(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュウドモナス sp.ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４１４９）から産生される、以下の表１に示す物理化学的性状を有するスタロバシンＨおよびＩからなる群から選ばれる抗生物質スタロバシン：
【表１】
0003568978.tif 000005
【請求項２】
工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１４９号として寄託されている、請求項１記載の抗生物質スタロバシンを産生するシュウドモナス sp.ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１。
【請求項３】
請求項２記載のシュウドモナス sp.ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１を培養し、培養物から抗生物質スタロバシンを分離、回収することからなる、請求項１記載の抗生物質スタロバシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な抗生物質に関し、さらに詳しくは、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１により産生される抗生物質スタロバシンＨおよびＩ、その産生微生物およびその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】
抗生物質の抗細菌活性は個々の細菌によって異なる上、しばしば耐性菌が出現して効果が低下することが知られている。今日では、多剤耐性菌の出現が問題となっており、治療を効果的に行うためには新規で有効な抗生物質の開発が望まれている。とりわけブドウ状球菌や溶血性連鎖状球菌などのグラム陽性菌には抗生物質耐性菌が多く、これらグラム陽性菌に対して高い活性を有する新規な抗生物質が必要とされている。
【０００３】
【課題を解決する手段】
本発明は、シュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１が産生する抗生物質スタロバシンＨおよびＩからなる群から選ばれる抗生物質スタロバシンを提供するものである。この抗生物質は、上記シュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１によって産生されるペプチド抗生物質である。スタロバシンＨおよびＩ（以下、単にスタロバシンということがある）は、上記シュウドモナスの菌株を培養することにより、極めて近似した同族体の複合体として得られる。その抗菌活性は従来の抗生物質と比較して、極めて強力である。スタロバシンＨおよびＩは、以下の表２に示した物理化学的特性を有する。
【０００４】
【表２】
0003568978.tif 000002
【０００５】
上記の物性で表される本発明の抗生物質スタロバシンは、インビトロおよびインビボで優れた抗菌活性を有し、特にグラム陽性菌に対して強力な作用を有することが分かった。
【０００６】
即ち、下記表３に示したように、本発明の抗生物質スタロバシンは優れた活性を示し、特にグラム陽性菌に高活性を有する。
急性毒性としては、マウスへの３００ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇ静脈内投与では、毒性死を認めなかった。
【０００７】
本発明の抗生物質スタロバシンＨおよびＩは、スタロバシン複合体を生産するシュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５，３６０（微工研菌寄第１０５７８号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３４２）から得られた一変異株シュウドモナスｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１を同化可能な炭素源、窒素源および無機塩類を含有する培地中で常法通り好気的に液中培養することにより得られる。なお、この菌は後述の実験例２記載の方法で培養し、その形態学的所見、培養特性、生理学的および生化学的性状等を基に、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１巻（１９８４）の記載を参照して総合的に判断し、上記菌株に帰属されたものである。この菌株は、自然発生的に、または人為的に変異する可能性があり、そのような変異体も、本発明のスタロバシンを産生する能力を保持している限り、本発明の範囲内に包含されるものであることは、当業者には明らかである。従って、本発明は、新規な抗生物質スタロバシンＨまたはＩを産生する、シュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１およびその変異体を提供するものである。シュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１は、茨城県つくば市東１−１−３の工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１４９号の下で寄託されている（受託日：平成６年２月１６日）。
