(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされている多孔質膜とを有し、所定の物質を検出する電気化学検出器を使用する検出方法であって、前記作用極として複数のものを用いることにより、同時に多点における電流若しくは電位を計測する酵素反応を用いて所定の物質のみを検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
所定の物質を検出する電気化学検出器であって、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された多孔質膜とを有し、前記多孔質膜が、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされていることを特徴とする電気化学検出器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞や生体の微小組織について、それらの刺激に対する応答の測定を目的とした電気化学検出器及び検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電極を手段とした検出器は、装置が簡便かつ安価であり、多くの分野で広く使用されている。
特にｐＨ電極やイオン電極のように汎用性の高い電極は、水質管理等の環境測定では不可欠である。
【０００３】
さらに、近年では電極の微小化に伴って（例えば、Ｍ．  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｏ．  Ｎｉｗａ，  Ｔ．  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｃｔａ，４２，３１７７−３１８３，１９９７）、極微小範囲における時間分解能の高い（「その場」）測定が行うことができるようになったため、電極は生体を対象にした測定にも用いられるようになった（例えば、Ｈ．  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．  Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，  Ｎ．  Ｋａｓａｉ，  Ｔ．  Ｍａｔｓｕｅ，  Ｉ．  Ｕｃｈｉｄａ，  Ｎ．  Ｍｏｒｉ，  Ｈ．  Ｏｈｙａ−Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ  Ｈ．  Ｋａｍａｄａ，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  １２，  ９−１０，  １０３７−１０４１，  １９９７）。
【０００４】
しかしながら多くの場合、使用に伴って電極の汚染、ひいては劣化が発生するため、電極感度の維持が困難となっている。
例えば、水質の分析や細胞を対象にした測定の際には、溶液中に含まれるタンパク質などの有機物質が電極上に付着し、電極の感度が低下してしまうため、測定値も不正確になり経時変化を追うような測定は不可能である。
さらに、頻繁に電極の研磨や交換が必要となる。
それゆえ、電極の感度を保持することが大きな課題となっている。
【０００５】
電極の汚染を除去するためには、例えば溶液を測定系に導入する前にその溶液に前処理を施し、問題となる可能性のある物質を除去するという方法があるが、その方法では溶液をサンプリングしてから測定するまでに時間差が生じ、「その場」測定ができない。
特に細胞を対象にした測定など、高時間分解能が必要な測定では使用が困難である。
そのため、短時間で簡便に効率よく電極汚染物質を除去できる方法が不可欠になっている。
【０００６】
また、電極電位を制御しながら電極に流れる電流を測定する場合、若しくは、電流を制御しながら電位を測定する場合、電極電位や電流値の変化が目的とする測定物質や、細胞などの測定対象物、目的物質を含有あるいは放出する物質、汚染物質など、電極や測定系に影響を与える場合もある。
例えば、細胞を測定対象にした場合では、細胞の活性が減少したり、ひどい場合になると細胞が死に至ることもあり、目的物質の正確な検出を妨害してしまう。
【０００７】
さらに、培養細胞を対象とした測定を行う場合、電極上で細胞を培養することが多く行われているが、その場合は同じ状態に保持した電極を再利用することが困難である。
以上の点から、簡便で広く利用されている電極を手段とした測定で、電極の汚染を防ぎ、かつ電極からの測定系への影響を軽減することは、必要不可欠の段階にきている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述した従来技術における問題点を解消するものであって、測定用の電極の汚染を低減し、電極の活性低下を防ぐことができ、測定対象物を「その場」測定できる、極めて簡便な方法であって、不要物を簡便にかつ短時間で除去する機能を有した電極測定装置の構築である。
【０００９】
またこの装置では、測定手段である電極と測定対象物とが極めて隣接しているものの、一定の距離だけ離れているため、電極を流れる電流や電位が測定系に影響を与えることもなく、正確な「その場」測定が可能である。
さらに、培養した細胞や生体組織を容易に移動することが可能となる。
このため、環境保全のニ一ズが高まる中、例えば、水質管理などの環境計測の分野や、近年注目されている細胞などを対象にした極微量測定の分野、物質移動を伴う反応過程の解析などの物理化学の分野などに貢献できるものと期待される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明の請求項１に係る検出方法は、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされている多孔質膜とを有し、所定の物質を検出する電気化学検出器を使用する検出方法であって、前記作用極として複数のものを用いることにより、同時に多点における電流若しくは電位を計測する酵素反応を用いて所定の物質のみを検出することを特徴とする。
