(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非毒性リポ多糖体の調製方法であって、
（ｉ）寄託番号：ＡＴＣＣ５５９６３で表されるアシドフィリウム（Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ）属の細菌を普通培地において培養するステップと、
（ｉｉ）前記培養した細菌を分離すると共に、分離した細菌を繰り返し洗浄するステップと、
（ｉｉｉ）前記洗浄した細菌を親油性溶媒で抽出するステップと、
（ｉｖ）前記抽出によって得られた抽出物を冷却すると共に、冷却した物質を繰り返し遠心分離するステップと、
（ｖ）前記遠心分離により得られる上清を透析するステップと、
（ｖｉ）前記透析した物質を凍結乾燥するステップと、
（ｖｉｉ）前記凍結乾燥した物質を極性溶媒で処理することにより、リポ多糖体を沈降させるステップと、
（ｖｉｉｉ）前記沈降したリポ多糖体を乾燥するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記普通培地は炭素源としてヘキソース、及び窒素源を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヘキソースはグルコース、及びガラクトースのうち一つ以上を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記窒素源は酵母抽出物、硫酸アンモニウム、及びミネラルのうち一つ以上を含む請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ミネラルはリン酸マグネシウム二カリウム、及び塩化カリウムのうち一つ以上を含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記分離した細菌を繰り返し洗浄するステップは、炭素源及び窒素源の内容物を除く普通培地の組成物で実施する請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記抽出するステップは、７０℃乃至９０℃の温度で実施する請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記細菌を分離するステップは、遠心のほか、高速遠心、膜濾過、長時間重力沈降により実施する請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記遠心は、４，０００〜１０，０００ｒｐｍで実施する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記親油性溶媒は、フェノール、ブタノール、及び水のうち一つ以上を含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結乾燥するステップは、透析物質をフリーズドライ法で凍結乾燥する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記極性溶媒は、炭素原子が最大４個の脂肪族アルカノールである請求項１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１の方法により調製されるリポ多糖体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、内毒血症または敗血症の予防に有効な新規の効力のある非毒性リポ多糖体（ＬＰＳ）の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
二重かつ非対称に構成された膜である大腸菌、腸炎菌等のグラム陰性菌のいわゆる外膜は、優勢な成分としていくつかの蛋白質およびクラスｍａｃｒｏａｍｐｈｉｏｐｈｉｌｅｓ、リポ多糖体（ＬＰＳ）からなるが、こうした細菌の生存力は細胞外膜上のＬＰＳ配列によってのみ左右される蛋白質である。１個の細菌の細胞は、４．９μｍ２の面積を占める約３．６．１０６ＬＰＳ分子を含有する。このために、その相互作用は標的で容易である。本発明による方法で調製されているリポ多糖体は、生物活性物質であると共に、ヒト病原体を含むグラム陰性菌の内毒素との病態生理学的相互作用を予防するために有効である。このリポ多糖体は補助Ｎｏ．ＭＴＣＣ１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属に属する新しい細菌から調製される。尚、この新しい細菌は、ブダペスト条約に基づく微生物の寄託機関ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９９７年４月３０日付けで寄託されており、寄託番号ＡＴＣＣ５５９６３が付与されている。
【０００３】
