(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コラーゲン又はトリプシンで変性させたII型コラーゲンを有効成分として含有する経口（経鼻、経腸及び経粘膜を含む）慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項２】
熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たものである請求項１記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項３】
トリプシンで変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、トリプシンを作用させて得たものである請求項１記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項４】
II型コラーゲンが、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サケ、サメ、エイ等の魚類由来である請求項１〜３の何れかに記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。
【請求項５】
酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コラーゲン又はトリプシンで変性させたII型コラーゲンを含有する機能性食品。
【請求項６】
熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たものであり；またトリプシンで変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、トリプシンを作用させて得たものである請求項５記載の機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は経口慢性関節リウマチ治療剤及び機能性食品に関する。より詳細には、変性させたＩＩ型コラーゲンを含有し、慢性関節リウマチの治療・予防に有用な薬剤及び機能性食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，  以下、ＲＡという）は罹患患者の多い慢性疾患の一つであり、結合組織に炎症をきたす全身的な疾患である。当該疾患は、主に関節の滑膜に非特異的炎症を起し、全身の多発性関節炎の病像を呈し、軟骨や骨の損傷をきたす。
ＲＡの発病メカニズムは充分に解析されていないが、リンパ球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ４が関係し、活性化Ｔ細胞が関与する自己免疫疾患であると考えられている（Ｌａｎｃｅｔ  ３４１，  ２８３，  １９９３）。ＩＩ型コラーゲンが軟骨中の主要構造蛋白であることや実験動物にＩＩ型コラーゲンを投与するとリウマチ関節炎と形態的に類似した症状を起すことから、ＩＩ型コラーゲンが本疾患の自己抗原の一つであると考えられている（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １４６，  ８５７，  １９７７；  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５４，  ２６，  １９８６）。
ＲＡに対する治療剤としては、抗リウマチ剤（金塩製剤、Ｄ−ペニシラミン等）、非ステロイド剤、免疫抑制剤などが汎用されているが、これらの薬剤の投与により十分な効果が得られないようなときには、強い抗炎症作用と免疫抑制作用を有しているステロイド剤が用いられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の薬剤によるＲＡの治療は対症療法的であり、根治的な治療法とはいえない。また、ステロイド剤は重篤な副作用を引き起こすおそれがあるので、その使用に際しては十分な注意をはらい、常に減量や使用中止を考慮する必要性のあることが指摘されている。最も望ましいＲＡの治療法は、疾患特異的なメカニズムに基づいて関節の炎症を軽減することであり、使用される薬剤は毒性のないことが望ましい。
このような観点から、免疫寛容に基づくＲＡの治療法が注目されている。免疫寛容とは、ある条件下に抗原で動物を処理しておくと、次にこの抗原で適切な免疫操作を行っても、抗体産生などの免疫応答が起こらない現象であり、免疫寛容を導く物質は免疫寛容原と称される。免疫寛容によるＲＡの治療法としては、ＩＩ型コラーゲン又はその部分配列を有するペプチドを免疫寛容原として用い、このぺプチドを新生児ラットに静脈ないし腹腔内投与すると、ＲＡの発症を抑制することができることが報告されている（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７０，  １９９９，  １９８９；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１，  ５００，  １９９３）。
【０００４】
上記の方法においては、免疫寛容原は静脈ないし腹腔内投与されているが、静脈ないし腹腔内投与による免疫寛容原の投与は煩雑であるのみならず、免疫寛容原のペプチドをＲＡ患者に連続的に静脈ないし腹腔内投与する場合には、ＲＡ患者に重篤なアレルギー反応やショックなどを引き起こすことも想定される。そこで、より簡便で且つ安全な投与方法によるＲＡの治療法が望まれている。
また、医薬品としてのみならず、日常的な食物の摂取を通してＲＡの治療・予防を図ることができればより好ましく、ＲＡの治療・予防を目的とする機能性食品も求められている。
