(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む検体液を濾過膜で濾過して、検体液中の微生物を濾過膜上に捕捉した後、該微生物中の生体成分を抽出し、次いで以下の（イ）〜（ニ）の物質を含むＡＴＰ変換反応試薬と、生物発光試薬を加えて、濾過膜上に生じる発光を測定することを特徴とする微生物の測定法。
（イ）ピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼ
（ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸
（ハ）ピロリン酸
（ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン
【請求項２】
生物発光試薬が、次の（イ）〜（ハ）の物質を含む試薬である請求項１記載の微生物の測定法。
（イ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン
（ロ）ルシフェリン
（ハ）ルシフェラ−ゼ
【請求項３】
微生物中の生体成分が、アデノシンリン酸エステル、ＲＮＡ、ピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼ、ホスホエノ−ルピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼ、ピルビン酸キナ−ゼ、酢酸キナ−ゼ、クレアチンキナ−ゼ、又はサイクリック３´，５´−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼから選ばれる１種以上である請求項１または２のいずれかに記載の微生物の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体液中の微生物を迅速、簡便かつ高感度に測定する方法に関する。
【０００２】
さらに詳しくは本発明は、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬により、濾過膜上に捕捉された微生物を測定する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
各種工業分野、臨床医学、基礎研究等の現場では、検体液中の微生物の測定が一般的に行なわれている。特に、食品、製薬、化粧品などの分野では、使用する水、原料、中間体あるいは製品中の微生物の管理が極めて重要である。また、電子工業でも使用する水の管理は重要であって、水中の微生物の生菌数は常に把握しておく必要がある。
【０００４】
従来、微生物の測定法としては、いわゆる寒天平板法が一般的である。本法は、検体中に存在する微生物を寒天平板培地上で培養し、生成したコロニーを観察する方法である（食品衛生指針）。しかしながら、この方法では培養操作を必要とするため、微生物の有無の判定あるいは生菌数の測定が可能となるまでに長時間（２〜３日）を要するという問題があった。
【０００５】
そこで、寒天平板法に代わる種々の迅速測定法が提案されている。迅速測定法の一つとして、ルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光反応を利用する方法が知られている。この方法では、検体液中の生菌数が十分に多い場合は、少量を試験管に採取したり、また、微生物の生菌数がやや少ない場合は、検体液を濾過膜で濾過して微生物を捕捉した後、該濾過膜を極少量の無菌水等に浸漬して、微生物を懸濁する。次いで、懸濁液の一部を小試験管に採取し、菌体中のアデノシン−３リン酸（以下ＡＴＰと略す）をＡＴＰ抽出剤により抽出する。次いで、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム等を含む生物発光試薬を加えて発光させ、その発光量をルミノメーター等の測定器を用いて測定することにより生菌数を算出していた（特開平２−５７１９７号、特開平２−１６３０９８号等、春田三佐夫他食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速化  第５８ページ、サイエンスフォーラム（１９８５）日本）。
【０００６】
しかしながら、これらの迅速測定法では、検体液中の生菌数が少ない場合（例えば１０３〜１０４個／ｍｌ以下）は、ＡＴＰ量がルミノメーターの測定限界以下であるために、微生物が十分に測定できないという問題があった。かかる場合には、微生物を濾過捕捉した濾過膜を、その微生物の増殖に適した栄養成分を含む培地で培養し、生菌数を測定限界以上に増加させる必要があった。
【０００７】
上記の迅速測定法を高感度化する方法として、検体液中の微生物を、多数の疎水性区画壁で囲まれた多数の小さな親水性濾過膜区画からなるメンブレンフィルター上に捕捉し、ＡＴＰ抽出剤、次いで生物発光試薬液を噴霧した後、メンブレン上の発光量を高感度の生物発光画像解析システムで測定するという方法が知られている（特開平５−３２８９９５号）。また、上記のメンブレンフィルターに代えて疎水性の濾過膜を使用する方法も公知である（特開平６−２３７７９３号）。
【０００８】
上記の迅速測定法や高感度測定法では、ルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光試薬を使用している。この場合、ルシフェラーゼが反応系中のＡＴＰを消費するに従って発光量が減衰してしまい、測定器の感度が低い場合は、メンブレンフィルタ−上の発光が十分に測定されない等の問題点があった。また、上記の方法において、生物発光試薬の濃度を増加させて発光速度を上げた場合でも、初期発光量が増大するのみで総発光量はなんら変化しないばかりか、生物発光試薬の噴霧後は発光量が経時的に急激に減衰するため、メンブレンフィルターを速やかに画像解析装置にセットして測定を開始しなければならないという問題点があった。
