(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋であり、生物学的活性を有するＧＩＦの製造方法であって、
ａ．図１または図２に記載のアミノ酸配列をコードするDNAを含むポリヌクレオチド配列を機能しうる結合様式で含むベクターでトランスフェクションした宿主細胞を培養し、
ｂ．実質的に純粋であり、生物学的活性を有するＧＩＦを単離する段階を含む前記の製造方法。
【請求項２】
ＧＩＦをコードするポリヌクレオチドが、下記式のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能しうるように結合している、請求項１記載の方法。
Ｒ1-〔Ｘ1-Ｘ2-Ｘ1-Ｘ2-Lys-Arg 〕-（式中、Ｒ1 は担体ペプチドであり、Ｘ1 はLys またはArg であり、Ｘ2 はアミノ酸である。）
【請求項３】
担体ペプチドがタンパク質前駆体のプロ領域である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
プロ領域がカルシトニン前駆体に由来する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＧＩＦがマウスのものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＧＩＦがヒトのものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
図１または図２に記載のアミノ酸配列を有する抗原非特異的ＧＩＦをコードする単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項９】
ベクターがウィルスである、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
ベクターがプラスミドである、請求項８記載のベクター。
【請求項１１】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
宿主が原核生物である、請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
宿主が大腸菌である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
宿主が真核生物である、請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１５】
宿主がCOS細胞である、請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
生物学的に活性なＧＩＦの製造方法であって、
ａ．請求項１１記載の宿主細胞を培養し、
ｂ．その培養物から実質的な純粋なＧＩＦを単離する段階を含む、前記の製造方法。
【請求項１７】
宿主細胞が真核生物である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞がCOS細胞である、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９２年６月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０４６１４号の一部継続出願である。また、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４６１４号は１９９１年６月３日に出願された第７０９，３７５  号の一部継続出願であり、この第７０９，３７５  号は１９９０年６月４日に出願された出願番号第５３３，８８９  号の一部継続出願である。
【０００２】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原に対するヒトの免疫応答を抑制するために利用することのできるヒトグリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）、およびＧＩＦをコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【０００３】
【従来の技術】
免疫応答は多くの場合有益であると考えられるが、場合によっては免疫応答の生じた動物にとって抗原に対するその免疫応答が実は有害となることもある。免疫応答が、それを受ける個体が深刻な病的続発症にかかりやすいような状態を作り出す例としては、紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患がある。紅斑性狼瘡の場合、罹患者の甲状腺、赤血球、ＤＮＡ、および血小板の決定基に反応する抗体がしばしば存在する。
【０００４】
免疫応答の抑制が記述されるもう一つの例としては、アレルギーの治療がある。アレルゲンに対するＩｇＥ抗体が枯草熱を引き起こし、外因性の喘息のような他のアレルギー疾患に関係していることが、明確になっている。アレルギー疾患におけるＩｇＥのきわめて重大な役割から、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体形成の制御および抑制がアレルギー疾患の根本治療の一つである可能性が高まった。例えば、ブタクサアレルゲンに対して感受性の枯草熱患者の血清中には、このアレルゲンに対するＩｇＥ抗体が常時検出される。ＩｇＥ抗体価は花粉のシーズン後に上昇するが、その後それ以外の期間にはごくわずかしか低下しない。血清中のＩｇＥの半減期はわずか２−３日であるから、ＩｇＥ抗体価の持続は、この抗体がアレルゲンに暴露されることがないにもかかわらず患者のリンパ系細胞によって連続して合成され続けていることを示す。
【０００５】
過去２０年にわたって、実験動物で、ＩｇＥ抗体応答を制御するために、いくつかの様々な試みが行なわれた。このような試みの一つは、古典的な免疫療法または脱感作療法を改良することであった。この療法では、アレルギー患者はごく微量のアレルゲンの注射を繰り返し受ける。脱感作療法によって一部の患者の臨床的な症状が改善されることが示された。しかしながら、枯草熱患者の血清中のＩｇＥ抗体価は、治療後も減少しなかった。この療法の主な免疫学的効果は、ＩｇＧ抗体形成の増強と、花粉シーズン後のＩｇＥ抗体価上昇の抑制である。
【０００６】
脱感作療法または免疫抑制療法の限界は、副作用のため患者が大量のアレルゲンに耐えられないことである。この問題点を克服するために、例えば尿素−変性抗原またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−結合抗原といった化学的に修飾されたアレルゲンを治療に用いる試みが行なわれた。修飾抗原は天然の抗原に対する抗体とは結合しないので、比較的大量の修飾抗原をアレルギー症状を引き起こすことなしに注射することが可能である。しかしながら、修飾抗原は抗原特異的Ｔ細胞を刺激することができる。修飾抗原をマウスに静脈注射することによって、天然抗原に対する一次ＩｇＥ抗体応答を抑制する抗原特異的サプレッサーＴ細胞の産生が引き起こされることが証明された。しかしながら、抗体価が最大に達した後に治療を始めた場合には、この療法は継続中のＩｇＥ抗体産生に対して最低限の効果しか有していなかった（Ｔａｋａｔｓｕ  および  Ｉｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１７，  １２１１，１９７６）。マウスでの観察と一致して、枯草熱患者でのポリエチレングリコール結合抗原の臨床試験は、この治療がＩｇＥ抗体価を下げることができないことを示した。修飾抗原を繰り返し注射することによって継続中のＩｇＥ抗体産生を抑制することができないのは、おそらくアレルギー患者に比較的大量の抗原特異的ヘルパーＴ細胞が存在するためであろう。修飾抗原は抗原特異的サプレッサーＴ細胞の産生を誘導するのみならず、ヘルパーＴ細胞数も増加させるので、治療による後者の影響によってサプレッサーＴ細胞の効果が打ち消されたのであろう。この解釈は、免疫したマウスに抗原特異的サプレッサーＴ細胞を移植した結果、継続中のＩｇＥ抗体産生が抑制されたという事実によって支持される（Ｔａｋａｔｓｕ  および  Ｉｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１７，  １２１１，１９７６）。以上の結果より、ヘルパーＴ細胞の数を増加させることなしに抗原特異的サプレッサーＴ細胞を産生することが可能であれば、枯草熱患者において持続するＩｇＥ抗体産生を抑制することが可能であることが示唆された。
【０００７】
１９８０年以来、本発明者らは、免疫グロブリンのイソタイプに特異的な様式でＩｇＥ合成を選択的に制御する様々な方法を研究してきた。この研究の結果として、ＩｇＥに対して親和性を有し、ＩｇＥ合成を選択的に制御する二種類のＴ細胞因子が発見された。ＩｇＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）の一方は、ＩｇＥ応答を選択的に増強し、他方のＩｇＥ−ＢＦはその応答を選択的に抑制する。このＩｇＥ増強因子とＩｇＥ抑制因子の主要な相違点は分子内の糖質部分であるとおもわれる。ＩｇＥ増強因子はレンチルレクチンおよびコンカナバリンＡに結合するが、ＩｇＥ抑制因子はこれらのレクチンに結合しない（Ｙｏｄｏｉ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２８，  ２８９，  １９８２  ）。ＩｇＥ増強因子またはＩｇＥ抑制因子のいずれか一方を選択的に生産するための細胞メカニズムの分析、ならびにこれらの因子の遺伝子クローニングによって、ＩｇＥ増強因子およびＩｇＥ抑制因子は構造遺伝子を共有すること、およびこれらの因子の糖質部分の性質および生物活性は翻訳後のグリコシル化過程で確立されることが示された（Ｍａｒｔｅｎｓ  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，  ８０９，  １９８７  ）。生理的条件下で、このグリコシル化過程は、この過程を促進または阻害する二つのＴ細胞因子によって制御される。これらの因子をグリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）およびグリコシル化促進因子（ＧＥＦ）と命名する。
【０００８】
ＧＩＦに特徴的な性質は、その生化学的活性である。このリンホカインはリポモジュリン（ホスホリパーゼ阻害タンパク質）に対するモノクローナル抗体と結合し、ホスホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化された誘導体であるとおもわれる（Ｕｅｄａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３０，  ８７８，  １９８３  ）。また、ＧＩＦの主な供給源が抗原特異的サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）であることが、マウスで明らかになった（Ｊａｄｉｅｕら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３，  ３２６６，  １９８４）。オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的サプレッサーＴ細胞ハイブリドーマに関するその後の実験から、抗原（ＯＶＡ）で処理した同系マクロファージでハイブリドーマ細胞を刺激すると、ＯＶＡに親和性を有するＧＩＦ（抗原結合性ＧＩＦ）の産生が起こることが示された。しかしながら、同じハイブリドーマはＯＶＡに親和性を示さないＧＩＦ（非特異的ＧＩＦ）を構成的に分泌した。非特異的ＧＩＦとＯＶＡ結合性ＧＩＦとの関係に関する研究によって、抗原結合性ＧＩＦは抗原結合性ポリペプチド鎖および非特異的ＧＩＦからなることが明らかになった（Ｊａｒｄｉｅｕ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、編、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．  Ｙ．，  ５９５ページ、１９８７）。抗原結合性ＧＩＦは他の研究者によって報告された抗原特異的サプレッサーＴ細胞因子（ＴｓＦ）と共通の抗原決定基を有し、抗原（担体）特異的な様式で抗体応答を抑制することも明らかになった。さらに、抗原結合性ＧＩＦのみならず、他の研究者によって報告された抗原特異的ＴｓＦも、モノクローナル抗リポモジュリン（１４１−Ｂ９）と結合した免疫吸着剤に結合し、この免疫吸着剤を酸性ｐＨで溶出することによって回収された。
【０００９】
アレルギー治療における脱感作療法の大きな限界にも関わらず、この療法は現在でも用いられている。結論として、抗原特異的ではあるが、現行の脱感作療法でみられるような副作用を持たない技法がまさに必要とされている。
免疫応答の抑制は、受容者対移植片（ＨＶＧ）および移植片対受容者（ＧＶＨ）拒絶反応を抑えるためにきわめて重要である。不幸にして、ＨＶＧやＧＶＨの場合だけでなく自己免疫疾患の場合にも、免疫応答の抑制には、限られた効果しかなく、特異的と言うよりはむしろ全身的に作用する毒性の高い薬剤を使用する。このような療法の現況は、毒性が低く特異性の高い免疫抑制剤の必要性を暗示する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を抑制するためのよりよい方法は、抗原に特異的に結合できる、免疫抑制に有効な量のヒトＧＩＦを投与することであると考えられる。こうすることによって、Ｔサプレッサー因子の濃度が特に優位なものとなり、その結果として抗原に対する免疫応答が減少する。このような結果を達成するための方法を本発明は提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、実質的に精製されたヒト抗原特異的および抗原非特異的ＧＩＦ、ならびにＧＩＦをコードするヌクレオチド配列を提供するものである。生物学的に活性なポリペプチドの一般的な組換え製造方法も提供される。
本発明は、望ましくない免疫応答に関わる抗原に対して特異性を有する、実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦに関する。このヒト抗原特異的ＧＩＦは、望ましくない免疫応答を抗原特異的な様式で免疫抑制するために、きわめて有用である。
【００１２】
本発明に於いては、アレルゲンに特異的に結合可能なヒト抗原特異的ＧＩＦが望ましい。本発明の特に望ましい実施態様に於いて、ミツバチ毒の主要アレルゲンであるホスホリパーゼＡ２  （ＰＬＡ２  ）のエピトープと結合するヒト抗原特異的ＧＩＦを開示する。この特異性によって、上記の抗原特異的ＧＩＦおよび同様の特異性を有する類似の抗原特異的ＧＩＦを、ＰＬＡ２  に対するヒト免疫応答を抑制するために用いることができる。別の特に望ましい実施態様に於いて、スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ）花粉のエピトープと結合するヒト抗原特異的ＧＩＦを開示するが、このＧＩＦをこの抗原に対するヒト免疫応答を抑制するために利用することができる。
【００１３】
ハチ毒ＰＬＡ２  に対して抗原特異性を有するＧＩＦの生産に利用される知見を、当業者は容易に他の抗原に拡大適用することができ、結果として余分な実験を行なうことなしに他の抗原に対して抗原特異性を有する他のＧＩＦ分子を調製し精製することができる。結論として、広く新分野を拓くという本発明の特徴によって、自己免疫疾患やアレルギーといった免疫応答が介在する病気を抑えるために使用することができる、他のアレルゲンに対するヒト抗原特異的ＧＩＦの調製が可能となる。ほとんどのアレルギーや様々の自己免疫疾患の場合のように、望ましくない免疫応答の抗原が公知である場合には、様々なヒト抗原特異的ＧＩＦの生産は特に容易である。
【００１４】
本発明のヒトＰＬＡ２  特異的ＧＩＦは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０４７３  を有する細胞系ＡＣ５から得られた抗原特異的ＧＩＦから得られるか、またはこれと同一の性質を有する。本発明のヒトスギ花粉特異的ＧＩＦは、細胞系３１Ｅ９から得られた抗原特異的ＧＩＦから得られるか、またはこれと同一の性質を有する。
【００１５】
ハイブリドーマの作成とその特徴を検定する方法
ハイブリドーマを作成するために用いられる一般的方法はよく知られている（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｉｍｍ．，  ６：  ２９２，  １９７６）。簡単に述べると、ミツバチ毒に対してアレルギーであるヒトに由来する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を化学修飾したＰＬＡ２  の存在下で培養した。非付着細胞を回収し、次にＩＬ−２およびリポコルチン−１とともに培養した後、リンパ芽球様細胞系ＢＵＣと融合させた。ハイブリドーマをＰＬＡ２  特異的ヒトＧＩＦの産生でスクリーニングした。
【００１６】
より一般的には、本発明はヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する連続的継代ハイブリドーマ細胞系を作成するための方法に関するものであり、この方法は以下の段階を含んでいる：
（ａ）抗原に対して活性化され、ＩＬ−２およびホスホリパーゼＡ２  阻害物質の存在下で培養したヒト抗原感作Ｔ細胞を得ること；さらに
（ｂ）活性化Ｔ細胞を融合によって融合相手の細胞系と結合させ、ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する能力を有するハイブリドーマを作成すること。
【００１７】
抗原感作Ｔ細胞は、末梢血液の単核細胞分画を含む種々の試料からとることが出来る。次いで、抗原感作Ｔ細胞は、感作に用いられた抗原の存在下で培養することによって活性化され、続いてその活性化Ｔ細胞をインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびホスホリパーゼＡ２  阻害物質の存在下で増殖させる。このような目的に特に有用なホスホリパーゼＡ２  阻害物質はリポコルチンである。あるいはまた、２−（ｐ−アミルシンナモイル）−アミノ−４−クロロ安息香酸（ＯＮＯ−ＲＳ−０８２，ＯＮＯ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．  ）といった、ＰＬＡ２  阻害活性を有する合成化合物を使用することができる。
【００１８】
一次抗原がＴ細胞に対して毒性を示す場合のような特定の条件下では、抗原を化学修飾することが望ましい。このような修飾に利用しうる物質は、塩酸グアニジンおよび臭化シアンを包含するが、当業者は余分な実験をすることなしに容易に同様の物質を捜し出すことができる。一般に、抗原の外部構造を破壊しない物質を用いることが望ましいが、これはこのような外部構造がサプレッサーＴ細胞の抗原のエピトープ認識に重要であると考えられているためである。しかしながら、このような問題は例えば多くのアレルゲンのような細胞毒性のない大多数の抗原にとって重要ではない。結論としては、典型的なアレルゲンでは、Ｔ細胞を刺激するために天然の分子を使用することができる。
【００１９】
本発明はヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する抗原特異的ヒトＴ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマを作成するための方法に関する。このようなＴ細胞およびハイブリドーマは、免疫抑制されるべき免疫応答に関わる抗原に特異的な反応性を示す。
本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦの抗原特異性を有するヒト抗原特異的ＧＩＦを産生するＴ細胞ハイブリドーマを分離することは、目的とするヒト抗原特異的ＧＩＦの作用のパターンを判定する型どおりのスクリーニング技法を用いて行うことができる。したがって、ＰＬＡ２  に特異的なヒトＧＩＦの場合、あるヒト抗原特異的ＧＩＦ試料がＰＬＡ２  に対してアレルギー反応を示す患者に由来する細胞の免疫応答を抑制するならば、そのヒト抗原特異的ＧＩＦ試料と本発明のハイブリドーマによって産生されるＰＬＡ２  に特異的なヒトＧＩＦとは同等である。
【００２０】
あるヒト抗原特異的ＧＩＦが本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦの特異性を有しているかどうかを判定するためのさらに別の方法は、本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦをそれが通常反応する抗原（例えばハチ毒ＰＬＡ２  ）とともにプレインキュベートし、ヒト抗原特異的ＧＩＦ試料がその抗原と結合する能力を阻害するかどうかを判定することである。もしヒト抗原特異的ＧＩＦ試料が阻害されたならば、その試料は、十中八九、本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦと同じエピトープ特異性を有する。
【００２１】
本発明で用いられるように、「エピトープ」という用語は、ヒト抗原特異的ＧＩＦまたは本発明のモノクローナル抗体と特異的に反応する決定基を包含するものとする。エピトープの決定基は通常、化学的に活性な分子の原子団、例えばアミノ酸または糖側鎖、からなり、特異的な三次元構造上の特徴、並びに特異的な電荷の特徴を有するのが通例である。
【００２２】
さらに別の態様に於て、本発明は実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを調製する方法に関するものであり、それは以下の段階を含んでなる；
（ａ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生する能力を有するハイブリドーマ細胞系を培養して、該細胞系にヒト抗原特異的ＧＩＦを産生させること；および、
（ｂ）培養上清から実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離すること。
【００２３】
このように使用されるハイブリドーマ細胞系は、上記のようにして作成される。さらに望ましくは、培養時には、このハイブリドーマを予め抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原で処理した同系マクロファージと共に培養するか、またはＣＤ３やＴ細胞リセプターに対する抗体で処理することによって、ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生するようにする。
【００２４】
培養上清からヒト抗原特異的ＧＩＦを単離し、または実質的に精製するために様々な技法を使用することができる。特に有用な技法は、抗原特異的ＧＩＦの結合する抗原を用いたアフィニティー精製であり、例えば固相に結合した抗原を用いる。この技法の応用としては、２種類のアフィニティー免疫吸着剤を段階的に利用して、ヒト抗原特異的ＧＩＦを実質的に精製することも出来る。このような方法に於て、実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階は以下の通りである；
（ｉ）ヒトＧＩＦと特異的に反応するモノクローナル抗体とハイブリドーマ細胞系培養液を反応させること；
（ｉｉ）モノクローナル抗体からヒトＧＩＦを溶出すること；
（ｉｉｉ  ）溶出したＧＩＦを、ヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反応させること；
（ｉｖ）抗原からヒト抗原特異的ＧＩＦを溶出すること；および
（ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２５】
あるいはまた、１１０ＢＨ３のような抗原特異的ＧＩＦに対するモノクローナル抗体と結合した免疫吸着剤を、抗原を結合させた免疫吸着剤の代わりに用いてもよい。実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する段階は以下の通りである；
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系培養液をヒト抗原特異的ＧＩＦが結合するモノクローナル抗体と反応させること；
（ｉｉ）ヒトＧＩＦをモノクローナル抗体から溶出すること；
（ｉｉｉ  ）溶出したＧＩＦをヒトＧＩＦと特異的に反応するモノクローナル抗体と反応させること；
（ｉｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦをモノクローナル抗体から溶出すること；および
（ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２６】
ハイブリドーマ細胞をＡＢＣ培地のような無血清培地に適応させることによってヒト抗原特異的ＧＩＦの精製が容易になる。サブクローンを抗−ＣＤ３で処理し、続いてそのハイブリドーマ細胞をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  でコーティングした培養シャーレで培養した後、培養上清中の抗原結合ＧＩＦを下記のようにイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。このような条件のもとで、実質的に純粋なヒト抗原特異的ＧＩＦを単離するための方法は以下の段階を包含する；
（ｉ）ハイブリドーマ細胞系培養上清を陰イオン交換マトリックスと接触させること；
（ｉｉ）そのマトリックスからヒトＧＩＦを溶出すること；
（ｉｉｉ  ）溶出したＧＩＦを、ヒトＧＩＦと特異的に反応するモノクローナル抗体と反応させるか、もしくはヒト抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原と反応させるか、またはその両者と反応させること；
（ｉｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを溶出すること；および
（ｖ）ヒト抗原特異的ＧＩＦを回収すること。
【００２７】
したがって、ヒト抗原特異的ＧＩＦを単離するために、例えば上記のように抗原特異的ＧＩＦが結合する抗原を使用し、またはヒトＧＩＦと特異的に反応する抗体を使用し、またはその両者を使用することによって、或いはイオン交換クロマトグラフィー精製はアフィニティー精製と組み合わせて用いて、ヒト抗原特異的ＧＩＦを単離する。
【００２８】
望ましい実施態様に於て、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  は、抗原特異的ヒトＧＩＦの精製に利用されるマトリックスである。利用可能な他のイオン交換材料には、ほとんどすべての市販の陰イオン交換アガロースおよびセルロース、例えばポリ硫酸化アガロース、を包含し、特にＱＡＥ（第４級アミン）誘導体、ｅｃｔｅｏｌａ  （エピクロロヒドリントリエタノールアミン）、ＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）誘導体、およびＡＥ（アミノエチル）セルロースを包含するが、それらに限定されない。当業者はこれらの様々なイオン交換材料の結合および溶出に関する特異的なパラメーターを知ることができ、または特別の実験を行なうことなしに容易に確認することができる。
【００２９】
ハイブリドーマ細胞系培養上清を、約２０ｍＭ塩類、例えばＮａＣｌで平衡化した陰イオン交換マトリックスに添加すると、ＧＩＦのほとんどがカラムを通過し、残りは約６０ｍＭまでの塩濃度によって溶出される。ＤＥＡＥからの溶出に望ましいＮａＣｌ濃度は１０ｍＭＴｒｉｓ中約２０−約６０ｍＭである。
ヒトＧＩＦのアフィニティー精製に特に有用であるモノクローナル抗体は、細胞系３８８Ｆ１  によって産生されるモノクローナル抗体、または細胞系３８８Ｆ１  によって産生されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するモノクローナル抗体、及び、細胞系１１０ＢＨ３によって産生されるモノクローナル抗体であるか、またはこれと同じ特異性を有するモノクローナル抗体である。
【００３０】
ヒト抗原特異的および抗原非特異的ＧＩＦの治療への利用
「抑制する」という用語は、治療を受けるヒトに於いて望ましくない免疫応答の有害な影響を減らすことを意味する。「免疫抑制に有効」という用語は、使用したヒト抗原特異的または非特異的ＧＩＦの量が、望ましくない免疫応答に起因する疾病または症状の原因を抑制するのに量的に十分であることを意味する。
【００３１】
本発明のヒトＧＩＦを投与するための用量の範囲は、免疫応答の症状が一定の抑制を受けるような、望ましい効果を生じるに十分な量である。用量は、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応などのような有害な副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に用量は、患者の年齢、健康状態、性別および病気の程度によって変化すると考えられ、当業者はこれを決定することができる。医師は、なんらかの治療に逆行する徴候があればその用量を調整することができる。一日または数日間、一日当り一回または二回以上の投与で、用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／投与から約２ｍｇ／ｋｇ／投与まで変化し得るが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／投与から約０．２ｍｇ／ｋｇ／投与までが望ましい。
【００３２】
本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦは、注射によって、または長時間のゆっくりとした潅流によって、非経口的に投与できる。本発明のヒトＧＩＦは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与可能である。
非経口投与の製剤は、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液を包含する。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。水性担体は水、含水アルコール溶液、乳濁液、または懸濁液を包含し、塩類液および緩衝剤を包含する。非経口賦形剤は、食塩水、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および食塩、乳酸塩リンゲル液、または不揮発油（ｆｉｘｅｄ  ｏｉｌ）  を包含する。静脈注射用賦形剤は、流動性栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルブドウ糖液を基本とするもの）などを包含する。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、防腐剤および他の添加物が含まれていてもよい。
【００３３】
また本発明は、本発明のヒト抗原特異的または抗原非特異的ＧＩＦを含む薬剤または医薬組成物を調製するための方法に関する。このような薬剤は、抗原に対する望ましくない免疫応答の治療に用いられ、その抗原は本発明のヒト抗原特異的ＧＩＦと結合する能力を有する。
本発明はまた、モノクローナル抗体およびこのような抗体を産生するＢ細胞ハイブリドーマに関する。この抗体はヒトＧＩＦに特異的に反応する。さらに、本発明は、抗原特異的ＧＩＦと特異的に反応するが、非特異的ＧＩＦと反応しないモノクローナル抗体（およびＢ細胞ハイブリドーマ）を提供する。この型の代表的なモノクローナル抗体は１１０ＢＨ３である。
【００３４】