グラム陰性病原体に感染すると、循環に放出されるＬＰＳは、ヒトなど宿主と多様な生理学的・病態生理学的相互作用を媒介し、特に生存の危険を来す。ヒトにおけるグラム陰性菌感染症のＬＰＳを原因とする病態生理学的疾患として、発熱（３８．６℃）、頻拍（９０拍／分）、頻呼吸（呼吸数＞２０回／分）、アシドーシス（ｐＨ７．３）、動脈低酸素血（ｐｐｏ＝７５ｍｍ  Ｈｇ）（１）が挙げられる。米国だけで毎年５０万人が敗血症に罹り、うち１７万５千人が死亡している（２）。人口がはるかに多いインドの事情はさらに深刻であることが予想されるため、敗血症の予測症例は高く、死亡率に対する影響は大きい。通常、敗血性ショックの発現を認める院内または集中治療室内の患者は、診断後７２時間以内に死亡することがある（３）。
【０００４】
網内細胞に対するＬＰＳ作用により産生されるメディエーターのなかには、インターロイキン６および８のほか、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）が含まれる。しかし、ＴＮＦαおよびＩＬ−１は敗血症の重要な因子である。
【０００５】
ヒトに対する敗血症の大きな影響を理解することにより、有効な抗敗血症薬の市場は、ニューヨークシティーのＯｐｐｅｎｈｅｕｎｅｒ＆Ｃｏ．Ｉｎｃのアナリストによると年間５億ドルになると考えられる（４）。急進展する市場は、現在可能性のある抗敗血症薬を開発中の２０社余りにとって大きな収入源になるとみられる。しかし、こうした利益を得る道は一直線というわけではない。
【０００６】
１９８０年代半ばに、カリフォルニア州エメリービルのＣｅｎｔｏｃｏｒ、ＸｏｍａおよびＣｈｉｒｏｎの３社が、敗血症の発生に重要な役割を果たす内毒素の毒性成分であるリピドＡに対するモノクローン抗体の開発を開始した。単球およびマクロファージの受容体に結合することにより、内毒素のリピドＡは、サイトカインとして知られる強力なメディエーターの放出を誘発する。敗血症を引き起こす前にリピドＡの過剰を（抑制する）抗体を使用するという考えは、製品を臨床試験用にしたＸｏｍａ社およびＣｈｉｒｏｎ社により利用されたが、これは失敗に終わった。しかし、モンタナ州ハミルトンのＲｉｈｉＩｍｍｕｎｅケミカル社は、グラム陰性型およびグラム陽性型の細菌との感染が認められるときに過剰に刺激されることのない宿主および免疫系に耐性のある良性のリピドＡを開発した。抗内毒素活性のためのもう一つの方法は、白血球に存在する自己蛋白質であって、内毒素に結合し、体そのものの活動に追随する殺菌性／浸透性増大蛋白質（ＢＰＩ）と呼ばれる物質の使用である。開発したのは、カリフォルニア州パロアイトのＩｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社であり、同剤はマウスにおいて優れた成績を示している。グラム陽性菌や真菌など敗血症を引き起こす病原体のシフトにより、現在の焦点はＴＮＦやＩＬ−１など免疫メディエーターに向けられている。
【０００７】
Ｓｙｎｅｒｇｅｎ社のＡｎｔｒｉｌ（ＩＬ−１の受容体拮抗薬）は単球により産生される蛋白質であり、好中球の受容体に結合することによりＩＬ−１の作用を抑制する効果があり、すでに罹患した患者において良好な結果が得られる。英国のＣｈｉｒｏｎ社やスイスのＨｏｆｆｍａｎｎ−ｌａ−Ｒｏｃｈｅ社など数社は、ＴＮＦ−結合抗体を用いた有望な成績が得られたため、現在、臨床試験が行われている。
【０００８】
しかし、抗ＴＮＦ受容体による方法は、敗血症患者における死亡率の増大が報告されているため、奏功しなかった（５）。しかしながら、抗サイトカインによる方法には依然として多くの擁護者がいるが、なかにはこの方法では同時に１種類の化学薬品だけしか誘発されないと不満を訴える擁護者もいる。それでも、１つの因子を制御することのより、他の効果を上昇させ、ＩＬ−１濃度が上昇するような免疫系において、ＴＮＦが充分な冗長度を有するものとなる。
【０００９】
敗血症に対するこのような効果的な治療には、ＴＮＦとＩＬ−１の両方に対して作用する多種類の作用物質が必要である、とカリフォルニア州立大学の細胞生物学者・エリクソンは述べている。メリーランド州ロックビルのＥｎｔｅｒＭｅｄ社は、「抗敗血症ワクチン」を用いてこの方向に進み、患者自身が免疫応答を備えるようにしている。ワクチンは脂質とコレステロールを材料とする小嚢に包まれたリピドＡからなり、開発の過程にある。したがって、「抗敗血小ワクチン」の方向において考え得る方法は、大腸菌のＬＰＳと免疫学的に交差反応するが、きわめて高い用量では致死率を示すことのない天然に生じる非毒性ＬＰＳを用いて試みられる。別の見方をすれば、これでグラム陰性菌の毒性ＬＰＳまたは内毒素により誘発される致命的なショックが予防される。
【００１０】
現状の技術において、以下に示すさまざまな標準的方法がある。
【００１１】
Ａ．１．トリクロロ酢酸による抽出。
【００１２】
