(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的免疫応答の調節が必要な患者に、抗原に対する該免疫応答を調節するために有効な量の次式：
【化１】
0003574456.tif 000006
（式中、R1及びR2はメトキシカルボニルであり、一方のR3は−CH2CH2COOCH3であり、他方のR3はCH2CH2COOHであり、及びR4はCH＝CH2である。）
で表される緑色ポルフィリンを、該緑色ポルフィリンに吸収される照射の非存在下において、該抗原に対する抗原特異的免疫応答が進行している間に投与して、抗原特異的免疫応答を調節するための医薬組成物。
【請求項２】
前記緑色ポルフィリンをリポソーム組成物として全身的に投与する、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記抗原が自己免疫である請求項１の組成物。
【請求項４】
前記患者が外来組織の受容者である請求項１の組成物。
【請求項５】
前記抗原が乾せんに関連する抗原であり、及び前記投与が局在的投与によるものである請求項１の組成物。
【請求項６】
前記抗原がアレルゲンである請求項１の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は光の非存在下で緑色ポルフィリンを投与することにより免疫応答を調節する分野に関するものである。特異的抗原に対する応答の過程の間に緑色ポルフィリンが投与されたとき抗原特異的免疫応答は調節される。さらには、光の非存在下において緑色ポルフィリンは細胞間伝達を阻害し、このようにして例えばレステノシスの予防又は治療を可能にする。
背景技術
総体として緑色ポルフィリンと称される光ダイナミック療法に用いられる化合物群は米国特許第5,283,255、4,883,790、4,920,143、5,095,030及び5,171,749を含む一連の特許に記載されており、それらの記載は本明細書に援用される。これらの緑色ポルフィリンはヘマトポルフィリンのジールス・アルダー反応及び生じた産物の所望による再転位又は還元を用いることにより調製される。これらの緑色ポルフィリンの特に好ましい形態は、前記出典特許に概要が述べられているが、一酸の形態のベンゾポルフィリン誘導体又は“BPD−MA"と示されている。この薬は現在では様々な腫瘍及びその他の症状の光ダイナミック治療に関して臨床試験中である。
光ダイナミック療法は、投与された光活性化化合物は、この場合は緑色ポルフィリンだが、光非存在下では生理的効果がないという仮定に基づいている。しかしながら、光に照射されたとき化合物の励起状態の形態は局部的毒性効果を及ぼす。そのために例えば腫瘍の治療には正常の細胞から除去された後に腫瘍の細胞に残るというこれらの光活性化化合物の性質が利用されている。化合物が正常の細胞から除かれる前でも新小脈管地帯への局部的光照射が効果的であるということも見いだされている。
本発明によれば、緑色ポルフィリンは光ダイナミック療法（PDT）において光活性化作用物として振る舞う能力とは独立に免疫調節力を持つこと及び細胞間伝達を阻害することが見いだされた。本発明は緑色ポルフィリンの従来予期されていなかったこの特性を利用するものである。
発明の開示
本発明は光照射なしに特定の抗原に関して起きる免疫応答に関与する緑色ポルフィリンの能力を利用するものである。生じる免疫調節は抗原特異的であり、そのことは遅延型の過敏症で得られた結果を使って後に説明される。そのために患者は自己抗原、アレルゲン及びその他に関し、一般的な免疫寛容を生じるという不利益を受けずに、望ましくない応答に対して保護されることができる。さらには、緑色ポルフィリンは後に説明されるように血栓症を引き起こすような細胞間伝達を阻害する。緑色ポルフィリンはまたRGD配列によって特徴づけられる既知のインテグリン類にコンホメーションの類似性を持つことが示されている。このことは望ましくない細胞間伝達によって特徴づけられる症状の予防又は治療のために、緑色ポルフィリンを使用することを可能にする。
