(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．００１〜約１０％のレチノールおよびレチニルエステルよりなる群から選択される化合物と；
（ｂ）クリムバゾール、ミコナゾール、ビフォナゾール、クロトリマゾール及びエコナゾールよりなる群から選択される０．０００１〜約５０％のアゾールと；
（ｃ）リノレオイルモノエタノールアミド、リノレオイルジエタノールアミド及びそれらの混合物よりなる群から選択される０．０００１〜約５０％の脂肪酸アミドと；
（ｄ）化粧上許容しうるベヒクルと
を含むスキンコンディショニング組成物。
【請求項２】
レチニルエステルがリノール酸レチニル、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニルおよびその混合物よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
成分（ａ）がレチノールである請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に局部的に施すことを特徴とする皮膚をコンディショニングする化粧方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に施すことを特徴とする皺肌、乾燥肌、荒肌、フレーク肌、老齢肌もしくは日焼け肌の外観を処置するための化粧方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪酸アミドとアゾールとレチノールもしくはレチニルエステルとを含有するスキンケア組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
レチノール（ビタミンＡ）は、人体にて天然に生ずると共に通常の表皮細胞分化につき必須である内生化合物である。天然および合成のビタミンＡ誘導体は各種の皮膚障害の処置に広範に使用されており、皮膚回復剤もしくは更新剤として使用されている。レチノイン酸は各種の皮膚状態、たとえば座瘡、皺、乾癬、老斑および変色を処置すべく使用されている［たとえばＡ．バールキスト等、ジャーナル・インベスト・ダーマトロジー、第９４巻、Ｄ．Ｂ．ホーランドおよびＷ．Ｊ．クンリッフ（１９９０）、第４９６〜４９８頁；Ｃ．Ｎ．エリス等、「皮膚におけるレチノールの薬理学」、バーゼル、カルガー、第３巻（１９８９）、第２４９〜２５２頁；Ｎ．Ｊ．ローウェ等、「皮膚におけるレチノールの薬理学」、第３巻（１９８９）、第２４０〜２４８頁；ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９３／１９７４３号参照］。レチノールおよびレチニルエステル（たとえば酢酸レチニルおよびパルミチン酸レチニル）はレチノイン酸よりも処方が容易であると共に安定である。残念ながら、レチノールおよびレチニルエステルは皮膚に利益を与える際レチノイン酸よりも効果が低い。本発明は部分的に、レチノールもしくはレチニルエステルと脂肪酸アミドおよびアゾールとの組合せがケラチン生成細胞増殖および分化の抑制における相乗的向上をもたらすという知見に基づいている。この効果はレチノール／レチニルエステルと脂肪酸アミドとの効果またはレチノール／レチニルエステルとアゾールとの効果より大であっただけでなく、これら３種の成分は互いに相乗作用してレチノイン酸反応を促進した。したがって脂肪酸アミドとレチノールもしくはレチニルエステルとの混合物はレチノイン酸に類似するが、レチノイン酸よりも使用が容易である。
【０００３】
ソーンフェルド（米国特許第５，０５７，５０１号）は、セスキテルペン化合物と約０．０２５〜約３５％のモノカルボキシル脂肪酸エステルもしくはアミドとを含有する組成物による丘疹鱗屑症および湿疹症の処置方法を開示している。組成物はレチノイドをも含むことができる。ソーンフェルドは、或る種のレチノイド（すなわちイソトレチノイン、トレチノイン、エトレチン（これらは全てレチノイン酸の立体異性型である）およびエトレチネート（トリメトクシフェニルレチノイン酸のエステル）が丘疹鱗屑症に対し効果を示すことを教示している。ＰＣＴ出願ＷＯ／９３２５１７７号（プロクタ・アンド・ギャンブル社）は特定種類の非環式カルボキサミド冷却剤を含有する皮膚へ局部的に施すための組成物を開示しており、たとえばレチノイン酸およびその誘導体（たとえばｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）のようなレチノイドを含むことができる。ＰＣＴ出願ＷＯ／９４０３１５６号（ローン・プーラン社）は、汚れた皮膚（たとえばニキビ、膿疱もしくは面疱）の処置および予防のための活性成分としてリノール酸もしくはその誘導体を含有する局部組成物を開示している。この組成物は０．０２５〜０．１重量％のトレチノインをも含有することができる。ヨーロッパ特許出願第０  ３８８  ２７５号（ピエール・ファブレ・コスメチク社）は、アルキルカルボキサミドと亜鉛塩（レチノイン酸亜鉛としうる）とを含有する脂漏症を処置するための組成物を開示している。
【０００４】
