(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フカン又はその塩：
（１）構成糖：フコースからなる、
（２）下記一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖を主骨格とする：
【化１】
0003564469.tif 000055
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであって、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈであり、ｎは１〜２００００の整数である）、
（３）Alteromonas sp.  SN-1009由来の硫酸化フカン分解酵素により低分子化され、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）で表される化合物より選択される１種類以上の化合物が生成する：
【化２】
0003564469.tif 000056
【化３】
0003564469.tif 000057
【化４】
0003564469.tif 000058
【化５】
0003564469.tif 000059
【化６】
0003564469.tif 000060
【化７】
0003564469.tif 000061
（全式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）中、ｎが１〜５であることを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖。
【化８】
0003564469.tif 000062
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【請求項３】
請求項１または２記載の硫酸化フカンにAlteromonas sp.  SN-1009由来の硫酸化フカン分解酵素を作用させてその分解物を採取することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の調製方法であって、調製される硫酸化フカンオリゴ糖が一般式（ＸＶＩ）で表される化合物である場合、該化合物は下記一般式（ＸＩ）または（ＸＩＩ）から選択される化学構造を有する、硫酸化フカンオリゴ糖の調製方法：
【化４６】
0003564469.tif 000063
【化４７】
0003564469.tif 000064
【請求項４】
硫酸化フカンがガゴメ（Kjellmaniella crassifolia）、マコンブ（Laminaria japonica）、あるいはレッソニア  ニグレッセンス（Lessonia nigrescens）由来である請求項３記載の硫酸化フカンオリゴ糖の調製方法。
【請求項５】
請求項３記載の方法で調製される硫酸化フカンオリゴ糖。
【請求項６】
下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）から選択される化学構造を有する硫酸化フカンオリゴ糖またはその塩：
【化９】
0003564469.tif 000065
【化１０】
0003564469.tif 000066
【化４８】
0003564469.tif 000067
【化４９】
0003564469.tif 000068
【化１１】
0003564469.tif 000069
【化１２】
0003564469.tif 000070
【化１３】
0003564469.tif 000071
（全式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の属する技術分野】
本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フカンオリゴ糖、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。これらの多糖はフコイダンあるいはフコイジンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコンブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれから抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ（例えば、非特許文献１参照。）。そのため、硫酸化多糖を酵素的に分解してそのオリゴ糖を得たりその構造を決定したりするにはそれぞれを分解する酵素を取得する必要がある。
【０００３】
硫酸化多糖の分子種としては、硫酸化フカン（例えば、特許文献１参照。）、硫酸化フコグルクロノマンナン（例えば、特許文献２参照。）、硫酸化フコガラクタン（例えば、特許文献３参照。）等、またそれらの他にも何種類もの分子種（例えば、特許文献４参照。）が報告されている。硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性（例えば、特許文献１参照。）、硫酸化フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性（例えば、特許文献５参照。）が報告されているなど、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つことが多い。
【０００４】
硫酸化多糖を医薬品として開発する場合、その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利である。しかしながら褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によって異なることが多いため、１種類の硫酸化多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する分解酵素が必要となる。コンブ目海藻由来の硫酸化多糖の構造が研究されているが、多くの分子種のうち数種類の構造が判明しているに過ぎない（例えば、特許文献６、７、非特許文献２、３、４参照。）。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第９９／４１２８８号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９６／３４００４号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第００／５０４６４号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第０１／８１５６０号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９７／２６８９６号パンフレット
【特許文献６】
特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献７】
特開平８−９２３０３号公報
【非特許文献１】
酒井武、外１名、「バイオサイエンスとインダストリー」、２００２年６月、第６０巻、第６号、ｐ．３７７−３８０
【非特許文献２】
柴田英之、外６名、「薬理と治療」、１９９８年８月、第２６巻、第８号、ｐ．１２１１−１２１５
【非特許文献３】
田幸正邦、外４名、「応用糖質科学」、１９９６年２月、第４３巻、第２号、ｐ．１４３−１４８
【非特許文献４】
ナガオカ（Ｎａｇａｏｋａ，Ｍ．）、外８名、「グリココンジュゲート・ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第１６巻、ｐ．１９−２６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことから、コンブ目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する酵素、すなわち硫酸化フカンを特異的に分解する酵素を使用して酵素的に製造した構造が均一な硫酸化フカンオリゴ糖が求められていた。
すなわち、本発明の目的は、コンブ目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する硫酸化フカン分解酵素を硫酸化フカンに作用させて得られる低分子化物及びその製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フカン又はその塩に関する。
（１）構成糖：フコースを含有し、
（２）下記一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする：
【化１５】
0003564469.tif 000002
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであって、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈであり、ｎは１以上の整数である）、
（３）Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９由来の硫酸化フカン分解酵素により低分子化され、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）で表される化合物より選択される１種類以上の化合物が生成する：
【化１６】
0003564469.tif 000003
【化１７】
0003564469.tif 000004
【化１８】
0003564469.tif 000005
【化１９】
0003564469.tif 000006
【化２０】
0003564469.tif 000007
【化２１】
0003564469.tif 000008
（全式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【０００８】
