(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0003603322.tif 000017
［式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立に水素原子；  ハロゲン原子；  アミノ基；  モノ（炭素数１個ないし６個の低級アルキル）アミノ基；  ジ（炭素数１個ないし６個の低級アルキル）アミノ基；  ヒドロキシ基；  炭素数１個ないし６個の低級アルコキシ基；  ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フェニルプロポキシ基、α−ナフチルメトキシ基、β−ナフチルメトキシ基、ナフチルエトキシ基、テトラヒドロナフチルメトキシ基からなる群から選ばれる炭素数７個ないし１２個のアラルコキシ基；  カルボキシル基；  炭素数１個ないし６個の低級アルコキシカルボニル基；    炭素数１個ないし６個の低級アルカノイルオキシ基又は炭素数１個ないし６個の低級アルキル基を示し、
Ｒは水素原子；  アミノ基；  ホルミルアミノ基；  炭素数１個ないし６個の低級アルカノイルアミノ基；  モノ（炭素数１個ないし６個の低級アルキル）アミノ基；  ジ（炭素数１個ないし６個の低級アルキル）アミノ基；  ヒドロキシ基；  炭素数１個ないし６個の低級アルコキシ基；  ベンジル基；  ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フェニルプロポキシ基、α−ナフチルメトキシ基、β−ナフチルメトキシ基、ナフチルエトキシ基、テトラヒドロナフチルメトキシ基からなる群から選ばれる炭素数７個ないし１２個のアラルコキシ基；  ベンジル基、フェネチル基、フェニルプロピル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ナフチルエチル基、テトラヒドロナフチルメチル基からなる群から選ばれる炭素数７個ないし１２個のアラルキル基又は炭素数１個ないし６個の低級アルキル基を示す］で表される化合物を、グリコシレーションする能力を有する微生物である、ミクロテトラスポラ・エスピー（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ ｓｐ．）Ａ３４５４９株（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２０６）又はサッカロスリクス・エヤロコロニジェネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ３９２４３株或いはその突然変異株と培養し、その培養液から一般式［ＩＩ］
【化２】
0003603322.tif 000018
［式中、Ｘ1、Ｘ2及びＲは前記と同じ意味を有する］で表される化合物を採取することを特徴とする一般式［ＩＩ］で表される化合物の製造法。
【請求項２】
Ｘ1及びＸ2がヒドロキシ基であり、Ｒが水素原子、アミノ基又は炭素数１個ないし６個の低級アルキル基であり、式
【化３】
0003603322.tif 000019
で表される基がグルコース残基であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は医薬の分野で有用であり、さらに詳細にはインドロピロロカルバゾール系の抗腫瘍性物質の製造に際し、グリコシル基の導入を円滑かつ効率的に行う方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは抗腫瘍性物質の探索研究を行って、微生物代謝産物中に新規な抗腫瘍性物質ＢＥ−１３７９３Ｃ（１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン）を見出し、先の特許出願（特開平３−２０２７７号）において開示した「ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオティクス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）第４４巻、７２３〜７２８頁（１９９１年）参照］。また、本発明者らは、上記ＢＥ−１３７９３Ｃの１３位に単糖残基を導入することにより、より優れた抗腫瘍活性を示す、一般式
【０００３】
【化４】
0003603322.tif 000002
［式中、Ｒ１は単糖残基のヒドロキシ基が、水素原子、低級アルキル基、低級アルキルカルボニルオキシ基及び低級アルコキシ基よりなる群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の置換基で置換されていてもよい炭素数５〜７個の単糖残基を示す］で表されるインドロピロロカルバゾール誘導体を見出し、開示した（国際公開  ＷＯ９１／１８００３）。そしてさらに研究を行った結果、該インドロピロロカルバゾール誘導体の１３位に単糖残基を導入し、かつ、６位に種々の化学修飾を加え、一般式
【０００４】
【化５】
0003603322.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アリール基、アラルキル基又は複素環基（該低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、アリール基、アラルキル基及び複素環基は、カルボキシル基、カルバモイル基、スルホ基、アミノ基、シアノ基、モノ−低級アルキルアミノ基、ジ−低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１〜５個の置換基を有していても良い）或いは式：−Ｙ−Ｒ３の基を示し、ここで、Ｙはカルボニル基、チオカルボニル基又はスルホニル基を示し、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アリール基、アラルキル基、