(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の１７０３番目〜２４０７番目の位置に相当する塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号２の１７０３番目〜２４０７番目の位置に相当する塩基配列に相補する塩基配列を有するＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳｐｈＩ制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含んでなる組換えベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
ＳｐｈＩ制限酵素の製造法であって、請求項３に記載の宿主細胞を該制限酵素の発現に好適な条件下で宿主細胞を培養することを特徴とする当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼと修飾メチラーゼ（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）とをコードする組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡからの前記酵素の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する酵素の一種である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入細菌成分から精製して、ＤＮＡを正確なフラグメントに切断するために実験室で使用できる。この性質を利用すれば、ＤＮＡ分子を唯一のものとして同定し且つその構成遺伝子に分別することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究に不可欠の道具であることが判明した。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学及び分析を実施するための手段となる生化学的「はさみ」なのである。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、該ヌクレオチド配列に結合することによって作用する。このようにして結合した制限エンドヌクレアーゼは認識配列内で、又は認識配列の片側に、ＤＮＡ分子を開裂する。種々の制限エンドヌクレアーゼが種々の認識配列に対して親和性を示す。これまでに調べられた数百種の細菌の中で、ほぼ百の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定された。
【０００４】
細菌は種毎に僅かの制限エンドヌクレアーゼしか所有しない性向を有する。エンドヌクレアーゼは通常、その由来源である細菌にちなんで命名される。例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ種は、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩ及びＨａｅＩＩＩという３種類の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し開裂する。これに対し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＲＹ１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する１種類の酵素ＥｃｏＲＩしか合成しない。
【０００５】
理論に拘束されたくはないが、自然界では、細菌細胞が安全に生存する上で制限エンドヌクレアーゼが保護的役割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアーゼは、該酵素がなければ細菌を破壊するか又は細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に細菌が耐えられるようにする。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ分子の長さを走査して、認識配列が出現する毎に前記長さを開裂することにより前記耐性を与える。このようにして開裂が行われると、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮＡが非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解されるようになる。
【０００６】
細菌保護系の第２の成分は修飾メチラーゼである。この種の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的な関係にあり、細菌が自己のＤＮＡを保護し、該ＤＮＡを外来感染ＤＮＡから判別できるようにする手段を与える。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識しこれに結合するが、ＤＮＡを開裂する代わりに、メチル基の付加によって前記配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾する。メチル化の後は、制限エンドヌクレアーゼが認識配列に結合することも、該認識配列を開裂することもない。細菌細胞のＤＮＡは常に自己の修飾メチラーゼの活性によって完全に修飾される。従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては全く感受性を示さない。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して感受性を示すのは、修飾されていない、従って識別可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の誕生により、現在では遺伝子をクローン化し、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質及び酵素を従来の精製技術よりも多量に産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための鍵は、この種のクローンを、その発生頻度が１０−３〜１０−４と低いときに、複雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」法によって誘導されるクローン集団内で同定する簡単で信頼できる方法を開発することにある。この方法は、クローンの大部分を占める望ましくないクローンが破壊され、希少な望ましいクローンが生き残るように、選択的であるのが好ましい。
【０００８】
タイプＩＩの制限−修飾系はより高い頻度でクローン化されている。第１のクローン化系では、バクテリオファージ感染が制限エンドヌクレアーゼクローンの同定又は選択手段として使用された（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  １７８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ３：９７−１１２（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８  １５０３−１５０７（１９８１））。細菌はその中に制限−修飾系が存在していればバクテリオファージによる感染に耐えることができるため、原則として、クローン化制限−修飾遺伝子を有する細胞が、ファージの作用を受けたライブラリーからの生存者として選択的に単離され得る。しかしながらこの方法の効果には限界があることが判明した。特に、クローン化制限−修飾遺伝子が選択的生存を可能にするのに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが判明した。
【０００９】
別のクローニング方法は、プラスミドによって運ばれる（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）という特徴が初期に付与された系を大腸菌クローニングプラスミド中に移す操作を含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０２−４０６（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ  １９：３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９（１９８５））。
【００１０】
第３の方法として、現在のところ活性メチラーゼ遺伝子の選択によってクローン化されている更に多くの系をクローニングするのに使用されている方法もある（例えば、１９８６年９月３日公開のＥＰＯ  Ｎｏ．：１９３，４１３、及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１（１９８５）参照）。制限遺伝子及び修飾遺伝子はしばしば密に関係しているため、これらの遺伝子はしばしば両方が同時にクローン化され得る。しかしながら、この選択によって完全な制限系が得られるとは限らず、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもある（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ  １０：２１９−２２５（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら、Ｇｅｎｅ  ２０：１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ  ２１：１１１−１１９（１９８３）；並びにＭｓＰＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１９８３））。
【００１１】
ある系では、クローニングの問題が、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入する試みに存在し得る。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメント上で挿入する場合は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主の遺伝子を開裂する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾又は保護しなければならない。
【００１２】
これらの系を大腸菌中でクローン化する上での別の障害が、種々のメチラーゼのクローニングプロセスで発見された。多くの大腸菌株（クローニングで通常使用されているものを含む）はシトシンメチル化含有ＤＮＡ（ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の導入に耐える系を有する（Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３：９０７０−９０７４（１９８６））。従って、どの大腸菌株をクローニングに使用するかを熟慮することも必要である。
【００１３】
精製した制限エンドヌクレアーゼは、そして制限エンドヌクレアーゼほどではないが修飾メチラーゼも、実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うための有用な道具であるため、これらの酵素を多量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によって得ることは商業的に有利なことである。このような株は、精製操作を容易にすると共に商業的に有用な量で酵素を産生する手段を与えるため、有用と思われる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−３５５９）から得ることができるＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡと、該組換えＤＮＡから前記酵素を製造するための方法とに関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ、即ちＤＮＡ配列５’−ＧＣＡＴＧＣ−３’を認識し、該認識配列内で４塩基３’オーバーハングを残して第２のＧＣ対の間で開裂を行う酵素（Ｆｕｃｈｓ，Ｌ．Ｙ．，Ｌ．Ｃｏｒｖａｒｒｕｂｉａｓ，ｌ．Ｅｓｃａｌａｎｔｅ，Ｓ．Ｓａｎｃｈｅｚ及びＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｇｅｎｅ  １０：３９−４６（１９８０））を発現する形質転換宿主にも関する。本発明の方法で産生したＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、実施例１のステップ１３に記載のように従来技術によって形成した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混入物を含んでいない。ＳｐｈＩ制限−修飾系をクローニングするための好ましい方法の１つは、適当なベクターを選択し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来ＤＮＡを含むライブラリーを幾つか形成し、ＳｐｈＩ修飾メチラーゼをコードするＤＮＡを含むクローンを単離し、メチラーゼクローンを含む大腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ株におけるエンドヌクレアーゼ活性のアッセイによってエンドヌクレアーゼ遺伝子の存在の有無を確認し、前記アッセイによって制限エンドヌクレアーゼが検出されなかった場合にはクローン化ＤＮＡとＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼのアミノ末端との配列決定を行い、これらの配列の比較によってクローン化ＤＮＡフラグメント上のエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を調べ、エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含む染色体ＤＮＡをクローン化し、サザン分析を用いて該クローンのライブラリーをスクリーニングし、ＰＣＲを用いて前記ライブラリーからエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを増幅し、調節されたプロモーターの後方に完全エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化し、これを中間コピー数プラスミド（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）上のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子で予め保護した宿主中に形質転換する操作を含む。
