(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤。
【請求項２】
リンパ球がＴ細胞である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
リンパ球がＢ細胞である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤。
【請求項５】
抗体がヒト抗体定常領域を有する、請求項４に記載の抑制剤。
【請求項６】
抗体がキメラ抗体またはヒト型化抗体である、請求項４又は５に記載の抑制剤。
【請求項７】
抗体が抗ＨＭ１．２４抗体である、請求項４に記載の抑制剤。
【請求項８】
抗体がキメラ抗ＨＭ１．２４抗体である、請求項６に記載の抑制剤。
【請求項９】
抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体である、請求項６に記載の抑制剤。
【請求項１０】
抗体が抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープと特異的に結合する、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項１１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、リンパ球活性化関与疾患の予防・治療剤。
【請求項１２】
リンパ球活性化関与疾患が自己免疫疾患、臓器等移植時の拒絶反応、またはアレルギーである、請求項１１に記載の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なリンパ球活性化抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人間の生きている環境には、ウイルス、細菌、カビ、寄生虫等のおびただしい種類の感染性の微生物が存在している。そのいずれかが生体内で増殖すると病気の原因となり、ひいては個体の死をももたらす。従って、個体が健康的に生活するためには、これら外因性の微生物などから生体を防御する機構が必要となる。この機構が「免疫」と呼ばれるものである。
生体において主に免疫を担当するのがリンパ球細胞である。リンパ球細胞は、その機能によりＴリンパ球（Ｔ細胞）とＢリンパ球（Ｂ細胞）に大別される。Ｔ細胞は抗原提示能、細胞障害能等を、Ｂ細胞は抗体産生能を有していると考えられている。これら２種のリンパ球は全て同じ血液幹細胞に由来し、骨髄中あるいはその他の器官で様々な分化、または増殖因子の作用を受けて分化を繰り返した後、末梢血中へ放出される。
【０００３】
例えば、Ｔ細胞の場合、骨髄中で造血幹細胞が前Ｔ細胞に分化した後胸腺へと移行し、さらに分化を繰り返し成熟Ｔ細胞になる。その後抗原の刺激により活性化され、増殖能あるいは細胞障害能等を有する活性化Ｔ細胞となる。一方、Ｂ細胞の場合、骨髄中で造血幹細胞がＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６  等のサイトカインの刺激によりプロＢ細胞、プレＢ細胞を経て成熟Ｂ細胞に分化し、さらに抗原刺激を受けて活性化され、最終的に抗体産生能を有する形質細胞となる。
【０００４】
従って、リンパ球がそれぞれの機能を発揮するためには最終的な活性化が必須である。前述の通り、免疫は外来の異物から生体を防御することが目的であることから、巧みな機構により異物（非自己）と自己を認識し、非自己のみを抗原として反応する仕組みになっている。ところがこの機構が何らかの原因で破綻し、自己をも抗原と認識するようになった結果起こる疾患が自己免疫疾患である。また、非自己に対し免疫反応が過度に、あるいは不適当な形で起こり、その結果組織障害を引き起こす状態をアレルギーという。
【０００５】
一方、他人の臓器等を移植した場合、それを非自己と認識し排除しようとする反応（拒絶反応）は、生体の正常な機構ともいえる。個体間には遺伝学的に違いがあることが知られており、その代表的なものが主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ  ）と呼ばれるものである。ＭＨＣ  が異なる個体からの臓器移植は、大きな拒絶反応を引き起こす。近年の医療技術の進歩により、白血病、あるいはリンパ腫治療時の骨髄移植、末期腎疾患患者に対する腎移植、さらには角膜移植等、臓器等の移植の必要性は非常に大きなものとなっている。それに伴い、拒絶反応をいかに抑制するかも大きな問題といえる。
【０００６】
多くの実験や研究により、リンパ球の活性化からそれに起因する疾患に至る経路が解明されつつあり、それに伴い、リンパ球活性化関与疾患に対する多くの治療薬が開発されている。現在リンパ球活性化に起因する自己免疫疾患のうち、慢性関節リウマチや全身性エリトマトーデス、さらには強皮症に対してアスピリンのような非ステロイド性抗炎症薬やステロイド剤、アザチオプリンのような免疫抑制剤が使用されている。
【０００７】
また、臓器等移植時の拒絶反応を抑制する目的で、主に腎移植や骨髄移植の際にサイクロスポリンやアザチオプリン、ミゾリビン等の免疫抑制剤が使用されている。さらに、アレルギーの治療薬としては抗ヒスタミン薬や、アレルギーの原因となる化学物質の遊離を抑制する化学伝達物質遊離抑制薬等が用いられている。しかし、これらのうち非ステロイド性抗炎症薬やステロイド剤、抗ヒスタミン薬や化学伝達物質遊離抑制薬はいずれも本疾患の原因であるリンパ球の活性化に対しては何ら作用せず、あくまで炎症を押さえる対症療法に過ぎないことから、本疾患を根本的に治療するものではない。
【０００８】
また、現在使用されている免疫抑制剤はその性質上、血球数減少やショック等の重篤な副作用を有するものも多く、未だ十分とは言い難い。さらに、自己免疫疾患の多くは現在も治療法や治療薬が全く無いのも現実である。
一方、Ｇｏｔｏ，  Ｔ．らは、ヒト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）を報告している（Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４，  １９２２−１９３０）。ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗ＨＭ１．２４抗体を投与すると、この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこと（小阪昌明ら、日本臨床  （１９９５）  ５３，  ６２７−６３５  ）から、抗ＨＭ１．２４抗体はラジオアイソトープ標識による腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。しかし、抗ＨＭ１．２４抗体がリンパ球の活性化抑制に関与することは知られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
現在用いられているリンパ球活性化関与疾患の治療薬には、種々の抗炎症剤や免疫抑制剤が挙げられるが、上記のごとく、未だ十分とは言い難く、これら疾患を治療し患者の苦痛を緩和する治療剤が待たれている。従って、本発明の目的は、リンパ球活性化抑制剤を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、所期の目的を達成すべく、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．ら  Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４．  １９２２−１９３０）を用いて、ＦＣＭ  （フローサイトメトリー）解析、Ｔ細胞の幼若化反応に対する作用、Ｂ細胞の抗体産生に対する作用、さらには抗ＨＭ１．２４抗体が特異的に結合する抗原蛋白質単離の研究を重ねた結果、抗ＨＭ１．２４抗体が認識する抗原タンパク質が活性化リンパ球に発現していること、および抗ＨＭ１．２４抗体がリンパ球の活性化を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、Ｔ細胞またはＢ細胞の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する、ヒト抗体定常領域を有する抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、キメラ抗体またはヒト型化抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体またはヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
【００１３】
本発明はまた、抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープと特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、リンパ球の活性化抑制剤を提供する。
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、リンパ球活性化関与疾患の予防・治療剤を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾患、臓器等移植時の拒絶反応、アレルギーの予防・治療剤を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
１．  抗体の作製
１−１．  ハイブリドーマの作製
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＨＭ１．２４抗原蛋白質やＨＭ１．２４抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１５】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原であるＨＭ１．２４抗原発現細胞としては、ヒ卜多発性骨髄腫細胞株であるＫＰＭＭ２  （特開平７−２３６４７５）やＫＰＣ−３２（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （１９９１）  ３２，  １４００  ）を用いることができる。また、感作抗原として配列番号１  に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。
