(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEMP1抗原に結合する抗体であって、抗体DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から選択される抗体と同等な結合性でSEMP1に結合する前記抗体。
【請求項２】
細胞株DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM ACC2460、DSM ACC2461、DSM ACC2462及びDSM ACC2463から成る群から選択される細胞株から得られる抗体。
【請求項３】
細胞株DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM ACC2460、DSM ACC2461、DSM ACC2462及びDSM ACC2463。
【請求項４】
抗体DSM ACC2458、DSM ACC2459、DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から選択される抗体と同等な結合性でSEMP1に結合する抗体を生産する方法であって、ヒトを除く、ある哺乳動物種にSEMP1の核酸を免疫接種し、そして次に
SEMP1ポリペプチドを免疫接種すること、及びその動物の細胞又は体液から前記抗体を単離することを特徴とする、前記方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抗体を0.1〜500 mg/mlの量でpH5.0〜7.0で含有する組成物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の抗体を含有する組成物の調製方法であって、その組成物中の抗体の濃度が0.1〜500 mg/mlであり、その組成物のpHが5.0〜7.0である様に、前記抗体の水溶液を緩衝水溶液と混合する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの密着結合タンパク質SEMP1に対する抗体、その製法、並びに診断及び治療におけるその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インビボでは哺乳動物細胞の細胞外環境が、細胞接着及び細胞増殖の制御を介して、腫瘍発生性でない正常な細胞活動を規定している。これらの主要な制御要因の損失が、腫瘍発生の顕著な特徴である。
【０００３】
最近、オクルディン(occludin)、及びクローディン(claudin)ファミリータンパク質が、細胞接着複合体である密着結合の主要な構成成分として同定された。マウスのclaudin-1は、明らかに、上皮細胞における主要な密着結合タンパク質を構成する(Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-401)。最近、ヒト相同体であるSEMP1 (老化関連上皮膜タンパク質, Swiss Prot. Acc. No. 095832, ヒトCLD1)が、分子遺伝学的解析により同定された(Swisshelm, K.A., et al., Gene 226 (1999) 285-295)。
【０００４】
細胞間接着としての密着結合、及びその密着性タンパク質が、腫瘍発生に関与するらしいことを示す多くの証拠が報告されている(Porvaznik, M., et al., J.Supramol. Struct. 10 (1979) 13-30; Swift, J.G., et al., J. Submicrosc. Cytol. 15 (1983) 799-810; Chochand-Prillet, B., et al., Ultrastruct. Pathol. 22 (1998) 413-420; Solar, A.P. et al., Carcinogenesis 20 (1999) 1425-1431; Woo, P.L., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 32818-32828)。更に最近、SEMP1の発現が上皮性の細胞及び組織に独占的であること、しかしその発現はヒト乳ガン腫瘍細胞においてインビトロでは減少調節されているか、又は完全に失われていることも報告されている(Swisshelm, K.A., et al., Gene 226 (1999) 285-295)。
【０００５】
腫瘍発生及び／又は腫瘍進行の診断評価、あるいはインビボ又はエキソビボでの治療行為において、密着結合タンパク質又はその関連タンパク質の欠失又は発現を検査するために、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が必要である。occludinを認識する抗体の作製及び適用が、インビトロで成功している(Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-401)。しかし、ヒトSEMP1又はそのマウス相同体claudin-1に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の作製は、非常に困難であった。マウスclaudin-1に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を作製できなっかったことも報告されている(Furuse, M., et al., J. Cell Biol.141 (1998) 1539-1550)。
【０００６】
極最近、マウスclaudin-1タンパク質のＣ末端細胞内ドメインに対するポリクローナル抗体がウサギで作成された。これは、その他の関連する内在性タンパク質とは交差しないものである(clone MH25, Zymed Loboratories Inc., 458 Carlton Court, South San Francisco, CA94080, Catalog No.71-7800, http://www.zymed.com/products/71-7800.html)。またマウスclaudin-1のＣ末端ドメインに対するモノクローナル抗体がラットで作製された(Furuse, M., et al., J. CellBiol. 147 (1999) 891-903)。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、抗体DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から選択される抗体と同等の結合性でSEMP1(ヒトCLD-1)ポリペプチドに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。