このような観点から、安全性が高く且つ簡便な投与方法によるＲＡの治療法が切望されており、経口免疫寛容によるＲＡの予防・治療が検討されている。経口免疫寛容、ひろくは粘膜免疫寛容は、抗原が経口的に腸管等の粘膜を通って入った場合、その抗原に対して全身の免疫応答が失われる現象であり、経口免疫寛容においては、抗原が経口的に腸管等の粘膜を通じて吸収されるとき、パイエル板、腸管上皮細胞及びこれと隣接するリンパ球、門脈、肝臓などのいろいろの器官と機能による作用を受けるので、アレルギー反応やショックなどを引き起こすことが少なく、アレルギーや臓器移植における免疫抑制療法として試みられている。  また、抗原が経鼻的に投与された場合にも、上記のような消化管粘膜を通じた吸収とともに、気道または肺などの粘膜を通じて吸収がなされるので、その抗原に対しての全身性免疫応答が失われる免疫寛容現象が生じる。
【０００５】
経口免疫寛容によるＲＡの予防に関して、ウシ関節由来未変性ＩＩ型コラーゲンを経口投与（胃内投与）されたマウスにおいて、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の発症が抑制されたことが報告されている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３，  ７４４３，  １９８６）。しかし、この報文では、加熱変性されたＩＩ型コラーゲンでは、ＣＩＡ発症の抑制効果は認められなかったことが記載されている。また、ＩＩ型コラーゲンの経口免疫寛容原性に関し、加熱処理することにより、免疫原性（抗原性又はアレルギー発症能）を低下させることができるが、免疫寛容原性は未変性のものと同程度か又はそれより低下することが報告されている（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ６９，  ６７３−６８３，  １９８２；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．，  １４０，  １４７７−１４８４，  １９８８）。
【０００６】
本発明者等はこの経口免疫寛容に注目し、鋭意研究を重ね、ＩＩ型コラーゲンの加熱変性条件を検討してきた。その結果、上記の報文の記載に反し、熱変性ＩＩ型コラーゲンは経口免疫寛容原として有用であり、ＲＡの発症を抑制できることを見出した。即ち、上記文献に記載の熱変性条件ではコラーゲンの熱変性が不十分であり、更に過酷な条件で熱変性して調製したＩＩ型コラーゲンは未変性ＩＩ型コラーゲンより高い経口免疫寛容原性を有することが判明した。
また、トリプシンでＩＩ型コラーゲンを処理し、得られたＩＩ型コラーゲンの変性物（断片化物）が未変性ＩＩ型コラーゲンより高い経口免疫寛容原性を有することが判明した。
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、ＲＡの予防・治療に有用な経口薬剤及び機能性食品を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
(1)酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コラーゲン又はトリプシンで変性させたII型コラーゲンを有効成分として含有する経口（経鼻、経腸及び経粘膜を含む）慢性関節リウマチ治療剤；
(2)熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たものである上記(1)記載の経口慢性関節リウマチ治療剤；
(3)トリプシンで変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、トリプシンを作用させて得たものである上記(1)記載の経口慢性関節リウマチ治療剤；
(4)II型コラーゲンが、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サケ、サメ、エイ等の魚類由来である上記(1)〜(3)の何れかに記載の経口慢性関節リウマチ治療剤；
(5)酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させたII型コラーゲン又はトリプシンで変性させたII型コラーゲンを含有する機能性食品；
(6)熱変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを６０℃以上で且つ１０分間以上の熱変性を行って得たものであり；またトリプシンで変性させたII型コラーゲンが、II型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（II）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるII型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、トリプシンを作用させて得たものである上記(5)記載の機能性食品；
である。
なお、本発明においては、便宜上、「経口」には、通常の経口の他、経鼻、経腸及び経粘膜も含まれるものとする。
【０００８】
本発明の経口慢性関節リウマチ治療剤及び機能性食品は、熱変性させたＩＩ型コラーゲン又はトリプシンで変性させたＩＩ型コラーゲンを含有することからなる。
