(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（化１）で表される核酸。
【化１】
0003603966.tif 000023
〔式中Ｘ’は抗体可変部位をコードする塩基配列を含有する核酸、Ｙは線状ファージコートタンパク質III又はVIIIをコードする塩基配列を含有し、かつその最後に終止コドンが存在する核酸、ＺはプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインをコードする塩基配列を含有する核酸、ｍは１又は０であり、ｍが１のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位と線状ファージコートタンパク質III又はVIIIとを含有する融合ポリペプチドをコードし、ｍが０のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位とプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインとを含有する融合ポリペプチドをコードしている〕
【請求項２】
一般式（化１）においてＺがプロテインＡのＦｃ結合ドメインをコードする塩基配列を含有する核酸である請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
一般式（化１）においてＹが配列表の配列番号１で表される塩基配列を含有する核酸であり、Ｚが配列表の配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列を含有する核酸である請求項１に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規遺伝子に関し、更に詳細には、高親和性抗体の選抜、及び人工抗体分子の作製等に有用な遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体の抗原特異性はＶ領域（ＶＨ  、ＶＬ  ）のアミノ酸配列によって決定されている。この抗体の可変領域を含むＦａｂ、あるいはＦｖ部分を大腸菌に発現させた抗体ライブラリーが作製されている。すなわち、マウス及びヒト由来のＶＨ  及びＶＬ  遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて、増幅した後に大腸菌発現ベクターに組込み発現させたものである〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４６巻、第１２７５〜１２８１頁（１９８９）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）  、第３４１巻、第５４４〜５４６頁（１９８９）、ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  、第２１３巻、第６１７〜６１９頁（１９９０）、ネイチャー、第３４７巻、第４８３〜４８５頁（１９９０）、サイエンス、第２４０巻、第１０３８〜１０４１頁（１９８８）、同、第２４０巻、第１０４１〜１０４３頁（１９８８）〕。
更に、目的の抗原と反応する抗体分子を発現する組換体を効率的にスクリーニングするために、抗体分子を線状ファージのコートタンパク質と融合タンパク質の形で発現させた、いわゆるファージ提示抗体ライブラリーも作製されている〔プロシーデイングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシージ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）第８９巻、第３５７６〜３５８０頁（１９９２）、同、第８９巻、第４４５７〜４４６１頁（１９９２）、同、第８８巻、第７９７８〜７９８２頁（１９９１）、同、第８８巻、第４３６３〜４３６６頁（１９９１）、ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー、第２２７巻、第３８１〜３８８頁（１９９２）、同、第２２６巻、第８８９〜８９６頁（１９９２）、同、第２２２巻、第５８１〜５９７頁（１９９１）、ネイチャー、第３５２巻、第６２４〜６２８頁（１９９１）、同、第３４８巻、第５２２〜５５４頁（１９９０）、同、第３４９巻、第２９３〜２９９頁（１９９１）〕。
【０００３】
このファージ提示抗体ライブラリーでは、ファージ表面に抗体分子由来ポリペプチドがあるために、抗原を固定化した樹脂等でファージ粒子を直接スクリーニングでき、そのファージ粒子を大腸菌に再度感染させることにより増殖できる。なお、本明細書中で用いるファージ粒子とはファージミド粒子も含まれる。したがって、短時間に数多くのクローンをスクリーニングすることができるばかりでなく、目的抗体分子をコードする遺伝子の回収が容易である。得られた目的抗体分子をコードする遺伝子から抗体分子を回収する方法としては、制限酵素消化により、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を取り除き、抗体分子のみを発現させることができる。また抗体遺伝子とファージコートタンパク質遺伝子の間にアンバー変異を入れておき、大腸菌の種類を変えることにより、抗体分子、あるいは抗体分子とコートタンパク質の融合タンパク質をそれぞれ選択的に発現できるベクターも構築されている。
また、発現された抗体分子を精製、あるいは使用するために抗体分子に短いペプチド鎖を融合させ、そのペプチド鎖に対する抗体を用いることにより、抗体を精製、あるいは検出することもでき、また酵素と融合タンパク質として発現させて、その酵素活性により、検出する形にしたものも開発されている〔バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  、第１１巻、第６０１〜６０５頁（１９９３）、同、第１０巻、第１１２８〜１１３２頁（１９９２）、ジーン（Ｇｅｎｅ）  、第１２２巻、第３６１〜３６５頁（１９９２）〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
抗体と抗原の親和力をいう場合、アフィニティーと呼ばれる固有親和力と、アビディティーと呼ばれる機能的親和力がある。前者は、抗体と抗原の結合部位で形成されている結合の強さ、すなわち、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力などにより決定される親和力であり、後者は、アフィニティーの強さに加えて、抗体及び抗原の結合部位の価数が多価である場合の総合的な親和力である。実際に抗体分子を免疫実験に用いる場合、アフィニティーが強く特異的であることが必要であるが、更にその価数が多い分子である方が実用上有用であり、アフィニティーが低い抗体分子であっても、その価数が多ければ全体として強い親和性を示すことになる。
ファージ提示抗体ライブラリーなどで用いられているベクターでは、抗体分子はＦａｂフラグメントあるいは一本鎖Ｆｖフラグメント〔ＶＨ  、ＶＬ  フラグメント間を数個のアミノ酸残基からなるスペーサーにより結合させて、一本鎖ポリペプチドとしたもの（以下ｓｃＦｖと略す）〕の形で発現させている。しかしながら、１つのファージ粒子に何個の抗体分子が提示されているかは不明であり、その個数の制御方法も示されていない。また、得られた抗体分子のアビディティーを上げて、実用上有用な形への変換方法も開示されていない。
本発明の目的は、ファージ提示抗体発現系において、提示された抗体機能を持つ分子の個数を制御し、アフィニティーの高い抗体分子を選抜する方法を提供でき、また得られた抗体分子を、多価の結合性を持たせることによりアビディティーが高く、抗原を高感度で検出できる人工抗体を作成する方法を提供することのできる遺伝子を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明は下記一般式（化１）で表される核酸に関する。
【０００６】
【化１】
0003603966.tif 000002
【０００７】
〔式中Ｘ'は抗体可変部位をコードする塩基配列を含有する核酸、Ｙは線状ファージコートタンパク質III又はVIIIをコードする塩基配列を含有し、かつその最後に終止コドンが存在する核酸、ＺはプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインをコードする塩基配列を含有する核酸、ｍは１又は０であり、ｍが１のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位と線状ファージコートタンパク質III又はVIIIとを含有する融合ポリペプチドをコードし、ｍが０のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位とプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインとを含有する融合ポリペプチドをコードしている〕
【０００８】
本発明者らは式（化１）で表される遺伝子を創製し、該遺伝子に抗体可変部位をコードする遺伝子を組込み、該抗体可変部位をファージ表面発現能を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形でファージ表面に発現させれば、該ファージ提示抗体のアフィニティーが簡便に測定でき、高アフィニティー抗体可変部位の選抜が効率よく行えること、また、該抗体可変部位をＦｃ結合能を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形で発現させれば、該タンパク質は、Ｆｃを含有する分子と複合体を形成し、該複合体は多価の抗体価を示すこと、極めて安定であること等より、高アビディティーな人工抗体として免疫学的使用に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の遺伝子は抗体可変部位をコードする遺伝子の組込部位を含有する遺伝子（以下、Ｘ遺伝子と称す）の下流に、ファージ表面発現能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する遺伝子（以下、Ｙ遺伝子と称す）、更に下流にＦｃ結合能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する遺伝子（以下、Ｚ遺伝子と称す）が並んで構成される。ここでいう抗体可変部位とは天然、あるいは人工のあらゆる抗体可変部位、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖをいうが、後述の方法でアフィニティー能を測定する場合はＦｖを選択するのが好ましい。
【００１０】
またファージ表面発現能を有するポリペプチドとしては線状ファージコートタンパク質ＩＩＩ  （以下、ｃｐＩＩＩ  と略す）や同ＶＩＩＩ（以下、ｃｐＶＩＩＩと略す）あるいはそれぞれの一部などが挙げられるが、抗体可変部位と融合ポリペプチドの形で発現され、ファージ粒子の表面に抗体可変部位が提示されるものであれば特に限定されない。更にＦｃ結合能を有するポリペプチドとは、例えばプロテインＡ、プロテインＧがあり、これらのＦｃ結合ドメイン、あるいはＦｃ結合ドメイン様構造体を用いても良い。Ｆｃ結合ドメイン、あるいはＦｃ結合ドメイン様構造体を用いる場合、ドメイン数は通常１〜５の範囲で選択される。これらの遺伝子の配列に関してはＸ遺伝子に組込まれた抗体可変部位の読取り枠に続く形で、Ｙ遺伝子がコードするポリペプチドの読取り枠がつながり、Ｙ遺伝子がコードしているポリペプチドの最後に終止コドンが存在する。またＸ遺伝子とＹ遺伝子の境界には制限酵素サイトが存在し、またＹ遺伝子とＺ遺伝子との境界にも制限酵素サイトが存在する。この２つの制限酵素サイトは、同じ制限酵素サイトであっても良いし、違う制限酵素サイトでも良いが、切断後生じる末端、すなわちＸ遺伝子末端とＺ遺伝子末端が接続可能であれば良い。更にＺ遺伝子は、Ｘ遺伝子に組込まれた抗体可変部位の読取り枠に続く形で、Ｚ遺伝子がコードするポリペプチドの読取り枠がつながり、Ｚ遺伝子がコードするポリペプチドの最後に終止コドンが存在するようにつながっている。
【００１１】
本発明の遺伝子はベクターに組込まれて使用される。本発明で使用されるベクターとしては、例えばファージミドベクターを基本骨格として、プロモーターの下流にＸ−Ｙ−Ｚ遺伝子が組込まれたベクター、ファージミドベクターを基本骨格としてプロモーターの下流にＸ−Ｙ遺伝子が組込まれたベクター、ファージミドベクターを基本骨格として、プロモーターの下流にＸ−Ｚ遺伝子が組込まれたベクターがあり、これらを組合せて使用することができる。
