(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物指標であって、
バチルス・サーキュランスである生体の、選択された数の胞子と、
前記胞子を接種されたキャリアと、
該接種されたキャリアのためのパッケージであって、前記パッケージは殺菌量のガス又は蒸気が前記胞子と接触するのを可能にする程度に十分な透過性を有する部分を含み実質的にバクテリアは不透過である、ところのパッケージと、
から成る生物指標。
【請求項２】
請求の範囲第１項の生体指標であって、
前記胞子の前記選択された数が、約５×105から約５×106個の範囲にある、
ところの生体指標。
【請求項３】
請求の範囲第１項の生体指標であって、
前記生体が、ATCC61バチルス・サーキュランスを含む、
ところの生体指標。
【請求項４】
請求の範囲第１項の生体指標であって、
前記キャリアが、吸着性基質から形成され、前記胞子は、そこに吸着され及び／又はその中に散布される、
ところの生体指標。
【請求項５】
請求の範囲第１項の生物指標であって、
前記パッケージの透過可能な前記部分が気体状酸化剤を通し、前記パッケージが実質的に液体に対し不透過である、ところの生物指標。
【請求項６】
請求の範囲第１項の生体指標であって、
前記パッケージの透過可能な前記部分は、減少した圧力の下で、過酢酸蒸気及び／または、アルゴン、ヘリウム、窒素、酸素及び水素の２つ又はそれ以上のガス混合物を通過させる、ところの生物指標。
【請求項７】
請求の範囲第６項の生物指標であって、
前記減少した圧力が、約0.1から約10トルである、ところの生物指標。
【請求項８】
請求の範囲第５項の生物指標であって、
前記パッケージの前記部分が、前記パッケージを露出させた後、約５分以内で殺菌量を通過させる、ところの生物指標。
【請求項９】
請求の範囲第１項の生物指標であって、
前記パッケージが、可撓性である、ところの生物指標。
【請求項１０】
請求の範囲第９項の生物指標であって、
さらに、多量の胞子の成長媒体から成り、前記成長媒体が、前記パッケージ内に配置され、脆弱な部材によって前記胞子から分離される、ところの生物指標。
【請求項１１】
請求の範囲第10項の生物指標であって、
前記パッケージに十分な力が加えられて前記脆弱な部材が壊れるまで、前記脆弱な部材は前記成長媒体を前記パッケージ内に十分に密閉して包囲するよう構成されている、ところの生物指標。
【請求項１２】
殺菌プロセスをモニターするための方法であって、
選択した数の生物バチルス・サーキュランス胞子を含む生物指標を殺菌チェンバ内に配置する工程と、
前記生物指標を殺菌ガスに露出させる工程と、
前記生物指標を前記殺菌チェンバから除去し、胞子成長条件下でキャリアを培養する工程と、
から成る方法。
【請求項１３】
請求の範囲第12項の方法であって、
前記露出させる工程が、酸化ガスへの露出を含む、ところの方法。
【請求項１４】
請求の範囲第12項の方法であって、
前記露出させる工程が、過酢酸蒸気、過酸化水素蒸気、過酢酸及び過酸化水素蒸気の混合物、及び／又はアルゴン、ヘリウム、窒素、及び水素の１つ又はそれ以上と酸素とのプラズマ生成ガス混合物への露出を含む、ところの方法。
【請求項１５】
請求の範囲第12項の方法であって、
前記殺菌チャンバが、前記露出させる工程以前に排気される、ところの方法。
【請求項１６】
請求の範囲第15項の方法であって、
前記排気によって、圧力が約0.1から約10トルの範囲に減少する、ところの方法。
【請求項１７】
請求の範囲第12項の方法であって、
残存している胞子の数が、前記露出させる工程の時間の関数として胞子成長条件下で決定される、ところの方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は概して気体状殺菌処理のための生物指標を含み、特に、気体状酸化殺菌薬及び殺菌処理のための生物指標に基づいたバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）の使用に関する。
背景技術