上記のように、ハイブリドーマを作成するための技法は当業者によく知られている。簡単に説明すると、本発明のＢ細胞ハイブリドーマは、アフィニティー精製したヒトＧＩＦでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、さらに後に追加免疫することによって調製された。最終免疫から２週間後に、動物から脾臓細胞をとり、予め致死量の放射線照射を行なった同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに移入した。移入を受けた同系マウスは、精製ヒトＧＩＦで二回免疫され、最終免疫から二週間後にその脾臓細胞をＳＰ２／０−１４ＡＧ骨髄腫細胞系と融合させた。ハイブリドーマをヒトＧＩＦに対するモノクローナル抗体の産生でスクリーニングした。
【００３５】
対象となるモノクローナル抗体の作用のパターンを判定する型どおりのスクリーニング技法を用いて、本発明のモノクローナル抗体の反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを単離することができる。したがって、あるモノクローナル抗体試料がヒトＧＩＦとは反応するがマウスＧＩＦとは反応しないならば、その抗体試料と本発明のハイブリドーマが産生する抗体とは同等である。
【００３６】
当業者は、抗イディオタイプ抗体を生成することによって、モノクローナル抗体３８８Ｆ１  または他のすべての本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する他のハイブリドーマの単離を行なうことができる（Ｈｅｒｌｙｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３２，  １００  １９８６）。抗−イディオタイプ抗体は、対象となるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。このような決定基は、抗体の超可変部に存在する。一定のエピトープに結合するのはこの領域であり、したがって抗体の特異性を担っている。対象とするモノクローナル抗体で動物を免疫することによって、抗−イディオタイプ抗体を調製することができる。免疫された動物は、このようなイディオタイプ決定基に対する抗体を産生することによって、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識しこれに応答する。第２の動物によって産生された抗−イディオタイプ抗体は、単一のハイブリドーマによって産生され、第２の動物を免疫するために用いられたモノクローナル抗体に特異的であるので、この抗−イディオタイプ抗体を使用することによって、免疫するために用いたハイブリドーマの抗体と同一のイディオタイプを持つ他のクローンを同定することができる。またそれによって本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する他のハイブリドーマを見いだすために必要なスクリーニングの総量を少なくし、非常に簡易にすることができる。
【００３７】
二つのハイブリドーマのモノクローナル抗体の間でイディオタイプが同一であることは、それら二つのモノクローナル抗体が同一のエピトープ決定基を認識するという点に関して同一であることを示す。したがって、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体を使用することによって、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することができる。
【００３８】
あるいはまた、本発明のモノクローナル抗体が特定の抗原、例えば通常３８８Ｆ１  が反応するヒトＧＩＦと結合するのを、あるモノクローナル抗体試料が妨げるかどうかを判定することによって、そのモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを判定して、余分な実験なしにそのモノクローナル抗体を評価することができる。モノクローナル抗体試料が、例えば３８８Ｆ１  による結合の減少を示して、３８８Ｆ１  と競合するならば、これら二つのモノクローナル抗体は同じエピトープと結合する可能性が高い。同様の試験をモノクローナル抗体１１０ＢＨ３に利用することができる。
【００３９】
モノクローナル抗体が３８８Ｆ１  のような本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを判定するためのさらに別の方法は、３８８Ｆ１  が通常反応する例えばヒトＧＩＦのような抗原とともに３８８Ｆ１  をプレインキュベートし、モノクローナル抗体試料のその抗原を認識する能力が阻害されるかどうかを判定することである。もしモノクローナル抗体試料が阻害されるのであれば、たぶん、その試料は本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００４０】
ある特定の条件のもとでは、診断や治療上の有効性の点から、あるイソタイプのモノクローナル抗体が他のものより望ましいことがある。モノクローナル抗体の特定のイソタイプは、直接、最初の融合から選択することによって、あるいは二次的に異なるイソタイプのモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマからクラススイッチ変異体を単離する血縁選択法を利用することによって、調製することができる（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＳＡ，  ８２，  ８８８６５３，１９８５；  Ｓｐｉｒａ  ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ７４，  ３０７，  １９８４  ）。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ  ＨＢ１０４７２により産生されたモノクローナル抗体３８８Ｆ１  の特異性を有するクラススイッチ変異体を包含する。この細胞系は、１９９０年６月４日に先だって、Ｍａｒｙｌａｎｄ州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）  に３０年間の寄託に付された。
【００４１】
本発明で使用される「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、例えばＦａｂ  およびＦ（ａｂ’）２  といった、エピトープ決定基と結合可能なそのフラグメントも包含することとする。
本発明のモノクローナル抗体は、本明細書中で言及した様々なタイプのヒトＧＩＦを精製するための免疫アフィニティークロマトグラフィーに使用することもできる。このような免疫アフィニティークロマトグラフィーが利用可能であるような一つの方法は、例えば本発明のモノクローナル抗体のＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ、Ａｆｆｉｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ）  またはＴｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）への結合を利用することによる。他のタンパク質混合物に由来するヒトＧＩＦを特異的に結合させて、その単離および精製を可能にするために、これらの固相に結合したモノクローナル抗体を用いることができる。例えば低ｐＨのカオトロピック薬剤、または尿素のような当業者に公知の技法を用いて、結合したＧＩＦをアフィニティークロマトグラフィー材料から溶出することができる。
【００４２】
もうひとつの実施態様において、本発明は、実質的に純粋な融合ポリペプチドＲ１−［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ａｒｇ］−Ｒ２  （式中、Ｒ１は担体ペプチドであり、Ｒ２は構造遺伝子によりコードされたポリペプチドであり、Ｘ１はＬｙｓ  またはＡｒｇ  であり、Ｘ２はアミノ酸である。）を提供する。上記の「担体ペプチド」またはシグナル配列は融合ペプチド配列のアミノ末端に位置する。真核生物の場合は、この担体ペプチドは小胞体を横切って融合ポリペプチドを輸送する働きをすると考えられている。その後、分泌タンパク質がゴルジ体を通過して分泌小胞および細胞外空間、または好ましくは外部環境へ輸送される。本発明に従って利用することができる担体ペプチドはタンパク質分解酵素認識部位を包含するプレプロペプチドを含む。許容できる担体ペプチドは、カルシトニンまたは他のホルモンのアミノ末端プロ領域を含み、これらはフランキング二塩基性部位（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅｓ）で切断される。プロカルシトニンは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ  切断部位を認識するプロホルモンのコンベルターゼ（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）によりプロセッシングされる。しかしながら、本発明は、担体としてのこのペプチドの使用のみに限定されるものではないことに留意しなければならない。本明細書で記載したようなプロカルシトニンと同様の性質を有する他の担体ペプチドも当業界では公知であり、また過度の実験を行うことなく容易に利用できる。
【００４３】
本発明のひとつの実施態様において、シグナル配列である担体ペプチドは、特にこの担体ペプチドのＮ末端の近くに位置する発現ベクター内に含まれる。このシグナル配列は融合タンパク質を小胞体の方向に向かわせる。典型的には、このシグナル配列は、２〜３個の極性残基で始まり高含有量の疎水性アミノ酸が続く約１６〜約２９個のアミノ酸のリーダーからなる。他の点で、検出可能な知られた保存配列はない。本発明の実施例で使用されたベクターはカルシトニンのプロ領域を使用するけれども、融合タンパク質を小胞体および外部環境へ輸送する手段を提供する他のシグナル配列は本発明において等しく有効である。そのようなシグナル配列は当業者に知られている。
【００４４】
本発明の担体ペプチドは、Ｐ４およびＰ６位に追加のＡｒｇ／Ｌｙｓ  残基を含む二塩基モチーフ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）  を有するタンパク質分解酵素認識部位を含有する。切断認識部位の相違は、タンパク質分解の特異性に対して異なるプロセッシング酵素が存在することを意味する。好ましくは、この切断部位は配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ２−ｌｙｓ−Ａｒｇ  （式中、Ｘ１はＬｙｓ  またはＡｒｇ  であり、Ｘ２はアミノ酸である）からなる約６個のアミノ酸である。この認識部位を利用することによっては、構造遺伝子によりコードされた極めて高い活性を有するタンパク質を作りうる。
【００４５】
タンパク質分解部位を認識するプロセッシング酵素の例としては、哺乳類酵素のフリン（ｆｕｒｉｎ）、酵母ペプチドプロセッシング酵素Ｋｅｘ２の相同体、および他のプロホルモンであるコンベルターゼ（ＰＣｓ）  を挙げることができる。好ましくは、本発明の担体ペプチドは、前駆体の切断部位で、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘ２−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ａｒｇ  配列を有するタンパク質分解酵素認識部位を含む。
【００４６】
本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、融合ポリペプチドのカルボキシ末端で、構造遺伝子によりコードされたポリペプチドを含む。構造遺伝子は担体および切断部位と結合した形で発現される。構造遺伝子は、発現ベクター中で担体および切断部位をコードする遺伝子と結合させてあり、その結果、融合ポリペプチドは一単位として発現される。ＧＩＦは本発明の融合ポリペプチドの形で発現させるために使用することができる構造遺伝子の一例である。
【００４７】
本発明は、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」なる用語は、天然において結合している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まないポリペプチドをいうものとする。当業者は、このポリペプチドのエピトープと結合するモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、タンパク質を精製するための標準的な技法を用いて、このポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを形成するであろう。また、このポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析により決定することができる。このポリペプチドは、ポリペプチドの活性が残っている限り、ポリペプチドの機能性フラグメントを含む。ポリペプチドの生物学的活性を有するより小さいペプチドは本発明に包含される。
【００４８】
本発明は、また、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含む。融合ポリペプチドのすべてあるいは一部をコードするすべてのポリヌクレオチドもまた、その切断生成物が生物学的活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明に包含されるものとする。そのようなポリヌクレオチドには、天然の、合成の、および意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、このポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発されてもよい。また、このポリヌクレオチド配列は、アンチセンス配列および遺伝子コードの結果縮重する配列を含む。２０個の天然アミノ酸があるが、そのほとんどは、１個以上のコドンで特定される。従って、ヌクレオチド配列によりコードされる融合ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、すべての縮重するヌクレオチド配列は本発明に包含される。
【００４９】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドも提供する。「相補的な」ヌクレオチド配列は、その相補的配列がハイブリダイズする条件下で、特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズするであろう。これらの条件には、温度、ｐＨ、緩衝液およびヌクレオチド組成が含まれる。例えば、二重鎖ＤＮＡ分子の陽性および陰性鎖は相補的なヌクレオチド配列である。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５塩基の長さ、典型的には１８塩基以上の長さであり、目的とするポリペプチドをコードするゲノミックＤＮＡに選択的にハイブリダイズするフラグメントを含む。選択的ハイブリダイゼーションとは、その相補体である標的ＤＮＡへのヌクレオチド配列の非特異的結合を回避する条件（例えば、ｐＨ、温度、緩衝液）を意味する。
【００５０】
本発明のＤＮＡ配列は、いくつかの方法で得ることができる。例えば、このＤＮＡは当業界で周知のハイブリダイゼーション法を用いて単離することができる。これらは、１）共通のヌクレオチド配列を検出するための、ゲノミックまたはｃＤＮＡライブラリーへのプローブのハイブリダイゼーション；２）共通の構造的特徴を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；および３）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による合成を含むが、それに限定されるものではない。
【００５１】
ハイブリダイゼーション法は、標識された混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる組換えクローンのスクリーニングに有用である。そこでは、各プローブは、変性した二重鎖ＤＮＡの異質な混合物を含むハイブリダイゼーション試料における特定のＤＮＡ配列の完全な相補体である可能性がある。そのようなスクリーニングにおいて、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性した二重鎖ＤＮＡのどちらかで行われる。ハイブリダイゼーションは、目的とするポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出において特に有用である。換言すると、非特異的な結合を回避するための緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）  ハイブリダイゼーション状態を用いることによって、例えば、その完全な相補体である混合物中における単一のプローブへの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーにより可視化することができる（Ｗａｌｌａｃｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９：８７９，  １９８１）。
【００５２】
ｃＤＮＡライブラリーを含む抗原非特異的ＧＩＦは、例えば、種々のｃＤＮＡを卵母細胞に注入し、生じるｃＤＮＡ遺伝子産物を十分な時間発現させ、例えば、抗原非特異的ＧＩＦポリペプチドに特異的な抗体を用いるか、またはＧＩＦ活性の機能的なアッセイを用いて、所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験することによって、スクリーニングすることができる。あるいは、抗原非特異的ＧＩＦポリペプチドに特異的な抗体を用いて少なくとも一つのエピトープを持つ抗原非特異的ＧＩＦポリペプチドについて、間接的にｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることもできる。そのような抗体はポリクローナル、あるいはモノクローナルのいずれでも、抗原非特異的ＧＩＦｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するために使用することができる。
【００５３】
核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング法は、適当なプローブが入手できる限り、いかなる生物からいかなる遺伝子配列を単離することも可能にする。問題になっているタンパク質をコードする配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的合成することができる。このためには、短い、オリゴペプチド長のアミノ酸配列が知られていなければならない。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子コードから演繹することができるが、コードの縮重を考慮に入れなければならない。配列が縮重している場合には、混合添加反応を行うことが可能である。これには、変性した二重鎖ＤＮＡの異質な混合物が含まれる。
【００５４】
ポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列の開発は以下のようにして得られる；１）ゲノミックＤＮＡ由来の二重鎖ＤＮＡ配列の単離；２）目的のポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造；および３）真核供与体細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成。後者の場合には、ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補体が最終的に形成され、これはｃＤＮＡと一般に言われる。組換え法に使用するための特定のＤＮＡ配列を開発するためのこれらの３つの方法のうち、ゲノミックＤＮＡ単離物の単離が最も一般的でない。哺乳類ポリペプチドを微生物で発現しようとする場合は、イントロンが存在するので、特にそうである。
【００５５】
ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が公知である場合、しばしば望ましい方法となる。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知でない場合、ＤＮＡ配列の直接的な合成は可能ではなく、ｃＤＮＡ配列の合成が望ましい方法である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法の中には、高いレベルの遺伝子発現を有する供与体細胞に豊富なｍＲＮＡの逆転写に由来するプラスミド−またはファージ−含有ｃＤＮＡライブラリーを形成する方法がある。ポリメラーゼ連鎖反応法と組み合わせて用いられる場合、ほとんど発現しない産物でさえクローニングできる。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合、標的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列とまったく同じの標識された一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプロープ配列を作製して、一本鎖形態に予め変性したｃＤＮＡクローン上で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法を採用してもよい（Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１：２３２５，  １９８３）  。
【００５６】
ラムダｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーは、少なくとも１個のエピトープを持つポリペプチドの発現について、このポリペプチドに特異的な抗体を用いて、間接的にスクリーニングされうる。そのような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかで、ｃＤＮＡによりコードされたタンパク質の存在を示す発現産物を検出するために使用することができる。
【００５７】
本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりインビトロに発現させることができる。「宿主細胞」は、ベクターが増幅でき、そのＤＮＡが発現できる細胞である。この用語には、当該宿主細胞のいかなる子孫も含まれる。突然変異が複製の間に生じることがあるので、子孫のすべてが親細胞と同一ではないかもしれないことが理解される。しかしながら、そのような子孫は「宿主細胞」という用語が使用される時には、含まれるものとする。安定な移入の方法、換言すれば、外来ＤＮＡが宿主中に継続して維持される方法は、当業界で公知である。
【００５８】
本発明においては、ポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクター中に挿入されてもよい。「組換え発現ベクター」なる用語は、抗原非特異的ＧＩＦ、例えば、担体ペプチドの遺伝子配列の挿入または組み込みにより、前もって操作された当業界で公知のプラスミド、ウィルスまたは他のベヒクルをいうものとする。そのような発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含む。本発明の使用に適したベクターには、細菌における発現のためのＴ７を基礎とする発現ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５６：１２５，  １９８７）、哺乳類細胞での発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：３５２１，  １９８８）  、および昆虫細胞での発現のためのバキュロウィルス由来のベクターが含まれるが、それに限定されるものではない。ＤＮＡセグメントは調節要素、例えば、プロモーター（例えば、Ｔ７、メタロチオネインＩ、またはポリヘドリンプロモーター）に機能するように結合しているベクターに存在し得る。
【００５９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物および真核生物において発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫、および哺乳類生物が含まれうる。本発明の好ましい宿主は真核生物である。真核生物のまたはウィルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方法は当業界で周知である。宿主で発現および複製可能な生物学的に機能するウィルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当業界で公知である。そのようなベクターは、本発明のＤＮＡ配列を組み込むために使用される。本発明の宿主細胞は融合タンパク質の切断部位を認識する酵素を元来コードすることが好ましい。しかし、融合ポリペプチドの発現が望まれる宿主細胞が切断部位を認識する酵素をもともと有していないならば、そのような酵素をコードする遺伝子配列を融合タンパク質のポリヌクレオチド配列と一緒に宿主細胞へ同時トランスフェクションすることができる。
【００６０】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用の技術により行ってもよい。宿主が大腸菌のような原核生物の場合には、指数増殖期後に回収し、続いて当業界に周知の手法によるＣａＣｌ２  法を用いて処理した細胞から、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピテント細胞を作製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２  またはＲｂＣｌを使用してもよい。また、形質転換は宿主細胞のプロトプラストを形成した後または電気穿孔法により行うこともできる。
【００６１】
宿主が真核生物の場合には、燐酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リポソームに内包されたプラスミドやウィルスベクターの挿入のような慣用の機械的手法のようなＤＮＡのトランスフェクションの方法を用いてもよい。また、真核細胞を本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子により同時トランスフェクションさせることもできる。もうひとつの方法は、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）またはウシ乳頭腫ウィルスのような真核ウィルスベクターを用いて一時的に感染させるか、または真核細胞を形質転換してタンパク質を発現させることである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，  １９８２）  。
【００６２】
微生物を用いてあるいは真核細胞を用いて発現させた本発明のポリペプチドを単離し精製する技法は、例えば、分取クロマトグラフィー分離およびモノクローナルおよびポリクローナル抗体の使用を含むような免疫学的分離といったいかなる慣用手段であってもよい。
以上の開示は、本発明を概括的に記述する。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができるが、これらの実施例は説明のみを目的として本明細書中に提示され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６３】
【実施例】
実施例１
ヒト抗原特異的グリコシル化阻害因子（ＧＩＦ）を産生するハイブリドーマ細胞系の調製および精製技法                    
Ａ．抗原
ハチ毒由来の凍結乾燥ホスホリパーゼＡ２  （ＰＬＡ２  ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ  より購入した。変性ＰＬＡ２  （Ｄ−ＰＬＡ２  ）および臭化シアン処理ＰＬＡ２  は、Ｋｉｎｇら、（Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  １７２；  ６６１，  １９７６）によって記載された方法によって調製した。Ｄ−ＰＬＡ２  を調製するために、５ｍｇのＰＬＡ２  を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  緩衝液ｐＨ８．６に溶解し、５ｍｇ／ｍｌジチオスレイトール存在下６Ｍ塩酸グアニジン中で変性させた。室温で１８時間後、スルフヒドリル基をヨード酢酸を用いてカルボキシメチル化した。変性タンパク質を０．０２Ｍ酢酸に対して透析し、使用するまで−４０℃に保った。ＰＬＡ２  内のメチオニン結合を切断するために、１０ｍｇのハチ毒ＰＬＡ２  を０．４ｍｌ蒸留水に溶解し、１００ｍｇＣＮＢｒを含有する１．２ｍｌギ酸を添加した。室温で２時間後、混合物を水で二倍に希釈し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  中で凍結乾燥した。天然ＰＬＡ２  をＴｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ）に、製造業者の勧める方法にしたがって結合させた。特に言及しない限り、１ｍｇタンパク質を１ｍｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合させた。
【００６４】
Ｂ．抗体
精製ヒトＥ骨髄腫タンパク質ＰＳ、ハイブリドーマＨ−１  ＤＮＰ−Ｅ−２６由来のモノクローナルマウスＩｇＥ（Ｌｉｕ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２４；  ２７２８，  １９８０）およびモノクローナル抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）は既報の論文に記載されたのと同様に調製した（Ｃａｒｉｎｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２７；  ２２１，  １９９０  ）。モノクローナル抗−Ｔ細胞レセプターαβ、ＷＴ３１Ｃ（Ｓｐｉｔｓ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３５；  １９２２，  １９８５）を含有する腹水は、ＤＮＡＸ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ  のＪ．  ＤｅＶｒｉｅｓ博士の厚意により提供を受けた。ウサギリポモジュリン１４１Ｂ９（Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３２；  １２８６，  １９８４）に対するマウスモノクローナル抗体は既報の記載と同様に調製した（Ａｓｋａｓａｋｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３１；  ３１７２，  １９８６）。マウスＩｇＧに対する特異的に精製されたヤギ抗体は、抗Ｈ（γ）鎖および抗Ｌ鎖の両方を含有するが、これはすでに報告されている（Ｓｕｅｍｕｒａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２５；  １４８，  １９８０  ）。フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体はＣａｐｐｅｌから購入した。ヒトＩｇＧおよび抗−リポモジュリン抗体（１４１Ｂ９）をＣＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合させた；約５ｍｇタンパク質を１ｍｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合させた。
