(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン特異的応答を促進するための、哺乳動物成長ホルモン受容体に特異的なモノクローナル抗体の治療量を含有する医薬組成物であって、該モノクローナル抗体が該受容体と架橋して３要素複合体を形成し、該受容体を活性化するものである医薬組成物。
【請求項２】
該哺乳動物がヒトであり、該モノクローナル抗体がＭＡｂ２６３である請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポリペプチド配位子と受容体の相互作用の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
配位子（リガンド）が誘発する受容体のオリゴマー化は、細胞外配位子結合ドメインを含有するチロシンキナーゼ受容体の大きなファミリーにとって信号変換の作用機序であると提唱されてきた（概略についてはＹａｒｄｅｎ，Ｙ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５７：４４３−４７８（１９８８）；Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２（１９９０）を参照のこと）。
これらのモデルでは１受容体（Ｒ）につき１ホルモン分子（またはサブユニット）（Ｈ）の結合がＨ２Ｒ２複合体の形成を誘発すると考えられている。例えば架橋性および非解離性の電気泳動的研究は、表皮成長因子（ＥＧＦ）がＥＧＦ受容体の二量化を促進し、受容体の自己リン酸化と細胞内チロシンキナーゼの活性化がそれに続くことを示唆している（Ｓｈｅｃｔｏｒ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７８：８３５−８３８（１９７９）；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ａ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：８４６−８５３（１９８３）；Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１４３４−１４４２（１９８７）；Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１４４３−１４５１（１９８７））。インスリン受容体（Ｋａｈｎ，Ｃ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４２０９−４２１３（１９７８）；Ｋｕｂａｒ  Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１０８６−１０９３（１９８９）；Ｈｅｆｆｅｔｚ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：８８９−８９４（１９８６））、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５−８９１２（１９８９）；Ｈａｍｍａｃｈｅｒ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２４８９−２４９５（１９８９）；Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８７７１−８７７８（１９８９））およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）受容体（Ｉｋａｒｉ，Ｎ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：８３１−８３７）を含む他のチロシンキナーゼ受容体の研究は、受容体のオリゴマー化がその生物学的効果と強く共役していることを示している。他のグループは最近、その細胞外結合ドメインと錯化したポリペプチドホルモンを結晶化させている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２７３０−１２７３６（１９８９）；Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２０８２−２２０８５（１９９０））。しかし、これらの受容体または他の受容体において配位子が誘発する変化に関する構造上の摂動と必要条件のより詳細な分析は、これらの膜結合系の複雑さと、高度に精製された天然の受容体または組換え受容体の量が適当でないという理由によって妨害されてきた。
【０００３】
精製された受容体が利用可能な場合、その検定法はしばしばホルモン−受容体複合体の性質が認識されないほどに組織化されていた。米国特許第５０５７４１７号では、組換えｈＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ｈＧＨｂｐ）またはｈＧＨ結合タンパク質への結合に関する非標識ｈＧＨと１２５Ｉ−ｈＧＨの競争を用いてｈＧＨ結合検定を行い、形成した複合体を沈殿させるために、得られた複合体をｈＧＨｂｐに対する抗体＋ポリエチレングリコールで処理している。これらの免疫沈殿検定法はｈＧＨがｈＧＨｂｐと１：１の複合体を形成することを示唆した。この免疫沈殿検定法は結合した１２５Ｉ−ｈＧＨの量を正しく検出したが、誤って１：１のモル比を示した。
【０００４】
ｈＧＨの受容体と結合タンパク質に関する様々な固相検定法が使用されてきた。そのような検定法は結合したｈＧＨの量を検出したが、受容体に対するｈＧＨのモル比を検出するものではなかった。固相またはｈＧＨ受容体を含有する膜画分を用いる結合検定法は、活性な受容体の総量および／または結合した内因性ｈＧＨの量を検出することができなかったので、受容体に対するｈＧＨのモル比を決定するには適していなかった。ＥＧＦに関するものなど、先の研究に基づいて、ｈＧＨ−受容体複合体はＨ２Ｒ２四量体であろうと推測されていた。
【０００５】
ヒト肝臓からクローニングされたｈＧＨ受容体（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５３７（１９８７））は１つの細胞外ドメイン（〜２８ｋＤ）、貫膜セグメントおよび細胞内ドメイン（〜３０ｋＤ）を有し、既知のチロシンキナーゼまたは他のタンパク質のいずれとも相同でない。それにもかかわらずｈＧＨ受容体の細胞外部分はプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ  ６９（１９８８））の細胞外ドメインに構造的に関連しており、概していえば少なくとも８つの他のサイトカインおよび関連受容体に構造的に関連している。大腸菌内で発現されるｈＧＨｂｐは１リットルにつき数十ミリグラム分泌されている（Ｆｕｈ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３１１１−３１１５（１９９０））。高度に精製されたｈＧＨｂｐは血清中に認められる天然のｈＧＨｂｐと比較して、ｈＧＨについて同じ特異性と高い親和性を保持している（ＫＤ〜０．４ｎＭ）。
【０００６】
ｈＧＨは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチンおよび成長ホルモンの他の遺伝的変種および種変種を含む相同なホルモンファミリーの一構成要素である（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｃ．Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，７：１６９（１９８６））。ｈＧＨは広範な種特異性を示し、クローン化された体因性受容体（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７）またはプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ，５３：６９）のいずれかに結合する点で、これらの中では珍しいものである。クローン化されたｈＧＨの遺伝子は大腸菌中で分泌型として発現されており（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．ら，Ｇｅｎｅ  ５５：１８９（１９８７））、そのＤＮＡとアミノ酸配列は既に報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）；Ｇｒａｙら，Ｇｅｎｅ  ３９：２４７（１９８５））。ｈＧＨの三次元構造はこれまで利用できなかった。しかしブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）に関する三次元折り畳みパターンが中ぐらいの解像度と精度で報告されている（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６４３４（１９８７））。相同体走査（ｈｏｍｏｌｏｇ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異導入法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０，１９８９）によってｈＧＨ受容体および抗体結合部位が同定されている。Ｎ−末端アミノ酸が欠失または変化しているＧＨは知られている。Ｇｅｒｔｌｅｒら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１８：７２０（１９８６）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２１：４１４（１９８７）、Ｂｉｎｄｅｒ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，７：１０６０−１０６８（１９９０）およびＷＯ９０／０５１８５を参照のこと。ｈＧＨの拮抗薬変種はＣｈｅｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，５（１０）：１８４５（１９９１）とその参考書目に記載の文献およびＷＯ９１／０５８５３に記述されている。ｈＧＨ変種はＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１（１９８９）およびＳｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）に開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
多くのポリペプチド配位子のそれらの受容体との相互作用の様式は未だ不明のままであるから、所望の特性を達成するべくそれらの配位子のアミノ酸配列変種を工作することは困難であった。基本的には、おそらくある場合には同様に作用する配位子または動物相同体の相同性分析や、例えば断片（例：トリプシン消化断片）の分析からもたらされる指針の下に、無作為に変異を導入してきた。次いで、所望の活性（例：作用薬または拮抗薬活性）について候補物質をスクリーニングしてきた。これらのスクリーニング法は単調で退屈であり、かつ、費用のかかるものであった（例：形質転換動物の使用（ＷＯ９１／０５８５３））。候補物質の選択の効率を改善する方法が求められている。具体的には、拮抗薬または作用薬であると思われる候補物質に集中させる方法が求められている。拮抗薬は天然の配位子の生物学的活性を抑制、阻害または妨害する物質であり、一方、作用薬は活性自体は天然の配位子より強い活性を示すが、それ自身は生物学的活性をもたない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、作用性または拮抗性ポリペプチド配位子を効率よく選別するための改善された方法；その受容体と逐次的に１：２の複合体を形成する配位子を検出する方法；上述の１：２配位子−受容体複合体の形成を妨害または促進する能力について候補物質を検定すること；作用薬または拮抗薬として作用することができるポリペプチド配位子のアミノ酸配列変種、を技術的背景とする。
したがって、本発明は、成長ホルモン特異的応答を促進するための医薬組成物であって、哺乳動物成長ホルモン受容体に特異的なモノクローナル作用薬抗体の治療量を含有する該医薬組成物、好ましくは該哺乳動物がヒトであり、該モノクローナル抗体がＭＡｂ２６３である上記本発明の医薬組成物を提供する。
本発明のその他の目的、特性および特長は下記の説明と添付の請求の範囲を考慮すればより明白になるであろう。
【０００９】
我々は予想外にも、成長ホルモンとそれらが属する立体配座的な配位子の一群がそれらの受容体と１：２の複合体を形成することができ、その場合、第１の配位子部位（部位１）が１つの受容体に結合し、次いで第２の配位子部位（部位２）がもう１分子の受容体に結合することによって１：２の複合体を与えることを発見した。本発明を適用することができる配位子は、両末端が非螺旋アミノ酸配列で終わっていて、かつ、非螺旋アミノ酸配列によって分断されている４つの両親媒性逆平行アルファ螺旋ドメインを含有する単量体配位子である。以下に詳述するように、成長ホルモン、プロラクチンおよび胎盤性ラクトゲンを用いた我々の研究への類比によって、部位１および／または２にアミノ酸配列変異を導入することによって上記配位子の作用性または拮抗性アミノ酸配列変種を効率よく設計することが可能になった。
【００１０】
配位子作用薬または拮抗薬である物質についてスクリーニングするために、２部位複合体形成検定法を用いる。このような物質は基本的には制約がなく、配位子のアミノ酸配列変種および結合タンパク質または受容体変種と共に、非タンパク質性有機化合物が含まれる。
このようなアルファ螺旋配位子の新しいアミノ酸配列変種についても記述する。具体的には、部位２における受容体への配位子の親和性を減少もしくは排除するアミノ酸配列突然変異を部位２に含む、ポリペプチド配位子に関する拮抗薬を提供する。理想的には、該配位子拮抗薬類縁体は部位２における受容体への親和性か低いか、もしくはそのような親和性を有さず、部位１における受容体への親和性が増大しているであろう。
【００１１】
また、一部位または両部位の配位子親和性を増大させる突然変異を部位１および／または部位２に有する作用薬配位子アミノ酸配列変種をも本明細書に開示する。好ましい態様として、二量体複合体中の配位子の平均滞在時間が、所望の細胞応答を達成するためにその複合体が必要とする時間と同じかそれ以上であるように、両部位の速度定数を選択する。配位子のポリペプチド作用薬変種は、（ａ）配位子に突然変異を導入して作用薬候補を作成し、（ｂ）その候補物質が第１の配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｃ）その候補物質が第２の配位子部位を介して受容体に結合する親和性を決定し、（ｄ）その候補物質が第１および第２部位の一方または両方で天然の配位子よりも高い親和性で結合する場合にそれを作用薬として選択することからなる方法によって同定される。
【００１２】
本発明によれば、ポリペプチド配位子の作用薬または拮抗薬候補を検出する方法であって、該配位子が通常逐次的に、まず第１の配位子部位を介して受容体ポリペプチドに結合し、次いで第１の部位とは異なる第２の配位子部位を介してもう１つの受容体ポリペプチドに結合し、配位子の第２の受容体結合部位における受容体に関するポリペプチド配位子の親和性に対する該候補の効果を決定することからなる方法が提供される。部位１の相互作用は後述するＭａｂ５などの部位２遮断抗体を用いる免疫沈殿によって決定される。あるいは、実質的に受容体と１：１の複合体のみを形成する野生型配位子の量を決定し、次いで受容体に関して上記の比率で天然の配位子と競合するという候補物質の能力を決定する。３要素複合体を形成するという候補物質の能力を追跡することによって部位２の相互作用を検定する。
【００１３】
候補物質が配位子のポリペプチド類縁体である場合には、部位２におけるその類縁体の結合の欠如が拮抗薬活性と正の相関を示す。受容体部位２に天然の配位子より高い親和性で結合する能力は作用薬活性と相関する。拮抗薬活性と作用薬活性は共に、部位１において天然の配位子より高い親和性で結合するという候補物質の能力と正に相関する。部位１および／または部位２に対する天然の配位子の結合を促進または抑制するというそれらの能力について、小分子または他の非類縁体候補物質を検定する。拮抗薬は、部位２および／または部位１（好ましくは部位２）における天然の配位子−受容体結合を妨害するというそれらの能力についてスクリーニングする。これは、例えばその配位子の部位２損傷変種を陽性対照として用いて、部位１における配位子受容体結合を抑制しないが、部位２結合を妨害する拮抗薬の同定を可能にする。
【００１４】
候補物質の効果は、天然のポリペプチド配位子の存在下で、もしくは天然のポリペプチド配位子の活性と比較して、測定することができる。第１の選択肢では、野生型配位子による受容体相互作用に対する候補物質の効果を測定する。第２の選択肢では、野生型配位子の活性を陽性対照として使用し、候補物質（通常は配位子のアミノ酸配列変種）の受容体結合特性を野生型配位子の非存在下で測定する。しかし一般的には、野生型配位子の存在下における競争型検定法として、作用薬または拮抗薬候補に関する検定を行うことが最善である。
我々は、ＧＨ受容体を結合することができる選択された抗体がＧＨの拮抗薬または作用薬として作用することをも決定した。したがって成長ホルモンの欠損または過剰の治療におけるＧＨの拮抗性または作用性のための方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は作用薬ポリペプチド配位子または拮抗薬ポリペプチド配位子の同定を容易にする。一般に本発明は下記の如く実施される。
第１に、受容体との１：２の３要素複合体に関与する配位子を同定するために、配位子と受容体の会合の化学量論を決定する。会合の化学量論は下記の方法の１つを用いて生理学的条件下で受容体に対する配位子の比率を測定することによって決定される。例えばＸ線結晶学、セパロースゲルでのサイズ排除クロマトグラフィー、抗体結合試験、走査熱量測定、ＢＩＡ−コア分析、ＣＤスペクトル分析または蛍光スペクトル分析。配位子−受容体複合体のＸ線結晶構造は有用であるが、決して化学量論を決定するために必要なわけではないことに注意すべきである。好ましくは、本明細書にさらに記述するフルオレセイン・ホモクエンチング法を使用する。この方法では、滴定によって決定されるように２つの受容体分子が配位子によって結合された時に、フルオレセイン分子が互いにクエンチ（消光）し、その溶液の蛍光が減少するように位置するフルオレセインで受容体を標識する。本明細書に記述する分析技術それ自体はよく知られており、当業者の技術の範囲内である。
【００１６】
好ましくは、受容体の細胞外ドメインを化学量論分析に使用する。即ち、貫膜ドメインが欠失しているか、さもなくば膜挿入または疎水性会合の能力がなくなっている受容体変種を用いて、この分析をインビトロで溶液中で行う。随意に細胞質領域を欠失させてもよい。そのような受容体は既知であり、組換え細胞培養中で発現させて、そこから回収することができる。
受容体が１より多数のポリペプチド鎖を含有する時には、その受容体調製物が受容体ポリペプチド鎖のすべてを含有することが好ましい。また３要素複合体が２つの異なる受容体鎖からなる時（例えばアルファ鎖とベータ鎖を含有するＩＬ−２またはＩＬ−３受容体複合体の場合など、例：Ｔｅｓｈｉｇａｗａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６５：２２３−２３８［１９７８］）には、両鎖を用いて分析を行う。この例では各受容体鎖に対する結合が１つの順序のみで逐次的に進行する。会合の順序は異なる受容体分子を関与させると容易に決定される。