【０００９】
上記の高感度測定法を用いたとしても、微生物の種類によっては、菌体中のＡＴＰ量が少ないために発光量が不十分であるという問題点があった。その場合、微生物が捕捉されている濾過膜を、微生物の種類に適した寒天培地上に置き、２５℃〜３７℃で４〜１５時間培養を行って微生物を増殖させる必要があるため、迅速な測定ができないという問題点があった。
【００１０】
上記の通り、生物発光反応により濾過膜上の微生物を測定する方法においては、菌体中のＡＴＰ量が少ないことやＡＴＰの消費等に起因する、発光量の減衰が問題となっていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、濾過膜上に捕捉された微生物の迅速、簡便かつ高感度な測定法を提供することにある。特に本発明の課題は、生物発光反応を用いる上記の測定法において、ＡＴＰの消費等に起因する発光量の減衰を解消することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、濾過膜上に捕捉された微生物の迅速、簡便かつ高感度な測定法について鋭意研究を重ねた結果、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬を組み合わせた方法が、該微生物の測定法として極めて優れていることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなはち本発明は、微生物を含む検体液を濾過膜で濾過して、検体液中の微生物を濾過膜上に捕捉した後、該微生物中の生体成分を抽出し、次いでＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬を加えて、濾過膜上に生じる発光を測定することを特徴とする微生物の測定法である。
【００１４】
なお、本発明でいうＡＴＰ変換反応試薬とは、反応時にＡＴＰが生成される任意の反応系（以下「ＡＴＰ変換反応」という）に関与する物質を含む試薬を意味する。
【００１５】
また、本発明でいう生物発光試薬とは、反応時にＡＴＰを消費する任意の生物発光反応（以下「生物発光反応」という）に関与する物質を含む試薬を意味する。また、微生物中の生体成分とは、微生物に含まれ、上記ＡＴＰ変換反応あるいは生物発光反応に関与する物質を意味する。
【００１６】
本発明においては、生物発光反応において消費されたＡＴＰが、ＡＴＰ変換反応において再生されるので、発光量及び発光時間が増大するという効果が得られる。
【００１７】
ＡＴＰ変換反応試薬、生物発光反応試薬および微生物中の生体成分については、後に詳説する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
１．ＡＴＰ変換反応試薬
本発明でいうＡＴＰ変換反応試薬とは、ＡＴＰ変換反応に関与する物質、例えば、ピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼ（以下「ＰＰＤＫ」という）を含む試薬であり、具体的には、例えば、次の（イ）〜（ニ）の物質を含む試薬である。
【００１９】
（イ）ＰＰＤＫ
（ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸
（ハ）ピロリン酸
（ニ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン
ＰＰＤＫは、マグネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノ−ルピルビン酸及びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸及びリン酸を生じる反応を触媒し、その逆の反応も触媒する公知酵素である。
【００２０】
上記の試薬と、反応系中のＡＭＰとが反応することにより、ＡＴＰが生成する。その反応式は以下の通りである。
【００２１】
【化１】
0003599979.tif 000002
【００２２】
ここでいう反応系中のＡＭＰとは、微生物中の生体成分として含まれているもの、および生物発光反応におけるＡＴＰの消費に伴って生成したものである。
【００２３】
また、本発明では、上記（イ）〜（ニ）の物質を含むＡＴＰ変換反応試薬に、他の物質を加えてもよい。例えば、サイクリック３′，５′−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼを加えた場合は、ＡＭＰのみならず、サイクリックＡＭＰからもＡＴＰが生成する。その反応式は以下の通りである。
【００２４】
【化２】
0003599979.tif 000003
【００２５】
また、上記（イ）〜（ニ）の物質を含むＡＴＰ変換反応試薬に、ピルビン酸キナーゼを加えた場合は、ＡＭＰのみならず、ＡＤＰからもＡＴＰが生成する。その反応式は以下の通りである。
【００２６】
【化３】
0003599979.tif 000004
【００２７】
この他、上記（イ）〜（ニ）の物質と、それ以外の物質との組み合わせであって、反応時にＡＴＰが生成する反応に関与する物質を含む試薬は、本発明のＡＴＰ変換反応試薬に含まれる。
【００２８】
ＡＴＰ変換反応に関与する物質の１つであるＰＰＤＫの理化学的性質及び製法は公知であり、その入手は比較的に容易である。植物由来のＰＰＤＫとしては、例えばトウモロコシ葉由来［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２、２８６２−２８６７  （１９７３）］及びサトウキビ葉由来［Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１４、１１７−１２５（１９６９）］の酵素が挙げられる。
