(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
0003542597.tif 000010
｛式中、
Ｅがアルキリデン基であり、又はその化合物が酸付加塩の形態にある場合にH2を表し、
Ｊが−CO−NH−、−CO−Ｏ−、−CO−Ｓ−及び−NH−CO−から選ばれており、
Ｔがアルキレン鎖であり、又はＪが−CO−NH−である場合に、Ｔはそのアミノ酸成分の残基であり、
Ｑがジスルフィド、エステル又はチオエステルであり、そして
Ｚがブロモアセテート、マレイミド、ジスルフィド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル・エステルである。｝により表される化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）中、Ｅがアルキリデン基であるとき、それが４までの炭素原子をもつ直鎖又は分枝鎖低級アルキリデンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の一般式（I a）：
0003542597.tif 000011
｛式中、
Ｅが請求項１中に定義したものであり、
ＲがＨまたはCH3であり、そして
R'がＨ又はNO2である。｝により表される化合物。
【請求項４】
0003542597.tif 000012
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項５】
0003542597.tif 000013
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項６】
0003542597.tif 000014
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項７】
0003542597.tif 000015
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項８】
0003542597.tif 000016
である、請求項３に記載の化合物又はその酸付加塩。
【請求項９】
0003542597.tif 000017
である、請求項３に記載の化合物又はその酸付加塩。
【請求項１０】
0003542597.tif 000018
である、請求項３に記載の化合物又はその酸付加塩。
【請求項１１】
0003542597.tif 000019
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１２】
0003542597.tif 000020
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１３】
0003542597.tif 000021
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１４】
0003542597.tif 000022
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１５】
0003542597.tif 000023
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１６】
0003542597.tif 000024
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１７】
0003542597.tif 000025
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１８】
0003542597.tif 000026
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項１９】
0003542597.tif 000027
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項２０】
0003542597.tif 000028
により表される化合物又はその酸付加塩。
【請求項２１】
タンパク質と請求項１〜20のいずれか１項に記載の化合物との反応により形成された結合体。
【請求項２２】
前記タンパク質が免疫グロブリン又はその断片である、請求項21に記載の結合体。
【請求項２３】
請求項21又は22に記載の結合体に結合した金属原子を含む標識されたタンパク質。
【請求項２４】
前記金属がTc及びReのラジオアイソトープから成る群から選ばれる、請求項23に記載の標識されたタンパク質。
【請求項２５】
以下の一般式（II）：
0003542597.tif 000029
｛式中、Ｅが請求項１において定義されたものと同じである。｝により表される化合物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、分子標識付けにおける改良に関し、そして特に、金属イオン、特にテクネチウム及びレニウムを生物学的に有用な分子に連結することができる新規の２官能価ヒドラジン誘導体に関する。
発明の背景
それらの高い生物学的特異性のために、特定の巨大分子（例えば、モノクローナル抗体及びそれらの断片）は、画像形成及び／又は治療の目的のために特異的なインビボにおける部位にラジオアイソトープを標的化するために使用されてきた。診断的な核医療におけるテクネチウムの準安定性アイソトープ、99mTcの使用は、よく確立されており、そしてレニウムのβ−放射アイソトープ、186Re、188Re及び189Reは、治療的に使用されることができる。テクネチウムを巨大分子に付着させる多くの方法が記載されている。これらの方法の幾つかは、その巨大分子（普通には免疫グロブリン）内のジスルフィド基のチオールへの還元、そして還元Tcを結合するためのこれらの基のその後の使用を含む（例えば、McKenzie et al,国際特許出願WO 87/04164及びBremmer et al,EP 0 271 806 A2）。このタイプの直接的な標識付け法は、幾つかの潜在的な欠点をもっている。ジスルフィド単位の還元は、タンパク質の変性及び生物学的特異性のその後の損失を導くことができる。また、この方法は、ジスルフィド部分を欠いた巨大分子を標識付けするために使用されることができない。
あるいは、99mTcは、２官能価キレート、例えば、DTPA（D Lanteigne and D J Hnatowich,Int.J.Appl.Radiat.Isot.,35,617、（1984））、キレート化チオセミカルバゾン（Y Arano et al,Int.J.Nucl.Med.Biol.,12,425,（1985））及びジアミドジチオール・リガンド（A Fritzberg,欧州特許出願,EP 188 256 2A2）を介して巨大分子に連結されることができる。これらの方法に関連した問題は、（そのキレート化基以外の部位においてそのタンパク質に結合する）テクネチウムのかなりの非特異的結合並びにTc−標識付けの遅い速度を含む。
我々は、先に、欧州特許出願EP 0 384 796 A2において、還元Tc、例えば、99mTcV（グルコヘプトネート）と反応する２−ヒドラジノピリジノ部分により生物学的分子（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル・ヒトIgG及び卵白アルブミン）及びより小さな分子（例えば、ペプチド）を修飾して安定な免疫反応性放射結合体を作り出す新規の方法について記載した。
ラジオアイソトープ又は医薬分子を担持するように修飾された生物学的分子（例えば、モノクローナル抗体）がインビボにおいて代謝され、そして得られた生成物がその体じゅうに分配されることが証明された。この代謝生成物の生体分布を制御する努力において、その修飾部分の化学的特徴が、親水性又は解裂性の官能基を含むことにより変更された。Paik et al（J.Nucl.Med.,30,1693−1701（1989）及びAntibod.Immmunoconjug.and Radiopharm,3,127−136（1990））は、モノクローナル抗体とラジオアイソトープ（111In）との間のエステル官能基の内挿が、そのアイソトープの血液クリアランスを加速し、そして正常臓器、例えば、筋肉、腎臓、肝臓及び脾臓内へのその取り込みを減少させることを証明した。正常臓器からのこの速いクリアランスは、その腫瘍／正常臓器の比を２−３倍に増加させた。同様に、非−腫瘍動物における増大されたクリアランスが、エステル又はジスルフィド基を通して付着されたキレート剤を介して111In又は99mTcラジオアイソトープにより標識付けされた抗体について、Deshapande et al（Nucl.Med.Biol.,16,587−597（1989））、Paik et al（Nucl.Med.Biol.,16,475−481（1989））、Weber at al（Bioconjugate Chem.,1,431−437（1990））、及びGustavson et al（米国特許5 112 953（1992））により示された。
