(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ZME−018抗原又は15A8抗原である腫瘍細胞表面抗原に対して反応する抗体と、生物応答調節物質であるTNFとの結合体。
【請求項２】
生物応答調節物質であるTNFが遺伝子組替えで生産された化合物である請求項１の結合体。
【請求項３】
乳ガン治療を必要とする患者に対して投与される15A8抗原と反応するTNF結合モノクローナル抗体。
【請求項４】
15A8腫瘍細胞表面抗原を持つ腫瘍があると診断された乳ガン患者に細胞障害あるいは細胞増殖阻止濃度で投与されるTNF結合モノクローナル抗体15A8。
【請求項５】
治療を必要とする患者に腫瘍の防止のために投与されるTNF結合モノクローナル抗体15A8。
【請求項６】
治療を必要とするメラノーマ患者に投与されるTNF結合モノクローナル抗体ZME−018。
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は一般に免疫結合体、さらに特定すれば標的となる組織部位に生物応答調節物質を搬送する免疫結合体を利用することに関する。この発明はまたモノクローナル抗体（MoAbs）と腫瘍壊死因子（TNF）のような生物応答調節因子との結合体でガンを治療することに関する。
〔従来の技術〕
生物応答調節因子は多くのタイプの細胞に多種の効果を発揮する。哺乳動物の細胞はその細胞レベルでの恒常性を維持するために一群のリンフォカインやサイトカインを生産している。さらに、多くの刺激に対応して、哺乳動物細胞はたくさんの蛋白産物を生産、分泌する。生理学的、あるいは薬理学的濃度で、INF−α,INF−β,INF−γ,IL−1,IL−7,TNF−α,TNF−βなどの生物応答調節物質はすべて潜在的な細胞毒性効果を持っている。腫瘍壊死因子（TNF）は多方面の作用を持つ多くの生物応答調節因子の一つである。TNFという言葉はTNFがMeth  Ａマウスのサルコーマの壊死を起こしたという最初の観察から由来している。TNFの抗腫瘍作用は多くのヒトや動物の腫瘍細胞でin vitroでもin vivoでも示されている。遺伝子組替えで作られたヒトTNFはサルコーマ、アデノカルシノーマ、メラノーマなどの腫瘍の壊死を起こすことが示されている。TNFは細胞の生育に多面的な影響を与え、ある細胞では生育を抑える作用を示し、その他の細胞では作用がなく（すなわち、細胞毒性が５％以下である）、またある細胞には生育促進作用を示す。TNFはまた骨の再吸収を促進し、内皮細胞の前凝集作用を高める。これらの多面的な作用は完全には理解されていない。別の生物応答調節因子のIL−１はTNFの作用の一部を持っているが、IL−１はTNFのものと違う特性を多く持っている。
しかしながら、生物応答調節物質が細胞に対して作用を発揮するためには生物応答調節物質が期待する効果を起こすに十分な濃度を標的とする細胞に届けてやらねばならない。
最近の生物応答調節物質の発見とそれによっておこされる過剰効果の研究によってガンのような治療しにくい疾患を治療ができるのではないかとの期待が生じている。しかしこれはそうだとは証明されていない。一つの障害はその生物調節物質の十分な量をその作用を発揮する標的組織または細胞に供給することができないことである。薬剤や他の細胞活性物質は患者に投与したとき全てではないにしても多くは宿主のなかで希釈され、またある程度は宿主の組織で代謝される。かくして、多くの場合、これらの細胞活性物質は非標的組織での希釈や吸収、または代謝のあることを見なして期待する効果を得るのに必要とされるより多くの量を投与しなければならない。
ガンは西洋諸国では死亡率や患者数で最も多い原因の一つである。ガンにはその特徴から多くの異なるタイプがある。しかし、ガンは少なくとも一つの共通した特徴があり、それは細胞の生育の制御機構の欠陥によっている。乳ガンと子宮ガンは西洋諸国の女性の悪性化による死亡の主要原因のうちの２つである。メラノーマは両性において非常に転移し易い病気であり、診断後５年以内にほとんど一様に死にいたる。局部的の悪性部分を外科的に除去することは疾患が初期の障害を超えていなければ効果があることが認められている。患部が広がってしまうと外科的な方法は侵された、あるいは悪性化した細胞を放射線照射する一般的な方法の補助的なものに過ぎない。放射線照射や化学療法のような一般に使われるとってかえられる近代的な治療法は腫瘍細胞にのみ効果を示すものでなく、それが悪性化した細胞に比例的に大きな破壊効果を持つけれども、しばしばそれはある程度は正常細胞にも影響する。
多くの腫瘍あるいはガン細胞は細胞膜結合性の、あるいは細胞質性の抗原、すなわち、抗原決定基を発現しており、それらは正常細胞では非常に弱いか、全く発現していない。ある腫瘍細胞は胚株細胞タイプにもみられるが成熟した動物の正常細胞では発現していない抗原を発現している。これら異常に発現している抗原は腫瘍細胞表面抗原（TAA）として知られている。TAAは特定の抗原が一つ以上の腫瘍に発現しているがそれを発現する特定の腫瘍細胞の全てあるいはほとんどで発現しているということで特異的である。腫瘍細胞の一つまたはそれ以上のTAAを発現できる。これら腫瘍細胞表面抗原は細胞の表面に発現したり（細胞表面抗原）、腫瘍細胞によって分泌されたり（分泌抗原）、あるいは細胞の中にとどまったり（細胞内抗原）する。細胞膜結合性あるいは細胞表面抗原は腫瘍細胞と宿主の免疫系との間の相互作用に主要な役割を持つと考えられているが、細胞質性の抗原はそれがしばしば腫瘍細胞によって多量に出されるので新生物化を追跡するのに役立っている。
これらの腫瘍細胞表面抗原の存在は動物やヒトにおいて腫瘍を検出し、診断し、存在部位を明らかにするために用いられる。ある場合には腫瘍細胞表面抗原の存在は特に腫瘍細胞に対する特定の薬剤を仕向けたり処理方法を用意させる。
抗体は通常外来の抗原、あるいは抗原決定基に応答して動物の免疫系によって作られる蛋白である。抗体はそれが向けられる特異的な抗原と結合する。特定の抗原、または抗原決定基に反応するモノクローナル抗体（MoAbs）は多量に作ることができる。腫瘍細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体はガン患者に全身投与されると腫瘍に局在する。この強力な特性は薬剤、毒素、放射性同位物質などを腫瘍に向けて運搬するために利用ができる。