【００２９】
また、微生物由来のものとしては、例えばプロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０、７２１−７２９（１９７１）］、アセトバクタ−・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７０）］、バクテロイデス・シンビオサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｓ）［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４２、１９９−２１２（１９７５）］及びミクロビスポ−ラ属［例えばミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｒｏｓｅａ）ＩＦＯ  １４０４７］等に属する微生物の生産する酵素が挙げられる。
【００３０】
本発明のＰＰＤＫとしては、例えば、上記の生物から精製した天然型ＰＰＤＫが使用できる。また、酵素活性を失わない範囲で、天然型ＰＰＤＫのアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異が導入された変異型ＰＰＤＫを使用することもできる。
【００３１】
天然型ＰＰＤＫは、遺伝子工学的手法により得ることもできる。すなわち、天然型ＰＰＤＫ遺伝子を適当なベクタ−宿主系に導入し、得られた組換え微生物の培養物からＰＰＤＫを採取すればよい。なお、ＰＰＤＫ遺伝子は、トウモロコシ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１１０８０−１１０８３（１９８８））、フラベリア・トリネルビア（Ｆｌａｖｅｒｉａ  ｔｒｉｎｅｒｖｉａ：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７３，１１６−１２１（１９９０））等の生物から既にクローニングされている。
【００３２】
変異型ＰＰＤＫを用いる場合、該ＰＰＤＫは、上記生物の変異株から得ることができる。また変異型ＰＰＤＫは、遺伝子工学的手法により得ることができる。すなわち天然型ＰＰＤＫ遺伝子の塩基配列中の１または複数の塩基に付加、欠失、置換等の変異を導入した変異型ＰＰＤＫ遺伝子を調製し、これを適当なベクタ−宿主系に導入し、得られた組換え微生物の培養物から変異型ＰＰＤＫを採取すればよい。遺伝子に変異を導入する方法としては、例えば、天然型ＰＰＤＫ遺伝子と変異原となる薬剤（ヒドロキシルアミン、亜硝酸、亜硫酸、５−ブロモウラシル等）とを接触させる方法が使用できる。この他、紫外線照射法、カセット変異法、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入法等を広く用いることができる。更には、化学合成したＤＮＡをアニーリングして、所望の部位に変異を有する変異型ＰＰＤＫ遺伝子を構築することも可能である。
２．生物発光試薬
本発明でいう生物発光試薬は、生物発光反応に関与する物質を含む試薬であれば特に限定されない。本発明の生物発光試薬とは、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応に関与する物質を含む試薬であり、具体的には、例えば、次の（イ）〜（ハ）の物質を含む試薬である。
【００３３】
（イ）マグネシウムイオン又は他の金属イオン
（ロ）ルシフェリン
（ハ）ルシフェラ−ゼ
上記の試薬と、反応系中のＡＴＰとが反応することにより、発光反応が生じる。その際に、ＡＴＰが消費され、ＡＭＰが生成する。その反応式は以下の通りである。
【００３４】
【化４】
0003599979.tif 000005
【００３５】
ここでいう反応系中のＡＴＰとは、微生物中の生体成分として含まれているもの、およびＡＴＰ変換反応により生成されたものである。
【００３６】
本発明のルシフェリンおよびルシフェラーゼとしては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタル、北米産ホタル、ヒカリコメツキムシ、ツチボタル等）を由来とするものが使用できる。
【００３７】
ルシフェラーゼは、上記生物の発光組織から精製した天然型ルシフェラーゼや、遺伝子工学的手法により調製した天然型ルシフェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼのアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使用することができる。
３．微生物中の生体成分
本発明でいう微生物中の生体成分とは、微生物に含まれ、本発明のＡＴＰ変換反応あるいは生物発光反応に関与する物質を意味する。そのような物質としては、例えば、アデノシンリン酸エステル（ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、サイクリックＡＭＰ等）、ＲＮＡ、ＰＰＤＫ、ホスホエノ−ルピルビン酸、ピロリン酸、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼ、ピルビン酸キナ−ゼ、酢酸キナ−ゼ、クレアチンキナ−ゼ、又はサイクリック３′，５′−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼ等が挙げられる。その他、上記生体成分の生成に関与する物質も、本発明でいう生体成分に含まれる。
【００３８】
生体成分がＲＮＡである場合は、反応系にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を加えることによりＲＮＡからＡＭＰが生成し、該ＡＭＰがＡＴＰ変換反応においてＡＴＰとなる。