低級アルコキシ基、ヒドラジノ基、アミノ基、アリールアミノ基、カルバモイル基又は複素環基（該低級アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アリール基、アラルキル基及び複素環基はハロゲン原子、保護されていてもよいヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、カルバモイル基、シアノ基及び低級アルコキシカルボニル基よりなる群から選ばれる１〜４個の置換基を有していても良く、そして該アミノ基及びカルバモイル基はさらにハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基、カルバモイル基及び低級アルコキシカルボニル基よりなる群から選ばれる置換基で置換されていても良い低級アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよい）を示すか、或いはＲ１とＲ２は一緒になって低級アルキリデン基（該低級アルキリデン基はアミノ基、モノ−低級アルキルアミノ基、ジ−低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基及びスルホ基よりなる群から選ばれる１〜４個の置換基を有していても良い）を示すか、或いはＲ１とＲ２はそれらが結合している窒素原子と一緒になって複素環基（該複素環基はアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基及びスルホ基よりなる群から選ばれる基で置換されていても良い低級アルキル基をその環上に有していても良い）を形成し、Ｇは五炭糖基又は六炭糖基を示し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、モノ−低級アルキルアミノ基、ジ−低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アラルコキシ基、カルボキシル基、低級アルコシカルボニル基又は低級アルキル基を示す］で表される化合物又はその製薬学的に許容しうる塩がさらに一層強い抗腫瘍活性を示すことを見出し、欧州特許公開公報  ＥＰ−Ａ−５４５１９５において開示した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
先の特許出願（国際公開  ＷＯ９１／１８００３及び欧州特許公開公報０５４５１９５  Ａ１）において開示したインドロピロロカルバゾール系の抗腫瘍性物質の製造において、グリコシル基を導入するに際し、より円滑に且つ効率よく導入を行う方法を見出すことが本発明が解決しようとする課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、種々の方法を考案した結果、微生物を用いてグリコシル基を導入する方法が著しく効率的であることを見出して本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は一般式［Ｉ］
【０００８】
【化６】
0003603322.tif 000004
［式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、モノ−低級アルキルアミノ基、ジ−低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アラルコキシ基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルカノイルオキシ基又は低級アルキル基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、低級アルカノイルアミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アラルコキシ基、アラルキル基又は低級アルキル基を示す］で表される化合物を微生物の培養液中に懸濁若しくは溶解し、微生物変換によって、一般式［ＩＩ］
【０００９】
【化７】
0003603322.tif 000005
［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＲは前記の意味を有する］で表される化合物に変換する製法である。
【００１０】
次に本明細書において用いられる用語の意味を説明する。
【００１１】
「低級」なる語は、この語が付された基又は化合物の炭素数が６個以下であることを意味する。従って、低級アルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等の炭素数１〜６個のアルキル基を意味する。
【００１２】
低級アルカノイルオキシ基とは、例えばアセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、イソプロピオニルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、イソペンタノイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基等の炭素数２〜６個のアルカノイルオキシ基を意味する。
【００１３】
低級アルコキシ基とは、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等の炭素数１〜６個のアルコキシ基を意味する。
【００１４】
低級アルコキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基等の炭素数２〜６個のアルコキシカルボニル基を意味する。
【００１５】
アラルキル基とは、ベンジル基、フェネチル基、フェニルプロピル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ナフチルエチル基、テトラヒドロナフチルメチル基等の炭素数７〜１２個のアラルキル基を意味する。