【００６５】
Ｃ．細胞系
１０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノールおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、ＲＰＭＩ８８６６リンパ芽球様細胞を培養した（ＲＰＭＩ１６４０培養基）。マウスＴ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞（Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０；  ２５３４，  １９８８）は、既報の論文（Ｈｕｆｆら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １２９；  ５０９，  １９８２  ）に記載された高濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持された。ヒトリンパ芽球様細胞系ＣＥＭ（ＢＵＣ）のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ−欠損変異株は、すでに報告されている（ＨｕｆｆおよびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  、８１；  １５１４，  １９８４）。
【００６６】
Ｄ．細胞培養およびハイブリドーマの構築
ミツバチ毒に対してアレルギーを示す患者から末梢血液を採り、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  での遠心分離によって、この血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。抗原感作Ｔ細胞を活性化するために、ＲＰＭＩ１６４０培養基に３ｘ１０６  有核細胞／ｍｌの濃度でＰＢＭＣを懸濁し、１０μｇ／ｍｌＤ−ＰＬＡ２  またはＣＮＢｒ処理ＰＬＡ２  の存在下で３日間培養した。非付着細胞を回収し、新培養基に再懸濁し（２ｘ１０５  細胞／ｍｌ）、次に３μｇ／ｍｌ組換えヒトリポコルチン１（ＢｉｏｇｅｎのＪ．  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  博士およびＢ．  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  博士の厚意により提供された）の存在下、６０ユニット／ｍｌ精製ＩＬ−２（クロマトグラフィーで精製されたヒトＩＬ−２、Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ，  Ｓｉｌｖｅｒｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）とともに４日間培養した。
【００６７】
Ｔ細胞ハイブリドーマを構築するために、予めＩＬ−２によって増殖させた１．２ｘ１０７  Ｔ細胞を２倍の細胞数のＢＵＣ細胞と混合した。混合細胞をペレット状にし、ポリエチレングリコール（１３００−１６００ＭＷ、Ｓｉｇｍａ  ）を用いて融合させた。細胞融合に関する詳細な方法は、すでに報告された通りである（Ｈｕｆｆら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  、８１；  １５１４，  １９８４）。ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）含有ＤＭＥＭに細胞を再懸濁し、５ｘ１０４  細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。完全ＤＭＥＭ中で週２回継代培養してハイブリッドクローンを維持した。Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激するために、８μｇ／ｍｌＯＫＴ３を用いて、０℃で４０分間この細胞を処理し、この抗体処理細胞（１ｘ１０６  ／ｍｌ）を、予め１０μｇ／ｍｌ抗−ＭＧＧでコーティングしたＬｉｍｂｒｏ組織培養ウェル（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｓ，  Ｍｃｌｅａｎ，  ＶＡ  ）に分注した。２４時間培養後、培養上清を得た。
【００６８】
Ｅ．ＣＤ３およびＴｃＲの検出
５％ＦＣＳおよび１０μＭＮａＮ３  を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、８μｇ／ｍｌＯＫＴ３または１：１０００希釈抗−ＴｃＲαβ（ＷＴ３１）含有腹水とともに、ハイブリドーマ細胞（１ｘ１０６  ／試料）を、０℃で４０分間、インキュベートした。対照として、同じ細胞のアリコートを同一濃度のマウスＩｇＧ２ａ    （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  イソタイプ対照）で処理した。５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで細胞を二回洗浄し、次にフルオレセイン標識した抗−マウスＩｇＧとともに４０分間インキュベートした。洗浄後、細胞に付随する蛍光をＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎ  を用いて分析した。
【００６９】
抗−マウスＩｇＧでコーティングされたウシ赤血球を用いたロゼット形成によって、ＣＤ３＋  ハイブリドーマ細胞を同定した。Ｗｉｌｈｅｌｍ  らの方法（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ９０；  ８９，  １９８６  ）によって、この抗体を赤血球に結合させた。簡単に述べると、０．５ｍｌのウシ赤血球沈渣を塩類液で４回洗浄し、０．７５ｍｌの０．５μｇ／ｍｌ精製抗−ＭＧＧに懸濁した；この細胞懸濁液に２５μｌＣｒＣｌ３  （１６．５ｍｇＣｒＣｌ３  を５ｍｌ塩類液に溶解する）をゆっくり混合しながら添加し、得られた細胞懸濁液を３０℃で１時間インキュベートした。抗−ＭＧＧ結合赤血球を塩類液で４回洗浄し、５ｍｌＦＣＳ（約１ｘ１０９  赤血球／ｍｌ）に再懸濁した。ＣＤ３＋  細胞を検出するために、５％ＦＣＳおよび８μｇ／ｍｌＯＫＴ３を含有する８０μｌＤＰＢＳに１０６  ハイブリドーマ細胞のペレットを懸濁した。０℃で４５分後、細胞を２回洗浄し、８０μｌＤＰＢＳ−５％ＦＣＳに再懸濁し、抗−ＭＧＧでコーティングされた赤血球およびクリスタルバイオレットの懸濁液２０μｌをこの細胞懸濁液に添加した。この混合物を２００ｇで５分間遠心分離し、チューブを０℃で２時間インキュベートした。ペレットを徐々に再懸濁し、顕微鏡下でロゼット形成した細胞を検査した。
【００７０】
Ｆ．ＣＤ３＋  細胞の濃縮
８μｇ／ｍｌＯＫＴ３（１．５ｘ１０６  細胞）で処理したハイブリドーマ細胞を、抗−ＭＧＧが結合した赤血球（約４ｘ１０８  赤血球）と混合して、上記の方法によってロゼットを形成した。ペレットを再懸濁し、６０％および５０％パーコール層からなるパーコール勾配の上端にのせた。チューブを  １２００ＲＰＭ（７００  ｇ）で２０分間、室温で遠心分離した。ペレット状の細胞を培養基で２回洗浄し、０．８３％ＮＨ４  Ｃｌ緩衝液で、０℃１分間、処理することによって、赤血球を溶解させた。細胞をＤＭＥ培養基で洗浄し、これに再懸濁し、細胞数を増加させるために培養した。
ＣＤ３＋  細胞のさらなる純化は細胞選別によって行なわれた。ハイブリドーマ細胞をＯＫＴ３で処理し、フルオレセイン標識した抗−ＭＧＧで染色した。ＦＡＣＳＴＡＲ  （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた細胞選別によって、ポジティブに染色された細胞を選択した。
【００７１】
Ｇ．ＩｇＥ−ＢＦの精製および検出
Ｔ細胞ハイブリドーマの培養上清を、ＤｉａｆｌｏＹＭ１００メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ  ）で濾過し、濾液をＹＭ５メンブランで限外濾過して１０倍に濃縮した。既報の方法にしたがって（ＩｓｈｉｚａｋａおよびＳａｎｄｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２６；  １６９２，  １９８１）ＩｇＥ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いてこの濾液中のＩｇＥ−ＢＦを精製した。培養濾液中またはＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分中のＩｇＥ−ＢＦの存在は、既述の方法（Ｋｉｓａｋｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８；  ３３４５，  １９８７）にしたがって、ＦｃεＲ＋  Ｂリンパ芽球様細胞系、ＲＰＭＩ８８６６細胞とヒトＩｇＥコーティングウシ赤血球（Ｅ−ＩｇＥ）とのロゼット形成の阻止によって評価された。３００ＲＰＭＩ８８６６細胞のうち、ロゼット形成細胞（ＲＦＣ）の割合を三回測定し、平均値＋ＳＤとして表示した。
【００７２】
１２Ｈ５細胞によって産生されるげっ歯類ＩｇＥ−ＢＦを同じ方法によって検出したが、ただし指示細胞としてはラットＩｇＥコーティングウシ赤血球を用い、ＦｃεＲ＋  Ｂ細胞の供給源としてはＮｉｐｐｏｒｔｒｏｎｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  に感染したＬｅｗｉｓ  系ラットの腸間膜リンパ節細胞を用いた（Ｙｏｄｏｉ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．    Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２４；  １３２２，  １９８０  ）。
【００７３】
Ｈ．ＧＩＦの検出
Ｔ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞（Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０；  ２５３４，  １９８８）を用いて、ＧＩＦを検出した。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を等量の検査試料と混合し、その細胞懸濁液を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥとともに２４時間培養した。培養上清をＣＦ５０Ａメンブランで濾過し、ＩｇＥ−ＢＦ含有濾液をレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ｙｏｄｏｉ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２５；  １４３６，  １９８０）で分画した。非結合タンパク質（流出画分）および０．２Ｍαメチルマンノシドで溶出されたタンパク質（溶出画分）の両者を、ＩｇＥ−ＢＦの存在について、ロゼット形成阻止技法で評価した。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥとのみ培養したときは、その細胞によって産生されたほとんどすべてのＩｇＥ−ＢＦは本質的にレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合し、αメチルマンノシドで溶出することによって回収された。したがって、流出／溶出画分のロゼット形成阻止パーセントの比は、０．２より小さい。十分量のＧＩＦがマウスＩｇＥとともに１２Ｈ５細胞の培養に添加された場合には、その細胞によって産生されたＩｇＥ−ＢＦの大部分は、レンチルレクチンに対する親和性を欠いており、流出画分に回収された    （Ｉｗａｔａ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１；  ３２７０，  １９８８）。したがって、流出／溶出画分のロゼット形成阻止パーセントの比が３．０またはそれより高いならば、ＧＩＦは（＋）と判定した。
【００７４】
Ｉ．  ＧＩＦの分画
ハイブリドーマ由来のＧＩＦがハチ毒ＰＬＡ２  に対して親和性を有するかどうかを判定するために、ハイブリドーマ細胞の培養上清を抗原−結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。ハイブリドーマ細胞をＯＫＴ３抗体（８μｇ／ｍｌ）で処理し、この抗体処理細胞懸濁液または非処理細胞懸濁液（１．５ｘ１０６  細胞／ｍｌ）のうち８ｍｌのアリコートを、抗−ＭＧＧでコーティングした組織培養フラスコで培養した。培養上清を４倍に濃縮し、２ｍｌ試料を０．４ｍｌＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着させた。流出画分を０．５ｍｌＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  と一晩混合し、免疫吸着剤を小カラムに詰めた。流出画分を回収した後、カラムをＤＰＢＳで洗浄し、１．０ｍｌグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０  で溶出した。既述の方法（Ａｋａｓａｋｉ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３６；  ３１７２，  １９８７）によって、抗−リポモジュリン（１４１Ｂ９）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で、ＧＩＦを部分精製した。
【００７５】
Ｊ．ホスホリパーゼ阻害活性の測定
アフィニティー精製ＧＩＦをアルカリ性ホスファターゼで既述のように処理した（Ｕｅｄｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３９；  ８９８，  １９８３  ）。簡単に述べると、１ｍｌの調製物をＴｒｉｓ−  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２に対して透析し、１単位の不溶性アルカリ性ホスファターゼ（子ウシ腸、Ｓｉｇｍａ  ）と室温で２時間混合した。遠心分離後、上清を０．１ＭＴｒｉｓ−  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析した。生合成過程で３  Ｈ−オレイン酸により標識された大腸菌およびブタ膵臓ＰＬＡ２  （Ｓｉｇｍａ  ）を用いて、アルカリ性ホスファターゼ処理試料のホスホリパーゼＡ２  阻害活性を測定した（Ｒｏｔｈｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１７；  ８７８，  １９８３）。詳細な方法は、Ｏｈｎｏら（Ｉｎｔｅｒｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １；  ４２５，  １９８９）に記載されている。簡単に述べると、ブタ膵臓ＰＬＡ２  （１ｘ１０−５ユニット）をＧＩＦと混合し、総容量１５０μｌとした。２５℃で５分後、  ３Ｈ標識大腸菌の懸濁液５０μｌ（５０００ｃｐｍ）  を添加し、その混合物を２５℃で５分間インキュベートした。５０μｌの２ＭＨＣｌを添加して反応を止め、５０μｌの１００ｍｇ／ｍｌＢＳＡをこの混合物に添加した。この懸濁液を５５００ｇで１分間遠心分離し、２５０μｌ上清中の放射能をシンチレーション分光計で測定した。
【００７６】
Ｋ．イオン交換カラムクロマトグラフィー
無血清培地中のＡＣ５細胞の培養上清を、限外濾過によって２５から１００倍に濃縮した。１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を蒸留水で８倍に希釈し、ＴｒｉｓでｐＨ８．０に調整し、ただちに１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ）カラム（３ｍｌ容）にかけた。流出（通過）画分を回収した後、カラムを４カラム容の２０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭＴｒｉｓ−  ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、洗液を通過画分に合わせた。４カラム容の５０ｍＭ，７５ｍＭ，１００ｍＭ，１５０ｍＭ，および２００ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭＴｒｉｓ−  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０でカラムに結合したタンパク質を良好に溶出した。各溶出画分を濃縮し、ダルベッコのリン酸緩衝塩類液（ＤＰＢＳ）に対して透析した。
【００７７】
Ｌ．ゲル濾過
ＤＢＰＳ中の試料１ｍｌをＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  カラム（１．６ｘ５０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ）にかけ、ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ，  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）を用いて、流速１ｍｌ／分でＤＰＢＳによりこのカラムからタンパク質を溶出し、適当な画分を集めた。ヒトＩｇＥ（ＰＳタンパク質、ＭＷ：１８５，０００）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ：６７，０００）、オボアルブミン（ＭＷ：４３，０００）、大豆トリプシンインヒビター（ＭＷ：２０，１００）、およびシトクロームＣ（ＭＷ：１２，５００）を用いて、このカラムを分子量で標準化（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）  した。ＩｇＥを除くすべての標準タンパク質は、Ｓｉｇｍａ  から購入した。標準タンパク質の保持時間はそれぞれ４１．９７，５２．０８，５５．１３５，６２．０９７，および７１．６７分であった。
【００７８】
Ｍ．ＧＩＦのアフィニティー精製
完全ＤＭＥ培地中のＣＬ３クローン培養上清を、限外濾過によって５倍に濃縮し、１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  または抗−ＧＩＦＳｅｐｈａｒｏｓｅ  カラム（５ｍｌ容）を通して一晩再循環処理することによって、上清中のＧＩＦをこの免疫吸着剤カラムに吸着させた（Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：  ３２７０，  １９８８）。この免疫吸着剤を２０カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、ビーズに結合したタンパク質を０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出することによって回収した。１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いた同一の技法によって、２３１Ｆ１細胞由来のマウスＧＩＦを精製した。
【００７９】
無タンパク質培地中で培養したＡＣ５細胞培養上清中のＧＩＦを単離するために、この上清を限外濾過によって５０から１００倍に濃縮した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  カラムから得られたこの上清の適当な画分を、５−６ｍｌにまで濃縮し、４℃で一晩、モノクローナル抗ＧＩＦ抗体と結合したＡｆｆｉｇｅｌ  １０−  免疫吸着剤１．０−１．５ｍｌと混合した。この懸濁液を小カラムに充填し、免疫吸着剤を４０カラム容のＤＰＢＳで洗浄した。一部の実験では、免疫吸着剤を４０カラム容のＤＰＢＳおよび２０カラム容の０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳで洗浄した。０．１５ＭＮａＣｌ含有０．０５ＭグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０−３．２、で免疫吸着剤に結合したタンパク質を溶出した。
【００８０】
Ｎ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＩＦの検出
アフィニティー精製ＧＩＦを脱イオン水中の０．０１％ＳＤＳに対して透析し、Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ  （Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）中で凍結乾燥した。次に、Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７：  ６８０，  １９７０）を用いて、１５％ポリアクリルアミドスラブゲル中でのＳＤＳゲル電気泳動によって試料を分析した。ゲルを固定し、タンパク質バンドを銀染色によって検出した（Ｏｃｈｓら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２：  ３０４，  １９８１  ）。分子量標準は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  から購入した。
【００８１】
Ｏ．ＥＬＩＳＡアッセイ
モノクローナル抗−ＧＩＦ抗体を検出するために、Ｓｔｅｅｌｅらによって記載された方法（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４２：  ２２１３，  １９８９）を多少変更して用いた。簡単に述べると、０．１Ｍ炭酸コーティング緩衝液、ｐＨ９．６で希釈した１００μｌアフィニティー精製ＧＩＦでＩｍｍｕｌｏｎ  Ｉ  プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を一晩コーティングした。以下の各操作段階の間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  含有リン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）で、プレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで、６−９時間、プレートをブロックした。次いで、各試験試料の１００μｌをウェルに添加し、そのプレートを一晩４℃に保持した。アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ，  Ｓｏ．  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）およびアルカリ性ホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ  ）を用いて、マウスＩｇのプレートへの結合を検出した。基質添加の３０分後に、マイクロプレートリーダーＭＲ５０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂ）において４１０ｎｍのフィルターでＥＬＩＳＡシグナルを読み取った。ＥＬＩＳＡアッセイでマウスｍＡｂのためのイソタイプ判定キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ  ）を使用することによって、モノクローナル抗体のイソタイプを決定した。
【００８２】
アフィニティー精製ＧＩＦ調製物の画分のＧＩＦを検出するために、ビオチン−アビジンシステムおよび増幅法（Ｓｔａｎｌｅｙ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ８３：  ８９，  １９８５  ）を用いて、感度を高めた。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ  マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，  Ｄｅｎｍａｒｋ  ）を５０μｌの各画分でコーティングした。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＴｗｅｅｎ／ＰＢＳで洗浄し、４℃で一晩、２％ＢＳＡでブロックした。洗浄後、５０μｌのビオチン結合ｍＡｂ１４１−Ｂ９（２００ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌの１：１５００希釈ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ  ）を各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルに結合したアルカリ性ホスファターゼの量を増幅システムによって測定した（Ｓｔａｎｌｅｙ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ８３：  ８９，  １９８５  ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ）。ＥＬＩＳＡシグナルを４９０ｎｍで測定した。
【００８３】
実施例２
ヒト抗原特異的ＧＩＦを産生するハイブリドーマの特性決定
上記のように、ハチ毒に感受性の患者のＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌＤ−ＰＬＡ２  の存在下で３日間培養し、活性化されたＴ細胞を３μｌ／ｍｌ組換えリポコルチン存在下で４日間、ＩＬ−２によって増殖させた。次に、Ｔ細胞をＢＵＣ細胞と融合させてハイブリドーマを構築した。本実験に於て、４ハイブリドーマクローンが得られた。完全ＤＭＥＭで各ハイブリドーマクローンを培養し、培養上清をＹＭ１００メンブランで濾過した。濾液を１０倍に濃縮し、１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦの存在について評価した。表１に示された結果は、４ハイブリドーマクローンのうち二つが構成的にＧＩＦを分泌することを示す。
0003578787.tif 000002
ａ）各クローンの培養濾液を１０倍に濃縮した。一容量の濾液を、同量の１２Ｈ５細胞懸濁液に添加し、１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥの存在下でこの細胞を２４時間培養した。縦列の数字は、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ非存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は２４．４＋０．３（ＳＤ）％であった。
ｂ）１２Ｈ５細胞を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥのみとともに培養し、培養濾液中のＩｇＥ−ＢＦをレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。
ｃ）培養濾液を１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画し、この免疫吸着剤からの酸溶出物を、もとの培養上清の１／１００容となるまで濃縮した。この試料をアルカリ性ホスファターゼで処理し、脱リン酸化物質の膵臓ホスホリパーゼＡ２阻害能を評価した。
ハイブリドーマクローンＣＬ３上のＣＤ３決定基の存在を、フローサイトメトリーおよびロゼット形成技法によって評価した。８μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＯＫＴ３で細胞を処理し、次に、フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇで染色した。全細胞の１０％足らずが染色された。またＯＫＴ３処理細胞のうちわずかに６−８％が抗−ＭＧＧ結合赤血球とロゼット形成することが明らかになった。結論として、実施例１に記載されたロゼット形成法を用いて、ＣＤ３＋  細胞は純化された。パーコール層での密度勾配遠心分離法によって、抗−ＭＧＧ結合赤血球とロゼット形成した細胞を、ロゼット形成しない細胞から分離し、完全ＤＭＥＭ中で培養することによって増殖させた。同様の手順を３回繰り返して、ＣＤ３＋  細胞集団を純化した。最終的な細胞調製物をＯＫＴ３で処理した後、抗−ＭＧＧ結合赤血球とともにインキュベートすることによって細胞集団の８０−９０％がロゼットを形成することが明らかになった。フローサイトメトリーにおいて、細胞の７５％がＯＫＴ３によって染色された。しかしながら、４代継代して２週間細胞を培養した結果、約５２％までＣＤ３＋  細胞が減少した（フローサイトメトリーによる測定）場合には、ＣＤ３＋  細胞集団を細胞選別によってさらに純化し、培養によって細胞を増殖させた。細胞選別を２回繰り返した後、安定的にＣＤ３を発現するＣＬ３集団が得られた。ＯＫＴ３およびＷＴ３１（抗−ＴｃＲαβ）によるこの細胞集団の蛍光染色は、ほぼ１００％の細胞がＣＤ３を表現し、細胞の大部分がＴｃＲαβを表現することを示した。ＣＤ３＋  細胞集団およびＣＤ３−  細胞集団を培養し、１２Ｈ５細胞をもちいてＧＩＦの有無について培養濾液を評価した。ＣＤ３＋  細胞の培養濾液にはＧＩＦ活性が検出されたが、ＣＤ３−  集団の培養濾液には検出されなかった。この結果は、ＧＩＦの起源がＣＤ３＋  細胞であることを示した。
【００８４】
マウスＧＩＦに特有の性質の一つはモノクローナル抗−リポモジュリン（１４１Ｂ９）がこのリンホカインと結合していることであるので、ＣＬ３細胞に由来するヒトＧＩＦが１４１Ｂ９結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着されるかどうかを判定することとした。ＣＤ３＋  ，  ＣＬ３クローンを培養して、１リットルの培養上清を得た。ＹＭ１００メンブランで濾過した後、濾液を５ｍｌに濃縮し、１ｍｌの１４１−Ｂ９Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。流出画分を回収した後、免疫吸着剤を１０カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に５カラム容のグリシン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。ＤＰＢＳに対して透析した後、１２Ｈ５細胞を用いて、分画におけるＧＩＦ活性の分布を測定した。表２に示す結果は、この培養濾液中のＧＩＦ活性のほとんどすべてが、１４１−Ｂ９Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合し、酸性ｐＨでの溶出によって回収されたことを示す。
0003578787.tif 000003
ａ）ＣＬ３クローンの培養上清をＹＭ１００メンブランで濾過し、濾液を２００倍に濃縮した。濃縮した濾液の５ｍｌを１ｍｌの１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。
ｂ）流出画分を回収した後、５カラム容のＤＰＢＳで免疫吸着剤を洗浄し、次に５カラム容のグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。
ｃ）１２Ｈ５細胞を用いて、表１に記載されたのと同様の方法によって、ＧＩＦ活性を評価した。縦列の数字は、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、このアッセイでは２２．９±０．６（ＳＤ）％であった。（＋）はＧＩＦの存在を示す。