一般に、コラーゲン分子は、−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｘ及びＹはアミノ酸残基）の繰り返しからなるアミノ酸約１０００残基（分子量約１０万）のポリペプチド鎖（α鎖）が３本撚り合わされてできている。現在までに発見されているコラーゲン分子の種類は１９種（Ｉ型〜ＸＩＸ型）あり、その内、ＩＩ型コラーゲンは３本のα１（ＩＩ）型ポリペプチド鎖で構成され、関節軟骨、椎間板髄核、眼ガラス体などに多く含まれている。
【０００９】
本発明において、原料となるＩＩ型コラーゲンの精製・単離は慣用の方法に準じて行うことができ、例えば、ＩＩ型コラーゲンを含有する生体組織を、ペプシン、プロナーゼなどの蛋白分解酵素を用いて限定分解し、塩分別沈殿法などで精製することにより調製することができる（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １４６，  ８５７−８６８，  １９７７；  Ａｒｔｈｒｉｌｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２２，  １３４４，  １９７９；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２４，  ２９１２，  １９８０など参照）。また、既に市販されているＩＩ型コラーゲンを用いることもできる。ＩＩ型コラーゲンの由来は特に限定されず、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ヒト、サル、ウサギ、マウス、ラット等の哺乳類、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、ヘビ等の爬虫類、マグロ、カツオ、サケ、サメ、エイ等の魚類など由来のコラーゲンが例示される。
更には、上記の各種動物のＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列に関する知見に基づいて化学合成されたＩＩ型コラーゲン、又は遺伝子組換技術により作製されたＩＩ型コラーゲンを用いることもできる。
【００１０】
本発明における熱変性ＩＩ型コラーゲンは、酸性条件下又はアルカリ性条件下にＩＩ型コラーゲンを熱変性することにより調製される。後記実験例に示されるように、かかる熱変性によりＩＩ型コラーゲンは断片化される。
熱変性条件は、加熱温度及び加熱時間により適宜調整し得るが、通常、６０℃以上で且つ１０分間以上の条件が適用され、好ましくは６５℃以上で１５分間以上、より好ましくはオートクレーブ処理（例えば、１２１℃、１５分間程度）が利用される。
【００１１】
酸性条件としては、例えば、クエン酸、酢酸、塩酸などの有機又は無機酸類を用いた溶液が例示され、好ましいｐＨ範囲としては５．５以下、より好ましくは２．０〜４．５が例示される。アルカリ性条件としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンなどの無機又は有機塩基を用いた溶液が例示され、好ましいｐＨ範囲としては９．５以上、より好ましくは１０．０〜１２．０が例示される。
【００１２】
好ましい熱変性条件としては、ＩＩ型コラーゲンの無機酸又は有機酸水溶液を、６５℃以上、好ましくは１００℃程度で、１５分間以上、好ましくは２０分間程度加熱するか；オートクレーブを用いて、１１０℃程度で３０分間以上、好ましくは２〜１０時間程度加熱するか、１２０℃程度で１５分間以上、好ましくは２０分間加熱する方法が挙げられる。
なお、後記実験例に示されるように、かかる熱変性ＩＩ型コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンα１鎖より低分子量の限定分解物を含有している。
【００１３】
本発明における他の変性ＩＩ型コラーゲンは、トリプシンで変性（断片化）させたＩＩ型コラーゲンである。
アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性（断片化）する手段としては、種々の物質及びその切断部位が知られており、それら変性薬剤の市販品を利用することができる。その一例を示せば、次のとおりである（なお、切断部位は↓で示す）。化学薬剤としては、ヒドロキシルアミン：Ａｓｎ↓Ｇｌｙ、蟻酸：Ａｓｐ↓Ｐｒｏ、酢酸：Ａｓｐ↓Ｐｒｏ、ＢＮＰＳ−スカトール：Ｔｒｐ↓、ｏ−ヨードソベンゾ酢酸：Ｔｒｐ↓などが例示できる。酵素としては、キモトリプシン：Ｔｒｐ↓及びＴｙｒ↓及びＰｈｅ↓、コラゲナーゼ：Ｐｒｏ−Ｘ↓Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、エンドプロテナーゼＬｙｓ−Ｃ：Ｌｙｓ↓、トロンビン：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓、トリプシン：Ａｒｇ↓及びＬｙｓ↓などが例示できる。
なお、これらの薬剤は単独または２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、上記の薬剤の使用は常法に準じて行うことができ、また使用量、反応温度等の条件も常法に準じて適宜設定することができるが、ＩＩ型コラーゲンを３０℃以上で且つ１０分間以上加温して、α１（ＩＩ）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるＩＩ型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に上記の薬剤を作用させるのが好ましい。
更に、変性（断片化）後に使用した薬剤を除去又は失活させる場合、当該方法は当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、加熱、透析、限外濾過、イオン交換体処理、ｐＨ調整などが例示される。
【００１４】