本発明の第２の発明は、下記一般式（Ｉ）中、ｎが１〜５であることを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
【化２２】
0003564469.tif 000009
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【０００９】
本発明の第３の発明は、本発明の第１または第２の発明の硫酸化フカンにＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９由来の硫酸化フカン分解酵素を作用させてその分解物を採取することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の調製方法に関する。
本発明の第３の発明において、上記硫酸化フカンはガゴメ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ  ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、マコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、あるいはレッソニア  ニグレッセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来であってもよい。
【００１０】
本発明の第４の発明は、本発明の第３の発明の方法で調製される硫酸化フカンオリゴ糖に関する。
【００１１】
本発明の第５の発明は、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）から選択される化学構造を有する硫酸化フカンオリゴ糖またはその塩に関する。
【化２３】
0003564469.tif 000010
【化２４】
0003564469.tif 000011
【化２５】
0003564469.tif 000012
【化２６】
0003564469.tif 000013
【化２７】
0003564469.tif 000014
【化２８】
0003564469.tif 000015
（全式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【００１２】
すなわち、本発明者らは鋭意研究の結果、硫酸化フカン分解酵素を用いて、コンブ目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解し、糖鎖工学用試薬として利用できる、構造の均一な硫酸化フカンオリゴ糖を製造する方法を見出し、また、それらのオリゴ糖の構造を決定し本発明を完成させた。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下本発明に関して具体的に説明する。
【００１４】
本発明において、特に限定はされないが例えば、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンを使用することができる。該多糖は硫酸基とフコースを主要構成成分とする。また、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンの主鎖は一般の糖よりも酸に対して弱いＬ−フコースからなるため、加熱や酸処理により容易に低分子化することができる。
【００１５】
本発明において、前述の特徴を備えた硫酸化フカンを使用することができる。その由来は特に限定されるものではないが、例えば、ガゴメ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ  ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、マコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、あるいはレッソニア  ニグレッセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）等コンブ目の海藻は硫酸化フカンの含有量が多く原料として好適である。
【００１６】
本発明の硫酸化フカン分解酵素とは、硫酸化フカン及び硫酸化フカンオリゴ糖などに作用してフコースとフコースの間のα−Ｌ−フコシル結合をエンド的に加水分解し、還元性末端にＬ−フコースを持つオリゴ糖を生成させる。
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖とは、硫酸化フカンに本発明の硫酸化フカン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がＬ−フコースである。
【００１７】
本発明で使用する硫酸化フカンを製造する際にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、ｐＨは４〜９、温度は１００℃以下が好ましい。また、上記抽出液中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過により効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。
【００１８】
このようにして褐藻類の硫酸化多糖画分を得ることができる。該画分を硫酸化フカン画分として例えば本発明の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用可能である。該画分を陰イオン交換カラムにより分離すればより純度の高い硫酸化フカンを得ることもできる。上記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸化フカンもともに本発明の硫酸化フカンオリゴ糖製造時の原料として使用できる。
【００１９】
本発明の硫酸化フカンの主骨格は、下記一般式（Ｉ）に表される。下記一般式において、ｎは１以上の整数であり、例えば１〜２０，０００の範囲、さらに好ましくは１〜１０，０００の範囲のものが本発明の硫酸化フカンに含まれる。また、本発明の硫酸化フカンには、上記範囲であれば、下記一般式（Ｉ）が連続的に繰り返した構造を持つもの、及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式（Ｉ）が含有される構造を持つもののいずれもが含まれる。
【化２９】
0003564469.tif 000016
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【００２０】
本発明で用いる硫酸化フカン分解酵素を生産する菌株は、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネィティブ  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第９巻（１９９４）に記載の基本分類によればアルテロモナス属細菌に分類される。しかしながらアルテロモナス属細菌は近年分類の再編成が行われており、細菌学的性質のみで分類するのは適当ではない。そこで、本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の細菌と相同性を比較したところ最も相同性が高い細菌はＴｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ属であった。しかしながらその遺伝距離は０．０５（ｃｈａｎｇｅ／ａｖｅｒａｇｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）以上であり、同属とは判定できなかった。そこで、本発明者らは、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の相同性から、本菌株は既知の属に属さない新属の細菌であると断定し、本菌株をフカノバクター  リィティカス  ＳＮ−１００９と命名した。本明細書において、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９）は、フカノバクター  リィティカス  ＳＮ−１００９と同じものである。
【００２１】
なお、上記菌株はＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９として、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７として、平成８年２月１３日（原寄託日）より寄託され、ブタベスト条約に基づき平成８年１１月１５日（移管日）より国際寄託されている。配列表の配列番号１に本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を示す。
【００２２】
従って、１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列より、フカノバクター  リィティカス  ＳＮ−１００９と同属と判断される細菌を培養して本発明に使用する硫酸化フカン分解酵素を製造することができる。また、本発明においては、上記Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９株の他にＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＮ−１００９株の自然的又は人工的変異株、その他アルテロモナス属、フカノバクター属に属する菌種等であって、本発明に使用する硫酸化フカン分解酵素生産能を有する微生物を利用することができる。
本発明で用いる硫酸化フカン分解酵素は、上記微生物より実施例１記載の方法で取得することができる。
【００２３】