以前の実験で、マウスＧＩＦがホスホリパーゼ阻害タンパク質のリン酸化誘導体であるという証拠が示された（Ｕｅｄｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３９：  ８９８，  １９８３  ）。したがって、ＣＬ３クローンの培養濾液中のＧＩＦは、１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて精製された。他の三クローン、ＣＬ１，ＣＬ２，およびＣＬ７、の培養濾液を、同様に１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。この免疫吸着剤からの酸溶出物をアルカリ性ホスファターゼで処理し、膵臓ホスホリパーゼＡ２  によって生合成過程で標識された大腸菌からの  ３Ｈ−オレイン酸の放出を阻害する能力を調べた（Ｒｏｔｈｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１７：  ８７８，  １９８３）。表１に示す結果は、ＣＬ３およびＣＬ７由来のアフィニティー精製ＧＩＦはホスホリパーゼ阻害活性を発揮するが、ＣＬ１およびＣＬ２由来の同一画分はホスホリパーゼＡ２  を阻害しなかったことを示す。
【００８５】
実施例３
ＧＩＦの抗原結合性
前の実験で、リポコルチン存在下でＩＬ−２によって増殖させた抗原活性化Ｔ細胞が、ハチ毒ＰＬＡ２  に親和性を示さないＧＩＦを構成的に分泌することが示されているが、同じ細胞にＣＤ３が架橋結合することによって、ＩｇＥ−ＢＦとともにこの抗原の結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に親和性を有するＧＩＦの産生が生じた。このような発見から、ＣＬ３クローンが抗原結合ＧＩＦおよびＩｇＥ−ＢＦを産生するかどうかを判定することとした。細胞を０℃でＯＫＴ３で処理し、この抗体処理細胞（１．５ｘ１０６  細胞／ｍｌ）を抗ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。対照として、非処理のＣＬ３細胞を抗ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。培養上清をＹＭ１００メンブランで濾過し、限外濾過で７倍に濃縮した。濃縮した培養濾液を１ｍｌＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に一晩吸着させ、非結合タンパク質画分および２ｍｌ洗液を合わせた。このＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を完全に洗浄し、グリシンＨＣｌ緩衝液で溶出した。ＲＰＭＩ８８６６細胞をＦｃεＲ＋細胞の供給源として用いて、ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの溶出画分をＩｇＥ−ＢＦの存在について評価した。
0003578787.tif 000004
ａ）ＣＤ３処理または非処理細胞を抗−ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。
ｂ）３０ｍｌ培養上清をＹＭ１００で濾過し、濾液を４ｍｌに濃縮した。この試料を１．０ｍｌＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着させた。酸溶出画分を４．０ｍｌに調整し、ロゼット形成阻止によってＩｇＥ−ＢＦについて評価した。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＢＦの割合は、３７．７±１．０％であった。
ｃ）ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出画分の１．０ｍｌをＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。この流出、洗浄、および酸溶出画分を１．３ｍｌに調整し、１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性について評価した。縦列の数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、２１．７±０．６（ＳＤ）％であった。
表３に示した結果は、抗−ＣＤ３処理細胞はＩｇＥ−ＢＦを産生するが、非処理細胞は検出可能な量のＩｇＥ−ＢＦを産生しなかったことを示す。ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出画分を２倍に濃縮し、１ｍｌ試料を０．２５ｍｌＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。この流出画分、洗浄液、および溶出画分を１．５ｍｌに調整し、それらの試料をＧＩＦ活性について評価した。表３に示すように、非刺激細胞および抗−ＣＤ３処理細胞のどちらに由来するＧＩＦも、ＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合しなかった。
【００８６】
抗−ＣＤ３処理ＣＬ３細胞由来のＧＩＦがＰＬＡ２  と結合しないのは、Ｔ細胞の活性化にＤ−ＰＬＡ２  を用いたことと関係があると考えられた。この可能性を調べるために、ハチ毒感受性の患者のＰＢＭＣからもっと多くのＴ細胞ハイブリドーマを構築した。Ｔ細胞ハイブリドーマを構築する手順は上記と全く同様であるが、但しＤ−ＰＬＡ２  の代わりにＣＮＢｒ−処理ＰＬＡ２  、１０μｇ／ｍｌでＰＢＭＣを刺激した。この実験の結果として、２２のハイブリドーマクローンが得られた。各クローンの培養濾液のＧＩＦアッセイは、２２クローンのうち１０個が構成的にＧＩＦを産生することを示した（結果は示さない）。７個のＧＩＦ分泌クローンをＯＫＴ３で処理し、抗−ＭＧＧでコーティングしたシャーレでこの抗体処理細胞を培養した。培養濾液を４倍に濃縮し、ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着させた。
0003578787.tif 000005
ａ）１．２ｘ１０７  細胞をＯＫＴ３で処理した。細胞を８ｍｌの培養基に再懸濁し、抗−ＭＧＧでコーティングしたフラスコに分注した。培養上清を４倍に濃縮し、ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着させた。ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出液をさらにＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画し、その流出および溶出画分のＧＩＦ活性を測定した。
ｂ）ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分をＩｇＥ−ＢＦの有無について評価した。ＩｇＥ−ＢＦ非存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は２６．３±０．６（ＳＤ）％であった。
ｃ）１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を測定した。数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ非存在下でのＩｇＥ−ＲＦＣの割合は、２６．０±０．７（ＳＤ）％であった。（＋）はＧＩＦの存在を示す。
表４に示すように、７クローンのうち６クローンのＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分は検出可能な量のＩｇＥ−ＢＦを含有した。ＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  でＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出画分をさらに分画し、この免疫吸着剤からの流出および溶出画分のＧＩＦ活性を測定した。表４に示す結果は、７クローンのうち５クローンに由来するＧＩＦの大部分がＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合し、酸性ｐＨでの溶出により回収されることを示す。これらのクローンが抗原結合ＧＩＦを産生するためにはＣＤ３の架橋結合が必要であることを確認するために、これらの５クローンを、抗−ＣＤ３で処理せずに、抗−ＭＧＧでコーティングしたウェルで培養した。予想通り、培養上清はＩｇＥ−ＢＦを含有せず、上清中のＧＩＦはＰＬＡ２  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合しなかった。
【００８７】
本発明は、ハチ毒ＰＬＡ２  に対してアレルギー反応を起こす患者のＰＢＭＣに由来するＧＩＦ産生Ｔ細胞集団の発達を可能にし、このＴ細胞からＧＩＦ産生ハイブリドーマを確立する技術を提供する。典型的なハイブリドーマはＣＤ３決定基およびＴＣＲαβを表現し、このことはこれらがＴ細胞ハイブリドーマであることを意味する。さらに、ハイブリドーマ上のＴｃＲ複合体は機能していると思われる。親Ｔ細胞（Ｃａｒｉｎｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２７：  ２２１，  １９９０  ）およびＧＩＦ産生ハイブリドーマ（表３、４）の大部分はいずれも、ＣＤ３の架橋結合によってＩｇＥ−ＢＦを産生した。また、モノクローナル抗体ＷＴ３１および抗−ＭＧＧによってＣＬ３およびＡＣ５クローンのＴｃＲαβが架橋結合した結果、ＩｇＥ−ＢＦが産生された（結果は示さない）。代表的なＣＤ３＋  ハイブリドーマをさらに調べた結果、ＣＬ３，ＢＥ１２，ＡＣ５およびＣＢ７クローンのすべてがＣＤ４およびＣＤ８をともに表現した。ハイブリドーマ構築に用いられたＢＵＣ細胞はＣＤ４＋  ＣＤ８−  であるので（Ｊ．  Ｓｔｏｂｏ博士からの私信）、ハイブリドーマの親Ｔ細胞がＣＤ４およびＣＤ８をともに表現するかどうかは明かでない。
【００８８】
本実験はＴ細胞ハイブリドーマの一部がその細胞上のＣＤ３の架橋結合によって抗原（ＰＬＡ２  ）結合ＧＩＦを産生することを示した。この発見は、代表的なマウスＧＩＦ−産生ハイブリドーマが抗原パルスした同系マクロファージによる刺激によって、または細胞上のＣＤ３の架橋結合によって、抗原結合ＧＩＦを産生するという事実と一致し（Ｉｗａｔａ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：  ３２７０，  １９８８，  Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４３：  ３９１７，  １９８９）、二つの種に由来する抗原結合ＧＩＦ間の類似性を示唆した。マウスの系では、ハイブリドーマから得られた抗原結合ＧＩＦはインビボ抗体応答を担体（抗原）−特異的に抑制した。ハイブリドーマ由来の抗原結合ＧＩＦが抗原結合ポリペプチド鎖と非特異的ＧＩＦからなること（Ｊａｒｄｉｅｕ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｇ．  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  他編、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．５９５，  １９８７  ）およびその抗原結合鎖はエフェクター型サプレッサーＴ細胞因子（ＴｓｅＦ）と共通の抗原決定基１４−１２を共有すること（Ｉｗａｔａ  ら、同上、１９８９）も明らかになった。異なる実験から、モノクローナル抗リポモジュリン抗体１４１−Ｂ９および抗−Ｉ−Ｊ抗体の両方が、ＧＩＦのみならず、ＴｓｅＦおよびＴｓｉＦの非抗原結合鎖（Ｉ−Ｊ＋  鎖）にも結合することが示されている（Ｊａｒｄｉｅｕ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８：  １４９４，  １９８６，  Ｓｔｅｅｌｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４２：  ２２１３，  １９８９）。以上の知見を総合すると、抗原結合ＧＩＦがＴｓｅＦと同一であることが示唆される。代表的なマウスＴｓハイブリドーマ７１Ｂ４の親Ｔ細胞は、ＯＶＡ刺激脾臓細胞を同一抗原で刺激し、次にＧＩＦの存在下で抗原活性化Ｔ細胞を増殖させることによって得られた（Ｉｗａｔａ  およびＩｓｈｉｚａｋａ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：  ３２７０，  １９８８）。同じ方策を用いて、本実験ではヒトＴ細胞ハイブリドーマの親細胞を得た。実際、ヒトハイブリドーマ由来の非特異的ＧＩＦとＰＬＡ２  結合ＧＩＦはいずれも、以前の研究でマウスＴｓＦがやはり結合することが明らかになっている１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合した（Ｓｔｅｅｌｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４２：  ２２１３，  １９８９）。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のＰＬＡ２  結合ＧＩＦがヒト抗原特異的ＴｓｅＦに相当する可能性がある。しかしながら、抗原結合ＧＩＦがマウスＴｓｉＦと同等である可能性もまだある。発明者の研究室での最近の実験は、ホスホリパーゼＡ２  インヒビターの存在下で細胞を前培養した後、抗原（コンアルブミン）で刺激された抗原提示細胞で刺激した場合、典型的なマウスヘルパーＴ細胞クローンＤ１０．Ｇ４．１は抗原結合ＧＩＦを産生することができることを示している（Ｏｈｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２：  ２５７，  １９９０）。この抗原結合ＧＩＦはモノクローナル抗体１４−３０と結合した。このモノクローナル抗体はむ��ろＴｓｉＦに特異的であることが明らかにされている（Ｆｅｒｇｕｓｏｎおよび  Ｉｖｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３６：  ２８９６，  １９８６）。Ｇｒｅｅｎ  ら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３：  ９５，  １９８７）は、ＵＶ照射抗原刺激マクロファージを用いた抗原刺激によってＤ１０．Ｇ４．１クローンが抗原結合ＴｓＦを産生すること、およびこの因子が補助分子とともに、エフェクター型抗原特異的Ｔｓの産生を誘導することも報告した。アレルギー患者由来のＰＢＭＣはヘルパーＴ細胞を含有するので、ヒトハイブリドーマ由来の抗原結合ＧＩＦがＴｓｅＦではなくＴｓｉＦに相当する可能性がまだある。
【００８９】
Ｔａｋｅｕｃｈｉら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：  ３０１０，  １９８８）は、ＫＬＨで刺激した個体、すなわち大量の同一抗原の注射を繰り返し受けた個体、のＰＢＭＣからＴｓｅクローンを確立した。また、Ｍｏｄｕｌｉｎ  ら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３２２：  ４５９，  １９８６）は、らい腫らい患者の病変からＴｓクローンを確立した。しかしながら、本発明以前には、ヒトＴｓ細胞由来のサプレッサー活性を仲介するエフェクター分子（ＴｓＦ）は同定されていない。ヒトＧＩＦとマウスＧＩＦとの類似性は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のＰＬＡ２  結合ＧＩＦがヒトサプレッサーＴ細胞に由来するＴｓＦに相当することを示唆する。抗原結合ＧＩＦを産生するＴ細胞ハイブリドーマは、この分子の生化学的解析を容易にするであろう。ＴｓならびにＴｓＦ（抗原結合ＧＩＦ）がＩｇＧ抗体応答よりもＩｇＥ抗体応答をより有効に抑制することがマウスでは繰り返し示されている    （Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１４：  １１０，  １９７５  ）。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ由来のアレルゲン結合ＧＩＦが実際にＴｓＦに相当するならば、Ｔ細胞因子が親Ｔ細胞のドナーのＩｇＥ抗体応答を抑制することは、当然予想される。
【００９０】
実施例４
スギ花粉特異的ＧＩＦを産生するハイブリドーマ細胞系の調製
日本において、スギ花粉は主要なアレルゲンであり、人口のかなりの部分に季節性のアレルギー性鼻炎および結膜炎を引き起こす。他の抗原に対する本発明の知見の一般的な適用可能性を調べるために、抗原特異的ＧＩＦ産生Ｔ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマを調製するための方法（上記）をスギアレルゲンに対してアレルギー反応を起こす患者の末梢血液単核細胞に適用した。
【００９１】
スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）に含まれる主要なアレルゲンは、ｃｒｙｊ−１と命名された４０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｙａｓｕｅｄａ  ら、Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７１：  ７７，  １９８３  ）。本研究のために、多少の改変を加えた上記方法によってスギ花粉抽出物からアレルゲンを単離した。簡単に述べると、花粉をエーテルで脱脂し、０．１２５Ｍ炭酸水素アンモニウムで３回抽出した。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムによって抽出物中の炭水化物を除去した。抽出物中のタンパク質を８０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ、その沈澱を０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液、ｐＨ７．８に溶解した。このＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で十分透析した後、タンパク質画分をＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ−５２，Ｗｈａｔｍａｎ  ）にかけ、通過画分を得た。この画分を濃縮し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０に対して透析し、この緩衝液で平衡化したＣＭセルロースカラム（ＣＭ−５２，Ｗｈａｔｍａｎ  ）にかけた。カラムをこの緩衝液で洗浄し、カラムに残留したタンパク質を０．３Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲカラムでのゲル濾過によってこの溶出液中のタンパク質をさらに分画し、ｃｒｙｊ−１を含有する主要タンパク質画分を得た。この画分の主なタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって４２ｋＤａと測定され、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はｃｒｙｊ−１と同一であった。このタンパク質を、１．５ｍｇ／ｍｌゲルの割合で、Ａｆｆｉｇｅｌ  １０に結合させた。
【００９２】
合成ホスホリパーゼＡ２  阻害物質、２−（ｐ−アミルシンナモイル）−アミノ−４−クロロ安息香酸（ＯＮＯ−ＲＳ−０８２，ＯＮＯ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）を、組換えヒトリポコルチンＩの代わりに用いた。以前の実験から、ＯＮＯ−ＲＳ−０８２がホスホリパーゼＡ２  の特異的阻害物質であり、マウス脾臓細胞培養においてＧＩＦ産生細胞の発生を促進することが明らかになっていた（Ｏｈｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １：  ４２５，  １９８９）。オボアルブミン感作マウスの脾臓細胞をオボアルブミンで刺激し、２μＭのＯＮＯ−ＲＳ−０８２または３μｇ／ｍｌの組換えヒトリポコルチンＩのいずれかの存在下で、ＩＬ−２によって抗原活性化Ｔ細胞を増殖させたとき、ＧＩＦを産生する抗原特異的Ｔ細胞が生じた。抗原刺激Ｔ細胞およびＴ細胞ハイブリドーマの構築は、上記とほぼ同様に行なわれたが、ただし抗原として精製ｃｒｙｊ−１を用い、ホスホリパーゼＡ２  阻害物質としてＯＮＯ−ＲＳ−０８２を用いた。このようにして、スギ花粉に対してアレルギー反応を起こす患者の末梢血液から単核細胞を得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。１０μｇ／ｍｌ  ｃｒｙｊ−１  の存在下で、単核細胞の懸濁液（３ｘ１０６  細胞／ｍｌ）を３日間培養した。非付着細胞を回収し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁し（３ｘ１０５  細胞／ｍｌ）、６０ユニット／ｍｌヒトＩＬ−２および２μＭのＯＮＯ−ＲＳ−０８２の存在下で４日間培養した。次に、このようにして増殖させた細胞を回収し、ＢＵＣ細胞と融合させてハイブリドーマを構築した。
【００９３】
ハイブリドーマをモノクローナル抗−ＣＤ３抗体ＳＰＢ−Ｔ３ｂ（Ｓｐｉｔｓ  ら、Ｈｉｂｒｉｄｏｍａ  ２：  ４２３，  １９８３）で処理し、細胞上のＣＤ３の存在を免疫蛍光法によって調べた。ＣＤ３＋のハイブリドーマだけを限界希釈によってサブクローニングした。
１０％ＦＣＳを含有する完全ＤＭＥ培地でＣＤ３＋ハイブリドーマクローンを維持し、１２Ｈ５細胞を使用することによって各クローンの培養上清をＧＩＦの存在について評価した。一患者に由来するハイブリドーマについて得られた結果を表５に示す。３ハイブリドーマ；３１Ｅ９，３１Ｂ７，および３２Ｂ４の培養上清中にＧＩＦ活性を検出した。別の２ハイブリドーマ３１Ｈ６および３１Ｈ３の上清は、弱いＧＩＦ活性を有すると思われる。こうして得られたＧＩＦ産生ハイブリドーマを抗−ＣＤ３抗体で処理した後、抗−マウス免疫グロブリンで処理し、その細胞を２４時間培養した。次に、培養上清をｃｒｙｊ−１結合免疫吸着剤で分画した。この免疫吸着剤からの通過画分および酸溶出画分に存在するＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて評価した。その結果は表５に含まれるが、３１Ｅ９細胞由来のＧＩＦはｃｒｙｊ−１−Ａｆｆｉｇｅｌに結合し、酸性ｐＨでの溶出で回収されるが、３１Ｂ７細胞由来のＧＩＦは抗原結合免疫吸着剤に結合しなかったことを示す。以上の結果は、抗−ＣＤ３で刺激することによって３１Ｅ９細胞がｃｒｙｊ−１に親和性を有するＧＩＦを産生することを示す。
0003578787.tif 000006
ａ）この表中のハイブリドーマは２回の異なる実験から誘導された。
ｂ）刺激を行なわなかったハイブリドーマの培養上清をＧＩＦの存在でスクリーニングした。１２Ｈ５細胞のアリコートを各ハイブリドーマの培養上清とともにマウスＩｇＥ存在下でインキュベートした。１２Ｈ５細胞の培養上清をＣＦ５０Ａで濾過してＩｇＥを除去し、濾液をレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。流出および溶出画分におけるＩｇＥ−ＢＦをロゼット形成阻止によって評価した。縦列の数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。（＋）（−）の表示は、それぞれＧＩＦの存在および非存在を示す。
ｃ）代表的なハイブリドーマを抗−ＣＤ３抗体で処理し、培養上清をｃｒｙｊ−１結合Ａｆｆｉｇｅｌ  で分画した。通過（非結合）画分および酸溶出（結合）画分中のＧＩＦ活性の存在を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。１２Ｈ５細胞培養濾液をレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。３１Ｅ９細胞由来のＧＩＦは、ｃｒｙｊ−１−Ａｆｆｉｇｅｌに結合し、酸性ｐＨでの溶出によって回収されるが、３１Ｂ７細胞由来のＧＩＦはｃｒｙｊ−１−Ａｆｆｉｇｅｌカラムに保持されなかった。
【００９４】
実施例５
ヒトＧＩＦに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の調製および特性決定
Ａ．ハイブリドーマの構築およびスクリーニング
抗−リポモジュリン（１４１−Ｂ９）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて、Ｔ細胞ハイブリドーマＣＬ３の培養上清中のヒトＧＩＦを精製した。アフィニティー精製ＧＩＦを完全フロイントアジュバントに混合し、２週間間隔で３回この抗原を腹腔内に注入して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。最終免疫から２週間後、免疫したマウスの脾臓細胞を採り、あらかじめ６２５Ｒγ線を照射した同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに１ｘ１０７  脾臓細胞を移入した。移入を受けたマウスは細胞移入後ただちに、および２週間後に、不完全フロイントアジュバントに包含される精製ＧＩＦで免疫された。追加免疫から１週間後、その脾臓細胞をＨＰＲＴ−欠失Ｂ細胞系ＳＰ２／０−１４ＡＧと融合させた。支持細胞層としてＢＡＬＢ／ｃマクロファージとともにＨＡＴ培地中でこの細胞を培養した。この培養で得られた１０２個のハイブリドーマクローンはマウス免疫グロブリンの産生によって選択され、Ｉｇ−産生ハイブリドーマはＥＬＩＳＡアッセイおよび続いて１２Ｈ５細胞を用いたバイオアッセイにより抗−ＧＩＦ抗体産生によって選択された。
【００９５】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｉｍｍｕｌｏｎ  Ｉ  プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）をアフィニティー精製ＧＩＦでコーティングした。対照ウェルにはＤＰＢＳを容れた。ウェルを２％ＢＳＡでブロックした後、培養上清を各ウェルに分注し、マウスＩｇのウェルへの結合を、アルカリ性ホスファターゼ結合抗−マウスＩｇ抗体を用いて判定した。表６に示すように、１１ハイブリドーマクローンの培養上清が有意なＥＬＩＳＡシグナルを与えた。
0003578787.tif 000007
ａ）ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であった培養上清を、ＣＬ３クローン由来のＧＩＦと結合する能力について評価した。
ｂ）ＢＳＡコーティングウェルへのハイブリドーマ培養上清中のマウスＩｇの非特異的結合と比較した、ＧＩＦコーティングウェルへの同上清中のＩｇの結合。４１０ｍμでの光学濃度。
ｃ）ハイブリドーマの培養上清と精製ＧＩＦの混合物をＹＭ１００メンブランで濾過し、濾液のＧＩＦ活性を調べた。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥとともに、濾液の存在下で培養した。細胞によって産生されたＩｇＥ−ＢＦをレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画し、レクチン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出および溶出画分におけるＩｇＥ−ＢＦをロゼット形成阻止によって評価した。数字は流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＧＩＦは細胞によって産生されるＩｇＥ−ＢＦの性質を変換する（上欄対下欄）。（＋）はＧＩＦの存在を表す。
【００９６】
次に、１２Ｈ５細胞を用いて、１１ハイブリドーマクローンの培養上清中の抗ＧＩＦの存在を判定した（Ｉｗａｔａ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０：  ２５３４，  １９８８）。５０％飽和硫酸アンモニウム沈澱によって、各クローンの培養上清のグロブリン画分を得た。リン酸緩衝塩類液に対して透析した後、この画分をもとの培養上清の１／５容量に調整した。１４１Ｂ９Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて、アフィニティー精製ＧＩＦのアリコートをＣＬ３クローンから調製した。これらのアリコートを等量の各クローン由来のグロブリン画分と混合し、その混合物を４℃で一晩インキュベートした。次に、この混合物をＹＭ１００メンブランで濾過し、濾液中のＧＩＦの存在を調べた。次に、１２Ｈ５細胞懸濁液のアリコートを等量の濾液と混合し、その細胞懸濁液を１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＥ存在下で２４時間培養した。培養上清をＣＦ５０Ａメンブランで濾過してＩｇＥを除去し、濾液中のＩｇＥ結合因子をレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。実験の結果は、表６に包含されるが、３３８Ｈ，３１８Ｈ，３８８Ｆ１  ，４７６Ｂおよび３３５Ｃクローンの培養上清によってＧＩＦが除去されることを示しており、このことはこれらのハイブリドーマが抗−ＧＩＦを産生することを示す。
【００９７】
Ｂ．モノクローナル抗−ＧＩＦによるヒトＧＩＦの精製
ＧＩＦに対するモノクローナル抗体を産生する６ハイブリドーマクローンの中で、３８８Ｆ１  だけがＩｇＧ抗体を産生した。このハイブリドーマをサブクローニングし、５％ＦＣＳを添加した高濃度グルコースダルベッコ培地で培養した。培養上清を限外濾過で濃縮し、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて上清中のＩｇＧを回収した。次にこのモノクローナル抗体をＴｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合させて免疫吸着剤を調製した。このモノクローナル抗体が抗−リポモジュリン（１４１Ｂ９）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合するのと同じ分子に結合することができるかどうかを判定するために、培養上清中のＧＩＦを１４１Ｂ９Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着させ、酸性ｐＨでの溶出によって回収した。次に、このアフィニティー精製ＧＩＦ調製物を抗−ＧＩＦ（３８８Ｆ１  ）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。流出画分を得た後、免疫吸着剤カラムを１０カラム容のダルベッコリン酸緩衝塩類液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、ついで、グリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。１２Ｈ５細胞を用いて、流出および溶出画分の階段希釈のＧＩＦ活性を測定した。表７に示す結果は、１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分のＧＩＦが抗−ＧＩＦ（３８８Ｆ１  ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  と結合し、酸性ｐＨでの溶出によって再び回収されることを示す。この結果は、抗−リポモジュリンおよび抗−ＧＩＦの両方がヒトＧＩＦに結合することを示す。
0003578787.tif 000008
