(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プラスミドpNB2（DSM9196）のDNA挿入配列に含まれるナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラーゼをコードするコード領域によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列；
（ｂ）プラスミドpNB2（DSM9196）のDNA挿入配列に含まれるナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラーゼをコードするコード領域のヌクレオチド配列を有するDNA配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列のいずれかに厳密な条件下でハイブリダイズするDNA配列；および
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）に記載の配列と比較して遺伝コードのため縮重しているDNA配列
からなる群から選択される、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列。
【請求項２】
（ａ）生物の細胞のゲノムDNAまたはmRNAに基づき、ゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する段階；
（ｂ）段階（ａ）により構築されたライブラリーで適当な宿主を形質転換する段階；
（ｃ）形質転換した細胞をヨウ素蒸気に曝す段階；
（ｄ）青色に染色された細胞を同定する段階；
（ｅ）段階（ｄ）で同定された細胞を単離し培養する段階；
（ｆ）形質転換された細胞からゲノムDNA挿入配列またはcDNA挿入配列を単離する段階、および
（ｇ）単離されたDNA配列にコードされるタンパク質がアミロスクラーゼ活性を有することを確認する段階、
を含む方法により得られる、請求の範囲１に記載のDNA配列。
【請求項３】
請求の範囲１または２に記載のDNA配列を含有する組換えDNA分子。
【請求項４】
アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列が、原核細胞または真核細胞中での転写を可能にするDNA配列に結合している、請求の範囲３記載の組換えDNA分子。
【請求項５】
DSM9196として寄託されたプラスミドpNB2。
【請求項６】
請求の範囲３〜５のいずれか一項記載の組換えDNA分子を含有する微生物。
【請求項７】
請求の範囲３〜５のいずれか一項記載の組換えDNA分子を含有する真菌。
【請求項８】
請求の範囲１または２に記載のDNA配列によってコードされるアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求の範囲６に記載の微生物または請求の範囲７に記載の真菌を、適当な培地中で培養することを含む、請求の範囲８に記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項１０】
DNA配列の発現を担うDNA配列に結合した請求の範囲１または２に記載のDNA配列が双子葉植物細胞に導入され、完全な植物が該植物細胞から再生されることを特徴とする、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる双子葉植物を製造する方法。
【請求項１１】
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）植物中で活性であり、各々の標的組織または標的細胞中でRNAを生成するプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードし、センス配向でプロモーターに融合している、請求の範囲10に記載の少なくとも１つのDNA配列；
（iii）RNA分子の転写終止およびポリアデニル化のために植物中で機能するシグナル、
を有する発現カセットを産生する段階；
（ｂ）発現カセットを植物細胞中に導入する段階；および
（ｃ）形質転換された植物細胞から完全な植物を再生する段階、
を含む、請求の範囲10に記載の方法。
【請求項１２】
請求の範囲１または２に記載のDNA配列が微生物中に導入され、発現される、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる微生物の製造方法。
【請求項１３】
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）選択された微生物中で活性であり、その下流のDNA配列の転写を担うプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロモーターに融合したDNA配列；
（iii）微生物中で機能する転写終止シグナル
を有する発現カセットを産生する段階、および
（ｂ）段階（ａ）で産生された発現カセットで適当な微生物を形質転換する段階、
を含む、請求の範囲12に記載の方法。
【請求項１４】
請求の範囲１または２に記載のDNA配列が真菌細胞中に導入され、発現される、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる真菌細胞の製造方法。
【請求項１５】
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）選択された真菌中で活性であり、その下流のDNA配列の転写を担うプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロモーターに融合したDNA配列；
（iii）真菌細胞中で機能する転写終止シグナル、
を有する発現カセットを産生する段階、および
（ｂ）段階（ａ）で構築された発現カセットで真菌細胞を形質転換する段階、
を含む、請求の範囲14に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞中におけるDNA配列の発現を可能にするDNA配列と組合せた、請求の範囲１または２に記載のDNA配列を含有するトランスジェニック植物細胞。
【請求項１７】
植物細胞中におけるDNA配列の発現を可能にするDNA配列と組合せた、請求の範囲１または２に記載のDNA配列を含有するトランスジェニック双子葉植物。
【請求項１８】
トランスジェニック双子葉植物が、テンサイ、タバコ、トマトまたはジャガイモであることを特徴とする、請求の範囲17に記載の植物。
【請求項１９】
請求の範囲１もしくは２に記載のDNA配列を使用して、ハイブリダイゼーションにより相同的なDNA配列またはRNA配列の単離する方法。
【請求項２０】
（ａ）アミロスクラーゼを培地中に分泌する、請求の範囲６に記載の微生物または請求の範囲７記載の真菌を、スクロース含有培地中でアミロスクラーゼを発現および分泌させる条件下で培養すること、並びに
（ｂ）培地から生成したα−1,4グルカンおよび／またはフルクトースを回収すること、
を含む直鎖型α−1,4グルカンおよび／またはフルクトースを製造する方法。
【請求項２１】
宿主細胞が固定化されている、請求の範囲20の方法。
【請求項２２】
（ａ）アミロスクラーゼによりスクロースをα−1,4グルカンおよび／またはフルクトースに変換させる条件下で、スクロース含有溶液を請求の範囲８のタンパク質に接触させること、並びに
（ｂ）その溶液から生成したα−1,4グルカンおよび／またはフルクトースを回収すること、
を含む直鎖型α−1,4グルカンおよび／またはフルクトースをインビトロで製造する方法。
【請求項２３】
タンパク質が固定化されている、請求の範囲22の方法。
【請求項２４】
（ａ）生物の細胞のゲノムDNAまたはmRNAに基づき、ゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する段階；
（ｂ）段階（ａ）により構築されたライブラリーで適当な宿主を形質転換する段階；
（ｃ）形質転換した細胞をヨウ素蒸気に曝す段階；
（ｄ）青色に染色された細胞を同定する段階；
（ｅ）段階（ｄ）で同定された細胞を単離し培養する段階；
（ｆ）形質転換された細胞からゲノムDNA挿入配列またはcDNA挿入配列を単離する段階、および
（ｇ）単離されたDNA配列にコードされるタンパク質がアミロスクラーゼ活性を有することを確認する段階、
を含むアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列を製造する方法。
【請求項２５】
請求の範囲10または11に記載の方法の段階を含み、植物において合成された直鎖型α−1,4グルカンを植物から単離する段階をさらに含む、直鎖型α−1,4グルカンを生産する方法。
【請求項２６】
発現カセットが、液胞またはアポプラストへのアミロスクラーゼタンパク質の輸送を確実にする輸送ペプチドをコードする配列を含む、請求の範囲25に記載の方法。
【請求項２７】
アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする、（ii）に示されているDNA配列が、アポプラストへの分泌をもたらすシグナル配列を含まない、請求の範囲25に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）に定義されているプロモーターが、ショ糖を貯蔵する植物の器官におけるアミロスクラーゼの発現を確実にする、請求の範囲25に記載の方法。
【請求項２９】
請求の範囲22に記載の方法によって得られる、直鎖型α−1,4グルカン。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アミロスクラーゼ（amylosucrase）活性を示すタンパク質を細胞内または細胞外で発現することができ、ショ糖からの直鎖型α−1,4グルカンの合成を触媒することができる植物および微生物を産生するための組換えDNA技術に関する。
さらに本発明は、植物ゲノムへ組み込まれた後、または微生物（特に細菌または真菌）へ形質転換された後、ショ糖からの直鎖型α−1,4グルカンの合成を触媒する酵素を発現するDNAを含有する新しいDNA配列およびプラスミド、ならびに上記DNA配列を含有するトランスジェニック生物（すなわち、植物、真菌および微生物）に関する。
