(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性セルロース低級アルキルエーテルを含有し、安定化剤を含まない安定な繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）含有フィルム製剤。
【請求項２】
水溶性セルロース低級アルキルエーテルが、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメチルセルロースから選ばれる１種または２種以上であり、その配合量が繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１重量部に対して５０〜１，５００，０００重量部の範囲内にある請求項１の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）含有フィルム製剤。
【請求項３】
多価アルコールおよび／または界面活性剤をさらに配合する請求項１の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）含有フィルム製剤。
【請求項４】
多価アルコールおよび／または界面活性剤の配合量が全製剤重量の０．３〜８０％重量の範囲である請求項３の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）含有フィルム製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は安定な線維芽細胞成長因子（以下、「ＦＧＦ」ともいう）を含有するフィルム製剤に関する。さらに詳しくは、本発明はＦＧＦに、水溶性セルロ−ス低級アルキルエーテル、さらに必要に応じて多価アルコールおよび界面活性剤から選ばれる可塑剤、さらに緩衝剤、殺菌剤等を配合した安定性の優れたフィルム製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＦＧＦは１９７４年にウシの脳下垂体から初めて検出され、１９８０年代中頃には、２つのタイプ、すなわち等電点（ｐＩ）が５〜６の酸性線維芽細胞成長因子（以下、「ａＦＧＦ」という）、およびｐＩが９〜１０の塩基性線維芽細胞成長因子（以下、「ｂＦＧＦ」という）が精製された。現在では、これらａＦＧＦおよびｂＦＧＦに加えて、ＩＮＴ２タンパク質、ＨＳＴ１タンパク質、ＦＧＦ５、ＨＳＴ２タンパク質／ＦＧＦ６、およびＫＧＦの７種の成長因子がＦＧＦファミリーに属するとされている。
このうちａＦＧＦ、ｂＦＧＦはヒトの種々の臓器に存在し、線維芽細胞や血管内皮細胞に対して強力な増殖作用がある。その臨床的利用として、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈瘤性下腿潰瘍の治療、角膜、皮膚、骨移植の容易化、創傷、骨折、腱の切断時の治療期間短縮が期待されており、将来的には、アルツハイマー病等の脳神経の変性疾患や心筋梗塞への応用も可能と考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＦＧＦは物理化学的に非常に不安定で、酸、アルカリ、熱等ですぐに失活してしまうことから、優れた生理活性物質であるにもかかわらず、医薬品としての開発は容易ではない。
そのため、ＦＧＦ配合製剤の安定化の試みとして、成長因子を安定化するために充分な水溶性多糖を含有する水性の医薬組成物とする方法（特開昭６３−１５２３４）、ＦＧＦムテインの水溶液にグリコサミノグリカンを添加する方法（特開平２−４０３９９）、ＦＧＦムテインもしくはその水溶液に硫酸化グルカンを添加する方法（特開平２−１３８２２３）、ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキシプロピルセルロースを配合する方法（特開平４−１２８２３９）、ＦＧＦとシュークロースオクタスルフェート（  ＳＯＳ）の塩とを結合、もしくは複合体とする方法（特開平４−３３００１７）、ＦＧＦとデキストラン硫酸との組み合わせの製剤（国際特許出願  ＷＯ  ９００３７９７）等が開示されている。
しかしながら、いずれも水性組成物、粉末組成物でのＦＧＦの安定化に限られている。
【０００４】
一般に、熱傷、褥瘡、糖尿病性潰瘍等の難治性皮膚潰瘍には、強力な創傷治癒促進作用のあるＦＧＦの投与が有効であると考えられている。上記従来の安定化されたＦＧＦの水性組成物、粉末組成物も通常の手法で、液、軟膏、クリーム、ゲル等の外用剤に調製して潰瘍部位に直接投与することも可能ではある。しかしながら、液剤の場合、ガーゼ等に含浸させて使うために傷口に固着し、ガーゼ交換時に新生上皮を損なうおそれがあり、軟膏、クリーム、ゲルの場合、傷口に手で塗り込まなくてはならず、ＦＧＦのような微量で活性の強い物質を扱うには好ましくない。さらに損傷部位は当然痛みを伴うことが考えられ、塗擦時の物理的刺激は痛みの閾値の低い患者にとって過度の刺激となる可能性がある。また、ＦＧＦを含有したハイドロゲル製剤（シート状）（国際特許出願ＷＯ  ９００３８１０）も提案されているが、凹凸のある創傷面への密着性に欠けるため、創傷面と製剤面との間に浸出液が貯留し、雑菌などによる化膿のおそれがある。また、フィルム製剤と異なり、水分を多量に含有しているためＦＧＦの安定性についても問題が残されている。