ａ）ＣＬ３クローン培養上清中のＧＩＦを抗−リポモジュリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて精製した。アフィニティー精製したＧＩＦ（１．５ｍｌ）を０．７５ｍｌの３８８Ｆ１  −結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した。流出画分を回収した後、カラムを１０カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に、３カラム容のグリシンＨＣｌ，ｐＨ３．０で溶出した。
ｂ）表４に記載されたのと同様の方法で１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を評価した。縦列の数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。（＋）はＧＩＦの存在を示す。
抗−ヒトＧＩＦがマウスＧＩＦと結合可能かどうかを判定するために、Ｔｓハイブリドーマ、２３１Ｆ１  細胞由来のマウスＧＩＦを１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製し、精製されたマウスＧＩＦのアリコートを１４１Ｂ９−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたは３８８Ｆ１−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  のいずれかによって分画した。流出画分を得た後、免疫吸着剤を３カラム容のＤＰＢＳで洗浄し、次に３カラム容のグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。予想された通り、すべてのＧＩＦ活性が１４１Ｂ９Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸着され、酸性ｐＨでの溶出で回収された。流出画分および洗浄画分のいずれにも、ＧＩＦ活性は存在しなかった。同じＧＩＦ調製物を３８８Ｆ１  −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で分画した場合、弱いＧＩＦ活性が流出画分に検出された。活性の大部分はＤＰＢＳによる洗浄で検出されたが、酸溶出画分は検出可能なＧＩＦ活性を含有しなかった。マウスＧＩＦは非常に低い親和性で抗−ヒトＧＩＦと結合し、中性ｐＨでの洗浄によって免疫吸着剤から解離すると思われる。以上の結果は、モノクローナル抗体３８８Ｆ１  がヒトＧＩＦに特異的であることを示す。
【００９８】
Ｃ．イオン交換クロマトグラフィーによるヒトＧＩＦの精製
ＡＣ５細胞を限界希釈によってサブクローニングし、ＣＤ３＋  クローンを得た。次に、この細胞を無血清ＡＢＣ培地に順化させた。フローサイトメトリーによって、この培地で培養したサブクローン上のＣＤ３の表現を確認した。ＣＤ３＋  サブクローンの培養上清を１０−３０倍に濃縮し、その調製物の階段希釈のＧＩＦ活性を測定した。このような結果に基づいて、サブクローン（ＡＣ５−２３）を選択したが、これはこのサブクローンの１０倍濃縮上清の１：３希釈物が、１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生へと変換することができたためである。
【００９９】
ヒトＧＩＦをイオン交換クロマトグラフィーで精製することができるかどうかを判定するために研究が行なわれた。ＡＢＣ培地中のＡＣ５サブクローンの培養上清を２５倍に濃縮した。濃縮された培養上清のうち１０ｍｌのアリコートを、ＴｒｉｓでｐＨ８．０に調整し、蒸留水で８倍に希釈し、次にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。濃度増加するＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  緩衝液でカラムに結合したタンパク質を溶出した。各画分を１０ｍｌに濃縮しＧＩＦ活性を測定した。
0003578787.tif 000009
ａ）ＡＣ５細胞の濃縮された培養上清を蒸留水で８倍に希釈して、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。画分１は２０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０による洗浄液と合わせた、通過画分を表す。濃度増加するＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで、カラムを段階的に溶出した。
ｂ）各画分を濃縮した後、全タンパク質を回収した。２００ｍＭＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出した後、多くのタンパク質がカラムに保持された。
ｃ）１２Ｈ５細胞を用いてＧＩＦ活性を検出した。数字はレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。ＩｇＥ−ＢＦ不存在下でのＲＦＣの割合は、２２．６±０．７（ＳＤ）％であった。（＋）（−）の表示は、ＧＩＦの存在および非存在を示す。
表８に示すように、通過画分および５０ｍＭＮａＣｌ溶出画分にＧＩＦ活性が検出されたが、他の画分には検出されなかった。最初の二つの画分の階段希釈の力価測定によって、通過画分が５０ｍＭ画分より高いＧＩＦ活性を有することが明らかになった。
【０１００】
個々の培養上清で繰り返し実験することによって、ＡＣ５細胞の培養上清を１００倍に濃縮し、蒸留水で３倍に希釈した後、カラムに通した場合には、培養上清中のＧＩＦの大部分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから回収することができることを確認した。通過画分および５０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  緩衝液による洗浄液をあわせ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにのせた元の試料の容量にまで濃縮した。濃縮された培養上清および通過（５０ｍＭＮａＣｌ）画分の階段希釈のＧＩＦ活性を検定した結果、両方の試料とも１：３０希釈物が、１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生へと変換することができることが示された。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに通すことによって、培養上清中のタンパク質の７５−８０％を除去できることも明らかになった。
【０１０１】
ＧＩＦの分子量を見積もるために、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからの濃縮された通過画分０．５ｍｌをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２  カラムにかけ、１ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶出した。この実験に於て、５ｍｌの画分を集め、各画分のＧＩＦ活性を１２Ｈ５細胞を用いて測定した。ＧＩＦ活性は画分９で検出されたが、これは７０から７５分の間に回収された。画分６および８も弱い活性を有するので、画分６、８、９の階段希釈のＧＩＦ活性を測定した。画分９の１：１０希釈でＧＩＦが検出されたが、他の画分の１：２希釈では検出されなかった。これらの結果は、ヒトＧＩＦの主要な分子種の分子量が、１１から１８ＫＤａの範囲にあることを示唆した。ＧＩＦ分子の大きさをもっとよく見積もるために、１ｍｌまたは２．５ｍｌの画分を集めた以外は同じ方法でＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２  でのゲル濾過を繰り返し行なった。３回の異なる実験から、ＧＩＦの大部分が６８から７２分の間に回収されることが示された。ゲル濾過による見積もりによれば、ＧＩＦの分子量は１２−１８ＫＤａであると思われる。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＧＩＦを同定する研究も行なった。ＡＢＣ培地でのハイブリドーマ培養上清２リットルを１００倍に濃縮し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで分画した。上記の実験に基づいて、濃縮した上清を脱イオン水で３倍に濃縮し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに通した。通過画分を濃縮し、ヒトＩｇＧ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に予め吸着させ、その画分中のＧＩＦを３８８Ｆ１−結合Ａｆｆｉｇｅｌ  でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。一部の実験では、免疫吸着剤からの酸溶出画分をｐＨ８．０に調整し、３８８Ｆ１−結合Ａｆｆｉｇｅｌ  でのアフィニティー精製を繰り返し行なった。還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアフィニティー精製ＧＩＦ調製物の分析を行なった。アフィニティー精製試料の主要バンドは、還元条件下で１４ＫＤａの分子量を有し、非還元条件下では１５ＫＤａであった。さらに、６７ＫＤａのバンドがたびたび観察された。アフィニティー精製調製物の一部をＤＰＢＳに対して透析し、その調製物中のＧＩＦ活性を検定した。透析および凍結乾燥に於てＧＩＦの回収率を１００％と仮定すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた試料は１：２５０のＧＩＦ力価を有するべきである。
【０１０３】
１４ＫＤａタンパク質とＧＩＦとの関係を判断するために実験を行なった。ＡＣ５クローンの培養上清２リットル中のＧＩＦをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーと、それに続く３８８Ｆ１−Ａｆｆｉｇｅｌ  でのアフィニティー精製によって、精製した。免疫吸着剤からの酸溶出液をｐＨ８．０に調整し、限外濾過によって１ｍｌに濃縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  カラムで分画した。２．５ｍｌずつの溶出画分を１２Ｈ５細胞を用いて活性測定した。この実験に於て、ＧＩＦ活性の大部分が、６７．５から７０分の間に溶出された画分に検出された。その画分中のＧＩＦの存在をビオチン結合ｍＡｂ１４１−Ｂ９を用いたＥＬＩＳＡによって確認した。ＥＬＩＳＡシグナルは弱かったが、ＧＩＦ含有画分のみがＥＬＩＳＡシグナルを与えた。ＧＩＦ含有画分の１ｍｌを凍結乾燥しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。その結果は、ＧＩＦ含有画分中に１４ＫＤａペプチドが存在することを確認した。
【０１０４】
実施例６
マウスＧＩＦの精製およびアミノ酸配列決定
抗−リポモディリンモノクローナル抗体１４１Ｂ９を用いて、ＧＩＦ産生マウスＴ細胞ハイブリドーマ２３１Ｆ１  細胞（Ｉｗａｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３２：１２８６，  １９８４）  の培養上清から、マウスＧＩＦを精製した。ＦＡＳＴ−γカラムを用いて、ハイブリドーマ１４１Ｂ９を注入したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水からモノクローナル抗体１４１Ｂ９を精製した。調製物中の約１０ｍｇのＩｇＧ１  は、１ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ  １０ビーズと結合した。ＧＩＦを得るために、１０％Ｎｕ−  血清を添加した高濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で２３１Ｆ１  細胞を培養した。培養物中の２３１Ｆ１  細胞の数が１〜２×１０６  個／ｍｌに達した後、細胞を回収し、無血清ＤＭＥＭに１．５×１０６  個／ｍｌの濃度で再懸濁し、４８時間培養した。この細胞の培養上清を限外濾過で１０００倍に濃縮し、濃縮された培養上清の１０ｍｌを２ｍｌの１４１Ｂ９結合Ａｆｆｉｇｅｌ  と６〜１２時間４℃で混合した。上記の免疫吸着剤を５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭの燐酸緩衝液で、次いで５００ｍＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で、よく洗浄した。その後、免疫吸着剤に保持されたタンパク質を０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０で溶出した。アフィニティー精製したＧＩＦを１／１０容の１００％（ｗｔ／ｖｏｌ）  トリクロロ酢酸と混合した。この混合物を−２０℃に１５分間保ち、１５，０００×ｇ  で５分間遠心分離して沈殿物を回収した。この沈殿物中のタンパク質を１５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル中、還元条件下で電気泳動にかけ、１０ｍＭＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１１．０中のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気ブロットした。クマシー  ブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色することによってタンパク質のバンドを可視化した後、１４ｋＤａのバンドのアミノ酸配列決定を行った。
【０１０５】
ＰＶＤＦ−免疫タンパク質を還元し、インサイチュでＳ−カルボキシメチル化し、その後、８％アセトニトリルを含有する９０ｍＭトリス緩衝液中で１ｐｍｏｌのアクロモバクタープロテアーゼＩ（和光純薬）で２０時間３０℃で消化した。消化したペプチドを、０．０５％トリフルオロ酢酸で平衡化した５μＣ８−３００Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ）  を用い、移動相としての水中で、逆相ＨＰＬＣにより分離した。ペプチドを２−プロパノール／アセトニトリル（７：３）中の０．０２％トリフルオロ酢酸の直線勾配（２〜５０％）で溶出した。２１４ｎｍに吸収を示す主要ペプチドピークを回収し、このペプチドのアミノ酸配列分析を微量配列決定法用改良プログラム（Ｉｗａｍａｔｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１０：５１−１５８，  １９９１）  を有するガス相配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４７０Ａ）を用いて行った。単離したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１０６】
【化１】
0003578787.tif 000010
【０１０７】
アクロバクタープロテアーゼＩによる消化の後ＰＶＤＦに保持されたペプチドフラグメントを、８％アセトニトリルを含有する１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）中、２ｐｍｏｌのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、１６時間３０℃で更に消化した。この消化の後、４つの主要ペプチドをＨＰＬＣで回収し、上記のようにして配列決定した。各ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
【０１０８】
【化２】
0003578787.tif 000011
【０１０９】
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ消化の後に膜に保持されたペプチドを、８％アセトニトリルを含有する１００ｍＭ  の重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）中で、１ｐｍｏｌのトリプシン−ＴＰＣＫ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）  により２０時間３０℃でさらに消化した。ひとつの主要ペプチド（Ｔ−１）を回収し、配列決定した。
【０１１０】
【化３】
0003578787.tif 000012
【０１１１】
小型の一片のＰＶＤＦ−固定化タンパク質シ−クエンサー（Ｓｈｉｍａｚｕ  ＰＳＱ−１）を注入することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列を直接配列決定した。
【０１１２】
【化４】
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【０１１３】
分析されたペプチドの約８５％がＮ末端メチオニン残基の欠失を示した。
【０１１４】
実施例７
ｃＤＮＡクローニングおよびマウスＧＩＦの配列決定
Ｎ末端アミノ酸配列および上記したもうひとつのペプチド（ＡＮ−５）の配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応法により部分ｃＤＮＡを増幅し、得られたｃＤＮＡを用いてマウスｃＤＮＡライブラリーを釣り上げることを試みた。ＰＣＲに使用した合成プライマーは以下の通りであった。
【０１１５】
【化５】
0003578787.tif 000014
【０１１６】
細胞質ＲＮＡをＧＩＦ産生マウスＴハイブリドーマ２３１Ｆ１  から単離した。オリゴ（ｄＴ）−セルロースを用いてｍＲＮＡを精製した後、２３１Ｆ１  ＲＮＡを鋳型としてｄＴ１５で開始した逆転写によりｍＲＮＡ鋳型に対する一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲを標準的な条件で行った。簡単に言うと、この鋳型ＤＮＡを９４℃で１分間変性し、上記したプライマーとともに５９℃で１分間アニールし、次いで、７２℃で４５秒間伸長させた。続いてのクローニングおよびＤＮＡ配列決定のために、ＰＣＲで増幅した０．２ＫｂのフラグメントをｐＣＲ１０００ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）に連結した。このフラグメントのヌクレオチド配列を確認した後、挿入物をＥｃｏＲＩ  消化により切断し、マウスＴ細胞ハイブリドーマ２３１Ｆ１  細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたが、これはＵｎｉ−ＺＡＰｃＤＮＡ  合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，    カリフォルニア）を用いて構築したものである。ＥｃｏＲＩ  認識部位を二本鎖ｃＤＮＡに結合させたが、これをその後ＸｈｏＩにより消化させ、ｃＤＮＡをＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターに連結した。このｃＤＮＡライブラリーを、上記０．２ＫｂのＤＮＡとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。５０万個の独立のクローンをスクリーニングした後、７個のクローンを単離した。この７個すべてのクローンの制限酵素切断地図を作製したところ、単一のパターンが示めされた。
【０１１７】
最も長いクローン（０．６５Ｋｂ）を標準的なジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定のために選択した。このヌクレオチド配列および演繹されるマウスＧＩＦのアミノ酸配列を図１に示す。下線は、精製したマウスＧＩＦのエドマン分解において同定されたペプチドの位置を示している。ＧＩＦタンパク質の大きさの見積もりは１３ｋＤａであり、これはＴハイブリドーマ２３１Ｆ１  細胞由来の精製ＧＩＦの大きさと相関がある。最初のメチオニンコドンの隣の（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列は翻訳開始則（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｕｌｅ）  を支持する。この挿入物の長さは０．６５Ｋｂであった。マウスＴ細胞および組織ＲＮＡのノーザンブロット分析により、０．６５〜０．７０Ｋｂに単一種のｍＲＮＡの存在が示され、このことは、得られたｃＤＮＡが全長であることを示唆している。また、ヌクレオチド８２の５’上流にメチオニン残基が見出されないので（図１）、このマウスＧＩＦタンパク質はシグナルペプチドを持たないことが見出された。
【０１１８】
実施例８
ヒトＧＩＦをコードするｃＤＮＡの単離
ヒトＴ細胞ハイブリドーマＡＣ５を抗−ＣＤ３抗体で染色し、ＧＩＦ産生ＣＤ３＋サブクローンをｍＲＮＡの供給源として採用した。オリゴ（ｄＴ）−セルロース上のＲＮＡの分画を繰り返してｍＲＮＡを単離したが、その後これを鋳型として用いて、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡを合成した。ＥｃｏＲＩ  認識部位を結合させた後、二重鎖ｃＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  スピンカラムに通す濾過によりサイズ選択した。その後、ｃＤＮＡをＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターと連結し、組換えファージライブラリーを構築した。このライブラリーにおいて、挿入物を含むファージの比率は全ファージの８８〜９６％であった。このｃＤＮＡライブラリーを、マウスＧＩＦをコードするｃＤＮＡのフラグメントとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。大腸菌ＸＬ１をマウスＧＩＦ−ｃＤＮＡを含むファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）とともに培養し、細菌中のＤＮＡを抽出した。プラスミドを遠心分離で精製し、ＢａｍＨＩ  およびＸｈｏＩにより消化した。アガロース上の電気泳動の後、５００ｂｐ  のバンドを抽出し、Ｇｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ＩＩ  キット（ＢＩＯ  １０１）  を用いて精製した。このｃＤＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｒｉｍ−Ｉｔ  ｇｏｌｄキットを用いてα−３２Ｐ−ＡＴＰで標識した。
【０１１９】
５×１０４ｐｆｕを含有するライブラリーとともに大腸菌ＰＬＫ−Ｆを培養し、ファージを大腸菌でコーティングしてあるナイロン膜（Ｄｕｒａｌｏｓｅ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移した。この膜をＬＢボトムプレートの上に置き、３７℃に一晩保った。０．５ＭのＮａＯＨで処理し、トリスで中和して、２×ＳＳＣで洗浄した後、この膜を８０℃で乾燥し、ＤＮＡを膜上に固定した。
【０１２０】
このｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために、上記の膜を超音波処理したサケ精子ＤＮＡで前処理し、その後、５分間１００℃で加熱しておいた３２Ｐ  標識マウスＧＩＦｃＤＮＡとともに、一晩６０℃でインキュベートした。この膜を２回それぞれ、０．１％ＳＤＳを含有する６×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣプラス０．１％ＳＤＳで洗浄し、ラジオオートグラフィーのフィルムに暴露した。陽性クローンからファージを抽出し、スクリーニングを２回以上繰り返して陽性クローンを単離した。スクリーニングされた２００，０００  個のファージの中で、２７個の陽性クローンが単離された。これらの陽性ファージクローンが実際にマウスＧＩＦｃＤＮＡに相同的なｃＤＮＡを含むことを確認するために、各陽性ファージクローンからファージミドＤＮＡを得て、１％アガロースゲルで電気泳動し、Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ膜にブロットし、その後３２Ｐ  標識マウスＧＩＦｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。
【０１２１】
ヒトＧＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定するために、各ファージクローン由来のファージミドをＥｃｏＲＩ  およひＸｈｏＩにより消化して、電気泳動を行って挿入物を得た。２７個のクローンのうち、０．５Ｋｂの挿入物を持つ７個のクローンについてジデオキシ法により配列決定した。この挿入物をＳａｃＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩにより消化し、フラグメントをｐＵＣ１９またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−  ベクターにサブクローニングした。プラスミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法により精製し、配列Ｖｅｒ２（ＵＳＢ）を用いてクローンを配列決定した。全長のｃＤＮＡ（ＰＮＹ１０６）の全ヌクレオチド配列を図２に示した。この配列は、ＧＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド３９０〜３９２のコドンがＡＡＴ（アスパラギン）であるのに対し、ＭＩＦｃＤＮＡがＡＧＴ（セリン）のコドンを持つ他は、主張されているヒトＭＩＦｃＤＮＡ（Ｗｅｉｓｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：７５２２−７５２６，  １９８９）  の配列に相同的であった。もうひとつの差異は、ｐＹＮ１０６における５’末端非コード領域がＭＩＦのそれよりも４０塩基長いことであった。
【０１２２】
ＲＮアーゼ保護アッセイをいくつかのＴハイブリドーマ細胞中で行い、ＧＩＦｃＤＮＡにより検出されたｍＲＮＡの構造に重複性があるか否かを測定した。その結果、ＧＩＦに相当するｍＲＮＡはたった一種類であることが確認された。
【０１２３】
実施例９
組換えＧＩＦの大腸菌における発現
Ａ．細菌発現系の構築
本実施例は、大腸菌におけるヒトおよびマウスＧＩＦポリペプチドの発現に関するものである。ＥｃｏＲＩ  およびＸｈｏＩ部位でＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔに挿入したヒトＧＩＦｃＤＮＡを以下のオリゴヌクレオチドプライマーとともにアニールした。
【０１２４】
【化６】
0003578787.tif 000015
【０１２５】
これらのプライマーをホスホルアミダイト法（ＭｃＢｒｉｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，  ２４：２４５−２４８，  １９８３）により合成した。その５’末端のプライマーは、好ましい細菌での発現のためのシャイン・ダルガルノ配列（Ｓｃｈｅｒｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  ８：３８９５−３９５０，  １９８０）  を含み、各プライマーはそれぞれ、ＡｆｌＩＩ  およびＢａｍＨＩ  を含んでいた。
【０１２６】
ヒトＧＩＦｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５５：３３５−３５０，  １９８７）  を用いて増幅した。特に言及しないか限り、各ＰＣＲサイクルにおける変性工程は９４℃で１分間に設定し、伸長は７２℃で２分間で行った。アニーリングの温度と時間は反応毎に可変としたが、これは、同時に行ういくつかの異なるＰＣＲに予想される要求に基づいて自由度があることを示すものである。
【０１２７】
アガロースゲルから単離された増幅したｃＤＮＡフラグメントをＡｆｌＩＩ  およびＢａｍＨＩ  により消化し、唯一のＡｆｌＩＩ  およびＢａｍＨＩ  部位でＴｒｐ  プロモーターおよびＴｒｐＡターミネーターを持つｐＳＴ８１１ベクター（図３、特開昭６３−２６９９８３  号）に連結挿入した。ｐＴＭＫ−ｈＧＩＦ  と称するこの新規なプラスミド（図４）をコンピテントＲＲ１大腸菌宿主細胞にトランスフォームした。アンピシリン耐性（ｐＳＴ８１１ベクターに存在するマーカー遺伝子）に基づいてプラスミド含有細胞を選択した。この合成オリゴヌクレオチドおよび全ヒトＧＩＦ遺伝子のＤＮＡ配列をプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２８】
マウスＧＩＦの細菌発現系をヒトＧＩＦと同じ手法により、ＢｌｕＳｃｒｉｐｔ  に挿入したマウスＧＩＦｃＤＮＡから構築した。ＰＣＲを用いてマウスＧＩＦｃＤＮＡの両末端にＡｆｌＩＩ  およびＢａｍＨＩ  部位を形成するためのプライマーは以下のとおりであった。
【０１２９】
【化７】
0003578787.tif 000016
【０１３０】
ｐＳＴ８１１ベクター中にマウスＧＩＦｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＴＭＫ−ｍＧＩＦと命名した。
または、ＡｆｌＩＩ  およびＢａｍＨＩ  による切除により、ヒトまたはマウスＧＩＦをコードする配列をｐＴＭＫ−ｈＧＩＦまたをｐＴＭＫ−ｍＧＩＦから回収し、モレキュラー  クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）に記載の手法を用いて、ＰＬ、ｌａｃ  、ｔａｃ  またはＯｍｐＦプロモーターを持つ所望の細菌ベクターに挿入することもできるであろう。これらの典型的な細菌ベクターを、当業界に公知の他のベクターと同様に、細菌宿主細胞にトランスフォームし、ＧＩＦを発現させることができるであろう。
【０１３１】
Ｂ．ＧＩＦを産生する大腸菌の培養
プラスミドｐＴＭＫ−ｈＧＩＦまたはｐＴＭＫ−ｍＧＩＦを含むＲＲ１大腸菌を５０μｌ／ｍｌのアンピシリンを含有する２０ｍｌのルリア培地で培養し、一晩３７℃で増殖させた。種培養物を０．８％グルコース、０．４％カザミノ酸、１０ｍｇ／ｌチアミンおよび５０ｍｇ／ｌアンピシリンから構成される１リットルのＭ９培地に無菌的に移し、３７℃で３時間培養した。この初期インキュベーションの最後に、４０ｍｇのインドールアクリル酸を添加し、培養物をさらに５時間３７℃でインキュベートした。
【０１３２】
実施例１０
大腸菌において発現された組換えＧＩＦ産物の精製
湿潤重量で約５ｇの回収した細胞を水に懸濁して３０ｍｌの体積にし、フレンチプレス（８０００ｐｓｉ  で４回繰り返した）で破壊した。上清および破壊した細胞のペレットを、１５０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離により分離した。この細胞ペレットを二回水で洗浄した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、このペレットのほとんどがヒトＧＩＦタンパク質であることが明らかになった。また、上清は可溶性ヒトＧＩＦタンパク質を含有していた。可溶性ＧＩＦの不溶性ＧＩＦに対する比は、約１：３であった。
【０１３３】
Ａ．可溶性ＧＩＦの精製