【００１７】
いくつかの受容体が１：２複合体を形成し得るが、これらの受容体はそれぞれ１より多数の鎖を含有し得る。配位子がそれらの鎖の１つにのみ結合し、他の鎖が結合鎖の適性な立体配座の維持に必要でない場合には、多鎖受容体の使用は必要でなく、配位子結合に必要な鎖が存在するだけでよい。
１：２の複合体を形成する配位子は２つの分離した結合部位によってそれらの受容体に結合する。受容体がこれら２つの部位に逐次的に、即ち、まず１つの部位（部位１）に、それから他の部位（部位２）に結合することを発見したことは本発明の重要な特徴である。逆の順序で起こることは観測されていない。この理解は拮抗性配位子の調製にとってとりわけ重要である。第１部位に関する配位子の親和性を増進しないとしても保存することが重要である。さもなくば、配位子類縁体は受容体に全く結合しない。他方、第２部位結合の効果的な破壊または阻害は拮抗薬活性を意味する。
【００１８】
本発明に従って配位子結合部位とそれらの付加順序を決定する。以下に詳述する方法で成長ホルモンの立体配座と候補配位子の立体配座を比較することによって、部位１と部位２が同定される。それらはアラニン走査突然変異法や他の系統的突然変異法（例：カセット突然変異法、ＰＣＲ突然変異法またはａｌａ走査）によってより完全に解析される。立体配座分析は変種を作成してスクリーニングする前に潜在的な部位１残基および部位２残基の範囲をかなり減縮することを可能にする。
いずれの場合にも、不能にする部位２の突然変異と機能的な部位１を伴う配位子類縁体を、３要素配位子：受容体複合体を形成させ得ないことによって同定する。ただしそのような変種は受容体と１：１の複合体を形成させ得るであろう。他方、不能にする部位１の突然変異と機能的な部位２を伴う類縁体は受容体に全く結合できないであろう。この決定のために使用される検定法はポリペプチドの会合を検出する検定法のいずれかであり、後述するホモクエンチング検定法やゲル濾過などを使用することができる。
【００１９】
立体配座分析は両親媒性アルファ螺旋単量体配位子の一群から配位子候補を選択することを容易にする。このような配位子は成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンと立体配座的に関連するので、成長ホルモンの構造との類推によってこれらの配位子の部位１および部位２を決定することは容易である。皮肉なことに、ＥＰＯ、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびインターロイキン２、３、４、６および７などの配位子の一次アミノ酸配列は成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンまたはプロラクチンとの相同性が乏しい。しかし、（一般にサイトカインまたはホルモンである）これらの配位子を従来の立体配座構造原理（Ｂａｚａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１：３５０−３５４（１９９１），Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２［１９７４］）によって分析すれば、若干の共通する構造上の特長を示すことが分かる。最も注目すべきことは、それらがそれぞれの前と後ろに実質上螺旋でない構造（螺旋間のループおよびそのタンパク質末端のＮ−末端およびＣ−末端配列）を伴う４つの主たる両親媒性アルファ螺旋によって特長づけられることである。主たるアルファ螺旋は典型的には約１５〜３０残基長である。これらをＮ−末端から順にＡ〜Ｄと命名する。短い螺旋セグメントは主たる螺旋を結合するループ中に存在し得る。
【００２０】
この種類の配位子のアルファ螺旋は両親媒性性である。即ち、これらは一般に螺旋の一方の側に疎水性残基を含有し、螺旋の他方の側に親水性残基を含有する。螺旋の連続する各３．６残基を螺旋状はしごの意味で１回転（ターン）と呼ぶ。螺旋の末端ではいくらかの微小なほつれが予期されるべきである。即ち、各アルファ螺旋末端は使用するアルゴリズムと当業者の判断に応じて約１〜３残基変化するであろう。この配位子群間の総合的な相同性の欠如にもかかわらず、いくつかの保存された残基が上記螺旋中に認められ、これらを用いて成長ホルモンと配位子を構造的に並列させる際の補助とすることができる。
【００２１】
成長ホルモンおよび相同な配位子プロラクチン並びに胎盤性ラクトゲンに関する我々の分析は、４要素アルファ螺旋サイトカインおよびホルモンのこの群の部位２が基本的に（ａ）Ｎ−末端から螺旋Ａの最初の３〜４回転までに延びる配列と（ｂ）螺旋Ｃのほぼ中央の４〜５回転とからなることを立証した。したがって部位２は非連続的であるが、両セグメントはそのタンパク質中で密接な近位にあり、その様式で受容体と相互作用する。部位２ドメインのいずれかもしくは両方を突然変異させる。突然変異のために候補残基を選択する際には一般に螺旋疎水性残基を無視する。ただし時としてそれらは該候補の機能的保全に影響を与え得る。さらに部位２内の残基のすべてが受容体結合に機能的または構造的な関与を示すわけではなかろう。しかし、本明細書に記載の原理の適用は、拮抗薬活性または作用薬活性についてスクリーニングする必要がある候補物質の数を著しく減少させる。
【００２２】
拮抗薬変種は、以下の詳述するように、候補位置における天然の残基の電荷、疎水性または嵩高さの本質的な変化によって特長づけられる。これは一般に問題の残基を置換するか、もしくはそれを削除することによって達成される。場合によっては、機能的または構造的に活性な部位２残基に隣接する残基を挿入することによって所望の効果を達成することができる。拮抗薬の製造における目標は部位２における受容体結合を排除すること、もしくは天然の配位子との関連で少なくとも２倍はそれを減少させることである。これは、受容体との構造的な相互作用（水素結合、塩橋形成、疎水相互作用など）に重要である１またはそれ以上の天然の残基の特長を激しく変化させることによって最も効果的に達成される。そのような残基を接触残基と呼ぶ。別法として、受容体と直接接触しない位置にあるが、接触相互作用に関与する残基の適性な配置にとって重要である残基を選択する。そのような残基を機能的残基と呼ぶ。
【００２３】
典型的な場合、約２０個を越えない位置（残基）が部位２変種（疎水的両親媒性性残基を除く）を作成する際に潜在的に重要であろう。これらのうち各アミノ酸群の代表的な構成要素のみを使用して候補物質を作成する。即ち、通常は、部位２内の各残基について残り１９種の天然に存在する残基を表す１９変種をスクリーニングする必要はない。その代わりに残基群の代表的構成要素を選択する。一般にこれらの群は、（ａ）正に荷電した残基（Ｋ、ＲおよびＨ）、（ｂ）負に荷電した残基（ＤおよびＥ）、（ｃ）アミド（ＮおよびＱ）、（ｄ）芳香族（Ｆ、ＹおよびＷ）、（ｅ）疎水性（Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭ）並びに（ｆ）非荷電親水性残基（ＳおよびＴ）である。さらに拮抗薬候補を作成する際には５種類の代表的残基をスクリーニングするよりはむしろ、典型的には１〜３種類だけを選択することで充分である。なぜなら適当な残基における本質的な変異はいずれも部位２を不能にするであろうからである。下記の表１を参照のこと。最も極端な置換は特長の相反する組み合わせを選択することによって作成される。例えば天然の残基がアラニン（小さい疎水性残基）であるならば、極端な置換は親水性で嵩高く荷電しているグルタミン酸であろう。さらに進化論的な多様性を示すものから残基を選択する。即ち、ある動物種の配位子がｈｕ受容体部位２に結合することができない場合には、変異残基を候補として選択する。拮抗薬を含有する可能性の高い突然変異体の充分なプールは典型的な場合、約２０から約６０までの部位２変種を含有するであろう。部位２における作用薬候補を選択するには微小相違法を用いる。部位１に関する下記の議論を参照のこと。このようなプールの作成とスクリーニングは過度の実験を必要とせず、充分に当業者の技術の範囲内であろう。
【００２４】
置換アミノ酸の選択でもその残基がアルファ螺旋構造内に位置するか、非螺旋構造内に位置するかを考慮すべきである。その残基が螺旋回転の一部である場合には、その置換がプロリンやグリシンなどの螺旋破壊残基でないことが好ましい。他方、プロリンまたはグリシンが野生型螺旋内に認められる残基である場合には、それらを自由に置換することができる。なぜならそれらの置換は螺旋立体配座を不安定化しないだろうからである。
【００２５】
部位１も非連続的な部位である。これは（ａ）螺旋Ａの中央４０％（おそらく螺旋Ａ中の部位２のＣ−末端と重複している）内、（ｂ）螺旋Ａと螺旋Ｂを連結しているループのＣ−末端２／３（好ましくはＣ−末端１／２）および（ｃ）螺旋ＤのＣ−末端１／２（好ましくは１／３）に位置する３つのセグメントからなる。比率はアミノ酸残基の直線的な配列について述べている。部位２拮抗薬突然変異で用いた方法とは対照的に、部位１ドメイン内の残基を改変せずに残しておく（突然変異によって部位２のみを不能にする拮抗薬の場合）か、改変するとすれば、結合を破壊しないように部位１の変異を選択する。その理由は、部位１を不能にすることはほとんどの態様で望ましくないからである。その代わりに部位１の親和性を約１０％から２倍以上にまで増大させることが目標である。したがって一般的にはこれらのドメイン内の残基を（欠失させたり隣接する挿入に付すのではなくて）置換し、立体障害決定基（その残基の嵩高い側鎖が、特に荷電している場合に、配位子−受容体結合相互作用を妨害または阻害するもの）を同定するために、最初のスクーニングをアラニン走査で行う。立体障害残基を同定したら、作用薬もしくは拮抗薬のための部位１置換を、表１の「作用薬」置換という表題のところから選択する。種多様性分析も作用薬を同定する際に同様に有用であろう。やはり約２０個以下の位置を部位１変異のために選択することが必要であろう。一般に各位置における突然変異は、元来の残基が属する群の残りの構成要素、並びに、嵩高さがより少ない側鎖を含有する、かつ／または、非荷電の、次に最も近い関係にある群（表１）の残基による置換であろう。
【００２６】
【表１】
0003572263.tif 000002
【００２７】
各部位は数個の非連続的なドメインを含有するので、これらのドメインのいずか１つに変異を導入する。即ち、与えられた部位の各ドメインを変化させる必要はない。部位２の螺旋ドメイン（螺旋ＡまたはＣ）（好ましくは螺旋Ｃ）は部位２に関する好ましい突然変異導入部位である。部位１の螺旋ドメイン（螺旋ＡまたはＤ）（好ましくは螺旋Ｄ）は部位１の変異にとって好ましい位置である。各部位の各ドメイン（部位２については２、部位１については３）中の少なくとも１残基を変化させることが本発明の範囲に包含されるが、典型的な場合、各部位について１残基のみを変化させる。他の態様として、２またはそれ以上の残基であって、通常は約５残基までを各ドメインで変化させる。
【００２８】
突然変異導入または変化のための螺旋残基の選択は図１７、１８および１９に示すような螺旋ホイール図の構築によって容易になる。これらは従来の方法で作成され、部位１および部位２の螺旋部分の変化について標的位置を同定する際に有用である。興味深い特定の残基は親水性残基、嵩高くない残基または螺旋立体配座を不安定化する傾向のある残基である。
置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせはスクリーニングの候補物質を作成する際に有用であるが、残基変化の効果は残基変化そのもの以上に拡大し得る。例えば受容体結合を防止するべく部位２を改変するのに適した方法は部位２内にＮ−またはＯ−グリコシル化部位を導入することである。この部位は酵母や高等真核細胞中で発現された時にグリコシル化され、立体的障害によって部位２の結合を妨害するであろう。この方法の１つの利点は部位２の構造的残基の正確な位置を決定する必要がないということである。なぜなら嵩高い隣接基の挿入が結合の阻害に必要な条件のすべてであり得るからである。他の利点は循環半減期を増大させるなどの変調とその変種の免疫原性を減少させることができるという能力である。したがって、例えば本明細書に記載の配位子（例えばＩＬ−２）の螺旋Ａおよび／またはＣ（好ましくはＣ）内にグリコシル化部位を挿入することは本発明に包含される。
【００２９】
候補作用薬または候補拮抗薬を、作用薬または拮抗薬として機能的に作用するというそれら候補物質の能力についてスクリーニングする。そのような検定法は従来から知られおり、例えば野生型配位子の効力と活性を検定するために典型的に使用される従来の検定法など、広く利用可能である。別法として、あるいは上記に加えて、受容体の化学量論を決定するために使用する検定法を、（とりわけ部位１で結合するが、部位２では結合しない拮抗薬を同定するために）使用することができる。これらの検定法自体は日常的なものであり、はなはだしい実験を必要としない。
【００３０】
ヒト成長ホルモンに関して部位２の構造的残基にはＴ３、Ｉ４、Ｌ６、Ｌ９、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｑ２２、Ｙ１０３、Ｎ１０９、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｇ１２０およびＴ１２３が含まれる。部位２の機能的残基にはＦ１、Ｉ４、Ｌ６、Ｒ８、Ｄ１１６およびＥ１１９が含まれる。これらの位置の１またはそれ以上でいずれかの残基を置換するか、天然の残基を欠失させるか、もしくはそれらに隣接して別の残基を挿入する。上述のように、通常は拮抗薬作用を求めるか、作用薬作用を求めるかに応じて、同じ種類または異なる種類の構成要素を置換する。これらの位置の１またはそれ以上に、あるいはそれらに隣接して導入される変異は部位２結合に影響を与えるであろう。一般に突然変異にとって好ましい残基には、Ｎ−末端ドメイン／螺旋Ａ内の指定された領域の少なくとも１つの突然変異と、Ｃ螺旋内のもう１つの突然変異が含まれる（具体的にはＦ１、Ｉ４、Ｌ６、Ｄ１１９およびＧ１２０）。ｈＧＨ拮抗薬の例にはＩ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０Ａ  ｈＧＨ、Ｉ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０Ａ／Ｔ１２３Ａ  ｈＧＨ、Ｆ１Ａ／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０Ｉ／Ｔ１２３Ａ  ｈＧＨ、Ｆ１Ａ／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０Ｆ  ｈＧＨおよびＦ１Ｔ／Ｉ４Ｆ／Ｌ６Ｒ／Ｇ１２０Ｒ／Ｔ１２３Ｄ  ｈＧＨと共に、受容体に対する部位１の親和性を増大させるＥ１７４、Ｈ２１、Ｒ６４、Ｋ１７２および／またはＦ１７６などの残基における追加の突然変異を伴う上記のいずれかが含まれる。例えばＥ１７４はＳに突然変異させることが好ましいが、他の態様ではＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰから選択される残基に突然変異させる。Ｆ１７６はＹに突然変異させることが好ましく、随意にＥ１７４Ｓ、Ｒ１６８Ｎ、Ｄ１７１Ｓ／Ａおよび／またはＩ１７９Ｔ（螺旋Ｄから）および螺旋ＡからのＦ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８ＤおよびＨ２１Ｎと組み合わせて使用してもよい。ファージミドスクリーニングによって野生型のホルモンよりも約３０倍強いＧＨｂｐへの結合を示す２つの部位１ｈＧＨ変種を同定した：Ｆ１０Ａ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２１Ｎ／Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１ＳまたはＡ／Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ／Ｉ１７９Ｔ。作用薬または拮抗薬を作成するために、これらの部位の突然変異を部位２における上述の突然変異と組み合わせる。拮抗薬の例にはＦ１Ａ／Ｉ４Ａ／Ｆ１０Ａ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２１Ｎ／Ｇ１２０Ｒ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｄ，ＥまたはＩ／Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１ＳまたはＡ／Ｅ１７４ＳまたはＡ／Ｆ１７６Ｙ／１７９Ｔ  ｈＧＨ、Ｆ１Ａ／Ｉ４Ａ／Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ  ｈＧＨ、Ｉ４Ａ／Ｇ１２０Ｒ／Ｅ１７４Ａ  ｈＧＨおよびＩ４Ａ／Ｇ１２０Ｉ／Ｆ１７４Ａ  ｈＧＨが含まれる。
【００３１】
他の拮抗薬態様ではＩ４Ａ、Ｌ６Ａ、Ｆ１および／またはＧ１２０を欠失させ、これらの残基の１またはそれ以上を欠失させる一方で残りの残基を置換し、かつ／または、これらの残基に隣接して１またはそれ以上の残基を挿入する。置換、欠失および挿入の組み合わせは有用である。単にそれらを選択することは成長ホルモンの活性を最適化する問題であろう。このような組み合わせの例にはＦ１（△）／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０Ｉ／Ｅ１７４ＡおよびＩ４（△）／Ｇ１２０（Ｋ）／Ｅ１７４Ａが含まれる。
部位１および部位２中の位置における突然変異の効果は一般に結合および親和性を抑制することであろう。ただしこれらの部位において選択された改変が日常的なスクリーニングによって決定されるように親和性の増大をもたらすこともある。例えばＥ１７４（Ｓ、Ｇ、ＡまたはＴ）および位置２１、１８および６４での変異はＧＨｂｐに対する部位１の親和性を増大させることが明らかになっている。
【００３２】
ＨＧＨ部位１構造的残基はＨ１８、Ｈ２１、Ｑ２２、Ｆ２５、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ４５、Ｑ４６、Ｐ６１、Ｓ６２、Ｎ６３、Ｒ６４、Ｅ６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｔ１７５、Ｒ１７８およびＣ１８９である。部位１の機能に影響を与える側鎖を有する残基はＰ５、Ｌ６、Ｆ１０、Ｍ１４、Ｆ５４、Ｅ５６、Ｉ５８、Ｓ６２、Ｎ６３、Ｒ６４、Ｅ６６、Ｑ６８、Ｙ１６４、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｉ１７９、Ｃ１８２およびＶ１８５である。受容体に対する部位１の親和性を増大させるために好ましい残基はＨ２１、Ｒ６４およびＥ１７４である。一般に部位１残基には置換のみを施し、削除したり、それらに隣接して残基を挿入したりしない。さらに、表１に記したように、部位１置換は一般に天然の残基と同じ群か、あるいは密接に関連する群から選ばれるであろう。作用薬活性と拮抗薬活性は共に部位１が受容体に結合することを必要とするので、部位１の激しい摂動は通常望ましくない。それでもなお例外（例えばＥ１７４Ａ）が存在し、したがって最適な置換を決定するために一群の置換体をスクリーニングすることが望ましい。
