(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の１ないし33のアミノ酸を含み、そして溶液中で三量体化するロイシンジッパードメイン、並びに異型哺乳類膜貫通蛋白質の細胞外領域を含む融合蛋白質をコードする発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細胞を培養することによって、可溶性オリゴマー哺乳類蛋白質を調製する方法。
【請求項２】
異型哺乳類膜貫通蛋白質がタイプII膜貫通蛋白質を含み、そしてロイシンジッパーが細胞外領域のアミノ基に近接する末端に融合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異型哺乳類膜貫通蛋白質がタイプＩ膜貫通蛋白質を含み、そしてロイシンジッパーが細胞外領域のカルボキシル基に近接する末端に融合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、ロイシンジッパードメインを除去して可溶性オリゴマー哺乳類蛋白質を提供する工程を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
可溶性オリゴマー哺乳類蛋白質を調製するための方法であって、第一ロイシンジッパーと第一異型哺乳類蛋白質とを含む第一融合蛋白質をコードする第一発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた第一宿主細胞を培養し、第二ロイシンジッパーと第二異型哺乳類蛋白質とを含む第二融合蛋白質をコードする第二発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた第二宿主細胞を培養し、ここにおいて、第一および第二ロイシンジッパードメインは優先的にヘテロ三量体を形成し、そして、ヘテロオリゴマー形成を促進する条件下で第一および第二融合蛋白質を組み合わせることを含む、そして、第一及び第二ロイシンジッパーの一方又は双方が、配列番号２の１ないし33のアミノ酸を含む、前記方法。
【請求項６】
以下の：
（ａ）配列番号２の１ないし33のアミノ酸を含み、そして溶液中で三量体化するロイシンジッパードメインと、異型哺乳類膜貫通蛋白質の細胞外領域との融合対；
（ｂ）配列番号２の１ないし33のアミノ酸を含み、そして溶液中で三量体化するロイシンジッパードメインと、腫瘍壊死因子／神経成長因子ファミリー及びその受容体の蛋白質の可溶性ホモ三量体形成ドメインとの融合体
からなるグループから選択される蛋白質。
【請求項７】
腫瘍壊死因子／神経成長因子ファミリー及びその受容体の蛋白質が以下の：
（ａ）TNFR;
（ｂ）TNFα；
（ｃ）TNFβ；
（ｄ）CD40L;
（ｅ）CD27L;
（ｆ）OX40L;及び
（ｇ）NGFR
からなるグループから選択される、請求項６に記載の蛋白質。
【請求項８】
異型哺乳類膜貫通蛋白質がタイプII膜貫通蛋白質であり、そしてロイシンジッパーが細胞外領域のアミノ基に近接する末端に融合している、請求項６に記載の蛋白質。
【請求項９】
異型哺乳類膜貫通蛋白質がタイプＩ膜貫通蛋白質であり、そしてロイシンジッパーが細胞外領域のカルボキシル基に近接する末端に融合している、請求項６に記載の蛋白質。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２の１ないし33のアミノ酸；および
（ｂ）異型哺乳類膜貫通蛋白質の細胞外領域
を含む蛋白質。
【請求項１１】
細胞外領域が可溶性CD40Lである、請求項10に記載の蛋白質。
【請求項１２】
請求項６ないし11のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、組換えDNA技術を使用する可溶性オリゴマー蛋白質の調製法に関する。
発明の背景
蛋白質の生物学的活性は適切な三次および四次構造、すなわち立体配座に依存している。多くの蛋白質はそれらの天然形態においてはオリゴマー（２つもしくはそれを上回るポリペプチド鎖からなる構造）として存在している。このようなオリゴマーは非共有結合性相互作用により安定化されることが良くあり、そしてそのため個々のペプチドの適切な三次構造に依存している。通常は天然形態の蛋白質を発現しない宿主細胞による適切な三次および四次構造を示す生物学的に活性な形態で組換え蛋白質を発現させることはしばしば重要な課題となっている。組換え蛋白質技術において特に興味の対象となっているのは、可溶性蛋白質としての生物学的活性形態をとる膜結合型の蛋白質の発現である。可溶性蛋白質は治療薬として、そして高度に精製された蛋白質を大量に必要とする他の適用法において有用である。
膜貫通蛋白質の可溶性形態は、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを削除し、そして適切なシグナルペプチドを添加してその蛋白質の可溶性形態の分泌を可能にさせることにより調製されている（Smith  el  al.、Science  238:1704、1987;Treiger  et  al.、J.Immunol.136:4099、1986）。幾つかの可溶性蛋白質は、膜蛋白質の細胞外ドメインを免疫グロブリンの重鎖不変領域に連結させた融合蛋白質として（Fanslow  et  al.、J.Immunol.149:65、1992;Noelle  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6550、1992）、あるいはマウスＴ白血球抗原CD8の細胞外ドメインとの融合蛋白質として（Hollenbaughet  et  al.、EMBO  J.11:4313、1992）発現されている。しかしながら、このような可溶性蛋白質は不適切な三次および／または四次構造のために生物学的活性を示さないことがある。膜貫通蛋白質の内の幾つかの可溶性形態は生物学的には活性であるが、発現性が乏しかったり、あるいは発現もしくは精製条件下で不安定であったりすることがあり、それはその蛋白質の一部分もしくは複数部分の欠損の結果としての構造変化に起因する。
ロイシンジッパー（Leucine  zipper）は、数々の蛋白質における保存ドメインとして存在する、４から５までのロイシン残基を含む反復性７残基モチーフ（repetitive  hepted  motif）を意味するのに用いられる用語である。ロイシンジッパーは短い平行らせん状コイルとして折り畳まれ、そしてロイシンジッパーがある蛋白質のあるドメインを形成する場合にはロイシンジッパーがその蛋白質のオリゴマー形成の原因となっていると考えられている。fosおよびjunロイシンジッパーから得られる配列は、ロイシンジッパー配列との融合蛋白質としての抗体のVLおよびVH領域をコードするDNAの発現による二重特異性抗体の形成において用いられている。（Kostelny  et  al.、J.Immunol.148:1547、1992）。また、ロイシンジッパー配列は、バクテリオファージλの可溶性DNA−結合性蛋白質であるλ抑制因子の二重体形成ドメインを置換するのに（Hu  et  al.、Science  250:1400、1990）、そしてペリプラズム腔内へ輸送される大腸菌（E. coli）のマルトース結合性蛋白質であるMalEの二量体形態の調製（BlondelおよびBedoulle、Protein  Engineering  4:457、1991）にも用いられている。
当該技術分野においては、生物学的に活性な組換えオリゴマー蛋白質、具体的には生物学的に活性な立体配置をとる膜結合型の可溶性蛋白質の発現法を開発する必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、ロイシンジッパードメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質をコードする発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細胞を培養することによる可溶性オリゴマー哺乳類蛋白質を調製する方法に関する。ある態様においては、異型哺乳類蛋白質は哺乳類の膜貫通蛋白質の細胞外ドメインを含み、そして得られる融合蛋白質はオリゴマーを形成する。他の態様においては、異型哺乳類蛋白質はサイトカインのような可溶性蛋白質を含み、そして得られる融合蛋白質はオリゴマーを形成する。他の態様においては、ロイシンジッパードメインが特異的蛋白質分解酵素での開裂により融合蛋白質から取り除かれる。他の態様においては、優先的にヘテロオリゴマーを形成するロイシンジッパードメインを利用することによりヘテロオリゴマー蛋白質を調製する。
【図面の簡単な説明】
図1Aは、ロイシンジッパードメインを含む可溶性オリゴマーヒトCD40−Ｌがヒトの扁桃Ｂ細胞の増殖を刺激する能力を示し、図1Bは、ロイシンジッパードメインを含む可溶性オリゴマーヒトCD40−Ｌがヒトの抹消血Ｂ細胞の増殖を刺激する能力を示す。
図２は、ロイシンジッパードメインを含むsCD27L−３すなわちCD27−Ｌの可溶性形態による、CD27−Ｌを発現するMP.1細胞へのCD27.Fcの結合の阻害を示す。曲線１（−−−）:I＝6.55;K＝7.84e＋11;Ka＝2.93e＋07;MF＝8.84e−10。曲線２（−−）:I＝111.49;K＝2.21e＋08;Ka＝2.93e＋07;MF＝8.83e−10。