【０００８】
また、本発明はこのような菌株を培養することにより、抗生物質スタロバシンＨおよびＩを製造する方法をも提供するものである。
培地組成、培養条件などは抗生物質の生産に一般に用いられているものを用いるとよい。培地は原則として、炭素源、窒素源、無機塩などを含む。必要に応じて、ビタミン類、前駆物質などを加えてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、有機酸などが単独でまたは混合物として用いられる。窒素源としては、例えば、大豆粉、コーンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが単独または、混合物として用いられる。無機塩としては、例えば、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩などがあげられ、必要に応じて培地に添加する。本発明のシュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５，３６０を適当な培地中で、温度２０〜３５℃、好ましくは２５〜２９℃で約１〜７日間培養すると、充分量の抗生物質スタロバシンが培養物中に産生される。次いで、通常の方法で培養物から生成物を分離し、所望により、分離、精製する。そのような方法は、全て当業者にとって周知である。
【０００９】
本発明の抗生物質スタロバシンは、インビトロおよびインビボで著しい活性を示し、種々の感染症、特にグラム陽性の多剤耐性菌による感染症の治療に有用と考えられる。
以下に実施例および実験例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。
【００１０】
実施例１
（ａ）発酵工程
グルコース１．０％、酵母エキス（ディフコ製）０．５％、水道水よりなる培地８００ｍｌ（２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７に調整）を含む２Ｌ容三角フラスコにシュウドモナスｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１の種菌（２ｍｌバイアル、−８０℃保存）を接種し、振幅７０ｍｍ、毎分１８０回転で、２８℃、２２時間振盪培養を行う。この培養液８００ｍｌを、グルコース１．０％、酵母エキス（ディフコ製）０．４％、モルトエキス（ディフコ製）１．０％、ポリペプトン（日本製薬）０．１％、水道水よりなる培地２０Ｌ（２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７に調整）を含む３０Ｌ容ジャーファメンターに植菌し、通気量１４Ｌ／分、内圧０．３５ｋｇ／ｃｍ２、撹拌回転数２００ｒｐｍで２８℃、２１時間培養する。
次いでこの培養液８Ｌを可溶性澱粉２．０％、粉末酵母２．０％、β−シクロデキストリン１．５％、オリーブ油０．５％、塩化マグネシウム６水塩０．３％、リン酸第一カリウム０．１％、消泡剤アデカノール（旭電化工業）ＬＧ１０９の０．０００８％、水道水よりなる培地１２５Ｌ（２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７に調整）を含む２５０Ｌ容タンクに植菌し、通気量６５Ｌ／分、内圧０．３５ｋｇ／ｃｍ２、撹拌回転数３５０ｒｐｍで２８℃、７２時間培養する。
【００１１】
（ｂ）分離工程
上記工程で得られた培養液１３８Ｌに、クロロホルム１．４Ｌを添加し殺菌する。次にアンバーライトＸＡＤ−７（オルガノ）１５Ｌを加え、３時間撹拌混合し活性物質をバッチ吸着させる。０．１ｍｍステンレスメッシュのフィルターを用いて樹脂を回収する。樹脂を水洗した後、ガラスカラム（内径２０ｃｍ）にセットし、４０Ｌの水で洗浄し、次に４０Ｌの３０％メタノール及び１５Ｌの５０％メタノール・２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、４０Ｌの６０％メタノール・２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で活性物を溶出する。
Ｓ．アウレウスＪＣ−１に抗菌活性を有する分画２０Ｌを集め、減圧濃縮して３Ｌとする。次に酢酸エチル３Ｌで洗浄して脂溶系の物質を除く。水層に溶けている酢酸エチルを減圧留去させた後、アンバーライトＸＡＤ−７（オルガノ）１Ｌカラム（内径６．５ｃｍ×３１ｃｍ）に活性物質を吸着させ、２Ｌの水で洗浄し、次に２Ｌの３０％含水ＭｅＯＨ及び３Ｌの５０％含水ＭｅＯＨで溶出を行う。溶出された分画をＨＰＬＣ分析し、スタロバシン群を含む分画を集め（２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．０に調整）、減圧濃縮、凍結乾燥し、３８９０ｍｇの粉末を得た。
【００１２】
（ｃ）精製工程