【００３３】
他の成長ホルモンにおける類似の残基は容易に同定され、同じ方法で改変される。例えばｈＧＨ中のＩ４はｂＧＨ中のＭ４に対応する。他の種から得られる成長ホルモンやｈＧＨの他のアレルを比較する際に残基番号に多少の変化が存在し得ることに注意すること。動物のＧＨが相同な位置にヒトＧＨと同じ残基を含有しない場合には、置換される残基はその位置における動物残基とは異なるもの、好ましくはその位置におけるヒト残基とは異なるものである。さもなくば、突然変異導入のための残基の選択を上述した方法と同じ方法で実行する。
【００３４】
構造分析または分子モデリングを用いて他の配位子（即ち、４つの逆平行両親媒性アルファ螺旋を含有する単量体ポリペプチド）中の変異のために類似する配列を同定する。チョウ−ファスマン分析を用いて候補配位子の構造を決定し、次いで各配位子について部位１と部位２内に位置する類似の残基を同定する。いくつかの例では構造的研究が既に公表されており、必要なことは部位１と部位２を同定するために様々なドメイン中の残基を成長ホルモンと比較することだけである。単量体配位子は正常な生理学的条件下で循環する単量体として発見されるものである。
そのような配位子の現在知られている例にはＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン２、３、４、６および７、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチン、アルファ−インターフェロン、べータ−インターフェロンが含まれる。その他の配位子も将来同定されるであろうし、本発明の教示はそれらにも等しく適用される。
【００３５】
これらの配位子に関する拮抗薬候補を作成するために、２つの領域：（ａ）Ｎ−末端からＡ螺旋の最初のＮ−末端１／３まで、および、（ｂ）Ｃ螺旋のほぼ中央の１／２（好ましくは１／３）の一方または両方に本質的な突然変異を導入する。これらのドメインはｈＧＨの部位２ドメインに対応する。作用薬は部位１および／または部位２に嵩高さが低く、かつ／または、電荷が少ない置換を導入することによって作成される（表１を参照のこと）。最適な拮抗薬は、受容体結合を防止するか、実質上欠失させるために部位２を突然変異させることによって、並びに、受容体に対する親和性を増大させるために部位１を突然変異させることによって作成される。理解されるであろうが、作用薬態様と拮抗薬態様の両方において、受容体に対する親和性を増大させるべく部位１を改変する。
【００３６】
成長ホルモン以外の配位子の拮抗薬変種および作用薬変種を作成する方法の例として、下記の表２を参照する。表２はｈＰＲＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯに関する推定の部位１および部位２主要部および核決定基を開示するものである。各配位子の螺旋ドメインを同定し、それらをｈＧＨの類似するドメインと比較することによって各部位に関する螺旋決定基を選択した。ｈＧＨ以外の配位子の構造または機能に寄与する非螺旋ドメインを同定する際にも同じ分析を適用する。表２は、Ｎ−末端内の部位２ドメインよりも部位２螺旋残基を標的にすることによって拮抗薬変種が好ましく作成されるという我々の確信を反映している。しかし、部位１および部位２に関する非螺旋類似残基を変化させることもできる。部位１および部位２について推測した表２の残基は、表にした配位子の受容体と構造的または機能的に相互作用する少なくとも１残基を含有するものと考えられる。これは３螺旋ドメインまたはその一部の１ないし３の遮断アラニン走査または相同体走査、該ドメインまたはその一部の欠失、Ｏ−またはＮ−結合型グリコシル化部位を作成するための３ドメインの１またはそれ以上の中の残基の置換によって容易に確認される。ドメインの活性を確認すれば、重要な機能的または構造的残基を同定するために残基毎のアラニン走査を用いることは容易な問題である。
【００３７】
【表２】
0003572263.tif 000003
表２の螺旋構造情報は、ＤｅＶｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５：３０６−３１２（１９９２）（ｈＧＨＧ）、Ｂａｚａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１：３５０−３５４（１９９１）（ｈＰＲＬ、ＩＬ−６、ＩＬ−２およびＥＰＯ）、Ｌｏｋｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：２１２５−２１３１（１９９１）、Ｂａｚａｎら，前掲（ＩＬ−２）およびＤｉｅｄｅｒｉｃｈｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１７７９−１７８２（ＧＭ−ＣＳＦ）から得た。上述のように、他の配位子に関するこのような情報は、モデリング、ｎｍｒあるいは好ましくはＸ線結晶学的分析によって得られる。
表２における部位指定は、螺旋Ａの長さの０．０７ないし０．５と螺旋Ｃの長さの０．５ないし０．８である部位２に基づく接触片を計算することによって到達した。これらの部位は概略と見なされるべきであり、おそらく適度の改善を必要とするであろう。各部位は記載の配列から±１〜５残基に位置し得る。
【００３８】
拮抗薬の製造では、標的螺旋残基に導入する残基または構造が一般には同じ種類（上記を参照のこと）のものでなく、置換される残基よりも嵩高いことが好ましい。他の態様では、部位残基を欠失させるか、他の残基（ＧやＰの如き螺旋破壊残基など）を部位残基に隣接して挿入する。次に一群の候補物質を作成し、最適な候補物質を同定するために本明細書に記載の方法によってスクリーニングする。しかし、たとえ変種配位子が天然の配位子との比較で作用薬または拮抗薬として作用し得ないとしても、その変種はその配位子にとっての従来からの用途（変種が天然の配位子にほぼ等しい活性を保持している場合）に、あるいはそれが受容体に結合できない場合には免疫学的な（例えば診断用の）試薬として有用であるということは強調されるべき点である。
ＩＬ−２拮抗薬候補を調製するための代表的な計画を表３に記載する。この計画では、表２で同定した推定上の部位２残基を、受容体結合を減じるのに好適なアミノ酸で置換する。追加の代替的な置換をもこの表に示す。
【００３９】
【表３】
0003572263.tif 000004
【００４０】
ＩＬ−６螺旋Ａ、ＣおよびＤに関する代表的な螺旋ホイールプロットをそれぞれ図１７、１８および１９に記載する。螺旋Ａ中で潜在的興味深い残基はＤ５４、Ｒ５８、Ｅ５１、Ｋ５５、Ｔ４８、Ｒ５２、Ｑ５６およびＳ４９であり、螺旋ＣではＫ１５７、Ａ１５８、Ｑ１５５、Ｑ１５２、Ｋ１５６およびＶ１４９である。  ｈＰＲＬに関する同様のプロットは、部位２を改変するための位置が残基Ｈ５８、Ｄ６９、Ｈ５５、Ｄ４８、Ｎ５９、Ｖ５２、Ｄ４５、Ｙ５６およびＲ４９（螺旋Ａ）と、Ｋ１４３、Ｑ１５０、Ｇ１５７、Ｅ１４６、Ｑ１６４、Ｒ１５３、Ｌ１６０、Ｓ１４２、Ｅ１４９、Ｓ１６３、Ｖ１４５、Ｋ１５２、Ｅ１４８、Ｈ１６６、Ｅ１５６およびＥ１５９（螺旋Ｃ）であることを示唆している。
興味深いｈＰＲＬ部位１（螺旋Ｄ）残基はＣ２０２、Ｒ２２０、Ｓ１９１、Ｋ２０９、Ｎ１９８、Ｌ２１６、Ｒ２０５、Ｓ１９４、Ｎ２１２、Ｈ２０１、Ｃ２１９、Ｅ１９０、Ｈ２０８、Ｙ１９７、Ｋ２１５、Ｒ２０４、Ｄ２１１、Ｌ１９３、Ｌ２００およびＫ２１８である。ｈＰＲＬ残基にはプレ配列のＮ−末端Ｍ＝１として番号を付与している。
【００４１】
当然のことながら本明細書でいう作用薬および拮抗薬は、部位１および／または２に認められる残基以外の追加の残基へ変異が導入されている配位子をも包含する。例えば候補物質を他のポリペプチドに融合させたり（例：免疫アフィニティー精製を容易にするため）、所望の活性に関与しない残基および適性な立体配座の維持に必要でない残基を欠失、置換または挿入したり（例：配位子の活性な断片を作成するため）、さもなくば従来の慣用に従って変化させる。
【００４２】
配位子が受容体に結合する際のＫａまたは親和性定数は、問題の部位で配位子が受容体に結合する速度（「結合」速度）を配位子が受容体から脱離する速度（「脱離」速度）で割った比である。高親和性相互作用とは「結合」速度が優勢である相互作用をいう。拮抗薬は一般に部位１に高親和性変異を有するであろう。たいていは、いずれかの部位での高親和性変異が受容体の性質に応じて作用薬にとって望ましい。配位子が受容体に結合し、３要素受容体複合体が連続的な信号ではなく単一を信号を発する場合には、受容体に対して極度に高い親和性を有する配位子類縁体が実際に充分な時間受容体を占めるので実質的に拮抗薬としての作用を開始する。例えば細胞の特徴の変化（例：タンパク質の放出、有糸分裂の刺激など）を信号化するのに二量化した受容体が２０〜３０分を必要とするならば、時間単位で受容体を占めるような速度定数を作用薬配位子が保持する必要はないであろう。したがって最適には、受容体の信号化事象が完了するのに必要な時間とほぼ同じ時間後に受容体から変種が脱離するように作用薬の親和性を最適化すべきである。高い（＞野生型の倍）部位１Ｋａは不活性な部位２を有する拮抗薬にとってまさしく望ましい。なぜならこれがその拮抗薬による受容体部位１の占有を増進し、それによって、そうでなければ天然の配位子にとって利用可能になるかもしれない受容体を拘束するであろうからである。したがって最も望ましくは、作用薬突然変異は二量化した受容体の信号化特性と合致する速度定数を有し、他方、拮抗薬は部位１において高い親和性を示し、部位２においてより低い親和性（または親和性の欠如）を示すであろう。Ｋａは、例えばＰｈａｒｍａｃｉａから市販されているＢＩＡ−コア装置の使用などによって、与えられた配位子変種について容易に決定される。
【００４３】
３要素複合体を形成するという配位子とその受容体の能力は、該複合体の形成に影響を与えるが配位子アミノ酸配列変種ではない物質の便利な検定終点としても機能する。例えば一群の候補非ペプチド分子または短いペプチド分子を作用薬効果または拮抗薬効果についてスクリーニングしようとするならば、その候補物質の存在下と非存在下で３要素複合体の形成を追跡するだけでよい。複合体形成を抑制する候補は拮抗薬として作用し、複合体を形成するのに必要な配位子と受容体の量を減少させるものは作用薬候補であろう。受容体または配位子に対する非特異的な効果（例：タンパク質変性）は従来からの分析法（例：ＣＤ研究）によって排除される。
【００４４】
さらにこの検定法は変種受容体とそれらの活性を検出するためにも有用である。例えば、配位子結合部位に関して天然の受容体と競争する能力を測定することによって、配位子に正しく結合するという能力について突然変異受容体を検定する。ホモクエンチングを用いるこのような検定法では、フルオレセイン標識受容体を天然の配位子の制限量に加え、標識された受容体と競争するという候補受容体の能力を受容体標準との関連で増大した蛍光によって測定する。蛍光のクエンチング（消光）や増進は、受容体集団の半分を１つの発蛍光団で標識し、残りの半分を増進分子またはクエンチング分子で標識することによって検出することもできる。このような系は広く知られており、一般に上記の３要素検定に適用することができる。この検定法を、単に複合体の分子サイズを追跡するだけで部位１または部位２結合の分析を可能にするように適合させることもできる。妥当な比率であるにもかかわらず配位子と受容体が全く複合体を形成しない場合には、部位１が欠損しているか、あるいは（受容体が候補物質である場合には）配位子部位１に関する受容体の結合部位が欠損している。（妥当な量の配位子または受容体が存在するにもかかわらず）１：１複合体のみが形成される場合には、部位２（またはその受容体部位；使用する候補物質による）が受容体に結合する能力を欠いている。同じ分析を適用することによって、野生型タンパク質より強い親和性で部位１または部位２で結合することができる配位子または受容体を同定する。
【００４５】
複合体形成に関する検定
３要素複合体を検出するための検定法には、複合体の分子量を決定すること、蛍光の発光または蛍光のクエンチングあるいは受容体上の標識間の他のエネルギー移動を決定すること、Ｂｉａ−コア分析、ゲル排除クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動、等電フォーカシング、沈降および透析が含まれる。他の好適な方法には受容体−配位子部位に結合する抗体の使用、偏光の旋光度、クロマトグラフィーおよび核磁気共鳴が含まれる。クロマトグラフィーの種類にはゲル濾過、イオン交換および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。いずれの分析法でも、複合体化していない配位子および／または受容体のバックグラウンドに対して３要素複合体の形成を決定することが可能であろう。
【００４６】
配位子とそれらの受容体
構造的に分析を行い、適切であれば本明細書に従って突然変異させる配位子の中には、成長ホルモン、インスリン様成長ホルモン、上皮小体ホルモン、インスリン、リラクシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン、造血性成長因子、肝性成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子−アルファ、腫瘍壊死因子−ベータ、ミュラー阻害物質、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−アルファやＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様因子成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩＥＰＯ、骨誘導性因子、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータおよびインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＦＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８などのインターロイキン（ＩＬ）および他のポリペプチド因子が含まれる。好ましい配位子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＥＰＯ、成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンなどの螺旋状単量体サイトカイン／ホルモンである。ｈＧＨの場合と同じ方法でこれらの配位子の受容体を使用し、上述のように拮抗薬または作用薬を選択する。
【００４７】
上述の議論はアミノ酸配列変種に集中した。しかし、標的残基をインビトロ法によって共有結合的に修飾することによっても同じ目的が達成される。これは、受容体に結合するという標的位置の残基の側鎖の能力を破壊もしくは改変する何らかの種類の化学修飾によって達成することができる。共有結合修飾が標的残基に対して充分に特異的であれば、最終的な効果は例えば置換突然変異と同じである。特異性は所望の側鎖と優先的に反応する試薬を選択することによって達成される。さらなる特異性は保護されるべき領域に結合する抗体で他の側鎖を遮断することによって達成される。修飾は、結合に直接参加するアミノ酸（構造的残基）の１または複数であり得る。あるいは立体配座の維持に関与している受容体結合の領域内のアミノ酸またはそれに隣接するアミノ酸をインビトロで共有結合的に置換する。共有結合的修飾には酸化、還元、アミド化、縮合など、あるいは多糖やポリエチレングリコールなどの嵩高い基の置換が含まれる。そのような部分（例：ポリエチレングリコール）をタンパク質に共有結合させる方法はよく知られている（例えばＤａｖｉｓら，米国特許第４１７９３３７号を参照のこと）。
【００４８】
システイン残基は最も一般的にはクロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。またシステイン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【００４９】
ヒスチジル残基はｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。なぜならこの試薬は比較的ヒスチジル側鎖に特異的だからである。臭化パラ−ブロモフェナシルも有用であり、この反応は好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム中で行われる。
【００５０】
リジニル残基およびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷が反転するという効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、トランスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応、ポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル、または他の嵩高い置換基が含まれる。
【００５１】
アルギニル残基は従来の試薬の１または数種との反応によって修飾され、それらにはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−クロロヘキサンジオンおよびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａゆえに、その反応がアルカリ条件下で行なわれることを必要とする。さらにこれらの試薬はアルギニンのイプシロン−アミノ基と共にリジンの基とも反応し得る。
【００５２】
チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物かテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基に光学的な標識を導入するという特別な興味をもって行うことができる。最も一般的にはＮ−アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種と３−ニトロ誘導体を形成させる。放射線免疫検定で使用するべく標識されたタンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化する。上述のクロラミンＴ法が好適である。
【００５３】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’（ここにＲとＲ’は異なるアルキル基を表す）との反応によって選択的に修飾される。さらにアスパルチル残基とグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基とグルタミニル残基に変換される。
【００５４】
グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミル残基とアスパルチル残基になる。あるいは温和な酸性条件下でこれらの残基を脱アミド化する。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲に包含される。
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ酸のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ，サンフランシスコ，７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【００５５】