【００１６】
なお、感作抗原として使用される、配列番号１  に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡはｐＵＣ１９  ベクターのＸｂａＩ切断部位に間に挿入されて、プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  として調製されている。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、平成５  年（１９９３年）１０月５  日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  ）として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平７−１９６６９４参照）。このプラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９  に含まれるｃＤＮＡ断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗ＨＭ１．２４抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを作製することができる。
【００１７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ  （Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００１８】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．  （１９７９）  １２３：  １５４８−１５５０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９７８）  ８１：  １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）  ６：  ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．  Ｄ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９７６）  ８：  ４０５−４１５  ）、ＳＰ２／０  （Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７８）  ２７６：  ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８０）  ３５：  １−２１  ）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，  Ｉ．  Ｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （１９７８）  １４８：  ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９）  ２７７：  １３１−１３３  ）等が適宜使用される。
【００１９】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８１）  ７３：  ３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ）、センダイウィルス（ＨＶＪ  ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００２０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ  培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ  ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ  溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ  溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ  ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００２１】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ  培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ  培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。
【００２２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をインビトロでＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、ＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８  参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＨＭ１．２４抗原またはＨＭ１．２４抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７  、ＷＯ  ９２／０３９１８  、ＷＯ  ９４／０２６０２  、ＷＯ  ９４／２５５８５  、ＷＯ  ９６／３４０９６  、ＷＯ  ９６／３３７３５  参照）。
【００２３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２４】
具体的には、抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマの作製は、Ｇｏｔｏ，  Ｔ．らの方法（Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４．  １９２２−１９３０）により行うことができる。工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成７  年９  月１４日にＦＥＲＭＢＰ−５２３３としてブタペスト条約に基づき国際寄託された抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、１０％ウシ胎児血清、５  ％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地、ハイブリドーマＳＦＭ  培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ  培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）等で培養し、その培養上清から抗ＨＭ１．２４抗体を精製する方法で行うことができる。
【００２５】
１−２．  組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，  Ａ．  Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  Ｊａｍｅｓ，  Ｗ．  Ｌａｒｒｉｃｋ，  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，  １９９０  参照）。
【００２６】
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ  ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７９）  １８，  ５２９４−５２９９  ）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９８７）  １６２，  １５６−１５９）等により全ＲＮＡ  を調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
【００２７】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ  領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲ  を用いた５’−ＲＡＣＥ  法（Ｆｒｏｈｍａｎ，  Ｍ．  Ａ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８８）  ８５，  ８９９８−９００２  ；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，  Ａ．  ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８９）  １７，  ２９１９−２９３２  ）を使用することができる。得られたＰＣＲ  産物から目的とするＤＮＡ  断片を精製し、ベクターＤＮＡ  と連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡ  の塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【００２８】
目的とする抗体のＶ  領域をコードするＤＮＡ  が得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ  領域）をコードするＤＮＡ  と連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ  領域をコードするＤＮＡ  を、抗体Ｃ  領域のＤＮＡ  を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００２９】
１−３．  改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ  領域をコードするＤＮＡ  をヒト抗体Ｃ  領域をコードするＤＮＡ  と連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３  、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６  参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００３０】