【００３９】
生物発光反応を用いる従来の測定法では、生物発光反応に関与する生体成分は主にＡＴＰであり、該ＡＴＰの消費に伴って発光量が減衰してしまうという問題があった。一方、本発明ではＡＴＰ変換反応を利用することにより、種々のアデノシンリン酸エステル（ＡＭＰ、サイクリックＡＭＰ、ＡＤＰ等）からＡＴＰが新たに生成され、かつ生物発光反応において消費されたＡＴＰも再生される。その結果、発光量および発光時間が増大するので、迅速、簡便かつ高感度な微生物の測定が可能となる。
４．検体液の濾過
本発明においては、まず、微生物を含む検体液を濾過膜で濾過して、検体液中の微生物を濾過膜上に捕捉する。
【００４０】
本発明でいう微生物とは、酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動物、動物又は植物の分化していない細胞及び組織培養物等を意味する。
【００４１】
検体液は、特に限定されないが、例えば、飲食物、医薬、化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、上記微生物の培養物等が挙げられる。また、上記の検体液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等等）に懸濁した溶液を検体液としてもよい。検体液が固形分を含む場合には、該検体液を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等等）に懸濁するか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱うことができる。
【００４２】
濾過膜は、微生物を捕捉できるものであれば特に限定されず、例えば、市販の親水性及び疎水性の濾過膜が使用できる。親水性濾過膜としては、例えば、親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンフルオライド、親水性ポリスルフォン、親水性ポリカーボネート、親水性ポリアミド、親水性ポリエチレン、親水性ポリプロピレン等の親水性のプラスチック系材料やアセチルセルローズやニトロセルローズ等の材料を用いて製造されたフィルム状又はシート状のものが使用される。
【００４３】
また、疎水性濾過膜としては、例えばＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポリトラフルオロエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）等や、疎水性の比較的大きい親水性濾過膜、例えばＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＡ（ポリアミド）、ＰＳ（ポリスルフォン）等を使用することができる。なお、疎水性の濾過膜を使用する場合は、濾過膜を予めアルコールのような親水性の溶媒で湿らせて一時的に親水化しておくことが望ましい。
【００４４】
検体液の濾過法としては、例えば、カップ状濾過容器（例えば、日本ミリポア社製ミリフレックスフィルターユニット、ステリフィル）などに濾過膜を装着して、検体液を吸引濾過し、微生物を濾過膜上に捕捉する方法が採用される。濾過終了後は濾過器から濾過膜を取り外し、必要により濾過膜の洗浄、風乾を行なう。微生物が、動物細胞、プロトプラスト等である場合、細胞の破壊を防ぐため、濾過膜の洗浄には生理食塩水等の等張液を使用することが望ましい。
５．バックグランドＡＴＰの分解
微生物を捕捉した濾過膜は、ＡＴＰ分解酵素を含む試薬（以下「ＡＴＰ消去剤」という）と接触させ、微生物菌体に含まれるＡＴＰ以外のＡＴＰ（以下「バックグランドＡＴＰ」という）を分解しておくことが望ましい。濾過膜をＡＴＰ消去剤で処理することにより、生物発光反応におけるバックグランド発光が低下し、微生物の測定感度が向上するという効果が得られる。
【００４５】
ＡＴＰ消去剤としては、例えば、アデノシンリン酸デアミナーゼ溶液、アデノシンリン酸デアミナーゼとその他の酵素（例えば、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼ）の混合溶液等が使用できる。ＡＴＰ消去剤中のアデノシンリン酸デアミナーゼの終濃度としては、０．００１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１０Ｕ／ｍｌが適当である。
【００４６】
濾過膜とＡＴＰ消去剤を接触させる場合、ＡＴＰ消去剤を濾過膜上に滴下または噴霧するか、ＡＴＰ消去剤に濾過膜を浸漬すればよい。
【００４７】
バックグランドＡＴＰを消去した後は、濾過膜上のＡＴＰ消去剤を除去あるいは失活させることが望ましい。ＡＴＰ消去剤の除去は、濾過膜をＡＴＰ消去済みの超純水や緩衝液で洗浄することにより実施される。また、ＡＴＰ消去剤は、該消去剤の阻害剤を作用させることにより失活させることができる。
【００４８】
ＡＴＰ消去剤がアデノシンリン酸デアミナーゼ溶液である場合、該消去剤の阻害剤としては、例えば、コホルマイシンが使用できる。コホルマイシンはアデノシンリン酸デアミナーゼの阻害剤として知られている（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＳ，ＳＥＲ．Ａ  Ｖｏｌ２０  Ｎｏ．４  ２２７−２３１）。
【００４９】
ＡＴＰ消去剤の阻害剤を作用させる場合は、該阻害剤を濾過膜上に滴下あるいは噴霧すればよい。
６．微生物中の生体成分の抽出