化学療法剤を腫瘍細胞に到達させ、その正常細胞への作用を減少させる方法の一つは抗体、もっと好ましくは正常細胞には存在しない腫瘍細胞上の抗原に反応するMoAbsの開発によって可能となった。
薬剤を結合した抗体は輸送手段として使われ、それによって薬剤は抗体が反応する特異的な腫瘍細胞タイプに指向される。抗体はまた毒素とも結合され、特異的な腫瘍細胞に直接毒素を向かわせる輸送方法として働く。特異的な腫瘍に薬剤や毒素を向かわせる輸送手段として薬剤や毒素を結合した抗体を使う特別の利点は望ましい場所に薬剤や化合物を濃縮させることができることである。特別の標的輸送システムなしでは、患者に投与された化合物は全身に分散し、それ故、望ましい標的に到達する濃度は非常に希釈されるだろう。抗体を標的に送るシステムを使うと抗体に結合して投与された化合物が標的とする部位の細胞に結合、あるいは近所に運ばれることになる。投与される化合物を結合した抗体は他のところ（例えば正常細胞）よりも高濃度に標的細胞に結合するのでその化合物は標的部位に濃縮されている。
「イムノトキシン」にするために抗体に細胞障害剤を結合させることはすでに報告されている。特に興味のあることは、リシンやアブリンのような細菌または植物起源の毒素の酵素的に活性のある部分（Ａ鎖）に結合したモノクローナル抗体のイムノトキシンであった。ネーベルとヨーク（Nevelle and York）、イムノロジカル・レビュー（Immnol.Rev.）（1982）62:75−91;ロスら（Ross et al.）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European J.Biochem.）（1980）104;ヴィテッタら（Vitteta et al.）、イムノロジカル・レビュー（Immunol.Rev.）（1982）62:158−183;ロスら（Ross et al.）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）（1982）42:457−464;トロウブリッジとドミンゴ（Trowbridge and Domingo）、ネイチャー（Nature,Lond.）（1981）294:171−173。イムノトキシンはMoAbsを植物由来の毒素または毒素の断片に結合することによって調製した。ゲロニンとリシンが蛋白合成を阻害するのに最も活性の高い植物由来の毒素である。
抗体へのゲロニンの結合は審査中のアメリカ特許申請No.216,595に記述されている。また、ゲロニン結合イムノトキシンの利用はいくつかのタイプのガンの治療について報告されている。
植物毒素や他の細胞障害剤の毒性の部分のための輸送システムとして抗体が使われるが、腫瘍壊死因子のような生物応答調節物質への抗体の結合や標的組織や細胞への特異的な輸送システムとしてのそのような結合体の利用は今日までできていない。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は生物応答調節物質のための新規な抗体輸送システムに向けられている。本発明はまた生物調節物質に共有結合で結合した細胞関連抗原に反応する抗体の免疫結合体の組成物を提供している。望ましくは、抗体は、腫瘍細胞に特異的な細胞関連抗原に対して反応する。実施内容の一つでは、免疫結合体に抗体、望ましくはモノクローナル抗体とそれと共有的に結合した生物応答調節物質を含んでいる。一方、この免疫結合体はこの技術分野の者にとっては既知の遺伝子工学的方法によって作られる融合タンパクでありうる。そのような融合タンパクは、抗体分子の抗原認識部位と生物応答調節物質の細胞障害性部分が含まれよう。
正常細胞は腫瘍細胞と同様TNFのような生物応答調節物質に対する表面受容体をもつから、TNFを特に標的とする腫瘍細胞に輸送する系はTNFでの治療の効果を高める。さらに、選択的に生物応答調節物質を細胞障害物のない細胞に輸送する輸送系も提供される。
標的とされる部位での化合物の濃度を保つ結果として、例えば細胞障害、生長促進、酵素誘導などの生物応答を得るために投与されねばならない抗体結合性化合物の量は非結合化合物が投与された時必要とされる量より何十倍も少くなろう。
化学的あるいは生物学的な化合物のために抗体結合体輸送システムを利用するもう一つの利点は代謝が減少し、宿主によって結合化合物が消失される速度がおそくなるために、宿主系に化合物が長く存在することである。細胞に対して活性のある化合物が宿主に接触されるのが代謝や消失の速度がおそくなるために長引くので、細胞活性化合物は低濃度で投与できるが、以前まではより高濃度でのみ得られたと同程度の効果を得ることができる。生物活性化合物の代謝や消去のメカニズムは一般に化合物に特異的で全体として殆んど理解されていない。代謝や消失の速度は全部ではないにしても殆んど全てその生物活性化合物が抗体と結合されると遅くなる。
実施例の一つで本発明は腫瘍細胞に選択的に結合し、殺す細胞障害性組成物を提供している。これら標的となる腫瘍細胞に正常細胞の中または上にみられるよりも多量に抗原性のマーカーを生産しているどんな腫瘍でありうる。望ましくは、抗原性マーカー、すなわちTAAは細胞表層抗原である一方、本発明は正常細胞によって正常に作られるより多量に細胞内抗原を生産する腫瘍細胞にも等しく適用できる。多くの腫瘍は細胞内抗原を生産し、腫瘍が壊死するときにこれを分泌するかあるいはそれら抗原を放出することが知られている。本発明の免疫結合体はまた、その細胞内抗原が通常の組織よりも高濃度に存在する腫瘍部位を特定させる。
本発明の免疫結合体は選ばれた標的細胞に対する細胞障害性の生物応答調節物質と輸送のためばかりでなく、標的部位が他の標的でない部位でみられるより多くの濃度に抗原性マーカーを含むときにその選ばれた標的部位に生物学的な作用剤を選択的に輸送するために利用される。
別の実施例では本発明はヒトの乳ガン細胞、子宮ガン細胞、メラノーマ細胞に対して選択的に結合し、細胞障害または細胞増殖抑制性を示す細胞障害性組成物を提供する。
もう一つの実施例では、この発明は本発明のイムノトキシン組成物の細胞障害性の作用量に細胞を接触することによって腫瘍関連抗原を発現しているヒトの乳ガン細胞、子宮ガン細胞、メラノーマ細胞及びその他の腫瘍細胞を殺す方法を提供している。
実施例の中で、本発明の免疫結合体が15A8抗原を発現している乳ガン腫瘍細胞に、細胞障害性免疫結合体を運ぶために使われている（この抗原は1987年３月23日受理されたアメリカ特許申請番号No.29,373で開示され請求されたモノクローナル抗体によって認識される）。