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸化フカン分解酵素を硫酸化フカン含有物に作用させることによって調製することができる。硫酸化フカン含有物としては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。
【００２４】
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製するにあたり、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フカン、若しくは該硫酸化フカン含有物はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の量を考慮して選定すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。反応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の配合比率や使用量、反応液の組成、反応時間等を調整することによって、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整することもできる。上記の様にして得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムにより分画することによって、更に均一な分子量あるいは均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。この方法により、後述するごとく、ＮＭＲ分析により構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を得ることができる。
【００２５】
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖としては、特に限定はされないが例えば、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）から選択される化学構造を有する硫酸化フカンオリゴ糖またはその塩が例示される。
【化３０】
0003564469.tif 000017
【化３１】
0003564469.tif 000018
【化３２】
0003564469.tif 000019
【化３３】
0003564469.tif 000020
【化３４】
0003564469.tif 000021
【化３５】
0003564469.tif 000022
（全式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【００２６】
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖に導くことが可能である。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。
【００２７】
本発明の硫酸化フカンオリゴ糖の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウム等の塩が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用することができる。例えば、特公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノピリジル化（ＰＡ化）を行い、該オリゴ糖のＰＡ−化物を調製すれば、硫酸化フカンオリゴ糖の蛍光標識標準物質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。
【００２９】
【実施例】
以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
本実施例において硫酸化フカンオリゴ糖の分子量は、質量分析結果から算出された平均分子量である。
【００３０】
参考例１  ガゴメ由来フコイダンの調製
養殖した乾燥ガゴメ２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）で破砕し、２０リットルの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを４０リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に２００ｇの活性炭、４．５リットルのエタノール、１２，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し５℃で２４時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により１００ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐＨを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．０とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ガゴメ由来フコイダンの乾燥物７６ｇを得た。
【００３１】
参考例２  硫酸化フカン画分の調製
参考例１記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む２０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ―セルロファインＡ−８００カラム（１１．４×４８ｃｍ）にかけ、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから１．９５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶出させた。溶出液は２５０ｍｌずつ分取した。各フラクションの総糖量をフェノール硫酸法により、ウロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した。溶出順に、フラクション４３−４９、５０−５５、５６−６７の画分をまとめ、それぞれを電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３−４９から３４０ｍｇ、５０−５５から８７０ｍｇ、５６−６７から２．６４ｇの乾燥物を得た。フラクション５６−６７から得た画分を硫酸化フカン画分とした。
【００３２】
参考例３    硫酸化フカン分解酵素活性測定方法
１２μｌの２．５％の硫酸化フカン画分溶液と、６０μｌの５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、９μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウムと、２１μｌの水と、１２μｌの本発明の硫酸化フカン分解酵素溶液とを混合し、３０℃で３時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、硫酸化フカン分解酵素溶液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。
【００３３】
１単位の硫酸化フカン分解酵素活性は上記反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化フカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。硫酸化フカン分解酵素活性は下記式により求めた。
｛（１２×１０００×２．５／１００）／ＭＧ｝×｛（ＭＧ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１２）｝＝Ｕ／ｍｌ
１２×１０００×２．５／１００：添加した硫酸化フカン画分（μｇ）
ＭＧ：基質硫酸化フカンの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化フカンが酵素により切断された部位の数
１８０：反応時間（分）
０．０１２：酵素液量（ｍｌ）
【００３４】
なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍｍ、昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム
検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
【００３５】
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。また、蛋白質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌの蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。
【００３６】
実施例１  硫酸化フカン分解酵素の調製
フカノバクター  リィティカス  ＳＮ−１００９を参考例１の方法で調製したフコイダン０．２％とペプトン０．３％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ８．２からなる培地４ｍｌを１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に接種し、２５℃で２４時間培養して種培養液とした。グルコース  ０．２５％、ペプトン  １％、酵母エキス  ０．０５％及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを２リットルの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に上記の種培養物を接種した、２５℃で２０時間培養したものを、ペプトン  １％、酵母エキス  ０．０２％及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水ｐＨ８．２からなる培地２０リットルを３０リットルのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に、参考例１の方法で調製したフコイダンを１００℃、２０分間処理したものを混合し、上記の種培養物を接種した。培養は２５℃で２８時間行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