本発明の目的は、放射標識付けされた生物学的分子の生体分布を有利に変更するように、金属イオン、例えば、99mTcを巨大分子に連結させるために使用されることができる親水性及び／又は解裂性の部分を内挿されたヒドラジノ基及び反応性基をもつ新規の２官能価の分子を提供することである。
発明の要約
本発明に従って、親水性部分（例えば、酸）及び／又は解裂性部分（例えば、ジスルフィド及びエステル）を含む新規の２官能価ヒドラジン化合物、並びにそれらの結合体、が提供される。本発明に係る化合物とモノクローナル抗体C46.3のＦ（ab）’断片との99mTc標識結合体の腫瘍局在化を示すインビボにおける結果を、以下に提示する。これらの化合物のいくつかは、直接法（例えば、Bremmer et al）を介して標識された同一の抗体断片に比べて顕著に改良された腫瘍／血液値を示す。
本発明は、以下の一般式（Ｉ）：
0003542597.tif 000002
｛式中、
Ｅがアルキリデン基であり、又はその化合物が酸付加塩形態にある場合にH2を表し、
Ｊが−CO−NH−、−CO−Ｏ−、−CO−Ｓ−及び−NH−CO−から成る群から選ばれ、
Ｔがアルキレン鎖であり、又はＪが−CO−NH−である場合、Ｔがアミノ酸部分の残基であり、
Ｑが親水性又は解裂性の部分であり、そして
Ｚがアミン−及び／又はチオール−反応性部分であり、又は
ＱとＺが一緒になって、親水性又は解裂性並びにアミン−及び／又はチオール−反応性の両方の官能基を有する基を形成する。｝により表される新規の化合物を提供する。
Ｅがアルキリデンである場合、それは４以下の炭素原子の、直鎖又は分枝鎖低級アルキリデンであることができる。
好適には、Ｚは、チオール−反応性の、例えば、ブロモアセテート、マレイミド又はジスルフィドであり又はアミン反応性の、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル・エステルである。上記の部分Ｑはジスルフィド、エステル又はチオエステルであることができる。
先に特定したように、式（Ｉ）の化合物が酸添加塩形態であるとき、その酸は、好適には、ハロゲン化水素酸、硝酸、トリフルオロ酢酸、テトラフルオロホウ素酸又は硫酸であるが、この化合物の使用を妨害しないことを提供する他の酸を使用してもよい。
本発明に係る化合物は、熟練有機化学者により合成されることができる。これらの分子は、一般的にそれ自体公知の様々な出発材料から多くの異なる方法で組み立てられることができる。便利には、添付図面内に表された反応スキームの中の１つ、スキーム１〜４又はその自明の修正は、使用される。このタイプの分子により、正確な出発材料及び反応条件を変化させて式（Ｉ）内に落ちる類似の生成物を作り出す類似の方法を与えることができる。さらに特に、式（Ｉ）の特定の化合物の合成の詳細を、以下の実施例中に与える。
本発明は、以下の一般式（II）：
0003542597.tif 000003
｛式中、Ｅが先に定義したものである。｝により表される新規の化合物をも提供する。これらの化合物は、リンカー分子としての利用をも見い出されることができる。
本発明は、さらに、巨大分子を本発明に係る化合物と反応させることにより形成された結合体をも提供する。好適には、この巨大分子は、タンパク質、例えば、免疫グロブリン、例えば、モノクローナル抗体、又はその断片である。これは、Abrams et al in J.Nucl.Med.,31,2022（1990）により記載された方法に類似する方法により達成されることができる。Abrams et alは、放射標識付けの方法についても記載しており、そして類似のやり方で、本発明に係る結合体は、本発明に従って結合体に結合された金属原子、例えば、99mTc又はReのラジオアイソトープである進歩性のある且つ有用な標識付けされた巨大分子を作り出すために使用されることができる。
以下、より詳細に記載するように、99mTc−標識付けされた抗体断片結合体に対するテストは、その腫瘍内で検出される放射能対その血液中の放射能の比、腫瘍対臓器内で検出される放射能の比、又はその血液からのクリアランスの、１以上の特徴において、本発明に従ってリンカー分子を使用しない標識された断片についての、又は異なるリンカー分子を使用する標識された断片についての、改良を示す。従って、本発明は、さらに、一般的に公知の原理に従って、画像形成及び／又は治療のための本発明に係る標識された巨大分子の使用を提供する。
本発明を、これからさらに以下の実施例中に記載するが、これらは、例示的であることを意図されており、限定的であることを意図されていない。
実験
1H−NMRスペクトルを、300MHzBruker AM 300 Spectrometer上で記録した。すべての1H−NMRスペクトルを別段の定めなきかぎりDMSO−d6中で記録した。
Fast Atom Bombardment Mass Spectral分析を、Bacc＝8kVにおいて開口してVG Analytical ZAB 2−SE高場質量スペクトル装置上で行った。
各実施例中括弧［］内に与える化合物は、Chemical Abstracts Service Registry Index命名法に合致する。
６−ヒドラジノニコチン酸、６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチン酸及びスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネートを、Abrams et al.J.Nucl.Med.,31,2022（1990）に従って合成した。
以下の実施例中で合成される個々の化合物の構造を添付図面中に与える、ここで、化合物の番号は、その実施例の番号に一致する。
実施例１
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸
ジオキサン（5ml）と飽和水性重炭酸ナトリウム溶液（5ml）の混合液中のγ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸（173mg）の激しく攪拌した溶液に、一部においてスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（300mg,1.0当量）を添加した。この混合物を３時間攪拌し、次に水（50ml）に注いだ。このpHを、10N NaOHによりpH14に調整し、次に濃HClによりpH7に調整し、そして酢酸エチル（40ml）により１回抽出した。この水相のpHを次に濃HClによりpH4に低下させ、塩化ナトリウムにより飽和させ、そして酢酸エチル（3 x 4ml）により抽出した。この併合有機相を乾燥させ（MgSO4）、そして減圧下で蒸発させ、白色粉末として上記生成物を得た（360mg,96％）。
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル・エステル
アルゴン下THF（10ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸（360mg）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（96mg）の攪拌溶液に、０℃においてDDC（170mg）を添加した。この混合物を０℃において２時間、次に室温において一夜攪拌し、その間に白色固体が沈殿した。この固体を濾別しそしてその濾液を減圧下で蒸発させて白色泡として上記生成物を得た（少量）。
１の合成
６−ヒドラジノ−ニコチンアミド−（Ｌ）−グルタミン酸−Ｎ−ヒドロキシ・スクシンイミジル・エステル・ヒドロクロリド
ジオキサン（2ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル・エステル（150mg）の攪拌溶液に、ジオキサン（2ml）中の塩化水素の飽和溶液を添加した。１時間後、沈殿がその均一溶液から形成し、攪拌をさらに３時間続け、次にその固体を濾別し、エーテルにより洗浄し、そして乾燥させて白色／黄色結晶性固体として上記生成物を得た。1H NMR（DMSO−d6）δ2.10−2.29（m,2H）,2.39（t,2H,J＝6.9Hz）,2.18（s,4H）,4.88（ｍ、1H）,6.93（d,1H,J＝8.8Hz）,8.18（d,1H,J＝8.8Hz）,8.63（m,2H）,9.04（d,1H,J＝7.6Hz,D2O交換可能）,9.95（br.s,2H,D2O交換可能）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;380（60,M＋１）,283（100）,201（35）,185（42）,136（40）。
実施例２