本発明の抗体は、マウスclaudin-1のＣ末端細胞内ドメインに対して、無視できないほどに結合することはない。
【０００８】
免疫化のためにSEMP1ポリペプチド断片を用いて抗SEMP1抗体を作製することはできなかったが、驚くことに、DNA免疫接種により、好ましくはSEMP1ポリペプチドの増強免疫接種（ブースト）の追加により、SEMP1特異的抗体を作製することが可能であることが分かった。本発明の方法によれば、SEMP1の全ての部分に対する抗体、特に細胞外ドメインに対する抗体を容易に提供することが可能である。後者の抗体は、SEMP1を介したシグナル伝達の調節に有用である。
【０００９】
DNAの免疫接種は、現在の技術により可能である。DNAの免疫接種というアイデアは、裸のプラスミドDNAをマウス筋肉に注射することにより、筋繊維へのトランスフェクションを介してトランス遺伝子の発現が起こり、その結果細胞毒性Ｔ細胞(CTL)と抗体応答の両方が誘導されたという事実に由来する(Barry, M.A., et al., Biotechniques 16 (1994) 616-618 and 620; Davis, H.L., et al., Hum. Mol. Genet. 2 (1993) 1847-1851; Davis, H.L., et al., Vaccine 12 (1994)1503-1509; Davis, H.L., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997) 635-646; Lowrie, D.B., Nat. Med. 4 (1998) 147-148; Ulivieri, C., et al., J. Biotechnol. 51 (1996) 191-194)。
【００１０】
DNAの免疫接種に用いる構成体は、レポーター遺伝子又は治療用遺伝子の供給に用いるものと同じである。基本的に、確立されている真核細胞用発現ベクターのいずれかを用い得る。ほとんどのDNA免疫接種用ベクターは、多様な宿主細胞内でトランス遺伝子を高レベルで発現させるために、強力なウイルス性プロモーター／エンハンサー配列を含んで成る。また、発現したRNAを停止させるために、ポリアデニル化配列も必要である。
【００１１】
用語「無視できないほどに結合することはない」とは、従来技術として周知である慣習的な結合検出方法によって抗体結合を検出できないことを意味する。慣習的には、免疫沈降法を用いて抗体結合を調べる。免疫沈降における誤差の通常の限界（すなわち「無視できないほどに結合することはない」という意味における限界）は約５％以下である。
【００１２】
用語「マウスclaudin-1のＣ末端」とは、そのＣ末端の細胞内ドメイン又はその一部分を意味する。このドメインは、配列番号４のアミノ酸185から211までである。
【００１３】
用語「抗体」は、抗体遺伝子により実質的にコードされる１又は複数のポリペプチドから成るタンパク質を指す。認知されている抗体遺伝子には、種々の定常領域遺伝子及び無数の可変領域遺伝子がある。種々の形態で抗体が存在し、それらには、例えばFv、Fab及びF(ab)2、更に単一鎖が含くまれる(Houston et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd ed. (1984); Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。
【００１４】
ヒトのFc受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物により生産された抗体が、特に有用である(WO 99/00010)。なぜならその様な抗体は、ヒト抗体と非常に似ているからである。本発明の好ましい抗体は、SEMP1抗原との相互作用に関して、抗体DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461及びDSM ACC2463から成る群から選択される抗体と同じ特性を有するモノクローナル抗体及びその断片である。
別のグループの抗体(DSM2460及びDSM2462)は、SEMP1の細胞内ドメイン(エピトープ2(IC2)、図４参照)に対するものである。
【００１５】
当該抗体は、好ましくは、少なくとも２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドを含んで成る。その各々の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、抗原と相互作用する結合ドメインを有する可変領域（一般的には当該ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を包含する。また、その各々の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、当該ポリペプチド鎖の定常領域（一般的にはカルボキシ末端）をも包含する。この領域は、抗体と、宿主の組織又は因子、例えば免疫系の種々の細胞、貪食細胞、及び古典的な補体系の第一成分(C1q)との結合を仲介し得る部分である。
【００１６】
典型的には、軽鎖及び重鎖ポリペプチドは完全な鎖であり、その各々は、可変領域と完全な定常領域とから本質的に成る。本発明の抗体の可変領域を、別のイソタイプの定常領域に移植することができる。例えば、イソタイプγ１の重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを、別の重鎖のクラス（又はサブクラス）の定常領域をコードするポリヌクレオチドに移植することができる。
【００１７】
更に一般的には、抗原結合を実質的に抑制することなく、場合により、人間に注射した場合に抗体の抗原性を実質的に増加させることなく、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対して１乃至数個のアミノ酸置換、特に保存的なアミノ酸置換を行うことができる。場合により、１乃至数個のアミノ酸の欠失又は付加を行うことができる。典型的には、定常領域又は可変領域、枠組み構造配列、及び相補性決定領域(CDR)に対してアミノ酸の置換、付加又は欠失を行う。
【００１８】
保存的アミノ酸置換は、類似の特性を有するアミノ酸によるアミノ酸置換である（例えば酸性特性を有するアミノ酸：Asp又はGlu)。保存的アミノ酸置換により、親配列による構造特性が実質的に変化しないことが必要である。その様なポリペプチド構造の例が、Protein, Structure and Molecular Principles, Creighton(editor), W.H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction toProtein Structure, C. Brandon and J. Tooze, Garland Publishing, New York (1981); Thornton, J.M., et al., Nature 354 (1991) 105-106に記載されている。
