(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性状を示すε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素。
１．作用：ε−ポリ−Ｌ−リシンをエンド型に加水分解し、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを生成する。
２．基質特異性：ε−ポリ−Ｌ−リシンを分解し、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを遊離するが、α−ポリ−Ｌ−リシンには作用しない。
３．至適反応条件：至適ｐＨはｐＨ７．５であり至適温度は５５℃である。
４．安定条件：安定ｐＨ範囲はｐＨ７〜１１であり安定温度範囲はｐＨ７．０で１０分間加熱した時、４０℃まで安定である。
５．分子量：高速液体クロマトグラフィーで測定した分子量は約３６，０００である。
【請求項２】
クリセオバクテリウム・グループＩＩｂに属するε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素生産菌を培養して、ε−ポリ−Ｌ−リシンを加水分解し低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを生成する酵素を培養液中より採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素の製造法。
【請求項３】
ε−ポリ−Ｌ−リシンを請求項１記載の酵素で加水分解することにより低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方法。
【請求項４】
重合度が２０以上のε−ポリ−Ｌ−リシンを請求項１記載の酵素で加水分解することにより、重合度が２〜１９であるε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はクリセオバクテリウム・グループＩＩｂに属する微生物を培養して、培養液中より得られるε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素、その製造法、及びε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素を利用した低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε−ポリ−Ｌ−リシンはグラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌等、各種の菌株に対し静菌作用があり、食品保存料として様々な食品の日持ち向上に利用されている。食品は多種多様なので、食品の置かれている環境によっては、ε−ポリ−Ｌ−リシンの通常量の添加では効果が出ないことがある。そのときは大量に添加する必要があるが、それによって食品の風味が損なわれることが多い。特開平４−２８７６９３号公報には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生する中性プロテアーゼでε−ポリ−Ｌ−リシンを処理するとε−ポリ−Ｌ−リシンが加水分解され、その加水分解物を食品に添加した場合、無処理のε−ポリ−Ｌ−リシンを添加した場合と比較して、えぐ味が改善されることが記載されている。しかし、アスペルギルス属菌の産生する中性プロテアーゼは基質特異性が広く、食品に直接添加された場合は食品成分由来の蛋白に作用し、風味、触感が著しく変化する恐れがある。そこで、ε−ポリ−Ｌ−リシンに特異的に作用する分解酵素が求められていた。
【０００３】
食品中のε−ポリ−Ｌ−リシンの量を測定するさいは、従来からメチルオレンジ法、高速液体クロマトグラフィー等が用いられているが、食品成分の除去が困難で煩雑であった。ε−ポリ−Ｌ−リシンに特異的に作用する酵素があれば、それを用いて食品から容易にε−ポリ−Ｌ−リシンを定量できる測定方法が開発できることが期待された。
また、ε−ポリ−Ｌ−リシンを蛋白水溶液に添加するとゲル化するなどの作用がある。そのさい添加するε−ポリ−Ｌ−リシンの分子量によって、生成するゲルの物性が異なることが知られている。そこで、蛋白に作用せず、ε−ポリ−Ｌ−リシンにのみ作用する分解酵素が望まれていた。
その他、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンは未知の生理活性を有し、多方面の利用が期待できる。
これらの理由から、ε−ポリ−Ｌ−リシンに基質特異性の高い加水分解酵素が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はε−ポリ−Ｌ−リシンに基質特異性の高い加水分解酵素を提供すること及びこの酵素を用いて低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる課題を解決するために、広く自然界よりε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素生産能を有する微生物を探索した。その結果、新たに土壌より分離された菌（ＯＪ−７株）が、ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素を培養液中に生産することを見いだした。また、この酵素を利用することによりε−ポリ−Ｌ−リシンを効率よく製造できることを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
