(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒存在下、アシル化剤と反応させ、アシル化することを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項２】
アシル化剤が、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物である請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項３】
反応温度が０〜５０℃であることを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項４】
アシル化触媒が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系触媒である請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項５】
アシル化触媒が４−ジメチルアミノピリジンまたは４−ピロリジノピリジンであることを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項６】
ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が１０万〜５００万であることを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項７】
カルボン酸がアミノ酸、ペプチドもしくはそれらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置換基を有する誘導体、オロチン酸、ウラシル−５−カルボン酸、１−（カルボキシアルキル）チミン、サリチル酸またはアセチルサリチル酸であることを特徴とする請求項２記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項８】
アミノ酸またはペプチドの誘導体が、アミノ保護基を有したものであることを特徴とする請求項７記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項９】
アシル化反応後、アミノ保護基を脱離することを特徴とする請求項８記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１０】
アシル化反応が酸の中和剤存在下で行われ、酸の中和剤として、３級アミンまたは無機塩基が用いられることを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１１】
前記水溶液が、水混和性有機溶媒を０〜５０％の範囲で含むことを特徴とする請求項１記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１２】
ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒存在下、アシル化剤と反応させた後、得られたアシル化ヒアルロン酸のアシル基を部分ケン化することにより任意の数のアシル基が導入されたアシル化ヒアルロン酸を得ることを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１３】
部分ケン化して得られるアシル化ヒアルロン酸のアシル基の導入数がヒアルロン酸構成二糖単位当たり０．００５〜０．５であることを特徴とする請求項１２記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１４】
水混和性有機溶媒水溶液に分子量１０万〜５００万のヒアルロン酸ナトリウムを溶解させた溶液に、無水ケイ皮酸もしくはケイ皮酸クロリドと４−ジメチルアミノピリジンもしくは４−ピロリジノピリジンと酸の中和剤とを含む水混和性有機溶媒溶液を添加して反応させ、分子量が１０万〜５００万であり、水酸基がケイ皮酸でエステル化されたヒアルロン酸を得ることを特徴とするシンナモイル化ヒアルロン酸の製造法。
【請求項１５】
水混和性有機溶媒が、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトアミドまたはピリジンであり、酸の中和剤がトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンまたは炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項１４記載のシンナモイル化ヒアルロン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は高分子ヒアルロン酸の水酸基のアシル化法に関する。ヒアルロン酸は動物組織中に天然に存在し生体再吸収性を有すると共に毒物学的および免疫学的作用が存在しないためそれ自体が薬剤、化粧品として利用されているが、これらをアシル化等の化学修飾を施すことによりさらなる用途が期待できる。例えばヒアルロン酸に医薬品や生理活性ペプチドを結合させたものは優れたドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳという）の薬剤となる。またヒアルロン酸にケイ皮酸やウラシル誘導体を結合させたものに紫外線を照射すると分子間架橋反応により三次元網目構造を有し不溶性の架橋ヒアルロン酸が得られ、生物分解性を有し生体適合性にすぐれた医療用材料となる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、水溶性多糖類のアシル化法としては、ヒアルロン酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦという）に懸濁させピリジンを触媒とし酸塩化物と反応させる方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１，４６−５０（１９６７）、Ｃｈｅｍ．Ｅｘｐｒｅｓｓ，６（９），６４７−６５０（１９９１））、グリコサミノグリカンのナトリウム塩を４級または３級アンモニウム塩に置換しＤＭＦに可溶にした後、ジメチルアミノピリジンを触媒とし酸無水物と反応させる方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２３６，１０７−１１９（１９９２））、プルランをＤＭＦ中ピリジンを触媒として塩化ベンゾイルと共に加熱する方法（特開昭５２ー７８２８６）等が知られている。