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミル−γ−ベンジル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル
DMF（10ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸（200mg）、γ−ベンジル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル・ヒドロクロリド（151mg,1.0当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（53mg,1.0当量）の溶液を、０℃においてアルゴン下攪拌しながら冷却した。この溶液に、トリエチルアミン（32mg,1.1当量）その後一部においてDDC（94mg,1.0当量）を添加し、そしてその混合物を０℃において３時間次に室温において４日間攪拌し、その間に白色固体が沈殿した。この溶液を酢酸エチル（50ml）により希釈し、冷却し、そしてその固体を濾別した。この濾液を減圧下で蒸発乾固させ、そしてその油状残渣を酢酸エチル（50ml）及び飽和水性重炭酸ナトリウム溶液（30ml）中で分配し、その有機相を分離させ、ブラインにより十分に洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、そして減圧下で蒸発乾固させて白色泡状の固体を得た（90％）。
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル
酢酸エチル（5ml）中の活性炭上パラジウム（Aldrich,10％）の懸濁液に、６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミル−γ−ベンジル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル（300mg）を添加し、そしてその混合物を６〜８時間（その反応がTLCにより完結するまで）水素雰囲気下で激しく攪拌した。この混合物を濾過し、そして減圧下で蒸発乾固させて、白色泡を得た。これを、さらに精製せずに次の段階に直接使用した。
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミル−γ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル
以上の生成物（100mg）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（18.4mg,1.0当量）を含む酢酸エチル（10ml）中に溶解し、そしてアルゴン下攪拌しながら０℃に冷却した。こ攪拌溶液に、一部においてDDC（33mg,1.0当量）を添加し、そしてこの混合物を室温において一夜攪拌し、その間に白色固体が沈殿した。この固体を濾別し、そしてその濾液を減圧下で蒸発させて白色泡として上記生成物を得た。
２の合成
６−ヒドラジノ−ニコチンアミド−（Ｌ）−グルタミル−γ−Ｎ−ヒドロキシ・スクシンイミジル−（Ｌ）−グルタミン酸ヒドロクロリド
ジオキサン（1ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミル−γ−Ｎ−ヒドロキシ・スクシンイミジル−（Ｌ）−グルタミン酸ｔ−ブチル・エステル（20mg）の攪拌溶液に、ジオキサン（1ml）中の塩化水素の飽和溶液を添加した。１時間後、沈殿がその均一溶液から形成し、攪拌をさらに24時間続け、次にその混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残った白色／黄色結晶性固体をデカンテーションによりエーテル（3 x）により洗浄し次に蒸発させ、そして乾燥させた。1H NMR（DMSO−d6）δ1.80−2.20（m,4H）,2.31（m,2H）,2.76（m,2H）,2.80（s,4H）,4.24（m,1H）,4.42（m,1H）,6.90（d,1H,J＝8.8Hz）,8.17（dd,1H,J＝8.8,2.4Hz）,8.71（s,1H）；質量分析（FAB）;m/e相対強度;509（18,M＋１）。
実施例３
６−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチンアミド−３−プロパノール
DMF（80ml）中のスクシンイミジル６−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチネート（10g,34.4mmol）の溶液に、DMF（20ml）中の３−アミノプロパノール（3.0ml,37.9mmol）の溶液を滴下し、そしてその混合物を室温において16時間攪拌し、次に減圧下で濃縮した。この残渣、薄黄色の油を酢酸エチル（50ml）中に溶解し、そして最小量の水により洗浄し、乾燥さ（Na2SO4）、そして減圧下で薄黄色の固体まで濃縮し、これを酢酸エチルから再結晶させて白色固体として所望の生成物を得た（5.6g,65％）。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル・グルタリル・クロリド
Benkovic,Lerner WO 88 09380;他のワン−ポット手順は以下のようなものである；
ジクロロメタン（30ml）中の無水グルタル酸（4.95g）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ・スクシンイミド（5.0g）を一部において添加し、そしてこの混合物を、その反応が完結するまで（1H NMRによりチェックして）室温において2.5時間攪拌した。この混合物に。カニューラを介して塩化オギザリル（3.0当量，ジクロロメタン中2M溶液,Aldrich,65ml）を滴下し、この間に強い発泡が生じた。この混合液を一夜攪拌し、次に減圧下で蒸発乾固させた。さらにジクロロメタンを添加し、そしてこの混合物をもう一度蒸発させた。この手順を、蒸発の間にその残渣が結晶し始めるまで、数回繰り返した。この固体をデカンテーションにより３回エーテルにより洗浄し、そして白色固体として上記生成物を得た。
３の合成
アルゴン下０℃におけるTHF（15ml）中の６−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチンアミド−３−プロパノール（200mg,0.8mmol）の溶液に、トリエチルアミン（123μl,1.1当量）その後Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルグルタリル・クロリド（200mg,0.8mmol）を一部において添加し、そしてその混合物を一夜攪拌しながら室温まで放置して温めた。減圧下の蒸発により、油を得て、これを酢酸エチル中に再溶解させ、そして氷浴内で冷却し、トリエチルアミン・ヒドロクロリドの白色結晶性沈殿物を得て、これを濾別した。この濾液を濃縮し、そしてカラム・クロマトグラフィー及び溶出液として酢酸エチル中の５％イソプロパノールを使用してシリカ・ゲルの短カラムにより精製した。所望の生成物を白色粉末固体として得た（80mg,22％）。1H NMR（CDCl3）δ1.15（t,3H,J＝7.5Hz）,1.96（pentet,2H,J＝6.2Hz）,2.08（pentet,2H,J＝7.1Hz）,2.31−2.40（dq,2H,J＝7.5,5.1Hz）,2.51（t,2H,7.1Hz）,2.73（t,2H,J＝7.1Hz）,2.84（s,4H）,3.50（q,2H,J＝6.4Hz）,4.24（t,2H,J＝6.1Hz）,6.54（br.t,1H,D2O交換可能）,7.19−7.26（m,2H）,7.97−8.01（dd,1H,J＝8.8Hz,2.4Hz）,8.50（dd,1H,J＝2.4,0.7Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;462（100,M＋１）,432（10）,233（42）。
実施例４
３−ヒドロキシプロピル−［６−（２−プロペニルヒドラゾン）］ニコチネート
DMF（20ml）中の６−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチン酸（3.08g,15.5mmol）及び炭酸カリウム（5.4g,39mmol）の混合物に、３−ブロモ−１−プロパノール（2.58g,18.6mmol）を添加した。この反応混合物をアルゴン下で16時間70℃において攪拌した。この溶液を冷却し、そして減圧下で蒸発乾固させた。この残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（2 x 50ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させて赤色の固体を得た。カラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル；塩化メチレン／メタノール（95/5））を使用して上記生成物を白色固体として単離した（2.3g,60％）。