ｈＧＨｂｐ上の２つの結合部位に関する証拠は抗体結合によって得られる。ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの親和性は、［１２５Ｉ］ｈＧＨのｈＧＨｂｐからの置換と、グリコシル化されたウサギＧＨ受容体から作成された抗受容体モノクローナル抗体（Ｍａｂ５）（Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５：１８０５−１８１３（１９８４）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１：４５９−４６８（１９８５））でその複合体を沈殿させることによって測定される。この検定法を用いると、スキャッチャード分析はｈＧＨとｈＧＨｂｐが１：１の複合体を形成することを示す（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７（１９８７）；Ｆｕｈ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３１１１−３１１５（１９９０）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５：１８０５−１８１３（１９８４）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１：４５９−４６８（１９８５）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７８６２−７８６７（１９８８））。もう１組のＭＡｂ（ＭＡｂ３８７または３Ｄ７）を用いた置換曲線のスキャッチャード分析（図４）は０．５ｈＧＨ対１ｈＧＨｂｐの化学量論をもたらした。これらの結果は、ｈＧＨ上の第２の部位に結合するためのｈＧＨｂｐの決定基をＭａｂ５が遮断したのだとすれば説明することができる。
【００５６】
各ｈＧＨポリペプチド上の２つの結合部位に関する証拠は、ｈＧＨ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１（１９８９））とｈＧＨｂｐ（実施例２）の間の結合決定基の走査突然変異分析においてモノクローナル抗体を用いることによって開発された。これらの研究で同定された決定基は１：１複合体の形成を調節するのに重要である。このデータに基づいて、我々はこれらの決定基をｈＧＨの非結合性相同体に装備し、ｈＧＨｂｐに強固に結合する類縁体を作成した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６１−１４６５（１９９０））。ｈＰＲＬ中に８置換を、またｈＰＬ中に５置換を組み込むことによって、我々はｈＧＨｂｐに結合して１：１複合体を形成する変種を作成した。
【００５７】
我々はゲル濾過を用いてこれらのｈＰＲＬまたはＰＬ変種（図５ＡおよびＢ）がｈＧＨｂｐの１または２分子に結合することができるかどうかを決定した。ホルモンに対するｈＧＨｂｐの比率が２：１である時に、ｈＰＲＬの両結合変種がｈＧＨｂｐとの１：１の複合体に対応する２つの対称なピークを示す。
抗体や複合体を分離するためのクロマトグラフィーを使用する必要を伴わずに溶液中で自由に結合を調べることができるので、我々は化学量論と反応の熱量をさらに評価するために走査熱量測定法を使用した（図６）。この実験によりｈＧＨｂｐに結合したｈＧＨの当量と反応の熱量を決定することが可能になった。
【００５８】
表１に野生型ｈＧＨとｈＧＨおよびｈＰＲＬの変種に関する滴定終点を要約する。ｈＧＨｂｐのすべてに結合するために必要なｈＧＨの比率は１に対して約０．５である。要するに、これらのデータはｈＰＲＬとｈＰＬ変種がｈＧＨｂｐの二量化にとって重要な決定基を欠いていることを強く示している。これらの決定基はｈＧＨの単一アラニン突然変異体中ではほとんど保存されているが、ｈＰＲＬまたはｈＰＬ変種では保存されていない。これはｈＧＨ上にｈＧＨｂｐに関する２つの結合部位が存在することを示唆している。これらの部位の１つをｈＧＨのアラニン走査突然変異法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１（１９８９））か、それぞれＭａｂ５またはＭａｂ２６３免疫沈殿検定法を用いるｈＧＨｂｐによって機能的に詳細に特徴づけた。ｈＧＨとｈＧＨｂｐ上の第２の部位はまだ解明されていなかった。
【００５９】
ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合はその成分に光学的な変化をほとんど引き起こさない。我々は複合体の形成時の円二色スペクトル（ＣＤ）および蛍光スペクトルの変化を調べた。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混合した場合、遠ＵＶＣＤスペクトルは基本的にｈＧＨとｈＧＨｂｐのスペクトルの和と同一である（図７）。この結果は複合体の形成時に通常の二次構造に大きな変化がないことを示している。近ＵＶＣＤスペクトル（図８）は芳香族アミノ酸側鎖の非対称な環境を反映している（Ｂｅｗｌｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１５５５（１９７９）；Ｂｅｗｌｅｙ  Ｔ．Ａ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２３３：２１９−２２７（１９８４））。ｈＧＨとｈＧＨｂｐのＵＶ吸収スペクトルの間には大きな相違があり、これは主としてｈＧＨと比較してｈＧＨｂｐのトリプトファン含量（それぞれ１対９）が多いことの結果である。しかしスペクトルの強度の増大を除いて、個々のスペクトルの和は混合後に得られたものと基本的に同一であった。
【００６０】
蛍光スペクトルでは、ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合時に、３４０ｎｍから３３４ｎｍへの青方偏移と蛍光強度のわずかな減少がある（図９）。ヨウ素クエンチングとスターン−ボルマー（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）分析は、ホルモン受容体複合体中のトリプトファンの暴露の減少があることを示している。これはｈＧＨを結合した時にｈＧＨｂｐ中の１またはそれ以上のＴｒｐ残基が隠される結果であると思われる。なぜなら蛍光クエンチング研究はｈＧＨ中のトリプトファンが感知し得るほどには溶媒にさらされていないことを示しているからである（Ｂｅｗｌｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１５５５（１９７９）；Ｂｅｗｌｅｙ，Ｔ．Ａ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２３３：２１９−２２７（１９８４））。対照的に、ｈＧＨｂｐの突然変異分析はｈＧＨへの結合にとってＴｒｐ１０４がとりわけ重要であることを示している。
【００６１】
上述のようにｈＧＨの結果は他のポリペプチド配位子（例えばホルモン−受容体系およびサイトカイン−受容体系）に関連している。成長ホルモン受容体とプロラクチン受容体は、インターロイキン２、３、４、５、６、７、エリスロポエチン、マクロファージコロニー刺激因子およびその他（概略については８を参照のこと）に関するサイトカイン受容体の大きいファミリーに構造的に関連していると思われる。これらの受容体の細胞内ドメインが、あったとしてもごくわずかな配列相同性しか共有せず、既知のチロシンキナーゼのいずれとも相同であるとは思われないということが注目される。それにもかかわらず、ＧＨ受容体（Ｃａｒｔｅｒ−Ｓｕ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１８６５４−１８６６１（１９８９））、ＩＬ−２受容体（Ａｓａｏ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６３７−６４４（１９９０））およびＩＬ−３受容体（Ｉｔｏｈ  Ｎ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：２４−３２７（１９９０））はホルモン結合のすぐ後にリン酸化型になる。ＩＬ−２受容体（Ｓｈａｒｏｎ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４８６９−４８７３（１９９０））とＩＬ−６受容体（Ｔａｇａ，Ｔ．ら，Ｃｅｌｌ  ５８，５７３−５８１（１９８９））の場合には、補助タンパク質および／または受容体が信号変換に関与することを示す証拠がある。ｈＧＨとその結合タンパク質で得られたこの結果は、ｈＧＨの結合が受容体の細胞外部分の二量化を誘発し、それが細胞内ドメインを結び合わせることによって、細胞質（または膜結合）成分と相互作用し得る活性なドメインが生成するというｈＧＨ受容体の活性化のモデルを支持するものである。これは複合体化した成分の立体配座の本質的な変化を伴わずに起こることもあるし、こうした変化を伴わずには起こらないこともある。
【００６２】
最近２つの他のグループが細胞外結合ドメインと錯化したポリペプチドホルモンを結晶化させている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２７３０−１２７３６（１９８９）；Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２０８２−２２０８５（１９９０））。しかしどちらも受容体の二量化に関する決定的な証拠を報告していない。ヒトＩＬ−２はＩＬ−２受容体のヒトｐ５５成分の可溶性組換え型と主に１：１の複合体として結晶化した。ただしジスルフィドで連結した少量のｐ５５二量体も観測された。架橋試験は機能的なＩＬ−２受容体複合体がＩＬ−２、ｐ５５およびｐ７０と呼ばれるもう１つの受容体成分の間で形成されるヘテロ二量体であることを示唆している（Ｓａｒａｇｏｒｉ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：１９１８−１９２６（１９８７）；Ｏｇｕｒａ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５：１２３−１３８（１９８８））。ＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン（ＥＧＦｂｐ）は１分子のＥＧＦとの錯化状態で結晶化されている（Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２０８２−２２０８５（１９９０））。結合研究と沈降分析は溶液における１：１のＥＧＦ・ＥＧＦｂｐ複合体の形成を示している。これらのデータはホルモンが誘発する二量化を経るには細胞外ドメインだけでは充分でないことを示唆している。しかし、これらの結合研究が複合体を沈殿させるために抗ＥＧＦ受容体ポリクローナル抗体を用いたことに注意すべきである。さらにこれらの結晶化実験と沈降実験では受容体に対して大過剰のホルモンが用いられた。我々の場合、天然のＧＨ受容体に対して生ぜしめたＭａｂが二量化を遮断し（図４）、大過剰のｈＧＨがｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２複合体を単量体複合体に解離させるであろう（図３、参考資料３４）。
【００６３】
この後者の効果は薬学的に重要な意味を含有し得る。ｈＧＨは天然には血清中で５ｎＭを超えるパルスとして生産され、１ｎＭよりはるかに低いレベルにまで迅速に低下する（Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４８：２３４９（１９６９）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１９３（１９７２）；Ｈｏ，Ｋ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６４：５１−５８（１９８７））。しかしｈＧＨｂｐは天然には血清中に約０．５〜１ｎＭの一定レベルで存在する（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６２：１３４−１４１（１９８６）；Ｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：１８１７−１８２３（１９８６））。このようにｈＧＨはｈＧＨｂｐより過剰に律動するので、細胞受容体と相互作用し得る（さらにはｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ・ｈＧＨ膜受容体型を有するヘテロ二量化複合体をも生産し得る）遊離のｈＧＨと共に、ｈＧＨｂｐとの１：１の複合体が生産されると予期するであろう。
【００６４】
我々は、ｈＧＨがｈＧＨｂｐと相互作用してｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２型の複合体を作ることを決定し、その結果としての細胞外受容体ドメインの二量化がこのホルモンに関する体因性信号変換を開始すると提唱した。補充されたｈＰＬとｈＰＲＬ類縁体（実施例４）はｈＧＨｂｐの二量化を促進しないので、我々はｈＰＬとｈＰＲＬ骨格が、受容体認識および結合に必要なものとは異なる必須の二量化決定基を欠いていると結論することができる。関与するドメインの位置を特定するために、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ相同体置換を伴う一連のｈＧＨ突然変異体と２つの欠失類縁体をホルモンが誘発する受容体の二量化の減少についてスクリーニングした。次に、より詳細なアラニン走査法によって重要な側鎖を同定した。
ｈＧＨｂｐ変種（Ｓ２３７Ｃ）を構築し、蛍光的に標識した。ホルモンが誘発する二量化を監視するために、図１０に記載の如く蛍光クエンチングを測定した。このクエンチングはｈＧＨとｈＧＨｂｐのモル比が１：２であることを示した（実施例４）。ｈＬＰおよびｈＰＲＬセグメント置換を伴う一連の相同体走査ｈＧＨ変種を蛍光検定法で試験した（表５）。これらのうちの４つはホルモンが誘発するｈＧＨｂｐ二量化に有意な減少を引き起こした（実施例４）。他の２つのｈＧＨ欠失類縁体では、ｈＧＨｂｐ二量化の欠如が第２部位ｈＧＨｂｐ結合の破壊によるものと思われる（表５）。
【００６５】
突然変異ｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を蛍光的に標識した。図１０に示すように、ホルモンが誘発する二量化を監視するために蛍光信号を用いた。１０ｎＭ濃度に固定したＳ２３７Ｃ−ＡＦに対してｈＧＨを連続的に希釈し、平衡時に蛍光クエンチングを測定した。フルオレセイン標識のホモクエンチングはｈＧＨの添加と共に増大し、ｈＧＨが０．５モル等量の時点で最大になった。しかし極めて注目すべきことに、より高い濃度のｈＧＨではこのホモクエンチングが反転し、過剰のｈＧＨの存在下でｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２がｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ単量体複合体に解離することを示した。
ｈＰＬおよびｈＰＲＬセグメント置換を伴う一連の相同体走査ｈＧＨ突然変異体をＳ２３７Ｃ−ＡＦに基づく検定法で試験した（表５）。これらのうちの３つ、即ちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）およびｈＰＲＬ（１１１−１０９）は有意な減少を引き起こした（１８、６および＞１００倍）。これらの突然変異体に関する一次部位（部位１）中の欠損が、観測されたｈＧＨｂｐ二量化の減少のほとんどを説明するものと思われる。さらに、結合親和性を減少させる一次部位決定基の突然変異（例：Ｒ６４ＡおよびＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）が二量化を減少させることも示され、一次部位に関してｈＧＨｂｐ親和性を増大させることが明らかになったｈＧＨ突然変異体（Ｅ１７４Ａ）が我々の検定法での測定によれば二量化をも増進させた。相同体走査突然変異体に加えて、ｈＧＨ欠失類縁体（欠失１〜８）はｈＧＨｂｐの二量化を誘発するという能力の劇的な減少（＞１００倍）を示した（実施例４）。また、ｈＧＨｂｐ二量化のこの欠如は二次部位ｈＧＨｂｐ結合の破壊によるものと思われた。
【００６６】
二次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定のアミノ酸特異的側鎖をアラニン走査によって詳細に調べた（実施例６）。２６アラニン突然変異体の分析により（表６）、２つの突然変異体のみ（Ｆ１ＡとＩ４Ａ）がｈＧＨｂｐ二量化の＞１０倍の破壊をもたらし、他の４つ（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１１９Ａ）が＞２倍の破壊をもたらすことが明らかになった。これらの決定基は一次部位結合にとって重要なものとは異なる。固定された濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ）に連続的なｈＧＨ添加を行う実験と蛍光ホモクエンチングは、ｈＧＨが誘発する二量化に関する迅速な平衡時間（＜３分）と、引き続いて起こる過剰のｈＧＨによる二量化の反転に関する遅い平衡時間（＞３０分）を示した。このことは二量化の反転が脱離速度律速であることを示唆している（作用機序については実施例６）。
【００６７】
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２結晶の形成は、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎが記述している方法（アカデミック・プレス，ロンドン（１９７６））に従ってＸ線結晶学技術を用いるｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体の三次元構造の決定を可能にした。この構造を図１３に記載し、下記実施例７で議論する。図１３の構造は各ｈＧＨが２つのｈＧＨ受容体またはｈＧＨｂｐに結合することを示している。各ｈＧＨｂｐはｈＧＨの異なる部分と接触しており、第１のｈＧＨｂｐは表７に記載のアミノ酸と接触し、第２のｈＧＨｂｐと接触しているｈＧＨアミノ酸を表８に示す。２つのｈＧＨｂｐ間で接触しているアミノ酸を表９に示す。
これらのアミノ酸接触点でｈＧＨの変種を作成し、本発明の検定法によってそれを検出することができる。ｈＧＨへの結合に関与するアミノ酸内、あるいは２つのｈＧＨｂｐ自体の間のアミノ酸内で同様にｈＧＨｂｐ変種を作成することができる。このようなｈＧＨｂｐ変種は、野生型ｈＧＨとｈＧＨｂｐを用いる本発明の検定法を用いて検出することができる。
【００６８】
ＨＲＧの医薬組成物と投与
貯蔵のために、所望の純度を有する配位子類縁体タンパク質を随意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前掲）と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、配位子類縁体またはＧＨｂｐ抗体の医薬製剤を調製する。許容される担体、賦形剤または安定化剤は使用される投与量と濃度で受容者にとって非毒性であり、これらにはリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（メトキシド形成を防止するため）、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオンおよび／またはツウィーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