【０００５】
本発明者らは、創傷治癒促進作用を有するＦＧＦを前記の如き難治性皮膚潰瘍の治療に用いるために、従来製剤の欠点を克服し、かつＦＧＦの安定化をはかる方法を鋭意研究したところ、水溶性高分子のフィルム製剤が、患部のサイズに合わして裁断し、創傷部位に置くだけの簡便な方法でＦＧＦを投与でき、しかも深部潰瘍に対して溶解して使用できる製剤であることを見いだした。また、水溶性高分子のフィルム製剤は薄くて柔軟性があるため物理化学的刺激が少なく、追随性があるため凹凸のある傷口にも密着し、微量の活性物質を正確かつ有効に投与することができ、液体で簡単に洗い流すことができるので傷の管理がし易いという、潰瘍部位に適用する製剤として満足すべき特徴を具備している。加えて水溶液中で極めて不安定であるＦＧＦが、含有水分の少ないフィルム製剤中では特定の安定化剤を用いずとも安定であることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は水溶性のセルロース低級アルキルエーテルをＦＧＦに配合し、必要に応じてさらに多価アルコールおよび界面活性剤から選ばれる可塑剤、並びに緩衝剤、殺菌剤等を配合することを特徴とする安定なＦＧＦフィルム製剤を提供する。
本発明に用いられるＦＧＦの例としては、遺伝子操作技術によりクローン化されたヒトＦＧＦ遺伝子を微生物や動物細胞で発現させることにより大量生産が可能となった組み換え型のＦＧＦが挙げられる。その配合量はフィルム製剤中に５μｇ〜１０ｍｇ／（１０×１０）ｃｍ２である。
本発明に用いる水溶性のセルロ−ス低級アルキルエーテルとしては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等が挙げられ、特にヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。これら水溶性セルロース低級アルキルエーテルの粘度範囲は５〜５０，０００ｃｐｓ（２％水溶液、２０℃、Ｂ型粘度計）が好ましい。
上記水溶性セルロース低級アルキルエーテルの配合量は、ＦＧＦ１重量部に対して５０〜１，５００，０００重量部、さらに好ましくは１００〜２５０，０００重量部、最も好ましくは３００〜２，０００重量部の範囲である。
【０００７】
本発明のフィルム製剤には、製剤の柔軟性を改善する目的でグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，３−ブチレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等の界面活性剤から選ばれる可塑剤を添加することができる。その添加量は、全製剤重量の０．３〜８０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは５〜６０重量％である。添加量が８０重量％を越えると、フィルム製剤としての形状が保てず好ましくない。
【０００８】
本発明のフィルム製剤は、さらに必要に応じて緩衝剤、殺菌剤を配合することができる。
本発明のフィルム製剤に用いる緩衝剤としては、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤などが挙げられる。そのｐＨは４．５〜７．５であり、好ましくはｐＨ５．０〜６．５である。
本発明のフィルム製剤に用いる殺菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。その配合量は０．０００５〜０．１重量％であり、好ましくは０．００１〜０．１重量％である。
本発明のフィルム製剤の厚みとしては、５〜５００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍである。製剤の厚みが５μｍ以下の場合は、フィルムの強度が弱くなり、破損が生じやすく、取扱いが難しいため好ましくない。逆に５００μｍを越えると、柔軟性に欠け、傷口への密着性が悪くなるため好ましくない。
【０００９】
本発明のフィルム製剤の一般的な製法としては、まず水または緩衝液に必要に応じて可塑剤、殺菌剤を加え、ついで水溶性セルロース低級アルキルエーテルを徐々に添加し、分散溶解させた後、ＦＧＦを含有する緩衝液を徐々に添加し、撹拌して均一な溶液にする。この溶液を脱気した後、展延、乾燥してＦＧＦ含有フィルム製剤とする。この場合、乾燥温度が高すぎるとＦＧＦが失活するおそれがあるので、乾燥温度は３０〜５０℃程度のなるべく低い温度が好ましい。
【００１０】
【実施例】
つぎに実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