４の合成
［３−ピリジンカルボン酸,6−プロピリデンヒドラジノ）−３−［（ブロモアセチル）オキシ］プロピル・エステル］
アルゴン下、乾燥塩化メチレン（20ml）中の３−ヒドロキシプロピル−［６−（２−プロペニル−ヒドラゾン）］ニコチネート（150mg,0.6mmol）及び水性炭酸ナトリウム（127mg,1.20mmol）の攪拌溶液に、０−５℃においてブロモアセチル・ブロミド（112mg,0.60mmol）を滴下した。この反応混合物を０−５℃において１時間、その後室温において１時間攪拌した。この固体を濾別し、そして塩化メチレン（50ml）による希釈後の濾液を水（25ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその粗生成物をガム状の固体として得た。分離用TLC（シリカ・ゲル・プレート1000μm,酢酸エチル／ヘキサン（2/1））を使用して、上記生成物を白色固体として単離した（120mg,54％）。1H NMR（CDCl3）δ1.16（t,3H,J＝7.5Hz）,2.15（m,2H,J＝6.3Hz）,2.36（m,2H,J＝7.6Hz）,3.84（s,2H）,4.34（t,2H,J＝6.2Hz）,4.41（t,2H,J＝6.3Hz）,7.31（d,1H,10.4Hz）,7.33（t,1H）,8.18（dd,1H,J＝2.2,9.1Hz）,8.66（d,J＝2.2Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;374（100,M＋１）,372（100,M＋１）,294（25）,176（52）,121（46）。
実施例５
Ｓ（２−チオピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド
このジスルフィドを、P C S Chong and R S Hodges,J.Biol.Chem.,（1981），256,5064の方法により合成した。
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−［Ｓ−（２−チオピリジル）］−（Ｌ）−システイン
Ｓ−（２−チオピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド（369mg,1.37mmol）及び飽和水性重炭酸ナトリウム溶液（5ml）及び水（3ml）の溶液に、ジオキサン（5ml）中のスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）−ピリジン−５−カルボキシレート（500mg,1.42mmol）の溶液を添加した。この反応混合物を室温において2.5時間攪拌した。水（25ml）をその反応混合物に添加し、そしてその水性溶液を酢酸エチルにより洗浄して未反応のエステルを除去した。この水相を塩化ナトリウムにより飽和させ、そしてpH3.7に酸性とした。この水溶液を酢酸エチル（2 x 25ml）により抽出した。この併合有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して611mgの粘着性の白色固体を得た。エーテルをそのフラスコに添加し、そしてその固体をその側から剥がし、そして濾過により単離して所望の生成物を白色固体として得た（550mg,82％）。
５の合成
６−ヒドラジノ−ニコチンアミド−Ｓ−（２−チオピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド
乾燥ジオキサン中の塩化水素（ガス）の溶液を５分間中程度の速度で乾燥ジオキサン中に塩化水素をバブリングすることにより調製した。この塩化水素／ジオキサン溶液（5ml）に６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−［Ｓ−（２−チオピリジル）］−（Ｌ）−システイン（50mg）を添加した。この反応混合物を室温において２時間攪拌し、そして白色固体が形成した。この溶媒を減圧下で除去し、そして次に高真空下で乾燥させて35mgの白色非晶質固体を得た。1H NMRδ3.30（m,2H）,4.65（m,1H）,6.93（d,1H,J＝8.6Hz）,7.25（m,1H）,7.75（m,1H）,8.15（d,1H,J＝8.6Hz）,8.45（d,1H）,8.70（s,1H）,9.05（d,1H）；質量分析（FAB）;m/e;366,351,257,223,202,179。
実施例６
Ｓ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド
４−ニトロピリジン・ジスルフィド（1.98g,6.34mmol）をDMF（10ml）に添加し、そしてこの混合物を加熱して溶解を助けた。この溶液を室温まで冷却し、そしてDMF（6ml）中の（Ｌ）−システイン／ヒドロクロリド（0.5g,3.17mmol）の溶液を添加した。この反応混合物は、明るい黄色となり、そしてこれを室温において16時間攪拌した。少量の沈殿物が形成され、これを濾過により除去した。この濾液を濃縮して濃い黄−茶色の油を得て、これはジクロロメタンによる処理の間に黄色の沈殿を作り出した。。この沈殿物を濾過により単離した。この固体を穏やかに加熱しながらメタノール中に溶解し、そして濾過して白色不溶性固体を除去した。この濾液をエーテルにより処理して沈殿を形成させた。この黄色の固体を濾過により単離して240mgの所望の生成物を得た。さらに120mgの生成物をその元のジクロロメタン濾液から沈殿させた；全収量360mg（39％）。
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−Ｓ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−（Ｌ）−システイン
Ｓ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド（220mg,0.70mmol）を飽和水性重炭酸ナトリウム（5ml）中に溶解させ、そしてジオキサン（5ml）中のスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（246g,0.70mmol）の溶液を添加し、そしてその反応混合物を室温において３時間攪拌した。水（25ml）を添加し、そしてその水溶液を酢酸エチルにより洗浄して未反応エステルを除去した。この水相を1N HClによりpH3.3に酸性とし、次に塩化ナトリウムにより飽和にした。この酸性水溶液を一夜硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して、145mgの黄色の固体を得て、これを、エーテル中に懸濁させ、そして濾過により単離して35mgの所望の生成物を得た。この濾液を濃縮し、そしてエーテル／ヘキサンにより処理してさらに95mgの所望の生成物を得た；全収量125mg（35％）。
６の合成
６−ヒドラジノ−ニコチンアミド−Ｓ−（２−チオ−５−ニトロピリジル）−（Ｌ）−システイン・ヒドロクロリド
乾燥ジオキサン中の塩化水素（ガス）の溶液を５分間中程度の速度で乾燥ジオキサン中に塩化水素をバブリングすることにより調製した。この塩化水素／ジオキサン溶液（5ml）に６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−［Ｓ−（２−チオ−５−ニトロ−ピリジル）］−（Ｌ）−システイン（50mg）を添加した。この反応混合物を室温において２時間攪拌し、そして白色固体が形成した。この溶媒を減圧下で除去し、そして次に高真空下で乾燥させて25mgの白色非晶質固体を得た。1H NMRδ3.30（m,2H）,4.66（m,1H）,6.92（d,1H,J＝9.0Hz）,8.01（d,1H,J＝9.0Hz）,8.12（d,1H,J＝8.9Hz）,8.48（dd,1H,J＝8.9,2.7Hz）,8.64（s,1H）,9.03（d,1H,J＝8.3Hz）,9.2（br.s,1H）；質量分析（FAB）;m/e;411,391,363,335,307,293,277,257,201,185,171,157。
実施例７
７の合成
実施例５及び６中に記載した手順と類似の実験手順を使用して（Ｌ）−ペニシラミンから合成した。1H NMR（DMSO−d6）δ1.41（s,3H）,1.43（s,3H）,4.75（m,1H）,6.92（d,1H,J＝9.1Hz）,7.20（m,1H）,7.79（m,2H）,8.14（dd,1H,J＝9.8,2.3Hz）,8.39（d,1H,J＝4.0Hz）,8.54（s,1H）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;394（Ｍ＋１）。
実施例８
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−３−プロパノール
