(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合性抗原クラスII蛋白質αサブユニットの第１番目のアミノ酸残基から始まり第７０番目から８０番目のいずれかのアミノ酸残基で終了する部分と、βサブユニットの第１番目から１０番目のいずれかのアミノ酸残基で始まり第１９５番目のアミノ酸残基で終了する部分とを融合させた融合蛋白質であって、該αサブユニットの第７０番目から８０番目のいずれかのアミノ酸残基と、該βサブユニットの第１番目から１０番目のいずれかのアミノ酸残基とを結合させることを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
主要組織適合性抗原クラスII蛋白質αサブユニットの第１番目のアミノ酸残基から始まり第７０番目から８０番目のいずれかのアミノ酸残基で終了する部分と、βサブユニットの第５０番目から６０番目のいずれかのアミノ酸残基で始まり第１１２番目のアミノ酸残基で終了する部分とを融合させた融合蛋白質であって、該αサブユニットの第７０番目から８０番目のいずれかのアミノ酸残基と、該βサブユニットの第５０番目から６０番目のアミノ酸残基とを結合させることを特徴とする融合蛋白質。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の融合蛋白質を固定化した材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原提示細胞表面などに見られる主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質のα及びβサブユニットを融合した蛋白質、あるいはこの融合蛋白質の全部又は一部の配列を含有する蛋白質及びスーパー抗原の除去・検出等に有用な該融合蛋白質を固定化した材料に関する。
【０００２】
【従来技術】
主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質（以下ＭＨＣクラスＩＩと略す）は、Ｂ細胞やマクロファージ、血管内皮細胞等の細胞表面に存在し、抗原提示の際に自己非自己を識別するために用いられる糖蛋白質である。近年になり、ＭＨＣクラスＩＩが細菌毒素等のスーパー抗原類の結合蛋白質であることが判明し、且つ自己免疫疾患においてＭＨＣクラスＩＩのサブクラスに偏りが見られることなどから、医学・免疫学的に重要視され始めている。
【０００３】
また、ＭＨＣクラスＩＩを固定化した材料は、ＭＨＣクラスＩＩ蛋白質結合性物質の溶液中からの分離・検出に用いられ、免疫学や医学領域に有効に用いられる。現在、ＭＨＣクラスＩＩを単離し入手するには、哺乳類細胞や昆虫細胞にＭＨＣクラスＩＩの遺伝子を導入させるか、あるいは天然に存在するＭＨＣクラスＩＩをＢ細胞やマクロファージ、血管内皮細胞などの細胞膜中より精製してくる必要がある。しかし、天然型ＭＨＣクラスＩＩを細胞膜中より大量に得る場合、膜表面の発現量が少ないために、大量の細胞を必要とし、培養細胞を用いたとしても多くの時間と費用を要する。
本発明者らは以前に微生物等を用いてＭＨＣクラスＩＩのα及びβサブユニットを個別に発現させ、その後に再構成によりＭＨＣクラスＩＩ分子が得られることを見出した（特表平６−８０９１４８号）。
【０００４】
また、哺乳類細胞や昆虫細胞に遺伝子技術を用いて組換え型ＭＨＣクラスＩＩを産生させる方法も報告されている。（ジャーナル    オブ    エクスペリメンタル    メディスン    第１７４  巻  ２１９ページ（１９９１），  セル    第６８巻  ４６５ページ（１９９２））。
【０００５】
ここで、個別にサブユニットを発現させることはサブユニット毎に変異を加えたりするのには有効であるが、再構成ＭＨＣクラスＩＩ分子を得るためには、各サブユニットの発現精製を別々に進める必要があるなど単一蛋白質を発現精製させることに比較して時間や費用が二倍必要である。また、哺乳類細胞や昆虫細胞を用いると、再構成したＭＨＣクラスＩＩとして蛋白質が得られるが、血液浄化カラム等のように固定化後の蛋白質の遊離が禁忌の場合には再構成体の両サブユニットを架橋した状態で固定化しサブユニットの解離による蛋白質のカラム内からの遊離を防止する必要が生じ、この固定化により蛋白質の活性が低下することが多い。
【０００６】
さらに、融合蛋白質を作製する際に、融合のための結合部位の違いが融合蛋白質の機能に大きく影響する。これは、融合蛋白質が本来の天然型の蛋白質と同様の構造をとる際に、結合部位によっては立体的障害になることが考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、単一蛋白質内にＭＨＣクラスＩＩのα及びβの両サブユニットの配列を含ませることにより生産性・操作性を容易にし、固定化後の架橋操作が不要であり、且つ、スーパー抗原結合性やＴ細胞活性化等の機能を有するＭＨＣクラスＩＩαサブユニットあるいはその一部とβサブユニットあるいはその一部を融合させた蛋白質（以下、融合蛋白質と呼ぶ）を提供すると共にスーパー抗原の除去等に有用な融合蛋白質固定化材料を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は下記の構成を有する。