インビボ投与に使用される配位子類縁体またはＧＨＧｐ抗体は滅菌状態でなければならない。これは凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。配位子類縁体または配位子類縁体に対する抗体は通常は凍結乾燥した形態か、溶液状態で保存されるであろう。
【００６９】
医薬配位子類縁体または配位子類縁体特異的な抗体組成物は、一般に滅菌注入口を持つ容器（例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で突き刺すことができる蓋を持つバイアルなど）に入れられる。
配位子類縁体またはＧＨｂｐ抗体を投与する経路は既知の方法（例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または病巣内経路による注射または注入、あるいは後述の徐放系によるなど）に従う。配位子類縁体を注入によっ連続的に投与するか、ボーラス注射によって投与する。ＧＨｂｐ抗体は同じ方法で投与するか、血流またはリンパ液への投与による。
【００７０】
徐放性調製物の好適な例には、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性基盤であって、該基盤が成型品（例：フィルムまたはマイクロカプセル）の形態にあるものが含まれる。徐放性基盤の例にはポリエステル、ヒドロゲル［例：Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）とＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）に記述されているポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸ガンマエチルの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）、非分解性エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）、Ｌｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体とロイプロリドアセテートからなる注射可能な微小球）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシラク酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。エチレンビニルアセテートや乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上にわたって分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。封入したタンパク質を体内に長時間残しておくと、３７℃で湿気にさらされた結果としてそれらが変性または凝集して、生物学的活性の喪失や免疫原性の考え得る変化をもたらすこともあろう。関与する機構に応じてタンパク質を安定化するために合理的な方法を工夫することができる。例えば凝集機構がチオ−ジスルフィド相互変換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが判明したとすれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿気含量を調節し、適当な添加剤を使用し、特殊なポリマー基盤組成物を開発することによって安定化を達成することができる。
【００７１】
徐放性の配位子類縁体または抗体組成物には配位子類縁体または抗体をリポソームに封入したものも含まれる。配位子類縁体または抗体を含有するリポソームはそれ自体は既知の方法によって調製される（ＤＥ３２１８１２１、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：３６８８−３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：４０３０−４０３４（１９８０）、ＥＰ５２３２２、ＥＰ３６６７６、ＥＰ８８０４６、ＥＰ１４３９４９、ＥＰ１４２６４１、日本国特許出願８３−１１８００８、米国特許第４４８５０４５号、米国特許第４５４４５４５号およびＥＰ１０２３２４）。通常リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％コレステロール以上であるが、その比率の選択は最適な配位子類縁体治療のために調節される。増大した循環時間を持つリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
【００７２】
変種の使用
天然に存在する配位子の作用を拮抗薬として遮断するように作用させるために、本発明の検定法によって選択される拮抗薬配位子変種を医薬製剤として使用するか、もしくは形質転換動物内で発現させる。形質転換動物は新案物として、あるいは実験モデルとして有用である。他の選択された配位子変種を作用薬として作用させるための医薬製剤に使用し、これを投与することによって天然に存在するサイトカインによって刺激される応答と類似する応答を強化または促進する。例えば医薬的に有効な剤形中にｈＧＨ変種を使用する（例えば１９８８年４月１５日に出願された米国特許第５０９６８８５号）。配位子変種は、それらが望ましくない副作用を軽減または排除する一方で天然に存在するサイトカインと類似する活性を有し得るという点で有利であり、糖尿病誘発活性を示さないｈＧＨ変種はそのような例の１つである。作用薬または拮抗薬として生物学的活性を有さない配位子変種は少なくとも１つの配位子免疫エピトープを保持しているであろうから、それらは野生型配位子またはそれらの抗体に関する免疫検定法で有用である。
【００７３】
モノクローナル抗体と受容体の刺激
我々はいくつかの抗体がｈＧＨ受容体を刺激できることを決定した。即ち、これら抗体は、３要素複合体を形成して受容体を活性化するというｈＧＨの能力を模倣する様式で受容体を架橋することができる。そのような作用薬抗体の例は本発明時にはすでに知られていたが、ｈＧＨの作用薬として作用するというそれらの能力は認められていなかった。好適な抗体はＭＡｂ２６３である（Ｂａｒｎａｒｄら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１５：１８０５−１８１３（１９８４）またはＢａｒｎａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３１：４５９−４６８（１９８５））。他の抗体には後述する方法で作成されるＭＡｂ３Ｄ９および１３Ｅ１がある。随意に、意図する宿主中で親抗体よりも免疫原性の低いキメラ型やＣＤＲ移植型を作成するためにこれらの抗体を使用する。これらの抗体は好ましくはヒト受容体に対するものである。ｈＧＨの作用薬は少なくとも二価でなければならない。しかし、１受容体分子にしか結合しないＦＡｂ断片などの一価抗体は拮抗薬として有用である。
【００７４】
いくつかの態様では上記二価抗体が二特異的である。即ち、抗体の１つの腕が１つの受容体エピトープを指向し、もう１つの腕が受容体上の別のエピトープを指向する。拮抗薬抗体の態様は受容体（好ましくはその受容体−受容体接触領域）を指向する１つの腕と、ＧＨ受容体以外の抗原を指向するもう１つの腕とを含有することができる。これらの抗体は従来のハイブリドーマ法によって、あるいは従来のハイブリドーマ法によって、あるいは各腕をコード化する重鎖および軽鎖で組換え細胞を形質転換する組換え法によって作成される。組換え法によって二特異性抗体を作成し、それをアフィニティー精製によって細胞培養から回収するか、もしくは従来の方法で抗体を別個に作成し、それらをインビトロで組み合わせる。
【００７５】
これらの結果は獣医学の分野ではとりわけ興味深い。なぜなら能動的免疫化によってＧＨ作用薬を作成するために成長ホルモン受容体またはその断片に対して動物を免疫化することによって上述の抗体をインビボで生じさせることが現在では可能だからである。したがって、受動的に（外因性の抗体の投与によって）抗体を投与するか、もしくは受容体での免疫化によって能動的に抗体を投与する。
作用薬抗体は成長ホルモンとの比較におけるそれらの親和性に基づく投与量で投与される。哺乳動物に関するさらなる投与量は後述のラット成長研究から容易に外挿される。拮抗薬抗体は、充分量の成長ホルモンと競争してその有効活性を正常範囲に減じるか、もしくは矮小動物が目的物であるならば正常未満に減じるように計算された投与量で投与される。
抗体は上述の配位子類縁体と基本的に同じ様式で投与される。作用薬抗体はこれまでに成長ホルモンが使用されてきたのと同じ目的のために使用される。
【００７６】
以下の実施例は本発明を実施するにあたって現在知られている最善の方法の例示を意図するものであるが、本発明がこれらの実施例に限定されると見なすべきではない。
【００７７】
【実施例】
実施例１
ｈＧＨ−受容体複合体の構造
本発明の検定法はｈＧＨ−受容体複合体構造、即ち１つのｈＧＨと２つのｈＧＨ受容体または結合タンパク質が検出し得る安定な複合体を形成するという発見に基づいている。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体検定法によってこれらの検定法を例示する。
ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２複合体の結晶化
ｈＧＨ（２２ｋＤａ）とｈＧＨｂｐ（２８ｋＤａ）の間の複合体の結晶（図１）を気相拡散（Ａ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８２））によって成長させた。これらの結晶は少なくとも２．７Åに回折し、ａ＝１４５．８Å、ｂ＝６８．６Å、ｃ＝７６．０Åの単位格子変数を伴う空間群（Ｐ２１２１２）に属する。これらの結晶の非対称単位の体積はその複合体がｈＧＨ・ｈＧＨｂｐもしくは（ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ）２の形態を取るとは考え難いものである。具体的には、溶媒含量が単位格子内で１：１複合体については高すぎ（６８％）、２：２複合体については低すぎる（３２％）必要があろう。結晶の典型的な溶媒含量は約５０％であるから（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３，４９１−４９７（１９６８））、これらの結晶が成分の非対称な混合物を含有する可能性が最も高かった。
【００７８】
結晶の正確は組成を評価するために、それらを０.１％トリフルオロ酢酸中で解離させ、変性条件下でクロマトグラフィーに付した(図２)。ペプチド結合の吸光度に対応する２１４ｎｍで監視したそれぞれのピークの積分によってｈＧＨとｈＧＨｂｐの量を定量した。４回の独立した決定によると、ｈＧＨｂｐピークに対するｈＧＨピークのＡ214の比率が０.４２±０.０２であった。ｈＧＨ・(ｈＧＨｂｐ)2の形態を有する複合体については、積分したピーク面積に関して予測される比率が各成分内の残基の数(ｈＧＨは１９１残基、ｈＧＨｂｐは２３８残基)に基づいて０.４０である。対照実験として、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２混合物は図２のように基本的に同じクロマトグラムを作り、他方、２：１混合物と１：１混合物は予期されるように異なるクロマトグラフを作った。したがって、図１の結晶はｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：２のモル比で含有した。溶液中で安定な複合体を作るというｈＧＨとｈＧＨｂｐの能力は、複合体形成が信頼できる検定変数であるということを追認するものである。
溶液におけるｈＧＨ(ｈＧＨｂｐ)2複合体の形成
サイズ排除クロマトグラフィーによって溶液におけるｈＧＨ(ｈＧＨｂｐ)2の存在を立証した。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：４、１：３、１：２、１：１および１：０.５で比率で混合し、各成分をスーパーロース１２ＦＰＬＣカラムでのゲル濾過によって分離した(図３)。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比率が１：４の時(図３Ａ)、それぞれｈＧＨ・(ｈＧＨｂｐ)2複合体と遊離のｈＧＨｂｐに対応する見かけ上の分子量７０ｋＤと３０ｋＤの２つのピークが存在する。これらのピークの
面積はｈＧＨｂｐの吸光度によって支配される。なぜならその
【数１】
0003572263.tif 000005
はｈＧＨ１２より２.９倍高いからである。ｈＧＨに関する
【数２】
0003572263.tif 000006
は０.８２ｃｍ-1であり、純粋な試料の吸光度と組成分析に基づいてｈＧＨｂｐについては２.３５ｃｍ-1である。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比率が１：３および１：２である時(図３Ｂおよび２Ｃ)、複合体ピークの形と位置には変化がないが、遊離のｈＧＨｂｐに対応するピークは徐々に減少して０に近づく。したがって１：２の比率では、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの基本的にすべてが複合体として結合している。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比率を１：１に調節し、最終的に１：０.５に調節すると(図３Ｄ、２Ｅ)複合体ピークの位置がより小さいサイズ(〜５５ｋＤ)に移動し、非対称になり、遊離のｈＧＨが蓄積するので、ｈＧＨ・(ｈＧＨｂｐ)2、ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐおよび単量体ｈＧＨに対応する種の混合物の存在が示唆される。これらのピークの全域で採取したタンパク質試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥによって割り当てた組成を確認した。もう１つの対照実験では、遊離の成分が単量体タンパク質として移動し、二量化がこれらの条件下でｈＧＨとｈＧＨｂｐの両方の存在を必要とすることを示すことがわかった。したがって複合体の形成を複数の検定法で検出することができ、ｈＧＨ・(ｈＧＨｂｐ)2複合体の形成は細胞受容体に対するｈＧＨ結合の指標として機能する。さらにサイトカイン-サイトカイン受容体複合体を形成するサイトカイン受容体を介して作用するサイトカインはいずれも、ｈＧＨ-ｈＧＨ受容体複合体と同様に、このような検定法で評価できる。
【００７９】
実施例２
ｈＧＨ受容体結合部位
受容体または結合タンパク質についてｈＧＨ結合部位を遮断する抗体を用いて、ｈＧＨ受容体またはｈＧＨ結合タンパク質に関するｈＧＨ結合部位の性質を特徴づけた。ｈＧＨｂｐ上の２つの結合部位に関する証拠は下記の通りである。
ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの親和性は典型的にはｈＧＨｂｐからの［１２５Ｉ］ｈＧＨの置換と、グリコシル化したウサギＧＨ受容体から作成された抗受容体モノクローナル抗体（Ｍａｂ５）による複合体の沈殿によって測定される（Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５：１８０５−１８１３（１９８４）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１：４５９−４６８（１９８５））。この検定法を用いることにより、ｈＧＨとｈＧＨｂｐが１：１の複合体を形成し得ることがスキャッチャード分析によって立証された（Ｌｅｕｎｇ  Ｄ．Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７（１９８７）；Ｆｕｈ  Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３１１１−３１１５（１９９０）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５，１８０５−１８１３（１９８４）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１：４５９−４６８（１９８５）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７８６２−７８６７（１９８８）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７８６２−７８６７（１９８８））。
【００８０】
最近になって、大腸菌から精製されたグリコシル化されていないｈＧＨｂｐを用いる免疫化によってさらなるＭａｂ（複数）が作成された（Ｆｕｈ  Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３１１１−３１１５（１９９０））。複合体を沈殿させるためにこれらの抗ｈＧＨｂｐ  Ｍａｂのうちの２つ（３Ｂ７および３Ｄ９）を用いる置換曲線のスキャッチャード分析（図４）は、より高い結合親和性（ＫＤはＭａｂ５の０．４ｎＭに対して０．１ｎＭ）と１ｈＧＨｂｐに対して０．５ｈＧＨの化学量論を与える。これらの結果は、ｈＧＨ上の第２の部位に結合するためのｈＧＨｂｐ上の決定基をＭａＢ５が遮断するとすれば説明することができる。Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ９を用いる検定法における協同性の欠如は１：１複合体におけるｈＧＨの親和性（Ｍａｂ５を用いて測定されるもの）が１：２複合体に関する値（Ｍａｂ３Ｂ７および３Ｄ９を用いて測定されるもの）より約４倍低いに過ぎないという事実を反映しているものと思われる。スキャッチャードプロットにおける上方の屈曲によって正の協同性を捕らえるには、はるかに大きく相違する親和性が必要であろう。さらに、Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ９は１：１複合体と１：２複合体の両方を沈殿させ、これが見かけ上の協同性を低下させるに違いない。したがってｈＧＨ第２結合部位の遮断は１：１のｈＧＨ−ｈＧＨｂｐモル比をもたらし、一方、第２結合部位を遮断しない抗体は１：２のモル比をもたらす。
【００８１】