０−５℃に冷却したDMF（4ml）中のスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）−ニコチネーチ（350mg）の攪拌溶液に、DMF（2ml）中の３−アミノ−１−プロパノール（90mg,1.2当量）の溶液を添加した。この混合物を０−５℃において１時間、そして次に室温において16時間攪拌した。この反応混合物を濃縮乾固して白色固体残渣を得た。この残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（2 x 15ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させて上記生成物を白色固体として得た（330mg,90％）。
アルゴン下、乾燥塩化メチレン（15ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−３−プロパノール（296mg,1当量）及び水性炭酸ナトリウム（212mg,2当量）の攪拌溶液に、０−５℃においてブロモアセチル・ブロミド（200mg,1.1当量）を滴下した。この混合物を０−５℃において1/2時間、その後室温において２時間攪拌した。この固体を濾別し、そして塩化メチレン（50ml）による希釈後の濾液を水（25ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその粗生成物を薄い黄色の固体として得た。その粗生成物を溶出液として塩化メチレン／メタノール（90/10）を使用したシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィーにより精製し、白色固体としてその純粋なブロモアセチル化生成物（267mg,62％）を得た。
８の合成
［酢酸，ブロモ−,3−［［（６−ヒドラジノ−３−ピリジニル）カルボニル］アミノ］プロピオ・エステル・モノヒドロブロミン）］
酢酸エチル中の臭化水素の溶液を５分間中程度の速度で酢酸エチル（10ml）に無水臭化水素（ガス）を通過させることにより合成した。
上記ブロモアセテート（90mg）を酢酸エチル（1ml）中に溶解し、そしてHBr/酢酸エチル（2ml）を添加し、そしてその反応混合物を室温において攪拌した。５分後に、この溶液は濁り、そして沈殿が形成した。攪拌を2 1/2時間続けた。この濁った混合物を濾過し、エーテル（3 x 10ml）により洗浄し、そして減圧下で乾燥させて白色固体を得た（65mg,71％）。1H NMR（DMSO−d6）δ1.95（t,2H,J＝6.2Hz）,3.35（t,2H,J＝6.2Hz）,4.15（s,2H）,4.20（t,2H,J＝6.2Hz）,6.95（d,1H,J＝8.8Hz）,8.15（dd,1H,J＝2.4,8.8Hz）,8.65（d,1H,J＝2.4Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;333（33,M＋１）,331（33,M＋１）,136（100）。
実施例９
３−ヒドロキシプロピル６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネート
DMF（20ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチン酸（3.0g,11.86mmol）及び炭酸カリウム（2.2g,15.9mmol）の混合物に、３−ブロモ−１−プロパノール（2.0g,14.39mmol）を添加した。この反応混合物をアルゴン下で16時間70℃において攪拌した。この溶液を冷却し、そして減圧下で濃縮乾固させた。この茶色の残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（2 x 50ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させて薄い黄色の油を得た。カラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル，酢酸エチル／ヘキサン（3/1））を使用して上記生成物を白色固体として単離した（2.28g,60％）。
アルゴン下、乾燥塩化メチレン（25ml）中の上記のエステル−アルコール（935mg,3.0mmol）及び水性炭酸ナトリウム（636mg,6.0mmol）の攪拌溶液に、０−５℃においてブロモアセチル・ブロミド（290μl,3.6mmol）を滴下した。この反応混合物を０−５℃において30分間、その後室温において１時間攪拌した。この固体を濾別し、そして塩化メチレン（50ml）による希釈後の濾液を水（25ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその粗生成物を茶黄色の粘着性固体として得た。カラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル；酢酸エチル／ヘキサン（2/1））を使用して上記生成物を白色固体として単離した（0.36g,28％）。
９の合成
ジオキサン中の臭化水素の溶液を５分間中程度の速度でジオキサン（10ml）に無水臭化水素（ガス）を通過させることにより合成した。上記ブロモアセテート（75mg）をジオキサン（2ml）中に溶解し、そしてHBr/酢酸エチル（2ml）を添加し、そしてその反応混合物を室温において２分間攪拌した。この濁った混合物を濾過し、エーテル（3 x 10ml）により洗浄し、そして減圧下で乾燥させて白色固体を得た（40mg,56％）。1H NMR（D2O）δ2.18（t,2H,J＝6.0Hz）,4.01（s,2H）,4.39（t,2H,J＝6.0Hz）,4.44（t,2H,J＝6.0Hz）,6.89（d,1H,J＝9.0Hz）,8.13（dd,1H,J＝2.0,9.2Hz）,8.62（d,1H,J＝2.0Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;334（100、Ｍ＋１）,332（100,M＋１）,212（76）,194（38）,154（48）,136（45）。
実施例10
３−ヒドロキシプロピル［（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド］−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタメート
DMF（5ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−γ−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸（1.0g,2.29mmol）及び炭酸カリウム（348mg,1.1当量）の攪拌溶液に、３−ブロモプロパノール（227μl,1.1当量）を添加し、そしてこの混合物を一夜55−60℃において加熱した。この溶液を減圧下で蒸発乾固させ、そしてその残渣を酢酸エチルと飽和水性重炭酸ナトリウムとの間で分配した。この有機相を分離させ、そして水により十分に洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させて泡状の白色固体を得た。所望の生成物を、溶出液としてヘキサン中の90％酢酸エチルを使用してシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィーにより精製して、白色固体を得た（900mg,78％）。
上記の化合物（200mg,0.40mmol）及び無水炭酸ナトリウム（84mg,2.0当量）をジクロロメタン（10ml）中に溶解し、そしてアルゴン下で０℃に冷却した。ブロモアセチルブロミド（40μl,1.2当量）を滴下し、そしてこの混合物を室温まで一夜放置して温めた。酢酸エチル（20ml）を添加し、そしてその溶液を飽和水性重炭酸ナトリウムにより洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させた。所望の生成物を、溶出液としてヘキサン中の80％酢酸エチルを使用してシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィーにより精製して、無色の油を得た（40mg,16％）。
10の合成
上記のブロモアセテート（40mg,0.06mmol）を無水ジオキサン中に溶解し、そして氷浴内で冷却した。臭化水素（ガス）を約１分間（又は飽和まで）その溶液中に通過させた。この溶液を３分間０℃において放置し、次にエーテルを添加してその生成物を沈殿させた。白色固体をそのフラスコの底に沈め、そしてその上清臭化水素溶液をパスツール・ピペットを用いてデカント除去した。次にこの固体をエーテルによる10回のデカンテーションにより洗浄し、そしてエーテルの残トレースを減圧下で蒸発により除去し、そして一夜真空中で乾燥させた。その生成物は白色固体であった（25mg,77％）。1H NMR（D2O）δ2.07（pentet,2H,J＝6.2Hz）,2.09−2.31（m,2H）,2.38（t,2H,J＝6.9Hz）,4.02（s,2H）,4.25（t,2H,J＝6.1Hz）,4.31（t,2H,J＝5.9Hz）,4.53（m,1H）,6.96（d,1H,J＝9.3Hz）,8.06−8.09（dd,1H,J＝9.3,2.1Hz）,8.41（d,1H,J＝2.0Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;463（100,M＋１）,461（100,M＋１）,383（22）,339（10）,237（10）。