クラウス等（米国特許第５，２１６，１４８号）は新形成、皮膚病および皮膚の老化を処置および予防するための特定の複合カルボキサミドの使用を開示している。バン・スコット等（米国特許第４，３８０，５４９号）およびユー等（米国特許第４，３６３，８１５号）は、ヒドロキシ酸もしくはそのアミドによる座瘡、乾燥肌、フレーク肌、鱗皮肌の処置につき開示している。ＥＰ  ０  ５８２４５８号はＮ，Ｎ−（１，４Ｃアルキル）ラウラミドの使用を開示している。ＥＰ  ０  ５５９  ３０４号は、皮膚平滑化剤としての少なくとも２５個の炭素原子を有するヒトロカルビル鎖を含有したアミドの使用につき開示している。ボウケイ等（米国特許第５，３０８，５５１号）は、特に成分として８〜１６Ｃ脂肪酸の１〜４Ｃアルカノールアミドを含有する皮膚洗浄用およびコンディショニング用組成物を開示している。英国特許出願第１，１２６，２８９号（ホフマン・ラ・ロッシェ社）は、ビタミンＡアルコールもしくはビタミンＡエステルと乳化剤とアルコールもしくはモノカルボン酸のジアルキルアミド（たとえばＮ，Ｎ−ジエチル−アセタミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドもしくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）から選択される溶剤とを含有する保存ビタミン製剤を開示している。１９９６年１１月１３日付け公開（本出願の優先権主張日より後）の先行出願であるヨーロッパ特許出願ＥＰ  ０  ７４２  ００５号（ユニレバー社、優先権主張日１９９５年５月８日）は脂肪酸アミドとレチノールもしくはレチニルエステルとの組合せを開示している。
【０００５】
レチノイドとアゾールとを含有する組成物も記載されている（たとえばユスフ等、ＣＡ  ２，１０１，１０１号、カウブェンベルク、米国特許第５，４７６，８５２号およびキーハニ、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９５０５８５２号参照）。しかしながら、これら刊行物は脂肪酸アミドを挙げていない。
【０００６】
アゾールと脂肪酸アミドとを含有する組成物も公知である。しかしながら、これら組成物はレチノイドを含まない（たとえばＷＯ  ９５／１７１７５号；ＥＰＯ  ３４７，１９９号；米国特許第４，８６７，９７１号；および米国特許第５，３４８，７３６号参照）。
【０００７】
上記に引用した技術は、三種の成分（すなわち脂肪酸アミドとアゾールとレチノールもしくはレチニルエステルとの相乗性組合せ物に基づくスキンコンディショニング組成物を開示していない。上記に引用した技術はいずれもレチノイン酸に対する効果的代案の必要性につき対処していない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、レチノイン酸での処理に類似する脂肪酸アミドおよびアゾールと組合せたレチノールもしくはレチニルエステルの相乗作用を示すスキンコンディショニング組成物を提供する。
【０００９】
【解決を解決するための手段】
本発明は、部分的に：
（ａ）  ０．００１〜約１０％のレチノールもしくはレチニルエステルと；
（ｂ）  ０．０００１〜約５０％のアゾールと；
（ｃ）  ０．０００１〜約５０％の脂肪酸アミド（脂肪酸は少なくとも６個の炭素原子を有する）と；
（ｄ）  化粧上許容しうるベヒクルと
を含有するスキンコンディショニング組成物を包含する。
【００１０】
ここで使用する「コンディショニング」という用語は乾燥肌、日焼け肌、皺、老斑、老齢肌の外観の予防および処置を意味し、角質層の柔軟性を増大させると共に一般に皮膚の品質を向上させる。この組成物は皮膚剥落、並びに表皮増殖および分化を改善するための化粧方法に使用することができる。
【００１１】
さらに本発明は皺肌、乾燥肌、フレーク肌、老齢肌、日焼け肌の処置および皮膚障害（たとえば座瘡もしくは乾癬）の処置に関する薬剤を製造するための本発明による組成物の使用をも包含する。
【００１２】
さらに本発明は皮膚におけるケラチン生成細胞増殖および分化を増大させるための化粧方法をも提供し、この方法は上記した本発明による組成物を皮膚に施すことからなっている。
【００１３】
本発明の生成物における脂肪酸アミドおよびアゾールの存在はレチノールもしくはレチニルエステルの性能を実質的に向上させ、すなわちアゾールと組合せた脂肪酸アミドは細胞増殖および分化に影響を与えるレチノールもしくはレチニルエステルの能力を実質的に増大させる。脂肪酸アミドもしくはアゾールは単独で使用すれば皮膚利益の向上に全く或いは殆ど作用を示さない。皮膚利益の実質的向上は、アミドおよびアゾールをレチノールもしくはレチニルエステルと組合せた場合にのみ実現される。要するに、本発明は少なくとも部分的にレチノールもしくはレチニルエステルと脂肪酸アミドとアゾールとの間の相乗的相互作用を見出したことに基づいている。
【００１４】
本発明の好適具体例において、アミドはＣ8 〜Ｃ24脂肪酸のアミド、特に好ましくはＣ8 〜Ｃ24脂肪酸のモノ−もしくはジ−アルカノールアミドであり、アゾールはクリムバゾールである。
【００１５】
本発明によれば、レチノールもしくはレチニルエステルを含有する組成物に有効量の脂肪酸アミドおよびアゾールを含ませることにより組成物の性能が実質的に向上する。或いは、それより低レベルのレチノールもしくはレチニルエステルを脂肪酸アミドとアゾールとを含有する組成物に含ませて、アミドおよびアゾールを含まない同様な処方物の性能に等しくすることもできる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
特記しない限り％は全て最終組成物の重量に基づく。
【００１７】
本発明の組成物は第１必須成分としてレチノールおよび／またはレチニルエステルよりなる群から選択される化合物を含有する。
【００１８】
「レチノール」という用語は次のレチノールの異性体を包含する：全−ｔｒａｎｓ−レチノール、１３−ｃｉｓ−レチノール、１１−ｃｉｓ−レチノール、９−ｃｉｓ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール。好適異性体は全−ｔｒａｎｓ−レチノール、１３−ｃｉｓ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−ｃｉｓ−レチノールである。全−ｔｒａｎｓ−レチノールがその広い産業上の入手性に基づき最も好適である。
【００１９】