【００１９】
例えば、１又は複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が、天然配列（好ましくは、抗原に直接に接触しないポリペプチドの一部分）において行われ得る。
本発明の抗体及び方法の範囲内で、同等な結合性でSEMP1に相互作用する多数の別の抗体を見出すことが可能である。その様な抗体は、寄託した抗体と同等な結合性でSEMP1抗原に結合し得る。
【００２０】
用語「同等な結合性で結合する抗体」とは、注目する抗体によりエピトープの重複が検出される抗体を意味する。このエピトープの重複を、競合検査系を利用して検出することができる。この目的のために、例えば酵素免疫検査を利用して、固定化したSEMP1抗原との結合に関して、ある抗体が既知の抗体と競合する程度を検査する。
【００２１】
前記の目的のために、適当に固定化した抗原（例えば、その表面にSEMP1を発現している細胞）を、前記の１つの寄託抗体に由来する標識抗体と、過剰量の注目する抗体と共にインキュベーションする。結合した標識を検出することにより、注目する抗体の結合が前記の標識抗体の結合を置換する程度を容易に確認することができる。その標識抗体に比べて、注目する抗体の濃度が同一である場合、又はより高い場合、好ましくは105倍過剰である場合に、前記の置換が少なくとも20％、好ましくは少なくとも50％であるならば、エピトープの重複が存在する。
【００２２】
当該抗体は、それが適当な様式でSEMP1に結合する限り、完全なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、それらの断片(例えばFv, (Fv)2, Fab, Fab', F(ab)2)、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってよい。CDR領域のみ又は、CD30への特異的結合能を付与するその一部分のみを有する短鎖の抗体断片もまた、特にその抗体が標識される場合には、適する。イソタイプIgG1の抗体が好ましい。
【００２３】
モノクローナル抗体の作成に関して、E. Harlow and D. Lane, Antibodies: ALoboratoryManual, Cold Spring Harbor Press (1988); Bessler, W.G., et al., Immunobiol. 170 (1985) 239-244; Jung, G., et al., Angewandte Chemie 97 (1985) 883-885; Cianfriglia, M., et al., Hybridoma 2 (1993) 451-457を参照すること。
【００２４】
また本発明は、SEMP1抗原、好ましくは図４に示すペプチド１〜37、より好ましくはペプチド５、21、29、30及び37に結合する抗体を生産する方法を提供する。この方法では、ある哺乳動物種に、SEMP1の読み枠をコードするプラスミドDNA(SEMP1の核酸)を免疫接種し、次にSEMP1ポリペプチドを免疫接種し、その後抗SEMP1抗体生産Ｂ細胞を単離し、それをミエローマ細胞株と融合させ、その融合細胞株を単離し、SEMP1に対する抗体活性を検査し、SEMP1に結合する抗体を生産する細胞株を単離し、その細胞株からモノクローナル抗体(Mab)を生産させ、それを、好ましくは実質的に純粋になるまで、単離する。
【００２５】
この免疫接種では、好ましくは、約３〜５ヶ月間にわたって一月毎にDNA接種を繰り返し、そしてＢ細胞の単離前約３日間毎日SEMP1ポリペプチドを、増強のために接種する。本発明の方法により、SEMP1ポリペプチド内の全ての免疫原性の領域又はドメインに対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を生産することが可能である。
【００２６】
その様なDNA免疫接種を行った後、当業界に周知の通りに、好ましくはHarlow E. and Lane D., "Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988)に記載の方法に従ってポリクローナル抗体(Pab)が回収される。
【００２７】
また本発明は、本発明の抗体の結合特異性を保持し、その抗原結合にとって重要でない領域内が修飾されている、本発明の抗体の誘導体を提供する。当該抗体誘導体を、本発明の抗体から、１又は複数の定常ドメインの交換及び／又は他の分子との連結により得ることができる。
【００２８】
従って例えば、イソタイプを決定する定常ドメインの交換を行うことができ、例えば、IgMクラスの抗体を、その抗原特異性を維持しつつ、IgGクラスの抗体に転換することができる。このイソタイプの転換を、周知の細胞生物学的又は分子生物学的手法により行い得る(Rothman, P., et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 1672-1679)。
【００２９】
人体内における免疫原性を低下させたモノクローナル抗体を生産する方法が好ましく、その場合、SEMP1抗体の可変領域を、ヒト抗体の定常領域に連結する。
【００３０】
また本発明は、診断又は治療、例えば腫瘍治療、血管形成の制御、天然若しくは合成化合物又は細胞を適用するための脳血液関門の制御、炎症反応の制御、眼圧の制御などのための本発明の抗体の使用に関する。この場合、細胞株DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461及びDSM ACC2463により分泌される抗体から成る群から選択される抗体を用いることが好ましい。
【００３１】
本発明の方法により得られる好ましい抗体は、表面に結合しているSEMP1分子、好ましくはSEMP1の細胞外ドメインと結合するので、それらは、生理学的又は病態生理学的な密着結合の発現を定性的又は定量的に検出するために非常に適する。この検出は、周知の通り、免疫学的な測定方法、好ましくはELISA法により行われる。この種の方法は周知である。その場合、本発明の抗体を、標識化及び／又は固定化して、用いることができる。
【００３２】
その様な診断における免疫学的方法では、検出可能な標識を結合した少なくとも１つの本発明の抗体の結合の後にシグナル変化を評価する。
診断上のSEMP1の重要性は、好ましくは、内皮／上皮細胞層の損傷及び透過性の検出、腫瘍細胞の転移の開始及び／又は進行、並びに腫瘍発生の進行の同定にある。
【００３３】