【０００９】
「主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質α及びβサブユニットを融合させた蛋白質の製造方法。」
本発明に用いたＭＨＣクラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子は既に報告されているＤＮＡ配列（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、セル、第６８巻、４６５頁（１９９２年）、Ｄ．Ａ．ＷｅｔｔＳｔｅｉｎら、ジャーナル    オブ    エクスペリメンタルメディスン、第１７４巻、２１９頁、（１９９１年））をもとにＰＣＲ法によりＢ細胞等のヒト細胞中より、常法、例えば「遺伝子増幅ＰＣＲ法（蛋白質・核酸・酵素臨時増刊、第３５巻、１７号、（１９９０年）」に記載の方法に従い得られた。このＤＮＡのコードする蛋白質の調製法としては、遺伝子組換え技術を利用して大腸菌、酵母菌、昆虫細胞や哺乳類細胞内で発現させる方法が挙げられる。このうち、増殖の速さ等の生産効率の高さ・培養条件等の操作性の良さから考えると大腸菌や酵母菌を用いることがより好ましい。発現の方法としては本蛋白質をコードするＤＮＡあるいはその一部に蛋白合成開始信号と終結信号、また、菌体外へ分泌させるときは分泌信号を付加した後、種々の公知の発現ベクターに結合させ、直接本発明の融合蛋白質を発現させる方法、また、他のペプチド、例えば、インターロイキン２、マルトース結合蛋白質、βガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ蛋白質などと融合蛋白質として発現させる方法がある。また、発現後の蛋白質の精製のしやすさを考慮して、ＭＨＣクラスＩＩの活性が保たれるならば、ヒスチジンの６量体等を付加しても良い。
【００１０】
ＭＨＣクラスＩＩの細菌に対する毒性を考慮すると発現の際に不溶性の顆粒体を形成させるか、ヒートショックプロモーター等の転写開始制御能の高いプロモーターを用いることが好ましい。
【００１１】
また、αサブユニットとβサブユニットを融合させる際に用いる連結部分のアミノ酸配列には制限はないが、親水性を高くすると水溶液中に直鎖状に伸張しスペーサーとして有効に作用でき、好ましい。また、スペーサーの長さは、天然型ＭＨＣクラスＩＩより予想される結合部位間距離より決定することが望ましく、また、再構成後に切断可能なように酵素的に切断可能なアミノ酸配列を導入することも可能である。
【００１２】
また、結合を行うαおよびβサブユニットの位置としては天然型のＭＨＣクラスＩＩの高次構造を考慮する必要があり、単にα１  領域とβ１  領域等を任意に結合させても連結部位が障害になり高次構造が破壊され、機能を有さない、あるいは機能低下したものが得られる場合が多い。そこで、高いスーパー抗原結合能やＴ細胞刺激能を有した融合蛋白質を得るためには、ＭＨＣクラスＩＩ蛋白質の高次構造（Ｊ．Ｈ．Ｂｒｏｗｎら、ネイチャー、第３６４巻、３３頁、１９９３年）を考慮しアミノ酸残基間に他のアミノ酸残基が障害となるように存在せず、かつ活性発現に必要な部位を欠損しないアミノ酸残基で結合させることが好ましい。本発明者が鋭意検討した結果では、スーパー抗原を結合し、Ｔ細胞を活性化させる機能を有するアミノ酸残基の結合は、αサブユニットの第７０番から第８０番目のいづれかのアミノ酸残基とβサブユニットの第１番から第１０番目のいづれかのアミノ酸残基間あるいは、αサブユニットの第７０番から第８０番目のいづれかのアミノ酸残基とβサブユニットの第５０番から第６０番目のいづれかのアミノ酸残基間あるいはβサブユニットの第７０番から第９０番目のいづれかのアミノ酸残基とαサブユニットの第１番から第１５番目のいづれかのアミノ酸残基間が好ましい。また、Ｔ細胞上のＣＤ４蛋白質により認識されるβ２  領域を欠如させることによりＴ細胞活性化を制御することや、他のポリペプチドと融合させることにより等電点の改変や機能を付加すること、さらに、サブユニットの鎖長を変化させることにより等電点や疎水性を改変し、溶解性を制御することも可能である。
【００１３】
「固定化方法」
融合蛋白質は、共有結合、イオン結合、配位結合、疎水結合又は包括法を用いて結合又は吸着することにより担体に固定化することができる。蛋白質の担体への固定化は、当業者にとって周知であり、周知のいずれの方法など、特に限定することなく用いることができる。これらのうち、蛋白質が遊離する可能性のない共有結合法を用いることが最も好ましい。共有結合にて蛋白質を固定化する場合には、蛋白質のアミノ基、カルボキシル基又はスルフィド基を利用する方法が一般的である。
【００１４】
「固定化担体」
