(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルオレンジで処理された固定化Ｃ型肝炎ウイルス抗原を含んで成る特異的結合アッセイ用固相。
【請求項２】
前記Ｃ型肝炎ウイルス抗原がＣ型肝炎ウイルスゲノムのNS3またはNS4領域から発現される、請求項１に記載の固相。
【請求項３】
前記Ｃ型肝炎ウイルス抗原がc200である、請求項２に記載の固相。
【請求項４】
抗Ｃ型肝炎ウイルスイムノアッセイの特異性を向上させる方法であって、メチルオレンジにHCV抗原を暴露し、前記HCV抗原を固相に結合させ、そして前記固相を使ってイムノアッセイを実施することを含んで成る方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法であって、
i) メチルオレンジおよびＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための少なくとも１つの第一の結合性リガンドを含有するコーティング溶液を含んで成る固相を提供し；
ii) 前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を含む可能性のある試料と接触させ；
iii)前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための少なくとも１つの第二の結合性リガンドと接触させ、ここで前記第二の結合性リガンドは検出可能な基により標識されており；そして
iv) 前記固相に結合したまたは前記固相に結合しなかった検出可能な基の量を測定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項６】
前記検出可能な基が、酵素、放射性原子、蛍光性分子および発光性分子から成る群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の結合性リガンドがc200、c22-3およびNS5であり、そして前記第二の結合性リガンドがヒトIgGに対する抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第一の結合性リガンドがc200、c22-3およびNS5である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の結合性リガンドがヒトIgGに対する抗体である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、特異的結合アッセイ用の固相の調製方法において、および容器中に計量分配されたコーティング溶液の容量をモニタリングするために、使用するコーティング溶液に色素、特にメチルオレンジ、を添加することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然の結合反応を利用する特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイは、臨床化学における分析技術として広範な用途が見出されている。反応の特異性のために、それらは生物学的液体中に非常に低い濃度で存在する生物学的分析物（ａｎａｌｙｔｅ  ）を定量するのに特に有利である。そのような分析物としては、例えば、抗原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク質などが挙げられる。
【０００３】
様々な色素または着色剤（以下、「色素」と総称する）が、試薬の計量分配（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）のモニタリングまたは試薬の計量分配の分光光度的モニタリングを助ける商業的なイムノアッセイコーティング方法において使われている。そのような色素の多くは市販されている。基本的に、色素は可視検出に備える。これは、例えば生物学的物質をマイクロウエルの表面上にコーティングするための製造方法の際に、容器、例えばマイクロウエル中への溶液の計量分配をモニタリングするのに特に有用となり得る。次いでコーティングされた容器がイムノアッセイ用の固相として使われる。使用する色素が固相支持体上にコーティングされたタンパク質の生物学的性質を妨害しないことが望ましい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タンパク質の中には色素と相互作用するものがあり、その結果として、この相互作用がアッセイ性能を低下させてしまうことがある。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を検出するためのアッセイに使われるマイクロウエルの製造の際にこのような問題が認められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の１つの目的は、抗ＨＣＶアッセイに存在するＨＣＶ抗原タンパク質に対して有害な影響を与えない、ＨＣＶ抗原を含んで成る固相コーティングを使用できる色素を提供すること、およびマイクロウエル充填容量のモニタリングを助けることである。本発明の別の目的は、アッセイ性能を実際に向上させるであろう色素を提供することである。
【０００６】