可溶性ＧＩＦ画分を一晩−８０℃で凍結させ、ゆっくりと室温に温めた。不溶性物質を１５０００×ｇで１５分間の遠心分離により除去した。この工程で、細菌の不純物のほとんどが除去できた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を添加して上清をｐＨ６．０に調整し、４℃で、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（５×１８ｃｍ）にかけた。このカラムを２ｍｌ／分の流速で２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、ＮａＣｌ段階勾配によりタンパク質を溶出した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で０．５ＭＮａＣｌによりＧＩＦを溶出した。ヒトＧＩＦの純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により見積もったところ、９５％以上の純度であった。
【０１３４】
Ｂ．不溶性ＧＩＦの精製および再生
６ＭのグアニジンＨＣｌおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．２ＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に、不溶性ヒトＧＩＦを含有するペレット画分を懸濁し、穏やかに攪拌しながら室温で３時間インキュベートして、ヒトＧＩＦを可溶化した。残っている不溶性物質を１５０００ｇで１５分間の遠心分離により除去した。
【０１３５】
可溶性ＧＩＦ画分を６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  Ｓｕｐｅｒ  Ｆｉｎｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（５×１００ｃｍ）にかけ、２ｍｌ／分の流速で室温で溶出した。ボイド容量が溶出した後、１０ｍｌの画分を回収し、ウェスタンブロット染色法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＧＩＦを分析した。ＹＭ５ミリポア限外濾過膜を用いて、約１２０ｍｌのＧＩＦ陽性画分を５ｍｌまで濃縮した。
【０１３６】
可溶化したＧＩＦの再生のために、室温で穏やかに攪拌しながら、試料をゆっくりと２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）２リットルに添加した。２４時間後、ＹＭ５膜を用いて混合物を１０倍に濃縮した。
残っている大腸菌不純物を除去するために、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＴＳＫ  ＤＥＡＥ−５ＰＷＤ（東ソー）カラム（７．５×７５ｍｍ）に試料をかけた。試料をカラムにかけた後、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌ／分の流速で室温にてカラム緩衝液中の０〜０．１ＭのＮａＣｌの勾配によりＧＩＦを溶出した。ウェスタンブロットで決定したＧＩＦ含有画分をＹＭ５膜を用いて濃縮した。ヒトＧＩＦの純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により見積もったところ、９５％以上の純度であった。組換えマウスＧＩＦを上記と同じ手法で精製した。
【０１３７】
実施例１１
組換えＧＩＦのアミノ酸配列決定および分析
Ａ．組換えヒトＧＩＦのアミノ酸配列
ＤＥＡＥカラムから得られた精製組換えヒトＧＩＦをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にブロットした。この膜をポンソーＳで染色し、ＧＩＦバンドをこの膜から切り出した。Ｓｈｉｍａｚｕ  ＰＳＱ−１  タンパク質シークエンサーを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。約６０％の組換えヒトＧＩＦがＮ末端に以下の１０個のアミノ酸を有していた。
【０１３８】
【化８】
0003578787.tif 000017
【０１３９】
この配列は、ヒトＧＩＦのｃＤＮＡ配列から演繹された配列と同一であった。約４０％のＧＩＦがＮ末端の１Ｍｅｔ残基を欠失していた。
【０１４０】
Ｂ．組換えマウスＧＩＦのアミノ酸分析
２４時間１１０℃で、減圧管中、０．２％のフェノールを含有する２回蒸留した５．７ＭのＨＣｌ中で、ＤＥＡＥカラムから得られた精製組換えマウスＧＩＦを加水分解した。この加水分解した試料を０．０２ＭのＨＣｌ中に懸濁し、そのアミノ酸組成を決定した（ＨＩＴＡＣＨＩ  ８３５Ｓ    アミノ酸分析機）  。これらの結果（表９）を分析すると、酸加水分解の際に起こる分解のために、Ｃｙｓ  、Ｔｈｒ  、Ｍｅｔ  およびＴｒｐ  残基の数は、ｃＤＮＡ配列から演繹される数よりも少ないことが一般に認識された。このようにＨｉｓ  残基の値が低いのは、ＮＨ３  からの分離が不十分であったことによる可能性がある。このアミノ酸組成分析において、Ｌｅｕ  のような内標準を既知の量で含有させておいたので、試料中のタンパク質を定量することができた。組換えマウスＧＩＦの２８０ｎｍにおける吸光係数は１．８９であった。
0003578787.tif 000018
【０１４１】
実施例１２
ＧＩＦに対するポリクローナル抗体の製造
フロインド不完全アジュバント中の１００μｇの同じＧＩＦ試料を、２〜３週間毎に３匹のウサギに皮下注射した。１１４日後に、このウサギの血清を回収し、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ．  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）でＩｇＧを精製した。約１５０ｍｇのＩｇＧが２５ｍｌの血清から得られた。この抗体はマウスＧＩＦおよびヒトＧＩＦを認識し、ウェスタンブロット法およびＧＩＦの精製に使用することができた。
【０１４２】
実施例１３
哺乳類細胞における組換えＧＩＦの発現
Ａ．直接発現用の哺乳類細胞発現系の構築
本実施例は、哺乳類細胞におけるヒトＧＩＦポリペプチドの発現に関するものである。ＥｃｏＲＩ  およびＸｈｏＩ部位でＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔに挿入したヒトＧＩＦｃＤＮＡを以下のオリゴヌクレオチドプライマーとともにアニールした。
【０１４３】
【化９】
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【０１４４】
各プライマーはＢｇｌＩＩ  またはＫｐｎＩ部位を含んでいた。ＰＣＲによりこのヒトＧＩＦｃＤＮＡを増幅し、アガロースゲルから単離し、ＢｇｌＩＩ  およびＫｐｎＩにより消化した。このフラグメントを、連結反応により、ＢｇｌＩＩ  部位およびこれに続くＰｓｔＩ部位を持つ改変ＳＲαベクター（Ｔａｋａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ８：４６６−４７２，  １９８８）に挿入した。ＳＲα−ｈＧＩＦ  （図５）と命名した、このプラスミドをコンピテントＤＨ５大腸菌細胞にトランスフォームした。ＳＲαベクター上に存在する  Ａｍｐｒ  遺伝子に基づいてプラスミドを含む細胞を選択した。プラスミドＤＮＡを培養細胞から単離し、全ヒトＧＩＦ遺伝子のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４５】
Ｂ．追加のシグナル配列を持つ哺乳類発現系の構築
ＤＮＡ構造の分析によると、ＧＩＦはシグナル配列を持たないようなので、ＧＩＦポリペプチドが、トランスフェクションされた細胞から構成分泌経路を通って分泌されるように、ＧＩＦにシグナル配列を導入するためにもう一つの発現系を構築した。ポリペプチドホルモン、成長因子および血漿タンパク質を含む、多くの分泌タンパク質が前駆体として合成され、翻訳後タンパク質分解プロセッシングを受けるが、翻訳後タンパク質分解プロセッシングはその分泌および生物学的活性の発現のためにしばしば要求されるものである。例えば、ヒトカルシトニンは大きな前駆体分子であるプロカルシトニンとして甲状腺の内分泌Ｃ細胞により合成される（Ｃｒａｉｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９５：３４５−３４７，  １９８２）  。プロカルシトニンは、Ｎ末端プロ領域、カルシトニン、およびＣ末端プロ領域から成るが、端部の二つ並んだ塩基性アミノ酸部位でタンパク質分解プロセッシングを受けて、カルシトニンペプチドを生成する（Ｂｕｒｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ３：１４０−１４７，  １９８９）。従って、プロカルシトニンは神経内分泌起源のタンパク質コンベルターゼにより切断されることが推測される（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６５：２９９７−３０００，  １９９０；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  ｏｆ  Ｓｃｉ．，  ８８：３４０−３４４，  １９９１）。さらに、ヒトプロカルシトニンのＮ末端プロ領域は−４位に追加のＡｒｇ  残基を有し、カルボキシ末端にＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ  の配列を有するが、この配列はプロセッシング酵素であるフリンにより認識されうる切断モチーフである（Ｆｕｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：４８２−４８６，  １９８９）。
【０１４６】
本実施例においては、ヒトＧＩＦｃＤＮＡをヒトカルシトニン前駆体のＮ末端プロ領域をコードする遺伝子の３’末端と読み枠内で融合させ、ＳＲαベクターに挿入した。また、ヒトフリンｃＤＮＡをクローニングし、ＳＲαベクターに挿入した。両方のベクターをＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）に同時トランスフェクションしたところ、成熟ヒトＧＩＦが分泌される結果となった。
【０１４７】
１．ｃＤＮＡのクローニング
ヒトカルシトニンｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、シグナルペプチドおよびヒトプロカルシトニン（ｐｒｏ−ＣＴ）  （Ｓｔｅｅｒｂｅｒｇｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２０７：９４，  １９８６）のＮ末端プロ領域をコードするｃＤＮＡフラグメントを増幅した。ｍＲＮＡをヒト甲状腺カルチノーマＴＴ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １８０３）から単離し、ＰＣＲの鋳型として使用したｃＤＮＡに逆転写した。
【０１４８】
以下に示すような、ＰｓｔＩ部位を持つオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ヒトカルシトニン前駆体遺伝子を増幅した。
【０１４９】
【化１０】
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【０１５０】
増幅した遺伝子をＰｓｔＩで消化したＳＲαベクターにクローニングした。ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔに挿入したヒトＧＩＦｃＤＮＡを以下に示すオリゴヌクレオチドプライマーとともにアニールした。
【０１５１】
【化１１】
0003578787.tif 000021
【０１５２】
上記のプライマーは、それぞれ、ＢｇｌＩＩ  部位とＫｐｎＩ部位を持っていた。増幅した遺伝子は、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ  の配列に続いてｈＧＩＦ配列をコードしている。この遺伝子をその後連結反応によりＢｇｌＩＩ  およびＫｐｎＩで消化したＳＲαに挿入したが、このＳＲαは上記したようなヒトカルシトニン前駆体遺伝子を有するものである。ＳＲα−ｈｃＧＩＦ（図６）と命名したこの新規なプラスミドをＤＨ５大腸菌細胞にトランスフォームした。プラスミドＤＮＡを培養細胞から単離し、全ヒトカルシトニン前駆体およびヒトＧＩＦ遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１５３】
ヒトフリンｃＤＮＡを同じＰＣＲ増幅法によりクローニングした。Ｐｏｌｙ（Ａ）  ＋  ｍＲＮＡをヒト膀胱カルチノーマ細胞系ＨＴ１３７６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４７２）  から単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ鋳型として使用した。ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  ＣＡ）を用いて、６個のオリゴヌクレオチドプライマー（以下に示すＦ１〜Ｆ６）を公表されているフリンｃＤＮＡ配列（Ｆｕｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：４８２，  １９８９）  に基づいて作製した。それぞれ、ヒトフリンＤＮＡの１〜９５１、９２２〜１６０４、および１５６５〜２３８５のコード化配列をカバーする、３個のｃＤＮＡフラグメントを対応するＰＣＲ生成物から精製した。２個のフラグメント間の２７ｂｐの重なりを利用して、アミノ末端タンパク質配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを隣接するｃＤＮＡフラグメントとともにアニールした。第１のフラグメントの５’末端と第２のフラグメントの３’末端に相当するプライマーを用いて、得られたｃＤＮＡ混合物を再アニールした。得られた１．６ＫｂのｃＤＮＡを、Ｂｓｐ  ＨＩ部位を通して残りのカルボキシル末端のフリンをコードする第３のｃＤＮＡフラグメントと連結した。全ｃＤＮＡ構築物をＴＡクローニングベクターｐＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）にサブクローニングした。ヒトフリンｃＤＮＡ配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅ  キット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  ＯＨ）を用いて決定した。制限部位マッピングおよび部分配列分析から、上記のクローニングしたｃＤＮＡは以前に報告されているヒトフリンと同一であることが明らかとなった。全長のヒトフリンを含むＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントを哺乳類発現ベクターｐＥＦｎｅｏにクローニングした。このｐＥＦｎｅｏは、改変したｐＥＦ−ＢＯＳ  にｎｅｏ−発現ユニットを挿入することにより作成したものである（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １８：５３２２，  １９９０）。
【０１５４】
ＰＣＲによるヒトフリンｃＤＮＡのクローニングに使用した６個の合成オリゴヌレオチドプライマーは以下の通りである。
【０１５５】
【化１２】
0003578787.tif 000022
【０１５６】
Ｆ１およびＦ２は、１〜９５１のフリンコード化配列を増幅するために使用し、Ｆ３およびＦ４は、９２２〜１６０４を増幅するために使用した。両ＰＣＲ産物とも、２７ｂｐの重なりを利用してアニールし、得られたｃＤＮＡ混合物をＦ１およびＦ４のプライマーを用いて再アーニルした。１．６Ｋｂの誘導されたｃＤＮＡを、ＢｓｐＨＩ  部位を通して、ヒトフリン遺伝子のフラグメント１５６５〜２３８５をコードするＦ５およびＦ６増幅ｃＤＮＡフラグメントと連結した。全フリンｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ  で消化したＳＲαベクターに挿入した。ＳＲα−ｈｆｕｒｉｎ  と命名したこの新規なプラスミドを、ＤＨ５大腸菌にトランスフォームした。プラスミドＤＮＡを培養細胞から単離し、合成オリゴヌクレオチドおよび全ヒトフリン遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１５７】
Ｃ．ＣＯＳ−１細胞におけるＧＩＦの発現
プラスミドＳＲα−ｈＧＩＦ  またはＳＲα−ｈｃＧＩＦとＳＲα−ｈｆｕｒｉｎ  をＣＯＳ−１  細胞にトランスフェクションした。１０％ハンクスＢＳＳ、２％ＦＣＳ、４０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン、１００μＭクロルキンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地に、１μｇ／ｍｌの濃度でプラスミドＤＮＡを添加した。この混合物を培養皿中のＣＯＳ−１  細胞の上にのせ、インキュベートした（５時間、３７℃、５％ＣＯ２）。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、一晩培養した（１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地中、３７℃）。再度洗浄した後、細胞を２０μｇ／ｍｌウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ）  、２０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）  、４０ｍＭモノエタノールアミン、０．１μＭ亜セレン酸ナトリウム、および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で１週間３７℃で培養した。対照として、挿入物を含まないベクターをＣＯＳ−１  細胞にトランスフェクションした。
【０１５８】
抗−マウスＧＩＦポリクローナル抗体を用いて、培養上清中のＧＩＦの量をウェスタンブロット法により見積もった。ＳＲα−ｈｃＧＩＦをトランスフェクションしたＣＯＳ−１  細胞由来の上清は成熟形態のＧＩＦを含むことが示された。カルシトニン−ＧＩＦとともに発現されたフリンは、ＧＩＦの分泌を可能にするカルシトニン前駆体配列を切断した。ＣＯＳ−１  細胞から分泌されたＧＩＦの量は、分泌されたカルシトニン前駆体−ＧＩＦの量に匹敵した。
【０１５９】
当業者は、ＳＲα−ｈＧＩＦ  またはＳＲα−ｈｃＧＩＦに匹敵する他の哺乳類発現ベクターを構築することができる。ヒトＧＩＦコード化配列をＳＲα−ｈＧＩＦ  またはＳＲα−ｈｃＧＩＦからＢｇｌＩＩ  およびＫｐｎＩによる切除により回収し、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２：１６１，  １７０，  １９８２）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ＵＳＡ，  ８４：３３６５−３３６９，  １９８７）およびｐＤＳＶＥ（Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏｓ．０２５，  ３４４および１５２．０４５）のような多くのベクターへの連結反応により挿入することができるであろう。これらのベクターを適当な宿主細胞、例えば、ＣＨＯ  、３Ｔ３  およびＢＨＫ  細胞にトランスフォームすることにより、ＧＩＦが発現するであろう。ＧＩＦの分泌を増加させるために、好ましいベクター系、シグナル配列を含むあるいは含まないＧＩＦｃＤＮＡ、および適当な宿主細胞を選択することは型通りの作業であろう。
【０１６０】
Ｄ．フリンｃＤＮＡと同時トランスフェクションせずに組換え切出しペプチドを分泌させるためのユニークな融合発現ベクターの構築
フリンは多くの組織の中で発現しており、多くはゴルジ領域に存在する（ブレスナーム（Ｂｒｅｓｎａｈａｍ，Ｐ．Ａ）等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２８５１，１９９０；ミツイ（Ｍｉｔｕｉ，Ｙ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６９５４，１９９１）が、このことはフリン若しくはフリン様酵素は構成分泌経路を通じての成熟タンパクの分泌に対するプロタンパク質の切断に関与することを示すものである。ＣＯＳ細胞中のフリン様酵素の存在は、スメーケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ，８９：８８２２，１９９２）によって予測されていた。従って、ＣＯＳ細胞中のフリン様酵素は、前記酵素に対する適切な切断モチーフが使用されれば、成熟ペプチドの分泌に対する組換え融合タンパク質のプロセッシングに利用することができる。
【０１６１】
Ｆｃ  ｃＤＮＡは、効率的なタンパク質分解切断部位を設計する試験目的で利用した。ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントはシグナルペプチドを持たず、またこのＦｃフラグメントをコードするｃＤＮＡフラグメントは翻訳開始コドンＡＴＧを有さず、該タンパク質は通常ほ乳類細胞へのｃＤＮＡのトランスフェクションによって発現されない。ｐｒｏ−ＣＴをＦｃフラグメントの担体ペプチドとして使用し、ＣＯＳ−１細胞中に推定されるフリン様酵素によって認識される適当な切断モチーフを形成するように、ｐｒｏ−ＣＴのカルボキシル末端のアミノ酸配列を改変した。プロセッシング酵素の切断モチーフについての予め得られている情報に基づき、異なった４種のアミノ酸配列をｐｒｏ−ＣＴ中に導入した。ｐｒｏ−ＣＴをコードするｃＤＮＡはヒトカルシトニンｃＤＮＡを鋳型として用い、表１０に挙げる様な一つの５’末端プライマー（ＣＴ１）及び異なる四種の３’末端プライマー（ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、及びＣＴ５）を使用するＰＣＲによって増幅した。異なった位置に数種の塩基残基を導入する事によって、プライマーＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、及びＣＴ５を改変し、ＣＯＳ−１細胞の推定されるエンドプロテアーゼによるプロセッシング効率に対するこのような変化の効果を検討した。
表１０
ヒトｐｒｏ−ＣＴのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
【０１６２】
【化１３】
0003578787.tif 000023
【０１６３】
破線による矢印は５’から３’方向の合成プライマーを示すものである。
ＣＴ１はｐｒｏ−ＣＴのアミノ末端をコードし、その他の四種のプライマーはｐｒｏ−ＣＴのカルボキシル末端をコードするものである。平線の矢印はエンドプロテアーゼによる切断部位を示すものである。ＣＴ２−ＣＴ５中のヌクレオチド配列、ＡＧＡＴＣＴＡＧＡはＢｇｌ  ＩＩ及びＸｂａｌにより認識される。
【０１６４】
プラスミドを構築するために、ＥｃｏＲＩ制限部位をＣＴ１中に導入し、Ｂｇｌ  ＩＩプラスＸｂａ  Ｉ制限部位をその他の４種のプライマー中に導入した。対応する４種のｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡフラグメントを作成した後、それらをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ  （＋）  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ及びＸｂａ１部位にサブクローニングした。Ｎｏｔ  Ｉはこのプラスミドベクター上でＸｂａ  Ｉの後ろの近接する制限部位となるために、前記のｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ及びＮｏｔ  Ｉによって切除された。次に、突然変異させた３’末端を有する４種の異なったｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡの各々を、キメラレトロウイルスプロモーターであるＳＲα（タカベ（Ｔａｋａｂｅ）等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：４６６，１９８８）を有する、ほ乳類発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ中に挿入した。この新規なプラスミドベクターをｐＭＥｐｒｏ−ＣＴ（図７）と命名した。このベクターはｉ）ＳＶ４０プロモータープラスこのレトロウイルスの長い末端繰り返しのＲ領域と融合したキメラプロモーターＳＲα、ｉｉ）ｐｒｏ−ＣＴ、及びｉｉｉ）ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）付加シグナルからなる。目的とする外来遺伝子の挿入のために、ｐｒｏ−ＣＴのカルボキシル末端タンパク質分解切断部位に続いて、ＢｇＩ  ＩＩ、Ｘｂａ  Ｉ、及びＮｏｔ  Ｉの多重クローニングサイトを含ませた。ＢｇＩ  ＩＩ及びＸｂａ  Ｉにより認識されるヌクレオチド配列（ＡＧＡＴＣＴＡＧＡ）は読み枠中のＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ残基をコードする。従って、この枠に従って外来ｃＤＮＡを導入し、ｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡと融合させることができる。
【０１６５】
Ｇ１及びＧ２の２種の２８ヌクレオチドプライマーを用い、ヒト白血病細胞系ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６２１）に由来するｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ増幅法によって、ヒトＩｇＧのＦｃ  ｃＤＮＡ  を得た。５’末端プライマーＧ１（５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ−３’）及び３’末端プライマーＧ２（５’−ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧ−３’）はそれぞれ下線を付したＸｂａ  Ｉ部位及びＮｏｔ  １部位を含む。このようにして得られたＦｃ  ｃＤＮＡをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）のＸｂａ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉ部位にサブクローニングした。このｃＤＮＡフラグメントをＡＢＩ２７０Ａ配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を使用して配列決定した。このＦｃ  ｃＤＮＡはヒンジ領域での３個のＣｙｓ残基の一番目のものの後に位置するＡｓｐ残基で始まる配列をコードしていた（エリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０，４０７１，１９８２  ）。前記のｃＤＮＡをｐｒｏ−ＣＴ領域後の読み枠内でｐＭＥｐｒｏ−ＣＴ中に挿入した。
【０１６６】
１．キメラタンパク質の分泌と切断
ｐｒｏ−ＣＴ領域とＦｃフラグメントを含む融合タンパク質がプラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞から分泌形態で産生されているか調べるために、２つ並んだ塩基性アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基だけでｐｒｏ−ＣＴをコードするｃＤＮＡを含むキメラプラスミドを使用した。抗−ヒトＩｇＧでトランスフェクションされた細胞の培養上清の免疫ブロット分析は、融合タンパク質が主に非還元条件下で分子量約６６ｋＤａ及び還元条件下で３７ｋＤａの分子量で検出されることを示した。ｐＭＥｐｒｏ−ＣＴのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションされた細胞の培養上清の同様な免疫ブロット分析によっても、抗−ＩｇＧ  ＣＴとの反応性を有するタンパク質が産生されていないことが確認された。
【０１６７】
非還元形態の主要タンパクの分子サイズが還元形態で見いだされるものの約２倍であるという知見に基づき、融合タンパク質が２量体タンパク質として合成されているに違いなと仮定した。ｐｒｏ−ＣＴ領域においてＣｙｓ残基が全く存在しないことから、前記の２量体はＦｃフラグメントのヒンジ領域におけるＣｙｓ残基間で形成されるジスルフィド結合に由来する可能性がある。それにも関わらず、前記タンパク質の分子サイズ（２量体として６６ｋＤａ、及び単量体として３７ｋＤａ）は、該タンパク質が成熟Ｆｃフラグメントではなく、ｐｒｏ−ＣＴ及びＦｃフラグメントから成る融合タンパク質を現すものであることを示している。
【０１６８】
プロセッシング効率は、異なった切断モチーフを有するキメラｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションすることにより決定される。免疫ブロット分析によれば、適切なタンパク質分解切断によって放出された前記のＦｃフラグメントは、キメラプラスミドが切断部位において２つ並んだ塩基性アミノ酸Ｌｙｓ−Ａｒｇモチーフをコードするｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡを含む場合には、検出できないと言うことが示された。抗−ＩｇＧ  ＣＴ抗体と反応した分泌タンパク質のすべてが還元条件下で３７ｋＤａの融合タンパク質であった。融合タンパク質が、Ｌｙｓ−Ａｒｇモチーフの他、Ｐ６位にＡｒｇ残基を有する場合にも、同様の結果が得られた。融合タンパク質が、Ｌｙｓ−Ａｒｇモチーフの他、Ｐ４位にＡｒｇ残基を有する場合には、ＦｃフラグメントがトランスフェクションされたＣＯＳ−１上清中で検出された。しかしながら、成熟Ｆｃフラグメントは抗−ＩｇＧに反応する分泌タンパク質のうちごくわずかな画分にすぎない。対照的に、ｐｒｏ−ＣＴのカルボキシル末端のＰ４及びＰ６位の両方にＡｒｇ残基を有する融合タンパク質は最も効率的にプロセッシングされて、成熟Ｆｃフラグメントを分泌した。ＣＯＳ細胞が切断モチーフのＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する融合タンパク質の形成のためのキメラプラスミドとともにトランスフェクションされた場合には、極わずかの量の担体タンパク質と大量の担体タンパク質、及び大量の成熟Ｆｃフラグメントが上清中に検出された。この結果は、ＣＯＳ細胞がＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列を認識するプロセッシング酵素を有していることを示すものである。
【０１６９】
２．  生物活性な組換えＧＩＦの発現のためのｐＭＥｐｒｏ−ＣＴプラスミドの応用
Ｆｃフラグメントの分泌のための上述した実験は、ＣＯＳ細胞での推定されるフリン様酵素の切断モチーフがＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇであることを示すことから、この配列を生物活性な組換ＧＩＦの形成のために使用した。Ｐｒｏ−Ｃｔ  ｃＤＮＡを、ＣＴ１及びＣＴ４プライマー（表１０参照）を使用してＰＣＲによって増幅し、その増幅したｃＤＮＡをＰＭＥ−ｐｒｏ−ＣＴプラスミド中に挿入した。ヒトＧＩＦ  ｃＤＮＡを、ＳＲαｈｃＧＩＦについて前述した方法によって、前記のプラスミド中に導入し、ｐｒｏ−ＣＴ  ｃＤＮＡと融合させた。ＣＯＳ細胞中へのプラスミドのトランスフェクションによって１３ｋＤａのＧＩＦが分泌された。
【０１７０】
実施例１４
哺乳類細胞において発現された組変えＧＩＦ産物の精製