このように、一つの観点では、本発明は抗原特異的免疫応答を調節する方法に向けられており、その方法は抗原に対する活性化された免疫応答を経験している患者に、当該抗原に対する前記免疫応答を調節するのに必要な量の緑色ポルフィリンを緑色ポルフィリンが吸収する光の非存在下において投与することからなり、さらに前記投与は当該特異的抗原そのものに対する免疫応答が活性化されている段階の間に行われる。
別の観点では、本発明は患者の中で細胞間伝達を調節する方法に向けられており、その方法はそうした調節を必要とする患者に、細胞間伝達を調節するのに効果的な量の緑色ポルフィリンを、緑色ポルフィリンが吸収する光の非存在下において投与することからなり、前記投与は望ましくない細胞間伝達が生じている間に行われる。
さらに別の観点では、本発明は本発明の方法に有用な緑色ポルフィリンの製剤を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の方法に有益な緑色ポルフィリンの代表的構造を示している。
図２はRGDAに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示している。
図３はRGDBに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示している。
図４はRGDCに代表される形態ファミリーの重ね合わせコンホメーショを示している。
図５はRGDAの代表的な形態にBPD−MAの３次元的構造が重ね合わされたものを示している。
図６はRGDBの代表的な形態にBPD−MAの３次元的構造が重ね合わされたものを示している。
図７はRGDCの代表的な形態にBPD−MAの３次元的構造が重ね合わされたものを示している。
図８はナイーブな、髭をはやしているBalb/cマウスのDTH応答における４個のBPDアナログの影響の比較を示している。
発明の実施の態様
特定の抗原に対する免疫応答が望ましくない非常に多くの実例がある。アレルギー反応、自己免疫反応並びに臓器移植、皮膚組織移植及びそのようなものの免疫拒絶反応がこれらの状況の中で目立っている。本発明の緑色ポルフィリンは、免疫応答が引き起こされる活性段階に投与されたとき効果的であり、したがって、抗原に対する暴露に続く期間に投与されたとき、又はもし免疫応答の活性形態が継続的であるなら、この継続段階で投与されたとき効果的である。
緑色ポルフィリンは自らが吸収する輻射の非存在下で効果を発揮する。この一文は、目標に対して意図的な輻射はなされないことを意味する。最小量のバックグランドの光なはお存在してもよい。前記背景技術の項で述べたように、緑色ポルフィリンは光ダイナミック治療プロトコルで広く用いられてきた。これらのプロトコルでは緑色ポルフィリンを多大な量含むように修飾された細胞又は組織の一群は、緑色ポルフィリン化合物が吸収する波長を含む光で意図的に照射される。緑色ポルフィリンによるこれらの波長の吸収は周囲の物質が害を受ける様な方法で分子の励起を引き起こす。毒性の原因となる励起化合物の崩壊の間に１重項酸素が発生すると仮定される。光活性化薬剤自体は無毒性であると推定されている。
本発明の方法においては励起を生じさせるための照射はプロトコルには含まれていない。しかしながら、全ての光を治療される患者から遮断する必要はない。このようにして、ここで用いられている“緑色ポルフィリンが吸収する輻射の非存在下”という文言は、暗黒ではなくむしろ典型的な周囲環境を意味する。すなわち、緑色ポルフィリンの既知の光ダイナミック効果は本発明の方法では用いられないことを単に意味する。
緑色ポルフィリン
緑色ポルフィリンの性質は、前記背景技術の項で参照した特許に記載されている。簡単に言うと、これらはプロトポルフィリンIXの誘導体であり、置換されたアセチレンとのジールス・アルダー反応を用い、所望により再転位及び／又は還元することにより得られる。このようにして得られる化合物の典型的な式は図１に示されている。図１で示される式の好ましい態様は、環式化合物が図１−３又は図１−４に示される式を持つものであり、及び／又はR1及びR2が各々に独立にカルバルコキシル（２−6C）、アルキル（１−6C）、アリールスルホニル（６−10C）、シアノ及び−CONR5COからなる群から選択されており、R3は各々独立にカルボキシル、カルボキシアルキル（２−6C）若しくは塩、アミド、エステル若しくはアシルヒドラゴネ若しくはアルキル（１−6C）であり、R4はCH＝CH2若しくは−CH（OR4'）CH3であり、ここでR5はアリール（６−10C）又はアルキル（１−6C）を意味し、R4'は水素又は場合により親水性置換基で置換されたアルキル（１−6C）を意味する。もちろん混合物も用いられることが出来る。