生物指標は特定の殺菌処理に抵抗する特殊な微生物の特徴的な調合として、初めてU.S.Pharmacopeia XXII,Official Monograph,pp.1625−1626に定義された。それは、特定の物質用の有効殺菌処理、並びに器具、原料、及び無菌処理のためのパッケージ部品の殺菌の発達及び確立の点で殺菌装置の物理的動作の限界を援助するのに使用される。また、それは一度確立し、先に確立されかつ提供された殺菌サイクルを回復するための周期的プログラムにおいて、殺菌サイクルをモニターするためにも使用される。それは、微生物の周知の種の生物培養を伴う２つの形式のうちのひとつである。ひとつにおいて、胞子が、接種されたキャリア（フィルター紙、ガラスまたはプラスチックのディスクまたは紐）の保全を維持するために、キャリアに付加されかつパッケージされるが、殺菌薬が効果を発揮するためには適正に個別の直接パッケージ内で使用される。他方において、該胞子は殺菌される接種生成物である表現ユニットのロットに、または類似のユニット（接種された同様の生成物）に付加される。
少し後のPharmacoperiaの1626頁には、“生物指標及びひとつの殺菌処理への抵抗として使用するために選択された微生物胞子の特定の菌株は、他の殺菌処理に対してまたは殺菌の同一モードの異なる殺菌条件に対してさえも必ずしも適切ではない。”と指摘する。
国家及び連邦の法律は、たとえば、エチレン酸化物（発ガン性物質）のような危険なガスの量を、毒性残留物または排気生成物を生成する装置または方法を使用するための作業環境において厳しく制限する。
プラズマを使用した殺菌容器が米国特許第3,383,163号で提案された。プラズマはガスに電磁場を付勢することにより生成されるイオン化されたガス体である。該イオン化ガスは殺菌される物体の表面に微生物を接触させ、かつ効果的に該微生物を破壊する。
最近登録された２つの特許は殺菌用に酸化ガスを使用する。Moultonらによる米国特許第5,084,239号は、下流プラズマ処置の代わりに抗菌剤処置を使った処理を説明する。該抗菌剤は減圧状態の下で過酢酸蒸気である。Campbellらによる米国特許第5,115,166号は殺菌される物質がプラズマからの反応原子にさらされるところのプラズマ殺菌装置及び方法を説明する。該プラズマは、酸素、アルゴン、ヘリウム、及び／または窒素、及び水素、または空気と水素の混合物、所望の比を与えるために酸素または窒素が補充された混合ガスから生成される。
酸化ガスを含むそのような殺菌処理は、胞子を含んだまま、殺菌されるべき物質へダメージを与えることなくかつ環境に安全な危険物の存在する状態で毒性残留物または放出物を伴うことなく、効果的に生体を殺せるが、処理をモニターする工程はそのような処理に対し通常使用されるさまざまな生物指標生体の減少した抵抗力のために適用を停止している。さらに、蒸気殺菌に対し生物指標において有用な生体として理解されるスチーロサーモフィラス菌（stearothermophilus）は酸化ガス殺菌処理に対して曲線の反応カーブを有することが発見された。これは、指標生体の不活性化が予測可能な方法で発生しなければならないために不利である。したがって、生物指標内の生物指標生体の数は、殺菌処理時間が適正な安全なマージンで調節されるよう照射時間のエキスポネンシャルで減少すべきである。正しい条件で、殺菌は第１オーダのキネティックス（運動論）を見積もり、その結果殺菌サイクル時間が単純に決定されるようにする。このように、特に気体状酸化殺菌薬及び殺菌処理に有用なよりよい細菌学的指標が有利である。
発明の開示
したがって、本発明の目的は殺菌薬がパッケージ内に進入しかつ生体胞子付近で実質的に一定の高濃度に達したとき、ガス殺菌処理における第１オーダの死のキネティックスに近い生物指標を与えることである。
本発明の他の目的は、より首尾一貫した、酸化ガス殺菌処理に対する比較的安定な抵抗を有する生物指標を与えることである。