また別の実施例では本発明がメラノーマ腫瘍細胞に対して結合し、細胞障害あるいは増殖抑制を示す免疫結合体を提供している。メラノーマ細胞はまたいくつかのTAAを発現している。ウイルソンら、（1981年）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J.Cancer）28:293は２つのそのようなメラノーマ抗原とそれから作ったモノクローナル抗体を記載している。ウイルソンによるその抗体の一つ（225.28S）はメラノーマの膜抗原を認識している。この抗原はこれよりZME−018と命名されている。
さらに別の実施例において、本発明はZME−018抗原またはそれと機能的に同等のものを発現している細胞に結合し細胞毒性または増殖阻止を示す免疫結合体を提供している。本発明の免疫結合体はメラノーマの細胞質性抗原と反応するウイルソンの465.12を含むがそれに限定はされない細胞質抗原を認識する抗体を含んでいる。
本発明の目的は生物応答調節物質に抗体の結合体を提供することである。
腫瘍関連抗原に反応する抗体と生物応答調節物質の部分とを結合体を含む組成物を提供することが本発明のもう一つの目的である。
抗体の部分と生物応答調節物質を含む遺伝子組換えで作られた化合物を含む組成物でその生物応答調節物質がその調節物質の細胞活性部分である組成物を提供することが本発明の別の目的である。その部分は期待する作用が標的細胞の破壊であるときは細胞障害部分であり、また別の望ましい細胞活性効果をもつときは非毒性である。
生物応答調節物質、またはその一部分との抗体の免疫結合体でその部分が腫瘍壊死因子、IL−1,IL−2,IL−3,IL−4,IL−5,IL−6,IL−7,TNF−α,TNF−β,INF−α,INF−β,INF−λからなる群の細胞活性部位から選ばれているような結合体を提供することが本発明の別の目的である。
もう一つの別の目的は生物応答調節物質あるいはその細胞活性のある部分を結合した標的細胞上のTAAに反応する抗体または抗体の一部を含む免疫結合体の細胞障害効果のある量を治療の必要な患者に投与することを含む例えばガンのような細胞増殖性の疾患を治療する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的はそのような治療を必要とする患者にTAAモノクローナル抗体に結合したTNFを投与することを含む腫瘍の再生を防ぐ方法を提供することである。
モノクローナル抗体の抗原認識部位をコードしている遺伝子をサイトカイン、リンフォカイン、望ましくはTNFのような生物応答調節物質またはそれからの細胞活性のある部分をコードしている遺伝子を融合させることによって遺伝子組換え法で作られた遺伝子融合産物である免疫結合体を提供することである。
水晶体の外科移植後の患者に本発明の免疫結合体を投与することを含む二次的な白内障形成を抑える方法を提供することがもう一つの目的である。
特異的な標的部位に対して生物応答調節物質を選択的に輸送するシステムを提供することが本発明の一つの目的である。
治療の必要な患者に生物応答調節物質と抗体を含む殺細胞性の免疫結合体を投与することによって腫瘍関連抗原をもった腫瘍の再生を防止することが本発明のもう一つの目的である。望ましくは、抗体はモノクローナル抗体で生物応答調節物質はTNFである。
本発明の目的の一つは腫瘍細胞に特異的に結合し、それを殺す細胞障害性の組成物を提供することである。
腫瘍細胞にとって毒性であるが、正常組織には害の少ない組成物を提供することが本発明のもう一つの目的である。
TNFのような生物応答調節物質と結合した乳ガン腫瘍関連抗原あるいはメラノーマのような腫瘍関連抗原と反応する抗体を含んでいる組成物を提供することが本発明のもう一つの目的である。
TNFのような生物応答調節物質を含む薬学的に許容される担体を入れた医薬組成物を提供することが本発明のもう一つの目的である。
〔課題を解決する手段〕
この発明の免疫化学的な誘導体は腫瘍関連抗原と反応する抗体と生物応答調節物質の結合体を含んでいる。
腫瘍関連抗原に反応する抗体に結合され本発明で使われている生物応答調節物質は限定されるものでないがTNF（α，β）,RIF〔  〕,IL−２、インターフェロン（α，β，γ）、IL−６のようなリンホカインやサイトカインを含んでいる。これらの生物応答調節物質は腫瘍細胞に対して多様な作用をもっている。これらの作用の中には直接作用によって腫瘍細胞を殺すと共に宿主の防御力の増加によっておこる腫瘍細胞の壊死を増やすことがある。腫瘍関連抗原に対して反応する抗体を生物応答調節物質に結合すると腫瘍細胞の中に選択的に局在するようにでき、従って抗増殖作用を改善し、一方非標的細胞が毒性を受ける非特異的作用を抑えられる。
細胞毒性を腫瘍に選択的に抗体によって運送することは肝、腎、骨髄というような感受性の高い部位を天然に存在する毒性物質の悪影響から守ることができる。運搬方法として生物応答調節物質に結合した抗体を使うことは腫瘍やその他の標的とする部位に濃縮される抗体に全ての毒性部分が結合されているので、その薬剤自体の投与量を低めることができる。
モノクローナル抗体の結合体はいろいろな二作用基をもった蛋白の結合剤を使って作られよう。そのような試薬の例はSPDP,IT、ジメチルアジピミジン塩酸のようなイミドエステルの二作用基性誘導体、ジサクシニミジルスベレートのような活性エステル、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのようなビス−アジド化合物、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム誘導体、トリレン−2,6−ジイソシアネートのようなジイソシアネート化合物、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンのようなビス−活性フルオリンなどである。
免疫結合体に使われる抗体は望ましくはモノクローナル抗体でもっと望ましくは特定の病理的条件、例えば、以下に限定されるものでないが、乳ガン、子宮ガン、メラノーマなどのガンなどに対して反応するモノクローナル抗体である。本発明に使われる抗体はウイルスやまたはウイルス被殻の抗原のような宿主に由来しない非細胞性抗原に反応するものでもよい。本発明の免疫結合体はそのような非宿主抗原に関するときは病理的に感染された宿主細胞に対する細胞毒性または細胞増殖抑制性の生物応答調節物質を運搬する選択的運搬材を提供する。
