(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチに起因して出現する自己抗体の検出方法であって、当該方法が、被験者から採取した体液試料を、組織または細胞に接触せしめて、体液試料内の当該自己抗体を免疫学的に検出する工程を含み、かつ当該自己抗体が、微少管組織化中心、当該微少管組織化中心から伸延する微少管、または当該微少管組織化中心および当該微少管に付随するタンパク質に対する抗体である、ことを特徴とする関節リウマチに起因する自己抗体の検出方法。
【請求項２】
前記自己抗体のみならず、抗−該抗体及び抗体−細胞質抗体も検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液が、ヒトの血液または滑液である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織または細胞が、ヒト、動物または昆虫に由来する請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記組織または細胞が、培養または樹立されたものである請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、HEp−２、マクロファージ、マクロファージ細胞系、McCoy細胞、およびこれら細胞の組み合わせからなるグループから選択される請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記マクロファージ細胞系が、IT−１細胞系（KFCC10772）である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒトの組織またはヒトの細胞が、ガラススライドに付着されるか、またはそれが培養された後にガラススライドに固定化される請求項４乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ガラススライドへの付着または固定が、有機溶媒または架橋試薬を用いて行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織または細胞が、界面活性剤で処理される請求項４乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記検出工程が、間接免疫蛍光法によって行われる請求項１乃至10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記間接免疫蛍光法が、骨格に伴う核周囲単一大顆粒の蛍光パターンを与える請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.発明の属する技術分野
本発明は、自己免疫疾患の新規診断方法に関する。さらに詳細には、本発明は、微少管組織化中心（microtuble organizing center、以下「MTOC」と称する）ならびに／または当該中心から伸延する微少管ならびに／または、ヒト及び動物の組織もしくは細胞に存在する付随（accompanying）タンパク質に対する抗体を免疫学的に検出することによる、自己免疫疾患を診断する新規の方法に関するものである。
2.先行技術の記載
自己免疫疾患、すなわち、外来物質でなく内在性物質に対する抗体の形成を惹起こす免疫系の障害は、２つの範疇すなわち、全身性リウマチ性疾患及び臓器特異的自己免疫疾患に分類されうる。全身性リウマチ性疾患はさらに、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチなどを包含する多種の疾患に分類されうる。
慢性関節リウマチは、極めて頻発性であり、全世界の個体数の１〜５％に見出されるものである。その典型的な症候には、手足が朝に硬直化すること、及び手足の関節痛が包含される。
慢性関節リウマチの病因論は未だ解明されていないので、その治療の成功または迅速なる診断は容易ではない。
現在に至るまで、慢性関節リウマチを診断するために、リウマチ因子が検出されてきている。しかしながら、リウマチ因子は、その疾患を有するすべての患者において検出されるわけではなく、さらに、健常なヒトの約５〜20％に陽性の結果が示されるのである。（ARA Glossary Committee、Dictionary of the rheumatic disease  11巻、diagnostic testing、第17頁、1985年）
これらの問題を回避するために、抗−ケラチン、抗−核周囲因子及び抗−RA−33抗体が開発された。これらの抗体は、慢性関節リウマチの診断上の特異性の向上に寄与するものであった。しかしながら、実際に使用するには、未だに感度が低い。
