Cambridge, 米国）を用いて実施した。使用される試験の検出感度は、５pg/mlに近いものである。ＮＫ細胞に対する樹枝状細胞の比率を変動させることからなる用量効果を実施する。
【００８５】
８．ＮＫ細胞の細胞傷害性試験
ＮＫ細胞のin vitro細胞傷害性を、感受性ＮＫ（ＹＡＣ−１）又は耐性ＮＫ（Ｐ８１５）と標識づけされた標的のクロム５１塩析という古典的な方法に従って評価する。
より具体的に言うと、４０〜７２時間インキュベーションしたＮＫ／ＤＣ共存培養又は分離培養の細胞を収集し、リンパ球及び樹枝状細胞を排除するためトリパンブルーで標識付けし、計数し、ＹＡＣ−１及びＰ８１５を標的細胞として使用する細胞傷害性試験の中でエフェクター細胞として使用した。標的細胞を、Ｎａ51Ｃｒ4Ｏ（１００μCi／１０6細胞; New England Nuclear）と共に３７℃で１〜２時間プレインキュベーションし、１度洗浄し、５％の不活性ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ １６４０培地の中で３７℃で１／２時間インキュベーションした。その後、細胞を３度洗浄し、Ｖ字形の底を持つ９６のウェルのマイクロタイトレーション平板内でウェル毎に２・１０3個の細胞の割合で播種した。エフェクター細胞と標的細胞は、合計０．２mlの体積内で、異なるエフェクター／標的比で混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。標的細胞の溶解度を、Luma平板中に移された０．１mlの上清を計数することによって測定した。標識づけされた標的細胞のみを含むウェルから自発的塩析を決定し、セトリミド２％を添加することによってクロム５１の最大塩析を決定した。比細胞傷害性は、以下のように計算された：  クロム51の塩析百分率＝１００×（実験的cpmの値−自発的塩析の値）／（最大塩析のcpmの値−自発的塩析のcpmの値）。
in vivoでの試験のためには、ＡＫ７細胞を有するか又は腫瘍の無い２〜３匹のマウスの脾臓を、ＦＬ化合物又はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）による２０日の処理の後に採取した。浸透溶解により赤血球を枯渇させた脾細胞の懸濁物を直ちに、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細胞を標的として用いる上記のとおりの細胞傷害性試験の中でエフェクター細胞として使用した。
【００８６】
９．ＦＬ化合物によるマウスのin vivo処置
０．１mlのＰＢＳの体積中の最低腫瘍発生用量のＡＫ７細胞（３・１０6個の細胞）をマウスの右脇腹に皮内投与接種する。ＣＨＯ細胞から誘導されたＦＬ化合物は、Immunex Corps (Seatle, USA, Lynch et al., Nature Medecine 3: 625, 1997）により供給された。このサイトカインを、１mlあたり１００μgでＰＢＳ中に希釈した形で使用した。発生２０日目のＡＫ７腫瘍（直径約２０mm2)を合計０．１mlの体積でＦＬ又はＰＢＳ（１０μg）を一日一回連続２０日間注射（左脇腹に皮下注射）することにより処置した。一週間に２度腫瘍の成長についてマウスを検査し、ノギスを用いて、ミリメートル単位の２つの垂直直径を測定することにより、腫瘍の平均寸法を例示した。腫瘍の成長率は、ＦＬによる１日目の処置の後の時間との関係における腫瘍のサイズ（mm2)を報告することによって決定された。全ての研究は、５匹の動物からなる群を用いて少なくとも４回実施された。
【００８７】
１０．in vivoでの抗体による枯渇の実験
枯渇実験においては、抗ＣＤ８α抗体（クローンＹＴＳ１９１．１．２，ラットのＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４抗体（クローンＹＴＳ１６９．４．２．１，ラットのＩｇＧ２ａ）及び抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６，マウスのＩｇＧ２）を使用した。胸腺欠損マウスの体内でハイブリドーマを培養し、腹水を前述の技術に従ってまずはカプリル酸で次に硫酸アンモニウムでの沈殿により回収、精製し、ＰＢＳに対し透析し、次に１mg/mlに調整した（Mckinney, 1987）。図面の説明中に相反する表示のないかぎり、枯渇は、Ｂ６マウスのＦＬによる処置の１日目に開始され、連続３日間腹腔内に２００〜３００μgのモノクローナル抗体を注射し、その後はＦＬ処置の間２日に一回注射した。ＦＬ処置の後、モノクローナル抗体を４日の間隔をおいて２回投与する。