かくして熱変性されたＩＩ型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させたＩＩ型コラーゲン（以下、便宜上、これらを合わせて、変性ＩＩ型コラーゲンという）は、そのまま本発明の治療剤又は機能性食品に利用することができ、また慣用のペプチド精製法（例えば、塩析、透析、ゲル濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ等）を用いて精製した後に使用してもよい。また、凍結乾燥などの手段により粉末化して使用してもよい。
【００１５】
上記の変性ＩＩ型コラーゲンは、免疫原性が低減されていると共に、未変性のＩＩ型コラーゲンに比べて免疫寛容原性が向上しているという特長を有する。更に、生体成分であるＩＩ型コラーゲンの変性物であることから、安全性が高いと推定される。これらの点については、後記の実験例に示されるように、変性ＩＩ型コラーゲンを経鼻投与したマウスを未変性ＩＩ型コラーゲンで免疫しても、ＣＩＡの発症率、発症指数及び発症足の割合の上昇が著しく抑制・遅延された。
【００１６】
また、２００μｇのような高投与量で熱変性ＩＩ型コラーゲンを経鼻投与した場合、抗原特異的抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）の産生は抑制されていると共に、炎症性のサイトカインであるＩＦＮ−γの産生も抑制されていた。このような現象は、アナジー（ａｎｅｒｇｙ）又はクローン麻痺として知られている。
また、熱変性ＩＩ型コラーゲンの０．２（又は２もしくは２０）μｇという少量を吸入させた場合、ＩｇＧ１の産生は維持されているが、炎症反応と関係があるとされているＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生が抑制されていた。更に、抗炎症性のサイトカインであるＩＬ−１０の産生が増強されていた。このような状態は、アクティブ・又はバイスタンダー・サプレッションとして知られている。
更に、本発明者等は、本発明の変性ＩＩ型コラーゲンは、加熱処理や薬剤処理により低分子量化すると共にＩＩ型コラーゲン分子の螺旋型立体構造が崩壊した構造を有すると考えている。Ｂリンパ球によって造られる抗体は、ＩＩ型コラーゲンの螺旋状の立体構造を認識して結合するので、本発明者等は、螺旋構造を破壊した変性ＩＩ型コラーゲンは、未変性ＩＩ型コラーゲンに比べて副作用などが少なく、安全であると考えている。
【００１７】
なお、ＩＩ型コラーゲンの変性方法は上記の例に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。例えば、製造工程上で加熱殺菌を必要とする製品（例えば、食肉加工食品、水産加工食品等の食品、牛乳等の乳製品、果汁、茶等の飲料、液状医薬品、経腸輸液等の医薬品など）において、原料に未変性ＩＩ型コラーゲンを添加し、加熱処理により熱変性ＩＩ型コラーゲンを生成させることにより、製品中に熱変性ＩＩ型コラーゲンを含有させてもよい。また、ＩＩ型コラーゲンを含有する原材料（例えば、家畜などの関節軟骨等）から、熱水抽出法により熱変性ＩＩ型コラーゲン含有物（例えば、スープ等）を調製することもできる。
【００１８】
本発明のＲＡ治療剤は、上記の変性ＩＩ型コラーゲンを有効成分とするものであり、ＲＡの治療・予防を目的として経口投与（経鼻投与、経腸投与及び経粘膜投与をも含む）される。
投与に際しては、有効成分を経口投与に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与され、このような製剤としては、例えば、経口剤（例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤など）、吸入剤、坐薬、経腸輸液等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
本発明のＲＡ治療剤において、有効成分の投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定されるが、例えば、１日当り０．０５μｇ〜５ｇ／ｋｇ体重程度とされ、１日数回に分けて投与してもよい。
【００１９】
また、本発明の機能性食品は、前記の変性ＩＩ型コラーゲンを含有することからなり、そのまま、又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、ＲＡの治療及び予防に有用な機能性食品（又は食品素材）として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形して食用に供してもよく、また種々の食品（例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、バター、粉乳など）に添加して使用されたり、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲物に添加して使用してもよい。
かかる機能性食品の形態における変性ＩＩ型コラーゲンの摂取量は、年齢、体重、症状、疾患の程度、食品の形態等により、適宜選択・決定され、例えば、１日当り０．０５μｇ〜５ｇ／ｋｇ体重程度とされるが、変性ＩＩ型コラーゲンは多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、それ以上の量を摂取してもよい。
【００２０】
【発明の効果】