また本発明は、ワクチンのアジュバント透過性を促進し、そしてガン、急性／慢性炎症疾患、心筋虚血、アテローム性硬化症、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、腸管感染の治療又は予防処置のための薬物に対する内皮／上皮組織の透過性を増加する方法を提供する。この場合、好ましくはSEMP1の細胞外ドメインに結合する本発明の１又は数個の抗体を、場合により通常の医薬用担体、アジュバント、充填剤又は添加剤と共に投与する。
【００３４】
治療投与中の免疫応答を予防するために、ヒト由来の抗体にできるだけ類似する抗体を用いることが好ましい(Glassy, M.C., and Dillman, R.O., Mol. Biother. 1 (1988) 7-13)。好ましくは、本発明の抗体のSEMP1結合配列の一部分又は全部が、ヒトの可変領域内の対応する配列により置換される様に、本発明の抗体の可変領域が更に修飾された抗体を用いる。その様な抗体は、例えば、キメラ抗体又はヒト化(CDR移植化)抗体である。
【００３５】
その様な抗体を、通常、齧歯類のモノクローナル抗体から製造する(Morrison,S.L., Annu. Rev. Immunol. 10 (1992) 239-265; Winter, G., and Milstein, C., Nature 349 (1991) 293-299)。特に好ましい本発明の態様では、腫瘍特異的なヒト抗体(Borrebaeck, C.A.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 3995-3999; Borrebaeck, C.A.K., Immunol. Today 9 (1988) 355-359)を治療のために用いる。更に、Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734などの記載通りに、ファージディスプレーライブラリーを介してヒトモノクローナル抗体を調製することが特に好ましい。
【００３６】
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor, New York及びBerger and Kimmel, Methods in Enzymology, Vol.152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), AcademicPress Inc., San Diego, CAの記載通りに、当業界に既知の方法により配列データに基づいて、本発明のSEMP1抗体を、組換え技術により調製することができる。本発明のポリヌクレオチドを、好ましくは、合成オリゴヌクレオチドから作製する。
【００３７】
その様な組換えポリペプチドを、当業界に既知の標準的な方法により、真核又は原核宿主細胞において発現させることができる。好ましくは哺乳動物細胞、例えばリンパ細胞株を宿主細胞として用いる。典型的には、そのためのポリヌクレオチド構成体は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域を含んで成る完全なヒト抗体の重鎖及び／又は完全なヒト抗体の軽鎖をコードする。
【００３８】
代替性のヒトの定常領域配列（重鎖及び／又は軽鎖）が、種々の参考資料から、例えば、限定でなく、E.A. Kabat et al. (1987) (37)に列挙したものから当業者により選択され得る。本発明の一つの態様では、ヒト軽鎖の定常領域のアミノ末端に、本発明の抗体の軽鎖の可変領域がペプチド連結されている（すなわち読み枠を一致させた融合）抗体軽鎖と、それに対応する重鎖とをコードするポリヌクレオチド配列を発現させ、そして重鎖／軽鎖の二量体及び別の抗体タイプを形成させる。
【００３９】
本発明の方法により得られたモノクローナル抗体は、細胞接着に関与する細胞表面上に結合しているSEMP1抗原に結合するので、それらを、人間のインビボ治療のために用いることができる。従ってまた本発明は、１又は複数の本発明の抗体を、場合により通常の医薬用担体、アジュバント、充填剤又は添加剤と共に含有する医薬組成物を提供する。本発明の当該組成物は、好ましくはワクチンのアジュバント透過性を改善する。
【００４０】
治療適用では、１又は複数の本発明の抗体の薬理学的有効量を含有する滅菌した当該組成物を、前記疾患の治療のために人間患者に投与する。典型的には当該組成物は、免疫原性を減弱させるために、本発明の抗体のCDR領域を含有するキメラ抗体又はヒト化抗体を含んで成る。
【００４１】
非経口投与用の当該組成物は、一般的に、容認される担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体の溶液を含有する。種々の水性担体、例えば水、緩衝水溶液、0.4％塩水、0.3％グリシン水などを用い得る。この溶液は滅菌され、一般的には粒状物質を含まない。当該組成物を通常の周知の方法により滅菌し得る。
【００４２】
当該組成物は、医薬上容認される補助物質を含んでよく、それらは、ほぼ生理学的条件にするために必要なものであり、例えばpH調整剤と緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどである。当該組成物中の本発明の抗体の濃度は広く変動し、例えば、重量で約0.01％未満から、通常は少なくとも約0.1％で、多くて５％程度までで変動し、主にその液体の容量、粘度などに基づいて、又は選択した特定の投与様式に従って選択される。
【００４３】
従って、典型的な筋肉内注射用医薬組成物は、滅菌緩衝水１mlと、約0.1〜250mg、好ましくは１〜10mgの本発明の抗体とを含有する。
【００４４】
前記載通り、本発明の抗体を、組成物、好ましくは非経口投与に適する医薬組成物中に組み込むことができる。好ましくは、0.1〜500mg/ml、好ましくは0.1〜250mg/mlの抗体を、好ましくは１〜500mmol/lの緩衝剤と共に含有する注射可能な緩衝溶液として当該抗体を製剤化する。この注射可能溶液は、液体の剤形でも又は凍結乾燥品の剤形でもよい。
【００４５】
この緩衝剤は、例えばL-ヒスチジン（好ましくは１〜50mM、最適には５〜10mM）でよく、そのpHは5.0〜7.0(最適にはpH 6.0)でよい。その他の適当な緩衝剤には、限定でなく、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムなどがある。当該溶液の毒性を改良するために、塩化ナトリウムを０〜300mM(液体剤形の場合最適には150mM)で用い得る。
【００４６】
凍結乾燥品の場合、凍結保護剤、主には０〜10％のスクロース（最適には0.5〜１％）を含有し得る。その他の適当な凍結保護剤にはトレハロース及びラクトースなどがある。凍結乾燥品の場合、増量剤、主には１〜10％のマンニトールを含有し得る。液体及び凍結乾燥品の両剤形の場合で、安定化剤、主には１〜50mMのL-メチオニン（最適には５〜10mM）を用い得る。その他の適当な増量剤には、グリシン、アルギニンなどがある。界面活性剤、主には０〜0.05％のポリソルベート80（最適には0.005〜0.01％）を含有し得る。別の界面活性剤には、限定でなく、ポリソルベート20及びポリオキシエチレンエーテル系界面活性剤、例えばBRIJ(登録商標)などがある。