直鎖型α−1,4グルカンは、グルコースモノマーから構成される多糖であり、グルコースモノマーはα−1,4グリコシド結合でのみ互いに結合している。最も多く存在する天然α−1,4グルカンは、植物デンプンの一成分であるアミロースである。最近、直鎖型α−1,4グルカンの商業的使用がますます重視されている。その物理化学的性質のために、アミロースは、無色無臭で香りがなく、毒性がなくかつ生物学的に分解可能なフィルムを製造するのに使用することができる。すでに今日、例えば食品産業、繊維産業、ガラス繊維産業および紙の製造の分野で、応用の可能性が数多くある。
天然のセルロース繊維と性質が同様である繊維をアミロースから製造し、紙の製造において部分的にまたは完全に両者を置き換えることに成功している。
アミロースは直鎖型α−1,4グルカンの最も重要な代表的物質であるため、錠剤製造の結合剤として、プリンやクリームの増粘剤として、ゼラチン代替物として、防音壁パネル製造の接合材として、そして蝋質油の流動性を改良するために特に使用されている。
最近ますます注目されているα−1,4グルカンの別の性質は、その分子がらせん構造のため有機化合物と包接化合物を形成する能力を有することである。この性質のために、α−1,4グルカンは広範囲の用途に使用できる。現在は、ビタミン、薬剤化合物および芳香物質の分子カプセル化のための使用、ならびに固定化直鎖型α−1,4グルカンによる物質の混合物のクロマトグラフィー的分離のための使用が考えられている。
アミロースはまた、いわゆるシクロデキストリン（シクロアミロース、シクロマルトースとも呼ばれる）製造の出発物質となる。シクロデキストリンはまた、製薬産業、食品加工技術、化粧品産業、および分析分離技術において広く使用されている。これらのシクロデキストリンは、６〜８個の単糖単位からなる環状マルトオリゴ糖であり、これは水に自由に溶解するが、包接化合物を形成するために利用できる疎水性の間隙を有する。
現在、直鎖型α−1,4グルカンは、デンプンからアミロースの形で得られる。デンプン自体は２つの成分からなる。１つの成分は、α−1,4結合グルコース単位の非分岐鎖としてのアミロースを形成する。他の成分は、α−1,4結合以外にグルコース鎖がα−1,6結合で分岐することもできる、グルコース単位からなる高度に分岐したポリマーであるアミロペクチンを形成する。これらの２つはその構造の違いとそれに由来する物理化学的性質の違いにより、異なる分野でも使用される。個々の成分の性質を直接利用できるようにするためには、これらを純粋な形で得ることが必要である。両成分ともデンプンから得られるが、数段階の精製が必要であり、多大な時間および費用がかかる。
したがって、デンプンの両成分を均一に得る可能性を見いだすことが緊急に必要とされている。このために、これまで、改変されたアミロース／アミロペクチン比率を有するデンプンを産生するために、デンプン産生植物が交配または遺伝子操作により改変されてきた。トウモロコシデンプンの通常のアミロペクチンの割合は、例えば70％であるが、交配によってほとんど100％のアミロペクチンよりなるデンプンを有するトウモロコシ変種（ワクシーメイズ（waxy maize））の確立に成功している（Akatsuka and Nelson,1966,J.Biol.Chem.241:2280−2285）。
さらにアミロース含有が増加した（60〜70％）いくつかのトウモロコシ変種（例えば、アミロースエクステンダー（amylose extender）変種およびアミロースダル（amolose dull）変種）が、交配により製造されている（Wolf et al.,1955,J.Am.Chem.Soc.77:1654−1659;Boyer et al.,1976,Die Starke:28:405−410）。アミロペクチンの形で均一なデンプンを合成する他の変種［例えば、コメ（Sano,1984,Theor.Appl.Genet.68:467−473）およびオオムギ（Shannon and Garwood,1984,Whistler,Bemiller,Paschall,Starch:Chemistry and Technology中、アカデミックプレス（Academic Press）、オーランド（Orlando）、第２版:25−86）、または高度にアミロースを含有するデンプン（例えば、エンドウ（peas））を合成する変種］を得るために他の植物が使用されている。上記の古典的な交配以外に、デンプン産生植物の遺伝子操作に基づく方法が報告されている。
例えば、「Visser et al.（1991,Mol.Gen.Genet.255:289−296）」は、デンプン顆粒結合デンプン合成酵素をコードする遺伝子のアンチセンス阻害により得られる、実質的に純粋なアミロペクチンデンプンを合成するジャガイモ変種を開示している。
国際公開第92/14827号（WO92/14827）は、分岐酵素の発現のアンチセンス阻害のために、アミロース／アミノペクチン比の増加したデンプンを産生するジャガイモの生産を開示している。しかし、国際公開第92/14827号に記載の植物は、高度にアミロースを含有するデンプンを産生しない。
これまで、数多くの試みおよび様々な方法にもかかわらず、純粋なアミロースデンプンを産生する植物を得ることはまだ成功していない。
またこれまで、他の方法、例えば遺伝子操作した微生物を用いて、高度に純粋なアミロースまたは純粋な直鎖型α−1,4グルカンを製造できる可能性は開示されていない。
さらに、植物、真菌、微生物、またはインビトロで直鎖型α−1,4グルカンの合成を触媒することができる酵素をコードするDNA配列はまだ、見いだされていない。
したがって、本発明の目的は、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる植物、真菌および微生物の製造を可能にするDNA配列および方法を提供することである。
本発明の目的は、本発明の請求の範囲により特徴付けられる態様の提供によって達成される。
したがって、本発明は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。
特に、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列、およびそれをコードする配列番号１に記載のDNA配列に関する。さらに本発明は、上記の本発明の配列とハイブリダイズし、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列、ならびに上記の本発明のDNA配列と比較して遺伝コードにより縮重しているDNA配列に関する。
本明細書において「ハイブリダイゼーション」という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション、好ましくは、例えばサムブルック（Sambrook）ら（1989、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク）に記載のような厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。
別の態様において、本発明は、以下の段階からなる方法により得られる、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する：
（ａ）生物の細胞のゲノムDNAまたはmRNAに基づき、ゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する段階；
（ｂ）段階（ａ）で構築されたライブラリーで適当な宿主を形質転換する段階；
（ｃ）形質転換された細胞をヨウ素蒸気に曝す段階；
（ｄ）青色に染色された細胞を同定する段階；
（ｅ）段階（ｄ）で同定された細胞を単離し、培養する段階；および
（ｆ）形質転換された細胞からゲノムDNA挿入配列またはcDNA挿入配列を単離する段階。
段階（ｂ）に記載の適当な宿主は、例えば大腸菌（E.coli）である。
好適な実施態様において本発明は、微生物、特にグラム陰性微生物、好ましくはナイセリア（Neisseria）種の細菌（特に好ましくはナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea））由来のアミロスクラーゼをコードするDNA配列に関する。
本発明のDNA配列はまた、発現されるタンパク質のある性質を改変するために、突然変異、または挿入、欠失、置換もしくは組換えによる配列改変により修飾することもできる。
これらの修飾の１つは、特に酵素の分泌を担うシグナル配列を欠失させ、他のシグナル配列または移動ペプチドをコードするDNAを挿入して、発現されるタンパク質の局在に影響を与えることである。
本発明のDNA配列、特に配列番号１に示される本発明のDNA配列またはその部分を、相同DNA配列がある生物中に存在するか、または発現しているかを決定するために使用することができる。これを行うためには、各生物のDNAまたはmRNA試料を、従来の方法で適当なハイブリダイゼーション条件下で本発明のDNA配列にハイブリダイズさせる。
また、本発明のDNA配列を用いることにより、標準的方法を用いて、種々の生物のゲノムから、アミロスクラーゼまたは類似の性質を有する酵素を同様にコードする相同配列を単離することができる。本明細書において、相同性とは、少なくとも40％〜60％、好ましくは60％を超える、特に80％を超える、さらに好ましくは95％を超える配列同一性を意味する。相同性とはまた、各DNA配列またはコードされるアミノ酸配列が、機能的におよび／または構造的に同等であることを意味する。本発明の配列に相同であって、１つまたはそれ以上の位置で本発明のDNA配列またはそれによりコードされるアミノ酸配列とは異なる配列は、通常、同じ機能を有する修飾物である該配列の変種である。これらは、天然に存在する変種、他の生物の同様の配列、または突然変異体であってもよい。これらの突然変異は、天然に存在するものであっても、または特定の突然変異誘発により達成されるものであってもよい。さらに、これらの変種は、合成的に産生された配列でもよい。これらのDNA配列はすべて、同様に本発明に包含される。
本発明のDNA配列の種々の変種によりコードされるタンパク質は、特定の共通の特徴（例えば、酵素活性、免疫学的反応性、コンフォメーションなど）、および物理的性質（例えば、電気泳動的移動度、クロマトグラフィーでの挙動、沈降係数、可溶性、分光学的性質、安定性など）を共有する。
関連するDNA配列を決定するためには、生物の遺伝子の内容、または該生物中の、もしくは該生物のある組織の遺伝子の発現を代表する、試験される生物の遺伝子ライブラリーを得なければならない。前者のタイプはゲノムライブラリーであり、後者はcDNAライブラリーである。
