(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で示される新規化学物質ハリメシンＢ
【化１】
0003578804.tif 000007
（式中Ａｃはアセチル基を示し、Ｍａｎはマンノシル基を示す。）
【請求項２】
下記の式（ＩＩ）で示される新規化学物質ハリメシンＣ
【化２】
0003578804.tif 000008
（式中Ａｃはアセチル基を示す。）
【請求項３】
フザリウム属に属しハリメシンＢ又はハリメシンＣを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にハリメシンＢ又はハリメシンＣを生成蓄積させ、該生成蓄積したハリメシンＢ又はハリメシンＣを採取することを特徴とするハリメシンＢ又はハリメシンＣの製造法。
【請求項４】
フザリウム属に属する微生物がフザリウム・スピーシーズ・FE 71-1（Fusarium sp. FE71-1）株（受託番号 FERM P-13910）である請求項３記載のハリメシンＢ又はハリメシンＣの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物が生産する新規抗微細藻類物質およびその製造法に関するものである。抗微細藻類物質は、船底や海上構造物にスライムを形成する珪藻の防汚損、珪藻を主とする赤潮の駆除に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
微細藻類に活性な物質としては、ジクロロフェニルジメチルウレア等の化学合成除草剤が考えられるが、より安全性が高い新規な抗微細藻類物質の開発が望まれている。また抗微細藻類物質としてはハリメシンＡが知られている。（特願平５−２６７２４２号明細書）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明は新規な抗微細藻類物質を天然界から検索し、その新規物質及びその製造法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記の式（Ｉ）で示される新規化学物質ハリメシンＢである。
【０００５】
【化３】
0003578804.tif 000002
【０００６】
（式中Ａｃはアセチル基を示し、Ｍａｎはマンノシル基を示す。）
また、本発明は、下記の式（ＩＩ）で示される新規化学物質ハリメシンＣである。
【０００７】
【化４】
0003578804.tif 000003
【０００８】
（式中Ａｃはアセチル基を示す。）。
更に、本発明は、フザリウム属に属しハリメシンＢ又はハリメシンＣを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にハリメシンＢ又はハリメシンＣを生成蓄積させ、該生成蓄積したハリメシンＢ又はハリメシンＣを採取することを特徴とするハリメシンＢ又はハリメシンＣの製造法である。そして、上記フザリウム属に属する微生物としては、フザリウム・スピーシーズ・ＦＥ  ７１−１（Ｆｕｓａｒｌｕｍ  ｓｐ．  ＦＥ  ７１−１）株が挙げられる。
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
以下にハリメシンＢ［式（Ｉ）の化合物］の物理化学的性質、及び、生物学的性質を示す。
【００１０】
１．物質の色：無色
２．分子量    ：９６６
３．分子式    ：Ｃ４８Ｈ８６Ｏ１９
0003578804.tif 000004
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ＝１：１）
０．８６  （１２Ｈ），  １．３  （２４Ｈ），  １．４  （２Ｈ），  １．６  （６Ｈ），  １．７  （４Ｈ），  １．８  （４Ｈ），  １．９  （３Ｈ），２．２  （２Ｈ），  ２．５  （２Ｈ），  ２．６  （２Ｈ），  ２．７  （２Ｈ），  ３．２  （１Ｈ），  ３．５  （１Ｈ），  ３．６  （２Ｈ），  ３．８  （３Ｈ），  ４．０  （１Ｈ），  ４．１  （１Ｈ），  ４．３  （１Ｈ），  ４．７  （１Ｈ），  ４．９  （１Ｈ），  ５．０  （１Ｈ），  ５．１  （１Ｈ），  ５．２  （１Ｈ）  ＰＰＭ
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ＝１：１）
１４．３，  ２１．３，  ２３．２，  ２３．３，  ２５．５，  ２５．９，  ３２．４，  ３２．６，  ３２．５，  ３４．８，  ３４．９，  ３８．５，  ３８．８，  ３９．８，  ４１．６，  ４１．７，  ４１．９，  ４２．５，  ４２．６，  ４３．１，  ６２．７，  ６６．２，  ６６．５，  ６８．３，  ６９．０，  ６９．７，  ７２．１，  ７２．２，  ７３．４，  ７３．６，  ７４．９，  ７５．６，  ７７．４，  １００．１，  １７１．２，  １７１．６，  １７２．６，  １７２．９，  １７９．４  ＰＰＭ
５．赤外吸収スペクトルにおける主な吸収帯（ＫＢｒ法）  ：３４１２，  ２９３２，  ２８６４，    １７３４，  １５７６，  １３７９，  １２３８，  １１７２，  １０７３ｃｍ  −１  