発明の詳細な説明
本発明は、ロイシンジッパードメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質をコードする発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細胞を培養することによる可溶性哺乳類蛋白質の調製法に関する。ある態様においては、異型哺乳類蛋白質は哺乳類の膜貫通蛋白質の細胞外ドメインを含む。哺乳類膜貫通蛋白質の例としては、腫瘍壊死因子／神経増殖因子レセプター（TNFR/NGFR）ファミリー（FarrahおよびSmith、Nature  358:26、1992;Goodwin  et  al.、Cell  73:447、1993）があり、そのファミリーにはCD40リガンド（CD40−Ｌ）、CD27リガンド（CD27−Ｌ）、OX40リガンド（OX40−Ｌ）、およびTNFが含まれる。このファミリーの蛋白質の所定のメンバーの構造研究により、それらはホモ三量体を形成することが示されている。本発明の方法はこのファミリーの他のメンバーにとっても有用であろう。
その上、他の多くの哺乳類膜貫通蛋白質が、生物学的活性形態においてはオリゴマー、すなわちヘテロオリゴマーもしくはホモオリゴマーのいずれかを形成する。造血系因子レセプターファミリーのメンバー（Cosman  et  al.、Trends  Biochem.Sci.15:265;1990）はこのような蛋白質の実例である。Gearing  et  al.（Science  255:1434、1992）は、低親和性LIFレセプターと一緒に細胞内において発現される際に、白血病阻害因子（LIF）とオンコスタチンＭ（Oncostatin  Ｍ）（OSM）との両方に高親和性結合性を付与する蛋白質（gp130）をコードする遺伝子のクローニングを報告している。低親和性レセプターと第二サブユニット蛋白質との類似相互作用により高親和性レセプターがもたらされるが、このような相互作用はこのファミリーの他のメンバーについても提唱されている（Hayashida  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:0655、1990;Kitamura  et  al.、Cell  66:1165、1991;Tavernier  et  al.、Cell  66:1175、1991;Devos  et  al,、EMPO  J.10:2133、1991）。造血系因子レセプターファミリーのメンバーである可溶性蛋白質は、ヘテロオリゴマーとして、あるいは幾つかの事例においてはホモオリゴマーとして発現される際に、それぞれの同族リガンドについてより高い親和性を示すであろう。２つもしくはそれを上回るサブユニットを含む他の膜貫通蛋白質についても同じことが言えるであろう。
他の態様においては、異型哺乳類蛋白質はサイトカインのような可溶性蛋白質を含み、そして得られる融合蛋白質はオリゴマーを形成する。サイトカインは、生理学的過程の調節において重要である抗原的非特異性細胞内シグナルを提供する免疫もしくは炎症反応の間に細胞により放出される可溶性媒介物である。TNFα、TNFβ、および神経増殖因子（NGF）のような所定の神経栄養因子はTNF/NGFファミリーに属する。このファミリーの所定のメンバーのモデル実験により、これらはオリゴマーを形成していると思われることが示された（GohおよびPorter、Protein  Eng.4:385、1991;PeitschおよびJongeneel、Int.Immunol.5:233、1993）。その上、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF;Pandit  et  al,、Science  258:1358、1992）を初めとする他のサイトカインもオリゴマーであることが知られている。このようなサイトカインも本発明の方法（この方法においては、ロイシンジッパードメインがオリゴマー性サイトカインの適切な四次構造を安定化させる）において有用であろう。
他の態様においては、サイトカインのヘテロオリゴマー形態が調製される。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）とインターロイキン−３（IL−３）との融合蛋白質は、各因子単独の場合、もしくはIL−３とGM−CSFとを組み合わせた場合のいずれと比較してもより有望な増殖刺激物であることが示されている（米国特許第5,073,627号および第5,108,910号）。GM−CSFとIL−３とを含む融合蛋白質、ならびにこのような融合蛋白質をコードするDNA配列は米国特許第5,073,627号および第5,108,910号において各々開示されており、これら両方共は引用することにより本明細書に取り込まれる。GM−CSFとIL−３とからなる類似の二官能性蛋白質は、優先的にヘテロダイマーを形成するロイシンジッパーを含む融合蛋白質としてこれらのサイトカインを発現させることにより形成可能である。
他の態様においては、ロイシンジッパードメインを、例えば特異的蛋白質分解酵素での開裂により融合蛋白質から取り除く。このような融合蛋白質は、ロイシンジッパー配列および異型蛋白質に加え、選択された蛋白質分解酵素により認識および開裂されるアミノ酸配列をも含んでいる。ロイシンジッパードメインは、発現および分泌の間に組換え融合蛋白質を安定化させる機能を示す。分泌蛋白質の精製後は、このロイシンジッパーを蛋白質分解酵素で処理することにより酵素的に除去する。この後に異型蛋白質は単量体となることができる。可溶性蛋白質のこのような単量体形態は、例えば、同族レセプターに結合すること、そしてレセプターの架橋結合形成の防止によりシグナル呈示を防止することによって、レセプターアンタゴニストとして有用であろう。
ロイシンジッパードメイン
ロイシンジッパーは、始めは数々のDNA−結合性蛋白質において同定された（Landschulz  et  al.、Science  240:1759、1988）。ロイシンジッパードメインは、これら（およびその他）の蛋白質内に存在し、そして蛋白質の二量体形成の原因となる保存ペプチドドメインを意味するのに用いられる用語である。ロイシンジッパードメイン（本明細書においては、オリゴマー化ドメインもしくはオリゴマー形成性ドメインとしても引用される）は、４つもしくは５つのロイシンが他のアミノ酸と共に散在している反復性７残基構造（repetitive  hepted  repeat）からなる。ロイシンジッパードメインの例は、酵母の転写因子GCN4において見いだされるもの、およびラット肝臓において見いだされる熱安定性DNA−結合性蛋白質（C/EBP;Landschulz  et  al.、Science  243:1681、1989）である。マウスのプロトオンコジーンｃ−myc（Landschulz  et  al.、Science  240:1759、1988）の遺伝子産物と同様に、２つの核トランスフォーミング蛋白質fosおよびjunもロイシンジッパードメインを示す。核オンコジーンfosおよびjunの産物はヘテロ二量体を優先的に形成するロイシンジッパーを含む（O'Shea  et  al.、Science  245:646、1989;TurnerおよびTjian、Science  243:1689、1989）。ロイシンジッパードメインはこれらの蛋白質における生物学的活性（DNA結合性）に必要である。
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、および多くのレトロウイルスを初めとする数々の異なるウイルスの融合誘導性蛋白質（fusogenic  protein）もロイシンジッパードメインを保持している（BucklandおよびWind、Nature  338:547、1989;Britton、Nature  353:394、1991;DelwartおよびMosialos、AIDS  Research  and  Human  Retro  viruses  6:703、1990）。これらの融合誘導性ウイルス蛋白質内のロイシンジッパードメインはそれらの蛋白質の膜貫通領域付近に存在しており、そのためロイシンジッパードメインが融合誘導性蛋白質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されている。融合誘導性ウイルス蛋白質のオリゴマー形成は融合孔（fusion  pore）の形成に関与する（Spruce  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:3523、1991）。また最近では、ロイシンジッパードメインが熱ショック転写因子のオリゴマー形成においてある役割を担っていることが報告されている（Rabondran  et  al.、Science  259:230、1993）。