【００４７】
医学的治療に適する本発明の抗体の用量は約0.01〜50 mg/kg体重であり、この用量を繰り返し投与することができる。
好ましい態様では、当該医薬組成物は、一投与あたり約0.01〜10mg/kgの用量の抗体を含有する。より好ましくは１mg/kgの用量の抗体を含有する。
【００４８】
好ましい投与様式は非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内投与）である。好ましい態様では、当該抗体を静脈内点滴又は注射により投与する。別の好ましい態様では、当該抗体を筋肉内又は皮下注射により投与する。
【００４９】
典型的には、医薬組成物は滅菌され、そして製造及び保存中に安定である必要がある。当該組成物は、溶液、微小乳状液、分散液、リポソーム、又はその他の高濃度薬物に適する整った構造体として製剤化され得る。滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要な場合には１又は複数の前記列挙した成分と共に適当な溶媒に加え、そして濾過滅菌を行うことにより調製され得る。
【００５０】
分散液は、一般的には、活性化合物を、基礎分散媒体及び前記列挙したその他必要な成分を含有する滅菌担体中に加えることにより調製される。滅菌注射溶液のために滅菌凍結乾燥粉末を調製する場合、その好ましい方法では、濾過滅菌した当該溶液を真空乾燥又は噴霧乾燥して、活性成分と任意の希望成分とから成る粉末を調製する。
【００５１】
溶液の適当な流動性を、例えばコーティング剤、例えばレシチンの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活性剤の使用により維持することができる。
注射用組成物の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びオエラチン(oelatin)を組成物中に含有させることにより達成し得る。
【００５２】
本発明の抗体及びその部分を、当業界に既知の種々の方法により、多数の治療適用のために投与することができる。好ましい投与経路／様式は、皮下注射、静脈注射又は点滴である。投与経路／様式は、希望する結果に応じて変化する。
【００５３】
ある態様では、当該活性成分を、その化合物の急速な放出を抑制する担体と共に調製することができ、それは、例えば放出制御型製剤、例えば移植体、経皮パッチ、及び微小カプセル式供給系である。生物分解性の生体適合ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を用いることができる。その様な製剤の調製方法が多数特許されており、又は当業者に周知である(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)。
【００５４】
本発明の抗体は、液体、粉末又は凍結乾燥品の形で用いられ、そして適当な希釈剤又は担体、例えば水、塩水、デキストロース水溶液、緩衝水溶液などと共に混合され得る。
【００５５】
本発明の抗体を、保存のために凍結乾燥し、そして使用前に適当な担体中で再構成することができる。通常の凍結乾燥及び再構成の方法が用いられる。この凍結乾燥と再構成により、生物活性が様々な程度で損失することがあり、それを補償するために使用量を調整する必要があろう。
【００５６】
いずれの投与経路を選択しても、本発明の抗体を、当業者に周知の通常の方法により医薬上容認される投与剤形に製剤化する。医薬上容認される酸又は塩基付加塩を用いて、抗体を製剤化してもよい。更に、当該化合物又はその塩を、適当な水和型で用いてもよい。
【００５７】
いずれの投与経路を選択しても、１又は複数の本発明の抗体を、無毒性で且つ治療上有効な量で治療に用いる。種々の要因、例えば患者のタイプ、年齢、体重、性別及び症状、腫瘍の種類、投与経路、並びに治療に用いる抗体の種類に応じて、治療投与様式が選択される。医師が、既知の抗体治療法に照らして当該薬剤の有効量を決定し、処方する。その場合、医師は最初に比較的低用量を用い、それから最大の効果が得られるまで、その用量を増していくだろう。
【００５８】
免疫接種における免疫増強（ブースト）のために有用な精製SEMP1ポリペプチドを、真核細胞中で組換え的に生産することができる。SEMP1は、細胞間の接触領域に局在する接着性の強い密着結合タンパク質であるので(Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 147 (1999) 891-903)、完全長のポリペプチドを単離及び精製することは非常に難しい。更に、SEMP1は膜結合型タンパク質であるので、膜からタンパク質を解離させることが必要である。
【００５９】
種々の界面活性剤(CHAPS, 3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート；オクチルグルコシド，デオキシコール酸，Igepal(登録商標)CA630, (オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール；Triton(登録商標)X-100 (オクチルフェノキシ); Thesit, ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル；ジギトニン)による細胞膜からのSEMP1の遊離は失敗した。しかし驚くことに、Zwittergent(登録商標)(N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート, Roche Diagnostics GmbH, DE)によりSEMP1を単離及び精製することができた。
【００６０】
従って本発明の別の点は、SEMP1ポリペプチドをクロマトグラフィーにより精製する方法である。この方法では、SEMP1ポリペプチドを含有する水性組成物をクロマトグラフィーカラムにかけ、そしてN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートの存在下でSEMP1ポリペプチドを溶出し、それをその溶出液から回収する。
【００６１】
本発明の別の点は、細胞膜などの基材からSEMP1ポリペプチドを遊離させる方法であり、その方法では、水溶液中の膜結合状態のSEMP1ポリペプチドを、そのポリペプチドが溶解する様にN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートにより処理する。
【００６２】