６．比旋光度［α］Ｄ２６  −２４．４°（ｃ６．６，クロロホルム）
７．溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶
８．生物学的性質
珪藻（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ，  ＮＩＥＳ−１６）の発育を阻止する最少濃度は、４μｇ／ｍｌであった。
【００１１】
以下にハリメシンＣ［式（ＩＩ）の化合物の物理化学的性質、及び、生物学的性質を示す。
１．物質の色：無色
２．分子量    ：６１８
３．分子式    ：Ｃ３２Ｈ５８Ｏ１１
0003578804.tif 000005
４．核磁気共鳴シグナル：
１）１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ＝１：１）
０．８６  （９Ｈ），  １．３  （１８Ｈ），  １．４  （２Ｈ），  １．６  （６Ｈ），  １．８  （４Ｈ），  １．９  （３Ｈ），  ２．４  （２Ｈ），  ２．５  （２Ｈ），  ２．６  （２Ｈ），  ３．８  （１Ｈ），  ４．０  （１Ｈ），  ４．２  （２Ｈ），  ４．９  （１Ｈ），  ５．０  （１Ｈ），  ５．２  （１Ｈ）  ＰＰＭ
２）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ＝１：１）
１４．４，  ２１．３，  ２３．２，  ２３．３，  ２５．６，  ２５．８，  ３２．３，  ３２．４，  ３２．７，  ３４．８，  ３４．９，  ３８．４，  ３８．９，  ３９．９，  ４１．７，  ４２．７，  ４２．８，  ４３．４，  ４３．７，  ６６．３，  ６８．８，  ６９．１，  ７１．８，  ７２．２，  ７３．５，  １７１．２，  １７１．６，  １７２．７，  １７５．６  ＰＰＭ
５．赤外吸収スペクトルにおける主な吸収帯（ＫＢｒ法）  ：３４４４，  ２９３４，  ２８６４，    １７３４，  １３７７，  １２４１，  １１７２，  １０５４ｃｍ−１
６．比旋光度［α］Ｄ２６  −９．２°（ｃ３．２，クロロホルム）
７．溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに可溶、水には難溶
８．生物学的性質
珪藻（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ，  ＮＩＥＳ−１６）の発育を阻止する最少濃度は、４μｇ／ｍｌであった。
【００１２】
ハリメシンＢ又はＣの用途は、特に限定されないが、その優れた抗微細藻類活性から、船底や海上建築物にスライムを形成する微細藻類の防汚染、微細藻類を主とする赤潮の駆除に用いることができる。
ハリメシンＢおよびＣの生産に用いる微生物としては、フザリウム属に属し、ハリメシンＢおよびＣ生産能を有する微生物であれば特に限定されず、代表的菌株としてフザリウム・スピーシーズ・ＦＥ  ７１−１（Ｆｕｓａｒｌｕｍ  ｓｐ．  ＦＥ  ７１−１）株  （ＦＥＲＭＰ−１３９１０）を挙げることができる。
【００１３】
このＦＥ  ７１−１  株の菌学的性質は、次の通りである。
【００１４】
ａ．形態学的所見
ＹＭ培地を用い３０℃で培養を行った後、光学顕微鏡、および走査型電子顕微鏡で形態の観察を行った。その結果、体制が変形体でなく、有鞭毛細胞を欠き、菌糸に隔壁を形成し、有性生殖は不明であった。分生子はフィアロ型で分生子座上に形成される新月型で４〜５の横隔壁を有する大分生子とフィアロ型で気生菌糸から分枝した分生子柄上に形成される卵形から長楕円形で単細胞の小分生子が観察された。また、菌糸あるいは大分生子の細胞の一部が厚膜化した厚膜胞子も認められた。
【００１５】
形態的特徴
小分生子柄：長さ１２．５〜８５×２．５〜５μｍ、各分枝端は単一の円筒形〜ややきり状、長さ１２．５〜４０×２．５〜５μｍのフィアライドとなる。
小分生子：フィアロ型分生子、卵円形〜長楕円形、１細胞、無色、平滑、まっすぐあるいはやや湾曲する。分離して塊状の集団を形成する。大きさ５〜１５×１．２〜２．８μｍ
大分生子柄：１０．０〜１８．０×２．２〜３．０μｍの側棍棒型のフィアライドをつける。
分生子柄は結束して、分生子座を形成する。培地上の分生子座は橙色〜淡褐色の粘塊状を呈す。
大分生子：フィアロ型分生子、新月形、両側にて細まる、通常４〜５隔壁。大きさ０、隔壁：７．５〜１２．５×２．２〜３．８μｍ、１隔壁：１２．０〜２１．２×２．０〜２．８μｍ、２隔壁：１６．２〜３０．０×２．２〜３．８μｍ、３隔壁：２２．５〜４２．５×２．２〜４．５μｍ、４隔壁：３５．０〜４５．５×２．５〜４．８μｍ、５隔壁：３５．０〜５０．０×２．８〜４．８μｍ、６隔壁：５０．０〜６０．０×４．５〜５５．２μｍ
厚膜胞子：菌糸中に形成、多産、滑面〜粗面、頂生または間生、単生または数個が連鎖、亜球形〜球形、７．５〜１０．５×５．０〜７．５μｍ、直径７．５μｍ、または大分生子の細胞中にも生じ、球形〜２細胞、直径５〜７．５μｍまたは１０．５〜１２．５×５〜７．５μｍ
【００１６】
ｂ．培養所見