【００１６】
アラルコキシ基とは、例えばベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フェニルプロポキシ基、α−ナフチルメトキシ基、β−ナフチルメトキシ基、ナフチルエトキシ基、テトラヒドロナフチルメトキシ基等の炭素数７〜１２個のアラルコキシ基を意味する。
【００１７】
モノ低級アルキルアミノ基とは、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基等の炭素数１〜６個のモノアルキルアミノ基を意味する。
【００１８】
ジ低級アルキルアミノ基とは、例えばジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルプロピルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、ブチルエチルアミノ基、メチルペンチルアミノ基、エチルヘキシルアミノ基等の炭素数１〜６個のアルキル基を窒素原子上に２個有するジアルキルアミノ基を意味する。
【００１９】
低級アルカノイルアミノ基とは、例えばアセチルアミノ基、プロピオニルアミノ基、イソプロピオニルアミノ基、ブタノイルアミノ基、イソブタノイルアミノ基、ペンタノイルアミノ基、イソペンタノイルアミノ基、ヘキサノイルアミノ基等の炭素数２〜６個のアルカノイルアミノ基を意味する。
【００２０】
ハロゲン原子とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を意味する。
【００２１】
式：
【００２２】
【化８】
0003603322.tif 000006
で表されるグリコシル基としては、例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース残基を例示することができ、グルコース残基が特に好ましい。
【００２３】
次に本発明化合物の製造法について説明する。
【００２４】
本発明は微生物を用いて化合物［Ｉ］をグリコシレーションし、化合物［ＩＩ］を製造する方法である。従って本発明に使用する微生物は化合物［Ｉ］をグリコシレーションすることのできる微生物であればいずれでも良いが、例えば千葉県市原市養老渓谷の土壌より分離された放線菌の一種、ミクロテトラスポラ・エスピー（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｓｐ．）Ａ３４５４９株又はサッカロスリクス・エヤロコロニジェネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ３９２４３等が使用できる。
【００２５】
以下にＡ３４５４９株の菌学的性状を示す。
１．形態
Ａ３４５４９株は、真性の気菌糸を着生せず、基生菌糸上に胞子は見られない。また、菌糸の分断も認められず、胞子のう及び菌核等の特殊な器官も観察されない。
２．各種寒天平板培地における培養性状
各種寒天平板培地において２８℃、１４日間培養した結果を第１表に示す。
【００２６】
【表１】
0003603322.tif 000007
３．生育温度（イースト・麦芽寒天培地、１４日間培養）
１８℃〜４３℃で生育し、最適生育温度は３０℃前後と思われる。
0003603322.tif 000008
５．炭素源の利用能
プリドハム・ゴドリーブ寒天を基礎培地とし、下記各種糖を添加して２８℃、１４日間培養したが生育は見られず、判定することが出来なかった。
【００２７】
Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、ラフィノース、Ｄ−マンニトール、
イノシトール、サリシン、シュクロース
６．菌体成分
細胞壁からはｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸が検出されたがグリシン、アラビノース及びガラクトースは検出されず、細胞壁タイプはＩＩＩ型であることが示唆された。全菌体主要糖成分はマデュロース（アラビノース、ガラクトース及びキシロースを含まない）が検出され、糖パターンはＢ型、またリン脂質タイプはＰＩＶであり、、メナキノンの主成分はＭＫ−９（Ｈ４）であった。
【００２８】
以上の菌学的諸性質よりＡ３４５４９株は放線菌ミクロテトラスポーラ属に属すると考えられ、Ａ３４５４９株をミクロテトラスポーラ  エスピー  Ａ３４５４９（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｓｐ．Ａ３４５４９）と称することとした。
【００２９】
尚、本菌株は、１９９２年１１月１７日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された［微工研菌寄第１３２９２号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３２９２）］が、１９９３年２月２５日に国際寄託に移管された（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２０６）。
【００３０】
本発明のグリコシレーションする能力を有する微生物の変異株は、例えばＸ線若しくは紫外線等の照射処理、例えばナイトロジェン・マスタード、アザセリン、亜硝酸、２−アミノプリン若しくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤による処理、ファージ接触、形質転換、形質導入又は接合等の通常用いられる菌種変換処理方法により一般式［Ｉ］で表される化合物をグリコシレーションし、一般式［ＩＩ］で表される化合物に変換する能力を有する微生物を変異させた微生物である。
【００３１】