例えば、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域およびＨ  鎖Ｖ  領域をコードするＤＮＡ  を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（  ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（  ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１  ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成８  年８  月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４６およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平９−２７１５３６参照）。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ  ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３  、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６  参照）。
【００３１】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲ  とヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ  配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ  法により合成する。得られたＤＮＡ  をヒト抗体Ｃ  領域をコードするＤＮＡ  と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００  、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６  参照）。
ＣＤＲ  を介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （１９９３）  ５３，  ８５１−８５６）。
【００３２】
例えば、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域ａバージョン（配列番号：２）およびＨ  鎖Ｖ  領域ｒバージョン（配列番号：３）をコードするＤＮＡ  を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成８  年８  月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４３としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平９−２７１５３６参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＨ  鎖Ｖ  領域ｓバージョン（配列番号：４）をコードするＤＮＡ  を含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成９  年（１９９７年）９  月２９日にＦＥＲＭ  ＢＰ−６１２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平９−２７１５３６参照）。キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ  領域が使用され、特に好ましいヒト抗体定常領域としてヒトＣ  γを使用することができる。
【００３３】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ  領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；  ＦＲ）およびＣ  領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体が挙げられる（特願平９−２７１５３６参照）。ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域の好ましい具体例としては、配列番号２に示される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＨ  鎖Ｖ  領域の好ましい具体例としては、配列番号３又は４に示される塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００３４】
１−４．  発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡ  シグナルを機能的に結合させたＤＮＡ  あるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ）を挙げることができる。
【００３５】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ  ４０  ）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１  α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ  ４０  プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９）  ２７７，  １０８）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９０）  １８，  ５３２２）に従えば容易に実施することができる。
【００３６】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  （１０９８）  ３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  （１９９２）  ６，  ２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８８）  ２４０，  １０４１−１０４３  ）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，  Ｓ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （１９８７）  １６９，  ４３７９  ）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
【００３７】
複製起源としては、ＳＶ  ４０  、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ  ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ  ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、インビトロおよびインビボの産生系がある。インビトロの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００３８】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）  哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ  、ＣＯＳ  、ミエローマ、ＢＨＫ  （ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）  両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）  昆虫細胞、例えば、ｓｆ９  、ｓｆ２１、Ｔｎ５  などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ）などが知られている。
【００３９】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をインビトロで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ  、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ  ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、インビボにて抗体を産生してもよい。
【００４０】
一方、インビボの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，  ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９３  ）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。
【００４１】
植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ  断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。
【００４２】
トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，  Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９４）  １２，  ６９９−７０２  ）。また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｓｕｓｕｍｕ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８５）  ３１５，  ５９２−５９４  ）。
さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，  Ｋ．−Ｃ．  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９４）  ２４，  １３１−１３８）。
【００４３】