特に、ANA試験（「抗−各抗体試験」）は、自己免疫疾患の診断において最も広範に使用されている試験である。しかしながら、HEp−２細胞系を用いる従来のANA試験は、主として全身性紅斑性狼瘡の検出にかかるものである。従って、慢性関節リウマチを診断するためには、別にリウマチ因子を検出する必要がある。
本発明者は、自己免疫疾患を診断するには、従来使用されていたHEp−２細胞よりもマクロファージがさらに有用であることを見出し、そしてマクロファージ細胞系の樹立に成功を収めた。樹立された細胞系は、「IT−１」と命名され、ブダペスト条約に従って、韓国、ソウルに所在するコリアン・カルチャー・コレクション・オブ・ミクロオーガニズムス、ヨンセイ大学（Yonsei University）に寄託され、第KFCC  10772号の受託番号を受けた。
さらなる研究を継続した結果、本発明者は驚くべきことに、慢性関節リウマチの患者の体液には、微少管組織化中心（「MTOC」）及び／またはそれより伸延する微少管（「MT」）に対する抗体が特徴的に含まれていることを見出した。
発明の要約
しかして、本発明の目的は、高い特異性及び感度を備えた、自己免疫疾患を診断するための方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患を診断するための方法であって、以下の工程すなわち、
自己免疫疾患に罹患していることが疑われる被験者の体液試料を、生組織または生細胞系に接触させ、そして
MTOC及び／またはMT及び／または付随タンパク質が、体液中の抗−MTOC−MT抗体と反応したか否かを判定する工程を含む方法を提供することにある。
本発明はさらに、抗−核抗体、抗−細胞質抗体及び抗−MTOC−MT抗体を、組織または細胞を使用することによって同時に検出するための方法も提供するものである。
本発明はさらに、自己免疫疾患を診断するための方法であって、以下の工程、すなわち、
組織または細胞が固定化されたガラススライドを調製し、
自己免疫疾患に罹患していることが疑われる被験者の体液試料を調製し、
前記ガラススライド上の組織または細胞に体液試料を接触させて所定の温度にて所定の時間インキュベートし、そして
組織または細胞中のMTOC、MTまたは付随タンパク質に応答する、抗−MTOC−MT抗体の存在を検出する
工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
本発明を、添付の図面を参照して、さらに詳細に説明する。
図１は、IT−１細胞を使用する間接免疫蛍光法によって検出された抗−MTOC−MT抗体を示す蛍光顕微鏡写真である。MTOCは、IT−１細胞の核近傍に位置しており、さらにMTOCから伸延する糸状のMTを認めることができる。
本発明の前記目的及び他の目的、特徴ならびに適用は、以下の詳細な説明から当業者に明示されよう。
発明の詳細な説明
本発明は、慢性関節リウマチの患者の体液に、微少管組織化中心（「MTOC」）、ならびに／またはそれから伸延する微少管（「MT」）、ならびに／またはMTOC及びMTに付随するタンパク質に対する自己抗体が特徴的に含まれているという、発明者の驚くべき知見に基づくものである。MTOC、MT及び付随タンパク質は、ヒトを包含する動物に起源を有する、あらゆる組織または細胞に存在している。さらに、MTOC、MT及び付随タンパク質が、昆虫に存在することが予測される。
本明細書において用いられる「抗−MTOC−MT抗体」なる語は、MTOC、MT、MTOCに付随するタンパク質及びMTに付随するタンパク質に対するあらゆる抗体を意味し、これらを包含するものである。これは、自己免疫疾患の患者の体液中の自己抗体は、MTOC、MT及び付随タンパク質の１、２またはすべてに、免疫学的に応答することができるという事実に基づいている。本明細書中、抗体は自己抗体であり、自己免疫疾患の患者、特に慢性関節リウマチの患者の体液に存在しているものである。
本発明で、自己免疫疾患の患者の抗−MTOC−MT抗体と反応するMTOC、MT及び付随タンパク質の供給源として役立つ組織または細胞の起源及び種類は、特に限定されるものではない。MTOC、MT及び付随タンパク質は、ヒトや、ラット、マウス、ウサギ、ウシなどの動物、及び昆虫のあらゆる組織または細胞に存在する。組織または細胞の種類については、簡単且つ容易に使用するために、種々の樹立された組織または細胞が好適に使用できる。例えば、本発明者によって提供される、樹立されたマクロファージ細胞系であるIT−１細胞系（KFCC  10772）が、好適に使用されうる。あるいは、HEp−２（寄託番号CCL  23としてATCCに寄託されており、もしくは市販により入手できる）などのヒトガン細胞を好適に用いることができる。特に、IT−１細胞系は、自己免疫疾患の患者のMTOC及びMTの、より迅速且つ明瞭な検出を可能とするので、より好適に使用できる。