特に好ましいものは図１−３及び図１−４の化合物であり、ここでR1及びR2が各々に独立にカルバルコキシル（２−6C）であり、一方のR3はカルボキシアルキル（２−6C）であり、他方のR3はカルボキシアルキル（２−6C）置換基のエステルであり、R4はCH＝CH2又は−CH（OH）CH3である。
さらに特に好ましいものは図１−３に示される化合物であり、ここでR1及びR2はメトキシカルボニルであり一つのR3は−CH2CH2COOCH3でありもう一つのR3はCH2CH2COOHでありR4はCH＝CH2である。この化合物はベンゾヒドロポルフィリン誘導体一酸（benzohydroporphyrin derivative monoacid）の頭文字をとってBPD−MAと呼ばれており、そのジールス・アルダー付加は環Ａで生じている。
治療される状態の性質
緑色ポルフィリンｈと特定の抗原に対する免疫応答が活性化されている期間に脊椎動物患者に投与されたとき、全体的免疫抑制を生じることなしに特定の抗原に対する応答を調節する。もしその患者が投与される免疫原／抗原に対してナイーブであるなら処理のタイミングは促進される。意図的に投与された抗原に対する望ましくない免疫応答が見いだされるのは、例えば皮膚移植又は臓器移植のようなアログラフトを用いた移植術、糖尿病のインシュリン補給に使われるような個々の細胞の移植、及びその他の外科手術又は、患者に意図的に外部からの細胞若しくは組織を注射で導入する事を含む措置においてである。望ましくない免疫応答が意図的に投与された化合物に起きるかもしれないその他の例は、患者の蛋白質に異種の蛋白質が使われる場合も含む。典型的な例には腫瘍治療の際のモニクローナル抗体の投与があげられる。ヒト型の抗体をつくる試みはなされているが、多くの場合、マウス由来のモノクローナル構体が人間の治療に用いられている。そのような抗体に対する望ましくない免疫応答は本発明の方法により調節することができる。これらの例においては一時的免疫応答が活性化され、そして抗原の投与と同時の又は抗原の投与のすぐ後の緑色ポルフィリンの投与は望ましい結果を与える。
免疫応答が外部からの抗原に対し起きる別の例はアレルギー反応によって説明される。これらの応答は一般的には二次的免疫応答であるが、この二次的暴露と同時に又はその後の短期間内に本発明の緑色ポルフィリンを投与することもまた効果的である。
前記の両方の場合において抗原若しくはアレルゲンが投与されると同時に又は抗原に対する活性化応答が必要とされる期間の間に緑色ポルフィリンは投与されるであろう。一般にこの期間は抗原の投与の24時間から48時間の間である。
本発明の方法が適当な患者は、一般に脊椎動物患者であり、好ましくはほ乳類の動物である。しかしながら脊椎動物生物は一般に似た細胞間伝達系を利用しそして類似的方法で免疫応答を構成する。特に好ましい患者は、ヒトの患者と並んで、家畜及び鳥類の患者動物である。正確なプロトコル、投薬量及び剤型はもちろん患者の性質によるであろう。
抗原の投与
緑色ポルフィリンの投与と同時に又はそのごく前に抗原を投与することはアレルゲンの性質に幅広くよるであろう。薬、モノクローナル抗体又は治療若しくは診断のために使われるその他の外来蛋白質といった意図的に投与された抗原の為には、投薬量レベル及び投与の形態は一般に抗原が投与される目的によって調節されるであろう。典型的には、抗原は適宜製剤化された薬剤組成物として従来より入手可能である、また、投薬量レベル並びに投与の予期されるルートはすでに知られている。
同種移植に関しては一般に次のようなことが信じられている；すなわち、予定されている受容者と同じ種の一員からの組織又は臓器を構成する細胞は、心臓、腎臓、肝臓、肺等といった血管化臓器並びに脳下垂体、甲状腺、副腎、上皮小体及び膵臓といった内分泌腺、及び皮膚移植片を含めて、免疫原性は有するものの、移植拒絶を引き起こす主要組織適合性抗原は含まないであろうということである。むしろこれらの抗原は不純物として移植された細胞に含まれる白血球のようなパッセンジャー細胞によって運ばれると信じられている。