融合蛋白質を固定化する担体としては、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール等の合成高分子やセルロース、キトサンあるいはその誘導体のような天然高分子、セラミックスや金属等の無機材料等で構成されるビーズ、繊維、中空糸、織物、プレート、チューブ等を用いることができる。このうち、固定化材料として官能基の挿入容易な高分子化合物を用いることがより好ましく、形態としては操作性や表面積の大きさから中空糸、ビーズ、繊維等がより好ましい。
【００１５】
本発明の融合蛋白質固定化材料はサブユニット同士が解離しないため、固定化された蛋白質はカラム上からは脱離することなく、血液、尿等の体液や食料品、飲料物中からスーパー抗原を除去する目的に用いることができ、これにより、食中毒、敗血症や自己免疫性疾患の治療や発症の予防が可能になる。また、免疫学的に抗原提示細胞に類似した人工材料を作製することや生体あるいは生体成分を人工的に刺激、活性化あるいは抑制する際に有効に利用することができる。
【００１６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ＭＨＣクラスＩＩαサブユニットとβサブユニットの融合蛋白質の大腸菌内でのヒートショックプロモーターを用いた発現及びスーパー抗原結合能とＴ細胞活性化能の回復。
【００１８】
ＭＨＣクラスＩＩのα及びβサブユニットの融合蛋白質は以下のように調製した。ｐＵＴベクターに制限酵素としてＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  を用いてαサブユニットの第１番から第８０番アミノ酸残基を挿入した。次にＰＣＲ法により、βサブユニットの１番目のアミノ基残基のアミノ末端側にＬグリシン−  Ｌスレオニンー  Ｌセリンー  Ｌグリシンをスペーサーとして、また、１９５番目のアミノ酸残基のカルボキシル末端側に翻訳終結信号を付加した後、この修飾したβサブユニットの遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  を用いて、αサブユニットの遺伝子を挿入した上記ｐＵＴベクターへ組み込み、これにより、αサブユニットその後ろに４アミノ酸残基のスペーサーを介してβサブユニットが結合した融合蛋白質のための発現ベクターを得た。このベクターを用いて大腸菌を形質転換し、Ｌ培地中で３０℃、８時間培養後、培地温度を４２℃に上昇させて誘導をかけ、誘導後に培地温度を３７℃に低下させて、さらに２時間培養した後、培養液より大腸菌を回収した。
【００１９】
ここで発現させた融合蛋白質は不溶性顆粒体であり、活性を維持していなかった。そこで、以下の方法で融合蛋白質の活性を回復させた。菌体の超音波破砕後の沈殿画分を６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭジチオスレイトールを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ＰＨ８．０により可溶化した。可溶化後に、イオン交換クロマトグラフ、ゲルろ過、硫安分画により精製し、その後、精製された融合蛋白質を、５０μｇ／ｍｌの濃度で６Ｍ塩酸グアニジン溶液に溶解し、４℃、１時間撹拌した。その後、４℃で１００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ＰＨ７．４中で透析した。
【００２０】
透析後の液を遠心処理し、沈殿部を除去後、遠心上清を濃縮し濃度５０μｇ／ｍｌに調製した。濃縮後の溶液を０．１ｍｌずつ酵素免疫学的測定（ＥＩＡ）用の９６穴プレート上に固相化した。
【００２１】
固相化したプレートにスーパー抗原の一つであるトキシックショックシンドロームトキシンー１（ＴＳＳＴ−１）を反応させ、その後、ペルオキシダーゼ標識した抗ＴＳＳＴ−１抗体を用いて結合したＴＳＳＴ−１を検出した。結合量をＥＩＡの発色量として測定した（表１）ところ融合蛋白質において高いスーパー抗原結合能が確認された。
【００２２】
さらに、スーパー抗原を反応させたプレートに、ヒト末梢血由来のＴ細胞を反応させ、活性化の程度をチミジンの取り込み量として測定した（表２）ところ、融合蛋白質において高いＴ細胞活性化能を認めた。
【００２３】
【表１】
0003603374.tif 000002
実施例２
ＭＨＣクラスＩＩ固定化カラムからの蛋白質の遊離試験。
【００２４】
天然型ＭＨＣクラスＩＩ及び融合蛋白質を蛍光標識した後に、蛋白質のカルボキシル基を利用してビーズ上に共有結合により固定した。固定後、ビーズを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄液中に蛍光物質が認められなくなるまで洗浄した。このビーズを等量の８Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液中に加え室温で１０分間撹拌した。
【００２５】