ロイシンジッパードメインは短い平行らせん状コイルとして折り畳まれる。（O'Shea  et  al.、Science  254:539;1991）。1953年にCrick（Acta  Crystallogr.6:689）により提唱された「穴に差し込まれるノブ」型（"knobs−into−holes"）の充填構造を有する平行らせん状コイルの一般構造はその性質が詳細に決定されている。ロイシンジッパードメインにより形成された二量体はMcLachlanおよびStewart（J.Mol.Biol.98:293;1975）の表記法に従い（abcdefg）ｎ［式中、ａおよびｄは一般的に疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、これらはヘリックスの同一面に並んでいる］と表示される反復性７残基構造により安定化される。相対する電荷を帯びる残基は一般的に位置ｇおよびｅに生じる。従って、２つのヘリックス状ロイシンジッパードメインから形成される平行らせん状コイルにおいては、第一ヘリックスの疎水性側鎖により形成される「ノブ」が第二ヘリックスの側鎖間に形成される「穴」の中に差し込まれる。
位置ｄに存在するロイシン残基は大きな疎水性安定化エネルギーの一因となっており、そしてこれは二量体形成にとって重要である（Krystek  et  al.、Int.J.Peptide  Res.38:229,1991）。Lovejoy  et  al.は最近、ヘリックスが上−上−下方向に走る３本鎖α−ヘリックスの束の合成を報告している（Science  259:1288、1993）。彼らの研究により、ヘリックス状単量体からのらせん状コイル形成のための主要推進力が、疎水性安定化エネルギーにより提供されることが証明された。これらの研究は、静電的相互作用がらせん状コイルの化学量および幾何学状態に寄与していることも示している。
数々の研究により、保存性アミノ酸が個々のロイシン残基と入れ替わっても二量体形成能の減少は最低限に抑えられるが、複数の変化が生じる場合には通常この活性の消失がもたらされることが示される（Landschulz  et  al.、Science  243:1681、1989;TurnerおよびTjian、Science  243:1689、1989;Hu  et  al.、Science  250:1400、1990）。van  Heekeren  et  al.は、数々の異なるアミノ酸残基がGCN4のロイシンジッパードメイン内のロイシン残基の代わりになることが可能であると報告し、そして更に、２つのロイシン置換を含む幾つかのGCN4蛋白質は弱い活性を示すことを発見した（Nucl.Acids.Res.20:3721、1992）。麻疹ウイルスの融合蛋白質（MVF）のロイシンジッパードメイン内の一番目および二番目の７残基構造型ロイシンの突然変異はシンシチウム形成（ウイルス誘導性細胞融合の測定値）に影響を及ぼさなかったが、４つのロイシン残基全てを突然変異させた場合、融合は全く生じなくなっていた（Buckland  et  al.、J.Gen.Virol.73:1703、1992）。いずれの突然変異もMVFが四量体を形成する能力には影響を及ぼさなかった。
最近、GCN4ロイシンジッパードメインを表す合成ペプチドのａおよびｄ残基におけるアミノ酸置換がロイシンジッパードメインのオリゴマー形成特性を変化させることが見いだされた（Alber、第６回蛋白質学会シンポジウム（Sixth  Symposium  of  the  Protein  Society）、San  Diego、CA）。位置ａの全ての残基がイソロイシンに代わる場合には、ロイシンジッパーは依然として平行二量体を形成する。この変化に加え、位置ｄのロイシン残基が全てイソロイシンに代わる場合には、得られるペプチドは溶液中において自発的に三量体平行らせん状コイルを形成する。位置ｄの全てのアミノ酸をイソロイシンで、そして位置ａの全てのアミノ酸をロイシンで置換すると四量体形成を行うペプチドが生じる。これらの置換を含むペプチドは依然としてロイシンジッパードメインとして引用されるが、それはオリゴマー形成のメカニズムが、先に記載されるもののような通常のロイシンジッパーについての、メカニズムと同一であると思われるためである。しかしながら、本発明以前には、ロイシンジッパーが単に一つの小ドメインであるに過ぎない長目のペプチドにおけるこれらの置換の効果は知られておらず、またこれらの配列を含むペプチドが細胞により発現および分泌されるか否かも知られていなかった。
遺伝子断片およびオリゴヌクレオチドの調製
約12から約20までのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド断片は、例えば自動DNA合成機を使用することにより当該技術分野において知られている方法に従って調製することができる。例えば、ロイシンジッパードメインのようなペプチドの重複部分をコードする幾つかのこのような断片を合成することができる。遺伝子コードの縮重が原因で、ほとんどのアミノ酸は２つもしくはそれを上回る異なるヌクレオチドトリプレットによりコードされている。所定のアミノ酸をコードするトリプレットの選択は、他の考慮対象事項の中でも最終遺伝子産物が発現される予定の生物体に依存するであろう。その後に重複断片を連結させて目的のペプチドをコードするDNAを形成することができる。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）技術（Saiki  et  al.、Science  239:487、1988）を利用し、そしてその遺伝子もしくは関連蛋白質をコードする遺伝子の既知のDNA配列から得られる5'（上流）および3'（下流）オリゴヌクレオチドプライマーを用いることで目的の蛋白質の全てもしくは一部分をコードする遺伝子断片を増幅させることができる。一連のPCR条件の例としては、94℃で２分、次に42℃で２分を１周期分、72℃で1.5分、次に94℃で１分、次いで48℃で１分を30周期分、そして72℃で７分を１周期分、が含まれる。得られるPCR産物とプラスミドもしくはベクター、あるいは一つのもしくは複数の追加的DNA配列との結合を容易にさせる目的で制限酵素部位を目的のDNA配列に添加することもできる。増幅済みDNA配列は、実質的にはYonおよびFried（Nucleic  Acids  Res.17:4895;1989）により記載される要領で連結することができる。
例えば、引用することにより本明細書に取り込まれる1993年７月23日に提出された米国特許出願第08/097,827号において開示されるように、ラットOX40の発表済み配列に基づく5'（上流）および3'（下流）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて全長のマウスOX40をクローン化した。上流プライマーは、ラットOX40の最初６つ（Ｎ−末端）のアミノ酸をコードする配列の上流に制限エンドヌクレアーゼSpe  Ｉのための認識部位を含んでいた。下流プライマーは、全長OX40の最後５つ（Ｃ−末端）のアミノ酸をコードする配列の上流に制限エンドヌクレアーゼSpe  Ｉのための認識部位を含んでいた。PCR産物をSpe  Ｉで消化し、そして約800bpの断片をゲル濾過により単離し、そして第二回目のPCR反応にこれを用いた。単離した断片を、自己連結を防止するためにウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ（CIAP）で予め処理してあるSpe  Ｉ切断済みプラスミド、pBLUESCRIPT  SK（登録商標）（Stratagene  Cloning  Systems社、La  Jolla、CA）内に連結させた。
他の実施例においては、膜貫通蛋白質の細胞内および膜貫通部分をコードするDNAを削除することにより膜貫通蛋白質の細胞外領域のみをコードするDNAを取得することができる。どの残基を削除すべきかを決定し、そして実際の削除を実施するための方法は当該技術分野において知られている。例えば、Smith  et  al.は、CD4抗原の膜貫通および細胞内部分を削除することにより調製したヒトCD4抗原の可溶性形態を記載している（Science  238:1704、1987）。Treiger  et  al.は、類似する方法を使用してインターロイキン−２レセプターの可溶性形態を調製した（J.Immunol.136:4099、1986）。
融合蛋白質を、細胞外領域および分泌されることが知られている蛋白質（もしくはその一部分）から形成することができる。例えば、膜結合型蛋白質からの細胞外ドメインと免疫グロブリン重鎖不変領域とを含む可溶性蛋白質が、Fanslow  et  al.、J.Immunol.149:65、1992、およびNoelle  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6550、1992、により記載されている。また、マウスＴ白血球抗原CD8の細胞外ドメインを利用して可溶性融合蛋白質が形成されている（Hollenbaugh  et  al.、EMPO  J.11:4313、1992）。
融合蛋白質の調製
融合蛋白質は、異なるすなわち異型の蛋白質もしくはペプチドから得られる２つもしくはそれを上回る領域を含むポリペプチドである。融合蛋白質は、所望の配列からの断片の酵素切断および連結という通常の技術を使用して調製する。合成オリゴヌクレオチドを利用するPCR技術を使用して所望の断片を調製および／または増幅することができる。所望の配列を表す重複合成オリゴヌクレオチドを使用して融合蛋白質をコードするDNA構築物を調製することもできる。融合蛋白質は、リーダー（もしくはシグナルペプチド）配列、リンカー配列、ロイシンジッパー配列、もしくは他のオリゴマー形成用配列を初めとする数々の配列、ならびに融合蛋白質の容易な精製もしくは迅速な検出のための手段を提供する抗原性の高い部分をコードする配列を含むことができる。