レチニルエステルはレチノールのエステルである。「レチノール」という用語は上記の意味を有する。本発明で使用するのに適するレチニルエステルはレチノールのＣ1 〜Ｃ30エステル、好ましくはＣ2 〜Ｃ20エステル、特に好ましくはＣ2 ，Ｃ3 およびＣ16エステルである。何故なら、これらはより一般的に入手しうるからである。レチニルエステルの例は限定はしないがパルミチン酸レチニル、蟻酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、酪酸レチニル、バレリン酸レチニル、イソバレリン酸レチニル、ヘキサン酸レチニル、ヘプタン酸レチニル、オクタン酸レチニル、ノナン酸レチニル、デカン酸レチニル、ウンデカン酸レチニル、ラウリン酸レチニル、トリデカン酸レチニル、ミリスチン酸レチニル、ペンタデカン酸レチニル、ヘプタデカン酸レチニル、ステアリン酸レチニル、イソステアリン酸レチニル、ノナデカン酸レチニル、アラキドン酸レチニル、ベヘン酸レチニル、リノール酸レチニル、オレイン酸レチニル、乳酸レチニル、グリコール酸レチニル、ヒドロキシカプリル酸レチニル、ヒドロキシラウリン酸レチニル、酒石酸レチニルを包含する。
【００２０】
本発明での使用に好適なエステルはパルミチン酸レチニル、酢酸レチニルおよびプロピオン酸レチニルから選択される。何故なら、これらは最も産業上入手し易く、したがって最も安価なためである。リノール酸レチニルもその優秀な効能に基づき好適である。
【００２１】
レチノールもしくはレチニルエステルは本発明の組成物中に約０．００１〜約１０％の量、好ましくは約０．０１〜約１％の量、特に好ましくは約０．０１〜約０．５％の量にて使用される。
【００２２】
本発明による組成物の第２必須成分は脂肪酸アミドである。好ましくは脂肪酸アミドは少なくとも６個の炭素原子を有する。適する脂肪酸は飽和および不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸を包含する。適する脂肪酸は、好ましくは８〜２４個の炭素原子、好ましくは１２〜２０個の炭素原子、特に好ましくは１２〜１８個の炭素原子を有する。何故なら、より長鎖の脂肪酸アミドは皮膚のコンディショニングにつき一層有利となるからである。本発明の最も好適な具体例において、必須脂肪酸が皮膚に栄養を与えるので必須脂肪酸のアミドが用いられる。必須脂肪酸の例は限定はしないがリノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、γ−リノレン酸、ホモ−γ−リノレン酸およびその混合物を包含する。リノール酸が最も好適であり、その理由はこれがセラミドへの先駆体となるからである。
【００２３】
本発明に使用するのに適するアミドは単純なアミド類（すなわち−ＣＯＮＨ2 基を有するもの）、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミド、モノ−アルカノールアミドおよびジ−アルカノールアミドとすることができる。適するアルキル基もしくはアルカノール基は１〜３０個の炭素原子、好ましくは１〜２０個の炭素原子、特に好ましくは１〜８個の炭素原子を有する。本発明に包含される好適アミドはモノ−およびジ−アルカノールアミド、特に必須脂肪酸のアミドである。アルカノールアミドがアルキルアミドよりも一般的に入手しやすい。
【００２４】
好適脂肪酸アミドはリノール酸、パルミチン酸およびココナッツ油のモノ−およびジ−エタノールアミドから選択される。
【００２５】
アミドは本発明の組成物中に約０．０００１〜約５０％、好ましくは約０．０１〜約１０％、特に好ましくは約０．１〜約５％の範囲の量にて含ませる。
【００２６】
本発明による組成物の第３必須成分はアゾールである。本発明で用いるアゾールは式Ｉ：
【００２７】
【化１】
0003540913.tif 000002
【００２８】
［式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は独立して水素；スルフヒドリル基（ＳＨ）；チオール基または１〜１２個の炭素原子を有するアルキル基；アリール基；１〜５個のハロゲン原子で置換されたアリール基；窒素原子および／または酸素原子を有する複素環式基；並びにその混合物から選択される］
を有する。
【００２９】
クリムバゾール、ミコナゾール、ビフォナゾール、エコナゾール、クロトリマゾールが最も好適である。さらに１，２，４−トリアゾール、オクチルトリアゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、スルコナゾール、リアラゾール、ブトコナゾールおよびその混合物も本発明で使用するのに適している。
【００３０】
アゾールは本発明の組成物中に約０．０００１〜５０％、好ましくは約０．００１〜約１０％、特に好ましくは約０．１〜５％の量にて含ませる。
【００３１】
化粧上許容しうるベヒクル
本発明による組成物は、この組成物におけるＴＣＣのための希釈剤、分散剤もしくはキャリヤとして作用することにより組成物を皮膚に施した際に分配を容易化させる化粧上許容しうるベヒクルをも含む。
【００３２】
水以外または水に加えるベヒクルは液体もしくは固体の皮膚軟化剤、溶剤、保湿剤、増粘剤および粉末を包含する。特に好適な非水性キャリヤはポリジメチルシロキサンおよび／またはポリジメチルフェニルシロキサンである。本発明のシリコーン類はいずれの場合も２５℃にて約１０〜１０，０００，０００ｍｍ2 ／ｓ（センチストークス）の範囲の粘度を有するものとすることができる。特に望ましくは低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物である。これらシリコール類はゼネラル・エレクトリック社から商標ビカシルＳＥおよびＳＦとして、並びにダウ・コーニング社から２００および５５０シリーズとして入手することができる。本発明の組成物中に使用しうるシリコーンの量はいずれの場合も組成物に対し５〜９５重量％、好ましくは２５〜９０重量％の範囲である。
【００３３】
化粧上許容しうるベヒクルは一般に組成物の５〜９９．９重量％、好ましくは２５〜８０重量％を構成し、他の化粧補助剤の不存在下で組成物の残部を構成する。好ましくは、ベヒクルはベヒクルの重量に対し少なくとも８０重量％の水である。好ましくは、水は本発明による組成物の少なくとも５０重量％、特に好ましくは組成物の６０〜８０重量％を占める。
