(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に合成高分子と細胞増殖因子を配合してなるコーティング液を支持基質に塗布し乾燥することにより得られる培養基材表面で、正常細胞が混在する癌細胞を培養し、癌細胞を選択的に増殖させる、癌細胞増殖方法であって、
前記合成高分子として、下限臨界共溶温度よりも低い温度では親水性を示し、下限臨界共溶温度以上では疎水性を示す感温性高分子を用い、
前記細胞増殖因子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、レクチン、接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種の細胞増殖因子を用い、
前記培養を前記下限臨界共溶温度よりも高い温度で行うことによって培養時の培養基材表面に疎水性を付与する、
癌細胞増殖方法。
【請求項２】
コーティング液が合成高分子を０．１２５ｗ／ｖ％以上の割合で含み、乾燥を２５℃以上の温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コーティング液が合成高分子を０．７５ｗ／ｖ％以上の割合で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記感温性高分子は、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物から選ばれる少なくとも１種である、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、癌細胞増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌細胞を培養するために生体から癌細胞だけを取り出すことは困難であり、癌細胞に正常細胞が混入することが一般的である。取り出された細胞を体外培養して細胞数を増大させ、検査、試験などに利用したり、あるいは、体外培養の際に検査や試験を行ったりする。これらの場合、癌細胞に混在する正常細胞は癌細胞の増殖度を調べるのに妨げとなる。なぜなら、増殖度は細胞数の増加やコロニー形成や数などにより測定するため、混入し増殖した正常細胞がその測定値に大きな誤差を与えるからである。
【０００３】
正常細胞を除去するために、従来、軟寒天培養や無血清培養などで自然消滅させたり、物理的に除去したり、トリプシンなどの酵素で処理したり、免疫学的に分画したりする方法が提案された。これらの方法は、正常細胞を死滅させたり、あるいは、癌細胞を正常細胞から分離したりするものであり、正常細胞が混在する癌細胞を培養して選択的に増殖させるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
癌細胞の増殖は間質系の正常細胞の産生した増殖因子（または成長因子）でその増殖が促されることがあるので、癌細胞を正常細胞の存在下で培養することが検討された。
正常細胞は、接着依存性（または足場依存性）を有するので、細胞を接着させるための培養基材が必要である。しかし、細胞を、コロナ放電処理したポリスチレン培養器など通常の培養基材に接着させて培養すると、正常細胞が癌細胞よりも優先的に増殖して培養基材全面に拡がり基材から癌細胞を巻きこんで剥離するので、癌細胞の培養を妨げる。
【０００５】
細胞の培養は、単に細胞数を増やすだけでは不十分であり、生体内においての増殖と同様にその細胞の特質を発揮させながら増殖させることが重要である。
この発明は、従来の癌細胞培養とは異なって、癌細胞に混在する正常細胞を殺さずにその増殖を停止あるいは抑制し、癌細胞だけをその特質を発揮させながら容易に選択的に増殖させる培養方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記課題を解決するために、水に合成高分子と細胞増殖因子を配合してなるコーティング液を支持基質に塗布し乾燥することにより得られる培養基材表面で、正常細胞が混在する癌細胞を培養し、癌細胞を選択的に増殖させる、癌細胞増殖方法であって、
前記合成高分子として、下限臨界共溶温度よりも低い温度では親水性を示し、下限臨界共溶温度以上では疎水性を示す感温性高分子を用い、
前記細胞増殖因子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、レクチン、接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種の細胞増殖因子を用い、
前記培養を前記下限臨界共溶温度よりも高い温度で行うことによって培養時の培養基材表面に疎水性を付与する、
癌細胞増殖方法を提供する。
線維芽細胞などの正常細胞の増殖を停止または抑制し、かつ、癌細胞を増殖させるためには、癌細胞と正常細胞の増殖の違いを把握する必要がある。ここで癌細胞と正常細胞の増殖の違いを考えてみると、癌細胞は、正常細胞に比較すると、周辺を認識できずに接触阻止を失って増殖し、細胞配列の乱れ（クリスクロスまたは交差細胞配列とも言う）や重なり合い増殖（パイルド・アップ・グロース）を起こす。正常細胞は、規則的に配列し、培養基材の壁あるいは境界に当たれば必ず増殖を停止し、しかも、重なり合い増殖を起こさない。つまり、正常細胞は外部認識が正常であり、培養基材の表面性状の変化を認識するので、そのように認識した場合には癌細胞とは異なって増殖を停止することができる。この発明は、癌細胞と正常細胞のそのような相違点に着目し、両者の培養基材への認識差を生じさせる条件を見いだし、この条件を培養基材に持たせたことが特徴である。
【０００７】
細胞の培養基材への接着性は基材の表面性状が親水性であるほど良好になり、逆に疎水性だと低下する。基材表面が全体的に均一に親水性を持つ場合は癌細胞が生体内とは異なって平面的に増殖し、また、正常細胞が共存しているときには正常細胞が優先的に増殖する。
この発明で用いられる増殖因子は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどに代表される細胞外マトリックスやゼラチン、レクチン、接着性オリゴペプチドなどが挙げられる。