螢光抗体を用いてフローサイトメトリーによって平行して行われた複数の実験により、観察された枯渇が、ＦＬ処置の９日目と２０日目で、標的とされた細胞亜個体群について９９％を上回っていることを確認することができた。Ｂ７の遮断実験のためには、ＦＬ処置の１０日目と１８日目の間で２日の間隔をおいてＣＴＬＡ４Ｉｇマウス融合タンパク質（Hoffman La Roche, ItalyのL. Adoriniにより提供された）２００μgをマウスに腹腔内注射した。内因性ＩＬ−１２の中和研究のためには、ＦＬ処置の５日目と１７日目の間で３日の間隔を置いて３００μgの個別用量で、抗−ｐ４０ＩＬ−１２精製抗体（クローンＣ−１７−８，ラットのＩｇＧ２ａ）を腹腔内注射した。内因性インターフェロンγの中和研究のためには、ＦＬ投与の１０日目、１５日目及び２０日目に、マウス一匹あたり３００μgの抗インターフェロンγ抗体（ハムスターのＩｇＧ）を腹腔内注射した。全ての実験は、１群あたりネズミ５匹の割合で、少なくとも２度実施した。
【００８８】
１１．マウスにおける樹枝状細胞の養子移入
１日目又は２０日目のＡＫ７腫瘍を有するＢ６−ヌードマウス又はＳＣＩＤマウスに、２週間、２〜５・１０6個の未成熟樹枝状細胞を一週間２度の割合で皮下腫瘍内注射した。１群あたり５匹のマウスを処置した。前述のとおりに腫瘍の成長を検査した。
【００８９】
１２．データの統計学的分析
異なる実験群（標準偏差を伴って平均として示されている）間の差の有意な性質を解釈するため、Fisherの方法そのものが使用された。樹枝状細胞の受身移入実験を解釈するため、Studentのｔ試験を用いて２つの群を比較した。９５％の結果における有意な性質は、個々の実験各々について表されている。
【００９０】
【実施例】
以下の例で紹介されている結果は、特に以下のことを明らかにしている：
１）  精製された樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養は、成熟樹枝状細胞及びＮＫ細胞の生存及びＮＫ細胞の急速な活性化をひき起こすこと、換言すると、樹枝状細胞は、その他に知られているものが全くない場合、サイトカインを添加することなく、また共存培養内のＩＬ−２、ＩＬ−１２の検出可能な分泌等を立証することなく、ＮＫ細胞を、その感受性あるＮＫ天然標的に対しきわめてＩＮＦγ分泌性が高く殺傷性のあるものにすることを可能にするものであり得ること。
２）  樹枝状細胞の養子移入あるいは樹枝状細胞のin vivoでの直接的拡大は、ＮＫの活性化に起因する重大な抗腫瘍効果をひき起こすこと。
【００９１】
例１：  樹枝状細胞は、細胞溶解活性及びin vitroでのＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生を刺激する。
この例は、分化の異なる段階で樹枝状細胞がin vitroで休止状態のＮＫ細胞を活性化させる特性を持つことを例示している。細胞傷害活性、インターフェロンγ産生及び増殖について試験を行った。
一連の実験において、同系の骨髄から誘導されたばかりの樹枝状細胞を、インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養し、未成熟状態に維持した（材料及び方法を参照のこと）。未成熟樹枝状細胞を収集し、集中的に洗浄し、サイトカインが無い状態で完全培地内で、同系のＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスで採取されたばかりの脾細胞から得た非接着性の単核細胞と、約１：１の初期比で同時インキュベーションした。これらの非接着性脾臓細胞の３分の１は、モノクローナルＤｘ５抗体又は抗−ＮＫ１．１モノクローナル抗体で、陽性標識づけされる。４０〜７２時間の共存培養後、ＮＫ細胞を計数し、異なるエフェクター／標的比で、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細胞に対し４時間、クロム５１の塩析の測定により細胞傷害性試験において試験した。
得られた結果は図１に示されており、これらの樹枝状細胞がＮＫ細胞の細胞溶解活性の活性化を誘発することを示している。特にこれらの結果は、次のことを示している：
−  ２つの細胞型の共存培養が、生存可能なＮＫ細胞の収獲を可能にすること及び、
−  ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比で同時インキュベーションされる場合、ＹＡＣ−１細胞の２０〜５０％の特異的溶解が２５〜１００：１というエフェクター細胞／標的細胞比で得られること。非感染性のＮＫであるＰ８１５細胞、試験された条件下で溶解されず、類似の濃度で別々に培養された２つの細胞個体群（ＮＫ細胞と樹枝状細胞）はいずれも、ＹＡＣ−１細胞の有意な溶解を誘発しない（図２〜３）。