【００３７】
得られた培養上清を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に溶媒置換し、遠心分離して上清を得た。
【００３８】
得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した２リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから４００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を６３ｍｌずつに分画し、活性画分を集めた。
【００３９】
得られた活性画分を排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した２００ｍｌ  ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を１９ｍｌずつに分画し、活性画分を集めた。
【００４０】
得られた活性画分を排除分子量１万の限外ろ過膜を装着させた限外ろ過装置により濃縮後、４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、１００ｍＭ  塩化カルシウム及び４Ｍ  塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍから１Ｍ  塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を９．４ｍｌずつに分画した。こうして硫酸化フカン分解酵素の精製物を得た。
【００４１】
実施例２  硫酸化フカン分解酵素を用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）調製
養殖したガゴメ乾燥物２００ｇを１０リットルの４５ｍＭ  塩化カルシウムと５００ｍＭ  塩化ナトリウムと９％  エタノールを含む１８ｍＭ  イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にひたし、硫酸化フカン分解酵素を３０Ｕ添加し、室温で２日間攪拌後、ろ紙でろ過し排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分１とした。
【００４２】
（２）精製
実施例２−（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分１を脱塩装置（マイクロアシライザー  Ｇ３、旭化成工業製）により脱塩後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この硫酸化フカンオリゴ糖溶液１に１０ｍＭとなるようにイミダゾールを、３００ｍＭとなるように塩化ナトリウムを添加し、３００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、３００ｍＭから１２００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションの中には少なくとも４個の明瞭なピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分について質量分析を行った。また、各ピークの糖組成を調べたところフコースのみで、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる各質量のオリゴ糖は表１に示すような組成のものと考えられた。
【００４３】
【表１】
0003564469.tif 000023
【００４４】
次に各ピークを形成するフラクションを集め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、下記の条件で精製した。
カラム：ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ（２０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
流速：８ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
平衡化溶液：１０％のアセトニトリルを含む０．５Ｍ  リン酸２水素ナトリウム
溶出溶液：１０％のアセトニトリルを含む０．５Ｍ  リン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１．５Ｍ  リン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。但し、ピーク番号１−（４）に関しては、１０％のアセトニトリルを含む７８７．５ｍＭ  リン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１４６２．５ｍＭ  リン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。
分取：１本あたり４ｍｌ
検出：フェノール硫酸法による
【００４５】
上記のカラムクロマトグラフィーにより分取したフラクションについて質量分析を行ったところ、ピーク番号１−（１）からは質量１９１４の物質が、ピーク番号１−（２）からは質量２２６４の物質が、ピーク番号１−（３）からは質量２３６６の物質が、ピーク番号１−（４）からは質量３４６０の物質がそれぞれ主ピークとして得られた。各ピーク部分を集め、１０％  エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％  エタノールで溶出して脱塩した。こうして本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）〜（４）を得た。
【００４６】
（３）構造解析
実施例２−（２）で得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）〜（４）について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法により還元末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、オリゴ糖１−（１）〜（４）の還元性末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定した。また、ＪＮＭα−５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いてＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
【００４７】
以下にオリゴ糖１−（１）〜（４）の物性を示す。
（ａ）オリゴ糖１−（１）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２に、マススペクトルを図３にそれぞれ示した。図１、図２において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図３において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１９１４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５５．０［Ｍ−４Ｎａ＋］４−、６１４．８［Ｍ−３Ｎａ＋］３−、９３３．８［Ｍ−２Ｎａ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表２及び表３に示す。
【００４８】
【表２】
0003564469.tif 000024
【００４９】
【表３】
0003564469.tif 000025
【００５０】
糖組成  Ｌ−フコースのみ（６分子）
硫酸基  １０分子
ナトリウム  １０分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（ＩＶ）の通りである。
【００５１】
【化３６】
0003564469.tif 000026
【００５２】
（ｂ）オリゴ糖１−（２）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図５に、マススペクトルを図６にそれぞれ示した。図４、図５において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図６において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２２６４
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５４．２［Ｍ−６Ｎａ＋］６−、４２９．８［Ｍ−５Ｎａ＋］５−、５４３．０［Ｍ−４Ｎａ＋］４−、７３１．６［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表４、表５に示す。
【００５３】
【表４】
0003564469.tif 000027
【００５４】
【表５】
0003564469.tif 000028
【００５５】
糖組成  Ｌ−フコースのみ（７分子）
硫酸基  １２分子
ナトリウム  １２分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。
【００５６】
【化３７】