本発明は、特異的結合アッセイ用の固相の調製方法において、および容器中に計量分配されたコーティング溶液の容量をモニタリングするために、使用するコーティング溶液に色素、特にメチルオレンジ、を添加することに関する。比色モニタリングを可能にするための抗Ｃ型肝炎ウイルスイムノアッセイ用コーティング組成物および固相に計量分配されるコーティング液容量の制御方法に使われる多数の色素が研究されている。それらの色素の多くはＨＣＶ組換えコーティングタンパク質の活性を低下させた。意外にも、本出願人らは、メチルオレンジの添加によって、コーティング溶液の容量をモニタリングできるだけでなく、色素としてのメチルオレンジの使用がタンパク質（特にＨＣＶ抗原）と正の相互作用をすることにより、アッセイ結果の特異性を向上させることができることを発見した。従って、図１と図２の比較に示されるように、メチルオレンジを含有する固相のコーティング溶液が、陽性試料と陰性試料とのより明確な区別を可能にする。
【０００７】
従って、本発明の一態様は、メチルオレンジで処理された少なくとも１つの固定化ＨＣＶ抗原を含んで成るイムノアッセイ用固相を提供することである。本発明の好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がウイルスゲノムのＮＳ３および／またはＮＳ４領域から発現される場合である。より好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がｃ２００である場合である。
【０００８】
本発明の別の目的は、コーティングを使って実施されるイムノアッセイの特異性を向上させるのに十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加することにより、抗ＨＣＶイムノアッセイの特異性を向上させる方法を提供することである。
【０００９】
本発明のこの観点の好ましい態様では、
ｉ）    メチルオレンジおよびＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための少なくとも１つの第一の結合性リガンドを含有するコーティング溶液を含んで成る固相を提供し；
ｉｉ）  前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を含む可能性のある試料と接触させ；
ｉｉｉ）前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための少なくとも１つの第二の結合性リガンドと接触させ、ここで前記第二の結合性リガンドは直接的にまたは間接的に検出可能な基により標識されており；そして
ｉｖ）  前記固相に結合した検出可能な基の量を測定する
ことにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法が実施される。あるいは、ＨＣＶに対する抗体の存否の指標として、固相に結合しなかった検出可能な基の量を測定することができる。検出可能な基は、例えば、酵素、放射性元素、蛍光性分子、または発光性分子であることができる。当業者は、ｉ）〜ｉｖ）  の段階が連続してまたは同時に実施できることを理解するだろう。また、第一の結合性リガンドと第二の結合性リガンドが同一であってもまたは異なってもよいことを理解するだろう。更に、測定された検出可能な基の量を、試料中に存在する抗ＨＣＶ抗体の量に関連づけることができる。
【００１０】
最後に、本発明の別の態様は、特異的結合アッセイ用の固相をコーティングするための改良方法であって、特異的結合アッセイの特異性を向上させるのに十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加することを含んで成る方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の利点は、次の発明の実施形態および実施例から明らかになるであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】
メチルオレンジ色素は、両性であり、水に微溶性であり、且つモノアゾ色素である（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第７版，  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ，  １９８６  年，  第４３４  〜４３５  頁）。メチルオレンジの実験式は  （ＣＨ３）２ＮＣ６Ｈ４Ｎ＝ＮＣ６Ｈ４ＳＯ３Ｎａである。それの主な一般用途は、繊維産業においてであり、通常は酸性浴からの毛および絹を染めること、並びに無機酸を中和すること（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＩ）  ，  第９版，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９４２  年，  第４６７  〜４６９  頁）、強塩基を指示することおよび水のアルカリ性を評価すること（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１１版，  ６０１９）である。メチルオレンジの生物学的用途は、下垂体の好酸性細胞を染色すること（Ｋｒｅｙｂｅｒｇ染色）および植物材料を染色すること（Ｆｌｅｍｍｉｎｇｓ  染色）である。
【００１３】
結合ペアを用いる「特異的結合アッセイ」では、「結合性リガンド」は一対の結合ペアのどちらの成分であってもよい。最も汎用される結合ペアは抗体と抗原または抗体とハプテンであるが、特異的結合反応に参加できる他の結合タンパク質レセプターおよび生物学的分子も使用できる。抗体と抗原との結合反応の場合、抗体か抗原のいずれかが結合性リガンドであることができる。
【００１４】