本発明のこれらのまたは他の目的はパッケージ内に含まれる選択された数の生物生体胞子から成る一つの生物指標実施例内で与えられる。該生体はバチルス・サーキュランスである。パッケージは微生物に対し不可入である（すなわち、実質的にはバクテリアに対して不透過である）が、気体殺菌処理の間に殺菌量のガスを胞子に接触させるのに十分な透過性を有する部分を有する。
本発明の他の態様において、選択された数の生物バチルス・サーキュランスの胞子を含む生物指標が酸化ガスのような殺菌ガスにさらされることにより、殺菌処理をモニターするための方法が与えられる。その後、該生物指標が除去されキャリアが培養される。生存胞子数は胞子成長の条件の下で決定される。
当該生体は非病原性であると考えられ、パッケージされると比較的長期保存を与えるのに十分に安定で、成長が単純であるため通常の技術及び材料を使って無菌試験を行うことができ、従来のスブチリス菌及びスチーロサーモフィラス菌などより高い抵抗力とより安定な抵抗パターンを有することが発見されたために、生体としてバチルス・サーキュランスを使用した生物指標はガス殺菌処理において有利である。
【図面の簡単な説明】
図.1は本発明の実施例と他の３つの生体菌（スブチリス菌、スチーロサーモフィラス菌、及びパミラス菌）の典型的な生存曲線を図示したものであり、縦軸は生存数の対数であり、横軸は分単位の時間を表し、使用される処理は２つの殺菌剤に相互作用的にさらし、そのひとつは過酢酸気体で他はプラズマ生成酸化ガス混合物である、ところの処理である。
図.2は過酢酸気体のみ使用される殺菌処理におけるバチルス・サーキュランス及びスブチリス菌の生存曲線を比較したものである。
図.3はプラズマ生成酸化ガス混合物のみが使用されるところの殺菌処理において、バチルス・サーキュランス及びスブチリス菌の生存曲線を比較したものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の生物指標はその生物指標が所期の目的のために使用されるまで、胞子の完全性を維持するために、パッケージされたバチルス・サーキュランスの胞子を有していなければならない。
バチルス・サーキュランス培養物は、たとえば、アメリカ・タイプ・カルチュア・コレクション（メリーランド州20852、パークローン・ドライブ、12301）から入手可能である。バチルス・サーキュランス株のうち、ATCC  61、ATCC13403、およびATCC21821、21822（それぞれ、n.proteophilusおよびn.biotinicusの亜種）は入手可能である。本発明を実施するために使用された株はATCC61として得られた。
本発明のパッケージの少なくとも一部がガス、または蒸気に対し透過性となり、バクテリアに対し不透過性となる。全体のパッケージがこのような部分のように構成されてもよく、しかし通常はパッケージは一部として、そして一つまたはそれ以上の材料から構成される。他の材料は、ここでは、ガスおよびバクテリアに対し不透過性に構成される。本発明のパッケージを形成するときに最適な不透過性材料としては、通常フィルム、シートまたは管に形をしたポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ピニルクロライド）、ポリ（エチレン・テレプタレート）が含まれる。
ガスまたは蒸気に対して透過性があり、バクテリアに対して不透過性となる部分には、典型的に、微細孔があり、その孔の容積平均直径が約0.02から0.5μの範囲にある。ガス、蒸気という用語は全体を通じて同義語として使用するが、ガスという用語はプラズマ工程から生成される活性種を説明することがある。適切な微細孔材料には、通常フィルムやシートの形をした、紡いで連結された（spunbonded）ポリエチレン、紡いで連結されたポリプロピレン、紡いで連結された微細孔のあるポリエチレン、微細孔のあるポリプロピレンが含まれる。紙もまた、本発明の実施例の透過性部分として使用し得る。透過性材料の厚さは変えても良いが、通常は約0.23から0.65mmの範囲で変えてもよい。ガスまたは蒸気透過性部分は、殺菌が実行され、バチルス・サーキュランスの胞子と接触するチャンバから、プラズマからの殺菌ガスまたは活性種が入る少なくとも一つの経路を画成するように形状付けられる。