0003564469.tif 000029
【００５７】
上記式（Ｖ）の硫酸化糖について、国際公開第００／６２７８５号パンフレット、実施例１−（２）記載の方法で、ＨＧＦ産生誘導活性を調べたところ、当該活性が確認できた。
【００５８】
（ｃ）オリゴ糖１−（３）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図８に、マススペクトルを図９にそれぞれ示した。図７、図８において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図９において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２３６６
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７１．４［Ｍ−６Ｎａ＋］６−、４５０．３［Ｍ−５Ｎａ＋］５−、５６８．６［Ｍ−４Ｎａ＋］４−、７６５．７［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表６及び表７に示す。
【００５９】
【表６】
0003564469.tif 000030
【００６０】
【表７】
0003564469.tif 000031
【００６１】
糖組成  Ｌ−フコースのみ（７分子）
硫酸基  １３分子
ナトリウム  １３分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＶＩ）の通りである。
【００６２】
【化３８】
0003564469.tif 000032
【００６３】
（ｄ）オリゴ糖１−（４）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１０に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１１に、マススペクトルを図１２にそれぞれ示した。図１０、図１１において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１２において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；３４６０
ＭＳ  ｍ／ｚ  ４０９．６［Ｍ−８Ｎａ＋］８−、４７１．４［Ｍ−７Ｎａ＋］７−、５５３．８［Ｍ−６Ｎａ＋］６−、６６９．３［Ｍ−５Ｎａ＋］５−、８４２．３［Ｍ−４Ｎａ＋］４−、１１３０．８［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表８〜表１０に示す。
【００６４】
【表８】
0003564469.tif 000033
【００６５】
【表９】
0003564469.tif 000034
【００６６】
【表１０】
0003564469.tif 000035
【００６７】
糖組成  Ｌ−フコースのみ（１１分子）
硫酸基  １８分子
ナトリウム  １８分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＶＩＩ）の通りである。
【００６８】
【化３９】
0003564469.tif 000036
【００６９】
実施例３  硫酸化フカン分解酵素を用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）調製
養殖したガゴメ乾燥物を穴径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業製）を用いてチップとした。２５０ｇのガゴメチップを５リットルの８０％エタノールに懸濁し、室温で２時間攪拌後、ろ過した。この８０％  エタノール洗浄を４回繰り返しガゴメチップ洗浄物を得た。ガゴメチップ洗浄物  ２５０ｇを５リットルの１２５ｍＭ  塩化カルシウムと２５０ｍＭ  塩化ナトリウムと１０％  エタノールを含む１７ｍＭ  イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、室温で２４時間攪拌後、ろ過、遠心分離して、ガゴメフコイダン溶液を得た。この抽出液１リットルに、硫酸化フカン分解酵素を１０Ｕ添加し室温で３日間攪拌後、ろ紙でろ過し、ろ液を遠心分離して上清を得、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分２とした。
【００７０】
（２）精製
実施例３−（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分２を、１００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、１００ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションは２個のピークを形成したのでそれぞれのピーク部分について質量分析を行った。また、各ピークの糖組成を調べたところフコースのみで、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる各質量のオリゴ糖は表１１に示すような組成のものと考えられた。
【００７１】
【表１１】
0003564469.tif 000037
【００７２】
次に各ピークを形成するフラクションを集め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、実施例２−（２）と同じ条件で精製した。
ＹＭＣ  パック  ポリアミンＩＩ  カラムを用いたクロマトグラフィーにより分取したフラクションについて質量分析を行ったところ、ピーク番号２−（１）からは、質量１９１４及び２０１６の物質が、ピーク番号２−（２）からは質量３１１０の物質がそれぞれ主要ピークとして得られた。
これら、質量１９１４、２０１６、及び３１１０の物質を含むピーク近辺のフラクションを集め、１０％エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出して脱塩した。こうして本発明の硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１、２−（１）−２、及び２−（２）を得た。
【００７３】
（３）構造解析
実施例３−（２）で得られた本発明の硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１、２−（１）−２、及び２−（２）について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法により還元性末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、還元性末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定した。また、ＪＮＭ  α−５００型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いてＮＭＲ分析を行った。構成糖の結合様式は、１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
以下に本発明の硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１、２−（１）−２、及び２−（２）の物性を示す。
【００７４】
（ａ）硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１の物性
上記分析の結果、硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１は本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）と同じ物質であると判明した。
【００７５】
（ｂ）硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−２の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１３に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１４に、マススペクトルを図１５にそれぞれ示した。図１３、図１４において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１５において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；２０１６
ＭＳ    ｍ／ｚ  ３１３．１  ［Ｍ−６Ｎａ＋］６−，  ３８０．３  ［Ｍ−５Ｎａ＋］５−，  ４８１．１  ［Ｍ−４Ｎａ＋］４−，  ６４９．１  ［Ｍ−３Ｎａ＋］３−，  ９８５．０  ［Ｍ−２Ｎａ＋］２−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１２及び表１３に示す。
【００７６】
【表１２】
0003564469.tif 000038
【００７７】
【表１３】
0003564469.tif 000039
【００７８】
糖組成    Ｌ−フコースのみ（６分子）
硫酸基    １１分子
ナトリウム    １１分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＶＩＩＩ）の通りである。
【００７９】
【化４０】
0003564469.tif 000040
【００８０】
（ｃ）オリゴ糖２−（２）の物性