【０００３】
しかしながらヒアルロン酸は通常ナトリウム塩の形で入手されるが、このものは有機溶媒に不溶であるため、ヒアルロン酸ナトリウムを原料として使用すると不均一系反応となりアシル化反応は非常に遅く、アシル基の導入数のコントロールが難しく、導入位置にむらを生じ易い。また、ヒアルロン酸のカルボキシル基と酸塩化物とが反応して酸無水物を形成し、これが水酸基と位置非特異的に分子内または分子間エステル結合を生じるなどの好ましくない副反応を伴う。
【０００４】
また、ヒアルロン酸のナトリウム塩を４級または３級アンモニウム塩に置換しＤＭＦに可溶にした後、ジメチルアミノピリジンを触媒とし酸無水物と反応させる方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２３６，１０７−１１９（１９９２））があるが、この塩交換操作は非常に煩雑である上、多量のＤＭＦ廃液を生じるため、環境的、工業的にも問題がある。  さらにこれらの方法は、そのほとんどが溶解度や反応速度を上げるために加熱を必要とするが、高分子量のヒアルロン酸の場合はそれにより速やかに低分子化を起こす。
【０００５】
また粘性の高い高分子量のヒアルロン酸の化学修飾では、高希釈条件での反応と濃縮を繰り返す必要があるため従来の合成法、精製法ではその操作の煩雑さにより処理中にエンドトキシンが混入し易く医用材料を提供するには適さない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は第１にヒアルロン酸の水酸基に低分子化を伴わずに、最良の可溶化溶媒であると共に、環境保全に適した、環境に優しい水系において、簡便な操作および精製法により任意の数のアシル基を均一に導入する方法を提供することであり、第２にそれらを主体とした応用性及び汎用性のあるＤＤＳ素材、および光架橋性ヒアルロン酸をエンドトキシンフリーの状態で、医療用材料として提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは鋭意研究の結果、上記課題を以下の構成によって達成することに成功した。すなわち、この発明は、以下の通りである。
１）  ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒存在下、アシル化剤と反応させ、アシル化することを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
２）  アシル化剤が、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物である前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【０００８】
３）  反応温度が０〜５０℃であることを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
４）  アシル化触媒が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系触媒である前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
５）  アシル化触媒が４−ジメチルアミノピリジンまたは４−ピロリジノピリジンであることを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【０００９】
６）  ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が１０万〜５００万であることを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
７）  カルボン酸がアミノ酸、ペプチドもしくはそれらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置換基を有する誘導体、オロチン酸、ウラシル−５−カルボン酸、１−（カルボキシアルキル）チミン、サリチル酸またはアセチルサリチル酸であることを特徴とする前記２）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１０】
８）  アミノ酸またはペプチドの誘導体が、アミノ保護基を有したものであることを特徴とする前記７）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
９）  アシル化反応後、アミノ保護基を脱離することを特徴とする前記８）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
１０）  アシル化反応が酸の中和剤存在下で行われ、酸の中和剤として、３級アミンまたは無機塩基が用いられることを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１１】
１１）  前記水溶液が、水混和性有機溶媒を０〜５０％の範囲で含むことを特徴とする前記１）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
１２）  ヒアルロン酸またはその塩の水酸基を水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液中で、アシル化触媒存在下、アシル化剤と反応させた後、得られたアシル化ヒアルロン酸のアシル基を部分ケン化することにより任意の数のアシル基が導入されたアシル化ヒアルロン酸を得ることを特徴とするアシル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１２】
１３）  部分ケン化して得られるアシル化ヒアルロン酸のアシル基の導入数がヒアルロン酸構成二糖単位当たり０．００５〜０．５であることを特徴とする前記１２）記載のアシル化ヒアルロン酸の製造法。
１４）  水混和性有機溶媒水溶液に分子量１０万〜５００万のヒアルロン酸ナトリウムを溶解させた溶液に、無水ケイ皮酸もしくはケイ皮酸クロリドと４−ジメチルアミノピリジンもしくは４−ピロリジノピリジンと酸の中和剤とを含む水混和性有機溶媒溶液を添加して反応させ、分子量が１０万〜５００万であり、水酸基がケイ皮酸でエステル化されたヒアルロン酸を得ることを特徴とするシンナモイル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１３】