このようにして、緑色ポルフィリンの投与は、MHCを有する細胞を含む移植片自体と同時に又はそのすぐ後に実行することができる。あるいは患者を予め保護するために、蛋白質自体として又は組織適合性抗原を有する細胞の表面に含まれた状態で、移植片とは別に投与することもでき、その場合は、緑色ポルフィリンは細胞又は組織適合性抗原の前投与に近い時間に投与される。例えば人間において、組織適合性の主要な決定因子はMHCクラスII抗原群中のHLA−DRと称されている。この因子はサブタイプに副分類されているので、もしドナーのサブタイプが類別されているなら、当該サブタイプのDR抗原を移植片自体より先に緑色ポルフィリンの投与の直ぐ前後に投与することができる。
もし抗原がアレルゲンであるならそのアレルゲンは緑色ポルフィリンと共に又は緑色ポルフィリンの投与のすぐ前に注射によって直接に若しくは経口によって投与することができる。代わりにその投与は自然界での暴露に似せることもでき、例えば患者にアレルギー応答を誘発することが知られている花粉を含む植物の側に患者を置くことができる。患者をこのような環境に置いたとき、緑色ポルフィリンは同時に又はそのすぐ直後に投与される。
もし抗原が自己抗原であるなら抗原の投与を別々に制御することはできない；そのような自己抗原は、リュウマチ性関節炎、多発性硬化症、紅斑性狼蒼、ある種の糖尿病又は一般に自己抗原により引き起こされる炎症性反応を含む多くの状態の原因であると信じられている。この場合、本発明の方法の効果は、内部から供給される自己抗原に対して継続的に活性な免疫応答に依存する。この場合は緑色ポルフィリンは自己免疫病に悩んでいる患者に、望ましくは免疫応答が最も明らかな期間に投与される。
自己免疫応答に関連すると信じられているさらの別の状態は乾癬である。本発明の方法は、特に局所投与を使ってこの症状を治療するために適している。
細胞間伝達
本発明の緑色ポルフィリンは、免疫応答を調節する能力に加えて、おそらくインテグリンに形態が似ている特徴に基づいて、細胞間伝達を阻害することが可能である。後述するように、本発明の緑色ポルフィリンの三次元構造は接着性RGD配列を持つ分子に代表される好ましい形態の三次元構造に似ている。さらには緑色ポルフィリンは、血栓症を阻害することができる、つまりRGDに基づく化合物の既知の能力を持つことが証明されている。それゆえ本発明の方法は、細胞間伝達が患者に好ましくない効果を持つ症状の治療にもまた適している。
一つのそのような例は、手術の後のレステノシス又は血管その他の外傷後のレステノシスの形成である。この目的のために本発明の方法は、このようなストレスへ応答における血栓形式の危険がある外科手術措置の短時間内に行うことができる。投与は、血栓症の原因である細胞間伝達を阻害する効果を得るために、典型的には全身的に、そしてタイミングを測って行われる。
製剤及び投与
本発明の緑色ポルフィリンは小分子の薬に一般に便利な方法で製剤化され及び投与することができ、そのような方法は例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,Easton,PAの最新版で説明されている技術で知られている。製剤組成物は、免疫調節するのに又は細胞間伝達を阻害するのに有効な量の緑色ポルフィリンを含有するであろう。投薬量レベルは投与、製剤化、治療される症状及び患者の性質等の多岐の因子により変化するであろうが、しかしながら、一般的には全身的投与のための緑色ポルフィリンの量は10Tg/kgから100mg/kgまでの範囲であり、好ましくは100Tg/kgから10mg/kgまでの範囲であり、最も好ましくは1mg/kgの近辺である。もし投与が局所的であれば適切な濃度は製剤中の約５パーセントから約95パーセントまでの間、好ましくは約10パーセントから約50パーセントの間である。