化合物［Ｉ］を化合物［ＩＩ］に変換するに際して用いる微生物株は、栄養源含有培地に接種して好気的に発育させる。栄養源としては、微生物の栄養源として公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、市販されているグルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、グリセリン、麦芽糖、デンプン、庶糖、糖蜜又はデキストリンなどが単独又は混合物として用いられる。窒素源としては、市販されている大豆粉、コーングルテンミール、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、綿実粉、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、無機アンモニウム塩又は硝酸ナトリウムなどが単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、市販されている炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム又は各種リン酸塩などを使用することができる。その他必要に応じて、鉄、マンガン、モリブデン、銅又は亜鉛などの重金属塩を微量添加してもよい。また、発泡の著しい時には、消泡剤として、例えば大豆油又は亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜添加しても良い。これらのもの以外でも、該微生物が利用し、生育に役立つもの例えば３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸又はホウ酸ナトリウムなどであれば、いずれも使用することができる。
【００３２】
培養方法としては、化合物［Ｉ］を添加する他は一般の微生物代謝産物の生産方法と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養でもよい。液体培養の場合は、静置培養、撹拌培養、振盪培養又は通気培養などのいずれを実施してもよいが、特に振盪培養又は深部通気撹拌培養が好ましい。培養温度は２０℃〜３７℃が適当であるが、好ましくは２５℃〜３０℃である。好ましい培地のｐＨは４〜８の範囲で、培養期間は２日間〜２０日間、好ましくは７日間〜１５日間である。
【００３３】
培養物から目的とする化合物［ＩＩ］を採取するには、微生物の生産する代謝物の培養物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用される。化合物［ＩＩ］は培養濾液中及び菌体中に存在するので、培養濾液又は菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法等を単独又は組合せて行うことにより精製できる。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども抽出精製に利用可能である。
【００３４】
本発明に使用する一般式［Ｉ］で表される原料化合物は、一般式［ＩＩＩ］
【００３５】
【化９】
0003603322.tif 000009
［式中、Ａは酸素原子又は−ＮＨ−を示し、Ｘ１、Ｘ２は前記の意味を有する］で表される化合物又は存在する官能基が保護されたその誘導体に一般式
【００３６】
【化１０】
0003603322.tif 000010
［式中、Ｒは前記の意味を有する］で表される化合物を反応させ、必要に応じて保護基を除去することにより製造するか、或は化合物［ＩＩＩ］又はその官能基保護誘導体にヒドラジンを反応させ、請求項１記載の一般式［Ｉ］で表される化合物のうち、Ｒがアミノ基である化合物を製造し、次いで、この化合物の構造式中、式
【００３７】
【化１１】
0003603322.tif 000011
で表される部分をホルミル化、低級アルカノイル化、アラルキル化、アルキル化するか、或は化合物［ＩＩＩ］又はその官能基保護誘導体にヒドロキシルアミンを反応させ、請求項１記載の一般式［Ｉ］で表される化合物のうち、Ｒがヒドロキシ基である化合物を製造し、次いでこの化合物の構造式中、式
【００３８】
【化１２】
0003603322.tif 000012
で表される部分をアラルキル化又は低級アルキル化し、更に必要に応じて保護基の除去を行うことにより製造することができる。
【００３９】
本発明に使用する出発原料化合物［ＩＩＩ］のうちＡが−ＮＨ−である化合物は、公知の方法、例えばダブル・フィッシャー・インドリゼーション法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）第５４巻、８２４〜８２８頁（１９８９年）参照］により製造することができる。また、別の方法としては、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・パーキン・トランスアクションズ  Ｉ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｉ）２４７５〜２４８０頁（１９９０年）に記載のインドロカルバゾールの合成法も挙げることができる。また更に、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）第４４巻、２８８７〜２８９２頁（１９８８年）に記載の合成法を利用することもできる。また、出発原料化合物［ＩＩＩ］のうち、Ａが酸素原子である化合物は、参考例３に示す方法によって製造することができる。
【００４０】
化合物［ＩＶ］は、市販品を用いることができ、また公知の方法で製造することもできる。
【００４１】
一般式［ＩＩＩ］で表される化合物又はその官能基保護誘導体と一般式［ＩＶ］で表される化合物との反応は化学の分野で広く知られたイミド又は酸無水物とヒドラジン、ヒドラジン誘導体、ヒドロキシアミン、アルコキシアミン又は低級アルキルアミンとの反応である。この反応は、化合物［ＩＩＩ］に化合物［ＩＶ］を無溶媒で直接反応させて良いが、反応に悪影響を及ぼさない溶媒、例えばテトラヒドロフラン等を反応溶媒として使用してもよい。反応に用いる化合物［ＩＶ］の量は化合物［ＩＩＩ］又はその官能基保護誘導体に対して通常少過剰から大過剰用いて行うことができるが、無溶媒の場合には１０〜４０モルの過剰量を用いることが好ましい。