【０００８】
この発明で用いられる合成高分子は、培養基材表面に上記細胞の非接着性（または疎水性）を付与し、正常細胞の伸展または増殖を抑制または停止するためのものであり、癌細胞や正常細胞を殺傷する毒性を持たないことが好ましい。好ましい合成高分子は、たとえば、感温性高分子、ポリスチレンのような疎水性を有する高分子であり、増殖因子と水中で混合された液を乾燥させることにより増殖因子と混ざり合った固体を生成するものが好ましい。感温性高分子は、ＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ：下限臨界共溶温度、または、感温性高分子の水和と脱水和の転移温度）以上に昇温すると疎水性を示して水不溶性となり、それよりも低い温度に冷却すると親水性（水溶性）を示すという特性を持っている。感温性高分子としては、たとえば、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物などが挙げられ、培養温度よりも低いＬＣＳＴを持っていることが好ましい。
【０００９】
この発明に用いる培養基材は、形状が限定されず、層、粒子、板、繊維、フレーク、スポンジ、マイクロビーズなどが可能であり、独立した固体でもよく、支持基質に付着した塗膜でもよい。支持基質は、たとえば、コロナ放電処理で親水性を付与したポリスチレンやポリエステル、その他の培養器などの親水性表面を持つ固体である。前記塗膜は、支持基質表面全体または一部に形成されうる。前記塗膜が支持基質表面の一部に形成される、たとえば、１または複数個のスポット状に形成されると、播種された正常細胞が塊を形成し、増殖した癌細胞と見分けがつきにくくなるという現象を防ぐことができ、好ましい。
【００１０】
前記培養基材は、たとえば、水に細胞増殖因子と合成高分子を配合してなる液を乾燥することにより作られる。該液は、増殖因子と合成高分子の水溶液であってもよい。前記塗膜は、前記液を支持基質に塗布して乾燥することにより形成されうる。
前記液は、合成高分子を増殖因子に対して１よりも大きい重量比、好ましくは５よりも大きい重量比、より好ましくは１３．３／１以下の重量比で含む。合成高分子を増殖因子に対して１以下の割合で含むと、基材表面では正常細胞が癌細胞よりも優先的に増殖するため、癌細胞を選択的に増殖させることができない。また、上記範囲の上限を上回ると基材表面が全体的に非接着性となって細胞が培養基材に付着せず培養できないおそれがある。
【００１１】
前記培養基材は、たとえば、下記▲１▼または▲２▼のやり方で作られうるが、その製造方法は特に限定されない。
▲１▼  合成高分子を０．１２５ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．２５〜１．５ｗ／ｖ％含み、合成高分子の増殖因子に対する重量比が上述の条件を満足するコーティング液を、２５℃以上、好ましくは２７〜２９℃で乾燥させる。このように低濃度で感温性高分子を含む液を２５℃未満の温度で乾燥させると、癌細胞を選択的に培養できる基材が得られない。高分子濃度０．１２５ｗ／ｖ％未満だと、乾燥温度をどのように設定しても癌細胞を選択的に培養できる基材が得られない。
【００１２】
▲２▼  合成高分子を０．７５ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．９〜２．０ｗ／ｖ％含み、合成高分子の増殖因子に対する重量比が上述の条件を満足するコーティング液をＬＣＳＴよりも低い温度、好ましくは１０〜２５℃で乾燥させる。高分子０．７５ｗ／ｖ％未満だと、上記▲１▼のやり方で培養基材を作る必要がある。高分子量が多すぎると細胞が基材に接着しないことがあるので上記上限値以下が好ましい。ＬＣＳＴよりも高い温度で乾燥させると、感温性高分子が凝集し、培養器から剥離し表面のコーティングが不均一になるおそれがある。
【００１３】
この発明で培養される癌細胞の種類は制限はなく、種々の癌細胞が可能である。この点は従来の方法とは異なる。癌細胞に混在する正常細胞も、線維芽細胞などいずれでも良く、制限はない。この点も従来の方法と異なる。この発明の方法は、細胞を接着させる対象として上記培養基材を用いること以外は従来の接着培養方法と同じやり方で行うことができる。培養に用いる液体培地や培養条件は、培養される細胞に応じて適宜設定すればよい。
【００１４】
この発明の方法を癌細胞傷害試験に適用する場合、癌細胞に接触させる薬剤は、制癌剤などである。癌細胞を薬剤に接触させてから上記培養基材に接着させて培養してもよいし、基材に接着させた癌細胞を薬剤の存在下で培養してもよい。基材への接着の前後で同じかまたは別の薬剤に接触させてもよい。
この発明の方法を用いると、癌細胞と正常細胞を識別することが可能である。たとえば、培養基材を支持基質である培養器表面に部分的に、スポット状に形成して培養を行うと、癌細胞は培養基材表面全体に増殖するのに正常細胞はそのスポット状部分には伸展せず増殖を停止するので、これによって識別することができる。
【００１５】
この発明の方法は、正常細胞が混入しやすい初代癌細胞の培養、臨床検体や形質転換した細胞を対象としてフォーカス形成による細胞の癌化能や悪性度の指標とする方法、単離した癌細胞を用いて抗癌剤（制癌剤）感受性試験や癌細胞に関連した酵素、細胞増殖因子、細胞外基質、腫瘍マーカーの研究、および、製品化、または、癌遺伝子、癌抑制遺伝子およびその産物の研究および製品化にも有用である。
【００１６】
この発明の方法によって培養された癌細胞は、たとえば、増殖因子と合成高分子のうちの一方または両方を選択的に溶解（分解して溶解する場合も含む）することにより、回収することも可能である。
【００１７】
【作用】