上述のように、インビトロまたはインビボの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ  鎖）または軽鎖（Ｌ  鎖）をコードするＤＮＡ  を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ  鎖およびＬ  鎖をコードするＤＮＡ  を単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４−１１５２３  参照）。
上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ）等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００４４】
２．  抗体の分離、精製
２−１．  抗体の分離、精製
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡ  カラム、プロテインＧ  カラムが挙げられる。プロテインＡ  カラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  、ＰＯＲＯＳ  、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。
【００４５】
その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣに適用することができる。また逆相ＨＰＬＣを用いることができる。
【００４６】
２−２．  抗体の濃度測定
２−１  で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ  等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプルをＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０  ｎｍの吸光度を測定し、１  ｍｇ／ｍｌ  を１．３５  ＯＤ  として算出する。また、ＥＬＩＳＡ  による場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ  重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６  ）で１  μｇ／ｍｌ  に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  （ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００  μｌ  を９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化する。
【００４７】
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ製）１００  μｌ  を添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ  （ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００  μｌ  を加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）を用いて４０５ｎｍ  での吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
【００４８】
３．  細胞の調製
本発明で用いる細胞は、以下の方法で調製することができる。
３−１．  ヒ卜末梢血リンパ球画分の調製
健常人より採取した末梢血液をＰＢＳ（−）で１／２  希釈後、５０  ｍｌ  遠心チューブ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ製）中でＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）に重層し４５０  ｘ  ｇ  、室温で４０分間遠心した後、境界層の単核球画分を分離する。同画分を１０％  牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）で適当密度に調製後、プラスチックシャーレ中で３７℃、５％ＣＯ２条件下にて１時間インキュベー卜する操作を２  度行うことにより、シヤーレに付着した細胞を除去する。残った非付着性の細胞をヒ卜末梢血リンパ球画分として以下の実験に用いることができる。
【００４９】
３−２．  ＳＡＣによるヒ卜末梢血Ｂ  細胞の活性化
上記の通り調製したヒ卜末梢血リンパ球をポリプロピレンチューブ中、５  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で１  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６存在下、あるいは非存在下で０．０ｌ  ％  ＳＡＣ（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．  製）と２  日間、３７℃、５％  ＣＯ２条件下でインキュべー卜することで、末梢血リンパ球中のＢ  細胞を活性化することができる。
３−３．ヒ卜末梢Ｔ  細胞の精製
ヒ卜末梢Ｔ  細胞は３−１  で調製したヒ卜末梢血リンパ球からＣｅｌｌｅｃｔ  Ｈｕｍｍ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏｔｅｘ製）を用いて、添付の方法に従い精製することができる。
【００５０】
３−４．ＰＨＡ  刺激によるヒ卜抹消血Ｔ  細胞の活性化
上記３−３  で精製したＴ  細胞を２％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し２４穴培養プレート中  １  ｘ  １０６  ｃｅｌｌ／１  ｍｌ／ｗｅｌｌ  の細胞密度で、１  あるいは１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ  （Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ  製）を添加し３７℃、５％ＣＯ２  条件下、４  日間培養することで末梢血リンパ球中のＴ  細胞を活性化することができる。
【００５１】
４．  ＦＣＭ  解析
リンパ球細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、ＦＣＭ  （フローサイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、新鮮分離細胞あるいはそれをさらに培養した細胞を用いることができる。例えば新鮮分離細胞として、末梢血単核球、末梢血リンパ球、末梢血Ｔリンパ球、末梢血Ｂリンパ球などを用いることができる。
【００５２】
上記細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、  ＦＡＣＳ  緩衝液（２  ％ウシ胎児血清、０．１  ％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））で２５μｇ／ｍｌ  に希釈した抗ＨＭ１．２４抗体あるいはコントロール抗体  １００μｌ  を加え、氷温下３０分インキュベートする。ＦＡＣＳ  緩衝液で洗浄した後、２５μｇ／ｍｌ  のＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  製）１００  μｌ  を加え、氷温下３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ  緩衝液で洗浄した後、６００  μｌ  のＦＡＣＳ  緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
【００５３】
５．  効果の確認
リンパ球はその活性化に伴いＴ細胞では幼若化反応が、またＢ細胞では抗体産生が認められる。また、両細胞とも活性化に伴い、細胞表面の種々の抗原マーカーの出現あるいは消失が観察される。従って、本発明のリンパ球活性化抑制剤の効果を確認するには、本発明で使用される抗体をＴ細胞に添加し幼若化反応を抑制すること、また、本発明で使用される抗体をＢ細胞に添加し抗体産生を抑制すること、あるいは本発明で使用される抗体をリンパ球に添加し細胞表面の抗原マーカーの発現の変化を評価することにより行うことができる。
【００５４】
５−１．Ｔ細胞の幼若化反応に対する抗ＨＭ１．２４抗体の効果
前述の通り精製したヒ卜末梢Ｔ  細胞を、２％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し９６穴培養プレート中  １  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、１  μｇ／ｍｌのＰＨＡ  （Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ  製）及び抗ＨＭ１．２４抗体またはコントロールマウスＩｇＧ２ａ  ２０μｇ／ｍｌと共に３７℃、５％ＣＯ２  条件下、４  日間培養し、３Ｈ−  チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を  １μＣｉ／ｗｅｌｌ  添加し、  ４  時間後の取り込みをβ−ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）で測定すればよい。
【００５５】
５−２．Ｂ細胞の抗体産生に対する抗ＨＭ１．２４抗体の効果
前述の通り調製したヒ卜末梢血リンパ球をポリプロピレンチューブ中、５  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で  ０．０ｌ  ％  ＳＡＣ  （Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．  製）と２  日間、３７℃、５％  ＣＯ２条件下でインキュべー卜することで、末梢血リンパ球中のＢ  細胞を活性化する。ＳＡＣ  処理した末梢血リンパ球を１０％  牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し９６穴培養プレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ製）で  ｌ  ｘ  １０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、抗ＨＭ１．２４抗体またはコントロールマウスＩｇＣ２ａ  ２０μｇ／ｍｌと共に３７℃、５％ＣＯ２  条件下６  日間培養した後、培養上清を回収する。