全身的投与ルートは、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、その他の注射によることができ、経口投与、適切な助剤を用いる経粘膜又は経皮投与、その他によることもできる。局所的投与はまた座薬又は皮膚用パッチを使う皮膚面又は粘膜面からの手段によって達成されることができ、あるいは緑色ポルフィリンをゲル又は軟こうの形で局在的に用いてもよい。
全身的投与がなされるときリポソーム組成物は特に好ましい。リポソームは標準的方法によって調製されることができ典型的には負に帯電したホスホリピドから調製され、そのようなホスホリピドには、リピド自体及び様々な安定化薬剤と並んでホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトール等が含まれる。リポソームは多重層状又は単層状であってもよく、及び大きさにも幅がありうる。リポソーム組成物内の緑色ポルフィリンの濃度は典型的には１から20パーセントまでの範囲である。
以下の例は本発明の説明のためであり、制限することは意図していない。
実施例１
MBPを抑制されたEAEに対する効果
PLマウスにおける実験的アレルギー脳脊髄炎（EAE）は人間における多発性硬化症に対するモデルとして使われている。この状態はミエリン塩基性蛋白質（MBP）であらかじめ処理したドナーマウスから脾臓細胞を注入することにより誘導されることができる。脾臓細胞は次のようにして得られた。PLマウスはMBP（4mg/ml燐酸バッファーサリン）を等量の完全フロイントアジュバント（不完全フロイントアジュバント中に結核菌H37RA 4mg）中に乳化して調製された混合物0.1mlを投与された。マウスは尻尾の基部に皮下注射された。免疫10日後に脾臓は取り除かれ、そして単体細胞懸濁液に細かく砕かれた。細胞は遠心によってペレットにされ赤血球は0.14M塩化アンモニウム中でリシスによる細胞溶解によって取り除かれた。細胞（４×106/ml）は75平方センチメートルのフラスコ中に５パーセントの胎児の子牛の血清、５×10-5M2−メルカプトエタノール、1mMピルビン酸ナトリウム、20mMヘペス、2mM1−グルタミン、100U/mlペニシリン、100Tg/mlストレプトマイシン及び100Tg/ml MBPを含むRPMI1640培地で培養された。摂氏37度、５パーセント炭酸ガス中で三日間培養された後、培養物は人間の組み換え体インターロイキン−２（rIL−２、50U/ml）でパルス処理され、そしてさらに48時間恒温器に戻された。その後細胞は集められ血清フリーの培地で洗われそして５×107個の細胞がナイーブな同系動物に静脈注射（iv）された。このように処置されたマウスは、典型的には細胞移入後18から25日でEAEを発症した。
四匹のコントロールマウスが先の段落で述べられたように準備され又培養された５×107個の細胞を静脈注射された。19日から30日後四匹中三匹のマウスがEAEに関連する特徴的な麻痺病を発症した。MBP反応Ｔリンパ球が中枢神経を侵すときこの症状が誘発される。しかしながら、実験集団においてはMBPプライム処理され又培養された細胞を同じように注射された四匹のマウスは、24時間後静脈に1.0mg/kgのBPD−MAを投与された。これらのマウスはどれもEAE症状を起さなかった。しかしながら、MBPでプライム処理され又培養された細胞を注射する24時間前に同じ量のBPDを投与されたマウスは、コントロールと同じようなEAEコースを示した。
BPD注射は培養細胞の投与後約24時間以内に投与されたときにのみ効果があったので、BPDは受容動物の内因性の細胞よりむしろ移入され活性化されたＴ細胞に直接に働くことが示される。
この例の第一段落で述べられたように調製された脾臓細胞は、100Tg/mlのMBPで培養されたとき、MBPで特異的で及びMBPによって活性化されるＴ細胞の増大によって増殖応答を引き起こす。この増殖応答を100パーセントとして表し、これに対してMBP非存在下で培養された細胞の増殖応答を０パーセントと表す。細胞が1ng/mlから1Tg/mlの濃度のBPD存在下で培養されるとき増殖は妨げられる。BPD1ng/mlでは増殖はわずか20パーセントであり10ng/mlではそれはゼロまで落ちる。100ng/ml以上では増殖応答はMBP非存在下で培養された細胞にみられるよりも減る。