本発明において用いられる菌株であるＯＪ−７株の菌学的性状は以下のとおりである。
（培養所見）
肉汁寒天平板で２４時間３０℃で培養したコロニーの形態は、直径１ｍｍ以下の円形、全縁で、低い凸状、黄色、半透明、なめらかで光沢があった。グラム陰性の短かん菌で芽胞形成及び運動性がなかった。カタラーゼ及びチトクロームオキシダーゼ活性が陽性で、グルコースＯＦ試験の成績が酸化的で陰性であった。また、本菌株は３７℃及び４１℃で弱い生育を示し、４５℃では生育が認められなかった。
【０００７】
（生化学的特徴）
３０℃で４８時間生育した時、ＮＯ３還元，インドール産生、グルコースからの酸の産生及びアルギニン・ジヒドロラーゼ活性が陰性、ウレアーゼ、エスクリン加水分解及び硝酸の産生が陽性、βーガラクトシダーゼ活性及びリンゴ酸の資化性が弱い陽性、グルコース、アラビノース、マンノース、マルトース、グルコン酸、クエン酸及びフェニル酢酸の資化性が陽性、マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、カプリン酸及びアジピン酸の資化性が陰性を示した。
３０℃で７日間生育した時、色素産生、スターチ加水分解、カゼイン加水分解、ＤＮａｓｅ活性、α−グルコシダーゼ活性及びバリン・アリルアミダーゼ活性が陽性、硫化水素産生、インドール産生及び、α−ガラクトシダーゼ活性が陰性を示した。
これらの性状から、本菌株をクリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）グループＩＩｂと同定した。本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ    Ｐ−１５００４として寄託されている。
クリセオバクテリウムグループＩＩｂが当該酵素の活性を有していることは今までに明らかにされていない。
本菌株より生産されるε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素の酵素学的および理化学的性質について記述する。
【０００８】
１．作用：ε−ポリ−Ｌ−リシンをエンド型に加水分解して、ε結合の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシン（重合度ｎ＝２〜１９）を生成する。
２．基質特異性：ε−ポリ−Ｌ−リシンを分解し、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを遊離するが、α−ポリ−Ｌ−リシンには作用しない。
３．分子量：高速液体クロマトグラフィー法で測定した。分子量は約３６，０００である。
４．温度の影響：至適反応温度は５５℃である。ｐＨ７．０，１０分間の加熱では４０℃まで安定である。
５．ｐＨの影響：至適反応ｐＨはｐＨ７．５である。４℃、６０時間の加熱ではｐＨ７〜１１で安定である。
【０００９】
６．酵素活性測定法：１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を０．１ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌのε−ポリ−Ｌ−リシン水溶液を０．４ｍｌ、生理食塩水０．４ｍｌ及び酵素溶液を０．１ｍｌを入れた試験管を３０℃で保温する。３０分間後、高速液体クロマトグラフィーの展開溶媒を１ｍｌ添加することで反応を停止する。遠心分離で沈澱を除き、上清液の１０μＬを逆相高速液体クロマトグラフィーに供する。展開溶媒はリン酸２水素１ナトリウム１０ミリモル濃度  ＋過塩素酸ナトリウム０．１モル濃度  ＋  オクチルスルホン酸ナトリウム１０ミリモル濃度  ＋  アセトニトリル３７．５％（ｖ／ｖ）の組成のものを用い、毎分１ｍｌの流速で展開する。カラムはＭ＆Ｓパック  Ｃ−１８（４．６  ｘ  １５０ｍｍ）を用いる。２１５ｎｍの波長の紫外線でε−ポリ−Ｌ−リシンの減少を測定する。
本条件下で酵素溶液１ｍｌ当たり１分間で１ｍｇのε−ポリ−Ｌ−リシンを分解する酵素量を１Ｕとする。
【００１０】
本発明の酵素はたとえば以下のようにして製造される。
クリセオバクテリウムグループＩＩｂ  ＯＪ−７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５００４）を培養液で好気的に培養する。この培養液は本菌が生育するものであればいかなるものでも良いが、好ましくはペプトン１．５％（ｗ／ｖ），酵母エキス１．５％（ｗ／ｖ），ショ糖１．０％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ），ｐＨ７．０の組成を持つ培養液を用いる。２５℃から３３℃の温度で２日から５日間の期間培養し、遠心分離機またはフィルターで菌体を除去する。菌体を除去した液に蛋白沈澱剤を添加して培養液中の蛋白を沈澱させる。当該酵素が沈澱し始めない濃度まで蛋白沈澱剤を培養液に加える。生成した沈澱を遠心分離機またはフィルターで除去する。沈澱を除去した液にさらに蛋白沈澱剤を加え、当該酵素の大部分が沈澱し終わるまで続ける。生成した沈澱を遠心分離機またはフィルターで濾過して取り出す。これが粗製の当該酵素である。蛋白沈澱剤としては、当該酵素を失活させないものであればいかなるものでも用いられるが、好ましくは硫酸アンモニウムを用い５０〜８０％飽和濃度の画分を得る。粗製の当該酵素は、必要に応じて、さらにカラムクロマトグラフィー等の手段で精製する。