【００５６】
本培養上清中のＩｇＧ  濃度は、ヒ卜ＩｇＧ  特異的ＥＬＩＳＡ  で測定することができる。即ち、０．１Ｍ  重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６  ）で１  μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  （ＴＡＧＯ製）１００  μｌ  を９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化する。ブロッキングの後、適当に希釈した培養上清あるいは標品としてヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ製）１００  μｌ  を添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
【００５７】
洗浄後、２０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ製）１００  μｌ  を加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）を用いて４０５ｎｍ  での吸光度を測定すればよい。
５−３．  細胞表面抗原マーカーの解析
前述の通り調製したヒ卜末梢血リンパ球、あるいはヒ卜末梢Ｔ  細胞を、５−１  または５−２  の通りＰＨＡ  またはＳＡＣ  および抗ＨＭ１．２４抗体またはコントロールマウスＩｇＧ２ａ  とともに培養する。これら細胞を、活性化の前後で発現が変化する細胞表面抗原マーカー、たとえばＣＤ１０，  ＣＤ２５，  ＣＤ３８，  ＣＤ４０，  ＣＤ４７，  ＣＤ５４，  ＣＤ９８，  ＰＣＡ−１，ＨＭ１．２４抗原等を認識する抗体と反応させる。これを前述４  の通りＦＣＭ  解析すればよい。
【００５８】
５−４．  効果の確認と関連疾患
後述の実施例に示されるように、活性化リンパ球にＨＭ１．２４抗原が発現していること、また抗ＨＭ１．２４抗体の添加によりＴリンパ球の幼若化の抑制、さらにはＢリンパ球の抗体産生抑制が認められた。これらのことから、抗ＨＭ１．２４抗体はリンパ球の活性化を抑制する効果を有することが示された。
【００５９】
一方、リンパ球の活性化が関与する疾患としては、自己免疫疾患、臓器等の移植時の拒絶反応、アレルギーが挙げられる。具体的には自己免疫疾患として橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン（Ａｄｄｉｓｏｎ  ）病、早発性閉経、インスリン依存性糖尿病、グッドパスツール（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ  ）症候群、重症筋無力症、男性不妊症、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体原性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、原発性胆汁性肝硬変症、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変症、潰瘍性大腸炎、シューグレン症候群、慢性関節リウマチ、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、円板状エリトマトーデス、全身性エリトマトーデス等が挙げられる（廣瀬俊一ら監訳、臨床免疫学イラストレイテッド（１９９４）南江堂）。
【００６０】
臓器等の移植時の拒絶反応として、腎、肝、心移植時の拒絶反応、角膜移植時の上皮性、あるいは内皮性拒絶反応、骨髄移植時のＨＶＤ  、あるいはＧＶＨＤ等が挙げられる（廣瀬俊一ら監訳、臨床免疫学イラストレイテッド（１９９４）南江堂）。アレルギーとして、アトピー疾患に代表されるＩ型アレルギー、薬物アレルギーに見られるＩＩ型アレルギー、各種の腎炎を引き起こすＩＩＩ  型アレルギー、化粧品や金属による皮膚炎などに代表されるＩＶ型アレルギーが挙げられる（畔柳武雄ら、新免疫学叢書（７）  免疫とアレルギー（１９８１）医学書院）。従って、本発明の治療剤は、これらリンパ球活性化関与疾患の治療剤として有用である。
【００６１】
６．  投与経路および製剤
本発明のリンパ球活性化抑制剤は、非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１  Ｋｇあたり０．０１  ｍｇ  から１００  ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１  〜１０００  ｍｇ  、好ましくは５  〜５０  ｍｇ  の投与量を選ぶことができる。本発明のリンパ球活性化抑制剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【００６２】
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ  ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１． 抗ＨＭ１．２４抗体の作製
１．抗ＨＭ１．２４抗体を含むマウス腹水の調製
抗ＨＭ１．２４抗体産生ハイブリドーマをＧｏｔｏ，  Ｔ  らの方法（Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４．  １９２２−１９３０）に従い得た。
【００６４】
あらかじめ１１、３  日前に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（和光純薬工業製）をそれぞれ５００  μｌ  ずつ腹腔内に投与したＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア製）に、本ハイブリドーマ５  ｘ  １０６  個を腹腔内に注入した。ハイブリドーマ注入後１０日目より、マウスの腹腔内に溜った腹水を１９ゲージの留置針ハッピーキャス（メディキット製）で採取した。採取した腹水は、低速遠心機ＲＬＸ−１３１  （トミー精工製）を用いて回転数１０００、３０００  ｒｐｍで２  回遠心し、ハイブリドーマ、血球等の雑排物を除去した。
【００６５】
２．マウス腹水からの抗ＨＭ１．２４抗体の精製
上記マウス腹水からの抗ＨＭ１．２４抗体の精製は以下の方法で行った。マウス腹水に等量のＰＢＳ（−）を加えた後、中空糸フィルターメディアプレップ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  製）を用いてろ過した後、高速抗体精製装置ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  製）およびＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラム（カラム体積  ２０  ｍｌ、日本ガイシ製）を用い、付属の説明書に基づき吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１  Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は直ちに１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）  を添加してｐＨ７．４  付近に調整した後、遠心限外濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  を用いて濃縮およびＰＢＳ（−）への緩衝液置換を行い、孔径０．２２μｍ  のメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  製）でろ過滅菌し、精製抗ＨＭ１．２４抗体を得た。
【００６６】
３．  コントロールマウスＩｇＧ２ａ  の精製
コントロールマウスＩｇＧ２ａ  の精製は以下の方法で行った。市販のマウスＩｇＧ２ａ（ＫＡＰＰＡ）（ＵＰＣ  １０）腹水（ＣＡＰＰＥＬ製）を精製水およびＰＢＳ（−）で溶解した。これを孔径０．２  μｍ  のメンブランフィルターＡｃｒｏｄｉｓｃ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  製）を用いてろ過した後、高速抗体精製装置ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  製）およびＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラム（カラム体積  ２０  ｍｌ、日本ガイシ製）を用い、付属の説明書に基づき吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１  Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４）を用いてアフィニティー精製した。
【００６７】
溶出画分は直ちに１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）  を添加してｐＨ７．４  付近に調整した後、遠心限外濃縮器Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０  を用いて濃縮およびＰＢＳ（−）への緩衝液置換を行い、孔径０．２２μｍ  のメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  製）でろ過滅菌し精製コントロールマウスＩｇＧ２ａ  を得た。
４．  抗体濃度の測定
精製抗体の濃度測定は吸光度の測定により行った。すなわち、精製抗体をＰＢＳ（−）で希釈した後、２８０  ｎｍの吸光度を測定し、１  ｍｇ／ｍｌ  を１．３５  ＯＤ  として算出した。
【００６８】
実施例２．    ＳＡＣ  刺激ヒ卜末梢血Ｂ  細胞の抗体産生に対する抗ＨＭｌ．２４抗体の効果
１．  ヒ卜末梢血リンパ球画分の調製