シグナルペプチドは細胞からの蛋白質の分泌を容易にする。例として挙げるシグナルペプチドは、マウス  インターロイキン−７（IL−7;Namen  et  al.、Nature  333:571;1988）のリーダー配列のアミノ末端の25アミノ酸である。他のシグナルペプチドも利用することができ、また、IL−７リーダー配列中の所定のヌクレオチドをアミノ酸配列を変化させることなく変えることもできる。さらに、IL−７配列がリーダー配列として作用する能力に影響を及ぼすことのないアミノ酸変化を作製することができる。
Flag（登録商標）オクタペプチド（配列番号1:Hopper  et  al.、Bio/Technology  6:1204、1988）は、融合蛋白質の生物学的活性を変化させず、抗原性が高く、そして特異的モノクローナル抗体による可逆的結合を受けているエピトープを提供するが、このことにより、発現される融合蛋白質の迅速な検出および容易な精製が可能になる。このFlag（登録商標）配列はAsp−Lys対のすぐ後に続く残基においてウシ粘膜のエンテロキナーゼにより特異的に開裂されもする。このペプチドをキャップとして導入させた融合蛋白質もやはり大腸菌内における細胞内分解に対する耐性を示す可能性がある。Flag（登録商標）配列に結合するマウスモノクローナル抗体は受託番号HB9259としてATCCに寄託してあり、Flag（登録商標）配列を含む融合蛋白質の精製の際にその抗体を使用する方法は米国特許第5,011,912号において開示されており、この開示は引用することにより本明細書に取り込まれる。
目的の蛋白質を他の蛋白質に直接連結させて融合蛋白質を形成することができ、別法では、これらの蛋白質が確実に適切な二次および三次構造を形成するのに十分な距離を空けてこれらの蛋白質を隔離することができる。適切なリンカー配列は、（１）柔軟性のある伸長した立体配座をとることができ、（２）融合蛋白質の機能性ドメインと相互作用することが可能な秩序だった二次構造を形作る傾向は示さず、そして（３）機能性蛋白質ドメインとの相互作用を亢進させることができる最低限の疎水性もしくは帯電特性を有するであろう。柔軟性の高い蛋白質領域内の典型的な表面アミノ酸には、Gly、Asn、およびSerがある。実際には、Gly、Asn、およびSerを含むアミノ酸配列のいずれの順列も、リンカー配列についての上述の基準を満たすことが予期される。ThrおよびAlaのようなほぼ中性である他のアミノ酸もリンカー配列中に用いることができる。リンカー配列の長さは融合蛋白質の生物学的活性に有意な影響を及ぼすことなく変化させることができる。融合させてある蛋白質が非必須Ｎ−もしくはＣ−末端アミノ酸領域を有する場合にはリンカー配列は不必要であり、これらの領域を用いて機能性ドメインを隔離し、そして立体障害の介入を回避させることが可能である。例として挙げるリンカー配列は米国特許第5,073,627号および第5,108,910号において開示されており、そしてこれらの開示は引用することにより本明細書に取り込まれる。
オリゴマー融合蛋白質を膜貫通蛋白質の細胞外部分から形成する場合には、ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー形成性ドメインをコードするDNA配列を、膜貫通蛋白質の細胞外領域をコードするDNA配列に融合させる。融合蛋白質の両メンバーを、この融合蛋白質のオリゴマー形成性ドメインが、融合蛋白質に関して天然の膜貫通蛋白質の膜貫通および細胞質内領域と同一方向に存在するように連結させる。オリゴマー融合蛋白質はロイシンジッパードメインのらせん状コイル相互作用により安定化されるであろう。従って、ある実施例においては、米国特許出願第07/969,703号において開示される（その開示は引用することにより本明細書に取り込まれる）タイプII膜貫通蛋白質であるCD40についてのリガンド（CD40−Ｌ）から得られる細胞外領域、およびオリゴマー形成性ドメインであるロイシンジッパー配列を含む融合蛋白質を細胞外領域のアミノ近位端に融合させる。タイプＩ膜貫通蛋白質から得られる融合蛋白質においては、オリゴマー形成性ドメインをタイプＩ膜貫通蛋白質の細胞外領域のカルボキシ近位端に融合させる。他の膜貫通蛋白質は一回を上回る回数で膜を通り抜ける。このような膜貫通蛋白質は２つもしくはそれを上回る異なる細胞外領域を有するであろう。可溶性オリゴマー融合蛋白質は、同一の膜貫通蛋白質からのそのような異なる細胞外領域の内の２つもしくはそれを上回るものからも調製することができる。
可溶性形態で天然に生じる蛋白質のオリゴマー形態も調製することができる。このような場合には、オリゴマー形成の結果生物学的に活性な可溶性蛋白質の立体配座が生じるようにオリゴマー形成性ドメインを可溶性蛋白質に連結させる。その上、ホモオリゴマー蛋白質もしくはヘテロオリゴマー蛋白質のいずれかを調製することができるが、これは、融合蛋白質のオリゴマー形成ドメイン（一つもしくは複数）がヘテロオリゴマーもしくはホモオリゴマーのいずれを優先的に形成するかに依存する。
発現ベクター
オリゴマー形成性ドメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質の組換えDNA技術による発現のための組換え発現ベクターは、オリゴマー形成性ドメインをコードする合成もしくはcDNA由来のDNA断片を含むDNA配列を含んでおり、そのDNA配列は、異型蛋白質をコードするDNA断片にその読み枠を合わせた状態で（インフレームで）連結させてある。これらのDNA断片を、哺乳類、微生物、ウイルス、もしくは昆虫遺伝子から得られるもののような適切な転写および／または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能なように連結させる。調節配列の例には、遺伝子発現における調節的役割を有する配列（例えば、転写プロモーターもしくはエンハンサー）、転写を制御するためのオペレーター配列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写および翻訳の開始および停止を制御する適切な配列が含まれる。その上、シグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に取り込ませることができる。例えば、シグナルペプチド（分泌用リーダー）のためのあるDNA配列を、オリゴマー形成性ドメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質をコードするDNAに機能可能なように連結させることができる。シグナルペプチドは前駆体アミノ酸配列の一部分として発現され、このシグナルペプチドにより、酵母宿主細胞による翻訳済み融合ポリペプチドの細胞外分泌を改善することが可能となる。
調節配列が融合蛋白質をコードするDNAに機能的に関連する場合に、ヌクレオチド配列を機能可能なように連結させる。従って、あるプロモーターヌクレオチド配列が融合蛋白質をコードするDNAの転写を制御する場合には、そのプロモーターヌクレオチド配列を融合蛋白質をコードするDNAに機能可能なように連結する。さらにその上、翻訳を促進させるためにリボソーム結合部位がベクター内に存在する場合には、そのリボソーム結合部位を融合蛋白質のための配列に機能可能なように連結できる。
哺乳類宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。例えば、一般的に用いられる哺乳類細胞プロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス（Polyoma  virus）、アデノウイルス２（Adenovirus2）、シミアンウイルス40（Simian  Virus40）（SV40）、およびヒトのサイトメガロウイルスから得られる。例えば、SV40複製起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位などのSV40ウイルスゲノムから得られるDNA配列を使用して、哺乳類宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要な他の遺伝子成分を提供することができる。ウイルス性初期および後期プロモーターは特に有用であり、それは双方とも、ウイルス性複製起点を含むことができる断片としてウイルスゲノムから簡便に取得することができるためである（Fiers  et  al.、Nature  273:113、1978）。SV40ウイルスの複製起点内に存在するHind  III部位からBgl  Ｉ部位までに広がる約250bpの配列が含まれれば、より小さいもしくはより大きなSV40断片を使用することもできる。