精製第一工程
上記工程で得られた粗粉末１８２０ｍｇを６０ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解して、ＹＭＣ  ＯＤＳカラム（Ｓ−１５／３０μ，５．０×５０ｃｍ、溶出液：アセトニトリル／２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）・５０ｍＭ硫酸ナトリウム＝４０／６０、流速：５０ｍｌ／分、ＵＶ検出：２１０ｎｍ）を用いて、分取高速液体クロマトグラフィーを行い、スタロバシンＨおよびＩを主成分とする分取液（２．４Ｌ）を得た。分取液はアセトニトリルを留去後、ダイアイオンＨＰ−２０（三菱化成）のカラムに吸着させ、水洗後、６０％含水アセトンで溶出させる。溶出液は、減圧下アセトンを留去後凍結乾燥し、１２６ｍｇの粉末を得た。
【００１３】
精製第二工程
上記工程で得られた粉末を、下記の条件で分取高速液体クロマトグラフィーにより精製して、スタロバシンＨおよびＩを得た。
粉末（１２６ｍｇ）を７ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。１回当たり１５ｍｇのサンプルをＡｓａｈｉｐａｋＯＤＰ−９０カラム（内径２１．５ｍｍ×３００ｍｍ，溶出液：２０ｍＭ  ＡｃＯＨアセトニトリル溶液／２０ｍＭ  ＡｃＯＨ水溶液＝４０／６０，流速：８ｍｌ／分，ＵＶ検出：２２０ｎｍ）に付し、溶出容積１４４ｍｌから１８４ｍｌの間にスタロバシンＨが溶出し、次いで２１６ｍｌから２８８ｍｌの間にスタロバシンＩが溶出する。この分離操作を繰返し、集めた各分取液を１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．０に中和後、アセトニトリルを減圧下に留去、次いで５％濃度になるようにＮａＣｌを添加し、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．５に調整する  。次に５％ＮａＣｌ水溶液で平衡化したＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ２０Ｐ（７５〜１５０μ，三菱化成）カラムに吸着させ、水洗後、７０％含水ＭｅＯＨで溶出する。溶出液は減圧下でＭｅＯＨを留去し、凍結乾燥して純粋なスタロバシンＨ（１２ｍｇ）およびスタロバシンＩ（３８ｍｇ）を得た。
【００１４】
実施例１で得られたスタロバシンＨおよびＩの物理化学的性状は表２に示した通りである。さらに、スタロバシンＨおよびＩのＩＲスペクトルをそれぞれ図１および図２に、スタロバシンＨおよびＩのＮＭＲスペクトルをそれぞれ図３および図４に示した。
【００１５】
実験例１  インビトロおよびインビボでの抗菌活性
１）インビトロ活性
実施例１で得た抗生物質スタロバシンＨおよびＩのインビトロでの抗菌活性を、寒天希釈法で検討した。結果を表３に示す。
【００１６】
【表３】
0003568978.tif 000003
【００１７】
２）インビボ活性
スタロバシンＩを用い、インビボの抗菌活性を調べた。マウスを感染性の細菌で腹腔内感染させ（チャレンジ）、チャレンジの１時間後に被験物質を皮下投与した。チャレンジから７日後の生存率に基づいて、ＥＤ５０値を算出した。ＭＩＣは寒天希釈法によって求めた。結果を下記の表４に示す。
【００１８】
【表４】
0003568978.tif 000004
【００１９】
実験例２  ＰＢＪ−５，３６０およびＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１の菌学的特性
本発明のＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１は、前述のＰＢＪ−５３６０株の突然変異体として得られたものである。尚、ＰＢＪ−５３６０は、京都府下で採取した土壌試料より分離されたものである。本発明のＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１の菌学的諸性状を以下に示す。尚、培養は原則として２８℃で実施した。
Ａ．形態
グラム陰性、桿菌であり、大きさは０．３〜０．５（μｍ）×０．８〜１．３（μｍ）である。一本以上の極鞭毛により激しく運動する。
【００２０】
Ｂ．培養所見
１）肉汁培地における培養
菌体の生育は殆ど見られなかった。管底に灰白色半透明の沈澱がごくわずかに生成した。
２）肉汁寒天穿刺培養
穿刺線に沿って糸状乃至は小乳頭状の生育を認めた。ガスの発生および色素の生成は見られなかった。表面に赤味がかった薄い菌苔を形成したが、この菌苔は時間の経過と共に、うす茶色半透明となり疣状の突起を所々に認めた。好気性菌である。
３）肉汁寒天斜面培養
菌体の生育は決して早い方ではなく、２８℃においては２日後より開始（目に見える）された。生育は糸状で、菌苔は半透明、淡黄色、隆起は扁平でぶつぶつした外観を呈した。周縁は全縁であった。菌苔の生育はその後良好となり、生育は糸状乃至は疣状で光沢を有し、湿潤したやや赤味を帯びた半透明褐色の菌苔になる。周縁は波状乃至は長波状である。ガスおよび色素の生成は認められなかった。