水（９２．３３ｇ）にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｍ）１）（６．０ｇ）を徐々に添加し、粒子が完全に分散溶解するまで撹拌を続ける。この液を撹拌しながら、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（１．６７ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤を作製する。
【００１１】
実施例２
水（８８．５ｇ）を７０℃以上に加温しながら、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０（ＨＰＭＣ  ２９１０）２）（９．０ｇ）を徐々に添加する。均一な熱水スラリーとなった後、外部から冷却しながら撹拌し、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（１．６７ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤を作製する。
【００１２】
実施例３
水（８８．５ｇ）を７０℃以上に加温しながら、メチルセルロース（ＭＣ）３）（９．０ｇ）を徐々に添加する。均一な熱水スラリーとなった後、外部から冷却しながら撹拌し、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（１．６７ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤を作製する。
【００１３】
実施例４
下記表１に示す配合成分に従い、フィルム製剤Ａ〜Ｄを作製する。すなわち、水または緩衝液（７８．３３ｇ）に可塑剤（１．０ｇ）、およびフィルム製剤Ｄの場合にはさらに殺菌剤（１．０ｍｇ）を加え、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ）（１９．０ｇ）を徐々に添加し、粒子が完全に分散溶解するまで撹拌を続ける。この液を撹拌しながら、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（１．６７ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤Ａ〜Ｄを作製する。
【００１４】
【表１】
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１）ＨＰＣ−Ｍ（日本曹達株式会社製）／粘度１５０〜４００センチポイズ／ヒドロキシプロピル基５２．４〜７７．５％
２）ＴＣ−５Ｓ（信越化学工業製）／粘度１５．０センチポイズ／メトキシル基２８．０〜３０．０％／ヒドロキシプロピル基７．０〜１２．０％
３）メトローズＳＭ−１５（信越化学工業製）／粘度１３．０〜１８．０センチポイズ／メトキシル基２７．５〜３１．５％
４）ＨＰＣ−Ｌ（日本曹達株式会社製）  ／粘度６．０〜１０．０センチポイズ／ヒドロキシプロピル基５２．４〜７７．５％
【００１５】
試験例１
本発明のＦＧＦ含有フィルム製剤中のＦＧＦの安定性を検討した。
（試験試料の作製）
本実験に用いたフィルム製剤は、以下の様にして製造した。
水（９３．３５ｇ）にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（６．２０ｇ）を徐々に添加し、粒子が完全に分散溶解するまで撹拌を続ける。この液を撹拌しながら、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（３．８ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤を作製し、これを試料とする。
（方法）
ヒトｂＦＧＦ含有等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および、ヒトｂＦＧＦ含有フィルム製剤を１５℃の恒温室に保存した。その後ＨＰＬＣ法によってｂＦＧＦの残存率を測定し、その結果を表２に示す。
【００１６】
（結果）
【表２】
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表２に示す結果から、本発明のフィルム製剤はｂＦＧＦを安定に保持することがわかる。
【００１７】
試験例２［創傷治療に及ぼす効果］
本発明のＦＧＦ含有フィルム製剤の創傷治療に及ぼす影響を、遺伝的糖尿病マウスの皮膚全層切除モデルを用いて検討した。
（試験試料の作製）
本実験に用いたフィルム製剤は、以下の様にして製造した。
水（９３．３５ｇ）にヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（６．２０ｇ）を徐々に添加し、粒子が完全に分散溶解するまで撹拌を続ける。この液を撹拌しながら、５ｍｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦを含有するクエン酸塩緩衝液（３．８ｍｌ）を徐々に添加し、均一になるまで撹拌を続ける。脱気した後、展延、乾燥し、フィルム製剤を作製し、これを試料３とする。また、ヒトｂＦＧＦを添加せずに同様に製造したものを試料１とする。