ここで用いられているように「モノクローナル抗体」という言葉は均質な抗体の集まりをもった抗体組成を意味している。抗体の起源やそれが作られた方法について制限を加えるつもりはない。
例として、乳ガン細胞はその細胞表層に22/KD抗原を発現している。この抗原に対する抗体はすでに作られている。この22/KD抗原のエピトープを認識するIgG1,IgG2a,IgG2bのイソタイプをもった特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが作られている。これらのイソタイプは全てその抗原の同じエピトープを認識している。この発明を記載するためにさらに例示の目的で、このエピトープは15A8と命名することとする。かくしてこれら抗体は全て機能的に等価である。さらに、この発明を実施する場合には同じ抗原上の異なる抗原性決定基に結合し、異なるエピトープを認識する抗体もまた機能的には同等である。
モノクローナル抗体はこの技術分野に通じた者にとっては既知の方法で作られる。例えばモノクローナル抗体15A8を作るハイブリドーマの細胞培養物を作る方法は1987年３年23日受理されたアメリカ特許申請番号No.29,373に記載されており、それは1984年12月５日受理のアメリカ特許申請番号No.678,264の部分継続申請でありまた欧州特許申請公報０−184−369（1986年６月11日出版）である。要約すれば、哺乳動物の腫瘍細胞をBALB/Cマウスの腹腔に３週間、全部で３〜４回の注射により投与した。最終投与の３日後脾臓を採り、脾細胞の懸濁液を調製し、107PAIミエローマ細胞と融合した。雑種細胞をヒポキサンチン−アミノプリテリン−チミジン（HAT）培地で選別した。ハイブリドーマの調製とこれらのモノクローナル抗体の特徴づけの詳細については以下に示す実施例の中で述べられる。しかし、この分野で知られるいかなる方法によってもTAAに対して作られたモノクローナル抗体が本発明の免疫結合体に使用できる。
「腫瘍細胞表面抗原」という言葉は正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において高濃度に検出される抗原に関することを意味している。「腫瘍細胞表面抗原」という言葉は通常ウイルスやその他の宿主性でない細胞などの抗原を含まないけれど、ここに用いられているように本発明の免疫結合体は正常細胞とは有意に異なる抗原性の濃度を示す細胞に対するBMRも指向していることはこの技術分野の者にとって明らかであろう。かくしてこの発明はウイルスに感染した細胞で、生物応答調節物質が毒性を示す作用のようなものよりむしろよい影響を示すような細胞に生物応答調節物質を送り込むことにも適用される。標的となる細胞が腫瘍細胞である必要はない。標的細胞は他の標的としない細胞と定性的にか定量的に異なる特異的な抗原決定基をもつことだけが必要である。
TNFのような生物応答調節物質は生きている動物の血清や、免疫細胞の増殖を刺激することが知られている物質（誘起剤）で動物や細胞を処理した後のリンパ細胞や培養細胞の培養上清、または組換え技術によって得ることができる。生物応答調節物質は例えばマウス、ウサギ、ラット、サル、ブタ、ヒトなどのような哺乳動物起源のものが得られる。望ましくはそのような蛋白はヒト起源のものから得られる。さらに望ましくは、組換え技術で作られるヒトの蛋白がよい。それから血清や培養上清あるいは細胞塊を採取し標的の腫瘍細胞株に対する生物活性が測定される。
「組換えによる蛋白」という言葉はこの技術分野で知られている組換えDNA技術によって作られ、生体にあるままの蛋白と匹敵する生物活性をもつ蛋白を示している。
組換えDNA技術はこの技術分野でよく知られている。一般に、例えばインターフェロンやTNFのような特定の蛋白質をコードしている遺伝子がそのもともとのプラスミドから切り出され、クローニングベクターに挿入されてクローニングされる。それから発現ベクターに入れられ、それが宿主生物、望ましくは微生物、さらに望ましくはE.coliを形質転換するのに使われる。宿主生物は例えばTNFやインターフェロンのような特定の蛋白を生産するある条件の下で外来の蛋白遺伝子を発現する。本発明を実施するためには、組換え技術で作られた生物応答調節物質は標的とされる部位に運ばれて示す活性が保たれている限りその構造は全く同じである必要はなく、また、生体にあるときの蛋白と全く同じ生物活性領域を示さねばならないということはない。
生物応答調節物質と免疫結合体にした生物応答調節物質の生物活性はこの技術分野で既述の方法で測定される。例えば、TNFの細胞障害活性は下記の実施例２に記されるようにＬ−929繊維芽細胞測定系を使って測定される。
モノクローナル抗体15A8やモノクローナル抗体ZME−018のような抗体は下記の実施例５に記されるようにSPDPで修飾され、それから実施例３や６に記されるようにイミノチオラン化されたTNFと結合された。TNFを結合した抗体は下記の実施例７に記されるようにセファデックスＳ−300カラムでのカラムクロマトグラフィーで精製された。
TNF結合抗体の細胞障害性はＬ−929繊維芽細胞測定法によって測定され、その増殖抑制活性はin vitro法で測定された。
本発明の免疫化合物はin vitroと同様in vivoでも腫瘍細胞を殺すために使われる。例えば、骨髄移植が行われたような臨床的状況では、骨髄は体外で腫瘍細胞が除去される。これにはしばしば腫瘍が放射線に感受性で全身照射が処置に必要なことがある。もし患者自身の骨髄の全腫瘍細胞を除くことができれば、放射線照射の前に患者からとり出して体外で腫瘍細胞を除き、そして照射によって破壊された骨髄細胞と、置換するために患者に戻すことができる。例えばin vitroでヒトの乳ガン細胞を殺すために使われる場合には、この結合体は少くとも約10mMの濃度で細胞培養培地に添加されよう。in vitroでの投与の仕方や方法は厳密なものでない。培地や潅流液と比肩しうる水溶性の組成が通常使われる。細胞障害性は従来の方法で測定され、残っている乳ガン細胞の有無あるいは程度を定量する。
本発明の免疫結合体を特定の抗原決定基をもった腫瘍があると診断された患者に投与することは、その腫瘍細胞を殺す必要のある場所に細胞障害剤を差し向け、濃縮させるであろう。そのように細胞障害剤を標的に向けることによって他の器官、組織や細胞に対する非特異的な毒性はなくなるか減少される。