本発明のパッケージは、たとえば熱シーリング、接着接合のような、在来の技術により、つなぎ合わされ、接合され、シールされて形成することができる。熱シーリングの例には、加熱されたローラの使用によるシーリング、加熱されたバーの使用によるシーリング、高周波シーリング、超音波シーリングが含まれる。感圧接着剤に基づく剥離可能なシールもまた使用できる。
パッケージは使用までの貯蔵の間、完全に生体を封入しておく。パッケージはバクテリアのような他の微生物が侵入することを防止する。その理由は、他の微生物が予期された数およびタイプの生体胞子に基づいた殺菌性の決定を邪魔し、混乱させるからである。したがって、中の生体胞子はある条件で保存され、その結果、続く実験室での分析は意味のあるものとなり、確かなものとなる。
本発明の生物指標は好適に、胞子の接種を受けたキャリアを含む。キャリアが、選択された数の生体胞子をパッケージ内に位置し、その生存性を続いて分析される、単なる手段であることが分かるであろう。つまり、キャリアは、キャリアのような機能が保存される限り、材料や形状の選択の際、広く変え得る。
接種されたキャリア材料、または生成物のタイプが生物指標の抵抗力に非常に影響を与えることが示唆された。好適なフィルター紙のキャリア材が本発明に対して優れた貯蔵安定性を有することを示した。好適なキャリアはフィルター紙のような材料により形成される。その紙は、もし生存の確定を達成することが望まれるならば、運ばれた胞子とともに容易に解離されるものである。
好適なフィルター紙キャリアのようなキャリアは、ただ単に所望の胞子濃度をもつ水溶性懸濁液を用意し、アリコートをキャリアにピペットにより移すことで胞子を接種され得る。したがって、キャリアの接種は、USPXXII静菌剤試験法に従って行うことができる。簡潔にいうと、水内にバチルス・サーキュランスの胞子が含まれる懸濁液が、フィルター紙のようなキャリアに接種するために、アリコート当たり所望の数の胞子を産するように、用意される。
植物形の生体ではない胞子が、植物バクテリアが殺菌工程により容易に殺菌されることが知られているので、使用される。胞子はまた、それらが数年間休止状態に保持できるので、優れた貯蔵特性を有する。したがって、標準化された胞子株の殺菌が殺菌工程から行われたとき、非常に高い確度で、殺菌チェンバ内のバクテリア株の殺菌が行われたと言える。
選択された胞子がキャリア上に接種される。キャリア上に胞子を接種する前に、熱ショック工程が好適に行われる。熱ショック工程は、発芽のための酵素反応を用意するために、胞子に死に至らしめない程度に与える熱処理である。したがって、好適に熱ショック工程、液状胞子懸濁液の冷却、希釈化、そして、キャリアの接種が続く。以下の方法が接種されたキャリアを用意し、個体群をつくるために使用できる。
接種されたディスクを10mlの希釈化ブランクの中に置く。各ディスクは次に、一様な懸濁液に分解され、最低15秒の間激しく撹拌される。適当な希釈化が次に行われ、配置される。TSY（トリプ（Tryptic）大豆寒天）が回復（成長）媒体として使用できる。20から35mlの範囲の寒天が、サンプルの適当なアリコートが移された後に、各プレート内に注がれる。各プレートは完全に凝固させることができ、転化され、24−48時間、32−37℃で培養される。約30から300の間の、ユニットを形成するコロニーを含むプレートが計数され、ディスク当たりの平均個体群が計算される。
本発明の生物指標は、その生物指標が既に使用されたときを示すような、一つまたはそれ以上の必要と思われる付加的成分を含んでもよい。