本発明の抗体を分泌する下記細胞株が、F. Hoffmann-La Roche AGにより2000年５月18日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany)に寄託された。
0003542784.tif 000002
【００６３】
前記抗体の特性は以下の通りである。
クローン３：ペプチド21(アミノ酸(aa)97-108, IC1)及び37(aa160-171, EC2)により競合阻害される；
クローン４：ペプチド21(aa97-108, IC1)により競合阻害される；
クローン７：ペプチド5(aa31-42, EC1)により競合阻害される；
クローン64：ペプチド29(aa136-147, EC2), 30(aa139-150, EC2)及び31(aa142-153, EC2)により競合阻害される；
クローン５：ペプチド41(aa191-202, IC2)により競合阻害される；
クローン38：ペプチド44(aa200-211, IC2)により競合阻害される。
【００６４】
ただし
EC1：細胞外エピトープ１(aa22-81)；
IC1：細胞内エピトープ１(aa103-117)；
EC2：細胞外エピトープ２(aa141-163)；
IC2：細胞内エピトープ２(aa185-211)。
当該抗体が結合するSEMP1の領域を、SEMP1遺伝子産物のアミノ酸配列上のアミノ酸番号として括弧内に示す。これを、３Ｄコンピュータ構造予測モデルのシグナルＰにより確認した(http://genome.cbs.dtu.uk/services/SignalP/)。
【００６５】
配列番号の説明
配列番号１：融合ペプチド
配列番号２：融合ペプチド
配列番号３：SEMP1のDNA配列
配列番号４：SEMP1ポリペプチドの配列
【００６６】
【実施例】
実施例１
細胞培養
a)Sf9昆虫細胞
通常の経代培養では、Sf9細胞(ATCC CRL 1711)を、T25フラスコ内で、10％血清(Gibco)、Yeastolate (Gibco)、Pluronic F-68、ゲンタマイシン(Gibco)を補充したIPL41培地(Gibco)中で増殖させた。SEMP1バキュロウイルスを感染させたSf9細胞を大量に単離するために、この細胞を7Lのバッチ発酵槽で培養し、そして接種の３日後に細胞を収集した。
【００６７】
b)SEMP1ハイブリドーマ
抗SEMP1抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、10% FCS, 2mM l-グルタミン(Roche Molecular Biochemicals), 1x 非必須アミノ酸(Biochrom AG), 1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG)及びNutridoma (Roche Molecular Biochemicals)を補充したRPMI1640培地中で培養した。抗SEMP1抗体を多量に含む培養上清を得るために、SEMP1ハイブリドーマ株を、Heraeus miniPerm classic(MWCO 12.5k)培養装置中で増殖させ、細胞濃度が1x107/mlに達した後１週間に数回その培地を収集した。
【００６８】
c)SEMP1レトロウイルスを生する細胞株AM12
SEMP1及びl-NGFR(低親和性神経成長因子受容体)(WO 95/06723)を形質導入したレトロウイルス生産性の両種指向性細胞株HSR BM01 (DSM ACC2235, WO99/60143)(MoMuLV系)を、10% FCS, 2mM l-グルタミン(Roche Molecular Biochemicals), 1x 非必須アミノ酸(Biochrom AG), 1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG)を補充したDMEM培地中で培養した。高力価の上清を得るために、全面密集に近い培養細胞に新鮮な培地を加え、24時間後にその上清を収集し(Machl, A.W., Cytometry 29 (1997) 371-374)、即座にそれを細胞の形質導入のために用いた。
【００６９】
d)MDA-MB435
SEMP1陰性のヒト乳ガン細胞株MDA-MB435と、SEMP1を形質導入した前記細胞とを、10% FCS, 2mM l-グルタミン(Roche Molecular Biochemicals), 1x 非必須アミノ酸(Biochrom AG), 1mMピルビン酸ナトリウム(Biochrom AG)を補充したRPMI培地中で培養した。レトロウイルスによりSEMP1を形質導入するために、全面密集に近い培養細胞を、実施例1cの記載通りに調製したレトロウイルスを含有する上清と共にインキュベーションした。その培養細胞からFACS(FACS Vantage, Becton Dickinson)により、l-NGFRに対するFITC標識抗体と結合した単一細胞を選別することにより、SEMP1を発現するMDA-MB435細胞株を得た。
【００７０】
実施例２
ベクターの構築とSEMP1の発現
Ｎ末端にHis6タグを付加したSEMP1を、標準的な方法に従ってpBlueBacHis2Bベクターによりクローン化した。このHis-SEMP1プラスミドと線状化バキュロウイルスDNAとをSf9細胞にトランスフェクトし、その３日後に上清を集めた(Invitrogen, Bac'NBlue System)。この高力価ウイルス保存液をSf9細胞に27℃で再度感染させた。感染３日後にその細胞を集め、超音波処理により総タンパク質を抽出した（抽出緩衝液：50mM NaP, 150mM NaCl, pH7.2)。そのタンパク質抽出液を30000gで20分間遠心し、そのペレットを50mM NaP, 150mM NaCl, 2% Zwittergent(N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート, 両性イオン性, Roche Molecular Biochemicals)中に溶解した。
【００７１】
His6タグ付加SEMP1を、前記粗溶解液からNiキレートセファロースカラム(Pharmingen)の親和性クロマトグラフィーにより抽出した。このカラムに300mM NiCl2を負荷し、平衡化緩衝液(50mM Tris, 500mM NaCl, pH8, 0.5% Zwittergent)で洗浄し、粗タンパク質分画を負荷し、そして平衡化緩衝液／10mMイミダゾールで洗浄した。平衡化緩衝液／200mMイミダゾールで溶出を行った。Ｎ末端のHis6タグとエンテロキナーゼタグのために、修飾したSEMP1タンパク質の分子量は23kDから27kDに増加した。
【００７２】
実施例３
免疫接種