BPDは用いられる濃度幅では光の非存在下で固有の毒性を持たないことが知られており、そのためにこれらの結果はBPDがMBP特異的Ｔ細胞においてアネルギーを誘発することを示す。
実施例２
DTHにおけるBPDの効果
よく立証された遅効型過敏症（DTH）モデルが用いられた。０日目に無毛系統マウスの鼠けい部地帯にジニトロフルオロベンゼン（DNFB）が塗られた。５日目にDNFBが耳に塗られ、引き続く24時間の間に、抗原特異的Ｔ細胞の共同作用によって、処理された耳の膨張を含む重大な炎症応答を生じさせた。
０日目にDNFBを塗られたマウスは−２日目、−１日目、０日目、＋１日目、＋３日目又は＋４日目に1mg/kgの投薬量でBPD−MAのリポソームを静脈注射した。５日目にマウスの耳をDNFBの塗布によりチェレンジし、そして耳の膨張は24時間後に測定された。処理されていないマウスでは最低限の耳の増大が認められた。BPDの代わりに塩化ナトリウム水溶液を投与されたDNFB感作マウスは、DNFBでのチャレンジの後に強い耳膨張応答を示した。膨張は膨張パーセントつまり
（チェレンジ後の耳の厚さ−チャレンジ前の耳の厚さ）／（チャレンジ前の耳の厚さ）×100
として記録された。
増大はふつうコントロールレベルよりも60から90パーセント上の範囲であった。しかしながら、−２日目、−１日目、０日目、１日目及び３日目にBPDが与えられたとき耳増大はコントロール動物に観測されたものよりも50パーセント少なかった。BPDが４日目に与えられたときDTH応答の抑制は略25パーセントであった。
さらなる実験において、あらかじめDNFBで感作されたマウスは異なる皮膚接触感作剤、つまりオキサゾローンによって処理された。次いでマウスをDNFBとオキサゾローンでチャレンジした。BPDで治療されたマウスはDNFBに対する応答の抑制を示した。しかしながら、オキサゾローンに対する耳膨張の減少はBPDを投与されたマウスでは見いだされなかった。このようにして抗原特異的Ｔ細胞（DNFBに反応を示す）のみがBPDに影響された。BPDで治療された場合でも治療がDNFB感作と同時の場合は、マウスは第二次抗原のオキサゾローンに応答する能力を保持していた。
実施例３
フィブリノーゲン結合へのBPDの効果
血小板はBlood（1987）70:307のShattilらに報告された方法の修正にしたがってトロンビンによって活性化された。簡単に述べると、100Tg/mlのBPDリポソーム又はコントロールを用いて摂氏22度で15分間プレインキュベーションした後、クエン酸加全血液は、摂氏22度で30分間、フィブリン重合抑制剤Gly−Pro−Arg−Pro（終濃度1.25mM）の存在下で、Ｉ−トロンビン（終濃度10U/ml）で処理された。フローサイトメトリーでフルオレセイン標識アンチフィブリノゲンポリクローナル抗体を使ってフィブリノゲンの結合を評価することにより血小板の活性化を測定した。その結果はアンチフィブリノゲンに対して陽性の血小板の百分率として表１に示されている（三回の実験の平均±標準偏差で決定された）。
0003574456.tif 000002
表１で示されているようにトロンビンと一緒に処理されたときアンチフィブリノゲンに陽性な血小板の百分率はBPDが存在しないとき約２パーセントから約86、87パーセントまであがる。しかしながら、100Tg/mlのリポソームBPDが存在するとき活性化のレベルは約三分の二減少する。
実施例４
皮膚他家移植拒絶に対するBPDの効果
MHC不適合マウス間の皮膚移植を含む皮膚他家移植拒絶アッセイはMedewar及びBillingham（1951）の方法によってなされた。コントロールマウス（ｎ＝16）は他家移植後11.1±1.9日で移植を拒否する。
実験群において、マウス（ｎ＝６）は他家移植後３−４時間で0.25mg/kgのBPD−MAリポソーム調製物の一回の静脈注射を受けており、そして拒絶までの20.7±0.9の移植の延長を示した。８日目にさらなる0.25mg/kgのBPDの注射を受けた別群のマウスは23.3±1.9日という中間の拒絶時間を示した。
このようにして、照射を受けないBPDは他家移植の拒絶を押さえている。
実施例５
リュウマチ性関節炎での付着分子に対するBPDの効果