in vivoでの治療に使うときは、イムノトキシンが治療上の効果のある量（すなわち、患者の腫瘍による負担をなくすあるいは減らす量）を患者に投与される。通常それらは静脈注射または腹腔内投与される。投与量や処方はガンの性質（初代か転移か）、その分布量、特定の免疫結合体の特徴など例えばその治療指標や患者の症歴等によるだろう。投与されたイムノトキシン量は、典型的には約0.1〜約10mg/患者の体重kgの範囲にある。体内投与の場合、免疫結合体は薬学的に許容される体内投与剤型にもとづいて注射剤（溶液、懸濁液、乳化液）に処方されよう。そのような剤型は無毒性で無作用のものである。その例は水、食塩水、リンゲル氏液、デキストロース液、５％のヒト血清アルブミンなどである。固形油やオレイン酸エチルのような非水溶液の剤型も使えよう。リポソームもまた担体として使われる。賦形剤にはイオン濃度を保ち化学的な安定化剤、例えば緩衝剤や保存剤のような添加物が少量含まれている。免疫結合体は典型的には大凡0.1〜10mg/mlの濃度でそのような賦形剤が処方される。
本発明の免疫結合体は従って非毒性の、不活性で薬学的に許容される担体として処方され、望ましくはpH大凡３ないし８にあり、さらに望ましくは６〜８である。
免疫結合体の投与量は予診の結果得られたin vivoでの効果に対するデータに左右されよう。また主として使用される特定の生物応答調節物質にもより、また単独に使われるか、あるいは他の薬剤や生物応答調節物質と併用されるかにも左右されよう。
上記のような薬学的製剤は治療上効果的な量（すなわち、患者の病理症状を減じる量）でヒトやその他の動物に体内投与されるのに適していて、その治療のタイプはその抗体輸送系に結合された特定の生物応答調節物質に左右されている。
抗体を結合したTNFのような生物応答調節物質はインターフェロン、望ましくはヒトのβ−インターフェロン（IFN−β）と一緒に投与されよう。IFN−βは生来のインターフェロンに比肩する生物活性をもつ免疫性のインターフェロンを指している。望ましくはそのインターフェロンは組換え技術で調製される。
以下の実施例は本発明の免疫結合体の調製、特徴、使用法について詳細に記したものとして提供している。これらの例はいかなる場合でも本発明を限定するつもりはない。
実施例１
TNFの精製
TNFはこの技術分野において知られている技術で精製されよう。例えばアガワル等（Aggarwal et al.）が単球由来のいくつかの細胞系統を含むいろいろな材料からTNFの精製を報告している。アガワル（Aggarwal,（1986年）メソッド・オブ・エンザイモロジー（Methods of Enzymologg）116;448、参照として提出する。
この方法はまたその他の材料からTNFを精製するのに利用できよう。
TNFは望ましくはこの技術に通じた者にとっては知られる組換え技術によって得られる。例えばそのような製法はアメリカ特許No.4,677,063やヨーロッパ公報EP186,214に詳細に記載されている。以下の実施例に示されるデータを得るのに用いられたTNF標品はカリフォルニア州南サンフランシスコのジェネンテック社から得た。
ヒトの組換えDNA由来のものはE.coliの抽出物から単一にまで精製された。
TNFは単一のバンドで移動し分子量は大凡18,000ダルトンである。
実施例２
TNFの細胞障害活性の測定
TNFの細胞障害活性はＬ−929細胞による次のような方法を利用して追跡した。10％のFCSを含むMEM培地に4,000のネズミのＬ−929繊維芽細胞を96ウエルプレートの各ウエルに入れ、37℃で24時間（５％CO2下で）培養した。それから細胞を0.5g/mlのアクチノマイシンＤを含む培地中でいろいろな量のTNFまたはTNF−抗体結合体と37℃、24時間（５％CO2）処理した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.2,PBS）で洗い、生細胞をクリスタルバイオレットで染色した。生細胞数を定量するためにそのプレートを590nmで測定した。
１×107U/mg以上の比活性をもったTNFが抗体との結合に使われた。TNF活性の単位はＬ−929細胞の成育を50％阻害させるTNF蛋白の量である。
実施例３
イミノチオランによるTNFの修飾
PBS中のTNFをセントリコン10マイクロ濃縮器で約2mg/mlに濃縮した。pH8のトリエタノールアミン塩酸（TEA/HCl）とEDTAを夫々pH8.0で60mM、1mMの最終濃度になるよう加えた。２−イミノチオランの原液（20mM）を1mMになるように加えて、その試料を窒素気液下で４℃、90分間インキュベートした。
過剰のイミノチオラン（IT）を50mM NaClと1mM EDTAを含むpH5.8の5mMビス−トリス／酢酸緩衝液で予め平衡化したセファデックスＧ−25（１×24cm）のカラムでゲル
0003589459.tif 000002
することで除いた。各フラクションについてブラッドフォームの色素結合法によってマイクロプレート中の蛋白含量を分析した。簡単にいうと40μｌの試料と、100μｌのPBS、40μｌの色素濃縮液を各ウエルに添加した。600nmにおける吸光度をダイナテック社のマイクロエライザ自動分析計で測定した。TNFはゲル排除量に溶出する（大凡フラクション番号14〜20）。これらの画分を集め、セントリコン10微量濃縮器で濃縮する。
実施例４
15A8乳ガン抗原とメラノーマ抗原ZME−018に対するモノクローナル抗体の調製とその特徴づけ
これらの抗体はこの分野の技術に通じる者にとっては知られている方法で作られる。モノクローナル抗体15A8を産生するハイブリドーマ細胞株を作る方法は1984年12年５日受理のアメリカ特許番号No.678,264の一部継続申請である1987年３月23日受理されたアメリカ特許申請No.29,373やヨーロッパ特許公報WO−184−369（1986年６月11日刊行）に詳細に記されている。簡単に記すと、哺乳動物の腫瘍細胞〔ソール等（Soule et al.）JNCI,51:1409−1413（1973）、ATCC目録No.TB−22〕を３週間毎に全部で３〜４回BALB/Cマウスの腹腔内に投与した。最終投与の３日後に脾臓をとり出し脾細胞懸濁液を調製し、ダルベコー改変イーグル培地中で２回遠心分離して（800×ｇ）洗浄した。108の免疫されたマウスの脾細胞とテオ・ステーリン博士〔スイス・バーゼル,J.ストッカー，リサーチ・デイスクロジャー,21713,155−177（1982）〕から得た107PAIミエローマ細胞とを45％（v/v）のポリエチレングリコール1500溶液中で融合するために再懸濁した。融合した雑種細胞はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HAT）培地で選別された。