【００３４】
適宜の皮膚有益材料および化粧補助剤
油もしくは油性物質を乳化剤と一緒に存在させて、油中水型エマルジョンもしくは水中油型エマルジョンのいずれかを、主として用いる乳化剤の平均親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）に応じて与えることができる。
【００３５】
本発明の組成物は好ましくは日焼止め剤を含む。日焼止め剤は、紫外線を遮蔽すべく一般的に用いられる物質を包含する。化合物の例はＰＡＢＡの誘導体、桂皮酸化合物およびサリチル酸化合物である。たとえばメトキシ桂皮酸オクチルおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）を使用することができる。メトキシ桂皮酸オクチルおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンはそれぞれ商標パルゾールＭＣＸおよびベンゾフェノン−３として市販入手しうる。乳液に用いられる日焼止め剤の正確な量は、日光の紫外線からの所望保護程度に応じて変化することができる。
【００３６】
他の好適な適宜成分は必須脂肪酸（ＥＦＡ）、すなわち全ての細胞の血漿膜形成に必須であり、ケラチン生成細胞ＥＦＡ欠乏に際し細胞を過大増殖させるような脂肪酸から選択される。ＥＦＡの補充はこれを修正する。さらにＥＦＡは表皮の脂質生合成をも増大させると共に、表皮のバリヤ形成につき脂質を供給する。必須脂肪酸は好ましくはリレール酸、γ−リノレン酸、ホモγ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、γ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸およびその混合物から選択される。
【００３７】
本発明の化粧組成物にはしばしば皮膚軟化剤が混入される。この種の皮膚軟化剤の量は全組成物に対し約０．５〜約５０重量％、好ましくは約５〜３０重量％の範囲とすることができる。皮膚軟化剤はエステル、脂肪酸、並びにアルコール、ポリオールおよび炭化水素のような一般的な化学種類として分類することができる。
【００３８】
エステルはモノエステルもしくはジエステルとすることができる。脂肪酸ジエステルの許容しうる例はアジピン酸ジブチル、セバシン酸ジエチル、ダイマー酸ジイソプロピルおよびコハク酸ジオクチルを包含する。許容しうる分枝鎖脂肪酸エステルはミリスチン酸２−エチル−ヘキシル、ステアリン酸イソプロピルおよびパルミチン酸イソステアリルを包含する。許容しうる三塩基性酸エステルはトリリノール酸トリイソプロピルおよびクエン酸トリラウリルを包含する。許容しうる直鎖脂肪酸エステルはパルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイルユールケイト（ｅｕｒｃａｔｅ）およびオレイン酸ステアリルを包含する。好適エステルはココ−カプリレート／カプレート（ココ−カプリレートとココ−カプレートとの配合物）、プロピレングリコール  ミリスチルエーテル  アセテート、アジピン酸ジイソプロピルおよびオクタン酸セチルを包含する。
【００３９】
適する脂肪族アルコールおよび脂肪酸は１０〜２０個の炭素原子を有するような化合物を包含する。特に好適なものはたとえばセチル、ミリスチル、パルミチンおよびステアリル  アルコールおよび酸のような化合物である。
【００４０】
皮膚軟化剤として作用しうるポリオールには線状および分枝鎖のアルキルポリヒドロキシル化合物がある。たとえばプロピレングリコール、ソルビトールおよびグリセリンが好適である。たとえばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような高分子ポリオールも有用である。ブチレングリコールおよびプロピレングリコールも浸透向上剤として特に好適である。
【００４１】
皮膚軟化剤として作用しうる炭化水素の例はいずれの場合も１２〜３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。その特定例は鉱油、石油ゼリー、スクワレンおよびイソパラフィンを包含する。
【００４２】
本発明による化粧組成物の範囲内で他の機能成分の種類は増粘剤である。増粘剤は一般に組成物の重量に対しいずれの場合も０．１〜２０重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％の量にて存在させる。増粘剤の例はＢ．Ｆ．グッドリッチ社から商標カルボポールとして入手しうる架橋したポリアクリレート物質である。たとえばキサンタンガム、カラギーナンガム、ゼラチン、カラヤガム、ペクチンおよびイナゴマメガムのようなガム類も使用することができる。或る種の状況下で、増粘機能はシリコーンもしくは皮膚軟化剤としても作用する物質により得ることもできる。たとえば、１０センチストークスを越えるシリコーンガムおよびたとえばステアリン酸グリセリンのようなエステルは二重の機能を有する。
【００４３】
本発明の化粧組成物には粉末を混入することができる。これら粉末はチョーク、タルク、白土、カオリン、澱粉、スメクタイト粘土、化学改変された珪酸マグネシウムアルミニウム、有機改変されたモンモリロナイト粘土、水和珪酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、オクテニルコハク酸アルミニウム澱粉およびその混合物を包含する。
【００４４】
他の補助微量成分も化粧組成物中に混入することができる。これら成分は着色料、乳白剤および香料を包含する。これら他の補助微量成分の量は組成物の重量に対しいずれの場合も０．００１〜２０重量％の範囲とすることができる。
【００４５】
組成物の使用
