(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の使用であって、所望により薬理学的に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤中に含有させて、酵素アデニル酸シクラーゼを促進する活性を示す薬用組成物を製造するための活性物質としての使用。
【請求項２】
テフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の使用であって、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤中に含有させて、痩身活性を示す化粧用組成物を製造するための活性物質としての使用。
【請求項３】
テフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の使用であって、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤中に含有させて、色素化活性を示す化粧用組成物を製造するための活性物質としての使用。
【請求項４】
テフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の使用であって、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤中に含有させて、抗老化活性を示す化粧用組成物を製造するための活性物質としての使用。
【請求項５】
抽出物が、種子抽出物であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
テフロシア属プルプレア種の抽出物が、組成物全量に対して0.001〜５重量％の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
テフロシア属プルプレア種の抽出物が、組成物全量に対して0.01〜５重量％の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする請求の範囲第６項記載の使用。
【請求項８】
抽出物が、C1〜C6アルコール又はC1〜C6ヒドロアルコール抽出溶媒から得られたものであることを特徴とする請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
アルコール溶媒が、メタノール及びエタノールから選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の使用。
【請求項１０】
酵素アデニル酸シクラーゼ促進剤としてのテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物、及び、所望により薬理学的に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤からなることを特徴とする、酵素アデニル酸シクラーゼを促進する活性を有する薬用組成物。
【請求項１１】
痩身剤としてのテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物、及び、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤からなることを特徴とする、痩身活性を有する化粧用組成物。
【請求項１２】
色素化剤としてのテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物、及び、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤からなることを特徴とする、色素化活性を有する化粧用組成物。
【請求項１３】
抗老化剤としてのテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物、及び、所望により化粧用に許容しうる媒質、分散媒又は賦形剤からなることを特徴とする、抗老化活性を有する化粧用組成物。
【請求項１４】
抽出物が、種子抽出物であることを特徴とする請求の範囲第10項から第13項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
テフロシア属プルプレア種の抽出物が、組成物全量に対して0.001〜５重量％の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする請求の範囲第10項から第14項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
テフロシア属プルプレア種の抽出物が、組成物全量に対して0.01〜５重量％の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする請求の範囲第15項記載の組成物。
【請求項１７】
抽出物が、C1〜C6アルコール又はC1〜C6ヒドロアルコール抽出溶媒から得られたものであることを特徴とする請求の範囲第10項から第16項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