この発明によれば、実質的に合成高分子と細胞増殖因子からなる培養基材表面で、正常細胞が混在する癌細胞を培養するので、癌細胞が交差細胞配列や重なり合い増殖を起こす。しかも、正常細胞が混在する癌細胞を培養しても、正常細胞は合成高分子により伸展しなかったり増殖を停止または抑制されたりするのに対し、癌細胞はその合成高分子が混合されていても増殖する。このため、正常細胞が混在する癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００１８】
【実施例】
以下に、この発明の実施例と、この発明の範囲を外れた比較例とを示すが、この発明は下記実施例に限定されない。下記の製造例で作った合成高分子水溶液を以下の実施例と比較例で使用した。
（合成高分子水溶液の製造例）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５０ｇをベンゼン５００ｍｌに溶解し、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．２ｇを重合開始剤として使用し、６０℃で１２時間、窒素気流中、攪拌下に重合を行って、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」と言う）を製造した。この重合物はベンゼン中で沈殿するためデカンテーションした後、沈殿物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、ジエチルエーテルを用いて沈殿精製を行った。得られたＰＮＩＰＡＡｍの１．０ｗ／ｖ％水溶液のＬＣＳＴ（濁度法による測定値）約３２℃であった。この水溶液をオートクレーブで滅菌処理し、ＬＣＳＴよりも低温にして再溶解し、０．２５、０．５、１．０、２．０および４．０ｗ／ｖ％の各水溶液を得た。
【００１９】
（実施例１Ａ）
０．３ｗ／ｖ％のコラーゲン水溶液（新田ゼラチン株式会社製品セルマトリックス・タイプＩ−Ｃ、ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン溶液）と１．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液とを等量混合したものを４℃で１日間スターラーで攪拌してコーティング溶液を作った。このコーティング溶液は、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含む。コーティング溶液を２８℃に保温し、同じ温度に保温した細胞培養用プラスチックディッシュ（２５０１０、岩城硝子株式会社製）に０．５ｍｌを注ぎ、ディッシュの表面全体をコーティング溶液で濡らした後、すぐに余剰液を吸い出して除去し、ディッシュを２８℃の恒温槽中に一晩入れて乾燥した。乾燥したディッシュはその表面にコラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍを１：３．４の重量比で含む層を有する。乾燥したディッシュをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このディッシュに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０５  細胞／ｍｌの割合で結腸癌株（ＤＬＤ−１）を懸濁した細胞懸濁液１ｍｌを播種した。この細胞懸濁液の入ったディッシュを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で４日間培養した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２０】
（比較例１Ａ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液を１０℃に保温し、１０℃に保温したディッシュを用い、１０℃の恒温槽で乾燥したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図３にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２１】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液を３０〜３４℃に保温し、３０〜３４℃に保温したディッシュを用い、３０〜３４℃の恒温槽で乾燥したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図２にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２２】
図１〜３中、それぞれ、Ａは画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍ、Ｂは画面横全長２６６６μｍで縦全長１７２７μｍである。図１〜３において、白い輪郭の黒い粒状の像が癌細胞である。
実施例１Ａと１Ｂでは、図１と２にそれぞれ見るように、個々の細胞が伸展せず球状に丸くなっている。比較例１Ａでは、図３にみるように、個々の細胞が丸くならずに多角形に伸展している。この現象は市販の培養器と同様に平面的な細胞伸展性である。なお、実施例１Ａ〜１Ｂも比較例１Ａも癌細胞特有の重なり合い増殖は示していた。
【００２３】
（実施例１Ｃ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍの濃度を１．０ｗ／ｖ％にしたこと、および、乾燥を１０℃で行ったこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察したところ、実施例１Ａと同様の結果が得られた。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２４】
（実施例１Ｄ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍの濃度を２．０ｗ／ｖ％にしたこと、および、乾燥を１０℃で行ったこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察したところ、実施例１Ａと同様の結果が得られた。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２５】