【００４２】
反応温度は通常約−５０〜約５０℃の範囲であり、必要に応じてこれ以上又はこれ以下の温度を選択することもできる。反応時間は通常約３０分〜約２日間の範囲内であるが必要に応じてこれ以上又はこれ以下の時間で行うこともできる。
【００４３】
このようにして得られる一般式［Ｉ］で表される化合物のうちＲがアミノ基である化合物中の、式
【００４４】
【化１３】
0003603322.tif 000013
のホルミル化は、アミノ基のホルミル化において通常用いられる方法で行うことができ、例えばギ酸、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド等と加熱するか、又は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中若しくは無溶媒でギ酸と酸無水物との混合物を反応させる方法等により行うことができる。
【００４５】
通常、ギ酸、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド等との反応は、約３０℃〜溶媒の沸点の範囲内で行われるが、必要に応じて、これ以上又はこれ以下の温度で行うこともでき、反応時間は、通常約３０分〜約２日間の範囲内である。この際、塩酸、硫酸等の酸触媒の存在下に行うことが好ましい。
【００４６】
ギ酸と酸無水物の混合物でホルミル化する場合は、通常約−５℃〜室温の範囲内で行われるが、必要に応じてこれ以上又はこれ以下の範囲で行うこともでき、また、反応時間は通常約１０分間〜約５時間であるが、必要に応じて、これより長く又は短くすることもできる。
【００４７】
また、低級アルカノイル化は、無溶媒又は適当な溶媒中、対応する低級アルカン酸ハロゲン化物又は酸無水物を反応させる方法等により行うことができる。
【００４８】
反応温度は、通常、約−５℃〜溶媒の沸点の範囲内で行われるが、必要に応じて、これ以下の温度で行うこともできる。
【００４９】
酸ハロゲン化物及び酸無水物は、通常、Ｒがアミノ基である一般式［Ｉ］の化合物に対して、少過剰量使用されるが、必要に応じて、これ以下又はこれ以上を用いることもでき、反応時間は、通常、約３０分から約２日間である。
【００５０】
Ｒがアミノ基である一般式［Ｉ］の化合物のアルキル化反応は、公知の方法、例えばアルキルハライド、アルキルメシレート又はアルキルトシレート等との反応、又はアルデヒド化合物若しくはケトン化合物と縮合、還元反応等により行うことができる。
【００５１】
また、Ｒがアミノ基である一般式［Ｉ］の化合物のアラルキル化反応は、アルキル化反応と同様の方法により行うことができる。
【００５２】
同様の方法によって、一般式［ＩＩＩ］で表される化合物のうちＡが−ＮＨ−である化合物のＡをアラルキル化又はアルキル化することができ、請求項１記載の一般式［Ｉ］で表される化合物のうちＲがアラルキル基又は低級アルキル基である化合物を製造することができる。
【００５３】
官能基の保護及び保護基の除去は、通常の化学分野で広く知られた方法で行うことができる。
【００５４】
また、上記反応の生成物は有機合成化学の分野における公知の方法、例えば沈澱法、溶媒抽出法、再結晶、クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００５５】
【実施例】
以下に参考例及び実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
参考例１
式
【００５６】
【化１４】
0003603322.tif 000014
で表される化合物の製造
ＢＥ−１３７９３Ｃ  ０．５２ｇを抱水ヒドラジン（和光純薬）３ｍｌに溶解し、室温に１時間撹拌した。濃塩酸を溶液が酸性になるまで加え、生じた沈殿を濾取し、精製水で洗浄後、減圧下に乾燥することにより、表題の式［Ｖ］で表される化合物０．５３ｇを得た（収率９８％）。
【００５７】
Ｒｆ値：０．６３（メルク社製  キーゼルゲル６０Ｆ２５４，展開溶媒：クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン＝３：１：１）
ＨＰＬＣ；１９．１分（カラム：クロマトレックスＯＤＳ，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，検出：ＵＶ３０５ｎｍ，流速：１ｍｌ／分，移動相：５０％から１００％メタノールまで，３０分間のリニアグラジエント）
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．６（２Ｈ，ｓ），１０．２（２Ｈ，ｓ），８．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．９０（２Ｈ，ｓ）
参考例２
式
【００５８】
【化１５】
0003603322.tif 000015
で表される化合物の製造
ａ）エチルマグネシウムブロマイド（ＥｔＭｇＢｒ）のテトラヒドロフラン溶液（０．９３モル，６．９ｍｌ）を４５℃に加温し、これに６−メトキシインドール（９４９ｍｇ）のトルエン溶液（７．８ｍｌ）を添加した。４０分後に２，３−ジブロモ−Ｎ−メチルマレイミド（３８８ｍｇ）のトルエン溶液（７．８ｍｌ）を４０分間を要して滴下により添加し、次いで２時間還流した。反応液を氷冷し、２０％クエン酸水溶液を添加後、酢酸エチルで抽出し、有機溶媒層を減圧下に濃縮し、残留物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーを行って、メタノールで展開することにより、２，３−ビス−（６−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミド４１５ｍｇを得た（収率７２％）。