【００９２】
もう１つの１連の実験では、脾臓の樹枝状細胞系統が使用された。この系統は、未成熟段階での細胞の長期にわたる成長及びその触発を可能にする培養条件下に維持された。この系統は次に、２４時間ＴＮＦα又はＬＰＳの存在下で成熟へと誘発された。成熟した細胞は、以前にWinzler et alにより記載されたように、重大な形態学的変化を呈する。集塊はもはや付着性をもたず、ＦＡＣＳによる分析は、分子ＤＣ１１Ｃ、Ｉ−Ａｂ、Ｂ７．２及びＤＣ４０の多大な発現を明らかにする。これらの成熟樹枝状細胞は上記のものと同じ条件下で、異なる比率でＢ６−Ｒag-/-マウスにおいて収獲されたばかりの休止状態のＮＫ細胞との４０〜４８時間の同時インキュベーションにより試験された。得られた結果は図２〜３に示されている。これらの結果は次のことを示している：
−  ２つの細胞型の共存培養は、別々のＮＫ細胞の培養の場合に比べはるかに優れた形でウェル内に生存可能なＮＫ細胞を収獲することを可能にする（１０〜３０％対２〜５％）。
−  ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比率で同時インキュベーションされた場合、ＹＡＣ−１細胞の４０〜６０％の特異的溶解が２５：１という標的細胞／エフェクター細胞比で得られる。ＮＫ非感受性であるＰ８１５細胞は、試験されたあらゆる条件下で溶解されなかった。類似の濃度で培地内で別々に培養された２つの細胞個体群（ＮＫ細胞及び樹枝状細胞）のいずれも、ＹＡＣ−１細胞の有意な溶解を誘発しなかった（図２）。ＭＣＡ２０５、ＭＣＡ１０１、ＴＳ／Ａ又はＡＫ７といったようなＭＨＣクラスＩで弱陽性のその他の腫瘍細胞の分解も、活性化されたＮＫ細胞の存在下で観察された（結果は示さず）。
得られた結果は同様に、ＮＫ−ＤＣの共存培養上清が、刺激性樹枝状細胞の数に応じて減少する有意なレベルのインターフェロンγを含有することをも示している（図３）。これと逆に、別々に培養されたＮＫ細胞の又は樹枝状細胞の上清の中には、インターフェロンγは検出できなかった。４０〜７０時間の共存培養後にチミジンの取込みによって決定されるように、これらの共存培養条件下では有意な増殖は全く観察されなかった。
したがってこれらの結果は、インターフェロンγの産生のためと同時に、時としてＫＩＲ効果を超える腫瘍細胞に対する特異的溶解活性のため、ＮＫ細胞の活性を刺激する未成熟及び成熟樹枝状細胞の能力を例示している。
【００９３】
前述の経験と類似した形で、同種異系細胞がＮＫ細胞の活性を刺激する能力を有しているということも立証された。簡単に言うと、０．１〜０．３：１のＮＫ：ＤＣ比で成熟樹枝状細胞の存在下で４０〜４８時間の共存培養によりＳＣＩＤＢＡＬＢ／ｃマウスの非接着性同種異系脾細胞が活性化された。結果は図２及び３に紹介されており、これらの同種異系樹枝状細胞がＮＫ細胞の溶解特性と同時にインターフェロンγの産性をも活性化するということを示している。
これらの結果全体は、それが骨髄又は脾臓から誘導された樹枝状細胞であろうと樹枝状細胞の確立された系統であろうと、自己由来又は同種異系の成熟又は未成熟樹枝状細胞が、触発された時点でＮＫ細胞の溶解活性ならびにＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生を共存培養によって有効に活性化する能力を持つ、ということを明らかに示している。
【００９４】
例２：  樹枝状細胞によるＮＫ細胞の刺激には、直接的細胞接触が関与する。成熟樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の活性化の原因となり得るＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮα／β又はＴＮＦαのような異なるサイトカインを分泌するものとして知られている。樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化における可溶性因子の考えられる関与を決定するためには、「トランスウェル」培養系が使用された。図４に紹介されている結果は、細胞溶解活性及び樹枝状細胞に応えたＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生が、ＮＫ細胞が樹枝状細胞と接触した状態で同時インキュベーションされる場合にのみ検出され、細胞を多孔性膜で分離した場合には検出されないことを示している。したがって、これらの結果は、樹枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化には細胞と細胞の直接的接触又は相互作用が必要であること、そしてこの活性化は、樹枝状細胞の膜内に存在する同時刺激因子が関与していることを示している。