実施例11
２−カルボキシエチル−２−ピリジルジスルフィドを、Carlesson et al,Biochem.J.（1978），173,723−737に従う手順により合成した。
11の合成
０℃におけるTHF（10ml）中の６−（２−プロペニルヒドラゾン）ニコチンアミド−３−プロパノール（190mg,0.8mmol）及び２−カルボキシエチル−２−ピリジルジスルフィド（163mg,1.0当量）の混合溶液にジシクロヘキシル−カルボジイミド（157mg,1.0当量）を添加し、そしてその混合物を72時間０−５℃において攪拌し、この間に白色固体が沈殿した。この白色固体を濾別し、そしてその濾液を減圧下で蒸発させた。このー残渣を酢酸エチル中に溶解し、そして冷却し、これはジシクロヘキシル・ウレア（"DCU"）のさらなる沈殿物を与えた。この手順をそのウレアのずべてが除去されるまでもう一度繰返した。所望の生成物を、溶出液としてジクロロメタン中の５％メタノールを使用してシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／エーテル中の再結晶化により白色固体を得た（85mg,25％）。1H NMR（CDCl3）δ1.15（t,3H,J＝7.5Hz,1.95（pentet,2H,J＝6.0Hz）,2.36（dp,2H,J＝5.0,7.6Hz）,2.80（t,2H,J＝7.0Hz）,3.07（t,2H,J＝7.0Hz）,3.50（m,2H）,4.04（t,2H,J＝6.0Hz）,6.51（broad triplet,1H,D2O交換可能）,7.07−7.12（m,1H）,7.17−7.21（m,2H）,7.60−7.72（m,2H）,7.95−7.99（dd,1H,J＝8.8,2.4Hz）,8.22（broad s,1H,D2O交換可能）,8.42−8.45（m,1H）,8.55（d,1H,J＝2.4Hz）；質量分析（FAB）;m/e相対強度;448（100,M＋１）,176（45）。
実施例12
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−２−エタンチオール
DMF（20ml）中のスクシンイミジル６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（2.0g,5.7mmol）及びトリエチルアミン（0.8ml,5.7mmol）の攪拌溶液に、２−アミノエタンチオール・ヒドロクロリド（0.65g,5.7mmol）を添加した。この反応混合物を室温において16時間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（50ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させて上記生成物を白色固体として得た（1.19g,67％）。
アルゴン下、乾燥塩化メチレン（20ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−２−エタンチオール（200mg）及び無水炭酸ナトリウム（２当量）の攪拌溶液に、０−５℃においてブロモアセチル・ブロミド（1.2当量）を滴下した。この反応混合物を０−５℃において30分間、その後室温において１時間攪拌した。この固体を濾別し、そして塩化メチレン（50ml）による希釈後の濾液を水（25ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその粗生成物を薄い茶色の粘着性固体として得た。カラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル；酢酸エチル／ヘキサン（2/1））を使用して上記生成物を薄い黄色の固体として単離した（110mg,41％）。
12の合成
［酢酸，ブロモ−,2−［［（６−ヒドラジノ−３−ピリジニル）カルボニル］アミノ］エチルチオエステル，モノヒドロブロミド］
酢酸エチル中の臭化水素の溶液を５分間中程度の速度で酢酸エチル（10ml）に無水臭化水素（ガス）を通過させることにより合成した。
上記BOC−ヒドラジノピリジン誘導体（22mg）を酢酸エチル（1ml）中に溶解し、そしてHBr/酢酸エチル（2ml）を添加し、そしてその反応混合物を室温において１時間攪拌した。この濁った混合物を濾過して、12mgの白色固体を得た（57％）。1H NMR（DMSO−d6）δ3.15（t,2H）,3.45（m,2H）,4.45（s,2H）,6.95（d,1H）,8.15（d,1H,）,8.65（s,1H）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;335（42,M＋１）,333（42,M＋１）,185（100）。
実施例13
２−（２−ピリジル）−S'−（２−アミノ）エチル・ジスルフィド・ヒドロクロリド
メタノール（40ml）中のAldrithiol（8.8g,0.04mol）及び氷酢酸（1.6ml）の攪拌溶液に、メタノール（25ml）中の２−アミノエタンチオール・ヒドロクロリド（2.3g,0.02mol）を滴下した。この明るい黄色の溶液を16時間室温において攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を塩化メチレン（100ml）と共に攪拌し、そして上記生成物を白色粉末として得た（3.6g,80％）。
６−（２−プロペニルヒドラゾン）−Ｎ−（2'−ピリジルジチオエチル）ニコチンアミド
（式（II）の化合物）
DMF（20ml）中のスクシンイミジル６−（２−プロペンヒドラゾン）ニコチネート（590mg,2.0mmol）及びトリエチルアミン（0.6ml）の溶液に２−ピリジル・ジチオアミノエタン・ヒドロクロリド（444mg,2mmol）を添加した。この反応混合物を室温において16時間攪拌した。この溶液を減圧下の濃縮乾固させた。この残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（2 x 50ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその粗生成物を白色固体として得た（650mg,90％）。1H NMR（DMSO−d6）δ1.02（t,3H）,2.25（q,2H）,3.05（t,2H）,3.55（m,2H）,7.05（d,1H,）,7.25（m,1H）,7.45（t,1H）,7.85（m,2H,）,7.95（d,1H）,7.55（m,3H）。
DMF（10ml）中の上記ジスルフィド（361mg,1.00mmol）及び氷酢酸（20μｌ）の溶液にDMF（2ml）中のメルカプトプロピオン酸（106mg,1.0mmol）を滴下した。この反応混合物を室温において16時間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を塩化メチレン（10ml）と共に粉砕し、そして上記生成物を白色粉末として得た（208mg,58％）。
13の合成
DMF（5ml）中の上記の酸（108mg,0.30mmol）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（35mg,0.30mmol）の攪拌溶液に、０℃においてDCC（63mg,0.31mmol）を添加した。この混合物を４℃において16時間攪拌した。この白色固体（DCU）を濾別し、そしてその濾液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を酢酸エチル（25ml）と共に粉砕し、そして濾過した。この濾液を減圧下で濃縮して（13）を白色粉末として得た（70mg,51％）。1H NMR（CDCl3）δ1.15（t,3H,J＝7.5Hz）,2.35（m,2H,J＝7.5Hz）,2.91（s,4H）,2.91（s,4H）,2.94（t,2H,J＝6.7Hz）,3.03（m,2H）,3.11（m,2H）,3.75（q,2H,J＝6.4Hz）,7.17（d,1H,J＝7.9Hz）,7.21（t,1H,J＝4.7Hz）,7.98（dd,1H,J＝2.4,8.8Hz）,8.53（d,1H）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;454（100,M＋１）,253（32）,225（82）,176（61）,121（46）。