上記実施例１Ａ〜１Ｄと比較例１Ａの結果より、合成高分子として感温性高分子を用いると、コーティング溶液の乾燥温度によって培養基材の細胞に対する表面性状が変わり、細胞の伸展性、増殖形態に変化をもたらすことがわかる。
（実施例２Ａ〜２Ｃと比較例２Ａ〜２Ｃ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液の乾燥温度を表１に示す温度に設定したこと、癌細胞株の代わりに生体から分離した癌細胞（表１参照）を含んだ外科手術材料を使用したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養６日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図４〜９にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２６】
【表１】
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図４〜９は、画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍである。図４〜６では、島状の領域が癌細胞コロニーであり、一部は重なり増殖により厚いコロニー（黒い像）となっており、線維芽細胞は見られない。これに対し、図７〜９では、線維芽細胞（黒い細長い像）と配列が不規則でドーム状に増殖した癌細胞とが混在している。図７では左上から中央下部にかけてカギ状に占めている領域が正常細胞であり、その他の領域は癌細胞である。図８では左下から半島状に突き出している領域が正常細胞であり、その他の領域は癌細胞である。図９では、右上の丸い領域と中央下部の丸い領域が癌細胞であり、その他の領域は正常細胞である。実施例では、３検体とも癌細胞のみが増殖して線維芽細胞は増殖を示さないことが観察され、これらの実施例の培養基材が癌細胞の選択的培養に使用できることがわかる。
【００２７】
（実施例３Ａ）
０．３ｗ／ｖ％のコラーゲン水溶液（新田ゼラチン株式会社製品セルマトリックス・タイプＩ−Ｃ、ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン溶液）と２．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液とを等量混合したものを４℃で１日間スターラーで攪拌してコーティング溶液を作った。このコーティング溶液は、ＰＮＩＰＡＡｍを１．０ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含む。コーティング溶液を１０℃に保温し、同じ温度に保温した細胞培養用１２ウェル（ｗｅｌｌ）プレート（ＭＳ−８０１２０、スミトモベークライト株式会社製）に０．２５ｍｌ／ウェルの割合で表面全体を浸した後、すぐに余剰液を吸い出して、１０℃の恒温槽で２４時間乾燥した。乾燥したプレートは、そのウェル内面にコラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍを１：６．７の重量比で含む層を有する。乾燥したプレートをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このプレートの各ウェルに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０５  細胞／ｍｌの割合で肺癌細胞株（ＱＧ−５６）を懸濁した細胞懸濁液を、各ウェルの細胞数が５×１０４  個となるように播種した。この細胞懸濁液の入ったプレートを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で５日間培養した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１０のＡにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２８】
他方、上記操作において、肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同様の操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１０のＢにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（比較例３Ａ）
実施例３Ａにおいて、１．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液を用いたこと、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１１のＡにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２９】
他方、上記操作において、肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同様の操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１１のＢにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（実施例３Ｂ）
実施例３Ａにおいて、肺癌細胞株の代わりに、ＨＦＬ−１とＱＧ−５６を４：１の細胞数比で均一に混合した細胞群を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１２にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３０】
（比較例３Ｂ）
比較例３Ａにおいて、肺癌細胞株の代わりに、ＨＦＬ−１とＱＧ−５６を４：１の細胞数比で均一に混合した細胞群を用いたこと以外は比較例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１３にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３１】