【００９５】
例３：  ＦＬ化合物による樹枝状細胞系統の白血球の拡大には、Ｂ６−ヌードマウス又はＲag２Ｂ６-/-において発生した陰性クラス１の腫瘍の退行が伴う。ＡＫ７細胞は、脇腹内での長期間の発生後に腹腔内に自発的に浸透する免疫原性の低いＢ６マウスの同系中皮腫細胞系統を表す。こうして得られた腫瘍ＡＫ７は、in vitroできわめて低いレベルのクラスＩの分子を発現する。Ｂ６−ヌードマウスの体内で発生２０日目の腫瘍ＡＫ７のＦＬ化合物による処置は、腫瘍成長の過渡的な抑制そして最終的にin vivoでの有意な成長の遅延を誘発する（図５参照）。逆にＦＬ化合物は、in vitroでＡＫ７細胞に対し直接的な細胞傷害性効果を全くもたらさない。in vivoでのこれらの腫瘍効果は、樹枝状細胞系統の白血球拡大に起因する脾腫及び腺腫が観察された、ＦＬによる治療の１０日目に観察され始める。
腫瘍成長速度は、ＦＬ処置の停止後５〜１０日目に、樹枝状細胞の数が減少した時点で通常のリズムをとり戻す。Ｂ６−ヌード又はＲag２Ｂ６-/-マウスにおいて観察されたＦＬによって誘発された抗腫瘍効果は、免疫適合マウスにおいて報告されたものと同じ位顕著であり（図７）、Ｔ細胞及びＢ細胞のいずれも腫瘍成長の遅延に関与しないということを強調している。
したがって、これらの結果は、樹枝状細胞の成長因子の投与が陰性クラスＩ腫瘍の退行を誘発することを立証している。これらの結果はさらに、この効果がＴ細胞又はＢ細胞の活性に起因するものでないということをも示している。
【００９６】
例４：  ＦＬ化合物により媒介される抗腫瘍効果は、ベージュマウスにおいて観察されず、腫瘍を持つ免疫適合マウスにおいては、抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体の投与によって遮断される。
ＦＬによって誘発される抗腫瘍効果のメカニズムをより精確に決定するような形で、ＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ベージュマウスを、類似の治療体制に従ってＦＬにより処置した。
Ｂ６−ベージュマウスは、ＦＬの投与にも関わらず、死をひき起こすまで漸進的に肥大する中皮腫を呈する（図６）。ＦＬにより誘発される殺腫瘍活性におけるＮＫ細胞の関与をより精確に決定するような形で、抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体を使用することによりＢ６−免疫適合マウスを枯渇させた。図７に紹介されている結果が示すように、この枯渇は、ＦＬにより誘発された抗腫瘍効果を完全に無効にするために必要かつ充分なものである。したがって、これらの結果は、抗腫瘍剤としてのＦＬ化合物の効率においてＮＫ細胞が必要かつ充分な非常に重要な役割を果たすということを示している。
【００９７】
例５：  ＦＬ化合物は、in vivoで脾臓ＮＫ活性を有意な形で増大させる。
この例は、in vivoでＮＫ細胞の活性を増大させるＦＬ化合物の能力を例示している。脾細胞及びリンパ神経節の単核細胞内でＦＡＣＳ分析により抗−ＮＫ１．１モノクローナル抗体で陽性と標識されたＮＫ細胞の絶対数は、腫瘍を呈するマウスにおいて及び腫瘍無しのマウスにおいて３〜５倍わずかに増大させられた。腫瘍ＡＫ７を呈する又は呈さないマウスにおいてＦＬ化合物又は食塩水により処置されたＢ６マウスの２０日目に収獲された脾細胞は、４時間にわたるクロム５１の塩析試験においてin vitroでＹＡＣ−１細胞に対する自発的細胞溶解活性について試験された。ヌードマウス又は免疫適合マウスを用いて同時に実施された異なる実験において、ＮＫ活性の有意な増大が示されたもののインターフェロンγの産生の有意な増大は示されず、腫瘍そのものの存在に帰することのできる有意な効果はなかった（図８）。Ｐ８１５細胞に対してはいかなる溶解も観察されなかった。そのうえ、血清又は脾臓のリンパ神経節の単核細胞の培養上清の中のインターフェロンγ及びＴＮＦαについてのサイトカインレベルは、試験された全ての条件において統計的に異なっておらず、ＩＬ−１β及びＩＬ−１２についていかなる検出可能レベルも観察されなかった。したがってこれらの結果は、ＦＬ化合物による処置がin vivoでの脾臓内のＮＫ活性の増大と関連性を持つということを示している。
【００９８】
例６：  抗−ＣＤ８αモノクローナル抗体又はＣＴＬＡ４−Ｉｇモノクローナル抗体の投与によるヌードマウスの枯渇は、ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果を有意な形で遮断する。
