(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白紋羽病に対する病原性が低い、ロセリニア・ネカトリックスFERM P-18142株。
【請求項２】
ロセリニア・ネカトリックスに属する菌株の中から、FERM P-18142株と同一のdsRNAを含む菌株を選抜することにより、白紋羽病に対する病原性が低い菌株を取得する方法。
【請求項３】
請求項２の方法によって得られる、白紋羽病に対する病原性が低いロセリニア・ネカトリックスに属する菌株。50100
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原性低下因子を含むロセリニア・ネカトリックスに属する新規な菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白紋羽病は、リンゴ、ナシ、クワなど多種の植物に発病する土壌伝染性の植物病害である。病原菌は、子のう菌に属するロセリニア・ネカトリックス（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ）である。この菌は、土壌中では罹病根の表面に白色の菌そうと樹皮下に菌糸束を形成する。本菌は土壌中の未分解植物残渣上で長期間生存し、そこに作物が栽培されると白紋羽病を引き起こす。本病は、開墾後年数を経た熟園地土壌で激発する。
【０００３】
ロセリニア・ネカトリックスは、植物の地下根部を侵す。そのため、容易に罹病部を観察できず、病気の発見が遅れ、地上部に症状が現れ発病に気づいた時期には、すでに治療不可能な状況になっているのが一般的であり、防除が困難な病害である。
【０００４】
従来、白紋羽病の防除法は、化学農薬の灌注等により行われていた。しかし、この方法は環境汚染の問題があり、環境汚染を引き起こす心配のない新しい防除法が望まれている。近年、化学農薬に代わるものとして生物農薬が注目されている。生物農薬は、害虫、雑草又は病害菌などの有害生物に感染・寄生する昆虫や微生物等を用いるもので、化学農薬に比べて、人体及び周辺環境に与える影響が少なく安全な農薬として期待されている。そして現在までに、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）を利用したバラ根頭がん腫病防除剤、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を利用したトマト、ナスの灰色かび病防除剤など数十種類の生物農薬が開発されている。しかし、白紋羽病菌を防除する生物農薬は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、病原性低下因子を含むロセリニア・ネカトリックスに属する新規な菌株を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、広島県のナシ園から病原性低下因子を含む白紋羽病菌を単離し、白紋羽病への防除に応用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、病原性低下因子を含むロセリニア・ネカトリックスに属する菌株である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のロセリニア・ネカトリックスに属する菌株は、病原性低下因子を含むことを特徴とするものである。このような菌株は、ロセリニア・ネカトリックスに属する菌株の中からｄｓＲＮＡを含む菌株を選抜することにより得られる。
【０００８】
本発明の菌株の一例としては、ロセリニア・ネカトリックスＷ３７０株を挙げることができる。この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８１４２として寄託されている（寄託日：平成１２年１２月１８日）。
ロセリニア・ネカトリックスは白色円形のコロニーを形成し、菌糸隔膜付近に洋なし状の膨らみをもち、先端部が二股に分かれるのが特徴である。また、培地上に胞子を形成せず、古い菌糸は厚膜化し黒く着色する。Ｗ３７０株は、以上の性質を持つことから、ロセリニア・ネカトリックスに属するものと認定した。
【０００９】