６〜８週齢の雌BALB/cマウスに免疫接種を行った。免疫接種する前に、100μlのカルジオトキシン(10μM/PBS)(LATOXAN, L-8012; Rosans, France)を両足の脛骨筋内に注射して、筋の変性／再生を誘発した（０日目）。シリカゲル膜カラム(Qiagen, DE)により精製した、SEMP1の読み枠を有するプラスミドDNA 50μg/50μl滅菌0.9%NaCl水を、各後脚の前脛骨筋内に注射した。このDNA用量を４週間毎に５回注射した。
【００７３】
97日目、すなわち脾臓を取り出す３日前に、眼球穿刺により少量の血清を採取した。血清力価の最も高いマウスを、前記のSf9細胞から精製したSEMP1タンパク質30μgの静脈投与により免疫増強した。129日目にこのマウスから脾臓を取り出し、下記の標準的方法によりハイブリドーマの作製に用いた。SEMP1陽性のハイブリドーマの大量培養からFACSによる細胞選別クローニング(FACS Vantage, Becton Dickinson)により、高生産性のハイブリドーマ株を得た。
【００７４】
抗SEMP1によるウエスタンブロット分析
Novex NuPage Bis-Tris系(Invitrogen)を用いて標準的な方法に従って、ウエスタンブロット分析を行った。種々の量の精製SEMP1タンパク質、又はSEMP1陽性細胞若しくはSEMP1陰性対照細胞からの抽出タンパク質を分離したゲルを転写したニトロセルロース膜を、SEMP1抗体を生産するハイブリドーマ株由来の上清(1:10及び1:100希釈)とインキュベーションした。抗SEMP1のシグナルを、標準的な化学発光法(Roche Molecular Biochemicals)により検出した。
【００７５】
実施例４
免疫蛍光顕微鏡
MDA-MB435細胞を、ポリLリシン(Sigma)で被覆した顕微鏡用スライド上で、標準的な培地中で、種々の密度で培養した。細胞をPBSで洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド/PBSにより室温で１時間固定した。0.05% Tween20/10%アルブミン/PBS中で１時間インキュベーションすることにより、透過性の亢進及びブロッキングを行った。その後、抗SEMP1抗体と、次にAlexa488で標識された抗マウスF(ab)2(Molecular Probes)とにより処理して、間接免疫蛍光染色を行った。
【００７６】
実施例５
レトロウイルス構成体及びウイルスによる形質導入
レポーター分子としての細胞表面マーカーl-NGFRを有するベクターを用いて、SEMP1レトロウイルスを作製した(Machl, A.W., Cytometry 29 (1997) 371-374)。要約すると、5'-LTRプロモーターが、マーカータンパク質l-NGFRの発現を誘導する。3'下流に位置するSV40プロモーターをCMVプロモーターにより置換し、それによりSEMP1の発現を誘導する。SEMP1遺伝子を、理想的なKozak配列(Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15(1987) 8125-8148)を導入したORFとしてクローン化した。
【００７７】
感染性のレトロウイルスを生産するために、SEMP1/l-NGFRレトロウイルスプラスミドを、リポフェクタミン(Gibco)により取扱説明書に従って、レトロウイルス生産性の両種指向性のHSR BM01細胞株にトランスフェクトした。FACSにより細胞選別を行い、そしてそのHSR BM01細胞株の培養上清による有効な形質導入率を検査することにより、高力価なレトロウイルスを生産するHSR BM01細胞株を得た。
この細胞株が生産したレトロウイルスを用いて、例えば腫瘍学的に適当な乳房カルシノーマ細胞に形質導入を行うことにより、抗体特異性及びSEMP1タンパク質の適正な局在化を証明することができる。
【００７８】
抗体特異性
種々のモノクローナル抗体のSEMP1特異性を、ウエスタンブロット分析により確認した。代表的な結果を図２に示す（矢印参照；SEMP1ハイブリドーマ株38による）。SEMP1陽性細胞のみ、例えばSAEC(小気管上皮細胞)及びCACO-2が、予想分子量の約23kDの位置にシグナルを有する。予想通り、造血細胞株K562はSEMP1陰性である。更にSEMP1陰性乳房カルシノーマ細胞株MDAMB435では、SEMP1タンパク質バンドは認められず、一方レトロウイルスにより形質導入した前記細胞株MDAMB435xSemp1では、強いSEMP1のバンドが認められた。
【００７９】
SEMP1ハイブリドーマ株38以外にも、SEMP1の種々の細胞内及び細胞外エピトープに対するモノクローナル抗体を生産する種々のSEMP1ハイブリドーマ株が得られた。
図３は、細胞におけるSEMP1抗体の結合特異性を示す。４回膜貫通型タンパク質であるSEMP1は、細胞間の接触部位にのみ局在する（矢印参照；SEMP1ハイブリドーマ株38による）。
【００８０】
実施例６
補完的なSEMP1抗体によるエピトープのマッピング
下記の手順に従ってELISAによりSEMP1抗体のエピトープを選別した。
Hisタグ付加SEMP1による96ウエルプレートのコーティング；
１％ウシアルブミンによるプレートのブロッキング；
洗浄（PBS/0.05%Tween20により２回）；
抗SEMP1活性を有するハイブリドーマ血清とのインキュベーション、ポジティブコントロールとして抗His抗体とのインキュベーション；
洗浄；
ペルオキシダーゼ結合二次抗体とのインキュベーション；
洗浄；
ペルオキシダーゼ基質(ABTS溶液)とのインキュベーション。
【００８１】
66個の異なる抗体のエピトープを同定するために、補完的なペプチドを用いてELISAを行った。そのために、SEMP1の親水性領域に由来する44個のペプチドを合成し、そして各反応毎に抗SEMP1抗体を含む上清とインキュベーションした。多量のペプチドを用いることにより、そのペプチドがエピトープに相当した場合、抗SEMP1抗体とHisタグ付加SEMP1との結合が低下する。
その発色シグナルの低下を、ペプチドとインキュベーションしていない上清の場合と比較して測定した。
【００８２】
実施例７
SEMP1ペプチドを免疫接種することによるSEMP1抗体作製の試み
融合ペプチド(QWRIYSAGD)-KLH (テンガイヘモシアニンに結合した配列番号１のペプチド)及びKLH-(MKCMKCLEDDEMQKM) (テンガイヘモシアニンに結合した配列番号２のペプチド)を、フロイントアジュバントと共に、２匹のウサギに注射した。免疫接種１回につき合計0.1mgのペプチドを３カ所の皮下に注射した。０，２，６及び８週目に注射を行った。ドットブロット上では前記ペプチドに対して、血清は高い抗体力価を示したが、細胞抽出物に対して又はFACS分析において、この血清は機能しなかった。
【００８３】
実施例８
ELISAの原理に基づく酵素免疫検査によるSEMP1の測定
試薬１：