【００１２】
前述の様にＸ遺伝子は、天然、又は人工の抗体可変部位をコードする遺伝子を組込むことができる。抗体可変部位をコードする遺伝子が組込まれたＸ遺伝子を以下Ｘ′遺伝子と称する。同様に、抗体可変部位をコードする遺伝子が組込まれたＸ−Ｙ−Ｚ遺伝子、Ｘ−Ｙ遺伝子、Ｘ−Ｚ遺伝子をそれぞれＸ′−Ｙ−Ｚ遺伝子、Ｘ′−Ｙ遺伝子、Ｘ′─Ｚ遺伝子と称する、なお、本明細書において抗体可変部位とは抗体の可変部位を分子中に含有するポリペプチドを意味する。
【００１３】
抗体可変部位をコードする遺伝子、例えばＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖをコードする遺伝子が組込まれたＸ′−Ｙ−Ｚ遺伝子を含有するファージミドベクターを保持する大腸菌にヘルパーファージを感染させると線状ファージが形成される。この時、ベクター上のＸ′−Ｙ遺伝子より、抗体可変部位がつながったファージコートタンパク質が発現し、ファージ表面に組込まれる。すなわち、この線状ファージ表面に、Ｘ′−Ｙ遺伝子にコードされた抗体可変部位を含むポリペプチドが提示されることになる。目的とする抗原結合能を有する抗体可変部位を提示したファージ粒子は、目的とする抗原を固定化した担体によるアフィニティースクリーニングで容易に選択することができる。この時、抗体可変部位を含むポリペプチドがＦｖフラグメントの形であれば、ファージ粒子を界面活性剤Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（以下、サルコシルと略する）を含む溶液で洗浄することにより、ファージの感染性を損うことなしに、ＦｖフラグメントのＶＨ  ドメインとＶＬ  ドメインを解離することができる。すなわち、この洗浄の条件によって、ファージ表面上で提示されている抗原結合能を持ったＦｖフラグメントの数を調整することができる。
このことにより、ファージ表面に存在する抗体の価数を調整でき、同価数でアフィニティーの高い抗体分子を提示しているファージ粒子を選抜することができる。この洗浄の条件は、例えば、表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡコアシステム（ファルマシア社）を利用して、抗原を固定化したセンサーチップに、様々な処理をしたファージ液を投入することにより決定することができる。
【００１４】
得られたファージ粒子を再度大腸菌に感染させることにより、目的抗体分子をコードする遺伝子を含むプラスミドを回収することができる。回収されたプラスミドは、制限酵素消化をしてＹ遺伝子を遊離させ、セルフライゲーションさせることによりＸ′−Ｚ遺伝子によりコードされる融合ポリペプチドを発現する形に変換できる。
変換されたプラスミドベクターを大腸菌に導入して培養することにより、Ｘ′−Ｚ遺伝子によりコードされる融合ポリペプチドを大量に生産することができる。このポリペプチドは、Ｆｃ結合能を持つことより、例えばＩｇＧを結合した樹脂を用いることにより容易に精製できる。又は、抗原を固定化した樹脂を用いても良い。
【００１５】
この様にして得られた抗体可変部位とＦｃ結合能を有するポリペプチドが融合したポリペプチドを、Ｆｃを含有する分子、例えばヒトＩｇＧと混合することにより、複合体が形成される。例えばＦｃ結合能を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２で表される遺伝子がコードするプロテインＡ由来のＦｃ結合ドメイン様の５８アミノ酸残基からなるＦｃ結合能を持つドメイン構造を含むポリペプチド（配列表の配列番号４）の場合、１つのＦｃを含有する分子に対し、２ヵ所で結合することができる〔ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  、第７８巻、第４７１〜４９０頁（１９７７）、モレキュラー  イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）  、第１７巻、第１５６３〜１５７３頁（１９８０）、ジ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）  、第４巻、第１０７５〜１０８０頁（１９８５）、プロテイン  エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第１巻、第２号、第１０２〜１１３頁（１９８７）〕。したがって、該Ｆｃ結合ドメインを含有する融合ポリペプチドは、例えばＩｇＧ１分子に対して２分子の融合ポリペプチドが付加した複合体を形成する。すなわち２価の抗体価を持つ分子を創製することができる。得られた複合体は、２価であるために抗体としてのアビディティーが高く、Ｆｃフラグメントを含むために抗Ｆｃフラグメント抗体を用いることで容易に検出でき、広くＥＬＩＳＡ等にも適用できる。
【００１６】
更に、Ｆｃ結合能を有するポリペプチドの数を倍加させると、更に安定な抗体価数の高い複合体が形成される。すなわち、例えば配列表の配列番号３で表される遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドを含有する融合ポリペプチドは、例えばヒトＩｇＧと、巨大分子を形成することなく、意外にもＩｇＧ２分子と融合ポリペプチド３分子の安定な複合体を形成する。この複合体は極めて安定であり、かつ３価の高い抗体価を有し、かつ抗Ｆｃフラグメント抗体で検出でき、該複合体もＥＬＩＳＡ等の適用に極めて有用な人工抗体である。
【００１７】
以上述べてきたような機能を持つ、本発明の遺伝子を含むベクターの例として、本発明者らが作製したプラスミドｐＭ１３Ｆｖがある。
【００１８】
プラスミドｐＭ１３Ｆｖの遺伝子配列に関する概略図を図１に示す。
図１中で本発明の遺伝子は、Ｘ遺伝子に相当する部分は  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ間であり、Ｙ遺伝子はＳａｌＩ−ＳａｌＩ間、Ｚ遺伝子はＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ間に相当する。このＸ−Ｙ−Ｚに相当する  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間の遺伝子配列も配列表の配列番号５に示す。
【００１９】
プラスミドｐＭ１３Ｆｖは、一般的なファージミドベクターであるプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイト間に本発明の遺伝子Ｘ−Ｙ−Ｚが挿入されている。ベクター由来プロモーターの下流にあるＸ遺伝子は、まず、ＳＤ配列（シャイン−ダルガルノの配列）に続いて１つ目の読取り枠があり、分泌シグナルペプチドとＶＨ  フラグメント様ポリペプチドの融合ポリペプチドがコードされている。
更に、その下流に再度ＳＤ配列があり、分泌シグナルペプチドＶＬ  フラグメント様ポリペプチドがコードされている２つ目の読取り枠が続く。ＶＬ  遺伝子の３′末端部分に制限酵素ＳａｌＩサイトが存在し（配列番号５の塩基番号８９１−８９６）、ＶＬ  遺伝子の読取り枠に続く形で、ΔｃｐＩＩＩ  ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１）を含有するＹ遺伝子がつながっている。
すなわち、２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプチド、ＶＬ  フラグメント様ポリペプチド、ΔｃｐＩＩＩ  ポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする。Ｙ遺伝子は、Ｙ遺伝子がコードするΔｃｐＩＩＩ  ポリペプチド遺伝子の更に下流にある制限酵素ＳａｌＩサイト（配列番号５の塩基番号１５５５−１５６０）でＺ遺伝子とつながっている。Ｚ遺伝子は、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号３）を含有する遺伝子である。
【００２０】
このような構造のｐＭ１３Ｆｖは制限酵素ＳａｌＩで完全消化するとＹ遺伝子が切り出され、Ｙ遺伝子を除いた後にセルフライゲーションさせれば、Ｘ遺伝子とＺ遺伝子はＳａｌＩサイトにて連結される。
この時、Ｚ遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドは、Ｘ遺伝子の２つ目の読取り枠に続く形で連結される。すなわち、プラスミドｐＭ１３Ｆｖを制限酵素ＳａｌＩで消化してＹ遺伝子を除いた後、本発明の遺伝子がコードする２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプチド、ＶＬ  フラグメント様ポリペプチド、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする。
【００２１】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖにおいて、Ｘ遺伝子に相当する部分には、ニワトリ卵白リゾチーム（以下、ＨＥＬと略す）に対するモノクローナル抗体由来のＦｖ遺伝子が挿入されているため、厳密に言えば本発明でいうＸ′遺伝子であるが、実際には、Ｆｖ遺伝子を容易に置換できるように制限酵素サイトが存在するため、挿入されているＦｖ遺伝子を単なるスペーサー配列と考えればＸ遺伝子とすることができる。すなわち、先に示した配列表の配列番号５で示した塩基配列中塩基番号１１５−１２０に存在するＰｓｔＩサイトと塩基番号４３８−４４４に存在するＢｓｔＥＩＩサイトでプラスミドｐＭ１３Ｆｖを切断して挿入されていたＶＨ  遺伝子を取り除き、読取り枠が合うように調製した任意のＶＨ  遺伝子を挿入できる。読取り枠が合うようなＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片は、ＤＮＡ合成機を用いて合成したＤＮＡでも良いし、あるいは、従来から用いられている方法により、ＰｓｔＩサイトあるいはＢｓｔＥＩＩサイトを含むように合成したＶＨ  遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲ法により得たＤＮＡ断片をＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩで消化して得たＤＮＡ断片でも良い。同様にしてＶＬ  遺伝子も配列表の配列番号５で示した塩基配列中塩基番号５８３−５８８に存在するＳａｃＩサイトと塩基番号８９１−８９６に存在するＳａｌＩサイト間でＶＬ  遺伝子をコードするＤＮＡ断片と置換することができる。ただしこのプラスミドｐＭ１３Ｆｖの場合は、Ｙ遺伝子とＺ遺伝子間にもＳａｌＩサイトがあるために、ＳａｌＩ消化は部分分解をしてベクターを調製する。
【００２２】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖの構築方法を簡単に説明する。ＨＥＬに対するモノクローナル抗体Ｄ１．３由来のＦｖフラグメントをコードするプラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３〔ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー、第２    １３巻、第６１７〜６１９頁（１９９０）〕はグレッグ  ウインター（Ｇｒｅｇ  Ｗｉｎｔｅｒ）博士（ケンブリッジ、ＵＫ）より譲渡を受けた。ただし、譲渡を受けたプラスミドは、文献記載の配列と多少異なっていた。このプラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３は、プラスミドｐＵＣ１９の  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間にＦｖフラグメントをコードする遺伝子が挿入されている。この  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片の配列を配列表の配列番号６に示す。
【００２３】
このプラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３のＶＨ  遺伝子を含む  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を、ｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩサイトに挿入してプラスミドＴ１９ＶＨを構築する。また、ＶＬ  遺伝子を含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社）のＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＶＬを構築する。このプラスミドＴ１８ＶＬを鋳型として、配列表の配列番号７で示した制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列とＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＶＬ３′ＳａｌＩと、配列表の配列番号８で示したプライマーＵＰＭＣＳを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅後、  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ消化をしてＤＮＡ断片を得る。これをプラスミドｐＴＺ１８Ｒの  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＶＬＳを得る。このプラスミドＴ１８ＶＬＳの、ＶＬ  遺伝子を含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を先に構築したプラスミドＴ１９ＶＨのＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳを得る。次に、プラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシア社）を鋳型として、配列表の配列番号９で示したプライマーＰｒｏＡ５′と、配列番号１０で示したプライマーＰｒｏＡ３′を用いてＰＣＲ法により、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化した後、プラスミドｐＴＺ１８ＲのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＰＡを得る。このプラスミドＴ１８ＰＡのプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドｐＦｖ−ＰＰを得る。次にプラスミドＭ１３ｍｐ１８を鋳型として、配列表の配列番号１１で示したプライマーｃｐＩＩＩ  ５′−１と配列番号１２で示したプライマーｃｐＩＩＩ  ３′を用いてＰＣＲ法により、ｃｐＩＩＩ  のＣ末端側ポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入する。この時、プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＶＬ  遺伝子に続いて、プライマーｃｐＩＩＩ  ５′−１由来配列がつながった向きに挿入されたプラスミドがｐＭ１３Ｆｖである。この様にして構築したプラスミドｐＭ１３Ｆｖを導入した大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＭ１３Ｆｖと命名、表示され工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１３６９８として寄託されている。
【００２４】
本発明の遺伝子を用いることにより、以下のことが可能となる。
まず、本発明の遺伝子は、ファージミドベクターに組込まれて使用される。そして本発明のＸ遺伝子に、Ｙ遺伝子がある状態で抗体可変部位をコードする遺伝子を挿入すれば、抗体可変部位をその表面に提示した、いわゆるファージ提示抗体ライブラリーを構築することができる。抗体遺伝子の取得方法としては、従来から用いられている方法に従って、ヒトを含む動物あるいはそれら由来の培養細胞などから得た、抗体のｍＲＮＡを含むＲＮＡを原料として、ｃＤＮＡを合成した後ＰＣＲ法によって天然の抗体可変部位を含む遺伝子を増幅させることができる。これを本発明の遺伝子に抗体可変部位が発現するように組込めば良い。あるいは、合成ＤＮＡを用いて、色々な種類のアミノ酸をコードするように作製した合成的な抗体可変部位をコードする遺伝子を用いてもよい。この場合、抗体可変部位の中でも特にアミノ酸の置換が多く、抗原と直接作用している超可変領域に変異を多く導入すると効果が期待できる。
【００２５】
このように構築した抗体可変部位を提示したファージ提示抗体ライブラリーから目的の抗原結合能を持つ抗体分子を提示しているファージを選択する場合、Ｘ′遺伝子がＦｖフラグメントを発現するように調製された場合非常に有用である。なぜならば、本発明者らは鋭意努力の結果、ファージ表面に発現している抗原結合能を有するＦｖ分子の数を制御する方法を見出したからである。Ｆｖフラグメントがその抗原結合能を示すのは、ＶＨ  フラグメントとＶＬ  フラグメントが結合してＦｖフラグメントとして存在している場合であり、ＶＨ  フラグメント、あるいはＶＬ  フラグメント単独ではその結合能は非常に低くなってしまう。
【００２６】
この性質を利用して、ファージ表面に発現しているＦｖフラグメントをＶＨ  フラグメントとＶＬ  フラグメントに解離させることにより、ファージ表面に複数個存在する抗原結合能を有するＦｖ分子の数を１分子程度にすることができる。これは、界面活性剤サルコシルを用いた穏やかな洗浄処理による工程で実施可能であり、かつ該工程はファージ粒子の感染性に何ら影響を与えない。ファージミドベクターを用いてそのファージ粒子に抗体分子を提示させる場合、その抗体分子の個数を制御できない。ファージ表面に２分子以上の抗体分子が存在すると、その抗体分子のアフィニティーが低くても、全体としてのアビディティーが高くなり、抗原を用いたアフィニティースクリーニングの際、あたかも高アフィニティーであるかのようにふるまう。この時、ファージ粒子の感染性を損うことなく、Ｆｖ分子の数を１分子程度に制御できれば、高アフィニティーの抗体分子を提示したファージ粒子を得ることが期待できる。ＶＨ  フラグメントとＶＬ  フラグメントが共有結合でつながっているｓｃＦｖや、Ｆａｂを提示したファージ提示抗体ライブラリーでは、このような制御をすることは難しい。また、得られたＦｖ分子を提示しているファージ粒子からＦｖフラグメントをコードしている遺伝子を回収し、ｓｃＦｖフラグメントやＦａｂフラグメントに変換することは容易である。すなわち、得られたファージミド粒子を大腸菌に感染させ、プラスミドを回収する。このプラスミドから、目的のＶＨ  遺伝子とＶＬ  遺伝子を取り出し、ｓｃＦｖフラグメントや、Ｆａｂフラグメントの形で発現できるように構築したプラスミドに入れ直せば良い。
【００２７】
目的の抗体可変部位を提示したファージ粒子が得られた後、用いた本発明の遺伝子がＸ′−Ｙ−Ｚの場合、実用上有用な形に変換するのは容易である。すなわち、得られたファージミド粒子を大腸菌に感染させて、プラスミドを回収する。その後前述の通り、Ｙ遺伝子を取り除き、Ｘ′−Ｚの形に変換すれば、プラスミドは抗体可変部位を含むポリペプチドとＺ遺伝子がコードするＦｃ結合能を有するポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現する形に変換される。
【００２８】
この抗体可変部位を含むポリペプチドと、Ｆｃ結合能を有するポリペプチドの融合ポリペプチドは、非常に有用である。すなわち、まず第１に、精製が容易である。例えば、Ｆｃを含む、ポリペプチドあるいはタンパク質を固定化した樹脂を用いて、培養物から融合ポリペプチドを回収することができる。第２に、この融合ポリペプチドを、Ｆｃを含むポリペプチドあるいはタンパク質、例えばヒトＩｇＧなどと混合することにより、安定な多価の抗体複合体を形成する。多価であるために、抗原との結合安定性は、１価である時よりも高く、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティング等の使用に用いる場合有用である。また、混合するＦｃを含むポリペプチドの性質により検出も容易となり有用である。このような融合ポリペプチドを作製するための本発明の遺伝子Ｘ′−Ｚの使用の際には、Ｘ′遺伝子がコードする抗体可変部位を含むポリペプチドは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントなどどのようなものも有効である。
【００２９】
また、本発明の遺伝子を用いることにより、ポリクローナル人工抗体を作製することもできる。すなわち、抗体可変部位をコードする遺伝子のライブラリーを作製し、次にＸ遺伝子に組込み、Ｘ′−Ｙ−Ｚ遺伝子ライブラリーを作製する。次に、Ｘ′−Ｙ遺伝子ライブラリーでファージを形質転換し、抗原結合性を有するＸ′−Ｙ遺伝子群を選抜する。次に選抜されたＸ′遺伝子群を有するＸ′−Ｚ遺伝子群を発現させることにより、ポリクローナル人工抗体を作製することができる。該ポリクローナル人工抗体も抗原精製、抗原測定、診断等の分野で有用である。
【００３０】
以上詳細に説明したように、本発明の遺伝子を用いることにより、抗原に対して特異的な抗体分子の中でも特にアフィニティーの高い抗体分子を選択し、更にアビディティーの高い人工抗体を提供することが可能となった。
【００３１】
【実施例】
次に実施例を示すが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３２】
実施例１  発現プラスミドの構築
ＨＥＬに対するモノクローナル抗体Ｄ１．３由来のＦｖフラグメントをコードするプラスミドｐＳＷｌＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３は、グレッグ  ウインター博士（ケンブリッジ、ＵＫ）より譲渡を受けた。ただし、譲渡を受けたプラスミドは文献記載の配列と多少異なっていた。このプラスミドｐＳＷｌＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３はｐＵＣ１９の  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間にＦｖフラグメントをコードする遺伝子が挿入されている。この  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片の配列を配列番号６に示す。
【００３３】
（１−１）  プラスミドｐＦｖ−ＰＰ、ｐＦｖ−Ｐの構築
プラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３Ｖ  ＫＤ１．３を制限酵素  ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、ＶＨ  遺伝子を含む約４７０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨを得た。また、プラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、ＶＬ  遺伝子を含む約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社）のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１８ＶＬを得た。このプラスミドＴ１８ＶＬを鋳型として、配列表の配列番号７に示した制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列と、ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＶＬ３′ＳａｌＩと配列番号８に示したｐＴＺ１８Ｒ由来配列であるプライマーＵＰＭＣＳを用いてＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡを制限酵素  ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。これをアガロースゲル電気泳動により分離後  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ断片を抽出精製した。
このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１８Ｒの  ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１８ＶＬＳを得た。このプラスミドＴ１８ＶＬＳはＶｌ  遺伝子の３′末端側に制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つ。