アルコール溶媒が、メタノール及びエタノールから選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第17項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、本質的に、テフロシア属、特にテフロシア属プルプレア種の抽出物の、薬用組成物、特に皮膚科用組成物製造のための、又は化粧剤としての用途、及びそれを適用してなる化粧トリートメント方法に関する。
テフロシア属の植物は、広く分布する亜熱帯植物であり、特に、インド及びスリランカに分布している。
テフロシア属に属する種であって、本発明に特に好適であるのは、テフロシア属プルプレア種である。このものは、高さ30〜100cmの多年生植物であって、一つのさやに４〜６個の種子を有し、赤色の花をつける。テフロシア属プルプレア種は、特にインドで知られており、このものは、アーユルベーダ医薬、すなわち、伝統的インド医薬として知られている。様々な部位が、各種疾患の治療のために使用されてきた：気管支、肝臓、腎臓等の病気、及び血液浄化に使用されてきた（Pandey、Quart.J.Crude  Drug  Res.13（1975）、pp.65〜68参照）。テフロシア属プルプレア種の種子は、また、低血糖活性のゆえに使用されてきた（Rahmanら、Indian  J.Med.Res.81、1985年４月、pp.418〜421参照）。ソックスレー抽出器による根部の99％アルコール抽出物を使用するテフロシア属プルプレア種のインビヒロ抗菌活性もまた知られている。（Agarwalら、Indian  J.Physiol.Pharmac.、Vol.31、No.4、1987年10〜12月、pp.284〜286参照）。
テフロシア属の植物を対象とする精力的研究の結果、及び特にテフロシア属プルプレア種を対象とする研究の結果、本発明者らは、予期せぬことに、テフロシア属の、特にテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物、及び特に種子の抽出物中に、酵素アデニル酸シクラーゼに対する強力な促進活性が存在することを見出した。この酵素は、ATPをAMPcとピロりん酸に変換することが知られている。この活性のゆえに、テフロシア属の抽出物、特にテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物は、化粧品又は医薬、特に皮膚科、痩身活性、抗炎症活性、メラノサイトに作用することによる色素化活性、及び抗老化活性における応用に有用である。
従って、第一の態様において、本発明は、テフロシア属の、特にテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の、医薬組成物、特に、皮膚科用組成物の製造用の活性物質としての用途を含むものであり、当該活性物質は、酵素アデニル酸シクラーゼの促進活性、痩身活性、抗炎症活性、色素化活性、及び抗老化活性を、特に局所的に、所望により薬理学的に及び特に皮膚科学的に許容しうる媒質、分散媒、賦形剤中に含有させて、適用される場合に、発揮する。
本発明は、また、テフロシア属、特にテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の、酵素アデニル酸シクラーゼを促進する化粧剤であって、特に局所的に適用される場合に、痩身効果、色素化効果、又は、抗老化効果を得るものとしての用途を含む。
有利な態様においては、上記抽出物は、テフロシア属の植物の種子抽出物、特にテフロシア属プルレア種の種子抽出物である。
テフロシア属プルプレア種の植物は、また、特にナプララート（Napralert、登録商標）データベースによれば、以下の同義的名称のもとに知られていることに注意すべきである：クラッカ属プルプレア種、ガレドウバ属ランシエフオリア種、ガレドウバ属プルプレア種、ガレパ属チンクトリア種、テフロシア属ガレゴイデス種、テフロシア属インジゴフエラ種、テフロシア属ロバタ種、及びテフロシア属マキシマ種であり、これらの全ては、当然に本発明に含まれる。
有利な態様においては、該種子抽出物は、直鎖又は環状分枝のC1〜C6のアルコールで抽出されたヒドロアルコール抽出物である。特に好ましいアルコールとしては、メタノール又はエタノールである。水とアルコールとの量比は、広い範囲にわたって設定することができる。しかしながら、実質的に等量であることが好ましい。
第二の態様においては、本発明は、また、痩身効果、色素化効果、又は抗老化効果を目的として、酵素アデニル酸シクラーゼの促進を獲得するための化粧トリートメント方法であって、患部の領域、特に表皮又は毛髪に、テフロシア属、特にテフロシア属プルプレア種の植物の抽出物の化粧用に有効な量を、所望により化粧用途に許容しうる媒質、分散媒、賦形剤中に含有させて、局所的に適用することに特徴がある化粧トリートメント方法を含む。
有利には、上述のいかなる態様においても、組成物全量に対して抽出物は、0.001〜５重量％、及び好ましくは0.01〜５重量％使用される。
本発明の他の目的及び利点は、以下に掲げる、もっぱら説明のためのみに記載されたものであって、本発明の範囲をいかなる意味においても限定するものではない、本発明の各種の実施例を参照しつつなされる説明によって明らかとなる。特に断らないかぎり、詳細な説明中及びクレーム中の％は、重量％である。
実施例１
テフロシア属プルプレア種からの植物抽出物の調製
市販のテフロシア属プルプレア種の1000gを粉砕し、1mmの篩にかけた。篩を通過したものを24時間、5Lの50/50V/Vメタノール−水混合物からなるヒドロアルコール抽出溶媒中に浸漬した。