【００１１】
低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンはたとえば以下のごとく製造される。
原料として用いられるε−ポリ−Ｌ−リシンは重合度が２０以上あればいかなるものでも使用可能であるが、好ましくは和光純薬（株）製のε−ポリ−Ｌ−リシン塩酸塩、チッソ（株）製の５０％（Ｗ／Ｗ）デキストリン粉末、低級脂肪酸グリセライド製剤（商品名：ガードキープ）またはグリシン製剤（商品名：ガードロング）が用いられる。
原料のε−ポリ−Ｌ−リシン塩酸塩をｐＨ７．０〜８．０の緩衝液に溶かす。緩衝液としては当該酵素を失活させないものであればいずれのものでもよいが、好ましくはリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５が用いられる。この溶液に当該酵素の水溶液を加えて混合し、２５℃〜４０℃で２時間インキュベートする。より低い重合度のものを得たいときはインキュベート時間をより長くする。反応液を加熱するか、有機溶媒または高速液体クロマトグラフィーの展開溶媒を加えるかして反応を停止し、変成した当該酵素蛋白を遠心分離機もしくはフィルターで濾過し取り除く。その反応液を逆相液体クロマトグラフィーに供し、重合度２〜１９のε−ポリ−Ｌ−リシンの画分を集める。カラムはＯＤＳ逆相カラムを用いる。展開溶媒は低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンが分離出来るものであればいかなるものでもよいが、好ましくはＡ液：リン酸２水素１ナトリウム１０ミリモル濃度＋過塩素酸ナトリウム０．１モル濃度＋オクチルスルホン酸ナトリウム１０ミリモル濃度、Ｂ液：２倍濃度のＡ液とアセトニトリルを液量で１：１に混合した溶液を使用する。展開はＡ液とＢ液の混合液中において、展開１分後にＢ液の濃度が５０％（Ｖ／Ｖ）から５５％（Ｖ／Ｖ）まで、２５分後に５５％（Ｖ／Ｖ）から７０％（Ｖ／Ｖ）、３５分後に７０％（Ｖ／Ｖ）〜７５％（Ｖ／Ｖ）に直線的に増加する濃度勾配に毎分１ｍｌの流速で溶出させる。２１５ｎｍの波長の紫外線でピークを検出し、目的の重合度のε−ポリ−Ｌ−リシンを得る。溶出液を陽イオン交換樹脂にかけ濃縮し、得られた濃縮液を凍結乾燥、真空乾燥あるいはデキストリン等の多糖類を混ぜてスプレードライする等の手段で粉末状の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンを得る。
重合度の如何を問わないときは酵素反応停止後の液を液体クロマトグラフィーをせず直接、イオン交換樹脂にかけてもよい。
【００１２】
以下、実施例で本発明を説明する。本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
実施例１
ペプトン１．５％（ｗ／ｖ），酵母エキス１．５％（ｗ／ｖ），ショ糖１．０％（ｗ／ｖ），塩化ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ），ｐＨ７．０の組成を持つ培養液１０ＬにクリセオバクテリウムグループＩＩｂ  ＯＪ−７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５００４）を２８℃で３日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離にて取り除き、得られた上清中に５２３Ｕ（２８２１ｍｇ）の当該酵素活性を認めた。この上清液に硫酸アンモニウムを加え、５０〜８０％飽和濃度の粗製の当該酵素の画分３２０Ｕ（６２４ｍｇ）を得た。
【００１３】
上記の粗製の当該酵素６２４ｍｇを０．０１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かし、同じ緩衝液に平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（３００ｍｌ）に吸着させ、０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した画分を０．０１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。その画分８６．４Ｕ（１１５ｍｇ）を同じ緩衝液に平衡化したＤＥＡＥ−セファセルのカラム（サイズ：直径３０ｍｍ，  長さ１００ｍｍ）に吸着させ、０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した活性画分に塩化カリウムを１モル濃度になるように加えた。この画分５５．１Ｕ（６．７ｍｇ）を同じ緩衝液に平衡化したフェニルセファセルのカラム（サイズ：直径３０ｍｍ，  長さ３０ｍｍ）に吸着させ、０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した活性画分を集めた。