アフィニテイー精製のために、モノクローナル抗−ヒトＧＩＦ、３８８Ｆ１（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：７２９，１９９２）若しくは組変えマウスＧＩＦに対するポリクローナルラビット抗体のどちらかを、製造業者によって推奨された手法に従ってＡｆｆｉｇｅｌ１０（Ｂｉｏｒａｄ）若しくはＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。モノクローナル抗体（２ー３ｍｇ）若しくはポリクローナル抗血清のγグロブリン画分（８ー１２ｍｇ）を１ｍｌのゲルに結合させた。
【０１７１】
免疫吸着剤上の培養上清の分画は４℃でおこなった。ＣＯＳ−１細胞の培養上清を、限外濾過によって１０ー２０倍に濃縮し、該濃縮上清の１０−１５容量を１容量の免疫吸着剤カラムに一晩通した。濃縮物質の容量が限られる場合には、２−４容量の上清を１容量の免疫吸着剤と一晩混合し、該懸濁液をカラムに充填した。前記のカラムを、７−１０カラム容のＰＢＳによって洗浄し、カラム中に保持されたタンパク質を、３−４カラム容の０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ３．０を用いて溶出させた。トリス緩衝液でｐＨを７−８に調節した後、前記の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＧＩＦを銀染色法若しくはポリクローナル抗ー組換えＧＩＦを用いるウェスタンブロットによって検出した。洗浄画分及び酸溶出画分をバイオアッセイ用のＲＰＭＩ１６４０媒地に対して透析した。酸で溶出させた画分中の１３ｋＤａタンパク質の純度は９０％以上であった。
【０１７２】
また、哺乳類細胞由来ＧＩＦを、慣用のカラムクロマトグラフィーによって精製した。本実施例では、１００ｍｌのＣＯＳ−１上清を１０倍に濃縮し、ＰＢＳで平衡化したＴＳＫ  Ｇ２０００ＳＷ（東ソー）カラム（２１．５ｘ６００ｍｍ）にかけた。前記のカラムを、３ｍｌ／分の流速で室温にて使用した。ポリクローナル抗ＧＩＦ抗体を用いるウェスタンブロット法により測定したところ、ＧＩＦは低分子量と見積もられた画分に溶出した。ＧＩＦ含有画分を溜め、限外濾過により濃縮し、２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化したＴＳＫ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー）カラムにかけた。流速０．５ｍｌ／  分で室温にてこのカラムに通した。添加した後、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、ＧＩＦをこの洗浄段階で回収した。大腸菌誘導ＧＩＦとＣＯＳ−１  由来ＧＩＦとのＤＥＡＥに対する結合能力の差異は、Ｏ結合グリコシル化または燐酸化の存在により説明できる。
【０１７３】
Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４逆相カラム（Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）（４．  ６×１５０ｍｍ）を用いて、ＧＩＦのさらなる精製を行った。ＤＥＡＥカラムからのＧＩＦ画分（１０ｍｌ）をＣ４カラムにかけ、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、流速０．４ｍｌ／分で室温にてカラム緩衝液中の０〜９０％エタノールの勾配によりＧＩＦ精製した。ＧＩＦは、５０〜６０％エタノールを含有する画分に溶出し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびポリクローナル抗−ＧＩＦ抗体を用いるウェスタンブロット法により同定した。
【０１７４】
実施例１５
組換えＧＩＦの生物学的活性
Ａ．組換えＧＩＦのＧＩＦ活性の評価
マウスＴ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換する試験試料の能力により、組換えヒトＧＩＦのグリコシル化阻害活性を評価した（Ｉｗａｔａ  およびＩｓｈｕｚａｋａ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４１：３２７０，  １９８８）  。このアッセイにおいて、１２Ｈ５細胞を２４時間１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＥとともに試験試料の存在下あるいは非存在下で培養した。培養上清をＣＦ５０Ａ膜を通して濾過してＩｇＥを除去した。濾液をレンチルレシチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  カラムにかけ、このカラムを２カラム容のＤＰＢＳで洗浄した。このカラムに保持されたタンパク質を０．２Ｍのαメチルマンノシドで溶出した。洗浄液と合わせた通過画分および溶出画分を各々２日間ＤＰＢＳに対して透析し、これらの画分を濃縮した。前に記載した手法（Ｙｏｄｏｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２４：４２５，  １９８０）により、ＩｇＥでコーティングした固定化ウシ赤血球によるＦｃεＲ＋Ｂ細胞のロゼット形成を阻止する画分の能力により、これらの画分におけるＩｇＥ−ＢＦの存在を評価した。線虫Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに感染したラットの腸間膜リンパ節細胞をＦｃεＲ＋細胞の供給源として採用した。１２Ｈ５細胞をマウスＩｇＥのみとともに培養した場合、その細胞により産生されたほとんどすべてのＩｇＥ−ＢＦがレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  と結合し、αメチルマンノシドによる溶出により回収された。従って、流出／溶出画分間のロゼット形成阻止パーセントの比は、０．２よりも小さかった。十分な量のＧＩＦを１２Ｈ５細胞の培養物にマウスＩｇＥとともに添加すると、この細胞により生成されるＩｇＥ−ＢＦの大部分はレンチルレシチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に保持されず、溶出画分に回収された。従って、流出／溶出画分間のロゼット形成阻止パーセントの比が２．０以上であるならば、試験試料中のＧＩＦは（＋）とされた。
【０１７５】
プラスミドＳＲα−ｈｃＧＩＦおよびＳＲα−ｆｕｒｉｎにより同時トランスフェクションしたＣＯＳ−１  細胞の培養上清は、１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換する能力を有している。階段希釈の２０倍濃縮した培養上清のＧＩＦ活性を上記の方法により評価したところ、その活性は１：１００の希釈で検出された。濃縮した上清の４ｍｌアリコートを２ｍｌの３８８Ｆ１（モノクローナル抗−ＧＩＦ）−結合  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で分画し、ほとんどすべての活性（＞７５％）を酸溶出画分中に回収した。その画分において、１３ｋＤａのペプチドだけが検出された。ウェスタンブロットにより、このタンパク質をＧＩＦと同定した。通過および酸溶出画分のＧＩＦ生物活性の力価測定により、前画分の活性は溶出画分中に回収されたそれの１／１０より小さいことが示された。ＧＩＦ活性の検出のための溶出画分の最大希釈におけるこの１３ｋＤａのタンパク質の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌであった。
【０１７６】
３８８Ｆ１Ａｆｆｉｇｅｌからの酸溶出画分を、さらにポリクローナル抗−組換えｍＧＩＦのγグロブリン画分と結合したＡｆｆｉｇｅｌ  上で分画した。すべてのＧＩＦ生物活性およびその画分における１３ｋＤａのペプチドは免疫吸着剤に結合し、酸溶出画分中に回収された。階段希釈の大腸菌由来γＧＩＦを対照として比較することにより、この画分におけるこの１３ｋＤａのぺプチドの濃度を見積もった。ＧＩＦ生物活性の検出に要求されるこのタンパク質の最小濃度は５ｎｇ／ｍｌであった。その結果をまとめると、活性な組換えｈＧＩＦは、モノクローナル抗−ヒトＧＩＦおよび組換えＧＩＦ（１３ｋＤａタンパク質）に対するポリクローナル抗体の両者に結合し、酸溶出により回収されたことが示された。
【０１７７】
モノクローナル抗リポモジュリン１４１−Ｂ９と結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  上で同じ培養上清を分画した。またもや、免疫吸着剤からの酸溶出画分はＧＩＦ活性を有していた。
ｐＭＥ  ｐｒｏ−ＣＴ−ｈＧＩＦ  プラスミド（実施例１３、Ｄ２）によるＣＯＳ−１  細胞のトランスフェクションにより、ヒトＧＩＦが得られたので、このトランスフェクションされたＣＯＳ  細胞の培養上清を３８８Ｆ１  ａｆｆｉｇｅｌ  上で分画し、酸溶出により回収された１３ｋＤａのペプチドのＧＩＦ生物学的活性を評価した。この方法により得られた１３ｋＤａのペプチド１０〜２０ｎｇ／ｍｌはＧＩＦ活性の検出に十分であった。この結果は、実施例１３Ｄに記載の手法が、生物活性の高いＧＩＦを生成するための有効な方法であることを示していた。
【０１７８】
組換えｈＧＩＦの生物活性がハイブリドーマ由来ＧＩＦのそれに匹敵するかどうか測定するために、ＧＩＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ３１Ｅ９をＤＭＥＭ中に培養し、ポリクローナル抗ｒＧＩＦ抗体と結合した免疫吸着剤を用いて培養上清中のＧＩＦを精製した。酸溶出画分中の１３ｋＤａのＧＩＦの濃度をウェスタンブロットにより見積もり、１２Ｈ５細胞を用いてこの画分のＧＩＦ活性を力価測定した。その結果により、５〜１４ｎｇ／ｍｌの１３ｋＤａペプチドは１２Ｈ５細胞を非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生に変換するのに十分であることが示された。従って、ＩｇＥ−ＢＦのグリコシル化を変換する能力に関して、組換えＧＩＦはハイブリドーマ由来ＧＩＦに匹敵するようである。また、この実験は、ハイブリドーマ由来ＧＩＦは組換えＧＩＦに対する抗体と反応したことを示している。
【０１７９】
前の実験は、マウスハイブリドーマ由来ＧＩＦの生物活性はアルカリ性ホスファターゼでの処理（Ｏｈｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｍａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １：４２５，  １９８９）により３〜１０倍に増加したことを示していたので、組換えｈＧＩＦの生物学的活性に対するこの影響を調べることにした。３８８Ｆ１−Ａｆｆｉｇｅｌ  からのアフィニテイ精製したｒＧＩＦにウシ血清アルブミンを２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、０．１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）に対して透析した。調製物の半分を十分な不溶性アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）  と混合し、酵素濃度を５単位／ｍｌとし、この懸濁液を穏やかに２時間室温にて攪拌した。この時間の後、この酵素を遠心分離により除去し、ＲＰＭＩ  １６４０培地に対して透析し、アルカリ性ホスファターゼ処理および非処理試料におけるＧＩＦ活性を評価した。これらの検討により、１：３０の希釈で非処理組換えＧＩＦは１２Ｈ５細胞を非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生に変換するが、１：６０の希釈では変換しないのに対し、アルカリ性ホスファターゼ処理試料におけるＧＩＦ活性は１：２００の希釈でも検出可能であることが示された。
【０１８０】
大腸菌の形質転換により得られた、あるいはプラスミドＳＲα−ｈＧＩＦ  によるＣＯＳ−１  細胞のトランスフェクションにより得られた組換えＧＩＦ調製物の生物活性を比較した。大腸菌の可溶性画分からの生成ＧＩＦ（実施例１０Ａを参照）を３８８Ｆ１−Ａｆｆｉｇｅｌ  またはポリクローナル抗−ＧＩＦ−結合ａｆｆｉｇｅｌ  上でさらに分画し、酸性ｐＨでの溶出により回収した。
【０１８１】
これらの調製物はすべて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１３ｋＤａの単一のバンドを与えた。この１３ｋＤａのＧＩＦの濃度を銀染色法により見積もり、１２Ｈ５細胞を用いて、アフィニテイ精製したＧＩＦのＧＩＦ生物活性を力価測定した。その結果は、１００〜２００ｎｇ／ｍｌのＧＩＦが、この細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの産生へ変換するのに要求されることを示した。プラスミドＳＲα−ｈＧＩＦ  でトランスフェクションされたＣＯＳ−１  細胞の培養上清からのＧＩＦを３８８Ｆ１−Ａｆｆｉｇｅｌ  を用いて精製し、ＧＩＦ活性を評価した。１２Ｈ５細胞を変換するための１３ｋＤａのＧＩＦの最小濃度は約１５０ｎｇ／ｍｌであった（表１１）。
0003578787.tif 000024
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積もった、各調製物における１３ｋＤａのＧＩＦタンパク質の濃度
ｂ）調製物のＧＩＦ活性は１２Ｈ５細胞を用いて力価測定した。
ｃ）１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ産生に変換するのに要求される１３ｋＤａのＧＩＦの最小濃度
【０１８２】
Ｂ．    マクロファージ遊走阻止活性の欠如
ｃＤＮＡヌクレオチド配列中のＧＩＦとＭＩＦとの相同性（Ｗｅｉｓｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  上掲書，  １９８９）  のため、ＧＩＦをＭＩＦ活性について試験した。ヒトＭＩＦは、ヒト単球並びにモルモット及びマウスのマクロファージの遊走を抑制するため、組換え体ｈＧＩＦの活性を、マウスマクロファージを用いて測定した。無菌鉱物油３ｍｌを正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、３日後に腹腔浸出細胞を回収した。単核細胞を、遠心分離によりＦＣＳ層を通して回収し、約５×１０７  の単核細胞を含む細胞ペレットを、１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中の予め温めた０．３５％アガロース５０μｌに懸濁した。この懸濁液の小滴１μｌを、平底９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルの中央に分布させ、これを氷上に５分間保持した。このウェルに、１５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭを試料と共に加え、全容量１００μｌで試験されるようにした。一つの試験試料を、三重又は四重に評価した。各小滴の直径を、倒立顕微鏡の下で測定した。２０ないし２４時間のインキュベーションの後、遊走する細胞の外側の領域の直径を測定し、遊走指数を計算した。遊走の阻止率は、下記の式により計算した。
遊走阻止率＝（１−試験試料の遊走指数／試料なしの遊走指数）×１００
ｒｈＧＩＦのＭＩＦ活性を、正の対照としてマウスγ−インターフェロンを用いて評価した。ＳＲα−ｈｃＧＩＦ及びＳＲα−ｈｆｕｒｉｎによるＣＯＳ−１細胞の同時トランスフェクションにより組換えｈＧＩＦの階段希釈物を得、上記のように３８８Ｆ１−ａｆｆｉｇｅｌを用いてアフィニティ精製した。該調製物のＧＩＦ力価は１：１００であったが、最終希釈度１：８又は１：４で、マクロファージ遊走の有為な阻止は検出されなかった。同じ実験において、１単位／ｍｌのＩＦＮγは、マクロファージの遊走を２０ないし４８％阻止した。
【０１８３】
これらの結果を、寒天小滴中のヒトの単球（Ｒｅｍｏｌｄ，  Ｈ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｄｌｓ  Ａ．Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１６：  ３７９，  １９８５）  を用い、ヒトＭＩＦを正の対照として用いて確認した。組換えｈＧＩＦは、１：１００の希釈度で、１２Ｈ５細胞を、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦを形成するように切り替えることができ、約０．８μｇ／ｍｌの１３ｋＤａ  ＧＩＦペプチドを含んでいたが、最終希釈度１：５でヒトの単球の遊走を阻止することはできなかった。これらの結果は、ｒｈＧＩＦが生物学的活性において、ＭＩＦとは異なることを示している。
【０１８４】
実施例１６
組換えｈｃＧＩＦによる抗原特異的サプレッサーＴ細胞のインビトロ生成
前の実験は、ラット−マウスＴ細胞ハイブリドーマ２３Ａ４細胞由来のＧＩＦが、抗原感作脾臓細胞  （Ｉｗａｔａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｚａｋａ，  Ｋ．；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：  ３２７０，  １９８８）からの抗原特異的サプレッサーＴ細胞の生成を促進することを示した。ＢＤＦ１  マウスが、アルム吸収オボアルブミンにより、ＩｇＥ抗体応答について免疫されると、その脾臓細胞は、抗原刺激に際して、グリコシル化増強因子（ＧＥＦ）を構造的に分泌し、ＩｇＥ強化因子（グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ）及び抗原結合ＧＥＦの両方を産生する。抗原感作脾臓細胞がオボアルブミンにより刺激され、抗原で刺激されたＴ細胞がＧＩＦの存在下でＩＬ−２により増殖すると、細胞はＧＩＦを分泌する。抗原刺激により、これらの細胞が非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦ及び抗原結合ＧＩＦを産生し、後者は、担体に特異的な方法で、同系マウスのＤＮＰ−ＯＶＡに対する抗体応答を抑制する。この現象をさらに完全に探究するために、組換えｈｃＧＩＦが、インビトロでＧＩＦ産生Ｔ細胞を生成する能力を有しうるか否かを調べることにした。
【０１８５】
ＢＤＦ１  マウスを、水酸化アルミニウムゲルに吸着させたオボアルブミン１μｇを用いて、ＩｇＥ抗体応答のために感作した。免疫感作から２週間後に、脾臓細胞を得、懸濁液（５×１０６  細胞／ｍｌ）を１０μｇ／ｍｌのＯＶＡと共に３日間培養して、抗原感作Ｔ細胞を活性化した。その後、抗原活性化細胞（２．５×１０５  細胞／ｍｌ）のアリコートを、組換えマウスＩＬ−２（５０単位／ｍｌ）を用い、ｒｈｃＧＩＦ（０．２５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で増殖させた。４日間培養した後、細胞を回収し、３回洗浄し、新鮮な培地に１．５×１０６  細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＧＩＦ（＋）又はＧＩＦ（−）培養物から回収された細胞懸濁液４ｍｌを、ｌａｂ  及びｌａｄ  の両方を有する８×１０５  個のＯＶＡ添加ＬＢ２７．４細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション，ロックビル，ＭＤ）とともに２４時間インキュベートした。抗原刺激Ｔ細胞の培養上清液を、ＩｇＥ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸収させ、ＩｇＥ−ＢＦを酸溶出により，  免疫吸着剤から回収した。その後、ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの通過画分を、ＯＶＡ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  上で分画し、グリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ３．０で溶出することにより、ＯＶＡ結合因子を回収した。ＩｇＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの溶出物（即ち、ＩｇＥ−ＢＦ）を、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  上で分画し、これらの因子の性質を調べた。表１２に示された結果は、ＩＬ−２単独で増殖されたＴ細胞からのＩｇＥ−ＢＦの大部分が、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合し、α−メチルマンノシドで溶出することにより回収されたことを示す。これとは対照的に、ｈｃＧＩＦの存在下でＩＬ−２により増殖されたＴ細胞は、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦを生成し、これは、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  上に保持されなかった。
【０１８６】
ＧＥＦ又はＧＩＦ活性とＯＶＡ結合因子との関係も評価した。抗原刺激により、ＩＬ−２単独で増殖されたＴ細胞はＯＶＡ結合ＧＥＦを生成するのに対し、組換えＧＩＦの存在下で増殖されたＴ細胞はＯＶＡ結合ＧＩＦを生成した（表１２）。そのようなＴ細胞由来のＯＶＡ結合ＧＩＦが、抗原（担体）に特異的な様式（Ｉｗａｔａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｚａｋａ，  Ｋ．；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８８）  で、ＢＤＦ１  マウスの抗体応答を抑制することが示された。従って、組換えＧＩＦは、抗原特異性サプレッサーＴ細胞因子を産生するサプレッサーＴ細胞の生成を促進した。
0003578787.tif 000025
ａ  抗原刺激Ｔ細胞を、組換えｈｃＧＩＦの存在下又は非存在下で、ＩＬ−２により増殖させた。
ｂ  ＩＬ−２により増殖されたＴ細胞を、抗原刺激ＬＢ２７．４細胞で刺激した。上清中のＩｇＥ−ＢＦを、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  上で分画した。数字は、各々レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／溶出画分によるロゼット阻害率示す。
ｃ  各々１２Ｈ５細胞及び２３Ａ４細胞を用いて、ＯＶＡ−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分のＧＩＦ及びＧＥＦ活性を評価した。
【０１８７】
実施例１７
組換えＧＩＦのインビボ活性
組換えＧＩＦのインビボ活性
前の実験は、ＧＩＦ産生ハイブリドーマの培養濾液のＧＩＦに富む画分を、免疫したマウスに、初回免疫の日から始めて繰り返して注入することにより、ＩｇＥ及びＩｇＧ抗体応答のいずれもが抑制されることを示した（Ａｋａｓａｋｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：  ３１７２，  １９８６）。組換えＧＩＦが同じインビボ効果を有するか否かを調べるために、大腸菌で発現させたｒｈＧＩＦ（実施例１０Ａ）及びＣＯＳ−１細胞で発現させたｒｈＧＩＦ（実施例１３Ａ）を、実施例１０及び１４に記載した方法により均質になるまで精製し、ＩｇＥ及びＩｇＧ１抗体応答を抑制する能力について評価した。ＢＤＦ１  マウスを、２ｍｇのアルムに吸着させた０．２μｇＤＮＰ−ＯＶＡを腹腔内に注射することにより免疫感作した。組換えＧＩＦを、０  、２  、４  、６  、８  、１０及び１２日目に腹腔内に注射し、血清中の抗ＤＮＰ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１８８】
第一の実験においては、ＰＢＳ中の大腸菌由来ｒＧＩＦを、１８μｇ／投与の用量で投与し、対照マウスにはＰＢＳのみを投与した。グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成から、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成へ１２Ｈ５細胞を切り替えするためのｒＧＩＦの最小濃度は約１μｇ／ｍｌであった。対照マウス及びＧＩＦ処理マウスの両方において、ＩｇＥ抗体力価は、２週間で最大になり、その後下降したが、ＩｇＧ１抗ＤＮＰ抗体力価は、免疫感作の後、４ないし５週間増加し続けた。従って、２週間目におけるＩｇＥ抗体力価及び４週間目におけるＩｇＧ１抗体力価をＧＩＦ処理群と未処理群との比較のために使用した。
0003578787.tif 000026
第二の実験においては、ＳＲα−ｈｃＧＩＦベクターを用いて発現させたＣＯＳ−１由来ｒｈＧＩＦを、２．５μｇ／注射の用量で腹腔内投与した。１２Ｈ５細胞の非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成への変換のためのｈＧＩＦの最小濃度は０．２μｇ／ｍｌであった。対照マウスにはＰＢＳのみを投与した。結果を下記に示す。
0003578787.tif 000027
ＧＩＦに対して副作用を示す動物はなかった。実施例はＧＩＦの免疫抑制効果を示す。
【０１８９】
実施例１８
抗原特異的グリコシル化抑制因子に対するモノクローナル抗体の生産
Ａ．材料及び方法
１．抗原及び抗体：
凍結乾燥したハチ毒ホスホリパーゼＡ２  （ＰＬＡ２  ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから得た。結晶オボアルブミン（ＯＶＡ）はオハイオ州クリーブランドのＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．  から得た。ＰＬＡ２  分子中のアミノ酸残基１３ないし２８に相当する合成ペプチド、及びアミノ酸残基２５ないし４０に相当する合成ペプチドは、Ｈｏｗａｒｄ  Ｇｒｅｙ  博士（  カリフォルニア州，  Ｌａ  ＪｏｌｌａのＣｙｔｅｌ  Ｃｏｒｐ．）により提供された。ＰＬＡ２  分子中のアミノ酸１９ないし３５に相当するペプチドは、日本の前橋市のキリン医薬研究所により合成された。これらの合成ペプチドの全ては、ＨＰＬＣにより精製され、そのアミノ酸配列が確認された。
モノクローナル抗ヒトＧＩＦ抗体，３８８Ｆ１  （ＡＴＣＣ  ＨＢ  １０４７２）は実施例５に記載した。
【０１９０】
２．  細胞系：
実施例３に記載したヒトＴ細胞ハイブリドーマＡＣ５細胞は、ＣＤ３及びＴＣＲαβの両方を発現し、構成的にＧＩＦを分泌する。これらの細胞を、１０％ＦＣＳ，１０％ＮＣＴＣ  １３５培地（Ｇｉｂｃｏ，  Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ），  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液，０．２ｕ／ｍｌウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ），５０μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１５０μｇ／ｍｌオキザロ酢酸及び抗生物質を加えた高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。
【０１９１】
抗ヒトＧＩＦを産生するＢ細胞ハイブリドーマは、アフィニティー精製した抗原結合ＧＩＦ（下記参照）により免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）  の脾臓細胞から構築した。最後の追加免疫感作から１週間目に、脾臓細胞を、Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３２：  １２８６，  １９８４    に記載された手法により、ヒポキサンチンホスホリボトランスフェラーゼ欠損Ｓｐ２／０  ＡＧ１４細胞（Ｓｃｈｕｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７１：  ２６９，  １９７８）  と融合した。このハイブリドーマのサブクローニングは限界希釈により行った。このハイブリドーマを、上記の完全ＤＭＥＭ培地中に維持した。
【０１９２】
３．ＧＩＦの分画及び精製
無血清培地中の未刺激ＡＣ５細胞の培養液上清中の非特異性ＧＩＦを、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムのクロマトグラフィーにより純化した。培養上清を、２０〜１００倍に濃縮し、蒸留水で３倍に希釈し、トリスでｐＨ８．０に調整し、その後、５０ｍＭのＮａＣｌを含有するトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通した。通過画分及び緩衝液によるカラムの洗浄液を合わせ、濃縮した。もとの培養上清中の非特異的ＧＩＦは、３８８Ｆ１  結合Ａｆｆｉｇｅｌ  を用いてアフィニティ精製した。濃縮した培養上清を免疫吸着剤を通して一晩再循環させた。３０カラム容量のＤＰＢＳで洗浄した後、免疫吸着剤に結合したタンパク質を、０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液，ｐＨ３．０で溶出することにより回収した。
【０１９３】
抗原結合ＧＩＦを生産するために、ＡＣ５細胞をＣＤ３の架橋により刺激した（Ｔｈｏｍａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：  ７２９，  １９９２）  。この細胞  （５×１０６  ｍｌ）を、５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＣＤ３（ＳＰＣ−Ｔ３  ｂ）で、４℃で３０分間処理し、抗体処理細胞を１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇと共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、細胞をＡＢＣ培地に、２×１０６  細胞／ｍｌで再懸濁し、２４時間培養した。培養の上清を限外濾過により１０ないし１５倍に濃縮し、ＰＬＡ２  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  カラムを通して一晩再循環させた。カラムをＤＰＢＳで洗浄し、カラム中に残っているタンパク質を０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液，ｐＨ３．０で溶出することにより回収した。
【０１９４】
アフィニティ精製したＧＩＦを、ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ，  Ｆｕｌｌｔｅｒｏｎ，  ＣＡ）  に連結したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（１．６×５０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通してゲル濾過により分画した。このカラムから、ＰＢＳを用いて０．８５ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶出させた。カラムをＢＳＡ（分子量６７，０００），ＯＶＡ（分子量４３，０００），大豆トリプシンインヒビター（分子量２０，１００）及びチトクロームＣ（分子量１２，５００）でキャリブレーションした。いくつかの実験においては、アフィニティ精製したＧＩＦ調製物を還元し、アルキル化した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０５ＭトリスＨＣｌ緩衝液中のＧＩＦ調製物を、１０ｍＭのジチオスレイトールと共に室温で１時間インキュベートし、その後、３０％モル過剰のヨードアセトアミドでアルキル化した。還元し、アルキル化した試料を同じＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにかけ、タンパク質をＰＢＳで溶出させた。