このようなライブラリーからの相同DNA配列の同定および単離は、標準的な方法（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、1989、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨークを参照）でハイブリダイゼーションすることにより行われる。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１に記載のDNA配列またはその一部と正確にまたは実質的に同じDNA配列を示すDNA分子が使用できる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるDNA断片はまた、DNA合成の従来法により調製され、本発明の配列と実質的に同一である。本発明のDNA配列にハイブリダイズする遺伝子が同定され単離されたら、配列を決定し、その配列によってコードされるタンパク質の性質を解析する必要がある。
アミロスクラーゼ（ショ糖:1,4−αグルカン４−α−グルコシルトランスフェラーゼ、E.C.2.4.1.4.とも呼ばれる）は、以下の反応式を行うと考えられている酵素である：
0003555086.tif 000002
この反応はトランスグルコシル化である。この反応の生成物は、直鎖型α−1,4グルカンおよびフルクトースである。補因子は不要である。アミロスクラーゼ活性は、これまでほんのわずかの細菌種でのみ見いだされており、その１つが特にナイセリア種（Neisseria）（Mackenzie et al,1978,Can.J.Microbiol.24:357−362）であり、この酵素はその酵素活性についてのみ調べられている。オカダ（Okada）らによると、ナイセリア・ペルフラバ（Neisseria perflava）から部分精製された酵素をショ糖に加えると、ある程度分岐しているグリコーゲン様多糖が合成される（Okada et al.,1974,J.Biol.Chem.249:126−135）。同様にナイセリア・ペルフラバ（Neisseria perflava）およびナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）の細胞内または細胞外で合成されるグルカンは、ある程度の分岐を示す（Riou et al.,1986,Can.J.Microbiol.32:909.911）。これらの分岐がアミロスクラーゼにより導入されるものか、または精製アミロスクラーゼ調製物中に混在物質として存在する別の酵素により導入されるものかは、まだ解明されていない。分岐を導入する酵素がまだ解明されていないため、重合反応と分岐反応の両方がアミロスクラーゼにより触媒されると考えられている（Okada et al.,1974,J.Biol.Chem.249:126−135）。
ナイセリア（Neisseria）中で構成的に発現される酵素は、非常に安定であり、重合生成物に非常に強く結合し、そして生成物であるフルクトースにより競合的に阻害される（Mackenzie et al,1977,Can.J.Microbiol.23:1303−1307）。ナイセリア（Neisseria）種であるナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）は、アミロスクラーゼを分泌する（Riou et al.,1986,Can.J.Microbiol.32:909−911）が他のナイセリア（Neisseria）種ではアミロスクラーゼは細胞内にとどまる。
アミロスクラーゼ活性を示す酵素は、微生物でのみ見いだされている。アミロスクラーゼを有する植物は知られていない。
本発明により、アミロスクラーゼにより触媒される反応の生成物は、これまで推定されていたように分岐していない直鎖型α−1,4グルカンであることが証明できた（前述）。
アミロスクラーゼの酵素活性の検出は、実施例３で後述されるように合成したグルカンを検出することにより行われる。検出は、一般にヨード染色により行われる。例えばヨウ素蒸気で処理して、アミロスクラーゼを発現する細菌コロニーを同定することができる。直鎖型α−1,4グルカンを合成するコロニーが、青色に染色される。
精製された酵素の酵素活性は、例えばショ糖含有アガロースプレート上で検出できる。このようなプレートにタンパク質を適用し37℃で１時間またはそれ以上インキュベートすると、該タンパク質はアガロース中に分散し直鎖型グルカンの合成を触媒する。直鎖型グルカンは、ヨウ素蒸気での処理により検出できる。さらにタンパク質は、未変性ポリアクリルアミドゲル中で検出できる。未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルをクエン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH6.5）で平衡化させ、ショ糖溶液（クエン酸ナトリウム緩衝液中５％）中で一晩インキュベートする。次にゲルをルゴール溶液（Lugol's solution）で染色すると、直鎖型α−1,4グルカンの合成のためアミロスクラーゼ活性を有するタンパク質が局在している領域が青色に染色される。
本発明のDNA配列を利用して、純粋なアミロースデンプン、すなわち直鎖型α−1,4グルカンを産生すること、およびデンプンの高収率と同時に高いアミロース／アミロペクチン比率が得られるようにデンプン産生植物を修飾することが可能である。本発明のDNA配列は、ショ糖からの直鎖型α−1,4グルカンの合成を触媒する酵素を産生することができる微生物および真菌（特に、酵母）を製造するのに使用できる。
さらに本発明のDNA配列またはそれによりコードされるタンパク質を利用して、低い製造コストで純粋なフルクトースシロップを製造することができる。
別に態様において本発明は、組換えDNA分子、例えば本発明のDNA配列またはその部分を含有するベクター、特にプラスミド（例えば、DSM No.9196で寄託されたプラスミドpNB2）に関する。本発明は特に、微生物、真菌または植物中でアミロスクラーゼ活性を有するタンパク質の発現を担う配列に、本発明のDNA配列が結合した組換えDNA分子、例えば
（ａ）下流のコード配列を微生物中で転写させる、微生物中で活性のある適当なプロモーター、および
（ｂ）アミロスクラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、ポロペプチドに翻訳可能なRNAの形成を可能にするようにプロモーターに結合したDNA配列、を含有するプラスミド、または、
（ａ）下流のコード配列を、トランスジェニック植物の成長の適当な時間もしくは適当な段階で、またはトランスジェニック植物のある種の組織中で転写する、植物中で活性のある適当なプロモーター、および
（ｂ）アミロスクラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、ポリペプチドに翻訳可能なRNAの形成を可能にするようにプロモーターに結合したDNA配列、を含有するプラスミドに関する。
本発明のさらなる目的は、本発明の組換えDNA分子を含有する微生物、真菌および植物である。
本発明のさらに別の目的は、本発明のDNA配列の１つによりコードされるアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質であり、特に微生物由来のもの、好ましくはグラム陰性微生物、具体的にはナイセリア（Neisseria）属、特に好ましくはナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のものである。本発明の目的はさらに、ゲル電気泳動で63±20キロダルトン、好ましくは63±15キロダルトンおよび最も好ましくは63±10キロダルトンの分子量を有するアミロスクラーゼである。
本発明のさらなる目的は、特に配列番号１に記載のアミノ酸配列を示す、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質である。本発明はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、または１つまたはそれ以上の位置で該配列とは異なるアミノ酸配列を示すタンパク質に関する。この差異は好ましくは、保存的なアミノ酸置換であり、タンパク質はアミロスクラーゼの酵素活性を有する。すなわち、本発明はさらに、そのアミノ酸配列が配列番号１に示すアミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸配列、特に少なくとも70％の相同性、好ましくは80％を超える相同性、さらに好ましくは90％を超える相同性、そして特に好ましくは少なくとも99％の相同性を示す、アミロスクラーゼに関する。
さらなる態様において本発明は、本発明のDNA配列の使用、ならびに原核細胞または真核細胞の形質転換のため、および原核細胞または真核細胞中のアミロスクラーゼの発現のための、本発明のDNA配列を含有するDNA分子、特にプラスミドの使用に関し、また本発明の組換えDNA分子を含有する微生物を適当な栄養物質中で培養することにより、本発明のタンパク質を製造する方法にも関する。
特に、本発明の目的は、植物細胞中での発現および形質転換された細胞からの完全植物を再生を担うDNA配列に結合した、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする領域からなる本発明のDNA配列を、植物細胞中に導入することを特徴とする、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる植物の製造方法である。
さらに本発明は、以下の段階を含む、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる植物細胞および植物の製造方法に関する。
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）植物中で活性があり、各標的組織または標的細胞中でRNAを生成するプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードし、センス配向でプロモーターに融合している、少なくとも１つのDNA配列；
（iii）RNA分子の転写終止およびポリアデニル化に関して植物中で機能するシグナル、