この画分を０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＋５０％（ｖ／ｖ）グリセロールで透析し、当該酵素の精製標品を得た。この精製標品は１２．３Ｕで０．９０ｍｇ、比活性が１３．７Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【００１４】
実施例２
和光純薬製ε−ポリ−Ｌ−リシン塩酸塩（分子量２０００〜４０００、重合度２０〜３５）１０ｍｇ／ｍｌ水溶液０．５ｍｌ、０．１モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．１ｍｌ、イオン交換水０．３５ｍｌからなる水溶液に、ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素１．７５Ｕ／ｍｌ水溶液０．０５ｍｌを加えて混合し反応させた。その直後にこの反応液５０μｌを取り出し、この反応液にＡ液２５％、Ｂ液７５％からなる展開溶媒５０μｌを加え遠心分離し、上清１０μｌを逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。カラムは化学品検査協会製Ｌ−カラム（ＯＤＳ）（４．６×２５０ｍｍ）を用いた。展開溶媒としてＡ液：リン酸２水素１ナトリウム１０ミリモル濃度＋過塩素酸ナトリウム０．１モル濃度＋オクチルスルホン酸ナトリウム１０ミリモル濃度、Ｂ液：２倍濃度のＡ液とアセトニトリルを液量で１：１に混合した溶液を使用した。展開はＡ液とＢ液の混合液中において、展開１分後にＢ液の濃度が５０％（Ｖ／Ｖ）から５５％（Ｖ／Ｖ）まで、２５分後に５５％（Ｖ／Ｖ）から７０％（Ｖ／Ｖ）、３５分後に７０％（Ｖ／Ｖ）〜７５％（Ｖ／Ｖ）に直線的に増加する濃度勾配で最終的に７５％（Ｖ／Ｖ）で毎分１ｍｌの流速で溶出させた。２１５ｎｍの波長の紫外線で検出したところ、図１のクロマトグラムを得た。
【００１５】
次に、前記反応液の残りを３０℃で４時間反応させ、反応液５０μｌに上記と同じ展開溶媒０．２ｍｌを加えて上記と同様に遠心分離し、上清１０μｌを同様に逆相高速液体クロマトグラフィーに供し、図２のクロマトグラムを得た。重合度２から２０以下の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンとＬ−リシンのピークが認められ、ε−ポリ−Ｌ−リシンの低分子化が明らかにみられた。また、Ｌ−リシンのピークが極めて低いことから、当該酵素反応の様式はエンド型と推定された。この反応液５０μｌから凍結乾燥にて０．２２ｍｇの重合度２〜１９のε−ポリ−Ｌ−リシンが得られた。
さらに、混合液を２０時間反応させ、反応液５０μｌを取り出し同様に逆相液体クロマトグラフィーに供したところ、図３のクロマトグラムを得た。重合度２から６の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンとＬ−リシンが検出され、重合度７以上のものはほとんど検出されなかった。この反応液５０μｌから凍結乾燥にて０．２１ｍｇの重合度２〜６のε−ポリ−Ｌ−リシンが得られた。
【００１６】
比較例
実施例２のε−ポリ−Ｌ−リシンの代わりにシグマ社製α−ポリ−Ｌ−リシン臭酸塩（分子量４０００〜１５０００、重合度３５〜１３０）を用いて、実施例２に準拠して反応をおこない反応０時間後と２４時間後との反応産物を分析した。反応０時間後のクロマトグラムを図４、２４時間後のクロマトグラムを図５で表した。
反応２４時間後でもクロマトグラムにほとんど変化がみられなかった。これはこの酵素がα−ポリ−Ｌ−リシンに作用しないことを示す。
【００１７】
【発明の効果】
本願発明に関わるε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素はε−ポリ−Ｌ−リシンに基質特異性が高く、ε−ポリ−Ｌ−リシンを加水分解し低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシン及びＬ−リシンを生成する。この酵素は、蛋白の共存下で蛋白を分解することなくε−ポリ−Ｌ−リシンを分解することができる。この性質によって、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンの食品工業を中心として多方面の用途が開ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基質とした反応での反応直後（０時間）の反応液の逆相クロマトグラムである。
【図２】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基質とした反応での反応４時間後の反応液の逆相クロマトグラムである。
【図３】実施例２において、ε−ポリ−Ｌ−リシンを基質とした反応での反応２４時間後の反応液の逆相クロマトグラムである。
【図４】比較例において、α−ポリ−Ｌ−リシンを基質とした反応での反応直後（０時間）の反応液の逆相クロマトグラムである。
【図５】比較例において、α−ポリ−Ｌ−リシンを基質とした反応での反応２４時間後の反応液の逆相クロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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