【００１５】
発明の詳細
本発明は、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びにこのような組換えＤＮＡから製造した酵素に関する。
【００１６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて困難であった。一般的なメチラーゼ選択法によって得たメチラーゼクローンはいずれも完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでいなかった。制限エンドヌクレアーゼの位置を決定するためには、メチラーゼクローンからのＤＮＡの配列と精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼから得たアミノ末端配列とを比較する必要があった。これらの結果から、完全な制限−修飾系を得るためには約２００〜４００ｂｐをクローニングする必要があると推算された。しかしながら、従来の方法によって完全な制限エンドヌクレアーゼをクローン化する試みは総て失敗に終わった。その原因はおそらく、エンドヌクレアーゼ遺伝子の致死率とＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子の比較的低い発現とにある。試行された方法には、大腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ中で完全な制限修飾系をクローニングする方法、並びにＳｐｈＩメチラーゼで予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方法がある。制限エンドヌクレアーゼの３’部分は最終的に、Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡのＫａｓＩライブラリーの構築によってクローン化された（ＫａｓＩは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で該遺伝子の３’末端の下流で開裂する）。ＰＣＲを用いてフラグメントを増幅することによりライブラリーから単離された正確なフラグメントはｐＵＣ１９中にクローニングされた。ＰＣＲ反応に使用されたプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内及びライブラリーの構築に使用されたベクター内の配列を含んでいた。クローニング後に、低コピープラスミド上の内因性プロモーターの制御下でＳｐｈＩメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築する試みは総て失敗に終わった。完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は最終的に、Ｐｔａｃプロモーターの制御下で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築することによって大腸菌中でクローン化され発現された。使用された宿主株は、中位コピー数プラスミドｐＳＹＸ２０上のＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め保護した大腸菌である。
【００１７】
Ｂｅｒｎａｎら，ＡＳＭ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ８９：２０６（１９８６）及びＢｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ１４Ａ：１０６（１９９０）の報告は、大腸菌宿主中での発現が見られなくても、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が部分的ＰｓｔＩライブラリーから単離したメチラーゼクローン上に含まれている可能性があると述べている。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓから単離された別の制限修飾系ＳａｌＩについても指摘されたことである（Ｒｏｄｉｃｉｏ及びＣｈａｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：３４９−３５３（１９８８）、Ｓｌａｔｋｏら，未公開の研究成果）。しかしながら、ＤＮＡの配列決定及びＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼのアミノ末端の配列決定の結果、メチラーゼクローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含まれてないことが判明した。
【００１８】
ＳｐｈＩ制限遺伝子を好ましくはクローン化して発現するための本発明の方法は図１に示す通りであり、下記のステップを含む：
１．  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを精製する。
【００１９】
２．  完全ＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子をフラグメントに開裂する制限エンドヌクレアーゼ、例えばＰｓｔＩ又はそのアイソシゾマーのうち任意のもので前記ＤＮＡを完全に及び／又は部分的に消化する。前記フラグメントはクローニング可能な大きさ、即ち約１．５〜１３ｋｂでなければならない。試用した他のエンドヌクレアーゼは、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ及びＸｂａＩを含めて、前述の条件を満たさなかった。
【００２０】
３．  ｐＢＲ３２２（又は好ましくは抗生物質耐性遺伝子中に少なくとも１つのＳｐｈＩ部位を有する任意の別のベクター）は、テトラサイクリン耐性遺伝子中にＳｐｈＩ部位を１つ有するため好ましいクローニングベクターである。
【００２１】
４．  消化したＤＮＡをクローニングベクターに連結する。得られた混合物を用いて適当な宿主、即ちｈｓｄＲ−、ｍｃｒＢＣ−株、例えば大腸菌株ＲＲ１又はＫ８０２（それぞれＡＴＣＣ  ３１３４３及びＡＴＣＣ  ３３５２６）を形質転換する。
【００２２】
５．  ＤＮＡ／細胞混合物を、好ましくは、形質転換細胞に対して選択的な抗生物質、例えばテトラサイクリンを含む富栄養培地にプレーティングする。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーをまとめて回収し、一次細胞ライブラリーを形成する。前述のように、この種の一次細胞ライブラリーは、クローニングエンドヌクレアーゼの様々な組合わせと、それぞれのクローニングエンドヌクレアーゼによるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡの完全な又は部分的な消化とを用いて最終的に合計１０個構築した。
【００２３】
６．  組換えプラスミドを一次細胞ライブラリーからｉｎ  ｔｏｔｏで精製して一次プラスミドライブラリーを形成する。
【００２４】
７．  次いで、精製プラスミドライブラリーを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ細胞から調製したＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ又は任意のＳｐｈＩアイソシゾマー、例えばＢｂｖＩもしくはＰａｅＩでｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全に消化する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は、修飾されていないメチラーゼ無含有クローンを選択的に破壊し、その結果ＳｐｈＩメチラーゼ含有クローンの相対頻度が増加する。メチラーゼ無含有クローンの破壊を促進するために、エキソヌクレアーゼ及び／又はホスファターゼを消化に加えてもよい。
【００２５】
８．  ＳｐｈＩメチラーゼクローンの同定：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを形質転換によって大腸菌株ＲＲ１又はＫ８０２のような適当な宿主に戻し、形質転換コロニーを抗生物質プレート上でのプレーティングによって再び得る。コロニーを採取し、そのＤＮＡを、ＳｐｈＩ修飾遺伝子の存在について下記のの方法で分析する：プラスミドＤＮＡを精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、ＳｐｈＩ消化に対して耐性であるかどうかを調べる。
【００２６】
９．  メチラーゼ遺伝子がクローン化されたことが確認されたら、そのクローンをＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。活性が検出されれば、ＳｐｈＩ制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に結合しており、クローン中に存在することになる。その場合は、後述のステップ１２まで飛び越すことができる。制限活性が検出されなければ、それは制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は結合しているが完全な状態でメチラーゼ遺伝子と共にクローン化されてはいないか、又は完全な状態でクローン化されているが発現はされていないことを意味する。これら３つの可能性のうちのいずれが現実のものであるかを調べるために、クローン化フラグメントの制限地図を作り、欠失を形成して、クローン化フラグメント内のメチラーゼ遺伝子の相対位置を決定する。次いでこの情報を用いて、制限遺伝子が結合しているものと仮定して、その制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子のいずれかの側面に存在しているかどうかを調べる。ＤＮＡが十分に存在していれば、制限遺伝子は結合していないか、又はクローン中に存在していても発現されてはいないとみなされる（ステップ１０に進む）。本発明のＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０の場合のように、クローン化ＤＮＡ内でメチラーゼ遺伝子の両側に、結合制限遺伝子をコードするのに十分な余地（ｒｏｏｍ）が存在していなければ、メチラーゼ遺伝子の一部分を用いてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ染色体の消化物をプローブし、サザンハイブリダイゼーションによって、既存のクローン化ＤＮＡの境界を超えて延びる領域のゲノム地図を形成する。このデータは、制限−修飾領域をメチラーゼ遺伝子とより多くの隣接ＤＮＡとを有する個々のフラグメントに開裂する特定のエンドヌクレアーゼを同定するのに役立つ。このようなエンドヌクレアーゼによって形成されたフラグメントの正確な大きさも前記データから計算される。制限遺伝子と修飾遺伝子とが結合していれば、前述のようなフラグメントは制限遺伝子もコードすると考えられる。
【００２７】
