(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において第８２番目のアミノ酸を除く１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において第８２番目のアミノ酸を除く１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列を含む、ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニル二リン酸合成酵素を採取することを特徴とするゲラニル二リン酸合成酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項５記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニル二リン酸を採取することを特徴とするゲラニル二リン酸の製造方法。
【請求項８】
請求項５記載の形質転換体の培養物をイソペンテニル二リン酸又はその異性体に作用させることを特徴とするゲラニル二リン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲラニル二リン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、並びにゲラニル二リン酸合成酵素及びゲラニル二リン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内で重要な機能を持つ物質のうち、イソプレン（ｉｓｏｐｒｅｎｅ：２−メチル−１，３−ブタジエン）を構成単位として生合成される物質は数多い。これらの化合物はイソプレノイド（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）又はテルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）とも呼ばれ、炭素数によりヘミテルペン（ｈｅｍｉｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ５）、モノテルペン（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ１０）、セスキテルペン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ１５）、ジテルペン（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ２０）、セスタテルペン（ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ２５）、トリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ３０）、テトラテルペン（ｔｅｔｒａｔｅｒｐｅｎｅ，  Ｃ４０）などに分類される。
【０００３】
これらの物質の実際の生合成は、活性型イソプレン単位であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ：  ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が合成されるところから始まる。架空の前駆体物質として提唱されたイソプレン単位の真の姿は、結局、活性型イソプレン単位といわれるＩＰＰである。
ＩＰＰの異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ：  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ＩＰＰとの縮合反応によってゲラニル二リン酸（ＧＰＰ：  ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ネリル二リン酸（ｎｅｒｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ：  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ：  ｇｅｒａｎｙｌ  ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ：  ｇｅｒａｎｙｌ  ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘキサプレニル二リン酸（ＨｅｘＰＰ：  ｈｅｘａｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘプタプレニル二リン酸（ＨｅｐＰＰ：  ｈｅｐｔａｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの鎖状活性型イソプレノイドに合成されることが知られている。
【０００４】
ＦＰＰやＧＧＰＰなどでは全トランス型（ａｌｌ−Ｅ型）が活性型と考えられるが、ｃｉｓ縮合反応することによって天然ゴム、ドリコール・バクトプレノール（ウンデカプレノール）、あるいは植物で見出される各種ポリプレノール等が合成される。これらの化合物は、分子内に持つピロリン酸と炭素骨格とのリン酸エステル結合エネルギーを用いて縮合反応が進行することにより合成されるものと考えられ、反応副産物としてピロリン酸が生成すると考えられている。
【０００５】
ゲラニオール及びその異性体ネロールはいずれも薔薇油主成分の香料であり、楠抽出物の樟脳は、防虫剤としても利用されている。
アリル性（ａｌｌｙｌｉｃ）基質であるＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＧＦＰＰなどにＩＰＰを順次縮合していく活性型イソプレノイド合成酵素は、プレニル二リン酸合成酵素又はプレニルトランスフェラーゼと呼ばれている。プレニル二リン酸合成酵素は、主要反応産物の炭素数の違いにより名称を区別している。例えば、炭素数１５個のファルネシル二リン酸の生成を触媒する酵素はファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）と呼ばれ、炭素数２０個のゲラニルゲラニル二リン酸の生成を触媒する酵素はゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）と呼ばれる。