１５）  水混和性有機溶媒が、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトアミドまたはピリジンであり、酸の中和剤がトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンまたは炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする前記１４）記載のシンナモイル化ヒアルロン酸の製造法。
【００１４】
以下、本発明につき、詳細に説明する。
【００１５】
本発明に用いられるヒアルロン酸は由来、分子量には限定されないが、一般的には天然物、好ましくは脊椎動物または微生物由来で、平均分子量が１０万〜５００万、好ましくは約６０万〜２００万が挙げられ、またそのカルボキシル基は塩の形態でもよくアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩いずれの形でも使用できるが、特に水溶性塩が好ましく、このような塩としては一般的には入手し易いナトリウム塩またはカリウム塩が便利である。
【００１６】
本発明におけるアシル化反応は水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液に溶解させたヒアルロン酸溶液中に、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物をアシル化剤として添加することにより行われる。具体的には、水、または水混和性有機溶媒の０〜５０％を含む水溶液に溶解させたヒアルロン酸またはその塩の溶液中に、攪拌しながら無水の該有機溶媒に溶解したアシル化剤を添加することによって行われる。ここで、水への有機溶媒の混和率（％）＝１００・有機溶媒容量／混合水溶液容量である。
【００１７】
本発明のアシル化反応における反応系は、上記条件を満足すれば、特に制限はなく任意の方法を使用し得るが、特に、ヒアルロン酸またはその塩は、初めに水で溶解し、次いで有機溶媒を添加もしくは添加することなく、この溶液にアシル化剤、酸の中和剤（塩基）、およびアシル化触媒の有機溶媒溶液を０〜５０℃、好ましくは、０℃以上、室温以下の範囲、より好ましくは、氷冷下に滴下してアシル化反応を行うことが好ましい。
【００１８】
本方法によれば従来の有機溶媒中での反応の場合に必要であった、塩交換や溶媒置換といった煩雑な操作を全く経ることなくヒアルロン酸のアシル化が達成できることが大きな利点である。
【００１９】
本発明におけるアシル化剤の添加の際、アシル化触媒としてＮ，Ｎ−ジアルキルアミノピリジン系触媒、特に４ージメチルアミノピリジンまたは４ーピロリジノピリジンを用いることが好ましく、また反応によって生成する酸を中和する目的で酸の中和剤としてトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンのような３級アミンまたは炭酸水素ナトリウムのような無機塩基を用いることが好ましい。これらはアシル化剤と共に添加されることが好ましいが、予めヒアルロン酸ナトリウム溶液中に加えておいても良い。
【００２０】
またアシル化反応温度は０〜５０℃の間、好ましくは０℃以上、室温（ＪＩＳ Ｋ００５０では５〜３５℃を室温という）以下、さらに好ましくは氷冷下であり、反応時間は３分から２時間かけてアシル化剤を滴下し、その後必要に応じた時間、例えば、３０分から２時間攪拌してアシル化反応を行う。その後エタノール沈殿法、透析などの公知の精製法を用いて低分子の不純物を除去する。このように反応温度を低く抑えることにより低分子化を起こし易い高分子量ヒアルロン酸でさえも、もとの分子量を保持したままでアシル化が可能となった。
【００２１】
アシル化されたヒアルロン酸の分子量は、全てのアシル基をケン化により除去したのちゲル濾過法（ＧＰＣ）等で決定できる。
【００２２】
反応溶媒は、水単独または水混和性有機溶媒を含んだ水溶液であり、アシル化剤の滴下中すべての成分を溶解させておく組成が好ましいが、反応の進行と共に生成物が析出しても問題ない。
ここで、水混和性有機溶媒とは、水と自由な割合で均一に混ざる有機溶媒でアシル化反応を阻害しないものを意味する。
【００２３】
本発明に使用される水混和性有機溶媒としては、具体的にジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトアミド、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等が挙げられる。また、反応溶媒としては、前記例示した水混和性有機溶媒のいずれかから選択される１種以上の総計で０〜５０％の範囲を含む水溶液であって、かつアシル化剤の滴下中すべての成分を溶解させておく組成が好ましい。なお、本発明の含水系での反応においては、反応の進行とともに疎水性のアシル基導入率が高くなるとアシル化ヒアルロン酸が不溶化するため、アシル基の導入数が高くなりすぎないという効果がある。さらに目的物を通常の固液分離手段で分離し、水および／または有機溶媒で洗浄することによって容易に精製することもできる。
【００２４】
ヒアルロン酸に対するアシル化剤およびアシル化触媒の量は、所望のアシル化ヒアルロン酸の種類、すなわち、ヒアルロン酸の分子量あるいはアシル化剤の種類およびアシル基の所望導入数等により適宜選定され得るが、一般的には反応中の試薬の分解による損失を考慮し過剰量用いるべきであろう。なお、アシル化ヒアルロン酸のアシル基の導入数（以下、ＤＳという）は、ヒアルロン酸構成二糖単位当たりの導入数として定義できる。ＤＳはプロトンＮＭＲの積分強度または２８０ｎｍの吸光度の測定により決定できる（実施例１参照）。
【００２５】
本発明では、ＤＳを所望の値に制御できるが、通常、０．００５〜０．５、好ましくは約０．０５〜０．５の範囲である。
【００２６】