１０．  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ又はＮｏｃａｒｄｉａから単離した制限−修飾系に関する過去の実験では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンは通常の粗細胞抽出物アッセイでは同定できないことが判明した。これは、大腸菌中での前記遺伝子の発現度が低いためである。しかしながら、Ｎｏｃａｒｄｉａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ中でクローニングするとしばしば検出可能な度合いまで発現し得る。メチラーゼ遺伝子を含み、場合によってはエンドヌクレアーゼ遺伝子も含むクローンｐＳｐｈＭ６．０からのフラグメントを、ｐＩＪ４８６のようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクター（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８に記述されている）上にサブクローニングし、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中に形質転換する。得られたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中クローンをメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現について調べる。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中クローンから発現されたエンドヌクレアーゼが存在すれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子はクローン化されてはいるが大腸菌中では発現されないことになる（ステップ１２に飛び越す）。本発明の場合のように発現が見られなければ、ＳｐｈＩエンドヌクレアーゼをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからできるだけ均質に精製し、最初の１０〜２０のアミノ酸のアミノ末端配列を決定する。このタンパク質配列情報をメチラーゼクローンの翻訳されたＤＮＡ配列と比較して、エンドヌクレアーゼ遺伝子がそのクローン化フラグメント上に存在するかどうかを調べ、存在していれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点がフラグメント上のどの位置に当たるかを調べる。これと同時に、タンパク質ゲルによって制限エンドヌクレアーゼタンパク質の大きさは約２７ｋＤであると決定される。これは、エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡの量が約０．８ｋｂであることを意味する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを有するクローンは、エンドヌクレアーゼのアミノ末端に関連した配列を含み、且つ前記配列の下流に少なくとも０．８ｋｂのＤＮＡを有するものであると同定されている。しかしながら本発明では、単離したメチラーゼクローンのいずれも、エンドヌクレアーゼ遺伝子を完全にコードするのに十分なＤＮＡをエンドヌクレアーゼ出発点の下流に含んでいないことが判明した。
【００２８】
１１．  ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残部のクローニング：完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をメチラーゼ遺伝子と共に又はメチラーゼ遺伝子なしに、保護してない、又はＳｐｈＩメチラーゼで予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主中にクローニングする試みは総て失敗に終わった。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を得るためには、まず制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分だけをクローニングする必要がある。サザンブロット分析で決定されるように制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で３’末端の下流で切断を行う制限エンドヌクレアーゼを用いてＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する。ライブラリーが得られれば、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎコロニー又はサザンハイブリダイゼーションによって制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分を含む正確なクローンを同定し、次いでＰＣＲ増幅を用いてライブラリーから単離もしくは増幅することができる。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端を含むフラグメントのクローンが単離されれば、これを用いて制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築して完全な遺伝子を得ることができる。
【００２９】
１２．  過剰発現：制限遺伝子を含むクローンを過剰発現できる方法は幾つかある。ＤＮＡ配列決定、詳細な地図の作成及び欠失データは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方法の決定に役立つ。過剰発現させる方法の１つは、大腸菌によって強く認識されるプロモーター、例えばｐＡＧＲ３上のＰｔａｃ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＷ．Ｊａｃｋから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の前に直接挿入する操作を含む。この操作は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点及び終了点の近傍に適当な制限部位をみつけ、ｐＡＧＲ３のプロモーターの近傍に相容性制限部位をみつけ、制限遺伝子をＰｔａｃプロモーターと一直線に並ぶようにｐＡＧＲ３に移し込むことによって実施し得る。あるいは、完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅のためにポリメラーゼ連鎖反応を使用するために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の前及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流のどこかで直接ハイブリダイズするプライマーを設計することもできる。得られたＤＮＡフラグメントは、ｐＡＧＲ３のような発現ベクター内で誘発性プロモーター（Ｐｔａｃ）の下流に直接挿入できる。使用し得る別の調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  １９：４３−５４（１９８２））及び１ＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：１２８（１９８１））、並びにｐＥＴ３Ａベクター上のＴ７プロモーター（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂ．，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹのＷｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒから入手可能）である。また、強力なリボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ  ＆  Ｄａｌｇａｒｎｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７１，１３４２−１３４６（１９７４））を遺伝子の前に配置して発現を増大させることもできる。本発明では、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護しなければならない。この操作は、別個のプラスミド上で、ＳｐｈＩ制限部位と重なり合う部位を修飾することによりＳｐｈＩ消化から保護するＮｌａＩＩＩのような異種メチラーゼ又はＳｐｈＩメチラーゼ中でクローニングすることによって達成される。使用するプラスミドは発現ベクターに対して相容性のものでなければならない。メチラーゼはまた、過剰発現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主のゲノムを保護するようなレベルで産生されなければならない。本発明では、ｐＡＣＹＣ１８４のような低コピー数プラスミド上にクローニングしたＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子では完全な保護は得られないことが判明した。中位コピー数プラスミド上にクローニングしたＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子を用いると、宿主ゲノムがＳｐｈＩ消化から完全に保護された。
【００３０】
前記遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌中で更に効果的に使用されるコドンを使用すべく、部位特異的突然変異誘発又は遺伝子の再合成によって変えることができる（Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１：３８９−４０９（１９８１））。
【００３１】
１３．  産生：ＳｐｈＩメチラーゼ又はエンドヌクレアーゼは、抗生物質を適当に選択して発酵槽内の富栄養培地で増殖させることにより、ＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子（又は異種メチラーゼ）及び過剰発現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンから産生し得る。その後細胞を遠心分離によって回収し、音波処理により破壊して、ＳｐｈＩメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
【００３２】
１４．  精製：ＳｐｈＩメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、アフィニティクロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーのような標準的タンパク質精製方法によって精製する。
【００３３】
前述の諸ステップは本発明の好ましい実施態様を構成するものであるが、当業者には明らかなように、前述の方法は当業者に公知の技術に従って変えることができる。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の現時点で好ましい実施態様を説明するためのものである。尚、この実施例は非限定的なものであり、本発明はこれに限定されることはない。
【００３５】
実施例１
ＳｐｈＩ修飾メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．ＤＮＡの精製：  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを調製するために、１ｇの細胞ペーストを５ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．６中に３０分間静かに振盪することにより再懸濁させた。該懸濁液を２つの３．０ｍｌアリコートに分けた。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．６中に１．７ｍｇ／ｍｌのリゾチームを溶解した溶液３．５ｍｌを各アリコートに加え、それぞれを３７℃で１５分間インキュベートした。ＳＤＳを１％まで加え、プロテイナーゼＫを０．１３ｍｇ／ｍｌまで加え、これらのアリコートを３７℃で１時間インキュベートした。１０％ＳＤＳ及び８％サルコシルの溶液０．４ｍｌを各アリコートに加え、インキュベーションを５５℃で２時間続けた。２つのアリコートを合わせ、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を４回交換して２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を塩化セシウム−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分離に使用できるようにするために、総量をＤＮＡ緩衝液で４０ｍｌに増加し、該ＤＮＡ溶液を２つの２０ｍｌアリコートに分け、各々に２０ｇの塩化セシウム及び０．２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミドを加えた。該ＤＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得られたＤＮＡバンドをシリンジ及び１８ゲージニードルを用いて取り出した。同量の氷冷水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出することによりエチジウムブロミドを除去した。塩化セシウムは透析によって除去した。次いで、ＮａＣｌを０．５Ｍまで加え、０．５５倍容のイソプロピルアルコールを表面に層状に加えて、ＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた。該ＤＮＡを、最終濃度約３８５μｇ／ｍｌで２ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中に溶解した。
【００３６】
ステップ２〜１０の注意事項：前述のように、合計５種の異なる制限エンドヌクレアーゼをそれぞれ使用してＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ染色体を消化し、１０のライブラリーを構築しスクリーニングした。メチラーゼクローンは部分的ＰｓｔＩライブラリーだけでしか得られられなかったため、ここでは部分的ＰｓｔＩライブラリーのみを詳述する。他の９個のライブラリーは、以下に略述する方法と類似の方法で作製した。
【００３７】
