(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｍａｓａｋｕｒａ  Ｓｉｅｂ．）の個体の一部を分離した組織片である茎頂組織を有する植物外植片を液体培地で回転培養して多芽体を誘導する工程と、
誘導された多芽体を培地で培養して多芽体を構成する腋芽を増殖・伸長させる工程と、
増殖・伸長した多芽体を構成する腋芽を固体培地で培養して発根させ、馴化を行ない、サクラの植物体を作出する工程と、
から成るサクラの多芽体による増殖方法。
【請求項２】
多芽体を得るための茎頂組織を有する植物外植片として、休眠芽、新梢、新梢腋芽の内の何れかが用いられることを特徴とする請求項１に記載のサクラの多芽体による増殖方法。
【請求項３】
誘導された多芽体を増殖・伸長させる工程に移すことにより、多芽体を構成する腋芽を伸長させると同時に多芽体を増殖させることを特徴とする請求項１に記載のサクラの多芽体による増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はサクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｍａｓａｋｕｒａ  Ｓｉｅｂ．）の多芽体による増殖方法に係り、とくに植物組織培養技術を用いたサクラの大量増殖技術に関するものであって、大量増殖能を有するサクラの多芽体の誘導による増殖方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
サクラの増殖は、現在、実生、挿し木、接ぎ木の３つの方法によって行なわれている。実生による増殖方法は、サクラの場合に、自家不和合性が強い品種が多いために、得られた個体は雑種の可能性が高く、商業的な大量増殖の技術としては利用が困難である。また挿し木による増殖方法は、前年枝挿し、緑枝挿し等が挙げられるが、何れの方法においても活着が悪く、後の樹勢も弱い。
【０００３】
そのために商業的な大量増殖の方法として、接ぎ木による増殖方法が利用されている。この方法は、切り接ぎ、削り接ぎ等の枝接ぎ、芽接ぎ、根接ぎ、寄り接ぎ等が挙げられる。何れの方法においても熟練と労力とを要する。また穂木は台木の影響を受けて子細な変異を生ずる。また穂木・台木間には、親和性があるために、誤った台木を用いると、活着しないか、活着しても生育不良のために、枯死の危険性がある。従って有効な増殖技術ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これらの問題を解決する手段として、植物組織培養技術を用いた大量増殖の方法が考えられる。植物培養技術を用いて誘導・再生した個体は、自根を有するために効率的な大量増殖が可能である。またサクラの植物体外植片よりカルスを誘導増殖し、カルスから不定芽を誘導・作出し、それらを植物体に再生する方法は、マザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｌａｎｎｅｓｉａｎａ  Ｗｉｌｓ．）において、松田等［Ｊａｐａｎ  Ｊ．  Ｂｒｅｅｄ，ｖｌｏ．３３，Ｎｏ．４：４８４〜４８６（１９８３）］によって報告されているが、再分化率が非常に低く、増殖効率の点から、商業的な増殖技術には至っていない。
【０００５】
またサクラの休眠芽や新梢、新梢腋芽等の茎頂組織から直接植物体を再生させる方法は、酒谷および天野［奈良林試研報  Ｎｏ．１７：２１〜３１（１９８７）］、片野および入江［植物組織培養  コロキウム資料集  Ｎｏ．２：７４〜７５（１９９０）］、田鎖および石原［園芸学会要旨  東北支部  昭６２：８１〜８２（１９８７）］等によって報告されている。何れも増殖率が低く、少量の外植片から多数の再生個体を得る大量増殖技術は開発されていない。
【０００６】
上述のように、組織培養によるサクラ植物体の大量増殖技術は、商業的に適用可能な技術には至っておらず、技術の開発が望まれている。本発明は、サクラの多芽体を誘導・増殖させることによる商業的なサクラの大量増殖技術の開発を目的とするものである。
【０００７】
本発明でいう多芽体とは、非常に短縮した状態の腋芽の集合体である。すなわち個々の腋芽は芽としての機能が備わっているために、容易に苗化させることができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段とその作用】