ハイブリドーマ・クローンはコットン等（Cotten,et al.）ヨーロピアン・ジャーナル・イムノロジー（European J.Immunol.）3:136（1973年）によって記載されているような既知の組織培養技術によってin vitroで培養される。MCF−７あるいはMDA−157細胞と反応するがヒトの包皮の繊維芽細胞には反応しない抗体産生ハイブリドーマをさらに調べた。15A8細胞系統によって生産される抗体とハイブリドーマが生産する機能的に同等の抗体はMCF−７細胞上の15A8抗原に反応した。それらはまたテストしたヒトの乳腺ガンからランダムに得られた31の中28に反応し、乳腺、腎近位管、胆のう皮、食道や唾液腺の正常ヒト上皮細胞と弱い反応を示したが、その他の正常組織の細胞とは反応せず、テストしたその他の悪性化した組織の18の中14とは反応しなかった。モノクローナル抗体15A8はまた全ての繊維芽細胞性の疾患、正常な乳腺上皮、多くのアデノカルシノーマとも反応した。それはメソテリオーマとは反応しなかった。モノクローナル抗体15A8はまた子宮や大腸、精巣ガン細胞と交叉反応する。
同じイデイオタイプをもった抗体を分泌する代表的なハイブリドーマ株、すなわち全て15A8エピトープを認識するがメリーランド州ロックビル市パークローン・ドライブ12301にあるアメリカ・タイプ・カルチュア・コレクション（ATCC）に寄託されており、登録番号HB−8655（15A8に対する）、HB−9344（15A8 GZaに対する）、HB−9345（15A8  GZb）とされている。
マウスのモノクローナル抗ヒト乳ガン抗体を例示してここに用いられているように「機能的に等価の」とは（１）例示のモノクローナル抗体と互いに阻害し合い、（２）ヒトの乳ガン細胞のように15A8抗原を発現する細胞と選択的に結合し、（３）ＧまたはＭアイソタイプをもち、（４）免疫沈殿法またはサンドイッチ免疫測定法で定量されるように15A8抗原に結合し、（５）TNFに結合したとき50〜100単位/mlの添加量でMCF−7,ME−180,BT−20またはA431細胞株のちの少くとも１つに対して少くとも50％の組織培養阻害量（TCID）を示す、ようなモノクローナル抗体を意味している。
ミエローマ細胞に結合するモノクローナル抗体は同様に調製された。細胞表層や細胞質性のミエローマ抗原に対するモノクローナル抗体の調製の詳細は参照に取り上げたウイルソン等（Wilson et al.）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J.Cancer）1981年、28:293に詳細に記載されている。
実施例５
SPDPによるモノクローナル抗体15A8またはモノクローナル抗体ZME−018の修飾
脱水したジメチルフォルムアミドml当り3mgの貯蔵液としてＮ−サクシイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のジメチルフォルムアミド溶液を調製した。結晶のSPDPは加水分解をうけるから、化学的に反応しうる架橋剤の実際の濃度はデュアルビームの分光光度計で260nmの吸光度を分析することで分光光学的方法によって決定される。SPDP貯蔵液の濃度は次式で計算される。
0003589459.tif 000003
1mgのモノクローナル抗体、例えば0.5mlのPBS中のモノクローナル抗体15A8あるいはモノクローナル抗体ZME−018をガラス試験管にとった。SPDPの貯蔵液をゆっくりと５倍モル過剰で試験管に加え、その間一定に混合する。混合液を30分間室温におき、その間５分毎に攪拌した。
過剰のSPDPはPBSで予め平衡化したセファデックスＧ−25カラム（１×24cm）でのゲル
0003589459.tif 000004
クロマトグラフィーによって除かれた。各フラクション（0.5ml）をPBS溶出してとり、ブラッドフォーム色素法によって蛋白含量を分析した。ゲル排除量のところ（画分は大凡14〜20）に抗体は溶出した。この画分は集められ、蛋白をセントリコン−30微量濃縮器で濃縮された。セントコリンに残される部分をEDTA（0.5mM）を含むpH7.0の100mM燐酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。抗体は大凡0.5〜0.75mlの終容量まで濃縮された。
実施例６
イミノチオラン修飾したTNFとSPDP修飾しモノクローナル抗体の結合
モノクローナル抗体15A8とモノクローナル抗体ZME−018を架橋剤としてＮ−サクシイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）及び／またはイミノチオラン（IT）でTNFに結合された。その結合体はMe−180やAAB−527細胞に対しての72時間組織培養法でテストされた。抗体結合体はこれら両細胞株に対して認められる増殖抑制活性（10単位/ml以下のTCID50％）を示した。
実施例４に記されているような修飾されたモノクローナル抗体15A8またはモノクローナル抗体ZME−018が実施例３にあるように修飾されたTNFと同量混合された。この割合は抗体に比べてTNFの５倍モルに過剰に相当する。この混合物のpHは0.05M/TEA/HCl緩衝液（pH8.0）を添加することによって7.0に調整され、その混合物を窒素下で４℃、20時間インキュベートした。ヨードアセトアミド（0.1M）を加えて最終濃度を2mMにし残っているフリーのスルフヒドリル基を抑え、それからインキュベーションを約25℃でさらに１時間続けた。反応混合物を４℃に貯え、ゲル
0003589459.tif 000005
による精製に用いた。モノクローナル抗体ZME−018を分泌する代表的なハイブリドーマ株がメリーランド州ロックビル市パークローン・ドライブ12301にあるアメリカ・タイプ・カルチュア・コレクション（ATCC）に寄託されており、登録番号HB−11009とされている。
実施例７
TNFモノクローナル抗体複合体の精製