アシル化反応中にアシル化生成物が析出してきた場合は、ガラスフィルター等を用いる濾過、遠心分離、デカント等の固液分離手段により析出物を分離し、重曹水、水、及びエタノール等の適当な溶媒で順次洗浄するといった、より簡便な精製操作で目的物を精製、単離することが出来る。一般にＤＳが高いと不溶化するが、このようにして得たアシル化ヒアルロン酸を氷冷下にて、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等の希アルカリにより部分ケン化することで任意のＤＳ値を有する部分アシル化ヒアルロン酸を得ることも出来る。
【００２７】
該ケン化の具体的方法としては、例えば不溶性のアシル化ヒアルロン酸を水に懸濁させておき、得たいＤＳとなるために必要量の水酸化ナトリウム水溶液を０℃で滴下し、室温で溶解するまで攪拌する。この場合、水酸化ナトリウムはケン化したいアシル基と等モルが使用される。
また、反応終了後も生成物が析出しない場合は、通常のこの種の反応の後処理、すなわちエタノール等を用いる有機溶媒沈澱、透析、塩析、更に所望によりＧＰＣ、アフィニティー、イオン交換等の各種クロマトグラフィー等によりアシル化ヒアルロン酸を精製することが可能である。
【００２８】
本発明のアシル化反応に使用されるアシル化剤は、カルボン酸の酸無水物（対称酸無水物、混合酸無水物）または酸ハロゲン化物である。また、少なくともアシル化反応時に酸無水物または酸ハロゲン化物に変化するものであってもよい。上記カルボン酸の種類は、限定されないが、好ましい例として、ペプチドもしくはそれらの誘導体、ケイ皮酸もしくはそのフェニル基に置換基を有する誘導体（例えば、ｐ−アミノケイ皮酸）、オロチン酸、ウラシル−５−カルボン酸、１−（カルボキシアルキル）チミン（例えば、１−（カルボキシエチル）チミン）、サリチル酸、アセチルサリチル酸等が挙げられる。
【００２９】
ヒアルロン酸に結合させるべきアシル基が、アミノ酸、ペプチドの残基である場合はそれらに含まれるアミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などのペプチド化学において常用されるアミノ基の保護基（「生化学辞典」第２版、１４７１〜１４７２頁、１９９０年１１月２２日、（株）東京化学同人発行）で保護しておく必要がある。得られた保護基を有するアシル化ヒアルロン酸は、目的に応じて脱保護し、フリーのアミノ基とすることができる。該フリーのアミノ基を有するアシル化ヒアルロン酸の該アミノ基と所望の薬剤、アミノ酸、あるいはペプチド等を結合させ有用なＤＤＳ薬剤等を製造することができる。
【００３０】
上記カルボン酸は、カルボン酸の酸無水物または酸ハロゲン化物のようなアシル化剤の形態で反応に供されるが、カルボン酸の酸無水物を得るためのカルボキシル基の活性化方法はカルボジイミド類（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等）による対称酸無水物法、あるいは塩化ジメチルホスフィノチオイル等による混合酸無水物法等から適宜選択できる。
【００３１】
例えば、対称酸無水物が好適なカルボン酸は、ケイ皮酸無水物が、混合酸無水物が好適なものはｔ−ブトキシカルボニル化グリシン、ベンジルオキシカルボニル化グリシン等が挙げられる。
そして、得られたベンジルオキシカルボニルグリシン化ヒアルロン酸のベンジルオキシ基を接触水素移動還元、または接触還元などにより脱保護し、フリーのアミノ基を有するグリシル化ヒアルロン酸を製造することができる。
【００３２】
また、アシル基がシンナモイル基の場合はケイ皮酸クロリド及び無水ケイ皮酸が有効である。さらにアシル基が１−カルボキシエチルチミン由来の場合には酸無水物による活性化が、オロチン酸由来の場合には酸塩化物による活性化がより好ましい。
本発明に使用されるアシル化剤は、その他、任意のカルボン酸から選定できる。該カルボン酸はカルボキシル基を少なくとも１個有する有機化合物（脂肪族、芳香族、および複素環系化合物を含む）であればよく、カルボキシル基を複数個有したものでもよい。
【００３３】
特に、カルボン酸としてサリチル酸、アセチルサリチル酸、メルファラン（４−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン）等の有用な薬剤を使用すれば、そのアシル化ヒアルロン酸はＤＤＳ製剤として使用可能である。
【００３４】
なお、含水溶媒中で行われる本方法は従来のグリコサミノグリカンのアシル化法に比べ操作が非常に簡便であり、エンドトキシンフリーの水を使用することでエンドトキシンを実質的に含まない目的物を容易に得ることができる。また工業的に問題となる有機廃液の量を大幅に減らせるといった利点も併せ持つ。
【００３５】
【実施例】
以下実施例により本発明を詳細に説明する。
【００３６】
実施例１
ジオキサン水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５００ｍｇ（２糖単位として１．２５ミリモル）を２００ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸無水物１．７ｇ（６．２５ミリモル）とトリエチルアミン８６５μｌ（６．２５ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン７６３ｍｇ（６．２５ミリモル）の１０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて３０分間で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液を１．７Ｌ（リットル）の酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として４１７ｍｇ得た。５００ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸ベンゼン環および２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐｍ）の強度比（３：２．２）よりヒアルロン酸の２糖単位あたりのシンナモイル基のＤＳは０．３７であった（図１参照）。
【００３７】
実施例２
部分ケン化法によるシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて２５分間で滴下した後、室温で３０分攪拌を続けた。生じた沈澱をガラスフィルター上に集め、エタノールにより十分に洗浄後乾燥した。得られた固体を微粉末とし２０ｍｌの水に懸濁させ氷冷下０．０５規定水酸化ナトリウム溶液を２ｍｌ滴下した。さらに氷冷下にて１時間４５分攪拌後得られた均一な溶液を実施例１と同様のエタノール沈澱法にて精製し、標記化合物を５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．４６であった。