上記課題を解決する本発明の請求項２に係る電気化学検出器は、所定の物質を検出する電気化学検出器であって、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された多孔質膜とを有し、前記多孔質膜が、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされていることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、電極の汚染を防止する機能と、さらに電極と測定系と相互の影響をなくすよう一定の距離離れた機能を有するために、多孔質膜を電極上に設置することに重要なポイントがある。
この多孔質膜は、微細な多数の孔を有する有機・無機物質の絶縁性の膜であり、目的とする物質のみを透過し、電極上ではその物質のみを捕捉、検出することができるものである。
例えば、目的物質よりも大きく妨害物質より小さい孔を有する多孔質膜を使用するか、或いは、多孔質膜に特殊な機能を保たせることで、例えば、電荷を持った物質のみを透過させて電極で検出したり、特定の感応基を有する物質のみ、あるいは、特定の分子量を持つ分子のみを検出するなど、測定のために選択性を持たせることも可能である。
【００１２】
このような多孔質膜を電極上に設置することにより、電極は多孔質膜によって、汚染物質からは簡便に隔絶されることになる。
また、透明性の多孔質膜を使用すれば透過型顕微鏡を使用した観察も行うことができる。
測定対象物が溶液の場合は、容易に目的物質のみを抽出できるし、あるいは、測定対象物が細胞などのように付着性の物質の場合でも、測定対象物を多孔質膜上に付着させて測定すれば、電極活性を損なうことなく、さらに「その場」で測定を行うことが可能である。経時変化を追うような測定も可能である。
【００１３】
電極と測定系との間に絶縁性の膜が存在することから、電極を流れる電流や電位変化の影響を測定系に与えることがないため、目的物のみの正確な測定を行うことができる。
また、同様の測定を連続して行う際も、電極を交換したり電極表面を研磨する必要がなく、特に、付着性培養細胞のように測定対象物が多孔質膜に付着しているような場合では、多孔質膜を交換することによりきわめて簡単に測定対象物を交換することができる。
【００１４】
電極は、一般に使用されている平板状のものやシリンダ状のものなどが使用でき、それらを複数用いれば、容易に同時に複数の測定を行うことも可能である。また、電極と測定対象との距離を一定に保つことができるため、目的物質の移動速度などの物理化学の分野への応用へも有効である。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例及び図面を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
〔実施例１〕
本発明の第１の実施例に係る電気化学検出器を図１に示す。
図１（ａ）はその概観構成図、図１（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図１（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例では、図１（ａ）に示すように、ポテンシオスタット（ＬＣ４Ｃ，Bioanalytical Systems Corp.）１０を用いて、測定用セル２０内に設置した作用極（電極）Ａに流れる電流を測定した。
電極電位などの制御及びモニタリングは、コントローラ・レコーダ（パーソナルコンピュータ）３０によって行った。
【００１７】
測定用セル２０内には、作用極Ａと共に参照極４０及び対極５０が測定溶液６０中に浸漬されている。
本検出器は、作用極Ａ及び多孔質膜Ｂから構成される極めて簡易な電気化学検出器である。
この電気化学検出器では、ポテンシオスタット１０を用いることで、参照極４０に対する作用極Ａの電位を制御しながら、同時に作用極Ａと対極５０の間に流れる電流（還元電流）を計測する。
【００１８】
作用極Ａとしては絶縁基板Ｃ上の薄膜電極を用い、その上部に多孔質膜Ｂを設置した。
これにより、タンパク質などの電極を汚染する物質（妨害物質）Ｆを除去することができ、多孔質膜Ｂを通過することのできる目的物である分子（目的物質）Ｅのみを作用極Ａで捕捉することが可能である。
多孔質膜Ｂは、例えば、目的物質Ｅよりも大きく妨害物質Ｆよりも小さい孔を有する物質を使用し、ポリカーボネート製膜を用いる場合には、レーザーを使用して任意の大きさの孔を開けることができる。
また、多孔質膜Ｂが透明であるため、顕微鏡下で使用することもできる。
【００１９】
作用極Ａは、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）以外にも金属や炭素などの材料を用いる場合もある。
作用極Ａ以外の電極（参照極４０あるいは対極５０）はガラス基板上に作用極Ａと同様に作製される場合もある。
また、本実施例では３電極法（作用極Ａ、対極５０、参照極４０）で作用極Ａが１つの場合を用いているが、電流値が極微量の場合は、検出は２電極法（作用極Ａと参照極４０）でも行うことができる。
必要であれば電流増幅器７０を用いる場合もある。
【００２０】
本実施例では、作用極Ａとしては、ガラス基板上の酸化インジウムスズ薄膜を、リソグラフィにより一辺５０マイクロメートルの正方彩の微小平板電極にして用いた。
作用極Ａのリード部は絶縁膜で完全に覆い、溶液６０とは接触しないようにした。参照極４０には銀／塩化銀を、対極５０には白金線を用いた。
【００２１】
次に、図１で示した系による測定結果を図２に示す。
図２は異なる濃度のグルタミン酸に対して、電極で得られた応答電流（還元電流）である。