ＹＭ培地上の集落の発育良好、気生菌糸はビロード状、白色、のちに淡褐色を帯びる。橙色粘塊状に分生子座が形成される。培地によって色素の生産性が異なり、黄〜橙赤色、紫、灰緑等を呈する。各種培地上での培養性状を表１に示す。
【００１７】
【表１】
0003578804.tif 000006
【００１８】
ｃ．生育条件
ＦＥ  ７１−１  株の生育環境についてＹＭ液体培地を用いて調査した。
生育温度範囲：１４〜３３℃
最適生育温度範囲：２９〜３３℃  ３０℃前後で最も良好に生育
生産ｐＨ範囲：３〜１１
最適生育ｐＨ範囲：４〜１０  ｐＨ９前後で最も良好に生育
【００１９】
ｄ．同  定
本菌株は、以上示したアナモルフのみ観察され、テレオモルフは観察されない。以上のａ〜ｃで得られた菌学的性質から、本菌株の分類学上の位置を「イラストレイティッド・ジェネラ・オブ・インパーフェクト・ファンジヤイ第４版（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ  ｆｕｎｇｉ．  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ．  Ｈ．Ｌ．ｂａｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ｂ．Ｈｕｎｔｅｒ．  １９８７年）  」に従って検索した結果、本菌株はフザリウム・スピーシーズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属することが認められた。本菌株を「フザリウム・スピーシーズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＥ  ７１−１  」とし、ブタペスト条約に基づき平成５年１０月１８日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１３９１０  として寄託した。
【００２０】
次に培養法について述べる。
本発明の培養においては通常の微生物の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。さらに、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育やハリメシンＢ又はハリメシンＣの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度は３０〜３５℃が適当であり、培養中の培地のｐＨはリン酸緩衝液などの緩衝液の添加により、４．０〜５．５に維持することが望ましい。液体培養で通常７日間培養を行うと、目的物質が培養液中および菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した時に培養を停止する。
【００２１】
培養物からハリメシンＢ又はハリメシンＣの単離精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養濾液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出液と培養濾液とを合わせて濃縮し、活性炭によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィーなどにより、抗微細藻類物質を得る。
【００２２】
なお、培養、精製操作中のハリメシンＢおよびＣの動向は、パラブロモフェナシル化したものについて高速液体クロマトグラフィーによる紫外線吸収を指標として追跡することができる。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
種菌としてフザリウムｓｐ．  ＦＥ  ７１−１  を用いる。該菌株を、４００ｍｌの酵母エキス液体培地（酵母エキス：０．４ｇ、グルコース：４．０ｇ、海水４００ｍｌ、ｐＨ＝８．０）を入れた１Ｌ三角フラスコ中で、３０℃、５日間振盪（１２０ｒ．ｐ．ｍ）  培養した。培養中、培地のｐＨは特に制御しなかった。
【００２４】
このようにして得られた培養液６Ｌを遠心分離した。遠心分離によって得られた上澄み液を、酢酸エチル（１２Ｌ）で抽出する。また得られた菌体は、２００ｍｌのエチルアルコールで抽出し、濃縮した後、水  （２００ｍｌ）に懸濁させ、酢酸エチル  （５００ｍｌ）によって抽出分配する。上澄み液の酢酸エチル抽出部と菌体から得られた酢酸エチル抽出部を合わせて、４０℃以下で減圧濃縮する。得られた濃縮液をクロロホルム−メタノール−水  （２：２：１）  の下層を溶出溶媒とする遠心液体クロマトグラフィー（ＬＬＢ−Ｍ，  三鬼エンジニアリング）  で分画し、クロロホルム−メタノール  （１５：１，  ｖ／ｖ）  を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、抗微細藻類活性を有するハリメシンＢ  １０ｍｇ，  ハリメシンＣ  ５ｍｇを得た。それぞれの物理化学的性質及び構造式は前記の通りであった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により抗珪藻活性を有するハリメシンＢおよびＣ並びにその製造法が提供される。ハリメシンＢおよびＣは、船底や海上構造物にスライムを形成する微細藻類の防汚損、微細藻類を主とする赤潮の駆除に有用である。