本願発明者等は、商業的なサクラの大量増殖技術の開発を目的として、使用する培地組成および培養工程について研究を行なった結果、多芽体によるサクラの商業的な大量増殖方法を見出した。
【０００９】
すなわち本発明によるサクラの植物体の作成方法は、液体培地で回転培養して多芽体を誘導するとともに、この多芽体をさらに別の培地で培養して増殖・伸長させる工程とを含むものである。ここで回転培養に用いられる液体培地は、無機塩類、炭素源、ビタミン類、オーキシンおよび／またはサイトカイニンを含む液体培地である。また増殖・伸長させる別の培地は、無機塩類、炭素源、ビタミン類を含む固体培地または液体培地である。
【００１０】
本発明によるサクラ植物体の作成は、まずサクラの外植片を液体培地で回転培養し、多芽体を得、この多芽体をさらに別の培地で培養することにより増殖させ、さらに発根させることによりサクラ植物体を得るものである。以下の説明において、多芽体を得るための液体培地を「誘導培地」とし、多芽体を増殖させるための培地を「増殖培地」とし、また多芽体を構成する腋芽を発根させてサクラの植物体を得るための培地を「苗化培地」とそれぞれ言うことにする。
【００１１】
サクラ外植片
多芽体を得るための外植片としては、茎頂組織を有するものであればよく、本願発明に使用し得るサクラ外植片としては、休眠芽、新梢、新梢腋芽等を例示することができる。
【００１２】
多芽体の誘導工程
多芽体をサクラ外植片から誘導するための誘導培地は、無機塩類、炭素源、ビタミン類、オーキシンおよびサイトカイニンを含むものである。なお場合によってはオーキシンを含まず、サイトカイニン単独でも誘導できることがある。
【００１３】
このような液体培地として、具体的には、従来から植物の組織培養に用いられる基本培地、例えば、Ｂ−５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら：Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，５０：１５１〜１５８，１９６８）、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ：Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５：４７３〜４９７，１９６２）、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｒ  ＆  Ｓｋｏｏｇ：Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，（Ｃｐｈ．），１８：１００〜１２７，１９６５）、Ｗｈｉｔｅ培地（Ｗｈｉｔｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｒｏｎａｌｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９６３）、Ｎ−Ｎ培地（Ｎｉｔｃｈ  ＆  Ｎｉｔｃｈ：Ｐｌａｎｔａ，７２：３５５〜３７０，１９６７）、ＷＰＭ培地（Ｌｏｙｄら：Ｐｒｏｃ．Ｉｎｃ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ，Ｐｒｏｐ．，Ｓｏｃ．，３０：４２１〜４２７，１９８１）等が挙げられ、さらにオーキシンおよびサイトカイニンを添加して調製される液体培地であってもよい。
【００１４】
培地の炭素源としては、単糖類としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、二糖類としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等を例示することができる。
【００１５】