【００２１】
４）肉汁ゼラチン穿刺培養
培養は室温下（２２〜２５℃）で実施した。ゼラチンをわずかに液化した。
５）肉汁寒天平板培地上での培養
菌体の生育は速くない。２８℃、２日後よりコロニーは可視となった。コロニーは最初、小型、点状、褐色半透明であり、周縁は全縁である。隆起については、コロニーが小型過ぎて観察不可能であった。その後、コロニーは生長し、点状乃至は円型を呈し、周縁は全縁、隆起は扁平乃至は凸円状である。コロニーは半透明、茶褐色で光沢を有する。ガスおよび可溶性色素の生成は、一切認められなかった。
６）リトマスミルクにおける培養所見
酸は生成せず、ペプトン化を行うが反応の開始は１４日以後となるなど、反応はかなり遅い方である。ガスの発生はなかった。
【００２２】
Ｃ．生理学的および生化学的諸性状
１）カタラーゼテスト：陽性
２）オキシダーゼテスト：陽性
３）ＯＦ−テスト：陰性（アルカリ性を呈した）
４）溶血性テスト：陽性（弱い）
５）５℃における生育能：陰性
６）Ｈ２Ｓの生成：陰性
７）硝酸塩の還元能：陽性
８）脱窒反応：陰性、但しＮ２ｇａｓを発生しないが、ＮＯ２−は還元する様であった。
９）クエン酸の利用能：陰性（クリステンセン培地、およびシモンズ培地）
１０）ＮＡＣ寒天培地上での生育：陰性（生育不可能）
【００２３】
１１）インドールの生成：陰性
１２）Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ反応（フォーゲス・プロスカウエル・テスト）：陰性
１３）メチルレッドテスト：陰性
１４）アルギニンの加水分解能：弱陽性
１５）リジンの脱炭酸能：陽性
１６）オルニチンの脱炭酸能：陽性
１７）エスクリンの加水分解能：陰性
１８）ＤＮａｓｅテスト：陰性
１９）澱粉の加水分解能：陰性
２０）ＯＮＰＧテスト（３７℃で培養）：陰性
【００２４】
２１）アシルアミダーゼテスト：陽性
２２）フォスファターゼテスト：陽性
２３）キチンの加水分解能：陰性
２４）シュークロースよりのレバンの生成能：陽性
２５）糖類よりの酸およびガスの生成能：以下の１３種の糖類から、酸およびガスを発生しない。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、マルトース、ラクトース、ラムノース、シュークロース、セロビオース、トレハロース、マンニットである。
２６）菌体内におけるｐｏｌｙ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積：陰性
２７）炭素源の資化能：無機塩を含む培地上において、単一の炭素源としてグルコース、および２ケト−グルコン酸カルシウムを資化して、菌体を形成することができる。この場合、生育のための特定のビタミン類は、特に要求する様には思われなかった。一方、Ｄ−（＋）−トレハロース、ＤＬ−アルギニン、ゲラニオール、β−アラニン、Ｌ−バリン、イノシットを資化しなかった。
２８）Ｇ＋Ｃ  ｍｏｌｅ  ％（ＨＰＬＣ法）：６０．４％（Ａ＋Ｔ  ｍｏｌｅ  ％は３９．６％であった）
【００２５】
以上の諸結果より見て、ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ１−２１は好気性のグラム陰性の桿菌であり、１本以上の極鞭毛を用いて液体培地中で活発なる運動を行う。カタラーゼ陽性であって、オキシダーゼを有する。ＯＦ−テストは陰性（アルカリ性を示す）であった。これらの結果より見れば、本菌はシュウドモナス科の中のシュードモナス属に帰属されることは明らかである。
【００２６】
シュウドモナス属について、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１巻（１９８４）中に記載の菌体内にｐｏｌｙ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を蓄積しない菌複合体について、上述の各性状を対比した所、一致するものおよび近似の種を発見することはできなかった。アルギニンを加水分解し、リジンおよびオルニチンを脱炭素する点で、かなり変わったシュウドモナスの一種といえる。そして、Ｇ＋Ｃ  ｍｏｌｅ  ％も６０．４％とシュウドモナスの中では、低い方のグループに帰属せられる。以上の諸結果を見て、本菌をシュウドモナス  ｓｐ．ＰＢＪ−５３６０−ＳＴＲ−１−２１と同定した。なお、これらの諸性状は親株ＰＢＪ−５３６０の諸性状と一致した。
【図面の簡単な説明】
【図１】スタロバシンＨのＩＲスペクトルを示すグラフ。
【図２】スタロバシンＩのＩＲスペクトルを示すグラフ。
【図３】スタロバシンＨのＮＭＲスペクトルを示すグラフ。
【図４】スタロバシンＩのＮＭＲスペクトルを示すグラフ。
【図１】
0003568978.tif 000006
【図２】
0003568978.tif 000007
【図３】
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【図４】
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