このプラスミドＴ１８ＶＬＳを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、ＶＬ  遺伝子を含む約４３０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片を先に構築したＶＨ  遺伝子を持つプラスミドＴ１９ＶＨのＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳを得た。このプラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳはｐＴＺ１９Ｒｌａｃプロモーターの下流に、ＶＨ  遺伝子、ＶＬ  遺伝子を持つ。
【００３４】
次にプラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシア社）を鋳型として、配列表の配列番号９に示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＰｒｏＡ５′と、配列番号１０に示した、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を持つプライマーＰｒｏＡ３′を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。
増幅してきた、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化しアガロースゲル電気泳動を行い約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をｐＴＺ１８ＲＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入しプラスミドＴ１８ＰＡを得た。次にこのプラスミドＴ１８ＰＡを制限酵素ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩで消化しアガロースゲル電気泳動を行い、約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。
【００３５】
このＤＮＡ断片を先に得たプラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドｐＦｖ−ＰＰを構築した。
このプラスミドｐＦｖ−ＰＰは、ＶＨ  フラグメントと、ＶＬ  フラグメントのＣ末端にプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造（配列番号４の５８アミノ酸残基）２個を含む融合ポリペプチドをコードする。このプラスミドｐＦｖ−ＰＰを制限酵素ＭｌｕＩで消化し、遊離する約１７０ｂｐのＤＮＡ断片を除いた後セルフライゲーションさせ、プラスミドｐＦｖ−Ｐを得た。このプラスミドｐＦｖ−ＰはＶＨ  フラグメントと、ＶＬ  フラグメントのＣ末端に配列表の配列番号２で示す遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造１個を含む融合ポリペプチドをコードする。
【００３６】
（１−２）  プラスミドｐＭ１３Ｆｖの構築
プラスミドＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社）を鋳型として、配列表の配列番号１１で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ  ５′−１と、配列番号１２で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列とＮｈｅＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ  ３′を用いてＰＣＲを行い、ｃｐＩＩＩ  のＣ末端側ポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅させた。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化後アガロースゲル電気泳動を行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片を実施例（１−１）  で得たプラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入した。得られたプラスミドのうち、ＶＬ  遺伝子に続いてプライマーｃｐＩＩＩ  ５′−１由来の配列がつながった向きに挿入されたプラスミドをプラスミドｐＭ１３Ｆｖとした。
【００３７】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖは、ＶＨ  フラグメントと、ＶＬ  フラグメントのＣ末端に配列表の配列番号１で示した遺伝子がコードする、ｃｐＩＩＩ  のＣ末端側のポリペプチド（ΔｃｐＩＩＩ）がつながった融合ポリペプチドとを発現するように構築されている。
更にこのプラスミドｐＭ１３Ｆｖの  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩに挿入されたＤＮＡ断片の概略図を図１に示し、塩基配列を配列表の配列番号５に示す。このプラスミドｐＭ１３Ｆｖは、制限酵素ＳａｌＩで消化後セルフライゲーションを行うことにより容易に実施例（１−１）  で構築したプラスミドｐＦｖ−ＰＰの形にすることができる。このプラスミドｐＭ１３Ｆｖを導入した大腸菌ＪＭ１０９  をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＭ１３Ｆｖと命名表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１３６９８として寄託した。
【００３８】
同様にして、プラスミドＭ１３ｍｐ１８を鋳型として、配列表の配列番号１３で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ  ５′−２と、先に用いたプライマーｃｐＩＩＩ  ３′を用いてＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡをＳａｌＩ消化後プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭ１３ΔＦｖを構築した。このプラスミドｐＭ１３ΔＦｖは、ｐＭ１３Ｆｖとほぼ同じ遺伝子配列を持っているが、プライマーｃｐＩＩＩ  ５′−２の配列の中に終止コドンが含まれているために、ＶＬ  遺伝子とΔｃｐＩＩＩ  遺伝子の間で読取り枠中に終止コドンが出現する。
したがって、ｐＭ１３ΔＦｖは、ＶＨ  フラグメントと、ＶＬ  フラグメントのみとを発現するように構築されている。
【００３９】
実施例２  ファージ表面へのＦｖフラグメントの発現とその性質の解析
（２−１）  Ｆｖ提示ファージ粒子の調製
実施例（１−２）  で得たプラスミドｐＭ１３Ｆｖを用いて大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換し、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３Ｆｖを得た。
コントロールとして、ｐＭ１３ΔＦｖを用いて大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換した大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３ΔＦｖを用いた。
これら２種の大腸菌を２×ＴＹ培地（１．６％バクトトリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。
この培養物４ｍｌを１２ｍｌの２×ＴＹ培地に接種し、３０℃で１時間培養した。２ｍｌのＭ１３Ｋ０７ファージ液（１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌ）を加えた後、培養液を３０℃で更に１時間培養した。この培養液を３ｍｌずつ７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５００ｍｌの２×ＴＹ培地６本に接種し、３０℃で２４時間培養した。同様にしてＭ１３Ｋ０７ファージをプラスミドを持たない大腸菌ＢＭＨ７１−１８を宿主として、調製した。それぞれ培養物より遠心分離により菌体を除き上清を得た。
【００４０】
３リットルの培養液上清に、１リットルのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール６，０００及び２．５ＭのＮａＣｌ）を加え、得られた混合物を４℃で一晩静置した。ファージを遠心分離にかけてペレットを生成した。沈殿物を３等分し、各ペレットを３種の異なった方法で調製した。すなわち、第１に、３００ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に室温にて１時間、第２に、３００ｍｌのＴＥＳ（０．１％のサルコシルを含有するＴＥ）に室温にて１時間、そして第３に、３００ｍｌのＴＥＳに室温にて１８時間、溶解、回転させた。この３種類の処理をしたファージ液に１００ｍｌのＰＥＣ／ＮａＣｌを添加することによって、ファージを再度沈殿させた。４℃で一晩回転することによって、沈殿物をＮＥＴ（１０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、０．１ＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解させた。ファージを１７０，０００×ｇで３時間遠心分離して集め、ＮＥＴに溶解した。最後に、ファージの精製を、濃度勾配ＣｓＣｌ超遠心法を用いて、３６，０００ｒｐｍ  で１時間遠心分離することによって行った。ファージのバンドを集め、ＮＥＴに対して透析してファージ液を得た。大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３Ｆｖより得られたファージをＭ１３Ｆｖ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３ΔＦｖより得られたファージをＭ１３ΔＦｖと命名した。このように調製した３種類のファージ液、Ｍ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦ、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７をそれぞれ先に述べた３種類の処理後精製したものについて以下の分析を行った。
【００４１】
（２−２）  ファージ並びにファージミドの感染性の測定
実施例（２−１）  で得た３種類のファージ（Ｍ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、Ｍ１３Ｋ０７）を３種類の処理（無処理、サルコシル洗浄１時間、サルコシル洗浄１８時間）したファージ溶液のコロニー形成能とプラーク形成能を測定した。すなわちこれらファージ溶液をＮＥＴを用いて適当に段階希釈した。このファージ溶液１００μｌに、対数増殖期（Ｏ．Ｄ．６００  ＝０．８）の大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）培養液５００μｌを加えて室温にて４５分間放置した。このうち１００μｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＴＹ培地プレートに直接塗りつけて、３７℃で一晩保温して出現したコロニー数を数えた。また別に１００μｌを５０℃に保温しておいた４ｍｌのソフトアガー（２×ＴＹ培地に０．６５％となるように寒天を溶かしたもの）に混ぜて２×ＴＹ培地プレートに広げて固化させた。これを３７℃で一晩保温して出現したプラーク数を数えた。この結果を表１に示す。すなわち表１は得られたファージ溶液のコロニー形成能とプラーク形成能を比較した表である。
【００４２】
【表１】
0003603966.tif 000003
【００４３】