【０００６】
すでに、バクテリア、アーキア（ａｒｃｈａｅａ）、真菌、植物、動物から各種プレニル二リン酸合成酵素遺伝子が得られており、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素、オクタプレニル二リン酸合成酵素、ノナプレニル二リン酸合成酵素（ソラネシル二リン酸合成酵素）、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素などについて、酵素の精製、活性測定及び遺伝子クローニング・塩基配列決定が報告されている。
【０００７】
産業的にも生命科学的にも重要かつ多岐にわたる化合物合成の根本をなすこれらプレニル二リン酸合成酵素は、一般的に不安定であり比活性も低く、工業的に利用することが期待できなかった。ところが、ここ数年、好熱性のバクテリアやアーキアから耐熱性のＦＰＰ合成酵素やＧＧＰＰ合成酵素遺伝子が単離され  ［  Ａ．  Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｐｏｕｌｔｅｒ  （１９９３），  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６８（１５），  １１００２−１１００７；  Ｔ．  Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ），  １１３（３），  ３５５−３６３；    Ｓ．−ｉ．  Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９（２０），  １４７９２−１４７９７］、プレニル二リン酸合成酵素を利用するための条件が整ってきた。
【０００８】
炭素数１０〜２５のプレニル二リン酸を合成する酵素はホモダイマーであり、  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で反応させるのは比較的容易でその報告例も多い。その中でも炭素数１０のプレニル二リン酸であるＧＰＰを特異的に合成する活性をもつ酵素は、部分精製の報告はあるが（Ｌ．Ｈｅｉｄｅ  ａｎｄ  Ｕ．Ｂｅｒｇｅｒ，  １９８９，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  ２７３（２），  ３３１−８）単離されていない。豚の肝臓からＧＰＰ合成酵素の精製に成功したとして報告されているが（Ｊ．Ｋ．Ｄｏｒｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２４１（２２），  ５３５３−５３６０．）、この酵素はＦＰＰの合成も同時に触媒してしまうため、現在のプレニル二リン酸合成酵素の定義からはＦＰＰ合成酵素と呼ぶべきものである。
【０００９】
ＧＰＰは、知られている多くのモノテルペンのうち、最初の合成中間体であり、モノテルペンの生合成経路で最も重要な化合物である。
しかしながら、ＧＰＰ合成酵素遺伝子はいまだに単離されていない。
そこで、好熱性生物由来の安定で非活性の高いホモダイマー型のプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を人工的に改変し、ＧＰＰの合成反応を特異的に触媒するホモダイマー型耐熱性プレニル二リン酸合成酵素を人工的に作り出す技術が要求されている。
【００１０】
好熱性生物由来のプレニル二リン酸合成酵素としては、これまでに、バシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＦＰＰ合成酵素とスルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のＧＧＰＰ合成酵素で改変された例がある。Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓのＧＧＰＰ合成酵素の変異型酵素とその遺伝子は、ＨｅｘＰＰ合成酵素活性欠損の出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロール代謝能を相補することを指標にして選択された［  Ｓ．−ｉ．  Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１（３１），  １８８３１−１８８３７  ］。リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）合成を指標に、ＧＧＰＰ合成活性をもつＢ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＰＰ合成酵素の変異型酵素とその遺伝子が得られ［  Ｓ．−ｉ．  Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１（１７），  １００８７−１００９５］、更に、Ａｓｐ−ｒｉｃｈドメイン保存配列Ｉ（ＤＤＸＸ（ＸＸ）Ｄ）の５アミノ酸残基上流のアミノ酸残基をコードする遺伝子を部位特異的変異させることによって、ＧＧＰＰからＨｅｘＰＰまでのプレニル二リン酸を様々な割合で合成する１８種の変異型酵素とその遺伝子が得られた［  Ｓ．−ｉ．  Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１（４８），  ３０７４８−３０７５４  ］。そして、Ａｓｐ−ｒｉｃｈドメイン保存配列Ｉ（ＤＤＸＸ（ＸＸ）Ｄ）の５アミノ酸残基上流に位置するアミノ酸残基が反応産物の鎖長制御に関与することがわかった。