たとえば、このような任意的手段が、マーカー、好適には染料または可変色インクのような視覚的なマーカーであってもよい。このような任意的成分はパッケージ内にあってもよく、外側面上にあってもよい。パッケージは柔軟なものでもよく、胞子成長媒体を脆弱な、シールされたガラス瓶内に含めてもよい。キャリアを除去することなく、殺菌するためのテストを行うために、このような様々なことを行うことができる。このようなさまざまな手段が米国特許第4,743,537号（1988年５月10日発行）、米国特許第4,717,661号（1988年１月５日発行）、米国特許第3,661,717号（1972年５月９日発行）、米国特許第3,440,144号（1969年４月22日発行）に図示をもって議論されている。これらすべての文献は参考文献としここに組み入れられる。したがって、生物指標を殺菌した後に、パッケージはガラス瓶を破裂させるために、曲げられ、圧搾される。次に、キャリアは成長媒体に晒され、成長に対した生物指標をモニターするために、パッケージからキャリアを除去する必要なく、培養できる。ph指標染料のような成長を示すための視覚的手段を含んでもよい。
本発明の生物指標は、相助作用する、二段階の酸化ガス殺菌工程を好適に使用して発展された。しかし、本発明の生物指標は他の気体状殺菌薬、他のガス状殺菌工程とともの広く使用される。本発明の特定の二段階工程の最初の工程において、酸化ガス、典型的には過酢酸の蒸気が殺菌剤として導入される。その工程の第２の段階において、アルゴン、酸素および水素のガスの混合物を使用して、プラズマ内に作られた活性種が、イオン−電子再結合および早期の緩和処理が行えるようにガス分配マニフォルドを通過し、次に酸化ガス混合物が殺菌チェンバに導入される。米国特許第5,115,166号は特に、プラズマ生成ガス混合物を説明する一方で、米国特許第5,084,239号は二段階工程が説明され、その一つの段階は殺菌剤として過酢酸蒸気を使用する。両特許はここに参考文献として組み入れる。
実験方法
本発明の生物指標の実施例が以下のように用意された。生物指標のためのパッケージは“Plastipeel Pouches"として、バクスター・ラボラトリーから得られた。これらのポーチ（小袋）は結合ポリエチレンファイバー（“Tyvek"）のガス透過性織物の上方シートを有し、不透過性ポリエステルフィルム（“Mylar"）の下シートを有する。その織物は既に三方がシールされ、キャリアの挿入後、残りの一方が使用者によりシールされる。フィルター紙ディスク（直径1/4インチ（シュレッチャー・アンド・シュエル社製、740E）がキャリアとして使用された。各ディスクには生物の106個の胞子の接種がなされた。比較実験生存曲線用に、各ポーチは二つの紙キャリアを含み一つにはバチルス・サーキュランス胞子があり、他方には比較用、スブチリス（subtilis）菌胞子の生体がある。生存曲線を比較し、スブチリス菌の胞子とバチルス・サーキュランスの胞子の死滅率分析を行うために、熱シールで区分分けされる。
殺菌ガスの露出間隔が選択され、生物指標がPlazlyte殺菌器（アブトックス）内に配置された。このような装置は実質的に米国特許第5,115,166号、および第5,084,239号に説明されている。生物指標は、過酢酸サイクルのみ、プラズマサイクルのみ、または選択された必要とされる露出時間の間両サイクルのみ、露出された。使用されたサイクルの間の過酢酸蒸気の量は約3mg/lで、その蒸気が過酢酸溶液を蒸発させることにより得られた。したがって、主要な過酢酸の気体状酸化種であると信じられているものに加えて、その蒸気はまた過酸化水素および酢酸（および水）を含む。プラズマ生成ガス混合物のための供給ガスはアルゴン、酸素および水素（アルゴンは約91.4％、水素3.8、、酸素4.7）で、一つのサイクルの間、約5.5標準l/minで流れる。結合した処理（両殺菌剤）は、（続く）プラズマ生成ガス混合物での処理の二倍の時間間隔の間、過酢酸蒸気の露出を行った。たとえば、三分の露出時間だと、キャリアが二分間、過酢酸蒸気に露出され、一分間、プラズマプロセスに露出される。
生物指標が殺菌ガス処理（壁の温度が約95゜Fに維持される）を受けた後、指標が除去され、殺菌性がテストされた。
各ポーチは開封され、それぞれのキャリアが無菌状態で、ラベル付けされた個々のグラインド管に移された。各管はキャリアが分解するまで、回転させられた。各解離されたキャリアが標準平板状算定菌数技術を使用して、順次希釈化された。生存した胞子の数は必要に応じて、胞子成長条件の下で決定された。