２．部分消化：  精製ＤＮＡを以下のようにＰｓｔＩで開裂して部分消化を行なった。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール緩衝液中５００ｕｇ／ｍｌのＤＮＡの溶液１００μｌを、１つの１００μｌアリコートと７つの５０μｌアリコートとに分けた。１００μｌの試験管に４０単位のＰｓｔＩを加え、ＤＮＡ１μｇ当たり４単位の酵素とした。この第１の試験管から５０μｌを取り出し、第２の試験管に移して２単位ＰｓｔＩ／μｇとし、以下同様にして、前の試験管の半分の量のＰｓｔＩを次の試験管に移した。これらの試験管を３７℃で１時間インキュベートし、７２℃で１５分間熱処理し、各試験管から１５μｌずつ採取してアガロースゲル電気泳動で分析した。中程度の、但し不完全な消化を示す試験管を、クローニング用部分消化フラグメント源として選択した（使用した部分消化試験管は０．２５Ｕ／μｇ、０．１２Ｕ／μｇ、０．０６Ｕ／μｇ及び０．０３Ｕ／μｇ試験管である）。個々の反応液を一緒に混ぜ合わせ、下記のステップ３に記載のように使用した。
【００３８】
３．連結反応：  フラグメント化したＤＮＡを以下の方法でｐＢＲ３２２に連結した。６μｇのＰｓｔＩ部分消化Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ（６０μｌ）を、ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化した３．０μｇのｐＢＲ３２２（３０μｌ）と混合した。２０μｌの１０×連結反応ミックス（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＡＴＰ）を加え、更に１１０．５μｌの無菌蒸留水を加えて最終量を１９８μｌとした。７．５μｌの濃縮Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２×１０６Ｕ／ｍｌ）を加え、該混合液を１７℃で４時間インキュベートし、次いで１０μｌのクロロホルムを加えて殺菌した。約６２．５μｌの連結ＤＮＡを使用して大腸菌株Ｋ８０２を次のように形質転換した。ＤＮＡを０．５ｍｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ２（５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム，６７ｍＭ  ＣａＣｌ２）と氷上で混合し、１．０ｍｌの氷冷コンピテント大腸菌Ｋ８０２（ｈｓｄＲ−Ｍ＋，ｍｃｒＡ−，ｍｃｒＢＣ−  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３５２６）細胞を加えた。４２℃で５分間インキュベートした後、１０ｍｌのルリアブロス（Ｌブロス）を加えて細胞を希釈し、３７℃で４時間インキュベートした。
【００３９】
４．一次細胞ライブラリー：  形質転換細胞培養液を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を１．０ｍｌのＬブロス中に再懸濁させた。２００μｌアリコートを、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むルリア寒天（Ｌ寒天）プレート上にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、各プレートに２．５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を注入し、形質転換コロニーをまとめて掻き取り、プールし、一次細胞ライブラリーを形成した。
５．一次プラスミドライブラリー：  一次プラスミドライブラリーを以下のように形成した。２．５ｍｌの一次細胞ライブラリーを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬブロス５００ｍｌ中に接種した。該培養液を３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％スクロース，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に室温で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を加え、次いで０．２５ＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームの溶液３ｍｌを加えた。得られた溶液を氷上に３時間放置し、次いで１２ｍｌの溶解用ミックス（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、６７ｍＭ  ＥＤＴＡ）をピペットで強く注入し、該細胞懸濁液を静かに撹拌して溶解を完了させた。溶解後、混合液を５０ｍｌプラスチック遠心管に移し、１７０００ｒｐｍ，４℃で４５分間遠心した。上清をピペットで取り出した。２０．０ｇの固体ＣｓＣｌを計量して５０ｍｌプラスチック製ねじ蓋付き試験管に入れ、２２．０ｇの上清をピペットで加えて混合した。該混合液に１．０ｍｌのエチジウムブロミド溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中５ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロミド）を加えた。得られた溶液を２つの５／８インチ×３インチのポリアロマー遠心管に移し、密封した。これらの遠心管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ７０ローターで、４４０００ｒｐｍ、１７℃で４２時間遠心した。プラスミドを回収すべく遠心管の頂部にメスで孔をあけ、２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下でシリンジによって回収した。両管から得た低い方のバンドをねじ蓋付きガラス試験管に一緒に入れ、同量の氷冷水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出することによりエチジウムブロミドを除去した。  抽出後の溶液を透析チューブに移し、ＤＮＡ緩衝液を４回交換して２４時間透析した。透析後のＤＮＡ溶液を予め計量した５０ｍｌ無菌遠心管に移し、量を測定した。５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度０．４Ｍまで加え、２倍容のイソプロパノールを加えて混合した。該溶液を−２０℃で一晩貯蔵してＤＮＡを沈澱させた。沈澱後、溶液を１５０００ｒｐｍ、０℃で１５分間遠心し、上清を捨てた。試験管を１５分間ベンチ上に放置して空気乾燥し、次いでＤＮＡペレットを５００μｌのＤＮＡ緩衝液中に溶解し、−２０℃で貯蔵した。このようにして調製したプラスミドのＤＮＡ濃度は１００〜２００μｇ／ｍｌであった。
【００４０】
６．プラスミドプールの消化：  ゲル精製した一次プラスミドプールを以下のように消化して非ＳｐｈＩメチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮＡをＳｐｈＩ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で３０μｇ／ｍｌに希釈した。調製した量は合計９００μｌである。１６Ｕ／μｇのＳｐｈＩを加え、該混合液を３７℃で２時間インキュベートした。１２分間７２℃に加熱して反応液中の酵素を死滅させた。該消化物にＥＸｏＩＩＩヌクレアーゼをＤＮＡ１μｇ当たり５０Ｕの濃度で加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、試験管にクロロホルムを１０μｌ加えた。遠心分離によってクロロホルムを除去した。
【００４１】
７．形質転換：  各試験管から採取した１２．５μｌ試料を用いて大腸菌ＲＲ１を形質転換した。４２℃で３分間インキュベートし、Ｌブロス中３７℃で４５分間増殖させた後、細胞／ＤＮＡ混合物を、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ寒天プレート上にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、プレートを調べた。ＳｐｈＩでのプラスミドライブラリーの消化により、形質転換体の数は約１０３に減少していた。
【００４２】
８．生存固体の分析：  セクション７で得た生存コロニーのうち２８個をテトラサイクリン含有Ｌブロス培養液１０ｍｌ中で増殖させ、それらが保有するプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９））の方法を改変した下記のミニプレッププラスミド精製方法によって調製した。
【００４３】
ミニプレップ操作：各培養液を８０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  グルコース、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。室温で１０分後、２．０ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各試験管に加え、これらの試験管を振盪して細胞を溶解させ、次いで氷上に配置した。溶液が透明になった時点で１．５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８を各試験管に加え、振盪した。形成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。各上清を、イソプロパノール３ｍｌを入れた遠心管内に注入し、混合した。室温で１０分後、前記遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で３０分間空気乾燥した。乾燥したペレットを８５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中に再懸濁させた。７５μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを各々に加え、該溶液を、５７５μｌのイソプロパノールを入れたエッペンドルフ試験管に移し、再び室温で１０分間沈澱させた。これらの試験管をマイクロ遠心機で４５秒間遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥した。該ペレットを、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む５００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。５０μｌの５ＭＮａＣｌ及び３５０μｌのイソプロパノールを順次加えてＤＮＡをもう一度沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを４５秒間遠心することにより沈降させ、上清を捨て、ペレットを１５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０からなる最終溶液中に再溶解した。その後、ＳｐｈＩでの消化によりプラスミドミニプレップを分析した。
【００４４】
９．メチラーゼ遺伝子クローン：  １つのプラスミドがＳｐｈＩ耐性を示し、２つのＰｓｔＩフラグメントを保有することが判明した（図２）。大腸菌クローンから調製した抽出物を下記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ制限アッセイにかけた。
【００４５】
エンドヌクレアーゼ活性について試験すべきクローンの培養液５０ｍｌを、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬブロスで３７℃で一晩増殖させた。５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞をペレット化した。上清を捨て、ペレットを３ｍｌの音波処理緩衝液（２０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。該細胞懸濁液にリゾチームを最終濃度２００μｇ／ｍｌで加えた。該混合液を氷上に３時間維持し、次いで−２０℃で凍結した。該混合物を氷上で解凍し、得られた懸濁液２ｍｌを音波処理緩衝液２ｍｌと混合した。該懸濁液に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の２５％溶液を０．４μｌ加え、ピペットに出し入れすることにより混合した。破壊された細胞を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。該細胞抽出物７．５μｌを１２０μｌの１×ＳｐｈＩ緩衝液及び５０μｇ／ｍｌ  ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（ＰｓｔＩで予め消化したもの）と一緒に３７℃で２時間インキュベートすることにより、上清の制限エンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。１５μｌ試料を電気泳動によって調べたところ、制限エンドヌクレアーゼ活性は認められなかった。
【００４６】