健常人より採取した末梢血液をＰＢＳ（−）で１／２  希釈後、５０  ｍｌ  遠心チューブ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ製）中でＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）に重層し４５０  ｘ  ｇ  、室温で４０分間遠心した後、境界層の単核球画分を分離した。同画分を１０％  牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  製）で適当密度に調製後、プラスチックシヤーレ中で３７℃、５％ＣＯ２条件下にて１時間インキュベー卜する操作を２  度行うことにより、シヤーレに付着した細胞を除去した。残った非付着性の細胞をヒ卜末梢血リンパ球画分として以下の実験に用いた。
【００６９】
２．  ＳＡＣによるヒ卜末梢血Ｂ  細胞の活性化
上記の通り調製したヒ卜末梢血リンパ球をポリプロピレンチューブ中、５  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で１  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６存在下、あるいは非存在下で０．０ｌ  ％  ＳＡＣ（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．  製）と２  日間、３７℃、５％  ＣＯ２条件下でインキュべー卜することで、末梢血リンパ球中のＢ  細胞を活性化した。ＳＡＣ  処理した末梢血リンパ球を１０％  牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し９６穴培養プレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ製）で  ｌ  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、抗ＨＭ１．２４抗体またはコントロールマウスＩｇＣ２ａ  ２０μｇ／ｍｌと共に３７℃、５％ＣＯ２  条件下６  日間培養した後、培養上清を回収した。
【００７０】
３．  ヒ卜ＩｇＧ  の定量
上記培養上清中のＩｇＧ  濃度は、ヒ卜ＩｇＧ  特異的ＥＬＩＳＡ  で測定した。即ち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６  ）で１  μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  （ＴＡＧＯ製）１００  μｌ  を９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化した。ブロッキングの後、適当に希釈した培養上清あるいは標品としてヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ製）１００  μｌ  を添加し、室温にて１時間インキュベーションした。
洗浄後、２０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ  （ＣＡＰＰＥＬ製）１００  μｌ  を加え、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）を用いて４０５ｎｍ  での吸光度を測定した。
【００７１】
４．  抗ＨＭｌ．２４抗体のＳＡＣ  刺激ヒ卜末梢血Ｂ  細胞の抗体産生に対する効果
図１に示すようにＳＡＣ  刺激によりＢ  細胞のＩｇＧ  産生は増強され、ここにコントロールマウスＩｇＧ２ａ  ２０μｇ／ｍｌを加えても変化はなかったが、抗ＨＭ１．２４抗体２０μｇ／ｍｌを加えるとＩｇＧ  産生の完全な抑制が観察された。従って、抗ＨＭ１．２４抗体はＢ  細胞の活性化を抑制することが示された。
【００７２】
実施例３．   ＰＨＡ  刺激ヒ卜Ｔ  細胞幼若化反応に対するＨＭ１．２４抗体の効果
１．  ヒ卜末梢血Ｔ  細胞の調製
ヒ卜末梢Ｔ  細胞は実施例２で調製したヒ卜末梢血リンパ球からＣｅｌｌｅｃｔ  Ｈｕｍｍ  Ｔｃｅｌｌ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏｔｅｘ製）を用いて、添付の方法に従い精製した。
２．  ＦＣＭ  解析
精製Ｔ細胞を２％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し２４穴培養プレート中  １  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／１  ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、０，  １，  １０μｇ／ｍｌのＰＨＡ  （Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ  製）と共に３７℃、５％ＣＯ２  条件下、４  日間培養した。これらの一部は４  日間の培養後ＰＨＡ  を含まない２％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、さらに３  日間培養した。これらの細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、  ＦＡＣＳ  緩衝液（２  ％ウシ胎児血清、０．１  ％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（−））で２５μｇ／ｍｌに希釈した抗ＨＭ１．２４抗体あるいはコントロール抗体  １００μｌ  を加え、氷温下３０分インキュベートした。
【００７３】
ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  製）１００  μｌ  を加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、６００  μｌ  のＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）で各細胞の蛍光強度を測定した。その結果、図２に示す通り、ＰＨＡ  によるＴ細胞の活性化に伴って、細胞上にＨＭ１．２４抗原が発現されることが明らかとなった。さらに図３に示す通り、活性化されて一旦発現したＨＭ１．２４抗原は、その後の培養によって消失しないことが示された。
【００７４】
３．  抗ＨＭｌ．２４抗体のＰＨＡ  刺激ヒ卜Ｔ  細胞幼若化反応に対する効果
精製Ｔ  細胞を２％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し９６穴培養プレート中  １  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で、１  μｇ／ｍｌのＰＨＡ  （Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ  製）及び抗ＨＭ１．２４抗体またはコントロールマウスＩｇＧ２ａ    ２０  μｇ／ｍｌと共に３７℃、５％ＣＯ２  条件下、４  日間培養し、３Ｈ−  チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を  １μＣｉ／ｗｅｌｌ  添加し、  ４時間後の取り込みをβ−  カウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）で測定した。
その結果、図４に示すように、Ｔ  細胞はＰＨＡ  刺激による幼若化反応により３Ｈ−  チミジン取り込みは上昇し、ここにコントロールマウスＩｇＧ２ａ  ２０μｇ／ｍｌを加えても変化はなかったが、ＨＭ１．２４抗体  ２０  μｇ／ｍｌを加えると３Ｈ−  チミジン取り込みの抑制が観察された。従って、抗ＨＭ１．２４抗体はＴ細胞の活性化を抑制することが示された。
【００７５】
参考例１． マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９４）  ８４，  １９９２−１９３０  に記載の方法にて、マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製した。
ヒト多発性骨髄腫患者骨髄由来の形質細胞株ＫＰＣ−３２（１ｘ１０７  個）（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （１９９１）  ３２，  １４００  ）をＢＡＬＢ／Ｃマウス（チャールスリバー製）の腹腔内に６  週間おきに２  回注射した。
このマウスを屠殺する３  日前にマウスの抗体産生価をさらに上昇させるために、１．５  ｘ  １０６  個のＫＰＣ−３２をマウスの脾臓内に注射した（Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （１９９０）  ３７，  ８９  ）。マウスを屠殺した後に脾臓を摘出し、Ｇｒｏｔｈ，  ｄｅ  Ｓｔ．  ＆  Ｓｃｈｒｅｉｄｅｇｇｅｒの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９８１）  ４１，  ３４６５  ）に従い摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞ＳＰ２／０  を細胞融合に付した。
【００７６】
ＫＰＣ−３２を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｏｓｎｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８２）  ４８，  ２３  ）によりハイブリドーマ培養上清中の抗体のスクリーニングを行った。５  ｘ  １０４  個のＫＰＣ−３２を５０  ｍｌ  のＰＢＳ  に懸濁し、９６穴プレート（Ｕ  底型、Ｃｏｒｎｉｎｇ  、Ｉｗａｋｉ  製）に分注し３７℃で一晩風乾した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ  ）を含むＰＢＳ  でブロックした後、ハイブリドーマ培養上清を加え４  にて２  時間インキュベートした。次いで、４  ℃にて１  時間ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ  ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  製）を反応させ、洗浄後室温にて３０分間ｏ−フェニレンジアミン基質溶液（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  製）を反応させた。