本発明による組成物は、主として人間皮膚に局部的に施すための製品として、特に皮膚をコンディショニングおよび平滑化すると共に皺肌もしくは老齢肌の外観を予防もしくは減少させる作用物質として使用される。
【００４６】
使用に際し、たとえば１〜１００ｍＬのような少量の組成物を適する容器もしくはアプリケータから皮膚の露出領域に施し、次いで必要に応じ手もしくは指または適する用具を用いて皮膚に展延させ或いは擦り込む。
【００４７】
製品形態および包装
本発明による局部皮膚処置組成物はローション、クリームもしくはゲルとして処方することができる。組成物は、粘土に適する共に消費者の目的とする用途に応じ適する容器に包装することができる。たとえばローションもしくはクリームは壜またはロール・ボール  アプリケータ或いは噴射剤によるエアロゾル装置または指操作に適するポンプを装着した容器に包装することができる。組成物がクリームであれば、これは単にたとえばチューブもしくは蓋付ジャーのような変形しない壜もしくは絞り容器に貯蔵することができる。さらに組成物はたとえば米国特許第５，０６３，５０７号（参考のためここに引用する）に記載されたようなカプセルに含ませることもできる。
【００４８】
したがって本発明は、ここに規定した化粧上許容しうる組成物を含有する密閉容器をも提供する。
【００４９】
【実施例】
以下、限定はしないが本発明を特定実施例によりさらに説明する。
【００５０】
材料および方法
細胞培養：
トリプシン処理により新生児の包皮から分離したヒト  ケラチン生成細胞をジュルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）ハムスＦ１２（１：１）培地／１０％胎児牛血清にて照射３Ｔ３マウス繊維芽細胞の存在下に増殖させて、ケラチン生成細胞コロニーの分裂を確立した。これら細胞を上記の条件下でその第２パッセージまで増殖させ、将来の使用につき凍結保存した。凍結された第２パッセージのケラチン生成細胞を解凍させると共に上記培地に塗沫し、５日間にわたり増殖させた後、クロネチックス・コーポレーション社、サンジエゴ、ＣＡからの０．１５ｍＭのＣａを含有する血清フリーのＭＣＤＢ  １５３系培地、すなわちケラチン生成細胞増殖培地（ＫＧＭ）または０．０９ｍＭのＣａを含有するギブコ社からのケラチン生成細胞血清フリー培地（ＫＳＦＭ）に切り換えた。細胞が８０〜９０％融合した７日目に、これらをトリプシン処理し、次いで各種の実験につき血清フリーの培地に塗沫した。
【００５１】
チミジン分析
3Ｈ−チミジン組込およびケラチン生成細胞増殖
培養ケラチン生成細胞による 3Ｈ−チミジンの組込をケラチン生成細胞増殖の分析として使用した。チミジンはＤＮＡのモノマー単位である４種のデオキシヌクレオシド（動物界における遺伝子情報の普遍的保存物）の１種である。たとえばケラチン生成細胞のような体細胞の細胞分裂に先立ち、細胞分裂を受ける細胞の完全ゲノムが複製される。これは細胞による大規模ＤＮＡ合成を含み、両娘細胞が遺伝子物質の同一コピーを受けることを可能にする。 3Ｈ−チミジンを細胞分裂の準備につきＤＮＡを合成しつつあるケラチン生成細胞の培地に含ませれば、標識されたヌクレオシドが新たな合成ＤＮＡに組込まれる。細胞集団への 3Ｈ−チミジンの組込み程度はこの細胞集団によるＤＮＡ合成の割合に比例し、したがって細胞増殖の指標となる。
【００５２】
ケラチン生成細胞（上記のように培養）を２４穴プレートに１ｍＬの培地における穴１個当たり４０，０００個の細胞の密度にて塗沫した。４日間にわたり培養した後、または細胞が６０〜７０％融合するまで培地を交換した。培地を交換してから２４時間後に試験化合物を穴に添加し（３反復）、その４時間後に５０μＬの培地における１μＣｉ 3Ｈ−チミジンを穴１個当たりに添加した。細胞をさらに２４時間にわたり培養した。培地を細胞から除去し、１０％氷冷トリクロル酢酸（ＴＣＡ）を添加し、プレートを氷上で３０分間にわたり培養した。これら細胞を５％ＴＣＡで５回洗浄し、次いで少なくとも１時間（一般に１晩）にわたり５００μＬの０．１Ｍで  ＮａＯＨに溶解させた。これら調製物を０．１ＭのＨＣｌで中和した。５０μＬの細胞調製物を用いて全蛋白質含有量を測定した。ＤＮＡの 3Ｈ標識からの崩壊／１分間（ＤＰＭ）を９００μＬの細胞調製物の液体シンチレーション計数により決定した。チミジン組込みの結果をＤＰＭ／μｇ蛋白質として現した。
【００５３】
トランスグルタミナーゼ分析
トランスグルタミナーゼ分析およびケラチン生成細胞分化
表皮における最終的分化の過程に際し、角質化エンベロプ（ＣＥ）として知られる蛋白質の厚さ１５ｎｍの層を細胞周辺の内表面に形成させる。ＣＥは、Ｎε−（γ−グルタミル）リジン  イソジペプチド結合（これは表皮で発現される少なくとも２種の異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）の作用により触媒される）の形成により互いに架橋された多数の異なる蛋白質で構成される。ＴＧアーゼ１は表皮の分化層に豊富に発現される（特に粒状層で発現される）が、未分化の基礎表皮には存在しない。すなわちＴＧアーゼ１は、より多量に分化した状態を示す高ＴＧアーゼ１レベルを有する表皮ケラチン生成細胞分化の有用な標識である。ＴＧアーゼ１抗体を用いるＥＬＩＳＡに基づいたＴＧアーゼ１分析を用いて以下の実施例における培養ケラチン生成細胞の分化状態を分析した。
【００５４】