本明細書中で用いる「固相」は、不溶性であり、且つ特異的結合アッセイにおいて用いられる結合性リガンドをそれに直接的にまたは間接的に取り付けることができる、任意の材料を指す。この固相は、結合性リガンドを引きつけそして固定化する固有特性のために選択することができる。あるいは、固相はアビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとを使った特異的結合反応を通して結合性リガンドを固定化する能力を保持することができる。天然材料、合成材料、または合成的に改変された天然材料を固相として用いることができる。固相に好ましい材料はポリスチレンである。所望により、固相は粒子、ディップスティック、または特異的反応を実施する容器の形であることができる。
【００１５】
本明細書中で用いる「コーティング溶液」は、特異的結合アッセイを実施する前に固相と接触される任意の溶液または試薬のことを言う。コーティング溶液はタンパク質および／または緩衝液を含んでもよいが、それらに限定されない。当業者は、適当なコーティング溶液を製造しそして適当な固相に適当なコーティング溶液を適用する方法を知っているだろう。
【００１６】
本明細書中で用いる「試料」は、着目の分析物を含む可能性のある任意の物質を言う。試料は生物学的液体、例えば全血；赤血球、白血球、血小板、血清および血漿をはじめとする全血成分；腹水、尿、脳脊髄液；並びに着目の分析物を含み得る他の体成分であることができる。所望により、試料は水、土壌および植物から得られてもよい。
【００１７】
ＮＳ３／ＮＳ４領域から発現されるＨＣＶ抗原、特にｃ２００は、例えば、既知の組換えＤＮＡ技術を使って調製することができる。ＨＣＶ配列（「ＨＣＶ−１」）はＧＥＮＢＡＮＫ  の受入れ番号Ｍ６２３２１から入手可能である〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２：３４４１−３４４４  （１９８４）〕。また、組換えＨＣＶタンパク質の調製も米国特許第５，７０５，３３０  号明細書に記載されている。
【００１８】
ＨＣＶゲノムおよび推定組換えタンパク質は、Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅ  他によりＶｏｘ  Ｓａｎｇ．  ６６：１２２−１２９  （１９９４）  中に示されている。特に、ｃ２００のアミノ酸配列はＡＡ１１９２〜１９３１である。ＨＣＶゲノム組織の更なる考察は、Ｃｅｅｓ，  Ｌ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ  他によるＴｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，  ３３４：１４７５−１４７９  （１９９４）中に見つけることができる。
【００１９】
本発明は固相コーティング溶液中にメチルオレンジを使用することにより、比色プロセス制御を可能にし且つ意外にもアッセイ性能を向上させる。コーティング溶液へのメチルオレンジの添加は、ＨＣＶ組換えタンパク質と陽性に相互作用して比色プロセス制御を可能にし且つアッセイの特異性を向上させた。
【００２０】
本発明の有効性および利点を下記の実施例により更に説明する。この実施例は例示するためのものであって、本発明の範囲および精神を限定するためのものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１：ＨＣＶ抗原コーティング工程中のメチルオレンジの適用：
ＡＭＥＲＬＩＴＥポリスチレン製マイクロウエル（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｕ．Ｋ．）を２００  μＬ  のコーティング緩衝液１またはコーティング緩衝液２（その組成は下記に記載する）のいずれかと共にインキュベートすることにより、該マイクロウエルにＨＣＶ抗原（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ  から入手した、ｃ２２−３，ｃ２００およびＮＳ−５）をコーティングした。該ウエルを室温で１６時間インキュベートした。ショ糖、塩類およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＲＩＳ緩衝液，  ｐＨ  ８．５で洗浄した後、マイクロウエルを乾燥し、そして２〜８℃で乾燥保存した。
【００２２】
コーティング緩衝液１，ｐＨ  ６．９５−７．０５
第二リン酸ナトリウム                        ５．４５    ｇ／Ｌ
第一リン酸カリウム                          １．５５    ｇ／Ｌ
２−クロロアセトアミド                    １．００    ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ                                  ０．７４４  ｇ／Ｌ
ＢＳＡ（プロテアーゼ不含有）              ０．００４  ｇ／Ｌ
ｃ２２−３                                ０．６  ｍｇ／Ｌ
ｃ２００                                  １．０  ｍｇ／Ｌ
ＮＳ−５                                  ０．２５  ｍｇ／Ｌ
脱イオン水                                １  Ｌ  まで
コーティング緩衝液２，ｐＨ  ６．９５−７．０５