１０．  ４．５及び０．９ｋｂ  ＰｓｔＩ挿入物内のメチラーゼ遺伝子の位置：  ＳｐｈＩメチラーゼクローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消化して、クローン化ＤＮＡの制限マップを作成した。該マップを用いて前記挿入物内の種々の領域を欠失させ、その結果生じるメチル化への影響を調べた。ＰｓｔＩ部位にまたがる〜１ｋｂメチラーゼ遺伝子の位置が正確に定められ、該遺伝子の両側のクローン化ＤＮＡの長さは３．５及び０．４ｋｂであることが判明した。メチラーゼクローンは、メチラーゼ遺伝子の右側には連結制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ（０．４ｋｂ）をもたないが、メチラーゼ遺伝子の左側には十分な余地を有すると考えられた。しかしながら、２つの遺伝子の間の距離、これら遺伝子の正確なサイズ、及びこれら遺伝子が結合しているか否かは不明であったため、クローンにおけるＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ活性の欠如は、制限遺伝子がクローン中に存在していないか、又は存在していても発現はされていないことを示すものであった。制限遺伝子が存在していても発現はされていないという場合には、隣接ＤＮＡを有するクローン化メチラーゼ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベクター中にサブクローニングし、これを用いてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓを形質転換した（ステップ１１，１２）。更に、メチラーゼクローンのＤＮＡ配列決定及びタンパク質配列決定を行って、クローン中に制限遺伝子の一部分もしくは全体が存在しているか、又は全く存在していないかを決定した（ステップ１３〜１４）。完全な制限遺伝子が存在していない場合には、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡのより大きな領域をクローニングした（ステップ１５〜１７）。
【００４７】
１１．  Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中へのＳｐｈＩメチラーゼサブクローンのクローニング：  メチラーゼクローンでは、制限エンドヌクレアーゼが連結していたならば、メチラーゼ遺伝子の正確な位置に依存して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子の片側にクローン化された。しかしながら、前記クローンは制限エンドヌクレアーゼ活性を発現しなかったし、２つのＳｐｈＩ制限−修飾遺伝子が結合されているという証拠もなかったため、メチラーゼサブクローンを、大腸菌よりもＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓに近い関係をもつ種であるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中にクローニングしてみることにした［以下に記載するのはｐＳｐｈＭ３．６由来の３．６ｋｂ  ＡｐａＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントのクローニングである。ｐＳｐｈＭ２．６から単離した２．６ｋｂのＡｐａＩ−ＳｎａＢＩフラグメントについても同様のサブクローニングを行った（部位の位置については図２参照）。結果は同じであったため、ここではＡｐａＩ−ＢｇｌＩＩサブクローニングのみを詳述する］１５μｌ（１．０μｇ）のｐＳｐｈＭ３．６を、２０ＵのＥｃｏＲＩ、２０ＵのＳｃａＩ及び２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩを含む５０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で３７℃で２時間消化した。全体を０．７％アガロースゲル中で２時間電気泳動にかけた。ＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳動させることにより、３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを回収した。前記ペーパーを、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌで２回洗浄した。次いで、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液７５μｌで前記ペーパーを４回洗浄することより、ＤＮＡをペーパーから溶出させた。その結果得られたＤＮＡフラグメント含有溶液を、３００μｌのフェノール／クロロホルム及び３００μｌのクロロホルムで順次抽出し、ドライアイス／エタノール浴中に１５分間配置して１ｍｌの無水エタノールで沈澱させた。１４０００ｒｐｍで５分間遠心してＤＮＡをペレット化した。得られたペレットを７０％エタノールで濯ぎ、空気乾燥し、最終量１０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。１０μｌ（０．５μｇ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ精製ＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し脱リン酸化したｐＩＪ４８６（ｐＩＪ４８６は  Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＥｎｇｌａｎｄのＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手）２μｌ（０．２μｇ）に、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）を含む１×連結緩衝液中５０μｌの最終量で、１２℃で一晩連結させた。１０μｌの連結反応ミックスを、約４×１０９のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手。ＴＫ２４は、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載されている）の原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）に加えた。該原形質体は前出のＨｏｐ��ｏｏｄ，Ｄ．Ａ．らの記述に従い、Ｐ緩衝液［１０３ｇのスクロース、０．２５ｇのＫ２ＳＯ４、２．０２ｇのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、２ｍｌの微量元素溶液及び８００ｍｌにするのに必要な量の蒸留水。これを８０ｍｌアリコートずつ分配し、オートクレーブ処理する。使用前に各８０ｍｌアリコートに下記の成分を加える：１ｍｌの０．５％ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｌの３．６８％ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ及び１０ｍｌの５．７３％ＴＥＳ緩衝液ｐＨ７．２。リットル当たりの微量元素溶液：４０ｍｇのＺｎＣｌ２、２００ｍｇのＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ及び１０ｍｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ］中で調製した。原形質体／ＤＮＡ混合物に０．５ｍｌの２５％ポリエチレングリコール１０００を加えた。これを１ｍｌピペットに３回出し入れした。該形質転換用ミックス０．１ｍｌを６つのＲ２ＹＥプレートの各々にプレーティングした［１０３ｇスクロース、０．２５ｇ  Ｋ２ＳＯ４、１０．１２ｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｇグルコース，０．１ｇ  Ｄｉｆｃｏカザミノ酸及び８００ｍｌ  Ｈ２Ｏ。この溶液８０ｍｌを２．２ｇのＤｉｆｃｏ寒天と混合し、オートクレーブ処理する。プレートを調製するために、前記ベース寒天溶液を融解し、以下の無菌溶液を加える：１ｍｌ  ０．５％ＫＨ２ＰＯ４、８ｍｌ  ３．６８％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｌ  ２０％Ｌ−プロリン，１０ｍｌ  ５．７３％ＴＥＳ緩衝液  ｐＨ７．２、０．２ｍｌ微量元素溶液及び０．５ｍｌ  １Ｎ  ＮａＯＨ。このプレート材料を層流フード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）内に入れて１時間以上乾燥する］。３０℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに１．０ｍｌのチオストレプトン水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を塗布した。コロニーが増殖するまでプレートを３〜４日間３０℃に戻した。
【００４８】
１２．  形質転換体の分析：  チオストレプトン選択によって得たコロニーを、独立コロニーの単離のために、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを入れたＲ２ＹＥプレートで画線培養した。増殖したコロニーを用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５ｍｌのＴＳＢ、Ｏｘｏｉｄ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ＳｏｙａＢｒｏｔｈに接種した。これらの培養液を通気しながら３０℃で２４時間インキュベートした。培養液１ｍｌについてミニプレップを実施した。この操作は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７９））によって記述されている操作と同じであるが、相違点として、ＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液を加える前に、４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中３７℃で３０分間インキュベートする必要がある。該ミニプレップＤＮＡ１０μｌを０．７％アガロースゲル上で泳動させることにより分析した。６つのクローンのうち２つが、ｐＩＪ４８６に挿入された正確な大きさのフラグメントを有していると思われた。これら２つの単離体に由来する胞子を回収し、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５００ｍｌのＴＳＢに接種した。ＣｓＣｌプラスミドプレップを、前出のＨｏｐｗｏｏｄらの論文ｐ９３に記載の方法３をスケールアップ（２０倍）した方法に従って、前記培養液上で調製した。得られたペレットを１７ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１８．７ｇ  ＣｓＣｌ及び０．４４ｍｌ  エチジウムブロミド（５ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。該溶液を２つの５／８インチ×３インチポリアロマー遠心管に移し、密封した。これらの管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ７０ローター内で４４，０００ｒｐｍ、１７℃で４８時間遠心した。プラスミドを回収するために管の頂部にメスで孔をあけ、２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下でシリンジにより回収した。両管から得た低い方のバンドを１５ｍｌのＣｏｒｅｘ管に一緒に入れ、同量の水と３倍容のエタノールとを加えることによりエチジウムブロミドを除去した。−２０℃で２時間後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心することによりＤＮＡをペレット化した。得られたペレットを、２ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁させた。５０μｌの８Ｍ  ＬｉＣｌを加え、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム及びクロロホルムで順次抽出した。前述のように３倍容のエタノールを該水溶液に加えてＤＮＡを沈澱させた。ペレットを、５００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁させた。精製したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して挿入物の存在を確認し、ＳｐｈＩで消化して、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のサブクローンがＳｐｈＩメチラーゼ活性を有しているかどうかを調べた。両サブクローンは明らかに同じものであり、正しい構造を有すると共にメチラーゼ活性を示した。即ち、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することができなかった。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を調べるために、プラスミドプレップに使用したものと同様に増殖させた培養液５０ｍｌをペレット化した。得られたペレットを１０．３％スクロースで洗��し、−７０℃で凍結した。解凍後、ペレットを湿潤細胞重量１ｇ当たり３ｍｌで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  アジ化ナトリウム及び２００ｍＭ  ＮＡＣｌの溶液に再懸濁させた。氷上で音波処理した後、１６，０００ｒｐｍで４５分間遠心することにより破片を除去した。上清をＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。ｐＥＧｓｐｈＭ２−４及びｐＥＧｓｐｈＭ２−６と称するこれらのサブクローンは、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で検出可能なＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これは、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈＩメチラーゼクローン上で完全なものではないことを意味する。