前述のように、ＲＡの発病メカニズムはＩＩ型コラーゲンを抗原とする自己免疫疾患であると考えられいる。本発明で用いられる変性ＩＩ型コラーゲンは、高い経口免疫寛容原性を有するので、本発明の治療剤を投与又は本発明の機能性食品を摂取することにより、免疫応答が抑制され、ＲＡの治療及び予防を行うことができる。従って、本発明によれば、ＲＡの予防を図ることができると共に既に発病しているＲＡの治療に利用することができる。更に、経口投与（経鼻投与、経腸投与及び経粘膜投与をも含む）や経口摂取によりＲＡの治療・予防を図ることができ、簡便性且つ安全性に優れる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例及び実験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実験例１
熱変性コラーゲンの調製
ウシ由来ＩＩ型コラーゲンのクエン酸溶液（ｐＨ３．０）を、６５℃で１５分間の加熱又はオートクレーブ中で加熱（１２１℃、１５分間）して変性させ、変性コラーゲンを得た。
以下、便宜上、６５℃で１５分間変性させたＩＩ型コラーゲンを「変性コラーゲンＡ」と、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で変性させたＩＩ型コラーゲンを「変性コラーゲンＢ」と称する。
【００２２】
実験例２
アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で処理することによる変性（断片化）ＩＩ型コラーゲンの調製
ウシ由来ＩＩ型コラーゲンを０．１Ｍ炭酸アンモニウム溶液に分散させ（濃度；１ｍｇ／ｍｌ）、５０℃で３０分間加熱した。これにトリプシン（ＴＰＣＫ−Ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え（ＩＩ型コラーゲンに対して２％）、３７℃１時間作用させた。そして、１２Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨ３．０に調整し、４℃にて１晩放置して酵素反応を停止させた。その後に、限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３、アミコン社製）を行い、ＩＩ型コラーゲンの未切断物及びトリプシンを取り除いて、酵素で変性（断片化）したＩＩ型コラーゲンを調製した。以下、便宜上、上記に準じてトリプシンで変性したＩＩ型コラーゲンを「変性コラーゲンＣ」と称する。
【００２３】
実験例３
ＣＩＡ（コラーゲン誘導性関節炎）発症抑制試験（１）
▲１▼方法
ＤＢＡ／１系マウスに免疫７日前にウシ由来変性コラーゲンＡ、Ｂ及びＣの１０ｍＭクエン酸溶液（コラーゲン含量：２００μｇ）を鼻腔より麻酔下にて吸入させた。０日目に未変性ＩＩ型コラーゲンとフロインド完全アジュバントで免疫し、更に２１日目に未変性ＩＩ型コラーゲンとフロインド不完全アジュバントで追加免疫して、ＣＩＡを発症させた。なお、比較例及び対照として、上記の変性コラーゲンに代えて、未変性ＩＩ型コラーゲン２００μｇ（比較例）、１０ｍＭクエン酸（対照）を吸入させた。
▲２▼結果
各群のＣＩＡ発症日数を比較し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｕ検定を行った。その結果を表１に示す。表１に示されるように、未変性ＩＩ型コラーゲンでは免疫寛容現象は認められないが、変性コラーゲンＡ、Ｂ及びＣにおいてはＣＩＡの発症が遅延し、明確な免疫寛容が認められた。また、オートクレーブを用いて過酷な条件下に変性を施された変性コラーゲンＢの方が、また５０℃で３０分間加温し、α１（ＩＩ）型ポリペプチド鎖の３本が撚り合わさってなるＩＩ型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解きほぐした後に、アミノ酸配列のうちアルギニン及びリジンのＣ末端を特異的に認識し、切断するトリプシンを作用させて得られた変性コラーゲンＣの方が、変性コラーゲンＡよりも免疫寛容原性は強いことが判明した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
実験例４
ＣＩＡ発症抑制試験（２）
▲１▼方法
ＤＢＡ／１系マウスに免疫３１日前から１日前までトリ由来変性コラーゲンＡ及びＢの凍結乾燥粉末を餌と混合（４％）して給餌した。ＣＩＡの発症は実験例２と同様な方法で行った。なお、比較例及び対照として、上記コラーゲンに代えて、未変性ＩＩ型コラーゲン（比較例）及びカゼイン（対照）を同量餌に混合して給餌した。
▲２▼結果
各群のＣＩＡ発症率（％）を観察日ごとに比較し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｕ検定を行った。その結果を図１に示す。なお、ＣＩＡ発症率（％）は、各マウスの四肢において、少なくとも関節炎評価１以上の肢を一つでも認めるとき、これを関節炎マウスとみなし、この関節炎マウス匹数を各群マウス匹数で割ったものをＣＩＡ発症率（％）とした。
図１に示されるように、未変性ＩＩ型コラーゲン、変性コラーゲンＡ及びＢにおいて有意（ｐ＜０．０１）にＣＩＡの発症が抑制され、明確な免疫寛容が認められた。また、未変性ＩＩ型コラーゲンよりも変性コラーゲンＡの方が免疫寛容原性は強く、更にオートクレーブを用いて過酷な条件下に変性を施された変性コラーゲンＢの方が変性コラーゲンＡよりも免疫寛容原性が強いことが判明した。
【００２６】
実験例５
変性ＩＩ型コラーゲン経鼻投与によるＣＩＡ発症抑制試験（投与量の影響）
▲１▼方法