【００５９】
ｂ）参考例２のａ）において得られた２，３−ビス−（６−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミド４１０ｍｇと、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）２５５ｍｇと、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を乾燥ベンゼン１５０ｍｌに添加し、４５分間アルゴン気流下で還流した。反応液を冷却後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄した後、減圧下に濃縮した。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン＝３０：１：１）に付し、次いでクロロホルム−メタノール（１０：１）で展開することにより、トリメチルアルチリアフラビンＣ  ２５０ｍｇを得た（収率６２％）。
【００６０】
ｃ）参考例２のｂ）において得られたトリメチルアルチリアフラビンＣ  ２５０ｍｇと、ピリジン塩酸塩２．２ｇとの混合物を封管中１８０℃で９０分間加熱した。反応物を冷却し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと１Ｎ塩酸とで希釈後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、次いで飽和食塩水で洗浄後、減圧下に濃縮乾固し、残留物をセファデックスＬＨ−２０のクロマトグラフィー用カラムにかけ、メタノールで展開することにより、表題の式［ＶＩ］で表される化合物（６−メチルアルチリアフラビンＣ）１３１ｍｇを得た（収率５６％）。
【００６１】
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７２［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．３５（２Ｈ，ｓ），９．７３（２Ｈ，ｓ），８．７０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．７８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．０Ｈｚ），３．１４（３Ｈ，ｓ）
参考例３
式
【００６２】
【化１６】
0003603322.tif 000016
で表される化合物の製造
２Ｎ苛性カリ水溶液１００ｍｌにＢＥ−１３７９３Ｃ  １．２ｇを添加し、室温で５時間撹拌した。反応液のｐＨを濃塩酸を用いて１．０に調整することにより生じた沈殿を濾取し、水３０ｍｌで洗浄後、減圧下に乾燥し、表題の式［ＶＩＩ］で表される化合物９６５ｍｇを得た（収率８０％）。
【００６３】
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５９［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．９（２Ｈ，ｂｒｓ），１０．４（２Ｈ，ｂｒｓ），８．２４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
実施例１
１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの製造法
斜面寒天培地に培養したミクロテトラスポラ・エスピー（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｓｐ．）  Ａ３４５４９株をグルコース０．２％、デキストリン２．０％、オートミ−ル０．５％、脱脂米ヌカ０．５％、脱脂肉骨粉０．２％、乾燥酵母０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、臭化ナトリウム０．０５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％からなる培地（滅菌前ｐＨ７．２）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培養用三角フラスコ１本に接種し、２８℃で８日間、回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液２ｍｌを上記組成の培地１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培養用三角フラスコ２０本に接種し、２８℃で回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。９日間培養した時点で、１フラスコあたりＢＥ−１３７９３Ｃの２０ｍｇ／ｍｌジメチルスルホキシド溶液０．５ｍｌを添加し、同上条件下で更に１５日間培養した。
【００６４】
上記培養液をメチルエチルケトン（ＭＥＫ）３Ｌで抽出した。ＭＥＫ抽出液を減圧下で濃縮した。得られた濃縮液を酢酸エチルを用いて抽出した。酢酸エチル抽出液（８５０ｍｌ）を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾固した。これをシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（内径２ｃｍ，長さ３０ｃｍ，ＢＷ−３５０シリカゲル，富士デヴィソン化学社製）に付し、クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン−２８％アンモニア水（２：１：３：０．２）で洗浄後、クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン（３：１：１）で溶出した。目的物を含む分画を濃縮乾固した後、少量のテトラヒドロフラン−エタノール（１：３）に溶解し、セファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィー（内径１．５ｃｍ，長さ８７ｃｍ）に付し、エタノールで溶出し、目的物を含む分画を濃縮乾固することにより表題化合物、１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン５３．９ｍｇを得た。
