(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MAGE-3タンパク質及び/又はカスパーゼ-12の活性化を抑制するMAGE-3タンパク質の一部切断型を有効成分として含有する細胞死阻害剤。
【請求項２】
MAGE-3タンパク質が以下の(e)又は(f)の組換えタンパク質である請求項１記載の細胞死阻害剤。
(e) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(f) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質
【請求項３】
一部切断型が以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質である請求項１記載の細胞死阻害剤。
(a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質
【請求項４】
細胞死がアポトーシス、予定細胞死、及びプログラム細胞死からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞死阻害剤。
【請求項５】
MAGE-3タンパク質及び/又はカスパーゼ-12の活性化を抑制するMAGE-3タンパク質の一部切断型を有効成分として含有する小胞体ストレス関連疾患の治療剤。
【請求項６】
MAGE-3タンパク質が以下の(e)又は(f)の組換えタンパク質である請求項５記載の治療剤。
(e) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(f) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質
【請求項７】
一部切断型が以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質である請求項５記載の治療剤。
(a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質
【請求項８】
小胞体ストレス関連疾患が、アルツハイマー病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、及び臓器障害からなる群から選択される少なくとも1種である請求項５〜７のいずれかに記載の治療剤。
【請求項９】
MAGE-3タンパク質又はカスパーゼ-12の活性化を抑制するMAGE-3タンパク質の一部切断型を有効成分として含有するカスパーゼ-12活性化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カスパーゼ１２又はその前駆体と結合することによりカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質、及び該タンパク質を含有する細胞死阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カスパーゼは多細胞生物のアポトーシスにおいて中心的役割を果たす蛋白質分解酵素である。ヒト及びマウスから現在までに計１４種類のカスパーゼが見出されている（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，  Ｎ．  Ａ．  ＆  Ｌａｚｅｂｎｉｋ，  Ｙ．  Ｃａｓｐａｓｅｓ，  ｅｎｅｍｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  １３１２−１３１６  （１９９８））。カスパーゼの機能は、その特異的な蛋白質分解活性によって特定の蛋白質群を切断することで果たされる。複数種類のカスパーゼが存在する理由の一つは、様々なアポトーシス刺激に対応して異なるセットのカスパーゼが働くためであると考えられている。
【０００３】
カスパーゼは発生過程の形作り、成体における恒常性の維持、体にとって有害な細胞の排除といった正常な機能を担う一方、万一、異常な活性化を起こした場合は神経変性疾患などの重篤な病気を引き起こすことが明らかになりつつある（Ｙｕａｎ，  Ｊ．  ＆  Ｙａｎｋｎｅｒ，  Ｂ．  Ａ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １，  Ｅ４４−４５  （１９９９））。
【０００４】
カスパーゼは不活性な前駆体として生合成され、分子内の特異的切断（プロセシング）によって活性化する。従って、プロセシングを抑制すればカスパーゼによるアポトーシスを抑制できる可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カスパーゼ１２の活性化を抑制するタンパク質、及び該タンパク質を含有する細胞死阻害剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、癌特異的タンパク質であるＭＡＧＥ−３又はその一部切断型がカスパーゼ−１２又はその前駆体と特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質
上記遺伝子としては、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【０００８】
（ｃ）  配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）  配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質をコードするＤＮＡ
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法である。
【０００９】
さらに、本発明は、ＭＡＧＥ−３タンパク質及び／又はその一部切断型とカスパーゼ−１２又はその前駆体とが結合してなる複合体である。
さらに、本発明は、ＭＡＧＥ−３タンパク質及び／又はその一部切断型を有効成分として含有する細胞死阻害剤である。
ＭＡＧＥ−３タンパク質としては、以下の（ｅ）又は（ｆ）の組換えタンパク質が挙げられ、一部切断型としては、前記（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質が挙げられる。
【００１０】
（ｅ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質
ここで、細胞死には、アポトーシス、ネクローシス、壊死、予定細胞死、プログラム細胞死、及び細胞傷害からなる群から選択される少なくとも１種が含まれる。
【００１１】
さらに、本発明は、ＭＡＧＥ−３タンパク質及び／又はその一部切断型を有効成分として含有する細胞死疾患の治療剤である。
ここで、細胞死関連疾患としては、アポトーシス、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、及び臓器障害からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１２】
さらに、本発明は、ＭＡＧＥ−３タンパク質又はその一部切断型とカスパーゼ−１２又はその前駆体とを結合させることを特徴とするカスパーゼ−１２の活性化抑制方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、癌特異的タンパク質であるメラノーマ関連抗原３（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ３、ＭＡＧＥ−３という）及びその一部切断型並びにその用途に関するものであり、上記タンパク質がカスパーゼ−１２のプロセシングを抑制する機能を有することに基づいて完成されたものである。