【００４９】
１３．  エンドヌクレアーゼ遺伝子がクローン化フラグメント上に存在するか否かを調べるために、そして存在している場合にはその位置をつきとめるために、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを下記の方法でできるだけ均質に精製した：４１３ｇのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからの粗細胞抽出物１．１リットルを下記のカラム上に下記の順序で配置した：ホスホセルロース、ヘパリン−セファロース、Ｑ−セファロース、ＭｏｎｏＱ  ＨＰＬＣ及びＭｏｎｏ−Ｓ  ＨＰＬＣ。その結果、〜５０％の純度のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物が得られた。
【００５０】
前記精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを２５〜３０ｐＭ用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  モデル４７０Ａの気相タンパク質配列決定器（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）でアミノ末端タンパク質の配列決定を行った。該制限エンドヌクレアーゼの最初の１３個のアミノ酸残基は、Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  ＬｅｕＳｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と決定された。
【００５１】
１４．  前記領域のＤＮＡ配列決定では、前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域が部分的ＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０上に存在するが、該クローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は存在せず、前記制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子の下流にあり、メチラーゼ遺伝子と同じ方向で転写されることが確認された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。該配列からは更に、制限エンドヌクレアーゼの残りをクローニングし次いで大腸菌中でのクローン化遺伝子の発現を誘起するための後続操作のベースとして使用されるデータも得られた。
【００５２】
１５．  制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りをクローニングするのに最も有用な酵素を決定すべく、サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，９８：５０３）を用いて隣接領域のゲノム地図を決定した。メチラーゼ遺伝子の一部分又は全体を含む幾つかのクローンを使用して、サザン、特定的にはｐＵＣ１９中にクローニングされた０．９ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメント又は１．４ｋｂ  ＳｍａＩ−ＡｐａＩフラグメント（図２）をプローブした。これらのプラスミドを下記の方法でニックトランスレーションにかけた：１μｌ（０．５μｇ）のＤＮＡと、１０μｌの緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）と、４μｌのｄＮＴＰ（各々０．１ｍｍｏｌ）と、５μｌのα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（１００ｐｍｏｌｅｓ、８００キュリー／ミリモル）と、１μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（２０単位）と、１μｌのＤＮＡｓｅＩ（１μｇ／ｍｌ）と７８μｌのＨ２Ｏとを混合し、１５℃で３時間インキュベートした。該混合物を５分間沸騰させ、即座に氷上に配置した。
【００５３】
サザンブロットは下記のように調製した：Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＥｃｏＲＩ，ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｍｌＩ、ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｃａＩＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ，ＳｎａＢＩ及びＳｔｕＩで別個に消化した。消化物を１．０％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。該ゲルを０．２５Ｍ  ＨＣｌに１０分間、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌに３０分ずつ２回、次いで０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１．５Ｍ  ＮａＣｌに３０分ずつ２回浸漬した。ニトロセルロースシートを水に短時間浸漬し、次いで１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭクエン酸三ナトリウム）に浸漬した。厚さ２インチに積重したペーパータオルと、Ｗｈａｔｍａｎ  ３ＭＭペーパー（１０×ＳＳＣに浸漬したもの）２枚と、湿潤ニトロセルロースメンブラン１枚と、処理したアガロースゲルと、もう１枚のニトロセルロースメンブランと、もう２枚の３ＭＭペーパーと、厚さ２インチに積重したペーパータオルとを用いてサンドイッチを形成した。該サンドイッチに重みをかけて押さえ付け、ニトロセルロースシートへのＤＮＡの移動を室温で一晩生起させた。該ニトロセルロースシートを０．９Ｍ  ＮａＣｌ、９０ｍＭ  クエン酸三ナトリウムで１０分間濯ぎ、真空炉で８０℃で１．５時間加熱して、移動したＤＮＡフラグメントをニトロセルロースに固定させた。４ｍｌの２０ｇ／ｌ  Ｆｉｃｏｌｌ、２０ｇ／ｌポリビニルピロリドン及び１２ｇ／ｌウシ血清アルブミンと、１５ｍｌの２０×ＳＳＣ（４．５ｍｌの３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）と、１００ｍｇ／ｍｌの変性し音波処理したサケ精子ＤＮＡ  １ｍｌと、８０ｍｌのＨ２Ｏとからなる溶液を１５ｍｌ入れたプラスチック袋の中に前記シートを配置した。該シートを振盪しながら６５℃で２時間インキュベートしてプレハイブリダイズした。１００μｌの放射性プローブを前記袋に加え、インキュベーションを振盪下６５℃で一晩続けた。次いで、ニトロセルロースシートを２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで３０分ずつ２回６５℃で洗浄し、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで３０分間６５℃で洗浄した。該シートを空気乾燥し、一晩かけてオートラジオグラムを作製した。
【００５４】
該サザンブロットデータから、１０種のエンドヌクレアーゼコーディングフラグメントの大体の寸法が判明した。ＡｐａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｓｔＹＩ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ，ＳａｃＩ，ＳｍａＩ及びＳｔｕＩフラグメントはメチラーゼ遺伝子の右側にＤＮＡを有する（図２）。プローブはＡｐａＩ消化物中で１．２ｋｂバンドにハイブリダイズし、ＢａｍＨＩ消化物中で７．５ｋｂバンドに、ＢｓｔＹＩ消化物中で４．９ｋｂバンドに、ＫａｓＩ消化物中で０．９ｋｂバンドに、ＭｌｕＩ消化物中で３．６ｋｂバンドに、ＰｖｕＩＩ消化物中で１．８ｋｂバンドに、ＳａｃＩ消化物中で４．５ｋｂバンドに、ＳｍａＩ消化物中で２．４ｋｂバンドに、そしてＳｔｕＩ消化物中では７．５ｋｂバンドにハイブリダイズした。その他のバンドはクローン化するには大きすぎると判断された。
【００５５】
１６．  ＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子の下流の領域を有するクローンの単離：ＳｐｈＩメチラーゼで予め保護した又は保護してない大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主中に完全ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をメチラーゼと共に又はメチラーゼ無しにクローニングする試みは総て失敗したため、前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端のみをクローニングする試みを行った。ＤＮＡ配列及びサザン分析の結果、ＫａｓＩ（又はＮａｒＩ）は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で切断を行い、約０．９ｋｂ下流の次の部位が制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端の下流のＤＮＡを開裂する筈であることが判明した。０．９ｋｂのＫａｓＩフラグメントをクローニングすれば、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りが得られる筈である。１００μｌ（９μｇ）のゲノムＤＮＡを採取し、１２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．９、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び２０ＵＫａｓＩ中で３７℃で２時間消化することによりＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡでＫａｓＩライブラリーを形成した。全体を０．７％アガロースゲルで２時間電気泳動にかけた。０．７〜１．０ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントをＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳動させることによって回収した。ステップ１１と同様の方法でＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから溶出した。このペレット化ＤＮＡを２０μｌの１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁させた。精製ＫａｓＩ消化フラグメント２０μｌ（〜０．５μｇ）を、ＫａｓＩで開裂し脱リン酸処理した５μｌ（０．２μｇ）のｐＵＣ１９に、１×連結反応緩衝液（１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）含有）中５０μｌの最終量で４℃で４８時間にわたり連結させた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＶＳ  ０．０２５μＭフィルターを用いて滴下透析（ｄｒｏｐ  ｄｉａｌｙｓｉｓ）により１０μｌの連結反応液を脱イオン処理した。次いでＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７６７中にエレクトロポレート（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅ）させた。該大腸菌は、Ｌブロス中で１リットルの細胞をＫｌｅｔｔ  ５０〜８０まで増殖させることによりエレクトロポレーション（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）用に調製した。前記細胞は氷上で１５〜３０分間冷却し、その後４，０００ｒｐｍで１５分間冷間遠心してペレット化した。該ペレットを氷冷無菌水で２回、１０％グリセロールで１回洗浄した。洗浄したペレットを１〜２ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁させて最終細胞濃度を３×１０１０細胞／ｍｌとした。細胞は必要時まで１００μｌアリコート中−７０℃で凍結した。調製した細胞中にＤＮＡをエレクトロポレートさせるべく、前記細胞をゆっくり解凍し、氷上に配置した。該細胞４０μｌを１０μｌの連結し透析したＤＮＡと混合した。該混合物を、冷却した０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベット内に配置した。該ＤＮＡ細胞混合物に時定数４〜５ｍｓｅｃ、１２．５ｋＶ／ｃｍで電気パルスを印加した。