【０１９５】
４．ＥＬＩＳＡ分析：
Ｎｕｎｃ  Ｆプレート（Ｍａｘ  Ｓｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ）  の各ウェルを、５０μｌの階段希釈度のＧＩＦ調製物で、４℃で一晩、２重又は３重にコーティングした。プレートを、基質の添加の前の工程を除く以下の工程間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸塩緩衝液で５回洗浄した。該プレートを、Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ中の２％のＢＳＡで、３７℃で１時間ブロックした。ｍＡｂ  ３８８Ｆ１  のＧＩＦへの結合が、増幅システムにより検出された。１５０ｎｇ／ｍｌのビオチニル化ｍＡＢ  ３８８Ｆ１  を含むＰＢＳ５０μｌを各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートし、洗浄した後、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼ（Ｚｙｍｅｄ）  の適当な希釈液（１：６０００）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ  トリスＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、５０μｌのアルカリ性ホスファターゼ基質、及び続いて増幅溶液（ＧＩＢＣＯ／Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）と共に３０分間インキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを発色させた。４９０ｎｍでの吸収を、ＥＬＩＳＡリーダーＭＲ５０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）  中で測定した。
【０１９６】
また、ＥＬＩＳＡは、抗原結合ＧＩＦに対するモノクローナル抗体についても行われた。Ｍａｘ−Ｓｏｒｐプレートを、ＧＩＦ標本でコーティングし、ＢＳＡでブロックした後、ＰＢＳ中のモノクローナル抗体（２００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ｍＡＢのアイソタイプに応じて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｂｉｏｒａｄ）  若しくは抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）の１：３０００希釈物、又はＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（Ｚｙｍｅｄ）の１：２０００希釈物を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡシグナルは、ペルオキシダーゼ基質（Ｚｙｍｅｄ）により発色され、４０５ｎｍの吸収により調べられた。
【０１９７】
５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティング：
アフィニティ精製したＧＩＦを、０．０１％ＳＤＳに対して透析し、凍結乾燥した。その後、試料を、１５％ポリアクリルアミドスラブゲル中で、Ｌａｅｍｅｌｉシステム（Ｌａｅｍｅｌｉ，  Ｕ．Ｋ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７：６８０，  １９８０）  を用いて、ＳＤＳゲル電気泳動により分析した。タンパク質のバンドは、銀染色法により検出した（Ｏｃｈｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２：３０４，  １９８１）。免疫ブロッティングについては、アフィニティ精製したＧＩＦを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。標準として、精製した大腸菌からの組換えＧＩＦを並行に電気泳動にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質は、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，  ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ）にブロットされ、この膜は、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｂｌｏｔｔｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）で、４℃で一晩インキュベートすることによりブロックされた。ＰＢＳ，ｐＨ７．５中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した後、膜をウサギ抗ｒＧＩＦの１μｇ／ｍｌのＩｇＧ画分で３７℃で１時間処理した。ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ及びＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、続いてオートラジオグラフィーにより、ウサギＩｇＧのタンパク質バンドへの結合を検出した。Ｘ線フィルム上のｒＧＩＦバンドの位置は、１４ｋＤａ標準として用いられた。
【０１９８】
Ｂ．  抗原結合ＧＩＦに対して特異的なモノクローナル抗体の生産：
ＡＣ５細胞を、抗ＣＤ３で、続いて抗ＭＧＧで処理し、上清中の抗原結合ＧＩＦをＰＬＡ２  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いてアフィニティー精製した。この調製物は、１：３０ないし１：６０の希釈度で、１２Ｈ５細胞を、グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成から、非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成に変換することができた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＦＡ中の調製物０．１ｍｌを腹腔内投与することにより免疫感作し、続いて不完全フロインドアジュバント中の同じ抗原の追加注射を５回行った。最後の追加注射の２週間後に、動物を殺し、その脾臓細胞を、Ｂ細胞系ＳＰ２／０ＡＧ１４と融合した。
【０１９９】
ハイブリドーマの培養上清を、マウスＩｇの存在について試験した。Ｉｇを産生するこれらのハイブリドーマを、さらに抗ＧＩＦの存在についてＥＬＩＳＡ分析により試験した。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐウェルに、ＰＬＡ２  結合ＧＩＦでコーティングし、培養上清中のマウスＩｇのＧＩＦコーティングウェルへの結合を、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍを用いて測定した。８つのハイブリドーマの培養液上清がＥＬＩＳＡによる実質的な吸収を呈した。８つのハイブリドーマの上清中の抗ＧＩＦ抗体の存在は、アフィニティー精製したＰＬＡ２  結合ＧＩＦのアリコートを各培養液上清と共にインキュベートし、続いてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）  を通してこの混合物を濾過することにより確認された。８つのハイブリドーマからの抗体全てが、ＧＩＦと結合するということが、濾液のＧＩＦ活性の分析により示された。これとは反対に、ＰＬＡ２  結合ＧＩＦ自体の濾液では、活性が有った。
【０２００】
その後、同じ培養液上清を、非特異的ＧＩＦに対するモノクローナル抗体の存在について試験した。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートを、アフィニティー精製した非特異的ＧＩＦ又は抗原特異的ＧＩＦでコーティングし、各Ｂ細胞ハイブリドーマの培養上清をウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄しＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍの１：２０００希釈物を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡシグナルを、ペルオキシダーゼ基質で発色させ、４０５ｎｍの吸収を測定した。ＧＩＦでコーティングし、ＨＲＰ結合抗体及び基質とインキュベートした対照ウェルの吸収を差し引いた。この実験の結果は、二つのハイブリドーマ、即ち１１０及び２０５のみが、抗原非特異的ＧＩＦによってよりも、ＰＬＡ２  結合ＧＩＦ（即ち、抗原特異的ＧＩＦ）によって、実質的により高いＥＬＩＳＡシグナルを与えることを示した。このハイブリドーマ１１０及び２０５は、限界希釈によりサブクローニングされ、各クローンの培養上清は、ＰＬＡ２  結合ＧＩＦに対するモノクローナル抗体の選択的結合について、ＥＬＩＳＡにより試験された。繰り返してサブクローニングした後、二つのハイブリドーマの各々のサブクローン、即ち１１０ＢＨ３及び２０５ＡＤ２が得られた。これらの培養液の上清は、抗原結合ＧＩＦによってのみＥＬＩＳＡシグナルを与えた。モノクローナル抗体１１０ＢＨ３はμκアイソタイプであり、２０５ＡＤ２はλ１  κアイソタイプであった。
【０２０１】
両方のモノクローナル抗体ともＰＬＡ２  特異的ＧＩＦに結合するが、非特異的ＧＩＦには結合しないことの確認は、バイオアッセイにより行った。ＧＩＦ調製物のアリコートを、１１０ＢＨ３細胞及び２０５ＡＤ２細胞のいずれかの培養上清を用いて、一晩インキュベートし、得られた混合物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１００を通して濾過した。１２Ｈ５細胞を用いての濾液中のＧＩＦ活性の測定により、両方の抗体ともＰＬＡ２  結合ＧＩＦには結合するが、非特異的ＧＩＦには結合しないことが示された。次に、モノクローナル抗体  １１０ＢＨ３を、ハイブリドーマの培養上清から、硫酸アンモニウムの１／３飽和溶液を用いて沈澱させることにより、純化し、５ｍｇのＩｇＭを１．５ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合させた。その後、ＡＣ５細胞からのＰＬＡ２  結合ＧＩＦ及び非特異的ＧＩＦを抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて分画した。ＰＬＡ２  結合ＧＩＦを、抗ＣＤ３処理ＡＣ５細胞の培養上清から、ＰＬＡ２  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  によるアフィニティ精製により製造し、一方、非特異的ＧＩＦを非刺激ＡＣ５細胞の培養上清から３８８Ｆ１  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を用いて製造した。表１３に示した結果は、ＰＬＡ２  結合ＧＩＦは１１０ＢＨ３を結合させた免疫吸着剤に結合し、酸性ｐＨで溶出により回収されるが、非特異的ＧＩＦは免疫吸着剤に保持されないことを示した。
0003578787.tif 000028
ａ      ＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  および非特異的ＧＩＦ  は、それぞれ１：１０および１：３０の希釈で、１２Ｈ５細胞を、グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成に変換できた。
ｂ      ＧＩＦ  調製物１  ｍｌを１１０  ＢＨ３−結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ０．２５  ｍｌと混合した。通過画分とＤＰＢＳでの洗浄物１  ｍｌを合わせた（通過画分）  。カラムを  ＤＰＢＳ  ５  ｍｌで洗い  （洗浄）  、その後グリシンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ３．０で溶出した（  溶出）  。透析後、各画分をＧＩＦ  分析のために１．０  ｍｌに濃縮した。
ｃ      ＧＩＦ  活性を１２Ｈ５細胞を使用して測定した。この列の数字は、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／  溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す  （方法を参照のこと）  。（  ＋）（−）  はＧＩＦ  活性の存在または非存在を示す。
ＥＬＩＳＡ  による抗原−  結合ＧＩＦ  と非特異的ＧＩＦ  の検出を試みた。非特異的ＧＩＦ  は、ＤＥＡＥ−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  カラムによるイオン交換カラムクロマトグラフィーによる、非刺激ＡＣ５  細胞の培養上清の分画により、純化した。ＮａＣｌ  ５０  ｍＭを含むトリス緩衝液での通過画分を濃縮した。抗−ＣＤ３−  刺激細胞の培養上清中の抗原−  結合因子を、ＰＬＡ２−  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を使用して精製し、そして酸溶出液中の因子を１１０ＢＨ３−  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  上で、さらに分画した。抗原−  特異的および非特異的ＧＩＦ  調製物の両方が、１：６０の希釈で１２Ｈ５細胞を、グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成に変換させた。次いで、Ｍａｘ−Ｓｏｒｂウェルを段階希釈のひとつの調製物でコーティングし、そしてブロッキングした後、モノクローナル抗体の３８８Ｆ１  または１１０  ＢＨ３  をウェルに添加した。モノクローナル抗体  ３８８Ｆ１は、非特異的ＧＩＦ  と抗原−  結合ＧＩＦ  調製物の両方でＥＬＩＳＡ  シグナルを示したが、一方モノクローナル抗体  １１０−ＢＨ３は抗原−  結合因子とは反応したが非特異的ＧＩＦ  とはしなかった。アッセイにおいて、モノクローナル抗体を無関係なＩｇＧ２ａ  またはＩｇＭ  で置換した場合はシグナルが検出されなかったので、ＥＬＩＳＡ  シグナルはモノクローナル抗体の特異的結合によるものと思われる。
【０２０２】
上述のアフィニティ精製した抗原−  結合因子をＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  、続いて１１０ＢＨ３−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を使用して得、この調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。抗原−  結合ＧＩＦ  をＰＬＡ２−  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  、続いて１１０ＢＨ３−  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を使用して精製した。免疫吸着剤からの酸溶出画分を０．０１％ＳＤＳの存在下で蒸留水に対して透析し凍結乾燥した。この調製物を還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色法により分析した。調製物は、非還元条件下で８５  ｋＤａ、６６  ｋＤａ、５８  ｋＤａの３  つの主バンドと１３  ｋＤａの弱いバンドを示した。還元条件下では、８５  ｋＤａバンドが消え、そして数個の新しいバンドが検出された。還元条件下で検出された主バンドの１  つは１４  ｋＤａであり、その移動度は非特異的ＧＩＦ  のものに相当するので、このバンドがＧＩＦ  であるかどうかを決定するために分析を行なった。抗原−  結合ＧＩＦ  の別の調製物を、１１０ＢＨ３−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  によるアフィニティークロマトグラフィーにより、抗−ＣＤ３−  刺激ＡＣ５  細胞の培養上清から得た。１２Ｈ５細胞を使用した免疫吸着剤からの通過および酸溶出画分の階段希釈における、ＧＩＦ  活性の力価測定により、培養上清中のＧＩＦ  活性の大部分は免疫吸着剤に結合し、そして酸溶出により回収されることが示された。活性は溶出画分の１：３０希釈物中に検出されたが、通過画分は１：６  のＧＩＦ  力価を示した。表１６に示すように、溶出画分はモノクローナル抗体  １１０ＢＨ３  と２０５ＡＤ２の両方でＥＬＩＳＡ  シグナルを示したが、流出画分はこの抗体で有意なＥＬＩＳＡ  シグナルを示さなかった。溶出画分は、非常に高濃度のＧＩＦ  を含有しているが、しかしながら、非特異的ＧＩＦ  に対する抗体（３８８Ｆ１）  を使用した場合は、通過画分は弱いがはっきりとしたＥＬＩＳＡ  シグナルを示した。次いで、溶出画分を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その後、ｒＧＩＦに対するポリクローナル抗体を使用する免疫ブロッティングにより分析した。大腸菌由来の組換えＧＩＦ  を同一のゲルの隣のウェルに添加した。還元条件下での電気泳動後、ゲル中のタンパク質はＰＶＤＦ膜に移動し、次いで抗−ｒＧＩＦ  のγグロブリン画分で処理された。両方の膜で、対照として使用したｒＧＩＦはＸ  線フィルム上に、はっきりとしたバンドを示した（  データ省略）  。分子量マーカーは１８  ｋＤａ以下のいずれのタンパク質も含んでいなかったので、ｘ−線フィルム上のｒＧＩＦを１３  ｋＤａマーカーとして使用した。この結果から、抗体は実際に１３  ｋＤａバンドに結合していることが示された。１３  ｋＤａバンドと非特異的ＧＩＦ  の間の関係を、非刺激ＡＣ５  細胞の培養上清から、３８８Ｆ１−結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した非特異的ＧＩＦ  の分析により確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−  ｒＧＩＦ抗体を用いた免疫ブロッティングによる非特異的ＧＩＦ  調製物の分析により、この非特異的ＧＩＦ  もこれらの抗体と反応する１３  ｋＤａタンパク質であることが示された。
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ａ      抗−ＣＤ３−  処理細胞の培養上清を濃縮し、１１０ＢＨ３−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  上で分画した。画分を濃縮した上清の元の体積まで濃縮し、２  倍に希釈し、その後  ＧＩＦ活性とＥＬＩＳＡ  分析のために力価測定した。
ｂ      １２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成から非グリコシル化ＩｇＥ−ＢＦの生成に変換できる画分の最大希釈
ｃ      ４０５  ｎｍでの吸収
ｄ      ４９０  ｎｍでの吸収
１３  ｋＤａ  ＧＩＦと抗原−  結合ポリペプチド鎖は、お互いに結合して抗原−結合ＧＩＦ  を形成すると推測された。その場合は、生理的条件下では抗原−  結合ＧＩＦ  の分子の大きさは非特異的ＧＩＦ  のものより大きいであろう。この可能性を試験するために、ＡＣ５  細胞からのＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  を１１０−ＢＨ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  を使用して部分的に精製し、そして調製物をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムを通してゲル濾過により分画した。各画分を、モノクローナル抗体の  ３８８Ｆ１と１１０  ＢＨ３  を使用してＥＬＩＳＡ  により抗原−  結合ＧＩＦ  について評価した。その結果は、ｍＡｂ  ３８８Ｆ１  により検出されたＧＩＦ  の大部分は、５５．５分と６０．５分の間に、５８．５分でのピークでカラムから溶出されたことを示している。分子の大きさは、その溶出時間から見積って、７４  ｋＤａであった。予測したように、この画分は、１２Ｈ５細胞を使用したバイオアッセイで測定したＧＩＦ  活性を有していた。ＧＩＦ−含有画分はモノクローナル抗体  １１０ＢＨ３  でＥＬＩＳＡ  シグナルを示したことは注目すべきである。この結果から、モノクローナル抗体  ３８８Ｆ１により認識された抗原決定基とモノクローナル抗体  １１０ＢＨ３  により認識された抗原決定基は同一の分子と結合していることが強く示唆される。
【０２０３】
抗原−  結合ＧＩＦ  が実際に、抗原−  結合鎖と非特異的ＧＩＦ  から成るのであれば、抗原−  結合ＧＩＦ  は還元およびアルキル化処理により、別々のポリペプチドに解離するかもしれない。
この可能性を調べるために、アフィニティ精製した抗原−  結合ＧＩＦ  を１０  ｍＭ  ＤＴＴ  中で還元した。ヨードアセトアミドを用いてアルキル化した後、試料を同一のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにかけ、そして３８８Ｆ１−抗原と１１０ＢＨ３−  抗原の分布をＥＬＩＳＡ  により測定した。その結果から、還元およびアルキル化物質中のＧＩＦ  の約半分が、その溶出時間が１５  ｋＤａ分子に相当する画分に回収されたことが示唆された。元の抗原−  結合ＧＩＦ  を分画した場合は、同じ画分がＧＩＦ  を含まなかったので、１５  ｋＤａのＧＩＦ  は抗原−  結合  ＧＩＦに由来するようである。実験により、１１０ＢＨ３により認識される分子の２  つのピークも示された；  最初のピークは元の抗原−  結合ＧＩＦ  に相当し、２  番目のピークの溶出時間は６２−６４  ｋＤａ  に相当した。後者の画分はＥＬＩＳＡ  での測定により、かなりの量のＧＩＦ  を含んでいなかったので、この画分中のタンパク質は、抗原特異的結合に関与する抗原−  結合ＧＩＦ  の切断生成物に相当するのであろう。
【０２０４】
Ｃ．    抗原−  結合ＧＩＦ  のエピトープ特異性：  ＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  が、ハチ毒ＰＬＡ２に特異的であることを確認するために実験を行った。抗原−  結合ＧＩＦ  を抗−ＣＤ３−  刺激  ＡＣ５細胞の培養上清から、ＰＬＡ２−  結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に吸収させ、その後酸性ｐＨで結合タンパク質を溶出して精製した。調製物のアリコートをＯＶＡ−結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  と一晩混合し、そして通過および酸溶出画分中のＧＩＦ  活性を測定した。予想したように、本質的に全てのＧＩＦ  活性がＯＶＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  に保持されず、そして通過画分に回収された。ＯＶＡ−セファロースをＤＰＢＳで洗浄し、そして免疫吸着剤をグリシン−  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ３．０で溶出した。しかしながら、ＧＩＦ  活性は酸溶出画分には検出されなかった。
【０２０５】
マウスＴｓハイブリドーマ３Ｂ３  由来のＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  についての前の実験により、この因子が、ハチ毒ＰＬＡ２分子中のアミノ酸残基１９−３４  を表すペプチドに対する親和性を有することが示されているので、ＡＣ５  細胞由来のヒト抗原−  結合ＧＩＦ  が、ＰＬＡ２分子由来のアミノ酸１９−３５  を表す合成ペプチドと結合しているＳｅｐｈａｒｏｓｅ  に結合できるかどうかを調べることにした。表１５に示すように、本質的に調製物中の全てのＧＩＦ  活性がｐ１９−３５−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で吸収され、そして酸性ｐＨでの溶出により回収された。エピトープ特異性を確認するために、ＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  のアリコートを、アミノ酸１３−２８  、１９−３５  または２５−４０  を表す０．２  ｍｇ／ｍｌ  の合成ペプチドと６  時間インキュベートし、そして各混合物をＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で吸収した。通過画分および酸溶出画分中のＧＩＦ  活性の測定により、ＧＩＦ  のＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  への結合はｐ１３−２８またはｐ１９−３５により阻害されるが、ｐ２５−４０によっては阻害されないことが示された（表１５）  。この結果をＥＬＩＳＡ  により確認した。ＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  をｐ２５−４０の存在下または非存在下でＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  で吸収した場合は、免疫吸着剤からの酸溶出画分は、１１０ＢＨ３でＥＬＩＳＡ  シグナルを示すが、通過区分はシグナルを示さなかった。同じＰＬＡ２−  結合ＧＩＦ  を、ｐ１９−３５の存在下で同じ免疫吸着剤で吸収すると、酸溶出画分は示さないが、通過画分はモノクローナル抗体でＥＬＩＳＡ  シグナルを示した。この結果を集約すると、ＰＬＡ２分子中のアミノ酸１９−２８  の配列は、抗原−  結合ＧＩＦ  により認識されるエピトープを含有することが示された。
0003578787.tif 000030
ａ      ＧＩＦ  力価が１：１０である、ＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分６  ｍｌをｐ１９−３５と結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  １．５  ｍｌ上で分画した。通過、洗浄および酸溶出の各画分を６．０  ｍｌに調整し、そしてそのＧＩＦ  活性を１２Ｈ５細胞を使用して測定した。
ｂ      ＧＩＦ  力価が１：３０である、ＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの酸溶出画分のアリコート    ０．５  ｍｌを、適切なペプチドの存在下または非存在下でＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ０．５  ｍｌと一晩混合した。ＰＬＡ２−  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  からの通過および酸溶出画分の両方を１．０  ｍｌに調整し、ＲＰＭＩ  １６４０  培地に対して透析し、そしてＧＩＦ  活性を評価した。１２Ｈ５細胞の懸濁液１  ｍｌを、等体積の試験する試料と混合し、ＩｇＥ  の存在下で培養した。
ｃ      数値は、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  からの流出／  溶出画分によるロゼット形成阻止パーセントを表す。（＋）（−）  はＧＩＦ  の存在と非存在を示す。
【０２０６】
材料の寄託
以下の細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ  （ＡＴＣＣ）に寄託した：
細胞系 ＡＴＣＣ受託番号 寄託年月日
３８８Ｆ１          ＨＢ１０４７２            １９９０年５月３１日
ＡＣ５                ＨＢ１０４７３            １９９０年５月３１日
３１Ｅ９            ＨＢ１１０５２            １９９２年６月２日
１１０ＢＨ３  ＨＢ−１１３４５    １９９３年５月１４日
これらの寄託は、特許手続きの目的のために微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約、およびそれらに基づく規則（ブダペスト条約）の規定にしたがって行なわれた。これは、寄託日から３０年間の生育可能な培養の維持を保証する。ＡＴＣＣによって、その生物はブダペスト条約の条件のもとで利用可能となるが、この条約は、関連する米国特許の発行に際して、またはあらゆる米国または外国の特許出願の公衆への開示の際に、培養子孫の永続的かつ無制限の利用可能性を社会に対して保証し、米国特許法第１２２条およびそれにしたがう長官規則にしたがって資格を与えられた米国特許商標局長官によって決定されたものに対して、その子孫の利用可能性を保証する（特に８８６ＯＧ６３８に関する３７ＣＦＲ§１．１４を包含する）。
【０２０７】
本出願の譲受人は、その培養寄託物が適当な条件下で培養されたときに死滅または消失または破壊された場合には、通告に基づいて、ただちに同一培養物の生育可能な検体と交換することに同意した。寄託された系統の利用可能性は、あらゆる政府の特許法に基づく権限のもとで付与される権利に違反して本発明を実施する許可と解釈されるべきでない。
【０２０８】
前述の明細書は、当業者に本発明を実施できるようにさせるために十分であると考えられる。寄託された態様は本発明の一態様の単なる実例として意図され、機能的に同等であるあらゆる細胞系が本発明の範囲に含まれるので、本発明は寄託された細胞系によって範囲を限定されない。材料の寄託は、本文に含まれる記述が最良の方法を含めて本発明のあらゆる態様の実施を可能にするには不十分であることを認めるものではないし、また寄託物の対応する特定の実例に請求の範囲を限定すると解釈されるべきでない。実際、本明細書に示し、記述したほかに、本発明の様々な変更が前述の記載から当業者に明白となるであろうが、そうした変更は添付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスＧＩＦのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＧＩＦのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ｐＳＴ８１１ベクターの地図を示す。
【図４】図４は、ｐＴＭＫ−ｈＧＩＦ  ベクターの地図を示す。
【図５】図５は、ＳＲα−ｈＧＩＦ  ベクターの地図を示す。
【図６】図６は、ＳＲα−ｈｃＧＩＦベクターの地図を示す。
【図７】図７は、融合発現ベクターｐＭＥｐｒｏＣＴの地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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