【００６５】
Ｒｆ値：０．３９（メルク社製，キーゼルゲル６０Ｆ２５４，展開溶媒；クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン−酢酸＝３：１：１：０．１）
ＨＰＬＣ；Ｒｔ  ８．７分（カラム：クロマトレックスＯＤＳ，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，検出：ＵＶ  ３０５ｎｍ，流速：１ｍｌ／分，移動相：メタノール：水＝６：４）
ＨＲ  ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１９．１３１３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．０（１Ｈ，ｓ），１０．９（１Ｈ，ｓ），１０．３（１Ｈ，ｂｒｓ），９．９３（１Ｈ，ｂｒｓ），８．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｂｒｓ），５．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｂｒｓ），４．０２（２Ｈ，ｍ），３．７４（１Ｈ，ｍ），３．６３（２Ｈ，ｍ），３．４１（１Ｈ，ｍ）
実施例２
１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの製造法
斜面寒天培地に培養したサッカロスリクス  エヤロコロニジェネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ  ３９２４３株をグルコース３．０％、ソーヤフラワー１．０％、綿実粕１．０％及び炭酸カルシウム０．３％からなる培地（滅菌前ｐＨ７．２）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培地用三角フラスコ７本に接種し、２８℃で４８時間、回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液４ｍｌずつをグルコース１．０％、デキストリン６．０％、亜麻仁粕１．５％、粉末酵母０．５％、硫酸第一鉄７水和物０．１％、リン酸二水素アンモニウム０．１％、硫酸アンモニウム０．１％及び炭酸カルシウム１．０％からなる培地（滅菌前ｐＨ７．２）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培地用三角フラスコ１５０本に接種し、２８℃で回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。１２０時間培養した時点で、１フラスコあたりＢＥ−１３７９３Ｃの２２ｍｇ／ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液０．５ｍｌを添加し、同上条件下で更に１２０時間培養した。
【００６６】
上記培養液を濾過して得られた菌体をメタノールで２回（５．１Ｌ，５．６Ｌ）、テトラヒドロフランで２回（２．２Ｌ，２．３Ｌ）抽出した。メタノール及びテトラヒドロフラン抽出液を合わせて約１６００ｍｌまで濃縮した。濃縮して得られた水溶液をヘキサン（７８０ｍｌ）で抽出して不純物を除去し、この水層を酢酸エチル３．３Ｌを用いて抽出した。酢酸エチル抽出液を濃縮乾固し、得られた残渣を酢酸エチル約９０ｍｌで洗浄した後の残渣をメタノール約９０ｍｌで抽出した。メタノール抽出液を濃縮乾固して、６９４ｍｇの黄橙色固体を得た。これをメタノール４０ｍｌに溶解し、メタノールを溶出液としたセファデックスＬＨ−２０（３．０×５３ｃｍ，ファルマシア社製）のカラムクロマトに付し、目的の化合物を含む分画を集めて濃縮乾固した。これをシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（１．５×４６ｃｍ，キーゼルゲル６０，メルク社）に付し、クロロホルム、次いでクロロホルム：メタノール（１０：１）で洗浄後、酢酸エチル：メタノール（１０：１）で溶出した。溶出液を濃縮乾固して目的の表題化合物、１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン（１６９ｍｇ）を得た。
【００６７】
こうして得られた表題化合物の物性データは、実施例１で得られた化合物の物性データと同一である。
実施例３
６−アミノ−１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの製造法
斜面寒天培地に培養したサッカロスリクス  エヤロコロニジェネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ  ３９２４３株をグルコース３．０％、ソーヤフラワー１．０％、綿実粕１．０％及び炭酸カルシウム０．３％からなる培地（滅菌前ｐＨ７．２）（培地Ａ）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培地用三角フラスコ１本に接種し、２８℃で７２時間、回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。この培養液２ｍｌずつをグルコース１．０％、デキストリン６．０％、亜麻仁粕１．５％、粉末酵母０．５％、硫酸第一鉄７水和物０．１％、リン酸二水素アンモニウム０．１％、硫酸アンモニウム０．１％及び炭酸カルシウム１．０％からなる培地（滅菌前ｐＨ７．２）（培地Ｂ）１１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培地用三角フラスコ８本に接種し、２８℃で回転振盪機（毎分１８０回転）上で培養した。１２０時間培養した時点で、１フラスコあたり６−アミノ−１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの５０ｍｇを含むテトラヒドロフラン−メタノール（３：７）溶液１ｍｌを添加し、同上条件下で更に９６時間培養した。