次に、濾過膜上に捕捉された微生物中の生体成分を抽出する。生体成分の抽出法は特に限定されないが、例えば、公知のＡＴＰ抽出剤を濾過膜上に滴下あるいは噴霧すればよい。ＡＴＰ抽出剤としては、例えば、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリトンＸ１００等）、トリクロル酢酸、過塩素酸等が使用できる。特にエタノールとアンモニアの混合液は、ＡＴＰ抽出操作後の揮発が容易である点や、前記ＡＴＰ分解酵素の活性を阻害するという点で、ＡＴＰ抽出剤として好適である。ＡＴＰ抽出剤の噴霧は、例えば超音波式噴霧機（松下電工製）等を用い、５秒〜５分間程度行えばよい。ＡＴＰ抽出後は、必要により、濾過膜の洗浄、乾燥を行い、ＡＴＰ抽出剤を除去する。
７．ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬の添加
次いで濾過膜上に、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬を滴下あるいは噴霧する。抽出した生体成分の流出を防止するため、上記試薬は松下電工製超音波式噴霧機等を用いて噴霧することが好ましい。
【００５０】
ＡＴＰ変換反応および生物発光反応の条件（試薬に含まれる各成分の終濃度、反応時間、温度等）、上記試薬の滴下あるいは噴霧の順序等は特に限定されず、微生物や濾過膜等の状態に応じて適宜設定すればよい。すなわち、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬は、混合して使用してもよく、順次濾過膜上に加えてもよい。
【００５１】
操作の簡便化という点から、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬とを混合して用いることが好ましい。その場合、例えば以下の組成の混合溶液を使用することができる。
【００５２】
（イ）ＰＰＤＫ；０．００１Ｕ／ｍｌ以上。好ましくは０．００２〜１００Ｕ／ｍｌ
（ロ）ホスホエノ−ルピルビン酸；終濃度０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５〜８．０ｍＭ。
【００５３】
（ハ）ピロリン酸；終濃度１．０μＭ以上。好ましくは５．０〜１００μＭとなる濃度。
【００５４】
（ニ）マグネシウムイオン；終濃度１．０ｍＭ以上、好ましくは５．０〜１００ｍＭ
（ホ）ルシフェリン；終濃度５．０μＭ以上、好ましくは５０．０〜１００００μＭ
（ヘ）ルシフェラ−ゼ；終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ
（ト）硫酸アンモニウム；終濃度０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５〜１００ｍＭ。
【００５５】
（チ）ジチオスレイト−ル；終濃度０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５〜１０ｍＭ
（リ）ＥＤＴＡ；終濃度０．１ｍＭ以上、好ましくは０．５〜１０ｍＭ
（ヌ）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）；終濃度１０ｍＭ以上、好ましくは２０〜２００ｍＭ。
【００５６】
上記の混合溶液を用いることにより、生物発光反応におけるＡＴＰの消費により生じたＡＭＰから、ＡＴＰが再生されるので、発光量および発光時間が増大する。その反応式は以下の通りである。
【００５７】
【化５】
0003599979.tif 000006
【００５８】
なお、上記の混合溶液において、硫酸アンモニウム、ジチオスレイト−ル、ＥＤＴＡ、ＨＥＰＥＳは、溶液の安定性や緩衝能の向上のために添加することが好ましい物質である。そのような物質としては、ウシ血清アルブミン、シュークロース等が使用できる。
【００５９】
本発明において、微生物中の生体成分であるサイクリックＡＭＰからＡＴＰを生成させる場合は、上記混合溶液にサイクリック３′，５′−ヌクレオチドホスホジエステラ−ゼ（０．０１Ｕ／ｍｌ以上。好ましくは０．０２〜１０Ｕ／ｍｌ。）を添加すればよい。
【００６０】
なお、ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬には、ＡＴＰ分解酵素であるアデノシンリン酸デアミナーゼを添加してもよい。上記試薬中にＡＴＰが混入している場合は、アデノシンリン酸デアミナーゼの添加により、試薬中のＡＴＰが消去される。その場合、ＡＴＰ抽出剤中にコホルマイシンを添加しておくことが好ましい。こうすることにより、濾過膜上に上記試薬を加えた場合に、微生物由来のＡＴＰの分解が防止できる。
【００６１】
上記のＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬の混合溶液にアデノシンリン酸デアミナーゼを添加する場合は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．０５〜１０Ｕ／ｍｌとなるように添加すればよい。
８．発光量の測定
濾過膜上に生じる発光を測定することにより、検体液中の微生物の有無の判定、あるいは生菌数の測定が可能となる。
濾過膜上に生じる発光の発光量は、ルミノメーター、例えばアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（改良型）により測定することができる。また、生物発光画像解析システム装置、例えばＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ〔テーパーファイバー付：浜松ホトニック（株）社製〕を用いて濾過膜上の輝点を撮像することにより、生菌数を測定することも可能である。
【００６２】
【実施例】
以下、実施例で本発明を説明する。実施例では、本発明の試薬として、ＰＰＤＫ発光試薬（ＡＴＰ変換反応試薬と生物発光試薬の混合試薬）を使用した。また、従来法の試薬として、ＨＳＬＵ（ＡＴＰ変換反応試薬を含まない生物発光試薬）を使用した。