【００３８】
部分ケン化に供したシンナモイル化ヒアルロン酸の原料のヒアルロン酸と部分ケン化して得られたシンナモイル化ヒアルロン酸の分子量変化をＧＰＣにより調べた結果を図２に示した。図２の（ａ）は、原料のヒアルロン酸、（ｂ）は、部分ケン化後のもので、図２から該部分ケン化によりヒアルロン酸は加水分解されなかったことを、ひいてはシンナモイル化においても低分子化されなかったことを示している。
【００３９】
尚、ＧＰＣ測定条件は次の通りである。
カラム温度：３５℃
カラム：東ソー  ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ６０００ＰＷＸＬ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２１０ｎｍ
サンプルインジェクション：３０μＬ
溶媒：０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液
【００４０】
実施例３
ＤＭＦ水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後ＤＭＦ１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌＤＭＦ溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として４２ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．４６であった。
【００４１】
実施例４
ピリジン水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後ピリジン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌピリジン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として６７ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．０９であった。
【００４２】
実施例５
塩基としてジイソプロピルエチルアミンを用いたシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）とトリエチルアミンに代えてジイソプロピルエチルアミンを用いたほかは、実施例３の方法に従ってシンナモイル化ヒアルロン酸を合成した。精製後減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として７４ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．５４であった。
【００４３】
実施例６
ケイ皮酸クロリドによるシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸クロリド１４４μｌ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として９８ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．２５であった。
【００４４】
実施例７
アシル化触媒として４−ピロリジノピリジンを用いたシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した。この溶液にケイ皮酸無水物２７８ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ピロリジノピリジン１４８ｍｇ（１．０ミリモル）の２ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて１５分間で滴下した後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。
【００４５】
得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．９５であった。
【００４６】
実施例８
シンナモイル化ヒアルロン酸（分子量１５万）の製造
平均分子量１５万のヒアルロン酸ナトリウム８００ｍｇ（２糖単位として２．０ミリモル）を２００ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１００ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸無水物２．７８ｇ（１０ミリモル）とトリエチルアミン１．３８ｍｌ（１０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１．２２ｇ（１０ミリモル）の２５ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて１時間で滴下した後、室温で１時間攪拌を続けた。得られた溶液に７５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、水溶液とすることにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸の２．７ｇ／ｌ水溶液として３００ｍｌ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．６０であった。
【００４７】
実施例９
有機溶媒を実質的に含まない水溶液中でのシンナモイル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した。この溶液にトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）を氷冷下にて加え均一に攪拌した後、ケイ皮酸クロリド１４４μｌを加え室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に２５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として５８ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたシンナモイル基のＤＳは０．２２であった。