溶液６０にはグルタミン酸酸化酵素（２．７Ｕ）、西洋わさび由来ペルオキシデース（１３．５Ｕ）及び電極反応メディエータであるフェロセニルメタノール（０．３３ｍｍｏｌ／ｌ）を含んだ緩衝液７５μｌを用いた。
【００２２】
その溶液６０の上に多数の孔（孔径０．６μｍ）を有するポリカーボネート製膜（厚さ７μｍ）を設置し、そのうえからグルタミン酸を滴下して得られた還元電流の変化を求めた。
この溶液６０中では、１ｍｏｌのグルタミン酸がグルタミン酸酸化酵素により酸化され１ｍｏｌの過酸化水素を生成し、その過酸化水素が西洋わさび由来ペルオキシデースにより還元され、同時にフェロセニルメタノール１ｍｏｌが酸化される。
【００２３】
作用極Ａでは、その酸化型フェロセニルメタノールの還元電流の変化を測定することにより、グルタミン酸の濃度を算出するというのが測定原理である。
電極電位は酸化型フェロセニルメタノールが十分還元される電位（参照極に対して０ｍＶ）に固定した。
この結果から、グルタミン酸の濃度に比例した還元電流が観測されることが分かった。
また、異なる酵素を用いることでグルタミン酸以外の物質も測定できる可能性も示唆された。
【００２４】
〔実施例２〕
本発明の第２の実施例に係る電気化学検出器を図３に示す。
図３（ａ）はその概観構成図、図３（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図３（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例では、実施例１と同様の測定系を使用し、検出部の作用極Ａに複数の電極を使用したものである。
【００２５】
作用極Ａとしては、実施例１と同様に、一辺５０マイクロメートルの酸化インジウムスズアレイ電極を、フォトリソグラフィにより作製した。
電極間の相互作用が無視できるよう、電極間は１５０マイクロメートルと充分離した。
電流測定は、マルチポテンシオスタット８０を用いて測定した。
ただし、電流測定は、複数の作用極Ａを扱えるよう２台のポテンシオスタットを使用しても測定可能である。
【００２６】
多孔質膜Ｂは、同様にポリカーボネート製多孔質膜（厚さ７μｍ、孔径０．６μｍ）を使用し、細胞の付着性を向上するため、Ｌａｍｉｎｉｎｅとｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎでコーティングした。
多孔質膜Ｂが透明であるため、倒立顕微鏡９０下で使用することもできる。
多孔質膜Ｂ上にウィスター系ラットの胎児（１８日）の神経細胞（大脳皮質）を、ＣＯ２濃度１０％、３７℃下で２３日間培養した。
【００２７】
培養液にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍに非働化ウマ血清、非働化ウシ血清、インシュリン、ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したものを使用した。
培養２日後に、細胞が付着し、成長していることを確認した。
培養２１日後に、多孔質膜上に培養した細胞をインキュベータから取り出し、細胞にダメージを与えないように測定溶液で２回洗浄し、電極上に設置した。
測定溶液には２ｍＭＣａ２＋を含むｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液を、細胞の刺激には３７ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム（５μｌ）を用いた。
【００２８】
測定溶液には、グルタミン酸酸化酵素（２．７Ｕ）、西洋わさび由来ペルオキシデース（１３．５Ｕ）及び電極反応メディエータとしてフェロセニルメタノール（０．３３ｍｍｏｌ／ｌ）を含んだｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液７５μｌを用い、作用極Ａ上に滴下した上に、上述した培養細胞（測定対象物）Ｄの付着した多孔質膜Ｂを乗せた。
作用極Ａには、細胞が近傍にあるもの２つを選択し、電極電位を参照極に対して０ｍＶに固定した時に電極に流れる電流を測定した。
その結果を図４に示す。
【００２９】
図４に示すように、溶液に塩化カリウムを添加した際、電極１、２でそれぞれ１２ピコアンペア、４ピコアンペアの電流増加が確認された。
これは、細胞がない状態で塩化カリウムを添加した時とは明らかに異なる応答であり、この結果は、刺激に対して細胞がグルタミン酸を放出しているということを示している。
このように、本装置が細胞の応答を検出できることが確認された。
【００３０】
〔実施例３〕
本発明の第３の実施例に係る電気化学検出器を図５に示す。
図５（ａ）はその概観構成図、図５（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図５（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例は、実施例２と同様の測定系であるが、図５に示すように、グルタミン酸の測定に必要な酵素及びメディエータ（グルタミン酸酸化酵素，西洋わさび由来ペルオキシデース固定化オスミウムポリマ）Ｇを作用極Ａ上に固定して測定を行った。
【００３１】
刺激は、３７ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム（５μｌ）を細胞近傍に添加して行った。
電極電位は酸化型オスミウムが十分還元される電位（参照極に対して−１００ｍＶ）に固定した。
その結果、同様に、２つの作用極Ａで測定された還元電流値の増加はそれぞれ２０ピコアンペアと１５ピコアンペアであった。
この結果は実施例２で得られた値よりも大きくなっていたが、これは、酵素やメディエータを電極を固定することにより、電極反応がより効率よく行われたためであると考えられる。
【００３２】
また、固定化することにより、測定溶液中に存在する酵素、メディエータが細胞に傷害を与えてしまい細胞の活性が低下する可能性が回避できるとも予想される。