【００６３】
0003599979.tif 000007
２．酵素活性の測定法
実施例において使用する酵素の活性測定法を以下に示す。
（１）ＰＰＤＫ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｒｏｓｅａ  ＩＦＯ１４０４７由来）
３ｍＭ  硫酸マグネシウム、２５ｍＭ  硫酸アンモニウム、２ｍＭ  ２メルカプトエタノ−ル、２ｍＭ  ピロリン酸、２ｍＭ  ホスホエノ−ルピルビン酸及び０．１ｍＭ  ＡＭＰを含む５０ｍＭ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＰＲＯＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ６．８）１８０μｌをマイクロチュ−ブにとり、温度平衡を３７℃に到達させた後、適当な活性を有する酵素溶液２０μｌを加え、１５分間反応させ、沸騰水中で３分間煮沸し反応を止める。この反応液を適当に希釈したもの５０μｌを試験管にとり、そこに「ルシフェ−ルＬＵ」（キッコ−マン社製）溶液を５０μｌ滴下し、発光量を測定する。別に予め既知濃度のＡＴＰ標準溶液を用いて、その発光量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃で１分間当たりに生成されるＡＴＰのμｍｏｌを計算し、この数値を使用酵素液中の活性単位とする。なお、３７℃で１分当たりに１μｍｏｌのＡＴＰを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
（２）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来）
活性の測定法；１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）（ｐＨ５．０）にＡＴＰを８０μＭとなるように溶解したものを基質溶液とする。基質液３ｍｌに酵素溶液液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間反応した後に６０％過塩素酸１００μｌを添加して、反応を停止し、２６５ｎｍの吸光度ＯＤを測定する。ＯＤ値が１分間当り２．４変化する酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。
（３）アピラ−ゼ  ｇｒａｄｅ  ＶＩＩＩ（ｆｒｏｍ  ｐｏｔａｔｏ）（シグマ社）
ｐＨ６．５、３０℃において、ＡＴＰから１分間当り１．０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。
【００６４】
〔実施例１〕
サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８）をＹＭ培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％モルトエキス、ｐＨ６．０）を用いて一晩培養を行った後、培養液を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で希釈して適宜、検体液とした。
【００６５】
濾過膜である日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メンブレンフィルター（０．４５μｍ疎水性格子入り、直径４７ｍｍ）を装着した濾過器に５ｍｌの超純水を加え、さらに上記検体液０．１ｍｌを加えてから吸引濾過した。さらに超純水１０ｍｌを用いて２回洗浄した後、ＡＴＰ消去剤（アデノシンリン酸デアミナーゼ０．５Ｕ／ｍｌ）５ｍｌにメンブレンを１０分間浸漬した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ溶液（０．０１Ｕ／ｍｌ）５ｍｌでメンブレンを洗浄した後、ＡＴＰ抽出剤を松下電工製超音波式噴霧器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧し、次いでメンブレンを５０℃で乾燥させた。
【００６６】
メンブレン上にＰＰＤＫ発光試薬（もしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧し、浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ  ５０にて１０分間発光を蓄積させた。次いで画像処理を行い、テレビモニター上で閾値以上の輝点のみを撮像し、輝点数を生菌数とした。検体液の濾過から、生菌数の測定までに要した時間は、３０分程度であった。
【００６７】
一方、比較実験として、寒天平板法を実施した。すなわち、上記の検体液をＹＭ寒天培地により３５℃で４８時間培養し、生成したコロニ−数を測定してＣＦＵ（コロニーフォーミングユニット）を求め、ＣＦＵを生菌数とした。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0003599979.tif 000008
【００６９】
本発明の測定法を用いることにより、寒天平板法と同様の結果が、ごく短時間で得られることがわかる。
〔実施例２〕
サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８）をＹＭ培地を用いて一晩培養を行った後、培養液を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で適宜、希釈した。次いで、希釈液を市販缶ビール１００ｍｌに添加し、これを検体液とした。
【００７０】
検体液を日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メンブレンフィルター（０．４５μｍ疎水性格子入り、直径４７ｍｍ）を装着した濾過器にて吸引濾過した。