この例は、細胞溶解ＮＫ活性の周辺増大及びＮＫ依存性の抗腫瘍効果における、ＦＬ化合物により誘発された骨髄性又はリンパ球様樹枝状細胞の亜個体群の役割について記載している。リンパ球様樹枝状細胞は、in vitroでのＳＡＣ＋ＩＦＮγ刺激に反応してＩＬ−１２を分泌するものとして記載されてきたことから、ＩＬ−１２がＮＫ細胞の刺激因子であるかぎりにおいて、抗ＣＤ８αモノクローナル抗体を用いた陽性ＣＤ８αリンパ球様樹枝状細胞（ＤＥＣ２０５＋）の選択的枯渇が、Ｂ６−ヌードマウスにおいて行われた。枯渇性モノクローナル抗体の注入は、ＦＬの存在下での分化された樹枝状細胞（ＦＬ０日目）が現われると直ちに開始され、高用量でのＦＬ処置の停止後最高１０日間続行された。ＣＤ８α分子は、Ｂ６−ヌードマウスにおいてマウスのＮＫ細胞上で発現されず、このため枯渇はリンパ球様樹枝状細胞の亜個体群に標的化されることになる。抗−ＣＤ８αモノクローナル抗体で枯渇されたＡＫ７腫瘍を持つマウスは、枯渇されていない対照マウス又は抗ＣＤ４抗体の注射を受けたマウスに比べ、ＦＬ処置に対する反応の有意性が低いものである（図９）。しかしながら、ＦＬ化合物は、この化合物で処置されていない動物に比べて、ＦＬを受けかつ陽性ＣＤ８α細胞が枯渇したマウスにおいて有効であり続けており、このことは、リンパ球様樹枝状細胞が、ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果に部分的にのみ関与するということを強調している。ＣＤ４マーカーを発現する骨髄性樹枝状細胞の小さな個体群は、これらの抗腫瘍効果に参加しないと思われる（図９）。
ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果における樹枝状細胞の非常に重要な役割を確認するため、ＮＫ細胞による認識のエフェクター段階に関与するものとして知られている同時刺激分子Ｂ７を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇマウス融合タンパク質の全身的注入を使用して標的化した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの全投入期間中、腫瘍の成長の抑制に対するＦＬの効率の統計的に有意な喪失が見られた（図１０）。反対に、対照実験におけるヒトＩｇＧの注入がin vivoでのＦＬの効率を変えることはなかった。ＡＫ７腫瘍がin vitroでＢ７分子を発現しないということを強調しなければならない。全体として、これらのデータは、陽性Ｂ７細胞及び／又は樹枝状細胞が、ＦＬ成長因子により得られるＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果において不可欠であること示している。
【００９９】
例７：  インターロイキン１２は、ＦＬにより誘発されるＮＫ抗腫瘍効果に関与しない。
サイトカインＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、in vivoでＮＫ活性を刺激するものとして知られているＴｈ１タイプのＴサイトカインである。そのうえ、前述の例で記載されたとおり、ＩＬ−１２を分泌する能力を持つリンパ球用樹枝状細胞の亜個体群は、観察された抗腫瘍効果にとって重要なものである。血清又は単核細胞から誘導された脾臓又はリンパ節の上清の中のＩＬ−１２レベルは、ＦＬによる処置を受けた動物において検出できないものであったが、マウスには、ＦＬ処置の５日目から２０日目に至るまで抗Ｐ４０ＩＬ−１２中和抗体を注射した。in vivoでは、ＦＬにより誘発された抗腫瘍効果に対するこれらのモノクローナル抗体の阻害効果は全くみられなかった（図１１）。これに対しin vivoでのインターフェロンγの中和により、ＦＬにより媒介された抗腫瘍効果を過渡的に遮断することが可能となり、このことはすなわち、中皮腫がＩＦＮγ感受性を持つためにＮＫの細胞傷害性がＩＦＮγにより媒介されることを暗に意味している（図１２）。得られたその他の結果がこれらの観察を裏づけている。特に、（ｉ）タイプ１のインターフェロンのレセプターについてのノックアウトマウスは、常に、本発明による樹枝状細胞により活性化可能なＮＫ細胞を提示する、（ii）これらの共存培養の上清はＣＴＬＬ２を増殖させず、このことは、これらの条件下で産生されたＩＬ−２又はＩＬ−１５の不在を証明している、及び（iii）抗−ＩＦＮγ抗体はin vivoでＦＬ化合物の活性をほとんど妨げない。
【０１００】
例８：  ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の発生期又は腫瘍の成長２０日目の樹枝状細胞細胞の養子移入は、腫瘍の成長に影響を及ぼす。