を有する発現カセットを産生する段階；
（ｂ）発現カセットを植物細胞中に導入する段階；および
（ｃ）形質転換された植物細胞から完全な植物を再生する段階。
有用なプロモーターとは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターのように植物のすべての組織で、遺伝子を構成的に発現するプロモーター、ならびに植物の特定の器官またはその成長のある期間だけ発現させるプロモーターである。ジャガイモ植物の塊茎中で特異的発現を行うプロモーター、例えばB33プロモーター（Liu et al,1990,Mol.Gen.Genet.223:401.406）、またはテンサイの根で特異的発現を行うプロモーターが公知である。さらに、葉においてその下流のDNA配列の光依存性および組織特異的発現を可能にするDNA配列が記載されている（Orozco and Ogren,1993,Plant Mol.Biol.23:1129−1138）。
製造段階（ａ）（ii）に記載のDNA配列は、基本的にアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするコード領域を含む任意のDNA配列である。有用なDNA配列は、微生物、好ましくはグラム陰性微生物（具体的には、ナイセリア（Neisseria）属で、特にナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のDNA配列である。
本発明の方法の好適な態様において、配列番号１に記載のアミノ酸配列または実質的にこれと同一のアミノ酸配列を示すタンパク質とともに、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列を使用する。
配列番号１に示すDNA配列と高度の相同性を示し、アミロスクラーゼをコードするDNA配列を使用することが好ましい。またその酵素活性が損なわれない限り、置換、挿入、または欠失により該配列から得られたDNA配列を使用することができる。
本発明の方法の特に好適な態様は、配列番号１に示すヌクレオチド配列もしくはその一部（その一部は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするのに充分なだけ長い）を示すDNA配列の使用に関する。
本発明によれば、アミロスクラーゼをコードするDNA配列は、センス配向でプロモーターに結合している（プロモーターの3'末端が、コード配列の5'末端に結合）。この配列は、必要に応じて、以下に詳述するポリペプチドの性質もしくはその局在を変更するために、転写調節因子（プロモーターおよび終止シグナル）との結合の前または後に修飾してもよい。配列番号１に示すDNA配列は、例えば細胞外アミロスクラーゼをコードする。分泌は、配列番号１に記載の配列のヌクレオチド939〜986によりコードされる、16個のＮ末端アミノ酸残基よりなるシグナル配列が担う。このような原核生物シグナル配列は通常、植物細胞中でもタンパク質の分泌を引き起こすため、配列番号１に記載のDNA配列を使用する場合は、発現されるタンパク質は植物のアポプラスト（apoplast）に輸送される。
植物細胞の細胞質ゾルで酵素を発現させるために、分泌を行うシグナル配列を除去しなけらばならない。発現される酵素がある種の亜細胞コンパートメント（例えば、葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリアまたは液胞）に指向させるには、分泌を行うシグナル配列を、シグナル配列、または発現されるタンパク質を各コンパートメントに輸送する輸送ペプチドをコードする配列で置換しなければならい。そのような配列は公知である。プラスチドへの輸送のために、例えばジャガイモ由来のリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（RUBISCO）の小サブユニットの前駆体タンパク質（Wolter et al.,1988,Prco.Natl.Acad.Sci.USA 85:846−850）、またはアシル担体タンパク質（ACP）の輸送ペプチドが有用である。液胞への輸送のために、例えばパタチン（patatin）のシグナル配列が使用できる（Sonnewald et al.,1991,Plant J.1:95−106）。使用される配列は、酵素をコードするDNA配列にインフレームで融合しなければならい。
製造段階（ａ）で構築された発現カセットの植物中の移動は、好ましくはプラスミド、例えばバイナリープラスミドを用いて行われる。
発現カセットが、形質転換された植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれることを確実にする技術を用いることが好ましい。
本発明の方法は、基本的にいかなる植物種にも適用できる。単子葉および双子葉植物も目的対象となる。形質転換法はすでに、種々の単子葉および双子葉植物について開示されている。
本発明のDNA配列は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質を発現するよに植物を修飾し、それにより植物中で直鎖型α−1,4グルカンの合成を可能にする。直鎖型α−1,4グルカンはその化学構造が植物で合成されるアミロースと同一であるため、純粋なアミロースを合成する植物を製造し、デンプン産生植物がアミロース比率の増加したデンプンを合成するように、該植物を修飾することができる。
ほとんどの植物において、光合成の過程で生成する光同化物は、糖、より具体的には主にショ糖の形で植物内の各標的器官に輸送される。アミロスクラーゼの重合反応の基質はショ糖であるため、上記の方法は基本的に、アミロスクラーゼ発現に関してすべての植物（単子葉および双子葉植物の両方）を修飾することを可能にする。好適な植物は、穀物植物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、ジャガイモ、またはカッサバ）、ならびにフルーツおよび野菜、例えば、リンゴ、プラム、ニンジンまたはトマトである。
植物におけるアミロスクラーゼ活性の発現は、特に直鎖型α−1,4グルカンの合成により植物から得られる抽出物の粘度を変化させるのに使用される。本明細書においては、トマトが目的対象である。トマトでのアミロスクラーゼの発現により、直鎖型α−1,4グルカンが合成され、こうしてこの果実から得られた抽出物の粘度が上昇する。
アミロスクラーゼの発現はさらに、多量のショ糖を貯蔵する植物の器官において特に有益である。そのような器官には、例えばテンサイの根、またはサトウキビの茎がある。これらの植物は通常検出できるほどのデンプンを合成しないため、アミロスクラーゼにより合成される直鎖型α−1,4グルカンはこれらの植物から純粋な形で単離される。
植物細胞中のショ糖の生合成の場所は、細胞質ゾルである。しかし、貯蔵の場所は液胞である。テンサイまたはジャガイモの貯蔵組織への輸送中または種子の内胚乳への輸送中に、ショ糖はアポプラストを通過しなければならい。したがって、３つのすべてのコンパートメント、すなわち細胞質ゾル、液胞およびアポプラストが、直鎖型グルカンの合成のためのアミロスクラーゼの発現について考慮することができる。
デンプン合成およびデンプン貯蔵が通常アミロプラストで行われるデンプン産生植物、例えばジャガイモまたはトウモロコシでは、アポプラスト、細胞質ゾル、または液胞でのアミロスクラーゼの発現により、これらのコンパートメントにおいてグルカンがさらに合成され、収率が大幅に上昇する。
ジャガイモは、デンプンの単離の間、アミロプラストで合成されたデンプンを、アポプラスト中、細胞質ゾル中、または液胞中でアミロプラストで合成された直鎖型α−1,4グルカンから分離することを可能にするため、デンプンおよび直鎖型α−1,4グルカンの両方を得るために同植物を使用することができる。
さらにアンチセンス構築体によるADPグルコースピロリン酸ホスホリラーゼの阻害のために、それぞれ塊茎および穀粒中でデンプン合成が完全に阻害されている、トランスジェニックジャガイモ植物およびトウモロコシ植物が知られている。その代わりに例えばジャガイモでは、可溶性糖、特にショ糖およびグルコースが塊茎中に蓄積される（Muller−Rober et al,.1992,EMBO J.11:1229−1238;EP−Ａ−0455316）。細胞質ゾル中でアミロスクラーゼが発現されることにより、これらの植物の液胞またはアポプラスト、すなわち分岐酵素が存在しないコンパートメントでは、高度にアミロースを含有するデンプン（すなわち、主に直鎖型α−1,4グルカンからなるデンプン）の合成が行われる。アミロスクラーゼにより触媒される反応の機序は、グルコース残基がショ糖から直鎖型グルカンに直接移されることを特徴とする。植物中のショ糖からの直鎖型グルカンの生合成では、まずショ糖がグルコースおよびフルクトースに分解され、次にこれが活性化中間体型であるADPグルコースに変換される。グルコース残基が酵素デンプンシンターゼにより、ADPグルコースからすでに存在するグルカンに移され、そしてADPを再び放出される。２つのADPグルコース分子へのショ糖の変換には、いくつかのエネルギー消費反応が必要である。
したがって、植物細胞中のアミロースからショ糖への合成のエネルギーバランスと比較すると、アミロスクラーゼにより触媒される反応のエネルギーバランスは、実質的により良好であり、アミロスクラーゼ活性を発現する植物中で合成されたグルカンの収率が増加する。
高等植物への外来遺伝子の導入を行うのに使用できる、大腸菌（E.coli）の複製シグナル、および形質転換された細菌細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含有する多くのクローニングベクターが利用できる。そのようなベクターの例としては、pBR322、pUC系、M13mp系、pACYC184などがある。目的の配列は適当な制限部位でベクターに導入することができる。得られるプラスミドは、大腸菌（E.coli）の形質転換に使用される。形質転換された大腸菌（E.coli）細胞は適当な培地中で培養され、次に収穫され溶解される。プラスミドが回収される。得られたプラスミドDNAの特徴を決定するのに一般に使用される分析方法は、制限分析、ゲル電気泳動、配列決定反応、ならびに生化学および分子生物学で知られているその他の方法である。すべての操作の後、プラスミドDNAを切断し、他のDNA配列に結合させる。すべてのプラスミドDNA配列は、同じかまたは別のプラスミドにクローニングすることができる。