炭素源濃度は５〜５０ｇ／ｌの範囲が好ましい。オーキシンとしては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−Ｄ、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、ピクロラム等を例示することができ、サイトカイニンとしては、ベンジルアデニン（ＢＡ）、４ージフェニルウレア（４ＰＵ）、イソペンテニルアデニン（２ｉｐ）、ゼアチン、カイネチン等を例示することができ、オーキシンおよびサイトカイニンを組合わせて、またはオーキシンおよびサイトカイニンを単独で使用することができる。例えばオーキシンを０．００１〜２．０ｍｇ／ｌ、サイトカイニンを０．００１〜１０ｍｇ／ｌ単独で、または組合わせて添加することが好ましい。またジベレリン生合成阻害剤を上記誘導培地に添加することにより、多芽体の誘導率が向上する場合がある。ジベレリン生合成阻害剤としては、アンミドール等を例示することができる。培地のｐＨは、５．０〜６．０に調製されたものが好ましい。
【００１６】
上記のように調製された培地は、オートクレーブ等により高温加圧滅菌処理を行なって使用される。
【００１７】
次に外植片から多芽体を誘導するための具体的な培養条件を以下に記す。上述した誘導培地をまず調製し、無菌の、または無菌化した外植片を置床する。外植片の無菌化は、エチルアルコール水溶液、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を用いて常法により実施できる。外植片を置床後に、２０〜３０℃の温度の下で１〜５ｒｐｍで垂直回転培養を行なうことにより、外植片から多芽体が形成される。この工程では５００〜３００００ｌｕｘ、１８〜２４時間日長下で良好な結果が得られる。
【００１８】
なお回転培養は、本願発明においてとくに特定されるものではないが、本願発明では、例えばＨＳＫ−ＲＢ（株式会社広島設備開発製）等の装置によって行なわれてよい。
【００１９】
多芽体の増殖工程
上記工程で得られた多芽体は、下記の増殖培地で培養することによって、多芽体を構成する短縮した腋芽を増殖させることができる。
【００２０】
増殖培地は無機塩類および炭素源、ビタミン類を必須成分とし、培地固化剤を添加したものであってよく、また液体培地であってもよい。具体的には上述のＢ−５培地、ＭＳ培地等を例示することができる。培地の炭素源としては、誘導培地と同様のものを例示することができる。培地固化剤としては、寒天、ゲルライト等を例示することができ、例えば寒天の場合には６〜１５ｇ／ｌの量を用いることが好ましい。
【００２１】
また上記の増殖培地に、オーキシン、サイトカイニン等を単独または組合わせて添加することにより、より好ましい結果が得られる。オーキシンとしては、多芽体誘導培地に示したものを例示することができ、例えば０．０５〜２．０ｍｇ／ｌの濃度が好ましい。サイトカイニンとしては、ベンジルアデニン等を例示でき、例えばベンジルアデニンの場合には０．０１ｇ／ｌ以上でとくに有効である。
【００２２】
多芽体増殖工程は、前記工程で得られた多芽体を上述した多芽体増殖培地に移し、２０〜３０℃、５００〜１００００ｌｕｘ、８〜１６時間日長下で４〜２４週間静置培養することによって成し得られる。
【００２３】
苗化工程
上述の多芽体誘導工程および／または増殖工程で得られた多芽体は、下記の苗化培地で培養することによって、サクラ植物体を得ることができる。
【００２４】
苗化培地は、無機塩類および炭素源、ビタミン類を必要成分とし、培地固化剤を添加したものである。具体的には、上述のＢ−５培地、ＭＳ培地等を例示することができる。培地の炭素源としては、誘導培地と同様のものを例示することができる。また培地の固化剤としては、増殖培地で用いたものと同様のものを例示することができる。
【００２５】
また上記の苗化培地に、オーキシンを添加することによって、より好ましい結果が得られる。オーキシンとしては、誘導培地に示したものを例示することができ、例えばＩＢＡの場合には、０．０５〜２．０ｍｇ／ｌの濃度が好ましい。
【００２６】
上述の苗化培地に多芽体の腋芽を置床し、２０〜３０℃、５００〜１００００ｌｕｘ、８〜１６時間日長下で静置培養することにより、発根を伴った植物体を得ることができ、さらに土壌への馴化、鉢上げを行なうことにより、サクラ植物体を作出することができる。
【００２７】
馴化の土壌としては、パーミキュライト、ピートモス、パーライト、桐生砂、鹿沼土、水ゴケ等を例示することができる。本発明により作出されたサクラ植物体は、茎頂組織から直接誘導されたものであって、脱分化を伴っていないクローン植物であり、形態および染色体数の観察の結果、変異が見られなかった。
【００２８】
【実施例】