図１０〜１３中、画面横全長２６６６μｍで縦全長１７２７μｍである。図１０〜１３において、黒い粒状の像が癌細胞であり、黒い細長い像が線維芽細胞である。
比較例３Ａでは、図１１にみるように、癌細胞と線維芽細胞はそれぞれ市販の培養器に直接播種された場合と同様に培養器全体に平面的に偏平に増殖した。特に、線維芽細胞は密集した状態で平行した、規則的な配列を示している（細胞が流れるように配列している）。これに対し、実施例３Ａでは癌細胞が重なり合い増殖（パイルアップ、癌細胞の特徴の１つ）するのが認められ（図１０のＢ参照）、重なり合い増殖が培養器全体に拡がるが、線維芽細胞はほとんど増殖しなかった（図１０のＡ参照）。
【００３２】
実施例３Ｂでは、図１２にみるように、癌細胞は図の中央部に見るように多数集まって塊状になって増殖しているのに対し、線維芽細胞はごくわずかの基材に接着しているがほとんど増殖していない。このため、この発明によれば、癌細胞が正常細胞と共存していても癌細胞の選択的増殖が可能である。これに対し、比較例３Ｂでは、図１３にみるように、線維芽細胞が優先的に培養基材全体に増殖しており、癌細胞が平面的に伸展して部分的に増殖している。
【００３３】
上記実施例と比較例では、この発明の培養方法の効果をわかりやすく示すために細胞株を用いて培養を行ったが、次に、実際に初代培養を行った実施例と比較例を示す。
（実施例４Ａ）
この実施例では、生体から分離した直腸組織で外科手術材料を使用した。この材料では癌細胞と正常細胞とが共存している。３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０５  細胞／ｍｌの割合で上記材料を酵素処理で分散して細胞懸濁液を得た。実施例３Ａにおいて、この細胞懸濁液を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１４にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３４】
（コントロール４Ａ）
実施例４Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１５にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３５】
（比較例４Ａ）
実施例４Ａにおいて、コラーゲンを含まず、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。しかし、癌細胞も線維芽細胞も接着しないので培養できなかった。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３６】
（実施例４Ｂ）
生体から分離した肺組織の外科手術材料を使用したこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１６にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（コントロール４Ｂ）
実施例４Ｂにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ｂの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１７にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３７】
（実施例４Ｃ）
生体から摘出した肺組織の外科手術材料を使用したこと、および、乾燥を室温（２８℃±１℃）乾燥で行ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１８にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３８】
（コントロール４Ｃ）
実施例４Ｃにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ｃの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１９にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３９】
図１４〜１９中、画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍである。図１４、１６〜１９において、所々白くなっている黒い粒状の塊や真っ黒な大きな塊の像が癌細胞コロニーであり、黒い細長い像が線維芽細胞である。図１５では、左端の大きな丸い領域が癌細胞である。
図１４、１６および１８にみるように、この発明によれば、癌細胞は重なり合い増殖してコロニーを形成したのに対し、線維芽細胞は基材にごくわずかに接着しているが増殖が認められず、癌細胞が選択的に培養された。これに対し、図１５、１７および１９にみるように、比較例では、癌細胞（図１５の左端の丸い領域、図１７と１９の黒い領域）の周りに線維芽細胞が優先的に増殖して基材全体に拡がっていた。
【００４０】
（比較例５Ａ）
実施例３Ａにおいて、０．５ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液を用いてＰＮＩＰＡＡｍを０．２５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同じ操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法で癌細胞と線維芽細胞のＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４１】
（実施例５Ａ〜５Ｆおよび比較例５Ｂ）
比較例５Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍ濃度または乾燥温度を表２に示すように変えたこと以外は比較例５Ａの操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法で癌細胞と線維芽細胞のＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４２】