本発明の菌株は、ロセリニア・ネカトリックスに属する既知の菌株と同様の方法で培養することができる。培地としては、オートミール寒天培地、ジャガイモ煎汁寒天培地などを使用することができる。培地上では、７〜３１℃の温度範囲で生育し、適温は２５〜２８℃である。
本発明の菌株は、白紋羽病の治療に使用することができる。即ち、本発明の菌株を培養し、それを白紋羽病にかかった植物の株元にある罹病部位に接種することにより、病原性低下因子は菌糸融合により培養菌から罹病植物上の病原菌に移行する。これにより、病原菌の病原性は低下し、本病は治療される。
【００１０】
【実施例】
〔実施例１〕
ｄｓＲＮＡを含むＷ３７０株から単菌糸分離により、ｄｓＲＮＡを除去した。
Ｗ３７０株を素寒天平板上で２５℃、１０日間培養した後、この菌株から菌糸先端の５〜６細胞を切り取り、これをセルロース膜を敷いたオートミール寒天培地に移植した。細胞の切り取りは、解剖顕微鏡下で行った。移植後、２５℃で１週間培養し、培地上の菌そうをセルロース膜ごと剥がしとった。菌そうから抽出した全核酸をＤＮａｓｅとＳ１ヌクレアーゼで処理した後、電気泳動を行い、ｄｓＲＮＡの存在を確認した。電気泳動の結果、幾つかの菌株においてｄｓＲＮＡが除去されていた。それらの中の４菌株をＷ３７０ｈｔｉ１−４株と命名した。
【００１１】
〔実施例２〕
Ｗ３７０株とＷ３７０ｈｔｉ１−４株との黄花ルピナスに対する病原性を比較した。
オートミール寒天培地で前培養したＷ３７０株とＷ３７０ｈｔｉ１−４株とを滅菌済のクワ切枝に接種し、２０〜３０℃で１０〜１４日間培養した。一方、黄花ルピナスを培養土（鹿沼土：腐葉土＝２：１）中で栽培した後（２５℃、３週間）、株元に上記クワ枝を埋め込み、黄花ルピナスに各菌株を接種した。接種から１０〜１４日後の黄花ルピナスの病徴を肉眼で観察し、各菌株の病原性を判断した。病原性は、以下の３段階で評価した。
【００１２】
病徴がみられない場合：０
植物が萎凋した場合  ：１
枯死した場合        ：２
この結果を図１に示す。図１に示すように、Ｗ３７０株の病原性が０〜１にとどまったのに対し、Ｗ３７０ｈｉｔ１−４株はいずれも高い病原性を示した。
なお、接種から１１日目の黄花ルピナスの状態を図２に示す。この図が示すように、Ｗ３７０ｈｔｉ１−４株を接種した場合にはいずれも植物体の萎凋がみられる。
【００１３】
〔実施例３〕
Ｗ３７０株及びＷ３７０ｈｔｉ１株、並びにこれらの菌株を接種した植物中にｄｓＲＮＡが含まれるかどうかを調べた。
Ｗ３７０株及びＷ３７０ｈｔｉ１株の培地生育菌体、並びにこれらの菌株を接種した黄花ルピナスの下胚軸から全核酸を抽出した。抽出した核酸を、ＤＮａｓｅとＳ１ヌクレアーゼで処理した後、電気泳動を行った。この結果を図３に示す。図中のレーン１〜５では、それぞれ以下のサンプルを使用している。
【００１４】
レーン１：Ｗ３７０株の培地生育菌体から抽出したｄｓＲＮＡ画分
レーン２：Ｗ３７０株を接種したルピナスの下胚軸から抽出したｄｓＲＮＡ画分
レーン３：Ｗ３７０ｈｔｉ１株の培地生育菌体から抽出したｄｓＲＮＡ画分
レーン４：Ｗ３７０ｈｔｉ１株を接種したルピナスの下胚軸から抽出したｄｓＲＮＡ画分
レーン５：非接種ルピナスの下胚軸から抽出したｄｓＲＮＡ画分
【００１５】
図３に示すように、病原性の弱いＷ３７０株及びそれを接種したルピナスでは、４．２，３．７，２．１８，２．１７，２．１５，１．４８，１．２８，１．２０，１．１８，０．９８，および０．９２ｋｂの１１種類のｄｓＲＮＡが検出された。一方、病原性の強いＷ３７０ｈｔｉ１株及びそれを接種したルピナスでは、ｄｓＲＮＡが検出されなかった。
【００１６】
【発明の効果】
本発明は、病原性低下因子を含むロセリニア・ネカトリックスに属する新規な菌株を提供する。この菌株は、白紋羽病の防除に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｗ３７０株及びＷ３７０ｈｔｉ１−４株接種からの日数と病原性との関係を示す図
【図２】Ｗ３７０株及びＷ３７０ｈｔｉ１−４株接種１１日目の黄花ルピナスの状態を示す図
【図３】Ｗ３７０株及びＷ３７０ｈｔｉ１株、並びにこれらの菌株を接種した植物から抽出したｄｓＲＮＡ画分の電気泳動の結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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