植物宿主細胞へのDNAの導入には多くの方法が利用できる。これらの方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換体として用いるＴ−DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、DNAの電気穿孔法、生物弾丸法によるDNAの導入、および他の可能な方法が含まれる。植物細胞への目的の遺伝子の導入の方法により、別のDNA配列が必要な場合もある。例えば、TiまたはRiプラスミドが植物細胞の形質転換に使用される場合、隣接領域としてTiおよびRiプラスミドＴ−DNAの少なくとも右の境界配列（しかし、ほとんどは左右の境界配列）を、導入される遺伝子に連結しなければならない。
アグロバクテリア（Agrobacteria）が形質転換のために使用される場合、導入されるDNAは、特殊なプラスミド、中間ベクターまたはバイナリーベクターにクローニングしなければならない。Ｔ−DNA中の配列に相同性のある配列により、中間ベクターは、相同的組換えによりアグロバクテリア（Agrobacteria）のTiまたはRiプラスミドに組み込むことができる。該プラスミドは、Ｔ−DNAの移動に必要なvir領域を含有する。中間ベクターはアグロバクテリア（Agrobacteria）中で複製できない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移すことができる（接合）。バイナリーベクターは、大腸菌（E.coli）とアグロバクテリア（Agrobacteria）の両方で複製することができる。これらは、左右のＴ−DNA境界領域が隣接した選択マーカー遺伝子およびリンカーもしくはポリリンカーを含有する。これらは、アグロバクテリア（Agrobacteria）に直接形質転換することができる（Holsters et al.,1978,Mol.Gen.Genet.163:181−187）。宿主細胞として作用するアグロバクテリア（Agrobacteria）は、vir領域を有するプラスミドを含有すべきである。vir領域は、植物細胞へのＴ−DNAの移動に必要である。別のＴ−DNAが存在してもよい。こうして形質転換したアグロバクテリア（Agrobacteria）は、植物細胞の形質転換に使用される。
植物細胞の形質転換のためのＴ−DNAの使用は、広く研究されており、EP120516、「Hoekema,バイナリー植物ベクター系（The Binary Plant Vector System）中、Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam,1985,第５章」、「Fraley et al.,Crit.Rev.Plant.Sci.,4:1−46」、および「An et al;1985,EMBO J.4:277−287」に充分に記載されている。
植物細胞へのDNAの移動のために、植物の外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）とともに培養することが便利である。感染した植物物質（例えば、葉の小片、幹の断片、根、およびプロトプラストまたは懸濁培養した植物細胞）から、形質転換された細胞の選択のための抗生物質または殺生物剤を含有する適当な培地中で、完全な植物を再生できる。こうして得られた植物は、導入されたDNAの存在についてスクリーニングされる。
植物細胞へのDNAの注入および電気穿孔法のために使用されるプラスミドについては特別の要件はない。pCU誘導体のような単純なプラスミドが使用できる。しかし、こうして形質転換された細胞から完全な植物を再生したい場合は、選択マーカーの存在が必要である。
導入されたDNAは、いったん植物細胞のゲノムに組み込まれると、一般にそこに安定にとどまり、本来の形質転換された細胞の子孫にも見いだされる。これは通常、殺生物剤または抗生物質（例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはグルフォシネート（gluphosinate）など）に対する耐性を、形質転換された植物細胞に付与する選択マーカーを含有する。したがって、個々に選択されたマーカーは、導入されたDNAの欠如した細胞からの、形質転換された細胞の選択を可能にする。
形質転換された細胞は、通常細胞内で増殖する（例えば、McCormick et al.,1986,植物細胞報告（Plant Cell Reports）5:81−84を比較参照）。これらの植物は通常の方法で増殖され、同じ形質転換遺伝物質または他の遺伝物質を有する植物と交雑することができる。得られたハイブリッド個体は、対応する表現型を有する。
表現型の特徴が安定に維持され遺伝されることを確認するために、２世代またはそれ以上培養する必要がある。さらに対応する表現型または他の特質が維持されることを確認するために、種子を採取する必要がある。
本発明の他の目的は、前述の本発明の方法から得られる修飾された植物細胞および植物、特に植物細胞中で本発明のDNA配列の発現を可能にするDNA配列と組合せた本発明のDNA配列を含有する植物細胞および植物である。この植物細胞は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質を発現し、こうして細胞または植物中で直鎖型α−1,4グルカンを合成することが特徴である。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物はさらに、アミロスクラーゼをコードするDNA配列を含有する該発現カセットを有する、ゲノム内に安定に組み込まれた組換えDNA分子を含有することを特徴とする。
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物中でアミロスクラーゼを利用して生成される直鎖型α−1,4グルカンは、通常生成されるデンプンと同じ方法で、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物から単離することができる。これらは同様に、本発明の目的である。
本発明はまた、好ましくはそれ自身のアミロスクラーゼ活性を持たない微生物中で、アミロスクラーゼ活性を有するポリペプチドの発現のための本発明のDNA配列またはその部分の使用に関する。
本願において、微生物は例えばシュレゲル（Schlegel）の「一般微生物学（Allgemeine Mikrobiologie）」（ゲオルグ・チエメ・フェアラーク（Georg Thieme Verlag）、1985、pages 1−２）で規定されたような細胞および原生生物であると理解すべきである。
今日バイオテクノロジー研究はほとんど、非常に広範な物質を合成し処理するために微生物を用いている。これは、微生物における原核生物および真核生物遺伝子の効率的な発現のために多くの種々の系が蓄積されてきたことにより可能になった（総説については、例えばMethods in Enzymology 153:385−516を参照）。例えば、細菌である大腸菌（E.coli）および枯草菌（Bacillus subtilis）の株が、広く利用されている。本発明のDNA配列、特に配列番号１に記載のDNA配列を提供することにより、適当な発現系を利用できる微生物中でアミロスクラーゼ活性を有するタンパク質を発現することが可能である。
本発明は特に、その微生物中で本発明のDNA配列が導入され発現される、直鎖型α−1,4グルカンを細胞内または細胞外のいずれかで合成することができる微生物の製造方法に関する。この方法は例えば、以下の段階を含む。
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）選択された微生物中で活性であり、その下流のDNA配列の転写を担うプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロモーターに融合したDNA配列；
（iii）微生物中で機能する転写終止シグナル
を有する発現カセットを産生する段階、および
（ｂ）段階（ａ）で作成された発現カセットで、適当な微生物を形質転換する段階。
発現ベクターは、当該分野で広く記載されている。これらはまた、選択された宿主中での複製を可能にする選択マーカー遺伝子および複製開始点に加えて、細菌またはウイルスプロモーターおよび転写終止シグナルを含有する。プロモーターと終止シグナルの間に、少なくとも１つの制限部位またはコードDNA配列の挿入を可能にする１つのポリリンカーがある。選択された生物中で活性である限り、通常対応する遺伝子の転写を調節するDNA配列をプロモーター配列として使用することができる。この配列は他のプロモーター配列で置換してもよい。遺伝子またはその下流の遺伝子の発現を選択的に制御する誘導性プロモーターの構成性発現を可能にするプロモーターを使用してもよい。これらの性質を有する細菌およびウイルスプロモーター配列が、当該分野で広く記載されている。下流の遺伝子の特に強い発現を可能にするプロモーターは、例えばT7プロモーター（Studier et al.,1990,in Methods in Enzymology 185:60−89）、lacuv5、trp、trp−lacUV5（DeBoer et al.,in Rodriguez,R.L.and Chamberlin,M.J.編、”プロモーター、構造および機能（Promotors,Structure,and Function）”中、プレーガー（Praeger）、ニューヨーク、1982,pp.462−481;DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25）、lp1、rac（Boros etal.,1986,Gene 42:97−100）またはompFプロモーターがある。
製造段階（ａ）（ii）中に記載のDNA配列は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするいかなるDNA配列であってもよい。好ましくは、微生物、特にグラム陰性細菌、好ましくはナイセリア（Neisseria）属に由来するDNA配列、特に好ましくはナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のDNA配列が使用される。特に好適な態様において、DNA配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはそれにハイブリダイズし、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列であり、該配列はセンス配向でプロモーターに結合している（プロモーターの3'末端がコード配列の5'末端に結合）。