しかし、ＧＰＰを特異的に合成する活性を有する変異型酵素は得られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲラニル二リン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列の一部を置換することによりゲラニル二リン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質である。
【００１３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において第８２番目のアミノ酸
を除く少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質
さらに、本発明は、上記（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。
さらに、本発明は、配列番号２で表される塩基配列を含む、ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子である。
さらに、本発明は、前記遺伝子を含む組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターによって形質転換された形質転換体である。
【００１４】
さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニル二リン酸合成酵素を採取することを特徴とするゲラニル二リン酸合成酵素の製造方法である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からゲラニル二リン酸を採取することを特徴とするゲラニル二リン酸の製造方法である。
さらに、本発明は、前記形質転換体の培養物をイソペンテニル二リン酸又はその異性体に作用させることを特徴とするゲラニル二リン酸の製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
プレニル二リン酸合成酵素（ヘテロダイマーの場合は一方のサブユニット）のアミノ酸配列には５つの保存領域が存在することが知られている  ［  Ａ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，３（４），  ６００−６０７  ］  。この５つの保存領域には、反応産物又は反応基質が結合していると考えられているアスパラギン酸残基に富む領域が２箇所存在する。この領域を「アスパラギン酸リッチドメイン」又は「Ａｓｐ−ｒｉｃｈドメイン」といい、このうち、プレニル二リン酸合成酵素のアミノ末端側に位置するＡｓｐ−ｒｉｃｈドメイン（保存領域ＩＩ）をＡｓｐ−ｒｉｃｈドメインＩ（配列：「ＤＤＸＸ（ＸＸ）Ｄ」（配列中、かっこ内の「ＸＸ」は存在しない場合がある））とし、カルボキシル末端側に位置するＡｓｐ−ｒｉｃｈドメイン（保存領域Ｖ）をＡｓｐ−ｒｉｃｈドメインＩＩとして両者を区別する。
【００１６】
上記のようなアスパラギン酸リッチドメインを有するプレニル二リン酸合成酵素としては、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素、オクタプレニル二リン酸合成酵素、ノナプレニル二リン酸合成酵素、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素などがあげられる。さらに具体的な例として、バシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のファルネシル二リン酸合成酵素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のファルネシル二リン酸合成酵素、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のファルネシル二リン酸合成酵素、ラットのファルネシル二リン酸合成酵素、ヒトのファルネシル二リン酸合成酵素、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のヘキサプレニル二リン酸合成酵素などが挙げられる。これらのうち、細菌型のファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列における領域Ｉ〜Ｖのアミノ酸配列を図４に示す。図４において、１．はバシルス・ステアロサーモフィラス由来のファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を、２．は大腸菌由来のファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を示す。枠で囲まれた部分（四角内）はアスパラギン酸リッチドメインＩ、星印（☆）はアスパラギン酸リッチドメインＩのＮ末端から４アミノ酸残基分Ｎ末端側のアミノ酸残基を示す。
【００１７】
本発明は、前記Ａｓｐ−ｒｉｃｈドメインＩよりも４アミノ酸残基上流に位置するアミノ酸残基を、そのアミノ酸よりも大きな分子量を持った他のアミノ酸残基に改変することにより、ゲラニル二リン酸合成酵素を創出し、当該酵素反応によりゲラニル二リン酸を製造することを特徴とする。すなわち、前記アスパラギン酸リッチドメインＩを構成するアミノ酸配列「ＤＤＸＸ（ＸＸ）Ｄ」のうち、Ｎ末端のアミノ酸（Ａｓｐ）から４個Ｎ末端側に存在するアミノ酸残基（図４、☆印を付したＳｅｒ）を、Ｓｅｒよりも分子量の大きい他のアミノ酸残基（Ｇｌｙ及びＡｌａを除くいずれかのアミノ酸、すなわちＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ及びＰｒｏからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸）に置換するものである。置換するアミノ酸はＧｌｙ及びＡｌａ以外であれば特に限定されないが、Ｐｈｅが好ましい。
【００１８】