樹枝状細胞の発達した個体群の独立したＮＫ活性の増大を報告することのできる間接的な事象を全て完全に排除するような形で、またＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の対話の直接的in vivo効果を明確に試験するような形で、強いＮＫ活性を呈するものとして知られているＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ヌード又はＳＣＩＤマウスに、ＡＫ７から１日目又は２０日目以降２週間にわたり週２度の割合で未成熟樹枝状細胞を２００〜５００万個皮下注射により受身移入させた。
結果は、図１３及び１４に示されており、対照群と比べて、樹枝状細胞により処置されたマウスの群における腫瘍の成長の有意な遅延を示している。これらの結果は、in vivoでのＮＫ細胞の活性の刺激における樹枝状細胞の役目を明確に示している。
【０１０１】
例９：  異種間触発培地による未成熟樹枝状細胞の触発
この例は、未成熟樹枝状細胞が、異種間培地の中で（因子の存在下で）触発され得ること、そして、触発がその成熟段階を改変しないことを例示する。
８日間ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＭ（ＣＭ）内で単球から誘導された５×１０6個の未成熟ＤＣ（ＭＤ−ＤＣ）を、以下のものの存在下で２４〜４８時間（８日目〜１０日目）培養した：
−  ４８時間培養された１０×１０6個の線維芽細胞Ｌ−９２９の上清に対応する触発培地（最終培地の１／３）及びＣＭ（最終培地の２／３）からなる培地；−  又は照射（５０００rads）を受けた１×１０6個の線維芽細胞Ｌ−９２９の存在下で、ＣＭ培地内で。
４８時間のインキュベーションの後、ＭＤ−ＤＣを回収し、単独で又は、健康なドナーの血液から負の免疫的選択により精製された同種異系のヒトＮＫ細胞の存在下で共存培養した（培養比：１ＮＫに対し２ＤＣ，ＮＫ濃度０．３×１０6個／ml）。その後ＤＣ／ＮＫの共存培養又はＤＣ単独又はＮＣ単独の上清をＥＬＩＳＡにて評価し、ＩＦＮγを測定した。これと並行して、共存培養細胞を回収し、番号づけし、クロムを含む標的５１Ｃｒ上に置いてそれらの溶解能を４時間にわたり評価した。得られた結果は図１５〜１６に示されている。これらの結果は明らかに、ＩＦＮγの分泌及び休止状態のＮＫ細胞の溶解活性を活性化する触発済み未成熟樹枝状細胞の高い能力を示している。
【０１０２】
例１０：  樹枝状細胞から誘導された調製物によるＮＫ細胞の活性化。
この例は、樹枝状細胞から誘導された調製物をＮＫ細胞の活性化のために使用できることを例示する。特に、この例は、樹枝状細胞から産生された膜小胞（又はデキソゾーム）がＮＫ細胞を活性化することを示している。
この例では、ＡＩＭＶ＋PeniStrepto＋Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ＋１０００IU/mlのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦという標準培地内で、転移性腫瘍（黒色腫、骨髄腫、リンパ腫）を持つ被験者又は健康な被験者の単球の接着性画分から、ヒトＭＤ−ＤＣ細胞を培養した。５日目又は６日目に培地を交換し、次に２４〜４８時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベーションしたこれらのＭＤ−ＤＣの上清を０.２μmのフィルターに通し、デキソゾームを分離するため７０，０００ｇで超遠心分離した。
材料及び方法（項目３及び４）で記載されているとおりに、マウスのＢＭ−ＤＣを培養し触発した。そのうえ、骨髄前駆体も代替的に１０００IU/mlのＧＭ−ＣＳＦ単独にて培養した。ＤＣを６日目まで培養し、デキソゾーム（ＤＥＸｍ）が由来する培養物の上清を３日目から６日目まで蓄積させた。これらを次に、例えば特許出願ＦＲ９７０９００７及びＦＲ９８０１４３７に記載されている手順に従って、又は示差的超遠心分離により回収する。
マウス及びヒトのＮＫ細胞を、材料及び方法（項目５）で記載されているとおりに収集した。
ＮＫ細胞をデキソゾームの存在下におくためには、ＳＣＩＤ／ＢＡＬＢｃマウスの脾臓のＮＫ細胞を、１５０万個／mlの濃度で円錐形の底を持つ９５ウェルの平板内でインキュベーションした（これらの脾細胞は３０％のＤＸ５＋ＮＫを含有する）。その後、デキソゾームをウェルあたりエキソゾームタンパク質１０〜２０μg（Bradford試験）の割合で添加し、細胞傷害性（ＹＡＣ−１細胞に対する）及びインターフェロンγの産生（マウス、ＩＦＮｇ、ＥＬＩＳＡで試験された上清）試験を行うため、１８〜２０時間目に細胞を回収した。細胞傷害性及びインターフェロン測定試験を、材料及び方法（項目７及び８）の中で記載されているとおりに実施した。
【０１０３】