【００１４】
カスパーゼ−１２前駆体は、細胞内の小胞体に局在し、小胞体特異的なストレスによって自己プロセシングが引き起こされ、活性化カスパーゼ−１２に成熟する（Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，  ９８−１０３  （２０００））。小胞体ストレスは、ヒトの神経変性疾患アルツハイマー病の病因の一つであることが示唆されている。従って、前駆体カスパーゼ−１２から成熟型カスパーゼ−１２への活性化の抑制、あるいは成熟型カスパーゼ自体の活性を抑制することにより、アルツハイマー病をはじめとする小胞体ストレス関連の疾患の予防、治療に使用することができる。また、ＭＡＧＥ−３タンパク質によるカスパーゼ活性化の抑制はカスパーゼ−１２に特異的であるため、これを応用した阻害剤は特異性が高く、他のカスパーゼの正常機能には悪影響を及ぼさないと期待される。
【００１５】
ここで、「カスパーゼ−１２の活性化を抑制する」とは、カスパーゼ−１２の前駆体に特異的に結合して前駆体から成熟型へのプロセシングを抑えること、あるいは、カスパーゼ−１２の成熟体に特異的に結合して成熟型（活性型）カスパーゼ自体の機能を抑えることを意味する。その結果、成熟型カスパーゼ−１２が引き起こす細胞死を阻害することが可能となる。但し、本発明においては、ＭＡＧＥ−３又はその一部切断型ＭＡＧＥ−３をカスパーゼ−１２の前駆体に結合させることが好ましい。
【００１６】
本発明においては、ＭＡＧＥ−３（Ｇａｕｇｌｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９，  ９２１−９３０  （１９９４））タンパク質又はその一部切断型のタンパク質を用いてカスパーゼ−１２の活性化を抑制することができる。なお、本発明において、ＭＡＧＥ−３タンパク質は「ＭＡＧＥ−３」と表示し、ＭＡＧＥ−３タンパク質をコードする遺伝子は「ＭＡＧＥ−３遺伝子」と表示する。上記ＭＡＧＥ−３及びその切断型は、カスパーゼ−１２に特異的であり、他のカスパーゼには結合活性を示さないものである。
【００１７】
本発明において、ＭＡＧＥ−３遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法を用いて単離される。そして、得られる遺伝子をベクターに導入して組換えベクターを作製し、さらに組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。組換えベクターを宿主内で機能し得るように発現ベクターとして構築すると、形質転換体を培養することによりＭＡＧＥ−３を単離精製することができる。
【００１８】
１．ＭＡＧＥ−３又はその一部切断型をコードする遺伝子のクローニング
本発明のＭＡＧＥ−３を得るため、まず、ＭＡＧＥ−３をコードする遺伝子をクローニングする。ＭＡＧＥ−３遺伝子の塩基配列は既に公知であるが（Ｇａｕｇｌｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９，  ９２１−９３０  （１９９４））、以下の通り遺伝子工学的手法により調製することもできる。
【００１９】
（１）  ＭＡＧＥ−３遺伝子  ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング
ＭＡＧＥ−３遺伝子のｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、精巣、腫瘍などの組織又は細胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法により、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００２０】
なお、本発明では市販のｃＤＮＡライブラリー（例えばヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社））を用いることもできる。
上記のようにして得られる形質転換体から目的のＤＮＡを有する株を選択するスクリーニング方法としては、例えば、抗体を用いたイムノスクリーニングによる方法、あるいは既知の配列からプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法が挙げられる。
【００２１】
（２）  一部切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子の調製
本発明においては、ＭＡＧＥ−３の一部切断型をコードする遺伝子（「切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子」という）の設計及び合成を行うことができる。一部切断型とは、ＭＡＧＥ−３の全長アミノ酸配列（配列番号２）のＮ−末端若しくはＣ−末端のいずれかまたは両側から最大で合計３１２個のアミノ酸が欠失した末端切断型のもの、すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、欠失後のアミノ酸が少なくとも５個、好ましくは１０個以上残存しているものを意味する。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において、第１番目〜８１番目（Ｓｅｒ）の欠失体、第１番目〜８８番目（Ｓｅｒ）の欠失体、第１番目〜９０番目（Ｇｌｎ）の欠失体、第１番目〜９３番目（Ｇｌｕ）の欠失体などが、本発明の一部切断型として挙げられる。
【００２２】
本発明の一部切断型のＭＡＧＥ−３タンパク質（切断型ＭＡＧＥ−３という）のうち１〜９３番目のアミノ酸を欠失させたものは、配列番号４で表される。該アミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第９４番目から第３１４番目のアミノ酸に対応するものである。
【００２３】
これらの断片は、該断片をコードする領域の外側の領域であって配列番号１で表される塩基配列の任意の領域の配列に基づいてプライマーを設計し、ＭＡＧＥ−３遺伝子（配列番号１；Ｇａｕｇｌｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９，  ９２１−９３０  （１９９４））を鋳型としてＰＣＲを行うことにより得ることができる。ただし、切断型ＭＡＧＥ−３を合成するためにはコード領域の５’末端に翻訳開始コドンを含む塩基配列を付加することが望ましい。
【００２４】
（３）  ＭＡＧＥ−３遺伝子の変異体又は切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子の変異体の作製
本発明においては、ＭＡＧＥ−３又は切断型ＭＡＧＥ−３のアミノ酸配列の一部に変異を導入することもできる。従って、これらのタンパク質の変異型も本発明のＭＡＧＥ−３又は切断型ＭＡＧＥ−３に含まれる。アミノ酸に変異を導入するには、該アミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
【００２５】
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異誘発法（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  １８２７７−１８２８４，  １９９６）に基づいて変異を導入するが、変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットなど）を用いて変異を導入することもできる。