生存する胞子の数の生存曲線は、露出段階の時間の関数で決定される。分離成分に対するＤ値は線形回帰分析を使用して、計算された。Ｄ値（十進（decimal）減少）は特定の個体群を90％だけ減少させるためのある露出状態で必要となる時間であり、生存物の数に対する時間の対数のグラフと整合する線の傾斜の負の逆数である。
上述した実験方法に従い、本発明の生物指標のデータおよび比較データが、以下のように決定された。
例  １
独特の殺菌薬として過酢酸蒸気を使用すると、スブチリス菌及びバチルス・サーキュランスの胞子に対して生存曲線が作られ、死滅率分析がなされた。計算のための露出時間が３、６、９、12、15、及び18分であり、死滅率試験のための露出時間は、９、12、15、18、21、及び24分であった。さらした後、各々の生物指標が、全個体群又は殺菌性について試験され、付加的な３つの各々の微生物からの非露出キャリアが、陽性（生存）の制御子として計算された。表１は、このような実験の３組からの平均データを示す。
0003597533.tif 000002
唯一、過酢酸蒸気を有するＤ値が、バチルス・サーキュランスに対して3.0分であった（スブチリス菌を有する過酢酸蒸気では2.2分）。
表１のデータは図２にプロットされる。これらデータは、バチルス・サーキュランスがスブチリス菌と同様に過酢酸蒸気に対して抵抗性があるが、主たる差異は、より短い工程時間でバチルス・サーキュランスのために示されたラグ因数であることを示す。
例  ２
例１で説明されたものと同様の他の実験が（３つで）実施されたが、ここで、発明の生物指標の実施例及び比較の指標が、プラズマ相サイクルのみに露出された。この実験からのデータは、表２に示される。
0003597533.tif 000003
これらデータは、図３にプロットされ、バチルス・サーキュランスがスブチリス菌と同様のプラズプロセスサイクルに対する抵抗性があることを示す。
例  ３
その他の実験が例１及び２と同様にして（３つで）実施されたが、ここで、過酢酸蒸気サイクルが、プラズマ生成酸化ガス混合物サイクルに従って実施された。さらに、比較は、２つ以上の生体でなされた。表３が、これらデータを示すが、図１が、３つの他の生体と比較されたときの発明の実施例の典型的な生存曲線分析をグラフに図示する。
0003597533.tif 000004
組み合わせたプロセス（プラズマ相サイクルに従った過酢酸蒸気サイクル）においてバチルス・サーキュランスのＤ値が、1.7から2.4分の範囲にあった。
例  ４
抵抗の知られている予測可能な安定レベルが適切な貯蔵寿命にわたって維持されるのに重要であることから、発明の生物指標実施例の全個体群及び抵抗の安定性が調査された。表４が８カ月の貯蔵時間（取り囲み条件）にわたる生物指標安定性評価からとったデータを示す。
0003597533.tif 000005
報告された全個体群は、各々３つでプレートされた、６個の個々の生物指標の最小量から導かれた平均計数を表す。
このデータは、紙の上で乾燥されたバチルス・サーキュランス胞子の取り囲む温度貯蔵安定性を示し、キャリアが８カ月又はそれよりも長い製造物満了日の間の貯蔵安定性を示す。
発明の生物指標の実施例は、酸化ガス殺菌サイクルの有効かつ機械的にモニターするプログラムの一部分であると考えられ、殺菌が達成されたことを示すために定量的に使用される。発明の実施例の知られている全固定群及び抵抗レベルは、いずれの所定の確率に対しても殺菌の保証を与えるために使用され、適当な取り囲む温度の貯蔵寿命にわたって知られている予測可能で安定レベルを与える。
発明が好適な特定の実施例に関連して上述されたが、説明及び例が図説を意図としたものであって発明の範囲を限定するものではなく、それは、添付の請求の範囲によって定義されることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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