ビリオン中のｆｄＤＮＡの、２６０ｎｍでのリン酸基１個当りのモル吸光係数は、６７５０であることが測定されている。Ｍ１３Ｋ０７のＤＮＡの長さは６．４ｋｂであり、Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖのＤＮＡの長さは４．８ｋｂであるので、１Ｏ．Ｄ．２８０  ユニット（以下ＤＵと略す）のファージは、Ｍ１３Ｋ０７については約１．３×１０１３個のファージ粒子に、またＭ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖについては約１．８×１０１３個のファージ粒子に対応するはずである。サルコシル処理を行わなかったサンプルの結果から、Ｍ１３Ｋ０７は０．２５ＰＦＵ／ファージ粒子であり、Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖは０．０６ＣＦＵ／ファージ粒子程度であることが示された。Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖに感染した細菌によって形成されたプラークは、ヘルパーファージから誘導されたと考えられ、調製物中の約１０％のファージがヘルパーファージであることが示唆された。これらの３種のファージ粒子の感染性は、０．１％サルコシル溶液を用いた１時間の処理（穏やかな洗浄）によっても、１８時間の処理（十分な洗浄）によっても、全く損なわれることがなかった。
【００４４】
（２−３）  ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの分析
実施例（２−１）  で調製したＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、及びＭ１３Ｋ０７それぞれ３種類の処理後調製したファージ１１．２ＤＵを、５％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノールを含む、１０ｍＭトリス−アセテート緩衝液（ｐＨ５．４）１ｍｌに溶解し、２４時間室温にてかくはんした。１ＮのＮａＯＨで中和した後、最終濃度０．１ＭとなるようにＭｇＣｌ２  を加えた。２０℃にて１５０，０００×ｇ１２時間遠心分離後上清を取出し、２分間沸騰させた。等容量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液を加え、そのうち１５μｌ（０．０７５ＤＵ相当）を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。泳動後セミドライブロッターを用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社）にブロッティングした。この膜を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に浸し室温で１時間保温することによりブロッキングした。一次抗体として抗Ｄ１．３Ｆｖフラグメントウサギ抗体（Ｄ１．３Ｆｖをウサギに免疫して得られた血清をＤ１．３Ｆｖ固定化カラムで精製したもの、以下抗Ｄ１．３抗体と略す）を０．０５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝液（以下ＰＢＳ／Ｔと略す）に加えたものに浸して室温で４時間保温した後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。検出に当っては、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧロバ抗体を用いたＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム社）を用いた。その結果を図２に示す。すなわち図２は線状ファージＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、及びＭ１３Ｋ０７を界面活性剤サルコシルを含む溶液で処理した場合に、ファージコートタンパク質に残存するＦｖフラグメント由来ポリペプチドの量を比較した図である。
【００４５】
Ｍ１３ΔＦｖ中のＦｖフラグメントがＭ１３ファージの表面に吸着するとは考えられないものの、ウェスタン・ブロッティングでは、ＶＨ  フラグメントとサイズが対応するバンドが現れた。しかし、ファージを０．１％のサルコシル溶液で１時間洗浄したところ、このバンドは完全に消えた。一方、Ｍ１３Ｆｖの場合には、２本のバンド、すなわち、ＶＨ  フラグメントと対応する１本の太いバンドと、ＶＬ  フラグメントをΔｃｐＩＩＩ  と融合させたものに対応するもう一本のバンドが、明らかに検出された。ファージを０．１％のサルコシル溶液で１時間洗浄した場合にも、ＶＨ  に対応するバンドが弱くなったものの、双方のバンドとも残存した。ファージを１８時間にわたって十分に洗浄すると、ＶＨ  の方のバンドは完全に消えたものの、ＶＬ  フラグメントをΔｃｐＩＩＩ  と融合させたものの方は、量が減少することもなくファージ上に残存した。
以上述べてきたごとく、ＶＨ  フラグメント並びにＶＬ  フラグメントの双方は、会合した形状でファージ表面上に発現され、また、サルコシル溶液を用いた処理によって、ＶＨ  フラグメントのみがファージ表面から除去される。
【００４６】
次にファージＭ１３Ｆｖ表面に発現されたＦｖフラグメントを定量するために、それぞれ０．０７５ＤＵのファージと濃度既知のＤ１．３Ｆｖフラグメントも同様にしてウェスタンブロッティングによって分析した。その結果を図３に示す。すなわち図３は、線状ファージＭ１３Ｆｖ表面に発現しているＦｖフラグメント由来ポリペプチドの量を比較した図である。
サルコシル溶液による１時間の洗浄後のＭ１３Ｆｖファージ上に発現されたＶＨ  のバンドの強度は、Ｆｖフラグメント１ｎｇに対応するようであった。
各レーンに、０．０７５ＤＵのファージから調製した全タンパク質を加えた。Ｆｖフラグメントの分子質量は２４．７ｋＤａ  であるので、１ｎｇのＦｖフラグメントは２．４×１０１０個の分子に対応する。このことから、０．１％のサルコシル溶液で１時間処理したＭ１３Ｆｖファージを調製する際には、約２％のファージがＦｖ分子を発現することが示唆された。しかし、ＶＨ  フラグメントの一部は、サルコシル溶液を用いた洗浄によって、ファージ表面から除去されていたはずである。
実際、Ｍ１３Ｆｖファージを洗浄を行わずに調製した際のＶＨ  のバンドの強度は、１時間の洗浄を行ったサンプルの場合のＶＨ  のバンドの強度より数倍高かった。洗浄を行わずにＭ１３ΔＦｖを調製した場合について示したのと同様にして、遊離ＶＨ  フラグメントがこの分画に非特異的に混入したおそれもあるので、Ｆｖフラグメントの正確な量を推定することは難しい。また、ファージ粒子からタンパク質を調製する過程でも、実質的な量のタンパク質の損失が生じたはずである。したがって、Ｆｖ分子を発現するＭ１３Ｆｖの本当の率は、上記の推定よりはるかに高いはずである。
以上述べてきたごとく、Ｍ１３Ｆｖファージはその表面上にＦｖ分子を実際に発現しており、また、Ｍ１３Ｆｖファージのうち、Ｆｖ分子を表面上に発現するものの率は、５％以上であると推定される。
【００４７】
（２−４）  ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの抗原結合性の分析
ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの抗原結合性を表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡコアシステム（ＢＩＡ  ｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ；ファルマシア社）によって調べた。ＨＥＬあるいは、抗Ｄ１．３抗体を、製造業者の指示に従って、バイオセンサーのチップの支持体に、アミン結合法によって化学的に結合させた。実験はすべて、ＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５％トゥイーン２０）を用いて、３０℃で、５μｌ／分の流速にて実施した。
【００４８】
実施例（２−１）  で得た９種類のファージ液をいずれもＨＢＳに対して透析した後、５種類の濃度（３．７、１．８、０．９、０．４５、０．２３ＤＵ／ｍｌ）に希釈して、２０μｌをＨＥＬ固定化センサーチップに投入した。その結果を図４〜図１２に示す。すなわち図４〜図１２はサルコシル処理が、無処理、１時間洗浄、１８時間洗浄がそれぞれ図４〜図６、図７〜図９、図１０〜図１２に対応し、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。また、同様にして濃度３．７ＤＵ／ｍｌのファージ２０μｌを投入した後に、抗Ｍ１３ファージウサギ抗体（Ｍ１３ファージをウサギに免疫して得られた血清をＭ１３ファージ固定化カラムで精製したもの、以下抗Ｍ１３抗体と略す）を更に投入してシグナルを増幅した。この結果を図１３に示す。すなわち図１３は、ファージをＨＥＬ固定化センサーチップに投入後、抗Ｍ１３抗体を更に投入した時の表面プラズモン共鳴センサーの結果を示した図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。また、ファージ表面にＤ１．３Ｆｖフラグメント由来ポリペプチドが存在しているかを調べるために、抗Ｄ１．３Ｆｖ抗体を固定化したセンサーチップに、濃度３．７ＤＵ／ｍｌのファージ液２０μｌを投入した。その結果を図１４に示す。すなわち図１４は、ファージを抗Ｄ１．３抗体固定化センサーチップに投入した時の表面プラズマモン共鳴センサーの結果を示した図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。
【００４９】
以上図４〜図１４に示した結果をまとめる。
図４、図５で示した通り、Ｍ１３Ｋ０７も、Ｍ１３ΔＦｖも、ＨＥＬとは結合しなかった。ベースラインの移動は、サンプルの状態、すなわち、溶質、ｐＨ、及び／又はイオン強度の違いに起因するものであると考えられる。結合によっては生じた共鳴単位（ＲＵ）は、３．７ＤＵ／ｍｌのファージ溶液について２００ＲＵ程度で、あまり高くなったものの、Ｍ１３ＦｖはＨＥＬと明らかに結合した（図６）。解離曲線の形状から判断すると、ファージの一部がＨＥＬから迅速に解離する一方（Ｋｏｆｆ  ＝３×１０−２Ｓ−１）、残りのファージはほとんど解離しないようであった（Ｋｏｆｆ  ＝１×１０−３Ｓ−１）。このことによって、これらのファージが異なった形状のファージを包含するものであることが示唆された。すなわち、表面上にＦｖ分子を１つのみ発現するファージと、ファージ粒子１つの表面上に複数のＦｖ分子を発現するファージとがあるのではないかと予測された。これは、サルコシル溶液で１時間にわたり洗浄を行ったＭ１３Ｆｖ調製物で得られた結果によって裏付けられた（図９）。図９に示された通り、サルコシルで１時間洗浄したＭ１３ＦｖファージがＨＥＬから解離する際の曲線は、単一の抗原結合部位を有するファージ抗体について予測される、単純なパターンとなった（Ｋｏｆｆ  ＝３×１０−２Ｓ−１）。サルコシル溶液で十分に洗浄したＭ１３Ｆｖは、ＨＥＬ結合活性を完全に消失した（図１２）。
【００５０】
センサーチップ上のＨＥＬに結合したファージ抗体を、抗Ｍ１３抗体を投入することによって直接検出した。図１３からは、抗Ｍ１３抗体の投入によって、サルコシルによる洗浄を行わなかったＭ１３Ｆｖの場合にはＲＵが増大し、サルコシル溶液で洗浄を行うとＲＵが低減し、そして十分に洗浄すると、ＨＥＬに結合したファージがバックグラウンドのレベルまで消失することが示唆された。こうした結果から、表面上にＦｖフラグメントを発現するファージがＨＥＬに結合することが、直接的に立証された。サルコシル溶液を用いた洗浄がＨＥＬとの結合活性に及ぼす影響は、ファージ表面からＶＨ  フラグメントが除去されることに起因するものであると考えられる。すなわち図１４に示すように、Ｍ１３Ｆｖの抗Ｄ１．３抗体分子への結合が、サルコシル溶液を用いた洗浄によって大きく影響されることはなかった。抗Ｄ１．３抗体はＶＨ  フラグメントのみならずＶＬ  フラグメントにも結合するので、これらの結果からは、サルコシルでの洗浄によってファージ表面から除去されたのがＶＨ  フラグメントのみであって、ΔｃｐＩＩＩ  と融合したＶＬ  フラグメントは、サルコシルによる洗浄後もファージの表面に吸着したままであることが示唆される。ＢＩＡコアシステムを用いた分析の結果は、実施例（２−３）  で得られたウェスタン・ブロッティングの結果と完全に合致するものである。
【００５１】