さらに、より至便な適用のために、組織または細胞をガラススライド上に固定化することができる。ガラススライド上へのヒト組織または細胞の固定化は、従来の方法を使用することによって行うことができる。時間、温度及び固定液などのパラメータは、当業者によって難なく選択されえ、本発明を限定するべきものではない。固定液として、エタノール、アセトン、またはメタノールなどの有機溶媒、及びパラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどの架橋試薬が、単独またはそれらの混合物として好適に使用されうる。
組織または細胞がガラススライド上に固定化される場合、容易且つ明瞭な読み取り結果を得るために、組織または細胞の細胞壁を除去するような処置を施してもよい。この目的のためには、Triton−Ｘ（商標）などの界面活性剤を使用するとよい。
組織または細胞におけるMTOC、MT及び／または付随タンパク質と、患者における抗−MTOC−MT抗体との間の免疫学的反応の結果は、免疫学的反応を検出するために用いられる種々の従来技術を使用することによって検出することができる。例えば、間接免疫蛍光法、免疫酵素法及びラジオイムノアッセイを使用することができる。
現在に至るまで、前記のように、自己免疫疾患の診断のために信頼できる結果を得るべく、２以上の別々の試験、例えば、ANA（抗−核抗体）試験に加えてリウマチ因子の試験を行わなければならなかった。これに対し、本発明によって、ヒト組織または細胞として使用されるべきヒトマクロファージIT−１またはヒトガン細胞HEp−２などの樹立された細胞系の使用が許容され、抗−MTOC−MT抗体のみならず抗−核抗体も同時に検出され、それによって慢性関節リウマチを包含する更に広範なる自己免疫疾患を検出することが可能となる。
自己免疫疾患の患者の体液としては、全血、血清または血漿などの血液試料、滑液、脳脊髄液、または胸膜液が挙げられるが、これらに限定されることはない。
組織または細胞系を使用して慢性関節リウマチを診断するための方法を、以下にさらに詳細に記載する。
組織または細胞が固定化されたガラススライドを調製する。慢性関節リウマチの患者由来の体液の連続２倍希釈液（それぞれ30μｌ）（1:20から1:1280までの希釈液）を、ガラススライドに滴下する。室温にて高湿下に約30分間反応させた後、ガラススライドをリン酸緩衝性生理食塩水（PBS）を含むコプラン（Copran）ジャーの中に入れ、攪拌機を用いて200rpmにて攪拌し、洗浄して乾燥させる。フルオレセインが接合された多価抗−ヒトイムノグロブリン（Dako）の希釈液（1:40）の30μｌをスライドに滴下し、次いで室温にて高湿下に約30分間反応させる。PBSでスライドを洗浄した後、0.2％エバンスブルー（Sigma）を使用することによりスライドを対比染色し、PBSで洗浄する。
吸収紙を使用して過剰の緩衝液を除去し、PBS−グリセロール溶液をその上に載せ、蛍光顕微鏡下に観察する。
MTOCの環状または輪の形状の蛍光パターンが、核の近傍に観察される。MTOCから伸延する糸状のMTもまた観察される（図１）。このようなパターンはそれぞれ、MTOC及びMTの形態学的特徴である（Molecular Biology of the Cell、第３版、Garland、789〜795頁）。
自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの患者の体液において検出される抗体は、MTOC、MT及び付随タンパク質に対する抗体であると考えられる。本発明者は、図１における蛍光パターンを慢性関節リウマチに特徴的な、「骨格に伴う核周囲単一大顆粒（perinuclear single large granular with skelton）」と命名した。
発明の好ましい実施態様
本発明は、以下の実施例によって具体化されよう。しかしながら、これら実施例は、例証の目的のみで提供されるのであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は、請求の範囲にて適正に理解されるべきである。実施例において部またはパーセントは、別段に示さない限り重量に基づくものである。
実施例１
10％ウシ血清を添加したRPMI−1640にて培養されたIT−１細胞系（KFCC  10772）の２×104細胞/mlを、ガラススライドのウェルに入れた。細胞は、５％CO2雰囲気下で37℃にて24時間、インキュベーター中で生育した。スライドから培地を除去し、このスライドをPBSで洗浄して、固定のためにアセトン−メタノール（1:1）の中へ５分間浸漬した。