得られた結果は、図１７〜２５で示されている。これらの結果は、未成熟で未触発の樹枝状細胞から産生されたデキソゾームによるきわめて顕著な活性化である、樹枝状細胞デキソゾームによるＮＫ細胞の活性化を明確に示している。さらに、観察された活性化は、ヒトデキソゾームがマウスＮＫ細胞を活性化することから、種のバリアを交叉させる。
より具体的に言うと、図１７は、ＤＸ５＋ＮＫ１００万個あたり約２０μgの用量で、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ内で培養されたマウス樹枝状細胞（ＢＭ−ＤＣ）に由来するエキソゾーム調製物により刺激されるＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスのＮＫ（３０〜４０％のＤＸ５＋細胞すなわちＮＫ細胞を含む脾細胞）によるマウスＩＦＮγの産生を示している。この用量では、大部分のケースにおいてＢＭ−ＤＣの直接的上清がＮＫの活性化に対し大きな影響を持つことはないのに対し、エキソゾームは、休止状態のＮＫの基本的細胞傷害性（図１８）ならびにそのin vitroでの生存（図１９）をも増大させる。図２０に示された結果はさらに、デキソゾームの投与後に「ヌード」マウスにおいて腫瘍ＡＫ７の平均サイズが減少することを示していることから、in vivoでのこの活性を確認している。したがって、これらの結果は、未成熟樹枝状細胞のエキソゾームがＮＫの活性を刺激することを示す。これらの結果は、同様に、活性化レベルがデキソゾームの濃度により影響されること、そしてＮＫ細胞１０6個あたり１０μg以上の用量が、in vitro及びex vivoでの活性化にとって好ましいことをも示している。
【０１０４】
なお、図２１に示されている結果は、ヒト樹枝状細胞のデキソゾームについてのこれらの観察を確認している。この実験において、ＭＤ−ＤＣは約９日間ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦの中で培養された。基本的に未成熟状態にあるこれらの細胞により分泌されたエキソゾーム（ＤＥＸｈ）は、７日目から９日目まで又は６日目から８日目まで回収された。これらのヒトデキソゾーム（ＤＥＸｈ）は、マウスＮＫ細胞の存在下で前述の条件で、ＮＫ細胞１００万個あたり２０〜４０μgの用量でインキュベーションされた。得られた結果は、ＩＦＮγの産生の刺激を示し、ＮＫ細胞の活性化を明らかにしている。
なお、図２２〜２３に示されている結果は、ベータ２−ミクログロブリン（古典的又は類似のクラスＩのＭＨＣ分子）の遺伝子又はクラスIIのＭＨＣの分子が欠損したマウス（「ノックアウト」）から由来するマウスＤＣのエキソゾームが、ＩＦＮγの産生のために休止状態のＮＫを刺激するその能力を保持する、ということを示している。これらの結果は、（ｉ）デキソゾームの刺激活性を確認し、（ii）刺激因子が（ＫＩＲｓ−キラー阻害レセプター、小又はＫＩＲｌ−キラー阻害レセプター、長の系統群のいくつかの要素とは異なり）クラスＩのＭＨＣの分子であると思われない、ということを表している。得られた結果は特に、ベータ２ミクログロブリン-/-Ｋ.Ｏ（図２２）又はクラスII. Ｋ.Ｏ.マウス（図２３）に由来するＤＣのデキソゾームで刺激されたＮＫによるＩＦＮ−γの産生が強いことを示す。ＮＫの刺激は、同様に、樹枝状細胞全体を使用することによっても観察された。
【０１０５】
最後に、図２４〜２５は、樹枝状細胞の刺激活性とそれが分泌するエキソゾームの間の或る種の相関関係を示す。したがって、示されている結果は、活性のきわめて高い樹枝状細胞（例えば成熟、場合によっては触発済み）が、より活性の低いデキソゾームを分泌することを示している。逆に、より低い活性を示す樹枝状細胞（例えば未成熟で未触発の樹枝状細胞）はきわめて活性の高いデキソゾームを分泌する。したがってこれらの要素は樹枝状細胞の状態に応じて、内部膜小胞から外部原形質膜までの刺激因子の移入を示唆している。より具体的に言うと、図２４は、ＧＭ−ＣＳＦ及び低用量のインターロイキン−４（１×）の存在下で培養されたＤＣのエキソゾームが、ＧＭ−ＣＳＦ及び高用量のＩＬ−４（５×）の存在下で培養されたＤＣに由来するそのホモログに比べ、はるかに有意にＮＫを刺激するのに対し、それらが誘導されたＤＣについては状況は逆である、ということを示している。
同様に、図２５は（Ｌ９２９の上清中で）触発済みＢＭ−ＤＣ細胞により分泌されたマウスのエキソゾームが、未触発のＢＭ−ＤＣに由来するそのホモログほど有意にＮＫを刺激せず、それらが由来したＤＣについては状況が逆転するということを示している。これに匹敵する結果が、ヒト樹枝状細胞を用いても得られた。
【０１０６】