コーティング緩衝液１中のメチルオレンジ    ０．００３  ｇ／Ｌ
【００２３】
ＨＣＶに対する抗体を測定するのに次のアッセイプロトコールを使って、コーティングされたマイクロウエルの性能を評価した。２０μＬ  の試料（既知抗ＨＣＶ活性を有するヒト血漿プール）と１６０  μＬ  の試料希釈剤（リン酸塩緩衝化塩溶液，  ｐＨ  ７．４）をＨＣＶコーティングしたマイクロウエルに添加し、そしてＡＭＥＲＬＩＴＥインキュベーター中で３７℃にて３０分間マイクロウエルをインキュベートした。マイクロウエルをＡＭＥＲＬＩＴＥ洗浄器上で洗浄した後、１８０  μＬ  の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を加え、マイクロウエルを更に１５分間インキュベートした。再びマイクロウエルをＡＭＥＲＬＩＴＥ洗浄器上で洗浄した後、増強発光反応〔Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  他（１９８３），  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，  １１５８−１１５９  〕によりＨＲＰ活性を測定した。発光性基質（ルミノール誘導体および過酸塩）並びにエンハンサー（置換フェノール）を含有するＡＭＥＲＬＩＴＥシグナル試薬をマイクロウエルに添加して、発光反応を開始させた。ＡＭＥＲＬＩＴＥアナライザー中で光シグナルを読み取った。
【００２４】
未知の試料についての≧１のシグナル対カットオフ比（Ｓ／Ｃ）値が反応性試料および抗ＨＣＶの存在可能性を示すように、アッセイにおける既知の陽性試料（抗ＨＣＶ活性を含む）について得られた光シグナルに換算係数を掛けたものをカットオフ値として設定した。＜０．９  の結果は抗ＨＣＶが陰性である非反応性試料を示す。≧０．９  〜＜１の結果は、グレーゾーン試料（どちらとも言えない試料）を示す。
【００２５】
コーティング溶液中にメチルオレンジを使って調製したマイクロウエル（ＭＯウエル）は、抗ＨＣＶアッセイにおいて、色素を含まないコーティング溶液を使って調製したマイクロウエル（対照ウエル）に比較して、より低い光シグナルを与えた。陽性対照についてのカットオフを設定するための換算係数は０．２５に設定した。Ｓ／Ｃに関する対照の性能は比較的変わらずに保持され（第１表）、このことは、コーティング緩衝液へのメチルオレンジの添加がアッセイの感度、即ち弱陽性の試料を検出するアッセイ能力、に有害な影響を与えなかったことを示す。
【００２６】
実施例２：特異性研究
実施例１に記載の通りにマイクロウエルをＨＣＶ抗原によりコーティングした。ＨＣＶに対する抗体が陰性であると推定された４３０  人のヒト血液提供者の血清を、実施例１の抗ＨＣＶアッセイプロトコールに従って、マイクロウエルを使って試験した。陰性血清についてのＳ／Ｃ値は、対照ウエルに比較してＭＯウエルを使った時、一般に低かった（平均Ｓ／Ｃ値＝それぞれ０．１３および０．１６）（図１）。≦０．１  のＳＣ値は、ＭＯウエルを使った時は提供者の４２％に得られたのに対し、対照ウエルを使った時は１７％に得られた。これらの値は、個々の提供者血清について得られた結果に関するものであるので、実施例１の血清プールの対照に対する結果と直接比較することはできないだろう。陰性試料について得られたＳ／Ｃの低下結果は、特異性の改善と陰性試料とカットオフの良好な区別をもたらす。この改善された分布を用いて、カットオフを適切にポジショニングすることにより、アッセイの感度と特異性を最適化することができる。例えば、アッセイの性能を最適化するために、実施例３では陽性対照についてのカットオフを設定する換算係数を０．３３に設定した。
【００２７】
実施例３：感度研究
実施例１に記載の通りにマイクロウエルをＨＣＶ抗原によりコーティングした。Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＭＡ，  ＵＳＡから得られた、市販のセロコンバージョンパネルを使って、実施例１のアッセイプロトコールに従って、抗ＨＣＶアッセイの臨床感度を評価した。Ｓ／Ｃ比は、０．３３の換算係数を掛けた陽性対照シグナルのカットオフ値を使って算出した。このアッセイによるセロコンバージョンパネルの結果は、ＭＯウエルと対照ウエルを使った時同じであった（第２ａ〜ｅ表）。試料の陰性または陽性状態に全く変化がなかったことから、コーティング組成物へのメチルオレンジの添加はアッセイ感度に何ら有害な結果を与えなかった。
【００２８】
【表１】
0003540675.tif 000002
【００２９】
【表２】
0003540675.tif 000003
【００３０】
【表３】
0003540675.tif 000004
【００３１】
【表４】
0003540675.tif 000005
【００３２】
当業者は、計量分配操作の間に間隔をあけて光学的に透明なマイクロウエル中に計量分配されるコーティング溶液の容量測定を可能にすることにより、色素の濃度を４５０  ｎｍでの分光光度測定によりモニタリングすることができ、よってウエルのコーティングのプロセス制御を助けるものとして利用できることを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はマイクロウエルコーティング溶液中にメチルオレンジを含まない試料のヒストグラムを表す。
【図２】図２はマイクロウエルコーティング溶液中にメチルオレンジを含む試料のヒストグラムを表す。
【図１】
0003540675.tif 000006
【図２】
0003540675.tif 000007