【００６８】
上記培養液を濾過して得られた菌体をテトラヒドロフラン８００ｍｌで抽出した。得られた抽出液７５０ｍｌを減圧乾固した後、水５００ｍｌより、酢酸エチル−ｎ−ブタノール（１０：１）溶液で２回抽出した。酢酸エチル、ブタノール層を減圧濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（２．５×４５ｃｍ，キーゼルゲル６０，メルク社）に付し、クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン−２５％アンモニア水（２：１：３：０．２）、次いでメタノール−テトラヒドロフラン−２５％アンモニア水（１：３：０．２）で溶出した。目的の溶出液を減圧乾固後、残渣を少量のテトラヒドロフランを含むエタノールに溶解し、濃縮することにより、沈殿として表題化合物１４３ｍｇを得た。
【００６９】
Ｒｆ値：０．２８（メルク社製，キーゼルゲル６０Ｆ２５４，展開溶媒：クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン＝３：１：１）
ＨＰＬＣ；Ｒｔ  １７．５分（カラム：クロマトレックスＯＤＳ，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，検出：ＵＶ  ３０５ｎｍ，流速：１ｍｌ／分，移動相：５０％から１００％メタノールまで，３０分間のリニアグラジエント）
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１０．９（１Ｈ，ｓ），１０．４（１Ｈ，ｓ），１０．０（１Ｈ，ｓ），８．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｂｒｓ），５．２２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９６（２Ｈ，ｂｒｓ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．０１（２Ｈ，ｍ），３．７４（１Ｈ，ｍ），３．６３（２Ｈ，ｍ），３．３９（１Ｈ，ｍ）
実施例４
６−メチル−１２，１３−ジヒドロ−２，１０−ジヒドロキシ−１３−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの製造法
斜面寒天培地に培養したサッカロスリクス・エヤロコロニジェネス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ３９２４３株を実施例３に記載されている培地Ａ  １１０ｍｌを含む５００ｍｌ容の培地用三角フラスコ１本に接種後、実施例３記載の培養条件を用いて７２時間培養した後、この培養液２ｍｌずつを実施例３記載の培地Ｂを含む５００ｍｌ容の三角フラスコ２本に接種し、同様の培養条件を用いて１２０時間培養した時点で、１フラスコあたり、６−メチル−１２，１３−ジヒドロ−２，１０−ジヒドロキシ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンの１０ｍｇを含むメタノール１ｍｌを添加し、更に１２０時間培養した。
【００７０】
上記培養液を濾過して得られた菌体をテトラヒドロフラン１００ｍｌで２回抽出した。得られた抽出液を減圧乾固後、水５０ｍｌより酢酸エチル５０ｍｌで４回抽出した。酢酸エチル層を減圧下で濃縮乾固しエタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０（１．５×９０ｃｍ，ファルマシア社製）のカラムクロマトグラフィーに付し、エタノールで溶出した。目的の化合物を含むフラクションを減圧濃縮乾固して、表題化合物１１．１ｍｇを得た。
【００７１】
Ｒｆ値：０．１９（メルク社製，キーゼルゲル６０Ｆ２５４，展開溶媒：クロロホルム−メタノール−テトラヒドロフラン＝３：１：１）
ＨＰＬＣ；Ｒｔ  ２０．０分（カラム：クロマトレックスＯＤＳ，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，検出：ＵＶ  ３０５ｎｍ，流速：１ｍｌ／分，移動相：５０％から１００％メタノールまで，３０分間のリニアグラジエント）
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３４［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．２（１Ｈ，ｓ），９．７６（２Ｈ，ｂｒｓ），８．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．０Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．０Ｈｚ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．８７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），４．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７，３．４Ｈｚ），３．９１（２Ｈ，ｍ），３．７７（１Ｈ，ｍ），３．５１（２Ｈ，ｍ），３．１５（３Ｈ，ｓ）
【００７２】
【発明の効果】
本発明は抗腫瘍性物質として用いられるインドロピロロカルバゾール誘導体の製造に極めて効率的なことから医薬品製造の分野において有用である。