三塩化酢酸（ＴＡＣ）による細胞の抽出が、組織学的に内毒素分離のための最初の方法である。これは高度に免疫原性のＬＰＳ蛋白質−りん脂質錯体である。
【００１３】
５倍の重量の氷冷水中に懸濁した細胞を４℃下に３時間、等量の０．５Ｎ  ＴＣＡで処理する。懸濁液を遠心分離し、上清を希釈水酸化ナトリウムで中和し、２倍の量の水で沈降させた錯体を透析し、遠心分離して細胞片を除去すると共に凍結乾燥する。
【００１４】
２．エチレングリコールによる抽出。
【００１５】
エチレングルコールにより、細胞から遊離多糖および／または全Ｏ−抗原錯体を選択的に抽出する。抽出条件はきわめて緩やかであり、抽出物質の変性または変異のリスクは低い。アセトンで乾燥させた細胞を、１０部の新鮮な蒸留ジエチレングリコールにより、室温で毎日数時間、攪拌して抽出する。抽出物を濾過し、透析すると共に遠心分離する。最後に−１０℃でアセトンを添加してＯ−抗原錯体を沈降させる。さらに、飽和した硫酸アンモノウムの１％水溶液で分画することにより精製を行う。この方法は時間がかかり、収率が低い。
【００１６】
３．加熱したフェノールによる抽出。
【００１７】
上述した２つの抽出法は有効であるが、１９６５年にＷＥＳＴＰＨＡＬとＪＡＮＮにより達成された分離法が最も多く用いられる。抽出された物質は蛋白質がわずかに含まれている。Ｓ＆Ｒ型のＬＰＳの抽出法としては充分であるが、Ｒ変異菌については不完全であることが多い。
【００１８】
４．ジメチルスルフォキシオド（ＤＭＳＯ）による抽出。
【００１９】
高温（＞６０℃）で蛋白質によりＬＰＳを抽出する。この抽出物から、蛋白質を含まないＬＰＳが、Ｏ−アセチル化により得ることができ、その後にクロロホルムで精製することができる。最後に、ＤＭＳＯ（室温でアセトン中２％）で脱アセチル化する。脱アセチル化時に一部のエステル結合脂肪酸をリピドＡから除去することが可能である。
【００２０】
５．フェノールクロロホルム石油エーテル（ＰＣＰ）による抽出。
【００２１】
フェノール水による方法では、Ｒ変異菌に存在する多量の疎水性内毒素が抽出されないことが多い。フェノールクロロホルム−石油エテール（２：５：８  ｖ／ｖ／ｖ）の混合液に均質化された乾燥菌を遠心分離し、上清を採取する。気化により上清からクロロホルムおよび石油エーテルを除去する。水を滴下して加え、残ったフェノール中のＬＰＳを沈降させる。この沈降物を遠心分離した後、石油エーテルで洗浄し、さらに４時間、１０５，０００で超遠心分離により精製する。
【００２２】
Ｂ．電気透析
ＳおよびＲの両形態から分離した内毒素は通常、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋など多くの一価陽イオンおよび二価陽イオンのほか、スペルミジン、スペルミン等の一部のポリアミンと結合している。これらの陽イオンはＬＰＳの溶解度および凝結に対して強力な影響を示す。ＬＰＳの電気透析が導入され、関連塩基で中和することにより塩に置換することができた。ＬＰＳのトリエチルアミン塩は水溶性がきわめて高い。この塩は超遠心分離において沈降されず、変性生物学的活性を示す。中和されていない電気透析ＬＰＳ調製液は長時間にわたって不安定となり、自己溶解により保存時に爆発する。
【００２３】
ガラクトースアミン感作されていないマウスにおいて、大腸菌の毒性ＬＰＳの致死量は８０μｇ／マウスであり、本発明による非毒性ＬＰＳの致死量は３０μｇ／マウスである。
【００２４】
Ｒ．ＳｐｈｅａｒｏｉｄｅｓやＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＬＰＳなどその他の非毒性ＬＰＳは、新規に認められた用量よりも高い用量で発熱性であり致死的であることが報告された。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｃｏｐｐｅｒ  ｍｉｎｅｓ地域の土壌から単離されたＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属に属する新しい菌株から新規のリポ多糖体を調製する方法を提供することを主な目的とする。
【００２６】
また、本発明は、内毒素症を来す毒性ＬＰＳ作用を媒介する作用物質であるが、それ自体は非毒性作用物質としての新規のリポ多糖体を調製する方法を提供することを目的とする。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
このように、本発明によれば、上述した内毒素ショックに有効な新規の非毒性リポ多糖体を調製するための方法であって、
１）標準条件下に通常の普通培地において補助ＭＴＣＣ１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属の細菌を増殖させるステップと、
２）周知の方法で細菌を分離した後、炭素および窒素源を除く同一の増殖培地で反復洗浄するステップと、