【００４８】
実施例１０
ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にカルボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミド溶液３ｍｌを氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白色粉末として７５ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）と第３ブチル基由来のシグナル（δ＝１．５ｐｐｍ）の強度比より求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
【００４９】
実施例１１
ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸の製造
ｔ−ブトキシカルボニルグリシンに代えてベンジルオキシカルボニルグリシン（Ｚグリシンとも記す）２０９ｍｇ（１．０ミリモル）を用い実施例１０と同様の方法に従った。
【００５０】
精製後、減圧乾燥することにより標記部分ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白色粉末として７４ｍｇ得た。ＮＭＲのヒアルロン酸アセチル基由来のシグナルと（δ＝２ｐｐｍ）とベンジルオキシカルボニルグリシンのベンジル基由来のシグナル（δ＝７．５ｐｐｍ）の強度比より求めたベンジルオキシカルボニルグリシンのＤＳは０．１１であった。
【００５１】
実施例１２
グリシル化ヒアルロン酸の製造（ベンジルオキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸の脱Ｚ化）
実施例１１で合成したＺグリシル化ヒアルロン酸６０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ／ｕｎｉｔ）を水５０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下で１０％パラジウム（Ｐｄ）活性炭１５ｍｇ、蟻酸アンモニウム１９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）加え、室温で６時間攪拌した後、再び同量のＰｄ活性炭、蟻酸アンモニウムを加え攪拌した。６時間後、再度同様の操作をした後、０．２２μｍのフィルターで活性炭を消去し、溶液を２日間透析した後、凍結乾燥により５１ｍｇの白色物を得た。ＮＭＲによりベンジル基由来のピーク（δ＝７．５ｐｐｍ）の消失を確認した。
【００５２】
実施例１３
ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸（分子量１５万）の製造  平均分子量１５万のヒアルロン酸ナトリウム８０ｍｇ（２糖単位として０．２ミリモル）を２０ｍｌの水に溶解した後、ジオキサン１０ｍｌを加えた。この溶液にｔ−ブトキシカルボニルグリシンのカルボキシル基をジメチルホスフィノチオイル基で混合酸無水物として活性化したｔ−ブトキシカルボニルグリシン１７５ｍｇ（１．０ミリモル）とトリエチルアミン１３９μｌ（１．０ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇ（１．０ミリモル）のジメチルホルムアミド溶液を氷冷下にて加えた後、室温で１時間半攪拌を続けた。得られた溶液に１５０ｍｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールを注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記ｔ−ブトキシカルボニルグリシル化ヒアルロン酸を白色粉末として５５ｍｇ得た。ＮＭＲより求めたｔ−ブトキシカルボニルグリシンのＤＳは０．０５であった。
【００５３】
実施例１４  事実上エンドトキシンフリーの水酸基の一部がシンナモイル化されたヒアルロン酸の製造
平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム５ｇ（２糖単位として１２．５ミリモル）を乾熱滅菌した３Ｌの三角フラスコに入れ、２Ｌの注射用水（エンドトキシンフリー）に溶解した後、ジオキサン５００ｍｌを加えた。この溶液にケイ皮酸無水物１７．４ｇ（６２．５ミリモル）とトリエチルアミン８．６５ｍｌ（６２．５ミリモル）と４−ジメチルアミノピリジン７．６３ｇ（６２．５ミリモル）の２５０ｍｌジオキサン溶液を氷冷下にて３０分間で滴下した後、室温で１時間攪拌を続けた。得られた溶液を１１Ｌの酢酸ナトリウム飽和エタノールに注ぎ、生じた沈澱を遠心分離した。得られた沈澱をさらに３回エタノール沈澱法により精製後、減圧乾燥することにより標記部分シンナモイル化ヒアルロン酸を白色粉末として４．６３ｇ得た。５００ＭＨｚのプロトンＮＭＲの測定の結果、ヒアルロン酸のアセチル基由来のシグナル（δ＝２ｐｐｍ）とケイ皮酸のベンゼン環および２重結合由来のシグナル（δ＝６．５−７．９ｐｐｍ）の強度比よりシンナモイル基のＤＳは０．３５であった。リムルステスト（トキシカラー、生化学工業（株）製により測定）により求めたエンドトキシン含量はシンナモイル化ヒアルロン酸１ｍｇ当たり２６．０ｐｇであった。
【００５４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明では生体適合性、生体内分解性をもちＤＤＳや光架橋性医療材料の素材として有用なアシル化ヒアルロン酸を分子量の低下を伴う事なく、環境に悪影響を与えない水を溶媒として、簡便な操作で、しかもエンドトキシンフリーの状態で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるシンナモイル化ヒアルロン酸（ＤＳ＝０．３７）の５００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】実施例２において、ケン化処理後のシンナモイル化ヒアルロン酸と原料ヒアルロン酸のＧＰＣ（ゲル濾過法）による比較を示したクロマトグラムである。
【図１】
0003563440.tif 000002
【図２】
0003563440.tif 000003