【００２６】
例えば、ＭＡＧＥ−３遺伝子又は切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子の塩基配列のうち、変異させた塩基及びその変異部位の前後１０塩基程度の領域を含むプライマーを合成する。そして、ＭＡＧＥ−３遺伝子を鋳型とし、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。この産物を精製後、適当な制限酵素で処理することにより、目的の変異型ＭＡＧＥ−３遺伝子又はその切断型遺伝子を得ることができる。
【００２７】
（４）  塩基配列の決定
上記の通り得られた遺伝子について塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００２８】
配列番号１にＭＡＧＥ−３遺伝子の塩基配列を、配列番号２にＭＡＧＥ−３のアミノ酸配列を示し、配列番号３に切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子の塩基配列を、配列番号４に切断型ＭＡＧＥ−３のアミノ酸配列を例示するが、これらのアミノ酸配列からなるポリペプチドがカスパーゼ−１２又はその前駆体に対し特異的結合活性を有する限り、すなわちカスパーゼ−１２の活性化を抑制することができる限り、当該アミノ酸配列において１又は複数個、例えば１又は数個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００２９】
また、本発明の切断型ＭＡＧＥ−３（配列番号４）に含まれるアミノ酸をコードする遺伝子（配列番号３）のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。さらに、上記切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子（配列番号３）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカスパーゼ−１２の活性化を抑制するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合はハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜１５０ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件をいう。
【００３０】
一旦本発明の切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子の塩基配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用いたＰＣＲによって、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００３１】
３．本発明の遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）  組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド  ＤＮＡ、ファージ  ＤＮＡ等が挙げられる。
【００３２】
プラスミド  ＤＮＡとしては、市販のもの、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いることができるが、これに限定されるものではなく、その他大腸菌由来のプラスミドとして例えばｐＢＲ３２２、  ｐＢＲ３２５、  ｐＵＣ１１８、  ｐＵＣ１１９等、枯草菌由来のプラスミドとして例えばｐＵＢ１１０、  ｐＴＰ５等、酵母由来のプラスミドとして例えばＹＥｐ１３、  ＹＥｐ２４、  ＹＣｐ５０等を使用することもできる。また、ファージＤＮＡとしてλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）などを、動物ウイルスとしてレトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどを、あるいは昆虫ウイルスベクターとしてバキュロウイルスなどを用いることもできる。さらに、遺伝子発現活性化タンパク質であるＢ４２などが連結された融合プラスミド（例えばｐＮＢ３２１など）を用いることもできる。但し、本発明では、上記融合プラスミドに限定されるものではなく、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどが連結された融合プラスミドを用いてもよい。
【００３３】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター  ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
（２）  形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、その他動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。
【００３５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＢ７００、ＬＫＳ８７などが挙げられる。
【００３６】
プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌感染性ファージに由来するＴ７プロモーターなどが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００３７】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ６９：２１１０−２１１４  （１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９４，１８２−１８７  （１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７５，１９２９−１９３３  （１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３，１６３−１６８  （１９８３））等が挙げられる。
【００３９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ＰＣ１２若しくはＮＧ１０８−１５細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ若しくはＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００４０】
４．切断型ＭＡＧＥ−３の生産
本発明の切断型ＭＡＧＥ−３は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４１】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００４３】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは６．５〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４４】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには  ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００４５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