哺乳類発現ベクターの例をOkayamaおよびBerg（Mol.Cell.Biol.3:280、1983）により開示される要領で作製することができる。Cosman  et  al.、Nature  312:768、1984により記載される有用な高発現性ベクターPMLSV  N1/N4は、受託番号ATCC39890号として寄託してある。さらに別の有用な哺乳類発現ベクターは欧州特許出願公開第0367566号および1991号５月16日に出願された米国特許出願第07/701,415号において記載されており、これらの開示は引用することにより本明細書に取り込まれる。OX40−ＬのようなタイプII蛋白質細胞外領域の発現については、米国特許第4,965,195号において記載されるインターロイキン−７（IL−７）用のシグナル配列、あるいは1984年７月２日に提出された米国特許出願第06/626,667号において記載されるインターロイキン−２レセプター用のシグナル配列のような異型シグナル配列を添加することができる。例として挙げる他のベクターはpDC406であり、これはSV40、ヒトの免疫不全症ウイルス（HIV）、およびエプスタイン−バーウイルス（EBV）から得られる調節配列を含む。
原核生物宿主細胞内にトランスフェクトされる発現ベクターは一般的に一つもしくは複数の表現型選択マーカーを含んでいる。表現型選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性を付与するかあるいは独立栄養上の必要条件を供給する蛋白質をコードする遺伝子、ならびにその宿主内での確実な増幅を行うために宿主により認識される複製起点である。原核生物宿主細胞用の他の有用な発現ベクターには、市販品として入手することが可能なプラスミドから得られる細菌性複製起点の選択マーカーがある。この選択マーカーはクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝子成分を含むことができる。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、そしてそのため形質転換させた細胞を同定するための単純な手段を提供する。pBR322の「骨格」部分を適切なプロモーターおよびOX40−ＬのDNA配列につなぎ合わせてある。市販品として入手することができる他のベクターには、例えば、pKK223−３（Pharmacia  Fine  Chemicals社、Uppsala、Sweden）、およびpGEM1（Promega  Biotec社、Madison、MI、USA）がある。
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターについては一般的にプロモーター配列が用いられる。一般的なプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang  et  al.、Nature  275:615、1978、およびGoeddel  et  al.、Nature  281:544、1979）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel  et  al.、Nucl.Acids  Res.8:4057、1980、および欧州特許出願公開第36776号）、ならびにtacプロモーター（Maniatis、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、p.412、1982）がある。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλ  PLプロモーターおよびcI857ts熱不安定性抑制因子配列を利用している。λ  PLプロモーターの誘導体を取り込ませてあり、American  Type  Culture  Collecitonから入手することができるプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2（大腸菌株JMB9（ATCC37092）中に内在する）およびpPLc28（大腸菌RR1（ATCC53082）中に内在する）がある。
宿主細胞
オリゴマー形成性ドメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質の発現に適する宿主細胞には、原核生物細胞、および酵母もしくはより高等な真核生物細胞がある。原核生物には、大腸菌もしくはバチルス（Bacilli）を例とするグラム陰性もしくはグラム陽性生物がある。形質転換に適切な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、バチルス  スブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ  ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトミセス（Stereptomyces）、およびスタフィロコックス（Staphylococcus）の属に含まれる様々な他の種がある。より高等な真核生物細胞には哺乳類起源の樹立細胞株がある。無細胞翻訳系を利用し、本明細書において開示されるDNA構築物から得られるRNAを用いることでオリゴマー形成性ドメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質を産生させることもできる。
大腸菌のような原核生物宿主細胞内においては、融合蛋白質は、原核生物宿主細胞内における組換えポリペプチドの発現を容易にさせるためのＮ−末端メチオニン残基を含むことができる。このＮ−末端Metを発現された組換え融合蛋白質から開裂することができる。大量の蛋白質分解もしくはジスルフィド分解処理を必要としない融合蛋白質の発現のために、原核生物宿主細胞を用いることができる。
細菌、真菌類、酵母、および哺乳類細胞性宿主を用いる利用に適するクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels  et  al.、Cloning  Vectors:A  Laboratory  Manual、Elsevier、New  York、（1985）、において記載されている。組換え融合蛋白質DNAを保持する発現ベクターを、当該技術分野において知られている方法に従って適切な宿主微生物もしくは哺乳類細胞の実質的に均一な培養物内にトランスフェクトもしくは形質転換させて、その融合蛋白質を発現するトランスフェクト済みもしくは形質転換済み宿主細胞を形成する。発現された融合蛋白質は宿主細胞内に含まれる、および／または培養物上清液中に分泌されるであろうが、それは宿主細胞および宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に依存する。
オリゴマー形成性ドメインと異型哺乳類蛋白質とを含む融合蛋白質は酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス（Saccharomyces）属（例えば,S.セレビシアエ（S.cerevisiae））からの宿主細胞中で発現させることができる。ピキア（Pichia）もしくはクルイベロミセス（Kluyveromyces）のような他の属の酵母も利用することができる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製用配列（ARS）、プロモーター領域、ポリアデニル化用の配列、および転写停止用の配列を含むことがよくあるであろう。酵母ベクターが複製起点配列および選択マーカーを含むことが好ましい。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman  et  al.、J.Biol.Chem.255:2073、1980）、もしくはエノラーゼ、グリアセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Hess  et  al.、J.Adv.Enzyme  Reg.7:149、1968、およびHolland  et  al.、Biochem.17:4900、1978）がある。酵母発現における利用に適する他のベクターおよびプロモーターは、Hitzemanの欧州特許公開出願第73,657号において更に詳細に記載されている。
酵母ベクターは、例えば、大腸菌内における選択および複製用のpBR322からのDNA配列（Ampr遺伝子および複製起点）を使用して組み立てることができる。酵母発現構築物内に含まれることが可能な他の酵母DNA配列には、グルコース−抑制性ADH2プロモーターおよびα−因子分泌リーダーがある。ADH2プロモーターは、Russell  et  al.（J.Biol.Chem.258:2674、1982）およびBeier  et  al.（Nature  300:724、1982）により既に記載されている。酵母のα−因子リーダー配列は異型ポリペプチドの分泌を指令する。このα−因子リーダー配列はしばしば、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、Kurjan  et  al.、Cell  30:933、1982、およびBitter  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  81:5330、1984、を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にさせるのに適する他のリーダー配列は当業者に知られている。あるリーダー配列を3'端付近で変化させて、一つもしくは複数の制限部位を含むようにすることができる。このことにより、構造遺伝子へのリーダー配列の融合が容易になるであろう。