ｈＧＨ上の２つの結合部位に関する証拠は次の通りである。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の結合決定基の走査突然変異分析でＭａｂ５を使用した。したがってこれらの研究で同定される決定基は１：１複合体の形成を調節する上で重要なものを反映する。このデータに基づいて我々はｈＧＨの非結合性相同体内にこれらの決定基を装備し、ｈＧＨｂｐと強固に結合する類縁体を作成した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６１−１４６５（１９９０））。例えば野生型ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）またはヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）はｈＧＨより１０５倍または１０３倍以上弱くｈＧＨｂｐに結合する。ｈＰＲＬ中に８つの置換を組み込むことによって（Ｅ６２Ｓ／Ｄ６３Ｎ／Ｑ６６Ｅ／Ｈ１７１Ｄ／Ｅ１７４Ａ／Ｎ１７５Ｆ／Ｙ１７６Ｆ／Ｋ１７８Ｒ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６１−１４６５（１９９０））、あるいはｈＰＬ中に５つの置換を組み込むことによって（Ｖ４Ｉ／Ｄ５６Ｅ／Ｍ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ／Ｍ１７９Ｉ）、我々はそれぞれｈＧＨよりわずかに６．２倍または１．４倍だけ弱くｈＧＨｂｐに結合する変種を作成した。
【００８２】
これらの変種が１または２分子のｈＧＨｂｐを結合することができるかどうかを決定するために我々はゲル濾過を用いた（図５）。ｈＧＨｂｐとホルモンの比率が２：１の時、ｈＰＲＬ（図５Ａ）とｈＰＬ（図５Ｂ）の両結合性変種はｈＧＨｂｐとの１：１複合体に対応する２つの対称なピーク（見かけ上の分子量約５５ｋＤａ）と、化学量論的に過剰なｈＧＨｂｐを表すより低分子量のピーク（３０ｋＤａ）を示す。同じ条件下で野生型ｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２複合体に対応する単一のピーク（見かけ上の分子量７７ｋＤａ）をもたらす（図５Ｃ）。図５Ｃにおける小さいサテライトピークはわずかに過剰なｈＧＨｂｐに由来するものである。ピーク組成をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
【００８３】
化学量論と反応の熱量をさらに評価するために我々は走査熱量測定法を使用した。なぜなら複合体を分離するために抗体やクロマトグラフィーを使用する必要がなく、溶液中で自由に結合を研究できるからである。固定した濃度のｈＧＨｂｐ（１５μＭ）を含有する溶液にｈＧＨを一部づつ加え、さらなるエンタルピー変化がなくなるまで反応の熱量を測定した（図６）。この実験によって我々はｈＧＨｂｐに結合するｈＧＨの当量と反応の熱量を決定することができた。
表４に野生型ｈＧＨとｈＧＨおよびｈＰＲＬの変種に関する反応の熱量と滴定終点を要約する。すべてのｈＧＨｂｐを結合するのに必要なｈＧＨの比率は約０．５対１である。さらに、結合を減少させる（２０倍まで）か、もしくは結合を増強する（４．５倍）一連の単一アラニン突然変異体は、反応のエンタルピーの変化を伴いはするが、ｈＧＨｂｐに対して野生型ｈＧＨと同じ結合の化学量論を与える。対照的にｈＧＨｂｐに対するｈＰＲＬの結合の化学量論は０．８５対１である。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
これらのデータは総合的にみてｈＰＲＬとｈＰＬ変種がｈＧＨｂｐの二量化にとって重要な決定基を欠いていたことを強く示している。これらの決定基はｈＧＨの単一アラニン突然変異体中ではほとんど保存されているが、ｈＰＲＬまたはｈＰＬ変種中では保存されていない。このことはｈＧＨ上にｈＧＨｂｐにとっての結合部位が２つあることを示唆している。これらの部位のうちの１つはそれぞれＭａＢ５免疫沈殿検定法を用いるｈＧＨｂｐまたはｈＧＨのアラニン走査突然変異法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｔ  ２４４：１０８１（１９８９））によって、機能的に詳細に特徴づけられている。ｈＧＨとｈＧＨｂｐ上の第２の部位は未解明のままであったが、これについて後述する。
【００８６】
実施例３
ｈＧＨ-受容体複合体およびスペクトル変化
受容体に対するｈＧＨの結合は各成分にほとんどスペクトル変化をもたらさない。ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合が各成分の大きな二次または三次構造の変化をもたらすかどうかを決定するために、我々は複合体形成時の円二色(ＣＤ)スペクトルと蛍光スペクトルの変化を調べた。０.０１Ｍ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)および２００ｍＭ ＮａＣｌ中で約１.０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を透析することによって分光光度測定用のタンパク質を調製した。透析後、その溶液を濾過し(０.２２μ，Millipore)、吸光度スペクトルを得た。そのスペクトルを光散乱についいて補正し(Shauenstein E.,J.Polymer Sci.16:45(1955))、２８０ｎｍでの吸光度によってタンパク質濃度を決定した。純粋な試料の組成分析と吸光度に基づ
いて、ｈＧＨに関する
【数３】
0003572263.tif 000008
は０.８２ｃｍ-1であり、ｈＧＨｂｐについては２.３５ｃｍ-1である。ｈＧＨはその４つの螺旋塊構造(Adbel-Meguid S.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sic.USA 84:6434(1987))に特有の強いα-螺旋ＣＤスペクトルを示す(Bewley T.A.ら,Arch.Biochem.Biophys.138:338-346(1970))。対照的に、ｈＧＨｂｐのＣＤスペクトルは、ジスルフィド結合で連結された主としてターンとループ(Cleary,S.ら,Biochemistry 28:1884(1989)；Hilder,R.C.ら,Biophysical Chemistry 31:45(1988))からなるタンパク質に特有であり、ｈＧＨｂｐは３つの隣接して連結したジスルフィド結合を含有する(Fuh G.ら,J.Biol.Chem.265:3111-3115(1990))。凍結細胞ペーストを低浸透圧緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１ｍＭ ＰＭＳＦ(Sigma)、２ｍＭ ＥＤＴＡ)中で融解した。その懸濁液をホモジナイズし、４℃で１時間撹拌した後、１００００×ｇで２０分間遠心分離した。その上清に固体硫酸アンモニウムを２６０ｇ／Ｌの濃度で加え、溶解するまで撹拌した。タンパク質沈殿物を１００００×ｇで３０分間の遠心分離によって集めた。そのペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。透析液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)中のＱセファロースカラム(Pharmacia)に添加し、０.０から０.５Ｍ ＮａＣｌへの直線的勾配で溶出させた。ｈＧＨｂｐを含有するピーク分画をｈＧＨアフィニティーカラムに直接充填した。洗浄の後、４Ｍ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)を用いてこのカラムを溶出させた。ピーク分画を合わせ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)で透析し、Mono Ｑカラムに添加し、洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)中０.０から０.２Ｍ ＮａＣｌへの直線的勾配で溶出させた。
【００８７】
ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混合する場合、遠ＵＶＣＤスペクトルはｈＧＨとｈＧＨｂｐに関するスペクトルの和と基本的に同一である（図７）。この結果は複合体化した時に通常の二次構造に大きな変化がないことを示している。近ＵＶＣＤスペクトル（図８）は芳香族アミノ酸側鎖の非対称な環境を反映する（Ｂｅｗｌｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５：１５５５（１９７９）；Ｂｅｗｌｅｙ  Ｔ．Ａ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２３３：２１９−２２７（１９８４））。ｈＧＨとｈＧＨｂｐのＵＶ吸収スペクトルの間には大きな相違があり、これは主としてｈＧＨと比較してｈＧＨｂｐのトリプトファン含量が高い（それぞれ１対９）結果である。しかしスペクトルの強度の増大を除いて、個々のスペクトルの和は基本的に混合後に得られるものと同一である。
【００８８】
蛍光スペクトルでは、ｈＧＨがｈＧＨｂｐに結合した時に、３４０ナノメートルから３３４ナノメートルへの青方偏移と蛍光強度のわずかな減少がある（図９）。ヨウ素クエンチングとシュターン・フォルマー分析はホルモン受容体複合体中のトリプトファンの暴露に減少があることを示している。蛍光クエンチング研究はｈＧＨ中のトリプトファンが感知し得るほどには溶媒にさらされていないことを示しているので（Ｂｅｗｌｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５：１５５５（１９７９）；Ｂｅｗｌｅｙ  Ｔ．Ａ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２３３：２１９−２２７（１９８４））、これはおそらくｈＧＨを結合した時にｈＧＨｂｐ中の１またはそれ以上のＴｒｐ残基が隠される結果であると思われる。対照的に、ｈＧＨｂｐの突然変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨへの結合にとりわけ重要であることを示している。これらの分光学的研究はｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合時にほとんど立体配座変化を示さないが、これらの方法は通常の二次構造の構造的変化（遠ＵＶＣＤ）および芳香族基の位置の変化（近ＵＶＣＤと蛍光クエンチング）に偏している。したがって複合体化した成分と遊離の成分の高解像構造は立体配座的変化をさらに明らかにするであろう。
【００８９】
実施例４
検定法と修飾されたｈＧＨ
修飾したポリペプチドホルモンを本検定法で評価した。一組のｈＧＨ残基（Ｆ１０、Ｆ５４、Ｅ５６、Ｉ５８、Ｒ６４、Ｑ６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｆ１７６、Ｒ１７８およびＶ１８５を含む）はｈＧＨｂｐに対する高親和性化学量論的結合を付与する上で重要であることが知られている（ＷＯ９０／０４７８８）。ｈＧＨｂｐに強固に結合するヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）類縁体とヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）類縁体（それぞれＫｄ＝１ｎＭおよび６ｎＭ）を同定するべく、これらの決定基をｈＧＨｂｐ結合非競争的ｈＧＨ相同体であるｈＰＬとｈＰＲＬに装備した。既に議論したようにｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用してｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２型の複合体を作る。採用したｈＰＬおよびｈＰＲＬ類縁体はｈＧＨｂｐの二量化を促進しないので、我々はｈＰＬ骨格とｈＰＲＬ骨格が最初の受容体認識と結合に必要なものとは異なる必須の二量化決定基を欠いていると結論することができる。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２の形成に関与するドメインの位置を特定するために、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ相同体置換を伴う一連のｈＧＨ突然変異体と２つの欠失類縁体を、ホルモンが誘発する受容体二量化の減少についてスクリーニングした。次に重要な側鎖をより詳細なアラニン走査法によって同定した。
【００９０】
ホルモンが誘発するｈＧＨｂｐの二量化を定量するために、我々はフルオレセインで標識されたｈＧＨｂｐのホモクエンチングを測定する高感度な検定法を使用した。突然変異ｈＧＨｂｐ  Ｓ２３７Ｃを構築し、精製し、５−ヨードアセタミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）と反応させることによって蛍光的に標識されたｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を得た。ここに得られたＳ２３７Ｃ−ＡＦ試薬は１ｈＧＨｂｐ分子につき１つの標識を保持しており、競争結合検定で完全な結合活性を保っている。フルレセインは重複する励起スペクトルと放射スペクトルを有するので、この蛍光プローブはこれらの分子が互いに接近した時にホモクエンチングを起こす。この信号を用いてホルモンが誘発するＳ２３７Ｃ−ＡＦの二量化を図１０に示すように監視した。
【００９１】
図１０には、ｈＧＨの連続的添加による１０ｎＭ  Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチングを示す。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦを結合緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３）で１０ｎＭ濃度に希釈し、１．０ｍｌづつ１２×７５ｍｍポリプロピレン検定チューブに分注した。別個に、１２０ｍＭから０．００２ｍＭまでにわたるｈＧＨの希釈液を作成した。次にｈＧＨ希釈液の一部（１０ｍｌ）または緩衝液のみをＳ２３７Ｃ−ＡＦチューブに加え、平衡化するために暗所で２５℃で５時間その混合物をインキュベートした。インキュベーション後、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ５０００Ｕ分光蛍光計を用いて４９０ｎｍの励起Ｉと５１２ｎｍの放射Ｉ（バンド幅はそれぞれ３ｎｍと１０ｎｍ）で蛍光測定を行った。３つの読み取り値からＦ／Ｆ０値を計算し、ｈＧＨ濃度に対してプロットした。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの調製は次の通りである。既に記述したように突然変異体Ｓ２３７Ｃ  ｈＧＨｂｐを構築し、精製した。１ｍｇ／ｍｌ  Ｓ２３７Ｃの溶液を２５ｍＭシステインＨＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３にし、位置２３７のシステインを脱遮断するために４℃で２時間インキュベートした。５０ｍＭ  ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ミニカラムを用いてこのタンパク質を脱塩し、直ちに５００ｍＭ  ５−ＩＡＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と暗所で４℃で１６時間反応させた。５−ＩＡＦ添加前の脱遮断されたＳ２３７ＣのＤＴＮＢ分析はＳ２３７Ｃ１分子につき１遊離チオール基の平均値を示した（２２μＭ遊離ＳＨ対１７μＭ  Ｓ２３７Ｃ）。２０ｍＭ  ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したもう１つのＰＤ１０ミニカラムを用いて、遊離の発蛍光団から５−ＩＡＦと反応したＳ２３７Ｃを精製した。精製したＳ２３７Ｃ−ＡＦの一部を−８０℃で保存し、使用する直前に融解した。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの吸着スペクトル分析は、７１３００（４９４ｎｍ）と６４８００（２８０ｎｍ）のモル吸光係数を用い、２８０ｎＭにおける５−ＩＡＦ吸光度の妨害について補正することにより、１．０ｍＭ  Ｓ２３７Ｃにつき０．８４ｍＭのフルオレセイン結合を示した。
【００９２】
ここで１０ｎＭ濃度に固定したＳ２３７Ｃ−ＡＦに対してｈＧＨを連続的に希釈し、平衡時に蛍光ホモクエンチングを測定した。ホモクエンチングはｈＧＨの添加と共に増大し、ｈＧＨが０．５モル当量（５ｎＭ）の時に最大（△Ｆ／Ｆ０＝１１％）になる。しかし極めて注目すべきは、このホモクエンチングがより高いｈＧＨ濃度で反転することであり、これは過剰のｈＨＧ（即ちｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ＞０．５）の存在下ではｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２がｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ単量複合体に解離することを示している。ドナー（Ｓ２３７Ｃ−ＡＥＤＡＮＳ、ｒｅｆ．）蛍光クエンチングとアクセプター（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）蛍光増大の両方を測定するために同一でないドナー／アクセプター対を用いる実験で示されるように、測定される蛍光ホモクエンチングは純粋なフォルスターエネルギー転移を反映する。大過剰のｈＧＨ（＞７０ｎＭ）の存在下で起こる蛍光測定値のＦ／Ｆ０＞１への増大は、結合したｈＧＨ・Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ複合体に対して遊離のＳ２３７Ｃ−ＡＦのより高い非特異的結合によるものと思われる。この現象は我々の検定法で得られるＩＣ５０値をわずかにゆがめるかもしれないが（図１１）、我々の分析の基礎である相対的ＩＣ５０値は影響を受けないはずである。
【００９３】
図１１ではｈＧＨが誘発するＳ２３７Ｃ−ＡＦの二量化に関するＩＣ５０値を決定した。結合緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３）中のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（図１０について説明したように調製したもの）の連続的希釈液（３倍）を６０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲にわたって調製し、１．０ｍｌづつを検定チューブに分注した。同様に、ｈＧＨを連続的に３μＭから０．００４μＭの範囲にわたって希釈した。ｈＧＨ希釈液の一部（１０μｌ）（１：２のｈＧＨとＳ２３７Ｃ−ＡＦのモル比を与える）と緩衝液のみをＳ２３７Ｃ−ＡＦの入った検定チューブに加え（３つ一組）、混合し、インキュベートすることによって暗所で２５℃で５時間平衡化した。平衡後、既に記述したように（図１０）蛍光を測定したが、ただし励起バンド幅を１０ｎＭとした。半最大△Ｆ／Ｆ０値を与えるｈＧＨの濃度としてＩＣ５０値を計算した。
表５にｈＧＨの様々な相同体置換体および欠失突然変異体によって誘発されるＳ２３７Ｃ−ＡＦの二量化に関するＩＣ５０値を示す。ｈＧＨ突然変異体の同定は△，欠失体、ｈＰＬ，ヒト胎盤性ラクトゲンによる置換体、ｈＰＲＬ，ヒトプロラクチンによる置換体として表す。欠失または置換の領域を括弧内に指定する。ＩＣ５０値は図３について記述したように決定した。標準偏差は一般に報告する値の＋／−５０％未満である。
【００９４】
【表５】
0003572263.tif 000009
【００９５】