【００７１】
メンブレンを超純水１００ｍｌにて洗浄した後、該メンブレンを、ＡＴＰ消去剤（アデノシンリン酸デアミナーゼ０．５Ｕ／ｍｌ、アピラーゼ０．５Ｕ／ｍｌ）５ｍｌに１０分間浸漬した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ０．０１Ｕ／ｍｌ溶液５ｍｌでメンブレンを洗浄した後、ＡＴＰ抽出剤を松下電工製超音波式噴霧器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧した。
【００７２】
メンブレンを５０℃で乾燥させた後、ＰＰＤＫ発光試薬（もしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧した。浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ  ５０にて１０分間発光を蓄積させてメンブレン上の発光を測定した後、画像処理を行いテレビモニター上に閾値以上の輝点のみを撮像し微生物数を測定した。検体液の濾過から、生菌数の測定までに要した時間は、３０分程度であった。
【００７３】
一方、比較実験として同じ検体液をＹＭ寒天培地により３５℃で４８時間培養して生成したコロニ−数を測定し、ＣＦＵ（コロニーフォーミングユニット）を求めた。結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
0003599979.tif 000009
【００７５】
本発明の測定法を用いることにより、寒天平板法と同様の結果が、ごく短時間で得られることがわかる。
【００７６】
〔実施例３〕
サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８）をＹＭ培地を用いて一晩培養を行った後、培養液の一部を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で適宜、希釈し、これを検体液とした。
【００７７】
日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メンブレンフィルター（０．４５μｍ疎水性格子入り、直径４７ｍｍ）を装着した濾過器に１０ｍｌの超純水を加え、さらに上記検体液０．１ｍｌを加えてから吸引濾過した。メンブレンを超純水１０ｍｌを用いて２回洗浄した後、該メンブレンをアデノシンリン酸デアミナーゼ０．５Ｕ／ｍｌにて１０分間処理した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ０．０１Ｕ／ｍｌにて洗浄した後、ＡＴＰ抽出剤を松下電工製超音波式噴霧器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧した。
【００７８】
メンブレンを５０℃で乾燥させた後、ＰＰＤＫ発光試薬（もしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧し、浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ  ５０にて１０分間発光を蓄積させて発光量を測定した。
【００７９】
一方、比較実験として、同じ検体液をＹＭ寒天培地により３５℃で４８時間培養して生菌数を測定した。結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
0003599979.tif 000010
【００８１】
本発明の方法を使用することにより、従来法に比べて発光量が大幅に増大したことがわかる。
〔実施例４〕
実施例３で発光量を測定したメンブレンを、発光反応開始から５分後に、再度浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ  ５０にて１０分間発光を蓄積させて発光量を測定した。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
0003599979.tif 000011
【００８３】
本発明の方法を使用することにより、発光時間が大幅に増大したことがわかる。
〔実施例５〕    大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２）を標準培地（酵母エキス０．２５％、トリプトン０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ７．１）を用いて一晩培養を行った後、培養液の一部を１０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）で適宜、希釈し、これを検体液とした。
日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メンブレンフィルター（０．４５μｍ、疎水性格子入り、直径４７ｍｍ）を装着した濾過器に１０ｍｌの超純水を加え、さらに上記検体液０．１ｍｌを加えてから吸引濾過した。メンブレンを、超純水１０ｍｌにより２回洗浄した後、アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ各０．５Ｕ／ｍｌにてメンブレンを１０分間処理した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ０．０１Ｕ／ｍｌにて洗浄した後に風乾し、次いでＡＴＰ抽出剤を松下電工製超音波式吸入器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧した。