【表２】
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（コントロール５Ａ）
比較例５Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は比較例５Ａの操作を繰り返した。肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同じ操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法でＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４３】
実施例５Ａ〜５Ｆと比較例５Ａ〜５Ｂの培養による癌細胞と線維芽細胞の増殖度を下式：
【００４４】
【数１】
0003594978.tif 000004
【００４５】
【数２】
0003594978.tif 000005
により求めた。増殖度１００％は、コラーゲン基材上での培養による増殖度と同じであることを意味する。結果を図２０〜２１に示した。
【００４６】
表２と図２０〜２１にみるように、感温性高分子濃度を高くするにつれて、正常細胞の増殖度は、癌細胞の増殖度に比べて大きく低下し、乾燥温度が高いとより大きく低下した。癌細胞の増殖度は乾燥温度の影響をほとんど受けない。
（実験１）
実施例４Ａと比較例４Ａで用いた各培養基材を使って、線維芽細胞株の培養実験を行った。乾燥したプレートをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このプレートの各ウェルに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０５  細胞／ｍｌの割合で線維芽細胞株（ＮＢ−１）を懸濁した細胞懸濁液を、各ウェルの細胞数が７×１０４  個となるように播種した。この細胞懸濁液の入ったプレートを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で６日間培養した。培養開始時、２日、４日、６日日後にそれぞれウェル内面に接着している細胞をエタノールで固定し、ＤＮＡ蛍光法で増殖度を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４７】
線維芽細胞株をＨＦＬ−１およびＭＲＣ−５にそれぞれ変えて上記実験１を繰り返した。培養開始時、２日、４日、６日日後にそれぞれウェル内面に接着している細胞をエタノールで固定し、ＤＮＡ蛍光法で増殖度を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
実験１での測定結果を、実施例は図２２のＡのグラフに、比較例は図２２のＢのグラフに示した。
【００４８】
図２２にみるように、比較例４Ａの培養基材ではどの線維芽細胞も同様にどんどん増殖していくのに対し、実施例４Ａの培養基材では培養開始時の細胞数からほとんど増加していないかまたはわずかしか増加していないことから線維芽細胞の増殖が停止あるいは抑制されていることがわかる。顕微鏡観察により、線維芽細胞が死んでいないことを確認した。
【００４９】
（実施例６Ａ〜６Ｌ、比較例６Ａ〜６Ｆおよびコントロール６Ａ〜６Ｃ）
実施例３Ａにおいて、癌細胞株として表３に示すものを用いたこと、または、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍ濃度または乾燥温度を表３に示す数値に設定したこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法でＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。ＺＲ−７５−１は乳癌株、Ｃ−１は結腸癌株、Ａ−５４９は肺癌株である。
【００５０】
【表３】
0003594978.tif 000006
実施例６Ａ〜６Ｌと比較例６Ａ〜６Ｆで培養された癌細胞の増殖度を上記数１に従って求め、結果を図２３に示した。
【００５１】
図２３にみるように、この発明の培養方法によれば、コラーゲン基材培養とほぼ同等かまたはわずかに低い増殖度で種々の癌細胞を増殖させることができる。
（実験２）
実施例３Ａで使用したコーティング溶液を市販の培養器に１マイクロリットルずつ、および、１０マイクロリットルずつ滴下し、培養器表面をコーティング溶液のスポットで部分的にコーティングし、１０℃および２８℃の各温度それぞれ乾燥したところ、表４の結果となった。
【００５２】
【表４】
0003594978.tif 000007
ここで、分離層ありとは、円形のコーティング膜が白濁した内円と透明なその外周リング（同心円状）とを有することであり、分離層なしとは、コーティング膜が透明で均一な円形となっていることである。
【００５３】
内円部には細胞が接着し、それと同心円状の外周リング（外円部）には細胞が接着しないことから内円部はコラーゲンからなっており、外円部は合成高分子からなっていることがわかった。これらのことから、タイプＩコラゲナーゼ（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）のようなコラーゲンを溶かす酵素で内円部を溶かして細胞を回収する方法も考えられる。
【００５４】
（実験３）
実験２で使用したコーティング溶液において、コラーゲン濃度がそれぞれ０．００１５、０．０１５、０．１５ｗ／ｖ％の３種類設定し、実験２と同様にして滴下し、２８℃で乾燥させて、分離層を作り、顕微鏡下でマイクロメーターにより内円と外円の直径を測定した。結果は表５のとおりである。
【００５５】
【表５】
0003594978.tif 000008