以上述べてきたごとくＭ１３Ｆｖファージの一部は、ファージ粒子１つの表面上に２つ以上のＦｖ分子を発現するものであり、また、サルコシル溶液を用いて穏やかに洗浄することによって、ファージ表面に提示された抗体の結合価を制御し、また、解離の際の速度論的性状を制御することができるとの結論に達した。
【００５２】
実施例３  Ｆｃ結合ドメイン様構造を含むポリペプチドに融合させさＦｖフラグメントを用いた、結合性の高い人工抗体の作製
（３−１）  Ｆｃ結合ドメイン様構造を含むポリペプチドに融合させさＦｖフラグメントの調製
実施例（１−１）  で構築したプラスミドｐＦｖ−Ｐ、プラスミドｐＦｖ−ＰＰとプラスミドｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３ＶＫ  Ｄ１．３を用いてそれぞれ大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換して、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／  ｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３Ｖ  Ｋ  Ｄ１．３、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−ＰＰ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−Ｐ  を得た。これら３種類の大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。この培養物１０ｍｌを１リットルの１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し３０℃で振とう培養した（各２リットル）。培養液の濁度が分光光度計でＯ．Ｄ．６００  ＝０．８となったところで最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、更に３０℃で３６時間振とう培養した。それぞれの培養物より遠心分離により菌体を除き上清を得た。
得られた上清それぞれ２リットルをペリコンカセット（ミリポア社）を用い、０．４５μｍのフィルターでろ過した。更に分画分子量１万のフィルターで濃縮後、結合用緩衝液〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）〕に置換した。
【００５３】
この濃縮液からＦｖフラグメントの精製には、ＨＥＬをリアクチ−ゲル（Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ、ピアス社）に固定化したアフィニティーゲルを、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰの精製にはＩｇＧセファロース６ＦＦ（ファルマシア社）を用いた。
すなわち、濃縮液２００ｍｌに対し１０ｍｌのそれぞれのアフィニティーゲルを加えた。混合物を４℃にて２４時間ゆっくりと回転させ、結合用緩衝液で５回洗浄した。ゲルをカラムに充てんし、アフィニティーゲルに結合したＦｖフラグメント等を、５０ｍＭのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、及び１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。溶出液を１Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）ですばやく中和し、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃にて２晩透析した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８／  ｐＳＷ１ＶＨ  Ｄ１．３Ｖ  Ｋ  Ｄ１．３、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−ＰＰ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−Ｐ  培養物から得られたＦｖフラグメント由来ポリペプチドをＦｖ、Ｆｖ−ＰＰ、Ｆｖ−Ｐと命名し、以下の分析に用いた。
【００５４】
まず得られたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、クマシ−ブリリアントブルーＲ２５０により染色して検出した。その結果を図１５に示す。すなわち図１５は、アフィニティー樹脂により精製されたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。図１５に示されるとおり、ＶＨ  部分とＶＬ  部分はいずれの場合もモル比１：１で会合してＦｖ形状をなしている。また、アフィニティークロマトグラフィーの結果から、プロテインＡから誘導された部分が、ＩｇＧ結合活性を有していることが示された。
【００５５】
（３−２）  Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＦｖ部分の物理的特性の分析
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰがＨＥＬと結合する際の会合定数（ＫＡ  ）及び会合エンタルピー（ΔＨ）を、マイクロカル社製のオメガ（ＯＭＥＧＡ）滴定熱量計を使用した熱量測定によって測定した（これをＤＴＣ分析と称する）。
すなわち、熱量測定装置は、１００μｌの投入用シリンジを使用して、２分間隔で２４回の投入を次々と行うよう、自動的に作動させた。
１５秒の間に、１．３６ｍｌのサンプル溶液の入った熱量測定装置のセルに、５μｌのＨＥＬ溶液を加えた。熱量測定を行うのに先立って、Ｏ．Ｄ．２８０  を測定することによってＨＥＬの濃度を正確に測定し、０．０２０２８ｍＭに固定した。熱量計のセル中のＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの濃度は０．０１ｍＭ程度に調整し、ＤＴＣ分析のデータから正確に計算した。熱量計を使用した結合実験は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び２００ｍＭのＮａＣｌ中で、３０℃にて実施した。
【００５６】
得られたデータから、ΔＧ及び−ＴΔＳの値も計算した。表２及び表３にデータをまとめて示す。すなわち表２及び表３は、ＦｖフラグメントのＨＥＬとの結合に関する熱力学的、動的学的パラメーターを示した表である。
【００５７】
【表２】
0003603966.tif 000004
【００５８】
【表３】
0003603966.tif 000005
【００５９】
Ｆｖ─Ｐ及びＦｖ−ＰＰのＫＡ  の値は、ＦｖのＫＡ  の値よりわずかに小さい。こうした違いは、これらの融合タンパク質を分析する際にエンタルピーの項がわずかに減少したことに由来するようである。次にＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰがＨＥＬと反応する際のＫｏｎ  を、ストップト・フロー装置（モデルＳＦ．１７ＭＶ、アプライド・フォト・フィジック社）を使用した蛍光消光法によって測定した。ＨＥＬの濃度を、６μＭから１６μＭまで２μＭずつ上昇させ、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの濃度は１μＭに固定した。
次に、５０μｌの各溶液を、１：１の容量比で混合した。励起光の波長は２８０ｎｍとし、３２０ｎｍ以上の波長の蛍光を検出した。実験は３０℃にて１３回行い、データの平均値を更なる分析に使用した。アプライド・フォト・フィジック社によって提供されたソフトウェアのマニュアルの説明に従って、非線形回帰解析を行い、見掛上の反応速度（Ｋａｐｐ  ）  を測定した。
【００６０】
この方法では、偽一次条件が仮定されており、次式（数１）：
【００６１】
【数１】
Ｋａｐｐ    ＝  Ｋｏｎ〔Ａ〕０    ＋  Ｋｏｆｆ  
【００６２】
が有効であると想定されている。式中の〔Ａ〕０  はＨＥＬの初期濃度に対応する。実験的には、抗体に対してＨＥＬがはるかに過剰となるような条件下でＨＥＬの濃度を変化させ、Ｋａｐｐ  の値を各濃度で測定した。Ｋｏｎは、〔Ａ〕０  に対するＫａｐｐ  のグラフの勾配の値から計算した。Ｋｏｆｆ  は、〔Ａ〕０  が０に等しい場合のＫａｐｐ  の値であるが、Ｋｏｆｆ  の実際の値は、この方法で実験的に測定するには小さすぎた。そこで、Ｋｏｆｆ  はＫｏｎ／ＫＡ  から計算した。ＫＡ  は上述のようにしてＤＴＣによって測定した。表３に、３種の分子についてのＫｏｎ並びにＫｏｆｆ  の値を示す。表３に示される通り分子が大きいほど、Ｋｏｎの値が小さく、Ｋｏｆｆ  の値が大きかったものの、これらの分子を比較した場合には、Ｋｏｎ並びにＫｏｆｆ  についてのこの違いは大きいとはいえなかった。
以上述べてきたように、ＤＴＣ分析とストップト・フロー分析の結果をまとめると、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰのいずれにおいても、Ｆｖ部分の物理的特性は実質的に同一であった。
【００６３】
（３−３）  ＩｇＧとＦｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ複合体の分析
Ｆｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰがヒトＩｇＧと会合する際の熱力学的パラメーターを、ＤＴＣによって測定した。まず、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ、及びＨＥＬを用いた結合実験で得られたデータに基づいて、熱量計のセル中のＦｖ−Ｐの濃度を０．０１００ｍＭに調整し、Ｆｖ−ＰＰの濃度を０．００５０ｍＭに調整した。２００μｌのシリンジ中のヒトＩｇＧ（シグマ社、＃Ｉ−４５０６）の濃度は、０．０４ｍＭ程度に調整した。１２．５μｌのＩｇＧ溶液を、１．３６ｍｌのＦｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰの溶液の入った熱量計のセルに２３回投入した。ＩｇＧの濃度は、ＤＴＣ分析で得られたデータから計算した。
【００６４】
ＤＴＣ分析の結果をＦｖ−Ｐについては図１６に、Ｆｖ−ＰＰについては図１７に示した。すなわち図１６及び図１７は、それぞれＦｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図であり、縦軸は熱量（抽入物ｋｃａｌ／モル及びμｃａｌ／秒）、横軸は投入番号及び時間（秒）を示す。そこから計算された熱力学的パラメーターを表４及び表５に示す。すなわち表４及び表５は、Ｆｖ−ＰとＦｖ−ＰＰのヒトＩｇＧとの結合に関する熱力学的パラメーターを示した表である。
【００６５】
【表４】
0003603966.tif 000006
【００６６】
【表５】
0003603966.tif 000007
【００６７】
Ｆｖ−ＰＰのＩｇＧに対する親和性はＦｖ−Ｐより約１０倍高く、これは主にエントロピーの項に由来するもののようであった。とはいえ、図１６、図１７における変曲点での反応物質の濃度のモル比から判定すると、ＩｇＧ分子１個が最大で２個のＦｖ−Ｐ分子と、そして２個のＩｇＧ分子が最大で２個のＦｖ−ＰＰ分子と結合しうるので、Ｆｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰのいずれのプロテインＡドメインも、Ｆｖ結合活性を有するものである。プロテインＡドメインの安定性、及びＦｃ部分の物理的接近可能性に差がある可能性もある。Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧの組合せでは、飽和点に達した後に異常な熱の吸着が観察された（図１７）。逐次滴定実験では、モル比が急激に、すなわち、ＩｇＧに対してＦｖ−ＰＰが過剰な条件から、ＩｇＧの方が過剰な条件へと変化する。この熱の吸着から、Ｆｖ−ＰＰに対してＩｇＧが過剰に存在する場合に、複合体が再編成されていることが示唆される。
【００６８】
Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとＩｇＧとの間に形成される複合体の分子形状を、ＨＰＬＣによって更に調べた。