メンブレンを風乾したのちに、ＰＰＤＫ発光試薬（もしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧し、浜松ホトニクス（株）製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬのテーパーファイバー入力式のものを用いて、１０分間の発光を累積させた後、出現した輝点の数を計測し、これを生菌数とした。なお、検体液の濾過から、生菌数の測定までに要した時間は、３０分程度であった。
また同じ検体を標準寒天培地（酵母エキス０．２５％、トリプトン０．５％、グルコース０．１％、寒天１．５％、ｐＨ７．１）にて３５℃で４８時間培養し、ＣＦＵを測定した。結果を表５に示す。
【表５】
0003599979.tif 000012
サッカロミセス  セレビシエ等の酵母を測定する場合と同様、大腸菌の測定においても、寒天平板法と同様の結果が、ごく短時間で得られた。一方、従来法での輝点数は０であった。酵母と比べると、大腸菌の細胞内ＡＴＰが少ないため、従来法では輝点が測定されなかったと考えられる。
本発明は、酵母のみならず、細菌の測定法としても好適に使用できることがわかる。
〔実施例６〕
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２）を標準培地（酵母エキス０．２５％、トリプトン０．５％、グルコース０．１％、ｐＨ７．１）を用いて一晩培養を行った後、培養液の一部を１０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）で適宜、希釈し、これを検体液とした。
あらかじめ少量のエタノールに浸漬後、水で充分に洗浄した疎水性ＰＶＤＦ膜（ＨＶＨＰ、直径４７ｍｍ、日本ミリポア社製）を装着した濾過器に１０ｍｌの超純水を加え、上記検体液０．１ｍｌを添加してから吸引濾過した。さらに超純水１０ｍｌにて２回洗浄したのち、アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ各０．５Ｕ／ｍｌにてメンブレンを１０分間処理した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ０．０１Ｕ／ｍｌにて洗浄した後に風乾し、ＡＴＰ抽出試薬を松下電工製超音波式吸入器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧した。
メンブレンを風乾したのちに、発光試薬（ＰＰＤＫもしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧した後に浜松ホトニクス（株）製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬのテーパーファイバー入力式のものを用いて、１０分間の発光を累積させた後、出現した輝点の数を計測し、これを生菌数とした。なお、検体液の濾過から、生菌数の測定までに要した時間は、３０分程度であった。
また同じ検体を標準寒天培地（酵母エキス０．２５％、トリプトン０．５％、グルコース０．１％、寒天１．５％、ｐＨ７．１）にて３５℃で４８時間培養して数を測定した。結果を表６に示す。
【表６】
0003599979.tif 000013
疎水性膜を使用した場合でも、寒天平板法と同様の結果が、ごく短時間で得られた。本発明は、酵母のみならず、細菌の測定法としても好適に使用できることがわかる。
〔実施例７〕
乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＩＦＯ  ３３４５）をＤＩＦＣＯ社製ＭＲＳ培地を用いて２晩培養を行った後、培養液の一部を１０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）で適宜、希釈した。次いで、希釈液を市販缶ビール３００ｍｌに添加し、これを検体液とした。
日本ミリポア社製ＲＭＤ特殊メンブレンフィルター（０．４５μｍ、疎水性格子入り、直径４７ｍｍ）を装着した濾過器で上記件体液を吸引濾過した。さらに超純水１０ｍｌにて４回洗浄したのち、アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼ各０．５Ｕ／ｍｌにてメンブレンを１０分間処理した。さらにアデノシンリン酸デアミナーゼ０．０１Ｕ／ｍｌにて洗浄した後に、ＡＴＰ抽出試薬を松下電工製超音波式吸入器（ＥＷ６２２）にて１０秒間噴霧した。
メンブレンを風乾したのちに、発光試薬（ＰＰＤＫもしくはＨＳＬＵ）を１０秒間噴霧した後に、浜松ホトニクス（株）製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬのテーパーファイバー入力式のものを用いて、１０分間の発光を累積させた後、出現した輝点の数を計測し、これを生菌数とした。なお、検体液の濾過から、生菌数の測定までに要した時間は、３０分程度であった。
また同じ検体を、寒天１．５％を含有するＭＲＳ培地にて３０℃で４８時間培養し、ＣＦＵを測定した。結果を表７に示す。
【表７】
0003599979.tif 000014
サッカロミセス  セレビシエ等の酵母を測定する場合と同様、乳酸菌の測定においても、寒天平板法と同様の結果が、ごく短時間で得られた。本発明は、酵母のみならず、細菌の測定法としても好適に使用できることがわかる。
【００８４】
【発明の効果】
従来法では、生物発光反応に関与する生体成分は主にＡＴＰであり、微生物中のＡＴＰが消費されてしまうと発光量は減衰していたが、本発明ではＡＴＰ変換反応を利用することにより、種々のアデノシンリン酸エステル（ＡＭＰ、ＡＤＰ、サイクリックＡＭＰ等）からＡＴＰが新たに生成され、かつ消費されたＡＴＰも再生される。その結果、発光量および発光時間が増大するので、迅速、簡便かつ高感度な微生物の測定が可能となる。