これを１時間、還流した。
その後、これを濾紙で濾過した（この際、必要なら圧力を加えることも可能であった）。そして、冷メタノールで洗った。
その後、アルコールと水を、濾液から完全になくなるまで真空中で蒸発させた。
残渣を秤量すると、80.11gのきれいな結晶質と黒っぽいペーストからなる不均一な外観を呈する抽出物を得た。
粗抽出物は、約50％の乾燥物と50％の残余溶媒を含んでいた。
このものは、そのままで使用することができたし、又は、必要なら当業者に周知の方法により更に精製することも可能であった。
実施例２
2.365kgの市販のテフロシア属プルプレア種の種子を粉砕し、1mmの篩に通し、その後、石油エーテルで脱脂した。
粉砕され、脱脂された種子は、その後、約10Lのエタノールでソックスレー抽出器により抽出を２時間行った。
溶媒を留去後、残渣を約58gの褐色ガムとして得た。
実施例３
テフロシア属プルプレア種抽出物によるアデニレートシクラーゼ活性の促進のための使用
ある種の物質は、細胞内メッセンジャーとして働き、従って、細胞の機能を生体の要求に適合させるための、細胞の必須構成物質である。このようなメッセンジャーとしては、例えば、環状モノホスフェートである３′,5′−アデノシン（AMPc）が含まれる。この分子は、アデノシン３′,5′−三りん酸からアデニル酸シクラーゼとよばれる酵素によって合成される。
その理論的反応は以下のとおりである：
0003555030.tif 000002
理論
細胞膜は、最初、フローラボラトリーズから入手可能の3T3株F442A系統を繊維芽細胞集合まで培養することにより得る。
これらの酵素源となる繊維芽細胞膜は、ATP存在下、37℃で予め定められた時間、反応溶液中でインキュベートされる。
得られるAMPcは、ラジオイムノアッセイ法によって測定される。基準活性、すなわち、エフェクターを含まない場合の活性を100％することにより、エフェクターの酵素系に対する影響を決定することができる。活性が100％を超える場合は、アデニル酸シクラーゼの活性化効果があることになり、活性が100％未満である場合は、その反対に阻害効果が示されることになる。
実施
細胞膜は、培養した繊維芽細胞から精製される。
この場合、細胞膜の精製は、多くの酵素をアッセイ媒体中に放出することに注意すべきである。これらのうち二つの酵素は、試験の実施には望ましくない。これらは、第一に、ATPをアデノシン二りん酸に変換するNa+、K+ATPaseであって、第二に、環状AMPをAMPに分解する３′,5′−AMPcホスホジエステラーゼである。従って、試験によって信頼性のある結果を得るためには、これら二つの酵素を阻害することが必須となる。前者は、ウアベインによって、後者は、テオフィリンによって、それぞれ阻害される。
反応溶液は、従って、以下の配合によって構成される：
・基質として、5mMアデノシン３′,5′−三りん酸（ATP）溶液50μl;
・ATPase阻害剤として、20mMウアベイン溶液100μl;
・ホスホジエステラーゼの阻害剤として、20mMテオフィリン溶液100μl;
・エフェクター乾燥物を0.05g/l含有する溶液100μl;
インキュベーションの後、反応は、100℃、10分間の加熱によって停止され、遠心分離し、そして上澄みを集めて、AMPcをラジオイムノアッセイ法（キット番号1117、フランス、イミュノテック社製）によって測定する。
結果
試験の結果は、以下の表に示される。
0003555030.tif 000003
上記結果から、テフロシア属プルプレア種の植物からの抽出物は、酵素アデニル酸シクラーゼを促進する大きな有意の活性を有することが明らかである。この活性は、植物抽出物がその分子を含有していないにもかかわらず、フォルスコリンからなる正の対照の活性に比較的近似している。
従って、テフロシア属抽出物、特にテフロシア属プルプレア種の抽出物は、化粧用又は薬用組成物の製造に使用する際の、フォルスコリンの興味ある代替物をなしている。
本発明の応用は、特に、AMPcが作用する生物学的過程から由来するものである。このような応用としては、本発明において好ましくは、痩身用組成物、皮膚や毛髪の色素化用組成物、抗炎症組成物、及び老化の影響を抑制するための組成物の製造が挙げられる。
実施例４
本発明の組成物の脂肪動員活性
・本発明の組成物の培養脂肪細胞に対する作用の評価
本発明の組成物の脂肪動員剤としての有効性を、マウスの前脂肪細胞、例えば、フローラボラトリーズ社から入手可能な3T3株F442系統等の細胞を用いて、評価することにした。3T3株F442系統等のマウスの前脂肪細胞は、培養条件がそれを可能とするならば、脂肪細胞に変化する能力を有するので選択された。
（H.Green及びC.Kehinde、Cell、１（1974）、113記載の方法の応用）
この系統は、インビトロにおいて脂肪細胞の分化を調べるためのモデルを構成するものであって、脂肪細胞の表現型が完成されると、本発明における細胞機能の細胞外調節を調べる可能性を提供するものである。この分化及びその調節は、幾つかの形態的及び生化学的変化を伴っており、特に、脂肪分解におけるグリセロールの放出に関する生化学的変化を伴っている。
従って、試験対象化合物の有効性を、下記式で表される脂質生成反応に含まれるグリセロール−３−りん酸デヒドロゲナーゼ（G3PDHという）の活性を測定することによって、評価することが便利である：