実施例１
〈材料および方法〉
サクラ品種センダイヤ（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｍａｓａｋｕｒａ  Ｓｉｅｂ．  ｃｖ．  ｓｅｎｄａｉｙａ，ｃｖ．ｎｏｖ．）の側枝休眠芽を一芽一節に調製し、７０％エタノール水溶液および次亜塩素酸ナトリウム水溶液により表面殺菌し、滅菌水によって洗浄後、顕微鏡下で茎頂組織を摘出し、外植片とした。外植片を多芽体誘導培地に２５ｍｌ培地当り１片を置床し、７００〜１００００ｌｕｘ、２４時間日長下で、直径が１ｍ、２ｒｐｍの回転培養装置ＨＳＫ−ＲＢ（株式会社広島設備開発製）で垂直回転培養を行なった。
【００２９】
ここで用いた誘導培地とは、２％シュクメロース、０．００５〜０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡ．０．１〜５．０ｍｇ／ｌＢＡを含むＢ−５液体培地である。
【００３０】
〈増殖培地〉
２〜３％シュクロース、０．１ｍｇ／ｌＩＢＡ、０．１〜１．０ｍｇ／ｌＢＡを含むＢ−５およびＭＳ寒天培地（寒天１０ｇ／ｌ）である。
【００３１】
〈苗化培地〉
３％シュクロース、０．０５〜０．１ｍｇ／ｌＩＢＡを含むＭＳ寒天培地（寒天１０ｇ／ｌ）である。
【００３２】
〈結果〉
約４週間後から多芽体の誘導が見られた。培養開始約１２週間後に計数したところ、１外植片につき２０〜５０個の腋芽から成る多芽体が誘導された。さらに得られた多芽体を上記の増殖培地に置床したところ、継続的に増殖を続け、約２４週間後に多芽体の腋芽数が３０〜４０倍に増殖した。増殖した腋芽から、増殖培地上で２０〜５０ｍｍの発根を伴わない幼植物体が形成された。得られた腋芽を苗化培地に置床したところ、約４週間後に増殖した腋芽の約３０〜４０％に発根が見られた。発根した腋芽は、根に付着した寒天を洗い流し、バーミキュライト、ピートモス、パーライト等の用土へ馴化し、活着後、腐葉土、川砂等を混合した普通の畑土に鉢上げを行ない、植物体を得た。得られた植物体について調査を行なったところ、形態的な変異等は観察されなかった。
【００３３】
実施例２
〈材料および方法〉
誘導培地に添加するＮＡＡ（オーキシン）濃度およびＢＡ（サイトカイニン）濃度を種々に変えて多芽体の誘導率をセンダイヤについて観察した。なおそれ以外の条件は上記実施例１と同様である。
【００３４】
実施例１と同様の方法で外植片を調製し、２％のシュクロース、０，０００５，０．０１，０．０２，０．０４，０．０５，０．１ｍｇ／ｌＮＡＡと０．００２，０．１，０．２，１．０，２．０，４．０，６．０ｍｇ／ｌＢＡを組合わせて添加したＢ−５液体培地に２５ｍｌ培地当り外植片１片を置床した。培養条件は約７００〜１００００ｌｕｘ、２４時間日長下であって、直径が１ｍの装置で回転数が２ｒｐｍの垂直回転培養を行なった。
【００３５】
〈結果〉
培養１２週間後に、０．００５〜０．０４ｍｇ／ｌのＮＡＡと、０．２〜４．０ｍｇ／ｌのＢＡを組合わせて添加した培地において、多芽体が誘導された。誘導率は３０〜８０％で、とくに０．００５〜０．０２ｍｇ／ｌのＮＡＡと、１．０〜４．０ｍｇ／ｌのＢＡの組合わせがとくに好ましい結果をもたらした。
【００３６】
実施例３
苗化培地に添加するＩＢＡ濃度を２．０ｍｇ／ｌとし、腋芽を置床し、１週間後にＩＢＡを添加しないＭＳ寒天培地に移植してその発根率をセンダイヤについて観察した。なお苗化培地のＩＢＡ濃度以外については、上記実施例１と同様の条件とした。
【００３７】
〈結果〉
腋芽をＩＢＡを添加しないＭＳ寒天培地に移植して約１週間後から発根が見られた。移植４週間後に観察したところ、発根率は８０〜９０％に向上した。発根が見られた植物体について馴化を行なったところ、ほとんどの個体が活着し、植物体が得られた。
【００３８】
【発明の効果】
以上のように本発明は、サクラの個体の一部を分離した組織片である茎頂組織を有する植物外植片を液体培地で回転培養して多芽体を得、この多芽体をさらに別の培地で培養して増殖・伸長し、さらに固体培地において上記の増殖・伸長された多芽体を発根させ、馴化を行なうことによって植物体を得るようにしたものである。
【００３９】
従って本発明によれば、少量の茎頂組織を有する植物外植片から多数の再生個体を得る極めて増殖率の高いサクラの大量増殖が可能になる。