【００７７】
２Ｎ硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）で４９２ｎｍ  における吸光度を測定した。ヒト免疫グロブリンに対する抗体を産生するハイブリドーマを除去するために、陽性ハイブリドーマ培養上清をヒト血清にあらかじめ吸着させ、他の細胞株に対する反応性をＥＬＩＳＡ  にてスクリーニングした。陽性のハイブリドーマを選択し、種々の細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで調べた。最後に選択されたハイブリドーマクローンを二度クローン化し、これをプリスタン処理したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に注射して、腹水を取得した。
【００７８】
モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウムによる沈澱とプロテインＡ  アフィニティクロマトグラフィーキット（Ａｍｐｕｒｅ  ＰＡ  、Ａｍｅｒｓｈａｍ製）によりマウス腹水より精製した。精製抗体は、Ｑｕｉｃｋ  Ｔａｇ  ＦＩＴＣ結合キット（ベーリンガーマンハイム製）を使用することによりＦＩＴＣ標識した。
その結果、３０のハイブリドーマクローンが産生するモノクローナル抗体がＫＰＣ−３２およびＲＰＭＩ  ８２２６  と反応した。クローニングの後、これらのハイブリドーマの培養上清と他の細胞株あるいは末梢血単核球との反応性を調べた。
【００７９】
このうち、３  つのクローンが形質細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体であった。これらの３  つのクローンのうち、最もフローサイトメトリー分析に有用であり、かつＲＰＭＩ  ８２２６  に対するＣＤＣ  活性を有するハイブリドーマクローンを選択し、ＨＭ１．２４と名付けた。このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを、サブクラス特異的抗マウスウサギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  製）を用いたＥＬＩＳＡ  にて決定した。抗ＨＭ１．２４抗体は、ＩｇＧ２ａ  κのサブクラスを有していた。抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマＨＭ１．２４は、工業技術院生命工学工業研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成７  年９  月１４日にＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【００８０】
参考例２． ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体の作製
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を下記の方法により得た。
参考例１  で作製されたハイブリドーマＨＭ１．２４から、常法により全ＲＮＡ  を調製した。これよりマウス抗体Ｖ  領域をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ  ）法および５’−ＲＡＣＥ  法により、合成、増幅した。マウスＶ  領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ  断片を得、これらのＤＮＡ  断片を各々プラスミドｐＵＣ  系クローニングベクターに連結し、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を常法に従い決定し、さらに各々のＶ  領域の相補性決定領域（ＣＤＲ  ）を決定した。
【００８１】
キメラ抗ＨＭ１．２４抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウス抗ＨＭ１．２４抗体Ｌ  鎖およびＨ  鎖のＶ  領域をコードするｃＤＮＡをＨＥＦ  ベクターに挿入した。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を作製するために、ＣＤＲ  移植法によりマウス抗ＨＭ１．２４抗体のＶ  領域ＣＤＲ  をヒト抗体へ移植した。ヒト抗体のＬ  鎖としてヒト抗体ＲＥＩ  のＬ  鎖を用い、ヒト抗体Ｈ  鎖としてフレームワーク領域（ＦＲ）１−３  についてはヒト抗体ＨＧ３  のＦＲ１−３  を用いＦＲ４  についてはヒト抗体ＪＨ６  のＦＲ４  を用いた。ＣＤＲ  を移植した抗体が適切な抗原結合部位を形成するようにＨ  鎖Ｖ  領域のＦＲのアミノ酸を置換した。
【００８２】
このようにして作製したヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖およびＨ  鎖の遺伝子を哺乳類細胞で発現させるために、ＨＥＦ  ベクターに、各々の遺伝子を別々に導入し、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖またはＨ  鎖を発現するベクターを作製した。
これら二つの発現ベクターをＣＨＯ  細胞に同時に導入することにより、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体を産生する細胞株を樹立した。この細胞株を培養して得られたヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のヒト羊膜由来細胞株ＷＩＳＨへの抗原結合活性および結合阻害活性を、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて調べた。その結果、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合活性を有し、さらにビオチン化マウス抗ＨＭ１．２４抗体を用いた結合阻害活性についても、キメラ抗体あるいはマウス抗体と同等の活性を有した。
【００８３】
なお、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域およびＨ  鎖Ｖ  領域をコードするＤＮＡ  を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（  ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（  ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１  ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成８  年８  月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４６およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４４としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＬ  鎖Ｖ  領域ａバージョン（配列番号：２）およびＨ  鎖Ｖ  領域ｒバージョン（配列番号：３）をコードする  ＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＬａ−ＡＨＭ−ｇκ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｒ−ＡＨＭ−ｇγ１  ）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１  丁目１  番３  号）に、平成８  年８  月２９日に、各々ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４３としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗体のＨ  鎖Ｖ  領域ｓバージョン（配列番号：４）をコードするＤＮＡ  を含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＲＶＨｓ−ＡＨＭ−ｇγ１）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成９年（１９９７年）９月２９日にＦＥＲＭ  ＢＰ−６１２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。
【００８４】
参考例３．   ＨＭ１．２４  抗原蛋白質ｃＤＮＡ  のクローニング
抗ＨＭ１．２４抗体が特異的に認識するＨＭ１．２４抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。
１．    ｃＤＮＡ  ライブラリーの作製
１  ）全ＲＮＡ  の調製
ヒ卜多発性骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２  から、全ＲＮＡ  をＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １８，  ５２９４（１９７９））の方法に従って調製した。すなわち、２．２  ｘ  １０８  個のＫＰＭＭ２  を２０  ｍｌ  の４  Ｍ  グアニジンチオシアネー卜（ナカライテスク製）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネー卜を遠心管中の５．３  Ｍ  塩化セシウム溶液に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０ロー夕ー中で３１，０００ｒｐｍ  にて２０℃で２４時間遠心分離することによりＲＮＡ  を沈殿させた。
【００８５】