使用される配列は、必要に応じて、後に詳述するようにポリペプチドの性質またはその局在を変化させるために、発現ベクターへの組み込みの前または後に修飾することができる。
配列番号１に記載の配列の代わりに、該配列から置換、挿入または欠失により得られたDNA配列も、そのコードされたタンパク質の酵素活性が損なわれない限り使用することができる。
段階（ｂ）の微生物の形質転換は通常、標準的な方法、例えばマニアチス（Maniatis）らの記載した方法（分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、1982、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press））を用いて行われる。
形質転換された微生物は、使用される各宿主の必要性に適した培地中で培養される。特にpH値、温度、換気などに注意すべきである。
本発明の別の目的は、上記の方法で得られた微生物であり、組換えDNA分子の一部である、アミロスクラーゼをコードするDNA配列を含有することを特徴とする微生物である。該組換えDNA分子は、使用される形質転換法により、使用される微生物の細胞のゲノムの外に存在してもよく、または微生物細胞のゲノム内に安定に組み込まれてもよい。
ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）によって発現されるアミロスクラーゼは、ショ糖を基本として細胞外で直鎖型α−1,4グルカンを合成する細胞外酵素である。細胞内で進行するほとんどの多糖の合成経路と異なり、活性化されたグルコース誘導体も補因子も必要ない。濃縮されたグルコース残基の間のα−1,4グルカン結合の生成に必要なエネルギーは、ショ糖分子のグルコース単位とフルクトース単位の間の結合の加水分解から直接得られる。
したがって、前述の製造段階で得られたアミロスクラーゼ分泌性微生物をショ糖含有培地中で分泌されたアミロスクラーゼとともに培養して、培地中でショ糖から直鎖型α−1,4グルカンの合成に導くことができる。これらのグルカンは、培地から単離することができる。
さらに、細胞を含まない酵素調製物を利用して、インビトロでα−1,4グルカンを合成することができる。
この場合、アミロスクラーゼ分泌性微生物は、定常増殖期に達するまで、ショ糖を含まない培地中で培養して、アミロスクラーゼを発現させることができる。増殖培地から遠心分離により細胞を除去して、分泌された酵素を上清から得ることができる。次に酵素をショ糖含有溶液に添加して、直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる。ショ糖含有増殖培地中での直鎖型α−1,4グルカンの直接合成に比較して、この方法は、反応条件がより良好に調節でき、反応生成物が実質的に純粋であり、さらに精製することが容易であるという点で有利である。
酵素は培地から、通常の精製方法（例えば、沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相高速液体クロマトグラフィーなど）により精製できる。
さらに発現ベクターに挿入されたDNA配列を修飾することによりポリペプチドを発現させ、ある性質のため培地中により容易に単離できるポリペプチドを得ることができる。その特異的結合性のために親和性クロマトグラフィーにより融合タンパク質を単離することができる別のポリペプチド配列とともに、融合タンパク質として酵素を発現することができる。
公知の方法としては、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させて、次にグルタチオンに対するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの親和性を利用しグルタチオンカラムで親和性クロマトグラフィーにより精製する方法がある（Smith and Johnson,1988,Gene 67:31−40）。他の公知の方法としては、マルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として発現させて、次にアミロースカラムで精製する方法がある（Guan et al,.1988,Gene 67:21−30;Maina et al,1988,Gene 74:365−373）。
精製された酵素を直接ショ糖含有溶液に加えて直鎖型α−1,4グルカンを合成できる可能性以外に、酵素を担体物質に固定化する代替法がある。このような固定化法は、合成触媒として酵素が容易に回収でき、数回使用できるという利点がある。酵素の精製は通常、非常に時間およびコストがかかり、酵素の固定化および再利用はコストの大幅な削減に寄与する。他の利点は、反応生成物が高度に純粋であることであり、これは特に、固定化酵素を使用すると反応条件がより良好に調節できるという事実に起因する。反応生成物として得られる不溶性直鎖型グルカンは、容易にさらに精製することができる。
共有結合または非共有結合により担体物質に結合できるタンパク質の固定化のために、多くの担体物質が利用することができるであろう（総説については、Methods in Enzymology Vol.135,136および137を参照）。広く使用されている担体物質は、例えばアガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、シリカまたはナイロンである。
精製される酵素と同様に、目的のポリペプチドを発現する微生物または特定の代謝物を分泌する微生物も固定化することができる。固定化は一般に、細胞を適当な物質（例えば、アルギン酸塩、ポリアクリルアミド、ゼラチン、セルロースまたはキトサン）の中に包括することにより行われる。しかし、担体物質に細胞を吸着または共有結合させることもできる（Brodelius and Mosbach,in Methods in Enzymology,Vol.135:173−175）。細胞の固定化の利点は、液体培地中で培養するよりも相当高い細胞密度が得られ、生産性がより高くなることである。また培養物の攪拌および換気のコスト、ならびに無菌性を維持するための手段のコストも低下する。重要な面は、固定化により連続生産が可能になり、その結果通常発酵反応で生じる長く非生産的な時期を避けることができるか、または少なくとも大幅に短縮することができることである。
微生物における場合と同様に、本発明のDNA配列も、真菌、特に酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））中でアミロスクラーゼ活性を発現するために使用することができる。酵母で異種遺伝子を発現するためのベクターは、すでに開示されている（例えば、Bitter et al.,1987,Methods in Enzymology 153:516−544）。細菌での増殖のための選択マーカー遺伝子または複製開始点以外に、これらのベクターは、形質転換された酵母細胞の同定を可能にする少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、酵母での複製を可能にするDNA配列、および目的の発現カセットの挿入のためのポリリンカーを含有する。発現カセットは、プロモーター、発現されるDNA配列、ならびに転写物の転写終止およびポリアデニル化を可能にするDNA配列から作成される。サッカロミセス（Saccharomyces）のプロモーターおよび転写終止シグナルも記載されており、利用できる。発現ベクターは、標準的方法（酵母遺伝学の方法、実験室コースマニュアル（Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1990）にしたがって、形質転換により酵母細胞内に導入することができる。ベクターを含有する細胞を選択し、適当な選択培地上で増殖させる。さらに酵母は、適当なベクターを用いて細胞のゲノム内へ相同的組換えを介して発現カセットを組み込み、形質を安定に遺伝することを可能にする。
アミロスクラーゼを発現する酵母株は、分泌されたアミロスクラーゼを得るために微生物と同様に使用できる。酵母の培養方法は、充分に記載されている（酵母遺伝学の方法、実験室コースマニュアル（Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1990）。酵母の固定化も可能であり、すでにエタノールの商業的生産に使用されている（Nabashima et al.,Methods in Enzymology中,Vol.136:394−405;Nojima and Yamada,Methods in Enzymology中,Vol.136:380−394）。
しかし、酵母は細胞外のショ糖を加水分解するインベルターゼを分泌するため、直鎖型α−1,4グルカンの合成のためにショ糖含有培地中でアミロスクラーゼを分泌する酵母を使用することは容易ではない。酵母はヘキソーストランスポーターを介して得られるヘキソースを取り込む。しかしゴザルボ（Gozalbo）およびホーマン（Hohmann）（1990,Current Genetics 17,77−79）は、欠陥のあるsuc2遺伝子を有するためインベルターゼを分泌することができない酵母株を開示している。これらの酵母細胞は、ショ糖を細胞内に取り込むための輸送系を持たない。このような株を本発明のDNA配列で修飾して、培地内にアミロスクラーゼを分泌するようにすれば、培地がショ糖を含有する場合でも、アミロスクラーゼにより直鎖型α−1,4グルカンが合成される。反応生成物として生成するフルクトースは、次に酵母のより取り込まれる。
したがって本発明はまた、本発明のDNA配列が真菌細胞に導入され発現されている、細胞内または細胞外に直鎖型α−1,4グルカンを合成することができる真菌細胞を製造する方法にも関する。この方法は、例えば以下の段階を含む。
（ａ）以下の部分配列：
（ｉ）選択された真菌細胞中で活性であり、下流のDNA配列の転写を担うプロモーター；
（ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロモーターに融合したDNA配列；
（iii）上記真菌細胞中で機能する転写終止シグナル、
を有する発現カセットを産生する段階、および