質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖２−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１６に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１７に、マススペクトルを図１８にそれぞれ示した。図１６、図１７において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１８において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；３１１１
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６５．８［Ｍ−８Ｎａ＋］８−、４２１．４［Ｍ−７Ｎａ＋］７−、４９５．２［Ｍ−６Ｎａ＋］６−、５９９．１［Ｍ−５Ｎａ＋］５−、７５５．０［Ｍ−４Ｎａ＋］４−、１０１３．７［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１４〜表１６に示す。
【００８１】
【表１４】
0003564469.tif 000041
【００８２】
【表１５】
0003564469.tif 000042
【００８３】
【表１６】
0003564469.tif 000043
【００８４】
糖組成  Ｌ−フコースのみ（１０分子）
硫酸基  １６分子
ナトリウム  １６分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＩＸ）の通りである。
【００８５】
【化４１】
0003564469.tif 000044
【００８６】
実施例４  硫酸化フカン分解酵素を用いたマコンブ硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）調製
養殖したマコンブの乾燥物を穴径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業製）を用いてチップとした。５００ｇのマコンブチップを４．５リットルの８０％エタノールに懸濁し、室温で２４時間攪拌後、ろ過した。この８０％エタノール洗浄を３回繰り返し、マコンブチップ洗浄物を得た。得られた洗浄物全量を、５０ｍＭ塩化カルシウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、及び１０％のエタノールを含む１０リットルの５０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液ｐＨ８．０に懸濁し、そこに、硫酸化フカン分解酵素を２Ｕ添加し、室温で５日間攪拌後、ろ紙でろ過し、ろ液を遠心分離して、上清を得、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子画分を回収しマコンブ硫酸化フカンオリゴ糖画分１とした。
（２）精製
上記（１）で得られたマコンブ硫酸化フカンオリゴ糖画分１に１０％エタノールを加えて下記の平衡化用緩衝液と導電率を同じにし、２００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、２００ｍＭから１．２Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出には４．５リットルの緩衝液を使用し、分取は１本あたり５０ｍｌとした。溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションは３個のピークを形成した。２つめのピーク近辺のフラクション（４４−４８）を集め、エヴァポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールにより平衡化させた４．１×９０ｃｍのセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。糖が検出された画分を集め、エヴァポレーターにより８．４ｍｌに濃縮後、下記の条件で精製した。
カラム：ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩ  （２０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
流速：８ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
平衡化溶液：１０％のアセトニトリルを含む８７５ｍＭのリン酸２水素ナトリウム
溶出：１０％のアセトニトリルを含む８７５ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１．４Ｍのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による
分取：１本あたり４ｍｌ
検出：フェノール−硫酸法による
【００８７】
上記のカラムクロマトグラフィーにより分取したフラクション（３回分、フラクションナンバー５０−５９近辺）を集め、排除分子量３５００の透析チューブを用いて１０％エタノールに対して透析し、エヴァポレーターで約４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化したセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出させた。
溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。主要ピークの近辺を集め、再度同様にセルロファインＧＣＬ−２５により精製した。本溶出画分の主要ピークを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖１を得た。
【００８８】
（３）構造解析
実施例２に記載の方法でオリゴ糖の構造解析を行ったところ、マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖１の構造は、実施例２に記載の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）と同じであることがわかった。
【００８９】
実施例５  レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製および構造解析
（１）調製
参考例１に記載の方法により、レッソニア  ニグレッセンスの乾燥チップからレッソニア  ニグレッセンス由来フコイダンを調製した。
すなわち、１０ｇのレッソニア  ニグレッセンス由来フコイダンを５０ｍＭ塩化カルシウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、及び１０％のエタノールを含む２リットルの５０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解し、そこに、硫酸化フカン分解酵素を１Ｕ添加し、室温で４０時間攪拌後、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子画分を回収しレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖画分１とした。
【００９０】
（２）精製
上記（１）で得られたレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖画分１を２００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０％のエタノールを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１０００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、２００ｍＭから７００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出には５リットルの緩衝液を使用し、分取は１本あたり５６ｍｌとした。溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションは７個のピークを形成した。それぞれのピーク近辺のフラクションを集め、エヴァポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、（以下それらをレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）から１−（７）とする。）１０％エタノールにより平衡化させた４．１×９０ｃｍのセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。糖が検出された画分を集め、エバポレーターにより濃縮後、下記の条件で精製した。
カラム：ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩ  （２０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
流速：８ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
平衡化溶液：レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）、（２）、（３）の場合は１０％のアセトニトリルを含む９０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）、（５）の場合は１０％のアセトニトリルを含む６３０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（６）の場合は１０％のアセトニトリルを含む７２０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）の場合は１０％のアセトニトリルを含む９００ｍＭのリン酸２水素ナトリウム
【００９１】