培養後、本発明の切断型ＭＡＧＥ−３が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、本発明の切断型ＭＡＧＥ−３が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４７】
５．細胞死阻害剤
ＭＡＧＥ−３及び切断型ＭＡＧＥ−３は、カスパーゼ−１２又はその前駆体と特異的に反応して前駆体から成熟体へのプロセシングを阻害する。従って、ＭＡＧＥ−３又はその切断型は、細胞死の阻害剤として、また細胞死に伴う疾患（細胞死関連疾患）の治療又は予防のために使用することができる。さらに、ＭＡＧＥ−３遺伝子及び切断型ＭＡＧＥ−３遺伝子は、細胞死関連疾患の遺伝子治療剤として有用である。またＭＡＧＥ−３の細胞内含量を定量することにより、細胞、組織の抗アポトーシス能を検査することができる。
【００４８】
上記細胞死関連疾患としては、アルツハイマー病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、及び臓器障害等が挙げられ、これらの疾患が単独で発症したものでも、複数種類が合併したものでも本発明の治療剤の適用対象となり得る。なお、合併症には上記疾患と他の疾患とが合併したものも含まれる。
本発明の治療剤又は遺伝子治療剤は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００４９】
本発明のタンパク質又は遺伝子を細胞死関連疾患の予防剤又は治療剤（遺伝子治療剤を含む）として使用する場合は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明のタンパク質又は遺伝子の使用の対象とすることができる。
【００５０】
本発明の治療剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００５１】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００５２】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００５３】
本発明の治療剤の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００５４】
本発明の遺伝子を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水層や脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる（リポソーム−遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与すればよい。
【００５５】
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態をを採用することもできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲が適当である。
【００５６】
６．抗アポトーシス活性の検出
本発明は細胞、組織の抗アポトーシス活性を検出することにも応用できる。すなわち、ＭＡＧＥ−３の定量によりＭＡＧＥ−３を高発現していることが示された細胞又は組織は、抗アポトーシス活性を獲得していると判断される。例えばＭＡＧＥ−３を特異的に認識する抗体（ポリクローナル、モノクローナル）を作用させることによりＭＡＧＥ−３の検出、定量が可能である。細胞、組織から調製した抽出液をニトロセルロース膜などにスポットしてドットブロットを作製するか、あるいは抽出液を電気泳動した後にニトロセルロース膜などに転写してウエスタンブロットを作った後、抗ＭＡＧＥ−３抗体及び２次抗体を順次作用させてＭＡＧＥ−３を検出できる。あるいは抽出液を用いてＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法などにより溶液のままＭＡＧＥ−３を定量することもできる。また、細胞、組織を直接、  抗ＭＡＧＥ−３抗体で免疫染色することにより、抗アポトーシス活性を獲得した細胞、組織の検出に用いることが可能である。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。なお、本実施例においては、核酸関連試薬及び酵素は、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社（日本）またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  社（アメリカ）より購入した。大腸菌用の培地基材はＤｉｆｃｏ社（アメリカ）より購入した。哺乳類細胞用の培地基材はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ社（アメリカ）より購入した。その他、一般試薬は、断りが無い限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（アメリカ）製を使用した。
【００５８】
〔実施例１〕  ＭＡＧＥ−３遺伝子のクローニング
ヒト精巣のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、アメリカ）を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、大量発現実験に用いるためのＭＡＧＥ−３蛋白質コード領域を得た。概要は以下の通りである。なお、一般的なＤＮＡ、ＲＮＡの取り扱いについてはＳａｍｂｒｏｏｋ  らの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ  （１９８９））に記述された方法に従った（以下、同様）。
【００５９】
ＭＡＧＥ−３はメラノーマ（黒色腫細胞）をはじめとする多くの癌細胞で高発現が観察されているが正常な組織については精巣以外でのみ発現が検出される（Ｖａｎ  Ｐｅｌ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １４５，  ２２９−２５０  （１９９５））。ＰＣＲに用いたプライマーＮＴＯＰ７７、  ＮＢＯＴ６８、ＮＴＯＰ７９、ＮＢＯＴ６５の配列は下記の通りである。後のクローニングを容易にするため、５’側のプライマー（ＮＴＯＰ７９）には制限酵素ＥｃｏＲＶ，  ３’側のプライマー（ＮＢＯＴ６５）には制限酵素ＸｈｏＩで切断可能な配列（それぞれＧＡＴＡＴＣとＣＴＣＧＡＧ）を含ませてある。
【００６０】
ＮＴＯＰ７７：  ＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴ（配列番号５）
ＮＢＯＴ６８：  ＧＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＧＴ（配列番号６）
ＮＴＯＰ７９：  ＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧ（配列番号７）
ＮＢＯＴ６５：  ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴ（配列番号８）
【００６１】