1.25μg/mlビオチニル化モノクローナル抗体クローン３(Peters, J.H., et al.,"Monoklonale Antikorper", Springer Verlag, Berlin, 1985, pp.209-212に基づいて調製した)；
10mmol/lクエン酸緩衝剤；
47mmol/lリン酸緩衝剤、pH6.3；
50mU/mlのペルオキシダーゼ連結モノクローナル抗体クローン５(Wilson, M.B., and Nakane, P.K., 1978, in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wick eds., pp.215-224, Elservier/North Holland, Amsterdamに基づいて調製した；この活性はペルオキシダーゼによる)。
【００８４】
試薬２：
100mmol/lリン酸−クエン酸緩衝剤、pH4.4；
3.2mmol/l過ホウ酸ナトリウム；
1.9mmol/l ABTS(2,2-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸塩))。
各々3, 5, 10及び25ng/mlの組換えSEMP1を加えたヒト血清を試料として用いる。
ストレプトアビジンで被覆されたポリスチレン製小チューブ(EP-A0269092に基づいて調製した)を用いて反応を行う。
【００８５】
測定方法：
前記小チューブ内で0.2mlの試料と１mlの試薬１とを20〜25℃で60分間インキュベーションした後、その溶液を吸引し、そして水道水で２回洗浄する。次に試薬２を加え、20〜25℃で30分間インキュベーションし、そして420nmの吸光度を光度計で測定する。この様にして標準曲線を得て、それにより検査試料中のSEMP1濃度を決定する。
【００８６】
実施例９
正常組織及び腫瘍組織におけるSEMP1の検出
組織学的切片上のSEMP1タンパク質を検出するために、正常組織及び乳ガン組織のパラフィン切片を調べた。図５は、抗SEMP1抗体(図5A, B)により、そして対照として非結合性抗体(C, D)により染色した切片を示す。本発明の抗SEMP1抗体は、種々の腺構造の上皮細胞のみに特異的に結合しているが、周囲の間葉性支質組織は染色されていない。
【００８７】
図５から明らかに、全ての上皮細胞においてその膜が染色されていることが示される。この図では、乳腺の切片において、小葉構造（上皮細胞）とは別に、管構造（内皮細胞）も本発明の抗体により染色され得ることは示されていない。
【００８８】
これとは対照的に、腫瘍組織におけるSEMP1の発現は、正常組織に比べて有意に低い。このことが図６及び７に示されている。乳房又は結腸の正常組織では、SEMP1はその上皮細胞の膜部分に特に認められ、一方腫瘍組織では、その膜及び細胞質にいくらかの染色が認められた。しかし腫瘍組織の染色は、正常組織に比べてかなり低かった。
【００８９】
図７は、正常な乳房組織の１つの切片と乳房腫瘍組織の８つの切片との比較を示す。図７では、特に小葉構造が染色されている。いずれの場合も、それらの膜に染色が認められる。乳房腫瘍組織の切片のいずれでも、膜の染色を検出することはできなかったが、正常乳房組織ではそれが認められた。乳房腫瘍組織では、常に細胞質が薄く均一に染色されている。
【００９０】
これらの実験から、本発明の抗SEMP1抗体は、細胞間の密着結合状態を診断するために有効に用いられること、従ってこれは腫瘍発生及び／又は腫瘍進行のための貴重なマーカーとなることが証明される。
【００９１】
引用文献
【表１】
0003542784.tif 000003
【表２】
0003542784.tif 000004
【００９２】
【配列表】
0003542784.tif 000005
0003542784.tif 000006
0003542784.tif 000007
0003542784.tif 000008
0003542784.tif 000009
0003542784.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】図１：SEMP1タンパク質の精製。SEMP1-バキュロウイルスを感染させたSf9昆虫細胞(Research Diagnostic Inc., NJ, USA)で、Hisタグ付加SEMP1を発現させた。Sf9細胞の溶解液の粗上清から、NiキレートカラムによりHisタグ付加SEMP1を精製した。200mMイミダゾールで溶出することにより、最高の収量及び純度が得られた。矢印は、Hisタグ付加SEMP1タンパク質の位置を示す。
【図２】図２：抗体の特異性及び細胞依存的なSEMP1の発現。ウエスタンブロット法による抗SEMP1モノクローナル抗体の特異性の分析。SEMP1陰性細胞(造血細胞株K562、乳ガン細胞株MDA-MB435)、及び陽性細胞(SAEC(小気管上皮細胞)、アデノカルシノーマCACO-2、SEMP1レトロウイルスにより形質導入した乳ガン細胞MDA-MB435)を全面密集に成るまで増殖させ、溶解し、そしてウエスタンブロット分析した。矢印は、天然のSEMP1タンパク質の位置を示す。
【図３】図３：乳ガン細胞におけるSEMP1の発現。バルク培養した、SEMP1を形質導入したMDA-MB435細胞におけるSEMP1の発現を、蛍光顕微鏡により分析した。Ｓ字状のSEMP1染色パターンから、その発現の特異性及び細胞間接触部位への局在化が示される。
【図４】図４：SEMP1のドメイン構造、及びSEMP1のモノクローナル抗体５のエピトープマッピング。配列番号４のアミノ酸(aa)22-81は第一細胞外ドメイン(EC1)であり、aa 103-117は第一細胞内ドメイン(IC1)であり、aa 141-163は第二細胞外ドメイン(EC2)であり、aa 185-211はＣ末端の細胞内ドメイン(IC2)である。aa 1-21(N末端), 82-102, 118-140及び164-184は膜ドメインである。
【図５】図５：正常なヒト乳房組織におけるSEMP1タンパク質の発現。SEMP1タンパク質を抗SEMP1／抗マウスPODにより染色し、そしてカウンター染色をヘマトキシリンにより行った（パネルＡ及びＢ）。二次抗体の抗マウスPODによるコントロール染色をパネルＣ及びＤに示す。パネルＡ及びＣ内の四角の枠は、パネルＢ及びＤにおいて拡大した領域を示す。
【図６】図６：正常な乳房組織及び結腸組織と、乳房及び結腸の腫瘍組織とのSEMP1発現の比較。図５の記載通りに染色した。
【図７】図７：異なる被験者の種々の乳房腫瘍組織と、正常乳房組織とのSEMP1染色の比較。図５の記載通りに染色した。
【図１】
0003542784.tif 000011
【図２】
0003542784.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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