（ｂ）段階（ａ）で構築した発現カセットで真菌細胞を形質転換する段階。
本発明の別の面は、本発明のDNA配列を用いて安価な方法で純粋なフルクトースシロップを製造する可能性である。フルクトース製造の従来法では、インベルターゼを用いてショ糖を酵素的に加水分解し、またはしばしば酸分解して、次にグルコースをグルコースイソメラーゼによりフルクトースに酵素的に変換することにより、フルクトースを製造している。いずれの方法によっても、グルコースおよびフルクトースの混合物が得られる。この２つの成分はクロマトグラフィー法により互いに分離する必要がある。
アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質を用いる純粋なフルクトースまたは純粋なフルクトースシロップの製造は、好ましくは、精製された酵素を用いて細胞を含まない系で行われる。後者は、適当な担体物質上に固定化されていてもよく、または可溶性で存在していてもよい。ショ糖が存在すると、直鎖型グルカンが合成され、フルクトースが放出される。反応生成物からの基質の分離または２つの反応生成物の分離は、例えばフルクトースは透過するがショ糖またはグルカンは透過しない膜を用いて行われる。フルクトースがこのような膜により連続的に除去されるならば、ショ糖はほぼ完全にフルクトースおよび直鎖型グルカンに変換される。
アミロスクラーゼはまた、好ましくは２つの膜の間に存在する担体物質に固定化される。その一方の膜はフルクトースは透過するがショ糖またはグルカンは透過しないものであり、他方はショ糖は透過するがグルカンは透過しないものである。基質は、ショ糖を透過する膜を介して供給される。合成されたグルカンは、２つの膜の間の間隙にとどまり、放出されたフルクトースは、フルクトースのみが透過する膜を介して反応平衡から連続的に除去することができる。このような構成は、反応生成物の効率的な分離を可能にし、したがって、特に純粋なフルクトースの製造を可能にする。
純粋なフルクトースを製造するためにアミロスクラーゼを使用することにより、比較的安価な基質であるショ糖を出発物質として用いることができ、さらにクロマトグラフィー法を用いることなく簡便な方法で反応混合物からフルクトースを単離することができるという利点がもたらされる。
したがって、本発明はまた、フルクトースの製造のためのアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質の使用に関する。
アミロスクラーゼ活性を有するタンパク質の使用のさらなる可能性は、これらをシクロデキストリンの製造のために使用することである。シクロデキストリンは、細菌バシルス・マセランス（Bacillus macerans）から得られる酵素シクロデキストリントランスグリコシラーゼ（EC2.4.1.19）によりデンプンを分解して産生される。デンプンの分岐のため、この系を用いてわずか約40％のグルコース単位がシクロデキストリンに変換される。アミロスクラーゼ活性を有する実質的に純粋なタンパク質を提供することにより、アミロスクラーゼおよびシクロデキストリントランスグリコシラーゼの同時作用下で、ショ糖を基本としてシクロデキストリンを合成することができる（アミロスクラーゼはショ糖からの直鎖型グルカンの合成を触媒し、シクロデキストリントランスグリコシラーゼはこれらのグルカンのシクロデキストリンへの変換を触媒する）。
本発明のプラスミドpNB2は、ブダペスト条約の規定にしたがって1994年５月６日にドイツ国ブラウンシュバイヒ（Braunschweig）のドイツ微生物寄託機関（DSM）に寄託番号DSM9196で寄託された。
使用した略語
IPTG        イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト−ピラニシド
使用した培地と溶液
YT培地      バクト−トリプトン  8g
酵母抽出物  5g
NaCl  5g
２回蒸留水で1000mlにする
YTプレート  1000ml当たりバクト寒天15gを含有するYT培地
ルゴール液  KI  12g
I26g
２回蒸留水で1.8リットルにする
図面の説明
図１は、プラスミドpNB2（DSM9196）を示す。
細い線は、クローニングベクターpBluescriptSK（−）の配列に対応する。太い線は、ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）のゲノムDNAの約4.2kb長の挿入配列を示す。アミロスクラーゼのコード領域は、挿入配列の下の矢印で示す。
挿入配列の上の配列を決定した領域を示す。すべての数値は、この2883塩基対の長さの領域に関する。
図２は、形質転換した大腸菌（E.coli）細胞をヨウ素蒸気に曝して発現させたアミロスクラーゼ活性を示す。
pBluescriptIISKプラスミド（Ａ）で形質転換した大腸菌（E.coli）細胞、およびプラスミドpNB2（Ｂ）で形質転換した大腸菌（E.coli）細胞を、YT培地（1.5％寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM IPTG）上に蒔き、37℃で一晩インキュベートした。次にプレートをヨウ素蒸気に曝した。プラスミドpNB2で形質転換した細胞のコロニーは、明瞭な青い光冠を示した。
以下の実施例により、本発明を例示する。
実施例１
ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）からのアミロスクラーゼ活性をコードするゲノムDNA配列の単離
ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）からのアミロスクラーゼ活性をコードするDNA配列の単離のために、まずゲノムDNAライブラリーを確立した。ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）細胞を、「コロンビア血液寒天（Columbia blood agar）」（ディフコ社（Difco））で37℃で２日間培養した。得られたコロニーをプレートから採取した。アウスベル（Ausubel）らの方法（「分子生物学の現在の方法」（Curret Protocols in Molecular Biology）、1987,ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（J.Wiler ＆ Sons）、ニューヨーク）により、ゲノムDNAを単離し、処理した。こうして得られたDNAを制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分的に消化した。得られたDNA断片を、BamH Iで消化したpBluescriptSK（−）に連結させた。連結生成物を、大腸菌（E.coli）XL1−Blue細胞中で形質転換した。選択のために、細胞を選択マーカーとしてアンピシリンを含有するYTプレートに蒔いた。この選択培地はさらに５％ショ糖および1mMIPTGを含有していた。
37℃で一晩インキュベートした後、結晶ヨウ素をシャーレのフタに入れ、細菌を有する培養プレートを逆さにしてシャーレの中にそれぞれ10分間置いて、生成した細菌コロニーをヨウ素で染色した。室温で蒸発したヨウ素は、アミロース様グルカンを含有する培養プレートの領域を青く染めた。青い光冠を示したコロニーから、Birnboim ＆ Doly（1979,Nucleic Acids Res.7:1513−1523）の方法によりプラスミドDNAを単離した。このDNAを再び大腸菌（E.coli）SURE細胞中で形質転換した。形質転換した細胞を、選択マーカーとしてアンピシリンを含有するYTプレートに蒔いた。陽性のクローンを単離した。
実施例２
プラスミドpNB2のゲノムDNA挿入配列の配列解析
実施例１にしたがって得られた大腸菌（E.coli）クローンから、組換えプラスミドを単離した。制限解析は、このプラスミドが２つのベクター分子および１つの約4.2kb長のゲノム断片より構成される連結生成物であることを示した。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPst Iで消化し、ゲノム断片を単離した（ジーンクリーン（GeneClean）、Bio101）。こうして得られた断片を、Pst Iで直鎖型化したpBluescript II SKベクターに連結し、Pst IおよびSma I制限部位が複製された。連結生成物を大腸菌（E.coli）細胞中で形質転換し、後者を選択のためアンピシリンプレートに蒔いた。陽性のクローンを単離した。これらのクローンの１つから、プラスミドpNB2（図１）を単離し、そのゲノムDNA挿入配列の一部を、ジデオキシ法（Sanger etal.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463.5467）を用いる標準的方法により決定した。全挿入配列の長さは約4.2kbpであった。このヌクレオチド配列は、2883塩基対の長さの部分配列から決定した。このヌクレオチド配列は後述する（配列番号１）。ゲノム挿入配列中の配列決定された領域の位置を図１に示す。
実施例３
形質転換した大腸菌（E.coli）細胞中の細胞外アミロスクラーゼ活性の発現
（ａ）YTプレート上での増殖中のアミロスクラーゼ活性の検出
細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌（E.coli）細胞を、標準的方法に従いベクターpNB2で形質転換した。形質転換した株のコロニーをYTプレート（1.5％寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM IPTG）上で37℃で一晩インキュベートした。アミロスクラーゼ活性は、コロニーをヨウ素蒸気に曝して検出した（図２）。アミロスクラーゼ発現コロニーは、青い光冠を示す。アミロスクラーゼ活性は、おそらくその内因性アミロスクラーゼプロモーターの活性のため、IPTGが存在しなくても観察される。
（ｂ）YT培地での増殖中のアミロスクラーゼ活性の検出
細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌（E.coli）を、標準的方法に従いベクターpNB2で形質転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖）に、形質転換した株のコロニーを接種した。細胞を一定条件（回転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩インキュベートした。アミロスクラーゼにより触媒された反応の生成物を、培養上清にルゴール溶液を加えて青く染色して検出した。