ＰＣＲのためのＤＮＡポリメラーゼ及び反応用緩衝液一式（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（ドイツ）より購入した。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。精巣ｃＤＮＡ１ｎｇを鋳型とし、ＮＴＯＰ７７及び  ＮＢＯＴ６８を用いて第一段目のＰＣＲを行った。第一段目の反応は、変性（９４℃，１分）、プライマーのアニーリング（５９℃，  １分）及びＤＮＡ伸長（７２℃，１分）の工程を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。これによって得られたＰＣＲ産物の１０００分の１量を２回目のＰＣＲに供した。第二段目の反応は、ＮＴＯＰ７９及び  ＮＢＯＴ６５をプライマーとして用い、変性（９４℃，１分）、プライマーのアニーリング（５０℃，  １分）及びＤＮＡ伸長（７２℃，１分）の工程を３５回繰り返した。
【００６２】
これらのＰＣＲによって特異的に増幅された約９００塩基対のＤＮＡ断片は制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩ（共にＴａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ社製）で末端を切断した後、アガロースゲル電気泳動とそれに続くＤＮＡ抽出（アメリカ・Ｂｉｏ１０１社製、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用した）によって精製した。精製したＤＮＡ断片は汎用ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＶ，  ＸｈｏＩ部位に挿入・連結し、プラスミドｐＮＢ１７８を得た。
【００６３】
〔実施例２〕  ＭＡＧＥ−３の大量生産
大腸菌を用いてＭＡＧＥ−３の大量生産を行った。
まず、ｐＮＢ１７８にクローン化されているＭＡＧＥ−３遺伝子をＰＣＲによって増幅した。なお、５’側プライマーにはＮｈｅＩで切断可能な配列を、  ３’側プライマーにはＸｈｏＩで切断可能な配列を付加した。反応サイクルは変性（９４℃，１分）、プライマーのアニーリング（５１℃，  １分）及びＤＮＡ伸長（７２℃，２分）の工程を１サイクルとしてこれを２５サイクル行った。
【００６４】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを実施例１に記載の方法と同様にして精製した後、大腸菌用発現プラスミドベクターｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アメリカ）のＮｈｅＩ，  ＸｈｏＩ部位に挿入、連結し、プラスミドｐＮＢ２０２を得た。なお、ｐＲＳＥＴ−Ａベクターを用いるとクローン化された遺伝子の５’端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ配列を含むタグ配列（Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ：配列番号９）が付加されるため、ニッケルイオンを有するアフィニティ樹脂（例えばＰｒｏｂｏｎｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた蛋白質のアフィニティ精製が可能となる。
【００６５】
ｐＮＢ２０２を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。形質転換体はアンピシリン（１００  ｍｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４  ｍｇ／ｍｌ）  を含むＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ  （１９８９））で培養した。対数増殖期にある形質転換体を含む培地に０．２  ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  （ＩＰＴＧ）を入れてＭＡＧＥ−３遺伝子の発現を誘導した。強制発現により生産されたＭＡＧＥ−３タンパク質はＮｏｖａｇｅｎ社（アメリカ）の方法に基づき、Ｐｒｏｂｏｎｄアフィニティ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。
その結果、１リットルの培養液から約１００  マイクログラムの精製ＭＡＧＥ−３を得た。精製されたＭＡＧＥ−３の純度が高いことはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図１）。
【００６６】
〔実施例３〕  ＭＡＧＥ−３とカスパーゼ−１２前駆体との結合実験
ＣＯＳ−１細胞中でカスパーゼ−１２前駆体とＭＡＧＥ−３蛋白質を強制的に発現させた後、その細胞抽出液中での両者の結合を免疫沈降法により検討した。
免疫沈降物の検出に使用するための抗ＭＡＧＥ−３抗体は、ウサギを免疫して作製した。ＭＡＧＥ−３のＣ−末端配列に相当するペプチド（ＣＨＩＳＹＰＰＬＨＥＷＶＬＲＥＧＥＥ（配列番号１０）、Ｔａｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アメリカ）をキャリアー蛋白質（活性化ヘモシアニン、Ｐｉｅｒｃｅ社、アメリカ）に結合させた後、アジュバントとともにウサギに注射した。なお、ペプチド・アミノ末端側の「Ｃ」はキャリアー蛋白質及びアフィニティ樹脂との結合のため人為的に付加してある。一方、同じ配列のペプチドを活性化ＦＭＰセルロファィン樹脂（生化学工業、日本）にカップリングさせてペプチドカラムを作製し、後のアフィニティ精製に用いた。免疫したウサギから得られた抗血清をペプチドカラムにアプライし、特異的抗体をペプチドに結合させた。特異的抗体はｐＨ２．６のグリシン溶液によってカラムから溶出させた。溶出液のｐＨは１  Ｍ  Ｔｒｉｓの添加によって中性まで上げ、中に含まれる特異的抗体を後の実験に用いた。
【００６７】
カスパーゼ−１２  ｃＤＮＡ及びＭＡＧＥ−３  ｃＤＮＡのそれぞれを哺乳類細胞用発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１（−）  （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、アメリカ）にクローン化し、ＣＯＳ−１細胞へ一過性のトランスフェクションにより導入した。カスパーゼ−１２についてはそのアミノ末端にＦＬＡＧ配列（Ｈｏｐｐ，  Ｔ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ６，  １２０４−１２１０  （１９８８））を付加するような改変遺伝子を用いた。細胞への導入にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いた。
【００６８】
トランスフェクションから２日後、ＣＯＳ−１細胞を回収し、細胞抽出液を調製した。抗ＦＬＡＧアフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、アメリカ）を用いて細胞抽出液中よりＦＬＡＧ付加カスパーゼ−１２を選択的に免疫沈降させた。なお、タンパク質の検出は、ウエスタンブロット法（Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ＆  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ  （１９８８））により行った（ＥＣＬ−ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。
【００６９】