したがってこれらの結果全体は、（ｉ）デキソゾームが休止状態のＮＫ細胞の活性を刺激する能力を持つこと、（ii）最も活性の高いデキソゾームは、より活性の低いつまり不活性の（そして場合によっては未触発の）樹枝状細胞により産生されると思われること、（iii）デキソゾームによる活性化が種のバリアを交叉させること、（iv）ＮＫ活性化の原因となる刺激因子がＤＥＸの表面にあり、同時刺激（もう１つの膜因子又はサイトカイン）を伴って又は伴わずに直接ＮＫに提示されること、そして（ｖ）刺激因子は、クラスＩのＭＨＣ分子であると思われないことを示している。したがってこれらの結果は、in vitro、ex vivo又はin vivoでのＮＫの活性化のためのデキソゾームの使用を支持している。
【図面の簡単な説明】
【図１】未成熟樹枝状細胞はin vitroでＮＫ活性を刺激することを示す。
【図２】成熟した脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性を刺激することを示す。
【図３】成熟した脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞によるＩＦＮγの産生を刺激することを示す。
【図４】活性化にはＮＫ細胞と樹枝状細胞の接触が関与することを示す。
【図５】腫瘍ＡＫ７を有するＢ６ヌードマウスにおけるＦＬの投与は腫瘍の成長の抑制を誘発することを示す。
【図６】ＦＬにより誘発される抗腫瘍効果はＮＫ細胞に依存することを示す。
【図７】ＦＬにより誘発される抗腫瘍効果はＮＫ細胞に依存することを示す。
【図８】ＦＬによる治療にはマウスＢ６の脾臓において増大したＮＫ活性を伴うことを示す。
【図９】Ｂ６ヌードマウスにおける抗ＣＤ８α抗体または抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験を示す
【図１０】in vivoでのＣＴＬ４Ｉｇの同時投与を示す。
【図１１】in vivoでの抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２のモノクローナル抗体の同時投与を示す。
【図１２】in vivoでの抗ＩＦＮγモノクローナル抗体の同時投与を示す。
【図１３】ＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウスにおける脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の予防的抗腫瘍効果を示す。
【図１４】ＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウスにおける脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の治療的抗腫瘍効果を示す。
【図１５】触発された未成熟樹枝状細胞による、ヒトＮＫ細胞の活性化（ＩＦＮγの測定）。
【図１６】触発された未成熟樹枝状細胞による、ヒトＮＫ細胞の活性化（遊離クロムの測定）。
【図１７】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウスＮＫ細胞を活性化することを示す（ＩＦＮγの測定）。
【図１８】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウスＮＫ細胞を活性化することを示す（ＹＡＣ１細胞の細胞溶解の測定）。
【図１９】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウスＮＫ細胞を活性化することを示す（ＮＫ細胞の生存率の測定）。
【図２０】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウスＮＫ細胞を活性化することを示す（in vivoでの腫瘍の平均サイズの測定）。
【図２１】ヒト樹枝状細胞のエキソゾームは休止状態のマウスのＮＫ細胞を活性化させることを示す。
【図２２】β−２−ミクログロブリンについてのＫＯマウスの樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活性化することを示す。
【図２３】クラスIIＭＨＣ分子についてのＫＯマウスの樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活性化することを示す。
【図２４】低用量または高用量のＩＬ−４で産生された樹枝状細胞と、それが産生するデキソゾームの活性の比較を示す。
【図２５】触発済みまたは未触発の樹枝状細胞と、それが産生するデキソゾームの活性の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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