（ｃ）ショ糖なしで培養した形質転換した大腸菌（E.coli）細胞の培養上清中のアミロスクラーゼ活性の検出
細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌（E.coli）細胞を、標準的方法でpNB2ベクターで形質転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン）に、形質転換した株のコロニーを接種した。細胞を一定条件（回転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩インキュベートした。次に細胞を遠心分離（30分、４℃、5500rpm、JA10ベックマン（Beckmann）ロータ）して除去した。上清を0.2μｍのフィルター（シュレイチャー及びシュエル（Schleicher ＆ Schuell））で無菌条件下で濾過した。
アミロスクラーゼ活性の検出は、以下のように行なった：
（ｉ）ショ糖含有寒天プレート上で上清をインキュベートして検出。上清40μｌを寒天プレート（50mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH6.5中５％ショ糖）中にくり抜いた穴に入れ、37℃で少なくとも１時間インキュベートした。アミロスクラーゼにより触媒された反応の生成物を、ヨウ素蒸気で染色して検出した。反応生成物が存在すると、青く染色される。
（ii）または、未変性のゲルで上清のタンパク質を電気泳動分離し、ショ糖でインキュベートした後、ゲル中の反応生成物を検出。40〜80μｌの上清を、８％未変性ポリアクリルアミドゲル（0.375Mのトリス、pH8.8）で100Vの電圧でゲル電気泳動により分離した。次にゲルを、約100mlの50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で２回15分間平衡化させ、クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）/5％ショ糖中で37℃一晩インキュベートした。アミロスクラーゼにより触媒された反応生成物を可視化するために、ゲルをルゴール溶液で洗浄した。アミロスクラーゼ活性を有するバンドは、青く染色された。
実施例４
部分的に精製したアミロスクラーゼによグルカンのインビトロ産生
細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、標準的方法にしたがって大腸菌（E.coli）細胞をpNB2ベクターで形質転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン）に、形質転換した株のコロニーを接種した。細胞を一定条件（回転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩インキュベートした。次に細胞を遠心分離（30分、４℃、5500rpm、JA10ベックマン（Beckmann）ロータ）して除去した。上清を0.2μｍのフィルター（シュレイチャー及びシュエル（Schleicher ＆ Schuell））で無菌条件で濾過した。
次にアミコンチャンバー（Amicon chamber）（排除サイズ30kDaを有するYM30膜、アミコン社（company Amicon））を用いて、加圧下（ｐ＝３バール）で、上清を200倍濃縮した。濃縮した上清を、50mlのショ糖溶液（50mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH6.5中５％ショ糖）に加えた。全溶液を37℃でインキュベートした。やや白い不溶性の多糖が生成した。
実施例５
実施例４からのアミロスクラーゼによって合成された反応生成物の特徴決定
実施例４に記載の不溶性反応生成物は、1MのNaOH中で可溶性である。最大吸収を測定して反応生成物を性状解析した。単離した反応生成物約100mg（湿重量）を、200μｌの1M NaOHに溶解し、水で1:10に希釈した。900μｌの0.1M NaOHおよび1mlのルゴール溶液を、この希釈液の100μｌに加えた。400〜700nmの間で吸収スペクトルを測定した。最大は605nmにあった（アミロースの最大吸収：約614nm）。
CARBOPAC PA1カラム（ジオネックス（DIONEX））による実施例４の反応混合物のHPLC解析は、不溶性生成物以外に可溶性生成物が生成したことを示した。これらの可溶性生成物は、短鎖の多糖である。鎖の長さは、約５〜約60グルコース単位であった。しかし、これより短いかまたは長い分子もある程度検出された。
利用可能な解析方法では、合成生成物中の分岐を検出することはできなかった。
実施例６
形質転換した大腸菌（E.coli）細胞中での細胞内アミロスクラーゼ活性の発現
ポリメラーゼチェーン反応（PCR）を用いて、プラスミドpNB2から配列番号１に記載の配列のヌクレオチド981〜2871を含む断片を増幅した。以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた：
0003555086.tif 000003
得られた断片は、16個のＮ−末端アミノ酸をコードするヌクレオチド以外の、アミロスクラーゼのコード領域を含有する。これらのアミノ酸は、細胞からの酵素の分泌に必要な配列を含み、さらにこのPCR断片は、88塩基対の3'非翻訳領域を含有する。プライマーを用いて、この断片の両端にNco I制限部位を導入した。
制限エンドヌクレアーゼNco Iで消化した後、得られた断片を、Nco I消化した発現ベクターpMex7に連結した。連結生成物を大腸菌（E.coli）細胞中で形質転換させ、形質転換したクローンを選択した。陽性のクローンをYTプレート（1.5％寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM IPTG）上で37℃で一晩インキュベートした。プレートをヨウ素蒸気に曝しても細菌のコロニーの周囲には青い染色は見られなかったが、グリコーゲンの細胞内産生が検出された（非形質転換XL1−Blue細胞中では染色されなかったのに対して、形質転換した細胞では褐色に染色）。タンパク質の機能を調べるために、YT培地で培養した形質転換細胞を超音波で破壊し、粗抽出物をピペットでショ糖含有寒天プレートに移した。プレートをヨウ素蒸気に曝すと、青い染色が観察された。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人:Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
（Ａ）氏名:Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
（Ｂ）街路名:Ihnestrasse 63
（Ｃ）氏名:Berlin
（Ｅ）国名:DE
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:14195
（Ｇ）電話：＋49 30 8300070
（Ｈ）ファックス：＋49 30 83000736
（ii）発明の表題：植物、真菌および微生物中で直鎖型α−1,4グルカンの合成を促進することができる酵素をコードするDNA配列
（iii）シーケンス数:4
（iv）文書通信住所：
（Ａ）メイディア形式:Floppy disk
（Ｂ）コンピューター:IBM PC cpmpatible
（Ｃ）運転システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.30（EPO）
（vi）先の出願の情報：
（Ａ）出願番号:DE P 44 17 879.4
（Ｂ）出願日:18−MAY−1994
（vi）先の出願の情報：
（Ａ）出願番号:DE P 44 47 388.5
（Ｂ）出願日:22−DEC−1994
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:2883塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名:Neisseria polysaccharea
（vii）直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名:genomic library in pBluescript II SK
（Ｂ）クローン名:pNB2
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:939..2780
（xi）配列の記載：配列番号:1:
0003555086.tif 000004
0003555086.tif 000005
0003555086.tif 000006
0003555086.tif 000007
0003555086.tif 000008
0003555086.tif 000009
（２）配列番号:2の情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:614アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:2:
0003555086.tif 000010
0003555086.tif 000011
0003555086.tif 000012
0003555086.tif 000013
（２）配列番号:3の情報
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"oligonucleotide"
（vi）直接の起源：
（Ａ）生物名:Neisseria polysaccharea
（xi）配列の記載：配列番号:3:
0003555086.tif 000014
（２）配列番号：の情報配列番号:4:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（Ａ）説明:/desc＝"oligonucleotide"
（vi）直接の起源：
（Ａ）生物名:Neisseria polysaccharea
（xi）配列の記載：配列番号:4:
0003555086.tif 000015
【図１】
0003555086.tif 000016
【図２】
0003555086.tif 000017