ＤＢＡ／１系マウスに免疫７日前にウシ由来変性コラーゲンＢの０．２、２、２０及び２００μｇ（何れも１０ｍＭクエン酸溶液）を鼻腔より麻酔下にて吸入投与した。０日目に未変性ＩＩ型コラーゲン（２００μｇ）とフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）で免疫し、更に２１日目に未変性ＩＩ型コラーゲン（２００μｇ）とフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）で追加免疫して、その日以降のＣＩＡ発症の様子を観察した。なお、対照として、上記の変性コラーゲンＢに代えて、１０ｍＭクエン酸のみを吸入させた。
【００２７】
▲２▼結果
試験結果を図２及び図３に示す。図２は発症指数の変化を示し、ここで発症指数とは、関節炎の症状（足の腫れ）を常法に従って各足ごとに０〜３までの評点で評価し、各マウスについて４足の評点を合計して合計点を求め、各マウスの合計点の平均値をとったものである。また、図３は発症足の割合（％）であり、関節炎を発症した足を合計し、全体の足の数で除して得た割合である。
図２及び図３に示されるように、対照（即ち、変性コラーゲンＢを事前に経鼻投与せずに、０日目及び２１日目に未変性ＩＩ型コラーゲンで免疫した試験群）では、追加免疫直後から経時的にＣＩＡの発症指数及び発症足の割合が上昇した。
それに対して、変性コラーゲンＢを２００μｇ吸入させた場合には、対照に比べて明らかに、ＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇は著しく抑制、遅延された。この抑制傾向は、２０及び２μｇの変性コラーゲンＢを吸入させた場合にも、用量依存的に認められた。
また、０．２μｇの変性コラーゲンＢを吸入させた場合には、２００μｇを吸入させた場合と同程度に、ＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇が著しく抑制、遅延された。
【００２８】
実験例６
変性ＩＩ型コラーゲン経鼻投与が血清中の抗ＩＩ型コラーゲン抗体価（サブクラス）に及ぼす影響
本試験では、変性ＩＩ型コラーゲン経鼻投与が抗体（サブクラス）プロファイルに及ぼす影響を調べた。即ち、ＩｇＧのサブクラスＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂはそれぞれ炎症反応に不可欠な補体との結合能があるので、関節炎の症状と関係があるとされている。
また、ＩｇＧ２ａの産生は、関節炎発症中の関節滑膜中に多く存在するＴ細胞（Ｔｈ１タイプ）の産生するＩＦＮ−γとも密接な関係がある。すなわち、特定の抗原に対する血清中のＩｇＧ２ａ産生量の低下は、当該抗原に対するＴｈ１タイプの反応が全身性に低下していることを示唆するものと考えられている。
【００２９】
▲１▼方法
供試血清の採取
上記実施例５の実験に平行して、免疫後２８日目（即ち、追加免疫後７日目）に試験マウス及び対照マウスから採血し、血清を採取した後、下記の方法で抗ＩＩ型コラーゲン抗体価（サブクラス）を測定した。
ＥＬＩＳＡによるＩｇＧサブクラスの測定
プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ製）に未変性ＩＩ型コラーゲン（５μｇ／ウエル）を吸着させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後に、適宜希釈したマウスの血清を加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後にアルカリフォスファターゼ標識したウサギ抗マウス抗体（抗マウスＩｇＧ１、抗マウスＩｇＧ２ａ、又は抗マウスＩｇＧ２ｂ、何れもＺＹＭＥＤ製）を加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後に基質溶液（パラニトロフェノール２リン酸、東京化成製）を加えた。３０分間放置後、５Ｎ  ＮａＯＨを加えて、反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果を図４に示す。
【００３０】
▲２▼結果
対照（即ち、変性コラーゲンＢを事前に経鼻投与せずに、０日目及び２１日目にＩＩ型コラーゲンで免疫した試験群）では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが産生されていた。その結果は、図２及び３に示すＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇と対応していた。
それに対して、変性コラーゲンＢ  ２００μｇを吸入させた場合には、対照に比べて明らかに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生が抑制されていた。その結果は、図２及び３に示すＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇の抑制と対応していた。
また、変性コラーゲンＢ  ２０、２又は０．２μｇを吸入させた場合には、対照に比べて、ＩｇＧ１の産生は抑制されていなかった。一方、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生は、対照に比べて抑制されていた。特に、０．２μｇを吸入させた場合のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生の抑制の程度は、２００μｇを吸入させた場合と同程度であり、図２及び３に示すＣＩＡの発症指数及び発症足の割合の上昇の抑制と対応していた。