ケラチン生成細胞（上記のように培養）を９６穴プレートに２００μＬの媒体における穴１つ当たり３，０００個の細胞の密度にて塗沫した。４日間にわたり培養した後、培地を試験化合物を含有する培地に交換した（１試験につき６反復）。細胞をさらに７２時間にわたり培養した後、培地を吸引除去し、プレートを−７０℃にて貯蔵した。これらプレートを冷蔵庫から取出し、細胞をＰＢＳで洗浄した。１００μＬの無菌水を添加し、細胞を−７０℃で凍結し、次いで解凍することにより凍結分画した。これら細胞を室温（Ｒ／Ｔ）にてＴＢＳ／３％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、牛血清アルブミン）と共に１時間にわたり培養し、次いで新鮮な洗浄緩衝液で濯いだ。これら細胞を、洗浄緩衝剤で１：３００にて希釈されたアメルシャム社（マウス）から得られた主たる抗体モノクローナル抗−ヒト  トランスグルタミナーゼ（ＩｇＧ）の５０μＬと共に３７℃にて１時間培養し、次いで洗浄緩衝液にて２回洗浄した。次いで細胞を、洗浄緩衝剤で１：２００にて希釈された第２抗体（Ｆｅｂ断片、アメルシャム社から得られるペルオキシダーゼ結合の抗−マウスＩｇＧ）の５０μＬと共に３７℃にて１時間培養し、次いで洗浄緩衝液にて２時間洗浄した。細胞を基質溶液（４ｍｇのｏ−フェニレンジアミンおよび３．３μＬの３０％Ｈ2 Ｏ2 、１０ｍＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．０）と共に５分間にわたり室温にて暗所（アルミニウム箔下）で培養した。反応を５０μＬの４Ｎ  Ｈ2 ＳＯ4 の添加により停止させた。各試料の吸光度をプレート  リーダーにて４９２ｎｍで読取った。６反復のうち、４種を両抗体で処理し、２種を第２抗体でのみ処理した（すなわち酵素結合Ａｂのバックグランド結合を測定する）。ＴＧアーゼ  レベルは、各処理の各読取値からバックグランドを引算すると共に両Ａｂに露出された各反復に関する平均値±ｓ．ｄ．を決定することにより判定した。
【００５５】
ＤＮＡ分析
細胞の処理後に検出されたＴＧアーゼ−１のレベルは細胞数により影響を受け、すなわち細胞数が大であるほど高レベルＴＧアーゼ−１が検出される。ＴＧアーゼ−１のレベルを同じウェルにおける細胞のＤＮＡ含有量に対し基準化して、細胞数の差に基づく変動を排除した。ＤＮＡの定量は細胞数の特に有用な指標であり、各細胞が同一のゲノムおよびしたがって同一量のＤＮＡを全ての目的で有するので、ケラチン生成細胞数を包含する細胞数の特に有用な指標となる。したがって１ウェル当たりの細胞の全ＤＮＡ含有量は、そのウェルにおける細胞数に正比例する。ＤＮＡの定量を用いて、細胞数に対しＴＧアーゼ  データを基準化した。
【００５６】
ケラチン生成細胞を２００μＬの培地にて穴１個当たり３，０００個の細胞の密度で塗沫した。４時間にわたり培養した後、培地を試験化合物を含有する培地と交換した（１試験につき６反復）。各細胞をさらに７２時間にわたり培養した後、培地を吸引し、次いで各プレートを−７０℃にて少なくとも１．５時間にわたり貯蔵した。各プレートを冷蔵庫から取出し、細胞を低温の１：１エタノール／アセトン溶液で３０分間にわたり固定した。１０μＬ／穴１個のヘキスト染料（１０μｇ／ｍＬの最終濃度）を添加し、これを１５分間培養し、蓋を被せ、次いで蛍光測定器で測定した（ｅｘ．３６０ｎｍおよびｅｍ．４６０ｎｍ）。染料溶液を除去すると共に、各ウェルをＰＢＳによりＴＧアーゼ分析の準備のため洗浄した。
【００５７】
【実施例】
実施例１
レチノイン酸はケラチン生成細胞分化状態を変化させるのにレチノールよりも効果的である
Ａ．  種々の濃度にてレチノイン酸もしくはレチノールを添加してから２４時間後における 3Ｈ−チミジンμｇ可溶性蛋白質の組込みに対する効果を検査した。得られた結果を表１Ａに要約する。
【００５８】
【表１】
0003540913.tif 000003
【００５９】
試験したレチノイン酸の全ての濃度（すなわち２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍおよび２．５×１０-9Ｍ）はエタノール比較、並びにそれぞれ２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍおよび２．５×１０-9Ｍのレチノール処理の両者に比べケラチン生成細胞増殖を顕著に増大させると共に、これは投与量依存的であった。これは、レチノールよりも表皮増殖に対し一層大の刺激作用をレチノイン酸が有することに一致する。
【００６０】
Ｂ．  レチノイン酸およびレチノールの添加の後におけるトランスグルタミナーゼ量の作用を検査した。得られた結果を表１Ｂに要約する。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
試験したレチノイン酸の全濃度（すなわち２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍおよび２．５×１０-9Ｍ）はエタノール比較および各レチノール処理の両者よりもケラチン生成細胞分化を減少させ、これは対応の各２．５×１０-7Ｍ、２．５×１０-8Ｍおよび２．５×１０-9Ｍのレチノール処理よりも顕著に高い程度であった。トランスグルタミナーゼ量の減少はレチノイン酸およびレチノールの両者につき投与量依存的であった。これは、レチノールよりも表皮分化に対する高い抑制作用をレチノイン酸が有することに一致する。
【００６３】
実施例２
ケラチン生成細胞増殖を増大させると共に分化を抑制するようリノレオイル−ジエタノールアミド（リノレオイル−ＤＥＡ）とビフォナゾールとレチノールとは相乗的に作用する
Ａ．  試験化合物を添加してから２４時間後における 3Ｈ−チミジン／μｇ可溶性蛋白質の組込みに対する効果を検査し、３回の独立した実験の総合結果を各エタノール比較に対し基準化した。得られた結果を表２Ａに要約する。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