２種のＨＰＬＣ用カラム、Ｇ３０００ＳＷ及びＧ２０００ＳＷ（東ソー社）を直列につないだ。作業はすべて室温にて行い、ランニング緩衝液として２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。１５μｌの５μＭヒトＩｇＧ溶液、又は１５μｌの１０μＭ  Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ溶液を、まず装置に投入した。複合体の形状の分析に際しては、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ（最終濃度はいずれの場合も１０μＭ）をヒトＩｇＧ（最終濃度、５μＭ）と混合し、室温で１時間インキュベートしてから、１５μｌの混合物をＨＰＬＣ装置に投入した。２４５ｎｍでの吸収を監視した。その結果を図１８に示す。すなわち図１８はＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ及びこれらのＩｇＧ混合物のＨＰＬＣによる結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．２４５  、横軸は時間（分）を示す。
【００６９】
予想分子質量は以下の通りであった。
ＶＨ  ドメイン、１２，８３１Ｄａ；ＶＬ  ドメイン、１１，８７７Ｄａ；プロテインＡのドメイン１個と融合したＶＬ  ドメイン、１９，３４１Ｄａ；プロテインＡのドメイン２個と融合したＶＬ  ドメイン、２５，９６３Ｄａ；ヒトＩｇＧ、１４６，０００Ｄａ（平均値）。
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの溶出曲線からは、いずれの場合にもＶＨ  ドメインとＶＬ  ドメインが互いに緊密に会合していることを示された。ヒトＩｇＧの溶出曲線には、大きなピークが１つと小さなピークが１つ含まれていた。小さい方のピークはＩｇＧの二量体と対応する。
予想どおり、ＦｖとＩｇＧの混合物の溶出曲線は、ＩｇＧとＦｖのそれぞれ別の溶出曲線を単に合せたものであり、これらの２種の分子の間に相互作用が起きていないことが示された。Ｆｖ−ＰをＩｇＧと混合した場合には、ＩｇＧのピークのやや前に、新たな物質のピーク（図１８中、分画Ａ）が溶出した。
Ｆｖ−ＰとＩｇＧの分画の物質が減少していることや、分子量から判断して、分画Ａは、１個のＩｇＧ分子と２個のＦｖ−Ｐ分子から構成される複合体〔（Ｆｖ−Ｐ）２  ＩｇＧ複合体と称する〕に対応する。
【００７０】
Ｆｖ−ＰＰをＩｇＧと混合した場合には、新たな小さいピークと大きなピーク（図１８中、分画Ｂ）が現れた。Ｆｖ−ＰとＩｇＧの場合と同様に、分画Ｂは、２個のＩｇＧ分子と３個のＦｖ−ＰＰ分子の複合体〔（Ｆｖ−ＰＰ）３  （ＩｇＧ）２  複合体と称する〕に対応している。
【００７１】
この（Ｆｖ−ＰＰ）３  （ＩｇＧ）２  複合体は、混合物中のＦｖ−ＰＰとＩｇＧ濃度を１０倍低減させた場合にも、選択的に形成した。また、溶出曲線から判断して、この（Ｆｖ−ＰＰ）３  （ＩｇＧ）２  複合体は、（Ｆｖ−Ｐ）２  ＩｇＧ複合体と比べて更に安定なようであった。ＩｇＧの大半は複合体中に見いだされ、複合体を形成していないＦｖ−ＰＰ分子の溶出曲線は極めてシャープで、図１８中分画Ｂを分取後同じ条件でクロマトグラフィーにかけた場合のＦｖ−ＰＰの溶出曲線とほぼ同一であった。
【００７２】
これら分画Ａ、Ｂが新たな複合体を形成していることを確認するために、変性条件下のＨＰＬＣにより更に分析した。すなわち、吸収のピークを示した分画（図１８中分画Ａ及びＢ）を分取し、凍結乾燥した。これらを５Ｍグアニジン−塩酸に溶解した後、同じカラムで変性条件下でＨＰＬＣ分析をした。ランニング緩衝液としては、５Ｍグアニジン−塩酸を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。コントロールとして、ＩｇＧとＦｖ−Ｐの混合物、並びにＩｇＧとＦｖ−ＰＰの混合物（それぞれ２種の成分のモル比は１：２）も分析した。
【００７３】
その結果を図１９に示す。すなわち図１９は、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ複合体（それぞれ図１８中の分画Ａ、Ｂ）の変性条件下のＨＰＬＣによる分析結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．２４５  、横軸は時間（分）を示す。図１９に示されたとおり、分画Ａの複合体は、モル比１：２：２でＩｇＧ、ＶＬ  −プロテインＡＦｃ結合ドメイン１個、及びＶＨ  に分かれた。また分画Ｂの複合体は、モル比２：３：３のＩｇＧ、ＶＬ  −プロテインＡＦｃ結合ドメイン２個及びＶＨ  を生じた。
【００７４】
以上述べてきたごとく、ＩｇＧ分子を加えると、Ｆｖ−Ｐ分子並びにＦｖ−ＰＰ分子が、複数の抗原結合部位を有する複合体を生ずる。
【００７５】
（３−４）  Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体の物理特性の分析
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ、あるいはそれらとＩｇＧ複合体の、固体支持体に結合させておいたＨＥＬとの複合体のＫｏｎ及びＫｏｆｆ  を、ＢＩＡコアシステムを使用して測定した。２００μｇ／ｍｌのＨＥＬ溶液３５μｌを、製造業者の指示に従って、バイオセンサーチップ上の支持体にアミン結合法によって化学的に結合させた。実験はすべて、５μｌ／分の流速で、ＨＢＳ中、３０℃にて実施した。まず、ヒトＩｇＧを含有する（モル比２：１）、あるいは含有しない１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び２５ｎＭの抗体（Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ）溶液２０μｌを、バイオセンサーチップ中に投入し、その後ＨＢＳで洗浄し、そして最後に、チップを１００ｍＭの塩酸で再生した。ヒトＩｇＧの混合条件は、希釈緩衝液としてＨＢＳを使用した以外は、実施例（３−３）  で示したＨＰＬＣによる分析の場合と同一とした。
【００７６】
その結果を図２０に示す。すなわち図２０は、ＩｇＧを加えた場合と加えない場合について、ＨＥＬのＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰとの会合、並びに生じた複合体の解離を、ＢＩＡコアシステムを使用して分析した際に得られた共鳴センサーの結果を示す図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。これらのデータに基づいて、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ  の値を計算した。その結果を表６に示す。すなわち表６は、ＢＩＡコアシステムにより測定したＦｖフラグメントとＨＥＬの結合に関する動力学的パラメーターを示した表である。
【００７７】
【表６】
0003603966.tif 000008
【００７８】
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰは、ＩｇＧ分子を加えなかった場合、ＢＩＡコアで測定したＫｏｎ及びＫｏｆｆ  の値が、いずれも、実施例（３−２）  で示したＤＴＣ並びにストップト・フロー装置で測定した値より１０倍程度小さかった。こうした見掛上の差は、おそらく、複合体の形成条件の違いに起因するものである。すなわち、ＢＩＡコアシステムの場合には、ＨＥＬは固体支持体に化学的に結合されているのに対し、ＤＴＣ及びストップト・フロー分析の場合には、反応物質は溶液中で遊離していた。こうした違いにもかかわらず、全体としての親和性を反映していると考えられるＫＡ  の値は、互いにほぼ同一であった。Ｋｏｆｆ  の値は、Ｆｖ−ＰとＩｇＧの組合せの場合を除き、いずれの場合にも、総じて抗体の濃度が低いほど小さかった。こうした現象は、ＢＩＡコアシステムを用いた分析に特有のもののようである。固体支持体上に形成した複合体の安定性は、バイオセンサーチップ上の固体支持体に結合させた抗原の物理的条件に左右されるようであった。すなわち抗体の接近可能性は、チップ上で等しく達成されたわけではなかったのである。真のＫｏｆｆ  は、理想的には、濃度をゼロとした地点で測定すべきである。したがって、測定値はすべて、経験的な予測値であると考えるべきである。
【００７９】
Ｆｖの場合、ＩｇＧを加えても、ＫｏｎにもＫｏｆｆ  にも何ら変化が生じなかった。Ｆｖ−Ｐの場合、ＩｇＧを加えると、Ｋｏｎの値は半分となり、Ｋｏｆｆ  の値が３分の１となった。しかし、Ｆｖ−Ｐの濃度が低い場合、Ｋｏｆｆ  の値は上昇した。この現象は、（Ｆｖ−Ｐ）２  ＩｇＧ複合体が不安定で、その結果、濃度が低いと解離してしまうことに起因すると考えられる。Ｆｖ−ＰＰの場合、ＩｇＧを加えたことがＫｏｆｆ  の減少に及ぼす正の効果が更に明りょうとなった。すなわち、測定を行ったすべての抗体濃度で、Ｋｏｆｆ  の値が３．５倍低かったのである。ＢＩＡコア分析で観察された、（Ｆｖ−Ｐ）２  ＩｇＧ複合体と（Ｆｖ−ＰＰ）３  （ＩｇＧ）２  複合体の間の安定性についてのこの違いは、実施例（３−３）  で示したＨＰＬＣ及びＤＴＣによる分析での結果と符合するものである。このように、（Ｆｖ−ＰＰ）３  （ＩｇＧ）２  複合体は、抗原との結合性に関して安定、かつ多価性であると考えられる。
【００８０】
（３−５）  Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１００μｇ／ｍｌ  ＨＥＬを９６穴プレート（スミコンマルチプレート；スミトモベークライト社）に５０μｌずつ入れ、プレートを４０℃に一晩保った。上清を除去した後、１００μｌの１％ＢＳＡを加え、室温に１時間保った。プレートをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、各ウェルに、５０μｌの一次抗体溶液を加えた。この一次抗体溶液は、ヒトＩｇＧを含有する、あるいは含有しない抗体（Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ）、あるいはヒトＩｇＧのみを段階希釈したものである。
【００８１】
ヒトＩｇＧの混合条件は、希釈緩衝液としてＰＢＳ／Ｔを使用した以外は、実施例（３−３）  で示したＨＰＬＣによる分析の場合と同一とした。
このプレートを室温で４時間保温した。溶液を取除いた後、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。二次抗体として、抗Ｄ１．３抗体をＰＢＳ／Ｔで希釈したものを５０μｌ加えた。室温に４時間保温した後、プレートをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。三次抗体として、ＰＢＳ／Ｔで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧロバ由来抗体、５０μｌを加え、室温で４時間保温した。
ＰＢＳ／Ｔで４回洗浄した後、０．０４％のｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤＡ）、０．０２％のＨ２  Ｏ２  、４８．５ｍＭのクエン酸塩、及びＮａ−  リン酸（ｐＨ５．０）からなる染色用溶液５０μｌを加えた。染色反応を暗室内で室温にて２０分間進行させ、５０μｌの２Ｍ硫酸を加えることにより停止させた。４９２ｎｍでの吸光度を、タイターテック（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）  〔マルチスカン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）、ＭＣＣ社〕によって測定した。その結果を図２１に示す。すなわち図２１はヒトＩｇＧのみのもの（×）と、Ｆｖ（白丸）、Ｆｖ−Ｐ（白四角）、Ｆｖ−ＰＰ（白三角）とＦｖにヒトＩｇＧを加えたもの（黒丸）、Ｆｖ−ＰにヒトＩｇＧを加えたもの（黒四角）、Ｆｖ−ＰＰにヒトＩｇＧを加えたもの（黒三角）を一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．４９２  、横軸は一次抗体濃度（μＭ）を示す。
【００８２】
また同様にして、二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ヒトＩｇＧＦｃフラグメントヤギ抗体（カッペル社、以下抗ヒトＦｃ抗体と略す）に変えて二次抗体の洗浄後発色させた。この場合、ＨＥＬに結合した一次抗体中にヒトＩｇＧが含まれているかを調べることとなる。