酵母の形質転換法は当業者に知られている。このような方法のあるものはHinnen  et  al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  75:1929、1978、により記載されている。例えば、0.67％の酵母用含窒素塩基、0.5％のカザアミノ酸、２％のグルコース、10μg/mlのアデニン、および20μg/mlのウラシルからできている選択培地中でTrp+形質転換体についての選択を行うことができる。ADH2プロモーター配列を含むベクターで形質転換させた酵母宿主細胞を、発現を誘導させるために「豊富」な培地中で増殖させることができる。豊富な培地の例は、80μg/mlのアデニンおよび80μg/mlのウラシルを添加した、１％のイーストエキストラクト、２％のペプトン、および１％のグルコースからなる培地である。ADH2プロモーターの抑制解除はグルコースがその培地から枯渇した際に生じる。
哺乳類もしくは昆虫宿主細胞培養系を利用して組換え融合蛋白質を発現させることもできる。適切な哺乳類宿主細胞株の例には、サルの腎臓細胞のCOS−７（ATCC  CRL  1651;Gluzman  et  al.、Cell  23:175、1981）、Ｌ細胞、C127細胞,3T3細胞（ATCC  CRL  163）、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、BHK（ATCC  CRL  10）細胞株、およびCV−1/EBNA細胞（ATCC  CRL  10478）がある。CV−1/EBNA細胞株は、エプスタイン−バールウイルスの核抗原−１（EBNA−１）をコードする遺伝子でCV−１細胞株をトランスフェクトさせることにより取得し、そしてこれはヒトのCMV即時−初期型エンハンサー／プロモーターからの指令を受けてEBNA−１を構造遺伝子として発現する。EBNA−１遺伝子により、EBVの複製起点を含む発現ベクターのエピソームとしての複製が可能になる。
蛋白質精製法
精製された可溶性融合蛋白質は、組換え可溶性融合蛋白質を発現させるのに適する宿主／ベクター系を培養し、そしてその後にこれを、個々の可溶性融合蛋白質用について最適化された標準的な蛋白質精製法を使用することで培養培地もしくは細胞抽出物から精製することにより調製する。
例えば、培養培地内に組換え蛋白質を分泌する系からの上清については、その濁りを除き、そして例えばアミコン（Amicon）もしくはミリポアペリコン（Millipore  Pellicon）限外濾過装置等の市販品として入手することができる蛋白質濃縮フィルターを使用して濃縮する。濃縮段階の後にはこの濃縮物を適切な精製用マトリックスに適用させることができる。適切なマトリックスには親和性クロマトグラフィーに使用するマトリックスが含まれる。例えば、適切な親和性マトリックスは、適切な支持体に結合させてある、融合蛋白質が結合する同族蛋白質（cognate  protein）、もしくはレシチン、もしくは融合蛋白質に結合する抗体分子を含む。
別法では、ペンデントのジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスもしくは基質を含む陰イオン交換樹脂、あるいは他の適切な陰イオン交換体を例とするイオン交換樹脂を利用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、もしくは蛋白質精製において一般的に利用される他の種類のものであることができる。別法では、陽イオン交換段階を利用することができる。適切な陽イオン交換体にはスルホプロピルもしくはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスがある。
ペンダントメチルもしくは他の脂肪族ペンダント基を有するシリカゲルを例とする疎水性RP−HPLC媒質を利用する一つもしくは複数の逆相拘束液体クロマトグラフィー（RP−HPCL）段階を利用して可溶性融合蛋白質を更に精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィーも可溶性融合蛋白質の精製に有用であろう。さらに、疎水性担体も低圧条件下において使用することができ、実例として挙げられる媒質はフェニル−セファロースである。前述の精製段階の内の幾つかもしくは全てを様々に組み合わせて利用して、均一な組換え蛋白質を提供することもできる。
生物学的活性
組換え可溶性融合蛋白質の生物学的活性は、組換え可溶性融合蛋白質の同族分子への結合により仲介される。同族分子は、組換え可溶性融合蛋白質と同族分子との適切な立体配座に基づく非共有結合性相互作用で組換え可溶性融合蛋白質に結合する分子として特定される。例えば、あるレセプターの細胞外領域を含む組換え可溶性融合蛋白質については、同族分子はそのレセプターの細胞外領域と結合するリガンドを含む。それとは逆に、あるリガンドを含む組換え可溶性融合蛋白質については、同族分子はそのリガンドに結合するあるレセプター（もしくは結合性蛋白質）を含む。
組換え融合蛋白質の同族分子への結合は生物学的活性のマーカーである。このような結合活性は、例えば同族分子の結合性ドメインへの結合についての結合（すなわち競合的結合アッセイ）により決定することができる。リガンドを含む組換え可溶性融合蛋白質についてのある形状の競合的結合アッセイは、放射性ラベル化可溶性レセプターおよびそのリガンドの天然形態を発現する未処理細胞を使用する。このようなアッセイは本明細書の実施例４において説明されている。同様に、あるレセプターを含む組換え可溶性融合蛋白質についての競合的アッセイは、放射性ラベル化可溶性リガンドおよびそのレセプターの天然形態を発現する未処理細胞を使用する。同族分子の天然形態を発現する未処理細胞の代わりとして固相に結合させてある精製済み同族分子を代用することができる。競合的結合アッセイは標準的な方法を用いて実施することができる。競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイもしくは蛍光活性化細胞選別により定量的もしくは半定量的な結果を得ることができるか、あるいはスキャチャード（Scatchard）プロットを利用して定量的な結果を作成することができる。
生物学的活性は、細胞増殖アッセイのような当該技術分野において知られている生物アッセイを用いても測定することができる。実例として挙げる生物アッセイは本明細書中の実施例２において記載されている。用いられる細胞増殖アッセイの種類は組換え可溶性融合蛋白質に依存するであろう。天然形態においてＴ細胞に作用する組換え可溶性融合蛋白質についての生物アッセイは、当該技術分野において知られている方法により取得される精製済みＴ細胞を利用するであろう。このような生物アッセイには、組換え可溶性融合蛋白質および至適レベル以下のCon  ＡもしくはPHAのような分裂促進因子の存在下において精製済みＴ細胞をインキュベートする同時刺激アッセイ（costimulation  assay）がある。同様に、天然形態においてＢ細胞に作用する組換え可溶性融合蛋白質については精製済みＢ細胞を使用するであろう。天然形態の組換え可溶性融合蛋白質が作用する細胞の種類に基づいて他の種類の細胞も選択することができる。増殖は、標準的な方法に従い、3Hチミジンのような放射性ラベル化物質の取り込みを測定することにより決定する。
生物学的活性を決定するための更に別の種類のアッセイは二次分子分泌の誘導である。例えば、所定の蛋白質はＴ細胞によるサイトカインの分泌を誘導する。Ｔ細胞を精製し、そしてこれをサイトカイン分泌を誘導するのに必要な条件下において（例えば、共同分裂促進因子（comitogen）の存在下）組換え可溶性融合蛋白質で刺激する。サイトカイン分泌の誘導は、サイトカイン依存性細胞株の増殖を測定する生物アッセイにより決定する。同様に、免疫グロブリン分泌の誘導を、酵素免疫アッセイのような定量的（もしくは半定量的）アッセイを用いることで、天然の形態においてＢ細胞に作用する組換え可溶性融合蛋白質で刺激した精製済みＢ細胞により分泌される免疫グロブリンの量を測定することにより決定する。実施例２はこのようなアッセイを示す。
本明細書において引用される全ての引用文献の関連開示は、引用することにより具体例として取り込まれる。以下に示す実施例は説明のために提供されるのであって、制限のために提供されるのではない。
実施例１
この実施例は、三量体CD40−Ｌとして引用される可溶性CD40−Ｌ融合蛋白質を発現するためのCD40−Ｌ  DNA構築物の作製法を記述する。CD40−Ｌは活性化Ｔ細胞において見いだされたタイプII膜貫通蛋白質であり、Ｂ細胞抗原CD40についてのリガンドとして作用する（Armitage  et  al.、Nature  357:80、1992;Spriggs  et  al.、J.Exp.Med.176:1543、1992）。1992年10月23日に提出された米国特許出願第07/969,703号において記載されるように（この開示は引用することにより本明細書に取り込まれる）、CD40−Ｌをコードする遺伝子のクローン化および配列決定が既に行われている。CD40−Ｌは腫瘍壊死因子（Tumor  Necrosis  Factor）（TNF）ファミリーの蛋白質の中のメンバーであり、このファミリーのいくつかのメンバーが三量体形態で存在するものと思われている。