大腸菌を２ｍｌのＬブロスで即座に希釈し、３７℃で１時間増殖させ、その後１５０ｍｍのアンピシリン含有Ｌ寒天プレート８つにプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに１０ｍｌのＬブロスを注入し、コロニーをまとめて掻き取った。各プレートを別個にプールして、それぞれ５，０００〜６，０００のコロニーを含むサブライブラリーを形成した。各サブライブラリー０．８ｍｌに０．２ｍｌのグリセロールを加え、凍結ストックとして−７０℃に維持した。Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚのミニプレップ操作（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２，ｐｐ３６８−３６９に記載）を用いて、但し操作全体を５倍にスケールアップして、各サブライブラリーの残り９ｍｌ中の細胞からプラスミドを単離した。最終ＤＮＡペレットを８．５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、９．３５ｇ  ＣｓＣｌ及び０．２５ｍｌエチジウムブロミド（５ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させた。ステップ１２と同様に勾配を形成してＤＮＡを精製した。サブライブラリーから精製したプラスミドをステップ１５と同様にＫａｓＩで消化し、アガロースゲル上を泳動させ、ブロットし、ｐＳｐｈ０．９でプローブした。８つのサブライブラリーのうち３つが所望の０．９ｋｂ  ＫａｓＩフラグメントを有しており、このフラグメントはプローブとして使用した０．９ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントにハイブリダイズした。これらのサブライブラリーから前記フラグメントを増幅するために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。プライマー１はＫａｓＩ部位の５’側のｐＵＣ１９配列の一部分と、ＫａｓＩ部位の３’側でクローニングされ且つ配列決定された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の領域とを含む：５’  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＧＧＧ  Ｃ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。プライマー２は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のＭ１３／ｐＵＣ逆配列決定プライマー（製品＃１２３３）である。クローニングベクターｐＵＣ１９の一部分を含むＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’セグメントを、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、各２００μＭのｄＮＴＰ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５％  ＤＭＳＯ中で、１ＵＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼとのＰＣＲ反応を、９５℃で１．５分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２分間で２０サイクル行うことによりサブライブラリーから増幅した。該反応混合物を０．７％アガロースゲルで電気泳動させた。約１．０〜１．２ｋｂの大きさのフラグメントをステップ１１と同様にＤＥＡＥペーパーを用いて精製した。精製フラグメントをＫａｓＩで消化し、ＫａｓＩ消化脱リン酸化ｐＵＣ１９中に連結した。得られた連結体を大腸菌ＥＤ８７６７中にエレクトロポレートさせ、アンピシリン含有Ｌ寒天にプレーティングした。Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前述の文献）を用いて３６の独立コロニー上でプラスミドＤＮＡミニプレップを調製した。３６のコロニーのうち１つが、正確な大き���の０．９ｋｂ挿入物を有するプラスミドを含んでいた。制限地図を作成したところ、該コロニーは正しい制限酵素部位を有していた。サザン分析の結果、新たに単離された前記コロニーはｐＳｐｈ０．９にハイブリダイズすることが判明した。これは、クローン化したフラグメントがおそらくは所望のフラグメントであることを意味するものである。前記０．９ｋｂ  ＫａｓＩフラグメントはＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分しか含んでいなかったため、遺伝子が再構築されるまではエンドヌクレアーゼ活性試験は不可能であった。該クローンをｐＥＧｓｐｈ４２−１．４と命名した（図３）。
【００５６】
１７．  ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼの再構築及び過剰発現：１０μｌ（５μｇ）のｐＥＧｓｐｈ４２−１．４を使用して制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築し、３μｌ（５μｇ）のｐＳｐｈ０．９を別個に１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．９）中３７℃で２時間にわたりＭｓｃＩで消化した。インキュベーション後、消化物をフェノール：クロロホルムの１：１混合物で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍容の９５％エタノールとで沈澱させた。エッペンドルフ遠心器で室温で５分間遠心してＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄した。該ペレットを１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２に再懸濁させた。ＭｓｃＩで消化したｐＳｐｈ０．９を、２０ＵのＸｂａＩの添加によって更に消化し、ＭｓｃＩで消化したｐＥＧｓｐｈ４２−１．４を２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩの添加によって更に消化した。３７°で２時間後、ＤＮＡを０．７％アガロースゲル上で泳動させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを製造業者の指示通りに使用して、ｐＳｐｈ０．９消化物から０．６ｋｂバンドを精製し、ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４消化物から１ｋｂバンドを精製した。これら２つのフラグメント（各々〜０．５μｇ）を１×リガーゼ緩衝液、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）中１２℃で１８時間連結反応させた（図４）。この連結フラグメントを、ＳｐｈＩメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主中で高コピープラスミド中にクローニングする試みは総て失敗に終わったため、再構築フラグメントを、調節した大腸菌プロモーターの後ろに直接クローニングしてみることにした。ＤＮＡ及びタンパク質の配列データを用いて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを形成した。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質の配列決定によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点であることが判明したＡＵＧコドンと重複する配列を含んでおり、２つの塩基が変化してＢｓｐＨＩ部位を形成していた：５’  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  Ｇ  ３’  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４。第２のオリゴヌクレオチドプライマーはｐＵＣ１９中のＫａｓＩ部位の左側に配列を含んでおり、増幅したフラグメントのクローニングを助けるためにＨｉｎｄＩＩＩ部位が該プライマー中に含まれている：５’  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣ  ３’ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５。これら２つのプライマーを、ｐＳｐｈ０．９及びｐＥＧｓｐｈ４２−１．４（既述）由来の連結フラグメントと一緒に、１ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを増幅するためのＰＣＲ（ステップ１６の条件を使用する）で鋳型として使用した。ステップ１１と同様にＤＥＡＥペーパーを用いてバンドを精製した。精製したＰＣＲ生成物を１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４中で２ＵのＢｓｐＨＩで２時間消化し、次いで１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中で２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＥＡＥペーパーを用いてアガロースゲルから精製した（図４）。精製フラグメント（〜０．１μｇ）を、４００ＵのＴＡ  ＤＮＡリガーゼを用いて３７℃で２時間��わたり総量４０μｌでＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（〜０．０５μｇ）で消化したＰｔａｃ発現ベクターｐＡＧＲ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｗ．Ｊａｃｋから入手）中に連結した。（ｐＡＧＲ３は、アンピシリン耐性遺伝子とｌａｃＩｑの単一コピーと、Ｐｔａｃプロモーターと、リードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写を防止するためのＰｔａｃプロモーターの上流のｒｒｎｂターミネーターの４倍直接反復（４  ｆｏｌｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）と、ｌａｃリボソーム結合部位の下流のＮｃｏＩ部位とを含むｐＢＲ３２２ベースのベクターである。）ｐＳＹＸ２０上のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子を有するコンピテント大腸菌ＥＤ８７６７を形質転換するために前記連結体を２０μｌ使用した。［ＮｌａＩＩＩメチル化認識部位ＣＡＴＧはＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位と重複するため宿主をＳｐｈＩ消化から防護する。ｐＳＹＸ２０（ＡＴＣＣ＃７５２６０）はｐＳＣ１０１複製開始点上にＫａｎｒ及びＴｃｒ遺伝子を有する中間コピー数プラスミドである。Ｔｃｒ遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子はＴｃプロモーターから構築的に発現できる。］形質転換細胞を３７℃で３０分間増殖させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含むＬ寒天にプレーティングした。３６のコロニーを採取し、独立したコロニーを単離すべく、アンピシリン及びカナマイシン含有Ｌ寒天上で画線培養した。ステップ８のミニプラスミドプレップ操作を用いて個々のコロニーからプラスミドを単離した。各ミニプレップ５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ消化物をｐＡＧＲ３のＨｉｎｄＩＩＩ消化物と比較した。３６のクローンのうち２４がｐＡＧＲ３より大きいプラスミドを有していると思われた。特徴を更に調べるために、これらのクローンから６つを選択した。これら６つのクローンをアンピシリン及びカナマイシン含有Ｌブロス２００ｍｌ中でＫｌｅｔｔ６０（中間対数期）まで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導後２時間で培養液を５０ｍｌ採取した。遠心分離によって細胞を回収し、音波処理用冷却緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  アジ化ナトリウム）で１回洗浄し、ペレットを−７０℃で凍結した。３０分後、ペレットを氷上で解凍し、細胞１ｇ当たり３ｍｌの音波処理用緩衝液に再懸濁させ、氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍで１時間遠心した。各抽出物１μｌを、１２μｌのｐＢＲ３２２（１２μｇ）と９０μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２と２２．５μｌのＰｓｔＩ（２０Ｕ／μｌ）とを含むＤＮＡ混合物４９μｌと混合し、水で９００μｌにした。該試験管から２５μｌを採取して２５μｌのＤＮＡ混合物と混合し、１：１の希釈を行った。１：１希釈を更に３回続けて行った。該反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。２５μｌの反応混合物全部を０．７％アガロースゲル上で泳動させた。粗細胞抽出物からの力価を、精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼからの既知の力価と比較した。６つのクローンのうち１つは、検出可能なＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を殆ど又は全く示さなかった。これに対し、５つのクローンはＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性が大きすぎて、該アッセイでは力価を正確に測定することができなかった。しかしながら、該酵素の力価は細胞１ｇ当たり１０５単位を超えると推定された。更に滴定したところ、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性は約１．５×１０７〜３×１０７であった。この値は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓの粗抽出物で観察される細胞１ｇ当たりのＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の約１０００倍以上である。特徴を更に調べ且つ最適化するために前記クローンから選択した１つのクローンに株名ＮＥＢ＃８０８を付与し、プラスミドはｐＧＥｓｐｈ５０−２と命名した。ＮＥＢ＃８０８の試料を、１９９２年８月５日にＭａｒｙｌａｎｄ，ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した。受託番号は６９０４５である。ＮＥＢ＃８０８の粗抽出物から得たＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図５に示す。