最初に、ｈＰＬおよびｈＰＲＬセグメント置換を用いて一連の相同体走査ｈＧＨ突然変異体をＳ２３７Ｃ−ＡＦに基づく検定法で試験した（表５）。これらのうちの３つ、即ちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）およびｈＰＲＬ（１１１−１２９）はホルモンが誘発するｈＧＨｂｐの二量化にわずかな減少（それぞれ１８、６および＞１００倍）を引き起こした。しかしｈＰＲＬ１２−１９とｈＰＲＬ５４−７４は一次部位結合にとって非常に重要な残基を破壊し、この部位に関するｈＧＨｂｐの親和性を本質的に減少させることがわかった。これらの突然変異体に関する一次部位結合の喪失は観測されたｈＧＨｂｐ二量化の減少の主たる原因であると思われる。実際に、野生型ｈＧＨによるＳ２３７Ｃ−ＡＦホモクエンチングについて観測された５００ｐＭというＩＣ５０は一次部位ｈＧＨｂｐ親和性について報告された値（Ｋｄ＝４００ｐＭ）とほぼ同一である。さらに、結合親和性を減じる一次部位決定基の突然変異（例：Ｒ６４ＡおよびＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）が二量化をも減じることが示され、一次部位についてｈＧＨｂｐの親和性を増進することが示されたｈＧＨ突然変異体（Ｅ１７４Ａ）は我々の検定法で測定したときに二量化をも増進する。他の相同体突然変異体ｈＰＲＬ（１１１−１２９）は一次部位結合には影響を与えないが、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した場合に、９０％はｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体のみを形成するが、残りの１０％はｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２を形成するという不均質性の証拠を示す。比較的無傷な二次部位結合を伴うこの突然変異体の副分画の存在は、この突然変異体の効果の原因をタンパク質折り畳みの失敗または翻訳後修飾に帰することができることを示唆している。
【００９６】
相同体走査突然変異体に加えて、２つのｈＧＨ欠失類縁体（１つはＮ−末端から８残基を除去したもの［△（１−８）］であり、もう１つのは残基３２〜４６が欠失した天然の変種（２０Ｋ  ｈＧＨ；米国特許第４４４６２３５号）である）を試験した（表５）。△（１−８）突然変異体はｈＧＨｂｐの二量化を誘発するという能力の劇的な減少（＞１００倍）を示した。この突然変異体は一次部位結合に対してわずかな効果しか持たないので（Ｋｄｍｕｔ／Ｋｄｗｔ＝４）、ｈＧＨｂｐ二量化の喪失は二次部位ｈＧＨｂｐ結合の破壊によるものと思われる。
【００９７】
実施例５
ｈＧＨ変種のアラニン走査
二次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定の側鎖を解明するために、△（１−８）、ｈＰＲＬ（１１−１９）およびｈＰＲＬ（１１１−１２９）突然変異体で同定されたドメインをアラニン走査によって詳細に調べた。ブタ成長ホルモンのＸ線結晶構造によれば相同体置換によって同定された２つのドメインは螺旋であり、かつ、高度に両親媒性であるので、われわれはスクリーニングする突然変異体を、残基が溶媒にさらされていると思われるこれらの螺旋の親水性表面に位置するものに集中させた。これらのドメインに加えて、Ｃ−末端付近の３突然変異体（Ｅ１８６Ａ、Ｓ１８８ＡおよびＦ１９１Ａ）をもスクリーニングした。なぜならこの領域における適当な相同体置換類縁体がなかったからである。
【００９８】
２６種の一組のアラニン突然変異体（表６）から、ｈＧＨｂｐの二量化に大きな破壊をもたらす２つの突然変異体Ｆ１ＡとＩ４Ａ（それぞれ３３倍と５６倍）と、≧２倍の減少を引き起こす他の４種（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１１９Ａ）を見つけた。アラニン走査はＮ−末端ドメイン中のＦ１ＡとＩ４Ａに隣接する残基が螺旋ＡとＣのＣ−末端ドメイン中の残基と共に、二次部位ｈＧＨｂｐ結合に有意な寄与をしないことを示している。Ｎ−末端ドメインからＦ１とＰ２を削除したｈＧＨ類縁体［△（１，２）］から得られる追加のデータは、△（１，２）がＦ１Ａのみの場合以上には二量化を破壊しないことを明らかにし、このことはＮ−末端アミンまたはカルボニル基ではなくフェニルアラニン側鎖が重要であることを示している。アラニン走査分析は、二次部位ｈＧＨｂｐ結合と受容体の二量化に最も寄与するｈＧＨ決定基がＦ１およびＩ４の疎水性側鎖であることを明らかにしている。これらの決定基は、主として親水性を示す（Ｂｏｕｔｉｎ  Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ  ６９：（１９８８））多くの残基（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：４９１−４９７（１９６８））からなる一次部位結合にとって必須なものとは著しく異なる。
【００９９】
表６に、アラニン置換したｈＧＨ突然変異体によって誘発されるＳ２３７Ｃ−ＡＦの二量化に関するＩＣ５０値を示す。突然変異体は野生型残基とアミノ酸配列中での位置及びそれに続く突然変異体残基（この場合にはアラニン）で命名されている。一文字コードによって指定されるアミノ酸はＡ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒである。発現されない突然変異体をＮＥと指定する。ＩＣ５０数は図３に記述の如く計算する。標準偏差は一般に報告する値の＋／−５０％未満または表示の通りである。
【０１００】
【表６】
0003572263.tif 000010
【０１０１】
実施例６
蛍光のホモクエンチング
固定した濃度のＳ２３７Ｃ-ＡＦ(１００ｎＭ)に対してｈＧＨの逐次的な添加を行うと、実時間で監視した蛍光ホモクエンチング(実施例４)は、ｈＧＨが誘発する二量化に関する速い平衡時間(＜３分)と、引き続いて起こる過剰のｈＧＨ(即ちｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ＞０.５)による二量化の反転に関する遅い平衡時間(＞３０分)を示す。このことは、二量化の反転が、
【数４】
0003572263.tif 000011
(ここでは化学量論的な結合がｈＧＨ過剰の条件下で二量化と競争する)
という機序に従う脱離速度律速であることを示唆している(Ｈ＝ｈＧＨ、Ｒ＝遊離のｈＧＨｂｐ、Ｒ1＝一次部位ｈＧＨｂｐ、Ｒ2＝二次部位ｈＧＨｂｐ)。我々は一次部位の化学量論的結合が起こり、それゆえにこれがｈＧＨ(ｈＧＨｂｐ)2複合体の形成と競争するに違いないことを知っている。化学量論的二次部位結合が起こり得るかどうかを決定するために、一次部位を除去するように工作した類縁体を、二量化に関して競争する能力について試験した。ｈＧＨｂｐ親和性を５００倍減少させる一次部位の中央部の突然変異を伴う二重突然変異体Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａは二次部位を保持している。図１２はｈＧＨｂｐの二量化が１６０倍過剰(８００ｎＭ)の存在下でさえ過剰のＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａによって反転し得ないことを示している。対照的に、工作された一次部位を含有し、二次部位決定基を欠く既知のｈＰＬ変種は２０ｎＭ(４倍過剰)のＩＣ50で効率よく二量化を遮断する。このデータは化学量論的な二次部位結合が起こらないということと、二量化が、
【数５】
0003572263.tif 000012
という逐次的な結合機序によって進行しなければならないということを立証している。
二次部位ｈＧＨｂｐ結合は化学量論的な一次部位複合体の形成を必要とするので、この結合事象はｈＧＨのみではなくｈＧＨ・(ｈＧＨｂｐ)中に存在する決定基に依存しなければならない。したがってこれらの決定基は一次部位ｈＧＨｂｐおよび／または最初のｈＧＨｂｐ結合事象によって引き起こされる立体配座変化から導入されなければならない。
【０１０２】
実施例７
Ｘ線結晶学に基づくｈＧＨ−ｈＧＨｂｐアミノ酸相互作用
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２結晶の形成は、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９７６）に記述されている方法に従ってＸ線結晶学的技術を用いてｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２複合体の三次元構造を決定することを可能にする。反復種晶添加と静置滴における蒸気拡散の組み合わせを用いてこの複合体の結晶を成長させた。わずかに２：１モル過剰になるようにｍｅｔ−ｈＧＨにｈＧＨｂｐを添加することによって結晶貯蔵液を調製し、これを４℃で２４時間インキュベートした。次に複合体を濃縮し、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  ＰＭＳＦを用いて平衡化したサイズ排除カラム（Ｇ７５−１２０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｓｉｇｍａ））に充填した。次に複合体を含有する分画を貯蔵し、濃縮し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  ＰＭＳＦに脱塩した。得られた貯蔵溶液中の複合体の濃度は４ｍｇ／ｍｌ（Ｅ２８０（０．１％）＝１．６７ｃｍ−１）であった。０．１Ｍ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）を用いて複合体の貯蔵液を１．７ｍｇ／ｍｌに希釈し、これに飽和硫酸アンモニウム（超純粋（Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｍａｎｎ））を加えて１０％飽和溶液を調製した。ＭＰＤ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて最終濃度１％にした。次にピペットを用いてこの混合物の５０μｌをＰｙｒｅｘガラススポットプレートに移し、１５０ｍｍ×２５ｍｍプラスチック培養皿中で４０％飽和硫酸アンモニウムに対して室温で２日間平衡化させた後、種結晶を導入した。４５ｋＶ、１１０ｍＡで作動する回転アノード発生器上で２．７Åに回折する１ｍｍ×０．５ｍｍ×０．１ｍｍの大きさの結晶が２週間以内に得られた。
【０１０３】
ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２結晶構造の三次元ポリペプチド構造を図１３に示す。太い線で描かれた中央上部の領域はｈＧＨ分子を表し、アルファ螺旋を明確に見ることができる。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子（１つは左側にあり、もう１つは右側にある）に結合している。これらのｈＧＨｂｐ分子のそれぞれは単一鎖によって連結された２つのドメインを有する。上部ドメインはｈＧＨ分子と同じ高さにあり、もう１つのドメインは垂直方向を向いており、この図の底部に向かって突き出している。ｈＧＨｂｐの後者の２つのドメインは図１３の最底部で互いに接触している。底部におけるこの接触は２つのｈＧＨｂｐ分子の間で唯一の接触領域を構成しており、この接触点について後述する。この構造に基づいて、相互作用する３つのポリペプチドのアミノ酸の分析を行った。これらは次の３つのカテゴリーに分類される：１）表７に列挙するｈＧＨとｈＧＨｂｐ１（最初に結合するｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；２）表８に列挙するｈＧＨとｈＧＨｂｐ２（２番目に結合するｈＧＨｂｐ）の間の相互作用；および３）表９に列挙する複合体中の２つのｈＧＨｂｐ間の相互作用。表７と表８は表示する唯一のｈＧＨｂｐアミノ酸に結合している唯一の個々のｈＧＨアミノ酸を開示している。結合している特定の部分と化学的相互作用の性質をも列挙してある。命名法は標準的な一文字標記に従い、アミノ酸の番号は天然のｈＧＨまたはｈＧＨｂｐのアミノ末端から番号を付与したものである。表７、７および８中の残りの用語は次の通りに定義される：ＭＣ＝主鎖、ＳＣ＝側鎖、ＳＳ＝ジスルフィド、ＨＢ＝水素結合、ＳＢ＝塩橋、ＶＷ＝ファン・デル・ワールス。これらの表は部位１および部位２が作用するすべての残基を網羅したものではない。
【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
【表９】
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【０１０７】
実施例８
ｈＧＨ受容体を刺激するためのモノクローナル抗体の使用
本発明の検定法を用いて成長ホルモン受容体に対するモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。次いで得られたモノクローナル抗体を、成長を促進する相対的能力についてインビボで評価することができる。グリコシル化されたラットおよびウサギ受容体を免疫原として用いてモノクローナル抗体ＭＡｂ２６３（Ａｇｅｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，オーストラリア，クイーンズランド）を作成した。下垂体切除ラットに、ラット中１５５μｇ／ＫｇのｈＧＨ投与量に対してモル基準で等価な投与量でＭＡｂ２６３を毎日皮下注射したところ、図１４に示すように有意な体重増加があった。
それぞれ８匹のラットからなる２つの群に、ＭＡｂ２６３（１．０５ｍｇ／ｋｇ）と共に、あるいはＭＡｂ２６３なしで、賦形剤緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１％牛血清アルブミン）を与えた。要求に応じて水と食物をラットに与えた。毎日の体重を図１４に示す。第６日の終了時にラットの体重を測定し、その結果を次の表１０に示す。
【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
したがって体重増加を得るために成長ホルモン受容体に対するモノクローナル抗体を投与することができる。
【０１１０】
実施例９
作用薬または拮抗薬活性に関する細胞検定法
細胞に基づく新規な生物活性検定系を本明細書に記載する。これはホルモンまたはサイトカイン受容体（例えばＥＰＯ、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、インターロイキン２、３、４、６または７の受容体など）にそのＣ−末端で解放されたＧＨ受容体の細胞外ＧＨ結合ドメインからなるハイブリッド受容体（米国特許第４８５９６０９号）形質転換細胞系に基づき、該細胞系は通常はホルモンまたはサイトカインに対して応答性であり、また通常はホルモンまたはサイトカインの受容体を含有する。通常、そのＮ−末端でＧＨ受容体断片に融合されたホルモンまたはサイトカイン受容体の貫膜および内部原形質部分のみを使用する。該細胞の応答特性は、例えば分析物の放出（例：脱顆粒）、有糸分裂性、増殖、膜特徴の変化などの測定可能な特徴である。
【０１１１】
ｈＧＨ受容体は血液形成起源の受容体の大きなファミリー（７）に属し、このファミリーにはインターロイキン−３（ＩＬ−３）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体が含まれる。Ｎａｇａｔａとその共同研究者ら（８）は、全長ネズミＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションされたＩＬ−３依存性骨髄性白血病細胞系（ＦＤＣ−Ｐ１）がＩＬ−３を伴わないＧ−ＣＳＦの添加によって増殖することを明らかにした。あるハイブリッド受容体（米国特許第４８５９８０９号および５０３０５７６号）は大阪バイオサイエンス研究所のＥｔｓｋｏ  Ｉｓｈｉｚａｋａ−ＩｋｅｄａおよびＳｈｉｇｅｋａｚｕ  Ｎａｇａｔａ博士によって構築されたものであり、これはＧ−ＣＳＦ結合ドメインを欠くが３つの細胞外フィブロネクチン反復、貫膜ドメインおよび細胞内ドメインを含有する型のｍＧ−ＣＳＦ受容体に連結したｈＧＨｂｐを含有する。フィブロネクチンドメインはＧ−ＣＳＦの結合に関与しないが、ｍＧ−ＣＳＦ受容体の良好な発現には必要である（８）。
【０１１２】
ｍＧ−ＣＳＦ受容体のエクソン７から１５（これは３つのフィブロネクチンドメインと貫膜および細胞内ドメインの全体をコード化する）に連結したｈＧＨ受容体のエクソン１から５まで（これは分泌シグナルと細胞外ｈＧＨ結合ドメインをコード化する）を含有するｃＤＮＡからハイブリッド受容体を構築した。ｈＧＨ受容体に由来する配列（Ｌｅｕｎｇ  Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７（１９８７））をＰＣＲによってベクターｐＢＯＳ−１６２（８）中にクローン化し、これによってＦＤＣ−Ｐ１細胞における該ハイブリッド受容体の発現を可能にした。２つの受容体断片の連結部にひとつのシステインを作った。安定なＦＤＣ−Ｐ１細胞系のトランスフェクションと培養は後述の通りである。
１細胞あたりのおよその受容体数と親和性を立証するために、全細胞上のハイブリッド受容体からの［１２５Ｉ］ｈＧＨの競争的置換を用いた。ＩＬ−３で成長させた細胞を検定の前にリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）＋１０％ＦＢＳで洗浄した。２０ｐＭ［１２５Ｉ］ｈＧＨ（Ｙ１０３Ａ）の存在下でｈＧＨの連続的希釈液と共に細胞を４℃で１８時間インキュベートした（１．２×１０６／ｍｌ）。次に過剰の標識を除去するために細胞をＰＢＳで２回洗浄した。第２ｈＧＨｂｐの結合を部分的に遮断し得るＹ１０３のヨウ素化を防止するためにＹ１０３Ａを用いた（９）。
【０１１３】
数回の独立した結合実験において、ｈＧＨに関する見かけ上のＫｄ値は０．１±０．０３ｎＭであり、１細胞につき１０００±３００個の受容体があった。この親和性は可溶性ｈＧＨｂｐに対するｈＧＨ結合より約３倍強く、細胞上の受容体に対するｈＧＨの結合に関する親和力効果の反映であり得る。トランスフェクションされなかった細胞はｈＧＨに関する特異的結合部位を欠いた（９）。図１５は細胞増殖を誘発するというｈＧＨの能力に対する増大するｈＧＨ濃度の効果を示している。低濃度においてｈＧＨはこの検定法で強力な作用薬として作用し、そのＥＣ５０は〜２０ｐＭで、この値は全細胞上の見かけ上のＫｄ（〜１００ｐＭ）よりいくらか低い。これは最大細胞増殖が１００％の受容体占有未満で起こり得ることの反映であり得る。
【０１１４】
突然変異分析（３，４）と構造研究（５）は各ｈＧＨ分子がｈＧＨｂｐを結合するための２つの別個の部位を含有する点で二価であることを示している。対照的にｈＧＨｂｐは、ｈＧＨ上の部位１または部位２に結合するために基本的に同じ決定基を使用するので、実際上一価である。過剰なｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）２複合体を解離させて、ｈＧＨが専ら部位１を介してｈＧＨｂｐに結合しているｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体を形成させるであろう。したがって我々は過剰なｈＧＨが拮抗信号であるに違いないと推定した（図２）。実際に極めて高いｈＧＨ濃度では増殖活性が失われる（ＩＣ５０＠２μＭ）。ＩＬ−３が誘発する細胞増殖は高いｈＧＨ濃度（８μＭ）の存在下でも変化せず、ｈＧＨが細胞増殖にとって毒性でないことを示している。作用薬変曲点または拮抗薬変曲点はいずれも細胞密度に依存せず（図１５）、この効果が細胞間の架橋受容体または他の細胞−細胞相互作用を伴わないことを示している。さらに全長ｍＧ−ＣＳＦ受容体を含有するＦＤＣ−Ｐ１細胞はｈＧＨに応答しないし、ハイブリッド受容体を含有する細胞もＧ−ＣＳＦに応答しない。