三量体CD40−Ｌは、リーダー配列、「ロイシンジッパー」として引用される33アミノ酸配列（配列番号２）、およびHopp  et  al.（Hopp  et  al.、Bio/Technology  6:1204、1988;配列番号１、Flag（登録商標）として引用される）により記載される８アミノ酸親水性配列を含み、その後にはヒトCD40−Ｌの細胞外領域（配列番号３および４の内のアミノ酸50からアミノ酸261まで）が続く。リーダー配列およびFlag（登録商標）配列の利用は既述されている。配列番号２中に存在する33アミノ酸は溶液中で自発的に三量体形成を行う。従って、この33アミノ酸配列を含む融合蛋白質は自発的に三量体もしくは多量体を形成することが予期される。
この構築物は、リーダー配列、先に記載される33アミノ酸配列（配列番号２）、およびFlag（登録商標）配列（配列番号１）に相当するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてその後に最終産物をヒトCD40−Ｌの細胞外領域（配列番号３および４の内のアミノ酸50からアミノ酸261まで）をコードするDNA断片に連結させることにより調製する。
得られる発現ベクターpDC406内連結産物をマウス腎臓細胞株CV−1/EBNA（ATCC  CRL  10478）内にトランスフェクトさせた。pDC406プラスミドには、SV40、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、およびエプスタイン−バーウイルス（EBV）から得られる調節配列が含まれている。CV−1/EBNA細胞株は、CV−１細胞株をエプスタイン−バーウイルス核抗原−１（EBNA−１）をコードする遺伝子とトランスフェクトさせることにより取得したが、この細胞株はヒトCMVの初期−中期型（intermediate−early）エンハンサー／プロモーターによる指令を受けてEBNA−１を構成遺伝子産物として発現する。EBNA−１遺伝子はEBVの複製起点を含むpDC406のような発現ベクターのエピソームとしての複製を可能にする。
融合構築物を発現する細胞を同定したら、今度はトランスフェクト済み細胞の大量培養物を増殖させて、可溶性オリゴマーCD40−Ｌを発現する細胞からの上清を蓄積させる。上清液中の可溶性オリゴマーCD40−Ｌ融合蛋白質を、実質的には米国特許第5,011,912号において記載される親和性精製により精製する。sCD40−Ｌは、本明細書に記載される他の蛋白質精製法を使用して精製することもできる。可溶性オリゴマーCD40−Ｌ融合蛋白質の銀染色化SDSゲルを調製して純度を決定することができる。類似の方法を使用して、マウスCD40−Ｌの細胞外領域（配列番号５および６の内のアミノ酸50からアミノ酸260まで）を含む三量体形成性構築物を調製および精製することができる。実施例２において示すように可溶性CD40−Ｌは膜結合型CD40−Ｌのものに類似する生物学的活性を示す。
実施例２
この実施例は、実施例１において記載される要領で調製した可溶性オリゴマーCD40−Ｌを用いるＢ細胞増殖活性およびポリクローナル免疫グロブリン分泌の誘導を説明する。ヒトのＢ細胞は、実質的にはArmitage  et  al.（J.Immunol.150:3671;1993）により記載される要領で精製した。簡潔に述べると、扁桃組織を緩和にほぐし、そして得られる細胞懸濁液をHistopaque（登録商標）（Sigma社、St.Louis、MO）にのせて遠心した。細胞（E)-のＴ−細胞枯渇化調製物を、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム−処理済みSRBC（ヒツジ赤血球細胞）でのロゼット形成によるＴ細胞の除去、および混入性非Ｂ細胞を溶菌させるためのＢ細胞Lympho−kwik（One  Lambda  Inc.社、Los  Angeles、CA）での37℃における１時間の処理により取得した。末梢血単核細胞（PBMC）を、食細胞を除去するためにLympho−kwik段階の前に、部分精製した細胞を無血清培地中で5mMのロイシンメチルエステル（Leu  ME;Sigma社、St.Louis、MO）で室内において１時間処理する段階を追加した上での同一様式において単離した。
Ｂ細胞増殖は、実質的にはArmitage  et  al.、上述、に記載される3H−チミジン取り込みアッセイを用いて測定した。細胞は、可溶性オリゴマーCD40−Ｌ単独での存在下において、あるいは5ng/mlのIL−４（Immunex  Corporation社、Seattle、WA）、５μg/mlの抗−IgMコーティング済みビーズ（BioRad社、Richmond、CA）、もしくはIL−４と抗−IgMとの組み合わせ物の存在下において３日間培養した。可溶性オリゴマーCD40−ＬがＢ細胞増殖を誘導する能力を評定するための代表的な実験の結果を図1Aおよび1Bに示す。sCD40−Ｌは、共同因子としてのIL−４、抗−IgM、もしくはこれらの組み合わせ物の存在下において扁桃Ｂ細胞の増殖を誘導した（図1A）。sCD40−Ｌはまた、共同因子としてのIL−４、抗−IgM、もしくはこれらの組み合わせ物の存在下において、そして同一供与者から取得したＢ細胞を用いた際に末梢血Ｂ細胞の増殖を誘導したが、いずれの共同因子が存在しない場合にも中レベルの増殖が見られた（図1B）。これらの結果は、Armitage  et  al.、上述、において記載される膜結合型組換えCD40−Ｌを用いて得られた結果と一致する。
ポリクローナル免疫グロブリン分泌は、実質的にはArmitage  et  al.、上述、に記載される要領に従い、ウエル当たり１×105のＢ細胞の10日培養物からの上清液についてのイソタイプ特異的ELISAにより決定した。精製済みＢ細胞を、10ng/mlのIL−２、IL−４（両者ともImmunex  Corporation社、Seattle、WA）、もしくはIL−10（Genzyme  Corporation社、Boston、MA）のいずれかの存在もしくは非存在下において、可溶性オリゴマーCD40−Ｌ（sCD40−Ｌ）を含む上清液の1:20希釈物、対照上清（対照S/N;ベクター単独でトランスフェクトさせた細胞からの条件培地）の1:20の希釈物、もしくは膜結合型CD40−Ｌを発現するトランスフェクション済みCV−1/EBNA（CV−1/CD40L;3×104細胞／ウエル）で刺激した。免疫グロブリン分泌を測定する代表的な実験の結果を表１に示すが、表示される値はELISAにより測定されng/mlの単位で示される、誘導化Ｂ細胞により分泌される各イソタイプの量を表す。
0003589665.tif 000002
これらの結果により、可溶性オリゴマーCD40−Ｌは膜結合型CD40−Ｌと同一様式においてポリクローナルな免疫グロブリン分泌を誘導することが示された。IL−２およびIL−10はIgM、IgG1、およびIgAの分泌を亢進させ、測定可能量のIgEの分泌は膜結合型CD40−Ｌについて観察されたようにIL−４の存在下においてのみ生じた。数々の異なる供与体からのＢ細胞を検査したところ同一パターンの免疫グロブリン分泌が示されたが、この絶対量は供与体毎に異なっていた。マウス系における類似実験においては、マウスCD40−Ｌの可溶性オリゴマー構築物も膜結合型マウスCD40−Ｌに匹敵する結果を生じた。
実施例３
この実施例は、sCD27L−３として引用される可溶性オリゴマーCD27−Ｌ融合蛋白質を発現させるためのCD27−Ｌ  DNA構築物の作製法を記述する。CD27−Ｌは、白血球抗原CD27に結合するタイプII膜貫通蛋白質である。CD27は大半の末梢血Ｔ細胞（Bigler  et  al.、J.Immunol.141:21、1988;van  Lier  et  al.、Eur.J.Immunol.18:811、1988）およびＢ細胞の亜集団（Maurer  et  al.、Eur.J.Immunol.20:2679、1990）において見いだされる。CD27−Ｌは腫瘍壊死因子ファミリーのサイトカインのメンバーである。CD27−Ｌをコードする遺伝子については、Goodwin  et  al.、Cell  73:447（1993）および1992年９月８日に提出された米国特許出願第07/941,648号の一部継続出願である      年    月    日に提出された米国特許出願第                号において記載されるように（これらの開示は引用することにより本明細書に取り込まれる）クローン化および配列決定が既に行われている。