具体的には、本発明のゲラニル二リン酸合成酵素は、ファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列番号５に記載のアミノ酸配列を参照）のうち第８２残基目のＳｅｒ残基を、例えばＰｈｅ残基に置換することにより得ることができる。
かかる置換は、例えば、熱安定性も高く比活性も高いと報告されているＢ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  由来のＦＰＰ合成酵素遺伝子の塩基配列を一部改変することにより行うことができる。
【００１９】
（１）  変異導入の目的遺伝子の調製
変異を導入するための目的遺伝子は、バシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＦＰＰ合成酵素（以下ＢｓｔＦＰＳと略す）遺伝子である。ＢｓｔＦＰＳ遺伝子の全塩基配列は公知であり（Ｔ．Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １１３，  ３５５−３６３；配列番号４）、またＤＤＢＪなどの遺伝情報データベースでアクセッション番号Ｄ１３２９３として公開されている。
【００２０】
Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓもＡＴＣＣなどの各種微生物の寄託機関から入手可能であるため（ＡＴＣＣ  １０１４９）、通常の遺伝子クローニング法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によってＢｓｔＦＰＳ遺伝子部分のＤＮＡを得ることができる。
次に、得られたＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクター（例えばｐＴＶ１１８Ｎ；宝酒造）につないで変異導入のためのプラスミドＤＮＡとする。このプラスミドＤＮＡをｐＦＰＳとする。
【００２１】
（２）  変異導入用オリゴヌクレオチドの合成及び変異の導入
変異導入のためのオリゴヌクレオチドは、ＢｓｔＦＰＳの８２位のアミノ酸残基をコードするＳｅｒコドンを、Ｇｌｙ及びＡｌａを除く任意の（Ｓｅｒ以外の）  アミノ酸をコードするコドン（例えばＰｈｅコドン）に置換する目的に加えて、新たにＢｓｐＨＩの切断部位（５’ＴＣＡＴＧＡ  ３’）が導入されるような設計になっており、例えば以下の塩基配列が挙げられる。
【００２２】
５’  ＣＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ３’（配列番号６）
この塩基配列は、ＢｓｐＨＩ切断部位を導入してもＢｓｔＦＰＳ遺伝子がコードするアミノ酸配列はコドンの縮重により変化しないよう設計されている。この切断部位の導入により、ＢｓｐＨＩ消化後のアガロースゲル電気泳動で置換変異導入されたプラスミドを検出することができる。
【００２３】
なお、オリゴヌクレオチドの合成は通常の化学合成装置を用いて行うことができ、さらに合成したオリゴヌクレオチドをリン酸化した後失活処理（例えば７０℃で１０分間）しておくことが好ましい。
次に、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記の通り作製したプラスミドに置換変異を導入する。変異の導入法は特に限定されず、例えばＫｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８５）８２，４８８）に基づく市販のキット（Ｍｕｔａｎ−Ｋキット；宝酒造社）を用いてもよく、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いてもよい。
【００２４】
得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、相補鎖合成用プライマーＤＮＡをアニーリングさせて二本鎖を合成する。これをプラスミドに組み込んで大腸菌株に形質転換を行う。
本発明の遺伝子は、例えば、生来のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号４）に部位特異的変異やＰＣＲ法等の常法にしたがって変異を導入することにより容易に得ることが出来る。
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバート法、ダイデオキシ法等の公知手法により行うことができるが、通常はダイデオキシ法に基づいた自動塩基配列決定装置を用いて配列決定が行われる。
【００２５】
配列番号２に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号１及び３に本発明のゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がゲラニル二リン酸合成酵素活性を有する限り、変異が導入されたアミノ酸配列（配列番号１又は３）の第８２番目のアミノ酸（例えばＰｈｅ）を除く当該アミノ酸配列において少なくとも１個（例えば１若しくは数個）のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列の第１番目のＭｅｔが欠失した配列を有するものなども、本発明のゲラニル二リン酸合成酵素に含まれる。また、これらのゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含まれる。
【００２６】
ここで、ゲラニル二リン酸合成酵素活性とは、ＩＰＰ又はその異性体（例えばＤＭＡＰＰ）を基質としてＧＰＰを合成する触媒活性を意味する。なお、変異の導入は、前記と同様の手法により行うことができる。
一旦本発明のゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は該遺伝子を鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２７】
（３）  ベクターの構築