実施例14
DMF（10ml）中の６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸（1g,2.3mmol）、トリエチルアミン（0.32ml,2.3mmol）及びＳ−（２−ピリジル）−S'−（２−アミノエチル）ジスルフィド（507mg,2.3mmol）の攪拌溶液に、０℃においてDCC（472mg,2.3mmol）を添加した。この混合物を４℃において16時間攪拌した。この沈殿した固体（DCU）を濾過し、そしてこの溶液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして飽和重炭酸ナトリウム（50ml）、ブライン（50ml）及び水（50ml）により抽出した。この有機相を乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で蒸発させてその生成物を白色固体として得た（1.28g,92％）。
エタノール（25ml）中の上記BOC−ヒドラジノピリジル−グルタミル・ジスルフィド（606mg,1.0mmol）及び氷酢酸（100μｌ）の溶液に、エタノール（10ml）中の３−メルカプトプロピオン酸（106mg,1.0mmol）を滴下した。この反応混合物を室温において16時間攪拌した。この溶液を減圧下で黄色の固体に濃縮乾固させた。カラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル；塩化メチレン／メタノール（3/2）及び酢酸（溶出液の４％））を使用して上記生成物を白色固体として単離した（302mg,50％）。
DMF（5ml）中のBOC−ヒドラジノピリジンジスルフィド酸（170mg,0.28mmol）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（33mg,0.29mmol）の攪拌溶液に、DDC（58.4mg,0.28mmol）を０℃において添加した。この反応混合物を４℃において16時間攪拌した。この白色固体（DCU）を濾別し、そしてその濾液を減圧下で濃縮乾固させた。この残渣を酢酸エチル（25ml）と共に粉砕し、そして濾過した。この濾液を減圧下で濃縮して上記生成物を白色粉末（75mg,38％）として得た。
14の合成
酢酸エチル中の臭化水素の溶液を、５分間中程度の速度で酢酸エチル（10ml）に無水臭化水素（ガス）を通過させることにより調製した。６−BOC−ヒドラジノグルタミル−ジスルフィド（30mg）を酢酸エチル（1ml）中に溶解し、そしてHBr/酢酸エチル（1ml）を添加し、そしてその反応混合物を室温において20分間攪拌した。このスラリーを濾過し、そして乾燥させて白色固体を得た（21mg,78％）。1H NMR（CD3OD）δ2.15（m,2H）,2.45（t,2H）,2.83（s,4H）,2.88（m,2H）,3.05（m,4H）,3.45（m,2H）,4.45（m,1H）,6.95（d,1H）,8.25（d,1H）,8.45（s,1H）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;543（22,M＋１）,332（49）,269（100）,207（85）。
生物学的テストにおける比較を許容するために、以下の化合物を合成した：
６−（BOC−ヒドオラジノ）−３−（Ｎ−ブロモアセチル）アミノピリジン
アルゴン下、乾燥アセトニトリル（25ml）中の３−アミノ−６−（BOCヒドラジノ）ピリジン（1.2g,5.4mmol）及び無水炭酸ナトリウム（682mg,6.4mmol）の攪拌溶液に０−５℃においてブロモアセチル・クロリド（1.1g,6.4mmol）を滴下した。この混合物を0.5℃において1/2時間、次に室温において３時間攪拌した。
この反応混合物を減圧下で濃縮乾固させ、そしてその残査を水（50ml）と酢酸エチル（150ml）との間で分配させた。この有機相を分液させ、乾燥させ（Na2SO4）、そして減圧下で25−30mlまで濃縮した。沈殿した白色固体（1.0g,54.3％）を濾過し、そして乾燥させた。1H NMR（DMSO−d6）：δ1.39（s,9H）,3.99（s,2H）,6.45（d,1H,J＝8.8Hz）,7.65（dd,1H,J＝2.4,8.8Hz）,8.15（d,1H,J＝2.4Hz）。分析：計算C12H17N4BrO3:C−41.75;H−4.96;N−16.23;Br−23.15実測:C−41.87;H−5.00;N−16.27;Br−23.27。
３−（Ｎ−ブロモアセチル）アミノ−６−ヒドラジノピリジン・ヒドロブロミド
（化合物15）
ジオキサン中の臭化水素の溶液を、５分間中程度の速度でジオキサン（10ml）を通して無水臭化水素（ガス）をバブリングさせることにより調製した。６−（BOC−ヒドラジノ）−（Ｎ−ブロモアセチル）−アミノピリジン（60mg）をジオキサン（2ml）中に溶解し、そしてHBr/ジオキサン（2ml）を添加し、そしてその反応混合物を室温において30分間攪拌し、その間に沈殿が形成された。この反応混合物を室温において全体として４時間攪拌し、その後濾過し、エーテル（3 x 25ml）により洗浄し、そして減圧下で乾燥させて白色固体を得た（50mg,87.7％）。1H NMR（D2O）：δ4.08（s,2H）,7.02（d,1H,J＝8.8Hz）;7.85（dd,1H,J＝2.4,8.8Hz）;8.25（dd,1H,J＝2.4Hz）。
欧州特許出願第EP 0 384 769 A2号中に記載された合成手順に従って、３−アミノ−６−（BOC−ヒドラジノ）−ピリジンを３−マレイミド−６−ヒドラジノピリジン・ヒドロクロリド（化合物16）を調製するために使用した。
本発明に係る追加の新規化合物を合成した：
実施例17
３−（ベンジルオキシアセチルアミド）−１−プロパノール
３−アミノ−１−プロパノール（3.0g,68.83mmol）、重炭酸ナトリウム（14.5g,172.6mmol）、水（100ml）、及びジオキサン（52ml）を４時間0.5℃においてジオキサン（36ml）中のベンジルオキシアセチル・クロリド（19.5g、106.0mmol）の溶液に滴下した。この混合物を酢酸エチル（3 x 200ml）により抽出し、そして減圧下で蒸発させて上記生成物を透明な油として得た（11.1g,72％）。
３−（ベンジルオキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート
６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチン酸（5.0g,19.74mmol）、DMF（25ml）、３−ベンジルオキシアセチルアミド−１−プロパノール（4.4g,19.74mmol）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（2.48g,19.74mmol）を０℃においてDMF（10ml）中のDCC（4.48g,21.71mmol）の溶液に添加し、そしてこの混合物を16時間攪拌した。この溶液を酢酸エチル（250ml）により希釈し、冷却し、そしてその固体を濾別した。この濾液を減圧下蒸発乾固させ、そしてその油状残渣を酢酸エチル（200ml）と飽和重炭酸ナトリウム溶液（30ml）との間で分配させた。この有機相を分離させ、乾燥（MgSO4）させ、そして減圧下で蒸発させた。この生成物をカラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル：酢酸エチル）により精製して白色固体を得た（5.1g,56％）。
３−ヒドロキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート
メタノール（16ml）中の活性炭上パラジウム（aldrich 10％,1.0g）の懸濁液に、３−（ベンジルオキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−（BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（1.6g,3.48mmol）及び蟻酸アンモニウム（1.1g,17.44mmol）を添加した。この混合物をアルゴン下で16時間激しく攪拌した。この懸濁液をセライトを通して濾過し、そして減圧下で蒸発させて白色泡（1.0g,78％）を得た。
３−メタンスルホニルオキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート
ジクロロメタン（20ml）中の３−ヒドロキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（1.0g,2.17mmol）及びトリエチルアミン（0.41ml,2.98mmol）の攪拌溶液に０℃においてジクロロメタン（5ml）中のメタンスルホニル・クロリド（0.23ml,2.98mmol）の溶液を滴下し、そしてその反応混合物を次にさらに２時間０℃において攪拌に供し、次に減圧下で蒸発させた。この残渣を酢酸エチル中に溶解し、そして水により洗浄し、乾燥（MgSO4）させ、そして減圧下で蒸発させて白色泡（1.2g,98％）を得た。