結合していないTNFはPBSで予め平衡化したセファデックスＳ−300カラム（2.5×50cm）でゲル
0003589459.tif 000006
することによって実施例６の反応混合物から分離した。
モノクローナル抗体ZME−018に結合したTNFを含む実施例６からの反応混合物がセファデックスカラムにかける前にセントリコン30微量濃縮器を用いて約1mlにまで濃縮された。このカラムはPBSで流された。1mlずつの画分を採取し、その50μｌをとってブラッドフォード色素結合法〔M.ブラッドフォード（M.Bradford）アナリティカル・バイオケミストリー（Analy−tical Biochemistry）72:248（1976）〕で蛋白量を分析した。
遊離の抗体とTNF結合した抗体は画分17〜40の付近に溶出し、一方非結合型のTNFは大凡46〜50の画分に溶出する。第１図はＳ−300カラムの溶出曲線を示している。遊離のTNF標準品の溶出（画分46〜48）が矢印によって示されている。非結合のモノクローナル抗体ZME−018の溶出は大体画分28に出ている。反応混合物をクロマトグラフィーをして画分20〜40を集めた。PAGEによる分析ではこれらの画分には遊離のTNFは含まれないことが示されている。この溶出パターンは各画分の50μｌを５〜20％の勾配した非還元のSDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動をすることによって確められた。この分析によって結合したものは抗体１分子当り１ないし３分子のTNFが結合しており遊離のTNFは含まれないことが確められた。
非結合の抗体はマウスの抗TNF抗体を結合したCNBr−セファロースを使った親和クロマトグラフィーによってTNF結合した抗体と分けられた。この樹脂は小さなカラム（１×4cm）に入れられ、予め0.1M NaClを含む10mMの燐酸緩衝液（pH7.2）で平衡化された。Ｓ−300で集めた試料をのせた後、カラムを30mlの同緩衝液で洗って非結合の抗体を完全に溶出した。TNF結合した抗体はカラムに結合した。
抗体−TNF複合体はTNF親和カラムの溶出曲線を示している第２図に示されているようにカラムから溶出した。素通りのピークには遊離の抗体だけが含まれ、一方画分58〜70は非結合のTNFと抗体を含まない抗体−TNF結合体が含まれている。Ｓ−300クロマトグラフィーから集めた画分を抗TNF抗体が結合された親和クロマトグラフィーにかけられた。そのカラムはPBSで十分に洗浄し、樹脂から遊離のモノクローナル抗体ZME−018を溶出させる（画分No.20がピーク）。モノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体の溶出は0.15M NaClバッファーを含む0.1M酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）でカラムを洗浄することによって行われた。第２図に示されるように精製された結合体は単一の蛋白ピークとして溶出した。５〜20％のアクリルアミドの連続的勾配の非還元ゲルによるPAGEでの解析によってその結合体が1,2,3個のTNF分子を結合したモノクローナル抗体ZME−018が含まれていることが示された。最終の産物には遊離のTNFまたは遊離のモノクローナル抗体ZME−018は検出できなかった。
溶出された画分の蛋白含量はブラッドフォードの色素結合法によって定量された。蛋白を含む画分を集め、溶出パターンを５〜20％の勾配の非還元ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって確めた。
実施例２に記されたＬ−929検定法が殆んど純粋のTNF−抗体結合体のTNF活性を評価するのに利用された。本質的に純粋なモノクローナル抗体15A8−TNFとモノクローナル抗体ZME−018−TNF抗体結合体はともにＬ−929検定法で活性が認められる。元の試料の1:1000希釈で大凡50％のＬ−929細胞の生育抑制をおこした。かくして元の標品の活性が1000U/mlであった。
実施例８
標的細胞に対するTNF結合と非結合モノクローナル抗体ZME−018の結合比較
標的のＡ−375（抗原陽性）細胞あるいはＴ−24（抗原陰性）細胞のモノクローナル抗体ZME−018の結合特性においてTNFでの修飾によって変化があるかどうかを調べるために細胞を96ウエルのプラスチックプレートの各ウエルに50,000細胞を播種し、室温で風乾させた。いろいろな濃度のモノクローナル抗体ZME−018またはモノクローナル抗体ZME−018−TNFを加え、３時間室温で結合させた。標準的なELISA法がマウスの抗体を検出するために実施された。
TNF結合と非結合のモノクローナル抗体ZME−018の標的細胞へ結合する力が評価された。50,000個の標的細胞（Ａ−325）または非標的のヒト胆のうガン細胞（Ｔ−24細胞）をマイクロタイタープレートの各ウエルに加えた。37℃で一晩細胞を乾かした。それから細胞を３回冷PBSをかえて洗い、一晩風乾した。細胞の表面の抗原決定基はこの処理後も抗原的に活性である。
細胞を接置した後、プレートを洗浄緩衝液（8lの２回蒸留中9.68トリス、64.8塩化ナトリウム、16mlのツイーン20、800mgのチメラソールを含む）で洗った。抗体試料を１％のウシ血清アルブミン（w/v）を含む洗浄緩衝液（希釈緩衝液）で希釈した。50μｌの0.002から100μg/mlの範囲の種々の濃度の結合または非結合のモノクローナル抗体ZME−018をウエルに添加した。１時間、４℃でインキュベートした後、その上清を除き、そのウエルを洗浄緩衝液で２回洗浄した。
ウエル当り50μｌのアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG（Bio−Rad製）を希釈緩衝液で1:1000（v/v）に希釈し（APGAM）、各ウエルに添加した。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、ウエルを洗浄緩衝液で２回洗浄した。室温で30分間暗所で50μｌの基質溶液〔80mMのクエン酸−燐酸塩（pH5.0）、1mMのABTS及び４μｌの30％過酸化水素〕とプレートをインキュベートした後、25μｌの4N硫酸を各ウエルに加えた。E Lisaプレートリーダーで492nmにおける吸光度が測定された。