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。本発明の組換えベクターを作製するのに使用できるベクターは、大腸菌等からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，  Ｈ．Ｃ．  ＆  Ｄｏｌｙ，  Ｊ．（１９７９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ７：  １５１３）又はその変法等により調製することができる。また、市販のものをそのまま用いてもよく、目的に応じて誘導した各種ベクターを用いてもよい。例えば、ｐＭＢ１由来の複製開始点を持つｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ２３３−３、ｐＴｒｃ９９Ａなどが挙げられる。また、コピー数が向上するように改変したｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６など、さらには、ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、Ｒ１、Ｆ因子等に由来するプラスミドも挙げられる。さらに、発現後の精製がより容易な融合タンパク質発現ベクター、例えばｐＧＥＸ系ベクターやｐＭａｌ系ベクターも利用できる。
【００２８】
また、プラスミド以外にもλファージやＭ１３ファージのようなウィルスベクターやトランスポゾンによっても遺伝子導入が可能である。ファージ  ＤＮＡとしては、例えば  Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９  、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が挙げられる。
これらのベクターへのゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子断片の組込みは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知の方法で行うことが出来る。例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター  ＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２９】
本発明の遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、宿主に応じた複製開始点、発現制御配列などを含めることができる。さらに、転写プロモーター、転写ターミネーター、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。この場合、プロモーターとしてはＰｔａｃ、Ｐｌａｃ、Ｐｔｒｃが挙げられ、ターミネーターとしてはｒｒｎＢターミネーターが挙げられ、リボソーム結合配列としてはＳＤ配列（５’−ＡＧＧＡＧＧ−３’で代表される）が挙げられる。
こうして作製されるプラスミドベクターの具体的なものとしては実施例中のｐＦＰＳｍが挙げられる。
【００３０】
（４）  形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の発現用組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）等のエッシェリヒア属又はバシルス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）等のサッカロミセス属又はピキア属に属する酵母、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属に属する糸状菌、カイコの培養細胞、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいは植物細胞等が挙げられる。
【００３１】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、転写プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写ターミネーターにより構成されていることが好ましい。また、転写プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
ＤＮＡからｍＲＮＡの転写を開始するするプロモータ配列として、天然に存在する配列（例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｂｌａ、ｌｐｐ、ＰＬ、ＰＲ、Ｔ３、Ｔ７など）を用いることができる。また、これらのプロモーター以外にも、それらの変異体（例えばｌａｃＵＶ５）又は天然にあるプロモーター配列を人工的に融合した配列（例えばｔａｃ、ｔｒｃなど）が知られており、本発明にも使用できる。
【００３２】
ここで、ｍＲＮＡから蛋白質を合成する能力を調節する配列として、リボソーム結合部位（ＧＡＧＧおよびその類似配列）から開始コドンであるＡＴＧまたはＧＴＧまでの距離が重要であることは既知である。また、３’側に転写終了を指令するターミネーター（例えば、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２）が組換え体での蛋白質合成効率に影響することはよく知られている。従って、本発明では、これらの配列を使用することにより、遺伝子の発現を効率よく行わせることができる。
細菌への外来遺伝子の導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ６９，  ２１１０−２１１４（１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３３】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター等が挙げられる。