２．５×１０-9Ｍのレチノイン酸はエタノール比較に比べ２７％および２．５×１０-9Ｍのレチノール処理に比べ１６％ケラチン生成細胞チミジン組込みを顕著に増大させた。２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡおよび２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-9Ｍビフォナゾールの両者は、レチノール単独と比較してケラチン生成細胞増殖に対し限界的な刺激作用を有した。しかしながら、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡ＋１０-9Ｍビフォナゾールの組合せは、エタノール処理および２．５×１０-8Ｍレチノール処理の両者に比べそれぞれ３０％および１９％顕著にケラチン生成細胞増殖を増大させた。２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡ＋１０-9Ｍビフォナゾールの組合せも、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡおよび２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-9Ｍビフォナゾールの各処理に比べケラチン生成細胞増殖を増大させた。したがって脂肪酸アミドとビフォナゾールとレチノールとは相乗的に作用して、ケラチン生成細胞増殖をレチノイン酸の刺激作用に近似するレベルまで増大させる。
【００６６】
Ｂ．  細胞のＤＮＡ含有量に対し基準化したトランスグルタミナーゼ１（ＴＧ１）レベルに対する効果を、試験化合物での７２時間の処理に対する反応につき検査し、表２Ｂに示す。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
２．５×１０-8Ｍのレチノイン酸はケラチン生成細胞ＴＧ１レベルを比較レベルの１３％まで抑制するのに極めて有効であった。２．５×１０-8Ｍのレチノールも１０-8Ｍ  ＬＡＭＥＡ＋１０-8Ｍビフォナゾールもケラチン生成細胞ＴＧ１レベルに対し抑制作用を示さなかった。しかしながら、２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-8Ｍ  ＬＡＭＥＡ＋１０-8Ｍビフォナゾールはケラチン生成細胞ＴＧ１を比較レベルの４２％まで抑制した。したがって、レチノールと脂肪酸アミドとビフォナゾールとは相乗的に作用して、ケラチン生成細胞分化をレチノイン酸の作用と同様に抑制する。
【００６９】
実施例３
リノレオイル−ＤＥＡとクリムバゾールとレチノールとはケラチン生成細胞増殖を相乗的に増大させると共に分化を抑制した
Ａ．  リノレオイル−ＤＥＡとクリムバゾールとレチノールとの 3Ｈチミジン組込みに対する効果を検査した。得られた結果を表３Ａに要約する。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
２．５×１０-7Ｍのレチノイン酸はエタノール比較よりも３０％および２．５×１０-8Ｍレチノール処理よりも２８％ケラチン生成細胞チミジン組込みを顕著に増大させた。２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡおよび２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-9Ｍクリムバゾールの両者は、比較およびレチノール単独に比べケラチン生成細胞増殖に対し顕著な刺激作用を有した。しかしながら、２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡ＋１０-9Ｍクリムバゾールの組合せは、エタノールおよび２．５×１０-8Ｍレチノール処理に比べ、それぞれ２９％および２７％ケラチン生成細胞増殖を顕著に増大させた。特に顕著には、２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡ＋１０-9Ｍクリムバゾールの組合せは、２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＤＥＡおよび２．５×１０-8Ｍレチノール＋１０-9Ｍクリムバゾールの各処理に比べ、それぞれ１７％および２０％ケラチン生成細胞増殖を増大させた。したがって、レチノールとリノレオイル−ＤＥＡとクリムバゾールとは相乗的に作用して、ケラチン生成細胞増殖をレチノイン酸の刺激作用に近似するレベルまで増大させる。
【００７２】
Ｂ．  細胞のＤＮＡ含有量に対し基準化したトランスグルタミナーゼ１（ＴＧ１）レベルに対する効果を試験化合物で７２時間処理した後に検査し、表３Ｂに示す。
【００７３】
【表６】
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【００７４】
２．５×１０-7Ｍレチノイン酸は比較レベルに対するケラチン生成細胞ＴＧ１レベルを抑制するのに極めて効果的であった（２９％）のに対し、より希釈された２．５×１０-9Ｍのレチノイン酸はそれほど効果的でなくＴＧ１レベルを５５％抑制した。２．５×１０-9Ｍレチノール、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍ  ＬＡＤＥＡおよび２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍクリムバゾールはケラチン生成細胞ＴＧ１レベルに対し抑制作用を示さなかった。しかしながら、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍ  ＬＡＤＥＡ＋１０-8Ｍクリムバゾールはケラチン生成細胞ＴＧ１を比較レベルの８３％まで顕著に抑制した。この抑制は比較、ＲＯＨ単独、ＲＯＨ＋ＬＡＤＥＡおよびＲＯＨ＋クリムバゾールよりも顕著に大であり、これら３種の成分（すなわちＲＯＨ、ＬＡＤＥＡおよびクリムバゾール）が相乗的に作用してケラチン生成細胞ＴＧ１レベルを顕著に抑制することを示す。この作用はクリムバゾール濃度が１０倍、すなわち２．５×１０-9Ｍ＋１０-8Ｍ  ＬＡＤＥＡ＋１０-7Ｍクリムバゾールであればずっと増大し、その結果この組合せはＴＧ１レベルを比較の７２％まで抑制した。したがって、レチノールと脂肪酸アミドとクリムバゾールとは相乗的に作用して、レチノイン酸の作用と同様にケラチン生成細胞分化を抑制する。
【００７５】
実施例４