結果を図２に示す。図２において、レーン１はその免疫沈降物にＭＡＧＥ−３が共存していることを示している。これは抗ＦＬＡＧアフィニティゲルにより沈降するカスパーゼ−１２前駆体にＭＡＧＥ−３が結合していたためである。対照実験として、ＣＯＳ−１細胞にＭＡＧＥ−３のみを強制発現させた場合には抗ＦＬＡＧアフィニティゲルによってＭＡＧＥ−３を免疫沈降させることはできない（レーン２）。
従って、哺乳類の培養細胞の中でＭＡＧＥ−３蛋白質とカスパーゼ−１２前駆体とは、安定な複合体を形成することが示された。
【００７０】
〔実施例４〕  カスパーゼ−１２内のＭＡＧＥ−３結合領域、及び特異性の検討
アメリカのＲ．  Ｂｒｅｎｔらが開発した酵母２ハイブリッド法（Ｇｙｕｒｉｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ７５，  ７９１−８０３  （１９９３））に従ってカスパーゼ−１２内のＭＡＧＥ−３結合領域を検討した。この方法によれば２種類の蛋白質の結合はこれらを含む酵母株がベータ・ガラクトシダーゼ活性を示すことで検出できる。
ＭＡＧＥ−３  ｃＤＮＡはベクターｐＪＧ４−５にクローン化することにより遺伝子発現活性化蛋白質（Ｂ４２）との融合遺伝子（プラスミド名、ｐＮＢ３２１）を作製した。
【００７１】
カスパーゼ−１２の成熟型に含まれるｐ１０サブユニット（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，  Ｎ．  Ａ．  ＆  Ｌａｚｅｂｎｉｋ，  Ｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，  １３１２−１３１６  （１９９８））に対応するｃＤＮＡ断片をベクターｐＥＧ２０２にクローン化することによりＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域との融合遺伝子（プラスミド名、ｐＮＢ３１６）を作製した。
【００７２】
検定用出芽酵母ＥＧＹ４８に３種類のプラスミド、ｐＮＢ３２１、ｐＮＢ３１６及びベータ・ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子を含むｐＳＨ１８−３４を導入した株  ＮＭＹ３０７を作製した。ＮＭＹ３０７を合成培地（０．６７  ％イースト窒素源（Ｄｉｆｃｏ社、アメリカ）、ヒスチジン−、トリプトファン−、ウラシル−不含・アミノ酸・核酸混合物（Ｂｉｏ−１０１社、アメリカ），  ２  ％  ガラクトース）で培養した。Ｇｙｕｒｉｓ  らの方法（Ｇｙｕｒｉｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ７５，  ７９１−８０３  （１９９３））に従ってＮＭＹ３０７の持つベータ・ガラクトシダーゼ活性を調べた。
一方、他のカスパーゼ（カスパーゼ−１，  −２，  −３，  −８）のｐ１０領域（それぞれ、ｐＥＧ２０２にクローン化した）とＭＡＧＥ−３（ｐＪＧ４−５にクローン化した）とを含む酵母株について、上記と同様にしてベータ・ガラクトシダーゼ活性を調べた。
【００７３】
結果を図３に示す。図３において、１、２、３、８及び１２は、それぞれカスパーゼ−１、−２、−３、−８及び−１２のｐ１０領域とＭＡＧＥ−３を含む酵母細胞である。「Ｐ」は正の対照株であり、ＥＧＹ４８に活性型の転写因子（プラスミド名、ｐＳＨ１７−４）とベータ・ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子（プラスミド名、ｐＳＨ１８−３４）を導入したものである。また、「Ｎ」は負の対照株であり、ＥＧＹ４８にカスパーゼ−１２のｐ１０とベータ・ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子を導入したものである。
【００７４】
ベータ・ガラクトシダーゼ活性が生じた酵母は、基質であるＸ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）から有色の物質を生成させていることが示された（下パネルの「１２」）。これは、成熟型カスパーゼ−１２の  ｐ１０領域がＭＡＧＥ−３蛋白質と結合したことを意味する。なお、このベータ・ガラクトシダーゼ活性は、比較として用いた正の対照株（下パネルの「Ｐ」）と同程度である。一方、負の対照株ではほとんど発色は見られなかった（下パネルの「Ｎ」）。さらに、試験したカスパーゼ−１、−２、−３及び−８は、いずれも負の対照株（Ｎ）と同様の発色しか見られなかった（図３、下パネル）。すなわち、これらのカスパーゼとＭＡＧＥ−３との結合は検出されなかった。
従って、カスパーゼ−１２内のＣ−末端側にあるｐ１０領域（成熟型において約１０ｋＤａのサブユニットになる）がＭＡＧＥ−３との結合に必要であることが示され、さらに、ＭＡＧＥ−３とカスパーゼ−１２との結合が特異的であることが示された。
【００７５】
〔実施例５〕  カスパーゼ−１２とＭＡＧＥ−３部分切断型との結合試験◎
カスパーゼ−１２（前駆体型）の  ｐ１０領域と結合可能な因子をＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いて探索した。
カスパーゼ−１２（前駆体型）  ｐ１０領域をｐＥＧ２０２にクローン化して相互作用トラップ法（Ｒ．  Ｂｒｅｎｔらによる、Ｇｙｕｒｉｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ７５，  ７９１−８０３  （１９９３））を行った。得られた結合タンパク質は、全てＭＡＧＥ−３の部分切断型であった。部分切断型は以下の通りである。最も短い切断型は、ＭＡＧＥ−３蛋白質（配列番号２）の９４番目のＧｌｙ残基からＣ−末端のＧｌｕ残基までのアミノ酸配列を有するものである（切断型１）。
【００７６】
切断型１：ＭＡＧＥ−３の１〜９３番目のアミノ酸が欠失したもの。
切断型２：ＭＡＧＥ−３の１〜９０番目のアミノ酸が欠失したもの。
切断型３：ＭＡＧＥ−３の１〜８８番目のアミノ酸が欠失したもの。
切断型４：ＭＡＧＥ−３の１〜８１番目のアミノ酸が欠失したもの。
【００７７】
上記の通り得られた切断型のそれぞれについて、Ｇｙｕｒｉｓらの方法（上記）に基づいて切断型ＭＡＧＥ−３との結合を調べた。すなわち、カスパーゼ−１２内のｐ１０領域、切断型ＭＡＧＥ−３、ｌａｃＺレポーター遺伝子の３者を形質転換により導入された出芽酵母ＥＧＹ４８をガラクトース合成培地プレート上で生育させた。プレート上のコロニーをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，  Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に移した後、酵母細胞を液体窒素につけて破砕した。破砕された酵母をつけたナイロン膜をＸ−Ｇａｌを含むリン酸緩衝液（Ｇｙｕｒｉｓ，  Ｊ．  ｅｗｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ７５，  ７９１−８０３  （１９９３））に浸し、３０？Ｃで４〜６時間保温した。カスパーゼ−１２  ｐ１０と切断型ＭＡＧＥ−３との結合によって酵母細胞内のｌａｃＺ遺伝子が発現されることによりβ−ガラクトシダーゼが産生され、その酵素活性によってナイロン膜上に青色の呈色反応が起こることを確認した。
【００７８】
調べた切断型全てが強い呈色反応を示したことから、ＭＡＧＥ−３の少なくともＧｌｙ９４からＧｌｕ３１４（Ｃ−末端）までの部分長ポリペプチド（図４のくさび型矢印（９４番目）からＣ末端（３１４番目）までの領域）もカスパーゼ−１２との結合能を有することが示された。