溶出：レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）、（２）、（３）の場合は１０％のアセトニトリルを含む９０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む９００ｍＭのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）、（５）の場合は１０％のアセトニトリルを含む６３０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１２６０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（６）の場合は１０％のアセトニトリルを含む７２０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１４４０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）の場合は１０％のアセトニトリルを含む９００ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む１６２０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。
【００９２】
分取：１本あたり４ｍｌ
検出：フェノール−硫酸法による
【００９３】
レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）から１−（７）の上記のカラムクロマトグラフィーにより分取したフラクションにおいて、それぞれの糖溶出画分を集め、エヴァポレーターで約４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化したセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出させた。
溶出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定した。主要ピークの近辺を集め、再度同様にセルロファインＧＣＬ−２５により精製した。但し、レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）に関しては、２種の主要ピークが認められたので、それぞれのピークをレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−１及び１−（７）−２とした。それぞれの溶出画分の主要ピークを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）から１−（７）−２を得た。
【００９４】
（３）構造解析
実施例２に記載の方法でオリゴ糖の構造解析を行った。
以下に、レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）から１−（７）−２の物性を示す。
【００９５】
（ａ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１９に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２０に、マススペクトルを図２１にそれぞれ示した。図１９、図２０において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２１において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；７１８
ＭＳ    ｍ／ｚ  ２１６．５［Ｍ−３Ｎａ＋］３−，３３６．０［Ｍ−２Ｎａ＋］２−，６９５．０［Ｍ−Ｎａ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１７に示す。
【００９６】
【表１７】
0003564469.tif 000045
【００９７】
糖組成    Ｌ−フコースのみ（２分子）
硫酸基    ４分子
ナトリウム    ４分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（Ｘ）の通りである。
【００９８】
【化４２】
0003564469.tif 000046
【００９９】
（ｂ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２３に、マススペクトルを図２４にそれぞれ示した。図２２、図２３において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２４において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；９６６
ＭＳ    ｍ／ｚ  ４５９．９［Ｍ−２Ｎａ＋］２−，９４２．９［Ｍ−Ｎａ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１８に示す。
【０１００】
【表１８】
0003564469.tif 000047
【０１０１】
糖組成    Ｌ−フコースのみ（３分子）
硫酸基    ５分子
ナトリウム    ５分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＸＩ）の通りである。
【０１０２】
【化４３】
0003564469.tif 000048
【０１０３】
（ｃ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の物性
質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２５に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２６に、マススペクトルを図２７にそれぞれ示した。図２５、図２６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２７において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。
分子量；１０６８
ＭＳ    ｍ／ｚ  ３３２．９［Ｍ−３Ｎａ＋］３−，５１１．０［Ｍ−２Ｎａ＋］２−，１０４５．０［Ｍ−Ｎａ＋］−
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１９に示す。
【０１０４】
【表１９】
0003564469.tif 000049
【０１０５】
糖組成    Ｌ−フコースのみ（３分子）
硫酸基    ６分子
ナトリウム    ６分子
なお、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナルの帰属の番号は下記式（ＸＩＩ）の通りである。
【０１０６】
【化４４】
0003564469.tif 000050
【０１０７】
（ｄ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の物性
実施例２に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の構造は、実施例２に記載の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）と同じであることがわかった。
【０１０８】
（ｅ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の物性
実施例２に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（５）の構造は、実施例２に記載の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）と同じであることがわかった。
【０１０９】
（ｆ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（６）の物性
本発明のレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（６）の質量分析の結果を以下に示す。
分子量；３４６１
ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６１．５［Ｍ−９Ｎａ＋］９−，４０９．６２［Ｍ−８Ｎａ＋］８−，４７１．４２［Ｍ−７Ｎａ＋］７−，５５３．８１［Ｍ−６Ｎａ＋］６−，６６９．３１［Ｍ−５Ｎａ＋］５−，８４２．３２［Ｍ−４Ｎａ＋］４−，１１３０．８３［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
糖組成  Ｌ−フコースのみ（１１分子）
硫酸基  １８分子
ナトリウム  １８分子
【０１１０】
（ｇ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−１の物性本発明のレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−１の質量分析の結果を以下に示す。
分子量；４６５９
ＭＳ  ｍ／ｚ    ４４２．８２［Ｍ−１０Ｎａ＋］１０−，４９４．７２［Ｍ−９Ｎａ＋］９−，５５９．３２［Ｍ−８Ｎａ＋］８−，６４２．６２［Ｍ−７Ｎａ＋］７−，７５３．５２［Ｍ−６Ｎａ＋］６−，９０８．８２［Ｍ−５Ｎａ＋］５−，１１４１．４３［Ｍ−４Ｎａ＋］４−
糖組成  Ｌ−フコースのみ（１５分子）
硫酸基  ２４分子
ナトリウム  ２４分子
【０１１１】
（ｈ）レッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−２の物性本発明のレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−２の質量分析の結果を以下に示す。
分子量；３５６４