ＲＮＡ  沈殿物を７０  ％エタノールにより洗浄し、そして１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  及び０．５  ％  ＳＤＳ  を含有する１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４  ）３００  μｌ  中に溶解し、それにＰｒｏｎａｓｅ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）を０．５  ｍｇ／ｍｌ  となるように添加した後、３７℃にて３０分間インキュべー卜した。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＲＮＡ  をエタノールで沈殿させた。次に、ＲＮＡ  沈殿物を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４  ）２００  μｌ  に溶解した。
２  ）ｐｏｌｙ（Ａ）  ＋ＲＮＡ  の調製
前記のようにして調製した全ＲＮＡ  の約５００  μｇ  を材料としてＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてキッ卜添付の処方に従って  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  を精製した。
【００８６】
３  ）ｃＤＮＡライブラリーの構築
上記  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  １０μｇ  を材料としてｃＤＮＡ合成キッ卜ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）を用いてキッ卜添付の処方に従って二本鎖  ｃＤＮＡ  を合成し、更にＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  製）を用いてキッ卜付属の  ＥｃｏＲＩアダプターをキッ卜添付の処方に従って連結した。ＥｃｏＲＩ  アダプターのカイネーション及び制限酵素  ＮｏｔＩ  処理はキッ卜添付の処方に従って行った。更に、約  ５００  ｂｐ  以上の大きさのアダプター付加二本鎖  ｃＤＮＡ  を１．５  ％  低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ  製）を用いて分離、精製し、アダプター付加二本鎖  ｃＤＮＡ  約４０  μｌ  を得た。
【００８７】
このようにして作製したアダプター付加二本鎖  ｃＤＮＡ  を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ  及びアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）処理した  ｐＣＯＳ１ベクター（特願平８−２５５１９６）と  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）を用いて連結し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。構築した  ｃＤＮＡ  ライブラリーは、大腸菌細胞株  ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）に形質導入され、全体のサイズは約  ２．５  ｘ  １０６個の独立したクローンであると推定された。
【００８８】
２．  直接発現法によるクローニング
１  ）ＣＯＳ−７  細胞へのトランスフェクション
上記の形質導入した大腸菌約  ５  ｘ  １０５クローンを  ５０  μｇ／ｍｌ  のアンピシリンを含む  ２−ＹＴ  培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａ１．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））にて培養することにより  ｃＤＮＡ  の増幅を行い、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））により大腸菌からプラスミド  ＤＮＡ  を回収した。得られたプラスミド  ＤＮＡ  はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  製）を用いてエレクトロポレーション法により  ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。
【００８９】
すなわち、精製したプラスミド  ＤＮＡ  １０  μｇ  を  １  ｘ  １０７細胞／ｍｌで  ＰＢＳ中に懸濁した  ＣＯＳ−７細胞液  ０．８  ｍｌ  に加え、１５００  Ｖ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分問の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞は、１０  ％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）を含むＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  製）にて、３７℃、５  ％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。
【００９０】
２  ）パンニングデイッシュの調製
マウス抗ＨＭ１．２４抗体をコーティングしたパンニングデイッシュを、Ｂ．  Ｓｅｅｄ  ら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ３３６５−３３６９  （１９８７））の方法に従って調製した。すなわち、マウス抗ＨＭ１．２４抗体を１０μｇ／ｍｌになるように  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ９．５  ）に加えた。このようにして調製した抗体溶液３  ｍｌを直径６０  ｍｍ  の細胞培養皿に加え、室温にて２  時間インキユべー卜した。０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ  溶液にて３  回洗浄した後、５％牛胎児血清、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  、０．０２  ％ＮａＮ３を含むＰＢＳ  を加え、ブロッキングした後、下記クローニングに用いた。
【００９１】
３  ）ｃＤＮＡ  ライブラリーのクローニング
前述のようにトランスフェク卜した  ＣＯＳ−７  細胞は、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ  を含むＰＢＳ  にて剥がし、５％牛胎児血清を含むＰＢＳ  で一回洗浄した後、約  １  ｘ  １０６細胞／ｍｌとなるように５％牛胎児血清及び０．０２％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ  に懸濁し、上記のように調製したパンニングデイシユに加え、室温にて約  ２  時間インキュべー卜した。５  ％  牛胎児血清及び０．０２  ％ＮａＮ３を含むＰＢＳ  で３度緩やかに洗浄した後、０．６％ＳＤＳ  及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液を用いてパンニングディシュに結合した細胞からプラスミドＤＮＡの回収を行った。
【００９２】
回収したプラスミド  ＤＮＡを再び大腸菌ＤＨ５  αに形質導入し、前述のようにプラスミドＤＮＡ  を増幅後、アルカリ法にて回収した。回収したプラスミド  ＤＮＡを  ＣＯＳ−７細胞にエレクトロポレーション法によりトランスフェク卜して前述と同様に結合した細胞よりプラスミドＤＮＡ  の回収を行った。同様の操作を更に１回繰り返し、回収したプラスミドＤＮＡ  を制限酵素ＥｃｏＲＩ  およびＮｏｔＩで消化した結果、約  ０．９ｋｂｐのサイズのインサー卜の濃縮が確認された。
【００９３】
さらに、回収したプラスミドＤＮＡ  の一部を形質導入した大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  のアンピシリンを含む２−ＹＴアガープレー卜に接種し、一晩培養後、単一のコロニーよりプラスミドＤＮＡ  を回収した。制限酵素ＥｃｏＲＩ  およびＮｏｔＩにて消化し、インサー卜のサイズが約  ０．９  ｋｂｐを示すクローンｐ３．１９  を得た。
本クローンについては、ＰＲＩＳＭ，  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキッ卜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  製）を用いて、キッ卜添付の処方に従い反応を行い、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）にて塩基配列の決定を行った。この塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号１  に示す。
【００９４】
【発明の効果】
抗ＨＭ１．２４抗体の処理によりＢ細胞からの抗体産生抑制、およびＴ細胞の幼若化の抑制が認められた。これらのことから、抗ＨＭ１．２４抗体はリンパ球の活性化を抑制する効果を有することが示される。
【００９５】
【配列表】
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0003552898.tif 000003
【００９６】
0003552898.tif 000004
0003552898.tif 000005
【００９７】
0003552898.tif 000006
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【００９８】
0003552898.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗ＨＭ１．２４抗体がＳＡＣ  刺激によるＢ細胞からの抗体産生を抑制することを示す図である。
【図２】図２は、ＰＨＡ  刺激したＴ細胞を抗ＨＭ１．２４抗体でＦＣＭ  解析したときのヒストグラムを示す。
【図３】図３は、活性化Ｔ細胞を抗ＨＭ１．２４抗体でＦＣＭ  解析したときのヒストグラムを示す。
【図４】図４は、抗ＨＭ１．２４抗体がＰＨＡ  刺激によるＴ細胞の幼若化反応を抑制することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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