【００７９】
〔実施例６〕  ＭＡＧＥ−３蛋白質とカスパーゼとの結合実験（成熟型カスパーゼ−１２の結合）
本実施例では、カスパーゼ−１２の前駆体及び活性型がそれぞれどの程度、ＭＡＧＥ−３蛋白質に結合するかをＧＳＴ−融合蛋白質結合実験により検討した。
成熟型カスパーゼ−１２（ｐ３０という）は、成熟型（活性型）カスパーゼ−１２には含まれないＮ−末端のプロ配列を前駆体型カスパーゼからあらかじめ除き、代わりにＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−  Ｈｉｓ配列をＮ−末端に持つタンパク質として作製した。このｐ３０のｃＤＮＡを大腸菌用発現プラスミドベクターｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化した。ｐ３０を大腸菌で大量発現させると自己プロセシングによって成熟型に変換される。
【００８０】
一方、前駆体型のカスパーゼを自己プロセシングをしないように安定化するため、カスパーゼ−１２の活性部位にあるＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に置換した変異型ｐ３０  （ｐ３０Ｃ／Ｓと表す）を別に大腸菌で大量発現させた。大腸菌の培養及びｐ３０蛋白質の誘導合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコールに従った。ｐ３０及びｐ３０Ｃ／Ｓは、ともにＮ−末端の６×（Ｈｉｓ）配列を利用してニッケルカラムアフィニティ・クロマトグラフィー（Ｐｒｏｂｏｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により精製した。
【００８１】
後にカスパーゼ−１２との結合産物を容易に回収する目的でＭＡＧＥ−３のＮ−末端側に人為的にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴと表す）を融合させた蛋白質をコードするｃＤＮＡ（ｐＮＢ３４１）を作製した。ＭＡＧＥ−３の  ｃＤＮＡを大腸菌用発現プラスミドベクター、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン）に読み枠を合わせてクローン化することにより融合遺伝子を構築した。大腸菌ＸＬ−２  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’にｐＮＢ３４１を導入後、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のプロトコールに従って大腸菌の培養及びＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質の誘導合成を行った。ＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３を含む大腸菌の抽出液からＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質をグルタチオン樹脂（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により精製した。精製は同社のプロトコールに従った。
【００８２】
精製したＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質をｐ３０（成熟型）またはｐ３０Ｃ／Ｓ（前駆体型）と混合した後、グルタチオン樹脂を用いて溶液より回収した。ＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質とともに共沈殿してくる蛋白質をウエスタンブロット法により解析した。
結果を図５に示す。図５において、各レーンは以下の通りである。
【００８３】
レーン１：成熟型カスパーゼ−１２とＧＳＴとを混合したときの対照（ＭＡＧＥ−３を含まない）
レーン２：  ＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３とともに沈殿として回収されたカスパーゼ−１２（成熟型）
レーン３：前駆体型カスパーゼ−１２とＧＳＴとを混合したときの対照（ＭＡＧＥ−３を含まない）
レーン４：ＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３とともに沈殿として回収されたカスパーゼ−１２（前駆体型）
【００８４】
図５より、ｐ３０（成熟型）及びｐ３０Ｃ／Ｓ（前駆体型）は、ともに共沈殿産物内に認められるが、成熟型に比べて前駆体型（ｐ３０Ｃ／Ｓ）の方が明らかに多く認められた（図５）。従って、カスパーゼ−１２は前駆体及び成熟型のいずれもＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質と結合するが、成熟型よりも前駆体の方が効率的にＧＳＴ−ＭＡＧＥ−３蛋白質と結合することが判明した。
【００８５】
〔実施例７〕  ＭＡＧＥ−３によるカスパーゼ活性化の抑制
本実施例では、試験管内で合成したカスパーゼ−１２前駆体（４８  ｋＤａ）を成熟型カスパーゼ−１２によって切断させ、生体内での活性化を試験管内で再現した。
前駆体に対する成熟型カスパーゼ−１２の切断部位は特異的であり、その切断部位は、成熟型に含まれる約２０  ｋＤａと約１０  ｋＤａのサブユニット（それぞれｐ２０、ｐ１０と呼ぶ）の境界にある特定のＡｓｐ残基の部位である（図６、図７Ａレーン２）。この切断反応液にＭＡＧＥ−３蛋白質を共存させることにより特異的切断を抑制することができる。実験は以下の通り行った。
【００８６】
カスパーゼ−１２前駆体をコードするｃＤＮＡと試験管内蛋白質合成キット（ＴＮＴ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社、アメリカ）を用いてカスパーゼ−１２前駆体を合成した。合成反応液には［３５Ｓ］で標識されたメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を入れて、前駆体が放射性標識されるようにした。
【００８７】
切断反応は、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）、１０  ｍＭ  ジチオスレイトール中に放射性標識前駆体、成熟型カスパーゼ−１２、ＭＡＧＥ−３を混合し、３７℃で４５分間、行った。切断反応の停止のため、２倍濃度の電気泳動サンプル緩衝液（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ６．８），  ２  ％  ラウリル硫酸ナトリウム、１０  ％メルカプトエタノール、０．２  ％  ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）を等量添加した後、１００？Ｃで４分間加熱した。
【００８８】
切断反応液はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１４％）電気泳動により展開した。電気泳動ゲルは増感剤Ａｍｐｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社）で処理した後、乾燥させ、オートラジオグラフィーに供した。乾燥ゲル内の放射性の蛋白質はＢＡＳ２５００検出システム（フジフィルム社、日本）により検出した。
結果を図７に示す。図７において各レーンは以下の通りである。
【００８９】
（１）  パネルＡ
レーン１：放射性メチオニンの存在下で試験管内合成したカスパーゼ−１２前駆体。