ＭＳ  ｍ／ｚ    ３７３．１２［Ｍ−９Ｎａ＋］９−，４２２．５２［Ｍ−８Ｎａ＋］８−，４８６．３２［Ｍ−７Ｎａ＋］７−，５７１．０１［Ｍ−６Ｎａ＋］６−，６８９．６１［Ｍ−５Ｎａ＋］５−，８６８．０２［Ｍ−４Ｎａ＋］４−，１１６４．９３［Ｍ−３Ｎａ＋］３−
糖組成  Ｌ−フコースのみ（１１分子）
硫酸基  １９分子
ナトリウム  １９分子
【０１１２】
実施例６  硫酸化フカン分解酵素を用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析
（１）調製
参考例１記載の養殖したガゴメ由来フコイダン１０ｇを４．８リットルの１２５ｍＭ  塩化カルシウムと２５０ｍＭ  塩化ナトリウムと１０％  エタノールを含む１７ｍＭ  イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、硫酸化フカン分解酵素を１０Ｕ添加し、室温で７２時間攪拌して、ガゴメフコイダンオリゴ糖溶液を得た。排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分３とした。
【０１１３】
（２）分析
上記（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分３を１００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、１００ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクションは２個のピークを形成したのでそれぞれのピーク部分について質量分析を行った。また、その糖組成を調べたところフコースのみで、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる各質量のオリゴ糖は表２０に示すような組成のものと考えられた。
【０１１４】
【表２０】
0003564469.tif 000051
【０１１５】
硫酸化フカンオリゴ糖画分３には上表に示すような種々の硫酸化フカンオリゴ糖が入っていることが判明した。
【０１１６】
実施例７  硫酸化フカン分解酵素を用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、構造解析及び生理活性
（１）実施例２−（２）で得られたＤＥＡＥ−セルロファインの４個の明瞭なピークの他に、それらよりも高い塩濃度で溶出される幅広いピークも認められたのでオリゴ糖４として採取し、実施例２と同様の方法でＮＭＲ分析を行った。その結果、硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）とほぼ同じスペクトルが得られた。この結果から、オリゴ糖４はオリゴ糖１−（２）が数分子結合した構造を持つことが強く示唆された。そこで、オリゴ糖４を実施例１記載の硫酸化フカン分解酵素により分解し、分解物をＨＰＬＣにより分析したところ、反応生成物の多くが硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）と同じ位置に溶出されてきた。
プルランを標準物質としたゲル濾過法により、上記オリゴ糖４の分子量を測定したところ、オリゴ糖４の分子量はオリゴ糖１−（２）の３倍程度であることが判明した。
【０１１７】
また、７糖残基の繰り返しの結合位置は、オリゴ糖４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを詳細に検討することにより、式（ＩＶ）中のＦ６のフコースの３位にα−（１→３）結合でつながっていることが明らかとなった。
【０１１８】
さらに上記方法に準じ、硫酸化多糖の分解物中より、（Ｉ）で表される硫酸化糖の１〜５量体、すなわち下記一般式（Ｉ）においてｎ＝１〜５で表される硫酸化糖を得た。
【化４５】
0003564469.tif 000052
（式中、ＲはＨ又はＳＯ３Ｈであり、Ｒの少なくとも１つはＳＯ３Ｈである。）
【０１１９】
以上のことから、ガゴメ昆布のような褐藻類から得られた硫酸化フカン含有多糖を、硫酸化フカン分解酵素で処理することにより低分子化され、上記一般式で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分子量をゲル濾過法を用いて、測定したところ、抽出条件がｐＨ６〜８、９５℃  約２時間の場合は、平均分子量は約２０万であった。
【０１２０】
（２）上記（１）で得られた硫酸化糖について、生理活性を調べた。その結果、式（Ｉ）で示される硫酸化糖は、国際公開第００／６２７８５号パンフレット、実施例１−（２）記載の方法で、ＨＧＦ産生誘導活性を調べたところ、当該活性が確認できた。また、式（Ｉ）の硫酸化糖について、国際公開第９９／４１２８８号パンフレット、実施例８ならびに実施例９記載の方法で保湿性を調べたところ、非常に有用であることが確認できた。
【０１２１】
【発明の効果】
本発明により硫酸化フカン分解酵素を使用した糖鎖工学用試薬として有用な様々な分子量の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法が提供される。また、構造が解明された種々の硫酸化フカンオリゴ糖が提供される。
【０１２２】
【配列表】
0003564469.tif 000053
0003564469.tif 000054
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図４】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図７】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図８】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図９】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１０】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１２】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１３】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１５】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−２の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１６】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（２）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１８】本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖２−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１９】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２１】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図２２】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２３】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２４】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図２５】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２６】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２７】本発明により得られるレッソニア  ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図である。
【図１】
0003564469.tif 000072
【図２】
0003564469.tif 000073
【図３】
0003564469.tif 000074
【図４】
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【図５】
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【図６】
0003564469.tif 000077
【図７】
0003564469.tif 000078
【図８】
0003564469.tif 000079
【図９】
0003564469.tif 000080
【図１０】
0003564469.tif 000081
【図１１】
0003564469.tif 000082
【図１２】
0003564469.tif 000083
【図１３】
0003564469.tif 000084
【図１４】
0003564469.tif 000085
【図１５】
0003564469.tif 000086
【図１６】
0003564469.tif 000087
【図１７】
0003564469.tif 000088
【図１８】
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【図１９】
0003564469.tif 000090
【図２０】
0003564469.tif 000091
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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