【０１１５】
実施例１０
ハイブリッド受容体細胞増殖検定を信号化するためのｈＧＨｂｐの二量化にとっての必要条件をさらに調べるために、我々はｈＧＨｂｐに対する二価モノクローナル抗体（ＭＡｂ）とそれらに由来する一価断片（ＦＡｂ）を使用した。低濃度の４つの異なる抗受容体ＭＡｂのうち３つの増大する濃度の添加が、細胞増殖の誘発に関してｈＧＨと同じぐらい強力であった（表１１）。
【０１１６】
【表１１】
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【０１１７】
ＭＡｂ５および２６３はＡｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー）から得たものであり、Ｗａｔｅｒｓとその共同研究者らによって記述されている（Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５：１８０５−１８１３（１９８４）；Ｂａｒｎａｒｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１：４５９−４６８（１９８５））。ＭＡｂ１３Ｅ１と３Ｄ９はＧｅｎｅｎｔｅｃｈのハイブリドーマグループから得たものであり、その性質は他の文献に記述されている（３）。簡単に述べると、プロテインＡ−セファロースに対する結合と０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ３．０）による溶出によってマウスの腹水からＭＡｂを精製した。ジチオスレイトールで活性化したＰＢＳ中のパパイン＋１０ｍＭ  システインでＭＡｂを１時間処理（５０：１重量ＭＡｂ／重量パパイン）することにより、ＦＡｂ断片を調製した。０．１Ｍヨードアセタミドの添加によって消化を停止させた。Ｆｃと残存ＭＡｂをプロテインＡ−セファロースに２回吸着させ、次いでスーパーロース１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル濾過によって除去した。
【０１１８】
各ＭＡｂに関するＥＣ５０値（０．３ないし１ｎＭ）は通常、ＥＬＩＳＡによって決定したＫｄよりいくらか低い値であった（表１１）。ｈＧＨの場合と同様に、これは全細胞に対する親和性効果および／または最大信号化が１００％受容体占有未満で達成されることの反映であろう。はるかに高い濃度（２０ｎＭないし＞１０μＭ）では３つのＭＡｂのうち２つが活性を失った。これはおそらく過剰のＭＡｂがｈＧＨｂｐへの一価結合ゆえに受容体の架橋を遮断するからであろう。対応する一価ＦＡｂ断片は基本的に不活性であり（表１１）、信号化活性にとって二価性が必要であることをさらに示している。
【０１１９】
これらのＭＡｂに関する用量応答曲線の相違は、それらがｈＧＨｂｐに結合する方法の相違によって説明することができる。ＭＡｂ５は、おそらく両受容体が互いに接触する領域に結合することによって（１１）、ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体に対する第２ｈＧＨｂｐの結合を防止する。ＭＡｂ５が最も効率が低いという事実は最大信号化にとって受容体が互いに密接に接近する必要があることを示しているのであろう。ＭＡｂ１３Ｅ１はｈＧＨ結合（１１）を遮断し、ｈＧＨの効果を模倣する。このＭＡｂは広い平坦部を示し、拮抗性相を示さない。これはおそらく我々が観測し得るほどに高いＭＡｂ濃度に達し得なかったためであろう。我々はこの中和ＭＡｂがｈＧＨと同様に結合して極めて安定な受容体二量体を形成するのであろうと考える。対照的に、ＭＡｂ２６３と３Ｄ９はホルモン−受容体境界から離れたところに結合し、類似する作用薬相と拮抗薬相を示す。これら２つの相はｈＧＨほどには広く離れていない。これはおそらく二量体が最適な受容体−受容体接触を伴わないからであろう。ＭＡｂ２６３と３Ｄ９が作用薬であるという事実は、活性な二量体を形成するための構造上の必要条件がかなりルーズであることを示唆している。
ＭＡｂ１３Ｅ１またはＭＡｂ５に由来するＦＡｂ断片はｈＧＨが誘発する細胞増殖に拮抗するが、ＭＡｂ２６３と３Ｄ９に由来するものは拮抗しない（表１２）。これらの研究はＭＡｂ１３Ｅ１とＭＡｂ５に関するエピトープがホルモン−受容体または受容体−受容体境界を遮断するという事実と合致している。
【０１２０】
【表１２】
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【０１２１】
実施例１１
二量化のためのｈＧＨ上の構造的な必要条件をさらに決定するために（図１３）、我々は部位１または部位２に対する受容体の結合を減じるように設計したｈＧＨの突然変異体を試験した。部位２決定基は保存しているが部位１中の重要な側鎖（１２）が変化している二重突然変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）は細胞増殖を促進するが、ＥＣ５０は野生型ｈＧＨ（表１１）より約１０３倍高い濃度に移動する。このことはインビトロで測定した部位１結合に関するＫｄの５００倍の減少と合致する（１２）。我々はＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａでの滴定において不活性相を観測し得るほど高い濃度には達し得なかった。単一ｈＧＨ突然変異体（Ｇ１２０Ｒ）は機能的な部位１を保持しているが、部位２を立体的に遮断する。この突然変異体は基本的にいずれの濃度でも不活性である。したがって、細胞増殖を促進するには部位１または部位２のいずれかに対する結合が必要であるが、それだけでは十分でない。
【０１２２】
逐次的な信号化機序は、部位２結合が遮断されている（しかし部位１結合は遮断されていない）突然変異体がｈＧＨの誘発する細胞増殖に拮抗するはずであることを予測させる。このことを調べるために、我々は最大細胞増殖の９０％を支持するに足るｈＧＨ（１ｎＭ）＋増大する濃度の野生型ｈＧＨまたは部位１（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）もしくは部位２（Ｇ１２０Ｒ）の突然変異体と共に細胞を培養した。我々の予期した通り、部位２突然変異体はｈＧＨに拮抗するが、部位１突然変異体は全く効果がない。実際に、部位２突然変異体は拮抗薬として野生型ｈＧＨより１００倍近く強力である（ＩＣ５０はＧ１２０Ｒについて２０ｎＭであり、ｈＧＨについて２μＭである；表１２）。これは我々にとっては意外なことではない。なぜならいったんＧ１２０Ｒが結合すれば、受容体を二量化し、作動させることができないからである。したがってＧ１２０ＲとｈＧＨの間の競争は部位１を介する遊離のホルモン分子結合にさらに制限される。対照的に、ｈＧＨが拮抗性遊離ホルモンであるためには結合したｈＧＨ中間体が反応する前に占有されていない受容体と反応する必要がある。これは高濃度のｈＧＨを必要とする。
【０１２３】
Ｇ１２０ＲはｈＧＨよりはるかに良好な拮抗薬であるが、５０％の拮抗性に必要な突然変異体の濃度はこの検定法ではｈＧＨより約２０倍高い（表１２）。これは、単量体Ｇ１２０Ｒ・受容体複合体におけるＧ１２０ＲよりもｈＧＨが二量体ｈＧＨ・（受容体）２複合体に強固に結合するという事実の反映であろう。あるいは最大の信号化が１００％の受容体占有を必要としないのかもしれない。いずれの場合にもＧ１２０Ｒ突然変異体における部位１の親和性を改善すれば、より強力な拮抗薬になるであろう。
【０１２４】
部位１を介してｈＧＨｂｐにより強固に結合するｈＧＨ変種が突然変異法によって作成されている（４，１３）。これらの変異の組み合わせ（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ）はｈＧＨｂｐに３０倍強固に結合する。この変種はｈＧＨと同等のＥＣ５０を持っていたが、自己拮抗性に関するＩＣ５０はｈＧＨより約３０倍低かった。このことは、結合したホルモン−受容体中間体上の部位２と可溶性ホルモン上の遊離の部位１の間の競争によって自己拮抗性がもたらされるという概念と合致する。部位１結合の改善がこのホルモンを作用薬として改善しなかったという事実は、受容体の二量化が律速であること、および、それゆえに部位１と部位２の両方に作用薬突然変異を導入することが望ましいことの反映であり得る。我々はこの変種がＧ１２０Ｒを含有するようにさらに突然変異させた。この４突然変異体変種はｈＧＨ拮抗薬としてＧ１２０Ｒより１０倍強力であった（図１６、表１２）。これは拮抗性にとって部位１結合親和性が重要であることのさらなる証拠である。
【０１２５】
我々の研究は、ｈＧＨ、ＭＡｂおよびそれらの誘導体によってもたらされる拮抗性または自己拮抗性が受容体二量化の遮断の結果であって、受容体の下方調節の結果ではないことを示している。第１に、ｈＧＨの代わりにＩＬ−３で増殖させた細胞は、より高いｈＧＨ応答またはｈＧＨ受容体数を示さない。受容体の下方調節は通常、受容体の活性化と強固に共役している。この場合、ｈＧＨに関する用量応答曲線の拮抗性部分が（１μＭではなく）生理学的に関連のあるｈＧＨ濃度で始まることを予期することができる。さらに、ＭＡｂとｈＧＨのそれぞれに関するＩＣ５０に対するＥＣ５０の比率は広範に変化し、受容体の活性化が単に結合特性を変化させるだけで阻害から容易に脱共役し得ることを示している。最後に、Ｇ１２０Ｒ突然変異体は不活性であるがｈＧＨより強力な拮抗薬であり、Ｇ１２０Ｒによる細胞の予備処理はその拮抗性効果を増進させない。したがってＧ１２０Ｒの拮抗性効果は単純な受容体下方調節とは合致しないのである。高濃度で自己拮抗性を発揮する他の配位子が受容体二量化の遮断に関与し、これが本発明の実施に有用な配位子を同定するための追加の基礎として働くことが考えられる。
【０１２６】
引用文献
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１１．Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６１−１４６５（１９９０）
１２．Ｅｌｂｅｒｇら，ＪＢＣ．２６５：１４７７０（１９９０）
１３．Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：３２４（１９９０）
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の複合体の結晶。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ７５−１００サイズ排除カラムでｈＧＨ／ｈＧＨｂｐ複合体を精製することによって、この複合体を調製した。
【図２】ｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の複合体を含有する高分子量ピークを遊離のｈＧＨから分離し、貯蔵し、濃縮した。これらの成分を１ｍｌ／分の流速での直線的なアセトニトリル勾配で無勾配的に溶出させた溶出曲線。矢印の時点で勾配を開始し、これを破線で示す。２１４ｎｍでの吸光度を実線で表す。
【図３】４：１、３：１、２：１、１：１、０．５：１に対応するさまざまな比率のｈＧＨｂｐとｈＧＨのゲル濾過クロマトグラフィー。各混合物中のｈＧＨｂｐとｈＧＨ（ｈＧＨをそれぞれ２０μＭおよび４０μＭとした１：１および０．５：１の比率を例外として１０μＭに固定した）の濃度は２８０ｎｍの吸光度に基づく。１００μｌのタンパク質試料をセファロース１２ＦＰＬＣカラム（ファルマシア）に適用し、溶出させた。ピークを２８０ｎｍでの吸光度について監視した。
【図４】様々な抗ｈＧＨｂｐモノクローナル抗体によって複合体を沈殿させた場合のｈＧＨｂｐに対するｈＧＨの結合に関するスキャッチャード分析。
【図５】ｈＧＨｂｐと、ｈＧＨｂｐに結合するように工作したヒトプロラクチン（パネルＡ）またはヒト胎盤性ラクトゲン（パネルＢ）の変種もしくはｈＧＨ（パネルＣ）との２：１比のゲル濾過クロマトグラフィー。ゲル濾過クロマトグラフィーによって試料を分析した。
【図６】ｈＧＨｂｐによるｈＧＨの滴定熱量測定。ｈＧＨｂｐ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中１５μＭ濃度）を１．３７ｍｌ滴定セル（ＭＣ２滴定熱量計，Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，マサチューセッツ州ノーサンプトン）に入れ、２５℃で平衡化した。この溶液にｈＧＨ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中４３７μＭ）を４μＬづつの増加単位で添加した。各注入間の間隔を５分間とし、各注入を８秒間にわたって行った。
【図７】ｈＧＨとｈＧＨｂｐの２つを１：１の比率で混合する前（−）および後（・・・・）のｈＧＨとｈＧＨｂｐの個々のスペクトルの和の遠ＵＶ（パネルＡ）における円二色スペクトル。遠ＵＶおよび近ＵＶスペクトルをそれぞれ０．０１ｃｍおよび１．０ｃｍセル中で０．２ｎｍおよび０．５ｎｍ間隔で集めた。
【図８】ｈＧＨとｈＧＨｂｐの２つを１：１の比率で混合する前（−）および後（・・・・）のｈＧＨとｈＧＨｂｐの個々のスペクトルの和の近ＵＶ（パネルＢ）における円二色スペクトル。遠ＵＶおよび近ＵＶスペクトルをそれぞれ０．０１ｃｍおよび１．０ｃｍセル中で０．２ｎｍおよび０．５ｎｍ間隔で集めた。
【図９】ｈＧＨとｈＧＨｂｐの２つを１：１の比率で混合する前（−）および後（・・・・）のｈＧＨとｈＧＨｂｐの個々のスペクトルの和の蛍光放射スペクトル。
【図１０】ｈＧＨの連続的添加による１０ｎＭ  Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチング。インキュベーションの後、島津ＲＦ５０００Ｕ分光蛍光光度計を用いて４９０ｎｍの励起λと５１２ｎｍの放射λ（バンド幅はそれぞれ３ｎｍおよび１０ｎｍである）で蛍光測定を行った。
【図１１】ｈＧＨが誘発するＳ２３７Ｃ−ＡＦの二量化に関するＩＣ５０の決定。結合緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３）中のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（図１０に記述のように調製したもの）の連続的希釈液（３倍）を２０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲にわたって調製し、１．０ｍｌづつ検定管に分注した。同様に１μＭから０．００４μＭの範囲にわたってｈＧＨを連続的に希釈した。ｈＧＨ希釈液の一部（１０μｌ）（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦに対して１：２モル比のｈＧＨを与える）と緩衝液のみをＳ２３７Ｃ−ＡＦ含有検定管に加え、混合し、平衡化するために暗所で２５℃で５時間インキュベートした。平衡化の後、上述（図１０）のように蛍光を測定したが、ここでは励起バンド幅を１０ｎＭとした。４変数曲線フィットから決定される半最大△Ｆ／Ｆ０値を与えるｈＧＨの濃度としてＩＣ５０値を計算した。６回の独立した実験の平均から０．５４（＋／−０．１４）ｎＭのＩＣ５０を計算した。
【図１２】過剰のｈＧＨまたはｈＧＨ突然変異体による、ｈＧＨが誘発するＳ２３７Ｃ−ＡＦ二量化の反転。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦとｈＧＨをそれぞれ１０ｎＭと５ｎＭの濃度で結合緩衝液中に希釈し、１．０ｍｌづつ検定管に分注した。次に、ｈＧＨ、突然変異体または緩衝液のみのいずれかの連続的希釈液を加え、平衡化のためにその混合物を暗所で２５℃で５時間インキュベートし、図１について記述したように蛍光を測定した。データ点は３つ１組の測定の平均であり、●はｈＧＨ、▲はＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ、■はｈＰＬリクルートを表す。誤差線はＳＥＭを与える。
【図１３】ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）２の結晶構造。中央上部の濃い線はｈＧＨ分子を表す。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子に結合しており、その１つは左側にあり、もう１つは右側にある。これらのｈＧＨｂｐ分子のそれぞれは一本鎖によって連結した２つのドメインを有し、上部ドメインはｈＧＨ分子と同じ高さにあり、他のドメインは垂直に配向し、図の下に向かって突き出ている。ｈＧＨｂｐのこれら最後の２つのドメインは最底部で互いに接触している。
【図１４】成長ホルモン受容体に特異的な抗体に対する応答としての体重増加。モノクローナル抗体Ｍａｂ２６３を８匹のラットに投与し（１．０５ｍｇ／ｋｇ）、対照群には賦形剤のみを投与した。体重測定を毎日行った。
【図１５】ｈＧＨ−ｍＧ−ＣＳＦハイブリッド受容体（９）を含有するＦＤＣ−Ｐ１細胞の、ｈＧＨが誘発する増殖。１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０μＭ  β−メルカプトエタノールおよび１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ２、３７℃で細胞を成長させた（８）。ＩＬ−３を含まない同じ培地で細胞を洗浄し、増大する濃度のｈＧＨで１８時間処理する前に、４×１０５／ｍｌ（○）、２×１０５／ｍｌ（●）および１×１０５／ｍｌ（□）の密度で１００μｌづつ９６穴プレートに接種した。ＤＮＡ合成を測定するために、培地２０μｌ中１μＣｉ／ウェルの添加によって細胞を［３Ｈ］−チミジンでパルス処理した。４時間後、細胞を収集し、ガラスフィルター上で洗浄した。シンチレーションカクテル２ｍｌを加え、ベックマンＬＳ１７０１シンチレーション計数器で計数した。各データ点は３つ１組の測定の平均値を表し、誤差線はＳ．Ｄ．である。
【図１６】ｈＧＨが誘発する細胞増殖のｈＧＨ変種による拮抗。細胞を図１５と同様に調製し、１ｎＭ  ｈＧＨ＋増大する量の部位１突然変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）（●）、部位２突然変異体（Ｇ１２０Ｒ）（□）、組合わされ増進された部位１突然変異体／部位２突然変異体（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ／Ｇ１２０Ｒ）（■）および野生型ｈＧＨ（○）と共にインキュベートした。
【図１７】ＩＬ−６拮抗薬または作用薬を調製する際の変異に適した推定α螺旋部位のホイールプロットを表す。これらの図の番号付与はＮ−末端プレ残基から開始するものであることに注意のこと。
【図１８】ＩＬ−６拮抗薬または作用薬を調製する際の変異に適した推定α螺旋部位のホイールプロットを表す。これらの図の番号付与はＮ−末端プレ残基から開始するものであることに注意のこと。
【図１９】ＩＬ−６拮抗薬または作用薬を調製する際の変異に適した推定α螺旋部位のホイールプロットを表す。これらの図の番号付与はＮ−末端プレ残基から開始するものであることに注意のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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