これらのことから、変性コラーゲンＢの２０、２又は０．２μｇ（特に、０．２μｇ）の投与は、補体との結合能から、関節炎の症状に関与するとされるＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの産生を抑制するという効果を奏する。さらには、変性コラーゲンＢの２０、２又は０．２μｇの投与は、ＩｇＧ１の産生能自体は抑制しないので、外来異物を認識し排除する機能を有する抗体産生能自体を抑制することはないという効果を奏する。
【００３１】
実験例７
変性ＩＩ型コラーゲンを経鼻投与したマウスより分離したリンパ球の産生するサイトカイン（変性ＩＩ型コラーゲン刺激の影響）
本試験では、炎症と関連するとして知られているサイトカイン（ＩＦＮ−γとＩＬ−１０）を測定し、変性ＩＩ型コラーゲン刺激の影響を調べた。
なお、ＴＧＦ−βやＩＬ−１０は抗炎症性（抑制性）のサイトカインとして知られており、実際のＲＡにおいても重要な免疫学的調節機能を果たすとも報告されている（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９，  １５６１７−１５６２７，  １９９４）。
【００３２】
▲１▼方法
リンパ球の分離と培養
前記実験例５の実験と同様に、ＤＢＡ／１系マウスに免疫７日前にウシ由来変性コラーゲンＢの０、０．００２、０．０２、０．２、２、２０及び２００μｇを鼻腔より麻酔下にて吸入させた。そして、０日目に未変性ＩＩ型コラーゲン（１００μｇ）とフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）をマウス足蹠部に免疫した。
そして、１０日目に、膝下リンパ節を摘出し単一細胞懸濁液を調製し、９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ製）に播腫した（１×１０６／ウエル）。各ウエルに無血清培地（Ｘ−ｖｉｖｏ２０、ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ製）を加え、さらにＩＩ型コラーゲン（最終濃度；５００μｇ／ｍｌ）を加え、５％ＣＯ２条件下で３日間培養し、培養上清を得た。
同様に、ＩＩ型コラーゲンを添加せずに培養し、又はＩＩ型コラーゲンを添加せずにコンカナバリンＡ（最終濃度；５μｇ／ｍｌ）を添加して培養し、それぞれの培養上清を得た。なお、コンカナバリンＡはＴ細胞のマイトージェンであり、全てのＴ細胞に抗原非特異的に刺激を与えるため、陽性対照として用いた。
【００３３】
サンドイッチＥＬＩＳＡによるサイトカインの測定
プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ製）に抗マウスサイトカイン・ラット単クローン抗体（抗マウスＩＬ−１０抗体：ＪＥＳ５−２Ａ５、抗マウスＩＦＮ−γ抗体：ＲＡ−６Ａ２、いずれもＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ製）をコーティング（５０μｌ／ウエル）し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、３％ＢＳＡ加ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにてブロックした。そして、適宜希釈した上記の培養上清を加えた。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて洗浄した後に、ビオチン標識した抗マウスサイトカイン・ラット単クローン抗体（抗マウスＩＬ−１０抗体：ＳＸＣ−１、抗マウスＩＦＮ−γ抗体：ＸＭＧ１．２、いずれもＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ製）を加えた。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後に、アビジン化アルカリフォスファターゼ（ＺＹＭＥＤ製）を加えた。更にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後に基質溶液（パラニトロフェノール２リン酸、東京化成製）を加えた。６０分間放置後、５Ｎ  ＮａＯＨを加えて、反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０の産生量を測定した。対照（変性コラーゲンＢ投与量０）に対するＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０の産生量の傾向を表２に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
▲２▼結果
培地にコンカナバリンＡを添加した場合（陽性対照）には、マウスより採取したリンパ球の均一な増殖が観察された。一方、ＩＩ型コラーゲンを培地に添加した場合には、コラーゲンに反応するリンパ球がコロニーを形成して増殖した。このコラーゲン反応性のリンパ球におけるサイトカイン産生を測定したところ、次のような結果が得られた。
ＩＦＮ−γについては、変性コラーゲンＢの２００μｇを吸入させたマウスより採取したリンパ球をＩＩ型コラーゲンとともに培養した場合には、変性コラーゲンＢを吸入させなかったマウス（対照）より採取したリンパ球を同様に培養した場合に比べて、炎症を増悪させるＩＦＮ−γの産生が抑制されていた。
ＩＬ−１０については、変性コラーゲンＢの０．００２、０．０２、０．２又は２μｇを吸入させたマウスより採取したリンパ球をＩＩ型コラーゲンとともに培養した場合には、変性コラーゲンＢを吸入させなかったマウス（対照）より採取したリンパ球を同様に培養した場合に比べ、抗炎症作用を有するＩＬ−１０の産生が促進されていた。特に、変性コラーゲンＢの０．２又は０．０２μｇを吸入させたマウスより採取したリンパ球をＩＩ型コラーゲンとともに培養した場合には、ＩＬ−１０の産生が促進されていた。