ビーズを取り出し、溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液中で透析し、透析後に溶液中の蛍光を測定したところ、天然型ＭＨＣクラスＩＩではサブユニットの解離により蛍光標識された蛋白質が溶液中に確認された。一方、融合蛋白質では溶液中に蛍光は認められず、蛋白質の解離は起こらないことが示された。
【００２６】
実施例３
ＭＨＣクラスＩＩαサブユニット部分配列とβサブユニット部分配列の融合蛋白質の大腸菌内でのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いた発現及びスーパー抗原結合能の回復。
【００２７】
ＭＨＣクラスＩＩαサブユニットの第１アミノ酸の位置にＮｃｏＩ  制限酵素サイトを挿入し、第７６番目のアミノ酸の後にＫｐｎＩ  サイトを挿入した形でＰＣＲを行い、βサブユニットの第５７番目のアミノ酸の前にＫｐｎＩ  サイトを導入し、βサブユニットの１１２番目のアミノ酸の後に翻訳終結信号とＢａｍＨＩ  サイトを挿入した形でＰＣＲを行い、これらをｐＥＴ３ｄベクター中に挿入することにより、αサブユニットの第７６番目のアルギニン残基とβサブユニットの第５７番目のアミノ酸アスパラギン酸残基とを、Ｌ−  グリシン−Ｌ−  スレオニンをスペーサーとして結合させた融合蛋白質のための発現ベクターを作製した。
【００２８】
この発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換した後、ＩＰＴＧで誘導をかけて発現させた。発現した融合蛋白質は実施例１と同様の方法により、精製および活性回復を行い、スーパー抗原の結合活性を測定した。その結果、表３に示すようにスーパー抗原の結合活性のある融合蛋白質が得られた。
【００２９】
【表２】
0003603374.tif 000003
実施例４
ＭＨＣクラスＩＩαサブユニット部分配列とβサブユニット部分配列の融合蛋白質の大腸菌内でのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いた発現及びスーパー抗原結合能の回復（２）。
【００３０】
βサブユニットの第１番目のアミノ酸の位置にＮｃｏＩ  サイトを、第７８番目のアミノ酸の後にＫｐｎＩ  サイトを導入した形でＰＣＲを行い、αサブユニットの第１１番目のアミノ酸の前にＫｐｎＩ  サイトを、第１９０番目のアミノ酸の後ろに終結信号とＢａｍＨＩ  サイトを導入した形でＰＣＲを行い、これらをｐＥＴ３ｄベクター中に挿入することにより、αサブユニットの第１１番目のグルタミン酸残基とβサブユニットの第７８番目のチロシン残基とをＬ−  グリシン−Ｌ−  スレオニン−Ｌ−  セリンをスペーサーとして結合させた融合蛋白質を作製した。この発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１を形質転換した後、ＩＰＴＧで誘導をかけて発現させた。発現した融合蛋白質は実施例１と同様の方法により、精製および活性回復を行い、スーパー抗原の結合活性を測定した。その結果、表４に示すようにスーパー抗原の結合活性のある融合蛋白質が得られた。
【００３１】
【表３】
0003603374.tif 000004
比較例１
比較例として、立体障害が存在するがスーパー抗原結合部位が存在するα１領域とβ１領域を結合した融合蛋白質を作製した。この融合蛋白質は、実施例１に示す融合蛋白質とほぼ同じ配列であり、αヘリックスやβシートを形成するのに充分なアミノ酸構成を有するが、結合のためのスペーサーが立体障害となるように設計した。結合位置はαサブユニットの８７番目のアミノ酸残基とβサブユニットの第１０番目のアミノ酸残基を４アミノ酸残基のスペーサーを介して結合した融合蛋白質のための発現ベクターを作製した。
【００３２】
作製法は実施例１とほぼ同様に行い、制限酵素としてＮｃｏＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  によりαサブユニット断片をｐＵＴベクターに挿入し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ  によりＰＣＲでスペーサー及び翻訳終結信号を付加したβサブユニット断片を上記αサブユニットを挿入したｐＵＴベクターへ組み込んだ。
【００３３】
発現は実施例１と同様にヒートッショック法を用い、可溶化、精製、活性回復固相化そしてＴＳＳＴ−１結合試験も実施例１と同様に行った。その結果、表５に示すように、立体障害のために立体構造が回復せず、ＴＳＳＴ−１結合能が低下することが確認された。
【００３４】
【表４】
0003603374.tif 000005
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、ＭＨＣクラスＩＩの機能を維持したまま生産性・操作性を向上させ、固定化後の架橋操作が不要であり、且つ、スーパー抗原結合性やＴ細胞活性化等の機能を有する融合蛋白質を提供すると共にスーパー抗原の除去等に有用な融合蛋白質固定化材料を提供することが可能になった。