酵母への外来遺伝子の導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，  １８２−１８７  （１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，  ８４，１９２９−１９３３  （１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））等が挙げられる。
【００３４】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ等が用いられる。この場合、プロモーターとしてヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
動物細胞への外来遺伝子の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３５】
植物細胞への外来遺伝子の導入方法としては、アグロバクテリウムによる感染法が広く用いられ、直接導入法としては例えばプロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ボンバードメント法等が挙げられる。
なお、本発明の組換えベクターは、大腸菌ＤＨ５αに導入され（ｐＦＰＳｍ（Ｓ８２Ｆ）／ＤＨ５α）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５５０として寄託されている。
【００３６】
（５）ゲラニル二リン酸合成酵素の製造
本発明のゲラニル二リン酸合成酵素は、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養が効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、グリセロール、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
【００３８】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、塩化カルシウム等が用いられる。
培養は、大腸菌を宿主として用いた場合、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で１６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、バッファー等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００４０】
培養は、通常、５〜１０％ＣＯ２存在下、３７℃で２〜２０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＭＳ培地、又はこの培地にカナマイシン、各種植物ホルモン等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、２０〜３０℃で３〜１４日行う。
【００４１】
培養後、本発明のゲラニル二リン酸合成酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕して細胞抽出物を調製する。また、本発明のゲラニル二リン酸合成酵素が菌体外又は細胞外に生産される場合には遠心分離等により菌体又は細胞を除去して培養上清を調製する。次に、これらの培養物（細胞抽出物又は培養上清）を、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば塩析、有機溶剤沈殿、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、当該培養物中から本発明のゲラニル二リン酸合成酵素を単離精製することができる。
但し、本発明のゲラニル二リン酸合成酵素は、上記培養物から酵素を精製しなくてもゲラニル二リン酸合成酵素活性を有する場合もあるため、当該酵素活性を有する限り、その細胞抽出物又は培養液をそのまま粗酵素溶液として用いることもできる。
【００４２】
（６）  プレニル二リン酸の製造
本発明によれば、実施例に示すように、本発明のＤＮＡにより形質転換した宿主を培養することにより、培養物中にＧＰＰを蓄積することができ、これを採取することによりＧＰＰを製造することができる。
本発明はまた、本発明の酵素を基質となるＩＰＰ又はＤＭＡＰＰに作用させることによってもＧＰＰを製造することができる。この方法においては、溶媒、特に水溶液中で、本発明の酵素を反応基質に作用させ、必要に応じて反応溶液中から目的とするプレニル二リン酸を採取すればよい。酵素としては、生成酵素だけではなく、種々の段階まで半精製して得られる粗酵素、または培養菌体もしくは培養物などの酵素含有物でもよい。また、前記の酵素、粗酵素または酵素含有物を常法にしたがって固定した固定化酵素であってもよい。
基質としてはＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰが用いられる。反応用の溶媒としては水または水性緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝液やリン酸緩衝液が用いられる。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は以下の実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
なお、本明細書中で、アミノ酸残基は以下の１文字表記または３文字表記の略号で示される。
【００４４】
Ａ；Ａｌａ；アラニン
Ｃ；Ｃｙｓ；システイン
Ｄ；Ａｓｐ；アスパラギン酸
Ｅ；Ｇｌｕ；グルタミン酸
Ｆ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン
Ｇ；Ｇｌｙ；グリシン
Ｈ；Ｈｉｓ；ヒスチジン
Ｉ；Ｉｌｅ；イソロイシン
Ｋ；Ｌｙｓ；リジン
Ｌ；Ｌｅｕ；ロイシン
Ｍ；Ｍｅｔ；メチオニン
Ｎ；Ａｓｎ；アスパラギン
Ｐ；Ｐｒｏ；プロリン
Ｑ；Ｇｌｎ；グルタミン
Ｒ；Ａｒｇ；アルギニン
Ｓ；Ｓｅｒ；セリン
Ｔ；Ｔｈｒ；スレオニン
Ｖ；Ｖａｌ；バリン
Ｗ；Ｔｒｐ；トリプトファン
Ｙ；Ｔｙｒ；チロシン