３）７０〜９０℃の温度下に親油性溶媒で細菌を抽出するステップと、
４）得られた物質を冷却し、繰り返し遠心分離するステップと、
５）ステップ（ｄ）から得られた上清を透析するステップと、
６）ステップ（ｅ）から得られた透析物質を凍結乾燥するステップと、
７）極性溶媒で凍結乾燥物質を処理し、リポ多糖体を沈降させるステップと、
８）リポ多糖体を濾過し、乾燥するステップと、
からなる方法が得られる。
【００２８】
細菌培養株は、グルコースおよび酵母抽出物を含有する合成培地において増殖させ、７２〜１２０時間にわたって３０〜３９℃の温度でインキュベートすることができる。
【００２９】
細胞の増殖後、約３０〜１０分間にわたり４０００〜１００００ｒｐｍの遠心分離で回収した後、グルコースと酵母抽出物を除く増殖に用いた同一の培地で洗浄する。
【００３０】
次に細菌の細胞を４炭素を超えない芳香族フェノールまたは脂肪族アルカノールなど加熱した親油性溶媒および水で処理する。さらに上記の混合液を６０〜１２０分間強く攪拌した。その後、混合液を氷で２〜１２℃の温度に冷却する。次にそれぞれ１５〜３０分間、４０００〜１００００ｒｐｍで遠心分離した。
【００３１】
上記の方法を３回繰り返す。すべての上清を２〜５日間、徹底的に透析した。この物質を沈降させ、濃度１．５％〜２．５％の溶液の形で２〜４℃の温度下に４〜６時間、１０５，０００〜１７０，０００ｒｐｍで超遠心分離にかけた。全体の方法で使用した水は発熱性がなく、環境からの汚染を回避するよう留意した。遠心分離を繰り返して行い、ほぼ精製されたＬＰＳを得た。次にこれをエタノールなど極性溶媒で処理し、２０〜４５分間、８５００〜１４０００ｒｐｍの速度で遠心分離により採取した沈降物を得た後、凍結乾燥して冷蔵庫に保存した。
【００３２】
本発明において調製される非毒性ＬＰＳ（ＮＴＬＰＳ）は、グラム陰性菌から以前に報告されたＮＴＬＰＳ源としてのＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍの周知の菌株と異なるＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ菌からの他に類型をみないＬＰＳである（６）。
【００３３】
通常、リピドＡの基本構造は、鎖の長さが程度が異なる４〜８個のアシル鎖を有する。ＬＰＳの構造機能関連の比較研究（７）では、大腸菌の多様な変形が明らかにされており、それらの生物活性はいくつかの顕著な特徴を示した。より多くのβヒドロキシル化およびより少数の脂肪アシル鎖により、１０７の係数で生物活性が劇的に低下した。本発明により調製された非毒性ＬＰＳはβヒドロキシル化脂肪酸アシル鎖の割合が高く、その非毒性が原因とみられるミリスチン酸鎖であるが、ＮＴＬＰＳは大腸菌のＬＰＳと免疫学的に交差反応性である。
【００３４】
この非毒性ＬＰＳ（すなわちＭＴＣＣ１９７９株からのＧＳ１８ｈ  ＬＰＳ）の組成は以下の通りである。
【００３５】
0003595966.tif 000002
本発明による非毒性ＬＰＳは、電気泳動的に大腸菌のＬＰＳに比べて、低分子量の成分からなる。大腸菌との免疫学的交差反応性の程度が高いことは、構造的に大腸菌のＬＰＳときわめて緊密な関係のある物質であることを示す。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明について詳細に述べるが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３７】
実施例１
ＭＴＣＣ１９７９の菌株を培養し、回収すると共に以下の条件下に７０ｎｍｓ（湿重量）、４ｇｍｓ（乾燥重量）を計量した。
【００３８】
0003595966.tif 000003
0003595966.tif 000004
0003595966.tif 000005
本発明により精製されたリポ多糖体の非毒性の実験的所見。それぞれ５匹からなる２群のマウスについて、本発明により精製されたリポ多糖体と大腸菌のリポ多糖体を投与して生存率の試験を行った。
【００３９】
１群には生理的食塩水のみを注射し、別の１群にはＬＰＳを注射した。５日間に死亡例は認められなかった。５日目に両群に毒性ＬＰＳを注射した結果、生理的食塩水群は７２時間以内に死亡したが、非毒性リポ多糖体群は完全に生存し、死亡例は認められなかった。注射はすべてマウスに軽く麻酔した後に行った。
【００４０】
【発明の効果】
本発明による方法で調製されたＬＰＳすなわちリポ多糖体の毒性は、周知のＬＰＳに比べて１５０〜２００分の１であり、大腸菌のＬＰＳに比べて２００万分の１、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳに比べて１５０〜２００分の１である。この非毒性ＬＰＳは内毒血症に対する予防薬として有効である。