【００５７】
１８．  ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼは次の方法でＮＥＢ＃８０８から産生し得る。まず、アンピシリン及びカナマイシン含有豊栄養培地を入れた発酵槽で中間対数期まで増殖させる。次いでＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加することにより前記培地を誘導し、１〜２時間増殖させ続ける。その後、遠心分離によって細胞を回収する。
【００５８】
１９．  ＮＥＢ＃８０８からのＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼの精製：以下の操作は総て氷上又は４℃で実施した。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ６．９、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ    β−メルカプトエタノール、５％グリセロール）２９１ｍｌに細胞９７ｇを再懸濁させ、１１，５００ＰＳＩＧでフレンチプレスに１回通して破壊した。該抽出物を１２，０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心し、得られた上清を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（５×１０ｃｍ）に通した。素通り液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を集め、緩衝液Ａで１：１で希釈し、０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（５×８ｃｍ）にかけた。該カラムを、０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ  ３５０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ８００ｍｌと１Ｍ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ  ８００ｍｌとで調製した塩化ナトリウム直線勾配にかけた。フラクションを流速５ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピークをプールし、０．５５〜０．７５Ｍ  ＮａＣｌでカラムから溶離した。５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａに対して一晩透析した後、プールした酵素を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ（登録商標）ＨＲ  １０／１０（８ｍｌ）に充填した。フラクションを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピークをプールし、０．３〜０．３５Ｍ  ＮａＣｌでカラムから溶離した。該プールを緩衝液ＡでＮａＣｌ濃度５０ｍＭまで希釈し、ＴＳＫ−ヘパリンＴｏｓｏＨａａｓ  ５ＰＷカラム（７．５ｃｍ×７．５ｍｍ  ＩＤ）に充填した。フラクションを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピークを０．４２〜０．５Ｍ  ＮａＣｌでカラムから溶離した。活性を含むフラクションをプールし、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール）に対して透析することにより濃縮した。この精製方法では合計１０．８×１０６単位の酵素が得られた。収率は１％である。
【００５９】
前記精製方法によって得たＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度を下記の基準に従って調べた。
【００６０】
１）連結反応：λＤＮＡの２０倍過剰消化後には、産生したＤＮＡフラグメントの９５％以上がＴ４  ＤＮＡリガーゼに連結した（５’末端濃度は１６℃で１〜２μＭ）。これらの連結フラグメントの９５％は再切断が可能であった。２）長時間の消化：１μｇのλＤＮＡと１０単位の酵素とを含む５０μｌの反応混合物を１６時間インキュベートすると、１単位の酵素で１時間反応させた場合と同じパターンのＤＮＡバンドが形成された。３）エキソヌクレアーゼ活性：音波処理した３  Ｈ  ＤＮＡ（１０５    ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む５０μｌの反応液中３７℃で４時間にわたり３，０００単位の酵素をインキュベートすると、０．０１％未満の放射能が放出された。４）エンドヌクレアーゼ汚染：１μｇのΦＸ１７４ＲＦＩ  ＤＮＡを含む５０μｌの反応液中３７℃で４時間にわたり１５０単位の酵素をインキュベートすると、２５％未満がＲＦ  ＩＩに転換した。試験は総て次の反応緩衝液中で実施した：５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨは２５℃で７．９）。
【００６１】
【配列表】
配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１
配列の長さ：２３５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【００６２】
【化１】
0003578781.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：２６９２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：７０３．．１６５３
他の情報：／ｎｏｔｅ＝「メチラーゼ遺伝子は位置７０３で始まり１６５３で終わる。制限エンドヌクレアーゼは位置１７０３で始まり２４１０で終わる」
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１７０３．．２４１０
配列
【００６３】
【化２】
0003578781.tif 000003
【００６４】
【化３】
0003578781.tif 000004
【００６５】
【化４】
0003578781.tif 000005
【００６６】
【化５】
0003578781.tif 000006
配列番号：３
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６７】
【化６】
0003578781.tif 000007
配列番号：４
配列の長さ：２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６８】
【化７】
0003578781.tif 000008
配列番号：５
配列の長さ：２６塩基対
配列の型：核酸
鎖の長さ：不明
トポロジー：不明
配列
【００６９】
【化８】
0003578781.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン化し産生するための好ましい方法の説明図である。クローニングプロジェクトに着手した時には、ＳｐｈＩ制限−修飾系のクローニングでどのエンドヌクレアーゼ又は条件が有利であるかも、またこれらのクローンにおける制限及び修飾遺伝子の位置も不明であった。図１及び実施例１に記載のクローニングの結果及びＤＮＡの配列決定、マッピング並びにクローンの特徴分析は、当初不明であったＳｐｈＩ制限−修飾系のクローニング及び発現の直接的経路を明らかにするものである。
【図２】ＰｓｔＩライブラリーのメチラーゼ選択によって得たＰｓｔＩの部分的クローンｐＳｐｈＭ６．０の地図である。
【図３】Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡから調製したＫａｓＩライブラリーからＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを単離する方法を簡単に示す説明図である。図面上部に示されている点々模様の大きな四角い枠はＫａｓＩライブラリーを表し、該枠内の２つの円は種々のクローンの中の２つのプラスミドであって、（円内に長い矢印で示されているように）ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含んでいる。矢頭は、ＫａｓＩライブラリーから所望のフラグメントを増幅するのに使用されるプライマーの位置を示している。プラスミド上の小さな四角い枠はベクター上の多重クローニング部位の位置を示す。
【図４】ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４と、ｐＥＧｓｐｈＲ５０−２を得るための制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の最構築及びＰＣＲとを簡単に示す説明図である。ｐＳｐｈＭ０．９はｐＵＣ１９にクローニングされたｐＳｐｈＭ６．０からの０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントである。ｐＳｐｈＭ０．９の地図に示されているＸｂａＩ部位はベクター内の部位であり、ＳｐｈＩ制限修飾系をコードするＤＮＡの一部分ではない。ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４内の点線は、地図上の該領域がベクターｐＵＣ１９に由来するものであることを示している（ＨｉｎｄＩＩＩ部位も含まれる）。再構築エンドヌクレアーゼ遺伝子の下に記されている太枠で囲まれた矢印は、過剰発現用にｐＥＧｓｐｈＲ５０−１を構築するためにエンドヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲに使用されるプライマーの位置及び方向を示している。
【図５】ＮＥＢ＃８０８の細胞抽出物から得たＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の力価をアガロースゲルの電気泳動写真で示す説明図である。ゲルのレーンの番号付けは左から右に向かって行われ、ゲルの左側のレーンが１、右側のレーンが２５である。１６μｌのｐＢＲ３２２（１６μｇ）と８０μｌの１０Ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ２と、１０μｌのＰｓｔＩ（２００Ｕ）とを混合し無菌水で８００μｌにしてＤＮＡ混合物を形成した。ＮＥＢ＃８０８から調製した粗抽出物１μｌを４９μｌのＤＮＡ混合物に加えた（図５、レーン１）。混合後、該試験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と一緒に第２の試験管に加えた（図５、レーン２）。第２の試験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と一緒に第３の試験管に加えた（図５、レーン３）。第３の試験管から２５μｌを採取し、２５μｌのＤＮＡ混合物と一緒に第４の試験管に加えた（図５、レーン４）。１：１の希釈を更に６回行った（図５、レーン５〜１６）。同様の１：１希釈をＳ．Ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓから精製した１μｌのＳｐｈＩについて行い（図５、レーン１８〜２５）、粗抽出物中の酵素の力価を評価した。３７℃で１時間インキュベートした後、各希釈物を２５μｌずつ０．７％アガロースゲル上に充填し、２時間泳動させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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