【００４５】
また、アミノ酸残基の置換は「置換前のアミノ酸残基」「アミノ酸残基番号」「置換後のアミノ酸残基」の順番で１文字表記のアミノ酸残基記号で表す。
例えば、第８２番目のＳｅｒをＰｈｅに置換する場合は、「Ｓ８２Ｆ」のように表示する。
【００４６】
〔実施例１〕  ＦＰＰ合成酵素遺伝子を含むプラスミドの作製
宝酒造より市販されているプラスミドベクターｐＴＶ１１８ＮのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にバシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＦＰＰ合成酵素（ＢｓｔＦＰＳ）遺伝子をサブクローニングした。このプラスミドＤＮＡをｐＦＰＳとする。なお、ＢｓｔＦＰＳ遺伝子の全塩基配列は、Ｔ．Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １１３，  ３５５−３６３、又はＤＤＢＪなどの遺伝情報データベースでアクセッション番号Ｄ１３２９３として公開されている。
【００４７】
〔実施例２〕変異導入用オリゴヌクレオチドの合成
実施例１で得られた遺伝子に変異を導入するため、次のオリゴヌクレオチドを合成した。
５’  ＣＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ３’（配列番号６）
上記オリゴヌクレオチドの配列は、ＢｓｔＦＰＳの８２位のアミノ酸残基をコードするＳｅｒコドンをＰｈｅコドンに置換する目的に加えて、新たにＢｓｐＨＩの切断部位（５’ＴＣＡＴＧＡ  ３’）が導入されるような設計になっている。このＢｓｐＨＩ切断部位の導入ではコドンの縮重のためＢｓｔＦＰＳ遺伝子がコードするアミノ酸配列は変化しない。ＢｓｐＨＩ切断部位の導入により、ＢｓｐＨＩ消化後のアガロースゲル電気泳動で置換変異導入されたプラスミドを検出することができる。
合成したオリゴヌクレオチドは以下の反応溶液中で３７℃で３０分間リン酸化をした後７０℃で１０分間失活処理した。
【００４８】
0003562280.tif 000002
【００４９】
〔実施例３〕ＢｓｔＦＰＳ遺伝子の８２位のアミノ酸残基に対するコドンへの置換変異の導入
実施例２で作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＫｕｎｋｅｌ法によって実施例１で作製したプラスミドに置換変異を導入した。Ｋｕｎｋｅｌ法を行うにあたっては、宝酒造から市販されているＭｕｔａｎ−Ｋキットを用いた。実験手順もＭｕｔａｎ−Ｋキット添付の実験書に従った。
大腸菌ＣＪ−２３６をホスト細胞としてプラスミドｐＦＰＳ中のチミン塩基がデオキシウラシル塩基に置き換わった一本鎖ＤＮＡを調製した。
得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型にして相補鎖合成用プライマーＤＮＡを下記のようにアニーリングさせた。
【００５０】
0003562280.tif 000003
【００５１】
さらに、２５μｌの伸長緩衝液、６０ユニットの大腸菌ＤＮＡ  リガーゼ、１ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを加え、２５℃で２時間相補鎖合成反応を行った。ただし、伸長緩衝液は、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  （ｐＨ８．０）、６０  ｍＭ酢酸アンモニウム、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５  ｍＭ  ＤＴＴ、１  ｍＭ  ＮＡＤ、０．５  ｍＭ  ｄＮＴＰである。
反応後、３μｌの０．２  Ｍ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）を加え、６５℃で５分間処理することにより反応を停止させた。
【００５２】
〔実施例４〕ＢｓｔＦＰＳ遺伝子の８２位のアミノ酸残基に対するコドンへ置換変異が導入された遺伝子を持つ形質転換体の作製
実施例３により作製したＤＮＡ溶液を用いて、下記のようにして大腸菌ＤＨ５α株へＣａＣｌ２法により形質転換を行った。すなわち、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２で処理したＤＨ５αコンピテント細胞懸濁液にＤＮＡ溶液を加え、氷上で３０分保持した。
得られた形質転換体を、形質転換選択マーカーであるアンピシリン含有寒天プレートにまき、３７℃で一晩培養した。アンピシリン耐性を表現型としてもつ形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓｐＨＩ消化後アガロースゲル電気泳動にかけることにより、得られた形質転換体のうち、ＢｓｐＨＩ切断部位をＢｓｔＦＰＳコード領域に持つ置換変異型ｐＦＰＳプラスミドを選択した。
【００５３】
次に、選択した置換変異型ｐＦＰＳプラスミドのＢｓｔＦＰＳ遺伝子の８２位アミノ酸残基に対するコドン周辺の塩基配列をダイデオキシ法によって決定した。その結果、８２位のＳｅｒコドン（ＴＣＴ）がＰｈｅ（ＴＴＣ）コドンに置き換わった置換変異型ＢｓｔＦＰＳ遺伝子（配列番号２）を含むｐＦＰＳプラスミドが得られた。この変異体をＳ８２Ｆと表示し、プラスミドをｐＦＰＳｍとする。
【００５４】
〔実施例５〕変異型ＢｓｔＦＰＳの活性測定
実施例４で得られた変異型および野生型ＢｓｔＦＰＳ遺伝子を含む２種の形質転換体、さらに、ベクターｐＴＶ１１８Ｎのみを保持する形質転換体から下記のようにして粗酵素液を調製した。
２ｘ  ＬＢ培地で一晩培養した形質転換体を遠心により集菌し、菌体破砕用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  （ｐＨ８．０）、  １０  ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。これを超音波破砕処理し、さらに、４℃、１０，０００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分遠心処理した上清を５５℃で３０分熱処理し、大腸菌由来のプレニル二リン酸合成酵素活性を失活させた。これをさらに同条件で遠心処理し、その上清を粗酵素抽出液として下記の反応溶液中、５５℃で１５分反応を行った。