結果は第３図に示されている。モノクローナル抗体ZME−018−TNF複合体は生来のモノクローナル抗体ZME−018と同程度にＡ−375標的細胞に結合した。モノクローナル抗体ZME−018−TNFまたは非結合のモノクローナル抗体ZME−018のＡ−135抗原を含んでいる標的細胞への結合には差がないから、化学的な結合法はその標的抗原に対する抗体の親和力をかえることはない。非標的のＴ−24胆のうガン細胞へのモノクローナル抗体ZME−018またはモノクローナル抗体ZME−018−TNF複合体の結合は検知できなかった。
実施例９
TNF及びモノクローナル抗体ZME−018−TNF複合体の増殖抑制効果
TNFとモノクローナル抗体15A8−TNFまたはモノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体の増殖抑制効果を200μｌの適当な組織培養培地中で96ウエルマイクロタイタープレートで大凡5,000の対数増殖期の細胞を１ウエルに播種することによって評価した。細胞を24時間37℃で空気中５％のCO2の環境下で接着させた。非標的の抗原陰性のＴ−24ヒト胆のうガン細胞、モノクローナル抗体15A8に抗原陽性のMe−180細胞、及びモノクローナル抗体ZME−180に対して抗原陽性のＡ−375ヒトメラノーマ細胞の対数増殖期に培地だけ（コントロール）、TNF、モノクローナル抗体15A8−TNF結合体またはモノクローナル抗体ZME−180−TNF結合体のいずれかといろいろな濃度で処理し、72時間、５％CO2含有空気の下で37℃でインキュベートした。プレートを３回冷PBSで洗った。50μｌのメタノールを各ウエルに加え、凍結と融解のサイクルをくリ返すことによって細胞を溶解した。それから蛋白濃度をブラッドフォード色素法で定量した。一方各ウエル中の細胞数はクリスタルバイオレット染色法で評価した。各ウエルの吸光度をELISAリーダーで測定し、コントロールウエル（無処理）と比較した。第４図に示されるように、TNFだけでは使用したTNFの細胞障害または抑制活性（50,000単／ウエル）をもたなかった。しかしながら、モノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体では10単位/mlで50％阻害が得られた。
細胞の生育抑制は蛋白濃度の減少または処理細胞の細胞数を生理食塩水処理のコントロールと比較することで評価された。非標的のＴ−24ガン細胞ではモノクローナル抗体15A8−TNF結合体またはモノクローナル抗体ZME−018−TNFによって生育の阻害はなかった。
Ｔ−24非標的細胞株に対してモノクローナル抗体15A8−TNFの影響はみられなかった。
その細胞表層に15A8抗原を含む細胞だけがTNFモノクローナル抗体15A8イムノトキシンによって殺されたので、このイムノトキシンは15A8腫瘍細胞表面抗原を含む細胞に向ってそしてそれを殺す効果的な方法であるが、一方正常な非腫瘍細胞表面抗原をもつ細胞に対しては障害を最少にするあるいは妨げることができる。
培養した抗原陽性のヒトメラノーマ細胞（AAB−27またはＡ−375）で検査したとき、モノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体は遊離のTNFよりも活性であった（第４図及び第５図）。第４図に示すように、TNFだけは50,000U/mlまでの量ではAAB−27細胞の生育に影響しなかった。しかし、第５図に示されるようにモノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体の約6U/mlで50％阻害が得られた。Ａ−375標的ヒトメラノーマ細胞は約100U/mlの量のTNFだけで阻害されたが、一方モノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体は約0.8U/mlの濃度で細胞を阻害した。Me−180標的細胞はTNFだけよりもモノクローナル抗体15A8−TNFイムノトキシンに対する方が10倍も感受性が高かった（第６図）。
第６図は約15U/mlでモノクローナル抗体15A8抗体を結合したTNFはMe−180細胞を50％に阻害したが、同じ効果を得るのに非結合TNFは200U/mlの濃度が必要であった。抗原陰性のＴ−24細胞ではTNFまたはモノクローナル抗体ZME−018−TNF結合体のいずれも影響なかった。
すなわち、TNFはモノクローナル抗体ZME−018及びモノクローナル抗体15A8との免疫結合体は抗原陽性細胞に対するTNFの細胞障害性を画期的に増大させるが、一方抗原陰性細胞には影響しない。加えて、TNFだけの生育抑制作用に全く抵抗性の細胞株では（第４図）、抗体による標的化によって細胞性の耐性を破ることができる。
この技術分野に通じた者は、本発明がこれに内在するものを含めてその目的を実行し、ここに記された目標や利点を得るために適合しうることを容易に評価できよう。ここに記載された化合物、方法や技法などは望ましい内容の代表的なものであり、例示のつもりで示したもので本発明の精神をこれに限定する意図ではない。この技術分野に通じた者にとって本発明の精神の中で行われる変更やその他の用途ができようし、別に示す特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
第１図はZME−TMF反応混合物のＳ−300ゲルパーミエーションクロマトグラフを示している。
第２図はＳ−300クロマトグラフィーから集めた画分を親和クロマトグラフィーを行ったクロマト図を示している。
第３図は標的抗原陽性のＡ−375細胞と抗原陰性のＴ−24細胞に対するZME−018−TNF結合体とフリーのTNFの結合の比較を示している。
第４図は抗原陽性のヒトメラノーマ細胞（AAB−527）に対するZME−TNF免疫結合体とTNFのみの場合の細胞毒性を示している。
第５図は抗原陽性のＡ−375細胞に対するZME−TNF免疫結合体の生育阻害を示している。
第６図は抗原陽性のZME−180細胞に対するMoAb 15A8−TNF免疫結合体の生育阻害を示している。
【図１】
0003589459.tif 000007
【図２】
0003589459.tif 000008
【図３】
0003589459.tif 000009
【図４】
0003589459.tif 000010
【図５】
0003589459.tif 000011
【図６】
0003589459.tif 000012