269名の慢性関節リウマチ患者由来の血清試料（−70℃にて保存されていた）を、1:20から1:1280まで連続的に２倍希釈した。各希釈液の30μｌをスライドに滴下し、室温にて高湿下に30分間反応させた。
ガラススライドを、次いでPBSを含むコプランジャーの中に入れ、攪拌機を用いて200rpmにて攪拌し、洗浄して乾燥させた。フルオレセインが接合された多価抗−ヒトイムノグロブリン（Dako）の希釈液（1:40）の30μｌをスライドに滴下し、次いで室温にて高湿下に30分間反応させた。PBSでスライドを洗浄した後、0.2％エバンスブルー（Sigma）を使用することによりスライドを対比染色し、PBSで洗浄した。吸収紙を使用して過剰のPBSを除去し、PBS−グリセロール溶液をその上に載せ、蛍光顕微鏡下に観察した。
結果を図１に示す。MTOCの環状または輪の形状の蛍光パターンが、核の近傍に観察された。MTOCから伸延する糸状のMTもまた観察された。すなわち、「骨格に伴う核周囲単一大顆粒」のパターンが観察された。
比較例１
リウマチ因子試験による慢性関節リウマチの診断
実施例１において使用されたと同様の血清試料0.05mlをガラススライドに滴下し、同量のヒトガンマグロブリンエマルション（Iatron）をそれに添加した。得られた混合液をよく混合し、１分間静置した。次いで、ガラススライドを水平方向に穏やかに振盪し、何らかの凝集について観察した。
結果
269の試料のうち、148（55％）が、本発明の試験（実施例１）及びリウマチ因子試験（比較例１）において陽性反応を示した。62（23％）の試料は、リウマチ因子試験では陰性であり、本発明の試験では陽性であった。一方、42（16％）の試料が、リウマチ因子試験では陽性であって、本発明の試験では陰性であった。そして、17の試料（６％）は、双方の試験ともで陰性であった。
これらの結果、本発明の方法は従来のリウマチ因子試験に比較して、極めて高感度であり、これによって偽陰性の結果の可能性が随分減じられることが示される。
実施例２
125名の健常なヒトの血液試料を使用して、実施例１及び比較例１の手順の試験を行った。
1:20の希釈率にて、本発明の試験によれば４％（125のうち５）で陽性の結果が得られ、一方リウマチ因子試験では9.6％（125のうち12）に陽性の結果が認められた。従って、抗−MTOC−MT抗体を使用する本発明の方法は、偽陽性の結果の可能性を低減させることを明らかにすることができた。従って、本発明の方法は、特異性を高めることができるものである。
実施例３
本発明の試験及びリウマチ因子試験の双方において陽性の結果を示している12名の患者の血液試料を調製した。IT−１細胞の代わりに、Kallestad（米国）またはMBL（日本国）より販売されている市販のHEp−２細胞について、同様の血液試料を使用して実施例１の手順の実験を行った。
双方の実験で、抗−MTOC−MT抗体の陽性の結果が得られた。しかしながら、前記２社から供給されたHEp−２細胞は、実施例１のIT−１細胞系よりも微弱な蛍光を示していた。さらに、HEp−２細胞を使用した試験では、非常に小さなサイズのMTOCしか示されなかった。
実施例４
IT−１細胞系を、それぞれ、４％パラホルムアルデヒド/0.2％Triton−Ｘの混合液で固定するか、または0.5％Triton−Ｘで処理したことを除いては、実施例１の手順の実験を行った。その結果、0.5％Triton−Ｘで処理した場合に、より明瞭な蛍光パターンが示された。
実施例５
慢性関節リウマチの患者は、通常関節の浮腫及び滑液の増加に見舞われる。よって、抗−MTOC−MT抗体を検出するために滑液が使用されうる。
10名の慢性関節リウマチ患者由来の滑液を使用したことを除いては、実施例１の手順の実験を行った。その結果、全ての滑液試料が陽性の結果を示した。
実施例６
IT−１細胞の代わりに、McCoy細胞（ATCC  CRL  1696）及びマウス由来のマクロファージ細胞系（RAW細胞、ATCC  TIB  71）を使用したことを除いては、実施例１の手順の実験を行った。これらの細胞を使用して、抗−MTOC−MT陽性であることがわかっている12名の患者由来の血清が適用されたガラススライドを作成した。これらのマウス細胞系は、IT−１細胞を用いた場合に認められたものに比較してMTOCが随分小さいことが示されたが、MTは陽性の結果を示した。
【図１】
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