細胞表面付着分子ICAM−１は活性化された細胞で上流制御されている。そのためにこの分子の出現は細胞活性化の指標と考えられている。
リュウマチ性関節炎患者からの滑液を種々の濃度のBPDと共に18時間組織培養培地で保温し、アンチICAM−１で処理して、フローサイトメトリーを行った。この測定の結果は表２に示されている。
0003574456.tif 000003
表２に示されているように、ICAM−１に陽性なゲートされない細胞の百分率はBPD非存在下の85.7パーセントから100ng/mlBPD存在下で66.9パーセントまでに減少している。この分子を提示しているリンパ球の百分率は比較的にBPDに影響されなかったが、しかしながら、単核細胞及び多核型細胞にとって100ng/mlBPDはICAM−１の発現を非常に減少させた。
いかなる理論に縛られることも望まないが、暗所ででBPDによって引き起こされる抗原特異的免疫調節は、活性化した造血細胞が発現するインテグリン又は付着分子との相互作用によって細胞伝達が阻害されることによると出願人は信じている。
実施例６
BPD−MAとインテグリン結合化合物のコンホメーションとの関係
二つの既知のインテグリンアンタゴニストであるRGDS及びアセチル化／アミド化されたCNPRGDYC（ここではチロシンはメチルエーテルとして存在する）を、三次元構造に関してBPD−MAの三次元構造と比較した。この比較はアルベルタ蛋白質研究所によってなされた。
RGDSに対する三次元構造の予測は、それらのエネルギーによって七つのファミリーに分類することができる1584個の可能なコンホメーションを示した。アセチル化、アミド化ペプチドCNPRGDYCに対する予測は、エネルギーによって五つのファミリーに分類できる1347個のコンホメーションを示した。
両方の蛋白質の予測における主要なファミリー集団の部分集合はRGDA、RGDB及びRGDCと称される実験的に見いだされる三つの集団のコンホメーションに似ている。これらの三集団のコンホメーションは、両方の蛋白質の代表的コンホメーションとして用いられた。
これらのファミリーに含まれるコンホメーションは図２から図４までに重ねられて示されており、図２はRGDAを示し、図３はRGDBを示し、図４はRGDCを示す。全てのコンホメーションは、カルボン酸（Asp）から窒素（Arg）までの官能基距離12−13/を持つ。図５から図７まではBPD−MAにこれらの三集団の各々の代表的コンホメーションを重ねたものを示している。図５はBPDをRGDAに重ねたものを示しており、図６はBPD−MAをRGDBに重ねたものを示しており、図７はBPD−MAをRGDCに重ねたものを示している。
これらの重ね合わせの全てにおいて重なった構造は平面的であり、及びアスパラギン酸及びアルギニンの官能基はBPD−MAの対応するカルボン酸官能基及び窒素官能基に重なっている。
その結果は、BPDはインテグリン結合性化合物のコンホメーションに似た幾つかの官能基の配置を持つらしいことを示している。
実施例７
DTH応答へのBPDアナログの実験的テスト
直接光の非存在下において局所的に与えられたハプテンDNFBに対するDTH応答に対して、BPD−MA、BPD−MB、BPD−DA及びBPD−DBが与える影響の比較を、上記実施例２で概略が述べられた方法を用いて行った。化合物は無毛のナイーブなBalb/cマウスによって評価された。各々の処理集団は４、５匹の動物からなっていた。BPDアナログはDMSO中で再構成されて及びDNFBの適用後24時間で投与された。マウスは実験の５日目に耳にチャレンジ処理を受け、そして１日後に応答が測定された。DMSOの最終濃度は２パーセントであった。コントロールマウスには、適宜対応する溶媒を投与した。
結果は表３及び表４に示されており並びに図８に要約されている。単体のBPDアナログはDTH応答を強く抑制した。二量体のBPDアナログはDTH応答を抑制しなかった。
0003574456.tif 000004
0003574456.tif 000005
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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