その結果を図２２に示す。すなわち図２２は、図２１と同様のものを一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．４９２  、横軸は一次抗体濃度（μＭ）を示す。
【００８３】
これらＥＬＩＳＡの結果は、プロテインＡから誘導した部分が、第１のヒトＩｇＧ分子ばかりでなく、第２及び第３の抗体にも結合した可能性があったので、得られたデータの解釈は多少複雑なものとなった。しかし、いずれの場合にも、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰを単独で使用した場合より、Ｆｖ−ＰとＩｇＧとの混合物、並びにＦｖ−ＰＰとＩｇＧとの混合物を用いた場合の方が検出の感度が高いことは明らかであった。更に、等しいＯ．Ｄ．４９２  の値を示す第１抗体の濃度を比較したところ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧとの混合物を用いた場合の検出の感度は、Ｆｖを単独で用いた場合の検出の感度より一桁以上高かった。
【００８４】
図２２に示すように、第２抗体として抗Ｆｃ抗体を使用したＥＬＩＳＡでは、ＩｇＧを加えた場合に感度が上昇することが明らかに観察された。ＩｇＧを加えなかった場合には、Ｆｖ−ＰもＦｖ−ＰＰもシグナルを示さなかったのである。以上述べてきたごとく、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰをＩｇＧと混合したものは、ＥＬＩＳＡに用いる反応物質として有用である。
【００８５】
（３−６）  Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体を用いたウェスタンブロッティング
０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２５μｇ、０．０６２５μｇのＨＥＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、セミドライブロッターを用いてＰＶＤＦ膜にブロッティングした。この膜を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ／Ｔに室温で１時間浸してブロッキングした。一次抗体としてＰＢＳ／Ｔで希釈した１０ｍＭのＦｖ、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰを使用した。室温で４時間保温後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。抗Ｄ１．３抗体を含有するＰＢＳ／Ｔに浸し、室温に４時間保ち、そしてＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。この膜を、更に、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体を含むＰＢＳ／Ｔに浸し、室温に４時間保った。ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄した後、ＥＬＣウェスタン  ブロッティングシステム（アマシャム社）を用いて検出した。
【００８６】
その結果を図２３に示す。すなわち図２３は、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰを一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＨＥＬ〔０．５μｇ（１）  、０．２５μｇ（２）  、０．１２５μｇ（３）  、０．０６２５μｇ（４）  〕のウェスタン  ブロッティングの結果を示した図である。
【００８７】
また同様にして、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体としてウェスタン  ブロッティングをした。
すなわち、実施例（３−３）  で示したＨＰＬＣの分析で用いた複合体をＰＢＳ／Ｔで１０００倍希釈したもの（Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ濃度として１０ｎＭ）を一次抗体として用いた。
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ヒトＦｃ抗体を用いた。
二次抗体洗浄後ＥＣＬウェスタン  ブロッティングシステムを用いて検出した。その結果を図２４に示す。すなわち図２４は、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体として、抗ヒトＦｃ抗体により検出したＨＥＬ〔０．５μｇ（１）  、０．２５μｇ（２）  、０．１２５μｇ（３）  、０．０６２５μｇ（４）  〕のウェスタン  ブロッティングの結果を示した図である。
【００８８】
これらウェスタン  ブロッティングの結果をまとめると、第２抗体として抗Ｄ１．３抗体を使用した場合、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰはＦｖより強い信号を示した。第２抗体として抗Ｆｃ抗体を使用した場合、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰのＩｇＧとの複合体は、予想どおり、更に強い信号を示した。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により提供される遺伝子を用いることにより、目的抗原に対して高アフィニティーの抗体分子をコードする遺伝子の選抜が容易となり、選抜された高アフィニティー抗体を含有するモノクローナル型の多価人工抗体の製造方法も提供される。目的抗原に対してアフィニティーを示す抗体分子をコードする遺伝子群を用いれば、ポリクローナル型の多価人工抗体の作製も容易であり、これらの多価人工抗体は、抗原精製、抗原測定、診断等の分野で有用である。
【００９０】
【配列表】
【００９１】
0003603966.tif 000009
【００９２】
0003603966.tif 000010
【００９３】
0003603966.tif 000011
【００９４】
0003603966.tif 000012
【００９５】
0003603966.tif 000013
0003603966.tif 000014
【００９６】
0003603966.tif 000015
【００９７】
0003603966.tif 000016
【００９８】
0003603966.tif 000017
【００９９】
0003603966.tif 000018
【０１００】
0003603966.tif 000019
【０１０１】
0003603966.tif 000020
【０１０２】
0003603966.tif 000021
【０１０３】
0003603966.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭ１３ＦｖのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＥｃｏＲ  Ｉ挿入断片とその付近の概略図。
【図２】線状ファージＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、Ｍ１３Ｋ０７をサルコシル処理した時にファージコートタンパク質に残存するＦｖフラグメント由来ポリペプチドを比較した図。
【図３】線状ファージＭ１３Ｆｖ表面に発現されているＦｖフラグメント由来ポリペプチドを比較定量した図。
【図４】ファージＭ１３Ｋ０７サルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図５】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図６】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図７】ファージＭ１３Ｋ０７をサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図８】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図９】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１０】ファージＭ１３Ｋ０７をサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１１】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１２】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１３】ファージをＨＥＬ固定化センサーチップに投入後、抗Ｍ１３ファージ抗体をさらに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１４】ファージを抗Ｄ１．３抗体固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１５】アフィニティ樹脂により精製されたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した図。
【図１６】Ｆｖ−ＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図。
【図１７】Ｆｖ−ＰＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図。
【図１８】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ及びこれらのＩｇＧ混合物のＨＰＬＣによる分析結果を示した図。
【図１９】Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ複合体の変性条件下ＨＰＬＣによる分析結果を示した図。
【図２０】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを、ＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図２１】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図。
【図２２】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図。
【図２３】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰを一次抗体として、抗Ｄ１．３抗体により検出したウエスタンブロッティングの結果を示した図。
【図２４】Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したウエスタンブロッティングの結果を示した図。
【図１】
0003603966.tif 000024
【図２】
0003603966.tif 000025
【図３】
0003603966.tif 000026
【図４】
0003603966.tif 000027
【図５】
0003603966.tif 000028
【図６】
0003603966.tif 000029
【図７】
0003603966.tif 000030
【図８】
0003603966.tif 000031
【図９】
0003603966.tif 000032
【図１０】
0003603966.tif 000033
【図１１】
0003603966.tif 000034
【図１２】
0003603966.tif 000035
【図１３】
0003603966.tif 000036
【図１４】
0003603966.tif 000037
【図１５】
0003603966.tif 000038
【図１６】
0003603966.tif 000039
【図１７】
0003603966.tif 000040
【図１８】
0003603966.tif 000041
【図１９】
0003603966.tif 000042
【図２０】
0003603966.tif 000043
【図２１】
0003603966.tif 000044
【図２２】
0003603966.tif 000045
【図２３】
0003603966.tif 000046
【図２４】
0003603966.tif 000047