0003555030.tif 000004
従って、酵素活性は、ジェイ．ペロー（J.Pairault）らによるProc.Nat.Acad.Sci.、第６巻（1979）、pp.5138〜42に記載の方法によって、放出NADHを検定する方法を用いることによって測定することができる。
これらの実験は、以下のようにして実施された。
１）培養条件
５％子牛血清、プラス５％牛胎児血清を含有するダルベッコモディファイドイーグル培地（DMEM）の存在下、前脂肪細胞は、直径35mmのペトリ皿に蒔かれた（20000細胞／皿）。
培養液は、DMEM培地プラス10％牛胎児血清によって２度更新された。
この条件下に、培養は、１週間（Ｄ＝D0）で集合状態に達した。この段階で、培養液に対して１重量％の濃度でインシュリンを添加することにより、脂肪細胞分化が活性化された。更にDMEM培地プラス10％牛胎児血清及び１％インシュリンの２回の交換をした。
細胞は、集合状態に達してから１週間後（Ｄ＝D7）に、更なる分化状態を呈した。
２）処理−生育力
細胞は、段階D7において、試験物質によって処理された。
処理は、対照として培養液を、培養のみによって、又は、同じ溶媒であってしかし各濃度の試験物質を含んだものによって、置き換えることによって行われた。
G3PDH活性を検定するために、培養液を処理後７日（Ｄ＝D14）に集めた。
３）D14の日におけるG3PDH酵素活性の検定
一層の細胞をはぎ取って集め、これを25mMトリスHCl緩衝液中、pH7.4で1mMのEDTA存在下、４℃にて激しくホモジェナイズした。G3PDH活性は、遠心分離後、細胞顆粒上澄みについて検定した。
検定は、上記ペローアッセイ法により行い、mgタンパク質あたりのG3PDH酵素活性を測定した。タンパク質含量は、ジェイ．ローリー（J.Lowry）によるBiol.Chem.、193（1951）、pp.265〜75、記載のタンパク質検定方法によって測定し、酵素活性は、ナノモル／分/mgタンパク質で表した。
これらの試験は、各サンプル毎、各対照群に行った。
以下の物質を試験に供した：
ａ）最初の対照物質としてDMEM培地に、6mlの培地に対して7.5μｌのエタノールを添加したもの；
ｂ）同一の培地であって、しかし、60μｌのDMSO（ジメチルスルホキシド）を6mlの培地に添加したもの；
ｃ）同一の培地であって、しかし、フォルスコリンを含有するコレウス属フォルスコリイ種の、市販の抽出物を、7.5μｌエタノール中に乾燥物を0.025g/lの濃度で希釈したものを6mlの培地に添加したもの；
ｄ）上記DMEM培地に、6mlの培地に対して、実施例２で得たテフロシア属プルプレア種乾燥抽出物を0.2g/lで60μｌのDMSOによって希釈したものを添加したもの；
ｅ）DMEM培地に、6mlの培地に対して、実施例２で得たテフロシア属プルプレア種乾燥抽出物を0.1g/lで60μｌのDMSOによって希釈したものを添加したもの；及び
ｆ）DMEM培地に、6mlの培地に対して、実施例２で得たテフロシア属プルプレア種乾燥抽出物を0.05g/lで60μｌのDMSOによって希釈したものを添加したもの。
得られた結果を下記表２に示す：
0003555030.tif 000005
表２の結果から、テフロシア属プルプレア種の植物の抽出物は、少量のNADH放出によって示されているように、G3PDH活性のかなり有意な阻害活性を有していることが明らかである。更に、濃度0.02g/lから、この活性は、アデニル酸シクラーゼを促進する活性及び脂肪分解に対する効果によって知られているフォルスコリンを含有するコレウス属フオルコリイ種の抽出物によって得られる活性に比べて同一程度か又は若干大きいことが判る。
フォルスコリンを含有せず、従って上述した活性のための化粧用又は薬用の組成物を製造するための用途において、フォルスコリンに対する興味深い代替物を提供する物質を用いて、G3PDH活性を阻害することは有利である。
本発明を、以下に、化粧用又は薬用、特に皮膚科用組成物の各種配合実施例を掲げつつ説明する。
実施例５
痩身用クリーム
・実施例１のテフロシア属プルプレア種の種子抽出物１％
・クリーム用賦形剤  q.s.p.                   100％
このクリームは、望ましい痩身効果が得られるまで、少なくとも１日１回、２〜３週間の間、脂肪のついた身体の領域に適用される。
実施例６
色素化用化粧用組成物
この組成物は、下記成分からなる：
・実施例１のテフロシア属プルプレア種の種子抽出物
0.5％
・通常の化粧用ゲル賦形剤  q.s.p.             100％
このゲルは、望ましい効果が得られるまで、色素化すべき皮膚の領域に適用される。
実施例７
抗炎症用医薬組成物、特に皮膚科用組成物
この組成物は、下記成分からなる：
・実施例１のテフロシア属プルプレア種の種子抽出物
0.2％
・薬理学的に許容しうる賦形剤  q.s.p.         100％
実施例８
抗老化用化粧用組成物
この組成物は、下記成分からなる：
・実施例１のテフロシア属プルプレア種の種子抽出物
0.1％
・常用の化粧用賦形剤  q.s.p.                 100％
この組成物は、皮膚の、抗老化効果が求められる領域に適用され、このものは、充分な期間にわたって、条件にもよるが、通常、数週間から数カ月にわたって適用される。