【００５５】
0003562280.tif 000004
【００５６】
反応後、３ｍｌの水飽和ブタノールを加えて反応産物をブタノール層に抽出した。得られたブタノール層１ｍｌに液体シンチレーター３ｍｌを加えて、液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定した。
結果を図１に示す。図１はＳ８２Ｆ変異型ＢｓｔＦＰＳと野生型ＢｓｒＦＰＳの酵素活性を示すグラフである。サンプル番号１、４、７はベクターｐＴＶ１１８Ｎのみを保持する宿主から調製したもの、サンプル番号２、５、８はＳ８２Ｆ変異型ＢｓｔＦＰＳをコードする遺伝子を保持する宿主から調製したもの、サンプル番号３、６、９は野生型ＢｓｔＦＰＳをコードする遺伝子を保持する宿主から調製したものである。また、サンプル番号１、２、３はアリル性基質としてＤＭＡＰＰを用いたときの結果を、サンプル番号４、５、６はアリル性基質としてＦＰＰを用いたときの結果を、サンプル番号７、８、９はアリル性基質としてＦＰＰを用いたときの結果を示す。
【００５７】
図１より、野生型酵素はＤＭＡＰＰとＧＰＰをアリル性基質として利用できＦＰＰを基質としないが、Ｓ８２Ｆ変異型酵素はＧＰＰをアリル性基質として利用する能力が極端に低下していることがわかる。
次に、別途同様に作製した反応液に、反応後すぐにジャガイモ酸性フォスファターゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌジャガイモ酸性フォスファターゼ、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７））１ｍｌを加えて３７℃で脱リン酸化処理をした後、３ｍｌのペンタンで抽出した。これを薄層クロマトグラフィー（逆相ＴＬＣプレート：ＬＫＣ１８（Ｗｈａｔｍａｍ社製）、展開溶液：アセトン／水＝９／１）により解析した。展開された脱リン酸化された反応産物をバイオイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）にかけ、放射活性の位置及び相対量を決定した。
【００５８】
結果を図２及び図３に示す。図２は、各アリル性基質を用いたときの変異型ＢｓｔＦＰＳ反応産物の脱リン酸化物におけるＴＬＣ展開パターンを示す。比較として、野生型ＢｓｔＦＰＳとベクターのみを保持する宿主より調製したサンプルを用いたときのものも示す。ｓ．ｆ．は溶媒先端、ｏｒｉ．は展開開始点、ＧＯＨはゲラニオール標準試料の展開位置、ＦＯＨはファルネソール標準試料の展開位置をそれぞれ表す。ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅは野生型ＢｓｔＦＰＳを用いたときの結果、Ｓ８２Ｆは変異型ＢｓｔＦＰＳを用いたときの結果、ｖｅｃｔｏｒはベクターのみを保持する宿主を用いたときの結果を示す。ｎ．ｄ．は活性が検出されなかったものを表す。図３は、野生型ＢｓｔＦＰＳと変異型ＢｓｔＦＰＳの反応産物特異性を示すグラフであって、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを基質とした際のＧＧＰＰ、ＦＰＰ及びＧＰＰの生成割合を示すものである。
図２及び図３の結果より、野生型ＢｓｔＦＰＳはＦＰＰを特異的に合成する反応を触媒していたが、Ｓ８２Ｆ変異型ＢｓｔＦＰＳではＧＰＰを特異的に合成する反応を触媒するようになった。すなわち、Ｓ８２Ｆ変異型ＢｓｔＦＰＳは、ゲラニル二リン酸合成酵素と呼びうる酵素に変化したことになる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、ゲラニル二リン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、並びにゲラニル二リン酸合成酵素及びゲラニル二リン酸の製造方法が提供される。
本発明の遺伝子は、モノテルペン類合成を目的とした代謝工学や酵素工学に利用できる点で有用である。
【００６０】
【配列表】
0003562280.tif 000005
0003562280.tif 000006
【配列表】
0003562280.tif 000007
0003562280.tif 000008
【配列表】
0003562280.tif 000009
0003562280.tif 000010
【００６１】
0003562280.tif 000011
0003562280.tif 000012
0003562280.tif 000013
【００６２】
0003562280.tif 000014
0003562280.tif 000015
【００６３】
0003562280.tif 000016
0003562280.tif 000017
0003562280.tif 000018
【００６４】
0003562280.tif 000019
0003562280.tif 000020
【００６５】
0003562280.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】変異型ＢｓｔＦＰＳと野生型ＢｓｒＦＰＳの酵素活性の結果を示す図である。
【図２】薄層クロマトグラフの写真である。
【図３】変異型ＢｓｔＦＰＳと野生型ＢｓｒＦＰＳの反応産物特異性を示す図である。
【図４】ファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列を比較した図である。
【図１】
0003562280.tif 000022
【図２】
0003562280.tif 000023
【図３】
0003562280.tif 000024
【図４】
0003562280.tif 000025