このように、本手法により、極微量濃度のグルタミン酸が高精度、高感度に測定できることが分かった。
【００３３】
〔実施例４〕
本発明の第４の実施例に係る電気化学検出器を図６に示す。
図６（ａ）はその概観構成図、図６（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図６（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例は、実施例３と同様の検出系であるが、培養海馬スライス片を用いて測定を行った例である。
即ち、生後２日目のラットの海馬スライス（３００μｍ厚）を作成し、前記した多孔質ポリカーボネート膜上で、ＣＯ2濃度１０％、３７℃下で培養した。
【００３４】
培養液にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍに非働化ウマ血清、非働化ウシ血清、ペニシリン・ストレプトマイシン、グルコース及び神経成長因子を加えたものである。
電極電位は、参照極に対して−１００ｍＶに固定した。
培養開始２日後、スライス片が多孔質膜膜（ポリカーボネート製）Ｂ上に付着し、成長していることを確認した。
【００３５】
培養開始７日後に、スライス片（測定対象物、生体微小組織）Ｄ’が固定された多孔質膜Ｂを取り出し、測定溶液で２回洗浄した。
実施例３で記述したように酵素、メディエータを固定した作用極Ａ上に測定溶液を３０μｌを滴下し、膜を設置した。
刺激は、測定溶液に溶解した１０ｍＭミューシモルをスライス片近傍に投与して行った。
その結果、電極で電流値の変化が観察された。
【００３６】
また、スライス片Ｄ’のない系では電流変化が観察されなかったことから、電流変化は、スライス片Ｄ’からのグルタミン酸の放出の可能性を示唆していると言える。
ミューシモルはＧＡＢＡＡリセプタのアゴニストであるが、ＧＡＢＡの投与による細胞からのグルタミン酸の放出は現在までに報告されている（例えば、Ｋ．  Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ，  Ｏ．  Ｎｉｗａ，  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，  ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  ８，  １３５３−１３５８，  １９９７  ）。
本実験からもそれを指示するような結果が得られた。
【００３７】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明の電極測定装置は、水質の検査や細胞などを対象にした測定の際に極めて有効な方法で、電極上に多孔質膜を設置するという簡便な方法で構築することができる。
多孔質膜により測定対象物や妨害物質を電極から簡便に分離することができるため、測定対象物や妨害物質によって電極を汚染されることなく、電極自体の活性を高く保つことができ、目的物質を高感度に高精度な測定が可能である。
それゆえ、電極の交換や活性化の頻度が減少し、装置の高寿命化が実現できる。
【００３８】
さらに、多孔質膜が絶縁性であるため、電極を流れる電流や電極に印加される電位が測定系（目的物質や測定対象物を含む）へ影響を及ぼすことも避けられるため、経時変化を追うような測定も可能である。
また多孔質膜上に細胞など測定対象物を固定することもできるため、測定対象物を簡便に交換することもできる。
透明な多孔質膜であれば、顕微鏡下での使用も可能である。
【００３９】
このように、本発明により、既存の電極をそのまま使用し、簡便な方法で高性能な「その場」測定ができるということで、近年社会的に注目されている水質分析などの環境分野などでの各種センシングや、細胞を対象にした神経伝達物質の測定などの測定系に極めて有効であり、利用される可能性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例に係る電気化学検出器であって、図１（ａ）はその概観構成図、図１（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図１（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図２】実施例１で示される測定系による測定例に係るグルタミン酸に対する電極の電流応答を示すグラフである。
【図３】本発明の第２の実施例に係る電気化学検出器であって、図３（ａ）はその概観構成図、図３（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図３（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図４】実施例２で示される測定系による測定例に係る培養細胞に塩化カリウム刺激を与えたときの異なる２つの電極における電流応答（還元電流）、コントロールは細胞が存在しない系で同様の刺激を与えたときの電流変化を示すグラフである。
【図５】本発明の第３の実施例に係る電気化学検出器であって、図５（ａ）はその概観構成図、図５（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図５（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図６】本発明の第４の実施例に係る電気化学検出器であって、図６（ａ）はその概観構成図、図６（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図６（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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