表４と５の結果は、この発明で使用する培養基材では癌細胞と正常細胞が接着しうる増殖因子主体とする部分が、合成高分子を主体とする部分で囲まれていて、正常細胞の増殖を抑制または停止させる境界が存在することを示している。
【００５６】
（実施例７Ａ〜７Ｃと比較例７Ａ〜７Ｂ）
実施例３Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍ濃度を表６に示す数値に変えたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養６日後、ウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察し、視野に占める細胞の面積を下記の基準で評価した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
◎…８０〜１００％
○…６０〜８０％
△…３０〜６０％
×…０〜３０％
結果を表６に示した。
【００５７】
【表６】
0003594978.tif 000009
表６にみるように、乾燥温度が１０℃のときには、合成高分子濃度が０．７５〜２．０ｗ／ｖ％で癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００５８】
【発明の効果】
この発明の方法により、癌細胞の培養、特に初代癌細胞培養を行うと、癌細胞が生体内での増殖と同様にその特質を発揮しながら増殖し、また、癌細胞に混在する正常細胞の伸展や増殖は停止または抑制される。この発明によれば、正常細胞を殺傷する薬剤を使用したりそのような培養条件を設定したりする必要がない。この発明によれば、培養基材以外は一般の細胞培養と同じ条件、装置を用いて、癌細胞およびこれと共存する正常細胞の種類や量に関わらず、癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００５９】
この発明によれば、従来困難であった癌細胞と正常細胞の区別を簡便に行い、癌細胞を単独で培養可能であるため、癌細胞単独の実験、観察が可能である。また、癌細胞の単離による株化もより容易になる。
この発明の方法を用いて癌細胞傷害試験を行えば、培養試験成功率の向上が期待される。従来の初代癌細胞培養法では混入した正常細胞の影響が非常に大きいのでその影響を差し引いて試験データを解析していた。これに対し、この発明の方法を用いた細胞傷害試験データは、前記影響が少なくなるので、データそのものがより正確になり、また、前記影響を差し引いたとしても正確さが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図２】実施例１Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図３】比較例１Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図４】実施例２Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図５】実施例２Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図６】実施例２Ｃで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図７】比較例２Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図８】比較例２Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図９】比較例２Ｃで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１０】実施例３Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１１】比較例３Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１２】実施例３Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１３】比較例３Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１４】実施例４Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１５】コントロール４Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１６】実施例４Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１７】コントロール４Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１８】実施例４Ｃで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１９】コントロール４Ｃで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図２０】コーティング液の合成高分子量に対する、癌細胞株と線維芽細胞株の増殖度を示すグラフである。
【図２１】コーティング液の合成高分子量に対する、癌細胞株と線維芽細胞株の増殖度を示すグラフである。
【図２２】線維芽細胞の培養日数による経時的増殖を示すグラフである。
【図２３】コーティング液の濃度と乾燥温度による癌細胞の増殖度の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
ＱＧ−５６  癌細胞株
ＨＦＬ−１  線維芽細胞株
ＮＢ−１    線維芽細胞株
ＭＲＣ−５  線維芽細胞株
ＺＲ−７５−１  乳癌株
Ｃ−１          結腸癌株
Ａ−５４９      肺癌株
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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