【００３６】
実験例８
熱変性物の検討
熱変性物の性状を検討するために、１０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ３．０）に、トリ由来ＩＩ型コラーゲンを０．１、０．３及び１．０％となるように溶解し、６５℃２０分間、１００℃２０分間及びオートクレーブ（１２０℃２０分間）の加熱変性を行い、得られた変性液を電気泳動に付した。その結果を図５に示す。図５において、Ａはオートクレーブ（１２０℃２０分間）処理コラーゲン、Ｂは１００℃２０分間処理コラーゲン、Ｃは６５℃２０分間処理コラーゲン、Ｄは未変性のコラーゲンを示し、各サンプルの３つのレーンは左側から０．１、０．３及び１．０％のコラーゲン濃度である。また、左右両端のレーンは分子量マーカーである。
図５に示されるように、未変性ＩＩ型コラーゲンはα１鎖（ＭＷ：１００，０００）のみから構成されているが、加熱変性により低分子量成分が増加し、１００℃２０分間及びオートクレーブ（１２０℃２０分間）の加熱変性を行った場合には、α１鎖は消失していた。このことから、限定分解された低分子成分が免疫寛容原として作用していることが示唆された。
ウシ由来ＩＩ型コラーゲンについて、同様な実験を行ったところ、図５と同様な電気泳動パターンが得られた。
また、ウシ由来変性コラーゲンＣについて、同様な電気泳動実験を行ったところ、αｌ鎖が消失するとともに、オートクレーブ（１２０℃、２０分間）処理物よりも更に低分子化され、分子量１０，０００以下の成分として検出された。このことから、限定分解された低分子成分が免疫寛容原として作用していることが示唆された。
【００３７】
実験例９
実験例１におけるクエン酸溶液に代えて水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ１１．０）を用いる以外は実験例１と同様にして熱変性を行い、熱変性ＩＩ型コラーゲンを調製した。
【００３８】
実施例１
ウシ由来変性コラーゲンＡ        ０．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム        ５    ｍｇ
コーンスターチ                ２０    ｍｇ
乳糖                        １７４．５ｍｇ
常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型し、錠剤を得た。
【００３９】
実施例２
ニワトリ由来変性コラーゲンＢ    ０．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム        ５    ｍｇ
乳糖                        １９４．５ｍｇ
常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬カプセルに充填し、カプセル剤を得た。
【００４０】
実施例３
ウシ由来変性コラーゲンＣ        ０．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム        ５    ｍｇ
乳糖                        １９４．５ｍｇ
常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬カプセルに充填し、カプセル剤を得た。
【００４１】
実施例４
天然果汁（濃縮果汁還元）に、ウシ由来変性コラーゲンＢを天然果汁２００ｍｌ当り０．５ｍｇの割合で混合した後、常法に準じて殺菌し、アセプティック包装して、果汁製品を得た。
【００４２】
実施例５
ウインナソーセージ用練り肉に、ウシ由来変性コラーゲンＢを当該練り肉１５ｇ当り３０μｇの割合で混合した後、常法に準じてソーセージケーシングに充填し、燻煙し、殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得た。
【００４３】
実施例６
ウシ由来変性コラーゲンＢに代えて、ウシ由来変性コラーゲンＣを用いる以外は実施例４と同様にしてウインナソーセージを得た。
【００４４】
実施例７
ニワトリ胸骨軟骨（通称、ヤゲン軟骨）１５０ｇに水１０００ｍｌを加え、タマネギ、ニンジン、パセリ、セロリ、ショウガなどの香味野菜、及び粒コショウを加えて、煮立て、弱火にて３時間加熱した。冷却後、ストレーナーで濾過し、塩、コショウで調味し、トリスープを得た。
なお、同スープについて、電気泳動実験を行ったところ、図５のＢと同様の泳動像が観察された。また、抗トリＩＩ型コラーゲン・ウサギ抗体を用いて、ウエスタン  ブロッティング実験を行ったところ、染色像が観察された。これらのことから、当該トリスープ中には、変性ＩＩ型コラーゲンが含有されていることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例４におけるＣＩＡの発症率を示す図である。
【図２】実験例５におけるＣＩＡの発症指数を示す図である。
【図３】実験例５におけるＣＩＡの発症足の割合を示す図である。
【図４】実験例６における、ＩＩ型コラーゲンに対する抗体のサブクラス別の抗体産生量を示す図である。
【図５】実験例８におけるＩＩ型コラーゲン熱変性物の電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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