コントロールとしては生理食塩液（２０μｌ／ｓｉｔｅ）を用い、またヒトｂＦＧＦを生理食塩水で所定濃度になるように調製したものを試料２とした。
なお、試料１および試料３は、用時に細切（１．４ｃｍ×１．４ｃｍ）して使用した。
試験群の構成を表３に示す。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
（試験方法）
試験前日にマウスの背部を電気バリカンと電気シェーバーを用いて丁寧に剪毛し、エーテル麻酔下で、背部皮膚を消毒用エタノールにて清拭後、外科用湾曲ハサミを用いて背部正中部に円形の皮膚全層切除創（２ｃｍ２）を作成した。
皮膚切除後、各試料を１日１回５日間（計５回）滴下あるいは貼付し、傷面をＢＩＯＣＬＵＳＩＶＥＲ（ジョンソン＆ジョンソンメディカル）  により被覆した。傷面を２〜４日間隔でプラスチックシートにトレース後、トレース方式図形解析システムにより創傷面積を測定し、切除直後の面積に対する比率を算出して創傷治癒効果を求めた（図１）。さらに創傷面の血管新生・肉芽形成の程度を肉眼的にスコアー付けし（０：無影響、１：軽度、３：中程度、４：強度）、経日変化を調べた（図２および図３）。
【００２０】
（統計解析）
各試料群の面積変動率の平均値と標準偏差を算出し、ハートリイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）の検定で等分散の場合は一元配置分散分析で、不等分散の場合はクラスカル−ウオリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）のＨ検定を実施した。その結果、５％で有意差が認められた場合、コントロール群と試料２投与群および試料１投与群と試料３投与群との差を多重比較した。また、創傷面の血管新生・肉芽形成の肉眼的スコアーの比較には、クラスカル−ウオリスのＨ検定を用いた。
【００２１】
（結果）
図１の結果では、コントロール群および試料１投与群の創傷面積は徐々に縮小し、切除後１８日目の創傷面積はそれぞれ平均２５．５％および２３．４％であった。一方、試料２および試料３投与群の創傷面積は、コントロールおよび試料１投与群と比較して、投与４日目より急速にかつ有意に縮小し、切除後１８日目の創傷面積はそれぞれ平均０．４％および２．６％で明らかな創傷治癒促進作用を示した。また、試料２と試料３の創傷面積推移に統計学的な差は認められなかった。
図２および３の結果より、試料２および試料３の血管新生，肉芽形成は、コントロールおよび試料１と比較していずれも早期に強く認められ創傷治癒促進に寄与したものと考えられた。また、血管新生および肉芽形成の程度において、試料２と試料３の両群間に差は認められなかった。
以上の結果から、本発明のヒトｂＦＧＦ含有フィルム製剤は創傷治癒剤として有効であることがわかる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、薬効成分であるＦＧＦと水溶性セルロース低級アルキルエーテル、および必要に応じて特定の可塑剤、緩衝剤、殺菌剤等を配合してフィルム製剤とすることにより、薬効成分のＦＧＦを物理化学的に安定に保持し得る、皮膚潰瘍部位に直接適用可能な製剤を提供する。
本発明のＦＧＦ含有フィルム製剤は、創傷治癒剤として皮膚潰瘍部位に適用するに際して、創傷部位に単に置くだけの簡便な方法で主薬成分を投与でき、また製剤が薄く柔軟性があるため、患部への刺激が少なく、患者に投与時の痛みを感じさせることがないという利点を有する。さらに、本発明のＦＧＦ含有フィルム製剤は追随性があるので凹凸のある創傷部にも密着し、微量の活性物質（ＦＧＦ）を正確に患部に投与することができる。さらに製剤を液体で簡単に洗い流すことができるので、傷の管理がしやすいという優れた皮膚潰瘍治療剤としての特徴を持つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】生理食塩液（コントロール）、ヒトｂＦＧＦ不含フィルム製剤（試料１）、ヒトｂＦＧＦ含有生理食塩液（試料２）および本発明のヒトｂＦＧＦ含有フィルム製剤（試料３）を適用した場合の、マウス皮膚全層切除モデルにおける創傷面積の変化率の経日変化を示すグラフ。
【図２】生理食塩液（コントロール）、ヒトｂＦＧＦ不含フィルム製剤（試料１）、ヒトｂＦＧＦ含有生理食塩液（試料２）および本発明のヒトｂＦＧＦ含有フィルム製剤（試料３）を適用した場合の、マウス皮膚全層切除モデルにおける創傷部位の血管新生の程度の経日変化を示すグラフ。
【図３】生理食塩液（コントロール）、ヒトｂＦＧＦ不含フィルム製剤（試料１）、ヒトｂＦＧＦ含有生理食塩液（試料２）および本発明のヒトｂＦＧＦ含有フィルム製剤（試料３）を適用した場合の、マウス皮膚全層切除モデルにおける創傷部位の肉芽形成の程度の経日変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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