３−（ブロモアセチルアミド））−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート
アセトン（200ml）中の３−（メタンスルホニルオキシアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（1.2g,2.68mmol）の攪拌溶液にアセトン（30ml）中の臭化リチウム（1.7g,26.9mmol）の溶液を滴下し、そしてその反応混合物を1.5時間還流まで加熱した。室温まで冷却に供した後、その混合物を減圧下で蒸発させ、そしてその残渣を酢酸エチル（100ml）中に溶解し、そして水（3 x 100ml）により洗浄した。この有機相を分離させ、乾燥（MgSO4）させ、そして減圧下で蒸発させ、そしてその生成物をカラム・クロマトグラフィー（シリカ・ゲル：酢酸エチル）により精製して白色泡を得た（0.8g,69％）。1H NMR（CDCl3）δ1.47（s,9H）,2.00（pentet,2H,J＝6.2Hz）,3.43（q,2H,J＝6.3Hz）,3.89（s,2H）,4.39（t,2H,J＝5.9Hz）,6.73（d,1H,J＝8.8Hz）,8.15（dd,1H,J＝2.2Hz,8.7Hz）,8.82（d,H,J＝2.2Hz）。
３−（ブロモアセチルアミド）−１−プロピル−（６−ヒドラジノ）ニコチネート・モノヒドロブロミド
アルゴン下、３−（ブロモアセチルアミド）−１−プロピル−（６−BOC−ヒドラジノ）ニコチネート（50mg）及び酢酸（1ml）の攪拌溶液に、臭化水素（Aldrich,酢酸中30wt％溶液,1ml）を添加した。この反応混合物を３分間攪拌し、そしてエーテル（20ml）を直ぐに添加してその生成物を沈殿させた。１分間攪拌した後、そのエーテルをデカンテーションにより除去した。この生成物をエーテルにより繰り返し（６−10回）洗浄し、そして最終トレースを減圧下蒸発により除去しで白色固体を得た（18mg,37％）。1H NMR（DMSO−d6）δ1.86（pentet,2H,J＝6.5Hz）,3.22（q,2H,J＝6.5Hz）,3.83（s,2H）,4.25（t,2H,J＝6.2Hz）,6.91（d,1H,J＝8.8Hz）,8.14（dd,1H,J＝2.2Hz,8.8Hz）,8.40（br.t,1H,D2O交換可能）,8.69（d,1H,J＝8.8Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;333（100,M＋１）,331（100,M＋１）,253（15）,194（43）,178（20）。
実施例18
実施例１中に記載した手順を使用して、α−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸は６−BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−α−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸を与えた。実施例10を使用して、６−BOC−ヒドラジノ）ニコチンアミド−α−ｔ−ブチル−（Ｌ）−グルタミン酸を、そのγ−ブロモアセテート誘導グルタミ酸リンカー分子に変換した。
最終的な脱−保護手順
酢酸（2ml）中のブロモアセテート（100mg,0.162mmol）の攪拌溶液に、臭化水素（Aldrich,酢酸中30wt％溶液,1.0ml）を添加した。この反応混合物を３分間攪拌し、そしてジエチル・エーテル（20ml）を直ぐに添加してその生成物を沈殿させた。その白色固体をそのフラスコの底に沈め、そしてその上清臭化水素溶液をパスツール・ピットによりデカンテーション除去した。この手順をエーテルにより10回繰り返し、そしてエーテルの残トレースを減圧下の蒸発により除去し、そして一夜真空中で乾燥させた。この生成物は白色固体であった（50mg,57％）。1H NMR（DMSO−d4）δ2.00（pentet,2H,J＝6.3Hz）,2.09−2.33（m,2H）,2.52（t,2H,J＝7.3Hz）,3.95（s,2H）,4.15（t,2H,J＝5.1Hz）,4.22（t,2H,J＝6.2Hz）,4.63（m,1H）,6.97（d,1H,J＝8.6Hz）,8.21（dd,1H,J＝2.1,9.2Hz）,8.47（d,1H,J＝2.1Hz）；質量分析（FAB）;m/e（相対強度）;463（100,M＋１）,461（100,M＋１）,379（10）,339（10）,269（15）。
放射標識付け手順
本発明に係る化合物を、標準的な方法を使用してモノクローナル抗体C46.3のＦ（ab）’断片のスルフヒドリル基に連結した（Chemical Modification of Proteins,Means and Feeney,Holden−Day Inc 1971を参照のこと）。修飾後の遊離−SH基の存在を、Grassetti and Murry（Arch.Biochem.Biophys.119,41−49,（1967））の検定法により確認した。Ｆ（ab）’断片当たりの遊離のヒドラジンの数を、Abrams et al,（J.Nucl.Med.31,2022（1990））により記載されたヒドラゾン形成検定法により測定した。
この修飾タンパク質を、次にAbrams et al,（J.Nucl.Med.31,2022（1990））により記載された手順と類似の手順に従って、そして比較のために上記Bremmer法を使用したその断片への99mTcの直接結合並びにその２つのヒドラジノ・リンカー分子15及び16を使用して、放射標識付けした。
マウスにおける生体分布の研究
腫瘍を３−４月齢の無胸腺ヌード・マウスにおいて106 LS174T大腸癌腫細胞のその後脇腹への皮下注射により増殖させた。
99mTc−標識断片結合体を、その眼窩後方腔を介してマウスに注射した。マウスは、約300μｌの容量のホスフェート−バッファー生理食塩水中５−50μｇのタンパク質及び150−800μCiの99mTcを受容した。マウス当たりに注射された量は、それぞれのシリンジの重量及び放射能の減少とそのマウスが受容した放射能の両方により定量された。
４及び22時間目に切開を行った。臓器を分析用計り上で計量し、そしてそれらの放射能をガンマ・カウンター上で測定した。臓器の生体分布を、標準的な方法を使用してこれらの測定値から測定した。マウスの血液容量は８％と推定された。血液の追加のアリコット（15μｌ）を薬理動態試験のために0.5及び２時間目に採取した。すべてのガンマ・カウンターの値は、その臓器と同じ時にその注射された投与量の保持されたアリコットをカウントすることにより放射能壊変について補正された。最終的なデータを、以下の表中、１群当たり５マウスの平均、（＋／−）標準偏差として表す。
表１及び２中に表したデータを見れば、解裂性エステル官能基を含むリンカー（化合物８、９、10及び17）が直接的標識付けと非−解裂性リンカー（化合物15及び16）を介しての標識付けの両方に比べて改良された腫瘍標的化を与えることが、明らかである。この腫瘍／血液比は、％注射投与量／組織１グラム（表２）に見られるように、その腫瘍内での保持とその血液からの速いクリアランスとの組み合わせのために、かなり高かった。ジスルフィド−ベースのリンカー（化合物５及び７）は、速い血液クリアランスをもつ結合体を与えた。
0003542597.tif 000004
0003542597.tif 000005
0003542597.tif 000006
注：
1.全データは５マウスの平均±標準偏差である。
2.MSR＝モル置換比、Fab'断片当たりに取り込まれたヒドラジンの数。
3.比較のための非−解裂性リンカー及び直接的標識付けの結合体からのデータ。
4.＞95％の99mTcが、核医薬において使用される標準的な薄層クロマトグラフィーにより検定されるようにFab'により結合された。
0003542597.tif 000007
0003542597.tif 000008
0003542597.tif 000009
注：
1.全データは５マウスの平均±標準偏差である。
2.MSR＝モル置換比、Fab'断片当たりに取り込まれたヒドラジンの数。
3.比較のための非−解裂性リンカー及び直接的標識付けの結合体からのデータ。
4.＞95％の99mTcが、核医薬において使用される標準的な薄層クロマトグラフィーにより検定されるようにFab'により結合された。
0003542597.tif 000030
0003542597.tif 000031
0003542597.tif 000032
0003542597.tif 000033
0003542597.tif 000034
0003542597.tif 000035
0003542597.tif 000036