sCD27L−３をコードする構築物はリーダー配列、ロイシンジッパードメインを含む37アミノ酸配列、およびアミノ酸39からアミノ酸193までのヒトCD27−Ｌの細胞外領域を含む；このヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号７および８に示す。この構築物を当該技術分野において知られる方法を使用することにより調製して、CD27−Ｌの細胞外領域をコードするDNAを取得した。簡便に述べると、CD27−Ｌの細胞外領域をPCR技術を使用することで全長を有するCD27−Ｌ  cDNAから増幅した。用いたプライマーは、所望の制限酵素部位をコードする配列（5'プライマーについては一つのSpe  Ｉ部位を含むACTAGT、および3'プライマーについては一つのNot  Ｉ部分を含むGCGGCCGC）を添加してあるCD27−Ｌの細胞外領域（配列番号７、5'プライマーについてはヌクレオチド222−245、そして3'プライマーについてはヌクレオチド663−689の相補配列）に由来した。CD27−Ｌの細胞外ドメインを表す増幅済みPCR産物をSpe  I/Not  Ｉ切断済みSMAG（pDC206）ベクター内にクローン化した。SMAGベクターはpDC201（Sims  et  al.、Science  241:585、1988）の誘導体であり、これはマウスIL−７リーダー配列を含む。このベクターを増幅させ、その後Spe  Ｉで切断し、そしてウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理した。ロイシンジッパー（配列番号１）のアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドを標準的な方法により合成し、そしてSpe  Ｉ切断済みベクターと連結させて、マウスIL−７リーダー配列（Namen  et  al.、Nature  333:571、1988）、ロイシンジッパードメイン、およびCD27−Ｌの細胞外ドメインを含む発現ベクターを形成した。この発現ベクターをpDC206/sCD27L−３として引用した。
pDC206/sCD27L−３を、pSV3Neoプラスミドと共にサルの腎臓細胞株CV−1/EBNA（ATCC  CRL  10478）内に同時トランスフェクトさせた。pSV3Neo（MulliganおよびBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2072;1981）はSV40  Ｔ抗原を発現するプラスミドであり、そしてそのためpDC206プラスミドのエピソームとしての発現を可能にする。
融合構築物を発現する細胞を同定したら、今度はトランスフェクトさせた細胞の大量培養物を増殖させて可溶性オリゴマーCD27−Ｌ融合蛋白質（sCD27L−３として引用される）を発現する細胞からの上清を蓄積させる。上清液中のsCD27L−３は、実質的には米国特許第5,011,912号において記載される要領での親和性精製により精製する。sCD27L−３は本明細書において記載される他の蛋白質精製法を用いても精製することができる。可溶性オリゴマーCD27−Ｌ融合蛋白質の銀染色化SDSゲルを調製して純度を決定することができる。実施例４に記載されるように、sCD27L−３は可溶性CD27に結合し、そしてCD27−Ｌを発現する細胞への可溶性CD27の結合を阻害する。
実施例４
この実施例はsCD27L−３の結合阻害活性を説明する。ヒト白血球の表面抗原CD27の可溶性形態を、実質的にはFanslow  et  al.、J.Immunol.149:65（1992）により記載される要領で調製して、CD27.Fcとして引用される二量体Fc融合構築物（Goodwin  et.al.、Cell  73:447;1993）を形成した。CD27.Fcは、CD27の細胞外領域およびヒトIgG1からのFc領域を含む。sCD27L−３は、CD27.Fcの、内在性CD27−Ｌを発現するエプスタイン−バールウイルス形質転換済みヒトＢ細胞株MP.1細胞への結合を阻害する。
pDC206/sCD27L−３でトランスフェクトさせたCV−1/EBNA細胞からの条件培養済み上清液を96ウエルプレート内で滴定した。一定量のCD27.Fc（１μg/ウエル）を各ウエルに添加し、その後にウエル当たり、結合用培地（１％のウシ血清アルブミン、0.2％のアジ化ナトリウム、および20MmのHEPES、pH7.2を含むRPMI−1640）中の１−２×106のMP.1細胞を添加した。このプレートを37℃において１時間インキュベートした。細胞をPBSで２度洗浄し、その後に遠心によりペレット形成させた。125I−マウス抗−ヒトIgG  Fcを一定濃度において各ウエルに添加し、そしてそのプレートを37℃において更に１時間インキュベートした。125I−マウス抗−ヒトIgG  Fcは、MP.1に結合しているCD27.Fcに結合した。最終インキュベーションの後、細胞をフタル酸油を含む試験管内に回収して結合した125I−マウス  抗−ヒトIgG  Fcと遊離のものとを分離して、そしてガンマー計測器を使用して放射活性の量を定量した。
この実験の結果を図２に示す。sCD27L−３はCD27.FcのMP.1細胞への結合の用量依存的阻害を示した。CD27.Fcの結合の阻害がsCD27L−３による阻害の滴定値の50％となる濃度を比較することにより、条件培地中のsCD27L−３の濃度が18μg/mlと40μg/mlとの間であることが評定された。この比較を行う際に、sCD27L−３のMWは135Kd（CD27−Ｌの細胞外領域の予想MWは45Kdであり、三量体形成についてはこれを３倍した）であると見積もり、そしてsCD27L−３のCD27.Fcへの結合はモル比において生じると仮定した。KiをKa（これは３×10-7M-1である）の10倍であると仮定し、そして初期濃度を１×10-8Mであると仮定した。この結果により、１×10-8Mの濃度という当初の仮説は約10倍低い方にずれており、そして上清液の1:3希釈物は実際に１×10-7Mという評定濃度を生じたことが証明された。
配列表
（２）配列番号:1
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:8アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列：配列番号:1
0003589665.tif 000003
（２）配列番号:2
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:33アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号:2
0003589665.tif 000004
（２）配列番号:3
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:786塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:mRNAに対するcDNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源
（Ａ）生物名:Human
（Ｂ）株名:CD40−Ｌ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1..783
（xi）配列：配列番号：
0003589665.tif 000005
0003589665.tif 000006
（２）配列番号:4
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:261アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号:4
0003589665.tif 000007
（２）配列番号:5
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:783塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNAに対するmRNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源
（Ａ）生物名:Mouse
（Ｂ）株名:CD40−Ｌ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1..780
（xi）配列：配列番号:5
0003589665.tif 000008
0003589665.tif 000009
（２）配列番号:6
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:260アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号:6
0003589665.tif 000010
（２）配列番号:7
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:689塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源
（Ａ）生物名:CD27リガンドトリマー（CD27−３）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:39..686
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:シグナルペプチド
（Ｂ）存在位置:39..110
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:成熟ペプチド
（Ｂ）存在位置:111..686
（xi）配列：配列番号:7
0003589665.tif 000011
（２）配列番号:8
（ｉ）配列の特性
（Ａ）配列の長さ:216アミノ酸残基
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号:8
0003589665.tif 000012
【図１Ａ】
0003589665.tif 000013
【図１Ｂ】
0003589665.tif 000014
【図２】
0003589665.tif 000015