レーン２〜７：カスパーゼ−１２前駆体を成熟型（０．２８μｇ）で切断したもの。切断反応の際、下記の量のＭＡＧＥ−３を共存させた。
【００９０】
レーン２（０μｇ）、レーン３（０．３μｇ）、レーン４（１．５μｇ）、レーン５（３μｇ）、レーン６（６μｇ）、レーン７（１２μｇ）
レーン８：カスパーゼ−１２前駆体を成熟型（１．１μｇ）で切断したもの。１２  μｇのＭＡＧＥ−３を共存させた。
レーン９：カスパーゼ−１２前駆体を成熟型（１．１μｇ）で切断したもの。ＭＡＧＥ−３の代わりに１２μｇの牛血清アルブミンを共存させた対照試料。
【００９１】
（２）  パネルＢ
レーン１：試料はパネルＡのレーン７と同様（切断反応の際、１２μｇのＭＡＧＥ−３を共存させた）。
レーン２：試料はパネルＡのレーン７と同様（切断反応の際、２４μｇのＭＡＧＥ−３を共存させた）。
レーン３：パネルＡのレーン９と同じ試料
【００９２】
図７Ａレーン２から７には、０から１２マイクログラムまで順次増量したＭＡＧＥ−３を共存させた例を示している。１２マイクログラムの添加でカスパーゼ−１２の切断反応はほぼ完全に抑制された。対照としてＭＡＧＥ−３の代わりに１２マイクログラムの牛血清アルブミンを加えた場合には、抑制効果は全く見られなかった（レーン９）。この抑制効果は、主にＭＡＧＥ−３がカスパーゼ−１２前駆体に結合することによるものである。
【００９３】
さらに、１２マイクログラムのＭＡＧＥ−３でほぼ完全に切断が抑制された条件下で、過剰（４倍量）の成熟型カスパーゼ−１２を加えても、切断は回復しなかった（レーン８）。一方、同様の条件下で過剰（２倍量）の基質（カスパーゼ−１２前駆体）を加えると、再び特異的切断を検出することができた（図７Ｂ，レーン２）。
【００９４】
以上より、カスパーゼは特異的な分子内切断によって活性化することが示された。また、ＭＡＧＥ−３はカスパーゼ−１２前駆体に強く結合し、カスパーゼ−１２の活性化を阻害することが示された。
【００９５】
〔実施例８〕  培養細胞におけるＭＡＧＥ−３の抗アポトーシス作用
本実施例は、培養細胞でＭＡＧＥ−３を高発現させると小胞体ストレス依存性のアポトーシスに対する抵抗性が高まることを確認するものである。
ＭＡＧＥ−３のカスパーゼ−１２活性化抑制を細胞レベルで検討するため、ＭＡＧＥ−３を高発現させた細胞株を樹立してアポトーシス刺激に対する反応を調べた。なお、精巣以外の正常組織ではＭＡＧＥ−３の発現は検出されていない（Ｖａｎ  Ｐｅｌ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １４５，  ２２９−２５０  （１９９５））。
【００９６】
ＭＡＧＥ−３  ｃＤＮＡを含むｐＮＢ１７９をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてマウスの筋芽細胞株、Ｃ２Ｃ１２細胞に導入した。ＰＮＢ１７９には薬剤耐性遺伝子Ｎｅｏが含まれていることを利用し、染色体に組み込まれたプラスミドを含む形質転換細胞を、抗生物質ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む培地で選択的に増殖させた。２週間の選択的培養の後、培養プレートに生じた耐性細胞のコロニーを拾い、別々に培養してクローン化した。それぞれのクローンにおけるＭＡＧＥ−３の発現量をウエスタンブロット（抗ＭＡＧＥ−３蛋白質抗体を用いた）で検討し、ＭＡＧＥ−３が高発現している２株（Ｃ２／ＭＡ１３，  Ｃ２／ＭＡ２１）を得た。
【００９７】
細胞内ではカスパーゼ−１２は小胞体依存性のアポトーシス誘導刺激によって活性化される（Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，  ９８−１０３  （２０００））。そこで、小胞体特異的カルシウムＡＴＰアーゼの阻害剤であるサプシガージン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、アメリカ，  Ｔｈａｓｔｒｕｐ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，  ２４６６−２４７０  （１９９０））を上記高発現株の培地に０．４μＭの濃度で添加した（２４時間）。
【００９８】
その結果、細胞内カルシウムバランスが崩れてカスパーゼ−１２の活性化を促し、細胞のアポトーシスが誘導された。すなわち、０．４マイクロモルのｔｈａｐｓｉｇａｒｉｇｉｎを２４時間作用させると、親株のＣ２Ｃ１２細胞の５０％以上がアポトーシスの形態を示して死に至った（図８、右側の上パネル）。
【００９９】
これに対して、Ｃ２／ＭＡ１３及び  Ｃ２／ＭＡ２１株は、同様のｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ処理に対して抵抗性を示した。顕微鏡観察によれば、Ｃ２／ＭＡ１３及び  Ｃ２／ＭＡ２１株は９０％以上の細胞は正常な形態を保っていた（図８、右側の中、下パネル）。なお、左側のパネルは、０．１％のジメチルスルホン酸処理した各細胞株の対照の試験結果である。
【０１００】
次に、ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ処理に対する抵抗性を定量化するため、それぞれの細胞の生存率を算出した。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所、日本）により細胞の生存率を測定した結果、２４時間のｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ  処理後、Ｃ２Ｃ１２の生存率は５０％まで低下するのに対し、Ｃ２／ＭＡ１３及び  Ｃ２／ＭＡ２１では高いレベル（７５％の生存率）に保たれていた。従って、ＭＡＧＥ−３の高発現により、細胞が小胞体特異的ストレスに対して抵抗性を有することが示され、これはアポトーシスの発生及び進行を抑制することを意味するものである。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明により、カスパーゼ−１２と特異的に結合してその活性化を抑制するタンパク質、及び該タンパク質を含有する細胞死阻害剤が提供される。上記タンパク質は、アポトーシスなどの細胞死を抑制するための薬剤として有用である。
【０１０２】
【配列表】
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【０１０３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌から精製したＭＡＧＥ−３のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す写真。
【図２】ＭＡＧＥ−３とカスパーゼ−１２との哺乳類培養細胞中における結合試験結果を示す写真。
【図３】ＭＡＧＥ−３とカスパーゼ−１２のｐ１０領域との結合試験結果を示す写真。
【図４】ＭＡＧＥ−３のアミノ酸配列を示す図。
【図５】ＭＡＧＥ−３とカスパーゼ−１２との結合親和性を比較した結果を示す写真。
【図６】カスパーゼ−１２前駆体の構造の模式図。
【図７】ＭＡＧＥ−３によるカスパーゼ−１２前駆体の活性化阻害試験結果を示す写真。
【図８】ＭＡＧＥ−３の高発現による細胞のアポトーシス抵抗性誘導試験の結果を示す写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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