クロトリマゾールとリノレオイル−ＭＥＡ（「ＬＡＭＥＡ」）とレチノールとはケラチン生成細胞増殖を相乗的に増大させた
試験化合物を添加してから２４時間後における 3Ｈ−チミジン／μｇ可溶性蛋白質の組込みに対する作用を検査し、その結果を表４に、比較に対し基準化して示す。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
２．５×１０-9Ｍのレチノイン酸はエタノール比較に比べ２８％および２．５×１０-9Ｍのレチノール処理に比べ１５％ケラチン生成細胞チミジン組込みを顕著に増大させた。２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＭＥＡおよび２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍクロトリマゾールの両者は比較と比べケラチン生成細胞増殖に対する刺激作用を有したが、この作用はレチノール単独よりも大でなかった。しかしながら、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＭＥＡ＋１０-8Ｍクロトリマゾールの組合せは、エタノール比較および２．５×１０-8Ｍレチノール処理の両者に比べ、それぞれ２９％および１６％ケラチン生成細胞増殖を顕著に増大させた。特に予想外に、２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＭＥＡ＋１０-8Ｍクロトリマゾールの組合せはケラチン生成細胞増殖を２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍリノレオイル−ＭＥＡおよび２．５×１０-9Ｍレチノール＋１０-8Ｍクロトリマゾール処理に比べ、それぞれ２１％および１７％顕著に増大させた。したがって、レチノールとリノレオイル−ＭＥＡとクロトリマゾールとは相乗的に作用して、ケラチン生成細胞増殖をレチノイン酸の刺激作用に近似するレベルまで顕著に増大させる。
【００７８】
実施例１〜４は、投与量に依存してレチノイン酸がチミジン組込みを増大させると共に皮膚ケラチン生成細胞におけるトランスグルタミナーゼ１レベルを減少させたことを示す。換言すれば、レチノイン酸はケラチン生成細胞増殖を増大させると共にケラチン生成細胞分化を減少させた。実施例１〜４においてはレチノイン酸を陽性比較として用い、さらに分析下にある他の化合物を比較する参照化合物として使用した。レチノールはケラチン生成細胞分化を抑制する際にレチノイン酸よりも顕著に効果が低く、さらにケラチン生成細胞増殖の増加については全く無効果であった。
【００７９】
しかしながら実施例１〜４の予想外の結果は、培養ケラチン生成細胞に対するレチノールの作用がレチノールもしくはレチニルエステルを脂肪酸アミドおよびアゾールと組合せればレチノイン酸の効果に近似するレベルまで増大させるがアゾールおよび脂肪酸アミドのそれぞれは単独では殆どもしくは全く作用を示さないことであった。上記の結果は、アゾールと組合せた脂肪酸アミドがレチノールもしくはレチニルエステルと相乗作用して、ケラチン生成細胞増殖を増大させると共にケラチン生成細胞分化を減少させることを示し、これはレチノイン酸の作用に類似する。
【００８０】
この試験の予想外の結果は、培養ケラチン生成細胞に対するレチノールの作用がレチノールを脂肪酸アミドおよびアゾールと組合せたレチノイン酸の効果に近似するレベルまで増大しうることであった。この効果はレチノール＋脂肪酸アミドの効果またはレチノール＋アゾールの効果よりも大であるだけでなく、３種の成分が互いに相乗的に作用してレチノイン酸型の反応を促進することであった。
【００８１】
実施例６〜１１は本発明による局部組成物を例示する。これら組成物は常法で処理することができる。これらは化粧用途に適している。特に、これら組成物は皺肌、荒肌、乾燥肌、フレーク肌、老齢肌および／またはＵＶ損傷肌に施すのに適し、外観および感触を改善すると共に健康な皮膚に施してその劣化を予防もしくは阻止するのに適する。
【００８２】
実施例６
この実施例は、本発明の組成物を混入した高内相油中水型エマルジョンを例示する。
【００８３】
【表８】
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【００８４】
実施例７
この実施例は本発明の組成物を混入した水中油型クリームを例示する。
【００８５】
【表９】
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【００８６】
アルフォール  １６ＲＤはセチル  アルコールである。
【００８７】
実施例８
この実施例は本発明の組成物を混入したアルコール性ローションを例示する。
【００８８】
【表１０】
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【００８９】
実施例９
この実施例は本発明の組成物を含有する他のアルコール性ローションを例示する。
【００９０】
【表１１】
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【００９１】
実施例１０
この実施例は本発明の組成物を混入したサンケアクリームを例示する。
【００９２】
【表１２】
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【００９３】
実施例１１
この実施例は本発明の組合せ物を混入した非水性スキンケア組成物を例示する。
【００９４】
【表１３】
0003540913.tif 000015
註１：少なくとも５０，０００の分子量と２５℃にて少なくとも１０，０００センチストークスの粘度とを有するＧＥＣ社から入手しうるジメチルシリコーンポリマー。
【００９５】
２：ダウ・コーニング社から入手しうるジメチルシロキサン環式ペンタマー
。
【００９６】
３：ダウ・コーニング社から入手しうるジメチルシロキサンテトラマー。